【手続補正書】
【提出日】平成29年3月13日(2017.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び１つの第二のプローブ分子を含んでいるプローブ分子のセットであって、その際、少なくとも２つのプローブ分子は、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、
その際、第一のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、第二のプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第二の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、
その際、第一のプローブ分子のポリマーラベルは、第二のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、ナノポア系において第一及び第二の標的核酸の独立した検出を提供する、前記プローブ分子のセット。
【請求項２】
第一及び第二のプローブ分子のポリマーラベルは、それらの個々の標的とハイブリダイズし、かつナノポア系において印加電圧をかけた際に別個のシグネチャコンダクタンス遮断を提供する、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
ポリマーラベルは、親水性ホモポリマー又は親水性ヘテロポリマーである、請求項１又は請求項２に記載のプローブセット。
【請求項４】
キャプチャ領域と末端伸長部は、核酸及びペプチド核酸から成る群から独立に選択される、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項５】
プローブセットは、少なくとも１つの付加的なプローブ分子を含み、該付加的なプローブ分子は、
ａ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
ｂ）キャプチャ領域の５’末端又は３’末端に共有結合する末端伸長部、及び
ｃ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含み、その際、付加的なプローブ分子の核酸キャプチャ領域は、第一及び第二の標的核酸とは別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含み、またその際、付加的なプローブ分子各々のポリマーラベルは、第一のプローブ分子、第二のプローブ分子及び他の付加的なプローブ分子のいずれかのポリマーラベルとは異なっていて、かつナノポア系において第一、第二及び付加的な標的核酸の独立した検出を提供する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項６】
プローブセットは、３、４、６又は８個のプローブ分子を含み、その際、前記プローブ分子の各々のキャプチャ領域は、別個の標的核酸に対して相補性を有する別個の配列を含み、またその際、前記プローブ分子の各々のポリマーラベルは、他のプローブ分子のポリマーラベルとは異なり、かつナノポア系において各プローブに相補性を有する各標的核酸の独立した検出を提供する、請求項５に記載のプローブセット。
【請求項７】
プローブ分子の核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項８】
第一のプローブ分子又は第二のプローブ分子の少なくとも１つの核酸キャプチャ領域は、その相補的標的核酸の全配列と相補的な配列を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項９】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルと第二のプローブ分子の末端伸長部に付着しているポリマーラベルは、それらの重合の量の点で異なる、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項１０】
第一のプローブ分子の末端伸長部に付着しているラベルは、特定の長さのポリエチレングリコールであり、かつ第二のプローブ分子の伸長部に付着しているラベルは、第一のプローブ分子に付着しているポリエチレングリコールとは異なる長さのポリエチレングリコールである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項１１】
付加的な別個の標的核酸に対して相補性を有する配列を含んでいるキャプチャ領域と、場合により末端領域とを有するプローブを更に含み、その際、前記プローブはポリマーラベルを欠如しており、かつ付加的な別個の標的核酸の独立した検出を提供する、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項１２】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のプローブセット。
【請求項１３】
ナノポア系を用いてサンプル中の少なくとも２つの別個の一本鎖標的核酸を検出する方法において、該方法は、
ａ）サンプルと請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のプローブセットとを接触させ、かつプローブ分子をサンプル中に存在するいずれかの標的核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイズされたサンプルを形成すること、その際、プローブ分子のセットは少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び１つの第二のプローブ分子を含む；
ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中で、前記ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体をナノポア中で捕捉し、かつ前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸との、アンジッピング・プロセスによる前記系のナノポアを通る移行を促進するのに十分な電圧をかけること、及び
ｃ）経時的に前記ナノポア系中の電流パターンを分析すること、その際、サンプル中の前記別個の一本鎖標的核酸の存在が、ナノポア中のそれぞれ別個にハイブリダイズされたプローブと標的核酸との捕捉に相応する２個の別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される
を含む前記方法。
【請求項１４】
サンプル中の第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在は、別個のシグネチャコンダクタンス遮断である別個のシグネチャ電流遮断を生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一の標的核酸の存在と第二の標的核酸の存在は別々に検出される、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）標的核酸に対して相補性を有する配列を含むキャプチャ領域、
（ｉｉ）キャプチャ領域の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端との両方に共有結合する末端伸長部、及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの末端伸長部に付着している少なくとも１つのポリマーラベル
を含んでいるプローブ分子であって、その際、前記プローブ分子はナノポア系における標的核酸の検出を提供する前記プローブ分子。
【請求項１７】
ａ）核酸キャプチャ領域は、ｉ）標的核酸とハイブリダイズできる、又はｉｉ）標的核酸とハイブリダイズでき、かつ標的核酸の配列と相補的な配列を含む；
ｂ）末端伸長部は、核酸キャプチャ領域の３’末端に共有結合されるポリ（ｄＣ）（２７−３３）である、及び
ｃ）ポリマーラベルは、ポリ（ｄＣ）末端伸長部に付着している、
請求項１６に記載のプローブ分子。
【請求項１８】
核酸キャプチャ領域は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さである、請求項１６又は請求項１７に記載のプローブ分子。
【請求項１９】
ポリマーラベルは、ポリグリコール、ポリアミン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びオリゴ糖から成る群から選択される、請求項１６から請求項１８のいずれか１項に記載のプローブ分子。
【請求項２０】
ポリマーラベルは、キャプチャ領域への末端伸長部の５’又は３’共有結合の９残基以内に位置する末端伸長部の残基に付着している、請求項１６から請求項１９のいずれか１項に記載のプローブ分子。
【請求項２１】
ナノポア系を用いてサンプル中の少なくとも１つの別個の一本鎖標的核酸を検出する方法において、該方法は、
ａ）サンプルと、請求項１６から請求項２０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのプローブ分子のセットとを接触させ、プローブ分子をサンプル中に存在するいずれかの標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたサンプルを形成すること、その際、プローブ分子のセットは少なくとも、１つの第一のプローブ分子及び１つの第二のプローブ分子を含む、
ｂ）デュアルチャンバーナノポア系のシスコンパートメント中の前記ハイブリダイズされたサンプル混合物に、ハイブリダイズされたプローブ／標的核酸複合体をナノポア中で捕捉し、かつ前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのアンジッピング・プロセスによる前記系のナノポアを通る移行を促進するのに十分な電圧をかけること、及び
ｃ）経時的に前記ナノポア系中の電流パターンを分析すること、その際、サンプル中の前記別個の一本鎖標的核酸の存在が、前記ハイブリダイズされたプローブと標的核酸とのナノポアを通る移行に相応する別個のシグネチャ電流遮断の発生により示される、
を含む前記方法。