(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式：
0003557210.tif 000026
［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜10である］
で示される１位が標識された試薬。
【請求項２】
Ｗが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項１に記載の１位が標識された試薬。
【請求項３】
ヘテロ原子が窒素、酸素及び硫黄の中から選択される請求項２に記載の１位が標識された試薬。
【請求項４】
前記検出可能部分が、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択される請求項１に記載の１位が標識された試薬。
【請求項５】
下記の式：
0003557210.tif 000027
［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ｂ）Ｘは接続部分であり、（ｃ）ｎは１〜10であり、（ｄ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％である］
で示される免疫原。
【請求項６】
Ｘが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項５に記載の免疫原。
【請求項７】
ヘテロ原子が窒素、酸素及び硫黄の中から選択される請求項６に記載の免疫原。
【請求項８】
免疫原性担体が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択される請求項５に記載の免疫原。
【請求項９】
下記の構造式：
0003557210.tif 000028
［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ｂ）ｎは１〜10であり、（ｃ）Ｘは結合部分であり、（ｄ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％である］
で示される免疫原で産生した抗体。
【請求項１０】
Ｘが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
免疫原性担体が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択したものである請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
検査試料中の対象分析物を定量するための競合イムノアッセイ方法であって、（ａ）前記検査試料を、下記の式：
0003557210.tif 000029
［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜10である］で示される１位が標識された試薬と、前記１位が標識された試薬及び前記対象分析物に結合することができる抗体とに接触させて反応溶液を形成し、（ｂ）前記抗体に結合した前記反応溶液中の前記１位が標識された試薬の量を前記検査試料中の前記対象分析物の量の関数として測定するステップを含む前記競合イムノアッセイ方法。
【請求項１３】
Ｗが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロ原子を窒素、酸素及び硫黄の中から選択する請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能部分を、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択する請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体を、下記の式５及び式6:
0003557210.tif 000030
0003557210.tif 000031
［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは第二の接続部分であり、（ｂ）ｎは１〜10であり、（ｃ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％である］
の中から選択した構造式を有する免疫原で産生する請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
Ｗが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
免疫原性担体を、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択する請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
検査試料中の対象分析物を定量するための競合イムノアッセイ方法であって、（ａ）前記検査試料を、標識された試薬と、下記の構造式：
0003557210.tif 000032
で示される免疫原で産生した抗体とに接触させ、但し前記式中、（ｉ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ii）ｎは１〜10であり、（iii）ｘは接続部分であり、（iv）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％であり、（ｖ）前記抗体は前記標識試薬及び前記対象分析物に結合することができ、（ｂ）前記抗体に結合した前記反応溶液中の前記標識試薬の量を前記検査試料中の前記対象分析物の量の関数として測定するステップを含む前記競合イムノアッセイ方法。
【請求項２１】
標識された試薬が、下記の式：
0003557210.tif 000033
［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分である］
で示される６位が標識された試薬である請求項20に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項２２】
Ｗ及びＸが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗ及びＸは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）Ｗ及びＸは同じか又は異なり得る、請求項21に記載のイムノアッセイ。
【請求項２３】
検査試料中のテストステロンを定量するための検査キットであって、
（ａ）下記の式：
0003557210.tif 000034
［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜10である］で示される１位が標識された試薬と、（ｂ）テストステロンと前記標識された試薬とに結合することができる抗体を含む抗体試薬とを含む前記検査キット。
【請求項２４】
Ｗが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項23に記載の検査キット。
【請求項２５】
Ｑが、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択したものである請求項23に記載の検査キット。
【請求項２６】
検査試料中のテストステロンを定量するための検査キットであって、
（ａ）下記の式：
0003557210.tif 000035
［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分である］
で示される６位が標識された試薬と、（ｂ）下記の構造式：
0003557210.tif 000036
で示される免疫原で産生した抗体とを含み、但し前記式中、（ｉ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ii）ｎは１〜10であり、（iii）Ｘは接続部分であり、（iv）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％であり、（ｖ）前記抗体は前記標識試薬及び前記対象分析物に結合することができる、前記検査キット。
【請求項２７】
Ｘ及びＷが０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘ及びＷは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）Ｗ及びＸは同じか又は異なり得る、請求項26に記載の検査キット。
【請求項２８】
下記の式：
0003557210.tif 000037
［式中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは接続部分であり、ｎは１〜10であり、テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜100％である］
で示される免疫原の製造方法であって、（ａ）1,4−アンドロスタンジエン−17β−オル−３−オンの17位をTBDMSにより保護し、（ｂ）ステップ（ａ）で得た化合物を４−ペンチルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−（4'−ペンテニル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｃ）ステップ（ｂ）で得た化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｄ）ステップ（ｃ）で得た化合物の17位の保護基を除去して、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを生成し、（ｅ）１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを免疫原性担体物質に接合するステップを含む前記方法。
【請求項２９】
下記の式：
0003557210.tif 000038
［式中、ｎは１〜10であり、n'はｎと同じ数値を有する］
で示される１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンの製造方法であって、（ａ）1,4−アンドロスタンジエン−17β−オル−３−オンの17位をTBDMSにより保護し、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を［n'＋１］−アルケニルマグネシアムブロミドでアルキル化して、１−［n'＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｃ）１−［n'＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（n'−カルボキシアルキル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｄ）１−α−（n'−カルボキシアルキル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液で処理することにより１−α−（n'−カルボキシアルキル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの17位の保護基を除去して、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを生成するステップを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規の免疫原、諸免疫原から産生した抗体、及び検査試料中のテストステロンを検出し定量するイムノアッセイで有用な標識試薬を開示する。これらの試薬を用いるイムノアッセイ及びこれらの試薬の合成方法も開示する。イムノアッセイは、好ましくは、微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）及び蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）である。前記新規の免疫原及び標識試薬を製造するための新規の出発材料も開示する。該新規の出発材料から新規の免疫原及び標識試薬を製造する方法も開示する。
発明の背景
アンドロゲンは、二次性徴を刺激し、雄の二次性徴を発現させる化合物である。一般にテストロゲンと呼ばれる17β−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オンは、雄の精巣の間質（ライディッヒ）細胞中で合成される。成人期のライディッヒ細胞中でのテストステロン合成は、主に下垂体黄体形成ホルモン（LH）の量によって制御される。雌の場合は、テストステロン生合成源が三つ存在する。副腎及び卵巣は少量のテストステロンを分泌し、アンドロステンジオンの末梢代謝による分は、正常な雌のテストステロン日産量の50〜60％に相当する。
テストステロンは血流中に２種類の形態で存在する。即ち、約99％のテストステロンは血漿タンパク質に結合しており、残りが結合していない。少なくとも３種類の血清タンパク質がテストステロンと結合する。各タンパク質は異なる親和性をもってテストステロンと結合する。該ホルモンは、生理学的濃度では、性ホルモン結合グロブリン（SHBG）と称する低キャパシティー高親和性βグロブリンに多く結合する。より少量がアルブミン及びコルチゾル結合グロブリンに結合する。テストステロンの構造式及び番号付け法は下記の通りである：
0003557210.tif 000002
テストステロンの構造式
テストステロンは主に肝臓で代謝される。テストステロンを代謝することができる酵素が、皮膚及び細網内皮系で同定された。主なテストステロン代謝経路は二つ同定されている。17−ケトン経路では、17β−ヒドロキシ基が酸化されてケトンになる。その結果、弱いアンドロゲンであるアンドロステンジオンが形成される。この経路では、生理活性が殆どない中間代謝産物が形成される。第二の経路である17−ヒドロキシ経路では、まずＡ環で変化が生じる。この経路では、17β−ヒドロキシ基は変化しない。これは重要なことである。なぜなら17β−ヒドロキシ基は、アンドロゲンステロイド及びその中間代謝産物の薬効に必要なものだからである。従って、この代謝経路では、かなりのアンドロゲン活性を有する中間代謝産物が生成される。
臨床的有用性
テストステロンの測定は性機能低下状態の評価に有用である。雄のテストステロン減少の一般的原因としては、性機能低下、睾丸摘出、エストロゲン療法、クラインフェルター症候群、下垂体機能低下症、睾丸性女性化症及び肝硬変が挙げられる。
雌のテストステロン量は通常、正常な雄の場合より遥かに少ない。雌の血清テストステロン量の増加の一般的な原因としては、多嚢胞性卵巣（スタイン−レベンタール症候群）、卵巣腫瘍、副腎腫瘍及び副腎過形成が挙げられる。女性の男性化は、アンドロゲン投与及びテストステロンの内因性過剰産生に起因する。
現行のテストステロンアッセイ
血清中のテストステロンの定量に使用できる方法は幾つか存在する。血清／血漿中テストステロン濃度の測定に使用される方法は、６種に大別される：
（１）ガスクロマトグラフィー／質量分光分析法（Sabot,J.F.ら,J.of  Chromatography,339:233（1985）;Shinohara,Y.ら,Biomedical  and  Environmental  Mass  Spectrometry,16:241（1988）;Furuta,T.ら,J.of  Chromatography,525:15（1990）;Fukushima,S.ら,J.of  Chromatography,565:35（1991）;Wudy,S.A.ら,Steroids,57:319（1992））；（２）同位体希釈質量分析法（Siekmann,L.,J.Steroid  Biochem.,11:117（1979）;Moneti,G.ら,J.Steroid  Biochem.,27（１−３）:53（1987））；（３）薄層クロマトグラフィー（Vingler,P.ら,J.of  Chromatography,571:73（1991））；（４）化学発光（Syropoulos,A.B.ら,Analytica  Chimica  Acta,239:195（1990）;Stabler,T.V.ら,Clin.Chem.,37（11）:1987（1991）;Van  Dyke  ＆  Van  Dyke,1991）（５）高性能液体クロマトグラフィー（Suzuki,Y.ら,J.of  Chromatogr.,426:33（1988）;Erkoc,F.U.ら,J.Chromatogr.Sci.,27:86（1989）;Ueshiba,H.ら,Clin.Chem.,37（８）:1329（1991）；（６）酵素結合イムノアッセイ（Hosoda,H.ら,Chem.Pharm.Bull.,28（10）:3035（1980）;Marcus,G.J.ら,Steroids,46（６）:975（1985）;Ali,E.ら,J.Immunol.Methods,147:173（1992）;Sengupta,J.ら,J.Immunol.Methods,147:181（1992）;Dhar,T.K.ら,J.Immunol.Methods,147:167（1992）;Rassasie,M.J.ら,Steroids,57:288（1992）;Rassasie,M.J.ら,Steroids,57:112（1992）;Boehringer  Mannheim  GmbH,1992）；及び（７）ラジオイムノアッセイ（Rao,P.N.ら,J.Steroid  Biochem.,９:539（1978）;Hosoda,H.ら,J.Steroid  Biochem.,10:513（1979）;Cekan,S.Z.,J.Steroid  Biochem.,11:1629（1979）;ICN  Biomedicals  Inc.,“RSL,125I  Testosterone"Package  Insert,Revision  No.4,1983年１月;Diagnostics  Products  Corporation,“Coat−Ａ−Count  Total  Testosterone",Package  Insert,V  116,1992年１月）。
1960年代以降の、感度及び特異性が極めて高いラジオイムノアッセイ（RIA）の開発は、ステロイドの定量に改革をもたらした。RIA法は速くて簡単で比較的低コストであるため、使用頻度が高い。この傾向は、便利で信頼性のある市販キットが入手できるようになって、著しく増大した。
市販のテストステロンアッセイは主に、臓器摘出を必要としない「直接的」ラジオイムノアッセイである。RIAでは、限定量の特異的抗体をホルモンと反応させる。125I標識テストステロンが、患者試料中のテストステロンと所定時間にわたり競合する。結合ホルモンを遊離ホルモンから分離した後、結合フラクションの放射能量を定量して、未知の試料の測定の基準となる標準曲線の作成に使用する。市販のテストステロンアッセイでは、結合ホルモンと遊離ホルモンの分離に使用する方法がいろいろ有る。
市販のRIAの具体例としては、Diagnostic  Products  Corporation（DPC）のCoat−Ａ−Count  Total  Testosterone  Assay、及びICN  Biomedicals  Inc.のRSL  125I−Testosteroneキットが挙げられる。DPCキットは下記のような固相分離方法を使用する：（１）テストステロンに特異的な抗体をポリプロピレン管の壁に固定し、（２）125Iテストステロンを患者試料中の対象分析物と競合させ、（３）管の上澄を採取して結合ホルモンを遊離ホルモンから分離する。
RSLキットは次のような液相分離方法を使用する:1）テストステロンに特異的な抗体を固相に結合するのではなく溶液中で自由にさせておき、２）125Iテストステロンを患者試料中の対象分析物を競合させ、３）沈降用抗血清（二次抗体）を加えて、テストステロンに特異的な抗体：ホルモンを沈殿させ、結合ホルモンを遊離ホルモンから分離する。
前述のRIA方法は下記の欠点を有する:1）取扱者が放射線防護手段を使用しなければならない;2）放射性廃棄物を処分しなければならない;3）使用する標識試薬の半減期が短い。これらの理由により、別のイムノアッセイ方法が模索された。
RIA法とは違って、最近導入された微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）は、医者の診療室及び病院の施設で使用される比較的新しい検査方法である。この方法では、抗体が懸濁ラテックス粒子に結合し、次いで測定すべき対応する対象分析物が特異的に結合する。次いで粒子をガラス繊維フィルターシステムに通す。粒子はガラス繊維フィルターに吸着され、非結合対象分析物はガラス繊維フィルターを通って洗浄される。ステロイドのような低分子量対象分析物の場合は、対象分析物に結合しなかった抗体分子の数を測定することにより対象分析物の量を決定する。この操作は、ハプテン標識接合体の添加によって実施する。次いで酵素の基質を加え、試料中の対象分析物量に反比例する蛍光量を発生させる。
広く使用されるようになった別の同位体不使用の均一相法は蛍光偏光である。この方法は、テストステロンの定量では知られていなかった。蛍光偏光法は、蛍光標識化合物が、直線偏光によって励起された時に、その回転速度に反比例する偏光度を有する蛍光を放出するという原理に基づく。従って、蛍光標識トレーサー−抗体複合体を直線偏光で励起すると、放出された光が高度の偏光状態を維持する。なぜなら発蛍光団は、光が吸収された時点と放出される時点との間は回転を抑制されるからである。「遊離」トレーサー化合物（即ち抗体に結合していない）を直線偏光によって励起すると、対応するトレーサー−抗体結合体より遥かに速く回転し、分子はよりランダムに配向されるため、放出された光の偏光が解消される。このように、蛍光偏光は、競合結合イムノアッセイで形成されたトレーサー−抗体結合体の量を測定する手段を提供する。
発明の概要
本発明は、対象化合物の１位に標識を有する新規試薬及び免疫原;1位免疫原に対する抗体；並びに新規の１位が標識された試薬及び免疫原を製造するための新規の出発材料、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを提供する。
本発明は、検査試料中のテストステロンを検出し定量するためのアッセイも提供する。該アッセイは、前記試薬を単独で、又は６位が標識された試薬もしくは６位免疫原に対する抗体と組合わせて使用する。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用するイムノアッセイである。好ましくは、アッセイは、イムノアッセイの特異性と均一相法の速度及び利便性とを併有し、検査試料中のテストステロンの正確で信頼できる定量を行う、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイである。
本発明は、新規の１位免疫原、新規の１位免疫原に対する抗体、１位が標識された試薬、並びに１位免疫原及び標識試薬を製造するための出発材料の合成方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の合成方法で１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを製造するための合成経路を示している。
第２図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンをウシ血清アルブミン（BSA）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。
第３図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。
第４図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをウシ血清アルブミン（BSA）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。
第５図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。
第６図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを６−カルボキシフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第７図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを５−カルボキシフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第８図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを６−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第９図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを4'−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第10図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンをアルカリホスファターゼに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第11図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンを4'−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第12図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをアルカリホスファターゼに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。
第13図は、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例10）及び６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例12）を用いて作成した標準曲線を示している。
発明の詳細な説明
本発明は、新規の１位が標識された試薬及び免疫原、並びに１位免疫原に対する抗体を提供する。１位が標識された試薬及び免疫原を製造するための新規の出発材料も提供する。本発明は、検査試料中のテストステロンを検出し定量するためのアッセイも提供する。これらのアッセイは、前記試薬を単独で、又は６位が標識された試薬もしくは６位免疫原に対する抗体と組合わせて使用する。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用するイムノアッセイである。好ましくは、アッセイは、イムノアッセイの特異性と均一相法の速度及び利便性とを併有し、検査試料中のテストステロンの正確で信頼できる定量を行う、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイである。本発明は、１位免疫原、標識試薬及びこれらの出発材料並びに１位免疫原に対する抗体の合成方法も提供する。
本明細書で使用する略号は以下の通りである：
Ar＝アルゴン
BSA＝ウシ血清アルブミン
CDCl3＝重水素化クロロホルム
DCC＝1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DMF＝ジメチルホルムアミド
EDA−BOC＝Ｎ−ブチルオキシカルボニルエチレンジアミン
EDAC＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
EtOAc＝酢酸エチル
EtOAc/Hex＝酢酸エチル／ヘキサン
EtOH＝エタノール
HF＝フッ化水素酸
HOSu＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
KLH＝キーホールリンペットヘモシアニン
Me2S＝硫化ジメチル
MeOH＝メタノール
Ｎ−Boc＝Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル
NHS＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
OTBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル
TBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル
TBDMSC＝ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド
ｔ−BuOH＝ｔ−ブタノール
TFA＝トリフルオロ酢酸
THF＝テトラヒドロフラン
TLC＝薄層クロマトグラフィー
TNBS＝トリニトロベンジルスルホン酸
１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン−EDA＝１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン−エチレンジアミン
４−アンドロステン−17β−オル−３−＝テストステロン
５−CFL＝５−カルボキシフルオレセン
６−CFL＝６−カルボキシフルオレセン
また、「１位免疫原」は、免疫原性担体タンパク質がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の１位に結合している免疫原であると定義される。
「６位免疫原」は、免疫原性担体タンパク質がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の６位に結合している免疫原であると定義される。
「１位が標識された試薬」は、標識がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の１位に結合している標識試薬であると定義される。
「６位が標識された試薬」は、標識がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の６位に結合している標識試薬であると定義される。
６位免疫原は当業者に公知である。これに対し、本出願人が知る限り、１位が標識された試薬及び１位免疫原は当業者に知られていない。従って、本明細書で開示する１位が標識された試薬及び免疫原、並びにこれらの合成化学も本発明の範囲内に包含される。M.Kocorら、Polish  J.Chem.,83:149−155（1979）は、テストステロンの１位に結合した（COOH）を開示している。しかしながらKocorらは、免疫原又は標識試薬、及びイムノアッセイにおけるこれら物質の使用、とりわけテストステロンのアッセイにおける使用は開示していない。更に、Kocorらは、本発明とは異なる合成方法を開示している。
本発明は、新規の１位免疫原及び標識試薬を製造するための新規の出発材料も提供する。該新規の出発材料の製造方法も提供する。その新規出発材料は１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンであり、その構造式は下記のように示される：
0003557210.tif 000003
１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロン
前記式中、ｎは１〜10の数字である。好ましくは、ｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。「n'」は「ｎ」と同じ値をさす。
好ましい出発材料は１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンであり、下記の構造式を有する：
0003557210.tif 000004
１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン
本発明は、新規の出発材料を製造するための新規の方法も提供する。
前記新規の１位が標識された試薬及び１位免疫原に対する抗体は、テストステロンのイムノアッセイで有用である。これらの物質は同一アッセイで使用でき、又は別の標識試薬もしくは抗体と組合わせて使用できる。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用する。本発明では、まず検査試料を標識試薬及び抗体試薬に同時に又は任意の順序で逐次接触させ、次いで抗体との結合反応に関与した又は関与しなかった標識試薬の量を検査試料中のテストステロン量の関数として測定することにより、テストステロンの検出及び特異的定量を実施する。
検査試料は任意の天然体液もしくは組織、又はこれらの抽出物もしくは希釈物であり、非限定的具体例としては全血、血清、血漿、尿及び唾液が挙げられる。
本発明は特に、免疫原、これらの免疫原から産生された抗体、並びにテストステロンの検出そして好ましくは特異的定量を行う微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）及び蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）で使用するための標識試薬に関する。
I.標識試薬
本発明の好ましい１位及び６位が標識された試薬はそれぞれ下記の一般式で示される：
0003557210.tif 000005
0003557210.tif 000006
式１中のｎは１〜10の数字を表す。好ましくはｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。
式１及び２中のＱは検出可能部分である。Ｑは、好ましくは、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択する。Ｑは好ましくは、蛍光分子又は酵素である。好ましい標識試薬では、Ｑは、4'−アミノメチルフルオレセン、５−アミノメチルフルオレセン及び６−アミノメチルフルオレセンのようなアミノメチルフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセンのようなカルボキシフルオレセン、５−及び６−アミノフルオレセンのようなアミノフルオレセン、チオ尿素フルオレセン並びにメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンの中から選択される。MEIA方式では、Ｑの好ましい具体例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−ラクタマーゼといった酵素である。化学発光分子としてのＱの具体例は、ルミノール、アクリジニウムスルホンアミド及びアクリジニウムエステルである。
Ｗは、好ましくは０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の接続部分である。但し、（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。１位が標識された試薬（式１で示される）を式５又は式６の免疫原に対する抗体と一緒にアッセイで使用する場合は、Ｗの特異的化学構造は免疫原のＸと同じか又は異なり得る。同様にして、６位が標識された試薬（式２で示される）を式５又は式６の免疫原に対する抗体と一緒にアッセイで使用する場合は、Ｗの特異的化学構造は免疫原のＸと同じか又は異なり得る。より好ましくは、Ｗは０〜10個の炭素とヘテロ原子とからなる。Ｗの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｗはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｗ＝０であれば、接続部分は存在しない。これは、Ｑが直接テストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。
フルオレセン標識した好ましい１位が標識された試薬は下記の式３で示される：
0003557210.tif 000007
蛍光偏光アッセイの場合は、式３の標識試薬を使用するのが好ましい。式３の試薬の製造には、1985年４月９日に交付されたKirkemoらの米国特許第4,510,251号“Fluorescent  Polarization  Assay  for  Ligands  using  Aminomethylfluorescein  Derivatives  as  Tracers"、及び1992年３月30日出願のMattinglyの米国特許出願第07/859,775号“５（６）−Methyl−Substituted  Fluorescein  Derivatives"に記載のように、アミノメチルフルオレセンを使用し得る。
酵素標識した好ましい１位が標識された試薬は下記の式で示される：
0003557210.tif 000008
他の１位が標識された試薬は下記の実施例で説明する。
II.免疫原
好ましい１位及び６位免疫原はそれぞれ下記の式５及び６で示される：
0003557210.tif 000009
0003557210.tif 000010
式５及び式６中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは接続部分である。接続部分、連結部、スペーサー、スペーサーアーム及びリンカーという用語は互換的に使用され、ある所定の物質（例えばハプテン）を第二の所定の物質（例えば免疫原性担体又は検出可能部分）と区分する任意の共有結合した化学的実体を意味する。
本発明では、Ｘは、好ましくは０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10個以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の接続部分を表し、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。Ｘの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｘはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｘ＝０であれば接続部分は存在しない。これは、Ｐが式５及び式６でテストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。より好ましくは、Ｘは０〜10個の炭素とヘテロ原子とからなる。
式５中の「ｎ」は１〜10の数字であり得る。好ましくは、ｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。
当業者に明らかなように、式５及び式６では、免疫原性担体に対するテストステロン誘導体の比は１対１に限定されない。テストステロン誘導体対免疫原性担体の比は、免疫原性担体上の化学的に得られる官能基の数によって決定され、合成の際の二つの材料の比率によって制御される。テストステロン誘導体によるＰ上の置換度は、免疫原性担体上に得られる官能基の１〜100％の範囲で変化し得る。置換率は好ましくは10％〜95％、より好ましくは15％〜85％である。
当業者に理解されるように、免疫原性担体物質Ｐは、当業者に広く知られているもののうちのいずれかから選択でき、通常はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであるが、十分な大きさ及び免疫原性を有する他の物質、例えば炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸、核酸等も使用し得る。好ましくは、免疫原性担体物質は、ウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロブリン等のようなタンパク質である。
より好ましい免疫原では、下記の構造式７に示すように、Ｐはウシ血清アルブミン（BSA）であり、Ｘは０である：
0003557210.tif 000011
III.1位が標識された試薬及び免疫原の製造
１位が標識された試薬及び免疫原は両方とも、新規の出発材料１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロン、より好ましくは１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを用いて合成できる。
１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンの製造ステップは下記の通りである：出発材料、1,4−アンドロスタンジエン−17β−オル−３−オン（ボルデノン）の17位をTBDMS基により保護し、次いで［n'＋１］−アルケニルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−［n'＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成する。この化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（n'−カルボキシアルキル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得る。その後、17位の保護基をアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液での処理によって除去し、所望のハプテン、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを得る。
好ましい１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンは１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンである。１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの合成は実施例１及び第１図に示す。本明細書では、図に示す化合物が化合物番号を有する場合は、その番号を角括弧内に示す。例えば第１図では、［２］は、１−（4'−ペンテニル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを表す。
実施例１及び第１図に示すように、出発材料1,4−アンドロスタンジエン−17β−オル−３−オン（ボルデノン）の17位をTBDMS基により保護し、次いで４−ペンテニルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−（4'−ペンチル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル［２］（第１図）を得た。この化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得た。その後、17位の保護基をアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液での処理によって除去し、所望のハプテン、１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン［３］（第１図）を得た。
１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロン、好ましくは１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを出発材料として、１位が標識された試薬及び免疫原を下記のように合成し得る。
A.好ましい新規の１位が標識された試薬の製造
式１の構造を有する好ましい１位が標識された試薬は、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを出発材料として下記のように合成できる：（ａ）テストステロンの１−α−（n'−カルボキシアルキル）基を選択的に活性化し、次いで（ｂ）該テストステロン誘導体を選択した検出可能部分に結合し、最後に（ｃ）非結合テストステロンを検出可能部分に結合したテストステロンと分離する。
より特定的には、前記の１位が標識された試薬は下記のように合成できる：（ａ）テストステロンの１−α−（n'−カルボキシアルキル）基を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、次いで（ｂ）該活性化エステルを塩基性条件下で検出可能部分に結合し、最後に（ｃ）非結合テストステロンをテストステロン−検出可能部分複合体又は検出可能部分とゲル浸透クロマトグラフィーによって分離する。
前記製造方法では、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンが好ましくは１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンである。好ましい検出可能部分は酵素及びフルオレセンである。
B.新規の好ましい１位免疫原の製造
式５で示される好ましい１位免疫原は、１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを出発材料として製造し得る。説明を簡単にするために、以後は好ましい１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンを非限定的具体例として使用するが、当業者には明らかなように、別の１−α−（n'−カルボキシアルキル）テストステロンを使用してもよい。第１図〜第４図に示す図式（及び対応する実施例）に基づいて説明する。
１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンは、当業者に公知の方法に従い、二官能リンカーを介して、又は直接的結合法で、タンパク質担体に結合し得る。二官能リンカーを使用する場合は、ｖ−Ｘ−ｙは下記の意味を表す:v及びｙは官能基であり、そのうちの一つは１−（カルボキシプロピル）テストステロンのカルボキシレートと反応し得、他方はＰ上の化学的に得られる官能基と反応し得る。Ｘは接続部分である。当業者には多くの二官能リンカーが知られている。例えば、本明細書に参考として包含されるBieniarzらの米国特許第5,002,883号には、ヘテロ二官能リンカーが記述されている。これらのヘテロ二官能リンカーは、末端がいずれか一方の官能基に対して特異性を示すため、場合によっては好んで使用される。また、合成における利便性のために、当業者によく知られている保護形態の官能基ｖ−及び−ｙ（例えば、本明細書に参考として包含されるT.W.Greene及びP.G.M.Wutts,Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,第２版,1991年,John  Wiley  ＆  Sons参照）を使用し、所望の時点で脱保護してもよい。
本発明の免疫原の製造では通常、ｖを−OH、−ハロゲン（例えば−Cl、−Br、−Ｉ）、−SH及び−NHR'の中から選択する。R'はＨ、アルキル、アリール、置換アリールの中から選択し、ｙはヒドロキシ（−OH）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）OH）、アミノ（−NH2）、アルデヒド（−CH（＝Ｏ））及びアジド（−N3）の中から選択する。Ｘは、好ましくは０〜50個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が10個以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の連結部分である。但し、（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。Ｘの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｘはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｘ＝０であれば接続部分は存在しない。これは、Ｐが式２でテストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。
テストステロンの１−（カルボキシプロピル）誘導体とｖ−Ｘ−ｙとの反応は、官能基ｙを有する接続部分Ｘを有する連結中間化合物（II）を生成する。官能基−ｙは、当業者に公知の幾つかの方法のいずれかで、免疫原性担体上の官能基と反応させることができる。通常安定性の高いアミド結合を形成するのが好ましいことが多い。アミド結合を形成するためには、まずスペーサーアームのカルボン酸部分［ｙ＝（−Ｃ（＝Ｏ）OH］を、1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドのような活性化用試薬及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような添加剤で活性化する。次いで、活性化形態のものを、免疫原性担体物質を含む緩衝溶液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、分離して又は分離せずに、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド又は混合炭酸塩に変換し、次いで免疫原性担体物質と混合する。当業者には明らかなように、アミド結合の形成には、ここに列挙するもの以外の多くの試薬を使用し得る。
末端アミン（ｙ＝−NH2）官能性を有するスペーサーアームは、アセトニトリル又はジメチルホルムアミドのような適当な溶液中でN,N'−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させることによって、高反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換できる。得られたウレタンを緩衝水溶液中で免疫原性担体物質と反応させると、免疫原が得られる。
末端アルデヒド官能性［ｙ＝−CH（＝Ｏ）］を有するスペーサーアームは、当業者に公知の方法に従い、還元アミノ化により、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下で緩衝水溶液中で免疫原性担体物質に結合できる。
スペーサーアームは、免疫原と類似の方法で、相補的センス（complementary  sense）でスペーサーアーム上の反応基と反応するアミノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基のような官能基を有する固体支持体に接合することができる。その結果、ハプテンに対する抗体の分離又は精製に使用できる固相が得られる。
このように、前述のテストステロン誘導体は、当業者に公知の種々の方法で免疫原性担体物質Ｐに結合できる。
IV.6位が標識された試薬及び免疫原の製造
６位が標識された試薬及び免疫原は、当業者に公知の方法、例えば６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（下記の構造を有する）を出発材料として使用する方法で合成し得る：
0003557210.tif 000012
６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン
V.抗体の産生
本明細書で開示する１位及び６位免疫原は、当業者に公知の方法に従い、本発明のイムノアッセイシステムで使用するためのポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体の製造に使用できる。通常は、ウサギ、ヤギ、マウス、テンジクネズミ又はウマのような宿主動物に、種々の部位の一つ以上へ、免疫原を普通はアジュバントと混合して注射する。その後、抗体力価が最適値に到達するまで該力価を評価すべく採血を行いながら、一定又は不定の時間間隔で、同一部位又は異なる部位への注射を行う。抗体は、十分量の血清を得るよう宿主動物の採血を行うか、又は体細胞ハイブリダイゼーション法、もしくは他の、モノクローナル抗体を得るための当業者に公知の方法によって得る。該抗体は、例えば−20℃で貯蔵し得る。
本発明の抗体は、完全免疫グロブリンの他に、免疫グロブリンの抗原結合フラグメントを含む。これらのフラグメントの具体例としては、Fab、Ｆ（ab'）２及びFvが挙げられる。この種のフラグメントは公知の方法で製造できる。
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの方法（Nature,256,495−497（1975））を用いて、免疫原又はそのフラグメントを接種した動物に由来する脾臓細胞を、通常は被接種動物と同じ又は異なる種の永久増殖細胞系（好ましくは骨髄腫細胞系）との融合によって不死化し、次いで適当なクローニング及びスクリーニング操作を行うことにより産生できる。
抗体は、Readingの米国特許第4,474,893号又はCabillyらの米国特許第4,816,567号に記載の方法に従って産生した組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体はまた、Segelらの米国特許第4,676,980号の記載の方法で化学的に構築して得る。
本発明のポリクローナル及びモノクローナル抗体は、好ましくは、式５の構造を有する１位免疫原を用いて産生する。より好ましくは、式７の構造を有する免疫原を使用する。
VI.新規の１位が標識された試薬及び免疫原を用いるイムノアッセイ
本発明者は、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用すると、優れたテストステロンイムノアッセイが可能になるという驚くべき事実を見出した（実施例18の微粒子酵素イムノアッセイによって例示されている）。この発見は驚くべきものである。なぜなら、当業者に公知のように、特異的抗体及び相補的標識ハプテン（例えば標識試薬）を製造する場合は、抗体応答を誘起するために使用する免疫原及び標識ハプテンの両方について化学構造を考慮しなければならないからである。従来は、選択性抗体との取得にとって重要なハプテン固有の特徴部分と離れたハプテン上の部位を介して担体にハプテンを接続する。同様にして、この種の抗体に結合することができる標識ハプテンを製造する場合は、担体タンパク質と同じ部位を介してハプテンに標識を接続するのが普通である。相補的標識ハプテンは通常、ハプテンの重要な特徴への抗体結合を妨害しないように、担体タンパク質の接続に使用した免疫原のそれと同じハプテン上の部位に標識を接続することによって合成する。
同一のテストステロン接続位置に同一の結合アームを用いた抗体及び酵素接合体を使用する適合システム（matching  system）では、臨床試料中のテストステロンの定量に必要な範囲の標準曲線の作成ができなかった。本発明は、抗体及び酵素接合体が、同一結合アームだが異なるテストステロン位置に接続されているという点で異なっている。この形態は、標準曲線を臨床試料中のテストステロンの定量に必要な範囲で作成できるという利点を有する。
実施例18から明らかなように、本発明の標識試薬は単独でテストステロンアッセイの性能を改善できる。従って、アッセイ又はキットは、本発明の標識試薬を、テストステロン及び本発明の標識試薬の両方を認識し、且つ実施例４及び５の免疫原によって産生する抗体であるのが好ましいポリクローナル又はモノクローナル抗体と共に使用し得る。また、FPIA又はMEIAのような競合イムノアッセイの実施を可能にするために、トレーサー及びテストステロンは抗体に競合的に結合できるものでなければならない。同様に、免疫原はテストステロンの誘導体又は類似体であるのが好ましい。標識試薬は、検査試料中に存在し得る内因性免疫グロブリン、即ち標識試薬に結合すべきではない抗体に結合しないか又はほとんど結合しないことが好ましい。これは、前記結合がアッセイの精度を妨害するのを回避するためである。尚、前記標識試薬、及びアッセイ又はアッセイキット用の抗体を産生させるために使用し得る免疫原は、同じ又は異なるＷ及びＸを有し得る（前出の式１、２、５及び６参照）。
A.微粒子酵素イムノアッセイを用いるテストステロンアッセイ
検査試料中のテストステロンの濃度又は含量は、本発明の試薬を使用することにより、微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）で正確に定量できる。テストステロンの特異的定量のためにMEIAを実施すべく、試料中のテストステロンを測定するための検量線を作成した。
本発明では、式６のテストステロン１−α−（3'−カルボキシプロピル）標識試薬（即ちトレーサー）を用いると、テストステロンの定量に関して優れた微粒子酵素イムノアッセイ結果が得られるという予想外の驚くべき事実が判明した。
特に、驚くべきことに、前記標識試薬の使用が、必要とされるアッセイの感度／精度にとって重要なものであるという予想外の事実が判明した。この利点は、テストステロンの特異的定量が先行技術と比べて改善されたことを意味する。
抗体に結合したトレーサーの量は、検査試料中に存在するテストステロンの量に反比例して変化する。従って、抗体結合部位に対するテストステロン及びトレーサーの相対的結合親和性は、アッセイシステムの重要なパラメーターである。
一般的には、微粒子酵素法は、基質を酵素で開裂して最終的蛍光生成物を得るという原理に基づく。競合酵素イムノアッセイの場合は、生成される蛍光生成物の量が試料中のテストステロン量に反比例する。
本発明に従ってテストステロンの特異的定量のために微粒子酵素イムノアッセイを実施する時は、抗血清か又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体の存在に対して検出可能な蛍光応答を生起することができる本発明の標識試薬の存在下で、テストステロンを含んでいる疑いのある検査試料を、抗血清か又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体に接触させる。
B.蛍光偏光イムノアッセイを用いるテストステロンアッセイ
一般的には、蛍光偏光法は、蛍光トレーサーが、特有の波長の平面偏向光によって励起された時に、所与の媒質中のトレーサーの回転速度に反比例する入射刺激光に対する偏光度を保持する別の特有の波長（即ち蛍光）で光を放出するという原理に基づく。このような特性の結果として、回転が抑制されているトレーサー物質、例えば粘稠溶液相中に存在するか、又は比較的遅い回転速度を有する別の溶液成分に結合しているトレーサー物質は、自由に流動する溶液中にある場合と比べて、比較的大きい発光偏光度を保持する。
本発明のテストステロン特異的定量のために蛍光偏光イムノアッセイを実施する場合は、テストステロンを含んでいる疑いのある検査試料を、抗血清又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を生起することができる本発明の標識試薬の存在下で、抗血清又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体と接触させる。次いで溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、該応答を検査試料中に存在するテストステロンの量の尺度として検出する。
本発明のテストステロン誘導体は、これらを一般的な担体物質に結合することにより免疫原を製造するために使用され、次いで抗体を得るために使用される。本発明のテストステロン誘導体は、検査試料中のテストステロンを定量するイムノアッセイで検出試薬として機能する標識試薬の製造にも使用される。
微粒子酵素アッセイ及び蛍光偏光アッセイは、市販の自動化計器、例えばIMx（登録商標）計器（本出願人）を用いて実施し得る。
C.他のアッセイ方式
本発明のテストステロン定量には、微粒子酵素アッセイ及び蛍光偏光アッセイ以外に様々なイムノアッセイ方式を使用できる。これらのイムノアッセイシステム方式の非限定的具体例としては、競合法、サンドイッチ法及びイムノメーター法が挙げられる。一般的には、これらのイムノアッセイシステムは、標識又は検出可能部分に接続した本発明の抗体又はそのフラグメントからなる標識試薬を含んでいる検査試料に由来する特定の対象分析物に、免疫グロブリン、即ち完全抗体又はそのフラグメントが結合する能力に依存する。検出可能標識の非限定的具体例としては、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、DNA、RNA、リポソーム、発色団、化学発光体、着色粒子及び着色微粒子、蛍光化合物、例えばアミノメチルフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオ尿素フルオレセン及びメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセン及び類似の蛍光誘導体が挙げられる。
典型的には、この種のイムノアッセイシステム方式における結合度は、対象分析物との結合反応に関与した又は関与しなかった標識試薬中に存在する検出可能部分の量によって決定される。検出され測定される検出可能部分の量は、検査試料中に存在する対象分析物の量に相関し得る。例えば、競合イムノアッセイシステムでは、しばしば対象分析物と称される測定すべき物質が、構造が類似している対象分析物及びトレーサーの一部分又は複数部分に特異的な抗体上の限定数の部位であって、前記抗体の産生に使用する免疫原と共有される前記部位に関して、しばしばトレーサーと称される検出可能部分に結合した類似の構造をもつ物質と競合する。この種のアッセイの一具体例は、（ａ）（所期の対象分析物を含んでいる疑いのある）検査試料を、標識試薬（即ちトレーサー）と、標識試薬及び対象分析物に結合できる抗体とに接触させて、反応溶液を形成し、（ｂ）該反応溶液を、抗体が標識試薬と存在している場合の対象分析物に結合するのに十分な時間にわたってインキュベートし、（ｃ）前記抗体に結合した反応溶液中の標識試薬の量を、検査試料中の対象分析物の量の関数として測定することからなる。標識試薬及び抗体は検査試料に同時に又は任意の順序で逐次添加し得る。好ましくは、標識試薬を加えた後で抗体を検査試料に加える。好ましいアッセイでは、１位が標識された試薬を、１位又は６位免疫原に対する抗体と共に使用する。６位が標識された試薬は、１位免疫原に対する抗体と共に使用することもできる。免疫原及び標識試薬の好ましい具体例は下記の実施例で示す。
V.検査キット
本発明の検査キットは、検査試料中のテストステロンを定量するための所望のイムノアッセイの実施に必要な必須試薬を総て含む。この種のイムノアッセイの具体例としては、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイが挙げられる。検査キットは、必要な試薬を、組成物として、又は試薬の相容性が許す場合には混合物として収容する１個以上の容器を組合わせたような商業用包装形態を有するのが好ましい。
特に好ましいのは、検査試料中のテストステロンの微粒子酵素イムノアッセイ定量のための検査キットであって、本出願明細書に記載のようなテストステロン定量用の任意のトレーサー化合物及び抗体を含む検査キットである。尚、検査キットは勿論、当業者に公知のような、且つユーザーの観点から所望であり得る他の物質、例えば緩衝液、希釈剤、標準物質等も含み得る。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
以下の実施例は、（１）１位免疫原及び標識試薬の合成の出発材料である１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの合成（実施例１）、（２）１位免疫原の合成（実施例２及び３）、（３）６位免疫原の合成（実施例４及び５）、（４）１位が標識された試薬の合成（実施例６〜10）、（５）６位が標識された試薬の合成（実施例11及び12）、（６）実施例２〜５の免疫原を使用する抗体の産生及び精製（実施例13〜16）、（７）実施例16で産生した抗体のラテックス粒子への結合（実施例17）、並びに（８）実施例４の６位免疫原及び実施例10の１位が標識された試薬を用いるイムノアッセイ（実施例18）を説明する。
本発明は、公開及び非公開の研究を参考としている。これらの研究は例えば、科学論文、係属特許出願及び特許等である。本明細書で引用する研究は総て、本明細書に参考として包含される。
本発明は特定の実施態様に基づいて説明したが、後述の「請求の範囲」を逸脱せずに当業者によってなされ得る変更及び代替も本出願の対象として包含される。
実施例１
この実施例（第１図）は、下記の式：
0003557210.tif 000013
１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンで示される１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの合成を説明する。
乾燥DMF150ml中のｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（11.0g、71mmol）溶液を撹拌し、これに1,4−アンドロスタジエン−17β−オル−３−オン（10.0g、35mmol）及びイミダゾール（9.5g、140mmol）を一度に加えた。該反応混合物を室温で4.5時間撹拌した。TLC［シリカゲル、EtOAc/Hex（10/90,v/v）］で、出発材料が完全に消滅したことが判明し、沈殿物が形成された。該反応混合物を300mlのペンタンに注入し、有機相を氷冷５％塩酸（100ml×２）、５％重炭酸ナトリウム（100ml×２）、ブライン（100ml×２）で洗浄し、MgSO4で脱水した。濾過し、濾液を減圧下で回転蒸発器で濃縮して、粘稠油状物を得た。重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル500g、EtOAc/Hex（10/90  v/v）→EtOAc/Hex（20/80  v/v）の溶離］で精製すると、純粋な1,4−アンドロスタジエン−17β−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが11.6g（83％）得られた。
1H NMR（300MHz,CDCl3）δ7.054（d,J＝10.30Hz,1H）,6.220（dd,J＝1.84Hz,J＝10.30Hz,1H）,6.063（m,1H）,3.545（t,J＝8.27Hz,1H）,2.600−2.300（m,2H）,2.000−0.700（m,13H）,1.237（s,3H）,0.879（s,9H）,0.779（s,3H）,0.000（s,6H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）δ186.30,169.16,155.84,127.46,123.84,81.43,52.73,49.77,43.64,43.45,36.74,35.66,33.23,32.83,30.79,25.83（3C）,23.68,22.56,18.75,18.07,11.41,−4.50,−4.84;質量分析（DCI,NH3）401（Ｍ＋Ｈ）+,418（Ｍ＋NH4）+.
４−ペンテニルマグネシウムブロミド
オーブン乾燥し、撹拌棒と隔壁と250ml添加漏斗とを備えた250ml三首丸底フラスコに、Mg削り屑（4.30g、0.177mol）を充填し、該装置をドライヤーで加熱しながらArで掃気した。室温に冷却した後、Mg削り屑を30mlの無水THFで覆った。I2結晶を加え、I2反応混合物の褐色が消えた直後に、該反応混合物をある程度緩めながら、無水THF50ml中の５−ブロモ−１−ペンタン（25g、0.168mol）溶液を2.5時間かけて滴下した。添加終了後、反応混合物を室温で２時間撹拌し、70mlの乾燥THFを加えて、沈殿したグリニャール試薬を溶解した。得られた溶液をAr下でカニューレにより乾燥隔壁キャップ付き200ml褐色壜に導入し、室温で貯蔵した。
１−α−（4'−ペンテニル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル
オーブン乾燥した250ml三首丸底フラスコに撹拌棒及び隔壁を具備し、THF中の４−ペンテン−１−イルマグネシウムブロミドの1.0M溶液（75ml、75mmol）をAr下で−20℃で仕込んだ。高速撹拌下の該懸濁液にCuBr−硫化ジメチル複合体（1.52g、7.4mmol）を一度に加えた。３分撹拌後、乾燥THF7ml中の1,4−アンドロスタジエン−17β−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（4.42g、11.03mmol）を添加漏斗を介して約３分間で添加した。添加漏斗内の沈殿物は少量の乾燥THF（3ml）で全て洗い落とした。次いで、フラスコを氷水中で15分間撹拌しながら０℃に暖めた。得られた暗赤色の溶液を−78℃に冷却し（ドライアイス−アセトン）、9N塩酸（Arでの掃気により脱酸素）の添加によりゆっくり停止して黄色混合物を得た。該混合物を150mlのジエチルエーテル及び150mlのブラインに注入した。有機相を分離し、半飽和重炭酸ナトリウム（100ml）、ブライン（100ml×２）で洗浄し、MgSO4で脱水した。脱水、濾過及び溶媒蒸発後に得られた粗成生物を重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル300g、EtOAc/Hex（10/90  v/v）］で精製すると、純粋な１−α−（4'−ペンテニル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが2.52g（49％）得られた。
1H NMR（300MHz,CDCl3）δ6.000−5.500（m,2H）,5.100−4.900（m,2H）,3.581（t,J＝8.27Hz,1H）,2.800−0.700（m,24H）,1.301（s,3H）,0.888（s,9H）,0.760（s,3H）,0.000（s,6H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）δ199.10,168.79,138.49,123.69,114.64,81.58,50.34,46.47,43.21,41.87,41.70,37.97,36.71,35.56,33.75,32.96,30.86,30.61,26.73,26.60,25.84（3C）,23.52,20.51,19.91,18.08,11.37,−4.47,−4.83;質量分析（DCI,NH3）471（Ｍ＋Ｈ）+,488（Ｍ＋NH4）+.
１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル
500ml三首丸底フラスコ内の、CH2Cl2（200ml）とMeOH（100ml）とピリジン（2ml）との混合物中の１−α−（4'−ペンテニル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（1.918g、4.07mmol）溶液にスーダンIII溶液（2ml、EtOH中0.1％）を加え、薄桃色の溶液全体を撹拌下で−78℃に冷却した。該反応混合物に、パスツールピペットを介して、O3流（90V、7.5psiのO2及び流量0.2slpmの流量で発生させた）を溶液の水面のすぐ下に通した。スーダンIIIの色が消えたらO3の添加を停止し、溶液中にN2を静かに通し、過剰O3を除去した。得られた溶液に硫化ジメチル（4ml、54.3mmol）を加え、該混合物を撹拌しながら一晩ゆっくりと室温に暖めた。TLC［シリカゲル、EtOAc/Hex（20/80、v/v）］で、出発材料が完全に消費されたことが判明した。該反応混合物を減圧下で回転蒸発器で蒸発させ、残渣を100mlのトルエンと共に２回同時蒸発させて残留MeOHを全て除去した。得られた残渣を30mlのｔ−BuOHに溶解し、２−メチル−２−ブテン（6.7ml、63mmol）を加え、次いで、リン酸塩緩衝液（pH＝3.3、0.20M）5mlに塩化ナトリウム（920mg、8.14mmol）を加えて新しく調製した酸化剤溶液を撹拌下でゆっくりと加えた。室温で30分間の撹拌後、酸化反応は完了していた。反応混合物を回転蒸発器で蒸発乾固させ、残渣をブライン300ml/EtOAc300mlの混合物と共に振盪し、pHをpH＝３に調整した。有機層を分離し、亜硫酸ナトリウム溶液（300ml、２％w/v、pH＝４）で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、蒸発させて粗成生物を得、これを重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル120g、CHCl3/MeOH（95/5）］で精製して油状物を得た。30mlのCH3CNから再結晶化すると、１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが固体物質として863mg（43％）得られた。
1H NMR（300MHz,CDCl3）δ5.701（s,1H）,3.581（t,J＝8.09Hz,1H）,2.700−2.300（m,2H）,2.320（t,J＝6.98Hz,2H）,2.000−0.800（m,20H）,1.310（s,3H）,0.888（s,9H）,0.760（s,3H）,0.000（s,6H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）δ198.84,178.46,168.80,123.71,81.53,50.29,46.49,43.21,41.82,41.69,37.91,36.61,35.56,33.85,32.96,30.87,30.60,26.77,25.86,23.52,22.67,20.51,19.93,18.08,11.36,−4.47,−4.78;質量分析（DCI,NH3）489（Ｍ＋Ｈ）+,506（Ｍ＋NH4）+.
１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン
50mlのCH3CN中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（841mg、1.76mmol）の懸濁液を撹拌し、これに、新しく調製したCH3CN中５％（v/v）の48％HFを10ml加えた。該混合物は撹拌によって徐々に均質になり、１時間後にTLC［シリカゲル、CH2Cl2（93/7,v/v）］で完全に反応したことが判明した。該反応混合物を300mlのブライン中に注ぎ、300mlのEtOAcで抽出した。有機層を分離し、ブライン（300ml×２）で洗浄し、MgSO4で脱水し、回転蒸発器で蒸発させて粗生成物を得、これを重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル120g、CHCl3/MeOH（90/10、v/v）］で精製すると、純粋な１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンが553mg（86％）得られた。
1H NMR（300MHz,CDCl3）δ5.704（s,1H）,3.669（t,J＝8.46Hz,1H）,2.700−2.300（m,2H）,2.309（t,J＝6.98Hz,2H）,2.150−0.800（m,21H）,1.308（s,3H）,0.801（s,3H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）δ199.14,178.41,168.92,123.68,81.48,50.65,46.36,42.84,41.79,41.62,37.86,36.16,35.48,33.90,32.91,30.52,30.32,26.67,23.37,22.64,20.43,19.86,11.13;質量分析（DCI,NH3）375（Ｍ＋Ｈ）+,392（Ｍ＋NH4）+.
実施例２
この実施例は、ウシ血清アルブミンへの１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第２図）。
0003557210.tif 000014
乾燥DMF1ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−３−オン、TBDMS−エーテル（64mg、0.17mmol）及びHOSu（24mg、0.21mmol）の溶液に、撹拌下でDCC（35mg、0.17mmol）を一度に加えた。30分間の撹拌後、均質溶液全体が濁った状態になった。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、活性化エステルの形成状況をTLC（シリカゲル、100％酢酸エチル）で監視した。該活性化エステル混合物を、綿栓を詰めた使い捨てピペットで濾過し、固体を1mlの乾燥DMFで洗浄した。濾過した活性化エステル溶液に、リン酸塩緩衝液（pH＝7.80）5ml中のウシ血清アルブミン（BSA、293mg）溶液を滴下した。室温で16時間撹拌した後、該反応混合物を透析膜管（Spectra/Por＊2,797925,カタログD1614−12、サイズ25mm、直径15.9mm）に移し、該管をリン酸塩緩衝液（４l、0.1M、pH＝7.80）に対して６時間透析した。次いで、該管を蒸留水４lに対して、７時間、17時間、７時間、17時間、７時間,17時間、７時間で透析した。該タンパク質溶液を凍結乾燥し、包装した。TNBS滴定の結果、アミノ基置換率は56％であった。
実施例３
この実施例は、キーホールリンペットヘモシアニンへの１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第３図）。
0003557210.tif 000015
乾燥DMF1ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−３−オン、TBDMS−エーテル（64mg、0.17mmol）及びHOSu（24mg、0.21mmol）の溶液に、撹拌下でDCC（35mg、0.17mmol）を一度に加えた。30分撹拌後、均質溶液全体が濁った状態になった。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、活性化エステルの形成状況をTLC（シリカゲル、100％酢酸エチル）で監視した。該活性化エステル混合物を、綿栓を詰めた使い捨てピペットで濾過し、固体を1mlの乾燥DMFで洗浄した。濾過した活性化エステル溶液に、リン酸塩緩衝液（pH＝7.80）10ml中のキーホールリンペットヘモシアニン（KLH、292mg）溶液を滴下した。室温で16時間撹拌した後、該反応混合物を透析膜管（Spectra/Por＊2,797925,カタログD1614−12、サイズ25mm、直径15.9mm）に移し、該管をリン酸塩緩衝液（４l、0.1M、pH＝7.80）に対して６時間透析した。次いで、該管を蒸留水４lに対して、７時間、17時間、７時間、17時間、７時間で透析した。該タンパク質溶液を凍結乾燥し、包装した。
実施例４
この実施例は、ウシ血清アルブミンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの結合を説明する（第４図）。
0003557210.tif 000016
乾燥DMF0.8ml中の、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（50mg、0.133mmol）、DCC（27.5mg、0.133mmol）及びHOSu（18.4mg、0.160mmol）の反応混合物を室温で16時間撹拌した。綿栓を詰めた使い捨てパスツールピペットで尿素を濾過し、0.8mlの乾燥DMFで洗浄した。濾液をまとめて、リン酸塩緩衝液（4.0ml、pH＝7.80）及びDMF（0.8ml）の混合物中のBSA（226mg）溶液に滴下した。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、次いで透析膜管［Spectra/Por＊2,797925,カタログD1614−12、サイズ25mm、直径15.9mm］に移した。該管を0.1Mリン酸塩緩衝液（pH＝7.80）４lに対して室温で７時間透析し、次いで蒸留水４lに対して７時間、17時間、７時間、17時間、７時間,17時間で透析した。免疫原を凍結乾燥し、貯蔵した。TNBS滴定の結果、アミノ基置換率は52％であった。
実施例５
この実施例は、キーホールリンペットヘモシアニンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの接合を説明する（第５図）。
0003557210.tif 000017
乾燥DMF0.8ml中の、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（50mg、0.133mmol）、DCC（27.5mg、0.133mmol）及びHOSu（18.4mg、0.160mmol）の反応混合物を室温で16時間撹拌した。綿栓を詰めた使い捨てパスツールピペットで尿素を濾別し、0.8mlの乾燥DMFで洗浄した。濾液をまとめて、リン酸塩緩衝液（8.0ml、pH＝7.80）及びDMF（1.6ml）の混合物中のKLH（180mg）溶液に滴下した。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、次いで透析膜管［Spectra/Por＊2,797925,カタログD1614−12、サイズ25mm、直径15.9mm］に移した。該管を４lの0.1Mリン酸塩緩衝液（pH＝7.80）に対して室温で７時間透析し、次いで蒸留水４lに対して７時間、17時間、７時間、17時間、７時間,17時間で透析した。免疫原を凍結乾燥し、包装した。
実施例６
この実施例及び第６図は、下記の式3:
0003557210.tif 000018
で示される好ましい１位が標識された試薬、テストステロン−フルオレセン接合体の合成を説明する。
新しく脱ガスした乾燥DMF2ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン、TBDMS−エーテル（95.4mg、0.254mmol）及びHOSu（58mg、0.504mmol）の溶液を撹拌し、これにDCC（53mg、0.254mmol）を一度に加えた。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、次いでＮ−BOC−エチレンジアミン（85mg、0.530mmol）を加え、該反応混合物を室温で16時間撹拌した。該溶液を綿を詰めた使い捨てピペットで濾過し、二つの分離用TLCプレート（厚さ2mm、C18逆相プレート）に適用した。これらのプレートをメタノール／水／酢酸（80/20/0.5,v/v）混合物で展開した。所望のバンドを切り取り、300mlのメタノールで抽出した。メタノール抽出物を濾過し、減圧下で蒸発させると、77mg（59％）のＮ−Boc保護エチレンジアミドステロイドが得られた。質量分析（DCI,NH3）517（Ｍ＋Ｈ）+,534（Ｍ＋NH4）＋。
Ｎ−Bocエチレンジアミドステロイド（44mg、0.085mmol）を塩化メチレン及びトリフルオロ酢酸1/1混合物（合計2ml）に溶解し、室温で10分間撹拌した。TLCで反応が完了したことが判明した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で除去した。脱保護アミンを分離せず、残渣を次の結合反応で直接使用した。
新しく脱ガスした乾燥DMF1ml中の６−カルボキシフルオレセン（36mg、0.098mmol）、HOSu（21mg、0.182mmol）及びDCC（20mg、0.097mmol）を室温で24時間撹拌した。TLCの結果、反応は完了していた。この活性化エステル溶液を１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン−EDA・TFA塩（0.098mmol）に加え、混合物全体を乾燥DMFで2mlに希釈した。トリエチルアミン（56μｌ、0.40mmol）を加え、該反応混合物を16時間撹拌した。綿を詰めた使い捨てピペットで反応混合物を濾過し、濾液をC18逆相分離用TLCプレート（厚さ1mm）に適用した。該プレートを真空乾燥し、メタノール／水／酢酸（70/30/0.5,v/v）で展開した。所望のバンドをメタノール（150ml）で抽出し、メタノール抽出物を減圧下で蒸発させると、48mg（63％）のトレーサーが得られた。質量分析（FAB）775（Ｍ＋Ｈ）+,797（Ｍ＋Na）＋。
実施例７
この実施例及び第７図は、下記の式：
0003557210.tif 000019
で示される、別の１位が標識された試薬、別のテストステロン−フルオレセン接合体の合成を説明する。
新しく脱ガスした乾燥DMF2ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−17β−オル−３−オン、TBDMS−エーテル（95.4mg、0.254mmol）及びHOSu（58mg、0.504mmol）の溶液を撹拌し、これにDCC（53mg、0.254mmol）を一度に加えた。該反応混合物を室温で16時間撹拌し、次いでＮ−BOC−エチレンジアミン（85mg、0.530mmol）を加え、該反応混合物を室温で16時間撹拌した。該溶液を、綿を詰めた使い捨てピペットで濾過し、二つの分離用TLCプレート（厚さ2mm、C18逆相プレート）に適用した。これらのプレートをメタノール／水／酢酸（80/20/0.5,v/v）混合物で展開した。所望のバンドを切り取り、300mlのメタノールで抽出した。メタノール抽出物を濾過し、減圧下で蒸発させると、77mg（59％）のＮ−Boc保護エチレンジアミドステロイドが得られた。質量分析（DCI,NH3）517（Ｍ＋Ｈ）+,534（Ｍ＋NH4）＋。
Ｎ−Bocエチレンジアミドステロイド（44mg、0.085mmol）を塩化メチレン及びトリフルオロ酢酸1/1混合物（合計2ml）に溶解し、室温で10分間撹拌した。TLCで反応が完了していることが判明した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で除去した。脱保護アミンを分離せず、残渣を次の結合反応で直接使用した。
0.5mlのDMF中の５−カルボキシフルオレセン（20.3mg、0054mmol）、HOSu（12mg、0.104mmol）及びDCC（11mg、0.054mmol）を室温で24時間撹拌した。TLCで反応が完了していることが判明した。この活性化エステル溶液を１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン−EDA・TFA塩（0.072mmol）に加え、該混合物全体を乾燥DMFで1mlに希釈した。トリエチルアミン（30μｌ、0.22mmol）を加え、該反応混合物を16時間撹拌した。綿を詰めた使い捨てピペットで反応混合物を濾過し、濾液をC18逆相分離用TLCプレート（厚さ1mm）に適用した。該プレートを真空乾燥し、メタノール／水／酢酸（70/30/0.5,v/v）で展開した。所望のバンドをメタノール（150ml）で抽出し、メタノール抽出物を減圧下で蒸発させると、31mg（75％）のトレーサーが得られた。質量分析（FAB）775（Ｍ＋Ｈ）+,797（Ｍ＋Na）＋。
実施例８
この実施例は、下記の式：
0003557210.tif 000020
で示されるトレーサーを製造するための６−アミノメチルフルオレセンへの１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの結合（第８図）を説明する。
新しく脱ガスした乾燥DMF0.5ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−テストステロン（55mg、0.147mmol）、HOSu（29mg、0.252mmol）及びDCC（26mg、0.126mmol）を室温で16時間撹拌し、その後６−アミノメチルフルオレセンヒドロブロミド（56mg、0.126mmol）及びトリエチルアミン（70μｌ、0.50mmol）を加えた。該反応混合物を室温で更に16時間撹拌した。TLCで反応が完了していることが判明した。該反応混合物を2mmの分離用プレート（順相）に適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、92/8/0.5,v/v）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中10％メタノール150mlで抽出した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で蒸発させると、36mg（34％）のトレーサーが得られた。質量分析（FAB）718（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例９
この実施例は、下記の式：
0003557210.tif 000021
で示されるトレーサーを製造するための4'−アミノメチルフルオレセンへの１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの結合（第９図）を説明する。
新しく脱ガスした乾燥DMF0.5ml中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン（55mg、0.147mmol）、HOSu（29mg、0.252mmol）及びDCC（26mg、0.126mmol）を室温で16時間撹拌し、その後4'−アミノメチルフルオレセン塩酸塩（50mg、0.126mmol）及びトリエチルアミン（35μｌ、0.25mmol）を加えた。該反応混合物を室温で16時間撹拌した。TLCで反応が完了していることが判明した。該反応混合物を2mmの分離用プレート（順相）に適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、92/8/0.5,v/v）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中10％メタノール150mlで抽出した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で蒸発させると、40mg（38％）のトレーサーが得られた。質量分析（FAB）718（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例10
この実施例は、アルカリホスファターゼへの１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第10図）。
0003557210.tif 000022
新しく脱ガスした乾燥DMF60.8μｌ中の１−α−（3'−カルボキシプロピル）−テストステロン（3.1mg、0.0083mmol）、NHS（1.09mg、0.0095mmol）及びEDAC（1.6mg、0.0083mmol）を室温で１時間混合した。該反応混合物3.5μｌ（７×10-4mmol）を、新しく脱ガスした乾燥DMF496.5μｌに加えた。該反応混合物300μｌ（4.9×10-6mmol）にアルカリホスファターゼ（2.9×10-5mmol）及びpH10.0の重炭酸塩緩衝液（0.02mmol、1.7mg重炭酸ナトリウム及び0.02mmol、2.1mg炭酸ナトリウム）を加えた。該反応体を室温で16時間混合し、次いでＧ−25セファデックスを用いてカラムクロマトグラフィーにかけると、所望のテストステロン接合体が得られた。
実施例11
この実施例は、下記式で示されるトレーサーを製造するための4'−アミノメチルフルオレセンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの結合（図11）を説明する。
0003557210.tif 000023
新しく脱ガスした乾燥DMF0.5ml中の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（19.2mg、0.051mmol）、HOSu（11.8mg、0.103mmol）及びDCC（19.5mg、0.095mmol）を室温で16時間撹拌した。活性化エステルは分離しなかった。該反応混合物に4'−アミノメチルフルオレセン塩酸塩（21mg、0.05mmol）及びトリエチルアミン（28μｌ、0.20mmol）を加えた。室温で16時間撹拌した後、該反応混合物を順相分離用シリカゲルプレートに適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、92/8/0/0.5、v/v）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中10％メタノール50mlで抽出した。質量分析（FAB）719（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例12
この実施例は、アルカリホスファターゼの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの接合を説明する（第12図）。
0003557210.tif 000024
６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン
新しく脱ガスした乾燥DMF60.8μｌ中の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（3.1mg、0.0083mmol）、NHS（1.09mg、0.0095mmol）及びEDAC（1.6mg、0.0083mmol）を室温で１時間混合した。該反応混合物3.5μｌ（７×10-4mmol）を、新しく脱ガスした乾燥DMF496.5μｌに加えた。該反応混合物300μｌ（4.9×10-6mmol）にアルカリホスファターゼ（2.9×10-5mmol）及びpH10.0重炭酸塩緩衝液（0.02mmol、1.7mg重炭酸ナトリウム及び0.02mmol、2.1mg炭酸ナトリウム）を加えた。該反応体を室温で16時間混合し、次いでＧ−25セファデックスを用いてカラムクロマトグラフィーにかけると、所望のテストステロン接合体が得られた。
実施例13
免疫感作方法
各々が６匹のウサギを含む４個のグループを下記の４種類の異なる免疫原のうちの一つで免疫感作した：（ａ）BSAに結合した６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン｛本明細書では６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:BSAとも称し、実施例４に示す構造式を有する｝、（ｂ）KLHに結合した６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン｛本明細書では６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:KLHとも称し、実施例５に示す構造式を有する｝、（ｃ）BSAに結合した１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン（実施例２）、及び（ｄ）KLHに結合した１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン（実施例３）。まず、将来の採血の評価で基準として使用するための血液の各ウサギから採取した。ウサギの膝窩リンパ節（PLN）に、フロイント完全アジュバント中に乳化した抗原0.5mgを注射した。３週間の間隔で、筋肉注射により、フロイント不完全アジュバント（FIA）で乳化した抗原0.250mgをウサギに追加注射した。最初の注射及び次の追加注射の10日後に、血液（50ml）を採取した。
抗体は３〜４ケ月後に成熟した。許容し得る特異性を示したウサギから、25ml/ウサギ／月で更に12ヵ月間にわたり血液を採取した。血液を集め、プールして、代表的抗血清プールを形成した。
血清の評価
採取血液を更に、特異性と、実施例10に記載の標識試薬及び実施例14、16、17及び18に記載する方法を用いる検量線作成の可能性とについて、IMx（登録商標）計器で評価した。
実施例14
抗血清のプロテインＡ精製
プロテインＡの一般的精製方法は下記の通りである。カラムクロマトグラフィー［20mlプロテインＡゲル（Pierce,カタログ番号20366g）、1.5Mグリシン/3M塩化ナトリウムpH9.0→0.1Mクエン酸pH3.0の溶離剤］による232.5mgの抗血清精製の結果、70mgの精製物質が得られた。溶出液を10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（3.0l）に対して２〜８℃で16時間透析した。該物質をMillipore  Immersible  CX−30限外濾過装置（カタログ番号PTTK11K25）を用いて濃縮し、10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（100ml）を用いて約5mg/mlのタンパク質濃度にした。濃縮物質を0.2μｍフィルターで濾過した。
実施例15
６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:Affi−Gel102アフィニティ樹脂の製造
下記の実施例は、実施例14で得た抗血清を更に精製するために使用したアフィニティ樹脂の製造を説明する。
Affi−Gel102ゲル（10.0ml、Bio−Rad、カタログ番号153−2401）を100.0mlの100％エタノールで洗浄した。100％エタノール10.0ml中の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（61.8mg、165μmol）を、洗浄したAffi−Gel102樹脂10.0mlに加えた。このスラリーにEDAC（38.3mg、199.8μmol）及びNHS（19.98mg、199.8μmol）を加えた。該スラリーを静かに４時間回転させた。該樹脂を20mlガラスカラム内に注入し、100％エタノール（100ml）、水（100ml）及び10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（100ml）で洗浄した。次いでカラムから排出し、後で使用するために貯蔵した。
実施例16
実施例15に記載の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム:Affi−Gel102アフィニティ樹脂を用いる実施例４及び５に記載の免疫原に由来する抗血清のアフィニティ精製
６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:BSA又は６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:KLHを接種したウサギから得たプロテインＡ精製抗血清を、実施例15の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:Affi−Gel102アフィニティ樹脂を用いて精製した。
一般的なアフィニティ精製操作は下記の通りである。まず、溶出液がpH7.2になるまで、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン:Affi−Gel102アフィニティ樹脂（10ml、実施例15）を10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2で洗浄した。プロテインＡ精製抗血清（50mg、実施例14）をカラムにかけ、16時間結合させた。カラムを10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（100ml）、2M塩化ナトリウム（100ml）及び10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（50ml）で洗浄した。抗体を0.1Mクエン酸、pH2.0で溶離し、5mgの精製物質を得た。
精製した抗血清を、Millipore  Immersible  CX−30限外濾過装置（カタログ番号PTTK11K25）、及び10mMリン酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH7.2（100ml）で約5mg/mlに濃縮した。
実施例17
この実施例は、実施例16で精製した抗血清をカルボン酸塩改質ラテックス（CML）粒子に共有結合する方法を説明する。
ラテックス粒子の洗浄
界面活性剤を用いて乳化重合により極めて均一なラテックス粒子を形成する。界面活性剤（通常は負の電荷を有する）は、粒子をタンパク質でコーティングする前に除去しなければならない。当業者に公知の粒子洗浄方法は幾つか存在する。Seradynの粒子洗浄方法（Microparticle  Immunoassay  Techniques,1988）を少しだけ変えて使用した。
水2ml中0.2gのラテックス粒子（Seradyn、カルボン酸塩改質ラテックス、直径0.396μｍ、MFGロット番号2179、PKGロット番号2B66）に、1gのBio−Rad混合床樹脂（カタログ番号1427425）を加えた。該スラリーを室温で１時間混合した。該反応混合物をガラス焼結フィルターで濾過し、界面活性剤を除いたラテックス粒子を含む濾液を水/0.1％アジ化ナトリウムで希釈して、3.2％ラテックス粒子溶液を得た。
洗浄したカルボン酸塩改質ラテックス粒子への抗体（実施例16）の共有結合
前述のラテックス粒子3mgにMES緩衝液pH4.5（0.025mmol）を加えた。室温で１分間混合した後、0.1mgのアフィニティ精製抗体（実施例16）を加えた。更に１分間混合した後、2.09μmolのEDACを加え、該反応混合物を室温で１時間混合した。粒子を遠心分離で精製し、ペレットを0.1％Tween20で２回、IMx（登録商標）MEIA  Line希釈剤で１回洗浄した。次いで、粒子をラテックス粒子貯蔵希釈剤（0.05mmolトリス、0.1mmol塩化ナトリウム、0.136gスクロース、125μｇウサギIgG、pH7.4）中に再懸濁した。
実施例18
テストステロンの微粒子酵素イムノアッセイ
ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例17）及び１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロンアルカリホスファターゼトレーサー（実施例10）を市販のIMx（登録商標）計器で使用した。IMx（登録商標）計器の一般的操作は、販売業者が推奨するIMx（登録商標）システム操作説明書に記載の手順に従った。IMx（登録商標）システム操作説明書には、１）操作理論：微粒子酵素イムノアッセイ;2）操作上の注意及び制限;3）毎日の始動操作;4）維持すべき品質管理に必要な毎月の及び定例の操作が記述されている。検量線及び交差反応性検査を下記のIMx（登録商標）アッセイ手順に従って実施した。
IMx（登録商標）テストステロンアッセイは、微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）法をベースとする。IMx（登録商標）テストステロン試薬及び試料を下記の方法で反応容器に加えた:1）抗体に結合したラテックス粒子（ラテックス粒子貯蔵希釈剤中のラテックス−抗体結合体2.5×10-6g、実施例17）、グリシン（3.9×10-5モル）及び50μｌの試料を、プローブ／電極アセンブリにより反応容器のインキュベーションウェル内で115μｌのIMx（登録商標）MEIA  Line希釈剤に最終pH5.5で加えた;2）514秒間インキュベートした後、175μl/250μｌのインキュベーション混合物を反応容器のガラス繊維マトリクスに移し、IMx（登録商標）MEIA  Line希釈剤で２回洗浄した;3）次いで、標識試薬（2.1×10-9モルのタンパク質、実施例10）を反応容器のガラス繊維マトリクスに加えた;4）６秒間インキュベートした後、非結合標識試薬をIMx（登録商標）MEIA  Line希釈剤で３回洗浄することにより除去した;5）次いで、抗体基質（４−メチルウンベリフェリルホスフェート）を反応容器のガラス繊維マトリクスに加え、蛍光生成物をIMx（登録商標）計器のMEIA光学アセンブリによって測定した。
ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例17）を、テストステロン、１−α−（3'−カルボキシブロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例10）及び６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例12）に結合する能力について評価した。第13図に示すように、テストステロンのMEIAアッセイを用いて標準曲線を作成した。１−α−（3'−カルボキシブロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例10）を用いると、より良好な標準曲線が得られた。
ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例17）の交差反応性をMEIAアッセイで評価した。構造的にテストステロンに相関しており、且つ内因性又は外因性起源に由来する雄又は雌の血液中に存在する化合物を検査した（表１）。
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表１は、ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例17）及び１−α−（3'−カルボキシプロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例10）を用いる記載のアッセイを妨害する可能性の有る化合物の交差反応性を示している。表１の化合物は、典型的には、テストステロンアッセイの特異性を調べるために市販アッセイで使用される。低い交差反応性は、アッセイ、特に抗体が、テストステロンに対して大きな特異性を有することを意味する。
【図２】
0003557210.tif 000039
【図３】
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【図１】
0003557210.tif 000041
【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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【図９】
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【図７】
0003557210.tif 000047
【図１０】
0003557210.tif 000048
【図１１】
0003557210.tif 000049
【図１２】
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【図１３】
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