【手続補正書】
【提出日】平成29年9月5日(2017.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）ヌクレアーゼとを含む融合蛋白質。
【請求項２】
ヌクレアーゼがＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインの単量体である、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の融合蛋白質の二量体。
【請求項４】
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合する、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
（ａ）請求項４に記載の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合することと、
（ｂ）請求項４に記載の第２の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質の不活性なＣａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、
を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）における融合蛋白質の結合が、融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ＤＮＡは、結合した融合蛋白質間の領域において切断される、
部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡがＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡがＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡが細胞内にあり、任意に細胞が真核細胞である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
二量体の各融合蛋白質の不活性なＣａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合し、その結果、１つの融合蛋白質がｇＲＮＡの一部分に結合し、もう一方の融合蛋白質がｇＲＮＡの別の部分に結合する、請求項３に記載の二量体と単一の拡張型ｇＲＮＡとを含む複合体。
【請求項１０】
ｇＲＮＡが長さ少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００ヌクレオチドであり、任意にターゲット核酸にハイブリダイゼーションする拡張型ｇＲＮＡの領域が、１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の複合体とＤＮＡを接触させることを含み、
（ａ）ｇＲＮＡが、ＤＮＡの２つの別々の領域にハイブリダイゼーションする２つの部分を含有し、
（ｂ）複合体が、ｇＲＮＡの部分が２つの領域にハイブリダイゼーションすることの結果として、ＤＮＡに結合し、
（ｃ）複合体の結合が、各融合蛋白質のヌクレアーゼドメインの二量体化をもたらし、その結果、ドメインは、結合した融合蛋白質間の領域においてＤＮＡを切断する、
部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項１２】
ｇＲＮＡの２つの部分がＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションするか、またはｇＲＮＡの２つの部分がＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｇＲＮＡの２つの部分が、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、任意にＤＮＡが細胞内にあり、任意に細胞が真核細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質がＤＮＡ切断ドメインを含まないか、または（ｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９、および（ｉｉ）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインの２つのドメインを含む融合蛋白質であり、ドメイン（ｉｉ）はＤＮＡ切断ドメインを含まない、Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質。
【請求項１５】
蛋白質がｇＲＮＡ結合ドメインを含まないか、または（ｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９、および（ｉｉ）ＤＮＡ切断ドメインの２つのドメインを含む融合蛋白質であり、ドメイン（ｉｉ）はｇＲＮＡ結合ドメインを含まない、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質。
【請求項１６】
（ａ）請求項１４および１５に記載の蛋白質
（ｂ）請求項１４に記載の蛋白質および１５に記載の融合蛋白質
（ｃ）請求項１５に記載の蛋白質および請求項１４に記載の融合蛋白質、または
（ｄ）請求項１４に記載の融合蛋白質および請求項１５に記載の融合蛋白質
を含む蛋白質二量体であって、
任意に、蛋白質二量体が、さらに複数のｇＲＮＡを含む。
【請求項１７】
請求項１６に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、二量体が、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こる、部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、蛋白質二量体が、ＤＮＡの２つの領域にハイブリダイゼーションする２つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こり、任意に２つのｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションする、部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の蛋白質二量体とＤＮＡを接触させることを含み、蛋白質二量体が、ＤＮＡの３つの領域にハイブリダイゼーションする３つのｇＲＮＡに結合して、ＤＮＡの切断が起こり、任意に、３つのＲＮＡが、第１および第２ならびに第２および第３の領域間として１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、任意に、ＤＮＡが細胞内にあり、任意に、細胞が真核細胞である、部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項２０】
ｇＲＮＡをさらに含み、それによって蛋白質：ｇＲＮＡ複合体を形成する請求項１、２、４、１４または１５のいずれか一項に記載の蛋白質または融合蛋白質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の蛋白質：ｇＲＮＡ複合体とＤＮＡを接触させることを含む、部位特異的なＤＮＡ切断のためのin vitroの方法。
【請求項２２】
二量体が単一のｇＲＮＡを介して連係する、Ｃａｓ９またはその断片の二量体であって、任意に、単一のｇＲＮＡが、（ｉ）それぞれＣａｓ９蛋白質に結合する能力があり且つ（ｉｉ）それぞれターゲット核酸にハイブリダイゼーションする少なくとも２つの部分を含み、任意に、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションするｇＲＮＡの部分が、それぞれ、ターゲット核酸に相補的な５以下、１０以下、または１５ヌクレオチド以下を含み、任意に、ｇＲＮＡの部分同士がリンカー配列によって離間され、任意に、リンカー配列がターゲット核酸にハイブリダイゼーションする二量体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の二量体とDNAを接触させることを含む、部位特異的DNA切断のためのインビトロの方法。
【請求項２４】
２つのドメイン（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９と（ｉｉ）リコンビナーゼ触媒ドメインとを含む融合蛋白質であって、任意に、リコンビナーゼ触媒ドメインがＨｉｎリコンビナーゼ、Ｇｉｎリコンビナーゼ、またはＴｎ３リゾルベースのリコンビナーゼ触媒ドメインの単量体であり、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインがｇＲＮＡに結合する、融合蛋白質。
【請求項２５】
二量体または四量体が２以上の核酸に結合し、任意に二量体または四量体の各融合蛋白質が核酸の反対鎖に結合する、請求項２４に記載の融合蛋白質の二量体または四量体。
【請求項２６】
（ａ）請求項２４に記載の第１の融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合することと、
（ｂ）請求項２４に記載の第２の融合蛋白質と第１のＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第１のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合することと、
（ｃ）請求項２４に記載の第３の融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合することと、
（ｄ）請求項２４に記載の第４の融合蛋白質と第２のＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、第２のＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合することと、
を含み、
それによって、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合が、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、
任意に、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが第１のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが第２のＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションし、
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡならびに／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたそれらのそれぞれのＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、ＤＮＡが細胞内に存在し、細胞が真核細胞または原核細胞である、２つのＤＮＡ分子間の部位特異的な組み換えのためのin vitroの方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項２４に記載の第１の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの一領域にハイブリダイゼーションする第１のｇＲＮＡに結合すること、
（ｂ）請求項２４に記載の第２の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第２の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第２の領域にハイブリダイゼーションする第２のｇＲＮＡに結合すること、
（ｃ）請求項２４に記載の第３の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第３の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第３の領域にハイブリダイゼーションする第３のｇＲＮＡに結合すること、
（ｄ）請求項２４に記載の第４の融合蛋白質とＤＮＡを接触させ、第４の融合蛋白質のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインが、ＤＮＡの第４の領域にハイブリダイゼーションする第４のｇＲＮＡに結合すること、
を含み、
それによって、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合蛋白質の結合が、ＤＮＡが組み換えられるような条件下で融合蛋白質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、
任意に、ステップ（ａ）〜（ｄ）のｇＲＮＡの２つがＤＮＡの同じ鎖にハイブリダイゼーションし、ステップ（ａ）〜（ｄ）の他の２つのｇＲＮＡがＤＮＡの反対鎖にハイブリダイゼーションし、
任意に、ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡが、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、ステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００塩基対以下離れたＤＮＡの領域にハイブリダイゼーションし、ＤＮＡが細胞内に存在し、細胞が真核細胞または原核細胞である、を含む単一のＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的な組み換えのためのin vitroの方法。
【請求項２８】
請求項１、２、４、１４、１５または２４のいずれか一項に記載の蛋白質または融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
請求項１、２、４、１４、１５または２４のいずれか一項に記載の蛋白質または融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む、組み換え蛋白質発現のためのベクター。
【請求項３１】
請求項１、２、４、１４、１５または２４のいずれか一項に記載の蛋白質または融合蛋白質を発現するための遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項３２】
核局在シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含み、任意に、１つまたは２つ以上のドメインがペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって離間され、ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカー、トリペプチドＧＧＳの１つもしくは２つ以上のリピートを含むアミノ酸配列、または図１２Ａにおいて提供されるいずれかの配列を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３３】
融合蛋白質が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２として示されているヌクレオチド配列、または配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２のいずれか１つのバリアントもしくは断片によってコードされる、請求項１に記載の融合蛋白質。