【手続補正書】
【提出日】平成29年5月15日(2017.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターであって、
前記微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
２μｍ以下の半値全幅を有する照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成され、前記流れ方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第１の方向と前記第１の方向と反対の軸に沿った第２の方向に前記照射スポットの照射位置するように構成される、少なくとも１つの照射光学系と、
前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第２の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第１の結果光データを与えるように構成される第１の光検出器と、前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第２の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの回折光の光強度に対応する第２の結果光データを与えるように構成される第２の光検出器と、を有する少なくとも１つの検出光学系と、
前記検出光学系からの前記第１の結果光データまたは前記２の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備える、
イメージフローサイトメーター。
【請求項２】
前記照射光学系は、前記入射光を回折限界まで収束させるように構成される、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項３】
前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記流れ方向に対して垂直である前記流路の断面の中心を前記入射光の焦点が通過するように、前記照射光学系に前記照射位置を走査させるように構成される、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項４】
前記検出光学系は、前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第２の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの側方散乱光の光強度に対応する第３の結果光データを与えるように構成される第３の光検出器を更に備え、
前記制御部は、更に、前記検出光学系からの第３の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出するように構成される、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項５】
前記照射光学系はレーザを有し、前記入射光は前記レーザからの光を含む、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項６】
前記照射光学系は、前記照射位置を走査するために、実質的に前記軸に沿って、前記入射光を偏向させる光デフレクタを有する、
請求項５に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項７】
前記光デフレクタは、音響光学デフレクタ又は電気光学デフレクタを含む、
請求項６に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項８】
微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、前記流れ方向に対して実質的に垂直に、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成される、少なくとも１つの照射光学系と、
前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第１の結果光データを与えるように構成される第１の光検出器と、前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの回折光の光強度に対応する第２の結果光データを与えるように構成される第２の光検出器と、を有する少なくとも１つの検出光学系と、
前記第１の結果光データまたは前記第２の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記微小粒子状試料の流速および走査速度から決定される座標を、少なくとも前記第１の結果光データまたは前記第２の結果光データと関連付け、
少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の２次元分布を決定する、
ように構成される、
システム。
【請求項９】
前記制御部は、前記２次元分布を示す２次元画像を提供するように構成される、
請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
複数の検出光学系と複数の照射光学系とを更に備え、前記複数の検出光学系は少なくとも１つの検出光学系を有し、前記複数の照射光学系は少なくとも１つの照射光学系を有し、
前記複数の検出光学系のそれぞれは、前記複数の照射光学系のそれぞれに対して、前記フローチャンバの反対側に配置され、
前記制御部は、
前記複数の検出光学系のそれぞれについて複数の２次元分布のそれぞれを決定し、前記複数の２次元分布は前記２次元分布を含み、
前記複数の２次元分布のそれぞれを複数組み合わせることで、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の３次元分布を生成する、
ように構成される、
請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記制御部は、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の３次元分布を示す３次元画像を生成するように構成される、
請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記微小粒子状試料の前記流速を測定し、前記制御部へ測定結果を出力する流速測定部を更に備える、
請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記制御部は、前記流速測定部からの前記測定結果に応じて、前記微小粒子状試料の前記流速を連続的に更新するように構成される、
請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記流速測定部は、前記流路内に配置され、又は、前記流路に接続され、前記流路を流れる前記微小粒子状試料の前記流速を観測する、
請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記流速測定部は、前記照射光学系と前記制御部とを含み、
前記照射光学系は、複数の回折光ビームを含む前記入射光を提供する位相格子を有し、
前記照射光学系は、前記流路の流れの前記方向の沿った互に異なる位置に前記複数の回折光ビームを指向させ、
前記制御部は、前記複数の回折光ビームから選択された２つの回折光ビームの照射位置の間の距離と、前記微小粒子状試料が前記照射位置を通過するときに得られる時間差とから、前記微小粒子状試料の前記流速を算出するように構成される、
請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記照射光学系は、前記流れ方向に対して垂直な１以上の軸に実質的に沿って、前記照射位置のそれぞれを走査するように構成される、
請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記照射光学系は、複数の光ビームを含む前記入射光を提供するように構成され、
前記照射光学系は、互いに異なる角度で、前記複数の光ビームを前記照射スポットに指向させ、
前記検出光学系は、前記光ビームのそれぞれに対応する、互いに分離された結果光データを与えるように構成され、
前記制御部は、検出された前記分離された結果光データを用いて、前記微小粒子状試料の３次元画像を算出するように構成される、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項１８】
前記照射光学系は、光源と、前記複数の光ビームを含む前記入射光を提供するために前記光源からの光を回折させる位相格子と、を有する、
請求項１７に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項１９】
複数の微小粒子状試料を前記流路に供給するように構成された流動誘起装置を更に備え、
前記複数の微小粒子状試料は前記微小粒子状試料を含み、
前記照射光学系は、照射体積にわたって前記照射位置を走査し、前記流路は前記複数の微小粒子状試料のうち１つのみが前記照射体積内に存在できるように形成される、
請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
【請求項２０】
微小粒子状試料を輸送する流体の流れをフローチャンバに与え、
前記フローチャンバ内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記微小粒子状試料よりも小さい照射スポットを走査し、前記走査は前記流体の流れの方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第１の方向および前記第１の方向と反対の軸に沿った第２の方向の走査を含み、
照射位置が前記第１の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第２の方向に走査されている間に、透過光の第１の検出信号と、前記照射スポットでの波長と実質的に同じ波長を有する回折光の第２の検出信号と、を検出し、
前記第１及び第２の検出信号と前記流体の流れの速度を用いて前記微小粒子状試料のイメージマップを決定する、
方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
図３Ａに示すように、デフレクタ２３を通過したレーザ光Ｌは、対物レンズ２４によりフローチャンバ１のマイクロ流路１２に、例えば回折限界まで収束される。一例においては、レーザ光は、約２．０μｍの半値幅のレーザスポットに収束される。以降、レーザ照射スポットは、スポット中心から光強度がスポット中心の半分となる位置までの領域として定義される。微小粒子状試料は、上述のマイクロ流路の性質により、マイクロ流路の中心付近にセルフアライメントされる。よって、レーザ光の焦点は、照射スポットにより走査される経路がマイクロ流路の中心を通過するように構成され、例えば回折限界まで収束されるレーザ光を、マイクロ流路を流動する微小粒子状試料上に照射することを容易にする。なお、この例では、レーザ光Ｌのデフレクタ２３による偏向角は小さい。従って、レーザ光がフローチャンバ１の平板形状部材１７を介して入射しても、屈折による焦点位置の変位のような影響は、無視できるほどに小さい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図３Ｂは、照射光学系２の他の構成である照射光学系２０の構成を模式的に示すブロック図である。照射光学系２０は、図３Ａに示す照射光学系２にλ／４板２５が追加された構成を有する。λはレーザ光源２１からの光の波長である。λ／４板２５は、レーザ光Ｌの光路に配置される。例えば、λ／４板２５は、デフレクタ２３と対物レンズ２４との間に挿入される。λ／４板２５は、直線偏光を円偏光に変換する。円偏光をもたらす他の光学構造も用いることができる。生体細胞又はタンパク質は、一般的に偏光特性を示す。よって、偏光顕微鏡は、生物学的観察にとって有益である。微小粒子状試料中の材質の偏光特性を検出するには、入射光ビームは全方位で対称であることが望ましい。円偏光ビームは、この性質を示す点で好都合である。しかし、多くのＡＯＤ及びＥＯＤは入射ビームの直線偏光、典型的には垂直偏光を用いて動作する。直線偏光から円偏光への変換のために１／４波長板を挿入することで、ＡＯＤ又はＥＯＤを用いることができるようになり、かつ、円偏光の好ましい生物学的性質を保つことができる。以下で図６を参照して説明するように、ｐ及びｓ偏光成分の検出により、微小粒子状試料の偏光特性を決定できる。図４Ａ及び４Ｂに、偏光成分検出のために設計される検出光学系の例を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
図４Ｂは、検出光学系３の光検出器３４の構成例を示す構成図である。光検出器３４は、上述の照射光学系２０と共に用いられる。光検出器３４は、偏光ビームスプリッタ３４１、ｓ偏光検出器３４３及びｐ偏光検出器３４２を有する。共焦点絞り３６を通過した光は、偏光ビームスプリッタ３４１に入射する。光Ｌ１１に含まれるｓ偏光Ｌ＿ｓはビームスプリッタ３４１で反射され、光Ｌ１１に含まれるｐ偏光Ｌ＿ｐは偏光ビームスプリッタ３４１を透過する。ｓ偏光検出器３４３は、ｓ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを検出結果として出力する。ｐ偏光検出器３４２は、ｐ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを検出結果として出力する。検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓ及びＳＩＧ＿Ｔｐは、図４Ａに示す検出信号ＳＩＧ＿Ｔの一部である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
様々な態様においては、流速、スポットサイズ、および、Ｘ軸偏向周波数パラメータは、（１）微小粒子状試料の望ましい領域の蛍光染料マーカーの励起強度レベルが閾値を超えるように、かつ、（２）望ましい走査イメージの解像度、ビット深さ、及び精細さをもたらすように設定される。様々な態様においては、スポットサイズが選択され、その後、流速と走査周波数とが制御される。例としては、半値全幅（ＦＷＨＭ）が２．０μｍ、偏向周波数が１ＭＨｚ、流速が１ｍ／ｓのスポットが挙げられる。この例では、ガウス分布のスポットの光強度の１／２よりも大きな光強度を有する１μｍの走査垂直解像度をもたらす。２μｍの半値全幅は、例えば血球のような１０μｍの粒子からのデータを有効な焦点深度にて有測定するのに好都合である。他の例においては、スポットサイズは０．５μｍであり、より高い解像度をもたらす。流速は１／４ｍ／ｓとすることができ、走査周波数を４ＭＨｚとすることができ、又は、これらの組み合わせとすることができる。一般に、スポットサイズを小さくするのと同じ割合で、流速を減少させ、又は、走査周波数を増加させることができ、その逆もまた成立する（スポットを大きくし、流速を増大又は走査周波数を減少させる）。流速は、望ましい解像度とスループットとを両立させるように選択される。速い流れは、高いスループットと低い垂直解像度をもたらす。遅い流れでは、スループットが低下するとともに、垂直解像度が改善される。水平解像度は、走査周波数とサンプリング周波数（例えば、１走査あたりのサンプル数）とで決定される。粒子の絶対的なサイズと形状とを有利に測定できるように、これらのパラメータを選択することができる。従来のフローサイトメーターは、このような測定を行う能力を提供しない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
大きなビームスポットで試料を照射する一般的なフローサイトメトリー装置では、ビームスポットの光強度は分布（例えば、ガウス分布）を有する。そのため、ビームスポット内での試料の位置により、検出感度にばらつきが生じる。例えば、微小粒子状試料が従来のフローサイトメーターの照射領域の中心にない場合、微小粒子状試料が照射領域の中心にある場合よりも信号強度が低くなる。一方、本構成を含む、本明細書で説明する様々な発明態様においては、ビームスポットは微小粒子状試料よりも小さい。これにより、試料の位置による検出感度の変動を大きく低減し、ほとんど排除することができる。また、これにより、直線掃引範囲でのレーザ照射スポットの光強度分布による変動を実質的に低減できる。微小粒子状試料を走査する小スポットは、一定の走査速度の領域内で均一な照明を提供できる。従来のスキームは、先端の幅が広い油性マーカーペンと幾分似ている。掃引領域の端よりも中央の方がカバレッジが大きい（光強度がより強い、又は、インクがより濃い）。微小スポットを用いることで、光強度の中心から端へのロールオフを都合よく減少させることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
様々な態様においては、微小粒子状試料６１を観察するためのイメージフローサイトメーター１００は、フローチャンバ１を有する。フローチャンバ１は、流れ方向（例えば＋Ｙ）に微小粒子状試料６１を流動させるようにフローチャンバ１に形成されたマイクロ流路１２を有する。少なくとも１つの照射光学系（例えば照射光学系２）は、選択された代表的サイズよりも小さな照射スポットの入射光Ｌで、フローチャンバ１の微小粒子状試料を照射できるように構成される。代表的サイズは、観察される微小粒子状試料６１又は他の対象物の性質に応じて選択される。例えば、上述のように、血球は、〜１０μｍの直径を有する。代表的サイズは、２μｍよりも大きなＦＷＨＭ、例えばＦＷＨＭが３μｍに設定され、２μｍのスポット（３μｍよりも小さい）を用いることができる。また、照射光学系２は、流れ方向に実質的に直交する方向（例えば、図８Ａの±Ｘ）に照射スポットの照射位置を走査する。少なくとも１つの検出光学系（例えば、検出光学系３又は４）が、フローチャンバ１から生じた光（例えば、Ｌ＿Ｔ−ＦＳ、Ｌ＿Ｔ−ＳＳ、Ｌｆ）の光強度を検出する。検出光学系３は、フローチャンバ１を介して照射光学系２と向かい合っている。また、検出光学系４（例えば検出光学系４）は、入射光の光軸からずれた位置に配置することができる。ＦＳ検出器は、正確に入射光Ｌの光軸上にある必要はないが（図１）、例えば光軸の±１°、±５°、±１０°又は±１５°以内とすることができる。制御部５は、検出光学系３で検出された結果光の光強度の変化に応じて微小粒子状試料を検出する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
実施の形態２
次に、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００について説明する。イメージフローサイトメーター２００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図９は、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター２００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００に、流速測定器６を追加した構成を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
実施の形態３
次に、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００について説明する。イメージフローサイトメーター３００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１０は、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター３００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００の照射光学系２を、照射光学系７に置換した構成を有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
実施の形態４
次に、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００について説明する。イメージフローサイトメーター４００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１７は、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター４００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００に追加的な照射光学系８及び検出光学系９を追加した構成を有する。図面の簡略化のため、図１７では、検出光学系４（図１）の表示を省略している。検出光学系４は、系２、３、８、９と共に用いることも、用いないこともできる。４つの検出光学系は、入射光（例えば、光Ｌａ、Ｌｂ）の２つの異なる軸に沿った前方及び側方散乱の測定を行うために用いることもできる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
照射光学系８は、照射光学系２と同様の構成を有し、フローチャンバ１を基準として照射光学系２に対して、例えば９０°回転した位置に配置される。検出光学系９（配置角度又は方向性の制限なく、垂直検出光学系として参照される）は、検出光学系３（平行検出光学系）と同様の構成を有し、フローチャンバ１を介して照射光学系８と向かい合う位置に配置される。この例では、照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置される。照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｙ平面、又は、例えばＸ−Ｙ、Ｘ−Ｚ又はＹ−Ｚ平面に対して４５°の他の面に配置することもできる。参照を図１に戻すと、一例においては、照射光学系２、８と検出光学系３、９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置され、（照射光学系２に対応する測方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳを検出するための）検出光学系４は、Ｚ軸周りに例えば５°〜８５°、具体的には１５°、３０°、４５°又は６０°の少量だけＸ−Ｚ平面が回転された平面に配置することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】イメージフローサイトメーター、システム及び方法