(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
着色粒子により標識化された、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第１の抗体が含浸された部位（１）を有する多孔性マトリックスと、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第２の抗体が固定化された反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとを有する試料中のヒトヘモグロビン検出装置であって、該部位（１）を有する多孔性マトリックスと該反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとが別の多孔性マトリックスからなり、該部位（１）と該反応部位（２）との距離が０．５ｃｍ  以上４ｃｍ以下である、ヒトヘモグロビン検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糞便中のヒトヘモグロビン（以下、ヒトＨｂとよぶ）を検出するための装置に関する。さらに詳しくは、消化管の腫瘍性機転を引き起こす疾患などの診断および治療上重要である、便潜血検出のための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以前は、糞便中の潜血の検出の方法として、Ｈｂのペルオキシダーゼ様作用を利用した非特異的な検出法が用いられていた。しかし、この方法は食肉中のヘモグロビンやその他の物質によっても反応が陽性となるため、検査前の厳しい食事制限が必要なうえ、正確度にも問題があった。
【０００３】
近年、抗ヒトＨｂ抗体によるヒトＨｂの免疫学的測定法（バロウズ（Ｂａｒｒｏｗｓ）  、アメリカン  ジャーナル  オブ  クリニカル  パソロジー（Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉ．  Ｐａｔｈｏｌ．）  ６９  ３４２−３４６，１９７８  参照）が開発されて以来、食事制限を必要としない糞便中の潜血の検出法がつぎつぎと開発されている。
【０００４】
特開昭５６−１０６１５４号公報では、サンドイッチＥＩＡまたは競合的ＥＩＡなどによりＨｂを検出する方法が述べられている。これらの方法は非常に高感度かつ特異的であるという利点を有する。しかし、その反面操作手順が多く煩雑で、測定には長時間を要するため、使用者の熟練が必要であり、使用する場面も限られたものとなるという欠点を有する。
【０００５】
特開昭５９−１２５０６４号公報では、抗Ｈｂ抗体感作ラテックスを用いた免疫学的ラテックス凝集反応によるＨｂの検出方法が記載されている。この方法は、操作が簡便であるという利点を有する。しかし、反応時間を厳守しないばあいは正確さに問題があり、判定が肉眼によるラテックスの凝集の有無の確認により行なわれるため紛らわしく、集団検診などの多検体同時処理には適さないという欠点を有する。また、便懸濁液をスライド板上で反応させなくてはならないため、使用者に臭気、不潔感などの不快感を与えるという欠点も有する。
【０００６】
これに関して、特開平１−１６１１５２号公報では、抗Ｈｂ抗体で感作したラテックスによる凝集反応を光学的に検出する自動化した機械について述べられている。この方法では、Ｈｂを定量的に測定でき判定の紛らわしさはなくなり、また自動化により操作性、作業者の不快さの点でも改善された。しかし、機械自体非常に高価なものとなり、集団検診用として多検体処理する際には適しているが、家庭および医院で少ない検体数を測定するには不向きである。
【０００７】
特開昭５９−１８２３６７号および特開昭６１−２２８３５１号公報には、便に直接スティックまたはサジを接触させてヒトＨｂを吸着させ洗浄したのち、これを特異的反応に付す方法が記載されている。また、特開昭６０−１７３４７１号公報には、抗Ｈｂ抗体を固定化した濾紙上に便を適用し、洗浄する方法が記載されている。しかし、これらの方法はいずれも洗浄および発色などの操作を必要とし、煩雑であるという欠点を有する。
【０００８】
特開平２−１４１６６５号公報には、抗Ｈｂモノクロナール抗体を感作した金コロイド粒子の凝集による色調の変化により検出する方法について記載されている。この方法は、結果の安定性、判定の容易性、操作の簡便性の点ですぐれているが、反応時間が数１０分と長くかかるという欠点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、家庭においても糞便中の潜血を測定できるよう、操作、判定の容易性および判定結果の安定性を兼ね備え、さらに作業者の不快感を除いた、操作が容易で短時間にヒトＨｂを検出しうる安価な装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的に鑑み鋭意検討を重ねた結果、ヒトＨｂ検出において、試料中のヒトＨｂと特異的に結合する抗体をクロマトグラフ媒体に組み込んだサンドイッチイムノアッセイと、反応・未反応成分の分離のためのクロマトグラフをあわせて行なうイムノクロマトグラフ法を、ヒトＨｂと抗体との凝集反応による妨害を受けない一定条件下で行なわせる装置により目的が達成されることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、着色粒子により標識化された、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第１の抗体が含浸された部位（１）を有する多孔性マトリックスと、試料中のヒトヘモグロビンと特異的に結合する第２の抗体が固定化された反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとを有する試料中のヒトヘモグロビン検出装置であって、該部位（１）を有する多孔性マトリックスと該反応部位（２）を有する多孔性マトリックスとが別の多孔性マトリックスからなり、該部位（１）と該反応部位（２）との距離が０．５ｃｍ  以上４ｃｍ以下である、ヒトヘモグロビン検出装置に関する。
【００１２】
つぎに本発明の装置について説明する。
【００１３】
本発明の装置は、第１の抗体が含浸された部位（１）および第２の抗体が固定化された反応部位（２）を有するクロマトグラフ媒体（３）からなる装置である。
【００１４】
本発明の第１の抗体としては、ヒトＨｂに対するモノクローナル抗体が用いられる。第２の抗体としては、ヒトＨｂと特異的に結合しうる抗体であれば、とくに限定されない。
【００１５】
第１の抗体は、着色粒子により標識化される。この標識化に用いられる着色粒子は肉眼により検出しうる粒子であればとくに限定されないが、好ましくは、たとえば金コロイドなどの金属コロイドまたは着色ラテックスが用いられる。該粒子の大きさは、通常直径約２０〜３００ｎｍ  の範囲であるが、それ以外の大きさの粒子も用いうる。
【００１６】
このような粒子による第１の抗体の標識化は、着色粒子表面への抗体の吸着により行なうことができる。たとえば着色粒子として金コロイドを用いるばあい、抗体と金コロイドとをすみやかに混合し、１〜２分インキュベーションしたのち、そこへ非特異的な凝集を防ぐためにポリエチレングリコールまたは牛血清アルブミンなどを加える。ついで、高速で遠心分離して上清を吸引除去する。えられた沈殿をポリエチレングリコールまたは牛血清アルブミンなどを含有する緩衝液に再懸濁して、遠心処理により残っている標識化されていない抗体を除くことにより、着色粒子により標識化された抗体がえられる（ジョージガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）  ら、ジャーナル  オブ  イムノロジカル  メソッズ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）３４，１１−２１，１９８０など参照）。
【００１７】
着色粒子により標識化された第１の抗体は、クロマトグラフ媒体の一部分に含浸・乾燥されていてもよいし、またはクロマトグラフ媒体とは別の繊維の多孔性マトリックスに含浸・乾燥され、該マトリックスがクロマトグラフ媒体と接触させられていてもよい。このようなマトリックスとしては、好ましくは不織布またはフェルトなどが用いられる。
【００１８】
第２の抗体は、クロマトグラフ媒体の一定の部位に固定化される。
【００１９】
固定化の方法は、クロマトグラフ媒体の種類によって異なるが、通常の濾紙、ガラスフィルター、ナイロンメンブレンなどのばあい、抗体はまずラテックス粒子と結合される。使用するラテックス粒子はフィルターの目の大きさ（保留粒子径）よりも大きな粒子径のものを用いるか、小さな粒子径のものを凝集させて用いる。
【００２０】
第２の抗体とラテックス粒子とを結合させた固相ラテックスは通常の方法により行なわれ調製される。たとえば、抗体とラテックスエマルジョンを室温で約２時間インキュベーションし、ついで牛血清アルブミンなどを含有する緩衝液を加え、遠心分離する。えられた沈殿を同じ緩衝液により１〜３回、懸濁・遠心分離操作を行なうことにより洗浄し、ラテックス粒子と結合された抗体、すなわち固相ラテックスがえられる。
【００２１】
ラテックス粒子と結合された抗体は、前記緩衝液に懸濁された状態で、スポッティングまたは直接噴射印刷されることにより固定化される。
【００２２】
一方、ニトロセルロースメンブレンやある種の活性化されたメンブレンでは、抗体溶液をそのままスポッティングまたは直接噴射印刷されることにより固定化される。
【００２３】
第２の抗体が固定化される部位は以下に述べる理由から、クロマトグラフ媒体上に、第１の抗体が含浸された部位から下流方向に０．５ｃｍ  以上４ｃｍ以下、好ましくは０．５ｃｍ  以上２ｃｍ以下の距離にあることが必要である。すなわち、ヒトＨｂはαおよびβ各２つのサブユニットからなる４量体であるという特殊な構造を有するため、１つのヘモグロビンあたり同一の抗原決定基を２つずつ有することになる。このため第１の抗体としてモノクローナル抗体を用いてもクロマトグラフ媒体中で、ヒトＨｂ・標識化抗体結合物が凝集塊を形成し、展開不能となってしまう。しかし、標識化抗体と反応部位との距離が４ｃｍ以下、とくに２ｃｍ以下であるばあいは、ヒトＨｂ・標識化抗体結合物は凝集塊の成長により展開が不能となる以前にすみやかに展開されて固定化抗体に捕捉されることが見出されたのである。一方、０．５ｃｍ  より短い距離のばあいは、第１の抗体が、抗原（ヒトＨｂ）と接触し、第２の抗体に達するまでの時間が短く、つまりは抗原抗体反応に要する充分な時間がえられないために、充分な感度がえられない。したがって０．５ｃｍ  以上の距離が必要である。
【００２４】
本発明の装置において用いられるクロマトグラフ媒体は、便懸濁液試料を展開できるものであればとくに限定されないが、試料の吸着がなく、均一で速い展開速度がえられるため、ガラスフィルターがとくに好ましい。このクロマトグラフ媒体の多孔性マトリックスは短冊状に成型して用いる。
【００２５】
本発明の装置は、便懸濁液試料を装置に適用する際に、試料を一時的に吸収、濾過するためのサンプルパッド（４）を有していてもよい。このようなサンプルパッドとしては、繊維の多孔性マトリックス、好ましくは不織布またはフェルトなどをクロマト展開に必要なサンプル量を保持できる程度の大きさにしたものが用いられる。該サンプルパッドは、第１の抗体含浸部位と該部位の下流側で一部重復してクロマトグラフ媒体上に位置する。このサンプルパッドにより便懸濁液が濾過されるため、事前に便中に含まれる繊維などの不溶物を除く操作が不要となる。
【００２６】
本発明の装置は、展開し終えた試料を保持するための吸水パッド（６）を有していてもよい。この吸水パッドは、吸水性の高い多孔性マトリックスからなる。該吸水パッドは展開し終えた試料をすべて保持するのに充分な大きさを有し、クロマトグラフ媒体の下流末端と重複して位置する。
【００２７】
本発明の装置は、ハウジング（５）を有していてもよい。ハウジングは、非浸水性の成形可能な材質、たとえばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、カルプまたはポリプロピレンなどからなり、サンプルパッド、クロマトグラフ媒体および吸水パッドからなる装置全体を被い、かつ試料適用部位および第２抗体固定化部位に窓が設けられている形状を有する。このハウジングを設けることにより、臭気や便懸濁液が漏出するのを防ぐことができる。
【００２８】
本発明の装置を用いた便懸濁液中のヒトＨｂの検出は以下のようにして行なわれる。すなわち、第一の抗体（１）が含浸された部位の側に試験試料を接触させ、ヒトＨｂを標識化された第一の抗体と反応させ、形成されたヒトＨｂ・第一抗体・着色粒子複合体をさらに該クロマトグラフ媒体（３）上で移動させ、固定化された第二の抗体（２）と反応させ、補足させることにより、試料中のヒトＨｂの有無を着色シグナルとして表現する。反応部位に着色シグナルが現われるか否かによって、試料中のヒトＨｂの有無を判定することができる。ここで、便を懸濁するための溶媒は、とくに限定されないが、たとえば０．１  重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水などが用いられる。
【００２９】
【実施例】
つぎに実施例に基づいて本発明をさらにくわしく説明するが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。
【００３０】
実施例
（ヒトＨｂのイムノクロマトグラフィーによるアッセイ）
（ａ）固相ラテックスの調製
市販ラテックスエマルジョン（積水化学工業株式会社製、Ｎ−４５０）を固形分濃度が０．６  重量％となるようリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）により希釈した。その１ｍｌと、ヒトＨｂに対するウサギ抗体を濃度１００  μｇ／ｍｌとしたもの１ｍｌとをエッペンドルフ遠沈管に採り、室温で２時間インキュベーションしてラテックス粒子にウサギ抗体を感作させた。ついで濃度０．１  重量％のウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含有するＰＢＳを用いて３回、８０００Ｇにて１０分間遠心沈降処理によって洗浄し、最終的に２ｍｌとなるよう再懸濁することにより、固相ラテックスを調製した。
【００３１】
（ｂ）金コロイド粒子の調製
金コロイド粒子の調製は、ジー  フレンス（Ｇ．  Ｆｒｅｎｓ）の方法（ネイチャー  フィジカルサイエンス（ＮＡＴＵＲＥ  ＰＨＹＳＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ）  ２４１  Ｊａｎ．１  １９７３  年参照）にしたがった。すなわち、濃度０．０１重量％の塩化金水溶液２００ｍｌ  を沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液２ｍｌを加えた。溶液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加熱沸騰を行なうことにより、平均粒子径が０．０４μｍの金コロイド分散液を調製した。
【００３２】
（ｃ）金コロイド粒子標識抗体の調製
金濃度が０．０１重量％である前記の金コロイド分散液を１Ｍ炭酸カリウム溶液を用いてｐＨを６．７  に調製した。これにヒトＨｂに対するモノクロナール抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり５μｇとなる割合で加えた。１〜２分後、その１０ｍｌに濃度１０重量％のＢＳＡを０．１ｍｌ  加え、１０，２００Ｇで１時間遠心沈降処理して上清を除去し、ＢＳＡを濃度０．１  重量％で含有するＰＢＳを用いて３回、１０２００  Ｇにて１時間遠心沈降処理により洗浄し、金コロイド粒子標識された第１の抗体を調製した。これを前記ＰＢＳ１０ｍｌに再分散させ、０．１ｍｌ  を５×１０ｍｍのベンリーゼ不織布（商品名、旭化成工業株式会社製）に含浸させ凍結乾燥した。
【００３３】
（ｄ）クロマトグラフ媒体の調製
市販ガラスフィルター（アドバンテック東洋製、ＧＣ−５０）より１０×１００ｍｍ  の膜ストリップを裁断し、これをガラス板上に置き、取り扱いやすくするために粘着テープにより固定した。ストリップの端から０．２  、０．５  、１．０  、２．０  、３．０  、４．０  または５．０ｃｍ  の位置に、アキュラジェッター液体噴射装置（商品名、ノードソン社製）およびＸＹテーブルエアロステージ（商品名、ＴＨＫ社製）を用いて、展開方向に垂直に、すなわちストリップの短辺と平行に固相ラテックス１μｌを１０ｍｍの長さに噴射印刷した。
【００３４】
（ｅ）装置の組立
１０×１２０ｍｍ  の粘着シート上に前記クロマトグラフストリップを、横幅１０ｍｍを揃えて、ラテックスを噴射印刷した部位より遠い方の端をそろえて置き、さらにその上に３方の端をそろえて１０×４０ｍｍの濾紙（ワットマン製、１７Ｃｈｒ）を重ね、テープでとめた。もう一方の前記のクロマトグラフストリップの端には、前記の金コロイド標識抗体含有不織布が２．５ｍｍ  重なるように置いた。さらに前記の金コロイド標識抗体含有不織布に２．５ｍｍ  重なるように、サンプルパッドとして１０×２０ｍｍのベンリーゼ不織布を置いた。
【００３５】
（ｆ）ヒトＨｂ含有試料の調製
ヒトＨｂ（シグマ製）を、濃度０．１  重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより希釈して、ヒトＨｂ濃度がそれぞれ０．１  、１．０  、１０および１００  μｇ／ｍｌのヒトＨｂ含有試料を調製した。
【００３６】
（ｇ）アッセイ
前記のヒトＨｂ含有試料２００  μｌまたはブランクとして濃度０．１  重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳ２００  μｌを前記（ｅ）においてえられた装置のサンプルパッドに滴下し、当該試料を展開させた。５分間の経過後、反応部位におけるラインの有無を観察した。
【００３７】
反応部位に何も現われなかったばあいを−、わずかにラインが認められるばあいを±、ラインが認められるばあいを＋およびはっきりとしたラインが認められるばあいを＋＋と評価した。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0003544968.tif 000002
【００３９】
表１より以下のことがわかる。すなわち、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が５．０ｃｍ  のばあい、試料中のＨｂ濃度が１０μｇ／ｍｌ以上になると反応部位におけるラインがあいまいになり、Ｈｂ濃度が１００  μｇ／ｍｌ以上では陰性の結果が出てしまう。一方、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が０．２ｃｍ  のばあい、試料中のＨｂ濃度が１μｇ／ｍｌでは反応部位におけるラインが少しあいまいになる。これに対して、標識化抗体含浸部位と反応部位との距離が０．５ｃｍ  以上４．０ｃｍ  以下であるときは、試料中の幅広い濃度範囲において安定な判定結果がえられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、家庭でも短時間で容易に安定な判定結果がえられ、しかも作業者の不快感をなくした簡便なＨｂ検出装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の平面図である。
【図２】サンプルパッドと吸水パッドを備えた本発明の装置の平面図である。
【図３】図２の装置の側面図である。
【図４】ハウジングを備えた本発明の装置の平面図である。
【図５】図４の装置の側面の断面図である。
【符号の説明】
１  標識化抗体含浸部位
２  反応部位
３  クロマトグラフ媒体
４  サンプルパッド
５  ハウジング
６  吸水パッド
７  粘着シート
【図１】
0003544968.tif 000003
【図２】
0003544968.tif 000004
【図３】
0003544968.tif 000005
【図４】
0003544968.tif 000006
【図５】
0003544968.tif 000007