【手続補正書】
【提出日】平成29年4月7日(2017.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に両凹型円板形状を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層状シェル及びペイロードを含み、
前記二層状シェルは、親水性外層、親水性内層、及び前記層間に疎水性領域を有し、
前記両親媒性ポリマーは、脂質に結合するアミン含有分岐ポリマーを含み、
前記ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記シェルの前記親水性外層を含む前記両親媒性ポリマーは、前記粒子が、約−１５ｍＶ〜約＋１５ｍＶのゼータ電位を有するように、ポリエチレングリコールから誘導体化される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであって、前記ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記酸素運搬剤は、合成ヘモグロビンまたは天然ヘモグロビンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記アロステリック調節因子は、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、及び２−［４−［［（３，５−ジメチルアニリノカルボニル］メチル］−フェノキシ］−２−メチルプロピオン酸からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記還元剤は、ロイコメチレンブルー、グルタチオン及びアスコルビン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、約３０００〜約１０，０００のヘモグロビン分子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンまたは約３０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記ナノ粒子は、実質的に、一酸化窒素を隔離することはない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中のヘモグロビン全濃度の約１０％以下まで酸化を制限する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記分岐アミン含有ポリマーはポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマー及びグラフト重合ポリマーからなる群から選択さる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記脂質は脂肪酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記脂肪酸は、１０，１２−ペンタコサジイン酸、ヘキサデシルオクタデカン酸、コラン酸、リノール酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸及びパルミチン酸からなる群から選択される、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
ナノ粒子の調製方法であって、前記ナノ粒子は、実質的に両凹型円板状を有し、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマーを含む二層状シェル並びに酸素運搬剤、前記アロステリック調節因子及び前記還元剤を含むペイロードを含有し、前記方法は、
（ａ）脂質を分岐ポリマーの前記遊離反応性基の少なくとも２５％に共有結合より共役することによって、前記分岐ポリマーを疎水的修飾し、両親媒性ポリマーを形成すること；
（ｂ）前記両親媒性ポリマーを非極性溶媒と混合すること、及び前記混合物を攪拌して、前記両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成すること；
（ｃ）前記ペイロードを極性溶媒と混合すること、及び前記ペイロード混合物を（ｂ）の前記混合物に添加して、二相混合物を形成すること、及び前記二相混合物を攪拌し、前記ペイロードを前記反転ミセルに移行すること；
（ｄ）熱及び水性溶媒の存在下において前記ペイロード含有前記反転ミセルを攪拌して、前記ペイロード含有前記両凹型円板状ナノ粒子を形成すること；
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記ペイロードは、前記ナノ粒子の前記内部に含有される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、血液代用組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、溶液または凍結乾燥粉末である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、対象者の血液の酸素運搬能力を補充するための医薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
したがって、一態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。両親媒性ポリマーは、脂質に共役結合する分岐ポリマーを含み得る。両親媒性含ポリマー有シェル外層の表面は、ポリエチレングリコールにより誘導体化されていてもよい。ナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。両親媒性ポリマーは、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸にポリエチレンイミン共役結合する分岐ポリマーを含んでいてもよい。また、両親媒性ポリマーは、パルミチン酸に共役結合するポリエチレンイミンを含んでいてもよい。酸素運搬剤は、ヘモグロビンであってもよい。アロステリック調節因子は、２，３−ＤＰＧであってもよい。還元剤は、ロイコメチレンブルーであってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含んでもよい。ナノ粒子は、凍結乾燥することができてもよく、また、長期間、周囲条件にて保存され得る。凍結乾燥ナノ粒子は、投与前に、種々の濃度で水性緩衝液中において再構成されてもよい。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
別の態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子の調製方法を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。この方法は、脂質をポリマーの遊離反応基に共有結合によって連結することによって、分岐ポリマーに疎水的修飾を行い、両親媒性ポリマーを形成することを含む。次に、両親媒性ポリマーは、非極性溶媒と混合させる。混合物は、攪拌して、両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成する。次に、反転ミセルを熱及び水性溶媒の存在下で攪拌し、両凹型円板状のナノ粒子を形成する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に添加し、その混合物を攪拌して、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に負荷する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の水性内側コア部内に含有されていてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
別の態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子の調製方法を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。この方法は、脂質をポリマーの遊離反応基に共有結合によって連結することによって、分岐ポリマーに疎水的修飾を行い、両親媒性ポリマーを形成することを含む。次に、両親媒性ポリマーは、非極性溶媒と混合させる。混合物は、攪拌して、両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成させる。次に、反転ミセルを熱及び水性溶媒の存在下で攪拌し、両凹型円板状のナノ粒子を形成させる。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に添加し、その混合物を攪拌して、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に負荷する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の水性内側コア部内に含有されていてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
別の態様では、本開示は、対象の血液の酸素運搬能力を補充する方法を提供する。本方法は、対象に有効量の酸素運搬ナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。症候性貧血または出血を伴う対象に投与するとき、投与されたナノ粒子は、肺からの潅流中、Ｏ２を捕捉し、その後、全身潅流中にＯ２を組織に送達させる。以下の主要なナノ粒子デザイン特性により、ナノ粒子による組織へのＯ２の送達が可能になる：（１）ナノ粒子シェルにより、酸素運搬剤（例えば、ヘモグロビン、改質ヘモグロビン、レグヘモグロビン、ヘミンまたはその他）による一酸化窒素の捕獲が阻止され、通常、Ｏ２の送達が不足している領域まで、血流が経由する内因性シグナル伝達が可能になる。（２）ナノ粒子ペイロードは、ヘテロトロピックアロステリック調節因子分子（例えば、２，３−ＤＰＧまたはその他）を含有し、肺潅流中、アロステリック調節因子は内側シェルに隔離され（高ｐＨにて。それによって酸素運搬剤のＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、アロステリック調節因子酸素運搬剤は、内側シェルから放出される（低ｐＨにて。それによって酸素運搬剤のＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、酸素運搬剤のＯ２親和性が変化し；粒子コア中におけるアロステリック調節因子の遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節される。生理学的必要性の設定［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。（３）ナノ粒子ペイロードは、酸化した酸素運搬剤を再循環させる還元剤（例えば、ロイコメチレンブルー、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｉｎｅ）、アスコルビン酸塩またはその他）を含有し、効果的にナノ粒子の循環時間を延長させる。それによって、ナノ粒子は、正常／異常な生理学（例えば、ヒトにおいて、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体にわたり、潅流中、効率よく、Ｏ２を放出させる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
別の態様では、本開示は、対象の血液の酸素運搬能力を補充する方法を提供する。本方法は、対象に有効量の酸素運搬ナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性内部コア部及び両親媒性ポリマー含有親水性外シェルを含む。また、ナノ粒子は、ヘモグロビンまたは合成ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧ及びロイコメチレンブルーも含む。症候性貧血または出血を伴う対象に投与するとき、投与されたナノ粒子は、肺からの潅流中、Ｏ２を捕捉し、その後、全身潅流中にＯ２を組織に送達させる。以下の主要なナノ粒子デザイン特性により、ナノ粒子による組織へのＯ２の送達が可能になる：（１）ナノ粒子シェルにより、ヘモグロビンまたは合成ヘモグロビンによる一酸化窒素の捕獲が阻止され、通常、Ｏ２の送達が不足している領域まで、血流が経由する内因性シグナル伝達が可能になる。（２）ナノ粒子ペイロードは、２，３−ＤＰＧを含有し、肺潅流中、２，３，−ＤＰＧは内側シェルに隔離され（高ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、２，３−ＤＰＧは、内側シェルから放出される（低ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、ＨｂＯ２親和性が変化し；ナノ粒子コア中での２，３−ＤＰＧの遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節される。生理学的必要性の設定値［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。（３）ナノ粒子ペイロードは、酸化Ｈｂを再利用するロイコメチレンブルーを含有し、ナノ粒子の有効循環時間を延長させる。それによって、ナノ粒子は、正常／異常な生理学（例えば、ヒトにおいて、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体にわたって、潅流中、効率よく、Ｏ２を放出させる。
出願書類には、少なくとも１枚のカラー写真を含む。カラー写真と共に本明細書公報の写しは、必要に応じて、必要な手数料の支払い時に、特許商標庁によって提供される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】ヘモグロビン含有ナノ粒子の調製及び種々の特性を示す図である。（Ａ）ナノ粒子の調製の略図及びナノ粒子の略図である。（Ｂ）ナノ粒子の調製におけるナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｃ）時間の経過に伴う様々な凍結乾燥ナノ粒子径及び非凍結乾燥ナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｄ）ニッケルグリッド上に堆積させたナノ粒子滴の透過型電子顕微鏡画像である。（Ｅ）Ｄにおけるナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像の方形化部分の拡大図である。（Ｆ）ナノ粒子の原子間力顕微鏡画像である。
【図２】ｐＨ１０（濃青色曲線）、ｐＨ９（緑色の曲線）、ｐＨ８．５（マゼンタ色の曲線）、ｐＨ８（薄青色の曲線）及びｐＨ６（赤色の曲線）にて計測されたナノ粒子の酸素結合−分離曲線を示す図である。（Ａ）ロイコベンジルメチレンブルーで標識した酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｂ）約５日間保管後の（Ａ）の酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｃ）非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｄ）約５日間保管後の（Ｃ）の非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。
【図３】ナノ粒子のレオロジー特性（Ａ）及び薬物動態学特性（Ｂ）示すグラフである。（Ａ）ナノ粒子：少なくとも１０％トルク（ウエルズ−ブルックフィールド・コーン／プレート型粘度計）に相当するデータポイントを使用して、血漿懸濁液対ＮＺＷ（ウサギ）血漿の体積比１：９及び１：１０について、３７．１℃で試験を行った。せん断速度に対する粘度のプロットにより、ナノ粒子は、血漿粘度にいかなる影響も及ぼさないことが明らかになった。（Ｂ）ナノ粒子ヘモグロビンは、９９ｍＴｃトレーサー投与量（５０μＣｉ／ｋｇ）により放射線標識し、ラット（ｎ＝３）に投与した。ヘパリン化マイクロキャピラリーチューブに投与後、０分、５分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分の時点で血液サンプルを取り、密封して、マイクロシリンジ内に入れたアリコート１０μｌをプラスチックチューブに入れ、キャップを付け、オートウェルガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｚａｒｄ３）を使用してカウントした。所見から、こうした特定の粒径範囲のナノ粒子にとって典型的な二項指数クリアランスが判明する。
【図４】表２に記載されている４つの異なるナノ粒子配合物のＮＯ隔離アッセイの代表的なトレースを図示する。差し込み図では、サンプルＦ−３を除き、その他の応答のより鮮明な画像が得られる。サンプル注入は、ヘムと等モルであり、データが正規化され、重複してもよい。
【図５】ＲＢＣ、無細胞Ｈｂ及び２つの異なるナノ粒子製剤Ｆ−３及びＦ−４のＮＯ隔離アッセイの代表的トレースを図示する（表２を参照されたい）。サンプルは、ヘムと等モルである。データが正規化され、重複し得る。挿入：各サンプルの初期隔離速度（データの最初の１０秒までにフィットさせる傾向線）。
【図６】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）について、除去されたすべてのＮＯを示す棒グラフである。曲線下面積（ＡＵＣ）は、隔離された全ＮＯを表す。いずれのサンプルも、ヘムと等モルである。＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。ナノ粒子配合物は、いずれも、ＲＢＣサンプル及びＨｂサンプルとは異なる。
【図７】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して、４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）のＮＯ隔離速度を示す棒グラフである。ＮＯ除去の初期速度は、サンプル投与後の最初の１分までのデータに対して、トレッド（ｔｒｅａｄ）線のフィッティングにより計算した：＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。無細胞Ｈｂにより、無処置ＲＢＣよりも、ＮＯがさらに活発に隔離され（周知のとおり）、すべてのナノ粒子配合において、ＮＯの隔離は、ＲＢＣより少ない。ただし、Ｆ−３（ＲＢＣと当量）は除く。
【図８】全身及び組織のＨＩＦレベルがＨＩＦ−α（ＯＤＤ）中の［Ｈｂ］の関数に応じて変化することを示すグラフ及び画像である（ルシフェラーゼマウス）。（Ａ−Ｂ）全身ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルは、希釈性貧血症中において有意に増加した。（Ａ）は、ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルを図示し、（Ｂ）は、動物の全身を示す画像である。（Ｃ〜Ｅ）類似の方法で組織特異的ＨＩＦ−ルシフェラーゼルミネセンスを変更して行った；脳（Ｃ）、腎臓（Ｄ）及び肝臓（Ｅ）。（Ｆ〜Ｇ）（Ｃ〜Ｅ）と同様に、ウェスタンブロット法による脳ＨＩＦ−１αタンパク質発現の測定結果であり、血液希釈が比例的に増大している。（Ｆ）は、ＨＩＦ−αと対照（α−チュブリン）とのウェスタンブロットイメージを示し、；（Ｇ）では、ＨＩＦ−αタンパク質のレベルを図示する。（Ｈ〜Ｊ）同様に、選択されたＨＩＦ−依存性ｍＲＮＡレベルも同様に上昇している：（Ｈ）ＧＬＵＴ１、（Ｉ）ＰＤＫ１、（Ｊ）ＭＣＴ４。（Ｋ−Ｌ）Ｈｂレベルと動物全身のＨＩＦルシフェラーゼとの関係を示す画像及びグラフを示す。具体的には、貧血が発現しているかまたは貧血から回復している間のＨＩＦルシフェラーゼシグナルは、Ｈｂと逆相関している。（Ｋ）全身の画像及び（Ｌ）正規化全身放射輝度（左ｙ軸）またはヘモグロビン濃度（右ｙ軸）対貧血（ｘ軸）。ＮＢ：急性血液希釈中の脳ｐＯ２のペア測定結果（リン光クエンチによる）は、［Ｈｂ］と相関し、解析、ＨＩＦ発現傾向の分析を確認する。以下の（［Ｈｂ］（ｇ／Ｌ）＆ｐＯ２（ｍｍＨｇ）（平均±標準偏差））、Ｎは、８匹（マウス）の測定値である：Ｈｂ  １２５．１±８．３−＞ｐＯ２  ６５．０±８．３；Ｈｂ  ８８．３±５．４−＞ｐＯ２  ５６．４±９．５；Ｈｂ  ７２．５±７．４−＞ｐＯ２  ５２．１±１０．３；Ｈｂ  ５２．４±３．９−＞ｐＯ２  ４０．６±６．８。
【図９】は、げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を示すグラフを示す。グラフ（Ａ）及び（Ｂ）は、脱血による、予測されるＡＶＯ２差の顕著な増大（２４〜６７％へ増大）を示し、（Ａ）では、生理食塩水による蘇生後、その状態が持続し、また、（Ｂ）では、血液代用剤により蘇生後、溶解する（６７〜３１％で正規化）。（Ｃ）いずれかの蘇生流体（生理食塩水＝ＮＳ、ナノ粒子溶液＝ＮＰ）により得られた血流力学的効果の差が観察されなかったのは、血圧の回復に加えて、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、改善されたＯ２含量によるものであることが示唆される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ｉｖ．酸素運搬ナノ粒子の調節
本開示のナノ粒子の重要な特徴は、粒子Ｏ２親和性と組織の呼吸との間の生理的連結である。当該技術分野において公知の従来の血液代用剤では、人工Ｏ２含有量が増加すると、これらの血液代用剤による適切なＯ２の放出（すなわち、生理学的Ｏ２解離曲線に沿って）は、ＨｂからＯ２親和性の正常なアロステリック制御の欠如によりインビボで稀に得られる（ｐ５０として表される、Ｏ２（ＳＨｂＯ２）のヘモグロビン飽和ｐＯ２は５０％である）。本発明では、革新的デザインのアロステリック調節因子シャトル式リザーバによりこの問題を解決する。ナノ粒子の構造がその機能に与える影響を示すために、例示的酸素運搬剤として、ヘモグロビン、例示的なアロステリック調節因子として２，３−ＤＰＧ、及び例示的分岐ポリマーとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含有する粒子を検討する。ナノ粒子ペイロードは、ヘテロトロピックアロステリック調節因子分子（２，３−ＤＰＧ）を含有し、肺潅流中、２，３，−ＤＰＧはシェルに隔離され（高ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、２，３−ＤＰＧは、シェルから放出される（低ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、ＨｂＯ２親和性が変化し；粒子コア中での２，３−ＤＰＧの遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節する。生理学的必要性の設定値［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。肺において循環性移行が完了し（または低酸素症が軽減するとき）、ｐＨが上昇すると、２，３−ＤＰＧは、ますますシェルと再適合し、それによって：１）肺中でのＯ２の負荷を促進させる及び２）組織Ｏ２負荷及びその分解物にｐ５０を結び付ける。こうした生理学的応答性アロステリック調節因子リザーバ−シャトルにより、本開示の酸素運搬ナノ粒子をすべての酸素運搬ヘモグロビンと区別することが重要である。更に、本開示の酸素運搬ナノ粒子のデザインにより、このシャトルの態様をさらに洗練させるか、または「調整」することができ、これによりナノ粒子デザインを臨床状況に適合させる能力が付与される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
また、ナノ粒子は、ＮＯ除去を制限するために、調整されてもよい。ＮＯは、哺乳類において重要な細胞内シグナル伝達分子であり、多くの生理学的工程及び病理学的工程に関与する。加えて、ＮＯは、強力な血管拡張薬である。ヘモグロビンは、酸素に対するヘモグロビンの結合活性と平行する結合活性を有するＮＯに結合する。制御しない状態で、ヘモグロビン系酸素担体は、ＮＯを隔離することができ、血管収縮をもたらし得る。ＮＯ除去を制限するための本開示の酸素運搬ナノ粒子の調整方法としては、酸素及びＮＯに曝露したナノ粒子の表面積を増大するか、または減少させるためにナノ粒子の形態を調整すること、ナノ粒子へのＮＯ拡散を制御するためにナノ粒子の外シェルを調整すること、全粒子径を調整すること、ペイロード密度を調整すること、またはこれらを組み合わせたものを挙げることもできる。当業者は、ナノ粒子を調整して、ナノ粒子中へのＮＯの拡散を制限することができるが、酸素運搬のための酸素拡散が可能であることは、理解されよう。例えば、外層の架橋程度を変更して、ナノ粒子によるＮＯ隔離範囲及び速度を調節することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
（ｈ）好ましい実施形態
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約２５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約２５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。 
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、ＭＷは１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上であってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約５０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上のＭＷを有していてもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、ニ官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上のＭＷを有していてもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
ＩＩ．酸素運搬ナノ粒子調製方法
本開示の別の態様は、自己組織化された、実質的に凹部円板状であるナノ粒子集団の調製方法である。概して、方法は、両親媒性ポリマーを形成すること；非極性溶媒中に両親媒性ポリマーを含む複数個の反転ミセルを形成すること；極性溶媒中に酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを懸濁すること；及びペイロードを攪拌によって反転ミセルを含む有機層に移行すること；及び反転ミセル自己組織化して、実質的に、両凹型円板状ナノ粒子とすることを含む。ナノ粒子は、ＰＥＧ化されていてもよい。あるいは、ナノ粒子は、架橋されていてもよい。更に別の代替形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ化及び架橋されていてもよい。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
（ａ）両親媒性ポリマーの形成
本開示の粒子調製方法は、一部、両親媒性ポリマーを形成することを含む。概して、方法には、共有結合により両親媒性脂質が分岐ポリマーに共役された疎水的修飾された分岐ポリマーを含む。好適な分岐ポリマー及び両親媒性脂質は、上記セクションＩに詳細に記載されている。上記のように、分岐ポリマーは、遊離反応性基を含む。遊離反応性基は、アミン基であってもよい。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（ｂ）複数個の反転ミセルの形成
ナノ粒子の調製方法は、更に、一部、複数個の反転ミセルを形成することを含む。概して、上記セクションＩＩ（ａ）の両親媒性ポリマーと非極性溶媒との混合物の攪拌によって、単分子反転ミセル（すなわち、逆ミセル）が形成される。典型的には、非極性溶媒中の両親媒性ポリマーの濃度は、約１０−７〜約１０−５Ｍである。一般に、両親媒性ポリマーの濃度は、約１０−６Ｍである。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
（ｄ）両凹型円板状ナノ粒子の自己組織化
上記セクションＩＩ（ｃ）において、ペイロードを含有する複数の反転ミセル形成後、本開示の方法は、反転ミセルの実質的に両凹型円板状ナノ粒子への自己組織化を含む。概して、方法には、熱及び溶媒系の存在下において、反転ミセルを攪拌することを含む。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
組成物は、配合され、患者の血液の酸素運搬能力を補充する幾つかの異なる手段によって、対象に投与されてもよい。このような組成物は、一般に、所望の場合、従来の無毒性医薬上許容可能な担体、アジュバント、賦形剤及びビヒクルを含む製剤を、血管内投与形態で投与され得る。