(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理されたアルブミン製剤において、血清アルブミン含量に対する凝集体含量が３重量％以下であり、且つアルブミン濃度を25％としてMancini法により測定したα１−酸性糖蛋白質含量が検出限界以下であるアルブミン製剤の製造法であって、血清アルブミン含有水溶液を、陰イオン交換体を用いて、pH5.0〜5.5、アルブミン1g当り陰イオン交換体の使用量が２〜5mlの条件下で処理して非吸着画分を回収する工程に付した後、加熱処理することを特徴とするアルブミン製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、アルブミン製剤及びその製造方法に関する。より詳細には、凝集体含量及び夾雑蛋白質含量が低減された血清アルブミン製剤及びその製造方法に関する。
［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］
血清アルブミンは血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してその運搬などの機能を果たしている。上記血清アルブミンを含有する製剤は、アルブミンの喪失及びアルブミン合成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。アルブミン製剤は、そこに混入してくる懸念のあるウイルスを不活化するために、通常、アルブミン含有水溶液の状態での加熱処理が汎用されている。このような方法により製造される市販のアルブミン製剤は、製剤中に凝集体（通常ポリマーと称されるので、以下、ポリマーという）が存在することが知られている。この凝集体は上記の加熱処理前には殆ど存在しないことから、加熱処理により熱に不安定な夾雑蛋白質の作用でアルブミンが凝集化したものと考えられる。市販のアルブミン製剤は安全に広く使用されていることから、この凝集体が特に人に害を及ぼすとは考えられていないが、加熱変性物であることより、製剤中にできるだけ含まれていないことが好ましい。
また、アルブミン製剤中には、夾雑蛋白質としてα１−酸性糖蛋白質が含まれており、該蛋白質は免疫抑制作用を有する。α１−酸性糖蛋白質はアルブミンと物理化学的性質の比較的よく似た蛋白質であり、分画法等の慣用の手段では効率的に分離することが困難である。従って、通常のアルブミン製剤中には免疫抑制作用を有するα１−酸性糖蛋白質が残存するおそれがあり、製剤中からできるだけ除去しておくことが望ましい。
本発明は上記の課題を解決すべく創案されたもので、本発明者らが種々検討を重ねた結果、ポリマーの形成はアルブミン中に混入するポリマー形成因子（凝集体形成因子）に起因し、該形成因子は熱に不安定な夾雑蛋白質（主としてハプトグロビン）である知見を得、アルブミン中のポリマー形成因子を除去することにより、加熱処理されてもポリマー含量の少ないアルブミン製剤が得られ、またα１−酸性糖蛋白質含量も低減できることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、ポリマー含量及びα１−酸性糖蛋白質含量が低減されたアルブミン製剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
［課題を解決するための手段］
上記の課題を解決すべくなされた本発明のアルブミン製剤は、アルブミン濃度を25％として測定したときに、血清アルブミン含量に対するポリマー含量が３重量％以下であり、且つMancini法により測定したα１−酸性糖蛋白質含量が検出限界以下であることを特徴とするものであり、また本発明のアルブミン製剤の製造方法は、血清アルブミン含有水溶液を該水溶液中に含まれるポリマー形成因子を除去する工程に付した後、加熱処理することを特徴とするものである。なお、ポリマー形成因子の除去は、陰イオン交換体を用いる方法又はアフィニティクロマトグラフィー法で行なうのが好ましい。
本発明にかかる製剤の主成分であり且つ本発明の製造方法の出発原料であるアルブミンの由来には特に制限がなく、具体的には哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウサギ等に由来するものが挙げられ、特にヒト由来のものが使用される。アルブミンを調製するための出発原料としては、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分等が例示される。
本発明のアルブミン製剤は、上記のアルブミンを含有する水溶液を、該溶液中に含まれるポリマー形成因子を除去する工程に付した後、加熱処理することにより得られる。
上記のアルブミン含有水溶液中のアルブミン含量としては、通常、0.1〜30％（W/V、特に明示のない限り以下同様）、好ましくは約１〜10％に調整される。
上記アルブミン含有水溶液中のポリマー形成因子の除去方法としては、ポリマー形成因子がハプトグロビン、α１−酸性糖蛋白質等のアルブミンより等電点の低い蛋白質であるので、これらを除去するために用いられる方法であればいずれも使用することができ、例えば、陰イオン交換体を用いる方法、アフィニティクロマトグラフィーを用いる方法等が挙げられる。特にポリマー形成因子の主成分であるハプトグロビンはアルブミンと物理化学的性質が比較的よく似ており分画法で効率的に分離するのは困難なので、陰イオン交換体を用いる方法又はアフィニティクロマトグラフィーを用いる方法が好ましい。
上記の方法において、陰イオン交換体を用いる方法を採用する場合、使用される陰イオン交換体としては陰イオン交換基（例えば、ジエチルアミノエチル基等）を有する不溶性担体であればいずれも使用することができ、より具体的には、この分野で慣用の陰イオン交換体、例えば、DEAE−セファロース▲R▼、Ｑ−セファロース▲R▼（いずれもファルマシア社製）、DEAE−トヨパール▲R▼、QAE−トヨパール▲R▼（いずれも東ソー社製）、A200セルロファイン▲R▼（生化学工業社製）、陰イオン交換樹脂等が例示され、ポリマー形成因子の除去率の点からしてＱ−セファロース、QAE−トヨパール等の強陰イオン交換体を用いるのが好ましい。
陰イオン交換体を用いる方法は、ハプトグロビン等のポリマー形成因子を含むアルブミン含有水溶液を陰イオン交換体と接触させることにより行われ、陰イオン交換体の使用量はアルブミン含有水溶液中のポリマー形成因子含量、陰イオン交換体の交換能等により適宜調整されるが、アルブミン1g当り、陰イオン交換体２〜5ml、通常3ml程度使用される。本方法はカラム法、バッチ法のいずれの方法にて行なってもよいが、ポリマー形成因子の除去効率の面からカラム法にて行なうのが好ましい。
カラム法にて行なう場合、前記のアルブミン含有水溶液をpH4.8〜9.0程度、好ましくはpH4.9〜5.5、より好ましくはpH5.1、塩濃度として0.001〜0.2Mの塩化ナトリウム程度、好ましくは0.001〜0.05Mに調整し、溶出液［例えば、0.02M酢酸ナトリウム（pH5.1）］で平衡化した陰イオン交換体カラムを通過させ、次いで溶出液で展開して非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制するため、低温（通常、10℃以下）にて行なうのが好ましい。
また、バッチ法にて行なう場合、上記条件に調整したアルブミン含有水溶液に、陰イオン交換体を添加して接触させ、10℃以下にて、30分〜２時間程度混和した後、遠心分離等の手段により陰イオン交換体と分離し、上清を回収することにより行われる。
ポリマー形成因子の除去方法とアフィニティクロマトグラフィー法を採用する場合、該方法に使用される担体としては、ハプトグロビン等のポリマー形成因子と特異的親和性を有する物質を固定化した不溶性担体（以下、アフィニティ担体という）が用いられる。不溶性担体としてはセルロール、デキストラン等が例示され、またハプトグロビン等のポリマー形成因子と特異的親和性を有する物質としては、夾雑蛋白質の種類に応じて種々の物質が用い得るが、例えば、ハプトグロビンに対しては抗ハプトグロビン抗体、ヘモグロビン等、α１−酸性糖蛋白質に対しては抗α１−酸性糖蛋白質抗体等が例示される。これらの抗ハプトグロビン抗体、抗α１−酸性糖蛋白質抗体等の抗体はこの分野で慣用の抗体産生法により調製することができる。上記の特異的親和性を有する物質と不溶性担体との結合は常法に準じて行なうことができ、例えば、ブロムシアン化されたセファロースを膨潤させた後、塩基性緩衝液中で特異的親和性を有する物質を不溶性担体にカップリングさせ、緩衝液で十分に洗浄することにより調製される。
アフィニティクロマトグラィーを用いる方法は、ハプトグロビン等のポリマー形成因子を含むアルブミン含有水溶液を、アフィニティ担体と接触させることにより行われ、例えば、それぞれの夾雑蛋白質と特異的親和性を有する複数の物質を固定化したアフィニティ担体と接触させたり、またハプトグロビンに対して特異的親和性を有する物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、次いでα１−酸性糖蛋白質に対して特異的親和性を有する物質を固定化したアフィニティ担体と接触させ、さらに必要に応じて他の夾雑蛋白質に対して特異的親和性を有するアフィニティ担体と接触させることにより行われる。
アフィニティ担体の使用量はアルブミン含有水溶液中のハプトグロビン等のポリマー形成因子含量、該アフィニティ担体の吸着能等により適宜調整されるが、アルブミン1g当り、アフィニティ担体２〜5ml、通常4ml程度使用される。本方法はポリマー形成因子の除去効率の面からカラム法にて行なうのが好ましく、例えば、前記のアルブミン含有水溶液をpH4.0〜9.0程度、好ましくはpH5.0〜8.0、より好ましくはpH6.8に調整し、アルブミンの溶解用液で平衡化した上記アフィニティ担体カラムを通過させ、必要に応じてカラムを溶解用液で洗浄し、非吸着分を回収することにより行われる。上記の操作はアルブミンの変性を抑制するため、低温（通常10℃以下）にて行なうのが好ましい。
上記工程により夾雑蛋白質が除去され、得られたアルブミン含有水溶液はポリマー形成因子含量が低減された溶液である。
かかる精製工程によりポリマー形成因子が低減されたアルブミン含有水溶液は適当な濃度に調整し、例えば、バイアルに充填するなど所望の製剤形態に製剤化された後、加熱処理されて本発明のアルブミン製剤が得られる。上記の加熱処理はアルブミン製剤中に混入するおそれのあるウイルスを不活化するもので、アルブミン濃度５〜30％程度、通常５又は20〜25％程度に調整した水溶液として行われ、加熱温度としては、夾雑ウイルスを不活化するに十分な温度及び時間行なえばよく、例えば、50〜70℃、好ましくは約60℃で、５〜20時間、好ましくは約10時間行われる。なお、上記の加熱処理に際しては、必要に応じて、アルブミンの安定化剤、例えば、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム、カプリル酸ナトリウム等を単独で又は混合して添加してもよい。これらアルブミンの安定化剤は、製剤中に含有されるアルブミン1g当り20〜60mg、好ましくは40mg程度使用される。
斯くして得られたアルブミン製剤は、アルブミン濃度を25％として測定したときに、血清アルブミン含量に対するポリマー含量が３重量％以下であり、且つMancini法により測定したα１−酸性糖蛋白質含量が検出限界以下である。
本発明のアルブミン製剤は、従来のアルブミン製剤と同様な用量、用法にて使用される。
［発明の効果］
本発明のアルブミン製剤は、加熱処理によりウイルスが不活化されていると共にポリマー含量及びα１−酸性糖蛋白質含量が極めて少なく、安全性、安定性等に優れた製剤である。
また、本発明の製造方法によれば、混入が危惧されるウイルスが加熱処理により不活化され、また加熱処理により生成するポリマーの形成因子であるハプトグロビン等の熱に不安定な夾雑蛋白質が予め除去されているので、ポリマー含量及び夾雑蛋白質含量の少ないアルブミン製剤を得ることができる。
［実施例］
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分をアセトンで脱アルコールし、アセトンパウダーを得た。次いで、アルブミン濃度が10％となるように水に溶解し、pHを5.1に調整した。この溶液をDEAE−セファデックスカラムで処理した。溶出液に安定化剤としてＮ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムをそれぞれ20mM添加し、60℃で10時間加熱処理し、アルブミン製剤を得た。該製剤中のポリマー含量をゲル濾過分析法にて測定した。その結果、ポリマー含量は、４回の繰り返し実験で3.0％以下（アルブミン含量に対する相対重量％、ポリマー含量に関して以下同様）であった。また、比較例として、DEAE−セファデックス処理をしていない溶液に安定化剤を添加し、同様に加熱した溶液中のポリマー含量を測定した。その結果、ポリマー含量は6.3％（４回の繰り返し実験の平均値）であった。
次いで、上記のDEAE−セファデックスに吸着した画分を溶出させ、ゲル濾過法とセルロースアセテート膜電気泳動法で分析した結果、吸着画分はハプトグロビンを主体とする蛋白質であった。
実施例２
ブロムシアン化セファロース4B（5.8g）を1mM塩酸で15分間膨潤させ、水洗した後、塩基性緩衝液［0.1M炭酸水素ナトリウム及び0.5M塩化ナトリウム含有（pH8.3）］で洗浄した。ヒトヘモグロビン（100mg）を上記塩基性緩衝液（40ml）に溶解し、ここに上記膨潤したゲル（20ml）を添加し２時間攪拌した。次いで、1Mグリシン（pH8.0）を15mlを添加し、４℃にて一夜攪拌した。ゲルを濾別し、塩基性緩衝液で十分に洗浄した後、リン酸緩衝食塩水で平衡化した。斯くして、ヒトヘモグロビン固定化セファロースを調製した。
一方、実施例１で使用した第Ｖ画分アセトンパウダーを水に溶解し、10％アルブミン溶液（炭酸ナトリウム及び水酸化ナトリウムにてpH6.8に調整）を調製した。この溶液を、上記セファロースゲル（20ml）を充填したカラムにとおし、溶出液を20mlずつ分画した。フラクションNo.2〜８について、一元免疫拡散法（Mancini法）でハプトグロビンを定量した。また各サンプル（5ml）をセントリカット−50にて2mlに濃縮し、安定化剤溶液（1ml中、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム36mg及びカプリル酸ナトリウム24mg含有）を280μlを添加し、60℃にて10時間加熱し、アルブミン製剤を得た。該製剤中のポリマー含量をゲル濾過分析法により測定した。溶出液のハプトグロビン（Hp）濃度とポリマー含量との関係を第１表に示す。
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上記表に示されるように、溶出液中のハプトグロビン濃度が低いほどポリマー含量が低い結果となった。実施例１及び２の結果を勘案すると、アルブミンより等電点の低い夾雑蛋白質（主としてハプトグロビン）を除去することによりポリマー含量を低減化できることが判明した。
実施例３
コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペースト（300g、アルブミン含量110.2g）を冷無菌蒸溜水1.2lに溶解し、約１時間で攪拌した。次いで、10（V/V）％酢酸を用いてpHを4.6に調整した後、約−２℃にて濾過（フィルター:0.45μｍ）し、さらに冷無菌蒸溜水1.2lを加え、0.8M炭酸水素ナトリウムでpH5.1に調整し、アルブミン水溶液を得た。
一方、QAE−トヨパール（350ml）をカラムに充填し、0.5M塩化ナトリウム（500ml）で十分に洗浄した後、0.02M酢酸ナトリウム（pH5.1）で平衡化し、陰イオン交換体カラムを調製した。このカラムに上記のアルブミン水溶液をとおし、さらに0.02M酢酸ナトリウム（1.2l）で洗浄した。通過液と洗浄液とを合わせ、1N水酸化ナトリウムにてpHを6.2に調整した後、透析・濃縮し、全量330ml（アルブミン濃度：約28％）とした（以下、アルブミン調整液という）。
このアルブミン調整液に安定化剤溶液（100ml中、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム5.55g及びカプリル酸ナトリウム3.89g含有）を39.6ml添加し、0.1N水酸化ナトリウムにてpHを6.85に調整した後、除菌濾過した。アルブミン濃度が25％となるように調整した後、所定量をバイアルに分注し、60℃にて10時間加熱処理してアルブミン製剤を得た。
得られた製剤中のポリマー含量をゲル濾過分析法により測定したところ、1.99％であった。なお、比較として、QAE−トヨパールカラムを使用しない点以外は、上記製法と実質的に同様にして調製したアルブミン製剤の加熱後のポリマー含量6.49％であり、本発明の製造方法により得られたアルブミン製剤のポリマー含量は著しく低いものである。
また、アルブミン製剤及び前記のアルブミン調整液中の夾雑蛋白質含量の測定を一元免疫拡散法（Mancini法:Mancini  G.ら、Immunochemistry,第２巻、第３号、第235−254頁、1965年）により行い、その結果を第２表に示す。なお、この際、用いた抗α１−酸性糖蛋白質血清、抗ハプトグロビン血清及び抗プレアルブミン血清は、ウサギを免疫動物として常法により調製したものである。これらの抗血清より作製した一元免疫拡散用ゲルを用い、それぞれに対応する夾雑蛋白質に対する沈降輪面積の標準曲線を第１図〜第３図に示す。
第２表に示されるように、本発明のアルブミン製剤及びアルブミン調整液は夾雑蛋白質含量の極めて少ないものであることが判明した。なお、第１図〜第３図から明らかなように、ハプトグロビンの検出限界は6.5mg/dlであり、α１−酸性糖蛋白質の検出限界は4mg/dlであり、プレアルブミンの検出限界は4mg/dlである。
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【図面の簡単な説明】
第１図から第３図は、それぞれα１−酸性糖蛋白質、ハプトグロビン及びプレアルブミンに対する一元免疫拡散法による標準曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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