(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における病原体の胃腸コロニー形成の予防または処置のための、活性成分として表皮成長因子（EGF）を含む、医薬組成物または動物用医薬組成物。
【請求項２】
動物における病原体による腸感染の予防または処置のための、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
病原体が細菌である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
細菌が大腸菌（E.coli）である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
細菌がサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）である、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
細菌がヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）である、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
表皮成長因子が動物の餌に存在する、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
経口投与のための、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
胃潰瘍部位の細菌コロニー形成の予防または処置をするために使用する、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
該細菌コロニー形成がヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）によって起こる、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
胃潰瘍の治癒を加速するために使用する、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
経口投与に使用する、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
動物の餌として投与するために使用する、請求項９記載の組成物。
【請求項１４】
EGFを１日あたり10−10,000μg/kg投与するために使用する、請求項９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、本明細書に参考として包含する、米国出願番号第08/438,901号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、胃腸治療剤としての表皮成長因子（EGF）の使用に関する。特に、EGFは体重増加の促進および病原体の胃腸コロニー形成の予防に使用できる。EGFは、免疫グロブリンの吸収増加にも使用し得る。EGFシグナルカスケードの阻害は、毒性または有害な化合物の取り込み予防および体重減少の促進に使用し得る。
発明の背景
多くの腸成長因子が表皮成熟および再生を加速させる。これらの一つは、小さい酸安定胃腸ペプチドである表皮成長因子（EGF）であり、本質的に唾液および腸分泌物および他の体液に存在し、初乳および乳汁中に大量に製造される。EGFは、ａ）生まれて初めの頃の腸細胞増殖および分化、ｂ）離乳前幼児の腸の機能的成熟化およびｃ）成人腸の表皮増殖を促進する（10、11、12、13、14）。更に、EGFは急速（数分以内）に電解質および栄養物の小腸吸収を上方制御し、その効果は腸細胞の尖端微小絨毛の同時の伸長と関係した（15）。EGFの可能性のある治療的利点は、EGFでの局所治療が創傷治癒を促進する（30）という研究により、およびより最近では、EGFの投与が大規模な腸管摘出後の腸からの栄養物吸収を促進するという発見（16）により脚光を浴びている。小腸と比較して、EGFのより多くのレセプターが、大腸菌（Escherichia coli）（以下E.coliと記載する）のような微生物の感染中に最もひどい細菌負荷が見られる、結腸で発見されている（17）。EGFは結腸を含む全腸で機能を上方制御する（12、16）。
EGFが種々の機能を有することが報告されているが、病原体の腸コロニー形成予防または体重増加の加速におけるその役割は先に報告されていない。これらの二つの新規に発見されたEGFの特性により、EGFは治療剤として非常に有用となる。EGFが病原体の腸コロニー形成または感染を予防する能力は、多くの重要な治療的適用を有する。このような適用の一つは、若い家畜動物における腸大腸菌症の治療である。
腸大腸菌症は、農業の経済とかなり密接な細菌感染である。腸大腸菌症（下痢（scours）とも呼ばれる）は、新生および若い家畜に最も一般的な病気である（１−６）。この病気を誘発する微生物は、病原性細菌である大腸菌（E.coli）である。感染は、家畜を飼育している間に発生し、カナダ西部および世界の他の地域での経済的損失の明白な原因である。疾病は、下痢、脱水および最後に死により特徴付けられる。従って、腸大腸菌症による経済的損失を防止するための方法の開発が真に望まれている。
若い家畜の腸大腸菌症の治療に加えて、EGFはまた病原体、すなわち、ウイルス（例えば、コロナウイルス、パルボウイルス、ロタウイルス）、細菌（例えば、サルモネラ種（Salmonella sp.）および赤痢菌種（Shigella sp.））または寄生虫（例えば、クリプトスポリジウム種（Cryptospordium sp.）およびアイメリア種（Eimeria sp.）の腸コロニー形成および旅行者の下痢によりもたらされる疾病の処置または予防にも使用できる。EGFの他の重要な使用は、胃潰瘍部位における細菌コロニー形成の予防である。細菌ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染は、再発性消化性潰瘍の主な危険因子であることが十分証明されている。潰瘍部位で細菌コロニー形成が起こり、潰瘍の慢性化に寄与することが示されている。従って、EGFは細菌ヘリコバクター・ピロリのコロニー形成の予防に有用であり得、従って、胃潰瘍の治癒の加速に有用であり得る。
EGFの投与が病原体による腸コロニー形成を予防できるという証明に加えて、本発明者らは、EGFが動物の体重増加を促進できることも示した。後者の効果は、ある刊行物がEGFが体重増加に効果を有しないと示しているため（21、25）、予期されなかった。ブタにおけるEGFの効果を研究する他の研究は（28、29）、腸ジサッカライドのレベルの付随した増加にもかかわらず、成長速度の加速の証明は不可能であった。
体重増加加速におけるEGFの使用は、また多くの重要な治療的適用を有する。この特性は、特に、感染に付随する下痢および脱水による体重減少の場合の、腸感染の処置に有用である。この特性はまたウシ、ブタ、家禽および魚業のような動物産業における生産性の増加にも有用である。後者の産業は、より多くの魚が養殖により生産されるようになっているため、より重要になってきている。動物産業において、EGFは家畜の食物添加剤として、または飲料水として摂取させるのが容易であり得る。体重増加のためのEGFの使用はまた栄養失調のヒトおよび神経性食欲不振症に罹患しているヒトの処置にも使用できる。
病原体によるコロニー形成の予防および体重増加の促進に加えて、EGFはまた栄養物の腸吸収を増加をせることも示されている。この特性はまた多くの治療的適用を有する。例えば、この特性は、EGFを、このような状況が必要であり得る栄養物の吸収を増加させることにより、腸感染の処置または体重増加の促進により有用にする。更に、胃腸吸収を上方制御することにより、EGFはまた新生児の免疫グロブリン取り込みも増加し得る。
新生児の免疫グロブリンの主な源は、母体からの初乳および乳汁であり、母体からの適切な免疫グロブリンの吸収不良は、感染性疾患の高い疾病率および致死率と関係する（31）。免疫グロブリン吸収率は、生まれて一日目が最大であり、その後、免疫グロブリン取り込みは減少し、腸閉鎖が起こる。EGFの投与は、（ａ）初乳、乳汁または他の源（経口免疫グロブリン製剤のような）からの免疫グロブリン吸収の促進および（ｂ）免疫グロブリン取り込みの促進をまたし得る腸閉鎖の遅延をし得る。
上記のように、EGFは栄養物の腸吸収の増加をもたらす。従って、EGFシグナルカスケードの阻害が栄養物の超吸収を減少させる。胃腸栄養物吸収の制御におけるEGFシグナルカスケードの阻害の臨床的利点は、今まで評価されていない。EGFレセプターまたはEGFシグナルカスケードのアンタゴニストが、例えば、肥満の治療のような腸吸収の減少が正当であり得る場合の胃腸治療剤として、または毒性または有害物質の腸取り込みを減少させるために使用し得る。
発明の要約
本発明は、胃腸治療剤としての表皮成長因子（EGF）の使用に関する。
一つの態様において、本発明は動物における病原体の腸コロニー形成の予防または処置のためのEGFの使用を提供する。腸感染および疾病は、食物生産動物における損失の主な原因である。
本明細書で使用する限り、“動物”なる用語は、魚および哺乳類（家畜およびヒトでさえ含む）のような動物界の全てのメンバーを含むことを意味する。
本明細書で使用する“病原体”なる用語は、細菌、ウイルスおよび寄生虫のような疾病の原因となる生物を含むことを意味する。胃腸系に侵入できる細菌性病原体の例は、E.coliおよびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）を含む。
EGFは好ましくは経口で、例えば、動物の餌として投与する。更に、飲料水に添加した凍結乾燥EGFは安定性が証明されており、そのように投与できる。
一つの態様において、本発明は動物における腸感染（ウイルス、細菌または寄生虫）の処置または予防のためのEGFの使用を提供する。
他の態様において、本発明は動物における腸大腸菌症（下痢（scours））の処置または予防のためのEGFの使用を提供する。
更なる態様において、本発明はヘリコバクター・ピロリに関係する胃潰瘍の予防または胃潰瘍の治癒加速のためのEGFの使用を提供する。
他の態様において、本発明は動物の体重増加促進のためのEGFの使用を提供する。これは、生産性を促進する非医薬食物添加剤の要求のある、農業および養殖産業のような動物産業における生産性の増加に有用である。
更なる態様において、本発明は動物、特に新生動物の腸における免疫グロブリン吸収の増加におけるEGFの使用を提供する。
また更なる態様では、本発明は、EGF活性を阻害して栄養素の腸管吸収を低減させる薬剤の使用を提供する。これは、肥満の処置または毒素の腸管吸収の低減など、腸管での吸収を低減させたい状況において有用であり得る。
本発明は、また、上記のあらゆる症状を処置または防止する医薬の調製におけるEGFの使用をその範囲内に含む。
図面の説明
図１は、ウサギにおける重量増加に対するEGFの効果を示すグラフである。
発明の詳細な説明
実施例1:
腸管感染に対するEGFの効果
E.coliによる腸管感染に対するEGFの効果を測定する実験を行った。その実験の結果を合わせて、下記に要約する。
ニュージーランド白ウサギ28匹（６週齢）を３グループにして研究した:1）対照（Con、ｎ＝９）、２）１×107RDEC−E.coliで感染させたもの（Ｉ、ｎ＝10）、および３）感染３日前から始めて10日間、毎日EGF60μｇで経口的に感染処置したもの（Ｉ−EGF、ｎ＝９）。重量増加、E.coliの直腸通過、および下痢の存否について動物を毎日検査した。感染後７日目に、動物を屠殺し、空腸（JEJ）、回腸（ILE）、および近位結腸からE.coliの定量用の粘膜を、そして空腸から粘膜酵素検定用の粘膜を入手した。
実験の結果は、表１に示す。対照のウサギ以外の、感染（Ｉ）ウサギおよび感染およびEGF処置（Ｉ−EGF）ウサギの糞便培養物はE.coliに対して陽性であった。グループＩでは、Ｉ−EGFまたは対照動物では下痢が見られなかったのに対して、４匹に下痢が見られた。感染は重量増加の低減をもたらし、これはEGFにより防止されている（表１参照）。EGF処置はまた、空腸、回腸、および近位結腸におけるE.coliコロニー形成をＩと比較して＞85％まで低下させ、かつ空腸マルターゼおよびスクラーゼ活性の低減を防止した。
上記結果は、非処置感染動物と比較した場合、重量増加の増強および下痢の不在により例示されるとおり、EGF投与がE.coli感染させたウサギにおいて多くの臨床的利点を有することを示す。EGF処置は、腸管粘膜におけるジサッカリダーゼ活性の増大および細菌コロニー形成の低減と関係している。
実施例２
腸管感染および細菌移行に対するEGFの効果
インビトロで上皮を渡る細菌移動に対する外来EGFの効果を評価し、かつEGF効果が細菌特異性であるかどうかを測定する実験を行った。
２×108ヒト病原性サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはE.coliを、トランスウェル膜（多孔性、3.0μｍ）で生育させた集密（コンフルエンス）状態のヒトCaCo2単層の先端表面に添加した。感染15分前に単層先端にEGF（100μＭ）またはPBSを与えた。感染後毎時間（０−7h）、膜下の培地を取り替え、細菌の経上皮移動速度（CFU/h）を計算した。
その結果は、インビトロで、EGFが最初E.coli（移動）を１時間遅延させ、その後侵入速度を＞95％まで阻害することを示している。S.チフィムリウムの移動は、EGF−処置単層にて完全に阻止された。
上記の結果は、EGFが細菌移動を妨害することにより少なくとも一部でその臨床的利点を発揮することを示している。EGFは、また、細菌繁殖を妨害し、および／または腸管表面への細菌接着を阻止することにより細菌コロニー形成を制御することによりその効果を発揮する。後者は、更に、トランスウェル膜研究での電子顕微鏡走査により示された。実際、これらの観察結果により、非処置単層の上皮表面にはEGF曝露したものと比べて著しく多数の微生物が接着することが明らかになった。この事実は、更に、EGF治療が腸感染の処置または予防に有用であり得ることを支持するものである。
実施例3:
重量増加に対するEGFの効果
EGFを、重量増加に対するその潜在的利点について試験した。ニュージーランド白ウサギ（６週齢、500−700g）の１グループに、経口用量の組換えヒトEGF（100μg/kg体重）を毎日与え、対照動物には、食塩水のみを与えた。９日目で、EGF−処置動物は、平均累積重量増加422±27g（ｎ＝10）であったのに対し、対照では394±16g（ｎ＝11）のみであった。図１を参照すると、EGF処置動物における重量増加の線形回帰曲線の傾きは、非処置対照のものよりも有意に大きかった（P 0.0002）。両方の曲線の線形解釈によると、EGFでの連続給餌は、重量増加に対する着実な増大効果を生むようである。
これらの結果は、EGFが健常動物における重量増加の加速を促進し得ることを示している。
実施例4:
栄養素吸収に対するEGFおよびEGFレセプター阻害因子の効果
栄養素吸収および刷子縁微細構造に対するEGFおよびEGFレセプター阻害因子の効果を測定するために、これらの実験を行った。
最初の実験は、管腔EGFが無傷組織におけるグルコース吸収を増大させることを示した。続く実験は、腸管刷子縁膜栄養素吸収に対するEGFおよびEGFレセプター（チロホスチン51）阻害因子の効果を調べた。チロホスチン51は、チロシンキナーゼの特異的阻害因子であり、EGF細胞内シグナル発生カスケードの重大な要素である。研究は、ニュージーランド白ウサギ（700−100g;およそ８週齢）にて実施した。適当な10cmの空腸ループ２つを1cm分節に分け、トライツの靭帯から5cm離れたところから縛った。別の実験では、食塩水媒体1.5ml中EGF（60ng/ml）、EGF＋チロホスチン（10μＭ）、またはチロホスチン（10μＭ）単独のいずれかをループの１つに投与した。他のループには、媒体のみを与え、一対の対照とした。１時間後、ループを取り出し、刷子縁膜小胞の調製のために粘膜を削った。刷子縁膜への栄養素（Ｄ−グルコースおよびＬ−プロリン）摂取を常用技術により測定した。管腔EGFは、対照と比較して、刷子縁膜グルコース輸送（EGF16.1±10対対照11.5±0.9nmol/分/mgタンパク質;n＝５）およびプロリン輸送（EGF3.8±0.5対対照2.6±0.3nmol/分/mgタンパク質;n＝５）の有意な増大を刺激した。グルコースおよびプロリン輸送の両方が同程度増強され、これは、EGFが栄養素輸送における全体的な増大を刺激することを示唆するものである。同時チロホスチン（TYR）投与は、グルコース摂取におけるEGF誘導化増大を完全に遮断し、対照と比較して栄養素摂取の有意な（ｐ＜0.001）低減をもたらした（EGF＋TYR5.9±0.3対対照10.7±0.6nmol/分/mgタンパク質;n＝４）。続いて、更に一連の実験を行い、刷子縁グルコース輸送に対するチロホスチン単独の効果を試験した。チロホスチン単独は、対照と比較してグルコース摂取を有意に（ｐ＜0.001）低減した（TYR8.0±0.8対対照10.7±1.0nmol/分/mgタンパク質;n＝４）。本発明は、予め、腸管栄養素吸収が多くの様々なモデルで重量増加と相関することを示した。従って、EGF処置は、栄養素吸収を増大させ、重量増加を促進する。逆に、チロホスチン処置は、重量増加の低減または重量損失を促進することができ、故に、肥満の処置に有用であるといえる。チロホスチン処置は、また、毒性物質または有害物質の腸管摂取を低減させることもできる。
実施例5:
免疫グロブリン吸収に対するEGFの効果
その他の一連の実験では、若齢動物の腸における免疫グロブリン摂取を増強するその能力について、EGFを試験した。
ラット（14日齢、Sprague−Dawley）を無作為に３グループに分けた。０時点で、３種類の溶液の１つを経口洗浄により各グループに与えた：グループ１には食塩水のみ（0.4ml）を与えた；グループ２には、食塩水（0.2ml）＋ヒツジIgG（0.2ml、5mg/ml）；グループ３には食塩水中EGF（0.1μg/ml）＋ヒツジIgG（0.2ml、5mg/ml）を与えた。接種後、１、２および４時間で、（メトキシフルオランでの麻酔後）心臓穿刺により各グループの４匹から採決した。血清を分離し、ヒツジIgGレベルをEnzyme−Linked Immunosorbant Assay（ELISA）により測定した。数値は、平均±標準誤差血清ヒツジIgG（μg/ml）として表した（表２）。
その結果は表２に示してあり、これはEGF投与が腸からの免疫グロブリン摂取を増大させることを示す。
上記は、EGFの新規有用性を記述するものである。特に、EGFが病原体による胃腸内コロニー形成を妨害し、動物の重量増加を促進することを示している。更に、EGFは、若齢動物における免疫グロブリン吸収を増大させ得る。結果的に、EGFは、牛肉、ブタ肉、鶏肉産業、並びに水産養殖などの動物産業における生産増加に使用できる非常に有用な薬剤である。更に、EGF処置は、ヒトでの臨床的利点を有し得る（即ち、クローン病、胃腸内感染、トラベラーズ下痢等の際）。EGFはまた、潰瘍部位でのコロニー形成を防止することにより胃腸潰瘍の治癒を速めることができる。
EGFの阻害因子は、腸における栄養素吸収を低減させ得るので、肥満の処置または毒素吸収の防止にも有用であるといえる。
本発明がEGFおよびEGF阻害因子の新規有用性に関連することは当業者ならば認識できるであろう。記載した実施例は、本発明を例示するモデルであることを意味し、本発明を限定するものではない。EGFまたはEGF阻害因子の投与様式、処方および用量は、特定の用途に応じて変わり得る。例えば、若齢の家畜を処置する場合、動物の餌または飲料水にEGFを混ぜて、経口的に投与できる。その用量は、１日当たり10〜10,000μg/kgの範囲で変えることができる。
0003549541.tif 000002
0003549541.tif 000003
0003549541.tif 000004
0003549541.tif 000005
0003549541.tif 000006
0003549541.tif 000007
【図１】
0003549541.tif 000008