【手続補正書】
【提出日】平成28年11月16日(2016.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス胚幹（ＥＳ）細胞における対象とするゲノム遺伝子座でのゲノムを改変するためのインビトロの方法であって、
前記マウスＥＳ細胞を、Ｃａｓ９タンパク質、前記対象とするゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ標的配列にハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触させることを含み、
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１０ｋｂのサイズであり、かつ
（ｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の５’標的配列に相同である５’相同性アーム；及び
（ｉｉ）前記対象とするゲノム遺伝子座の３’標的配列に相同である３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含み、
前記マウスＥＳ細胞を、前記ＬＴＶＥＣの存在下で、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡと接触させた後、前記マウスＥＳ細胞のゲノムが、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の少なくとも３０ｋｂの欠失及び／または前記対象とするゲノム遺伝子座の前記挿入核酸の少なくとも３０ｋｂの挿入を含む標的遺伝子改変を含むように改変される、方法。
【請求項２】
前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む単一の核酸分子として導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一の核酸分子が、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態で一緒に融合した前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、別々に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質が、タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡの形態で導入され、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入され、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡの形態で導入される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓ９タンパク質、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質−ＲＮＡ複合体として導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、かつ
（ｃ）前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする第３の核酸に作動可能に連結された第３のプロモータを含む第３の発現構築物の形態であり、
ここで、前記第１、第２、及び第３のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性であり、
前記第１、第２及び第３の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または別々の核酸分子上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモータを含む第１の発現構築物の形態であり、かつ
（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡを含むｇＲＮＡをコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモータを含む第２の発現構築物の形態であり、
ここで、前記第１及び第２のプロモータが、前記マウスＥＳ細胞において活性であり、
前記第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にあるか、または別々の核酸分子上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、及び前記対象とするゲノム遺伝子座での前記挿入核酸の挿入を同時に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記欠失した内因性核酸配列が３０ｋｂ〜約１１０ｋｂであり、前記挿入核酸が約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的遺伝子改変が、２対立遺伝子の遺伝子改変である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記２対立遺伝子の遺伝子改変が、２つの相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変マウスＥＳ細胞が、前記対象とするゲノム遺伝子座で複合ヘテロ接合性であるか、または半接合性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
１つの染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での前記標的遺伝子改変が、内因性核酸配列の欠失及び前記挿入核酸の挿入を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的遺伝子改変が、（１）第１及び第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座での内因性核酸配列の欠失、ならびに（２）前記第１の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座への前記挿入核酸の挿入、及び前記第２の相同染色体における前記対象とするゲノム遺伝子座の撹乱を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂであるか；あるいは
前記標的遺伝子改変が、目的のゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記ＬＴＶＥＣが、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂである、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的遺伝子改変が、前記挿入核酸の挿入を含み、前記挿入核酸が、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂであるか；あるいは
前記標的遺伝子改変が、さらに、対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、ここで、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入核酸が、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記挿入核酸が、約４０ｋｂ〜約１４０ｋｂである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列には、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直ぐ隣接する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’相同性アームの合計が、１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子改変が、
（ａ）相同またはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置換、
（ｂ）内因性核酸配列の欠失、
（ｃ）内因性核酸配列の欠失であって、
少なくとも３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲に及ぶ、内因性核酸配列の欠失、
（ｄ）外因性核酸配列の挿入、
（ｅ）少なくとも３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、または約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲に及ぶ、外因性核酸配列の挿入、
（ｆ）相同またはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、
（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、
（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接する条件付き対立遺伝子の挿入、
（ｉ）前記マウスＥＳ細胞において活性なプロモータに作動可能に連結された選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子の挿入、あるいは、
（ｊ）それらの組み合わせ、を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失を含み、
前記欠失が、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂであるか；あるいは
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座における前記挿入核酸の挿入をさらに含み、前記挿入は少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記欠失は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂである、
請求項１〜２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
欠失する前記ゲノム遺伝子座の領域が、約３０ｋｂ〜約１１０ｋｂである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的遺伝子改変が、前記対象とするゲノム遺伝子座の領域の欠失と、前記挿入核酸の前記対象とするゲノム遺伝子座での挿入とを含み、前記欠失が少なくとも３０ｋｂであり、かつ前記挿入が少なくとも３０ｋｂである、請求項１〜２３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含む、改変されたマウスＥＳ細胞を特定することと、
（ｂ）前記改変されたマウスＥＳ細胞をマウス宿主胚に導入することと、
（ｃ）代理母において前記マウス宿主胚を懐胎させることと
をさらに含み、前記代理母が、前記対象とするゲノム遺伝子座で前記標的遺伝子改変を含むＦ０世代マウスを生み出す、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。