【手続補正書】
【提出日】平成29年4月13日(2017.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ヒトナイーブ型多能性幹細胞（ＰＳＣ）であって、非メチル化Ｘ不活性化特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を有し、
（ｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが女性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型女性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を２つ有し、ここで女性細胞中にＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子が２つ存在することは、前記ＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターにおいてシーケンシングされたＣｐＧのメチル化リードを約２０％よりも少なく有することを意味し、
（ｉｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが男性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型男性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を１つ有し、ここで男性細胞中にＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子が１つ存在することは、前記ＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターにおいてシーケンシングされたＣｐＧのメチル化リードを約２０％よりも少なく有することを意味し、および／または 
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルについて、免疫染色アッセイにより決定される核から細胞質への発現率が１に等しいもしくは１を超えることを特徴とする、単離ヒトナイーブ型ＰＳＣ。 
【請求項２】
請求項１に記載の単離ヒトナイーブ型ＰＳＣ細胞を少なくとも１０％含む、単離ナイーブ型ＰＳＣ集団。 
【請求項３】
請求項１に記載の単離ナイーブ型ＰＳＣおよび培養基を含有する、細胞培養液。 
【請求項４】
前記培養基は、少なくとも１０回継代するあいだ前記ナイーブ型ＰＳＣを未分化多能性状態で維持できる、請求項３に記載の細胞培養液。 
【請求項５】
ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化因子、ならびに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の薬剤を含有する、培養基。 
【請求項６】
ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化因子、ならびに形質転換増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の薬剤を含有する、培養基。 
【請求項７】
細胞および請求項５または６のいずれか一項に記載の培養基を含有する、細胞培養液。 
【請求項８】
前記培地は、少なくとも２回継代するあいだナイーブ型多能性幹細胞を未分化状態で維持できる、請求項７に記載の細胞培養液。 
【請求項９】
ナイーブ型多能性幹細胞（ＰＳＣ）を発生させる方法であって、 
非ナイーブ型ＰＳＣ細胞を、前記非ナイーブ型ＰＳＣからナイーブ型ＰＳＣを発生させることのできる条件下においてインキュベートする工程を有し、 
（ｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが女性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型女性ＰＳＣはＸ不活性化特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子の非メチル化対立遺伝子を２つ有し、 
（ｉｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが男性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型男性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を１つ有し、および／または 
前記ナイーブ型ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルについて、免疫染色アッセイにより決定される核から細胞質への発現率が１に等しいもしくは１を超えることを特徴とする、ナイーブ型ＰＳＣを発生させる方法。 
【請求項１０】
前記条件は請求項５または６のいずれか一項に記載の培養基を含む、請求項９に記載の方法。 
【請求項１１】
前記条件は低酸素を含む、請求項９または１０に記載の方法。 
【請求項１２】
前記培養基はＭＢＤ３阻害剤をさらに含有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項１３】
前記培養基はクロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤をさらに含有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項１４】
前記培養基はＰ６６アルファ・コイルドコイル・ドメインをさらに含有する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項１５】
前記非ナイーブ型ＰＳＣはプライム型ＰＳＣ、胚盤胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および体細胞からなる群より選択される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項１６】
体細胞からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発生を改善する方法であって、
（ａ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群より選択される少なくとも二種の増殖因子を、体細胞中において発現させる工程、ならびに
（ｂ）前記体細胞中におけるＭｂｄ３の発現および／または活性を阻害する工程を有する、体細胞からのｉＰＳＣの発生を改善する方法。 
【請求項１７】
前記Ｍｂｄ３活性の前記阻害を、ヌクレオソームリモデリング脱アセチル化酵素（ＮｕＲＤ）複合体への前記Ｍｂｄ３の結合を阻害することによって実施する、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
前記Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への前記結合の前記阻害を、クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤を用いて実施する、請求項１７に記載の方法。 
【請求項１９】
前記Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への前記結合の前記阻害を、Ｐ６６アルファ・コイルドコイル・ドメインを用いて実施する、請求項１７に記載の方法。 
【請求項２０】
前記Ｍｂｄ３発現の前記阻害をプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を用いて実施する、請求項１７に記載の方法。 
【請求項２１】
前記体細胞においてＥＳ細胞発現Ｒａｓ（ＥＲＡＳ）コード配列を外因的に発現させる工程、または前記体細胞において前記ＥＲＡＳの内因的発現を活性化する工程をさらに有する、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項２２】
前記発現をさせる前の前記Ｍｂｄ３のレベルのうち１０〜３０％が前記Ｍｂｄ３の前記阻害により阻害されるよう、前記発現を少なくとも４８時間実施する、請求項１６に記載の方法。 
【請求項２３】
前記発現を約４８時間実施し、前記約４８時間の後で前記阻害を実施する、請求項１６に記載の方法。 
【請求項２４】
前記ｉＰＳＣはネズミｉＰＳＣである、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項２５】
ＬＩＦ、ＥＲＫ１／２阻害剤、およびＧＳＫ３ｂ阻害剤を含有する培地中で前記ネズミｉＰＳＣを培養する工程をさらに有する、請求項２４に記載の方法。 
【請求項２６】
前記ｉＰＳＣがヒトｉＰＳＣである場合、前記方法は、 
（ｃ）ＬＩＦ、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）を含有する培養基中で前記ヒトｉＰＳＣを培養する工程 
をさらに有する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項２７】
前記培地はＲＯＣＫ阻害剤をさらに含有する、請求項２６に記載の方法。 
【請求項２８】
工程（ｃ）を、工程（ａ）における前記発現から約４８時間後に実施する、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。 
【請求項２９】
前記発現を、前記増殖因子のＤＮＡトランスフェクションによって実施する、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項３０】
前記発現を、前記増殖因子のＲＮＡトランスフェクションによって実施する、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項３１】
前記発現を、前記増殖因子のタンパク質トランスフェクションによって実施する、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項３２】
前記ナイーブ型ＰＳＣは２０回を超えて継代培養しても前記未分化多能性状態を維持できる、請求項１に記載の前記単離ナイーブ型ＰＳＣ。 
【請求項３３】
ナイーブ型多能性幹細胞（ＰＳＣ）を発生させる方法であって、
非ナイーブ型ＰＳＣ細胞を、前記非ナイーブ型ＰＳＣからナイーブ型ＰＳＣを発生させることのできる条件下においてインキュベートする工程を有し、 
前記ナイーブ型ＰＳＣは、非メチル化Ｘ不活性化特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を有し、 
（ｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが女性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型女性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を２つ有し、 
（ｉｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが男性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型男性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を１つ有し、および／または 
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルについて、免疫染色アッセイによる核から細胞質への発現率が１に等しいもしくは１を超えることを特徴とし、 
前記条件は、ＫＯ−ＤＭＥＭ、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、Ａｌｂｕｍａｘ  Ｉ、ＬＩＦ、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、およびプロテインキナーゼＣ阻害剤を含有する培養基を含む、ナイーブ型ＰＳＣを発生させる方法。 
【請求項３４】
ナイーブ型多能性幹細胞（ＰＳＣ）を発生させる方法であって、
非ナイーブ型ＰＳＣ細胞を、前記非ナイーブ型ＰＳＣからナイーブ型ＰＳＣを発生させることのできる条件下においてインキュベートする工程を有し、 
前記ナイーブ型ＰＳＣは、非メチル化Ｘ不活性化特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を有し、 
（ｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが女性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型女性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を２つ有し、 
（ｉｉ）前記ナイーブ型ＰＳＣが男性ＰＳＣである場合、前記ナイーブ型男性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化対立遺伝子を１つ有し、および／または 
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルについて、免疫染色アッセイによる核から細胞質への発現率が１に等しいもしくは１を超えることを特徴とし、 
前記条件は、ＫＯ−ＤＭＥＭ、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、Ａｌｂｕｍａｘ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＩＦ、ＴＧＦβ１、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、およびプロテインキナーゼＣ阻害剤を含有する培養基を含む、ナイーブ型ＰＳＣを発生させる方法。 
【請求項３５】
始原生殖細胞を発生させる方法であって、霊長類ナイーブ型多能性幹細胞を、前記霊長類ナイーブ型多能性幹細胞から始原生殖細胞を誘導できるよう選択された培養基中において培養する工程を有し、前記培養基はＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含有する、始原生殖細胞を発生させる方法。