【手続補正書】
【提出日】平成29年6月7日(2017.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロウイルス粒子を含む組成物を製造するための方法であって、
ａ）前記エンテロウイルス粒子を含有する培地を製造するステップと
ｂ）前記エンテロウイルス粒子を前記培地から精製するステップと、
ｃ）精製したエンテロウイルス粒子を安定させるステップと、
ｄ）前記エンテロウイルス粒子をホルマリン不活化するステップであって、前記不活化の少なくとも一部の間、リン酸緩衝液以外の緩衝液が前記エンテロウイルス粒子の凝集を防ぐまたは少なくするのに十分な濃度で存在することにより、不活化後のＤ抗原の欠損をリン酸緩衝液に比べ１／８〜１／１０に減少させる、ステップと、
ｅ）エンテロウイルス粒子をアルミニウム塩アジュバントに吸着させるステップであって、アラムへの吸着比率は少なくとも９５％であるステップとを含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）の前記緩衝液は、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＢＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、および重炭酸塩緩衝液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液は、ｐＨが約６．８〜７．２で、濃度が３０ｍＭ〜７０ｍＭの範囲、好適には４０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）の前記アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウム、またはその両方の混合物の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルミニウム塩アジュバントは、濃度が１．５ｍｇ／０．５ｍＬ投与量〜２．５ｍｇ／０．５ｍＬ投与量、好適には、２．１００ｍｇ／０．５ｍＬ投与量〜２．４ｍｇ／０．５ｍＬ投与量で、ｐＨが約６．５の水酸化アルミニウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
三価ワクチンにおけるアルミニウムの合計含有量が０．５ｍＬ投与量当たり０．８〜１．２ｍｇ、好適には０．８ｍｇのＡｌ３＋であって、１型に対し少なくとも０．４ｍｇのＡｌ３＋、２型に対し少なくとも０．２ｍｇのＡｌ３＋、３型に対し少なくとも０．２ｍｇのＡｌ３＋であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エンテロウイルス粒子を含む前記組成物はワクチンである、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記エンテロウイルス粒子はポリオウイルスのエンテロウイルスである、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記エンテロウイルス粒子は、血清型が１型、２型、および３型のセービンポリオウイルスを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エンテロウイルス粒子は、血清型がＩＰＶ１型（Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ＩＰＶ２型（ＭＥＦ−１株）、および／または、ＩＰＶ３型（Ｓａｕｋｅｔｔ株）のソークポリオウイルスを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンは、投与量減量不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与量減量不活化ポリオワクチンは、
ｉ）投与量が標準投与量の４２ＤＵではなく１５Ｄ抗原単位未満である不活化ポリオウイルス１型、
ｉｉ）投与量が１８Ｄ抗原単位未満の不活化ポリオウイルス２型、及び／又は
ｉｉｉ）投与量が標準投与量の３２ＤＵではなく１５Ｄ抗原単位未満である不活化ポリオウイルス３型を有する、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法であって、
前記投与量減量不活化ポリオワクチンは、
ｉ）５−１６−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与セービン組成物、
ｉｉ）５−１６−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与セービン組成物、
ｉｉｉ）２．５−８−５から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与セービン組成物、
ｉｖ）２．５−８−５から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与セービン組成物、
ｖ）５−８−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与セービン組成物、
ｖｉ）５−８−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与セービン組成物、
ｖｉｉ）７．５−１６−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与セービン組成物、
ｖｉｉｉ）７．５−１６−１０から選択される、セービンの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与セービン組成物、
ｉｘ）８−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与ソーク組成物、
ｘ）８−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与ソーク組成物、
ｘｉ）１０−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与ソーク組成物、
ｘｉｉ）１０−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与ソーク組成物、
ｘｉｉｉ）１０−２−１２から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与ソーク組成物、
ｘｉｖ）１０−２−１２から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与ソーク組成物、
ｘｖ）５−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する単回投与ソーク組成物、および
ｘｖｉ）５−２−５から選択される、ソークの１型、２型、３型の組み合わせを有する２回投与ソーク組成物の群から選択することが可能である方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載の方法であって、
ソークポリオウイルスまたはセービンポリオウイルスを含有する投与量減量不活化ポリオワクチンを調製するための前記方法は、
ａ）前記ポリオウイルスを含有する培地を製造するステップと、
ｂ）前記ポリオウイルスを前記培地から精製するステップと、
ｃ）グリシンを含有するＭ−１９９培地を加えることにより、精製したポリオウイルスを固定するステップと、
ｄ）前記ポリオウイルス粒子の凝集を防ぐまたは少なくする、濃度が３０ｍＭ〜６０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液の存在下で、０．０２５％のホルムアルデヒドを３７℃で５〜１３日間用いて前記ポリオウイルスを不活化することにより、不活化後のＤ抗原の欠損をリン酸緩衝液と比較し１／８〜１／１０倍に減少させる、ステップと、
ｅ）不活化ポリオウイルスを濃度が２〜２．５ｍｇ／投与量の水酸化アラムアジュバントに吸着させるステップであって、１型、２型、および３型の水酸化アラムへの吸着比率は９５％超であるステップとを含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３に記載の方法であって、
ソークポリオウイルスまたはセービンポリオウイルスを含有する投与量減量不活化ポリオワクチンを調製するための前記方法は、
ａ）前記ポリオウイルスを含有する培地を製造するステップと、
ｂ）前記ポリオウイルスを前記培地から精製するステップと、
ｃ）グリシンを含有するＭ−１９９培地を加えることにより、精製したポリオウイルスを固定するステップと、
ｄ）前記ポリオウイルス粒子の凝集を防ぐまたは少なくする、濃度が３０ｍＭ〜６０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液の存在下で、０．０２５％のホルムアルデヒドを３７℃で５〜１３日間用いて前記ポリオウイルスを不活化することにより、不活化後のＤ抗原の欠損をリン酸緩衝液と比較し１／８〜１／１０に減少させる、ステップと、
ｅ）不活化ポリオウイルスを濃度が２〜２．５ｍｇ／投与量の水酸化アラムアジュバントに吸着させるステップであって、１型および３型の水酸化アラムへの吸着比率は９５％超であるステップとを含む方法。
【請求項１６】
前記投与量減量ソーク不活化ポリオワクチンまたは投与量減量セービン不活化ポリオワクチンは２型を含まない、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与量減量IPVを含む多価ワクチンが、ヘモフィルスインフルエンザｂ（Haemophilus influenzae b）、ナイセリアメニンギチジスA型(Neisseria meningitidis type A)、ナイセリアメニンギチジスC型（Neisseria Meningitidis type C）、ナイセリアメニンギチジスW型（Neisseria Meningitidis type W）、ナイセリアメニンギチジスY型（Neisseria Meningitidis type Y）、ナイセリアメニンギチジスX型（Neisseria Meningitidis type X）、ナイセリアメニンギチジスB型（Neisseria Meningitidis type B）、ストレプトコッカスニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカスアガラクチア（Streptococcus agalactiae）、サルモネラチフス（Salmonella typhi）、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、RSV、C型肝炎ウイルス、ジフテリアトキソイド（diphtheria toxoid）、破傷風トキソイド（tetanus toxoid）、全細胞百日咳（whole cell pertussis）、無細胞百日咳（acellular pertussis）、スタフィロッコッカスアウレス（Staphylococcus aureus）、炭疽菌(anthrax)、ビブリオコレラ（Vibrio cholera）、ジカ（Zika）、エボラ（Ebola）、チクングニア（Chikungunya）、デング熱（dengue）、マラリア（malaria）、麻疹（measles）、ムンプス（mumps）、風疹（rubella）、BCG、日本脳炎（Japanese encephalitis）、ロタウイルス（Rotavirus）、天然痘（smallpox）、赤痢菌（Shigella）、黄熱（yellow fever）、腸チフス（typhoid）、CMV、帯状発疹（Shingles）、水痘ウイルス（Varicella virus）、HPV、HSVおよびHIVからなる群から選択される病原体に由来する１つまたは複数の抗原を含む、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】エンテロウイルス不活化およびアジュバント吸着のための改良された方法、ならびに、それから得られる投与量減量ワクチン組成物
【背景技術】
【０００１】
ポリオウイルスの流行は、生きた弱毒セービンポリオ株に基づく経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）の使用により大幅に減少してきた。しかしながら、根絶後の時代では、ＯＰＶには限界がある。そのため、セービンＩＰＶの開発がＷＨＯのポリオ撲滅戦略で重要な役割を果たす。野生型のソークポリオ株の代わりに弱毒セービンを用いることは、ワクチン製造時の安全性を高めるだろう。さらに、伝播型ワクチン由来ポリオウイルス（ｃＶＤＰＶ）の発生を防ぐためには、ポリオ撲滅後はＯＰＶの使用を中止し、ＩＰＶで置き換えるべきである。これらのｃＶＤＰＶは伝染し、神経毒性（野生ポリオウイルスと同等）を帯び、ワクチン関連麻痺性灰白髄炎を引き起こす可能性がある。このような株はポリオウイルスを世界に再度まき、撲滅の達成を無効にする可能性がある。
【０００２】
ＩＰＶは、筋肉内（ＩＭ）注射または深部皮下（ＳＣ）注射により送達される。ＩＰＶは、現在、非アジュバント化単独型製剤として、または、ＤＴ−ＩＰＶ（ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド含有）ならびに六価ＤＴＰＨｅｐＢ−Ｈｉｂ−ＩＰＶワクチン（百日咳、Ｂ型肝炎、およびインフルエンザ菌Ｂを追加で含有）などの種々の組み合わせの何れかで、利用可能である。現在利用可能な標準投与量のポリオワクチンには、４０単位の不活化ポリオウイルス１型（Ｍａｈｏｎｅｙ）、８単位の不活化ポリオウイルス２型（ＭＥＦ−１）、および３２単位の不活化ポリオウイルス３型（Ｓａｕｋｅｔｔ）としてＤ抗原が含有される（例えば、Ｉｎｆａｎｒｉｘ―ＩＰＶ（商標））。現行の単独型ＩＰＶの調製にアジュバントは含まれない。
【０００３】
ほとんどの専門家が、ＩＰＶの証明済みの防御実績および安全性を理由に、ＩＰＶを世界規模で使用することが好適であることに同意する。しかしながら、ＯＰＶと比較した場合、ＩＰＶの原価は著しく高い。これは主に、（ｉ）投与量当たりでより多量なウイルス、（ｉｉ）追加の下流処理（つまり、濃縮、精製、および不活化）と関連するＱＣテスト、（ｉｉｉ）下流における抗原の欠損または回復不良、ならびに（ｉｖ）封じ込めを必要とするためである。今まで、低所得国および中所得国においては、経済的課題がＩＰＶの革新と実行に対する主な障害であった。ｓＩＰＶの製造コストは現在、ＩＰＶと同等であると推定されるが、これはＯＰＶより約２０倍高い。ポリオウイルス撲滅後のＩＰＶに対する今後の世界的需要は、現在の１年に８億回分という現在のレベルから４５億回分へと増加する可能性がある。その結果、ＩＰＶの「拡張」供給への取り組みが必要とされるだろう。
【０００４】
従来型ワクチンの供給が世界的なニーズを満たすには不十分である状況、または、従来型ワクチンの製造コストが、発展途上国にとって入手可能な価格でワクチンを販売することを妨げる状況では、より少ないＩＰＶ抗原投与量を用いて感染に対する防御を提供する、投与量を減量した有効ワクチン製剤が望ましい。また、より少ないＩＰＶ投与量に暴露されることは、現行の市販製剤と比較し、より安全である可能性がある。したがって、ＩＰＶをより入手可能な価格で利用できるようにする種々の戦略を評価する必要がある。
【０００５】
パンデミック・インフルエンザワクチンの場合、アジュバントの使用は投与量の減量を可能にし、利用しやすくし、ワクチンのコストを低減させた。そのため、ｓＩＰＶのアジュバント化ワクチン製剤はコストを低減し、また、世界的に利用可能なｓＩＰＶ投与量の数を増加させることになると推測されている。
【０００６】
世界的に異なる研究グループが、いくつかのアジュバント、つまり、アラム（Ａｌｕｍ）、エマルジョン（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、ＴＬＲ−アゴニスト（ＭＰＬ、ＣｐＧ、ポリ−ＩＣ、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ））、ｄｍＬＴ、1,25-ジヒドロキシビタミンＤ３、ＣＡＦ０１、ポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)-ホスファゼン]（ＰＣＰＰ）、およびベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコン粒子を利用することにより、ワクチン（特に、インフルエンザワクチン）の投与量の節減を評価したことがある。研究されたアジュバント型のほとんどが、以下の、ｉ）安全性未確認または規制機関により有毒であると分類される、ｉｉ）投与経路に関し制限がある、ｉｉｉ）製造再現性がない、ｉｖ）アジュバントの安定性、というハードルに直面した。
【０００７】
エマルジョンアジュバント（ＭＦ−５９、ＡＳ０３、ＡＦ３）は、以前、インフルエンザワクチンおよびＢ型肝炎ワクチンに強力な投与量減量効果（＜１／３０）を与えることが報告された。これらのアジュバントは、注射部位でデポ（ｄｅｐｏｔ）を形成して抗原物質の分散放出と抗体製造形質細胞の刺激を可能にすることにより機能する。しかしながら、これらのアジュバントは、広範なヒト予防ワクチンの使用には有毒すぎると見られており、通常、副作用がより許容される、がんなどの重篤な、および／または末期的な状態のためにとっておかれる。
【０００８】
さらに、アルミニウム塩は安全だと考えられており、ｓＩＰＶを含有する混合ワクチンですでに用いられており、開発のハードルは最も低く、製造コストも低い。しかしながら、アルミニウムアジュバントは、著しい投与量減量を可能にするか未知である。
【０００９】
病原体に対するワクチン、特にウイルス性ワクチンの製造において最も重大なステップの１つは、ウイルス不活化である。ウイルス不活化の場合、ホルマリンがワクチン製造時に最も頻繁に用いられる不活化剤である。ホルムアルデヒドは、表面タンパク質の第一級アミン基を、他の近くのタンパク質またはＤＮＡ中の窒素原子と、−ＣＨ２リンケージを介して不可逆的に架橋させることにより、ウイルスを不活化する。ホルマリンをウイルス不活化に用いることの潜在的問題は、これが反応生成物を生じさせる一連の化学反応を伴い、これがウイルスタンパク質の架橋およびウイルス粒子の凝集を引き起こし得るということである。これは、ホルマリンの不活化効率を阻害し、また、ワクチンにおける抗原の免疫原性の部分的な低下を招き得る。したがって、これまでホルマリンのポリオウイルス不活化は、抗原性と同様にウイルスの免疫原性に影響を与え得ることが報告されてきた。Morag Ferguson et al Journal of General Virology (1993), 74, 685-690を参照のこと。以前開示されたホルムアルデヒドの不活化法はリン酸緩衝液の存在下で特に実行されるが、最も重大なことには、ここにおいてセービン１型／２型／３型のエピトープ改変とともにＤ抗原の著しい欠損が観察され（不活化後のＤ抗原の回復：セービン１型で２２％、セービン２型で１５％、セービン３型で２５％）、そのためエピトープの構造が保持されなかった。そのため、（リン酸緩衝液の存在下において）ホルマリンで不活化されたポリオウイルスの受容体により作られる抗体は、防御免疫反応に寄与し得ない可能性がある。
【００１０】
科学者らは、特に回復力に富むポリオウイルスを不活化する場合に、ホルマリン不活化とＵＶ不活化を組み合わせることによって、ＵＶ不活化またはホルマリン不活化単独での限界をそれぞれ越えることに挑戦した。例えば、McLean, et al., “Experiences in the Production of Poliovirus Vaccines,”Prog. Med. Virol., vol 1, pp. 122-164 (1958.) Taylor et al. (J. Immunol. (1957) 79:265-75)が、ホルマリンと紫外線の組み合わせを用いたポリオウイルスの不活化について記載しているのを参照すること。Molner et al. (Am. J. Pub. Health (1958) 48:590-8)は、紫外線−ホルマリン不活化ポリオワクチンを予防接種した対象の血液において、測定可能なレベルの血中抗体が形成されることを記載する。Truffelli et al. (Appl. Microbiol. (1967) 15:516-27)は、ホルマリン、ＵＶ光、およびβ-プロピオラクロン（ＢＰＬ）からなる３段階の不活化プロセスによる、ハムスタにおけるアデノウイルスおよび腫瘍原性シミアンウイルス４０の腫瘍形成能の不活化について報告する。Miyamae (Microbiol. Immunol. (1986) 30:213-23)は、紫外線およびホルマリンを用いた処置による、センダイウイルスの免疫原の調製を記載する。しかしながら、これまで論じられてきた、β-プロピオラクロン（ＢＰＬ）のようなホルムアルデヒドの有力な代替手段は、狂犬病ウイルスの他の構成要素と組み合わせる場合、免疫複合反応を引き起こすことが報告されている。加えて、マウスにおいて、扁平上皮がん、リンパ腫、および肝臓がんを生じさせることが示されている。
【発明の概要】
【００１１】
そのため、セービン株の抗原構造の構造的一体性を維持する好適なホルムアルデヒド不活化条件を用いることにより、かつ、投与量が著しく減量された（つまり、１／８〜１／１０）ｓＩＰＶ（セービンＩＰＶ）ワクチン組成物をもたらし得る、安全でコスト効率の良いアジュバントを利用することにより、製造コストを下げ、ワクチンの供給を増大し、ワクチンを発展途上国にとって入手可能にすることが特に望ましい。
【００１２】
本発明者らは、驚くべきことに、ホルムアルデヒド不活化後のＤ抗原の欠損は、不所望なポリオウイルスの凝集を予想外に引き起こすリン酸緩衝液の存在に起因する可能性があることを発見した。本発明は、ＴＲＩＳ緩衝液の存在下におけるホルムアルデヒド不活化の改良プロセスを提供することにより確実にエピトープの改変を最小にし、それに続くＤ抗原の欠損を最小にする。次いで、少なくとも、セービン１型については投与量が１／８、セービン３型については投与量が１／３である、投与量が著しく減量されたセービンＩＰＶワクチン組成物を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】０．９％ＮａＣｌにおいて調製したアラムリン酸ゲル（異なるアラムリン酸ゲル濃度でのｐＨ対ゼータ電位）を示す図である。
【図２】ＷＦＩにおいて調製したアラムリン酸ゲル（異なるアラムリン酸ゲル濃度でのｐＨ対ゼータ電位）を示す図である。
【図３】０．９％ＮａＣｌにおいて調製した水酸化アラムゲル（異なる水酸化アラムゲル濃度でのｐＨ対ゼータ電位）を示す図である。
【図４】ＷＦＩにおいて調製した水酸化アラムゲル（異なる水酸化アラムゲル濃度でのｐＨ対ゼータ電位）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の重要な態様は、前記ホルマリン不活化改良プロセスとアラム塩への吸着が、以下の、
ａ）セービンＩＰＶ精製バルクを、ｐＨが６．８〜７．２のＴＲＩＳ緩衝液（３０〜５０ｍＭ）に加えるステップと、
ｂ）グリシン（５ｇｍ／Ｌ）を含有するＭ−１９９培地を（ａ）の混合物に加えるステップと、
ｃ）混ぜながら０．０２５％ホルムアルデヒドを加えるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）で得られた混合物を３７℃で５〜１３日間、磁気攪拌機上でインキュベートするステップと、
ｅ）インキュベート後の混合物について、７日目に０．２２μを中間濾過に、１３日目に０．２２μを最終濾過にかけるステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）の後に得られるバルクを２〜８℃で保存するステップと、
ｇ）Ｄ抗原単位の決定のためにＤ−Ａｇ ＥＬＩＳＡを実行するステップと、
ｈ）加圧滅菌した所望量のＡｌ（ＯＨ）３を取って、５０ｍＬの容器において０．８〜１．２ｍｇ／投与量の最終濃度のアラム（Ａｌ＋＋＋）を得るステップと、
ｉ）調整Ｄ抗原単位を有するｓＩＰＶバルクを加え、希釈剤（1０ｘ Ｍ−１９９＋０．５ Ｇｌｙｃｉｎｅ％）を用いて体積を構成するステップと、
ｊ）最終製剤のｐＨを調整し、ｐＨが６〜６．５の最終製剤を得るステップと、
ｋ）製剤バルクを２〜８℃で一晩、磁気撹拌にかけるステップとを含み、
ステップ（ａ）のホルマリン不活化は、リン酸緩衝液の存在下では起きない、ということである。
【００１５】
本発明の第１実施形態は、ホルムアルデヒド不活化時に用いる前記緩衝液を、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＢＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、および重炭酸塩緩衝液からなる群から選択可能であるということである。
【００１６】
第１実施形態の好適な態様は、濃度が３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭから選択され、好適には４０ｍＭであり、ｐＨが６．８、６．９、７、７．１、および７．２から選択され、好適には６．８〜７．２であるＴＲＩＳ緩衝液またはＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水）の存在下で、前記ホルムアルデヒド不活化が起き得、前記不活化はいずれのリン酸緩衝液も利用しないということである。
【００１７】
本発明の第２実施形態は、濃度が１．５ｍｇ／投与量、１．８ｍｇ／投与量、２．２ｍｇ／投与量から選択され、好適には２ｍｇ／投与量〜２．４ｍｇ／投与量であり、ｐＨは６．２、６．３、６．４、および６．５から選択され、好適には６．５である水酸化アルミニウムに、ホルマリン不活化ｓＩＰＶを吸着させることができるということである。
【００１８】
本発明の第３実施形態は、前記ホルマリン不活化改良プロセスと水酸化アルミニウムの吸着は、不活化後、Ｄ抗原を５０％〜８０％回復させることが可能であり、水酸化アルミニウムの吸着率は８５〜９９％となり得るということである。
【００１９】
第３実施形態の一態様は、本発明が、４０ＤＵ−８０ＤＵ−３２ＤＵという標準的な投与量と比較し、セービン１型については少なくとも１／８、セービン３型については少なくとも１／３という投与量の減量をもたらす、ホルマリン不活化改良プロセスと水酸化アルミニウム吸着を提供するということである。
【００２０】
第３実施形態の第２態様は、本発明が、ｉ）投与量が少なくとも５Ｄ抗原単位である不活化ポリオウイルス１型、ｉｉ）投与量が少なくとも８Ｄ抗原単位である不活化ポリオウイルス２型、およびｉｉｉ）投与量が少なくとも１０Ｄ抗原単位である不活化ポリオウイルス３型からなるワクチン組成物をもたらす、改良されたホルムアルデヒド不活化法と改良された水酸化アルミニウム吸着法を提供する。
【００２１】
本発明の第４実施形態は、前記アルミニウム塩アジュバントは、濃度が１．５ｍｇ／０．５ｍＬ投与量〜２．５ｍｇ／０．５ｍＬ投与量、好適には２．１００ｍｇ／０．５ｍＬ投与量〜２．４ｍｇ／０．５ｍＬ投与量であり、ｐＨが約６．５の水酸化アルミニウムであるということである。
【００２２】
第４実施形態の一態様は、三価ワクチン（１型、２型、および３型）のアルミニウム合計含有量が、０．５ｍＬ投与量当たり８００〜１０００μｇ、好適には８００μｇのＡｌ３＋であって、１型に対し少なくとも４００μｇのＡｌ３＋、２型に対し少なくとも２００μｇのＡｌ３＋、３型に対し少なくとも２００μｇのＡｌ３＋であることを特徴とすることである。
【００２３】
第４実施形態の別の態様は、前記投与量減量ポリオウイルスワクチン組成物が、１型および３型からなり得、２型を欠き、投与量体積が０．１〜０．４ｍＬとなり得るということである。
【００２４】
本方法により調製した投与量減量ワクチン組成物は、ｉ）抗原がｓＩＰＶ１型、もしくはｓＩＰＶ２型、もしくはｓＩＰＶ３型、もしくはｓＩＰＶ１型およびｓＩＰＶ２型、もしくはｓＩＰＶ１型およびｓＩＰＶ３型、もしくはｓＩＰＶ２型およびｓＩＰＶ３型、もしくはｓＩＰＶ１型、ｓＩＰＶ２型、およびｓＩＰＶ３型からなり得る「単独型ｓＩＰＶ」、または、ｉｉ）混合ワクチンの非ＩＰＶ抗原を、限定されるわけではないが、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳抗原、無細胞百日咳抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、インフルエンザ菌Ｂ型抗原、髄膜炎菌Ａ抗原、髄膜炎菌Ｃ抗原、髄膜炎菌Ｗ−１３５抗原、髄膜炎菌Ｙ抗原、髄膜炎菌Ｘ抗原、髄膜炎菌Ｂブレブ（bleb）抗原もしくは髄膜炎菌Ｂ精製抗原、Ａ型肝炎抗原、サルモネラ・チフィ抗原、肺炎レンサ球菌抗原から選択することが可能な、「ｓＩＰＶ含有混合ワクチン」であり得る。
【００２５】
非ＩＰＶ抗原は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、または、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウム両方の混合物に吸着される場合もあるし、吸着されない場合もある。
【００２６】
ポリオウイルスは細胞培養物において増殖し得る。細胞培養物はベロ細胞株またはＰＭＫＣであってよく、これはサル腎に由来する連続細胞株である、ベロ細胞は、好都合なことに、マイクロキャリアで培養することが可能である。増殖後、限外濾過、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、およびクロマトグラフィなどの技法を用いてビリオンを精製することができる。患者に投与する前に、ウイルスを不活化しなければならないが、これはホルムアルデヒドでの処置により達成することが可能である。
【００２７】
組成物はバイアルに入れて提供するか、または、既製の充填シリンジに入れて提供することができる。シリンジは針付きまたは針なしで供給することができる。シリンジには、単回投与量の組成物が含まれるだろうが、バイアルには単回投与量または多数回投与量（例えば、２投与量）が含まれ得る。一実施形態では、投与量はヒト用である。さらなる実施形態では、投与量は成人、青年、幼児、乳児、または１歳未満のヒト用であり、注射により投与することができる。
【００２８】
本発明のワクチンは、単回投与剤形または多数回投与剤形（例えば、２投与量）に入れることができる。前記多数回投与量の組成物は、２投与量、５投与量、および１０投与量からなる群から選択することが可能である。多数回投与剤形に関し、シリンジを予め充填するにはバイアルが好適である。効果的な投与量体積は慣例的に定めることが可能だが、注射用組成物の典型的なヒト投与量の体積は０．５ｍＬである。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）
セービンＩＰＶ（ｓＩＰＶ）の精製
１）タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）
清澄させた採取プールを、１００Ｋｄａのカセット（０．５ｍ２）を有するタンジェンシャルフロー・フィルトレーション系を用いて１０Ｘに濃縮し、次にリン酸緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて採取体積について３回ダイアフィルトレーションを行った。
【００３０】
２）カラムクロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）により精製を行った。１０ＸＴＦＦ濃縮物を、Akta explorer（ＧＥヘルスケア）を用いて、ｘｋ−２６カラムに充填されたDEAE Sepharose fast flow（弱アニオン交換体）に通した。負に帯電した不純物がカラムに結合する一方、ポリオウイルスは４０ｍＭのリン酸緩衝液を含む流水に集められることが分かった。
【００３１】
３）ＴＲＩＳ緩衝液交換
かなり煩雑な不活化手順（１３日間）での抗原の欠損を最小にするため、精製ウイルスプールの緩衝液を、ＴＦＦ系（１００ＫＤａ、０．１ｍ２）を用いて、リン酸緩衝液からＴＲＩＳ緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ７）に交換した。精製ウイルスプールは、３倍体積のｔｒｉｓ緩衝液に交換した。
【００３２】
（実施例２）
Ａ）ｓＩＰＶの不活化
０．５％グリシンを有する１０Ｘ濃縮Ｍ−１９９を、最終濃度が１Ｘとなるように加えた。不活化剤のホルマリン（０．０２５％）を、常に混ぜながら精製ウイルスバルクに加えた。７日目と１３日目に０．２２μの濾過を挟みつつ、１３日間絶えず撹拌しながら３７℃で濾過を実行した。
【００３３】
Ｂ）ＴＲＩＳ緩衝液およびリン酸緩衝液におけるｓＩＰＶの不活化
０．０２５％のホルムアルデヒドを、３７℃で１３日間の不活化に用いた。
【００３４】
表１：Ｄ抗原含有量、ＴＲＩＳ緩衝液およびリン酸緩衝液の存在下におけるホルマリン不活化
【表１】
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【００３５】
ホルムアルデヒド不活化法をリン酸緩衝液の存在下で特に実行した場合、セービン１型について著しいＤ抗原の欠損が観察された。一方、ＴＲＩＳ緩衝液の存在下でのホルムアルデヒド不活化は、Ｄ抗原の欠損を最小にすることが分かった。
【００３６】
表２：不活化時に用いる異なる濃度のＴＲＩＳ緩衝液
【表２】
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【００３７】
４０ｍＭの濃度のＴＲＩＳ緩衝液が、ｓＩＰＶ１型、２型、および３型のＤ抗原含有量保存の点で、最も効率的であることが分かった。
【００３８】
Ｃ）ＥＬＩＳＡによるＤ抗原含有量決定
１日目：プレートのコーティング
１．１００μＬの特異的なウシ抗ポリオを、各ウェルのＰＢＳにピペットで入れた。
２．マイクロタイタープレートを封止し、室温で一晩インキュベートした。
【００３９】
２日目：ブロッキング
１．プレートを３回洗浄した（洗浄／希釈緩衝液−１ＸＰＢＳ中の０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）。
２．３００μＬのブロック緩衝液（１％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ）を各ウェルにピペットで入れた。
３．プレートを封止し、３７℃±１で４５分間インキュベートした。
【００４０】
サンプルの添加
１．プレートを３回洗浄した。
２．１００μＬのサンプル希釈剤を列Ａのウェルを除く全てのウェルに加えた。
３．１００μＬの標準物をカラム２および３の最初の２つのウェルに加えた。
４．１００μＬのサンプルをカラム４〜１２の最初の２つのウェルに加えた。
５．サンプルを適切な濃度に予備希釈した。
６．１００μＬのサンプル希釈剤をカラム１の最初の２つのウェルに加えた。
７．各ウェルから１００μＬを同じカラムの隣のウェルに移し、最後のウェルからは１００μＬを廃棄することにより、カラムの下方に向かって連続２倍希釈を行った。
８．３７℃で２時間、インキュベートした。
９．プレートを一晩４℃で保存した。
【００４１】
３日目：モノクローナル抗体の添加
１．プレートを３回洗浄した。
２．１００μＬの希釈（１：２４０）した型特異的モノクローナル抗体を加えた。
３．プレートを封止し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００４２】
結合体
１．プレートを３回洗浄した。
２．１００μＬの希釈結合体（１型−１：２４００、２型−１：１５００、３型−１：４８００）を加えた。
３．プレートを封止し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００４３】
基質の添加
１．１００μＬのＴＭＢ基質を全てのウェルに加えた。
２．混合物を、室温で１０分間インキュベートした。
３．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止させた。
４．プレートを４５０／６３０ｎｍで読み取った。
５．Ｄ抗原の濃度をＫＣ４ソフトウェアを用いて計算した。
【００４４】
（実施例３）
ｓＩＰＶの吸着
１．Ａｌ（ＯＨ）３およびＡｌＰＯ４の加圧滅菌済みの１％ストックを、製剤の調製に用いた。
２．所望の体積のＡｌ（ＯＨ）３／ＡｌＰＯ４を利用し、１００ｍＬのガラス瓶において必要な濃度のアラムを得た。
３．既知のＤ抗原単位を有する不活性化ポリオウイルスバルクを加え、希釈剤を用いて体積を構成した。
４．最終の製剤ｐＨを１Ｎ ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いて６．５に調整した。
５．製剤バルクを２〜８℃で一晩、磁気攪拌機上で保存した。
【００４５】
（実施例４）
予備製剤研究
異なる濃度のＡｌ（ＯＨ）３およびＡｌＰＯ４を０．９％生理食塩水およびＷＦＩにおいて調製して、ｐＨの変化に対するサイズおよびゼータ電位を調べた。
【００４６】
ＡｌＰＯ４のゼータ電位は、生理食塩水と同様にＷＦＩの存在下でも、ｐＨが５から７．５へ上昇するにつれ低下する（陰性）ことが観察された（図１および２参照）。
【００４７】
一方、Ａｌ（ＯＨ）３の生理食塩水溶液のゼータ電位は、ｐＨおよびＡｌ（ＯＨ）３塩濃度とは無関係に一定である（図３および４参照）。
【００４８】
（実施例５）
アラムリン酸および水酸化アラムへのｓＩＰＶの吸着研究
【００４９】
表３：セービンの１型、２型、および３型（力価１０６．０／投与量）の、アラム（リン酸アラムおよび水酸化アラム）への吸着
【表３】
2017533899.tif 000003
【００５０】
セービンポリオウイルス３型は、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）と５０〜６０％しか吸着しない。一方、セービンポリオウイルス３型は、Ａｌ（ＯＨ）３と少なくとも９０％吸着する。したがって、セービンの１型、２型、および３型の吸着に関し、水酸化アラムは、リン酸アラムと比べより効率的であることが分かった。
【００５１】
（実施例６）
アラム吸着ｓＩＰＶの免疫原性研究
アジュバント化ｓＩＰＶのラットにおける免疫反応を調べるため、ＳＮＴ試験（血清中和試験）を実行した。血清を分離し、それを、型特異的ポリオウイルスについて、中和抗体の存在をテストするために用いた。試験を有効化するため、対照血清を用いた。ウイルスの逆滴定も行って、添加された攻撃ウイルス粒子の数を得た。
【００５２】
動物モデル：Ｗｉｓｔａｒラット（８週、約２００ｍｇ）、グループごとにオス５０％、メス５０％
接種経路：筋肉内
体積：０．５ｍＬ
採血：２１日目
採血部位：後眼窩静脈叢（Retro-Orbital plexus）
【００５３】
表４：１型
【表４】
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【００５４】
驚くべきことに、５ＤＵ／投与量の水酸化アラムでアジュバント化した1型セービンＩＰＶは、４０ＤＵ／投与量のソークＩＰＶワクチン、および、５ＤＵ／投与量のリン酸アラムでアジュバント化したセービンＩＰＶと比べ、より良好なセロコンバージョンを提供することが分かった。
【００５５】
表５：２型
【表５】
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【００５６】
８ＤＵ／投与量のアジュバント併用２型ｓＩＰＶは、８ＤＵ／投与量のソークＩＰＶワクチンと比較し、同等のセロコンバージョンを提供した。
【００５７】
表６：３型
【表６】
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【００５８】
１０ＤＵ／投与量のアジュバント併用３型ｓＩＰＶは、３２ＤＵ／投与量のソークＩＰＶワクチンと比較し、同等のセロコンバージョンを提供することが分かった。
【００５９】
表７：研究後、セービンの１型、２型、および３型のそれぞれで観察された最大投与量減量
【表７】
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【００６０】
本開示の発明の原則を適用し得る多くの潜在的な実施形態を考慮し、例示した実施形態は本発明の好適な例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものととらえるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定義される。そのため、この特許請求の範囲のおよびその趣旨内にある全ての発明が特許請求される。
【００６１】
Ｉ．アジュバント化セービンポリオウイルスの免疫反応
ウイルスをＡｌ（ＯＨ）３でアジュバント化した場合、優れた投与量の節減が示されることが観察された。
免疫化のために単回投与の投薬計画を考える場合は、セービンのポリオ１型、２型、３型それぞれについて、５−１６−１０Ｄ抗原が最良の組み合わせである。
免疫化のために２回投与を考える場合は、２．５−８−５が優れた免疫を与える。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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ＩＩ．アジュバント化ソークポリオウイルスの免疫反応
ウイルスをＡｌ（ＯＨ）３でアジュバント化した場合、優れた投与量の節減が示されることが観察された。
免疫化のために単回投与の投薬計画を考える場合は、ソークのポリオ１型、２型、３型それぞれについて、８−２−５Ｄ抗原が最良の組み合わせである。
免疫化のために２回投与を考える場合は、５−２−５が優れた免疫を与える。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【００６２】
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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