(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿又は血清中に含まれるｎｍ２３タンパク質又はｎｍ２３タンパク質の抗原性を有するその類似体と、抗ｎｍ２３タンパク質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法によりｎｍ２３タンパク質又はその類似体を測定することからなる、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質又はその類似体の測定方法。
【請求項２】
ヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質と抗ヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法によりヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質を測定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記免疫測定法は、ＥＬＩＳＡである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生体から分離された血漿又は血清について請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法を行なうことを含む悪性腫瘍の検出方法。
【請求項５】
前記悪性腫瘍は、悪性リンパ腫である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記悪性腫瘍は白血病である請求項４記載の方法。
【請求項７】
予後を予測するものである請求項４ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｎｍ２３タンパク質又はその類似体の測定方法及びそれを用いた悪性腫瘍の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｎｍ２３タンパク質は、分化誘導抑制因子又は癌転移関連因子とも呼ばれるタンパク質であり、ヌクレオシド２リン酸キナーゼと同一物質であることがわかっている。白血病細胞や悪性リンパ腫細胞におけるｎｍ２３タンパク質の異常発現が知られており（角  純子ら、  血液・腫瘍科，  ３６（２）：１８５−１９５，１９９８；  ＤＮＴ  Ａｒｙｅｅｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９６）７４，  １６９３−１６９８）、ｎｍ２３タンパク質を免疫反応により検出することにより悪性腫瘍を診断することも公知である（特開平１０−２１２２９９号公報、ＷＯ９８／１１２３２）。そして、ｎｍ２３タンパク質に特異的に反応する抗ｎｍ２３タンパク質モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体も市販されている。また、細胞中のｎｍ２３タンパク質のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により測定することにより、白血病等の悪性腫瘍の予後診断を行うことも公知である（角  純子ら、上掲；特許第２７５８５００号公報、ＷＯ９８／１１２３２）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、免疫反応を利用した、従来のｎｍ２３タンパク質の検出方法は、免疫組織染色によるものであり、ｎｍ２３タンパク質を正確に定量することは困難である。また、ｎｍ２３タンパク質のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により測定する方法は、細胞からのｍＲＮＡの調製等に多少手間がかかり、多数の検体を短時間内に処理しなければならない臨床検査には必ずしもベストな方法であるとは言い難い。
【０００４】
従って、本発明の目的は、従来法よりも簡便にｎｍ２３タンパク質を測定することができる、ｎｍ２３タンパク質の測定方法及びそれを利用した悪性腫瘍の診断方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、血漿や血清中にｎｍ２３タンパク質が、免疫測定法により検出できる程度の濃度で含まれることを見出し、更に、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質濃度を免疫測定法により測定することにより悪性腫瘍及びその予後の診断を行うことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、血漿又は血清中に含まれるｎｍ２３タンパク質又はｎｍ２３タンパク質の抗原性を有するその類似体と、抗ｎｍ２３タンパク質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法によりｎｍ２３タンパク質又はその類似体を測定することからなる、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質又はその類似体の測定方法を提供する。また、本発明は、生体から分離された血漿又は血清について上記本発明の方法を行なうことを含む、悪性腫瘍の検出方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質又はｎｍ２３タンパク質の抗原性を有するその類似体を測定する。従来より、ｎｍ２３タンパク質並びにその生理学的意義及び臨床的意義はよく研究されているが、ｎｍ２３タンパク質が血漿や血清中に測定可能な濃度に存在することは知られておらず、測定されたことも報告されていない。本発明は、本願発明者らが見出した、この驚くべき知見に基づくものである。
【０００８】
ｎｍ２３タンパク質は、一群のタンパク質の総称であり、ヒトでは、ｎｍ２３−Ｈ１、ｎｍ２３−Ｈ２、ＤＲ−ｎｍ２３及びｎｍ２３−Ｈ４が知られている。これらのアミノ酸配列も公知であり、例えば上記血液・腫瘍科，  ３６（２）：１８５−１９５，１９９８の第１８７頁の図２に記載されている。これらのいずれを測定する方法も本発明の範囲に含まれる。これらのうち、ヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質が好ましい。また、本発明の方法には、これらのｎｍ２３タンパク質の抗原性を有するｎｍ２３タンパク質の類似体を測定することも含まれる。ここで、「ｎｍ２３タンパク質の抗原性を有するｎｍ２３タンパク質の類似体」とは、ｎｍ２３タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合に１又は複数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、抗ｎｍ２３タンパク質抗体と抗原抗体反応を行うことができるタンパク質を意味し、ｎｍ２３タンパク質の変異体や断片等が包含される。
【０００９】
本発明の方法では、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質又はその類似体を免疫測定するが、免疫測定法自体は何ら限定されるものではなく、周知の免疫測定法のいずれをも採用することができる。すなわち、反応形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法等、標識で分類すれば、酵素免疫測定、放射免疫測定及び蛍光免疫測定並びにビオチン標識を用いた免疫測定法等が知られているが、これらのいずれをも採用することができる。これらのうち、特殊な装置を必要とせず、測定感度も高いサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）が特に好ましいがこれに限定されるものではない。免疫測定のためには、抗ｎｍ２３タンパク質抗体が必要であるが、抗ｎｍ２３タンパク質抗体は、ｎｍ２３タンパク質を免疫源として用いる常法により容易に調製することができる。また、上記の通り、抗ｎｍ２３タンパク質モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は市販もされているので、それらの市販抗体を好ましく用いることもできる。下記実施例には、これらの市販抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの１例が具体的に記載されている。なお、免疫測定法によれば、抗原の検出のみならず、定量も可能であるので、本発明で言う「測定」には、検出と定量の両者が包含される。また、免疫測定に供する試料は、血漿又は血清の原液であってもよいし、所望により、適当な倍率で希釈した、血漿又は血清の希釈物であってもよい。
【００１０】
下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法により測定された、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質の量は、悪性腫瘍に関連している。すなわち、悪性腫瘍患者では、健常人に比較して、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質量が有意に多い。従って、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質量を測定することにより、悪性腫瘍の診断を行うことができる。また、悪性腫瘍の予後とも関連しており、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質量が多い場合には、予後が悪い。従って、血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質量を測定することにより、悪性腫瘍の予後の診断を行うこともできる。
【００１１】
本発明の方法により診断が可能な悪性腫瘍としては、悪性リンパ腫、白血病及び固形癌等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１  血漿及び血清中のヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の免疫測定及び悪性リンパ腫との関連性の確認
１．  材料及び方法
（１）  患者
１９８７年〜１９９６年の間に継続的に診断され、治療された、２０１人の未治療の患者のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質を測定した。２０１人の患者の内、１８４人は非ホジキンリンパ腫に罹患していた。ワーキング・フォーミュレーション・スキーム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：  Ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓａｇｅ．    Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．    Ｃａｎｃｅｒ  ４９：２１１２，  １９８２）に従って分類すると、その１８４人のうち３５人は低悪性度、１４７人は中悪性度、２人は高悪性度のリンパ腫に罹患していた。他の患者の内の９人はホジキン病に罹患し、８人は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫に罹患していた。アナーバー分類システム（Ｃａｒｂｏｎｅ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｈｏｄｋｉｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３：１８６０，  １９７１）に従って、臨床進度を決定した。この際の評価基準には、完全な履歴と物理的試験、すなわち、胸部レントゲン写真、骨髄の吸引生検及びバイオプシー、胸部、腹部及び骨盤のコンピュータートモグラフィー、ヘモグラム、並びにルーチンな生化学検査が含まれていた。１８０人の患者は、併用化学療法による治療を受けた。中悪性度及び高悪性度リンパ腫並びに播種性疾患の患者は、通常、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシン、ドキソルビシン及びプロカルバジン（ＣＯＰ−ＢＬＡＭ）（Ｎｉｉｔｓｕ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ５５：８８，  １９９５）による治療、又は２週間に１度のＣＯＰ−ＢＬＡＭと顆粒球コロニー刺激因子による治療（Ｎｉｉｔｓｕ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ５６：１６３，  １９９６）を受けていた。低悪性度リンパ腫患者は、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニソン（ＣＯＰ）又はＣＯＰ−ＢＬＡＭによる治療を受けた。７４人の患者は、化学療法に加え、放射線治療も受けた。全ての患者について、２〜３ヶ月毎に経過観察を行った。再評価の基準には、物理的検査、ヘモグラム、生化学的検査、並びに胸部、腹部及び骨盤のコンピュータートモグラフィーが包含されていた。経過期間の中央値は６４ヶ月であった（２４〜１２０ヶ月の範囲）。進行期（中悪性度又は高悪性度）非ホジキンリンパ腫に罹患していた１４９人の患者の内、８８〜１２０ヶ月（中央値：６８ヶ月）の経過観察後に１０９人が生存していた。他の４０人は、診断後１〜３４ヶ月（中央値：１２ヶ月）の間に死亡した。
【００１４】
平均年齢３４歳（２４歳〜５２歳）の２１人の健常人からの血漿試料を比較のために分析した。１週間以内に発熱したことがなく、投薬を受けておらず、妊娠しておらず、あらゆる慢性又は急性の疾病に罹患したことがない健常人から回収した。
【００１５】
（２）  静脈血試料
ヘパリンを含有する滅菌試験管に末梢静脈血を採り、氷上に少なくとも１０分間静置して血小板の活性化を回避した。試料は２０００ｇで１５分間、４℃で遠心し、０．２２μｍマイクロフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、フランス国Ｍｏｌｓｈｅｉｍ）、−８０℃で貯蔵した。
【００１６】
（３）  ＥＬＩＳＡによるヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の測定
５０ｍＭの重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中に２．５μｇ／ｍｌの濃度で抗ｎｍ２３−Ｈ１モノクローナル抗体（東京の生化学社製）を含む溶液５０μｌで９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２５８０５−９６，  Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州）のウェルを一晩コートし、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μｌの２５％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大阪の大日本製薬社製）で１時間インキュベートした。血漿試料をＰＢＳで２倍希釈し、その５０μｌを各ウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）含有ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で４回洗浄した。次いで、試料を抗ｎｍ２３−Ｈ１ポリクローナル抗体（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．製）と共に室温で１時間インキュベートし、Ｔ−ＰＢＳで４回洗浄し、アリカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カリフォルニア州リッチモンドのＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂ社製）の５００倍希釈物と共に室温で１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで４回洗浄した後、基質としてジエタノールアミンを用い、アリカリフォスファターゼ検出キット（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂ社製）を用いてアルカリフォスファターゼ活性を測定した。マイクロプレート−ＥＬＩＳＡリーダーを用い、補正波長を６２０〜６３０ｎｍとして、４０５〜４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として、組換えｎｍ２３−Ｈ１−ＧＳＴタンパク質（Ｕｒａｎｏ  Ｔｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３０９：３５８，  １９９２；  Ｏｋａｂｅ−Ｋａｄｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３６３：３１１，  １９９５）を用いた。
【００１７】
図１に、上記ＥＬＩＳＡ系の標準曲線を示す。ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度に依存して４１５ｎｍにおける吸光度（４１５ｎｍにおける吸光度から６３０ｎｍにおける吸光度を差し引いたもの）が増加しており、このＥＬＩＳＡ系により、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質を定量できることがわかる。一方、ｎｍ２３−Ｈ２タンパク質（アミノ酸配列でｎｍ２３−Ｈ１と８８％の相同性を有する）の濃度を高めても吸光度はほとんど変化しない。このことから、上記のＥＬＩＳＡ系ではｎｍ２３−Ｈ１タンパク質が特異的に定量されることがわかる。これは、ＥＬＩＳＡに用いた市販の抗ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質モノクローナル抗体が、ｎｍ２３−Ｈ２タンパク質とはほとんど特異的に反応しないものであることに起因する。血漿試料は、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の濃度が１００ｎｇ／ｍｌ未満になるまで希釈した。通常、血漿は２倍希釈して用い、血漿に代えて血清を用いた場合にも同様な結果が得られた（図２）。用いた正常血漿試料（ｎ＝２１）におけるｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度は１０  ｎｇ／ｍｌ未満であったが、進行期リンパ腫患者からの血漿試料では異なっていた（図３）。ｎｍ２３タンパク質の１つの活性であるヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ活性はヒト血漿中で検出することができると報告されている。これはおそらく、生体内での赤血球の部分的な溶解によるものであると考えられている  （Ｗｉｌｌｅｍ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１３６６３，  １９９８）。従って、溶血によりもたらされ得るｎｍ２３タンパク質を排除するために、溶血の指標として遊離の血漿ヘモグロビン含量を測定した。遊離の血漿ヘモグロビンは公知の方法（Ｔｅｓｔａ  ＵＫ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １４０：２５１，  １９８２）により測定した。用いた全ての血漿試料において、遊離の血漿ヘモグロビン濃度は１２０μｇ／ｍｌ未満であった（図３）。ヒト赤血球抽出物におけるｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と遊離のヘモグロビン濃度との関係を調べた。遊離ヘモグロビン（赤血球抽出物）の濃度が高い場合には有意な濃度のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質が検出されたが、ヘモグロビンの濃度が１２０μｇ／ｍｌ未満の場合には有意な濃度のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質は検出されなかった（図３）。
【００１８】
（４）  統計学的解析
治療に対する反応性は、化学療法の終了時に判定した。「完全寛解」は、臨床的、放射線学的及び組織学的基準に基づいて検出可能な病変が存在しないことと定義される。部分寛解は、腫瘍体積が５０％を超えて縮小したことを意味する。完全寛解の期間は、化学療法の完了から再発又は最終の経過観察までの期間である。全生存率は、治療の開始から死亡又は最終の経過観察までの期間における全生存率を意味する。生存率の解析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法（Ｋａｐｌａｎ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ  ５３：４５７，  １９５８）法に従って行った。無病生存率は、全く再発することなく生存した率である。従って、完全寛解に全く達することがなかった患者の無病生存期間は０ヶ月である。曲線間の統計学的有意差は、ログ−ランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）テスト及び一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎテスト  （Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｆ：  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １：８０，  １９４５）により決定した。グループ間の差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔ  （ノンパラメトリック解析）（Ｍａｎｔｅｌ  Ｎ：  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ５０：１６３，  １９６６）により行い、ｐ＜０．０５が有意であることを示す。予後の多変量解析は、Ｃｏｘの比例危険回帰モデル（Ｃｏｘ’ｓ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ−ｈａｚａｒｄｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）（Ｃｏｘ  ＤＲ，  Ｊ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  Ｂｒ３４：１８７，  １９７２）を用いて行った。全ての計算は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン６．１０（ノースキャロライナ州ＣａｒｙのＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて行った。
【００１９】
２．  結果
（１）  患者及び健常人対照の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の測定
悪性リンパ腫患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の濃度（ｎ＝２０１，  平均±標準偏差、４２．９１±５９．６９  ｎｇ／ｍｌ）は、健常人対照のそれ（ｎ＝２１，  ６．１３±４．１３  ｎｇ／ｍｌ）と比較して有意に高かった（ｐ＝０．０００１）。ホジキン病  （ｎ＝９，  ２０．３３±１７．１５  ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．００１９５）、低悪性度非ホジキンリンパ腫（ｎ＝３５，  １８．９３±１９．３３  ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．０１７５）、中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫（ｎ＝１４９，  ５０．７３±６６  ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．００００１）及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ｎ＝８，  ２７．６５±２８．６８  ｎｇ／ｍｌ）（ｐ＝０．００１７）患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度は、健常人対照のそれよりも有意に高かった。中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度は特に高く、低悪性度非ホジキンリンパ腫患者のそれよりも有意に高かった（ｐ＝０．００７）（図４）。なお、図４中、「ＮＨＬ」は非ホジキンリンパ腫、「ＡＴＬＬ」は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫を意味し、横棒は平均値を示す。米印は、その数に応じて以下の有意差を示す。＊：ｐ＜０．０５，  ＊＊＊：  ｐ＜０．００１，  ＊＊＊＊：  ｐ＜０．０００１。しかしながら、高悪性度と中悪性度の患者間の血漿中ｎｍ２３−Ｈ１濃度には有意差がなかった（ｐ＝０．９４）。また、びまん性大細胞性、びまん性混合型、びまん性切れ込み小細胞性、リンパ芽球性等の、中悪性度及び高悪性度リンパ腫のサブタイプの間では有意差がなかった（データは示さず）。これらのことは、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１濃度が、進行期非ホジキンリンパ腫のワーキング・フォーミュレーショングレードとは独立していることを示している。
【００２０】
（２）  進行期リンパ腫におけるｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と臨床特徴
表１は、１４９人の中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫患者の臨床特徴を示す。治療前における、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１濃度が高いことは、予後が悪いこと、例えば、パフォーマンス・ステイタスが悪い、アナーバー・ステージがＩＩＩ又はＩＶである、Ｔ細胞型である、血清中の可溶性インターロイキン−２レセプター濃度が高いこと等と相関する（全ての比較においてｐ＜０．０２、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔ）（表１）。国際予後指標の低悪性度（Ｌ）＋低悪性度−中悪性度（Ｌ−Ｉ）リスク群と高悪性度−中悪性度（Ｈ−Ｉ）＋高悪性度（Ｈ）リスク群間の、高ｎｍ２３−Ｈ１濃度の患者の割合には有意差がなかった（ｐ＝０．２４，表１）。国際予後指標スコアがＬ（ｎ＝３５），  Ｌ−Ｉ（ｎ＝６５），  Ｈ−Ｉ（ｎ＝３７）及びＨ（ｎ＝１２）リスクの群の患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度は、それぞれ３４．９±４０．６、５２．１±６６．７、５４．２±８１．９及び７８．８±６３．２  ｎｇ／ｍｌであった。平均濃度はリスクが高まるにつれて高くなる傾向が見られたが、統計学的な有意差はなかった（ｐ＝０．０６５）。
【００２１】
【表１】
0003557367.tif 000002
【００２２】
１４９人の患者のうち、１２６人（８４．６％）において完全寛解が得られ、これら１２６人の患者の診断時における血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の濃度は３７．４３±４８．５５  ｎｇ／ｍｌであり、これは、部分寛解又は無反応患者のそれ（９３．６０±９８．６２  ｎｇ／ｍｌ，  ｐ＝０．０００１）よりも有意に低かった。このことは、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の血漿濃度と治療反応性との間の密接な関係を示唆している。
【００２３】
（３）  ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と生存率の関係
１４９人の進行期（中悪性度及び高悪性度）非ホジキンリンパ腫患者を、ｎｍ２３−Ｈ１の血漿濃度８０  ｎｇ／ｍｌをカットオフ値として、ｎｍ２３−Ｈ１濃度が異なる２つの群に分けた。なお、このカットオフ値は、５０  ｎｇ／ｍｌ  （＜５０，  ｎ＝１０３対≧５０，  ｎ＝４６）、８０  ｎｇ／ｍｌ（＜８０，  ｎ＝１２１対≧８０，  ｎ＝２８）及び１００  ｎｇ／ｍｌ（＜１００，  ｎ＝１３２対≧１００，  ｎ＝１７）の異なるカットオフ点による結果に基づいて決定された（データ図示せず）。高ｎｍ２３−Ｈ１群（≧８０，  ｎ＝２８）と低ｎｍ２３−Ｈ１群（＜８０，  ｎ＝１２１）の３年生存率は、それぞれ６．７％及び７６．４％であり（ログ−ランクテスト及び一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎテストの両者においてｐ＝０．０００１）、無病生存率は１４．２％及び７０．２％（ログ−ランクテスト及び一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎテストの両者においてｐ＝０．０００１）であった（図５、６）。
【００２４】
国際予後指標スコアに従って分類された患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度の有意性も評価した。低リスク群（Ｌ）及び低−中リスク群（Ｌ−Ｉ）では、全生存率（図７）及び無病生存率（図８）とも、ｎｍ２３−Ｈ１濃度８０  ｎｇ／ｍｌ以上の患者が、８０  ｎｇ／ｍｌ未満の患者よりも低かった（ｐ＝０．０００１）。このことは、ｎｍ２３−Ｈ１濃度が高いと、治療効果が劣ることを示している。同様な結果は、高−中リスク群（Ｈ−Ｉ）及び高リスク群（Ｈ）においても得られた（ｐ＝０．０００１）（図９、図１０）。
【００２５】
（４）  進行期リンパ腫における単変量解析による予後因子
中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫（ｎ＝１４９）患者における完全寛解率の単変量解析により、高ｎｍ２３−Ｈ１濃度（≧８０  ｎｇ／ｍｌ）、年齢、低いパフォーマンス・ステイタス、高い国際予後指標スコア及び高い可溶性インターロイキン−２レセプター濃度が、有意な予後不良因子であった（表２）。単変量解析によると、また、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１濃度、年齢、パフォーマンス・ステイタス、乳酸デヒドロゲナーゼ濃度、国際予後指標スコア、免疫表現型、可溶性インターロイキン−２レセプター濃度及び可溶性ＣＤ４４濃度が、全生存率と相関しており（ｐ＜０．０５、表２）、これらのうち、ｎｍ２３−Ｈ１濃度、パフォーマンス・ステイタス、国際予後指標、免疫表現型及び可溶性インターロイキン−２レセプター濃度は、また、無病生存率とも相関していた（ｐ＜０．０５、表２）。
【００２６】
【表２】
0003557367.tif 000003
【００２７】
（５）  進行期リンパ腫における多変量解析による予後因子
単変量解析により有意であることが証明された８つの予後因子（ｎｍ２３−Ｈ１濃度、年齢、パフォーマンス・ステイタス、乳酸デヒドロゲナーゼ濃度、国際予後指標スコア、免疫表現型、可溶性インターロイキン−２レセプター濃度及び可溶性ＣＤ４４濃度）と生存率との関連を、Ｃｏｘの比例危険モデルを用いた多変量解析により評価した。この解析により、中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫患者では、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１濃度が最も重要な独立予後因子であることが示された（表３）。無病生存率との関連に関し、６つの因子（ｎｍ２３−Ｈ１濃度、パフォーマンス・ステイタス、乳酸デヒドロゲナーゼ濃度、国際予後指標スコア、免疫表現型及び可溶性インターロイキン−２レセプター濃度）を調べた。ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の血漿濃度が高いことが、低い無病生存率の最も重要な予後決定因子であることが同定された（表４）。国際予後指標スコアを計算するために用いた５つの予後因子及びｎｍ２３−Ｈ１血漿濃度と、完全寛解及び生存率との関連をさらなる多変量解析を用いて調べた（表５、６）。これらの結果は、ｎｍ２３−Ｈ１濃度が、完全寛解率及び生存率の両方を予測することができる独立した予後因子であることを示している。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【表４】
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【００３０】
【表５】
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【００３１】
【表６】
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【００３２】
実施例２  血漿中のｎｍ２３−Ｈ１濃度と白血病の関連
合計２７４人の各種白血病患者から実施例１と同様にして集めた血漿を試料として、実施例１と同じサンドイッチＥＬＩＳＡにより血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度を測定した。なお、健常人対照としては、実施例１と同じ２１人の健常人からの血漿を用いた。統計学的解析は実施例１と同様にして行った。
【００３３】
表７並びに図１１及び図１２に、白血病の種類、患者数、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の血漿濃度及びｐ値を示す。なお、図１２中、ＣＭＬ−ＣＰは慢性骨髄性白血病−慢性期、ＣＭＬ−ＢＣは慢性骨髄性白血病−骨髄芽球再発、ＭＤＳは骨髄異形成症候群、ＭＤＳ−ｏｖｅｒｔは骨髄異形成症候群−白血化を意味する。これらに示されるように、全ての種類の白血病患者において、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度は、健常人対照に比べて統計学的に有意に高かった。このことから、本発明の方法により、白血病の診断を行うことができることが明らかになった。
【００３４】
【表７】
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【００３５】
また、表８及び表９に急性骨髄性白血病患者の各種臨床因子、患者数、ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の血漿濃度及びｐ値を示す。さらに表１０に、急性骨髄性白血病に対するＣｏｘの比例危険モデルによる多変量解析の結果を示す。さらに、図１３及び図１４に急性骨髄性白血病の低ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質血漿濃度（＜８０ｎｇ／ｍｌ）患者と高ｎｍ２３−Ｈ１タンパク質血漿濃度（≧８０  ｎｇ／ｍｌ）患者の全生存率及び無病生存率をそれぞれ示す。これらからわかるように、血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度が、重要な予後因子であることが証明された。
【００３６】
【表８】
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【００３７】
【表９】
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【００３８】
【表１０】
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【００３９】
【発明の効果】
本発明により、従来法よりも簡便にｎｍ２３タンパク質を測定することができる、ｎｍ２３タンパク質の測定方法及びそれを利用した悪性腫瘍の診断方法が提供された。本発明の方法によれば、試料としては血漿若しくは血清又はそれらの希釈物を用いることができ、また、免疫測定は操作も簡単であるので、簡便に測定を行うことができる。さらに、上記実施例から明らかなように、本発明の方法により測定される血漿又は血清中のｎｍ２３タンパク質濃度は、リンパ腫及び白血病のような悪性腫瘍の診断及び予後の推測に極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、組換えｎｍ２３−Ｈ１タンパク質又は組換えｎｍ２３−Ｈ２タンパク質濃度と吸光度との関係を示す標準曲線である。
【図２】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、進行期リンパ腫患者の血漿若しくは血清又は健常人対照の血漿の希釈率と、その中に含まれるｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度との関係を示す図である。
【図３】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、進行期リンパ腫患者若しくは健常人対照の血漿又は赤血球抽出物中のヘモグロビン濃度とｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度との関係を示す図である。
【図４】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、各種悪性リンパ腫患者及び健常人の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度並びに各群間の統計学的有意差の程度を示す図である。
【図５】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度の高低と全生存率との関係を示す図である。
【図６】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、中悪性度及び高悪性度非ホジキンリンパ腫患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度の高低と無病生存率との関係を示す図である。
【図７】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、国際予後指標スコアに従って低リスク及び低−中リスクに分類された患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と全生存率との関係を示す図である。
【図８】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、国際予後指標スコアに従って低リスク群及び低−中リスク群に分類された患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と無病生存率との関係を示す図である。
【図９】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、国際予後指標スコアに従って高−中リスク群及び高リスク群に分類された患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と全生存率との関係を示す図である。
【図１０】本発明の実施例１において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、国際予後指標スコアに従って高−中リスク群及び高リスク群に分類された患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度と無病生存率との関係を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、各種白血病患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度を示す図である。
【図１２】本発明の実施例２において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、各種白血病患者の血漿中のｎｍ２３−Ｈ１タンパク質濃度を示す図である。
【図１３】本発明の実施例２において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定されたｎｍ２３−Ｈ１タンパク質血漿濃度が低い  （＜８０  ｎｇ／ｍｌ）急性骨髄性白血病患者と高い  （≧８０  ｎｇ／ｍｌ）急性骨髄性白血病患者の全生存率を示す図である。
【図１４】本発明の実施例２において行ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定されたｎｍ２３−Ｈ１タンパク質血漿濃度が低い  （＜８０  ｎｇ／ｍｌ）  急性骨髄性白血病患者と高い  （≧８０  ｎｇ／ｍｌ）  急性骨髄性白血病患者の無病生存率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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