【手続補正書】
【提出日】平成29年9月21日(2017.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
ＧＵＳ活性アッセイのプロトコルは、ＧＵＳプロトコル：遺伝子発現のレポーターとしてＧＵＳを使用する（Ｅｄ．Ｓｅａｎ  Ｒ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２）から作成した。このプロトコルは、９６ウェルプレートで行うために変更した。このアッセイでは、タンパク質抽出物緩衝液（５％グリセロールを含むＧＵＳアッセイベース緩衝液）を用いて、ＺＷ１−ＺＰ１３３２  ＃１１及び＃１２タンパク質抽出物を２０倍に希釈し、ＺＷ１−ＺＰ１３３７  ＃１及び＃８タンパク質抽出物を８０倍に希釈した。新しいＧＵＳアッセイワーキング緩衝液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を、３，９３０μＬのＧＵＳアッセイベース緩衝液、２０μＬの１Ｍ  ＤＴＴ、及び５０μＬの１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧ）と混合して調製し、３７℃に予熱した。Ｆａｌｃｏｎ９６ウェル平底プレートも、２００μＬの０．４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３停止液を各ウェルに添加することによって準備した。ＧＵＳアッセイ反応を、２５μＬの希釈タンパク質抽出物及び１００μＬの予熱ＧＵＳワーキング緩衝液を添加することによって０．２ｍＬのＰＣＲ管で開始させ、次いで３７℃でインキュベートした。１５分後、３０分後、４５分後、及び６０分後に、２５μＬの反応液を反応管から除去し、準備した９６ウェルプレートで即座に２００μＬの停止液と混合した。３つの併発反応を、各タンパク質抽出物で行った。２０μＬのＧＵＳアッセイワーキング緩衝液と５μＬのタンパク質抽出物緩衝液との混合物を盲験としてウェルに添加した。反応の完了後、９６ウェルプレートをＶｉｃｔｏｒ  ＩＩＩプレートリーダーでスキャンして、各ウェルのＯＤ４０５を決定した。盲験の測定値を各反応から差し引いた。β−グルクロニダーゼによる４−ニトロフェノールの放出を反映する平均ＯＤ４０５を、反応時間に対してプロットし、１分当たりのＯＤ４０５の変化を示す勾配Ｓ（ＯＤ４０５／分）を得た。最後に、反応速度Ｒ（ＯＤ４０５／μｇタンパク質／分）を、反応勾配Ｓ及び反応に加えられたタンパク質の量に基づいて計算した。各タンパク質抽出物の反応勾配（Ｓ）及び反応速度（Ｒ）は、以下の表２に示されている。平均反応速度を使用して、Ｐｇａｐに対するプロモーター強度を示す相対活量を計算した。この結果は、ＰｇａｐＵプロモーターが、Ｐｇａｐプロモーターよりも約４．４倍高い強度を有することを実証した。
【表２】
2016531555.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．配列が配列番号１で示されている天然Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの９０位でＣのＴでの塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む合成核酸分子。
２．配列番号２、４、６、及び７からなる群から選択されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む合成核酸分子。
３．異種核酸分子に機能的に連結された上記１又は２に記載の合成核酸分子を含むキメラ遺伝子。
４．前記異種核酸分子が、タンパク質又はペプチドをコードする、上記３に記載のキメラ遺伝子。
５．前記異種核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及び干渉ＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ分子をコードする、上記３に記載のキメラ遺伝子。
６．上記１又は２に記載の合成核酸分子を含むベクター。
７．ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法であって、上記１又は２に記載の合成核酸分子を前記細胞に導入するステップを含む、方法。
８．導入するステップが、上記１又は２に記載の合成核酸分子を前記細胞のゲノムに組み込むステップ、又は前記細胞内で安定に複製するプラスミドを維持するステップを含む、上記７に記載の方法。
９．ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、上記１又は２に記載の合成核酸を含む組換え細菌株。
１０．単離核酸分子が、キメラ遺伝子のプロモーターである、上記９に記載の組換え細菌株。
１１．前記キメラ遺伝子が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、及びリボロース−リン酸３−エピメラーゼからなる群から選択される酵素をコードする単離核酸分子を含む、上記１０に記載の組換え細菌株。
１２．改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモー
ターを作製する方法であって：
ａ）ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む核酸断片を単離するステップ、及び
ｂ）前記単離した断片に、ａ）９０位におけるＣのＴでの塩基置換を導入し、これにより、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製するステップ
を含む、方法。
１３．上記１２に記載の方法によって作製される、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が配列番号１で示されている天然Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの９０位でＣのＴでの塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む合成核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、４、６、及び７からなる群から選択されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター配列を含む合成核酸分子。
【請求項３】
異種核酸分子に機能的に連結された請求項１又は２に記載の合成核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の合成核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法であって、請求項１又は２に記載の合成核酸分子を前記細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項６】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）及びザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の合成核酸を含む組換え細菌株。
【請求項７】
改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製する方法であって：
ａ）ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）又はザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域を含む核酸断片を単離するステップ、及び
ｂ）前記単離した断片に、ａ）９０位におけるＣのＴでの塩基置換を導入し、これにより、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを作製するステップ
を含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって作製される、改善された合成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。