(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）
【化１】
0003600851.tif 000007
で表されるエポキシドンを有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科野菜根こぶ病の防除剤。
【請求項２】
フォーマ sp.No.324株を有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科野菜根こぶ病の防除剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エポキシドン若しくはその誘導体、又は、それを生産する微生物を有効成分とするアブラナ科野菜根こぶ病の防除剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エポキシドン（ｅｐｏｘｙｄｏｎ）は、抗ガン活性を持つ物質としてフォーマ（Ｐｈｏｍａ  ）ｓｐｐ．の培養上清から１９６６年にＣｌｏｓｓｅ，Ａ．  らが単離精製した物質である（Ｃｌｏｓｓｅ，Ａ．  ら（１９６６）  Ｈｅｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２５：２０４−２１３  ）。Ｃｌｏｓｓｅ，Ａ．  らは、同文献中で、エポキシドンについて、抗ガン活性はｍａｓｔｚｅｌｌｔｕｍｏｒｓ  Ｐ−８１５に対するＥＣ５０が１ｐｐｍ  、マウスに対する急性毒性はＬＤ−５０  が７０ｍｇ／ｋｇ  であると報告している。
【０００３】
また、Ｓａｋａｉ，Ｒ  らは、アカクローバーの病原菌であるフィロスティクタ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ）  ｓｐ．から植物に対し毒性を示す物質を単離精製し、これをフィロシノール（ｐｈｙｌｌｏｓｉｎｏｌ  ）と命名したが（Ｓａｋａｉ，Ｒ  ら（１９７０）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｕｓｉｏｌｏｇｙ  １１：９０７−９２０）、その後の研究によりフィロシノールは、エポキシドンと同一の物質であることがわかった。Ｓａｋａｉ，Ｒ  らは、同文献中で、１００  ｐｐｍ  エポキシドン液をアカクローバー、シロクローバー、アルファルファ、ダイズ、ジャガイモ、アブラナ、エンバク、ヒエ、及びその他の植物の葉片に施用すると暗灰部が生じ、また、アカクローバーの葉柄をエポキシドンの１０ｐｐｍ  液に２４時間浸漬すると、しおれが観察されることを報告している。また、Ｓａｋａｉ，Ｒ  らは、同文献中で、エポキシドンが、エンバクに対して約１ｐｐまで子葉鞘の伸長を阻害し、根の伸長を促進することを報告しており、エポキシドンが反ＩＡＡ活性を有することを示唆しているが、ＩＡＡとエポキシドンは競合的ではなく、また、エポキシドンによる子葉鞘の伸長阻害はシステインなどで回復することも報告している。
【０００４】
エポキシドンを生産する微生物としては、上記の他に、キクの病原菌であるマイコスファエレラ・リグリコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｌｉｇｕｌｉｃｏｌａ  ）（ａｎａｍｏｒｐｈ：Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）やフォーマ・クリサンセミ（Ｐｈｏｍａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）が知られている（Ａｓｓａｎｔｅ，Ｇ．ら（１９８０）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．ｍｅｄｉｔ．１９：１６３−１６４、Ａｓｓａｎｔｅ，Ｇ．ら（１９８１）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：１９５５−１９５７  ）。また、エポキシドンの類似化合物としては、サルスベリ（Ｃｒａｐｅｍｙｒｔｌｅ  ）の病葉から分離された糸状菌及びチャの病原菌ペスタロティオプシス・ロンギセタ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｌｏｎｇｉｓｅｔａ）より単離精製されたエピエポキシドン（ｅｐｉｅｐｏｘｉｄｏｎ  ）（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈら（１９７８）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：１３０３−１３０４、Ｎａｇａｔａ，Ｔら（１９９２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８１０−８１１  ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ  ）、ビソチラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）の産生するポリケタイド抗生物質パチュリン（ｐａｔｕｌｉｎ  ）の合成過程中に見出されるイソエポキシドン（ｉｓｏｅｐｏｘｉｄｏｎ  ）などが知られている（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｊ  ら（１９７９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８２：４４５−４５３、  Ｔｅｈ−Ｗｅｉ，Ｄら（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：７９８７−７９８８  ）。
【０００５】
エポキシドンは、上記のように様々な生理活性を持つが、この他にも、例えば、ピシウム・デバリヤヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、アファノマイセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ  ）、ピリキュラリア・オライゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｌｙｚａｅ）、スクレオチニア・スクレロティオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）といった糸状菌やキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ）  ｓｐｐ．  、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ）  ｓｐ．といった細菌などの広範な微生物に対して弱い抗菌性（ＭＩＣ＝５０−１００  ｐｐｍ  ）を示すことが報告されている（Ｓａｋａｉ，Ｒ  ら（１９７０）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｕｓｉｏｌｏｇｙ  １１：９０７−９２０）。
【０００６】
しかしながら、エポキシドンあるいはその類縁体が、アブラナ科野菜根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に対する抗菌活性を有するといった報告は全くない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
アブラナ科野菜根こぶ病は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅを原因とする病害であり、土壌中に長期わたって生存する休眠胞子から遊走子が放出され、これがアブラナ科植物の毛根、さらに根の細胞に感染し、発病する。根の細胞に感染したＰｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅは、細胞内で増殖し、植物根の肥大、異常、こぶ形成を引き起こし、罹病植物の水分吸収を妨げ、生育不良や枯死に至らしめる。
【０００８】
アブラナ科野菜根こぶ病を防除するため、従来から静菌性のペンタクロロニトロベンゼン（ＰＣＮＢ）が多用されてきている。しかし、この薬剤は、土壌等の環境への残留が深刻であるという問題がある。また、近年用いられるようになった殺菌剤フルスルファミドは、魚毒性が高いという問題がある。
【０００９】
このように、従来から行われているアブラナ科野菜根こぶ病に対する防除手段は、いずれも何らかの欠点を有しており、より有効な防除手段の開発が待ち望まれていた。
本発明は、このような要求に応えるべくなされたものであり、その目的とするところは、アブラナ科野菜根こぶ病の新規な防除手段を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、スミレ属植物（Ｖｉｏｌａ  ｓｐ．  ）の葉面より分離した微生物の培養液が、アブラナ科野菜根こぶ病に対し非常に強い防除活性を有することを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、エポキシドンまたはその誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科野菜根こぶ病の防除剤である。
また、本発明は、フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株またはその変異株を有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科野菜根こぶ病の防除剤である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）エポキシドン等を有効成分とする防除剤
本発明の防除剤は、エポキシドンまたはその誘導体を有効成分とする。本発明におけるエポキシドンまたはその誘導体は、下記の式（Ｉ）で表すことができる。
【００１３】
【化２】
0003600851.tif 000002
【００１４】
ここで、Ｒ１  は、−ＣＨ３  、−（ＣＨ２  ）ｎ  ＯＲ４  、又は−ＣＨ（ＣＨ３  ）ＣＨ２  ＯＨを表し〔但し、ｎは１から４までの整数で、Ｒ４  は水素原子、アセチル基又はプロピレン基〕、Ｒ２  及びＲ３  は、Ｒ２  が−ＯＨもしくは−ＯＣＯＣＨ３  を表し、かつＲ３  が−Ｈを表すか、あるいはＲ２  及びＲ３  の両者で＝Ｏを表す。
【００１５】
式（Ｉ）で表されるいずれの化合物も本発明の防除剤に使用することができるが、それらの中でもエポキシドンを好ましい化合物として例示することができる。
【００１６】
エポキシドンは、化学的に合成することも可能であるが（Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ａら（１９８２）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ４６：１８７９−１８８３、Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ａら（１９７４）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８：１６３−１６９）、微生物を用いて生産することもできる。エポキシドンを生産する微生物としては、フォーマ属、フィロスティクタ属、マイコスファエレラ属に属する微生物などを例示することができる。これらの微生物の生産物からエポキシドンを単離精製することは、アブラナ科野菜根こぶ病に対する防除活性を指標とし、各種クロマトグラフィーを用いて行うことができる。エポキシドンの誘導体は、エポキシドンから常法に従って合成することができる。
【００１７】
本発明の防除剤は、上記で製造されたエポキシドンまたはその誘導体をそのまま直接使用してもよいが、一般には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、又は適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所要の場合はさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤などの製剤として使用される。
【００１８】
本発明の防除剤の対象病害としては、アブラナ科野菜根こぶ病を挙げることができる。
本発明の防除剤を実際の圃場において使用する場合、圃場１０アールあたり有効成分たるエポキシドン等の量が５００ｇ〜２５０００ｇになるように使用するのが好ましいが、これに限定される必要はない。
【００１９】
（２）フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株等を有効成分とする防除剤
本発明の防除剤は、フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株またはその変異株を有効成分とする。ここで、フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株の変異株とは、フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株に由来する菌株であって、菌学的性質の一部がフォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株と異なるが、その培養上清がアブラナ科野菜根こぶ病に対する防除活性を有する菌株をいう。
【００２０】
フォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株は、スミレ属植物の葉面より分離した菌株であり、以下のような菌学的性質を有する。
▲１▼  ＰＤＡ平板培地上で赤褐色のピグメントを産生する
▲２▼  菌糸は幅  ２．５−５．０（平均  ５．０）μｍ  で白〜灰、灰褐色
▲３▼    数〜約１０の細胞よりなるれんが状の厚膜胞子構造物を連鎖して形成する
▲４▼    分生子はＰＤＡ平板培地上で培地のふちに多く形成される直径  ０．１−２  ｍｍの暗灰色から褐色の分生子殻状構造物中にフィアロ型に形成される
▲５▼    分生子は  ２．５−７．５（平均  ５．０）μｍ  ×２．５−３．７５（平均２．６４）μｍ  でだ円形
▲６▼    β胞子の形成は認められない
【００２１】
以上の菌学的性質を、Ｔｈｅ  Ｐｈｏｍａ  ａｎｄ  Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｙ  Ｗｏｌｌｅｎｗｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈａｐｆｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｆｒｕｉｔ−ｒｏｔｔｉｎｇ（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ３：１−５０＋ｓｕｐｐｌ．），１９７３に基づき検討した結果、分生子が分生子殻中にフィアロ型に形成される点、れんが状の厚膜胞子を形成する点、分生子形状より、Ｎｏ．３２４株をフォーマ属に属するものと判断した。なお、この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８４として寄託されている（受託日：平成８年１２月５日）。
【００２２】
本発明の防除剤は、上記のフォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株またはその変異株をそのまま直接使用してもよいが、一般には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、又は適当な粉末あるいは粒状担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所要の場合はさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤、粒剤などの製剤として使用される。
【００２３】
本発明の防除剤を実際の圃場において使用する場合、圃場１０アールあたり有効成分であるフォーマ  ｓｐ．Ｎｏ．３２４株等の菌体量が１５〜１５０００  ｇなるように使用するのが好ましい。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕
Ｖｉｏｌａ  ｓｐ．  の葉面を滅菌水で洗い流し、これをポテトデキストロース寒天培地に塗布して、温度約２５℃で５日間培養し、生育したコロニーを多数分離した。これらを各々ポテトデキストロース液体培地に移植して、温度約２５℃で７日間振とう培養した。
【００２５】
培養ポットにつめたクレハ園芸培土に、アブラナ科野菜根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ  ）の胞子液を１ポット当たり５ｍｌ（冷凍保存罹病組織をスピードカッターで磨砕して調整した休眠胞子液２×１０７  個／ｍｌ  ）ピペットマンで灌注接種した。接種日と同日に上記分離微生物の培養上清を灌注処理（３０−４０ｍｌ／ポット）した後、ハクサイ（品種：王将）の種子を播き、トロン室（２２〜２６℃）に入れ１カ月後に発病を評価した。発病は、病徴を以下の４段階に分けて調べ、評価した。
【００２６】
０：発病なし
１：側根に小さなこぶが形成される
２：側根に大きなこぶ、あるいは主根にこぶが形成される
３：主根に大きなこぶが形成される
【００２７】
評価した発病の歩合について対照を１００％とし、その比を発病度（％）で表した。
発病度の評価の結果、Ｎｏ．３２４の菌株で処理した苗の発病度は０％であった。そこで、この菌株を有用菌株として以下の処理に供した。
【００２８】
〔実施例２〕
Ｎｏ．３２４菌株をポテトデキストロース液体培地に接種し、２５〜２８℃、７日間、ロータリーシェイカーで振盪培養した。３回分の培養液約２４  Ｌを６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体と上清とに分けた。３回分の上清７．８５Ｌ  ×３（ｐＨ  ７）にそれぞれ１％の活性炭（７８．５ｇ，  Ｄａｒｃｏ  Ｇ−６０  ）を加えて１時間攪拌した。活性物質が吸着されたそれぞれの活性炭をろ過して集め、活性炭７８．５ｇ  につきアセトン−水（６：４、１回目７８５  ｍｌ、２回目３１４  ｍｌ）で１時間攪拌し、活性物質を溶出した。
【００２９】
すべての溶出液をあわせてロータリーエバポレーターで約６０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液をＯＤＳ（４．５  ｃｍ×２７ｃｍ）のカラムにチャージして活性物質を吸着させた。このカラムを１００  ％水で溶出し、分取した。それぞれの分画について、実施例１記載の方法でアブラナ科野菜根こぶ病に対する防除活性を調べ、防除活性の認められた２７０ｍＬ−４５０ｍＬ  の間の溶出液を濃縮し、２．０６ｇ  の粗活性物質を得た。これを更にＬＨ−２０  のカラム（３．３  ｃｍ×７８ｃｍ、溶出液、メタノール／クロホルム／水／３：１：１）を用いたゲル濾過クロマトで精製し、防除活性の認められた７５５  ｍＬ−９００ｍＬの分画を濃縮し、１．４７５ｇの粗活性物質を得た。これを３１５ｍｇ  と  １．１６ｇとに分けて更にシリカゲルのカラム（前者はシリカゲル３０ｇ  と後者は５０  ｇ、溶出溶媒、クロロホルム／メタノール  ９５：５）で精製し、それぞれ２６５  ｍｇと１．０２ｇ  の無色の油状物質として活性物質合計１．２９  ｇを単離した。この物質は、ＮＭＲ、ＭＳ等の分析結果よりエポキシドンと同定された。
【００３０】
〔実施例３〕
実施例２で得られたエポキシドンについて、各アブラナ科植物の根こぶ病に対する発病抑制効果を調べた。発病度の評価は、微生物培養上清の代わりにエポキシドン溶液を用いた点を除き、実施例１と同様にして行った。なお、対照として、ＰＣＮＢ水和剤の発病抑制効果も調べた。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
0003600851.tif 000003
【００３２】
様々な種類の植物の根こぶ病菌に効果があることがわかる。
〔実施例４〕
実施例２で得られたエポキシドンについて、各土壌におけるハクサイ根こぶ病に対する発病抑制効果を調べた。発病度の評価は、微生物培養上清の代わりにエポキシドン溶液を用いた点、及び播種土壌を変化させた点を除き、実施例１と同様にして行った。なお、対照として、７５０  倍に希釈したＰＣＮＢ水和剤の発病抑制効果も調べた。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0003600851.tif 000004
【００３４】
様々な土壌の種類でも効果は維持されることを示す。
〔比較例１〕
実施例２で得られたエポキシドンについて、各病害に対する発病抑制効果を調べた。発病度の評価は、以下の点以外は、実施例１と同様にして行った。
【００３５】
１）微生物培養上清の２倍濃縮液を用いた（イネいもち病のみ）
２）接種する病原菌を変えた
３）キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病、キュウリ疫病、イネいもち病の場合は病原菌及び培養上清、薬剤を植物の葉面に施用した
４）発病度の評価を地上部の発病を基準とした
５）無処理の発病度を１００％とした際にどれだけ発病が抑制されるかを示す防除価で表示した
なお、対照として、ベンレート、モレスタン、オーソサイドの発病抑制効果も調べた。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
0003600851.tif 000005
【００３７】
根こぶ病以外の病害に対する効果は認められない。
〔比較例２〕
実施例２で得られたエポキシドンについて、各病原菌に対する最低生育阻止濃度を求めた。結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
0003600851.tif 000006
【００３９】
表４が示すように、エポキシドンは、植物病原菌に対してはほとんど抗菌活性を示さない。アブラナ科野菜根こぶ病菌に対する抗菌活性は、本病原菌が絶対寄生性のため測定できないが、推論するに抗菌活性はないと考えられる（表４で用いた菌は非常に分類学的に広い範囲を含んでいる）。このことから、エポキシドンは、既存の植物病害防除剤とは作用機作が異なることが推測される。従って、エポキシドンは、薬剤抵抗性菌が発生した場合に特に有効な抗菌物質であると考えられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は、アブラナ科野菜根こぶ病の新規な防除剤を提供する。アブラナ科野菜根こぶ病は、防除が困難な病害であり、これに有効な本防除剤は極めて有用な防除剤である。