(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化および同様な疾病のスクリーニング試験法において、体液または組織試料中に、３−クロロチロシンが正常被検者における濃度と比べて高濃度で存在することを測定することからなる上記方法。
【請求項２】
試料はヒトの炎症組織である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料はヒトの血清または血漿部分である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
３−クロロチロシンの存在および濃度を、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析により測定する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
３−クロロチロシンの上昇した濃度は、正常レベルより約10倍から約100倍高い、請求項１記載の方法。
【請求項６】
３−クロロチロシンの存在および濃度を、前記３−クロロチロシンに対する抗体を用いる免疫検定法により測定する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は新規診断法に関する。更に詳しく言えば、本発明は、活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化および同様な疾病、例えば関節炎、炎症性腸疾患、虚血性パーフュージョン（reper fusion）損傷ならびに同様な炎症および血管疾患、の診断法およびスクリーニング試験法に関する。
合衆国における死亡の主因は心臓病である。合衆国においては年間約百万人が心臓病で死亡する。実際には、心臓病は多種多様な病気であり、その多くの主な原因は動脈硬化である。
アテローム性動脈硬化は、プラークと呼ばれる脂肪沈着物が内膜（動脈内壁）に蓄積する動脈硬化の一般的な形式である。心臓へ血液を供給する動脈に対して生じた狭窄の結果として、心臓の酸素供給（血液により運ばれる）が減少する。血液供給が目立って減少すると、個人は狭心症の苦痛を感じるかも知れない。このような苦痛は、例えば興奮が高まる、あるいは運動している間、心臓が異常に大量の血液を必要とする場合に悪化することが多い。このようにして心臓がその酸素供給を阻んだとき、心筋組織は死ぬ。即ち、冠動脈閉塞あるいは心筋梗塞が起こり、もし広い区域の組織が影響を受けるなら、致命的となりうる。
従って、個人が狭心症の痛みの症状を経験したときには、急いで医学的救助を求めるのがよい。もし既に痛みが起こっていたならば、心筋梗塞を防止するため、あるいは医療を受けるために、早い医学的対応が必要かも知れない。
心臓疾患と闘うために使われる多くの治療剤はあるけれども、それらの使用は、既に過度の組織損傷が起こっている場合に限られる。血管形成術あるいはバイパス外科手術といった外科的介入も必要かも知れない。
上記事項からみて、アテローム性動脈硬化に対する診断法およびスクリーニング試験は、医学分野で重要な実際の使用価値をもつ筈であることは明白である。このような診断法は、食餌、運動などといった個人の調整の中で予防手段を設けるために、あるいは心筋梗塞の開始前に治療の介入を行なうために有用であろう。
従って、本発明の主要な目的は、活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化および類似の疾病、例えば関節炎、炎症性腸疾患、虚血性パーフュージョン損傷およびそれに類する炎症および血管の病気、に対する診断法あるいは予防的スクリーニング試験法を提供することである。
もう一つの目的は、例えば心臓カテーテル法のような侵害的手順とは違って、患者に対し本質的に非侵害的なアテローム性動脈硬化診断法を提供することにある。
（注：以下の背景となる情報ならびに当業者にとって公知の通常の試験法および実験室的手順、および本明細書中で用いられている他のこのような最新式の技術に関する参考文献をカッコ内に示し、本明細書の末尾に付けた）。
低密度リポタンパク質（LDL）の濃度増加は、アテローム性動脈硬化性血管疾患の発生に対する主要な危険因子であることが知られている（１）。以前の報告は、アテローム性動脈硬化の病理学的発生が始まるためには、LDLが酸化されねばならないことを示している（2,3）。しかし、生体内酸化に対して根底にある経路は、これまで明確にされたことがなかった。ここで考えられる一つの機構は、活性化食細胞により分泌されるヘムタンパク質、ミエロペルオキシダーゼを含んでいる（3,6）。
ミエロペルオキシダーゼは、食細胞によりつくり出された過酸化水素（H2O2）を利用して、強力な殺微生物および細胞毒作用物質を発生させる（７−９）。触媒活性のあるミエロペルオキシダーゼはヒトのアテローム性動脈硬化病変部位に存在し、そこでは該酵素は脂質を取り込んだ大食細胞、換言すれば、初期のアテローム性動脈硬化病変部位の細胞的証明、と同じ場所に集まる（10）。アテローム性動脈硬化症の種々な段階における酵素に対する免疫学的染色のパターンは、タンパク質と結合した脂質酸化生成物に対するパターンと著しく類似する（11）。
ミエロペルオキシダーゼの最もよく特性が明らかにされた生成物は次亜塩素酸（HOCl;文献5,7）である：
Cl＋H2O2＋H+＝HOCl＋H2O  （反応式１）
この強力なオキシダントは電子の豊富な基質を塩素化し、ヘム基を酸化漂白する（9,12−15）。試薬HOClに中性pHで暴露されたLDLは、凝集するようになり、マクロファージによって迅速に取り込まれ分解される（16）。
LDLの主要タンパク質である同様な性質のリポタンパク質（アポリポタンパク質B100に富む）がアテローム性動脈硬化病変部位から単離された（6,17−19）。変性LDLの非調整吸収は、マクロファージを泡沫細胞へ変える上で非常に重要であるかも知れない（１−３）。HOClで変性されたタンパク質と選択的に反応する単クローン抗体は、ヒトのアテローム、およびアテローム性動脈硬化組織から単離されたLDL−様粒子におけるエピトープを認識する（６）。
ミエロペルオキシダーゼは、生理学的なハロゲン化物濃度でHOClを発生させることが知られている唯一のヒト酵素である（7,20）。しかし、HOClにより発生した大抵の酸化生成物は、非特異的であるか、あるいは分解して情報価値のない化合物を生ずる（9,21,22）。最近の容器内研究によると、ミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系はＬ−チロシンを酸化して３−クロロチロシンを生成することを実証している（23−25）。
発明の簡単な記述
本発明は、活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化およびそれに類する疾病に対する診断法およびスクリーニング試験法を提供するものである。
本法は、体液または組織中で、ミエロペルオキシダーゼ媒介酸化的損傷に対する高度に選択的かつ敏感なマーカーとして、３−クロロチロシンの存在を測定することからなる。
患者の体液または組織から、通常の患者における濃度に比して実質的に高い濃度で３−クロロチロシンが検出されることは、活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化および多種多様な病気のスクリーニングに役立つ。
本診断法はまた活性化食細胞および／または炎症が関与するアテローム性動脈硬化および類似の疾患に対する治療の介入の有効性をモニターするための、また生体内での酸化的緊張に対する検定法として有用である。
本診断法に使用する体液または組織は、例えば活性化食細胞の代謝生成物を含む血清または血漿、尿または体組織あるいは細胞でよい。
本発明によれば、活性化食細胞は、ミエロペルオキシダーゼを利用してLDLのアポリポタンパク質B100上のチロシン残基の芳香環を塩素化することが分かった。ヒトのアテローム性動脈硬化病変部位を分析したところ、正常な大動脈内膜と比較して、タンパク質に結合した３−クロロチロシン含量に10倍の増加が示された。更にまた、循環LDLと比較して病変部位LDLでは３−クロロチロシンの濃度が100倍高い。従って、ヒトのアテローム性動脈硬化性大動脈中に、またアテローム性動脈硬化病変部位から単離されたLDL中に、３−クロロチロシンが検出されることは、ミエロペルオキシダーゼがリポタンパク質の酸化的変性に対する重要な経路であり、それ故に血管の疾病の発生における中枢的作用因子であることを示す。
本明細書中に示されたように、ヒトのアテローム性動脈硬化組織中に３−クロロチロシンが検出されることは、Cl2がLDLの生体内酸化に対する反応性中間体として作用しているかも知れないことを示す。
これらの結果は、ミエロペルオキシダーゼが生体内でハロゲン化反応を果す最初の直接的証拠を提供する。リポタンパク質酸化とミエロペルオキシダーゼによりつくり出された反応性中間体との間のつながりは、LDLの生体内酸化にこの酵素が関係していることそして３−クロロチロシンがスクリーニングに対する合理的診断マーカーに相当し、そのためヒトのアテローム性動脈性血管疾病を防止するために設計された特異的な介入を利用できることを示す。
発明の詳細な説明
本明細書は、本発明を構成すると考えられる主題事項を個々に指摘し、別々に請求する請求項で結んでいるが、本発明は図面と共に取り上げた特に適当な具体例についての下記の詳細な説明から一層よく理解されるであろう。該図は簡単に言えば：
図１は、ヒト活性化食細胞に暴露されたLDLにおける３−クロロチロシンの生成を示す。ヒト好中球（１×106個/ml）を、DTPA（100μＭ）およびLDL（512μｇタンパク質/ml）で補充したHank's平衡塩類溶液中37℃でインキュベートした。好中球をホルボールエステル（PMA;200nM）で活性化し、間欠反転により浮遊状態に保った（完全好中球系）。
60分のインキュベーション後、好中球を遠心により除いた。上澄を脱脂質し、透析し、13C−標識した内部標準を加え、次に試料を酸加水分解にかけた。酸加水分解物中のＬ−チロシンおよび３−クロロチロシン含量を、下記の「方法」のところで述べる安定同位体希釈GC−MS分析により測定した。
この完全系への追加または削除は示した通りである。添加の最終濃度は次の通りである：
３−アミノトリアゾール（３−AT）,10mM;
NaN3,1mM;
NaCn,1mM;
カタラーゼ（Cat）,10μG/ML;
超酸化物ジスムターゼ（SOD）,10μg/ml;および
イオノマイシン（Iono）,1μＭ。
LDLの３−クロロチロシン含量を、その前駆物質アミノ酸であるＬ−チロシンの含量に対して標準化する。値は二回の定量の平均である。同様な結果は三回の独立した実験でも観察された。
図２は、種々な酸化系によって修飾されたLDL中の３−クロロチロシンの生成を示す。LDL（512μｇタンパク質/ml）を、リン酸塩緩衝食塩水（10mMリン酸ナトリウム,150mM  NaCl,pH7.4）単独（対照）中で、あるいは示された酸化系と共に370℃でインキュベートした。完全ミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系は、20nMミエロペルオキシダーゼと100μM H2O2からなる。HOClは100μＭで用いた。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（10μg/ml）およびラクトペルオキシダーゼ（10μg/ml）を100μM H2O2と共に用いた。LDLをミエロペルオキシダーゼ、HOCl、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼに60分暴露した。
すべての他の酸化反応を24時間行なった。オキシダントの最終濃度は次の通りである：ペルオキシナイトライト、100μM;CuSo4、10μM;CuSO4とH2O2、それぞれ100μＭと2mM;FeSO4、10μM;ヘミン、10μM;およびグルコース、100mM。リポキシゲナーゼによるLDLの酸化は、以前に記述されたように（45）ホスホリパーゼA2を補なった150mM NaCl、50mMホウ酸塩中で実施した。
反応生成物を脱脂質し、酸加水分解し、アミノ酸加水分解物の３−クロロチロシン含量を安定同位体希釈GC−MS分析により測定した。値は二重の定量の平均である。三回の独立した実験でも同様な結果が観察された。HRP、セイヨウワサビペルオキシダーゼ;MPO、ミエロペルオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ。
図３は、健常およびアテローム性動脈硬化症のヒト大動脈組織の３−クロロチロシン含量を示す。外科手術で得たヒトの胸大動脈組織を直ちに氷冷酸化防止剤緩衝液中に入れ、分析まで−80℃で冷凍した。通常および進行、アテローム性動脈硬化病変部位から得た内膜を液体窒素中で粉末化し、脱脂質し、透析し、13C−標識内部標準でスパイクし、酸加水分解にかけた。次に加水分解物中のアミノ酸をC18カラム上で固相抽出により単離し、誘導体化し、「方法」のところで述べるように、安定同位体希釈GC−MS分析にかけた。
図４は、ヒトアテローム性動脈硬化組織から、および血漿から採取されたLDL中の３−クロロチロシンのレベルを示す。「方法」のところで述べるように、血漿およびアテローム性動脈硬化性大動脈から、それぞれ連続超遠心によりLDLを単離した。リポタンパク質の３−クロロチロシン含量を安定同位体希釈GC−MS分析により測定した。
本発明を更に詳細に説明するために、下記の例を実施するが、本発明はこれらの特定の例に、あるいはその中に記述された詳細事項に、制限されないことは明らかであろう。
例
材料
ペルオキシナイトライトはMonsanto Corporation（セントルイス,MO）からの贈呈品である。家兎抗ヒトアポリポタンパク質B100抗血清はGustav Schonfeld博士（ワシントン大学，セントルイス,MO）からの贈呈品である。すべての他の試薬はSigma Chemical Co.あるいは指示供給源から購入した。
方法
一般手順  全ガラス器具は、使用前に、塩素要求量無しとした（ヨウ化物から三ヨウ化物への酸化によりモニターして、気密容器中37℃で10分のインキュベーションにおいて、1mM  HOClの消費＜３％）（12,25,27）。緩衝液はChelex−100樹脂で処理して遷移金属イオンを除去し、そして塩素要求量がゼロであることを実証した。ミエロペルオキシダーゼ（ドナー：過酸化水素，オキシドレダクターゼ,EC1.11.1.7）は、以前に記述されているように（28,29）単離した（最終A430/A280比0.6）。酵素濃度は、分光測光で測定した（ε430＝170mM-1cm-1;文献30）。ヒト好中球は浮遊密度遠心（31）により単離した。好中球の単離および実験に対しては、媒質Ａ（100μＭジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）を追加したHank's平衡塩類溶液,pH7.2で，マグネシウム，カルシウム，フェノールおよび重炭酸塩を含まず;Gibco−BRL,Gaithersburg,MD）を用いた。
Ｌ−３−［13C6］クロロチロシンはＬ−［13C6］チロシンから試薬HOClを用いて合成し、逆相HPLC分析により定量した（25,26）。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いて、Markwell−修飾Lowreyタンパク質検定法（32）を使用することにより測定した。H2O2濃度は分光測光法で測定した（ε240＝39.4M-1cm-1;文献33）。LDL（ｄ＝1.019〜1.070g/ml）は、絶食しない健康な男女被実験者から、連続密度超遠心（34）により単離した。SDS−PAGEは、家兎抗ヒトアポリポタンパク質B100抗血清および対照非免疫抗血清（36）を使用し、ウェスタン  ブロット分析を用いてLaemmli（35）により記述されたように行なった。
組織の収集
ヒトの大動脈組織の新鮮な標品は、移植片提供者および血管外科患者から得た。組織を直ちに氷冷標準食塩水中ですすぎ、緩衝液Ａ（65mMリン酸ナトリウム,pH7.4,100μM DTPA,100μＭブチル化ヒドロキシトルエン（BHT））中に入れ、分析まで−80℃でN2下で冷凍した。LDLは死亡後10時間以内の死体解剖で得た胸大動脈の内膜から単離した。剖検組織をDTPA（100μＭ）で補充した氷冷リン酸塩緩衝食塩水の中ですすぎ、直ちに−80℃でN2下に緩衝液Ａ中で分析まで冷凍した。対照研究は、これら条件下で６か月まで貯蔵した組織の３−クロロチロシン含量に検知しうる程の変化がないことを示した。
組織処理  外科手術の大動脈標品を、10mM  ３−アミノトリアゾール（ミエロペルオキシダーゼ阻害剤）で補なった緩衝液Ａを満した密封バッグ中で解凍した。その後の全工程は、特に断らない限り４℃で実行した。Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth Study（37）の基準を用いて、アテローム性動脈硬化病変を形態学的に分類した。大動脈内膜をその保存液から取り出し、液体N2中で凍結させ、ステンレス鋼乳鉢と乳棒を用いて液体N2下に粉末化した。
組織粉末（湿重量〜20mg）を1mlの緩衝液Ｂ（100μM DTPAおよび10mM  ３−アミノトリアゾールで補ったH2O）中に浮遊させ、次に０℃で三回脱脂質した。単相抽出混合物（H2O:メタノール：水−洗浄ジエチルエーテル（1:3:7;v:v:v））を渦巻くようにかきまぜ、０℃で30分インキュベートし、タンパク質を遠心により回収した（5000×g,0℃で10分）。このタンパク質粉末を緩衝液Ｂ中に浮遊させ、50mM  Na［PO4］,pH7.0,100μM DTPAおよび10mM  ３−アミノトリアゾールからなる緩衝液に対して透析することにより塩化物を除き、次に緩衝液Ｂに対して一晩透析した。
ヒトアテローム性動脈硬化内膜からのLDL分離  LDLを血管組織からSteinbrecker等（19）の方法により、緩衝剤Ｃ（0.15M  NaCl,10mMリン酸ナトリウム（pH7.4）,1mM  EDTA,100μM DTPA,50μg/mlの大豆トリプシン阻害剤,100μM BHT,1μＭフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび10mM  ３−アミノトリアゾール）（これは酸化防止剤，プロテアーゼおよびミエロ−ペルオキシダーゼ阻害剤を含む）を用いて単離した。分離された胸大動脈を緩衝剤Ｃで満した密封バッグ中で解凍した。
脂肪のすじおよび中間の病変部を媒質から一部切除し（湿重量〜9g/大動脈）、液体N2中で冷凍し、ステンレス鋼の乳蜂と乳棒を用いて液体N2下で粉末化し、脈管内膜粉末を50mL無菌円錐形の管中に集めた。緩衝液Ｃを加え（組織の湿重量1g当り5ml）、管を４℃で一晩転倒（end−over−end）振盪させた。次に試料を４℃で15分5000×ｇで回転させ、上澄を４℃で30分間100,000gで遠心にかけた。ペレットおよび最上部の脂肪血（lipemic）層を捨てた。
残存する上澄中のLDL様粒子を連続密度超遠心（ｄ＝1.019−1.070g/ml）（34）により単離した。リポタンパク質の単離に用いたすべての溶液中に金属キレート剤（100μM DTPA）およびミエロペルオキシダーゼ阻害剤（10mM  ３−アミノトリアゾール）を含めた。
タンパク質加水分解  タンパク質加水分解にはHBrを用いた。それはHClに暴露したＬ−チロシンに３−クロロチロシンが発生することが予備実験によって実証されたからである。10ピコモルの３−［13C6］クロロチロシンおよび100ナルモルのＬ−［13C6］チロシンの添加後、脱脂質し透析したタンパク質（〜１−4mg）を緩衝剤Ｂ中に浮遊させ、ガラス反応容器中で真空乾燥した。
次に各容器に１％フェノールを含むHBr（6N）0.5mlを加えた。
反応容器を真空下でのガス抜きとアルゴン掃気を交互に五回行ない、120℃で24時間インキュベートした。加水分解後、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）1.5mlを加え、直ちに混合物を、0.1％TFAで平衡化させた固相C18抽出カラム（Supelclean  LC−18SPEチューブ,3ml:Supelco Inc.,ベルフォンテ,PA）上に通した。カラムを同じ緩衝液で2mlで洗浄し、0.1％TAF中50％メタノール2mlで溶離し、回収されたアミノ酸を真空乾燥した。
質量分析測定による分析  アミノ酸のｎ−プロピル、ペルヘプタフルオロブチル（HFB）およびｎ−プロピル、ペルペンタフルオロプロプリオニル（PFP）誘導体を調製し（38）、拡張された質量範囲を装置したHewlett Packard 5988A質量分析計と連結させたHewlett Packard 5890ガス  クロマトグラフで分析した。クロマトグラフィー分離は、典型的には、キャリヤーガスとしてHeを使用し、スプリットレスモードで30mのDB−17キャピラリーカラム（Hewlett Packard;内径0.2mm,膜厚0.25μｍ）を用いて行なった。カラムを次の温度勾配:20℃／分で150℃から250℃、で、インジェクター、トランスファーラインおよびソース温度をそれぞれ250℃、250℃および130℃にセットして操作した。
アミノ酸類は、負イオン化学イオン化モード（25,26）で、安定同位体希釈GC−MS分析を用いて定量した。３−クロロチロシンは、そのｎ−プロピル−per−HFB誘導体として、質量対電荷比（m/z）451（Ｍ・−−HFB）の基準ピーク、他の顕著なイオン、ｍ・/z629（M-−HF）、およびこれらの同位体標識された内部標準イオン、それぞれm/z457および635、の選ばれたイオン  モニターイングを利用することによりモニターした。
Ｌ−チロシンは、そのｎ−プロピル−ペル−HFB誘導体として、ｍ−z417（Ｍ・−−HFB）の基準ピーク、もう一つのm/z595（Ｍ・−−HF）における主要イオン、およびこれらの標識された内部標準イオン、それぞれm/z423および601、を用いてモニターした。検出限界（信号／ノイズ＞10）は、すべてのアミノ酸に対し＜10fモルであった。
結果
３−クロロチロシンは、活性化食細胞のミエロペルオキシダーゼ
H2O2−Cl-系により媒介されるLDL酸化に対する特異的マーカーである。３−クロロチロシン生成が、ミエロペルオキシダーゼによるタンパク質損傷に対するマーカーとして働くかどうかを決定するため、ヒト好中球に暴露されたLDLのアポリポタンパク質B100中の酸化されたアミノ酸のレベルを定量した。質量分析検定によると、新しく調製されたLDL中に３−クロロチロシンを検出できなかった（検出限界＜0.1μモル／モルチロシン）。活性化食細胞とインキュベートしたLDLにおいては、３−クロロチロシン含量の劇的な増加が明らかである（図１）。３−クロロチロシンの生成には細胞をホルボールエステルで活性化する必要がある。
ペルオキシダーゼ阻害剤（アジ化物、３−アミノトリアゾールおよびシアン化物）および過酸化物スカベンジャー（カタラーゼ）の添加は３−クロロチロシン産生を抑制するので、この細胞媒介反応にミエロペルオキシダーゼとH2O2が関係していることが分かる。
超酸化物ジスムターゼ（これはO2−からH2O2への変換を触媒する）をカルシウムイオノホアのイオノマイシン（NADPHオキシダーゼの活性化を高め、ミエロペルオキシダーゼ分泌を刺激する）と共に、あるいは無しに添加すると、更に塩素化アミノ酸の発生を起こす。総合すると、これらの結果は、アポリポタンパク質Ｂ−100のチロシル残基の塩素化に食細胞のミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系が関係することを示す。
酵素的に発生したHOClがLDLを酸化するかどうかを調べるため、ミエロペルオキシダーゼによるアポリポタンパク質B100の塩素化に対する反応の要件（表１）を決定した。完全ミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系の存在は、３−クロロチロシン産生を起こした。塩素化は酵素、H2O2およびCl-を要求し、ペルオキシダーゼ阻害剤およびカタラーゼにより妨害されるので、この反応経路にHOClが関係している。試薬HOClは３−クロロチロシン生成を起こすことから、ミエロペルオキシダーゼにより発生したHOClがこのハロゲン化反応における中間体であることが確実となる。
ミエロペルオキシダーゼによるタンパク質損傷のマーカーとしての３−クロロチロシンの特異性を確定するために、種々な容器内酸化系がLDLのアポリポタンパク質B100に塩素化アミノ酸を発生させる能力について調べた。完全ミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系および試験HOClに暴露されたLDLに、重要な意味をもつ程のレベルで３−クロロチロシンが検出された（図２）。
これとは著しく違って、銅、鉄、ヒドロキシルラジカル発生系（H2O2＋銅）、ラクトペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ペルオキシナトライト、グルコースまたはリポキシゲナーゼのいずれかにより酸化されたLDLの３−クロロチロシン含量には殆ど変化が無かった（図２）。これら系のすべてがLDL酸化を起こしたことは脂質酸化生成物の出現によりモニターされる通りである（チオバルビツール酸反応物質検定および／または脂質ヒドロペルオキシド；文献27,34）。総合すると、これらの結果は、３−クロロチロシン産生がミエロペルオキシダーゼ−H2O2−Cl-系によるLDL酸化に対する高度に特異的なマーカーであることを示している。
３−クロロチロシンは、ヒトアテローム性動脈硬化組織中に高濃度で存在する。３−クロロチロシンがミエロペルオキシダーゼにより生体内で生成されうるかどうかを決定するため、ヒトのアテローム性動脈硬化病変部位中の塩素化アミノ酸について調査を行なった。生体外タンパク質酸化を防止するために処理する組織に使用される緩衝液中に、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を添加した。分析手順にかけた組織中の３−クロロチロシン濃度は、ミエロペルオキシダーゼの補充で増加しなかった。これらの結果は、ミエロペルオキシダーゼによる３−クロロチロシンの発生が組織採取と処理の間に起こりそうもないことを示している。
アテローム性動脈硬化性組織の酸加水分解物から単離されたアミノ酸を、誘導体化しそしてGC−MSにより分析した場合、真正３−クロロチロシンのそれと同一の主要イオンおよび保持時間を示すアミノ酸が検出された。この化合物の生体は、３−クロロチロシンのヘプタフルオロブチリルおよびぺンタフルオロプリオピオニル誘導体両者を使用して真正標準品との比較により確証を得た。選ばれたイオンモニターイングは、アミノ酸から誘導されたイオンが３−［13C6］クロロチロシンから誘導されたイオンと、両方の誘導体について同時溶出することを実証した。これらの結果は、ヒトアテローム性動脈硬化性組織から調製されたアミノ酸加水分解物中に、タンパク質と結合した３−クロロチロシンが存在することを示す。
ミエロペルオキシダーゼにより生じたHOClが、アテローム性動脈硬化病変部でタンパク質に損傷を与える役割を演じうるかどうかを決定するために、外科手術で取り出された正常組織およびアテローム性動脈硬化性大動脈組織中の３−クロロチロシン濃度を定量した。進行したアテローム性動脈硬化病変部は、正常な大動脈組織と比較したとき、３−クロロチロシン含量に３倍の増加を示した（図３）。
ヒトのアテローム性動脈硬化病変部から単離されたリポタンパク質を含むアポリポタンパク質B100は、３−クロロチロシンの顕著な増加を示す。  LDLの生体内酸化を触媒する際のミエロペルオキシダーゼの可能な役割を直接評価するため、剖検で採取したヒトのアテローム性動脈硬化組織からLDL（α＝1.019−1.070g/ml）を単離し、次にその３−クロロチロシン含量を定量した。ヒトのアポリポタンパク質B100に対して単一特異性の家兎多クローン抗体は、病変部LDLに500kDaタンパク質、予期された分子質量タンパク質、を検知した。他の研究者（6,17−19）により以前に注目された通り、免疫反応性の広範囲の低分子質量形も病変部から単離されたLDL中に存在する。
直列の一組としたSuperose 6およびSuperose 12（pharmacia−LKB  Biotechnology,ピスカッタウェイ,NJ）ゲル濾過カラム上で分別された病変部LDLの分析は、循環LDLと共にクロマトグラフィーにかけ、免疫反応性アポリポタンパク質B100タンパク質の＞95％を含む主要成分を実証した（ELISA）。
血管病変部から採取したLDLの質量分光測定分析は、循環LDLに観察される値より100倍高い３−クロロチロシン濃度を実証した（図４）。これらの結果は、ヒトの動脈壁におけるLDL酸化に対する一つの経路がミエロペルオキシダーゼによるＬ−チロシンの芳香環のハロゲン化を含むことを示している。
0003553611.tif 000002
完全系は、LDL（512μｇタンパク質/ml）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO;40nM）、H2O2（100μＭ）およびCl-（NaClとして;100mM）を補った緩衝液Ｂ（20mM  Na［PO4］,pH7.0,100μM DTPA）からなる。37℃で１時間のインキュベーション後、「方法」のところで述べたように、３−クロロチロシン含量を安定同位体希釈GC−MSにより定量した。この検定法の検出限界はＬ−チロシン１モルにつき３−クロロチロシン＜0.1uモルであった。値は重複定量の平均である。三回の独立した実験においても同様な結果が観察された。
本発明の開示を読めば、本発明の主旨と範囲から離れることなく、種々な他の例が当業者にとって明白となるであろう。このような他のあらゆる例も請求の範囲内に含めるものとする。従って、体液または組織試料中の３−クロロチロシンの存在および濃度も、３−クロロチロシンに対する多クローンまたは単クローン抗体を用いる免疫検定法において、免疫沈殿手順により定量できる。一部位および二部位放射線免疫検定法および酵素免疫検定法、例えばEngvall and Perlmann,J.Immunol.109,129−135（1972）により記述された酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）の手順を本発明診断法に使用できる。
0003553611.tif 000003
256,495−497（1975），およびEur.J.Immunol.6,511−519（1976）；およびGoding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press Inc.,New York（1983）に記載された通常のハイブリドーマ方法論により調製できる。
0003553611.tif 000004
0003553611.tif 000005
0003553611.tif 000006
【図１】
0003553611.tif 000007
【図２】
0003553611.tif 000008
【図３】
0003553611.tif 000009
【図４】
0003553611.tif 000010