(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の特性を有する骨芽細胞増殖促進および骨強化因子。
(1) 乳清由来であること
(2) 乳清および／または乳清由来の蛋白水溶液を、1) 分画分子量3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させる工程、2) 80℃10分間の加熱をして沈殿を生じさせ、上澄み液を採取する工程、3) pH1.5〜3.5で食塩の最終濃度を0.2Ｍ以上にして沈殿を生じさせ、この沈殿の水溶性画分を採取する工程、の全てを行って得ることができる水溶性画分に存在すること
(3) 分子量5,000〜28,000ダルトン(SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）の範囲にあること
(4) 等電点4〜9の範囲にあること
【請求項２】
請求項１に記載される骨芽細胞増殖促進、骨強化因子を含有せしめてなる骨強化のための医薬品。
【請求項３】
請求項１に記載される骨芽細胞増殖促進、骨強化因子を含有せしめてなる骨強化作用を有する飲食品または飼料
【請求項４】
乳清タンパク濃縮物の水溶液を、1)分画分子量3万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させる工程、2)80℃10分間の加熱をして沈殿を生じさせ、上澄み液を採取する工程、3)pH1.5〜3.5で食塩の最終濃度を0.2Ｍ以上にして沈殿を生じさせ、この沈殿の水溶性画分を採取する工程、の全てを行うことを特徴とする骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、乳清由来の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子及びその製造法に関する。本発明の因子は、飲食品、医薬、動物飼料にその原料として加えて骨を強化し骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折及び腰痛等の各種骨疾患の患者が増加している。その原因は次の様に解明されている。
骨組織においては、たえず骨の生成と分解吸収が営まれており若い時には骨生成と分解吸収のバランスがとれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが分解吸収に傾く（アンカップリングと呼ぶ）。このアンカップリングが長年にわたって続くと骨組織がもろくなって前記の疾患を生じるとされる。従ってアンカップリングを防ぐことができれば骨粗鬆症、骨折、腰痛等を予防できることは判っている。
従来よりアンカップリングを防ぎ各種骨疾患の予防および治療の方法として
１）食事によるカルシウムの補給、２）軽い運動、３）日光浴、４）薬物療法、の４種類が行われてきた。食事によるカルシウムの補給には炭酸カルシウム及び燐酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻及び魚骨粉等の天然カルシウム剤が使われている。食品及び食品素材のこれまでの使用目的は全てカルシウムの補給である。次に軽い運動についてはゲートボールや３０分程の散歩等が良いとされているが、体が弱ってくると軽い運動もやっかいなものである。まして寝たきり老人になるとほとんど運動ができなくなる。
３番目の日光浴はビタミンＤ３の補給という点で良いとされているがこれだけでは不充分である。最後の薬物療法には１α−ヒドロキシビタミンＤ３、カルシトニン製剤等が知られ、骨強化作用があるとされている。しかしこれらは、化学物質を有効成分とする医薬品そのものであって、食品素材として安全にしかも長期的にマイルドな条件で摂取して骨を強化できる物質ではない。
このように食品素材に長期的にマイルドに安全に使われる骨強化作用を有する物質についてその効力が確立されているものはまだ知られていない。
【０００３】
本発明者らはこのような物質を得るために乳清蛋白中の骨強化因子の探索を続けてきた。すなわち、乳、特に乳清の蛋白質画分を分画し、その画分から骨を強化することのできる骨芽細胞増殖促進・骨強化画分を得ようと試みた。その結果、乳清蛋白の水溶性画分から、逆浸透（ＲＯ）膜または電気透析（ＥＤ）等により乳清由来の塩を除いた蛋白及びペプチド混合物に骨を強化する作用があることを見いだした（特開平４−１８３３７１号公報参照）。
さらに本発明者らは、この乳清蛋白及びペプチド混合物（以下、乳清蛋白という）中の骨強化因子の分画を試みた結果、エタノールで沈澱する画分、特にその水溶性成分に骨芽細胞増殖因子及び骨強化因子が存在することを見いだした（特開平５−１７６７１５号公報参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような乳清蛋白の分画の確立を続行し、さらに分画した、別の面からみればより物性値が明らかになった画分に骨芽細胞増殖促進・骨強化因子があることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
従って、本発明の課題は、乳、特に乳清から骨強化作用を有する画分を分離抽出し、骨芽細胞増殖促進・骨強化因子を提供することにある。さらに、本発明の課題は、このような因子を食品、医薬、飼料に添加して骨を強化することのできる食品、医薬及び飼料を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、乳清蛋白の分画を前記のようにさらに試みたところ、次の画分に骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子が存在することを見出した。
すなわち、本発明は、次の特性を有する骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子に関する。
【０００６】
（１）  乳清由来であること
（２）  乳清および／または乳清由来の蛋白水溶液を、１）  分画分子量３万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させる工程、２）８０℃１０分間の加熱をして沈澱を生じさせ、上澄み液を採取する工程、３）  ｐＨ１．５〜３．５で食塩の最終濃度を０．２Ｍ以上にして沈澱を生じさせ、この沈澱の水溶性画分を採取する工程、の全てを行って得ることができる水溶性画分に存在すること
（３）  分子量  ５，０００〜２８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電  気泳動法による）の範囲にあること
（４）  等電点４〜９の範囲にあること
【０００７】
前記に記載される骨芽細胞増殖促進、骨強化因子を含有せしめてなる骨強化作用を有する飲食品、医薬品及び飼料。
【０００８】
乳清タンパク濃縮物の水溶液を  １）分画分子量３万以上の限外濾過膜で限外濾過して透過させる工程、２）８０℃１０分間の加熱をして沈澱を生じさせ、上澄み液を採取する工程、３）ｐＨ１．５〜３．５で食塩の最終濃度を０．２Ｍ以上にして沈澱を生じさせ、この沈澱の水溶性画分を採取する工程、の全てを行うことを特徴とする骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子の製造法。
【０００９】
本発明の骨芽細胞増殖促進および骨強化因子を製造するには、乳原料、特に乳清または乳清蛋白の水溶液を８０℃で１０分間加熱させて生ずる沈澱を除き、得られる上清を分画分子量３０，０００以上の限外濾過膜その他の膜で処理して透過する画分を採取する。あるいは乳清または乳清蛋白質を酸性、特にｐＨ１．５  〜３．５  にしてさらに食塩の最終濃度を０．２Ｍ以上とすることによって沈澱を生じさせ、この沈澱の水溶性画分を採取し、これを分画分子量３万以上の限外濾過膜その他の膜で処理して透過する画分を採取する。または、乳清蛋白水溶液を分画分子量３万以上の限外濾過膜で処理して透過した画分を取り、これを加熱または食塩処理を行って採取する。得られる画分は、分子量  ５，０００〜２８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）等電点４〜９の画分となっている。
このような画分は、後で実施例に示すように骨芽細胞増殖促進及び骨強化活性を有する。
【００１０】
さらに、本発明は、このようにして得られた骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子を含有せしめた食品、医薬及び飼料に関する。
【００１１】
本発明の骨芽細胞増殖及び骨強化因子の原料は乳が用いられる。
このような乳としては牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の新鮮乳、粉乳、脱脂乳、還元乳等が挙げられる。そして、これらの乳から乳清（ホエー）を得、それから蛋白を採取した乳清蛋白を用いることが望ましい。
乳清は、乳または脱脂乳に酸を加えるかまたは、レンネットを作用させて生じる凝固物を取り除いた透明な黄緑色の液体であって、チーズまたはカゼイン製造の副産物として通常得られている。また、乳清蛋白は、この乳清を限外濾過、逆浸透法、クロマトグラフィー、透析等によって処理することによって得られる蛋白で、このなかには、乳糖を除去し蛋白含有量を高めた乳清蛋白濃縮物も包含される。また蛋白はペプチドであってもよい。また、蛋白を蛋白分解酵素で分解したものであってもよい。
【００１２】
本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は、このような乳清または乳清蛋白の水溶液を８０℃で１０分間熱処理することによって生ずる沈澱を除き、上清中に含有されている。またｐＨ１．５  〜３．５  に調整して、さらに食塩の最終濃度を０．２Ｍ以上にすることによって沈澱を生じさせ、この沈澱の水溶性画分中にも含有されている。
【００１３】
本発明者らは、この乳清及び乳清蛋白を熱処理し、その熱安定性を調べた。その結果８０℃１０分の処理では、骨芽細胞増殖促進活性・骨強化活性は何等影響を受けることがなかった。さらに９０℃において約８５％の骨芽細胞増殖促進活性が残存し、９５℃においても約７０％の骨芽細胞増殖促進活性が残存した。この熱安定性の性質を用いることにより、乳清中の他の成分から骨芽細胞増殖促進活性・骨強化因子を分離することができる。すなわち、熱安定性の悪い成分は熱処理を行うことによって沈澱として除去できる。この熱処理時のｐＨは３．５  〜７．０  が効率よく両者を分画できるｐＨである。
本発明における食塩処理は、ｐＨ１．５  〜ｐＨ３．５  で行うと有効である。食塩による分画は各ｐＨで沈澱形成に差があるが、ｐＨ３．０  〜ｐＨ３．５  の時食塩の最終濃度が０．２Ｍ以上で沈澱する。
また、この食塩処理は、他のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、リン酸塩、２価金属塩、などでも最適ｐＨ、濃度は食塩とは異なるものの代用できる。
【００１４】
また、本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は、限外濾過においては分画分子量３万以上の限外濾過膜を透過することが判った。通常この水溶性画分は、凍結乾燥して粉末にする。この水溶性画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると分子量５，０００  〜２８，０００の範囲内に主要なバンドがみられた。
また、得られた沈澱画分をペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素で限定分解し、蛋白分解酵素限定分解物としても骨芽細胞増殖促進および骨強化因子は残存した。
【００１５】
本発明では、このような骨芽細胞増殖促進・骨強化因子を飲食品、飼料、薬品等（以下、食品等という）に含有させることができる。
本発明の乳清蛋白の骨芽細胞増殖促進・骨強化因子を含有した食品等には、吸収性の良いカルシウム塩を添加することが望ましい。このような吸収性の良いカルシウム塩には、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻あるいは牛乳由来のカルシウムまたはその塩、これらの含有物を例示することができる。
また、さらに本発明の乳清蛋白は、脱塩を行ってもよい。
従って、本発明の食品等は、乳清蛋白の分画物あるいはその脱塩画分、蛋白分解画分またはそれらに吸収性の良いカルシウム塩を添加してなるもの等を含有するものである。
本発明の骨芽細胞増殖促進・骨強化因子を含有せしめて得られる食品等の例を挙げると牛乳、ジュース、ゼリー、パン、麸、スープ、ソーセージ、錠剤等があり、飼料には飼料添加物、その他の飼料が、さらに医薬として、経口的に投与できる錠剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。
本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は、これを１００  〜５００ｍｇ  これらの飲食品等に添加含有することによって、骨を強化することができる。
【００１６】
また、本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子は元来乳の成分であって、ラットによる動物試験でも急性毒性は認められなかった。
【００１７】
次に、本発明の乳清蛋白の製造法を実施例をあげて説明する。
【実施例１】
乳清タンパク濃縮物１５ｋｇを  １００リットルになるように溶解し、ｐＨ４．５  に調整した後、８０℃１０分間蒸気にて加温した。これを、５，０００  ×ｇ、１０分間の遠心処理で沈澱を除去し、８０リットルの溶液を得た。この１０リットルを凍結乾燥し、５３０  ｇの凍結乾燥粉末を得た（画分Ａ）。残りの３５リットルをｐＨ３．０  にして、食塩濃度で０．２Ｍにして生成する沈澱を１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により除去した。この上清に食塩濃度で２．０Ｍになるように調整し、生成する沈澱を１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により集めた。これを、２０リットルの蒸留水に懸濁させ、その１０リットルを逆浸透（ＲＯ）にて脱塩して凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末を得た（画分Ｂ）。残りの１０リットルは分画分子量１０万の限外濾過（ＵＦ）膜（ＤＤＳ社製）を用いて透過させ、透過液を分画分子量３万のＵＦ膜を透過させ、透過液を電気透析により脱塩し、さらにこれを凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。（画分Ｃ：本発明画分）。画分Ｂおよび画分Ｃの収量はそれぞれ、１２２７ｇ、５４０  ｇであった。
【００１８】
【実施例２】
乳清タンパク濃縮物７．５ｋｇ  を５０リットルになるように溶解し、ｐＨ４．５  に調整した後、８０℃１０分間蒸気にて加温した。これを、分画分子量５０万のＵＦ膜（ＤＤＳ社製）を用いて透過させ、透過液６０リットルの半分をＲＯ膜により脱塩し凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た（画分Ｄ）。残りの３０リットルをｐＨ３．５  に調整し食塩を最終濃度で０．３Ｍにして１５，０００×ｇ、１０分間の遠心を行って生成する沈澱を除去した。この上清を食塩濃度が２．０Ｍになるように調整し１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により沈澱を生ぜしめ、これを集め、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た（画分Ｅ：本発明画分）。画分Ｄおよび画分Ｅの収量はそれぞれ、  ６３２ｇ、  ２３５ｇであった。
【００１９】
【参考例１】
脱脂乳  ２００リットルに塩酸を加えてｐＨ４．７  にしカゼインを沈澱させ、５，０００  ×ｇ、２０分間の遠心により乳清  １８５リットルを得た。これを、分画分子量５０万のＵＦ膜（ＤＤＳ社製）でＵＦ処理を行い、その透過液をさらに分画分子量３万のＵＦ膜でＵＦ処理を行うことにより脱塩とともに濃縮し、濃縮液を６リットル得た。この内２リットルはそのまま凍結乾燥し（画分Ｆ）、２リットルは、ｐＨ６．３  にて８０℃１０分間、加熱処理して５，０００  ×ｇ、１０分間の遠心による上清を取りこれを凍結乾燥した（画分Ｇ）。また残りの２リットルは、ｐＨ１．５  で食塩濃度が３Ｍになるように調整し生成する沈澱を１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により集め、それを水に溶かした後電気透析により脱塩し凍結乾燥した（画分Ｈ）。画分Ｆ，Ｈ，Ｇのそれぞれの収量は、それぞれ  ３４０ｇ、  １８８ｇ、  ２０２ｇであった。
【００２０】
【実施例３】
乳清タンパク濃縮物５．０ｋｇ  を５０リットルの水に溶解し、ｐＨを３．５  に調整し、最終食塩濃度が３．０Ｍになるように調整した。ここで沈澱する画分を１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により回収し、これを１０リットルの水に溶解した。この２リットルを電気透析して凍結乾燥し（画分Ｉ）、８リットルをｐＨ４．５  に調整して８０℃１０分間の熱処理を行った。この内半分を  ５，０００×ｇ、１０分間の遠心により上清を取りこれを凍結乾燥した（画分Ｊ）。また残りを分画分子量５０万のＵＦ膜処理を行い、その透過液を逆浸透（ＲＯ）により脱塩して凍結乾燥した（画分Ｋ：本発明画分）。画分Ｉ，Ｊ，Ｋの収量は、それぞれ  ４３０ｇ、  ２５５ｇ、  １７８ｇであった。
【００２１】
【実施例４】
乳清タンパク濃縮物２．５ｋｇ  を５０リットルの水に溶解し、ｐＨを３．０  に調整し、最終食塩濃度が３．０Ｍになるように調整した。ここで沈澱する画分を１５，０００×ｇ、１０分間の遠心により回収し、これを１０リットルの水に溶解した。これを分画分子量５０万のＵＦ膜処理を行い、その内半分の透過液をＲＯにより脱塩して凍結乾燥した（画分Ｌ）。残りの半分は８０℃１０分間の熱処理を行い  ５，０００×ｇ、１０分間の遠心により上清を取りこれを凍結乾燥した（画分Ｍ：本発明画分）。画分Ｌ，Ｍの収量は、それぞれ  ２１６ｇ、  １７５ｇであった。
【００２２】
【実施例５】
実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍの凍結滑剤粉末をＳＤＳ−ボリアクリルアミドゲル電気泳動により分画すると、分子量５，０００  〜２８，０００の範囲内に主要なバンドがみられた。
また、等電点電気泳動を行った所、等電点４〜９に主要なバンドがみられた。
【００２３】
【実施例６】
実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍの骨芽細胞増殖促進効果
培養骨芽細胞様株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を９６穴の平底細胞培養プレートに撒き込み、０．３  ％牛血清を含むα−ＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ製）で培養した。培地  １００μｌ  に対して、実施例１〜５で得られた画分Ａ〜Ｍを最終濃度で５μｇ  ／ｍｌ、５０μｇ  ／ｍｌになるように添加し、１８時間培養した。その後、トリチウムでラベルしたチミジンを添加し、２時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活性によって骨芽細胞の増殖活性を測定した。
試験結果を図１に示す。図１は、培地に実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍを加えなかったときの放射活性を  １００％としたときに、実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍを加えると何％の放射活性に相当するかによって細胞増殖活性を示している。
画分ＡからＭを最終濃度で５０μｇ  ／ｍｌで作用させると、培地のみで培養した時に比べ、細胞増殖活性が  １５０％から  ４２０％まで増加していた。また、５μｇ  ／ｍｌで作用させても、細胞増殖活性がみられた。このことから、実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍには骨芽細胞増殖作用があることがわかった。
また、培養骨芽細胞株ＵＭＲ１０６  株においても同様な結果が得られた。
【００２４】
【実施例７】
コラーゲン合成促進作用
骨芽細胞様株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を、実施例６で用いた培地に、実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍを最終濃度で５０μｇ  ／ｍｌになるように添加し、この培地で３７℃、３日間培養し、合成されたコラーゲンの量を調べた。合成されたコラーゲンの量はハイドロキシプロリンを定量することにより求めた。ハイドロキシプロリンの定量は、細胞破砕液を６Ｎ−塩酸で含水し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いることにより行った。この結果を図２に示す。この結果、実施例１〜４及び参考例１で得られた画分Ａ〜Ｍを作用させると、培地のみで培養した時に比べてハイドロキシプロリン量が増加し、骨芽細胞のコラーゲン合成が促進されることが判明した。
【００２５】
【実施例８】
骨強化作用
実施例で得られた画分Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｍ（本発明画分）を表１に示すようにカゼインに置き換えて飼料に２％添加し、飼料を調製した。飼料中のカルシウムとリンの量はともにすべての群で飼料  １００ｇあたり  ３００ｍｇとなるように調整し、カルシウム：リン比を１：１とした。
動物は６週齢のＳＤ系雌性ラットを用いた。骨粗鬆症モデルラットは、１週間予備飼育した後に卵巣摘出手術を施し低カルシウム食で１ケ月間飼育することにより作製した。その時、擬似手術を施し、卵巣を摘出しないシャムラットも７匹作製した。１試験群７匹で試験を行った。
骨粗鬆症モデルラットを、それぞれの被験飼料で１ケ月間飼育した。
１ケ月後に各実験群のラットの大腿骨を摘出し、破断特性測定装置で骨強度を測定した。
【００２６】
【表１】
0003604159.tif 000002
【００２７】
試験結果を図３及び図４に示す。図３に示したように、大腿骨破断力は対照群（Ｃｏｎｔ）  に比べて画分Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｍ群で統計的に有意に高い値を示した。図４で示した骨破断エネルギーも画分Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｍ群で統計的に有意に高い値を示した。このことから、実施例で得られた画分Ｃ，Ｅ，Ｋ，Ｍには骨強化作用があることがわかった。
【００２８】
次に本発明の食品類について実施例を挙げて具体的に示す。
【実施例９】
0003604159.tif 000003
上記成分を混合し容器に充填し、加熱殺菌して飲料を通常の製造法にて製造した。
【００２９】
【実施例１０】
0003604159.tif 000004
上記の成分を配合し、加圧成型して錠剤を通常の製造法にて製造した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子ならびにこれを含有させた食品類は、骨を強化する作用を有することから各種の骨関節疾患、特に骨粗鬆症の予防あるいは治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６の骨芽細胞増殖促進効果を示す。
【図２】実施例７のコラーゲン合成促進作用を示す。
【図３】実施例８の骨粗鬆症モデルラットの骨破断力を示す。
【図４】実施例８の骨粗鬆症モデルラットの骨破断エネルギーを示す。
【図１】
0003604159.tif 000005
【図２】
0003604159.tif 000006
【図３】
0003604159.tif 000007
【図４】
0003604159.tif 000008