(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中のピルビン酸を定量するに際し、被検体にプトレッシンおよびプトレッシントランスアミナーゼを作用させ、生成する４−アミノブタナールに酸化型ニコチンアミド補酵素および４−アミノブタナール脱水素酵素を作用させ、該酵素反応に伴って生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することによってピルビン酸量を決定することを特徴とするピルビン酸の定量方法。
【請求項２】
プトレッシン、酸化型ニコチンアミド補酵素、プトレッシントランスアミナーゼおよび４−アミノブタナール脱水素酵素を含有してなるピルビン酸定量用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は被検体中のピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬に関するものである。本発明により、被検体中のピルビン酸の濃度を酵素的により簡便かつ正確に定量する方法および定量用試薬が提供される。
【０００２】
【従来の技術】
ピルビン酸は、生体内において糖、脂質及びアミノ酸の代謝に関与する重要な化合物のひとつである。このピルビン酸を定量することにより、生体内の代謝状態に関する重要な知見を得ることできる。さらに、被検体中の種々の生体成分を定量するに際し、この生体成分を酵素的反応あるいは化学的反応を使用してピルビン酸に変換せしめた後に、ピルビン酸を定量することによって生体成分を定量する方法があり、ピルビン酸の高感度で、かつ精度の高い定量方法は産業上重要である。例えば、被検体中のシアル酸を定量するに際し、被検体にノイラミニダーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを作用させシアル酸をピルビン酸とＮ−アセチルマンノサミン変換せしめ、生成するピルビン酸を定量することにより被検体中のシアル酸の濃度を定量する方法が採られている。
【０００３】
従来からのピルビン酸の代表的な定量方法としては、（社）日本臨床検査薬協会編集、「体外診断用医薬品集」、４８８頁、薬事日報社（１９９１年）に記載のピルビン酸を還元型ニコチンアミド補酵素と乳酸脱水素酵素の存在下で反応させ、反応の進行に伴って減少する還元型ニコチンアミド補酵素量を紫外線領域の吸光度の減少を分析することによってピルビン酸を定量する方法（以下ＵＶ法と略記する）、およびピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の存在下で酸化せしめ、反応の進行に伴って生成する過酸化水素を分析することによってピルビン酸を定量する方法（酸化酵素法と略記する）が代表的である。
【０００４】
また、これらの定量法の他に、正確にピルビン酸を定量可能な方法として特開昭６２−１４７９９号公報に記載のＤ−アラニントランスフェラーゼとＤ−アミノ酸オキシダーゼを使用する酵素サイクリングを利用した高感度なピルビン酸もしくはその塩の定量方法、特開昭６４−３７３００号公報に記載のピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リン酸、及び電子受容体の存在下でピルビン酸をアセチルリン酸、二酸化炭素、及び還元型電子受容体に変換させてピルビン酸を定量する方法、及び特開平４−３４６７９６号公報に記載の乳酸デヒドロゲナーゼ、チオＮＡＤ類、及び還元型ＮＡＤ類を用いる酵素サイクリング法によるピルビン酸の高感度定量方法が提案されている。さらに、特開平５−９５７９８号公報及び特開平５−２１９９９１号公報に記載のピルビン酸に還元型補酵素Ａ（以下ＣｏＡ−ＳＨという）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、及び酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを作用させて、生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を測定することによりピルビン酸を定量する方法がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来から用いられてきたこれらのピルビン定量方法は、いくつかの難点を有している。すなわち、乳酸脱水素酵素を使用するＵＶ法は、被検体中のピルビン酸と添加された還元型ニコチンアミド補酵素とが乳酸脱水素酵素の作用によって反応し、反応の進行に伴って減少する還元型ニコチンアミド補酵素量を紫外線領域の吸光度の減少を測定することによってピルビン酸を定量している。従って、本方法はあらかじめ反応基質として添加される還元型ニコチンアミド補酵素に基づいた紫外線領域における高い初期吸光度を有する。この初期吸光度は、添加される還元型ニコチンアミド補酵素の量によって変動し、ピルビン酸定量の難点となっている。すなわち、還元型ニコチンアミド補酵素の添加量が多過ぎる場合、初期吸光度が高くなり過ぎ、吸光度測定装置の測定範囲外になることがある。また、還元型ニコチンアミド補酵素の添加量が少な過ぎる場合、初期吸光度は低くなり吸光度測定装置にとって都合は良くなるが、乳酸脱水素酵素の基質として還元型ニコチンアミド補酵素の量が化学量論より不足する場合が生じ、結果としてピルビン酸量を正確に定量出来ない難点となる。
【０００６】
一方、ピルビン酸酸化酵素を用いる、酸化酵素法によるピルビン酸の定量法は、最終的には生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの作用によってキノン色素を生じさせるため、被検体に含有される血清成分あるいは尿成分に代表されるペルオキシダーゼ阻害剤、例えばアスコルビン酸やビリルビン等の化合物の影響を受けやすく、正確にピルビン酸量を定量出来ない難点を有している。
【０００７】
これらの難点を克服するために研究されてきた特開昭６２−１４７９９号公報に記載のＤ−アラニントランスフェラーゼとＤ−アミノ酸オキシダーゼを使用する酵素サイクリングを利用した高感度なピルビン酸もしくはその塩の定量方法においては、最終的には過酸化水素量を測定する方法であり、基本的にはピルビン酸酸化酵素を使用する方法と同様に、被検体に含有される血清成分あるいは尿成分に代表されるペルオキシダーゼ阻害剤、例えばアスコルビン酸やビリルビン等の化合物の影響を受けやすい難点を依然として有している。
【０００８】
又、特開昭６４−３７３００号公報に記載のピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リン酸、及び電子受容体の存在下でピルビン酸をアセチルリン酸、二酸化炭素、及び還元型電子受容体に変換させてピルビン酸を定量する方法は、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート類とフォルマザン色素原体類の２つの化合物を必要とする。しかし、特にフェナジンメトサルフェート類の化合物は安定性が悪く、本原理を試薬化する際の大きな難点となっている。
【０００９】
特開平４−３４６７９６号公報に記載の乳酸デヒドロゲナーゼ、チオＮＡＤ類、及び還元型ＮＡＤ類を用いる酵素サイクリング法によるピルビン酸の高感度定量方法は、酵素サイクリングを利用しているため確かに高感度化は実現出来る技術ではあるが、反応系に含まれる還元型ＮＡＤ類に帰属する初期吸光度を回避出来ない欠点を有している。さらに、特開平５−９５７９８号公報及び特開平５−２１９９９１号公報に記載のピルビン酸に還元型補酵素Ａ（以下ＣｏＡ−ＳＨという）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、及び酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを作用させて、生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を測定することによりピルビン酸を定量する方法は、反応系に不安定なＣｏＡ−ＳＨを使用しなければならない難点を有している。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる従来の定量方法における多くの課題を解決すべく簡便かつ精度の高いピルビン酸の定量方法を鋭意研究した結果、被検体中のピルビン酸は、プトレッシンと酸化型ニコチンアミド補酵素の存在下でプトレッシントランスアミナーゼと４−アミノブタナール脱水素酵素の作用により、定量が容易である還元型ニコチンアミド補酵素を化学量論的に生成することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち本発明は、被検体中のピルビン酸を定量するに際し、被検体にプトレッシンおよびプトレッシントランスアミナーゼを作用させ、生成する４−アミノブタナールに酸化型ニコチンアミド補酵素および４−アミノブタナール脱水素酵素を作用させ、該酵素反応に伴って生成する還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量することによってピルビン酸量を決定することを特徴とするピルビン酸の定量方法である。
【００１２】
他の発明は、プトレッシン、酸化型ニコチンアミド補酵素、プトレッシントランスアミナーゼおよび４−アミノブタナール脱水素酵素を含有してなるピルビン酸定量用試薬である。
【００１３】
本発明のピルビン酸の定量方法は、被検体中のピルビン酸を最終的に定量性の優れた還元型ニコチンアミド補酵素に変換せしめることによって、従来の方法に代わり得る、操作が簡便で精度の高いピルビン酸の定量方法を提供するものである。
【００１４】
本発明でいう被検体とは、尿、血液、血清、血漿、培養物、培養液、あるいは細胞内液等の液体あるいは抽出液を言う。
【００１５】
本発明で使用されるプトレッシンは、フリーの塩基のものでも塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等に代表される塩化合物でも特に限定されないが、試薬の調合の際の精度および簡便さの立場から塩化合物が好適に使用される。
本発明に使用するプトレッシントランスアミナーゼは、１モルのピルビン酸と１モルのプトレッシンに対して作用し、１モルの４−アミノブタナールと１モルのアラニンを生成するものであれば特に限定されず、かかる特性を有する酵素を特に制限なく使用することが出来る。このプトレッシントランスアミナーゼの作用は以下にように示すことが出来る。
【００１６】
ピルビン酸  ＋  プトレッシン  →  ４−アミノブタナール  ＋  アラニン
かかる酵素を例示すれば、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２３９巻、７８３頁（１９６４年）に記載のエシェリヒア・コリーＢ由来のジアミン：α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼやアグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、４３巻、１０４３頁（１９７９年）に記載のシュードモナス属細菌  Ｆ−１２６由来のω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ、あるいはジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１２８巻、７２２頁（１９７６年）に記載のシュードモナス・アエルギノサ由来のγ−アミノ酪酸：α−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、および特願平１−４５４１６号公報に記載のストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属由来のプトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼが挙げられる。
【００１７】
本発明に使用される酸化型ニコチンアミド補酵素は特に限定されるものではなく、使用する４−アミノブタナール脱水素酵素が基質と認識するものであればいかなるものでも良い。例示すれば、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤ＋と略す）、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ＋と略す）、チオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ＋と略す）、およびチオニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ＋と略す）が挙げられる。
【００１８】
本発明に使用する４−アミノブタナール脱水素酵素は、１モルの４−アミノブタナールと１モルの酸化型ニコチンアミド補酵素に対して作用し、１モルの４−アミノ酪酸と１モルの還元型ニコチンアミド補酵素を生成するものであれば特に限定されず、かかる特性を有する酵素が特に制限なく使用される。この４−アミノブタナール脱水素酵素の作用を以下に示す。
【００１９】
酸化型ニコチンアミド補酵素  ＋  ４−アミノブタナール  →  還元型ニコチンアミド補酵素  ＋  ４−アミノ酪酸
このような酵素を例示すれば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５巻、１７３７−１７４１頁（１９７４年）に記載のシュードモナス（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来の４−アミノブタナール脱水素酵素、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１３巻、４１８１−４１８４頁（１９７４年）に記載のシュードモナス（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来の３−アミノプロパナール脱水素酵素、および特開昭６３−２４８３８８号公報に記載のミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の４−アミノブタナール脱水素酵素が挙げられる。
【００２０】
本発明の定量方法において、被検体にプトレッシン、酸化型ニコチンアミド補酵素、プトレッシントランスアミナーゼおよび４−アミノブタナール脱水素酵素を作用させる条件としては、生体中の成分を酵素的に定量する公知の条件が特に制限なく採用出来る。通常、反応液量は０．１〜１０ｍｌの範囲で行われるが、特に０．２〜３ｍｌの範囲が好適である。反応の際のｐＨ条件は、特に限定されないが、一般にはプトレッシントランスアミナーゼおよび４−アミノブタナール脱水素酵素の２つの酵素の酵素活性が最大に発現される条件が望ましい。そのようなｐＨ条件としてはｐＨ６．０〜１０．５の範囲が好適である。さらに、この範囲のｐＨを酵素反応の時間中維持することを目的として緩衝液を用いることが一般的である。緩衝液の種類は特に限定されないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用される。
【００２１】
これらの緩衝液の濃度は特に限定されないが、例えば２〜５００ｍＭの濃度範囲が好適である。本発明の定量方法の温度条件としては１５〜４０℃の範囲が好適である。また、反応時間は本発明の定量方法における２つの酵素反応が完了する時間であれば特に限定されないが、通常１〜３０分の範囲が一般的である。
【００２２】
また、プトレッシンの存在濃度としては、被検体中に存在するピルビン酸の濃度に対して過剰量あれば特に限定されないが、通常１〜２００ｍＭの濃度範囲で使用するのが一般的である。特に２〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。
【００２３】
本発明の定量方法および定量用試薬に使用するプトレッシントランスアミナーゼ量は、酵素の活性、反応条件、定量対象となるピルビン酸の濃度等によって異なり、一概に限定できないが、好ましくは被検体中に存在するピルビン酸が、所定の時間内に完全に４−アミノブタナールに変換されるに充分な酵素量に達していれば良い。なお、酵素量は以下、１分間当りに１μｍｏｌｅの生成物を生成させる酵素量を１Ｕまたは１ユニットと示し、酵素濃度は反応溶液１ｍｌ当りのユニット数としてＵ／ｍｌで示す。そのようなプトレッシントランスアミナーゼ量としては通常０．０１〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０Ｕ／ｍｌの範囲が好適である。
【００２４】
本発明の定量方法および定量用試薬に用いられる酸化型ニコチンアミド補酵素の濃度は、使用する４−アミノブタナール脱水素酵素の性質に依るが、一般に４−アミノブタナール脱水素酵素の酸化型ニコチンアミド補酵素に対するＫｍ値の２〜２００倍の濃度範囲、すなわち通常は０．５〜２００ｍＭの濃度範囲で添加される。特に４〜１００倍の濃度範囲、すなわち１〜１００ｍＭの濃度範囲が好適である。
【００２５】
本発明の定量方法および定量用試薬に使用する４−アミノブタナール脱水素酵素量は、酵素の活性、反応条件、定量対象となるピルビン酸の濃度等によって異なり、一概に限定できないが、好ましくは被検体中に存在するピルビン酸の酵素反応により生成した４−アミノブタナールが、所定の時間内に完全に４−アミノ酪酸に変換され、同時にその化学当量の酸化型ニコチンアミド補酵素を還元型ニコチンアミド補酵素に変換せしめるに充分な４−アミノブタナール脱水素酵素量に達していれば良い。そのような４−アミノブタナール脱水素酵素量としては通常０．０１〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で使用されるが、特に０．０５〜５０Ｕ／ｍｌの範囲が好適である。
【００２６】
本発明のピルビン酸定量用試薬は、必須成分であるプトレッシン、酸化型ニコチンアミド補酵素、プトレッシントランスアミナーゼおよび４−アミノブタナール脱水素酵素を各々前記好ましい量で通常緩衝液と混合して調製される。但し後述するように、２ステップ反応法でピルビン酸を定量する場合は、プトレッシンおよびプトレッシントランスアミナーゼを緩衝液と混合した試薬、酸化型ニコチンアミド補酵素および４−アミノブタナール脱水素酵素を緩衝液に混合した試薬の２種の試薬からなる定量用試薬とすることもできる。
【００２７】
本発明の定量方法における反応は、プトレッシン、、プトレッシントランスアミナーゼ、酸化型ニコチンアミド補酵素、４−アミノブタナール脱水素酵素、および被検体中のピルビン酸の５成分から成る複合反応である。実際に被検体中のピルビン酸を定量する際には、以下に示す２ステップ反応法と１ステップ反応法の二つの方法が任意に使用できるが、実用的には簡便さの点から１ステップ反応が好適に使用される。
【００２８】
２ステップ反応法とは、予め被検体にプトレッシンとプトレッシントランスアミナーゼと含む緩衝液を分注して１５〜４０゜Ｃ下で１〜２０分間作用させ、被検体中のピルビン酸の量に対応した４−アミノブタナールを生成せしめた後、さらに酸化型ニコチンアミド補酵素と４−アミノブタナール脱水素酵素とを含む緩衝液を分注して同温度下で２〜２０分間、生成した４−アミノフタナールと反応せしめた後に生成した還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法である。一方、１ステップ反応法とは、被検体にプトレッシン、プトレッシントランスアミナーゼ、酸化型ニコチンアミド補酵素、および４−アミノブタナール脱水素酵素の４成分を含む緩衝液を分注し１５〜４０℃下で１〜３０分間反応せしめた後に、被検体中のピルビン酸量に対応した還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法である。全試薬成分を同時に作用させても、本発明の各酵素反応は特異的且つ逐次的に進行し、ピルビン酸量に対応して還元型ニコチンアミド補酵素が定量的に生成する。
【００２９】
最終的に得られる還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法は、既存の一般的な方法を用いることができる。例えば、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨである場合は、３４０ｎｍの吸光度の増加を、生成する還元型ニコチンアミド補酵素がＴｈｉｏ−ＮＡＤＨあるいはＴｈｉｏ−ＮＡＤＰＨである場合は、４００ｎｍの吸光度の増加量を測定することにより定量できる。また、高感度に定量したい場合は、生成する還元型ニコチンアミド補酵素とテトラゾリウム塩化合物とからジアフォラーゼの作用によりホルマザン色素を生成せしめ、このホルマザン色素を比色定量することにより高感度に還元型ニコチンアミド補酵素の生成量を定量できる。
【００３０】
【作用】
本発明に基づくピルビン酸の定量方法は、被検体中のピルビン酸にプトレッシンおよびプトレッシントランスアミナーゼを作用させて４−アミノブタナールを生成せしめ、さらにこの生成した４−アミノブタナールを酸化型ニコチンアミド補酵素および４−アミノブタナール脱水素酵素を作用させて還元型ニコチンアミドを生成させ、生成した還元型ニコチンアミド補酵素を定量することを特徴とする。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によるピルビン酸の定量方法は、従来から使用されていた血清あるいは尿等に代表される被検体中の阻害物質の影響を受けず、定量時の初期吸光度が低く抑えられており、さらにアセチル−ＣｏＡのような不安定な化合物を使用しない従来のピルビン酸定量法の欠点を克服する方法である。したがって、本発明のピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬は、日常の作業としてピルビン酸の定量が簡便かつ短時間に、しかも精度良く実施できる方法および試薬を提供する。
【００３２】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定されるものではない。なお、酵素活性値を示す単位として、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を生成させる酵素量を１ユニットと示した。
【００３３】
製造例１〔プトレッシントランスアミナーゼの調製〕
プトレッシントランスアミナーゼは、次の方法で調製した。０．５％グルコース、０．４％ポリペプトン、０．５％  魚肉エキス、０．３％アセチルプトレッシン、０．２％食塩、０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ７．５）１Ｌを５Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブした後、２８℃下でこの培地にストレプトミセス・アベラニウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｌｌａｎｅｕｓＲ−２０［微工研菌寄  第５４４３号］を植菌した。２８゜Ｃで２４時間振とう培養を行った後この培養液を、予め上記と同様の組成を有する培地１５０Ｌを仕込み滅菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数３００ｒｐｍ、通気１００Ｌ／ｍｉｎで、１８時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。
【００３４】
得られた菌体の約２．７Ｋｇ（湿菌体重量）を４０％エタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）１２Ｌに懸濁し、その懸濁液をダイノミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行った。その破砕液を連続遠心分離機を使用して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のプトレッシントランスアミナーゼの総活性は２２，０００ユニット、比活性は０．０７２ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００３５】
この上清液を、予め１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化した４ＬのＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）に加え、１時間攪拌した後４０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１５Ｌで洗浄した。次いで、０．５Ｍの食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５Ｌで酵素成分を溶出させた。［総酵素活性＝１５，４００ユニット、比活性＝０．５６ユニット／ｍｇ−タンパク］
この酵素溶液を限外濾過により脱塩した後、６５℃で３０分間熱処理を行い、生じた沈澱を遠心分離により除いた。［総酵素活性＝１２，２００ユニット、比活性＝２．１ユニット／ｍｇ−タンパク］
こうして得られた酵素液を、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）で平衡化しておいた１ＬのＤＥＡＥ−セルロースのカラムに通し吸着させた。カラムを同様の緩衝液２Ｌで洗浄した後、食塩の直線濃度勾配によりプトレッシントランスアミナーゼを溶出させた。［総酵素活性＝８，８２０ユニット、比活性＝３．５ユニット／ｍｇ−タンパク］
この溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウムを２０％となるように添加し、次いで予め２０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいた０．１Ｌのブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモウニウムの逆直線濃度勾配によりプトレッシントランスアミナーゼを溶出させた。［総酵素活性＝７，４３０ユニット、比活性＝４．４ユニット／ｍｇ−タンパク］
得られた酵素溶液を限外濾過により濃縮した後、１．７ＬのセファクリルＳ−４００（ファルマシア社製）を充填したカラムに通しゲル濾過を行い活性画分を集めることによって精製プトレッシントランスアミナーゼを得た。［総酵素活性＝７，３６０ユニット、比活性＝４．５ユニット／ｍｇ−タンパク］
製造例２〔４−アミノブタナール脱水素酵素の調製〕
４−アミノブタナール脱水素酵素は、次の方法で調製した。０．５％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．２％酵母エキス、０．３％プトレッシン、０．１％リン酸第二カリウム、０．２％食塩、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、および０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ７．０）１Ｌを５Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブした後、３０℃下でこの培地にミクロコッカス・フラビダス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｉｄｕｓ）［微工研菌寄  第５６３３号］を植菌した。３０℃で２４時間振とう培養を行った後、この培養液を、予め上記と同様の組成を有する培地１５０Ｌを仕込み滅菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養を行った。培養条件は３０℃、攪拌回転数３００ｒｐｍ、通気１００Ｌ／ｍｉｎで、２２時間培養の後、培養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。得られた菌体を８Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、その懸濁液をダイノミル細胞破砕機に連続的に通過させて菌体破砕を行った。その破砕液を連続遠心分離機を使用して遠心分離し、上清液を得た。［総酵素活性＝２７７，０００ユニット、比活性＝０．１８ユニット／ｍｇ−タンパク］。
【００３６】
この上清液を、予め２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて平衡化した４ＬのＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）に加え１時間攪拌して酵素を吸着させた後、濾過した。ＤＥＡＥ−セルロースを同様の緩衝液１０Ｌで洗浄を行い、次いで同様の緩衝液に０．４Ｍの食塩を含有させた緩衝液５Ｌで酵素成分を溶出させた［総酵素活性＝１０３，０００ユニット、比活性＝４１．９ユニット／ｍｇ−タンパク］。
【００３７】
この酵素溶液を限外濾過により脱塩した後、この脱塩酵素溶液を、予め２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて平衡化した１．５ＬのＤＥＡＥセルロースカラムに４−アミノブタナール脱水素酵素を吸着させた。カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配により酵素を溶出させた［総酵素活性＝７４，５００ユニット、比活性＝７７．７ユニット／ｍｇ−タンパク］。
こうして得られた酵素液を限外濾過によって濃縮した後、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）で平衡化した１．７ＬのセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）を充填したカラムに通しゲル濾過を行い活性画分を集めた［総酵素活性＝６０，２００ユニット、比活性＝９８．９ユニット／ｍｇ−タンパク］。
【００３８】
この活性画分を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）で平衡化した５００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し酵素を吸着させた後、次いで食塩の直線濃度勾配により４−アミノブタナール脱水素酵素を溶出さることによって精製酵素を得た。［総酵素活性＝１８，０００ユニット、比活性＝１３０ユニット／ｍｇ−タンパク］。
実施例１
製造例１において得られたプトレッシントランスアミナーゼおよび製造例２において得られた４−アミノブタナール脱水素酵素の精製酵素を用いて、最初にピルビン酸定量用試薬を調製した後、ピルビン酸標準液およびその希釈液中のピルビン酸の定量を行って検量線を作成した。
【００３９】
［ピルビン酸定量用試薬の調製］
２０ｍＭ    プトレッシン・二塩酸塩
５ｍＭ    ＮＡＤ＋
５Ｕ／ｍｌ  プトレッシントランスアミナーゼ
５Ｕ／ｍｌ  ４−アミノブタナール脱水素酵素
５０ｍＭ    リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
上記の組成から成る試薬をピルビン酸定量用試薬とする。
【００４０】
［ピルビン酸の定量］
光路幅１ｃｍのキュベット中に上記のピルビン酸定量用試薬を０．９ｍｌ分注し、３０℃下で２分加温した。その後、２ｍＭに調製したピルビン酸標準液を、あるいはその希釈液を試料溶液として各々分注し混和後、ただちに３０゜Ｃ下で１０分間インキュベイションを行い、次いで生成物であるＮＡＤＨに帰属される３４０ｎｍの吸光度を測定した。同様にして試料溶液の代わりに精製水を同量分注して反応させて吸光度を測定した。結果を表１および図１に示す。
【００４１】
【表１】
0003586485.tif 000002
【００４２】
上記結果から、試料溶液中のピルビン酸量と生成する還元型ニコチンアミド補酵素量との間に優れた直線関係が得られことがわかり、ピルビン酸の定量方法として好適な方法であることを示している。
【００４３】
実施例２
本発明の定量方法の性能を評価する目的で、実施例１と同様のピルビン酸定量用試薬を用いて添加回収試験を行った。血清試料、尿試料、培養上清液、および精製水の各検体に各々ピルビン酸の最終濃度が１．０ｍＭになるように添加したものを被検体とした。尚、血清および尿は健常人から採取したものを、培養上清液は大腸菌をＬＢ培地で２４時間培養した後２５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した上清液を使用した。
【００４４】
光路幅１ｃｍのキュベット中に実施例１に示したピルビン酸定量用試薬を０．９ｍｌ分注し、３０℃下で２分加温した。その後、１００μｌの各被検体を試料溶液として各々分注し混和後、ただちに３０゜Ｃ下で１０分間インキュベイションを行い、次いで生成物として増加したＮＡＤＨに帰属される３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、コントロール試験として、試料溶液としてピルビン酸を添加する前の各被検体を使用し、上記と全く同様の操作を行い３４０ｎｍの吸光度を測定した。添加回収率は、以下の式から算出した。結果を表２に示す。
【００４５】
【数１】
0003586485.tif 000003
【００４６】
【表２】
0003586485.tif 000004
【００４７】
何れの被検体も添加したピルビン酸が高回収率で定量され、被検体の種類によらずまた被検体中の雑物質の影響を受けずに高精度で定量可能であることを示している。
【００４８】
比較例１
ピルビン酸定量方法として代表的な方法であるピルビン酸酸化酵素法による被検体中のピルビン酸定量結果を比較例１として示す。
【００４９】
［ピルビン酸定量用試液の調製］
０．５０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン
０．７０ｍＭ  ＴＯＯＳ
０．２０ｍＭ    チアミンピロフォスフェイト
１０μＭ  ＦＡＤ
１．０ｍＭ    ＥＤＴＡ
１０ｍＭ  硫酸マグネシウム
５Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）
５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸酸化酵素（東洋紡社製）
５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．９）
上記の組成から成る試液をピルビン酸酸化酵素法定量試液とする。
【００５０】
［ピルビン酸の定量］
被検体として実施例２に記載したものと全く同様の血清試料、尿試料、培養上清液、および精製水各々にピルビン酸の最終濃度が２００μＭになるように添加したものを使用した。光路幅１ｃｍのキュベット中に上記のピルビン酸酸化酵素法定量試液を０．９ｍｌ分注し、３０℃下で２分加温した。その後、１００μｌの各被検体を試料溶液として各々分注し混和後、ただちに３０゜Ｃ下で１０分間インキュベイションを行い、次いで生成したキノン色素に帰属される５５０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、コントロール試験として、試料溶液としてピルビン酸を添加する前の各被検体を使用し、上記と全く同様の操作を行い５５０ｎｍの吸光度を測定した。添加回収率は、実施例２の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
0003586485.tif 000005
【００５２】
表３に示す結果の通り、ピルビン酸酸化酵素法による被検体中のピルビン酸の定量精度は回収率の点から明らかに劣ることが示された。
【００５３】
比較例２
ピルビン酸定量方法として代表的な一方法である乳酸脱水素酵素法による被検体中のピルビン酸定量結果を比較例２として示す。
【００５４】
［ピルビン酸定量用試液の調製］
０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ
５Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素（東洋紡社製）
５０ｍＭ    リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
上記の組成から成る試液を乳酸脱水素酵素法定量試液とする。
【００５５】
［ピルビン酸の定量］
被検体として実施例２に記載したものと全く同様の血清試料、尿試料、培養上清液、および精製水各々にピルビン酸の最終濃度が１．０ｍＭになるように添加したものを使用した。光路幅１ｃｍのキュベット中に上記の乳酸脱水素酵素法定量試液を０．９ｍｌ分注し、３０℃下で２分加温した。その後、１００μｌの各被検体を試料溶液として各々分注し混和後、ただちに３０゜Ｃ下で１０分間インキュベイションを行い、次いで反応に使用され減少したＮＡＤＨに帰属される３４０ｎｍの吸光度を測定した。さらに、コントロール試験として、試料溶液としてピルビン酸を添加する前の各被検体を使用し、上記と全く同様の操作を行い３４０ｎｍの吸光度を測定した。添加回収率は、以下に示す式から算出した。結果を表４に示す。
【００５６】
【数２】
0003586485.tif 000006
【００５７】
【表４】
0003586485.tif 000007
【００５８】
表４に示す結果の通り、乳酸脱水素酵素法による被検体中のピルビン酸の定量はピルビン酸添加前の測定における吸光度が高く、結果として回収率即ち定量精度の面で劣ることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピルビン酸標準液およびその希釈液を本発明の方法で定量した際の検量線を示す図である。
【図１】
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