(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの皮膚の光老化を抑制するための組成物であって、UVA遮断剤と、UVB遮断剤と、レチノイドとの組み合わせを、局所的に許容可能な担体中に含み、太陽光への暴露の少なくとも７時間以上前に皮膚に適用するための組成物。
【請求項２】
ほぼ毎日皮膚に塗布するための、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記レチノイドがレチノイン酸またはレチノールである、請求項１または２の組成物。
【請求項４】
グルタチオンと、Ｎ−アセチルシステインおよびその誘導体と、リポ酸と、これらの混合物と、からなる群から選択される酸化防止剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項の組成物。
【請求項５】
UVA遮断剤が、４−ｔ−ブチル−4'−メトキシジベンゾイルメタンまたはその誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項６】
UVB遮断剤が、オキシベンゾンまたはメトキシシンナメートである、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項７】
ローション、クリーム、軟膏、水ベースの液体または油ベースの液体として組成されている、請求項１〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項８】
製剤がスプレー可能なものである、請求項１〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項９】
組成物が、テトラサイクリンおよびその誘導体と、皮膚科学的に許容可能なトリアゾールおよびその誘導体と、レチノイン酸のシトクロムP450媒介代謝を抑制する化合物と、これらの相溶混合物と、からなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項の組成物。
【請求項１０】
UVA遮断剤と、UVB遮断剤と、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）との組み合わせを局所的に許容可能な担体中に含み、UV暴露の少なくとも７時間以上前に皮膚に塗布することにより、ヒトの皮膚においてUV誘発MMP形成の誘発を抑制することによってヒトの皮膚の光老化を抑制するための組成物。
【請求項１１】
UVへの暴露の少なくとも７時間ないし16時間以上前に皮膚に適用するための、請求項10の組成物。
【請求項１２】
UVA遮断剤が、４−ｔ−ブチル−4'−メトキシジベンゾイルメタンまたはその誘導体である、請求項10または11の組成物。
【請求項１３】
UVB遮断剤が、オキシベンゾンまたはメトキシシンナメートである、請求項10〜12のいずれか１項の組成物。
【請求項１４】
組成物が、テトラサイクリンおよびその誘導体と、皮膚科学的に許容可能なトリアゾールおよびその誘導体と、レチノイン酸のシトクロムP450媒介代謝を抑制する化合物と、これらの相溶混合物と、からなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む、請求項10〜13のいずれか１項の組成物。
【請求項１５】
UVA遮断剤が、UVA1遮断剤である、請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１６】
UVA遮断剤が、UVA1遮断剤である、請求項10〜14のいずれか１項の組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はヒトの皮膚の光防護に関する。特に、本発明は、局所塗布用組成物と、かかる組成物を使用して皮膚の光老化（特に、日々遭遇し得る間接光および／または直接光への曝露によって誘発される光老化）を抑制するための方法に関する。さらに、本発明は、UV誘発紅斑（皮膚の赤味）を軽減するための新規な方法および組成物を提供する。
背景技術
光老化とは、太陽光線に繰り返し曝露されることによって生じるヒトの皮膚の外観および／または機能の変化、特にシワやその他の皮膚の外観の変化を説明するのに用いられている用語である。
ヒトをはじめとする様々な動物に影響を及ぼすとともにこれらの動物が生活していくのを可能にする、地表に達する太陽放射は、紫外線（UV）（λ＜400nm）、可視光線（400nm＜λ＜700nm）および赤外線（IR）（λ＞700nm）で構成されている。UV放射は通常、UVA（320〜400nm）、UVB（290〜320nm）、UVC（＜290nm）に分けられる。UVC放射は成層圏のオゾンによって遮断され、地表には届かない。一般に、太陽光線の紫外線（UV）成分、特にUVBが光老化の主な原因物質であると考えられている。
どの程度のUV曝露で光老化が起こるのかは現時点では明らかになっていないが、ヒトの皮膚の紅斑（一般にサンバーンとして見られる赤味）を発生させるのに必要な量は周知であり、特定のUV源からの「最小紅斑量（MED）」として経験的に定量化されている。紅斑誘発性が最も高いのはUVB波長290〜300nmである。UV波長が約300nmよりも長くなるとUV放射による紅斑発生率は急激に落ちる。波長320nmおよび340で皮膚の赤味が生じる可能性はそれぞれ、波長約298nmの場合の100分の１および1000分の１である。それにもかかわらず、紅斑や皮膚の変色（tanning）を引き起こすレベルで太陽光線に繰り返し曝露されることと光老化との間には、関連性があるのが普通である。UVBによる紅斑は被爆強度ではなく全被爆量の関数になると考えられている。Physiology,Biochemistry,and Molecular Biology of the Skin（皮膚の生理学、生化学、分子生物学）、第２版、L.A.Goldsmith編（New York:オックスフォード大学出版、1991）によれば、UVAはメラニン形成誘発性かつ紅斑誘発性であり、UVAに曝露されると、ヒトの皮膚で32kDaのストレスタンパク質の合成が誘発されるだけでなく、UVB曝露後には見られなかった「即時」紅斑が発生する。
ヒトの皮膚の光老化は、臨床的には肌荒れ、シワ、まだらな色素沈着、黄ばみ、たるみ、さらには前ガン性腫瘍、最終的には悪性腫瘍となる症状によって特定される。光老化は一般に、顔、耳、頭皮のはげた部分、首、前腕、手など日常的に太陽光線に曝露される皮膚に発生する。
皮膚の太陽光線に曝露される部分の光老化の防止には、一般にサンスクリーン剤が用いられる。サンスクリーン剤は、UV光を吸収、反射および／または散乱させる成分を含有する局所製剤である。サンスクリーン剤の中には不透明な粒子状物質を主成分とするものがあり、一例としては、酸化亜鉛、酸化チタン、クレー、塩化第二鉄が挙げられる。このような製剤は視覚的に識別可能でかつ閉塞性（毛穴などを塞ぐ性質）であるため、こうした不透明組成は化粧用として許容できないものであるとするヒトが多い。皮膚の上で透明または半透明である、ｐ−アミノ安息香酸（PABA）、オキシベンゾン、ジオキシベンゾン、エチルヘキシルメトキシシンナメート、オクトクリレン（octocrylene）、オクチルメトキシシンナメート、ブチルメトキシジベンゾイルメタンなどの化学物質を含有するサンスクリーン剤もある。このようなタイプのサンスクリーン剤は不透明なものより化粧用として許容されやすいが、それでも耐用期間は比較的短く、洗浄や汗によって落ちやすい。
上述したように、一般に認められている皮膚に対する光損傷の病因には、紅斑（サンバーンまたは赤味すなわち、文字通りの意味で皮膚の紅潮）を引き起こすのに十分な太陽光線への曝露が関与しており、十分なUVB放射が紅斑を引き起こすことが知られている。この見解によれば、光老化を抑制するための光発明による組成物および方法にはUVBを遮断または吸収する化合物を使用することが含まれ、かかる組成物を使用する必要があるのは太陽光線への曝露によって紅斑が生じる尤度が十分にある場合のみであると言える。さらに最近のサンスクリーン剤組成物には、UVA放射およびUVB放射の両方を遮断する化合物を組み合わせたものが含まれている。
太陽のUV放射が皮膚に活性酸素（ROS）を誘発するのではないかという意見が出されている。Rieger,M.M.著、Cosmetics and Toiletries（化粧品）（1993）108:43〜56では、周知の酸化防止剤を皮膚に局所塗布してROSの存在量を低下させることについて検討されている。
太陽によって損傷を受けた皮膚の外観を改善するための治療時には、レチノイド類が用いられている。米国特許第4,877,805号には、光老化した皮膚の治療方法について記載されている。この特許では、老化の作用が見られ始めるまではレチノイドを塗布して光損傷を治療することにはほとんど意味がないとされている。いくつかの研究が行われ、全光損傷を受けた皮膚の外観がトランス型レチノイン酸で改善されていた。G.D.Weinstein  et  al.、「Topical  Trentinoin  for  Treatment  of  Photodamaged  Skin（光損傷皮膚の治療用の局所トレチノイン）」、Arch.Dermatol.、127:659〜665（1991年５月）、J.S.Weiss  et  al.、「Topical  Tretinoin  Improves  Photoaged  Skin（局所トレチノインによる光老化した皮膚の改善）」J.Amer.Med.Assn.、259（４）:527〜532（1988年１月22/29）。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、結合組織、特にコラーゲンの生理学的破壊および病理学的破壊に主な役割を果たす一種の酵素である。この分野では、様々なタイプのコラーゲンおよびコラゲナーゼ（複数のタイプのMMP）が周知であり、詳しい説明については本願出願人による係属中の米国特許出願第08/588,771号（1996年１月19日出願；かかる出願における開示内容全体をあらゆる目的で本明細書に引用したものとする）に見出すことができる。MMP発現に影響する、MMP阻害剤（すなわち、プロテイナーゼの直接阻害剤）および分子経路阻害剤（すなわち、AP−１阻害剤）が他の分野で周知であり、同様に上述した出願第588,771号に記載されている。
要するに、最新の技術では、光損傷は主にUVB放射によって生じるものであって、光損傷の防止には現在入手可能なサンスクリーン剤で十分であるとみなされている。「Ceilley博士［current  President  fothe  American  Academy  of  Dermatology（米国皮膚学会現会長）］は、太陽を避けてサンスクリーン剤を使用することで、博士が実際に治療した多くの皮膚ガンだけでなく、博士の患者が気に掛けている早期のシワも防止できたかもしれないと考えている」Skin  SAVVY、Amer.Acad.Dermat.、USA  Today別刷、1997年５月。
発明の開示
本発明は、好ましい一実施の形態において、皮膚の結合組織を分解し、光老化の原因になる可能性のあるMMPが紅斑量未満（suberythemal）のUV放射によって誘発されるという本発明者らの発見に基づくものである。すなわち、本発明者らは、UV放射への曝露は、紅斑を引き起こすには不十分であるが、コラーゲンおよびエラスチンなどの真皮の結合組織を分解するMMPを誘発し、これが光損傷の原因になると考えられることを発見した。すなわち、（UVAおよび／またはUVBでの）UV曝露は紅斑を引き起こすには不十分であるが、MMPを通して光損傷を引き起こすには十分なのである。このこと自体、従来技術における「光損傷」という用語を、紅斑を必要としないものとして定義しなおすべきである。したがって、UVAおよび／またはUVB放射の組み合わせによって、皮膚が大幅に損傷を受ける可能性がある。本発明者らによる発明は、広義には、UVAおよび／またはUVB放射が原因となる光損傷を防止すること、特に光損傷の臨床徴候が認められる前にこれを防止することを包含するものである。
本発明者らの好ましい実施の形態では、レチノイドを使用して光損傷を防止する。本発明のもう１つの実施の形態では、本発明者らは、MMPの生成を抑制および／または活性を阻害することによって光損傷を防止する上で他の様々な化合物も有用であることを見出している。これらの化合物の中には、「酸化防止剤」と呼ばれ紅斑を防止できるものもあるが、同時にUV曝露されたヒトの皮膚におけるMMP濃度を低下させることができる。これとは別に、本発明者らがこのような化合物を試験した結果、紅斑を防止することとMMPのUV媒介増大を抑制することとの間には、何ら相関性はないことが分かっている。
本発明のさらに別の実施の形態では、本発明者らは、UV曝露が原因で発生したヒトの皮膚表面でのMMP濃度の増加をレチノイドによって抑制できることを見出した。従来技術では、レチノイド類は光損傷皮膚の治療および修復に有用であると教示されているが、本発明者らは、MMPレベルのUV誘発上昇をレチノイドによって妨害できるため、レチノイド類を予防的に使用して光損傷の発生を防止できることを発見した。
このため、要するに、本発明者らの発明の一実施の形態は、局所的に許容可能な担体中に、UVA遮断剤とUVB遮断剤とMMP阻害剤とを含む組成物であって、特に日々使用するためのかかる組成物を含む。
また、通常はむき出しの皮膚（顔、頭、手、額など）に、UVA遮断剤とUVB遮断剤とMMP阻害剤とを含む組成物を局所塗布することによって、間接的なUV曝露が紅斑を発生させない場合に間接的な光損傷を防止するための方法すなわち光損傷の予防も含まれる。
本発明者らの発明のさらに他の実施の形態は、紅斑阻害剤およびMMP阻害剤を含む組成物、特に光損傷に対して予防的に使用するためのかかる組成物である。
もう１つの実施の形態では、本発明者らの発明は、UVA遮断剤およびUVB遮断剤のコーティングが施されているかまたはこれらが混入されている窓構造体に関するものである。本明細書において、遮断剤とは広義に、特定の光線を吸収、反射または無害波長に変調することによって、放射の皮膚に対する直接的な影響をなくす化合物である。
本発明のさらに他の実施の形態では、レチノイドの存在するこれらの組成物において、その組成物は、皮膚におけるレチノイドの崩壊を抑制する化合物をさらに含むと好ましい。このような化合物は、レチノイド類のシトクロムP450媒介崩壊を抑制するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明者らの発見に基づいて、UV曝露が原因の皮膚損傷の一般的な経路であると思われることを示している。
図２は、紅斑量未満のUVB/UVA放射が、コラゲナーゼ、ストロメライシン−１、92kDaのゼラチナーゼ（いずれもMMP）を誘発する事実を示している。棒グラフは、これらのタンパク質各々についてのラジオブロット試験結果の定量的な表現である。
図３は、ヒトの皮膚が紅斑量未満のUVB/UVAに規則的かつ繰り返し曝露されると、92kDaのゼラチナーゼおよびコラゲナーゼのMMPレベルが一貫して高い値になるという事実を示している。
図４は、フィルタなしと５枚の異なるフィルタを通して測定して図５に示す結果を得た場合の照明装置によって放出されるスペクトルを示している。
図５は、放出されるエネルギ量が一定である場合に、ヒトの皮膚におけるコラゲナーゼの誘発を（図４に示す様々なフィルタを通した）UV波長の関数として示したものである。
図６は、本明細書に記載の実験（図５に示す結果を得た実験を除く）に用いた照明装置によって放出されるスペクトルを示している。
図７は、局所塗布用の市販のサンスクリーン剤が、ヒトの皮膚に2MEDのUVB/UVAを曝露した後に紅斑を誘発したという結果を示している。
図8Aおよび図8Bは、UVA遮断剤のUV吸光度と、ヒトのUV曝露皮膚をこのような遮断剤によって前処理した場合の紅斑に対する影響を示したものである。
図９は、ヒトの皮膚において、2MEDの放射への曝露による紅斑を防止することに対して、メラトニン、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）、２−フリルジオキシム（FDO）がおよぼす影響と、1MEDの放射への曝露による紅斑を防止することに対して、アセチルサリチル酸（ASA）およびビタミンＣがおよぼす影響を示している。
図10は、ヒトの皮膚において、2MEDの放射への曝露によるコラゲナーゼ活性の上昇を防止することに対して、メラトニン、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）、２−フリルジオキシム（FDO）がおよぼす影響と、1MEDの放射への曝露によるコラゲナーゼ活性の上昇を防止することに対して、アセチルサリチル酸（ASA）およびビタミンＣがおよぼす影響を示している。
図11Aおよび図11Bは、NACによる皮膚の前処理時間が、NACのUV誘発コラゲナーゼおよびゼラチナーゼを阻害する効力におよぼす影響を示している。
図12は、ヒトの皮膚でUV誘発された92kDaのゼラチナーゼを阻害する上での特定のUVA遮断剤の有効性を示している。
図13Aは、レチノイドでの前処理が、2MEDの放射への曝露時に、ヒトの皮膚において、コラゲナーゼ、92kDaのゼラチナーゼ、ストロメライシン−１のUV誘発上昇の阻害におよぼす影響を示している。
図13Bは、２種類のレチノイドが、MED未満のUVで誘発されるＩ型コラゲナーゼ活性の増大におよぼす影響を示している。
図14A乃至図14Dは、UV放射への曝露後のヒトの皮膚における様々なMMP（それぞれ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、92kDaのゼラチナーゼ、72kDaのゼラチナーゼ）の上昇の時間変化を示している。
図15Aおよび図15Bは、前処理時間が、UV誘発されたコラゲナーゼおよび92kDaのゼラチナーゼ、ｃ−JUNタンパク質を阻害するレチノイドの有効性におよぼす影響を示している。
好ましい実施の形態の詳細な説明
本発明は、皮膚、特にヒトの皮膚の光老化を抑制すること（すなわち、低減または防止）に関する。本発明による処置は、一般に毎日の生活の中で太陽光線に常時曝露される、頭、首、手、腕などの皮膚に施すと好ましい。紅斑の原因となる線量未満のUVに繰り返し曝露されると光老化が発生する可能性があるため、本発明はこのような低線量曝露を受けやすい皮膚に対して施すべきものである。
皮膚の白い人々の大半は、皮膚1cm2あたり30〜50mJの範囲のUVB線量で紅斑を生じる。したがって、本発明では、皮膚の光老化部分がこの範囲未満の線量（一般に約5mJ/cm2を上回る値であるが、これは太陽光線に数分曝露された状態に相当する）にさらされるのを防止する。太陽が本質的に頭上にあるときに地表に達する太陽光線からは、以下の量すなわちUVB0.5％、UVA6.5％、可視光線38.9％、IR54.0％が放射される。これらのタイプの放射では、以下のようなエネルギ束が得られる。
UVBで2.11mJ/cm2・ｓ（21.1W/m2）、UVAで8.57mJ/cm2・ｓ（85.7W/m2）、可視光線で53.2mJ/cm2・ｓ（532W/m2）、IRで72.2mJ/cm2・ｓ（722W/m2）。
特定の理論に拘束されることは望ましくはないが、皮膚の変化を引き起こすいくつかのUV誘発性化学経路の概要を示す図１を参照した以下の実施例から一層よく明らかになろう。図示のように、UV放射はMAPキナーゼカスケードを誘発し、ここから発生する２つの経路が示されている。一方の経路は、紅斑を引き起こすインターロイキン類を誘発し、他方の経路は、結合組織分解を引き起こすMMPを誘発する。従来技術ではこれらの結果をUVB放射によるものであるとみなしていたが、本発明者らは、一連の実験において、UV曝露皮膚に視覚的な痕跡がなかったとしても光損傷ではUVAが決定的な原因物質であることをここに示す。しかしながら、本願に関しては、UVAおよびUVBの両方が、場合によっては個別にであっても、太陽放射への曝露後のヒトの皮膚におけるUVを媒介としてMMPの誘発に関与していることを理解されたい。
上記の従来技術では、一般に最小紅斑量すなわちMEDを基準にしてUV放射への曝露量を測定している。最小紅斑量は、皮膚の赤味を引き起こすのに十分なUV放射への曝露量として定義される。1MEDは通常、太陽放射約30mJ/cm2・ｓに相当する。従来技術の見解として、赤味（サイバーン、紅斑）を引き起こすのに十分な自然の太陽光線に曝露させると光老化がはじまるというものがある。（自然の太陽光線の場合よりもUVA/UVB比を小さくして）UVAおよびUVB放射の両方を放出する後述のUV源を使用して、本発明者らは、皮膚の赤味が誘発されると、MMPも誘発されることを確認した。このため、サンスクリーン剤は、赤味を防止して光老化を防止するものであるため、これを使用すべきであるというのが現時点の最新の見解である。
本発明者らは、自らが現在の見解のうちいくつかと矛盾し、様々なUV曝露量および曝露前に塗布する様々な化合物を使用することがヒトの皮膚およぼす影響を実験によって見出したと考えている。本発明者らの予期しなかった結果の１つは、皮膚の赤味を引き起こすには至らないUV曝露量でも、ヒトの皮膚におけるMMP活性（よって、光老化）が増大するということである。したがって、従来のサンスクリーン剤は赤味を防止することはできるが、UV曝露後に光老化部分のMMP活性増大を防止することはできない。本発明者らは赤味を防止する化合物を確認した。これは、紅斑による痛みおよび不快感を防止するためだけでなく、（光損傷を防ぐからと勧められた組成物を使用した後に紅斑が生じると、その組成物の光老化防止成分には効果がないと考えてしまう患者がいてもおかしくないため）場合によっては光老化を抑制する組成物中に紅斑阻害剤を含ませることで薬剤摂取率を維持する上でも、重要である。
また、他の予期しない発見は、UVA放射を遮断することで、ヒトのUV曝露した皮膚におけるMMP性の増大およびcJUNタンパク質濃度の上昇が予防的に抑制されるため、光老化の予防になるということである。紅斑量未満UV曝露が光老化を引き起こすという本発明者らの発見と合わせて、本発明者らの発明の一特徴は、光老化の予防薬として毎日使用するUVA遮断剤を想定したものである。UVBはMMPも誘発するため、さらに好ましい組成物にはUVA遮断剤とUVB遮断剤の両方を含有する。
さらに別の予期しない発見として、レチノイドによる皮膚の前処理によって、UV曝露後に通常発生するMMP活性の増大が緩和されるということがある。したがって、本発明者らの発明は、光老化に対する予防薬として、レチノイドを含有しUV曝露前に局所塗布するための組成物を想定している。
本発明者らによる研究のもう１つの予期しない発見として、特定の化合物（中には酸化防止剤としての特性を有すると報告されているものもある）は良好な紅斑防止サンスクリーン作用を呈するにもかかわらず、UV曝露後にMMP活性増大を抑制するようには見えないということがある。
以下、図面を参照して本発明を説明する。図示の結果を得た実験の詳細、本発明者らに協力してくれた志願被験者を照射するのに用いた装置、さらに免疫組織学的方法について説明する。志願被験者の被験皮膚領域は、生涯の大半において太陽に曝露されることなく一般に隠れているかまたは物理的に保護されている領域（例えば臀部および尻の皮膚）である。本発明者らによる研究の結果から明らかなように、生体外（in  vitro）での実験のみを頼りにして、化合物がMMP阻害剤であるか否か、その化合物が生体内（in  vivo）での阻害剤として使用するのにも適しているか否かを判断することはできない。したがって、本明細書に開示するような方法によって、このような化合物を試験し、かかる化合物で所望の治療効果が得られるか否かを判断しなければならない。
図２は、紅斑量未満のUV曝露が、コラゲナーゼ、ストロメライシン−１、92kDaのゼラチナーゼのMMPを誘発する事実を示している。志願被験者の皮膚の一部を、1MEDを基準として以下の量すなわち、0.01、0.05、0.1、0.5、１および２の量のUV放射に曝露した。生検およびその後の放射定量法（ラジオアッセイ）から、（棒グラフで定量的に表現した、図面のラジオブロットから明らかなように）MMPの誘発にはMEDの半分で十分であり、MMPの産生量を基線（ベースライン）レベルを大きく上回る高さにするには0.1MEDですら十分であること、さらにはコラゲナーゼを基線レベルを超える高さにするには0.01MEDで十分であることが分かる。このように、図２は、紅斑量（MED）未満のUV放射によってMMPの産生が引き起こされることを示している。それにもかかわらず、特に低線量のUV放射への曝露後に、ヒトの皮膚がMMPレベルの高くない基線状態に戻ると仮定できる場合もある。
図３は、紅斑量未満のUV放射に繰り返し曝露されると、MMPが生成され、これらのレベルが長時間にわたって高い値にとどまるというさらに別の事実を示している。２日ごとにMEDの半量の放射線を人々に照射した場合、MMPレベルは高いまま維持された。したがって、MED未満のUV放射に繰り返し曝露されることで、コラーゲンは連続的に破壊される。図２に示すように極めて少量のUV線量でMMPが誘発されるという知識と図３とを組み合わせると、ヒトの皮膚では、毎日MED未満であるが慢性的にUV放射に曝露されるとMMPレベルが高くなり、皮膚がMED未満のUV曝露による影響から完全に元に戻ることはないことが示唆される。
図４は、フィルタなしの場合と、従来の様々なフィルタ（WG320  １、F1  3mm、UV34  2.5、SF12  ２、WG360  2.5）を用いた場合の照明装置から放出されるスペクトルを示している。様々なフィルタを介して装置から放出されるスペクトルを異なる線種で示してある。WG320  １フィルタは、UVB、UVA2、UVA1のいずれでも太陽に近いとみなすことができ、一方WG360  2.5フィルタはUVA1放射しか透過しない。この装置には、UVBランプ（オハイオ州レークウッドのUltraviolet  Resources  Inc.から入手可能なPhilipsの型番TL40W/12/RS）およびUVAランプ（オハイオ州クリーブランドのＱ−Panel  Lab  Productsから入手可能なＱ−Panel  UVA−351）の両方が含まれている。
本発明者らは、被験者に一定量のエネルギを照射した場合のコラゲナーゼの誘発を波長の関数として得る試験を行った。図４に示す曲線について考えると、放出波長の関数としての各曲線下の面積の積分比率によって、志願被験者が特定のフィルタからの光線に曝露された相対的な持続時間を求めることができる。このため、たとえ同量のエネルギを被験者に照射したとしても、WG360  2.5フィルタからの光線に曝露される持続時間の方が、WG320  １フィルタからの光線に曝露される持続時間よりも長かった。図５に示す結果から、UVBとUVAとの組み合わせによってコラゲナーゼが誘発され（フィルタWG320  １）、UVA1のみ（フィルタWG360  2.5）でもコラゲナーゼの誘発には十分であろうことが示唆される。太陽が地平線上にある午前中の早い時間と夕方の遅い時間には、UVA:UVBの比は実際に大きくなるため、皮膚は日中よりも多くのUVA放射に曝露されることになる。したがって、UVA1でもMMPを高めるためには十分であるという図５に示す結果は、太陽に曝露されても紅斑が発生しない午前中の早い時間と夕方の遅い時間に発生するものであり、紅斑が認められない場合ですら光損傷はこのような時間帯にも起こるというということを示している。また、平均的な人間が、サンバーン発生の余地はありそうにないため、外で日光にあたっても「安全な」時間帯だと考えていることとは逆で、それでも太陽のUV放射によってMMPは依然として誘発されるため安全ではないのである。
紅斑応答は、少なくとも有意な痛みおよび不快感が発生するため臨床的にみて重要である。医師の処方箋なしで購入可能な様々なサンスクリーン剤も、図７に示すように皮膚を紅斑から皮膚を保護する。これらのサンスクリーン剤には一般にUVB遮断剤しか含まれていないのにもかかわらず、現状ではその多くに「UVA」遮断剤という表示がある。市販のUVA遮断剤であるPARSOL  1789の遮断スペクトルを図8Aに示す。右側の縦軸は遮断剤の吸光度特性を示し、左側の縦軸は一般に約300nmよりも長い波長で紅斑を防止する上での遮断剤の相対的な有効性を示している。このUVA遮断剤は、本発明者らの標準的な光源からの2MED  の光線に対していくらかは皮膚を保護する（図8B）。
紅斑の防止には他の様々な化合物も使用されている。本発明者らは、UV照射および続く生検の約７時間前に多数の異なる化合物を皮膚に塗布し、UVによって誘発される皮膚の赤味を防止する上での有効性を試験した。メラトニンは約2MEDを超える照射量での紅斑を防止するように思われる。ビタミンＥはいくらか劣ったが、それでも紅斑の防止には極めて効果的であった。アセチルサリチル酸（ASA）およびビタミンＣも、曝露の16時間前に塗布した場合に、1MEDの光線によって誘発される紅斑から皮膚を保護した。紅斑の防止にはFDOも効果的であった。NACは紅斑に対しては明らかに何の効果もなかった。
図９に示す結果に基づくと、本発明者らの発明のうちの１つは、UV放射に曝露される皮膚に、（ｉ）メラトニンおよび／またはビタミンＥ（あるいはそのいずれかの誘導体）を曝露の少なくとも約７時間前、および／または（ii）アセチルサリチル酸、ビタミンＣおよび／またはFDO（あるいはそのいずれかの誘導体）を曝露の少なくとも16時間前に塗布することによって、紅斑を防止するための方法である。
以上、様々な抗紅斑性化合物について研究および説明（図９）してきたが、これらの化合物を試験し、紅斑の防止がMMPレベルの上昇防止を示しているのか否かを判断した。この結果を図10に示す。サンバーン防止性は良好であるが、メラトニンおよびビタミンＥ（いずれも前処理）ではいずれも、2MEDの光線への曝露後に92kDaのゼラチナーゼおよびコラゲナーゼなどのMMPの誘発は防止されなかった。同様に、サンバーンの防止には有用であるが、コラゲナーゼ活性の上昇防止にはASAの効果はなかった。予想外にも、紅斑防止には効果のなかったNACが、2MEDの光線への曝露後にMMP活性が増大するのを防止する上で効果的であった。本発明者らは、NACを使用してMMPレベル（92kDaのゼラチナーゼおよびコラゲナーゼなど）の上昇を防止するには、曝露（1MED:図11Aおよび図11B）の４時間以上前、好ましくは少なくとも約７時間前に、前処理を施しておく必要があることも発見した。
従来を振り返ってみると、紅斑誘発性応答を防止した化合物（メラトニン、ビタミンＣおよびＥ、FDO、ASA）は、必ずしもコラゲナーゼ活性におけるUV誘発増加の防止に効果があるとは限らなかった（図９および図10を比較）。一方、紅斑の防止に明らかに効果のない化合物（例えばNAC）がMMPのUV媒介増加を防止するのに有用な場合がある。このため、もう１つの発明は、NAC、FDOまたはビタミンＣ（またはこれらの誘導体）を使用し、少なくとも曝露の約７時間前に塗布して92kDaのゼラチナーゼおよびコラゲナーゼなどのMMPのUV誘発上昇を防止することである。
以上、UVA1がMMPレベルを上昇させることを示したが、この上昇の防止にはUVA1遮断剤も有用である（図12）。これらの遮断剤は、ｃ−JUNタンパク質の誘発も防止する（データ図示せず）ため、MMPレベルおよび／または活性の増大を防止できることがある。
レチノイドは、MMPのレベルおよび／または活性のUV誘発増大に対する好ましい阻害剤である。レチノイン酸は、曝露の48時間前に塗布した場合に、MMPコラゲナーゼ、92kDaのゼラチナーゼ、ストロメライシン−１のレベルおよび活性の2MEDのUVBによって媒介される誘発ならびにこれらの物質の転写（mRNAとして測定）を減少させる。（図13A）。Ｉ型コラゲナーゼ活性のUV誘発上昇の防止には、紅斑線量未満であっても、約10倍濃度のレチノールでレチノイン酸とほぼ同じ程度に効果的である（図13B）。
2MEDのUVに１回曝露されるとMMPレベルが増大するが、このレベルは一般に曝露約24時間後に最大になる（図14A〜図14A、本発明者らの係属中の出願第588,771号の図2a〜図2dと同一）。紅斑またはUV誘発MMP活性に対して効果的であると思われる様々な化合物での場合と同様に、レチノイドを用いる場合も前処理を施すのが好ましく、曝露のできるだけ前に前処理を施す方が良い（図15A）。処理時間が長ければ長いほど、おそらくMMPレベルの上昇を招くと思われるｃ−Junタンパク質レベルのUV媒介増加が経時的に防止される。事実、曝露の約48時間前ににレチノイドを用いた場合、ｃ−JUNタンパク質レベルの上昇は大幅に抑えられるように見える。（図15B）。ｃ−JUNタンパク質レベルの時間変化はUV曝露によって誘発されるこれらのMMPのレベルの時間変化を反映したものであると予測する人がいるかもしれないが、レチノイドをMMP阻害剤として用いた場合、これらのレベルは一定のまま維持され、わずかに上昇しただけであった（基線と比較；ただし、このレベルは未処理の保護していない皮膚で誘発されるレベルよりもかなり低い）。ｃ−JUNタンパク質のレベル低下することから、レチノイドは検討対象とした時間変化全体にわたってUV媒介皮膚反応のキネティクスを変化させるのではなく、MMPの産生を減らしているのだということが分かる。
本発明は、皮膚の光老化を防止するための方法として、MMP阻害剤およびUVA/B遮断剤の両方を含有する組成物を毎日局所塗布することを含む。本明細書にて示し、かつ、当該医学分野の従来技術の現在の見解とは逆に、紅斑量未満のUV曝露によって破壊的なプロテイナーゼの生成が引き起こされる。大半の人は１日のうち何時間かを日光の下で過ごし（犬の散歩や仕事に行く時）、これは従来にいう「日光浴」ではないため、毎日紅斑量未満の太陽光線に曝露されることで、UV媒介によるMMP活性の上昇が生じることが一因となって光損傷が生じるとは考えられていなかったであろう。ヒトの皮膚がなぜ紅斑量未満のUVに曝露されるとMMPを生成するよう機能するのかについて古生物学的な説明がなされているかもしれないが、少なくともこのタイプの光老化を防止あるいは少なくとも抑制する本発明者らによる方法は、（ｉ）UVA/B遮断剤（すなわち、広義には、光線を吸収、反射または無害波長に変調することによって、UVA/UVB放射の皮膚に対する直接的な影響を遮断する１種またはそれ以上の化合物）、（ii）UV誘発MMP活性増大を抑制または低減するための予防的にみて効果的な化合物および／またはMMPの直接的な阻害剤および（iii）これらの成分の１種またはそれ以上の相溶混合物を毎日局所塗布することによって達成可能である。これらの実験に鑑みて、本発明者らの発明の好ましい実施の形態は、MMP阻害剤、好ましくはレチノイドと、UVA遮断剤およびUVB遮断剤の両方とをさらに含む改良されたサンスクリーン剤組成物である。
本明細書において、MMPの「阻害剤」は、MMP産生につながる自然な生理学的経路における１つまたはそれ以上のステップを阻害および／またはこれらのプロテイナーゼ１種またはそれ以上を直接的に阻害する。このように、MMP阻害剤は様々なシグナル伝達化合物および／またはMMPの自然産生原因である転写因子（例えばcJUNおよびcFOS;両方でMMPを産生する）１種またはそれ以上を阻害することができる。
レチノイドは一種のMMP阻害剤である。MMPの阻害剤は、MMPおよび／またはMMPの自然産生原因である転写因子AP−１およびNF−κＢに直接作用することができる。NF−κＢの活性化を抑制するものとしては、E5510が挙げられている（Fujimori,T.et  al.、Jpn.J.Pharmacol.（1991）55（１）:81〜91）。米国特許第4,877,805号に開示されているようなレチノイドおよびAP−１拮抗作用に特異的な解離レチノイド（Fanjul  et  al.によってNature（1994）372:104〜110に記載されているものなど）、グルココルチコイドおよびビタミンD3はAP−１を標的にする。ビタミンD3による治療効果を高めるための化合物がビタミンD3のMMP阻害効果も高めることがあるが、これは係属中の出願第08/832,865（J.Voorhees  et  al.、「Method  for  Assessing  1,25（OH）2D3  Activity  in  Skin  and  for  Enhancing  the  Therapeutic  Use  of  1,25（OH）2D3（皮膚における1,25（OH）2D3の活性をアッセイし、1,25（OH）2D3の治療的な用途を増すための方法））、1997年４月４日出願（かかる出願における開示内容を本明細書に引用したものとする）に記載されている。レチノール以外の他のレチノイドとしては、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＡアルデヒド（レチナール）、ビタミンＡ酸（全トランス型レチノイン酸、９−シス型レチノイン酸、13−シス型レチノイン酸をはじめとするレチノイン酸（RA））、エトレチナートの他、欧州特許出願公開第EP−A2−０  379367号、米国特許第4,887,805号および同第4,888,342号（かかる特許における開示内容全体を本明細書に引用したものとする）に記載されているものなどの天然物および合成の類似物が挙げられる。本発明においては、レチノイド活性を生体内にて呈する限り、レチノイド活性を有する様々な合成レチノイドおよび化合物が有用であると思われる。これについては、記載上Allergan  Inc.に譲渡された様々な特許に記載されている。その一例として、以下の番号の米国特許が挙げられる:5,514,825、5,598,700、5,696,162、5,688,957、5,677,451、5,677,323、5,677,320、５、675,033、5,675,024、5,672,710、5,688,175、５、663,367、5,663,357、5,663,347、5,648,514、5,648,503、5,618,943、,618,,931、5,618,836、5,605,915、,602,130。レチノイド活性を有すると説明されているさらに他の化合物が以下の番号の別の米国特許に記載されている:5,648,563、5,648,385、5,618,839、5,559,248、5,616,712、5,616,597、5,602,135、5,599,819、5,556、996、5,534、516、5,516,904、5,498,755、5470,999、5,468,879、5,455,265、5,451,605、5,343,173、5,426、118、5,414,007、5,407,937、5,399,586、5,399,561、5,391、753など（上記および下記の特許および参考文献の開示内容全体を本明細書に引用したものとする）。
MMPは、BB2284（Gearing,A.J.H.et  al.によってNature（1994）370:555〜557に記載）、G II29471（McGeehan  G.M.et  al.によってNature（1994）370:558〜561に記載）およびTIMP（脊椎動物のコラゲナーゼを阻害するメタロプロテイナーゼの組織阻害剤ならびに、ゼラチナーゼおよびストロメライシンをはじめとする他のメタロプロテアーゼ）によっても阻害される。本発明に有用なさらに他の化合物としては、Galardin、Batimastat、Marimastatなどのヒドロキサム酸塩（hydroxamate）およびヒドロキシ尿素誘導体、（様々な病因の中でも特に、皮膚潰瘍、皮膚癌、表皮水泡症の治療においてMMPの阻害に有用であるとして）欧州特許出願公開第Ｅ−A1−０  558635号および同第EP−A1−０  558648号に開示されているものが挙げられる。レチノイドは、転写調節を示すTIMP  mRNAの定常状態レベルを高めることが、Goldsmith,L.A.によって報告されている（Physiology,Biochemistry,and  Molecular  Biology  of  the  Skin（皮膚の生理学、生化学、分子生物学）、第２版（New York:オックスフォード大学出版、1991）第17章）。それにもかかわらず、本発明者らは自らの発見に基づき、これが生体内すなわちヒトの皮膚においては誤りであることを見出した。
他のMMP阻害剤としては、ゲニステインおよびケルセチン（米国特許第5637703号、同第5665367号およびフランス特許出願公開第FR−Ａ−2,671,724号に記載されているものなどであり、かかる特許および公開公報の開示内容を本明細書に引用したものとする）および関連の化合物ならびに、NAC（Ｎ−アセチルシステイン）などの他の酸化防止剤が挙げられる。
本発明に有用な一種の化合物としてのレチノイドに加え、レチノイン酸を代謝するシトクロムP450酵素を阻害する薬剤であればどのような薬剤であっても、本発明を実施するにあたって有用なものとなり得る。皮膚では、レチノイドは活性型としてレチノイン酸（RA）に変換される。皮膚において機能する天然のレチノイドは全トランス型であるか、あるいは代謝によって全トランス型になるものである。レチノイン酸（RA、全トランス）は、ヒドロキシル化によって（RA  ４−水酸化酵素を経由して）失活するまで代謝され、４−ヒドロキシ−RAになるが、次いでこれがシトクロムP450依存性モノオキシゲナーゼ系によって媒介される反応によって酸化する。（S.Kang  et  al.、「Liarozole  Inhibits  Human  Epidermal  Retinoic  Acid  ４−Hydroxylase  Activity  and  Differentially  Augments  Human  Skin  Responses  to  Retinoic  Acid  and  Retinol  In  Vivo（生体内でのリアロゾール（liarozole）によるヒト表皮レチノイン酸４−水酸化酵素活性の阻害とヒトの皮膚のレチノイン酸およびレチノールに対する応答の差動的増大）」、J.Invest.Dermatol.、107:183〜187（1996年８月）、E.A.Duell  et  al.、「Human  Skin  Levels  of  Retinoic  Acid  and  Cytochrome  Ｐ−450−derived  ４−hydroxyretinoic  Acid  after  Topical  Application  of  Retinoic  Acid  In  Vivo  Compared  to  Concentrations  Required  to  Stimulate  Retinoic  Acid  Receptor−mediated  Transcription  In  Vitro（レチノイン酸受容体媒介転写をin  vitroにて刺激するのに必要な濃度と比較した、レチノイン酸を生体内にて局所塗布した後のレチノイン酸およびシトクロムp450由来の４−ヒドロキシレチノイン酸のヒトの皮膚中濃度）」J.Clin.Invest.、Skin  Retinoid  Levels  and  Reporter  Gene  Activity（レチノイドの皮膚中濃度およびレポーター遺伝子の活性）、90:1269〜1274（1992年10月）、E.A.Deull  et  al.、「Retinoic  Acid  Isomers  Applied  to  Human  Skin  in  Vivo  Each  Induce  ａ  ４−Hydroxylase  That  Inactivates  Only  Trans  Retinoic  Acid（生体内すなわちヒトの皮膚に塗布した各レチノイン酸異性体による、トランス型レチノイン酸のみを失活させる４−水酸化酵素の誘発）」、J.Invest.Dermatol.、106:316〜320（1996年２月）、これらの開示内容を本明細書に引用したものとする）。したがって、全トランス型RAの排出代謝を妨害する化合物すなわち、９−シスRAおよび13−シスRAなどの局所的に塗布されるレチノイドの活性代謝物には、皮膚におけるRAの量を増加させるという利点がある。このため、天然（全トランス型）RAの皮膚における分解を防止することで、その濃度が効率的に高まり、本明細書に記載の利点が得られる。皮膚科学的に許容可能かつ、P450媒介分解に対して阻害性を有するまたは阻害性を持ちやすい化合物の一例としては、特にチアゾール類などのアゾール類が挙げられ、例えば、ケトコナゾール（米国特許第4,144,346号および同第4,223,036号）、フルコナゾール（米国特許第4,404,216号）、イトラコナゾール（米国特許第4,267,179号）、リアロゾール、イルテマゾール（irtemazole）などの他がこれに含まれる。上記の物質に関連し、同じく有用である化合物としては、例えば、フルシトシンなどのジアジン類が挙げられる。また、このようなシトクロムP450阻害剤をこれより少ない量のレチノイドと併用すると有益である。P450阻害剤はレチノイドの代謝排出量を減少させるため、同じ結果を達成するのに必要なレチノイドの量は少なくてすむ。さらに、特定の化合物を塗布し、CRABP（細胞質レチノイン酸結合タンパク質）の変化を試験で確認することによってこの化合物がRAの分解を抑制するか否かを判断する分析方法を利用できる。これは、被験化合物の局所塗布によってRAのレベルも上昇した場合に、レベルが高くなるものである。
局所塗布可能であって請求の範囲に記載の発明の実施に有用なさらに他のMMP阻害剤としては、ミノサイクリン、ロリテラサイクリン（roliteracycline）、クロルテトラサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリンおよびこれらの様々な塩などの、テトラサイクリンおよびその誘導体が挙げられる。アレルギー反応または感作反応が生じる可能性があるため、このような有害反応の有無についてテトラサイクリンの局所投与を慎重に観察すべきである。
「酸化防止剤」と呼ばれる様々な化合物もMMP阻害剤として有用である。特定の動作理論に拘束されることは望ましくはないが、これらの化合物は、例えばMAPキナーゼカスケードを経由してMMP誘発を開始またはこれを誘導する場合がある遊離ラジカルおよび反応性酸素種を、失活またはそれ以外の場合は低減することができる。これらの化合物としては、米国特許第5,296,500（かかる開示内容を本明細書に引用したものとする）号に記載されているように、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）またはグルタチオンエチルエステルなど、さらに広義にはＮ−CH3（CH2）nCOシステイン（式中、ｎは０〜８、さらに好ましくは４以下の整数）および関連化合物ならびにその誘導体などのグルタチオンおよびその先駆物質が挙げられる。これらの他のMMP阻害剤としては、ビタミンＣおよびNACなどの水溶性化合物ならびにFDOが挙げられる。MMP阻害剤として作用し得る他の様々な化合物としては、Ｐ−カロテンおよびその誘導体または他のカロテノイド類などの脂質可溶性化合物、グルタチオンおよびその（またはNACの）誘導体、α−リポ酸（1,2−ジチオラン−３−ペンタン酸）、エブセレン（２−フェニル−1,2−ベンズイソセレナゾル−３（2H）−オン）などのセレン化合物、ゲニステイン（イソフラボン）、ケルセチン（フラボン−３−オール）、ピクノゲノール（フラバン−３−オール）などのイソフラボン類、エルゴチオネイン、サポニン（例えば、Polypodium  leucotomosから得たものなど）、イチョウ葉エキス（フラボングリコシドおよびテルペンラクトン）およびナツシロギク（Chrysanthemum  parthenium）エキス（セスキテルペンラクトン）が挙げられる。
塗料および染料業界では、車、住居、衣類の顔料の劣化または変色を防止する様々なUV遮断剤が周知である。ヒトの皮膚に用いるのに特に好ましいUVA1/2遮断剤はPARSOL(R)1789（Schering−Plough）ならびにこのUVA遮断剤の調製について記載した上述の米国特許第4,387,089行に開示されているものである。本発明者らは、真のUVA遮断剤はcJUN  mRNAおよびコラゲナーゼならびにゼラチナーゼの誘発を阻害するということを見出した。
本発明の組成物は、化粧用として適した任意の形で提供可能である。好ましくはローションまたはクリームであるが、軟膏中または油ベースの液体ならびにスプレー可能な液体の形（例えば、髪および頭皮をUVによる損傷から保護する「ヘア」スプレーであり、ローションや軟膏を髪に塗布した場合に生じるような見た目に油っぽくならず化粧用として許容可能な方法で乾燥するベース中に溶解）であってもよい。さらに、本発明で想定している組成物は、１種またはそれ以上の相溶性かつ化粧溶として許容可能な、着色料、香料、皮膚軟化剤、湿潤剤などの一般に用いられているアジュバントや、アロエ、カモリール（chamolile）などの植物性薬品を含有してもよい。局所的に使用する場合、レチノイドは約0.05％〜約５％、さらに好ましくは0.1％〜１％の濃度で用いるのが好ましい。上述したレチノイドおよび様々な酸化防止剤は、また、好ましくは経口投与によって全身投与することも可能である。経口服用の場合、レチノイドは、全用量で有毒料未満として約0.1mg/kg（体重）〜約1mg/kgまたはこれ以上の量で摂取するのが好ましい。酸化防止剤は、好ましくは「メガ量」（例えば、ビタミンＣで少なくとも1g/d、少なくとも１種またはそれ以上のトコフェノールで1000I.U.）で摂取するのが好ましい。
要するに、本発明者らの発明は、広義には、UV曝露後にサンバーンを防止することからMMP活性の増大を防止することまで含めて、「光老化」を防止するという概念に再度的を合わせたものであるとみなされる。本発明者らの発明は、UVA/B遮断用サンスクリーン剤を使用することで、皮膚レベルでUVA/B放射を遮断；酸化防止剤を局所塗布することで、MAPキナーゼカスケードおよびMMP誘発を開始させるUV放射による反応性酵素種の皮膚中での生成を遮断；レチノイドまたは（本明細書において広義に定義したような）MMP阻害剤を局所塗布することで、UV曝露後におけるMMP活性増大につながる転写因子の誘発を遮断;MMPの阻害剤を局所塗布することで、その活性を直接的に阻害および／または窓構造体中またはかかる構造体表面のコーティング中にUVA遮断剤を提供することで、かかる構造体を介してヒトの皮膚にUVA放射が伝達されるのを遮断する形態のうち、１つまたはそれ以上の形態で光老化に対する予防法を提供する。
本発明者らによる発見に鑑みると、紅斑量（MED）未満のUV放射によって皮膚が損傷を受けることは明らかである。このため、医師の指示のもとに使用する眼鏡およびほとんどのサングラスには、UV反射性または呼吸性の材料またはコーティングが含まれているが、本発明者らの発明のもう１つの態様は、特に、医師の指示のもとに使用する眼鏡およびサングラスだけでなく、住居、オフィスおよび自動車の窓用など、あらゆるタイプのガラス表面でUVAの伝達を防止するUVコーティングを提供することにある。さらに、ジェット航空機は大気中の非常に高いところを飛行するため、窓の近くにいる乗客はUVAおよびUVB放射に曝露される場合があるだけでなく、これよりも危険なUVC放射にも曝露されることがある。本発明者らの発明についての本記載があれば、窓のコーティングに関する技術分野の当業者は、UVA遮断剤を識別し、これを膜形成可能または硬化可能（ペイント状など）コーティングに取り入れて、窓構造体に接合または積層することが容易にできるであろう。このように、もう１つの実施の形態では、本発明は、UV反射性および／または吸収性のコーティング（特にUVA遮断剤）および／または化合物を内部に有する透明または半透明のポリマー構造体を含む。このような構造体としては、ベビーカーのプラスチック製の日除けや、太陽が低い位置にある時に店舗の窓に掛けられるプラスチック製のシェード（一般に着色されているかまたは薄い色が付けられている）など、窓状の装置および窓を覆う装置が挙げられる。繰り返すが、このようなタイプの構造体を製造する技術分野の当業者であれば、UVA遮断剤を提供し、膜形成ポリマー材料（例えば、可塑化ポリビニルアクリレート）に取り入れ、UVA放射の伝達を遮断する透明または半透明の窓構造体を提供することが容易にできよう。UVAを遮断する窓に関連して、上述したようにUVAおよびUVBの相対量は空にある太陽の高さの関数として変化する。太陽の高さが低い場合（すなわち、天頂角０゜の「日中の」太陽との対比で、朝または夕方の太陽）、UVA:UVBの相対量は他の時間帯（例えば正午）よりも大きくなる。このように高さが低い時は、UVA対UVBの相対量は２倍を上回ることもある。このため、日中の太陽が最も大きな損傷を与えるという現在の仮説（天頂が高ければ高いほどUVB光線の量が多くなり、ひどいサンバーンを引き起こしやすいため、この仮説はもっともらしいものである）とは逆に、紅斑量未満のUVBとUVA放射とが組み合わさることで光損傷が発生するという本発明者らの発見から、他の時間帯にも光損傷から保護することの重要性が分かる。このため、午前中および／または夕方の時間に仕事に行くおよび／または仕事から帰る運転手を保護するには、広いスペクトルのUVA/B窓コーティングが有用であろう。
以下の実施例では、４つのF36T12  ERE−VHO  UV球を使用して、ヒトの皮膚を照射した。すべての時間について、電球の4cm前方にKodocel  TA401/407フィルタを早着し、UVC放射（＜290nm）を除去した。IL443光線療法用放射計およびSED240/UVB/W光検出器（マサチューセッツ州ニューベリーのInternational  Light社）を用いて放射強度を観察した。Optronic  Labroatories  OL754システムを用いて分光放射測定を行った。４つの電球の光源から約43cm（17インチ）での全照射量（290〜800nm）は約1.5mJ/cm2・ｓ（1.49×10-3W/cm2）であった。この電球からの放射出力を分光放射測定によって求めたところ、UVB約47％およびUVA約27％（約９％がUVA1（340〜400nm）および約18％がUVA2（320〜340nm））、残りが可視光線とIR放射であった。この４つの電球のセットでの約160秒の曝露が1MEDでの曝露に相当する。従って、UVBが0.5％でUVAが6.5％の自然の太陽光線と比較すると、この実験で用いた４つの電球のセットで得られるUVA放射量は、同じUVB量の日光に曝露された場合よりも極めて少ないことが分かるであろう。
以下の実施例では、エタノール70％（保存剤として0.05％BHTを含む）中にPEG（ポリエチレングリコール）30％を含有する「標準的なビヒクル」を使用した。可溶性架橋テロペプチドの放射免疫検査（アッセイ）によって、皮膚コラーゲンのUV誘発された分解を評価した。それぞれノーザン分析およびウェスタン分析によって、MMPおよびいずれかの内在性阻害剤（TIMP）のmRNAおよびタンパク質レベルを求めた。Ｉ［3H］型コラゲナーゼの分解によって、コラゲナーゼ活性を測定した。酵素電気泳動法によってMMP活性を測定した。
実施例１−−AP−１の紅斑量未満の誘発
コーカサス人の成人９名の尻領域（すなわち、通常は太陽光線の曝露されることのない皮膚）を、様々な時間で上述した電球セットからのUV放射に曝露した後、組織試料を採取して分析した。図２および図３に示されるように、かつ1MEDとして上述した２分40秒（160秒）の時間を使用して、志願被験者の皮膚の様々な部分を、電球からの、０、0.01、0.05、0.1、0.5、１および2MEDの放射に曝露した。曝露された（および0MEDの未曝露の）皮膚から得た真皮の生検組織試料を、AP−１の有無およびAP−１をコードするDNAへの結合が何倍になるかについてアッセイした。Angel,P.et  al.、Cell（1987）49:729〜739およひSato,H.およびSeiki,M.、Oncogene（1993）8:395〜405に記載されているように、特定のMMPの産生は転写因子AP−１によって媒介される。
これらの図面に示される生検結果は驚くべきものである。少なくとも0.01MED程度までの紅斑量未満の線量では、未曝露皮膚の場合に存在するレベルよりも明らかに高いレベルでAP−１が誘発される。これらの予期しない結果から、本発明者らは、人の皮膚に対する光損傷が、UVBおよびUVAを含む紅斑量未満のMED放射線量によって誘発される場合があるため、少なくともUVAおよび任意にUVBを遮断するサンスクリーン剤を毎日塗布することによって、どこにいる人でも光老化が起こらないように保護することができると考えるに至っている。
実施例２−−紅斑量未満のコラゲナーゼ誘発のレチノイド予防法
本発明者らの係属中の出願第588,771号（上述したものであり、その開示内容を本明細書に引用したものとする）に記載されているように、レチノイドは紅斑量の放射の後にコラゲナーゼをはじめとする様々なMMPの誘発を阻害することが明らかになっている。
志願被験者10名の尻の皮膚を使用して、上述したものと同一の一般的な手順に従って、彼ら志願被験者各人について、標準的なビヒクルのみ、0.1％のレチノイン酸（RA）または１％のレチノール（ROL）を用いて予め処理した。志願被験者から得た組織試料を、前処理後、曝露しなかった後、４つの電球セットからの光線0.5MEDに曝露した後にそれぞれ生検した。
これらの生検の結果を図13Bに示す。この図は、10名の志願被験者についての生体内におけるＩ型での倍増値（fold  increase）に対する前処理レジメ（regime）および曝露レジメを示したものである。図中の結果に示されるように、ヒトの皮膚をレチノイドで前処理すると紅斑量未満のUVによって誘発されるコラゲナーゼ活性を阻害することができる。図２に示す結果と矛盾することなく、紅斑量未満のUVへの曝露によってコラゲナーゼ活性は有意に増大する。
実施例１および２の結果は本発明者らにとって予想外かつ好奇心をそそられるものであり、本発明者らは皮膚の保護および太陽によって誘発される皮膚の損傷についての現在の見解に対する疑いに駆られた。エリザベス女王時代の英国および東洋の多くの文化（例えば日本や韓国など）などの、黒く焼けた「屋外派の」肌が審美的に魅力的ではないと考えられている様々な文化の中においては、いつにあっても、太陽による皮膚への損傷を防止および／または「保護性の」皮膚の色（tan）を誘発するために様々な化合物および組成物が試されてきた。本発明者らは、様々な化合物および組成物を昔からあるものと新規なものの両方について、UV曝露した皮膚に対する生体内での効果が本当にあるのか否かを試験することにした。
実施例３−−局所的な前処理後のUV曝露による影響Ｉ
メラトニンは、昼夜の明暗サイクルによって媒介されると見られているホルモンである。最近になって、メラトニンを酸化防止剤として作用させ得るという見解が出された。
本発明者らは、６名の志願被験者を評価し、上述したものと同一の一般的な手順を使用して、局所的なメラトニンがUV誘発紅斑に何らかの影響をおよぼす場合にそれがどのようなものかを判断した。５分間の曝露後の様々なUV線量での曝露結果および志願被験者各々の紅斑応答を図９に示す。志願被験者のそれまで光線曝露されていない皮膚を、標準的なビヒクルのみまたは５％のメラトニンで前処理した。図９に示す結果から、2MEDの光線への曝露後、ビヒクル処理した皮膚に紅斑が誘発され、メラトニン処理した皮膚では誘発されなかったということが分かる。メラトニン処理した皮膚に紅斑が誘発された場合でも、ビヒクル処理してUVを照射した皮膚の場合に比べるとかなり軽度で存在していた。それにもかかわらず、上記にて示したように、紅斑が存在しないことと光損傷がないこととは必ずしも関連しているとは限らないことに留意すべきである。
もう一組の実験では、志願被験者にはビヒクルのみまたは５％のメラトニンまたは５％のビタミンＥで曝露の約７時間前に前処理した皮膚領域があった。次に、これらの領域を約2MEDのUV放射に曝露した後、クロマメータの目盛を記録して紅斑の度合いを判断し、生検試料を採取してＩ型コラゲナーゼおよび92kDaのゼラチナーゼの活性を判断した。図９に示す結果から、ビヒクル処理後にUV曝露した皮膚と比較して、メラトニンおよびビタミンＥはいずれも紅斑を大幅に減少させたということが分かる。したがって、メラトニンおよびビタミンＥは酸化防止剤であるとされることがあるが、本発明者らは、これらの物質によって良好な抗サンバーン性サンスクリーン効果が得られることを見出した。また、図10に示す結果から分かるように、メラトニンおよびビタミンＥは、ヒトのUV曝露皮膚においてMMP活性の増大を抑制するようには機能しなかった。
実施例４−−局所的な前処理後のUV曝露による影響II
UV放射は遊離ラジカルを生成することが知られているため、光損傷の原因についてのもう１つの理論は反応性酸素種（ROS）および他の遊離ラジカルのUV放射による生成に関するものである。従って、本発明者らは、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）および２−フリルジオキシム（FDO）ならびにアスピリン（アセチルサリチル酸、ASA）などの「酸化防止剤」がMMP誘発による紅斑または光損傷に何らかの影響をおよぼすか否かについて研究を行った。
曝露の16時間前に志願被験者を前処理した。曝露および生検は上記の実施例において説明したように実施した。１つの実験では、志願被験者の皮膚をビヒクルのみまたは５％のASAまたは3.5％のビタミンＣで前処理し、紅斑についてはクロマメータを用いて試験し、コラゲナーゼ活性については酵素電気泳動法によって試験した。1MEDでの曝露後、図９は、アスピリンまたはビタミンＣでの前処置によって、1MEDでの曝露時のUV誘発紅斑が、未処理（ビヒクルのみで処理）の皮膚の場合よりも減少し、アスピリンを用いると紅斑が約30％減少するのに対して、ビタミンＣでは未処理の皮膚よりも約30％低かった。しかしながら、生検試料のコラゲナーゼ活性を評価した場合、結果は図10に示すようになる。すなわち、アスピリン処理した皮膚では未処理の皮膚よりもコラゲナーゼ活性が高く、ビタミンＣでは未処理の皮膚と比べてコラゲナーゼ活性が約25％低下した。繰り返すが、これらの驚くべき結果から、紅斑とMMPによって媒介され、UVによって誘発されるヒトの皮膚の光損傷とを相関させることはできないということが分かる。事実、紅斑のみに注目するとアスピリンを使用したくなるかもしれないが、これらの結果から、アスピリンにはＩ型コラゲナーゼが媒介する皮膚の光分解に対する保護効果がないことが分かる。
ビヒクルのみかまたは20％のNAC、または５％のFDOを用いて、2MEDでの曝露で上記と同じ一般的な実験プロトコルを繰り返した。これらの化合物は同様に曝露前に志願被験者に塗布しておいた。図９は、これらの化合物について紅斑を分析した結果を示しており、FDOは紅斑を完全に阻害したが、NACには前く効果がなかった（すなわち、ビヒクル処理した皮膚と同じ）ことが分かる。しかしながら、ここでも驚くべきことに、図10に示すように同じ曝露レベルでＩ型コラゲナーゼ活性を分析したところ、NACではコラゲナーゼ活性に対して有意な保護性が得られたが、FDOではMMP誘発に対していくらか保護されただけであった。
実施例５−−前処理時間依存性
特定の化合物がUV放射への曝露後に紅斑および／または皮膚のMMP媒介分解を抑制するか否かの判断という一般には予測できないことに加え、本発明者らは、保護性には時間依存の効果がある可能性があることを発見した。
４つの電球セットを用いて志願被験者の皮膚を1MEDの光線に曝露し、ビヒクルのみかまたは20％のNACで、曝露の４時間（HRS）または７時間前に前処理した。曝露後、上述したようにしてクロマメータおよび酵素電気泳動法による分析を実施した。
NACには、前処理の時間数とは関係なくUV曝露皮膚の赤味を防ぐ効果はなかった。図11Aおよび11Bは、図９の結果との比較で、NACで前処理して1MEDの光線に曝露した後のＩ型コラゲナーゼに対する予期しない影響を示している。NACで７時間前処理した場合、（コラゲナーゼ活性の150％増大が認められた）未処理の皮膚と比較して、92kDaのゼラチナーゼ（図11A）およびコラゲナーゼ（図11B）活性のUV誘発増大に対する阻害効果が得られたが、４時間の前処理では効果はなかった。
実施例６−−市販のサンスクリーン剤の効果
本発明者らは、市販されているサンスクリーン剤のUV誘発紅斑およびコラゲナーゼ活性に対する影響についても評価した。志願被験者の皮膚を標準的なビヒクルおよび（皮膚の異なる領域で）３種類のサンスクリーン剤すなわち、エチルヘキシルｐ−メトキシシンナメートおよびオキシベンゾンを含有するSPF（サンプロテクト指数）15の組成物、パッケージにUVAおよびUVB保護性があると記載され、オクトクリレン（10％）、オクチルメトキシシンナメート（7.5％）、オキシベンゾン（６％）を含有するSPF30の組成物、パッケージにUVAおよびUVB保護性があると記載され、SPF30の組成物と同一の成分を高含有量で含有するSPF50の組成物で前処理した。
ビヒクルおよびサンスクリーン剤で皮膚の異なる領域を前処理し、次いで2MEDの光線に曝露した後、志願被験者の皮膚の紅斑を評価した。図７の結果から分かるように、市販のサンスクリーン剤ではいずれも、UV誘発紅斑に対しては優れた保護性が得られ、未処理の皮膚と比較して本質的に赤味は全くなかった。
実施例７−−紅斑量未満のUVに規則的に曝露されることによる生理学的な影響
本発明者らは、生体内にて紅斑量未満のUV線量に繰り返し曝露されることによるMMP誘発、特にＩ型コラゲナーゼおよび92kDaのゼラチナーゼの誘発に対する影響について検討した。0.5MEDの光線を志願被験者の４つの別々の部位に照射し、各部位を曝露間隔48時間で１回、２回、３回、４回UVに曝露した。最後の曝露から24時間後に、（対照例として用いた）未照射領域から得た皮膚も含め、各志願被験者から得た皮膚を生検し、MMP活性を分析した。図３に示すように、１回のUV曝露後にコラゲナーゼ活性およびゼラチナーゼ活性はそれぞれ2.2倍および4.4倍に増大し、４日間にわたって１日おきに曝露を繰り返した時ですらも本質的にこれと同じレベルで増大し続けた。
本発明者らはレチノイド（特にトランス型レチノイド酸、tRA）がUV曝露後に皮膚でのMMP活性を低下させることを明らかにしたが、曝露前にtRAで前処理することによる影響についても研究した。皮膚をtRAで処理しても、コラゲナーゼ、92kDaのゼラチナーゼまたはストロメライシンの低い基底レベルには変化は見られなかった。UVを引き続いて照射することで、レチノイドで前処理した皮膚におけるMMPのレベルが未処理の皮膚と比べて実質的に低下する。0.01〜2MEDの範囲の様々なUV線量で志願被験者を光線に曝露し、これらの領域と未曝露領域から生検試料を取得した。図２、図３および図14A〜図14Dにおいて示されるように、極めて低い紅斑量未満の曝露レベルで、曝露後８時間以内にストロメライシン−１が誘発された。この誘発は、明らかに0.1MEDでのものであった。これらの曝露の後、0.1％のtRAを曝露領域に３日間毎日塗布し、同じく生検試料を採取した。図13Bに示されるように、tRAはストロメライシン−１タンパク質が有意に減少する要因ではなかった。
実施例８−−UV波長のMMP誘発におよぼす影響
本発明者らは、周知のUVA遮断剤で皮膚を前処理することで、2MEDのUV放射への曝露後に紅斑およびMMP活性の両方にどのような影響がおよぶかについて研究した。特に、本発明者らは、米国特許第4,387,089（かかる開示内容を本明細書に引用したものとする）に記載されている、PARSOL(R)1789（PARSOL  Ａとしても知られている）ブランドの４−ｔ−ブチル−4'−メトキシジベンゾイルメタンを使用した。（PARSOL  MCXおよびPARSOL  MOXは、市販のサンスクリーン剤に一般に用いられているUVB遮断剤である２−エチルヘキシルｐ−メトキシシンナメートの商標名であり、米国特許第4,713,473号に開示されている。かかる開示内容を本明細書に引用したものとする）。UVA1、UVA2およびUVB波長でのPARSOL(R)1789の吸光度特性を図8Aに点線で示す。同図において示されるように、この化合物は、UVA2放射の遮断時に特に有用であり、UVA1放射の遮断でもいくらか効果的である。影付きの線は自然の紅斑誘発性UV放射の波長を示す。図示のように、紅斑は主にUVB放射によって発生する。
一組の実験で、志願被験者には、ビヒクルのみかまたは５％のPARSOL(R)1789UVA遮断剤で前処理した未曝露領域があった。これらの前処理領域をUV放射約2MEDに曝露し、後に、紅斑を試験して生検し、92kDaのゼラチナーゼの活性とcJUNタンパク質の有無を試験した。
図8Bは、サンバーンについての曝露後の試験の結果を示している。この試験では、PARSOL(R)1789で前処理した皮膚をUV曝露によって誘発されるサンバーンに対して保護しなかった。PARSOL(R)1789がUVA放射を有意に遮断することを根拠として、これらの結果からUVB放射がサンバーンにおける主な原因物質であるという裏付けが得られる。
図12は、志願被験者の皮膚におけるゼラチナーゼの生体内での活性検査の結果を示している。この活性は、ビヒクルで処理した皮膚をUVに曝露した場合に比べて、PARSOL(R)1789で処理した皮膚をUVに曝露した場合の方が大幅に低くなった。事実、UVA遮断剤で処理した皮膚におけるゼラチナーゼ活性は、ビヒクルで処理した未曝露の皮膚での場合とそれほど大きくは違わなかった。これらの結果から、UV曝露皮膚でのUV媒介MMP誘発の一因は明らかにUVAであることが分かる。したがって、皮膚の光老化および光分解を引き起こす傾向のある放射は特定波長のUV放射のみである。よって、本発明者らの発明は、UVA遮断性のサンスクリーン剤を使用することで、光老化を防止することを含む。
実施例９
上記にて示した通り、活性成分を皮膚に塗布してからそれがMMPまたはその先駆物質を生体内にて阻害する機能が発揮されるまでの間には時間差がある場合がある。図15Aに示されているのは、RAを局所塗布する時間変化と、UV放射への曝露時に、これがコラゲナーゼやゼラチナーゼ、cJUNタンパク質の阻害におよぼす影響についての研究の結果である。
皮膚を2MEDのUV放射に曝露する７時間（ｈ）前、16時間前、24時間前および48時間前に、志願被験者をビヒクルのみかまたはビヒクルプラス0.1％のRAで前処理し、曝露の24時間後に志願被験者の皮膚の曝露部分から生検試料を採取した。図18Aに示されるように、曝露の24時間前にビヒクルのみで前処理した場合、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼの活性は基線レベルになる。曝露の７時間前にRAで前処理した場合、コラゲナーゼまたはゼラチナーゼの活性はビヒクル単独の場合と比べてさほど大きく違わなかった。16時間前に処理を施すと、コラゲナーゼ活性はビヒクル単独で前処理した場合とほとんど変わらないが、ゼラチナーゼ活性は明らかに低下する。24時間前に前処理を施すと、コラゲナーゼ活性およびゼラチナーゼ活性はいずれもビヒクルを使用した場合よりも有意に低くなる。48時間前に前処理を施すと、コラゲナーゼ活性およびゼラチナーゼ活性はさらに低下する。
また、（１）曝露の48時間前に（ａ）ビヒクルのみまたは（ｂ）ビヒクル中にRAを含有するもので皮膚を前処理および（２）曝露の８時間前にRAを分散させたビヒクルで前処理することで、UV放射に曝露された皮膚におけるcJUNタンパク質の量が変化するか否かを判断するための研究を行った。図15Bから明らかなように、RAで曝露の８時間前に前処理を施した場合は、ビヒクルのみで前処理（曝露の48時間前）した場合と比べて、皮膚でのcJUNタンパク質の量に変化は起こらなかった。一方、曝露の48時間前にRAで前処理を施した場合、皮膚におけるcJUNタンパク質の量が有意に減少した。図１に示す経路に鑑みると、皮膚におけるcJUN量の増加によってAP−１濃度が上昇し、必然的に組織分解を伴ってMMPが増加するのであろうと考えられる。
これらの結果に鑑みると、光老化を抑制するための活性成分としてレチノイドを使用する場合、UV放射への曝露の８時間以上前に皮膚にレチノイドを塗布すると好ましく、さらに好ましくは少なくとも16時間前、一層好ましくは少なくとも24時間前、さらに最長で48時間前までに塗布すると好ましい。本発明者らの先の出願第588,771号に示されているように、UV放射への曝露後にコラゲナーゼおよびゼラチナーゼの活性が基底レベルから増大するには、最長48時間という相当な時間がかかる場合がある。この実施例に示す結果はまた、局所塗布後のレチノイドがMMP経路を下方制御するには、決して短くはない時間がかかる可能性があることも示している。このため、光老化を抑制するための好ましい方法は保護が必要な日の前日に本組成物を使用することであり、最も好ましくは、（特に、本発明者らが示したように、間接的な紅斑量未満のUV線量によってMMP活性が上方制御される場合には）本組成物を毎日使用し、光老化が常に抑制されるようにすることである。
実施例で使用する方法
このセクションで参照する内容について、これを言及することで本明細書に援用する。
生化学的な分析用の皮膚上清の調製  液体窒素下にて皮膚試料を乳鉢および乳棒で粉砕し、10mM  Hepes、1mM  EDTA、5mM  EGTA、10mM  MgCl2、50mM  グリセロリン酸、5mM  NaVO4、2mM  DTT、0.5mM  PMSF、10μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、10μg/mlのペプスタチン、0.5％のNP−40を含有する緩衝液中で、Dounce組織摩砕機にて均質化した。ホモジネートを14,000gで15分間遠心分離し、上清を回収して本明細書にて説明するような生化学的判断用に用いた。
マトリックスメタロプロテイナーゼアッセイ  生検後すみやかに組織片を液体窒素中にて冷凍し、20mM  Tris  HCl（pH7.6）プラス5mM  CaCl2中にて均質化し、さらに3000×ｇで10分間遠心分離して、粒子状物質を除去した。3H標識した原線維Ｉ型コラーゲン（Fisher,G.J.et  al.による、Nature、379、335〜339（1996）およびHu,C−Ｌ  et  al.、Analytic.Biochem、88、638〜643（1978）に記載）から可溶性の放射性フラグメントを放出する能力を膠原溶解性活性の測定基準として利用した。組織抽出物を1mM  アミノフェニル酢酸第二水銀（APMA）と共に３時間保温培養し、不活性型のマトリックスメタロプロテイナーゼを活性型に転化させた。引き続いて、コラーゲン基剤（マサチューセッツ州ボストンのNEN−DuPont社）0.2μCiを組織抽出物50μｌと共に24時間保温培養した。24時間の保温培養時間の終了時に、試料を12,000×ｇで10分間遠心分離し、無傷タンパク質をペレット化した。次に、上清液の残留放射能を測定し、この測定値から加水分解された基剤の比率を求めた。
ゼラチン酵素電気泳動法（Varani  et  al.、前掲引用書中）を使用してMMP−２（72kDaのゼラチナーゼすなわちゼラチナーゼＡ）およびMMP9（92kDaのゼラチナーゼすなわちゼラチナーゼＢ）の活性を評価した。ゼラチン1mg/mlを含有する8.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル中にて組織抽出物を電気泳動した。電気泳動後、１％Triton  Ｘ−100中にて３回連続して洗浄してSDSを除去した。最初の２回の洗浄はそれぞれ20分間、最後の１回は一晩行った。レーザーデンシトメトリーによって加水分解ゾーンの幅の定量化を行った。
ｃ−Junキナーゼ活性アッセイ  （例えば、M.Hibi  et  al.、「Identification  of  an  oncoprotein  and  UV−responsive  protein  kinase  that  binds  and  potentiates  the  ｃ−Jun  activation  domain（ｃ−Jun活性化ドメインを結合および増強する腫瘍性タンパク質およびUV応答性タンパク質キナーゼの同定）」、Genes  Dev.、7:2135〜2148（1993）に記載されているような）固相キナーゼアッセイによって、皮膚上清におけるｃ−Jun活性を求めた。
RNAのノーザン分析  （G.J.Fisher  et  al.、「Cellular,immunologic  and  biochemical  characterization  of  topical  retinoic  acid−treated  human  skin（レチノイン酸で局所処理したヒトの皮膚の細胞的、免疫的および生化学的な性質決定）」、J.Investig.Dermatol.、96:699〜707（1991）に記載されているような）塩酸グアニジニウム溶解および超遠心分離によって、皮膚試料から全RNA（例えば、ｃ−Junについて）を単離した。G.J.Fisher  et  al.によって（「All  trans  retinoic  acid  induces  cellular  retinol−binding  protein  in  human  skin  in  vivo（生体内すなわちヒトの皮膚における細胞性レチノール結合タンパク質の全トランク型レチノイン酸による誘発）」J.investig.Dermatol.、105:80〜86（1995）にて）説明されているようにして、試験対象となる特定のmRNAに対するランダムに初回抗原刺激を与えた32P標識cDNAプローブを用いて、全RNA（40μg/レーン）のノーザン分析を実施した。
タンパク質のウェスタン分析  G.J.Fisher  et  al.によって（「Immunological  identificastion  and  functional  quantitation  of  retinoic  acid  and  retinoid  Ｘ  receptor  proteins  in  human  skin（ヒトの皮膚におけるレチノイン酸およびレチノイドＸ受容体タンパク質の免疫学的同定および機能容量）」J.Biol.Chem.、269:20629〜20635（1994）において）記載されているようにして、ヒトの皮膚から得られた原子核抽出物中にてウェスタン分析によってJunタンパク質を検出した。免疫反応性タンパク質を拡張化学ルミネッセンス検出によって可視化し、レーザ濃度計（デンシトメトリー）によって定量化するか、あるいは拡張化学蛍光検出によって可視化し、ストーム（Storm）画像形成装置（カリフォルニア州パロアルトのMolecular  Dynamics）によって定量化した。
クロマメータ  市販のMinoltaクロマメータ（クロマメータCR200、型番94401085）を用いて、曝露の24時間後に紅斑（皮膚の赤味）を測定した。
上記の説明は、本発明の一例を示すためだけのものであり、これを限定することは意図していない。様々な変更、修正および追加が可能であることは、本明細書を熟読した当業者であれば理解できると思われ、これらは請求の範囲に規定する本発明の趣旨および範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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