【手続補正書】
【提出日】平成29年1月16日(2017.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者由来の試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）患者の生体試料または患者の腫瘍分子プロファイリングのデータを取得する工程；
ｂ）前記患者の試験遺伝子を含む個々の発現構築物を作製する工程、
ｃ）前記患者からの前記試験遺伝子を保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型遺伝子の発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによって、前記癌患者の試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、前記患者の前記試験遺伝子をコードするポリヌクレオチド中の候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
【請求項２】
アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程をさらに含む、請求項２に記載の方法：
ｅ）前記アッセイ細胞中への前記構築物およびベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で生存能力のあるアッセイ細胞を各遺伝子座に添加する工程；および
ｆ）前記患者からの前記試験遺伝子を発現する前記アッセイ細胞で発現したＦＴＲの少なくとも１つの属性を対応する野生型発現遺伝子と比較する工程であって；
その際、前記癌患者の試料由来の前記試験遺伝子を発現する前記アッセイ細胞と、前記対応する野生型遺伝子を発現する前記アッセイ細胞との間の異なる結果が、患者特有のドライバー変異の候補として前記試料からの試験遺伝子を特定するために使用される方法。
【請求項４】
前記ＦＴＲの属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または、
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１をコードする、
請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択されるか、または、
前記発現構築物の第１および／または第２のセットが２本鎖直鎖状ＤＮＡを含むか、または、
前記発現構築物の第１および／または第２のセットの前記プロモーターが構成的プロモーターであるか、または、
前記試験遺伝子の前記発現構築物がＩＲＥＳおよび第２のレポーター遺伝子をさらに含むか、または、
トランスフェクション試薬の存在下で固体支持体上の前記ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含むか、または、
前記発現構築物の第１および／または第２のセットの前記プロモーターが誘導性プロモーターであるか、または、
トランスフェクト細胞内での前記発現構築物および／または発現ベクターの発現を誘導して前記腫瘍からの前記試験遺伝子の前記第１のセットと前記アレイ中の各遺伝子座用の前記ＦＴＲの遺伝子産物を取得することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者の前記試験遺伝子の前記発現構築物が、プロモーターへ作動可能に連結された特定の増幅されたｃＤＮＡを含み、前記増幅されたｃＤＮＡが以下の工程によって取得される請求項１に記載の方法：
癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）生体試料から取得された複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｂ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用してｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程。
【請求項９】
腫瘍患者由来の試料において異常なシグナル伝達経路をもたらす変異を特定する方法であって：
ａ）患者の試料または患者の腫瘍分子プロファイリングのデータを取得する工程；
ｂ）前記患者中の試験遺伝子変異を含む発現ベクターを作製する工程；
ｃ）前記試験遺伝子に対応する野生型遺伝子を含む対照発現構築物を作製する工程；
ｄ）特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを作製する工程；
ｅ）アッセイ細胞を、前記変異した試験遺伝子発現ベクターまたは前記野生型発現構築物の１種とＦＴＲをコードする前記発現ベクターとでトランスフェクトする工程；
ｆ）アッセイ細胞を、前記変異した試験遺伝子または野生型遺伝子ならびに前記ＦＴＲの発現を可能にするのに十分な期間インキュベートする工程；および
ｇ）細胞内での前記ＦＴＲの細胞内局在を決定する工程；
を含み、
前記試験および対照アッセイにおける異なる細胞内局在の前記ＦＴＲの存在が、前記遺伝子変異が前記ＦＴＲの前記標的遺伝子の異常な局在を引き起こすことを示す、
方法。
【請求項１０】
前記細胞内局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＦＴＲの前記標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択されるタンパク質をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記腫瘍細胞から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）前記複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）工程（ｃ）の前記増幅されたｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であって、ｃＤＮＡがプロモーターへ作動可能に連結されている工程；
ｅ）前記腫瘍からの前記増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットのアドレス可能なアレイを形成する工程であって；
それによって、前記腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を特定するのに適する、前記シグナル伝達タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレイを提供する工程。
【請求項１３】
アッセイ細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９および癌患者の細胞から選択されるか、または
腫瘍細胞が癌患者の腫瘍試料由来であり、前記腫瘍試料が、生検、術後の腫瘍切片、血液試料、気管支肺胞洗浄、および骨髄から選択されるか、または、
前記方法によって特定される異常なシグナル伝達タンパク質の候補が患者特有のドライバー変異である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アレイ中の各遺伝子座用のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加する工程（ｆ）をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法：
ｇ）前記アッセイ細胞内への前記ＤＮＡ構築物のコトランスフェクションを可能にする条件下で生存能力のあるアッセイ細胞を各遺伝子座に添加する工程；および
ｈ）前記腫瘍からの前記ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞内で発現した前記ＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較する工程であって；
前記腫瘍細胞由来のｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との間の異なる結果が異常なシグナル伝達タンパク質の候補として前記腫瘍細胞からの前記ｃＤＮＡを特定するために使用されるか、または
前記ＦＴＲの前記標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択されるタンパク質をコードする。
【請求項１６】
癌患者の生体試料中の１つまたは複数の患者特有のドライバー変異を特定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記生体試料から複数のｍＲＮＡを取得する工程；
ｂ）前記複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーのセットを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーの特定のｃＤＮＡを増幅する工程；
ｄ）増幅されたｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成する工程であってｃＤＮＡがプロモーターへ作動可能に連結されている工程；
ｅ）アドレス可能なアレイにおいて、生存能力のあるアッセイ細胞を担体に添加する工程；
ｆ）前記腫瘍からの前記増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第１のセット、および前記対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第２のセットを添加する工程であって；発現構築物の各々が、前記アッセイ細胞中への前記発現構築物のトランスフェクションを可能にする条件下で、アッセイ細胞にアドレス可能な異なる遺伝子座で添加される工程であって；
それにより、前記癌患者の生体試料中の患者特有のドライバー変異を特定するのに適する、シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチド中に候補変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレイを作製する工程。
【請求項１７】
前記生体試料が腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アレイ中の各遺伝子座用の特定のレポーター遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポーター（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを前記アッセイ細胞に添加する工程（ｇ）をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍からの前記ｃＤＮＡを発現する前記細胞でＦＴＲの少なくとも１つの属性をその対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較する工程をさらに含み；
生体試料由来のｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞と、前記対応する野生型ｃＤＮＡを発現する前記アッセイ細胞との間の異なる結果が患者特有のドライバー変異の候補として前記生体試料からの前記ｃＤＮＡを特定するために使用されるか、または
前記ＦＴＲの属性が蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択されるか、または
前記局在が細胞質、核、核小体、細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含むか、または
前記ＦＴＲの前記標的遺伝子部分が腫瘍サプレッサー、細胞骨格タンパク質、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、タンパク質キナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードするか、または
前記ＦＴＲの前記レポーター遺伝子部分が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択されるタンパク質をコードする、請求項１８に記載の方法。