【手続補正書】
【提出日】平成29年1月10日(2017.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び１種又は２種以上のエネルギー基質と、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための培養培地。
【請求項２】
前記培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、付着依存性細胞を増殖させるための無血清培養液。
【請求項４】
単離された臍帯組織由来細胞を培養する方法であって、
ａ．アミノ酸類、ビタミン類、塩類、ヌクレオシド類、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを含む培養培地におけるマイクロキャリア上に播種された臍帯組織由来細胞を増殖させる工程であって、該培養培地は、該細胞が所望の初期個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって、血清が補充される、工程と、
ｂ．該細胞が該所望の初期個体群密度に達した後、無血清培養液を添加する工程であって、該無血清培養液は、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、亜セレン酸ナトリウムを含む、工程と、
ｃ．該細胞が所望の最終個体群密度に達することが可能な十分な期間にわたって該細胞を増殖させる工程と、を含み、
該臍帯組織由来細胞は、実質的に血液を含んでいないヒト臍帯組織から単離され、培養中の自己再生及び自己増殖が可能であり、分化する潜在能力を有し、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、及びＨＬＡ−ＤＲを発現しない、方法。
【請求項５】
前記方法は、前記マイクロキャリア上に前記細胞を播種する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、工程ｃの後に前記細胞を単離する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、培地交換を必要としない、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、スピナーフラスコ培養システムにおいて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
培養の前及び後の前記細胞の特性は、実質的に同じである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
培養の前及び後の前記細胞の特性は、同じである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記所望の初期個体群密度は、３〜４日後に達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロキャリアは、アミン処理された表面を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養培地は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び１種又は２種以上のリン酸ナトリウム塩と、
ヌクレオシド類であるチミジン、アデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、リポ酸／チオクト酸、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及び１種又は２種以上のエネルギー基質と、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種又は２種以上のエネルギー基質は、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養培地は、
少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−アルギニン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−シスチン、少なくとも約０．２ｇ／ＬのＬ−グルタミン、少なくとも約０．０１ｇ／Ｌのグリシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−ロイシン、少なくとも約０．０９ｇ／ＬのＬ−リシン、少なくとも約０．０２ｇ／ＬのＬ−メチオニン、少なくとも約０．０５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、少なくとも約０．０３ｇ／ＬのＬ−セリン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−トレオニン、少なくとも約０．００９ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−チロシン、少なくとも約０．０８ｇ／ＬのＬ−バリン、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−システイン、少なくとも約０．０００４ｇ／ＬのＬ−アラニン、少なくとも約０．０１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、少なくとも約０．００６ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、少なくとも０．０３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、少なくとも約０．００５ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び少なくとも約０．０００３ｇ／ＬのＬ−タウリンと、
それぞれが約５×１０−６ｇ／Ｌ〜約０．０１５ｇ／Ｌのビタミン類と、
少なくとも約０．０５ｇ／Ｌの無水塩化カルシウム、少なくとも約０．１ｇ／Ｌの塩化カリウム、少なくとも約０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも約０．０８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム、Ｈ２Ｏ、及び少なくとも約０．０００５ｇ／Ｌの第二リン酸ナトリウム７水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
少なくとも約０．０００１ｇ／Ｌのチミジン並びにそれぞれが最少で約０．００５ｇ／Ｌのアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
少なくとも０．００３ｇ／Ｌのインスリン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのトランスフェリン、少なくとも約５×１０−６ｇ／Ｌのリポ酸／チオクト酸、少なくとも０．０５ｇ／Ｌのエタノールアミン、及び少なくとも約０．００００４ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウムと、を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地は、２〜２０％のＦＢＳが補充されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養培地は、約７．５％、約１０％、又は約１５％のＦＢＳが補充されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地は、プトレシン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記無血清培養液は、
アミノ酸類であるＬ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−タウリンと、
ビタミン類であるＤ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサル、リボフラビン、チアミン、ｄ−ビオチン、ピリドキシン、及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）と、
塩類である第一リン酸ナトリウム及び第二リン酸ナトリウム７水和物と、
微量のミネラル類である硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）と、
ヌクレオシド類であるアデノシン、シチジン、ウリジン、及びグアノシンと、
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、リポ酸／チオクト酸、及び亜セレン酸ナトリウムと、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記無血清溶液は、プトレシン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記無血清培養液は、エネルギー基質が欠如している、請求項３に記載の無血清培養液。
【請求項２２】
前記無血清培養液は、エネルギー基質が欠如している、請求項４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
培養培地及び無血清培養液はまた、更なる成分を含有してもよい。例えば、培養培地及び／又は無血清培養液は、プトレシン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
任意追加的に、培地は、プトレシン、アルブミン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。一実施形態において、アルブミンは、ウシ血清アルブミンである。一実施形態において、ウシ血清アルブミンは、脂質の多いウシ血清アルブミンである、市販のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の形態で提供される。別の実施形態において、培地は、市販の安定化剤／消泡剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を更に含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
任意追加的に、無血清培養液は、プトレシン、ウシ血清アルブミン、安定化剤、及び／又は消泡剤を更に含んでもよい。一実施形態において、ウシ血清アルブミンは、脂質の多いウシ血清アルブミンである市販のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の形態で提供される。別の実施形態において、無血清培養液は、市販の安定化剤／消泡剤のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を含む。