【手続補正書】
【提出日】平成29年2月2日(2017.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｄ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子
を１または２以上の遺伝子が発現される条件下で含む組換え宿主細胞を増殖させることを含む、細胞培養物においてレバウディオサイドＭを産生する方法であって、
ここで、少なくとも１つの遺伝子が組換え遺伝子であり；
ここで、レバウディオサイドＭが宿主細胞によって産生され；
ここで、ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、１，２−ビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥまたはその混合物を含む、
前記方法。
【請求項２】
１または２以上の遺伝子が構成的に発現され、および／または１または２以上の遺伝子の発現が誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化；
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化；
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化すること；および
（ｄ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化すること
が可能な１または２以上のポリペプチドを使用する、植物由来もしくは合成ステビオールまたはステビオールグリコシドの細胞培養物における全細胞生物変換を含む、レバウディオサイドＭを産生する方法であって、
ここで、少なくとも１つのポリペプチドが、細胞によって産生された組換えポリペプチドであり；
ここで、ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、１，２−ビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥまたはその混合物を含む、
前記方法。
【請求項４】
全細胞が組換え細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）植物由来もしくは合成ステビオールまたはステビオールグリコシドおよび１または２以上のポリペプチドを反応混合物に添加すること、ここで少なくとも１つのポリペプチドが組換えポリペプチドであり、および１または２以上のポリペプチドが、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能であり；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能であり；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能であり；およびステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能である；および
（ｂ）反応混合物においてレバウディオサイドＭを合成すること
を含む、レバウディオサイドＭを産生するためのin vitroの方法。
【請求項６】
（ａ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｄ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子
を含む、細胞培養物においてレバウディオサイドＭを産生するための組換え宿主細胞であって、
ここで、少なくとも１つの遺伝子が組換え遺伝子であり；
ここで、ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、１，２−ビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥまたはその混合物を含む、
前記組換え宿主細胞。
【請求項７】
組換え宿主細胞が、
（ｅ）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｆ）ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｇ）ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｈ）ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；
（ｉ）ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む；および／または
（ｊ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで、シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドが、配列番号４または９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
ここで、（ｅ）〜（ｊ）における遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子である、
をさらに含む、請求項１に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドが、配列番号１６に記載のアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するポリペプチド；配列番号１５または８６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するポリペプチド、または配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含み、
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列に対して５５％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；および
（ｄ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して５５％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
ここで、少なくとも１つのポリペプチドが組換えポリペプチドである、
請求項１、３もしくは５に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドが、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｔ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２８５Ｔ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３Ｎ、Ｔ２８４Ｒ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含む１または２以上のポリペプチドバリアントを含む、請求項１、３もしくは５に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
レバウディオサイドＭを細胞培養物から単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに単離することをさらに含む、請求項１、３もしくは５に記載の方法であって、ここで、単離する工程が：
（ａ）レバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離してレバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む上澄みを得ること；
（ｃ）充填カラムにおいて吸着樹脂を提供することを含む、１または２以上の吸着樹脂を提供すること、および
（ｄ）工程（ｂ）の上澄みを１または２以上の吸着樹脂に接触させてレバウディオサイドＭの少なくとも一部を単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに得、それによってレバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに単離すること；または
（ａ）レバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離してレバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む上澄みを得ること；
（ｃ）１または２以上のイオン交換もしくはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること；および
（ｄ）工程（ｂ）の上澄みを１または２以上のイオン交換もしくはイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムに接触させてレバウディオサイドＭの少なくとも一部を単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに得ること；または
（ａ）レバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離してレバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに含む上澄みを得ること；
（ｃ）レバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに結晶化または抽出し、それによってレバウディオサイドＭを単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに単離すること
を含む、前記方法。
【請求項１１】
レバウディオサイドＭを細胞培養物から単独で、または少なくとも１つの他のステビオールグリコシドとともに回収することをさらに含む、請求項１、３もしくは５に記載の方法であって、
ここで回収されたレバウディオサイドＭが、植物由来のステビア抽出物から得られたレバウディオサイドＭに対して、ステビア植物由来の成分の減少したレベルを有する、前記方法。
【請求項１２】
組換え宿主細胞が、レバウディオサイドＭを細胞培養物の少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの濃度において産生するか；または
組換え宿主細胞が、レバウディオサイドＭを細胞培養物の少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの濃度において産生し、および細胞培養物が、グルコース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰキシロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、および／または酵母窒素ベース（ＹＮＢ）をさらに含む、
請求項１、３もしくは５に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
細胞培養物が、
（ａ）組換え宿主細胞によって産生されたレバウディオサイドＭ、
ここで、レバウディオサイドＭが細胞培養物の少なくとも６００ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する；
（ｂ）グルコース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰキシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｃ）微量の金属、ビタミン、塩、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、請求項１もしくは３に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
組換え宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞または細菌細胞を含む、請求項１もしくは４に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞であって；
ここで、真菌細胞が酵母細胞を含み；
ここで、酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞であるか；または
ここで、酵母細胞がサッカロミケス属であるか、または
ここで、酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である、
前記方法または前記組換え宿主細胞。
【請求項１５】
所定の温度で所定の時間、発酵槽において組換え宿主細胞を増殖させる、ここで温度および時間は、レバウディオサイドＭの産生を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子が、２以上のコピー数を有する、請求項１、３もしくは５に記載の方法または請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
反応混合物が、
（ａ）反応混合物において産生されたレバウディオサイドＭ、
ここで、レバウディオサイドＭが、反応混合物の少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの濃度において存在する；
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドの１または２以上
（ｃ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰキシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｄ）反応緩衝液および／または塩
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）約１％〜約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭ；
ここで、組成物が、ステビア抽出物に対して、非ステビオールグリコシドのステビア植物由来成分の減少したレベルを有する；または
（ａ）約１％〜約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭ；
ここで、レバウディオサイドＭが、請求項３に記載の全細胞生物変換方法によって産生される；または
（ａ）約１％〜約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭ；
ここで、レバウディオサイドＭが、植物由来のステビア抽出物から得られたレバウディオサイドＭに対して、ステビア植物由来成分の減少したレベルを有する；
ここで、レバウディオサイドＭが、請求項５に記載のin vitroの方法によって産生される；または
（ａ）約１％〜約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭ；
ここで、レバウディオサイドＭが、植物由来のステビア抽出物から得られたレバウディオサイドＭに対して、ステビア植物由来成分の減少したレベルを有する；
ここで、レバウディオサイドＭが、請求項６に記載の組換え宿主細胞によって産生される；
ここで、少なくとも１つのステビア植物由来成分が異臭に寄与する植物由来の化合物であり；およびここで、組成物が、ステビア抽出物に対して、０．１％未満のステビア植物由来成分を有する、
を含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物を含む、食品。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【請求項２１】
（ａ）組換え宿主細胞によって産生されたレバウディオサイドＭ、
ここで、レバウディオサイドＭが、細胞培養物の少なくとも６００ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する；
（ｂ）グルコース、フルクトースおよび／またはスクロース；および／または
（ｃ）微量の金属、ビタミン、塩、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸を含む、補助栄養
を含む、細胞培養物。
【請求項２２】
（ａ）組換え宿主細胞によって産生されたレバウディオサイドＭ、
ここで、レバウディオサイドＭが、細胞培養物の可溶化液の少なくとも６００ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する；
（ｂ）グルコース、フルクトース、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰキシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｃ）微量の金属、ビタミン、塩、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸を含む、補助栄養
を含む、細胞培養物の可溶化液。
【請求項２３】
（ａ）反応混合物において産生されたレバウディオサイドＭ、
ここで、レバウディオサイドＭが、反応混合物の少なくとも約６００ｍｇ／Ｌの濃度において存在する；
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’のβ１，２グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’のβ１，３グリコシル化が可能なポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチド；およびステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基においてグリコシル化することが可能なポリペプチドの１または２以上；
（ｃ）ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコース、ＵＤＰラムノース、ＵＤＰキシロース、および／またはＮ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｄ）反応緩衝液および／または塩
を含む、反応混合物。