【手続補正書】
【提出日】平成29年6月12日(2017.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物または非ヒト生物を改変する方法において、
組成物を発現させるためその組成物を作動可能にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、前記組成物が、
（Ａ）天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が、
（Ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、および
ＩＩ．場合により少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含み、
（Ａ）、（ｂ）および（ｃ）が５’から３’配向で配置されており、
成分ＩおよびＩＩは前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルスベクターの１つ以上が形質導入によって送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
必要としている対象または非ヒト対象における目的のゲノム遺伝子座の標的配列の欠陥によって引き起こされる病態を治療または阻害する方法において、前記標的配列の操作によって前記対象または非ヒト対象を改変するステップを含み、および前記病態は、
組成物を発現させるためその組成物を作動可能にコードする１つ以上のＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを含むＡＡＶまたはレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む治療を提供することを含む前記標的配列の操作による治療または阻害に感受性があり、前記標的配列は発現時の前記組成物によって操作され、前記組成物が、
（Ａ）天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が、
（Ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、および
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
［（Ａ）、（ｂ）および（ｃ）は５’から３’配向で配置されており、
成分ＩおよびＩＩは前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
または
（Ｂ）天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（Ａ）真核細胞における標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、および
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、
［成分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物
を含む、方法。
【請求項４】
インビトロ、および／またはエキソビボで実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
発現を誘導することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物または対象が真核生物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物または対象が非ヒト真核生物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物または対象が哺乳動物または非ヒト哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ２／８を含むＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９、任意選択によりＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガイド配列の発現が前記Ｔ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの前記発現によってドライブされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素を送達する方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチドまたは酵素コード配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを前記細胞に送達することにより前記細胞に送達される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＡＶまたはレンチウイルスをコードする１つまたは複数の核酸分子を含有するまたはそれから本質的になる１つまたは複数のプラスミドをＡＡＶ感染細胞またはレンチウイルス感染細胞に形質移入すること、および前記ＡＡＶまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須のＡＡＶ  ＡＡＶまたはレンチウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐおよび／またはヘルパー核酸分子を提供することを含む、請求項９に記載のＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを調製する方法。
【請求項１５】
前記ＡＡＶまたはレンチウイルスをコードする１つまたは複数の核酸分子を含有するまたはそれから本質的になる１つまたは複数のプラスミドをＡＡＶ感染細胞またはレンチウイルス感染細胞に形質移入すること、および前記ＡＡＶまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須のＡＡＶ  ＡＡＶまたはレンチウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐおよび／またはヘルパー核酸分子を提供することを含む、請求項７に記載の方法で使用するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを調製する方法。
【請求項１６】
前記ＡＡＶまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須の前記ＡＡＶまたはレンチウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐが、前記細胞に１つまたは複数のヘルパープラスミドまたは１つまたは複数のヘルパーウイルスを形質移入することにより供給される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヘルパーウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が昆虫細胞であり、前記ヘルパーウイルス（存在する場合）がバキュロウイルスである、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的配列に５’−ＮＲＧ（式中Ｎは任意のヌクレオチドである）がその３’末端で隣接しまたは後に続き、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属である（またはそれに由来する）、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
医薬または治療において使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物もしくは非ヒト生物を改変する方法または目的ゲノム遺伝子座の標的配列の欠陥により引き起こされる病態を治療もしくは阻害する方法において使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
エキソビボ遺伝子またはゲノム編集における請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
エキソビボ遺伝子またはゲノム編集用医薬、または目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物もしくは非ヒト生物を改変する方法または目的ゲノム遺伝子座の標的配列の欠陥により引き起こされる病態を治療もしくは阻害する方法において使用される医薬の製造における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
（Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（Ａ）真核細胞の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、場合により少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むポリヌクレオチド配列
［（Ａ）、（ｂ）および（ｃ）が５’から３’配向で配置されており、
転写時に前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、かつＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである］
または
（Ｂ）  Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
（Ａ）真核細胞の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
［転写時に前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、かつＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである］
を含む組成物において、
医薬または治療において使用されるか；または目的のゲノム遺伝子座の標的配列の操作によって生物または非ヒト生物を改変する方法において使用されるか；または目的のゲノム遺伝子座の標的配列の欠陥によって引き起こされる病態を治療または阻害する方法において使用されるか；またはエキソビボ遺伝子またはゲノム編集において使用され、
前記ポリヌクレオチドが、１つ以上のウイルスベクターを含むベクター系内に含まれる、組成物。
【請求項２７】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡがキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２８】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、複数のキメラおよび／または複数の多ガイド配列と単一ｔｒａｃｒ配列とをさらに含む多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項２９】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の位置で両鎖の開裂を指向するヌクレアーゼである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３０】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３１】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上の突然変異Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６Ａを含む、請求項３０に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３２】
前記１つ以上の突然変異が前記ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１ドメインにある、請求項３０に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の位置での開裂を指向するニッカーゼである、請求項２９に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３４】
前記ニッカーゼが二重ニッカーゼである、請求項３３に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３５】
少なくとも２つ以上のＮＬＳをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３６】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、転写時に前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、かつ前記酵素が機能ドメインをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３７】
前記機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項３６に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３８】
前記転写活性化ドメインがＶＰ６４である、請求項３６に記載の方法、使用または組成物。
【請求項３９】
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１および第２の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えるステップをさらに含む、請求項１〜２１または２６〜３８のいずれか一項に記載の方法において、
前記組成物が、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）前記第１の標的配列にハイブリダイズし得る第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒメイト配列、
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
（ｄ）前記第２の標的配列にハイブリダイズし得る第２のガイド配列、
（ｅ）第２のｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列、および
を含み、場合により、前記第１のｔｒａｃｒ配列と前記第２のガイド配列との間にリンカー配列が存在することで前記第１のガイド配列と前記第２のガイド配列とがタンデムになっている、ポリヌクレオチド配列、および
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が５’から３’配向で配置されており、前記ポリヌクレオチド配列が前記第１のｔｒａｃｒ配列と前記第２のガイド配列との間にリンカー配列を含むことで前記第１のガイド配列と前記第２のガイド配列とがタンデムになっており、および転写時に前記第１および前記第２のｔｒａｃｒメイト配列がそれぞれ前記第１および第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記第１および前記第２のガイド配列が、それぞれ前記第１および第２の標的配列に対する第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、ポリヌクレオチド配列、
または
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、成分ＩおよびＩＩが前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写時に第１のｔｒａｃｒメイト配列が第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記第１および前記第２のガイド配列が、それぞれ前記第１および第２の標的配列に対する第１および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する、第２の調節エレメント
を含み、
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記第１の標的配列にハイブリダイズする前記第１のガイド配列、および（２）前記第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記第１のｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記第２の標的配列にハイブリダイズする前記第２のガイド配列、および（２）前記第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記第２のｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡであり、および
前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列の近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって前記生物または前記非ヒト生物を改変する、方法。