【手続補正書】
【提出日】平成29年3月3日(2017.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの樹状細胞の集団であって、前記同じ対象からの肝細胞癌癌幹細胞(ＨＣＣ−ＣＳＣ)を含む肝細胞癌細胞を含む肝腫瘍試料由来の肝細胞癌特異的ペプチドを含む前記樹状細胞の集団、を含む免疫原組成物であって、
前記癌幹細胞集団が少なくとも５０％癌幹細胞であり、
前記肝腫瘍試料由来のＨＣＣ−ＣＳＣは無血清培地中でin vitroで培養された場合にスフェロイドを形成することによって特徴づけられ、
前記癌幹細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＡＴＰ−結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、サトケラチン７（ＣＫ７）、ｃ−ｋｉｔ、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４ａ）、Ｋｉ６７、Ｎａｎｏｇ、Ｎ−カドヘリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ；ＣＤ５６）、Ｏｃｔ３／４、Ｏｖ１、ＯＶ６、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）／Ｓｎａｉｌ（ＳＮＡＩ１）、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ７、Ｔｗｉｓｔおよびビメンチンからなる群より選ばれる１以上のバイオマーカーを発現することによって特徴づけられる、
前記免疫原性組成物
【請求項２】
肝細胞癌癌幹細胞（ＨＣＣ−ＣＳＣ）由来の肝細胞癌特異的ペプチドが、
ａ．細胞抽出物、または、
ｂ．細胞ライセート、または、
ｃ．インタクトな癌幹細胞、
の形態ある、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
インタクトなＨＣＣ−ＣＳＣが、
ａ．照射する、または、
ｂ．ＨＣＣ−ＣＳＣを核架橋剤に曝露する、
ことによって非増殖性にされているが、依然として代謝的に活性である、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
アジュバントが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＨＣＣ−ＣＳＣが、
ａ．ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドであって、前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＥｐＣＡＭ、ＯＶ１およびＯＶ６の２つ以上を発現する、または、
ｂ．初期ＨＣＣ−ＣＳＣであって、前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも約８０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔの２つ以上を発現する、
ｃ．ＨＣＣ−ＣＳＣが混成ＨＣＣ−ＣＳＣであって、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％が、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２の２つ以上を発現する、または、
ｄ．ＨＣＣ−ＣＳＣがＥＭＴ（胚間葉転換）−ＨＣＣ−ＣＳＣの形態であって、前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔの２つ以上を発現する、
請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
肝細胞癌の治療のための、請求項１に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項８】
肝細胞癌癌幹細胞（ＨＣＣ−ＣＳＣ）の集団を調製する方法であって、
ａ．肝腫瘍試料を取得することと；
ｂ．前記腫瘍試料を機械的に解離させることと；
ｃ．前記腫瘍試料を酵素的に単細胞懸濁物へ解離させること；
ｄ．前記細胞懸濁物を非接着性基質上の所定の培地中で培養して、増殖中のＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド株を作製することであって、前記所定の培地が無血清であり、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して作用する少なくとも１つの成長因子が追加されており、前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーα-フェトプロテイン(ＡＦＰ)、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現し、
ｅ．重力差分離によって前記ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを沈降させること、および、
ｆ．ｅ．のＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイドを解離させ、ｄ．の所定の培地へ移し、ｄ．の培地中で接着性条件下でin vitroで培養して前記ＨＣＣ−ＣＳＣ集団を増殖および拡大させることであって、前記ＨＣＣ−ＣＳＣ集団が、初期ＨＣＣ−ＣＳＣ亜集団、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ亜集団および胚間葉転換（ＥＭＴ）−ＨＣＣ−ＣＳＣ亜集団を含む、
前記方法。
【請求項９】
ＨＣＣ−ＣＳＣスフェロイド集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、Ｏｖ１およびＯＶ６のうちの２つ以上を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アクチビンＡ、ＦＧＦおよび無血清培地の存在下で培養した場合に初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団が生成される請求項８記載の方法であって、
a.前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、Ｏｃｔ３／４、Ｆｏｘ２Ａ、Ｏｖ１、ＯＶ６、ＣＤ１３３、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ９０のうちの２つ以上を発現する；または、
ｂ．前記初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％が、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔのうちの２つ以上を発現する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＧＦ、ＥＧＦおよび血清添加増殖培地の存在下で培養した場合、混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団が生成され、前記混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２のうちの２つ以上を発現する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ＦＧＦを含む血清添加培地で培養した場合、ＥＭＴ癌幹細胞が生成される請求項８記載の方法であって、
ａ．前記ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％の細胞が、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの２つ以上を発現する；または、
ｂ．前記集団中の細胞の少なくともが、バイオマーカーＡＦＰ、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４およびビメンチンの２つ以上を発現する；または、
ｃ．前記集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＡＦＰ、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４およびビメンチンの２つ以上を発現する；または、
ｄ．上皮マーカーＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭおよびＥ−カドヘリンの少なくとも１つの発現が消失する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔの２つ以上を発現する；または、
ｂ．混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４およびＡＢＣＧ２の２つ以上を発現する；または、
ｃ．ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔの２つ以上を発現する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がさらにバイオマーカーＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、Ｏｖ１、Ｏｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ９０の１以上を発現する；または、
ｂ．初期ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４およびｃ−ｋｉｔの１以上を発現する；
ｃ．混成ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａおよびＡＢＣＧ２の２つ以上を発現する；または、
ｄ．ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも８０％がＡＦＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４およびビメンチンのうちの１以上を発現する、または、
ｅ．ＥＭＴ−ＨＣＣ−ＣＳＣ集団中の細胞の少なくとも９０％がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔのうちの１以上を発現する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
所定の培地が
ａ．表２に記載の任意の培地である、または、
ｂ．表２と表３の組合せからの任意の培地である、または、
ｃ．表２、表３および表４の組合せからの任意の培地である、または、
ｄ．表２と表４の組合せからの任意の培地である、
請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
成長因子が、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはアクチビンＡのうちの１または複数である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦが塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所定の培地はアクチビンＡまたは抗酸化剤が追加されていない、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
所定の培地がＨＣＣ-ＣＳＳの自然分化を防止するのに有効な量で、アクチビンＡのアゴニストが追加されている、または、アクチビンＡのアンタゴニストが追加されている、または、グルタチオンが追加されている、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
肝細胞癌に対する免疫応答を刺激するための、請求項１記載の免疫原性組成物であって、前記免疫応答が、
（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、
（ii）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、および、
（iii）Ｂ細胞応答、
の１以上である、前記免疫原性組成物。