(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１、式２及び式３
【化１】
0003569432.tif 000007
【化２】
0003569432.tif 000008
【化３】
0003569432.tif 000009
の（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールであるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類の製造方法であって、
糖類と重量対容量百分率１０〜５０％のグリセロールとを溶解し、これにアスペルギルス・ニガー由来のα−グルコシダーゼを作用させて、グリセロールにα−Ｄ−グルコピラノシル基を導入することを特徴とするα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類の製造方法。
【請求項２】
糖類は、グルコース、マルトース、オリゴ糖またはこれらを含有する物質である請求項１に記載のα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類の製造方法。
【請求項３】
反応終了液にさらに糖類を少なくとも一回以上添加する請求項１または２に記載のα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類の製造方法。
【請求項４】
さらに、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類をアミノカラムクロマトグラフィーにより２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール及び１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類に分離する請求項１〜３のいずれかに記載のα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類の製造方法。
【請求項５】
式１、式２または式３
【化４】
0003569432.tif 000010
【化５】
0003569432.tif 000011
【化６】
0003569432.tif 000012
の（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの少なくとも１つを含むα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類を主成分とすることを特徴とする甘味剤。
【請求項６】
医療品用である請求項５に記載の甘味剤。

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、すっきりとした甘さを持ち、褐変性やメイラード反応性が極めて低く、優れた加熱安定性があり、且つ、難消化性、非う蝕性、高い保湿性等の機能性を有するα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類及びその効率的な製造方法及びその特性を有効に利用した食品、化成品、医薬品に関するものである。
【０００２】
【従来技術とその課題】
麹菌などの多くの糸状菌はα−アミラーゼ、グルコアミラーゼのようなアミラーゼ以外にもα−グルコシダーゼを生産することが知られている。α−グルコシダーゼはエキソ型アミラーゼで、グルコシルトランスフェラーゼ、トランスグルコシダーゼとも呼ばれ、マルトースやオリゴ糖からα−１  ，４結合したグルコース残基を他の物質に転移する作用を持つ。たとえば、転移するグルコシル基の受容体が水、エチルアルコール、グルコース、マルトース、イソマルトースの場合はそれぞれグルコース、エチル−α−グルコシド（公開特許：平４−１１２７９８）、イソマルトース、パノース、イソマルトトライオースを生成する。なお、受容体が水の場合、グルコアミラーゼなどの作用に似た加水分解とも見られるので、以後これを加水分解と呼ぶ。
【０００３】
清酒醪中でもα−グルコシダーゼの転移作用に関する報告がこれまで多くされているが、本発明者らは糖転移の受容体がグリセロールであるα−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類（以後、ＧＧと表記する）を新たに発見し、さらに麹を用いた他の醸造物中、たとえば、みそ、みりんなどもＧＧを含んでいることが判明した。
【０００４】
本発明におけるＧＧは、（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールの三成分から成るが、このうち２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールだけは、藍藻類（シアノバクテリアとも呼ばれる）、特に海洋などの高塩濃度環境で生息するものに存在し、本発明とは異なる酵素反応により菌体内で生合成され、浸透圧調整に関わっていることが報告されている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，７３，１９３〜２０２，１９７９；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，６５０〜６５１，１９８０；Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，７３，３０１〜３０７，１９８３；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０，１〜４，１９８４；Ｐｌａｎｔａ，１６３，４２４〜４２９，１９８５；Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４８，２７５〜２７９，１９８７；Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ，６０，５９６〜６００，１９９１；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４０，１４２７〜１４３１，１９９４など）。しかしこれらの報告では、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール自体の諸性質は述べられておらず、また１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類は本発明者らによって清酒醪中から初めて発見されたものである。下にそれぞれの環状構造を示す。
【化４】
0003569432.tif 000002
【化５】
0003569432.tif 000003
【化６】
0003569432.tif 000004
【０００５】
清酒中のＧＧの濃度はせいぜい０．５％程度の低レベルであるが、清酒中のＧＧは清酒のいわゆる「幅のある味」、「押し味」といった効果をもたらし、すっきりとした甘さを与えていることがわかった。ＧＧの甘味度はシュクロースの約０．５５倍であり、またＧＧは加熱に対して安定で褐変し難く、メイラード反応を起こし難い特性を有す。他にもＧＧには非う蝕性、難消化性、高い保湿効果が認められ、清酒が飲料以外にも調味料や化粧品として用いられているのは、少なからずこれらのＧＧの特性が反映していると予想される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
如上のように、清酒中のＧＧ濃度は低レベルで、清酒醸造の副産物である清酒粕中のＧＧ含量も低く、これらからの抽出、精製は効率が悪い。また有機合成法としては、イソマルトース、マルチトールなどを四酢酸鉛や過ヨウ素酸塩でグリコール開裂したものを還元する方法、あるいはＫｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ反応により合成したβ−グルコシドをアノメリゼーションした後、β−グルコシダーゼでβ−グルコシドを加水分解する方法などあるが、収率が極めて悪く、精製等が非常に煩雑になる。このように、α−グルコシド類の製造方法には優れた一般的合成方法がなく、効率の良い生産技術が必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、カビ類のα−グルコシダーゼを比較的高濃度のグリセロール溶液中で特定の基質に作用させると、優れた反応性を示し、ＧＧを効率良く生産する技術を確立することができた。すなわちα−グルコシダーゼは比較的高濃度の、たとえば重量対容量百分率２５％（以下、各濃度は重量対容量百分率で表記する）以上のグリセロール溶液中でも有効に反応し、またこの条件下で基質、たとえばマルトースの加水分解は起こりにくいことがわかった。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明における基質としてはマルトース以外にも、グルコース、シュクロース、オリゴ糖の混合溶液、水飴、α−アミラーゼなどによる澱粉分解物、マルチトールのような還元性末端を水素添加した糖類を用いることができる。
【０００９】
本反応に使用できる酵素はα−１，６−グルコシル転移酵素と呼ばれるα−グルコシダーゼである。酵母由来のα−グルコシダーゼはα−１，４−グルコシル転移酵素がほとんどであるため、利用できるものは一部しかないが、カビ由来のα−グルコシダーゼは大部分が利用でき、中でもＡｓｐ．ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒなどの生産するα−グルコシダーゼが好適である。精製酵素はもちろん、粗精製酵素でも使用できる。また、基質と酵素を同時に供給する点では、麹も利用可能である。
【００１０】
作用条件は特定ではないが、たとえば作用温度はグリセロール３７．５％で２４時間反応させた場合、４０℃でＧＧの生産量は最大であったが、３０℃においてもその７０％の生産量が認められ利用できる。また、さらに低温で実施すると反応速度は低下するが、ＧＧの生産には支障がない。作用ｐＨは３〜６の範囲が好適である。酵素添加量は、基質に５％マルトースを用いて、基質グラム（ｇ）当たり０．６〜５０Ｕ（国際単位）の範囲で実験したが、２．５Ｕ／ｇを添加すると充分目的を達成する。また、この条件では基質（マルトース）当たりの収率は６６％と高いが、反応に使用されたグリセロールが少なく、後の精製過程の効率を上げるためにも、反応液中のＧＧの濃度を高める方が好ましい。そこで、基質を２４時間毎に添加していったところ、連続１０回の基質添加でも酵素は安定に作用しＧＧの濃度を上げることができた。このような連続バッチ処理により生産量を高める方法は、コストや操作性の面から有効である。
【００１１】
反応を終了した溶液には、ＧＧ以外にもグリセロール、グルコース、オリゴ糖などが存在する。食品などの甘味料、保湿剤、呈味改善剤としてはそのまま使用できる。また、高純度のＧＧを使用する場合、活性炭カラムクロマトグラフィーなどの精製方法が有効で、溶出液を濃縮すればシロップ状のＧＧが得られる。さらに、精製したＧＧの一部を比較的高濃度のアセトニトリル、たとえば８５％アセトニトリルを溶出液に用いアミノカラムクロマトグラフィーを行うと、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールと１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール類を分離、精製することができる。
【００１２】
精製したＧＧを用いて、その特性について調べたところ、ＧＧはグルコース、マルトース、シュクロースに比べ、加熱に対し安定で褐変が少なく、メイラード反応を起こし難いことがわかった。
【００１３】
図１にグルコース、マルトース、シュクロース、ＧＧの各１０％水溶液の、ｐＨ４または７における６０分間加熱後の着色度と加熱温度の関係を示した。横軸が加熱温度、縦軸が着色度（厚さ１ｃｍのセルにおける４２０ｎｍの吸光度から７２０ｎｍの吸光度を差し引き、希釈倍率を乗じた値）を示す。
【００１４】
図２にｐＨを調整した、０．５％のグリシンを含むグルコース、マルトース、シュクロース、ＧＧの各１０％水溶液の１００℃、６０分間加熱後の着色度とｐＨの関係を示した。横軸がｐＨ、縦軸が着色度（厚さ１ｃｍのセルにおける４２０ｎｍの吸光度から７２０ｎｍの吸光度を差し引き、希釈倍率を乗じた値）を示す。
【００１５】
図３にグルコース、マルトース、シュクロース、ＧＧの各１０％水溶液のｐＨ４または７における６０分間加熱後の残存率をＨＰＬＣで測定した結果を示す。横軸が加熱温度、縦軸が残存率を示す。
【００１６】
また、１．５〜４％（０．５％刻み）のシュクロース水溶液のうち、５％ＧＧ水溶液の甘さに相当するシュクロース濃度を８名のパネラーにより官能検査したところ、シュクロース濃度２．５％の甘さに近いとした者が４名、３％に近いとした者が４名という結果になった。よってＧＧの甘さはシュクロースの約０．５５倍であることがわかり、しかもすっきりとした甘さで、多くの糖アルコールで問題になる苦味は感じられないという良い評価が得られた。他にもＧＧには非う蝕性、難消化性があり、さらに現在保湿剤として広く使用されているグリセロールやソルビトールに比べ、高い保湿性が認められた。
【００１７】
図４はＧＧの非う蝕性を示す図である。宮村（歯学，６０，７１７〜７３１，１９７３）の方法に準じ、水１ｍｌまたは、各１．２５％のグルコースまたはＧＧ水溶液１ｍｌに、それぞれハートインフージョンブイヨン１ｍｌと新鮮唾液３ｍｌを添加した溶液について、３７℃におけるｐＨの経時変化を示した。
【００１８】
図５はＧＧの保湿性を示す図である。相対湿度約６０％で平衡状態にあるグリセロール、ソルビトール、ＧＧを、相対湿度約３５％で放湿または相対湿度約７５％で吸湿させた時の重量変化を示す。横軸は時間を、縦軸は重量変化を示す。
【００１９】
表１はＧＧの消化性を示す表である。岡田ら（日本栄養・食糧学会誌，４３，２３〜２９，１９９０）の方法に準じ、ヒト唾液、人工胃液、ブタ膵臓α−アミラーゼ、ラット小腸粘膜酵素による消化性を示した。
【表１】
0003569432.tif 000005
【００２０】
清酒醪中から初めて発見されたＧＧは、このように多くの機能を持ち、たとえば甘味料、各種調味料、和洋菓子類、酒類、各種飲料、果実野菜加工食品、畜肉魚肉製品、乳製品、即席食品、冷凍食品、治療食品などの飲食物や練り歯磨き、化粧品などの化成品やうがい剤、内服液などの医薬品への甘味剤、呈味改良剤、矯味剤、保湿剤として有効に利用できる。
【００２１】
【作用】
マルトース濃度５％、グリセロール濃度３７．５％の溶液にα−グルコシダーゼ２．５Ｕ／ｇを添加し、４０℃、２４時間反応させた溶液についてＧＧ、グルコース、オリゴ糖をＨＰＬＣにより分離定量した。その結果、イソマルトースなどの二糖類やパノース、イソマルトトライオースなどの三糖類以上のオリゴ糖はほとんど生成しておらず、グルコースとＧＧが主な生成物として認められた。すなわち、このような濃度のグリセリン溶液中では、α−グルコシダーゼによるグルコースやマルトースなどへの糖転移反応が抑制され、新たにグリセロールへの糖転移反応が起こっていることがわかった。
【００２２】
表２はマルトース濃度５％、グリセロール濃度３７．５％の溶液に、α−グルコシダ−ゼをマルトースグラム当たり２．５Ｕ／ｇ添加し、４０℃、２４時間反応させた溶液の組成をＨＰＬＣにより測定した結果を示す表である。
【表２】
0003569432.tif 000006
【００２３】
芳川ら（日本食品工業学会誌，４１，８７８〜８８５，１９９４）は、α−グルコシダーゼを用いたエチル−α−グルコシド（以下α−ＥＧと表記する）の製造において、マルトースから２個のグルコースへの加水分解作用と、マルトースからグルコースとα−ＥＧを生成する糖転移作用を比べた場合、後者の糖転移作用が優先するとα−ＥＧ／グルコース比の値が大きくなると報告している。そこで同様に、本発明のα−グルコシダーゼによるＧＧ製造においても、基質の加水分解作用よりもＧＧを生成する糖転移作用が優先した時にはＧＧ／Ｇ比（重量比）（以下ＧＧ／Ｇ比と表記する）が増加すると思われる。加水分解作用と糖転移作用が同じ速さで起こると仮定すれば、２モルのマルトースを基質として、水、グリセロールの各々１モルに作用し、グルコース（分子量１８０）３モルとＧＧ（分子量２５４）１モルが生じ、ＧＧ／Ｇ比は２５４／（１８０×３）＝０．４７となる。表２から求めたＧＧ／Ｇ比は約１．３で、０．４７を越えており、基質の加水分解よりもグリセロールへの転移反応が優先していた。また、このＧＧ／Ｇ比と、基質当たりのＧＧの収率を指標として、基質濃度とグリセロール濃度について検討した。その結果、基質濃度は低濃度で収率が良かったが、ＧＧ／Ｇ比は基質濃度５％付近で高く、またグリセロール濃度が５０％を越えると収率は低下した。
【００２４】
図６は基質濃度とＧＧ収率およびＧＧ／Ｇの関係を示す図である。各濃度のマルトースを基質として、２５％のグリセロール溶液中でカビ由来のα−グルコシダーゼ２．５Ｕ／ｇをｐＨ５で５０℃、２４時間反応させた溶液をＨＰＬＣによりＧＧとグルコースを定量した結果を示した。横軸は基質濃度、左側の縦軸の数値にて基質当たりのＧＧの収率を棒グラフで、右側の縦軸の数値にて反応溶液中のＧＧ／Ｇ比を折れ線グラフで示す。
【００２５】
図７はグリセロール濃度とＧＧ収率およびＧＧ／Ｇの関係を示す図である。基質としてマルトースを５％、各濃度のグリセロール溶液中でカビ由来のα−グルコシダーゼ２．５Ｕ／ｇをｐＨ５で５０℃、２４時間反応させた溶液をＨＰＬＣによりＧＧとグルコースを定量した結果を示した。横軸はグリセロール濃度、左側の縦軸の数値にて基質当たりのＧＧの収率を棒グラフで、右側の縦軸の数値にて反応溶液中のＧＧ／Ｇ比を折れ線グラフで示す。
【００２６】
精製したＧＧはエムルシンでは分解されず、マルターゼでグルコースとグリセロールに分解されることから、α−アノマーであることを確認した。さらに、精製したＧＧをトリメチルシリル（以下、ＴＭＳと表記する）化後、キャピラリーガスクロマトグラフィー−質量分析装置（以下、ＧＣ−ＭＳと表記する）を用いて分析すると、３つのピークに分離した。後述のようにＧＧは２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（以下、ＧＧ−ＩＩと表記する）、（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（以下、Ｒ−ＧＧ−Ｉと表記する）、（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（以下、Ｓ−ＧＧ−Ｉと表記する）の三成分の混合物であり、これら三成分の比は、たとえば１０：４９：４１であった。
【００２７】
上記ＧＣ−ＭＳで分離した３つのピークの同定は、化学的に合成したＧＧを用い、溶出時間とマススペクトルから確認した。ＧＧ−ＩＩの合成方法については、マルチトールの過ヨウ素酸塩による短時間のグリコール開裂を利用した。すなわち、マルチトールのグルコピラノシル基の２、３、４位の炭素に結合している水酸基はそれぞれシス配置であり、またそのアグリコンであるソルビトールの炭素間の結合は自由に回転するので、過ヨウ素酸塩によるグリコール開裂はソルビトールの炭素間の方が速く進む。反応が進みすぎるとグルコピラノシル基も開裂が進むので、反応時間を制限する必要がある。そこで、４％マルチトール１００μｌに２％過ヨウ素酸ナトリウム１ｍｌを添加し、４分間室温で反応させた。反応終了後、塩化バリウムを添加し、生じた過ヨウ素酸バリウムの沈殿をろ別、除去した。さらにイオン交換カラムで脱塩後、水素化ホウ素ナトリウムで還元し、活性炭クロマトグラフィー及びＨＰＬＣで精製した。合成したＧＧ−ＩＩをＴＭＳ化しＧＣ−ＭＳで分析すると、ＧＧのＴＭＳ誘導体の３ピークのうちで初めに溶出するピークのみが認められ、ＧＧのＴＭＳ誘導体のピークとマススペクトルも一致した。Ｓ−ＧＧ−Ｉについては、Ｋａｎｅｄａら（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，７９５〜７９８，１９８４）がゲンチオビオースの四酢酸鉛によるグリコール開裂により、リリオシドＤ（（２Ｓ）−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール）を合成した方法を参考にし、イソマルトースの四酢酸鉛によるグリコール開裂を利用した。１０％イソマルトース５００μｌに酢酸５ｍｌと四酢酸鉛１４０ｍｇ（イソマルトースの２モル当量）を加え反応させ、沃素澱粉混液２００μｌに反応液２０μｌを添加した時、沃素澱粉混液の色が変わらなくなったところを反応の終点とした。この反応液の大部分の酢酸をロータリーエバポレーターで除去し、さらにイオン交換カラムで脱塩後、ＧＧ−ＩＩと同様に還元し、精製した。合成したＳ−ＧＧ−ＩをＴＭＳ化しＧＣ−ＭＳで分析すると、ＧＧのＴＭＳ誘導体の３ピークのうちで最後に溶出するピークのみが認められ、ＧＧのＴＭＳ誘導体のピークとマススペクトルも一致した。また上記Ｓ−ＧＧ−Ｉと同様に、トレハルロースを四酢酸鉛（トレハルロースの１モル当量）によるグリコール開裂後、還元、精製したものをＴＭＳ化しＧＣ−ＭＳで分析すると、マススペクトルも一致するＳ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体のピークと、ＧＧのＴＭＳ誘導体の３ピークのうちでＳ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体の直前に溶出するピークが認められ、ＧＧのＴＭＳ誘導体のピークとマススペクトルが一致した。これら２つのピークを与えるトレハルロースの四酢酸鉛による分解物は１つの化合物（３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−２−オキソ−１−プロパナール）であるが、還元反応の際にグリセロールの２位の炭素が（Ｒ）、（Ｓ）−配置となる２種類の化合物を与える。この２種類の化合物のＴＭＳ誘導体のマススペクトルに違いがないことから、ＧＧのＴＭＳ誘導体の３つのピークのうちで２番目のピークはＲ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体であることがわかった。
【００２８】
図８はＧＧのＴＭＳ誘導体をＧＣ−ＭＳで分析した時のトータルイオンクロマトグラムである。縦軸はフラグメントイオンのトータルイオン強度、横軸は分析時間を示した。各ピークに対応する成分の略号（ＧＧ−ＩＩは２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、Ｒ−ＧＧ−Ｉは（２Ｒ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール、Ｓ−ＧＧ−Ｉは（２Ｓ）−１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール）と括弧内に溶出時間（分）を示した。このクロマトグラムにおける三成分の比（溶出順）は、およそ１０：４９：４１であった。
【００２９】
図９は図８のＧＧ−ＩＩに相当するピークより得たＧＧ−ＩＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。縦軸はイオン強度、横軸はフラグメントイオンの質量数を表す。
【００３０】
図１０は図８のＲ−ＧＧ−Ｉに相当するピークより得たＲ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。縦軸はイオン強度、横軸はフラグメントイオンの質量数を表す。
【００３１】
図１１は図８のＳ−ＧＧ−Ｉに相当するピークより得たＳ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。縦軸はイオン強度、横軸はフラグメントイオンの質量数を表す。
【００３２】
清酒醪中にもこれら三成分が存在したが、ＧＧ三成分の比は、たとえば６：６６：２８であった。この三成分の比の違いについて検討したところ、α−グルコシダーゼの作用によりマルトースとグリセロールから生成するＧＧ三成分のうち、先ずＲ−ＧＧ−Ｉ、ＧＧ−ＩＩが増加し、それより遅れてＳ−ＧＧ−Ｉが生成してくる。また、精製したＧＧにα−アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ    ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）やグルコアミラーゼ（Ｒｉｚｏｐｕｓ    ｓｐ．由来）を作用させてもＧＧは分解されないが、α−グルコシダーゼを作用させると、先ずＲ−ＧＧ−Ｉ、ＧＧ−ＩＩから分解が起こり、遅れてＳ−ＧＧ−Ｉの分解が起こる。すなわち、基質であるマルトースがなくなってくると、見かけ上ＧＧがα−グルコシダーゼの基質となり、ＧＧ三成分の比の変化が生じてくる。このようにα−グルコシダーゼの受容体結合部位の選択性や基質認識の違いによって、ＧＧ三成分の比が微妙に変化していると思われる。よって、本発明において、ＧＧ製造時に基質が減少した際、ＧＧ三成分の比は変化するが、ＧＧの加水分解による減少を抑えるために、グリセロール濃度は高めの方が望ましい。また、並行複発酵の清酒醪中では、主に酵母の生産したグリセロールへ麹のα−グルコシダーゼによる糖転移反応が生じＧＧが生成すると思われるが、同時にグルコースやアルコールなどからイソマルトースやエチル−α−グルコシドの生成などが起こりＧＧの生成と競合した結果、ＧＧ三成分の比が本発明のものと異なっていると考えられる。
【００３３】
【実施例】
次に本発明の実施例を製造方法と用途に分けて具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（製造方法の実施例１）
マルトース１水和物５３ｇ（マルトースとして５０ｇ）とグリセロール３７５ｇを水で溶解し１０００ｍｌとし、カビ（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）由来の市販α−グルコシダーゼ製剤（トランスグルコシダーゼＬ−アマノ、天野製薬製、５０Ｕ／ｍｌ）２．５ｍｌを加え、４０℃で２４時間反応させた。反応液を８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、生じた浮遊物をろ紙（東洋ろ紙Ｎｏ．２）にてろ過し、除去した。
【００３５】
このろ液５μｌを高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと表記する）で分析した。ＨＰＬＣの条件はカラムにＳｈｉｍ−ｐａｃｋ    ＳＣＲ−１０１（Ｎ）（内径７．９ｍｍ、長さ３０ｃｍ、島津製作所製）を用い、カラム温度は５０℃とし、溶出液には水を用い、流速は毎分０．６ｍｌ、検出器に示差屈折率計を用いた。ＧＧ濃度は後述の精製ＧＧで約２％の水溶液を作製し、この水溶液と、この水溶液にマルターゼ（酵母由来、オリエンタル酵母製）を加え３７℃で一晩反応させた溶液を上記ＨＰＬＣで測定し、マルターゼの作用によりＧＧが分解して生成したグルコース濃度と分解し減少したＧＧのピーク面積とそれぞれの分子量から検量線を作成し算出した。測定の結果、反応ろ液にはＧＧが３．８％、グルコース３．０％、グリセロール２９．５％が含まれ、二糖類以上のオリゴ糖は微量であった。反応ろ液のＧＧ収量は３８ｇで、収率は７６％であった。
【００３６】
また、反応ろ液１μｌをスクリューキャップ付き試験管にとり乾燥デシケーター中に一晩置いた後、ＴＭＳ化剤（ＴＭＳＩ−Ｃ、ジーエルサイエンス製）を１００μｌ加え、６０℃で１０分反応させた溶液１μｌをＧＣ−ＭＳ（ヒューレットパッカード製ＨＰ５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフ、モデル５９７１Ａ質量検出器）で分析した。ＧＣ−ＭＳ条件はキャピラリーカラムにＤＢ−２２５（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．１５μｍ、Ｊ＆Ｗ    Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用い、キャリアガスにヘリウム（カラム背圧８ＰＳＩ）、スプリット法（スプリット比１：５０）で注入し、注入口温度は２４０℃、インターフェイス温度は２８０℃、カラム温度は１００℃から２００℃まで１分間に５℃の割合で昇温し、次に１６分から２０分の間に溶出する成分を電子衝撃型イオン化法（電子ビームエネルギー７０ｅＶ）でイオン化し、質量数７０〜６５０ａｍｕ（原子質量単位）の範囲を１分間に約１．５回の速さで走査し、マススペクトルを採集した。溶出時間と得られたマススペクトルからそれぞれの成分を確認した。また同時に得られるトータルイオンクロマトグラムのピーク面積の測定結果から、反応ろ液中のＧＧ−ＩＩ、Ｒ−ＧＧ−Ｉ、Ｓ−ＧＧ−Ｉの成分比を算出すると１１：４１：４８であった。
【００３７】
反応ろ液をさらに、イオン交換樹脂（アンバーライトＭＢ−２、オルガノ製）を常法に従い、長さ３０ｃｍまで充填した内径１．５ｃｍのガラスカラムに通し、除蛋白、脱塩した溶液を得た。この溶液をおよそ半分の量までロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液１０ｍｌを、クロマトグラフ用活性炭１００ｇ及びセライト（Ｎｏ．５３５）１００ｇ（いずれも和光純薬工業製）を常法に従い充填した内径５ｃｍのガラスカラムを用い、活性炭カラムクロマトグラフィーを行った。適宜溶出液を上記ＨＰＬＣで測定しながら、最初は水で溶出し、グルコースとグリセリンを除去した後、続けて２％アルコールをカラムに通し、ＧＧが単独で溶出した画分を集めた。この活性炭カラムクロマトグラフィーを２回行い、ＧＧ溶出画分をロータリーエバポレーターで濃縮すると、無色透明のシロップ状の精製ＧＧ約１ｇが得られた。
【００３８】
（製造方法の実施例２）
実施例１の２４時間反応後の溶液１０００ｍｌに、さらにマルトース１水和物５３ｇ（マルトースとして５０ｇ）のみを添加し、同じ条件で反応させることを繰り返した。α−グルコシダーゼは１０日後も安定に作用し、１０日間の繰り返しの結果、ＧＧの収量は１６４ｇとなり、１回の反応よりも約５倍増加した。
【００３９】
図１２は、基質を連続して添加することにより、ＧＧの収量が上がったことを示す図である。基質としてマルトースを５％、３７．５％グリセロール溶液中でカビ由来のα−グルコシダーゼ２．５Ｕ／ｇをｐＨ５で４０℃、２４時間反応させた溶液１０００ｍｌにさらにマルトースを５％添加し、これを繰り返した。各反応終了時に反応液の一部を取り、ＨＰＬＣによりＧＧを定量した結果を示した。横軸はマルトース添加回数と初期反応液１０００ｍｌ当たりのマルトース添加量の累計、左側の縦軸の数値にて初期反応液１０００ｍｌ当たりのＧＧの収量を棒グラフで、右側の縦軸の数値にて基質当たりのＧＧの収率を折れ線グラフで示す。
【００４０】
この反応溶液を製造方法の実施例１で行ったＧＣ−ＭＳにて同様に分析するとＧＧ−ＩＩ、Ｒ−ＧＧ−Ｉ、Ｓ−ＧＧ−Ｉの成分比は９：５０：４１であった。また製造方法の実施例１で行った活性炭カラムクロマトグラフィー及びＧＧ溶出画分の濃縮を繰り返すことで、無色透明のシロップ状の精製ＧＧ１４０ｇを得た。
【００４１】
（製造方法の実施例３）
製造方法の実施例２で得たシロップ状の精製ＧＧ約２０ｇを水で３０ｍｌとし、その一部をカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ    Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩ（内径１ｃｍ、長さ２５ｃｍ、ワイエムシイ製）を用いたＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣの条件は、カラム温度３５℃、８５％アセトニトリルにより流速毎分３ｍｌで溶出し、示差屈折率計で検出した。溶出してきた２つのピークをそれぞれ集め、ロータリーエバポレーターで濃縮した。それぞれの溶出画分をＴＭＳ化後、製造方法の実施例１で行ったＧＣ−ＭＳで分析すると、最初の画分がＧＧ−ＩＩ、後の画分がＲ−ＧＧ−Ｉ、Ｓ−ＧＧ−Ｉの混合物であった。このＨＰＬＣによる分離及びそれぞれの画分の濃縮操作を繰り返し行い、それぞれシロップ状の精製ＧＧ−ＩＩを約１．５ｇ、精製ＧＧ−Ｉ類を約１５ｇ得た。
【００４２】
（用途の実施例１    清酒）
４０％アルコール９００ｍｌ、無水ブドウ糖５０ｇ、粉末水飴７０ｇ、製造方法の実施例２で得たシロップ状のＧＧ６０ｇ、７５％乳酸０．４ｍｌ、コハク酸１．１ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．２ｇを水で溶かして１２００ｍｌとし、アルコール濃度３０％のＧＧ添加調味アルコール液を調製した。また、対照として、４０％アルコール９００ｍｌ、無水ブドウ糖８０ｇ、粉末水飴１００ｇ、７５％乳酸０．４ｍｌ、コハク酸１．１ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．２ｇを水で溶かして１２００ｍｌとし、アルコール濃度３０％の調味アルコール液を調製した。ＧＧ添加調味アルコール液１２００ｍｌと水５００ｍｌまたは対照の調味アルコール液１２００ｍｌと水５００ｍｌをそれぞれ１２５０ｍｌの清酒醪に添加し、遠心分離で酒粕を分離し、アルコール約２０％の増醸酒を得た。これら各々を火入れ、滓下げ後、アルコール約１５％になるように加水し火入れして、ＧＧ高含有清酒及び対照の清酒を作製した。これらを５名のパネラーで官能検査した結果、ＧＧ高含有清酒は対照の清酒に比べ、「こくがある」、「木目細かく、ソフトである」、「ふくらみがある」、「すっきりとした甘さである」といった良い評価を得た。このように、ＧＧはすっきりとした甘さで深みのある風味を与えること以外にも、ＧＧが難消化性物質であるため、ＧＧ高含有清酒はカロリーをやや抑えたものとなった。
【００４３】
（用途の実施例２    練り歯磨き）
製造方法の実施例２で得たシロップ状のＧＧ５ｇと第２りん酸カルシウム１５ｇ、プルラン１ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．５ｇ、グリセロール７ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．１５ｇ、防腐剤２０ｍｇ、水４  ｍｌを常法により混合し、練り歯磨きを作製した。ＧＧの甘さと非う蝕性を活かした本品は、とりわけ子供用の練り歯磨きに適している。
【００４４】
（用途の実施例３    化粧クリーム）
製造方法の実施例２で得たシロップ状のＧＧ２ｇとモノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２ｇ、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５ｇ、α−グルコシルルチン１ｇ、流動パラフィン１ｇ、トリオクタン酸グリセリル１０ｇ、防腐剤５０ｍｇを常法により加熱溶解し、さらに１，３−ブチレングリコール５ｇ、乳酸２ｇ、精製水６６ｍｌを添加し、ホモジナイザーにより乳化後、適量の香料を加え混合し、化粧クリームを作製した。本品はＧＧの保湿効果により、特に乾燥肌用化粧クリームとして好適である。
【００４５】
（用途の実施例４    カルシウム剤）
乳酸カルシウム２ｇを乳鉢ですりつぶし、温湯（精製水）３０ｍｌで溶解し、製造方法の実施例２で得たシロップ状のＧＧ４ｇを加え混合し、カルシウム剤を作製した。本品は小児の発育期におけるカルシウム補給剤として利用できる。本品のように、服用時加温する必要がある内用液剤、とりわけ小児用のものでは、加熱安定性が優れている甘味剤としてＧＧは好適である。
【００４６】
なお、エチル−α−グルコシドにおいて糖転移反応の受容体であるエタノールのように、グルコースとの縮合部位が一個所しかない場合と比べ、グリセロールでは三個所の縮合部位がある。立体選択的グリコシル化反応、特にα−グルコシル化反応は、糖質化学の分野では重要な研究課題の一つになっており、ＧＧはα−グルコシダーゼの受容体結合部位の選択性や基質特異性など、酵素学的にも興味深い物質になる。
【００４７】
また、ＧＧは微生物細胞膜構成成分であるグリセロ糖脂質合成の基質になりうる。微生物のグリセロ糖脂質は動植物のものと異なり、構成単糖や結合が多様であり、生合成や分解については一部のものしか明らかになっておらず、これらの生理的役割を解明することは、微生物利用工業の発展につながるものである。さらにＧＧの一成分である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロールは単離精製が可能であり、一部の藍藻類での浸透圧調整への関与が明確であることからも微生物利用工業分野では興味深い物質となる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によりＧＧを安価に大量生産することができるようになった。ＧＧは加熱に対し安定で褐変し難く、メイラード反応を起こし難い。また、非う蝕性、難消化性、高い保湿性が認められ、清酒醪などの麹を用いた醸造物中に存在するＧＧは呈味物質以外にも機能性物質として広範な利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＧの褐変性を示す図である。
【図２】ＧＧのメイラード反応性を示す図である。
【図３】ＧＧの加熱安定性を示す図である。
【図４】ＧＧの非う蝕性を示す図である。
【図５】ＧＧの保湿性を示す図である。
【図６】基質濃度とＧＧ収率およびＧＧ／Ｇの関係を示す図である。
【図７】グリセロール濃度とＧＧ収率およびＧＧ／Ｇの関係を示す図である。
【図８】ＧＧのＴＭＳ誘導体をＧＣ−ＭＳで分析した時のトータルイオンクロマトグラムである。
【図９】図８のＧＧ−ＩＩに相当するピークより得たＧＧ−ＩＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。
【図１０】図８のＲ−ＧＧ−Ｉに相当するピークより得たＲ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。
【図１１】図８のＳ−ＧＧ−Ｉに相当するピークより得たＳ−ＧＧ−ＩのＴＭＳ誘導体のマススペクトルである。
【図１２】基質を連続して添加することにより、ＧＧの収量が上がったことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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