【手続補正書】
【提出日】平成29年2月28日(2017.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｂ．（i）トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又は
（ii）ＡＬＫ５阻害剤、又は
（iii）甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤、
を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法。
【請求項３】
トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で前記細胞を培養することを含む、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法。
【請求項４】
得られる細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｃ）が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤で補充された培地で培養されない細胞に対して、ＨＢ９発現を増強する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤  ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択される、請求項１〜３又は１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記段階（ｃ）の培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｃ）にさらに、トリヨードチロニンが補充された培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地がさらに、ＡＬＫ５阻害剤で補充されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地がさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤と、ＰＫＣアクチベータとで補充されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＭＰ受容体阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択され、前記ＰＫＣアクチベータが、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培地がさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸で補充されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞であり、前記培地はさらに、ＦＧＦ７が補充されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．培養容器と、
ｂ．大量の分化培地と、
ｃ．多能性幹細胞から誘導した分化した細胞の集団であって、少なくとも１０パーセントの前記分化した細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を共発現する、分化した細胞の集団と、を含む多能性幹細胞から誘導した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養。
【請求項２２】
前記分化培地が、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤で補充された増殖培地を含む、請求項２１に記載の細胞培養。
【請求項２３】
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１である、請求項２２に記載の細胞培養。
【請求項２４】
前記分化した細胞が、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項２１に記載の細胞培養。
【請求項２５】
前記増殖培地にさらに、１つ又は２つ以上の
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるスムーズンド受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、で補充されている、請求項２２に記載の細胞培養液。
【請求項２６】
前記増殖培地がさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸で補充されている、請求項２５に記載の細胞培養。
【請求項２７】
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している分化した多能性幹細胞の集団を含むインビトロ細胞培養であって、少なくとも１０パーセントの前記細胞が、ＨＢ９、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する、インビトロ細胞培養。
【請求項２８】
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも３０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項２７に記載の細胞培養。
【請求項２９】
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも５０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項２７に記載の細胞培養。
【請求項３０】
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも８０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項２７に記載の細胞培養液。
【請求項３１】
前記分化した細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項２３に記載の細胞培養液。
【請求項３２】
前記分化した細胞が、インスリンを産出する、請求項３１に記載の細胞培養液。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。  当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。  本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。  本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
本発明は以下を提供する。
[１]
多能性幹細胞から膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法であって、
ａ．多能性幹細胞を培養することと、
ｂ．多能性幹細胞を、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、
ｃ．トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることと、の段階を含む方法。
[２]
得られる細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１に記載の方法。
[３]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１に記載の方法。
[４]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
[５]
ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
[６]
前記甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである、請求項１に記載の方法。
[７]
段階（ｃ）が、トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
[８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞に対して、ＨＢ９発現を増強する、請求項７に記載の方法。
[９]
前記段階（ｃ）の培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項１に記載の方法。
[１０]
段階（ｃ）にさらに、トリヨードチロニンを補足した培地中、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１に記載の方法。
[１１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項１０に記載の方法。
[１２]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した培地での処理によって、前腸内胚葉細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出する方法。
[１３]
得られた細胞の少なくとも１０パーセントが、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１及びＨＢ９に対して陽性である、請求項１２に記載の方法。
[１４]
ＮＫＸ６．１陽性膵臓内胚葉前駆細胞中のＨＢ９の発現を増強する、請求項１２に記載の方法。
[１５]
ＮＫＸ２．２の発現を減少させる、請求項１２に記載の方法。
[１６]
ＳＯＸ２及びアルブミン発現を抑制する、請求項１２に記載の方法。
[１７]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項１２に記載の方法。
[１８]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で培養することを含む、請求項１２に記載の方法。
[１９]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足した培地で培養されない細胞と比較した時に、ＨＢ９発現を増強する、請求項１８に記載の方法。
[２０]
さらに、トリヨードチロニンを補足した培地中で、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することによる、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の形成が含まれる、請求項１２に記載の方法。
[２１]
前記培地にさらに、ＡＬＫ５阻害剤を補足する、請求項２０に記載の方法。
[２２]
前記培地にさらに、ＢＭＰ受容体阻害剤と、ＰＫＣアクチベータを補足する、請求項１２に記載の方法。
[２３]
トリヨードチロニンとＡＬＫ５阻害剤を補足する培地中、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することを含む、（ａ）ＨＢ９発現を増加させ、（ｂ）ＳＯＸ２とアルブミン発現を抑制する、方法。
[２４]
トリヨードチロニンと、ＡＬＫ５阻害剤を補足した培地中で前記細胞を培養することを含む、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、膵臓内胚葉／内分泌前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞、又は膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞中の、グルカゴン、ソマトスタチン及びグレリンをダウンレギュレートする方法。
[２５]
前記培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項２４に記載の方法。
[２６]
前記細胞が、膵臓前腸前駆細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞であり、前記培地にさらに、ＦＧＦ７を補足する、請求項２５に記載の方法。
[２７]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤  ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
[２８]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２７に記載の方法。
[２９]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
[３０]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項２９に記載の方法。
[３１]
前記ＢＭＰ受容体阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ及びＣｈｏｒｄｉｎから選択され、前記ＰＫＣアクチベータが、ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択される、請求項２２に記載の方法。
[３２]
ａ．培養容器と、
ｂ．大量の分化培地と、
ｃ．多能性幹細胞から誘導した分化した細胞の集団であって、少なくとも１０パーセントの前記分化した細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＨＢ９を共発現する、分化した細胞の集団と、を含む多能性幹細胞から誘導した細胞を分化するためのインビトロ細胞培養。
[３３]
前記分化培地が、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地を含む、請求項３２に記載の細胞培養液。
[３４]
前記増殖培地が、ＭＣＤＢ１３１である、請求項３３に記載の細胞培養。
[３５]
前記分化した細胞が、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３２に記載の細胞培養。
[３６]
前記増殖培地にさらに、１つ又は２つ以上の
ａ．ＭＲＴ１０又はシクロパミンから選択されるスムーズンド受容体阻害剤と、
ｂ．ＳＡＮＴ−１又はＨＰＩ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストと、
ｃ．ＬＤＮ−１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ又はＣｈｏｒｄｉｎから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤と、
ｄ．ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ及びＩＬＶから選択されるＰＫＣアクチベータと、
ｅ．ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子と、
ｆ．レチノイン酸と、
ｇ．アスコルビン酸と、
ｈ．ヘパリンと、
ｉ．硫酸亜鉛と、が補足される、請求項３３に記載の細胞培養液。
[３７]
前記増殖培地にさらに、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸及びアスコルビン酸を補足する、請求項３６に記載の細胞培養液。
[３８]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している分化した多能性幹細胞の集団を含むインビトロ細胞培養液であって、少なくとも１０パーセントの前記細胞が、ＨＢ９、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する、インビトロ細胞培養液。
[３９]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも３０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４０]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも５０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４１]
ＮＫＸ６．１とＰＤＸ１両方を発現する前記細胞の少なくとも８０パーセントが、ＨＢ９も発現する、請求項３８に記載の細胞培養液。
[４２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する、請求項１に記載の方法。
[４３]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを産出する、請求項１２に記載の方法。
[４４]
前記分化した細胞が、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を含む、請求項３５に記載の細胞培養液。
[４５]
前記分化した細胞が、インスリンを産出する、請求項４４に記載の細胞培養液。
[４６]
トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で、多能性幹細胞から誘導した細胞を培養することを含む、膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞を産出するための方法。
[４７]
多能性幹細胞から誘導した細胞を、約３〜約９日間、前記増殖培地中で培養する、請求項４６に記載の方法。
[４８]
前記細胞を、甲状腺ホルモンを補足するが、ＡＬＫ５阻害剤は補足しない第一増殖培地中、約２〜３日間培養し、続いて、得られた細胞集団を、甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した追加的増殖培地中、約３〜６日間培養する、請求項４７に記載の方法。
[４９]
前記細胞をさらに、前記甲状腺ホルモンを含むが、ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中、約３日間培養する、請求項４８に記載の方法。
[５０]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項４８に記載の方法。
[５１]
前記ＡＬＫ５阻害剤が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＡＬＫ５ｉ、ＳＤ２０８、ＴＧＦ−Ｂ阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｖ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  Ｉ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体ｉｎｈ  ＩＩＩからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
[５２]
膵臓内分泌細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項４６に記載の方法。
[５３]
前記細胞を、トリヨードチロニン、チロキシン、トリヨードチロニンの類似体、チロキシンの類似体及びその混合物から選択される甲状腺ホルモン、又はＡＬＫ５阻害剤、又は甲状腺ホルモンとＡＬＫ５阻害剤両方を補足した増殖培地中で培養させることを含む、多能性幹細胞又はそれより誘導した細胞の分化を介して、β細胞の特徴的なマーカーを発現している細胞の収率を増加させるための方法。
[５４]
前記甲状腺ホルモンが、トリヨードチロニンである、請求項５３に記載の方法。
[５５]
β細胞の特徴的なマーカーを発現している前記細胞が、インスリンを発現する、請求項５４に記載の方法。