(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
0003557212.tif 000003
で表される化合物。
【請求項２】
炭素源、窒素源及び微量元素源の培地中でノデュリスポリウム（Nodulisporium）種MF−5954の生成株を発酵させ、化合物を単離することからなる請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項３】
株がノデュリスポリウム（Nodulisporium）種MF−5954,ATCC  74245である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を製造できる生物学的に純粋なノデュリスポリウム（Nodulisporium）種MF−5954培養物。
【請求項５】
ノデュリスポリウム（Nodulisporium）種MF−5954,ATCC  74245である請求項４に記載の生物学的に純粋な培養物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
米国特許第4310519号明細書及び第4199569号に開示されているアベルメクチンのような新規駆虫薬はよく知られている。しかしながら、このようなアベルメクチン化合物は内部及び外部寄生虫に対して強力な薬剤ではあるが、本発明の化合物とは製造的に異なる。放線菌から単離された大環状物質であるアベルメクチン類は本発明の多環式真菌代謝物とは関係がない。de  Jesus等,J.Chem  Soc.Perkin  Trans  I,697−701ページ（1984）には、多環式構造を有するjanthitremsとして同定された真菌代謝物が記載されているが、上記構造は本発明の化合物の幾つかの構造要素を欠いている。
発明の要約
本発明は新規な駆虫薬及び外部寄生虫駆除薬の製造に関する。従って、このような新規化合物を開示することが本発明の目的である。他の目的は該化合物の新規製造方法を提供することである。他の目的は該化合物の製造に使用される微生物及び該製造に適用可能な発酵条件を記載することである。更に別の目的は本発明の化合物を駆虫薬として使用する組成物及び方法を記載することである。以下の記述を読めば、それ以外の目的は明白となろう。
【図面の簡単な説明】
図１、図２及び図３はそれぞれ化合物１、２及び３のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。図面では、共鳴ピークの幾つかを「×」で示す。これらのピークは共存する溶媒由来のものであり、化合物の構造とは関係ない。
図１はVarian  Unity  500  NMR分光計にて、CD2Cl2中、500MHz、25℃で記録した化合物１の核磁気共鳴スペクトルである。化学シフトは、δ5.32の溶媒ピークを内部標準として用いて0ppmのTMSに対するppmで示す。診断ピークのみを記す。
図２はVarian  Unity  400  NMR分光計にて、CD2Cl2中、400MHz、25℃で記録した化合物２の核磁気共鳴スペクトルである。化学シフトは、δ5.32の溶媒ピークを内部標準として用いて0ppmのTMSに対するppmで示す。診断ピークのみを記す。
図３はVarian  XL300  NMR分光計にて、CDCl3中、300MHz、室温で記録した化合物３の核磁気共鳴スペクトルである。化学シフトは、δ7.24の溶媒ピークを内部標準として用いて0ppmのTMSに対するppmで示す。診断ピークのみを評価する。
発明の詳細な説明
本発明は独特の構造を有する新規化合物に関する。本発明は更に、Nodulisporium種又はその突然変異体の発酵培地における本発明の化合物の新規製造方法に関する。
本発明の化合物は以下の構造式：
0003557212.tif 000002
で表される。
前記構造式は、ある位置では立体配置を限定せず、別の位置では立体配置を限定して図示しており、本発明はこのような全ての立体異性体を包含するものとすべきである。特に、種々の不斉中心の立体異性体はα配置であってもβ配置であってもよい。α及びβはそれぞれ、このような基が分子の全体面よりも下にあるのか上にあるのかを示す。
本発明の化合物は主に、寄生虫、例えばマダニ、シラミ、ノミ、並びに家畜動物や家禽にかみつく他の昆虫（例えばTenophalides,Ixodes,Psoroptes,Lucilia及びHemotobia）のような節足動物寄生虫によって生ずる疾病の治療及び／又は予防で駆虫薬として使用される。該化合物は、ヒトを含む他の動物で発生する寄生虫病の治療にも有効である。最良の結果のために使用すべき最適量は勿論、治療すべき動物の種、寄生虫感染又は侵入の型及び深刻度に依存する。一般に、約0.001〜約100mg/kg動物体重の新規化合物を経口投与すると、良好な結果が得られる。このような全用量は１回で投与するか又は１〜５日のような比較的短期間で分割投与する。本発明の新規化合物を用いれば、約0.025〜約50mg/kg体重を１回用量で投与することによって動物で上記寄生虫の優れた駆除が達成される。必要とあれば治療を繰り返して再感染を防止する。これは寄生虫の種や使用する農業技術に依存する。これらの物質を動物に投与する技術は当業者には公知である。
本発明の化合物はゴキブリBlatella種、アリSolenopsis、イガTineola種、ヒメマルカツオブシムシAttagenus種及びイエバエMusca  domesticaのような家庭内病害虫に対しても活性である。
本発明の化合物は、貯蔵穀物の病害虫（例えばTribolium種、Tenebrio種）や、農業植物の病害虫（例えばハダニ（Tetranychus種）、アブラムシAcyrthiosiphon、移動性直翅類（例えばバッタ）、及び直物組織上に存在する未成熟期の昆虫）に対しても有用である。この化合物は、農業では重要となり得る土壌線虫や植物寄生虫（例えばMeloidogyne種）の駆除のための殺線虫剤として有用である。
本発明の化合物は、カプセル剤、濃縮塊もしくは錠剤のような単位剤形で、又は液体飲薬（通常はペントナイトのような懸濁剤や湿潤剤又は同様の賦形剤を添加した活性成分の水溶液、水中懸濁液又は水中分散液）として経口投与することができる。一般に、飲薬は更に消泡剤を含んでいる。飲薬処方物は一般に約0.001〜約1.0重量％の活性化合物を含んでいる。好ましい飲薬処方物は約0.01〜約0.1重量％の活性化合物を含み得る。カプセル剤及び濃縮塊は活性成分をデンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はリン酸二カルシウムのようなキャリヤーベヒクルと混合してなる。
本発明の化合物の乾燥固体単位剤形での投与が所望される場合は通常、所望量の本発明の化合物を含むカプセル剤、濃縮塊又は錠剤が使用される。これらの剤形は、活性成分を適切な微粉希釈剤、充填剤、崩壊剤及び／又は結合剤（例えばデンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ゴム等）と均質かつ混合することによって製造される。このような単位処方物は、治療すべき宿主動物の型、感染の深刻度や型、及び宿主の体重のような要因によって駆虫薬の総重量や含量が大幅に変動し得る。
本発明の化合物を動物飼料原料を介して投与すべき場合、化合物は飼料に均質に分散させるか、ふりかけ剤として使用するか、又は固形飼料の形態で使用して飼料完成品に添加するか、場合によっては別個に与えることもできる。あるいは、本発明の駆虫用化合物は例えば管腔内、筋肉内、気管内又は皮下注射で動物に非経口投与してもよい。この場合、活性成分は液体キャリヤーベヒクルに溶解又は分散させる。非経口投与の場合、活性材料を、好ましくは植物油種（例えばピーナツ油、綿実油等）の許容可能なベヒクルと適当に混合する。ソルケタール（solketal）、グリセロール、ホルマール及び水性非経口処方物を用いる有機調製物のような他の非経口ベヒクルも使用される。本発明の化合物は投与用経口処方物に溶解又は懸濁させる。このような処方物は一般に約0.55重量％〜約５重量％の本発明の化合物を含んでいる。
本明細書に記載する化合物を動物の飼料成分として投与するか又は飲料水に溶解もしくは懸濁させる場合、活性化合物を不活性キャリヤー又は希釈剤に均質に分散させた組成物を使用する。不活性キャリヤーとは、駆虫薬とは反応せず、且つ動物に安全に投与できるものを指す。飼料投与用キャリヤーが動物配給物の成分であるか又は成分になり得るものであることが好ましい。
適切な組成物には飼料プレミックス又は補助物質が含まれ、この中には本発明の化合物が比較的多量に存在する。これらは動物に直接与えるか又は直接もしくは中間の希釈又は配合ステップの後に飼料に添加するのに適している。このような組成物に適した典型的なキャリヤー又は希釈剤には例えば、蒸留酒残渣の乾燥穀物、粗びきトウモロコシ粉、柑橘類粗びき粉、発酵残留物、カキ貝殻粉末、コムギふすま、糖蜜可溶性物質、粗びきトウモロコシ穂粉、食用マメ粉砕飼料、ダイズ粒、圧潰石灰石等が含まれる。粉砕、攪拌、微粉砕又は混転のような方法により、本発明の化合物をキャリヤー全体に均質に分散させる。本発明の化合物を約0.005重量％〜約2.0重量％含んでいる組成物が飼料プレミックスに特に適している。動物に直接与えられる飼料補助物質は、本発明の化合物を約0.0002重量％〜約0.3重量％含んでいる。
このような補助物質を、飼料完成品の活性化合物濃度が寄生虫病の治療及び防除に望ましいものとなるような量だけ動物飼料に加える。本発明の化合物の所望される濃度は前述した要因や使用する特定化合物によって異なるが、通常は所望の駆虫結果を達成するために本発明の化合物を約0.001重量％〜約0.2重量％の濃度で飼料に与える。
更には、化合物を動物飼料に添加すべき場合、発酵ブロスの乾燥菌糸体滓を使用することが可能である。菌糸体は活性の大部分を含み、菌糸体の活性レベルは調べることができるので、直接動物飼料に添加することができる。
本発明の化合物は、生長中又は貯蔵中の作物に損害を及ぼす農業病害虫を駆除するのにも有用である。この化合物はこのような農業病害虫を防除するために、散布液、粉剤、エマルジョン等のような公知の技術を用いて生長中又は貯蔵中の作物に適用される。
本発明の化合物の駆虫活性は、個々の化合物の試料、該化合物の混合物、濃厚抽出物等を、３日前に適当な寄生虫に感染させたマウスに飼料を介して経口投与することにより調べることができる。投薬開始から11日目、12日目及び13日目にマウスの排泄物中の卵を調べ、翌日マウスを殺して、小腸の近位部分に存在する虫の数を調べる。卵及び虫の数が薬物を適用していない感染対照と比較して大幅に減少するときには、活性化合物であるとする。
本発明の新規化合物は、真菌属Nodulisporiumの株を発酵させることにより製造される。このような一培養物は、本出願人の培養物コレクションではMF−5954と称する。MF−5954生成株はAmerican  Type  Culture  Collection（12301  Parklawn  Drive,Rockville,MD.20852）の永久コレクションに寄託されており、受託番号は74245であった。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき1993年９月21日に行われた。
Nodulisporium種  MF−5954の形態及び培養上の特徴は以下の通りである：
（Ｌ−954,967を産生する）MF−5954は、Bills及びPolishookの表面滅菌法（1991）によって、JP337（木本組織由来の内長性真菌）として単離された。以下の説明では、頭文字が大文字の色の名前はRidgway（1912）による。
粗びきトウモロコシ寒天（Difco）では、コロニーは25℃、相対湿度50％、12時間の蛍光灯明暗周期で６日後に直径42mmに達する。コロニーマット増殖は見られない。表面は付着してフェルト状、全体に無色；浸出物及び可溶性顔料はなし；裏側無色；甘く芳しい匂いがする。
粗びきカラスムギ寒天（Difco）では、コロニーは同一条件下で６日後に直径42mmに達する。コロニーマットは付着してまばらに綿状で、コロニー中心は黄色−褐色（マルス黄色、ローシェンナ色）、中間から縁は淡黄色−褐色（淡橙色黄色、アンチモン黄色）、縁は全体に白色；浸出物、匂い及び可溶性顔料はなし；裏側は淡褐色。
ジャガイモ−スクロース寒天（Singleton等、1992）では、コロニーは同一条件下で６日後に直径43mmに達する。コロニーマットは付着してまばらに綿状で、赤味がかった褐色（淡い赤褐色、赤ワイン色）で、コロニー中心は色あせて、縁で透明になる、縁は不明瞭；浸出物、匂い及び可溶性顔料はなし；裏側は赤褐色（濃い赤ワイン色）。
37℃で、粗びきトウモロコシ寒天上、暗所では、コロニーは６日後に直径82mmに達する；コロニーマットは、マットが付着している接種点（白色）を除いて全体に綿状である、縁全体は白色；浸出物及び可溶性顔料はなし；裏側は無色；甘く芳しい匂いがする。
菌糸は透明から淡褐色、隔膜あり、壁は平滑から僅かにざらつき、厚い壁、幅2.5〜3.5μｍ。単線虫（mononematous）分生子柄、直立、150−400×3.0−4.0μｍ、房毛で分岐、透明から淡褐色、隔膜あり、厚い壁、平滑から細かなざらつきからいぼ状、時折オリーブに似た丸い突起部（直径2.5μｍ）あり。分生子発生細胞は全割性、末端16−24×1.5−2.0μｍ、末端は細かなざらつきからいぼ状、円筒形、不規則。分生子は倒卵形から長円−楕円形、先端を切り取った付着点、4.1−5.7×1.6−2.5μｍ、透明、隔膜なし、薄い壁、分生子発生細胞の先端から仮軸で生成、denticalsに先端クラスターとして蓄積。
MF−5954を真菌属Nodulisporium（Hyphomycetes,Deuteromycotina）内に置く。この属の重要な生物分類特徴には、通常分岐している単線虫分生子柄及び分生子のシンポジュラス（sympodulous）生成が含まれる。更には、分生子が多量に生成されるために、分生子を保有する区域は末端又は節間及び小節である（Jong及びRogers、1972）。これらの特徴によって、Nodulisporium属は、Geniculosporium、Xylocladium及びUstilinaのような他の同様の真菌と区別される。これらの属は多数のクロサイワイタケ科（xylariaceous）（子嚢菌門（Ascomycotina））真菌（例えばHypoxylon、Xylaria、Rosellinia等）の無性（アナモルフ）状態である。
大半のNodulisporium単離物とは異なり、MF−5954は37℃でよく増殖するが、培養物中では既知の種と結び付ける他の特徴的な性質は示さない。従って、Nodulisporium種と名付ける。
引用文献
1.Bills,G.F.及びPolishook,J.D.1991.「Microfungi  from  Carpinus  caroliniana」,Can.J.Bot.69（７）:1477−1482。
2.Jong,S.C.及びRogers,J.D.1972.「Illustrations  and  descriptions  of  conidial  states  of  some  Hypoxylon  species」.Wash.State  Agric.Exp.Sta.Tech.Bull.No.71.51p。
3.Ridgway,R.1912.Color  standards  and  color  nomenclature.著者出版,Washington,D.C.43p.＋53pl。
4.Songleton,L.L,Mihail,J.D.及びRush,C.M.（編）.1992.Methods  for  research  on  soilborne  phytopathogenic  fungi,appendix  A,p.247.APS  Press,St.Paul,Minnesota。
本発明の化合物は、Nodulisporium種の生成株を用いて、後述する条件下で適切な固体又は水性普通培地において好気性発酵中に生成される。多数の抗生物質の製造に使用されるような水性及び固体培地は、これらの多環式化合物の製造方法への使用に適している。
このような普通培地は、微生物によって同化され得る炭素及び窒素源、並びに一般に少量の無機塩を含んでいる。更には、この発酵培地は、微生物の増殖及び所望化合物の生成に必要な微量金属を含み得る。これらは通常、栄養源として使用され得る炭素及び窒素の複数源中に十分な濃度で存在するが、勿論所望とあれば培地に別個に添加してもよい。
一般に、糖質、例えばグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、デキストリン、セレロース、粗びきトウモロコシ粉、オートムギ粉等やデンプンのような炭水化物は普通培地で適切な同化性炭素源である。培地で使用される炭素源の正確な量は培地中の他の成分にも多少依存するが、通常は培地中に１〜150g/lの炭水化物量で十分であることが知見されている。これらの炭素源は個々に使用することができるし、このような幾つかの炭素源を同一培地で組み合わせてもよい。
本発明の化合物の生成では、種々の窒素源（例えば酵母水解物、酵母自己融解物、酵母細胞、トマトペースト、粗びきトウモロコシ粉、オートムギ粉、粗びきダイズ粉、カゼイン水解物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、蒸留酒残渣の可溶性物質、粉状綿実しめかす、食肉抽出物等）がNodulisporium種によって容易に同化され得る。種々の窒素源は培地中１〜5g/lの量で単独又は組み合わせて使用することができる。
培地中に取り込むことができる養分無機塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、ホスフェート、スルフェート、クロライド、カーボネート及び同等のイオンを得ることのできる慣用的な塩が含まれる。鉄、亜鉛、マンガン、銅、ホウ素、モリブデン等のような微量金属も含まれる。
以下及び実施例に記載する培地は、使用され得る多様な培地を単に例示するものであって、限定するものではない。
以下は、Nodulisporium種  MF−5954株,ATCC74245の増殖に適した培地例である。
寒天斜面培地の組成
酵母抽出物    4g
麦芽抽出物    10g
グルコース    4g
バクト寒天    20g
蒸留水      1000ml
pH7.0
シード培地及び生成培地の組成シード培地
成分 g/L
酵母抽出物  4.0
麦芽抽出物  8.0
グルコース  4.0
ジュンロン  1.5
蒸留水を用いて培地を調製し、pHを7.0に調製した後に滅菌し、じゃま板のない250ml三角フラスコに50mlずつ小分けした。綿栓を使用した。121℃で20分間滅菌した。
生成培地Ａ
1.固体部分：
4Lのローラーボトルに1250ccのバーミキュライトを添加する。ラテックスで栓をする。60分間オートクレーブ処理、次いで30分間乾燥。
2.液体部分：
成分 g/L
グルコース                                150.0
尿素                                        4.0
NZアミン型Ａ                                4.0
K2HPO4                                      0.5
MgSO4・7H2O                                 0.25
KCl                                         0.25
ZnSO4・7H2O                                 0.9
CaCO3                                      16.5
蒸留水を用いて培地を調製した（pHは調整せず）。これを1L三角フラスコに425mlずつ小分けした。綿栓を使用し、培地を121℃で15分間滅菌した。
生成培地Ｂ
成分 g/L
グリセロール        75.0
グルコース          10.0
アルダミンPH         5.0
（NH4）2SO4          2.0
粗びきダイズ粉       5.0
トマトペースト       5.0
クエン酸ナトリウム   2.0
蒸留水を培地を調整し、pHを7.0に調整した後に滅菌した。培地をじゃま板のない250ml三角フラスコに50mlずつ小分けした。フラスコを綿栓し、121℃で20分間オートクレーブ処理した。
Nudulisporium種を使用する発酵を約20℃〜約40℃の範囲の温度で実施することができる。最適の結果のためには、これらの発酵を約22℃〜約36℃の範囲の温度で実施することが最も好都合である。約22℃〜約27℃の温度が最も好ましい。本発明の化合物を生成するのに適した普通培地のpHは約6.5〜約8.0の範囲であり、好ましい範囲は約6.8〜約7.3である。
小規模発酵は、既知の滅菌技術を使用して適量の普通培地をフラスコ内に導入し、フラスコにNodulisporiumu種の胞子又は栄養細胞増殖物を接種し、フラスコを綿で軽く栓をし、95〜300rpmの回転振盪器にて約25℃の一定室温で約７〜35日間発酵させることにより好都合に実施される。より大規模な作業の場合、攪拌器及び発酵培地通気手段を備えた適切なタンクで発酵を実施することが好ましい。タンク内に普通培地を形成し、滅菌後にNodulisporium種の栄養細胞増殖源を接種する。約22〜27℃の範囲の温度で普通培地を攪拌及び／又は通気しながら、発酵を７〜25日間継続する。通気度は発酵器寸法、攪拌速度等のような幾つかの要因に依存する。一般にはより大規模の発酵物では、約95〜300rpmにて、約50〜500L/分（LPM）の空気で攪拌する。
本発明の化合物の全発酵ブロスからの分離及び化合物の回収は、溶媒抽出により、また種々のクロマトグラフィー技術や溶媒系を用いるクロマトグラフィー分別を適用して実施する。
本発明の化合物は水への溶解度が低いが、有機溶媒には溶ける。この特性を使用して、発酵ブロスから化合物を回収することが好都合であり得る。従って、一つの回収方法では、発酵ブロス全体をほぼ同量の有機溶媒と合わせる。どんな溶媒も使用できるが、水不混和性溶媒（例えば酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム等）を使用することが好ましい。最大の回収を達成するには一般に数回の抽出が望ましい。溶媒は、本発明の化合物及び本発明の化合物の駆虫活性が欠如している他の物質を分離する。溶媒が水不混和性溶媒の場合、層を分離して有機溶媒を減圧下で濃縮する。残留物を、好ましくはシリカゲルを含んでいるクロマトグラフィーカラム上に置く。カラムは所望の生成物及び若干の不純物を保持するが、多くの不純物、特に非極性不純物は通過させる。カラムを穏やかな極性の有機溶媒（例えば塩化メチレン又はクロロホルム）で洗浄して、更に不純物を除去する。次いでこれを塩化メチレン又はクロロホルムと有機溶媒との混合物で洗浄する。有機溶媒としてはアセトン、メタノール及びエタノール等が好ましい。溶媒を蒸発させ、クロマトグラフィー媒質としてはシリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換樹脂、デキストランゲル等を用いて、溶離剤としては種々の溶媒や溶媒の組み合わせを用いてカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー等により残留物を更に精製する。薄層、高圧、液体及び分取層クロマトグラフィーを使用して、本発明の化合物の存在を検出して該化合物を単離することができる。
前述の技術や当業者に公知の他の技術を使用すれば、本発明の化合物を含む精製組成物が得られる。生物活性又は物理化学的特徴について種々のクロマトグラフィー画分を分析することによって所望化合物の存在を調べる。化合物の種々のスペクトル特徴、特に核磁気共鳴、紫外及び赤外スペクトルを詳細に分析して両方の化合物を調べた。
実施例１
1.培養：寒天斜面にMF−5954を導入し、これを使用してFVM（凍結栄養菌糸体）を調整した。寒天斜面の一部をシード培地Ａ（50ml,じゃま板なし250mlフラスコ）に無菌移動させた。これを２インチ行程の回転振盪器にて、220rpm、25℃、相対湿度85％で３日間インキュベートしてバイオマスを得た。バイオマスの一部をグリセロールを含む滅菌バイアルに移し、（FVMとして）凍結した。これらを−75℃で10〜15％のグリセロール最終濃度に維持した。1.0mlの解凍した一次FVMを前述のようにシード培地内に移して25℃で２〜３日間、220rpmでインキュベートし、凍結させることにより一次FVMから二次FVMを調整した。
2.シード：凍結バイアル（FVM）を室温に解凍し、これを使用して50mlのシード培地Ａに対して0.5〜1.0mlのMF−5954シード培養物を接種した。これらを回転振盪器（220rpm）上、25℃、相対湿度85％で２〜３日間増殖させた。時には第２期のシードを使用した。これを生長させるためには、前述の第１期のシード1mlを50mlの新しいシード培地Ａに希釈し、25℃、220rpm、相対湿度85％で24〜30時間インキュベートした。
3.生成：生成培地Ａの組成は固体基質発酵培地である。シードの一部（18〜24ml）を425mlの生成培地Ａ内に置いた。このフラスコを強く攪拌させてバイオマスを分散させた。粒子の大きいバーミキュライトを1250cc含む4Lローラー培養容器内に内容物を注入して小分けした。ローラーボトルの内容物を振盪／混合して均質に接種してならした。ローラーボトルをWheatonローラー装置上で約4rpmにて、22〜25℃、相対湿度50〜75％で19〜28日間水平方向に回転させてインキュベートし、発酵培地中に二次代謝物を得た。
本発明の化合物の生成について幾つかの液体培地を調べ、その結果発酵規模をより簡単に大きな容器に拡大することができた。ごく少数の被試験液体培地で生成が検出された。液体生成培地Ｂを使用した。シード培養物を前述のように接種し、回転振盪器上、220rpm、25℃、相対湿度85％で３日間増殖させた。シードの一部（1ml）を使用して、50ml（２％接種物）を含む各生成フラスコに接種した。回転振盪器（220rpm）上、25℃、相対湿度50％で21〜28日間フラスコをインキュベートした。
２つの生成方法は製造する生成物の量が殆ど同様であった。しかしながら、第２の方法（液体生成培地Ｂ）は、攪拌容器まで規模を拡大できるため、多量に製造できるという利点を有する。固体生成法（培地Ａのローラーボトル）では規模拡大は困難になる。
更に、より大きな容器（22Lタンク）を使用してこの培養物から本発明の化合物を生成した。
実施例２
生成及び予備特性分析
培地上で21日間増殖させた培養物を12個の2Lローラーボトルを、100rpmの回転機にてそれぞれ４時間、650mlのメチレンエチルケトン（MEK）で抽出した。抽出物を濾過し、合わせ、真空下で蒸発乾固して重量を8gにした。この材料を20mlの塩化メチレンに溶解し、95:5の塩化メチレン：メタノールで、800mlのシリカゲル（E.Merck）カラムに装入した。溶離に使用する以下の溶媒の各々のカラム容量比:95:5、9:1、3:1、1:1塩化メチレン：メタノール及びメタノール。40mlずつに画分を収集した。画分51−55に活性の大部分があることを、バイオアッセイ（Lucilia）によって測定した。当該画分を合わせ、真空下で蒸発乾固して、200mgの重量を得た。この試料を8.5mlのメタノールに溶解し、メタノール中のSephadex  LH20カラム（Pharmacia）に装入し、6.5ml/分の流量で13mlずつの画分を収集した。画分41−50に活性があったので、これらをプールし、乾燥して、90mgの重量を得た。この材料を0.5mlのメタノールに溶解し、Eka  Nobel  Ｃ−18  HPLCカラム（9.6mm×250mm）に室温で２回注入し、270nm、4ml/分の流量で監視した。使用した溶媒系は70:30のアセトニトリル：水で、0.1％TFAを含み、１回目の単離では画分26−27で、２回目の単離では画分27−28に活性材料が単離された。分析HPLC:Eka−Nobelカラム（4.6×250mm  Ｃ−18）、流量1ml/分、40℃、及びTLCにより数種の溶媒系で化合物純度を調べた。プールした画分を真空濃縮し、塩化メチレン中に抽出し、乾燥すると、4.8mgの純粋化合物（化合物１）が得られた。
前述のシリカカラムからのその後の画分も生物活性を有していた。画分を合わせ、真空乾燥させて、1.4gの重量を得た。固体をメタノールで数回洗浄した。この固体は化合物１と同様の紫外スペクトルを示す成分を含んでいた。この分光特性を使用して、更なる精製ステップを監視し、純粋化合物で最後に生物活性を調べた。即ち、500重量mg含んでいるメタノール溶液をメタノール中、250ml  Sephadex  LH−20カラムで分別した。これらの合わせた画分には大半の重量が含まれていた。この材料を乾燥し、3mlメタノールに再度溶解し、8ml/分の流量の80−20のアセトニトリル−水（0.1％TFA）溶媒系を用いて分取Zorbax  Ｃ−18カラム（22.5mm×250mm）に1mlの材料を室温で注入し、270nmで紫外線検出し、8mlずつの画分を収集した。３つの分別の各々から得た画分29を合わせて化合物２を得た。画分21−22は化合物３を含んでいた。両方の溶液を濃縮し、酢酸エチルで抽出し、水洗し、乾燥した。化合物２の重量は1.8mgで、化合物３は重量は1.0mgであった。両方の化合物を化合物１と同様にNMR及びMS解析により特性分析した。
JEOL  HX110質量分析計で高速原子衝撃（FAB）質量スペクトルを記録した。ジチオトレイトール：ジチオエリトリトール（20/80）のマトリックスを用いてFABスペクトルを得た。ultramark  1960（Fomblin）を基準化合物として用いて高分解能で正確な質量測定を実施した。重要な高分子解能データを以下に示す。
化合物１
実測値    計算値         式          帰属  
680.3891  680.3951   C43H53NO6＋Ｈ   Ｍ＋Ｈ
662.3790  662.3845   C43H51NO5＋Ｈ  680−H2O
化合物２
実測値    計算値         式          帰属  
695.3806  695.3822     C43H53NO7       M+
13C  NMRデータ
Varian  Unity  400及び500NMR分光計のそれぞれで、CD2Cl2中、100及び125MHzで25℃にて13C  NMRスペクトルを記録した。化学シフトは、53.8ppmの溶媒ピークを内部標準として用いて0ppmのテトラメチルシラン（TMS）に対するppmで示す。
化合物１（125MHz）:198.0,172.6,162.0,154.7,154.6,140.8,140.0,138.4,135.9,134.0,125.9,125.1,122.7,122.0,121.8,117.5＊,116.7,113.1,76.8,76.4＊,75.3,73.9,72.6,58.2,56.1,48.0,47.8,45.2,39.1,32.3,32.0,30.1,29.9,27.8,26.0、25.7,24.7,23.5,19.6,18.1＊,15.1,12.6,11.2ppm。
炭素数43はHR  FAB−MSによって誘導される分子式C43H53NO6と一致する。
化合物２（100MHz）:198.1,172.0,162.0,154.8,147.1,140.1,138.3,135.9,134.0,126.8,122.6,122.0,121.8,117.8＊,116.7,113.2,106.9,76.6＊,75.3,73.9,73.3,72.7,58.2,55.5,49.6,48.1,44.5,41.3,39.5,32.0,30.4,30.1,30.0,29.9,27.8,26.0,24.8,23.4,18.0＊,17.7,16.7,15.3,12.5ppm。
炭素数43はHR  FAB−MSによって誘導される分子式C43H53NO7と一致する。
＊を付けた炭素は幅広い共鳴として観察された。
1H  NMRデータ
300、400又は500MHz分光計で1H  NMRスペクトルを記録した。化学シフトは溶媒ピークを内部標準として用いて0ppmのTMSに対するppmで示す。
化合物１（図１参照）（500MHz）：δ0.96（3H,s）,1.07（3H,s）,1.12（3H,s）,1.14（3H,s）,1.31（3H,s）,1.33（3H,s）,1.42（3H,s），〜1.46（3H,br.s）,1.96（3H,d,J＝1Hz）,2.32（1H,dd,J＝11,14Hz）,2.75（1H,dd,J＝6.5,14Hz）,2.81（1H,dd,J＝3,6.0Hz）,2.85（1H,m）,3.43（1H,m）,4.96（1H,br.s）,5.09（1H,s）,5.20（1H,br.s）,5.22（1H,d,J＝6.0Hz）,5.95（1H,d,J＝15Hz）,6.06（1H,d,J＝3Hz）,6.40（1H,dd,J＝11,15Hz）,7.33（1H,br.d,J〜11Hz）,7.71（1H,s）。
化合物２（図２参照）（400MHz）：δ0.95（3H,s）,1.07（3H,s）,1.122（3H,s）,1.126（3H,s）,1.31（3H,s）,1.34（3H,s）,1.42（6H,s）,1.73（1H,dd,J＝9.5,12.5Hz）,1.86（3H,d,J＝1.5Hz）,2.34（1H,br.dd,J＝7.5,12.5Hz）,2.36（1H,dd,J＝11,14Hz）,2.78（1H,dd,J＝6.5,14Hz）,2.81（1H,dd,J＝3,6.5Hz）,2.93（1H,m）,4.88（H,br.q.J〜8Hz）,5.00（1H,br.s）,5.10（1H,s）,5.20（1H,dq,J〜1Hz）,5.21（1H,d,J＝6.5Hz）,6.06（1H,d,J＝3Hz）,6.93（1H,dq,J＝8,1.5Hz）,7.72（1H,s）。
化合物３（図３参照）（300MHz）：δ0.91（3H,s）,1.05（3H,s）,1.09（3H,s）,1.11（3H,d,J〜7.5Hz）,1.13（3H,s）,1.33（3H,s）,1.34（3H,s）,1.47（3H,s）,2.30（1H,dd,J＝10.5,13.5Hz）,2.72（1H,dd,J＝6.5,13.5Hz）,2.87（1H,dd,J＝3,6.0Hz）,4.00（1H,dd,J＝2.5,10.5Hz）,4.58（1H,m）,5.02（1H,br.s）,5.07（1H,s）,5.17（1H,br.s）,5.23（1H,d,J＝6.0Hz）,6.02（1H,d,J＝3Hz）,7.67（1H,s）。
略字:s＝シングレット、ｄ＝ダブルレット、ｑ＝クアルテット、br＝幅広い、ｍ＝マルチブレット、Ｊ＝1H−1Hカップリング定数（Hz）（±0.5Hz、〜＝約）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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