【手続補正書】
【提出日】平成28年12月12日(2016.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量で定義された（mass-defined）薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、
複数の薬物候補を生成し、前記薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、
質量分析を利用して前記複数の薬物候補を分析して、前記薬物候補の少なくとも幾つかに関して前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び
薬理学的性質に基づいて作製された、前記複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、
を含み、前記質量で定義された薬物候補ライブラリー内の前記薬物候補の同一性が、前記薬物候補それぞれの前記特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法。
【請求項２】
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、ターゲットに結合する能力、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の薬物候補が、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の薬物候補が、ノットのあるペプチド（knotted-peptides）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の薬物候補の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの薬物候補の前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
軽い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
前記重い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記軽い結び目のあるペプチドが、前記重い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記重い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む、請求項９および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の部分にコンジュゲートされていて、前記重い結び目のあるペプチドが、第二の部分にコンジュゲートされている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、それぞれ前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一及び第二の送達経路が、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、又は吸入経路から選択される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの１３Ｃ原子が、前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方の
中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記軽い結び目のあるペプチド、前記重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方が、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の薬物候補が、ペプチド、タンパク質又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の薬物候補が、リジン残基を欠くペプチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の薬物候補が、チップによるオリゴヌクレオチド合成を利用して生成される、請求項１〜８および１７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の薬物候補のうちの少なくとも１つの薬物候補が、前記少なくとも１つの薬物候補を対象において追跡するための検出可能な標識を含む、請求項１〜８および１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
薬理学的性質を有するペプチドを同定する方法であって、
複数のペプチドを含む組成物を対象に投与すること；
前記複数における前記ペプチドのうちの少なくとも幾つかを含む試料を前記対象から得ること；
前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記ペプチドのうちの前記少なくとも幾つかの同一性を決定すること；及び
前記ペプチドのうちの前記少なくともいくつかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性のうちの１つまたは複数の活性を示すかを同定すること
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本開示の幾つかの態様において、クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、本開示によるペプチドを含む医薬組成物、又は本開示のペプチドを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与し、それにより該疾患を処置することを含む、方法が提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
複数の薬物候補を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析すること；及び
前記単離された試料中で、前記薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、
を含む、方法。
（項目２）
薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；
前記複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を前記対象から得ること；及び
前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
を含む、方法。
（項目３）
前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記複数の薬物候補が、複数のペプチドを含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目５）
前記複数の薬物候補が、複数の低分子化学分子を含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目６）
前記複数の薬物候補が、複数の生物製剤を含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目７）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌に関連づけられる、項目９又は１０に記載の方法。
（項目１２）
前記対象から複数の試料を得ることをさらに含み、各試料が前記複数のペプチドを投与した後の異なる時点で得られる、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記複数の試料のうちの少なくとも幾つかの試料を分析して、前記複数のうちの各試料において、前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定することをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性が、質量分析を利用して決定され、そこで前記ペプチドのそれぞれが、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記対象において前記少なくとも１つのペプチドを追跡するために検出可能な標識を含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、前記少なくとも１つのペプチドが、前記疎水性部分を欠く前記少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記疎水性部分が、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記試料が、組織試料又は体液試料を含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記体液試料が、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記試料が、血液を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記組織試料が、生検又は剖検組織を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記組織が、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む、項目２０又は２３に記載の方法。
（項目２５）
前記薬物候補に共通する前記薬理学的性質を利用して、前記薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象が、動物である、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記対象が、ヒトである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
質量で定義された（mass-defined）薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、
複数の薬物候補を生成し、前記薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、
質量分析を利用して前記複数の薬物候補を分析して、前記薬物候補の少なくとも幾つかに関して前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び
薬理学的性質に基づいて作製された、前記複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、
を含み、前記質量で定義された薬物候補ライブラリー内の前記薬物候補の同一性が、前記薬物候補それぞれの前記特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法。
（項目３４）
薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、
複数の薬物候補を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記ライブラリー薬物候補が、項目３３に記載の質量で定義された薬物候補ライブラリーのものであること；及び
前記単離された試料中で、前記薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、
を含む、方法。
（項目３５）
薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、
項目２６に記載の質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである、複数のライブラリー薬物候補を対象に投与すること、
前記対象から、前記複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を得ること、及び
前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
を含む、方法。
（項目３６）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む、項目３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記複数の薬物候補が、ノットのあるペプチド（knotted-peptides）を含む、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記複数の薬物候補の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの薬物候補の前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される、項目３９又は４０に記載の方法。
（項目４４）
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む、項目４３又は４４に記載の方法。
（項目４６）
前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記複数の結び目のあるペプチドが、１００を超えるペプチド、１０００を超えるペプチド、又は１００００を超えるペプチドを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４８）
前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、項目３３〜４７に記載の方法。
（項目４９）
前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、項目３３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
軽い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結
び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
前記重い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
を含む、方法。
（項目５４）
異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
軽い結び目のあるペプチドを含む組成物を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
前記重い結び目のあるペプチドを含む組成物を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
を含む、方法。
（項目５５）
前記軽い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む、項目５３又は５４に記載の方法。
（項目５６）
前記重い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む、項目５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記第一の結び目のあるペプチドが、第一の部分にコンジュゲートされていて、前記重い結び目のあるペプチドが、第二の部分にコンジュゲートされている、項目５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、それぞれ前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、疎水性部分を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記第一及び第二の送達経路が、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される、項目５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記第一又は前記第二の送達経路のいずれかが、経口経路を含む、項目５３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
少なくとも１つの１３Ｃ原子が、前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方の
中に存在する、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
前記軽い結び目のあるペプチド、前記重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方が、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する、項目５３〜６２のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、項目５３〜６３に記載の方法。
（項目６５）
前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、項目５３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；
前記複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を前記対象から得ること；及び
前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
を含む、方法。
（項目７０）
前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記複数の薬物候補が、複数のペプチドを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代
謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌に関連づけられる、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記対象から複数の試料を得ることをさらに含み、各試料が前記複数のペプチドを投与した後の異なる時点で得られる、項目７１に記載の方法。
（項目７８）
前記複数の試料のうちの少なくとも幾つかの試料を分析して、前記複数のうちの各試料において、前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性が、質量分析を利用して決定され、そこで前記ペプチドのそれぞれが、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８０）
前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補を含む、項目６９に記載の方法。
（項目８１）
前記複数の薬物候補が、１０を超える薬物候補を含む、項目６９に記載の方法。
（項目８２）
前記複数の薬物候補が、１００を超える薬物候補を含む、項目６９に記載の方法。
（項目８３）
前記複数の薬物候補が、１０００を超える薬物候補を含む、項目６９に記載の方法。
（項目８４）
前記複数の薬物候補が、１００００を超える薬物候補を含む、項目６９に記載の方法。
（項目８５）
前記複数のペプチドが、１００を超えるペプチドを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８６）
前記複数のペプチドが、１０００を超えるペプチドを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８７）
前記複数のペプチドが、１００００を超えるペプチドを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８８）
前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記対象において前記少なくとも１つのペプチドを追跡するために検出可能な標識を含む、項目７１に記載の方法。
（項目８９）
前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、前記少なくとも１つのペプチドが、前記疎水性部分を欠く少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す、項目７１に記載の方法。
（項目９１）
前記疎水性部分が、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記試料が、組織試料又は体液試料を含む、項目６９に記載の方法。
（項目９３）
前記体液試料が、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記試料が、血液を含む、項目６９に記載の方法。
（項目９５）
前記組織試料が、生検又は剖検組織を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９６）
前記組織が、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９７）
前記薬物候補に共通する前記薬理学的性質を利用して、前記薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む、項目６９に記載の方法。
（項目９８）
前記対象が、動物である、項目６９に記載の方法。
（項目９９）
前記対象が、ヒトである、項目６９に記載の方法。
（項目１００）
質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、
複数の薬物候補を生成し、前記薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、
質量分析を利用して前記複数の薬物候補を分析して、前記薬物候補の少なくとも幾つかに関して前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び
薬理学的性質に基づいて作製された、前記複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、
を含み、前記質量で定義された薬物候補ライブラリー内の前記薬物候補の同一性が、前記薬物候補それぞれの前記特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法。
（項目１０１）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０３）
前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、項目１００に記載の方法。
（項目１０４）
前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０５）
前記複数の薬物候補が、１０を超える薬物候補を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０６）
前記複数の薬物候補が、１００を超える薬物候補を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０７）
前記複数の薬物候補が、１０００を超える薬物候補を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
前記複数の薬物候補が、１００００を超える薬物候補を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０９）
前記複数の薬物候補が、結び目のあるペプチドを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１０）
前記結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記複数の薬物候補の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの薬物候補の前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１２）
前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１１３）
前記複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される、項目１０９に記載の方法。
（項目１１４）
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記複数の結び目のあるペプチドが、１００を超えるペプチドを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１８）
前記複数の結び目のあるペプチドが、１０００を超えるペプチドを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１９）
前記複数の結び目のあるペプチドが、１００００を超えるペプチドを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１２０）
異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
軽い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
前記重い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
を含む、方法。
（項目１２１）
前記軽い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記重い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２３）
前記第一の結び目のあるペプチドが、第一の部分にコンジュゲートされていて、前記重い結び目のあるペプチドが、第二の部分にコンジュゲートされている、項目１２０に記載の方法。
（項目１２４）
前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、それぞれ前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、疎水性部分を含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記第一及び第二の送達経路が、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される、項目１２０に記載の方法。
（項目１２７）
前記第一又は前記第二の送達経路のいずれかが、経口経路を含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２８）
少なくとも１つの１３Ｃ原子が、前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方の中に存在する、項目１２０に記載の方法。
（項目１２９）
前記軽い結び目のあるペプチド、前記重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方が、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する、項目１２０に記載の方法。
（項目１３０）
対象の腫瘍を画像化するためのペプチドであって、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むクロロトキシンを含み、前記腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む、ペプチド。
（項目１３１）
前記ペプチド内の前記アミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、Ｄ−アミノ酸である、項目１３０に記載のペプチド。
（項目１３２）
以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号４７）（ここで、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％、８３％、８６％、８９％、９０％又は９２％同一のアミノ酸配列を有する、項目１３０又は１３１に記載のペプチド。
（項目１３３）
以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号４７）（ここで、アミノ酸配列内のアミノ酸の少なくとも３つは、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチド。
（項目１３４）
前記ペプチド内の前記アミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％が、Ｄ−アミノ酸である、項目１３３に記載のペプチド。
（項目１３５）
検出可能な標識をさらに含む、項目１３３〜１３４のいずれかに記載のペプチド。
（項目１３６）
前記のペプチド内のアミノ酸全てが、Ｄ−アミノ酸である、項目１３０〜１３５のいずれかに記載のペプチド。
（項目１３７）
前記検出可能な標識が、前記ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされているか、又は前記ペプチド内のリジン残基にコンジュゲートされている、項目１３０〜１３２又は１３５〜１３７のいずれかに記載のペプチド。
（項目１３８）
前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、項目１３７に記載のペプチド。
（項目１３９）
前記検出可能な標識が、シアニン色素を含む、項目１３７に記載のペプチド。
（項目１４０）
項目１３０〜１３９のいずれか１項に記載のペプチド、又はそれらの組み合わせを含む組成物。
（項目１４１）
対象におけるペプチドを検出する方法であって、
前記対象に、項目１３０〜１３２のいずれかに記載のペプチド又は項目１３５〜１３９のいずれかに記載のペプチド又は項目１２６に記載の組成物の有効量を投与すること、及び検出可能な標識を検出すること、
を含む、方法。
（項目１４２）
前記検出することが、前記検出可能な標識を検出することにより前記対象における領域の画像を得ることを含む、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記検出することが、癌組織の手術中の視覚化を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記検出可能な標識の視覚化が、前記対象の腫瘍の外科的除去を誘導する、項目１４２に記載の方法。
（項目１４５）
クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、
それを必要とする対象に、項目１３０〜１３９に記載のペプチドを含む医薬組成物又は項目１４０に記載の組成物の治療有効量を投与し、それにより前記疾患を処置すること、
を含む、方法。
（項目１４６）
前記組成物の前記ぺプチドが、細胞毒性剤、毒素、アンチセンスヌクレオチド、癌用薬物、ヌクレオチド薬、代謝モジュレータ、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬物コンジュゲート、又はそれらの組み合わせをさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記疾患が、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、乳腺癌（mammary  cancer）、結腸癌、肉腫、口腔扁平上皮癌、血液外皮腫、又はそれらの組み合わせに関連する癌組織を含む、項目１４５又は１４６に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態による、様々なスカフォールドを示すゲル画像を提供する。
【図２】ＰＣＲアセンブリからタンパク質回収までの初期ライブラリー創出の図解を示す。表面残基（ＤＨＱループ）の１つの潜在的パッチを示して、初期ペプチドライブラリーのためのランダムな突然変異誘発アプローチを例示している。残基Ｋ１５及びＫ２３は、アラニンに対して化学的コンジュゲーションを容易にするように変異している。図２は、配列番号７４を開示する。
【図３】本発明の一実施形態による、ペプチドライブラリーを作製する例示的方法を示している。
【図４】本発明の一実施形態による、ペプチドライブラリーを生成する例示的方法を示している。
【図５】本発明の一実施形態による、ノッチン（例えば、バブルプロテイン（bubble  protein））を作製するのに用いられ得る例示的融合系を示している。
【図６】本発明の一実施形態による、質量分析を利用した大きなライブラリーの分析を示している。
【図７】本発明の一実施形態による、ノッチン変異体を発現するためにシデロカリン融合物を利用する例示的方法を示している。
【図８】本発明の一実施形態による、発現するノッチンスカフォールドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図９Ａ】本発明の一実施形態による、プールされたライブラリーの生成の図解を提供する。図９Ｂは、９Ａの拡大図である。図９Ａは、出現する順で、それぞれ、配列番号75〜78を開示し、図９Ｂは、出現する順で、それぞれ、配列番号79〜80を開示する。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態による、プールされたライブラリーの生成の図解を提供する。図９Ｂは、９Ａの拡大図である。図９Ａは、出現する順で、それぞれ、配列番号75〜78を開示し、図９Ｂは、出現する順で、それぞれ、配列番号79〜80を開示する。
【図１０】本発明の一実施形態による、クローン化されたノッチンライブラリーからの代表的シークエンシングデータを記載している。図10は、出現する順で、それぞれ、配列番号81〜109を開示する。
【図１１】本発明の複数の実施形態による、３０００の要素からなるノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図１２】本発明の一実施形態による、リバースプロテオミクスによる突然変異耐性の評価を示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
ペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の変異体は、ランダムにすること（縮重コドン又はエラープローンＰＣＲなどの技術による）又は完全に定義することができる。チップによるオリゴヌクレオチド合成の進展により、ＤＮＡライブラリーの作製が安価かつルーチンになり、ＤＮＡから作製されたペプチドライブラリーの組成の完全な定義を可能にした。それぞれが特有の質量フラグメント又はトリプシン分解フラグメントを有するようにペプチドを設計することにより、質量分析を、ペプチドそれぞれの存在について同時にスクリーニングするために用いることができる。幾つかの態様において、本開示は、対象の腫瘍を画像化するためのペプチドであって、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むクロロトキシンを含み、腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む、ペプチドを提供する。本開示の更なる態様において、該ペプチド内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、Ｄ−アミノ酸である。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ(配列番号47)（ここで、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％、８３％、８６％、８９％、９０％又は９２％同一のアミノ酸配列を有し得る。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ(配列番号47)（ここで、アミノ酸配列内のアミノ酸の少なくとも３つは、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本開示のペプチドは、該ペプチド内のアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％が、Ｄ−アミノ酸である。幾つかの態様において、本開示のペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。本開示の幾つかの態様において、所定のペプチド内のアミノ酸全てが、Ｄ−アミノ酸である。本開示の幾つかの態様において、検出可能な標識は、該ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされているか、又は該ペプチド内のリジン残基にコンジュゲートされている。本開示の他の態様において、検出可能な標識は、近赤外色素を含む。本開示の他の態様において、検出可能な標識は、シアニン色素を含む。本開示の様々な態様において、本明細書に記載されたペプチドのいずれか、又はそれらの組み合わせを含む組成物を、生成することができる。本発明の幾つかの態様において、対象におけるペプチドを検出する方法であって、対象に、本開示のペプチド又はその組成物の有効量を投与すること、及びそれに含まれる検出可能な標識を検出すること、を含む、方法が提供される。さらなる態様において、本開示は、検出可能な標識を検出することにより対象における領域の画像を得ることをさらに含む。さらなる態様において、該検出することは、癌組織の手術中の視覚化を含む。さらなる態様において、検出可能な標識の視覚化は、対象の腫瘍の外科的除去を誘導する。本開示の幾つかの態様において、クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本開示によるペプチドを含む医薬組成物、又は本開示のペプチドを含む組成物の治療有効量を投与し、それにより該疾患を処置すること、を含む、方法が提供される。さらなる態様において、該ペプチド組成物は、細胞毒性剤、毒素、アンチセンスヌクレオチド、癌用薬物、ヌクレオチド薬、代謝モジュレータ、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬物コンジュゲート、又はそれらの組み合わせをさらに含む。さらなる態様において、該疾患は、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、乳腺癌（mammary  cancer）、結腸癌、肉腫、口腔扁平上皮癌、血液外皮腫、又はそれらの組み合わせに関連する癌組織を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
例示的実施形態において、特定の表面残基の位置を、縮重コドンを利用したランダム突然変異誘発のターゲットとするオリゴヌクレオチド構成アプローチ（本明細書にさらに記載される）を利用して、ペプチドライブラリーを創出することができる（図２）。一態様において、該方法は、１０の特有の、又は重複する３つのアミノ酸サブドメインを変異させることにより、スカフォールドを通して解析することを含むことができる。本発明者らは、どの部位が突然変異に耐容するかを決定したら、より大きなランダム化ライブラリーを構築するであろう。これらのライブラリーは、その後、個別に、又はプール形式でスクリーニングすることができる。例えばＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位を含むプライマーを用いて、アセンブリの反応を増幅させることができ、精製されたＰＣＲ産物を、ベクター（例えば、ダイダロスベクター：ｐＣＶＬ−ｓＵＣＯＥ−ＳＦＦＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）にクローニングすることができる。得られたレンチウイルスライブラリーを利用して、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞）に形質導入して、変異体を分泌する細胞のポリクローナル集団を創出することができる。分泌された構築物を、Ｎ末端分泌シグナル及びＣ末端タグ（例えば、ＳＴＲＥＰＩＩタグ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）(配列番号34)）で操作することができる。分泌されたペプチドを、例えばサイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーを利用して、培養上清から回収することができる。多様性が限定された、又は多様性が広範囲である複数のライブラリーを、このアプローチを利用して作製することができる。分泌されたタンパク質ライブラリーの多様性を計測して、下流のスクリーニング用途での検出限界を確立するために、精製されたペプチドプールをタンデム質量分析を利用して分析することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
幾つかの態様において、本発明は、Ｄ−アミノ酸を有し、クロロトキシンスカフォールドを基にしたペプチド、例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を包含する。クロロトキシンを基にしたペプチドは、様々な量のＤ−アミノ酸を含むことができる。クロロトキシンの天然のペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ(配列番号35)。該ペプチドは、配列内に存在するシステイン残基の間に形成された４つのジスルフィド結合によりさらに架橋させることができる。天然のペプチドは、Ｌ−アミノ酸の全てを含む。化学的には、インビボで存在するものなどのキラル環境以外では、クロロトキシンの全Ｄ−アミノ酸形態が、クロロトキシンの全Ｌ−アミノ酸形態と識別不能の可能性がある。Ｄ−アミノ酸は、本質的には極めてまれであるため、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、タンパク質分解に対して抵抗性であり得る。したがってＤ−アミノ酸のクロロトキシンは、例えば対象への投与後の生体液中で、切断に抵抗し得る。こうしてＤ−アミノ酸のペプチドは、例えば経口投与することができ、より低い免疫反応を有していてもよい。Ｄ−アミノ酸は、抗原プロセシング及び提示の予防を支援し、それにより抗原性を低下させることもできる。本発明において使用されるＤ−アミノ酸としては、例えばｄＡｒｇ、ｄＨｉｓ、ｄＬｙｓ、ｄＡｓｐ、ｄＧｌｕ、ｄＳｅｒ、ｄＴｈｒ、ｄＡｓｎ、ｄＧｌｎ、ｄＣｙｓ、ｄＧｌｙ、ｄＰｒｏ、ｄＡｌａ、ｄＶａｌ、ｄＩｌｅ、ｄＬｅｕ、ｄＭｅｔ、ｄＰｈｅ、ｄＴｙｒ、及びｄＴｒｐを挙げることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
例えば本発明のペプチドを作製する方法によれば、非常に様々なクロロトキシン変異体を、作製することができる。例えば、従来の突然変異誘発及び合成に基づくシステムを利用して、何千ものクロロトキシンＤ−アミノ酸変異体を、クロロトキシンの天然由来アミノ酸配列を基にして調製することができる。幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、以下の配列：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ(配列番号35)と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８６％、８９％、９０％、９２％又は９５％同一であり、アミノ酸の全て又は幾つかがＤ−アミノ酸である、アミノ酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体は、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸である、少なくとも３つの配列内アミノ酸を有することができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも３５が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
一実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである）(配列番号36)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空
気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである）(配列番号37)。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）；分子量：４０６５．６Ｄａ(配列番号38)。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号39)。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号40)。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号41)。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである(配列番号42)）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）；分子量：４７６５Ｄａ(配列番号43)。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号44)。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号45)。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）(配列番号46)。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
例えば、本発明は、以下の配列：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ(配列番号47)（ここで、アミノ酸の幾つか又は全ては、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ又はＲを含み得る）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８６％、８９％、９０％、９２％又は９５％同一のアミノ酸配列を有する、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含むことができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体は、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸である、少なくとも３つの配列内アミノ酸を有することができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも３５が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
幾つかの実施形態において、Ｌｃｎ２との融合物としてのペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の発現を、自己開裂するＬｃｎ２と共に、ＣＩＤＧ(配列番号49)の直後のＲＡＲＹＫＲ(配列番号48)と共に、そして外部開裂されたものをその位置のＥＮＬＹＦＱ(配列番号50)と共に、利用することができる。前者は、タンパク質輸送の間に哺乳動物細胞により開裂することができ（例えば、フリンによる）、遊離Ｌｃｎ２及び結び目のあるペプチドを、周囲の培地に分泌させることができる。ＥＮＬＹＦＱ(配列番号50)は、タバコエッチプロテアーゼ部位であり、哺乳動物細胞で内在的に見出されることはない。この系の構造体は、融合物として分泌することができ、外部ＴＥＶプロテアーゼの付加により結び目のあるペプチドを後に切断することができる。これは、ノッチンを回収するのに有用となり得る。幾つかの実施形態において、ポリヒスチジン又はポリアルギニンなどの精製「ハンドル」がＬｃｎ２に付加され得、続いてタンパク質分解により除去される。結び目のあるペプチドに加えて、これらの融合系を、ケモカイン、インターロイキン、及びペプチドホルモンなどの医療的関心のある発現困難なタンパク質にも用いることができる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
４つのスカフォールド：ヘフトキシン、ＣＴＩ、クロロトキシン、及びエピレグリンを、定義されたライブラリーの作製のために選択した。ターゲットアミノ酸配列のリストを、インシリコで作製することで、それぞれのライブラリーの各要素が、特有の質量のトリプシン分解フラグメントを有するようにし、結合エピトープを作製するために、突然変異が構造的に隣接するように選択した。システインは、突然変異を受けず、リジンは、Ｎ末端コンジュゲーションを明確にするために特異的に回避させた。各スカフォールドの３０００の変異体を作製して、各スカフォールドをＰＣＲプライマー部位の特有の組み合わせにより隣接させ、それにより４つのサブライブラリーそれぞれを、独立に増幅させることができた。全ての構築物が、Ｎ末端ＢａｍＨＩ部位及びＣ末端ＮｏｔＩ部位を有し、１２０００のオリゴヌクレオチドのプールからの各サブライブラリーのＰＣＲ増幅に続いて、標準の技術を利用して、各サブラリーを制限消化して、切断された親ベクター（フリン切断物とＴＥＶ切断物の両方）にＬｃｎ２融合タンパク質としてクローニングした。ＨＫ２９３細胞をこのプラスミドライブラリーと、ダイダロス発現に必要となる補助的プラスミドをトランスフェクトし、培地中のウイルスを３〜４日後に回収した。ウイルスを遠心分離により濃縮して、標準手順を利用したタンパク質生成のためにＨＥＫ２９３細胞に感染させるために使用した。本発明者らは、ＴＥＶ切断可能な構築物が、ニッケル樹脂上のＩＭＡＣによる融合物の回収を容易にすることができるため、その構築物がライブラリー生成の際に技術的により容易に取り扱えることを見出した。ＩＭＡＣに続いて、融合タンパク質をＰＢＳで透析して、６×ＨＩＳタグ(配列番号51)ＴＥＶプロテアーゼで一晩切断させ、次に再度ニッケル樹脂を用いて材料を処理することにより、Ｌｃｎ２及びプロテアーゼを除去した。切断されたペプチドライブラリーを含有するフロースルーを更に精製して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により１０ｍＭギ酸アンモニウムにバッファー交換して、ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥させた。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
ペプチド：ハヤトウリ由来トリプシン阻害剤の３０００の変異体の質量を指標とするライブラリーを、インシリコで創出した。ペプチド内のリジン残基は全て、アルギニン残基に変化した。得られた配列は、ＣＰＲＩＬＭＲＣＲＬＤＴＤＣＦＰＴＣＴＣＲＰＳＧＦＣＧ(配列番号52)であった。この配列のＧ１及びＳ２を、分子のＮ末端に付加した。スカフォールドの分子構造を用手法で分析して、スカフォールド構造を破壊せずに変化させ得る配列部分を同定した。同定されたアミノ酸残基は、Ｍ８、Ｒ９、Ｌ１２、Ｄ１３、Ｔ１４、Ｆ１７、Ｐ１８、Ｔ１９、Ｔ２１、Ｒ２３、Ｐ２４、Ｓ２５、Ｇ２６を含んだ。同定されたアミノ酸は、Ｒ２３、Ｐ２４、Ｓ２５、及びＧ２６であり、それぞれβターンの１〜４の位置に配置されていた。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
プール内に３つを超えるトリプトファン残基が保持された変異体はなかった。プールの各要素の逆翻訳を、ＤＮＡ合成のために選択した。ＤＮＡ合成の間、Ｎ末端ＧＳ部分のコード化を、ＧＧＡＴＣＣに変更した。さらに５’配列：
ＡＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡＧ(配列番号53)及び３’配列：ＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＣ(配列番号54)を、プールの各要素に付加した。プールの特定の要素が選択されない限り、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）又はＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）制限部位を含まないように逆翻訳を選択した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
配列
以下の記述は、本明細書で同定された該当する遺伝子及び構築物のＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列である。
シームレスクローニングのための親構築物の構築：
【化１】
2016505826.tif 000001
シームレスクローニングにより先のＮｏｔＩ切断による親配列にクローニングされた融合
タンパク質配列（本来の１０の組み合わせ）：
【化２】
2016505826.tif 000002
【化３】
2016505826.tif 000003
【化４】
2016505826.tif 000004
【化５】
2016505826.tif 000005
【化６】
2016505826.tif 000006
【化７】
2016505826.tif 000007
【化８】
2016505826.tif 000008
【化９】
2016505826.tif 000009
【化１０】
2016505826.tif 000010
【化１１】
2016505826.tif 000011
【化１２】
2016505826.tif 000012
【化１３】
2016505826.tif 000013
【化１４】
2016505826.tif 000014
【化１５】
2016505826.tif 000015
【化１６】
2016505826.tif 000016
【化１７】
2016505826.tif 000017
【化１８】
2016505826.tif 000018
【化１９】
2016505826.tif 000019
【化２０】
2016505826.tif 000020
【化２１】
2016505826.tif 000021
ＢａｍＨ１／ＮｏｔＩクローニングのための親構築物の構築：
【化２２】
2016505826.tif 000022
ＢａｍＨＩ部位が、ノッチンの前に「ＧＳ」を付加する。この構築物は、ライブラリーをクローニングするために用いることができる。
フリン開裂のための親構築物の構築。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩクローニングは理想的なフリン切断部位：RARYKRS（配列番号67）−RARYKRGS（配列番号68）を含むことができ、それはＢａｍ  ＨＩ部位に用いることができる。
【化２３】
2016505826.tif 000023
【化２４】
2016505826.tif 000024
【化２５】
2016505826.tif 000025
【化２６】
2016505826.tif 000026
【化２７】
2016505826.tif 000027
【化２８】
2016505826.tif 000028
【化２９】
2016505826.tif 000029
【化３０】
2016505826.tif 000030
【化３１】
2016505826.tif 000031
【化３２】
2016505826.tif 000032
【化３３】
2016505826.tif 000033