(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター遺伝子および前記レポーター遺伝子のN-末端側に配置されたII型トランスメンブレンドメインをコードするDNAを含むベクターであって、前記DNAが標的遺伝子へ安定に組み込まれる場合、前記標的遺伝子がシグナル配列を有する分泌たんぱく質または膜間タンパク質をコードする場合には前記レポーター遺伝子の発現の検出が可能であり、前記標的遺伝子がシグナル配列を有しない分泌たんぱく質または膜間たんぱく質をコードする場合には前記レポーター遺伝子の発現が検出されない、前記ベクター。
【請求項２】
さらに選択性標識物をコードする遺伝子を含む、請求項１のベクター。
【請求項３】
選択性標識物が薬剤耐性マーカーである、請求項２のベクター。
【請求項４】
以下の工程を含む細胞外たんぱく質をコードする標的真核遺伝子を単離する方法：(1) II型トランスメンブラン領域および腔−感受性指示標識物をコードするベクターを複数の細胞へ導入する工程であって、その際前記指示標識物は前記II型トランスメンブラン領域の3'へ配置され、これにより前記ベクターは前記複数の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれ複数のトランスジェニック細胞を形成し、前記複数の細胞の少なくとも一つの細胞において、前記ベクターは安定的にN-末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする遺伝子へ組み込まれる、前記工程；
(2) 前記複数の細胞を、前記細胞または前記細胞の派生物において前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質として優先的活性形で発現する条件であって、N-末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質として前記指示標識物を発現しない前記複数の細胞においては発現しないまたは優先的不活性形で発現する前記条件下でインキュベートする工程；
(3) 前記細胞または前記細胞の派生物において活性指示標識物の発現を検出する工程；
(4) 前記細胞外たんぱく質の少なくともN-末端領域をコードする核酸を前記細胞または前記細胞の派生物から単離する工程。
【請求項５】
前記ベクターがさらに選択性標識物をコードする請求項４の方法。
【請求項６】
前記細胞が胚幹細胞である請求項４の方法。
【請求項７】
前記優先的活性形が検出可能な量の触媒活性であり、前記優先的不活性形が検出不可能な量の触媒活性である請求項４の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、細胞外たんぱく質をコードする遺伝子における突然変異を含むトランスジェニック細胞を作製する方法：
(1) II型トランスメンブラン領域および腔- 感受性指示標識物をコードするベクターを複数の細胞へ導入し、その際前記指示標識物は前記II型トランスメンブラン領域の3'へ配置され、これにより前記ベクターは複数の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれ複数のトランスジェニック細胞を形成し、前記複数の細胞の少なくとも一つの細胞において、前記ベクターはN-末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする遺伝子へ安定的に組み込まれる工程；
(2) 前記複数の細胞または前記複数の細胞の派生物を、前記マーカーが前記細胞または前記細胞の子孫において前記細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質として優先的活性形で発現する条件であって、N-末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質のN-末端領域との融合たんぱく質として前記指示標識物を発現しない前記複数の細胞においては発現しないまたは優先的不活性形で発現する前記条件下でインキュベートする工程；
(3) 前記細胞または前記細胞の派生物における活性指示標識物の発現を検出する工程であって、その際前記細胞が細胞外たんぱく質をコードする遺伝子における突然変異を含むトランスジェニック細胞である、前記工程。
【請求項９】
前記ベクターがさらに選択可能な標識物をコードする請求項８の方法。
【請求項１０】
前記細胞が多分化能性細胞である請求項８の方法。
【請求項１１】
前記優先的活性形が検出可能な量の触媒活性であり、前記優先的不活性形が検出不可能な量の触媒活性である請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膜および分泌たんぱく質をコードする標的遺伝子を補足するための新規ベクターおよびその使用に関する。
【従来の技術】
分泌たんぱく質は、絶対ではないが一般に、おおよそ１８−２５  個の疎水性アミノ酸のＮ−末端延長部（  または“  シグナル配列”  ）を有することが特徴的である。このシグナル配列は翻訳生成物を分泌経路へ向かわせるものであり、これによりポリペプチドが細胞外へ出るために細胞膜を通り抜けるようになる。通常、シグナル配列は分泌過程の間にたんぱく質加水分解によりポリペプチドから分解され、これにより最終分泌生成物にはこの配列がない。このクラスの分泌たんぱく質には、たとえばポリペプチドホルモンおよびサイトキンが含まれる。
【０００２】
膜の間にまたがるたんぱく質（  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、一般に、シグナル配列のほかに、シグナル配列の下流に、しばしば同じサイズの一つ以上の疎水性配列を含む。トランスメンブラン領域はポリペプチドのこれ以上の移動を妨害し、この結果、膜の間にまたがるたんぱく質が製造される。このクラスのトランスメンブランたんぱく質は全てＩ  型配向を指し、ここではたんぱく質のＮ−末端が細胞の外側に向けられ、そしてたとえばポリペプチドホルモンのレセプターおよびサイトキンのレセプターを含む。また、Ｎ−末端シグナル配列のない膜間たんぱく質の少数のクラスがあり、これらのたんぱく質はＩ  型またはＩＩ型配向のいずれかで存在するであろう（  ハイ、１９９２）  。ＩＩ型膜たんぱく質は、Ｎ−末端が細胞質ゾルに残るように膜に挿入される。これらのたんぱく質が選ぶ配向は主に内部トランスメンブラン領域を横切る電位差により決定される（  ハートマン、ラッパポルトおよびロディッシュ、１９８９）  。
【０００３】
様々な発現クローニング方法が長年にわたって分泌たんぱく質および膜間たんぱく質を同定するために展開されてきた（  シモンズ、１９９３）  。これらの方法はランダムにｃＤＮＡを発現ベクターへクローニングし、そしてトランスフェクトした細胞を細胞表面の抗原決定基の出現に関しスクリーニングすることに基づく。この技術の最近の実施態様、“  シグナル配列捕捉”  （  タシロら、１９９３）  、において、Ｎ−末端シグナル配列をコードするｃＤＮＡフラグメントは、一時的にトランスフェクトした細胞の表面における特異的抗原決定基の出現について分析することにより同定された。新規分泌または膜間たんぱく質を同定するための発現クローニングシステムは、技術的な要求が多過ぎそして一般には量の多いｍＲＮＡ種の検出の方に都合が良い。さらに、これらの方法で単離された遺伝子の機能および発現プロフィールは、かなり努力しないと確認できない。
【０００４】
“  遺伝子捕捉（  ｇｅｎｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ）”  は、真核細胞の遺伝子におけるランダムな挿入変異を発生させるために発展してきた（  コズラーら、１９８９；  ブレナーら、１９８９；  ケールら、１９８９；およびフリードリッヒおよびソリアノ、１９９１）  。一般には、このようなベクターは、組み換え配列を形成するするために転写単位を挿入されたベクター配列の単離を促進する構造成分および得られた組み換え配列を同定および／または特性決定させる他の要素を有する。したがってたとえば、公知ベクターは、真核構造遺伝子、たとえば全てのエキソンの５’末端に生じるスプライス受容体部位および最終エキソンの後に通常は続くポリアデニル化部位と普通は結合する配列を含む。ベクターが正しい向きでイントロンへ挿入した場合、スプライス受容体およびポリアデニル化部位を利用してベクターのレポーター遺伝子配列へスプライスされた標的遺伝子の一部分を含む融合ＲＮＡ  転写物が生じる。同様な機能を有する他のベクターは、スプライシングに頼らず単に標的遺伝子のコード配列内での組み換えの結果としてランダムな組み換えが起こる。
【０００５】
レポーター遺伝子の発現を活性化する各々の挿入は、理論的には標的遺伝子の正常なコード配列を中断して突然変異を起こす挿入を表す。さらに、レポーター遺伝子の発現は、標的遺伝子の調節管理下にあり、したがってレポーター遺伝子の発現は標的遺伝子の発現パターンを反映すべきものである（  スカルネスら、１９９２）  。最後に、ＲＮＡ  融合転写物に含まれる標的遺伝子の一部は融合転写物からまたは挿入部位の下流のゲノムＤＮＡ  から直接クローン化されうる（  スカルネスら、１９９２；フォンメルヒナーら、１９９２；チェンら、１９９４；デグレゴリーら、１９９４）  。マウス胚幹（ＥＳ）細胞の遺伝子捕捉はこれまで、マウスが成長する間に発現した遺伝子を同定しそして同時に突然変異化するための迅速であるがしかし実質的にランダムな方法を提供してきた（  スカルネスら、１９９０）  。しかしながら、様々な選択基準に基づいて標的真核遺伝子を同定および／または単離する必要がある。興味のある特定クラスの遺伝子は、分泌および膜間たんぱく質をコードするものである。
【０００６】
遺伝子捕捉ベクターは、一般に、β−  ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含む。β−  ガラクトシダーゼ（  β−  ｇａｌ）はシグナル配列およびトランスメンブラン領域のない細胞質ゾル酵素である。このレポーターは、β−  ｇａｌ  がその酵素活性に影響を及ぼすことなく大きなＮ−末端融合体に順応できるという事実のために細菌において遺伝子融合体を発現するための特に有用な道具であった（  カサダバン、チョウおよびコーヘン、１９８０）  。分泌された分子の全てまたは一部を含む融合体を使用して分泌を開始するＮ−末端シグナル配列に対する要求を決めていた（  ベンソン、ホールおよびシルハビィ、１９８５；  シルハビィおよびベックウィズ、１９８５）  。しかしながら、これらの融合体は細胞外に出ず、β−  ｇａｌ  が細菌膜を通過することができないことを示唆する。同様に、β−  ｇａｌ  レポーターは真核細胞において分泌経路と不適合であることがわかっている。酵母において、インベルターゼ酵素のシグナル配列を含むβ−  ｇａｌ  融合体はＥＲの膜フラクションと結合するがしかしさらに分泌経路に沿って通ることはできない（  エルムら、１９８４）  。これらの例では、β−  ｇａｌ  活性は保存される。対照的に、カエノルハビディテス    エレガンス（  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）では、β−  ｇａｌ  活性は分泌したラミニンのＮ−末端シグナル配列を含む融合体において失われる（  ファイアー、ハリソンおよびディクソン、１９９０）。シグナル配列およびβ−  ｇａｌ  の間に予測したＩ  型（  ハートマンら、１９８９）  トランスメンブラン領域を含むと、多分細胞質ゾルにβ−  ｇａｌ  を維持することにより、融合体たんぱく質に対する酵素活性が回復した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ここにおいて、上記で概略した問題を解決しそして遺伝子捕捉のプロトコールに基づいたより一層明確な形の方法を見出した。修飾された遺伝子捕捉ベクター、分泌捕捉は、β−  ｇａｌ  レポーター遺伝子の活性がベクター挿入の部位で内因性遺伝子からのシグナル配列の獲得に依存するように計画された。シグナル配列を含まずレポーターを活性化することができない融合体は、かなりの努力をすることなしには確認することができない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
標的遺伝子を検出および／または単離するための方法および組成物が提供される。本発明の第一の見地によれば、標的真核遺伝子へ挿入すると、発現時に真核遺伝子の核酸配列によりコードされるそのアミノ酸配列の第一の部分およびベクターの核酸配列によりコードされるそのアミノ酸配列の第二の部分を有するポリペプチドをコードする修飾された遺伝子を産生する成分を含むベクターであって、該ベクターが、その結果前記ポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で位置するようになるアミノ酸配列をコードする核酸配列の真核遺伝子における存在と示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）に結合し特性をポリペプチドに付与する配列を含むことを特徴とするものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明による特に有用なベクター群は、ポリペプチドに分泌または膜間たんぱく質と結合するシグナル配列の真核遺伝子における存在と示差的に結合する特性を付与する一つ以上の配列を含むベクターである。アミノ酸配列をコードする核酸配列の標的真核遺伝子における存在と“  示差的に結合”  しその結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係に位置することにより、示差的に結合する特性の存在または不存在は、本発明のベクターが、（１）  その結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係に位置することになるアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する標的真核遺伝子と、（２）  その結果キメラポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係に位置することになるアミノ酸配列をコードする核酸配列が欠けている標的真核遺伝子との間の区別をすることができる。本発明の好ましい実施態様において、本発明のベクターは、（１）  シグナル配列を有するたんぱく質たとえば分泌たんぱく質をコードする標的真核遺伝子と（２）  シグナル配列を有さないたんぱく質たとえば非−  分泌たんぱく質をコードする標的真核遺伝子との間を区別することができる。
【００１０】
前記“  付与する（ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ）”  配列はたとえば膜結合たんぱく質の少なくとも一部分を含むことができる。この実施態様において、ベクターのレポーター遺伝子要素によりコードされるたんぱく質生成物は、標的遺伝子へ組み込まれた時、遺伝子が分泌または膜間たんぱく質と結合するシグナル配列を含むかどうかにしたがって、二つの立体配置のうちの一つを強制的にとることができる。すなわちたとえば、遺伝子が分泌または膜間たんぱく質をコードする場合、ベクター配列の膜結合たんぱく質要素によりレポーター遺伝子生成物が活性化されそして検出可能な信号を作るように細胞成分と関係する立体配置をとる。これに代わり、ベクターを分泌または膜間たんぱく質をコードしない標的遺伝子へ組み込んだ場合、ベクター配列の膜結合たんぱく質要素により、レポーター遺伝子生成物が活性化されずしたがって検出可能なシグナルを生成しないように細胞成分と関係する立体配置をとるであろう。
【００１１】
ベクター配列の膜たんぱく質結合たんぱく質要素は好ましくはＩＩ型トランスメンブラン領域すなわち膜間配列および必要ならばぶらさがり配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）  を含む領域である（  以下参照）。すなわち、好ましいベクターはレポーター遺伝子およびＩＩ型トランスメンブラン領域であって好ましくはレポーターのＮ−末端に位置するものを含み、それぞれが修飾遺伝子の発現時にレポーターポリペプチドの検出がシグナル配列を有する分泌たんぱく質をコードする真核遺伝子に依存し、そしてレポーターは真核遺伝子が非−  分泌たんぱく質をコードする場合実質的に検出することができないように配置している。レポーターは一般に特徴的表現型、たとえば酵素活性たとえばβ−  ガラクトシダーゼ活性を提供する。
本発明のベクターは、好ましくは真核遺伝子への前記成分の挿入を促進する核酸配列を含む。これらの配列は、たとえば（ａ）ｍ  ＲＮＡ  からのイントロン配列の排除に関連する配列たとえばスプライス受容体配列、または（ｂ）ポリアデニル化シグナル配列である。これに代わり、ベクターはスプライス受容体配列がなく、したがって遺伝子のコード配列へ直接挿入されてもよい。
【００１２】
問題のベクターはまた、ベクター成分が標的真核遺伝子へ挿入される結果、形質転換された細胞の選択および／または同定を可能にする要素を含んでもよい。このような選択可能の要素は、示差的に結合する特性とは別に、形質転換細胞における第二の特性を伝える：たとえば、ベクターの成分を標的真核遺伝子へ挿入してその結果抗生物質耐性または限定した培地において生き残りおよび／または増幅することができる能力を付与することからなる細胞の選択ができる特性である。このようなマーカー配列の例は、その結果形質転換された細胞が抗生物質たとえばＧ４１８に対し耐性であるか、または様々な程度の増殖因子または栄養依存性を有するようになるものである。その結果キメラポリペプチドが示差的結合特性および顕著な選択可能特性の両方を有することになる配列を有するベクターが、二つの特性が同じ要素から得られうるとしても、特に好ましい（  たとえば細胞の構造成分と予め決められた空間的関係にしたがって示差的に活性である選択可能なマーカー）。前者のベクターの例としては、キメラたんぱく質においてβ−  ガラクトシダーゼ（  β−  ｇａｌ）とネオマイシン（ｎｅｏ）  ホスホトランスフェラーゼ活性の両方を付与する配列を有するものである。一つの構築物においてβ−  ガラクトシダーゼ（  β−  ｇａｌ）とネオマイシン（ｎｅｏ）  ホスホトランスフェラーゼ活性の両方を付与する構築されたβｇｅｏ  組合せ配列が特に好ましい。
【００１３】
検討したように、内因性遺伝子のシグナル配列を獲得しないキメラポリペプチドにおける示差的結合特性を選択的に不活性化することは、キメラポリペプチドをＥＲの膜にＩＩ型配向に挿入することによる。好適なＩＩ型トランスメンブラン領域は、好ましくは以下に記載のように、経験的に特定される。さらに、内部トランスメンブラン領域（  シグナルアンカー配列）を含むがシグナル配列を含まないたんぱく質の配向は、しばしばトランスメンブラン領域のいずれかの側の１５個のアミノ酸において陽性に帯電したアミノ酸の数から予測される（  ハートマン、ラッパポートおよびローディッシュ、１９８９）  。しかしながら、予測されたＩ  型配向のたんぱく質は、Ｎ−末端が多くの陽性に帯電したアミノ酸を含む場合、強制的にＩＩ型に配向させられるかもしれない。このような配向の陽性を失ったぶらさがり配列は、以下のＣＤ４  で示すように、直ちに同定される。これらの場合において、陽性を失ったぶらさがり配列を保持して領域のＩＩ型特性を保つことが必要である。これらの指標を用いて、公知ＩＩ型たんぱく質のいずれかからトランスメンブラン領域を新規分泌捕捉ベクターを設計するために選択してもよい；好適なトランスメンブラン領域はハートマン、ラッパポルトおよびローディッシュ（１９８９）によりリストされたＩＩ型たんぱく質からのもの、たとえばヒトＰ−糖たんぱく質、ヒトトランスフェリンレセプターまたはラットゴルジ体のシアリルトランスフェラーゼのトランスメンブラン領域である。これに代わり、合成またはハイブリッドＩＩ型トランスメンブラン領域を使用してもよい。
【００１４】
さらに本発明は、前記で定義したベクターを利用して細胞を形質転換し、その結果前記ポリペプチドが宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で位置するようになるアミノ酸配列をコードする核酸配列の標的真核遺伝子における存在と示差的に結合する特性を分析することにより形質転換細胞を検出することを含む宿主細胞の構造成分と予め決められた空間的関係で位置するたんぱく質をコードする標的真核遺伝子を検出および／または単離する方法を提供するものである。好ましい実施態様において、方法は、以下の工程からなる細胞外たんぱく質をコードする標的真核遺伝子を単離する方法である；（１）  複数の細胞へＩＩ型トランスメンブラン領域および腔−  感受性指示標識物をコードするベクターを導入し、その際前記指示標識物は前記ＩＩ型トランスメンブラン領域に対し３’に配向し、これにより前記ベクターは前記複数の細胞のゲノムへ安定的に組み込まれて複数の通過性（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）細胞を形成し、ここで前記多数の細胞の少なくともひとつの細胞で前記ベクターがＮ−末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質をコードする遺伝子へ安定的に組み込まれ；（２）  前記複数の細胞を、前記指示標識物が前記細胞または前記細胞の派生物において前記細胞外たんぱく質のＮ−末端領域との融合たんぱく質として優先的活性形で発現し、そしてＮ−末端シグナル配列を有する細胞外たんぱく質のＮ−末端領域との融合たんぱく質として前記指示標識物を発現しない前記複数の細胞において発現しないかもしくは優先的に不活性形で発現する条件下でインキュベートし；（３）  前記細胞または前記細胞の派生物での活性指示標識物の発現を検出し；（４）  前記細胞外たんぱく質の少なくともＮ−末端領域をコードする核酸を前記細胞または前記細胞の派生物から単離する。
【００１５】
これらの方法のベクターは、腔−  感受性標識物、すなわち細胞の分泌腔たとえばＥＲ、ゴルジ体、分泌小胞などに存在しない場合優先的に検出可能である標識物を含む。たとえば、標識物は、腔において優先的に不活化されるガラクトシダーゼのような酵素である。本発明を実施する同様な方法は、腔に存在する場合優先的に検出可能である標識物を使うことである。重要な特徴は、標識物が腔の中または外にあるかどうかにしたがって示差的な検出ができることである。標識物が腔の外で優先的に検出可能である場合、ベクターはまた前記のようにＩＩ型トランスメンブラン領域を含む。さらに、ベクターは前記のように腔−  感受性標識物と同じまたは異なった選択可能な標識物を含でもよい。
ベクターは常法により細胞へ導入される。たとえば、培養物における細胞では、常法たとえばトランスフェクション（  リポフェクション、沈降、エレクトロポーション、等）、マイクロ注入法等が使用される。微生物における細胞に対しては、導入はウィルス、リポソーム、または他の通常の方法により仲介される。
【００１６】
広範囲の様々な細胞が対象分泌捕捉ベクターの標的になることができ、これらは幹細胞、分化可能の細胞たとえば接合体、胚、ＥＳ細胞、他の幹細胞たとえばリンパ様および骨髄幹細胞、神経幹細胞、形質転換細胞たとえば腫瘍細胞、感染細胞、分化細胞等が含まれる。細胞は培養物中またはインビボで標的にされうる。ベクターは、標的細胞のゲノム（  すなわちクロマチン）へ安定的に組み込まれる。一般には、ベクターは少なくとも一つの細胞ではなく、多数の細胞のゲノムへランダムに組み込まれ、ベクターは、シグナル配列がベクター／  挿入物に対し５’に配向するようにＮ−末端シグナル配列を有する内因性細胞外たんぱく質（  すなわち、分泌型またはトランスメンブランたんぱく質）をコードする遺伝子へ組み込まれる。このような細胞は腔−  感受性標識物およびＩＩ型トランスメンブラン領域をコードする対象ベクターの少なくとも一部を含む細胞外遺伝子の突然変異された対立遺伝子を獲得する。
【００１７】
安定的に導入されたベクターを含む細胞は、細胞外たんぱく質のＮ−末端領域との融合たんぱく質として優先的に検出可能な形で発現される、すなわち融合たんぱく質が、内因性たんぱく質部分が機能的シグナル配列を含む場合標識物を介して優先的に検出可能である条件下でインキュベートされる。インキュベーション条件は主に細胞の型により決定され、そして最初のトランフェクトされた細胞の有糸分裂増殖および分化も含む。
優先的に検出可能な形の標識物は常法により検出されうる。しばしば、優先的検出可能性は標識物におけるシグナル型の変化または色彩の変化もしくは光学密度の変化としてもたらされる。シグナルを優先的に発現する細胞は、内因性シグナル配列を含む融合たんぱく質を含むことが予測される。このような内因性シグナル配列をコードする核酸を次いで常法により、代表的には突然変異ゲノム対立遺伝子またはその転写物をクローニングすることにより細胞から単離する。この方法において、公知および新規細胞外たんぱく質をコードする遺伝子が得られる。さらに、対象方法を修正して通過性動物、細胞列、組み換え分泌たんぱく質等のような生成物を得るようにしてもよく、これらの幾つかを以下に記載する。
【００１８】
【実施例】
以下の実験および実施例を説明のために示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
内因性遺伝子のＮ−末端シグナル配列を捕獲して活性β−  ガラクトシダーゼ融合たんぱく質を生成することができる修飾した遺伝子捕捉ベクター（  ここでは“  分泌捕捉”  という）を見出した。プロトタイプベクターｐＧＴ１．８ＴＭ（  図２）を用いると挿入部が新規カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｕｎｃ−６  関連ラミニン、ｓｅｋ  レセプターチロシンキナーゼおよび二つのレセプター結合たんぱく質チロシンホスファターゼ、ＬＡＲ  およびＰＴＰｋの細胞外領域において見出され、したがってトランスメンブランおよび分泌たんぱく質生成物をコードする遺伝子における挿入変異を検出する分泌捕捉ベクターの選択的特性を確認した。
分泌捕捉計画は、ｌａｃＺをベースとする遺伝子捕捉ベクターから出発して発展した（  ゴスラーら、１９８９；  ブレナーら、１９８９；ケールら、１９８９；  フリードリッヒおよびソリアノ、１９９１；スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、１９９２）  。これらのベクターは、細胞の別々の室へ集まるＮ−末端β−  ガラクトシダーゼ（  βｇａｌ）融合生成物を作り出すことができ、これは多分シグナルを分類する働きをする内因性たんぱく質配列の獲得の反映である（  スカルネスら、１９９２；ブルンスら、１９９４）  。
ここで、我々はＮ−末端シグナル配列をコードする遺伝子、すなわち細胞表面に発現しそうな遺伝子を捕獲するための手段としてβ−  ｇａｌ  融合たんぱく質を示差的に分類することを説明する。
【００１９】
材料および方法
ベクター。    βｇｅｏ  レポーターは、ｐＳＡ  βｇｅｏ  のＣｌａＩ／ＳｐｈＩ  フラグメントで遺伝子捕捉ベクターｐＧＴ１．８のＣｌａＩ（ｌａｃＺ  で唯一）／ＳｐｈＩ（ｎｅｏで唯一）  フラグメントを置換することにより得られた（  フリードリッヒおよびソリアノ、１９９１）  。ｐＧＴ１．８はｐＧＴ４．５（  コスラーら、１９８９）  の派生物であり、３’Ｅｎ２  配列が０．２ｋｂＢｃｌＩ／ＢａｍＨＩ  ＳＶ４０ポリＡ  シグナルで置換されている。親ベクターｐＡｃｔβｇｅｏ  はβｇｅｏ／ＳＶ４０ポリＡ  カセットと連結した０．５ｋｂ  ヒトβ−  アクチンプロモーター（  ジョイナー、スカルネスおよびロッサン、１９８９）  を含む。βｇｅｏ  翻訳の開始点は、次の融合体発生のためにいずれかの側において唯一のＳａｌＩおよびＮｒｕＩ部位とともにコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を含むように処理した。ＳａｌＩ部位をラットＣＤ４ｃＤＮＡ  の完全コード領域を含む  ＢａｌＩ  フラグメントの各末端に位置させた（  クラークら、１９８７）  。ＣＤ４  のＮ−末端を含む０．４５ｋｂ  ＳａｌＩ／ＫｐｎＩフラグメントまたは完全ＣＤ４  コード領域を含む１．４ｋｂ  ＳａｌＩ／ＮｄｅＩ  フラグメントを、ｐＡｃｔβｇｅｏ  を消化したＳａｌＩ／  ＮｒｕＩへクローン化し、それぞれｐＡｃｔＳＳβｇｅｏ  および  ｐＡｃｔＳＳＴＭ  βｇｅｏ  を発生させた。分泌捕捉ベクターｐＧＴ１．８ＴＭは、ｐＧＴ１．８ｇｅｏ  においてβｇｅｏ  をフレームに挿入したトランスメンブラン領域（ＴＭ）を含むＣＤ４  の０．７ｋｂＰｓｔＩ／ＮｄｅＩフラグメントを含む。
【００２０】
ＥＳ細胞培養物
ＣＧＲ８  ＥＳ細胞（  ジェイ    ニコラス（Ｊ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ）によるマウス１２９／Ｏｌａ  系に由来する飼料独立型細胞列（  マウントフォードら、１９９４））を、０．２３％  重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＭＥＭ必須アミノ酸、２ｍＭ  グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸塩、５０μＭ  β−  メルカプトエタノール、１０％  子牛胎児血清（  グローベファーム（Ｇｌｏｂｅｐｈａｒｍ））および１００  単位／ｍｌ  ＤＩＡ／ＬＩＦ  を含むグラスゴウ（  Ｇｌａｓｇｏｗ  ）ＭＥＭ／ＢＨＫ１２  培地に維持した。２５０  μＦ／２５０Ｖにセットしたバイオラッド遺伝子パルサー（ＢｉｏＲＡｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）を用いてＰＢＳ０．８ｍｌ容量中プラスミドＤＮＡ１００μｇ  を用いて１０７  個のＥＳ細胞をエレクトロポレート（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することにより短期間でトランスフェクトした細胞を得、これをゼラチン処理したカバーガラス上で３６時間培養した後に分析した。安定な細胞列を得るために、５  ×１０７  〜１０８  個のＣＧＲ８  ＥＳ  細胞を直線化プラスミドＤＮＡ１５０μｇ  を用いてエレクトロポレート（３μＦ／８０Ｖ）し、５  ×１０６  個の細胞を１０ｃｍ皿上に塗布し、コロニーを２００  μｇ／ｍｌゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（ジブコ（ＧｉｂＣｏ）  ）において選択した。βｇａｌ  酵素活性およびたんぱく質を分析するために、ＥＳ細胞をゼラチン化カバーガラス上で増殖し、Ｘ−ｇａｌ  またはポリクローナルウサギα−  βｇａｌ  抗血清およびＦＩＴＣ−  結合したロバα−  ウサギＩｇＧ（ジャクソン    イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））  を用いて染色した。膜を通過させるために、細胞を０．５％ＮＰ−４０  で処理し、その後で抗体染色した。
【００２１】
ＲＮＡ  分析およびＲＡＣＥクローニング
ノザン法およびＲＡＣＥを既に記載（  スカルネスら、１９９２）  したように行った。すでに使用した５’ＲＡＣＥ法（  スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、１９９２）  へ幾つかの修正を加えた：（１）  マイクロダイアリシス（０．０２５ミクロンフィルター、ミリポア）をエタノール沈降に代えて使用し、（２）  重複ＰＣＲ（各々３０回）をアンカープライマーおよびＣＤ４  に特異的なプライマーを用いて実施し、続いてアガロースゲルにおいてサイズ選択し、アンカーおよびＥｎ−２  ２５６プライマーを用いて二回目のＰＣＲ  を行い、（３）  クロモスピン４００  カラム（  クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてＸｂａＩ／Ｋｐｎ消化ＰＣＲ  生成物をサイズ選択し次いでクローニングした。
【００２２】
結果
Ｎ−末端シグナル配列を含むβｇａｌ  融合体がこれらの細胞下分布により同定されるかどうかを試験するために、ベクターを、βｇｅｏ  、βｇａｌ  とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の両方を有するキメラたんぱく質（  フリードリッヒおよびソリアノ、１９９１）  と融合したＣＤ４  Ｉ  型膜たんぱく質（  クラークら、１９８７）  の一部を発現するように構築した（  図１）。ＣＤ４  のシグナル配列と融合したβｇｅｏ（ｐＡｃｔＳＳβｇｅｏ）は、小胞体（ＥＲ）に蓄積し、しかしβｇａｌ  活性はなかった。したがって、ＥＲの腔へのβｇｅｏ  の輸送はβｇａｌ  酵素機能を停止するようであった。βｇａｌ  活性は、たぶん細胞質ゾルにβｇａｌ  を維持することにより、ＣＤ４（ｐＡｃｔＳＳＴＭβｇｅｏ）のトランスメンブラン領域を含むことにより回復した。活性たんぱく質はＥＲと結合し、複数の細胞質含有物において、ＥＳコロニーではほとんど観察されないパターンが通常の遺伝子捕捉ベクターで得られ、これはたぶん膜間たんぱく質をコードする遺伝子のシグナル配列およびトランスメンブラン領域の両方の下流の挿入がめったにないからであろう。したがって、分泌およびＩ  型膜たんぱく質の両方における挿入部を同定するために、我々の遺伝子捕捉ベクターｐＧＴ１．８ｇｅｏ  を修飾してβｇｅｏ  の上流にＣＤ４  のトランスメンブラン領域を含ませた（  図２）。ベクターは、直線化された後、ｐＳＡ  βｇｅｏ  のプラスミド骨格（  線で表す）におけるＳｃａＩ（Ｓｃ）部位またはＥｎ−２イントロンの５’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）部位のいずれかでエレクトロポレートされた。Ｇ４１８−  耐性コロニーの数が二つのエレクトロポレート実験（  実験１：  ５ｘ１０７個の細胞；実験  ２：  １０８  個の細胞）  で得られ、検出可能なβｇａｌ  活性を発現する割合を右側に示す。分泌捕捉ベクターｐＧＴ１．８ＴＭでは、βｇａｌ  酵素活性はシグナル配列の上流に生じる挿入部のいずれかで回復される。
【００２３】
パイロット試験において、我々の遺伝子捕捉ベクターの相対的効率を、ＥＳ細胞へエレクトロポレート後の最初のｐＳＡ  βｇｅｏ  と比較した。ｐＳＡ  βｇｅｏ  は我々のベクターにはない翻訳の開始点を含んでいるが、ｐＧＴ１．８ｇｅｏ  と比べてより少数のＧ４１８−  耐性コロニーがｐＳＡ  βｇｅｏ  で得られた。さらに重要なことに、ｐＳＡ  βｇｅｏ  から派生されたほとんどすべてのコロニーで高レベルのβｇａｌ  活性を示し、一方我々のベクターは広い範囲の染色強度を示しβｇａｌ  陰性コロニーの割合が多い。ｐＳＡ  βｇｅｏ  ベクターの配列分析はその酵素活性を低めることが知られているｎｅｏ  で点突然変異を示した（  イエノフスキー、フィンおよびペロウ、１９９１）  。したがって、ｐＳＡ  βｇｅｏ  ベクターは高レベルで発現された遺伝子に対し予備選択性であり、我々のベクターにおいてｎｅｏ  突然変異の修正により低レベルで発現した遺伝子を入手できる（  以下参照）。
【００２４】
ｐＧＴ１．８ｇｅｏ  コロニーのほぼ半分が検出可能なβｇａｌ  活性を発現しそしてすでに観察されたβｇａｌ  染色の様々な細胞下パターンを示す。これと対照的に、ｐＧＴ１．８ＴＭコロニーはわずか２０％  だけがβｇａｌ  活性を発現し、すべてがｐＡｃｔＳＳＴＭβｇｅｏ  融合体のβｇｅｏ  活性特性の“  分泌”  パターンを示す。ｐＧＴ１．８ＴＭでトランスフェクトした安定な細胞列はほとんどの場合分化していないＥＳ細胞において検出可能なβｇａｌ  活性を示すが、しかしながら我々は場合により一連の分化した細胞型においてのみ検出可能なβｇａｌ  活性を示すＥＳ細胞を見出した。分泌捕捉ベクターで観察されたβｇａｌ  陽性コロニーの割合の低下およびβｇａｌ  染色の珍しいパターンは、βｇａｌ  活性がＮ−末端シグナル配列を含む融合体でのみ保持され、そしてｎｅｏ  活性ではなくβｇａｌ  活性がシグナル配列を持たないたんぱく質との融合体で失われるということを示している。
【００２５】
我々のデータによれば、分解可能なＮ−末端シグナル配列の不存在下で、融合たんぱく質はＩＩ型膜たんぱく質としての性質を示し、βｇｅｏ  がＥＲ腔に入り、ここでβｇａｌ  酵素が不活性になる（  ハイ、１９９２）（図３）。これを確認するために、幾つかのβｇａｌ  −  陰性細胞列を単離し、免疫蛍光法で分析した。βｇａｌ  陰性細胞列はａ−βｇａｌ  抗体およびＥＣＬ  検出システム（  アマーシャム）を用いて全細胞溶菌液のイムノドットブロットから同定された。４８個のコロニーのスクリーンから、３  個のβｇａｌ  陰性細胞列を回収し、免疫蛍光法で分析した。これらの列において、融合たんぱく質は、溶剤通過性の不存在下に細胞の表面において検出され、βｇｅｏ  融合たんぱく質のＩＩ型配向を示した。これと対照的に、溶剤通過性は、Ｉ  型膜たんぱく質について予期されるように、βｇａｌ  陽性細胞列において融合たんぱく質を検出するのに必須であった。
【００２６】
分泌捕捉ベクターにおけるβｇａｌ  の観察された選択活性のモデルを、図３  に示す。シグナル配列を含む遺伝子におけるｐＧＴ１．８ＴＭ（  斜線の入った四角形）の挿入はＩ  型配置で小胞体の膜に挿入される融合たんぱく質を作る。ベクターのトランスメンブラン領域は細胞ゾルにおいてβｇａｌ  を保持し、ここで活性のままである。シグナル配列のない遺伝子におけるベクターの挿入は、内部ＴＭ領域との融合たんぱく質を作る。これらの融合体において、トランスメンブラン領域はシグナルアンカー配列として作用し（  ハイ、１９９２）  、ＩＩ型配向にβｇｅｏ  を置き、ＥＲの腔へβｇｅｏ  を晒し、ここでβｇａｌ  活性が失われる。内因性シグナル配列の獲得における酵素活性のこの依存性は、Ｎ−末端シグナル配列をコードする遺伝子へ挿入することについての簡単なスクリーンを提供する。さらにこのモデルの証拠は幾つかの分泌捕捉挿入部と結合した幾つかの遺伝子をクローニングすることからもたらされる。
【００２７】
５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ  末端の迅速増幅）を用いて検出可能なβｇａｌ  活性を発現する分泌捕捉挿入部と結合する内因性遺伝子の一部をクローニングした（  表１）。ノザンおよびＲＮＡ  ドットブロット分析は、Ｇ４１８−  耐性細胞列のほぼ１／２（この研究において分析された１１のうち５）がスプライス受容体を正しく利用しておらず、ベクターのイントロン配列とハイブリッド化する融合転写物を生産していることを示した。これらの挿入部は多分正しい遺伝子捕捉の結果を表さず、したがってこれ以上分析されなかった。６  個の正しくスプライスした列のノザン法分析は、各細胞列において独特なサイズのβｇａｌ  融合転写物を検出した。これらの実験において、１５μｇ  のＥＳ細胞ＲＮＡ  のノザン法は、ｌａｃＺ遺伝子とハイブリッド化され、そしてＳＴ５３４（ＬＡＲ）挿入部からクローン化されたＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  フラグメントで再調査された。少なくとも二つの独立したＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  を各細胞列からクローン化した。ＳＴ５１４  を除く全ての細胞列から得られたｃＤＮＡは、ＳＴ５３４  調査で示したように全ての細胞列に対し普遍的な融合体転写物および内因性転写物の両方を検出した。ＳＴ５１４  挿入はＥＳ細胞において非常に低いレベルで発現した遺伝子が捕捉されうることを示す。ＳＴ５１４  培養物において、βｇａｌ  活性はわずかに異なった細胞において観察されただけで、したがって融合体も内因性転写物のいずれもノザン法では検出されなかった。
【００２８】
すべての場合において、ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  の配列分析により、スプライス受容体の正しい使用およびβｇｅｏ  とのフレームに一箇所開放したリーディングフレームが示された。１  個の挿入部をネトリンに入れ、これはカエノルハビディティス  エレガンス（  イシイら、１９９２）  のｕｎｃ−６  遺伝子と類似の分泌ラミニンをニワトリで最近クローン化したものである（  セラフィニら、１９９４）  。残りの５  個の挿入部が膜間たんぱく質の細胞外領域を中断した：ドュロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｆａｔ  腫瘍サプレッサー遺伝子に非常に近似した新規カドヘリン（  マホネイら、１９９１）  、ｓｅｋ  レセプターチロシンキナーゼ（  ギラルディ−  ヘベンストレイトら、１９９２）  、レセプター結合たんぱく質チロシンホスファターゼＰＴＰｋ（  ジャングら、１９９３）  、および第二のレセプター結合チロシンホスファターゼＬＡＲ  における二つの別々の挿入部（  ストロウリら、１９８８）  。これらの結果により、βｇａｌ  活性が挿入部位における内因性遺伝子からのＮ−末端シグナル配列を獲得することに依存するという予想が支持される。
【００２９】
ｓｅｋ（ＳＴ４９７）  およびネトリン−  １（ＳＴ５１４）遺伝子における挿入部から導かれる胚におけるβｇａｌ  発現のパターンは、マウスｓｅｋ（ニエトら、１９９２）  およびニワトリネトリン（  ケネディら、１９９４）  遺伝子に対し公開されたＲＮＡ  自体の結果と非常に類似しており、遺伝子捕捉ベクターが内因性遺伝子発現のパターンを正確に報告するというさらに別の証拠を提供した（  スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、１９９２）  。これらの実験に対し、キメラ胚および生殖系列マウスがＣ５７Ｂ１／６  胚磐胞の注入により発生した（  スカルネス、アウァーバッハおよびジョイナー、１９８９）  。適当な段階の胚を切り開き、固定し、記載のようにＸ  −ｇａｌ    で染色した（  ベディントンら、１９８９）  。ＬＡＲ  における両方の挿入物（ＳＴ４４８，５３４）  は、８．５ｄ胚において弱く拡散した発現を示した。ＰＴＰｋにおける挿入物（ＳＴ５３１）  は、内胚葉および近軸中胚葉においてβｇａｌ  発現を示し、新しく圧縮した体節において最も高い。ＬＡＲ  およびＰＴＰｋにおける成人マウスの有する挿入物の組織におけるβｇａｌ  発現は、ｍＲＡＮ発現の公知位置と非常に関係する（  ジャングら、１９９３；  ロンゴら、１９９３）  。βｇａｌ  活性の最も高いレベルは、ＳＴ５３４（ＬＡＲ）マウスの肺、乳腺および脳に見られ、そしてＳＴ５３１（ＰＴＰｋ）  マウスの脳と肝臓にみられた。
【００３０】
ＬＡＲ、ＰＴＰｋおよびｓｅｋ  遺伝子に挿入部を有するＥＳ細胞列は、マウスの生殖系列へ伝達された。ＰＴＰｋおよびＬＡＲ  挿入部の生殖系列伝達に続いて、繁殖分析により、挿入部のいずれかに対するマウス同型接合体が成熟しそして繁殖能力があることがわかった。ＬＡＲ  およびＰＴＰｋ遺伝子が効果的に分断されたことを確認するために、野性型および同型接合型成人組織からのＲＮＡ  のノザン法は、各挿入位置の下流領域からのｃＤＮＡを用いて証明された。野性型（＋／＋）  、異型接合型（＋／−）  および同型接合型（−／−）ＴからのＲＮＡ  １０μｇ  のノザン法において、成人マウスＳＴ５３４（ＬＡＲ）の肺およびＳＴ５３１（ＰＴＰｋ）  の腎臓は、挿入部に対してＬＡＲ  およびＰＴＰｋ  ｃＤＮＡ  配列３’とともにハイブリッド化され、そして荷重コントロールとしてリボソームＳ１２  遺伝子を用いて再調査された。両方の突然変異に対し、正常の完全長さの転写物は同型接合型動物では検出されなかった。
【００３１】
分泌捕捉挿入部がある場合、標的遺伝子の細胞外領域の大部分を含むであろう融合体を発生させるので、機能の損失および機能の獲得（  すなわち、優勢−  劣性）の両方の突然変異を作ることが可能である。しかしながら、ＬＡＲ  およびＰＴＰｋとのβｇｅｏ  融合体はこれらのたんぱく質の細胞外領域の３００  未満のアミノ酸を含むので、これらの挿入部は無価値の突然変異を表す。ＬＡＲ  およびＰＴＰｋは、レセプターＰＴＰ  遺伝子のこれまで増加した一群のメンバーである（  サイトー、１９９３）  。ＬＡＲ  およびＰＴＰｋ突然変異マウスに明白な表現型が存在しなかったことは、筋原性およびＳｃｒ−群遺伝子の複数の構成員における標的突然変異で観察されたように、遺伝子群のメンバー間の機能の重なりのためであろう（  ラドニッキら、１９９３；  スタイン、ボーゲルおよびソリアノ、１９９４；  ロゥエル、ソリアノおよびマルマス、１９９４）  。
【００３２】
同定された最初の６  個の遺伝子に基づいて、分泌捕捉は大きな膜間レセプターを優先させることを示す。ＬＡＲ  における二つの別々の挿入部の回収は、現在のベクターの設計が遺伝子の制限されたクラスに近づくであろうことを示唆している。遺伝子のイントロンにおける挿入のための遺伝子捕捉ベクターの必要性は、大きなイントロン領域からなる遺伝子を検出するのに賛成する本来的な性質を有し、したがってこのやり方で入手可能な遺伝子の数が限定されることが予測される。より大きな遺伝子のプールを入手するために、我々は三つの可能性のあるリーディングフレームの各々にベクターを構築した。さらに、僅かのまたは全くイントロンの無いより小さい転写単位において挿入部を回収するために、スプライス受容体を欠いたベクターの“  エキソン捕捉”  版を見出した。三つのリーディングフレームで処理された分泌捕捉ベクターおよびエキソン捕捉ベクターの相対的効果を図４  に示す。ＣＧＲ８  ＥＳ  細胞のエレクトロポレートは前記のように実施された（  実験１：  ２Ｘ１０７個の細胞；  実験２：  １０８個の細胞）  。各ベクターはＧ４１８−  耐性コロニーの同程度の数が得られ、同じ割合のβｇａｌ  活性の分泌パターンを示す。ベクターを組合せると、膜レセプターおよび分泌リガンドの両方を含むゲノムの代表的サンプリングが得られる。
【００３３】
本発明において、我々は、βｇｅｏ  レポーター遺伝子をＮ−末端トランスメンブラン領域を有するように修飾することができることを示したことが明らかであろう。Ｎ−末端シグナル配列をコードする内因性遺伝子へ組み込むと、細胞質ゾルにβｇａｌ  を維持し、ここで機能的酵素活性を保持するＩ  型配置を想定する融合たんぱく質が作られる（  図３（ｉ）参照）  。逆に、修飾したレポーターがシグナル配列をコードしない遺伝子へ組み込まれると、疎水性トランスメンブラン領域自体が細胞によりシグナルアンカー配列として認識され、ＩＩ型配向に融合たんぱく質を置き、その際βｇａｌ  酵素が不活化する（  図３（ｉｉ）  参照）  。したがって、βｇａｌ  またはβｇｅｏ  が予めＮ−末端ＩＩ型トランスメンブラン領域で固定されている構築物は特別な性質を有する。構築物がシグナル配列をコードする分泌遺伝子へ組み込まれるならば、βｇａｌ  は活性のままである。これが非−  分泌遺伝子へ組み込まれている場合、βｇａｌ  活性は遮断される。これにより、分泌遺伝子への組み込がレポーター遺伝子活性ついての簡単な検定（  たとえば、色彩の変化）により同定されることができるようになる。
【００３４】
【表１】表１  ６  個の分泌捕捉挿入部と関係する内因性遺伝子の同定
0003592426.tif 000002
【００３５】
１  自然差示（ｄｉｆｆ）細胞型の亜群を含むＥＳ細胞培養物のＸ−ｇａｌ  染色に基づく。
（＋／−）  は差示細胞型の亜群における発現を示す。
２  転写サイズがノザン法から測定された（  図４  およびデータを示さず）。Ｎ．Ｄ．は検出せず。
３  括弧内の数は、ラットＬＡＲ（ＡＣ  Ｌ１１５８６）、マウスｓｅｋ（ＡＣ  Ｓ５１４２２）、ニワトリネトリンＩ（ＡＣ  Ｌ３４５４９）およびマウスＰＴＰｋ（ＡＣ  Ｌ１０１０６）  のアミノ酸配列に基づく内因性の挿入位置を示す。新規カドヘリンの種子バンク入手番号は、受け入れられるべきである。
４  異型接合型異種交配からの離乳年齢期の同種接合型動物の回収に基づく。（？）  は未知の表現型、成長における繁殖。ＮＡ、適用されず、生殖ではまだ挿入されず。
【００３６】
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ステロイリ、エム．  ら（  Ｓｔｒｅｕｌｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，１５２３−１５３０（１９８８）
タシロら（  Ｔａｓｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，６００−６０３（１９９３）
イエノフスキー、アール．  エル．  、フィン、エム．  およびペロゥ、ジェイ．  ダブリュ．  （  Ｙｅｎｏｆｓｋｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｆｉｎｅ，Ｍ．  ＆  Ｐｅｌｌｏｗ，Ｊ．Ｗ．  ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４３５−３４３９（１９９１）
【００３８】
本明細書に列記した文献および特許出願の全ては、各々個々の文献または特許出願が参考として編入されることを特別にそして個々に示したように、ここで参考として編入される。これまでの発明が明確な理解の目的で説明および実施例により詳細に記載されているとはいえ、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく一定の変化および修正がこれに施されることも本発明の技術の点で当業者にとって直ちに明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ４  ／  βｇｅｏ  融合たんぱく質を発現するためにデザインされたベクターを示し、一時的トランスフェクション実験の要約である。
【図２】遺伝子捕捉ベクター（ｐＳＡβｇｅｏ）および（ｐＧＴ１．８ｇｅｏ）  および第二の捕捉ベクター（ｐＧＴ１．８ＴＭ）のデザインおよびＥＳ細胞の安定なトランスフェクションにおける相対的効果を示す。ｐＳＡ  βｇｅｏ  は最小アデノウィルスＩＩ型メジャーレイトスプライス受容体（ＳＡ；開放ボックス、イントロン；影付きボックス、エキソン）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ｐＳＡ  βｇｅｏ  に存在するｎｅｏ（＊  ）  における突然変異は、βｇｅｏ  のＣｌａＩ（Ｃ）／ＳｐｈＩ（Ｓ）  フラグメントの置換により訂正される。ｐＧＴ１．８ｇｅｏ  およびｐＧＴ１．８ＴＭはマウスＥｎ−２スプライス受容体（  ゴスラーら、１９８９）  およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むがしかし翻訳開始シグナル（ＡＴＧ）  を含まない。分泌捕捉ベクターｐＧＴ１．８ＴＭは、ｐＧＴ１．８ｇｅｏ  におけるβｇｅｏ  でトランスメンブラン領域挿入ｉｎ−ｆｒａｍｅを含むＣＤ４  の０．７ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＮｄｅＩ  フラグメントを含む。
【図３】分泌捕捉ベクターにおけるβｇａｌ  の選択的活性化の我々のモデルを示す。
【図４】三つのリーディングフレームの各々およびエキソン捕捉デザインを捕獲するためにデザインされた分泌捕捉ベクターの相対的効率を示す。各リーディングフレーム（ｐＧＴ１ｔｍ  から３ｔｍ）におけるベクターは、すべてではなくＥｎ−２の３０ｂｐのＥｘｏＩＩＩ欠失と続くＢｇ１ＩＩ  リンカーの挿入により構築された。エキソン捕捉ベクター（ｐＥＴｔｍ）  はｐＧＴ１．８ＴＭからＥｎ−２スプライス受容体を除くことにより作られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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