(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
残留水分が少なくとも３％であり、トロンビン、プロトロンビン、活性化プロトロンビン複合体、ＦＥＩＢＡ及びそれらの混合物から選択される血液凝固アクチベーター又はプロアクチベーターを含有することを特徴とする、保存安定なフィブリンスポンジ。
【請求項２】
カルシウムイオンをも含むことを特徴とする、請求項１に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項３】
残留水分が３〜３５％、特に１０〜２５％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項４】
トロンビンを１〜３００Ｕ/ｃｍ３、好ましくは５〜１００Ｕ/ｃｍ３、最も好ましくは１０〜５０Ｕ/ｃｍ３含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項５】
安定化剤、保存剤、抗生物質、治療剤、抗繊維素溶解剤、成長因子、さらなる血漿タンパク、酵素、阻害剤、又はそれらの混合物を含有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項６】
それ自身の重量の少なくとも２倍、好ましくは４倍の液体吸収能力を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項７】
ウイルス不活化されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項８】
ウイルス不活化がそれぞれ独立した２つのウイルス不活化工程によって行われることを特徴とする、請求項７に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項９】
溶出しうる血漿タンパク、特に溶出しうるトロンビンを含まないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１０】
ウイルスに対して安全な出発物質から調製されたことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１１】
無菌パッケージ内に、直ちに使用しうる形で存在することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１２】
少なくとも１ｍｍ、好ましくは５〜１０ｍｍの間の厚さを有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１３】
少なくとも１層が止血性である、多層物質であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１４】
比重が０.００５〜０.１５ｇ/ｃｍ３、好ましくは０.０１〜０.０９ｇ/ｃｍ３、最も好ましくは０.０２〜０.０５ｇ/ｃｍ３の間であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジと、血液凝固因子を含有する成分とを含むことを特徴とする、傷を遮蔽するためのキット。
【請求項１６】
血液凝固因子がフィブリノーゲン、因子ＸＩＩＩ、フィブロネクチン、トロンビン又はこれら因子の混合物であることを特徴とする、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のフィブリンスポンジを製造する方法であって、以下の工程からなる方法：
ａ）好ましくは因子ＸＩＩＩを含有するフィブリノーゲン溶液と、好ましくはＣａ２＋イオンを含有するトロンビン溶液とを混合し、ある温度、好ましくは２０〜３７℃で、フィブリンクロットの形成及び場合によってはフィブリンの交差結合に充分な期間、好ましくは１０分〜２４時間インキュベートしてフィブリンクロットを調製し、
ｂ）フィブリンクロットを急速冷凍及び凍結乾燥し、
ｃ)残留水分を少なくとも３％、好ましくは３〜３５％、特に好ましくは１０〜２０％に調節し、
ｄ）所望によりフィブリンスポンジを適当な容器、特に空気及び/又は水を通さない容器に、パッケージングする。
【請求項１８】
フィブリノーゲン溶液及び/又はトロンビン溶液中にさらなる血漿タンパク及び/又はさらなる活性物質及び/又は添加物が含有されていることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
フィブリノーゲン溶液又はそのトロンビン溶液との混合物を凝固開始前に形成することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
フィブリンクロットを水又は水溶液で洗浄し、及び/又はさらにトロンビン及び/又はさらに血漿タンパク及び/又はさらに活性物質を含有する溶液と一緒にインキュベーションすることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
さらなる血漿タンパクがフィブロネクチン、繊維素溶解阻害剤、プラスミノーゲン及びアルブミンからなる群から選択され、さらなる活性物質が非血漿性の繊維素溶解阻害剤又は合成の繊維素溶解阻害剤、抗生物質及び成長ホルモンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
添加物が、糖、糖アルコール、多価アルコール、アミノ酸、テンシッド、可塑剤及び湿潤剤からなる群から選択されること、とりわけグリセロールであることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１７記載の方法の工程ｂ）の後に、フィブリンクロットを水又は水溶液で洗浄し、及び/又はさらにトロンビン及び/又はさらに血漿タンパク及び/又はさらに活性物質を含有する溶液と一緒にインキュベーションし、次いで再度急速冷凍し、凍結乾燥することを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
凍結乾燥後に得られた生成物を切断することを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
無菌の出発物質を用い、最終生成物まで無菌条件下に維持して製造を行うことを特徴とする、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
止血、組織接着、細胞培養支持体及び/又は傷の治癒に用いられるものである、請求項１に記載のフィブリンスポンジ。
【請求項２７】
無菌形である請求項1記載のフィブリンスポンジを細胞培養の生物学的支持体として使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は規定された残留水分を有するフィブリンスポンジ、その製造方法、その止血、組織接着及び傷の治癒を支持するための使用、並びに適用のためのキットに関する。
従来技術には、極めて多種多様な、フィブリンに基く止血性の傷遮蔽（カバー）物質、例えばフィブリンスポンジ、フィブリンメンブラン、又はフィブリンゲルが記載されており一部は使用もされていた。
【０００２】
止血のためには、フィブリノーゲンと、トロンビン又は対応するプロトロンビンアクチベーターとの組合わせが必要であるという意見が広く知られていた。即ち、例えばコラーゲンに基く、フィブリノーゲン及びトロンビンを含有するフリース（毛被）様の平坦な物質（ＴａｃｈｏＣｏｍｂョ）、フィブリノーゲンと活性化因子Ｘを含有する扁平な物質（ＡＴ ０ ３５９ ６５３， ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）又はフィブリノーゲン及びトロンビンを含有する乾燥製品としての平坦な物質（ＥＰ ０ ７４８ ６３３， ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）が従来技術で知られている。フィブリノーゲン及び活性化因子Ｘに基く扁平な（平坦な）物質は既に柔軟で順応性に富んでいるが、他の平坦な物質は、含有されているフィブリノーゲンがトロンビン又は他の血液凝固活性化物質と早期に反応することを防止するために絶対的な乾燥状態で保存する必要がある。
【０００３】
Ｂｅａｒｉｎｇ Ｅ．Ａ．Ｊｒ． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｖｏｌ． ２３， １９４４， ｐ． ５８６）はフィブリンフォーム（泡状体）とその止血剤としての使用に関する分野での一般的な発展について議論している。
フィブリンに基く様々な物質、例えばフィブリン粉末、フィブリンフィルム、及びフィブリンフォームに関する調査は例えば文献（Ｇｅｒｅｎｄａｓ Ｍ．， ”Ｆｉｂｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｓ ａｉｄｓ ｉｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｗｏｕｌｄ ｈｅａｌｉｎｇ”， ｐｐ． ２７７， Ｋ Ｌａｋｉ （ｅｄ．） Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ， Ｍ． Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９６８）に記載されている。
さらに、フィブリンフォイル又はフィブリンメンブランも先行技術から既知である（例、ＥＰ ０ ４８５ ２１０−Ａ２）。そのような物資は非常に薄く非吸収性であるためにごく限られた程度の止血にしか使用できなかった。フィブリンスポンジとは対照的にこれらの物質はその製造過程で、例えば荷重をかけることにより故意に圧縮されていた。従って、これらの物質は、泡状物質（フォーム）と比較して、第１に高密度であることを特徴とする。
【０００４】
本発明はフィブリンに基く、止血、組織接着、及び傷の治癒を補助する手段であって、従来の手段に比較して良好な、特に改良された効果を有する手段であり、取り扱いが簡単であり、同時に単純な組成物を用いて安価に製造でき、しかも応用範囲が広い手段を提供することを目的とする。その上、該フィブリン物質には他の活性物質及び補助物質を付加することが当然可能である。
【０００５】
本発明は、残留水分が少なくとも３％、好ましくは３〜３５％の間、とりわけ１０〜２０％の間である、保存安定なフィブリンスポンジを提供することでこの目的を達成した。水の含量又は残留水分は、フィブリンスポンジが柔軟で滑らかな硬度（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を有し、その結果、実質上、その取扱い及び効果が向上するように調節する。
【０００６】
先行技術から、硬くもろい、硬度を有するフィブリン含有乾燥製品は、残留水分を増加することで柔軟かつしなやかになることが知られていた。しかしながら、高い残留水分を有するタンパク製品の安定性について、特にそれがトロンビンのような感受性酵素又は他の血液凝固アクチベータ―又はプロアクチベーターを含有する場合には、一般に不利益があった。
【０００７】
そのような感受性タンパク製品を、通常、凍結乾燥によって残留水分を３％以下、最も多くの場合に１％以下にすると安定化されるということは、理由のないことではない。
従って、好ましくはトロンビンを含有し、残留水分或いは水含量を増大したフィブリン製品が、上記のことにもかかわらず保存安定性を有するということは驚くべきことである。
【０００８】
本発明のフィブリンスポンジはその保存安定性の故に、一般に室温で６ヶ月保存した後であっても、さらに２年又はそれ以上の保存後であっても、依然として適用に極めて適しており、場合により存在するトロンビン活性又は血液凝固アクチベーター又はプロアクチベーターの活性が実質上保存されていると理解される。室温で少なくとも６ヶ月、好ましくは２年又はそれ以上にわたって、実質上、７０％以上の活性が保存されることが好ましい。３７℃においても、本発明の残留水分１５％のフィブリンスポンジは、少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月以上、安定でトロンビン活性が完全に維持されることが分かった。
【０００９】
本発明の製品（調製物）は、止血、組織接着及び傷の治癒を補助するための手段に対する多方面の需要に応えるものであって、以下の特性を有する：
−優れた、そして持久性の効果、即ち、迅速な止血又は接着効果があり、二次出血又は接着した組織部分が後で脱離しない、
−複数回適用における優れた耐性（過敏性を誘発しない）、
−傷治癒過程での完全な再吸収、
−なめらかで阻害のない傷治癒、
−ウイルス性又は他の病原体（例えば、プリオン、ウシ海面状脳症、ＢＳＥ）の伝達に関して最大限可能な安全性、
−既述のごとく使用が単純、
−いつでも使用できる生成物の保存安定性が、例えば、保証される。
【００１０】
好ましくは、本発明のフィブリンスポンジはフィブリンフリース（毛被）様扁平物質であるか、または低密度で高吸収能のフィブリンフォーム（泡状体）であることが好ましい。
本発明のフィブリンスポンジは、フィブリンフリース様扁平物質というとき、非―泡状のフィブリンクロットを本発明に従って凍結乾燥することによって得ることができるものであり、多孔性、特に実質上気泡が散在していない微細な孔構造を有する物質と理解されるべきである。他方、フィブリンフォームという語句は、フィブリノーゲン溶液を起泡し、トロンビン溶液と混合し、このようにして得られた起泡したフィブリンクロットを凍結乾燥することで得られる物質であると理解されるべきである。起泡はまたトロンビン添加の直後に起ってもよい。
【００１１】
本発明のフィブリンスポンジはそのまま使うこともできる。それは本質的にフィブリンと、フィブリノーゲンからフィブリンを生産するために必要なトロンビンからなり、驚くべきことにはこの単純な態様でさえも優れた止血及び接着効果を表す。
【００１２】
しかしながら、他の添加物、好ましくは血液凝固アクチベーター又はプロアクチベーターを含有させることもできる。そのような添加物は本発明の製品中に均一に分布していることが好ましい。
血液凝固アクチベーター又はプロアクチベーターはトロンビン、プロトロンビン、活性化因子Ｘ、プロトロンビン複合体、活性化プロトロンビン複合体、ＦＥＩＢＡ、カルシウムイオン及びそれらの混合物から選択されることが好ましい。
特に、付加的なトロンビンは、本発明の調製物中に１〜３００Ｕ／ｃｍ３、好ましくは５〜１００Ｕ／ｃｍ３、最も好ましくは１０〜５０Ｕ／ｃｍ３の間の量で加えられることが好ましい。
【００１３】
驚いたことに、本発明の固形フィブリンに基き、付加されたトロンビンをも含有する調製物は依然として冷蔵庫内又は室温、さらには３７℃においてさえ、長期保存で安定である（加速安定性試験において）。特に、含有されているトロンビン活性は実質上長時間維持される。含有されているトロンビン活性は、例えば、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液で抽出した後、発色性基質（Ｔｈ−１，Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）を用い、自体既知の方法で測定することができる。
【００１４】
血液凝固アクチベーター、プロアクチベーターのような物質に加えて、本発明のフィブリンスポンジは安定化剤、保存剤、抗生物質、治療剤、抗繊維素溶解剤、成長因子、さらなる血漿タンパク、酵素、阻害剤、又はそれらの混合物を含有していてもよい。
安定化剤としては、トロンビン安定化剤が好ましく、特に多価アルコール、多糖類、ポリアルキレングリコール、アミノ酸又はその混合物、又は水分含量を安定化する物質、特に多糖類又は多価アルコールを用いる。ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グルコース又はスクロースのような単糖類又は二糖類、又はトロンビン活性又は残留水分を安定化する任意の糖類又はアミノ酸も好ましい。
【００１５】
同様に、例えば、製品が所望の柔軟性を得るように、グリセロールのような水分−安定化活性化物質（ｈｙｄｒｏ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を加えることで製品における所望の柔軟性を達成するか改良することができる。そのような物質の存在下で凍結乾燥した後には残留水分レベルが増大しうる。
好ましい抗繊維素溶解剤は、アプロチニン、アプロチニン誘導体、α−２−マクログロブリン、α−２‐プラスミンインヒビター、α−１‐プラスミンインヒビター、プラスミノーゲン活性化物質インヒビター、活性化プロテインＣのインヒビター又はインアクチベーター、プラスミン結合物質、又はそれらの物質の混合物からなる群から選択される。合成物質、特に合成繊維素溶解インヒビター、例えばε−アミノ−カプロン酸又はトラネキサム酸を用いることもできる。また、本発明によれば非−血漿性抗繊維素溶解剤、例えば植物起源のものを用いることもできる。
好ましい成長因子として、例えば、サイトカインがある。さらなる血漿タンパクとして、アルブミン、因子ＸＩＩＩ又はフィブロネクチンが挙げられる。
【００１６】
さらに、例えば体内でのフィブリンスポンジの吸収を調節するために、即ち、それを促進又は阻害するために、特定のプロ酵素、酵素又は酵素阻害剤も本発明のフィブリンスポンジに混合することができる。それらの物質には、例えば、プラスミノーゲン、コラゲナーゼ、プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、プラスミン阻害剤、又はエラスターゼ阻害剤などが含まれる。
本発明の製品はそのままで充分な吸収能力を有する。好ましくは少量の界面活性物質（テンシッド）、Ｔｗｅｅｎョ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）をさらに加えることにより、本発明の調製物の吸収能力がさらに増大されうる。
【００１７】
かくして、本発明の調製物は特に以下の性質によって特徴付けられる：
高い柔軟性又は適合性を有するので、凹凸に形成された傷の表面に問題なく適用することができる。さらに、高い吸収能を有するので、出てくる血を遅滞無く吸収することができる。
本発明のフィブリンスポンジは、それ自身の重量の少なくとも２倍、好ましくは４倍以上の液体吸収能力を有することが好ましい。
【００１８】
好ましい態様では、本発明の製品中に血液塊が数秒、好ましくは３０秒以内に吸収されるように凝固促進性が物質中に均質に分布している。
本発明はまた、フィブリンに基くフィブリンスポンジを製造する方法であって、以下の工程：
−  フィブリノーゲンとトロンビンとを混合し、混合物をある温度、好ましくは２０〜３７℃で、フィブリンクロットの形成及び、特にフィブリンの交差結合の完了に充分な期間、好ましくは１０分〜２４時間インキュベートし、
−  フィブリンクロットを（急速冷凍及び）凍結乾燥し、そして
−  残留水分を少なくとも３％、好ましくは３〜３５％の間、とりわけ１０〜２０％の間に調節することを特徴とする方法にも関する。
好ましい実施態様では、水分含量の調節を凍結乾燥の間に行う。しかし、凍結乾燥後、加湿器内でインキューベーションすることで残留水分を所望のレベルに調節することもできる。
【００１９】
本発明による調製物の製造には、洗浄及び／又はインキューベーション工程も供給することが好ましい。こうすることで、本発明の方法により、例えば塩類のような可溶性成分は除去される一方、加えたトロンビンは驚異的に大量残存する。
洗浄は蒸留水で行うことができるが、さらなる活性物質又は添加物を含有する溶液を用いても良い。こうすることで最終生成物の組成を意図的に調節したり変化させることができる。
【００２０】
特に、フィブリンクロット中に含有されるトロンビンは実際上、等張性食塩水による洗浄では溶出しないことが分かった。例えば、１０倍量の等張性食塩水で４時間洗浄した後、洗浄水中に認められたのは全トロンビンの約４％にすぎない。他方、他の血漿タンパク、例えばアルブミンは同じ条件下で比較的迅速に溶出する（４時間で約２５％、８時間で約５０％）。
【００２１】
最後に、好ましくは本発明の調製物中に均質に分布している血液凝固アクチベーター又はプロアクチベーターそれ自体の驚くべき安定性を、さらに自体既知の安定化剤、例えば糖、糖アルコール、多価アルコール、アミノ酸等又はそれらの混合物によって一層増大することができる。
さらに好ましい態様では、上記のごとく、その調製の経過中にフィブリンスポンジを洗浄し、及び／又はさらなる物質を浸透させる。好ましくは、フィブリンクロットの凍結乾燥前に浸透させる。しかしながら、洗浄又はインキュベーションを凍結乾燥後に行っても良く、次いで、さらなる凍結乾燥工程を行っても良い。
【００２２】
フィブリンフォームはフィブリノーゲン溶液をトロンビンと混合する前又は混合直後であるが、凝固が起る前に起泡することにより調製することができる。この起泡には従来技術において一般的な全ての方法を用いることができる。これらは例えば、これらは化学的、物理的及び／又は機械的手段又は方法でありうる。ガスを導入するか又は発生させる、特に集中的かつ機械的に撹拌することによって空気を導入する（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ 処理等）。物理的な方法の例として、真空の適用が言及される。
【００２３】
しかしながら、そのうえ、これまで記載されたフィブリンスポンジの調製方法と対照的にフィブリノーゲン溶液又はフィブリノーゲントロンビン混合物を凝固の開始前に起泡させることが絶対的に必要であるというわけでないことが分かった。
これまで記載されたフィブリンスポンジの調製方法と対照的に、起泡させずに調製されたフィブリンクロットを実質的に縮小させずに、凍結乾燥した後、特別に微小多孔性の吸収性調製物が製造される。
【００２４】
冷凍及び凍結乾燥の前に、フィブリンクロットが比較的低い塩含量、又は低いイオン強度を有することが好ましく、０．１５以下であることが好ましく、実質上塩を含有しないことが好ましい。
起泡の回避は、特に、後者が滅菌条件下で行われるべきである場合、実質上調製法を単純化し容易にする。
さらに好ましい態様では、フィブリンスポンジ、即ち、特にフィブリン平坦（扁平）物質又はフィブリンフォームを、それぞれの調製後にカットする。切断後傷遮蔽物（カバー）として用いられうる切断面積ができるだけ大きくなるように切断することが好ましい。驚くべきことに、これらの切断領域の吸収能力は凍結乾燥直後の非切断（いわゆる、「本来の」）表面よりも大きいことが分かった。
【００２５】
多数回適用後における良好な耐性、とりわけアレルギー反応の回避は、専らヒトタンパクを使用すること、並びに例えば滅菌法のようなタンパクを変性させる方法（例えば、γ−線照射）を避けることで好首尾に達成される。
特に単純な態様では、本発明の傷遮蔽製品は、滅菌出発物質から出発し、最終生成物に至るまで滅菌条件を維持する。
本発明の調製物は、感受性の血漿タンパクのための適当なウイルス不活化法によって処理されたヒト血漿タンパク画分から調製することが好ましい。
【００２６】
この不活化処理はテンシドおよび／または熱処理、例えば固形状態での熱処理、特にＥＰ−０ １５９ ３１１またはＥＰ−０ ５１９ ９０１またはＥＰ−０ ６７４ ５３１に記載の蒸気処理によって確実に行うのが好ましい。
ひとつの好ましい態様では、残留水分含量６〜１５％の間、好ましくは約１２％で蒸気熱処理により熱処理を行う。スポンジ内にトロンビンが存在する場合、驚くべきことに、これらの条件下でさえ、ほぼ全てのトロンビン活性が維持されることが分かった。
【００２７】
ウイルスのさらなる不活化処理はまた、化学的方法または化学／物理的方法による処理、例えばＷＯ９４／１３３２９、ＤＥ ４４ ３４ ５３８またはＥＰ ０ １３１ ７４０（溶媒）に記載のカオトロピック物質または光不活性化による処理を含む。
２つの別個のウイルス不活化法を実施することが好ましい。
ナノフィルトレーションもまた、本発明の範囲内の、ウイルスを涸渇する好ましい方法である。
【００２８】
ウイルス安全性を高めるさらなる可能性は、まず、最大限可能な程度、ウイルス的に安全な出発物質のみで製造を開始し、次いで、製造工程の経過中、汚染の危険性を排除することにある。ヒト血漿由来の調製物中におけるウイルス又は他の病原体に関して可能な最大の安全性は、血漿供給者を注意深く選択し、モニターし、出発物質である血漿を病原性ウイルスに関してテストする（好ましくは単独供与試験（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）こと、特に、ＰＣＲ法によってテストすることで一層確実になる。
【００２９】
しかし、基本的には本発明の調製物は組換え又はトランスジェニック材料から調製してもよいが、この場合も安全な方法に関する必要性を満たさなければならない。
滅菌中間生成物（滅菌ろ過した溶液）から出発し、最終生成物を滅菌パッケージングするまで、滅菌条件下で調製し、その後の最終容器中での滅菌（即ちγ−線照射などによる滅菌）を不要にすることが好ましい。
【００３０】
傷の治癒工程の間における完全な吸収並びになめらかで円滑な傷の治癒は、フィブリン及び所望によりマトリックスとして血漿タンパク（例えば、フィブロネクチン）を用いること、並びにフィブリン形成を好ましくはほぼ生理的イオン強度、及びほぼ生理的ｐＨにおいて因子ＸＩＩＩの存在下で起こさせることにより、繊維芽細胞の発芽および迅速かつ円滑な傷の治癒に必須の生理学的フィブリン構造を有する交差結合したフィブリンクロットを得ることにより、達成される（Ｒａｄｌ ら、Ｍｅｄ． Ｗｅｌｔ， ３６， ｐｐ． ７６９−７７６， １９８５）。
本発明のフィブリンスポンジの長さ及び幅は使用のタイプに応じて随意選ぶことができる。厚みは、その指示に応じて１〜２０ｍｍの間の実用的な範囲であることが好ましく、３〜１５ｍｍの範囲又は５〜１０ｍｍの範囲であることが好ましい。
本発明のフィブリンスポンジはまた他の物質（材料）との組合わせとして存在しうる。
特別の態様においては、スポンジを数層に形成し多層材料を形成する。少なくとも１つの層が止血特性を有することが好ましい。各層を同一材料で形成してもよく、あるいはそれらは材料及び／又は組成において異なっていてもよい。
【００３１】
スポンジ材料は材料又は各層の比重によて特徴つけられる。好ましい態様では、比重は０．００５〜０．１５ｇ／ｃｍ３の間であり、０．０１〜０．０９ｇ／ｃｍ３であることがより好ましく、０．０２〜０．０５ｇ／ｃｍ３であることが最も好ましい。
他の好ましい態様では、層は同じ材料で構成されるがその物理的特性、例えば、比重が異なる。各層の物理的特性を変化させることで、スポンジの１つの側はなめらかで高い吸収能力を有するが他の側はより目が詰んでいて漏れないという特徴を有するスポンジが得られる。様々な層の性質を変化させるもう一つの方法は層を形成する物質の量又は濃度若しくは各層に浸み込ませる物質の量又は濃度を変化させることによって行われる。例えば、異なる層のトロンビンの濃度を変えることができる。
【００３２】
フィブリンスポンジは、例えば、出血している傷の上に適用し、少しの間（およそ３０秒間）、そこに僅かに押し付けて使用されるであろう。スポンジは血を非常な速さで吸い上げ、吸い上げられた血はスポンジ内で凝固する。その結果、傷表面に漏れないフィブリンスポンジの固着が起り、それは最終的に止血及び接着効果の基礎となる。
製品は、いわゆる乾燥接着剤（好ましくは比較的薄いスポンジ）として用いることができる。２つの（やわらかい）出血組織部分を接着するために「乾燥接着剤」の適当な一片を１つの傷表面に適用した後、第２の傷表面（第２の組織部分）を適合させて短時間押し付ける。
【００３３】
本発明のフィブリンスポンジに関して指示される医学分野は極めて大きい。にじみ出る出血のみならず、高い血圧の、非常に広い出血領域の場合における止血にもスポンジを用いることができる。本発明のフィブリンスポンジを用いて、次の内的及び外的手術工程を、成功裏に行うことができるであろう：一般手術、例えば実質性臓器（肝臓、腎臓、膵臓など）の手術、心血管手術、胸部手術、移植手術、整形外科手術、骨外科及び形成外科の分野での手術、耳鼻咽喉科における手術、神経外科領域における手術、泌尿器科系及び婦人科系管における手術、及び総体的な止血処理並びに通常の傷の治療。
【００３４】
本発明の他の側面では、本発明のフィブリンスポンジと血液凝固因子を含有する成分とを含む傷の接着のためのキットを提供する。この血液凝固因子はフィブリノーゲン、因子ＸＩＩＩ、フィブロネクチン、トロンビン又はそれら因子の混合物であることが好ましく、とりわけ、市販品から入手可能なフィブリノーゲンに基く組織接着剤製品等の好ましくは保存安定形のフィブリノーゲン成分が好ましい。
【００３５】
本発明のスポンジは又、細胞培養、特にケラチン生成細胞、上皮細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞等の哺乳類細胞の細胞培養における生物学的支持体としても有用である。
従って、本発明は本発明のフィブリンスポンジを滅菌された形で含む、細胞培養の生物学的支持体とし用いるためのキットを提供する。
例えば、抗生物質、種々のアミノ酸及び／又は種々の成長因子などの添加物をスポンジ内に存在させるか、培地に後から加えても良い。
本発明のフィブリンスポンジを細胞培養に用いることで、例えば、皮膚、骨、軟骨及び／又は神経などのそれぞれの組織の代替品を形成することが可能である。
【００３６】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例
（比較的低含量の）トロンビンを含有する交差結合したフィブリンによるフィブリンフリース様平坦物質
製造
因子ＸＩＩＩ及びフィブロネクチンを含有するフィブリノーゲン溶液の調製用出発物質は、蒸気処理でウイルス不活化され凍結乾燥されている市販の組織接着剤製品（Ｔｉｓｓｕｃｏｌョ、ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）であった。製造元の指示に従って製品をアプロチニン水溶液（３０００ＫＩＵ／ｍｌ）に溶解し、さらに蒸留水で１：４希釈してフィブリノーゲン濃度を約２０ｍｇ／ｍｌとした。この溶液２０ｍｌをトロンビン−ＣａＣｌ２溶液（ヒトトロンビン、約１０Ｕ／ｍｌ ５ ｍＭ ＣａＣｌ２）と素早く混合し、ペトリ皿（ＩＤ＝８．４ｃｍ）に注ぎ、最初は室温で約３０分間静置した後、さらに約１６時間３７℃で加湿器内でインキュベートした。次いで、厚さ約７ｍｍの円盤状のクロットを急速冷凍し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品（フリース様扁平物質）は軽く（ふんわりした）、微細孔のある外観を有し、凍結乾燥前のクロットの形を実質上維持していた。しかしその物質は、最適な適用のためには、依然として脆すぎた。所望の柔軟性と曲げやすさに改善するために、平坦な材料を室温で加湿器内で約３時間インキュベートすることにより、柔軟で適用可能な、吸収性の高い物質を得た。
【００３７】
分析、インビトロ試験
残留水分：約１５％
曲げやすさ：＞９０°層の厚さの半分に対応する平均曲率半径
フィブリン交差結合：γ−鎖：１００％
α−鎖：約８０％
トロンビン含量：１Ｍ ＮａＣｌで抽出した後の測定：１．４Ｕ／ｃｍ３
水の吸収能力：それ自身の重量の約６倍
水吸収速度：扁平物質の表面に滴下した水（５０μｌ）は約２５秒で完全に吸い上げられる。
（他は同一条件下、扁平物質の切断面から水は事実上即座に、即ち５秒以内に、吸収された。）
【００３８】
１．３  効果
１．１に従って製造された製品の接着及び止血効果をいわゆる腎臓極（ｋｉｄｎｅｙ ｐｏｌｅ）切除モデルウサギで試験した。
このために、ケダミン（ｋｅｄａｍｉｎ）及びキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎ）（ペントバルビタール投与後）で麻酔下、試験動物の腎臓を露出させ、腎臓極を外科手術用のメスで切除する。均一な強度で出血している直径約１〜１．５ｍｍの円形の領域が形成される。被検製品を出血領域に適用し、正確に３０秒間指で軽く押し付けた後、緩める。製品の接着を観察し、完全な止血が観察されるまでの時間を測定する。血液が滲み出せばガーゼ綿棒で取り、被検製品とガーゼ綿棒からアンモニアで抽出した後、失血量を比色定量分析によって測定する。
１．１に従って得た製品の試験を２羽のウサギで行った。
【００３９】
結果：
いずれの場合でも、製品は強く出血している表面に良く接着し、実際上、即座に完全な止血が達成された（３０秒以内で）。１時間の２次観察期間中に後の出血は観察されなかった。
全血液の損失（試験物質に吸収された血液、他に漏れた血液はない）は、それぞれ０．１０及び０．１８ｍｌに達した。
これと比較して、ガーゼによる従来の止血では、このモデルにおける血液損失は出血時間３分間で約５ｍｌであり、無処置の場合には出血時間９分間で約２７ｍｌである。
１．１に従って得た製品の、従来手段と比較して実質上改良された印象的な効果が証明された。