【手続補正書】
【提出日】平成29年3月31日(2017.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメア反復配列及び染色体のサブテロメア配列を増幅する方法であって、前記方法は：
ａ）以下によって核酸伸長産物を作製すること：
ｉ）二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列に伸長プライマーをハイブリダイズすることであって：
（１）二本鎖染色体ＤＮＡは、テロメア反復配列を含むテロメア領域及びサブテロメア配列を含むサブテロメア領域を有し；及び
（２）伸長プライマーは：
（Ａ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分及び
（Ｂ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分
を含む、前記ハイブリダイズすること；及び
ｉｉ）時間が限られた伸長反応を行って二本鎖染色体ＤＮＡのサブテロメア領域の方へ伸長プライマーを伸張することであって、伸長反応は、予め定められた長さの範囲内でテロメア領域を有する二本鎖染色体ＤＮＡのみからのテロメア反復配列及びサブテロメア配列の両方を含む伸長産物を産生するように調節される、前記伸長すること；及び
ｂ）伸長産物の配列を増幅すること、
を含み；これによりテロメア反復配列及びサブテロメア配列を有する核酸を含む長さの限られた増幅産物を産生する、前記方法。
【請求項２】
配列は：
（１）アニーリング条件下で伸長産物におけるサブテロメア領域に独特の配列にハイブリダイズする第１の増幅プライマー；及び
（２）アニーリング条件下でアンカー配列にハイブリダイズする第２の増幅プライマー、
を使用して増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の増幅プライマーは、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］、５’−ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡ−３’［配列番号：１０］（染色体１）、５’−ＧＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＡＣ−３’［配列番号：１１］（染色体５）または５’−ＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＣＣ−３’［配列番号：１２］（染色体９）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の増幅プライマーは、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］を含み、及び第２のプライマーは、配列５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣ−３’［配列番号：８］を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
増幅されたテロメア産物の長さ範囲は、ＰＣＲ反応において時間が限られた伸長時間を使用して決定することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対照配列を同時増幅することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対照配列は、複数の非テロメア反復配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
短いテロメアの存在量を決定するための方法であって：
ａ）被験体から３’オーバーハングを含む二本鎖染色体ＤＮＡを含む試料を得ること；
ｂ）請求項１の方法を使用して二本鎖染色体ＤＮＡから長さの限られた増幅産物を産生すること；及び
ｃ）長さの限られた増幅された産物から短いテロメアの存在量を決定すること、
を含む前記方法。
【請求項９】
ｄ）試料からの総テロメアの存在量の測定と短いテロメアの存在量を比較することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）は、総テロメアの存在量の関数として短いテロメアの存在量を決定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
短いテロメアの存在量を決定することは、ｑＰＣＲを使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ｑＰＣＲは、第１及び第２のプライマーを使用して行われ、
ｉ）前記第１のプライマーは、第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、及び前記第２のプライマーは、第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、
ｉｉ）前記ハイブリダイズしたプライマーは、これらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしたときに、プライマー伸長ができる、及び前記第１のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第１のプライマーが前記第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、前記第１のプライマーと前記反復単位のヌクレオチドとの間に内部塩基対ミスマッチを生じ、
ｉｉｉ）前記第１のプライマーは、また第１及び第２のプライマーが互いにハイブリダイズするときに、前記第２のプライマーの３’末端ヌクレオチドとミスマッチを生じ、
ｉｖ）前記第２のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第２のプライマーが前記第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、前記第２のプライマーと前記反復単位のヌクレオチドとの間の内部塩基対ミスマッチを生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
短いテロメアの存在量を決定することは、サザンブロット、ドットブロット法、スロットブロット、免疫化学、核酸シーケンシング、またはデジタルＰＣＲによって試料における平均テロメア長を測定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
短いテロメアの存在量は、存在量比の測定である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
総テロメアの存在量は、ゲノム参照配列の存在量に相対的に測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ゲノム参照配列は、単一コピー参照核酸配列または非テロメア反復ＤＮＡ配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
単一のコピー参照核酸配列は、ヒトβ‐グロビンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非テロメア反復ＤＮＡ配列は、Ａｌｕ反復配列または動原体性反復配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）被験体から試料を得ること；
ｂ）請求項８〜９および１０〜１６に記載のいずれかの方法を使用して短いテロメアの存在量を決定すること；及び
ｃ）短いテロメアの存在量を状態または疾患と関連づけること、
を含む、方法。
【請求項２０】
短いテロメアの存在量の測定は、試料からの総テロメアの存在量と短いテロメアの存在量を比較して決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
症状または疾患は、死亡リスクである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
テロメアの存在量は、絶対存在量である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
絶対存在量は、テロメア配列の長さとして測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
症状または疾患は、疾患のリスクである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
疾患のリスクは、年齢に関連した疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
年齢に関連した疾患は、心臓血管疾患であり；及び集団における平均より低い測定は、心臓血管疾患のリスクの増加を関連づけられる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
関連に基づいた診断または予後を被験体に提供することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
関連に基づいた被験体を治療することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）被験体から複数の試料を得ることであって；試料は、期間にわたって採取され；及びそれぞれの試料は、異なる時に得られる、前記得ること；
ｂ）請求項８〜９および１０〜１６に記載のいずれかの方法を使用してそれぞれの複数の試料における短いテロメアの存在量を決定すること；
ｃ）短いテロメアの存在量の測定における増減率を決定すること；及び
ｄ）（１）健康の測定；（２）病態のリスク；（３）テロメア疾患または（４）薬物応答性と増減率を関連づけること、
を含む、方法。
【請求項３０】
短いテロメアの存在量は、短いテロメアの存在量を試料からの総テロメアの存在量と比較することによって決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（１）（Ａ）アニーリング条件下で二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分、及び
（Ｂ）染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域における配列に、またはサブテロメア領域における配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分、
を含む第１の増幅プライマー；及び
（２）アニーリング条件下でサブテロメア配列にハイブリダイズする第２の増幅プライマー、
を含む、キット。
【請求項３２】
（３）アニーリング条件下でアンカー配列の相補物にハイブリダイズする第３の増幅プライマー、
をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
（３）短いテロメアの測定のハイブリダイゼーション、伸長、増幅及び定量化工程を実施する試薬、
をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
（３）公知のテロメア長をもつ染色体ＤＮＡを含む対照試料及び参照試料、
をさらに含む、請求項３１に記載のキット。