【手続補正書】
【提出日】平成28年11月22日(2016.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹（ＥＳ）細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を有する自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含む、非ヒト動物の遺伝子改変された体細胞であって、
前記部位特異的リコンビナーゼカセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るような様式で、互いに対して同じ方向に配向した第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接し、
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、前記遺伝子改変された体細胞ではなく、未分化多能性幹細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する、体細胞。
【請求項２】
（ａ）前記体細胞は、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、腎細胞、肝細胞、および脂肪細胞からなる群から選択されるか、または
（ｂ）前記体細胞は、線維芽細胞である、
請求項１に記載の遺伝子改変された体細胞。
【請求項３】
前記線維芽細胞は、ブタまたはウシから得られる、請求項２に記載の遺伝子改変された体細胞。
【請求項４】
前記ブタは、ミニブタである、請求項３に記載の遺伝子改変された体細胞。
【請求項５】
（ａ）前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、
（ｂ）前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、胚盤胞期胚のＥＳ細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動するか、あるいは、
（ｃ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に選択マーカー遺伝子をさらに含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結しており、好ましくは、前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、
請求項１に記載の遺伝子改変された体細胞。
【請求項６】
（ａ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞のゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｂ）前記体細胞の遺伝子改変されたゲノムは、条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｃ）前記リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｄ）前記リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｅ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記体細胞のゲノム内の転写活性遺伝子座に位置するか、あるいは
（ｆ）前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、
請求項１に記載の遺伝子改変された体細胞。
【請求項７】
選択マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ遺伝子を含まない、遺伝子改変およびクローン化された非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）核酸コンストラクトを、非ヒト動物の分化体細胞内に導入し、遺伝子改変されたゲノムを形成することと、
（ｂ）（ａ）の遺伝子改変されたゲノムを、除核宿主卵母細胞内に導入することと、
（ｃ）（ｂ）の卵母細胞を融合および活性化させて、人工的接合体を形成することと、
（ｄ）前記接合体が胚盤胞胚形成期に達するまで、（ｃ）の人工的接合体を培養することと、
（ｅ）（ｄ）の胚盤胞を代理母の子宮内に移植し、前記選択マーカー遺伝子および前記リコンビナーゼ遺伝子を含まない前記遺伝子改変されたクローン化非ヒト動物を形成することとを含み、
前記核酸コンストラクトは、ＥＳ細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含み、
前記リコンビナーゼ発現カセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るように、同じ方向で配向した第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接し、
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、前記分化体細胞ではなく、未分化多能性幹細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する方法。
【請求項８】
（ａ）前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、あるいは
（ｂ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に位置する選択マーカー遺伝子を含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結しており、好ましくは、前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞のゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｂ）前記体細胞は、前記ゲノム内に条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｃ）前記核酸コンストラクトは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しており、好ましくは、前記プロモーターは、構成的プロモーターであるか、
（ｄ）前記核酸コンストラクトは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、請求項１７に記載の方法。
（ｅ）前記核酸コンストラクトは、プロモーターに作用可能に連結した選択マーカー遺伝子を含むか、あるいは
（ｆ）前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
分化体細胞からの遺伝子改変されたゲノムを含む、非ヒト動物のクローン化卵母細胞であって、前記遺伝子改変されたゲノムは、ＥＳ細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を有する自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含み、前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第１および第２の組み換え部位が隣接している、クローン化卵母細胞。
【請求項１１】
（ａ）前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、トリ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびロバからなる群から選択されるか、
（ｂ）前記分化体細胞は、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、および脂肪細胞からなる群から選択されるか、あるいは
（ｃ）前記分化体細胞は、線維芽細胞である、
請求項１０に記載のクローン化卵母細胞。
【請求項１２】
前記線維芽細胞は、ブタまたはウシから得られる、請求項１１に記載のクローン化卵母細胞。
【請求項１３】
前記ブタは、ミニブタである、請求項１２に記載のクローン化卵母細胞。
【請求項１４】
（ａ）前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、
（ｂ）前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、胚盤胞期胚のＥＳ細胞において部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動するか、あるいは
（ｃ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に選択マーカー遺伝子を含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結しており、好ましくは、前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、
請求項１０に記載のクローン化卵母細胞。
【請求項１５】
（ａ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞ゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｂ）前記体細胞は、ゲノム内に条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｃ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｄ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接しているか、
（ｅ）前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記体細胞ゲノム内の転写活性遺伝子座に位置するか、あるいは
（ｆ）前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、
請求項１０に記載のクローン化卵母細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
一実施形態において、核酸コンストラクトは、標的化コンストラクトである。一実施形態において、標的化コンストラクトは、ノックアウト対立遺伝子を含む。一実施形態において、標的化コンストラクトは、ノックイン対立遺伝子を含む。一実施形態において、核酸コンストラクトは、導入遺伝子を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
胚性幹（ＥＳ）細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を有する自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含む、非ヒト動物の遺伝子改変された体細胞であって、
前記部位特異的リコンビナーゼカセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るような様式で、互いに対して同じ方向に配向した第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接し、
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、前記遺伝子改変された体細胞ではなく、未分化多能性幹細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する、体細胞。
（項目２）
前記体細胞は、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、腎細胞、肝細胞、および脂肪細胞からなる群から選択される、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目３）
前記体細胞は、線維芽細胞である、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目４）
前記線維芽細胞は、ブタから得られる、項目３に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目５）
前記ブタは、ミニブタである、項目４に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目６）
前記線維芽細胞は、ウシから得られる、項目３に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目７）
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目８）
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、胚盤胞期胚のＥＳ細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目９）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に選択マーカー遺伝子をさらに含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結している、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１０）
前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、項目９に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１１）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞のゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１２）
前記体細胞の遺伝子改変されたゲノムは、条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１３）
前記リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１４）
前記リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１５）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記体細胞のゲノム内の転写活性遺伝子座に位置する、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１６）
前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、項目１に記載の遺伝子改変された体細胞。
（項目１７）
選択マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ遺伝子を含まない、遺伝子改変およびクローン化された非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）核酸コンストラクトを、非ヒト動物の分化体細胞内に導入し、遺伝子改変されたゲノムを形成することと、
（ｂ）（ａ）の遺伝子改変されたゲノムを、除核宿主卵母細胞内に導入することと、
（ｃ）（ｂ）の卵母細胞を融合および活性化させて、人工的接合体を形成することと、
（ｄ）前記接合体が胚盤胞胚形成期に達するまで、（ｃ）の人工的接合体を培養することと、
（ｅ）（ｄ）の胚盤胞を代理母の子宮内に移植し、前記選択マーカー遺伝子および前記リコンビナーゼ遺伝子を含まない前記遺伝子改変されたクローン化非ヒト動物を形成することとを含み、
前記核酸コンストラクトは、ＥＳ細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含み、
前記リコンビナーゼ発現カセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るように、同じ方向で配向した第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接し、
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、前記分化体細胞ではなく、未分化多能性幹細胞において前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する方法。
（項目１８）
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に位置する選択マーカー遺伝子を含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結している、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞のゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記体細胞は、前記ゲノム内に条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
前記核酸コンストラクトは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸コンストラクトは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目１７に記載の方法。
（項目２５）
前記核酸コンストラクトは、プロモーターに作用可能に連結した選択マーカー遺伝子を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２６）
前記プロモーターは、構成的プロモーターである、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２８）
分化体細胞からの遺伝子改変されたゲノムを含む、非ヒト動物のクローン化卵母細胞であって、前記遺伝子改変されたゲノムは、ＥＳ細胞特異的プロモーターに作用可能に連結した部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を有する自己切断型リコンビナーゼ発現カセットを含み、前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットには、前記カセットが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で切断され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第１および第２の組み換え部位が隣接している、クローン化卵母細胞。
（項目２９）
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、トリ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびロバからなる群から選択される、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３０）
前記分化体細胞は、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、および脂肪細胞からなる群から選択される、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３１）
前記分化体細胞は、線維芽細胞である、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３２）
前記線維芽細胞は、ブタから得られる、項目３１に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３３）
前記ブタは、ミニブタである、項目３２に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３４）
前記線維芽細胞は、ウシから得られる、項目３１に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３５）
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、Ｏｃｔ−３／４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｉｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３６）
前記ＥＳ細胞特異的プロモーターは、胚盤胞期胚のＥＳ細胞において部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の転写を駆動する、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３７）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記第１および第２の組み換え部位の間に選択マーカー遺伝子を含み、前記選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作用可能に連結している、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３８）
前記選択マーカー遺伝子に作用可能に連結した前記プロモーターは、構成的プロモーターである、項目３７に記載のクローン化卵母細胞。
（項目３９）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含まず、前記選択マーカー遺伝子は、前記体細胞ゲノム内の別の遺伝子座に位置し、前記選択マーカー遺伝子には、前記選択マーカーが前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、互いに対して同じ方向に配向した第３および第４の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目４０）
前記体細胞は、ゲノム内に条件付きノックアウト対立遺伝子を含み、前記条件付きノックアウト対立遺伝子には、前記条件付き対立遺伝子が前記部位特異的リコンビナーゼの存在下で除去され得るように、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目４１）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目４２）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、標的化されている内在性遺伝子の少なくとも１つのイントロンに相同性のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列には、前記第１および第２の組み換え部位が、上流側および下流側で隣接している、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目４３）
前記自己切断型リコンビナーゼ発現カセットは、前記体細胞ゲノム内の転写活性遺伝子座に位置する、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。
（項目４４）
前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼからなる群から選択される、項目２８に記載のクローン化卵母細胞。