【手続補正書】
【提出日】平成29年6月19日(2017.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【図１Ａ】ＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。
【図１Ｂ】ＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。
【図１Ｃ】レポーターコンストラクトのデザインである。
【図１Ｄ】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）および免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）の両方によってアッセイした、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体がＲＮＡ誘導性転写活性化を示すことを表すデータを示す図である。
【図１Ｅ】Ｃａｓ９Ｎ、ＭＳ２−ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡの存在下におけるレポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化を示すＦＡＣＳおよびＩＦによるアッセイデータを示す図である。
【図１Ｆ】個々のｇＲＮＡおよび複数のｇＲＮＡによる転写誘導を表すデータを示す図である。
【図２Ａ】Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびＴＡＬＥによる標的化のランドスケープを評価する方法を示す図である。
【図２Ｂ】Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が平均してその標的配列中の１〜３個の変異に対して許容性があることを表すデータを示す図である。
【図２Ｃ】Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が、ＰＡＭ配列に局在するものを除いて、点変異にほとんど感受性がないことを表すデータを示す図である。
【図２Ｄ】２塩基のミスマッチの導入によってＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体活性が顕著に損なわれることを表すヒートプロットデータを示す図である。
【図２Ｅ】１８塩基長のＴＡＬＥが平均してその標的配列中の１〜２個の変異に対して許容性があることを表すデータを示す図である。
【図２Ｆ】１８塩基長のＴＡＬＥが、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と同様に、その標的中の１塩基のミスマッチにほとんど感受性がないことを表すデータを示す図である。
【図２Ｇ】２塩基のミスマッチの導入によって１８塩基長のＴＡＬＥの活性が顕著に損なわれることを表す、ヒートプロットデータを示す図である。
【図３Ａ】ガイドＲＮＡデザインの模式図である。
【図３Ｂ】５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックおよび３′オーバーハングを生じさせるオフセットニックについての非相同末端結合の割合を表すデータを示す図である。
【図３Ｃ】５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックおよび３′オーバーハングを生じさせるオフセットニックについての標的化の割合を表すデータを示す図である。
【図４Ａ】ＰＤＢ  ＩＤ：４ＥＰ４（青）のＲｕｖＣのＤ７位の金属配位残基の模式図（左）、配位しているＭｇイオン（灰色の球）および３Ｍ７Ｋ由来のＤＮＡ（紫）を含むＰＤＢ  ＩＤ：３Ｍ７Ｋ（オレンジ）およびＰＤＢ  ＩＤ：４Ｈ９Ｄ（シアン）のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの模式図（中央）、および分析した変異体のリスト（右）を示す図である。
【図４Ｂ】ＣＡＳ９変異体ｍ３およびｍ４、ならびにそれら変異体のそれぞれとＶＰ６４との融合体のヌクレアーゼ活性が検出不能であることを表すデータを示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｂのデータの高分解能検査を示す図である。
【図５Ａ】Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ活性を決定するための相同組換えアッセイの模式図である。
【図５Ｂ】ランダム配列挿入を有するガイドＲＮＡおよび相同組換えの割合を示す図である。
【図６Ａ】ＯＣＴ４遺伝子のガイドＲＮＡの模式図である。
【図６Ｂ】プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトでの転写活性化を示す図である。
【図６Ｃ】転写活性化を内在性遺伝子のｑＰＣＲにより示す図である。
【図７Ａ】ＲＥＸ１遺伝子用のガイドＲＮＡの模式図である。
【図７Ｂ】プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの転写活性化を示す図である。
【図７Ｃ】ｑＰＣＲによって内在性遺伝子の転写活性化を示す図である。
【図８Ａ】標準化された発現レベルを算出するための多段階特異性分析処理フローを模式的に示す図である。
【図８Ｂ】バイアスがかけられたコンストラクトライブラリー内に生じたミスマッチの数に対する結合部位の割合の分布データを示す図である。左：理論的分布。右：実際のＴＡＬＥコンストラクトライブラリーで観察された分布。
【図８Ｃ】ミスマッチの数に対する、結合部位に集計したタグの数の割合の分布データを示す図である。左：陽性対照試料で観察された分布。右：対照でないＴＡＬＥが誘導された試料で観察された分布。
【図９Ａ】標的配列中の１〜３個の変異に許容性を示す、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化グランドスケープの分析のデータを示す図である。
【図９Ｂ】ＰＡＭ配列に局在しているものを除いて、点変異への感受性がないことを示すＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化ランドスケープの分析データを示す図である。
【図９Ｃ】２塩基のミスマッチの導入により活性が顕著に損なわれることを示す、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化ランドスケープの分析のヒートプロットデータを示す図である。
【図９Ｄ】ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９の予想されるＰＡＭがＮＧＧであり、またＮＡＧであることを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す図である。
【図１０Ａ】１８塩基長のＴＡＬＥがそれらの標的配列中の複数の変異に対して許容性があることを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す図である。
【図１０Ｂ】３つの異なるサイズ（１８塩基長、１４塩基長、および１０塩基長）のＴＡＬＥの標的化ランドスケープの分析のデータを示す図である。
【図１０Ｃ】ほぼ１塩基ミスマッチの分解能を示す１０塩基長のＴＡＬＥのデータを示す図である。
【図１０Ｄ】ほぼ１塩基ミスマッチの分解能を示す１０塩基長のＴＡＬＥのヒートプロットデータを示す図である。
【図１１Ａ】デザインされたガイドＲＮＡを示す図である。
【図１１Ｂ】種々のガイドＲＮＡの非相同末端結合のパーセンテージを示す図である。
【図１２Ａ】推定上の直交性Ｃａｓ９タンパク質の比較および特徴を示す図である。図１２Ａ：ＳＰ、ＳＴ１、ＮＭ、およびＴＤの反復配列。保存度を示すように塩基が着色されている。
【図１２Ｂ】大腸菌中でのＣａｓ９タンパク質の特徴解析に用いたプラスミド。
【図１２Ｃ】スペーサーとプロトスペーサーがマッチする場合、Ｃａｓ９による切断によってライブラリーから機能性ＰＡＭが除去される。
【図１２Ｄ】標的化プラスミドのスペーサーとライブラリーのプロトスペーサーがマッチしない場合、Ｃａｓ９は切断しない。
【図１２Ｅ】非機能性のＰＡＭは切断または除去されない。
【図１２Ｆ】ＰＡＭを特定するための選択スキーム。Ｃａｓ９タンパク質および２つのスペーサー含有標的化プラスミドの一方を発現する細胞を、対応するプロトスペーサーを有する２つのライブラリーの一方で形質転換し、抗生物質選択を行った。生存している切断されなかったプラスミドのディープシークエンシングを行った。マッチしないプロトスペーサーライブラリーに対するマッチするプロトスペーサーライブラリー内の各配列の相対的存在量を比較することにより、Ｃａｓ９によるＰＡＭ除去を定量化した。
【図１３Ａ】Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＮＭによるライブラリーの平均除去を反映する。
【図１３Ｂ】Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＳＴ１によるライブラリーの平均除去を反映する。
【図１３Ｃ】Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＴＤによるライブラリーの平均除去を反映する。
【図１３Ｄ】各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。
【図１３Ｅ】各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。
【図１３Ｆ】各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。
【図１４Ａ】ＮＭによる転写抑制を示す図である。抑制を定量化するために用いるレポータープラスミド。
【図１４Ｂ】ＮＭによる転写抑制を示す図である。マッチおよびミスマッチのスペーサー・プロトスペーサー対について標準化された細胞蛍光。エラーバーは５回反復実験の標準偏差を表す。
【図１５】大腸菌中でのｃｒＲＮＡの直交認識を示す図である。Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡの全ての組合せを有する細胞を、マッチまたはミスマッチのプロトスペーサーおよび適切なＰＡＭを有するプラスミドに曝した。マッチするスペーサーとプロトスペーサーの対からコロニーが確実に得られるように十分な細胞をプレーティングし、全コロニー数を用いて除去倍率を算出した。
【図１６Ａ】ヒト細胞におけるＣａｓ９による遺伝子編集を示す図である。相同組換えアッセイを用いて遺伝子編集効率を定量化した。Ｃａｓ９によるプロトスペーサー内のＤＮＡ二本鎖切断は、ドナー鋳型を用いて分断型ＧＦＰカセットの修復を促進し、完全な（intact）ＧＦＰを有する細胞が生じた。各Ｃａｓ９についての的確なＰＡＭを準備するために、３種類の異なる鋳型を用いた。
【図１６Ｂ】各Ｃａｓ９についての的確なＰＡＭを準備するために、３種類の異なる鋳型を用いた。蛍光細胞をフローサイトメトリーにより定量化した。それぞれについてのｓｇＲＮＡと組み合わせた、ＮＭ、ＳＴ１、およびＴＤの細胞選別の結果。各Ｃａｓ９に対するプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列が各セットの上に示される。各プロットの右上隅に修復効率が示される。
【図１７Ａ】ヒト細胞における転写活性化を示す図である。ｔｄＴｏｍａｔｏ誘導性（driving）ミニマルプロモーターを特徴とする転写活性化のためのレポーターコンストラクト。プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列をミニマルプロモーターの上流に配置した。
【図１７Ｂ】プロトスペーサーへのヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の結合により、転写が活性化し、蛍光が増大した。Ｃａｓ９活性化因子およびｓｇＲＮＡの全ての組合せで細胞に遺伝子導入し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を可視化した。それぞれのＣａｓ９が自身のｓｇＲＮＡと対になった場合にのみ転写が活性化された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ−３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２  ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株； エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ１  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ‐Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・カプリナス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）Ｃｈａｌｌｉｓ  ｓｕｂｓｔ  ＣＨ１株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ−１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ−９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉｌ株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８株；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ−１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディ��フォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１−２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ  １４株；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ２６３８株；キャンピロバククー・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejunidoylei）２６９  ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）ＦＳＣ１９８株；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６−３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、本明細書に記載されるようにヌクレアーゼ欠損にされたまたはニッカーゼにされた、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類以上の標的核酸に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、
前記２種類以上の標的核酸にそれぞれ結合し、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってそれぞれガイドされる２種類以上の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損（nuclease-null）ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
２種類以上の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡ、前記２種類以上の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記２種類以上の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
（ａ）ＲＮＡと、（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインと、（ｄ）標的核酸との共局在複合体が２種類以上形成され、前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが前記（ｄ）標的核酸の発現を制御する、
細胞において２種類以上の標的核酸の発現を調節する方法。
【請求項２】
直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記第２の外来核酸が、前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２種類以上のＲＮＡをコードする前記第１の外来核酸が、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、且つ、転写制御タンパク質またはドメインをコードする前記第３の外来核酸が、前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ａ）ＲＮＡが１０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）ＲＮＡが２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を上方制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を上方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが転写抑制因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を下方制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を下方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｄ）標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記２種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記２種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記（ｄ）標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第１の標的核酸が活性化され、第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
複数種類の第１の標的核酸が抑制され、複数種類の第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
１種類または複数種類の第１の標的核酸が活性化され、１種類または複数種類の第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞において１種類または複数種類の標的核酸の発現を制御すると同時に、細胞において１種類または複数種類の標的核酸を改変する方法であって、
少なくとも１種類のＲＮＡが前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的であり、少なくとも１種類のＲＮＡが前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である、２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
（１）１つの不活性ヌクレアーゼドメインを有し、且つ前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記少なくとも１種類のＲＮＡによってガイドされる、１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼ、および（２）前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記少なくとも１種類のＲＮＡに結合し且つガイドされる、１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡ、前記１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼ、前記１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
（ａ）ＲＮＡと、（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼと、および（ｃ）改変される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼが、前記（ｃ）改変される標的核酸にニックを入れ、
（ａ’）ＲＮＡと、（ｂ’）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、（ｃ’）転写制御タンパク質またはドメインと、（ｄ’）制御される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、前記（ｃ’）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ’）制御される標的核酸の発現を制御する、方法。
【請求項２２】
細胞において１種類または複数種類の標的核酸の発現を制御すると同時に細胞において１種類または複数種類の標的核酸を改変する方法であって、
少なくとも１種類のＲＮＡが前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的であり、少なくとも１種類のＲＮＡが前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である、２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
（１）前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記少なくとも１種類のＲＮＡによってガイドされる、１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼ、および（２）前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記少なくとも１種類のＲＮＡに結合し且つガイドされる、１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡ、前記１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼ、前記１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
（ａ）ＲＮＡと、（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼと、および（ｃ）改変される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、前記（ｃ）改変される標的核酸を切断し、
（ａ’）ＲＮＡと、（ｂ’）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、（ｃ’）転写制御タンパク質またはドメインと、（ｄ’）制御される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、前記（ｃ’）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ’）制御される標的核酸の発現を制御する、方法。
【請求項２３】
２種類以上の標的核酸のそれぞれに相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸、
２種類以上の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸、および
２種類以上の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を含み、
（ａ）ＲＮＡ、（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインのそれぞれが、（ｄ）標的核酸のそれぞれに対する共局在複合体の構成要素である細胞。
【請求項２４】
直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記第２の外来核酸が、前記直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
２種類以上のＲＮＡをコードする前記第１の外来核酸が、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写制御タンパク質またはドメインをコードする前記第３の外来核酸が、前記転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が真核細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２８】
前記（ａ）ＲＮＡが１０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２９】
前記（ａ）ＲＮＡが２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３０】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３１】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を上方制御する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３２】
前記（ｃ）転写制御タンパク質またはドメインが、前記（ｄ）標的核酸の発現を上方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３３】
前記（ｄ）標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３４】
前記２種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記２種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３６】
前記（ｄ）標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３７】
前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項４０】
前記（ｂ）直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３に記載の細胞。