【手続補正書】
【提出日】平成29年8月29日(2017.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノスパイクによる細胞膜の穿孔により、合成殺菌表面上の細胞にとって致死的である、該ナノスパイクのアレイを含む合成殺菌表面。
【請求項２】
該表面が、親水性である、請求項１に記載の表面。
【請求項３】
該ナノスパイクが、約100 nm〜約600 nmの高さである、請求項１または２に記載の表面。
【請求項４】
該ナノスパイクの直径が、その自由端よりもその根元において大きい、請求項１〜３のいずれか1つに記載の表面。
【請求項５】
該ナノスパイクが、最大値の半分の高さでの直径が、約20 nm〜約300 nmである、請求項１〜４のいずれか1つに記載の表面。
【請求項６】
該ナノスパイクの先端が、約4 nm〜約50 nmの直径である、請求項５に記載の表面。
【請求項７】
該ナノスパイクが、中心から中心で約200 nm〜約700 nm離れて位置する、請求項１〜６のいずれか1つに記載の表面。
【請求項８】
該ナノスパイクが、アレイ内で隣接する複数のナノスパイクの先端が一緒になることができる程度に屈曲することができる、請求項１〜７のいずれか1つに記載の表面。
【請求項９】
ナノスパイクの弾性のヤング率が、約10 GPa〜約300 GPaである、請求項１〜８のいずれか1つに記載の表面。
【請求項１０】
該ナノスパイクが、枝分かれする、請求項１〜９のいずれか1つに記載の表面。
【請求項１１】
該ナノスパイクの自由端において、または自由端に向かっての枝分かれである、請求項１０に記載の表面。
【請求項１２】
該表面を形成する基板が、シリコンを含む、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の表面。
【請求項１３】
該表面を形成する基板が、ホウ素をドープしたシリコンを含む、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の表面。
【請求項１４】
該表面が、ブラックシリコン(bSi)を含む、請求項１〜１１のいずれか1つに記載の表面。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか1つに記載の表面を含む、デバイス、ツール、付属品または装置。
【請求項１６】
壁、床、天井、手すり、ドアノブ、ハンドル、シートカバー、テーブル、椅子、照明スイッチ、トイレ、蛇口、シンク、洗面台、卓上、ベッド、マットレスおよび枕カバー、病院の家具、食品調理表面、調理および食品調製調理器具および機器、食品および飲料の包装および貯蔵容器、食品ラップ、医療，外科，獣医および歯科ツール，装置および器具、医療，歯科および獣医用インプラント、手袋、櫛、ブラシ、カミソリ、はさみ、食品および飲料のミキサーおよび加工/包装機器または機械、食品および飲料の加工ライン、食肉処理場付属品およびツール、防護服、ゴーグルおよびメガネ、上下水道管、タンクおよびドレイン、ボートの船体および水域および海洋設備から選ばれる、請求項１５に記載のデバイス、ツール、付属品または装置。
【請求項１７】
ナノスパイクによる細胞膜の穿孔により、合成殺菌表面上の細胞にとって致死的である、ナノスパイクのアレイを含む合成殺菌表面の製造方法であって、基板表面を含むシリコンを反応性イオンエッチングに曝露させることを含む方法。
【請求項１８】
基板が、ホウ素をドープしたシリコンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
SF6およびO2中で、反応性イオンエッチングを行なう、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
約30mTorr〜約40mTorrの加工圧および約80W〜約120WのRIE力で、反応性イオンエッチング(RIE)を行なう、請求項１７〜１９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか1つに記載の方法によって製造される、ナノスパイクによる細胞膜の穿孔により、合成殺菌表面上の細胞にとって致死的である、ナノスパイクのアレイを含む合成殺菌表面。
【請求項２２】
細胞を、請求項１〜１４および２１のいずれか1つに記載の合成殺菌表面に曝露させる、細胞を除去するか、または細胞生存を減少させる方法。
【請求項２３】
細胞が、細菌細胞、細菌胞子、ウイルス感染細胞、藻細胞または海生もしくは水生生物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
分析されるべき細胞を、請求項１〜１４および２１のいずれか1つに記載の合成殺菌表面に曝露させる、分析のために細胞を溶解する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、殺菌活性を示す材料、特に、接触すると細胞が死滅する新規な表面トポグラフィーを示す表面に関する。本発明は、また、このような表面を含むデバイス、該表面を作成する方法、および細胞を該表面に曝露させる、細胞の生存を撲滅または減少させる方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】2つのサンプルの表面パターンを明示する、35,000倍の倍率における(a)ブラックシリコン(bSi)および(b)トンボの前翅の上部表面の走査電子顕微鏡写真を示す(スケールバー＝200 nm)。表面を53°の角度で傾けると、ブラックシリコンのナノ構造物が、より鋭く、他方とは異なっており、トンボの翅のナノ構造物の約2倍の高さであることがわかる。光学的プロフィロメトリーを用いて、この差異をさらに強調した(c、d)。いくつかの視覚的差異にもかかわらず、(a)および(b)のように上から見た場合、2つの空間パターン形成は、多少類似しており、このことは、変異マップ生成を介して顕微鏡写真が三次元モデルに変換される(e)および(f)においてさらに例示される。
【図２】トンボの翅およびブラックシリコンとの相互作用の結果として著しく破壊されるように見える、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、枯草菌栄養細胞および枯草菌胞子の代表的SEM顕微鏡写真を示す(a-d、i-l)。対応する共焦点レーザー走査顕微鏡写真は、この破壊が細胞にとって致死的であったことを確認する(e-h、m-p)。非生存細菌細胞および胞子をヨウ化プロピジウムで染色し(赤)、生存細胞をSYTO(登録商標) 9で染色した(緑)。すべての細胞は、赤く見え、細菌を不活性化することにおける表面の高い効率を示した。SEM スケールバー＝200 nm、CLSM スケールバー＝5 μm。
【図３】(a)ブラックシリコンおよびトンボの翅の表面の殺菌効率のグラフを示す。インキュベーション時間1分当りのサンプル投影表面面積1cm2当たりの殺された細胞の数として、bSiおよびベニヒメトンボの翅の表面の動態的殺菌効率を計算した。対応する時間間隔にて対照に残っている細胞の数から生存細胞の数を引くことによって、殺された細胞の数を決定した。対照において観察された細菌数の経時減少は、貧栄養リン酸緩衝生理食塩水中での程度の少ない自然の細胞死によるものである。誤差バーは、生物系に関連した自然変動を表し、コロニー形成単位における標準偏差に基づいて作成された。(b)は、bSiの投影表面面積と試験された細胞型の最小感染量を中和するのに必要な時間との間の関係のグラフを示す。このグラフは、試験されたすべての細胞型の最小感染量が、非常に短い時間枠で非常に小さいbSiサンプルによって中和されうることを実証する。たとえば、0.2 cm2の大きさのbSiサンプルは、枯草菌細胞の最小感染量を約5分以内で殺すのに十分な大きさである。
【図４】a：トンボの翅およびb：bSi表面の最上層における元素組成を見い出すために0〜1400 eVで行われたサーベイスキャンによるXPSスペクトル情報を示す。次いで、約20 eV間隔で、O 1sおよびC 1sピークにわたる高解像度スキャン差込を行った。ｃ：翅およびd：ブラックシリコン表面における静的接触角測定は、翅は超疎水性であるが、ブラックシリコン表面は適度に親水性であることを実証する。
【図５】金コーティングしたbSiおよびベニヒメトンボの翅の殺菌活性を実証する走査電子顕微鏡画像を示す。金の薄層でコーティングした後に、bSi(a、b)およびトンボの翅(c、d)の両方の殺菌効果を試験した。両方の表面は、緑膿菌(a、c)および黄色ブドウ球菌(b、d)に対するその殺菌活性を維持した。
【図６】ガラスコントロール表面上のa：緑膿菌、b：黄色ブドウ球菌、c：枯草菌栄養細胞およびd：枯草菌の胞子の細胞形態を示す走査電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは、1 μmである。
【図７】滑らかなシリコンコントロール表面上のa：緑膿菌、b：黄色ブドウ球菌、c：枯草菌栄養細胞およびd：枯草菌の胞子の細胞形態を示す走査電子顕微鏡画像を示す。
【図８】bSi表面による細菌細胞濃度の減少を実証する棒グラフを示す。bSi表面の存在下で30時間にわたってインキュベートした場合、懸濁液中のすべての細胞型の数が減少した。より長時間(特に24時間および30時間)インキュベートした場合、貧栄養培地のせいで、細胞数はコントロールにおいても減少する傾向にあった。24時間および30時間後の懸濁液中の胞子のデータは、胞子の発芽に起因する複雑な事態のために除外された。
【図９】ブラックシリコン自己組織化ナノピラー配列(nanopillar arrayed)表面と赤血球の相互作用の定量分析を提供する。(a)3時間にわたる接触における赤血球とbSi表面との相互作用を示すSEM画像(上面)。(b)bSiおよび市販のシリコンウェハー上の赤血球の動的付着；データは、3回の独立した実験における、10の異なる面積からの付着した細胞の平均総数としてプロットされた。(c)bSi表面における無傷の赤血球と破裂した赤血球の割合；該表面において両凹形状を維持した赤血球を無傷の細胞とみなし、損傷をうけた細胞の「セルプリント(cell prints)」を破裂した細胞とみなした。
【図１０】bSiナノピラー配列表面と相互作用中の赤血球の形態的変化を示す。単一の赤血球の段階的な破裂過程を示すSEM顕微鏡写真(a)上面および(b)側面。健康な両凹形状の細胞は、該表面と接触すると変形するようになり、最終的には破裂した。破裂した細胞および／または膜の幾つかの片が見られ、「セルプリント」とみなされた。CLSM分析(c)は、赤血球の破裂を確認した。1,1'-ジオクダデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩で細胞を染色した。bSi表面と細胞を接触させた後、5、15および30分の時点で、CLSM画像を撮った。
【図１１】ブラックシリコン表面に付着し、破裂したRBCのラマン分析を提供する。(a)520 cm-1におけるシリコンの特徴的なピークおよび(c)480 cm-1〜560 cm-1におけるラマン活性の統合。(b)赤血球のヘモグロビン分子の特徴的なピークおよび(d)1209 cm-1〜1660 cm-1におけるラマン活性の統合。ブラックシリコン表面で破裂している赤血球の(e)CLSMおよび(f)SEM画像。すべての実験において、赤血球は、bSiとともに30分間インキュベートされた。青い丸の点線は、両凹形状を維持している細胞を示す。黄色い長方形の破線は、完全に破裂した赤血球の「セルプリント」を示す。
【図１２】自己組織化ナノピラー配列シリコンの表面分析を提供する。(a)5分間エッチングされたナノピラーシリコンの代表的な上面SEM画像(スケールバーは、500 nmである)。(b)直径100 nmまで伸ばした、集団において38 nmおよび面積%において49 nmにて最大を示すナノピラーの面積%および集団分布。分布のショルダーおよびテーリングは、ナノピラーチップの凝集を表した。(c)上面SEM画像の高速フーリエ変換は、4つの広い直交ローブへと広がる強いリングを表した；歪んだ正方形状のパターンの証拠。(d)ローブペアの1つを横切るグレースケール強度(0〜255)プロフィールは、185 nmである隣接するナノピラー間の平均距離の測定値を示し、拡張されたショルダーは、より大きい距離にて整えられたナノピラーを表した。(e) ナノピラーの代表的な側面SEM画像。(f)5つのSEM画像における平均±50測定値の分散として計算された寸法を有するナノピラーの模式図。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の殺菌表面は、秩序だっているか、または無秩序である、曝露された細胞に対して致死的であるナノスパイクのアレイの存在を特徴とする。たとえば、ナノスパイクは、所定の表面内での平均で、約150 nm〜約550 nm、約200 nm〜約500 nm、約250 nm〜約450 nmまたは約300 nm〜約400 nmなどの約100 nm〜約600 nmの表面からの高さを有することができる。本発明の1つの実施態様において、ナノスパイクは、約300 nm〜約500 nmの平均高さを有する。たとえば、走査電子顕微鏡によって、高さ(およびナノスパイクの他の平均寸法)を容易に決定することができる。必ずしも必要ではないが、ナノスパイクは、先端に到る自由端に向かってそれらが直径で約4 nm程度狭まるように、それらの根元(すなわち、表面へのスパイクの付着部分)において、もしくは根元に向かって大きくなる寸法を有する。たとえば、最大値の半分の高さで、ナノスパイクは、約20 nm〜約150 nm、25 nm〜約100 nm、30 nm〜約60 nm または約35 nm〜約50 nmなどの約20 nm〜約300 nmの直径を有する。1つの態様において、ナノスパイクは、最大値の半分の高さで、約20 nm〜約50 nmまたは25 nm〜約40 nmの平均直径を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
結論
合成bSiによって提示される広範囲の殺菌活性は、細胞が表面構造(およびそれらの付随する応力)の物理的相互作用力に応答し、細胞変形および細胞死がもたらされるメカノ応答性微生物学への新たなアプローチのための機会を提供する。このようなナノ材料を容易に作製する能力は、生物医学的および工業的適用の両方における使用のための、広範囲の殺菌表面の開発におけるその使用の可能性を示唆する。我々の結果は、(i)ナノ構造のbSiおよび天然のベニヒメトンボの翅が、ペプチドグリカン細胞壁および内部膜上の表面ナノ構造によって引き起こされる変形的応力に対する機械的および構造的応答によって駆動する殺菌活性を有する非常に有効な殺菌表面であること；(ii)細菌細胞を殺すことにおいてトンボの翅の表面構造に類似の有効性を有する合成抗菌ナノ材料が、容易に作製できること；ことを実証する。
これらの表面は、表面の化学官能性とは独立して有効であるように見え、(iii)このような合成表面は、天然の対応物と比較して、増強された殺菌活性を示す。これらのデータは、メカノ応答性表面が、微生物汚染に反撃することにおいて演じることができる影響力の明らかな実証を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
赤血球が付着したエッチングされたシリコン表面のスペクトルを図12に示す。690 cm-1〜1909 cm-1の赤血球のラマンピークは、細胞膜と相互作用する遊離細胞質ヘモグロビンおよびサブメンブランヘモグロビンなどのすべてのヘモグロビン分子のヘムにおける結合振動に対応する。破裂した細胞からのいくつかの破片は、ヘモグロビンが検出されなかった細胞膜の残りの下に、ナノピラー上の集塊として見られる(図12(e))。ヘモグロビンは、によって損傷されなかった無傷の赤血球内で容易に検出された(図12(e))。これらの結果は、SEM分析に一致することが見い出された(図12(f))。