【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０と接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されるペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２と接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されるポリペプチドと、
を備えるシステムであって、
前記ペプチドが前記ポリペプチドと会合すると、前記検出可能な生物発光シグナルが、基質の存在下で生成されることを特徴とする、システム。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号２と比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３〜４３８または配列番号２１６２〜２３６５のアミノ酸配列から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記ペプチドが、第１の相互作用ポリペプチドとの第１の融合物の一部であり、前記ポリペプチドが、第２の相互作用ポリペプチドとの第２の融合物の一部であり、前記第１及び第２の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと前記第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると複合体を形成するように構成されており、そして、前記ペプチド及びポリペプチドが、生物発光複合体を形成し、前記第１及び第２の相互作用ポリペプチドの間で複合体が形成すると、基質の存在下で検出可能な発光を生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
請求項５に記載の第１及び第２の融合物を備える、生物発光複合体。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号４４０と比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号２からなる前記ペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号２からなる前記ペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４４１〜２１５６の配列のうちの１つから選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
請求項５に記載のシステムの前記第１及び第２の相互作用ポリペプチド間の安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）前記第１及び第２の相互作用ポリペプチド間の安定な相互作用が起こることを可能にする条件で、前記第１及び第２の融合物を配置する工程と、
（ｂ）前記ペプチド及びポリペプチドによって、基質の存在下で放出された前記生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１及び第２の相互作用ポリペプチド間の安定な相互作用を示す工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記第１の融合物が、第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合物が、第２の核酸配列から発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、単一のベクターに含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクター上に存在する、請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
上記の明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及び系の種々の修正形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなろう。本発明は具体的な実施形態に関連して記載されたが、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を実施するための記載の様式の種々の修正形態は、本発明の範囲内にあることが意図される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ペプチド。
〔２〕前記ペプチドが配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕前記ペプチドが、配列番号２のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号４４０からなる前記ポリペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔４〕前記アミノ酸配列が、表１のペプチドから選択される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔５〕前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔６〕前記〔１〕に記載のペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔７〕前記〔１〕に記載のペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されることを特徴とする、融合ポリペプチド。
〔８〕前記〔７〕に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔９〕（ａ）前記〔７〕に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
（ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出する相補性ポリペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
〔１０〕配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成されることを特徴とする、ポリペプチド。
〔１１〕前記ポリペプチドが、配列番号４４０のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、配列番号２からなる前記ペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び、配列番号２からなる前記ペプチドと組み合わせた時の生物発光活性から選択される、前記〔９〕に記載のポリペプチド。
〔１２〕前記アミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列のうちの１つから選択される、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１３〕前記ポリペプチドが配列番号２からなる前記ペプチドと会合すると、基質の存在下で、前記検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１４〕前記アミノ酸配列が、合成であるか、非天然のアミノ酸を含有するか、またはペプチド模倣体である、前記〔１０〕に記載のポリペプチド。
〔１５〕前記〔１０〕に記載のポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、核酸。
〔１６〕前記〔１０〕に記載のポリペプチドと、第１の相互作用ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、前記第１の相互作用ポリペプチドが、前記第１の相互作用ポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチドとが接触すると前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されることを特徴とする、融合ポリペプチド。
〔１７〕（ａ）前記〔１６〕に記載の融合ポリペプチドと、
（ｂ）第２の融合ポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、前記第２の融合ポリペプチドが、
ｉ）前記第２の相互作用ポリペプチドと、
ｉｉ）２つの間に会合が形成された時に、配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出させる相補性ペプチドとを含み、
前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドとが会合し、
配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと前記相補性ポリペプチドとが会合することを特徴とする、生物発光複合体。
〔１８〕（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するペプチドアミノ酸配列を含むペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するポリペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドと
を含む生物発光複合体であって、検出可能な発光を示すことを特徴とする、生物発光複合体。
〔１９〕前記ペプチドアミノ酸配列と前記ポリペプチドアミノ酸配列とが会合する、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２０〕前記ペプチドアミノ酸配列が、表１のペプチド配列から選択される、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２１〕前記ポリペプチドアミノ酸配列が、表２のポリペプチド配列から選択される、前記〔１８〕に記載の生物発光複合体。
〔２２〕前記ペプチドアミノ酸配列が、第２の相互作用要素と会合した第１の相互作用要素に付着する、前記〔１９〕に記載の生物発光複合体。
〔２３〕前記ポリペプチドアミノ酸配列が、前記第２の相互作用要素に付着する、前記〔２２〕に記載の生物発光複合体。
〔２４〕前記ポリペプチドアミノ酸配列及びペプチドアミノ酸配列は、前記第１及び第２の相互作用要素の会合の非存在下では会合することができない、前記〔２３〕に記載の生物発光複合体。
〔２５〕（ａ）既存のタンパク質の断片ではない第１のアミノ酸配列と、
（ｂ）既存のタンパク質の断片ではない第２のアミノ酸配列と
を含む生物発光複合体であって、
前記生物発光複合体が、検出可能な発光を示し、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合し、前記生物発光複合体が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とが会合すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出することを特徴とする、生物発光複合体。
〔２６〕（ｃ）相互作用対の第１のメンバーを含む第３のアミノ酸配列であって、前記第１のアミノ酸配列に共有結合される、第３のアミノ酸配列と、
（ｄ）相互作用対の第２のメンバーを含む第４のアミノ酸配列であって、前記第２のアミノ酸配列に共有結合される、第４のアミノ酸配列と
をさらに含む、前記〔２５〕に記載の生物発光複合体。
〔２７〕前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の非共有結合相互作用は、前記相互作用対の前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間の非共有結合相互作用が存在しない場合、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列とを会合させるのに十分ではない、前記〔２６〕に記載の生物発光複合体。
〔２８〕第１のポリペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む、前記〔２６〕に記載の生物発光複合体。
〔２９〕前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖が、細胞内で発現される、前記〔２８〕に記載の生物発光複合体。
〔３０〕（ａ）非発光性対と、
（ｂ）相互作用対と
を含む生物発光複合体であって、
前記非発光性対の各非発光性要素が、既存のタンパク質の断片ではなく、
前記相互作用対の各相互作用要素が、前記非発光性対の前記非発光性要素の１つに共有結合されることを特徴とする、生物発光複合体。
〔３１〕第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）前記第１のアミノ酸配列を第３のアミノ酸配列に付着させ、かつ前記第２のアミノ酸配列を第４のアミノ酸配列に付着させる工程であって、前記第３及び第４のアミノ酸配列が、既存のタンパク質の断片ではなく、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体は、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを放出し、前記第３及び第４のアミノ酸配列の間の非共有結合相互作用は、追加の安定化力及び／または凝集力の非存在下で前記第３及び第４のアミノ酸配列の複合体を形成するには十分ではなく、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用は、前記第３及び第４のアミノ酸配列の安定な複合体を生成するためのっ前記追加の安定化力及び／または凝集力を提供する工程と、
（ｂ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用が起こることを可能にする条件で、工程（ａ）の前記第１、第２、第３、及び第４のアミノ酸配列を配置する工程と、
（ｃ）基質の存在下での前記第３及び第４のアミノ酸配列の前記安定な複合体によって、基質の存在下で放出された前記生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間の安定な相互作用を示す工程と
を含むことを特徴とする、方法。
〔３２〕前記第１のアミノ酸配列を前記第３のアミノ酸配列に、かつ前記第２のアミノ酸配列を前記第４のアミノ酸配列に付着させる工程が、前記第１のアミノ酸配列及び前記第３のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質を形成する工程と、前記第２のアミノ酸配列及び前記第４のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質を形成する工程とを含む、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質が、それぞれ、前記第１及び第３のアミノ酸配列の間と前記第２及び第４のアミノ酸配列の間とに、リンカーをさらに含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記第１の融合タンパク質が、前記第１及び第３のアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合タンパク質が、前記第２及び第４のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列から発現される、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３５〕単一のベクターは、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列を含む、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクター上に存在する、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３７〕工程（ａ）及び（ｂ）が、前記第１及び第２の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３８〕非発光性対の最適化方法であって、
（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列を整列させる工程と、
（ｂ）前記関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定する工程と、
（ｃ）３つ以上のタンパク質に関連するタンパク質の第１及び第２の断片を提供する工程であって、前記断片は、個別には実質的に非発光性であるが、前記断片が安定に相互作用すると発光を示す工程と、
（ｄ）前記第１及び第２の断片を各々１ヶ所以上の位置で突然変異させる工程であって、前記突然変異が、前記断片の配列をコンセンサス配列の対応する部分により類似するように変更し、前記突然変異が、既存のタンパク質の断片ではない非発光性対を生じさせる工程と、
（ｅ）前記非発光性対を、会合していない場合の発光の非存在と、前記非発光性対が安定に会合した場合の発光とについて試験する工程と
を含むことを特徴とする、方法。
〔３９〕前記非発光性対が、前記第１及び第２の断片と比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、再構成の親和性の増加、再構成の親和性の減少、発現の増強、細胞内溶解性の増加、細胞内安定性の増加、及び再構成された発光の強度の増加から選択される、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕（ａ）配列番号４４０と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２からなるペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ポリペプチドと、（ｂ）前記ポリペプチド及び配列番号２からなるペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。
〔４１〕（ａ）配列番号２と１００％未満かつ４０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０からなるポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、ペプチドと、（ｂ）前記ペプチド及び配列番号４４０からなるポリペプチドによって生成される生物発光複合体のための基質とを備えることを特徴とする、検出試薬。