【手続補正書】
【提出日】平成29年2月8日(2017.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【図１】図1A〜1Cは、自然発生前立腺癌のマウスモデル（TRAMP：マウス前立腺のトランスジェニック腺癌）におけるネイティブヒトMIC（B）の前立腺特異的発現が低分化（PD）前立腺癌の進展および転移を促進することを示している。図1Aは、TRAMP/MICBマウスの有意に減少した生存率をTRAMPマウスと比較して示すカプラン・マイヤープロットを示している（p＜0.001）。腫瘍関連死のみをこの分析で考慮した。数字は、示されている生存時間の間に調査された動物を示している。図1Bは、24週齢TRAMP/MICBマウスのコホート（n=12）における有意に増加した前立腺重量をTRAMP同腹仔（n=13）と比較して示している。図1Cは、TRAMP/MIC（B）マウス（6/12マウスの代表）およびTRAMP同腹仔（13匹のマウス中12匹の代表）由来の腫瘍および付随するリンパ節の肉眼的形態の代表画像を示している。
【図２Ａ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Aは、腫瘍細胞における表面MICB発現の集計IHCスコアを示している。
【図２Ｂ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Bは、PDおよびWD腫瘍における同等レベルのMICB発現をmRNAレベルで示す定量RT-PCRを示している。
【図２Ｃ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Cは、24週齢TRAMP/MICBマウスのコホートにおける癌腫の進展の間の様々な年代でのsMICBの血清レベルのELISA測定を示している。*：p＜0.01、**：p＜0.001。ns：有意でなかった。PD癌腫の進展がsMICBの血清レベルの顕著な上昇を伴うことに注目されたい。
【図２Ｄ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Dは、24週齢TRAMP/MICBマウスにおける血清sMICBと腫瘍の量との相関を示している。
【図２Ｅ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Eは、PDおよびWD腫瘍における同等レベルの内因性NKG2DリガンドRAE-1の発現をmRNAレベルで示す定量RT-PCRを示している。
【図２Ｆ】TRAMP/MICマウスにおけるPD癌腫への加速度的進行が血清sMICの上昇および表面MICの喪失を伴うことを示している。図2Fは、TRAMP/MICB癌腫における内因性NKG2DリガンドRAE-1の発現のパターンを示すIHC染色の代表顕微鏡写真および集計スコアを示している。
【図３Ａ】前立腺癌の進行がNK細胞の末梢での維持におけるsMICにより誘導される減損を伴うことを示している。図3Aは、24週齢TRAMP/MICB、TRAMP、および野生型B6マウスのコホートにおける脾臓CD8（図3A）細胞およびNKG2D+集団の比較を示している。左パネル：フローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット。右パネル：各コホートのフローサイトメトリー分析の蓄積された統計データ。**：WD腫瘍を発症したTRAMPマウスまたはTRAMP/MICBマウスに対してp＜0.001。
【図３Ｂ】前立腺癌の進行がNK細胞の末梢での維持におけるsMICにより誘導される減損を伴うことを示している。図3Bは、24週齢TRAMP/MICB、TRAMP、および野生型B6マウスのコホートにおける脾臓NK（図3B）細胞およびNKG2D+集団の比較を示している。左パネル：フローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット。右パネル：各コホートのフローサイトメトリー分析の蓄積された統計データ。**：WD腫瘍を発症したTRAMPマウスまたはTRAMP/MICBマウスに対してp＜0.001。
【図３Ｃ】前立腺癌の進行がNK細胞の末梢での維持におけるsMICにより誘導される減損を伴うことを示している。図3Cは、24週齢TRAMP/MICBマウスのコホートから分析された、血清sMICBと脾臓NK細胞集団の有意な逆相関を示している。
【図３Ｄ】前立腺癌の進行がNK細胞の末梢での維持におけるsMICにより誘導される減損を伴うことを示している。図3Dは、PD癌腫を発症したTRAMP/MICBマウスにおけるNK細胞の全身的（iLNおよびBM）欠乏を示すフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットおよび蓄積データの統計を示している。iLN：鼠径リンパ節。BM：骨髄。
【図３Ｅ】前立腺癌の進行がNK細胞の末梢での維持におけるsMICにより誘導される減損を伴うことを示している。図3Eは、TRAMP/MICBマウス由来のPD腫瘍中の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）におけるNK細胞の有意な減少を示すフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットおよび統計データを示している。すべてのデータは、少なくとも5匹の動物の3回の独立したアッセイからの結果を示している。
【図４Ａ】sMICが実験的TRAMP-C2肺転移モデルにおいてNK細胞の末梢恒常性を損ない肺転移を促進すること、およびモノクローナル抗体（mAb B10G5）によるsMICの中和がNK細胞の恒常性を回復させ肺転移を消滅させることを示している。図4Aは、実験計画を示している。
【図４Ｂ】sMICが実験的TRAMP-C2肺転移モデルにおいてNK細胞の末梢恒常性を損ない肺転移を促進すること、およびモノクローナル抗体（mAb B10G5）によるsMICの中和がNK細胞の恒常性を回復させ肺転移を消滅させることを示している。図4Bは、微小転移の肺沈着物の定量を示しており、sMICが肺転移を促進することおよび抗sMIC（mAb B10G5）による処置が肺転移を阻害することを示している。
【図４Ｃ】sMICが実験的TRAMP-C2肺転移モデルにおいてNK細胞の末梢恒常性を損ない肺転移を促進すること、およびモノクローナル抗体（mAb B10G5）によるsMICの中和がNK細胞の恒常性を回復させ肺転移を消滅させることを示している。図4Cは、骨髄、リンパ節、および脾臓におけるNK細胞の頻度を示すフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット（左パネル）および蓄積された統計データ（右パネル）を示している。cIgG：sMIC中和mAb B10G5のアイソタイプ対照IgG。*：抗sMIC（mAb B10G5）処置グループおよびTRAMP-C2細胞を注射した全動物に対してp＜0.05。
【図４Ｄ】sMICが実験的TRAMP-C2肺転移モデルにおいてNK細胞の末梢恒常性を損ない肺転移を促進すること、およびモノクローナル抗体（mAb B10G5）によるsMICの中和がNK細胞の恒常性を回復させ肺転移を消滅させることを示している。図4Dは、NK細胞の再生能力を示す代表的なフローサイトメトリー分析および5日間にわたる脾臓BrdU+ NK細胞の蓄積の定量を示している。データは、サブグループあたり5匹の動物および3回の独立した実験の代表である。
【図５】図5A〜5Dは、sMICが、移植された転移性TRAMP-C2-sMICマウスにおいて養子移入されたNK細胞集団をかく乱することを示している。1 x 107個のV450標識CD45.1+共通遺伝子系脾細胞を、TRAMP-C2-sMICBを移植したCD45.2+マウスまたはTRAMP-C2マウスに移入した。これらのマウスを、CD45.1+共通遺伝子系脾細胞を与える前または後にsMICB中和抗体（mAb B10G5）または対照IgG（cIgG）で処置した。共通遺伝子導入の5日後にマウスを安楽死させた。図5Aおよび5Bは、安楽死時の脾臓（図5A）およびリンパ節（図5B）における総養子移入CD45.1+集団中のCD45.1+ NK細胞のパーセンテージを示している。図5Cおよび5Dは、sMICBが脾臓（図5C）およびリンパ節（図5D）において共通遺伝子系CD45.1+ NK細胞集団をかく乱することならびに抗sMIC（mAb B10G5）処置がNK細胞の増殖能力を回復させることを示すV450希釈アッセイの要約を示している。各グループで5〜8匹の動物を使用した。データは3回の独立した実験を表している。
【図６】図6A〜6Dは、TRAMP前立腺における膜限定NKG2DリガンドMICB.A2の発現が腫瘍の進行を防止することを示している。図6Aは、TRAMP/MICB.A2マウス（MICB.A2が前立腺で特異的に発現されるTRAMPマウス）の無腫瘍生存を示すカプラン・マイヤープロットを示している。数字は、調査された動物を示している。図6Bは、同年齢のTRAMP（n=13）同腹仔との比較でTRAMP/MICB.A2 bi-Tgマウス（n=21）において有意に減少した前立腺重量を示している。同年齢の野生型B6が正常対照として示されている。図6Cは、sMICBがTRAMP/MICB.A2マウスの血清においてELISAにより検出されなかったことを示している。*：アッセイ陽性対照としてのTRAMP/MICBマウス由来の血清。図6Dは、TRAMP/MICB.A2マウスにおける抗体によるNKG2D機能の遮断が前立腺重量を有意に上昇させたことを示している。図6Dのデータは、2回の独立した実験を表している。
【図７Ａ】膜限定MICB.A2がNKおよびCD8 T細胞の両方においてNKG2D抗腫瘍免疫を維持することを示している。図7Aは、24週齢TRAMP/MICB.A2、TRAMPおよび野生型B6マウスのコホート由来の脾臓NK細胞のフローサイトメトリー分析ならびに相対的なNKG2D発現レベルを示している。左パネル：代表的なドットプロット。右パネル：蓄積されたデータの定量。
【図７Ｂ】膜限定MICB.A2がNKおよびCD8 T細胞の両方においてNKG2D抗腫瘍免疫を維持することを示している。図7Bは、TRAMP/MICB.A2マウスおよびB6マウス由来の脾臓NK細胞が、RMA-RAE-1細胞で4時間の期間刺激した場合に、同等レベルのIFNγ産生（図7B；左：フローサイトメトリー分析の代表的なドットプロット；右：データの統計的要約）を有することを示している。細胞傷害性アッセイは、標準的な51Cr放出アッセイを用いて行った。抗マウスNKG2D抗体C7を、遮断抗体として使用した。
【図７Ｃ】膜限定MICB.A2がNKおよびCD8 T細胞の両方においてNKG2D抗腫瘍免疫を維持することを示している。図7Cは、TRAMP/MICB.A2マウスおよびB6マウス由来の脾臓NK細胞が、RMA-RAE-1細胞で4時間の期間刺激した場合に、同等レベルの溶解能力（図7C）を有することを示している。細胞傷害性アッセイは、標準的な51Cr放出アッセイを用いて行った。抗マウスNKG2D抗体C7を、遮断抗体として使用した。
【図７Ｄ】膜限定MICB.A2がNKおよびCD8 T細胞の両方においてNKG2D抗腫瘍免疫を維持することを示している。図7Dは、脾臓CD8 T細胞集団およびそれらのNKG2D発現のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットおよび統計を示している。すべてのデータは、最低5匹の動物の3回の独立した分析を表している。
【図８】図8A〜8Dは、男性における転移性前立腺癌の進展が、血中のNK細胞の頻度の減少および高レベルの血清sMICを伴うことを示している。データは、36名の、そのうち25名が限局性疾患（非met）と診断され、11名が遠隔転移（Met）と診断された、処置を受けていない前立腺癌患者のNK細胞（CD3-CD56+）の頻度（図8A）、T細胞（CD3+CD56-）の頻度（図8B）、およびsMICの血清レベル（図8C）を示している。同年齢の健常男性（n=10）由来のサンプルを対照として使用した。データは、3回の独立したアッセイからの結果を表している。図8Dは、すべての患者における血清sMICと循環中のNK細胞の頻度の間の有意な逆相関を示している。
【図９】図9A〜9Dは、p2B10G5処置が原発性前立腺癌を顕著に退行させ、転移を阻害したことを示している。図9Aは、処置の概要である。図9Bは、抗体処置および対照グループの代表的な総前立腺サイズを示している。図9Cは、抗体処置および対照グループの前立腺重量の要約を示している。図9Dは、抗体処置および対照グループにおける転移発生の要約を示している。
【図１０】図10A〜10Cは、抗体処置の全身的効果を示している。図10Aは、処置過程の間の動物の体重を示している。図10Bは、処置終了時の血清サイトカインプロフィールを示している。図10Cは、研究のエンドポイントにおいてELISAによって測定された血清sMICを示している。
【図１１】図11A〜11Cは、抗体処置がNK細胞の恒常性および機能を増強したことを示している。図11Aは、抗体処置および対照グループの脾臓およびLNにおけるNK細胞の頻度を示している。図11Bは、抗体処置および対照グループの脾臓およびLNにおけるNK細胞の再生または増殖を示している。図11Cは、PMAおよびイオノマイシン刺激に応じたNK細胞のIFNγ産生を示している。
【図１２】図12A〜12Bは、抗体処置がCD8 T細胞の活性化および機能を増強したことを示している。図12Aは、抗体処置が、増加した活性化の指標であるNKG2D+CD8 T細胞の増加をもたらしたことを示している。図12Bは、抗体処置がPMAおよびイオノマイシン刺激に応じたCD8 T細胞のIFNγ産生を顕著に増加させたことを示している。
【図１３】図13A〜13Cは、抗体処置がCD4ヘルパーT細胞をTh1およびTh17に分極させ、かつセントラルメモリーCD4 T細胞の蓄積を増強させることを示している。図13Aは、Th1細胞の頻度の要約を示している。図13Bは、Th17細胞の頻度の要約を示している。図13Cは、セントラルメモリーCD4 T細胞の要約を示している。
【図１４】図14A〜14Cは、NKG2Dリガンドの前立腺限定発現が前立腺の生理または全身免疫を変化させないことを示している。図14Aは、前立腺特異的導入遺伝子コンストラクトを示している。脱離性ナイーブMICBまたは脱離抵抗性変異MICB.A2の発現は、前立腺特異的ラットプロバシンプロモーター（-426〜+28 bp）の制御下で行われた。図14Bは、MICBまたはMICB.A2の前立腺特異的発現のRT-PCR検出を示している。PR：前立腺。LV：肝臓。LU：肺。MU：筋肉、SP：脾臓。図14Cは、NKG2Dリガンドの発現が前立腺重量に有意に影響しないことを示している。
【図１５Ａ】MICの前立腺特異的発現が全身的なNK細胞およびCD8 T細胞の数に対する影響を有さないことを示している。図15Aは、各遺伝子型のNK1.1集団（CD3-NK1.1+）の代表的なフローサイトメトリー分析（左パネル）および蓄積されたデータの定量（右パネル）を示している。
【図１５Ｂ】MICの前立腺特異的発現が全身的なNK細胞およびCD8 T細胞の数に対する影響を有さないことを示している。図15Bは、NK細胞におけるNKG2D発現の代表的なヒストグラムを示している。
【図１５Ｃ】MICの前立腺特異的発現が全身的なNK細胞およびCD8 T細胞の数に対する影響を有さないことを示している。図15Cは、CD8 T細胞集団のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットを示している。すべてのデータは、遺伝子型あたり少なくとも6匹の動物を表している。
【図１５Ｄ】MICの前立腺特異的発現が全身的なNK細胞およびCD8 T細胞の数に対する影響を有さないことを示している。図15Dは、CD8 T細胞集団のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットを示している。すべてのデータは、遺伝子型あたり少なくとも6匹の動物を表している。
【図１６】図16A〜16Bは、TRAMPおよびTRAMP/MICBマウスの脾臓およびリンパ節におけるNK細胞（図16A）およびCD8 T細胞（図16B）の絶対数を示している。データは、PD腫瘍への進行に伴いNK細胞数が有意に減少するが、CD8 T細胞数はそうならないことを示している。図16Cは、TRAMPおよびTRAMP/MICBマウスの腫瘍実質に浸潤した総CD8 T細胞およびNKG2D+CD8 T細胞を示す代表的なドットプロットおよび蓄積された統計データを示している。データは、総CD8 T細胞浸潤に有意差はないが、NKG2D+CD8 T細胞が有意に減少したことを示している。TIL：腫瘍浸潤リンパ球。
【図１７】図17A〜17Bは、抗体p2B10G5のsMIC特異性の特徴づけを示している。図17Aは、精製されたp2B10G5 mAbがMIC（AおよびB）特異的であることを示すフローサイトメトリー分析の代表的なヒストグラムを示している。マウス前立腺腫瘍細胞株TRAMP-C2（TC2）ならびにその派生株TC2-MICAおよびTRAMP-MICBを、FcRγをブロックするためにCD16/32と共にインキュベートした後に、2μg/mlのp2B10G5または対照マウスIgG（cIgG）およびPE結合ヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートした。図17Bは、p2B10G5がsMIC特異的であることを示す未編集の免疫ブロットを示している。TC2-sMICBまたはTC2細胞の培養上清2mlをp2B10G5およびプロテインAビーズと共にインキュベートした。脱グリコシル化のために、免疫複合体の半分をPNGaseFで処理した。免疫複合体を、SDS-サンプルバッファーに溶解させ、7.5％ SDS/PAGEゲルに充填し、ニトロセルロース膜に移し、そしてヤギ抗MICBポリクローナル抗体AF1599（R&D Systems）を用いてブロットした。レーン1：脱グリコシル化sMICB、レーン2：ネイティブsMICB。
【図１８】図18は、腫瘍転移巣を有する組織におけるNK細胞の喪失を示している。棒グラフは、1つの肺切片から計数したNK細胞の集計データを示している。個体の平均データを得るために、各動物由来の5つの肺切片を計数した。データは、腫瘍微小転移巣を含む肺実質におけるNK細胞の喪失を示している（H&E染色における矢印）。
【図１９Ａ】移植されたTRAMP-C2（TC2）およびTC2-sMICBの転移モデルの脾臓およびリンパ節における、養子移入されたV450標識共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1の集団（図19A）のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットを示している。データは、維持された共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1細胞が、TC2-sMICB細胞を移植したマウスにおいて、TC2細胞を移植したマウスにおけるよりも有意に低かったことを示している。データはまた、sMIC中和抗体処置が、NK細胞の増殖を増加させることにより、TC2-sMICB細胞を移植したマウスにおける共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1細胞の持続性を増加させることを示している。
【図１９Ｂ】移植されたTRAMP-C2（TC2）およびTC2-sMICBの転移モデルの脾臓およびリンパ節における、養子移入されたV450標識共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1の増殖（図19B）のフローサイトメトリー分析の代表的なドットプロットを示している。データは、維持された共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1細胞が、TC2-sMICB細胞を移植したマウスにおいて、TC2細胞を移植したマウスにおけるよりも有意に低かったことを示している。データはまた、sMIC中和抗体処置が、NK細胞の増殖を増加させることにより、TC2-sMICB細胞を移植したマウスにおける共通遺伝子系CD45.1+ NK1.1細胞の持続性を増加させることを示している。
【図１９Ｃ】図19Cは、sMICBがNK細胞ホーミング受容体CD62Lの発現に影響しないことを示す代表的なドットプロットおよび蓄積された統計データを示している。
【図２０−１】P2B10G5抗体（IgG1 K）の軽鎖（SEQ ID NO:7として開示されるタンパク質配列およびSEQ ID NO:19として開示されるDNA配列）の配列を示している。
【図２０−２】P2B10G5抗体（IgG1 K）の重鎖（SEQ ID NO:8として開示されるタンパク質配列およびSEQ ID NO:20として開示されるDNA配列）の配列を示している。
【図２１】図21A〜21Gは、sMIC特異的モノクローナル抗体B10G5による治療が原発性前立腺癌および転移巣の顕著な阻害／退行をもたらすことを示している。図21Aは、処置レジメンの概要である。図21Bおよび21Cは、B10G5治療またはアイソタイプ対照IgG（cIgG）を受けたマウスの代表的な総前立腺サイズおよび前立腺重量の要約を示している。図21Dは、転移発生の要約を示している。図21Eは、B10G5治療がsMICの血清レベルを減少させることを示している。図21Fは、処置終了時の血清サイトカインプロフィールのグラフを示している。図21Gは、治療過程全体のマウスの体重変化のグラフを示している。対照グループにおける体重増加は大きな原発性腫瘍量によるものであることに留意されたい。
【図２２】図22A〜22Gは、B10G5治療がNK細胞の恒常性および機能を増強するだけでなく、適応性T細胞機能も強化することを示している。図22A〜22Bは、B10G5治療が末梢におけるNK細胞数およびNK細胞の再生能力を有意に増加させることを示している。図22Cは、B10G5治療がPMAおよびイオノマイシン再刺激に応じたNK細胞のIFNγ産生を有意に増強することを示している。図22DはB10G5治療がCD8 T細胞における共刺激性NKG2Dの発現を有意に増加させることを示している。図22Eは、この治療が再刺激に応じたCD8 T細胞のIFNγ産生を強化することを示している。図22Fは、B10G5治療がdLN内のCD4 T細胞の腫瘍反応性Th1およびTh17への分極を刺激することを示している。図22Gは、B10G5治療がCD44hiメモリーCD4およびCD8 T細胞を有意に増加させることを示している。データは、3回の独立した研究の代表である。各グループの動物についてn>5である。*：p<0.05。
【図２３】図23A〜23Cは、NKの欠乏がB10G5の治療効果を弱めることを示している。図23Aは、NKの欠乏によって大きく拡大した前立腺腫瘍を示している。図23Bは、B10G5治療を受けたNK欠乏および非欠乏マウスの間で前立腺重量を比較するグラフを示しており、腫瘍がNK細胞の欠乏によりB10G5治療に対して応答しなくなったことを示している。図23Cは、B10G5治療の間のNK欠乏により減少したIFN-γ+ CD4 T細胞のパーセンテージのグラフを示している。
【図２４】図24は、キメラchB10G5抗体が、C1R-MICA細胞により発現されたMICAに対する結合に関してネイティブmAb B10G5と同等の親和性を有することを示すフローサイトメトリー分析のヒストグラムを示している。キメラchB10G5は、mAb B10G5（IgG1）の可変領域VLおよびVHをそれぞれCLおよびCHのヒトIgG1定常領域と融合させることによって作製した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
腫瘍の進行および転移がNK細胞の恒常性の減損を通じてsMICBによって促進されることを確認するため、静脈内接種後にsMICBを発現するおよび発現しないTRAMP癌腫由来同系転移性細胞株TRAMP-C2（TC2）（41、42）の成長特性を判定した（図4A）。移植3週間後に、動物を2週間の期間、sMIC中和抗体P2B10G5または対照IgGで処置した（図17A〜17B）。予想通り、肺における微小転移沈着物は、sMICBを発現するTC2細胞（TC2-sMICB）を移植したマウスにおいて、TC2細胞を移植したものよりも有意に高かった（図4B）（顕微鏡画像データ示さず）。同時に、TC2-sMICB細胞を移植したマウスの脾臓、LN、および肺において、NK細胞の有意な減少が、TC2細胞を移植したものと比較して見られた（図4Cおよび18）（顕微鏡画像データ示さず）。さらに、TC2-sMICBの肺微小転移沈着物は、sMIC中和抗体によって有意に減少し（図4B）（顕微鏡画像データ示さず）、同時にNK細胞の末梢プールが回復した（図4C）。BrdUパルスによって、高増殖性NK細胞がTC2-sMICB保有マウスの脾臓に蓄積せず、しかしそれはsMICB中和抗体処置により回復したことが見出された（図4D）。まとめると、これらのデータは、sMICBが腫瘍細胞の転移を促進し、そしてそのような活性がNK細胞の末梢維持の崩壊と強く関連することを明確に示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
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