(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セル（２）上に保持させた媒質中に分散浮遊している微生物群又は微粒子群から特定の微生物（３）又は微粒子を顕微鏡（４）の視野下でマイクロピペット（６）内に吸引するマイクロマニピュレータであって、
媒質中の特定の微生物（３）又は微粒子にレーザ光を照射して当該微生物（３）又は微粒子をトラップするレーザトラッピング手段（７）と、
レーザ光によりトラップした微生物（３）又は微粒子以外の微生物群又は微粒子群を、前記媒質中に配設した少なくとも一対の電極（8A, 8B) 間に電界を形成させることにより一方または双方の電極（8A, 8B) に吸着させておく電気的吸着手段（９）と、
前記レーザトラッピング手段（７）によりトラップされた特定の微生物（３）又は微粒子を媒質中に進出されたマイクロピペット（６）内に吸引する吸引手段（10）とを備えたことを特徴とするマイクロマニピュレータ。
【請求項２】
微生物（３）又は微粒子を顕微鏡の視野下でマイクロピペット（６）内に吸入する際に、微生物又は微粒子を分散浮遊させた媒質液を保持するセルであって、
レーザ光を照射することにより媒質中の特定の微生物（３）又は微粒子をトラップする第一の領域（A1) と、前記レーザ光によりトラップされた特定の微生物（３）又は微粒子をマイクロピペットで吸引する第二の領域（A2) が、通路（21）を介して連通して形成され、
前記第一の領域には、媒質中に電界を形成する少なくとも一対の電極（8A, 8B) が配設されたことを特徴とするセル。
【請求項３】
微生物（３）又は微粒子を顕微鏡の視野下でマイクロピペット（６）内に吸入する際に、微生物又は微粒子を分散浮遊させた媒質液を保持するセルであって、
レーザ光を照射することにより媒質中の特定の微生物（３）又は微粒子をトラップした状態で、マイクロピペット（６）内に吸入する領域（Ａ）が形成されると共に、
媒質中に電界を形成する少なくとも一対の電極（8A, 8B) が前記領域（Ａ）を挟んで形成されていることを特徴とするセル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、媒質中に分散浮遊している微粒子群又は微生物群を顕微鏡でモニタしながら特定の微粒子又は微生物を一つだけ選択し、マイクロピペット内に吸引するマイクロマニピュレータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、大腸菌は遺伝子操作を行うために頻繁に使用されるが、この場合に、所定の薬液中に分散させて遺伝子操作を行った後、薬液中に分散する大腸菌を薬液ごとマイクロピペット等で吸入し、これを培養槽に移植して培養し、大量のＤＮＡを複製させるようにしている。
しかし、薬液中に分散している大腸菌は、固体差により、その全てが遺伝子操作されているわけではなく、これをマイクロピペットで吸入するときには同時に複数の大腸菌を吸入してしまうため、培養された大腸菌は遺伝子操作されたものとされないものが混合した状態になり、遺伝子操作されたものの収率が低い。
したがって、１個の大腸菌から培養することができればこれを純粋培養することができるので、その大腸菌が遺伝子操作されていれば、遺伝子操作された大腸菌だけを収率１００％で得ることが可能になる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、マイクロピペットで１個だけを吸引するためには、周囲の固体を同時に吸い込まないようにマイクロピペットの先端を細くしなければならず、その先端が折れやすいという問題があった。
細胞のように運動しない又は運動の鈍い微生物や微粒子については、媒質中の固体数を極端に少なくすることにより、比較的太めのマイクロピペットでも１個の固体を吸引することが可能となるが、大腸菌等のように動きが比較的速い（数μｍ〜数十μｍ／ｓ）ものについてはその動きに追従して操作することが難しく、１個だけを吸引することが困難であった。
【０００４】
また、自動制御等により追従して動かすことができたとしても、マイクロピペットを薬液内で移動させるときに薬液がかき回されて流れが生じ、吸引しようとする微生物自身が移動してしまうので、結局、薬液を大量に吸い込んで複数の微生物を同時に捕捉することはできても、微生物を１個だけ吸引することは困難であった。
そこで、本発明は、大腸菌のように動きの速い微生物や微粒子でも、これを１個だけ確実に吸引できるようにすることを技術的課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するために、本発明は、セル上に保持させた媒質中に分散浮遊している微生物群又は微粒子群から特定の微生物又は微粒子を顕微鏡の視野下でマイクロピペット内に吸引するマイクロマニピュレータであって、媒質中の特定の微生物又は微粒子にレーザ光を照射して当該微生物又は微粒子をトラップするレーザトラッピング手段と、レーザ光によりトラップした微生物又は微粒子以外の微生物群又は微粒子群を、前記媒質中に配設した少なくとも一対の電極間に電界を形成させることにより一方または双方の電極に吸着させておく電気的吸着手段と、前記レーザトラッピング手段によりトラップされた特定の微生物又は微粒子を媒質中に進出されたマイクロピペット内に吸引する吸引手段とを備えたことを特徴とする。
【０００６】
これによれば、媒質中の特定の微生物又は微粒子にレーザ光を照射すると当該微生物又は微粒子がその焦点位置にトラップされ、大腸菌のように速く動き回る細菌類でもその動きが停止される。
この状態で、媒質中に平等電界を形成するとその電界内に存在する荷電微粒子が反対極性の電極に向かって泳動される電気泳動現象を起こす。また、不平等電界を形成するとその電界内に存在する電気的に中性な微生物や微粒子は分極が生じ、両端に正負等しい量の電荷が誘導されるが、外部電界が一様でないため、力にアンバランスが生じ、微生物や微粒子が電界密度の高い方に向かって泳動される誘電泳動現象を起こす。
【０００７】
そして、この電気泳動，誘電泳動により、電極間にある微生物群又は微粒子群は、レーザ光によりトラップされた特定の微生物又は微粒子を除いて電極に向かって移動し、当該電極に吸着されるので、特定の微生物又は微粒子は他の微生物群又は微粒子群から分離される。
次いで、前記レーザ光を走査し、または、セルを移動させてその特定の微生物又は微粒子をマイクロピペット吸引位置まで移動させたり、マイクロピペットをトラップ位置まで進出させれば、特別細いマイクロピペットを用いることなく、特定の微生物又は微粒子を１個だけ確実に吸引することができる。
【０００８】
なお、誘電泳動は、電気泳動とは異なり、その違いは交流電界で顕著に現れる。すなわち、電気泳動は、電界が平等であるか不平等であるかにかかわらず、荷電粒子にクーロン力が作用して、荷電粒子がその極性と反対極の電極に引き寄せられるものでしるから、交流電界中においては、荷電粒子は電界の交番と共に向きを反転して一点を中心に振動するのみで並進運動は起こさないのに対し、誘電泳動では、電界の交番と共に分極された双極子の向きを反転させながら常に微生物又は微粒子は電界の強い方（誘電率によっては弱い方）へ運ばれる。
特に、微生物や微粒子を扱う場合、電極のすぐ近くに微生物や微粒子があるため、媒質液となる水溶液中で直流電界による電気泳動を利用すると電気分解などの電極反応の影響が問題となるのに対し、交流電界による誘電泳動現象を利用すれば電極反応が生じにくい。
【０００９】
また、この不平等電界は、二つの板状電極の面同士を対向させるのではなく形成するのではなく、例えば、一方又は双方の電極を針状又はナイフエッジ状（線状）に形成することにより、３次元的に不平等な電界を形成すればよい。
例えば、媒質中にナイフエッジ状の電極を対向させた場合、電極間に生じる電界の電気力線は、その断面方向から見ると、一方のナイフエッジ先端から放射状に広がって、他方のナイフエッジ先端に収束するので、電極先端近傍の電界が強く、電極の中間部分の電界が弱い不平等電界が形成される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に示す実施形態に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明に係るマイクロマニピュレータの一例を示す概略構成図、図２はそれに使用するセルを示す斜視図、図３は電極間に形成される不平等電界の模式図、図４は操作手順を示す説明図である。
【００１１】
電気的に中性な微生物を捕捉する場合を例にとって説明すると、図中１は、セル２に保持させた媒質液中から大腸菌等の微生物群から一つの固体を選択して捕捉するマイクロマニピュレータであって、前記セル２が倒立顕微鏡４のステージ５上に置かれ、前記微生物３を吸引するマイクロピペット６がセル２内に対し進退可能に配設されると共に、任意の照射位置にレーザ光を照射して当該照射位置にある特定の微生物３をトラップした状態で、前記レーザ光を走査し又はセル２が置かれたステージ５を移動させることによりレーザ光でトラップした特定の微生物３を前記微生物群から分離して媒質中に進出されたマイクロピペット６の先端位置（吸引位置）まで移送するレーザトラッピング手段７と、セル２上に溜めた媒質中に配設した少なくとも一対の電極８Ａ，８Ｂ間に不平等電界を形成することによりレーザ光でトラップした微生物３以外の微生物群を当該電極８Ａ，８Ｂに吸着させておく電気的吸着手段９と、前記レーザトラッピング手段７により特定の微生物３がマイクロピペット６の先端位置（吸引位置）まで移送されてきたときにこれを吸引する吸引手段１０とを備えている。
【００１２】
倒立型顕微鏡４は、ステージ移動装置１１によりＸ−Ｙ方向に移動可能に配設されたステージ５の下方に対物レンズ１２が配設されると共に、その光軸上にセル２内を撮影するＣＣＤカメラ１３がセットされ、当該ＣＣＤカメラ１３で撮影された像がディスブレイ装置１４に表示される。
そして、前記レーザトラッピング手段７は、倒立型顕微鏡４の対物レンズ１２を透過するレーザ光によりセル２内の微生物３をトラップするようになされ、レーザ光源１５から出力されるレーザ光の光路中には、レーザ光の照射位置をＸ方向及びＹ方向に移動させるスキャニングミラー１６ｘ，１６ｙを有するスキャニング装置１７及びダイクロイックミラー１８が介装され、当該ダイクロイックミラー１８で反射された反射されたレーザ光が対物レンズ１２を透過し、セル２内に集光されるように成されている。
なお、対物レンズ１２としては例えば倍率 100倍，ＮＡ＝1.30の液浸対物レンズが使用され、レーザ光源１５としては例えば半導体レーザが使用されている。
【００１３】
媒質液を保持するセル２は、図２に示すように、例えば極薄のガラス板で形成され、その板面２０上には、レーザ光を照射することにより媒質中の特定の微生物をトラップする第一の領域Ａ1 と、前記レーザ光によりトラップされた特定の微生物をマイクロピペットで吸引する第二の領域Ａ2 が、通路２１を介して連通して形成されている。
各領域Ａ1 及びＡ2 を仕切る仕切壁２２と、板面２０の周囲を囲む周壁２３は、例えばフォトレジスト法や印刷法により樹脂を板面２０上に付着させて形成されている。なお、各領域Ａ1 及びＡ2 は、板面２０に凹部を設けることにより形成する場合であってもよい。
【００１４】
そして、前記第一の領域Ａ1 には、媒質中に不平等電界を形成する電極８Ａ，８Ｂが配設されている。
この電極８Ａ，８Ｂは、互いに対向する面２４に複数の線状導体２５・・・が所定間隔で埋め込まれており、各電極８Ａ，８Ｂ間に交流・直流電圧を印加することにより、図３に示すような不平等電界が形成される。
これは、電気力線が、一方の電極８Ａの各線状導体２５から放射状に広がって、他方の電極８Ｂの各線状導体２５に収束するので、電極８Ａ，８Ｂの近傍２６では電気力線の密度が高く従って電界が強く、電極８Ａ，８Ｂの中間部分２７では電気力線の密度が低く従って電界が弱い不平等電界が形成される。
なお、電極８Ａ，８Ｂの形状はこれに限るものではなく、例えは一方が点又は線状の電極で、他方が面状であってもよく、要するに、電気的に中性な微生物，微粒子を誘電泳動により吸着させるときは、不平等電界が形成されるものであればよい。
【００１５】
また、セル２の裏面側には、圧電セラミックス，圧電素子，超磁歪素子等の振動子２８が取り付けられており、セル２を超音波振動させることによりセル２の板面２０に吸着した微生物や微粒子を振るい落とすようになされている。
【００１６】
３０は、マイクロマニピュレータ１を制御する制御装置であって、その入力側には、ＣＣＤカメラ１３，キーボード３１，マウス３２が接続され、その出力側には、ディスプレイ装置１４，レーザ光源１５の駆動装置３３，電極８Ａ，８Ｂ間に１ＭＨｚ程度の高周波の交流電界を形成する高周波発振器３４，振動子２８を駆動する振動発生装置３５，レーザスキャニング装置のドライバ３６，ステージ駆動装置１１が接続されいてる。
【００１７】
以上が本発明装置の一例であって、次に、その作用について図４（ａ）〜（ｄ）を伴って説明する。
まず、セル２をステージ５上にセットし、図４（ａ）に示すように、第一の領域Ａ1 内に多数の微生物（例えば大腸菌）を含む媒質液を滴下すると共に、第二の領域Ａ2 内に微生物のいない媒質液を滴下する。
この状態で放置すると、第一の領域Ａ1 内の微生物が通路２１から第二の領域Ａ2 に泳ぎ出してしまうので、すぐに高周波発振器３４により電極８Ａ，８Ｂに交流電圧を印加して不平等電界を形成させると、微生物は誘電泳動を起こして各電極８Ａ，８Ｂに向かって移動する。
このようにして、図４（ｂ）に示すように微生物を各電極８Ａ，８Ｂに吸着させ、第一の領域Ａ1 内に閉じ込めておく。
なお、このとき電極８Ａ，８Ｂ間には、例えば媒質液の抵抗率が１０ｋΩ・ｃｍ以上のときに、４００Ｖ／ｃｍ，１ＭＨｚ程度の交流電圧を印加する。
【００１８】
次いで、電極８Ａ，８Ｂに印加されている電圧を一時的に遮断すると不平等電界が消失し、図４（ｃ）に示すように、電極８Ａ，８Ｂ  に吸着されていた微生物が電極から離れて泳ぎだすので、これをディスプレイ装置１４で見ながら、電極８Ａ，８Ｂの中間位置にある特定の微生物３に対し、スキャニング装置１７によりレーザ光を照射すれば、その位置で微生物３がトラップされる。
【００１９】
そして、再び電極８Ａ，８Ｂに交流電圧を印加すると、図４（ｄ）に示すように、不平等電界が形成されるので、レーザ光によりトラップした特定の微生物３以外の微生物は再び電極８Ａ，８Ｂに吸着される。
ここで、スキャニング装置１７を駆動させてレーザ光を走査することにより、又はステージ駆動装置１１によりステージ５を移動させることにより、図４（ｄ）に示すように、レーザ光でトラップした特定の微生物３を第一の領域Ａ1 から通路２１を通って第二の領域内へ移動させ、予め媒質液内に進出させておいたマイクロピペット６の先端位置（吸入位置）に位置決めする。
【００２０】
そして、微生物３がレーザスポット外に移動しない程度までレーザ光の出力を弱めながら、吸引手段１０を作動させてマイクロピペット６内に微生物３を吸引すると、マイクロピペット６を移動させることなく、微生物を１個だけ確実に捕捉することができる。
また、他の微生物は電極８Ａ，８Ｂに吸着されているので第二の領域Ａ2 に泳ぎ出すことがなく、第二の領域Ａ2 にはレーザ光でトラップした特定の微生物しかいないので、マイクロピペット６の先端が多少太くても、確実に１個だけをマイクロピペット６内に吸引することができる。
【００２１】
次いで、マイクロピペット６をロボットアーム（図示せず）などにより培地を形成したマイクロプレート（図示せず）まで移動させて、マイクロプレート上に微生物３を吐出する。
これにより、例えば遺伝子操作した大腸菌を１個の菌から１００％の収率で純粋培養することがきる。
【００２２】
なお、電極８Ａ及び８Ｂは、図２に示す場合に限らず、図５（ａ）に示すように互いに対向する面２４に、長手方向に沿って線状導体２５を配設してもよい。この場合は、図５（ｂ）に示すように、厚さ方向に不平等な電界が形成される。
また、荷電粒子などを電気泳動により吸着させる場合は平等，不平等を問わず電界を形成すれば足りるので、板状の導体で電極８Ａ，８Ｂを形成し、その面同士を対向させて配設してもよい。
【００２３】
図６はセル２の他の実施形態を示す斜視図であって、本例では、二つの円形の穴６１及び６２を形成したセル板６３が、基板６４に重ねられて形成され、前記円形穴６１と基板６４で形成される凹部が、レーザ光を照射することにより媒質中の特定の微生物３又は微粒子をトラップする第一の領域Ａ1 となり、円形穴６２と基板６４で形成される凹部が、レーザ光によりトラップされた特定の微生物３又は微粒子をマイクロピペットで吸引する第二の領域Ａ2 となる。
そして、セル板６３の底面には、セル板６３が基板６４と重ねられたときに、前記各領域Ａ1 及びＡ2 を連通するトンネル型の通路２１となる溝が形成されている。
また、基板上には、前記第一の領域Ａ1 となる円形穴６１が重なる位置に、アルミを蒸着してなる薄膜電極８Ａ，８Ｂが形成されている。
【００２４】
これによれば、前記第一の領域Ａ1 に微生物が混在する資料となる媒質を満たし、前記第二の領域Ａ2 に微生物のいない媒質を満たして、第一の領域Ａ1 にレーザ光を照射し任意の微生物３を捕捉すると共に、電極８Ａ，８Ｂ間に電界を形成して他の微生物３を電極８Ａ，８Ｂに吸着させた後、トンネル型の通路２１を通ってこれを第二の領域Ａ2 に移送させる。
そして、第二の領域Ａ2 に移送された微生物３を、マイクロピペット６で吸引すれば、第二の領域Ａ2 にはレーザ光でトラップした特定の微生物しかいないので、マイクロピペット６の先端が多少太くても、確実に１個だけをマイクロピペット６内に吸引することができる。
【００２５】
図７はセル２のさらに他の実施形態を示す斜視図であって、本例では、レーザ光を照射することにより媒質中の特定の微生物３又は微粒子をトラップした状態で、マイクロピペット６内に吸入する領域Ａが形成されると共に、媒質中に電界を形成する少なくとも一対の電極８Ａ, ８Ｂが前記領域Ａを挟んで形成されている。
【００２６】
これによれば、前記領域Ａに微生物が混在する資料となる媒質を満たして、当該領域Ａ内にレーザ光を照射し任意の微生物３を捕捉すると共に、電極８Ａ，８Ｂ間に電界を形成して他の微生物３を電極８Ａ，８Ｂに吸着させる。
そして、この状態で、マイクロピペット６をレーザ光の照射位置まで進出させてトラップされている微生物３を吸引すれば、その近傍には、レーザ光でトラップした特定の微生物しかいないので、マイクロピペット６の先端が多少太くても、確実に１個だけをマイクロピペット６内に吸引することができる。
【００２７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、微生物群又は微粒子群の中からレーザトラッピング手段により特定の微生物や微粒子をレーザ光でトラップしてその動きを止め、トラップした特定の微生物又は微粒子以外の他の微生物又は微粒子は電気的吸着手段により電極に吸着させておくことができ、レーザ光でトラップした特定の微生物や微粒子をマイクロピペットで吸入させれば、マイクロピペットの先端近傍には微生物や微粒子が１個だけ位置決めされ、他の微生物や微粒子は存在しないので、先端が比較的太いマイクロピペットを使用しても微生物や微粒子を確実に１個だけ吸引することができるという大変優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るマイクロマニピュレータの一例を示す概略説明図。
【図２】それに使用するセルを示す斜視図。
【図３】電極間に形成される不平等電界の模式図。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は夫々操作手順を示す説明図。
【図５】（ａ），（ｂ）は夫々他の電極を示す斜視図及び電界模式図。
【図６】セルの他の例を示す斜視図。
【図７】セルのさらに他の例を示す斜視図。
【符号の説明】
１・・・マイクロマニピュレータ
２・・・セル
３・・・微生物
４・・・倒立顕微鏡
６・・・マイクロピペット
７・・・レーザトラッピング手段
８Ａ，８Ｂ・・電極
９・・・電気的吸着手段
１０・・・吸引手段
２０・・・板面
Ａ1 ・・・第一の領域
Ａ2 ・・・第二の領域
２１・・・通路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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