【手続補正書】
【提出日】平成29年1月30日(2017.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物であって、そのゲノム内に、少なくとも１つの改変内在性長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座のノックアウトを、前記非ヒト動物が前記ノックアウトに関連した表現型を示すように含む、非ヒト動物。
【請求項２】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）遺伝子座である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記ノックアウトが前記ｌｎｃＲＮＡまたはその一部をコードする１または複数のエクソンの欠失を含む、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記ノックアウトが、
（ａ）前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソンを含む前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンの欠失、
（ｂ）前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと最後のエクソンとの間のすべてのエクソンの欠失、
（ｃ）前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソンを含む前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンの欠失、あるいは、
（ｄ）前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域の欠失
を含む、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記ノックアウトが
（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換すること；
（ｂ）前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入配列に置換すること；または
（ｃ）前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入配列に置換すること
を含む、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座である、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列および／または選択マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記レポーターをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に位置し、前記内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターが前記ヌクレオチド配列の発現を駆動する、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記核酸配列の発現がｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記第１のヌクレオチド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
前記非ヒト動物が前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の前記ノックアウトに関してホモ接合性である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
前記非ヒト動物が齧歯動物である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記非ヒト動物がラットまたはマウスである、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が、Ｐｉｎｔ、Ｐａｎｔｒ２、Ｆｅｎｄｒｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈａｇｌｒ、Ｋａｎｔｒ、ＰｅｒｉｌまたはＴｕｇ１遺伝子座である、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
前記表現型が、
（ａ）早期老化関連表現型、
（ｂ）致死、
（ｃ）肺発生の欠陥、
（ｄ）骨格および／または筋肉組織の形態学的または機能的奇形、
（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、
（ｆ）脳の発達の欠陥、または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのそれらの組み合わせ
である、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項２１】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＰｉｎｔ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、
（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、
（ｂ）筋力の低下、
（ｃ）繊維形成、
（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、
（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、
（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、
（ｇ）寿命中位数の減少、
（ｈ）脊椎湾曲、
（ｉ）器官萎縮、
（ｊ）早期老化関連表現型、
（ｋ）脳の発達の欠陥、または
（ｌ）（ａ）〜（ｋ）のいずれかのそれらの組み合わせ
を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ６：３１１６６０２６−３１１９７８４６の間の前記Ｐｉｎｔ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項２１に記載の非ヒト動物。
【請求項２３】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｐｉｎｔ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｐｉｎｔ１遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項２１に記載の非ヒト動物。
【請求項２４】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ６：３１１６６０２６−３１１９７８４６の間のゲノム配列と置き換わる、請求項２３に記載の非ヒト動物。
【請求項２５】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＰａｎｔｒ２遺伝子座であり、前記ノックアウトが、脳の発達の欠陥、および／または早期老化関連表現型を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項２６】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ１：４２７０７１４３−４２７１３６９８の間の前記Ｐａｎｔｒ２遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項２５に記載の非ヒト動物。
【請求項２７】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｐａｎｔｒ２遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｐａｎｔｒ２遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項２５に記載の非ヒト動物。
【請求項２８】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ１：４２７０７１４３−４２７１３６９８の間のゲノム配列と置き換わる、請求項２７に記載の非ヒト動物。
【請求項２９】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＦｅｎｄｒｒ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、致死、および／または肺発生の欠陥を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項３０】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ８：１２１０５４８８２−１２１０７４０６５の間のＦｅｎｄｒｒ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項２９に記載の非ヒト動物。
【請求項３１】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項２９に記載の非ヒト動物。
【請求項３２】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ８：１２１０５４８８２−１２１０７４０６５の間のゲノム配列と置き換わる、請求項３１に記載の非ヒト動物。
【請求項３３】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＨＯＴＴＩＰ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、骨格および／または筋肉の少なくとも１つの形態学的または機能的欠陥を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項３４】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ６：５２２６２８３４−５２２６７６０３またはＣｈ６：５２２６５３７４−５２２６７６０３の間のＨＯＴＴＩＰ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項３３に記載の非ヒト動物。
【請求項３５】
前記ノックアウトが
（ａ）前記ＨＯＴＴＩＰ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記ＨＯＴＴＩＰ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項３３に記載の非ヒト動物。
【請求項３６】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ６：５２２６２８３４−５２２６７６０３またはＣｈ６：５２２６５３７４−５２２６７６０３の間のゲノム配列と置き換わる、請求項３５に記載の非ヒト動物。
【請求項３７】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＨａｇｌｒ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、致死を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項３８】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ２：７４７５０４３３−７４７６２８８６の間のＨａｇｌｒ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項３７に記載の非ヒト動物。
【請求項３９】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｈａｇｌｒ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｈａｇｌｒ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項３７に記載の非ヒト動物。
【請求項４０】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ２：７４７５０４３３−７４７６２８８６の間のゲノム配列と置き換わる、請求項３９に記載の非ヒト動物。
【請求項４１】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＫａｎｔｒ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、脳の発達の欠陥、および／または早期老化関連表現型を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項４２】
前記ノックアウトが、ゲノム座標ＣｈＸ：１５２２９８５４４−１５２３２７４７５の間のＫａｎｔｒ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項４１に記載の非ヒト動物。
【請求項４３】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｋａｎｔｒ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｋａｎｔｒ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項４１に記載の非ヒト動物。
【請求項４４】
前記挿入核酸が、ゲノム座標ＣｈＸ：１５２２９８５４４−１５２３２７４７５の間のゲノム配列と置き換わる、請求項４３に記載の非ヒト動物。
【請求項４５】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＰｅｒｉｌ遺伝子座であり、前記ノックアウトが、脳の発達の欠陥、早期老化関連表現型、および／または周産期致死を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項４６】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ３：３４７６７８４９−３４７８２２９２の間のＰｅｒｉｌ遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項４５に記載の非ヒト動物。
【請求項４７】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｐｅｒｉｌ遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｐｅｒｉｌ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項４５に記載の非ヒト動物。
【請求項４８】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ３：３４７６７８４９−３４７８２２９２の間のゲノム配列と置き換わる、請求項４７に記載の非ヒト動物。
【請求項４９】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がＴｕｇ１遺伝子座であり、前記ノックアウトが、脳の発達の欠陥、および／または早期老化関連表現型を示すマウスをもたらす、請求項１８に記載の非ヒト動物。
【請求項５０】
前記ノックアウトが、ゲノム座標Ｃｈ１１：３６３９７９４−３６４８７５８またはＣｈ１１：３６３９７９４−３６４５５１８の間のＴｕｇ１遺伝子座のゲノム配列の欠失を含む、請求項４９に記載の非ヒト動物。
【請求項５１】
前記ノックアウトが
（ａ）前記Ｔｕｇ１遺伝子座の前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを挿入核酸に置換すること、または
（ｂ）前記Ｔｕｇ１遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸に置換すること
をさらに含む、請求項４９に記載の非ヒト動物。
【請求項５２】
前記挿入核酸が、ゲノム座標Ｃｈ１１：３６３９７９４−３６４８７５８またはＣｈ１１：３６３９７９４−３６４５５１８の間のゲノム配列と置き換わる、請求項５１に記載の非ヒト動物。
【請求項５３】
請求項１〜１７および１９〜５２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞、組織、または胚。
【請求項５４】
着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えして、前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の少なくとも前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンを欠失させ得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む、ターゲッティングベクター。
【請求項５５】
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む、請求項５４に記載のターゲッティングベクター。
【請求項５６】
前記着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、前記レポーターをコードする前記第１の核酸配列が、前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている、請求項５５に記載のターゲッティングベクター。
【請求項５７】
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項５４または５５に記載のターゲッティングベクター。
【請求項５８】
前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項５７に記載のターゲッティングベクター。
【請求項５９】
前記レポーターをコードするセグメントおよび／または前記選択マーカーの核酸をコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位をさらに含む、請求項５８に記載のターゲッティングベクター。
【請求項６０】
前記第１の核酸配列および／または前記第２の核酸配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、請求項５５〜５６および５８〜５９のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
【請求項６１】
前記挿入核酸が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項６０に記載のターゲッティングベクター。
【請求項６２】
請求項１に記載の非ヒト動物を作る方法であって、
（ａ）５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させることであり、前記標的コンストラクトが前記細胞のゲノム内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えを行って改変多能性細胞を形成すること、
（ｂ）前記改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に懐胎させることであり、前記代理母が改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、
前記遺伝子改変が、前記非ヒト動物がノックアウトと関連する表現型を示すように前記少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡのノックアウトをもたらす、方法。
【請求項６３】
前記ｌｎｃＲＮＡがｌｉｎｃＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ノックアウトが、前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の少なくとも第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンの欠失を含む、請求項６２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１遺伝子座、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
多能性細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）多能性細胞内に、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、
前記遺伝子改変が前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の少なくとも第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと前記最後のエクソンとの間のすべてのエクソンの欠失をもたらす、方法。
【請求項６７】
前記多能性細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記多能性細胞がマウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞、組織または胚を得る方法であって、
ゲノム内に内在性長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座のノックアウトを含むマウスから細胞、組織または胚を誘導すること
を含み、ここで、前記ノックアウトが、前記ノックアウトと関連する表現型を示すマウスをもたらす、方法。
【請求項７１】
長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）遺伝子座によってコードされる前記ｌｉｎｃＲＮＡの構造および／または機能について有益である、非ヒト動物のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座についての遺伝子発現プロファイルを生成するための方法であって、前記方法は、
請求項１に記載の非ヒト動物を得ることであって、ここで、前記ノックアウトが、前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の少なくとも、前記第２のエクソン、最後のエクソン、および前記第２のエクソンと最後のエクソンとの間のすべてのエクソンをレポーター遺伝子で置換することをさらに含み、ここで、前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の内在性プロモーターが、前記レポーター遺伝子の発現を制御する、こと；
前記非ヒト動物において前記レポーター遺伝子を発現すること；および
前記レポーター遺伝子の発現を調査することにより、前記ｌｉｎｃＮＡ遺伝子座についての発現プロファイルを生成することであって、前記レポーター遺伝子の前記空間的および／または時間的発現と、前記非ヒト動物によって示される表現型との相関関係が、前記ｌｉｎｃＲＮＡの構造および／または機能を確認すること、
を含む、方法。
【請求項７２】
前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座についての発現プロファイルを生成することが、前記レポーター遺伝子を発現する少なくとも１つの細胞型を特定することを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座についての発現プロファイルを生成することが、前記非ヒト動物の胚形成の間か、非ヒト動物の成熟期を通してか、前記非ヒト動物が死ぬまでか、またはそれらの組合せの間、前記レポーター遺伝子の発現を調査することを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本開示を読めば当業者には理解されるように、他のさらなる態様および実施形態が含まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非ヒト動物であって、そのゲノム内に、少なくとも１つの改変長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座を含み、前記少なくとも１つの改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｎｃＲＮＡをコードする核酸配列内に機能喪失型変異を含む、非ヒト動物。
（項目２）
前記ｌｎｃＲＮＡが長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記機能喪失型変異が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる、項目１または２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が前記ｌｎｃＲＮＡまたはその一部をコードする１または複数のエクソンの欠失を含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記破壊またはノックアウトが、
（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子内に１または複数のエクソンの欠失、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に１または複数のエクソンの欠失、あるいは、
（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域の欠失を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記破壊またはノックアウトが前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換することを含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、項目６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目８）
前記第１のヌクレオチド配列が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目９）
前記レポーターをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に位置し、前記内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターが前記ヌクレオチド配列の発現を駆動する、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１０）
前記核酸配列の発現がｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う、項目９に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第１のヌクレオチド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１２）
前記置換が、
（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まる前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを前記挿入核酸で置換すること、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まる前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを前記挿入核酸で再置換すること、あるいは
（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を前記挿入核酸で置換することを含む、項目６〜１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、項目６〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、項目６〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記非ヒト動物が、以下の表現型、すなわち、
（ａ）早期老化関連表現型、
（ｂ）周産期致死、
（ｃ）肺発生の欠陥、
（ｄ）尾部および後肢の形態学的奇形、
（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのそれらの組み合わせの、１または複数を持つことによって特徴づけられる、項目１〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記ｌｎｃＲＮＡがＰｉｎｔであり、前記非ヒト動物が、
（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、
（ｂ）筋力の低下、
（ｃ）繊維形成、
（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、
（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、
（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、
（ｇ）寿命中位数の減少、
（ｈ）脊椎湾曲、
（ｉ）器官萎縮、または
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのそれらの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記非ヒト動物が脳の発達の欠陥を示す、項目１〜１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｃｅｌｒｒ、Ｐａｎｔｒ１、Ｃｒｎｄｅ、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｐｉｎｔ、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、またはＴｕｇ１である、項目１９に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記非ヒト動物が哺乳類である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２２）
前記哺乳動物が齧歯動物である、項目２１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記哺乳動物がマウス、ラット、またはハムスターである、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
項目１〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞、組織、または胚。
（項目２５）
着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む、ターゲッティングベクター。
（項目２６）
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む、項目２５に記載のターゲッティングベクター。
（項目２７）
前記着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、前記レポーターをコードする前記第１の核酸配列が、前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている、項目２６に記載のターゲッティングベクター。
（項目２８）
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、項目２６〜２７のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目２９）
前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、項目２５〜２８のいずれか一項に記載のターゲッティングベクターコンストラクト。
（項目３０）
前記レポーターをコードするセグメントおよび／または前記選択マーカーの核酸をコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位をさらに含む、項目２９に記載のターゲッティングベクター。
（項目３１）
前記第１の核酸配列および／または前記第２の核酸配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、項目２５〜３０のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目３２）
前記挿入核酸が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、項目２５〜３１のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目３３）
少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作る方法であって、
（ａ）５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させることであり、前記標的コンストラクトが前記細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えを行って改変多能性細胞を形成すること、
（ｂ）前記改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に懐胎させることであり、前記代理母が改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、
前記遺伝子改変が前記少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす、方法。
（項目３４）
前記ｌｎｃＲＮＡがｌｉｎｃＲＮＡである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトを含む、項目３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
多能性細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）多能性細胞内に、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、
前記遺伝子改変がｌｎｃＲＮＡ機能の機能喪失をもたらす、方法。
（項目３８）
前記多能性細胞がヒトｉＰＳ細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記多能性細胞がマウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。