(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾプス・ハンショウ (Rhizopus hangchow) IFO-4749株が産生し、分子量約37,600（SDS-PAGE）を有し、次のＮ末端アミノ酸配列を有するアスパルチック・プロティナーゼ。
Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Phe-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Gly-
【請求項２】
以下の性状をもつ請求項１記載のアスパルチック・プロティナーゼ。
1)  至適pHはpH3〜4である。
2)  pH2〜7でpH安定性があり、酸性領域でタンパク質を良好に分解する。
3)  αｓ-カゼインを分解する。
4)  pH3〜4でトリプシノーゲンを活性化する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  が産生するアスパルチック・プロティナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスパルチック・プロティナーゼは、作用至適ｐＨが酸性側にあり活性部位にアスパラギン酸残基を有するプロティナーゼの総称で、消化薬や麹の補助剤あるいは代替品として用いられたり、調味液やペプチドなどを製造する際に用いられたりしている。このアスパルチック・プロティナーゼの起源としては、動物の胃液中のペプシンや仔牛胃のレンニンなどが広く知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）  属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）  属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）  属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  属などの微生物もアスパルチック・プロティナーゼの起源として知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、微生物を起源とする種々の酵素について鋭意研究を行っていたところ、リゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  がアスパルチック・プロティナーゼを産生することを見出し、本発明をなすに至った。したがって、本発明は、リゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  が産生するアスパルチック・プロティナーゼを提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アスパルチック・プロティナーゼ産生能を有するリゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  を培養し、菌体中にアスパルチック・プロティナーゼを生成、蓄積させた後、分離、精製することにより得られるアスパルチック・プロティナーゼであり、分子量約３７，６００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を有し、次のＮ末端アミノ酸配列を有する。
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
【０００５】
次に、本発明のアスパルチック・プロティナーゼの製造法について説明する。本発明のアスパルチック・プロティナーゼの製造に用いるリゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  は、本発明のアスパルチック・プロティナーゼを産生するものであればいずれの菌株でも良く、例えばその菌株として、リゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  ＩＦＯ−４７４９株を挙げることができる。このＩＦＯ−４７４９株は財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｏｓａｋａ）  で何らの制限を受けること無く入手することができる。
【０００６】
本発明のアスパルチック・プロティナーゼを製造する際に行うリゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  の培養に用いる培地は、通常のリゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  の培養に用いる培地であれば良く、液体培地を用いることもできるし、固体培地を用いることもできる。また、本発明のアスパルチック・プロティナーゼを産生させるための誘導物質は特に必要としない。なお、培養温度は２５℃前後が好ましく、培養時間は４日程度で良い。
【０００７】
このようにリゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  の菌体中に生成、蓄積させたアスパルチック・プロティナーゼの精製は、酵素の精製に通常用いられる方法を適宜組み合わせることにより行われる。例えば、液体培養においては、濾過や遠心分離などの処理により培養物から菌体を分離した後、酵素処理や物理的処理により菌体を破砕し、アスパルチック・プロティナーゼを溶出させて粗酵素画分を得る。また、固体培養においては、緩衝液などの溶媒を用いてアスパルチック・プロティナーゼの粗酵素画分を抽出する。そして、この粗酵素画分は、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの処理により精製される。
【０００８】
次に、本発明のアスパルチック・プロティナーゼの理化学的性質を示す。
（１）  分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３７，６００であり、Ｓｕｐｅｒｏｓｅを用いたファースト・プロテイン・リキッド・クロマトグラフ（ＦＰＬＣ）で３６，０００である。
（２）  等電点：等電点電気泳動で  ４．５である。
（３）  基質特異性：インシュリンＢ鎖中の  Ｌｅｕ１５−Ｔｙｒ１６及び  Ｔｙｒ１６−Ｌｅｕ１７の二つのペプチド結合を初期に切断し、さらに、  Ｌｅｕ１１−Ｖａｌ１２、  Ａｌａ１４−Ｌｅｕ１５及び  Ｐｈｅ２４−Ｐｈｅ２５を切断する。また、トリプシノーゲンをｐＨ２〜５の領域で活性化する。
（４）  至適ｐＨ：ｐＨ３〜４である（図１参照）。
（５）  熱安定性：ｐＨ  ３．０で４５℃、５分間の処理により酵素活性は減少し、ｐＨ  ３．０で５０℃、５分間の処理により酵素活性は完全に消失する。
（６）  ｐＨ安定性：ｐＨ２〜７で極めて安定である（図２参照）。また、ｐＨ  ９．０で、５℃、一夜の処理により酵素活性の約５０％が減少する。
（７）  阻害剤：１μＭ  のペプスタチンＡにより酵素活性は完全に消失し、１４℃、４０分間のＮ−ジアゾアセチルノルロイシンメチル    エステル（Ｎ−ｄｉａｚｏａｃｅｔｙｌｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＤＡＮ）処理により酵素活性の約５６％が減少する。（８）  Ｎ末端アミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
（９）  構造：円偏光二色性スペクトルの測定（図３参照）により、約９０％のβ−構造を有する。
【０００９】
なお、アスパルチック・プロティナーゼ活性は、以下のようにして測定した。０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．０）で希釈した酵素液１ｍｌに２％ミルクカゼイン溶液１ｍｌを加え、３０℃で１０分間反応させた。０．４Ｍトリクロロ酢酸２ｍｌを加えて反応を停止させた後、２０分間以上放置し、トーヨー濾紙  ＮＯ．２  で濾過した。この濾液１ｍｌに０．４Ｍ炭酸ナトリウム５ｍｌを加えて充分撹拌した後、６倍希釈  Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬１ｍｌを加えて３０℃で３０分間放置し、吸光度  ６６０ｎｍを測定した。これとは別に予め失活させておいた酵素液を用い盲検を行った。酵素活性は、３０℃、ｐＨ  ３．０で２％ミルクカゼイン水溶液を基質として酵素反応を行った際に、１秒間にチロシン１ｍｏｌｅ相当の  ２８０ｎｍの吸光度と同等のトリクロロ酢酸可溶性分解物を遊離させる酵素量を１ｋａｔａｌ  とした。また、酵素蛋白質１ｋｇ当たりの  ｋａｔａｌ数で比活性を示した。
【００１０】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
粗酵素の調製
小麦ふすま１，８００ｇに水  １，５００ｍｌを加えて殺菌した後、リゾプス・ハンショウ  （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｈａｎｇｃｈｏｗ）  ＩＦＯ−４７４９株を接種し、２５℃で４日間培養した。培養後、得られた麹に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  １０，０００ｍｌを加え、低温室にて一夜抽出を行い、粗酵素液  ７，３５０ｍｌを得た。この粗酵素液を遠心分離した後、ホローファイバー（ＡＩＬ−１０１０、旭化成社製）  を用いて濃縮し、凍結乾燥して粗酵素粉末  １５．５ｇを得た。このアスパルチック・プロティナーゼ粗酵素粉末の比活性は  ７．９×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率は６８％であった。
【００１１】
アスパルチック・プロティナーゼの精製
上記のようにして得られた粗酵素粉末  １０ｇを２ｍＭ酢酸カルシウム含有１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．２）  １００ｍｌに懸濁し、２時間撹拌して溶解した後、遠心分離  （１５，０００×ｇ、２０分）  し、得られた上清を同緩衝液に対して透析した。透析後、遠心分離  （１５，０００×ｇ、２０分）  し、その上清を粗酵素液とした。
この上清に３５％濃度となるよう硫安を穏やかに加え、遠心分離  （１０，０００×ｇ、２０分）  し、その上清を３５％硫安画分上清とした。比活性は  ８．７×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。
【００１２】
この３５％硫安画分上清を予め３５％硫安濃度の２ｍＭ酢酸カルシウム含有１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．２）で平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ  （東ソー株式会社製）  に供した。そして、３５〜０％硫安濃度直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ溶出活性画分とした。比活性は  ９．１×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。
【００１３】
このＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ溶出活性画分を２ｍＭ酢酸カルシウム含有１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）に対して充分透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）  に供した。そして、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  溶出活性画分とした。比活性は１５．８×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。
【００１４】
このＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ  溶出活性画分を２ｍＭ酢酸カルシウム含有１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．０）に対して十分透析した後、同緩衝液で平衡化したＳＰ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）  に供した。そして、０〜０．７５Ｍ  塩化ナトリウム直線濃度勾配により活性画分を溶出し、その溶出液をＳＰ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ  溶出活性画分とした。
【００１５】
このＳＰ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ  溶出活性画分をミリＱ水に対して十分透析し、凍結乾燥して精製アスパルチック・プロティナーゼ  ２１２ｍｇを得た。このようにして得られた精製アスパルチック・プロティナーゼは、電気泳動的に単一であり、比活性は１１×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。また、アスパルチック・プロティナーゼ活性の収率は８％であった。
【００１６】
【試験例１】
実施例１で得られたアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応を調べた。  ２．５ｍＭ塩酸に０．５ｍｇ／ｍｌ濃度となるようトリプシノーゲンを溶解した溶液２５μｌ  、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ３．０）５０μｌ  、酵素液２５μｌ  を混合し、３０℃で活性化反応を行った後、０．３Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．３）  ０．５ｍｌ、水  ０．９ｍｌを加えて反応を停止した。そして、この溶液に１０ｍＭ  Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ  ５μｌ  を加えて３０℃で反応させた後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｆ−３０００（株式会社日立製作所製）  を用いて励起波長  ３６０ｎｍ、蛍光波長  ４４０ｎｍにて蛍光強度を測定した。この条件において、１秒間にトリプシノーゲン１ｍｏｌｅを活性化するのに必要な酵素量を１ｋａｔａｌ  とした。その結果、本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化反応における比活性は１３．９×１０−３ｋａｔａｌ／ｋｇ蛋白質であった。
【００１７】
【試験例２】
実施例１で得られたアスパルチック・プロティナーゼのアレルゲン蛋白質に対する分解能を調べた。２％αＳ  −カゼイン（ｐＨ  ３．０）５μｌ  及び２％β−ラクトグロブリン（ｐＨ  ３．０）５μｌ  を基質とし、酵素溶液（ｐＨ  ３．０）５μｌ  をそれぞれ加え３０℃で反応させた後、０．８Ｍトリクロロ酢酸５μｌ  を加えることにより反応を停止させた。この反応液を３０℃で２０分間以上放置した後、遠心分離  （１５，０００×ｇ、２０分）  して沈澱物を得た。そして、この沈澱物を  ＳＤＳ化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して分解の様子を見た。
その結果を図４に示す。本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、αＳ  −カゼインは分解するが、β−ラクトグロブリンは分解しないことが判った。
【００１８】
【試験例３】
実施例１で得られたアスパルチック・プロティナーゼの酸化インシュリンＢ鎖に対する基質特異性を調べた。酸化インシュリンＢ鎖  （シグマ社製）  を  ＨＰＬＣ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔに供して精製したものを基質として用い、３０℃、ｐＨ  ３．０で酵素反応を行った。２５％アンモニア水を１／１０量加えることによって反応を停止した後、減圧乾固し  ０．１％ＴＦＡ  に溶解して試料とした。この試料を  ＨＰＬＣ  ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔに供してピークを分取し、各ピークのアミノ酸配列をペプチドシークェンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライド・バイオシステムズ社製）  で分析して、切断点及び切断の順序を決定した。
本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、  Ｌｅｕ１５−Ｔｙｒ１６及び  Ｔｙｒ１６−Ｌｅｕ１７の二つのペプチド結合を初期に切断し、さらに、  Ｌｅｕ１１−Ｖａｌ１２、  Ａｌａ１４−Ｌｅｕ１５及び  Ｐｈｅ２４−Ｐｈｅ２５を切断することが判った。
【００１９】
【試験例４】
実施例１で得られたアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を調べた。１レーン当たり  ０．１μｇ  、  ０．５μｇ  、  １．０μｇ  となるよう酵素を供し、１５Ｖ／ｃｍで２時間、アガロース電気泳動を行った。泳動後、ゲルを  ０．１５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．３）に浸漬し、３０分間、室温に放置した後、スキムミルク−アガロースプレートに載せた。３７℃で２時間反応させた後、０．０２％  ａｍｉｄｏ  ｂｌａｃｋを加えて２０分間染色し、水洗した後、５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  を含む  ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．８）で脱色した。また、比較例として、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）  由来のアスパルチック・プロティナーゼについても同様の試験を行った。
その結果を図５に示す。本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）  由来のアスパルチック・プロティナーゼよりも強い凝乳活性を有することが判った。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、ｐＨ２〜７で安定であり、酸性領域で蛋白質を良好に分解することから、胃液で分泌されるペプシンの代替品として有用であると共に、ｐＨ３〜４で膵臓由来のトリプシノーゲンを活性化することから、十二指腸で分泌されるエンテロキナーゼの代替品としても有用である。
また、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、ペプシンとエンテロキナーゼの二つの機能を有する消化酵素であり、αＳ  −カゼインの分解能を有するので、消化管が未成熟な新生児のための消化剤として用いることにより、新生児にとって問題となる乳や卵などのアレルギーを予防することが可能となる。
さらに、本発明のアスパルチック・プロティナーゼは、雑菌に汚染され難い酸性領域で高い活性を示すので、調味料や低アレルゲン化食品などの食品素材を製造する際に用いる蛋白質分解酵素としても最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化に対するｐＨの影響を示す。
【図２】本発明のアスパルチック・プロティナーゼのトリプシノーゲン活性化に対するｐＨの安定性を示す。
【図３】本発明のアスパルチック・プロティナーゼの円偏光二色性スペクトルの測定結果を示す。
【図４】本発明のアスパルチック・プロティナーゼによるアレルゲン蛋白質（αｓ  −カゼイン、β−ラクトグロブリン）の加水分解を示す。
【符号の説明】Ｌ−Ｌ  １  ，  ６  ：マーカー蛋白質Ｌ−Ｌ  ２  ，  ３  ，  ４  ：αｓ  −カゼインＬ−Ｌ  ７  ，  ８  ，  ９  ，１０  ：β−ラクトグロブリン
【図５】本発明のアスパルチック・プロティナーゼ及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）  から得られるアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性を示す。
【符号の説明】
Ｌ−Ｌ  １  ，  ２  ，  ３  ：本発明のアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性
Ｌ−Ｌ  ４  ，  ５  ，  ６  ：アスペルギルス・サイトイのアスパルチック・プロティナーゼの凝乳活性
【図１】
0003547021.tif 000002
【図２】
0003547021.tif 000003
【図３】
0003547021.tif 000004
【図４】
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【図５】
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