【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年7月21日(2017.7.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
静置細胞培養用のガス透過性の細胞培養・細胞回収器具であって、
生育面と生育面に対向する上部限界とを少なくとも一部の境界とする内部体積を有し、生育面が非多孔質で液体不浸透性かつガス透過性の材料からなり、周囲雰囲気のランダムな動きによりガス透過性材料の少なくとも一部分がその雰囲気ガスと接触するようになっており、
細胞取り出し開口部を有する細胞取り出し管と、
生育面から離れた位置に培地取り出し開口部を有する培地取り出し管とを有し、
器具を静置培養の向きに置いた際に、生育面が水平状態にあり、生育面の少なくとも一部分においては対向する上部限界の下にあり、
細胞取り出し開口部と生育面との間の距離が培地取り出し開口部と生育面との間の距離よりも小さく、培地取り出し開口部が生育面と上部限界との間の最大距離の５０％かまたはそれ以下の生育面からの高さにあり、細胞取り出し管が生育面と接していることを特徴とする器具。
【請求項２】
請求項１の器具であって、培地の高さの最大値が2.0 cm以上であることを特徴とする器具。
【請求項３】
請求項１の器具であって、器具が静置培養の向きにあるとき、培地取り出し管と生育面との間の距離が少なくとも0.2 cmであることを特徴とする器具。
【請求項４】
請求項３の器具であって、生育面と培地取り出し開口部との間の距離が2.0 cmを越えないことを特徴とする器具。
【請求項５】
請求項１の器具であって、生育面の面積に対する内部体積の割合が2〜20ml／cm2であることを特徴とする器具。
【請求項６】
請求項１の器具であって、二つ以上の培地取り出し開口部を有し、器具が静置培養の向きにあるとき、各培地取り出し開口部が生育面と異なる高さに存在することを特徴とする器具。
【請求項７】
請求項１の器具であって、生育面サポートを備えることを特徴とする器具。
【請求項８】
請求項１の器具であって、ガス透過性材料がシリコーンからなることを特徴とする器具。
【請求項９】
請求項１の器具であって、器具を細胞取り出し向きに置いたときに、細胞取り出し開口部が内部体積の低所に設置されることを特徴とする器具。
【請求項１０】
請求項１の器具であって、器具の内部に細胞と培地を含み、器具が細胞培養に適した雰囲気ガスが存在する場所にあり、静置培養の向きに置かれていることを特徴とする器具。
【請求項１１】
静置細胞培養用のガス透過性の細胞培養・細胞回収器具であって、
生育面と生育面に対向する上部限界とを境界とする細胞培養の区画を有し、生育面が非多孔性で液体不透過性かつ気体透過性の材料からなり、前記気体透過性材料の少なくとも一部が生育面サポートと接しており、前記生育面サポートにより培養中にガス透過性材料を水平方向に保持し、かつ、強制せずとも雰囲気ガスがガス透過性材料の下側と接触できるようになっている細胞培養の区画と、
生育面と接触しない培地取り出し開口部を含む培地取り出し管と、
器具が細胞回収の向きに置いた際に培地および細胞を器具の低所から抜き取る役割を持つ細胞取り出し開口部を含む細胞取り出し管とを備えており、
器具を静置培養の向きに置いた際に、生育面が水平状態であり、生育面と細胞取り出し開口部との間の距離が生育面と上部限界との間の距離の半分未満であること
を特徴とする器具。
【請求項１２】
請求項１１の器具であって、器具が静置培養の向きにあるとき、生育面と培地取り出し開口部との間の距離が少なくとも0.2 cmであることを特徴とする器具。
【請求項１３】
請求項１１の器具であって、生育面と培地取り出し開口部との間の距離が2.0 cmを越えないことを特徴とする器具。
【請求項１４】
請求項１１の器具であって、器具の内部に細胞と培地を含み、器具が細胞培養に適した雰囲気ガスが存在する場所にあり、静置培養の向きに置かれていることを特徴とする器具。
【請求項１５】
請求項１４の器具であって、細胞がT細胞を含むことを特徴とする器具。
【請求項１６】
請求項１１の器具であって、器具を静置培養の向きにしたときに、細胞取り出し管が底部に接触していることを特徴とする器具。
【請求項１７】
請求項１１の器具であって、生育面の面積に対する内部体積の割合が2〜20ｍｌ／cm2であることを特徴とする器具。
【請求項１８】
請求項１１の器具であって、ガス透過性材料がシリコーンからなることを特徴とする器具。
【請求項１９】
請求項１１の器具であって、二つ以上の培地取り出し開口部を有し、器具が静置培養の向きに置かれたとき、各培地取り出し開口部が生育面と異なる高さに存在することを特徴とする器具。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
この発明の別の実施例として、細胞の損失なく培養中の培地体積を減らすことができ、遠心分離の必要性なく細胞を濃縮でき、器具から細胞を取り出すまえに細胞密度を増大させることができるようなガス透過性細胞培養・細胞回収器具を開示する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
この発明の別の実施例においては、オペレータが培養物へ供給を行おうとしたときに、培養中の器具の数を増やす必要性を最小限に抑えるため、細胞の損失なく培養中の培地体積を減らすことができるような、新規なガス透過性細胞培養および細胞回収器具の使用方法を開示する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
この発明は、添付図面と関連付けてこの発明のさまざまな実施例に関する以下の詳しい説明を考慮すると、より完全に理解されるであろう。
【図１Ａ】例１における抗原特異性Ｔ細胞の個体数が初期刺激のあと最初の７日間で少なくとも７回の細胞倍増を受けることを示している。
【図１Ｂ】例１に対する四量体分析によって求めた、時間の経過による細胞集団内におけるＴ細胞個体数の増殖の大きさを示すデータである。
【図１Ｃ】例１において、抗原特異性Ｔ細胞の個体数の増殖速度が２３日間の期間で減速することを示している。
【図２】例１における抗原特異性Ｔ細胞の可能な増殖と、観測された増殖倍率との間の相違を示す表である。
【図３Ａ】例２において、刺激のあとの抗原特異性Ｔ細胞の存在を示している図である。
【図３Ｂ】例２において、抗原特異性Ｔ細胞と抗原提示細胞との比率を4:1に維持しながら表面密度を1×106/cm2から3.1×104/cm2まで低下させたときの抗原特異性Ｔ細胞の個体数の増殖を示している。
【図３Ｃ】例２において、一定個体数の抗原提示細胞が存在する状態で、表面密度を1×106/cm2から3.1×104/cm2まで低下させたときの抗原特異性Ｔ細胞の個体数の増殖を示している。
【図４】図３に記載されている作業を続けたときに得られる結果の例を示しており、目的の細胞がほかの細胞の支援を必要とするとき、目的の細胞がフィーダ細胞および／抗原提示細胞を適切に供給される限り、従来になく低い表面密度で個体数の増殖を開始できることも示している。
【図５】３種類の表面密度（CTL数/cm2）において培養を開始することによって、目的の細胞の個体数の増殖の程度の再現力を表すヒストグラムである。
【図６】データを得るために使用したガス透過性テストフィクスチャの断面図を示している。
【図７Ａ】例５において行われた、この発明に従って作製された抗原特異性Ｔ細胞の増殖曲線を従来の方法と比較して示している。
【図７Ｂ】例５に対して、フローサイトメトリの前方散乱対側方散乱の分析によって求めた細胞生存性が、この発明に従って作製された抗原特異性Ｔ細胞においては、従来の方法に比較して著しく高かったことを示している。
【図７Ｃ】例５に対して、アネキシン-PI 7AADによって求めた細胞生存性が、この発明に従って作製された抗原特異性Ｔ細胞においては、従来の方法に比較して著しく高かったことを示している。
【図７Ｄ】例５に対して、CFSE標識された細胞の日ごとのフローサイトメトリ分析によって求めたところ、この発明の新規な方法で作製された細胞の優れた増殖が従来の方法を用いて培養された細胞と同じ細胞固有の増殖速度を有していることが示されており、細胞の死滅の結果として細胞増殖の速度が増大していることが確かめられる。
【図８Ａ】培地を入れ替える必要性なく、従来の方法において可能な値を超えてEVB-CTLがいかに増殖可能であるかを示している。
【図８Ｂ】例６の培養条件は最終細胞生成物をいかに改変しないかを、EBERに対するQ-PCRによって評価して示している。
【図８Ｃ】例６の培養条件は最終細胞生成物をいかに改変しないかを、Ｂ細胞マーカCD20に対するQ-PCRによって評価して示している。
【図９】目的の細胞と抗原提示細胞（この場合にはAL-CTL細胞とLCL細胞が組み合わさって30000個/cm2の表面密度で細胞集団を形成している）の累計表面密度が非常に低いとAL-CTLの個体数の増殖を開始できないことを我々が実験的に示した例を示している。
【図１０Ａ】細胞を培養する二つの新規な方法が23日間にわたって従来の方法よりもいかに多くの細胞を作製するかを示す例８のデータを示している。
【図１０Ｂ】例８においてテストフィクスチャの中で培養された細胞の写真を示している。
【図１０Ｃ】例８において、二つの新規な培養方法と従来の方法ではすべて同じ表現型を有する細胞が作製されることを示している。
【図１０Ｄ】例８に対して、EBVのLMP1、LMP2、BZLF1およびEBNA1からのEBVペプチドエピトープで刺激され、HLA-A2-LMP2ペプチド五量体染色で染色したＴ細胞が、ペプチド特異的Ｔ細胞の頻度が同程度であることを示した代表的な培養を示している。
【図１０Ｅ】例８の新規な方法および従来の方法に対して、細胞がそれらの細胞溶解の活性と特異性を維持し、HLAミスマッチのEBV-LCLの殺傷を小さくして自己由来のEBV-LCLを殺傷したことを、51Cr遊離試験によって評価して示している。
【図１１】従来のシナリオのもとでの生育面上の目的の細胞の個体数増殖を、この発明の一つの側面を用いた目的の細胞タイプの個体数の増殖と比較してグラフ表示したものを示している。
【図１２】ガス透過性材料から構成された生育面と、1あるいは2 ml/cm2以上の従来になく高い培地体積と生育面積との比率を利用することによって得ることができる利点の例を示している。
【図１３】従来のシナリオのもとでの生育面上の目的の細胞の個体数増殖の新規な方法を、この発明の一つの実施例での目的の細胞タイプの個体数増殖と比較してグラフ表示したものであり、そこでは終了したときの細胞の表面密度が従来の表面密度よりもずっと大きい。
【図１４】従来の方法に対してさらなる利点を提供する細胞作製の別の新規な作製方法を示している。
【図１５】新規な方法の威力と、それが種々の段階において十分に効率を得るために作製実験計画を調節することがなぜ有用かを示すために、図１４に描かれている各作製方法の比較を示している。
【図１６】作製が進行するにつれて効率を得るために新規な方法において作製実験計画をどのように調節することができるかの例を示している。
【図１７Ａ】1.0E+06個/cm2における実験条件と結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１７Ｂ】0.5E+06個/cm2における実験条件と結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１７Ｃ】0.25E+06個/cm2における実験条件と結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１７Ｄ】0.125E+06個/cm2における実験条件と結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１７Ｅ】0.0625E+06個/cm2における実験条件と結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１８】図１７Ａから図１７Ｅに詳しく示されている実験条件それぞれの表面密度に対して個体数増大の増殖倍率を比較している。
【図１９Ａ】グルコース濃度を除いて同等の開始条件のもとで、K562細胞の培養に対する実験条件と典型的な結果の代表的な表計算シートを示している。
【図１９Ｂ】二つのグルコース開始条件のもとで、１１日間にわたる細胞個体数の増殖を示している。
【図１９Ｃ】各培養条件におけるグルコースの減少率を示している。
【図１９Ｄ】各培養条件におけるグルコースの消費率を示している。
【図１９Ｅ】240 mg/dlのグルコース濃度で開始された培養に対して、公式による計算を用いて予測される細胞の個体数と、マニュアルで数えて求めた細胞の数を重ねたものを示している。
【図１９Ｆ】240 mg/dlのグルコース濃度で開始された培養に対して、公式による計算を用いて予測される細胞の個体数と、マニュアルで数えて求めた細胞の数を重ねたものを示している。
【図２０】さまざまな培地供給条件のもとでの、生育面に対して規格化された個体数の成長をグラフ表示したものである。
【図２１】細胞個体数の代替的測定値としてグルコースの低下を用いることができることを示す実験に対して、０日目、９日目、１６日目の条件を要約した表計算シートを示している。
【図２２Ａ】開示されている新規な細胞培養方法および／あるいは新規な細胞回収方法を実行するように構成された細胞培養および細胞回収器具１０００のこの発明の実施例の一例の断面図を示している。
【図２２Ｂ】培養の与えられた任意の細胞作製段階の開始時において、静置培養の初期状態にある細胞培養および細胞回収器具１０００を示している。
【図２２Ｃ】体積を減らした培地で細胞を回収するように準備された細胞培養および細胞回収器具１０００を示している。
【図２２Ｄ】細胞回収培地１０２４を移転するために、元の水平な細胞培養位置から角度１０２６だけ偏向した位置まで細胞培養および細胞回収器具１０００の向きを変えるプロセスを示している。
【図２３Ａ】培養の開始時における、そして培養が進行したときの評価Ａの条件を示している。
【図２３Ｂ】培養の開始時における、そして培養が進行したときの評価Ｂの条件を示している。
【図２３Ｃ】培養の開始時における、そして培養が進行したときの評価Ｃの条件を示している。
【図２３Ｄ】培養中のさまざまな時点における、培養物中の生きた全細胞を示している。
【図２３Ｅ１−２３Ｅ３】培養の最初と培養の終わりにおける、CAR T細胞発現の割合を示している。
【図２３Ｆ】培養中のCAT T細胞の全増殖倍率を示している。
【図２３Ｇ】評価Ａにおける生細胞の個体数の予測は、マニュアルで数えた細胞の個体数を表していたことを示す図である。
【図２３Ｈ】条件Ａと条件Ｂから得られた細胞の、PSCAを発現する腫瘍細胞を殺傷する能力を示している。
【図２４Ａ】PSCAに特異性を有するCAR T細胞の個体数の増殖を並べて比較したものである。
【図２４Ｂ】Muc1に特異性を有するCAR T細胞の個体数の増殖を並べて比較したものである。
【図２４Ｃ】CAR T細胞の個体数の増殖のグラフである。
【図２４Ｄ】Muc1細胞の個体数の増殖のグラフである。
【図２４Ｅ】生育面積の異なる３つのガス透過性培養器具の個体数成長曲線を示している。
【図２４Ｆ】表面密度に対して規格化されたあとの、図２４Ｅの曲線の個体数の成長を示している。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
定義
接着細胞：生育面に付着した細胞
抗原提示細胞（APC）：目的の細胞にトリガを加える作用をして特定の抗原に反応する細胞。
CTL：細胞傷害性Ｔ細胞
細胞密度：細胞の数と培地の単位体積との比率（細胞数/ml）
目的の細胞：作製プロセスによって量を増殖させたり回収させたりすることを目的としている特定のタイプの細胞。一般に、目的の細胞は非接着性であり、例としては、調節性Ｔ細胞（Treg）、ナチュラルキラー細胞（NK）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、初代Ｔリンパ球、および広範囲の抗原特異性細胞、そして他の多くのもの（それらのすべてがそれらの機能、in-vivo永続性、安全性を改変するために遺伝子操作も可能である）が含まれる。治療用途で必要な細胞は、フィーダ細胞や抗原提示細胞の一方あるいは両方を使って増殖させることができる。それらには、PBMC、PHAブラスト(blast)、OKT3 T、Bブラスト、LCL、およびK562（自然の、あるいは発現するように遺伝子改変されており、抗原および／あるいはエピトープや、41BBL、OX40、CD80、CD86、HLAなどの補助刺激分子など、その他多数）が含まれ、これらはペプチドあるいはその他の関連の抗原でパルスされていてもされていなくてもよい。
EBV：エプスタイン・バール・ウィルス
EBV-CTL：特異性で(specifically)認識されるEBV感染した細胞、あるいはそのＴ細胞表面受容体を介してEBV誘導ペプチドを発現あるいは提示する細胞。
EBV-LCL：エプスタイン・バール・ウィルスによって形質転換されたＢリンパ芽球様細胞株。
フィーダ細胞：目的の細胞を量的に増殖させるよう作用する細胞。環境によっては抗原提示細胞もフィーダ細胞として作用することがある。
生育面：培養器具の中で細胞が上に載っている領域。
培養開始時：一般に培養プロセスの開始時や作製サイクルの開始時における条件のことを指している。
培地交換：細胞に栄養分を供給することと同義であり、通常は古い培地に新鮮な培地を補充するプロセスのことである。
PBMC：末梢血から抽出された末梢血単核細胞であり、目的の細胞のいくらかの源であり、フィーダ細胞として作用することができる。
レスポンダ（R）：刺激細胞に反応する細胞。
静置細胞培養：培養器具がルーチンの操作のために場所を移されるとき、かつ／あるいは細胞に新鮮な培地などが定期的に供給されるときを除いて、撹拌あるいは混合されることのない培地中での細胞培養方法である。一般に、静置培養の培地は静穏状態にある。培地は、潅流システム（培地が容器の中を常時移動する）や、培地を動かすために培養器具が物理的に振動させられる振動システム、撹拌システム（そこでは器具内で撹拌棒が動いて培地と細胞を撹拌する）、あるいは培養のときに培地を動かし混合するために使用されるその他の任意の機構あるいは装置で起きるような強制的な動きは被らない。細胞は器具中で生育面に沈降し、ときどき行われる供給の期間を除いて乱されない状態でそこに存在する。供給の時には、培養物は、まず培地を取り出し、そのあと培地を追加することによって、あるいは培地を取り出さずに培地を追加することによって、あるいは培地および細胞を取り出し、その培地および細胞を新しい器具へ移してこれらの器具に新鮮な培地を追加することによって、新鮮な培地が提供される。供給プロセスを補助するポンプは一般的なものである。例えば、ガス透過性細胞培養バッグは、通常、閉じたシステムの中で流体を移動させるのに重力あるいはポンプに頼っている。培養期間の大部分は、細胞や培地が静穏で撹拌されない状態で存在する期間である。この発明は細胞静穏培養法を目指している。
刺激：抗原提示細胞および／あるいはフィーダ細胞が目的の細胞に対して有する効果。
スティミュレータ（S）：レスポンダ細胞に影響を与える細胞。
表面密度：その上に細胞が載っている器具内の生育面の単位面積当たりの細胞の量。
懸濁細胞：生育面に付着する必要のない細胞であり、非付着細胞と同義である。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
すべての条件が、最終的におおよそ同じ数の生細胞に到達していることに注目のこと。しかし、培養のときに培地の追加に頼らない条件では、他の条件よりもより速く生細胞が最大数に到達した。例えば、2.5 ml/cm2条件に対しては最大密度に到達するのに２０日かかったが、一方で培養を始めたあとに新鮮な培地が追加されない条件に対しては生細胞が同じ最大数に到達するのにたった１１日しかかからなかった。また、供給を受けない条件においては、個体数の成長速度がずっと優れていた。これも重要なことであるが、15.0cmの高さの培地で培養を開始する条件は、10.0cmの条件に対して細胞がより長い間にわたって高い生存性の持続期間を維持できる能力を示した。例えば、15.0cmにおいては最大細胞個体数に達したあと約４日間にわたって生存性は比較的高かったが、一方で10.0cm条件においては約１あるいは２日後に急速に減少した。ここで生じる実際的な利点は、細胞を回収する時間がより長くかかる作製プロセスである。養子細胞療法の分野における通常の技術者は、これの価値を認めるであろう。というのも、人々がなぜ大きな時間枠で細胞回収を行うことに価値を見出すかについては、品質制御の測定の結果を得るのが遅れることから、患者の状態が変わることに至るまで、多くの理由が存在するからである。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２０】
例１３：培地交換の簡略化された方法を可能にする新規な静置ガス透過性細胞培養および細胞回収器具、および細胞作製プロセスを完了したあとに培地から細胞を分離するのに必要な苦労を大きく軽減する新規な方法。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２１】
図２２Ａは、ここに開示している新規な細胞培養方法および／あるいは新規な細胞回収方法を実施できるように構成された細胞培養・細胞回収器具１０００のこの発明の実施例のひとつの例の断面図を示している。細胞取り出し管１００４の細胞取り出し開口部１００２は生育面１００６の近くに位置する。培地取り出し管１０１０の培地取り出し開口部１００８は生育面１００６の近くに位置する。生育面１００６はガス透過性材料から構成されている。ウィルソン'７１７号を含めて、適切なガス透過性材料について当業者が学ぶための情報源は数多く存在する。生育面１００６は液体浸透性はなく、非多孔質であることが好ましい。生育面１００６から内部体積１００４の上部限界１０１２までの距離によって、培地が存在できる空間の体積が決まる。培地は、上部限界１０１２を超える高さまで延びる培地取り出し管１０１０や細胞取り出し管１００４の中に存在することもできるが、当業者はこの実施例を説明する目的にとっては、最大の培地高さは内部体積１０１４の底部から上部限界１０１２までが最大の距離と考えるべきである。この細胞培養および細胞回収器具は、細胞および／あるいは培地を混合するために撹拌機構やその他の任意の機構を必要としない。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２２】
図２２Ｂは、培養の任意の与えられた細胞作製段階の開始時における静置培養の初期状態にある細胞培養および細胞回収器具１０００を示している。細胞培養および細胞回収器具１０００は生育面１００６が水平方向を向いた方向にあり、細胞１０１６は生育面１００６の上に沈降している。この説明のための実施例においては、生育面サポート１０１８を用いて生育面１００６を水平状態に保持しており、一方で、ガスを生育面１００６のところへ流すためにポンプやその他の機構を用いる必要はなく、雰囲気ガスを生育面１００６と接触させられるようになっている。生育面サポート１０１８をどのように構成するかの情報については、当業者はウィルソン'７１７号を参照することができる。培地１０２０は内部体積１０１４の境界内で任意のレベルに存在可能であるが、最上部の培地位置１０２２は図示されているように生育面１００６と平行であることが好ましい。細胞培養および細胞回収器具１０００は細胞培養に適した雰囲気中に、また細胞培養に適した温度で置かれる。雰囲気ガスは、生育面１００６との間でガスを行き来させるためのポンプあるいはその他の機構を用いる必要はなく、ランダムな動きによって生育面１００６のガス透過性材料と接触する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２４】
図２２Ｃは、細胞培養および細胞回収器具１０００から、より少ない培地体積中で細胞を回収させる別のステップを示している。細胞１０１６は抜き取らずに、培地を培地取り出し管１０１０の培地取り出し開口部１００８を介して取り出す。このステップのあとに残った培地が細胞回収培地１０２４として図示されている。残っている細胞回収培地が少ないほど、養子細胞療法に対する従来の方法では不可欠なものでありまた現状では遠心分離に大きく頼っている培地から細胞を分離するプロセスの手間がより低減される。しかし、培地体積を減らすときに細胞をあまり多く失わないように気を付けることが重要である。好ましくは、失われるのは細胞の10%以下であり、より好ましいのは実質的に失われる細胞がないことである。より詳しく指針を示すために、我々はこの発明のこの側面を使った例を示す。100 cm2の生育面積を有するガス透過性シリコーンから生育面が構成されており、培地体積が2000 mlで、培地体積を減らした時点での高さが20 cmであって、それによって200 ml/cm2の培地体積と生育面積との比率を形成しており、培地体積を減らした時点で生育面の上に約１兆個の細胞からなる培養細胞個体群が存在するような、図２２Ａに示されているものと類似したガス透過性器具において、我々は、細胞の目に見えるような減少を避ける能力を示すと同時に、培地体積において１００倍の低減を実現し、また、たった0.2 cm（生育面が水平状態にあるときに測定した）の細胞回収培地高さとたった0.2 ml/cm2の細胞回収培地体積と生育面積との比率によって特徴付けられる細胞回収時点において一連の条件を設定した。つぎに、我々は培地を、いまの場合には器具中の培地を渦状にかき混ぜた。それによって細胞は即座に生育面から持ち上げられ、また細胞は細胞回収培地の中に分布させられる。つぎに、我々は細胞取り出し管の細胞取り出し開口部を介して細胞を取り出した。細胞取り出し開口部は器具のエッジに沿って配置されており、我々は器具を傾けて、培地が細胞取り出し開口部の位置に集まるようにした。細胞と細胞回収培地を集めてからすぐに、我々は細胞回収培地中の細胞濃度を調べた。驚くべくことに、それは約1 ml当たり約５千万個であった。したがって、養子細胞療法における静置細胞培養の従来の方法において使用されている遠心分離装置を用いることなく、1 ml当たり約５０万個の初期細胞密度から１００倍の係数で細胞を濃縮することができた。その結果、細胞回収のために行うさらなる培養プロセスはわずかだった。本質的に、我々は遠心分離を行う必要のある培地体積を2000 mlからたった20 mlに減らすことができ、全体のプロセスは約１分以内で行われた。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２５】
培地取り出し管の培地取り出し開口部の位置は、生育面が水平状態にあるときには生育面から0.2 cm以上の距離にあることが好ましい。例えば、生育面が水平状態にあるときに生育面から0.2 cmと2.0 cmとの間にあれば、この発明の細胞培養方法の多くにおいて著しく体積を低減できるようになる。生育面が水平状態にあるときの培地取り出し開口部と生育面との間の距離の上限は、培地が細胞回収のために減らされる時点での培地の一般的な高さを考慮に入れた距離であることが好ましい。例えば、遠心分離される必要のある培地の体積を、静置細胞培養の従来の方法に対して50%減らそうとするなら、培地取り出し管の培地取り出し開口部は、培地高さの50%のところまで入れることになろう（器具は培地が生育面全体にわたって存在できるように設計されているものと仮定する）。実験室スペースを使用するには割増料金がかかることから、器具の高さは中に存在すると予想される培地の高さとおおよそ同じにすべきである。したがって、従来の方法に対して培地体積処理において少なくとも２倍の低減を得るというオプションを提供するためには、器具の高さを使用時の一般的な培地高さとちょうど同じにするか、あるいは少しだけ高くなるように器具を設計し、培地取り出し管の培地取り出し開口部を、生育面から約0.2 cmから（生育面が水平状態にあるとき）、器具の内側から測って器具の上部から生育面までのおおよそ半分の点までに配置するのが、経験上よい指針である。例えば、器具中の成長培地の上部境界から生育面までの距離が、器具中の培地の可能な高さを表しているなら、生育面が水平状態で、可能な培地高さの50%以下にあるとき、培地取り出し開口部は生育面の0.2 cm上方、あるいはそれ以上に位置することが好ましい。培地高さがどこにあるか不確かなときには、器具の中に複数の培地取り出し管を設けることができる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２６】
細胞取り出し管の細胞取り出し開口部は器具の下端に沿って配置されていて、器具の向きを変えずに細胞回収培地を集められることが好ましい。しかし、望むなら器具は向きを変えることができる。図２２Ｄは細胞培養および細胞回収器具１０００を、もともとの水平な細胞培養位置から傾斜角度１０２６の位置まで向きを変えるプロセスを示しており、このプロセスによって、内部に細胞１０１６が分布されている細胞回収培地１０２４を細胞取り出し管１００４の細胞取り出し開口部１００２に対して配置し直すことで、細胞回収培地１０２４をそのあと抜き取れるようになる。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２７】
しかし、細胞取り出し管の細胞取り出し開口部は器具の下端に沿って配置されている必要はない。細胞回収培地内で細胞を混合するステップが終了したら、単に細胞回収培地が細胞取り出し開口部のところへくるまで器具を回転させ、細胞回収培地を細胞取り出し管から取り出すことによって、器具内の任意の位置から細胞回収培地を取り出すことができる。当業者は、管は図示されているようである必要はなく、任意の構造でよいことがわかるであろう。設計の鍵となる特徴は、培地取り出し開口部を前述のとおり生育面に対して好ましい位置におくことができる機能にある。したがって、管は器具の側部に隔壁を設けたような簡単なものでも、入れ子式チューブのような複雑なものでもよい。当業者はまた、細胞培養および細胞回収の方法は閉じた系を成す構造に頼る必要はなく、開かれた系をなす構造という簡単な手段で実現することもできることを認識しなければならない。例えば、我々はウィルソン'７１７号に記載されているタイプの開いた系の器具を用い、培地取り出し管および細胞取り出し管としてピペットを用いても、上述した方法を実施し各ステップを繰り返すことで上述の濃縮を達成できた。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
この発明のさまざまな実施例に記載されている、細胞培養培地体積と生育面積との大きな比率の利点をとらえるためには、細胞培養および細胞回収器具の内部高さは任意の特定の用途において少なくとも2.0 cm以上であることが好ましい。また、細胞培養と細胞回収を容易にするために、細胞培養および細胞回収器具は、生物適合性の材料から構成されおり、透明で目視で評価ができ、堅固で取扱いが容易であることが好ましい。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２９】
この発明の細胞培養および細胞回収器具から、細胞を取り出すことなく培地を取り出す方法の発見によって、養子細胞療法における培地交換プロセスに関係する従来の静置細胞培養方法に対して別の利点を生じる。この明細書は培地を補充するための培地の取り出しや培地の交換を避ける新規な方法を述べているけれども、技術者がそのプロセスを実施したいという状況も存在するかもしれない。従来の方法は培地を取り出したり入れ替えたりするときには細胞を取り出すことになり、したがって一般的に行われているのは、培地を取り出し、それを一つあるいは複数の新しい器具に分布させ、それらすべての器具に培地を追加することである。したがって、供給を行うときにはいつも、より多くの器具がいることになる。これは我々の新規な方法では必要ない。というのは、我々のこの発明の細胞回収方法では、ピペットのように簡単なものでよい管を用いて培地を取り出すときに、器具中に細胞を残すからである。細胞を損失することなく培地体積を減らすために、スクリーンやフィルタ、あるいは器具の遠心分離を何ら用いる必要がない。細胞の個体数が最大表面密度になるまで、培地を単に取り出して、同じ器具に追加するだけである。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３１】
したがって、この明細書を用いて、当業者は以下のものからなる静置ガス透過性細胞培養および細胞回収器具の好ましい実施例を形成すべきである。
ａ．ガス透過性材料から形成された生育面と、
ｂ．器具が動作中は、生育面は水平状態にあり、
ｃ．培地取り出し開口部を有する培地取り出し管と、
ｄ．細胞取り出し開口部を有する細胞取り出し管と、
ｅ．内部体積と
ｆ．内部体積の最上部位置の境界を形成する上部境界と、
ｇ．上部境界から生育面までの距離が可能な培地高さであり、上部境界から生育面までの距離が2.0 cmを超え、
ｈ．生育面が水平状態にあるとき、培地取り出し管が生育面の上方にある距離が、生育面の少なくとも0.2 cm上方であり、可能な培地高さの50%を超えることはない。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３２】
この器具は、ウィルソン'７１７号に記載されている器具のうちの関係のある部分を備えていることが好ましい。また、この知識を得て、ガス透過性器具の製造者は、ウィルソン'７１７号に記載されているものを含めて、ガス透過性材料から構成された生育面と培地取り出し管と培地取り出し開口部と細胞取り出し管と細胞取り出し開口部とを有する細胞培養および細胞回収器具をユーザに提供するとともに、以下の事柄に対する説明書を提供したりその情報を普及させたりすることによって、細胞培養のより効率的な方法を容易にすることができる。
ａ．細胞および培地を器具の中に追加し、
ｂ．細胞は哺乳類のもので、非接着細胞タイプとし、
ｃ．生育面を水平方向に向け、細胞を生育面の上に載せて、細胞培養に適した雰囲気中に、細胞培養に適した温度で細胞培養および細胞回収器具を設置し、
ｄ．細胞を生育面の上に沈降させ、
ｅ．生育面の上に沈降した細胞の数と、培地体積との比率が、初期の静置培養細胞密度であり、
ｆ．生育面の上に沈降した細胞の数と、生育面の表面積との比率が、初期の静置培養表面密度であり、
ｇ．培地体積と、生育面の表面積との比率が、初期の静置培養培地体積と生育面積との比率であり、
ｈ．もっとも低い培地位置からもっとも高い培地位置までの距離が、初期の静置培養培地高さであり、
ｉ．ある時間の間にわたって細胞が静置培養の状態に存在できるようにし、またさらに、細胞培養および細胞回収器具からの細胞を回収するために以下からなるステップを有し、
ｊ．細胞を抜き取ることなく、細胞取り出し管の培地取り出し開口部を介して培地の一部を取り出す段階からなる回収前のステップであり、ここで器具中に残った培地体積が細胞回収培地体積であり、
ｋ．生育面が水平状態にあるときに細胞回収培地のもっとも上の位置から細胞回収培地のもっとも下の位置までの距離が、細胞回収培地の高さであり、
ｌ．細胞回収培地の体積と、生育面の表面積との比率が、細胞回収培地体積と生育面積との比率であり、
ｍ．細胞回収培地体積と培地体積との比率が、培地の減少割合になり、以下からなる細胞回収ステップを有し、
ｎ．細胞を細胞回収培地の中に混合する段階と、
ｏ．回収培地中の細胞の数と、細胞回収培地の体積との比率が、回収した細胞密度になり、
ｐ．細胞取り出し管の細胞取り出し開口部を介して、細胞と細胞回収培地を、細胞培養および細胞回収器具から取り出す段階。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３３】
細胞回収培地体積と、生育面積との比率は少なくとも0.2 ml/cm2であり、培地低減割合が少なくとも50%であることが好ましい。この方法は、ここに記載されている利点を提供する、目的の初期静置培養細胞密度や、初期静置培養表面密度、初期静置培養の培地体積と生育面積との比率、および／あるいは初期静置培養高さを含めて、この発明の任意の実施例を利用することができることを当業者にはアドバイスする。また、この方法は膵島での使用も含んでいることを当業者は認識するとよい。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
別の重要な発見は、培養中でのAPCの存在に関するものである。明らかに、条件Ａから回収されたＴ細胞はＴ細胞生成量が高いため、関係のある抗原（PSCA）を発現する腫瘍細胞を殺傷する能力が高く、培養の終了時には開始時の状態に対してCAR発現Ｔ細胞（CAR-PSCA）の個体数が大きな割合を占めている。これと比較して、培養の開始時にはAPCを欠いているため、条件Ｂは細胞の個体数におけるCAR発現Ｔ細胞（CAR-PSCA）の割合を培養期間にわたってまったく増大させることができない。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４４】
より短い時間の間により多くの細胞を作製する能力、培地交換あるいは培地の強制的混合を必要とせずにサイトカインを追加できる能力、培養に新鮮な培地を供給する必要性をなくせる能力、マニュアルで細胞を数える必要性を避けられる能力、そして細胞回収のときに細胞が存在する培地の量を、培養の終わりに存在する体積のたった２％にまで減らせる能力は、養子細胞療法用の細胞作製に対する従来の方法に固有の問題の多くを克服するこの発明の威力を示した。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５６】
細胞損失のない培地の取り出し：この発明の実施例においては、細胞はガス透過性材料から構成された生育面の上にさまざまな好ましい表面密度で存在し、従来の方法に対して培地の高さを大きく（および／あるいは培地体積と生育面積との比率を大きく）できる。そのあと、細胞の損失なく従来の方法に対して培地の高さを下げること（および／あるいは培地体積と生育面積との比率を下げること）によって利点が生じる。この開示によれば、培地交換の方法を改良すること（そこではプロセスにより多くの器具を追加する必要がない）、および／あるいは細胞回収の方法を改良する（細胞を回収するのに必要な培地体積が小さくなる）ことが可能であることを当業者は認識するであろう。我々は離散的な値を有する例を用いてこれら関連する利点を説明するが、この発明はここに与えられている離散的な値に限定されるものではない。当該分野の通常の技術者には、与えられている値や、それら値の組み合わせは、彼らがそれらの値を連続的に解釈することによって、記述されている利点を得るよう手引きするものであることを認識してほしい。例えば、培地は任意の高さで存在でき、好ましくは（2.1 cm、2.5 cm、6.08 cm、10.0 cmなど）2.0 cmを超える高さが好ましい。したがって、好ましくは生育面の0.2 cmあるいはそれ以上の上方の任意の高さにある培地取り出し管の培地取り出し開口部は、細胞の損失なく培地を取り出すときにそれが培地高さより低いところに位置する限り、0.2 cmあるいはそれより高い高さにあり、それによって培地からの細胞の分離を減らし、かつ／あるいはユーザが培地交換のときに細胞を別の器具へ移さなくてもよいようにできることが好ましい。この発明はここに与えられている離散的な数値に限定されるものではない。