(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｎｏｂｉｌｉｓ  ）を、Ｄ−セリンを含有する澱粉・アンモニウム培地で培養することを特徴とする炎症抑制物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（以下、「Ｓ．ノビリス」と略記する）の培養によってアレルギー性および非アレルギー性炎症抑制物質（以下、「ＳＥＫ−１００５」と略記する）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炎症反応はアレルギー性炎症と非アレルギー性炎症に大別される。アレルギーは、ある抗原との２度目の接触の際に生じる免疫反応が、個々人によって過度にあるいは不適当な形で現われる一種の病的症状であって、関与する抗体の性質の違いからＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ  型およびＩＶ型の反応に分類されている。これら４つの型のうち、ＩＩＩ  型反応（免疫複合体反応：アルサス反応）およびＩＶ型反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反応）に関与するアレルギー性炎症反応は慢性関節リウマチのような自己免疫疾患、更には喘息、肝炎、腎炎、皮膚炎のような種々の炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じていることが明らかになってきた。
【０００３】
ところで、従来より放線菌培養濾液中には種々の抗生物質が見つけられており、当該培養濾液は生理活性物質の宝庫と言われている。しかしながら、アレルギー性炎症を抑制する物質は、現在までのところ放線菌培養濾液から見つけられた例がない。
【０００４】
また、従来の抗炎症剤であるアスピリン（日経サイエンス  ３：７０（１９９１））やインドメタシン（Ｔｈｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３：１０５７（１９８５）  ）は、アレルギー性炎症に対して抑制作用が極めて弱いという問題点がある。
【０００５】
本発明者らは、原材料としてＳ．ノビリスを用いてアレルギー性炎症抑制作用を有する物質の探索を行った結果、培養液またはその乾固物から有機溶剤によって抽出された抽出物が、アレルギー性および非アレルギー性の炎症反応に対する顕著な抑制作用と安全性を有することを確認し、抗炎症剤として全く問題がないものであることを見い出し（特開平５−２５０５３号）、さらにその精製法も確立した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来よりＳ．ノビリスの培養に用いられていた澱粉・アンモニウム培地（可溶性澱粉、Ｋ２  ＨＰＯ４  およびＮＨ４  Ｃｌからなる）では、ＳＥＫ−１００５の生産性が低い点が問題となっていた。
【０００７】
本発明の目的は、このような実情から、Ｓ．ノビリスの培養に用いる培地を改良し、ＳＥＫ−１００５をより効率的に得ることができる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｎｏｂｉｌｉｓ  ）を、従来の澱粉・アンモニウム培地にＤ−セリンを添加してなる培地で培養することにより、炎症抑制物質ＳＥＫ−１００５の生産性が顕著に向上することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
炎症抑制物質を産生する放線菌Ｓ．ノビリスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ  ４２７４）（これは米国においてＡＴＣＣ  １９２５２およびオランダにおいてＣＢＳ  １９８．６５としても保存）などの菌が使用できる。
【００１０】
一般に放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、以下のような栄養物を含んだ培地を用いて行われる。すなわち、液体培地の場合、その成分として、ブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質類などの１種または複数種を含んだ水溶液が用いられる。
【００１１】
本発明方法において、ＳＥＫ−１００５を生産させるための培地は、Ｄ−セリンを含有する澱粉・アンモニウム培地である。澱粉・アンモニウム系の培地の代表的な例としては、可溶性澱粉、リン酸水素二カリウム（Ｋ２  ＨＰＯ４  ）および塩化アンモニウム（ＮＨ４  Ｃｌ）を含む液体培地が挙げられる。Ｄ−セリンはアミノ酸の１種であり、市販品を用いることができる。
【００１２】
培地中の可溶性澱粉の濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％、Ｋ２  ＨＰＯ４  の濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％、ＮＨ４  Ｃｌの濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％である。また、培地中のＤ−セリンの濃度は好ましくは０．００１〜１．０重量％である。
【００１３】
液体培地のｐＨは２〜９の範囲が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ましい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日である。なお、固体培養の場合には、おもに上記の液体培養の培地にさらに寒天を含んだものを用いるが、固体培養の培養条件も液体培養のそれとほぼ同じである。
【００１４】
こうして、Ｓ．ノビリスを培養した後、溶剤抽出、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー等の常套手段により産生物を回収する。
【００１５】
本発明方法により得られたＳＥＫ−１００５を炎症抑制剤に製剤化するには、通常はこれを製剤用担体と共に製剤組成物の形態とする。担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、滑沢剤などの稀釈剤あるいは賦形剤が例示される。また適当な溶剤を選定することにより、得られた溶剤抽出液ないしはその濃縮物をそのままの形態で外用液剤として使用することもできる。
【００１６】
ＳＥＫ−１００５を用いて製剤化される炎症抑制剤の投与単位形態としては、上記の如き外用液剤の外、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、軟膏剤などが例示される。
【００１７】
炎症抑制剤中に含有すべきＳＥＫ−１００５の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好ましくは炎症抑制剤中に０．１〜５０重量％の範囲である。
【００１８】
ＳＥＫ−１００５より得られた炎症抑制剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。たとえば上記の如き外用液剤の場合には、これを皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接塗布し、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与され、また軟膏剤の場合には塗布される。
【００１９】
ＳＥＫ−１００５より得られた炎症抑制剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択されるが、通常は１日当りＳＥＫ−１００５として０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組成物を３〜４回／日に別けて投与することももちろん差し支えない。
【００２０】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例を挙げて、本発明を具体的に実証する。
【００２１】
実施例１
５００ｍｌ容の坂口フラスコ２本において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に対し、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）にＤ−セリン（ナカライテスク社製）０．０１重量％を添加して、それぞれ液体培地１２５ｍｌを調製した。ついで、これらの培地に、理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を接種し、振とう培養器（ＴＡＩＴＥＣ社製、Ｂｉｏ−Ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−３００Ｌ）を用いて、３０℃、１６０ｒｐｍで振とう培養した。培養時間と培養液中のＳＥＫ−１００５生産量の関係を調べるために、培養開始から４８時間および９６時間後に各フラスコから５０ｍｌずつサンプリングを行った。同時刻のサンプリング液同士を集め、各収集液を遠心分離（２５００Ｇ×１０ｍｉｎ）し、上清を得た。この上清１００ｍｌを３００ｍｌ容の分液ロートに入れ、これに等量の酢酸エチルを加え、混合液を１０分間振とうした。５分間静置後、水相と酢酸エチル相を分離した。分離した水相に等量の酢酸エチルを加え、上述の操作を繰り返し、再度水相と酢酸エチル相を分離した。分離した水相に等量の酢酸エチルを加え、上述の操作をもう一度繰り返した。こうして３回の操作で得られた酢酸エチル相を集めて、集合液をエバポレーターで濃縮乾固し、粗抽出物を得た。粗抽出物を１ｍｌのメタノールに溶かしたものを、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する）を用いた分析用試料とした。
【００２２】
まず、ＨＰＬＣでＳＥＫ−１００５を定量するために、以下のように検量線を作成した。ＳＥＫ−１００５は、ＯＤＳカラム（東ソー社製、ＯＤＳ−８０ＴＭ、φ４．６ＭＭＩＤ×２５．０ＣＭＬ）を用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６０００Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオーブン６５５Ａ−５２）において、検出波長２１０ｎｍ、温度４０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎの条件で、溶離液として水：アセトニトリル：メタノール＝６：７：７を用いた場合、４１〜４５分のリテンションタイムを示すことは、すでにわかっている。このことを利用して、ＳＥＫ−１００５をメタノールに溶解させて  ２、  ５、１０、２０、５０、１００  μｇ／ｍｌとしたものの４０μｌ、すなわち０．０８、０．２  、０．４  、０．８  、２．０  、４．０  μｇをそれぞれ上記条件でＨＰＬＣに供し、ＳＥＫ−１００５量とピーク面積との関係を調べた。このとき、０．２  〜２．０  μｇの範囲で直線関係があることがわかり、直線回帰計算により得られた直線を、ＳＥＫ−１００５検量線とした。図１は、ＨＰＬＣに供したＳＥＫ−１００５の量とそのピーク面積の関係およびその回帰直線を示すグラフである。
【００２３】
次いで、上記の分析用試料を同じ条件でＨＰＬＣに供し、得られたＳＥＫ−１００５のピーク面積から、上記検量線によりＳＥＫ−１００５の含有量を計算した。
【００２４】
培養時間とＳＥＫ−１００５生産量との関係を表１に示す。
【００２５】
実施例２
５００ｍｌ容の坂口フラスコ２本において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）に酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、イーストエクストラクト）０．２重量％を添加して、それぞれ液体培地１２５ｍｌを調製した。ついで、これらの培地に、理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を接種し、振とう培養器（ＴＡＩＴＥＣ社製、Ｂｉｏ−Ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−３００Ｌ）を用いて、３０℃、１６０ｒｐｍで９６時間振とう培養（種培養）した。さらに、１０リットル容ジャーファーメンター（三ツワバイオシステム社製、ＫＭＪ−１０Ｃ−ＦＰＭＩＩＩ）において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に対し、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）にＤ−セリン（ナカライテスク社製）０．０１重量％を添加して、液体培地６リットルを調製した。この培地に、上記種培養液の４２ｍｌを接種し、３０℃、３００ｒｐｍで６日間、通気攪拌しながら培養を行った。なお、通気量は２リットル／ｍｉｎとし、ｐＨは０．１ＮのＨＣｌおよびＮａＯＨを用いて６．５に保った。培養開始後、培養液中に含まれるＳＥＫ−１００５を経時的に定量するため、培養液から２４時間ごとに約１００ｍｌずつをサンプリングした。サンプリングした培養液は、それぞれ実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣ分析によりＳＥＫ−１００５含有量を測定した。培養時間とＳＥＫ−１００５生産量との関係を表２に示す。また、培養開始から３日後の培養液を酢酸エチルで抽出処理し、この抽出液のＨＰＬＣ分析を行った。この分析チャートを図２に示す。
【００２６】
比較例１
培地として、Ｄ−セリンを含有しない澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）を用いる以外は、実施例１と同じ方法で放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を培養し、培養時間とＳＥＫ−１００５生産量との関係を調べた。その結果を実施例１の結果とともに表１に示す。
【００２７】
【表１】
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実施例１と比較例１の結果を示す表１から明らかなように、放線菌Ｓ．ノビリスを培養する際、Ｄ−セリンを含有しない澱粉・アンモニウム培地を用いた場合では、培養開始後４日目でＳＥＫ−１００５の生産量がピークとなり、その生産量は、１４６．３μｇ／ｌであった。しかし、同培地にＤ−セリンを０．０１重量％添加した場合には、生産量のピークは４日目と同じであったが、その生産量は２６０．２μｇ／ｌであった。すなわちＤ−セリンを添加することによって、約２倍の量のＳＥＫ−１００５生産を達成できることがわかる。
【００２８】
比較例２
培地として、Ｄ−セリンを含有しない澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）を用いる以外は、実施例２と全く同じ方法で放線菌Ｓ．ノビリスを培養し、培養時間とＳＥＫ−１００５生産量との関係を調べた。その結果を実施例２の結果とともに表２に示す。また、培養開始から３日後の培養液を酢酸エチルで抽出処理し、この抽出液のＨＰＬＣ分析を行った。この分析チャートを図３に示す。
【００２９】
【表２】
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表２および図３から明らかなように、放線菌Ｓ．ノビリスを培養する際、Ｄ−セリンを含有しない澱粉・アンモニウム培地を用いた場合では、培養開始後３日目でＳＥＫ−１００５の生産量がピークとなり、その生産量は２３．６μｇ／ｌであった。しかし、同培地にＤ−セリンを０．０１重量％添加した場合には、生産量のピークは３日目であったが、その生産量は７７７．４μｇ／ｌであった。すなわち、後者は前者と比較して、約３２倍の量のＳＥＫ−１００５生産を達成できることがわかる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、放線菌ストレプトマイセス・ノビリスをＤ−セリンを含有する澱粉・アンモニウム培地で培養することにより、炎症抑制物質を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、ＨＰＬＣに供したＳＥＫ−１００５の量とそのピーク面積の関係およびその回帰直線を示すグラフである。
【図２】実施例２において、培養開始から３日後の培養液を酢酸エチルで抽出処理し、この抽出液のＨＰＬＣ分析を行って得られた分析チャートである。
【図３】比較例２において、培養開始から３日後の培養液を酢酸エチルで抽出処理し、この抽出液のＨＰＬＣ分析を行って得られた分析チャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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