【手続補正書】
【提出日】平成29年11月14日(2017.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法であって、前記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第１のＬ−核酸と前記１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、前記酵素活性が、前記第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ―ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、前記配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
【請求項２】
Ｌ−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法であって、前記変異酵素活性提示部分が、前記標的Ｌ−核酸を増幅することができ、
前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
【請求項３】
（ｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の以下のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のうちのいずれか１つで、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換され、ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記変異酵素活性提示部分が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含み、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位であり、好ましくは前記変異酵素活性が温度安定性ポリメラーゼ活性である、請求項１および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、前記変異酵素活性が、第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
タンパク質。
【請求項９】
（ｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換され、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換され、ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記変異酵素活性提示部分が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含み、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
請求項８から９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位であり、好ましくは前記変異酵素活性が温度安定性ポリメラーゼ活性である、請求項８および１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、
前記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、好ましくは前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記野生型のポリメラーゼが、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
ポリメラーゼの変異体。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換され、ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
請求項１３に記載のポリメラーゼの変異体。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼの変異体が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含み、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
請求項１３から１４のいずれか１項に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項１６】
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
請求項１３に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項１７】
Ｌ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【請求項１８】
Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【請求項１９】
Ｌ−核酸分子に結合する標的分子の同定のための方法であって、以下の、
（ａ）Ｌ−核酸分子の異種性の集合を作製するステップと、
（ｂ）前記標的分子と、ステップ（ａ）のＬ−核酸分子の異種性の集合を接触させるステップと、
（ｃ）前記標的分子により結合されていないＬ−核酸分子を分離するステップと、
（ｄ）前記標的分子により結合されたＬ−核酸分子を増殖するステップであって、前記増殖ステップがタンパク質を使用しており、前記タンパク質が、請求項８〜１２のいずれか１つに記載のタンパク質である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
タンパク質を生成する方法であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ―アミノ酸であり、
（ａ）前記タンパク質の２つ以上のフラグメントが化学的に合成されており、これにより前記フラグメントが全体で、前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくは前記フラグメントが、固相ペプチド合成により合成されており、
（ｂ）ステップ（ａ）のフラグメントが、セグメントの縮合、天然の化学的なライゲーション、酵素的なライゲーション、またはその組み合わせにより互いに結合しており、
前記タンパク質が、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質である、
方法。