【手続補正書】
【提出日】平成29年3月13日(2017.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、外因性ポリペプチドを発現する安定な細胞株を産生するための方法：
エレクトロポレーション、特にフローエレクトロポレーションを使用して、特に環状もしくは直線状発現構築物、細菌プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、または人工染色体から選択される発現構築物、好ましくは細菌プラスミドを細胞、特に哺乳動物細胞中にトランスフェクトする工程であって、該発現構築物が、（i）選択可能な遺伝子と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む、工程；
条件的致死濃度の選択物質を含む培養条件下での選択遺伝子の発現について選択する工程であって、特にバッチ培養条件または懸濁培養条件において選択が行われ、例えば細胞を酪酸ナトリウム中でまたは無血清培地中で培養する、工程、および
任意で、該細胞により産生された該外因性ポリペプチドを単離または精製する工程をさらに含み、かつ/または
トランスフェクトおよび選択された細胞を凍結させる工程をさらに含み、かつ/または
以前に凍結されたトランスフェクトおよび選択された細胞を増殖させる工程をさらに含み、
特に
(a)該発現構築物を細胞中にトランスフェクトする工程が、フローチャンバーにおいて電場中に該細胞の懸濁液を流すことを含み、該電場が、該フローチャンバーを少なくとも部分的に画定しており反対の電荷を有する電極を対向させることにより生成され、該フローチャンバーの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、および/あるいは
(b1)該細胞にトランスフェクトする工程が、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を収容するためのチャンバーを備えるフローエレクトロポレーションデバイスを用いることを含み；該チャンバーが、反対の電荷を有することができる（oppositely chargeable）電極を対向させることにより少なくとも部分的に画定されており；かつ該チャンバーの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、または
(b2)該細胞にトランスフェクトする工程が、フローエレクトロポレーションデバイスを用いることを含み、該フローエレクトロポレーションデバイスが、フローチャネルを画定している壁であって、該フローチャネルが、エレクトロポレーションゾーンを有し、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されている、壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁の実質的な部分を形成する第1の電極と、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁の実質的な部分を形成する第2の電極とを含む該エレクトロポレーションゾーン内で該フローチャネルを画定しており、該第1の電極および該第2の電極が、電気エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれた場合に、それらの電極間に、該懸濁液が流れることができる電場を形成するようになっており、特に該第1の電極および該第2の電極が、互いに少なくとも1mmの間隔をおいて配置されており、かつ/もしくはフローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有し、該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、または
(b3)該フローエレクトロポレーションデバイスが、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を収容するためのフローチャンバーを備え；該フローチャンバーが、反対の電荷を有することができる電極を対向させることにより少なくとも部分的に画定されており；かつ該フローチャンバーが、約1対100cmのもしくは1対70cmのもしくは1対50cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有する、または
(b4)該フローエレクトロポレーションデバイスが、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されたフローチャネルを画定している壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁の少なくとも一部分を形成する第1の電極と、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁の少なくとも一部分を形成する第2の電極とを備える該フローチャネルを画定しており、該第1の電極および該第2の電極が、電気エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれた場合に、それらの電極間に、該懸濁液が流れることができる電場を形成するようになっており、特に該第1の電極および該第2の電極が互いに少なくとも1mmもしくは3mmの間隔をおいて配置されており、かつ/もしくは該フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有し、特に該フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有しかつ該第1の電極および該第2の電極が、互いに少なくとも3mmの、特に約3mmから約2cmの間隔をおいて配置されており、かつ該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満、もしくは1ワット当たり約0.1℃から1ワット当たり約4℃、もしくは1ワット当たり約1.5℃から1ワット当たり約2.5℃である、または
(b5)該フローエレクトロポレーションデバイスが、粒子を含む懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されたフローチャネルを画定している壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁を形成する第1の電極プレートと、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁を形成する第2の電極プレートとを備える該フローチャネルを画定しており；該電極の領域が該懸濁液と接触しており、かつ、該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約4℃未満になるように電極間距離が選定され；対になった該電極が、電気的エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれており、それにより、電場が該電極間に形成され；それにより、該フローチャネルを介して流れる該粒子の該懸濁液が、該電極間に形成される電場に供されることができ、特に該フローチャネルを画定している該電極プレートがガスケットをさらに備え、該ガスケットが、非導電性材料から形成され、かつ、間隔をおいた関係で該電極プレートを維持するように該第1の電極プレートと該第2の電極プレートの間に配置されており、該ガスケットが、その中で該フローチャネルの対向する側壁を形成するチャネルを画定しており、特に該ガスケットが、該第1の電極プレートと該第2の電極プレートの各々とシールを形成し、特に
(i)該デバイスが、複数のフローチャネルを備え、かつ該ガスケットが、複数のチャネルの各々の対向する側壁を形成する該複数のチャネルを含む、および/もしくは
(ii)該入口フローポータルおよび該出口フローポータルの一方が穴を含み、該穴が、一方の該電極プレートに形成され、かつ該フローチャネルと流体連通している、および/もしくは
(iii)該入口フローポータルおよび該出口フローポータルの他方が穴を含み、該穴が、一方の該電極プレートに形成され、かつ該フローチャネルと流体連通している、および/もしくは
(iv)該入口フローポータルおよび該出口フローポータルの他方が穴を含み、該穴が、他方の該電極プレートに形成され、かつ該フローチャネルと流体連通している、および/もしくは
(v)熱を放散させるための該フローチャネルに動作可能に結合された冷却エレメントをさらに含み、特に該冷却エレメントが熱電冷却エレメントを含み、特に該冷却エレメントが、該電極と接触して流れる冷却液を含み、かつ/もしくは該冷却エレメントが、該電極に動作可能に結合されたヒートシンクを備える、および/もしくは
(vi)該フローチャネルの耐熱性が1ワット当たり約3℃未満、もしくは1ワット当たり約0.5℃〜1ワット当たり4℃、もしくは1ワット当たり約1℃〜1ワット当たり3℃である、および/もしくは
(vii)該第1の電極が、細長い導電性構造を備え、該第2の電極が、管状の導電性構造を備え；管状の該第2の電極が、該第1の電極に対して間隔をおいた関係で該第1の電極を取り囲むように、該電極が同心円状に配列されており；かつ該フローチャネルが、該第1の電極と該第2の電極の間に画定された環状空間内に配置されている、および/もしくは
(viii)該電極が、該フローチャネルを画定している該壁の少なくとも一部分を形成する、および/もしくは
(ix)間隔をおいた同心円状の関係で該第1の電極および該第2の電極を維持するための同心性環状スペーサーをさらに含む、および/または
(x)該デバイスが、第2の同様のデバイスと直列に配列されているか、もしくは第2の同様のデバイスと並列に配列されている、
特に該フローチャネルにおいてエレクトロポレーションされた該細胞が、それにより実質的に熱分解されない、
方法。
【請求項２】
フローエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程が、1ワット当たり約10℃未満の熱抵抗を有するフローチャネルを使用することを含むか、または
フローエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程が、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を、フローチャネルを通じて流すこと；および、該フローチャネルを通じて流している間、該懸濁液を電場に曝露することを含み、該電場が0.5kV/cm超の強度、特に約3.5kV/cm超の強度を有する、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
エレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞の50％超、約50%から95%、約60%から90%、または約70%から80%が、前記外因性ポリペプチドを発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約50％超、約60%超、約70%超、約80%超、約90%超、約50%〜90%、または約60%〜90%の生存可能性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
選択した前記トランスフェクトされた細胞の限界希釈を用いて単一細胞コロニーを得る工程であって、特にマルチウェルプレートを使用して単一細胞コロニーを得る、工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、かつ前記選択物質が抗生物質であり、特に該抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、またはブラストサイジン、特にネオマイシン、例えばG418もしくはその誘導体に対する耐性を付与する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
トランスフェクトされた前記細胞が、条件的致死濃度の前記抗生物質と共に少なくとも5から21日間、または5から10日間培養される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、条件的致死濃度の前記抗生物質と共に培養された後、細胞が、より低い濃度の該抗生物質を有する培養物中で維持される、特に該より低い濃度が該条件的致死濃度の約25%から75％、または約50％以下であり、特に細胞が該より低い濃度で4から20日間維持され、特に限界希釈を使用して安定なトランスフェクトされた細胞をクローニングする前に、細胞が該より低い濃度で維持される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がCHO細胞であり、かつG418またはその誘導体、好ましくはG418の条件的致死濃度が少なくとも約0.8mg/ml、約1.0mg/ml超、または約1.6mg/ml超である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記外因性ポリペプチドを発現するクローン細胞を産生するために、例えば大規模製造用に、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程であって、特に
(a)単離されたクローン細胞を増殖させる工程が、前記抗生物質を含む培地中であり、特に増殖の最中の該抗生物質の濃度が、該抗生物質の条件的致死濃度の50％以下または25％以下である、および/または
(b)細胞を1L、3Lまたはそれより多い容積で増殖させ、特に該細胞を、前記抗生物質を含む培地中で増殖させ、特に該抗生物質の濃度が条件的致死濃度である、
工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
選択された前記細胞が、少なくとも約0.1g/L、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約1.0g/L、少なくとも約1.5g/L、少なくとも約2g/L、少なくとも約3g/Lの外因性ポリペプチドを産生し、かつ/または
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約0.1g/L、少なくとも約0.5g/L、少なくとも約1.0g/L、少なくとも約1.5g/L、少なくとも約2g/L、もしくは少なくとも約3g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内、7週間以内、もしくは6週間以内に産生し、かつ/または
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり10、20、30、40、50、60、もしくは80ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、かつ/または
増殖させたクローン細胞が、対照細胞と比較して、1日に1細胞当たり10％超、20%超、40%超、もしくは50％超多いタンパク質を産生し、対照細胞が、同様のトランスフェクトされた細胞であるが、条件的致死濃度の50％以下である濃度の抗生物質と共にインキュベートされたものである、かつ/または
トランスフェクトされた細胞が、世代60以降に、世代10〜20のレベルの少なくとも50％であるレベルの外因性タンパク質を産生する、
請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
安定なCHO細胞発現株を産生するための方法であって、
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）G418耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、CHO細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）約1.6mg/ml超のG418を含む培地中のトランスフェクトされたCHO細胞を選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、選択したトランスフェクトされたCHO細胞を限界希釈により単離する工程；および
（d）安定なCHO細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされたCHO細胞を増殖させる工程
を含み、任意で、複製した該トランスフェクトされたCHO細胞により産生された外因性ポリペプチドを回収する工程をさらに含み、特に
(a)該トランスフェクトされた細胞が、1.6mg/mlのG418を含む培地中で少なくとも6日間維持され、かつ/または
(b)該安定なCHO細胞発現株が、約2g/Lを上回る外因性タンパク質を培地中で産生する、
方法。
【請求項１３】
高産生性CHO細胞株についてスクリーニングするための方法であって、
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）G418耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、CHO細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）約1.6mg/mL超のG418を含む培地中のトランスフェクトされたCHO細胞を少なくとも6日間にわたって選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、選択したトランスフェクトされたCHO細胞を限界希釈により単離する工程；
（d）安定なCHO細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされたCHO細胞を増殖させる工程；および
（e）該外因性ポリペプチドの産生について該細胞を評価する工程
を含み、任意で、該外因性ポリペプチドの高産生株であるCHO細胞株を同定する工程を含む、
方法。
【請求項１４】
精製タンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、以下の工程を含む方法により産生された、組成物：
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）条件的致死濃度の抗生物質を含む培地中のトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、限界希釈により、選択したトランスフェクトされた細胞を単離する工程；
（d）安定な細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程；および
（e）該外因性ポリペプチドを回収する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
[本発明1001]
以下の工程を含む、外因性ポリペプチドを発現する安定な細胞株を産生するための方法：
エレクトロポレーションを使用して発現構築物を細胞中にトランスフェクトする工程であって、該発現構築物が、（i）選択可能な遺伝子と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む、工程；
条件的致死濃度の選択物質を含む培養条件下での選択遺伝子の発現について選択する工程。
[本発明1002]
エレクトロポレーションがフローエレクトロポレーションである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記発現構築物が細菌プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、または人工染色体である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記発現構築物が環状である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記発現構築物が直線状である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記発現構築物が細菌プラスミドである、本発明1003または1004〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記細胞が哺乳動物細胞である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記発現構築物を細胞中にトランスフェクトする工程が、フローチャンバーにおいて電場中に該細胞の懸濁液を流すことを含み、該電場が、該フローチャンバーを少なくとも部分的に画定しており反対の電荷を有する電極を対向させることにより生成され、該フローチャンバーの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記細胞にトランスフェクトする工程が、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を収容するためのチャンバーを備えるフローエレクトロポレーションデバイスを用いることを含み；該チャンバーが、反対の電荷を有することができる（oppositely chargeable）電極を対向させることにより少なくとも部分的に画定されており；かつ該チャンバーの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記細胞にトランスフェクトする工程が、フローエレクトロポレーションデバイスを用いることを含み、該フローエレクトロポレーションデバイスが、フローチャネルを画定している壁であって、該フローチャネルが、エレクトロポレーションゾーンを有し、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されている、壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁の実質的な部分を形成する第1の電極と、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁の実質的な部分を形成する第2の電極とを含む該エレクトロポレーションゾーン内で該フローチャネルを画定しており、該第1の電極および該第2の電極が、電気エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれた場合に、それらの電極間に、該懸濁液が流れることができる電場を形成するようになっており、かつ、該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに少なくとも1mmの間隔をおいて配置されている、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有する、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
前記フローチャネルにおいてエレクトロポレーションされた前記細胞が、それにより実質的に熱分解されない、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記フローエレクトロポレーションデバイスが、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を収容するためのフローチャンバーを備え；該フローチャンバーが、反対の電荷を有することができる電極を対向させることにより少なくとも部分的に画定されており；かつ該フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有する、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記比率が約1対70cmである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記比率が約1対50cmである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記フローエレクトロポレーションデバイスが、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されたフローチャネルを画定している壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁の少なくとも一部分を形成する第1の電極と、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁の少なくとも一部分を形成する第2の電極とを備える該フローチャネルを画定しており、該第1の電極および該第2の電極が、電気エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれた場合に、それらの電極間に、該懸濁液が流れることができる電場を形成するようになっており、かつ、該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約10℃未満である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記フローチャネルの熱抵抗が、1ワット当たり約0.1℃から1ワット当たり10℃である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに少なくとも1mmの間隔をおいて配置されている、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに少なくとも3mmの間隔をおいて配置されている、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有する、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有し、かつ前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに少なくとも1mmの間隔をおいて配置されている、本発明1017〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有し、かつ前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに少なくとも3mmの間隔をおいて配置されている、本発明1017〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記フローチャンバーが、約1対100cmの、緩衝液と接触している合わせた電極表面対電極間距離の比率を有し、かつ前記第1の電極および前記第2の電極が、互いに約3mmから約2cmの間隔をおいて配置されている、本発明1017〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記フローチャネルにおいてエレクトロポレーションされた前記細胞が、それにより実質的に熱分解されない、本発明1017〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記チャンバーの熱抵抗が、1ワット当たり約0.1℃から1ワット当たり約4℃である、本発明1008〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記チャンバーの熱抵抗が、1ワット当たり約1.5℃から1ワット当たり約2.5℃である、本発明1008〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記フローエレクトロポレーションデバイスが、粒子を含む懸濁液の連続流を受け入れるようにかつ該連続流を一時的に収容するように構成されたフローチャネルを画定している壁；該フローチャネルと流体連通しており、それにより入口フローポータルを介して該フローチャネル中に該懸濁液を導入することができる、該入口フローポータル；該フローチャネルと流体連通しており、それにより出口フローポータルを介して該フローチャネルから該懸濁液を取り出すことができる、該出口フローポータルを備え、該壁が、該フローチャネルの第1の壁を形成する第1の電極プレートと、該第1の壁の反対側にある該フローチャネルの第2の壁を形成する第2の電極プレートとを備える該フローチャネルを画定しており；該電極の領域が該懸濁液と接触しており、かつ、該フローチャネルの熱抵抗が1ワット当たり約4℃未満になるように電極間距離が選定され；対になった該電極が、電気的エネルギーの供給源と電気通信している状態で置かれており、それにより、電場が該電極間に形成され；それにより、該フローチャネルを介して流れる該粒子の該懸濁液が、該電極間に形成される電場に供されることができる、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記フローチャネルを画定している前記電極プレートがガスケットをさらに備え、該ガスケットが、非導電性材料から形成され、かつ、間隔をおいた関係で該電極プレートを維持するように前記第1の電極プレートと前記第2の電極プレートの間に配置されており、該ガスケットが、その中で該フローチャネルの対向する側壁を形成するチャネルを画定している、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ガスケットが、前記第1の電極プレートおよび前記第2の電極プレートの各々とシールを形成する、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
前記デバイスが、複数のフローチャネルを備え、かつ前記ガスケットが、複数のチャネルの各々の対向する側壁を形成する該複数のチャネルを含む、本発明1028〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記入口フローポータルおよび前記出口フローポータルの一方が穴を含み、該穴が、一方の前記電極プレートに形成され、かつ前記フローチャネルと流体連通している、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記入口フローポータルおよび前記出口フローポータルの他方が穴を含み、該穴が、一方の前記電極プレートに形成され、かつ前記フローチャネルと流体連通している、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記入口フローポータルおよび前記出口フローポータルの他方が穴を含み、該穴が、他方の前記電極プレートに形成され、かつ前記フローチャネルと流体連通している、本発明1028〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
熱を放散させるための前記フローチャネルに動作可能に結合された冷却エレメントをさらに含む、本発明1028〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記冷却エレメントが熱電冷却エレメントを含む、本発明1028〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記冷却エレメントが、前記電極と接触して流れる冷却液を含む、本発明1028〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記冷却エレメントが、前記電極に動作可能に結合されたヒートシンクを備える、本発明1028〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記フローチャネルの耐熱性が1ワット当たり約3℃未満である、本発明1028〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記フローチャネルの耐熱性が、1ワット当たり約0.5℃〜1ワット当たり4℃である、本発明1028〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記フローチャネルの耐熱性が、1ワット当たり約1℃〜1ワット当たり3℃である、本発明1028〜1042のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記第1の電極が、細長い導電性構造を備え、前記第2の電極が、管状の導電性構造を備え；管状の該第2の電極が、該第1の電極に対して間隔をおいた関係で該第1の電極を取り囲むように、該電極が同心円状に配列されており；かつ前記フローチャネルが、該第1の電極と該第2の電極の間に画定された環状空間内に配置されている、本発明1028〜1040のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記電極が、前記フローチャネルを画定している前記壁の少なくとも一部分を形成する、本発明1028〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
間隔をおいた同心円状の関係で前記第1の電極および前記第2の電極を維持するための同心性環状スペーサーをさらに含む、本発明1028〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記デバイスが、第2の同様のデバイスと直列に配列されている、本発明1028〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記デバイスが、第2の同様のデバイスと並列に配列されている、本発明1028〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
フローエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトする工程が、1ワット当たり約10℃未満の熱抵抗を有するフローチャネルを使用することを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1048]
フローエレクトロポレーションにより前記細胞にトランスフェクトする工程が、エレクトロポレーションされる細胞の懸濁液を、フローチャネルを通じて流すこと；および、該フローチャネルを通じて流している間、該懸濁液を電場に曝露することを含み、該電場が0.5kV/cm超の強度を有する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記電場が、約3.5kV/cm超の強度を有する、本発明1048の方法。
[本発明1050]
エレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞の50％超が、前記外因性ポリペプチドを発現する、本発明1001〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
エレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞の約50％から95％が、前記外因性ポリペプチドを発現する、本発明1001〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
エレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞の約60％から90％が、前記外因性ポリペプチドを発現する、本発明1001〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞の約70％から80％が、前記外因性ポリペプチドを発現する、本発明1001〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約50％超の生存可能性を有する、本発明1001〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約60％超の生存可能性を有する、本発明1001〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約70％超の生存可能性を有する、本発明1001〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約80％超の生存可能性を有する、本発明1001〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約90％超の生存可能性を有する、本発明1001〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約50％から90％の生存可能性を有する、本発明1001〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
フローエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた前記細胞が、選択の前および／または後に約60％から90％の生存可能性を有する、本発明1001〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
選択した前記トランスフェクトされた細胞の限界希釈を用いて単一細胞コロニーを得る工程をさらに含む、本発明1001〜1059のいずれかの方法。
[本発明1062]
マルチウェルプレートを使用して単一細胞コロニーを得る、本発明1061の方法。
[本発明1063]
バッチ培養条件または懸濁培養条件において選択が行われる、本発明1001〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、かつ前記選択物質が抗生物質である、本発明1001〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンに対する耐性を付与する、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記選択物質がG418またはその誘導体である、本発明1066の方法。
[本発明1068]
トランスフェクトされた前記細胞が、条件的致死濃度の前記抗生物質と共に少なくとも5から21日間培養される、本発明1001〜1063のいずれかの方法。
[本発明1069]
トランスフェクトされた前記細胞が、条件的致死濃度の前記抗生物質と共に5から10日間培養される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記細胞が、条件的致死濃度の前記抗生物質と共に培養された後、細胞が、より低い濃度の該抗生物質を有する培養物中で維持される、本発明1001〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記より低い濃度が、前記条件的致死濃度の約25から75％である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記より低い濃度が、前記条件的致死濃度の約50％以下である、本発明1070または1071の方法。
[本発明1073]
細胞が前記より低い濃度で4から20日間維持される、本発明1070〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
限界希釈を使用して安定なトランスフェクトされた細胞をクローニングする前に、細胞が前記より低い濃度で維持される、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記細胞がCHO細胞であり、かつG418またはその誘導体の条件的致死濃度が少なくとも約0.8mg/mlである、本発明1067の方法。
[本発明1076]
G418またはその誘導体の前記条件的致死濃度が約1.0mg/ml超である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
G418またはその誘導体の前記条件的致死濃度が約1.6mg/ml超である、本発明1001〜1075のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記抗生物質がG418である、本発明1067または1075〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
前記細胞を酪酸ナトリウム中で培養する、本発明1001〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記外因性ポリペプチドを発現するクローン細胞を産生するために、単離および選択されたクローン細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1001〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
単離されたクローン細胞を増殖させる工程が、前記抗生物質を含む培地中である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
増殖の最中の前記抗生物質の濃度が、該抗生物質の条件的致死濃度の50％以下である、本発明1081の方法。
[本発明1083]
増殖の最中の前記抗生物質の濃度が、該抗生物質の条件的致死濃度の25％以下である、本発明1081の方法。
[本発明1084]
細胞を大規模製造用に増殖させる、本発明1080の方法。
[本発明1085]
細胞を1L超の容積で増殖させる、本発明1080または1084の方法。
[本発明1086]
細胞を3Lまたはそれ以上の容積で増殖させる、本発明1085の方法。
[本発明1087]
前記細胞を、前記抗生物質を含む培地中で増殖させる、本発明1086の方法。
[本発明1088]
前記抗生物質の濃度が条件的致死濃度である、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記細胞を無血清培地中で培養する、本発明1001〜1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記細胞により産生された前記外因性ポリペプチドを単離または精製する工程をさらに含む、本発明1001〜1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
選択された前記細胞が、少なくとも約0.1g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
選択された前記細胞が、少なくとも約0.5g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
選択された前記細胞が、少なくとも約1.0g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
選択された前記細胞が、少なくとも約1.5g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
選択された前記細胞が、少なくとも約2g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
選択された前記細胞が、少なくとも約3g/Lの外因性ポリペプチドを産生する、本発明1001〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約0.1g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約0.5g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約1.0g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約1.5g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約2g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
増殖させたクローン細胞が、少なくとも約3g/Lの外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1080〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
増殖させたクローン細胞が、前記濃度の外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから7週間以内に産生する、本発明1097または1102の方法。
[本発明1104]
増殖させたクローン細胞が、前記濃度の外因性ポリペプチドを、トランスフェクトされてから6週間以内に産生する、本発明1103の方法。
[本発明1105]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり10ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1001〜1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり20ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1105の方法。
[本発明1107]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり30ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1106の方法。
[本発明1108]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり40ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1107の方法。
[本発明1109]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり50ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1108の方法。
[本発明1110]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり60ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1109の方法。
[本発明1111]
増殖させたクローン細胞が、1日に1細胞当たり80ピコグラム超の外因性タンパク質を、トランスフェクトされてから8週間以内に産生する、本発明1110の方法。
[本発明1112]
増殖させたクローン細胞が、対照細胞と比較して、1日に1細胞当たり10％超多いタンパク質を産生し、対照細胞が、同様のトランスフェクトされた細胞であるが、条件的致死濃度の50％以下である濃度の抗生物質と共にインキュベートされたものである、本発明1001〜1111のいずれかの方法。
[本発明1113]
増殖させたクローン細胞が、対照細胞と比較して、1日に1細胞当たり20％超多いタンパク質を産生する、本発明1001〜1112のいずれかの方法。
[本発明1114]
増殖させたクローン細胞が、対照細胞と比較して、1日に1細胞当たり40％超多いタンパク質を産生する、本発明1001〜1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
増殖させたクローン細胞が、対照細胞と比較して、1日に1細胞当たり50％超多いタンパク質を産生する、本発明1001〜1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
トランスフェクトされた細胞が、世代60以降に、世代10〜20のレベルの少なくとも50％であるレベルの外因性タンパク質を産生する、本発明1001〜1115のいずれかの方法。
[本発明1117]
トランスフェクトおよび選択された細胞を凍結させる工程をさらに含む、本発明1001〜1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
以前に凍結されたトランスフェクトおよび選択された細胞を増殖させる工程をさらに含む、本発明1001〜1117のいずれかの方法。
[本発明1119]
以下の工程を含む、安定なCHO細胞発現株を産生するための方法：
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）G418耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、CHO細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）約1.6mg/ml超のG418を含む培地中のトランスフェクトされたCHO細胞を選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、選択したトランスフェクトされたCHO細胞を限界希釈により単離する工程；および
（d）安定なCHO細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされたCHO細胞を増殖させる工程。
[本発明1120]
複製した前記トランスフェクトされたCHO細胞により産生された外因性ポリペプチドを回収する工程をさらに含む、本発明1119の方法。
[本発明1121]
前記トランスフェクトされた細胞が、1.6mg/mlのG418を含む培地中で少なくとも6日間維持される、本発明1119または1120の方法。
[本発明1122]
前記安定なCHO細胞発現株が、約2g/Lを上回る外因性タンパク質を培地中で産生する、本発明1119〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
以下の工程を含む、高産生性CHO細胞株についてスクリーニングするための方法：
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）G418耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、CHO細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）約1.6mg/mL超のG418を含む培地中のトランスフェクトされたCHO細胞を少なくとも6日間にわたって選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、選択したトランスフェクトされたCHO細胞を限界希釈により単離する工程；
（d）安定なCHO細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされたCHO細胞を増殖させる工程；および
（e）該外因性ポリペプチドの産生について該細胞を評価する工程。
[本発明1124]
前記外因性ポリペプチドの高産生株であるCHO細胞株を同定する工程をさらに含む、本発明1123の方法。
[本発明1125]
精製タンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、以下の工程を含む方法により産生された、組成物：
（a）フローエレクトロポレーションデバイスを使用して、（i）抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする配列と、（ii）外因性ポリペプチドをコードする配列とを含む発現構築物を、細胞中にトランスフェクトする工程；
（b）条件的致死濃度の抗生物質を含む培地中のトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（c）クローン細胞を得るために、限界希釈により、選択したトランスフェクトされたCHO細胞を単離する工程；
（d）安定な細胞発現株を産生するために、単離したトランスフェクトされた細胞を増殖させる工程；および
（e）該外因性ポリペプチドを回収する工程。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が当業者には明らかであるため、詳細な説明および特定の実施例が、本発明の好ましい態様を示し、例示だけのために与えられることを理解すべきである。