(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏ロイコチトゾーン由来の免疫原性蛋白質を認識する単クローン抗体を用いることにより、イムノスクリーニングにより選別されることを特徴とする配列番号１に示す免疫原性蛋白質遺伝子クローン。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子クローンが発現する免疫原性蛋白質、及びアジュバントを含むことを特徴とする鶏ロイコチトゾーン症に対するワクチン。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子クローンを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
発現制御配列に操作的に結合された請求項３記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４記載の組換えＤＮＡ分子が挿入されたベクター。
【請求項６】
配列番号１に示す組換えＤＮＡ分子により発現された配列番号２に示すポリペプチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリペプチドにより調製された鶏ロイコチトゾーン症ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、鶏のロイコチトゾーン症に対する遺伝子工学的手法により製造されたワクチンに関する。更に詳しくは本発明は、真コクシジウム目、住血胞子虫類（亜目）に分類され、鶏のロイコチトゾーン症を引き起こすロイコチトゾイダエ科、ロイコチトゾーン属に属するロイコチトゾーン・カウレリーの免疫原性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子を挿入した発現ベクターを移入した宿主細胞により発現された蛋白質を有効成分として用いた、鶏のロイコチトゾーン症に対するワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
鶏のロイコチトゾーン症は、住血胞子虫類であるロイコチトゾーン・カウレリー（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｎ  ｃａｕｌｌｅｒｙｉ）の感染によって引き起こされる疾病である。Ｌ．ｃａｕｌｌｅｒｙｉは、最初、１９０９年ベトナムにおいて、鶏の血液中にマラリア顆粒を持たない円形のガメトサイト（生殖母体）として認められ、ロイコチトゾーン属の原虫としてそのように命名がなされたものである。
【０００３】
わが国における鶏のロイコチトゾーン症は、１９５４年に兵庫県下で初めて確認され、その病原体は、Ｌ．ｃａｕｌｌｅｒｙｉと同定され、その後、本原虫は吸血昆虫の一種である双翅目Ｄｉｐｔｅｒａのヌカカ科Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅに属するニワトリヌカカＣｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ａｒａｋａｗａｅ（以下ヌカカと略称する）によって生物学的に伝播されることが実験的に証明され、その生活環がほぼ明らかにされた。ロイコチトゾーン・カウレリーは、宿主の鶏の体内でのジゾゴニー（増員生殖）とガメトゴニー（生殖体形成生殖）、伝播者であるヌカカの体内でのスポロゴニー（胞子形成生殖）の３つの発育期を持っている。
【０００４】
本原中に感染したヌカカの吸血の際にその唾液と共に鶏の体内に侵入したスポロゾイト（種虫）は、種として肺、肝、脾、腎などの血管内皮系の細胞に寄生して第１代シゾント（分裂体）を形成する。感染後５〜７日目にはそれより第１代メロゾイト（分裂小体）が血液中に放出され、そらは全身に分布する血管内皮系細胞に再び侵入して第２代シゾントとして増殖し、後記には宿主細胞から離れて細胞間隙でさらに発育する。１４日目にはこれらシゾントから第２代メロゾイトが血液中に放出され、次いでそれらは赤血球細胞に侵入して発育、１８〜１９日目には宿主細胞から遊離してそれぞれマクロガメトサイト（雌性生殖母体）、ミクロガメトサイト（雄性生殖母体）として成熟する。
【０００５】
両ガメトサイトはヌカカの吸血時に鶏の血液と共にその中腸内に取り込まれ、マクロガメート（雌性生殖体）とミクロガメート（雄性生殖体）を形成して融合（受精）し、チゴート（融合体）を経てオオキネート（虫葉体）となり、虫腸壁の細胞間隙に侵入し、次いでその外膜下に移行してオオシスト（胞のう体）に発育する。オオシストの内部には数十個のスポロゾイトが形成され、それらはオオシスト壁の崩壊に伴ってヌカカの対腔に出た後の唾液腺に移動してその発育環を完了する。
【０００６】
本原虫感染による鶏の症状と病変は、主として第２代シゾントが発育するシゾゴニーの末期と第２代メロゾイトが赤血球系細胞に寄生してガメトサイトに発育する過程のガメトゴニーの時期に認められる。本症の最も特徴的な各臓器及び組織の出血病変と貧血症状は、第２代シゾントによる血管栓塞に伴う出血とガメトゴニーの原虫の寄生によって赤血球が破壊されるために引き起こされるものと考えられている。
【０００７】
本原虫の媒介体であるヌカカは、水田などに生息するため水田を有する東南アジア、中国、北朝鮮、韓国が流行地と認められている。わが国においても初めてロイコチトゾーン症が確認されて以来、毎年夏期にその流行が繰り返され、鶏の生産性に対して多くの損失を与えてきたが、１９６４年以降にはピリメタミンが、１９６８年からはピリメタミンとサルファ剤の合剤が本症の予防薬として試料に添加されるようになってからはその発生は激減した。しかしその後、原虫のこのような薬剤に対する耐性の獲得や薬剤の残留性の問題から、有効薬剤の使用期間が限定されたこと、また一部有効薬剤が安全性の問題により、その使用が禁止になったこと等によりその防圧は困難なものとなってきており、被害も恒常的なものになってきている。
【０００８】
鶏ロイコチトゾーン症に対し従来試作されていたワクチンには、スポロゾイトを用いた生ワクチンと虫体由来物質を抗原とする不活化ワクチン、さらには原虫感染した鶏の臓器乳剤を材料とした不活化ワクチンがある。スポロゾイトを用いた生ワクチンはヌカカの唾液腺よりスポロゾイトを分離し、その少数で鶏を免疫するものである〔椎原ら、静岡県養鶏試験場研究報告、１３：２５−２７（１９７８）〕。また虫体由来物質を抗原とした不活化ワクチンは次のようなものである。
【０００９】
虫体由来抗原には鶏体及び発育鶏卵由来の第１代シゾント、第１代メロゾイト、第２代シゾント、第２代メロゾイトならびに可溶性抗原などがあるが、この中スポロゾイト接種後１０〜１５日目に感染鶏の血清中に検出される可溶性の抗原は第２代シゾントと抗原性状がほぼ同じで、それと同様に比較的強い免疫原性が認められている。そこで、こお血清抗原材料をホルマリンで不活化して試作したワクチンで、その有用性が認められている〔Ｉｓｏｂｅ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊｐｎ，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，３７：２１４−２１９（１９８８）〕。
【００１０】
更に臓器乳剤不活化ワクチンは、上述のような原虫抗原を大量に得る困難さを改善するためになされたもので、スポロゾイト接種後１３日目の感染鶏より胸腺、肺、肝、脾、腎、Ｆ嚢を採取して臓器乳剤とし、これをホルマリンで不活化した材料でワクチンを試作するものであり、やはりその効果が認められている〔Ｍｏｒｉｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｒｅｓ．，７６：６３０−６３２（１９９０）〕。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ワクチンの有効性は一応確かめられているものの、前記したように量産が難しく供給に問題があること、抗原材料として血清、臓器などを使用することによる品質の一定性、安全性などに問題があることにより、依然として、合成薬剤に依存しなければならないのが現状であり、従って、前記したような問題が生じている。これに対処するためには、新たな医薬品に開発が必要とされるが、産卵鶏に使用することから残留性の問題が生じないワクチンが望まれる。しかし、原虫は細菌やウイルスと比較して生活環が複雑であること、その培養が困難であることから有効でかつ安全性の高い、安価な量産供給可能なワクチンの開発は未だなされていないのが現状である。
【００１２】
しかしながら一方で、本原虫の生活環が明らかにされたことからヌカカの人工飼育技術が確立され、スポロゾイトの確保が可能となり、鶏に対する原虫感染実験を計画的に行うことができるようになったと同時に、鶏体内での原虫発育環の各ステージでの原虫の採取も可能となった。これらの成果によりロイコチトゾーン症の免疫学的研究も可能となり、感染鶏の血中抗体価の測定が可能となり、血清中への特異抗原の出現及びそれに対する抗体の産生も確かめられている。更に、原虫の第２代シゾントには、免疫原性の存在を示唆する成績も得られている。そこで、このような基礎的試験研究に基づいた本疾病に対する予防法で、養鶏業界の損失を可及的に少なくするために、効果的で安価なワクチンの安定した量産供給が切望されている。
【００１３】
鶏ロイコチトゾーン症に対処するには前記したような予防法では一般的な実用化にはかなりの制約がある。即ち、スポロゾイトによる免疫ではヌカカからスポロゾイトを得るため、大量供給、スポロゾイトの保存方法に難点があり、また、ヌカカは本症以外の伝染病の媒介昆虫でもあることが知られていることから、ヌカカに潜む可能性のある他の病原体をも鶏に移入してしまうおそれがある。また血清抗原を得るにも、臓器乳剤を得るにも常に実験感染した鶏を材料とせねばならず、これらによるワクチンは生産効率が低いため、大量供給や低価化には限界がある。
【００１４】
このようなことから、本発明の目的は鶏、ヌカカを用いずロイコチトゾーン症を予防するために、遺伝子工学的手法により作出した組換え体により発現させた蛋白質でワクチンを作製し、それによって安価で安定した大量供給が可能な鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン症に対する遺伝子組換えワクチンを提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために本発明は、ロイコチトゾーン・カウレリーの発育期のシゾゴニーで形成され、感染防御に重要な抗原を含むとされる第２代シゾント（２ＧＳ）を分離、精製し、これよりｍＲＮＡを抽出、精製し、これに対するｃＤＮＡを作成後、ラムダファージλｇｔ１１を用いてインビトロパッケージングによってｃＤＮＡライブラリーを調製した。次に、このｃＤＮＡライブラリーで大腸菌Ｙ１０９０株を形質転換し、２ＧＳ抗原に対する単クローン抗体を用いたイムノスクリーニングで免疫原性蛋白質遺伝子クローンを選別した。
【００１６】
このクローン由来遺伝子を発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲ１に挿入し、挿入発現プラスミドを大腸菌ＴＢ１株に移入した組換え微生物の免疫原性蛋白質遺伝子（Ｒ７遺伝子、Ｒ７：クローン番号に由来する）の蛋白質（グルタミン酸４５．１％を含む酸性蛋白質）をマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、この蛋白質を含む菌体の超音波抽出液を製剤化した。
【００１７】
クローンの選別は、２ＧＳの超音波抽出液を出発材料として作製した単クローン抗体を用いたイムノスクリーニングで行ったが、この単クローン抗体はあらかじめ、単クローン抗体結合アフィニティーカラムで精製した２ＧＳ抗原が免疫賦与能を有することを認め、２ＧＳの免疫原性蛋白質遺伝子の選別に有効であることを確認したものである。Ｒ７遺伝子によつて発現される蛋白質はＥＬＩＳＡにより、クローンの選別に用いた単クローン抗体ともロイコチトゾーン原虫に感染した鶏血清とも反応し、かつ蛋白質で免疫された鶏はロイコチトゾーン感染に対して抵抗性を獲得することが認められた。このような知見に基づいて本発明は完成されたものである。
【００１８】
本発明において、ベクターに挿入されるｃＤＮＡは、ロイコチトゾーン・カウレリーに分類される原虫由来ならば株には特に限定されない。本発明において、免疫原性蛋白質遺伝子クローンとは、特にロイコチトゾーン原虫の第２代シゾントが有している蛋白質をコードしているｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡライブラリーから、免疫原性蛋白質を認識する単クローン抗体によって認識されて得られる一部のクローンをいい、又、サザーンハイブリダイゼーションによってその一部と反応が示されるクローンをいい、実質的には下記に塩基配列を示す。
【００１９】
【化１１】
0003582663.tif 000002
【化１２】
0003582663.tif 000003
【化１３】
0003582663.tif 000004
【００２０】
本発明において使用可能なベクターとしては、大腸菌発現ベクター、大腸菌フアージ系ベクター、大腸菌−培養細胞シヤトルベクター、ウイルスベクター等であって、宿主細胞、特に大腸菌内で蛋白質を発現できるものであれば特に限定されない。本発明における発現蛋白質によりロイコチトゾーン症のワクチンを調製する場合、特に精製の操作なしに感染細胞の抽出液をそのまま使用しても防御効果が認められる。濃縮は例えば大腸菌体内での発現の場合であるが、培養液の遠心沈澱菌体の超音波処理時の浮遊液量で、または超音波抽出液の硫安濃縮沈澱の溶解液量でその度合が加減できる。鶏にはアジュバンドとしては例えば水酸化アルミニウムゲルと混合して、公知の方法により免疫ができる。
【００２１】
本発明に用いられる原材料と好ましい組合せについて以下に述べる。
（１）組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７
マスターセルストック及びワーキングシードストックとして−２０℃で保存されていて、ワクチンを作出する出発材料となる保存株である。
（２）アンピシリン
宿主大腸菌ＴＢ１株に移入された発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７はアンピシリン耐性遺伝子を有し、これが宿主菌の培養に一つの選択性を与える。
（３）Ｌ−ブロス寒天培地
ワーキングシードから一次元培養を行うための培地で、１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト及び１％塩化ナトリウムを主成分とし、１％細菌用寒天末および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む。
【００２２】
（４）Ｌ−ブロス培地、ｐＨ７．０
一次元培養から二次元培養を行うための培地で、上記Ｌ−ブロス寒天培地で寒天末を除いたもの。
（５）Ｌ−ブロス発現培養培地、ｐＨ７．０
組換え微生物の発現培養を行うための培地で、上記のＬ−ブロス培地でさらに０．２％グルコースを含む。
（６）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
発現培養時の対数増殖期に培養液に添加する発現誘発剤。
（７）リシスバッファー、ｐＨ７．０
培養菌体を超音波処理する際に、菌体を浮遊させる緩衝液で、１０ｍＭリン酸塩、３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．２５％ツイーン２０、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭＥＤＴＡ、及び１０ｍＭＥＧＴＡを含む。
【００２３】
（８）飽和硫酸アンモニウム
菌体の超音波抽出液の有効成分を沈澱させる。
（９）生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０
飽和硫酸アンモニウムによる有効成分の沈澱物を溶解させる。
（１０）ホルマリン
ワクチンの不活化及び防腐を目的として終濃度０．２％に添加する。
（１１）水酸化アルミニウム
ワクチンのアジュバントとして、終濃度５００μｇＡ１／ｍｌに添加する。
【００２４】
本発明に用いられる原材料の一般的使用量、好ましい使用量の範囲
（１）組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７のワーキングシードストツクス：１回にエーゼルのループフル量または数μ１
（２）アンピシリン：１００μｇ／ｍｌ
（３）Ｌ−ブロス寒天培地、ｐＨ７．０：１回に２０ｍｌ／プレートの１プレート
以下は組換え微生物１００ｌ  培養トその処理に対する使用量である。
（４）Ｌ−ブロス培地、ｐＨ７．０：２ｌ
（５）Ｌ−ブロス発現培養培地、ｐＨ７．０：１００ｌ
（６）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド：１Ｍ溶液、１００ｍｌ
【００２５】
（７）リシスバッファー、ｐＨ７．０：６．７ｌ  （発現培養液の約１／１５量）
（８）飽和硫酸アンモニウム：６．７ｌ  （リシスバッファーと同量）
（９）ＰＢＳ、ｐＨ７．０：５ｌ
（１０）ホルマリン：１０％、１００ｍｌ×２（下記の水酸化アルミニウムゲル添加後の添加量を含む）
（１１）水酸化アルミニウムゲル：１０００μｇＡ１／ｍｌ、５ｌ
【００２６】
【作用及び効果】
（１）作用
本発明によるワクチンは形質転換微生物による生産物であることから、次の点で鶏で生産される原虫抗原採取法より優れている。
１）安全性：本ワクチンに使用される組換え微生物は病原性、有毒物質産生性、及び伝達性はないことから本ワクチンもそのような性質はない。また本ワクチンは組換え微生物の超音波処理による抽出液で、しかもホルマリンで不活化したものであるので、感染性のおそれもない。
２）経済性：原虫採取のためのヌカカ、鶏及びそれらに要する飼育設備、施設、人手などの全てを省くことができるので、経済性に優れている。
３）生産性：組換え微生物の宿主菌は大腸菌であるため、容易に大量培養が可能となり、また発現蛋白質の精製の操作を必要としないので、生産性が高い。
【００２７】
（２）効果
１）本ワクチンは実施例４に記載したように免疫後、スポロゾイトを鶏あたり１３０００〜１５０００匹を静脈内に接種して実験感染させても、非免疫群に比較して明らかに原虫の発育を抑えることから、本目的を適えるものである。
２）前記の安全性の点から環境への病原体汚染の問題はない。
３）発現培養による各標品のＥＬＩＳＡ抗原価はほぼ一定していることから、抗原の量的変動が少なく、均一なワクチンを提供できる。
【００２８】
【実施例】
以下に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものでないことはいうまでもまない。
実施例
ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾントの免疫原性蛋白質遺伝子のクローニング、ワクチンクローンの選定、及び遺伝子組換えワクチンの感染防
御機能試験
（１）ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由来ｃＤＮＡライブラリー
の調製
ヌカカより調製したロイコチトゾーン・カウレリーのスポロゾイトを約５週令の鶏１羽当たり約１００００匹静脈内に接種して実験感染させた。感染後第２代シゾント（２ＧＳ）が出現する時期の１３日目に鶏を解剖し、胸腺、肺、肝、腎、脾、Ｆ嚢の各臓器を採取し、それらの臓器乳剤から２ＧＳを分離、精製した。
【００２９】
これよりＲＮＡをグアニジウムイソチオシアネート法により抽出し、塩化リチウムによる分別沈澱を行い、さらにエタノール沈澱を行って総ＲＮＡを得た後、ｍＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（宝酒造社製）を用いて、２回精製を繰り返して得た。次に、市販のキット（アマーシャム社製）を用いｍＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドまたはランダムヘキサヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素でギュブラーとホフマンの方法に準じてｃＤＮＡを合成した。
【００３０】
得られた１本鎖ｃＤＮＡにＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラーゼとを作用させて２本鎖ｃＤＮＡにした後、ＥｃｏＲＩアダプター（宝酒造社製）を付加したものをラムダファージλｇｔ１１（アマーシャム社製）の両アームとライゲーションさせ、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いてラムダファージのパッケージングを行ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。
ｃＤＮＡライブラリーを調製するにあたり、ＥｃｏＲＩアダプター付加ｃＤＮＡをアガロース電気泳動で４つにサイズ分画した。これらについてのライゲーション操作後にインビトロパッケージングを行った。従って、ｃＤＮＡライブラリーは２種のプライマーのｃＤＮＡライブラリーは２種のプライマーのｃＤＮＡについてそれぞれ４種が調製された。
【００３１】
（２）ｃＤＮＡライブラリーのプラークイムノスクリーニング及びクローンの選      定
２種のプライマーに基づいた各ｃＤＮＡライブラリーで、その調製前のサイズ分画に由来する各サイズの小さい方の２種（＜５００ｂｐ）は省き、大きい方の２種（＞５００ｂｐ）について、それぞれ大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス寒天培地上で常法にしたがってプラークの生成を行った。常法にしたがって、ｌａｃプロモーターの誘発剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含浸させたニトロセルロースフィルターに写し取り、イムノスクリーニングを行った。スクリーニングに用いた一次抗体には、２ＧＳ抗原の６７ｋＤａ付近を認識するＭ５と１００〜２００ｋＤａを認識するＲ１の２種の単クローン抗体の等量混合物を用いた。２次抗体にはＨＲＰ標識家兎抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡを、発色反応の基質にはジアミノベンチジンを用いた。
【００３２】
単クローン抗体は、予めそれぞれの単クローン抗体結合アフィニティーカラムで精製した各２ＧＳ抗原の混合物での試験であるが、感染防御性が認められ、本スクリーニングに適していると判断されたものである。スクリーニングの見落としを防止することからも、両者の混合物を用いて行った。
尚、両者共それによって認識される抗原は分子量的に単一ではなく、それぞれ上述したようなある範囲のものが認識されることから、本原虫抗原は同一エピトープの繰り返し構造を有しているものと推察される。
【００３３】
クローニングの結果、オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドプライマーに基づいたｃＤＮＡの場合で３３種（Ｔ番号を付す）の、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーに基づいたｃＤＮＡの場合で４４種（Ｒ番号を付す）の組換えＤＮＡが得られた。それらを再クリーニングした後、クローンの選定を行った。
【００３４】
即ち、再スクリーニングした際にも発色が比較的強い陽性反応を示したファージを増殖後、大腸菌Ｙ１０８９株に感染させて溶原菌を調製した後、誘発剤にＩＰＴＧを用いた発現培養を行い、細胞ライセートを調製して同単クローン抗体の混合物を用いてイムノドットブロットテストを行って抗原の発現を再確認すると共に、一方、陽性ファージを増殖、精製後ＥｃｏＲＩ−切断フラグメント生成の確認を行い、その結果Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１８、Ｒ２９、Ｒ３５、Ｒ４２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ９、Ｔ１０の１７種を免疫原性蛋白質遺伝子の有力なクローンとして選定した。以上の工程の要約を図１、図２及び図３に示した。
【００３５】
このようにして得られたクローンが、実際に免疫原性を賦与し得るものかをみるために、この段階でＲ１５、Ｔ１０の任意の２種の細胞ライセートについて、アジュバントとして水酸化アルミニウムゲルを５００μｇＡｌ／ｍｌに添加して感染防御試験を試みた。感染防御試験の方法と効果判定の方法の概略については実施例の（４）に述べるが、Ｒ１５及びＴ１０λｇｔ１１クローンの発現蛋白質の感染防御試験の結果は表１に示すように未接種対照群も含めて全例に発症、死亡が認められなかったが、免疫鶏にスポロゾイト１９５００匹／羽で攻撃を行った後、１３日目に血清中に出現する原虫の発育過程に由来する血清可溶性抗原（ＳＳＡ）の量的値（ＳＳＡ価）では、その値の低い羽数が免疫群は未接種対照群を上回ったことから、Ｒ１５、Ｔ１０には弱いながらも免疫性が認められたと判断した。
【００３６】
また攻撃直前の血清の２ＧＳ抗原に対するワクチン抗体価（ＥＬＩＳＡ抗体価）も免疫群では全例未接種対照群に比較して上昇していることが認められた。このことから本スクリーニングによって得られたクローンは本目的に適うものと判断した。
【００３７】
【表１】
0003582663.tif 000005
【００３８】
（３）発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩサブクローン及びワクチンクローンの選定ワクチン実用化の発現培養のために、上記１７種のクローンの当該遺伝子をそれぞれ発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩ（バイオラブス社製）に挿入し、上述と同様のイムノスクリーニングでｐＭＡＬ−ｃＲＩサブクローンを得て、大腸菌ＴＢ１株に移入した。これらのサブクローンについて２種の単クローン抗体それぞれに対するＥＬＩＳＡ抗原価測定とサザーンハイブリダイゼーションによりクローンの群別を試みてワクチンクローンの選定を行った。ＥＬＩＳＡには発現培養を行って調製した試料を、サザーンハイブリダイゼーションには、一方で当該遺伝子をｐＵＣ１９にもサブクローンして調製したプラスミドを用いた。
【００３９】
製剤の作製方法でもある発現培養による試料の調製方法は次の通りである。宿主菌のＬ−ブロス液体培地を用いた３７℃での振とう培養で対数増殖期にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭに添加して、さらに３７℃で４〜６時間培養して蛋白質をマルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現させた後、遠心分離して得られた菌体をリシスバッファーに浮遊、超音波処理し、再び遠心分離して超音波抽出液を得た。さらにこの抽出液を飽和硫酸アンモニウムで処理して得られた沈澱をＰＢＳに溶解し、ホルマリンを終濃度０．２％に添加し、４℃で１晩以上静置後試料とした。
【００４０】
ＥＬＩＳＡ抗原価の測定結果では、単クローン抗体Ｍ５及びＲ１のいずれかと明らかな反応性を示したクローンは１７種の中８種であり、その中、単クローン抗体Ｍ５反応群はＲ１、Ｒ４ａ、Ｒ１３及びＴ３で、単クローン抗体Ｒ１反応群はＲ７、Ｒ１５、Ｒ３５及びＴ１０でいずれも４種ずつであった。なお、単クローン抗体Ｒ１と強い反応性を示したＲ７、Ｒ１５は、培養によっては単クローン抗体Ｍ５とも反応性を示した。
【００４１】
ｐＭＡＬ−ｃＲＩサブクローンの発現蛋白質（粗物質）のＥＬＩＳＡ抗体価及びサザーンハイブリダイゼーションによる群別とクローンのサイズ、並びにＥＬＩＳＡ抗原価：単クローン抗体Ｍ５及びＲ１それぞれに対する反応性、サザーンハイブリダイゼーション：プローブＲ４ａ、Ｒ７及びＲ１５に対する反応性の測定結果を表２に示した。
【００４２】
一方、プローブとしてＲ４ａ、Ｒ７及びＲ１５の各プラスミド由来精製フラグメントを用いたサザーンハイブリダイゼーションの結果では図３に示すようにプローブＲ４に対してＲ４ａ、Ｔ３が、プローブＲ７とＲ１５に対してはいずれの場合もＲ７、Ｒ１５、Ｒ３５及びＴ１０が反応性を示した。これらについて各クローンのＤＮＡサイズ（近似値）とともに表２に示した。
【００４３】
【表２】
0003582663.tif 000006
【００４４】
サザーンハイブリダイゼーションで、プローブＲ４ａと反応したものはＲ４ａとＴ３で、ＥＬＩＳＡ抗原価による単クローン抗体Ｍ５反応群としては同一群であるＲ１ａ、Ｒ１３との反応性は認められなかったが、ＥＬＩＳＡ抗原価による２種の単クローン抗体を認識するクローンの群別と、サザーンハイブリダイゼーションによる遺伝子の相互類似性を示すクローンの群別とは一致するものと判断した。
【００４５】
そこで、単クローン抗体Ｒ１認識群とＭ５認識群の各４種のクローンの発現試料の混合物を用いた感染防御試験の比較を試みた。その結果は表３に示した。スポロゾイト攻撃時の血清の２ＧＳ抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価では明らかにＲ１群はＭ５群を上回り、また攻撃後１３日目のＳＳＡの抑制程度もＲ１群はＰＢＳ対照群を有意に上回っていた。さらに８種の個々のクローンを任意に選んで行った感染防御成績からは、単クローン抗体Ｍ５と反応する代表的なクローンＲ４ａによる免疫抗体は、ＥＬＩＳＡで同じＲ４ａの抗原とは反応するが２ＧＳ抗原とは常に反応性を示さず、これに対して単クローン抗体Ｒ１と反応するクローンによる免疫抗体は、同法で同じ抗原ともまた２ＧＳ抗原とも反応性を示すことがわかった。
【００４６】
一方、また８種のウエスタンブロットの成績からも、単クローン抗体Ｍ５は、当該遺伝子を挿入しないベクターを移入した宿主菌由来の抽出液（発現の陰性対照）の数多くの蛋白質をも認識するが、これに対し単クローン抗体Ｒ１はそのような現象を示さず、常に発現によって生じた蛋白質を主として認識するものであることがわかった。
【００４７】
【表３】
0003582663.tif 000007
【００４８】
以上のことから、ワクチンクローンには２ＧＳ抗原に対して特異性を示すＲ１単クローン抗体認識クローンから選定することが適切であると判断した。これらのクローンについてさらに感染防御試験で検討した結果、Ｒ７、Ｒ１５の両クローンがワクチンクローンの候補に挙げられたが、効果を示す回数が上回ったＲ７が最終的にワクチンクローンとして決定された。このようにして得られたＲ７クローンの組換え微生物をＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７と命名し、これを発現させて作製したワクチンをロイコチトゾーン症遺伝子組換えワクチン（Ｒ７ワクチンと略称）した。なお、本組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７は工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年３月２２日、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２４０として寄託されている。
【００４９】
次に、本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７について以下の成績を説明する。
ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７切断Ｒ７フラグメントの電気泳動像：
組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７の増殖培養菌から精製したｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７プラスミドとこれのＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡについて、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。図４は当該組換え微生物からｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７プラスミドが得られ、このプラスミドからＥｃｏＲＩ−切断により、約６．１ｋｂｐのベクターと約２．０ｋｂｐのＲ７フラグメントが生じることを示す。
【００５０】
本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７の発現材料の電気泳動像及びウエス
タンブロット像：
発現培養液の液量に対し１／１０量の菌体浮遊液の超音波破砕抽出液を、さらに飽和硫酸アンモニウムで処理して１／４０量とした発現材料に、等量の泳動用試料緩衝液を加え、これの２０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（８％濃度のゲル）にアプライして泳動を行った（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ウエスタンブロットの１次抗体には単クローン抗体Ｒ１を用いた。このときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を図６（ａ）、（ｂ）に、ウエスタンブロット像を図７のそれぞれ示した。
【００５１】
図６（ａ）、（ｂ）に示すように発現材料では２００ｋＤａ近くに２本のバンドが出現したが、一方、発現の誘発をかけない非発現材料ではそれらのバンドはみられなかった。また、図７に示すように発現材料ではそれらのバンドに反応性がみられたが、一方、非発現材料では反応性はみられなかった。なお、発現材料の２０倍希釈での反応性は２本のバンドの中、一方だけになったとみられる。
【００５２】
このように２００ｋＤａ近くにバンドがみられる材料は、後述の単クローン抗体Ｒ１との反応でＥＬＩＳＡ抗原価が示されるが、さらにそれらの関連性をみるために、発現材料についてセファクリルＳ２００によるカラムクロマトグラフイー行い、その画分Ｆ１、Ｆ２及びＦ３のカラムアプライ量に対して各４倍濃縮材料について、同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ像およびウエスタンブロット像を調べた。このときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像およびウエスタンブロット像をそれぞれ図８及び図９に示した。
【００５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２００ｋＤａ近くに２本のバンドがＦ１では、やはりウエスタンブロット反応性がみられるが、それらのバンドがみられないＦ２およびＦ３では反応性はみられなかった。なお、Ｆ１の２０倍希釈での反応性はやはり２本のバンドの中、一方だけになったとみられる。また、これらの画分についてのＥＬＩＳＡ抗原価はＦ１では認められたが、Ｆ２には認められなかった。
【００５４】
発現材料及びその濾過画分のＥＬＩＳＡ抗原価（１００倍に希釈した単クローン抗体Ｒ１を用いたときのＥＬＩＳＡ抗体価）はつぎの通りである。
0003582663.tif 000008
【００５５】
このように、発現材料ではＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２００ｋＤａ近くにバンドが出現し、それらがウエスタンブロット反応を示すのに対し、同様の非発現材料ではそれらのバンドは出現せず、ウエスタンブロットでも反応性がみられないこと、またＥＬＩＳＡ抗原価はそれらのバンドが出現する材料にのみ認められることから、それらの物質が発現融合蛋白質と判断された。Ｒ７遺伝子の塩基配列は以下の通りで、その両末端の下線部分はＥｃｏＲＩアダプター領域を示す。
【００５６】
【化１４】
0003582663.tif 000009
【化１５】
0003582663.tif 000010
【化１６】
0003582663.tif 000011
【００５７】
本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７の発現融合蛋白質領域
融合蛋白質領域は、
【００５８】
【化１７】
0003582663.tif 000012
【化１８】
0003582663.tif 000013
【化１９】
0003582663.tif 000014
【化２０】
0003582663.tif 000015
で示すように、マルトース結合蛋白質遺伝子の最初の開始コドンＡＴＧから１ａｃＺａ遺伝子の最後の終止コドンＴＧＡまでの３３９９ｂｐ（１１３２個のアミノ酸）である。その中に２０１９ｂｐのＲ７遺伝子がＥｃｏＲＩアダプターを介して挿入されている。ＥｃｏＲＩアダプター領域は破線で、Ｒ７領域は実線で示した。Ｒ７遺伝子の両末端のＥｃｏＲＩアダプターを含めた領域の蛋白質は６８９個のアミノ酸から成り、その組成は次の通りである。
【００５９】
Ａｌａ      ３（０．４）                Ｌｅｕ      ２（０．３）
Ａｒｇ      ２（０．３）                Ｌｙｓ    ６８（９．９）
Ａｓｎ    ２５（３．６）                Ｍｅｔ      ５（０．７）
Ａｓｐ    １２（１．７）                Ｐｈｅ      ２（０．３）
Ｃｙｓ      １（０．１）                Ｐｒｏ      ５（０．７）
Ｇｌｎ    １４（２．０）                Ｓｅｒ      ６（０．９）
Ｇｌｕ  ３１１（４５．１）              Ｔｈｒ    ５４（７．８）
Ｇｌｙ      ９（１．３）                Ｔｒｐ      ０（０．０）
Ｈｉｓ    ６８（９．９                  Ｔｙｒ      ８（１．２）
Ｉｌｅ    ３５（５．１）                Ｖａｌ    ５９（８．６）
Ｅｎｄ      ０（０．０）
【００６０】
酸性アミノ酸    （Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）              ３２３（４６．９）
塩基性アミノ酸  （Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）                ７０（１０．２）
芳香族アミノ酸  （Ｐｈｅ＋Ｔｒｐ＋Ｔｙｒ）        １０（１．５）
疏水性アミノ酸  （芳香族アミノ酸＋Ｉｌｅ  ＋Ｌｅｕ  ＋Ｍｅｔ  ＋Ｖａｌ  ）  １１１  （１６．１）
分子量＝８４１４４
【００６１】
（４）本Ｒ７ワクチンの感染防御試験
本原虫症ワクチンの感染防御試験による効果判定には、免疫鶏にスポロゾイトで攻撃後、主として１３日目の血清の可溶性抗原（ＳＳＡ）価の測定、２１日目までの発症、生・死判定を含む臨床症状の観察、及び２１日目の血液中のガメトサイト数の測定等の評価の結果がその評価の対象となり、その他ワクチン抗体価（攻撃直前の血清抗体価）の測定及び攻撃後２１日目の血液中の赤血球数の測定等の結果も評価の参考とした。
【００６２】
ＳＳＡ価またはガメトサイト数の測定は、スポロゾイトで攻撃後２１日目を経ても発症、生・死では効果判定不能の場合にも評価の対象になるものである。ＳＳＡ価の測定は、攻撃スポロゾイトにより血清中に出現する原虫の発育過程に由来するＳＳＡ価の量を、感染耐過鶏血清を用いたゲル内沈降反応で調べ、陽性反応の程度が低いもの程、スポロゾイトの発育が抑えられたことになり、したがってその反応が少ない羽数が非免疫対照群の羽数に比較して多いもの程、防御効果が認められたことになる。同様にガメトサイト数の測定はやはりスポロゾイトがガメトサイトにまで発育するその数を測定するもので、血液中にその数が少ない羽数が非免疫対照群の羽数に比較して多いもの程、防御効果が認められたことになる。
【００６３】
ワクチンは前述の実施例の（３）に記載した通りに調製し、最終的に水酸化アルミニウムゲルを加えた時点でその量は培養液量に対して１／１０とした。以下３ロットの試作品についてそれぞれ試験−１、試験−２及び試験−３として行った。鶏は試験−１、試験−２及び試験−３ではそれぞれ３６日令、２３日令および２１日令のいずれもＳＰＦ鶏由来ひなを用い、ワクチンを左右大腿部筋肉内に０．５ｍｌずつ計１ｍｌを２週間隔で２回注射した。試験−３ではさらに１．５ｍｌずつの計３ｍｌでも試みた。ワクチン２回注射２週間後に血清を採取した後、攻撃はロイコ原虫静岡株のスポロゾイトを１羽あたり、試験−１では１３６００匹、試験−２では１２５００匹、試験−３では１５０００匹を静脈内接種して行った。
【００６４】
攻撃直前に採血し、攻撃後２１日間臨床症状の観察を行い、この間１３日目に採血し、また観察終了時に血液サンプルを採取した。さらに攻撃時及び試験終了時の体重を測定した。
それらによる試験−１、試験−２及び試験−３における主として、ワクチン抗体価（攻撃直前のＥＬＩＳＡによる血清抗体価）、攻撃後１３日目のＳＳＡ価、攻撃後２１日目までの臨床症状観察、試験終了時のガメトサイト数等及び増体重の結果をそれぞれ表４、表５及び表６に示した。
【００６５】
試験−１
【００６６】
【表４】
0003582663.tif 000016
１）陽性を示した血清の最高希釈倍数
２）沈降線のみられた血清の最高希釈倍数
３）攻撃後日数
４）死亡のための検査できず
５）血液凝固のため検査できず
【００６７】
表４の結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡ抗体価はワクチン群では＜１００〜１６００倍で、対照群の全例＜１００倍に比較して上昇が認められた。ＳＳＡ価は、ワクチン群では認められた抗原は２〜３２倍（平均１４．５倍）であったのに対し、対照群では８〜＞５１２倍（平均６４．０倍）の抗原が認められ、両者の間には明らかな差が認められた。
【００６８】
臨床症状観察結果では、ワクチン群では８例中３例が発症、その中２例が死亡したのに対し、対照群では８例中全例が発症し、その中４例が死亡した。ガメトサイト数は、ワクチン群では平均２０４万匹／ｍｌで、対照群の平均１１０万匹／ｍｌより多かったが、むしろ差はないとみるのが適切と思われる。ヘマトクリット値（試験終了時）は、ワクチン群では平均２０．６であったのに対し、対照群では１６．３で、ワクチン群におけるヘマトクリット値の回復が対照群より早い傾向が見られた。更に、増体重はワクチン群では平均６０ｇであったのに対し、対照群では−４５ｇであった。
以上の試験結果から、特にＳＳＡ価の測定及び臨床症状の観察の結果から効果が認められると判定された。
【００６９】
試験−２
【００７０】
【表５】
0003582663.tif 000017
表５の結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡ抗体価は、ワクチン群では１００〜１２８００倍で、対照群の全例＜１００倍に比較して上昇が認められた。ＳＳＡ価は、ワクチン群では７例中３例に４〜３２倍の抗原が認められたが、残る４例には抗原は認められなかった。これに対し対照群では全例に３２〜２５６倍の抗原が認められた。
【００７１】
臨床症状観察結果では、ワクチン群では全例に死亡する例は認められなかったが、発症は全例に認められ、その程度はワクチン群では７例中１例が＋＋＋の重度の発症を示した他は１例が＋＋の中等度であり、５例は＋の軽度であった。これに対し対照群では７例中１例が＋＋の中等度以外は、残り６例が＋＋＋の重度であった（肉冠褪色、元気なくうずくまり、嗜眠状態の何れか１つの症状を示した場合は＋、２つの症状を示した場合は＋＋、全ての症状を示した場合は＋＋＋とした）。
【００７２】
ガメトサイト数は、ワクチン群では１６３万匹／ｍｌで、対照群の６０１万匹／ｍｌに比較して少なかった。赤血球数は、ワクチン群では３１１万個／ｍｍ３  であったのに対し、対照群では２２４万個／ｍｍ３  であった。更に増体重は、ワクチン群では平均１４０ｇであり、対照群の平均４３ｇを上回った。
以上の結果から、特にＳＳＡ価の測定および臨床症状の観察結果から効果が認められると判定された。
【００７３】
試験−３
【００７４】
【表６】
0003582663.tif 000018
表６の結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡ抗体価は、ワクチン群では１００〜８００倍で、対照群の全例＜１００倍に比較して上昇が認められた。ＳＳＡ価は、ワクチン群と対照群と共に臨床的に特に所見は認められなかった。臨床症状観察結果では、ワクチン群と対照群と共に、臨床的に特に所見は認められなかった（表中の＋は、肉冠に軽度の白色化がみられたことを示す）。
【００７５】
ガメトサイト数は、ワクチン群では全例ガメトサイトは認められず、これに対し対照群では平均６１２万匹／ｍｌで、両者には明らかな差が認められた。増体重は、両者間に差は認められなかった。なお、この試験では、ワクチンの１回に１ｍｌ接種でも３ｍｌ接種でも効果に差は認められなかった。
以上３例の試験成績より、本ワクチンはロイコチトゾーン症ワクチンとして効果が認められると判定された。
【００７６】
【配列表】
【００７７】
配列番号：１
配列の長さ：２０１９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：塩基配列
起源
生物名：ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント
株名：静岡株
配列
【００７８】
【化２１】
0003582663.tif 000019
【化２２】
0003582663.tif 000020
【化２３】
0003582663.tif 000021
【００７９】
配列番号：２
配列の長さ：３３９９
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：塩基配列
起源
生物名：ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント及び大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来発現プラスミドｐＫＫ２３３−２由来ｐＭＡＬ−ｃＲＩ
株名：静岡株
配列
【００８０】
【化２４】
0003582663.tif 000022
【化２５】
0003582663.tif 000023
【化２６】
0003582663.tif 000024
【化２７】
0003582663.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾントの免疫原性蛋白質遺伝子のクローニング及びワクチンクローンの選定の工程図である。
【図２】ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント免疫原性蛋白質遺伝子のクローニングを示すものである。
【図３】クローン化第２代シゾント免疫原生蛋白質遺伝子の発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩへの挿入を示すものである。
【図４】Ｒ７及びＲ１５及びＲ４ａプローブをそれぞれに対するｐＵＣ１９−クローンプラスミド反応のハイブリダイゼーションを示すものである。
【図５】ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７切断Ｒ７フラグメントのアガロース電気泳動像を示すものである。
【図６】（ａ）および（ｂ）はＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７発現材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を顕微鏡写真によって示すものである。
【図７】ＴＢＩ／ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７発現材料のウエスタンブロット像を顕微鏡写真によって示すものである。
【図８】発現材料のカラムクロマト画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を顕微鏡写真によって示すものである。
【図９】発現材料のカラムクロマト画分のウエスタンブロット像を顕微鏡写真によって示すものである。
【図１】
0003582663.tif 000026
【図２】
0003582663.tif 000027
【図３】
0003582663.tif 000028
【図４】
0003582663.tif 000029
【図５】
0003582663.tif 000030
【図６】
0003582663.tif 000031
【図７】
0003582663.tif 000032
【図８】
0003582663.tif 000033
【図９】
0003582663.tif 000034