(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
KM1124（FERM BP−4729）またはKM1135（FERM BP−4731）であるヒトMx蛋白質と特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項２】
ハイブリドーマ細胞株KM1124（FERM BP−4729）が生産するヒトMx蛋白質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマ細胞株KM1135（FERM BP−4731）が生産するヒトMx蛋白質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項２または３項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒトMx蛋白質MxAの検出方法。
【請求項５】
ウィルス性疾患を判定するための、請求項２または３項に記載のモノクローナル抗体を用いたヒトMx蛋白質MxAの検出方法。
【請求項６】
請求項２または３項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒトMx蛋白質MxAの検出キット。
【請求項７】
請求項２または３項に記載のモノクローナル抗体を含む、ウィルス性疾患の判定キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、種々の疾患の診断に有用なヒトMx蛋白質と特異的に反応するモノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリドーマに関する。
背景技術
Mx蛋白質はインターフェロンで細胞を刺激したときに誘発される蛋白質であり、インフルエンザウィルス感染に対する抵抗性を示すうえで重要な蛋白質であることが、マウスを用いた実験により明らかとなった［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1910−1914（1983）,Cell 44,147−158（1986）,Cell 62,51−61,（1990）］。その後、ヒトにおいても細胞をインターフェロンで刺激するとマウスMx蛋白質とホモロジーのある二種類の蛋白質が誘導されることが見いだされ、それぞれMxA、MxBと名付けられた［Mol.Cell.Biol.9,5062−5072（1989）,J.Virol.64,1171−1181,（1990）］。インフルエンザＡウィルスと水疱性口内炎ウィルス（vesicular stomatitis virus）を用いた感染実験により、MxAは細胞内でのウィルスの増殖を抑制するが、MxBには抑制活性がないことが明らかとなった［J.Virol.64,3370−3375（1990）］。
MxAに対するモノクローナル抗体は、精製した蛋白質をマウスに免疫することにより初めて作製された［J.Interferon Res.7,331−343（1987）］。その後、トーヴィン（Towbin）らが大腸菌で発現されたリコンビナントMxAを免疫原として５個のモノクローナル抗体を作製した［J.Interferon Res.12,67−74（1992）］。トーヴィンらのモノクローナル抗体はエンザイムイミュノアッセイ（ELISA）とウェスターンブロッティングによりMxAに反応することが確認され、Ｎ末アミノ酸から１〜429番目に存在するエピトープを認識するものと430〜662番目に存在するエピトープを認識するものに区別された。
最近、Mx蛋白質の構造と機能についての研究が進展し、Mx蛋白質にはGTP−結合ドメインとGTPase活性があり、それらは抗ウィルス活性に重要であると考えられるようになった［Trends in cell biology,3,268−272,（1993）］。また、Mx蛋白質は、セルフ・アセンブリ（self−assembly）モチーフを持ち、それを利用して互いに会合することにより大きな複合体を形成し抗ウィルス機能を発揮している可能性も示唆された［J.Biol.Chem.268,15033−15038（1993）］。
Mx蛋白質の構造と機能の関係を詳細に解明できれば、それを反映したウィルス感染状態を正確に診断することが可能となる。MxAを認識する従来公知のモノクローナル抗体では、結合部位の特定が曖昧なためGTP−結合ドメインやセルフ・アセンブリ・モチーフと機能との関係の解明が困難であり、正確なウィルス感染状態の診断が不可能である。また、人為的にインターフェロンで刺激せず、ウィルス感染のみで細胞内に誘発されるMxAを認識できるモノクローナル抗体も報告されていない。
本発明は、ヒトMx蛋白質MxAのＮ末アミノ酸から、10〜220番目、221〜297番目または469〜662番目に存在するエピトープを認識し、ウェスターンブロッティング、免疫沈降または免疫細胞染色によりヒトMx蛋白質と特異的に反応するモノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリドーマに関する。
発明の開示
本発明の抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の製造法の概略は以下の通りである。
MxAをコードするcDNAを公知の方法［J.Interferon Res.12,67−74（1992）］に従ってプラスミド上にクローニングし、大腸菌に導入する。MxAは大腸菌の菌体内顆粒として発現され、貯留されるので、菌体を超音波処理などにより破壊し、界面活性剤や蛋白質変性剤を用いてMxAを可溶化する。可溶化したMxAを数回の遠心分離を繰り返すことにより精製する。精製したリコンビナントMxAを免疫した動物の脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、MxAに反応し、MxAを含まない大腸菌由来の夾雑蛋白質と反応しないモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択する。該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化し、該培養液または腹水よりモノクローナル抗体を採取する。このようにして得られるモノクローナル抗体の中から、ウェスターンブロッティングでMxAに特異的に反応するものを選択する。さらに、免疫細胞染色の第一抗体として使用したときにインターフェロンで刺激した細胞およびウィルスに感染した細胞を陽性に染色できるものを選択する。
次にこのようにして得られたモノクローナル抗体が認識する部位を決定するための方法を以下に示す。
MxA遺伝子を制限酵素を用いて短く切断し、インビトロ−トランスクリプション（in vitro transcription;Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）によりmRNAを合成する。次いで、インビトロ−トランスレーション（in vitro translation;Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）を35S−メチオニン存在化で行なうことにより、Ｃ末側のアミノ酸残基を段階的に短かくした35S−メチオニン標識フラグメント蛋白質を合成する。これらの標識蛋白質とモノクローナル抗体を反応させ、反応物を第二抗体を標識したビーズなどを用いて沈降させる。沈降物をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーにより、沈降した蛋白質の分子量を決定する。この分子量からモノクローナル抗体の結合部位を決定する。
このようにして得られるヒトMx蛋白質MxAの各ドメインを認識する数種類のモノクローナル抗体は、ウィルス感染状態の診断などに利用することができる。
以下に、本発明の抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の製造法を詳細に説明する。
（１）抗原の調製
MxAをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌に導入し、リコンビナントMxAを得るか、インターフェロンなどで刺激した培養細胞からMxAを精製する。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに（１）により調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜10回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを脾細胞の供給源として提供する。
脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をMEM培地（日水製薬社製等）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）［Current Topics in Microbiology and Immunology、18,1−7,（1978）］、P3−NS1/1−Ag41（NS−１）［European J.Immunology,6,511−519,（1976）］、SP2/0−Ag14（SP−２）［Nature,276,269−270,（1978）］、P3−X63−Ag8653（653）［J.Immunology,123,1548−1550（1979）］、P3−X63−Ag8（X63）［Nature,256,495−497（1975）］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）、２−メルカプトエタノール（５×10-5M）、ジェンタマイシン（10μg/ml）および牛胎児血清（FCS）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（15μg/ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×107個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS（リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水１リットル、pH7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1,000（PEG−1,000）2g、MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM培地１〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにする。遠心分離（900rpm、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）およびアミノプテリン（４×10-7M）を加えた培地〕100ml中に懸濁する。この懸濁液を96穴培養用プレートに100μl/穴ずつ分注し、５％CO2インキュベーター中、37℃で７〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原として用いたMxAに反応し、MxAを含まない蛋白質に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
当該抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株KM1124、KM1132、KM1135等があげられる。ハイブリドーマ細胞株KM1124、KM1132、KM1135は平成６年７月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれFERM BP−4729,FERM BP−4730,FERM BP−4731として寄託されている。
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、（３）で得られた抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×106〜５×107細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、５分間）して固形分を除去後、40〜50％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白質量の定量はローリー法および280nmでの吸光度より算出する。
（６）ウェスターンブロッティング（リコンビナントMxAとの反応）
（５）で選択された抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の反応特異性の確認をウェスターンブロッティングにて行う。
１〜10μｇの大腸菌で発現したリコンビナントMxAまたはインターフェロンなどで刺激した細胞から精製したMxAをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）にて分画後、PVDF（ポリビニリデンジフルオリド）膜にブロッティングする。BSA溶液でブロッキング後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体１〜10μg/mlを室温で２時間または４℃で一晩反応させる。PBSまたはPBS−Tweenでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体１〜50μg/mlを50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体がMxAにのみ反応し、MxAを含まない蛋白質と反応しないことを確認する。
（７）ウェスターンブロッティング（細胞内在性MxAとの反応）
インターフェロンαで刺激した細胞をPBSで洗浄後、細胞溶解用緩衝液に懸濁し、４℃、１〜10時間放置後遠心分離する。得られた上清をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）にて分画後、PVDF膜にブロッティングする。BSA溶液でブロッキング後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体１〜10μg/mlを室温で２時間または４℃で一晩反応させる。PBSまたはPBS−Tweenでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体１〜50μg/mlを50〜100μl/穴ずつ分注し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体がインターフェロンαなどで刺激した細胞由来のMxAと反応することを確認する。
（８）免疫細胞染色（インターフェロンαなどで誘発されるMxAの検出）
チャンバースライドに付着型培養細胞の懸濁液（２×104細胞／穴）を100〜500μl/穴で分注し、インターフェロンαなどで刺激して37℃で一晩培養する。PBSで洗浄後、パラホルムアルデヒドなどで固定する。PBSで洗浄後、抗体の通過性を良くするためTriton Xなどで細胞を処理する。正常ウマ血清などを用いてブロッキングした後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体１〜10μg/mlを室温で30分間反応させる。洗浄後、蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体１〜50μg/mlを100〜500μl/穴ずつ分注し、室温で30分間遮光して反応させる。よく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡し、インターフェロンαなどで刺激した細胞に反応し、無刺激の細胞とは反応しないことを確認する。
（９）免疫細胞染色（ウィルス感染で誘発されるMxAの検出）
チャンバースライドに付着型培養細胞の懸濁液（２×104細胞／穴）を100〜500μl/穴で分注し、インフルエンザウィルスなどのウィルスを感染させ、37℃で一晩培養する。PBSで洗浄後、パラホルムアルデヒドなどで固定する。PBSで洗浄後、抗体の通過性を良くするためTriton Xなどで細胞を処理する。正常ウマ血清などを用いてブロッキングした後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体１〜10μg/mlを室温で30分間反応させる。洗浄後、蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体１〜50μg/ml 1を100〜500μl/穴ずつ分注し、室温で30分間遮光して反応させる。よく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡し、ウィルスに感染した細胞に反応し、無刺激の細胞とは反応しないことを確認する。
（10）モノクローナル抗体の結合ドメインの決定
MxAをコードする遺伝子DNAを数種類の制限酵素で切断し、T7 RNAポリメラーゼ存在下でインビトロ−トランスクリプション（in vitro transcription）を行ない、異なった長さの数種類のmRNAを合成する。次にこれらのmRNAを用いて、インビトロ−トランスレーション（in vitro translation）を35S−メチオニン存在下で行なうことにより、Ｃ末側のアミノ酸残基を段階的に短かくした35S−メチオニン標識フラグメント蛋白質を合成する。これらの標識蛋白質と抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体を４℃で１〜４時間反応させる。さらにこの反応液に第二抗体を標識したビーズを加え、振とうしながら４℃で１時間反応させる。遠心分離により得た沈降物をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーにより、沈降した蛋白質の分子量を決定する。この分子量からモノクローナル抗体の結合部位を決定する。
本発明の抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株KM1124、KM1132、KM1135がそれぞれ生産するモノクローナル抗体KM1124、KM1132、KM1135があげられる。
本発明の抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体は、ウィルス感染で誘発されるMxAと反応する能力を有するためウィルス感染の検査に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、MxAを大腸菌で発現するためのベクターの構造を示す。
第２図は、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体のMxAおよびMxAを含まない大腸菌夾雑蛋白質に対する反応性を示す。
第３図は、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体により沈降された35S−メチオニン標識されたMxAフラグメント蛋白質のオートラジオグラフィーの結果を示す。レーン１〜７はＮ末端から10〜662残基、レーン８〜12はＮ末端から10〜468残基、レーン13〜17はＮ末端から10〜297残基、レーン18〜22はＮ末端から10〜220残基のMxAフラグメント蛋白質と抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体との免疫沈降物をそれぞれ示す。用いた抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体は、レーン3,8,13および18がKM1124、レーン4,9,14および19がKM1126、レーン5,10,15および20がKM1132、レーン6,11,16および21がKM1135である。レーン１はMxAフラグメント蛋白質およびモノクローナル抗体非存在下での結果、レーン２は、モノクローナル抗体の代わりにラット抗Mx蛋白質MxA血清を用いた場合の結果、レーン7,12,17および22は、モノクローナル抗体非存在下での結果をそれぞれ示す。
第４図は、各MxAフラグメントに対する抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124,KM1126,KM1132およびKM1135の免疫沈降物の生成の有無、および各モノクローナル抗体のMxA上の結合部位を示す。矢印で示した範囲がそれぞれ抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124,KM1126,KM1132およびKM1135の結合部位の存在範囲を示す。
第５図は、突発性発疹、手足口病、ムンプス、伝染性単核症患者由来末梢血単核細胞におけるMxA蛋白の発現を示す。
第６図は、健常人および各種ウィルス感染患者由来末梢血細胞表面上のMxAと抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1135との反応性をフローサイトメーターを用いて測定した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例
（１）抗原の調製
MxAをコードするcDNAを含む発現ベクター（第１図）を公知の方法（Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）で大腸菌に導入し、200mlのLB培地（200μg/mlのアンピシリンを含む）中で、37℃で４時間培養後、0.5mMのイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を添加し、さらに37℃で２時間培養した。培養液200mlを3,000×ｇで15分間遠心分離し、得られた大腸菌を含む沈殿を100mlの緩衝液１（10mM Tris−HCl,1mM EDTA,150mM NaCl,pH8）に懸濁した。再び遠心分離後、沈殿を7mlの緩衝液１で懸濁し、超音波処理により菌体を破壊した。これを10,000×ｇで30分間遠心分離し、得られた沈殿を3.5mlの緩衝液２（50mM Tris−HCl,10mM EDTA,100mM NaCl,0.5％Triton X−100,pH7.9）に懸濁し、20℃で５分間静置後再び10,000×ｇで15分間遠心分離した。この遠心分離操作を２回繰り返し、得られた沈殿を3.5mlの緩衝液３（50mM Tris−HCl,1mM EDTA−200mM KCl,10mM MgCl2,10mMジチオスレイトール,20％グリセロール,6M尿素pH7.9）に懸濁し、０℃で10分間静置後、10,000×ｇで15分間遠心分離した。この遠心分離操作を２回繰り返し、得られた沈殿をさらに2mlの緩衝液４（10mM Tris−HCl,0.1mM EDTA,1mMジチオスレイトール,6M塩化グアニジン,pH7.9）に溶解し、10,000×ｇで15分間遠心分離することにより可溶化された蛋白質を上清中に回収した。その上清を１リットルの緩衝液５（50mM Tris−HCl,10mM EDTA,100mM NaCl,5％グリセロール,0.25％Triton X−100 pH7.9）に対し２回透析した。この方法により、200mlの大腸菌培養液から2.5mgのMxAが回収された。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
（１）で調製したMxAの30μｇをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×109細胞とともに５週令の雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後30μｇのMxAを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
酵素免疫測定法
96穴のEIA用プレート〔グライナー（Greiner）社製〕に（１）で得られたMxA1〜50μg/mlまたは１％BSA溶液を10〜100μl/穴ずつ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートにコートした。次いで、１％BSAを含むPBS溶液（BSA−PBS）を100〜200μl/穴分注し、室温で１〜２時間または４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、BSA−PBSを捨て、PBSでよく洗浄した後、第一抗体として、BSA−PBSで希釈した試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清、精製モノクローナル抗体）を20〜100μl/穴分注し、室温で２〜３時間または４℃で一晩放置した。PBSまたはPBS−Tweenで、よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ（DAKO）社製〕を50〜100μl/穴分注し、室温で２時間放置した。
PBS−Tweenでよく洗浄した後、ABTS基質液〔2,2'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）１リットルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μl/mlを加えた溶液〕を用い発色させ、OD415nmの吸光度を測定した。
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−U1を正常培地で培養し、細胞融合時に２×107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（４）ハイブリドーマの作製
（２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃でポリエチレングリコール−1,000（PEG−1,000）2g、MEM培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108マウス脾細胞を加え、１〜２分間毎にMEM培地１〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離（900rpm、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100ml中に懸濁した。
この懸濁液を96穴培養用プレートに100μl/穴ずつ分注し、５％CD2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。この培養上清を（１）に示した酵素免疫測定法で調べ、MxAに反応し、MxAを含まない大腸菌由来夾雑蛋白質に反応しない穴を選び、さらにHT培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、14個の抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株KM1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134および1135を得た（第２図）。
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c）に（４）で得られたハイブリドーマ株を５〜20×106細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜8ml/匹）し、遠心分離（3,000rpm、５分間）して固形分を除去した。これをカプリル酸沈殿法（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。ハイブリドーマ株KM1122、KM1123、KM1124、KM1125、KM1126、KM1127、KM1128、KM1129、KM1130、KM1131、KM1132、KM1133、KM1134、KM1135からそれぞれ得られる抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体をそれぞれKM1122、KM1123、KM1124、KM1125、KM1126、KM1127、KM1128、KM1129、KM1130、KM1131、KM1132、KM1133、KM1134、KM1135と名付けた。
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行ない決定した。各抗体のサブクラスを第１表に示す。
0003539567.tif 000002
（６）ウェスターンブロッティング（リコンビナントMxAとの反応）
（５）で得られた抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の反応特異性を以下に示すウェスターンブロッティングにより調べた。
１μｇの大腸菌で発現したMxAをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）により分画後、PVDF膜にブロッティングした。BSA溶液でブロッキング後、精製した抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体10μg/mlを室温で２時間または４℃で一晩反応させた。PBS−Tweenでよく洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ（DAKO）社製〕を室温で１時間反応させた。よく洗浄した後、HRP−カラーディベロプメントリージェント基質液〔60mg HRP−カラーディベロプメントリージェント（バイオラッド社）を20ml氷冷メタノールに溶解した後、室温に戻し、100mlのTBS緩衝液（2.42gトリス、29.24g塩化ナトリウム/l、PH7.5）を加え、使用直前に60μｌの過酸化水素を加えたもの〕を用いて発色させた。その結果、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1122,KM1124,KM1126,KM1128,KM1129,KM1132およびKM1135がMxAにのみ反応し、MxAを含まない大腸菌由来夾雑蛋白質に反応しないことを確認した。
（７）ウェスターンブロッティング（細胞内在性MxAとの反応）
インターフェロンαで刺激したヒトグリオーマ細胞T98G（ATCC CRL1690）をPBSで洗浄後、細胞溶解用緩衝液［50mMTris−HCl（pH7.2）,1％Triton X,150mM NaCl,2mM MgCl2,2mM CaCl2,0.1％NaN3,50mMヨードアセトアミド,50mM N−エチルマレイミド,1mg/mlロイペプシン,0.1mMジチオスレイトール］に懸濁し、４℃で２時間放置後遠心分離した。得られた上清をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動（Antibodies−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988）にて分画後、PVDF膜にブロッティングした。BSA溶液でブロッキング後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体の精製抗体10μg/mlを室温で２時間または４℃で一晩反応させた。PBS−Tweenでよく洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体〔ダコ（DAKO）社製〕を室温で１時間反応させた。よく洗浄した後、HRP−カラーディベロプメントリージェント基質液を用いて発色させた。その結果、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1122,KM1124,KM1126,KM1128,KM1129,KM1132およびKM1135がインターフェロンαで刺激した細胞由来のMxAと反応することを確認した。
（８）免疫細胞染色（インターフェロンで誘発されるMxAとの反応）
８穴のチャンバースライドにヒトグリオーマ細胞T98G（ATCC CRL1690）の懸濁液（２×104細胞／穴）を500μl/穴で分注し、インターフェロンα（1000U/ml）で刺激し、37℃で一晩培養した。PBSで洗浄後、用時調整した４％パラホルムアルデヒドを500μl/穴で分注し、室温で30分間固定した。PBSで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、0.1〜0.2％Triton X−100を500μl/穴で分注し、室温で５分間処理した。10％正常ウマ血清を500μl/穴で分注し、室温で30分間ブロッキングした後、精製した抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体10μg/mlを室温で30分間反応させた。PBSで洗浄後、FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬社製）を200μl/穴ずつ分注し、室温で30分間遮光して反応させた。反応後、PBSでよく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡した。その結果、第２表に示したように抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124,KM1126,KM1132およびKM1135がインターフェロンαで刺激した細胞に反応し、無刺激の細胞とは反応しないことを確認した。
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（９）免疫細胞染色（ウィルス感染で誘発されるMxAとの反応）
８穴のチャンバースライドにヒトグリオーマ細胞T98G（ATCC CRL1690）に懸濁液（２×104細胞／穴）を500μl/穴で分注し、インフルエンザウィルスを感染させ、37℃で一晩培養した。PBSで洗浄後、用時調製した４％パラホルムアルデヒドを500μl/穴で分注し、室温で30分間固定した。PBSで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、0.1〜0.2％Triton X−100を500μl/穴で分注し、室温で５分間処理した。10％正常ウマ血清を500μl/穴で分注し、室温で30分間ブロッキングした後、精製した抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体10μg/mlを室温で30分間反応させた。PBSで洗浄後、FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬）を200μl/穴ずつ分注し、室温で30分間遮光して反応させた。反応後、PBSでよく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡した。その結果、第３表に示したように抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124およびKM1135がウィルスに感染した細胞に反応し、無刺激の細胞とは反応しないことを確認した。
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（10）モノクローナル抗体の結合ドメインの決定
MxAをコードするDNAを公知の方法に従い、制限酵素Bst X 1,Pst 1,Nae l,Bam H lで切断し、T7 RNAポリメラーゼ存在下でインビトロ−トランスクリプション（Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition published by Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）を行ない、異なった長さの数種類のmRNAを合成する。次にこれらのmRNAを用いて、インビトロ−トランスレーションを35S−メチオニン存在下で行なうことにより、Ｃ末側のアミノ酸残基を段階的に短かくした35S−メチオニン標識フラグメント蛋白質を合成した。インビトロトランスレーションはレティキュロサイト・ライゼート（reticulocyte lysate;プロメガ社製＃ L416A）を用いて行ない、方法は添付のマニュアルに従って行なった。その結果、MxAのＮ末端から10〜662残基、10〜468残基、10〜297残および10〜220残基の標識蛋白質が合成された。これらの標識蛋白質と抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体（1mg/ml溶液を1.25μｌ使用）を反応緩衝液（50mM Tris−HCl,1％NP−40,0.2％BSA,pH8.0）中で４℃で１時間反応させた。さらにこの反応液に第二抗体を標識した40μｌのビーズ（E.Y.Labo社製＃AG−005、２倍希釈）を加え、振とうしながら４℃で１時間反応させた。４℃、10,000×ｇで15秒間遠心分離して得られた沈降物をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオグラフィー（富士メディカルＸ線フィルム）により、沈降した蛋白質の分子量を決定した。その結果を第３図に示す。この分子量からモノクローナル抗体の結合部位を決定した（第４図）。その結果、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1126およびKM1135はMxAのアミノ末端から10〜220残基中に結合部位があり、KM1124は220〜297残基中に結合部位があり、KM1132は468〜662残基中に結合部位があることが明らかとなった。
（11）免疫細胞染色（インターフェロンαで誘発されるMxAとの反応−経時変化−）
８穴のチャンバースライドに付着型培養細胞（ヒトグリオーマT98G、ATCC CRL1690）の懸濁液（２×104cells/ml）を500μl/穴で分注して37℃で一晩培養後、さらにインターフェロンα（1000U/ml）で刺激して37℃で０〜６時間培養した。PBSで洗浄後、用時調製した４％パラホルムアルデヒドを500μl/穴で分注し、室温で30分間固定した。PBSで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、0.2％Triton X−100を500μl/穴で分注し、室温で５分間処理した。10％正常ウマ血清を500μl/穴で分注し、室温で30分間ブロッキングした後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124,KM1132およびKM1135の精製抗体をそれぞれ濃度10μg/mlを200μl/穴ずつ分注し、室温で30分間反応させた。PBSで洗浄後、FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬）を200μl/穴ずつ分注し、室温30分間遮光反応させた。PBSでよく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡した。その結果、第４表に示したように、KM1124,KM1132およびKM1135がインターフェロンαにより誘導されたMxAを検出できることが明らかとなった。
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（12）免疫細胞染色（ウイルス感染で誘発されるMxAとの反応−経時変化−）
８穴のチャンバースライドに付着型培養細胞（ヒトグリオーマT98G、ATCC CRL1690）の懸濁液（２×104cells/ml）を500μl/穴で分注して37℃で一晩培養後、さらにインフルエンザウイルスを感染させて37℃で０〜８時間培養した。PBSで洗浄後、用時調製した４％パラホルムアルデヒドを500μl/穴で分注し、室温で30分間固定した。PBSで洗浄後、細胞膜の抗体透過性を上げるため、0.2％TritonX−100を500μl/穴で分注し、室温で５分間処理した。10％正常ウマ血清を500μl/穴で分注し、室温で30分間ブロッキングした後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1124,KM1132およびKM1135の精製抗体をそれぞれ10μg/mlを200μl/穴ずつ分注し、室温で30分間反応させた。PBSで洗浄後、FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体（和光純薬）を200μl/穴ずつ分注し、室温で30分間遮光反応させた。PBSでよく洗浄した後、グリセリンで封入し蛍光顕微鏡にて顕鏡した。その結果、第５表に示したように、KM1124,KM1132およびKM1135がウイルス感染により誘導されたMxAを検出できることが明らかとなった。
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（13）免疫細胞染色（ウィルスで誘発されるMxAとの反応）
突発性発疹、手足口病、ムンプス、伝染性単核症はいずれも主に小児に見られるウイルス性疾患である。これら疾患の患者由来の末梢血単核細胞をそれぞれリンホプレップで分離、サイトスピン標本を作製した。標本を４℃でアセトン固定（20分間以上）を行い乾燥後、10％牛血清アルブミンを含むTBS〔0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）〕に浸した。10％ウサギ血清を含むTBSで希釈した抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1135（20μg/ml）を室温で30分間反応させた後、TBSで洗浄した。二次抗体であるウサギ抗マウス抗体（DAKO社）を室温で30分間反応させた後、TBSで洗浄した。マウスモノクローナルAPAAP複合体（DAKO社）を室温で30分間反応させ、TBSで洗浄後アルカリフォスファターゼ発色基質試薬（DAKO社）を用いて発色させ、顕微鏡による観察を行った。その結果、第５図に示すように、いずれの患者由来の末梢血単核細胞がKM1135により陽性に染色された。
（14）フローサイトメトリー（ウィルスで誘発されるMxAとの反応）
健常人または患者由来末梢血単核細胞（１×106〜107）をPBS中に浮遊させ、500×ｇ、３分間遠心分離した後４％パラホルムアルデヒドで室温、15分間固定した。PBSで洗浄後、0.1％の牛血清アルブミンを含むTBSで0.1％に希釈したTritonX−100で室温、５分間処理した。洗浄バッファー（１％牛胎児血清と0.1％アジ化ナトリウムを含むPBS）で２回洗浄後、抗ヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体KM1135（20μg/ml）を細胞調製液100μｌ当り2.5μｌ加えて、氷上20分間反応させた。洗浄バッファーで２回洗浄後、FITC標識抗マウスIgG抗体（Zymed社、1000倍希釈）で氷上20分間反応させた。洗浄バッファーで２回洗浄後、フローサイトメーターを用いて測定した。その結果、第６図に示したように、健常人と細菌感染患者由来末梢血単核細胞は、KM1135と反応しないかあるいは非常に弱くしか反応しなかったのに対し、ウィルス感染患者由来末梢血単核細胞は、KM1135と強く反応した。
産業上の利用可能性
本発明により、ウィルス感染状態の診断などに有用なヒトMx蛋白質MxAモノクローナル抗体が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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