(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ｉ）8.0〜11.0の範囲内のpHにおいて0.01〜0.25モルのバッファー中のタンパク質の第１水性混合物、及び
ii）以下の式：
Ｇ−LM−PEG−LM−Ｇ
｛式中、−PEG−は、以下の式：
−Ｏ−（CH2−CH2−Ｏ−）ａ−
（式中、ａは、20〜300の整数である。）により表されるジラジカル断片であり；
−LM−は、式−Ｃ（Ｏ）−のカーボネート・ジラジカル、式−（CH2）bC（Ｏ）−（式中、ｂは、１〜５の整数である。）のモノエステル・ジラジカル、式−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃは、２〜10の整数であり、そしてそのジラジカルの脂肪族部分は飽和であっても不飽和であってもよい。）のジエステル・ジラジカル、式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｄは、２〜10の整数である。）のジカーボネート・ジラジカル、及び以下の式−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃは、２〜10の整数であり、ｄは、２〜10の整数であり、そしてＲは、ラクチド、グリコリド、トリメチレン・カーボネート、カプロラクトン及びｐ−ジオキサノンから成る群から選ばれる１〜10のモノマー断片をもつポリマー又はコポリマーである。）により表されるオリゴマー・ジラジカルから成る群から選ばれるジラジカル断片であり；そして
−Ｇは、スクシンイミジル、マレイミジル、フタルイミジル、イミダゾールイル、ニトロフェニル、及びトレジルから成る群から選ばれる脱離基である。｝をもつ架橋剤の第２水性混合物、
から本質的に成る接着剤組成物であって、ここで、上記第１水性混合物と第２水性混合物の組合せ物は、初めは液体であるが、組織表面上でその後に硬化して、当該組織に結合するフレキシブルで実質的なマトリックスを与える前記接着剤組成物。
【請求項２】
前記第１水性混合物中のタンパク質が、20〜60wt/vol％血清アルブミンである、請求項１に記載の接着剤組成物。
【請求項３】
前記第２水性混合物中の架橋剤の濃度が、当該架橋剤の重量平均分子量が1,000〜5,000の範囲内にあるとき、50〜300mg/mlであり、かつ、前記第２水性混合物中の架橋剤の濃度が、当該架橋剤の重量平均分子量が5,000〜15,000の範囲内にあるとき、300〜800mg/mlである、請求項１に記載の接着剤組成物。
【請求項４】
前記第１水性混合物と前記第２水性混合物の初めの液体組合せ物が、１分間未満で組織の表面で硬化して、４〜60日間で吸収されるフレキシブルで実質的なマトリックスを与える、請求項１に記載の接着剤組成物。
【請求項５】
以下の：
ｉ）8.0〜11.0の範囲内のpH及び0.01〜0.25モルのバッファー濃度におけるバッファー中のタンパク質の第１水性混合物と、
ii）以下の式：
Ｇ−LM−PEG−LM−Ｇ
｛式中、−PEG−は、以下の式：
−Ｏ−（CH2−CH2−Ｏ−）ａ−
（式中、ａは、20〜300の整数である。）により表されるジラジカル断片であり；
−LM−は、式−Ｃ（Ｏ）−のカーボネート・ジラジカル、式−（CH2）bC（Ｏ）−（式中、ｂは、１〜５の整数である。）のモノエステル・ジラジカル、式−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃは、２〜10の整数であり、そしてそのジラジカルの脂肪族部分は飽和であっても不飽和であってもよい。）のジエステル・ジラジカル、式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｄは、２〜10の整数である。）のジカーボネート・ジラジカル、及び以下の式−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃは２〜10の整数であり、ｄは、２〜10の整数であり、そしてＲは、ラクチド、グリコリド、トリメチレン・カーボネート、カプロラクトン及びｐ−ジオキサノンから成る群から選ばれる１〜10のモノマー断片をもつポリマー又はコポリマーである。）により表されるオリゴマー・ジラジカルから成る群から選ばれるジラジカル断片であり；そして
−Ｇは、スクシンイミジル、マレイミジル、フタルイミジル、イミダゾールイル、ニトロフェニル、及びトレジルから成る群から選ばれる脱離基である。｝をもつ架橋剤の第２水性混合物との、混合物を形成することから成る組織接着剤の調製方法であって、ここで、上記第１水性混合物と第２水性混合物の組合せ物は、初めは液体であるが、組織表面上でその後に硬化して、当該組織に結合するフレキシブルで実質的なマトリックスを与える前記調製方法。
【請求項６】
組織を接着するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の接着剤組成物。
【請求項７】
肺組織中のエアー・リークをシールするための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の接着剤組成物。
【請求項８】
外科手術後の接着を防止するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の接着剤組成物であって、当該組成物が外科手術部位の周囲の組織に適用されることができる前記接着剤組成物。
【請求項９】
血液又は他の液体のリークを防止し又は制御するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の接着剤組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、インビポにおいて組織を接着し又はシールするために使用されることができる接着剤シーラント組成物に、そして特に、組織を接着し、肺系の空気洩れを防止し又はコントロールするために組織をシールし、又は外科手術により引き起こされる組織接着を防止するために、それが組織に適用されるときに一緒に混合され、そして次にインビボにおいて硬化する２成分の液体接着剤組成物に関する。
背景
組織を接着し又はシールするためにさまざまな技術が使用されてきた。例えば、異なるタイプの組織が、縫合系、ステープル、テープ及び包帯を含む多数の手順、材料及び方法により機械的に接着され又はシールされてきた。いくつかの適用においては、これらの材料は、それが治癒するときに組織を接着し及び／又はシールし、そして次に一定時間にわたり吸収されることを意図される吸収性材料から作られている。
医療用接着剤又は“組織糊（tissue glue）”の一般的な用途は、広い適用を見い出されていない。今日まで、組織、例えば皮膚を接着し又はくっつけるために使用されることができるいくつかの接着剤材料が知られている。例えば、3M,St.Paul,MNから入手可能なVETBOND組織接着剤又はB.Braun,Melsungen,Germanyから入手可能なHISTOACRYL接着剤のようなシアノアクリレート接着剤が、組織を接着するために使用されることができる。シアノアクリレート接着剤に加えて、皮膚を接着し又はくっつけるための他のタイプの材料が、報告されている。例えば、Doi他に付与された米国特許第4,839,345号は、外部で皮膚に接着するであろうが、容易に除去又は剥がされ、そして次にその皮膚に再接着されることができるパップ（cataplasm）又は化粧用マスクとして使用される水和架橋タンパク質接着剤ゲルについて報告している。他の架橋タンパク質ヒドロゲルが、皮膚又は粘膜を通して治療剤、例えば、酵素又は薬物をデリバリーするためのタンパク質支持体として役立つことを報告している。例えば、1993年８月４日に出願された国際特許出願PCT/US93/07314を参照のこと。さらに他の材料が、出血を止め又は防ぐための止血剤として使用されている。特に、フィブリノーゲンとトロンビンの混合物、Immuno AG,Vienna,Austriaから入手可能なTISSEELシーテント又はBehringwerke,Marburg,Germanyから入手可能なBERIPLAST−Ｐ止血剤又はシーラントが、組織、例えば、血管をシールし、そしてそれ故血液の漏れを防止するために血管手術において使用されてきた。
要するに、十分な強さ、生物学的適合性及び生物学的吸収性をもち、並びにこのような組成物が最近の医療手順又は運用において容易に使用されることを許容するであろう他の所望の特性をもついくつかの利用可能な接着剤組成物が存在する。好適な組織接着剤又はシーラントの非利用可能性は、好適で有用な組織接着剤が適合しなければならない厳格な要求に関係することができる。重要には、組織接着剤が、内部又は外部組織のいずれについても実質的な結合強度を提供しなければならない。この接着剤は、正常な治癒又は再生過程を妨害しない生物学的適合性材料から作られなければならない。好適な組織接着剤は、液体形態で容易に投与され、そして次に一旦適用されると速く、理想的には１分未満に硬化されることもできる。さらに、組織接着剤は、硬化した後、柔軟で、曲げやすく（pliant）残り、そして良好な機械強度をもたなければならない。最後に、組織接着剤は、許容される時間期間にわたり、アレルギー応答、悪い組織反応又は全身毒性効果を伴わずに、インビボにおいて完全に吸収され又は分解されなければならない。好ましくは、また、好適な接着剤は、それが適用された後容易に吸収されるであろう。
発明の要約
本発明は、組織を接着し及び／又はシールするために使用されることができる非毒性の吸収性接着剤シーラント組成物である。本接着剤組成物は、約8.0−11.0のレンジ内のpHをもつ水性バッファー中の、タンパク質、好ましくは、血清タンパク質、例えばアルブミンの第１部、並びに水相溶性又は水溶性の２官能価架橋剤の第２部を含む２成分混合物から容易に形成される。上記混合物の２つの部が併合されるとき、この混合物は、最初は液体である。次にこの併合された混合物は、約１分未満に組織の表面上でインビボにおいて硬化して、その組織にしっかりと接着し、そして約４〜60日間、好ましくは、約４〜28日間内で容易に吸収される、強力で、柔軟で、曲がり易い実質的な組成物を与える。
本発明の好ましい態様においては、接着剤シーラント組成物が、約1:10容量部〜約10:1容量部のアルブミン溶液対架橋剤のレンジ内の、緩衝液化塩基性血清アルブミン・タンパク質溶液の容量対ポリエチレン・グリコール・ジスクシンイミジル・スクシネート架橋剤の容量の比率を含む２部混合物から形成される。本接着剤組成物の上記２つの部の混合を容易にするために、アルブミン溶液対架橋剤の容量対容量比は、好ましくは、1:1の比である。
好ましい血清アルブミン・タンパク質は、悪い組織及び不所望の免疫学的応答を防止するように選ばれる。本接着剤混合物がヒト組織を接着し又はシールするために使用されるとき、好ましい血清アルブミンは、滅菌され、約8.0−11.0のpH値をもつ塩基性バッファーを用いて透析され、約50,000の分子量カット−オフをもつ膜を通しての限外濾過により濃縮されて、約20−60wt/vol％、好ましくは約35−45wt/vol％のヒト血清アルブミンをもつ濃縮緩衝液化水性混合物を作り出された精製ヒト血清アルブミンである。
好ましい２官能価架橋剤は、約1,000−15,000のレンジ内の、そして好ましくは、約2,000−4,000のレンジ内の分子量（重量平均）をもつポリエチレン・グリコール誘導架橋剤を含む。この架橋剤の分子量が約1,000〜5,000のレンジ内にあるとき、この架橋剤は、一般に、約50−300mg/mlの濃度において水に溶解される。同様に、この架橋剤の分子量が約5,000〜15,000のレンジ内にあるとき、この架橋剤は、一般に、300−800mg/mlのレンジ内の濃度において水に溶解される。
本発明の接着剤組成物は、さまざまな適用において使用されることができる。いくつかの適用は、縫合糸、ステープル、テープ及び／又は包帯の付属物又は代替物のいずれかとして組織を一緒に結合させるための本接着剤シーラント組成物の使用を含む。他の適用においては、本接着剤は、外科手術後の接着を防止するために使用されることができる。この適用においては、本接着剤組成物は、その部位が治癒するとき外科手術部位における接着の形成を防止するために内部臓器又は組織の表面上に適用され、そして層として硬化する。追加の適用は、縫合又はステープル線において血液又は他の液体の洩れを防止し又はコントロールし、並びに肺系内での空気の洩れを防止し又はコントロールするために、組織をシーリングすることを含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の接着剤組成物の計測された剥離力を図示したものである。
図２は、切除されたモルモットの皮膚ストリップを一緒に接着するために使用される異なる接着剤組成物サンプルの剥離力計測値を図示したものである。
図３は、接着剤シーラント組成物の破裂強度を計測するために使用される装置の略図である。
詳細な説明
本発明は、インビボにおいて組織を接着し及び／又はシールするために必要な高い機械的強度、柔軟性、速い硬化速度及び十分な接着性をもつ接着剤組成物に関する。本接着剤組成物は、２成分、すなわち、緩衝液化塩基性タンパク質溶液と２官能価架橋剤から作られる。この緩衝液化されたタンパク質溶液と２官能価架橋剤は、典型的には、商業的に入手可能な材料及び確立された合成方法を用いて調製される。本接着剤組成物の調製における商業的に入手可能な材料は、本発明の実施において利点を提供する。なぜなら、これらの材料のほとんどが、一般に、臨床的な安全性及び／又は使用の歴史をもっているからである。
本接着剤組成物における使用に好適なタンパク質は、非免疫原性の水溶性タンパク質を含む。血清リポプロテインは、この目的のために特によく合っている。なぜなら、これらのタンパク質は、脂質に結合し、そしてまた、天然又は半天然状態において比較的高い弾性を示すからである。これらの特性は、強く並びに曲げやすく及び弾性である硬化マトリックスを提供すると信じられている。他の溶解性タンパク質も、血清リポプロテインに加えて、本発明における使用に好適である。タンパク質、例えば、エラスチン、フィブロネクチン及びコラーゲンの誘導体の水性混合物が、本発明において使用されることができる。
遺伝子操作法により作り出される他のタンパク質も、本発明において有用であることができる。例えば、米国特許第5,243,038号は、合成DNAをデザインし、及び構築し、そして大きなポリペプチド、例えば、天然のタンパク質絹とエラスチン中に見られるセグメントと同一のアミノ酸配列を含むブロック・コポリマーの合成において新規の遺伝子材料を使用する方法について開示している。この技術は、そのポリペプチド鎖内で架橋部位（例えば、リシン残基）の数及び間隔を変え、そして所望の特性、例えば、弾性、水溶性、又は組織表面に対するアフィニティーを付与するポリペプチド・ブロックをこれらの部位に介在させることにより、本発明における使用のためにタンパク質を最適化するために使用されることができる。このような多官能価の組換えタンパク質の正確な組成は、その所望の物理的特性及び意図された最終用途に依存するであろう。
本接着剤組成物中で使用されることができる好ましい緩衝液化タンパク質溶液は、そのバッファー濃度が約0.01〜0.25モルのレンジ内にある約8.0〜11.0の間のpHに緩衝液化された濃縮水性血清アルブミン・タンパク質混合物を含む。好適なバッファー系は、それらのバッファーがその架橋剤と悪く反応せず又は他の方法でそれを変えない限り、生理学的に及び／又は臨床的に許容される、例えば、公知の炭酸塩又はリン酸塩バッファー系であるバッファーを含む。好ましいバッファー系は、約0.05〜0.15モルのレンジ内の濃度における約9.0〜10.5のpH値における炭酸塩／重炭酸塩バッファー系である。
血清アルブミン・タンパク質は、知られた単離工程を使用して血清から容易に単離される。さらに、遺伝子形質転換された細胞からヒト血清アルブミンを作り出すこともできる。例えば、Quirk et al.,Biotechnology and Applied Biochemistry,11:273:287（1989）,Kalman et al.,Nucleic Acids Research,18:6075−6081（1990）,Sleep et al.,Biotechnology,8:42−46（1990），及びSijmons et al.,Biotechnology,8:217−221（1990）を参照のこと。ヒト血清アルブミンを組換えにより作り出す能力は、この方法で作り出されたタンパク質が、血清から直接的に単離されるアルブミンを汚染するかもしれない病原体、ウィルス又は他の汚染物を含まないであろうという利点を提供する。本緩衝液化混合物中で使用されるとき、血清アルブミンが変性されていないことが判明している。このアルブミンは、それが使用される前に変性されないので、このアルブミン・タンパク質は、それらの天然のコイルした立体形態を保持し、そしてこれ故に、ゲル様固体を提供するための硬化工程の間に架橋した後に、その硬化した接着剤が、好適な接着剤マトリックスを提供するのに十分な柔軟性を保持していると信じられる。
さまざまな好適な架橋剤が、本発明において使用されることができる。好ましい架橋剤は、ポリエチレン・グリコール又はポリオキシエチレン鎖部分（−PEG−）、活性化脱離基部分（−Ｇ−）並びにその−PEG−部分とその脱離基部分−Ｇを結合する連結部分（−LM−）を含む。架橋剤は、以下の式：
Ｇ−LM−PEG−LM−Ｇ
｛式中、−PEG−が、以下の式：
−Ｏ−（CH2−CH2−Ｏ−）ａ−
（式中、ａが、20−300の整数である。）により表される２価の断片であり；また、−LM−が、２価の断片、例えば、式−Ｃ（Ｏ）−により表されるカーボネート２価基、式−（CH2）bC（Ｏ）−（式中、ｂが、１〜５の整数である。）により表されるモノエステル２価基、式−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃが、２〜10の整数であり、そしてその基の脂肪族部分が飽和又は不飽和であることができる。）により表されるジエステル２価基、式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｄが、２〜10の整数である。）により表される２カーボネート、又は、式−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−，−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−（CH2）ｃ−Ｃ（Ｏ）−若しくは−Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（CH2）ｄ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｃが、２〜10の整数であり、ｄが、２〜10の整数であり、そしてＲが、１〜10のモノマー・ラクチド、グリコリド、トレメチレン・カーボネート、カプロラクトン又はｐ−ジオキサノン断片をもつポリマー又はコポリマーである。）により表されるオリゴマー２価基であり；そして−Ｇが、脱離基、例えば、スクシンイミジル、マレイミジル、フタルイミジル、又はあるいは、ニトロフェニル、イミダゾールイル又はトレジル脱離基である。｝により表される化合物を含む。
この架橋剤の−PEG−部分は、好ましくは、約1,000〜15,000のレンジ内の重量平均分子量をもつ、好ましくは、約2,000〜4,000のレンジ内の重量平均分子量をもつ商業的に入手可能な化合物から誘導される。これらの化合物は、異なるタイプのバイオメディカル材料において使用されることができる。なぜなら、それらは、その分子量が約30,000を下廻るとき、非毒性であり、同時にその体から容易に排出されることが立証されているからである。
脱離基、−Ｇ、すなわち、架橋剤の部分は、その架橋剤が、タンパク質の遊離の１次又は２次アミノ基と反応し又は化学的に結合することを許容する活性化された脱離基である。好適な脱離基は、スクシンイミジル、他のイミド、例えばマレイミジル及びフタルイミジル、複素環脱離基、例えば、イミダゾールイル、芳香族脱離基、例えば、ニトロフェニル、又はフッ素化アルキルスルホン脱離基、例えば、トレジル（CF3−CH2−SO2−Ｏ−）を含む。好ましい脱離基は、スクシンイミジル基である。なぜなら、この基の突然変異誘発性、発癌性（oncogenicity）及び奇形形成性（teratogenicity）の研究は、その架橋反応及び／又はその接着剤組成物の硬化として放出される少量のこの活性化基が、局所的又は全身的毒理学的リスクを提供しないことを示唆しているからである。
本組成物中で使用されるとき、連結部分、−LM−は、いくつかの異なるタイプの２価化合物であることができる。例えば、上記−PEG−部分と上記−Ｇ部分をもつ商業的に入手可能な化合物は、飽和２カルボン酸、例えばコハク酸と連結して、飽和シエステル連結部分を与えた。あるいは、不飽和ジカルボン酸、例えば、フマル酸、マレイン酸、フタル酸又はテレフタル酸が、不飽和ジエステル連結部分を与えるために使用されることができる。あるいは、この連結部分は、容易に加水分解される化合物、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリトリメチレン・カーボネート、又はポリカプロラクトンのオリゴマー誘導体、並びにこれらの列記したポリマーの好適なモノマーを用いて作ったコポリマーであることができる。
本発明の他の態様においては、活性化された脱離基は、ポリエチレン・グリコールのカーボネート・エステルに直接的に付着されることができる。この態様においては、この連結基、−LM−は、その架橋剤の−PEG−部分と−Ｇ部分の間のカーボネート基−Ｃ（Ｏ）−であろう。本発明のさらに他の態様においては、この連結基は、ジカーボネート、例えば、エチレン・ビスクロロホルメートによりその−PEG−部分と−Ｇ部分を連結させることにより調製されるエチレン・ジカーボネートであることができる。
この架橋剤は、知られた工程、手順又は合成方法、例えば、米国特許第4,101,380号又は同第4,839,345号中に報告された手順、1990年４月19日に出願された国際出願番号PCT/US90/02133中に報告された手順又はAbuchowski et al.,Cancer Biochem.Biophys.,7:175−186（1984）により報告された手順を用いて、調製されることができる。要するに、ポリエチレン・グリコールと好適な酸無水物が、塩基の存在中好適な極性有機溶媒中に溶解され、そしてポリエチレン・グリコール・ジエステル２酸を作るのに十分な時間期間にわたり還流される。次に、このジエステル２酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は他の縮合剤の存在中好適な極性有機溶媒中脱離基、例えば、Ｎ−ヒドロキシ・イミド化合物と反応され、そして室温で撹拌されて、所望の２官能価架橋剤が作られる。
あるいは、ポリエチレン・グリコール及び好適な２カルボン酸クロライド又はビスクロロホルメートが、混合酸クロライド・ポリエチレン・グリコール・エステル又は混合クロロホルメート・ポリエチレン・グリコール・エステルを作るのに十分な時間期間にわたり好適な極性有機溶媒中に溶解されることができる。次にこの混合エステルは、所望の２官能価架橋剤を作るために、好適な極性有機溶媒中化合物、例えば、Ｎ−ヒドロキシ・イミド化合物と反応され、そして十分な時間期間にわたり昇温において撹拌される。
本接着剤組成物の硬化時間が、異なるpH値をもつバッファーの使用によりあつらえられることができることも判明している。例えば、そのバッファーのpHを変えることにより、約10秒から約10分未満までその硬化速度時間を変化させることができる。簡単に言えば、濃縮水性血清アルブミンと架橋の混合物と、より高濃度のバッファーとの混合は、最も速い硬化時間を提供する。より高濃度のタンパク質と架橋剤が、比較的より強く、硬化したマトリックスを提供することも判明している。しかしながら、その混合物があまりに濃縮され、そして粘度があまりに大きくなる場合、これらの接着剤組成物は、容易に適用されるようなものではなく又はその接着剤に不所望の特性を提供することができる。例えば、あまりに粘度が高い混合物は、利用可能なアプリケーター、例えば、シリンジ又はスプレー装置を使用して容易に適用されることができない。さらに、架橋剤の濃度があまりに高い場合、得られた硬化した接着剤マトリックスは、水又は他の液体の存在中でのそのマトリックスの強度が低下されるような程度まで、膨潤することができる。さらに、射出及び／又はスプレー装置を用いて上記２成分を適切に混合する能力が減少されることができる。
本発明の２成分接着剤組成物は、多数の異なる方法において組織に適用されることができる。例えば、本接着剤は、素早く一緒に混合され、そして次に一般的なアプリケーターを用いて適用されることができる。あるいは、これら２つの成分は、一緒に混合され、そして次にスプレーとして適用されることができる。他の適用方法においては、本接着剤の２つの部分は、ディアル・シリンジに添加される。このシリンジの２つの円筒部は、スパイラル・ミキサー・ノズルに固定された“Y"コネクトに接続される。これら２つの成分がシリンジから外に押し出されるとき、それらは、ノズル内で混合され、そして比較的均一でコントロールされたやり方で適宜その組織に直接的に適用されることができる。あるいは、２成分フィブリン・シーラント・キットと共に使用されるためのスプレー・ノズル、例えば、Immuno AG,Vienna,Austriaにより販売されたTISSEELスプレー・チップが、上記スパイラル・ミキサー・ノズルの代わりに使用されることができる。この適用においては、本接着剤組成物の微細なスプレーが、そのシリンジのプランジャーが押し込まれるとき、組織上に小分けされる。
本発明の接着剤組成物は、さまざまな最近の医療手順及び運用において使用されることができる、その適用においては、本接着剤組成物は、最近の運用を使用して通常要求される縫合を取り除き又はその数を実質的に減少させ、並びに特定の縫合のその後の除去の必要性を取り除くために、使用されることができる。他の態様においては、本接着剤組成物は、皮膚移植片を付着させ、そして再構築手術の間に組織フラップ又は自由なフラップを位置決めするために使用されることができる。さらに他の適用においては、本接着剤組成物は、歯周手術における歯肉フラップを閉じるために使用されることができる。これらの適用の全てにおいて、本接着剤組成物は、生組織の２つの隣接層の間に有効にサンドイッチされる硬化した材料の薄い層である。本接着剤組成物の生物学的吸収性及び毒性の欠如のために、上記２つの組織層の治癒及びその後の互いの再付着が妨害されない。
接着剤それ自体としての本接着剤組成物の使用に加え、本組成物は、シーラントとして使用されることもできる。この適用において使用されるとき、本組成物は、肺手術に目下関連する空気洩れを防止し、又は他の外科手術手順において出血を阻止し又は防止するために使用されることができる。このやり方で使用されるとき、下に横たわる組織は、比較的厚い接着剤の層により被覆されることができる。なぜなら、その組織それ自体が片側上でだけ治癒されることが必要であるからである。この接着剤の他の側は、硬化するとき、約４〜60日間の比較的短い時間期間にわたりインビボにおいて吸収されるであろうつるつるしたゲルを提示する。本接着剤組成物のこの特性の観点から、それは、最近の外科手術手順に関連する不所望の組織接着を防止するために使用されることもできる。
実施例
以下の実施例は、請求に係る発明の実施を記載し、そして説明することを意図される。しかしながら、これら実施例は、添付の請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定すると解されてはならない。
以下の手順は、いくつかの異なるタイプの２官能価架橋剤を調製するために使用された。以下の手順は、先に引用した米国特許第4,101,380号及びAbuchowski et al中に報告された手順を修正したものである。
実施例１
ポリエチレン・グリコール・ジスクシンイミジル・スクシネートPEG−SS2の合成
ポリエチレン・グリコール、PEG（50g,Aldrich Chemical Company,Milwaukee,WI、3,400平均分子量として販売されたもの、GPC分析Mnが2,980であり、Mwが3,480であった。）を、無水コハク酸（14.7g）と無水ピリジン（12ml）を含む1,2−ジクロロエタン（250ml）中に溶解させた。この混合物を、３日間窒素下で還流させた。その溶媒の濾過及び蒸発後、その残査を100mlの水中に溶かし、そしてカチオン交換樹脂DOWEX 50（H+）（50g）で30分間処理した。次にこの混合物を濾過し、そしてDOWEX 50を水（50ml 1倍）で洗浄した。この併合濾液を無水ジエチル・エーテル（50ml 2倍）で洗浄した。PEG−ジスクシネートを次に２回の100mlクロロホルム洗浄により水から抽出した。クロロホルムの蒸発は、約49gのPEG−ジスクシネートを作り出した。
このPEG−ジスクシネートを、37℃において200mlのN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中に溶解し、そして4.23gのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）をその溶液に添加した。この混合物を０゜に冷却した。7.58gのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を50ml DMF中に溶解し、そして連続撹拌しながら上記溶液に滴下した。この混合物を、24時間室温において放置し、そして濾過した。100mlのトルエンをその濾液に添加し、そしてその溶液を氷浴内に置いた。望ましいポリエチレン・グリコール・ジスクシンイミド・スクシネート製品、PEG−SS2を、石油エーテルをゆっくりと添加することにより沈澱させた。この沈澱物を、10−20ミクロンの焼結ガラス・フィルター上に集めた。トルエン中での溶解及び石油エーテルによる沈澱を３回繰り返した。PEG−SS2をさらに、100mlの0.1M pH2.2シトレート／ホスフェート・バッファー中に溶解し、そして４〜８ミクロンの焼結ガラス・フィルターを通して濾過することにより精製した。このPEG−SS2をクロロホルム（100ml 2倍）により抽出し、そしてその溶媒をロータリー・エバポレーター内で減圧下蒸発させた。次にPEG−SS2をトルエン中に溶解し、そして石油エーテルを用いて沈澱させ、室温において一夜真空下で乾燥させ、そして冷蔵庫内に保存した。
実施例２
ジカルボキシメチル・ポリエチレン・グリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミド・エステルの合成
Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,ALから購入したジカルボキシメチル・ポリ（エチレン・グリコール）（mol.wt.3400）及びSigma Chemical Co.,St.Louis,MOから購入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド（1g）を、窒素下で機械的に撹拌しながら30mlの無水DMF中に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、そして5ml DMF中のジシクロヘキシルカルボジイミド（1.79g）の溶液を滴下した。
この撹拌を３時間上記冷温において、次に室温において一夜（16時間）続けた。沈澱したジシクロヘキシルウレアを濾過により除去した。トルエン（100ml）をその濾液に添加し、そして０℃に冷却した。次にその生成物を、石油エーテルの添加により沈澱させた。この沈澱を焼結ガラス・フィルター上に集めた。トルエン中への溶解及び石油エーテルを用いた再沈澱を、３回繰り返した。この生成物をデシケーター内で真空下乾燥させた。
実施例３
ポリエチレン・グリコール−ジ−オリゴグリコリド・ジスクシンイミジル・スクシネートの合成
500mlの３首丸底フラスコを窒素下で火炎乾燥させた。50gのPEG（mol.wt.3400）、300mlのキシレン、及びキシレン中の0.33Mのオクタン酸第１スズの１滴を、連続窒素パージを行いながらそのフラスコ内にチャージした。このフラスコを、その溶液を沸騰させるために加熱して、そして50mlのキシレンを蒸留により除去した。次にこの溶液を室温まで冷却した。17gのグリコリド（Boehringer Ingleheim KG,Ingleheim,Germany）をそのフラスコに添加し、そしてその反応混合物を16時間窒素下で還流させた。このコポリマー反応混合物を熱いまま濾過して、ポリグリコリド・ホモポリマーを除去した。次にこのコポリマーを冷却しながらその濾液から沈澱させ、そして濾過により集めた。このコポリマーを、500mlのジクロロメタンと7gの塩化スクシニルを入れたフラスコ内に入れた。この溶液を窒素下一夜（16時間）還流した。8.5gのＮ−ヒドロキシスクシンイミドをこのフラスコに添加し、そして還流をさらに一夜の期間にわたり続けた。白色固体を、この溶液を冷却する間の沈澱により得た。次に、この生成物を、数回、トルエン中に再溶解し、そして石油エーテルを用いて再沈澱させることにより精製した。最終沈澱物を真空下で乾燥させ、そしてデシケーター内に保存した。この生成物の構造をNMR分析により確認した。
実施例４
ポリエチレン・グリコール−ジマレイミジル・スクシネートの合成
約12gのPEG−ジスクシネートと1gのＮ−ヒドロキシマレイミド（Aldrich Chemical Co.）を、窒素下50mlの無水DMFを入れた250ml 3首丸底フラスコ内に入れた。この混合物を機械的に撹拌しながら60℃において溶解し、そして０℃に冷却した。DMF（5ml）中1.82gのジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を、そのフラスコに滴下した。この反応を室温において窒素下で一夜混合に供した。ジシクロヘキシルウレアを濾過により除去し、そしてその生成物を、トルエンを添加し、そして石油エーテルを用いて沈澱させることにより得た。トルエン中への溶解及び石油エーテルによる再沈澱を３回繰り返した。この精製された生成物を真空下で乾燥させ、そしてデシケーター内に保存した。
実施例５
ポリオキシエチレン・グリコール−ジフタルイミジル・スクシネートの合成
約15gのPEG−ジスクシネートと1.65gのＮ−ヒドロキシフタルイミド（Aldrich Chemical Co.）を、窒素下30mlの無水DMFを入れた250ml 3首丸底フラスコ内に入れた。この混合物を、機械的に撹拌しながら60℃において溶解し、そして０℃まで冷却した。DMF（5ml）中1.82gのジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を、このフラスコに滴下した。この反応を室温において窒素下で一夜混合に供した。ジシクロヘキシルウレアを濾過により除去し、そしてその生成物を、トルエンを添加し、そして石油エーテルを用いて沈澱させることにより得た。トルエン中への溶解及び石油エーテルを用いた沈澱を、３回繰り返した。この精製された生成物を、真空下で乾燥させ、そしてデシケーター内に保存した。
実施例６
２成分接着剤の調製
以下の手順を、さまざまなタンパク質源、及び２官能価架橋剤を使用して２成分接着剤を調製するために使用した。表１中に列記したようなタンパク質及び架橋剤の水溶液を、ポーセレン（porcelain）テスト・ウェル内にピペットで入れ（各溶液0.2ml）、そしてステンレス・スチール棒で連続混合した。この２成分接着剤の各々の硬化時間及び物理的コンシステンシーも、表１中に列記する。
これらのデータは、PEG−SS2により架橋された魚及びウシのゼラチン、卵及び血清のアルブミン並びにカゼイン・タンパク質が、ひじょうに弾性であり、良好な接着強さ及び比較的速い硬化速度をもった接着剤を提供したことを示した。
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実施例７
バッファー及びpHの効果
２成分接着剤を、実施例６中に記載した方法に従って調製した。但し、そのタンパク質溶液中のバッファーのpHを、表２中に列記するように変えた。これらのデータは、好ましいpHレンジが約8.44〜10.0であることを示している。
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実施例８
接着強さに対する架橋剤の効果
Sigma Chemical Co.からの30％HSA（ヒト血清アルブミン）溶液及びBaxter Healthcare,Inc.からの25％HSA溶液を、４℃において一夜0.1M炭酸塩／重炭酸塩pH10バッファーに対して透析し、そして60psigにおいて窒素下加圧濾過セル内の50,000分子量カット−オフ・セルロース・エステル・ディスク膜（Spectrum Medical Industries,Inc.）を通しての限外濾過により約40％に濃縮した。その最終濃度を、集められた濾液の容量に基づいて計算した。一夜の限外濾過の間にこれらの条件下で得られた最大濃度は、典型的には42〜45％であった。SigmaからのRSA（ウサギ血清アルブミン）及びICN Biomedical,Inc.からのRSA結晶化タンパク質を、0.1M pH10炭酸塩／重炭酸塩バッファー中に溶解し、そしてHSAのために使用したのと同一の方法により40％まで濃縮した。
PEG−SS2（3,400mw及び10,000mw）の各種濃度を脱イオン水中で調製した。上記アルブミン及び架橋剤溶液を、1mlデュアル・シリンジを用いて等容量においてデリバリーした。これらのシリンジ先端に、1.8インチ×0.187インチ（4.57cm×0.475cm）直径のスパイラル・ミキサー・ノズル（TAH Industries,Inc.,Robbinsville,NJ,部品番号150−312）内に挿入された特別に機械加工されたTEFLONアダプターに接続されたＹコネクターを装置した。上記接着剤混合物を、接着テストのために、上記ミキサーを通してそのテスト支持体上に直接的にインクジェットした。
新たに切除したモルモットの皮膚を、ストリップに切断し、そして0.5×1.0インチ（1.27cm×2.54cm）の開口をもつポリスチレン窓を、特定領域内に上記糊を閉じ込めるためにそのストリップの一端上に置いた。その窓に糊を充填する間、それを、他のモルモット皮膚ストリップでカバーした。500gのスチールの重りを約１分間このアセンブリーの上に置いた。このサンプルを、１インチ（2.54cm）のゲージ長及び５ポンド（2.27kg）のロード・セルを用いて0.8インチ／分（2cm/分）の引っ張り速度に設定されたコンピューター制御の機械的テスト装置（880 Material Test System,MTS System,Inc.,Minneapolis,MN）のあご部（jaws）内で剥離させた。剥離力を、図１に示すような、剥離を続けるのに必要な一定の力として接着破壊の開始後に記載した、４連を、各テスト条件について行った。このテスト結果を図２に列記する。
実施例９
接着剤シーラント・バースト強さの計測
図３に示した加圧アセンブリーを、テスト膜内の標準化された孔（holes）又はスリットをシールするために使用された材料のバースト強さ（bursting strengh）をテストするために使用した。このアセンブリーは、０〜15psigのレンジをもつミリボルト出力タイプの圧力変換器（２）（MODEL PX236,Omega Engineering,Inc.,Stamford,CT）及び圧力入口（３）をもつアルミニウム圧力容器（１）を含む。テストを行うために、約5mm直径の孔（４）（又は他の標準的な欠陥）を、ダイ・カッターを使用してテスト膜（５）の中心に切り出した。次にこの膜を、そのTEFLONフィルム内により大きな（直径14mm）の孔内に中心をもつ、その膜内に孔をもつ一片の0.4mm厚TEFLONフィルム上に置いた。次にこのTEFLONフィルムを、その膜側を下にして平らな表面上に置き、そして接着剤シーラント・テスト材料を、そのフィルム内の孔を満たすように適用した。次に、固体のTEFLONブロックを、そのTEFLONフィルムが、正確に0.4mm厚のシーラントの層を作り出すためのスペーサーとして役立つように、硬化前にシーラント上に素早く置いた。所望の硬化時間が経過した後、そのTEFLONブロックを、ひっくり返し、そしてその膜を注意して剥がして、その膜の孔をカバーするシーラントの環状パッチ（６）を得た。シールされた欠陥をもつテスト膜を次に、２つのゴム・ワッシャー（８）の間に、そして次に２つの金属ワッシャー（９）の間にそれを入れることにより圧力容器（７）の開端上にマウントした。気密シールを、その圧力容器の対立ネジ（11）上にそのネジ・カバー（10）をまわし込むことにより得た。そのカバー内の開口（12）は、同じく直径35mmであり、これは、内径35mmのワッシャーと共に、加圧テストのための固定された膜表面を提供した。
２つのタイプの膜、コラーゲン膜又は新たに切除したブタ心臓（pericardium）サンプルのいずれかを、使用した。このブタ心臓サンプルを、摘出直後又は24時間以内で４℃における防湿容器内での保存後のいずれかにおいて使用した。これらの条件下、その組織の保存時間に基づくシーラント性能における区別できる差異はなかった。
加圧シーケンスは、シリンジ・ポンプ（Sage Instruments Model 351,Orion Research,Inc.）を使用して１秒当り１立方センチメーターの固定速度でその加圧口に空気をインクジェットすることにより開始した。上記圧力変換器を、圧力（mm水銀）を読み、そして接着剤シーラント破裂時のピーク圧力値を示すようにプログラムされたデジタル引っ張りゲージ・メーター（Omega Model DP 205−S,Omega Engineering,Inc.）に接続した。反復テストは、再現性のあるピーク圧力値を与え、そしてその標準偏差が各ケースにおいて報告された。
加圧テストを、コラーゲン及び心膜の膜上、3,400m.wt.PEG−SS2（130mg/ml）と、異なるpH値における0.08M炭酸塩／重炭酸塩バッファー中の40％HSA（又はRSA）の接着剤組成物を用いて行った。表３中に列記した結果は、約130mmHgの典型的なピーク圧力値をもつ優れたシーラント性能を立証する。
さらに、生理食塩水溶液中に浸漬した後の上記シーラントについてのピーク圧力を計測した。このテストは、先に記載したように行った。但し、シーラントでコードされた膜の表面は、加圧前90分間までの時間期間にわたり生理食塩水に漬けられた。そのシーラント・ヒドロゲルは厚さ約２倍に膨潤したけれども、シーラント性能の実質的な保持は、確保された。
表４は、魚皮膚ゼラチン、ニワトリ卵アルブミン、及びフィブリノーゲンを含むさまざまなタンパク質をテストすることにより得られたデータを示す。トロンビンと混合されたフィブリノーゲン（“フィブリン糊”、BERIPLAST−Ｐシーラント、Behringwerke,Marburg,Germany）を、対照シーラント材料として使用した。これらの材料のいずれも、上記血清アルブミン実施例と同様の性能を発揮しなかった。この主な欠点は、有意な強さを達成するのに必要な硬化及びエージング時間であった。特に、ニワトリ卵アルブミンは、５分未満にわたりエージングされた血清アルブミンから得られたのと同一のバースト強さを達成するために、25分間の硬化後エージングを必要とした。
上記と同一の工程を、pH9とpH8における0.08M炭酸塩／重炭酸塩バッファーに対する透析により、追加の25％HSA溶液について繰り返した。HSAのpH7溶液を、限外濾過によりその元の25％HSA溶液の濃度から40％までの濃縮により得た。架橋剤溶液PEG−SS2（3400mw）は、1ml脱イオン水中に溶解した130mgであった。上記アルブミン及び架橋剤溶液を、実施例８におけるような1mlのデュアル・シリンジを使用して等容量においてデリバリーした。加圧テストを、コラーゲン膜を使用して上述のように行った。但し、そのシーラント・ヒドロゲルを、テスト前にエージングした。これらの結果も表４中に列記する。これらのデータは、最適加圧テスト値が、そのアルブミン溶液のpHの上昇に伴ってより速く達成されることを立証する。その上、完全硬化が生じた後に得られた硬化シーラントは、そのアルブミン溶液のpHが高くなるにつれて予想外により高くなる。
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実施例10
一般的及び胸部外科手術における２成分接着剤シーラントの使用
麻酔したブタを、胸部外科手術合併症、例えば、肺及び気管切除、気管支腔フィステル（bronchopleufal fistulas）、及び気胸症（pneumo−thorax）をもたらす他の症状のための実験モデルとして使用した。
２成分接着剤は、パートＡ、すなわち、0.08M  pH10炭酸塩／重炭酸塩バッファーに対する商業的に入手可能なHSA（25％溶液、BUMINATE  25％,Baxter Healthcare Corp.,Hyland Division,Glendale,CA）の透析、その後の50,000分子量カット−オフ・セルロース・エステル・ディスク膜を使用した50psiにおける限外濾過による40％までの濃縮、により調製した40％HSA、及びパートＢ、すなわち、使用前30分以内に滅菌蒸留水中に溶解した3,400m.wt.PEG−SS2の130mg/ml溶液を含んでいた。PEG−SS2を、実施例１中に記載したように合成し、そして精製した。
刺し傷を、メスを用いて麻酔したブタの肺に作り、これは、その部位に投与された灌注液を通して空気の泡立ちにより証明されるような吸気の間のかなりの空気洩れをもたらした。この傷を、血液及び液体を除去するためにガーゼで吸い取った。呼吸器を停止し、そして上記接着剤を、スパイラム混合チップを装備したデュアルシリンジ（Behring PANTAJECTシリンジ、Behringwerke,Marburg,Germany）を使用してシーラントとして適用した。20秒の硬化時間後、ベンチレーションを回復し、そしてその肺を再び灌注液でカバーした。空気洩れは全く観察されなかった。
ブタの腸内での機能的な端々吻合（end−to end anatomosis）を、標準的なステープリング手順を使用して行った。上記の接着剤材料を、そのステープル線に適用した。これは、その吻合線をシールしたようであった透明の接着性のヒドロゲル・コーティングをもたらした。
これらの条件下で、上記シーラントによりコートされた吻合線は気密であり、一方、シールされていない吻合線は気密ではなかったことが観察された。
実施例11
術後接着を防ぐための２成分接着剤の使用
テストされた組織シーラント・ヒドロゲルは、２部の液体システムであった。パートＡは、等張性pH10炭酸塩バッファー（0.1M）中のヒト血清アルブミンの滅菌40（w/v）％溶液であった。パートＢは、使用直前に調製された滅菌蒸留水中に10,000分子量PEG−SS2（ポリエチレン・グリコール・ジスクシンイミジル・スクシネート）の400mg/ml溶液であった。溶液ＡとＢを、スティック・ミキシング・ヘッド（Tah Industries,Inc.）に接続されたデュアル・シリンジ・システムを用いて等量混合した。
上記シーラント配合品の術後接着防止の評価を、一連の10匹の雌ウサギにおいて開始した。腹壁の２×2cm領域を、中心線腹壁切開により露出された腹腔の各側上で筋膜まで下方に切開した。子宮角（uterine horns）を、No.1メス刃を用いて20回こそげることにより傷を与えた。各動物は、その腹壁損傷の中の１だけにテスト材料をランダムに適用することによりその自身の対照として役立った。次にその子宮角は、その腹壁切開に最も近い傷の端から数ミリメーター以内にその腹膜に２つのスティッチを用いて付着された。
外科手術の２週間後に、上記ウサギを、その腹膜損傷部位上に存在する接着の程度、タイプ、及び引っ張り強さ（tenacity）を評価し、そして格付けするために、検査した。これらの等級を得るために使用した格付け方法を、表６中に示す。技術的困難性に、表５中に注意したように、出くわしたが、上記テスト材料は、知られた活性成分の存在を伴わずに、接着の防止及びそれらの重用における減少の両方において予想外の利点を提供した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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