【手続補正書】
【提出日】平成29年8月8日(2017.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼのターゲット部位を同定するための方法であって、
（ａ）二本鎖核酸ターゲット部位を切断するヌクレアーゼを提供し、ターゲット部位の切断が、５’リン酸部分を含む切断された核酸鎖をもたらすこと、
（ｂ）ヌクレアーゼのターゲット部位を含む候補核酸分子をヌクレアーゼが切断するのに好適な条件下で、候補核酸分子のライブラリーと（ａ）のヌクレアーゼを接触させること、ここで、各核酸分子は、候補ヌクレアーゼターゲット部位と定常挿入配列とを含む配列のコンカテマーを含む、および
（ｃ）ステップ（ｂ）においてヌクレアーゼによって切断された核酸鎖上の未切断のヌクレアーゼターゲット部位の配列を決定することによって、（ｂ）においてヌクレアーゼによって切断されたヌクレアーゼターゲット部位を同定すること、任意に、ここで、ヌクレアーゼが平滑末端を生じる、または、ここで、ヌクレアーゼが５’オーバーハングを生ずる、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）の決定することが、５’リン酸依存的なライゲーションによって、ステップ（ｂ）においてヌクレアーゼによって切断された核酸鎖の５’末端に最初の核酸アダプターをライゲーションすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸アダプターが二本鎖形態で提供される、任意に、ここで、５’リン酸依存的なライゲーションが平滑末端ライゲーションである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼによって切断された核酸鎖に最初の核酸アダプターをライゲーションする前に５’オーバーハングを埋めることを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）の決定することが、アダプターにハイブリダイゼーションするＰＣＲプライマーおよび定常挿入配列にハイブリダイゼーションするＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ反応によって、未切断のターゲット部位を含むヌクレアーゼによって切断されたコンカテマーの断片を増幅することをさらに含む、任意に、ここで、単一の未切断のターゲット配列を含む分子について、増幅された核酸分子を濃縮することをさらに含む、任意に、ここで、濃縮することがサイズ分画を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）の決定することが、ステップ（ｂ）においてヌクレアーゼによって切断された核酸鎖またはＰＣＲによって得られたそのコピーをシーケンシングすることを含む、および／または、
候補核酸分子のライブラリーが、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２個の異なる候補ヌクレアーゼ切断部位を含む、および／または、
ヌクレアーゼが、疾患と関連した遺伝子内の特異的なヌクレアーゼターゲット部位を切断する治療用ヌクレアーゼである、任意に、ここで、治療用ヌクレアーゼが、特異的なヌクレアーゼターゲット部位を切断し、かつ１０よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、５よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、４よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、３よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、２よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、１よりも多くの追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断せず、または全く追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定することをさらに含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）のヌクレアーゼが、ＲＮＡ分子との複合体を形成するＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼであり、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体が、ＲＮＡ分子の配列に相補的な核酸配列に特異的に結合する、任意に、ここで、ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ分子がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、任意に、ここで、ｓｇＲＮＡが、ターゲット配列に相補的である１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼターゲット部位が［ｓｇＲＮＡ相補配列］−［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）］構造を含み、ヌクレアーゼがｓｇＲＮＡ相補配列内でターゲット部位を切断する、任意に、ここで、ｓｇＲＮＡ相補配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレアーゼが非特異的核酸切断ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレアーゼが、切断ドメイン二量体化時にターゲット配列を切断する核酸切断ドメインを含む、および／または、ヌクレアーゼが、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む、任意に、ここで、ヌクレアーゼがＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
結合ドメインがジンクフィンガーを含む、任意に、ここで、結合ドメインが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
結合ドメインが転写活性化因子様エレメントを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）が、ヌクレアーゼによって切断された核酸鎖上の無傷のヌクレアーゼターゲット部位の直接的なシングルエンドシーケンシングによって、ヌクレアーゼによるヌクレアーゼターゲット部位を同定することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
定常挿入配列が１０〜１００ヌクレオチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
複数個の核酸分子を含む核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼターゲット部位および１０〜１００ヌクレオチドの定常挿入配列を含む配列のコンカテマーを含む、任意に、ここで、候補ヌクレアーゼターゲット部位が、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によって切断され得る部位である、任意に、ここで、候補ヌクレアーゼターゲット部位がＣａｓ９ヌクレアーゼによって切断され得る、前記ライブラリー。
【請求項１７】
候補ヌクレアーゼターゲット部位が、［ｓｇＲＮＡ相補配列］−［ＰＡＭ］構造を含むＣａｓ９ヌクレアーゼターゲット部位であり、ｓｇＲＮＡ相補配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
複数個のヌクレアーゼからコンセンサスターゲット部位を特異的に切断するヌクレアーゼを選択する方法であって、
（ａ）同じコンセンサス配列を切断する複数個の候補ヌクレアーゼを提供すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法を用いて、コンセンサスターゲット部位とは異なる候補ヌクレアーゼによって切断されたヌクレアーゼターゲット部位を同定すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたヌクレアーゼターゲット部位（単数または複数）に基づいてヌクレアーゼを選択すること、
を含む、
前記方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）において選択されたヌクレアーゼが、最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断するヌクレアーゼである、任意に、ここで、
（ｉ）最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断するヌクレアーゼが、コンセンサス部位とは異なる最低数のターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼである、または
（ｉｉ）最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼが、ターゲットゲノムの文脈中で、コンセンサス部位とは異なる最低数のターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼである、および／または、候補ヌクレアーゼが、コンセンサスターゲット部位以外のいずれのターゲット部位も切断しないヌクレアーゼである、任意に、ここで、ステップ（ｃ）において選択された候補ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼの治療有効濃度で対象のゲノム中のコンセンサスターゲット部位以外のいずれのターゲット部位も切断しないヌクレアーゼである、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）において選択されたヌクレアーゼとゲノムをインビトロで接触させることをさらに含む、任意に、ここで、ゲノムが、脊椎動物、哺乳類、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである、および／または、
ここで、ゲノムが任意に生細胞内にある、任意に、ここで、ゲノムが対象内にある、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
コンセンサスターゲット部位が、疾患または障害と関連したアレル内にある、任意に、ここで、（ｉ）コンセンサスターゲット部位の切断が、疾患または障害の処置または予防をもたらす、または（ｉｉ）コンセンサスターゲット部位の切断が、疾患または障害の症状の緩和をもたらす、
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳであり、および、アレルが任意にＣＣＲ５アレルであるか、または、疾患が増殖性疾患であり、および、アレルが任意にＶＥＧＦＡアレルである、請求項２１に記載の方法。