【手続補正書】
【提出日】平成29年6月8日(2017.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫細胞受容体鎖からクロノタイププロファイルを生成する方法であって、
（ａ）反応混合物中、プライマー伸長条件下で、第１セットのプライマーとＢ細胞及び／又はＴ細胞由来の再構成された核酸サンプル及び／又は無細胞系ＤＮＡサンプルとを組み合わせる工程であって、前記第１セットのそれぞれのプライマーは受容体特異的な部分、第１のプライマー結合部位を含有する５’−非相補的末端、及び前記受容体特異的な部分と前記第１のプライマー結合部位との間に配置された配列タグを含み、前記受容体特異的な部分は、第１の所定の位置にて異なる再構成された核酸にアニーリングし、伸長して第１伸長産物を生成する、工程と；
（ｂ）プライマー伸長条件下で、前記反応混合物に第２セットのプライマーを添加する工程であって、前記第２セットのそれぞれのプライマーは、受容体特異的な部分を有し、前記受容体特異的な部分は、第２の所定の位置にて前記第１の伸長産物にアニーリングし、前記第２セットのそれぞれのプライマーは、伸長して第２の伸長産物を生成し、それぞれの第２の伸長産物は、第１のプライマー結合部位、配列タグ、及びＴ細胞受容体鎖又はＢ細胞受容体鎖の部分をコードしている再構成された核酸を含む、工程と；
（ｃ）前記反応混合物においてポリメラーゼ連鎖反応を実施して、アンプリコンを生成する工程であって、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、前記第１のプライマー結合部位に特異的な順方向プライマーと、前記第２セットのプライマーに特異的な逆方向プライマーとを使用する、工程と；
（ｄ）前記アンプリコンを配列決定して、複数のＴ細胞受容体鎖及び／又はＢ細胞受容体鎖のクロノタイププロファイルを生成する工程と、を含む、複数の免疫細胞受容体鎖からクロノタイププロファイルを生成する方法。
【請求項２】
前記複数のＴ細胞受容体鎖がＴＣＲβ、ＴＣＲδ及びＴＣＲγを含み、前記第１セットのプライマー及び前記第２セットのプライマーが、ＴＣＲβ及びＴＣＲδのＶＤＪ領域をコードしている再構成された核酸領域に隣接するプライマー及びＴＣＲγのＶＪ領域に隣接するプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列決定する工程が：
それぞれのエラー率を有し、それぞれのタグ配列と、再構成された核酸配列とを含む配列リードを生成することと；
同様のタグ配列を有する配列リードをアライメントして、同様の配列タグを有する配列リードのグループを形成することと；
グループの配列リードを結合させてクロノタイプを決定することであって、配列リードのグループの尤度が明らかに少なくとも９５％であるときは常に、配列リードのグループを、異なる再構成された核酸配列に結合させる、決定することと；
前記クロノタイプから前記クロノタイププロファイルを生成することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の伸長産物及び／又は前記第２の伸長産物の生成後に、伸長していない前記第１セット及び／又は前記第２セットのプライマーを除去する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１セットの前記プライマーのアニーリング及び伸長が、前記第１の伸長産物の融解後に繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２セットの前記プライマーのアニーリング及び伸長が、前記第２の伸長産物の融解後に繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記除去する工程が、前記反応混合物にエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のＢ細胞受容体鎖がＩｇＨ及びＩｇＫを含み、前記第１セットの前記プライマー及び前記第２セットの前記プライマーが、ＩｇＨのＶＤＪ領域、ＩｇＨのＤＪ領域、及びＩｇＫのＶＪ領域をコードしている再構成された核酸領域に隣接するプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の、複数の免疫受容体鎖をコードしている再構成された核酸のクロノタイププロファイルを生成する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞及び／又はＢ細胞及び／又は無細胞系ＤＮＡを含む個体由来のサンプルのＴ細胞受容体遺伝子又はイムノグロブリン遺伝子の再構成された核酸分子に配列タグを付加させてタグ−核酸複合体を生成する工程であって、少なくとも１つのタグ−核酸複合体又はそれらのコピーには異なる配列タグが付加されている、工程と；
（ｂ）前記タグ−核酸複合体を増幅させる工程と；
（ｃ）前記タグ−核酸複合体を配列決定して、それぞれのエラー率を有し、それぞれの配列タグと、再構成された核酸配列とを含む配列リードを提供する工程と；
（ｄ）同様の配列タグを有する配列リードをアライメントして、同様の配列タグを有する配列リードのグループを形成する工程と；
（ｅ）グループの配列リードを結合させてクロノタイプを決定する工程であって、配列リードのグループの尤度が明らかに少なくとも９５％であるときは常に、配列リードのグループを、異なる再構成された核酸配列に結合させる、工程と；
（ｆ）クロノタイプレベルを検出することにより前記サンプルのクロノタイププロファイルを生成する工程と、を含む、サンプル中の、複数の免疫受容体鎖をコードしている再構成された核酸のクロノタイププロファイルを生成する方法。
【請求項１０】
前記付加させる工程が、
反応混合物中、プライマー伸長条件下で、第１セットのプライマーとサンプルとを組み合わせることとであって、前記第１セットのそれぞれのプライマーは受容体特異的な部分、第１のプライマー結合部位を含有する５’−非相補的末端、及び前記受容体特異的な部分と前記第１のプライマー結合部位との間に配置された配列タグを含み、前記受容体特異的な部分は、第１の所定の位置にて異なる再構成された核酸にアニーリングし、伸長して第１伸長産物を生成する、組み合せることと；
プライマー伸長条件下で、前記反応混合物に第２のプライマーセットを添加することとであって、前記第２セットのそれぞれのプライマーは、受容体特異的な部分を有し、前記受容体特異的な部分は、第２の所定の位置にて前記第１の伸長産物にアニーリングし、前記第２セットのそれぞれのプライマーは、伸長して第２の伸長産物を生成し、それぞれの第２の伸長産物は、第１のプライマー結合部位、配列タグ、及びＴ細胞受容体鎖又はＢ細胞受容体鎖の部分をコードしている再構成された核酸を含む、添加することと、を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応混合物から、伸長していない前記第１セット及び前記第２セットのプライマーを除去する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１セットの前記プライマーのアニーリング及び伸長が、前記第１の伸長産物の融解後に繰り返される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２セットの前記プライマーのアニーリング及び伸長が、前記第２の伸長産物の融解後に繰り返される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記除去する工程が、前記反応混合物にエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記付加する工程及び前記増幅させる工程がタグ−核酸複合体を生成し、少なくとも１つの再構成された核酸及びそのそれぞれのコピーには複数の異なる配列タグが付加されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記再構成された核酸が、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ及びＴＣＲγ鎖をコードしている再構成された核酸を含み、前記第１セットのプライマー及び前記第２セットのプライマーが、ＴＣＲβ及びＴＣＲδのＶＤＪ領域をコードしている再構成された核酸領域に隣接するプライマー及びＴＣＲγのＶＪ領域に隣接するプライマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記再構成された核酸が、ＩｇＨ及びＩｇＫをコードしている再構成された核酸を含み、前記第１セットのプライマー及び前記第２セットのプライマーが、ＩｇＨのＶＤＪ領域、ＩｇＨのＤＪ領域、及びＩｇＫのＶＪ領域をコードしている再構成された核酸領域に隣接するプライマーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列リードのグループの尤度が明らかに少なくとも９９．９％であるときは常に、前記結合させる工程が、前記配列リードのグループを、異なる再構成された核酸配列に結合させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記配列タグがモザイクタグであり、前記モザイクタグが、交互する定常領域及び可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記順方向プライマー及び／又は逆方向プライマーが、サンプルタグを含有する５’−非相補的末端を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の所定の位置が、Ｖ領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｖ領域の重複していない異なる部分にアニーリングする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の所定の位置が、Ｊ領域又はＣ領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｊ領域の重複していない異なる部分にアニーリングする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｊ領域の単一のプライマー結合部位にアニーリングする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記添加する工程が、前記反応混合物においてポリメラーゼ連鎖反応を実施して、アンプリコンを生成することを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記第１のプライマー結合部位に特異的な順方向プライマーと、前記第２セットのプライマーに特異的な逆方向プライマーとを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記順方向プライマー及び／又は逆方向プライマーが、サンプルタグを含有する５’−非相補的末端を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列タグがモザイクタグであり、前記モザイクタグが、交互する定常領域及び可変領域を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の所定の位置が、Ｖ領域である、請求項１０に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｖ領域の重複していない異なる部分にアニーリングする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の所定の位置が、Ｊ領域又はＣ領域である、請求項１０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｊ領域の重複していない異なる部分にアニーリングする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２セットのそれぞれのプライマーの受容体特異的な部分が、Ｊ領域の単一のプライマー結合部位にアニーリングする、請求項３１に記載の方法。