(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質とリン脂質との反応を界面活性剤を加えずに、ｐＨが１から５の間で、かつ／または、５０℃〜１３０℃の温度で行うことを特徴とする、精製した膜タンパク質の再活性化法。
【請求項２】
ｐＨが３から５の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
８０℃〜１３０℃の温度で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
植物または動物由来の純粋な脂質、純粋な脂質の所定の混合物、または、天然の脂質混合物を用いて行う、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
溶解した膜タンパク質を用いて行う、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
再活性化をアフィニティーカラムに結合した膜タンパク質を用いて行う、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
免疫吸着カラムを用いる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
膜タンパク質に対し１種類以上のモノクローナル抗体を用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリクローナル抗体を用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
組織因子アポタンパク質を用いて行う、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
組織因子アポタンパク質がヒト、動物または組換え体由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組織因子アポタンパク質の突然変異体を用いて行う、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２に記載のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、界面活性剤非存在下で再活性化した組換え組織因子アポタンパク質を含む、プロトロンビン時間の測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本発明は、精製した膜タンパク質の再活性化法に関する。
【０００２】
膜タンパク質（例えば、レセプター）は、一以上の膜貫通領域並びに細胞内および細胞外領域から構成される。このようなタンパク質の活性は、精製したタンパク質を人工膜へ組込んだ後にしばしば測定されている。
【０００３】
組織因子（組織トロンボプラスチン）を、一例として挙げることができる。この血液凝固系のＶＩＩ  因子のレセプターは、アポタンパク質および脂質からなっている（Ｐｉｔｌｉｃｋ，  Ｆ．Ａ．  およびＮｅｍｅｒｓｏｎ，  Ｙ．、１９７０年）。このアポタンパク質は、２６３個のアミノ酸からなるグリコシル化されたポリペプチドである。これはカルボキシ末端付近に２３個のアミノ酸の疎水性配列を有し、これによりアポタンパク質は膜に固定されている。細胞内部分は２１個のアミノ酸からなっている（Ｆｉｓｈｅｒ等、１９８７年；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  等、１９８７年）。インビボでは、組織因子は血液と直接に接触しない細胞の膜内在性タンパク質として存在している。その細胞表面レセプターとしての生理的機能は、血液または血漿と接触した時点での血漿凝固ＶＩＩ  因子との結合と活性化である。この複合体はセリンプロテアーゼ活性を有し、因子ＩＸおよびＸを活性化することにより凝固を開始させることができる。
【０００４】
組織因子を単離するには２種類の異なる方法がある。その１つによると、活性な組織因子は、好適な組織を崩壊させ、膜画分を単離することによって部分精製される。この材料は、主として血漿中の血液凝固を調べる診断試薬の調製に使用される。この膜タンパク質は結合脂質分子を含んで単離されるため、アポタンパク質の再活性化が不要である。
【０００５】
二番目の方法では、単離したアポタンパク質が得られる。これはほとんど失活しているため（Ｂｒｏｚｅ，  Ｇ．Ｊ．  等、１９８５年）、再活性化の必要がある。そのためには、これを脂質膜内に再度組込まなければならない（Ｐｉｔｌｉｃｋ，  Ｆ．Ａ．  およびＮｅｍｅｒｓｏｎ，  Ｙ．１９７０年、Ｂａｃｈ等、１９８１年）。前記の組織因子を製造する微生物では活性の十分な膜タンパク質を提供することができないため、この方法は組換体を通じて得られるタンパク質に必須である。これらの原則的な知見は、インビトロでの部分または全合成によって調製できるタンパク質にもあてはまる。
【０００６】
精製した膜タンパク質を脂質膜に再度組み込む方法としては、多くのものが知られている。このためには、通常は界面活性剤、例えばデオキシコール酸塩など、を用いてリン脂質の水性懸濁液を調製する。この懸濁液を、精製した膜タンパク質と混合する。続いて、界面活性剤を透析などを用いて除去する。アポタンパク質をリン脂質懸濁液と混合するかまたは界面活性剤を除去することによって、このタンパク質は生成する膜小胞に取り込まれる（Ｐｉｔｌｉｃｋ，  Ｆ．Ａ．  およびＮｅｍｅｒｓｏｎ，  Ｙ．、１９７０年）。デオキシコール酸塩は透析によって除去することができるので、好ましい界面活性剤である。しかしながら、原則的には、混合物から除去することができるならば、他の界面活性剤を用いることもできる。
【０００７】
例えば、Ｗｉｊｎｇａａｒｄｓ等は、タウロコール酸ナトリウムを界面活性剤として用いて組織因子を再脂質化する方法について記載した。彼らはｐＨ４．０で最適ｐＨとなることを見出したが、再脂質化後に混合物から界面活性剤を除去しなければならなかった。
【０００８】
界面活性剤を使用する根本的な欠点は、混合物からこれらの補助剤を除去する必要があるということである。これらはタンパク質の膜への取り込みを媒介するものの、脂質小胞にも組込まれるため、膜−タンパク質複合体の活性を著しく妨害する。界面活性剤を除去するには、混合物は概して大量の緩衝液に対して透析される。この段階は時間と手間がかかり、収率や活性の損失を引き起こす。その上、この方法では、界面活性剤を完全に除去することはできない。
【０００９】
【発明の概要】
本発明は、界面活性剤を使用せずに精製した膜タンパク質を再活性化し、生理的環境におけるタンパク質と機能的に一致するようにする簡便な方法を提供することをその目的とする。この再活性化は、適切な膜タンパク質の好適な脂質ミセルへの取り込み（再脂質化）から成る。これは凝固過程における精製した組織因子アポタンパク質の天然の生理活性を回復することのできる唯一の手段である。
【００１０】
【発明の具体的説明】
驚くべきことに、再脂質化は界面活性剤によらずタンパク質／脂質混合物を酸性にしおよび／または加熱することによって行うことができることが分かった。原則として、本発明による方法は、精製したタンパク質の混合物にも適用できる。
【００１１】
再脂質化は、十分に低いｐＨ値でタンパク質とリン脂質とを混合することによって行うことができる、ということが分かっている。この方法では、リン脂質を界面活性剤によって溶解する必要はなく、代わりに水溶液中でそれらを乳化するだけで十分である。試料を混合して均質にした直後に、ｐＨを所望の値へ再度調整することができる。適当なｐＨはｐＨ１〜５の間、好ましくはｐＨ２〜４、特に好ましいｐＨは約３である。当業者に既知の植物または動物由来の天然リン脂質混合物を使用することができる。当業者に既知の所定の純粋な物質またはその混合物も、同様に使用することができる。本発明による方法は、植物リン脂質の混合物を用いて行うのが好ましい。
【００１２】
再脂質化は、溶解した膜タンパク質またはアフィニティーカラム（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む免疫吸着カラム）に結合した膜タンパク質を用いて行うことができる。原則としては、人間、植物、動物、微生物または組換体由来の膜タンパク質が使用でき、天然に存在するタンパク質の突然変異体も同様に使用することができる。最高５０ｍｇ／ｍｌまでの濃度に溶解した膜タンパク質の使用が好ましい。この場合、最初にリン脂質の水性エマルジョンを２００ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌまでを酸性ｐＨで緩衝液と混合する。次に、精製した膜タンパク質をこの酸性エマルジョンに加えて混合する。１〜１０分、好ましくは２〜６分間のインキュベーション後に、緩衝液を加えて混合物を中和する。
【００１３】
本発明の目的は、リン脂質の存在下でタンパク質を加熱することによって、膜タンパク質を脂質膜に組込む第二の態様に基づいており、またこれを達成することができる。酸性化に関した方法と同様、界面活性剤によって脂質を溶解することは必要ない。リン脂質として既に前記したような材料を使用することができる。
【００１４】
使用する膜タンパク質およびリン脂質の型および好ましい濃度の範囲は、本発明の第一の態様と同じである。
【００１５】
５０℃〜１３０℃、より好ましくは８０〜９５℃で１〜１０分間の加熱が好ましく、より好ましくは４〜６分間程度である。続いて混合物を１〜１０分、好ましくは４〜６分程度以内に室温に冷却し、続いて緩衝液を加える。
【００１６】
再脂質化の後、膜タンパク質は脂質膜に組み込まれた活性な形態で存在する。これは好適な添加物を加えて提供したり、次の工程に付すことができる。組織因子アポタンパク質を本発明による方法の１つを用いて再脂質化する場合、これを治療薬または診断薬として使用することができる。後者の場合、再脂質化組織因子は、詳細には血漿中の血液凝固を調べる目的で、プロトロンビン時間（以下「ＰＴ」ということがある）の測定試薬に調製することができる。
【００１７】
【実施例】
組織因子アポタンパク質の例を用いて、本発明を下記において更に詳細に説明することにする。
【００１８】
実施例１ 組換体由来および精製したヒトのトロンボプラスチンアポタンパク質の酸性化による再脂質化
ヒトの組織因子アポタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。このタンパク質を、前記Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物から免疫吸着カラムを用いて精製し、１０μｇ／ｍｌに希釈した。
リン脂質懸濁液５０μｌ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ  ２５Ｐ、蒸留水中０．５％ｗ／ｖ、Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ社製、ドイツ）および０．１Ｍグリシン５０μｌ（ＨＣｌによってｐＨ２．５に調整したもの）を混合して再脂質化混合物とした。
混合後、この試料を室温で５分間インキュベーションし、次いで組織因子アポタンパク質１００μｌを加えた。再び混合した後、試料を室温で１分間インキュベーションし、次いで、５０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、５ｇ／リットルグリシン、１３ｍＭＣａＣｌ２および０．１％０．ＮａＮ３（ｐＨ７．５）の溶液を８００μｌ加えた。
プロトロンビン時間は、Ｓｃｈｎｉｔｇｅｒ  とＧｒｏｓｓ  の凝固計によって測定（正常ヒト血漿プール０．１ｍｌ＋再脂質化した組織因子０．２ｍｌ）し、凝固時間１１．０秒を得た。
【００１９】
実施例２ 再脂質化のｐＨ依存性
組織因子の再脂質化は、実施例１に説明される通り行った。しかしｐＨ値の異なるグリシン緩衝液（ｐＨ１．５から１３．５）を用いた。このｐＨは、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ懸濁液を組織因子と混合した後に測定した。図１は、再脂質化混合物のｐＨ測定値および得られたプロトロンビン時間の関係を示す。最適ｐＨは、ｐＨ３からｐＨ５の間である。この範囲内では、プロトロンビン時間の測定値は、同量の組織から単離した生組織因子について測定したプロトロンビン時間に匹敵する。選択した緩衝液を用いた前記の再脂質化混合物において更に低いｐＨ値を得ることは不可能だが、そのような低いｐＨ値も好適であると考えられる。
【００２０】
実施例３ 酸性化による再脂質化の時間依存性
再脂質化は実施例１に説明される通りに行った。混合物は、脂質およびタンパク質を混合した後、１０秒から１０分間の種々の時間差で中和した。続いて正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間を凝固計で測定した。図２に酸性ｐＨでのインキュベーションの長さ、および測定したプロトロンビン時間の関連を示す。プロトロンビン時間は、酸性ｐＨでのインキュベーションの長さには僅かに依存するのみであり、最短のプロトロンビン時間は５から１０分間の長さのインキュベーションから得られる。
【００２１】
実施例４ 加熱による再脂質化
組織因子アポタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）１００μｌおよび蒸留水中０．５％（ｗ／ｖ）のＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ２５Ｐ  １００μｌを再脂質化混合物を形成させるために混合した。
この混合物を、２５℃から９５℃の温度に５分間曝した。続いてこれを５分以内に室温まで冷却し、５０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、５ｇ／リットルグリシン、１３ｍＭＣａＣｌ２、０．１％ＮａＮ３（ｐＨ７．５）の溶液８００μｌを加えた。正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間は、Ｓｃｈｎｉｔｇｅｒ  とＧｒｏｓｓ  の凝固計で測定した。図３に加熱段階の温度およびプロトロンビン時間の測定値の関連を示す。最短時間は、９５℃での加熱段階から得られる。８０℃以上の温度では、これと一致する量の生組織因子について測定したものより短いプロトロンビン時間となる。図４に９５℃での加熱段階の長さおよび正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間の測定値との関連を示す。再脂質化は、長さわずか１分間の加熱段階から得られる。
【００２２】
実施例５ 試薬としての質（ＶＩＩ  因子に対する感受性）
正常ヒト血漿プールは、ＶＩＩ  因子欠陥血漿で希釈する（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ  、マールブルク、ドイツ）。ＶＩＩ  因子の濃度は１００％から１０％の間で用いた（正常ヒト血漿プールに基づく）。
続いてこの試料のプロトロンビン時間を、Ｓｃｈｎｉｔｇｅｒ  とＧｒｏｓｓ  の凝固計で測定した。測定時間は、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間と関連していた。図５に、この試料におけるＶＩＩ  因子濃度に依存した相対的なプロトロンビン時間［比＝（ＰＴ）／（ＰＴ１００％ＶＩＩ  因子）］を示す。以下の２種類の組織因子試薬を使用した。
ａ）ヒト胎盤から単離した生組織因子（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ  ）
ｂ）組換え組織因子アポタンパク質から出発し、本発明による方法によって調製した試薬（実施例１と同様）
ヒト個体群（９５百分位数（ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ））におけるＶＩＩ  因子濃度の正常範囲は、１．００±０．２０のプロトロンビン比で示される。この範囲外のプロトロンビン比を有する血漿は病的であると考えられる。この感受性限界と一致するＶＩＩ  因子濃度は、ここに使用した両試薬と非常に類似している。
【図面の簡単な説明】
【図１】再脂質化のｐＨ依存性
試薬は、実施例１および実施例２に記載される通りに調製した。Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ２５Ｐを、ｐＨ値の異なるグリシン緩衝液と予め混合した。組織因子アポタンパク質を加えた後、そのｐＨを測定し、続いて混合物を中和した。正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間（ＰＴ）は、Ｓｃｈｎｉｔｇｅｒ  とＧｒｏｓｓ  の凝固計で測定した（複製決定の平均値）。
【図２】酸性条件下での再脂質化の時間依存性
試薬は、実施例１および実施例３に記載される通りに調製した。図は、酸性ｐＨでのインキュベーションの長さを変えた、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間（ＰＴ）（複製決定の平均値）を示したものである。
【図３】再脂質化の加熱段階の温度依存性
試薬は、実施例４に記載される通りに調製した。この図は、５分間の加熱段階の温度への、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間（複製決定の平均値）を示したものである。
【図４】加熱による再脂質化の時間依存性
図は、９５℃での加熱温度の長さへの、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間ＰＴ（複製決定の平均値）を示したものである。
【図５】ＶＩＩ  因子に対する感受性
試薬は、実施例１にしたがって調製し、正常ヒト血漿プールは実施例５にしたがってＶＩＩ  因子欠陥血漿で希釈した。
図は、ＶＩＩ  因子濃度に依存した相対的なプロトロンビン時間［比＝（ＰＴ）／（ＰＴ１００％ＶＩＩ  因子）］を示したものである。この試薬は、本発明による方法によって組換え組織因子から調製し、部分精製したヒト胎盤からの生組織因子と比較した（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ  ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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