(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces nobilis）の菌体を、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびアセトンよりなる群から選ばれる少なくとも１種の溶剤により抽出処理して得られる菌体抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにかけ、極性がメタノール：アセトニトリル＝１：１混合溶剤を８５％含む水溶液からメタノールの間にあるもので溶出された画分より、溶剤からの再結晶化を用いて精製することを特徴とする炎症抑制物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アレルギー性及び非アレルギー性のいずれの炎症反応にも有効な炎症抑制物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症反応はアレルギー性炎症と非アレルギー性炎症に大別される。アレルギーは、ある抗原との２度目の接触の際に生じる免疫反応が、個々人によって過度にあるいは不適切な形で現れる一種の病的症状であって、関与する抗体の種類からＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ  型及びＩＶ型の反応に分類されている。
これら４つの型のうち、ＩＩＩ  型反応（免疫複合体反応：アルサス反応）及びＩＶ型反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反応）に関与するアレルギー性炎症反応は、慢性関節リウマチのような自己免疫疾患、更には喘息、肝炎、腎炎、皮膚炎のような種々の炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じている。
【０００３】
ところで、従来より放線菌培養濾液中には種々の抗生物質が見つけられており、当該培養濾液は生理活性物質の宝庫と言われている。しかしながら、アレルギー性炎症を抑制する物質はこれまで放線菌培養濾液から見つけられた例がなかった。
また、従来の抗炎症剤であるアスピリン（日経サイエンス，３：７０，１９９１）やインドメタシン（Ｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，３：１０５７，１９８５  ）はアレルギー性炎症に対して抑制作用がきわめて弱いという問題点がある。
【０００４】
そこで、放線菌を用いてアレルギー性炎症抑制作用を有する物質の探索を行った結果、放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（以下、「Ｓ．ノビリス」とする）培養液の粗抽出物に、アレルギー性炎症反応に対する顕著な抑制作用と安全性を確認し、抗炎症剤として全く問題がない極めて有用な組成物を見出すことに成功し（特開平５−２５０５３号公報）、同培養液から種々のカラムクロマトグラフィーを用いてアレルギー性炎症反応抑制物質を単離することを提案している。更に、同培養液に硫酸アンモニウムを添加し、その時の沈殿物を溶剤で抽出して得られる抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー及び溶剤からの再結晶化を用いて炎症抑制物質を効率的に精製する方法についても提案している。
【０００５】
しかしながら、従来の精製方法では、硫酸アンモニウムによる沈殿物中の不純物量が非常に多いため、その抽出操作が煩雑となることが問題となった。そのため、炎症抑制物質を大量に確保するためには、複数回に分けて精製を行わなければならず、非常に多くの時間を必要とした。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、効率よく短時間で炎症抑制物質を大量に精製する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、放線菌Ｓ．ノビリスの菌体を、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびアセトンよりなる群から選ばれる少なくとも１種の溶剤により抽出処理して得られる菌体抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーにかけ、極性がメタノール：アセトニトリル＝１：１混合溶剤を８５％含む水溶液からメタノールの間にあるもので溶出された画分より、溶剤からの再結晶化を用いて精製することにより、炎症抑制物質が単品で得られることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明において、原料である放線菌Ｓ．ノビリスは、公的保存機関から入手可能であり、例えば理化学研究所の保存菌（ＪＭＣ４２７４）（これは米国においてＡＴＣＣ１９２５２及びオランダにおいてＣＢＳ１９８．６５としても保存）等の菌が使用できる。
【０００９】
上記放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべき栄養物を含んだ培地を用いて行われる。液体培養の場合、その培地の成分としては、例えばブドウ糖等の糖類、ペプトンや麦芽エキス等のタンパク質類、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質などを一種以上含む水溶液が好適に用いられる。代表的な培地としては、例えば澱粉・アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、Ｋ２  ＨＰＯ４  、ＮＨ４  Ｃｌを含む）が挙げられる。
液体培地のｐＨは２〜９の範囲が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ましい。また、液体培養の培養時間は１〜１４日が好ましい。
【００１０】
このようにして得た培養液を濾過し、放線菌Ｓ．ノビリスの菌体を得る。該菌体について溶剤により抽出処理を行い、菌体抽出物を得る。
なお、抽出処理に際しては、菌体をそのまま溶剤と接触させてもよいが、あらかじめ乳鉢等ですりつぶしたり、ホモジナイザー、超音波発生機等で粉砕して用いるのが好ましい。
【００１１】
上記抽出処理に用いる溶剤としては、ジクロロメタン、酢酸エチルおよびアセトンよりなる群から選ばれる少なくとも１種に限定される。
【００１２】
上記抽出処理において、菌体と溶剤の比率は特に限定されないが、抽出効率及び操作性の観点から、菌体１ｇ（湿重量）あたり溶剤１０〜２０ｍｌが好ましい。また、抽出時間は溶剤の種類や抽出温度等によって異なるが、１０分〜２４時間が好ましい。
抽出中は液を静置するか、または攪拌しながら放置する。抽出操作は同一試料に対して複数回繰り返すのが好ましい。
【００１３】
次に、上記菌体抽出物に対するカラムクロマトグラフィーについて述べる。
カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシランのようなオクタデシルシラン類）を用い、充填量は特に限定されないが、チャージする菌体抽出物に対して重量比で１０〜５００倍量を充填するのが好ましい。
【００１４】
菌体抽出物をカラムにチャージする際は、まずＯＤＳに吸着させる。この時のＯＤＳの量は特に限定されないが、吸着させる菌体抽出物に対して重量比で０．５〜２０倍量が好ましい。その後、少量の溶剤に懸濁しカラムにチャージする。
カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒は、極性が、メタノール：アセトニトリル＝１：１混合溶剤を８５％含む水溶液からメタノールの間にあるものが用いられる。
【００１５】
次に、溶剤による再結晶化について述べる。
再結晶化に用いる溶剤としては、本発明における炎症抑制物質が溶ける溶剤であれば特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール等が好ましい。
再結晶の方法としては、例えば、熱を加えて少量の溶剤に当該物質を含有するＯＤＳ溶出画分を溶かし、溶剤を徐々に冷やして再結晶化させてもよいし、当該物質の溶解性の高い溶剤に当該物質を含有するＯＤＳ溶出画分を溶かし、そこに当該物質の溶解性の低い溶剤を徐々に加えて再結晶化させてもよい。
【００１６】
本発明により得られる炎症抑制物質を製剤化するには、通常はこれを製剤用担体とともに製剤組成物の形態とする。担体としては、剤型に応じた薬剤を調整するのに通常使用されるものが用いられ、例えば充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、付質剤、表面活性化剤、滑沢剤、賦形剤等が挙げられる。
また適当な溶剤を選定することにより、得られる炎症抑制物質をそのままの形態で外用液剤として使用することもできる。
【００１７】
本発明により得られる炎症抑制物質から製剤化される炎症抑制剤の投与単位形態としては、上記外用液剤のほか、例えば錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
上記炎症抑制剤中に含有すべき炎症抑制物質の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、炎症抑制剤中に０．０１〜５０重量％が好ましい。
【００１８】
本発明における炎症抑制物質より得られる炎症抑制剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、上記のごとき外用液剤の場合には、これを皮膚ないしは粘膜等の所要部位に直接塗布し、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与され、また貼付剤、軟膏剤の場合には貼付または塗布される。
【００１９】
炎症抑制剤の投与量は、使用目的、症状等により適宜選択されるが、通常１日あたり本発明における炎症抑制物質として０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度である。また、上記製剤組成物を３〜４回／日に分けて投与することももちろん差し支えない。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明を実施例につき説明する。
（実施例１）
理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を、酵母エキス０．２％添加澱粉・アンモニウム培地２５０ｍｌ中で約４８時間振とう培養（前々培養）し、続いて同培地１２Ｌに前々培養菌液２４０ｍｌを接種し、約２４時間通気攪拌し培養（種培養）した。さらに、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に可溶性澱粉１ｇ、リン酸水素二カリウム０．０５ｇ、塩化アンモニウム０．０５ｇを含有）７００Ｌに種培養した全量を接種し、約３０℃で１〜１０日間通気攪拌し培養した。この培養液を濾過し、湿重量で約９００ｇの放線菌Ｓ．ノビリスの菌体を得た。
【００２１】
上記菌体１００ｇ（湿重量）にジクロロメタン１Ｌを加えて３０分間超音波を照射した後、さらにジクロロメタン４Ｌを加えて室温で１時間攪拌した。濾過後、抽出液をエバポレーターを用いて乾固させ、菌体抽出物８ｇを得た。
【００２２】
次に上記菌体抽出物８ｇを、ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシラン）２５ｇに吸着させ、少量の溶剤（アセトニトリル：メタノール：水＝７：７：６）に懸濁したものを、ＯＤＳカラム（直径３２ｍｍ、長さ７６０ｍｍ、充填ＯＤＳ担体量２７５ｇ、カラム内溶剤アセトニトリル：メタノール：水＝７：７：６）にチャージし、溶出した。
溶出溶媒は、アセトニトリル：メタノール：水＝７：７：６を１Ｌ、アセトニトリル：メタノール：水＝８：８：４を１．２Ｌ、アセトニトリル：メタノール：水＝９：９：２を２００ｍｌ、アセトニトリル：メタノール：水＝１９：１９：２を２０ｍｌ×５０本、メタノールを５００ｍｌの順に流した。
【００２３】
次に、上記アセトニトリル：メタノール：水＝１９：１９：２の溶出溶媒による溶出画分のうち、５〜１５本目の画分を合わせてエバポレータを用いて乾固させることにより、１０６ｍｇの溶出物を得た。これを適当量のメタノールに溶解後、水を少量添加し、４℃で１日放置し結晶化させた。この操作を数回繰り返し、炎症抑制物質５０ｍｇを得た。
【００２４】
（試験例１）ＩＩＩ  型アレルギー反応に対する作用
ｉ）ウサギ抗オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ）血清の調製
江田らの方法（日薬理誌，６６：２３７，１９７０）に準じて、以下の手法でウサギ抗オボアルブミン血清を調製した。すなわち、生理食塩水に溶解したオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）との等量混合乳化液よりなる抗原液を調製した。この抗原液の０．５ｍｌずつを体重約３ｋｇのニュージーランド産ホワイト種の雄性家兎の左右でん筋内に１週間毎に４回注射した。最終注射の７日後に頸動脈から採血し、血清のみを分離取得し、ウサギ抗オボアルブミン血清とした。この抗血清のラット４時間異種受身皮膚アナフィラキシー（４時間  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＰＣＡ）反応の力価は１：３２であった。
【００２５】
ｉｉ）ラット４時間異種ＰＣＡ反応（ＩＩＩ  型アレルギー性皮膚反応）に対する作用実施例１で得られた炎症抑制物質を０．４ｍｇ／ｍｌになるように、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加してなる溶液に懸濁した。なお、対照実験用として、インドメタシンを１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液に懸濁した。このようにして得た懸濁液を供試液とした。また、コントロールとして、上記炎症抑制物質を含まないジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を供試液とした。被験動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００２６】
まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ（炎症抑制物質量として０．８ｍｇ／ｋｇ、インドメタシン量として２ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与した。次いで、その１８〜２２時間後に上記ウサギ抗オボアルブミン血清を生理食塩水で４倍に希釈してなる注射液０．０５ｍｌを背部皮内に注射し、ラットを上記抗血清で感作した。
さらにその４時間後、対応する抗原として２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む０．５重量％エバンスブルー生理食塩水を２．５ｍｌ／ｋｇ静脈内注射して、４時間異種ＰＣＡ反応を惹起した。
【００２７】
こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色素を、Ｈａｒａｄａらの方法（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２３：２１８，１９７１）に従って抽出定量した。すなわち、抗原注射の１時間後に動物を屠殺し、４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚を細切し、これを０．３％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム水溶液３容とアセトン７容の混合液中に２４時間浸漬放置し、漏出色素を抽出した。このようにして抽出した色素を６２０ｎｍで比色定量し、漏出色素量を求め、これをウサギ抗オボアルブミン血清を注射した部位（ｓｉｔｅ）あたりの漏出色素量（μｇ）として表した。なお試験は５匹のマウスを用いて行い、漏出色素量（ｓｉｔｅ／μｇ）はその平均値で示した。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
結果から明らかなように、インドメタシンを投与した群では、コントロールと比べて漏出色素量に差は認められないが、実施例１で得られた炎症抑制物質を含有する供試液を投与した群では、コントロールと比べて、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色素量が大幅に減少した。すなわち、本発明により得られた炎症抑制物質はアレルギー性炎症抑制活性を有する。
【００３０】
（試験例２）毒性試験
以下の方法で実施例１で得られた炎症抑制物質の毒性を調べた。
まず、炎症抑制物質を、最終濃度が４０ｍｇ／５ｍｌになるように、上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液に懸濁し、供試液とした。被験動物としては体重２５〜３０ｇのＩＣＲ雄性マウスを用いた。
上記供試液をマウスに５ｍｌ／ｋｇ（試験例１の有効量の５０倍に相当）を腹腔内投与した。
その結果、毒性症状は特に認められず、また供試液投与２週間後の死亡率は０％であった。生存した被験動物の剖検においても、何ら異常は認められなかった。この結果からも明らかなように、実施例で得られた炎症抑制物質は有効量の５０倍量で毒性を示さなかった。なお試験は５匹のマウスを用いて行った。
【００３１】
（比較例１）
従来法、すなわち培養液に硫酸アンモニウムを添加し、その沈殿物からの抽出物を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー及び再結晶化により炎症抑制物質を精製する方法で炎症抑制物質を単離し、１週間あたりに単離できる炎症抑制物質量を、本発明の方法を用いた場合と比較した。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
上記の結果から、本発明によると、同一時間あたりに従来法の４倍量の炎症抑制物質を単離することが可能となった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法は上述のとおりであり、これによると、活性を損なうことなく、効率的に短時間で炎症抑制物質を大量に精製できる。