(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
50までのヌクレオチド単位長さを有するオリゴヌクレオチドであって、配列番号52または53の配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の糖間結合の少なくとも１つがホスホロチオエートである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチドの少なくとも１つが糖の2'位に修飾を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
キメラオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
細胞または組織中の蛋白質キナーゼＣ−αの発現を調節する方法であって、細胞または組織を、請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。
【請求項６】
試料中の蛋白質キナーゼＣ−αをコードする核酸分子の存在を検出する方法であって、試料を、請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。
【請求項７】
蛋白質キナーゼＣ−αの発現に関連する状態を治療する方法であって、ヒトを除く動物を有効量の請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。
【請求項８】
該状態が過増殖性状態である、請求項７の方法。
【請求項９】
蛋白質キナーゼＣ−αに関連する状態を診断する方法であって、該状態を有すると疑われるヒトを除く動物からの細胞、組織または体液を、in vitroまたはex vivoで、請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。
【請求項１０】
該状態が過増殖性状態である、請求項９の方法。
【請求項１１】
配列番号117に規定される配列を含む、50までのヌクレオチド単位長さを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号117に規定される配列を含む、50までのヌクレオチド単位長さを有するポリヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
試料中の、ヒト蛋白質キナーゼＣ−αをコードする遺伝子を検出する方法であって、試料を、請求項12記載のポリヌクレオチドプローブと、プローブと前記蛋白質キナーゼＣ−αをコードする遺伝子との間にポリヌクレオチドデュープレックスが形成しうる条件下で接触させ；ポリヌクレオチドデュープレックスの存在または不在を検出し、このことによりポリヌクレオチドデュープレックスの存在は前記遺伝子の存在を示す、ことを含む方法。
【請求項１４】
ある状態に関連する蛋白質キナーゼＣ−αの存在をスクリーニングする方法であって、該状態を有すると疑われる動物からの細胞、組織または体液を、in vitroまたはex vivoで、請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させ、そしてハイブリダイゼーションを検出することを含み、ここでハイブリダイゼーションは蛋白質キナーゼＣ−αの存在を示す方法。
【請求項１５】
該状態が過増殖性状態である、請求項14の方法。
【請求項１６】
配列番号106に規定される配列に相補的である、50までのヌクレオチド単位長さを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号106に規定される配列に相補的である、50までのヌクレオチド単位長さを有するポリヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はプロテインキナーゼＣの発現の変調に応答する疾病状態のための治療、診断および研究用試薬に関する。特に、本発明はプロテインキナーゼＣに関連する核酸と特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドがプロテインキナーゼＣの発現を変調することが見いだされた。軽減および治療効果が得られた。
背景技術
蛋白質のリン酸化は細胞内への細胞外信号の導入において中心的な役割を果たしている。そのようなリン酸化を引き起こすキナーゼと称される酵素は成長因子、ホルモンおよび細胞の代謝、増殖および分化に関与するその他の因子の作用標的である。主たる信号伝達経路の一つに酵素プロテインキナーゼＣ（PKC）が含まれており、細胞増殖および分化に重大な影響を与えることが知られている。PKCは、信号伝達において放出される代謝産物であるジアシルグリセロール（DAG）により活性化される。
ホルボールエステルと称される一群の発癌促進剤が細胞性レセプターを通して細胞にそれらの多面的な効果を示す場合において、PKCが主たる、および多分唯一の細胞性レセプターであることが発見されたことからPKCに関しての興味がかき立てられた（Gescher  et  al.,Anti−Cancer  Drug  Design_1989,4,93−105）。腫瘍生成が可能なホルボールがPKCの活性化においてDAGの効果を模倣しうることは、これらの発癌促進剤がPKCを通して作用し、この酵素の活性化が少なくとも部分的には腫瘍発生の原因になることを示唆している（Parker  et  al.,Science  1986,233,853−866）。
実験的証拠は、PKCが結腸癌の増殖制御において一つの役割を果たしていることを示している。腸管中の特定の細菌が脂質をDAGに変換し、PKCを活性化し細胞の増殖を変化させていると信じられている。このことは高い食物脂肪と結腸癌の間の相関を説明するものであろう（Weinstein,Cancer  Res.（Suppl.）1991,51,5080s−5085s）。また、結腸直腸癌の患者の結腸粘膜中のPKCの大部分は、癌を持たない患者のものと比較すると活性化された状態にあることが示されている（Sakanoue  et  al.,Int.J.Cancer  1991,48,803−806）。
高進された腫瘍発生はまた、ヌードマウス内に接種された培養細胞中のPKCの過剰発現とも相関している。PKCの突然変異形は高進された転移能を持つ非常に悪性の腫瘍細胞を誘導する。
スフィンゴシンおよび関連するPKC活性の阻害剤は、インビボにおいて腫瘍細胞増殖および放射線誘発形質転換を阻害することが示されている（Endo  et  al.,Cancer.Research  1991,51,1613−1618;Borek  et  al.,Proc.Natl.Acad.Sci  1991,88,1953−1957）。多くの実験的にまたは臨床的に有用な抗癌剤はPKCに対して変調効果を示す。従って、PKCの阻害剤は重要な癌の予防または治療剤であろう。PKCは通常の抗癌剤のより合理的な設計のためのもっともらしい標的であることが示唆されてきた（Gescher,A.およびDale,I.L.,Anti−Cancer  Drug  Design  1989,4,93−105）。
また、実験はPKCが乾癬および皮膚癌のような過増殖性皮膚疾患の病理生理学において重要な役割を果たしていることを示している。乾癬は炎症、表皮の過増殖および細胞分化の減少により特徴付けられる。種々の研究はこれらの症状を引き起こす上でのPKCの役割を示唆している。培養ケラチン細胞におけるPKC刺激が過増殖を起こすことを示すことができる。炎症はホルボールエステルにより誘発でき、PKCにより制御される。DAGは皮膚病性疾患にPKCが関与することに関係しており、乾癬性病変において多量に生成される。
PKCの阻害剤はインビトロにおいて抗増殖性および抗炎症性効果の両方を有することが示されている。シクロスポリンＡおよびアントラリンのような抗乾癬薬はPKCを阻害することが示されている。PKCの阻害は乾癬の処置に対する治療法として示唆されてきた（Hagemann,L.およびG.Mahrle,Pharmacology  of  the  Skin,H.Mukhtar編、CRC  Press,Boca  Raton,FL,1992,p.357−368）。
PKCは単一の酵素ではなく一群の酵素である。現在のところ、少なくとも７つのPKCのイソ型（イソ酵素）が同定されている：α、β、γ、δ、ε、ζ、およびη。これらのイソ酵素は組織および器官分布の異なるパターンを有し（総説としてNishizuka,Nature  1988,334,661−665を参照されたい）、異なる生理学的機能を果たしているのであろう。例えば、PKC−γは中枢神経系でのみ発現されるらしい。PKC−αおよび−βはほとんどの組織で発現されるが、異なる細胞型においては異なる発現のパターンを有する。例えば、PKC−αおよびPKC−βの両方ともヒト表皮に発現され、それから精製されている。PKC−αは主として表皮の基底層のケラチン細胞中に検出されたが、PKC−βは主として表皮の中間層およびランゲルハンス細胞中に観察される。PKC−ηは主に皮膚および肺で観察されており、これらの組織での発現レベルは脳におけるレベルよりも高い。このことは、脳に最も豊富に発現される傾向があるPKC群の他の構成要素とは対照的である（Osada  et  al.,J.Biol.Chem.1990,265,22434−22440）。他のPKCイソ酵素であるPKC−ζは、増殖カスケードの制御において重要な役割を果たしていると考えられている。これは、XenopusPKC−ζのAUGを標的とするアンチセンスRNA、ペプチド阻害剤または15−merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Xenopus卵母細胞においてPKC−ζのレベルを枯渇させることによって示された。これらの枯渇された卵母細胞は、インシュリンに応答する成熟に耐性であるが、プロゲステロンにより活性化される成熟経路は影響を受けなかったことが示された。WO93/20101。ここに掲げたPKCイソ酵素は本発明による標的化に好適であるが、PKCの他のイソ酵素もまた本発明に包含される。
現在のところ、異なるPKCイソ酵素はそれらが発現される器官または組織に依存して種々の疾患過程に関与すると信じられている。例えば、乾癬病変においてはPKC−αおよびPKC−β間の比が変化しており、正常皮膚と比較してPKC−βが優先して失われている（Hagemann,L.およびG.Mahrle,Pharmacology  of  the  Skin,H.Mukhtar編、CRC  Press,Boca  Raton,FL,1992,p.357−368）。
ある１つのイソ酵素についてさえも、単一の遺伝子から発現された多数のRNA転写産物がありうる。例えば、PKCαの場合、２つのmRNA転写産物、すなわちロング（約8.5kb）転写産物およびショート（約4kb）転写産物が見られる。ネズミおよびウシPKCα遺伝子からも多数のPKCα転写産物が生成される。ロング転写産物とショート転写産物との比は、種によってさまざまであり、組織によってもさまざまであると考えられる。さらに、この比と細胞の増殖段階との間にはある関連性があるかもしれない。
多数の化合物がPKC阻害剤として同定されているが（総説としてHidakaおよびHagiwara,Trends  in  Pharm.Sci.1987,8,162−164を参照されたい）、特異的にPKCを阻害するものはほとんど見いだされていない。１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）のようなキノリン  スルホンアミド誘導体はマイクロモル濃度でPKCを阻害するが、それらはPKCおよびcAMP−依存性およびcGMP−依存性プロテインキナーゼに対して類似の酵素阻害動力学を示している。ストレプトマイセス（Streptomyces）種のアルカロイド生成物であるスタウロスポリンおよびその類似体は、現在同定されている内で最も強力なPKCのインビトロ阻害剤である。しかしながらそれらは異なるプロテインキナーゼ間では限られた選択性しか示さない（Gescher,Anti−Cancer  Drug  Design  1989,4,93−105）。あるセラミドおよびスフィンゴシン誘導体は、PKC阻害活性を有し、治療用に使用される見込みを有することが示されているが、この酵素の特異的阻害剤についての長い間の要求が存在する。
また、研究の道具および特定のイソ酵素と関連するかもしれない疾患の治療の両方として、特定のPKCイソ酵素を阻害することが望まれている。Godsonら（J.Biol.Chem.268:11946−11950（1993））は、最近、サイトメガロウイルスプロモーター系発現ベクターにおけるアンチセンスPKC−α  cDNAの安定なトランスフェクションを用いて、PKC−α蛋白質の発現が特異的に約70％減少させることを開示した。この阻害により、ホルボールエステルPMAに応答するホスホリバーゼA2−介在アラキドン酸放出が欠失することが示された。同一の研究者による、オリゴデオキシヌクレオチドを用いてPKC活性を阻害しようとする試みは、オリゴヌクレオチドの分解のため最終的には成功しなかった。
発明の目的
本発明の主たる目的は、プロテインキナーゼＣに関連する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供することである。
本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素に関連する疾患のための選択的治療法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの発現を変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明の別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現を選択的に変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
さらに別の目的は、プロテインキナーゼＣに関連する疾患の診断手段を提供することである。
本発明のさらなる目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素に関連する疾患を区別する診断手段を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、プロテインキナーゼＣの発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、プロテインキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。
本発明の目的は、PKCαのロングmRNA転写産物に独特の配列を含む、ヒトPKCαの3'−非翻訳領域をコードする新規な核酸分子を提供することである。
本発明の別の目的は、PKCαの特定のmRNA転写産物の発現を選択的に変調しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヒトPKCの検出用のポリヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、PKCαの特定のmRNA転写産物を検出するポリヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、PKCαの特定のmRNA転写産物に関連する疾患を区別する診断手段を提供することである。
本発明の目的は、PKCαに関連する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供することである。
本発明の別の目的は、PKCαの特定のmRNA転写産物に関連する疾患のための選択的治療法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、PKCαの特定の転写産物の発現の影響およびそれらに関連する疾患の研究のための研究道具を提供することである。
本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の記載を考察することにより明らかとなるであろう。
図の簡単な説明
図１（ａ）および（ｂ）は、PKC−αとハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドの、PKC発現に対する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレオチドはPKC標的領域の5'から3'に配置される。
図２は、A549細胞をオリゴヌクレオチドで処理した後のPKC−α蛋白質レベルの用量依存性減少を示す線グラフである。▼＝ISIS  4632;■＝ISIS  4649;●＝ISIS  4636;▲＝ISIS  4648。
図３は、A549細胞をオリゴヌクレオチドで処理した後のPKC−α  mRNAの減少を示す棒グラフである。斜線を付けた棒は8.5kb転写産物を表し、白抜きの棒は4.0kb転写産物を表す。
図４は、デオキシギャップの長さとキメラオリゴヌクレオチドのPKCに対する活性との間の関係を示す線グラフである。
図５は、異なるデオキシギャップ長さを有するキメラオリゴヌクレオチド（すべて配列番号３）の用量依存曲線を示す線グラフである。
図６は、配列番号３のいくつかの2'−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの、PKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響を示す棒グラフである。斜線を付けた棒は8.5kb転写産物を表し、白抜きの棒は4.0kb転写産物を表す。
図７は、配列番号３のいくつかの2'−Ｏ−メチルおよび2'−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチド（6996、7273）の、PKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜線を付けた棒は8.5kb転写産物を表し、白抜きの棒は4.0kb転写産物を表す。
図８は、配列番号３の別の2'−Ｏ−メチルおよび2'−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチド（7008、7294）の、PKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響を示す棒グラフおよび図表である。斜線を付けた棒は8.5kb転写産物を表し、白抜きの棒は4.0kb転写産物を表す。
図９は、別のオリゴヌクレオチドの、PKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響を示す一組の棒グラフである。図9Aは、オリゴヌクレオチド6632、6653および6665を示す。図9Bは、オリゴヌクレオチド3521（比較のため）、7082、7083および7084を示す。斜線を付けた棒は8.5kb転写産物を表し、白抜きの棒は4.0kb転写産物を表す。
図10は、ISIS3521の抗腫瘍活性を示す線グラフである。それぞれの破線は、対照オリゴヌクレオチドで処理した１匹の動物の腫瘍体積を表し、それぞれの実線は、ISIS3521で処理した１匹の動物の腫瘍体積を表す。
図11は、ヌードマウスにおけるヒトMDA−MB231腫瘍の成長に及ぼすオリゴヌクレオチドの影響を示す一組の線グラフである。図11Aは、ISIS3521について得られた結果を示し、図11BはISIS3527について得られた結果を示す。それぞれの線は１匹の動物における腫瘍体積を表す。●＝対照；○＝オリゴヌクレオチド、60mg/kg;△＝オリゴヌクレオチド、6mg/kg。
図12は、A549細胞におけるPKC−η発現に及ぼす20merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの影響を示す棒グラフである。
図13は、ヒトPKCα遺伝子の3'−非翻訳領域の一部の、先に知られている配列の3'末端に近いBcl I部位から始まり、3'方向に伸ばしたヌクレオチド配列（配列番号104）である。新たに決定された配列は、ヌクレオチド56から始まり、下線が施されている（配列番号105）。太字の配列は、PKCαのロングmRNA転写産物に独特である（配列番号106）。
図14は、オリゴヌクレオチド7911（配列番号117）で処理した後の細胞におけるPKCα  mRNAレベル（対照のパーセントとして表す）の経時変化を示す線グラフである。ショートmRNA転写産物およびロングmRNA転写産物の両方のレベルが示されている。ショートmRNA転写産物のレベルは実線で示される。ロングmRNA転写産物のレベルは破線で示される。ISIS7911（配列番号117）処理から12時間後までに、両方のメッセンジャーのレベルは80％以上減少した。
発明の要約
本発明に従うと、PKCをコードする遺伝子に由来するDNAまたはRNAと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、そのような特異的ハイブリダイゼーションを行うのに十分な同一性および数のヌクレオチド単位を含む。この相関関係は普通、「アンチセンス」と称されている。一つの好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の翻訳開始コドンと特異的にハイブリダイズすることができ、好ましくは配列CATを含む。別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは遺伝子の5'−非翻訳または3'−非翻訳領域と特異的にハイブリダイズしうる。さらに別の好ましい態様においては、特定のPKCイソ酵素またはPKCイソ酵素の特定の組をコードするDNAまたはmRNAと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存在させることができる。
別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、改良された標的親和性、細胞への取り込みまたは細胞性ヌクレアーゼの存在下における安定性等のいくつかの望ましい性質を与えるような、１つまたはそれ以上の化学的修飾を含む。そのような用途を有する修飾の例としては、2'−Ｏ−アルキルおよび2'−フルオロ糖修飾およびホスホロチオエート主鎖修飾が挙げられる。
本発明の別の観点は、細胞または組織中のPKCまたは特定のPKCイソ酵素またはイソ酵素の組の発現を変調するための方法に関する。本発明の他の観点は、PKCをコードするDNAまたはRNAの細胞または組織における検出法、および特定のPKCイソ酵素をコードするDNAまたはRNAの細胞または組織における特異的検出法に関する。そのような方法は、前記RNAまたはDNAの作用を妨害するためまたは検出するために、前記遺伝子を含むと疑われる細胞または組織を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
本発明の別の観点は、PKCまたはそのイソ酵素の一つに関連する疾患を有すると疑われる動物の診断および治療法に関する。そのような方法は、PKCの発現を変調するため、PKCに関連する状態を処置するため、またはその診断を行うために、動物または動物からの細胞または組織または体液を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
本発明は、ヒトPKCαの3'−非翻訳領域の一部をコードする核酸配列を提供する。ポリヌクレオチドプローブおよびPKCαを検出する方法もまた提供される。本発明のいくつかの態様においては、PKCαの特定のmRNA転写産物に特異的な核酸配列、ならびにこの転写産物を特異的に検出するためのポリヌクレオチドプローブおよび方法が提供される。
本発明の他の態様に従えば、PKCαをコードする核酸に特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。さらに別の態様においては、PKCαの特定のmRNA転写産物と特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、便利にかつ望ましくは、薬学的に許容しうる担体中に存在させることができる。
本発明のさらに別の観点においては、細胞において、PKCαまたは特定のPKCα  mRNA転写産物の発現を変調させる方法が提供される。本発明のさらに別の観点は、細胞においてPKCαをコードする核酸を検出する、および細胞において特定のPKCα転写産物をコードする核酸を検出する方法に関する。そのような方法は、前記核酸の効果を妨害するまたは前記核酸を検出するために、細胞を本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
本発明のさらに別の態様においては、PKCαまたはその転写産物の１つの発現に関連する疾患を有する動物を治療する方法が提供される。そのような方法は、PKCαの発現を変調するため、PKCαに関連する状態を処置するため、またはその診断を行うために、動物を治療的有効量の本発明に従うオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
発明の詳細な説明
現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くのヒトの疾患の治療のための治療剤として受け入れられている。オリゴヌクレオチドはワトソン−クリック塩基対により定義されているごとく、DNA、pre−mRNAまたは成熟mRNAの相補的配列と特異的に結合（ハイブリダイズ）して、DNAから蛋白質への遺伝的情報の流れを妨害する。標的配列に対して特異的にさせられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質はまた、それらを非常に有用なものにしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは単量体単位の長い鎖であるため、それらは任意の標的RNA配列に対して容易に合成することができる。多くの最近の研究は、標的蛋白質研究のための生化学的道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用性を述べている（Rothenberg  et  al.,J.Natl.Cancer  Inst.1989,81,1539−1544;Zon,G.,Pharmaceutical  Res.1988,5,539−549）。オリゴヌクレオチド化学の最近の進歩、および増強された細胞取り込み、標的結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチドの合成により、現在では治療法の新しい形態としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を考えることが可能である。例えば、ｃ−mybを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、急性骨髄性白血病を有する患者に由来する骨髄からの骨髄性白血病細胞が完全に排除された（Gewirtz  and  Calabretta,米国特許第5,098,890号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトにおいて、サイトメガロウイルス網膜炎感染の治療のための臨床的効力を有することが示されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PKCに関連する状態を治療するための従来の方法で直面する問題点の理想的な解決法を提供する。それらは問題とするイソ酵素またはイソ酵素の特定の組を選択的に阻害するように、または、問題とするイソ酵素の群の全てのメンバーを阻害するように設計することができる。
プロテインキナーゼＣの活性または代謝を変調する現在の薬は、それらの特異性の欠如による多くの許容できない副作用を有するか、または酵素の阻害において限られた有効性しか示さない。本発明は従来の研究者が直面した問題を、酵素を直接的に阻害するのではなく酵素の産生を変調することにより解決し、治療効果を達成する。本発明においては、オリゴヌクレオチドは直接mRNAまたは遺伝子にハイブリダイズし、最終的に遺伝子から産生されるPKC蛋白質の量を変調する。本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、通常は反対側の核酸鎖のまたは１つの核酸鎖中の２つの領域の相補的塩基の間で水素結合（ワトソン−クリック塩基対形成としても知られている）して二本鎖デュープレックスを形成することを意味する。グアニンおよびシトシンは、これらの間に３つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。アデニンおよびチミンは、これらの間に２つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。「特異的にハイブリダイズしうる」および「実質的に相補的な」とは、特異的結合が望まれる条件下（すなわち、インビボアッセイおよび治療的処置の場合には生理学的条件、インビトロアッセイの場合にはアッセイを実施する条件）で、オリゴヌクレオチド（またはポリヌクレオチドプローブ）の、非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を示す用語である。特異的にハイブリダイズしうるためには、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブはその標的核酸配列と100％相補的である必要はないことが理解されるであろう。
オリゴヌクレオチドとその相補的（または「標的」）核酸との間の関係は、一般に「アンチセンス」として称される。
アンチセンス攻撃のために特定の遺伝子を標的とすることが好ましい。PKCα、β、γ、δ、ε、ζおよびηをコードする遺伝子が特にこの方法のために有用であることが発見されている。PKC発現の阻害は、疾患の治療、特に過増殖性および炎症性疾患の治療に有用であると予期される。しかし、本発明の文脈においては、「変調」とは、PKC発現の増加または減少（促進または阻害）のいずれかを意味する。
本発明の文脈において、術語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基および天然のホスホジエステル結合により連結されたペントフラノシル（糖）基から形成されたポリヌクレオチドを意味する。この術語は実際上、天然に存在する化学種または天然に存在するサブユニットまたはそれらの密接な類似体から形成された合成種を意味する。
術語「オリゴヌクレオチド」はまた、天然に存在するオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在しない部分を有する成分を意味してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは変更された糖部分、核塩基または糖間（主鎖）連結を有していてもよい。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、増強された標的結合親和性およびヌクレアーゼの存在下における増加した安定性等の性質のため、しばしば天然形よりも好ましい。
本発明において意図されるいくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例としては、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間連結または短鎖複素原子または複素環糖間連結等の、糖間主鎖連結を含むものが挙げられる。最も好ましいものは、CH2−NH−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2、CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2、およびＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2主鎖（ここでホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−CH2である）を有するものである。ホスホロチオエートもまた最も好ましい。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。Summerton,J.E.and  Weller,D.D.、米国特許出願第5,034,506号。ペプチド核酸（PNA、「蛋白質核酸」とも称される）主鎖等の別の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖はポリアミド主鎖に置き換えられていてもよく、ここでヌクレオシドの塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子またはメチレン基に直接または間接的に結合されている（例えば、P.E.Nielsen,M.Egholm,R.H.Berg,O.Buchardt,Science  1991,254,1497、および米国特許出願第08/054,363号（1993年４月26日出願）を参照のこと、これらを本明細書の一部としてここに引用する）。別の好ましい態様にしたがえば、ホスホジエステル結合は、キラルでありかつ対掌体特異的である構造で置換されている。当業者は本発明の実施に使用するための別の結合を選択することが可能であろう。
オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾核塩基を含む化学種を含んでいてもよい。すなわち、天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンをそのように用いてもよい。同様に、本発明の本質的教義から離れない限りは、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾もまた有効である。そのような修飾の例は2'−Ｏ−アルキル−および2'−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明において有用である糖部分の2'位における修飾のいくつかの特定の例は、OH、SH、SCH3、Ｆ、OCN、Ｏ（CH2）nNH2、またはＯ（CH2）nCH3（式中、ｎは１から約10である）;C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル;Cl;Br;CN;CF3;OCF3;O−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル;O−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル;RNA開裂基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬理学的性質を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改良するための基、または類似の性質を有するその他の置換基である。１つまたはそれ以上のペントフラノシル基が、他の糖、シクロブチル等の糖模倣体または糖の代わりになる他の成分で置換されていてもよい。
キメラまたは「ギャップを有する」オリゴヌクレオチドもまた、本発明の好ましい態様である。これらのオリゴヌクレオチドは、二つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を有し、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドを含む。典型的には、１つまたはそれ以上の領域は、１つまたはそれ以上の有利な性質、例えば増加したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞への取り込みまたはRNA標的への増加した結合親和性を付与する修飾されたヌクレオチドを含む。１つまたはそれ以上の非修飾または異なるように修飾された領域は、RNAseH活性を指示する能力を保持する。キメラオリゴヌクレオチドは、本出願の出願人に譲渡されているPCT出願US92/11339に開示されており、この内容をすべて本明細書の一部としてここに引用する。現在のところ好ましいキメラオリゴヌクレオチドの例は、2'−デオキシヌクレオチドの「デオキシギャップ」を有する2'−Ｏ−メチルまたは2'−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドである。通常は、このデオキシギャップ領域は２つの2'−アルキル域の間に位置している。これらの好ましい態様においては、糖間（主鎖）連結は、均一なホスホロチオエートまたはホスホロチオエート連結とホスホジエステル連結のある種の組み合わせでありうる。
すべてのそのようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド（または、天然のラインに沿って合成されたオリゴヌクレオチド）と機能的に交換可能であるが、天然の構造とは一つまたはそれ以上の相違を有するものとして記述するのが最適であろう。すべてのそのようなオリゴヌクレオチドは、PKC  RNAとハイブリダイズするのに有効に機能する限り、本発明に包含される。
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ましくは約５から約50ヌクレオチド単位を含む。約８から30のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドがより好ましく、約12から25のヌクレオチド単位を有するものがさらにより好ましい。理解されるように、ヌクレオチド単位とは、ホスホジエステルまたは主鎖構造を形成する他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位に適切に結合されている塩基−糖の組み合わせ（または類似の構造の組み合わせ）である。
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技術により都合よくかつ日常的に作製することができる。そのような合成のための装置はApplied  Biosystemsを含むいくつかの販売元から市販されている。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は機械的に仕事を処理する人の能力の範囲内である。ホスホロチオエートまたはアルキル化誘導体等の他のオリゴヌクレオチドを合成するために類似の技術を使用することもよく知られている。他の修飾および置換オリゴマーは、同様にして合成することができる。
本発明に従うと、当業者は、メッセンジャーRNAは、３文字遺伝コードを用いて蛋白質をコードしている情報を含むコーディング領域のみならず、5'−非翻訳領域、3'−非翻訳領域、5'キャップ領域およびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとして当業者に知られている領域を形成する付随するリボヌクレオチドをも含むことを理解するであろう。従って、これらの付随するリボヌクレオチドならびにコーディングリボヌクレオチドの全体または一部を標的とするオリゴヌクレオチドを本発明に従って形成することができる。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、5'キャップ領域、イントロン／エクソン結合部、コーディング配列または5'−もしくは3'−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリダイズすることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、PKC遺伝子またはPKC遺伝子に由来するメッセンジャーRNAにハイブリダイズしうるように設計される。そのようなハイブリダイゼーションが達成された場合、メッセンジャーRNAの正常な役割を妨害し、細胞におけるその機能の変調が生ずる。妨害されるべきメッセンジャーRNAの機能には、蛋白質翻訳部位へのRNAのトランスロケーション、RNAから蛋白質への実際の翻訳、一つまたはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、および多分RNAに携わっているであろう独立した触媒活性のような全ての生体機能が含まれる。RNA機能へのそのような妨害の全体の効果はPKC遺伝子発現の変調である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬、治療薬、予防薬および研究用試薬およびキットとして使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはPKC遺伝子およびmRNAにハイブリダイズするため、この事実を利用してサンドイッチおよびその他のアッセイを容易に組み立てることができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはPKC  mRNAの特定のイソ酵素にハイブリダイズするため、特定のPKCイソ酵素についての細胞および組織のスクリーニングのためのアッセイが工夫できる。そのようなアッセイは種々のPKC形に関連する疾患の診断に利用することができる。PKC遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する手段の準備は日常的に達成される。そのような準備には、酵素のコンジュゲート、放射性標識または別の適した検出系が含まれる。PKCの存在または不在を検出するためのキットもまた製造されるであろう。
治療または予防処置のために、オリゴヌクレオチドが本発明に従って投与される。オリゴヌクレオチドは医薬組成物中に処方され、それにはオリゴヌクレオチドに加えて、担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性化剤などが含まれているであろう。医薬組成物は、オリゴヌクレオチドに加えて、一つまたはそれ以上の活性成分、例えば抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬を含んでいてもよい。
医薬組成物は、局所または全身の処置が望まれているか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与することができる。投与は局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、吸入により、または非経口で（例えば、静脈内点滴または皮下、腹腔内または筋肉内注射）実施されるであろう。
局所投与のための処方には軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末もしくは油性基剤、粘稠化剤等が必要かまたは望ましいであろう。コーティングしたコンドームもまた有用であろう。
経口投与のための処方には、散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプセル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。
非経口投与のための処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。
投与量は処置されるべき状態の重度および応答性に依存するが、通常は、数日から数カ月の処置過程で、治癒が達成されるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで、一日当たり一回またはそれ以上の投与量であろう。当業者は最適の投与量、投与法および反復率を容易に決定することができる。
本発明はまた、ヒトPKCαの3'−非翻訳領域をコードする配列を有する核酸分子を提供する（図13）。この配列は、ヒトA549細胞から調製されたcDNAクローンから決定され、先に公表されたPKCα配列（Finkenzeller  et  al.,Nucl.Acids  Res.18:2183（1990）;Genbank受託番号X52479）の3'−最末端と重なるクローンから始まり、3'方向に伸びている。1080ヌクレオチドの後に達するポリアデニル化部位（図13中のヌクレオチド1136）は、PKCαのショート（4kb）mRNA転写産物の3'末端として同定された。3'方向の追加の676ヌクレオチドの配列が決定され、この配列はPKCαのロング（8kb）mRNA転写産物に独特である。本発明の核酸分子は、好ましくはデオキシリボ核酸からなり、本発明のいくつかの観点においては二本鎖である。また、本発明に従えば、該核酸分子が単離される。本明細書で用いられる「単離された」との用語は、実質的に均一であるように精製されまたは合成された分子を意味する。この用語は、ある種の不純物が組成物中に存在する可能性を排除するものではなく、関連性のない核酸配列が存在しないことを意味する。
本発明に従えば、ヒトPKCα遺伝子の3'−非翻訳領域の一部に特異的にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドプローブが提供される。PKCαのロングmRNA転写産物の一部に特異的にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドプローブもまた提供される。このようなプローブを診断または研究目的に使用して、PKCαの発現を検出しまたは定量化することができる。プローブを用いて、PKCαのロング転写産物を特異的に検出しまたは定量化することができる。該ポリヌクレオチドプローブは、約５から約50ヌクレオチド単位の長さの範囲でありうる。本発明のより好ましい態様においては、プローブは約８から約30ヌクレオチド単位の長さである。理想的には、該プローブは、約12から約25ヌクレオチド単位の範囲の長さである。本発明のポリヌクレオチドプローブは理想的には50ヌクレオチド長さを越えないため、該プローブは標的配列の一部にのみ特異的にハイブリダイズすることが認識されるであろう。当業者は、標的化されるべきPKCα配列の部分を同定することができる。最も適切には、標的配列は独特であるように選択され、このことにより、プローブの標的以外へのハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドノイズが減少する。例えば、アデニンヌクレオチド単位の反復配列は、多くの遺伝子に生ずる共通配列であるため、当業者はそのような配列を選択しないであろう。実施する者は、有用なプローブを同定し設計するために、Genbank等の配列受託機関において見いだされる配列の探索および比較を行うことを選択するであろう。そのような方法は、独特の配列を同定するために慣用的に用いられている。これらの独特の配列は、プローブとして用いる場合、PKCαの発現の制御に決定的である必要はない。
以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限することを意図したものではない。
実施例１  オリゴヌクレオチド合成
非修飾DNAオリゴヌクレオチドは、ヨウ素により酸化する標準ホスホロアミダイトの化学を使用する自動化DNAシンセサイザー（Applied  Biosystems  モデル380B）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミダイトはApplied  Biosystems（Foster  City,CA）から購入した。ホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドについては、ホスファイト結合の段階的チオ化のために、標準酸化ボトルを3H−1,2−ベンゾジチオール−３−オン  1,1,−ジオキシドの0.2Mアセトニトリル溶液に置き換えた。チオ化サイクル待ち時間は68秒に増加し、続いてキャッピング工程を実施した。
2'−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホルアミダイトを2'−Ｏ−メチル  β−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト（Chemgenes,Needham,MA）に置き換え、テトラゾールおよび塩基のパルス放出の後の待ち時間を360秒に増加して、上述の方法にしたがって合成した。同様に、2'−Ｏ−プロピルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この方法をわずかに変更して製造することができる。
オリゴヌクレオチドは、制御細孔ガラスカラム（Applied  Biosystems）から切断し、55℃で18時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した後、2.5容量のエタノールおよび0.5M  NaClから二回沈澱させることにより精製した。分析ゲル電気泳動は、20％アクリルアミド、8M尿素、45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0で実施した。
試験したオリゴヌクレオチドは表１に示されている。配列データは、Finkernzeller  et  al.,Nucl.Acids  Res.1990,18,2183;Genbank受託番号X52479により発表されたcDNA配列からのものである。オリゴヌクレオチドの下に与えられている配列番号はcDNAで配列決定されるべき第一の残基（ATG開始コドンの上流の28番目の残基）に対して相対的なものである。
0003553068.tif 000002
0003553068.tif 000003
実施例２  細胞培養およびホルボールエステルおよびPKC−αを標的とするオリゴヌクレオチドによる処理
PKC蛋白質半減期は6.7時間から24時間まで変動することが報告されている（Young  et  al.,Biochem.J.1987,244,775−779;Ballester  et  al.,J.Biol.Chem.1985,260,15194−15199）。これらの長い半減期のため長いインキュベーション時間が必要とされ、アンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングする場合、PKC−αの定常状態を阻害することは実際的ではない。したがって、PKCの細胞内レベルを可逆的に低くするホルボールエステルの能力を利用した。細胞をホルボールエステルで処理すると、最初にキナーゼ活性の活性化、続いてPKCのダウンレギュレーションが起こる。PKC−αについては、このダウンレギュレーションは、キナーゼの合成速度は明らかに変化せずに蛋白質分解の速度が増加した直接の結果であることが示されている。
ヒト肺癌腫（A549）細胞において、Krug  et  al.,J.Biol.Chem.1987,262,11852−11856の方法の変法を用いたホルボールエステル  12,13−ジブチレート（PDBu）の処理は、PKC−α  mRNAレベルに影響を与えずにPKC−αの細胞レベルを低下させ、この効果は可逆的であることが決定された。PKC−αを標的とするオリゴヌクレオチドの効力をスクリーニングするアッセイの基本は、最初にPDBuで長期間処理することによりPKC−α蛋白質レベルを低下させ、細胞をよく洗浄することによりPDBuを除去し（これにより細胞は新規のPKC−α蛋白質を合成することができる）、新PKC−α蛋白質の再合成を阻害するために細胞をオリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることである。
方法:A549細胞（American  Type  Culture  Collection,Bethesda  MDから入手した）を、６−ウェルプレート（Falcon  Labware,Lincoln  Park,NJ）上、1gグルコース／リットルおよび10％ウシ胎児血清（FCS,Irvine  Scientific,Santa  Ana,CA）を含むダルベッコ改良イーグル培地（DME）中でコンフルエントになるまで増殖させた。
細胞を500nMのPDBu（Sigma  Chem.Co.,St.Louis,MO）で12−16時間（終夜）処理した。次に、細胞をDMEで37℃で３回洗浄し、20μｌのDOTMA（Lipofectin試薬,BRL,Bethesda,MD）を含む1mlのDMAを加えた。オリゴヌクレオチドを１μＭの濃度となるよう添加し、細胞を37℃でさらに４時間インキュベートした。
細胞を0.1mg/ml  BSAを含む3mlのDMEで１回洗浄し、0.1mg/mlBSAを含む2mlのDMEをさらに加えた。オリゴヌクレオチド（１μＭ）を加えて細胞を37℃で24時間インキュベートした。
細胞をリン酸緩衝化塩溶液（PBS）中で３回洗浄し、細胞蛋白質を120μｌの試料緩衝液（60mM  トリス  pH6.8,2％SDS,10％グリセロール,10mMジチオスレイトール）中に抽出して５分間煮沸した。PKC−α蛋白質の細胞内レベルはイムノブロッティングにより決定した。
実施例３  PKC発現のイムノブロットアッセイ
細胞抽出物を10％SDS−PAGEミニゲル上で電気泳動した。分離した蛋白質を電気泳動的移動によりImmobilon−Ｐ膜（MIllipore,Bedford  MA）に移し、膜を５％脱脂ミルクを含むTBS（トリス−HCl  pH7.4,150mM  NaCl）中、60分間ブロックした。次に、膜を、0.2％脱脂ミルクを含むTBSで0.2μg/mlに希釈した、PKC−αに対するモノクローナル抗体（UBI,Lake  Placid  NY）とともに４℃で16時間インキュベートした。続いて0.2％脱脂ミルクを加えたTBS中で３回洗浄した。次に膜を125I−標識ヤギ抗マウス二次抗体（ICN  Radiochemicals,Irvine,CA）とともに１時間インキュベートした。次に膜を0.2％脱脂ミルクを加えたTBS中でよく洗浄した。バンドを可視化しホスファーイメージャー（Molecular  Dynamics,Sunnyvale,CA）を使用して定量した。PKC−αは80kDの分子量を有する単一バンドとして現れる。
各々のオリゴヌクレオチドは３回試験し（３重に）、実験の結果はオリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、存在する蛋白質のパーセントに対して標準化されている（図1aおよび1b）。５つの最も有効なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンおよびそれからわずかに上流および下流の領域を標的としている（オリゴ１、３、17、７、６）。次に最も有効なオリゴヌクレオチドはRNAの3'非翻訳領域を標的としている（オリゴ２、５、14）。
実施例４  PKCの他のイソ酵素
ヒトPKC−αを標的とするオリゴヌクレオチドについて得られた結果は、最も有効な標的配列は翻訳開始コドンを囲む配列および3'−非翻訳領域であることを示した。これらの配列はまた、PKCの他のイソ酵素に対するオリゴヌクレオチドについても有効な標的であると考えられる。PKCの有効な阻害剤であろうアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に同定されている。これらのオリゴヌクレオチドは実施例１のごとく合成し、入手可能な場合には適当な抗体を用いて実施例２および３のごとくスクリーニングすることができる。または、TPA−応答性エンハンサーまたは適当なプロモーターの影響下、所望のPKCのイソ酵素とルシフェラーゼを一時的に同時発現するレポーター遺伝子アッセイ系を確立することができる。次に、常法を用いてルシフェラーゼ活性を測定することによりPKC発現をアッセイする。すなわち、Greenberg,M.E.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,（F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.SeidmanおよびK.Strahl編）,John  Wiley  and  Sons,NY（1987）により記載されているごとく、界面活性剤トリトンＸ−100による溶解により細胞からルシフェラーゼを抽出する。Dynatech  ML1000発光計を用いて、ルシフェリン（Sigma）添加による625μＭまでのピーク発光の測定を行う。
PKC−β、タイプＩおよびII
配列データは、Kubo  et  al.,FEBS  Lett.1987,223,138−142,Genbank受託番号X06318,M27545,X07109からのものである。配列はcDNAで配列決定された最初の5'塩基から番号付けられている。PCK−βタイプＩおよびIIは単一の遺伝子産物の異なるmRNAスプライシングの結果である。このため同一のアミノ末端を有する蛋白質が生じている（mRNAの5'末端）；しかしながら、カルボキシ末端に配列の相違が存在する（mRNAの3'末端）。下記のオリゴヌクレオチド（翻訳開始コドンを標的とする）はPKC−βタイプＩおよびII両方の発現を変調することが期待される：
0003553068.tif 000004
下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはPKC−βタイプＩの3'非翻訳領域を標的とする：
0003553068.tif 000005
下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはPKC−βタイプIIの3'非翻訳領域を標的とする：
0003553068.tif 000006
PKC−γ：
配列データは、Coussens  et  al.,Science  1986,233,859−866,Genbank受託番号M13977からのものである。配列はcDNA中で配列決定された最初の5'塩基から番号付けられている。完全な配列は入手不可能であった：オープンリーディングフレームの3'最末端および3'非翻訳領域が欠如している。その結果、これらの領域は現在のところアンチセンス標的としては入手不可能である。
0003553068.tif 000007
PKC−η：
PKC−ηのための配列データはBacherおよびその協同研究者［Bacher  et  al.,Mol.Cell.Biol.1991,11,126−133］,Genbank受託番号M55284からのものである。彼らはそのイソ酵素をPKC−Ｌと名付けている；しかしながら、その配列はマウスPKC−ηのものとほとんど同一であり、一貫性を保つためここでは後者の命名法が用いられた。配列はcDNA中で配列決定された最初の5'塩基から番号付けられている。
0003553068.tif 000008
実施例５  PKC−α蛋白質合成に対するホスホロチオエート/2'−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの効果の用量応答性：
一連のホスホロチオエート（配列ID番号:1、２、３および５を有する完全2'−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）を合成した。PKC−α合成をダウンレギュレーションするため、A549細胞を500nMのPDBuで18時間処理し、洗浄してPDBuを除去した後、オリゴヌクレオチドおよびDOTMA/DOPE陽イオン性リポソームで処理した。４時間後に培地を置き換え、さらに20時間放置して細胞を回復させた。蛋白質を抽出し、実施例３に記載したように、イムノブロッティングによりPKC−α蛋白質レベルを決定した。結果はホスファーイメージャー（Molecular  Dynamics,Sunnyvale  CA）で定量化し、図２に対照（食塩水処理）のパーセントとして示されている。ISIS4649（配列ID番号:3;四角）は500nMでPKC−α蛋白質レベルを85−90％減少させ、約260nMのIC50を有していた。
実施例６  PKC−α  mRNAレベルに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
A549細胞を、陽イオン性脂質DOTMA/DOPE存在下、500nMのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理し、洗浄後さらに20時間放置して回復させた。全RNAを抽出し、20μｇを各々1.2％ゲルで分離してナイロン膜に移した。これらのブロットは、32P放射性標識PKC−α  cDNAプローブで探査したのちこれを取り出し、等量のRNAが充填されたことを確認するため放射性標識G3PDHプローブで再探査した。各々のオリゴヌクレオチド（3520、3521、3522および3527）を用いて二重に試験した。二つの腫瘍なPKC−α転写産物（8.5kbおよび4.0kb）を調べ、ホスファーイメージャー（Molecular  Dynamics,Sunnyvale  CA）で定量化した。結果は図３に示されている。オリゴヌクレオチド3521（配列ID番号:2）、3522（配列ID番号:3）および3527（配列ID番号:5）は、PKC−α  mRNAレベルの50％より大きな減少を与えた。オリゴヌクレオチド3521および3527は小さい方の転写産物の約80％の減少および大きい方の転写産物の90％を超える減少を与えた。
実施例７  キメラ（デオキシギャップ）2'−Ｏ−メチル  オリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチド3521（配列ID番号:2）、3522（配列ID番号:3）および3527（配列ID番号:5）をさらなる研究および修飾のために選択した。これらの配列を有するオリゴヌクレオチドを、2'−Ｏ−メチル化領域が隣接し、中心に種々の長さのデオキシギャップを有する均一なホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオチドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチド（500nM濃度）のPKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響をノーザンブロット分析により試験した。結果は図４に示されている。８ヌクレオチドまたはそれ以上のデオキシギャップは全ての場合においてPKC−α  mRNAレベル（両方の転写産物とも）の最大の減少を与えた。配列ID番号:3を有するオリゴヌクレオチドは４ヌクレオチドのデオキシギャップ長で約83％PKC−α  mRNAを減少させ、６またはそれ以上のデオキシギャップ長でPKC−α  mRNAをほとんど完全に消滅させた。
これらのオリゴヌクレオチドの用量応答曲線が図５に示されている。４または５のヌクレオチドデオキシギャップを有する2'−Ｏ−メチル  キメラオリゴヌクレオチドは、200−250nMのPKC−α  mRNA減少に対するIC50（PKC−α  mRNAレベルの50％減少を与えるのに必要なオリゴヌクレオチド濃度）を有し、完全デオキシオリゴヌクレオチド（すべてを通してホスホロチオエート）も同様であった。８−ヌクレオチドデオキシギャップを有する2'−Ｏ−メチル  キメラオリゴヌクレオチドは約85nMのIC50を有していた。
このキメラオリゴヌクレオチド（配列ID番号:3）のいくつかの変異体についてPKC−α  mRNAレベルを下げる能力を比較した。これらのオリゴヌクレオチドは表７に示されている。
0003553068.tif 000009
これらのオリゴヌクレオチドのPKC−α  mRNAレベルに及ぼす影響は図６に示されている。オリゴヌクレオチド7008、3522および5352がPKC−α  mRNAの減少を示し、5352が最も活性であった。
配列ID番号:3を有する一連の2'−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは表８に示されている。
0003553068.tif 000010
これらの2'−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドを2'−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドと比較した。オリゴヌクレオチド7273および7294はその2'−Ｏ−メチル対応物よりもPKC−α  mRNAレベルを低下させることにおいてより活性であった。このことは図７および８に示されている。
実施例８  PKC−α  mRNAを減少させるその他のオリゴヌクレオチド：
ヒトPKC−α  3'非翻訳領域を標的とする別のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを設計し合成した。これらの配列は表９に示されている。
0003553068.tif 000011
図９に示したように、オリゴヌクレオチド6632、6653、7082および7083は最も強くPKC−α  mRNAレベルを減少させた。
実施例９  ヒトA549肺腫瘍細胞の培養
ヒト肺癌瘍細胞株A549はAmerican  Type  Culture  Collection（Bethesda  MD）から入手した。細胞は1gmグルコース／リットルおよび10％ウシ胎児血清（Irvine  Scientific,Irvine  CA）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Irvine  Scientific）で増殖させた。細胞はマウスに導入するため、トリプシン処理し、洗浄して同一の培地に再懸濁した。
実施例10  ヌードマウスにおけるA549腫瘍細胞の増殖に対するISIS3521の効果：
200μｌのA549細胞（5x106細胞）をヌードマウスの内腿の皮下に移植した。配列ID番号:2を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドISIS3521を、腫瘍細胞接種後１週間目から始めて週に２度４週間投与した。オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質（DMRIE/DOPE）で処方し、腫瘍の付近に皮下で投与した。オリゴヌクレオチド用量は5mg/kgであった（60mg/kgの陽イオン性脂質とともに）。腫瘍サイズは週毎に記録した。
図10に示したように、３匹のマウス中２匹で腫瘍の増殖はほぼ完全に阻止され、３匹目のマウスでも対照に比べて減少していた。このISIS3521による腫瘍増殖の阻害は統計的に有意である。対照オリゴヌクレオチド（ISIS1082）はPKC  mRNA標的と有意な配列相同性を有しない21−merのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
その腫瘍がすでに検出可能なサイズに達しているマウスへのオリゴヌクレオチドの投与は、続く腫瘍増殖に対して識別可能な効果を示さなかった。
実施例11  ヌードマウスにおけるヒトMDA−MB231腫瘍の増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：
MDA−MB231ヒト乳癌腫細胞はAmerican  Type  Culture  Collection（Bethesda  MD）から入手した。連続的に移植されたMDA−MB231腫瘍をヌードマウスの皮下に確立した。２週間後から、オリゴヌクレオチド3521および3527（配列ID番号:5を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の食塩水溶液を60mg/kgおよび6mg/kgの用量で14日間毎日静脈内投与した。対照オリゴヌクレオチドISIS1082もこれらの用量で投与し、対照食塩水も同様に投与した。腫瘍増殖速度をオリゴヌクレオチド投与の２週間にわたってモニターした。図11に示したように、両方のPKC−αオリゴヌクレオチド（3521および3527）は、60mg/kgおよび6mg/kgの用量で腫瘍細胞増殖を有意に阻害した。対照オリゴヌクレオチド（ISIS1082）もまた腫瘍増殖をいくらか減少させたが、この効果は高用量においてもアンチセンスオリゴヌクレオチドより効果が少なく、低用量ではほとんど効果がなかった。6mg/kgおよび0.6mg/kgの同一のオリゴヌクレオチドを用いてより低い用量での研究を行った。ISIS3521は0.6mg/kgで腫瘍増殖を有意に減少させた。ISIS3527もこの濃度で腫瘍増殖を阻害したが、この結果は統計的に有意ではなかった。
実施例12  マウスにおけるマウスルイス肺癌腫増殖に対するオリゴヌクレオチドの効果：
連続的に移植されたマウスルイス肺癌腫をマウスで確立した。オリゴヌクレオチド3521および3527を6mg/kgおよび0.6mg/kgの用量で14日にわたり毎日静脈内に投与した。オリゴヌクレオチド投与の２週間の間、腫瘍増殖速度をモニターした。予想されたごとく、ヒトPKC配列を標的とするこれらのオリゴヌクレオチドは、マウス由来腫瘍に対しては有意な効果を有していなかった。
実施例13  ヘアレスマウスにおける内在性PKC−α発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS4189の効果：
正常動物における内在性PKC−α  mRNAレベルに対するオリゴヌクレオチド効果を調べるためには、マウスPKC−αに相補的なオリゴヌクレオチドを用いる必要があった。ISIS4189はマウスPKC−αのAUGコドンを標的とする20−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。この領域はヒトPKC配列と相同性がなく、このオリゴヌクレオチドはヒト細胞におけるPKC−αの発現に何の影響も与えない。ISIS4189はC127マウス乳上皮細胞におけるmRNA減少に対し200nMのIC50を有している。食塩水溶液中のISIS4189を、１、10または100mg/kg体重の濃度でヘアレスマウスの腹腔に投与した。７日間にわたり毎日投与した。肝臓、腎臓、脾臓、肺および皮膚からの組織をとり、PKC−α  mRNAおよび蛋白質レベルを決定した。また、肝臓、腎臓および肺の標本について、組織病理学的調査を行った。ISIS4189は、100mg/kgでマウス肝臓における内在性PKC−α  mRNAレベルを対照（食塩水）の10−15％まで阻害した。
実施例14  ヒトPKC−ηと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：
ヒトPKC−ηと相補的な一連の20−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、500nMの濃度で、ノーザンブロットアッセイを使用し、ヒトA549細胞でのPKC−η  mRNAレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列は表10に示されており、結果は図12に示されている。
0003553068.tif 000012
オリゴヌクレオチド6432、6443、6431、6442、6435、6434、6445、6553、6581および6603はPKC−η  mRNAレベルを50％以上減少させた。最も強力なオリゴヌクレオチドはISIS6581（3'非翻訳領域を標的とする）およびISIS6445（コーディング領域を標的とする）であり、このアッセイにおいてPKC  mRNAをほとんど完全に失わせた。
実施例15  ヒトPKC−ζと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：
ヒトPKC−ζと相補的な一連の20−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように合成した。標的配列源はGenbank  HSPKCZ座、受託番号Z15108（Hug,H.）であった。これらのオリゴヌクレオチドを、500nMの濃度で、ノーザンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６に記載されているごとく、ヒトA549細胞でのPKC−ζ  mRNAレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニングの結果は表11に示されている。
0003553068.tif 000013
この実験において、オリゴヌクレオチド9007、9008、9011、9012、9013、9015、9017、9018、9020、9021、9022、9023、9024、9025、9028および9029がmRNAレベルの少なくとも50％の阻害を示し、現在のところ好適である。
実施例16  ヒトPKC−εと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング：
ヒトPKC−εと相補的な一連の20−merホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように合成した。標的配列源はGenbank  HSPKCE座、受託番号X65293（Burnsら）であった。これらのオリゴヌクレオチドを、500nMの濃度で、ノーゾンブロットアッセイを使用して実質的に実施例６に記載されているごとく、ヒトA549細胞でのPKC−ε  mRNAレベルを減少させる能力についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチド配列およびスクリーニングの結果は表12に示されている。
0003553068.tif 000014
この実験において、オリゴヌクレオチド7942、7944、7945、7946および7948がmRNAレベルの少なくとも40％の阻害を示し、現在のところ好適である。
実施例17  ヒトPKCαの3'非翻訳領域のDNAシークエンシング
A549細胞（American  Type  Culture  Collection,Bethesda  MDから入手）を６−ウェルプレート（Falcon  Labware,Lincoln  Park,NJ）を用い、1gグルコース／リットルおよび10％ウシ胎児血清（FCS,Irvine  Scientific,Santa  Ana,CA）を含むダルベッコ改良イーグル培地（DME）中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を集め、常法を用いて全RNAを単離した。Sambrook,J.,Fritsch,E.およびT.Maniatis（1989）.Molecular  Cloning:a  laboratory  manual.Cold  Spring  Harbor  Laboratory,Cold  Spring  Harbor,N.Y.,7章。
cDNAはFrohmanらの3'RACE技術を用いてRNAから作製し［Frohman,M.A.,Dush,M.K.およびG.R.Martin（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8998−9002］、3'RACEキットはGibco/BRL（Bethesda,MD）から入手した。cDNAの第一の鎖の作製にはオリゴdTプライマーを使用した。続くポリ（Ａ）テイルの部位からの増幅には、キットで提供されたオリゴヌクレオチドまたは同一のオリゴヌクレオチド（ISIS  5586;配列ID番号:107:5'−GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT−3'）を使用した。既知の配列の内部からの増幅にはISIS6288を使用した（配列ID番号:108:5'−GGGGTAGAATGCGGCGGCAGTATGAAACTCACCAGCG−3'）。PCR反応で生じたDNAをゲルで精製し、Sal IおよびBcl Iで消化した後、常法（Sambrookら、1989）を用いてBluescriptプラスミド（Stratagene,La  Jolla,CA）内へクローン化した。クローン化DNAを、USBからのSequenaseキットを用いて配列決定した。
既知の配列（GenBank受託番号x52479）の3'末端に近いBcl I部位から最もしばしば得られているポリアデニル化の部位までの得られた新規配列なヌクレオチド56−1136として図13に示されている。この部位はショート（4kb）PKCαメッセンジャーの3'末端であると考えられる。
この配列を伸長し、それによりロングPKCαメッセンジャー（8.5kb）に特異的な配列を得るため、インバースPCR技術を用いた。Ochman,H.,Gerber,A.S.およびD.L.Hartl（1988）Genetics  120:621−623。この技術を、組のプライマーおよび制限酵素を用いて３回実施した。各々の回で約200塩基の新しい配列が生じた；全体の新規配列（配列ID番号:104）は図13にボールド体（ヌクレオチド1137−1812）で示されている。この配列は、以前に報告されたPKCα  cDNA配列の末端近くのBcl I部位（TGATCA）から始まって3'の方向に伸びるかたちで示されている。Finkenzellerら、Nucl.Acids  Res.18:2183（1990）;GenBank受託番号x52479。ヌクレオチド56から始まる新しく決定された配列には下線が付けてある（配列ID番号:105）。ショート（4kb）mRNA転写産物の3'末端と考えられるポリアデニル化の最も共通な部位はヌクレオチド1136である。この部位から下流の配列（従ってロングメッセンジャーに独特である）はボールド体で示されている（配列ID番号:106）。
実施例18  PKCαの3'UTR中の新規配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
実施例17に記載したようにして得られた新規配列に相補的である一連のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、処置開始24時間後でのA549細胞におけるPKCαRNAの減少または除去を起こさせる能力に基づいてスクリーニングした。A549細胞を陽イオン性脂質DOTMA/DOPE存在下、500nMのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで４時間処理し、洗浄後さらに20時間放置して回復させた。全RNAを抽出し、20μｇを各々1.2％ゲルで分離してナイロン膜に移した。これらのブロットは、32P放射性標識PKC−α  cDNAプローブで探査したのちこれを取り出し、等量のRNAが充填されたことを確認するため放射性標識G3PDHプローブで再探査した。二つの主要なPKC−α転写産物（8.5kbおよび4.0kb）を調べ、ホスファーイメージャー（Molecular  Dynamics,Sunnyvale  CA）で定量化した。オリゴヌクレオチドおよびその活性は表13に示されている。
0003553068.tif 000015
ISIS7911（配列ID番号:117）はこの予備的な実験において、PKCα  mRNAレベル（ロングおよびショートメッセンジャーの両方）を対照と比較して50％減少させた。従ってこのオリゴヌクレオチドは好適である。より詳細な分析により、ISIS7911は処置の最初の６時間の間にロング（8.5kb）メッセンジャーの量を選択的に減少させ、処置後３時間の時点では４倍の選択性で減少させることが示された。ISIS7911処置の12時間後には、両方のメッセンジャーレベルは80％を超えて減少していた。経時変化のデータは図14に示されている。
【配列表】
配列番号:1:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
0003553068.tif 000016
配列番号:2:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:2:
0003553068.tif 000017
配列番号:3:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:3:
0003553068.tif 000018
配列番号:4:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:4:
0003553068.tif 000019
配列番号:5:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:5:
0003553068.tif 000020
配列番号:6:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:6:
0003553068.tif 000021
配列番号:7:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:7:
0003553068.tif 000022
配列番号:8:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:8:
0003553068.tif 000023
配列番号:9:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:9:
0003553068.tif 000024
配列番号:10:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:10:
0003553068.tif 000025
配列番号:11:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:11:
0003553068.tif 000026
配列番号:12:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:12:
0003553068.tif 000027
配列番号:13:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:13:
0003553068.tif 000028
配列番号:14:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:14:
0003553068.tif 000029
配列番号:15:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:15:
0003553068.tif 000030
配列番号:16:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:16:
0003553068.tif 000031
配列番号:17:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:17:
0003553068.tif 000032
配列番号:18:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:18:
0003553068.tif 000033
配列番号:19:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:19:
0003553068.tif 000034
配列番号:20:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:20:
0003553068.tif 000035
配列番号:21:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:21:
0003553068.tif 000036
配列番号:22:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:22:
0003553068.tif 000037
配列番号:23:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:23:
0003553068.tif 000038
配列番号:24:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:24:
0003553068.tif 000039
配列番号:25:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:25:
0003553068.tif 000040
配列番号:26:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:26:
0003553068.tif 000041
配列番号:27:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:27:
0003553068.tif 000042
配列番号:28:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:28:
0003553068.tif 000043
配列番号:29:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:29:
0003553068.tif 000044
配列番号:30:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:30:
0003553068.tif 000045
配列番号:31:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:31:
0003553068.tif 000046
配列番号:32:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:32:
0003553068.tif 000047
配列番号:33:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:33:
0003553068.tif 000048
配列番号:34:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:34:
0003553068.tif 000049
配列番号:35:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:35:
0003553068.tif 000050
配列番号:36:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:36:
0003553068.tif 000051
配列番号:37:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:37:
0003553068.tif 000052
配列番号:38:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:38:
0003553068.tif 000053
配列番号:39:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:39:
0003553068.tif 000054
配列番号:40:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:40:
0003553068.tif 000055
配列番号:41:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:41:
0003553068.tif 000056
配列番号:42:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:42:
0003553068.tif 000057
配列番号:43:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:43:
0003553068.tif 000058
配列番号:44:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:44:
0003553068.tif 000059
配列番号:45:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:45:
0003553068.tif 000060
配列番号:46:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:46:
0003553068.tif 000061
配列番号:47:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:47:
0003553068.tif 000062
配列番号:48:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:48:
0003553068.tif 000063
配列番号:49:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:49:
0003553068.tif 000064
配列番号:50:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:50:
0003553068.tif 000065
配列番号:51:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:51:
0003553068.tif 000066
配列番号:52:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:18
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:52:
0003553068.tif 000067
配列番号:53:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:17
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:53:
0003553068.tif 000068
配列番号:54:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:54:
0003553068.tif 000069
配列番号:55:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:55:
0003553068.tif 000070
配列番号:56:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:56:
0003553068.tif 000071
配列番号:57:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:57:
0003553068.tif 000072
配列番号:58:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:58:
0003553068.tif 000073
配列番号:59:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:59:
0003553068.tif 000074
配列番号:60:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:60:
0003553068.tif 000075
配列番号:61:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:61:
0003553068.tif 000076
配列番号:62:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:62:
0003553068.tif 000077
配列番号:63:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:63:
0003553068.tif 000078
配列番号:64:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:64:
0003553068.tif 000079
配列番号:65:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:65:
0003553068.tif 000080
配列番号:66:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:66:
0003553068.tif 000081
配列番号:67:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:67:
0003553068.tif 000082
配列番号:68:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:68:
0003553068.tif 000083
配列番号:69:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:69:
0003553068.tif 000084
配列番号:70:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:70:
0003553068.tif 000085
配列番号:71:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:71:
0003553068.tif 000086
配列番号:72:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:72:
0003553068.tif 000087
配列番号:73:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:73:
0003553068.tif 000088
配列番号:74:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:74:
0003553068.tif 000089
配列番号:75:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:75:
0003553068.tif 000090
配列番号:76:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:76:
0003553068.tif 000091
配列番号:77:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:77:
0003553068.tif 000092
配列番号:78:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:78:
0003553068.tif 000093
配列番号:79:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:79:
0003553068.tif 000094
配列番号:80:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:80:
0003553068.tif 000095
配列番号:81:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:81:
0003553068.tif 000096
配列番号:82:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:82:
0003553068.tif 000097
配列番号:83:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:83:
0003553068.tif 000098
配列番号:84:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:84:
0003553068.tif 000099
配列番号:85:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:85:
0003553068.tif 000100
配列番号:86:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:86:
0003553068.tif 000101
配列番号:87:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:87:
0003553068.tif 000102
配列番号:88:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:88:
0003553068.tif 000103
配列番号:89:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:89:
0003553068.tif 000104
配列番号:90:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:90:
0003553068.tif 000105
配列番号:91:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:91:
0003553068.tif 000106
配列番号:92:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:92:
0003553068.tif 000107
配列番号:93:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:93:
0003553068.tif 000108
配列番号:94:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:94:
0003553068.tif 000109
配列番号:95:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:95:
0003553068.tif 000110
配列番号:96:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:96:
0003553068.tif 000111
配列番号:97:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:97:
0003553068.tif 000112
配列番号:98:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:98:
0003553068.tif 000113
配列番号:99:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:99:
0003553068.tif 000114
配列番号:100:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:100:
0003553068.tif 000115
配列番号:101:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:101:
0003553068.tif 000116
配列番号:102:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:102:
0003553068.tif 000117
配列番号:103:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:103:
0003553068.tif 000118
配列番号:104:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1812塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:SEQ ID NO:104:
0003553068.tif 000119
配列番号:105:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1757塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:SEQ ID NO:105:
0003553068.tif 000120
配列番号:106:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:676塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列:SEQ ID NO:106:
0003553068.tif 000121
配列番号:107:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:37
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:no
（xi）配列:SEQ ID NO:107:
0003553068.tif 000122
配列番号:108:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:37
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:no
（xi）配列:SEQ ID NO:108:
0003553068.tif 000123
配列番号:109:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:109:
0003553068.tif 000124
配列番号:110:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:110:
0003553068.tif 000125
配列番号:111:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:111:
0003553068.tif 000126
配列番号:112:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:112:
0003553068.tif 000127
配列番号:113:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:113:
0003553068.tif 000128
配列番号:114:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:114:
0003553068.tif 000129
配列番号:115:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:115:
0003553068.tif 000130
配列番号:116:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:116:
0003553068.tif 000131
配列番号:117:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:117:
0003553068.tif 000132
配列番号:118:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:118:
0003553068.tif 000133
配列番号:119:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:20
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（iv）アンチセンス:yes
（xi）配列:SEQ ID NO:119:
0003553068.tif 000134
【図１（ａ）】
0003553068.tif 000135
【図１（ｂ）】
0003553068.tif 000136
【図２】
0003553068.tif 000137
【図３】
0003553068.tif 000138
【図４】
0003553068.tif 000139
【図５】
0003553068.tif 000140
【図６】
0003553068.tif 000141
【図７】
0003553068.tif 000142
【図８】
0003553068.tif 000143
【図９Ａ】
0003553068.tif 000144
【図９Ｂ】
0003553068.tif 000145
【図１０】
0003553068.tif 000146
【図１１Ａ】
0003553068.tif 000147
【図１１Ｂ】
0003553068.tif 000148
【図１２】
0003553068.tif 000149
【図１３】
0003553068.tif 000150
【図１４】
0003553068.tif 000151