(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミド中に、消耗性ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロン、および、強発現誘導性プロモーターを有する遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトを有し、消耗性ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロンが、プロモーターとして発現誘導性の低いプロモーターを使用し、かつ該プロモーターの配列とネオマイシントランスフェラーゼ遺伝子翻訳領域との間にアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも１組含んでなる挿入配列を有するものである、哺乳動物宿主細胞において遺伝子組換タンパク質の高生産性を誘導する発現ベクター。
【請求項２】
消耗性ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロンおよびマルチクローニングサイトが、消耗性ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロンの転写方向において、消耗性ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロン、マルチクローニングサイトの順に位置している請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
消耗性ネオマシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロンが、トリプレットの構成単位としての開始位置がネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子の翻訳領域開始位置と対応するアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも一組含んでなる挿入配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
消耗性ネオマシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子シストロンが、トリプレットの構成単位としての開始位置がネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子翻訳領域開始位置に対応するか、または１塩基もしくは２塩基ずれた位置にあるアミノ酸配列をコードできる配列のうち少なくとも２種類の配列を含んでなる挿入配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
該挿入配列が人為的に合成されたリンカーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
該挿入配列が自然に存在する配列に由来するものであるか、またはそれを改変したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
該挿入配列の少なくとも一部がトランスポゾン配列に由来することを特徴とする請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
発現誘導性の低いプロモーターとして、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーターを由来とするもの、哺乳動物には通常感染し難いウイルス抗原のもつプロモーター、またはそのいずれかのプロモーターからエンハンサー部分を除去したものを使用することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
タンパク質遺伝子を組み込んだ請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、G418耐性細胞クローンであるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法。
【請求項１０】
該プラスミド中に、プロモーターとして、発現誘導性の低いプロモーターを使用したジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子シストロンを有し、哺乳動物宿主細胞としてジヒドロ葉酸還元酵素欠損CHO細胞を用い、該プラスミドの遺伝子の該宿主細胞への遺伝子導入後にメトトレキセートによる該プラスミドの遺伝子の効率的な増幅を可能にする請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子シストロンの発現誘導性の低いプロモーターとして、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーターを由来とするもの、哺乳動物には通常感染し難いウイルス抗原のもつプロモーター、またはそのいずれかのプロモーターからエンハンサー部分を除去したものを使用することを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
タンパク質遺伝子を組み込んだ請求項１０または１１に記載の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法。
【請求項１３】
タンパク質遺伝子を組み込んだ請求項１〜８、１０および１１のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させ、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に高水準のタンパク質生産をすることのできるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞を宿主として高水準に遺伝子組換タンパク質生産を可能にする哺乳動物細胞用発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、特に、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換では活性が得られ難いタンパク質の生産に適する。
【０００２】
【従来の技術】
組換タンパク質生産に用いる発現ベクターは数多く開発されており、とくに大腸菌や酵母などの微生物を宿主とした発現系では高い収率が期待できる。しかしながら、これらの微生物を宿主とする発現系ではタンパク質の修飾に問題があったり、哺乳動物タンパク質に固有の特徴が失われたりすることがある。このため、例えば生物学的活性が糖鎖に依存するタンパク質の場合、哺乳動物細胞を宿主としてそのタンパク質を生産することが必要になる。こうした要請にも拘わらず、哺乳動物細胞を宿主とする組換タンパク質発現系の生産性は一般に低く、導入遺伝子の安定性にも問題がある場合が多い。
【０００３】
哺乳動物細胞を宿主とした組換タンパク質生産の事例は、組織性プラスミノーゲンアクチベータ（特開昭５９−１８３６９３号公報；ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年）、エリスロポイエティン（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，２５７頁，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４６５頁，１９８６年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，６７頁，１９８８年）、ＩＦＮ−γ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８０．４５６４頁，１９８３年）、ＩＦＮ−β（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３頁，１９９０年）などに見られる。また、モノクローナル抗体の遺伝子組換生産に関しても数多くの報告がある（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６９頁，１９９２年；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５，１９１頁，１９８９年；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１４５５頁，１９９２年）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
哺乳動物細胞を用いた組換タンパク質の生産性を上げることはタンパク質性医薬品や診断薬などの製造において非常に重要である。さらに、それらの開発研究にも有効な手段を与える。そのため、哺乳動物細胞とくにチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、効率的な遺伝子導入および高生産性の獲得を可能にする発現ベクターが求められている。
【０００５】
効率的な遺伝子導入とは、組換細胞全体に対して目的物質を有効に生産する細胞クローンの数が相対的に小さく、それにより高生産性クローンのセレクションが容易であること、一方目的とするタンパク質を産生する細胞のポピュレーションが小さいにも拘わらず高生産性クローンが出現する期待値が大きいことである。得られる細胞のポピュレーションが大きいとその分セレクションに時間と労力を要することになり効率が悪い。また潜在的に高い生産性をもつクローンを見落とす可能性も高い。
【０００６】
高生産性の獲得とは、遺伝子導入により得られた細胞クローンの組換タンパク質の生産レベルが高いことであり、これはおもに発現ベクターの性質、性能に由来すると考えられる。遺伝子発現のレベルは染色体上の位置により著しく異なることが見出されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，６７９頁，１９９０年）。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遺伝子導入により組み込まれる遺伝子のコピー数を大きくすることで高発現を達成するのではなく、宿主細胞染色体上の高発現位置にプラスミド遺伝子が組み込まれたものがネオマイシン耐性株として結果的にセレクトされる仕組みをもつ発現ベクターを開発した。遺伝子導入後のＧ４１８耐性株としての初期クローンの高生産性はネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（以下、ＮＥＯｒと記載する）遺伝子発現の仕組みに依存する。また、該発現ベクターはジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと記載する）遺伝子をもち、その発現誘導性を工夫することにより薬剤刺激により効率的な遺伝子増幅を可能にする発現ベクターを開発した。結果、高水準で安定的なタンパク質の産生を可能にする発現ベクターを作製でき、本発明を完成した。
【０００９】
導入されるＮＥＯｒ遺伝子の発現が起こらないかもしくは低すぎると、組換体である宿主細胞はネオマイシン（以下、Ｇ４１８で代表する）に対する耐性を獲得することができない。しかしながら本発明者らがこれまでに行った研究においては、市販のベクターを含みＮＥＯｒ遺伝子をもつ発現ベクターを用いたすべてのケースにおいて非常に多くのＧ４１８耐性株が得られた。このような結果に基づく限り、プラスミドから供与されたＮＥＯｒ遺伝子の発現は、トランスフェクションの結果得られた細胞が形質転換体であるかどうかの選択マーカーとしての役割以外には殆ど寄与していないと推定された。
【００１０】
本発明者らは、ＮＥＯｒ発現の仕組みをさらに制限的にすることにより、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンが宿主細胞染色体上の高発現位置に組み込まれない限りＧ４１８耐性獲得のために必要とするレベルのＮＥＯｒ発現が起こらないように設計した。すなわち、ＮＥＯｒ遺伝子の発現性を極めて劣化・減衰させたものにすることにより、組み込まれるプラスミド遺伝子が染色体上の極めて高い発現性をもつ位置に導入されない限り、形質転換体ではあっても培地中のＧ４１８セレクションに対して生存が困難であるようにした。発現ベクターのＮＥＯｒ遺伝子シストロンに弱いプロモーターを使用した報告はいくつかあるが（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：１２４６頁，１９８３年；  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年；  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７，１２９６頁，１９８７年；ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年）、これらの事例において高生産性の形質転換体が有効かつ十分に選択されているとは考え難い。
【００１１】
本発明は、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンの構成として、発現誘導性を低下させたプロモーターを使用し、かつ該プロモーターとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域との間にアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも１組含むことよりなるＤＮＡ配列を挿入（挿入配列）してもつこと、または、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞におけるＮＥＯｒの発現機構を著しく消耗させ減衰せしめる点においてこれと同等の構成をもつことにより、遺伝子導入により形質転換された宿主細胞におけるＮＥＯｒの発現機構を著しく消耗させ減衰せしめるものである。本発明の、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンはプロモーターを弱化しただけのものとは異なり、高発現位置へプラスミド遺伝子が導入されたＧ４１８耐性株を特異的に獲得できるよう導くことから、「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」と定義する。
【００１２】
すなわち、本発明は、プラスミド中に該消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンおよび強発現誘導性プロモーターを有する発現ベクターを提供する。当該ベクターは、哺乳動物宿主細胞において遺伝子組み換えタンパク質の高生産性を誘導する。
【００１３】
該「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」のプロモーターとしては、哺乳動物細胞では通常発現し難いタンパク質遺伝子のプロモーターを由来とするもの、哺乳動物には通常感染し難いウイルス抗原のもつプロモーター、またはそのいずれかのプロモーターからエンハンサーを除去したものを使用でき、より具体的には、ＣＨＯ細胞に対して通常非感染性であるＳＶ４０のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものか（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年）またはこれと同等に発現性の充分に低いプロモーターを使用することが好ましい。また、挿入配列は例えば”トリプレットの構成単位としての開始位置がＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始位置に対応するアミノ酸配列をコードし得る配列”を少なくとも１組含んでなる。該挿入配列として好ましくは”トリプレットの構成単位としての開始位置がＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域のものと１塩基または２塩基ずれた位置にあるアミノ酸配列をコードし得る配列”をも含み、そのうち少なくとも２種類を有することが望ましく、さらに好ましくはこれら３種類をすべて含んでなることが望ましい。該挿入配列としてのＤＮＡ配列には、こうした条件をもとに人為的に合成したリンカーを使用できるが、自然に存在する配列で条件に合致するものがあればそれを由来とするものまたはそれを改変したものを用いても良い。例えば、トランスポゾンＴｎ５（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４５，１０７頁，１９８１年）などのトランスポゾン配列中にはトリプレットの構成単位としてそれぞれ開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードし得る配列がすべて含まれており、その配列中の適当な領域を使用することにより該条件を満足するものを作製することが可能である。該挿入配列の長さは、ＮＥＯｒの発現を低下させるのに十分なものであればよく、アミノ酸配列をコードし得る配列が何組含まれているかによって変わるものであるが、通常には３０〜１０００塩基、好ましくは１００〜４００塩基である。また、ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始位置前後（具体的には（−６），（−３），（＋４））のコザック共通配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，８１９５頁，１９８７年）に該当する位置の塩基はピリミジン塩基であるか、またはピリミジン系塩基に改変されていることが望ましい。
【００１４】
プラスミドＤＮＡの宿主細胞染色体上の強発現性位置への組み込みはＮＥＯｒ遺伝子シストロンのもつ特性からＧ４１８セレクションにより結果的に達成されることになるが、染色体上の当該位置における目的タンパク質の発現自体は強力に誘導される必要がある。このため、タンパク質遺伝子を組み込むマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳと記載する）のプロモーターおよびポリアデニレーションシグナル（以下、ｐｏｌｙＡと称する）には最も強い発現誘導性をもつものの中から選択する。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルスＩｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ（ｈＣＭＶ  ＭＩＥ：Ｃｅｌｌ，４１，５２１頁，１９８５年）プロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８３１頁，１９８７年）、ｐｏｌｙＡシグナルにはウシ成長ホルモン由来のｐｏｌｙＡ配列（ＤＮＡ  ５，１１５頁，１９８６年）等があげられる。本明細書中ではこの目的とするタンパク質遺伝子を組み込むＭＣＳをもつシストロンを「ＭＣＳシストロン」と称する。
【００１５】
本発明は、また、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、Ｇ４１８耐性細胞クローンであるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００１６】
本発現ベクターは好ましくはまたＤＨＦＲ遺伝子シストロンを有する。このベクターは、哺乳動物宿主細胞としてジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞を用い、該プラスミドの遺伝子の該宿主細胞への遺伝子導入後にメトトレキセートによる該プラスミドの遺伝子の効率的な増幅を可能にする。
【００１７】
ＤＨＦＲ遺伝子シストロンにおいては、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンに使用するものと同様に発現誘導性を低下させたプロモーター、例えばＣＨＯ細胞に対して通常非感染性であるＳＶ４０のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものを用いる。より好ましくはＤＨＦＲ遺伝子翻訳領域開始位置前後のコザック共通配列に該当する位置の塩基がピリミジン塩基であるか、またはピリミジン系塩基に改変されていることが望ましい。遺伝子増幅を促進するためには、導入するＤＨＦＲ遺伝子に変異を導入することによりメトトレキセート（以下、ＭＴＸと記載する）への親和性を低下させる方法が知られている（特開昭５９−１９２０８９号公報）が、本発明者らはＤＨＦＲ遺伝子の発現誘導性を弱くするかまたは抑制的にしておくことにより、培地中に含まれるＭＴＸが宿主細胞染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの増幅を促すよう導く方がより効果的と考えた。
【００１８】
本発明は、また、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記ＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有する発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させることを含む、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００１９】
本発明は、さらに、タンパク質遺伝子を組み込んだ上記の発現ベクターを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させ、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に高水準のタンパク質生産をすることのできるタンパク質の高生産性形質転換体を得る方法を提供する。
【００２０】
本発明は、また、上記のＤＨＦＲ遺伝子シストロンおよび強発現誘導性プロモーターを有する遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトを有する発現ベクターを提供する。この発現ベクターは上記消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを有する発現ベクターの構築のために使用できる。
【００２１】
本発明において「発現誘導性の低いプロモーター」とは、タンパク質発現のために一般的に使用されているプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、βアクチンプロモーターなどにより誘導される場合に較べてタンパク質の発現が弱いプロモーターを意味している。「アミノ酸をコードし得る配列」とは、対応する開始コドンと終始コドンをもちその間にペプチドをコードできる遺伝子配列をもつものであって、好ましくは構成するアミノ酸の数が２０前後あるいはそれ以上あるのが望ましい。「シストロン」とは、プロモーター、構造遺伝子、ポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）を基本構成とする転写・翻訳によりタンパク質を発現する単位を意味するが、これらのいずれかに関連するかもしくは任意のＤＮＡ配列を挿入配列として含んでも良い。「強発現誘導性プロモーター」とは、通常の発現ベクターにおいて、タンパク質発現のために一般的に使用されているプロモーターを意味し、好ましくは、特に発現誘導性が高いヒトサイトメガロウイルスＭａｊｏｒ  Ｉｍｍｅｉｄａｔｅｌｙ−Ｅａｒｌｙ抗原プロモーター、β−アクチンプロモーターなどのプロモーターを意味する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明発現ベクターは、バックボーンベクター上に、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン、ＭＣＳシストロンを組み込むことによって、また、さらにＤＨＦＲ遺伝子シストロンを組み込むことによって得ることができる。バックボーンベクターとしての制限は特になく、例えば、大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクター（ｐＵＣ系：Ｇｅｎｅ，３３：１０３頁，１９８５年、ｐＢＲ３２２等：Ｇｅｎｅ，２２，２７７頁，１９８３年）が使用できる。
【００２３】
本発明のベクターの使用法として、タンパク質遺伝子を本発明のベクターのＭＣＳに組み込んだ後、リポフェクチン法またはエレクトロポーレーションにより宿主細胞に遺伝子導入を行い、Ｇ４１８に対する耐性だけでセレクションを行い、タンパク質の高生産性形質転換体を得る方法が挙げられる。セレクションで生存した細胞の多くは既に相対的に高い発現レベルを達成しているが、その中からさらに高い生産性をもつ細胞を選択するためタンパク質の発現レベルをアッセイしてもよい。得られた高生産性細胞はクローニングを繰り返した後、継代して安定化させる。さらに高生産性株を得たい場合は、本発明のベクターとしてＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有するベクターを使用し、培地中にＭＴＸを加え、宿主細胞内に組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子を刺激することにより遺伝子増幅を行う。一般にＭＴＸはＤＨＦＲ遺伝子の増幅だけでなく、単独あるいはネオマイシンと併せて遺伝子組み込み細胞のセレクションに用いられるが（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，１６５頁，１９８１年；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９，６０１頁，１９８２年）、本発明ではＮＥＯｒ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子の役割は分担するものとした。すなわち、ＮＥＯｒはセレクションのためのものであり、ＤＨＦＲは組み込まれたプラスミドベクター遺伝子を増幅するためのものとした。
【００２４】
以下、本発明発現ベクターの製造方法を具体例を挙げて説明する。なお、この具体例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
【００２５】
＜１＞バックボーンベクター［ｐＢＢＶ］の作製
バックボーンベクターｐＢＢＶは、プラスミドｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３頁，１９８５年）のｌａｃＺ領域を完全に取り除き、開裂部位を新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＢＢＶリンカー）で置換することにより制作する。ｐＢＢＶ作製のフローチャートを図１に示す。ｐＢＢＶは、大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）とアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有する。
【００２６】
＜２＞遺伝子クローニング用プラスミドの作製
（ａ）  ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミド［ｐＣＶ３］の作製
プラスミドｐＵＣ１１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３頁，１９８５年）のもつマルチクローニングサイトを、新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＣＶ３リンカー）で置換することにより作製する。ｐＣＶ３作製のフローチャートを図２に示す。
【００２７】
（ｂ）  ＭＣＳシストロンをもつ遺伝子クローニング用プラスミド［ｐＣＶ４］の作製
プラスミドｐＵＣ１８の既存のマルチクローニングサイトを除去して、新しく合成したマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＣＶ４リンカー）で置換することにより作製する。これは、ＭＣＳシストロンの作製過程で用いる構築用プラスミドである。ｐＣＶ４作製のフローチャートを図３に示す。
【００２８】
＜３＞カセット構築用プラスミド［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１，ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２］の作製
ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつプラスミドおよびＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつプラスミドを作製するために、あらかじめプロモーターとポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）の間にマルチクローニングサイトを有するカセット構築用プラスミドを作製する。ＤＨＦＲ遺伝子シストロン用としてｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用としてｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製する。基本構成は共通で、プロモーターとしてＳＶ４０由来の初期プロモーター（ＳＶ４０複製オリジンを含む）を改変したもの、ポリアデニレーションシグナルとしてＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを採用する。これらをあらかじめ用意されたＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ３に組み込むことにより作製する。ＤＨＦＲ用とＮＥＯｒ用との違いはＳＶ４０プロモーターの５’末端の制限酵素切断配列が一部異なるだけである。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製のフローチャートを図４に、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２作製のフローチャートを図５に示す。
【００２９】
（３−１）  ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１の作製
（ａ）  プロモーターの選択
ウイルス抗原プロモーター領域からエンハンサー部分を取り除くことによりプロモーターを弱化することができるとの報告をもとに（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，１２４６頁，１９８３年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７．１２９６頁，１９８７年）、ＳＶ４０初期プロモーターのエンハンサー部分を除去することにより発現誘導性の低いプロモーターを作製する。具体的には、ＳＶ４０複製オリジン（Ｏｒｉ）を含む初期プロモーター配列を改変して使用する。すなわち、ｐＢＲ３２２上にＢａｍＨＩでライゲートしたＳＶ４０ウイルス全ＤＮＡをもつプラスミドｐＳＢ４０／ＢＲ（広島大学より入手）から、配列番号８および９に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＳＶ４０初期プロモーター配列を切り出し、プラスミドｐＣＶ３のＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩサイト間に組み込む。続いてこの配列中に存在する７２ｂｐ繰返配列中にそれぞれあるＳｐｈＩ間（ＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ）をセルフライゲーションすることによりエンハンサー部分を除去し（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，１２４６頁，１９８３年）、該プロモーターを弱化させる。弱化させたプロモーターをＰＳＶ４０ＤＥ，作製されたプラスミドをｐＳＶＰ１ａと称する。
【００３０】
（ｂ）  ｐｏｌｙＡシグナル配列の選択と設定
ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のｐｏｌｙＡシグナルを有するプラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ａ（ｐＳＶ４０／ＢＲ由来，広島大学より入手）から８１０塩基を切り出して使用する。発現ベクターにおけるＳＶ４０  ｐｏｌｙＡは、一般的にはターミネーションシグナルを含むことを条件に短いものを使用する傾向にあるが、他のシストロンへの影響を避けるために充分な長さの配列を設定するとよい。この配列の３’末端の制限酵素切断配列は新しく合成したリンカー（ＳＰＳＶ４０リンカー）により変更した後（変更後のプラスミドはｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂ）、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切り出してｐＳＶＰ１ａに組み込むことにより、ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１を作製する。
【００３１】
（３−２）ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２の作製
（ａ）  プロモーターの選択
プロモーター配列には、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンに使用したものと同じくＳＶ４０プロモーターを弱化させたＰＳＶ４０ＤＥを採用する。これはＤＨＦＲ用と同じ手順でｐＳＶ４０／ＤＲから切り出されるが、５’センスプライマーとしては制限酵素切断配列の一部（ＥｃｏＲＩ）が省略されたもの（配列番号７）を合成して使用する。プロモーター配列からのエンハンサー部分除去もＤＨＦＲ遺伝子シストロンの場合と同様の方法で行い、作製されたプラスミドをｐＳＶＰ１ｂとする。
【００３２】
（ｂ）  ｐｏｌｙＡの選択と設定
ｐｏｌｙＡについても、ＤＨＦＲ用の場合と同じ方法でｐＳＶ４０ｐＡ−ＢからＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切り出してｐＳＶＰ１ｂに組み込むことにより、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用ベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製する。
【００３３】
＜４＞ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクター［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ］の作製
（４−１）  「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロン」を作製するための挿入配列の調製
（ａ）  トランスポゾン由来配列の利用
ＮＥＯｒ遺伝子の発現機構を消耗させるため、プロモーターとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の間に任意のアミノ酸配列をコードし得る配列を少なくとも１組好ましくはトリプレットの構成単位としての開始位置が異なる３種類すべてを含んでなる挿入配列をもつが、発明者らは自然に存在する配列であるトランスポゾン配列（Ｔｎ５：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４５，１０７頁，１９８１年；Ｇｅｎｅ，１８，３２７頁，１９８２年）を由来とする配列中にこの挿入配列としての条件を満足する領域があることを見いだした。本発明中の実施例のベクターで使用した３５４塩基からなるトランスポゾン配列部分にはいくつものアミノ酸配列をコードし得る遺伝子配列、すなわち開始コドンと見なし得る”ＡＴＧ”が出現する（合計７個あり、内６個は該配列中に対応する終止コドンを有し、最も下流にある翻訳領域から数えて（−１６）の位置から始まる７個目の”ＡＴＧ”にはＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の開始コドン直後の”ＡＴＧＡＴＴＧＡ（下線部分）”が終止コドンとして対応し完結する）。また、この配列中には、トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類すべてのアミノ酸配列をコードし得る配列が含まれている。従って、トランスポゾン配列はＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域５’末端から上流に数えて２７０ｂｐないし１９０ｂｐ程度を採用すれば良いが、短い場合でも少なくとも８０ｂｐ程度はあるのが望ましい。また、３’側末端の配列はＮＥＯｒ遺伝子の開始コドンの３つ前（−３）の塩基が”Ｃ”、６つ前（−６）の塩基が”Ｔ”であって、共にピリミジン系塩基でありコザック共通配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，８１９５頁，１９８７年）には該当しない。従ってこのトランスポゾン配列はＰＳＶ４０ＤＥとＮＥＯｒタンパク質をコードする遺伝子との間に位置することにより、ＮＥＯｒ遺伝子の発現機構を効果的に消耗させ減衰させることができると考えられた。
【００３４】
（ｂ）挿入配列としての人工リンカーの調製
挿入配列としては人為的にリンカーを合成して使用することもできる。この場合トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類すべてのアミノ酸配列をコードする配列を含むよう、また各々の長さは２０アミノ酸程度またはそれ以上の長さのものになるように設計する。各々のアミノ酸配列は必ずしも直列である必要は無くオーバーラップした共有部分をもっても良い。このリンカーをＰＳＶ４０ＤＥとＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域との間に挿入することにより、ＮＥＯｒ遺伝子の発現を効果的に減衰させることができると考えられる（以下、このリンカーを挿入リンカーとして記載する）。この合成リンカー挿入配列を用いる実施の形態は後述の＜８＞に記載する。
【００３５】
（４−２）  ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの構築
（ａ）  トランスポゾン由来配列を利用する場合
ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターは、Ｐｓｖ４０ＤＥ（プロモーター）、挿入配列（トランスポゾン由来配列）、ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域配列およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡで構成する。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２にはＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０  ｐｏｌｙＡがすでに組み込まれていることから、この間にＴｎ５由来のＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列を組み込む。Ｔｎ５配列は一般的に利用されているｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７頁，１９８２年）に含まれているため、これをもとに切り出して使用する。ｐＳＶ２−ｎｅｏの場合はＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列を強い発現誘導性を持つＳＶ４０プロモーターとの組み合わせで使用しており、本発明での利用法とは全く共通性がない。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ作製のフローチャートを図７に示す。
【００３６】
（ｂ）  人為的な合成リンカー挿入配列を使用する場合
ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２にはＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０  ｐｏｌｙＡがすでに組み込まれていることから、この間に挿入配列としての合成リンカーを組み込むことにより作製できる。また、本発明の実施例のように、トランスポゾン由来配列を挿入配列としてもつよう最終的に作製された発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを使用し、トランスポゾン配列部分を合成リンカー配列に置き換えることにより、発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを作製することもできる。
【００３７】
（４−３）  ＮＥＯｒ遺伝子翻訳配列への変異導入
ＮＥＯｒ遺伝子の翻訳開始部分を好ましくは典型的なＫｏｚａｋ非共通配列にするために、開始コドン”ＡＴＧ”直後の塩基をポイントミューテーションでピリミジン系塩基である”Ｃ”または”Ｔ”に変更する（実際には”Ｃ”に変更した）。これによりＮＥＯｒ遺伝子のＭｅｔの次のアミノ酸は、ＩｌｅからＬｅｕまたはＰｈｅに変更される。この変更導入後のＮＥＯｒ遺伝子をＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子と称する。トランスポゾン配列およびＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子からなる配列を配列番号２６に示す。
【００３８】
＜５＞ＭＣＳシストロンをもつカセットベクター［ｐＥＸＰ−ＢＬ２］の作製
ＭＣＳシストロンは、プロモーター、目的とするタンパク質遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト（ＭＣＳ−Ｂ）およびｐｏｌｙＡで構成する。プロモーターには、最も強力な発現誘導性をもつプロモーターの一つとされているｈＣＭＶ  ＭＩＥ抗原プロモーターを由来として使用する（ＰＣＭＶ）。また、ｐｏｌｙＡシグナルにも高生産性でかつ再現性に優れているとの報告のあるウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）を採用する。ＭＣＳシストロンをもつシストロンベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２の作製のフローチャートを図８に示す。
【００３９】
（ａ）  ＰＣＭＶプロモーターの設定範囲
ＰＣＭＶの配列は、ｈＣＭＶ  ＭＩＥ抗原のプロモーター／エンハンサー領域を含む約６ｋｂの配列をｐＳＶ２−Ｎｅｏに組み込むことにより作製されたプラスミドｐＳＶ２−Ｎｅｏ／ＥｃｏＨ（東海大より入手）由来である。ＰＣＭＶの範囲は、ｈＣＭＶ  ＭＩＥ遺伝子中で２１ｂ，１９ｂ，１８ｂ，１７ｂの繰り返し配列を全て含むプロモーター／エンハンサー領域とし、配列番号１６および１７に示す塩基配列を有するプライマー（末端に制限酵素切断配列５’：ＥｃｏＲＶ、３’：ＣｌａＩを付けたもの）を用いて切り出し、ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ４のＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩサイト間に組み込む。作製されたプラスミドをｐＣＶ４／ＣＭＶと称する。
【００４０】
（ｂ）  ｐｏｌｙＡの選択
ウシ肝細胞を由来とするゲノムＤＮＡから、ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡを調製する。文献（Ｇｅｎｅ，１１，２９１頁，１９８７年）ではポリアデニレーションシグナル配列のうちＰｖｕＩＩとＫｐｎＩで切り出せる２２９ｂｐを用いて高い生産性でかつ再現性のある結果を得ているが、この間の配列中にターミネーター（”ＡＡＴＡＡＡ”）は１回出現する。基本的にｐｏｌｙＡは１つで充分と考えられるが、ＭＣＳシストロンをさらに安定化しターミネーションが強くかかるようにプラスミドｐＣＶ４／ＣＭＶ中にｂＧＨ  ｐｏｌｙＡが二重の配列になるように組み込んでも良い（（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）２：配列番号２７）。
【００４１】
（ｃ）  ＭＣＳシストロンをもつプラスミド［ＥＸＰ−ＢＬ２］
こうして作製されたプラスミド（ｐＥＸＰ−ＢＬ２）においては、ＰＣＭＶの３’末端制限酵素サイトと（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）２の５’末端の制限酵素サイトの間に、目的とするタンパク質遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ−Ｂ）が存在する。すなわち、５’−ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−３’が利用できる。組み込むタンパク質遺伝子が開始コドンから始まる場合には、５’側に直接つける制限酵素サイトとしてはＣｌａＩまたはＫｐｎＩを選択するのが望ましい。
【００４２】
＜６＞ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクター［ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ］の作製
ＤＨＦＲ領域は、ＰＳＶ４０ＤＥ（プロモーター）、ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡより成る。ＰＳＶ４０ＤＥとＳＶ４０  ｐｏｌｙＡはすでにｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１に組み込まれており、これにＤＨＦＲ遺伝子配列を組み込むことにより作製する。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ作製のフローチャートを図６に示す。
【００４３】
ＤＨＦＲ遺伝子は、マウス繊維芽細胞３Ｔ３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，９５０１頁，１９８１年）を由来として、開始コドンの５’上流６ｂから終止コドンの３’下流約８５ｂまでの範囲をＰＣＲプライマーで切り出す。５’側は開始コドンの直前の６塩基”ＧＣＣＡＴＣ”の”Ｇ”および”Ａ”からピリミジン系塩基に改変し（例えば、”ＴＣＣＣＴＣ”）、さらにその５’側にＰｓｔＩサイトをもつように調製する。３’側は終止コドンの下流８５ｂにあるＢｇｌＩＩサイトまでとする。このＰＣＲプライマーにより、ＤＨＦＲ遺伝子の開始コドンの５’側の（−６）、（−３）および開始コドン直後（＋４）の塩基はオリジナルにはコザック共通配列であるが、それぞれピリミジン系塩基に改変することにより非共通配列を形成する。これによりＤＨＦＲタンパク質の開始コドンの次のアミノ酸はＶａｌからＬｅｕまたはＰｈｅに変更される。この変異導入されたＤＨＦＲ遺伝子をＭｕ−ＤＨＦＲとし、その塩基配列を配列番号２５に示す。
【００４４】
＜７＞発現ベクター［ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ］の作製
予め用意された発現ベクター構築用のバックボーンベクターｐＢＢＶに、同一の転写方向にＮＥＯｒ領域（ＮＥＯｒ遺伝子シストロン）、目的物質組込領域（ＭＣＳシストロン）およびＤＨＦＲ領域（ＤＨＦＲ遺伝子シストロン）の順で組み込むことにより作製する。方法は以下の通りである。ＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲからＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩでＤＨＦＲ遺伝子シストロンを切り出し、バックボーンベクターｐＢＢＶのマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩサイト間にライゲートすることによりプラスミドベクターｐＮＯＷ−１を作製し、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯからＣｌａＩおよびＳａｃＩＩでＮＥＯｒ遺伝子シストロンを切り出し、ｐＮＯＷ−１のマルチクローニングサイトのＣｌａＩ−ＳａｃＩＩサイト間にライゲートし、その後ＣｌａＩサイトをつぶしてプラスミドｐＮＯＷ−２を作製し、ｐＥＸＰ−ＢＬ２からＳｐｌＩおよびＥｃｏＲＶでＭＣＳシストロンを切り出し、ｐＮＯＷ−２のマルチクローニングサイトのＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＶサイト間にライゲートすることにより発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを作製する。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ作製のフローチャートを図９に、マップを図１０に示す。
【００４５】
＜８＞合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクター［ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ］の作製
完成したｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａをもとに、［トランスポゾン配列からＭｕ−ＮＥＯｒ配列に続く配列部分］を［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］に置換する。
【００４６】
（ａ）合成リンカーの作製
トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードできる配列をすべて含む遺伝子配列を調製するために、それぞれ約５０塩基からなる２つのリンカー（ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  １（＋），  ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  ２（−））およびそれらの相補配列（ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  １（−），  ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  ２（＋））を合成する。これらのリンカーをＰＣＲ増幅させ、ＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  １（＋）の末端の”ＣＣＡＡＧＣ”と相補的に対応するＭＳＲ−Ｌｉｎｋｅｒ  ２（−）の末端”ＧＧＴＴＣＧ”とにより接続する。接続された合成リンカー（配列番号２９）は、５’側にＰｓｔＩサイト，  ３’側にＥｃｏＲＶサイトをもつ。
【００４７】
（ｂ）トランスポゾン配列から合成リンカー挿入配列への置換
次いで、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを使用して、別途に合成したプライマーを使用しＭｕ−ＮＥＯｒの５’側から数えて７塩基上流から終始コドンまでを切り出す。接続した合成リンカーの３’末端およびＭｕ−ＮＥＯｒの５’末端にはＥｃｏＲＶが付けられており、これを接続することにより挿入配列としての合成リンカーとＭｕ−ＮＥＯｒを接続した配列を作製する。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａからトランスポゾン配列だけを切り出して置換するための適当な制限酵素切断サイトがないため、準備した［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］を用いて、対応するｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの［トランスポゾン配列からＭｕ−ＮＥＯｒ配列に続く配列］を置換する。いずれも５’側にＰｓｔＩサイト，３’側にＥｃｏＲＶをもつため、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡをＰｓｔＩ，  ＥｃｏＲＶで開裂後、同じ制限酵素を用いて［合成リンカー挿入配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した配列］をライゲートする。新しく作製される、消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンの挿入配列が合成リンカーであることを特徴とする発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡとする。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ作製のためのｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ作製のフローチャートを図１１に示す。以下、図９にフローチャートを示す作製方法において、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの代わりにｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａを使用することによりｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを作製する。また、ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマップを図１２に示す。
【００４８】
次に、本発明発現ベクター（ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡおよびｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）の利用方法について説明する。
本発現ベクターは以下の手順によって使用できる。
【００４９】
（１）目的物質（タンパク質）の遺伝子をクローニングした後、（２）本発明発現ベクター（プラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡまたはｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）のＭＣＳに組み込む。（３）組み込まれた該発現ベクターを増殖させた後、（４）ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲネガティブ）にリボフェクチン法またはエレクトロポレーションで遺伝子導入し、（５）培地中にＧ４１８を加え培養することによりＧ４１８耐性細胞をセレクトする。（６）得られた細胞を培養しながらクローニングを繰り返し、（７）目的物質の産生量の高いクローンを選択し、（８）さらに増殖速度が速くなり安定化するまで培養を継続する。（９）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。（１０）高生産性のクローンに対して、培地中にＭＴＸ（１０ｎＭ−１μＭ）を段階的にくわえることにより導入されたプラスミド遺伝子を増幅させ、（１１）改めて高生産性クローンを選択し、（１２）さらに増殖速度が早くなり安定化するまで培養を継続する。（１３）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。なお培地の無血清化は（９）と（１３）のいずれの段階で行ってもよい。
【００５０】
以下、本発明発現ベクターの使用例について説明する。
＜１＞発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡによるコングルチニン産生試験
（ａ）コングルチニン遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
目的物質として、血清レクチンの一種であるウシコングルチニンを選択した。このタンパク質の活性には糖鎖が必要であり、大腸菌や酵母を宿主とした生産には適さない。ウシコングルチニンの遺伝子をクローニングしｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマルチクローニングサイトに組み込んだ後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（Ｄｒ．Ｇａｉｌ  Ｕｒｌａｕｂから譲受）にリポフェクチン法により遺伝子導入した。培地にＧ４１８を加え培養したところ、９６０ウエル中３３ウエルにのみ細胞の生存が見られた（Ｇ４１８耐性株）。生存細胞のほとんどはコングルチニンを有意に高いレベルで産生していたが、これらのうちから生産性の高い細胞として５クローンを選び継代培養したところすべてが７．０μｇ／ｍｌ（４日間）を示し、最も高い産生レベルを示したもの１１．８μｇ／ｍｌであった。これは文献等で報告されている代表的な発現ベクターによる遺伝子増幅前の初期クローンのデータと比較して最も高い水準であった（ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０．１４５５頁，１９９２年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，６６２頁，１９９０年；Ｇｅｎｅ，７６，１９頁，１９８９年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４頁，１９９１年）。遺伝子増幅による組換細胞のスクリーニングには通常６ヶ月から１年を要しかつ培養条件や増幅刺激剤濃度による差異が大きいため、発現ベクターのプライマリーな性能比較は増幅前の初期クローンの発現レベルで行うのが適当と考えられる。これにより本発明の発現ベクターの性能は極めて高いことが判明した。この結果、「消耗性ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつ発現ベクター」は、得られるＧ４１８耐性株の数が極めて低い一方、非常に高い効率で目的物質タンパク質の高生産性細胞株の確立を可能にすることが確かめられた。本発明者らは市販の哺乳動物細胞用発現ベクターや独自に開発した発現ベクターを用いてこれまで数多くの試験を行ってきたが、コングルチニン発現量はいずれも最高５０ｎｇ／ｍｌ（４日間）までであり、実用的とは言えなかった。これにより、本発明発現ベクターは非常に高いタンパク質発現レベルを可能にすることが証明された。
【００５１】
＜２＞発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａによるコングルチニン産生試験
（ａ）コングルチニン遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立
＜１＞と同様の方法で、ウシコングルチニンの遺伝子をｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａのマルチクローニングサイトに組み込んだ後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株にリポフェクチン法により遺伝子導入した。１０％ＦＣＳを添加した培地にＧ４１８を加え培養したところ、９６０ウエル中４８ウエルに細胞の生存が見られ（Ｇ４１８耐性株）、これら生存細胞のほとんどがコングルチニンを有意に高いレベルで産生していた。クローニングを繰り返しながら培養を継続したところ、１μｇ／ｍｌ（４日間）を越える高水準のコングルチニン産生クローンが多数得られ、うち最も高い産生レベルを示したものは６．８μｇ／ｍｌであった。従って、トランスポゾン配列を由来とするような天然型の配列でも挿入配列としての条件を満たしていれば、高生産性のＧ４１８耐性株を獲得できることが証明された。この実験では、細胞株の安定化後培地中のＦＣＳレベルを下げ無血清培地であるＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ社、ハイポキサンチンとチミジンが含まれていない）への馴化を行ったところ、充分に適応することが判明しコングルチニンの生産性にも有意な低下は認められなかった。
【００５２】
（ｂ）Ｇ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、コングルチニン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、ＭＴＸによる遺伝子増幅を行った。始めに１０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間培養後、５０ｎＭのＭＴＸを含む培地でさらに２週間増幅させたところ、コングルチニンの産生レベルは培地当たり１８．６μｇ／ｍｌ（４日間）に上昇した。遺伝子増幅に用いるＭＴＸ濃度は一般に１０ｎＭ〜１０μＭの間の多段階とされ、最終濃度としては１μＭがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の樹立には問題がある。このため低濃度ＭＴＸで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では５０ｎＭまでとした。また通常セレクションを含めたＭＴＸ暴露期間は６−１２ヶ月とされるのに対して、本実験では約４週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なコングルチニンの産生量増加がみられ、遺伝子増幅系に関しても本発現ベクターの高い性能が確かめられた。多くの論文が示唆するように、毒性がほとんど問題とならない範囲（＜１μＭ）でＭＴＸの濃度レベルを上げるかまたはＭＴＸ暴露時間を長くすることによりさらに高い生産性が期待できる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００５４】
【実施例１】
（１）バックボーンベクターｐＢＢＶの作製
プラスミドｐＵＣ１８に新たに組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＢＢＶリンカー）として、配列番号１に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号２に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は，３’−ＮｄｅＩ−ＳａｃＩＩ−ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ−５’とし、５’末端は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ）とした。プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造株式会社、１ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｖｕＩＩで処理することによりｌａｃＺをコードする領域を完全に除去した。この溶液に対して、ＢＢＶリンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造株式会社）のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地（東洋紡株式会社）を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＢＢＶリンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＢＢＶとした。
【００５５】
（２）ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ３の作製
プラスミドｐＵＣ１１９のマルチクローニングサイトを除去して新たに組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＣＶ３リンカー）として、配列番号３に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号４に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は、５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ  ３’とし、３’末端はＢｌｕｎｔ  Ｅｎｄとした。プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造株式会社、１ｎｇ（０．１μｌ））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＣＶ３リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＣＶ３リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ３とした。
【００５６】
（３）弱化ＳＶ４０プロモーター（ＰＳＶ４０ＤＥ）の作製
（ａ）  弱化ＳＶ４０プロモーター（ＤＨＦＲシストロン用）の作製
プラスミドｐＳＶ４０／ＢＲからＳＶ４０  Ｏｒｉを含むＳＶ４０初期プロモーターを切り出すため、配列番号５に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＳ１）と配列番号６に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＳ２）を合成した。ＰＳ１プライマーの５’側末端には、元の配列のＰｖｕＩＩサイトを変更してＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを付与した。また、ＰＳ２プライマーの３’側末端には、元のＨｉｎｄＩＩＩサイトを変更してＰｓｔＩサイトを付与した。ｐＳＶ４０／ＢＲゲノム（ｐＳＶ４０／ＢＲ由来，  広島大学より入手）１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、これらのＰＳ１プライマーとＰＳ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，  １００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ），酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＳａｃＩＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＰｓｔＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．３５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００５７】
プラスミドｐＣＶ３をＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで処理した後の溶液に対して、上記のＤＮＡ溶５μｌを加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振とう培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＶ４０プロモーターＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＳＶ０ａとした。さらにこのプラスミドについて制限酵素ＳｐｈＩでセルフライゲーション（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行いエンハンサー部分を除去することにより、５’末端にＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトがついたＰＳＶ４０ＤＥを有するプラスミドｐＳＶＰ１ａを作製した。
【００５８】
（ｂ）弱化ＳＶ４０プロモーター（ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用）の作製
配列番号５に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＳ１）の代わりに、配列番号７に示す塩基配列を有する別の５’センスプライマー（ＰＳ３）を合成して用いた点を除き、上記（ａ）項に記載の弱化ＳＶ４０プロモーター（ＤＨＦＲ遺伝子シストロン用）の作製と同様の方法で、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用の弱化ＳＶ４０プロモーターＰＳＶ４０ＤＥを有するプラスミドｐＳＶＰ１ｂを作製した。このＰＳ３プライマーは、５’末端にＳａｃＩＩサイトのみをつけたものである（ＥｃｏＲＩサイトは付けない）。３’アンチセンスプライマーは同じもの（ＰＳ２：配列番号６）を使用した。
【００５９】
（４）ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡの調製
プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−ＡのＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル配列の３’末端ＥｃｏＲＩサイトにＳＰＳＶ４０リンカーをライゲートすることによりＥｃｏＲＩサイトをつぶし、ＡｐａＩ−ＣｌａＩサイトに変更した。まずＳＰＳＶ４０リンカーとして、配列番号８に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号９に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ａ  １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＩでダイジェストした後、得られた溶液に対してＳＰＳＶ４０リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＰＳＶ４０リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選びｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂとした。
【００６０】
（５）弱化ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを組み込んだカセットの作製
（ａ）  ＤＨＦＲ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１の作製
プラスミドｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂ  １ｎｇ（０．１μｌ）に制限酵素ＢａｍＨＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａ  Ｉ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いて５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．８ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。一方、プラスミドｐＳＶ１ａを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで処理した後、得られた溶液１ｎｇ／０．１μｌに対して上記のＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振とう培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＳＶ４０  ｐｏｌｙ  ＡのＤＮＡが挿入されているものを選びｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１とした。
【００６１】
（ｂ）  ＮＥＯｒ遺伝子シストロン構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２の作製
上記（ａ）項に記載のｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製と同様の方法で、ｐＳＶ４０ｐＡ−Ｂから得られたＳＶ４０  ｐｏｌｙＡのＤＮＡとプラスミドｐＳＶＰ１ｂをもとに、ＮＥＯｒ遺伝子シストロン用の弱化ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０  ｐｏｌｙＡをもつプラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２を作製した。
【００６２】
（６）  ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクターの作製
（６−１）  ＤＨＦＲ遺伝子のクローニング
（ａ）  ＤＨＦＲ  ｍＲＮＡの単離
マウス繊維芽細胞株３Ｔ３を培養し１０７ｃｅｌｌｓを得た後、グアニジンイソチオシアネート法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２，２１９頁，１９８７年）によりｍＲＮＡを分離した。まずフラスコ中に細胞を浮遊させ、得られた細胞を滅菌処理したＰＢＳ中に再度浮遊させ遠心分離用チューブに移した。温度条件０℃下で４５０×Ｇ，１０分間の遠心分離を行い、上清は廃棄した。６ＭのＧＴＧ−ＣｓＣｌ，１０ｍＭクエン酸ナトリウム，０．１ｍｌβ−メルカプトエタノールおよび０．５％サルコシルの混合溶液に得られた細胞を加えて懸濁・溶解し、これを１８ゲージの注射針を通してＲＮＡを断片化した。このようにして得たもの２．５ｍｌを、超遠心管中の５．７Ｍ  ＣｓＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ液２．５ｍｌの上に重層した。これを超遠心機を用いて３５，０００ｒｐｍで８時間遠心し、上清を注意深く捨てた後に、底に沈殿したＲＮＡ分画をフェノールで抽出し飽和させた滅菌水に溶解した。これにエタノールを加えて、１２，０００ｒｐｍの遠心でＲＮＡを沈殿させた。ついで沈澱物をエタノールで３回洗浄したのち風乾した。得られたＲＮＡを３ｍｌのＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁した。こうして得られたｍＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍの吸光度により、約０．３μｇ／μｌであった。
【００６３】
（ｂ）  ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの調製
ＤＨＦＲの遺伝子をＰＣＲ増幅するために、配列番号１０に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＤ１）と配列番号１１に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＤ２）を合成した。５’側末端はＰｓｔＩサイトとナンセンスなピリミジン配列”ＴＣＣＣＴＣ”を人為的に結合された配列とし、３’側末端は終止コドンから約８５ｂ下流にあるＢｇｌＩＩサイトまでを含むものとした。ｃＤＮＡを合成するために、２μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの溶液を用いた。滅菌したＲＮａｓｅフリーのチューブに、ＰＣＲバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌ、オリゴｄＴプライマー２．０μｇ、ＰＣＲ逆転写酵素（２００  ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌに０．５μｌのＲＮａｓｅフリーのＤＥＰＣ水を加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした後、７０℃で１５分間加熱し反応を停止させた。得られたｃＤＮＡは、用意したＰＣＲ用の反応液に直接加えた。この溶液にＰＤ１プライマーとＰＤ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，  １００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ  （１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．６５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００６４】
（６−２）  ＤＨＦＲ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲの構築
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ヶ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対してＤＨＦＲのＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、５’末端はＰｓｔＩで、また３’末端はＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの突出末端で結合させた。このときＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＤＨＦＲのＤＮＡが挿入されており、プラスミドがＡｐａＩの制限酵素サイトをもつものを選んだ。なおこのプラスミドからＤＨＦＲ遺伝子を切り出しシークエンシングすることにより、ＤＨＦＲ遺伝子全配列および開始コドン”ＡＴＧ”から（＋４）の位置の塩基が”Ａ”から”Ｃ”に変わっていることを確認した（Ｍｕ−ＤＨＦＲ、配列番号２５）。
【００６５】
（７）ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターの作製
（ａ）トランスポゾン配列を含むＮＥＯｒ遺伝子の調製
ＮＥＯｒ遺伝子領域には、３５４塩基からなる５’上流のトランスポゾン配列とＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域がつながったものを使用した。この配列はＴｎ５由来でｐＳＶ２−ｎｅｏにふくまれているため切り出して使用した。まず、配列番号１２に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＮ１）と配列番号１３に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＮ２）を合成した。ＰＮ１プライマーの５’側末端には、元の配列のＨｉｎｄＩＩＩサイトを変更してＰｓｔＩサイトを付与した。また、ＰＮ２プライマーの３’側末端には、元のＳｍａＩサイトを変更してＢａｍＨＩサイトを付与した。ｐＳＶ２−ｎｅｏゲノム１ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＰＮ１プライマーとＰＮ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しそのうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．３ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００６６】
（ｂ）  ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯの構築
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ケ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対して  ＮＥＯｒ遺伝子のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたに  ＮＥＯｒ遺伝子を含むトランスポゾン配列ＤＮＡを挿入されているものをＧ４１８耐性で確認して選んだ。
【００６７】
（ｃ）  ＮＥＯｒ遺伝子への部分特異的突然変異導入
ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域開始コドン”ＡＴＧ”の直後の塩基”Ａ”を”Ｃ”に変更するため、配列番号２４に示す塩基配列を有する変異導入用アンチセンスプライマーを合成した。ｐＳＶＰ（Ｄ）／ＮＥＯゲノム１ｎｇ（１μｌ）に対して、このアンチセンスプライマーを１００ｐｍｏｌｅ加え、ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社）を使用して部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）を誘導した。Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。作製されたプラスミドベクターをｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯとした。トランスポゾン配列から、ＮＥＯｒ遺伝子からなる配列を切り出し、改めてシーケンシングすることにより、これら全体の塩基配列と、ＮＥＯｒ遺伝子開始コドン”ＡＴＧ”の直後の（＋４）の位置の塩基が”Ａ”から”Ｃ”に変わっていることを確認した（Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子）。この配列を配列番号２６に示す。
【００６８】
（８）ＭＣＳシストロンをもつカセットベクターの作製
Ａ．ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用プラスミドｐＣＶ４の作製
ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトを除去して新たにＭＣＳ関連遺伝子を組み入れるマルチクローニングサイト用のリンカー（ＣＶ４リンカー）として、配列番号１４に示す塩基配列を有するセンスＤＮＡと配列番号１５に示す塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。このリンカーの制限酵素切断配列は、３’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ−ＳｐｌＩ−ＥｃｏＲＩ−５’とした。プラスミドｐＵＣ１８  １ｎｇ（０．１μｌ））を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＣＶ４リンカーのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＣＶ４リンカーのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ４とした。
【００６９】
Ｂ．ＰＣＭＶの調製と組み込み
（ａ）  ＰＣＭＶの調製
プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ／ＥｃｏＨからＰＣＭＶを切り出すため、配列番号１６に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＣ１）と配列番号１７に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＣ２）を合成した。ＰＣ１プライマーの５’側末端にはＥｃｏＲＶサイトをまたＰＳ２プライマーの３’側末端にはＣｌａＩサイトを付与した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ／ＥｃｏＨゲノム１ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＰＣ１プライマーとＰＣ２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＥｃｏＲＶ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．６ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７０】
（ｂ）  ＰＣＭＶのＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み
一方、組み込まれる側のプラスミドｐＣＶ４  １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＣｌａＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＰＣＭＶ  ＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＰＣＭＶのＤＮＡが挿入されているものを選び出しｐＣＶ４／ＣＭＶとした。
【００７１】
Ｃ．ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡの調製と組み込み
（ａ）  ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡを含むＤＮＡの単離
採取したウシ肝臓細胞組織をドライアイス上でスライスしながら、１００μｇ／ｍｌになるようにプロティネースＫ溶液を加えたバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），１０ｍＭ  ＤＥＴＡ，  ０．１％  ＳＤＳ）で抽出し穏やかに混合した。５５℃で１時間インキュベートした後、さらに３７℃で一晩インキュベートした。Ｔｒｉｓで平衡化した中性フェノールを等量加え、室温で２０分間穏やかに混合した。室温で２，０００×Ｇ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上層（５ｍｌ）を回収し新しいチューブに移した後、再度同じ条件で遠心分離を行った。再度上層を回収し新しいチューブに移した後、２倍量の１００％エタノールを重層し、ゆっくりとかきまぜながらバッファーとエタノールを混合した。得られたＤＮＡをガラス棒で巻き取って回収した後風乾し、５ｍｌのＴＥ溶液に入れ４℃で一晩おき溶解した。得られたＤＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍの吸光度により約０．５μｇ／μｌであった。
【００７２】
（ｂ）  ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ遺伝子のＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み（１）
ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列を二重に接続するために、制限酵素サイトの異なる二種類のｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列を作製した。このためあらかじめ、２組の５’センスプライマーと３’アンチセンスプライマー、すなわち、第一の組み合わせの配列番号１８に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＢ１１）と配列番号１９に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＢ１２）、および、第二の組み合わせの配列番号２０に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＰＢ２１）と配列番号２１に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマー（ＰＢ２２）を合成した。
【００７３】
得られたＤＮＡ試料のうち１００ｎｇを取り出し、ＰＣＲテンプレートを用いて所望の制限酵素切断配列を両端にもつｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列を作製した。まずＤＮＡ試料１００ｎｇ（１μｌ）に対して、第一の組み合わせのセンスプライマーＰＢ１１とアンチセンスプライマーＰＢ１２をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，  １００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ  （１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しそのうちの１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＸｂａＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．２３ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７４】
プラスミドｐＣＶ４をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ  ＤＮＡが挿入されているものを選びｐＣＶ４／ＣＭＶ−ｂＧＨ１とした。
【００７５】
（Ｃ）  ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ遺伝子のＭＣＳシストロン関連遺伝子クローニング用プラスミドへの組み込み（２）
続いて、第一のプライマーの組み合わせでＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ試料のうち１ｎｇ（１μｌ）を取り出し、第二の組み合わせのセンスプライマーＰＢ２１とアンチセンスプライマーＰＢ２２をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＸｂａＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢｇｌＩＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．４７ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００７６】
プラスミドｐＣＶ４／ＣＭＶ−ｂＧＨ１をＢａｍＨＩおよびＳｐｌＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たに第二のｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ  ＤＮＡが挿入されているもの、すなわちｂＧＨ  ｐｏｌｙＡが二重に結合して挿入されているもの（（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）２）を選び、これをＭＣＳシストロンをもつカセットベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２とした。作製されたｐＥＸＰ−ＢＬ２をＸｂａＩとＳｐｌＩで切り出し、改めてシーケンシングし配列を確認した（配列番号２７）。
【００７７】
（９）発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの構築
（ａ）  ＤＨＦＲシストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ−１の作製）プラスミドｐＳＶ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ  １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＥｃｏＲＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付し、ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．７５ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ配列はＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するもので、ＰＳＶ４０ＤＥ、Ｍｕ−ＤＨＦＲ遺伝子およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡからなる。
【００７８】
一方、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＢＢＶ  １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＡｐａＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液に対して、ＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＡｐａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＤＨＦＲ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選び出しｐＮＯＷ−１とした。
【００７９】
（ｂ）  ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ−２の作製）
プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ  １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＳａｃＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＣｌａＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付し、ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約２．４ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。この配列はＮＥＯｒシストロンを構成するＤＮＡ配列で、ＰＳＶ４０ＤＥ、トランスポゾン配列、Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡからなる。
【００８０】
一方、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＮＯＷ−１  １ｎｇ（１μｌ）を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＣｌａＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、ＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＳａｃＩ−ＣｌａＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱した  コンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選んだ（ｐＮＯＷ−２Ｐ）。
【００８１】
得られたプラスミドｐＮＯＷ−２ＰのマルチクローニングサイトのＣｌａＩサイトを除去するため、ＡｐａＩ−ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ部分を新たに合成したＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶリンカーで置換することによりＣｌａＩサイトを除去した。まずこのリンカーとして、５’−ＣＧＡＴ−３’の塩基配列を有するセンスＤＮＡと３’−ＣＧＧＧＣＴＡ−５’の塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡを合成した。プラスミドｐＮＯＷ−２Ｐ  １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＶでダイジェストした後、得られた溶液に対して、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＶリンカーセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、次いでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＣｌａＩでダイジェストできないものを選び出しｐＮＯＷ−２とした。
【００８２】
（ｃ）  ＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列の組み込み（プラスミドｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａの作製）
プラスミドｐＥＸＰ−ＢＬ２  １００ｎｇ（１μｌ）に１０×Ｈ溶液１μｌを加え、制限酵素ＥｃｏＲＶ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＳｐｌＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約１．１ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ、遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。この配列はＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列で、ＰＣＭＶ、ＭＣＳ−Ｂ、および（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ）２からなる。
【００８３】
一方、ＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列が組み込まれる側のプラスミドｐＮＯＷ−２  １ｎｇ（０．１μｌ）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｐｌＩで処理した。得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ（０．１μｌ）に対して、ＭＳＣシストロンを構成する配列のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＥｃｏＲＶ−ＳｐｌＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうちＭＳＣシストロンを構成するＤＮＡ配列が挿入されているものを選んだ。こうして作製された発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａとした。この発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａについて、構成する各部分を制限酵素により断片化し、それぞれをシーケンシングしつなぎあわせることにより、各遺伝子配列が正しく挿入されていることを確認した。
【００８４】
【実施例２】
（１）合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡの構築
（ａ）  合成リンカーの作製
トリプレットの構成単位として開始位置の異なる３種類のアミノ酸配列をコードし得る配列をすべて含むことよりなる遺伝子配列を調製するために、第一配列として、配列番号３０に示す塩基配列を有するリンカー（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  １（＋））と配列番号３１に示すその相補配列（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  １（−））を合成した。次に、第二配列として配列番号３３に示す塩基配列を有するリンカー（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  ２（−））と配列番号３２に示すその相補配列（ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  ２（＋））を合成した。ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  １（＋）の５’末端にはＰｓｔＩサイト、３’末端にはＭＳＲ−ｌｉｎｌｅｒ  ２とアニーリングして接続するための配列”ＣＣＡＡＧＣ”が付与されている。また、ＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  ２（−）の３’末端にはＥｃｏＲＶサイト、５’末端には第一配列とアニーリングして接続するための配列”ＧＧＴＴＣＧ”が付与されている。
【００８５】
（ｂ）  ２つのリンカーの接続
ＰＣＲテンプレートを用いて所望の制限酵素切断配列を両端にもつＭＳＲリンカー配列を作製した。第一の組み合わせのセンスＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  １（＋）とアンチセンスＭＳＲ−ｌｉｎｋｅｒ  １（−）をそれぞれ１００ｐｍｏｌｅを用意し、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，  １００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ  （１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＥｃｏＲＶＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．１ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８６】
プラスミドｐＵＣ１８をＰｓｔＩおよびＳｍａＩで処理した後の溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対して、上記のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ついでＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにＭＳＲリンカーＤＮＡが挿入されているものを選びｐＵＣ１８／ＭＳＲとした。
【００８７】
（ｃ）  Ｍｕ−ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域の切り出し
ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯからＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子翻訳領域を切り出すため、配列番号３４に示す塩基配列を有する５’センスプライマー（ＮＥＯ−Ｎ’１）と配列番号３５に示す３’アンチセンスプライマー（ＮＥＯ−Ｎ’２）を合成した。ＮＥＯ−Ｎ’１プライマーの５’末端にはＥｃｏＲＶサイトが、ＮＥＯ−Ｎ’２の３’末端にはＢａｍＨＩサイトを付与した。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａゲノム  １ｎｇ（０．１μｌ））に対して、これらのＮＥＯ−Ｎ’１プライマーとＮＥＯ−Ｎ’２プライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＥｃｏＲＶ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．８ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８８】
（ｄ）  ＭＳＲリンカーとＮＥＯｒの接続
ＰＣＲテンプレートを用いてＭＳＲリンカー配列とＭｕ−ＮＥＯｒ配列を接続した。上記（ｂ）および（ｃ）で調製された各配列のＤＮＡをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅを用意し、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（０．５μｌ）とＰＣＲバッファー液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０μｌ，１００ｍＭ  ＤＴＴ  １．０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ０．５μｌ（１０ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酢酸ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）０．２５μｌを加え、最終容量が１００μｌになるように滅菌水を加えた。これらの混合溶液にミネラルオイルを一滴添加し次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９５℃４分間の加熱処理後、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３ステップを３０回繰り返してから、７２℃１０分間の処理をして反応を終了した。このＰＣＲ反応溶液から水相を取り出しその内の１０μｌに１０×Ｈ溶液２μｌを加え、次いで制限酵素ＰｓｔＩ  ２０Ｕ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ  ２０Ｕ（１μｌ）を加え、滅菌水を７μｌ加えた後に３７℃で１時間反応させた。反応液は、０．８％アガロースゲルを用いた５０ｍＡ  ３０分間の電気泳動に付した。ゲルに波長３６０ｎｍの紫外線を照射して検出された約０．９ｋｂのバンドを切り出した。このアガロース断片を１．５ｍｌチューブに入れ遠心分離機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた水溶液をピペットで分離してＤＮＡ溶液とした。
【００８９】
（ｅ）  ＮＥＯｒ遺伝子シストロンをもつカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯへの組み込み得られたＤＮＡ（ＭＳＲリンカーとＮＥＯｒの接続配列）を実施例１で得られたプラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯへ組み込んだ。ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでパーシャルダイジェスチョン処理した（これはＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ中にもＰｓｔＩサイトが１ケ所ふくまれていることによる）。この溶液０．１μｌ（１ｎｇ  ＤＮＡ）に対してＮＥＯｒ遺伝子のＤＮＡ溶液０．５μｌを加え、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩサイト間にライゲートした。この反応には、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応させた後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新らたにＭＳＲリンカー配列に接続されたＭｕ−ＮＥＯｒ遺伝子を含むＤＮＡが挿入されているものをＧ４１８耐性で確認して選んだ（ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ）。
【００９０】
（ｆ）  発現ベクター  ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡの構築
以下、実施例１と同様の方法で、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−ＡからＮＥＯｒ遺伝子シストロンを構成するＤＮＡ配列を切り出してプラスミド  ｐＮＯＷ−１に組み込むことによりｐＮＯＷ−２ＰＡを作製した。さらに実施例１と同様の方法でｐＮＯＷ−２に対応するｐＮＯＷ−２Ａを作製し、続いてプラスミドｐＥＸＰ−ＢＬ２から切り出したＭＣＳシストロンを構成するＤＮＡ配列をｐＮＯＷ−２Ａに組み込んだ。こうして作製されたＮＥＯｒ遺伝子シストロンに合成リンカー挿入配列をもつ発現ベクターをｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡとした。この発現ベクターについて、構成する各部分を制限酵素により断片化し、それぞれをシーケンシングしつなぎあわせることにより、各遺伝子配列が正しく挿入されていることが確認した。
【００９１】
【実施例３】
（１）ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡを用いたコングルチニンの産生試験
（ａ）  コングルチニンｃＤＮＡの調製とｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡへの組み込み
プラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのＭＣＳ−Ｂに遺伝子を組み込むために、ウシコングルチニンｃＤＮＡの両端の制限酵素切断配列を配列番号２２に示す塩基配列を有する５’センスプライマーと配列番号２３に示す塩基配列を有する３’アンチセンスプライマーを用いて改変した。ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ  １ｎｇ／０．１μｌを制限酵素ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで処理した後、得られたプラスミドを含む溶液１ｎｇ／０．１μｌに対して、コングルチニンｃＤＮＡ末端改変のためのセンスプライマーとアンチセンスプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌｅ加え、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２のＩ液２．０μｌを加えて１６℃で３０分間反応させた。反応液を大腸菌コンピテントセルＸＬ１−ＢＬＵＥ  ０．１ｍｌに加え、氷上で３０分間反応後、４２℃で６０秒間熱ショックを加えた。２分間氷上に置いた後ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加え、３７℃で１時間シェーカーで振盪培養した。５，０００ｒｐｍで１分間遠心し上清を廃棄した。チューブ内に残った溶液で沈澱したコンピテントセルを懸濁して１：１０の割合で２枚の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むアンピシリンプレートにまいた。３７℃で一晩培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち新たにコングルチニンのＤＮＡが挿入されているものを選んだ。組み込まれたコングルチニン遺伝子を切り出し改めてシーケンシングし塩基配列を確認した（配列番号２８）。
【００９２】
（ｂ）  宿主ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ欠損株）への遺伝子導入
子牛胎児血清（ＦＣＳ，  ＧＩＢＣＯ社）を１０％添加したＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これにＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように混合し、直径６０ｍｍのディシュに植え、３７℃，  ５％  ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養上清を廃棄し、その代わりにあらかじめリポフェクチン溶液（ＢＲＬ社）と混合した５μｇのＤＮＡ（コングルチニン遺伝子を組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ）を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地５ｍｌを加え１６時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理によりディシュより回収し、細胞数を数えた後１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地に細胞を懸濁し、これを０．１ｍｌ／ウエルになるように９６ウエルのマイクレプレート２枚に播種した。３７℃，５％  ＣＯ２の条件で２週間培養したところ１９２ウエル中３３ウエルにおいてのみ生存細胞がみられＧ４１８耐性を獲得した細胞の増殖をみた。
【００９３】
（２）コングルチニン産生試験
（ａ）  Ｇ４１８耐性細胞の増殖とコングルチニン産生レベル測定試験
コングルチニン産生レベルを確認したところ、殆どのＧ４１８耐性株において高水準であったが、これらのうちから代表的な５クローンを選んでクローニングを２回繰り返した。続いて、１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地にＧ４１８耐性細胞を混合し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度）、細胞クローン５ｍｌをそれぞれ２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えた。細胞がコンフルエントになるまで培養し細胞数を測定したところ２×１０６ｃｅｌｌｓであった。それぞれのディシュの培養上清を廃棄し、同じ組成の１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地を２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収した。コングルチニンの産生量を測定したところ、全てのディシュで１４μｇ／２ｍｌを超えていることが判明した。産生量を表１に示す。最も産生レベルの高かったクローン７−３は１１．８μｇ／ｍｌに達した。
【００９４】
【表１】
0003582965.tif 000002
【００９５】
【実施例４】
（１）ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを用いたコングルチニンの産生試験
（ａ）  コングルチニンｃＤＮＡのｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａへの組み込みと宿主ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ欠損株）への遺伝子導入
実施例３と同様の方法で、ウシコングルチニン遺伝子をプラスミドベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡのＭＣＳ−Ｂに組み込んだ。子牛胎児血清（ＦＣＳ，  ＧＩＢＣＯ社）を１０％添加したＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ社）を調製し、これにＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように混合し、直径６０ｍｍのディシュに植え、３７℃，  ５％  ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養上清を廃棄し、その代わりにあらかじめリポフェクチン溶液（ＢＲＬ社）と混合した５μｇのＤＮＡ（コングルチニン遺伝子を組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ）を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地５ｍｌを加え１６時間培養した。培養した細胞をトリプシン処理によりディシュより回収し、細胞数を数えた後１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように４００μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地に細胞を懸濁し、これを０．１ｍｌ／ウエルになるように９６ウエルのマイクロプレート１０枚に播種した。３７℃，５％  ＣＯ２の条件で２週間培養したところ９６０ウエル中４８ウエルにおいてのみ生存細胞がみられＧ４１８耐性を獲得した細胞の増殖をみた。
【００９６】
（２）コングルチニン産生試験
（ａ）  Ｇ４１８耐性細胞の増殖とコングルチニン産生レベル測定試験
コングルチニン産生レベルを確認したところ、殆どのＧ４１８耐性株において高水準であったが、これらのうちから代表的な５ウエルを選んでクローニングを２回繰り返した。続いて、１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地にＧ４１８耐性細胞を混合し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度）、細胞クローン５ｍｌをそれぞれ２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えた。細胞がコンフルエントになるまで培養し細胞数を測定したところ２×１０６ｃｅｌｌｓであった。それぞれのディシュの培養上清を廃棄し、同じ組成の１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地を２ｍｌ加え、４日間培養し、その培養上清を回収した。コングルチニンの産生量を測定したところ、全てのディシュで４μｇ／２ｍｌを超えていることが判明した。産生量を表２に示す。最も産生レベルの高かったクローン１１Ａは６．８μｇ／ｍｌに達した。
【００９７】
【表２】
0003582965.tif 000003
【００９８】
（ｂ）  ＭＴＸによるプラスミド遺伝子増幅
コングルチニン産生クローンをさらに継代培養し安定化させた後、低濃度のＭＴＸを培地に加え遺伝子増幅を行った。第一段階として、ＭＴＸ  １０ｎＭ，Ｇ４１８  ２００μｇ／ｍｌを加えた１０％ＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社，ハイポキサンチンとチミジンが含まれていない）にセレクトした細胞クローン１１Ａを混合し、２５ｃｍ２のカルチャーフラスコに植えコンフルエントになるまで培養した（２週間）。培養上清を廃棄し、同じ組成のＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（１０ｎＭ  ＭＴＸ，２００μｌ／ｍｌ  Ｇ４１８を加えたもの）を２ｍｌ加え４日間培養した後、培養上清を回収しコングルチニンの産生レベルを測定した。続いて、ＭＴＸ  ５０ｎＭ，Ｇ４１８  ２００μｇ／ｍｌを加えた１０％ＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地で再度コンフルエントになるまで培養した（２週間）。培養上清を廃棄し、同じ組成のＦＣＳ添加Ｉ−ＭＥＭ培地（５０ｎＭ  ＭＴＸ，２００μｌ／ｍｌ  Ｇ４１８を加えたもの）を２ｍｌ加え４日間培養し、培養上清を回収しコングルチニンの産生レベルを測定した。結果は表３の通りであった。得られた細胞は極めて増殖速度が遅く、アダプテーションが進んで増殖が早くなればさらに高いレベルの生産性に達すると思われた。
【００９９】
【表３】
0003582965.tif 000004
【０１００】
【実施例５】
（１）ヒトＩＦＮ−β産生試験
実施例４と同様の手順で、ヒトＩＦＮ−β（Ｇｅｎｅ，１０，１１頁，１９８０年）のｃＤＮＡを繊維芽細胞よりクローニングした後ｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａに組み込み、さらにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入した。Ｇ４１８セレクション後ヒトＩＦＮ−βの産生レベルをみたところ表４の通りであった。なお、ＩＵは抗ウイルス活性により求めた値である。
【０１０１】
【表４】
0003582965.tif 000005
【０１０２】
（２）ＭＴＸによるプラスミド遺伝子増幅
実施例４と同様の手順でヒトＩＦＮ−β産生クローン７２を低濃度のＭＴＸ培地に加え、遺伝子増幅を行った。まずＭＴＸ  ５０ｎＭで増幅した後、ヒトＩＦＮ−β産生レベルを測定したところ表５の通りであった。
【０１０３】
【表５】
0003582965.tif 000006
【０１０４】
（３）ヒトＩＦＮ−β産生クローンの無血清培地への馴化
ヒトＩＦＮ−β産生クローン７２を５０ｎＭ  ＭＴＸで遺伝子増幅したクローン７２２２について無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ，  ＧＩＢＣＯ社，  ヒポキサンチンとチミジンが含まれていない）に２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８，  ５０ｎＭ  ＭＴＸを加えた培地で馴化した。
【０１０５】
馴化後にヒトＩＦＮ−β産生量を測定した結果、４７３，９００ＩＵ／ｍｌであり、１０％ＦＣＳ添加時とほぼ同等の結果を得た。
【０１０６】
（４）無血清培地を用いたヒトＩＦＮ−β産生試験
実施例５（１）で得たヒトＩＦＮ−βｃＤＮＡを組み込んだｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａを、無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ，  ＧＩＢＣＯ社，  ヒポキサンチンとチミジンが含まれていない）で馴化したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入し、同培地に２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を加えた培地でセレクション後、ヒトＩＦＮ−βの産生量を測定したところ、表６の通りであった。
【０１０７】
【表６】
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【発明の効果】
本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準の遺伝子組換タンパク質生産を可能にする発現ベクターを提供することができる。
【０１０８】
【配列表】
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【０１０９】
0003582965.tif 000009
【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
0003582965.tif 000030
【０１３１】
0003582965.tif 000031
【０１３２】
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0003582965.tif 000033
【０１３３】
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0003582965.tif 000035
【０１３４】
0003582965.tif 000036
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【０１３５】
0003582965.tif 000038
0003582965.tif 000039
【０１３６】
0003582965.tif 000040
【０１３７】
0003582965.tif 000041
【０１３８】
0003582965.tif 000042
【０１３９】
0003582965.tif 000043
【０１４０】
0003582965.tif 000044
【０１４１】
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【０１４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、バックボーンベクターｐＢＢＶリンカー作製のフローチャートを示す。
【図２】図２は、ｐＣＶ３（ＳＶ４０関連遺伝子クローニング用）作製のフローチャートを示す。
【図３】図３は、ｐＣＶ４（ＭＣＳ関連遺伝子クローニング用）作製のフローチャートを示す。
【図４】図４は、ＤＨＦＲカセット構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−１作製のフローチャートを示す。
【図５】図５は、ＮＥＯカセット構築用プラスミドｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ−２作製のフローチャートを示す。
【図６】図６は、ＤＨＦＲカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ作製のフローチャートを示す。
【図７】図７は、ＮＥＯカセットベクターｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ作製のフローチャートを示す。
【図８】図８は、ＭＣＳカセットベクターｐＥＸＰ−ＢＬ２作製のフローチャートを示す。
【図９】図９は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａ構築のフローチャートを示す。
【図１０】図１０は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−Ａのマップを示す。
【図１１】図１１は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡ構築のためのｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＮＥＯ−Ａ構築のフローチャートを示す。
【図１２】図１２は、本発明の発現ベクターｐＮＯＷ／ＣＭＶ−ＡＡのマップを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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