(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体であって、約３０００：１と約１：１との間の比で、酸化型グルタチオンを基にした化合物および金属物質を含む複合体であって、ここで、該金属物質が、白金およびパラジウムからなる群より選択される金属を含み、
該酸化型グルタチオンを基にした化合物が以下の式：
【化１】
0003547400.tif 000059
を有し、
ここで、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが、同一または異なったものであり得、そして、各々が有機ユニットおよび該有機ユニットの塩からなる群より選択され、
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが、同一または異なったものであり得、そして、各々がアミン基、カルボキシル基およびアミドからなる群より選択されるユニットを含む、
複合体。
【請求項２】
前記複合体が、約１０００：１と約１：１との間の比で、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物および前記金属物質を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体が、約１０００：１と約１０：１との間の比で、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物および前記金属物質を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体が、約１０００：１と約１００：１との間の比で、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物および前記金属物質を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記金属が、白金である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記白金物質が、白金塩、配位化合物および有機金属化合物からなる群より選択される、請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
前記白金物質が、白金配位化合物である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記配位化合物が、シスプラチンである、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨの任意の２つが、少なくとも１つの共有結合によって互いに連結する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨの任意の２つが、アミド結合によって互いに連結する、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが、同一または異なったものであり得、そして各々がアミノ酸を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、酸化型グルタチオンであり、そしてＡとＥの両方が−ＣＯ２Ｈであり、ＢとＤの両方が−ＮＨ２であり、ならびにＧとＨの両方が−ＣＯ２Ｍであり、Ｍが対イオンである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、Ｓ−チオエチルアミングルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、ビス−［ＤＬ−６，８−チオエト酸］・グルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１５】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、［β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル］・グルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１６】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、［９−β−Ｄ−リボフラノシルアデニル］・グルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１７】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、ビス−［Ｌ−２−アミノ−４−［メチルチオ］ブタン酸］・グルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、ビス−［Ｌ−フェニルアラニル］グルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１９】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、酸化型グルタチオンのアシル化された第一級グルタミン酸アミノ基を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項２０】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、ビス−［メチオニル］・グルタチオンジスルフィド、ビス−［アスパルチル］・グルタチオンジスルフィド、ビス−［ヒスチジル］・グルタチオンジスルフィド、ビス−［３−ヨード−チロシル］・グルタチオンジスルフィド、［γ−アミノブタノイル］・グルタチオンジスルフィド、ビス−［γ−ヒドロキシブタノイル］・グルタチオンジスルフィド、ビス−［リポイル］・グルタチオンジスルフィド、およびビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル］・グルタチオンジスルフィドからなる群より選択される、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、複素環式炭酸および複素環式ヌクレオチドからなる群より選択されるユニットに対してアミド結合またはホスホルアミド結合を有する、請求項８に記載の複合体。
【請求項２２】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、ビス−［ピリジン−３−カルボニル］・グルタチオンジスルフィド、ウリジン−５’−モノホスファトイル・グルタチオンジスルフィド、イノシン−５’−モノホスファトイル・グルタチオンジスルフィド、フォリクリルスクシニル・グルタチオンジスルフィドおよびグリセロール−１，３−ジホスファチルグルタチオンジスルフィドからなる群より選択される、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、テトラ−ドーパミングルタチオンジスルフィドおよびテオフィリングルタチオンジスルフィドからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項２４】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、前記金属物質と化学的に相互作用する、請求項１に記載の複合体。
【請求項２５】
前記複合体が、以下の式：
【化２】
0003547400.tif 000060
を有する、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
酸化型グルタチオンを基にした化合物のジスルフィド結合を安定化するための方法であって、該酸化型グルタチオンを基にした化合物を、白金およびパラジウムからなる群より選択される金属を含む金属物質と相互作用させる工程を包含し、
該酸化型グルタチオンを基にした化合物が、以下の式：
【化３】
0003547400.tif 000061
を有し、
ここで、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが、同一または異なったものであり得、そして、各々が有機ユニットおよび該有機ユニットの塩からなる群より選択され、
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが、同一または異なったものであり得、そして、各々がアミン基、カルボキシル基およびアミドからなる群より選択されるユニットを含む、
方法。
【請求項２７】
前記金属が、白金である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記白金物質が、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物に比例して、約０．０００３当量〜約１当量の間の量で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記白金物質が、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物に比例して、約０．００１当量〜約０．０１当量の間の量で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記白金物質が、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物に比例して、約０．００１当量〜約０．１当量の間の量で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記白金物質が、前記酸化型グルタチオンを基にした化合物に比例して、約０．００１当量〜約１当量の間の量で存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記白金物質が、白金金属、塩、配位化合物および有機金属化合物からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記白金物質が、シスプラチンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２６に記載の方法であって、前記相互作用させる工程が、以下：
グルタチオントリペプチドを基にした化合物を提供する工程；および
グルタチオントリペプチドナトリウム塩と、酸化剤ならびに白金およびパラジウムからなる群より選択される金属物質とを相互作用させ、トリペプチドダイマー、つまり、酸化型グルタチオンの構造的アナログである化合物、すなわち、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドを得る反応、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記酸化剤が、酸素および過酸化水素からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酸化剤が、過酸化水素である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約１当量より少ない前記過酸化水素、および約０．０００３当量と約１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約１当量より少ない前記過酸化水素、および約０．００１当量と約０．１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約１当量より少ない前記過酸化水素、および約０．００１当量と約０．０１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約１当量より少ない前記過酸化水素、および約０．００１当量と約１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約０．９当量の前記過酸化水素、および約０．０００３当量と約１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約０．９当量の前記過酸化水素、および約０．００１当量と約０．１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約０．９当量の前記過酸化水素、および約０．００１当量と約０．０１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応工程が、１当量の前記グルタチオンを基にした化合物と、約０．９当量の前記過酸化水素、および約０．００１当量と約１当量の間の前記白金物質を反応させる工程を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記相互作用工程が、約０．０００３当量〜約１当量の間の前記白金物質を、約１当量の前記酸化型グルタチオンを基にした化合物に添加する工程を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩からなる群より選択される塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バナジウム塩、マンガン塩、鉄塩、モリブデン塩、亜鉛塩、および銀塩からなる群より選択される塩である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩および遷移金属の塩を含む群より選択される前記酸化型グルタチオンを基にした塩が、得られる、すなわち合成される、請求項３４または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記酸化型グルタチオンを基にした化合物が、フッ化物含有塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】
サイトカインおよび造血因子の内因性産生を調節および／またはサイトカインの効果を再現し、従って、正常細胞、腫瘍細胞および／またはウイルスに形質転換された細胞において、代謝、増殖、分化およびアポトーシス誘導のプロセスの調節を提供し、そして有効成分として、請求項１〜２５に記載の、有効な量の複合体を含む医薬薬剤。
【請求項５１】
腫瘍学的障害、感染障害、免疫学的障害、血液学的障害、虚血性障害、神経変性障害、代謝障害および内分泌疾患の処置について示された、請求項５０に記載の医薬薬剤。
【請求項５２】
ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして肺癌の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５３】
ビス−［３−ヨード−チロシル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして黒色腫の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５４】
ビス−［ドーパミン］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして大脳腫瘍の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５５】
ビス−［システアミン］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして結腸直腸癌の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５６】
システアミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして乳癌の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５７】
ＧＳＳＧ・Ｐｔの二亜鉛塩を含み、そして前立腺癌の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５８】
テオフィリン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして卵巣癌の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項５９】
リチウム塩−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして急性リンパ芽球性白血症の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６０】
ジリチウム塩−ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびシステアミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして急性骨髄芽球性白血症の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６１】
ビス−［ヒスチジル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして結核症の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６２】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔからなる群より選択され、そしてＢ型ウイルス性肝炎、Ｃ型ウイルス性肝炎およびその混合感染からなる群より選択される疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６３】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔからなる群より選択され、そしてヘルペスの処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６４】
テトラ−ドーパミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして髄膜炎、敗血症からなる群より選択される疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６５】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびテトラ−ドーパミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして腹膜炎の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６６】
抗原−ＧＳＳＧ・Ｐｔおよび／または抗体−ＧＳＳＧ・Ｐｔからなる群より選択され、そしてウイルス起源の特別危険な感染、特に、リフトバレー熱および細菌起源の特別危険な感染、特に、野兎病の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６７】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして急性膵炎の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６８】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして化膿性術後後遺症の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項６９】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびウリジン−［５−モノホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そしてＡＩＤＳの処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７０】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびウリジン−［５−モノホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして感染起源の免疫抑制の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７１】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして糸球体腎炎の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７２】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして慢性関節リウマチの処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７３】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして膠原病の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７４】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組み合わせからなる群より選択され、そして全身性エリテマトーデスの処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７５】
ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびジヒドロフルオリド−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合わせからなる群より選択され、そしてアレルギー状態であるアトピー形態の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７６】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体のバナジウム塩を含み、そしてＩ型糖尿病の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７７】
ビス−［リポイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そしてＩＩ型糖尿病の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７８】
ビス−［フェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして虚血性大脳状態の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項７９】
［β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして虚血性心臓疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８０】
グリセロール−［１，３−ジホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして機能的心筋不全の症候群として主に表された虚血性心臓疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８１】
ビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして神経変性疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８２】
ビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして脱髄疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８３】
γ−ヒドロキシ−［ブタノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして大脳低酸素症の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８４】
γ−アミノ−［ブタノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして躁うつ病の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８５】
ビス−［ニコチノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして血管アテローム性動脈硬化形成リポタンパク質のバランスにおける代謝障害とともに表された疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【請求項８６】
フォリクリル−［スクシニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含み、そして内分泌疾患の処置を示す、前記誘導された複合体からなる、請求項５０または５１に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、医学に、より詳しくは、薬理学に関する。すなわち、本発明は、ペプチド起源の活性な代謝産物に基づく医学的薬剤を産生する方法に関し、これは、臨床的実施において、種々の病理的症候群および疾患を、正常細胞および形質転換された細胞の代謝、増殖、分化およびアポトーシスのプロセスに対する区別された影響によって防止および処置するために使用されることが意図される。
【０００２】
（発明の背景）
抗感染性および抗腫瘍性の化学療法の実用的医学への、実行を絶えず増強する現代の薬理学産業は、２つの医学−生物学的問題（ＭＤＲ遺伝子系の活性化に起因する場合を含む、医学的薬剤に対する耐性（寛容および薬理学的効力の減少）の形成；ならびに第一に免疫担当細胞系および造血；心毒性、肝毒性、腎毒性および、神経毒性の変更によって明らかとなった所望でない吸収効果の形成）の広がりを容易にする。これらの問題の典型的な原因は、その物理的−化学的特性によって非常に有効であり得るが、しかしまた、その正に性質において、生物に対して外来物であり得る、化学療法薬剤および単細胞微生物によって産生された薬剤の広範な投与である。
【０００３】
従って、理論的および実用的な医学的研究は今、天然の重要な代謝産物（すなわち、通常は、生理的に重要および適切なプロセスについての多くの生物学的に活性な生成物の内因性の産生および改変についての連鎖反応を誘発することが自然に決定される、ペプチド起源の細胞内の生化学的因子）により大きな注意を払っている。
【０００４】
広範に研究されるべきことが公知である代謝産物は、特に、硫黄含有ペプチドおよびそれらの誘導体であり、第一にはこれはチオール基である。所定の基において、トリペプチド「グルタチオン」（γ−グルタミル−システイニル−グリシン；本明細書の以下ではＧＳＨ）の生物学的影響が広範に研究されるべきことが公知である。
【０００５】
グルタチオントリペプチド二量体である、酸化型のグルタチオン（ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシン；本明細書の以下ではＧＳＳＧ）（ここで、上記の式を有する２分子のトリペプチドは、システイン残基間で共有結合を介して連結されている）もまた、周知である。
【０００６】
サイトカインおよび造血因子（コロニー刺激因子、すなわちコロニー増殖因子を含む）の内因性産生を刺激／調節するという、ＧＳＳＧの独特の性質が見出された［１］。その上、生物学的媒体において、酸化型形態で外因的に導入されたＧＳＳＧに薬学的薬剤寿命において示された［１］安定化は、これらの効果を増大させた。主要なシグナル伝達系に対する、および後者を介した、増殖、分化およびアポトーシスに対するサイトカインの効果の調節を決定する細胞ゲノムに対する、サイトカインの普遍的な影響について調整されるサイトカインとの相互作用の後に、細胞（組織、そして、従って、器官）において発生する事象は、周知である。
【０００７】
国際出願［２］において、活性の主体として酸化型のグルタチオン（ＧＳＳＧ）の誘導体を以下のものとして含む医学的薬剤の群が与えられている：それらの塩；またはＧＳＳＧとそれらの塩との組み合わせを含む複合薬物；または新しい組成物としての誘導体（すなわち、ＧＳＳＧと別の化合物との間での共有結合の作製を通して後者が得られた場合、新しい化合物の式）。その上、ＧＳＳＧ分子のジスルフィド形態を変化の度合で安定させる全ての技術的な解決策は、正常な状態におけるサイトカインの誘導および造血因子の産生において有意により効果的であり、そして病的な状態においてさらに大きな程度で効果的であることが最初に実証された。さらに、ジスルフィドの形態として、より大きな度合いのＧＳＳＧ分子の安定性によって特徴付けられたＧＳＳＧ誘導体の薬物形態は、生物学的培地における新しい薬物動力学、および大部分の調節効果を刺激するだけでなく、大部分の調節効果を決定するさらに非常に多種のサイトカインおよび造血因子の産生を誘導する能力、ならびに一定の範囲のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の効果の再生を特徴とした。
【０００８】
還元型のグルタチオン（ＧＳＨ）の前駆体からグルタチオントリペプチド二量体（すなわち、酸化型のグルタチオンであるＧＳＳＧ）を得るための方法は、周知である。
【０００９】
ところで、還元型のグルタチオン形態を酸化するためには３つの主要な方法がある。第１に、ＧＳＨにおけるシステインの、かなり不安定なメルカプト−ＳＨ基［３］は、大気酸素のような弱酸化剤で酸化され得る［４、５］。しかし、この場合は反応速度がかなり低く、そして所望の収量には非常に長い時間（何日も）を必要とする。重金属イオンおよび、特に、有毒な銅による触媒作用は、純粋な薬学的薬を得るには、重大な問題を生じ得る。
【００１０】
別の酸化方法は、過酸化水素、ヨウ素、フェロシアン化カリウムなどのような、より強力な酸化剤を含む［６、７］。これらの反応は、一般的に、ずっと速く進む（数十分から数時間）が、反応条件を制御することが難しいのが欠点であり、その結果、酸化生成物（例えば、対応する酸の誘導体）による生成物の重大な汚染となり得る。従って、時々、かなり骨の折れる、さらなる精製手順を加える必要があり、この精製手順は、このプロセスをひどく値上がりさせ得る。
【００１１】
なお、別の酸化方法は、酸化剤としての気体状物質（窒素酸化物）、スルホキシドおよび他の化合物の使用を含むが、これらの酸化剤は稀であり得、規模拡大には受け入れられない［８、９］。
【００１２】
技術的な本質に関してはもっとも近い、安定化されたジスルフィド結合を有する複合体として酸化型のグルタチオンを得るための以前に公知の別の方法は、酸化剤としての過酸化水素の使用を含む［６］。このプロセスは、ｐＨが約８．０〜８．５の水溶液中で、過酸化水素を当量用いて、室温で行われる。その反応時間は約１時間であり、そして生成物収率は９０％である。主な不純物（１０％まで）は、他の酸化生成物であり、この酸化生成物は高価な分取ＨＰＬＣ分離によってしか取り除かれ得ず、この分離は薬物のコストをひどく増大させ得る。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、サイトカインおよび造血因子の内因性産生の調節、従って、正常細胞における物質代謝、増殖および分化の調節、ならびに腫瘍形質転換細胞および／またはウイルス形質転換細胞におけるアポトーシス機構の誘導に基づいて種々の疾患を処置するための、ＧＳＳＧに基づく所定の特性を有する新しい薬学的に受容可能な化合物（すなわち、酸化型グルタチオンの構造アナログ、すなわち、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチド）ならびに薬学的に受容可能なそれらの誘導体の作製を含む。
【００１４】
好ましい実施形態の例を含む適用された発明において、当該分野において認められている以下の用語が使用される。
【００１５】
一般に、「複合体」は、異なる化学種の混合物を言い得る。その「混合物」は、物理的な混合物または化学的な混合物（すなわち、化学結合または静電相互作用のいずれかを含む化学的相互作用を有する）であり得る。１つの実施形態において、その混合物は、溶液中に異なる化学種を溶解および／または懸濁し、そして生じた固体を沈殿または濾過することによって調製され得る。別の実施形態において、その混合物は、配位（水素）または弱い共有結合によって連結された、異なる化学種（大部分は、２つより多くない薬剤）を含む均一溶液であり得る。
【００１６】
「酸化型グルタチオンに基づく化合物」とは、二量体の各々の単位がカチオン基（このカチオン基で、その塩が得られる）；またはシステイン基と結合したグルタミン酸誘導体、またはグリシン基の塩誘導体を含み、そしてトリペプチドの各々の単位が、システインの硫黄原子によって互いに対応して結合して、硫黄−硫黄結合（ジスルフィド結合）を形成する、グルタチオン二量体の基本構造を有する任意の化合物を言う。「誘導体」は、酸化型グルタチオンに基づく化合物または前駆体の少なくとも１つの反応性基を、別の化学種と反応させることによって調製され得る。酸化型グルタチオンに基づく化合物の例は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ自体、すなわち、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドである。
【００１７】
本出願で使用される場合、「薬学的に受容可能な塩」は、身体上に対する好ましくない有害な影響を伴わずに身体内での使用において受容可能である塩の形態の任意の複合誘導体を含み、例えば、ナトリウム、リチウム、亜鉛またはバナジウムのカチオン、すなわち、それぞれナトリウム、リチウム、亜鉛またはバナジウムの塩を含む。
【００１８】
本出願で使用される場合、「薬学的に受容可能な組成物」（誘導体）は、薬学的に受容可能な物質としてその複合体またはその誘導体を含み、そしてＧＳＳＧ・Ｐｔに共有結合した活性な代謝産物または他の化学的化合物の群を含み得る。例えば、このような誘導体は、フェニルアラニンまたはシスタミンに共有結合したＧＳＳＧ・Ｐｔである。
【００１９】
本出願で使用される場合、「代謝」は、生存する生物内で起こる、上記の生物における生存機能の維持を担うすべての生化学的反応の全体を含む［１２］。
【００２０】
本出願で使用される場合、「増殖」は、（細胞の）エレメントを構成することに起因した同様の形態（細胞）の繁殖または増加を含む［１３、１４］。
【００２１】
本出願で使用される場合、「分化」は、相対的に単純な機能から、組織特異的な遺伝子発現による所定の細胞型に付随する形態学的および／または機能的な不均質性においてのような、より複雑な、特化した機能への細胞転換を伴う元のものと区別する特徴の獲得または保有を含む細胞の変化を含む［１５、１６、１７、１８］。
【００２２】
本出願で使用される場合、「アポトーシス」は、遺伝子でプログラムされた、細胞外または細胞内のシグナルによって開始された生理学的な細胞死の形態学的に識別可能な形態を含む［１９、２０、２１］。
【００２３】
本出願で使用される場合、「サイトカイン」は、免疫応答の発達、造血および異なる疾患の病因において重要な役割を果たし、遺伝子の活性化を介してその効果を発揮し、全ての免疫系エレメントについての調節に関与する、異なる細胞型によって産生されたペプチド起源の調節化合物を含む。［１９、２０］
本出願で使用される場合、「医学的薬物」は、腫瘍性疾患、感染性疾患、血液学的疾患、免疫学的疾患、神経変性疾患、または他の疾患に対して治療効果を有する、本発明の複合体（例えば、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよび誘導体）を含む任意の薬物形態を含む。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍性および感染性疾患」、「種々の起源の造血および免疫抑制」、および「他の疾患」は、任意の腫瘍性または感染性疾患、赤血球または骨髄の抑制によって引き起こされるかまたは付随する任意の状態、あるいは量的なまたは機能的な免疫パラメーターにおける減少、ならびに任意の他の疾患または病理学状態を意味し、ここで、上記のサイトカインおよび／または造血因子の内因性の産生および／またはアポトーシス機構の誘導の刺激／調節が、当業者によって有利とみなされる。
【００２５】
本発明は、安定化されたジスルフィド結合を有する、酸化型グルタチオンに基づく多数の化合物を開示し、そして特に、本発明の化合物と金属物質とを約３０００：１〜約１：１の間の比で含む複合体を開示し、ここで、この金属物質は、白金およびパラジウムからなる群から選択される金属を含み、ここで、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、金属物質と化学的に相互作用する。この所定の群の金属は、酸化反応に関する白金およびパラジウムの触媒特性に起因して選択される。好ましくは、この金属は白金である。なぜなら、白金は、低い濃度において効果的な触媒だからである。理想的に、酸化型グルタチオンに基づく化合物と組み合わせた金属物質は、複合体を生物学的媒体において溶解性にする。
【００２６】
本発明の１つの局面は、酸化型グルタチオンに基づく化合物および金属物質を含む複合体を提供する。不溶性の部分が生体系において何らかの毒性効果または危険な効果を生じない限り、金属物質のほんの一部は不溶性であり得る。白金物質は、白金の塩、配位化合物、および有機金属化合物からなる群から選択され得る。好ましくは、その白金物質は、シスプラチン（シス−Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２すなわちシス−ジアミンジクロロ白金（塩化白金すなわち白金の塩化塩）または白金のカリウム塩）のような白金配位化合物である。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明は、酸化型グルタチオンに基づく新しい化合物およびシス−ジアミンジクロロ白金または白金酸カリウムの生成に関する。好都合な短縮形態の表示法が本明細書において使用される。例えば、ＧＳＳＧ自体およびシスプラチンを含む複合体は、ＧＳＳＧ・Ｐｔと表わされる。誘導体は、新しく付加された化学基によって表わされる（例えば、ビス−［ヒスチジル］−ＧＳＳＧ）。
【００２８】
本発明はまた、酸化型のグルタチオンを、安定化されたジスルフィド結合を有し、式：ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシン二ナトリウム塩を有し、シス−ジアミンジクロロ白金または白金酸カリウムのような白金金属を、モル比で３０００：１で、より好ましくはモル比で１０００：１、または１００：１、または１０：１で有する複合体として得るための、新しい方法を提供する。
【００２９】
本発明に従って、その複合体は、それを生物学的媒体に導入した際に安定化されたジスルフィド結合を有し、そして従って、生物学的媒体中でジスルフィド形態において、より長い薬物半減期が提供されることが特徴付けられる。
【００３０】
複合体を生成するための本方法の一般的な手順は、触媒としての白金物質、特に、シス−ジアミンジクロロ白金または白金酸カリウムと組み合わせた過酸化水素酸化剤としての酸化反応のための還元型のグルタチオンを使用する工程を包含する。この方法は、より少ない量の過酸化水素（例えば、０．９当量）に使用を許容し、その結果、ＧＳＳＧについての非常に高い収率（ＨＰＬＣのデータによると、９８％より大きい）に加えて、超酸化生成物の除去となる。従って、得られた生成物は、高い純度を有し、さらなる精製を必要としない。
【００３１】
任意の上記の手順を通して得られる、手近の酸化型のグルタチオンと複雑な白金化合物との、所定の割合におけるの単純な混合が、有意に小さな技術的および経済的影響を与えることに注意すべきである。手近の酸化型のグルタチオン（その価格は還元型の価格より２〜３倍高い）の購入または酸化形態の合成の実施においてさらなる支出を負った場合、得られた薬物の精製（すなわち、２段階の複合体の生成）のために使用する費用が発生する。
【００３２】
本発明の別の局面は、酸化型グルタチオンに基づく化合物のジスルフィド結合の安定化のための方法を提供する。この方法は、酸化型グルタチオンに基づく化合物と金属物質との相互作用を含む。この金属物質は、白金およびパラジウムからなる群から選択される金属を含む。「ジスルフィド結合の安定化」は、ＧＳＳＧシステインの２つの硫黄原子の間の結合を維持し、そして酸化型グルタチオンに基づく化合物（例えば、ＧＳＳＧ）の還元形態（例えば、ＧＳＨ）への容易な転換を防止するためのプロセスを言う。長時間の間、グルタチオンに基づく化合物をＧＳＳＧの形態で維持することによって、この化合物は、応答した長い期間にわたって、生物学的媒体において、薬学的に効果的であり得る。
【００３３】
１つの実施形態において、「酸化型グルタチオンに基づく化合物と金属物質との相互作用」は、グルタチオンに基づく化合物を提供する工程、およびこの化合物を酸化剤および白金物質と反応させる工程を含む。「グルタチオンに基づく化合物」とは、グリシン／塩／誘導体に結合したシステイン／塩／誘導体に結合したグルタミン酸／塩／誘導体を含む構造を有する任意の化合物を言う。グルタチオンに基づく化合物の例としては、グルタチオン自体または任意の誘導体が挙げられ、ここで、誘導体は、反応性基を別の化学種と反応させることによって調製され得る。得られた生成物は、酸化型のグルタチオンの構造アナログであり、すなわち、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドである。従って、本発明のこの実施形態において、グルタチオンに基づく化合物はＧＳＨのような還元形態であり、酸化剤との反応は、グルタチオンに基づく化合物の硫黄−硫黄結合を生成するための酸化を含む。この酸化剤は、硫黄に基づく別のラジカルと反応してグルタチオンに基づく化合物のＳ−Ｈ結合を切断して、最終的に硫黄−硫黄結合を提供し得る、硫黄に基づくラジカルを有する化合物および水素原子を生成し得る任意の種であり得る。このＳ−Ｈ結合の切断を行い得る種々の酸化剤が、当該分野において周知である。好ましい実施形態において、この酸化剤は、酸素および過酸化水素からなる群から選択される。
【００３４】
本方法において、グルタチオンに基づく化合物との、酸化剤および白金物質との反応は、酸化反応を含む。反応物の相対量は、好ましくは約１当量のグルタチオンに基づく化合物と、約１当量未満の過酸化水素のような酸化剤、そしてより好ましくは、約０．９当量の過酸化水素である。別の実施形態において、この酸化反応は、約１当量のグルタチオンに基づく化合物と、約０．０００３当量と約１当量との間の白金物質との、好ましくは約０．００１当量と約１当量との間の白金物質との、より好ましくは約０．００１当量と約０．１当量との間、さらにより好ましくは約０．００１当量と０．０１当量との間で、１当量未満の酸化剤の存在下での反応を含む。別の実施形態において、約１当量のグルタチオンに基づく化合物を、約１当量の白金物質と、１当量未満の酸化剤の存在下で反応させる。
【００３５】
１つの実施形態において、この方法は、グルタチオンに基づく化合物を約０．９当量の過酸化水素および約０．００１当量のシスプラチンで酸化する工程を包含する。この方法の１つの有利な特徴は、グルタチオンに基づく化合物の増大した酸化速度である。本方法の別の有利な特徴は、得られた複合体の収率が、約９８％を超える量まで増加し、そしてこの増加した収率が、増大した純度に伴うことである。この複合体の精製は、液体クロマトグラフィーが行われて、９９％を超える複合体の純度を得るという点で有意な程度まで単純化され、この純度は医薬品規格に従う。先行技術の方法は、その方法次第で７５〜９３％の酸化型グルタチオンの純度を達成したのみである。
【００３６】
好ましい実施形態において、その複合体は、シス−ジアミンジクロロ白金の存在下の、還元型グルタチオンの酸化によって１工程で合成され、このシス−ジアミンジクロロ白金は、酸化反応触媒として機能し得る。その反応条件は、１当量未満の過酸化水素の使用によって正確に調節され得る。従って、超酸化生成物の形成は減少し得、生成物のほぼ定量的な収率となる。従って、複合体の１工程合成は、有意な技術的単純化および安定化されたジスルフィド結合を有するＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体の生成を提供する。
【００３７】
好ましい実施形態において、この反応をモノナトリウム塩として還元型グルタチオンを含む溶液中で実行し、そして室温にて撹拌しながら約０．９当量の過酸化水素および以下：
ａ）  Ｐｔ［（ＮＨ３）２］Ｃｌ２  シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ），
ｂ）  Ｋ２［ＰｔＣｌ４］  テトラクロロ白金（ＩＩ）カリウム，
ｃ）  Ｋ２［ＰｄＣｌ４］  テトラクロロパラジウム（ＩＩ）カリウム，
の組成式を有する約０．００１当量の上記の水可溶性白金錯体化合物またはパラジウム錯体化合物を加えたこの化合物はＧＳＨ分子の酸化反応のための触媒として機能する。この酸化反応は、代表的に約１．５〜２時間で進む。酸化プロセスの完全性についてのコントロールを、ＨＰＬＣアッセイによって行い得る。このプロセスを、反応溶液の親液性乾燥によって完了し、モル比１０００：１（白金およびナトリウムの分光分析によって確認した）の酸化型グルタチオンおよびシス−ジアミンジクロロ白金から成る複合体を得る。アミノ酸アッセイのデータ、ＮＭＲ（１Ｈ）スペクトルのデータ、ＨＰＬＣによる保持時間のデータに従う、得られた複合体のペプチド構成は、ヘキサペプチド、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシンに相当する。この混合物の含量は２％を超えず、そしてジナトリウム塩としての生成物収率は、乾燥複合体について計数して、９６〜９８％である。
【００３８】
本発明の別の局面は、サイトカインおよび造血因子の内因性産生を刺激する方法を提供し、この方法は、サイトカインもしくは造血因子または両方の刺激を必要とする哺乳動物の身体へ、約３０００：１〜約１：１の間の比で酸化型グルタチオンに基づく化合物および金属材料を含む複合体の有効量を導入する段階を含み、ここでこの金属材料は白金およびパラジウムから成る群から選択される金属を含む。
【００３９】
本発明の別の局面は、サイトカインおよび造血因子の内因性産生を刺激する酸化型グルタチオンに基づく化合物の能力を増強しそして長期化する方法を提供する。この方法は、約３０００：１〜約１：１の間の比で酸化型グルタチオンに基づく化合物の金属材料との相互作用の段階を含み、ここで、この金属材料は、白金およびパラジウムから成る群から選択される金属を含む。
【００４０】
さらに、本発明の別の局面は、腫瘍学的疾患、感染性疾患、虚血性疾患または神経変性疾患から成る群から選択される疾患を有する被験体を処置するための方法を提供する。この方法は、治療効果を得るように、サイトカインおよび／もしくは造血因子あるいは両方の内因性産生を刺激するための有効量において、約３０００：１〜約１：１の間の比における酸化型グルタチオンに基づく化合物および金属材料を含む複合体の、このような処置を必要とする被験体への投与を含む。「治療効果」は、患者の状態の緩和、好ましくない身体状態の予防または治癒を含み、そして通常細胞における増殖の調節、通常細胞における分化の調節、および形質転換細胞におけるアポトーシスの誘導から成る群から選択されるプロセスを含み得、ここでこの形質転換細胞は、まず第１に病理学的に変質された細胞、腫瘍性形質転換細胞およびウイルス形質転換細胞を含み得る。
【００４１】
１つの実施形態において、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、一般式：
【００４２】
【化４】
0003547400.tif 000002
を有し、ここでＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨは、有機単位および有機単位の塩から成る群から各々選択され得る。好ましくは、「有機単位」は、グルタチオンベースの化合物が生物学的培地において可溶のままであることを可能にし、そしてさらに、有機単位は、適用された投薬量において酸化型グルタチオンに基づく化合物へ毒性を与えるべきではない。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨが同一または異なり得ることが理解される。好ましくは、Ａ〜Ｈ基は、アミン基、カルボキシル基およびアミドから成る群から選択される単位を各々含み得る。例えば、Ａ〜Ｈは、アミノ酸またはアミド結合を介して結合された誘導体を示し得る。あるいは、Ａ〜Ｈの任意の２つは、お互い少なくとも１つの共有結合によって結合され得る。従って、Ａ〜Ｈは環状構造の部分であり得る。
【００４３】
１つの実施形態において、この複合体は、好ましくは約３０００：１と１：１との間の比、より好ましくは１０００：１と１：１との間の比、より好ましくは約１０００：１と１０：１との間の比、さらにより好ましくは約１０００：１と１００：１との間の比における金属材料と比較した酸化型グルタチオンに基づく化合物の多大な超過を含む。他の実施形態において、この複合体は、等量の酸化型グルタチオンに基づく化合物および金属材料、すなわち約１：１の比を含む。
【００４４】
１つの実施形態において、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）自体およびその塩であり、ここでＡおよびＥの両方は−ＣＯ２Ｈであり、ＢおよびＤの両方は−ＮＨ２であり、そしてＧおよびＨの両方は−ＣＯ２Ｍであり、Ｍは対イオンである。この対イオンはプロトン、有機ベースのイオン（例えば、テトラアルキルアンモニウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属、または遷移金属）であり得る。水性の培地において、任意のＡ〜Ｈはイオン化基を含み得、例えば、ＡおよびＥが−−ＣＯ２であり得、そしてＢおよびＤが−ＮＨ２＋であり得、そしてイオン化基は適切な対イオンによって中性にされる、とか理解される。
【００４５】
基本的な複合体を、酸化剤の存在下で、金属材料と還元型グルタチオンとの相互作用から、上述の方法によって調製し得る。
【００４６】
これらの化合物および薬学的に受容可能なその得られた薬物形態（ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質複合体を含む）は、それを必要とする被験体の初期の被験体の生物学的状態に依存して、治療目的を可能にする薬物として適用され、広範囲のサイトカインおよび造血因子の内因性産生を刺激／調節し、そして／またはサイトカイン効果を再生し、ならびに通常の細胞（代謝、増殖および分化調節）および形質転換細胞（アポトーシス機構法誘導）に関して区別された効果を実行する。「形質転換細胞」は、腫瘍性形質転換細胞および／またはウイルス性形質転換細胞をいう。
【００４７】
ウイルス性疾患を含む、腫瘍学的疾患、感染症の処置に対して、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質およびその薬学的に受容可能な誘導体、特に、その塩の治療効果は、形質転換細胞のアポトーシスの死を排他的に活性化するように独自の能力を用いる広範囲の内因性サイトカイン産生の刺激として説明され得る。
【００４８】
実行された実験的および臨床的調査は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質およびその誘導体から得られた薬物の治療効果が、多重サイトカイン活性化作用（ｍｕｌｔｉｃｙｔｏ  ｋｉｎｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ならびにサイトカインおよび種々の疾患の処置においてそれらの用量を便宜的に考慮することを可能にする造血因子効果を再生する能力に基づくことを示す。
【００４９】
本発明に従って、特定の器官／組織に対する最大の親和性ならびに通常の細胞における代謝、増殖および分化のプロセスの調節ならびに腫瘍性形質転換細胞および／またはウイルス性形質転換細胞におけるアポトーシス機構法の誘導を提供する目的のある生物学的薬理学的効果を有する薬剤は、上述の複合体であるＧＳＳＧ・Ｐｔ、すなわち、活性原理として、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドを含む。
【００５０】
本発明に従って、この薬剤は、サイトカインおよび造血因子の内因性産生の調節、ならびに／またはサイトカイン効果の再生に対して指定され、従って、代謝、増殖、分化およびアポトーシスのプロセスの調節を提供する。
【００５１】
本発明に従って、薬剤は、腫瘍学的障害、感染的障害、免疫学的障害、血液学的障害、虚血性障害、神経変性障害、代謝障害および内分泌障害の処置に対して指定される。
【００５２】
本発明に従って、肺癌の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５３】
本発明に従って、黒色腫の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［３−ヨード−チロシル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５４】
本発明に従って、大脳腫瘍の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［ドーパミン］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５５】
本発明に従って、結腸直腸癌の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［システアミン］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５６】
本発明に従って、乳癌の処置に対して指定される好ましい薬剤は、システアミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５７】
本発明に従って、前立腺癌の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔの二亜鉛（ｄｉｚｉｎｃ）塩を含む複合体から成る。
【００５８】
本発明に従って、卵巣癌の処置に対して指定される好ましい薬剤は、テオフィリン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００５９】
本発明に従って、急性リンパ芽球白血症の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩を含む複合体から成る。
【００６０】
本発明に従って、急性骨髄芽球性白血症の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩およびシステアミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００６１】
本発明に従って、結核症の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［ヒスチジル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００６２】
本発明に従って、ウイルス性Ｂ型肝炎、ウイルス性Ｃ型肝炎、およびその混合感染から成る群から選択される疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔから成る群から選択される複合体から成る。
【００６３】
本発明に従って、ヘルペスの処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔから成る群から選択される複合体から成る。
【００６４】
本発明に従って、髄膜炎、敗血症から成る群から選択される疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、テトラ−ドーパミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００６５】
本発明に従って、腹膜炎の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびテトラ−ドーパミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組み合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００６６】
本発明に従って、ウイルス起源の特別危険感染、特に、リフトバレー熱、および／または細菌性起源、特にツラレミアの処置に対して指定される好ましい薬剤は、菌体抗原−ＧＳＳＧ・Ｐｔおよび／または抗体（菌体抗原に対する）−ＧＳＳＧ・Ｐｔから成る群から選択される複合体から成る。
【００６７】
本発明に従って、急性膵炎の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００６８】
本発明に従って、化膿性の手術後の後遺症の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびイノシン−５−モノホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００６９】
本発明に従って、ＡＩＤＳの処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびウリジン−［５−モノホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７０】
本発明に従って、感染起源の免疫抑制の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびウリジン−［５−モノホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７１】
本発明に従って、糸球体腎炎の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７２】
本発明に従って、慢性関節リウマチの処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７３】
本発明に従って、膠原病の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７４】
本発明に従って、全身性エリテマトーデスの処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩ならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７５】
本発明に従って、アレルギー状態であるアトピー形態の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔおよびジヒドロフルオリド−ＧＳＳＧ・Ｐｔならびにその組合せから成る群から選択される複合体から成る。
【００７６】
本発明に従って、Ｉ型糖尿病の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ＧＳＳＧ・Ｐｔのバナジウム塩を含む複合体から成る。
【００７７】
本発明に従って、ＩＩ型糖尿病の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［リポイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００７８】
本発明に従って、虚血性大脳状態の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［フェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００７９】
本発明に従って、虚血性心臓疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［カルノシル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（［β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル］ −ＧＳＳＧ・Ｐｔ）を含む複合体から成る。
【００８０】
本発明に従って、機能的心筋不全症候群として主に顕性な虚血性心臓疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、グリセロール−［１，３−ジホスファチル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８１】
本発明に従って、神経変性疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８２】
本発明に従って、脱髄疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８３】
本発明に従って、大脳低酸素症の処置に対して指定される好ましい薬剤は、γ−ヒドロキシ−［ブタノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８４】
本発明に従って、躁うつ病精神病の処置に対して指定される好ましい薬剤は、γ−アミノ−［ブタノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８５】
本発明に従って、管アテローム性動脈硬化症形成リポタンパク質のバランスにおける代謝障害に関して顕著な疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、ビス−［ニコチノイル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８６】
本発明に従って、視床下部性−下垂体性卵巣系の交代に起因する内分泌性疾患の処置に対して指定される好ましい薬剤は、フォリクリル（ｆｏｌｌｉｃｕｌｙｌ）−［スクシニル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔを含む複合体から成る。
【００８７】
本発明は、添付の図面を用いて例示され、この図面は模式図であり、そして縮尺に対して描画されることを意図されない。この図において、種々の図において例示される同一のまたはほぼ同一の各々の構成要素は、単一の数字により表現される。明確化目的に対して、全ての構成要素がすべての図中に標識されるわけでなく、本発明の各々の実施形態のすべての構成要素が示されるわけではない。ここで、例示は、当業者が本発明を理解することを可能にするためには必要ではない。
【００８８】
複合体合成スキームは、図２に提供される。
【００８９】
得られるＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体は、所定の化合物に新しい効果の二つの方向性を提供する。この所定の化合物は、酸化されたグルタチオンの構造アナログであり、すなわちその化学式に従って安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドである。
【００９０】
第一に、白金化合物によるジスルフィド結合の安定化は、酸化された形態での生物学的媒質中のＧＳＳＧ・Ｐｔの半減期を有意に増加させ、ＧＳＳＧに特異的な生物学的−薬理学的効果をかなり拡張する。その上、白金材料と酸化されたグルタチオン（ＧＳＳＧ）分子との間の相互作用は、リガンド交換の可能性を提供する。すなわち、ＮＨ３基の代りに、二対の孤立電子対を有する二つの硫黄原子が、白金原子とのドナー／アクセプター結合に関与し得る。また、酸化型グルタチオンに基づく化合物のＮＨ２基が集中することに起因する、上記のジスルフィド結合の安定化、およびＧＳＳＧのコンホメーション全体（図５）の安定化に関するさらなる可能性についても考慮され得る。
【００９１】
第二に、複合体中の白金化合物の存在は、類似の重要な方法で、ＧＳＳＧ・Ｐｔの化学修飾の能力を増加させ、そしてＧＳＳＧ・Ｐｔと別の化学（生化学）化合物との間の共有結合に基づく、新しい化合物（新しい物質製法）としてある範囲のそれらの誘導体が得られる。この点において、複合体中のＰｔは、ＧＳＳＧ・Ｐｔと別の化学／生化学成分との間の共有結合の形成の触媒である。
【００９２】
基本のＧＳＳＧ・Ｐｔ分子の化学修飾を介して、新しい薬物を作製することが可能であり、この薬物では、基本構造（シス−ジアミンジクロロ白金を有する酸化されたグルタチオン複合体に基づく、高い医学的−生物学的活性がすでに証明されている）を備える分子内に、その他の共有結合した生化学的に活性な分子のフラグメントが存在する。共有結合化合の利用は、安定性および組成物の標準化特性のような重要な薬物の特徴の範囲を広げることを可能にする。化学修飾の出発物質は、二つの一級グルタミン酸アミノ基、シスチンジスルフィド結合ならびにグリシンのカルボキシル基およびグルタミン酸のα−カルボキシル基、を有するＧＳＳＧ・Ｐｔヘキサペプチドコアである（図６）。
【００９３】
生化学的に重要な分子のわざわざ選ばれた共有結合フラグメントは、基本のＧＳＳＧ・Ｐｔ材料複合体の医学的−生物学的特徴をかなり改善し得、それらを各々の特定の治療目的に対してより選択的にし、所望の処置過程において顕著な増大を生じる。それは、生化学的活性機構における、フラグメントの付加的な効果で、薬物分子の標的細胞または標的分子への輸送の迅速な改善で、レセプターへの親和性の強化で、酸化−還元（レドックス）電位の必要な再分配で、およびその他の因子の範囲およびそれらの組合せ、で条件付けられ得る。従って、当面の問題は、ある範囲の予め決められた特性を有する新しい化学化合物を取得することである。
【００９４】
一つの実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、グルタチオンおよびシステアミンの誘導体であり得る。グルタチオンは、複合体の調製の後に誘導され得るか、または複合体の調製の前に誘導され得、すなわち、ＧＳＨは、二量体への酸化の前に誘導され得る。図１５（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）は、酸化型グルタチオンに基づく化合物を得た後の、グルタチオンを基礎とする異なる化合物の種々の例を示す。
【００９５】
一つの実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、アシル化された一級グルタミン酸アミノ基を有する。この改変体は、Ｎ−保護活性化アミノ酸誘導体によるアシル化に最も適しており、このアシル化では、システインのメルカプト基の一時的な保護の段階、それに続く縮合（活性化エステル法）の後に、Ｎ−保護基およびＳ−保護基を除去し、そしてシス−ジアミンジクロロ白金の添加とともに過酸化水素で酸化することで、グルタミン酸アミノ基をアミノ酸で修飾されたＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体を生じる。この実施形態では、この酸化型グルタチオンに基づく化合物は、以下からなる群から選択され得る：ビス−［メチオニル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ａ）、ビス−［アスパルチル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｂ）、ビス−［ヒスチジル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｃ）、ビス−［３−ヨウ素−チロシル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｄ）、ビス−［γ−アミノブタノイル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｅ）、ビス−［γ−ヒドロキシブタノイル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｆ）、ビス−［ＤＬ−６，８−チオエト酸（ｔｈｉｏｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）］・グルタチオンジスルフィド（図１５ｂ）、およびビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニニル］・グルタチオンジスルフィド（図１６ｇ）。
【００９６】
複合体がフェニルアラニル基を含む場合、この化合物はビス−フェニルアラニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである（図７を参照のこと）。
【００９７】
この基本スキームに従って、保護されたアミノ酸の誘導体、オキシ−酸、カルボン酸およびそれらの誘導体によるアミノ基のアシル化に基づく、その他の全てのＧＳＳＧ・Ｐｔ修飾体は、合成される。修飾する分子の特異的性質により、この方法のわずかな改変が可能である。最初のＧＳＨ化合物のための保護基は、Ｂａｍ（Ｎ−ヒドロキシメチルベンズアミド）を含む。アミノ酸（ＡＡ）は、ＢＯＣ（カルバミン酸ブチル）またはＯ−Ｓｕ（Ｎ−オキシコハク酸イミドエステル；詳細については図８を参照のこと）のような基で保護され得る。
【００９８】
【化５】
0003547400.tif 000003
複合体がビス−メチオニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（すなわち、（Ｍｅｔ）２ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、メチオニン基の導入は、縮合段階の後のＢＯＣ保護基の脱障害化（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）を含み得る。
【００９９】
複合体がビス−アスパルチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、アスパラギン酸基は、前述のスキーム全体に従って、導入され得る。β−カルボキシル基のための一時的な保護基は、可能であれば、好ましくは除去され、必要であればＢＯＣ−保護基が同時に導入される。Ｎ−ＢＯＣ−アスパラギン酸のβ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（すなわち、ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＳｕ）は、縮合段階において適用され得る。この保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により除去され得る。
【０１００】
複合体がビス−ヒスチジル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、ヒスチジンのイミダゾール環は、縮合段階で使用され得るジ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒスチジン誘導体（すなわち、ＢＯＣ−Ｈｉｓ（ＢＯＣ）−ＯＳｕ）を経て保護され得る。上記の場合のように、これらの保護基はトリフルオロ酢酸で除去され得る。
【０１０１】
複合体がビス−３−ヨウ素−チロシル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、可能な保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルエステルのような酸に不安定な保護基である。縮合段階で使用されるチロシン誘導体は、ＢＯＣ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＳｕであり得る。
【０１０２】
複合体がＧＡＢＡ−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（γ−アミノブタノイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、酸に不安定なｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基は、縮合段階で使用され得る。
【０１０３】
複合体がＧＯＢＡ−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（γ−ヒドロキシブタノイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、酸に不安定なｔｅｒｔ−ブチルエステル基（トリフルオロ酢酸溶液により除去され得る）は、ＧＯＢＡヒドロキシル基を保護するために使用され得る。縮合段階で使用される誘導体は、ＧＡＢＡ（ＯＢｕｔ）−ＯＳｕであり得る。
【０１０４】
複合体がビス−リポイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、リポ酸の側鎖官能基は、特別な保護を必要としないと考えられる。縮合段階では、リポ酸の活性化（ヒドロキシコハク酸イミド）エステルを適用することが可能である。ＴＦＡ処理の必要を、無くし得る。
【０１０５】
複合体がビス−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（ビス−ＤＯＰＡ−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、ＤＯＰＡ分子を導入するために、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの二つのヒドロキシル基をｔｅｒｔ−ブチルエステルで予め保護し、そしてアミノ基をＢＯＣ−保護基で保護する必要があり得る。複合体前駆体との縮合のために、活性化エステルが、得られ得（ヒドロキシコハク酸イミドエステルまたはペンタフルオロフェニルエステル）、これは過剰モル量で使用される。保護基の除去は、トリフルオロ酢酸溶液を用いて同時に起き得る。
【０１０６】
複合体がビス−［カルノシル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（ビス−β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、カルノシンは、縮合の前にβ−アラニンのアミノ基およびヒスチジンのイミダゾール基のジ−ＢＯＣ誘導体として保護され得る。次いで、縮合および続く脱障害化は、上記のように行なわれ得る。ビス−［カルノシル］−ＧＳＳＧの構造は、図１９ａに見出され得る。
【０１０７】
別の実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、複素環式カルボン酸およびヌクレオチドからなる群から選択されるユニットへのアミド結合またはホスホルアミド結合を有する。この実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物の例としては、ビス−ニコチノイル−グルタチオンジスルフィド（ビス−［ピリジン−３−カルボニル］・グルタチオンジスルフィド）（図１７ａ）、ウリジン−５’−モノホスファトイル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｏｙｌ）・グルタチオンジスルフィド（図１７ｂ）、イノシン−５’−モノホスファトイル・グルタチオンジスルフィド（図１７ｃ）、フォリクリルスクシニル・グルタチオンジスルフィド（図１７ｄ）およびグリセロール−１，３−ジホスファチル・グルタチオンジスルフィド（図１７ｅ）が挙げられる。
【０１０８】
複合体がビス−ニコチノイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（ビス−ピリジン−３−カルボニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、側鎖官能基を持たないニコチン酸は、ヒドロキシコハク酸イミドまたはペンタフルオロフェニルのような対応する活性化エステルとしての保護された誘導体を得ることなしに、複合体前駆体との縮合に導入され得る。保護基の除去のためのＴＦＡ処理は、不必要であり得る。
【０１０９】
複合体がウリジン−５’−モノホスファトイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（ＵＭＰ−５’−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、ウリジン−５’−モノホスフェートは、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミドの存在下で、アミドとの反応においてホスホアミド結合を形成し得る［１０］。複合体前駆体は、アミノ成分として使用されるテトラトリメチルシリル誘導体のような、保護されたカルボキシル基を有し得る。脱障害化は穏和な水−アルコール系で進行し得る。
【０１１０】
複合体がイノシン−５’−モノホスファトイル−ＧＳＳＧ・Ｐｔ（ＩＭＰ−５’−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）である場合、合成スキームは、上記の誘導体（ＵＭＰ−５’−ＧＳＳＧ）と類似である可能性が最も高い。
【０１１１】
複合体がフォリクリルスクシニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、ＧＳＳＧ・Ｐｔとエストロンとの間の連結は、スクシニル残基を介するアミド結合およびエステル結合により形成される。エストロンは、無水コハク酸との反応、ならびにそれに続くＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドによる、保護またはブロックされた複合体前駆体およびテトラ−トリメチルシリル誘導体との縮合により、活性化誘導体へ変換され得る。脱障害化は水−アルコール系で行なわれ得る。
【０１１２】
複合体がグリセロール−１，３−ジホスファチル−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、修飾は、保護された（アミノ成分としてのテトラ−トリメチルシリル誘導体として）複合体前駆体を用いるカルボジイミド法により進行し得、この合成法は、ホスホアミド誘導体の合成における合成法と類似している（実施例１３および１４を参照のこと）。
【０１１３】
別の実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、テトラ−ドーパミン・グルタチオンジスルフィド（図１８ａ）およびテオフィリン・グルタチオンジスルフィド（図１８ｂ）からなる群から選択され得る。アミド結合の形成は、複合体のカルボキシル基とアミドとの間で起き得る。４つのカルボキシル基全ての反応性は、非常に類似し、従って、生成物の混合物が生じ得る。
【０１１４】
複合体がテトラ−ドーパミン−ＧＳＳＧ・Ｐｔである場合、ドーパミンの３，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、アミノ成分として使用され得、そして複合体のジ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル誘導体は、カルボキシル成分として使用され得る。縮合は、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドにより進行し得、そして保護基の除去は、トリフルオロ酢酸溶液を用いて行なわれ得る。
【０１１５】
複合体がＧＳＳＧ・Ｐｔ−テオフィリンである場合、テオフィリンは、アミノ成分として使用され得、複合体前駆体は、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル誘導体として、カルボキシル成分のために使用され得る。縮合は、「Ｆ」−錯体を用いて行なわれ得る。保護基の除去は、トリフルオロ酢酸溶液を用いて行なわれ得る。
【０１１６】
別の実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、混合ジスルフィドを含み得る。可能な結合された構造は、混合ジスルフィド構造（対称および非対称）を含み得る。（図２０ａ〜２０ｃを参照のこと）
一つの構造（図２０ｂ）は、出発物質のメルカプト基の相互酸化を経て形成され得る。さらなる保護基および縮合方法は、不必要であり得る。
【０１１７】
別の化合物（図２０ａ）は、システアミンのアミノ基と、複合体前駆体のカルボキシル基のうちの一つとの間でアミド結合を形成することにより得られ得る。Ｎ−保護基を導入すること、および複合体前駆体のカルボキシル基を活性化することが必要であり得る。四つのカルボキシル基の存在に起因して、化学量論を操作すること、および／または生じた化合物のクロマトグラフィー分離を行うことが必要であり得る。
【０１１８】
合成条件は、さらなるアミノ成分等価体の存在により構造２０ｂと異なる。クロマトグラフィー精製では、構造２０ｂは指標（ｗｉｔｎｅｓｓ）として使用される。
【０１１９】
構造２０ｂは、構造２０ｃから、メルカプト基の反応におけるさらなるジスルフィド結合形成を通して得られる。生成物のクロマトグラフィー分離の際に、指標として構造２０ｃを有することが必要であり得る。
【０１２０】
別の実施形態では、酸化型グルタチオンに基づく化合物は、以下からなる群から選択される塩であり得る：アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および遷移金属塩。このような塩の例としては、二バナジウム酸塩（図２１ａ）、二フッ化水素酸塩（図２１ｂ）、二リチウム塩（図２１ｃ）、二ドーパモニウム塩、および二亜鉛塩（図２１ｄ）、が挙げられる。
【０１２１】
これらの塩は、対応する量の塩形成成分、塩基または酸の添加により得られ得る。アミノ基を有する塩の例としては、ＧＳＳＧ・Ｐｔの二バナジウム酸塩（（ＨＶＯ３）２−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）またはＧＳＳＧ・Ｐｔの二フッ化水素酸塩（（ＨＦ）２・ＧＳＳＧ・Ｐｔ）が挙げられる。カルボキシル基を有する塩の例としては、ＧＳＳＧ・Ｐｔの二リチウム塩（実施例２を参照のこと）、ＧＳＳＧ・Ｐｔ二ドーパモニウム塩またはＧＳＳＧ・Ｐｔ亜鉛塩が挙げられる。
【０１２２】
本発明の別の局面において、ヘキサペプチドビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシン二ナトリウム塩およびシス−ジアミンジクロロ白金（ｃｉｓ−白金）、のような複合体を含む薬物は、上記の方法に従って得られる。
【０１２３】
他の好ましい誘導体としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、モリブデン塩、バナジウム塩および他の塩の形態でＧＳＳＧ・Ｐｔ物質誘導体、ならびに、フェニルアラニン、またはメチオニンおよび本明細書中のＤ型およびＬ型のアミノ酸を含むいくつかの他のアミノ酸；あるいはシステアミン、リポ酸、またはイノシンへの共有結合を介して得られたＧＳＳＧ・Ｐｔ誘導体が挙げられる。
【０１２４】
１つの実施形態において、ＧＳＳＧ・Ｐｔの治療上の影響の免疫学的、生化学的および分子生物学的効果の兆候は、全てＬ型のアミノ酸を有するＧＳＳＧ・Ｐｔを５０％、およびが一方がＤ−型で表され、そして他方はＬ−型で表される２つの化学的に等しいアミノ酸を有する、ＧＳＳＧ・Ｐｔを５０％含む組み合わせが用いられる場合に得られる。
【０１２５】
１つの実施形態において、ＧＳＳＧ・ＰＴとタンパク質分子（ポリペプチド起源の物質）との間の共有結合の形成に基づいたポリペプチド化合物が形成される。そのタンパク質物質として、微生物から得られる抗原か、または抗原による動物身体を免疫した後に得られる抗体のいずれかが用いられることは重要なことである。図２２に、一方の物質のカルボキシル基と他方のアミノ基との間のペプチド結合ＣＯ−ＮＨの形成に基づいた、タンパク質物質を有するＧＳＳＧ・Ｐｔの化合物の例がある。ＧＳＳＧ・Ｐｔ分子と結合するタンパク質分子は、ＧＳＳＧ・Ｐｔのカルボキシル基の１つとタンパク質のα−またはε−ＮＨ２基との間のペプチド（アミド）結合の形成を介して得られ得る。水溶性カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドは、結合のための試薬として用いられ得る。標的生成物は、透析またはゲルクロマトグラフィーを介して精製され得る。
【０１２６】
生物学的培地に導入される血液および組織（器官）における、新しいＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物動態学は（ＧＳＳＧ自体と比較して）、ＧＳＳＧ・Ｐｔ分子がＧＳＳＧ代謝酵素として、および、第一に、ＧＧＳＧからＧＳＨへの還元のための主要酵素であるＮＡＤＰ・Ｈ＋依存性レダクターゼとして、あまり利用可能ではないことを示す。その上、生物学的培地におけるジスルフィド形態でのＧＳＳＧ・Ｐｔ半減期は、有意に増加する（表５、６、および７、ならびに実施例３および４を参照のこと）。
【０１２７】
構造上のアナログ、すなわち、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と比較した、安定化したジスルフィド結合（ＧＳＳＧ・Ｐｔ）を有するヘキサペプチドの基本的に新しい薬物動態学は、新しく決定された以下の生物学的−薬理学的効果のための最適な兆候を提供した：
・有意に広範囲の、放射性免疫抑制および化学的免疫抑制の条件下でのサイトカイン、増殖因子および造血因子（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０ならびにＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ、エリスロポイエチン、コロニー刺激性因子）の内因性産生の刺激／調節（実施例５〜７を参照のこと）；
・免疫学的に重要な遺伝子の酸化還元に感受性の発現、および細胞のシグナル伝達系のための主要タンパク質の「重要な」システイン改変のための機構の誘導による、いくつかのサイトカイン効果（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）の再現（実施例８を参照のこと）；
・細胞、特に免疫細胞、神経細胞ならびに肝臓細胞および腎臓細胞において、酸化還元の外形（ｒｅｄｏｘ−ｃｏｎｔｏｕｒ）を形成する主要酵素の活性の調節；
・放射線と高用量とを組み合わせた化学療法を受けている患者での、抑制された骨髄造血（赤血球数、白血球数および血小板数、ならびにＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１６／５６＋、ＣＤ１９／２０＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９５＋のレベルを含む）の回復（実施例９〜１３を参照のこと）；
・肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）の効果、ならびに心臓毒性、肝臓毒性、および神経毒性の（活性な抗菌性、抗ウイルス性、および抗腫瘍性化学療法の条件下での）徴候の減少；
・正常細胞（機能性ストレス下にある細胞を含む）および形質転換された細胞に関する分化した影響、すなわち正常な細胞／組織での代謝、増殖および分化の刺激、ならびに、それと同時に腫瘍および／またはウイルスで形質転換した細胞のみのアポトーシス機構を誘導する能力。
【０１２８】
本発明の薬物の別の有利な特徴は、代謝異常に対する、特に糖尿病（ＩＩ型）での炭水化物代謝の障害に対する、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質およびその塩の影響を、修正することである。この場合（実施例７を参照のこと）、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の影響（そのバナジウム塩）による組織中の正常なｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比ならびにチオールジスルフィド比の回復は、患者の血液中のグルコース含有量の正常値を安定に設定することを（これは考慮すべき治療効果である）提供した。
【０１２９】
複合体の生産のための方法は、ある範囲の新しい特徴、すなわち：
・増加した生化学的薬物安定性、すなわちＧＳＳＧ代謝酵素による（第一に、基本的に生物学的培地におけるジスルフィド形態での薬物の半減期を正確に増大させるＮＡＤＰ・Ｈ＋依存性グルタチオン還元酵素よる）「非攻撃性」（すなわち、これらの酵素の作用にはるかにアクセスし難い）；
・高いレベル供与体−受容体電位を有する新しい生物理学的成分；
・上記分子内の新しい反応部位の存在、および、それによる全く新しい化学修飾の能力；
を有する薬物の設計のための基礎として、異なる複合体の合成を可能にする。
【０１３０】
複合体の特性は、独特の細胞の「ジャイロスコープ」（極端な外部環境因子（物理的、化学的および生物学的な因子）の条件下で、平衡の回復を提供する）として複合体を機能させる：
・サイトカインのプロフィールにおいて、すなわち主に増殖を制御するサイトカイン；および主にイムノコンピテント細胞の分化を制御するサイトカイン；
・チオールジスルフィド代謝の回復による電子動力学の供与体／受容体平衡を含む、細胞の酸化還元能力の比；ＮＡＤ／ＮＡＤ・Ｈ比およびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰ・Ｈ比；
・ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比、細胞外および細胞内のイオン化カルシウムの変化；
・転写の分化因子（ＮＦＢ）と増殖因子（ＡＰ−１）との関係；ｐ５３、ｐ２１およびＲａｓタンパク質の機能的活性化の兆候の関係、従って細胞の増殖、分化、およびアポトーシスの平衡（正常細胞および形質転換された細胞におけるこれらの効果の基本的に異なる表示を考慮に入れる）。
【０１３１】
酸化型グルタチオンに基づく化合物のジスルフィド結合と白金物質との間の化学的相互作用の存在は、生物学的系の電子平衡の提供の際に新しい生物理学的意義を形成する。いずれの理論によっても拘束されることを望まないが、化学的相互作用は、イオウ原子上の非共有電子対が電子不足の物質（例えば、プラチナ物質）と強力に相互作用する供与体／受容体対であると考えられ得る。また、いずれの機構によっても制限されることを望まないが、細胞の活性および細胞の物理的状態が、生物学的系全体にわたる供与体／受容体相互作用によって少なくとも部分的に決定される場合、等しい生体電位を有する電子供与体および電子受容体の間の平衡は寿命パラメーターであり得る。このような平衡の変化は、異なる細胞機能および物理的特性の制限のために使用され得る［１１］。可動電子の供給源は、窒素、酸素およびイオウの非共有電子対のようなπ−電子を含み得る。正常な細胞における受容基（例えば、−Ｃ＝Ｏ−基）（π−電子のような供与体電子の供与体／受容体動力学を介して平衡を保たれ得る）は、ほとんど存在しない。
【０１３２】
悪性細胞は、供与体／受容体平衡の過剰の供与体電子への劇的な妨害を有すると特徴付けられる。受容体分子は、癌細胞にはほとんど存在しない。この状態におけるこの不均衡の考えられる解決策は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質のように同じ分子内に供与体／受容体特性を有する分子の存在である。ＧＳＳＧ・Ｐｔを生物学的培地に導入することは、生物学的培地における電子平衡の回復を引き起こし得る。この回復は、活性酸素形態（例えば、スーパーオキシドアニオンラジカルである一重項酸素）の形成を含む反応における白金原子による触媒を含み得る。
【０１３３】
既述の状況において、細胞の電子平衡は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質と酸化還元（すなわち、供与体／受容体）対を生成する細胞ＧＳＨ（上記供与体がＧＳＨであることを意味する）との相互作用である。高増殖性インパルスと共に腫瘍を形質転換した細胞に特徴的である、細胞中での高いＧＳＨレベルが存在する場合、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の前酸化的な（すなわち、酸化的な）特性が、最も明白な方法で現れる。この場合において酸化的なストレスは、アポトーシス機構の誘導のために細胞内信号を形成する。腫瘍細胞のミトコンドリア機能の変化のみを引き起こす腫瘍細胞において形成される。
【０１３４】
正常であるが、「疲れた」細胞、「疲れ切った」細胞のために、酸化的−還元的電位の最適化、代謝性形質転換のための生体エネルギー供給、ゲノム機能部位（特に、免疫学的に有意な遺伝子および転写因子）の還元に感受性の適切な発現、が存在し得る。
【０１３５】
形質転換された細胞であるＧＳＳＧ・Ｐｔに関して、π−電子の連鎖移動反応、呼吸鎖による電子／プロトン移動反応のミトコンドリア酸化−還元反応（ミトコンドリアからチトクロムＣの強制放出を生じる）の妨害、およびＮＡＤ・Ｈ＋／ＮＡＤＰ・Ｈの転位の比（すなわちアポトーシス機構誘導のために細胞内シグナルを形成する）を含む生命機能との不適合が存在し得る。
【０１３６】
有効成分である、ＧＳＳＧと、白金およびパラジウムからなる群より選択された金属物質との複合体（ＧＳＳＧ・Ｐｔ／Ｐｄ）（内因性サイトカインおよび造血因子の産生を刺激すること／有効に調節すること、および形質転換された細胞のアポトーシスを誘導することが可能な安定したジスルフィド結合を有する）は、以下の、本発明者らにより最初に開発されたペプチド合成技術により得られ得る。
【０１３７】
（白金（ＩＩ）またはパラジウム（ＩＩ）錯化合物を有するＧＳＳＧ複合体の合成法）
１７０ｇ（０．５５モル）の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を、２００ｍｌの水に懸濁する。そして撹拌しながら、１３９ｍｌ（１．５５モル）の４Ｎ  ＮａＯＨ溶液、次いで以下の溶液の１つを添加する：
ａ）１７０ｍｌの０．０５％シス−ジアミンジクロロ白金（シス−［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２］）水溶液（０．２８ミリモル）；
ｂ）２３５ｍｌの０．０５％テトラクロロ白金酸カリウム（Ｋ２［ＰｔＣｌ４］）水溶液（０．２８ミリモル）；
ｃ）１８５ｍｌの０．０５％テトラクロロパラジウム酸カリウム（Ｋ２［ＰｄＣｌ４］）水溶液（０．２８ミリモル）。
【０１３８】
得られた透明な、わずかに黄色の溶液を１８〜２０℃に冷却し、そして２８３ｍｌの３％過酸化水素溶液（Ｈ２Ｏ２溶液）を、少量ずつ、５分間にわたって、反応混合温度が（浸した温度計で）２２〜２５℃を超過しないような速度で、添加した。
【０１３９】
過酸化水素溶液（Ｈ２Ｏ２）の添加の３０分後、ｐＨを測定し、次いで、同時に温度制御（２２〜２５℃の範囲内であるべきである）を行いながら、４Ｎカセイソーダ溶液を、ｐＨが５．６〜５．８に達するまで、一滴ずつ添加した。次いで、冷却器（ｃｏｏｌｉｎｇ）を取り除き、そして室内温度（室温）で３０分より長くの間撹拌を続けた。
【０１４０】
酸化反応の完全性の制御を、ＨＰＬＣアッセイにより行う。ＨＰＬＣのための液体クロマトグラフ（Ｌｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＯＤＳ  ４．６×２５０ｍｍのカラムを有するＢｅｃｋｍａｎ型、Ｓｏｌ．Ｍｏｄｕｌｅ  １２６、Ｄｅｔ．１６８型、または同じもの）を用意する。ＨＰＬＣの移動相を調製するために、２０ｃｍ３のアセトニトリルおよび１ｃｍ３の新しく蒸留したトリフルオロ酢酸を１０００ｃｍ３メスフラスコに移し、そしてその体積を脱イオン化した水で標線まで増やした。溶液を混合し、そして真空中で振盪することで脱気する。
【０１４１】
全過酸化水素溶液量の添加の３０分後、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて酸化反応の完全性を調べる。さらに、微量注射器を用いて１０μｌの反応混合物を取り、そしてそれを１ｍｌの移動相（０．１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、９８：２）に溶解する。２０μｌの得られた溶液をクロマトグラフ（Ｂｅｃｋｍａｎ  １２６  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ、Ｄｉｏｄ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅ  １６８、カラムＬｕｎａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＯＤＳ  ４．６＿２５０ｍｍ、または同じもの）に導入する。溶出を無勾配のレジームで、３０分間、０．１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、９８：２の系において；流速１ｍｌ／ｍｉｎ、２２０ｎｍでの検出、１９０〜６００ｎｍの走査にて、行う。
【０１４２】
上述の条件下での保持時間は、還元型グルタチオンについては５．０±０．５分、酸化型グルタチオンについては１１．０±０．５分である。
【０１４３】
標準的なクロマトグラム積分後のＨＰＬＣデータにより、酸化型グルタチオン含有量が９７％未満である場合、同じレジームで３０分間より長く撹拌を続け、そしてＨＰＬＣ制御を繰り返す。
【０１４４】
結果が９７％に等しいか９７％を超える場合には、反応が完結したと見なし、そして反応溶液の濾過をする。ここで、０．７μｍより大きくない孔径を有するフィルターを使用する。
【０１４５】
乾燥時の重量損失は、１００℃で、ＣａＣｌ２およびＰ２Ｏ５上での真空中（１ｍｍＨｇ）、一定重量まで乾燥する際、５％を超えない。
【０１４６】
ＨＰＬＣデータによる準備した生成物中の主要物質の含有量は、９８％より低くならない。
【０１４７】
従って、Ｐｔ（ＩＩ）またはＰｄ（ＩＩ）の錯化合物との複合体として、酸化グルタミンを得る。
【０１４８】
外見：白色無臭粉体
溶解性：水、注入のための０．９％等張食塩水に溶解；９５％アルコール、クロロホルム、エーテルおよび他の有機溶媒に不溶
溶液の透明性および色：１０ｍｌの水中の０．０５ｇの薬物をに溶液は、透明で、かつ無色の溶液である。
【０１４９】
１％溶液のｐＨ：電位差測定により５．６〜６．０、装置はｐＨ／ｍＶ／℃メーター（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ、モデル５９００３−１５または同じもの）である。
【０１５０】
確実性（Ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ）：
ａ）アミノ酸分析（６ｎＨＣｌ、１１０℃、２０時間）、
グリシン−２．０±１５％；グルタミン酸−２．０±１５％；システイン−２．０±４０％；アミノ酸分析器ＡＡＡ  Ｔ−３３９  Ｍ  Ｐｒａｇｕｅまたは同じもの
ｂ）ＨＰＬＣ−標準のビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システニル−ビス−グリシン二ナトリウム塩に対応する流出時間で
クロマトグラフィの条件：装置−ＢＥＣＫＭＡＮ「Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ」バージョン６．０、Ｄｉｏｄ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅ  １２６または同じもの
アッセイ−移動相中の２０μｌの０．１％薬物溶液、Ｃ１８逆相カラムＵＬＴＲＡＳＰＥＲＥ  ＯＤＳ  ２５０±４．６ｍｍのクロマトグラフィー、無勾配（アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸（２：９８））条件下で；流速１ｍｌ／ｍｉｎ、２２０ｎｍでの検出、１９０〜６００ｎｍの走査
純度（主要物質の含有量）：
ａ）ＨＰＬＣで：９８％未満でない
ｂ）アミノ酸分析で：８５％未満でない（正確な重量での「確実性」節、「ａ」項に従って分析）
（元素含有量決定のための方法）：
正確なアッセイ重量（約５０ｍｇ）を５０ｍｌの二重蒸留水に溶解し、そしてその溶液を分析のために使用した。
【０１５１】
白金の含有量を、誘導結合プラズマを用いて、ＶＧ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ、Ｅｎｇｌａｎｄにより製作されたＰＱｅモデルの装置で、質量スペクトル分析の方法の方法により定量的に決定する。分析の相対的精度は５％である。
【０１５２】
他の元素含有量を、誘導結合プラズマを用いて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｊａｒｅｌｌ  Ａｓｈ、ＵＳＡにより製作されたモデルＴＲＡＣＥ  ６１Ｅの装置で、原子発光分光法の方法により定量的に決定する。分析の相対的精度は５％である。
【０１５３】
ｃ）ナトリウム（Ｎａ）含有量は、発光スペクトル法により７．０±０．５％である。
【０１５４】
ｄ）白金（Ｐｔ）含有量は、質量分析法により０．０３２±０．０１％である。
【０１５５】
ｅ）パラジウム（Ｐｄ）含有量は、質量分析法により０．０１７±０．０１％である。
【０１５６】
【化６】
0003547400.tif 000004
それによって、引き続く動物およびヒトでの使用を目的として得られたヘキサペプチド複合体（ＧＳＳＧ・Ｐｔ）は、合成濃度０．０１〜３．０％で、注射のための滅菌水、または薬学的に受容可能な任意の溶媒中にバルク物質を溶解することにより調製される、注射可能な薬物形態中の薬学的に受容可能なＧＳＳＧ・Ｐｔ誘導体として適用される。実験設定でのインビトロ使用のためには、ＧＳＳＧ・Ｐｔまたはその誘導体は、培養培地、等張食塩水、グルコース溶液などのような、対応する実験の実行可能な溶媒中に溶解され得る。
【０１５７】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ、その塩、およびその組成物の注射可能な医薬形態は、動物実験において、ならびに広範囲の臨床実験および傷病者での予備試験においても同様に試験されている。ヒトおよび動物用途のための薬物形態は、医薬形態の化学汚染または細菌による汚染を防ぐためのあらゆる努力をしながら、滅菌され、そして発熱物質を含まない条件下で調製されるべきである。
【０１５８】
本発明は、複合体またはその誘導体を含む薬物が、内因性サイトカイン産生プロセス、ならびに、従って、Ｔ−およびＢ−リンパ球の部分母集団（ＣＤ＋−細胞）の増殖および分化プロセスに対する調節効果を有する、という有利な特性を示す。薬剤導入は、広範囲のサイトカインおよび造血性因子範囲、ならびにＣＤ＋−リンパ球の生産を生じ得る。従って、この範囲において、サイトカイン相互作用の観点から、それらが刺激する効果に関してアゴニスト−サイトカインとアンタゴニスト−サイトカインの両方が存在する（例えば、ＩＬ−１αおよびβ、ならびにＩＬ−４の「関係」）。それに関連し、本発明の薬物は、患者の最初の免疫発生系の状態（機能亢進または機能低下）に依存して、この系における乱れた平衡を回復し得る。
【０１５９】
所定の提供物は、実施例９〜１３において例示され、これは、免疫を抑制された患者（放射線または併用化学療法を受けている腫瘍学的な患者）では、サイトカイン合成誘導（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）はＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１６／５６＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ３４＋数の回復を伴い得；そして、免疫自己攻撃（ｉｍｍｕｎｏａｕｔｏａｇｒｅｓｓｉｏｎ）徴候を伴う患者は−Ｃ型ウイルス性肝炎の場合における細胞傷害性リンパ球または繊維芽細胞のクローンで、Ｆａｓ−Ａｇ（ＣＤ９５＋）が発現され、これは、アポトーシスメカニズム誘導ならびにウイルス形質転換細胞および／または「攻撃性」細胞の排除を促進することを示す。
【０１６０】
本発明の別の有利な特徴は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の非経口的な導入の１０分後の単離されたヒトリンパ球に対する複合体の影響（ピークは、３０分に観測される（リンパ球から得られるサイトゾルタンパク質のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｉｎｇ）の最高レベル））、細胞のシグナル伝達系活性の統合的な特徴である、リンパ球サイトゾルタンパク質に対するチロシンにおけるリン酸化レベルの有意な増加、の発見を含む。ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の影響に起因する、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰイノシトールリン酸依存性シグナル系の重要なファクターに対するこれらの状態における変化は（実施例８を参照のこと）、まず第一に、サイトカインおよび造血性因子の合成を担う免疫学的に重要な遺伝子に対して、レドックス甘受性の遺伝子発現を生じさせる。従って、処置目的におけるＧＳＳＧ・Ｐｔ物質適用は、特に、腫瘍学的およびレトロウイルスの病理において観察される、サイトカインに対するレセプターの感受性損失の場合において、サイトカインおよび造血性因子の内因性の産生を刺激するだけでなく、生化学的および生理学的なサイトカイン効果の再現もまた提供する。
【０１６１】
腫瘍形質転換細胞および／またはウイルス形質転換細胞においては、アポトーシスメカニズムは、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質多サイトカイン（ｍｕｌｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅ）活性影響（そのｐ５３依存性およびｐ５３非依存性アポトーシス誘導メカニズムに対する影響）を介して、および悪性（癌）細胞におけるドナー／アクセプターπ電子バランスの変化を介して誘導される（実施例１４〜１６を参照のこと）。
【０１６２】
最初の患者の生物学的状態（その患者の免疫状態：免疫不全（すなわち、反応性低下）；または免疫自己攻撃（すなわち、反応性亢進）；腫瘍形質転換細胞もしくはウイルス形質転換細胞の存在を含む）に依存して、この複合体および／または薬学的に受容可能なその誘導体は、それぞれ、内因性のサイトカイン産生刺激物質／変更因子として、および／またはアポトーシスメカニズム誘導物質として作用し得る。
【０１６３】
この複合体は、種々の方法により投与され得る：経口的または、吸入溶液、局所点滴、点眼、鼻腔内導入、上皮適用の軟膏、静脈注射溶液、注射溶液、および坐薬からなる群から選択される溶液形態として。好ましくは、グルタチオンが、非経口的または局所的に導入される。
【０１６４】
１つの実施形態においては、この複合体は、体重当たりで約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。別の実施形態においては、この複合体は、体表面積当たりで約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の間の用量で投与される。別の実施形態においては、この薬物は、所望の治療的効果が達成されるまで、１日１回以上、１日以上のパルス投与または連続投与により適用され得る。
【０１６５】
好ましい実施形態においては、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の薬学的に受容可能な誘導体は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ物質もしくはその塩に対して、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１．０ｍｇのＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の用量で；または体表面積１ｍ２当たり１〜１００ｍｇの用量で、そして上皮的に／点滴を介して適用される場合は、同様に体表面積１ｍ２当たり１〜１００ｍｇの用量で、各２４時間の間に少なくとも１回、身体に導入される。また、この薬物は、連続的に注入され得るか、またはそうでなければ、ＧＳＳＧ・Ｐｔ基剤およびその塩に対して体重１ｋｇ当たり０．１〜１．０ｍｇの２４時間の総用量、そして各２４時間の間に体表面積１ｍ２当たりでは１〜１００ｍｇを有するように身体に導入される。
【０１６６】
この複合体が溶液として投与される場合、好ましくは、この溶液は、約１％〜約１０％の間のこの複合体の濃度を有する。好ましくは、非経口的な使用のためのＧＳＳＧ・Ｐｔ物質の薬学的に受容可能な誘導体は、薬学的に受容可能な溶媒中（例えば、水、グルコース溶液、塩化ナトリウムの等張液、緩衝塩溶液を含む水溶液として）である。他の生理学的な溶媒またはキャリアが用いられ得る。この複合体が注射可能形態として投与される場合、この注射可能形態は、好ましくは、この複合体を約０．０１％〜約３．０％の間の濃度で溶液中に含む。
【０１６７】
異なる体腔に対する適用を含む局所的な適用のために、有機溶媒またはキャリアが、軟膏、ペースト、クリーム、または坐薬の形態において用いられ得る。
【０１６８】
以下に与えられる本発明の実施形態の実施例は、本発明の実際的な使用の可能性を示し、そしてその有効性を確証し、そしてまた広範囲の示される疾患（実施例９〜１８）を考慮して、一連の開発された医薬を用いることの便宜を示す。
【０１６９】
（本発明の実施形態の実施例）
（実施例１）
（ビス−（Ｌ−フェニルアラニル−γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシン  二ナトリウム塩の合成）
（Ｉ．）概略的な薬物の特徴
１．名称：ビス−（Ｌ−フェニルアラニル−γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシン  二ナトリウム塩、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｐｌａｔｉｎｕｍ）との複合体。
【０１７０】
２．構造式−図７を参照のこと。
【０１７１】
３．全体式：Ｃ３８Ｈ４８Ｎ８Ｏ１４Ｎａ２Ｓ２・［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２］。
【０１７２】
４．分子量：９５０，９４（Ｐｔ含有量０．０３３％のＣ３８Ｈ４８Ｎ８Ｏ１４Ｎａ２Ｓ２について）。
【０１７３】
５．外観：白色無臭粉末。
【０１７４】
６．溶解度：水、注射用の塩化ナトリウム０．９％等張液に可溶；９５％アルコール、クロロホルム、エーテルおよび他の有機溶媒に不溶。
【０１７５】
７．溶液の透明度および色：１０ｍｌの水中０．０５ｇのこの薬物の溶液は、透明および無色。
【０１７６】
８．０．１％溶液のｐＨ：５．７５（電位差測定）。
【０１７７】
９．確実性：
ａ）対応のアミノ酸分析（６ｎＨＣｌ、１１０℃、２０時間）、（誤差限界２０％、システインに対して−３５％）：グリシン−２．００；グルタミン酸−１．９２；システイン−１．８１；フェニルアラニン−２．０４
ｂ）「ＢＲＵＫＥＲ」ＡＭ５００、５００ＭＨｚ、Ｄ２ＯによるＮＭＲ（１Ｈ）分光法
【０１７８】
【表４２】
0003547400.tif 000005
１０．純度（主要物質含有量）：
ａ）ＨＰＬＣ：９７％以上：
デバイス：ＢＥＣＫＭＡＮ「Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ」Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０、Ｄｉｏｄ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅ  １２６。アッセイ−移動相中２０μｌの０．１％薬物溶液、アセトニトリル−０．１％三フッ化酢酸（２：９８）の定組成条件下、変換されたＣ１８相を用いるＵＬＴＲＡＳＰＥＲＥ  ＯＤＳ  ２５０×４．６ｍｍカラム上のクロマトグラフィー；流速１ｍｌ／分、２２０ｎｍで検出、１９０〜６００ｎｍをスキャン、ＰＤＡ関数−Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｐｌｏｔ，３Ｄ
ｂ）アミノ酸分析：８５％以上（正確な質量の物品９ａによる分析）；
ｃ）薄膜クロマトグラフィーは純一であり、分析はバンドへの５μｌの１％薬物溶液の導入で行われる。Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍプレートがあり、系：ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）。展開は、標準的な方法（ニンヒドリンおよび塩素＼ベンジジン）に従って行われる。Ｒｆ＝０．１５；
ｄ）発光スペクトル法によるナトリウム（Ｎａ）含有量：４．８％；
ｅ）質量分析による白金（Ｐｔ）含有量：０．０３３％。
【０１７９】
１１．検出された元素含有量、μｇ／ｇ：
銀（Ａｇ）                ＜１．０（０．０００１％未満）
アルミニウム（Ａｌ）      ２．０
砒素（Ａｓ）              ＜１．０
バリウム（Ｂａ）          ＜０．５０
ベリリウム（Ｂｅ）        ＜０．０５
カルシウム（Ｃａ）        ７．０
カドミウム（Ｃｄ）        ＜０．０５
コバルト（Ｃｏ）          ＜０．５
クロム（Ｃｒ）            １．７
銅（Ｃｕ）                ＜０．５
鉄（Ｆｅ）                ＜１．０
カリウム（Ｋ）            ＜２．５
セレン（Ｓｅ）            ＜２．０
マグネシウム（Ｍｇ）      ＜２．５
マンガン（Ｍｎ）          ＜０．２
モリブデン（Ｍｏ）        ＜０．２
ナトリウム（Ｎａ）        ４８ｍｇ／ｇ
ニッケル（Ｎｉ）          ＜０．５
鉛（Ｐｄ）                ＜０．４０
白金（Ｐｔ）              ３３０μｇ／ｇ
ストロンチウム（Ｓｒ）    １．９
チタン（Ｔｉ）            ＜０．５
バナジウム（Ｖ）          ＜０．５
亜鉛（Ｚｎ）              ０．６５
アンチモン（Ｓｂ）        ＜０．５。
【０１８０】
測定法：
正確なアッセイ重量（約５０ｍｇ）を５０ｍｌの２回蒸留した水に溶解し、この溶液を分析に用いる。
【０１８１】
プラチナ含有量を、ＶＧ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ，Ｅｎｇｌａｎｄより作製されたＰＱｅデバイスで、誘導結合プラズマ（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｏｕｎｄ  ｐｌａｓｍａ）を用いる質量分析の方法により、定量可能に決定する。分析相対的精度は５％である。
【０１８２】
他の元素の含有量は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｊａｒｅｌｌ  Ａｓｈ，ＵＳＡにより作製されたＴＲＡＣＥ  ６１Ｅデバイスで、誘導結合プラズマ（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｂｏｕｎｄ  ｐｌａｓｍａ）を用いる原子発光分光法の方法により、定量可能に決定する。分析相対的精度は５％である。
【０１８３】
１２．乾燥による質量損失：ＣａＣｌ２およびＰ２Ｏ５上、減圧下（１ｍｍＨｇ）、１００℃で一定の質量になるまで乾燥することで１０％。
【０１８４】
（ＩＩ．）合成法の説明
１３．プロセスの化学スキーム−図８を参照のこと。
【０１８５】
１４．方法の説明。
【０１８６】
（ＩＩＩ）．３．０７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の量の生成物（Ｉ）γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシンおよび５．８９ｇ（１３ｍｍｏｌ）の量のＮ−ヒドロキシメチルベンズアミド（ＩＩ）を３０ｍｌの無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）混合物中に、室温で１時間溶解する。次いで、溶媒を減圧下４０℃で留去し、３０ｍｌの無水エチルアルコールをその残留物に加える；溶媒を再び減圧下で留去し、この手順をさらに２回繰り返す。生成物を、５０ｍｌの無水ジエチルエーテル中で粉砕することを通して結晶化し、濾過し、フィルター上で２×２０ｍｌの無水エーテルで洗浄し、そしてさらにそれをＫＯＨおよびＰ２Ｏ５上、減圧下で乾燥する。９０％エタノールより再結晶化する。収量−５．５０ｇ（８０％）。Ｒｆ＝０．４３、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍ、系：ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）。
【０１８７】
（Ｖ）．４．４０ｇ（１０ｍｍｏｌ）の量の生成物（ＩＩＩ）を１５ｍｌの蒸留水および２５ｍｌのジオキサンの混合物中で攪拌する；次いで、混合しながら、１０ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）の２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を加える。
【０１８８】
次いで、３．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）のフェニルアラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＶ）をこの反応混合物中に導入し、そして攪拌を室温で１２時間続ける。
【０１８９】
次いで、この混合物を減圧下４０℃で乾燥までエバポレートする。この残渣を、２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、２×２０ｍｌの１Ｎ硫酸、水、炭酸水素ナトリウム（２×５０）、水で洗浄し、有機層を無水塩化カルシウム上に置く。次いで、酢酸エチルを減圧下４０℃で乾燥まで留去し、この生成物を酢酸エチル／エーテルから結晶化する。
【０１９０】
この結晶を濾過により分離し、五酸化リン上、減圧下で一定の質量まで乾燥する。生成物収量（Ｖ）−４．８８ｇ（７０％）。Ｒｆ＝０．８０、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍ、系：ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）。
【０１９１】
（ＶＩ）６．８７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の量の生成物（Ｖ）を、蒸留したトリフルオロ酢酸２０ｍｌ中に溶解し、そしてその溶液を室温で２時間放置する。次いで、生成物を無水エーテル（約２００ｍｌ）により沈殿させ、濾過し、そして、ＫＯＨ上で減圧下にて、一定重量まで乾燥させる。生成物収量−（Ｖ）５．２８ｇ（９０％）。Ｒｆ＝０．４８、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍ、系：ｎブタノール−酢酸−水（４：１：１）。
【０１９２】
（ＶＩＩ）．５．８７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の量の生成物（ＩＶ）を１００ｍｌのメタノール−水（１：１）の混合物中に溶解し、次いで２００ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の酢酸水銀溶液を加え、この混合物を室温で１時間攪拌する。次いで、沈殿効率をアッセイで制御しながら、硫化水素フローを、この溶液を通して２０分間散布する。硫化水銀沈殿物を濾過し；濾液を１０ｍｌの体積まで減圧下でエバポレートし；次いで、２００ｍｌのイソプロピルアルコールを加え、この生成物を０〜４℃に冷却することにより結晶化する。この結晶を濾過し、イソプロピルアルコール、アセトンで洗浄し、Ｃ２Ｏ５上、減圧下で乾燥する。生成物収量（ＶＩＩ）−３．７２ｇ（８２％）。Ｒｆ＝０．３０、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍ、系：ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：１）。
【０１９３】
（ＶＩＩＩ）．４．５４ｇ（１０ｍｍｏｌ）の量の生成物（ＶＩＩ）を、２０ｍｌの水に懸濁し、そして攪拌しながら５ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の２Ｎ  ＮａＯＨ溶液、次いで４．８ｍｌの０．０５％ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ）（ｃｉｓ−［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２］）の水溶液を加える。この溶液を、１８〜２０℃まで冷却し、そして約２分間で、ほんの少しずつ、５．１ｍｌの３％溶液を温度が２２〜２５℃を超えないような速度で加える。全過酸化水素量の導入の３０分後、この溶液のｐＨを測定し、そして溶液温度をモニターしながら（それは２２〜２５℃の範囲内である）、必要量の４Ｎ  ＮａＯＨ溶液の添加により、その値を５．６〜５．８に導く。次いで、外部の冷却なしで３０分間攪拌を続け、次いで、この反応混合物のコントロール分析をＨＰＬＣにより行う。その目的で、この反応溶液より１０μｌ取り出し、１ｍｌの移動相に溶解した。ＨＰＬＣデータに従って、酸化された形態の含有量が９５％以上の場合、この反応は完了したとみなされる。そうでなければ、室温での攪拌をさらに３０分間続け、ＨＰＬＣアッセイを繰り返す。
【０１９４】
次いで、この反応溶液を、孔のサイズが０．７μｍよりも大きくないフィルターを通して濾過し、濾液を凍結乾燥する。得られた乾燥生成物を、減圧下、４０℃で、無水塩化カルシウム上で、一定の質量まで乾燥する。収量−４．５１ｇ（９５％）。
【０１９５】
準備した物質を、項目５〜１２に従って分析する。
【０１９６】
（実施例２）
（ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシン  リチウム塩の合成）
（Ｉ．）概略的な薬物の特徴
１．名称：ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシン  二リチウム塩、ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金との複合体。
【０１９７】
２．構造式−図９を参照のこと。
【０１９８】
３．全体式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ６Ｏ１２Ｌｉ２Ｓ２・［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２］。
【０１９９】
４．分子量：６２４．４９（Ｐｔ含有量０．０３２％のＣ２０Ｈ３０Ｎ６Ｏ１２Ｌｉ２Ｓ２について）。
【０２００】
５．外観：白色無臭粉末。
【０２０１】
６．溶解度：水、注射用の塩化ナトリウム０．９％等張液に可溶；９５％アルコール、クロロホルム、エーテルおよび他の有機溶媒に不溶。
【０２０２】
７．溶液の透明度および色：１０ｍｌの水中０．０５ｇのこの薬物の溶液は、透明および無色。
【０２０３】
８．０．１％溶液のｐＨ：５．０〜６．０（電位差測定）。
【０２０４】
９．確実性：
ａ）対応のアミノ酸分析（６ｎＨＣｌ、１１０℃、２０時間）：グリシン−２．０（２．０）；グルタミン酸−１．９（２．０）；システイン−１．７（２．０）
ｂ）対応のＮＭＲ（１Ｈ）分光法：ＣＨ２（δ２．０５、２．４０、３．００、３．８０）；ＣＨ（δ３．７２、４．６５）
ｃ）ＨＰＬＣは、降伏時間（ｙｉｅｌｄ  ｔｉｍｅ）による標準と一致。
【０２０５】
１０．純度（主要物質含有量）：
ａ）ＨＰＬＣで＞９５％；
ｂ）アミノ酸分析で＞８５；
ｃ）薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）純一：
ｄ）発光スペクトル法によるリチウム（Ｌｉ）含有量は２．２±０．１％
ｅ）質量分析による白金（Ｐｔ）含有量は０．０１〜０．０２％。
【０２０６】
（ＩＩ．）生成物合成の段階的スキーム（Ａ→Ｂ→Ｃ）
Ａ．還元型グルタチオン（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン）の酸化
Ａ１−過酸化水素により原料還元型グルタチオンをｐＨ＝８で処理する段階−図１０を参照のこと。
【０２０７】
原料化合物（Ｉ）：γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシン（ＧＳＨ）
Ｈ−γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ
試薬：１）過酸化水素（３５％）Ｆｌｕｋａ
２）アンモニア溶液（２５％）
反応条件：（Ｉ）および試薬の水溶液を２０℃で（ｐＨ＝８．０）２０分間攪拌する。
【０２０８】
Ａ２−遊離のヘキサペプチド  ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシンの分離（図１１を参照のこと）
【０２０９】
【化７】
0003547400.tif 000006
原料化合物：Ａ１段階の反応混合物
試薬：氷酢酸
反応条件：氷酢酸によるＡ１反応混合物のｐＨ＝５．０までの酸性化、溶液濾過および生成物の凍結乾燥。
【０２１０】
Ａ酸化段階処理のコントロール：Ｄｅｌｔａ  Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによる（０．１％ＴＦＡ−ＭｅＣＮ、０〜２５％）；化合物（ＩＩＩ）のピーク（＞９７％）（７．４±０．４分）の存在および化合物（Ｉ）のピーク（３．０±０．３分）の不存在をチェックする。
【０２１１】
Ｂ．酸化された形態（ＩＩＩ）のリチウム塩（ＩＶ）への変換−図１２を参照のこと
原料化合物：遊離のヘキサペプチド（ＩＩＩ）
試薬：１Ｎ  ＬｉＯＨ溶液
反応条件：
ａ）２当量のＬｉＯＨによる化合物（ＩＩＩ）水溶液の滴定；
ｂ）減圧下３５〜４０℃で水のエバポレーション；
ｃ）イソプロピルアルコールによる生成物の沈殿；
ｄ）沈殿の濾過；
ｅ）アセトンによる沈殿の洗浄；
ｆ）減圧下（１ｍｍＨｇ）３５〜４０℃で生成物の乾燥。
【０２１２】
Ｂ段階処理のコントロール：試薬の量および乾燥における技術的条件を検査する。
【０２１３】
Ｃ．最終生成物の品質コントロール
１．ＨＰＬＣによる主要物質の含有量：＞９７％。
【０２１４】
この分析は無勾配条件のアセトニトリル−０．１％三フッ化酢酸（２：９８）にて、逆相Ｃ１８を充填した２５０×４．６ｍｍカラムにて、移動相に０．１％薬物溶液２０μｌを用いて行う；流速１ｍｌ／分、２２０ｎｍで検出。同条件で得られる標準ピークと比較する。
【０２１５】
２．非酸化チオール基含有量の分光光度分析データによる主要物質含有量：＞９５％
分析：０．５％薬物溶液０．１２ｍｌを２５ｍｌメスフラスコ（０．１％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８）１ｍｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび２％  ＮａＢＨ４溶液１ｍｌ）に入れる。反応混合物を３０分間２０℃でインキュベートする。反応を、攪拌しながら０．０５ｍｌずつ２分間かけて１Ｍ  ＨＣｌ０．６ｍｌを導入し、続いて攪拌しながら３分かけてアセトン２ｍｌを導入して終結させる。続いて、Ｅｌｍａｎ試薬０．２５ｍｌを添加し、そして全体（容量）を０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）により移す。水を比較溶液として、光学濃度を４１２ｎｍで測定する。同時に、薬物標準を用いた手順を実行し、そして得られたデータを比較する。
【０２１６】
３．他（異質）の混合物の存在：ＴＬＣデータにより、薬物は純一である。
【０２１７】
分析は、バンドに０．１％薬物溶液５μｌを導入して行う。プレートは、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０ｆ（Ｍｅｒｃｋ）１０×５ｃｍである：ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水系（１５０：１００：３０：１２０）。展開は、標準方法（ニンヒドリンおよび塩素／ベンジジン）により行う。
【０２１８】
４．発光スペクトル方法によるリチウム（Ｌｉ）含有量は、２．２±０．１％である。
【０２１９】
（実施例３）
（静脈内導入後の血液血清および組織中のＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧの薬物動態学および代謝）
異なった用量でのＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ静脈内導入後の時間−ＧＳＳＧ濃度曲線およびＧＳＳＧ代謝に関与する酵素の活性変化を研究した。２ｍｇ／体重ｋｇおよび２０ｍｇ／体重ｋｇの用量での単回ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ静脈内導入の後、酸化されたグルタチオン濃度の変化を、６０分間、動物の血液血清、肝臓、腎臓、脾臓およびリンパ球で評価した。さらに、ＧＳＳＧ代謝に関与した酵素の活性変化を評価した（グルタチオンレダクターゼ、グルタチオン−ペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、γ−グルタミル−トランスペプチダーゼ）。
【０２２０】
この研究は雄ＣＢＡマウス（標準体重−１８０〜２００ｇ）で行った。５群の動物（それぞれ１５匹以上のマウスで）を形成させた。群の説明を下記に表す。
【０２２１】
コントロール群：
＃１−薬物の代わりに試験物ビヒクル（通常生理食塩水−（ＮＳ））の単回注射を受けるインタクト動物；
試験群：
＃２−ＧＳＳＧ注射（投与量２ｍｇ／ｋｇ）（ＧＳＳＧは通常生理食塩水に溶解）を受ける動物
＃３−ＧＳＳＧ注射（投与量２０ｍｇ／ｋｇ）（ＧＳＳＧは通常生理食塩水に溶解）を受ける動物
＃４−ＧＳＳＧ・Ｐｔ注射（投与量２ｍｇ／ｋｇ）（ＧＳＳＧ・Ｐｔは通常生理食塩水に溶解）を受ける動物
＃５−ＧＳＳＧ・Ｐｔ注射（投与量２０ｍｇ／ｋｇ）（ＧＳＳＧ・Ｐｔは通常生理食塩水に溶解）を受ける動物。
【０２２２】
血液サンプルは、１、２、５、１０、２０、４０および６０分で採取し、血清は分離し、そして濃度分析を標準法（主要段階は、タンパク質沈殿、サンプルからの非極性および中間極性化合物の除去、ならびにそれに続く無勾配溶出条件および直線勾配溶出条件での分光光度検出を用いるクロマトグラフィー分析である）により行った。
【０２２３】
薬物静脈内導入での血液血清、異なる器官およびリンパ球中のＧＳＳＧ含有量変化を表１−４に示す。
【０２２４】
ＧＳＳＧ代謝に関与する酵素の活性（グルタチオンレダクターゼ：ＥＣ．１．６．４．２；グルタチオン−ペルオキシダーゼ：ＥＣ．１．１１．１．９；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ：ＥＣ．２．５．１．１８；γ−グルタミル−トランスペプチダーゼ：ＥＣ．２．３．２．２）をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨにより作製された標準試薬キットにより決定した。投与量２ｍｇ／ｋｇのＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧの静脈導入後の酵素活性変化値を表５、６、７に示す。
【０２２５】
血液血清、肝臓、腎臓、脾臓およびリンパ球中の薬物の動力学的分布を比較すると、ＧＳＳＧに関するＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物動態学の明らかな優位性が明白である。１０分のＧＳＳＧ濃度は、初期濃度とほとんど等しいが、同時にＧＳＳＧ・Ｐｔ濃度は、初期パラメーターを５０倍上回り、そして研究期間の最後まで所定の高いレベルのままである。その上、血液血清中および組織中の最大ＧＳＳＧ・Ｐｔ濃度は、最大ＧＳＳＧ濃度を３倍上回る。これらの特徴は、ＧＳＳＧと比較して高いＧＳＳＧ・Ｐｔへの影響の有効持続期間を決定する。
【０２２６】
表５、６、７の資料からわかるように、ＧＳＳＧ薬物は、多くの証明された指標でチオール代謝に関与する酵素の活性の約２倍増加するが、しかしＧＳＳＧ・Ｐｔはチオール代謝酵素（主にＨＡＤＰ・Ｈ−グルタチオン−レダクターゼ）の活性を顕著には変化しない。このことは、グルタチオン代謝に関与する主要酵素に関して、基質としての大きなＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物安定性を示し、それゆえに血液血清および異なった器官でのグルタチオン酸化型のより長い存在を引き起こす。腫瘍形質転換メカニズムの点で重大な役割を果たしていると、現在考えられるグルタチオン−Ｓ−レダクターゼに対するＧＳＳＧ・Ｐｔの効果が、前述からの非常に重要な例外であることを見出した。所定の酵素の活性は、ＧＳＳＧ・Ｐｔにより刺激され、その点ではＧＳＳＧに比較して大きな程度である（表５、６および７）ことに注目した。
【０２２７】
従って、得られたデータ分析は、この薬物の薬物動態学の新しい動力学を決定する主要なグルタチオン代謝酵素（全ての中で一番は、グルタチオン−レダクターゼ）の選択的影響に対する高いＧＳＳＧ・Ｐｔ安定性を示した。それは新しい生物学的−薬学的効果の明示およびその結果に新しいＧＳＳＧ・Ｐｔ治療効果の明示を容易にする。
【０２２８】
（実施例４）
（実験的静脈内導入におけるＧＳＳＧ・ＰｔとＧＳＳＧの薬物動態学の比較分析）
【０２２９】
【表４３】
0003547400.tif 000007
【０２３０】
【化８】
0003547400.tif 000008
【０２３１】
【表４４】
0003547400.tif 000009
【０２３２】
【表４５】
0003547400.tif 000010
【０２３３】
【化９】
0003547400.tif 000011
【０２３４】
【表４６】
0003547400.tif 000012
（結論）
直接方法およびモデル上の推定の両方により得られる主要ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物動態的パラメター（最大血液濃度および有効薬物作用期間）は、主要ＧＳＳＧ薬物動態的パラメーターを約２−３倍超えることがＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物とＧＳＳＧ薬物の比較分析で示された。ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物動態曲線下の面積の計算により決定した薬物の血液存在期間を示す積分指標は、ＧＳＳＧに関する対応した指標を４倍越える。従って、より有利な薬学動態学パラメターのために、このＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物は、ＧＳＳＧ薬物に比較して高い薬学的活性および生物学的有用性を有する。
【０２３５】
（実施例５）
（インビボでのヒト末梢血単核白血球によるサイトカイン生成に対するＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧの効果）
酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）およびその構造的アナログ（それは安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドである）を、インビトロのヒト末梢血単核白血球によるサイトカイン生成に対する効果について評価した。
【０２３６】
白血球サイトカイン生成を、試験物質の導入のすぐ後にマイトジェンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を細胞培養液へ添加することによって引き起こした。
ＣｏｎＡおよび試験物へ細胞を２４時間さらし、培養上清を採取し、そしてサイトカイン決定まで−７０℃で貯蔵した。
【０２３７】
各濃度レベルの試験物の存在下での、細胞の機能的状態およびマイトジェンに対応する能力を評価する目的で、コントロール細胞培養物（同一濃度で試験物を含む）を、最初のＣｏｎＡおよび試験物質の同時の導入の後、７２時間インキュベートした。インキュベーション完了の１６時間前に、３Ｈ−チミジンを添加し、そしてＤＮＡへの標識取り込み速度を細胞試験系機能状態の基準として解釈した。
【０２３８】
男性の健康なボランティアからの静脈血をへパリン処理したプラスチックチューブの中に集めた（内毒素試験済み）。ＰＭＮＬ画分をＦｉｃｏｌｌおよびジアトリゾエートナトリウムの密度勾配中に遠心分離により単離した（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；Ｓｉｇｍａ）。
【０２３９】
細胞濃度を、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）；Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）；ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）；ウシ胎仔血清（１０％）を含む培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０，Ｓｉｇｍａ）１ｍＬ当り２×１０６に調整した。使用した全ての試薬は、細胞培養試験グレードＳｉｇｍａであった。細胞生存度を、トリパンブルー排除法により評価し、そして１００μＬの細胞懸濁液（２００，０００細胞）を、組織培養物用平底９６−ウェル滅菌マイクロタイタープレートの各ウェル内に配置した。各被験体からの細胞を３９ウェル以上の中に配置した。
【０２４０】
試験物（ＧＳＳＧ、およびＧＳＳＧ・Ｐｔ）の下記の５つの最終濃度を評価した：５０００μｇ／ｍＬ；５００μｇ／ｍＬ；５０μｇ／ｍＬ；５μｇ／ｍＬおよび０．５μｇ／ｍＬ。各濃度は、その以前に溶解させた試験物の適切な量を含む培地を５０ｍＬ添加することにより、６以上のウェルに確立した。別の６ウェルをコントロール培養液のために用いた：５０μＬの培地のみを添加した。
【０２４１】
試験物を培養液に導入した後すぐに、最終濃度４．０μｇ／ｍＬのために必要とされる量のＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ、細胞培養試験）を含む５０Ｌの培地と自然の３Ｈ−チミジン取り込み（ＣｏｎＡ無しで）の評価を提供する３つのさらなるウェルを除く全てのウェルに添加した。
【０２４２】
３７℃および５％のＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後、３つのウェルの含有物（各６つ１組の同じウェルから）を、取り出し、遠心分離し、そして上清を凍結させ、そしてサイトカインアッセイを実行するまで、−７０℃で維持した。（各６つ１組の）その他の３つのウェル中の培養物を上記に記載された条件下でさらにインキュベートした。
【０２４３】
インキュベーションが始まって５６時間後に、１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンを全ての残留培養液の中に添加し、プレートをさらに１６時間インキュベートし、続いてウェルの含有物を収集し、そしてガラス繊維フィルターへ移し、それを結果として５％トリクロロ酢酸およびエタノールで処理した。フィルターを乾燥し、そしてその放射能（１分当りのカウント、ｃｐｍ）を液体シンチレーションカウンター、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ  １２０５（ＬＫＢ）を用いて決定した。
【０２４４】
３つ１組の同一の培養液の平均放射能値をマイトジェン刺激の指標（未刺激の培養液（ＣｏｎＡ無しの３ウェル）の平均ｃｐｍ値に対するＣｏｎＡ刺激した培養液の平均ｃｐｍ値の比率）を計算するのに用いた。このウェルの刺激指標（試験物は種々の濃度で存在した）は、細胞の機能状態の基準およびマイトジェン刺激に応答する細胞の能力として役立った。
【０２４５】
７２時間比べたコントロール培養液３組が１５から５０の範囲の刺激指数の値でＣｏｎＡへのマイトジェン応答を発生した場合にのみ、２４時間培養物３組の上清を、引き続きサイトカイン含有量についてアッセイした。
【０２４６】
インターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；インターロイキン−４（ＩＬ−４）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子α、γ（ＴＮＦ−α、γ）、およびインターフェロンα、γ（ＩＦＮ−α、γ）の濃度は市販の試薬キット（Ｍｅｄｇｅｎｉｘ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いたＥＬＩＳＡにより決定した。これらの濃度は、１ｍＬの培養液上清当りｐｇの量で発現された。
【０２４７】
顕著な発見が表８、９にて与えられる。表８および９から理解され得るように、培養培地の中へのＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔの添加は、結果として統計的に有意でありかつ用量依存性の、ヒト単核白血球によるサイトカイン生成の刺激を生じた。しかし、ＧＳＳＧ・Ｐｔ刺激の影響は、ＧＳＳＧ効果と比較して、広いサイトカインの範囲の生成の刺激および調節を伴って、研究したサイトカイン生成に対してより有意（１．５−２倍大きい）であった。表８および９における相関関係したサイトカインの変化（ＩＬ−４、ＩＬ−１０の減少に対してＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、γの増加）の相関性が明らかに分かり得る。
【０２４８】
したがって、インビトロのヒト末梢単核白血球に対するＧＳＳＧ・Ｐｔの影響はそれらの相互的調節効果を考えると、培養培地へのより広いサイトカイン範囲の放出というかなりの刺激で表され、そして、それにより、ヒト血球の自然サイトカイン生成能力に対するＧＳＳＧ・Ｐｔの刺激および調節効果が確認された。
【０２４９】
（実施例６）
（シクロホスファミド誘導の造血抑制および免疫抑制におけるサイトカインおよび造血因子生成ならびに造血パラメーターおよび免疫パラメーターに対するＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔの効果）
１．酸化（ＧＳＳＧ）グルタチオンおよびその構造アナログ、（それは安定したジスルフィド結合を有するヘキサペプチドである）を、細胞分裂抑制剤シクロホスファミド（ＣＰ）の単回投与により誘導した造血抑制および免疫抑制のマウスモデルにおいて評価した。
【０２５０】
本研究は、インビトロでインターロイキン−１（ＩＬ−１α、β）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；インターロイキン−３（ＩＬ−３）；インターロイキン−４（ＩＬ−４）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子α、γ（ＴＮＦ−α、γ）、インターフェロンα、γ（ＩＦＮ−α、γ）およびＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを生成する、ＣＰ処理したマウス脾細胞の能力に対する試験物の５日間長期投与の効果を評価するように設計した。さらに、血液白血球およびリンパ球の数および骨髄細胞質（カリオサイト数）を、ＣＰ投与後８日で決定した。次いで、ＣＰを受けた動物いくつかを、ヒツジの赤血球（ＳＲＢＣ）でチャレンジし、そして抗原に対する体液性免疫応答を評価した。
【０２５１】
雄のＣＢＡマウス（体重１８０−２００ｇ）に、投与量５０ｍｇ／ｋｇでＣＰの単回腹腔内注射を行った。４つの動物群（各１５匹以上のマウス）を形成した。群の説明は下記に表される。
コントロール群：
＃１−ＣＰ注射の代わりに通常生理食塩水（ＮＳ）の単回注射を受けたインタクト動物（さらに試験物ビヒクル（通常生理食塩水）で処理した）。
＃２−単回ＣＰ注射を受けた動物（さらに試験物ビヒクル（通常生理食塩水）で処理した）。
試験群：
＃３−単回ＣＰ注射を受けた動物（さらに試験物ビヒクル（通常生理食塩水にＧＳＳＧを溶解）投与量５ｍｇ／ｋｇで処理した）。
＃４−単回ＣＰ注射を受けた動物（さらにＧＳＳＧ・Ｐｔ（通常生理食塩水に溶解）投与量５ｍｇ／ｋｇで処理した）。
【０２５２】
ＣＰ注射の２４時間後、各群の５匹の動物を、ＳＲＢＣで免疫した（０．５ｍＬのＮＳ中１０７細胞、腹腔内）。
【０２５３】
ＣＰ注射（免疫の２４時間後）後、３日目に、試験物または参照物の腹腔内注射を開始した（上記のように）。５日間、注射を行った：毎日、１日１回。
【０２５４】
５日間の処置過程の完了、２４時間後（ＣＰ注射後、８日目に）、マウスを安楽死させ、そしてインビトロでの脾臓リンパ球による自発的なサイトカイン因子および造血因子の産生の評価のために、脾細胞培養物を無菌的に調製した。
【０２５５】
同時に、血液サンプルおよび骨髄サンプルを、血中の白血球、リンパ球および骨髄の有核の細胞の計数のために集めた。
【０２５６】
免疫された動物由来の血清サンプルを、ＳＲＢＣアグルチニンのレベルについて試験した（ＣＰ注射８日後および免疫７日後）。
【０２５７】
表１０は、ヘモ抑制および免疫抑制を誘導したシクロホスファミドのバックグラウンドに対する試験物を受け入れた、脾細胞によるサイトカイン因子および造血因子の産生のパラメーター、骨髄および血液カウント指標、ならびにマウスにおけるヒツジ赤血球への免疫応答を示す。
【０２５８】
表１０のデータに従って、ＧＳＳＧ・Ｐｔ投与をサイトカイン因子および造血因子の産生の標準まで設定したが、ＧＳＳＧはわずかな刺激効果を示したのみであった。加えて、より広範囲のサイトカイン因子および造血因子のためのＧＳＳＧ・Ｐｔ刺激産生は同様に、対応する病的な過程での相互関係を有するサイトカインの変化の正の相関と共に確認されたサイトカインの状態に関して変化に対する有意な調節的影響を有した。
【０２５９】
従って、ＣＰ誘導血液および免疫無防備状態の動物におけるＧＳＳＧ・Ｐｔの使用は、ヒツジ赤血球に対する骨髄および血液細胞指標ならびに免疫応答発生の回復と共に、サイトカイン因子および造血因子の内因性の産生の顕著な刺激を生じる。
【０２６０】
２．本研究の目的は、シクロホスファミド誘導血球減少（骨髄減少（ｍｙｅｌｏｐｅｎｉａ））モデルでのＧＳＳＧ・Ｐｔ効力を調査することであった。
【０２６１】
研究は、１６０．０グラムの重量の白雄ラットにて行った。シクロホスファミドを、１００ｍｇ／ｋｇの用量で背の皮下に１回導入した（注射用のビヒクルは水であった）。
【０２６２】
４つの動物の群（それぞれに少なくとも１５のマウス）を編成した。群の記載を、以下に示す。
【０２６３】
コントロール群
・＃１−ＣＰ注射の代わりに、１回の通常の生理食塩水（ＮＳ）の注射を受けた無処置の動物であり、それらは、さらに試験物ビヒクル（通常の生理食塩水）で処置された、群；
・＃２−１回のＣＰ注射を受けた動物であり、それらは、さらに試験物ビヒクル（通常の生理食塩水）で処理された、群。
【０２６４】
試験群
・＃３−１回のＣＰ注射を受けた動物であり、それらは、さらに５ｍｇ／ｋｇの用量のＧＳＳＧ・Ｐｔ（通常の生理食塩水に溶解した）で処理された、群。
【０２６５】
ＣＰ注射後の２日目に、試験物または参照物の腹腔内注射を開始した（１０〜１５日目の間、１日１回）
それぞれのシリーズの終わり（１０日目および１５日目）に、実験群を、エーテルの過剰摂取により安楽死させ、そして分析のために、末梢血液（尾静脈）および骨髄（大髄骨）を採取した。血液学的な研究を、ユニット化された標準の方法を使用して行った。末梢血液分析の結果を、表１１に示す；ミエログラム分析の結果を、表１２に示す。
【０２６６】
表１１を分析することにより、１００ｍｇ／ｋｇの用量のシクロホスファミドは、絶対的であり相対的であるリンパ球減少症（観察期間に依存する（１５日目で最大を示した））を有する生成した血球エレメントのすべてで顕著な血球減少の効果を示すことが見出されたと記述することができる。
【０２６７】
４匹の動物が：９日目、１０日目、１２日目および１４日目に死んだことに注意すべきである。実際、これらの動物の全てが無気力、活力低下、重量減少を示した。
【０２６８】
ＧＳＳＧ・Ｐｔの導入は、顕著な刺激効果を提供した。全身の状態の改善、正の体重変化が観察され、そして血液において現れた未成熟な細胞形態は、骨髄造血の活性化を示した。動物の死は、記述されなかった。
【０２６９】
ミエログラムの分析は、１００ｍｇ／ｋｇの用量のシクロホスファミドが顕著な骨髄毒効果を示すことが見出されたことを示した。赤血球形成、血小板（ｔｒｏｍｂｏｃｙｔｏ−）生成、およびリンパ球生成は、特に抑制された。骨髄抑制は、１５日目に最も顕著であった。
【０２７０】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ投与は、かなりの骨髄抑制効果を有した。
【０２７１】
１５日間の毎日の過程として導入される１０ｍｇ／ｋｇの用量の、このＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物は、シクロホスファミド誘導血球減少および骨髄減少における顕著な骨髄刺激効果を発揮する。この薬物投与は、処理動物の１００％生存率を提供したが、コントロール群において３０％の死亡率が記述された。
【０２７２】
（実施例７  照射誘導造血抑制および免疫抑制におけるサイトカインおよび造血因子の産生、ならびに造血および免疫パラメータへのＧＳＳＧおよび（Ｌｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔ）の効果）
酸化された（ＧＳＳＧ）およびその構造的なアナログ（それは、ＧＳＳＧ・Ｐｔ（Ｌｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔ）のリチウム塩である）の両方は、合計線量１Ｇｙ［１９、２２、２７−３７］の１回の照射により誘導される血液抑制および免疫抑制のマウスモデルにおいて評価された。
【０２７３】
研究を、インビトロで、インターロイキン１（ＩＬ−１  α、β）；インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン３（ＩＬ−３）；インターロイキン４（ＩＬ−４）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；インターロイキン８（ＩＬ−８）；インターロイキン１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン１２（ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子α、γ（ＴＮＦ−α、γ）、インターフェロンα、γ（ＩＦＮ−α、γ）およびＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを生成するための照射に曝露したマウス由来の脾細胞の能力における試験物の７日間の毎日の投与の効果を評価するように設定した（曝露２時間後に投与を開始した）。加えて、血液白血球およびリンパ球数、および脾臓細胞質および骨髄細胞質（カリオサイト数）、ならびに脾臓および延髄コロニー刺激能力が、照射後８日目に測定された。
【０２７４】
雄ＣＢＡマウス（体重量１８〜２０ｇ）は、１回１８０ｋＶの線量の０．５ｍｍのＣｕのフィルター（１５ｍＡ、距離７０ｃｍ、持続時間２分２８秒で）を通ったＸ線に照射された。吸収された合計線量は、約１Ｇｙを含んだ。
【０２７５】
４群の動物（それぞれに少なくとも１２匹のマウス）を、編成した。群の記載は、以下に示す。
コントロール群：
・＃１−ストレス衝撃を再生するために偽照射処置を受けた無処置の動物であり、それらは、さらに試験物ビヒクル（通常の生理食塩水）で処理された、群；
・＃２−１Ｇｙの線量で照射されたコントロール動物であり、それらは、さらに試験物ビヒクル（通常の生理食塩水）で処理された、群；
試験群
・＃３−１Ｇｙの線量で照射されたコントロール動物であり、それらは、さらに５ｍｇ／ｋｇの用量の試験物（通常の生理食塩水に溶解したＧＳＳＧ）で処理された、群；
・＃４−１Ｇｙの線量で照射された動物であり、それらは、さらに５ｍｇ／ｋｇの用量の試験物（通常の生理食塩水に溶解したＬｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔ）で処理された、群。
【０２７６】
照射後２時間で、試験物または参照物の腹腔内注射を開始した（上記のように）。注射は、７日間行った：１日１回、毎日。
【０２７７】
７日間の処置過程の完了後、２４時間（照射後８日目）で、マウスを安楽死させ、インビトロでの脾臓リンパ球による自発性サイトカインおよび造血因子の産生（インターロイキン１（ＩＬ−１  α、β）；インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン３（ＩＬ−３）；インターロイキン４（ＩＬ−４）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；インターロイキン８（ＩＬ−８）；インターロイキン１０（ＩＬ−１０）；インターロイキン１２（ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子α、γ（ＴＮＦ−α、γ）、インターフェロンα、γ（ＩＦＮ−α、γ）およびＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）の評価のための脾細胞培養物を無菌的に調製した。
【０２７８】
同時に、血液、脾臓および骨髄サンプルが、血液白血球およびリンパ球、および脾臓および骨髄の有核の細胞計数のために収集された。
【０２７９】
加えて、脾臓細胞および骨髄細胞の造血性コロニー形成能力を、コントロール群または試験群の動物より得た脾臓細胞または骨髄細胞を静脈内に受けた照射された同素（ｓｉｎｇｅｎｉｃ）のＣＢＡマウスの脾臓におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）直接カウント法により評価した。
【０２８０】
曝露後８日目の照射動物の骨髄および脾臓でのサイトカインおよび造血因子の産生についての脾細胞レベル、血液、骨髄、および脾臓細胞指標、ならびにコロニー形成パラメータ（コロニー形成ユニット、ＣＦＵ）を表１３にまとめた。
【０２８１】
表のデータより明白なように、ＧＳＳＧは顕著に低い効力を産生したが、Ｌｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔ投与は、脾細胞によるサイトカインおよび造血因子の産生の統計学的な顕著な回復を生じる。しかし、Ｌｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔは、対応する病的な過程に関して、より広いサイトカインおよび造血因子の範囲の内因的産生に影響し、ならびにサイトカインの状態の変化を調節する。
【０２８２】
従って、発達した照射誘導性の血液抑制および免疫抑制を有する動物における適用方法としてのＬｉ・ＧＳＳＧ・Ｐｔの用法は、内因性のサイトカイン因子および造血因子の産生の明白な刺激調節を生じ、そして血液、リンパ球および造血器官の細胞組成物の効果的な回復、ならびに骨髄および脾臓のコロニー形成活性もまたもたらす。
【０２８３】
（実施例８  リン酸修飾のプロセスならびにＩＬ−２レセプターを有するリンパ球の量に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体およびその塩の効果）
ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体およびその塩を有するサイトカインの免疫生化学的な効果の再生の分子機構を、研究した。
【０２８４】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体およびその塩：ナトリウム（Ｎａ）、リチウム（Ｌｉ）およびマグネシウム（Ｍｇ）の研究行為を、細胞増殖抑制性のシクロホスファミド（ＣＦ）の１回の投与により誘導される血液抑制および免疫抑制のマウスモデルで評価した。
【０２８５】
この研究で、リンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンへのリン酸化レベルの能力およびＩＬ−２レセプターの「活性な」リンパ球キャリアの量に対する験物の５日間の長期投与の効果を評価した。
【０２８６】
雄ＣＢＡマウス（体重量１８〜２０ｇ）に、５０ｍｇ／ｋｇの用量で単回のＣＰの腹腔内注射を与えた。ＣＦ注射の後、この動物に、２４時間後５ｍｇ／ｋｇの用量の試験物を共に導入した。試験物は、５日間導入された（１日１回、毎日）。試験物の導入の完了の２４時間後に、マウスを安楽死させ、そして実験を行うために血液サンプルを収集した。
【０２８７】
単核白血球の画分をフィコール−メトリゾエート（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，Ｓｉｇｍａ）勾配中の遠心分離により得た。細胞濃度は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  グルタミン、５０ｍｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児を含む細胞培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０）の１ｍｌあたり２×１０６細胞に調製した。細胞生存度をトリパンブルー排除法により評価し、次いで細胞懸濁液を９６−ウェルマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）プレートにウェルあたり２００，０００細胞で置いた。
【０２８８】
ＩＬ−２レセプターのリンパ球キャリアの量を、Ｈｏｒｇａｎ  Ａ．Ｆ．（１９９４）に従って、単核スリップ（ｓｌｉｐ）のスミアにおいて決定した。ＩＬ−２レセプターのｐ５５およびｐ７５鎖に対する単核抗体を、第１の抗体として使用した。第１の抗体を示すために、標識されたマウス免疫グロブリンに対するポリクローナルウサギ抗体を使用した。ＩＬ−２レセプターのリンパ球キャリアの数を、合計リンパ球の数に対する百分率とした。
【０２８９】
代謝的標識のためにリンパ球を、１０％ウシ血清を添加したＩｇｌａ培地中で培養した。［３２Ｐ］オルトリン酸を用いた代謝的標識を、１０〜１２時間、１００  μＣｉ／ｍｌの［３２Ｐ］オルトリン酸塩を含むリンを含まないＤＭＥ培地中において細胞インキュベーションにより行った。サンプル毎に、同位元素を有する０．２ｍｌの培地を添加した。インキュベーション後、細胞をピペッティングすることにより破砕し、そして６０００ｇで３０分遠心分離した。得られた上清を、Ｆｕの方法（１９９２）でホスホチロシンに対するポリクローナル抗体を用いる免疫沈降のために使用した。タンパク質Ａ−セファロース（ｓｅｆａｒｏｓｅ）を免疫複合体の沈降のために使用した。沈降物を、３回洗浄し、そして沈降活性を「γ」カウンターでカウントした。
【０２９０】
行われた研究の結果（表１４）によると、単離されたリンパ球におけるＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体の作用は、観察されたリンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンにおけるリン酸化レベルの有意な増加を１０分で生じ、これはシグナル伝達系の活性の欠かせない徴候である。これらの変化は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体の作用、大部分はＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体の派生の作用により、サイトカインおよび造血因子の合成の原因である酸化還元感受性の遺伝子（第一に、免疫学的に重要な遺伝子）の発現の調節を決定する。
【０２９１】
表１５において、データは、リンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンのリン酸化レベル、およびシクロホスファミド誘導性の血液抑制および免疫誘導を有する試験物を受けたＣＢＡ系統マウスにおけるＩＬ−２レセプターのリンパ球キャリアの百分率を示す。
【０２９２】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体塩の適用は、ＩＬ−２レセプターのリンパ球キャリアの百分率の増加、およびほとんど規格されたそれらの量（通常の量は、１８．３±１．６％）を生じる。リンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンのリン酸化レベルが研究された場合、同様の調節が見出された。
【０２９３】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体塩の適用は、シクロホスファミドによりモデリングされた免疫不全状態におけるＩＬ−２レセプターのリンパ球キャリアの百分率の回復を生じる。記載された試験物の免疫刺激作用の因子の１つであり得るシグナル伝達系のリンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンにおけるリン酸化レベルの増加が存在する。
【０２９４】
従って、実施例は、サイトカイン（第一に、ＩＬ−２）の範囲の調節効果を再生する（模倣する）ＧＳＳＧ・Ｐｔの証拠を提供する。本発明者らは、ＩＬ−２効果の再生として免疫応答性細胞および造血細胞の系における調節サイトカインシグナル伝達を行う細胞内機構のＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体による誘導を意味することを意図する。行われた研究は、免疫発生器官および造血器官の細胞のシグナル伝達系のリンパ球サイトゾルタンパク質のチロシンのリン酸化レベルの変化がシクロホスファミドをモデリングした免疫不全の条件において、活性リンパ球の量の動的な規準化の効果を引き起こすことを示した。
【０２９５】
従って、治療的目的での薬用薬物の形態におけるＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体およびその誘導体の適用は、サイトカインおよび造血因子の内在性産生を刺激するだけではなく、免疫生化学的サイトカイン効果の再生（主に腫瘍学的およびレトロウイルス病理学において、レセプターの脱感作が観察される場合）もまた提供する。
【０２９６】
（実施例９  胃癌、腹膜転移、腹水、巨脾腫および胆汁うっ滞性肝炎を有する患者における内因性サイトカイン産生の刺激およびＧＳＳＧ・Ｐｔ適用の治療的効果）
３３歳の患者は、２年以上の間、胃新生物を有すると診断された（中程度の分化度の腺癌）。１９９３年に、その患者は、悪性胃潰瘍のために手術され、そして肝門（ｐｏｒｔｅ  ｈｅｐａｔｉｓ）において多数の高密度なリンパ節が発見され、それらは、転移であると考えられた。
【０２９７】
１９９４年１月に、重症の胆汁うっ滞により化学療法（５−ＦＵ）の過程を完了し、そしての左および右肝臓管路の経皮のドレナージを行い、続いて、６ヶ月後ブラウン吻合を有する変わりやすいトランスリバー（ｔｒａｎｓｌｉｖｅｒ）排液管を有する総胆管空腸吻合術（ｃｈｏｌｅｄｏｃｈｏｅｊｕｎｏｓｔｏｍｙ）を行った。
【０２９８】
１９９５年１１月、患者の状態は、悪化した。検査によると患者は、活性な第２の肝炎を体験した。肝臓は肥大しかつ痛みがあり、そして肋骨弓より上へ５〜６ｃｍ突出した。血液化学指標は、持続的に異常であることを示し、行われた処置によりほとんど矯正しなかった：ビリルビン−間接的なため４０．０（最大３１．０）；アミノトランスフェラーゼの活性−通常の上限より約６倍高く、低アルブミン血症は、最高２６％であった；ならびにγグロブミン過剰血症もまた存在した；高コレステロール血症は、最高１０．２μｍｏｌ／ｌであった。
【０２９９】
ファイバー胃腸検査（ｆｉｂｒｏｇａｓｔｒｏｃｏｐｙ）の間（１９９５年、１１月）、胃癌は、胃体の中央領域に位置し、約８ｃｍの伸展が確認された。腫瘍は、固体様型であった。胃壁は強固であった。組織検査は、腫瘍が中程度の分化の腺癌であることを定義した。１９９５年１２月、その患者は、調査的な開腹術を受けた。腹水は、複数の転移を伴い腹膜、巨脾腫の至る所に見出された。この患者の症例は、手術不能であると同定された。
【０３００】
ＧＳＳＧ薬物形態を適用する決定がなされた。その薬物を、非経口的に注射し（筋内および静脈内）、そして加えて、この薬物形態を、内視鏡を通じて腫瘍組織の周囲に局所注射を介して使用した。インサイチュでの筋内および静脈内注射に使用した平均用量−０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、および局所注射−最高５０ｍｇ。この薬物の非経口注射は、１日おきに、ｂ．ｉ．ｄ．（朝に静脈内注射、および夕方に筋内注射）で、３週間適用され、その後、４週間に週２回適用された。内視鏡を介するこの薬剤の導入は、７日に１回行われた。フィブロガストロドゥオデノスコピー（ｆｉｂｒｏｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎｏｓｃｏｐｙ）を使用した薬物形態での処置の開始の２ヶ月後、以下を示した：食道は通った、粘膜はピンクであった、心臓ロゼット（ｃａｒｄｉａ  ｒｏｓｅｔｔｅ）は部分的に閉じていた。空の胃における中程度の量の泡沫状の分泌が胃にあり、それは胆汁で集中的に染色された。腫瘍の範囲は４．８ｃｍであった。同時に、造血および血液の化学指標の実質的な改善が見出され、そして肝臓の大きさは、最大３ｃｍにまで縮小した（肋骨弓の下）。
【０３０１】
処置の完了後、６ヶ月（１９９６年７月）で、患者の状態は顕著に悪化した。検査によると第２の肝炎が再発した。肝臓は、大きさが増大し柔らかくなり、肋骨弓を超えて４ｃｍ突出した。血液化学指標は異常であり、行われた処置によりほとんど改善されなかった：ビリルビン−間接的なため３６０（最大２８．０）；アミノトランスフェラーゼの活性−通常の上限より約４倍高い、低アルブミン血症は最大２１％；そしてγグロブミン過剰血症もまた存在し；高コレステロール血症は最大９．４２μｍｏｌ／ｌ。
【０３０２】
ファイバー胃腸検査（１９９６年６月）において、胃癌は、胃体の中央領域に位置し、そして約６ｃｍの伸展が確認された。腫瘍は、固体様型であった。胃壁は、強固であった。組織検査は、腫瘍が中程度の分化の腺癌であることを定義した。１９９６年８月、患者は、調査的な開腹術を受けた。腹水は、複数の転移を伴い腹膜、巨脾腫の至る所に見出された。
【０３０３】
以前に行われた治療を考慮して、この決定は、先の投与されたＧＳＳＧ薬物の構造的なアナログである新規の薬物ＧＳＳＧ・Ｐｔを適用するためにとられた。この薬物は、同一の養生法：非経口的に（筋肉内および静脈内に）に従って、導入し、そしてさらにこの薬物形態を、内視鏡を通じて腫瘍組織の周辺への局所注射により導入した。平均用量は、筋肉内注射および静脈内注射については、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、そして局所注射については、インサイチュで５０ｍｇまでで用いられた。この薬物の非経口注射を、３週間の間、隔日、１日２回（朝に静脈内注射および夕方に筋肉内注射）、そしてその後、４週間の間、１週間に２回適用した。内視鏡を通じてのこの薬物導入を、７日間に１回行った。
【０３０４】
適用した薬物を用いた処置開始２ヶ月後：肝臓は、肋骨弓を越えて１ｃｍ隆起した（触診で感じない）。超音波試験データに従って：以前に決定された癌の部位の場所に線維組織が存在する。線維胃鏡検査（ｆｉｂｒｏｇａｓｔｒｏｃｏｐｙ）において：食道は通過可能であり、粘膜はピンクであり、噴門ロゼットは、部分的に閉じていた。胃壁は弾性である。空の胃において、唾液と共に胃の中に中程度の量の泡沫状分泌物があった。腫瘍の範囲は、１．５ｃｍであった。十二指腸は、自由に通過可能であった。同時に、血液学指標および血液化学指標の実質的な改善を示した。
【０３０５】
薬物ＧＳＳＧ・Ｐｔおよび以前に用いたＧＳＳＧ薬物の治療的有効性の比較によって、臨床学的指標、生化学的指標、血液学的指標、および免疫学的指標、線維胃鏡検査データ（腫瘍の大きさは、ＧＳＳＧ投与後の４０％の減少と比較して、ＧＳＳＧ・Ｐｔを適用している間に７５％減少する）での明確な変化よって明示された利点を見出した（表１６、１７）。さらに、表１７において、ＧＳＳＧ・Ｐｔが、それらの含有量の変化に対して、調節作用を有するサイトカインおよび造血因子の広い範囲の産生を刺激することが、理解され得る。
【０３０６】
従って、本発明に従う処置は、血液学的パラメーター、血液化学的パラメーターおよび免疫学的パラメーターおける同時に起こる明白な有益の変化、ならびに生活の質の有意な改善を有する、腫瘍過程の注目すべき退行を生じる。
【０３０７】
（実施例１０）
（肺癌の処置に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ適用の治療的有効性）
患者番号１：Ｒｅｓｎｉｋｏｖ  Ｅｕｇｅｎｉｙ  Ｆｒｉｄｒｉｈｏｖｉｃｈ
生年：１９３８年
診断：右肺上葉の癌
組織の診断：番号４５７６０（Ｓｔａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ
ｏｎ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ）−小細胞癌
病歴：番号４０２４
入院の際の病訴：わずかな労作の際の、激しく排出される粘膜性の痰、呼吸困難を伴なう咳嗽。
【０３０８】
客観的な試験：この患者の状態は、良好である。末梢リンパ節は膨大していない。右肺の上部領域および中部領域で弱められた粗い呼吸音がある。非常にわずかな労作の際にまれに乾性ラ音、呼吸困難がある。
【０３０９】
エックス線撮影（最初のデータ）：上部縦隔影が、膨大した右気管傍リンパ節によって広幅化している。上部右根部分の不明瞭な影が広幅化している。両肺における顕著な間隙の変化のバックグラウンドに対して、右肺の末梢Ｓ３領域においてさらなる影がある。右葉間の境界は、肥厚化されている。結論：リンパ管炎の徴候を有する根および縦隔のリンパ節への転移の徴候がある。
【０３１０】
処置過程：ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いる３つの免疫化学的療法の過程を、適用した。
【０３１１】
処置後：患者の状態は、有意に改善された：軽い衰弱は、まだあり、呼吸困難はない。
【０３１２】
客観的な試験：状態は、良好である。末梢リンパ節は、膨大していない。右肺の中間部分において、弱められた呼吸音がある。他の部分での呼吸音は、小胞性である。ラ音はない。
【０３１３】
エックス線撮影（治療を行った後）：肺領域は、特に明瞭である。右肺のＳ３領域に軽い浸潤の徴候がある。根は膨大していない。右根投影においてさらなる形成はない。縦隔上部の影は、膨大していない。孤立気管傍リンパ節が、決定され得る。
【０３１４】
患者番号２：Ｓｅｍｙｏｎｏｖ  Ｐｅｔｒ  Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖｉｃｈ
生年：１９４５年
診断：右肺癌、肝臓転移
組織の診断：番号４５９９８、小細胞癌
病歴：番号４０７６
入院の際の病訴：軽い労作の際の、激しく排出される粘膜性の痰、呼吸困難を伴なう咳嗽、衰弱、胃に伸びる腰椎領域に常に痛み。最近６ヶ月の間に、患者は６ｋｇ痩せた。
【０３１５】
客観的な試験：状態は、中程度に重症である。強膜は、黄疸性である。呼吸音は粗く、右肺上部および中部において弱められている。右鎖骨上領域において、膨大したリンパ節を触診し得る（個体の堅さ、ほとんど動かない、大きさ３．０ｃｍおよび１．０ｃｍ、無痛性）。聴診では、右の中間部分において、弱められた粗い呼吸音がある。非常にわずかな労作の際に孤立乾性ラ音、呼吸困難がある。肝臓は、肋骨弓上で３．５ｃｍ隆起した。
【０３１６】
試験において、以下が見出された：中葉気管支癌、中葉換気過少、肺炎。超音波試験において、転移性の肝臓障害の徴候がある。
【０３１７】
エックス線撮影（最初のデータ）：右肺中葉は、サイズが減少される（中葉換気過少の状態）。増加した肺パターンのバックグラウンドに対して、水平葉間胸膜に沿って異なる縁を有する、集中的なほとんど同種の浸潤がある。右根は、決定され得ない。右肺および左肺の上葉および下葉は、任意の特定の特徴を有さない。縦隔器官は、著しく転置しなかった。
【０３１８】
処置過程：ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いた３つの免疫化学的療法の過程が適用された。
【０３１９】
処置後：患者の状態は、有意に改善された：衰弱および呼吸困難はなく、食欲は出てきて、彼は、５ｋｇ増えた。血液指数は、回復した。
【０３２０】
客観的な試験：状態は、良好である。末梢リンパ節は、膨大していない。右肺の中間部分において、弱められた呼吸音がある。他の部分での呼吸音は、小胞性である。ラ音はない。
【０３２１】
肝臓の超音波検査データおよびＣＡＴスキャンデータに従って：全塊退行過程（ｆｕｌｌ  ｍａｓｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）がある。
【０３２２】
エックス線撮影（処置を行った後）：胸部のエックス線写真で中葉の些少な無気肺が存在する。根は、構造的であり、膨大しておらず、右根は、わずかに下方へ転置している。心臓は、大きさにおいて膨大していない。
【０３２３】
最初のデータと比較すると、かなりの明確な発達があった：右で、肺組織がより透明になってきている（換気過少の徴候の減少）。浸潤性の影はない。
【０３２４】
結論：
ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物の処置の有効性を評価して、以下が見出された：
１．指標の臨床的な回復（一般的な状態の改善、症状の病理の欠如、体重の増加）；
２．レントゲン写真の変化（肺組織の透明性増加、影の浸潤性の欠如、無気肺の消失および換気過少）；
３．指数の血液学的な回復（赤血球数およびヘモグロビン含量の増加、白血球数の回復）；
４．超音波データおよびＣＡＴスキャンデータの変化（全腫瘍退行過程）；
５．免疫指数の回復および抗腫瘍サーベイランス系の回復を示すＣＤ１６＋数、ＣＤ２５＋数の増加；
６．広い範囲のサイトカイン合成の誘導ならびにそれらの含量相互調節の変調（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αの含量変化の相関関係）。
【０３２５】
従って、示された臨床的な実施例において、ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物適用が、免疫系および造血系のより効果的な回復を保証する、臨床的指数、レントゲン学的指数、血液学的指数および免疫指数のより速い回復を提供することを実証した。前述は、最終的に患者の生活の質の有意な上昇を行う、腫瘍退行過程を示す。
【０３２６】
（実施例１１）
（慢性Ｂ型ウイルス性肝炎（ＣＨＢＶ）の処置に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ適用の治療的有効性）
患者番号１：Ｋｕｐｃｈｅｎｋｏ  Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｉｃｈ
生年：１９４５年
診断：ＣＨＢＶ、中程度の活性グレードを有する複製期（ＰＣＲ  ＨＢＶ＋）
病歴：番号１０６８
入院の際の病訴：衰弱、右肋骨弓の下に不快感、吐気、食欲なし。
【０３２７】
既往歴（ａｎａｍｎｅｓｉｓ  ｍｏｒｂｉ）：最近６年間で、記載された患者は、右肋骨弓の下の鈍痛、衰弱、尿の色の変化が定期的に現れた。試験で、以下が見出された：３４μｍｏｌ／Ｌまでの高ビリルビン血症、５．４ｍｍｏｌ／時間．ＬへのＡＬＴの上昇。ＣＨＢＶ血清学的マーカーおよびＰＣＲ  ＨＢＶ（＋）を、病院の試験で決定した。
【０３２８】
客観的な試験：この患者の状態は、良好である。肝臓は、肋骨弓を越えて２ｃｍ隆起した。この肝臓の縁は、堅固であり、そして圧痛がある。
【０３２９】
以前の処置は、行われなかった。
【０３３０】
処置過程：養生法に従って、ＧＳＳＧ薬物の投与を用いた処置過程を実行した。
【０３３１】
実行した処置過程後の状態：明確な変化を以下に示した−一般的な状態の有意な改善、衰弱および吐気なし、不快感の減少。肝臓は、肋骨弓を越えて０．５ｃｍ隆起した。肝臓の縁は、軟らかく、そして圧痛がない。
【０３３２】
患者番号２：Ｌｕｋａｓｈｅｎｋｏ  Ｉｇｏｒ  Ｍａｔｖｅｙｅｖｉｃｈ
生年：１９６４年
診断：ＣＨＢＶ、複製期（ＰＣＲ  ＨＢＶ＋）、中程度の活性
病歴：番号１０４３
入院の際の病訴：かなりの衰弱、食欲なし、発汗、尿の暗色化。
【０３３３】
既往歴：この患者は、１９９６年１月から病気の始めに気付き、この時、初めて、この患者は、右肋骨弓の下の鈍痛、３８．７℃までの体温の上昇、嘔吐、尿の暗色化が現れた。急性のウイルス性Ｂ型肝炎が診断および血清学的に確認された。この患者は、無毒化治療および抗菌的治療を施された。しかし、後に、上昇したＨｂｓ  Ａｇ値およびＡＬＴ値、持続性のウイルス複製活性が観察された。最後になされた試験で、以下が見出された：７８μｍｏｌ／Ｌの高ビリルビン血症、６．２ｍｍｏｌ／時間．ＬへのＡＬＴの上昇。ＣＨＢＶ血清学的マーカーおよびＰＣＲ  ＨＢＶ（＋）を、病院の試験で決定した。
【０３３４】
客観的な試験：一般的な状態は、良好である。皮膚および強膜は、黄疸性である。肝臓は、肋骨弓を越えて２．５ｃｍ隆起した。肝臓の縁は、堅固であり、そして圧痛がある。
【０３３５】
以前の処置：１９９７年９月１７日から、この患者は、２１日間アシクロビルを投与された。この過程の完了後、ＡＬＴは２１ｍｍｏｌ／時間．Ｌまで、ビリルビン３２ｍｍｏｌ／時間．Ｌに上昇した。Ｈｂｓ  Ａｇ度は変化しなかった。この患者の状態を、有意な無力性−植物性症候群（ａｓｔｈｅｎｉｃ−ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と規定した。
【０３３６】
処置過程：養生法に従って、ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物の投与を用いた処置過程を実行した。
【０３３７】
実行した処置過程後の状態：活気のある以下の明確な変化を示した−一般的な状態の有意な改善、衰弱なし、発汗および吐気なし。皮膚および強膜は、黄疸性ではなかった。尿の色は正常になり、不快感は減少した。肝臓は、肋骨弓を越えて０．５ｃｍ隆起した。肝臓の縁は、より軟らかく、そして圧痛がなくなった。
【０３３８】
比較（表２０、２１）：
ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物およびＧＳＳＧ薬物の治療の有効性の比較分析において、前者は、有利であることが示され、これは以下によって明らかとなった：
１．生化学的指数の規準化（ＡＬＴ減少およびビリルビン減少）；
２．有意なＨＢｓ  Ａｇ減少および複製停止；
３．免疫指数の規準化およびウイルス形質転換細胞中のアポトーシス過程の活性化を示すＣＤ９５＋含量の増加；
４．より広範囲のサイトカインの著しい調節。
【０３３９】
（実施例１２）
（急性Ｂ型ウイルス性肝炎（ＡＨＢＶ）の処置に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ適用の治療的有効性）
患者の氏名：Ｍｉｎｉｎａ  Ｏｋｓａｎａ  Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖｎａ
性別：女性
年齢：２０歳
入院患者カード：６７８
診断：急性ウイルス性Ｂ型肝炎（ＨＢｓ  Ａｇ「＋」）、複製期（ＰＣＲ  ＨＢＶ「＋」）、長期の形態；慢性Ｄ型ウイルス性肝炎、複製期（ＰＣＲ  ＨＤＶ「＋」）
試験中の病訴：衰弱、食欲減少
既往歴：この患者は１９９７年８月に病気を感じ、この時、彼女は、急激な衰弱、倦怠感、背骨の痛み、３８．８℃までの体温の上昇を示した。暗色尿および強膜黄疸が、１０日後に現れた。この患者は、ウイルス感染クリニックに入院した。ここで、彼女は、無毒化治療、鎮痙治療、抗菌治療の過程を受けた。しかし、複製ウイルス活性およびＧＰＴレベルの上昇はまだ、存在した。長期化した細胞溶解症候群が、薬物ＧＳＳＧ・Ｐｔの投与の基礎を与えた。
【０３４０】
以前の処置は、行わなかった。
【０３４１】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物での処置：１９９７年１０月３０日〜１１月２３日まで。
【０３４２】
処置過程完了後の患者の状態：患者の状態は、良好である。彼女は、食欲が増し、衰弱の減少を示した。
【０３４３】
結論（表２２〜２４）：
ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いた免疫調節過程は、以下の明確な変化を提供した：生化学的指標の規準化；ＨＢＶ複製およびＨＤＶ複製の終結；ＨＢｓＡｇ持続性の終結；ウイルス感染細胞アポトーシス誘導；一般的な状態の改善；安定な治療効果。
【０３４４】
（実施例１３）
（慢性Ｃ型ウイルス性肝炎（ＣＨＣＶ）の処置に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ適用の治療的有効性）
患者の氏名：Ｚｕｂｏｖ  Ｖｉｔａｌｉｙ  Ｖａｌｅｒｉｅｖｉｃｈ
性別：男性
年齢：１８歳
患者の病状：番号１０４３
診断：慢性Ｃ型ウイスル性肝炎、複製期（ＰＣＲ  ＨＣＶ「＋」）、中程度に著しい活性；慢性Ｂ型ウイルス性肝炎、組み込み期（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ）（ＰＣＲ  ＨＢＶ「−」）；麻薬中毒、麻薬による精神異常。
【０３４５】
試験中の病訴：衰弱、右の肋骨の下、膝関節、背骨および橈骨手根関節の痛み。
【０３４６】
既往歴：この患者は、１９９７年８月の始めから膝関節および背骨において痛みを示した。血液試験において、ビリルビンレベルの３４μｍｏｌ／Ｌまでの上昇およびＧＰＴレベルの２．１ｍｍｏｌ／時間．Ｌまでの上昇を見出した。１９９７年８月１５日からの病院での試験の間、抗ＨＣＶ  ＩｇＧおよびＣ型肝炎ウイルスの複製活性が見出された。
【０３４７】
既往歴（ａｎａｍｎｅｓｉｓ  ｖｉｔａｅ）：この患者は、１４日目で薬物の使用を開始した。試験時間に、彼に１日あたり２ｇまでのヘロインを使用する。彼は麻薬離脱の状態である。
【０３４８】
以前の処置は、行わなかった。
【０３４９】
ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いた免疫調節治療過程：１９９７年８月１５日〜１９９７年９月７日まで。
【０３５０】
処置過程完了後の患者の状態：この患者の状態は、良好である。彼は、衰弱の有意な減少を示し、右肋骨の下における痛みおよび関節における痛みを示さなかった。前記の患者に関して、麻酔離脱状態は、痛みを有さずに、そして少ない時間でほとんど減少した。生化学的指数の規準化およびウイルス複製活性の欠如が特徴付けられた。
【０３５１】
結論：ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いた免疫調節治療過程は、以下に示した明確な変化を提供した：生化学的指標の規準化および血清学的指標の規準化；ＨＣＶ複製の終結。免疫指数およびサイトカイン状態パラメーターは、感染過程制御およびウイルス複製非存在と相関する。処置後のＦａｓＡｇ（ＣＤ９５＋）に対するモノクローナル抗体を用いた液体クロマトグラフィーによる患者の末梢血液リンパ球の試験は、ウイルス感染細胞におけるプログラムされた細胞死過程の活性化を示すＣＤ９５＋細胞の増加を示した。処置後１ヶ月および３ヶ月の管理で、この状態の安定化が示された。
【０３５２】
併用薬物中毒およびＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物の適用での離脱状態は、より速く矯正され、そして患者を苦しむことのないようにした。
【０３５３】
複製活性および併用薬物中毒と共に慢性Ｃ型肝炎のためのＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物を用いた免疫調節過程は、以下の結果を提供している：
・血液中の生物学的指標の規準化；
・血液学的指標の規準化；
・ＨＣＶ複製の終結；
・免疫血液指標およびサイトカイン状態の規準化；
・末梢血液リンパ球におけるアポトーシス過程の誘導；
・薬物離脱状態の迅速な矯正；
・安定な治療の効果。
（実施例１４）
（正常細胞および形質転換細胞における増殖発達ならびにアポトーシスＤＮＡ分解に影響を与えるＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔの比較分析）
正常細胞および形質転換（ＨＬ−６０）細胞で、増殖発達ならびにアポトーシスＤＮＡ分解に影響を与えるＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔを、比較的に分析した。最終的に、ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔを、ＨＬ−６０骨髄株細胞、および健康なボランティアの血液から得られた正常なヒトリンパ球を用いて２４時間インキュベートした。
【０３５４】
健康なボランティアの静脈血液を、エンドトキシンについて試験をしたヘパリン処理された試験チューブ中に収集し、血中の白血球の単核画分を、フィコール計量勾配（ｆｉｃｏｌｌ−ｍｅｔｒｉｚｏａｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，Ｓｉｇｍａ）における遠心分離によって得た。細胞濃度を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５０ｍｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンおよび１０％胎仔ウシ血清を含む細胞培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０）１ｍｌあたり２×１０６細胞に調整した。細胞生存度を、トリパンブルー排除法により評価し、次いで、その細胞懸濁液を、２４ウェルマイクロリットルプレートおよび９６ウェルマイクロリットルプレートのウェル中に１ウェルあたり２５０，０００細胞で置いた。
【０３５５】
ＨＬ−６０骨髄系統細胞を、１０％胎仔ウシ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。培養を密閉フラスコで行い、培地容量は１２ｍＬであり、培地を４日毎に交換した。試験する直前に新鮮な培地中の細胞懸濁液を、２４ウェルマイクロリットルプレート中に入れ（それぞれのウェルの細胞濃度は、１ウェルあたり２５０，０００細胞であった）、そしてその試験物−ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔ−を、最終濃度１００μｇ／ｍＬまで、対応するウェル中に添加した。
【０３５６】
試験物に対する効果試験を、培養液中に添加後２４時間、４８時間に行った。
【０３５７】
分析手順は、以下を含んだ：２４〜４８時間のインキュベーション後、それらをトリパンブルー排除法によって総細胞数および死細胞数を算定し；その後、細胞懸濁液を遠心分離（１２，０００  ｇ、エッペンドルフ試験チューブにおいて１０分間）した。細胞ペレットを、ＤＮＡ分離前に凍結し、−７０℃で保った。ＤＮＡの分離を、Ｋｉｒｂｉ−Ｇｅｏｒｇｉｙｅｖフェノール法によって行った。細胞ペレットに対して、０．５ｍｌの１０％ＳＤＳ、および０．１Ｍ  ＥＤＴＡならびに０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む０．５ｍｌのＴＥ緩衝液（「Ａ」緩衝液）を添加し、そしてペレットを１５分間そのチューブを振盪することによって再懸濁した。次いで、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０によって調整された等量のフェノールを加え、その産物を２分間混合し、そしてエッペンドルフ試験チューブにおいて、１２，０００  ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離完了後、上部水相を再度フェノール処理した。フェノール処理後、上部水相を２回、等量の水相で混合したフェノールクロロホルム混合液（１：１）で処理した。水相を１２，０００  ｇで１０分間の遠心分離によって分離し、汲み出し、そして一旦、等量のクロロホルムと混合した。その後、それを１２，０００  ｇで遠心分離し、上相を分離し、２倍量の−２０℃で凍結された蒸留されたエチルアルコールと混合し、そして−２０℃で一晩保存した。ＤＮＡペレットを、１２，０００  ｇで１０分間の遠心分離により集め、その上清を除去し、そしてペレットを、２００μＬの、−２０℃で５分間凍結した７０％エチルアルコールによって洗浄し、同じ条件で再び遠心分離し、そしてその後そのペレットを１時間風乾した。次いで１０μＬのＡ緩衝液で希釈し；そのＤＮＡ量を、Ｄｉｓｈｅ法により決定し、そして２％アガロースゲル（「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）により作製されたＮＡグレード（ｇｒａｄｅ）を有するアガロースを使用した）において電気泳動を実施した。ＤＮＡ電気泳動分離は、「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）によって作製されたデバイスにおいて２％アガロースゲルのブロック（ｂｌｏｃｋ）で行った。緩衝溶液としては、０．０２Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０２Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０４Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７を適用した。アガロース（２％）は、電極緩衝液（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で調製した。ＤＮＡサンプル（２〜５μｇ）を、ゲルスロット中に置いた。電気泳動は、６Ｗ／ｃｍの電気電界強度で３時間行った。サンプル推進を、臭素−フェノールブルーの動きによって観察した。電気泳動完了後、ゲルブロックをデバイスから取り出し、そしてエチジウムブロミド溶液（３μｇ／ｍＬ  Ｈ２Ｏ）を有する容器中に、暗所で３０分間入れた。インキュベーション完了後、そのゲルを、水でリンスし、そして「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）により作製されたトランスイルミネーターで、波長２５４ｎｍの透過紫外線照射で調べた。そのゲルを赤色フィルターを用いてＺｅｎｉｔ  Ｅカメラにより���真に撮った。
【０３５８】
その研究結果を、表２８および２９ならびに図１３および１４に示す。表２８および２９のデータにおいて理解し得るように、正常細胞および形質転換細胞に影響を与えるＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔは、代替的特徴を有する。ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔは正常細胞の増殖を刺激した（表２８）。正常細胞（表２８）から得られたＤＮＡの電気泳動は、生存可能細胞について特有の同質の高分子画分を背景に、追跡可能な大量のアポトーシスフラグメントの存在のみを示した。
【０３５９】
対照的に、骨髄起源（ＨＬ−６０）癌細胞培養において、両方の薬剤の影響によるアポトーシスの活性化および細胞分裂阻害が観察された（表２９、図１４）。影響の多様性は、量的な性質を有した。
【０３６０】
従って、ＧＳＳＧ衝撃後の死滅ＨＬ−６０細胞量は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ影響後の死滅ＨＬ−６０細胞量より確実に少ない（表２９）。ＨＬ−６０細胞における、より強い衝撃効果（ＧＳＳＧと比較したＧＳＳＧ・Ｐｔ）に対する明らかな指標は、電気泳動分析後に得られたアポトーシスフラグメントの特徴である。薬剤でインキュベートしていないＨＬ−６０細胞のＤＮＡ電気泳動は、高分子の存在（特に、生存可能細胞についての特有の同質ＤＮＡ（図１４、バンド＃２））を実証した。ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤およびＧＳＳＧ薬剤で２４時間および４８時間インキュベートした細胞のＤＮＡ電気泳動は、ＤＮＡオリゴヌクレオソーム分解を示した（図１４、それぞれバンド１および３）。すなわち、アポトーシスのラダーは、プログラムされた細胞死における疑う余地のない徴候である。しかし、ＧＳＳＧで処理したＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスのラダーは、生存可能ＨＬ−６０細胞について特有のかなり大量の高分子ＤＮＡを含んだが（図１４、バンド＃１）、ＧＳＳＧ・Ｐｔで処理した細胞における高分子ＤＮＡは、実質的に存在しなかった（図１４、バンド＃３）。
【０３６１】
ＨＬ−６０細胞は、ｐ５３遺伝子において不完全であり（ｐ５３遺伝子欠失）、そしてＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔ処理を介したアポトーシス誘導は、ｐ５３産物の関与を伴わずに単に起こり得る。したがって、ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤は、ｐ５３遺伝子産物とは無関係にプログラムされた細胞死の内部輪郭（ｉｎｎｅｒ  ｃｏｎｔｏｕｒ）を活性化することが言える。ｐ５３欠失は、およそ半分の癌病理症例に存在する。実験結果は、腫瘍の化学的治療に対するＧＳＳＧ、そして特にＧＳＳＧ・Ｐｔの効果を示したようであった。
【０３６２】
結論：実施された研究は、正常細胞（リンパ球）の生存度を増加させ、そして逆に、形質転換細胞におけるアポトーシスを誘導する（すなわち、抗腫瘍活性を働かせる）ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤の能力を示すデータを得ることを可能にした。そのうえ、形質転換された細胞のアポトーシス誘導に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ活性は、目的の生存度判定基準（すなわち、ＧＳＳＧ処理後かなりの数が現われ、そしてＧＳＳＧ・Ｐｔ処理後には大部分が存在しなかった高分子ＤＮＡの存在）に従ったＧＳＳＧ薬剤に対する活性を有意にしのいだ。従って、アポトーシス誘導における重要な因子であるｐ５３遺伝子において不完全な骨髄株ＨＬ−６０の細胞について得られたそのデータは、本発明者らが以下のように述べることを可能にする：
ＧＳＳＧおよびＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤は、ｐ５３遺伝子産物に関係なくアポトーシス発生の内部輪郭を誘導する；
複合体に基づくＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤は、ＧＳＳＧに対してより高い化学的治療活性（形質転換細胞におけるアポトーシス誘導に起因する）を保持する。
【０３６３】
（実施例１５）
（増加されたｒａｓ遺伝子発現を有するｐ５３癌抑制遺伝子において不完全な正常細胞および形質転換細胞で、増殖発達ならびにアポトーシスＤＮＡ分解に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ効果の分析）
異なる系統の形質転換細胞（ＨＬ−６０、Ｃ−８、Ａ−４）の増殖発達およびアポトーシスＤＮＡ分解に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ効果を、アポトーシス発生および細胞応答に対する多分化能の因子であるｒａｓ遺伝子について重要な因子であるｐ５３欠失に依存して比較的に分析した。ＨＬ−６０細胞培養物は、ｐ５３遺伝子において不完全な骨髄球性白血症（ｍｙｅｌｏｌｅｕｋｏｓｉｓ）起源のヒト細胞である。細胞培養物Ｃ−８およびＡ−４は、ｒａｓ遺伝子、およびアデノウイルス抗原フラグメントであるＥ１ａ発現増強因子の遺伝子を伴うプラスミドを有する形質転換されたマウス繊維芽細胞である。そこでは、Ａ−４細胞は、ｐ５３遺伝子を欠失しており、そしてＣ−８の細胞は、インタクトなｐ５３遺伝子を含んだ。ドナー血液のリンパ球スリップ（ｓｌｉｐ）をインタクトなｐ５３遺伝子を有するヒト細胞のコントロールとして使用した。
【０３６４】
ＨＬ−６０（ｐ５３−−）骨髄系統細胞は、１０％胎仔ウシ血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖した。細胞懸濁液の培養を、密閉フラスコ中で実施し、培地容量は１２ｍＬであり、培地を４日毎に取り替えた。試験する直前に新鮮な培地中細胞懸濁液を、２４ウェルマイクロリットルプレート（それぞれのウェル対する細胞濃度は、ウェルあたり２５０，０００細胞であった）に入れ、そして試験物−ＧＳＳＧ・Ｐｔ−を最終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬまで対応するウェルに添加した。
【０３６５】
健康なボランティアの静脈血液を、エンドトキシンについて試験をしたヘパリン処理された試験チューブ中に収集し、血中の白血球の単核画分は、フィコール計量勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，Ｓｉｇｍａ）における遠心分離によって得た。細胞濃度を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５０ｍｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンおよび１０％胎仔ウシ血清を含む細胞培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０）１ｍｌあたり２×１０６細胞に調整した。細胞生存度を、トリパンブルー排除法により評価し、次いで、その細胞懸濁液を、２４ウェルマイクロリットルプレートおよび９６ウェルマイクロリットルプレートのウェル中に１ウェルあたり２５０，０００細胞で置いた。
【０３６６】
マウスの形質転換された繊維芽細胞は、１０％胎仔ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地中で増殖した。その細胞懸濁液の培養は密閉フラスコで行い、培地容量は１２ｍＬであり、培地を４日毎に交換した。試験する直前に、新鮮な培地中の細胞懸濁液を、２４ウェルマイクロリットルプレート中に入れ（それぞれのウェルの細胞濃度は、１ウェルあたり５０，０００細胞であった）、そしてその試験物ＧＳＳＧ・Ｐｔ−を最終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬまで、対応するウェル中に添加した。
【０３６７】
試験物に対する効果試験を、培養液中に導入後２４時間、４８時間に行った。
【０３６８】
分析手順は、以下を含んだ：２４〜４８時間のインキュベーション後に、それらをトリパンブルー排除法によって総細胞数および死細胞数を算定し；その後、細胞懸濁液を遠心分離（３，０００  ｇ、エッペンドルフ試験チューブで１０分間）した。細胞ペレットを、ＤＮＡ分離前に凍結し、−７０℃で保った。ＤＮＡの分離は、Ｋｉｒｂｉ−Ｇｅｏｒｇｉｙｅｖフェノール法によって行った。細胞ペレットに対して、０．５ｍｌの１０％ＳＤＳ、および０．１Ｍ  ＥＤＴＡならびに０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む０．５ｍｌのＴＥ緩衝液（「Ａ」緩衝液）を添加し、ペレットを１５分間のそのチューブを振盪することによって再懸濁した。次いで、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０によって調整された等量のフェノールを加え、その産物を２分間混合し、そしてエッペンドルフ試験チューブ中で、１２，０００  ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離完了後、上部水相を再度フェノール処理した。フェノール処理後、上部水相を２回、等量の水相で混合したフェノールクロロホルム混合液（１：１）で処理した。水相を１２，０００  ｇで１０分間の遠心分離によって分離し、汲み出し、そして一旦、等量のクロロホルムと混合した。その後、それを１２，０００  ｇで遠心分離し、上相を分離し、２倍量の−２０℃で凍結された蒸留されたエチルアルコールと混合し、−２０℃で一晩保存した。ＤＮＡペレットを、１２，０００  ｇで１０分間の遠心分離により集め、その上清を除去し、そしてペレットを、２００μＬの、−２０℃で５分間凍結した７０％エチルアルコールによって洗浄し、同じ条件で再び遠心分離し、そしてその後そのペレットを１時間風乾した。次いで１０μＬのＡ緩衝液で希釈し；そのＤＮＡ量を、Ｄｉｓｈｅ法により決定し、そして２％アガロースゲル（「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）により作製されたＮＡグレードを有するアガロースを使用した）において電気泳動を実施した。ＤＮＡ電気泳動分離は、「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）によって作製されたデバイスにおいて２％アガロースゲルのブロックで行った。緩衝溶液としては、０．０２Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０２Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０４Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７を適用した。アガロース（２％）は、電極緩衝液で調製した。ＤＮＡサンプル（２〜５μｇ）を、ゲルスロット中に置いた。電気泳動は、６Ｗ／ｃｍの電気電界強度で３時間行った。サンプル推進を、臭素−フェノールブルー指示薬の動きによって観察した。電気泳動完了後、ゲルブロックをデバイスから取り出し、そしてエチジウムブロミド溶液（３μｇ／ｍＬ  Ｈ２Ｏ）を有する容器中に、暗所で３０分間入れた。インキュベーション完了後、そのゲルを、水でリンスし、「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）により作製されたトランスイルミネーターで、波長２５４ｎｍの透過紫外線照射で調べた。そのゲルを赤色フィルターを用いてＺｅｎｉｔ  Ｅカメラにより写真に撮った。
【０３６９】
研究結果は、表３０、３１、３２、３３に示される。表３１から明らかなように、ＧＳＳＧ・Ｐｔは、ｐ５３遺伝子を欠失しているＨＬ−６０細胞培養におけるアポトーシスを誘導する。その効果は、１０μｇ／ｍＬの濃度で幾分発達したが、１００μｇ／ｍＬでより明らかであった。プログラムされた細胞死の、疑う余地のない徴候であるＤＮＡヌクレオソームサイズの複合のＤＮＡアポトーシスフラグメントの集塊もまた観察された。
【０３７０】
対照的に、ＧＳＳＧ・Ｐｔは、正常細胞に対して刺激効果を生じた（すなわち、特定の増殖が観察された（表３０））。正常細胞から得られたＤＮＡの電気泳動は、それが、生存可能細胞についての特有の同質の高分子画分によって提示されたことを示した。
【０３７１】
従って、正常細胞および形質転換細胞に対する薬剤作用の相違は、基本的に互いに異なっていた。ＧＳＳＧ・Ｐｔ相違作用における機構は、ｒａｓ遺伝子シグナル伝達系を介して、ｐ−５３非依存性アポトーシス経路の活性化によって決定され得る。このｒａｓ遺伝子系は、分裂促進因子カスケードを介して細胞の増殖および分化を刺激し得、そして別の細胞シグナルカスケードを介してアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導し得る。
【０３７２】
それを調べるために、マウス繊維芽細胞に影響を与えるＧＳＳＧ・Ｐｔと、増強されたｒａｓ遺伝子発現を比較したが、インタクトなｐ５３遺伝子（野生型）が存在する−細胞Ｃ−８（５３＋＋）、またはｐ５３遺伝子が存在しない細胞（遺伝子的欠失）−（細胞Ａ−４（ｐ５３−−））において異なっていた。表３２および表３３から理解し得るように、ＧＳＳＧ・Ｐｔの効果は、両方の細胞系統において現れた。アポトーシス誘導は、有意に示された。それは、ｐ５３非依存性アポトーシス経路の活性化を示す。両方の細胞系統における活性化されたｒａｓ遺伝子の存在は、ＨＬ−６０細胞よりも形質転換された繊維芽細胞において、より顕著なアポトーシス表示の説明になり得る。ｒａｓ遺伝子シグナル伝達系を介したアポトーシス誘導が確認された。Ａ−４細胞およびＣ−８細胞に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ効果は、１０μｇ／ｍＬの濃度では違いはなかった。Ｃ−８細胞に比べて、Ａ−４細胞に対する有意に優れたＧＳＳＧ・Ｐｔ効果は、１００μｇ／ｍＬ濃度で注目された。ｐ５３タンパク質の不在は、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導のためのｒａｓシグナル伝達経路を更に増強させるようであった。
【０３７３】
ｐ５３遺伝子欠失は、およそ半分の癌疾患症例において生じる。これらの実験の結果は、それらの腫瘍の化学的治療に対するＧＳＳＧ・Ｐｔの有効性を暗示し得る。
【０３７４】
結論：それらの研究に由来するデータは、正常細胞（リンパ球）生存度を増加させ、そしてこれに反して、形質転換細胞におけるアポトーシスを誘導するＧＳＳＧ・Ｐｔ薬剤の能力を示した（すなわち、抗腫瘍活性を行った）。そのうえ、形質転換細胞（ｐ５３遺伝子において不完全な）のアポトーシス誘導に関するＧＳＳＧ・Ｐｔ活性は、高い薬剤濃度におけるインタクトなｐ５３遺伝子を有する細胞についての活性より優れていた。目的の生存度の判定基準（すなわち、正常なドナー細胞（リンパ球スリップ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｌｉｐ）から得られた）のＧＳＳＧ・Ｐｔ処理後にかなり大量に現れる高分子ＤＮＡの存在）に従って、特に細胞死は存在しなかったが、形質転換細胞に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ衝撃があった場合、ＤＮＡアポトーシス分解が観察された（すなわち、ｐ５３遺伝子（特に、刺激作用を有する）を欠失している細胞における不可逆的なアポトーシス死誘導の徴候）。以前に、実施例９において、ＧＳＳＧ・Ｐｔ処理後のサイトカイン範囲の活性化を示した。ｒａｓシグナル伝達経路の活性化有するサイトカイン作用が決定され得ることを考慮すると、サイトカインの刺激はまた、ｒａｓ遺伝子タンパク質との相互作用を介して抗腫瘍効果を生じ得る。
【０３７５】
（実施例１６）
（癌抑制遺伝子を欠失するマウス形質転換細胞培養物における増殖発達およびアポトーシスのＤＮＡ分解に対するＧＳＳＧ・Ｐｔ効果の分析）
ＧＳＳＧ・Ｐｔは、活性化されたｒａｓ遺伝子であるインタクトなｐ２１遺伝子を有する細胞株（ｐ２１＋＋；Ｃ−８細胞）およびノックアウトｐ２１遺伝子を有するマウス細胞株（ｐ２１−−）の形質転換繊維芽細胞の増殖発達およびアポトーシスのＤＮＡ分解に効果を及ぼす。
【０３７６】
ｐ２１＋＋系統の細胞は、ｒａｓ遺伝子およびアデノウイルス抗原フラグメントであるがインタクトなｐ５３およびｐ２１遺伝子を有するＥ１ａ発現増強因子の遺伝子を有するプラスミドを有する、マウス形質転換繊維芽細胞である。ｐ２１（−−）系統は、インタクトなｐ５３およびｒａｓ遺伝子を有するが、ｐ２１遺伝子を欠失する。これは、細胞分裂Ｇ１期の障害性調節の状況における、アポトーシス誘導に対するＧＳＳＧ・Ｐｔの効果を評価することを可能にする。
【０３７７】
細胞培養物を、１０％胎仔ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地中で増殖した。細胞懸濁液培養を、培地量が１２ｍＬの密封したフラスコ中で行い、培地を４日毎に交換した。試験前に直接、新鮮な培地中の細胞懸濁液を、２４ウェルμｌプレートに移し（各ウェルについて細胞濃度は、１ウェル当たり５０，０００細胞であった）、そして試験物「ＧＳＳＧ・Ｐｔ」を、対応するウェル中に最終濃度１００μｇ／ｍＬまで添加した。
【０３７８】
試験物についての効果試験を、培養物中への導入後２４、４８時間で行った。
【０３７９】
分析の手順は、以下の工程を包含する：２４〜４８時間のインキュベーション後、総細胞数および死細胞数をトリパンブルー排除法によって計算した；後に、細胞懸濁液を（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆテストチューブ中で、３，０００  ｇで１０分間）遠心分離した。細胞ペレットを凍結し、そしてＤＮＡ分離の前に−７０℃で保存した。ＤＮＡ分離を、Ｋｉｒｂｉ−Ｇｅｏｒｇｉｙｅｖフェノール法によって行った。細胞溶解を、０．５ｍｌの１０％ＳＤＳの添加によって行った。０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で調整した後、等量のフェノールを添加し、その産物を２分間混合し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｌｆテストチューブ中で、１３，０００  ｇで１５分間遠心分離した。フェノール除タンパク質を２回繰り返した。後に、水相を、フェノール−クロロホルム混合物（１：１）を用いて２回処理し、そしてクロロホルムを用いて１回処理した。核酸を、２容量の９６％エチルアルコールを添加して、２０  Ｃで一晩によって沈降した。ＤＮＡを、３０分間１３，０００  ｇで遠心分離することによって集め、デカントし、７０％エチルアルコールを用いて洗浄し、そして風乾した。乾燥後、沈殿物をＴＥ緩衝液に溶解した。ＤＮＡ濃度を、得られた溶液中で決定した（Ｄｉｓｈｅ方法による）。核酸の分画の含量を、２％アガロースゲル中の電気泳動によって決定した（「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）によって作製されたＮＡグレードのアガロースを使用した）。ＤＮＡ電気泳動分離を、「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）によって作製されたデバイス中で、２％アガロースゲルのブロック中で行った。電気泳動を、ｐＨ７．４のＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ  トリス、０．０２Ｍの酢酸ナトリウム、０．０２ＭのＥＤＴＡ）中、６Ｗ／ｃｍの電界強度で３時間行った。サンプルの推進を、臭素フェノールブルー指示薬運動（ｂｒｏｍｉｎｅ−ｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｍｏｔｉｏｎ）によって観察した。電気泳動の結果を、エチジウムブロマイド溶液（５μｇ／ｍｌ）を用いたゲル染色の後、「Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ」（Ａｕｓｔｒｉａ）によって作製されたトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）において、透過した紫外線照射（λ＝２５４ｎｍ）中で試験した。
【０３８０】
研究の結果を、表３４、３５に示す。表３４から明らかなように、ＧＳＳＧ・Ｐｔは、多重のＤＮＡヌクレオソームサイズであるＤＮＡアポトーシスの断片の集塊によって明らかにされる活性化ｒａｓ遺伝子を有するｐ２１＋＋細胞培養物中で、アポトーシスを誘導する。
【０３８１】
不活性なｒａｓシグナル伝達系を有するがＧ１期における細胞周期の遅れの制御を欠失するｐ２１（−−）細胞において、ＧＳＳＧ・Ｐｔは、ｐ２１＋＋細胞（表３４、３５）におけるアポトーシスよりも低い程度でアポトーシスを誘導した。これは、ｒａｓ系が、分裂促進因子のカスケードを介した細胞増殖および細胞分化を刺激し得、そして別の細胞シグナルカスケードを介してアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導し得るという事実によって、結び付けられ得る。ｐ２１遺伝子発現の非存在は、ｒａｓシグナル伝達経路の特異的カスケードの相互関係における変化を引き起こし得、そしてそれに関して、ｐ２１遺伝子欠失の場合において、薬物によるアポトーシス刺激を減少させる。
【０３８２】
ｐ２１遺伝子の欠失は、腫瘍学的な疾患においてはめったに起こらない。これは、実施された実験の問題を考慮することが、これら腫瘍の化学療法に対するＧＳＳＧ・Ｐｔの有効性を意味し得る（ｐ２１遺伝子に変異を有する腫瘍における低い有効性を伴う場合を除く）。
【０３８３】
（結論）：実施された研究は、形質転換された細胞においてアポトーシスを活動的に誘導する（すなわち、抗腫瘍活性を与える）ＧＳＳＧ・Ｐｔ薬物の能力を示すデータを得ることを可能にした。増強されたｒａｓ遺伝子発現は、形質転換された細胞Ｃ−８におけるアポトーシス誘導を容易にし、このことはｒａｓシグナル伝達系を介するＧＳＳＧ・Ｐｔ抗腫瘍活性の実行を示す。ｐ２１遺伝子発現の非存在の場合におけるより小さい薬物効果は、ｒａｓシグナル伝達経路の分裂促進的カスケードおよびアポトーシスのカスケードにおける因子の再分布によって決定され得る。
【０３８４】
それにもかかわらず、ＤＮＡアポトーシスの分解の存在（すなわち、不可逆的なアポトーシスの死の誘導の徴候）が、ｐ２１欠損細胞でさえ、ＧＳＳＧ・Ｐｔ作用の後に見出される。
【０３８５】
前述によって、本発明者らが、ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体ベースの薬物が、以下であることを述べることを可能にする：
・ｒａｓ依存アポトーシス経路の誘導を介する腫瘍形質転換細胞に関して、化学療法的な活性を実現する；
・ｐ２１欠失細胞を含む腫瘍形質転換細胞におけるアポトーシスの発生を誘導する。
【０３８６】
（実施例１７）
（糖尿病の患者におけるＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の治療的効果）
患者：Ｂｒｏｎａｖｅｔｚ  Ｌｉｄｉａ  Ｓｅｒｇｅｙｅｖｎａ
性：女性
年齢：３７
外来患者カード：＃６３
診断：糖尿病。インシュリン非依存性型−ＩＩ型。糖尿病の血管障害、グレードＩＶ。
【０３８７】
病歴：最初に、高血糖は３１歳の時に明らかとなった。１９９４年１０月、この患者は、病院＃１６の内分泌部門（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）に認められた。患者の母方の遺伝的経歴に糖尿病症例があった。この疾患は徐々に発達し、血糖値は、１２．１〜１５．７ｍｍｏｌ／Ｌを上下し、糖尿は７％であった。
【０３８８】
以前の処置：疾患の発症において、この患者は頻繁に病院に認められた；１９９４年に６ヶ月の間、彼女に、Ｉｎｓｕｌｉｎｌｅｎｔｅ  Ｓ．Ｎ．Ｃ．−３２  ＩＵおよびスルホニルウレアグループの経口低血糖剤を投与した；次いで、インシュリンを中止し、そしてこの患者に抗糖尿病剤（Ｂｕｃａｒｂａｎ、Ｄｉａｂｅｔｏｎ）を使用した。血糖は、１０．７から１５．４ｍｍｏｌ／Ｌに変化し、糖尿は３〜７％であった。
【０３８９】
１９９８年１月に、この患者は病院に運ばれ、そして以下の処置レジメンを施した：Ｄｉａｂｅｔｏｎは０．０８ｇ（２錠）を１日に２回、Ｇｌｕｃｏｂａｙは０．１を１日に３回。
【０３９０】
血糖含量：
９．００  １２．６ｍｍｏｌ／Ｌ
１２．００  １２．０ｍｍｏｌ／Ｌ
１４．００  １５．３ｍｍｏｌ／Ｌ
１７．００  １９．１ｍｍｏｌ／Ｌ
６．００  １１．５ｍｍｏｌ／Ｌ
糖尿−３％。
【０３９１】
以前の治療が無効果であったため、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の薬物を使用することを決定した。
【０３９２】
（ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩に関する病院の処置レジメン）：１９９８年１月１７日より
１日に１回で１０日間ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の静脈内注射（日用量は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）。
【０３９３】
続く１０日間は、１日おきにＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の静脈内注射（日用量は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）。
【０３９４】
続く１０日間（３回目の１０日間）は、１日に１回、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の筋内注射（日用量は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）。
【０３９５】
ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩処置を、ＤｉａｂｅｔｏｎおよびＧｌｕｃｏｂａｙによって変更された処置レジメンと共に実施した。Ｄｉａｂｅｔｏｎは０．０８を１日に２回、Ｇｌｕｃｏｂａｙは０．０５を１日に３回投与した。
【０３９６】
血糖が、正常値に回復し、そして食後８．２〜１０．６ｍｍｏｌ／Ｌを超えなかった。退院後、患者は、１ヶ月間外来患者として、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩処置を受けた。
【０３９７】
（ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩に関する外来の処置レジメン）
１ヶ月にわたって、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩の筋内注射を、１日に１回（日用量は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）投与した。
【０３９８】
ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物を用いた処置の連続２ヶ月間に、１．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌへのグルコース含量の減少という注意される２つの発症が存在し、その時は、抗糖尿病薬物投与量を低くする。２ヶ月の処置の後、Ｇｌｕｃｏｂａｙを中止する。
【０３９９】
（処置過程完了後の患者の状態）：基礎治療に関する補助としてのＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物の投与を用いた４ヶ月の処置の後、患者の通常状態は、顕著に改善し、そして良好であるとして評価される。血液学的な血液の指標、生化学的な血液の指標、免疫学的な血液の指標の進展は、表３６、３７中に提供される。
【０４００】
グルコース、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、チオールジスルフィド比および他の分析されたパラメーターの、指標の進展に対するコメント。
【０４０１】
グルコース含量の進展は、抗糖尿病薬物の影響有効性（ｉｍｐａｃｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に対する統合的な基準である。ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物に加えた経口の抗糖尿病薬物（ＤｉａｂｅｔｏｎおよびＧｌｕｃｏｂａｙ）による併用治療によって、血糖の正常化、Ｄｉａｂｅｔｏｎの治療投与量の減少およびＧｌｕｃｏｂａｙの中止を生じた。通常、血液学的パラメーターの変化、生化学的パラメーターの変化および免疫のパラメーターの変化の特徴は、代謝および全身性反応の回復を示し、これは、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物に関する抗糖尿病の成分を決定をし得ない。以下の指標（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰおよびチオールジスルフィド比（ＴＤＲ））が使用され、血糖レベルを安定化する細胞反応複合体におけるＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物作用の分子機構を基礎的に特徴付けることを可能にした。特に、重要な細胞内メッセンジャー（ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ）は、細胞内代謝プロセスへのグルコース流動の強度を決定する。その上、ｃＧＭＰ依存的酵素による細胞系は、細胞内グルコースの摂取強度を決定する。逆に、ｃＧＭＰレベルは、細胞内の酸化ポテンシャルによって決定される。特に、酸化剤はｃＧＭＰレベルを上昇し、逆に、抗酸化剤は、ｃＧＭＰ量の抑制作用を行う。従って、抗酸化剤およびプロ酸化剤（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｎｔ）のバランスを反映する細胞内チオールジスルフィド比（ＴＤＲ）は、細胞内ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ指標の値を決定する。生物を全体として考慮に入れると、本発明者らは、グルコースレベル変動と関連付けられる統合的内部媒体として、血液中のこれらの指標を分析し得る。なぜならグルコース代謝は、チオールジスルフィド代謝およびサイクリックヌクレオチド系と共に、本研究者らの生物における全ての細胞型の機能に関して無効に出来ない構成要素だからである。
【０４０２】
得られた結果は、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物のグルコース低下の影響を示した。さらに、この効果は、ｃＧＭＰ量の上昇進展（ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ指標の低下）およびＴＤＲ値の減少（チオール酸化型の上昇）を伴う。血糖調節における酸化チオール型およびｃＧＭＰの調節可能性を考慮すると、これは、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物の調節性低血糖効果の基本メカニズムが示され得る。とりわけ、ＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物の細胞酸化還元の外形への調節影響は、酸化剤成分レベルの上昇を提供し、逆に、ｃＧＭＰのためのサイクリックヌクレオチド系（グアニリルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌａｔ−ｃｙｃｌａｓｅ）の誘導およびホスホジエステラーゼ阻害それぞれにおける、ｃＧＭＰ合成酵素およびｃＧＭＰ破壊酵素である）におけるバランスを再分配する。ｃＧＭＰ調節影響は、インシュリン依存的組織へのグルコースの輸送プロセスを刺激し、血糖減少を呼び起こす。
【０４０３】
（結論）：併用した糖尿病の処置に関する模式図中のＧＳＳＧ・Ｐｔバナジウム塩薬物の適用は、以下の治療的な効果を達成し得た：
・生活の質の改善および血糖レベル安定化
・投与されたグルコース低下薬物の投与量の減少
・血液学的指標、生化学的指標および免疫学的指標の正常値への回復
（実施例  １８）
（腸チフスワクチンおよび生菌ツラレミアワクチンのモデルにおけるＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄのアジュバント活性の比較に関する研究）
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄのアジュバント特性を、化学腸チフスおよび生菌ツラレミアワクチンを用いて免疫された白マウス（ｗｈｉｔｅ  ｍｉｃｅ）の実験において評価した。
【０４０４】
実験において、工場「Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ」（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手した体重１８〜２１ｇの無作為に繁殖された成体雄マウスを使用した。免疫を、市販の薬物によって実施した。ツラレミアワクチンを、用量２５０微生物細胞で腹腔内に導入し、腸チフスのワクチンを、以前に選択した最適な投与量で（ヒト投与量の０．２に等しい）皮下に導入した。
【０４０５】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄを、免疫前の２日間、１日に１回腹腔内経路を介して０．５ｍｌ量で導入し、そして、免疫する日、抗原注射の４０〜６０分前、１回の導入当たり５ｍｇ／ｋｇの投与量で導入した。同様の期間において、コントロール動物に、０．５ｍｌの塩化ナトリウムの等張液を用いて導入した。
【０４０６】
ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄのアジュバント有効性は、遅延型過敏症応答（ＤＴＨＲ）および特異的抗体の決定による、細胞性免疫および体液性免疫へのこれらの影響を介して評価した。試験を、免疫後１４日目に実施した。ＤＴＨＲを得るために、マウスに、０．０５ｍｌ量の対応する抗原（ツラリン（ｔｕｌａｒｉｎｅ）またはＳ．ｔｙｐｈｉのＯ−抗原）を用いて右後肢に皮下的に導入し、そして左後肢に、同様の量の等張塩化ナトリウム溶液を導入した。２４時間後、マウスを過量のエーテルによって安楽死させ、両後肢を足関節のレベルで切断かつ秤量し、次いで反応指標を計算した。ツラレミア薬剤および腸チフス薬剤の体細胞抗原に対する抗体を、対応する抗原赤血球診断アッセイを適用する非直接的な凝集アッセイによって決定した；ＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄの抗体発生への影響は、２つの基準（セロコンバージョン頻度および抗体力価の値）を用いて評価した。
【０４０７】
研究の結果を、表３８〜４１に示す。
【０４０８】
得られたデータは、免疫前のＧＳＳＧ・ＰｔおよびＧＳＳＧ・Ｐｄの５ｍｇ／ｋｇ用量での３回の腹腔内誘導が、化学腸チフスワクチンおよび生菌ツラレミアワクチンに対する増強された免疫応答を生じることを示し、この免疫応答は、（コントロールと比較すると）これらの微生物の体細胞抗原におけるより強い抗体発達および高程度のＤＴＨＲを示した。得られたデータと共に、研究薬物の両方のアジュバント効果が、実際は同様であるということに注意すべきである。なぜなら、免疫応答値のわずかな差違は、統計学的に無意味であるからである。
【０４０９】
従って、酸化型グルタチオンを含有する白金およびパラジウムの新しい誘導体は、ツラレミア薬剤および腸チフス薬剤の抗原に関するアジュバンド効果を有する、活性な生物学的かつ薬理学的組成物である。
【０４１０】
当業者は、本明細書中に列挙される全てのパラメーターが例証であることを意味し、そして実際のパラメーターが、本発明の方法および装置が使用されるための特定の適用に依存するということを容易に認識する。従って、前記の実施形態は、一例としてのみ示され、そして添付される特許請求の範囲およびその等価物の範囲内において、本発明は、具体的に記載される場合よりも別の方法で異なって実施され得ることが理解される。
【０４１１】
【表４７】
0003547400.tif 000013
0003547400.tif 000014
0003547400.tif 000015
【０４１２】
【表１】
0003547400.tif 000016
【０４１３】
【表２】
0003547400.tif 000017
【０４１４】
【表３】
0003547400.tif 000018
【０４１５】
【表４】
0003547400.tif 000019
【０４１６】
【表５】
0003547400.tif 000020
【０４１７】
【表６】
0003547400.tif 000021
【０４１８】
【表７】
0003547400.tif 000022
【０４１９】
【表８】
0003547400.tif 000023
【０４２０】
【表９】
0003547400.tif 000024
【０４２１】
【表１０】
0003547400.tif 000025
【０４２２】
【表１１】
0003547400.tif 000026
【０４２３】
【表１２】
0003547400.tif 000027
0003547400.tif 000028
【０４２４】
【表１３】
0003547400.tif 000029
【０４２５】
【表１４】
0003547400.tif 000030
【０４２６】
【表１５】
0003547400.tif 000031
【０４２７】
【表１６】
0003547400.tif 000032
【０４２８】
【表１７】
0003547400.tif 000033
0003547400.tif 000034
【０４２９】
【表１８】
0003547400.tif 000035
【０４３０】
【表１９】
0003547400.tif 000036
【０４３１】
【表２０】
0003547400.tif 000037
【０４３２】
【表２１】
0003547400.tif 000038
【０４３３】
【表２２】
0003547400.tif 000039
【０４３４】
【表２３】
0003547400.tif 000040
【０４３５】
【表２４】
0003547400.tif 000041
【０４３６】
【表２５】
0003547400.tif 000042
【０４３７】
【表２６】
0003547400.tif 000043
【０４３８】
【表２７】
0003547400.tif 000044
【０４３９】
【表２８】
0003547400.tif 000045
＊−最初の細胞数は−２５万／ｍＬ
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＲＰＭＩ  １６４０培地でのインキュベーション
【０４４０】
【表２９】
0003547400.tif 000046
＊−最初の細胞数は−２５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差、×−ＧＳＳＧ（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＲＰＭＩ  １６４０培地でのインキュベーション
【０４４１】
【表３０】
0003547400.tif 000047
＊−最初の細胞数は−２５万／ｍＬ
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＲＰＭＩ  １６４０培地でのインキュベーション
【０４４２】
【表３１】
0003547400.tif 000048
＊−最初の細胞数は−２５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＲＰＭＩ  １６４０培地でのインキュベーション
【０４４３】
【表３２】
0003547400.tif 000049
＊−最初の細胞数は−５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差、（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＤＭＥＭ培地でのインキュベーション
【０４４４】
【表３３】
0003547400.tif 000050
＊−最初の細胞数は−５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差、（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＤＭＥＭ培地でのインキュベーション
【０４４５】
【表３４】
0003547400.tif 000051
＊−最初の細胞数は−５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差、（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＤＭＥＭ培地でのインキュベーション
【０４４６】
【表３５】
0003547400.tif 000052
＊−最初の細胞数は−５万／ｍＬ
＊＊−コントロールと比較した有意差、（ｐ＜０．０５）
××−１０％ウシ胎仔血清を加えた薬物無しのＤＭＥＭ培地でのインキュベーション
【０４４７】
【表３６】
0003547400.tif 000053
＊−ｒ１−血中グルコースの経過およびｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比の変化の相関比；ｒ２−血液のグルコースの経過およびチオール−ジスルフィド比の変化の相関比
【０４４８】
【表３７】
0003547400.tif 000054
【０４４９】
【表３８】
0003547400.tif 000055
【０４５０】
【表３９】
0003547400.tif 000056
【０４５１】
【表４０】
0003547400.tif 000057
【０４５２】
【表４１】
0003547400.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シス−ジアミンジクロロ白金を有するビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシンジナトリウム塩の構造を示す。
【図２】図２は、シス−ジアミンジクロロ白金を有する酸化型グルタチオンジナトリウム塩の複合体の合成のスキームを示す。
【図３】図３は、窒素原子の非共有電子対に起因する白金原子と２つのＮＨ３基との間のドナーアクセプター結合を示す。
【図４】図４は、リガンド交換（ジスルフィド結合に対してＮＨ３基）に起因する、および硫黄原子の非共有電子対に起因する白金原子と２つの硫黄原子との間のドナーアクセプター結合の７つの形成を介する、ＧＳＳＧ分子のジスルフィド結合安定化についての提案された機構を示す。
【図５】図５は、図４に所与された機構を介し、およびグルタチオンのＮＨ２基に対するＮＨ３リガンドの交換（相当的に、ＮＨ２基の集中およびＧＳフラグメント）を介するＧＳＳＧ分子の安定化の提案された機構を示し、このリガンド交換は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ複合体の新しい「生物物理学」を形成し、四角（白四角）はドナー部位を示し、そして丸（白丸）はアクセプター部位を示す。
【図６】図６は、ＧＳＳＧ・Ｐｔ分子の化学的改変についての主な部位（取り囲まれた）を示す；
【図７】図７は、ビス−フェニルアラニル−ＧＳＳＧ・Ｐｔの構造を示す；
【図８】図８は、シス−ジアミンジクロロ白金を有するビス−（Ｌ−フェニルアラニル−γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−システイニル−ビス−グリシンについての合成のスキームを示す。
【図９】図９は、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシンのリチウム塩の構造を示す。
【図１０】図１０は、ｐＨ＝８で過酸化水素を用いた供給源産物、すなわち還元型グルタチオンの処理の段階を示す（ＧＳＳＧ・Ｐｔリチウム塩についての合成図式の段階）；
【図１１】図１１は、ビス−（γ−Ｌ−グルタミル）−Ｌ−シスチニル−ビス−グリシンの遊離ヘキサペプチドの抽出を示す（ＧＳＳＧ・Ｐｔリチウム塩についての合成スキームのＩＩＩの段階）。
【図１２】図１２は、ＧＳＳＧ・Ｐｔのリチウム塩における酸化ＧＳＳＧ（ＩＩＩ）形成の移行を示す；
【図１３】図１３は、インキュベーション時間−４８時間で、ＧＳＳＧ（２）、ＧＳＳＧ・Ｐｔ（３）を用いた処理の後、コントロール群（１）での通常細胞のＤＮＡ分解特性を示す；
【図１４】図１４は、ＧＳＳＧ（１）、ＧＳＳＧ・Ｐｔ（３）を用いてインキュベーション時間４８時間で処理した後の、コントロール群（２）でのＨＬ−６０細胞のＤＮＡ分解特性を示す。
【図１５（ａ）】図１５（ａ）は、Ｓ−チオエチルアミン・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１５（ｂ）】図１５（ｂ）は、ビス−［ＤＬ−６，８−チオエト酸］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１５（ｃ）】［β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１５（ｄ）】［９−β−リボフラノシルアデニル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１５（ｅ）】ビス−［Ｌ−２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタン酸］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ａ）】図１６（ａ）は、ビス−［メチオニル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｂ）】図１６（ｂ）は、ビス−［アスパルチル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｃ）】図１６（ｃ）は、ビス−［ヒスチジル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｄ）】図１６（ｄ）は、ビス−［３−ヨウ素−チロシル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｅ）】図１６（ｅ）は、ビス−［γ−アミノブタノイル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｆ）】図１６（ｆ）は、ビス−［γ−ヒドロキシブタノイル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１６（ｇ）】図１６（ｇ）は、ビス−［３，４−ジヒドロキシフェニルアラニニル］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１７（ａ）】図１７（ａ）は、ビス−ニコチノイル−グルタチオンジスルフィド（ビス−［ピリジン−３−カルボニル］・グルタチオンジスルフィド）の構造を示す。
【図１７（ｂ）】図１７（ｂ）は、ウリジン−５’−モノホスファチル・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１７（ｃ）】図１７（ｃ）は、イノシン−５’−モノホスファチル・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１７（ｄ）】図１７（ｄ）は、フォリクリルスクシニル・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１７（ｅ）】図１７（ｅ）は、グリセロール−１，３−ジホスファチル・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１８（ａ）】図１８（ａ）は、テトラ−ドーパミン・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１８（ｂ）】図１８（ｂ）は、テオフィリン・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１９（ａ）】図１９（ａ）は、ビス−カルノシル・グルタチオンジスルフィド（ビス−［β−アラニル−Ｌ−ヒスチジル］−ＧＳＳＧ・Ｐｔ）の構造を示す。
【図２０（ａ）】図２０（ａ）は、非対称混合ジスルフィド化合物の構造を示す。
【図２０（ｂ）】図２０（ｂ）は、対称混合ジスルフィド化合物の構造を示す。
【図２０（ｃ）】図２０（ｃ）は、対称および二重架橋混合ジスルフィド化合物の構造を示す。
【図２１（ａ）】図２１（ａ）は、二バナジウム酸塩の構造を示す。
【図２１（ｂ）】図２１（ｂ）は、二フッ化水素酸塩の構造を示す。
【図２１（ｃ）】図２１（ｃ）は、二リチウム塩の構造を示す。
【図２１（ｄ）】図２１（ｄ）は、亜鉛塩の構造を示す。
【図２２】図２２は、ポリぺプチド［抗原または抗体］・グルタチオンジスルフィドの構造を示す。
【図１】
0003547400.tif 000062
【図２】
0003547400.tif 000063
【図３】
0003547400.tif 000064
【図４】
0003547400.tif 000065
【図５】
0003547400.tif 000066
【図６】
0003547400.tif 000067
【図７】
0003547400.tif 000068
【図８】
0003547400.tif 000069
【図９】
0003547400.tif 000070
【図１０】
0003547400.tif 000071
【図１１】
0003547400.tif 000072
【図１２】
0003547400.tif 000073
【図１３】
0003547400.tif 000074
【図１４】
0003547400.tif 000075
【図１５（ａ）】
0003547400.tif 000076
【図１５（ｂ）】
0003547400.tif 000077
【図１５（ｃ）】
0003547400.tif 000078
【図１５（ｄ）】
0003547400.tif 000079
【図１５（ｅ）】
0003547400.tif 000080
【図１６（ａ）】
0003547400.tif 000081
【図１６（ｂ）】
0003547400.tif 000082
【図１６（ｃ）】
0003547400.tif 000083
【図１６（ｄ）】
0003547400.tif 000084
【図１６（ｅ）】
0003547400.tif 000085
【図１６（ｆ）】
0003547400.tif 000086
【図１６（ｇ）】
0003547400.tif 000087
【図１７（ａ）】
0003547400.tif 000088
【図１７（ｂ）】
0003547400.tif 000089
【図１７（ｃ）】
0003547400.tif 000090
【図１７（ｄ）】
0003547400.tif 000091
【図１７（ｅ）】
0003547400.tif 000092
【図１８（ａ）】
0003547400.tif 000093
【図１８（ｂ）】
0003547400.tif 000094
【図１９（ａ）】
0003547400.tif 000095
【図２０（ａ）】
0003547400.tif 000096
【図２０（ｂ）】
0003547400.tif 000097
【図２０】
0003547400.tif 000098
【図２１（ａ）】
0003547400.tif 000099
【図２１（ｂ）】
0003547400.tif 000100
【図２１（ｃ）】
0003547400.tif 000101
【図２１（ｄ）】
0003547400.tif 000102
【図２２】
0003547400.tif 000103