(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素の存在下でエステラーゼを不活性化させる方法であって、該酵素混合物にＣｕ化合物を接触させることを特徴とするエステラーゼの不活性化方法。
【請求項２】
セファロスポリンＣからＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有物を用いてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を製造する方法において、Ｃｕ化合物と接触させた、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ含有物を用いることを特徴とするグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法。
【請求項３】
セファロスポリンＣからＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有物を用いてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を製造する方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ含有物およびセファロスポリンＣを含有した液に、Ｃｕ化合物を接触させることを特徴とするグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法。
【請求項４】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ含有物が、トリゴノプシス・バリアビリスの細胞、部分的に破壊された前記細胞、膜透過性の付与された前記細胞、前記細胞から抽出された酵素抽出液、または固定化酵素である請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
Ｃｕ化合物の濃度が１０〜２０００ｐｐｍである請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、セファロスポリンＣからＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有物を用いてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸に酵素変換する方法の改良法に関する。さらに詳しくは該酵素中に共存するエステラーゼ酵素を選択的に不活性化またはエステラーゼ酵素反応を選択的に阻害する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（以下「ＧＬ−７ＡＣＡ」と称する）はセファロスポリンＣ（以下「ＣＰＣ」と称する）から７−アミノセファロスポラン酸を製造するための製造中間体であることはよく知られている。ＧＬ−７ＡＣＡを高い収率で得るために、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（以下「ＤＡＯ」と称する）の作用を利用して、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡへ酵素的に変換する種々の方法が知られている。
【０００３】
例えば、特公昭５０−７１５８号公報、特公昭５５−３５１１９号公報等には、カタラーゼによるＨ２Ｏ２の分解を防止するために、無機アザイド類や過ホウ酸塩などのカタラーゼ阻害剤の存在下でＣＰＣの酵素的酸化を行い、ＧＬ−７ＡＣＡを得る方法、特公昭５９−１５６３５号公報には、カタラーゼ阻害剤を存在させる代わりに、カタラーゼで分解される以上の過酸化水素の存在下で反応させる方法が述べられている。特公昭５５−３５１１８号公報には、トリゴノプシス・バリアビリスの活性化細胞にナトリウムアジドなどのカタラーゼ阻害剤を用いることによってＣＰＣの酵素的酸化反応を行い、高い収率のＧＬ−７ＡＣＡを得る方法が述べられている。特開平３−５３８７９号公報には、ｐＨ約１１〜１２の塩基性水溶液で処理してカタラーゼ活性を不活化したＤＡＯを使用する方法が述べられている。
【０００４】
また、特開平３−５３８７９号公報には、デスアセチル−ＣＰＣおよびデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの副生を防止するために、トリゴノプシス・バリアビリスの細胞をアセトン／水で処理して、エステラーゼ活性を不活性化したＤＡＯを使用する方法が述べられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、前記の酵素反応を工業スケールで経済的に実施するには、いくつかの問題を含んでいた。それらの課題の１つに、トリゴノプシス・バリアビリスに由来するエステラーゼの存在による収率の低下がある。
エステラーゼは、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡへの酸化反応中に、そこに生成したα−ケト−アジポイル−７−アミノセファロスポラン酸（以下「ＫＥＴＯ−ＣＰＣ」と称する）反応中間体ならびにＣＰＣおよびＧＬ−７ＡＣＡの３位のアセトキシメチル基のアセチル基を脱離（脱アセチル化）し、ＧＬ−７ＡＣＡの収量を減少させる。
【０００６】
また、該エステラーゼによって副生されるデスアセチル−ＣＰＣおよびデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡは、不純物としてＧＬ−７ＡＣＡの品質に多大な悪影響を及ぼす。したがって、ＧＬ−７ＡＣＡの収率および品質を向上させるために、該エステラーゼの不活性化あるいは該エステラーゼ反応の阻害は重要である。
一方、エステラーゼの不活性化を図る方法として、ＤＡＯ生産菌を９０〜５０％の水／アセトン（２：１、ｖ：ｖ）混合液で処理することによってエステラーゼを除去する方法（特開平３−５３８７９号公報）等が知られている。しかし、アセトンを除去する等の処理が複雑かつ面倒であり、さらに、工業レベルに応用できる簡易かつ効率的なエステラーゼ活性の不活性化法の確立が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
以上の点に鑑みて本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＤＡＯ生産菌であるトリゴノプシス・バリアビリス由来のＤＡＯ含有物にＣｕ化合物、例えば、ＣｕＳＯ４を接触させることによって、ＤＡＯ活性存在下でエステラーゼを選択的に不活性化することができることを、また、該ＤＡＯ含有物およびＣＰＣを含有した液に、Ｃｕ化合物を接触させることによって、ＤＡＯによる酵素的酸化反応中にエステラーゼ反応のみを特異的に阻害することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＤＡＯの存在下でエステラーゼを不活性化させる方法であって、該酵素混合物にＣｕ化合物を接触させることを特徴とするエステラーゼの不活性化方法であり、また、本発明は、ＣＰＣからＤＡＯ含有物を用いてＧＬ−７ＡＣＡを製造する方法において、Ｃｕ化合物と接触させた、ＤＡＯ含有物を用いることを特徴とするＧＬ−７ＡＣＡの製造方法、前記の方法においてＤＡＯ含有物およびＣＰＣを含有した液に、Ｃｕ化合物を接触させることを特徴とするＧＬ−７ＡＣＡの製造方法である。
【０００９】
本発明において酸化反応に用いるＣＰＣ溶液は、ＣＰＣ粉末を水に溶解した水溶液、あるいはＣＰＣ生産菌であるアクレモニウム・クリソゲナムを適当な培地、例えば、シュークロース２％、炭酸カルシウム０．５％、硫酸カルシウム１．２５％、酢酸アンモニウム０．８％、コーンスターチ３％、ビートモラセス５％、脱脂大豆６％、メチルオレート３％等を含む培地、またはその他ＣＰＣ生産菌に好適な栄養培地によって培養され菌体、固形分等が除去された培養液を挙げることができる。
【００１０】
ＤＡＯ含有物にＣｕ化合物を接触させるエステラーゼの不活性化方法は、該酵素が未精製の状態あるいは部分的に精製された状態の如何なる形態であってもよく、例えば、トリゴノプシス・バリアビリスの細胞、部分的に破壊した細胞、膜透過性にした細胞、それから該酵素を抽出した細胞不含の抽出液、固定化酵素等として存在している場合が挙げられる。これらは、従来公知の方法で得ることができる。
本発明において用いられるＤＡＯ含有物は、トリゴノプシス・バリアビリスに由来するものが好ましいが、ＫＥＴＯ−ＣＰＣの副生を阻止するためには、カタラーゼを欠損した菌株、例えば、トリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株（受託番号：微工研菌寄第１３０７４号、国際寄託番号；ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３５９）などを使用するのがより好ましい。
【００１１】
ＤＡＯ含有物の水溶液または懸濁液に、１０〜２０００ｐｐｍ濃度のＣｕ化合物を溶解させ、５〜２５℃で２〜２４時間接触処理することにより、エステラーゼ活性が選択的に低減される。この処理により、エステラーゼ活性を半分以下にすることができる。前記処理において、Ｃｕ化合物濃度を１０〜４００ｐｐｍ程度の範囲で行えば、ＤＡＯ活性に全く影響することなくエステラーゼを不活性化することができる。さらに、Ｃｕ化合物濃度を５０〜４００ｐｐｍの範囲で前記処理を行えば、エステラーゼ活性が１／１０以下に低減し、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比を１％以下にすることができるので好ましい。
【００１２】
本発明においては、共存するエステラーゼの不活性化は、酵素的酸化反応前だけでなく、共存するエステラーゼを不活性化させていないＤＡＯ含有物を作用させて、ＣＰＣからＧＬ−７ＡＣＡに酵素的酸化反応する段階においてＣｕ化合物を接触させてもよい。すなわち、前記のＣｕ化合物の接触を、エステラーゼが共存するＤＡＯ含有物に前もって直接行うのではなく、該酵素含有物をＣＰＣ溶液に反応させる際に、Ｃｕ化合物を添加することにより行われる。この場合においても、前記反応液中のＣｕ化合物の濃度が１０〜２０００ｐｐｍの範囲になるようにＣｕ化合物を接触させればよい。さらに、Ｃｕ化合物濃度を５０〜４００ｐｐｍの範囲で前記反応を行えば、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比を１％以下にすることができるので好ましい。本発明で使用するＣｕ化合物は、ＣｕＳＯ４などが挙げられる。
【００１３】
エステラーゼ活性は、適量の酵素サンプルを、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した２ｇ／Ｌ濃度のＧＬ−７ＡＣＡ溶液に添加し、２５℃で３０分間反応させた後、等量のメタノールを添加することによって反応を停止させ、生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することにより求めることができる。
また、ＤＡＯ活性は、適量の酵素サンプルを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した１０ｇ／Ｌ濃度のＣＰＣ溶液に添加し、２５℃で１５分間反応させた後、等量のメタノールを添加することによって反応を停止させ、生成したＧＬ−７ＡＣＡおよびＫＥＴＯ−ＣＰＣをＨＰＬＣにて定量することにより求めることができる。
ＤＡＯ含有物を酵素的酸化反応中にＣｕ化合物と接触させる場合は、酵素的酸化反応の前後のデスアセチル−ＣＰＣとデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡを定量する。ＣＰＣに対するデスアセチル誘導体の増加分を、エステラーゼ／ＤＡＯの活性比とする。
【００１４】
ＣＰＣ含有液にＤＡＯ含有物を作用させることにより酵素的酸化反応を行うに当たっては、通常、反応液に酸素を吹き込みながら行われる。反応温度は通常２０〜３０℃の範囲で行われる。反応時間はＣＰＣ濃度、ＤＡＯ含有物の使用量または活性度合い、反応温度、ｐＨにより左右されるが、ＨＰＬＣ，薄層クロマトグラフィー等により、反応の経過を追跡することができるので、ＧＬ−７ＡＣＡが最大に生成される時期を待って適宜反応を終了すればよい。通常は３０分〜４時間程度である。ＫＥＴＯ−ＣＰＣの残存量を低減させるために、過酸化水素を反応液に加えてもよい。
得られた反応液から目的とするＧＬ−７ＡＣＡを採取、精製するには、公知の方法により行えばよい。
【００１５】
【実施例】
以下に，本発明について実施例および参考例を挙げて，さらに詳しく説明するが、本発明は，これらの実施例により何等限定されるものではない。
（実施例１）
トリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株をグルコース２％、コーンスチープリカー２％およびＤＬ−メチオニン０．２％を含む培地により、２５℃で６０時間培養し、得られた培養液６０ｍｌ（湿菌体６ｇを含む）にトルエン０．３ｍｌを加え、２５℃で２時間撹拌して菌体の膜透過性を付与した。
【００１６】
得られたトルエン含有培養液に、２３．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶解し、室温で２時間放置した。得られたトルエン−Ｃｕ含有培養液から適量の酵素サンプルを取り出し、これを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した２ｇ／ＬのＧＬ−７ＡＣＡ溶液に添加し、２５℃で３０分間反応させた後、等量のメタノールを加えることによって反応を停止させた。生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの量をＨＰＬＣで定量したところ、新たに生成したデスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡは定量できず、該酵素サンプル中のエステラーゼは十分に不活性化されていることがわかった。
次いで、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を、前記のトルエン−Ｃｕ含有培養液と混合し、該混合液中に酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、９３．２％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００１７】
（実施例２）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与し、かつ、エステラーゼを不活性化させたトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株のトルエン−Ｃｕ含有培養液を得た。一方、８．５ｇ／Ｌ濃度のＣＰＣを含むアクレモニウム・クリソゲナムの培養液をｐＨ２．５で除菌した後、ｐＨ７．５に調節し，得られたＣＰＣ培養液１２００ｍｌを前記トルエン−Ｃｕ含有培養液６０ｍｌと混合した。
次いで、前記混合培養液に酸素を吹き込み、かつ、３．５％濃度の過酸化水素２３．９ｍｌを連続的に添加しながら，２０℃で約２４０分間反応させたところ、９２．８％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００１８】
（実施例３）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液を得た。一方、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を前記トルエン含有培養液６０ｍｌと混合した。
次いで、該混合液に０．５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、９２．２％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者を合わせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００１９】
（実施例４）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液６０ｍｌと、実施例２と同様の方法によって得られたＣＰＣ培養液１２００ｍｌとを混合した。
次いで、該混合液に０．５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込み、かつ、３．５％濃度の過酸化水素２３．９ｍｌを連続的に添加しながら、２０℃で約２４０分間反応させたところ、９２．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者を合わせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００２０】
（実施例５）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、得られたトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株の培養液４００ｍｌ（湿菌体４０ｇを含む）にトルエン２．０ｍｌを加え、実施例１と同様の方法で処理した。
該トルエン含有培養液に１５７．３ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶解し，室温で２時間放置した。得られたトルエン−Ｃｕ含有培養液から適量の酵素サンプルを取り出し、実施例１と同様の方法でエステラーゼ活性を測定したところ、該酵素サンプル中のエステラーゼは、実施例１と同様に十分に不活性化されていることがわかった。
次いで、１０ｇのＣＰＣ粉末を１０００ｍｌの水に溶解し、これをｐＨ７．５に調節したＣＰＣ溶液を、前記のトルエン−Ｃｕ含有培養液と混合し、該混合液中に酸素を吹き込みながら、２０℃で約３０分間反応させたところ、９９．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００２１】
（実施例６）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液４００ｍｌと、実施例１と同様の方法によって得られたＣＰＣ溶液１０００ｍｌとを混合した。
次いで、該混合液に０．６６ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加溶解し、酸素を吹き込みながら、２０℃で約３０分間反応させたところ、９８．１％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
なお、反応の前後でエステラーゼによるデスアセチル−ＣＰＣ、デスアセチル−ＧＬ−７ＡＣＡの増加は、両者をあわせても、添加したＣＰＣの量の１％以下であった。
【００２２】
（参考例１）
実施例１と同様の方法によって培養を行い、該培養液に膜透過性を付与したトリゴノプシス・バリアビリス  ＫＣ−１０３株のトルエン含有培養液６０ｍｌと、実施例１と同様の方法によって得られたＣＰＣ溶液１０００ｍｌを混合した。次いで、該混合液に酸素を吹き込みながら、２０℃で約１８０分間反応させたところ、８３．０％の収率でＧＬ−７ＡＣＡが得られた。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと共存するエステラーゼを、特異的に不活性化、あるいは該エステラーゼ反応のみを阻害することができるので、極めて高収率で高品質のＧＬ−７ＡＣＡが得られる。また、本発明は、極めて簡単かつ安全性がよいので、工業スケールで実施可能である。