【手続補正書】
【提出日】平成29年4月5日(2017.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞を脱分化または再プログラム化するための方法であって、
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択される合成ｍＲＮＡ再プログラム化因子のうちいずれか１種または複数とトランス活性化ドメインとの融合産物を有効量含む組成物を、単離された体細胞にトランスフェクトし、これにより前記体細胞を再プログラム化または脱分化するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記合成ｍＲＮＡが、転写からのいかなる汚染非ｍＲＮＡ種も除去するために精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ウェル内から密度勾配で播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が非ヒト霊長類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がカニクイザル細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞がアカゲザル細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がヒヒ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がイヌ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がウマ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がウシ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がブタ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒツジ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、Ｎ末端ＭｙｏＤトランス活性化ドメインと融合したＯｃｔ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｏｃｔ４が、タンデムに３連でＮ末端ＭｙｏＤトランス活性化ドメインと融合している、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞を再プログラム化するための方法であって、
フィーダーフリー表面上で標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞２５ｋ〜２５０ｋの密度で、標的細胞を成長させるステップと、
約５０ｎｇ〜約８００ｎｇ／ｍｌにわたる用量の、請求項１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を前記細胞にトランスフェクトするステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
標的細胞を、フィーダーフリー表面上で標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞５０ｋ、７５ｋ、１００ｋまたは１５０ｋの密度で成長させるステップと、
１ｍｌのｍＲＮＡあたり約５０ｎｇ〜約８００ｎｇにわたる用量の、請求項１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を前記細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
継代せずにｉＰＳＣを獲得するステップと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞１５ｋ、３０ｋ、５０ｋ、７５ｋ、１００ｋ、１５０ｋ、２５０Ｋ、５００Ｋのうち選択されたいずれか１種の密度で成長させるステップであって、各ウェルの容量を、０．５ｍｌ〜５ｍｌの適切な培地となるよう調整する、ステップと、
１ｍｌのｍＲＮＡあたり約５０ｎｇ〜８００ｎｇにわたる用量の、請求項１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
前記細胞を継代せずにｉＰＳＣを獲得するステップと
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
異種フリーである、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記１種または複数の因子が、ｍＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記体細胞に、少なくとも２種の異なるＲＮＡをトランスフェクトする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記体細胞が、単能性細胞、複能性細胞、多能性細胞および分化細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１種または複数のＲＮＡが、前記体細胞から単能性細胞、複能性細胞または多能性細胞への脱分化を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記因子のうち少なくとも１種が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびＭＹＣ  ｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８  ｍＲＮＡを組み合わせて投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣ  ｍＲＮＡを組み合わせて投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
前記トランスフェクトされた細胞が、培養において人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞として維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスフェクトされた細胞が、人工多能性幹細胞を形成し、分化細胞を形成するように前記ｉＰＳ細胞を誘導するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
患者における疾患または障害の１種または複数の症状を処置または阻害するための、請求項１に記載の方法に従って脱分化された細胞を含む、組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、ＲａｒｇおよびＬｒＨ−１トランス活性化ドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、ＶＰ１６トランス活性化ドメインと融合したＯｃｔ４を含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一実施形態では、本開示は非ヒト霊長類細胞に由来するｉＰＳＣを提供し、これを、他の動物性製品を伴わない組み込みフリー、フィーダーフリーの検査環境をもたらし得るため、疾患モデル系の確立に使用した。したがって、本明細書に記載されている非ヒトｉＰＳＣは、前臨床検査に有用である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
体細胞を脱分化または再プログラム化するための方法であって、
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択される合成ｍＲＮＡ再プログラム化因子のうちいずれか１種または複数とトランス活性化ドメインとの融合産物を有効量含む組成物を、単離された体細胞にトランスフェクトし、これにより前記体細胞を再プログラム化または脱分化するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記合成ｍＲＮＡが、転写からのいかなる汚染非ｍＲＮＡ種も除去するために精製される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、ウェル内から密度勾配で播種される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記細胞が非ヒト霊長類細胞である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞がカニクイザル細胞である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞がアカゲザル細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞がヒヒ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記細胞がイヌ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記細胞がウマ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞がウシ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞がブタ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記細胞がヒツジ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物が、Ｎ末端ＭｙｏＤトランス活性化ドメインと融合したＯｃｔ４を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
Ｏｃｔ４が、タンデムに３連でＮ末端ＭｙｏＤトランス活性化ドメインと融合している、項目２に記載の方法。
（項目１５）
哺乳動物細胞を再プログラム化するための方法であって、
フィーダーフリー表面上で標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞２５ｋ〜２５０ｋの密度で、標的細胞を成長させるステップと、
約５０ｎｇ〜約８００ｎｇ／ｍｌにわたる用量の、項目１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を前記細胞にトランスフェクトするステップと
を含む、方法。
（項目１６）
標的細胞を、フィーダーフリー表面上で標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞５０ｋ、７５ｋ、１００ｋまたは１５０ｋの密度で成長させるステップと、
１ｍｌのｍＲＮＡあたり約５０ｎｇ〜約８００ｎｇにわたる用量の、項目１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を前記細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
継代せずにｉＰＳＣを獲得するステップと
を含む、項目４に記載の方法。
（項目１７）
標的細胞を、フィーダーフリー表面において標準６ウェルプレート内でウェルあたり細胞１５ｋ、３０ｋ、５０ｋ、７５ｋ、１００ｋ、１５０ｋ、２５０Ｋ、５００Ｋのうち選択されたいずれか１種の密度で成長させるステップであって、各ウェルの容量を、０．５ｍｌ〜５ｍｌの適切な培地となるよう調整する、ステップと、
１ｍｌのｍＲＮＡあたり約５０ｎｇ〜８００ｎｇにわたる用量の、項目１に記載の再プログラム化因子の合成ｍＲＮＡのうちいずれか１種または複数を細胞にトランスフェクトするステップであって、より初期の時点においてより後期の時点よりも低い用量を使用する、ステップと、
前記細胞を継代せずにｉＰＳＣを獲得するステップと
を含む、項目４に記載の方法。
（項目１８）
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項目４に記載の方法。
（項目１９）
異種フリーである、項目４に記載の方法。
（項目２０）
前記１種または複数の因子が、ｍＲＮＡ、制御性ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記体細胞に、少なくとも２種の異なるＲＮＡをトランスフェクトする、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記体細胞が、単能性細胞、複能性細胞、多能性細胞および分化細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記１種または複数のＲＮＡが、前記体細胞から単能性細胞、複能性細胞または多能性細胞への脱分化を誘導する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記因子のうち少なくとも１種が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびＭＹＣ  ｍＲＮＡからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目２５）
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８  ｍＲＮＡを組み合わせて投与する、項目４に記載の方法。
（項目２６）
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣ  ｍＲＮＡを組み合わせて投与する、項目４に記載の方法。
（項目２７）
前記トランスフェクトされた細胞が、培養において人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞として維持される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記トランスフェクトされた細胞が、人工多能性幹細胞を形成し、分化細胞を形成するように前記ｉＰＳ細胞を誘導するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
患者における疾患または障害の１種または複数の症状を処置または阻害するための方法であって、項目１に記載の方法に従って細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで脱分化させる、ステップと、前記細胞を前記患者に投与するステップとを含む、方法。
（項目３０）
前記組成物が、ＲａｒｇおよびＬｒＨ−１トランス活性化ドメインをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目３１）
前記組成物が、ＶＰ１６トランス活性化ドメインと融合したＯｃｔ４を含む、項目１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（実施例１）
ＩＶＴ鋳型の作製
ライゲーション非依存性クローニング（Ligation  Independent  Cloning）（ＬＩＣ）を使用して、直鎖状ＰＣＲ産物ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）鋳型を生成するためのプラスミド構築物を構築した。本出願人らは先ず、対象とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）インサートを受け入れるよう設計された挿入部位に隣接する５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み入れた、親プラスミド（ｐＩＶＴ）を構築した。ＯＲＦ隣接配列は、Warrenら、Cell  Stem  Cell、２０１０年に記載されている通りのものであり、低二次構造リーダーおよび強力なコザック（Kozak）部位（５’ＵＴＲ）ならびにマウスα−グロビン３’ＵＴＲを含む。テイルド（tailed）プライマーを使用してプラスミドから増幅された２種のＰＣＲ産物の再アニーリングにより、５’オーバーハングを有する直鎖化バージョンのＰＩＶＴベクターを産生した。相補的オーバーハングを有するＯＲＦ  ＰＣＲ産物を類似の手順により産生し、ベクターＰＣＲ産物と共にプールし、熱ショックによりＤＨ５α細菌に形質転換して、遺伝子特異的構築物（ｐＩＶＴ−ＫＬＦ４等）をクローニングした。得られたプラスミドを鋳型ＰＣＲ反応に使用して、Warrenら、Cell  Stem  Cell、２０１０年に記載されている通り、Ｔ７プロモーター、ＵＴＲ隣接ＯＲＦ、およびポリＡテイルの付加を駆動するためのＴ１２０テイル（配列番号１）を組み入れた直鎖状ＩＶＴ鋳型を作製した。テイルドリバースプライマー（Ｔ１２０ＣＴＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＡＣＣＡ（配列番号２））の使用により、Ｔ１２０テイル（配列番号１）領域を導入した。Ｍ３ＯおよびＶＰｘ３融合構築物に関して、トランス活性化ドメインをコードする配列を、テイルドプライマーを使用したＰＣＲによりＯＲＦに付け加えた。ＰＣＲ産物鋳型ストックをほぼ１００ｎｇ／ｕＬの濃度で維持した。