(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸イオンを含む試料液にポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物を添加混合し、亜硝酸イオンとの反応により生成したジアゾ基を有するポルフィリン化合物の吸光度又はそれを励起したときの蛍光強度を測定して、試料液中に含まれる亜硝酸イオン濃度を求めることを特徴とする亜硝酸イオン濃度測定方法。
【請求項２】
ポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物が、アミノフェニルポルフィンであることを特徴とする、請求項１に記載の亜硝酸イオン濃度測定方法。
【請求項３】
アミノフェニルポルフィンが、５、１０、１５、２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィンであることを特徴とする、請求項２に記載の亜硝酸イオン濃度測定方法。
【請求項４】
上記ポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物と試料液中の亜硝酸イオンとの反応を酸性条件下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の亜硝酸イオン濃度測定方法。
【請求項５】
吸光度の測定を４３４ｎｍ付近の波長で行うか、蛍光強度の測定を波長４３４ｎｍの励起光で励起したとき放出される６６０ｎｍ付近の波長について行うことを特徴とする、請求項３に記載の亜硝酸イオン濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料液中の亜硝酸イオンを比色分析法を利用して定量する方法、特に亜硝酸イオンと試薬との反応に基づく吸光度又は蛍光強度を測定して亜硝酸イオンを定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
亜硝酸イオンの定量は、亜硝酸イオンのみならず、硝酸イオンや一酸化窒素等の窒素酸化物の定量にも応用することができる。即ち、硝酸は還元カラムや試薬により還元して亜硝酸イオンとしたうえで測定することにより、その定量が可能である。又、酸化窒素等も様々な吸収液に通すことによって酸化が進み、亜硝酸イオンとして測定することが可能である。
【０００３】
亜硝酸イオンの直接比色定量法は、１８７９年にＧｒｉｅｓｓらが提唱したジアゾカップリングによる発色法が現在でも主流となっている。以来、アゾ色素生成に関する種々の改良がなされて来たが、アゾ色素の吸光度から亜硝酸イオンを定量するという基本方針には変化がなかった。
【０００４】
例えば、ＪＩＳに定められている亜硝酸イオンの比色定量法では、亜硝酸イオンを含む試料液に４−アミノベンゼンスルホン酸アミドを加えてジアゾ化し、これに更に二塩化Ｎ−１−ナフチルエチレンジアンモニウムを添加してカップリングさせ、このジアゾカップリング反応により生成したアゾ色素の波長５４０ｎｍにおける吸光度を吸光光度計により測定する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来の亜硝酸イオンの定量法にあっては、比色定量のための試薬の感度が低いことが大きな課題であった。即ち、従来利用している反応に供するモル吸光係数は２〜３万程度と予想され、かかる反応系においては飛躍的に感度を向上させる試薬は見いだすことができなかった。
【０００６】
更に、従来の亜硝酸イオンの定量法では、ジアゾカップリング反応の反応過程が２段階に及ぶため、それぞれの反応条件を制御することが難しく、また他のイオンによる妨害を受け易いといった欠点があった。
【０００７】
本発明は、かかる従来の事情に鑑み、吸光光度法のような比色分析法を利用して、亜硝酸イオンを簡便に、しかも高感度で定量することができる、全く新しい亜硝酸イオン濃度の測定方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明が提供する新しい亜硝酸イオン濃度測定方法は、亜硝酸イオンを含む試料液に試薬としてポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物を添加混合し、亜硝酸イオンとの反応により生成したジアゾ基を有するポルフィリン化合物の吸光度又はそれを励起したときの蛍光強度を測定して、試料液中に含まれる亜硝酸イオン濃度を求めることを特徴とするものである。
【０００９】
本発明が試薬として使用するポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物としては、そのアミノ基が亜硝酸イオンと反応してジアゾ基を生成するポルフィリン化合物であれば特に限定されないが、ジアゾ反応の容易さや感度の点で芳香族第一級アミン、例えばポルフィン核にアミノフェニル基を有するアミノフェニルポルフィンが好ましい。
【００１０】
尚、アミノフェニル基のようなアミノ基はポルフィン核の外側にある。又、ポルフィン核上の置換基としてのアミノ基の数並びに位置は限定されず、例えば置換基が１つのアミノ基だけでも、アミノ基以外に他の置換基があっても良い。しかし、通常はポルフィン核の５、１０、１５、２０位が最も置換され易いので、試薬合成が比較的容易な点で５、１０、１５、２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィン（以下ＴＡＰＰと略記する）が特に好ましい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明方法では、吸光・蛍光スペクトルに大きなピークを有するポルフィン核と、亜硝酸イオンによりジアゾ化する第一級アミンとを合わせ持つ化合物を試薬として選択し、ジアゾ化によって変化するポルフィン核のソーレ吸収帯の吸光又は蛍光を測定して、亜硝酸イオンの定量を行うものである。
【００１２】
ポルフィン核を有するポルフィリン化合物は、モル吸光係数が数十万にも達するソーレ吸収帯と称する大きな吸収帯を有すると共に、金属イオンと錯体を形成しやすいので、この性質を利用して従来から比色定量法による金属イオンの定量分析に試薬として使用されている。しかし、その方法は、ポルフィリン化合物と金属イオンとの錯体の形成、あるいはポルフィリン化合物の錯体からの金属イオンの解離により、ポルフィン核の吸光・蛍光スペクトル特性が変化することを利用するものであった。
【００１３】
本発明方法は、このようなポルフィリン化合物の錯体を利用したものとは異なり、亜硝酸イオンとのジアゾ化反応に大きな吸収帯を有するポルフィリン化合物を利用するという、新たな観点からの亜硝酸イオンの定量方法である。
【００１４】
試薬であるポルフィン核にアミノ基を有するポルフィリン化合物は、ポルフィン核自体が電子吸引性であるためアミノ基は亜硝酸イオンの攻撃を受けやすく、強酸性では迅速に亜硝酸イオンと反応してジアゾ基が生成する。この試薬であるアミノ基を有するポルフィリン化合物と亜硝酸イオンとの反応は、酸性条件下、好ましくはｐＨ３以下、更に好ましくはｐＨ約１にて行う。又、反応温度は室温でも良いが、室温〜５０℃の温度範囲が好ましく、約３０℃が更に好ましい。特にｐＨ約１及び温度約３０℃の反応条件が、前記のごとくジアゾ化反応の進行が容易であると共に、各種金属イオンとの錯体形成が行われず、妨害イオンの影響もないため、最も好ましい。尚、反応時間はフローインジェクション法等の分析法によって変わるが、通常は３０分程度が好ましい。
【００１５】
尚、亜硝酸イオンはポルフィリンの１分子に対して１分子が反応すると、その後の反応速度は非常に遅くなる。従って、この反応は、ポルフィリン１分子に複数のアミノ基が存在していても、その１つが反応すると残りのアミノ基は亜硝酸イオンとの反応が遅くなるので、選択的に１：１の反応とみて差し支えない。
【００１６】
ポルフィン核を有するポルフィリン化合物は、ソーレ吸収帯に特有な大きな吸収を有するが、亜硝酸イオンとのジアゾ化反応によってジアゾ基が生成すると、ソーレ吸収帯が大きく減少する。その機構は、ジアゾ基の生成によって電子がポルフィン核に吸引されて一種のキノイドのような電子構造を取り、このときの電子の流れ込みによりポルフィン核に特有の１８π電子共鳴系が乱され、ソーレ吸収帯が大きく減少するものと考えられる。
【００１７】
従って、既知濃度の亜硝酸イオンを含む複数の標準液と前記アミノ基を有するポルフィリン化合物試薬とを反応させ、反応後の液の吸光度を吸光光度計で測定するか、又は反応後の液に励起光を照射したときの蛍光強度を蛍光光度計で測定し、亜硝酸イオン濃度に対する吸光度又は蛍光強度の検量線を作成しておけば、濃度未知の亜硝酸イオンを含む試料液について、同様に反応させた後の吸光度又は蛍光強度を測定することにより、前記検量線から試料液の亜硝酸イオン濃度を求めることができる。
【００１８】
測定すべきソーレ吸収帯の波長は、試薬として使用するポルフィリン化合物によって若干異なるが、例えばＴＡＰＰの場合には、波長４３４ｎｍ付近に大きな吸収ピークがあるので、この波長付近の吸光度を測定する。又、蛍光強度の測定は、波長４３４ｎｍの励起光で励起したとき放出される波長６６０ｎｍ付近の蛍光強度を測定する。
【００１９】
かかる本発明方法によれば、反応過程が従来のジアゾカップリング反応の場合の２段階に比べて１段階ですむため、反応条件の簡素化を図ることができ、同時にポルフィン核に特有な大きな吸収帯を利用することによって、ＪＩＳ等に定められた従来法のアゾ色素の吸光度を測定する方法に比べて大幅な感度の向上を達成できる。
【００２０】
尚、本発明方法を、液体クロマトグラフィーやフローインジェクション法と組み合わせれば、試料液の流れの中で亜硝酸イオンを連続的に分析することが可能である。液体クロマトグラフィーは、通常陰イオン交換樹脂でイオンの分離を行った後に対象とするイオンを測定するもので、多成分測定において亜硝酸イオンを他のイオンと同時に高感度で測定する場合に適している。又、フローインジェクション法は、前処理から測定までを試料液の流れの中で行うもので、モニタリングや自動測定等に適している。
【００２１】
【実施例】
実施例１
試薬として、図１に示すように、ポルフィン核に図２のアミノフェニル基を４個有する５、１０、１５、２０−テトラキス（４−アミノフェニル）ポルフィン（ＴＡＰＰ）を使用した。このＴＡＰＰは水溶性で、その水溶液はｐＨ約１において波長４３４ｎｍにモル吸光係数（ε）が約３×１０５の大きなソーレ吸収帯に依存する鋭いピークを持つ。
【００２２】
このＴＡＰＰを８．０×１０−７モル／ｌ含有するＴＡＰＰ試薬と、亜硝酸イオン濃度の異なる標準液とを混合し、塩酸でｐＨ１．０に調整し、温度３０℃で３０分間反応させた。反応後の液の吸光度を吸光光度計で測定したところ、波長４３４ｎｍにおける吸光度は図３に示すように亜硝酸イオン濃度の増加に伴って減少した。図３において、曲線ａは濃度比ＮＯ２−／ＴＡＰＰ＝０、曲線ｂは濃度比ＮＯ２−／ＴＡＰＰ＝０．５、及び曲線ｃは濃度比ＮＯ２−／ＴＡＰＰ＝４．０の場合を示している。
【００２３】
同様にして得られた検量線を図４に示した。図４の縦軸のＡは吸光度であり、Ａ３０は反応時間３０分後の吸光度及びＡ０はブランク値を表す。又、横軸はＴＡＰＰ（８．０×１０−７モル／ｌ）に対する亜硝酸の濃度を表す。検量線は亜硝酸イオン濃度０〜４×１０−７モル／ｌの範囲で直線となり、２×１０−７モル／ｌでの変動係数は１０回の測定で１．０３％であった。このことは、反応系が非常に安定していることを示している。又、本発明方法における検出限界は、亜硝酸イオンとしてＳ／Ｎ＝３で測定して４×１０−９モル／ｌ（０．１８μｇ／ｌ）であった。これは、従来の方法と比較して１０倍以上の感度である。
【００２４】
更に、妨害物質として塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、銅イオン、アルミニウムイオン、マグネシウムイオン等の影響を調べたが、いずれにおいても亜硝酸イオンに対して１０００倍濃度の共存であっても影響は認められなかった。又、各種金属イオンとの錯形成反応も全く観測されなかった。
【００２５】
実施例２
図５に示すフローインジェクション測定装置を利用し、実施例１と同じＴＡＰＰ試薬（８．０×１０−７モル／ｌ）を用いて、亜硝酸イオンのＦＩＡ蛍光検出法による測定を実施した。
【００２６】
ポンプ１により塩酸Ａを供給してインジェクター２内の試料液Ｂを反応管４に導き、同時に別のポンプ３によりＴＡＰＰ試薬Ｃを反応管４に供給し、両者を混合した。反応管４は内径０．５ｍｍ及び長さ２ｍのテフロンチューブからなり、この反応管４を覆っている恒温槽５により反応温度を約３０℃の一定温度に保持した。反応管４から出た反応後の試料液は蛍光検出器６に送られ、波長４３４ｎｍの励起光を照射することにより放出される６６０ｎｍ付近に極大波長をもつ蛍光の蛍光強度（Ｒ．Ｆ．Ｉ．）を蛍光検出器６で測定した。
【００２７】
その結果、試料液の亜硝酸イオン濃度を変えて測定することにより、ＴＡＰＰの蛍光スペクトルは、図６に示すように亜硝酸イオン濃度の増加に伴って減少した。図６において、曲線ａはＮＯ２−濃度＝０モル／ｌ、曲線ｂは同濃度＝５．０×１０−８モル／ｌ、曲線ｃは同濃度＝１．０×１０−７モル／ｌ、曲線ｄは同濃度＝１．５×１０−７モル／ｌ、曲線ｅは同濃度＝２．０×１０−７モル／ｌ、曲線ｆは同濃度＝４．０×１０−７モル／ｌ、曲線ｇは同濃度＝６．０×１０−７モル／ｌ、及び曲線ｈは同濃度＝８．０×１０−７モル／ｌの場合を示している。
【００２８】
図６から分かるように、亜硝酸イオンが反応するとＴＡＰＰの蛍光スペクトル自体が小さくなる。従って、実施例１の場合と同様に検量線を作成することができ、その検量線を用いて濃度未知の亜硝酸イオンの定量を行うことができる。その場合、図５に示すようにデータ処理装置７を用いて、検出された蛍光強度から亜硝酸濃度を自動的に求めることが可能である。尚、蛍光の場合には、他のイオン種による妨害も少なく、バックグラウンドのノイズも小さいことから、更に高感度の測定が期待できる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ基を有するポルフィリン化合物を試薬とし、亜硝酸イオンをジアゾ化反応のみで光分析システムにかけ、その吸光度又は蛍光強度を測定することにより、亜硝酸イオン濃度を求めることができる。従って、ジアゾカップリング反応により発色させる従来の亜硝酸イオンの測定方法に比較して、本発明方法は１０倍以上も高い感度が得られると共に、反応過程が１段階となるので反応条件制御が単純化され、妨害イオンの影響も少ない。
【００３０】
又、本発明方法は、亜硝酸イオン以外にも、硝酸や酸化窒素等の亜硝酸イオンを生成し得る物質の測定にも利用できることは勿論のこと、クロマトグラフィー技術やフローインジェクション法と組合せて自動測定等にも応用することができるので、従来技術では難しかった自然環境水中の亜硝酸イオンの測定をはじめ、環境分析や臨床分析等の広い分野での応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において試薬として用いるポルフィリン化合物の化学構造式である。
【図２】図１の化学構造式中におけるφを意味するアミノフェニル基の化学構造式である。
【図３】実施例１で得られた亜硝酸イオン濃度の違いによるＴＡＰＰの吸光度特性を示すグラフである。
【図４】実施例１で得られた亜硝酸イオン濃度と吸光度との関係を示す検量線のグラフである。
【図５】実施例２で用いたフローインジェクション測定装置の概略図である。
【図６】実施例２で得られた亜硝酸イオン濃度の違いによるＴＡＰＰの蛍光強度特性を示すグラフである。
【符号の説明】
１  ポンプ
２  インジェクター
３  ポンプ
４  反応管
５  恒温槽
６  蛍光検出器
７  データ処理装置
Ａ  塩酸
Ｂ  試料液
Ｃ    ＴＡＰＰ試薬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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