(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症疾患起炎菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）菌が保有するＤＮＡを、制限酵素Pst Iで処理して得られる配列番号１乃至７に記載の少なくとも１つの塩基配列からなるＤＮＡ断片を含み、かつストレプトコッカス・ニューモニエ菌が保有するＤＮＡと特異的に反応することを特徴とする感染症診断用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、感染症疾患の原因菌、特に、細菌性肺炎の代表的起炎菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  菌の検出および同定に有用なプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
病理学的に、感染とは病原性の微生物（以下、「菌」と称する）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立することを指し、生体内での菌の増殖に起因する発症は、宿主の抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するものである。
【０００３】
感染症の中でも、ストレプトコッカス・ニューモニエ菌（肺炎球菌）などの細菌を原因とする肺葉および気管支の炎症、すなわち、細菌性肺炎の治療体系の改善が、当該技術分野では急務とされていた。  すなわち、細菌性肺炎は、ストレプトコッカス・ニューモニエ  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  菌、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）  菌などの細菌が、肺胞腔を主な炎症の場として発症することに端を発するものであり、臨床的には、通常、上気道炎症状に引き続き、突然に悪寒戦慄をもって発症し、４０℃前後の高熱が弛張し、激しい咳嗽、胸痛、喀痰が出現する。  また、全身倦怠感、食欲不振、頭痛といった全身症状も強く、呼吸困難、チアノーゼを呈し、また、合併症として菌血症、髄膜炎、関節炎を併発することもあり、時に致死的経過をとる重篤かつ緊急な感染症である。
【０００４】
このように、細菌性肺炎については、特に、的確な早期診断のもとに、適切な早期治療を実施することが必要であることから、迅速な治療方法の改善が待望されている。
【０００５】
さらに、肺炎を含めた感染症に羅病すると、生体組織内では第一義的には好中球、単球及びマクロファージ系の食細胞がその防御機能を果たし、また、優勢になった菌が食細胞組織から血液中に侵出したことにより、血液中に菌が出現するものと考えられている。
【０００６】
一般には、細胞の食菌力が菌の毒力に及ばず、ストレプトコッカス・ニューモニエ菌などの細菌が、肺葉および気管支の組織に定着して炎症を引き起こす現象が細菌性肺炎と定義されている。  そして、従来の細菌性肺炎の診断においては、（１）  臨床症状、（２）  検体の培養、（３）  検体に含まれる菌のグラム染色、および（４）  ショック状態の確認が必須であり、これらの項目が確認されて初めて治療方針が決定される。  典型例では、前述の臨床症状、胸部Ｘ線所見、および好中球増加、ＣＲＰ（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｃ反応性蛋白質）など急性相反応性物質の増加を認めることによって推定はできるものの、確定診断のためには、喀痰、胸水あるいは血液などの検体から起炎菌を検索・確定した上で、菌の種類に応じた適切な抗生物質を使用し、治療しなければならない。  従って、臨床現場においては、迅速かつ確実な原因菌の同定が望まれている。
【０００７】
また、近年は、レジオネラ肺炎、カリニ肺炎などの新しい型の肺炎も確認されており、さらには、ＭＲＳＡ（メシチリン耐性黄色ブドウ球菌）といった耐性株の出現もみられ、起炎菌検索の重要性はさらに増大してきている。
【０００８】
しかしながら、実際には、起炎菌の確定は困難を伴うのが通常であり、特に、市中肺炎の場合、３０〜５０％程度は起炎菌不明のまま治療が開始されていると言われている。  すなわち、細菌性肺炎が疑われた患者の起炎菌の検索方法としては、喀痰、上気道分泌物、胸水、病巣局所、あるいは血液からの採取試料を検体として使用し、まず、これを塗沫検査により炎症細胞などの観察により検査材料としての適否を判断し、次いでグラム染色を行って、陽性・陰性の別、球菌・桿菌の別を決定する。  そして、選択培地を用いて菌を培養することで、起炎菌種の同定が行われるのが一般的な手順である。  ところが、この方法によると、菌の培養に長時間を要する上に、常在菌の混入が避けられず、また、細菌性肺炎を疑われた時点で、大量に抗生物質を投与されている場合には、たとえ検体中に菌が含まれていても、増菌・増殖できない場合が多く、実際には、これら検体からの菌の培養の成功率は極めて低いものとなっている。
【０００９】
さらに、サブルーチンとしての方法に、菌体成分や菌の代謝産物の機器分析法（辨野義己、「ガスクロマトグラフィーによる細菌同定の迅速化」、臨床検査、ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１２，  ｐｐ．１６１８−１６２３  、１９８５年１１月、医学書院参照）、特異抗体を利用した方法（特開昭６０−２２４０６８号参照）  、さらには、ＤＮＡの特異性を利用したハイブリダイゼーションによる方法（特表昭６１−５０２３７６号）  等があるが、いずれも、菌の分離及び増菌培養が必須とされている。
【００１０】
一方、感染症における食細胞の機能に着目したものとして、血液試料中の白血球成分が集中しているバフィーコート（Ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。  一般にバフィーコート標本で菌が検出される頻度は、成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に３０％程度にとどまるが、新生児の場合、１０例中７例（７０％）で菌を検出している報告もあり、塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関する情報は治療における大きな指針となっている。
【００１１】
上記従来技術においては、その前処理操作として、少なくとも検体からの菌の選択的分離に１〜２日、増菌に１日、固定操作に１日以上、合計で３〜４日は十分かかり、現実にはこの培養を菌が発育するまで続けることになるので、前処理操作に一週間以上要する場合が多く、さらに、菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌が混入しても区別できない場合もある。
【００１２】
そして重要なことは、前述した事情から、培養すべき検体中の多くの菌は食細胞に取り込まれ、抗生物質投与のため死んでいるか静止状態にあるため、培養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、臨床検体を用いた培養による実際の菌の検出率は１０％前後と、非常に低い。  換言すれば、臨床的に肺炎の可能性が疑われた患者の血液をさらに一昼夜以上培養して検査しても結局、その９０％は菌の存在すら判明しないのが現状である。
【００１３】
このような状況から、現在は起炎菌の確定と、それに即した抗生物質の選択が要求されているにもかかわらず、臨床的に細菌性肺炎の可能性が疑われた段階で、検出結果が出るのを待たずに治療、すなわち、起炎菌不明のまま、最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質を投与し、１、２日間様子を見て、効果が現れないと別の抗生物質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである。
【００１４】
また、検体中の菌を染色により検出する方法では、生体成分も菌と同様に染色されるため、検鏡して認められる形態によってのみ迅速に菌を判別するのは、熟練が必要であり、判定が困難な場合もある。
【００１５】
このように、迅速・確実な診断が求められる疾患であるにもかかわらず、従来の診断方法では十分対応できていなかったのが実情である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記当該技術分野が抱えている課題に鑑みて完成されたものであり、その要旨とするところは、感染症原因菌、特に、細菌性肺炎の代表的起炎菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  菌が保有するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的な反応性を有するプローブ、および、当該プローブに含まれるストレプトコッカス・ニューモニエ菌が本質的に保有している遺伝子部分の塩基配列を解明することにある。
【００１７】
すなわち、本発明のプローブにより、例えば、食細胞に取り込まれて破壊されつつある菌においてなお維持されている菌のＤＮＡを、その特異性に基づいて有為に検出でき、これにより、菌を培養・増殖せずに、感染症疾患の原因菌が迅速かつ確実に検出できる。  また、これらのプローブの塩基配列情報を参照してプライマーをデザインすれば、ハイブリダイゼーションを行わなくとも、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅により、感染症原因菌を同定することができる。
【００１８】
また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブを非放射性のもの、例えば、ビオチン化したプローブを用いれば、放射性同位元素使用施設のない一般検査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、検出作業が迅速、簡便に行える。
【００１９】
以下に、感染症疾患、特に、肺炎起炎菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ  （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  菌に由来するプローブの実施例を示す。
【００２０】
【実施例】
実施例１：ストレプトコッカス・ニューモニエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  菌由来ＤＮＡプローブ
（１）  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌由来ＤＮＡプローブの調製
臨床菌株  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  をＢＨＩ  （Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地で一晩培養し、培養菌体を集菌して、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ  ＳＧ  を加えた上で、  Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ法（”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ  ｂｙ  ｐｈｅｎｏｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ｖｏｌ．  ７２，  ｐｐ．６１９−６２９  （１９６３））に従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した。
【００２１】
抽出したＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩで完全消化し、ベクターｐＧＥＭ−３Ｚ  にランダムクローニングし、得られたクローンから  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  菌特有の、すなわち、天然の  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  菌が保有するＤＮＡとの特異的反応性を示したＤＮＡ断片を含む７種のプローブを選抜した。
【００２２】
そして選抜された各プローブを、プローブＳＰ−２２  、プローブＳＰ−２３  、プローブＳＰ−２５  、プローブＳＰ−２６  、プローブＳＰ−５−１５  、プローブＳＰ−５−３４  、およびプローブＳＰ−６−６と命名し、その制限酵素地図を図１ならびに図２に示した。
【００２３】
（２）  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌由来ＤＮＡプローブの種特異性の検討
各プローブと各種感染症原因菌株のＤＮＡとの反応性を、以下の方法により検討した。
【００２４】
まず、検討対象菌株として、下記表１に列挙した臨床単離株および寄託菌株を準備した。  なお、表１中の、ヒト・ゲノミックＤＮＡおよび対照試料の入手源として、４名の健康な成人男子から採取した白血球、ならびにプラスミド  ｐＧｅｍ−３２を含んだ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｋ−１２，  ＪＭ１０９形質転換体をそれぞれ準備した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
そして、各臨床菌株を実施例１（１）  に記載の方法に従って、各菌株が保有するＤＮＡを抽出し、この抽出したＤＮＡの一定量（例えば、５μｌ）をナイロンフィルタにスポットし、アルカリ変性したものをドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの試料とした。  なお、ヒト・ゲノミックＤＮＡ試料は、前出のＳａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ  法に、先に入手した白血球を適用することで調製した。  一方、対照試料は、後述する実施例２（１）  に記載のプラスミドＤＮＡの調製方法に、先に入手したプラスミド  ｐＧｅｍ−３２を含んだ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，  ＪＭ１０９  形質転換体を適用することで調製した。    次いで、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ  （ＢＲＬ社製）  でラベルしたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌由来のＤＮＡプローブを、マニアティスのマニュアル（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）”，
Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８２））に従い、４５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ  、４２℃の条件下で、終夜ハイブリダイゼーションを実施した。
【００２７】
終夜ハイブリダイゼーションを終えた試料を、５５℃にて  ０．１×ＳＳＣ  、０．１％ＳＤＳ  による２０分間の洗浄を２回行った後に、  Ａｎｔｉ−Ｄｉｇ−ＡＬＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＢＲＬ社製）  で検出・発色させ、ハイブリダイゼーションの状況を確認した。
【００２８】
各プローブと各臨床菌株のＤＮＡとの反応性に関する実験結果を、下記表２に示した。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
上記表２から明らかなように、いずれのプローブもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌に由来するＤＮＡに対してのみ反応性を示し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  属以外の菌種由来のＤＮＡはもちろん、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の他の菌種由来のＤＮＡに対しても反応性（ハイブリッドの形成）が認められず、その種特異性が確認された。
【００３１】
実施例２：塩基配列の解析
実施例１にて種特異性が確認されたＤＮＡプローブ（計７本）の塩基配列を下記の方法に従って決定した。
【００３２】
（１）  プラスミドＤＮＡの調製
サブクローンされた（塩基配列を決定すべき）挿入断片を  ｐＧｅｍ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に含んだＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，  ＪＭ１０９形質転換体を、５ｍｌの  Ｌｕｒｉａ−ＢａｃｔａｎｉＭｅｄｉｕｍ  （ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ，  １０ｇ／１Ｌ；  ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ５ｇ／１Ｌ；  ＮａＣｌ，  １０ｇ／１Ｌ；  ５Ｎ  ＮａＯＨ  でｐＨ  ７．０に調整）に植菌し、一晩培養した。
【００３３】
培養液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ．）して集菌した。    沈澱物に２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）  を含む  ５０ｍＭ  グルコース／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  溶液を  １００μｌ  加え、室温で５分間放置した。    得られた懸濁液に１％の濃度でドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含む  ０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて混合した。    ５Ｍ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ４．８）  １５０μｌ  をさらに加えて混合し、１５分間氷冷した。
【００３４】
そして、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，  １５ｍｉｎ．）して得た上清を、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、上清に２倍量のエタノールを加え、さらに遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，  ５ｍｉｎ．）して沈澱を得た。    この沈澱物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液  １００μｌ  に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、室温で１５分間放置した。
【００３５】
この調製物に  ０．１Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．８）  を  ３００μｌ  加え、フェノール／ＣＨＣｌ３処理し、上清にエタノールを加えて沈澱を得た。    この沈澱物を乾燥し、１０μｌ  の蒸留水に溶解したものをＤＮＡ試料とした。
【００３６】
（２）  塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理を  ＡｕｔｏＲｅａｄ（登録商標）  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｓｉａ）を用いて行った。
【００３７】
すなわち、鋳型となるＤＮＡが３２μｌ  溶液中に５〜１０μｇ  の濃度になるように調整した。  １．５ｍｌのミニチューブ（エッペンドルフ）に、鋳型ＤＮＡ  ３２μｌ  を移し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を８μｌ  加えて穏やかに混合した。    そして、軽く遠心した後、室温で１０分間放置した。
【００３８】
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）  ７μｌ  と蒸留水４μｌ  を加え、さらにエタノールを  １２０μｌ  加えて混合し、ドライアイス上で１５分間放置した。    そして、１５分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを集め、注意しながら上清を除去した。    得られた沈澱物を７０％エタノールで洗浄し、１０分間遠心分離した。    そして、注意しながら再度上清を除去し、減圧条件下で沈澱物を乾燥した。
【００３９】
沈澱物を蒸留水１０μｌ  に溶解し、螢光性のプライマー〔Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｍ１３  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ５’−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄ  ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ  −３’（１．６ｐｍｏｌ／μｌ；  ０．４２  Ａ２６０  ｕｎｉｔ／ｍｌ）；  Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ５’−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄ  ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ  −３’（２．１ｐｍｏｌ／μｌ；  ０．４２  Ａ２６０  ｕｎｉｔ／ｍｌ）  〕２μｌ  （０．４２  Ａ２６０  ｕｎｉｔ／ｍｌ，  ４〜６ｐｍｏｌ）とアニーリング用緩衝液２μｌ  を加え穏やかに混合した。
【００４０】
そして、軽く遠心した後、６５℃で５分間熱処理を行い、素早く３７℃条件下に置き、そこで１０分間保温した。    保温後１０分以上室温で放置し、軽く遠心した。    そして、延長用緩衝液１μｌ  とジメチルスルホキシド３μｌ  を加えたものを試料とした。
【００４１】
４本のミニチューブにＡ、Ｃ、ＧおよびＴと記入し、それぞれのチューブにＡＭｉｘ  （ｄｄＡＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）  、Ｃ  Ｍｉｘ  （ｄｄＣＴＰ  をｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）  、Ｇ  Ｍｉｘ  （ｄｄＧＴＰ  をｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）  およびＴ  Ｍｉｘ（ｄｄＴＴＰをｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃ７ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと共に溶解したもの）  を  ２．５μｌ  ずつ分注した。    なお、それぞれの溶液は使用時までは氷中で保存し、使用時には３７℃で１分間以上保温してから使用した。
【００４２】
希釈したＴ７ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；６〜８ｕｎｉｔｓ／２μｌ）２μｌ  をＤＮＡ試料に加え、ピペッティングもしくは穏やかな混合により、完全に混合した。
【００４３】
混合後すぐに、この混合液を  ４．５μｌ  ずつ保温しておいた４種の溶液に分注した。  なお、分注に際しては新しいチップを用いた。
【００４４】
３７℃で５分間保温し、停止溶液を５μｌ  ずつそれぞれの反応液に加えた。
【００４５】
この分注においても、新しいチップを用いた。    ９０℃で２〜３分間保温し、すぐに氷中で冷却した。    電気泳動には１レーンあたり４〜６μｌ  を泳動した。
【００４６】
（３）  塩基配列の決定
実施例１および２に開示した、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌が保有するＤＮＡに対して特異性を有するプローブそれぞれの塩基配列の決定を、泳動温度４５℃、泳動時間６時間として、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  を用いて行った。
【００４７】
その結果、プローブＳＰ−２２（配列番号１）、プローブＳＰ−２３（配列番号２）  、プローブＳＰ−２５（配列番号３）  、プローブＳＰ−２６（配列番号４）  、プローブＳＰ−５−１５（配列番号５）、プローブＳＰ−５−３４（配列番号６）、およびプローブＳＰ−６−６（配列番号７）それぞれの塩基配列の全容が明らかとなった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のプローブを用いれば、例えば、食細胞に取り込まれた感染症原因菌を増殖することなく直接検出し、かつ菌を迅速にしかも正確に同定できる。  すなわち、本発明のプローブを用いた診断では、１回分の検体で菌の同定まで行え、診断に要する時間も従来法の３〜４日（検出される率は低い）  から、約１〜２日と飛躍的に短縮でき、しかもその検出率は格段と高い。  それ故、細菌性肺炎の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、感染症患者に早期の内に有効な治療が実施でき、ひいては死亡率の低減も期待される。
【００４９】
また、感染症疾患起炎菌の中でも、特に、肺炎の発症に深く関連する、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌が保有するＤＮＡに特異的に反応するプローブの塩基配列を明らかにしたことにより、これらプローブを人工的に調製することを可能とした。  さらに、解析した塩基配列の情報の一部を利用して作製したプライマーを用いて、臨床検体に含まれる感染症原因菌のＤＮＡを、ＰＣＲ法によって増幅して、原因菌の迅速な診断に役立てることができる。
【００５０】
さらに、臨床検体に含まれるＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの塩基配列と本発明によって解析された塩基配列とを比較参照することにより、肺炎起炎菌種の迅速な同定が行える。
【００５１】
上記したように、本発明は、所期の目的であった感染症診断用プローブを提供するのみならず、ＰＣＲ用プライマー作製の指針として、また臨床検体に含まれるＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡとの比較参照用に適した標準配列として優れた有用性が期待され、さらには感染症疾患起炎菌（肺炎起炎菌）が保有するＤＮＡに特異的に反応するプローブの今後の探究・開発における貴重な手がかりをもたらすなどの優れた効果を奏するものである。
【００５２】
また、本願出願にて開示した塩基配列は、臨床分離株のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡをランダムにクローニングして得られたものであり、それ故、本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。
【００５３】
さらに、野性株が保有するＤＮＡに変異部分が存在することは当然考えられるが、上記実施例の開示から明らかなように、当該ＤＮＡ変異部分が、感染症診断のためのハイブリダイゼーションへ利用する際の本発明プローブの特異性、あるいは本願出願にて開示した塩基配列情報を感染症の迅速診断を目的としたＰＣＲ法のプライマーをデザインするために利用できる等の、本発明が奏する有用性には何ら影響を与えるものではない。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌検出用プローブ  ＳＰ−２２、  ＳＰ−２３、および  ＳＰ−２５の制限酵素ＰｓｔＩの制限酵素地図である。
【図２】ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌検出用プローブ  ＳＰ−２６、ＳＰ５−１５、ＳＰ５−３４、および  ＳＰ６−６の制限酵素ＰｓｔＩの制限酵素地図である。
【図１】
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【図２】
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