(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む過程によって作製される、インサイチューで天然のＰｒＰＳｃと特異的に結合する１０８l/molの結合親和性を有する抗体：
(a)ファージ上において抗体ライブラリーを合成する段階であり、該ファージが、両ＰｒＰ遺伝子が除去されかつ免疫反応を惹起するためにＰｒＰＳｃにより免疫化された哺乳動物由来の遺伝材料を含むものである段階、
(b)ファージをＰｒＰ蛋白質を含む組成物と接触させることにより、試料に対してライブラリーをパニングする段階、及び
(c) インサイチューで天然のＰｒＰＳｃ蛋白質と結合するファージを単離する段階。
【請求項２】
ファージ上における抗体ライブラリーが、
(1a)免疫応答を生じさせるための、ＰｒＰ蛋白質による、内因性の両ＰｒＰ遺伝子が除去されている宿主哺乳動物の免疫化、
(2a)宿主哺乳動物からの、抗体の産生を引き起こす細胞の採取、
(3a)(2a)の細胞からのRNAの単離、
(4a)cDNAを作製するためのRNAの逆転写、
(5a)プライマーを用いてのcDNAの増幅、及び
(6a)抗体がファージ上に発現されるようなファージディスプレイベクターへの(5a)のcDNAの挿入、
によって調製される、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
リポソーム中に分散された抗原が、プロテイナーゼKによって消化されないＰｒＰＳｃのコア部分であって、該コア部分がビオチン化されている、リポソーム中に分散された抗原に対して抗体をパニングする段階、をさらに含む過程によって得られる、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
以下の段階を含む、ある供給源中のヒトＰｒＰＳｃを検出する方法：
ヒトＰｒＰＳｃを含むことが疑われる供給源を、インサイチューで供給源中に存在する天然のヒトＰｒＰＳｃの50％またはそれ以上と特異的に結合する診断的有効量の請求項１〜３に記載の抗体と接触させる段階、および、該抗体が供給源中の何らかの材料と特異的に結合するか否かを判定する段階。
【請求項５】
支持体の表面、および、支持体の表面と結合した請求項１〜３に記載の抗体であって、インサイチューで天然のＰｒＰＳｃに対して１０８l/molのKaを有することを特徴とする抗体、を含むアッセイ。
【請求項６】
抗体が、液体流動可能な試料中に存在するＰｒＰＳｃの50％またはそれ以上と結合する能力によって特徴付けられる、請求項5記載のアッセイ。
【請求項７】
複数の異なる抗体が支持体の表面に結合していて、それぞれの抗体がＰｒＰＳｃに対して１０８l/molのKaを有する、請求項5記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
発明の分野
本発明は、抗体を入手するための方法、および該抗体を使用するためのアッセイに関する。より具体的には、本発明は、天然発生型のＰｒＰＳｃと特異的に結合する抗体を入手するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発明の背景
プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系の海綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。現在の有力な仮説は、プリオン蛋白質の感染性には核酸成分は必要でないというものである。さらに、１つの種の動物（例えばヒト）を感染させるプリオンは、別の種（例えばマウス）を感染させないと考えられる。
【０００３】
プリオンおよびこれによって引き起こされる疾患の研究における重要な段階は、プリオン蛋白質（「ＰｒＰ」）と命名された蛋白質の発見および精製であった［Ｂｏｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：１３０９〜１１（１９８２）；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：６９４２〜５０（１９８２）；ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｃｅｌｌ  ３５：５７〜６２（１９８３）］。その後、プリオン蛋白質をコードする完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。ＰｒＰｃは単一コピーの宿主遺伝子によってコードされ［Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  ４６：４１７〜２８（１９８６）］、通常は神経細胞の外表面に認められる。プリオン病は、ＰｒＰｃがＰｒＰＳｃと呼ばれる変異型に変換されることによって起こる。しかし、ＰｒＰｃの実際の生物学的または生理学的な機能は不明である。
【０００４】
動物およびヒトの伝染性神経変性疾患の伝染および発病にはいずれもプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）のスクレイピー型アイソフォームが必要である。これについては、プルシナー（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，  Ｓ．Ｂ）、「プリオン病の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｉｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１５１５〜１５２２（１９９１）を参照されたい。動物で最も頻度の高いプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、ならびにウシの牛海綿状脳症（ＢＳＥ）である［Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈ，  ＪおよびＷｅｌｌｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｕｎｏｌ．  １７２：２１〜３８（１９９１）］。ヒトでは以下の４種類のプリオン病が確認されている：（１）クルー、（２）クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）［Ｇａｊｄｕｓｅｋ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７：９４３〜９６０（１９７７）；Ｍｅｄｏｒｉら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２６：４４４〜４４９（１９９２）］。ヒトのプリオン病が散発性、遺伝性および感染性の疾患として出現する理由は、当初は謎であったが、現在ではＰｒＰの細胞遺伝学的な由来によって説明されている。
【０００５】
ＣＪＤ患者の大部分は散発性であるが、約１０〜１５％はヒトＰｒＰ遺伝子の変異によって生じる常染色体優性遺伝疾患として遺伝する［Ｈｓｉａｏら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４０：１８２０〜１８２７（１９９０）；Ｇｏｌｄｆａｒｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８０６〜８０８（１９９２）；Ｋｉｔａｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）（１９９４）］。死体脳下垂体に由来するヒト成長ホルモン、および硬膜移植片に起因する医原性ＣＪＤも発生している［Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：２４〜２７］。ＣＪＤと、スクレイピーに感染したヒツジの肉の消費などの感染原因との関係を明らかにするために多くの試みがなされたが、医原的に引き起こされた発症例を除いて、現在までに同定されたものはない［Ｈａｒｒｉｅｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５１：１１１３〜１１１９（１９８８）］。一方、ニューギニア高地に住むフォレ族および近隣種族に数十年にわたって病害をもたらしてきたクルーは、儀式として行われるカニバリズム（人喰い）の際の感染によって蔓延したと考えられている［Ａｌｐｅｒｓ，  Ｍ．  Ｐ．、神経系の遅発性伝染病（Ｓｌｏｗ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）、第１巻、Ｓ．  Ｂ．  ＰｒｕｓｉｎｅｒおよびＷ．Ｊ．  Ｈａｄｌｏｗ編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｏｒｅｓｓ）、ｐｐ．  ６６〜９０（１９７９）］。
【０００６】
ＣＪＤの実験用霊長類への一次伝染（ｉｎｉｔｉａｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）には、ウィリアム・ハドロー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｄｌｏｗ）によるクルーとスクレイピーとの類似性の認識にさかのぼる長い歴史がある。１９５９年にハドローは、クルーが原因で死亡した患者から調製した抽出物を非ヒト霊長類に接種してその動物の観察を続ければ、長期の潜伏期の後に本症を発病することが予想されると提唱した［Ｈａｄｌｏｗ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ２：２８９〜２９０（１９５９）］。７年後に、ガジュセック（Ｇａｊｄｕｓｅｋ）、ギブス（Ｇｉｂｂｓ）およびアルパース（Ａｌｐｅｒｓ）は、クルーにチンパンジーへの伝染性があり、潜伏期が接種後１８〜２１カ月であることを示した［Ｇａｊｄｕｓｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０９：７９４〜７９６（１９６６）］。クルーの神経病理学的所見とＣＪＤのそれとの類似性［Ｋｌａｔｚｏら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８：７９９〜８４７（１９５９）］が契機となり、後者にもチンパンジーを用いた類似の実験が行われ、ＣＪＤも伝染することが１９６８年に報告された［Ｇｉｂｂｓ，  Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６１：３８８〜３８９（１９６８）］。過去２５年の間に、ＣＪＤ、クルーおよびＧＳＳの約３００症例がさまざまな無尾猿および有尾猿（ａｐｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ）へ伝染している。
【０００７】
このような実験に伴う高額の出費、動物数の不足、およびしばしば指摘される非人道性などは、この種の研究を制約しており、このため、知識の蓄積の妨げとなっている。最も信頼性の高い伝染データは非ヒト霊長類を用いた試験によって得られるとの指摘は以前からあるが、ヒトプリオン病の症例の一部は、明らかに規則性には欠けるものの、齧歯類にも伝染している［Ｇｉｂｂｓ，  Ｊｒ．ら、神経系の遅発性伝染病（Ｓｌｏｗ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）、第２巻、Ｓ．  Ｂ．  ＰｒｕｓｉｎｅｒおよびＷ．Ｊ．  Ｈａｄｌｏｗ編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｏｒｅｓｓ）、ｐｐ．  ８７〜１１０（１９７９）；Ｔａｋｅｉｓｈｉら、ヒトおよび動物のプリオン病（Ｐｒｉｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｐｒｕｓｉｎｅｒら編（Ｌｏｎｄｏｎ：Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ）、ｐｐ．  １２９〜１３４（１９９２）］。
【０００８】
パッチソン（Ｐａｔｔｉｓｏｎ）は、ヒツジと齧歯類との間のスクレイピー病原体の移行に関する研究の中で、ヒトプリオン病の齧歯類への伝染が稀であることを「種間障壁」の例として挙げている［Ｐａｔｔｉｓｏｎ，  Ｉ．Ｈ．，  ＮＩＮＤＢ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ２，  Ｄ．Ｃ．  Ｇａｊｄｕｓｅｋ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｇｉｂｂｓ，  Ｊｒ．およびＭ．Ｐ．  Ａｌｐｅｒｓ編（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．：  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、ｐｐ．  ２４９〜２５７（１９６５）］。以上の調査では、プリオンの１つの種から他の種への一次的移行には長期の潜伏期が必要であり、また発症に至る動物は稀であった。一方、同一種における二次的移行は、すべての動物が発症し、潜伏期間も著しく短いことが特徴である。
【０００９】
シリアンハムスター（ＳＨａ）とマウスとの間にみられる種間障壁の分子的基盤はＰｒＰ遺伝子の配列にあることが、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを用いて示されている［Ｓｃｏｔｔら、Ｃｅｌｌ  ５９：８４７〜８５７（１９８９）］。ＳＨａＰｒＰとＭｏＰｒＰとは、２５４アミノ酸残基のうち１６カ所が異なる［Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  ４６：４１７〜４２８（１９８６）；Ｌｏｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：６３７２〜６３７６（１９８６）］。ＳＨａＰｒＰを発現しているＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスでは、ＳＨａプリオンを接種した際の潜伏期に短縮が認められる。ヒトまたはヒツジＰｒＰの導入遺伝子を発現したマウスで同じような試験を行った場合には種間障壁は解消されず、感染した動物の比率は極めて低く、潜伏期も極めて長い。したがって、例えばヒトプリオンの場合には、何らかの試料がプリオンに感染しているか否かを判定するために試料を確実に試験することを目的として、トランスジェニック動物（別の種のＰｒＰ遺伝子を含むマウスなど）を用いることはできない。このような試験が存在しないことによる健康上のリスクの重大性は以下に例示する。
【００１０】
ヒト脳下垂体に由来するＨＧＨを投与された後にＣＪＤを発症した若年成人の数は４５例を上回る［Ｋｏｃｈら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１３：７３１〜７３３（１９８５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：２４〜２７（１９９２）；Ｆｒａｄｋｉｎら、ＪＡＭＡ  ２６５：８８０〜８８４（１９９１）；Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｂｒ．  Ｍｅｄ．Ｊ．  ３０２：８２４〜８２８（１９９１）］。幸いなことに今日では組換えＨＧＨが用いられているが、ＨＧＨの高値によって誘発されるｗｔＰｒＰｃの発現の増強がプリオン病の発病を引き起こす可能性がわずかながらあることも指摘されている［Ｌａｓｍｅｚａｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９６：１１６３〜１１６９（１９９３）］。脳下垂体から調製されたＨＧＨがプリオンによって汚染されていることは、疑いのあるロットのＨＧＨを接種されたサルが６６カ月後にプリオン病を発症したことからも裏づけられている［Ｇｉｂｂｓ，  Ｊｒ．ら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２８：３５８〜３５９（１９９３）］。プリオン病の潜伏期が長いことから、医原性ＣＪＤの全容が明らかになるには何十年もかかり、その間に世界中の多数の人々がＨＧＨを投与された。医原性ＣＪＤは、ヒト脳下垂体由来の性腺刺激ホルモンを投与された不妊症の女性４例［Ｈｅａｌｙら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０７：５１７〜５１８（１９９３）；Ｃｏｃｈｉｕｓら、Ａｕｓｔ．  Ｎ．Ｚ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２０：５９２〜５９３（１９９０）；Ｃｏｃｈｉｕｓら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５５：１０９４〜１０９５（１９９２）］のほか、硬膜移植を受けた少なくとも１１例に発症したとみられている［Ｎｉｓｂｅｔら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ２６１：１１１８（１９８９）；Ｔｈａｄａｎｉら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ６９：７６６〜７６９（１９８８）；Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ５４：９４０（１９９１）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：２４〜２７（１９９２）］。このような医原性ＣＪＤの症例の存在は、プリオンによって汚染された可能性のある医薬品に対するスクリーニングの必要性を強調するものである。
【００１１】
最近、フランスの２人の医師が、死体から抽出した成長ホルモンを投与された小児に対する過失致死の罪で告発された。この小児はクロイツフェルト・ヤコブ病を発症した。（Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｓｉｓｔ，  Ｊｕｌｙ  ３１，  １９９３，  ４ページを参照）。パスツール研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によれば、１９８３年から１９８５年中期までにヒト成長ホルモンを投与された若年者におけるＣＪＤの発症例は１９８９年以来２４例報告されている。これらの小児の１５例はすでに死亡した。現在では、死体から抽出した成長ホルモンを投与されたフランスの小児数百人がＣＪＤを発病する危険にさらされていると考えられる（Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｓｉｓｔ，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０，  １９９３，  １０ページ参照）。ＰｒＰモノクローナル抗体を作出しようという今までの試みは、失敗に終わっている（ＢａｒｒｙおよびＰｒｕｓｉｎｅｒ，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｖｏｌ．  １５４，  Ｎｏ．３，  ５１８〜５２１（１９８６）参照）。したがって、疾患の原因となる化合物を検出するための解析法が必要である。特に、ＣＪＤの原因となるプリオンが試料材料中に存在するか否かを試験するための簡便で費用効果の高い解析系に対する必要性が明らかに存在する。本発明はこのような解析法を提供するものである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
発明の概要
本発明の抗体は、インサイチューで、天然のプリオン蛋白質（すなわち、天然のＰｒＰＳｃ）と高度の結合親和性を示して特異的に結合すると考えられる。本抗体は、ある基質の上に配置し、ある試料に関して、その試料が病原型のプリオン蛋白質を含むか否かを判定するためのアッセイに用いることができる。本抗体は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を特徴とする：（１）感染性プリオンを中和する能力、（２）インサイチューでプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）と結合する、すなわち細胞培養物中またはインビボで、プリオン蛋白質の処理（例えば変性させる）を要せずに天然型のプリオン蛋白質と結合する、および（３）組成物中のＰｒＰＳｃ型（すなわち疾患型）プリオン蛋白質の高い比率と結合する、例えばＰｒＰＳｃ型プリオン蛋白質の５０％またはそれ以上と結合する。好ましい抗体は、さらに（４）特定の種の哺乳動物のみのプリオン蛋白質と結合する、例えばヒトプリオン蛋白質とは結合するがその他の哺乳動物のプリオン蛋白質とは結合しない、という能力を特徴とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
１つの重要な目的は、天然のプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）と結合する抗体を提供することである。
【００１４】
もう１つの目的は、特定の種の動物のプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）のエピトープと特異的に結合し、その他の種の動物のプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）とは結合しない抗体を提供することである。
【００１５】
もう１つの目的は、疾患に関連したプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）（例えばヒトＰｒＰＳｃなど）と特異的に結合し、疾患に関連しない変性ＰｒＰ蛋白質（例えばヒトＰｒＰＣ）とは結合しないモノクローナル抗体を提供することである。
【００１６】
さらにもう１つの目的は、１つまたはそれ以上の種の動物に由来する１つまたはそれ以上の種類のプリオン蛋白質と結合する能力を特徴とするさまざまな特異的抗体の作製を可能とするための具体的な方法を提供することである。
【００１７】
本発明のもう１つの目的は、ＰｒＰＳｃ型のＰｒＰ蛋白質を検出するためのアッセイを提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、疾患に関連したプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）と疾患に関連しないＰｒＰＣとの区別を可能とするためのアッセイを提供することである。
【００１９】
もう１つの目的は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコまたはニワトリなどの特定の種の天然のＰｒＰＳｃと特異的に結合するプリオンを検出することである。
【００２０】
本発明の１つの利点は、ある試料における天然のＰｒＰＳｃの存在を検出するための、迅速で、効率的で、経済的なアッセイが提供されることである。
１つの明確な利点は、本アッセイを、該プリオンを含む可能性がある医薬品（天然の供給源に由来するもの）、食品、化粧品または任意の材料などの製品におけるプリオン（すなわちＰｒＰＳｃ）の有無に関するスクリーニング法として用いることができ、これによって、この種の製品の安全性に関するさらなる保証が提供されることである。
もう１つの利点は、ＰｒＰＣを変性させるプロテアーゼとともに本抗体を用いることができ、それによって感染型（ＰｒＰＳｃ）プリオンと非感染型（ＰｒＰＣ）プリオンとを区別するための手段が提供されることである。
本発明のさらにもう１つの利点は、本発明の抗体が、例えばＰｒＰＳｃを中和するなど、天然型のプリオンの感染性を中和する能力によって特徴づけられることである。
もう１つの利点は、本発明の抗体が、インサイチューで（ＰｒＰＳｃ）プリオン蛋白質と結合する、すなわち細胞培養物またはインビボにおいて、プリオン蛋白質を特別に処理、単離または変性させなくとも自然な状態の天然型の（ＰｒＰＳｃ）プリオンと結合すると考えられることである。
もう１つの利点は、本発明のプリオン蛋白質が、感染型のプリオン蛋白質（例えばＰｒＰＳｃ）の比較的高い割合と結合する、例えば組成物中のＰｒＰＳｃ型プリオン蛋白質の５０％またはそれ以上と結合すると考えられることである。
【００２１】
本発明の１つの重要な特徴は、本方法によって、抗体を（１）製品を精製するためのプリオンの中和、（２）プリオン蛋白質の抽出、および（３）治療法、などの用途に特に適合させる、同一または個々に操作された特徴を有する、さまざまに異なる種類のプリオン蛋白質抗体を作製することが可能となることである。
【００２２】
本発明の１つの特徴は、抗体の作製にファージディスプレイライブラリーを用いることである。
【００２３】
本発明のもう１つの特徴は、ファージに対して、その表面に抗体の特異的結合蛋白質が発現されるよう遺伝的操作を加えることである。
【００２４】
本発明の上記ならびにその他の目的、利点および特徴は、以下により完全に詳述するキメラ型遺伝子、アッセイ法およびトランスジェニックマウスに関する詳細を読むことによって当業者には明らかになると思われる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の抗体、解析法およびその使用を提供する方法を開示し説明する前に、本発明が、特定の抗体、解析法または方法に制限されるものではなく、それらは当然ながら変更がありうることが理解される必要がある。また、本明細書で用いる用語は特定の態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、それは添付した請求の範囲によってのみ制限されることも理解される必要がある。
別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意の材料および方法を利用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記載する。本明細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用される方法および／または材料を説明または開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２６】
「ＰｒＰ蛋白質」「ＰｒＰ」などの用語は、本明細書では互換可能に用いられ、ヒトおよび動物における疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染性粒子型ＰｒＰＳｃ、および適切な条件下で感染性ＰｒＰＳｃ型に変換される非感染型のＰｒＰＣの両方を意味するものとする。
【００２７】
「プリオン」、「プリオン蛋白質、および「ＰｒＰＳｃ蛋白質」などの用語は、本明細書では互換可能に用いられ、ＰｒＰ蛋白質の感染性ＰｒＰＳｃ型を意味し、「蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」および「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」の２つの単語をつなげて短縮したものであり、その全体ではないが大部分がＰｒＰ遺伝子によってコードされるＰｒＰＳｃ分子を含む。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。既知のプリオンには、動物を感染させて、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピーのほか、別名狂牛病と呼ばれるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こすものがある。ヒトが罹患するプリオン病としては、（１）クルー、（２）クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）の４種類が知られている。本明細書で用いられるプリオンには、以上の疾患のすべてもしくは任意の１つ、または用いられる任意の動物、特にヒトおよび家畜における他の疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。
【００２８】
「ＰｒＰ遺伝子」という用語は、本明細書では、図２〜５に示した蛋白質ならびに本明細書に「病原性の変異および多型」との小見出しを付けて一覧を示したものなどの多型物および変異物を発現する遺伝的材料を説明するために用いられる。「ＰｒＰ遺伝子」という用語は一般に、任意の型のプリオン蛋白質をコードする任意の種の任意の遺伝子を意味する。一般的に知られたいくつかのＰｒＰ配列は、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９０９７〜９１０１（１９９２）に記載されており、この文献はこのような配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。ＰｒＰ遺伝子は、本明細書で説明する「宿主」および「被験」動物を含む任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべての多型および変異から得ることができ、この用語は、まだ発見されていないその他のこのようなＰｒＰ遺伝子も含むことが認識される必要がある。このような遺伝子によって発現される蛋白質は、ＰｒＰＣ（非疾患型）またはＰｒＰＳｃ（疾患型）のいずれかの型であると想定される。
【００２９】
「標準化プリオン調製物」「プリオン調製物」「調製物」などの用語は、例えばプリオン病の徴候を呈する１組の哺乳動物からの脳組織などであって、その哺乳動物が、（１）本明細書に記載の導入遺伝子を含む、（２）除去された内因性ＰｒＰ遺伝子を有する、（３）遺伝的に異なる種からのＰｒＰ遺伝子の多数のコピーを有する、または（４）除去された内因性ＰｒＰ遺伝子と遺伝的に異なる種からのＰｒＰ遺伝子との雑種であるような、ＰｒＰプリオンに関連したものと実質的に同じ遺伝的材料を含む哺乳動物の脳組織から得られる、プリオン含有組成物を説明するために、本明細書では互換可能に用いられる。標準化プリオン調製物を得るための哺乳動物は、プリオンの接種の結果として、および／または例えば多数のコピーのＰｒＰ遺伝子などの遺伝的に改変された構成に起因する疾患の発症のために、ＣＮＳ機能障害の臨床徴候を呈する。
【００３０】
「人工的なＰｒＰ遺伝子」という用語は、本明細書において、「キメラ型ＰｒＰ遺伝子」のほか、宿主動物（マウスなど）のゲノムに含められた際に、例えばヒト、ウシまたはヒツジなどの遺伝的に異なる被験動物のみを通常は感染させるプリオンに対する感染性をその哺乳動物が獲得するような、組換えによって構築されたその他の遺伝子も包含するために用いられる。一般に、人工的な遺伝子には、異なるコドン、好ましくは遺伝的に異なる哺乳動物（ヒトなど）の対応するコドンとの置換によって天然の配列の１つまたはそれ以上（しかし全体ではなく、一般的には４０個未満）のコドンが遺伝的に改変されている哺乳動物のＰｒＰ遺伝子のコドン配列が含まれる。遺伝的に改変された哺乳動物は、遺伝的に異なる哺乳動物のみを感染させるプリオンに関して試料を解析するために用いられる。人工的な遺伝子の実例は、マウスのすべてのコドンがヒト、ウシまたはヒツジの異なるコドンによって置換されてはいないという条件の下で、図２、３、および４に示した通りのマウスのコドンの同じ相対的位置が、図に示したヒト、ウシおよびヒツジのコドンから選択された１つまたはそれ以上のコドンによって異なる形に置換された配列をコードするマウスＰｒＰ遺伝子である。人工的なＰｒＰ遺伝子は、遺伝的に異なる動物のコドンを含むだけでなく、天然のＰｒＰ遺伝子とは関連しないもののそれが動物に挿入されると通常は遺伝的に異なる動物のみを感染させるプリオンに対する感染性が該動物に付与されるようなコドンおよびコドン配列も含まれる。
【００３１】
「キメラ型遺伝子」「キメラ型ＰｒＰ遺伝子」「キメラ型プリオン蛋白質遺伝子」などの用語は、１つまたはそれ以上のコドンがヒト、ウシまたはヒツジなどの遺伝的に異なる被験動物からの対応するコドンによって置換された、マウスなどの宿主動物のコドンを含む人工的に構築された遺伝子を意味するために、本明細書では互換可能に用いられる。１つの特殊な例においては、キメラ型遺伝子は、宿主動物種（マウスなど）となる哺乳動物のＰｒＰ遺伝子の開始配列および終止配列（すなわち、Ｎ末端コドンおよびＣ末端コドン）を含み、また第２の種（ヒトなど）の被験哺乳動物のＰｒＰ遺伝子の対応部分のヌクレオチド配列も含む。キメラ型遺伝子を、宿主の種となる哺乳動物のゲノムに挿入すると、第２の種の哺乳動物のみを通常は感染させるプリオンに対する感染性が哺乳動物に付与される。本明細書で開示する好ましいキメラ型遺伝子は、マウスＰｒＰ遺伝子の開始および終止配列、ならびにそれによって発現する蛋白質に９残基の相違が生じるような様式でマウスＰｒＰ遺伝子とは異なる対応するヒト配列によって置換された非末端配列領域を含むＭＨｕ２Ｍである。
【００３２】
「プリオンに関連した遺伝的材料」という用語は、プリオンに感染する動物の能力に影響を及ぼす任意の遺伝的材料を包含するものである。したがって、この用語は「ＰｒＰ遺伝子」「人工的なＰｒＰ遺伝子」「キメラ型ＰｒＰ遺伝子」または「除去されたＰｒＰ遺伝子」の任意のものを包含し、本明細書ではプリオンに感染する動物の能力に影響を及ぼすそれらの改変とも定義される。標準化プリオン調製物は、動物のすべてが同一型のプリオンに感染しほぼ同時に感染の徴候を呈するように、そのすべてがプリオンに関連した実質的に同一な遺伝的材料を有する動物を用いて作製される。
【００３３】
「宿主動物」および「宿主哺乳動物」という用語は、その動物の体内に通常は存在しない遺伝的材料を含むように、そのゲノムを遺伝学的および人工的に操作された動物を説明するために用いられる。例えば、宿主動物には、そのＰｒＰ遺伝子が除去された、すなわち非機能的遺伝子が付与されたマウス、ハムスターおよびラットが含まれる。宿主は、抗体を産生させるためにプリオン蛋白質を接種される。抗体を産生する細胞は、ファージライブラリーを作出するための遺伝的材料の供給源である。その他の宿主動物は、天然の（ＰｒＰ）遺伝子を有すると考えられる動物、または人工的遺伝子の挿入によってもしくは遺伝的に異なる被験動物の天然のＰｒＰ遺伝子の挿入によって、改変された動である。
【００３４】
「被験動物」および「被験哺乳動物」という用語は、宿主動物のＰｒＰ遺伝子と被験動物のＰｒＰ遺伝子との間に相違があるという点で宿主動物と遺伝的に異なる動物を説明するために用いられる。被験動物は、それに対する感染性を被験動物が一般に有するようなプリオンが任意の試料に含まれているか否かを判定するための解析試験を実施したいと考える対象となる任意の動物であってよい。例えば、被験動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌまたはニワトリであってもよく、その被験動物のみを通常は感染させるプリオンが特定の試料に含まれるか否かを判定することができる。
【００３５】
「遺伝的に異なる動物」および「遺伝的に異なる哺乳動物」という用語は、宿主動物の天然のＰｒＰコドン配列と遺伝的に異なる被験動物との相違点が、１７個またはそれ以上のコドン、好ましくは２０またはそれ以上のコドン、最も好ましくは２８〜４０コドンであるような動物を説明するために用いられる。したがって、マウスのＰｒＰ遺伝子は、ヒト、ウシまたはヒツジのＰｒＰ遺伝子に関しては遺伝的に異なるが、ハムスターのＰｒＰ遺伝子に関しては遺伝的に異なっていない。
【００３６】
「除去されたプリオン蛋白質遺伝子」「破壊されたＰｒＰ遺伝子」などの用語は、その遺伝子の機能を失わせるような様式で改変された（例えば、ヌクレオチドの付加および／または除去）、内因性のＰｒＰ遺伝子を意味する目的で本明細書では互換可能に用いられる。非機能的なＰｒＰ遺伝子の実例およびそうしたものを作成する方法は、「ビューラー（Ｂｕｅｌｅｒ），  Ｈ．ら、「神経細胞表面ＰｒＰ蛋白質を欠失したマウスの正常発達（Ｎｏｒｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ＰｒＰ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６、５７７〜５８２（１９９２）」およびウェイスマン（Ｗｅｉｓｍａｎ）の国際公開公報第９３／１０２２７号に記載されている。遺伝子を除去する方法は、「カペチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２（１９８７）」に開示されており、これらの文献はすべて参照として本明細書に組み入れられる。好ましくは、２つの対立遺伝子はいずれも破壊される。
【００３７】
「雑種動物」「トランスジェニック雑種動物」などの用語は、除去された内因性のプリオン蛋白質遺伝子を有する第１の動物と、（１）キメラ型遺伝子もしくは人工的なＰｒＰ遺伝子、または（２）遺伝的に異なる動物のＰｒＰ遺伝子のいずれかを含む第２の動物との交雑によって得られる動物を意味する目的で、本明細書では互換可能に用いられる。例えば、雑種マウスは、マウスＰｒＰ遺伝子が除去されたマウスと、（１）ヒトＰｒＰ遺伝子（これは多数のコピーが存在してもよい）または（２）キメラ型遺伝子を含むマウスとの交雑によって得られる。雑種という用語には、結果として得られる子孫が、遺伝的に異なる種のみを通常は感染させるプリオンに対する感染性を有するものであれば、２つの雑種の同系交配による子孫を含む任意の雑種の子孫が含まれる。雑種動物は、プリオンを接種し、本発明のモノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマの作製のための細胞の供給源として用いることができる。
【００３８】
「感染性を有する」「プリオンに対する感染性を有する」などの用語は、遺伝的に異なる被験動物のみを通常は感染させるプリオンを接種した場合に疾病を発症するようなトランスジェニック被験動物または雑種被験動物を説明するために、本明細書では互換可能に用いられる。この用語は、キメラ型ＰｒＰ遺伝子が存在しなければヒトプリオンに感染しないと考えられるものの、キメラ型遺伝子が存在する場合にはヒトプリオンに対する感染性を有するような、トランスジェニックマウスＴｇ（ＭＨｕ２Ｍ）などのトランスジェニック動物または雑種動物を説明するために用いられる。
【００３９】
「抗体」とは、ある抗原と結合する能力を持つ免疫グロブリン蛋白質を意味する。本明細書で用いるような抗体には、抗体全体のほかに、関心対象のエピトープ、抗原または抗原性断片と結合しうる任意の抗体断片も含まれる（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）。
【００４０】
本発明の抗体は、ＰｒＰＳｃ蛋白質に対する免疫反応性または免疫特異性を有し、このため、それと特異的および選択的に結合する。自然または天然のＰｒＰＳｃに対する免疫反応性または免疫特異性を有する抗体が好ましい。ＰｒＰＳｃに対する抗体は、好ましくは免疫特異的であり、すなわち関連した材料との交差反応性を実質的に持たない。「抗体」という用語は、すべての種類の抗体（例えばモノクローナル抗体）を包含するが、本発明の抗体は、好ましくは本明細書に記載するファージディスプレイ法を用いて産生される。
【００４１】
「精製抗体」とは、天然の状態で付随しているその他の蛋白質、炭水化物および脂質を実質的に含まないものを意味する。このような抗体は、天然のＰｒＰＳｃ蛋白質（またはその抗原性断片）と「優先的に結合する」、すなわち、抗原性に関連のないその他の分子を実質的に認識せず結合しない。本発明の精製された抗体は、好ましくは特定の種のＰｒＰＳｃ蛋白質に対する免疫反応性および免疫特異性を有し、より好ましくは天然のヒトＰｒＰＳｃに対して免疫特異的である。
【００４２】
ＰｒＰ蛋白質の「抗原性断片」とは、本発明の抗体と結合する能力を持つような蛋白質の部分を意味する。
【００４３】
「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチド、すなわちPrPＳｃ蛋白質のエピトープに対する抗体の高いアビディティおよび／または高親和性結合を意味する。この特定のポリペプチド上のエピトープに対する抗体の結合は、好ましくは任意のその他のエピトープ、特に関心対象の特定のポリペプチドに付随する分子、または同一試料中にある分子中に存在すると思われるものに対する同一抗体の結合よりも強く、例えば抗体がほぼ独占的にPrPＳｃと結合してPrPＳｃの変性断片とは結合しないような結合条件に調整することによって、PrPＣの変性断片よりもPrPＳｃとより強く結合する。関心対象のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、その他のポリペプチドと弱いが検出可能なレベル（例えば、関心対象のポリペプチドに関して示された結合の10％またはそれ未満）で結合してもよい。このような弱い結合、またはバックグラウンド結合（background binding）は、関心対象の化合物またはポリペプチドに対する特異的抗体の結合により、例えば適切な対照を用いることによって容易に区別可能である。一般に、インサイチューで10７ｌ／molまたはそれ以上、好ましくは10８ｌ／molまたはそれ以上の結合親和性で天然のPrPＳｃと結合する本発明の抗体は、PrPＳｃと特異的に結合するといわれている。一般に、10６ｌ／molまたはそれ未満の結合親和性を有する抗体は、現在用いられている従来の方法を用いた場合に検出可能なレベルで抗原と結合しないと思われるため、有用でない。
【００４４】
「検出可能な標識がなされた抗体」「検出可能な標識がなされた抗ＰｒＰ」または「検出可能な標識がなされた抗ＰｒＰ断片」とは、検出可能な標識が結合された抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、通常は化学結合によって結合させられるが、標識がポリペプチドである場合には、代わりに遺伝子操作法によって結合させてもよい。検出可能な標識がなされた蛋白質を生産するための方法は、当技術分野では周知である。検出可能な標識は、当技術分野で周知のさまざまなこの種の標識から選択してよいが、通常は、放射性同位体、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、常磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または検出可能な信号（例えば、放射能、蛍光、発色）を発するかもしくはその基質に標識を曝露した後に検出可能な信号を発するその他の成分もしくは化合物である。さまざまな検出可能な標識／基質の対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および標識された抗体を用いるための方法は、当技術分野では周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、（抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９８８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００４５】
「処理」「処理する」などの用語は、本明細書では一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、ある疾患もしくその症状を完全または部分的に防止する点で予防的であってもよく、ならびに／またはある疾患および／もしくはその疾患に起因する有害効果を部分的または完全に治癒させる点で治療的であってもよい。本明細書で用いられる「処理」とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患に対するあらゆる処理を範囲に含んでいて、  （ａ）その疾患を発症しやすいと考えられるがまだその疾患を有するとは診断されていない対象における疾患の発症の防止、
（ｂ）疾患の抑制、すなわちその進展を停止させること、または
（ｃ）疾患の緩和、すなわち疾患の緩解をもたらすこと、を含む。本発明は、感染性プリオンを有する患者に対する処理を目的としており、特に、ＰｒＰＳｃの感染によってウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症またはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病などの中枢神経系疾患に罹患したヒトに対する処理を目的としている。
【００４６】
本明細書で用いる略号には以下のものが含まれる：
ＣＮＳは中枢神経系、
ＢＳＥはウシ海綿状脳症、
ＣＪＤはクロイツフェルト・ヤコブ病、
ＦＦＩは致死性家族性不眠症、
ＧＳＳはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、
Ｈｕはヒト、
ＨｕＰｒＰはヒトプリオン蛋白質、
Ｍｏはマウス、
ＭｏＰｒＰはマウスプリオン蛋白質、
ＳＨａはシリアンハムスター
ＳＨａＰｒＰはシリアンハムスタープリオン蛋白質、
Ｔｇはトランスジェニック、
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）はシリアンハムスターのＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
Ｔｇ（ＨｕＰｒＰ）は完全なヒトＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
Ｔｇ（ＳｈｅＰｒＰ）は完全なヒツジＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
Ｔｇ（ＢｏｖＰｒＰ）は完全なウシＰｒＰ遺伝子を含むトランスジェニックマウス、
ＰｒＰＳｃはプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム、
ＰｒＰＣはプリオン蛋白質の細胞含有性の共通で、一般的アイソフォーム、
ＭｏＰｒＰＳｃはマウスプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム、
ＭＨｕ２Ｍは、マウスＰｒＰ遺伝子のある領域が、マウスＰｒＰと９コドン異なる対応したヒト配列によって置換されているキメラ型のマウス／ヒトＰｒＰ遺伝子、
Ｔｇ（ＭＨｕ２Ｍ）マウスは、キメラ型ＭＨｕ２Ｍ遺伝子を含む本発明のトランスジェニックマウス、
ＭＨｕ２ＭＰｒＰＳｃは、キメラ型ヒト／マウスＰｒＰ遺伝子のスクレイピー型アイソフォーム、
ＰｒＰＣＪＤはＰｒＰ遺伝子のＣＪＤ型アイソフォーム、
Ｐｒｎ−ｐ０／０は、ＭｏＰｒＰ遺伝子などの内因性のプリオン蛋白質遺伝子の両方の対立遺伝子の除去を示し、
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ＋／ｏ）８１／Ｐｒｎ−ｐ０／０は、ＳＨａＰｒＰを発現するトランスジェニックマウスの特定の系統（８１）であり、＋／ｏはヘテロ接合体であることを示し、
Ｔｇ（ＨｕＰｒＰ）／Ｐｒｎｐ０／０は、ヒトプリオン蛋白質遺伝子（ＨｕＰｒＰ）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の２つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交雑によって得られた雑種マウス、
Ｔｇ（ＭＨｕ２Ｍ）／Ｐｒｎｐ０／０は、キメラ型プリオン蛋白質遺伝子（ＭＨｕ２Ｍ）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の２つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交雑によって得られた雑種マウスを示す。
【００４７】
ＦＶＢは、ＦＶＢマウスの卵は比較的大きく外因性ＤＮＡのマイクロインジェクションに対する耐性が比較的高いため、トランスジェニックマウスの作出にしばしば用いられる標準的な同系交配系統のマウスである。
【００４８】
本発明の一般的な局面
本発明の核心は、PrPＳｃ蛋白質と特異的に結合し、好ましくはインサイチューで単一の種の（例えばヒトの）天然の非変性PrPＳｃ蛋白質と、10７ｌ／molまたはそれ以上、好ましくは10８ｌ／molまたはそれ以上の親和性で結合し、さらに好ましくはヒトPrPＳｃのみと結合してヒトPrPＣの変性断片とは結合しない抗体である。本抗体は、PrP蛋白質遺伝子のさまざまな変異体および／または多型物によってコードされるすべての蛋白質と結合してもよい。または、その一連の各抗体がPrP遺伝子の異なる変異体または多型物によってコードされる蛋白質と特異的に結合する、一連の抗体（2種またはそれ以上の異なる抗体）が提供される。本抗体は支持体表面と結合させて、特定の型のヒトPrPＳｃの有無に関するインビトロでの試料のアッセイのために用いることができる。また、本抗体を検出可能な標識と結合させて、特定の型の天然型PrPＳｃの有無に関するインビボでのアッセイのために動物に注入することもできる。
【００４９】
あらゆる任意の抗原から抗体を作製する諸手順が知られているが、例えばＰｒＰＳｃなどの特定の蛋白質と結合する抗体を作製することは特に困難であることが、これまでの実践によって明らかにされている。ＰｒＰＳｃに対する抗体を得ることに伴う難しさは、一部には、それが特殊および未知の性質を持つことに関係している。本明細書に記載する手順に従うことによってインサイチューで天然のＰｒＰＳｃと結合する抗体が得られており、本明細書に記載された手順に従うことにより、ＰｒＰＳｃおよび抗体の作製が困難なその他の蛋白質に対するその他の抗体を得ることができる。
【００５０】
本発明の抗体を生産するためには、宿主哺乳動物に対するプリオン蛋白質、すなわち感染性ＰｒＰＳｃの接種から始めることが好ましい。宿主哺乳動物は任意の哺乳動物であってよく、好ましくは本明細書で定めるマウス、ラット、モルモットまたはハムスターなどの種類の宿主哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。宿主動物には、好ましくは遺伝的に異なる種である別の種にとって内因性であるプリオン蛋白質が接種される。例えば、マウスにヒトプリオン蛋白質が接種される。好ましくは、この宿主哺乳動物には、遺伝的に異なる哺乳動物種の感染性プリオン蛋白質が接種される。例えば、マウスにヒトＰｒＰＳｃが接種される。この様式で正常な宿主哺乳動物を用いた場合でも、一部の抗体を作製することは可能である。しかし、宿主動物がプリオン蛋白質の遺伝子を有しており、遺伝的に異なる種に由来するプリオンを接種された場合には、抗体としては、たとえそれが生じたとしても、宿主動物のプリオン蛋白質のエピトープと遺伝的に異なる種のエピトープとの間に相違点があるエピトープに関するもののみが生じると思われる。これは実質的に、生じる可能性のある抗体の量を制限し、感染型のプリオン蛋白質と選択的に結合するが非感染型の変性断片とは結合しない抗体を見いだす能力を低下させる。このため、異なる種のプリオン蛋白質同士を区別する抗体を作製しようと試みていないのであれば、抗体作製過程を、除去された（ａｂｌａｔｅｄ）プリオン蛋白質遺伝子、すなわち、Ｐｒｎｐ０／０と略記するヌル（ｎｕｌｌ）ＰｒＰ遺伝子を有する哺乳動物を用いて開始することが好ましい。したがって、本発明は一般にこのような「ヌル」哺乳動物の使用と関連して記載され、特に「ヌルマウス」と関連して記載される。
【００５１】
抗体はまず、内因性ＰｒＰ遺伝子が除去された、すなわちＰｒＰ遺伝子が機能しないようにされた宿主動物（例えばマウス）を作出することによって作製される。除去されたＰｒＰ遺伝子を有するマウスを「ヌルマウス」と呼ぶ。ヌルマウスは、正常なマウスＰｒＰ遺伝子へのＤＮＡの断片の挿入および／または遺伝子の一部の除去によって破壊されたＰｒＰ遺伝子を供することで作製することができる。この破壊された遺伝子はマウス胚に注入され、相同組換えを介して内因性ＰｒＰ遺伝子と置換される。
ヌルマウスには、抗体の形成を促すためにプリオンが接種される。さらに、抗体が最大限に生じるようにアジュバントおよびプリオンの注入が一般に用いられる。
【００５２】
続いてこのマウスを屠殺し、骨髄および脾臓の細胞を摘出する。細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写させる。続いて、抗体の重鎖および軽鎖（またはその部分）をＰＣＲによって増幅する。増幅されたｃＤＮＡライブラリーはそのまま用いてもよく、または、一定の範囲の変異体を作り出し、それによってライブラリーのサイズを大きくするための操作の後に用いてもよい。
【００５３】
続いて、１つのベクターが、重鎖の断片をコードするｃＤＮＡ挿入物をベクターの第１の発現カセット中に含み、軽鎖の断片をコードするｃＤＮＡ挿入物をベクターの第２の発現カセット中に含むように、ＩｇＧの重鎖をコードする増幅されたｃＤＮＡおよび軽鎖をコードする増幅されたｃＤＮＡをファージディスプレイベクター（例えば、ｐＣｏｍｂ３ベクター）に挿入することによって、ＩｇＧファージディスプレイライブラリーを構築する。
【００５４】
続いて、当技術分野で周知の方法を用いて、連結されたベクターを繊維状ファージＭ１３にパッケージングする。続いて、ファージ粒子の数を増幅するために、パッケージングがなされたライブラリーを用いて大腸菌の培養物を感染させる。細菌細胞が溶菌を生じた後に、ファージ粒子を単離してパニング手順に用いる。作製されたライブラリーを、プリオンを含む組成物に対してパニングする。続いて、例えばヒトＰｒＰＳｃなどのＰｒＰＳｃと選択的に結合する抗体断片を単離する。
【００５５】
ＰｒＰ蛋白質の詳細
ＰｒＰ  ２７〜３０と命名される、精製された感染性プリオンの主要な構成要素は、偏在性の細胞蛋白質であるＰｒＰＣの疾患発症性の形態であるより大きな天然蛋白質ＰｒＰＳｃの、プロテイナーゼＫ抵抗性の中核部である。ＰｒＰＳｃはスクレイピーに感染した細胞のみに認められるが、ＰｒＰＣは感染細胞および非感染細胞の両方に存在しており、このことはＰｒＰＳｃが感染性プリオン粒子の唯一ではないとしても主要な構成要素であることを意味する。ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃはいずれも同じ単一コピーの遺伝子によってコードされるため、ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃが生じる機序の解明へ向けて多大な努力が払われた。この目標の中心に位置するものは、これらの２つの分子の間の物理的および化学的な差異の特徴を示すことであった。ＰｒＰＳｃがＰｒＰＣと区別される性質には、溶解度の低さ（Ｍｅｖｅｒら、１９８６、ＰＮＡＳ）、抗原性の弱さ（Ｋａｓｃａｃｋ、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  １９８７；Ｓｅｒｂａｎ  Ｄ．  １９９０）、プロテアーゼ抵抗性（Ｏｅｓｃｈら、１９８５  Ｃｅｌｌ）、およびＰｒＰ  ２７〜３０の、スクレイピーに罹患した脳で認められるＰｒＰアミロイド斑（Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  １９８３）と超微細構造的および組織化学的なレベルで極めて類似したロッド状凝集物への重合化が含まれる。プロテイナーゼＫを用いることにより、ＰｒＰＣは変性させうるが、ＰｒＰＳｃは変性させないことが可能である。これまでに、ＰｒＰＳｃへの変換をもたらすＰｒＰＣにおけるトランジション後化学修飾を同定するためのさまざまな試みがなされたが、結局は失敗に終わった（Ｓｔａｈｌら、１９９３  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。この結果、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは実際には同一分子の配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒ）であると提唱されている。
【００５６】
従来の技法を用いてＰｒＰの立体配座を記載することは、溶解度の問題および十分量の純粋な蛋白質を生産する際の困難さが妨げとなっていた。しかし、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは、立体配座的には異なる。いくつかの種に由来するＰｒＰのアミノ酸配列に基づいた理論的計算では、分子中に４つの推定上のらせん状モチーフが予測されている。実験的な分光学的データからは、ＰｒＰＣにおけるこれらの領域は事実上β−シートを有しないα−ヘリックス配置をとることが示されている（Ｐａｎら、ＰＮＡＳ  １９９３）。これと極めて対照的に、同じ試験ではＰｒＰＳｃおよびＰｒＰ  ２７〜３０がアミロイド蛋白質に典型的なβ−シートをかなり高い割合で含むことが明らかになっている。さらに、ＰｒＰのアミノ酸残基９０〜１４５に対応する伸長性の合成ペプチドを用いた試験では、これらの切断型の分子が溶解条件を変更することによってα−ヘリックスまたはβ−シート構造のいずれかに変換されると考えられることが示されている。ＰｒＰＣのＰｒＰＳｃへのトランジションには、それまでα−ヘリックスであった領域がβ−シート構造をとることが必要である。
【００５７】
一般に、スクレイピー感染では免疫応答が生じず、宿主生物体は同一種からのＰｒＰＳｃに対する耐性を有する。多量のＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０による免疫化を受けた後にウサギではポリクローナル抗ＰｒＰ抗体が産生されている（Ｂｅｎｄｈｅｉｍら、ＰＮＡＳ  １９８５、Ｂｏｄｅら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  １９８５）。同様にマウスでも抗ＰｒＰモノクローナル抗体がいくつか産生されている（Ｋａｓｃａｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  １９８７、Ｂａｒｒｙら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １９８６）。これらの抗体は、ＳＨａおよびヒトに由来する天然のＰｒＰＣおよび変性ＰｒＰＳｃの両方を同等によく認識する能力を持つが、ＭｏＰｒＰとは結合しない。当然ながら、これらの抗体のエピトープは、ＳＨａ−とＭｏＰｒＰとの間で異なるアミノ酸を含む配列の領域にマッピングされた（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３）。
【００５８】
上記の部分で引用した刊行物に記載された型の抗体が、ＰｒＰＣとは結合するが、ＰｒＰＳｃとは結合しない理由は完全には明らかになっていない。特定の理論の立場をとらずとも、ＰｒＰＣの立体配座の中に蛋白質がある場合に露出されるエピトープが、露出されていないか、または蛋白質が比較的非溶解性であって互いにより緊密に折り畳まれているようなＰｒＰＳｃの立体配置の中に一部が隠れているために、このようなことが起こる可能性があることが示唆される。ＰｒＰＳｃに対する極めてわずかな結合は起こると思われるため、ＰｒＰＣと結合するがＰｒＰＳｃとは結合しない抗体という表現は絶対的な意味では正しくない（しかし、一般に受け入れられている意味では正しい）ことが指摘されている。本発明の目的に関して、全く結合が生じないという表現は、平衡定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）または結合定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）Ｋａが１０６ｌ／ｍｏｌまたはそれ未満であることを意味する。さらに、Ｋａが１０７ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上、好ましくは１０８ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上である場合には、結合が存在すると認識される。１０７ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上の結合親和性は、（１）単一のモノクローナル抗体（すなわち、１つの種類の抗体が多数ある）、（２）複数の異なるモノクローナル抗体（例えば、５種の異なるモノクローナル抗体のそれぞれが多数ある）、または（３）多数のポリクローナル抗体、によると考えられる。また、（１）〜（３）の併用も可能である。
【００５９】
好ましい抗体は、試料中のＰｒＰＳｃの５０％またはそれ以上と結合すると思われる。しかし、上記の（１）〜（３）のようないくつかの異なる種類の抗体を用いることによってこれが達成される場合もありうる。異なる抗体の数を増やすことは、単一の抗体を用いた場合と比べて、試料中におけるＰｒＰＳｃのより高い割合と結合させる上でより有効であることが明らかになっている。例えば、単一の抗体「Ｑ」の６つのコピーを用いると、試料中のＰｒＰＳｃの４０％と結合すると思われる。同様の結果は、抗体「Ｒ」および「Ｓ」の６つのコピーを用いても得られるとする。しかし、「Ｑ」「Ｒ」および「Ｓ」のそれぞれを２コピーずつ用いた場合、この６個の抗体は試料中のＰｒＰＳｃの５０％を超える割合と結合すると思われる。したがって、ＰｒＰＳｃと結合する２種またはそれ以上の抗体を併用することにより、すなわちＰｒＰＳｃに対する結合親和性Ｋａが１０７ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上である２種またはそれ以上の抗体を併用することによって、相乗効果を得ることができる。このため、Ｄ４、Ｒ２、６Ｄ２、Ｄ１４、Ｒ１およびＲ１０ならびに／または関連した抗体の併用によって、相乗的な結果が提供されうる。
【００６０】
抗体／抗原の結合力
ある抗原と抗体とを結合させる力には、本質的には、２つの関連しない蛋白質、すなわちヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンなどのその他の巨大分子の間に生じる非特異的相互作用と異なる点はない。これらの分子間力は、（１）静電力、（２）水素結合、（３）疎水結合、および（４）ファン・デル・ワールス力という４つの一般的な領域に分類することができる。静電力は、２つの蛋白質の側鎖上にある反対に荷電したイオン基同士の間の引力によるものである。この引力（Ｆ）は、荷電体の間の距離（ｄ）の二乗に反比例する。水素結合力は、−ＯＨ、−ＮＨ２および−ＣＯＯＨなどの親水基同士の間に可逆性の水素性架橋が形成されることによってもたらされる。この種の力は、以上の基を有する２つの分子がどれだけ近く配置されるかに大きく依存している。疎水結合力は、水中で油の細かい粒子が融合して単一の大きな油滴を形成するのと同じように働く。したがって、バリン、ロイシンおよびフェニルアラニンの側鎖などの非極性で疎水性の基は、水性環境において会合しようとする傾向がある。最後のファン・デル・ワールス力は、外部電子雲の間の相互作用によって分子間に生じる力である。
【００６１】
以上の異なる型の力のそれぞれに関するより詳細な情報は、Ｉ．  Ｍ．  ロイッティ（Ｒｏｉｔｔｉ）編の「本質的免疫学（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第６版）、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｉｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９８８から入手することができる。本発明に関して有用な抗体は、これらの力のすべてを発揮する。ＰｒＰ蛋白質に対する高度の親和性または結合強度を有する抗体、特にインサイチューでＰｒＰＳｃに対する高度の結合強度を有する抗体を得ることは、これらの力を多量に累積させることによってはじめて可能となる。
【００６２】
抗体／抗原の結合強度の測定
ある抗体とある抗原との間の結合親和性は、上記の力のすべてに関する測定値を累積する測定によって測定することができる。このような測定を実施するための標準的な手順はすでにあり、天然のＰｒＰＳｃを含むＰｒＰ蛋白質に対するインサイチューでの本発明の抗体の親和性の測定に直接適用することができる。
【００６３】
抗体／抗原の結合親和性を測定するための1つの標準的な方法は、抗原に対しては透過性であるが抗体に対しては非透過性である材料を含む容器である透析嚢（dialysis sac）の使用によるものである。抗体と完全または部分的に結合した抗原は、透析嚢内部の水などの溶媒中に位置する。続いてこの嚢を、抗体または抗原を含まない、例えば水などの溶媒のみを含むより大きな容器の内部に配置する。透析膜を介して拡散しうるのは抗原のみであるため、透析嚢内部の抗原の濃度と、外側のより大きい容器の内部の抗原の濃度とは平衡に近づいていくと考えられる。透析嚢をより大きな容器中に配置して平衡に到達するまでの時間をおいた後に、透析嚢内部および周囲の容器の内部の抗原の濃度を測定し、続いて濃度の差を決定することが可能である。これにより、透析嚢内で抗体と結合したままの抗原の量、および抗体と解離して周囲容器中に拡散した量を算出することができるようになる。拡散によって進入するあらゆる抗原を除去するために周囲容器の内部の溶媒（例えば水）を常に交換することによって、透析嚢内部にある抗原を抗体から完全に解離させることができる。周囲の溶媒を交換しない場合には、この系はある平衡に達すると思われ、反応、すなわち抗体と抗原との間の会合および解離に関する平衡定数（K）を算出することができる。この平衡定数（K）は、透析嚢内部で抗原と結合した抗体の濃度を、遊離抗体の結合部位の濃度と遊離抗原の濃度とをかけた値で割った値として算出される。平衡定数または「K」値は、一般にリットル／モルの単位で計測される。このK値は、遊離状態にある抗原および抗体と、結合型の抗原および抗体との間の自由エネルギーの差（Δg）を測定したものである。以下に説明するファージディスプレイ法を用いた場合には、得られる抗体は10７ｌ／molまたはそれ以上の親和性すなわちK値を有する。
【００６４】
抗体の結合活性
上記の通り、「親和性」という用語は、１つの抗体の１つの抗原決定基との結合を記載するものである。しかし、実際の大部分の環境では、１つの抗体と多価抗原との相互作用が問題となる。「結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）」という用語は、この結合を表現するために用いられる。結合活性に寄与する因子は複雑であり、抗原上の各決定基を指向する任意の血清における抗体の不均一性、および決定基それ自体の不均一性が含まれる。大部分の抗原が多価であることは、２つの抗原分子が１つの抗体によって結合するという個々の抗体の連結の算術的合計よりも常に大きく、通常は数倍の大きさである興味深い「ボーナス」効果をもたらす。したがって、１つの抗血清と１つの多価抗原との間で測定される結合活性は、１つの抗体と１つの抗原決定基との間の親和性よりも幾分高いと考えられる。
【００６５】
抗体を作製するためのヌルＰｒＰマウス
本発明により、耐性の問題は回避され、ＰｒＰ遺伝子（Ｐｒｎｐ）の両方の対立遺伝子が除去されたマウス（Ｐｒｎｐ０／０）を一部に用いて、Ｍｏおよびその他のＰｒＰ上の広範なエピトープを認識する能力を持つ一連のモノクローナル抗体がより効率的に作製される（Ｂｕｅｌｅｒら、１９９２）。これらのＰｒＰ欠損マウス（またはヌルマウス）は、その発達および行動の点では正常マウスと区別不能である。これらのヌルマウスは、感染性ＭｏＰｒＰＳｃの大脳内接種後にもスクレイピーに対する抵抗性を示す（Ｂｕｅｌｅｒら、１９９３  Ｃｅｌｌ；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  １９９２）。さらに、Ｐｒｎｐ０／０マウスは、アジュバントとして比較的少量の精製されたＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を用いて免疫化を行った後にＭｏ−、ＳＨａおよびヒトＰｒＰに対するＩｇＧ血清抗体価を生じると考えられる（Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  １９９３）。抗体が産生されるための十分な時間をおいた後に、免疫化されたＰｒｎｐ０／０マウスを屠殺し、従来の方法でハイブリドーマを作製した。これらのマウスに由来する融合細胞は、ＰｒＰに特異的な抗体を分泌した。しかし、これらのハイブリドーマは、数時間を超えてＰｒＰ特異的抗体を分泌することはなかった。これでは十分に成功したとは思われないという観点から、異なる手法を用いた。
【００６６】
ファージディスプレイ
コンビナトリアル抗体ライブラリー技術、すなわち、Ｍ１３繊維状ファージの表面に発現させた抗体ライブラリーからの抗原に基づく選択は、モノクローナル抗体の作製に新たな手法を提供するものであり、プリオンの問題に関して特に適切であるハイブリドーマ法と比較して多くの利点を持つ（Ｈｕｓｅら、１９８９；Ｂａｒｂａｓら、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、１９９４）。本発明は、ＭｏＰｒＰによって免疫化されたＰｒｎｐ０／０マウスから調製したファージ抗体ライブラリーから得たＰｒＰ特異的モノクローナル抗体を提供する目的でこの種の技術を用いる。本発明では、インサイチューでＭｏＰｒＰを認識する第１のモノクローナル抗体が提供され、ヌルマウスから特異的な抗体をクローニングするためのコンビナトリアルライブラリーの応用が示される。ファージディスプレイ技術を用いる大規模なコンビナトリアルライブラリーの作製に含まれる一般的な方法は、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号に記載および開示されており、この特許はファージディスプレイ法の開示および記載のために参照として本明細書に組み入れられる。
【００６７】
ヌル動物
本発明は、本明細書では主としてヌルマウス、すなわち、ＰｒＰ遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたＦＶＢマウスに関して記載される。しかし、その他の宿主動物も使用可能であり、好ましい宿主動物はマウスおよびハムスターであるが、中でもマウスは、トランスジェニック動物の作出に関してかなりの知識が存在する点で最も好ましい。可能な宿主動物には、ハツカネズミ属（マウスなど）、ドブネズミ属（ラットなど）、アナウサギ属（ウサギなど）、ならびにハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ）属（ハムスターなど）およびモルモット属（モルモットなど）から選択される属に所属するものが含まれる。一般に、正常な成体重量が１ｋｇ未満であるような哺乳動物は繁殖および維持が容易であって使用可能である。
【００６８】
ＰｒＰ遺伝子
ＰｒＰ遺伝子を構成する遺伝的材料は、多くの異なる動物種に関して知られている（Ｇａｂｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９０９７〜９１０１（１９９２）を参照）。さらに、異なる哺乳動物のＰｒＰ遺伝子の間にはかなりの相同性が存在する。例えば、マウスＰｒＰのアミノ酸配列をヒト、ウシおよびヒツジのＰｒＰと比較したものを、その相違点のみに関して示した図２、３および４を参照されたい。ＰｒＰ遺伝子に関する遺伝的な相同性はかなり高いものの、この違いには場合によっては意義がある。より具体的に言えば、異なる哺乳動物のＰｒＰ遺伝子によってコードされる蛋白質におけるわずかな違いのために、１つの哺乳動物（ヒトなど）に感染するプリオンは、異なる種の哺乳動物（マウスなど）には通常は感染しない。この「種間障壁」のため、ヒトなどの異なる動物を通常は感染させるプリオンが特定の試料に含まれるか否かを判定するためにマウスなどの通常の動物（すなわち、ＰｒＰ蛋白質に関連した遺伝的材料が操作されていない動物）を用いることは一般的には可能ではない。本発明は、抗体がデザインされる対象である任意の種の動物の天然のＰｒＰＳｃ蛋白質と結合する抗体を提供することによって、この問題点を解決する。
【００６９】
病原性の変異および多型
ヒトＰｒＰ遺伝子に多くの病原性変異が知られている。さらに、ヒト、ヒツジおよびウシのＰｒＰ遺伝子には多型が存在することが知られている。以下は、このような変異および多型を一覧表として示したものである。
0003586275.tif 000002
【００７０】
ヒト、ヒツジおよびウシのＰｒＰ遺伝子のＤＮＡ配列は決定されているため、それぞれの場合において、それらのそれぞれのプリオン蛋白質の完全なアミノ酸配列を予測することが可能である。大多数の個体で生じる正常なアミノ酸配列は、野生型のＰｒＰ配列と呼ばれる。この野生型配列は、特定の特徴的な多型的変異を生じることが多い。ヒトＰｒＰの場合には、残基１２９（Ｍｅｔ／Ｖａｌ）および２１９（Ｇｌｕ／Ｌｙｓ）に２種のアミノ酸多型がみられる。ヒツジＰｒＰは、残基１７１および１３６に２種のアミノ酸多型を有し、ウシＰｒＰは成熟型プリオン蛋白質のアミノ端領域内に８アミノ酸モチーフ配列の５回または６回の反復を有する。これらの多型はいずれもそれ自体に病原性はないが、プリオン病に影響を及ぼすと考えられる。これらの正常変異とは異なり、遺伝性ヒトプリオン病の形質を分離させる、ＰｒＰの特定のアミノ酸残基またはオクタリピート（８単位反復；ｏｃｔａｒｅｐｅａｔ）の数が変化するようなヒトＰｒＰ遺伝子の特定の変異が同定されている。
【００７１】
変異および多型を示した上記の一覧表にさらに大きな意味を持たせるために、すでに発表されているＰｒＰ遺伝子の配列を参照することができる。例えば、ニワトリ、ウシ、ヒツジ、ラットおよびマウスのＰｒＰ遺伝子は開示されており、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９０９７〜９１０１（１９９２）に掲載されている。シリアンハムスターに関する配列は、バスラー（Ｂａｓｌｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ  ４６：４１７〜４２８（１９８６）に掲載されている。ヒツジのＰｒＰ遺伝子はゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎｎ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２４７６〜２４８０（１９９０）に掲載されている。ウシに関するＰｒＰ遺伝子の配列はゴールドマンら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：２０１〜２０４（１９９１）に掲載されている。ニワトリＰｒＰ遺伝子に関する配列はハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７６６４〜７６６８（１９９１）に掲載されている。ミンクに関するＰｒＰ遺伝子の配列はクレッチマー（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍｅｒ）ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：２７５７〜２７６１（１９９２）に掲載されている。ヒトＰｒＰ遺伝子の配列はクレッチマーら、ＤＮＡ  ５：３１５〜３２４（１９８６）に掲載されている。マウスのＰｒＰ遺伝子の配列はロホト（Ｌｏｃｈｔ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：６３７２〜６３７６（１９８６）に掲載されている。ヒツジに関するＰｒＰ遺伝子の配列はウェスタウェイ（Ｗｅｓｔａｗａｙ）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：９５９〜９６９（１９９４）に掲載されている。以上の刊行物はすべて、ＰｒＰ遺伝子およびＰｒＰのアミノ酸配列を開示および説明する目的で本明細書に参照として組み入れられる。
【００７２】
ヒトプリオンの「系統」
齧歯類における研究では、プリオンの系統によってＰｒＰＳｃの蓄積に異なるパターンが生じ［Ｈｅｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１２１３〜１２２８（１９９２）；ＤｅＡｒｍｏｎｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４９〜６４５３（１９９３）］、それがＰｒＰＳｃの配列によって劇的に変化することが示されている［Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、印刷中（１９９４）］。長い間、プリオンの多様性の分子的基盤は、スクレイピーに特異的な核酸に起因するとされてきた［Ｂｒｉｃｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ６８：７９〜８９（１９８７）］が、これは全く発見されていない［Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７２：３７〜４９（１９９１）；Ｋｅｌｌｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７３：１０２５〜１０２９（１９９２）］。プリオンの系統を説明するための他の仮説には、ＰｒＰのＡｓｎに結合した糖鎖の違い［Ｈｅｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１２１３〜１２２８（１９９２）］およびＰｒＰＳｃの複数の配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）［Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，  Ｓ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１５１５〜１５２２（１９９１）］によるものが含まれる。Ｔｇ（ＭＨｕ２Ｍ）マウスにおけるＰｒＰＳｃのパターンは、ＣＪＤのために死亡したヒトから得た３種類の接種物に関して極めて類似していた。
接種を受けたＴｇ（ＭＨｕ２Ｍ）マウスの脳におけるＰｒＰＳｃの蓄積パターンは、ＲＭＬプリオンおよびＨｕプリオンについては著しく異なっていた。しかし、ＭｏＰｒＰＳｃを含むＲＭＬプリオン接種物は比較的多量のＭｏＰｒＰＳｃの形成を促したが、ＨｕＰｒＰＣＪＤを含むＨｕプリオン接種物はＭＨｕ２ＭＰｒＰＳｃの産生を誘発した。神経細胞の空胞化および星状神経膠腫を特徴とする神経病理学的変化の分布は、ＲＭＬプリオンまたはＨｕプリオンを接種されたＴｇ（ＭＨｕ２Ｍ）マウスの脳におけるＰｒＰＳｃの蓄積パターンと同様である。
【００７３】
標準化プリオン調製物
標準化プリオン調製物は、本発明のアッセイを試験し、それによりアッセイの信頼性を高めるために作製される。この調製物は任意の動物から得ることができるが、被験動物のプリオンを含む脳材料を有する宿主動物から得ることが好ましい。例えば、ヒトプリオン蛋白質遺伝子を含むトランスジェニックマウスは、ヒトプリオンを産生することができ、このようなマウスの脳は標準化ヒトプリオン調製物を作製するために用いることができる。さらに、本調製物が「標準」であるためには、それは好ましくは一連（例えば、１００、１，０００またはそれ以上の動物）の実質的に同一な動物から得られる。例えば、極めて多数のヒトＰｒＰ遺伝子（すべての多型および変異）のコピーをすべてが含む１００匹のマウスは、疾患を自然発症すると思われ、各々から得た脳組織を組み合わせることによって有用な標準化されたプリオン調製物が作製されうると考えられる。
【００７４】
標準化プリオン調製物は、上述されたタイプの任意の改変された宿主動物を用いて作製することができる。例えば、ヒト、ウシ、ヒツジまたはウマなどの遺伝的に異なる種のみを一般的には感染させるプリオンに対する感染性を獲得し、その改変された宿主動物がプリオンの接種から３５０日後またはそれ以内の期間のうちにＣＮＳ機能障害の臨床徴候を発症するように遺伝的に改変されたマウス、ラット、ハムスターまたはモルモットを用いて、標準化プリオン調製物を作製することができる。最も好ましい宿主動物はマウスであり、その理由は一部には、使用に高額の費用を要しないため、およびトランスジェニックマウスの作出に関して得られている経験の量が他の種類の宿主動物の作出に関する量よりも豊富であるためである。標準化されたプリオン調製物の作製に関する詳細は、１９９５年８月３１日に提出された「試料中のプリオンを検出する方法、および同目的で使用されるトランスジェニック動物」と題する米国特許出願である米国特許出願番号第０８／５２１，９９２号、および１９９６年７月３０日に提出された「試料中のプリオンの検出、ならびに同目的で使用されるプリオン調製物およびトランスジェニック動物」と題する米国特許出願である弁理士明細書番号第０６５１０／０５６００１号に記載されており、これらの２件の出願はいずれも参照として本明細書に組み入れられる。
【００７５】
マウスなどの適切な種類の宿主を選択したならば、次の段階は、標準化プリオン調製物の作製に用いるために適した種類の遺伝的操作を選択することである。例えば、マウスは、本発明のキメラ型遺伝子の挿入によって遺伝的に改変されたマウスであってもよい。この群のマウスは、キメラ型遺伝子の発現レベルを上昇させるために、多数のコピーのキメラ型遺伝子の導入および／または複数のプロモーターを導入されたものでもよい。または、内因性ＰｒＰ遺伝子が除去されたマウスと、ゲノム内にヒトＰｒＰ遺伝子が挿入されたマウスとの交雑による本発明の雑種マウスを用いることもできる。当然ながら、このような雑種マウスにはさまざまな下位区分がある。例えば、発現の増強のために、ヒトＰｒＰ遺伝子を、多数のコピーとして挿入すること、および／または複数のプロモーターとともに使用することもできる。さらにもう１つの選択肢として、さまざまに異なる種類のプリオン、すなわち２つまたはそれ以上の種類の被験動物のみを一般的には感染させるものに対する感染性を有するマウスを作出するために、ゲノム内に複数の異なるＰｒＰ遺伝子を挿入することによってマウスを作出することもできる。例えば、ヒトの配列の一部、ウシの配列の一部を含む独立したキメラ型遺伝子、およびヒツジの配列の一部を含むさらにもう１つのキメラ型遺伝子を含むキメラ型遺伝子を含むマウスを作出することもできる。３つの異なる種類のキメラ型遺伝子のすべてがマウスのゲノムに挿入された場合には、そのマウスはヒト、ウシおよびヒツジのみを一般的には感染させるプリオンに対する感染性を有すると考えられる。
【００７６】
適切な哺乳動物（マウスなど）および適切な様式の遺伝的改変（例えばキメラ型ＰｒＰ遺伝子の挿入）を選択した後の次の段階は、プリオンに関連した遺伝的材料に関して実質的に同一な多数のそのような哺乳動物を作出することである。より具体的には、作出されるそれぞれのマウスは、ゲノム内に同一のキメラ型遺伝子を実質的に同一のコピー数で含むものであろう。これらのマウスは、マウスの９５％またはそれ以上が接種から３５０日後またはそれ以内のうちにＣＮＳ機能障害の臨床徴候を発症して、すべてのマウスがほぼ同一時点、例えば互いに３０日以内にこのようなＣＮＳ機能障害を発症するように、プリオンに関連した遺伝的材料に関して十分に遺伝的に同一である必要がある。
このようなマウスの、例えば５０匹またはそれ以上、より好ましくは１００匹またはそれ以上、さらに好ましくは５００匹またはそれ以上の多数の群が作出された場合には、その次の段階は、遺伝的に異なる哺乳動物のみを一般的には感染させるプリオン、例えばヒト、ヒツジ、ウシまたはウマからのプリオンをマウスに接種することである。異なる群の哺乳動物に与える量はさまざまであってよい。哺乳動物にプリオンを接種した後は、その哺乳動物が例えばＣＮＳ機能障害の臨床徴候などのプリオン感染症の症状を呈するまでその哺乳動物を観察する。プリオン感染症の徴候を呈した後に、それぞれの哺乳動物の脳または少なくとも脳組織の一部を摘出する。摘出された脳組織をホモジェネートすることにより、標準化プリオン調製物が提供される。
【００７７】
トランスジェニックマウスの群に遺伝的に異なる動物からのプリオンを接種する代わりに、プリオンに関連した疾患を自然発症するマウスを作出することも可能である。これは例えば、マウスゲノムに極めて多数のコピーのヒトＰｒＰ遺伝子を導入することによって実施することができる。コピー数を例えば１００またはそれ以上に増やした場合には、マウスはＣＮＳ機能障害の臨床徴候を自然発症し、かつその脳組織内にはヒトを感染させる能力を有するプリオンを有すると考えられる。これらの動物の脳またはこれらの動物の脳組織の部分を摘出およびホモジェネートして、標準化プリオン調製物を作製することが可能である。
【００７８】
標準化プリオン調製物は、そのまま使用することも、さまざまに異なる種類の陽性対照が提供されるような様式で希釈してごく一部を使用することもできる。より具体的には、既知の量のさまざまなこのような標準化調製物を、第１の組のトランスジェニック対照マウスに接種するために用いることができる。実質的に同一な第２の組のマウスには、試験される材料、すなわちプリオンを含む可能性のある材料を接種する。実質的に同一な第３の群のマウスには、いかなる材料も注入しない。続いて、この３つの群を観察する。マウスにいかなる材料も注入していないことから、第３の群は当然ながら発病しないはずである。もしこのようなマウスが発病するようであればアッセイは正確でなく、これはおそらく疾患を自然発症するマウスが作出された結果であると思われる。標準化調製物を注入された第１のマウスが発病しない場合もアッセイは不正確であり、これはおそらく、そのマウスが、遺伝的に異なる哺乳動物のみを一般的には感染させるプリオンを接種した場合に発病するように正しく作出されていないためであると考えられる。しかし、第１の群が発病して第３の群が発病しない場合には、アッセイは正確であると推定することができる。したがって、第２の群が発病しなければ被験材料はプリオンを含んでおらず、第２の群が発病すれば被験材料にはプリオンが含まれる。
【００７９】
本発明の標準化プリオン調製物を用いることにより、プリオンを含む高度に希釈された組成物を作製することができる。例えば、１００万分の１もしくはそれ未満の割合、または１０億分の１もしくはそれ未満の割合で含む組成物を作製することができる。このような組成物は、プリオンの有無の検出における本発明の抗体、アッセイおよび方法の感度の試験に用いることができる。
【００８０】
プリオン調製物は、一定量のプリオンを含むと考えられ、同型の背景から抽出されている点で望ましい。したがって、調製物中の混入物は一定であり、制御可能である。標準化プリオン調製物は、さまざまな医薬品、全血、血液分画、食品、化粧品、臓器、ならびに特に生きたヒトまたは死体に由来する臓器、血液およびその製品などの（生きている、または死亡した）動物に由来する任意の材料におけるプリオンの有無を判定するためのバイオアッセイの実施において有用であると考えられる。したがって、標準化プリオン調製物は、調製物を添加して特定の過程に関する変動の減少を評価するような、精製プロトコールのバリデーションに有意義である。
【００８１】
有用な用途
上記および以下の詳細な実施例でさらに説明するように、本発明の方法を、広い範囲のさまざまな抗体、すなわち、さまざまな特定の特徴を有する抗体を作製するために用いることが可能である。例えば、単一の種の体内で通常生じるプリオン蛋白質のみと結合し、その他の種の体内で通常生じるプリオン蛋白質とは結合しない抗体を作製することができる。さらに、感染型プリオン蛋白質（例えばＰｒＰＳｃ）のみと結合し、非感染型（例えばＰｒＰＣ）とは結合しないように抗体をデザインすることもできる。続いて、単一の抗体または一連の異なる抗体を用いてアッセイ装置を作成することもできる。このようなアッセイ装置は、当業者に公知の従来の技術を用いて調製することができる。抗体を公知の技法を用いて精製および単離し、公知の手順を用いて支持体表面に結合させることもできる。これによって得られる、抗体が結合した表面は、試料をアッセイして１種またはそれ以上の種類の抗体がその試料に含まれるか否かを判定するために用いることができる。例えば、ヒトＰｒＰＳｃのみと結合する抗体をある材料の表面に付着させることができ、ある試料をプロテイナーゼＫによって変性させることができる。変性した試料を、材料の表面に結合した抗体と接触させる。全く結合が生じなければ、その試料にはヒトＰｒＰＳｃが含まれていないと推論することができる。
【００８２】
また、本発明の抗体は、プリオンを中和する能力によっても特徴づけられる。具体的には、本発明の抗体をプリオンと結合させることによってプリオンの感染性は失われる。したがって、本発明の抗体組成物をあらゆる任意の製品に添加して、その製品中に存在するあらゆる感染性プリオン蛋白質を中和することができる。このため、ある製品が感染性プリオン蛋白質を含む可能性のある天然供給源から生産される場合には、本発明の抗体を予防措置として添加し、それによって感染性プリオン蛋白質に起因する感染の可能性をなくすことができると思われる。
【００８３】
本発明の抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィー技術と組み合わせて用いることができる。より具体的には、本抗体をクロマトグラフィーカラム内の１つの材料の表面上に配置することができる。その後に、精製しようとする組成物をカラムへ通過させることができる。精製しようとする試料に、抗体と結合する何らかのプリオン蛋白質が含まれていれば、それらのプリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）は試料から除去され、それによって精製されると思われる。
【００８４】
最後に、本発明の抗体は、哺乳動物の処理に用いることができる。本抗体を予防的に与えることも、感染性プリオン蛋白質にすでに感染していて、上記のアッセイの使用によってこの種の感染が判定された個体に投与することも可能である。投与する必要のある抗体の正確な量は、患者の年齢、性別、体重および病状などの多数の因子に応じて異なる。当業者は、少量の抗体を投与してその効果を判定し、その後に用量を調整することによって正確な量を決定することができる。用量は０．０１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまでの範囲が可能であり、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇを、１日１回またはそれ以上の回数に分けて、１日または数日にわたって投与することが示唆されている。プリオンの感染性の「リバウンド」の発生を避けるために、抗体は２〜５日またはそれ以上の連続した日数にわたって投与することが好ましい。
【００８５】
【実施例】
実施例
以下の実施例は、本発明のキメラ型遺伝子、トランスジェニックマウスおよびアッセイの作成および使用の仕方に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明らが発明とみなしている内容の範囲を制限するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確であるように努力は払っているが、実験的誤差および偏差が含まれていると考慮されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総重量にしめる部分重量であり、分子量は加重平均された分子量であり、温度は℃で示し、圧力は大気圧またはその近傍圧である。
【００８６】
抗体（Ｆａｂ）を発現するファージディプレイ抗体ライブラリーの構築
抗体、特に抗体のＦａｂ部分を発現させるためのファージディプレイライブラリーの構築は、当技術分野では周知である。好ましくは、抗体を発現するファージディプレイ抗体ライブラリーは、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、および１９９２年９月１６日に提出された米国特許出願第０７／９４５，５１５号に記載された方法に従って調製され、これらは参照として本明細書に組み入れられる。本発明の抗体を作製するために、本開示を用いて、一般的な方法の手順を適合させることが可能である。
【００８７】
プリオン特異的抗体をコードするＲＮＡの単離
一般に、抗ＰｒＰ抗体に関するファージディスプレーライブラリーは、抗ＰｒＰ抗体をコードするＲＮＡを含むＲＮＡのプールをまず単離することによって調製される。これを達成するには、ある動物（例えば、マウス、ラットまたはハムスター）に対して関心対象のプリオンによる免疫化を施す。しかし、通常の動物は、プリオンに対する抗体を検出可能または十分に高いレベルでは産生しない。この問題は、（ＰｒＰ）遺伝子が両方の対立遺伝子とも除去された動物に対して免疫化を行うことによって回避される。このようなマウスはＰｒｎｐ０／０と命名されており、このようなマウスを作出するための方法はビューラー（Ｂｕｅｌｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）および１９９３年５月２７日に刊行されたワイスマン（Ｗｅｉｓｍａｎｎ）による国際公開公報第９３／１０２２７号に開示されている。「ヌル」動物へのプリオンの接種により、プリオンに対するＩｇＧ血清力価がもたらされる（Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  １９９３）。１つの好ましい態様では、免疫化のために選択される動物は、ビューラーおよびワイスマンによって記載されたＰｒｎｐ０／０マウスである。
一般に、「ヌル」動物において血清抗体反応を誘発させるために必要なプリオンの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまでである。
【００８８】
プリオン蛋白質は、動物に対して、一般に注射、好ましくは腹腔内または静脈内注射、より好ましくは腹腔内注射によって投与される。動物には１回注射を行った後、引き続いて少なくとも１回から４回のブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）注射、好ましくは３回のブースター注射を行う。免疫化の後に、当技術分野では周知の方法に従って、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法などの標準的な免疫学的アッセイを用いて、その動物の抗血清のプリオンに対する反応性を試験することが可能である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）。プリオン結合性の抗血清を有する動物に対して、さらにプリオンを注射することによって追加抗原刺激（ｂｏｏｓｔ）を行ってもよい。
【００８９】
血清の抗体レベルは、抗体分泌の予測値であり、したがって、リンパ球、特に形質細胞における特定のｍＲＮＡのレベルの予測値でもある。このため、血清抗体、特に比較的高レベルの血清抗体の検出は、そのような血清抗体をコードするｍＲＮＡを産生する形質細胞などの高レベルのリンパ球と相関している。このため、プリオン蛋白質による免疫化を受けたマウスから単離された形質細胞は、特にその形質細胞が最後の注射による追加抗原刺激から短期間（例えば、約２〜５日、好ましくは３日）のうちにマウスから単離された場合には、プリオン特異的抗体を産生するリンパ球（例えば形質細胞）を高い比率で含むと思われる。このため、マウスの免疫化およびその後の注射による追加抗原刺激は、マウスの形質細胞の全集団の中に存在する抗ＰｒＰ抗体産生性の形質細胞の全体的な比率を高めるために有用である。さらに、抗ＰｒＰ抗体は最高血清レベルまたはその付近で産生されるため、抗ＰｒＰ抗体産生性の形質細胞は抗ＰｒＰ抗体を産生しているところであり、このためこれらの抗体をコードするｍＲＮＡも最高レベルまたはその付近である。
【００９０】
抗原特異的抗体の血清レベル、このような抗原特異的抗体を産生するリンパ球の数、および抗原特異的抗体をコードするｍＲＮＡの総量の間にみられる上記の相関によって、関心対象の抗原特異的抗体をコードするｍＲＮＡに富むｍＲＮＡのプールを単離するための手段が提供される。当技術分野で周知の方法に従って（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９を参照）、形質細胞を含むリンパ球を、プリオンによる免疫化を受けた動物の脾臓および／または骨髄から単離する。好ましくはリンパ球は、最後の追加抗原刺激から約２〜５日後、好ましくは約３日後に単離する。続いて、これらの細胞から全ＲＮＡを抽出する。哺乳動物細胞からＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）。
【００９１】
リンパ球ｍＲＮＡからの、抗体をコードするｃＤＮＡの産生
当技術分野で周知の方法に従い（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）、逆転写酵素を用いて、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを産生させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡを増幅する。重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡを増幅するために用いる３’プライマーは、特定の抗体サブクラスの重鎖または軽鎖抗体に共通した既知のヌクレオチド配列に基づく。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの重鎖を増幅するためには、ＩｇＧ１の重鎖をコードする遺伝子の定常領域に基づく１組のプライマーを用いることができ、一方、ＩｇＧ１サブクラスの軽鎖を増幅するためには、ＩｇＧ１の軽鎖をコードする遺伝子の定常部分に基づく別の組のプライマーが用いられる。５’プライマーは、データベース中の多数の可変領域の検討に基づいて得られたコンセンサス配列である。このようにして、特定の抗体クラスまたはサブクラスのすべての抗体をコードするＤＮＡが、増幅されたＤＮＡによってコードされる抗体の抗原特異性にはかかわらずに増幅される。重鎖または軽鎖をコードする遺伝子全体を増幅することが可能である。または、そのＰＣＲ増幅産物が、その対応する重鎖または軽鎖と会合して、抗原結合において機能する、すなわちプリオン蛋白質と選択的に結合することができる重鎖または軽鎖遺伝子産物をコードする限りにおいて、重鎖または軽鎖をコードする遺伝子の一部のみを増幅してもよい。好ましくは、このファージディスプレイ産物は、ＦａｂまたはＦｖ抗体断片である。
【００９２】
増幅のために選択された、抗体をコードするｃＤＮＡは、任意のアイソタイプをコードすることができ、好ましくはＩｇＧのサブクラスをコードする。模範的なマウスＩｇＧサブクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３が含まれる。増幅を目的とする特定の抗体サブクラスをコードするｃＤＮＡの選択は、例えば、抗原に対するその動物の血清抗体の反応などを含む種々の因子によって異なる。好ましくは、ＰＣＲ増幅を目的として選択される、抗体サブクラスをコードするｃＤＮＡは、その動物が最も高い抗体価を有する抗体を産生する抗体サブクラスのものである。例えば、血清ＩｇＧ１の抗体価が、血清抗体反応において検出される他のどのＩｇＧサブクラスよりも高ければ、ＩｇＧ１をコードするｃＤＮＡをｃＤＮＡプールから増幅する。
好ましくは、重鎖および軽鎖を形質細胞ｃＤＮＡから増幅することにより、１）重鎖ｃＤＮＡの増幅産物を含んでいて、その重鎖が特定の抗体サブクラスのものであるｃＤＮＡプール、および２）軽鎖ｃＤＮＡの増幅産物を含んでいて、その軽鎖が特定の抗体サブクラスのものであるｃＤＮＡプール、という２つの別々に増幅されたｃＤＮＡプールが作製される。
【００９３】
トランスジェニック動物からの抗体
ある動物にある抗原を感染させて、その後に抗体産生に寄与する細胞（およびそのＤＮＡ）を取り出すことによって抗体をコードする遺伝的材料を得ることに加えて、キメラ型マウス／ヒトもしくは完全なヒト抗体を作製するために、トランスジェニック動物の作出または上記の技術およびトランスジェニック技術の使用によって遺伝的材料を得ることも可能である。キメラ型または完全に外来性の免疫グロブリンを作製するための技術には、所望の抗原と結合する免疫グロブリンの全体または一部をコードする遺伝的材料がその生殖細胞系に挿入されたトランスジェニック動物の細胞からの入手が含まれる。完全なヒト抗体は、ヒト抗体をコードする遺伝的材料がそのゲノムに挿入されたトランスジェニック動物に産生させることができる。トランスジェニック動物にこのような抗体を産生させるための技術は、１９９０年４月１９日に刊行された国際公開公報第９３／１０２２７号に記載されている。さらに、グッドハード（Ｇｏｏｄｈａｒｔｄ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  第８４巻４２２９〜４２３３ページ、１９８７年６月、およびブッチーネ（Ｂｕｃｃｈｉｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２６巻、４０９〜４１１ページ、１９８７年３月２６日も参照され、これらはすべて、トランスジェニック動物に抗体を産生させる方法の開示および記載のために参照として本明細書に組み入れられる。
【００９４】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーとともに用いるためのベクター
続いて、重鎖をコードするｃＤＮＡおよび軽鎖をコードするｃＤＮＡのそれぞれを、適したベクターの別々の発現カセット中に挿入する。好ましくは、本ベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、１）原核生物の分泌シグナルドメイン、２）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡのいずれか）のための、重鎖ｃＤＮＡのための発現カセット中にある挿入部位、および３）繊維状ファージ膜アンカードメイン、を含む融合ポリペプチドをコードしていて、これを発現する能力を有するヌクレオチド配列を含む。
本ベクターは、融合ポリペプチドを発現させるために原核生物または哺乳動物のＤＮＡの発現調節配列、好ましくは原核生物の調節配列を含む。このＤＮＡ発現調節配列は、構造遺伝子の産物を発現するための任意の発現シグナルを含むことができ、異種ポリペプチドの発現のために、発現カセットに機能的に結合した５’および３’要素を含むことができる。この５’調節配列には、転写を開始するための１つのプロモーター、および上流にある翻訳可能な配列の５’末端で機能的に結合された１つのリボソーム結合部位が規定される。このベクターは、原核細胞、好ましくは大腸菌などのグラム陰性細胞における維持および複製のための複製開始点をさらに含む。また、本ベクターは、その発現によって、そのベクターによる形質転換を受けた原核または真核細胞に薬剤耐性などの選択的な利点が付与される遺伝子も含むことができる。
繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは、繊維状ファージ粒子の基質と会合し、それによって融合ポリペプチドをファージ表面に取り込む能力を持つｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコート蛋白質の１つのドメインである。分泌シグナルは、その蛋白質がグラム陰性菌の周辺質膜（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を標的とするようにさせる、蛋白質のリーダーペプチドドメインである。グラム陰性菌（大腸菌など）に関するこのようなリーダー配列は、当技術分野では周知である（例えば、Ｏｌｉｖｅｒら、Ｎｅｉｄｈａｒｄ，  Ｆ．Ｃ．（編）、大腸菌およびネズミチフス菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．、１：５６〜６９、１９８７）。
【００９５】
ファージディスプレイベクター中で用いるための繊維状ファージ膜アンカー
ベクターのための好ましい膜アンカーは、繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄおよび同等の繊維状ファージから得ることができる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによってコードされるコート蛋白質中に認められる。繊維状ファージのコート蛋白質の膜アンカードメインはコート蛋白質のカルボキシ末端領域の一部であり、脂質二重膜の両端に架橋するための疎水性アミノ酸残基の領域、および膜の細胞質面に通常認められ、膜から伸長する荷電アミノ酸残基を含む。ファージｆ１では、遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質の膜架橋領域は、第４１位から第５２位までのカルボキシ末端の１１残基を含む（Ｏｈｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５６：９９５１〜９９５８、１９８１）。模範的な膜アンカーは、ｃｐＶＩＩＩに対して第２５位から４０位までの残基を含むと考えられる。したがって、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子のＶＩＩＩコード蛋白質に由来する（ｃｐＶＩＩＩまたはＣＰ  ８とも呼ばれる）。遺伝子ＶＩＩＩのコート蛋白質は、成熟した繊維状ファージの大半のファージ粒子上に存在し、典型的にはコート蛋白質が約２５００〜３０００コピー存在する。
【００９６】
もう１つの好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩのコート蛋白質に由来する（ｃｐＩＩＩとも呼ばれる）。遺伝子ＩＩＩのコート蛋白質は、成熟した繊維状ファージのファージ粒子の一端に存在し、典型的にはコート蛋白質が約４〜６コピー存在する。繊維状ファージ粒子、それらのコート蛋白質、および粒子集団の構造に関する詳細な説明は、ラシェッド（Ｒａｃｈｅｄ）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、５０：４０１〜４２７、１９８６）およびモデル（Ｍｏｄｅｌ）ら（バクテリオファージ：第２巻（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ：Ｖｏｌ．２）、Ｒ．  Ｃａｌｅｎｄｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ｐ３７５〜４５６、１９８８）による総説の中に見いだされる。
【００９７】
好ましくは、繊維状ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡは、ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡを容易に切除することができ、ベクターの発現カセットの残りの部分を破壊することなくベクターが取り除かれるように、ライブラリーベクター中のｃＤＮＡ挿入物の３’側に挿入される。ファージ膜アンカーをコードするＤＮＡのベクターからの除去、および適切な宿主細胞における本ベクターの発現により、可溶性の抗体（Ｆａｂ）断片の産生がもたらされる。この可溶性Ｆａｂ断片はファージと結合した状態のＦａｂの抗原性を保持しており、このため、抗体の全体（断片化していないもの）が用いられるアッセイおよび治療法に用いることができる。
【００９８】
本発明とともに用いるためのベクターは、ヘテロ二量体の受容体（１つの抗体または抗体Ｆａｂなどのようなもの）を発現する能力を有する必要がある。すなわち、本ベクターは２つの別々のｃＤＮＡ挿入物（例えば、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡ）を独立に包含および発現する能力を有する必要がある。各発現カセットは、その繊維状ファージのアンカー膜をコードするＤＮＡが重鎖ｃＤＮＡに関する発現カセット中のみに存在する場合を除いて、上記の諸要素を含むことができる。したがって、抗体またはＦａｂがファージの表面上に発現される場合には、ファージ表面には重鎖ポリペプチドのみが係留される。軽鎖はファージ表面に直接的には結合しないが、重鎖ポリペプチドの自由部分（すなわち、ファージ表面と結合していない重鎖の部分）との会合を介してファージと間接的に結合する。
【００９９】
好ましくは、本ベクターは、定方向性連結を可能とする１つのヌクレオチド配列、すなわちポリリンカーを含む。ポリリンカーは、上流および下流に位置する複製および輸送のための翻訳可能なＤＮＡ配列と機能的に結合していて、ベクター中へのＤＮＡ配列の定方向性連結のための部位または手段を提供する、発現ベクターの１つの領域である。典型的には、定方向性ポリリンカーは、２つまたはそれ以上の制限酵素認識配列すなわち制限部位が規定されたヌクレオチド配列である。制限酵素による切断が起こると、この２つの部位から、翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結することができる付着末端が生じる。好ましくは、この２つの付着末端は非相補的であり、このためにカセット中へのｃＤＮＡの定方向性挿入が可能となる。ポリリンカーは１つまたは複数の定方向性クローニング部位を提供するものであり、挿入されたｃＤＮＡの発現期間中に翻訳されてもされなくてもよい。
【０１００】
好ましくは、本発現ベクターは、繊維状ファージ粒子の形態における操作を可能とするものである。このようなＤＮＡ発現ベクターは、適切な遺伝的相補体が提示された場合に、そのベクターが１本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製され、繊維状ファージ粒子中にパッケージングされるように、繊維状ファージの複製開始点が規定された１つのヌクレオチド配列をさらに含む。この特徴は、本ＤＮＡ発現ベクターに対して、引き続いて行う個々のファージ粒子の単離のためにファージ粒子中にパッケージングされる能力を提供する（例えば、単離された細菌コロニーの感染、およびその中での複製による）。
【０１０１】
繊維状ファージの複製開始点は、複製開始、複製終了、および複製によって生じた複製形態のパッケージングのための部位が規定された、ファージのゲノムの１つの領域である（例えば、Ｒａｓｃｈｅｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、５０：４０１〜４２７、１９８６；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８８：２１５〜２２３、１９８６を参照のこと）。本発明における使用のために好ましい繊維状ファージの複製開始点は、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄファージの複製開始点である（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：７５８３〜７６００、１９８８）。好ましいＤＮＡ発現ベクターは、発現ベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３’およびｐＣＯＭＢ３Ｈである。
【０１０２】
ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターは、（ｉ）重鎖および軽鎖が個々のプロモーターではなく単一のＬａｃプロモーターによって発現され、（ｉｉ）重鎖および軽鎖が、同一のリーダー配列（ｐＨＢ）ではなく２種類の異なるリーダー配列（ｐｇ１ＢおよびｏｍｐＡ）を有する、改変型のｐＣｏｍｂ３である。ｐＣｏｍｂ３Ｈに関する参考文献には、ワング（Ｗａｎｇ）ら（１９９５）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、印刷中がある。ｐＣｏｍｂ３Ｈの原理は、基本的にはｐＣｏｍｂ３に関するものと同じである。
【０１０３】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製
重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを発現ベクター内にクローニングした後、適切な繊維状ファージを用いて全ライブラリーのパッケージングを行う。続いて、このファージを用いてファージ感受性の細菌培養物（大腸菌の菌株など）を感染させ、ファージの複製および細胞の溶解を行わせてから、破壊された細菌細胞の細片から溶解物を単離する。このファージ溶解物には、免疫化された動物から単離されてクローニングされた重鎖および軽鎖を表面に発現する繊維状ファージが含まれる。一般に、重鎖および軽鎖はＦａｂ抗体断片としてファージ表面上に存在し、Ｆａｂの重鎖は融合ポリペプチドの繊維状ファージ膜アンカー部分を介してファージ表面に係留されている。軽鎖は重鎖と結合して抗原結合部位を形成する。キメラ型抗体を作製する方法は、１９８９年３月２８日にキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らに発行された米国特許第４，８１６，５６７号に記載されており、これはこのような手順の開示および記載のために参照として本明細書に組み入れられる。さらにボブルゼッカ（Ｂｏｂｒｚｅｃｋａ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２、ｐ．１５１〜１５５（１９８０）およびコニーツニー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ）ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  １４（１）、ｐ．８５〜９１（１９８１）も参照されたく、以上は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーからのプリオン抗原特異的Ｆａｂの選択
１つのプリオン抗原と特異的に結合するＦａｂまたは抗体を発現するファージは、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体の同定および単離のためのさまざまな手順のいずれを用いて単離することもできる。このような方法には、イムノアフィニティー精製（例えば、抗体を結合させたカラムに対するファージの結合）および抗体パニング法（例えば、抗原に対する高い結合親和性を持つファージを選択するための、固体支持体に結合させた抗原に対する反復実施によるファージの結合）が含まれる。好ましくは、ファージは、当技術分野で周知の技法を用いるパニングによって選択される。
抗ＰｒＰ抗体を発現するファージの同定および単離の後には、ファージを用いて細菌培養物を感染させることができ、そこで単一のファージ単離物が同定される。それぞれの別個のファージ単離物を、上記の１つまたは複数の方法を用いてさらにスクリーニングすることができる。抗原に対するファージの親和性をさらに確実にするため、および／または抗原に対するファージの相対的親和性を決定するために、その抗体またはＦａｂをコードするＤＮＡをファージから単離して、ベクター内に含まれる重鎖および軽鎖のヌクレオチドを、当技術分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）を用いて決定することができる。
【０１０５】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーから選択されたファージからの可溶性Ｆａｂの単離
可溶性抗体またはＦａｂは、抗体の重鎖に関する発現カセットと関連した繊維状ファージアンカー膜をコードするＤＮＡを切除することにより、同じ二シストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターの改変型ディスプレイから産生させることができる。好ましくは、アンカー膜をコードするＤＮＡは、重鎖発現カセットの残りの部分の破壊、または発現ベクターのその他のあらゆる部分の破壊を起こさずにアンカー膜配列の切除を可能とする、好都合な制限部位に隣接している。続いて、アンカー膜配列を持たない改変されたベクターに、その改変ベクターのパッケージングおよび細菌細胞への感染を行った後に、可溶性重鎖と同時に可溶性軽鎖を産生させる。
または、ベクターが適切な哺乳動物の発現配列を含む場合には、Ｆａｂを産生させるために、改変されたベクターを用いて真核細胞（例えば、哺乳動物または酵母細胞、好ましくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）に形質転換を施すこともできる。改変されたベクターが真核細胞での発現を生じない場合には、好ましくは本ベクターは、適切なベクターへのサブクローニングのために、重鎖および軽鎖の両方の発現カセットを単一のＤＮＡ断片として切除されうる。真核細胞および／または原核細胞における蛋白質の発現のためには、多数のベクターが、商業的に入手可能および／または当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。
【０１０６】
商業的アッセイ
以下の実施例１４〜１８、特に実施例１７は、何ら変性を生じさせずに、ＰｒＰＳｃに対して特異的に結合する抗体の単離を示している。ＰｒＰ蛋白質（すなわち、ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃ）を含む試料は、プロテアーゼＫ（ＰＫ）による消化を用いて変性させることができる。この種のものの使用は、ＰｒＰＣは消化するが、ＰｒＰＳｃは消化しないと考えられる。したがって、消化実施後に、実施例１７の通りに、適切な結合条件下でこの試料を抗体（例えばＲ２）と接触させる。好ましくは、この抗体はある基質と結合しており、試料を抗体が表面に結合された基質材料と容易に接触させられるように配置することができる。材料が基質表面に結合した抗体と結合すれば、感染性ＰｒＰＳｃの存在が確認される。
【０１０７】
本発明の商業的な態様では、本発明の抗体をサンドイッチ型アッセイにおいて用いることが望ましい。より具体的には、本発明の抗体を、１つの基質支持体表面に結合させることができる。試験しようとする試料を、結合が生じる条件下で支持体表面と接触させる。その後、反応していない部分をブロックし、その上にあるあらゆる蛋白質と結合すると思われる普遍的抗体を表面と接触させる。検出可能な標識がなされた普遍的抗体を、支持体表面上の抗体と結合したあらゆるＰｒＰＳｃと結合させる。結合が生じると標識が発色などによって検出可能となり、それによって標識の存在が示され、そのことから試料中のＰｒＰＳｃの存在が間接的に示される。本アッセイは、１００万分の１またはそれ未満、さらに１０億分の１またはそれ未満の割合の量で存在するプリオン（ＰｒＰＳｃ）の検出が可能である。ＰｒＰＳｃは、（ａ）動物供給源から抽出された治療的に活性な成分を含む薬学的製剤、（ｂ）ヒト供給源から抽出された成分、（ｃ）ヒト供給源から抽出された器官、組織、体液または細胞、（ｄ）注射剤、経口剤、クリーム剤、坐剤および肺内投与製剤からなる群より選択される製剤、（ｅ）化粧品、および（ｆ）哺乳動物の細胞培養物から抽出された薬学的に活性な化合物、からなる群より選択される１つの供給源の中に存在する可能性がある。また、このような供給源の材料は、本発明の抗体を添加することにより、ＰｒＰＳｃ蛋白質が除去または中和されるよう処理することが可能である。また、本発明には、それを必要とするある哺乳動物に対する、ＰｒＰＳｃ蛋白質の感染性を中和する能力を特徴とする抗体であって、ＰｒＰＳｃ蛋白質と選択的に結合する抗体の治療的有効量の投与を含む、処理の方法も含まれる。
【０１０８】
一般化された手順
本発明の抗体は、さまざまな技法によって得ることができると思われる。しかし、一般的な手順には、ファージ表面上における蛋白質（すなわち、抗体またはその一部）のライブラリーの合成が含まれる。続いて、このライブラリーを、ＰｒＰ蛋白質を含む組成物、特にＰｒＰＳｃを含む天然に生じる組成物と接触させる。ＰｒＰ蛋白質と結合するファージを、続いて単離し、ＰｒＰ蛋白質と結合する抗体またはその一部を単離する。その抗体またはその一部をコードする遺伝的材料の配列を決定することが望ましい。さらに、その他の抗体の産生のために、この配列を増幅して、それ単独または他の遺伝的材料とともに適切なベクターおよび細胞系列に挿入することができる。例えば、ＰｒＰＳｃと結合する可変領域をコードする配列を、定常／可変構築物を産生する１つの抗体のヒト定常領域をコードする１つの配列と融合させることができる。この構築物を増幅して、ヒト化抗体の産生のために適した細胞系列への挿入が可能な適切なベクターに挿入することもできる。このような手順は、１９８９年３月２８日にキャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らに発行された米国特許第４，８１６，５６７号に記載されており、これはこのような手順の開示および記載のために参照として本明細書に組み入れられる。さらにボブルゼッカ（Ｂｏｂｒｚｅｃｋａ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２、ｐ．１５１〜１５５（１９８０）およびコニーツニー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ）ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  １４（１）、ｐ．８５〜９１（１９８１）も参照され、以上も参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
ＰｒＰ蛋白質と結合する抗体またはその部分をコードする遺伝的材料が単離された場合には、その遺伝的材料を用いて、ＰｒＰに対するより高い親和性を有する他の抗体またはその一部を産生させることが可能である。これは、位置指定突然変異誘発の技術、またはランダム突然変異誘発および選択によって実施される。具体的には、配列内部にある個々のコドンまたはコドンの群を除去するか、異なるアミノ酸をコードするコドンによって置換する。この結果、多数の異なる配列の形成、増幅、および付加的なファージの表面上における抗体またはその一部の変異体の発現のための使用が可能となる。これらのファージは、続いて、ＰｒＰ蛋白質に対する抗体の結合親和性の試験のために用いることができる。
【０１１０】
ファージライブラリーは、各種の異なる方法で作製することができる。１つの手順によれば、マウスまたはラットなどの１つの宿主動物にＰｒＰ蛋白質による免疫化、好ましくはＰｒＰＳｃによる免疫化を施す。免疫化は、より多量および多種の抗体を形成させるためにアジュバントを併用して実施してもよい。抗体が産生されるための十分な時間をおいた後に、接種された宿主哺乳動物から抗体産生をもたらす細胞を採取する。採取した細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを作製するために逆転写にかける。抽出したｃＤＮＡをプライマーを用いて増幅し、適切なファージディスプレイベクターに挿入する。このベクターにより、ファージ表面上に抗原またはその一部を発現させる。ディスプレイベクターへの挿入の前に、ｃＤＮＡに位置指定突然変異を施すことも可能である。具体的には、より規模の大きいライブラリー（すなわち、多数の変異体を有するライブラリー）を作製するために、コドンを除去するか、または異なるアミノ酸を発現するコドンによって置換し、続いてそれをファージの表面上に発現させる。その後、上記の通りに、ファージを試料と接触させ、ＰｒＰ蛋白質と結合したファージを単離する。
【０１１１】
【実施例】
実施例
以下の実施例は、本発明のアッセイおよび組換え抗ＰｒＰ抗体の作成および使用の仕方に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明らが発明とみなしている内容の範囲を制限するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確であるように努力は払っているが、実験的誤差および偏差が含まれていると考慮されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総重量にしめる部分重量であり、分子量は加重平均された分子量であり、温度は℃で示し、圧力は大気圧またはその近傍圧である。
【０１１２】
実施例１
ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０の精製
ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０の精製ロッドは、ＲＭＬプリオン（チャンドラースクレイピー単離物（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  Ｒ．Ｌ．、１９６１、Ｌａｎｃｅｔ、１３７８〜１３７９））を接種され、臨床的に罹患したＣＤ−１マウスの脳から調製した。プリオンのロッドは、以前に記載されている通りに（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  １９８３  Ｃｅｌｌ）、ショ糖密度勾配分画によって回収した。簡潔に示すと、４８〜６０％（重量／容積比）ショ糖中に沈殿するプリオンのロッドを含む分画を、蒸留水にて２：１に希釈し、１００，０００×ｇの遠心処理を４℃で６時間行った。ペレットを水中に再懸濁し、再度遠心処理にかけた後に、０．２％サルコシルを含む、Ｃａ／Ｍｇ非含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にロッドを再懸濁した。ＰｒＰ  ２７〜３０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色分析によって決定された主要な蛋白質であった。蛋白質の定量化は、既知の量のウシ血清アルブミンを蛋白質濃度の標準として用いるビシンコニン酸色素結合法によって実施した。
【０１１３】
実施例２
Ｐｒｎｐ０／０マウスの免疫化
ＰｒＰ遺伝子の両方の対立遺伝子（Ｐｒｎｐ）が除去されたＰｒｎｐ０／０マウスに対して、実施例１に記載した通りに単離した、精製されたＭｏＰｒＰ  ２７〜３０のロッドによる免疫化を施した。Ｐｒｎｐ０／０マウスおよび本系統を作出するための方法は、当技術分野では周知である（Ｂｕｅｌｅｒら、１９９２）。Ｐｒｎｐ０／０マウスは、発達および行動の点では正常マウスと区別不能であり、感染性ＭｏＰｒＰＳｃの大脳内接種後にもスクレイピーに対する抵抗性を示し（Ｂｕｅｌｅｒら、１９９３  Ｃｅｌｌ；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  １９９３）、アジュバントとして比較的少量の精製されたＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を用いて免疫化を行った後にＭｏ−、ＳＨａおよびヒトＰｒＰに対するＩｇＧ血清抗体価を生じると考えられる（Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  １９９３）。
６週齢のＰｒｎｐ０／０マウス３匹（３）に対して、完全フロインドアジュバント中に十分に乳化させたＭｏＰｒＰ  ２７〜３０ロッド１００μｇの腹腔内注射による免疫化を施した。引き続いてマウスに対して、１回目はロッド１００μｇを含み、２回目はロッド５０μｇを含む不完全フロインドアジュバントにより、２週間間隔で２回の追加抗原刺激を行った。２回目の追加抗原刺激から４日後に、以下の実施例３に記載した通りに、各マウス血清のプリオン蛋白質に対する反応性を分析した。抗ＰｒＰ反応性の抗血清を有していたマウスに対して、２回目の追加抗原刺激から１４日後に、５０μｇのプリオンロッドを含む不完全フロインドアジュバントによる３回目の注射による追加抗原刺激を行った。
【０１１４】
実施例３
ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０による免疫化を受けたＰｒｎｐ０／０マウスの血清反応性
コンビナトリアルライブラリーからの特異的な抗体の単離が成功したことを示す主要な予測指標は、検討しようとする抗原に対する血清抗体の反応性である（ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４）。血清の抗体レベルは、抗体分泌の予測因子であり、このため形質細胞中の特定のｍＲＮＡのレベルの予測因子でもある。抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーの組成物を最終的に指示するのは、この後者の因子である。
２回目の追加抗原刺激から４日後に、実施例２で説明した通りにＭｏＰｒＰ  ２７〜３０による免疫化を受けたＰｒｎｐ０／０マウスの尾部から採血し、続いて実施する免疫学的分析のために、抗血清を−２０℃で保存した。免疫化を受けたマウス血清（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の各抗体サブクラス）の、変性および非変性のＭｏ−およびＳｈａＰｒＰ  ２７〜３０に対する反応性をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡのウェルには、４０μｇ／ｍｌのＰｒＰロッドを含むｐＨ８．６の１００ｍＭ重炭酸ナトリウム５０μｌを用いて４℃で一晩コーティングを施した。ＥＬＩＳＡにおける抗原としては変性ＰｒＰロッドを用い、６Ｍイソチオシアン酸グアニジウムを５０μｌ添加して室温で１５分放置した後に、ウェルをＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳで６回洗った。続いて、３％ＢＳＡを含むＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳによってすべてのウェルをブロックした。抗血清はＰＢＳによって連続希釈し、ウェルとともに３７℃で１時間インキュベートした。余剰の抗血清を１０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで１０回洗うことによって除去し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３マウス抗体のいずれかと特異的に結合する標識化ヤギ抗マウス抗体を用いて結合状態の抗血清を検出した。
３匹のマウスはすべて抗ＰｒＰ  ＩｇＧ抗体を産生した。これらのマウスのうちＤ７２８２と命名した１匹の血清反応性を、免疫化されたマウスの抗体反応の模範例として図５に示した。Ｍｏ−およびＳＨａのＰｒＰ抗原に対する血清抗体価が最も高かったのは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブクラスであった。これに対して、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３の抗ＰｒＰ抗体価は、免疫化を受けていないＰｒｎｐ０／０マウスの血清におけるすべてのＩｇＧサブクラスで認められたバックグラウンドレベルの反応性と近似していた。抗体価は、変性ロッドに対する値の方が非変性ロッドに対するものよりも高かった。Ｍｏ−およびＳＨａの変性ロッドに対する血清反応性の類似は、この２つの蛋白質の間にアミノ酸配列の高度の相同性があることを反映する可能性が高いと考えられる。しかし、非変性Ｍｏ−ロッドに対してかなり高い血清反応性（変性ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０に関するレベルの約４０〜５０％の値）がみられたものの、非変性ＳＨａロッドに関する反応性はバックグラウンドレベルにあった。
【０１１５】
実施例４
抗ＰｒＰ抗体をコードするｍＲＮＡの単離、およびファージディスプレイ抗体ライブラリーの構築
注射による最後の追加抗原刺激から３日後に、Ｄ７２８２マウスを屠殺し、骨髄および脾臓組織からＲＮＡを調製した。マウス脾臓からの全ＲＮＡの調製は、当技術分野で周知の方法（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９）に従って実施した。骨髄組織からのＲＮＡの調製は、まずマウスの両側後肢から脛骨および腓骨を摘出することによって行った。続いて骨を各端部の近傍で切断し、２７ゲージ針を用いて骨小腔にイソチオシアン酸グアニジウムを注入することにより、それらの内容物を流し出した。続いて、マウス脾臓に関して説明するものと同じようにしてＲＮＡの調製を続けた。
【０１１６】
続いてこのＲＮＡ調製物をプールし、当技術分野で周知の方法に従って、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。Ｄ７２８２マウスのｍＲＮＡから、１）ＩｇＧ１ライブラリー、および２）ＩｇＧ２ｂライブラリーの２つのｃＤＮＡライブラリーを独立に構築した。これらのライブラリーの各々について、重鎖をコードするｃＤＮＡおよび軽鎖のｃＤＮＡを、プールしたｃＤＮＡの別々の分画からＰＣＲによって別々に増幅した。ＩｇＧ１サブクラスのマウス軽（κ）鎖および重（α１またはα２ｂ）鎖をコードするＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチド５’および３’プライマーは、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９）が用いたものと同じであり、表１に提示しているその他の重鎖プライマーおよび表１に提示している重鎖ポリマーと同じであった。プライマーは、重鎖断片をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた。
【表１】
0003586275.tif 000003
【０１１７】
ＰＣＲはパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）９６００を用いて実施し、９４℃での変性を３０秒間、５２℃でのハイブリダイゼーションを６０秒間、および７２℃での伸長を６０秒間行う増幅処理を３５周期にわたって行った。
この結果得られた、ＩｇＧ１ならびにＩｇＧ２ｂサブクラスの重鎖および軽鎖をコードする増幅されたｃＤＮＡを、ベクターｐＣｏｍｂ３にクローニングした。ｐＣｏｍｂ３ベクターを用いて、繊維状ファージの表面上に表示されたＦａｂ抗体ライブラリーを調製する方法はすでに記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、ＰＮＡＳ、１９９３；Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ  １９９１）。簡潔に示すと、各ベクターがベクターの１つの発現カセット中に重鎖断片をコードする１つのｃＤＮＡ挿入物を含んで、ベクターの別の発現カセット中に軽鎖断片をコードするｃＤＮＡ挿入物が挿入されるように、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂの重鎖をコードする増幅されたｃＤＮＡおよび軽鎖をコードする増幅されたｃＤＮＡをｐＣｏｍｂ３ベクター内に挿入することによって、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂのファージディスプレイライブラリーを構築する。その結果得られるＩｇＧ１ライブラリーは約９×１０６個の独立したクローンを含んでおり、得られたＩｇＧ２ｂライブラリーは約７×１０５個の独立したクローンを含んでいた。
【０１１８】
続いて、この連結されたベクターに、当技術分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）を用いて、繊維状ファージＭ１３によるパッケージングを施した。続いて、ファージ粒子の数を増幅するために、パッケージングがなされたライブラリーを用いて大腸菌の培養物を感染させる。細菌細胞の溶解が生じた後に、ファージ粒子を単離し、次に行うパニング手順に用いた。後の増幅および使用のために、ファージライブラリーはいくつかに均等に分割して保存する。ファージライブラリーの別々の分割物は、後の増幅および使用のため分けて保存する。
【０１１９】
実施例５
ＰｒＰとの結合に関するファージディスプレイ抗体ライブラリーのスクリーニング抗原結合性ファージを、（Ｂｕｒｔｏｎら、ＰＮＡＳ  １９９１、Ｂａｒｂａｓ  Ｌｅｒｎｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９１）に記載されたパニング手順によってＥＬＩＳＡウェルに結合させたＰｒＰ抗原に対する変性ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０ロッドの結合性に関して選択した。簡潔に示すと、４０μｇ／ｍｌのＭｏＰｒＰロッドを含むｐＨ８．６の１００ｍＭ重炭酸ナトリウム５０μｌによって、ＥＬＩＳＡウェルに４℃で一晩コーティングを施した。続いて、６Ｍイソチオシアン酸グアニジウム５０μｌとともに室温で１５分インキュベートすることによってＰｒＰロッドを変性させ、その後にウェルをＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳで６回洗った。続いて３％ＢＳＡを含むＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳによってすべてのウェルをブロックした。
抗体ファージの均等分割物を、ＰｒＰをコートした別々のＥＬＩＳＡウェルに対して適用した。パニング実験では、１ウェル当たり合計約１×１０１０個の抗体ファージを添加した。
このファージを、強く結合したＭｏＰｒＰ抗原とともに３７℃で２時間インキュベートした。結合しなかったファージを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで１０回洗うことによって除去した。続いて、結合したファージを酸溶出によってウェルから取り外してプールし、再増幅の後に２回目のパニングの対象とした。
パニングを５回実施することによってＩｇＧ１ライブラリーを選択した。１回目のパニングから５回目までの測定の間に、ＰｒＰコードを施したＥＬＩＳＡウェルから溶出したファージの数によって決定されるＰｒＰ特異的抗体ファージは４０倍に増幅された。
【０１２０】
実施例６
選択された抗体産生ファージによる可溶性Ｆａｂの産生
４回目および５回目のパニング時に溶出されたファージクローンから可溶性Ｆａｂが産生された。選択されたファージクローンから得たＤＮＡを単離し、適切な制限酵素を用いて、ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターからファージコート蛋白質ＩＩＩ（繊維状ファージ膜アンカー）を取り除いた。このＤＮＡは自己連結を起こし、それによって可溶性Ｆａｂを発現する能力を持つベクターが生じる（可溶性Ｆａｂを産生させる手順は（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ  １９９１）に詳細な記載がある）。続いて、以上のベクターを別々に用いてＦａｂを発現するように細菌に形質転換を施し、単離された形質転換株を選択する。
Ｆａｂの発現は、細菌培養物にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えて一晩放置することで誘導させた。この細菌に遠心処理を施し、この結果得られた細菌ペレットに超音波処理または３回の凍結解凍処理を行い、細菌の細胞膜周辺腔からＦａｂを放出させた。続いて、ＥＬＩＳＡでＰｒＰに対する細菌Ｆａｂ上清の反応性を検討した。
【０１２１】
実施例７
抗ＰｒＰ  ＦａｂのＰｒＰ抗原との結合に関するＥＬＩＳＡ分析
実施例６で産生された可溶性Ｆａｂの、変性および非変性ＰｒＰ抗原ならびに合計ＰｒＰペプチドとの結合を、実施例３で説明したＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。合成ＰｒＰペプチドは、当技術分野で周知である従来のペプチド合成手順を用いて作製した。
変性ＭｏＰｒＰロッドに対する４回目のパニング時に採取したＦａｂクローンのうち、変性ＰｒＰに対する反応性を有していたのは５％未満であったが、５回目の同じパニングの際に採取したクローンの約５０％はＰｒＰ抗原を認識した。ＥＬＩＳＡでは、このパニングで得たすべての反応性クローンは、変性ＭｏおよびＳＨａロッドと特異的に結合する能力を持っていたが、どちらの種の非変性ロッドとも結合しなかった。さらに、すべての抗ＰｒＰ  Ｆａｂが、ＭｏおよびＳＨａのＰｒＰの残基９０〜１４５にわたる範囲の合成ペプチドを認識せず、このことから以上の抗体はプリオン蛋白質の残基１４６から２３１までの間に結合することが示唆された。
【０１２２】
実施例８
プリオンに感染した、および感染していない齧歯類の脳組織に対する、選択された抗ＰｒＰ抗体（Ｆａｂ）の結合に関する分析
ファージディスプレイ抗体ライブラリーのパニングによって同定された抗体の反応性を、プリオンに感染した齧歯類の脳組織のＳＤＳ／ＰＡＧＥ、および選択されたＦａｂを用いるウエスタンブロット分析によって検討した。プリオンに感染した、および感染していないマウスの脳組織から得た蛋白質を、免疫反応性を検討する抗原として用いた。抗原は、Ｃａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳ中に浸したマウス脳組織を２０ゲージ針に５回通過させ、続いて２２ゲージ針に１０回通過させて破砕することによって調製した。続いて、１０％（重量／容積比）ホモジェネートに１６００×ｇ、４℃の遠心処理を５分間行った。上清蛋白質の均等分割物を０．２サルコシルを含むＣａ／Ｍｇ非含有ＰＢＳによって希釈し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。この希釈物を等容積の非還元性２倍ＳＤＳ／ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸した後にＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７、６８０〜６８５）にかけた。免疫ブロット法は、１：１０００に希釈したマウスＩｇＧ一次抗血清を用いて、以前に記載されている通りに実施した（Ｐａｎら、ＰＮＡＳ  １９９３）。
【０１２３】
実施例９
核酸の塩基配列決定
いくつかのＰｒＰ特異的クローンに関して、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のヌクレオチドならびにアミノ酸配列を決定した。核酸の塩基配列決定は、Ｔａｑ蛍光ジデオキシヌクレオシド終結サイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、モデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって行った。抗体の軽鎖配列を解明するためのプライマーは、（−）鎖とハイブリダイズするプライマーＭｏＳｅｑＫｂ［５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ−３’］およびＯｍｐＳｅｑ［５’−ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  Ｇ−３’］であり、重鎖については（＋）鎖と結合するＭＯＩｇＧＧｚＳｅｑ［５’−ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＣ−３’］および（−）鎖と結合するＰｅｌＳｅｑ［５’−ＡＣＣ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ−３’］である。
変性ＰｒＰに対する１回のパニングで得たいくつかのファージクローンに関して導出されたアミノ酸配列を図６および７に提示した。図６は、マウスＤ７２８２から得たＩｇＧ１ライブラリーの変性ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０ロッドに対するパニングによって作製され、選択された重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示している。以上の配列は極めて類似しているが、不均一な部分も多数含んでおり、これはマウスをＰｒＰ抗原に反復曝露した後の体細胞変異の結果である可能性が高い。これらのクローンで検討した重鎖配列はすべて、極めて類似した配列を含んでいた。特に重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）は、検討したすべてのＦａｂクローンにおいてヌクレオチドレベルで一致していた。重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、フレームワーク（ＦＲ）３およびＦＲ４にはわずかな差異が認められた。これらの差異は多数であったため、ＰＣＲまたは塩基配列決定時の誤差のためとは考えにくく、おそらくはマウスが抗原による反復刺激を受けたことによる体細胞変異の間に生じたものと考えられる。軽鎖の配列も極めて類似していたが、可変領域の全体にわたって局所的な不均一性が認められ、これもおそらく体細胞変異に起因すると考えられた。
【０１２４】
実施例１０
存在する抗体によるエピトープのマスキング後の抗プリオン抗体の選択
変性ＰｒＰに対するＩｇＧ１ライブラリーのパニングによって、おそらく単一のエピトープを指向する１つのクローンの体細胞変異体と考えられる、一連の関連した抗体が作製された（実施例９）。他のエピトープに対する抗体を得るため、通常のやり方のパニングを行う前に、上記の一連のものに由来するプロトタイプ抗体をＥＬＩＳＡウェル中にある変性ＰｒＰに添加した。以降のすべてのパニング段階でこのマスキング抗体を用いた。この手順を用いた場合、抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて変性ＰｒＰと反応する異なる配列に由来していた。これらの抗体は、ＰｒＰ上の異なるエピトープを指向する可能性が高いと考えられる。マスキングの手順は、ディツェル（Ｄｉｔｚｅｌ）ら（１９８５）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記載されている通りに実施した。ＰｒＰと相互作用する抗体以外の分子を用いてマスキングを実施することも可能と思われる。
【０１２５】
実施例１１
ＰｒＰＳｃに対して特異的な抗ＰｒＰ抗体を発現するファージ粒子の選択
ＰｒＰＳｃと結合するがＰｒＰＣとは結合しないファージクローンを同定するために、各実施例で説明したものと同様のファージディスプレイ抗体ライブラリーに対してパニングを行う。ＰｒＰＳｃ抗原およびＰｒＰＣ抗原は、ＥＬＩＳＡアッセイに関して記載した通りに、マイクロタイター用ディッシュの別々のウェルに結合させる。ファージディスプレイ抗体ライブラリーをまずＰｒＰＣの入ったＥＬＩＳＡウェルに対してパニングする。結合しなかったファージはウェルから取り除いてプールする。ＰｒＰＣ抗原と結合したファージはウェルから採取し、廃棄するか、または後の分析のためにプールする。続いて、プールした非結合性のファージをＰｒＰＣが入ったＥＬＩＳＡウェルに再び添加して、ＰｒＰＣに対して結合しない点に基づいて再度選択する。ＰｒＰＣ抗原上で何度か繰り返して選択した後に、ファージをプールし、ＰｒＰＳｃ抗原を含むＥＬＩＳＡウェルに対するパニングを行った。このパニングを数回繰り返し、それによってＰｒＰＳｃ抗原と結合するファージがさらに複数回のパニングによって選択されるようにした。ＰｒＰＳｃ抗原に対するパニングを５〜１０回行った後に、ファージをそれぞれ単離した。ＰｒＰＳｃ特異的ファージまたは単離されたＦａｂのＰｒＰＣ抗原に対する結合能は、ＰｒＰＣ抗原を用いるＥＬＩＳＡによって再確認が可能である。この結果選択されるファージは、ＰｒＰＳｃと結合するが、ＰｒＰＣとは結合しない。
【０１２６】
実施例１２
アイソフォームとは無関係にＰｒＰＳｃを同定する抗ＰｒＰ抗体を発現するファージ粒子の選択
ＰｒＰＳｃアイソフォームによる複数回の免疫化を受けたマウスから得たリンパ球ＲＮＡから、またはさまざまな種類のＰｒＰＳｃアイソフォームによる免疫化を受けた数匹のマウスから得たリンパ球ＲＮＡのプールから、上記の通りに、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを調製する。続いて、このファージをＰｒＰＳｃの異なるアイソフォームに由来する抗原を含む複数の異なるウェルを用いてパニングする。ファージのパニングは、各段階でそのアイソフォームと結合するファージを選択しながら、ＰｒＰＳｃの各アイソフォームに対して行う。ファージのパニングは、ＰｒＰＳｃの各アイソフォームについて合計約５〜１０回実施する。検討したすべてのアイソフォームに対するパニングの全段階の後に残ったファージを続いて単離する。選択された各ファージまたは単離されたＦａｂの免疫反応性を、種々のＰｒＰＳｃアイソフォームのそれぞれに対するＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法または組織化学的分析によって検討し、同じくＰｒＰＣとの交差反応性も検討した。
【０１２７】
実施例１３
ＰｒＰＳｃのアイソフォームに特異的な抗ＰｒＰ抗体を発現するファージ粒子の選択
特定のＰｒＰＳｃアイソフォームによる免疫化を受けたマウスのリンパ球ｍＲＮＡから調製されるファージディスプレイ抗体ライブラリーを、上記の実施例に従って調製する。続いて、結果として得られたファージを、１つの特定のＰｒＰＳｃアイソフォームのみと結合する能力に関してパニングによって選択する。このパニングには、それに対する特異的抗体が望まれる特定のＰｒＰＳｃアイソフォームに由来する抗原を含む一式のウェルを含む、ＰｒＰＳｃのさまざまなアイソフォームに由来する抗原を含む複数の異なるウェルを用いる。まずファージを、望ましくないＰｒＰＳｃアイソフォームに対してパニングし、その抗原と結合しないファージを選択する。パニングは、ＰｒＰＳｃアイソフォームのそれぞれに関して合計約５〜１０回連続して行う。続いて、望ましくないＰｒＰＳｃアイソフォームと結合しないファージを、望ましいＰｒＰＳｃアイソフォームに対して約５〜１０回パニングして、抗原と結合するものを選択する。すべてのパニングを実施した後に残ったファージを単離する。選択されたこれらのファージは、望ましい特定のＰｒＰＳｃアイソフォームのみに対する結合特異性を有する抗体を発現するものである。選択された各ファージまたは単離されたＦａｂの免疫反応性を、種々のＰｒＰＳｃアイソフォームのそれぞれに対するＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって検討し、同じくＰｒＰＣとの交差反応性も検討する。
【０１２８】
実施例１４
Ｐｒｎｐ０／０マウスにおけるＰｒＰＳｃに対する血清反応性の生成および特徴分析
上記の実施例に示した実験法により、１０７ｐｆｕ／ｍｌ前後のサイズを有するコンビナトリアルライブラリーからの特異的な抗体の単離が成功したことを示す主要な予測指標が、検討しようとする抗原に対する血清抗体の反応性であり、ライブラリーの組成物を最終的に指示するのは、この因子であることが確立された。Ｐｒｎｐ０／０マウスは、ＰｒＰ  ２７〜３０蛋白質を有するマウス（Ｍｏ）またはシリアンハムスター（ＳＨａ）のプリオンロッドのいずれかによる免疫化により、直ちに強い免疫応答を明らかに示したが、最も高い血清抗体価が認められたのは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２サブクラスであった。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３の抗ＰｒＰ抗体価は、免疫化を受けていないＰｒｎｐ０／０マウスの血清ですべてのＩｇＧサブクラスに関して認められたバックグラウンドレベルの反応性と近似していた。ＰｒＰＳｃに対する免疫応答を高め、免疫レパートリー（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を増大させる試みにおいて、Ｐｒｎｐ０／０（９４％ＦＶＢ）雌マウスにＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を含むリポソームによる免疫化を行った。免疫応答の多様性をさらに高めるために、短期的および長期的手順の両方を用いてマウスに免疫化を施した。ＳＨａプリオンロッドによる免疫化の場合とは対照的に、ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を含むリポソームによる免疫化では、４種のＩｇＧサブクラスのすべてを含む抗血清抗体価が得られた。
【０１２９】
実施例１５
ヒストブロットに対する、ＰｒＰによる免疫化で得られた血清の反応性
ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を含むリポソームによる免疫化を受けたマウスから得た血清中に認められたＩｇＧ抗ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０の性質をさらに調べるために、本発明者らは、正常およびスクレイピーに感染したＳＨａの脳のクリオスタット切片をニトロセルロース膜上に移行させるヒストブロット法により、血清をインサイチューで検討した。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理した正常ＳＨａの脳切片には両方の血清とも若干の非特異的反応性を示したが、ＰＫで処理したＳＨａスクレイピー感染脳切片に対する反応性の増加が示されたのは長期的な免疫化を受けたマウスからの血清のみであった。この反応性は、血清を１／１０００に希釈した場合にも明らかであった（結果は提示せず）。いずれの血清とも、まずＰＫで処理して、続いて３Ｍ  ＧｄｎＳＣＮに１０分間曝露させたＰＫ処理ＳＨａスクレイピー感染脳切片に対しては典型的な反応性を示した。免疫化を受けていないＰｒｎｐ０／０（９４％ＦＶＢ）雌マウスからの血清は、正常なＳＨａ脳切片、スクレイピー感染ＳＨａ脳切片に対して全く免疫反応性を示さなかった。
【０１３０】
スクレイピーに感染したＳＨａ脳のヒストブロットにおけるＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０および変性ＳＨａＰｒＰの染色
正常な、接種を受けていない対照ＳＨａ、およびＳｃ２３７プリオンの接種後にスクレイピーの臨床徴候を呈したＳＨａからＰｒＰＣを除去するために、ヒストブロットをプロテイナーゼＫによって処理した。ＳＨａＰｒＰを変性させるために、ヒストブロットを３Ｍ  ＧｄｎＳＣＮで１０分間処理した。短期的および長期的な免疫化を受けたマウスから得た血清の１／２００希釈物とともに、ブロットを４℃で一晩インキュベートした。本明細書に記載した結果では、抗血清が、変性していない感染性プリオン、すなわち天然のＰｒＰＳｃと明らかな陽性の反応を生じることが示された。
図８は、スクレイピーに感染したＳＨａ脳に関する、染色された８種の異なるヒストブロットを示している。正常な、接種を受けていない対照ＳＨａ（Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）、およびＳｃ２３７プリオンの接種後にスクレイピーの臨床徴候を呈したＳＨａ（Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）からＰｒＰＣを除去するために、以上のヒストブロットをプロテイナーゼＫによって処理した。ＳＨａＰｒＰを変性させるために、ヒストブロットを３Ｍ  ＧｄｎＳＣＮで１０分間処理した（Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨ）。短期的（Ａ〜Ｄ）および長期的（Ｅ〜Ｈ）な免疫化を受けたマウスから得た血清の１／２００希釈物とともに、ブロットを４℃で一晩インキュベートした。以上の結果から、本発明の抗体が天然の変性していない感染性プリオンに対する結合能を有する、すなわち天然のＰｒＰＳｃに対する結合能を有することが明らかに示された。
【０１３１】
実施例１６
実施例１４の免疫化マウスからのモノクローナル抗体の作製
合計８種のファージＦａｂディスプレイライブラリーを構築した：短期的および長期的な免疫化を受けたマウスから採取したｍＲＮＡからのＩｇＧ１κ、ＩｇＧ２ａκ、ＩｇＧ２κおよびＩｇＧ３κである。ＰｒＰ  ２７〜３０を含むプリオンロッドに対するパニングによって抗ＰｒＰ  Ｆａｂを発現するファージを単離する際の困難さを克服するために、ライブラリーをビオチン化ＳＨａ  ２７〜３０に対してパニングし、リポソーム中に分散化させて、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイター用プレートと結合させる１つのパニング系を用いた。５回のパニングの後に、５０種を超えるクローンからの大腸菌抽出物を、ＥＬＩＳＡにてビオチン化ＳＨａ  ２７〜３０、ＳＨａ  ２７〜３０ロッドおよび９０〜２３１組換えＳＨａと反応させた。これらのクローンは、ＳＨａＰｒＰの残基９０〜２３１に対応する組換えｒＰｒＰとも反応するため（メルホーン（Ｍｅｌｈｏｒｎ，  Ｉ）ら、プリオン蛋白質の精製された１４２残基ポリペプチドの高レベルの発現および特徴分析（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  １４２−ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５、５５２８〜２２３７（１９９６））、事実上すべてのライブラリーからより異質なクローンを首尾よく単離するために、８種のライブラリーのすべてをこの抗原に対してパニングした。ＩｇＧの重鎖をコードするプラスミドの領域のＤＮＡシークエンシングにより、別個のクローンとして３０種のＦａｂが同定された。
【０１３２】
実施例17
モノクローナル抗体の特徴分析
陽性クローンからの大腸菌抽出物による最初のELISAにより、3F4モノクローナル抗体とは異なり（カスザック（Kascsak, R.J.）ら、「スクレイピーに関連した繊維性蛋白質に対するマウスのポリクローナルおよびモノクローナル抗体（Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-assocoated fibril proteins）」、J. Virol. 61:3688〜3693（1987））、以上のFabは、天然の状態の、すなわち変性段階を経ずともPrP 27〜30と結合することが示唆された。これらのFabの新規性を定量的な特徴として示すために、本発明者らはそれらを精製し、酵素的切断によってモノクローナル抗体3F4から3F4 Fabを作製した。さまざまな濃度の精製Fabを用いて、SHaPrPの検出のための標準的なELISAを実施した。特徴的なSHa PrPの結合特性（プリオンロッドに対する基礎的結合、および3M非変性GdnSCNで処理されたSHaPrP 27〜30に対する強い反応性）を示した3F4とは対照的に、新たに単離されたFabは何ら変性段階を経ずともプリオンロッドと反応した。非変性プリオンロッドとの最大半減結合（half-maximal binding）が得られたのはFabの濃度が約0.5pg／mlの場合であり、このことから、本抗体の見かけの結合親和性は約10８ｌ／molであることが示された。
図9は、プリオン蛋白質SHa 27〜30に対する精製FabのELISA反応性を示したグラフである。さまざまな濃度の抗体3F4および組換え抗体の、ショ糖精製を行った0.2μgの感染性SHaプリオンロッドでコートしたELISAウェルに対する結合性を評価した。この結果から、本発明のすべての組換え抗体は、抗体3F4と比べて、プリオンに対して実質的により高い結合性を有することが明らかに示された。
【０１３３】
変性プリオン蛋白質ＳＨａ  ２７〜３０に対する精製ＦａｂのＥＬＩＳＡ反応性に関する手順
さまざまな濃度の精製３Ｆ４  Ｆａｂおよび組換えＦａｂを、ショ糖精製を行った天然型またはＥＬＩＳＡウェル中にて３Ｍ非変性ＧｄｎＳＣＮで１０分間処理した変性型のＳＨａプリオンロッド０．２μｇによってコートしたＥＬＩＳＡウェルに対する結合性について評価した。
図１０は、変性プリオン蛋白質ＳＨａ  ２７〜３０に対する精製ＦａｂのＥＬＩＳＡ反応性を示したグラフである。図９と比較して図１０は、図９の通りの本発明の組換え抗体は３Ｆ４と比べてプリオンロッドに対するより高い親和性を示したが、Ｒ１を除くすべての組換え抗体は変性抗原に対してより低い親和性を示した点で興味深い。
【０１３４】
実施例18
免疫沈降法によるモノクローナル抗体の特徴分析
SHaPrP 27〜30の免疫沈降
Fabの抗PrP 27〜30活性の確認と同時に、3F4が非変性SHaPrP 27〜30と結合する能力を持たないことの確認のために、SHa 27〜30を含むリポソームを用いる免疫沈降法を開発した。Fab産生クローンからの大腸菌抽出物により、溶液中に存在するSHaPrP 27〜30の40〜50％が免疫沈降を生じたが、1／500に希釈した3F4によって免疫沈降を生じたのは痕跡量のSHaPrPのみであった。細菌上清におけるFabの濃度は典型的には1〜10pg／mlのオーダーであった。このことは、抗原に対する親和性が高いことを意味する（10７〜10８ｌ／molまたはそれ以上）。抗体3F4は腹水として得られ、免疫沈降実験では約1μg／mlの濃度に希釈して使用されたものと考えられる。新たなFabがSHaPrP 27〜30の免疫沈降をもたらす能力を、3F4との比較により、精製したFab mAb D4およびR2を用いて評価した。Fab 2Rは、0.1pg／ml（500pl中に50ng）という低濃度でもSHaPrP 27〜30を強力に免疫沈降させ、このことから、親和性が10８M−２（すなわち10８ｌ／mol）よりも高いオーダーであることが示された。Fab 2Rの能力はそれよりも低かったが、3F4よりは効率的に明らかな抗原の免疫沈降を引き起こした。D4、R2、6D2、D14、R1およびR10はすべて本発明の抗体として言及されることに留意する必要がある。
組換えFabによるSHaPrP 27〜30の免疫沈降
【０１３５】
１／５００に希釈した３Ｆ４、およびＦａｂを含む大腸菌抽出物１００μｌがＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０の免疫沈降を引き起こす能力を、ウエスタンブロット法によって観測した。レーン１４を除くすべてのレーンは、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＦａｂおよびプロテインＡアガロースを含む免疫沈降物である。レーン１、３、５、７、９、１１、１３にはＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を含むリポソーム１０μｌを添加した。異なるさまざまなクローンからの１／５００に希釈した大腸菌抽出物１００μｌを以下の通りに添加した：レーン２〜３、６Ｄ２；レーン４〜５、Ｄ１４；レーン６〜７、Ｒ１；レーン８〜９、Ｒ１０；レーン１０〜１１、Ｄ４；レーン１２〜１３、３Ｆ４。レーン１４には免疫沈降に用いた量の１／２の容積のリポソームをロードした。
【０１３６】
上記の結果は、図１１の写真に示されている。写真には、本発明の組換え抗体を用いた場合により高度の免疫沈降が生じたことが示されている。
【０１３７】
図１２は、本発明の精製されたＦａｂ（２Ｒおよび４Ｄ）ならびに３Ｆ４によるＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０の免疫沈降を示す写真である。抗原の免疫沈降を引き起こす能力はウエスタンブロット法によって観測した。レーン１４を除くすべてのレーンは、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＦａｂおよびプロテインＡアガロースを含む免疫沈降物である。結果を得るために、レーン５、９および１３を除くすべてのレーンに、ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０を含むリポソーム１０μｌを添加した。レーン２〜１３の各レーンには、添加した精製Ｆａｂの量（ｎｇ）をあわせて表示した。レーン１４には、免疫沈降に用いた量の半分の容積のリポソームをローディングした。以上の結果は、本発明の抗体２Ｒおよび４Ｄを用いた場合には、３Ｆ４と比べて著しく高度の免疫沈降が生じたことを示している。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡのデータ（図９）は、多数のＦａｂが非変性ＰｒＰ  ２７〜３０と飽和性結合を生じ、その最大半減結合が０．５μ／ｍｌ前後であることを明らかに示している。これは見かけの結合定数１０８Ｍ−１（Ｆａｂの分子量＝５０，０００）に対応する。同時に、３Ｆ４は２μｇ／ｍｌまでの範囲で明らかな結合性を示さなかった。図１０に示した変性ＰｒＰ  ２７〜３０との場合には、組換えＦａｂはより高いレベルで結合するが、見かけの親和性は同程度である。このことは、変性がより抗原性の高い部位で生じたものの、それらの親和性は変わらなかったことを示唆する。重要なことに、３Ｆ４はこの場合には組換えＦａｂと同程度に結合し、見かけの親和性は１０８Ｍ−１のオーダーである。図９および図１０の３Ｆ４に関するデータの比較から、非変性型におけるＰｒＰ  ２７〜３０の完全性が強く示唆される。このことから、これらの組換えＦａｂが、ＰｒＰ  ２７〜３０の調製物中に存在する変性ＰｒＰの分画と反応したと考えることも可能であろう。しかし、３Ｆ４が非変性ＰｒＰ  ２７〜３０との反応性を示さず、さらに変性ＰｒＰ  ２７〜３０とは強い反応性を示したことは、この解釈を否定するものであり、これらの組換えＦａｂが非変性ロッドを高い親和性で認識することを強く示唆している。
【０１３９】
免疫沈降データは、ＥＬＩＳＡのデータを裏づけるものである。粗細菌上清中に認められるような低濃度の組換えＦａｂ（典型的には１〜１０μｌ／ｍｌ）は、ＰｒＰ  ２７〜３０を免疫沈降させる高い効力を有する（図１１）。これは１０７〜１０８Ｍ−１のオーダーの親和性を意味する。これに相当する濃度条件下では、３Ｆ４は明らかな沈降を引き起こさない。より定量的な分析（図１２）では、Ｆａｂ  Ｒ２が０．１〜０．２μｇ／ｍｌの範囲の若干の滴下によって非常に効率的にＰｒＰ  ２７〜３０の免疫沈降を引き起こすことが示されており、これは結合親和性が１０８Ｍ−１のオーダーであることを意味する。Ｆａｂ  ４Ｄの親和性はこれよりも低く、３Ｆ４による免疫沈降は実際に極めて弱いものであった。この詳細な実験からみて、３Ｆ４の親和性は５×１０７Ｍ−１よりもかなり低く、おそらく１０７Ｍ−１よりも低いと考えられる。
【０１４０】
【発明の効果】
これらを総合すると、以上のデータは、これらの組換えＦａｂが１０７〜１０８Ｍ−１の範囲の親和性を有することを示している。
本明細書では、本発明に関して最も実践的であって好ましい態様と考えられるものを示し、説明している。しかし、この内容からの逸脱も本発明の範囲にあり、本開示を読むことにより当業者には改変が想起されることが理解される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常野生型のヒトＰｒＰ蛋白質と正常野生型のマウスＰｒＰ蛋白質との間の相違点を示すＰｒＰ蛋白質の部分の模式図である。
【図２】図２は、マウスＰｒＰのアミノ酸配列を、マウスＰｒＰとヒトＰｒＰとの間の明確な相違点とともに示したものである。
【図３】図３は、マウスＰｒＰのアミノ酸配列を示しており、特にマウスＰｒＰとウシＰｒＰとの間の相違点を示したものである。
【図４】図４は、マウスＰｒＰのアミノ酸配列を示しており、特にマウスＰｒＰとヒツジＰｒＰとの間の明確な相違点を示したものである。
【図５】図５は、変性マウスＰｒＰ  ２７〜３０に対するマウス（Ｄ７２８２）の血清の反応に関して、血清希釈度と４０５ｎｍにおける光学濃度との関係を示した棒グラフである。
【図６】図６は、マウスＤ７２８２から得たＩｇＧ１ライブラリーを変性ＭｏＰｒＰ  ２７〜３０ロッドに対してパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）することによって作製した、選択された（Ａ）重鎖および（Ｂ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示したものである。
【図７】図７は、ＰｒＰに対する１回のパニングで得られたファージクローンの一部に関して導出されたアミノ酸配列を示したものである。
【図８】図８Ａ〜８Ｈは、ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０および変性ＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０の染色結果を示すヒストブロット８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ、８Ｇおよび８Ｈの写真である。
【図９】図９は、プリオン蛋白質ＳＨａ  ２７〜３０に対する精製ＦａｂのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、変性プリオン蛋白質ＳＨａ  ２７〜３０に対する精製ＦａｂのＥＬＩＳＡ反応性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の組換えＦａｂによるＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０のアミノ沈降を示す写真である。
【図１２】図１２は、本発明の精製ＦａｂによるＳＨａＰｒＰ  ２７〜３０のアミノ沈降を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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