(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列、配列番号１に示すアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有し、下記の理化学的性質を有する組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡ；
（１）  作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンを示す。
（３）  熱安定性
水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しない。
【請求項２】
配列表における配列番号２に示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
遺伝子コードの縮重に基づき、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
スルフォロブス属の微生物に由来する請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項６】
自律複製可能なベクターが、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）又はｐＫＫ２２３−３である請求項５に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項８】
宿主が大腸菌である請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の形質転換体を液体培地中で培養し、培養物から下記の理化学的性質を有する組換え型耐熱性酵素を採取することを特徴とする組換え型耐熱性酵素の製造方法；
（１）  作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンを示す。
（３）  熱安定性
水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しない。
【請求項１０】
培養物中の組換え型耐熱性酵素を遠心分離、瀘過、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取することを特徴とする請求項９に記載の組換え型耐熱性酵素の製造方法。
【請求項１１】
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に請求項９又は１０に記載の製造方法で得られた組換え型耐熱性酵素を作用させて、トレハロースを遊離させる工程を含んでなる非還元性糖質の酵素的変換方法。
【請求項１２】
非還元性糖質濃度が５０％（ｗ／ｗ）以下の水溶液中に請求項９又は１０に記載の製造方法により得られた組換え型耐熱性酵素を共存せしめ、５５℃を越える温度で作用させる請求項１１に記載の非還元性糖質の酵素的変換方法。
【請求項１３】
非還元性糖質が、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に非還元性糖質生成酵素を作用させて得られたものである請求項１１又は１２に記載の非還元性糖質の酵素的変換方法。
【請求項１４】
非還元性糖質が、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請求項１１、１２又は１３に記載の非還元性糖質の酵素的変換方法。
【請求項１５】
還元性澱粉糖に、非還元性糖質生成酵素と、請求項９又は１０に記載の製造方法により得られる組換え型耐熱性トレハロース遊離酵素とを同時に作用させるか、これらの酵素をこの順序で作用させてトレハロースを生成させ、生成したトレハロース、又は、これを含む糖質を採取することを特徴とする、トレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１６】
還元性澱粉糖が、澱粉質を酸及び／又はアミラーゼにより部分加水分解して得られるグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖であることを特徴とする、請求項１５に記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１７】
澱粉枝切酵素を併用することを特徴とする請求項１５又は１６に記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１８】
トレハロース、又は、これを含む糖質を採取するに際し、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項１５、１６又は１７に記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１９】
トレハロースが、含水結晶又は無水結晶である請求項１５乃至１８のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなかった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、主として菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにもみられるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、菌体に含まれるトレハロースが高々１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げるのが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム属やアルスロバクター属に属するある種の微生物がグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することを見出し、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）に開示した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム属やアルスロバクター属に属する微生物が産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることも見出した。
【０００５】
ところが、上記微生物が産生する酵素は、いずれも４０℃付近に至適温度を有しており、実際にトレハロースの製造に使用するには熱安定性にやや難のあることが判明した。すなわち、斯界においては、澱粉や澱粉質を糖化するには、一般に、５５℃を越える温度で反応させるのが望ましいとされており、これは、５５℃以下で糖化すると雑菌汚染が顕著となり、反応物のｐＨが低下して酵素が失活したり、これにより、大量の基質が未反応のまま残存したりすることによる。敢えて熱安定性に劣る酵素で糖化しようとすると、ｐＨの推移に多大の注意を払わなければならず、万一、ｐＨが顕著に低下した場合には、反応物にアルカリ等を加えて可及的速やかにｐＨを上昇させるなどの対策を講じなければならない。
【０００６】
斯かる状況に鑑み、本発明者らが、斯かる作用ある耐熱性酵素につき引続き検索したところ、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を始めとするスルフォロブス属の微生物が産生する酵素は、５５℃を上回る温度で反応させても、実質的に失活することなく、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質から効率的にトレハロースを遊離することを見出した。しかしながら、これら微生物は酵素の産生能が充分でなく、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質からトレハロースを大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００７】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記耐熱性酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素を創製することにある。
【０００９】
この発明の別の目的は、その創製された組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【００１１】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
【００１２】
この発明のさらに別の目的は、斯かる形質転換体を利用する、組換え型耐熱性酵素の製造方法を提供することにある。
【００１３】
この発明のさらに別の目的は、組換え型耐熱性酵素を利用する、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素的変換方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、下記の理化学的性質を有する組換え型耐熱性酵素により解決するものである。
（１）    作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
（２）    分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンを示す。
（３）    等電点
等電点電気泳動法により測定すると、約５．６乃至６．６に等電点を示す。
（４）    温度安定性
水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベートしても、実質的に失活しない。
【００１５】
この発明は、前記第二の課題を、上記組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１６】
この発明は、前記第三の課題を、上記組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１７】
この発明は、前記第四の課題を、上記組換え型耐熱性酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１８】
この発明は、前記第五の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物から組換え型耐熱性酵素を採取してなる組換え型耐熱性酵素の製造方法により解決するものである。
【００１９】
この発明は、前記第六の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に上記組換え型耐熱性酵素を作用させてトレハロースを遊離させる工程を含んでなる非還元性糖質の酵素的変換方法により解決するものである。
【００２０】
【作用】
この発明の組換え型耐熱性酵素は、５５℃を越える温度で反応させても、実質的に失活することなく、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
【００２１】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、これを、通常、当該酵素を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該酵素の産生を発現する。
【００２２】
この発明の組換えＤＮＡは、通常、当該酵素を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該酵素の産生を発現する。
【００２３】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該酵素を産生する。
【００２４】
斯かる形質転換体をこの発明の製造方法にしたがって培養すれば、所望量の当該酵素が容易に得られる。
【００２５】
この発明の酵素的変換方法により、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質は、トレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換される。
【００２６】
この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の全く新規な耐熱性酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素はスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）の培養物から得ることができ、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合わせてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１）    作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
（２）    分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンを示す。
（３）    等電点
等電点電気泳動法により測定すると、約５．６乃至６．６に等電点を示す。
（４）    至適温度
ｐＨ６．０で３０分間反応させると、７５℃付近に至適温度を示す。
（５）    至適ｐＨ
６０℃で３０分間反応させると、ｐＨ５．５乃至６．０付近に至適ｐＨを示す。
（６）    熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、８５℃付近まで安定である。
（７）    ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至９．５まで安定である。
【００２７】
次に、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の理化学的性質を解明すべく行った実験について説明する。
【００２８】
【実験例１  精製酵素の調製】
５００ｍｌ容フラスコに０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地を約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、硫酸を加えてｐＨ３．０に調整した。この液体培地にスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を接種し、７５℃、１３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して第一の種培養液を得た。１０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約５ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整後、第一の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養して第二の種培養液を得た。その後、３００ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約２５０ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整後、第二の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、通気量１００ｌ／分で４２時間通気撹拌培養した。
【００２９】
約１７０ｌの培養物をＳＦ膜により膜濾過し、遠心分離して得られた湿重量約２５８ｇの菌体を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｌに浮遊させ、超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた約３００ｍｌの上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で２４時間静置後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈澱部を採取し、適量の１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、新鮮な同じ緩衝液に対して２４時間透析後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して酵素活性ある約３００ｍｌの上清を得た。
【００３０】
この上清を予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール』約３６０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．３Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１０時間透析し、遠心分離により不溶物を除去した後、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用ゲル『ブチルトヨパール６５０』約３５０ｍｌのカラムに負荷し、１Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。
【００３１】
硫酸アンモニウム濃度０．２Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１６時間透析し、遠心分離により不溶物を除去した後、予め０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製ゲル瀘過クロマトグラフィー用ゲル『トヨパールＨＷ−５５』約３５０ｍｌのカラムに負荷し、カラムに０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。溶出液から酵素活性ある画分を採取し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１６時間透析し、遠心分離により不溶物を除去した後、ブチルトヨパール６５０を使用する疎水クロマトグラフィーを再度適用し、溶出液から酵素活性ある画分を採取した。この画分を予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいたファルマシア製ゲル瀘過クロマトグラフィー用カラム『スーパーローズ１２  ＨＲ  １０／３０』に負荷し、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液して得られる溶出液から酵素活性ある画分を採取した。このようにして調製した精製酵素の比活性は約７３０単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約０．８６単位であった。
【００３２】
常法により、この精製酵素を７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したところ、ゲル上には酵素活性を伴なう実質的に単一のバンドが観察され、精製酵素が極めて高純度であることが窺われた。
【００３３】
なお、この発明を通じて、耐熱性酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、基質としてα−マルトトリオシルトレハロースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）を４ｍｌとり、これに適宜希釈した酵素液を１ｍｌ加え、６０℃で３０分間インキュベートして反応させた後、反応物を１ｍｌとり、ソモギ銅液２ｍｌに加えて反応を停止させ、ソモギ−ネルソン法により還元力を測定する。同時に、予め１００℃で３０分間加熱して失活させておいた酵素液を使用する系を設け、上記と同様に処置して対照とする。耐熱性酵素の１単位とは、上記反応条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素の量と定義する。
【００３４】
【実験例２  耐熱性酵素の理化学的性質】
【００３５】
【実験例２−１  作用】
基質としてα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に２０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、これに実験例１で調製した精製酵素を基質固形分１ｇ当たり２単位加え、６０℃で４８時間反応させた。反応物を常法により脱塩後、和光純薬工業製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により糖組成を分析した。高速液体クロマトグラフィーは室温下で実施し、溶出液を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニタしながら、溶離液として水を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。別途、基質としてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオースを使用する５種類の系を設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
表１の結果は、精製酵素が末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースとグルコース又はマルトオリゴ糖をほぼ定量的に遊離する一方、グルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖には全く作用しなかったことを示している。これらの事実は、精製酵素が末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に選択的に作用し、そのトレハロース残基とグリコシル残基間のグリコシド結合を特異的に加水分解することを示唆している。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規な作用機序を辿るものと推定される。
【００３８】
【実験例２−２  分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、第６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンに相当する位置に酵素活性を伴なう単一バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００３９】
【実験例２−３  等電点】
２％（ｗ／ｖ）アンフォラインを含むポリアクリルアミドゲル上で精製酵素を等電点電気泳動したところ、約５．６乃至６．６に等電点を示した。
【００４０】
【実験例２−４  至適温度】
常法により、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、相違する温度で３０分間反応させたところ、図１に示すように、精製酵素は７５℃付近に至適温度を示した。
【００４１】
【実験例２−５  至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違するマッキルヴェイン氏緩衝液中、６０℃で３０分間反応させたところ、図２に示すように、精製酵素はｐＨ５．５乃至６．０付近に至適ｐＨを示した。
【００４２】
【実験例２−６  熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、相違する温度で６０分間インキュベートしたところ、図３に示すように、精製酵素は８５℃付近まで安定であった。
【００４３】
【実験例２−７  ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違するマッキルヴェイン氏緩衝液又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートしたところ、図４に示すように、精製酵素はｐＨ５．５乃至９．５付近まで安定であった。
【００４４】
【実験例２−８  Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、パーキン・エルマー製気相プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用して分析したところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４５】
【実験例２−９  部分アミノ酸配列】
精製酵素を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で６４時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め８％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、８％（ｖ／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約５７分後に溶出したペプチド断片を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片は配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４６】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
【００４７】
そこで、本発明者が、配列表における配列番号３及び４に示す部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）の染色体ＤＮＡを鋭意検索したところ、配列表における配列番号２に示す５´末端からの塩基配列を有する約１，７００塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、同微生物が産生する耐熱性酵素は５５６個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号１に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４８】
配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１）    供与体微生物の培養物から耐熱性酵素を分離し、高度に精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。一方、その精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解し、加水分解物からペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２）    別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分消化し、消化物から約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３）    大腸菌にこの組換えＮＤＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４）    形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００４９】
次の実験例３及び４では、上記（２）乃至（４）の工程を具体的に説明するが、これら実験例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行などにも詳述されている。
【００５０】
【実験例３  耐熱性酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００５１】
【実験例３−１  染色体ＤＮＡの調製】
５００ｍｌ容フラスコに０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地を約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、硫酸を加えてｐＨ３．０に調整した。この液体培地にスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を接種し、７５℃、１３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。１０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約５ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養した。
【００５２】
遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結し、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５３】
【実験例３−２  組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１８と形質転換体ＳＵ１８の調製】実験例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ  ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）』を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ  ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４  ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得られた組換えＤＮＡにストラタジーン・クローニング・システムズ製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加え、３７℃で１時間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５４】
このようにして得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを５０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された約７，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列のＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏで表わされる配列に基づき５´−ＴＴＹＡＡＲＹＴＮＴＧＧＧＣＮＣＣ−３´で表わされる塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した１２種類の形質転換体を選択した。
【００５５】
常法により、これら１２種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列のＧｌｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓで表わされる配列に基づき化学合成した５´−ＣＡＲＴＧＧＧＴＮＧＡＹＧＡＹＴＴＹＣＡ−３´で表わされる塩基配列のプローブ２を同位体３２Ｐで標識後、イー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３乃至５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じて上記組換えＤＮＡにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。このようにして得た組換えＤＮＡ及び形質転換体を、それぞれ、『ｐＳＵ１８』、『ＳＵ１８』と命名した。
【００５６】
形質転換体ＳＵ１８をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１８は約６，０００塩基対からなり、図５に示すように、当該酵素をコードする約１，７００塩基対からなるＤＮＡを制限酵素Ｓｓｐ  Ｉによる切断部位の下流に連結していた。
【００５７】
【実験例３−３  形質転換体ＳＵ１８による組換え型耐熱性酵素の産生】
５００ｍｌ容フラスコに０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例３−２で調製した形質転換体ＳＵ１８を接種し、３７℃、１３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、１０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約５ｌとり、同様に滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養した。培養物を常法により超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去した後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約３０単位の組換え型耐熱性酵素が検出された。
【００５８】
対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又はスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）をアンピシリン無含有の上記と同一組成の液体培地を使用し、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）の場合、始発ｐＨ及び培養温度をそれぞれ３．０及び７５℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の酵素活性を測定したところ、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）による耐熱性酵素の産生は培養物１ｌ当たり約２単位と、形質転換体ＳＵ１８と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は耐熱性酵素を全く産生しなかった。
【００５９】
その後、形質転換体ＳＵ１８が産生した組換え型耐熱性酵素を実験例１乃至２の方法により精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンと等電点電気泳動で約５．６乃至６．６に等電点を示すとともに、水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しないなど、供与体微生物であるスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素とほぼ同じ理化学的性質を有していた。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても耐熱性酵素を製造でき、且つ、その生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６０】
【実験例４  相補鎖ＤＮＡの調製並びにその塩基配列及びアミノ酸配列の決定】
実験例３−２で得た組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１８を２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５´−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３´で表わされる塩基配列のプライマーを５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマーを５´末端から３´末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６１】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ  ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６２】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を分析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す約１，７００塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はその配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号３及び４に示す部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号３の配列は配列番号５における第１乃至３０番目の配列に、また、配列番号４の配列は配列番号５における第３０１乃至３１９番目の配列に一致した。これは、この発明の組換え型耐熱性酵素が配列表における配列番号１に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有することあり、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）由来のＤＮＡにおいては、そのアミノ酸配列が配列表における配列番号２に示す５´末端からの塩基配列によりコードされていることを示している。
【００６３】
以上説明したように、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する耐熱性酵素は、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この耐熱性酵素を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え型耐熱性酵素並びにその製造方法及び用途につき、具体的に説明する。
【００６４】
この発明でいう組換え型耐熱性酵素とは、組換えＤＮＡ技術により創製され、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する耐熱性酵素全般を意味する。この発明の組換え型耐熱性酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号１に示すＮ末端からのアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の理化学的性質を実質的に変えることなく、配列番号１のアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の理化学的性質は保持しているものの、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それが所期の理化学的性質を具備しているかぎり、当然、この発明の組換え型耐熱性酵素に包含される。
【００６５】
この発明による組換え型耐熱性酵素は、特定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号２に示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。
【００６６】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を含むスルフォロブス属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１日乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００６７】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
【００６８】
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩＩ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ｂｓｔ  ＸＩ、Ｈｐａ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００６９】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、末端トレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質を含む栄養培地で培養し、該糖質よりトレハロースを遊離するものを選択すればよい。
【００７０】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、瀘過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常に方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合わせて適用すればよい。
【００７１】
前述のとおり、この発明による組換え型耐熱性酵素は、５５℃を越える温度で反応させても、実質的に失活することなく、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離するという、従来の酵素には見られない独特の性質を有する。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点がある。当該酵素のこの性質を利用することにより、従来、還元性故に敬遠されがちであった種々の澱粉糖を、還元性を有しないか還元性が顕著に低下した、扱い易い、有用な糖質に変換できることとなる。
【００７２】
斯かる変換方法につきさらに説明すると、この発明による組換え型耐熱性酵素の基質にはα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースなどの末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質が用いられる。斯かる非還元性糖質は、澱粉又はアミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を酸及び／又はアミラーゼにより部分加水分解して得られるグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に、例えば、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）や同じ特許出願人による特願平６−１６６０１１号明細書（特開平８−６６１８８号公報）に開示されている非還元性糖質生成酵素を作用させることにより得ることができる。これら非還元性糖質生成酵素の基質となり得るグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖は、通常、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の１種又は２種以上を含んでなる。アミラーゼ研究会編『ハンドブック・オブ・アミレーシーズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、１９８８年、バーガモン・プレス発行に記載されているα−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ及びマルトヘキサオース生成アミラーゼは、斯かる還元性澱粉糖の調製に特に有用であり、これらアミラーゼのいずれかを使用することにより、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を豊富に含む澱粉糖混合物が容易且つ効率的に得られる。なお、このとき、必要に応じて、プルラナーゼやイソアミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用すれば、非還元性糖質生成酵素の基質となり得る還元性澱粉糖の収量を上げることができる。斯かる還元性澱粉糖の１種又は２種以上を濃度５０％（ｗ／ｗ）まで含む水溶液に非還元性糖質生成酵素を適量共存せしめ、水溶液を、通常、温度４０乃至８５℃に、また、ｐＨを約４乃至８の範囲に保ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応させる。
【００７３】
この発明による変換方法においては、通常、基質として上記したような非還元性糖質の１種又は２種以上を含む水溶液にこの発明の組換え型耐熱性酵素を共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量のトレハロースが遊離するまで反応させる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の基質濃度下でも進行するが、この発明による変換方法を大規模に実施する場合には、より高濃度の２％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨは組換え型耐熱性酵素が失活することなく基質に効率的に作用するレベルに設定され、温度は５５℃を越え、８５℃を越えないレベルに、望ましくは、約５６乃至７０℃に、また、ｐＨは４乃至７、望ましくは、約５乃至６の範囲に設定される。組換え型耐熱性酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設定する。斯くして、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質は効率的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換され、α−マルトトリオシルトレハロースの場合、変換率は約９９％にも達する。澱粉加水分解物に前記アミラーゼのいずれかと、非還元性糖質生成酵素及び当該酵素を同時に作用させるときには、非還元性糖質が生成すると同時にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に分解されるので、トレハロース含量の高い糖組成物が収量良く、効率的に得られる実益がある。
【００７４】
この発明の変換方法により得られた反応物はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精製する。すなわち、瀘過、遠心分離などにより反応物から不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とする。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的にトレハロースのみからなる製品を得るには、上記シロップ状物にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコール、アセトンなどによる分別沈澱、膜瀘過、酵母による発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種又は２種以上を適用する。大量に反応物を処理するには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は疑似移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であり、これらの方法によるときには、トレハロースの含量が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。
【００７５】
斯くして得られるトレハロース及びトレハロースを含む糖組成物は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例えば、飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として極めて有用である。
【００７６】
以下、２〜３の実施例により、この発明による組換え型耐熱性酵素の製造方法と非還元性糖質の変換方法を具体的に説明する。
【００７７】
【実施例Ａ−１  組換え型耐熱性酵素の製造】
５００ｍｌ容フラスコに１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例３−２の方法で得た形質転換体ＳＵ１８を接種し、３７℃、１３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、３０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃まで冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００７８】
培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり、約３５０単位の組換え型耐熱性酵素が産生していた。この上清を実験例１の方法により精製したところ、比活性約７２０単位／ｍｇ蛋白質の組換え型耐熱性酵素を１ｍｌ当たり約２３０単位含む水溶液が約１２ｍｌ得られた。
【００７９】
【実施例Ａ−２  組換え型耐熱性酵素の製造】
【００８０】
【実施例Ａ−２（ａ）  形質転換体の作製】
実験例３−２の方法により得た組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１８を制限酵素Ｓｓｐ  Ｉ及びＢａｎ  ＩＩＩで切断し、配列表の配列番号２に示す塩基配列における第２２乃至７４０番目までの塩基配列を含む約７２０塩基対のＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片に予め制限酵素Ｓｓｐ  Ｉ及びＢａｎ  ＩＩＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）』を加え、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩静置して連結させることにより、第一の組換えＤＮＡを得た。
【００８１】
別途、常法により化学合成した５´−ＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡ−３´、５´−ＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＡＡＴ−３´、５´−ＡＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＡ−３´、５´−ＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡ−３´及び５´−ＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３´で表わされる塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドを適量混合し、１００℃、６５℃、３７℃及び２０℃でそれぞれ２０分間インキュベートしてアニールさせた。得られた配列表の配列番号６に示す塩基配列と配列番号２に示す塩基配列における第１乃至２１番目までの塩基配列からなる５５塩基対の二本鎖ＤＮＡに予め制限酵素Ｓｓｐ  Ｉで切断しておいた第一の組換えＤＮＡを上記と同様にして連結させることにより、配列表の配列番号６に示す塩基配列と配列番号２の塩基配列における第１乃至７４０番目までの塩基配列を含む第二の組換えＤＮＡを得た。
【００８２】
次に、実験例３−２の方法により得た組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１８を制限酵素Ｂａｎ  ＩＩＩ及びＢｓｔ  ＸＩにより切断し、得られた配列表の配列番号２に示す塩基配列における第７４１乃至１，６６８番目までの塩基配列を含む約１，６００塩基対のＤＮＡ断片に、予め制限酵素Ｂａｎ  ＩＩＩ及びＢｓｔ  ＸＩにより切断しておいたプラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）』を連結させて第三の組換えＤＮＡを得た。
【００８３】
別途、常法により化学合成した５´−ＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧ−３´、５´−ＧＴＡＴＡＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴ−３´、５´−ＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＡ−３´及び５´−ＡＴＴＧＡＴＡＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴ−３´で表わされる塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドを適量混合し、上記と同様にしてアニールさせた。得られた配列表の配列番号２に示す塩基配列における第１，６３９乃至１，６６８番目までの塩基配列を含む４０塩基対の下記の化１に示す塩基配列の二本鎖ＤＮＡに予め制限酵素Ｈｐａ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉにより切断しておいた第三の組換えＤＮＡを連結させることにより、配列表の配列番号２に示す塩基配列における第７４１乃至１，６６８番目までの塩基配列と化１に示す塩基配列を含む第四の組換えＤＮＡを得た。
【００８４】
【化１】
0003557289.tif 000003
【００８５】
次に、第二の組換えＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＢａｎ  ＩＩＩにより切断して得られた配列表の配列番号２に示す塩基配列における第１乃至７４０番目までの塩基配列を含んでなる約７７０塩基対のＤＮＡ断片及び第四の組換えＤＮＡを制限酵素Ｂａｎ  ＩＩＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断して得られた配列表の配列番号２に示す塩基配列における第７４１乃至１，６６８番目までの塩基配列を含んでなる約９３０塩基対のＤＮＡ断片を予め制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結させ、配列番号２に示す塩基配列を含むこの発明による組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１９を得た。
【００８６】
斯くして得られた組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１９を実験例３−２の方法に準じて宝酒造製コンピテントセル『ＢＭＨ７１−１８』に導入し、当該酵素をコードするＤＮＡを含むこの発明による形質転換体ＳＵ１９を得た。実験例３−２の方法により形質転換体ＳＵ１９を培養し、培養物から菌体を採取し、溶出させた組換えＤＮＡを精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ  ｐＳＵ１９は約６，３００塩基対からなり、図６に示すように、当該酵素をコードする１，６６８塩基対からなるＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｓｐ  Ｉによる切断部位の下流に連結していた。
【００８７】
【実施例Ａ−２（ｂ）  形質転換体による組換え型耐熱性酵素の製造】
形質転換体ＳＵ１９を２％（ｗ／ｖ）マルトース、４％（ｗ／ｖ）『Ｎ−Ｚ−Ｓｏｙペプトン』（シグマ製）、２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例Ａ−１と同様にして培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約８００，０００単位の組換え型耐熱性酵素が産生していた。この上清を実験例１の方法により精製したところ、比活性約７２０単位／ｍｇ蛋白質の組換え型耐熱性酵素を１ｍｌ当たり約３，２００単位含む水溶液が約１，８５０ｍｌ得られた。
【００８８】
実験例２の方法によりこの精製酵素の性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量５４，０００乃至６４，０００ダルトンと等電点電気泳動で約５．６乃至６．６に等電点を示すとともに、水溶液（ｐＨ７．０）中、８５℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しないなど、供与体微生物であるスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素とほぼ同じ理化学的性質を有していた。
【００８９】
【実施例Ｂ−１  トレハロースを含むシロップ状物への変換】
【００９０】
【実施例Ｂ−１（ａ）  耐熱性非還元性糖質生成酵素の調製】
５００ｍｌ容フラスコに０．１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム七水塩、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カリウム及び水からなる液体培地を約１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、硫酸を加えてｐＨ３．０に調整した。この液体培地にスルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）を接種し、７５℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養して第一の種培養液を得た。１０ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約５ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整後、第一の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、通気量５００ｍｌ／分で２４時間通気撹拌培養して第二の種培養液を得た。その後、３００ｌ容ファーメンターに上記と同一組成の液体培地を約２５０ｌとり、同様に滅菌し、７５℃まで冷却し、ｐＨ３．０に調整後、上記で得た第二の種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、７５℃、通気量１００ｌ／分で４２時間通気撹拌培養した。
【００９１】
約１７０ｌの培養物をＳＦ膜により膜濾過し、遠心分離して得られた湿重量約２５８ｇの菌体を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｌに浮遊させ、超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた約３００ｍｌの上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で２４時間静置後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈澱部を採取し、適量の１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、新鮮な同じ緩衝液に対して２４時間透析後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して酵素活性ある約３００ｍｌの上清を得た。
【００９２】
この上清を予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール』約３６０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．３Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１０時間透析後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した後、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用ゲル『ブチルトヨパール６５０』約３５０ｍｌのカラムに負荷し、１Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。
【００９３】
硫酸アンモニウム濃度０．８Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１６時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した後、予め０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化しておいたセプラコル製ゲル瀘過クロマトグラフィー用ゲル『ウルトロゲルＡｃＡ  ４４』約３５０ｍｌのカラムに通液した。溶出液から酵素活性ある画分を採取し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して１６時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した後、予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化しておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『Ｍｏｎｏ  Ｑ』約１０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を通液した。そして、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、トレハロースの製造に供した。このようにして得た非還元性糖質生成酵素の比活性は約８１単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約０．２４単位であった。
【００９４】
なお、この発明を通じて、非還元性糖質生成酵素の活性は、次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、基質としてマルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を４ｍｌとり、これに適宜希釈した酵素液を１ｍｌ加え、６０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、１００℃で３０分間加熱して反応を停止させる。反応物を１ｍｌとり、脱イオン水で１０倍希釈した後、ソモギ−ネルソン法により還元力を測定する。同時に、予め１００℃で３０分間加熱して失活させておいた酵素液を使用する系を設け、上記と同様に処置して対照とする。非還元性糖質生成酵素の１単位とは、上記反応条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を消失させる酵素量と定義する。
【００９５】
【実施例Ｂ−１（ｂ）  トレハロースを含むシロップ状物への変換】
とうもろこし澱粉を１５％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。ｐＨ６．０に調整後、ノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミール６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を糊化・液化した。澱粉液化液を１２０℃で３０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５８℃に冷却し、ｐＨ５．５に調整後、澱粉固形分１ｇ当たり、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を３，０００単位、実施例Ｂ−１（ａ）の方法で得た耐熱性非還元性糖質生成酵素を３．０単位、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型耐熱性酵素を５．０単位加え、６４時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮し、濃度約６０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００９６】
粘度と還元性低く、トレハロース、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、グルコース、マルトース、マルトトリオース及びマルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖を固形分当たりそれぞれ７１．０％、２．９％、１．０％、４．９％、１０．５％、８．２％又は１．５％含む本品は、まろやかで上品な甘味に加えて適度の保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【００９７】
【実施例Ｂ−２  トレハロースを含む粉状物への変換】
本例では、実施例Ｂ−１のシラップ状物におけるトレハロース含量を高めるべく、イオン交換樹脂によるカラム分画を実施した。すなわち、東京有機化学工業製ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を水中に懸濁し、内径５．４ｃｍ、長さ５ｍのジャケット付きステンレス製円筒管４本に均一に充填し、円筒管を直列に連結してカラムの全長を２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に保ちつつ、実施例Ｂ−１（ｂ）の方法で得たシロップ状物を適宜希釈し、カラムに対して５％（ｖ／ｖ）負荷し、５５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で通液してシロップ状物に含まれる糖質を分画した。溶出液の糖組成を分析し、トレハロース含量の高い画分のみを採取し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、固形分当たりトレハロースを約９７％含む粉状物を原料固形分当たり約５５％の収量で得た。
【００９８】
まろやかで上品な甘味を有しながらも、実質的な還元性を有しない本品は、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【００９９】
【実施例Ｂ−３  結晶性トレハロースを含む粉状物への変換】
実施例Ｂ−２の方法で得たトレハロース含量の高い画分を約７５％（ｗ／ｗ）まで濃縮後、助晶機に移し、緩やかに撹拌しながら助晶して晶出率約４５％のマスキットを得た。約８５℃の温風を噴霧乾燥塔の上部から下方に向かって送風しつつ、このマスキットを約１５０ｋｇ／ｃｍ２の加圧下、噴霧乾燥塔の上部に設  けた噴霧ノズルより噴霧乾燥塔の下方に向かって噴霧する一方、噴霧乾燥塔の底部に設けた金網コンベア上に捕集した結晶性粉状物を、コンベア下部より約４５℃の温風を送風しつつ、噴霧乾燥塔外に徐々に搬出した。その後、粉状物を熟成塔に移し、約４０℃の温風を送風しながら１０時間熟成して結晶化と乾燥を完了した。このようにして、トレハロース含水結晶を含む粉状物を原料固形分当たり約９０％の収率で得た。
【０１００】
まろやかで上品な甘味を有しながらも、実質的な還元性を有しない本品は、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１０１】
【実施例Ｂ−４  結晶性トレハロースを含む粉状物への変換】
タピオカ澱粉を３６％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、懸濁液に炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。ｐＨ６．０に調整後、ノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミール６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を糊化・液化した。澱粉液化液を１２０℃で３０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５８℃に冷却し、ｐＨ５．２に調製後、澱粉固形分１ｇ当たり、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を２，０００単位、実施例Ｂ−１（ａ）の方法で得た耐熱性非還元性糖質生成酵素を２．５単位、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型耐熱性酵素を５．０単位加え、７２時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、５０℃に冷却し、ナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固形分１ｇ当たり１０単位加え、４０時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを７５．５％含むシロップ状物を得た。
【０１０２】
シロップ状物を約８４％（ｗ／ｗ）まで濃縮後、助晶機に移し、種晶としてトレハロース含水結晶を固形分当たり約２％（ｗ／ｗ）加え、緩やかに撹拌しながら助晶して晶出率約４５％のマスキットを得た。このマスキットをプラスチック製バットに分注し、室温で３日間静置して固化・熟成させた後、バットからブロック状物を取出し、切削機により粉砕して、トレハロース含水結晶を含む固状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【０１０３】
実質的に吸湿性を示さず、取扱い易い本品は、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１０４】
【実施例Ｂ−５  結晶性トレハロースを含む粉状物への変換】
馬鈴薯澱粉を６％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、ナガセ生化学工業製α−アミラーゼ剤『ネオスピターゼ』を澱粉固形分当たり０．０１％（ｗ／ｗ）加え、ｐＨ６．２に調整後、温度８５乃至９０℃に保ちつつ１時間反応させて澱粉を糊化・液化させた。澱粉液化液を１２０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、６０℃に冷却後、ｐＨを５．５に調整し、澱粉１ｇ当たり、ノボ・ノルディスク・インダストリー製プルラナーゼ剤『プロモザイム２００Ｌ』を５００単位、実施例Ｂ−１（ａ）の方法で得た耐熱性非還元性糖質生成酵素を３．０単位、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型耐熱性酵素を５．０単位加え、４８時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、５０℃、ｐＨ５．０に調整後、ナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固形分１ｇ当たり１０単位加え、４０時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを７９．３％含むシロップ状物を得た。
【０１０５】
このシロップ状物をナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂としてオルガノ製『Ｃ６０００』を用いた以外は実施例Ｂ−２と同様にカラム分画し、固形分当たりトレハロースを約９５％含む画分を採取し、約７５％（ｗ／ｗ）まで濃縮後、実施例Ｂ−４と同様に助晶し、得られたマスキットのブロック状物を粉砕して、トレハロース含水結晶を含む粉状物を原料澱粉固形分当たり約７０％の収量で得た。
【０１０６】
実質的に吸湿性を示さず、取扱い易い本品は、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１０７】
【実施例Ｂ−６  無水結晶トレハロースを含む粉状物への変換】
林原生物化学研究所製アミロース『ＥＸ−Ｉ』１重量部を水１５重量部に加熱溶解し、溶液を６５℃、ｐＨ５．５に調整後、アミロース固形分１ｇ当たり実施例Ｂ−１（ａ）の方法により得た耐熱性非還元性糖質精製酵素を２．０単位と実施例Ａ−２の方法により得た組換え型耐熱性酵素を６．０単位加え、４８時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、５０℃、ｐＨ５．０に調整後、ナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』をアミロース固形分１ｇ当たり１０単位加え、さらに４０時間反応させた。新たに生じた反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、常法にしたがって濾過し、活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製後、濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して固形分当たりトレハロースを８２．２％含むシロップ状物を得た。
【０１０８】
このシロップ状物を実施例Ｂ−５と同様にしてカラム分画し、固形分当たりトレハロースを９８％含む画分を採取し、減圧下で加熱しながら約８５％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、種晶として無水結晶トレハロースを固形分当たり約２％（ｗ／ｗ）加え、撹拌しながら１２０℃で５分間混合後、プラスチック製バットに分注し、１００℃で真空乾燥して結晶化させた。その後、バットからブロック状物を取出し、切削機により粉砕したところ、結晶化率約７０％の無水結晶トレハロースを含む水分含量約０．３％（ｗ／ｗ）の固状物を原料アミロース固形分当たり約７０％の収率で得た。
【０１０９】
無水結晶トレハロースには含水物の水分を吸収し、トレハロース含水結晶に変わる性質があるので、無水結晶トレハロース含量の高い本品は、飲食物、化粧品及び医薬品を始めとする組成物並びにそれら組成物の原料及び中間加工物を脱水又は乾燥するための安全な脱水剤として有用である。また、まろやかで上品な甘味を有する本品は、甘味剤、呈味改善剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品及び医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１１０】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する新規な耐熱性酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により、この耐熱性酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。この発明の組換え型耐熱性酵素を使用する変換方法によるときには、雑菌汚染を懸念することなく、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質をトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖からなる糖組成物に効率的に変換すことができる。斯くして得られるトレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく、飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。しかも、この発明の組換え型耐熱性酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使用し得るものである。
【０１１１】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【０１１２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：５５６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
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【０１１３】
配列番号：２
配列の長さ：１６６８
配列の型：核酸
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【０１１４】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメントの種類：Ｎ末端フラグメント
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【０１１５】
配列番号：４
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメントの種類：中間部フラグメント
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【０１１６】
配列番号：５
配列の長さ：１６６８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
配列の特徴
起源
生物名：スルフォロブス・アシドカルダリウス
株名：ＡＴＣＣ３３９０９
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【０１１７】
配列番号：６
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：オリゴヌクレオチド
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【図面の簡単な説明】
【図１】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の至適温度を示す図である。
【図２】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素の熱安定性を示す図である。
【図４】スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）が産生する耐熱性酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】この発明による組換えＤＮＡであるｐＳＵ１８の制限酵素地図である。
【図６】この発明による組換えＤＮＡであるｐＳＵ１９の制限酵素地図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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