(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0003539739.tif 000008
〔式中、Ｒはアセチル基を、ＸはＬ−アラニン残基を、Ａは２−テトラデシルヘキサデカノイルを意味し、Ｒ1は水素原子及びＲ2 は水素原子、メチル基又はエチル基を意味する。〕で表される化合物及びその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、後述の一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩に関する。本発明の化合物はアジュバント活性を有するとともに、インフルエンザウイルス様人工膜ワクチン、すなわちいわゆるビロソームワクチンの構成成分として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
現在使用されているインフルエンザＨＡワクチンは、流行ウィルスの血球凝集素分子上での突然変異によりその有効性は安定しないため、より効果的な、ワクチンの開発が強く望まれている。
その試みとしてＨＡ（血球凝集素）とＮＡ（ノイラミニダーゼ）とを主成分とするコンポーネントワクチンや、６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンを用いたインフルエンザウィルス粒子様人工膜ワクチンいわゆるビロゾームワクチン（特開昭６１−２８２３２１号参照）などが知られている。特に、後者は、血中の抗体価の向上の点で優れた効果が得られる事が知られており有用性が期待されていた。
【０００３】
しかしながら、本ワクチンは投与部位における局所刺激性のため好ましからざる副作用として発赤がみられることがあり、医薬品としては必ずしも満足し得るものとは言えなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、より実用性の高いビロソームワクチンの構成成分を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の構造を有するムラミルジペプチド誘導体が実用性の高いビロソームワクチンの構成成分として有用であるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は一般式
【０００６】
【化２】
0003539739.tif 000002
【０００７】
〔式中、Ｒはアセチル基を、ＸはＬ−アラニン残基を、Ａは２−テトラデシルヘキサデカノイルを意味し、Ｒ1は水素原子及びＲ2 は水素原子、メチル基又はエチル基を意味する。〕で表される化合物及びその塩を提供する。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物の部分構造 -NH(CONH2)CHCH2CH2CO-については不斉炭素を１個有することからＤ体及びＬ体の異性体が存在するが一般的にはＤ体が好ましい。
又、式（Ｉ）の化合物の糖部分の１位については、α体及びβ体の異性体が存在するが、いずれも本発明のワクチンに使用可能である。
【００１４】
本明細書においては、両異性体を同時に表す時には便宜的に下記部分構造式で表わす。
【００１５】
【化３】
0003539739.tif 000003
【００１６】
次に式（Ｉ）の化合物の製造法を説明する。
【００１７】
【化４】
0003539739.tif 000004
【００１８】
即ち、式（II）の化合物を式（III)の化合物とカルボジイミド法、アイントップ法、活性エステル法等のペプチド合成で繁用される縮合方法を用いて反応させることにより目的の式（Ｉ）の化合物を製造することができる。例えば、活性エステル法を用いた場合には、式（II）の化合物をジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリルあるいはこれらの混合物に溶解しＮ，Ｎ−ジスクシンイミディルカルボナート、Ｎ，Ｎ−カルボニルイミダゾール、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミディルオキザラート等の試薬と、有機塩基例えばトリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、４−ジメチルアミノピリジンの存在下、通常０〜約６０℃程度で３０分〜数時間反応させることにより活性エステル体とし、ついで、先の反応と同様塩基の存在下、約−１５℃〜６０℃程度好ましくは、０℃〜２５℃で式（III)のアミン化合物を加え、数１０分〜１日程度反応することによって式（Ｉ）の化合物を製造することができる。尚、ここで、上記試薬は、式（ＩＩ）の化合物と等量で使用することができ、又有機塩基も式（ＩＩ）の化合物と等量又は過剰量で使用することができる。ついで生成物をシリカゲルカラムクロマトなどの手段を用いて精製することにより式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
【００１９】
式（ＩＩ）の化合物の出発物質は、特公昭６３−１１３５９号公報に記載の方法により調製することができる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の化合物は、優れたアジュバント活性を示すと共に、該化合物とHANA抗原とを用いてインフルエンザビロソームワクチンを形成させた場合には、優れたワクチン効果が得られるとともに優れた安全性が得られた。従って、式（Ｉ）の化合物は、ビロソームワクチンの構成成分として極めて優れた化合物である。
【００２１】
以下、本発明を実施例及び試験例により説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン1.０ｇをテトラヒドロフラン１００mlに溶解しＮ，Ｎ−ジスクシンイミデイルカルボナート0.３ｇ及びトリエチルアミン0.１５mlを加え室温で１時間半攪拌後２８％アンモニア水0.２２mlを加え、室温でさらに３０分攪拌する。
【００２３】
反応液を減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付した。クロロホルム−メタノールで溶出して精製し、水−ジオキサンから凍結乾燥すると、（６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタムアミド0.４４ｇが得られた。
【００２４】
融点  １５５〜１６５℃
分子量；926 (C49H91N5O11) ：
FAB Mas m/z927(M+1)
1H-NMR (DMSO-d6)  δ：0.85 (6H, t, J=7 Hz),
1.2 〜1.3, 1.39, 1.50 (58 H, m)
1.72 (1H, m), 1.80 (3H, s)  1.93 (1H, m)
2.08 (2H, t, J=8 Hz)，2.30 (1H, m),
3.28 (1H, t, J=9 Hz)，3.46 (1H, t, J=9 Hz)
3.67 (1H, m), 3.81 (1H, m)  4.02 (1H, d-d, J=12 Hz, 5 Hz),  4.12 (1H, d-q, J=9 Hz, 5 Hz)
4.31 (2H, m), 4.34 (1H, d, J=10 Hz)
4.44  および 4.98 (1H)
5.43 (1H, d, J=4 Hz)，6.67 (1H, d, J=4)
6.74 (1H, s)  7.01 (1H, s)，7.27 (1H, s)
7.30 (1H, s)  7.65 (1H, d, J=7 Hz)
8.08 (1H, d, J=8 Hz)，8.17 (1H, d, J=8 Hz)
【００２５】
実施例２
（６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン1.０ｇをテトラヒドロフラン１００mlに溶解しＮ，Ｎ−ジスクシンイミディルカルボナート0.３ｇ及びトリエチルアミン0.１５mlを加え室温で１時間半攪拌後４０％メチルアミン水溶液0.２mlを加え、室温でさらに３０分攪拌する。
【００２６】
反応液を減圧濃縮し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付した。クロロホルム−メタノールで溶出して精製し、水−ジオキサンから凍結乾燥すると、（６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル）−Ｌ−アラニル−Ｎr −メチル−Ｄ−グルタムアミド0.５ｇが得られた。
【００２７】
融点  ９５〜１００℃
分子量；939 (C50H93N5O11) ：
FAB Mas m/z940(M+1)
1H-NMR (DMSO-d6)  δ：0.85 (6H, t, J=7 Hz),
1.2 〜1.3, 1.39, 1.50 (58 H, m)
1.73 (1H, m), 1.79 (3H, s)  1.93 (1H, m)
2.07 (2H, t, J=8 Hz)，2.30 (1H, m),
2.55 (3H, d, J=5 Hz)
3.26 (1H, t, J=9 Hz)，3.46 (1H, t, J=9 Hz)
3.68 (1H, m), 3.82 (1H, m)  4.03 (1H, d-d, J=12 Hz, 5 Hz),  4.12 (1H, d-q, J=9 Hz, 5 Hz)
4.30 (2H, m), 4.36 (1H, d, J=10 Hz)
4.98 (1H, t, J=3.5 Hz)
5.43 (1H, d, J=7 Hz)，6.67 (1H, d, J=4 Hz)
7.01 (1H, s)，7.31 (1H, s)
7.64 (1H, d, J=7 Hz)  7.71 (1H, d, J=5 Hz)
8.07 (1H, d, J=8 Hz)，8.17 (1H, d, J=8 Hz)
【００２８】
実施例３
実施例２と同様にして〔６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル〕−Ｌ−アラニル−Ｎr −エチル−Ｄ−グルタムアミドを製造した。
分子量；953 (C51H95N5O11) ：
FAB Mas m/z954(M+1)
1H-NMR (DMSO-d6)  δ：0.85 (6H, t, J=7 Hz),
0.99 (3H, t, J=7 Hz)
1.2 〜1.3, 1.39, 1.50 (58 H, m)
1.71 (1H, m), 1.79 (3H, s)  1.93 (1H, m)
2.06 (2H, t, J=8 Hz)，2.29 (1H, m),
3.04 (2H, d-q, J=3.5 Hz, 7 Hz)
3.28 (1H, t, J=9 Hz)，3.45 (1H, t, J=9 Hz)
3.68 (1H, m), 3.81 (1H, m)
4.03 (1H, d-d, J=12 Hz, 5 Hz)
4.12 (1H, d-q, J=9 Hz, 5 Hz)
4.29 (2H, m),  4.35 (1H, d, J=10 Hz)
4.97 (1H, t, J=3.5 Hz)
5.44 (1H, d, J=7 Hz)，6.68 (1H, d, J=4 Hz)
7.01 (1H, s)，7.30 (1H, s),
7.64 (1H, d, J=7 Hz), 7.76 (1H, d, J=5.5 Hz)
8.07 (1H, d, J=8 Hz)，8.16 (1H, d, J=8 Hz)
【００２９】
試験例１
インフルエンザＨＡＮＡ抗原の調製
インフルエンザＡ／山形／１２０／８６株感染尿膜腔液から高速遠心処理（２３０００rpm ，９０分）低速遠心処理（６０００rpm ，６０分）、続いてショ糖密度勾配遠心処理（３００００rpm 、３時間）を行なうことによって精製ウィルスを得た。さらに、このウィルス液にトリトンＸ−１００を１％濃度となるように加え十分に攪拌し、ウィルスを可溶化後ショ糖密度勾配平衡法によって精製ＨＡＮＡ抗原液を得た。
【００３０】
ビロゾームワクチンの調製
上記で調製した精製ＨＡＮＡ抗原液を用い表１に示した配合の４種ワクチンサンプルを次の如くして調製した。まず、各成分を混合したのち、オクチルグルコシドを４％の濃度になるように添加して可溶化し、通常の方法で５％グルコース含有リン酸塩緩衝液（pH7.４）にて透析を行なった。得られた各サンプルを  ＨＡＮＡ抗原濃度で７０μｇ／mlになるように調整した。得られたサンプルはビロゾームを形成していた。本発明のサンプル No.１及び２のビロゾームを図１及び２に示した。
【００３１】
モルモット各群１０匹の背部皮下に本発明のビロゾームワクチン（ No.１，２）及び対照ワクチンの１５倍希釈液を0.５ml／匹の投与量で接種した。接種３週間後に、同量を追加接種した。３週目、５週目に採血を行ない、ＷＨＯ法に準じてヘマグルチニンインヒビション（Hemagglutinin Inhibition Test)を行ない、抗体産生能を測定した。結果を表１に示した。
【００３２】
0003539739.tif 000005
【００３３】
上表から明らかなように、本発明の化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンは対照化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンに比べ同等以上の抗体産生能を示した。
＊対照化合物：６−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
発赤反応試験
発赤反応試験は、ウサギ（５匹）の背皮内にサンプル0.５mlを接種し、経日的に発赤の表面積を測定し、５匹の合計面積を求め、次いで１匹当りの平均の発赤表面積を算出した。結果を表２に示した。
【００３４】
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【００３５】
上表から明らかなように、本発明の化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンは対照化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンに比べ低い発赤を示した。
発熱試験
発熱試験は、生物学的製剤基準一般試験法を用い、ウサギの静脈内に各サンプルを１ml投与した。判定は、３匹の発熱反応の和が、1.３℃以下の場合には、発熱試験陰性また、2.５℃以上の場合は、発熱試験陽性とした。結果を表３に示した。
【００３６】
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上表から明らかなように、本発明の化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンは対照化合物を構成成分として用いたビロソームワクチンに比べ低い発熱性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物を用いたサンプルＮｏ．１のワクチンの粒子構造を示す９５，０００倍の電顕写真である。
【図２】本発明の化合物を用いたサンプルＮｏ．２のワクチンの粒子構造を示す９５，０００倍の電顕写真である。
【図１】
0003539739.tif 000009
【図２】
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