【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基、ならびに
(b)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基
を含み、かつPCSK9に特異的に結合する、ヒト涙液リポカリンのムテイン。
【請求項２】
PCSK9のアンタゴニストであり、
PCSK9へのLDL-Rの結合に関して競合的であり、
PCSK9への、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 33を含むモノクローナル抗体の結合に関して競合的であり、
PCSK9の媒介によるLDL-Rの下方調節を全面的にもしくは部分的に阻害でき、または
PCSK9の存在下でLDL取込みを回復させることができる、
請求項1に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３】
10nM以下の解離定数(KD)でヒト以外の霊長類のPCSK9またはその免疫原性断片、
10nM以下の解離定数(KD)でマウスPCSK9もしくはその免疫原性断片、または
10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、もしくは1pM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその断片
に結合する、請求項1または2に記載のリポカリンムテイン。
【請求項４】
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換：
Arg26→Ser、Phe、Trp、His、もしくはThr、
Glu34→Asn、Thr、Arg、もしくはGly、
Leu56→Met、Ser、Gln、Phe、His、もしくはAsn、
Ser58→Lys、Ala、Arg、Trp、もしくはPro、
Met31→Ala、Gly、His、Pro、Ser、Asp、Glu、もしくはGln、
Leu33→Tyr、Trp、Tyr、Phe、Pro、もしくはAla、
Ser61→TrpまたはPhe、
Asp80→Ser、Met、Pro、Ile、Gln、Tyr、Ser、Val、もしくはThr、
Glu104→Leu、Pro、Ser、Ala、Asn、Thr、Lys、もしくはAsp、
His106→Pro、Gln、Gly、Arg、Val、Thr、Asn、もしくはLeu、
Lys108→Gln、Ala、Trp、Tyr、Arg、Asp、Asn、Ser、Glu、もしくはThr、
Glu27→Arg、Ser、Gln、Thr、Phe、Lys、Ala、もしくはArg、
Pro29→Gly、Asp、Asn、Ile、Leu、もしくはMet、
Asn32→Ile、Leu、Tyr、Met、もしくはTrp、
Leu105→Cys、Tyr、Trp、Glu、Arg、Ser、His、Ala、Val、Asp、Pro、Gly、もしくはLys、
Phe28→Cys、Arg、Lys、Trp、Asp、Gly、His、Leu、もしくはAsn、
Glu30→Arg、Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、もしくはAsn、
Ile57→Tyr、Trp、His、Gln、Thr、もしくはArg、または
Lys83→Arg、Ser、Gln、Thr、もしくはGlu
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項５】
(I)成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つ：
2016519051.tif 000001
または、
(II)成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つ：
2016519051.tif 000002
または、
(III)成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せ：
2016519051.tif 000003
、好ましくはさらに、成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換：
2016519051.tif 000004
のうちの1つまたは複数、
または(IV) 成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せ：
2016519051.tif 000005
、好ましくはさらに、成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換：
2016519051.tif 000006
のうちの1つまたは複数
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項６】
成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に対して、位置28または位置105におけるシステイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含み、または成熟ヒト涙液リポカリンの配列に対して少なくとも75％の同一性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項７】
SEQ ID NO: 3〜28、62〜71、および82のいずれか1つに示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 23に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 13に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 20に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列、または
SEQ ID NO: 22に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列
を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項８】
標識部分にコンジュゲートされている、
対象の内部の特定の身体領域、生物、組織、器官、または細胞を標的とすることができる部分にコンジュゲートされている、
ムテインの血清半減期を延ばすことができる部分にコンジュゲートされている、
ポリアルキレングリコール分子にコンジュゲートされており、好ましくはSEQ ID NO: 30〜32のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、
アルブミン結合タンパク質にコンジュゲートされており、好ましくはSEQ ID NO: 83〜84のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、または
融合物に新しい特徴を与えることができる部分に融合されている、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項９】
PCSK9に結合する、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを作製する方法であって、
(a)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、
(i)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに
(ii)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数
における変異誘発に供し、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインをコードする1種または複数種の核酸分子を得る段階、
(b)(a)で得られた1種または複数種の核酸分子を発現系において発現させ、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを得る段階、ならびに
(c)(b)で得られた1種または複数種のムテインをさらに選択する段階
を含む方法。
【請求項１０】
(I)段階(c)が、
(ci)PCSK9またはその免疫原性断片を提供する段階、
(cii)選択によって得られた1種または複数種のムテインをPCSK9またはその免疫原性断片と接触させ、それによって、PCSK9またはその免疫原性断片とそれに対する結合親和性を有するムテインとの複合体の形成を可能にする段階、および
(ciii)結合親和性を有していない、または実質的な結合親和性を有していない、1種または複数種のムテインを除去する段階
をさらに含み、
(II)段階(c)における選択が、競合的条件下で実施され、または
(III)段階(a)が、
(a)(iii)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置79、92、および105のうちのいずれか1つまたは複数における変異誘発に供する段階
をさらに含む、
請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子またはSEQ ID NO: 36〜61、72〜81、および86〜89のいずれか1つに示す核酸分子。
【請求項１２】
請求項11に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１３】
対象の中のPCSK9に結合させるための、または
対象におけるLDL-RへのPCSK9の結合を阻害するための、
請求項1〜8のいずれか一項に記載のムテインまたはそのようなムテインを含む組成物の使用。
【請求項１４】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のムテインの使用であって、
(I) PCSK9の検出のための、
(a)ムテインを、PCSK9を含むと疑われる試験試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)適切なシグナルによって複合体を検出すること
を含む使用；
(II)PCSK9の分離のための、
(c)ムテインを、PCSK9を含むことになっている試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(d)試料から複合体を分離すること
を含む使用；または
(III) 化合物で処置すべき予め選択された生物、組織、器官、または細胞へとその化合物を標的指向させるための、
(e)ムテインを前記化合物とコンジュゲートさせること、および
(f)予め選択された生物、組織、器官、または細胞にムテイン/化合物複合体を送達すること
を含む使用。
【請求項１５】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のムテインを含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸配列の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
[本発明1001]
(a)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列の配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基、ならびに
(b)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列の配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基
を含み、かつPCSK9に特異的に結合する、ヒト涙液リポカリンのムテイン。
[本発明1002]
PCSK9のアンタゴニストであるリポカリンムテイン。
[本発明1003]
PCSK9へのLDL-Rの結合に関して競合的であるリポカリンムテイン。
[本発明1004]
PCSK9への、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 33を含むモノクローナル抗体の結合に関して競合的であるリポカリンムテイン。
[本発明1005]
PCSK9の媒介によるLDL-Rの下方調節を全面的にまたは部分的に阻害できるリポカリンムテイン。
[本発明1006]
PCSK9の存在下でLDL取込みを回復させることができるリポカリンムテイン。
[本発明1007]
10nM以下の解離定数(KD)でヒト以外の霊長類のPCSK9またはその免疫原性断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1008]
10nM以下の解離定数(KD)でマウスPCSK9またはその免疫原性断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1009]
10nM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1010]
1nM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1011]
0.1nM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1012]
1pM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1013]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Arg26→Ser、Phe、Trp、His、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1014]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu34→Asn、Thr、Arg、またはGly、Leu56→Met、Ser、Gln、Phe、His、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1015]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ser58→Lys、Ala、Arg、Trp、またはProのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1016]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Met31→Ala、Gly、His、Pro、Ser Aps、Glu、またはGlnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1017]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Leu33→Tyr、Trp、Tyr、Phe、Pro、またはAlaのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1018]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ser61→TrpまたはPhe、Asp80→Ser、Met、Pro、Ile、Gln、Tyr、Ser、Val、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1019]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu104→Leu、Pro、Ser、Ala、Asn、Thr、Lys、またはAspのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1020]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換His106→Pro、Gln、Gly、Arg、Val、Thr、Asn、またはLeuのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1021]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Lys108→Gln、Ala、Trp、Tyr、Arg、Asp、Asn、Ser、Glu、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1022]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu27→Arg、Ser、Gln、Thr、Phe、Lys、Ala、またはArgのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1023]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Pro29→Gly、Asp、Asn、Ile、Leu、またはMetのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1024]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Asn32→Ile、Leu、Tyr、Met、またはTrpのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1025]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Leu105→Cys、Tyr、Trp、Glu、Arg、Ser、His、Ala、Val、Asp、Pro、Gly、またはLysのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1026]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Phe28→Cys、Arg、Lys、Trp、Asp、Gly、His、Leu、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1027]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu30→Arg、Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1028]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ile57→Tyr、Trp、His、Gln、Thr、またはArgのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1029]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Lys83→Arg、Ser、Gln、Thr、またはGluのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1030]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
2016519051.tif 000007
。
[本発明1031]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
2016519051.tif 000008
。
[本発明1032]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
2016519051.tif 000009
。
[本発明1033]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換
2016519051.tif 000010
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1032のムテイン。
[本発明1034]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
2016519051.tif 000011
。
[本発明1035]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換
2016519051.tif 000012
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1034のムテイン。
[本発明1036]
成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に対して、位置28または位置105におけるシステイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1035のいずれかのムテイン。
[本発明1037]
成熟ヒト涙液リポカリンの配列に対して少なくとも75％の同一性を有する、本発明1001〜1036のいずれかのムテイン。
[本発明1038]
SEQ ID NO: 3〜28、62〜71、および82のいずれか1つに示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1039]
SEQ ID NO: 23に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1040]
SEQ ID NO: 13に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1041]
SEQ ID NO: 20に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1042]
SEQ ID NO: 22に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1043]
標識部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1044]
対象の内部の特定の身体領域、生物、組織、器官、または細胞を標的とすることができる部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1045]
ムテインの血清半減期を延ばすことができる部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1046]
ポリアルキレングリコール分子にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1047]
SEQ ID NO: 30〜32のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、本発明1046のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1048]
アルブミン結合タンパク質にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1049]
SEQ ID NO: 83〜84のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、本発明1048のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1050]
融合物に新しい特徴を与えることができる部分に融合されている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1051]
PCSK9に結合する、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを作製する方法であって、
(a)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、
(i)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに
(ii)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数
における変異誘発に供し、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインをコードする1種または複数種の核酸分子を得る段階、
(b)(a)で得られた1種または複数種の核酸分子を発現系において発現させ、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを得る段階、ならびに
(c)(b)で得られた1種または複数種のムテインをさらに選択する段階
を含む方法。
[本発明1052]
段階(c)が、
(ci)PCSK9またはその免疫原性断片を提供する段階、
(cii)選択によって得られた1種または複数種のムテインをPCSK9またはその免疫原性断片と接触させ、それによって、PCSK9またはその免疫原性断片とそれに対する結合親和性を有するムテインとの複合体の形成を可能にする段階、および
(ciii)結合親和性を有していない、または実質的な結合親和性を有していない、1種または複数種のムテインを除去する段階
をさらに含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
段階(c)における選択が、競合的条件下で実施される、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
段階(a)が、
(a)(iii)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置79、92、および105のうちのいずれか1つまたは複数における変異誘発に供する段階
をさらに含む、本発明1051〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
本発明1001〜1050のいずれかのムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1056]
SEQ ID NO: 36〜61、72〜81、および86〜89のいずれか1つに示す核酸分子。
[本発明1057]
本発明1055または1056の核酸分子を含む宿主細胞。
[本発明1058]
対象の中のPCSK9に結合させるための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインまたはそのようなムテインを含む組成物の使用。
[本発明1059]
対象におけるLDL-RへのPCSK9の結合を阻害するための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインまたはそのようなムテインを含む組成物の使用。
[本発明1060]
PCSK9の検出のための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを、PCSK9を含むと疑われる試験試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)適切なシグナルによって複合体を検出すること
を含む使用。
[本発明1061]
PCSK9の分離のための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを、PCSK9を含むことになっている試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)試料から複合体を分離すること
を含む使用。
[本発明1062]
化合物で処置すべき予め選択された生物、組織、器官、または細胞へとその化合物を標的指向させるための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを前記化合物とコンジュゲートさせること、および
(b)予め選択された生物、組織、器官、または細胞にムテイン/化合物複合体を送達すること
を含む使用。
[本発明1063]
本発明1001〜1050のいずれかのムテインを含むキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
いくつかの態様において、本開示によるヒト涙液リポカリンムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む:
2016519051.tif 000013
。