【手続補正書】
【提出日】平成29年3月15日(2017.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的抗体を発現するＢ細胞の同定方法であって、
（ｉ）目的の抗原で免疫にした宿主または自然感染した宿主からＢ細胞を取得すること；
（ｉｉ）目的の抗原に結合する抗体を産生するＢ細胞を、濃縮前のＢ細胞画分に比べてより高い割合で含有する、抗原特異的Ｂ細胞の濃縮集団を得るために、前記Ｂ細胞の画分を濃縮すること；
（ｉｉｉ）前記濃縮抗原特異的Ｂ細胞集団から得た１つ以上の画分を、目的の抗原に結合する単一の抗体を産生するクローン性Ｂ細胞集団の形成に有利な培養条件下で個別に培養すること；
（ｉｖ）目的の抗原に結合する単一の抗体を産生する、前記クローン性Ｂ細胞集団を検出し、これにより１つ以上の抗原特異的Ｂ細胞を同定すること；
（ｖ）任意で、少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、前記工程（ｉｖ）にて同定されたクローン性抗原特異的Ｂ細胞集団をスクリーニングすること；
（ｖｉ）任意で、異なるクローン性Ｂ細胞培養物から得た抗原特異的Ｂ細胞をプールすること；
（ｖｉｉ）前記工程（ｉｖ）または任意の工程（ｖ）もしくは任意の工程（ｖｉ）を経て得た抗原特異的Ｂ細胞を、染色後のＢ細胞の陽性及び／または陰性の選択を容易にする少なくとも１つの標識で染色すること；ならびに
（ｖｉｉｉ）前記染色した抗原特異的Ｂ細胞を分取し、任意で、前記分取した染色Ｂ細胞をゲーティングして、単一の抗原特異的Ｂ細胞を単離すること；
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
（ｉｘ）前記分取したＢ細胞によって発現される抗原特異的抗体の可変配列の増幅を容易にする、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の反応媒体に、前記分取したＢ細胞を入れること（この場合、任意で、工程（ｘｉ）が酵母、細菌、植物、昆虫、両生類または哺乳類の細胞、二倍体酵母、ピキア種またはピキア・パストリスなどの組換え細胞中で発現させることを含む）；
（ｘ）前記増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸の配列を決定すること；
（ｘｉ）前記増幅させた抗原特異的抗体の可変配列をコードする核酸またはその変異体を発現させ、抗体ポリペプチドを作製すること；及び
（ｘｉｉ）前記発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定し、任意で、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、蛍光免疫測定法、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））分析、またはＥＬＩＳＡのような他の抗原結合法を使用して、前記発現させた抗体ポリペプチドのうち目的の抗原に結合する抗体ポリペプチドを決定すること；
によって、可変軽鎖領域及び／または可変重鎖領域をコードする、抗原特異的抗体の可変配列をクローニングすることをさらに含み、
ここで任意に前記宿主はモルモット、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトであるか、またはここで前記宿主がウサギであり、
工程（ｉ）が脾臓、リンパ節、骨髄、末梢血単核細胞及び血液から選択される少なくとも１つの供給源からＢ細胞を採取することを含む、および／または、工程（ｉ）が、脾臓、リンパ節、骨髄、末梢血単核細胞及び血液から選択される２つ以上の供給源からＢ細胞を採取し、２つ以上の供給源の前記Ｂ細胞をプールすることを含み、および／または
当該方法は前記宿主から得た血清中に存在する抗原特異的抗体及び／または中和抗体の力価を確立することを含む、
前記方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
（ａ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、固体マトリックスまたは担体に直接的または間接的に付着させた抗原を用いる抗原特異的Ｂ細胞のアフィニティー精製を含み、任意で、前記固体マトリックスが磁気ビーズを含み、任意で、前記固体マトリックスがカラムを含み、かつ／または任意で、前記固体マトリックスもしくは前記担体に直接的もしくは間接的に付着させた前記抗原がビオチン化しており、ストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートロアビジンを介して前記マトリックスもしくは前記担体に付着しており；
（ｂ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、（１）Ｂ細胞とビオチン標識抗原を合わせること、（２）任意で、前記Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物を洗浄すること、（３）前記（１）または（２）のＢ細胞／ビオチン標識抗原の構成物にストレプトアビジンビーズを導入すること、（４）前記ストレプトアビジンビーズ／Ｂ細胞／ビオチン標識抗原の構成物をカラムに通すこと、及び（５）前記カラムを洗浄して、前記結合したＢ細胞を前記カラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること、を含み；
（ｃ）前記濃縮工程（ｉｉ）が、（１）ビオチン標識抗原とストレプトアビジンビーズを合わせること、（２）前記ビオチン標識抗原／ストレプトアビジンビーズの構成物をカラムに通すこと、（３）前記カラムを洗浄して、ビオチン標識抗原で被覆したビーズを前記カラムから溶出させること、（４）Ｂ細胞と前記被覆ビーズを合わせること、（５）前記Ｂ細胞と被覆ビーズの混合物をカラムに通すこと、及び（６）前記カラムを洗浄して、前記結合したＢ細胞を前記カラムから溶出させ、これにより、濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団を得ること、を含み；あるいは、
（ｄ）前記濃縮法（ａ）、（ｂ）及び／もしくは（ｃ）または前記濃縮法の組み合わせを少なくとも１回繰り返すことにより、さらに濃縮された抗原特異的Ｂ細胞集団となる；
ここで、前記濃縮工程（ｉｉ）により、抗原特異的Ｂ細胞の割合が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、もしくは少なくとも１０，０００倍に高まり、かつ／または前記濃縮Ｂ細胞集団中の抗原特異的Ｂ細胞の割合が少なくとも１％、５％もしくは１０％である、前記方法。
【請求項４】
前記濃縮抗原特異的Ｂ細胞が、工程（ｉｉｉ）にて、フィーダー細胞を含む培地中で培養され、任意で、
（ａ）前記フィーダー細胞が照射済みＥＬ４細胞であり；
（ｂ）前記培養培地が活性化Ｔ細胞の馴化培地を含み；
（ｃ）前記濃縮Ｂ細胞が約１％〜約５％の活性化ウサギＴ細胞の馴化培地を含有する培地で培養され；
ここで任意で、前記培養が少なくとも約１〜９日、２〜８日、３〜７日、４〜６日もしくは５〜７日間行われ、または任意で、前記培養が約５〜７日間実施される、および／または、
前記濃縮Ｂ細胞をマルチウェルプレートで培養し、各ウェルが少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００個の濃縮Ｂ細胞を含有し；そして任意で、
（ａ）前記濃縮Ｂ細胞をマルチウェルプレートで培養し、各ウェルが約５０〜約１００個の濃縮Ｂ細胞を含有し；
（ｂ）前記濃縮Ｂ細胞をマルチウェルプレートで培養し、各ウェルが約２５〜約５０個の濃縮Ｂ細胞を含有し；
（ｃ）前記濃縮Ｂ細胞をマルチウェルプレートで培養し、各ウェルが約１０〜約２５個の濃縮Ｂ細胞を含有し；または
（ｄ）前記濃縮Ｂ細胞をマルチウェルプレートで培養し、各ウェルが約１〜約２００個の濃縮抗原特異的Ｂ細胞を含有し、これらを照射済みＥＬ４細胞及びＴ細胞上清（ＴＳＮ）とマルチウェルプレートの各ウェル中で混合する；および／または
前記抗原認識検出工程（ｉｖ）が、抗原反応性上清を含むマルチウェルプレートの個々のウェルを特定するために、前記培養した濃縮Ｂ細胞から上清を取り、前記上清を評価することによって、抗原特異的Ｂ細胞を含有するウェルを検出することを含み、ここで任意で、
（ａ）前記上清をＥＬＩＳＡによって評価し；
（ｂ）前記濃縮Ｂ細胞を約２〜約７日間培養した後の抗原特異的ＩｇＧの産生及び総ＩｇＧ産生量について前記上清を評価し；
（ｃ）（１）抗種Ｆａｂでプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清を前記プレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧを用いて上記上清中の総ＩｇＧを検出することによって、総ＩｇＧ産生量について前記上清を評価し、任意で、前記抗種Ｆａｂが抗ウサギＦａｂで、抗種ＩｇＧが抗ウサギＩｇＧであり；かつ／または
（ｄ）（１）非標識抗原でプレートをコーティングすること、もしくはビオチン標識抗原でストレプトアビジンプレートをコーティングすること、（２）培養したＢ細胞から得た上清を前記プレートに添加すること、及び（３）抗種ＩｇＧを用いて上記上清中の抗原特異的ＩｇＧを検出することによって、抗原特異的ＩｇＧ産生について前記上清を評価し；ここで任意で、前記抗種ＩｇＧが抗ウサギＩｇＧであり；ここで任意で、マルチウェルプレート中の抗原特異的ウェルと総ＩｇＧウェルの比が、Ｂ細胞濃縮とクローン性とに相関する；
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記任意の機能活性スクリーニング工程（ｖ）が、少なくとも１つの所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有するウェルを特定するために、抗原特異的機能性アッセイを使用して抗原反応性上清を評価することを含み、任意で、
（ａ）前記任意の機能活性スクリーニング工程（ｖ）が、結合相手への抗原結合に対するアゴニスト作用もしくはアンタゴニスト作用、特定の標的細胞型の増殖の誘発もしくは阻害、標的細胞の溶解の誘発もしくは阻害、または抗原に関与する生物学的経路の誘発もしくは阻害を呈する抗原特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、前記工程（ｉｖ）で同定された抗原特異的Ｂ細胞をスクリーニングすることを含み、さらに任意で、
（ｂ）Ｔ１１６５細胞の増殖の誘発もしくは阻害、ＴＦ１細胞の増殖の誘発もしくは阻害、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるｃＡＭＰ産生の誘発もしくは阻害、またはＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用の阻害に関して、前記抗原特異的抗体をスクリーニングする、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）前記ＥＬＩＳＡスクリーニングによる抗原反応性上清を別のプレートに移し、凍結する；および／または
（ｂ）１つ以上の凍結及び保存工程が前記方法工程の１つ以上の間に存在し、任意で、凍結または保存媒体の添加を伴う；および／または
前記染色工程（ｖｉｉ）が陰性抗原特異的Ｂ選択方法を容易にし、任意で、前記陰性抗原特異的Ｂ選択方法がフローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な非ＥＬ４細胞を分取することを含み、任意で、前記陰性抗原特異的Ｂ選択が、Ｔｈｙ１．２に特異的な標識抗体などの照射済みＥＬ４細胞を染色する第１の標識と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの生存不能細胞を染色する第２の標識とでＢ細胞を染色することによって行われる、および／または
前記染色工程（ｖｉｉ）が陽性抗原特異的Ｂ選択方法を容易にし、任意で、前記陽性抗原特異的Ｂ選択方法がフローサイトメトリーを使用して、すべての生存可能な種特異的Ｂ細胞を分取することを含み；任意で、前記陽性抗原特異的Ｂ選択が、抗ウサギＩｇＧなどの種ＩｇＧに特異的な標識抗体などの種特異的Ｂ細胞を染色する第１の標識と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの生存不能細胞を染色する第２の標識とでＢ細胞を染色することによって行われる、および／または
前記任意のゲーティング工程（ｖｉｉｉ）が、別個の物理学的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する、分取後の生存可能な非ＥＬ４細胞を選択することを含む、および／または
フローサイトメトリーが、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または免疫磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて実施される、および／または
前記分取工程（ｖｉｉｉ）が、前記細胞をＲＴ−ＰＣＲ反応媒体に直接分取することを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び細胞分取の前に合わせるか、または（ｂ）類似の親和性及び／もしくは所望の機能特性を有する抗原特異的抗体を分泌する抗原特異的Ｂ細胞を含有する異なる個々のウェルを染色及び分取の前に合わせる；ここで任意で、
（ｉ）約２〜約１０個の異なる個々のウェルから得た抗原特異的Ｂ細胞を合わせ；
（ｉｉ）約１０〜約５０個の異なる個々のウェルから得た抗原特異的Ｂ細胞を合わせ；または
（ｉｉｉ）約５０〜約１５０個の異なる個々のウェルから得た抗原特異的Ｂ細胞を合わせる；
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）が、免疫付与から約２０〜約９０日後、たとえば免疫付与から約５０〜６０日後に、前記宿主からＢ細胞を取得することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記任意のゲーティング工程が、未染色細胞の自家蛍光に基づいてゲートを設けることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜１９のいずれか一項の方法に従って作製された、別個の物理的性質（ＦＳＣ／ＳＳＣ集団）を有する生存可能な非ＥＬ４細胞を主に含む分取集団であって、任意で前記集団が生存可能な種特異的Ｂ細胞を含む、分取集団。
【請求項１１】
Ｔｈｙ１．２に特異的な標識抗体などの照射済みＥＬ４細胞を染色する第１の標識と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの生存不能細胞を染色する第２の標識とでＢ細胞を染色することによって行う陰性抗原特異的Ｂ選択を用いて、フローサイトメトリーによって取得する、請求項１０に記載の細胞の分取集団。
【請求項１２】
ウサギＩｇＧに特異的な標識抗体などの種特異的Ｂ細胞を染色する第１の標識と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの生存不能細胞を染色する第２の標識とで染色することによって行う陽性抗原特異的Ｂ選択を用いて、フローサイトメトリーによって取得する、請求項１０に記載の分取集団。
【請求項１３】
腫瘍抗原、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、神経伝達物質、ＰＣＳＫ９またはＩＬ−６などのヒト抗原に特異的なＢ細胞を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の分取集団。