(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式  （Ｉ、配列番号  ：  １）
Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｌｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ２−Ｘａａ２−Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｌｙｓ−Ｒ
（式中  Ｘａａ１  は  Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ  又は  Ｉｌｅ  を意味し、Ｘａａ２  は  Ｖａｌ  又は  Ｌｅｕ  を意味し、Ｒ  は  ＯＨ  又は  ＮＨ２  を意味する）
にて示され且つ抗菌活性を有していることを特徴とする、ポリペプチド又はその塩。
【請求項２】
請求項  １  に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分とす  る抗菌剤。
【請求項３】
請求項  １  に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分とす  る細菌性疾患治療剤。
【請求項４】
請求項  １  に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分とす  る抗真菌剤。
【請求項５】
請求項  １  に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分とす  る真菌性疾患治療剤。
【請求項６】
請求項  １  に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分とす  る、食品又は飼料用の抗菌性添加剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なポリペプチド及びその用途に係る。本発明によるポリペプチド又はその塩は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性を有しており且つ毒性が極めて低いので、一般細菌性疾患又はカンジダ症等の真菌性疾患治療剤の有効成分として、更には食品又は飼料用の抗菌性添加剤として使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
抗菌活性を有するペプチド類の開発に関するの研究は従来から盛んに行われている。
例えば、環状ペプチド誘導体  （特開昭  ５８  −  ２１３７４４  号公報）、酵母類に対する抗菌ポリペプチド  （特開昭  ６０  −  １３０５９９  号公報）、新規グリコペプチド  （特開昭６１−  ２５１６９９  号公報）、グラム陽性菌に効果を示すオリゴペプチド  （特開昭  ６２  −２２７９８  号公報）、ペプチド系抗生物質  （特開昭  ６３  −  １７８９７  及び特開平  ６  −５６８８９  号公報）  等を例示することができる。しかしながら、これらのペプチド類の内で、殊に真菌に対して充分な抗菌効果を発揮するものは存在しないようである。
尚、近年に至り臨床の場では  ＡＩＤＳ  等による真菌症が問題になってきている。抗真菌剤としてはアムホテリシン  Ｂ  やトリアゾール系のものが主として用  いられているが、その効果が充分でなかったり副作用が強い等の点で満足し得る抗真菌剤は得られていないのが現状である。従って、安全性に優れ、効果が充分に期待できるペプチド性の抗真菌剤が求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】
本発明は従来技術におけるこのような困難をふまえてなされたものであり、本発明の目的は、ポリペプチド系抗菌剤を開発する上で従来課題とされてきた生産コストを低く抑え且つ合成が容易であり、しかも正常細胞に対しては毒性が極めて低く且つ抗菌活性、殊に抗真菌活性においても優れた新規なポリペプチドを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】
本発明者等は鋭意検討を重ねた結果、正電荷を有するリジン残基を基本とし、これに主としてバリン又はロイシン残基を組み合わせた  １０  個以下の構成アミノ酸からなるポリペプチドがカンジタ菌等に対しても強い抗真菌活性を示すと共に、赤血球やミドリザル由来の腎細胞等の正常細胞に対する毒性が極めて低いことを見い出し、これによって本発明を基本的には完成するに至った。
【０００５】
従って、本発明は一般式  （Ｉ、配列番号  ：  １）
Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｌｙｓ−Ｘａａ２−Ｘａａ２−Ｘａａ２−Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｌｙｓ−Ｒ
（式中  Ｘａａ１  は  Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ  又は  Ｉｌｅ  を意味し、Ｘａａ２  は  Ｖａｌ  又は  Ｌｅｕ  を意味し、Ｒ  は  ＯＨ  又は  ＮＨ２  を意味する）
にて示されるポリペプチド又はその塩を提供すると共に、これらの内の少なくとも  １  種を有効成分として含有する抗菌剤乃至食品及び飼料用の抗菌性添加剤を  提供するものである。
【０００６】
本明細書において、アミノ酸は本技術分野において慣用されている  ３  文字又  は  １  文字略号で示され、例示すれば下記の通りである。
リジン  ：  Ｌｙｓ  又は  Ｋ、ロイシン  ：  Ｌｅｕ  又は  Ｌ、バリン  ：  Ｖａｌ  又は  Ｖ、
フェニルアラニン  ：  Ｐｈｅ  又は  Ｆ、イソロイシン  ：  Ｉｌｅ  又は  Ｉ。
【０００７】
本発明によるポリペプチドは、上記の一般式  （Ｉ）  から明らかなようにＬｙｓ−  Ｘａａ１−Ｌｙｓ  （Ｘａａ１  は上記の疎水性アミノ酸を意味する）  なる配列を有するトリペプチドを  Ｎ  及び  Ｃ  末端に有し、中央の部位にロイシン又はバリンを  ３  個  有している比較的単純な構造を有するポリペプチドである。尚、Ｃ  末端がカルボキシル基であっても、アミド化されていてもポリペプチドの抗菌活性は殆ど同じであり、アミド化されている場合の方が若干高い。
本発明によるポリペプチドは、その構成アミノ酸の数が僅か  ９  個であり、合  成上に課題のあるトリプトファン、システイン、メチオニン等を含有していないので、化学合成法により容易に且つ廉価に大量生産することが可能でき、これにより既述の課題を解決すると共に本発明の目的を達成することができる。
これらのポリペプチドは塩の形であることが可能であり、例えば塩酸、トリフルオロ酢酸や燐酸等の無機又は有機酸の付加塩であることができる。
【０００８】
本発明による抗菌剤はペプチドであるために経口投与等された場合においては、毒性の発現は殆どない。その他の投与経路であっても、他の化学物質である抗生物質のように残留性が問題になることはない。従って、本発明によるポリペプチドはヒト又は他の動物における細菌性疾患、特に真菌症に対して有効であり、又食品や飼料用の抗菌性添加物としても使用することができる。
本発明によるポリペプチドを医薬品として用いる場合には、主として注射剤として製剤化されるが、錠剤等の経口剤、クリーム剤乃至軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、膣剤又はトローチ剤とすることもできる。
【０００９】
【実施例等】
次に、製造例及び薬理活性試験例に関連して本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。
製造例
（１）  抗菌性ポリペプチドの合成と精製
ポリペプチドの合成は、パーキンエルマー社製のペプチド合成装置  （ｍｏｄｅｌ４３１Ａ）  を使用し、ｔ−Ｂｏｃ  アミノ酸を用いた固相法により行った。
アミノ酸は、α−アミノ基が  ｔ−ブトキシカルボニル基  （ｔ−Ｂｏｃ  基）  にて保護されたもので、その他  ε−アミノ基は  ２−クロロベンジルオキシカルボニル基等で  保護されたものを用いた。樹脂は、Ｃ  末端がアミドのペプチドを与える  ｐ−メチ  ルベンズヒドリルアミン  （ＭＢＨＡ）  樹脂又は  Ｃ  末端がカルボキシルのペプチドを  与えるフェニルアセトアミドメチル  （ＰＡＭ）  樹脂を用いた。
ＭＢＨＡ  樹脂または  ｔ−Ｂｏｃ  リジンが導入された  ＰＡＭ  樹脂  ０．５  ｍｍｏｌ  をトリフル  オロ酢酸／塩化メチレンにより  ｔ−Ｂｏｃ  基を除去し、保護アミノ酸  ２  ｍｍｏｌ  とジ  シクロヘキシルカルボジイミド  （ＤＣＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール  （ＨＯＢｔ）  で縮合反応を行うことによりペプチド結合を形成させた。塩化メチレンにて洗浄後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシル末端から順次アミノ酸を導入することにより本発明による各種のペプチドを合成していった。
合成したペプチドについてはトリフルオロメタンスルホン酸法にて脱保護基、脱樹脂を行なった。即ち、ペプチド  ５００  ｍｇ  に対しトリフルオロメタンスルホン酸  １ｍｌ、トリフルオロ酢酸  ５ｍｌ、チオアニソール  １ｍｌ  及びエタンジチオール０．５ｍｌ  を氷冷しながら  ２  −  ３  時間反応させた。
粗ペプチドを下記に示す条件の逆相  ＨＰＬＣ  により精製した。
カラム：ウォーターズ社製の  μ−ボンダスフェア  Ｃ−１８  （１９ｍｍ  ｘ  １５ｃｍ）、
溶出液：０．０１２Ｎ  塩酸中  １５％  から  ５０％  のアセトニトリルの直線勾配、３５  分    間、
流速  ：７．０ｍｌ／ｍｉｎ。
ＨＰＬＣ  によるメインピーク部分を回収して凍結乾燥した。その一部をパーキン  エルマー社製のペプチドシークェンサーにて調べた処、サンプルはすべて正しく化学合成されていることが確認された。
尚、本発明の範畴に属しない各種のアミノ酸配列を有する抗菌性ポリペプチドも同様に合成され、精製された。
【００１０】
（２）  生理活性の試験法
抗菌活性は、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度  （ＭＩＣ）  として求めた。
測定は  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  （ＮＣＣＬＳ，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，  １９８８）  ｆｒｏｍ  ＵＳＡ  に従って行った。即ち、各菌体を  ＣａｔｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ  （ＣＳＭＨＢ）  培地で振盪培養後、６５０ｎｍ  における吸光度が  ０．３  になるように菌の濃度を調整し、更に培地で  １０６  ＣＦＵ／ｍｌ  にな  るように希釈する。この菌体溶液と培地で希釈した抗菌物質のサンプルを各々５０μｌ  添加し、３５℃  で  ２０  −  ２４  時間培養し最小発育阻止濃度を求めた。
【００１１】
抗菌活性の測定例  １  （中央部の  Ｌｅｕ  の数が異なるアナログの抗菌活性）
Ｎ  末端と  Ｃ  末端におけるアミノ酸配列が  ＲＬＫ  の場合と  ＫＬＫ  の場合について、中央の部位が  Ｌ  であって、その数が異なるポリペプチドの抗菌活性を調べ  た結果は、下記の表  １  に示される通りであった。
この表  １  から、Ｎ  及び  Ｃ  末端が  ＲＬＫ  の場合には、Ｌｅｕ  の数が  ５  個の場合に最も活性が高く  ４  個  、３  個になると活性は弱くなる傾向がある。一方、本発明が関与する  ＫＬＫ  を基本にした場合には  ４  個や  ３  個の方が活性において優れて  いることが明らかになった。
【００１２】
【表１】
0003547504.tif 000002
【００１３】
抗菌活性の測定例  ２  （ＫＬＫ  の部位を変換したアナログの抗菌活性）
ＭＩＣ  の測定結果が下記の表  ２  に示されている。この表  ２  から明らかなように、ＫＬＫ  の  Ｋ  （リジン）  の部位を正電荷を有する他のアミノ酸に変換した場合に、Ｒ    （アルギニン）  への変換では活性は保持されるが、Ｈ  （ヒスチジン）  への  変換では活性は消失する。又、表  ２  には明示されていないが、アミノ酸配列に  おける中央部に  Ｌ  （ロイシン）  を有しないものは活性を有しないことが判明した。尚、ＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ２  を基本として  ＫＬＫ  の  Ｌｅｕ  の部位を他のアミノ酸に変換したアナログでは  Ｇｌｙ  （グリシン）  に変換したものでは活性は殆ど消失し、Ａ（アラニン）  又は  Ｃ  （システイン）  に変換したものでは  ＭＲＳＡ  等の耐性菌に対す  る活性が大幅に減少し、他の疎水性アミノ酸である  Ｖ  （バリン）、Ｉ  （イソロイシン）  又は  Ｆ  （フェニルアラニン）  に変換したものでは活性が保持されることも判明した。
【００１４】
【表２】
0003547504.tif 000003
【００１５】
抗菌活性の測定例  ３  （Ｃ  末端に  ＫＬＫ  の部位を有しないポリペプチドの抗菌活  性）
Ｃ  末端に  ＫＬＫ  のトリペプチドを有しないポリペプチドの  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  に対する抗菌活性は  Ｌｅｕ  の数に拘らず、Ｃ  末端に  ＫＬＫ  を有する場合の活性と比較して１／２  −  １／８  程度に低下した  （下記の表  ３  参照）。
【００１６】
【表３】
0003547504.tif 000004
【００１７】
抗菌活性の測定例  ４  （カンジタ菌に対する活性測定）
真菌に対する活性は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  を用い培地はサブロー培地を用いて  ＭＩＣ  の測定を行った。その結果  ＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ２  及び  ＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ２  が他のペプチドと比較して極めて抗真菌活性の高いことが明らかになった  （下記の表  ４  参  照）。
【００１８】
【表４】
0003547504.tif 000005
【００１９】
抗菌活性の測定例  ５
抗菌活性の測定例  ３  及び  ４  の結果から  ＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ２  （配列番号  ７）  は  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  や  Ｅ．  ｃｏｌｉ  に対してのみでなく真菌に対しても強い抗真菌活性を示し、又  ＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ２  （配列番号  ２）  も強い抗真菌活性を示すので、アミノ酸配列のＮ  及び  Ｃ  末端が  ＫＬＫ  又は  ＫＶＫ  であり且つ中央の部位が  ＬＬＬ  のみ  ではなく、  ＶＶＶ  又は  Ｖ  と  Ｌ  の組合せからなる各種のポリペプチドを合成して  ＭＩＣ  を求め  た結果を下記の表  ５  に示す  （この表  ５  には上記の配列番号  ２  及  び  ７  に該当  するポリペプチドの抗細菌及び抗真菌活性も併せて示されている）。
【００２０】
【表５】
0003547504.tif 000006
0003547504.tif 000007
【００２１】
表  ５  から明らかなように、本発明によるポリペプチドはグラム陽性菌及びグ  ラム陰性菌の広い範囲の微生物に対してのみならず、真菌である  Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓに対しても強い抗菌活性を示すことが判明した。
【００２２】
正常細胞に対する細胞障害活性の測定
（１）  培養細胞における細胞障害活性
ミドリザル腎  （ＧＭＫ）  由来の細胞を  ９６  穴プレートでコンフルエントになるま  で培養する。培地を捨てて新たに検体である抗菌性ポリペプチドを含有する培地を添加する。３７℃、５％  ＣＯ２で  ２０  −  ２４  時間培養する。培地を除去し、ＰＢＳ（−）１００μｌ  にて洗浄する。
１ｍＭ  の臭化  ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ  テトラゾリ  ウム  （ＭＴＴ）  を含有する培地  ５０μｌ  を添加し、３７  ℃、５％  ＣＯ２  で  １  時間培養す  る。その後、１０％  ドデシル硫酸ナトリウムと  ０．０４Ｎ  塩酸を含有する  ５０％  イソブタノール溶液  １００μｌ  を添加した後に、５４０ｎｍ  で吸光度を測定する。この場合に、生細胞の酵素により  ＭＴＴ  が呈色物質のホルマザンに還元され、このホルマ  ザンの量は細胞数に比例して増加するので、特異的吸光度を測定することにより障害を受けていない細胞の量が判明する。結果は、５０％  の細胞障害性を示す抗菌性ペプチド濃度で表した  （後記の表  ６  参照）。
表  ６  から明かな通り、本発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央  部が  ３  個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドは  ５０％  の細胞障害性値が何れも  ２００μｇ／ｍｌ  以上であり、正常細胞に対して作用する蜂毒のメリチンと  比較する場合に細胞障害活性は弱く  １／４０  以下であり、中央部が  ５  個  の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比較する場合にも  １／３  以下  であり毒性は少なく安全性に優れたペプチドであることが判明した。
【００２３】
（２）  羊赤血球  （ＳＲＢＣ）  の溶血反応
羊保存血液  （羊血液にアルセバー氏液を等量添加したもの）  ０．２ｍｌ  に  ＰＢＳ  を  ０．８ｍｌ  添加し、２０００  ｘ  ｇ  で  ５  分間遠心し、上清を除去することにより洗浄を行う。ＰＢＳ  を  １０ｍｌ  添加した後、この赤血球溶液  ２５μｌ  に検体である抗菌性ポリ  ペプチド溶液  ２５μｌ  を添加し、３７℃  で  ２  時間インキュベーションする。  ２０００ｘ  ｇ  で  ５  分間遠心を行い、上清の吸光度を  ５７６ｎｍ  で測定する。結果は、１０％  の溶血性を示す抗菌性ポリペプチド濃度で表した  （下記の表  ６  参照）。
表  ６  から明かな通り、本発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央  部が  ３  個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドでは溶血作用濃度が何  れも  ２５０μｇ／ｍｌ  以上であり、蜂毒のメリチンと比較する場合に赤血球に対する  溶血活性は  １／６０  以下であり、中央部が  ５  個の疎水性アミノ酸から構成される  ポリペプチドと比較する場合にも有意に低く、毒性が少ない安全性に優れたペプチドであることが判明した。
【００２４】
【表６】
0003547504.tif 000008
【００２５】
製剤例
本発明によるポリペプチド  （ＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ２、配列番号  ２）  を  ５０ｍｇ  宛含有す  るようにバイアルに無菌的に分配し、凍結乾燥により水分を除去して密封する。この製剤は用時は注射用生理食塩水に溶解せしめられる。
尚、本発明によるポリペプチドの安定化剤としてアルギニン等のアミノ酸類やクエン酸等の有機酸及びヒト血清アルブミン等を用いることができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によるポリペプチドは、正常細胞に対する毒性が極めて低く、幅広い抗菌活性を有しており、殊に真菌に対しても強い抗菌活性を示すので一般細菌性感染症のみならず真菌症の治療剤の有効成分として、更には食品及び飼料用の抗菌性添加剤として利用することが可能である。尚、本発明によるポリペプチドは、その構成アミノ酸の数が僅か  ９  個であり且つ合成上等において課題のあるアミ  ノ酸を有していないので化学合成法により比較的廉価に調製することができる。
【配列表】
0003547504.tif 000009
0003547504.tif 000010
0003547504.tif 000011
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