(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９８３の乳酸菌を培養した培養上清液を酒母，モロミ，生酒などに添加して抗腐敗酒を製造することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の抗腐敗酒の製造方法において、培養上清液に硫酸アンモニウムを低濃度加えて生成した沈殿を除去した後、更に、上清液に硫酸アンモニウムを高濃度加えて得た沈殿物を酒母，モロミ，生酒などに添加することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無菌的な充填装置，限外ろ過装置等の高額な設備投資を必要とせず、火落ちによる腐造を阻止し、風味を損なうことなく好ましい酒質を持った酒を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
清酒を製造する際には、通常、火落菌の汚染による品質劣化を防ぐために加熱殺菌が行われる。尚、清酒の火落ちは、清酒に含まれるメバロン酸及びアルコールを必須栄養素とするＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに属する乳酸菌が汚染することで起こる。
【０００３】
従って、清酒の火落ちをなくすには、この火落菌の汚染・増殖ができない状態を作出すれば良い。
【０００４】
しかし、生酒の場合は製品の特徴から加熱殺菌は行われず常に火落菌による品質劣化（香味の劣化、以下、火落ちという）の危険がある。従って、生酒の火落菌による汚染を防ぐためにはミクロフィルターによるろ過，クリーンブースの使用，限外ろ過装置等の使用が行われている。
【０００５】
しかし、これらの方法は火落菌を完全に除去することはできず、また、これらの方法は高額な設備投資が必要で中小の酒造メーカーではコスト的に見合わない。
【０００６】
本発明は、上記問題点を解決するもので、清酒の製造工程中，貯蔵中または瓶詰め後、火落菌が汚染しても火落菌の増殖を抑え腐造を防止することができる抗腐敗酒の製造方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨を説明する。
【０００８】
寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９８３の乳酸菌を培養した培養上清液を酒母，モロミ，生酒などに添加して抗腐敗酒を製造することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法に係るものである。
【０００９】
また、請求項１記載の抗腐敗酒の製造方法において、培養上清液に硫酸アンモニウムを低濃度加えて生成した沈殿を除去した後、更に、上清液に硫酸アンモニウムを高濃度加えて得た沈殿物を酒母，モロミ，生酒などに添加することを特徴とする抗腐敗酒の製造方法に係るものである。
【００１０】
【発明の作用及び効果】
ヨーロッパ諸国では食品添加物として乳酸菌が生産する抗菌性物質バクテリオシンの使用が認められており、ラクトコッカス属が生産するバクテリオシンの一つであるナイシンは乳製品や缶詰食品などの製造の際、汚染菌による食品の変敗を防止する目的で使用されている（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５２，５２９（１９５２）、Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，３７３０（１９９２））。
【００１１】
最近、このナイシンが火落菌に対しても有効であることが報告されたが、プロテアーゼ失活もしくは除去した清酒に限定されており、プロテアーゼ活性を有する生酒に添加したのでは効果がない（Ｋａｚｕｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７４，１９４（１９９２））、特開平４−２６２７７４号公報）。
【００１２】
本発明に係る乳酸菌（受託年月日：平成１０年９月９日，寄託機関：工業技術院生命工学工業技術研究所，受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１６９８３、以下、寄託乳酸菌という。）の培養上清液若しくは該培養上清液から精製した物質（現時点では末同定）は、酒母，モロミ，生酒に添加しても、酵素によって抗菌活性が失われることなく、火落菌に対して殺菌作用を示すため火落菌による汚染を生じさせない、若しくは既に汚染している火落菌を死滅させる効果が生ずることを実験により確認した。従って、寄託乳酸菌は抗菌性物質を生産しているものと推測される。よって、寄託乳酸菌を使用することで酒の火落ちがなくなり、常に高品質を保持した清酒若しくは生酒が得られることになる。
【００１３】
また、当該培養上清液は熱に対して安定であることも実験で確認しており、従って、加熱殺菌工程を経る清酒の場合（例えば最終的瓶詰め前に加熱工程を採用する場合）にも当該寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質は使用でき長時間火落ち防止効果が期待できる。即ち、瓶詰めの処理の際、空気中から菌が侵入したりしても、当該寄託乳酸菌から生産される物質は抗菌活性を失っていない為、火落ち防止上効果が継続し得ることになる。
【００１４】
本発明は上述のように、酒母，モロミ，生酒等に寄託乳酸菌の培養上清液若しくは該培養上清液から精製した物質を添加するから、酒の製造工程中，貯蔵中または瓶詰め後、火落菌が汚染しても火落菌の増殖を抑え腐造を防止することのできる画期的な抗腐敗酒の製造方法となる。
【００１５】
【実施例】
以下に本発明の実験例について述べる。
【００１６】
（１）  培養上清液の火落菌に対する抗菌スペクトル実験
乳酸菌培地上に寄託乳酸菌のコロニーを培養により形成し、このコロニー上に各々被検菌を接種した火落菌用培地を重層固化し、５〜７日間３０℃にて培養した。寄託乳酸菌のコロニーのまわりに透明な環状帯（増殖阻害）を現したものを感受性菌、そうでないものを非感受性とした。結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
0003554232.tif 000002
【００１８】
表１に示すように、寄託乳酸菌は、アルコール度数１５％以上の清酒に生育しやすいＬ．ｆｒａｃｔｉｖｏｒａｎｓ、アルコール度数１０％の清酒に生育しやすいＬ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉなどに効果があることがわかった。
【００１９】
（２）  寄託乳酸菌の培養上清液を添加した酒の腐敗実験
火入れ前（生酒）、火入れ後（清酒）に前記寄託乳酸菌の２４時間培養上清液を生酒，清酒９ｍｌに対し夫々１ｍｌ添加後、火落菌を菌体数１０６（ＣＦＵ／ｍｌ）になるように接種し、３０℃で培養を行い火落菌の増殖度合いを調べた。結果を表２に示した。尚、火入れとは酒を６５〜７０℃で加熱する操作で、これにより、酒の殺菌，酒中の酵素の失活を行い、清酒の品質を保持するものである。
【００２０】
【表２】
0003554232.tif 000003
【００２１】
表２に示すように、火入れ前、火入れ後ともに添加した培養上清液によって、火落菌の増殖を阻害・死滅させる効果があった。これは生酒中に含まれる酵素によって培養上清液中の抗菌活性物質が分解されないことを示している。これらの結果から、培養上清液の添加で抗腐敗酒が得られることがわかった。
【００２２】
尚、寄託乳酸菌を酒母，モロミに対して添加しても表１及び２と同様な結果が得られ、また、当該培養上清液を精製して得た物質を用いても表１及び２と同様な結果が得られる。
【００２３】
（３）  寄託乳酸菌が生産する抗菌物質の活性測定法
寄託乳酸菌の培養上清液に含まれる抗菌物質の活性を円筒寒天平板法で測定した。滅菌シャーレ（径９ｃｍ）に１％（ｗ／ｖ）寒天を含むＭＲＳ培地２０ｍｌを流し固化させ、次に、ＭＲＳ液体培地中３０℃、４８時間培養した試験菌  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ  ＩＦＯ  １５８８６  を滅菌生理食塩水で１０倍に希釈し、これを１％（ｗ／ｖ）寒天４ｍｌに１００μｌ加え重層固化した。この平板上に４個のステンレススチール製の円筒（内径６ｍｍ、外形８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を乗せ測定用の円筒寒天平板とした。円筒中には段階的に希釈した抗菌物質を含む溶液を１００μｌ注入し、３０℃で、４８時間培養した。円筒の周囲に阻止円が出来る最大の希釈率の逆数を抗菌物質の活性（ＡＵ／ｍｌ）とした。
【００２４】
（４）  抗菌性物質の性質についての実験
寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質の性質を検討した。寄託乳酸菌の培養上清液１．０ｍｌ（４０ＡＵ／ｍｌ）を、下記表３の各条件で加熱処理を行い、氷中で冷却後活性を測定した。結果を表３に示した。
【００２５】
【表３】
0003554232.tif 000004
【００２６】
表３に示すように、寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質は１００℃、３０分の処理を行っても活性は失われなかった。
【００２７】
（５）  抗菌活性に及ぼす各種プロテアーゼの影響実験
培養上清液２．０ｍｌ（４０ＡＵ／ｍｌ）に下記表４に示した各種プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を１．０ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３０℃で２０時間保温した。続いて、１００℃で１０分間加熱して前記プロテアーゼを失活した後、活性を測定した。結果を下記表４に示した。
【００２８】
【表４】
0003554232.tif 000005
【００２９】
表４に示すように、寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質の活性は、  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ、Ｔｒｙｐｓｉｎ  で処理することによって完全に失われた。また、  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ  、  Ｐａｐａｉｎ  で処理することによって活性が半減した。これらの結果は寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質が、タンパク性の物質であることを示している。
【００３０】
（６）  抗菌性物質の精製実験
寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質を以下の方法で部分精製した。
【００３１】
段階１．硫酸アンモニウムによる分画
ＭＲＳ液体培地で３０℃，２４時間培養した寄託乳酸菌を５００ｍｌのＭＲＳ液体培地に１０％（ｖ／ｖ）移植し、同条件（３０℃，２４時間）で培養した。これを１０，０００ｘｇ（ｘｇ＝重力加速度），２０分遠心して上清液を得た。この上清液に３０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩４℃で放置後、１０，０００ｘｇ，２０分遠心して沈殿を除去した。沈殿を除去した上清液に更に８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩４℃で放置後、１０．０００ｘｇ，２０分遠心し、８０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム沈殿画分を得た。この沈殿を少量のイオン交換水に溶解し、これを粗抗菌物質とした。
【００３２】
段階２．脱塩及びＭｏｎｏ  Ｓカラムクロマトグラフィー
粗抗菌物質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０緩衝溶液で平行化したＦａｓｔ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍ  ＨＲ  １０／１０カラム（ファルマシアバイオテク社製）で脱塩した。得られたフラクション（液体）の内、活性のあるフラクションを一つにまとめ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ９．０緩衝溶液で平行化したＭｏｎｏ  Ｓ  ＨＲ  ５／５カラム（ファルマシアバイオテク社製）にのせ、同緩衝液で洗浄後、０−１．０Ｍ  ＫＣｌを含む同緩衝液の直線濃度勾配法で溶出した。
【００３３】
これにより、寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質を比活性７２ＡＵ／ｍｇまで部分精製した。
【００３４】
得られた物質の精製の試験結果を下記表５に示す。
【００３５】
【表５】
0003554232.tif 000006
【００３６】
表５に示すように、上記段階１．及び段階２．によって、タンパク１ｍｇ当たりの活性（比活性）の高い物質が得られた。これは、上記段階１．及び段階２．によって（若しくは上記段階１．か段階２．のいずれかでも）、寄託乳酸菌が生産する抗菌性物質を精製できることを示している。
【００３７】
尚、硫酸アンモニウム以外の物質によってタンパクを沈殿させる方法でも同様の結果を得ることができるものと考えられる。
【００３８】
以下、上記実験の結果得られた作用効果をまとめる。
【００３９】
１．無菌的な充填装置，限外ろ過装置等の高額な設備投資を行っても完全に防ぐことができなかった火落ちを防ぐことができ、既存の設備を利用して安全に生酒の製造，出荷ができる。
【００４０】
２．特に通常の清酒と比較して、火落菌汚染の危険性の大きい低アルコール酒での効果が期待でき、大きく酒質の多様化につながる。
【００４１】
３．通常、生酒以外の清酒は貯蔵前と瓶詰め前の二回、加熱殺菌を行うが、両方あるいは一方の加熱工程を省略することが可能になり、コストを押さえ、なおかつ品質の向上につながる。
【００４２】
４．本実施例による抗菌性物質の研究は他の食品へも応用が可能となり、食品産業の雑菌汚染防止への用途開発にもつながる。
【００４３】
５．本実施例による抗菌性物質は熱に強く、酒の生産工程において加熱を必要とする場面があっても、該抗菌性物質によって火落菌が殺菌される。
【００４４】
６．本実施例による抗菌性物質はタンパク性の物質であり、このタンパクの活性により火落菌が殺菌される。
【００４５】
７．本実施例による抗菌性物質は硫酸アンモニウムによる不活性タンパクの沈殿や、脱塩やＭｏｎｏ  Ｓカラムによって精製することができる。