【手続補正書】
【提出日】平成29年2月13日(2017.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの輸送体遺伝子、および、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの転写因子遺伝子を含む、細胞培養液中でステビオールグリコシドを生産する組み換え微生物であって、
前記組み換え微生物が、少なくとも１つの輸送体遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子、またはその両方、を過剰発現するかまたはその減少した発現を有し、
前記組み換え微生物が、さらに以下：
（ａ）  スクロース輸送体（ＳＵＣ１）ポリペプチドおよびスクロースシンターゼ（ＳＵＳ１）ポリペプチドをコードする１つまたは２つ以上の遺伝子；
（ｂ）  ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）  ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）  ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）  ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）  ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｇ）  シトクロムＰ４５０複合体を還元できるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、および、さらに以下：
（ｈ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３のヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコースまたはその両方をそのＣ３’でベータ１，３−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｊ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｋ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコースまたはその両方をそのＣ２’でベータ１，２−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子
の１つまたは２つ以上を含み、
前記遺伝子の少なくとも１つが、組み換え遺伝子であり、
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥもしくはレバウジオシドＭまたはそれらの組み合わせである、前記組み換え微生物。
【請求項２】
輸送体遺伝子が、内在性の輸送体遺伝子または異種輸送体遺伝子であり、ここで異種輸送体遺伝子が、ステビア輸送体遺伝子である、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
輸送体遺伝子が、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体またはMajor Facilitatorスーパーファミリー（ＭＦＳ）輸送体をコードする、請求項１または２に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
輸送体遺伝子または転写因子遺伝子が、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＬ０１３Ｃ、配列番号１０５で示されるアミノ酸配列を有するＹＢＬ００５Ｗ、配列番号１０６で示されるアミノ酸配列を有するＹＬＲ２６６Ｃ、配列番号１０７で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ１５３Ｗ、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ３２８、配列番号１０９で示されるアミノ酸配列を有するＹＩＬ０１３、配列番号１１０で示されるアミノ酸配列を有するＹＰＬ０５８、配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有するＹＤＲ４０６、配列番号１１２で示されるアミノ酸配列を有するＹＮＲ０７０ｗ、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ３２８、配列番号１１４で示されるアミノ酸配列を有するＹＫＬ２０９ｃ、配列番号１１５で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＲ２８１、配列番号１１６で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ０１１Ｗ、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＬ０７５ｃ、配列番号１１８で示されるアミノ酸配列を有するＹＩＬ１６６ｃ、配列番号１１９で示されるアミノ酸配列を有するＹＬＲ００４ｃ、配列番号１２０で示されるアミノ酸配列を有するＹＫＲ１０３ｗ、配列番号１２１で示されるアミノ酸配列を有するＹＣＲ０１１Ｃ、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列を有するＹＢＲ００８Ｃ、配列番号１２３で示されるアミノ酸配列を有するＹＩＬ１２０Ｗ、配列番号１２４で示されるアミノ酸配列を有するＹＩＬ１２１Ｗ、配列番号１２５で示されるアミノ酸配列を有するＹＢＲ０４３Ｃ、配列番号１２６で示されるアミノ酸配列を有するＹＬＬ０２８Ｗ、配列番号１２７で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＲ１３８Ｃ、配列番号１２８で示されるアミノ酸配列を有するＹＰＲ１５６ｃ、配列番号１２９で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ２７３Ｃ、配列番号１３０で示されるアミノ酸配列を有するＹＮＬ０６５Ｗ、配列番号１３１で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＲ２２４Ｗ、配列番号１３２で示されるアミノ酸配列を有するＹＰＲ１９８Ｗ、配列番号１３３で示されるアミノ酸配列を有するＹＨＲ０４８Ｗ、配列番号１３４で示されるアミノ酸配列を有するＹＭＬ１１６Ｗ、配列番号１３５で示されるアミノ酸配列を有するＹＫＲ１０６Ｗ、配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有するＹＮＲ０５５Ｃ、配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ３７８Ｗ、配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有するＹＭＲ２７９Ｃ、配列番号１３９で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＬ１５８Ｃ、配列番号１４０で示されるアミノ酸配列を有するＹＨＬ０４０Ｃ、配列番号１４１で示されるアミノ酸配列を有するＹＨＬ０４７Ｃ、配列番号１４２で示されるアミノ酸配列を有するＹＰＬ０９２Ｗ、配列番号１４３で示されるアミノ酸配列を有するＹＬＲ２３７Ｗ、配列番号１４４で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＬ１８６Ｃ、配列番号１４５で示されるアミノ酸配列を有するＹＡＬ０６７Ｃ、配列番号１４６で示されるアミノ酸配列を有するＹＥＬ０６５Ｗまたは配列番号１４７で示されるアミノ酸配列を有するＹＢＲ１８０Ｗであるポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
過剰発現が、ＹＧＲ２８１、ＹＯＲ３２８、ＹＧＬ０１３ＣまたはＹＢＲ００８Ｃの過剰発現を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
減少した発現が、各遺伝子座を破壊することによる、ＹＧＬ０１３Ｃ、ＹＢＬ００５Ｗ、ＹＯＲ１５３Ｗ、ＹＯＲ３２８、ＹＤＲ４０６、ＹＯＲ３２８および／またはＹＬＬ０２８Ｗの減少した発現を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
以下：
（ａ）  ＳＵＳ１ポリペプチドが、配列番号７８または配列番号８０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）  ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成できるポリペプチドが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）  ＧＧＰＰからｅｎｔ−コパリル二リン酸を合成できるポリペプチドが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）  ｅｎｔ−コパリルピロリン酸からｅｎｔ−カウレンを合成できるポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）  ｅｎｔ−カウレンからｅｎｔ−カウレン酸を合成できるポリペプチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｆ）  ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールを合成できるポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）  シトクロムＰ４５０複合体を還元できるポリペプチドが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７または配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドが、配列番号３０または配列番号９１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｉ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチドが、配列番号８５または配列番号８９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；
（ｊ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドが、配列番号２９または配列番号８８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；および／または
（ｋ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドが、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５５、配列番号８６または配列番号９０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、
請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項８】
遺伝子が、微生物における発現のためにコドン最適化されており、および、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化されていてもよい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
以下：
（ａ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチド；
（ｂ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチド；
（ｃ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチド；あるいは、
（ｄ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチド
をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子をさらに含み、ここで遺伝子の少なくとも１つのが、組み換え遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
遺伝子の１つまたは２つ以上が発現される条件下で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物を増殖させることを含む、細胞培養液からステビオールグリコシドの排出を変化させる方法であって、
輸送体遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子、またはその両方である少なくとも１つの遺伝子が、発現され；
ステビオールグリコシドが、組み換え微生物によって生産され；
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭである、前記方法。
【請求項１１】
１つまたは２つ以上の遺伝子が発現される条件下で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物を増殖させることを含む、細胞培養物においてステビオールグリコシドを産生する方法であって、
輸送体遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子、またはその両方である少なくとも１つの遺伝子が、発現され；
増殖されることが、遺伝子の１つまたは２つ以上の発現を誘導すること、または、遺伝子の１つまたは２つ以上を構成的に発現することを含み得；
ステビオールグリコシドが、組み換え微生物によって生産され；
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭである、前記方法。
【請求項１２】
（ａ）  レバウジオシドＡが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する組み換え微生物において合成され；
（ｂ）  レバウジオシドＢが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する組み換え微生物において合成され；
（ｃ）  レバウジオシドＤが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する組み換え微生物において合成され；
（ｄ）  レバウジオシドＥが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する組み換え微生物において合成され；および／または
（ｅ）  レバウジオシドＭが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチドを発現する組み換え微生物において合成される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組み換え微生物が、配列番号１１５で示されるアミノ酸配列を有するＹＧＲ２８１、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列を有するＹＯＲ３２８、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列有するＹＧＬ０１３Ｃ、または、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列を有するＹＢＲ００８Ｃを過剰発現する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステビオールグリコシドが、細胞培養物中に、少なくとも５００ｍｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養物からレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離することをさらに含み、単離するステップが、以下：
（ａ）  レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）  細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を得ること；
（ｃ）  充填カラム中の１つまたは２つ以上の吸着レジンを提供することを含む、前記吸着レジンを提供すること；ならびに、
（ｄ）  少なくとも一部のレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つまたは２つ以上の吸着レジンに接触させること、それによって、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離すること
を含むか、あるいは、
（ａ）  レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）  細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を得ること；
（ｃ）  １つまたは２つ以上のイオン交換またはイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムを提供すること；ならびに
（ｄ）  少なくとも一部のレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に得るために、ステップ（ｂ）の上清を、１つまたは２つ以上のイオン交換またはイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムに接触させること、それによって、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離すること
を含むか、あるいは、
（ａ）  レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む細胞培養物を提供すること；
（ｂ）  細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を得ること；ならびに、
（ｃ）  レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に結晶化または抽出すること、それによって、レバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離すること
を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養物からレバウジオシドＭを単独でまたは少なくとも１つの他のステビオールグリコシドと一緒に回収することをさらに含み；
ここで回収されたレバウジオシドＭが、ステビア草由来ステビア抽出物から得られたレバウジオシドＭと比較して、ステビア草由来成分の減少したレベルを有する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組み換え宿主細胞が、発酵槽内においてある温度である期間増殖させられ、ここで温度および期間が、ステビオールグリコシド組成物の産生を容易にする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
以下：
（ａ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ２’でのベータ１，２グリコシル化；
（ｂ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方のＣ３’でのベータ１，３グリコシル化；
（ｃ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドのそのＣ−１３ヒドロキシル基でのグリコシル化；ならびに
（ｄ）  ステビオールまたはステビオールグリコシドのそのＣ−１９カルボキシル基でのグリコシル化
を可能とする１つまたは２つ以上のポリペプチドを使用して、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物を含む細胞培養物中で、草由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドの全細胞のバイオコンバージョンを含む、レバウジオシドＭを産生する方法であって、
ポリペプチドの少なくとも１つが、組み換え微生物によって産生される組み換えポリペプチドであり；
ステビオールグリコシドが、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、１，２−ビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤもしくはレバウジオシドＥまたはこれらの混合物を含む、前記方法。
【請求項１９】
以下：
（ａ）  草由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドおよび１つまたは２つ以上のポリペプチドを、反応混合物へ加えること、
ここでポリペプチドの少なくとも１つが、組み換えポリペプチドであり、ならびに、
１つまたは２つ以上のポリペプチドが、ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をＣ２’でベータ１，２グリコシル化でき；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をＣ３’でベータ１，３グリコシル化でき；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化でき；および、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化でき；
ならびに
（ｂ）  反応混合物中でレバウジオシドＭを合成すること
を含む、レバウジオシドＭを産生するin vitroでの方法。
【請求項２０】
組み換え微生物が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻細胞または細菌細胞であり；
細菌細胞が、Escherichia細菌細胞、Lactobacillus細菌細胞、Lactococcus細菌細胞、Cornebacterium細菌細胞、Acetobacter細菌細胞、Acinetobacter細菌細胞またはPseudomonas細菌細胞を含み；
真菌細胞が、酵母細胞を含み；
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種の細胞であり；あるいは
酵母細胞が、Saccharomyceteである；あるいは
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種の細胞である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物または請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
以下：
（ａ）  請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物；
（ｂ）  組み換え微生物によって産生された１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドの１つ；および
（ｃ）  グルコース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロースおよび／またはＮ−アセチル−グルコサミンおよび／または酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）
を含み、
ここで１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥもしくはレバウジオシドＭまたはこれらの組み合わせであり；
１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドの少なくとも１つが、培養培地の少なくとも１ｍｇ／リットルの濃度で細胞培養物中に存在する、細胞培養物。
【請求項２２】
以下：
（ａ）  請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物によって産生された１つまたは２つ以上のステビオールグリコシド、ここで１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭであり；ならびに、
（ｂ）  グルコース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロースおよび／またはＮ−アセチル−グルコサミンおよび／または酵母窒素原礎培地（ＹＮＢ）
を含む、細胞培養溶解物。
【請求項２３】
以下：
（ａ）  反応混合物中で産生されたレバウジオシドＭ、ここでレバウジオシドＭが、反応混合物中少なくとも５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在し；
（ｂ）  ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ２’でベータ１，２グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールグリコシドの１３−Ｏ−グルコース、１９−Ｏ−グルコース、または、１３−Ｏ−グルコースおよび１９−Ｏ−グルコースの両方をそのＣ３’でベータ１，３グリコシル化できるポリペプチド；ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１３ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド；ならびに、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ−１９カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド、のうち１つまたは２つ以上；
（ｃ）  ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−ラムノース、ＵＤＰ−キシロース、および／または、Ｎ−アセチル−グルコサミン；および／または
（ｄ）  反応緩衝液および／または塩
を含む、反応混合物。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み換え微生物によってか、または請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法によって生産された、ステビオールグリコシド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のステビオールグリコシドを含む、甘味料組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の甘味料組成物を含む、食品。
【請求項２７】
請求項２５に記載の甘味料組成物を含む、飲料または飲料濃縮物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
スクロースシンターゼはあらゆる好適な生物に由来し得る。例えば限定なしに、Arabidopsis thaliana（例えば配列番号７８）またはCoffea arabica（例えば配列番号８０）由来のスクロースシンターゼのコード配列（例えばPCT/US2012/050021の配列番号１７８、１７９および１８０参照）が、好適なプロモーターの制御下にある発現プラスミドにクローニングされて、宿主（例えば微生物または植物）によって発現され得る。ＳＵＳコード配列はＳＵＣ２（スクロース加水分解酵素）欠損S.cerevisiae株によって発現されて、酵母による細胞外のスクロースの分解を回避し得る。スクロースシンターゼは、かかる株によって、スクロース輸送体（例えば、A.thaliana  ＳＵＣ１輸送体またはその機能的なホモログ）および１つまたは２つ以上のＵＧＴ（例えばＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅまたはそれらの機能的なホモログの１つまたは２つ以上）と組み合わせて発現され得る。スクロースを含有する培地によって宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースおよび１つまたは２つ以上のグルコシド（例えばステビオールグルコシド）の生産を促進し得る。尚、場合によっては、スクロースシンターゼおよびスクロース輸送体が、特定の化合物（例えばステビオール）の生産用の組み換え体である宿主細胞によってＵＧＴと一緒に発現され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016506743000001.app