【手続補正書】
【提出日】平成28年11月21日(2016.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者においてグルテン不耐症、セリアック病、小麦アレルギー、または疱疹状皮膚炎を治療する方法であって、
有効量のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはそれらの塩を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはそれらの塩がグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物の摂取前に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはそれらの塩がグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物の摂取と共に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはそれらの塩がグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物の摂取後に前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ネペンテシンＩが投与される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／またはそれらの塩を含む組成物であって、
グルテン源をさらに含み、
前記グルテン源は、小麦、ライ麦、および大麦の製品からなる群より選択される、組成物。
【請求項７】
栄養補助食品である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
医薬組成物である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
食物である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
患者のグルテン不耐症および関連する状態の調節に用いる、請求項６ないし９、または請求項１２ないし１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物の摂取前の患者への投与用である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ネペンテシンＩまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
ネペンテシンＩＩまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩまたはこれら各々の薬学的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、約ｐＨ５以上である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
胃のプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびプロピルエンドペプチダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの付加酵素をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
トランスグルタミナーゼの阻害剤、抗炎症剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、肥満細胞安定化剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、および抗ＴＮＦα剤からなる群より選択される少なくとも１つの付加剤をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一般に、グルテン不耐症の治療では、生涯続く厳格なグルテン抜きの食事療法が行なわれる。しかし、グルテン抜きの食事療法は、不便で、制限が多く、またグルテンを控えるのは困難である。そのため、グルテン不耐症の効果的な代替治療が必要とされている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明は、酵素ネペンテシンが、特に、低ｐＨ（例えば、約２〜３）において、タンパク質およびオリゴペプチド（グルテンを含有する）を切断する高いタンパク質分解活性を有するという発見に関する。ネペンテシン（ＥＣ  ３．４．２３．１２）は、熱帯地方において、一般的にモンキーカップ（ｍｏｎｋｅｙ  ｃｕｐｓ）の名で知られる、ウツボカズラ属（食虫性の嚢状葉植物）の嚢状葉の分泌液等、様々な植物源から単離または濃縮され得る植物由来のアスパラギン酸プロテアーゼである。Ｔｏｋｅｓらの「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ  Ｌ．，Ｐｌａｎｔａから分泌される消化酵素（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ  Ｌ．，  Ｐｌａｎｔａ）」（Ｂｅｒｌ．）  １１９，  ３９−４６  （１９７４）。ネペンテシンの活性が、食品タンパク質のペプチドへの分解を部分的に担う胃に存在する酵素である、ペプシン（ＥＣ  ３．４．２３．１）よりも約１０００倍高いことが分かっている。また、ネペンテシンが、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＩおよびＷを除く多くのアミノ酸残基の後ろを効果的に切断する、ペプシンに比べはるかに緩い特異性を有することも分かっている。特に、Ｋ、ＲおよびＰの後ろを切断する。比較すると、ペプシンは、疎水性残基Ｆ、ＬおよびＭを効率良く切断するが、Ｐ、Ｈ、ＫおよびＲの後ろを切断することは、基本的に絶対にない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】（Ａ）Ｐ１またはＮ末端側の切断部位および（Ｂ）Ｐ１′またはＣ末端側の切断部位におけるネペンテシン切断選好性部位を示す図である。データを、アミノ型に応じて分類し、Ｈａｍｕｒｏらの「Ｈ／Ｄ交換適合条件における豚由来の固定化ペプシンの特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｐｓｉｎ  ｉｎ  Ｈ／Ｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２２（７）：１０４１−１０４６（２００８）によるペプシンのデータを同様に表記したものと比較する。黒色の棒は、ネペンテシン消化を示し、灰色の棒は、ペプシン消化を示す。切断割合（％）は、集合におけるある残基の総数に対する、ある残基で観察される切断数を表す。実施例に記載するように、６つの変性タンパク質の消化物からネペンテシンデータを得た。
【図２】ドメイン型の種類に応じて配置された、ＸＲＣＣ４複合ペプチドの配列表を示す図である。４つの異なる酵素：基質比（６５：１〜５２０：１、青色の棒）におけるペプシンの消化および４つの異なる酵素：基質比（０．００７５：１〜０．３８：１、赤色の棒）におけるネペンテシンの消化により、ペプチドを得た。
【図３】Ｃ末端アミノ酸により分類された、ネペンテシン消化後に得られたペプチドの平均ＭＡＳＣＯＴスコアを示す図である。各計算に使用したペプチド数は、棒の上部にあり、末端アミノ酸に関する。実施例に記載するように、６つの変性タンパク質よりペプチドを得た。
【図４】酵素：基質比の範囲（説明文に示す）に関する（Ａ）ネペンテシンおよび（Ｂ）ペプシンにより消化されたＸＲＣＣ４のペプチドイオンクロマトグラム（ＰＩＣ）を示す図である。カラムに対して同一の質量の基質の添加をして酵素消化のＰＩＣを作製した。
【図５】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、小麦由来のグリアジンから、３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分後に同定された全てのペプチドの平均長を示す図である。偽陽性同定を排除するため、スコアにおける信頼水準９５％のカットオフ値（ｐ＜０．０５）を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を入れ子の図に示す。
【図６】３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分間の消化後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチド数を長さで分類し表示する図である。データは、図５に示すものと同様である。
【図７】３７℃で、１０分、６０分、１２０分、３６０分または８１０分間の消化後の特定の長さを得る確率として、図５に示すものと同一のデータを表示する図である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本明細書において使用される場合、用語「グルテン」は、通常、特定の個人に潜在的に悪影響をもたらす、小麦または大麦およびライ麦を含む近縁穀物にあるタンパク質を指す。グルテンタンパク質は、単量体タンパク質、およびジスルフィド結合により結合した高分子量および低分子量のサブユニットの集合体の非常に不均一な混合物である、α−グリアジン類、β−グリアジン類、γ−グリアジン類およびω−グリアジン類等のグリアジン類を含む。多くの小麦グルテンタンパク質は、特徴が明らかにされている（例えば、Ｗｏｙｃｈｉｋらの「小麦グルテンのタンパク質のアミノ酸成分（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｌｕｔｅｎ）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ９（４），  ３０７−３１０  （１９６１）参照）。本明細書で使用される用語「グルテン」は、食物に含まれるグルテンからのグルテンタンパク質に由来し、免疫反応異常を生じさせる可能性があるオリゴペプチドをも含む。それらオリゴペプチドのうちいくつかは、通常の消化酵素に耐性がある。上述のタンパク質およびオリゴペプチドを含むグルテンは、グルテン不耐症患者のセリアック病のＴ細胞の抗原となると考えられている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
用語「ネペンテシン」は、酵素番号ＥＣ  ３．４．２３．１２のアスパラギン酸プロテアーゼを指し、全てのアイソフォームおよびネペンテシンＩやネペンテシンＩＩ等の様々なネペンテシンならびにこれらの塩を含む。塩としては、限定するものではないが、遊離ネペンテシンの生物学的効果および性質を維持し、かつ生物学的にまたはその他の意味において有害ではない、１つ以上の塩基または１つ以上の酸を有するネペンテシンにより形成されるそれらの塩を指す。無機塩基由来の塩は、ナトリウム塩類、カリウム塩類、リチウム塩類、カルシウム塩類、マグネシウム塩類、鉄塩類、亜鉛塩類、銅塩類、マンガン塩類、およびアルミニウム塩類等が挙げられる。有機塩基由来の塩としては、限定するものではないが、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、およびポリアミン樹脂等の、第１級、第２級、および第３級アミンと、天然置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂とを含む置換アミンが挙げられる。塩類を形成可能な酸としては、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸等の無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、Ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸等の有機酸が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ネペンテシン誘導体は、グルテン解毒能を保持する、生物学的等価物、断片、および伸長ネペンテシンならびにそれらの塩を含む。一部の実施形態において、ネペンテシン誘導体は、ネペンテシンの生物学的等価物を含む。「生物学的等価物」は、ネペンテシンと、少なくとも約８０％の相同性および同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９８％の相同性を有するもの、またあるいは、所望の構造を維持し、タンパク質分解活性の少なくとも一部を呈しつつ、ストリンジェントな条件下でネペンテシンをコードするヌクレオチド配列またはその相補体をハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一部の実施形態において、ネペンテシン誘導体は全ネペンテシンタンパク質のうち少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、または少なくとも約５０個の連続するアミノ酸を有する、もしくは、１００個以上の連続するアミノ酸を含むネペンテシン断片であり、それらは、最大値がネペンテシンの完全なタンパク質である。また、ネペンテシン誘導体は、付加配列を有するネペンテシンをも含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
「ハイブリダイゼーション」は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われてよいハイブリダイゼーション反応を指す。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、周知であり、当該技術分野において（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）「モレキュラークローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版、参照）に公開されている。（ストリンジェンシーを高めるための）適切な条件の例としては、培養温度：２５℃、３７℃、５０℃、および６８℃、緩衝液濃度：１０倍のＳＳＣ、６倍のＳＳＣ、１倍のＳＳＣ、０．１倍のＳＳＣ（ＳＳＣとは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸緩衝液）、ならびに他の緩衝液系によるそれらの等価物、ホルムアミド濃度：０％、２５％、５０％、および７５％、培養時間：５分〜２４時間および持続時間を増加させる、頻度を増加させる、または緩衝液濃度を減少させる洗浄などの条件が挙げられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ネペンテシンは、ウツボカズラ属等の植物の嚢状葉の分泌液等の天然源から、濾過または固定化ペプスタチンに基いたアフィニティー精製等の既知の方法により濃縮または精製することができる。植物源から単離される他、ネペンテシンまたはその誘導体は、当該技術分野において既知な従来の方法を用いて、化学合成または生合成により調製され得る。化学合成は、ネペンテシンの配列に応じたアミノ酸のカップリングにより成され得る。様々なペプチドカップリング法、および例えばアプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州フォスターシティ）、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）や他のメーカー製の自動合成装置などの市販のペプチド合成装置を利用可能である。ネペンテシンの生合成は、既知の生物工学技術を用いて、ネペンテシンのＤＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡを用いて細胞を転写し、細胞のネペンテシン生成を可能にすることにより、組み換え合成システムを利用し、成され得る。例えば、ネペンテシンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ラクトバチルス、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、およびタバコ細胞等の植物細胞の培養などの生命体の宿主−ベクター系を確立することにより生成することができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を摂取すると同時に患者に投与される。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、成分または食物への添加剤等、食物と共に投与される。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、食物とは別に投与される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、小麦、ライ麦、および大麦等から作られたパン、パスタ、およびシリアル等のグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物と共に、食品添加物として投与される。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、そのような食物の成分として添加される。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、任意に、約ｐＨ５以上等の不活性なｐＨで、摂取前の食物に分散される。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者による食物の摂取中にグルテンを含有する食物に適用可能な粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリーム等として作製またはそれらに取り込まれ得る。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、キャンディー、チューインガム、咀嚼する栄養補助食品、シロップ等の容易に投与するため、個人の食欲に訴える形状にすることができる。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、砂糖、塩、サラダドレッシング、スパイス、チーズ、バター、マーガリン、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、シードバター、カーネルバター、ピーナッツバター等の一般的な食料品に混ぜることができる。好ましくは、ネペンテシンを含む食料品または添加剤は、温度上昇によりネペンテシンまたはその誘導体の活性の損失の可能性を最小限に止めるため、患者に摂取される前の熱処理を不要とする。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
通常、ネペンテシンまたはその誘導体は、所望なグルテン分解効果を生じるために安全かつ十分な量投与される。正確な量は、投与されるネペンテシンまたはその誘導体の特徴、および食物の種類や量、患者のグルテンに対する感受性等、多くの要因に依存する。一般的に、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者がグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を摂取する予定がある、摂取している、または摂取した時など、必要な時に投与される。平均的な人で、１日につき、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、または、１回につき、約１ｍｇ〜約１００ｇの投与量で投与することができる。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、１日に、０．０１、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、または１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）およびそれらの値のうち任意の２つ間の範囲（終点を含む）で投与することができる。一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、１回につき、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、７０ｇ、１００ｇ、およびそれらの値のうち任意の２つの間の範囲（終点を含む）で投与することができる。一部の実施形態において、患者がグルテンを含有する食物を摂取する回数に応じて、日に、１回、２回、３回等投与され得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
一部の実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、胃のプロテアーゼ（例えば、ペプシンおよびペプシノゲン）など別の酵素、Ｃｈｅｎらの「米のアスパラギン酸プロテアーゼの遺伝子ファミリー：遺伝子構造および発現、予想されるタンパク質の機能と系統発生の関係（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｒｉｃｅ：  Ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎ）」Ｇｅｎｅ  ４４２：１０８−１１８（２００９）に記載されるもの等、別のアスパラギン酸プロテアーゼ、およびプロピルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）、およびジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＤＣＰ）または米国特許第７，９１０，５４１号に記載のシステインプロテイナーゼＢ等の酵素と共に投与される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
別の態様において、ネペンテシンまたはその誘導体を含む食料製品が提供される。一部の実施形態において、食料製品は、小麦、ライ麦、および大麦から作られたベーカリー製品（例えば、ケーキ、マフィン、ドーナツ、ペストリー、ロールパン、およびパン）、パスタ、クラッカー、トルティーヤチップス、シリアル等、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のあるものである。一部の実施形態において、食料製品は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある別の食物と共に摂取することができる。そのような食物の非限定の例としては、粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリーム、キャンディー、チューインガム、シロップ、砂糖、塩、サラダドレッシング、スパイス、チーズ、バター、マーガリン、スプレッド、バター、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、シードバター、カーネルバター、ピーナッツバターなどが挙げられる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
質量分析によるネペンテシン消化のマッピング
水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途用に設計されたＬＥＡＰ  ＨＴＸ−ＰＡＬオートサンプラーおよびディスペンスシステムを使用し、タンパク質の消化を行い、データをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｔｒｉｐｌｅ−ＴＯＦ  ５６００  ＱｑＴＯＦ質量分析計で収集した。ＭＳ／ＭＳデータからＭａｓｃｏｔ  （ｖ２．３）を用いて、ペプチドを同定した。つまり、８μＬの８μＭ  タンパク質（ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、リガーゼ  ＩＶ−タンデムＢＲＣＴドメイン、ＰＮＫ、ミオグロビン、またはシトクロムＣ）を１０μＬの１１倍濃縮液体と、１０℃で２分間混合した。ミオグロビンおよびシトクロムＣは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。１μＭの基質濃度に希釈後、１５μＬを質量分析計に接続された冷却逆相ＬＣシステム（４℃）に注入した。ペプチドを５ｃｍの２００μｍ  ｉ．ｄ．  Ｏｎｙｘ  Ｃ１８モノリス型カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）で捕捉し、３％〜４０％のアセトニトリル勾配で１０分間溶出させた。これら分析で検出されたペプチドを、気相分取法（ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）に似た、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数の情報依存性取得におけるＣＩＤ断片化のため選択した。Ｂｌｏｎｄｅｒ  Ｊら、「質量分析法による、気相分取を用いたナチュラルキラー細胞ミクロソームのプロテオミクス研究（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １６９８（１）：８７−９５  （２００４）。スペクトルを全６つのタンパク質の配列を保存している小規模データベースで探索した。配列結果を手動で確認した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
ＤＮＡ損傷修復に関連する複合体のＨＤ交換
ＢＲＣＴを含むＸＲＣＣ４（１−２００）およびＢＲＣＴを含むＸＲＣＣ４（完全長）の保存溶液を緩衝液（１０ｍＮ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で等モル濃度（１０ｍＭ）まで希釈し、４℃で少なくとも３０分間培養し、錯体形成を促進させた。試料をＨＤＸ分析まで４℃に維持した。Ｄ２Ｏ（２５％ｖ／ｖ）を添加しつつ、アリコートを２０℃で２分間、重水素化した。その後、アリコートを２の方法で消化した。第１の消化法において、タンパク質の重水素化物を試料に１００ｍＭの冷グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を添加することにより急冷し、急冷タンパク質溶液をペプシンマイクロリアクターに注入した。このマイクロリアクターを注入バルブとＣ１８カラムの間のＨＴＸ−ＰＡＬシステムに搭載した。タンパク質消化物を、モノリス型Ｃ１８キャピラリーカラムで捉え、質量分析計に溶出させた。マイクロリアクターを含む全液体要素を４℃で冷やし、分析時間（＜１５分）重水素化の逆交換を最小限とした。第２の消化法において、等量の重水素化タンパク質を急冷し、同時に、３μＬまたは５μＬの１１倍ネペンテス液で、それぞれ３または５分間、１０℃で消化させた。試料を質量分析計に接続された冷却ＬＣシステムに注入した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
結果
嚢状葉液の抽出
嚢状葉植物の分泌液を濃縮し、消化酵素をｐＨを低下（ｐＨ２．５）させることにより、活性化させた。濃縮工程およびプロテオーム液による活性化による影響をプロテオミクス法を用いて決定した。まず、ネペンテシン酵素の存在を確認するため、非活性な濃縮物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ごくわずかにクマシー染色された７つの連続したゲル領域をトリプシンで消化し、標準的な方法を用いてナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。活性化したプロテアーゼ液の完全なカタログとなることを期待してはいないが、分析により、植物由来のアスパラギン酸プロテアーゼ  ネペンテシンＩ／ＩＩの存在に加え、グルカナーゼ、キチナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびペルオキシダーゼ、さらにはわずかなレベルのショウジョウバエおよび細菌汚染を確認した。プロテオーム液の複雑性の低さは、細菌の分析、Ｈａｔａｎｏ  Ｎ、Ｈａｍａｄａ  Ｔ（２０１２）の「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａの嚢状葉液の餌動物の成分により導かれる分泌タンパク質のプロテオーム解析（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｅｙ  ｉｎ  ｐｉｔｃｈｅｒ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３；７５（１５）：４８４４−５２  （Ｅｐｕｂ  Ｊｕｎ．  １５，  ２０１２）と一致したが、  この分析において、ネペンテシン−Ｉが、幅広い質量範囲（４０〜７０ｋＤａ）に分布していることが分かった。その後、酸活性化液体を同様の様式で処理し、分析した。活性化工程により、全タンパク質収量が減少し、組成物の簡略化が見られた。ネペンテシン−Ｉとは別に、ケラチンとアクチンからのみわずかな汚染が見られた。これら分析は、ネペンテシンが主成分である濃液体の複雑さの低さを示す。活性化および８０倍に濃縮した液体の総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより計測により、２２ｎｇ／μＬであった。この値は、液体の濃縮について記述する以前の研究（Ｔｏｋｅｓ  ＺＡら「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ−Ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ−Ｌにより分泌される消化酵素（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ−Ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ−Ｌ）」  Ｐｌａｎｔａ  １１９（１）：３９−４６（１９７４））と一致した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
一連のタンパク質をＨＤＸ−ＭＳ実験に適した条件下で、濃縮した液体で消化した。濃縮物の消化特異性の特徴を、ペプシンでの同様の研究（Ｈａｍｕｒｏ  Ｙら「Ｈ／  Ｄ交換に互換性のある条件における固定化ブタペプシンの特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｐｓｉｎ  ｉｎ  Ｈ／Ｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２２（７）：１０４１−１０４６（２００８）」との比較をサポートするために、位置Ｐ１およびＰ１′（図１）において示す。いくつかの混入したタンパク質が明らかに存在していたとしても、濃縮液体中の計測されたタンパク質の全てがネペンテシンであると仮定して、本実施例において、酵素―基質比は、１：８５である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ネペンテシンデータは、１６１２残基の評価を表し、対応するペプシンデータ（１３，７６６残基）のように広範囲ではないが、配列の多様性は、位置Ｐ１およびＰ１′のレベルでの比較を保証するために設定されたタンパク質において著しく高い。ペプシンの秀でた特異性が位置Ｐ１に現れている。これは、Ｐ、Ｈ、ＫおよびＲの後ろで切断することが基本的にありえないが、疎水性残基Ｆ、Ｌ、およびＭの高効率な切断を表している。ネペンテシンは、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＩおよびＷを除いて、多くの残基の後ろを切断する。それは、予想されるペプシンＰ１残基の後ろだけでなく、ペプシン消化においてありえない残基、特にＫ、Ｒ、およびＰにおける高確率な切断をサポートする。位置Ｐ１′において、ペプシンは、一般的に芳香族の任意の残基を含む疎水性残基を選好することを示す。逆に、ネペンテシンは、恐らくＧ、ＰおよびＨに対してを除き、位置Ｐ１′における選択性について、より低いことを示す。全体として、ネペンテシンは、ペプシンに対し、位置Ｐ１における、著しく緩い特異性を示し、非常に高効率な指標を提供する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
緩い特異性がＨＤＸ−ＭＳ用途用の配列マッピングの改善につながるかどうかを決定するため、完全長ＸＲＣＣ４（球状ドメインおよび拡張ヘリカルストークおよび長く不規則なＣ末端を含むタンパク質）を精製した。Ｈａｍｍｅｌ  Ｍら「ＸＲＣＣ４リガーゼＩＶ複合体のＸＬＦ調節フィラメントアーキテクチャ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｆｉｌａｍｅｎｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＸＲＣＣ４．  Ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １８（１１）：１４３１−１４４２（２０１０）、およびＪｕｎｏｐ  ＭＳら「Ｘｒｃｃ４  ＤＮＡ修復タンパク質の結晶構造および末端結合の影響（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘｒｃｃ４  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）」Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９（２２）：５９６２−５９７０（２０００）。そのようなマルチドメインタンパク質を、単一の消化プロトコルに含ませることは困難であり、特に天然変性領域は、ペプシンでの消化が乏しい傾向があり、それらは、比較的、疎水性残基が枯渇し、プロリンに濃縮され、残基が荷電されるためである。Ｄｕｎｋｅｒ  ＡＫら「．  天然変性タンパク質（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ＆Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  １９（１）：２６−５９（２００１）。このタンパク質のペプシンおよびネペンテシンマップを図２に示す。この比較において、異なるプロテアーゼ量および再帰ＭＳ／ＭＳ実験を用いた、両酵素の徹底的なマッピングを進めた。ネペンテシンは、完全長のタンパク質のカバレッジに優れ、ペプシンが１８７に対し、ネペンテシンは、３５７個のペプチドである（１１個の残基の平均ペプチド長は、両酵素において同一である）。両酵素は、多くの数の重複ペプチドがある球状およびストーク領域を表すが、ネペンテシンにより提供される相補性は明らかである。例えば、ネペンテシンは、球状ドメイン（残基１〜３０）のβシート領域の非常に大幅なカバレッジを提供する。変性Ｃ末端領域は、はるかに大きい範囲および非常に高い冗長性に及ぶ。この変性テール領域の各残基は、ネペンテシンを用いて、１６倍のカバレッジおよびペプシンで４．７倍のカバレッジを受ける。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ペプチド検出のバイアスの存在は、メトリックで平均検索スコアを選択することにより探索される（図３）。このアプローチは、配列マップが定義される原理手段として配列同定の信頼性を強調する。本発明者らがトリプシン系ボトムアッププロテオミクスからわかるものと同一の、１つの異常値はＲである。Ｒで終結するペプチドの高いスコアは、高い平均ペプチド強度と優れた断片化の組み合わせを表していると考えられる。Ｗａｒｗｏｏｄ  Ｓら「定性的および定量的プロテオミクスのグアニジン化学（Ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２０（２１）：３２４５−３２５６（２００６）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
酵素効率をより詳細に試験した。単に、酸素・基質比を変えることによりペプチド質量マップを変化させ得るまたは調節し得る度合を図４に示す。溶液中の消化のため、ネペンテシン添加を５０倍の範囲にわたって変化させた。ペプシンの実験では、過度のペプシン自己分解を避けるため、遊離ペプシンではなく、スラリー形式の固定化ペプシンを使用した。酵素添加を８倍の範囲にわたって変化させた。量が少なければ、ペプチド強度に乏しく、量を多くすると、マップの自己分解への影響はなかった。ネペンテシンは、より多い添加においてでさえ非常に低い自己消化を生じることを見出した。効果的な消化を計測するため、集合ペプチドのイオンクロマトグラム（ＰＩＣ）を使用した。５２０：１（ペプシン：基質）で見られた分布との比較的類似した分布と０．３８：１（ネペンテシン：基質）との比較は、ＨＤＸのような用途において、ネペンテシンの効果がペプシンを超えて、顕著な１４００倍の改善を表すことが分かった。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ネペンテシン消化は、酵素添加を変化させ、ＸＲＣＣ４の可変的な提示を作成することにより、大きな断片を小さくより容易に変化させることができた。これは、ＰＩＣが、高添加での短い保持時間から低添加での長い保持期間に変化したことから、図４Ａにおいて証明された。この変化は、低酵素添加時の＞１２から、高酵素添加時の１０に変わる、最も多いときのペプチドの平均ペプチド長に関する。逆に、可変のペプシン添加は、ＰＩＣまたは平均ペプチド長を著しく変化させることはなかった（図４Ｂ）。強制流ペプシンマイクロリアクターは、進歩しているが、より小さな断片を生じさせないようであった。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
ネペンテシンによるグリアジンの消化
ネペンテシンによりグリアジンの消化を水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途用に設計されたＬＥＡＰ  ＨＴＸ−ＰＡＬオートサンプラーおよびディスペンスシステムを用いて、溶液中で実行した。データをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｔｒｉｐｌｅ−ＴＯＦ  ５６００  ＱｑＴＯＦ  質量分析計を用いて収集した。ペプチドをＭＳ／ＭＳデータからＭａｓｃｏｔ  （ｖ２．３）を用いて同定した。簡潔に説明すると、１２ｐｍｏｌの粗グリアジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）を、２μＬの１００倍濃縮液体と混合した。消化後、全容量を質量分析計に接続された逆相ＬＣシステムに注入した。ペプチドを７ｃｍの１５０μｍ  ｉ．ｄ．Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８カラムで捕捉し、１０分または３０分、１０％〜４０％のアセトニトリル勾配で溶出した。これら分析で検出されたペプチドを、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数の情報依存性取得方式におけるＣＩＤ断片化のため選択した。スペクトルを、全ての同定された小麦グリアジン（α、β、γ、ω）タンパク質、さらに低高分子量のグルテニンの配列を含有する小型のデータベースで探索した。図５は、３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、小麦からのグリアジンのネペンテシン消化物から同定された全てのペプチドの平均長を示す。偽陽性同定を排除するため、スコアにおける信頼水準９５％のカットオフ値を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を入れ子の図に示す。