【手続補正書】
【提出日】平成29年9月26日(2017.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズ生殖系列形質転換体から作り出されたシュートを選択する方法であって、
ａ．ダイズ植物の細胞の集団を、導入遺伝子を用いて形質転換するステップであって、形質転換された細胞の前記集団が、形質転換された生殖系列細胞および形質転換された非生殖系列細胞を含むステップと、
ｂ．形質転換された細胞の前記集団からシュートを再生するステップと、
ｃ．形質転換された細胞の前記集団によって生成された前記シュートを単離するステップと、
ｄ．再生され単離された前記シュートを選択発根培地に付すステップであって、（ｉ）前記形質転換された生殖系列細胞によって生成された、再生され単離され付された前記シュートが、生存可能な根を作り出し、（ｉｉ）前記形質転換された非生殖系列細胞によって生成され、再生され単離され付された前記シュートが、生存可能な根を作り出さず、前記選択発根培地がグルホシネートを含む、ステップと、
ｅ．前記シュートが生存可能な根を作り出すか否かを検出することによって、ダイズ生殖系列形質転換体から作り出された前記シュートを選択するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換が、アグロバクテリウム形質転換、微粒子銃、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合形質転換、エレクトロポレーション形質転換、超音波形質転換、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション形質転換、裸のＤＮＡ形質転換、プラスミドベクター形質転換、ウイルスベクター形質転換、シリコンカーバイド媒介性形質転換、エアゾールビーミング形質転換またはＰＥＧ形質転換からなる群から選択される形質転換法を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ダイズ植物の細胞の前記集団が、ダイズ植物組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ダイズ植物組織が、Ｌ２／Ｌ３組織層またはＬ１組織層である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ２／Ｌ３組織層が、生殖系列細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌ１組織層が、非生殖系列細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ２／Ｌ３組織層が、成長点ダイズ植物組織、根ダイズ植物組織および維管束ダイズ植物組織からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌ１組織層が、表層ダイズ植物組織、基本ダイズ植物組織およびマントルダイズ植物組織からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記導入遺伝子が、少なくとも１種の遺伝子発現カセット内に含有される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現カセットが、選択マーカー遺伝子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択マーカー遺伝子が、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現カセットが、形質遺伝子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現カセットが、ＲＮＡｉ遺伝子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択発根培地が、２，４−Ｄをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択発根培地内の前記グルホシネート濃度が、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択発根培地中の前記グルホシネート濃度が、１．０ｍｇ／Ｌ〜１０．００ｍｇ／Ｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択発根培地中の前記グルホシネート濃度が、１．０ｍｇ／Ｌである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択発根培地が、基礎塩、ビタミン、ミネラルおよび炭素供給源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記基礎塩が、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５基礎塩、Ｓｃｈｅｎｋ＆Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ基礎塩、Ｗｈｉｔｅの基礎塩、Ｃｈｕ（Ｎ６）基礎塩、ＤＫＷ／Ｊｕｇｌａｎｓ基礎塩、ＨｏａｇｌａｎｄのＮｏ．２基礎塩、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ基礎塩およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記基礎塩が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ基礎塩である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ビタミンが、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５ビタミン、ＭＥＭビタミン、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇビタミン、Ｓｃｈｅｎｋ＆Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔビタミンおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ビタミンが、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５ビタミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸塩、ラクトース、グリセロールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記炭素供給源がスクロースである、請求項２３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は以下を提供する。
［１］ダイズ生殖系列形質転換体から作り出されたシュートを同定する方法であって、
ａ．ダイズ植物の細胞の集団を、導入遺伝子を用いて形質転換するステップであって、形質転換された細胞の上記集団が、形質転換された生殖系列細胞および形質転換された非生殖系列細胞を含むステップと、
ｂ．形質転換された細胞の上記集団からシュートを再生するステップと、
ｃ．形質転換された細胞の上記集団によって生成された上記シュートを単離するステップと、
ｄ．再生され単離された上記シュートを選択発根培地に付すステップであって、（ｉ）上記形質転換された生殖系列細胞によって生成された、再生され単離され付された上記シュートが、生存可能な根を作り出し、（ｉｉ）上記形質転換された非生殖系列細胞によって生成され、再生され単離され付された上記シュートが、生存可能な根を作り出さないステップと、
ｅ．上記シュートが生存可能な根を作り出すか否かを検出することによって、ダイズ生殖系列形質転換体から作り出された上記シュートを同定するステップとを含む、方法。
［２］上記形質転換が、アグロバクテリウム形質転換、微粒子銃、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合形質転換、エレクトロポレーション形質転換、超音波形質転換、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション形質転換、裸のＤＮＡ形質転換、プラスミドベクター形質転換、ウイルスベクター形質転換、シリコンカーバイド媒介性形質転換、エアゾールビーミング形質転換またはＰＥＧ形質転換からなる群から選択される形質転換法を使用する、上記［１］に記載の方法。
［３］ダイズ植物の細胞の上記集団が、ダイズ植物組織を含む、上記［１］に記載の方法。
［４］上記ダイズ植物組織が、Ｌ２／Ｌ３組織層またはＬ１組織層である、上記［３］に記載の方法。
［５］上記Ｌ２／Ｌ３組織層が、生殖系列細胞を含む、上記［４］に記載の方法。
［６］上記Ｌ１組織層が、非生殖系列細胞を含む、上記［４］に記載の方法。
［７］上記Ｌ２／Ｌ３組織層が、成長点ダイズ植物組織、根ダイズ植物組織および維管束ダイズ植物組織からなる群から選択される、上記［４］に記載の方法。
［８］上記Ｌ１組織層が、表層ダイズ植物組織、基本ダイズ植物組織およびマントルダイズ植物組織からなる群から選択される、上記［４］に記載の方法。
［９］上記導入遺伝子が、少なくとも１種の遺伝子発現カセット内に含有される、上記［１］に記載の方法。
［１０］上記遺伝子発現カセットが、選択マーカー遺伝子を含む、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記選択マーカー遺伝子が、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］上記遺伝子発現カセットが、形質遺伝子を含む、上記［９］に記載の方法。
［１３］上記遺伝子発現カセットが、ＲＮＡｉ遺伝子を含む、上記［９］に記載の方法。
［１４］上記選択発根培地が、グルホシネートまたは２，４−Ｄを含む、上記［１］に記載の方法。
［１５］上記選択発根培地内の上記グルホシネート濃度が、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌである、上記［１２］に記載の方法。
［１６］上記選択発根培地中の上記グルホシネート濃度が、１．０ｍｇ／Ｌ〜１０．００ｍｇ／Ｌである、上記［１２］に記載の方法。
［１７］上記選択発根培地中の上記グルホシネート濃度が、１．０ｍｇ／Ｌである、上記［１２］に記載の方法。
［１８］上記選択発根培地が、基礎塩、ビタミン、ミネラルおよび炭素供給源を含む、上記［１］に記載の方法。
［１９］上記基礎塩が、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５基礎塩、Ｓｃｈｅｎｋ＆Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ基礎塩、Ｗｈｉｔｅの基礎塩、Ｃｈｕ（Ｎ６）基礎塩、ＤＫＷ／Ｊｕｇｌａｎｓ基礎塩、ＨｏａｇｌａｎｄのＮｏ．２基礎塩、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ基礎塩およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］上記基礎塩が、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ基礎塩である、上記［１９］に記載の方法。
［２１］上記ビタミンが、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５ビタミン、ＭＥＭビタミン、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇビタミン、Ｓｃｈｅｎｋ＆Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔビタミンおよびそれらの組合せからなる群から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２２］上記ビタミンが、ＧａｍｂｏｒｇのＢ−５ビタミンである、上記［２１］に記載の方法。
［２３］上記炭素供給源が、グルコース、デキストロース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、グルクロン酸塩、ラクトース、グリセロールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２４］上記炭素供給源がスクロースである、上記［２３］に記載の方法。
ダイズ生殖系列形質転換体から作り出されたシュートを同定する方法が本明細書に開示される。一実施形態として、ダイズ植物の細胞の集団を、導入遺伝子を用いて形質転換する。その後の実施形態では、形質転換された細胞の集団を、シュートに再生する。さらなる実施形態では、シュートを細胞の集団から生成し、単離する。一実施形態では、シュートを、グルホシネートを含有する選択発根培地と接触させる。さらに別の実施形態では、再生され単離されたシュートをグルホシネートの存在下で培養し、形質転換された生殖系列細胞によって生成された、再生され単離されたシュートを、グルホシネートの存在下で生存可能な根を作り出し、形質転換された非生殖系列細胞によって生成された、再生され単離されたシュートは、グルホシネートの存在下で生存可能な根を作り出さない。その後の実施形態では、シュートが生存可能な根を作り出すか否かを検出することによって、ダイズ生殖系列形質転換体から作り出されたシュートを同定する。