(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に in vivo 投与するためのベクターであって、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、宿主内でのＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のヌクレオチド配列、および
宿主内で前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質を発現するために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列
を含み、更に、
前記異種シグナルペプチドが、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤのシグナルペプチドである
ことを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記第１のヌクレオチド配列が、トランスメンブランコード領域を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質断片をコードすることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記プロモーター配列が iｍｍediate early サイトメガロウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
宿主内で前記ベクターから in vivo で発現されるときの前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質の免疫保護能を増強するために、更に第２のヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
前記第２のヌクレオチド配列が、異常なｍＲＮＡスプライシングを防止するために、一対のスプライス部位を含むことを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記第２のヌクレオチド配列が、前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に配置されたことを特徴とする請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
前記第２のヌクレオチド配列が、ウサギβ-グロビンイントロンIIのヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
プラスミドベクターであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドp82Ｍ35Ｂ(ＡＴＣＣ 203790)であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内に起こすために、宿主に in vivo 投与するための免疫原性組成物であって、請求項１〜９のいずれかに記載のベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
呼吸器シンシチウムウイルス(ＲＳＶ)による感染によって発症する疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする第１のヌクレオチド配列を分離すること、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、第２のヌクレオチド配列を形成すること、
前記第２のヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結することによる非複製性ベクターの産生において、前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を起こすために宿主に投与するとき、前記制御配列は前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現を指示するものであること、
前記ベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること、および
前記異種シグナルペプチドが、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤのシグナルペプチドである
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列が、トランスメンブラン領域を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードすることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１個の制御配列が、iｍｍediate early サイトメガロウイルスプロモーターを含むことを特徴とする請求項11または12に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主内で前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護を増強するために、前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結する段階を含むことを特徴とする請求項11〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫保護増強配列を、前記制御配列と前記ヌクレオチド配列の間で前記ベクター中に導入することを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫保護増強配列が、異常なｍＲＮＡスプライシングを防止するために、一対のスプライス部位を含むことを特徴とする請求項14または15に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫保護増強配列が、ウサギβ-グロビンイントロンIIであることを特徴とする請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記非複製性ベクターがプラスミドベクターp82Ｍ35Ｂ(ＡＴＣＣ 203790)であることを特徴とする請求項11〜17のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）ワクチンの分野に関し、とりわけＲＳＶの融合（Ｆ）蛋白質をコードする核酸配列を含むワクチンに関する。
【０００２】
（発明の背景）
パラミクソウイルス科のウイルスに属する負鎖ＲＮＡウイルスである呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）は、幼児や低年齢児童における細気管支炎および肺炎の原因となる主要なウイルス病原体である（参考文献１−この出願明細書全体を通して、本発明に関わる技術の状況をより完全に説明するために、様々な参考文献を括弧内に引用する。各引用に対する完全な文献情報を本明細書の終わり、請求項の直前に示す。これによって、これらの参考文献の開示内容を本明細書中に参考として組込む。）。ＲＳＶが引起す急性気道感染のために、米国では年間約９００００人が入院し、４５００人が死亡している（参考文献２）。ＲＳＶ感染による医療経費は、米国だけで年間３億４千万ドルを超えている（参考文献３）。現在のところ、ＲＳＶに対する認可されたワクチンはない。ＲＳＶワクチンを開発するための主な手法は、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびサブユニットワクチンを含んできた。
【０００３】
ＲＳＶのＦ蛋白質は、このウイルスの最も重要な保護抗原のひとつとみなされている。ＲＳＶサブグループＡおよびＢから得たＦ蛋白質のアミノ酸配列には、顕著な類似性（８９％の同一性）が見られ（参考文献３）、抗Ｆ抗体は両サブグループのウイルスを交差中和するだけでなく、両サブグループのウイルスによる感染に対して免疫動物を保護することができる（参考文献４）。その上、Ｆ蛋白質は、マウスおよびヒトにおけるＲＳＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球にとっての主要ターゲットと確認されてきた（参考文献３および参考文献５）。
【０００４】
ＲＳＶ蛋白質をワクチンとして使用することは、傷害を伴う恐れがある。非経口的に投与したワクチン候補物質は、セロネガティブなヒトまたはチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関して、これまでのところ免疫原性が弱いことがわかった。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の低年齢幼児がもつ経胎盤獲得母性抗体のような受動獲得抗体の存在下で、更に減衰する恐れがある。ＲＳＶ感染細胞培養物から得た精製した融合蛋白質から成り、イムノアフィニティまたはイオン交換クロマトグラフィーによって精製したＲＳＶに対するサブユニットワクチン候補物質について、説明がなされてきた（参考文献６）。この製剤によるセロネガティブまたはセロポジティブなチンパンジーの非経口的免疫処置が行われ、約１：５０ のＲＳＶ血清中和力価を誘導するために、５０μｇの投与量３回分がセロネガティブな動物において必要とされた。その後、これらの動物を野生型ＲＳＶで攻撃したとき、ウイルス暴露や臨床疾患に対する免疫処置の効果を上部気道では検出できなかった。このワクチンによる免疫処理が下部気道におけるウイルス暴露に及ぼす効果は調べられなかったが、この部分は非経口的免疫処置によって誘導される血清抗体が最大の効果を示すと予想し得る部位である。少数のセロポジティブな人々において、安全性および免疫原性の研究が行われてきた。セロポジティブな子どもおよびセロネガティブな３人の子ども（年齢は全員 ２．４歳を超えている）において、そのワクチンは安全であることが判明した。免疫処置を受けた子どもが少数であったために、下部気道疾患に対する免疫処置の効果を決定することができなかった。セロポジティブな子どもにおける１回の免疫処置で、その子ども達の ４０ から ６０％に４倍のウイルス中和抗体力価の増加が誘導された。したがって、このワクチンのＲＳＶ誘発疾患に対する効力を評価するために、十分な情報は得られていない。サブユニットＲＳＶワクチンが直面する他の問題は、セロネガティブな被験者に免疫原性製剤を接種すると、ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンに見られるものに類似した疾患増強（時々、免疫増強と云われる）が起こる可能性である。幾つかの研究において、ＲＳＶ Ｆ蛋白質または合成ＲＳＶ ＦＧ融合蛋白質による免疫処置に対する免疫反応が、ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンが誘導するものに似た疾患増強をネズミ類に引起した。非複製性抗原を用いた免疫処置が疾患増強を伴うことは、セロネガティブなヒトにそのような抗原を使用する場合、注意が必要であることを示している。
【０００５】
ＲＳＶが引起す疾患に対する弱毒化生ワクチンは、主に２つの理由によって有望と思われる。第１に、弱毒化生ワクチンによる感染によって、粘膜抗体と血清抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫反応が誘導される。第２に、弱毒化生ワクチン候補物質または自然獲得野生型ウイルスによる幼児の感染は、その後の再自然感染時に疾患増強を伴わない。ウイルス中和性母性抗体を有するより低年齢の幼児に対し免疫原性を示すが、年齢６カ月以上のセロネガティブな幼児には弱毒化されている弱毒化生ワクチンを産生することは、挑戦に値する課題であろう。弱毒化生ウイルスワクチンには、残存病原性および遺伝的不安定性という危険性もある。
【０００６】
幾つかの研究で、外来蛋白質をコードする配列を含有するプラスミドＤＮＡを注入することによって、外来蛋白質の発現およびその抗原に対する抗体と細胞傷害性Ｔリンパ球反応の誘導が起こることが示された（例えば、参考文献７、８、９を参照されたい）。免疫処置を目的として、ウイルス蛋白質を発現させるためにプラスミドＤＮＡ接種を使用することによって、前に概説した各戦略に優る幾つもの利点が生じ得る。第１に、ウイルス自体に対する抗体の存在下、その抗体によるウイルスの中和のために効力を失うことなく、ウイルス抗原をコードするＤＮＡを投与することができる。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏ で発現される抗原は本来のコンフォメーションを示すはずであり、したがって、野生型ウイルス感染において存在する抗原が誘導する抗体反応に類似した反応を誘導するはずである。それとは対照的に、蛋白質の精製に使用する幾つかのプロセスは、コンフォメーションの変化を誘発することができ、その結果、保護エピトープの免疫原性と恐らく免疫増強が失われる恐れがある。第３に、注入したプラスミドＤＮＡからの蛋白質の発現を、ウイルス感染細胞の場合よりかなり長い期間 ｉｎ ｖｉｖｏ で検出することができ、これによって細胞傷害性Ｔ細胞の誘導が延長し、抗体反応が増強するという理論的な利点が得られる。第４に、抗原の ｉｎ ｖｉｖｏ 発現によって、外来アジュバントを必要とせずに保護が得られるかもしれない。
【０００７】
本発明の譲受人に譲渡され、その開示内容が参考として本明細書に組込まれている １９９６年１２月１９日に公表された国際公開第９６／０４０９５号および米国特許第５８４３９１３号、第５８８０１０４号、第６０１９９８０号および第６０２２８６４号において、ＲＳＶに対する免疫反応を起こすために宿主に投与するための、非複製性ベクター、とりわけプラスミドベクター、およびそれらを含む免疫原性組成物の提供が記載されている。このようなベクターは、ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を発生させるＲＳＶ Ｆ蛋白質またはＲＳＶ Ｆ蛋白質断片をコードする第１のヌクレオチド配列、宿主中にＲＳＶ Ｆ蛋白質を発現させるために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列、およびＲＳＶ Ｆ蛋白質が宿主中でベクターから ｉｎ ｖｉｖｏ で発現したときの免疫保護能を増強するために、第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列の間に配置された第２のヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
ＲＳＶによって発症する疾患に対して、ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするＤＮＡ分子の投与によって免疫処置をすることができることは、上記の国際公開第９６／０４０９５号に記載される発明までは知られていなかった。特に、分泌形態のＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を用いたＲＳＶ誘発疾患に対する免疫処置の効力は、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は重度の疾患を起こす。ＲＳＶによって発症する疾患に対する保護のため、および診断用試薬やキットの調製のために、ワクチンを含めた免疫原性製剤に使用するために、ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を分離し、ｉｎ ｖｉｖｏ で投与するためのベクターを改良することは、有用であり、望ましいことであろう。とりわけ、セロネガティブな幼児を含むヒトにおいて免疫原性で保護性であり、疾患増強（免疫増強）を引起さない改良ワクチンを提供することは、望ましいことであろう。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによって引起される疾患に対して宿主を免疫処置する方法、その方法で使用される核酸分子、およびその核酸分子を利用した診断手順に関する。とりわけ、本発明は、改良された核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチンの提供を対象としている。
【００１０】
本発明の一態様に従えば、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内で起こすために、宿主に ｉｎ ｖｉｖｏ で投与される免疫原性組成物であり、かつ、投与される宿主内で非複製性であるプラスミドベクターを含むベクターであって、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、その代わりに、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチド配列をコードする配列を含むヌクレオチド配列と、
ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現のために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列
を含むベクターを含む組成物が提供される。
【００１１】
ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、トランスメンブラン領域が欠如したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするものであってよい。トランスメンブラン領域の発現が欠如すると、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態が生成する。ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、成熟したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする部分を含んでよい。
【００１２】
ＲＳＶ Ｆ蛋白質の ｉｎ ｖｉｖｏ 発現量の増強に有用であることが判明したひとつの異種シグナルペプチドは、単純疱疹ウイルスＩ（ＨＳＶ Ｉ）ｇＤのシグナルペプチドである。既に引用した国際公開第９６／０４０９５号に記載のように、このような増強された発現量は、自家シグナルペプチド配列を有するベクターと同じ投与量でそのベクターの免疫原性の改良をもたらす。ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、本発明のこの態様によって提供されるベクターは、とりわけ、図１０ に見られるようなプラスミドｐ８２Ｍ３５Ｂであってよい。
【００１３】
ＲＳＶ Ｆ蛋白質が宿主内でベクターから ｉｎ ｖｉｖｏ で発現されるとき、その免疫保護能を増強するために、ベクターは第２のヌクレオチド配列を含んでよい。第２のヌクレオチド配列は、異常なｍＲＮＡスプライシングを防止することによって、実質的に全ての転写ｍＲＮＡがＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするために、一対のスプライス部位を含んでよい。このような第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に配置されてよい。このような第２のヌクレオチド配列は、図８に示すようなウサギβ−グロビンイントロンＩＩの配列であってよい（ＳＥＱ ＩＤ番号：５）。
【００１４】
ベクターの中に使用されるプロモーター配列は、宿主内でＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現をもたらす適当な任意のプロモーターであってよい。そのプロモーター配列は、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってよい。
【００１５】
本発明で提供されるベクターのいくつかは、免疫原性組成物の形でベクターを投与した後にＲＳＶ Ｆ蛋白質の ｉｎ ｖｉｖｏ 発現によってＲＳＶ感染または疾患に対して宿主を免疫処置するのに使用できる。
【００１６】
本発明の他の態様に従えば、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内に起こすために、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためであって、本発明で提供される非複製性ベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含む免疫原性組成物が提供される。
【００１７】
本発明の更に他の態様に従えば、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置する方法であって、本発明にて提供される免疫原性組成物の有効量を宿主に投与することを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明は更に、ＲＳＶによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置するための免疫原として使用するときの、本発明にて提供されるベクターにまで拡張される。その上、本発明は、ＲＳＶによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置するための医薬の製造における、本発明にて提供されるベクターの使用にまで拡張される。
【００１９】
本発明は、自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠き、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドを含んだＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を使用する新規な方法であって、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を分離すること、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、前記ヌクレオチド配列を形成すること、
前記ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結することによる非複製性ベクターの産生において、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を起こすために前記ベクターを宿主に投与するとき、前記制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現を指示するものであること、および
そのベクターを宿主に投与すること
を含む方法も含んでいる。
【００２０】
本発明のこの態様に従って提供される手順は、
前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結することによって、好ましくは免疫保護増強配列を制御配列とヌクレオチド配列の間に導入することによって、宿主内でＲＳＶ Ｆ蛋白質による免疫保護を増強する
段階を更に含み得る。
【００２１】
その上、本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染によって発症する疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする第１のヌクレオチド配列を分離すること、
自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、第２のヌクレオチド配列を形成すること、
第２のヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結することによる、プラスミドベクターを含む非複製性ベクターの産生において、宿主内でそのベクターから ｉｎ ｖｉｖｏ で発現するときの、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を起こすために宿主に投与するとき、その制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現を指示するものであること、および
そのベクターを ｉｎ ｖｉｖｏ 投与のためのワクチンとして製剤すること
を含む方法を含んでいる。
【００２２】
宿主内でベクターから ｉｎ ｖｉｖｏ で発現するときのＲＳＶ Ｆ蛋白質の免疫保護能を増強するために、第２のヌクレオチド配列を更に第３のヌクレオチド配列に動作可能に連結してもよい。そのベクターはプラスミドベクターｐ８２Ｍ３５Ｂであってよい。本発明は更に、本明細書で説明したベクターの免疫有効量を含む免疫原性組成物だけでなく、この方法によって生産されるヒト宿主を含む宿主に投与するためのワクチンも含む。
【００２３】
前記のように、本発明で提供されるベクターは、診断用途において有用である。したがって、本発明の他の態様において、検体中のＲＳＶ Ｆ蛋白質の存在量を決定する方法であって、
（ａ）本発明で提供される非複製性ベクターで宿主を免疫処置することによって、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生する段階と、
（ｂ）ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離する段階と、
（ｃ）検体を分離抗体と接触させることによって、検体中に存在する任意のＲＳＶ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる段階と、
（ｄ）複合体の生成量を決定する段階
を含む方法が提供される。
【００２４】
抗体を引出すために使用する非複製性ベクターは、プラスミドベクターｐ８２Ｍ３５Ｂであってよい。
【００２５】
本発明は、検体中のＲＳＶ Ｆ蛋白質の存在を検出するための診断キットであって、
（ａ）ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生するための、本発明で提供される非複製性ベクターと、
（ｂ）前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離するための分離手段と、
（ｃ）分離したＲＳＶ Ｆ特異抗体を検体と接触させることによって、検体中に存在する任意のＲＳＶ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる接触手段と、
（ｄ）複合体の生成量を決定するための同定手段
を含むキットも含む。
【００２６】
本発明は更に、ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異ポリクローナル抗体を産生する方法であって、本明細書に記述した免疫処置法の使用を含み、免疫処置した動物からＲＳＶ Ｆ蛋白質特異ポリクローナル抗体を分離する段階を更に含む方法も対象とする。
【００２７】
本発明は、ＲＳＶのＦ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生する方法であって、
（ａ）本発明で提供される非複製性ベクターを構築する段階、
（ｂ）そのベクターを少なくとも１匹のマウスに投与することによって、少なくとも１匹の免疫マウスを産生する段階、
（ｃ）少なくとも１匹のその免疫マウスからＢリンパ球を除く段階、
（ｄ）少なくとも１匹のその免疫マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、ハイブリドーマを産生する段階、
（ｅ）そのハイブリドーマをクローニングする段階、
（ｆ）抗Ｆ蛋白質抗体を産生するクローンを選択する段階、
（ｇ）抗Ｆ蛋白質抗体産生クローンを培養する段階、および
（ｈ）抗Ｆ蛋白質モノクローナル抗体を分離する段階
を含む方法も対象とする。
【００２８】
本出願明細書において、「ＲＳＶ Ｆ蛋白質」という用語は、（１）長さの完全な成熟ＲＳＶ Ｆ蛋白質であって、様々なＲＳＶ株中に自然に発生する変異を含め、アミノ酸配列に変異を有する蛋白質、（２）トランスメンブラン領域を欠いたＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態、および（３）ＲＳＶ Ｆ蛋白質の機能的類縁体、を定義するために使用される。本出願明細書において、第１の蛋白質が第２の蛋白質と免疫学的に関連し、および／または第２の蛋白質と同じ機能を有する場合、第１の蛋白質は第２の蛋白質の「機能的類縁体」である。機能的類縁体は、例えば、その蛋白質の断片、または、その置換型、付加型または欠失型の突然変異体であってよい。ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および／またはＣＴＬを生じるＲＳＶ Ｆ蛋白質断片が、その中に含まれる。
【００２９】
本発明はさらに、図に係る以下の概括的な説明および実施例からさらに詳しく理解されよう。
【００３０】
（発明の全般的説明）
上記のように、本発明は一般に、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して防御を獲得する免疫、および特別のベクターを利用する診断法に関する。本発明において、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含ませるために幾つかの組換えベクターが構築された。ここに記載されたベクターのうちのあるものはまた、前記の国際公開第９６／０４０９５号に記載されているが、それら調製の記載以外、本発明の部分を形成しておらず、免疫化研究における使用は完全さを期するため、また比較のためにここに含まれる。
【００３１】
自己由来シグナルペプチドをコード化する配列を有する完全長ＲＳＶ Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列を図２（ＳＥＱ ＩＤ番号：１）に示す。ここに用意されたある一定の構築物は、完全長ＲＳＶ Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ番号：２）蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含むが、他のものは、末端コドンを膜内外のコード化領域（図３を参照、ＳＥＱ ＩＤ番号：３）のすぐ上流への挿入により修飾されたＲＳＶ Ｆ遺伝子を含み、蛋白の膜内外部分の発現を防止し、膜内外領域（ＳＥＱ ＩＤ番号：４）を欠如する分泌形または切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白を産生する。さらに、本発明に従ってここに用意されたある一定の構築物は、自生のシグナルペプチド配列よりはむしろ、非相同性シグナルペプチド配列をコード化する核酸配列を含み蛋白発現の数および免疫原性の増強を提供する。具体的に、ＨＳＶ ＩｇＤに関するシグナルペプチド配列は、好ましい実施形態におけるこのような目的のために使用される。しかしながら、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）などの他の非相同性シグナルペプチドを使用してもよい。
【００３２】
コード化ＲＳＶ Ｆ蛋白の発現のために、実際にはＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド配列をプロモーター配列に結合させる。このプロモーター配列は直接早期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。このプロモーターは引用文献１３ に記載されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲなどの構築プロモーター類、メタロチオニンプロモーターなどの誘導プロモーター類、および組織特異的プロモーター類など任意の他の好適なプロモーターを使用してもよい。
【００３３】
動物に投与する場合、投与される動物における抗体反応により示されるように、ここに提供されたベクター類はｉｎ ｖｉｖｏ ＲＳＶ Ｆ蛋白発現で働く。下記にさらに詳述するように、このような抗体類は、ここで試料中のＲＳＶ蛋白の検出に用いることが可能である。コード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白が、プラスミドｐＸＬ１（図４）のように膜内外領域を欠いているＲＳＶ Ｆ蛋白の形態である場合、下記実施例に見られるように、ベクターの投与は、抗体および細胞介在免疫反応を中和する生ＲＳＶウイルスおよび免疫化された動物における免疫強化の欠如によるチャレンジに対して、マウスおよびコトンラットにおいて防御を提供した。
【００３４】
組換えベクターはまた、ヌクレオチド配列をコード化するＲＳＶ Ｆ蛋白に隣接して位置する第２のヌクレオチド配列を含んで、宿主の ｉｎ ｖｉｖｏ で発現される際にＲＳＶ Ｆ蛋白の免疫防御能力を増強することもできる。このような増強は、ｉｎ ｖｉｖｏ 発現の増大、例えばｍＲＮＡ安定性の増大、転写および／または翻訳の増大により与えることができる。この追加配列は、プロモーター配列とＲＳＶ Ｆ蛋白コード化配列との間に位置することが好ましい。
【００３５】
この増強配列には、転写および翻訳中の異所ｍＲＮＡスプライシングを防止する１対のスプライス部位を含んでもよく、その結果、実質的に全ての転写ｍＲＮＡが、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する。具体的には、図７に示されたウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：５）は、引用文献１５ にも記載されているように、このようなスプライス部位を備えることができる。
【００３６】
イントロンＩＩ配列、ＣＭＶプロモーター、および膜内外領域を欠く切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白にコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドｐＸＬ２（図５）は、下記の実施例に見られるように、生ＲＳＶによるチャレンジに対してマウスにおける完全防御を誘導した。さらに、イントロンＩＩ配列、ＣＭＶプロモーター、および完全長ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドｐＸＬ４（図７）は、下記の実施例に見られるように、生ＲＳＶによるチャレンジに対してマウスにおける防御を提供した。プラスミドｐＸＬ１、ｐＸＬ２、ｐＸＬ３およびｐＸＬ４は全て、自己由来シグナルペプチド配列を含有し、前記国際公開第９６／０４０９５号に従って構築される。
【００３７】
イントロンＩＩ配列、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ ＩｇＤシグナルペプチドコード化配列、および膜内外領域を欠く切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドｐ８２Ｍ３５Ｂ（図１０）は、本発明に従い下記の実施例に見られるように、心臓毒による前処理が完全保護を授けるｐＸＬ２にとり必要とされる条件下、心臓毒の前処理無しで完全防御を誘導した。
【００３８】
ここで提供されたベクターはまた、ＲＳＶからのさらなる抗原をコード化する第３のヌクレオチド配列、少なくとも１つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調節剤も含んでよい。このようなベクターは、キメラ構造またはビシストロン構造における前記第３のヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、第３のヌクレオチド配列を含有するベクター類を個々に構築してもよく、ここに提供された核酸分子と共に宿主に共に投与してもよい。
【００３９】
本発明の種々の実施形態は、ワクチン接種、ＲＳＶ感染の診断と治療の分野に多くの応用を有することは当業者にとって実に明白となる。このような利用について、さらに非限定の検討をさらに下記に示す。
【００４０】
１．ワクチン調製並びに利用
ワクチンとして用いるのに好適な免疫原性組成物は、ここに開示されるようなＲＳＶ Ｆ遺伝子類およびベクター類から調製できる。このワクチンは、被験者に抗Ｆ抗体の産生などの免疫反応を誘発する。核酸を含有するワクチンなどの免疫原組成物は、ポリヌクレオチド投与のために生理学的に許容できる液体溶液または乳濁液での注射剤として調製可能である。この核酸は、核酸リポソーム（例えば、引用文献１７ の国際公開第９３２４６４０号に記載されるような）として当業界に知られるレシチンリポソーム類または他のリポソーム類などのリポソーム類と関連づけられ、またはこの核酸は、さらに以下に詳細が記載されるようにアジュバントと関連づけられる。カチオン性脂質を含んで成るリポソーム類は、自発的に且つ迅速にＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用し、ポリヌクレオチドの １００％まで捕捉するリポソーム／または核酸複合体となる。さらに、ポリカチオン性複合体は細胞膜と融合し、リソソーム区画の分解性酵素を迂回するポリヌクレオチドの細胞内送達を生じさせる。公表されたＰＣＴ出願国際公開第９４／２７４３５号には、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子免疫化に関する組成物を記載している。カルシウムイオン類、ウイルス蛋白および他のトランスフェクション促進剤などの核酸の細胞内取り込みを補助する試薬の使用が有利と成り得る。
【００４１】
ポリヌクレオチド免疫原性製剤はまた、生分解性の持効性粒子を含むマイクロカプセルとして製剤化することもできる。このように米国特許第５，１５１，２６４号には、バイオベクタースプラ分子（Ｂｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ）（ＢＶＳＭ）と呼ばれたリン脂質／糖脂質／多糖種の微粒子担体を記載している。この微粒子担体は、その層のうちの１層に生物活性を有する多様な分子を輸送するために意図される。
【００４２】
米国特許第５，０７５，１０９号には、５０：５０ ポリ（ＤＬ−ラクチデコ−グリコリド）中、抗原のトリフェニル化キーホールリンペットヘモシニアンおよびブドウ球菌エンテロトキシンＢのカプセル化を記載している。カプセル化用の他のポリマー類には、ポリ（グリコリド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキサレート類、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド類）、ポリオルトエステル類、およびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物などが考えられる。
【００４３】
公表されたＰＣＴ出願国際公開第９１／０６２８２号には、複数の生体接着ミクロスフェア類および抗原類を含んで成る送達媒体を記載している。ミクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンである。この送達媒体は、特に鼻粘膜を通ってのワクチンの取り込み用のものである。この送達媒体は、さらに吸収増強剤を含んでよい。
【００４４】
ＲＳＶ Ｆ遺伝子並びにベクター類は、それと適合する製剤上許容できる賦形剤と混合することができる。このような賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを挙げることができる。この免疫原性組成物およびワクチンは、その効果を強化するために湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助剤をさらに含有してもよい。この免疫原性組成物およびワクチンを、可能ならば局所麻酔による注射部位の前処理後、皮下注射、静脈注射、皮内注射または筋内注射により非経口的に投与してもよい。あるいは、本発明に従って形成された免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫反応を誘発する様式で製剤化並びに送達されてもよい。このように免疫原性組成物は、例えば鼻または経口（胃内）経路により粘膜表面に投与できる。あるいは、坐薬および経口製剤などの他の投与態様を所望できる。坐薬に関して、結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコール類またはトリグリセリド類を含んでよい。経口製剤は、通常、例えば製薬グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの初発剤を含んでよい。
【００４５】
免疫原性製剤並びにワクチンは、投薬剤形に適合した様式、および治療上効果的であり、防御的および免疫原性となるような用量で投与される。投与量は、例えばＲＳＶ Ｆ蛋白およびそれに対する抗体を合成し、要すれば細胞介在の免疫反応を生じさせる個々の免疫系の能力など治療を受ける被験者に依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、好適な投薬量の範囲は、当業者により容易に決定でき、ＲＳＶ Ｆ遺伝子およびベクターの約１μｇから約１ｍｇのレベルであり得る。初発投与並びに追加抗原投与量に係る好適な用法−用量もまた変わり得るが、初発投与に引き続く投与を含んでもよい。投薬量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズに従って変えられる。１種の病原体のみに対して防御するワクチンは単価ワクチンである。幾つかの病原体の抗原物質を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり、また本発明に属すことができる。このような組み合わせワクチンは、例えば種々の病原体、または同一病原体の種々の株、または種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。
【００４６】
ベクター類が、リン酸緩衝生理食塩水中 ０．０５％から ０．１％溶液として一般に使用されるアジュバント類と共に投与されると、免疫原性は有意に改善される。アジュバント類は抗原の免疫原性を増強するが、必ずしもそれ自体が免疫原性ではない。アジュバント類は投与部位近くの局所に抗原を保持することにより作用し、免疫系の細胞に対する抗原の緩やかな放出の維持を促進する貯留効果を生じさせる。アジュバント類はまた、貯留抗原に対し免疫系の細胞を引きつけることができ、そのような細胞が免疫反応を誘発するように刺激できる。
【００４７】
免疫刺激剤またはアジュバント類は、例えばワクチンに対する宿主の免疫反応を改善するために長年使用されてきた。したがって、アジュバント類は、抗原に対する免疫反応を増強することが認められてきた。しかしながら、これらのアジュバントの幾つかは毒性があり、ヒトおよび多数の動物における使用を不都合にさせる望ましくない副作用を引き起こし得る。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般に集合的にアルムと呼ばれる）のみが、通常ヒトおよび獣医用ワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【００４８】
広範囲の外因性アジュバントおよび他の免疫調節物質は、抗原に対し効力のある免疫反応を誘発することができる。これらには、膜蛋白抗原に対して錯体を作るサポニン類が挙げられ、モノホリル脂質Ａ、ＱＳ２１ およびポリホスファゼンと同様、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、鉱油との複雑なポリマー、鉱油中の殺菌マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌産生物を産生する。
【００４９】
本発明の詳細な実施形態において、ＲＳＶのＦ蛋白をコード化する第１のヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、免疫系の細胞など選択された細胞に対してこのベクターを標的にする標的分子と協働して送達できる。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、多様な方法、例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコード化するＤＮＡで被覆された金ミクロ発射物のマウスの皮膚への導入は、マウスに抗ＢＧＨ抗体を産生させることを開示したＴａｎｇら（引用文献１０）の方法、他方、ジェットインジェクタが生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および哺乳動物の組織にトランスフェクションするのに使用できることを示したＦｕｒｔｈら（引用文献１１）の方法により宿主に送達可能である。
【００５１】
２．イムノアッセイ
本発明のＲＳＶ Ｆ遺伝子およびベクター類は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡｓおよび他の非酵素的結合抗体結合アッセイまたは当業界に知られた方法などのイムノアッセイでの利用のために抗Ｆ抗体の生成に係る免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、先ずベクターを宿主に投与し、ＲＳＶ Ｆ蛋白に特異的な抗体を生成する。これらのＲＳＶ Ｆ特異的抗体を、選択された表面、例えばポリスチレン微量定量プレートのウェルなどの抗体を結合できる表面上に固定化する。不完全に吸着された抗体を除去するために洗浄後、試験試料に関して抗原的に中性であると知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液などの非特異的蛋白を選択された表面に結合させ得る。これは、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、したがって抗血清の表面上への非特異的結合により生じた背景を減じることができる。
【００５２】
次いで固定化表面を、臨床的または生物学的材料などの試料と接触させ、免疫複合体（抗原／抗体）形成に資した方法で試験する。この方法は、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ の溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含んでもよい。次に試料を、約２０℃から ３７℃の温度範囲などで約２時間から４時間培養させる。培養後、試料接触面を洗浄し、非免疫複合体物質を除去する。洗浄方法は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ またはホウ酸緩衝剤などの溶液での洗浄を含んでよい。試験試料と結合ＲＳＶ Ｆ特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、引き続く洗浄後、免疫複合体形成の発生率および平均量が決定できる。
【００５３】
生物材料
ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子を含み、ここに言及するある一定のプラスミドは、ブダペスト条約に従って本願書の出願前に、米国 ２０１１０−２２０９ バージニア州マナサス、１０８０１大学通り、アメリカ型培養収集（Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託されている。寄託プラスミドの試料は、これまたは米国特許出願に基づき特許を認可する上で公衆にとって入手できることになり、寄託物の入手に関する全ての制限はこの時点で除かれる。寄託保管所が生存試料を施行できない場合、この寄託物は交換されることになる。寄託された実施形態が発明の例証としてのみ意図されるものであることから、ここに記載され特許請求された発明は、寄託プラスミドによる範囲において限定されない。本出願に記載されるものと同様のまたは等しい抗原をコード化する任意の等しいかまたは同様のプラスミドが本発明の範囲内にある。
【００５４】
0003602448.tif 000002
実施例
上記開示は、広く本発明を説明する。より完全な理解は、以下の具体的実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に例証目的のために説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。同等物の形体変化および代用物の変化は、状況を示唆でき、または都合よくできるように熟慮されている。特殊な用語がここでは用いられているが、このような用語は、説明上意図されているものであり、限定目的のためではない。
【００５５】
分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学の方法を用いるが、本開示において明白には説明されず、これらの実施例は、科学文献に詳細に記載されており、十分に当業者の技量内にあるものである。
【００５６】
実施例１
本実施例は、ＲＳＶ Ｆ遺伝子を含有するベクターの構築を説明する。
【００５７】
図１は、呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示し、図２は、完全長のＲＳＶ Ｆ蛋白（ＳＥＱ ＩＤ番号：１）および推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：２）をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を示す。図３は、分泌されるＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ番号：３）および推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：４）を示す。
【００５８】
ＲＳＶ Ｆをコード化するｃＤＮＡが、直接早期のプロモーター、エンハンサーおよびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイントロンＡ配列の下流域、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）Ｐｏｌｙ−Ａ部位の上流域にサブクローン化した、４種のプラスミドＤＮＡ構築物のセットが作製された（図４から図７に図式的に示されるように）。プロモーターを含有する １．６ＫｂＳｓｐｌ−ＰｓｔＩフラグメント、エンハンサーおよびＣＭＶタウン株のイントロンＡ配列は、ジョンズホプキンス大学のＧ．Ｓ．Ｈａｙｗａｒｄ博士から恵与されたプラスミドｐＲＬ４３ａ（引用文献２０）から最初に誘導され、ＥｃｏＲＶとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ１１ＳＫ＋／−のＰｓｔＩ部位（層遺伝子）との間でサブクローン化した。Ｆ蛋白の分泌体を発現するプラスミド（図４および図５のｐＸＬ１およびｐＸＬ２）の構築に関しては、サブグループＡに属する臨床単離体から独自にクローン化されたＦｃＤＮＡの切頭形体を含有する １．６ＫｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが、ｐＲＳＶＦから切除され（引用文献１８および国際公開第９３／１４２０７号）、ＥｃｏＲＩとｐＳＧ５のＢａｍＨＩ部位（層遺伝子、引用文献１４）との間でサブクローン化した。次に １．６ＫｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントまたは ２．２ＫｂＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのいずれかをｐＳＧ５構築物から切除し、クレノウで充填し、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／−構築物のＳｍａＩ部位にサブクローン化した。ｐＳＧ５から誘導された ０．６ＫｂＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ウサギβ−グロビンからのイントロンＩＩ配列を含んでいた。引き続きプラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、クレノウで充填され、ＸｂａＩで消化され、３．２Ｋｂまたは ３．８Ｋｂのいずれかのフラグメントを生成した。これらのフラグメントは、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）にＣＭＶプロモーターを含有する ０．８ＫｂＮｒｕＩ−ＸｂａＩフラグメントの代わりに使用され、それぞれ最終のｐＸＬ１およびｐＸＬ２構築体となる。
【００５９】
完全長Ｆ蛋白（ｐＸＬ３およびｐＸＬ４−図６および図７）を発現するプラスミドの構築に関して、完全長ＲＳＶ ＦｃＤＮＡは、挿入体（引用文献１８および国際公開第９３／１４２０７号）を含有する組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３−ＳＫ（層遺伝子）から １．９ＫｂＥｃｏＲＩフラグメントとして切除し、ｐＳＧ５（層遺伝子）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。次いで １．９ＫｂＥｃｏＲＩフラグメントまたは２．５ＫｂＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントのいずれかをｐＳＧ５構成物から切除し、クレノウで充填し、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／−構成物のＳｍａＩ部位にサブクローン化した。残りのｐＸＬ３およびｐＸＬ４に関する構築は、上記のｐＸＬ１およびｐＸＬ２の構築と同じであった。したがって、ＣＭＶプロモーターとイントロンＡ配列以外のｐＸＬ１〜４における残りのベクター成分は、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶから誘導された。プラスミドｐＸＬ１およびｐＸＬ２は、停止コドンを輸送するＦ蛋白の切頭形／分泌形を発現するのに作製され、不活性分子と比較して、膜内外（ＴＭ）およびＣ末端サイトソール尾部を含む４８個のアミノ酸のＣ−末端欠失となった。これに対してｐＸＬ３およびｐＸＬ４は、ＴＭおよびサイトソールＣ末端尾部を含むＲＳＶ Ｆ分子の不活性膜付着体を発現するために作製された。ｐＸＬ２およびｐＸＬ４中のイントロンＩＩ配列の存在根拠は、このイントロンがＲＮＡの正確なスプライシングを仲介すると報告されたことであった。ＲＳＶ−Ｆに関するｍＲＮＡが、異所スプライシングの傾向があると思われたことから、イントロンＩＩ配列の存在は、これを克服する助けとなると思われる。４種の全てのプラスミド構築体は、ＤＮＡ塩基配列決定分析により確認された。プラスミドｐＸＬ１、ｐＸＬ２、ｐＸＬ３およびｐＸＬ４は全て、自己由来シグナルペップチド配列を含有し、前記の国際公開第９６／０４０９５号に従って構築される。
【００６０】
プラスミドＤＮＡは、製造元の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ社（米国カリフォルニア州チャッツワース）からのプラスミドメガキットを用いて精製された。
【００６１】
実施例２
本実施例では、マウスの免疫化を説明する。マウスは引用文献１６に記載されるようにＲＳＶによる感染に鋭敏である。
【００６２】
筋内（ｉ．ｍ．）免疫化について、９匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群（オス、６〜８週齢）（米国メイン州バーハーバー、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋に、ｐＸＬ１〜４のそれぞれ２×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）を両側に注射した。ＤＮＡ注射５日前に、筋肉を２×５０μＬ（ＰＢＳ中１０μＭ）の心臓毒剤（Ｌａｔｏｘａｎ、仏国）で処理した。心臓毒剤による筋肉の前処理は、ＤＮＡ取り込みを増加し、それに続く筋内経路による免疫反応を増強すると報告されている（引用文献２４）。これらのマウスは、１カ月後同様に抗原追加された。対照群のマウスを、同一のスケジュールに従ってＲＳＶ Ｆ遺伝子の無い同一のベクター要素配列を含有するプラセボプラスミドで免疫化した。皮内（ｉ．ｄ．）免疫化に関しては、１００μｇのｐＸＬ２（ＰＢＳ中２μｇ／μＬ）を背基部から１〜２ｃｍ遠位の皮膚に注射した。これらのマウスは、１カ月後同様に抗原追加された。
【００６３】
第２の免疫化後 ７５日目に、マウスは、１０５．４プラーク形成単位（ｐｆｕ）のマウス適合ＲＳＶのＡ２サブタイプ（米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学Ｐ．Ｗｙｄｅ博士より恵与された）によりチャレンジされた。肺は４日後無菌的に除去され、重量計測し、２ｍＬの完全培地中均質化した。肺ホモジネートにおけるｐｆｕ数は、ワクチン品質のベロ細胞を用いて前記（引用文献１９）のように２回で決定された。これらのデータは、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計解析に供された。
【００６４】
免疫化マウスから得られた血清を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価（それぞれＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）およびＲＳＶ特異的プラーク減少力価に関して分析した。ＥＬＩＳＡは、免疫親和性精製ＲＳＶ Ｆ蛋白（５０ｎｇ／ｍＬ）で被覆された ９６ウェルプレートおよび２倍連続希釈の免疫血清を用いて実施された。アルカリホスファターゼ（カナダ国オンタリオ州 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体として用いられた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体力価の測定のために、使用される二次抗体は、それぞれ単一特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヒツジ抗マウスＩｇＧ１抗体（カナダ国オンタリオ州トロント、Ｓｅｒｏｔｉｃ）およびラット抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（米国カリフォルニア州サンフランシスコ、Ｚｙｍｅｄ）であった。プラーク減少力価は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてＰｒｉｎｃｅら（引用文献１９）に従って決定された。４倍連続希釈の免疫血清は、培地中 ５０ｐｆｕのＲＳＶ長株（ＡＴＣＣ）と共に５％ＣＯ２存在下、３７℃１時間培養した。次にベロ細胞をこの混合に感染させた。プラークを ８０％メタノールで固定し、５日後ペルオキシダーゼ（カナダ国オンタリオ州 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）抱合マウス抗ＲＳＶ ＦモノクローナルＩｇＧ１抗体およびロバ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて展開した。ＲＳＶ特異的プラーク減少力価は、プラーク数の６０％減少を生じる血清試料の希釈として定義された。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイの双方は、２重に実施され、データは２つの測定平均として表される。これらのデータはＳｉｇｍａＳｔａｔ（カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計解析に供された。
【００６５】
ＤＮＡ免疫化後ＲＳＶ特異的ＣＴＬの誘導を検討するために、２匹の免疫化マウスから脾臓を除去し、集められた単細胞懸濁液を調製した。脾細胞は、１ＴＣＩＤ５０／細胞ＲＳＶ（長株）に２時間感染させてガンマ放射された（３，０００ラド）同系脾細胞（２．５×１０６個の細胞／ｍＬ）を用いて １０Ｕ／ｍＬマウスインターロイキン２（ＩＬ−２）を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で ２．５×１０６個の細胞／ｍＬにて培養した。マウスＩＬ−２源は、バーゼル免疫研究所のＨ．Ｋａｒａｓｕｙａｍａ博士（引用文献２０）から恵与された高濃度のＩＬ−２を構成的に分泌するマウス細胞系の上澄液であった。ＣＴＬ活性は、標準的な４時間のクロム放出アッセイにおいて ｉｎ ｖｉｔｒｏ の再刺激５日後に試験した。標的細胞は、それぞれ５種の５１Ｃｒ標識未感染ＢＡＬＢ／ｃ線維芽細胞（ＢＣ細胞）および永続的ＲＳＶ感染ＢＣＨ１４線維芽細胞であった。洗浄された応答細胞は、９６ウェルＶ字底組織培養プレートにて３７℃４時間、２００μＬ中目標比率に対してエフェクターを変えて２×１０３個の標的細胞を用いて培養した。自発的且つ総クロム放出は、応答リンパ球の不在下、培地または ２．５％トリトン−Ｘ１００ のいずれかを用いて標的細胞を培養することにより決定された。特異的なクロム放出パーセントは、（カウント−自発的カウント）／（総カウント−自発的カウント）×１００ として算出された。試験は３回実施され、データは３回の測定平均として表される。ＣＴＬアッセイにおける抗体遮断試験に関して、クロム標識ＢＣまたはＢＣＨ４細胞を添加する前に、エフェクター細胞は、ＣＤ４（ＧＫ１．５）（引用文献２１）に対する精製ｍＡｂまたはマウスＣＤ８（５３−６．７）（引用文献２２）に対する精製ｍＡｂの最終１０μｇ／ｍＬにより１時間培養した。殺ＣＴＬにおける抗クラスＩＭＨＣ抗体の効果を決定するために、クロム標識標的細胞ＢＣまたはＢＣＨ４を、エフェクター細胞の添加前にクラスＩＭＨＣ（３４−１−２Ｓ）（引用文献２３）のＫｄおよびＤｄを認識するｍＡｂを分泌するハイブリドーマの培養上澄の ２０μＬで培養した。
【００６６】
実施例３
本実施例では、筋内経路によるポリヌクレオチド免疫化による免疫原性および防御を説明する。
【００６７】
筋内ＤＮＡ投与後抗体応答を特性化するために、免疫血清を、ＥＬＩＳＡによる抗ＲＳＶ ＦＩｇＧ抗体力価に関してまたＲＳＶ特異的プラーク減少力価に関してそれぞれ分析した。４種のプラスミド構築物はすべて免疫原性であることが判った。ｐＸＬ１〜４で免疫化されたマウスから得た血清は、プラセボ群と比較して、有意な抗ＲＳＶ ＦＩｇＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価を示した（下記の表１）（それぞれＰ＜０．００６１および＜０．０００１、マン‐ホイットニー検定）。しかしながら、ｐＸＬ１、ｐＸＬ２、ｐＸＬ３、ｐＸＬ４のいずれで免疫化したマウス間でも抗ＲＳＶ ＦＩｇＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価のいずれにおいても有意差はない。
【００６８】
下気道の初回抗原刺激のＲＳＶ感染に対してｐＸＬ１〜４の防御能力を評価するために、免疫化マウスをマウス適合ＲＳＶで鼻腔内にチャレンジし、およびチャレンジ後のウイルス肺力価を評価した。４種のプラスミド構成体すべてが、ＲＳＶ感染に対してマウスを防御することが判った。プラセボ群と比較して、ウイルス肺力価における有意な減少が、ｐＸＬ１〜４で免疫化されたマウスに観察された（Ｐ＜０．０００１、マン‐ホイットニー検定）。しかしながら、防御程度の変化がプラスミドに依存して観察された。特に、ｐＸＬ１は、ｐＸＬ３よりも防御性があり（Ｐ＝０．００１０９、マン‐ホイットニー検定）、およびｐＸＬ４はｐＸＬ３よりも防御性あったが（Ｐ＝０．００１２５）、一方、ｐＸＬ２のみが完全防御を誘導した。この結論は、エンドポイントとして多くの完全防御マウスでの他の解析により確認された（フィッシャーの完全検定）。構築体ｐＸＬ１、ｐＸＬ２またはｐＸＬ４は、プラセボ以上の効果が無かったｐＸＬ３よりも高程度の防御を与えた（Ｐ＜０．００４、フィッシャーの完全検定）。ｐＸＬ２のみが全ての免疫化マウスの中で完全防御を与えた。
【００６９】
上記の統計解析は、ｐＸＬ１がｐＸＬ３よりも有意な防御を提供することを明らかにした。前者は切頭形および分泌形を発現し、後者はＲＳＶ Ｆ蛋白の不活性膜固定形を発現する。さらに、ｐＸＬ４はｐＸＬ３よりも防御性があることが示された。これら２つの構築体間の相違は、ｐＸＬ４におけるイントロンＩＩ配列の存在である。イントロンＩＩ配列と関連してＲＳＶ−Ｆの分泌形を発現する構築体ｐＸＬ２は、実施例２のプロトコルにて免疫化された全マウスにおいて完全防御を提供するのは唯一のプラスミドであった。
【００７０】
実施例４
本実施例では、免疫原性および防御能力におけるｐＸＬ２の投与経路の影響を説明する。
【００７１】
ＤＮＡ投与の筋内および皮内経路を、抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価およびＲＳＶ特異的プラーク減少力価の観点で免疫原性に関して比較した。免疫血清の解析により（下記の表２）、ＤＮＡ投与の皮内投与を抗ＲＳＶ ＦＩｇＧおよびＩｇＧ１抗体応答により判定すると、筋内経路と同じく免疫原性であり、ＲＳＶ特異的プラーク減少力価も同様であることが明らかとなった。しかしながら、筋内経路のみが有意な抗ＲＳＶ ＦＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導したが、一方、皮内経路が使用された場合、ＩｇＧ２ａイソタイプ力価は無視してよいものであった。筋内および皮内経路はまた、ＲＳＶ特異的ＣＴＬの誘導に関して比較した。有意なＲＳＶ特異的ＣＴＬ活性が、筋内免疫化マウスにおいて検出された。対照的に、細胞応答は皮内接種されたマウスにおいて有意により低かった（下記の表３）。これらの相違にもかかわらず、下気道の初回抗原刺激のＲＳＶ感染に対する防御は、いずれかの経路を経て免疫化された両群のマウスにおいても観察された（下記の表４）。ＲＳＶ−ＦＤＮＡにより誘導されたＣＴＬは、古典的なＣＤ８＋クラスＩ制限ＣＴＬである。標的細胞のＢＣＨ４線維芽細胞は、クラスＩＭＨＣのみを発現し、クラスＩＩＭＨＣを発現しない。さらに、抗クラスＩＭＨＣ抗体を有するＢＣＨ４標的細胞の前培養は、ＲＳＶ−Ｆ ＤＮＡ誘導ＣＴＬ系列の溶菌活性を有意に遮断した。抗ＣＤ８抗体は、ＢＣＨ４細胞の溶菌を部分的に遮断できたが、ＣＤ４分子の抗体は全く効果が無かった（下記の表５）。ｍＡｂからＣＤ８による全遮断の欠如は、ＣＤ８に影響を受けないＣＴＬ（たとえそれらがＣＤ８＋ＣＴＬであっても、それらのＴＣＲがクラスＩＭＨＣ＋ペプチドに十分な親和性を有し、クラスＩＭＨＣのアルファ３とＣＤ８との相互作用を必要としないことを意味する）によるか、またはこれらの実験に用いられた抗体量が制限されていたことによると考えられる。ＹＡＣ−１（ＮＫ感受性標的）細胞の溶菌は検出できなかった（データは示さず）。
【００７２】
実施例５
本実施例では、ｐＸＬ２を用いたコトンラットにおける免疫化試験を説明する。
【００７３】
ＤＮＡ免疫化に対するコトンラットの免疫反応は、下記の表６に示されたプロトコルにより分析された。５日目に、４０匹のコトンラットを無作為に選び、各５匹の８グループに分けた。グループ１からグループ７のコトンラットは、心臓毒剤（１．０μＭ）を前脛骨（ＴＡ）の両側筋肉に筋内接種された。１日目に、グループ８のコトンラットはブピバカイン（０．２５％）をＴＡ筋肉内に接種された。０日目に、各グループの数匹の動物を採血し、ワクチン投与前の試験動物の血清中のＲＳＶ特異的抗体濃度を決定した。次いで全ての動物に、２００μｇのプラスミドＤＮＡ、プラセボ（ＲＳＶ非特異的ＤＮＡ）、ＲＳＶの １００ 中央値のコトンラット感染量（ＣＲＩＤ５０；ポジティブコントロール）またはＨｅｐ−２組織培養細胞で調製したホルマリン不活化ＲＳＶを接種し、アルムにて抗原増強された。４４日後グループ１および７のコトンラットのＴＡ筋にカルジオトキシンを接種した。４日後（ワクチンによる初回抗原刺激の ４８日後）、グループ８の動物は、右肢のＴＡ筋にブピバカインを再接種した。翌日（ワクチンによる初回抗原刺激の７週後）、全ての動物を採血し、生存ＲＳＶを投与したグループの動物を除く全ての動物を０日目に用いた同一物質の同一用量で抗原追加を行った。２９日後、各コトンラットを採血し、次いでＨｅｐ−２組織培養細胞で増殖した １００ ＣＲＩＤ５０ ＲＳＶ Ａ２により鼻孔内（ｉ．ｎ．）チャレンジした。このウイルスチャレンジの４日後（＋８８日目）、全てのコトンラットを殺し、肺を除去した。各肺のセットから１葉をホルマリンで固定し、肺組織病理学の組織評価が施された。残りの肺葉は、ＲＳＶの存在と濃度について評価された。０日目、４９日目および ７８日目に採取された各血清を、ＲＳＶ中和活性、抗ＲＳＶ融合活性およびＲＳＶ特異的ＥＬＩＳＡ抗体について試験した。
【００７４】
＋４９日目および＋７８日目のＲＳＶ中和活性は、それぞれ下記の表７（ａ）および表７（ｂ）に示す。表７（ａ）に示された結果から理解できるように、＋４９日目の生ＲＳＶおよび免疫ＤＮＡで免疫化された動物は、重要なＲＳＶ結成中和力価を有していた。ホルマリン不活化ＲＳＶで免疫化された動物は、＋４９日目のプラセボグループと等しい中和力価を有したが、＋７８日目までの抗原追加後は、５．８（ｌｏｇ１０／０．０５）に到達した。追加抗原では、生ＲＳＶまたは筋内プラスミド免疫化により免疫化された動物においては有意な効果は無かった。
【００７５】
＋８２日目の鼻（上気道）洗浄におけるＲＳＶ力価を下記の表８に示す。＋８２日目の肺（下気道）のＲＳＶ力価を下記の表９に示す。全てのワクチンは、肺感染に対して防御を呈したが、これらの条件下で、生菌ウイルスのみが上気道感染に対して全体防御を呈した。
【００７６】
コトンラットからの肺を、肺組織病理学に関して組織学的に調査し、この結果を下記の表１０ に示す。実質的に感染細胞の無いまたは感染徴候の無いグループ９、および本試験で見られた最大の肺病理を示したグループ３から得られた肺切片を除いて、他のグループから得られた全ての肺切片は、よく知られたものが観察され、すなわち、散乱した感染細胞が大抵の領域存在し、幾らかの隔膜厚みがあった。これらには軽度の感染症の徴候がある。大多数の感染細胞および他の感染徴候がグループ３（すなわち、ウイルスチャレンジ前にホルマリン不活化［ＦＩ］ＲＳＶワクチンが投与された）からの肺切片に存在する。この結果は、ＲＳＶ Ｆ蛋白を発現するプラスミドＤＮＡでの免疫化は、プラセボと異なり肺組織病理とならないが、ＦＩ−ＲＳＶはより重篤な病理を生じた。
【００７７】
実施例６
本実施例では、ＲＳＶチャレンジ後のｐＸＬ２により免疫化したマウスにおける局所サイトカイン発現プロフィルの測定を説明する。
【００７８】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを実施例１に記載した通り調製したｐＸＬ２ １００μｇにより、０週目および６週目に免疫化し、１０週目に鼻腔内ＲＳＶチャレンジを行った。対照マウスを同一プロトコルに従って、ＦＩ−ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免疫化し、ＲＳＶでチャレンジさせた。ウイルスチャレンジの４日後、免疫化マウスから肺を除去し、直ちに液体窒素中で凍らせた。総ＲＮＡは、クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿により、ＴＲＩｚｏｌ／β−メルカプトエタノール中ホモジナイズした肺から調製した。次に、クローン法からのＩＬ４、ＩＬ５またはＩＦＮ−γ特異的プライマーを用いて、ＲＮＡ試料において逆転写ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。次に増殖産生物をクローン法からのサイトカイン特異的３２Ｐ標識プローブと液体ハイブリッド形成を行い、５％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ゲル中の放射性シグナルの走査により定量化した。各処理群から３つのマウス肺を除去し、最低２回肺サイトカイン発現の分析を行った。データは図９に示し、これらの測定平均値と標準偏差を示している。
【００７９】
図９に示されたデータから判るように、
１．生ＲＳＶによる鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化は、平均したサイトカインプロフィル（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５）となり、他方、ＦＩ−ＲＳＶによる筋内（ｉ．ｍ．）免疫化は、Ｔｈ２優位（ＩＬ−４およびＩＬ−５の上昇）となった。これらの結果は、文献で報告された結果と同様である。
【００８０】
２．ＦＩの分泌（ｓｅｃ．）体を含むｐＸＬ２によるｉ．ｍ．または皮内（ｉ．ｄ．）経路を介しての免疫化により、生ＲＳＶ免疫化によるものと同様の平均したサイトカインプロフィルが増大した。
【００８１】
３．分泌形蛋白を発現するｐＸＬ２を用いてのｉ．ｍ．およびｉ．ｄ．免疫化によるサイトカイン反応の大きさは、生ＲＳＶ免疫化によるものよりも有意に高い。
【００８２】
実施例７
本実施例では、本発明に従って、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化し、５’ＵＴＲおよび単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶＩ）ｇＤのシグナルペプチドを含むプラスミドベクターの構築を説明する。
【００８３】
プラスミドｐ８２Ｍ３５Ｂは、図１０ に示された計画に従って調製された。ＣＭＶプロモーター、イントロンＡおよびＢＧＨポリＡ配列を含むプラスミドｐＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ）（図１１：ＳＥＱ ＩＤ番号：６）は、制限酵素ＰｓｔＩにより線状化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端鈍化させた。ウサギβグロビンイントロンＩＩ配列をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＳＧ５（層遺伝子：引用文献１４）より回収し、０．６Ｋｂフラグメントを単離し、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理によって末端鈍化させた。次に、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩフラグメントをＰｓｔ Ｉ／末端鈍化ＶＲ１０１２ プラスミドと結合させた（図１０）。このベクターを次にＥｃｏＲＶによって制限化し、脱リン酸した。
【００８４】
ＲＳＶ Ｆの分泌体をＳａｌＩを用いた消化によってプラスミドｐＸＬ２より単離し（実施例１；図５）、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理により末端鈍化し、次いでＫｐｎＩにより制限化し、５’ＫｐｎＩ，３’末端鈍化フラグメントを産生した。ＨＳＶＩｇＤ配列は図１２に示されるように、ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：７）、および誘導アミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ番号：８）配列を有する合成オリゴペプチドとして合成した。
【００８５】
ｇＤオリゴヌクレオチドは５’鈍化末端と３’ＫｐｎＩ認識配列を有する。単離したＲＳＶ Ｆフラグメント、ｇＤオリゴおよびＶＲ１０１２ プラスミドを用いて、３方向結合を実施しプラスミドｐ８２Ｍ３５Ｂを産生した（図１０）。
【００８６】
実施例８
本実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ におけるＲＳＶ Ｆ蛋白の発現および分泌を示す。
【００８７】
ＢＨＫ細胞は、実施例７に記載した通り調製され、ｐ８２Ｍ３５Ｂによって取り込まれ、その対の一方が実施例６に記載した通りに調製された自己由来のＲＳＶ Ｆシグナルペプチド（ｐＸＬ２）を含むか、またはリポフェクチン（Ｇｔｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてベクター要素のみ（プラセボ）によって取り込まれるかのいずれかである。取り込み４８時間後に上澄液分画を回収し、Ｆ特異的酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ＲＳＶ Ｆ蛋白の定量化に供した。３つの独立した取り込みアッセイを各々のベクターについて行った。
【００８８】
捕捉剤として、１つのアフィニティー精製したマウスモノクロ−ナル抗ＲＳＶ Ｆ抗体（２μｇ／ｍＬ）を、また、検出剤としてもう１つのビオチン化モノクローナル抗ＲＳＶ Ｆ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を用いてＥＬＩＳＡを行った。続いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。用いたＲＳＶ Ｆ標準蛋白は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、培養ウイルスの界面活性剤溶菌液から精製した。
【００８９】
表１１（下記）に得られた結果を示す。表１１に見られるように、プラセボに比べて、ｐ８２Ｍ３５ＢとｐＸＬ２は双方とも取り込み ４８時間後にＢＨＫからのＦ蛋白の有意な発現／分泌を媒介した。さらにｐ８２Ｍ３５Ｂ取り込みＢＨＫ細胞の上澄液分画においては、ｐＸＬ２取り込み細胞の上澄液分画よりも顕著に高濃度のＦ蛋白が一貫して検出され、後者の ５．４倍の改善を示した。これらの結果は、自己由来のＲＳＶ Ｆシグナルペプチドのコード配列を５’ＵＴＲのコード化配列およびＨＳＶＩｇＤのシグナルペプチドに置き換えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのＦ蛋白の発現／分泌が有意に増大することを示している。
【００９０】
実施例９
本実施例では、ｐ８２Ｍ３５Ｂを用いて実施された免疫原性試験を示す。
【００９１】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（オス、６〜８週齢）（米国メイン州バーハーバー、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋の両側に、２×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）のｐ８２Ｍ３５Ｂ、ｐＸＬ２またはベクター要素のみ（プラセボ）を注射した。幾つかの群では、ＤＮＡ注射５日前に、該筋肉を２×５０μＬ（ＰＢＳ中 １０μＭ）の心臓毒剤（Ｌａｔｏｘａｎ、仏国）で処理したが、その他の群ではこの前処理は行わなかった。これらのマウスに６週間後、同じ投与量のプラスミドＤＮＡで抗原追加した。ポジティブコントロール群のマウスに、Ｈｅｐ２細胞（引用文献１６）で増殖したＡ２サブタイプの臨床ＲＳＶ株の １０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）で鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化を行った。
【００９２】
免疫化マウスから得られた抗血清を、特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗ＲＳＶ ＦＩｇＧ抗体力価の分析およびＲＳＶ特異的プラーク減少力価の分析を行った。免疫アフィニティー精製したＲＳＶ Ｆ蛋白（５０ｎｇ／ｍＬ）を塗布した ９６ウェルプレートおよび免疫血清の２倍連続血清希釈液を用いてＥＬＩＳＡを行った。アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を二次抗体として使用した。プラーク減少力価は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてＰｒｉｎｃｅら（引用文献１９）に従って決定した。免疫血清の４倍連続希釈液を ５０ｐｆｕのＲＳＶ長株（ＡＴＣＣ）と共に５％のＣＯ２存在下、培養温度 ３７℃で１時間培養し、混合物を用いてベロ細胞に感染させた。プラークを ８０％メタノールで固定し、５日後にマウス抗ＲＳＶ ＦモノクローナルＩｇＧ１抗体およびペルオキシダーゼ抱合ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州 Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を用いて展開した。ＲＳＶ特異的プラーク減少力価は、プラーク数において ６０％減少となる血清試料の希釈として定義した。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイは双方とも２回実施し、データは２回の測定平均を表した。
【００９３】
これらの試験結果を下記の表１２ に示す。血清抗体反応の誘導（表１２）に関しては、ｐ８２Ｍ３５Ｂは、使用されたＤＮＡ投与量および免疫化法の下で、心臓毒剤前処理の必要性無しで効果的であり、２回免疫化後 ７．２±１．１（ｌｏｇ２力価／１００）の抗Ｆ ＩｇＧ力価および １１．８±０．９（ｌｏｇ２）のＲＳＶ特異的プラーク減少力価となった。それに対し、心臓毒剤前処理無しでｐＸＬ２によって誘発された抗体力価はそれより有意に低かった（２．９±２．３ のＩｇＧ力価および ８．２±１．９ のプラーク減少力価）。しかし、ｐＸＬ２により誘発された血清抗体反応は、心臓毒剤前処理工程によって有意に改善した（７．４±１．１ のＩｇＧ力価および １０．５±０．８ のプラーク減少力価）。プラセボは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず検出し得る血清抗体反応を誘発することはできなかった。
【００９４】
この傾向は、防御試験の結果（表１２）に拡張させることができた。ベクターｐ８２Ｍ３５Ｂは心臓毒剤前処理無しで肺のＲＳＶ感染に対し完全防御を与えた。それに対し、ｐＸＬ２は同一条件で部分的な防御を与えるのみであった。しかし、免疫化法に心臓毒剤前処理工程を含めた場合はｐＸＬ２ベクターにより完全防御が達成された。プラセボでは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず防御は見られなかった。
【００９５】
これらの結果は、自己由来ＲＳＶ Ｆシグナルペプチドのコード化配列を５’ＵＴＲおよびＨＳＶＩｇＤのシグナルペプチドのコード化配列に置き換えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で評価されたＦ蛋白の発現／分泌（実施例８）における有意な増大のみならず、Ｆ蛋白に対する免疫原性、またマウスモデルで評価されたＲＳＶ感染に対する防御能力も増大することを示している。
【００９６】
（開示の概要）
本開示を要約すると、本発明は、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子を含むある一定の新規のベクター、このようなベクターを用いる免疫化法およびこのようなベクターを用いる診断法を提供する。本発明の範囲内での変更は可能である。
【００９７】
【表１】
0003602448.tif 000003
【００９８】
【表２】
0003602448.tif 000004
【００９９】
【表３】
0003602448.tif 000005
【０１００】
【表４】
0003602448.tif 000006
【０１０１】
【表５】
0003602448.tif 000007
【０１０２】
【表６】
0003602448.tif 000008
【０１０３】
【表７（ａ）】
0003602448.tif 000009
【０１０４】
【表７（ｂ）】
0003602448.tif 000010
【０１０５】
【表８】
0003602448.tif 000011
【０１０６】
【表９】
0003602448.tif 000012
【０１０７】
【表１０】
0003602448.tif 000013
【０１０８】
【表１１】
0003602448.tif 000014
【０１０９】
【表１２】
0003602448.tif 000015
【０１１０】
参考文献
【０１１１】
【表１３】
0003602448.tif 000016
【０１１２】
【表１４】
0003602448.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示す図である。
【図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ】自己由来のシグナルペプチド（ＳＰ）を有する呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白の膜付着形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：１）、およびそれによりコード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：２）を示す図である。
【図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ】自己由来のシグナルペプチド配列（ＳＰ）を有し、膜内外領域を欠如するＲＳＶ  Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：３）、およびそれによりコード化された膜内外領域を欠如する切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：４）を示す図である。
【図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ】膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１の構築を示す図である。
【図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ】膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列を含有するプラスミドｐＸＬ２の構築を示す図である。
【図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ】ＲＳＶ Ｆ蛋白の完全長の膜付着形をコード化する遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ３の構築を示す図である。
【図７】ＲＳＶ Ｆ蛋白の膜付着形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列を含有するプラスミドｐＸＬ４の構築を示す図である。
【図８】ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：５）に関するヌクレオチド配列を示す図である。
【図９】ＲＳＶチャレンジ後のＤＮＡ免疫化マウスにおける肺サイトカイン発現プロフィルを示す図である。
【図１０】膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンＩＩ配列およびシグナルペプチド配列ＨＳＶ ＩｇＤを含有するプラスミドｐ８２Ｍ３５Ｂの組み立てを示す図である。
【図１１】プラスミドＶＲ−１０１２ のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：６）を示す図である。
【図１２】ＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：７）および合成オリゴペプチドとして合成されたＨＳＶ ＩｇＤシグナルペプチド配列の誘導アミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ番号：８）配列を示す図である。
【図１】
0003602448.tif 000018
【図２Ａ】
0003602448.tif 000019
【図２Ｂ】
0003602448.tif 000020
【図２Ｃ】
0003602448.tif 000021
【図２Ｄ】
0003602448.tif 000022
【図２Ｅ】
0003602448.tif 000023
【図３Ａ】
0003602448.tif 000024
【図３Ｂ】
0003602448.tif 000025
【図３Ｃ】
0003602448.tif 000026
【図３Ｄ】
0003602448.tif 000027
【図４Ａ】
0003602448.tif 000028
【図４Ｂ】
0003602448.tif 000029
【図４Ｃ】
0003602448.tif 000030
【図４Ｄ】
0003602448.tif 000031
【図５Ａ】
0003602448.tif 000032
【図５Ｂ】
0003602448.tif 000033
【図５Ｃ】
0003602448.tif 000034
【図５Ｄ】
0003602448.tif 000035
【図６Ａ】
0003602448.tif 000036
【図６Ｂ】
0003602448.tif 000037
【図６Ｃ】
0003602448.tif 000038
【図６Ｄ】
0003602448.tif 000039
【図７Ａ】
0003602448.tif 000040
【図７Ｂ】
0003602448.tif 000041
【図７Ｃ】
0003602448.tif 000042
【図７Ｄ】
0003602448.tif 000043
【図８】
0003602448.tif 000044
【図９】
0003602448.tif 000045
【図１０】
0003602448.tif 000046
【図１１Ａ】
0003602448.tif 000047
【図１１Ｂ】
0003602448.tif 000048
【図１１Ｃ】
0003602448.tif 000049
【図１１Ｄ】
0003602448.tif 000050
【図１１Ｅ】
0003602448.tif 000051
【図１１Ｆ】
0003602448.tif 000052
【図１１Ｇ】
0003602448.tif 000053
【図１１Ｈ】
0003602448.tif 000054
【図１１Ｉ】
0003602448.tif 000055
【図１２】
0003602448.tif 000056