【手続補正書】
【提出日】平成29年3月6日(2017.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．対象からの樹状細胞の集団であって、前記同じ対象からの卵巣癌癌幹細胞（ＯＶ−ＣＳＣ）を含む卵巣癌細胞を含む卵巣腫瘍サンプル由来の卵巣癌特異的ペプチドを含む、前記樹状細胞の集団、を含む免疫原組成物であって、
前記癌幹細胞集団が少なくとも５０％癌幹細胞であり、
卵巣腫瘍サンプル由来の前記ＯＶ−ＣＳＣは無血清培地中でin vitroで培養された場合にスフェロイドを形成することによって特徴づけられ、
前記癌幹細胞の少なくとも８０％が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ１１７、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、サイトケラチン８（ＣＫ８），α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｋｉ−６７、Ｎａｎｏｇ、Ｎ−カドヘリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ; ＣＤ５６）、Ｏｃｔ３／４、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）／Ｓｎａｉｌ（ＳＮＡＩ１）（Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ）、Ｔｗｉｓｔ、ビメンチン、癌抗原−１２５（ＣＡ−１２５）、細胞表面ムチン１細胞（ＭＵＣ−１）、ヒト精巣上体タンパク質（Ｈｅ−４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、形質転換増殖因子β受容体（ＴＧＦβＲ）、Ｓｏｘ２、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、ネスチン、および腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）からなる群より選ばれる１以上のバイオマーカーを発現する、
前記免疫原性組成物。
【請求項２】
卵巣癌癌幹細胞（ＯＶ−ＣＳＣ）由来の卵巣癌特異的ペプチドが、
ａ．細胞抽出物、または、
ｂ．細胞溶解物、または、
ｃ．インタクト癌幹細胞、
の形態である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
インタクトＯＶ−ＣＳＣが
ａ．照射する、または、
ｂ・ＯＶ−ＣＳＣを核架橋剤に曝露する、
ことによって非増殖性にされているが、依然として代謝的に活性である、
請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
アジュバントが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＯＶ−ＣＳＣが、
ａ．ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドであって、前記ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４およびＫｉ−６７の２以上を発現する、
ｂ．初期ＯＶ−ＣＳＣであって、前記初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７およびＫｉ−６７の２以上を発現する、
ｃ．混合型ＯＶ−ＣＳＣであって前記混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８およびＫｉ−６７の２以上を発現する、または、
ｄ．上皮間葉転換（ＥＭＴ）−ＯＶ−ＣＳＣであって、前記ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｓ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４およびＴｗｉｓｔの２以上を発現する、
請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
卵巣癌の治療のための請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
卵巣癌癌幹細胞（ＯＶ−ＣＳＣ）集団を調製するための方法であって、
ａ．卵巣腫瘍のサンプルを取得し、
ｂ．前記腫瘍サンプルを機械的に解離させ、
ｃ．前記腫瘍サンプルを酵素的に単一細胞懸濁物へ解離させ、
ｄ．前記細胞懸濁物を非接着性基質上の所定の培地で培養して、増殖中のＯＶ−ＣＳＣスフェロイド株を作製することであって、前記所定の培地が無血清であり、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、前記ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団中の少なくとも８０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４およびＫｉ−６７の２種類以上を発現し、
ｅ．分別的重力によって前記ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを沈降させ、
ｆ．ｅ．のＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを解離させ、ｄ．の所定の培地へ移し、ｄ．の培地中で接着性条件下でin vitroで培養してＯＶ−ＣＳＣ集団を増殖および拡大させることであって、前記ＯＶ−ＣＳＣ集団が、初期ＯＶ−ＣＳＣ亜集団、混合型ＯＶ−ＣＳＣ亜集団および上皮間葉転換（ＥＭＴ）−ＯＶ−ＣＳＣ亜集団を含む、
、上記方法。
【請求項９】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アクチビンＡ、ＦＧＦおよび無血清培地の存在下で培養した場合に初期ＯＶ−ＣＳＣ集団が生成される、請求項８記載の方法であって、
ａ．前記初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７およびＫｉ−６７２種類以上を発現する：または、
ｂ．前記初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７およびＫｉ−６７２種類以上を発現する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＧＦ、ＥＧＦおよび血清含有増殖培地の存在下で培養した場合、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団が生成され、前記混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＧＦを含む血清含有培地で培養した場合、ＥＭＴ癌幹細胞が生成される請求項８記載の方法であって、
ａ．前記ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４およびＴｗｉｓｔの２種以上を発現する、または、
ｂ．前記ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらに、バイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種以上を発現する、または、
ｃ．ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、または、
ｂ．混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａ、およびＡＢＣＧ２の２種類以上を発現する、または、
ｃ．ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％が、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の１種類以上を発現する、または、
ｂ．初期ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７およびＫｉ−６７の１種類以上を発現する、または、
ｃ．混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａ、およびＡＢＣＧ２の２種類以上を発現する、または、
ｄ．ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種類以上を発現する、または、
ｅ．ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
所定の培地が、
ａ．表２に記載されたいずれかの培地である、
ｂ．表２および表３の組み合わせから得るいずれかの培地である
ｃ．表２、表３、および表４の組み合わせから得るいずれかの培地である、または、
ｄ．表２および表４の組み合わせから得るいずれかの培地である、
請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
増殖因子が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、またはアクチビンＡの１種類以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦが塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所定の培地にアクチビンまたは抗酸化剤が添加されていない、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
所定の培地にＯＶ-ＣＳＣの自発的分化を防ぐのに効果的な量でアクチビンＡ作用剤が添加されている、または、アクチビンＡ拮抗剤が添加されている、またはグルタチオンが添加されている、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
アクチビンＡ拮抗剤がホリスタチン、またはアクチビンＡと特異的に結合する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
付着性基材が、ＲＧＤトリペプチドモチーフが豊富なタンパク質でコーティングされた表面を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
卵巣癌に対する免疫反応を刺激するための、請求項１に記載の免疫原性組成物であって、前記免疫応答が、
（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、
（ii）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、および、
（iii）Ｂ細胞応答、
の１以上である、前記免疫原性組成物。