【手続補正書】
【提出日】平成29年5月17日(2017.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C-Cケモカイン受容体5型遺伝子（CCR5）内のターゲット核酸配列を開裂する変異体が得られるように突然変異が導入されている、I-OnuIまたはI-OnuIホモログ。
【請求項２】
ターゲット核酸配列SEQ ID NO:5を開裂する、請求項1記載の変異体。
【請求項３】
SEQ ID NO:2に関して19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、240からなる群より選択される位置に、少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個、さらにより好ましくは少なくとも25個のアミノ酸置換を含む、請求項1または2記載の変異体。
【請求項４】
DNA認識界面と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の変異体。
【請求項５】
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるタンパク質配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の変異体。
【請求項６】
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID N0:31のタンパク質配列と、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも97％、およびより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の変異体。
【請求項７】
核酸結合ドメイン、触媒ドメイン、末端エピトープタグ、および蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの追加タンパク質ドメインに融合された請求項1〜6のいずれか一項記載のI-OnuI変異体またはI-OnuIホモログ変異体のDNA認識界面を含む、キメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項８】
追加タンパク質ドメインがTALEおよびジンクフィンガードメインからなる群より選択される核酸結合ドメインである、請求項7記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項９】
SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:33からなる群より選択されるMegaTAL CCR5_S08タンパク質配列である、請求項8記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項１０】
追加タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有する、請求項7または9記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項１１】
触媒ドメインが、5'-3'エキソヌクレアーゼ、より好ましくはTrex2、およびより好ましくは一本鎖Trex2である、請求項10記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項１２】
追加タンパク質ドメインがペプチドリンカーによってI-OnuI変異体に融合されている、請求項7〜11のいずれか一項記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項記載のI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項1〜12のいずれか一項記載のI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼを細胞内に導入する工程を含む、細胞内のCCR5遺伝子を修飾するための方法。
【請求項１６】
DNA末端プロセシング酵素を細胞に導入することによって突然変異誘発を増加させる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
DNA末端プロセシング酵素が、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む同じベクターによってコードされるトランスジーンとして、I-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼと共に細胞に導入される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
DNA末端プロセシング酵素が3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項16または17記載の方法。
【請求項１９】
DNA末端プロセシング酵素がTREX2である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
DNA末端プロセシング酵素が一本鎖TREX2ポリペプチドである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
レアカッターエンドヌクレアーゼの核酸開裂部位の周囲にあるCCR5遺伝子の少なくとも1つの領域とホモロジーを共有する少なくとも1つの配列が隣接している導入されるべき配列を含むドナーマトリックスを導入する工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、T細胞、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞、またはCD34+細胞である、請求項17〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
細胞を含む、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染を処置または防止するための医薬であって、該細胞が、請求項1〜12のいずれか一項記載のI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼを該細胞内に導入することによって修飾されたCCR5受容体をコードする遺伝子を含む、医薬。
【請求項２４】
前記細胞が、T細胞、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞、またはCD34+細胞である、請求項23記載の医薬。
【請求項２５】
請求項14記載のベクターを含む、対象におけるHIV感染を処置または防止するための医薬。
【請求項２６】
請求項15〜22のいずれか一項記載の方法によって不活性化されたCCR5タンパク質をコードする遺伝子を含む、単離された細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
特定の局面では、CCR5遺伝子中の異なるDNA配列を標的にする試みとして、いくつかのI-OnuI変異体を作出した。さらなる局面では、CCR5遺伝子の第6膜貫通ヘリックスと最後の細胞外ループとの境界を標的とする新しいLHE変異体を提供する。これらの特定I-OnuI変異体は、意外にも、以前のものと比較して、T細胞におけるCCR5の発現の妨害に、はるかに高い効率を示すと共に、それらが引き起こす細胞毒性は、はるかに低かった。次に、さらなる局面では、改良された特性、とりわけ初代ヒト細胞を処置するための安全で有用な試薬を得るために要求される特異性および効率の増加を同様に示すキメラエンドヌクレアーゼが形成されるように、本発明のこれら特定変異体をいくつかの改変核酸結合ドメインに融合した。これらの分子は、CCR5遺伝子座におけるゲノム編集に関する効率が実証されており、HIV感染を処置するための方法に役立つであろう。
[本発明1001]
C-Cケモカイン受容体5型遺伝子（CCR5）内のターゲット核酸配列を開裂する変異体が得られるように突然変異が導入されている、I-OnuIまたはI-OnuIホモログ。
[本発明1002]
ターゲット核酸配列SEQ ID NO:5を開裂する、本発明1001の変異体。
[本発明1003]
SEQ ID NO:2に関して19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、240からなる群より選択される位置に、少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個、さらにより好ましくは少なくとも25個のアミノ酸置換を含む、本発明1001または1002の変異体。
[本発明1004]
DNA認識界面と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する、本発明1001〜1003のいずれかの変異体。
[本発明1005]
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:31からなる群より選択されるタンパク質配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの変異体。
[本発明1006]
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID N0:31のタンパク質配列と、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも97％、およびより好ましくは99％を有する、本発明1001〜1003のいずれかの変異体。
[本発明1007]
核酸結合ドメイン、触媒ドメイン、末端エピトープタグ、および蛍光タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの追加タンパク質ドメインに融合された本発明1001〜1006のいずれかのI-OnuI変異体またはI-OnuIホモログ変異体のDNA認識界面を含む、キメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1008]
追加タンパク質ドメインがTALEおよびジンクフィンガードメインからなる群より選択される核酸結合ドメインである、本発明1007のキメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1009]
SEQ ID NO:25およびSEQ ID NO:33からなる群より選択されるMegaTAL CCR5_S08タンパク質配列である、本発明1008のキメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1010]
追加タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、リコンビナーゼ活性からなる群より選択される触媒活性を有する、本発明1007または1009のキメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1011]
触媒ドメインが、5'-3'エキソヌクレアーゼ、より好ましくはTrex2、およびより好ましくは一本鎖Trex2である、本発明1010のキメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1012]
追加タンパク質ドメインがペプチドリンカーによってI-OnuI変異体に融合されている、本発明1007〜1011のいずれかのキメラエンドヌクレアーゼ。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかのI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1014]
本発明1013のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1015]
本発明1001〜1012のいずれかのI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼを細胞内に導入する工程を含む、細胞内のCCR5遺伝子を修飾するための方法。
[本発明1016]
DNA末端プロセシング酵素を細胞に導入することによって突然変異誘発を増加させる、本発明1015の方法。
[本発明1017]
DNA末端プロセシング酵素が、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む同じベクターによってコードされるトランスジーンとして、Onu-I変異体またはキメラエンドヌクレアーゼと共に細胞に導入される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
DNA末端プロセシング酵素が3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
DNA末端プロセシング酵素がTREX2である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
DNA末端プロセシング酵素が一本鎖TREX2ポリペプチドである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
レアカッターエンドヌクレアーゼの核酸開裂部位の周囲にあるCCR5遺伝子の少なくとも1つの領域とホモロジーを共有する少なくとも1つの配列が隣接している導入されるべき配列を含むドナーマトリックスを導入する工程を含む、本発明1015の方法。
[本発明1022]
（a）本発明1001〜1012のいずれかのI-OnuI変異体またはキメラエンドヌクレアーゼを細胞内に導入することによって、該細胞内のCCR5受容体をコードする遺伝子を修飾する工程、および
（b）該細胞を対象に投与する工程
を含む、対象におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染を処置または防止するための方法。
[本発明1023]
前記細胞が、T細胞、造血幹細胞、リンパ球前駆細胞、またはCD34+細胞である、本発明1017〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
本発明1014のベクターを対象に投与する工程を含む、対象におけるHIV感染を処置または防止するための方法。
[本発明1025]
本発明1015〜1022のいずれかの方法によって不活性化されたCCR5タンパク質をコードする遺伝子を含む、単離された細胞。