(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列とこのＤＮＡ配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を増幅する方法において、
（Ａ）オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ配列の任意の位置に非特異的にハイブリダイズする温度で前記アニーリングを行う増幅サイクルと、
（Ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度で前記アニーリングを行う複数の増幅サイクル、
とをこの順序で含み、（Ａ）の増幅サイクルを一回のみ行うことを特徴とするＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項２】
ＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の一部の配列と同一の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（特異的プライマー）と、特異的プライマーよりもＴｍが低く任意の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（非特異的プライマー）とを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を増幅する方法において、
（Ａ）非特異的プライマーがＤＮＡ配列に非特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う増幅サイクル、
（Ｂ）特異的プライマーがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル、
（Ｃ）非特異的プライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル、
とを含み、（Ａ）の増幅サイクルを一回のみ行い、（Ｂ）及び（Ｃ）の増幅サイクルを（Ａ）の増幅サイクルの後に行うことを特徴とするＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項３】
請求項１において、前記オリゴヌクレオチドプライマーと同一の配列を有するＤＮＡ配列の部位よりも下流側の近傍の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ反応液中に加えることを特徴するＤＮＡ配列の増幅法。
【請求項４】
請求項２において、特異的プライマーと同一の配列を有するＤＮＡ配列の部位よりも下流側の近傍の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ反応液中に加えることを特徴するＤＮＡ配列の増幅法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＤＮＡ配列の増幅法に関し、詳しくは配列既知のＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡ配列を、簡便、迅速に増幅する方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、同一配列を有するＤＮＡを大量に複製し分子数を増大させる方法、すなわちＤＮＡを増幅する方法として、いわゆるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く行われている。この方法は、図１に示したように、
▲１▼二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性、
▲２▼増幅を目的とする部位の両端の配列に相当するオリゴヌクレオチド（プライマー１、プライマー２）と、前記熱変性ＤＮＡとのアニーリング、
▲３▼前記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ反応、
からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、前記ＤＮＡ配列を指数関数的に増幅する方法である。
【０００３】
この方法により、極めて微量のＤＮＡの増幅が可能となったが、増幅させたい領域の両末端の配列が知られていないとプライマーを合成することができないため、既知配列にしか適用できないものであった。
【０００４】
そこで、配列既知のＤＮＡ配列に隣接する配列未知のＤＮＡ領域を増幅する方法として、上記ＰＣＲ法を基本とするいくつかの改良法が報告されている。
一つは、既知配列の両側または片側に隣接する未知配列を、制限酵素で切断してから環状化し、既知配列部分に特異的で互いに外向きの２種の特異的プライマーを用い、通常のＰＣＲ法と同様の増幅サイクルを繰り返して行うという方法であり、逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）法と呼ばれている。
【０００５】
また、”ｂｕｂｂｌｅ”ＰＣＲ法と呼ばれる方法は、既知配列の片側に隣接する未知配列を制限酵素で切断し、これに２本鎖オリゴヌクレオチドを連結させ、既知配列に特異的なプライマーとオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用い、増幅サイクルを繰り返すという方法である。なお、この方法では、未知配列に連結させるオリゴヌクレオチドは、その中央部に相補的ではない配列を含み、既知配列に特異的なプライマーから伸長して合成された配列にのみプライマーが結合するように、配列が設計されている
しかしながら、これらの方法は、適当な制限酵素の選択やＤＮＡの環状化、あるいはオリゴヌクレオチドの連結に労力と時間を要する。また、ＤＮＡ増幅反応の産物を用いて塩基配列を決定するためには、増幅反応液中に含まれるプライマーやヌクレオチドを除去するための操作が必要とされる。
【０００６】
このような問題を解決するために、ＤＮＡの環状化やオリゴヌクレオチドの連結をせずに、既知配列に連結する未知配列を、単一のプライマーを用いて増幅させる方法が開示されている（Ｐａｒｋｓ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｓｈｅｎｋ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  Ｎｏ．２５  （１９９１）））。この方法は、既知配列に相当する配列を有するプライマーを用い、このプライマーが未知配列に非特異的にハイブリダイズするような温和な条件下での増幅サイクル、及び前記プライマーが特異的にハイブリダイズするようなストリンジェントな条件下での増幅サイクルを各々繰り返すことにより前記既知配列及び未知配列を増幅するという方法である。
【０００７】
また、特異的プライマーに加えて任意の配列を有する非特異的プライマーを用い、異なる温度でアニーリングして増幅サイクルを行うことにより未知配列を増幅する方法が提案されている（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９，  Ｎｏ．１１  （１９９１）））。すなわち、図２に示すように、特異的プライマーを増幅させたいＤＮＡ配列にハイブリダイズする温度で、かつ、非特異的プライマーがミスマッチを含みながらハイブリダイズする温度でアニーリングを行い、増幅サイクルを繰り返して既知配列近傍のＤＮＡを増幅することができる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、既知配列に隣接する配列を、ＤＮＡの環状化やオリゴヌクレオチドの連結といった複雑な操作を必要とせずに、しかも、効率よく増幅させることができる方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、オリゴヌクレオチドプライマーが非特異的に標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせる増幅サイクルを１回のみ行い、しかる後にプライマーが特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う増幅サイクルを繰り返すと、効率よくＤＮＡ配列を増幅できることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＮＡ配列とこのＤＮＡ配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を増幅する方法において、
（Ａ）オリゴヌクレオチドプライマーがＤＮＡ配列の任意の位置に非特異的にハイブリダイズする温度で前記アニーリングを行う１回の増幅サイクルと、
（Ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度で前記アニーリングを行う複数の増幅サイクル、
とを含むことを特徴とするＤＮＡ配列の増幅法である。
【００１１】
また本発明は、ＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の一部の配列を有するオリゴ  ヌクレオチドプライマー（特異的プライマー）と、特異的プライマーよりもＴｍが低く任意の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（非特異的プライマー）とを、ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼ反応液中で混合し、前記ＤＮＡ配列の変性と、このＤＮＡ配列とＤＮＡプライマーとのアニーリングと、ＤＮＡポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより前記ＤＮＡ配列を増幅する方法において、
（Ａ）非特異的プライマーがＤＮＡ配列に非特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う１回の増幅サイクル、
（Ｂ）特異的プライマーがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル、
（Ｃ）非特異的プライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う複数回の増幅サイクル、
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の増幅法。
【００１２】
尚、本発明においては、「ハイブリダイズ」とは、一本鎖ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプライマーとが水素結合により部分的二本鎖を形成することをいい、「アニール」あるいは「アニーリング」とは、一本鎖ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドプライマーとがハイブリダイズするような条件に置くことをいう。
【００１３】
また、特記しない限り、「特異的」とはプライマーとＤＮＡ配列とがミスマッチを含まずにハイブリダイズすることをいい、「非特異的」とは、これらがミスマッチを含んでハイブリダイズすることをいう。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
＜１＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法に使用するプライマー
特異的プライマーは、ＤＮＡ配列の一部の配列に特異的な、すなわちＤＮＡ配列の一部と同一の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーであり、その配列は未知配列に隣接する既知配列から選択する。
【００１５】
一方、非特異的プライマーは、任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであり、既知配列に隣接する未知配列上で、特異的プライマーと同一の配列を有するストランドでない方のストランドのうち相補的な部位（以下、「標的部位」という）にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単に「ポリメラーゼ」という）反応のプライマーとしての役割を果たすためのものである。
【００１６】
非特異的プライマーは、特異的プライマーよりもＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：相補的な配列との二本鎖形成及び解離が平衡となる温度）が低くなるように設計することが好ましく、この温度差としては５℃以上、好ましくは１０〜１５℃が挙げられる。尚、Ｔｍ値は、下記計算式により予想できる。
【００１７】
【数１】
Ｔｍ  ＝  ６９．３℃  ＋  ０．４１（％ＧＣ比）℃−６５０／Ｌ℃
（但し、Ｌはプライマーの塩基数を表す）
【００１８】
尚、上式により得られるＴｍ値は、塩を含まない水溶液中での値であり、実際は塩濃度やｐＨ等によって左右される。通常のポリメラーゼ反応に用いられる緩衝液中では、上記で得られる値よりも高い場合が多い。
【００１９】
ところで、本発明は、非特異的プライマーから始まるポリメラーゼ反応により合成させるストランドに特異的プライマーをハイブリダイズさせ、他方のストランドを合成することを基本とする。したがって非特異的プライマーは、上記ポリメラーゼ反応により特異的プライマーがハイブリダイズする部位に到達できる位置に結合しなければならない。
【００２０】
一般に、ポリメラーゼ反応により合成されるＤＮＡ鎖長は、限定された条件下で約１０ｋｂであり、一般的な条件下では５ｋｂ前後が限界であることから、この観点からは非特異的プライマーは鎖長が短い方が好ましい。例えば、未知配列が均一な配列である場合、非特異的プライマーは、既知配列から５０００〜１００００塩基以内の未知配列にハイブリダイズできる必要がある。すなわち、ヌクレオチドは４種類であるから、５〜１０ｋｂ以内の位置に非特異的配列がハイブリダイズできるためには、ミスマッチ部分を除いて、６（＝ｌｏｇ４４０９４）ないしは７（＝ｌｏｇ４１６）塩基の非特異的プライマーを使用しなければならない。
【００２１】
しかし、６〜７塩基程度の鎖長の非特異的プライマーを用いると、ＤＮＡ配列上の多数の目的としない部位にハイブリダイズし、非特異的プライマーが反対側のストランドに結合して起こるポリメラーゼ反応によるる副産物を生じ、それらの反応が目的とする配列を増幅する反応と拮抗するために目的産物の増幅が阻害されてしまう恐れがある。
【００２２】
上記の条件を満足するためには、配列の異なるオリゴヌクレオチド混合物、又は複数種のヌクレドチドと水素結合を形成できるイノシン残基を含むオリゴヌクレオチドを非特異的プライマーとして用いて水素結合を形成できる塩基数を増加させるとともに、長鎖のプライマーを用いてＴｍ値よりもかなり低温で多数のミスマッチを起こさせて既知配列近傍にハイブリダイズさせ、以後の反応においては、プライマーのＴｍ近傍でハイブリダイズさせることによって、配列特異性を向上させることが好ましい。この場合、特異的プライマーの鎖長としては２０〜２５が好ましい。一方、非特異的プライマーの鎖長は１４〜１７が好ましい。いずれのプライマーも、プライマー内で２次構造を形成せず、またプライマーどうしが互いにハイブリダイズしない配列であることが好ましい。
【００２３】
＜２＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法
本発明は、非特異的プライマー（特異的プライマーのみを使用する場合は特異的プライマー）が、ＤＮＡ配列の任意の位置に非特異的にハイブリダイズする温度でアニーリングを行う増幅サイクルを１回行うことを特徴とし、従来知られている異なる温度で増幅サイクルを行う種々の方法に適用することができる。
【００２４】
尚、以下の記載において、非特異的プライマー（特異的プライマーのみを使用する場合は特異的プライマー）がＤＮＡ配列に非特異的にハイブリダイズする温度（「低温」）でアニーリングを行う増幅サイクルを「低温サイクル」、特異的プライマーのみ（特異的プライマーのみを使用する場合を含む）がＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度（「高温」）でアニーリングを行う増幅サイクルを「高温サイクル」、非特異的プライマーがその配列と相補的なＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする温度（「中温」）でアニーリングを行う増幅サイクルを「中温サイクル」という。
【００２５】
以下に、上記各サイクルを、図３に基づいて説明する。図３において、ＤＮＡ配列のうち、特異的プライマーと同一の配列を有するストランド（図中、細線）を「＋鎖」、他方のストランド（図中、「太線」）を「−鎖」と呼ぶ。
【００２６】
（１）増幅サイクル
▲１▼高温サイクル
高温サイクルは、特異的プライマーのみを選択的に−鎖上の対応する部位にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応により未知配列を増幅させるための反応である。このサイクルが、最も特異性の高い反応であり、副産物の生成量が少ない。特異的プライマーはより低い温度でもハイブリダイズできるので、ＤＮＡ配列を増幅させるためには高温サイクルは必ずしも必要ではないが、増幅産物の特異性を高めるためには行うことが好ましい。また、複数種の特異的プライマーを使用することにより、増幅産物の収率を高めることができる。
【００２７】
▲２▼低温サイクル
低温サイクルは、非特異的プライマーを＋鎖上の非特異的な位置にハイブリダイズさせ、−鎖を合成させるための反応である。非特異的プライマーは、複数の部位にハイブリダイズし、さらに−鎖にもハイブリダイズするので、このサイクルでは副産物が多く生成する。低温サイクルを行った後に高温サイクルを行い、さらに再び低温サイクルを行うと、非特異的増幅が起こり（図３中、＊、＊＊印）、その結果、＋鎖、−鎖共に非特異的プライマーにより増幅されるものが生じる（図中、＊＊印：以下、「両方向非特異的増幅産物」という）。このような増幅産物は、ＤＮＡ配列のうち目的としない多数の部位で生成されるので、目的産物の収率が悪くなる。
【００２８】
▲３▼中温サイクル
低温サイクルを行った後に高温サイクルを行うと、＋鎖のうち非特異的プライマーに対応する部位は、非特異的プライマーに完全に相補的な配列に置換される。非特異的プライマーは、低温では非特異的にＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるが、中温ではハイブリダイズできない。しかし、中温であっても上記の置換された配列は相補的であるのでハイブリダイズすることができるので、−鎖の合成が可能となる。これに対し、低温サイクルで生成する＊印や＊＊印に相当する産物は中温サイクルでは理論上生成しないので、両方向非特異的増幅産物の生成を抑制することが可能となる。
【００２９】
尚、低温サイクル及び中温サイクルでも特異的プライマーはＤＮＡ配列にハイブリダイズできるので、特異的プライマーから始まるポリメラーゼ反応も起こるが、この反応では非特異的増幅は起こらないので、図中では二回目の低温サイクルと中温サイクルでは省略してある。ただし、特異的プライマーの配列に近似する配列が、染色体ＤＮＡ上の既知配列以外の部位に存在する場合には、非特異的増幅が起こり得る。この増幅産物も、特異的プライマーに近似するＤＮＡ配列を増幅するという意味では目的産物である。
【００３０】
（２）本発明の態様
本発明の方法は、上記の各サイクルを組み合せることにより行われ、基本的には１回の低温サイクルと、これに続く高温サイクル及び中温サイクルの繰り返しからなる。上述したように、高温サイクルは必ずしも必要ではないが、中温においても非特異的プライマーがミスマッチを含みながらＤＮＡ配列にハイブリダイズするものがある程度存在するために、両方向非特異的増幅産物の生成を抑制するためには、高温サイクルを含むことが好ましい。また、低温サイクルを行う前に、高温サイクルを複数回行うと、さらに増幅産物の特異性を高めることができる。
【００３１】
各サイクルの最適な組み合せ及び回数は、使用するプライマーの種類や増幅を目的とするＤＮＡ配列のＧＣ含量等により異なるが、いくつかの態様を以下に例示する。
【００３２】
（ｉ）特異的プライマーのみを使用する場合
特異的プライマー自体も低温では非特異的にＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるので、非特異的プライマーを用いなくても増幅できる場合がある。
【００３３】
特異的プライマーのみを使用する場合は、低温サイクルを１回行い、その後に、高温サイクルを繰り返すことが好ましく、低温サイクルの前に高温サイクルを複数回行うことがさらに好ましい。
【００３４】
（ｉｉ）特異的プライマー及び非特異的プライマーを用いる場合
この場合も、上記と同様に、低温サイクルを１回行い、その後に、高温サイクルと中温サイクルを繰り返すことが好ましく、低温サイクルの前に高温サイクルを複数回行うことがさらに好ましい。
【００３５】
また、各増幅サイクルを行った後に、使用した特異的プライマーがＤＮＡ配列にハイブリダイズする部位よりも下流（３’側）の部位に相当する他の特異的プライマーを使用して、再び増幅を行うと、増幅産物の特異性をより向上させることができる。尚、高温サイクルと中温サイクルを繰り返す代わりに、両プライマーのＴｍの中間温度で中温サイクルを複数回行うことも可能である。
【００３６】
（３）本発明に用いる反応条件等
本発明の方法に用いる各反応は、従来のＰＣＲ法あるいはその改良法と特に変わるところはなく、通常用いられている条件を採用すればよい。
【００３７】
例えば、ＤＮＡ配列の変性は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性することができる温度に置けばよく、例えば、９０〜９４℃、３０秒〜２分が挙げられる。尚、ＤＮＡポリメラーゼがこの段階やアニーリングの段階で失活しないように、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等の耐熱性ポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００３８】
アニーリングは、変性を行った後に、高温サイクルでは特異的プライマーの予想Ｔｍ〜＋１０℃の範囲に、中温サイクルでは非特異的プライマーの予想Ｔｍ程度に、低温サイクルでは非特異的プライマーの予想Ｔｍよりも２０℃前後低い温度に、各々１〜５分置くことにより行われるのが通常である。又、アニーリングが起こり易いように、特に低温サイクルでは変性の後に経時的に上記温度まで下げるとよい。尚、理論的にはアニーリングはＴｍよりも低い温度で行われるが、前述したように予想Ｔｍは塩を含まない水溶液中での値であるので、ポリメラーゼ反応液中では特異的プライマーは、上記温度以上でアニーリングすることができる。
【００３９】
ポリメラーゼ反応は、反応に使用するＤＮＡ合成酵素の反応至適温度で行い、例えばＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用するときは７０〜７２℃の範囲で２〜４分程度反応させる。
【００４０】
また、反応温度の設定、調整は、市販のＰＣＲ用の装置を用いて行うことができる。尚、各ステップの保持時間は酵素の反応速度、耐熱性、使用する機器の加熱、冷却速度等により適宜設定する。例えば、酵素の反応速度が高い場合は反応時間を短く、酵素の耐熱性が高い場合には変性時間を長くすることができる。
【００４１】
さらに、上記の方法でＤＮＡ配列を増幅した後に、使用した特異的プライマーの標的部位よりも下流の部位にハイブリダイズする他の特異的プライマーを用意し、高温サイクルと中温サイクルを繰り返すことにより、目的産物をより選択的に増幅することができる。
【００４２】
＜４＞本発明のＤＮＡ配列の増幅法の応用
（１）塩基配列決定への応用
上記のＤＮＡ配列の増幅法を、ジデオキシ法による塩基配列決定に応用することにより、未標識のプライマーを用いて塩基配列を決定することができる。
【００４３】
ジデオキシ法は、塩基配列を決定しようとするＤＮＡと、この塩基配列の一部に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、デオキシヌクレオチドと、ジデオキシヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼとを緩衝液中で共存させてポリメラーゼ反応を行い、ＤＮＡ合成産物を電気泳動により解析することによって塩基配列を決定する方法である。デオキシヌクレオチドに対して少量加えられたジデオキシヌクレオチドがポリメラーゼ反応で取り込まれると、ＤＮＡ合成が停止するので、ＤＮＡ合成産物を電気泳動により解析することにより、塩基配列を決定することができる。この方法では、合成産物の検出は、通常ＲＩ標識プライマーを用いたオートラジオグラフィー、あるいは蛍光標識プライマーを用いた光学的方法により行われる。
【００４４】
本発明を応用して塩基配列を決定するには、例えば、塩基配列を決定しようとするＤＮＡ配列を特異的プライマー及び非特異的プライマーを用いて増幅した後、増幅反応液に適量のジデオキシヌクレオチドを加え、高温サイクルを繰り返せばよい。こうすることにより、ポリメラーゼ反応による合成産物を、サイクルの回数に比例して増幅させながら、ジデオキシヌクレオチドの取り込みを行うことができる。
【００４５】
従来のＰＣＲ法による増幅産物をジデオキシ法で塩基配列決定する場合には、塩基配列決定用のプライマーを添加する前に、ＰＣＲ法に用いたプライマーを反応液から除く必要があるが、この方法によると、特異的プライマーと非特異的プライマーのＴｍが異なるため、これらのプライマーを除くことなく、特異的プライマーを塩基配列決定用のプライマーとしてそのまま使用することができる。この点では、種々の改良法でも同様であるが、これらは副産物の含量が高いので、直接配列決定に用いることはできない。これに対し、本発明の方法では、目的産物の純度が高いので、増幅反応液をそのまま塩基配列決定に使用することができる。
【００４６】
（２）その他
本発明は、増幅産物をプローブとした染色体歩行や、形質転換生物の同一性の鑑定、レトロウイルスの挿入部位の決定等にも応用することができる。
【００４７】
本発明の方法は、既知配列に隣接する未知配列を増幅することができるので、ｃＤＮＡの配列を基に、プロモーターやイントロン等の配列を得ることができる。また、タンパクのアミノ酸配列から推定される配列を有する特異的プライマーを使用して、そのタンパクをコードする遺伝子を増幅することができる。
【００４８】
【作用】
以下に、本発明の態様として特異的プライマーと非特異的プライマーを用い、
▲１▼複数回（ｘ回）の高温サイクルからなる第１工程と、
▲２▼１回の低温サイクルからなる第２工程と、
▲３▼複数回（ｙ回）の高温サイクルと複数回（ｚ回）の中温サイクルからなる複合サイクルの反復（ｎ回）である第３工程、
からなる方法を例として、作用を図４に基づいて具体的に説明する。尚、理解を容易にするために、出発物質であるＤＮＡ配列を１コピーとして説明する。ここで１コピーとは、ゲノムＤＮＡ等のように、出発物質が極めて長いＤＮＡが分断されたものである場合、それぞれが１分子づつであることをいう。したがって、通常は、増幅を目的とする既知配列に隣接する未知配列以外に、多数のＤＮＡ配列が混在している。
【００４９】
＜１＞第１工程
第１工程は、高温サイクルをｘ回行うことにより行われる。最初の反応サイクルでは、変性により２本の一本鎖ＤＮＡが得られ、そのうち一方が鋳型となって、その既知配列部分に特異的プライマーが完全にマッチした状態でハイブリダイズし、鋳型の配列と相補的なＤＮＡが合成される。もう一方の一本鎖ＤＮＡは、ここでは鋳型とならない。
【００５０】
２回目の反応サイクルでは、最初の反応サイクルで得られた部分二本鎖ＤＮＡが変性により再び一本鎖ＤＮＡとなり、以下最初の反応サイクルと同様にして、特異的プライマーがプライマーとなってＤＮＡが合成される。これがｘ回繰り返されると、特異的プライマーが末端となる一本鎖ＤＮＡがｘ個生成する。
上記以外の部分では、特異的プライマーは、高温サイクルでは標的部位以外には結合できず、非特異的反応は起こらないので副産物は生成しない。
【００５１】
この段階では、目的産物は、（１＋ｘ）個となる。
【００５２】
＜２＞第二工程
第二工程は、１回の低温サイクルからなり、ＤＮＡ配列の任意の部位に非特異的プライマーがミスマッチを含んでハイブリダイズし、ＤＮＡ合成が行われる。ここで新たに生成するＤＮＡの末端は非特異的プライマー自体であり、鋳型の相当する部分の配列が非特異的プライマーの配列に置換されたことになる。以降の中温・高温サイクルで特異的プライマーからＤＮＡが合成されると非特異的プライマーに相補的な配列が生成し、この部位に非特異的プライマーが特異的にハイブリダイズできるので、低温でのアニーリングを必要とせず、副産物の生成を抑制することができる。
【００５３】
一方、染色体ＤＮＡ中には、非特異的プライマーの配列と完全に一致又は近似する配列が確率的に存在するので、この配列の近傍に非特異的プライマーがハイブリダイズすると、両方向非特異的増幅産物が生成し、その産物が増幅する。また、目的以外の部位にも非特異的プライマーがハイブリダイズする結果、副産物の増幅が起こるが、生成するストランドの反対側のストランドには特異的プライマーがハイブリダイズできないので、それ以上の増幅は理論上起こらない。しかし、その一方で、中温サイクルでも非特異的プライマーがミスマッチを含みながらある程度ハイブリダイズするので、中温サイクルでも副産物の増幅が起こり得る。
【００５４】
従来の方法では、低温サイクルを反復して行うので副産物がかなり生成するが、本発明では低温サイクルを１回としたことで、副産物の生成を抑制することができる。
【００５５】
この段階で、目的産物は（１＋ｘ＋１）個となるが、鋳型分子自体は非特異的プライマーの配列に置換していないので、以降の反応の鋳型となるものは（ｘ＋１）である。
【００５６】
＜３＞第３工程
第３工程は、ｙ回の高温サイクルとｚ回の中温サイクルからなる複合サイクルを、ｎ回反復して行われる。この工程では、高温サイクルでは目的産物のみが増幅し、中温サイクルでは目的産物及び低温サイクルで生じた両方向非特異的産物の両者が増幅される。その結果、複合サイクルをｎ回行った後には、目的産物は、（ｘ＋１）｛（ｙ＋２）２（ｚ−１）｝ｎ個となり、副産物は２ｚｎ個となる。
【００５７】
上記の反応以外に、特異的プライマーが低温サイクルで非特異的にハイブリダイズしてできる増幅産物も生じる。こうして生じる産物１分子につき、第３工程では２（ｙ＋ｚ）ｎ倍に増幅される。また、低温サイクルで、非特異的プライマーが、特異的プライマーの標的部位に近い部位や遠い部位にハイブリダイズする結果、長さの異なる増幅産物ができることがある。このような産物も、目的とする未知配列が増幅されたものであるので、その意味では目的産物であり、増幅産物の単一化を目指す場合を除いて問題とはならない。
【００５８】
第３工程では、目的産物に対する両方向非特異的増幅産物の生成量が最少となるようにｘ、ｙ、ｚ、ｎを決定するのが好ましい。全ての工程における全サイクル数ａ＝ｘ＋１＋ｎ（ｙ＋ｚ）は、酵素の耐熱性によって制限され、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製：ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用する場合には、ａ＝５０程度が限界であるのでａを一定と考えると、（ｘ＋１）｛（ｙ＋２）２（ｚ−１）｝ｎ／２ｚｎが最大になるのは、ｘ＝４、ｙ＝２、ｚ＝１のときである。また、ｎはａを何回にするかによって決定される。
【００５９】
上記第１〜３工程からなるサイクル（以下の実施例では、「大サイクル」という）終了後に、別の非特異的プライマーを用いて大サイクルを行うと、増幅産物の特異性を向上することができる。
【００６０】
【実施例】
以下に、本発明のＤＮＡ配列の増幅法及びその応用についての実施例を説明する。
【００６１】
【実施例１】
Ｔ−ＤＮＡ挿入配列に隣接する植物ゲノム配列の増幅
本発明のＤＮＡ配列の増幅法の実施例として、植物ゲノムにＴ−ＤＮＡを挿入し、このＴ−ＤＮＡ配列を既知配列として、これに隣接する植物ゲノムを増幅した例を説明する。
【００６２】
（１）Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ植物の作製
シロイヌナズナに、ＴｉプラスミドのバイナリーベクターであるｐＧＤＷ３２を持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）を、リーフデスク法などの方法で感染させ、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ形質転換植物を得た。これらの形質転換植物から、尿素−フェノール法などによりゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６３】
（２）増幅反応の反応液の組成
Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の末端近傍にハイブリダイズする特異的プライマーとして３種のオリゴヌクレオチドＴＲ１、ＴＲ２、ＴＲ３を用意した。これらの配列は、配列表に、各々配列番号１、配列番号２及び配列番号３として記載した通りであり、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の５’側から３’側に順にハイブリダイズする。尚、これらのプライマーは２３塩基からなり、各々Ｔｍ値はＴＲ１が６０．６℃、ＴＲ２とＴＲ３が５７．１℃である。これらのプライマーが、既知配列にハイブリダイズする位置を図５に示す。尚、この配列は、プライマーと同一の配列を有するストランドを示している。
【００６４】
非特異的プライマーとしては、配列番号４、５、６に示した配列を有する３種のオリゴヌクレオチド混合物Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３を用意した。各配列中、ＷはＡ又はＴ、ＳはＧ又はＣを表す。
【００６５】
Ｗ１は１５塩基からなる６４種類のオリゴヌクレオチドの混合物であり、Ｔｍ値は４３．７℃、Ｗ２は１６塩基からなる１２８種類のオリゴヌクレオチドの混合物であり、Ｔｍ値は４６．６℃、Ｗ３は１６塩基からなる２５６種類のオリゴヌクレオチドの混合物であり、Ｔｍ値は４５．３℃である。
【００６６】
ＤＮＡの増幅は、使用するプライマーを変えて本発明の方法を２回以上行うのが好ましい。各反応における反応液は、鋳型とプライマー以外は共通した組成のものを使用した。この基本組成は、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、１００μＭ  ｄＮＴＰとした。
【００６７】
１回目の大サイクルでの反応液は、上記基本組成に１０ｎｇの鋳型ゲノムＤＮＡ、０．７単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、０．２μＭのＴＲ１、非特異的プライマー（２μＭ  Ｗ１、３μＭ  Ｗ２、４μＭ  Ｗ３のうちいずれか１種）を添加して最終的に２０μｌとした。反応は、これに２０μｌのミネラルオイルを重層して行った。
【００６８】
２回目以降の大サイクルでのＤＮＡ増幅反応は、１回目と同じ非特異的プライマーを使用したが、特異的プライマーは１回目の反応に使用した特異的プライマーよりも、３’側にハイブリダイズできる特異的プライマー（ＴＲ２、ＴＲ３）を使用した。この反応液には、１回目の反応液０．１μｌと３．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２μＭの特異的プライマー（ＴＲ２又はＴＲ３）、非特異的プライマーを添加して計１００μｌとし、これに２０μｌのミネラルオイルを重層して反応を行った。
【００６９】
また、各回の反応を通じて使用する非特異的プライマーの選定においては、まず、Ｗ１を使用して反応し、好ましい増幅産物が得られない場合には、順次Ｗ２、Ｗ３を使用して１回目の反応から再度実施するとよい。
【００７０】
（３）増幅反応の反応温度サイクル
１回目の大サイクルのＤＮＡ増幅反応は、市販の装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を使用して、以下の工程で行った。
【００７１】
（第１工程）
ＤＮＡの変性（９４℃１分）、アニーリング（６５℃１分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３分間）からなる高温サイクルを、５回繰り返した。
【００７２】
（第２工程）
９４℃１分でＤＮＡの変性を行った後、５分間で２５℃まで冷却し、２５℃５分保持してアニーリングを行い、５分間で７２℃まで加熱してから７２℃で３分ポリメラーゼ反応を行い、低温サイクルとした。
【００７３】
（第３工程）
ＤＮＡ変性（９４℃３０秒）、アニーリング（６５℃１分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３分）からなる高温サイクルを２回と、ＤＮＡ変性（９４℃３０秒）、アニーリング（４５℃１分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３．５分）からなる中温サイクル１回を行う複合サイクルを、１５回繰り返した。
【００７４】
２回目以降の大サイクルでの増幅反応は、９４℃１分、６２℃１分、７２℃３分の高温サイクルが２回、９４℃３０秒、４５℃１分、７２℃３．５分の中温サイクル１回からなる複合サイクルを１３回繰り返すことにより行った。
【００７５】
各々の反応後の反応液のうち、５μｌをとり、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物のＤＮＡを分析を行った。結果を図６（Ａ）に示す。レーン１は大サイクル１回目の増幅産物、レーン２、３はこれをさらに２回目の大サイクルで増幅して得られた産物についての結果である。
【００７６】
さらに、出発ＤＮＡ配列１ｎｇに対し、１５０ｎｇの小麦クロモゾームＤＮＡを加え、同様にして増幅させて得られた産物を解析した。結果を図６（Ｂ）に示す。レーン１は大サイクル１回についてのもの、レーン２、３はさらに２回目の大サイクルを行ったもの、レーン４は、レーン２の試料について３回目の大サイクルを行ったものである。
【００７７】
図中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、図の左に各バンドの分子量を示した。また、各試料について、大サイクルの回数及び最終サイクルに用いたプライマーの種類を表１に示す。
【００７８】
【表１】
0003602550.tif 000002
【００７９】
（解析結果）
大サイクル１回のみのもの（レーン１）では、主要な増幅産物は３種類（３本のバンド）あるが、特異的プライマーを代えてさらに増幅サイクルを行うと、１本のバンドになる。このバンドは、レーン２、３で大きさが異なる位置に泳動されるが、これは特異的プライマーがハイブリダイズする位置が、レーン３のものではより３’側であるためである。これらのバンドはレーン１ではほとんど認められないが、２回目の大サイクルを行うことによって、目的産物の特異性が向上した結果、１本のバンドのみが増幅されたものと考えられる。
【００８０】
尚、Ｔ−ＤＮＡ挿入配列の場合では、大サイクル１回目では、非特異的プライマーが結合する部位が異なる結果生じる増幅産物の種類は、平均２．２個であり、通常は最大５種類程度である。
【００８１】
レーン１で認められるバンドは、２回目の大サイクルでは消失し、両端が特異的プライマーである増幅産物であると推定される。これらの増幅産物は、レーン２、３で得られるバンドとは大きさは異なるが、単に低温サイクルで特異的プライマーがハイブリダイズした結果得られたものであり、既知配列に隣接する未知配列が増幅されたという意味においては目的産物であるということができる。
【００８２】
また、染色体ＤＮＡにＴＲ１の配列に類似する配列が存在し、その近傍にＴＲ１がハイブリダイズした結果、両端が特異的プライマーである増幅産物として生成した可能性もある。これらは、既知配列とは近傍の配列が異なるために、ＴＲ２やＴＲ３を使用した場合には増幅されず、バンドが消失したと考えられる。
【００８３】
いずれにしても、シロイヌナズナ染色体ＤＮＡのように長いＤＮＡ配列（約１０１８塩基）を材料に用いても、本発明の方法により、目的とするＤＮＡ配列の特異的増幅が可能であることがわかった
また、出発材料にさらに多様性に富んだ小麦クロモゾームＤＮＡ（約１．５×１０１０）を大量に加えても、特異的な増幅が認められ（レーン２〜４）、本発明の方法が極めて特異性の高いものであることがわかる。
【００８４】
【実施例２】
増幅産物を直接鋳型とする塩基配列の決定
次に、本発明の応用として、増幅産物を直接鋳型として用いた塩基配列決定の例を説明する。
【００８５】
実施例１で得られた大サイクル２回目反応液１０μｌ（１００〜２００ｎｇのＤＮＡを含む）に対し、０．５μｌの（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（〜１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、４μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と１０  ｐｍｏｌｅの特異的プライマー（ＴＲ２）を含む緩衝液３０μｌを加えた。この反応液を各９μｌずつに４分割し、各分割液に対し１μｌの０．５ｍＭ  ｄｄＧＴＰ，  ５ｍＭ  ｄｄＡＴＰ，  ５ｍＭ  ｄｄＴＴＰ，  ５ｍＭ  ｄｄＣＴＰのいずれかを添加し、９４℃２０秒、６０℃１分、７２℃２分のサイクルを４０回繰り返す反応を行った。この反応液を、通常のジデオキシ法に用いる塩基配列決定と同様に電気泳動を行って塩基配列を決定した。
【００８６】
得られた塩基配列を配列番号７に示す。塩基番号６９までは形質転換に用いたＴｉプラスミドの配列で、塩基番号７０〜２５１まではゲノムＤＮＡ中に挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接する未知のシロイヌナズナゲノムＤＮＡ配列であった。尚、得られた未知配列は、シロイヌナズナゲノムＤＮＡのサザン分析の結果から、約２００塩基対を基本単位とする繰り返し配列であることが解明された。
【００８７】
図７に、他の塩基配列決定例における電気泳動の結果を示す。本発明では、ジデオキシヌクレオチドの取り込みとＤＮＡ合成産物の増幅を同時に行っているが、通常のジデオキシ法と同様にシークエンスラダーが形成されていることがわかる。
【００８８】
【実施例３】
Ｐ１ベクター挿入断片の増幅
次に、本発明の実施例として、Ｐ１ベクターに挿入されたＤＮＡの配列の増幅の例を説明する。
【００８９】
（１）Ｐ１ベクターが挿入された大腸菌ゲノムＤＮＡの調製
シロイヌナズナ染色体ＤＮＡ断片を含むＰ１ベクターを保有する大腸菌のコロニーを爪楊枝等で取り、直接反応液中に懸濁し、増幅反応に用いる鋳型とした。また、液体培地で培養した大腸菌からアルカリリシス法などによりＰ１プラスミドＤＮＡを調製してもよい。
【００９０】
（２）増幅反応の反応液の組成
Ｐ１ベクターのクローニングサイトの近傍に存在するＳｐ６プロモーターの配列の１部を有するオリゴヌクレオチドを３種用意し、特異的プライマーとした。各々のプライマーは、ハイブリダイズする部分がクローニングサイトから挿入配列方向である順に、Ｓｐ６−１（配列番号８：２２塩基、Ｔｍ６２．１℃）、Ｓｐ６−２（配列番号９：１７塩基、Ｔｍ５２．８℃）、及びＳｐ６−３（配列番号１０：１５塩基、Ｔｍ４２．４℃）である。
【００９１】
一方、非特異的プライマーとしては、実施例１に用いたＷ３を使用した。
ＤＮＡ増幅反応は、特異的プライマーを変えて２回以上行った。各反応における反応液組成は、特異的プライマー以外は実施例１と同様であり、特異的プライマーには、１回目の大サイクルにはＳｐ６−１を、２回目の大サイクルにはＳｐ６−２又はＳｐ６−３を、各々０．２μＭ使用した。
【００９２】
（３）増幅反応の反応温度サイクル
１回目のＤＮＡ増幅反応は、実施例１と同様にして行った。また、２回目の増幅反応は、９４℃１分、４５℃１分、７２℃３．５分の中温サイクルを２２回繰り返すことにより行った。
【００９３】
各々の反応後の反応液のうち、５μｌをとり、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物のＤＮＡを分析を行った。結果を図８に示す。
レーン１、２は、各々異なるＰ１クローンを鋳型として、Ｓｐ６−１を特異的プライマーとした１回の大サイクルにより増幅を行った結果である。レーン３、４は、レーン１の試料を特異的プライマーにＳｐ６−２、Ｓｐ６−３を各々用いて２回目の大サイクルを行ったもの、レーン５、６はレーン２の試料をＳｐ６−２、Ｓｐ６−３を各々用いて２回目の大サイクルを行ったものについての結果である。
【００９４】
（解析結果）
レーン１の試料では、多数のバンドが認められるが、プライマーを代えて大サイクルを繰り返すと１本のバンドになる（レーン３、４）。これに対し、レーン２の試料では、大サイクル１回ですでに一本のバンドに集約されている。この結果は、増幅に用いる材料によっては、１回の大サイクルのみで充分であることを示している。特に、Ｐ１クローンのように鋳型配列が１０５塩基程度の長さのものについては、１回で充分な場合が多いと考えられる。したがって、大サイクル１回目終了後の反応液について増幅産物の解析を行い、不十分であればさらにプライマーを代えて大サイクルを２回、あるいは３回行えばよい。
【００９５】
【実施例４】
次に、本発明の実施例としてＰ１ベクターに挿入されたＤＮＡの配列を、実施例３とは異なる反応温度サイクルで増幅した例を説明する。
【００９６】
（１）Ｐ１ベクターが挿入された大腸菌ゲノムＤＮＡの調製
実施例３と同様にして行なった。
【００９７】
（２）増幅反応の反応液の組成
特異的プライマーは実施例３に用いたＳｐ６−１を使用した。一方、非特異的プライマーとしては、実施例１に用いたＷ２を使用した。ＤＮＡ増幅反応における反応液組成は、実施例３と同様の組成を使用した。
【００９８】
（３）増幅反応の反応温度サイクル
１回目のＤＮＡ増幅反応は、実施例１の（第３工程）をＤＮＡ変性（９４℃３０秒）、アニーリング（５８℃１分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３分）からなる中温サイクルを３０回繰り返した。反応後の反応液のうち、５μｌをとり、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物のＤＮＡの分析を行なった。結果を図９に示す。
【００９９】
（解析結果）
この結果は、第３工程を中温サイクルのみで行なった場合も、目的とする増幅産物が得られることを示している。実施上特に、単一のバンドとすることを必要としない場合には、本実施例の方法で目的を達することが可能である。
【０１００】
【実施例５】
続いて、実施例１で得られたＴ−ＤＮＡを挿入したシロイヌナズナの染色体ライブラリーのうちの１株について、第３工程を中温サイクルのみで行った増幅例を説明する。
【０１０１】
（１）Ｔ−ＤＮＡ挿入配列を持つ植物の作製
実施例１と同様にして行った。
【０１０２】
（２）増幅反応の反応液の組成
特異的プライマーは実施例１に用いたＴＲ２あるいはＴＲ３を使用した。一方、非特異的プライマーとしては、実施例１に用いたＷ３を使用した。ＤＮＡ増幅反応における反応液組成は、実施例１と同様の組成を使用した。
【０１０３】
（３）増幅反応の反応温度サイクル
増幅反応は、実施例１の（第３工程）をＤＮＡ変性（９４℃３０秒）、アニーリング（５８℃１分）、ポリメラーゼ反応（７２℃３分）からなる中温サイクルを３０回繰り返した。特異的プライマーとしてＴＲ２あるいはＴＲ３を用いた増幅反応液から各々５μｌをとり、１．２〜１．５％のアガロースゲル電気泳動を行い、増幅産物のＤＮＡの分析を行なった。結果を図１０に示す。
【０１０４】
（解析結果）
いずれの特異的プライマーを用いた場合でも、増幅産物は、ほぼ単一のバンドとして得られた。ＴＲ３を用いた場合の増幅産物（レーン２）は、ＴＲ２を用いた場合の増幅産物（レーン１）よりも小さく、その差はＴ−ＤＮＡ中のＴＲ２及びＴＲ３と同一の配列を有する部位の距離６４塩基と一致していた。このことから、上記で得られた各々の増幅産物は、いずれも目的産物であることがわかった。
【０１０５】
この結果は、シロイヌナズナのように大きな染色体を材料にした場合でも、中温サイクルのみで目的とする増幅産物が得られることを示している。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明の方法により、既知配列に隣接する未知配列を、ＤＮＡの環状化やオリゴヌクレオチドの連結といった複雑な操作を必要とせずに、しかも、効率よく増幅させることができる。
【０１０７】
【配列表】
【０１０８】
0003602550.tif 000003
【０１０９】
0003602550.tif 000004
【０１１０】
0003602550.tif 000005
【０１１１】
0003602550.tif 000006
【０１１２】
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【０１１３】
0003602550.tif 000008
【０１１４】
0003602550.tif 000009
【０１１５】
0003602550.tif 000010
【０１１６】
0003602550.tif 000011
【０１１７】
0003602550.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＰＣＲ法の原理を示す図。
【図２】公知の改変ＰＣＲ法の原理を示す図。
【図３】本発明に用いる増幅サイクルを示す図。
【図４】本発明の方法の概念を示す図。
【図５】Ｔ−ＤＮＡの配列の一部と、これに特異的プライマーがハイブリダイズする位置を示す図。
【図６】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動図。
【図７】塩基配列決定の電気泳動図。
【図８】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動図。
【図９】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動図。
【図１０】ＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す電気泳動図。
【符号の説明】
図中、Ｍはマーカーを、図の左の数字は分子量を示す。
【図１】
0003602550.tif 000013
【図２】
0003602550.tif 000014
【図３】
0003602550.tif 000015
【図４】
0003602550.tif 000016
【図５】
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【図６】
0003602550.tif 000018
【図７】
0003602550.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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