(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産菌を培地に培養し、その培養物から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。但し、該３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の理化学的性質は以下の通りである。
（１）酵素作用
ＮＡＤ＋の存在下に３−ヒドロキシ酪酸に作用して、アセト酢酸、ＮＡＤＨ及びＨ      ＋を生成する作用を有する。
（２）基質特異性
３−ヒドロキシ酪酸に基質特異性を示す。
（３）分子量
６００００±５０００（ゲル濾過法にて）
（４）至適ｐＨ
８〜９
（５）至適温度
４５〜５０℃
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も良好な安定性を示す。
【請求項２】
アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産菌が、アルカリゲネス・エスピーＮｏ．９８１（微工研条寄第２５７０号）株である請求項１記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）生産菌を培養し、その培養物から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取してなる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来技術及び課題】
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（ＥＣ．１．１．１．３０）は、ＮＡＤの存在下３ーヒドロキシ酪酸に作用して１モルのＮＡＤを消費し、１モルのアセト酢酸及び、１モルの還元型ＮＡＤに変換する触媒作用を示す酵素として知られている。
【０００３】
これまで３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素について、動物由来のものとしては例えばラット脳（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６８，９８０−９８３（１９９０））、ラット肝臓（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６８，１２２５−１２３０（１９９０））、ウシ心臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２６２，８５−９８（１９８８））が報告されている。
【０００４】
また、微生物由来のものとしてはロードスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７，６０３−６０７（１９６２））、シュードモナス・レモイグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅｉ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０，４０２３−４０２９（１９６５））、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０４，１２３−１２６（１９７８））、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８３９，３００−３０７（１９８５））、ズーグロエア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９，６２５−６３５（１９８１））、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４１，２９７−３００（１９８７））、アゾスピリルム・ブラジレンズ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６，６４５−６４９（１９９０））等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの菌株以外の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有する菌株による該酵素の製造法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の工業的生産の可能な製造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、奈良県五条市のジャガイモ畑の土壌から単離したアルカリゲネス属菌ＮＯ．９８１菌株が３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有することを初めて見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産菌を培養し、その培養物から３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法である。
以下に本発明について詳細に説明する。
【０００８】
まず、本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産菌について、アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはアルカリゲネス属に属するＮＯ．９８１株が挙げられ、本菌株は工業技術院技術研究所（現；工業技術院生命工学技術研究所）に寄託番号微工研条寄第２５７０号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５７０）として寄託したものである。なお本菌株の菌学的性質、同定及び命名については特開平３−１２７９８５号公報、米国特許第５１７３４１６明細書に詳細に記載されている。
【０００９】
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、アルカリゲネス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００１０】
炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤等の菌の生育や３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００１１】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５゜Ｃ〜３５゜Ｃである。培養時間は条件により異なるが３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が最も産生される時間まで培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種種の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液を得る。
【００１２】
粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を得る。例えば、粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用して３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を沈澱させ、回収する。さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることにより３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００１３】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００１４】
つぎに本発明で得られる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性測定法
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２ｍｌ、５０ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸０．１ｍｌ、１０ｍＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロテトラゾニウムブルー）０．０２ｍｌ、１０％のトリトンＸ−１００を０．０１ｍｌ、及び蒸留水０．５２ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７゜Ｃで１分間予備加温した後、２０μｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎの塩酸を添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水２０μｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７゜Ｃで１分間に１μモルの還元型ＮＡＤを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
【００１５】
【数１】
0003602162.tif 000002
【００１６】
理化学的性質
（１）酵素作用：基質として３−ヒドロキシ酪酸を用いた酵素作用を以下に示す。
【００１７】
【化１】
0003602162.tif 000003
【００１８】
（２）基質特異性：３−ヒドロキシ酪酸に基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通りである。
【００１９】
【表１】
0003602162.tif 000004
【００２０】
（３）Ｋｍ  値：１．６±０．５（ｍＭ）（３−ヒドロキシ酪酸に対して）
０．１２±０．０２（ｍＭ）（ＮＡＤに対して）
４）等電点：５．０±０．２（キャリアー−アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（５）分子量：６００００±５０００（ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、３００００±５０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐＨ５．０〜６．０の範囲は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範囲は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０の範囲は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは８〜９にあった。
（７）ｐＨ安定性
１００ｍＭ各種緩衝液（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示す。ｐＨ４．０〜５．０は１００ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０〜６．０は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を２５゜Ｃ〜６０゜Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示すとおりであり、本酵素の至適温度は４５〜５０゜Ｃであった。
（９）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示すとおり少なくとも３７゜Ｃまで安定であった。
（１０）金属イオンの影響
各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響について調べた結果は表２に示すとおりで、銅イオンによる強い阻害がみられた。
【００２１】
【表２】
0003602162.tif 000005
【００２２】
【実施例】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はなんらこれにより限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
アルカリゲネス・エスピーＮＯ．９８１株をグルタミン酸２％、酵母エキス５．０％からなる培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌに接種し、２８゜Ｃ、４８時間培養し、得られた種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌに添加し、２８゜Ｃで４８時間培養した。培養終了後、培養物を４５００ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体５６０ｇを回収した。
【００２４】
この菌体に１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１％リゾチーム溶液２ｌを加え、３７゜Ｃ、３０分間反応させて、可溶化を行った。その後、これを４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去して、その上清１８７０ｍｌ（４１１００Ｕ）を得た。
ついでこの上清に５％硫酸プロタミン１８．７ｍｌを加えて沈でん物を遠心除去し、その上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化カリウムの０〜１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２０．３ＭＫＣｌの溶出画分（３１７００Ｕ）を回収した。この酵素溶液に４Ｍ濃度となるようにＮａＣｌを溶解し、フェニルセファロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は４Ｍ〜０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌの溶出画分（２０８０Ｕ）を回収した。
【００２５】
ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）のイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．４ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．２５ＭのＮａＣｌの溶出画分（２００００Ｕ）を回収した。更に、この酵素液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキシアパタイト（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．３Ｍリン酸緩衝液による直線グラジエントにより行い、０．０６〜０．１Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６０００Ｕ）を回収し、凍結乾燥して精製３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（２１３Ｕ／ｍｇ、７５ｍｇ）を得た。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、アルカリゲネス属に属する微生物による新規な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるケトン体の１つの３−ヒドロキシ酪酸の測定用酵素をして提供できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の熱安定曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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