【手続補正書】
【提出日】平成29年4月21日(2017.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体であって、該細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7のγ重鎖（SEQ ID NO:1）およびκ軽鎖（SEQ ID NO:2）に由来する単鎖FV断片を含む、CD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項２】
モノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片が、SEQ ID NO:3〜5およびSEQ ID NO:7〜8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項３】
細胞内シグナリングドメインがCD3ζシグナリングドメインを含む、請求項1または2記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項４】
細胞内シグナリングドメインが4-1BBドメインを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項５】
ヒトCD8α鎖の膜貫通ドメインおよびストークドメインを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項６】
アミノ酸配列SEQ ID NO:14および15と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項７】
CD19に特異的ではない他の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
核酸配列SEQ ID NO:17と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項8記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項8または9記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインおよび少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞であって、細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片を含む、遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１２】
請求項1〜7のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１３】
CD19に特異的ではない他のキメラ抗原受容体をさらに含む、請求項11または12記載の遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１４】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項11〜13のいずれか一項記載の遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１５】
ドナーから回収された、請求項11〜14のいずれか一項記載の遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１６】
患者から回収された、請求項11〜14のいずれか一項記載の遺伝子操作免疫細胞。
【請求項１７】
治療において使用するための、請求項11〜16のいずれか一項記載の遺伝子操作細胞。
【請求項１８】
B細胞リンパ腫およびB細胞白血病の治療において使用するための、請求項11〜16のいずれか一項記載の遺伝子操作細胞。
【請求項１９】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）請求項1〜7のいずれか一項記載の少なくとも1種のCD19特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
【請求項２０】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞において発現させる工程
を含む、請求項19記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項２１】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）CD19に特異的ではない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、請求項19記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項２２】
請求項1〜7のいずれか一項記載のCD19特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を含む、その必要のある対象を処置するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明者らは、CD19特異的モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含むCD19特異的CAR（4G7-CAR）を生成し、得られた4G7-CARの初代T細胞への導入が、抗原結合と無関係に、形質導入された細胞により長期間の「活性化」状態を付与し得ることを、驚くべきことに見出した。（例えば、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2による）インビトロの非特異的な活性化の後、これらの細胞は、FMC63 scFVを含む類似したCARによって形質導入された細胞と比較して、より長期間にわたり、増加した細胞サイズ（芽細胞形成）および活性化マーカー（CD25）の発現を示した。この長期活性化は、より長期間の増殖を可能にし、インビトロでの4G7-CAR細胞の増大のための抗原非依存性の機序を提供する。従って、本発明は、特異的なモノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含む少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。具体的には、本発明のCARは、免疫細胞へ形質導入された後、抗原非依存性の細胞の活性化および増殖に寄与する。本発明は、CD19特異的モノクローナル抗体4G7に由来するscFVを含むCARをコードする核酸、ベクター、および4G7 CARを細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法にも関する。本発明は、表面に4G7を発現している遺伝子改変免疫細胞、特に、抗原機序と無関係に増殖する免疫細胞にも関する。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、B細胞リンパ腫またはB細胞白血病の処置のような治療的適用のために特に有用である。
[本発明1001]
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体であって、該細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7のγ重鎖（SEQ ID NO:1）およびκ軽鎖（SEQ ID NO:2）に由来する単鎖FV断片を含む、CD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1002]
モノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片が、SEQ ID NO:3〜5およびSEQ ID NO:7〜8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001のCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1003]
細胞内シグナリングドメインがCD3ζシグナリングドメインを含む、本発明1001または1002のCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1004]
細胞内シグナリングドメインが4-1BBドメインを含む、本発明1001〜1003のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1005]
ヒトCD8α鎖の膜貫通ドメインおよびストークドメインを含む、本発明1001〜1004のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1006]
アミノ酸配列SEQ ID NO:14および15と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1005のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1007]
CD19に特異的ではない他の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
[本発明1009]
アミノ酸配列SEQ ID NO:17と少なくとも75％、好ましくは80％、85％、90％、95％を有する核酸配列を含む、本発明1008のポリヌクレオチド。
[本発明1010]
本発明1008または1009の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1011]
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインおよび少なくとも1つの細胞内シグナリングドメインを含むCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞であって、細胞外ドメインが、CD19に特異的なモノクローナル抗体4G7に由来する単鎖FV断片を含む、遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1012]
本発明1001〜1007のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1013]
CD19に特異的ではない他のキメラ抗原受容体をさらに含む、本発明1011または1012の遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1014]
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、本発明1011〜1013のいずれかの遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1015]
ドナーから回収された遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1016]
患者から回収された遺伝子操作免疫細胞。
[本発明1017]
治療において使用するための遺伝子操作細胞。
[本発明1018]
B細胞リンパ腫およびB細胞白血病において使用するための遺伝子操作細胞。
[本発明1019]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）本発明1001〜1007のいずれかの少なくとも1種のCD19特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
[本発明1020]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞において発現させる工程
を含む、本発明1019の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1021]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）CD19特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）CD19に特異的ではない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、本発明1019の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1022]
（a）本発明1001〜1007のいずれかのCD19特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法。