【手続補正書】
【提出日】平成29年8月30日(2017.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）脂肪細胞由来幹細胞（ASC）の集団を、ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間、三次元培養に置く工程；
（b）前駆体細胞集団を産生するために、ASC由来細胞凝集体の細胞と、アクチビンAおよび線維芽細胞成長因子（FGF）を含む第1の培養培地とを接触させる工程；ならびに
（c）誘導肝細胞様細胞（iHep）を含む誘導細胞集団を産生するために、前駆体細胞集団の細胞と、肝細胞成長因子（HGF）を含む第2の培養培地とを接触させる工程
を含み、工程（a）の開始から工程（c）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が13日間未満である、
ASCの集団から肝細胞様細胞の集団を産生する方法。
【請求項２】
三次元培養がスピナーフラスコ培養である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
三次元培養がマイクロキャリア培養である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
三次元培養が懸滴浮遊培養である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
工程（a）の開始から工程（c）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が10日間またはそれ未満である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間が3日間またはそれ未満である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ASC由来細胞凝集体の細胞が第1の培養培地と7日間またはそれ未満の間接触する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
FGFがFGF4である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第1の培養培地がWntシグナル伝達アゴニストをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
Wntシグナル伝達アゴニストがWnt3aである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第2の培養培地が、オンコスタチンM（OSM）、デキサメタゾン（Dex）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
第2の培養培地が、オンコスタチンM（OSM）、デキサメタゾン（Dex）、およびジメチルスルホキシド（DMSO）をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
誘導細胞集団のうちのiHepである細胞のパーセンテージを決定する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞のパーセンテージを決定する工程が、
誘導細胞集団の細胞と、肝細胞マーカー分子に対する特異的結合作用物質とを接触させる工程；および
肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞のパーセンテージを決定する工程
を含み、肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞がiHepである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
誘導細胞集団の細胞のうちの11％以上がiHepである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
誘導細胞集団の細胞のうちの25％以上がiHepである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
誘導細胞集団をiHepについて富化する工程をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
富化する工程が蛍光活性化細胞選別（FACS）を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法により産生された誘導肝細胞様細胞(iHep)を含む、肝機能を改善して、低下した肝機能を有する個体を治療するための薬学的組成物。
【請求項２０】
少なくとも1×104個のiHepを含む、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
iHepを肝臓内に移植するための、請求項19または20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
超音波ガイド下注射を用いてiHepが肝臓内に移植される、請求項21記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
個体が哺乳動物である、請求項19〜22のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
哺乳動物がヒトである、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
ASCが、個体から単離されたASCである、請求項19〜24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
iHepの存在は、例えば誘導細胞集団と肝細胞マーカータンパク質に特異的な抗体とを接触させる工程、および発現が陽性である細胞のパーセンテージを決定する工程を含む、種々の方法によって確認され得る。一部の態様において、誘導細胞集団の15％以上が、肝細胞様細胞である。ある場合には、誘導細胞集団の37％以上が、肝細胞様細胞である。一部の態様において、ASCからiHepを作製するのに経過する時間は、13日間未満（例えば、10日間未満）である。肝損傷（例えばアセトアミノフェン毒性による、例えば肝不全）は急速に（例えば、2週間またはそれ未満のうちに）死を引き起こし得るため、主題の方法による、iHep産生の高い効率、およびiHepが産生され得る短い時間枠は、治療法を容易にする。本開示の方法を実践するためのキットも提供される。
[本発明1001]
（a）脂肪細胞由来幹細胞（ASC）の集団を、ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間、三次元培養に置く工程；
（b）前駆体細胞集団を産生するために、ASC由来細胞凝集体の細胞と、アクチビンAおよび線維芽細胞成長因子（FGF）を含む第1の培養培地とを接触させる工程；ならびに
（c）誘導肝細胞様細胞（iHep）を含む誘導細胞集団を産生するために、前駆体細胞集団の細胞と、肝細胞成長因子（HGF）を含む第2の培養培地とを接触させる工程
を含み、工程（a）の開始から工程（c）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が13日間未満である、
ASCの集団から肝細胞様細胞の集団を産生する方法。
[本発明1002]
三次元培養がスピナーフラスコ培養である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
三次元培養がマイクロキャリア培養である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
三次元培養が懸滴浮遊培養である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
工程（a）の開始から工程（c）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が10日間またはそれ未満である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間が3日間またはそれ未満である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ASC由来細胞凝集体の細胞が第1の培養培地と7日間またはそれ未満の間接触する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
ASC由来細胞凝集体の細胞が第1の培養培地と7日間またはそれ未満の間接触する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
FGFがFGF4である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
第1の培養培地がWntシグナル伝達アゴニストをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
Wntシグナル伝達アゴニストがWnt3aである、本発明1003の方法。
[本発明1012]
第2の培養培地が、オンコスタチンM（OSM）、デキサメタゾン（Dex）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
第2の培養培地が、オンコスタチンM（OSM）、デキサメタゾン（Dex）、およびジメチルスルホキシド（DMSO）をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
誘導細胞集団のうちのiHepである細胞のパーセンテージを決定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記細胞のパーセンテージを決定する工程が、
誘導細胞集団の細胞と、肝細胞マーカー分子に対する特異的結合作用物質とを接触させる工程；および
肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞のパーセンテージを決定する工程
を含み、肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞がiHepである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
誘導細胞集団の細胞のうちの11％以上がiHepである、本発明1014の方法。
[本発明1017]
誘導細胞集団の細胞のうちの25％以上がiHepである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
誘導細胞集団をiHepについて富化する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
富化する工程が蛍光活性化細胞選別（FACS）を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
（a）
（i）脂肪由来幹細胞（ASC）の集団を、ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間、三次元培養に置く工程、
（ii）前駆体細胞集団を産生するために、ASC由来細胞凝集体の細胞と、アクチビンAおよび線維芽細胞成長因子（FGF）を含む第1の培養培地とを接触させる工程、ならびに
（iii）誘導肝細胞様細胞（iHep）を含む誘導細胞集団を産生するために、前駆体細胞集団の細胞と、肝細胞成長因子（HGF）を含む第2の培養培地とを接触させる工程
を含み、工程（i）の開始から工程（iii）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が13日間未満である方法
によって、ASCの集団から肝細胞様細胞の集団を産生する工程；ならびに
（b）肝機能を改善するために、有効数のiHepを個体内に投与する工程
を含む、低下した肝機能を有する個体を治療する方法。
[本発明1021]
三次元培養がスピナーフラスコ培養である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
三次元培養がマイクロキャリア培養である、本発明1020の方法。
[本発明1023]
三次元培養が懸滴浮遊培養である、本発明1020の方法。
[本発明1024]
工程（a）の開始から工程（c）における誘導細胞集団の産生までの総経過時間が10日間またはそれ未満である、本発明1020の方法。
[本発明1025]
ASC由来細胞凝集体を産生するのに十分な期間が3日間またはそれ未満である、本発明1020の方法。
[本発明1026]
ASC由来細胞凝集体の細胞が第1の培養培地と7日間またはそれ未満の間接触する、本発明1020の方法。
[本発明1027]
ASC由来細胞凝集体の細胞が第1の培養培地と7日間またはそれ未満の間接触する、本発明1020の方法。
[本発明1028]
FGFがFGF4である、本発明1020の方法。
[本発明1029]
第1の培養培地がWntシグナル伝達アゴニストをさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1030]
Wntシグナル伝達アゴニストがWnt3aである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
第2の培養培地が、オンコスタチンM（OSM）、デキサメタゾン（Dex）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1032]
工程（i）の開始から工程（iii）における誘導肝細胞様細胞（iHep）を含む誘導細胞集団の産生までの総経過時間が13日間未満である、本発明1020の方法。
[本発明1033]
誘導細胞集団のうちのiHepである細胞のパーセンテージを決定する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1034]
前記細胞のパーセンテージを決定する工程が、
誘導細胞集団の細胞と、肝細胞マーカー分子に対する特異的結合作用物質とを接触させる工程；および
肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞のパーセンテージを決定する工程
を含み、肝細胞マーカー分子の発現について陽性である細胞がiHepである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
誘導細胞集団の細胞のうちの15％以上がiHepである、本発明1020の方法。
[本発明1036]
誘導細胞集団の細胞のうちの25％以上がiHepである、本発明1035の方法。
[本発明1037]
工程（b）の前に、誘導細胞集団をiHepについて富化する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1038]
富化する工程が蛍光活性化細胞選別（FACS）を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
少なくとも1×104個のiHepが投与される、本発明1020の方法。
[本発明1040]
iHepが肝臓内に移植される、本発明1020の方法。
[本発明1041]
超音波ガイド下注射を用いてiHepが肝臓内に移植される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
個体が哺乳動物である、本発明1020の方法。
[本発明1043]
哺乳動物がヒトである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
ASCが、個体から単離されたASCである、本発明1020の方法。
[本発明1045]
工程（a）の前に、個体からASCを単離する工程をさらに含む、本発明1044の方法。