【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年2月7日(2017.2.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】膵胆管癌の診断、予後、再発のモニターおよび治療的／予防的治療の評価のための物質および方法
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌、特に膵胆管癌（ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）の診断、予後、再発のモニターおよび治療的または予防的治療の評価、遺伝子型異常の検出、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法、ならびにそのような方法において有用なプローブのセットおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
胆管上皮から生じる悪性疾患である胆管癌（ＣＣＡ）および膵癌は、膵胆道において見出される最も一般的な腫瘍型である。これらの癌は高い死亡率を示し、５年生存率は５％未満である。膵癌は２００９年に米国で１０番目に多いタイプの癌であるが、米国人において第４位の癌死亡原因である。
【０００３】
ＣＣＡは比較的稀な腫瘍であるが、その頻度は世界中で増加しつつあり、その理由は不明である。慢性炎症が胆管上皮の癌の発生の傾向を高めることを証拠は示唆している。したがって、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を有する患者は胆管癌の高いリスクを有する。ＰＳＣ患者は、典型的に、疑わしい領域の細胞学的ブラッシングを含む定期的なＥＲＣＰサーベイランスを受ける。
【０００４】
膵胆管悪性疾患を有する患者は末期に症状を示す傾向にあり、この時には、成功しうる介入の確率は低い。早期検出は外科的切除のための最良の機会を患者に与え、現在のところ、外科的切除が、最も生存可能な治療選択肢である。
【０００５】
内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）中の適当な診断用組織の獲得は難題である。生検採集の成功は、幾つかの構造体の、困難な解剖学的位置により妨げられうる。膵胆管生検は小さく、不適当であり、および／または診断用細胞を欠く傾向にある。腫瘍の病理学的証拠（例えば、生検、細胞学的ブラッシングおよび細針吸引（ＦＮＡ））は癌の疑いを確認するのに必要であるが、現在の診断アッセイは悪性疾患の検出に関する限られた感度しか有していない。ＥＲＣＰ中に細胞学的ブラッシングが行われることがあり、それは癌の精査中の全領域をサンプル採取しうるため、組織学的検査が陰性である場合、悪性疾患の診断を与えうるが、通常の細胞診の感度は十分とは言えない。ＥＣＲＰブラッシングの通常の細胞学的分析による癌の検出率は比較的低い（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃにおいては２０％）。細胞学的ブラッシングに対するデジタルイメージ分析（ＤＩＡ）および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、通常の細胞診と比較して癌の検出率を改善しているが、ＤＩＡは、悪性疾患の、独立した予測因子ではないことが示されており、中止されている（Ｆｒｉｔｃｈｅｒら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６（７）：２１８０−２１８６（２００９））。元々は膀胱癌の検出のために設計されたプローブ（ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を使用するＦＩＳＨは、悪性疾患の、独立した予測因子であることが示されている（Ｆｒｉｔｃｈｅｒら（２００９），前掲）。しかし、ＦＩＳＨは通常の細胞診と比較して約２倍多くの癌症例を検出するが、それは癌試料の半分を検出できない。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）はＰ１６遺伝子に対する遺伝子座特異的プローブを含有し、Ｐ１６遺伝子は、第９染色体の短腕上に位置する腫瘍抑制遺伝子であり、膵胆管癌の集団において欠失していることが公知である（Ｃａｌｄａｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８（１）：２７−３２（１９９４）；また、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８（４）：４１０（１９９４）における正誤表も参照されたい）。しかし、陽性に関する閾値は確定されておらず、したがって、本出願人の知る限りにおいては、このプローブは現在の臨床実施において評価されていない。コンピュータ断層撮影、超音波および磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）のようなイメージング法は膵胆管の可視化を可能にする。しかし、イメージングを用いる良性構造と悪性構造との識別は常に可能なわけではない。膵胆管悪性疾患を有する患者においては、ＣＡ１９−９のような血清腫瘍マーカーレベルが上昇しうるが、そのようなマーカーは癌に特異的ではなく、したがって限られた有用性しか有していない。
【０００６】
Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５６（１）：７３−８２（１９９９））は、３０個の浸潤性管性腺癌および２３個の膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＴ）の免疫組織学的分析ならびに６個の癌組織および７個の膵癌細胞系の免疫ブロット分析を用いて、膵癌におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の幾つかのメンバーの発現を調べたと報告している。Ｍｃｌ−１（骨髄細胞白血病配列１）の発現が浸潤性管性腺癌の９０％および膵管内乳頭粘液性腺癌の８８％において見出されたと報告されている。Ｍｃｌ−１タンパク質レベルは全ての膵癌細胞系において均一に高かったと報告されている。
【０００７】
ＭｃＫａｙら（ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ）１３（５）：３０９−３１９（２０１１年５月；２０１１年３月１０日に電子公開））は、ＣＣＡにおける新規潜在的治療標的を特定するためにアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いたと報告している。とりわけ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）遺伝子を含む領域が頻繁に得られたと報告されている。Ｈａｒｄｅｒら（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１５（３６）：４５１１−４５１７（２００９年９月２８日））は、ＥＧＦＲが進行胆管癌の患者における有望な治療標的でありうると報告している。Ｙｏｓｈｉｋａｗａら（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９８（２）：４１８−４２５（２００８年１月２９日；２００７年１２月１８日に電子公開））は、とりわけＥＧＦＲの免疫組織化学的分析を用いて、ＣＣＡの２３６症例を遡及的に評価したと報告している。彼らはＥＧＦＲの過剰発現と肝外胆管癌（ＥＨＣＣ）の肉眼的型、リンパ節転移、腫瘍病期、リンパ管浸潤および神経周囲浸潤との関連性を認めたと報告している。ＥＧＦＲ発現は重要な予後因子および腫瘍再発のリスク因子であることが判明したと報告されている。そのような結果に基づいて、彼らは、ＥＧＦＲ発現がＣＣＡにおける腫瘍発現に関連していると示唆した（Ｉｔｏら，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９７（２）：９５−１００（２００１）も参照されたい）。Ｇｗａｋら（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３１（１０）：６４９−６５２（２００５年１０月；２００５年１０月２０日に電子公開））は、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における欠失が、肝内または分化不良ＣＣＡにおいて、より一般的に見出されることを認めたと報告している。
【０００８】
膵腺癌における、とりわけＭＹＣ遺伝子の増加／増幅が、Ｂｉｒｎｂａｕｍら（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ５０（６）：４５６−４６５（２０１１年６月；２０１１年３月１５日に電子公開））により報告されている。
【０００９】
遺伝子のなかでもとりわけＰ１６遺伝子の改変が膵胆管腺癌（ＰＤＡＣ）（Ｄｅｌｐｕら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２（１）：１５−２４（２０１１年３月））および膵管内乳頭粘液性新生物（ＩＰＮＭ）（Ｈｕｏら，Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｂｉｎｇ  Ｌｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ３７（１０）：６７０−６７５（２００８年１０月））において頻繁に認められると報告されている。また、Ｋａｒａｍｉｔｏｐｏｕｌｏｕらは、Ｐ１６がＣＣＡにおける重要な予後マーカーであることを開示している（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０（５）：７８０−７８６（２００８年１１月））。Ｔｏｎｉｎｉらは、膵癌の患者の結末の、独立した予測因子としての、とりわけＰ１６に関する有力な証拠が存在することを開示している（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １１（１２）：１５５３−１５６９（２００７年１２月））。そのような変化は発癌中に徐々に生じると報告されている。Ｐ１６（ＭＴＳ１）遺伝子の頻繁な体細胞突然変異およびホモ接合欠失が膵腺癌において報告されている（Ｃａｌｄａｓら，（１９９４），前掲）。他の研究者は、癌と慢性炎症とを識別するためにそのような変化が利用可能であると報告している（例えば、Ｔｈｏｓａｎｉら，Ｐａｎｃｒｅａｓ  ３９（８）：１１２９−１１３３（２０１０年１１月）を参照されたい）。
【００１０】
前記を考慮すると、より高感度で、より高い信頼性を有し、より情報性に富む診断および予後方法が膵胆管癌の処置において依然として必要とされている。本開示は、膵胆管癌の診断、予後および治療的または予防的治療の評価のためのマーカーのセット、ならびに該マーカーセットを含む使用方法およびキットを提供しようとするものである。膵胆管癌の最適な検出のための最良の組合せを決定するためには、本明細書に記載されている種々のマーカーの広範な試験が必要であった。この及び他の目的および利点ならびに本発明の特徴は、以下に記載されている詳細な説明から明らかとなるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｒｉｔｃｈｅｒら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６（７）：２１８０−２１８６（２００９）
【非特許文献２】Ｃａｌｄａｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８（１）：２７−３２（１９９４）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８（４）：４１０（１９９４）における正誤表
【非特許文献４】Ｍｉｙａｍｏｔｏら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５６（１）：７３−８２（１９９９）
【非特許文献５】ＭｃＫａｙら，ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ）１３（５）：３０９−３１９（２０１１年５月；２０１１年３月１０日に電子公開）
【非特許文献６】Ｈａｒｄｅｒら，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１５（３６）：４５１１−４５１７（２００９年９月２８日）
【非特許文献７】Ｙｏｓｈｉｋａｗａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９８（２）：４１８−４２５（２００８年１月２９日；２００７年１２月１８日に電子公開）
【非特許文献８】Ｉｔｏら，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９７（２）：９５−１００（２００１）
【非特許文献９】Ｇｗａｋら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３１（１０）：６４９−６５２（２００５年１０月；２００５年１０月２０日に電子公開）
【非特許文献１０】Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ５０（６）：４５６−４６５（２０１１年６月；２０１１年３月１５日に電子公開）
【非特許文献１１】Ｄｅｌｐｕら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２（１）：１５−２４（２０１１年３月）
【非特許文献１２】Ｈｕｏら，Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｂｉｎｇ  Ｌｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ３７（１０）：６７０−６７５（２００８年１０月）
【非特許文献１３】Ｋａｒａｍｉｔｏｐｏｕｌｏｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０（５）：７８０−７８６（２００８年１１月）
【非特許文献１４】Ｔｏｎｉｎｉら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １１（１２）：１５５３−１５６９（２００７年１２月）
【非特許文献１５】Ｔｈｏｓａｎｉら，Ｐａｎｃｒｅａｓ  ３９（８）：１１２９−１１３３（２０１０年１１月）
【発明の概要】
【００１２】
概括
患者における高い段階の異形成、膵胆管癌、膵胆管への転移癌を検出する、またはそのリスクの増大を推測する方法を提供する。該方法は、患者からの内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）中に採集されたブラッシング試料のような膵胆管細胞のサンプルを、骨髄細胞白血病配列１（ＭＣＬ１）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む検出可能な様態で標識されたプローブのセットと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、染色体異常の存在を判定することを含む。ポリソミーは高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示し、一方、テトラソミー、Ｐ１６の喪失、ＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得、あるいは併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。
【００１３】
また、プローブのセットを提供する。該プローブセットはＭＣＬ１に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む。
【００１４】
また、キットも提供する。該キットは、（ａ）患者における膵胆管癌の検出を可能にするプローブのセット（ここで、該プローブセットはＭＣＬ１に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む）、および（ｂ）患者における膵胆管癌を検出するための説明書（ここで、該説明書は、患者から得られた膵胆管細胞のサンプルにおいて、染色体異常の存在を判定することを含む）を含む。ポリソミーは高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示し、一方、テトラソミー、Ｐ１６の喪失、ＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得、あるいは併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はプローブに対する細胞の百分率の棒グラフであり、ここで、白色の棒は正常を示し、陰影付きの棒は癌を表す。
【図２】図２はプローブに対する平均プローブコピー数の棒グラフである。
【図３】図３は、プローブに対する、ホモ接合喪失を有する細胞の百分率の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本開示は、膵胆管癌の診断、予後、再発のモニターおよび治療的または予防的治療の評価のためのマーカーのセット、ならびに該マーカーセットを含む使用方法およびキットを提供しようとするものである。以下の用語が本開示に適用される。
【００１７】
「約」は、示されている値からの凡そ＋／−１０％の変動を意味する。そのような変動は、本明細書に記載されている任意の与えられた値に、それに対して特定の言及がされているかどうかにかかわらず、常に含まれると理解されるべきである。
【００１８】
米国国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により定義されている「生物マーカー」は、「正常な生物学的過程、発病過程または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定され評価される特性」である。
【００１９】
「胆管癌（ＣＣＡ）」は、肝臓から胆汁を排出する胆管の癌である。それは、該腫瘍の全てが完全に切除できなければ治療不能であり急速に致死的となる比較的稀な腺癌である。
【００２０】
「染色体計数（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）プローブ（ＣＥＰ）」または「動原体プローブ」は、細胞内の特定の染色体の数が数えられることを可能にする任意のプローブである。染色体計数プローブは、典型的には、特定の染色体の動原体の近く又は該動原体における領域、典型的には反復性ＤＮＡ配列（例えば、アルファサテライトＤＮＡ）を認識し、それに結合する。動原体は細胞分裂中の忠実な分離に必要とされるため、染色体の動原体は、典型的に、その染色体を代表するとみなされる。特定の遺伝子座に対応するシグナルの数（コピー数）を、動原体に対応するシグナルの数と比較することにより、特定の染色体領域の欠失または増幅は、それが通常は存在する染色体全体の喪失または獲得（アネウソミー（ａｎｅｕｓｏｍｙ））から区別されうる。この比較を行うための１つの方法は、該遺伝子座を表すシグナルの数を、動原体を表すシグナルの数で割り算することである。１未満の比は該遺伝子座の相対的な喪失または欠失を示し、１より大きな比は該遺伝子座の相対的な増加または増幅を示す。同様に、染色体内の不均衡な獲得または喪失を示すために、同じ染色体上の２つの異なる遺伝子座の間で、例えば、該染色体の、２つの異なる腕上で、比較が行われうる。染色体全体の喪失または獲得を概算するために、染色体に対する動原体プローブの代わりに、染色体腕プローブが代替的に使用されうる、と当業者は認識するであろう。しかし、そのようなプローブは、染色体を計数するのに、それほど正確ではない。なぜなら、そのようなプローブに対するシグナルの喪失は、染色体全体の喪失を常に示すわけではない可能性があるからである。染色体計数プローブの例には、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ（旧称Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から商業的に入手可能であるＣＥＰ（登録商標）プローブが含まれる。
【００２１】
「コピー数」は、単一遺伝子座、１以上の遺伝子座またはゲノム全体のＤＮＡのいずれかには無関係に、そのようなＤＮＡの測定値である。２の「コピー数」は、（性染色体を除き、二倍性ゆえに）ヒトにおいては「野生型」である。ヒトにおける（性染色体の場合を除く）２以外の「コピー数」は野生型から逸脱している。そのような逸脱は、増幅、すなわち、コピー数の増加、および欠失、すなわち、コピー数の減少、更にはコピー数の非存在を含む。
【００２２】
「標識された」、「検出可能な標識で標識された」および「検出可能な様態で標識された」は、実体（例えば、プローブ）が検出可能であることを示すために、本明細書において互換的に用いられる。「標識」および「検出可能な標識」は、実体を検出可能にするために該実体に結合させた部分、例えば、標的配列への結合に際してプローブを検出可能にするために該プローブに結合させた部分を意味する。該部分自体は検出可能でないかもしれないが、更にもう１つの部分と反応すると検出可能となりうる。「検出可能な様態で標識された」なる語の使用は、そのように標識することを含むと意図される。検出可能な標識は、測定されうるシグナルを該標識が生成し、該シグナルの強度が結合実体の量に比例するするように選択されうる。核酸のような分子を標識および／または検出するための多種多様な系、例えばプローブがよく知られている。標識核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により直接的または間接的に検出可能な標識を組込む又はコンジュゲート化（結合）することにより調製されうる。適当な検出可能標識には、放射性同位体、発蛍光団、発色団、化学発光物質、微粒子、酵素、磁性粒子、電子密集粒子、質量標識、スピン標識、ハプテンなどが含まれる。発蛍光団および化学発光物質が本発明において好ましい。
【００２３】
「遺伝子座特異的プローブ」および「遺伝子座特異的識別体（ＬＳＩ）」は、染色体上の領域内の特定の遺伝子座、例えば、転移において獲得／喪失を受けることが確認されている遺伝子座に選択的に結合するプローブを表すために、本明細書において互換的に用いられる。プローブは、エキソン、イントロンおよび／または調節配列、例えばプロモーター配列などを含むコードもしくは非コード領域またはその両方を標的化しうる。
【００２４】
「核酸サンプル」は、プローブとのハイブリダイゼーションに適した形態の核酸を含むサンプル、例えば、核またはそのような核から単離もしくは精製された核酸を含むサンプルを意味する。核酸サンプルは、全または部分（例えば、特定の染色体）ゲノムＤＮＡ、全または部分ｍＲＮＡ（例えば、特定の染色体または遺伝子）、あるいは選択された配列を含みうる。凝縮染色体（例えば、間期または中期に存在するもの）はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨにおける標的としての使用に適している。
【００２５】
「膵胆管癌」は、全てのタイプの膵胆管癌、例えば、全てのタイプの膵癌、例えば、膵頭部癌および膵体部癌、ならびに前記の胆管癌（ＣＣＡ）、例えば、総胆管癌および門胆管癌、ならびに胆嚢癌を含む。
【００２６】
「所定カットオフ」および「所定レベル」は、一般に、アッセイ結果を所定カットオフ／レベルと比較することにより診断／予後／治療効力結果を評価するために用いられるカットオフ値を意味し、ここで、該所定カットオフ／レベルは種々の臨床パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善など）に既に関係または関連づけられている。
【００２７】
本開示の文脈における「プローブ」は、選択的ハイブリダイゼーションを可能または促進する条件下、標的配列の少なくとも一部に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。一般に、プローブはＤＮＡのコードまたはセンス（＋）鎖に相補的、あるいはＤＮＡの非コードまたはアンチセンス（−）鎖に相補的（「逆相補的」と称されることがある）でありうる。プローブは長さにおいて有意に変動しうる。幾つかの用途においては約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１５〜約７５ヌクレオチド、例えば、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さが好ましい可能性があり、一方、染色体プローブには約５０〜１×１０５ヌクレオチドの長さが好ましい可能性があり、遺伝子座特異的プローブには約２５，０００〜約８００，０００ヌクレオチドの長さが好ましい可能性がある。
【００２８】
本開示の文脈における「選択的にハイブリダイズする」（ならびに「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」）は、ストリンジェントな条件下の主として特定のヌクレオチド配列との核酸分子の結合、二本鎖形成またはハイブリダイゼーションを意味する。「ストリンジェントな条件」なる語は、プローブが主にその標的配列にハイブリダイズする、および他の非標的配列にそれより低い度合でハイブリダイズする又は全くハイブリダイズしない条件を意味する。核酸ハイブリダイゼーションの文脈における（例えば、アレイ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨにおける）「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、条件によって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）（“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定められたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全マッチプローブにハイブリダイズする（定められたイオン強度およびｐＨにおける）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上またはアレイ上の１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用した場合の４２℃である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）。
【００２９】
「標的配列」、「標的領域」および「核酸標的」は、例えば喪失および／獲得の判定の対象となっている特定の染色体位置に存在するヌクレオチド配列を意味する。本明細書において用いられている用語は、特定の実施形態を説明することを目的としたものであるに過ぎず、ほかの点において限定的であると意図されるものではない。
【００３０】
膵胆管癌の検出、診断、予後、再発モニターおよび治療的／予防的治療の効力のモニターの方法
患者における高い段階の異形成または膵胆管癌を検出する、あるいはそのリスクの増大を推測する方法を提供する。該方法は、患者からの膵胆管細胞のサンプルを、ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む検出可能な様態で標識されたプローブのセットと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、染色体異常の存在を判定することを含む。ポリソミーは高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示し、一方、テトラソミー、Ｐ１６の喪失、ＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得、あるいは併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。特に、ポリソミー（細胞当たり２コピーを超える２以上の遺伝子座）（例えば、＞４細胞におけるもの）は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示し、テトラソミー（４コピーの各遺伝子座）（例えば、＞１１細胞におけるもの）、またはｐ１６喪失（９ｑ２１の非存在）（例えば、少なくとも５％の細胞におけるもの）、または８＞細胞におけるＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得（細胞当たり２コピーを超える１つの遺伝子座）、あるいは４＞細胞における併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。該方法は、癌を炎症性良性状態から区別するために、前癌病変を特定するために、ＣＣＡのリスクを有することが知られている原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）患者のための早期スクリーニング手段を提供するために、ならびに治療判断を補助するための染色体異常に関する情報を得るために、ならびに／または予後情報および本明細書に記載されている他の利点を得るために使用されうる。
【００３１】
膵胆管細胞のサンプルはいずれかの適当な方法により得られうる。好ましい方法は内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）中のブラッシングによるものである。
【００３２】
前記方法は、当技術分野で公知のいずれかの適当な検出方法を用いて行われうる。好ましくは、前記方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて行われる。好ましくは、各プローブは検出可能な様態で標識され、２以上のプローブが同一サンプルに対して同時または連続的に使用される場合には、好ましくは、各プローブは、異なる標識、例えば異なる発蛍光団で、検出可能な様態で標識される。
【００３３】
各プローブが検出可能な様態で標識されている（そして２以上のプローブが同一サンプルに対して同時または連続的に使用される場合には、異なって標識されている）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば、各プローブが発蛍光団で標識されている（そして２以上のプローブが同一サンプルに対して同時または連続的に使用される場合には、異なって標識されている）ＦＩＳＨにより、前記方法が行われる場合、該方法は、新鮮な膵胆管細胞［新鮮細胞は１〜３日間培養されることが可能であり、染色体が高度に凝縮され可視化されうる中期において細胞を遮断するためにブロッカー、例えばコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）が培養に加えられることが可能である］のサンプルに対して行われることが可能であり、該サンプルは凍結され、または固定され（例えば、ホルマリン中で固定され、パラフィン中に包埋され）、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接近可能性を増大させ非特異的結合を低減するために（例えば、ＲＮアーゼおよびペプシンで）処理され、ついで１以上のプローブでのハイブリダイゼーション、未結合プローブを除去するための洗浄、およびハイブリダイズしたプローブの検出に付されうる。例えば、細胞懸濁液は単層としてスライド上に適用されることが可能であり、所望の細胞密度が得られるまで光学または位相差顕微鏡により細胞密度が測定されうる。該スライドを２×クエン酸ナトリウム塩液中に３７℃で１０分間、ＨＣｌ中の０．０５％  ペプシン中に３７℃で１３分間、ＰＢＳ中に室温で５分間、１％  ホルムアルデヒド中に室温で５分間、およびＰＢＳ中に室温で５分間浸漬し、等級付きアルコール中に通過させ、乾燥させることが可能である。膵胆管細胞のホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）サンプルの切片（厚さ約５μｍ）をスライド、例えばＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ正荷電スライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから入手可能）上にマウントし、５６℃で一晩焼き付けし、脱パラフィン化させ、１×クエン酸ナトリウム塩液（ｐＨ６．３）中に８０℃で３５分間浸漬させ、水中で３分間洗浄した。３７℃で１５分間のプロテアーゼ消化（４ｍｇ  ペプシン／ｍＬおよび０．２Ｎ  ＨＣｌ）の後、該切片を水中で３分間洗浄し、等級付きエタノールに通過させ、乾燥させることが可能である。好ましくは、ＦＦＰＥ切片またはスライド（細胞懸濁液を伴うもの（すなわち、細胞学的スライド））を使用する前記のとおりの１以上のプローブでのハイブリダイゼーションを、自動化共変性オーブン（ＨＹＢｒｉｔｅまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ／Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｂｂｏｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を製造業者の説明書に従い使用して（そのような方法は、典型的には、プローブおよび標的核酸の変性を含む）、３７℃で１６〜１８時間行う。ハイブリダイゼーション後、該切片または細胞学的スライドを、好ましくは、カバーガラスを取り外すために洗浄バッファー（２×クエン酸ナトリウム塩液／０．３％  ＮＰ４Ｏ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）中に室温で２〜１０分間配置し、ついで７３℃���洗浄バッファー中に２分間浸漬し、乾燥させ、４’６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）Ｉ色落防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）でマウントする。好ましくは、該スライドを、単一帯域通過フィルタ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を備えた落射蛍光顕微鏡で分析する。
【００３４】
検出前に、細胞サンプルは、所望により、見掛け上の細胞異常に基づいて、前選択されうる。前選択は、疑わしい細胞を特定し、それにより、スクリーニングがそれらの細胞に絞られることを可能にする。前選択はより速いスクリーニングを可能にし、陽性結果が見逃されない可能性を増加させる。細胞学的サンプルからの細胞は顕微鏡スライド上に配置され、異形成および腫瘍細胞に一般に関連している細胞異常に関して視覚的に走査されうる。そのような異常には、通常はプローブのそれらの標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションの後、核酸染料または色素、例えばヨウ化プロピジウムまたは４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で核を対比染色することにより評価される核サイズ、核形状および核染色の異常が含まれる。典型的には、腫瘍（新生物）細胞は、拡大しており形状において不規則であり及び／又は斑染色パターンを示す核を含有する。ヨウ化プロピジウムは、典型的には約０．４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で使用され、６１４ｎｍの発光ピーク波長で観察されうる赤色の蛍光を発するＤＮＡ特異的染料である。ＤＡＰＩは、典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、低倍率でＤＡＰＩフィルターで４５２ｎｍの発光ピーク波長で観察されうる青色の蛍光を発するＤＮＡ特異的染料である。この場合、検出のために前選択された細胞のみが染色体喪失および／または獲得に関する計数に付される。好ましくは、少なくとも１００のオーダーの前選択細胞、そしてＤＡＰＩフィルターを使用した場合に異常核を有する多数の細胞が存在するように見える場合には好ましくはそれ以上の前選択細胞が、染色体喪失および／または獲得を評価するために選択される。
【００３５】
あるいは、異形成または疑わしい病変の幾らかのレベルを示す組織における領域は、低倍率でＤＡＰＩフィルターを使用して局在化され、いずれかのプローブの異常なコピー数を有する核の存在に関して徹底的に精査されうる。正常細胞においては、与えられたプローブの２コピーが検出されるであろう。異常細胞においては、与えられたプローブの、それより多い又は少ないコピーが検出されるであろう。好ましくは、最も顕著なコピー数変化を伴う領域が計数のために選択される。可能な場合には、多数の異常な領域が選択され、各異常領域内で、少なくとも約１０個のランダムな核が高倍率（６４倍または１００倍の対物レンズ）で分析されて、少なくとも約１００個の核が分析される。好ましくは、核は非重複的であり、十分に明るいシグナルを有する。
【００３６】
あるいは、細胞学的または組織学的特徴から独立して、検出用の細胞が選択されうる。例えば、顕微鏡スライド上の与えられた領域内の全ての非重複的細胞は染色体喪失および／または獲得に関して評価されうる。もう１つの例として、該スライド上の細胞、例えば、顕微鏡スライド上で連続的に数において少なくとも約５０、より好ましくは少なくとも約１００のオーダーで変化した形態を示す細胞が、染色体喪失および／または獲得を評価するために選択されうる。
【００３７】
ＭＣＬ１（１ｑ２１）、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＰ１６（９ｐ２１）のコピーが計数される。
【００３８】
したがって、そのような方法は、患者から得られた膵胆管細胞のサンプル、例えば核酸サンプルを、ＭＣＬ１に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む検出可能な様態で標識されたプローブのセットと、該プローブがその標的核酸配列に選択的に結合し、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するのを可能にする（または促進する）条件下で接触させることを含む。そのような方法は、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出し、ハイブリダイゼーション複合体の数を計数することを更に含む。ＭＣＬ１（１ｑ２１）、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＰ１６（９ｐ２１）を含むハイブリダイゼーション複合体の数を考慮して、該方法は、ＭＣＬ１（１ｑ２１）、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＰ１６（９ｐ２１）のコピー数を決定することを更に含む。所望により、該コピー数は、予想される又は「正常」なコピー数（すなわち、２コピー）と比較されることが可能であり、ここで、適当な場合には、２を超えるコピー数（すなわち、獲得）および２未満のコピー数（すなわち、喪失）は、該細胞がＦＩＳＨにより異常であることを示す。２コピーを超える２以上の遺伝子座の存在はポリソミーを示す。＞４細胞におけるポリソミーの存在は高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示す。２コピーを超える単一遺伝子座のような、単一遺伝子座のコピー数の増加は、単一遺伝子座獲得を示す。８＞細胞における単一遺伝子座の獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。２コピーを超える単一遺伝子座および０または１コピーのＰ１６のような、併発するＰ１６喪失を伴う単一遺伝子座のコピー数の増加は、併発するＰ１６喪失を伴う単一遺伝子座獲得を示す。＞４細胞における併発するＰ１６喪失を伴う単一遺伝子座の獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。全遺伝子座の４コピーの存在はテトラソミーを示す。＞１１細胞におけるテトラソミーの存在は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。Ｐ１６シグナルの非存在はＰ１６喪失を示す。細胞の少なくとも５％におけるＰ１６の非存在は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。
【００３９】
脱パラフィン化、前処理、染色および通常のスライド洗浄も、当技術分野で公知の方法に従い行われうるが、ＶＰ  ２０００  Ｐｒｏｃｅｓｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）のような自動化系の使用は、評価用のスライドを調製するのに必要とされる時間を減少させる。スライドは、大きなバッチ（例えば、５０スライド）で調製されることが可能であり、一方、ハイブリダイゼーション後の洗浄のために標準的なコプリン（Ｃｏｐｌｉｎ）ジャーが使用される場合には、小さなバッチ（例えば、４スライド）で調製されうる。また、スライドのスコア化は、自動化イメージングを用いて完全自動化されることが可能であり、それにより、試料分析に要される手作業の時間が節約される。完全自動化はまた、より異常な細胞をより頻繁に且つ一貫して捕捉するイメージングアルゴリズムの使用を可能にする。また、当技術分野で公知のスライド調製のいずれかの適当な方法が用いられうるが、スライドは、好ましくは、ＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して調製され、これはより均一な且つ一貫した細胞単層を与える。
【００４０】
当技術分野で既に公知である又は現在開発中である他の方法は、ホルマリン中に固定されパラフィン中に包埋された細胞以外の膵胆管細胞のサンプル、例えば、膵胆管細胞からの新鮮または凍結細胞、ホモジナイズされた細胞、細胞溶解細胞あるいは単離または精製核酸（例えば、ＤＮＡのような「核酸サンプル」）（本明細書中で用いる「膵胆管細胞のサンプル」は、コピー数および獲得／喪失の決定を可能にする膵胆管細胞のサンプルの全ての形態を含むと意図される）の使用を必要としうるか、または該使用が好ましいかもしれない。また、トランケート化人工物を減少させ、余分な包埋物を排除するために、核はパラフィン包埋試料の厚い切片から抽出されうる。典型的には、生物学的サンプルは、一旦得られたら、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、集められ、加工された後、ハイブリダイゼーションに付される。そのような加工は、典型的には、プロテアーゼ処理およびアルデヒド溶液（例えば、ホルムアルデヒド）中の追加的な固定を含む。
【００４１】
本発明において使用されうる方法の例には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＰＣＲ産物の濃度測定走査、デジタルＰＣＲ（所望により、コピー数が決定されるべき遺伝子および／または染色体領域の前増幅を伴う）（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：９２３６−９２４１（１９９９）、米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号および米国特許出願公開第２００９／００６９１９４号を参照されたい）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８−８２１（１９９２）；および国際公開出願番号ＷＯ  ９３／１８１８６を参照されたい）、マイクロサテライトまたはサザン対立形質分析、ドットブロット、アレイ、マイクロアレイ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３９：Ｓ１６−Ｓ２１（２００７年７月））、多重（マルチプレックス）増幅可能プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、多重連結依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ  ５７（２００２）を参照されたい）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ；Ｋｕｍａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４（３）：２２６−２３４（２００５））、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、コーマ（ｃｏｍｂｅｄ）ゲノムＤＮＡ上の蛍光プローブ長の測定（Ｈｅｒｒｉｃｋら，ＰＮＡＳ  ９７（１）：２２２−２２７（２０００））、参照問合せピロシークエンシング（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｑｕｅｒｙ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＲＱＰＳ；Ｌｉｕら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４９１（２０１０））、参照配列上へのフォスミド末端のマッピング（毛管に基づく技術）、微小電気泳動およびナノポアシークエンシング（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１５４４−１５４６（２００６）；およびＳｈｅｎｄｕｒｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：３３５−３４４（２００４）を参照されたい）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび類似方法による分析のための核酸標的の変性は、典型的には、細胞形態を維持するような方法で行われる。例えば、染色体ＤＮＡは、高いｐＨ、熱（例えば、約７０〜９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）およびそれらの組合せにより変性されうる。一方、プローブは数分間の加熱により変性されうる。
【００４３】
変性後、ハイブリダイゼーションを行う。プローブをその核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるための条件は、一般に、特異的ハイブリッドを得るための、与えられたハイブリダイゼーション法において利用可能な条件の組合せを含み、その条件は当業者により容易に決定されうる。そのような条件は、典型的には、制御された温度、液相、およびプローブと標的との接触を含む。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的の長さ、標的およびプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度およびインキュベーションの持続時間を含む多数の要因によって変動する。少なくとも１つの工程が標的とのプローブの接触に先行しうる。あるいは、プローブおよび標的は、互いに接触したまま一緒に、または生物学的サンプルとのプローブの後続接触を伴って、変性条件に付されうる。ハイブリダイゼーションは、約２５〜約５５℃の範囲の温度で約０．５〜約９６時間の範囲で例示される時間にわたって、またはより好ましくは、約３２〜約４０℃の温度で約２〜約１６時間の範囲の時間にわたって、例えば２〜４×ＳＳＣとホルムアミドとの約５０：５０の体積比の混合物の液相中のプローブ／サンプルの後続のインキュベーションを伴って達成されうる。特異性を増加させるために、ブロッキング剤、例えば、米国特許第５，７５６，６９６号（その内容の全体を、特にブロッキング核酸の使用の説明に関して、参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている未標識ブロッキング核酸が使用されうる。他の条件は、当業者に容易に理解されるとおり、プローブを、サンプル中に存在するその核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるために、容易に用いられうる。ハイブリダイゼーション法は、例えば、Ｐｉｎｋｅｔら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｃｈｏｏ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；およびＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００４４】
適当なインキュベーション時間が完了したら、一連の洗浄により、サンプルＤＮＡへの染色体プローブの非特異的結合が除去されうる。所望のストリンジェンシーに応じて、温度および塩濃度が適切に選択される。要求されるストリンジェンシーのレベルは、ゲノム配列に関連した特定のプローブ配列の複雑さに左右され、プローブを既知遺伝的組成のサンプルに系統的にハイブリダイズさせることにより決定されうる。一般に、高いストリンジェンシーの洗浄は、約０．２×〜約２×ＳＳＣおよび約０．１％〜約１％のノニオン界面活性剤、例えばＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）で、約６５〜約８０℃の範囲の温度で行われうる。より低いストリンジェンシーの洗浄が要求される場合には、該洗浄は、増加した濃度の塩で、より低い温度で行われうる。
【００４５】
発蛍光団標識プローブまたはプローブ組成物が使用される場合には、検出方法は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを判定するための他の手段を含みうる。任意の適当な顕微鏡イメージング法が、複数の発蛍光団を観察するために、本明細書に記載されている方法と共に用いられうる。蛍光顕微鏡法が用いられる場合、ハイブリダイズしたサンプルは、各発蛍光団の励起に適した光の下で、適当なフィルターの使用により観察されうる。あるいは、自動化デジタルイメージング系、例えばＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ，ＢｉｏＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ系がシグナル計数およびデータ獲得アルゴリズムと共に使用される。
【００４６】
用いられる方法に応じて、結果の表示を促進するために、および蛍光強度における小さな相違を検出する感度を改善するために、デジタルイメージ分析系が用いられうる。典型的な系はＱＵＩＰＳ（定量的イメージ処理系（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）の頭字語）であり、これは、自動化ステージ、焦点制御およびフィルターホイールを備えた標準的な蛍光顕微鏡に基づく自動化イメージ分析系（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）である。該フィルターホイールは励起波長の選択のために該顕微鏡の蛍光励起光路内にマウントされる。ダイクロイックブロックにおける特別なフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）は、イメージレジストレーションシフトを伴わない複数の色素の励起を可能にする。該顕微鏡は２つのカメラポートを有し、そのうちの１つは高感度高速ビデオイメージ表示のための強化ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を有し、これはスライド上の興味深い領域を見出すために、および合焦するために使用される。他方のカメラポートは冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺによるモデル２００）を有し、これは高い分解能および感度での実際のイメージ獲得のために使用される。該冷却ＣＣＤカメラはＳＵＮ  ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にＶＭＥバスを介してインターフェース接続される。多色イメージの全獲得は、イメージ処理ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して制御される。
【００４７】
アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）においては、プローブは基体上の別個の位置に固定化され、標識されない（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ９６／１７９５８号を参照されたい）。その代わりに、標的核酸を含むサンプル核酸は標識される。サンプル核酸はハイブリダイゼーションの前に標識され、あるいはハイブリダイゼーション複合体が検出可能な様態で標識される。二色または多色ａＣＧＨにおいては、該プローブアレイは、異なって標識された標的核酸の、２以上の集合体に、同時または連続的にハイブリダイズされる。
【００４８】
前記方法は、膵胆管癌の予後、膵胆管癌の予防的または治療的治療（例えば、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍を有する患者へのチロシンキナーゼインヒビターの投与）の効力のモニター、および膵胆管癌の再発のモニターにおいて使用されうる。該方法は、他の検出方法で得られた結果を確認するために使用されうる。前癌病変を有する患者における癌のリスクは、そのような方法、および癌の攻撃性を用いて評価されうる（例えば、視野内の、より多い染色体異常および／またはより広がった染色体異常は、細胞に影響を及ぼす）。そのような方法は、治療判断、例えば積極的サーベイランス、手術または療法（例えば、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍を有する患者へのチロシンキナーゼインヒビターの投与）および補助薬物治療の判断を補助するためにも使用されうる。所望により、本明細書に記載されている方法は、他の試験、例えば通常の細胞診、組織学的検査、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイ、ノモグラム、メチル化、突然変異などと共に使用されうる。
【００４９】
したがって、該方法は、試験サンプルが得られた患者の診断、予後、または治療的／予防的治療の効力の評価を更に含みうる。該方法が、試験サンプルが得られた患者の治療的／予防的治療の効力を評価することを更に含む場合、該方法は、所望により、効力を改善するために必要に応じて、該患者の治療的／予防的治療を修飾することを更に含む。該方法は自動化系または半自動化系における使用に適合化されうる。
【００５０】
一般に、染色体異常に関して膵胆管細胞のサンプルをアッセイするに際して得られた結果を評価するための基準として、所定レベルが用いられうる。一般に、そのような比較を行う際には、疾患、障害または状態の個々の段階またはエンドポイントとの或いは個々の徴候との個々の染色体異常（存在またはレベル）の連関または関連づけが行われうるように、個々のアッセイを、適当な条件下、十分な回数行うことにより、該所定レベルが得られる。典型的には、該所定レベルは参照被験者（または被験者の集団）のアッセイにより得られる。
【００５１】
特に、疾患の進行および／または治療をモニターするために用いられる所定レベルに対して、染色体異常（存在またはレベル）は「不変」、「好適」（または「好適に変化」）または「不適」（または「不適に変化」）でありうる。「上昇」または「増加」は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定レベル）より高い、あるいは別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早期またはベースラインのサンプル）より高い、膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常のレベルに関するものである。「低下」または「減少（低減）」なる語は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定レベル）より低い、あるいは別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早期またはベースラインのサンプル）より低い、膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常のレベルに関するものである。「変化」なる語は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定レベル）と比較して、あるいは別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早期またはベースラインのサンプル）と比較して変化（増加または減少）した、膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常のレベルに関するものである。
【００５２】
与えられた染色体異常に関する典型的または正常なレベルまたは範囲は標準的な慣例に従い定められる。幾つかの場合における染色体異常のレベルは非常に低いため、いわゆる変化レベルまたは変化は、実験誤差またはサンプル変動によっては説明できない、典型的または正常なレベルまたは範囲あるいは参照レベルまたは範囲と比較していずれかの正味の変化が存在する場合に生じたとみなされうる。したがって、個々のサンプルにおいて測定されたレベルは、いわゆる正常被験者からの類似サンプルにおいて決定されたレベルまたはレベル範囲と比較されるであろう。この場合、「正常被験者」は、検出可能な疾患を有さない個体であり、「正常」または「対照」患者または集団は、例えば、それぞれ、検出可能な疾患を示さないものである。更に、染色体異常がヒト集団の大多数において高レベルで通常は見出されない場合には、「正常被験者」は、与えられた染色体異常の、検出可能なレベルの実質的増加を示さない個体であるとみなされることが可能であり、「正常」（「対照」と称されることがある）患者または集団は、与えられた染色体異常の、検出可能なレベルの実質的増加を示さないものである。「見掛け上正常な被験者」は、染色体異常が評価されていない又は評価されつつある者である。与えられた染色体異常のレベルが「上昇」していると言えるのは、該染色体異常が通常は検出不能であるが、試験サンプルにおいて検出される場合、および正常レベルより高いレベルでアナライトが試験サンプル中に存在する場合である。したがって、とりわけ、本開示は、膵胆管癌またはそのリスクを有する被験者のスクリーニング方法を提供する。
【００５３】
該方法は他のマーカーなどの検出をも含みうる。
【００５４】
本明細書に記載されている方法は、被験者が膵胆管癌またはその発生リスクを有するか否かを決定するためにも使用されうる。特に、そのような方法は、
（ａ）被験者からの膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常を（例えば、本明細書に記載されている方法、または当技術分野で公知の方法を用いて）決定し、
（ｂ）工程（ａ）において決定された染色体異常のレベルを所定レベルと比較する工程を含むことが可能であり、ここで、工程（ａ）において決定された染色体異常のレベルが所定レベルに対して好適である場合には、該被験者は、膵胆管癌の、より低いリスクを有すると決定される。しかし、工程（ａ）において決定された染色体異常のレベルが所定レベルに対して不適である場合には、該被験者は膵胆管癌またはそのリスクを有すると決定される。
【００５５】
また、被験者における膵胆管癌の進行をモニターする方法を本発明において提供する。所望により、該方法は、
（ａ）被験者からの膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常を決定し、
（ｂ）被験者からの膵胆管細胞の、より後のサンプルにおける、染色体異常のレベルを決定し、
（ｃ）工程（ｂ）において決定された染色体異常のレベルを、工程（ａ）において決定された染色体異常のレベルと比較する工程を含み、ここで、工程（ｂ）におけるレベルが、工程（ａ）において決定されたレベルと比較して不変または不適である場合には、膵胆管癌が該被験者において継続、進行または悪化していると決定される。比較として、工程（Ｂ）において決定されたレベルが、工程（ａ）において決定されたレベルと比較して好適である場合には、膵胆管癌は該被験者において中断、軽減または改善している可能性がある。
【００５６】
所望により、該方法は、工程（ｂ）において決定された染色体異常のレベルを、例えば所定レベルと比較することを更に含む。所望により、更に、工程（ｂ）において決定されたレベルが、例えば、所定レベルに対して不適に変化していることを、該比較が示す場合には、該方法は、例えば１以上の医薬組成物、放射線および／またはホルモン療法で、ある期間にわたって被験者を治療することを含む。
【００５７】
更にまた、該方法は、例えば１以上の医薬組成物、放射線および／またはホルモン療法で治療を受けている被験者における治療をモニターするために用いられうる。特に、そのような方法は、被験者が治療される前に、被験者からの膵胆管細胞の第１サンプルを準備する。次に、膵胆管細胞の第１サンプルにおける染色体異常のレベルを（例えば、本明細書に記載されている又は当技術分野で公知の方法を用いて）決定する。染色体異常のレベルを決定した後、所望により、ついで該レベルを所定レベルと比較する。膵胆管細胞の第１サンプルにおいて決定されたレベルが所定レベルより低い場合には、該被験者は治療されない。しかし、膵胆管細胞の第１サンプルにおいて決定されたレベルが所定レベルより高い場合には、該被験者は、ある期間にわたって治療される。被験者が治療される期間は当業者により決定されうる（例えば、該期間は約７日間〜約２年間、好ましくは、約１４日間〜約１年間でありうる）。
【００５８】
治療の経過中、ついで膵胆管細胞の第２および後続サンプルを該被験者から得る。サンプルの数、および該サンプルを被験者から得る時点は決定的なものではない。例えば、第２サンプルは、被験者が最初に治療された７日後に得られることが可能であり、第３サンプルは、被験者が最初に治療された２週間後に得られることが可能であり、第４サンプルは、被験者が最初に治療された３週間後に得られることが可能であり、第５サンプルは、被験者が最初に治療された４週間後に得られることが可能である、などであろう。
【００５９】
それぞれの第２または後続サンプルを被験者から得、第２または後続サンプルにおける染色体異常のレベルを（例えば、本明細書に記載されている又は当技術分野で公知の方法を用いて）決定する。ついで、第２および後続サンプルのそれぞれにおいて決定されたレベルを、第１サンプル（例えば、最初に所望により所定レベルと比較されたサンプル）において決定されたレベルと比較する。工程（ｃ）において決定されたレベルが、工程（ａ）において決定されたレベルと比較して好適である場合には、膵胆管癌は中断、軽減または改善している可能性があり、該被験者は治療継続されるべきである。しかし、工程（ｃ）において決定されたレベルが、工程（ａ）において決定されたレベルと比較して不変または不適である場合には、膵胆管癌が継続、進行または悪化していると決定され、該被験者は、例えば、より高い投与量の医薬組成物、放射線またはホルモンで治療されるべきであり、あるいは該被験者は、異なる方法で治療されるべきである。
【００６０】
一般に、反復試験が行われうるアッセイでは（例えば、疾患の進行および／または治療に対する応答をモニターする場合）、第２または後続試験サンプルは、第１試験サンプルが被験者から得られた後の或る期間において得られる。特に、被験者からの第２試験サンプルは、第１試験サンプルが被験者から得られた数分後、数時間後、数日後、数週間後または数年後に得られうる。例えば、第２試験サンプルは、第１試験サンプルが被験者から得られた後の約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１１週、約１２週、約１３週、約１４週、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週、約３６週、約３７週、約３８週、約３９週、約４０週、約４１週、約４２週、約４３週、約４４週、約４５週、約４６週、約４７週、約４８週、約４９週、約５０週、約５１週、約５２週、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年の時期に被験者から得られうる。
【００６１】
更に、本開示はまた、膵胆管癌の素因を有する又は膵胆管癌に罹患している被験者が治療から利益を得るかどうかを決定する方法に関する。特に、該開示は付随的な診断方法および製品に関する。したがって、本明細書に記載されている「被験者における疾患の治療をモニターする」方法は、最適には、療法のための候補を選択または特定することをも更に含みうる。
【００６２】
したがって、特定の実施形態においては、該開示はまた、膵胆管癌またはそのリスクを有する被験者が療法の候補であるかどうかを決定する方法を提供する。一般に、該被験者は、該疾患の何らかの症状を経験している者、またはそのような疾患またはそのリスクを有すると実際に診断されている者、および／または本明細書に記載されている染色体異常の不適レベルを示す者である。
【００６３】
該方法は、所望により、本明細書に記載されているアッセイを含み、ここで、染色体異常のレベルは被験者の治療の前および後に評価される。治療後の染色体異常の不適レベルの観察は、更なる又は継続的な治療を受けることから被験者が利益を得ないことを証明しており、一方、治療後の染色体異常の好適レベルの観察は、更なる又は継続的な治療を受けることから被験者が利益を得ることを証明している。この証明は臨床研究の管理を補助し、患者のケアの改善をもたらすことを補助する。
【００６４】
プローブ
プローブのセットも提供する。該プローブセットは、ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む又はそれらからなる。
【００６５】
遺伝子座特異的プローブとして使用される適当なプローブは、遺伝子を含有する染色体上の特定の領域にハイブリダイズする。遺伝子ＭＣＬ１（１ｑ２１）に対する遺伝子座特異的プローブは第１染色体上のｑ２１（すなわち、１ｑ２１）におけるＭＣＬ１遺伝子の全部または一部にハイブリダイズしうる。遺伝子ＭＣＬ１に関する最近公開された研究は、この遺伝子がＣＣＡ細胞におけるＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）抵抗性を引き起こすことを示している（Ｗｅｒｎｅｂｕｒｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３０）：２８９６０−２８９７０（２００７））。ＴＲＡＩＬは癌治療のための有望な物質であり、したがって、患者の腫瘍のＭＣＬ１状態は治療判断のための貴重な情報でありうる。
【００６６】
ＥＧＦＲに対する遺伝子座特異的プローブは第７染色体上のｐ１２（すなわち、７ｐ１２）におけるＥＧＦＲ遺伝子の全部または一部にハイブリダイズしうる。ＥＧＦＲは、非小細胞肺癌および進行性膵癌を有する患者の一部において、チロシンキナーゼインヒビターにより成功裏に標的化されており（ＤｅＨａａｎら，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３８（３）：４９１−４９９（２００７年３月））、したがって、膵胆管癌の場合に潜在的に治療上重要なもう１つの遺伝子である。更に、ＥＧＦＲは第７染色体上に位置し、膵胆管癌細胞における第７染色体の獲得（すなわち、トリソミー７）は悪性疾患の存在に関するリスク因子であることが示されている。なぜなら、トリソミー７を有する患者の約半分が癌と診断されているからである（Ｆｒｉｔｃｈｅｒら（２００９），前掲；Ｍｏｒｅｎｏ  Ｌｕｎａら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３１（４）：１０６４−１０７２（２００６））。
【００６７】
ＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブは第８染色体上のｑ２４（すなわち、８ｑ２４）におけるＭＹＣ遺伝子の全部または一部にハイブリダイズしうる。Ｐ１６遺伝子（９ｑ２１）に対する遺伝子特異的プローブは第９染色体上のｐ２１（すなわち、９ｐ２１）におけるＰ１６遺伝子の全部または一部にハイブリダイズしうる。
【００６８】
染色体プローブとして使用される適当なプローブは、染色体の動原体に関連した反復性ＤＮＡにハイブリダイズしうる。霊長類染色体の動原体はＤＮＡの長い縦列反復の複合体ファミリーを含有し、これは、α−サテライトＤＮＡと称される約１７１塩基対（ｂｐ）の長さの単量体反復から構成される。染色体プローブは、典型的には、約５０〜１×１０５ヌクレオチド長である。より長いプローブは、典型的には、約１００〜５００ヌクレオチド長の、より小さな断片を含む。
【００６９】
染色体領域または部分領域を標的化する遺伝子座特異的プローブおよび染色体計数プローブ（ＣＥＰ）は商業的に入手可能であり、あるいは当業者により容易に製造されうる。そのようなプローブはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から商業的に入手可能である。染色体プローブは、例えば、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、クローン化ヒトＤＮＡ、例えばプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびＰＩ人工染色体（ＰＡＣ）（ヒトＤＮＡ配列のインサートを含有するもの）から製造されうる。関心のある領域はＰＣＲ増幅またはクローニングにより得られうる。もう１つの実施形態においては、該染色体プローブはオリゴプローブでありうる。あるいは、染色体プローブは当技術分野で公知の方法に従い合成的に製造されうる。
【００７０】
特定の遺伝子座の標的化が望まれる場合には、標的化遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが好ましいことがあるが、それが必要なわけではない。遺伝子座特異的プローブは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（その遺伝的異常が転移に相関しているもの、例えばＭＹＣ）にハイブリダイズするように設計されうる。
【００７１】
該プローブは当技術分野で公知のいずれかの方法により製造されうる。プローブは合成または組換え製造されうる。そのようなプローブは約２５，０００塩基対〜約８００，０００塩基対の長さの範囲でありうる。
【００７２】
好ましくは、プローブは検出可能な様態で標識され、２以上のプローブが同一サンプル上で同時または連続的に使用される場合には、好ましくは、各プローブは異なって標識される。好ましくは、該プローブは、発蛍光団で、検出可能な様態で標識される。好ましい発蛍光団の例には、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リッサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアナート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアナート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアナート、エリスロシン−５−イソチオシアナート、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）およびカスケード・ブルー（ＣＡＳＣＡＤＥ  ｂｌｕｅ）アセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されるものではない。使用される個々の標識は決定的なものではないが、望ましくは、個々の標識は該プローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびいずれかの他のプローブ上の標識の検出を妨げるものではない。該標識は、望ましくは、アッセイの感度を最大にするために、およびいずれのバックグラウンドを超えるものでも検出可能となるように、可能な限り低いコピー数で検出可能である。また、望ましくは、該標識は、非常に局在化したシグナルを与え、それにより、高度の空間的分解能を与える。
【００７３】
核酸プローブへの発蛍光団の結合は当技術分野でよく知られており、いずれかの利用可能な手段により達成されうる。例えば、発蛍光団は個々のヌクレオチドに共有結合されることが可能であり、標準的な技術、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲ標識、末端標識、個々の残基、例えばシトシン残基の化学修飾による直接標識（米国特許第５，４９１，２２４号）などを用いて、標識ヌクレオチドはプローブ内に取り込まれうる。あるいは、発蛍光団は、プローブ内に取り込まれている活性化リンカーアームでヌクレオチドに共有結合されることが可能であり、例えば、アミノ交換されている該プローブのデオキシシチジンヌクレオチドにリンカーを介して共有結合されることが可能である。プローブを標識するための方法は米国特許第５，４９１，２２４号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ，”ｐｐ．２１−４０，Ｆａｎ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）（それらの両方を、プローブの標識のそれらの説明に関して、参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００７４】
標識含有部分として、発蛍光団の代わりに、他の物質または染料が使用されうる、と当業者は認識するであろう。発光物質には、例えば、放射線発光、化学発光、生物発光およびリン光標識含有部分が含まれる。視認可能な光で検出可能である物質には、シアニン染料が含まれる。あるいは間接的手段により可視化される検出部分が使用されうる。例えば、プローブは、当技術分野で公知の通常の方法を用いて、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、ついで検出のために更に加工されうる。ビオチン含有プローブの可視化は、検出可能なマーカーにコンジュゲート化されたアビジンの後続の結合により達成されうる。該検出可能マーカーは発蛍光団であることが可能であり、この場合、プローブの可視化および識別は後記のとおりに達成されうる。
【００７５】
あるいは、標的領域にハイブリダイズした染色体プローブは、不溶性有色生成物の生成のための適当な基質との標識部分の酵素反応により可視化されうる。各プローブは、異なる標識部分の選択により、該セット内の他のプローブから識別されうる。セット内のビオチン含有プローブは、適当な基質およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲート化されたアビジンの存在下の後続のインキュベーションにより検出されうる。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）はアルカリホスファターゼの基質として働き、ジアミノベンゾアートはＨＲＰの基質として働く。
【００７６】
キット
また、キットも提供する。該キットは、（ａ）患者における膵胆管癌の検出を可能にするプローブのセット、および（ｂ）患者における膵胆管癌の検出、診断、予後または治療的／予防的治療の評価のための説明書を含む。したがって、該キットは、（ａ）患者における膵胆管癌の検出を可能にするプローブのセット［ここで、該プローブセットは、ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブを含む又はそれらからなる］、および（ｂ）患者における膵胆管癌の検出のための説明書（ここで、該説明書は、患者から得られた膵胆管細胞のサンプルにおいて、染色体異常の存在を判定することを含み、ここで、ポリソミーは高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示し、テトラソミー、Ｐ１６の喪失、ＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得、あるいは併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる）を含みうる。特に、ポリソミー（細胞当たり２コピーを超える２以上の遺伝子座）（例えば、＞４細胞におけるもの）は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌を示す。ＭＣＬ１、ＭＹＣまたはＰ１６の単一遺伝子座獲得（細胞当たり２コピーを超えるもの）（例えば、８＞細胞におけるもの）、併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲまたはＭＹＣの単一遺伝子座獲得（例えば、４＞細胞におけるもの）、あるいはテトラソミー（４コピーの各遺伝子座）（例えば、＞１１細胞におけるもの）、またはｐ１６喪失（Ｐ１６の非存在）（例えば、少なくとも５％の細胞におけるもの）は、高い段階の異形成、膵胆管癌または膵胆管への転移癌のリスクの増大を推測させる。そのようなキットは、ブロッキング剤または他のプローブ、該プローブの検出を促進するための種々の標識または標識化剤、ハイブリダイゼーション用の試薬（例えば、バッファー）、間期スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）などを更に含みうる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は本開示を例示するためのものである。該実施例は、特許請求している本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００７８】
実施例１
この実施例は候補プローブの選択を記載する。
【００７９】
多重比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２８：６２（２００９）；Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６０（２）：１５１−１６１（２００１）；およびＬｅｅら，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９（５）：６８２−６８７（２００４））に基づいて膵胆管腫瘍において見出される共通の染色体変化を特定するために、文献の精査を行った。新規プローブを設計し、製造した。また、商業的に入手可能なプローブセットであるＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を比較のために評価した。第１プローブセットは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）で標識されたＥＧＦＲ（７ｐ１２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識されたＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）で標識されたＰ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）で標識された第９染色体に対する動原体プローブ（染色体計数プローブ９（ＣＥＰ９（登録商標）））からなるものであった。第２プローブセットは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）で標識されたＰ５３（１７ｐ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）で標識された第１７染色体に対する動原体プローブ（ＣＥＰ１７（登録商標））、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識されたＥＲＢＢ２（１７ｑ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）で標識されたＡＵＲＫＡ（２０ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブからなるものであった。第３プローブセットは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）で標識されたＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１；１ｑ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）で標識されたＤ５Ｓ７２１（５ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）で標識されたＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識されたＴＥＬ（１２ｐ１３）に対する遺伝子座特異的プローブからなるものであった。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）プローブセットは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）で標識された第３染色体に対する動原体プローブ（ＣＥＰ３（登録商標））、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識された第７染色体に対する動原体プローブ（ＣＥＰ７（登録商標））、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）で標識されたＰ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）で標識された第１７染色体に対する動原体プローブ（ＣＥＰ１７（登録商標））からなる。
【００８０】
膵胆管癌を検出する際のプローブの質および精度を評価するために、プローブ選択研究を行った。このアッセイの意図される臨床用途は、ＥＲＣＰ中に得られる膵胆管ブラッシングであるが、腫瘍切除試料を評価した。なぜなら、関心のある細胞が、高い信頼性で多数存在するからである。癌を含有する集められたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肝臓（ｎ＝１４）、胆管（ｎ＝１）および膵臓（ｎ＝１４）切除体を特定した。各切除体は１人の患者からのものであった。ＦＩＳＨ分析のための各場合のために、４個のスライドを調製した。対応するＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）スライドが病理学者により顕微鏡法で評価され、関心領域（腫瘍および良性管）が選び出された。それらの２９個の切除体のうち、１６個の領域のＣＣＡ（２個の領域は同一切除体／患者からのものであった）および１４個の領域の膵腺癌が特定された。９個の切除試料のなかで９個の良性管が特定された。該関心領域を未染色組織スライド上で同時に選び出し、３つの候補ＦＩＳＨプローブセットおよびＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）でハイブリダイズさせた。各プローブセットごとに別々のスライドを使用した。４個のプローブ発蛍光団のそれぞれを可視化するためのフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して、ハイブリダイズしたスライドを評価した。該関心領域をＦＩＳＨスライド上に配置し、その領域内の５０個の細胞を評価した。それらの４個のプローブのそれぞれに関する、細胞当たりのシグナルの数を記録した。
【００８１】
全プローブは、Ｐ５３（１７ｐ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ以外は高い質を有していた。該プローブは非常に小さく、非特異的であった。したがって、それを識別し評価することはしばしば困難であった。
【００８２】
パラフィン包埋腫瘍試料において観察された遺伝子座獲得を図１に示す。該図はプローブに対する細胞の百分率の棒グラフである。１，５００個の腫瘍細胞のうち、コピー数増加（細胞当たり＞２コピー）を伴う細胞の比率を、各プローブに関して評価した。３００個の正常細胞のうち、コピー数増加（細胞当たり＞２コピー）を伴う細胞の比率を、各プローブに関して評価した。図１に示されているとおり、腫瘍試料における増加の最高比率を示した５個のプローブには、８ｑ２４、１ｑ２１、７ｐ１２、１７ｑ１２および１１ｑ１３が含まれた。
【００８３】
プローブ当たりに観察された平均プローブコピー数を図２に示す。図２に示されているとおり、最高平均コピー数を示した５個のプローブには、８ｑ２４、１７ｑ１２、２０ｑ１３、１ｑ２１および７ｐ１２が含まれた。
【００８４】
ホモ接合喪失を有する細胞の比率を図３に示す。１，５００個の腫瘍細胞のうち、各遺伝子座のホモ接合喪失（細胞当たり０コピー）を有する腫瘍細胞の比率を、各プローブに関して評価した。３００個の正常細胞のうち、各遺伝子座のホモ接合喪失（細胞当たり０コピー）を有する正常細胞の比率を、各プローブに関して評価した。図３に示されているとおり、ホモ接合喪失を有する細胞の最高比率を示したプローブは９ｐ２１であった。この研究における癌細胞の４０％以上がホモ接合喪失を有していた。
【００８５】
全ての記録細胞からのシグナルパターンを使用する癌の検出のための最適カットオフ値を決定するために、統計分析を行った。正常膵胆管組織に存在するシグナルの数を表すために、前記の９個の良性管を使用した。表１に示されているとおり、偽陽性を伴わない（すなわち、１００％の特異性）で、各プローブに関して、正常染色体含量を有する細胞からの腫瘍細胞において染色体異常（獲得および喪失）を最も良く識別したカットオフ値を決定するために、ＲＯＣ（受信者動作特性）分析を行った。１ｑ２１および１１ｑ１３に関するカットオフは、保存的となるために、２％（１細胞）から４％（２細胞）に増加された。
【００８６】
【表１】
2015504665.tif 000001
【００８７】
前記に基づいて、Ｐ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブを選択した。プローブ選択統計分析の次工程は、１００％の標的特異性を有する表１からの確立されたカットオフを使用して３個のプローブの種々の発癌性プローブ組合せの感度（感受性）を計算することであった。表２は、高い感度を有する２５個のプローブ組合せ、および比較用のＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（ＣＥＰ３（登録商標）、ＣＥＰ７（登録商標）およびＣＥＰ１７（登録商標））の性能を一覧している。Ｐ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブの添加を伴う各プローブセットの感度が示されている。
【００８８】
【表２】
2015504665.tif 000002
【００８９】
【表３】
2015504665.tif 000003
【００９０】
ＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブは、分析された全ての他のプローブと比較して最も頻繁に最高コピー数を伴う獲得を検出した。ＭＣＬ１（１ｑ２１）、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＰ１６（９ｐ２１）を含むプローブセットは、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）の動原体プローブ（８０．０％）より高い感度（８６．７％）を有していた。このプローブセットの感度（９３．３％）は、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（９６．７％）より１つだけ少ない癌症例を検出した。
【００９１】
実施例２
この実施例は、実施例１において選択されたＦＩＳＨプローブを使用するＥＲＣＰブラッシングの分析を記載する。
【００９２】
この研究の目的は、臨床病理追跡を伴う患者からの膵胆管ブラッシング試料を使用するＦＩＳＨにより試料が異常であるとみなすためのカットオフを選択することであった。悪性疾患の検出に関する該新規プローブセットの性能はＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）の性能と後に比較される。
【００９３】
癌を疑わせる膵胆管狭窄を有する患者がＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃにおける臨床診療の一部としてＥＲＣＰを受け、その途中に、狭窄ブラッシングが得られ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提出された。ブラッシングを細胞ペレットに製し、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）プローブセットを使用してＦＩＳＨ分析を行った。残存細胞ペレットを、それが存在する場合には、実験室内で保管した。２００５年にＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてブラッシングを連続的に受けた９７名の異なる患者からの試料を遡及的に特定した。包含基準は以下のとおりであった：（ａ）追跡の際の良性または悪性としての狭窄の最終的分類、（ｂ）利用可能な残存細胞ペレット、および（ｃ）癌を有さない患者に関する少なくとも１年の臨床追跡。癌に関するゴールドスタンダードには、悪性疾患の病理学的証拠（例えば、生検、細針吸引（ＦＮＡ）または通常の細胞診）および／または臨床的証拠（イメージング上の腫瘍または塊、明白な転移を伴う癌の進行）が含まれた。別々ののＥＲＣＰ処置からの２以上の試料を有する患者の場合には、最も早い／第１ブラッシングのみを分析に使用した。最も早いブラッシング試料が利用不可能な場合には、次の連続的な来院の際のブラッシングを利用した。
【００９４】
実施例１において選択された４個のＦＩＳＨプローブを含有する最終プローブ混合物を以下の処方で調製した：ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）で標識されたＭＣＬ１（１ｑ２１）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で標識されたＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）で標識されたＭＹＣ（８ｑ２４）、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）で標識されたＰ１６（９ｐ２１）。
【００９５】
各保管細胞ペレットからの細胞懸濁液を、ピペットを使用してガラススライド上に手動で滴下させ、該最終プローブセットでハイブリダイズさせた。試料の盲検評価が保証されるように、スライドに研究識別番号を付けた。別々に各細胞のＦＩＳＨシグナルパターンを決定するために各蛍光プローブの可視化のためのフィルターを有する蛍光顕微鏡でスライドを分析した。各試料の一方の末端から、１００個の連続的な上皮細胞のシグナルパターンを計数し、記録した。ＦＩＳＨパターンは、ダイソミー（各プローブに関して２個のシグナル）、ホモ接合９ｐ２１喪失（０コピーの９ｐ２１プローブ）、単一遺伝子座獲得（＞２コピーの１遺伝子座）、併発する９ｐ２１喪失を伴う単一遺伝子座獲得（０または１コピーの９ｐ２１を伴う＞２コピーの１遺伝子座）、テトラソミー（プローブ当たり４コピー）およびポリソミー（＞２コピーの２以上のプローブ）を含んでいた。１００細胞の計数の後、該試料の残りを次いでスクリーニングし、いずれかの異常なＦＩＳＨパターンを、それが存在する場合には記録した。１００個未満の細胞しか存在しない、またはハイブリダイゼーションシグナルが存在しない若しくは不明瞭である場合には、試料は非診断的とみなされた。
【００９６】
各細胞をそのＦＩＳＨシグナルパターンに従い分類した。各試料に関して、１００の細胞数を、ホモ接合９ｐ２１喪失を伴う細胞の比率を計算するために用いた。その他のＦＩＳＨ異常（単一遺伝子座獲得、併発する９ｐ２１喪失を伴う単一遺伝子座獲得、テトラソミーおよびポリソミー）に関しては、異常細胞の絶対数を表にした。癌を有さない患者は統計分析では良性（正常）とみなされた。高い特異性を維持しつつ最高感度を有するカットオフを選択するために、各ＦＩＳＨ異常に関して、ＲＯＣ曲線を作成した。
【００９７】
５２名の男性および４５名の女性が該研究に参加し、平均年齢は５７歳（２０〜８６歳の範囲）であった。４５名の患者（４６％）が原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を有していた。５５名の患者（５７％）が、胆管癌（ＣＣＡ；ｎ＝３６）、膵腺癌（ｎ＝１０）、胆嚢腺癌（ｎ＝４）、転移性結腸腺癌（ｎ＝２）、転移性乳腺癌（ｎ＝１）、形質細胞腫（ｎ＝１）および移植後リンパ増殖性障害（ｎ＝１）を含む癌と診断された。７個の試料は、細胞充実性の欠如（ｎ＝４）、材料の不明瞭さ（ｎ＝２）またはハイブリダイゼーションシグナルの欠如（ｎ＝１）のため、非診断的ＦＩＳＨ結果を示した。
【００９８】
１００細胞計数におけるホモ接合９ｐ２１喪失、１ｑ２１の単一遺伝子獲得を有する細胞の絶対数、８ｑ２４の単一遺伝子座獲得を有する細胞の絶対数、９ｐ２１の単一遺伝子座獲得を有する細胞の絶対数、単一遺伝子座獲得および併発する９ｐ２１喪失（ヘミ接合またはホモ接合）を有する細胞の絶対数、テトラソミーを有する細胞の絶対数、およびポリソミーを有する細胞の絶対数のＲＯＣ曲線分析に基づいて、膵胆管ブラッシングに対してＦＩＳＨプローブセット１ｑ２１、７ｐ１２、８ｑ２４および９ｐ２１を陽性的に使用するための最適カットオフ値を選択した。該カットオフを表４に示す。
【００９９】
【表４】
2015504665.tif 000004
【０１００】
該新規プローブセットに関するカットオフ値の適用は４１個の陽性試料を与えた。該新規プローブセットおよび該カットオフ値を用いて検出されたそれぞれの各ＦＩＳＨ異常に関する試料の数を表５に示す。ポリソミーおよびいずれかの他のＦＩＳＨ異常に関するカットオフ値に達した試料（ｎ＝１４）をポリソミーとして分類した。単一遺伝子座獲得および併発する９ｐ２１喪失を伴う単一遺伝子座獲得に関するカットオフ値に達した試料（ｎ＝２）を、併発する９ｐ２１喪失を伴う単一遺伝子座獲得として分類した。
【０１０１】
【表５】
2015504665.tif 000005
【０１０２】
合計９０個の試料が両方のプローブセットにより診断的ＦＩＳＨ結果を示した。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）プローブセットを考慮した場合、ポリソミーは、標準的な臨床診療に従い陽性とみなされた唯一のＦＩＳＨ異常であった。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）は２１個の試料において真に陽性であり、そのうちの２個は該新規プローブセットによっては陰性であった。該新規ＦＩＳＨプローブセットは３６個の試料において真に陽性であり、そのうちの１８個はＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）によっては陰性であった。膵胆管悪性疾患の検出に関してＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）と比較した場合の（表４におけるカットオフ値を使用した場合の）該新規ＦＩＳＨプローブセットの性能特性を表６に示す。該新規プローブセットはＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）より有意に高感度であった（それぞれ７３％対４１％）。１つの例がＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）によっては偽陽性であり、５つの例が該新規プローブセットによっては偽陽性であった。
【０１０３】
【表６】
2015504665.tif 000006
【０１０４】
したがって、１ｑ２１（ＭＣＬ１）、７ｐ１２（ＥＧＦＲ）、８ｑ２４（ＭＹＣ）および９ｐ２１（Ｐ１６）に対するプローブを含有する新規ＦＩＳＨプローブセットをカットオフ値（表４）の選択のために膵胆管ブラッシング試料に適用した。現在使用されているＦＩＳＨプローブセット（すなわち、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標））と比較して、該新規プローブセットでは、膵胆管悪性疾患の検出に関する関連感度が有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。該新規プローブセットは、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）と比較して、癌を有する１６名の追加的な患者（３２％）を検出した。悪性疾患を有さない５名の患者が該新規プローブセットでは陽性と特定され、そのうちの１名はＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）によっても陽性とみなされた。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）と比較された該新規プローブセットの特異性は有意に異なっていた（Ｐ＝０．０４６）。
【０１０５】
実施例３
この実施例は、実施例２におけるＦＩＳＨプローブでのＥＲＣＰブラッシングの分析において使用されたカットオフの妥当性検証を示す。
【０１０６】
患者のブラッシング試料の別の組を評価した。該新規プローブセットの性能を癌の検出に関してＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）および通常の細胞診と評価した。
【０１０７】
標準的な実施に従い、通常の細胞診およびＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）ＦＩＳＨのためにＥＲＣＰブラッシングを集めた。２００６年〜２００８年に評価された１１２名の異なる連続的な患者からの残存細胞ペレットを遡及的に特定した。包含基準および悪性疾患に関するゴールドスタンダードは、実施例２において用いたのと同じであった。
【０１０８】
標準的な実施に従い、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおける通常の細胞診およびＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）のために各試料を等しく分割した。通常の細胞診では、ＴｈｉｎＰｒｅｐスライドがＰａｐ染色され、悪性疾患に関して陰性、異型、疑い又は陽性と細胞病理学者により評価された。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）ＦＩＳＨプローブセットとのハイブリダイゼーションのために、細胞懸濁液をスライド上に手動で滴下した。４個以上のポリソミー細胞が存在する場合には、ＦＩＳＨスライドは陽性とみなされた。
【０１０９】
該膵胆管ＦＩＳＨプローブセットとのハイブリダイゼーションのための手動滴下スライドを調製するために、残存細胞ペレットを遡及的に使用した。実施例２に記載されているとおりに、スライド調製、ＦＩＳＨハイブリダイゼーションおよび分析を行った。ブラッシングカットオフ研究からのカットオフ値（表４）を、各試料に関する膵胆管ＦＩＳＨ結果を得るために、ブラッシング妥当性検証試料の分析から得られた細胞数に適用した。
【０１１０】
６７名の男性および４５名の女性が該研究に参加し、平均年齢は５８歳（２３〜９４歳の範囲）であった。４５名の患者（４６％）がＰＳＣを有していた。６５名の患者（５８％）が、ＣＣＡ（ｎ＝４９）、膵腺癌（ｎ＝８）、転移癌（ｎ＝４）、胆嚢腺癌（ｎ＝３）膨大部腺癌（ｎ＝１）を含む癌と診断された。通常の細胞診の結果（表７）は５５例（４９％）の陰性、２４例（２１％）の異型、１５例（１３％）の疑い、および１８例（１６％）の陽性を含んでいた。通常の細胞診断分類ごとの癌を有する試料の比率を表７に示す。
【０１１１】
【表７】
2015504665.tif 000007
【０１１２】
ＦＩＳＨ結果（表８）は、ポリソミーを有する５０例（４６％）、テトラソミーを有する４例（４％）、１ｑ２１、８ｑ２４または９ｐ２１の単一遺伝子座獲得を有する６例（５％）および陰性の５２例（４６％）を含んでいた。ＦＩＳＨ診断分類ごとの癌を有する試料の比率を表８に示す。
【０１１３】
【表８】
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【０１１４】
ブラッシングの妥当性検証組合せにおける膵胆管ＦＩＳＨプローブセット（表４のカットオフ値を使用した場合）、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）および通常の細胞診の性能特性を表９に示す。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）を使用する標準的な臨床診療に従い、ポリソミーはどちらのプローブセットにおいても統計計算では陽性とみなされた。陽性の通常の細胞診の結果のみが臨床診療において妥当だとみなされた。したがって、異型および疑いの細胞診結果は統計では陰性とみなされた。該膵胆管プローブセットは通常の細胞診（７４％対２８％、Ｐ＜０．０００１）およびＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（７４％対５１％、Ｐ＝０．０００３）より有意に高感度であり、類似した特異性を示した。該膵胆管プローブセットにより、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）と比較して３個少ない偽陽性を伴って１４個の追加的な癌症例が検出された。
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
この研究の結果は、ＥＲＣＰブラッシング試料において該膵胆管プローブセットに関して得られたＦＩＳＨカットオフ値が適切なものであることを示している。独立した患者コホートに対するこれらのカットオフ値の適用は、類似した特異性で、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）または通常の細胞診より有意に高い感度をもたらした。これらのデータは該カットオフ値の妥当性を示しているだけでなく、該膵胆管ＦＩＳＨプローブセットの臨床的有用性をも実証している。
【０１１７】
本明細書に挙げられている全ての特許、特許出願公開、雑誌論文、テキストおよび他の刊行物は、本開示が関連している技術分野の当業者の技術水準を示している。各個の刊行物が参照により本明細書に組み入れられると明確かつ個別に示されている場合と同等に、全てのそのような刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１１８】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に明確に開示されていないいずれの要素または限定の非存在下であっても適切に実施されうる。したがって、例えば、「含む」、「から実質的になる」および「からなる」なる語のいずれかの本明細書における各場合は、その他の２つの語のいずれかで置き換えられうる。同様に、文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形表現は複数形対象物を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載されている及び／又は本開示を読めば当業者に明らかとなるそのタイプの１以上の方法および／または工程を含む。
【０１１９】
用いられている用語および表現は説明の用語として用いられており、限定の用語として用いられているのではない。この点において、ある用語が「定義」において定義されており、「詳細な説明」における他の箇所では、それ以外の定義、記載または考察がなされている場合には、全てのそのような定義、記載および考察が該用語を指すものであると意図される。また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は存在しない。更に、「詳細な説明」においては、例えば「定義」のような小見出しが用いられているが、そのような使用は専ら参照の容易さのためのものであり、１つの節においてなされているいずれの開示をもその節に限定するとは意図されず、むしろ、１つの小見出しのもとでなされている全ての開示は、それぞれの他の小見出しのもとの開示を構成すると意図される。
【０１２０】
特許請求している本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴の文脈において具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更を当業者は行いうる、と理解されるべきである。そのような修飾および変更は、本出願において特許請求している本発明の範囲内であるとみなされる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における高い段階の異形成、膵胆管癌、膵胆管への転移癌、又はそのリスクの増大を検出する方法であって、
ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ及びＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブからなる検出可能な様態で標識されたプローブのセットと、患者からの膵胆管細胞のサンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、
染色体異常の存在を判定することを含み、
ここで、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌は、サンプル中のポリソミーにより示され、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌のリスクの増大は、（ｉ）テトラソミー、（ｉｉ）Ｐ１６喪失、（ｉｉｉ）ＭＣＬ１、ＭＹＣ若しくはＰ１６の単一遺伝子座獲得、又は（ｉｖ）サンプル中の併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲ若しくはＭＹＣの単一遺伝子座獲得により示され、
それにより、高い段階の異形成、膵胆管癌若しくは膵胆管への転移癌、又はそのリスクの増大が患者において検出される、方法。
【請求項２】
１００個のうち４よりも多い細胞におけるポリソミーによって、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌が示され、（ｉ）１００個のうち１１よりも多い細胞におけるテトラソミー、（ｉｉ）細胞の少なくとも５％におけるＰ１６喪失、（ｉｉｉ）１００個のうち８よりも多い細胞におけるＭＣＬ１、ＭＹＣ若しくはＰ１６の単一遺伝子座獲得、又は（ｉｖ）４よりも多い細胞における併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲ若しくはＭＹＣの単一遺伝子座獲得によって、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌のリスクの増大が示される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブからなるプローブのセット。
【請求項４】
キットであって、
（ａ）患者における膵胆管癌の検出を可能にするプローブのセットであって、ＭＣＬ１（骨髄細胞白血病配列１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブおよびＰ１６に対する遺伝子座特異的プローブからなるプローブのセット、および
（ｂ）患者における膵胆管癌を検出するための説明書であって、患者から得られた膵胆管細胞のサンプルにおける染色体異常の存在を判定することを含む、説明書
を含み、
ここで、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌が、ポリソミーによって示され、（ｉ）テトラソミー、（ｉｉ）Ｐ１６喪失、（ｉｉｉ）ＭＣＬ１、ＭＹＣ若しくはＰ１６の単一遺伝子座獲得、又は（ｉｖ）併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲ若しくはＭＹＣの単一遺伝子座獲得によって、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌のリスクの増大が示される、キット。
【請求項５】
４よりも多い細胞におけるポリソミーによって、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌が示され、（ｉ）１１よりも多い細胞におけるテトラソミー、（ｉｉ）細胞の少なくとも５％におけるＰ１６喪失、（ｉｉｉ）８よりも多い細胞におけるＭＣＬ１、ＭＹＣ若しくはＰ１６の単一遺伝子座獲得、又は（ｉｖ）４よりも多い細胞における併発するＰ１６喪失を伴うＭＣＬ１、ＥＧＦＲ若しくはＭＹＣの単一遺伝子座獲得によって、高い段階の異形成、膵胆管癌又は膵胆管への転移癌のリスクの増大が示される、請求項４記載のキット。