(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原菌と拮抗するバチルス  ズブチリスＮＣＩＢ１２３７６株菌およびＮＣＩＢ１２６１６株菌から選ばれるいずれか１種又は２種の細菌の培養物から胞子を乾燥重量で５０重量％以上含むように調製された胞子画分を含有し、抗生物質画分を含有しない農園芸用殺菌剤組成物。
【請求項２】
カビ類に属する病原菌により引き起こされる植物の病害を防除する効果を有するバチルス  ズブチリスＮＣＩＢ１２３７６株菌およびＮＣＩＢ１２６１６株菌から選ばれるいずれか１種又は２種の細菌の培養物から胞子を乾燥重量で５０重量％以上含むように調製された胞子画分を含有し、抗生物質画分を含有しない農園芸用殺菌剤組成物。
【請求項３】
前記胞子画分の水分含量が０．１〜８０重量％の範囲である請求項１または２に記載の農園芸用殺菌剤組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の農園芸用殺菌剤組成物を栽培植物に施用することを特徴とする農園芸植物の病害防除法。
【請求項５】
前記胞子画分を栽培植物に施用する方法が、栽培植物の種子にコートする、栽培植物の花に単花処理する、栽培植物の茎葉に処理する、栽培植物の傷口箇所、剪定部に塗布処理する、土壌潅注する、土壌混和する、の何れかである請求項４に記載の農園芸植物の病害防除法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、胞子画分及びこれを含有する農園芸用殺菌剤組成物並びにこの農園芸用殺菌剤組成物を用いた植物病害防除法に関し、詳しくは、バチルス属に属する細菌の胞子画分及びこれを含有する病害防除作用に優れた農園芸用殺菌剤組成物及びこれを用いた効果的な植物病害防除法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、農園芸植物を各種病害から保護する方法として、安全性、効果の持続性を考慮して、各種病害を引き起こす病原菌と拮抗する微生物を用いて病害の発生を予防する方法が広く用いられている。
【０００３】
この様に農園芸植物の病害を防除するのに用いられてきた微生物として、トリコデルマ属、グリオクラディウム属、バチルス属に属する細菌等が挙げられ、これまでに、これらの微生物を含有する農園芸用殺菌剤組成物も数多く研究開発されている。
【０００４】
この中でバチルス属に属する細菌については、例えば、特開昭６３−２７３４７０号公報では、バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＢ３株菌（ＮＣＩＢ１２３７５）、バチルス  ズブチリスＪＢ３．６株菌（ＮＣＩＢ１２３７６）、バチルス  ズブチリスＲ１株菌（ＮＣＩＢ１２６１６）あるいはこれらの変異株等から得られる抗菌物質が植物の病気、動物及びヒトの微生物感染を抑制し、更に一般的な微生物汚染を抑制するとし、上記各菌株の培養物を用いて各種農園芸植物の病害を防除する試みがなされている。
【０００５】
また、特開平２−２２２９９号公報には、上記バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＢ３株菌（ＮＣＩＢ１２３７５）、バチルス  ズブチリスＪＢ３．６株菌（ＮＣＩＢ１２３７６）、バチルス  ズブチリスＲ１株菌（ＮＣＩＢ１２６１６）あるいはこれらの変異株等から誘導される抗生物質を単離し、これを各種農園芸植物の病害防除に用いるという試みがなされている。
【０００６】
しかし、この様なバチルス属に属する細菌を応用した農園芸植物の病害防除方法では何れも、持続性、定着性、安定性等の点が必ずしも十分であるとは言えなかった。
【０００７】
また、この様なバチルス属に属する細菌が胞子を形成することは知られており、培養物などから胞子を単離することもよく行われているが、胞子をある量以上に含有する胞子画分が大量に調製され、使用された例はこれまでに報告されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、バチルス属に属する細菌の胞子画分及びこれを含有する病害防除作用に優れ、更に、定着性、持続安定性のよい農園芸用殺菌剤組成物及びこれを用いた効果的な植物病害防除法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、バチルス属に属する細菌の培養物から一定量以上の胞子を含有するように胞子画分を取り出し、これを有効成分として農園芸用殺菌剤組成物に配合することにより、病害防除作用に優れ、更に、定着性、持続安定性がよい農園芸用殺菌剤組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、バチルス属に属する細菌の培養物から胞子を５０重量％以上含むように調製された胞子画分及びこれを含有する農園芸用殺菌剤組成物並びに、この農園芸用殺菌剤組成物を用いた農園芸植物の病害防除方法である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
＜１＞バチルス属に属する細菌の胞子画分
本発明の胞子画分は、バチルス属に属する細菌を培養して得られる培養物から胞子を５０重量％以上含むようにして調製された胞子画分である。
【００１３】
本発明に用いるバチルス属に属する細菌としては、バチルス属に属する細菌であれば特に制限はされないが、好ましくは植物病原菌と拮抗するバチルス属に属する細菌が挙げられ、その内でもより好ましくはバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられ、更に、その内でもバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株菌が好ましく挙げられる。
【００１４】
バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌及びバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所（ＦＥＲＭ）に１９９４年１１月１７日付で寄託されている。また、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌はＮＣＩＢ１２３７６株菌として、バチルスズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株菌はＮＣＩＢ１２６１６株菌として、スコットランド，ＡＢ９８ＤＧ，アバーディーン（Ａｂｅｒｄｅｅｎ），アビーロード（Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ）１３５，Ｐ．Ｏ．ボックス３１のナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｔｄ．）（ＮＣＩＢ），トリー・リサーチ・ステーション（Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ）に１９８６年１２月２２日付（ＮＣＩＢ１２３７６）、１９８７年１２月２４日付（ＮＣＩＢ１２６１６）で寄託されており、これらの株の性質は、欧州特許出願公開第２７６１３２号公報に記載されている。
【００１５】
本発明の胞子画分は、上記バチルス属に属する細菌の培養物から得られるが、バチルス属に属する細菌の培養は、例えば、往復式振盪培養、ジャーファメンター培養、培養タンク培養等の液体培養や固体培養等、バチルス属に属する細菌の通常の培養方法に準じて行うことができる。
【００１６】
培養に用いる培地は、胞子を効率よく形成しやすい培地であれば何でもよく、炭素源としてグルコース、デンプン、デキストリン、シュークロース、糖蜜等の糖類、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセリン等のアルコール類を、窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩や硝酸塩及び酵母エキス、コーン・スティープ・リーカー、肉エキス、小麦胚芽、ポリペプトン、大豆粉等の有機窒素源を、無機塩としてリン酸、カリウム、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄等の塩類、例えば、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などを配合することができる。また、必要に応じて消泡剤等の種々の添加剤を用いることも可能である。
【００１７】
培養の条件は特に限定されるものではないが、培養は、固体培養あるいは、液体培養では通気撹拌や振盪培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは１５〜４０℃、ｐＨは好ましくは４〜９、より好ましくは６〜８の範囲で行う。
【００１８】
上記の様にして得られたバチルス属に属する培養物より胞子を５０重量％以上含有する胞子画分を分離する方法であるが、膜分離、遠心分離、濾過分離等の方法を用いて行うことができる。得られた胞子画分は、そのままある程度の水分を含んだ状態で後述の農園芸用殺菌剤組成物に用いることも、また、必要に応じて凍結乾燥、通風乾燥、スプレードライ等の乾燥法を用いて乾燥物として農園芸用殺菌剤組成物に用いることも可能である。
【００１９】
本発明の胞子画分の製造方法を、例えば、バチルス  ズブチルス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌を用いた場合について説明する。バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌の斜面培養物をブイヨン培地（肉エキス１％、ペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％含有）を入れた坂口フラスコに植菌後、回転振盪機で３０℃で１日間培養する。得られた培養物を培地（グルコース２％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％）を入れた発酵槽に植菌して好気的条件下で３０℃で７２時間培養して培養液を得る。この培養液を遠心分離して培養上清と菌体沈殿物に分離し、培養上清を除去後、菌体沈殿物を水で洗浄し、湿菌体（胞子画分）を得る。また、この胞子画分（湿菌体）を−８０℃で凍結後、減圧下で乾燥して粉砕すれば胞子画分の乾燥物とすることができる。この様にして得られるバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株菌培養物の胞子画分は、前記菌株の胞子を乾燥重量で約５０重量％〜１００重量％含有するものである。
【００２０】
＜２＞農園芸用殺菌剤組成物
本発明の農園芸用殺菌剤組成物に、上記バチルス属に属する細菌の胞子画分を配合する際には、含有胞子重量が組成物全量の０．０００１〜１００％となるように配合することが好ましい。また、本発明の農園芸殺菌剤組成物に含有される胞子画分は、水分含量が０．１〜８０重量％の範囲であることが好ましい。
【００２１】
本発明の農園芸用殺菌剤組成物は、通常の微生物製剤の製造方法に従って、上記バチルス属に属する細菌の胞子画分を必要に応じて各種任意成分と共に、粉剤、粒剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル、塗布剤等に製剤化したものである。
【００２２】
上記任意成分としては、固体担体として、カリオンクレー、ベントナイト、モンモリロナイト、珪藻土、酸性白土、タルク類、パーライト、バーミキュライト等の鉱物質微粉末、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機塩、フスマ、キチン、多糖類、米糠、小麦粉等の有機物微粉末等を、また、補助剤として、カゼイン、ゼラチン、アラビアガム、アルギン酸、糖類、合成高分子（ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸類等）、ベントナイト等の固着剤や分散剤、その他の成分として、プロピレングリコール、エチレングリコール等の凍結防止剤、キサンタンガム等の天然多糖類、ポリアクリル酸類等の増粘剤を挙げることができる。
【００２３】
この様にして得られる本発明の農園芸用殺菌剤組成物が適応される植物の病原菌としては、病原菌がかび類に属するもの、例えば、イネの紋枯病菌リゾクトニア  ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、いもち病菌ピリキュラリア  オリゼー（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、オオムギのうどんこ病菌エリシフェ  グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、コムギの立枯病菌ゲウマノマイセス  グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、エンドウの褐斑病菌アスコキタ  ピシ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｐｉｓｉ）、ソラマメの赤色斑点病菌ボトリチス  ファバエ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｆａｂａｅ）、
【００２４】
野菜類、例えば、トマト、ナス、イチゴ、キュウリ、レタス、インゲン等の灰色かび病菌ボトリチス  シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、キャベツの黒すす病菌アルタナリア  ブラッシコーラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、トマトの葉かび病菌クラドスポリウム  フラバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）、疫病菌フィトフトラ  インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、萎ちょう病菌フザリウム  オキスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、キュウリのうどんこ病菌スフェロテカ  フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、べと病菌シュードペロノスポラ  キュベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、立枯病菌ピシウム  ｓｐ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐ．）、ネギのさび病菌プシニア  アリー（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ａｌｌｉｉ）、小菌核病菌スクレロチニア  アリー（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ａｌｌｉｉ）、ハクサイの黒斑病菌アルタナリアブラッシセア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ニンジンの黒葉枯病菌アルタナリアダウシ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｄａｕｃｉ）、ホウレンソウの立枯病菌リゾクトニア  ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、レタスの菌核病菌スクレロチニア  スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ナスの半身萎ちょう病菌バーティシリウム  ダリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、イチゴのうどんこ病菌スファエロテカ  フムリ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）、炭そ病菌コレトトリカム  フラガリア（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）、
【００２５】
花卉類、例えば、シクラメン、キク、バラ、スターチス等の灰色かび病菌ボトリチス  シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、バラのうどんこ病菌スファエロテカ  パノッサ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｐａｎｎｏｓａ）、キクの白さび病菌プッシニア  ホリアナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｉａｎａ）、
【００２６】
果樹の白紋羽病菌ロセリニア  ネカトリックス（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、カンキツ類の青かび病菌ペニシリウム  イタリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ）、黒点病菌ディアポルセ  シトリ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｃｉｔｒｉ）、ナシの赤星病菌ジムノスポランジウム  アシアチカム（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、リンゴの黒星病菌ベンツリア  イネクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、モモの灰星病菌モニリニア  フルクチコーラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、
【００２７】
芝生のラージパッチ病菌リゾクトニア  ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、葉枯病菌カーブラリア  ｓｐ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ）、ヘルミントスポリウム  ｓｐ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ）、さび病菌プッシニア  ゾイシア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｚｏｙｓｉａｅ）、ダラースポット病菌スクレロチニア  ホメオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）、春はげ病菌フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、雪腐病菌ティフラ  インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）、ブラウンパッチ病菌リゾクトニア  ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）等を挙げることができる。
【００２８】
＜３＞本発明の植物病害防除法
本発明においては、上記の様な各種栽培植物の各種病害を防除する目的で、上記本発明の農園芸用殺菌剤組成物を栽培植物に施用する。
【００２９】
施用の方法としては、剤型等の使用形態、作物や病害によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、水面施用、施設内施用、土壌混和施用、土壌潅注施用、表面処理（種子粉衣、塗布処理等）育苗箱施用法、単花処理、株元処理等の方法を挙げることができるが、好ましくは、各種剤型の農園芸用殺菌剤組成物を栽培植物の種子にコートする、栽培植物の花に単花処理する、栽培植物の茎葉に処理する、栽培植物の傷口箇所、剪定部に塗布処理する、土壌潅注する、土壌混和する等の方法が挙げられる。
【００３０】
また、栽培植物への農園芸用殺菌剤組成物の施用に際して、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材、ポリビニルアルコール系資材等）等を混合施用、あるいは混合せずに交互施用、または同時施用することも可能である。
【００３１】
本発明の農園芸用殺菌剤組成物の施用量は、病害の種類、適用植物の種類、殺菌剤組成物の剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、液剤の農園芸用殺菌剤組成物を地上散布する場合には、その施用の胞子濃度は、通常約１０６ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬ〜１０１０ＣＦＵ／ｍＬであり、好ましくは約１０７ＣＦＵ／ｍＬ〜１０９ＣＦＵ／ｍＬであり、施用量は、０．５〜５０Ｌ／ａである。また、粒剤、粉剤等はなんら希釈することなく製剤のままで施用することも可能であり、地上散布する場合、胞子の施用量が、１０１２〜１０１４ＣＦＵ／ａ程度となるように散布することが好ましい。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を説明する。まずはじめに、バチルス属に属する細菌の胞子画分の実施例及び比較例の抗生物質画分、生菌体画分の製造について説明する。
【００３３】
【実施例１〜３】
粉末胞子
バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の保存菌の斜面培養物の一白金耳をフラスコ当たり１００ｍＬのブイヨン培地（肉エキス１％、ペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％含有）の入った坂口フラスコ（５００ｍＬ容）に植菌後、振幅１０ｃｍ、回転数１２０ｒｐｍの往復振盪機を用いて３０℃で１日間培養した。得られた培養物３００ｍＬを培地（グルコース２％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％）１５Ｌの入った３０Ｌ容の発酵槽に植菌し、好気的条件下で３０℃で７２時間培養して培養液を得た。得られた約１５Ｌの培養液を常法に従って遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０分間）して培養上清と菌体沈殿物に分離した。培養上清を抗生物質画分（比較例１）として分離後、菌体沈殿物を水で洗浄し、湿重量約７８０ｇの湿菌体（胞子画分）を得た。
【００３４】
上記で得られたバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子画分（湿菌体）約１１０ｇを−８０℃で凍結後、減圧下で乾燥して粉砕することにより、乾燥重量約２２ｇのバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の粉末胞子を得た（実施例１）。この粉末胞子は、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子を１００重量％含有するものであった。
【００３５】
また、上記で得られたバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子画分（湿菌体）約６００ｇを水３Ｌに懸濁後、スプレードライヤー（ニロジャパン社製）に１．５〜２Ｌ／ｈｒの流速で処理した（入口温度１５０℃、出口温度１００℃）。スプレードライヤーによって得られた乾燥物を粉砕することにより乾燥重量約７８ｇの粉末胞子を得た（実施例２）。この粉末胞子は、バチルスズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子を１００重量％含有するものであった。
【００３６】
上記でバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株を用いる替わりに、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株を用いて同様の培養、分離操作を行い、湿重量７５０ｇのバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株湿菌体（胞子画分）を得た、その後、この胞子画分について上記実施例２と同様のスプレードライヤーによる乾燥操作を行い、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株の胞子を５０重量％含有する乾燥重量約９８ｇのバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株粉末胞子を得た（実施例３）。
【００３７】
【比較例２】
バチルス属に属する細菌の生菌体画分（湿菌体）
バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の保存菌の斜面培養物の一白金耳をフラスコ当たり１００ｍＬのブイヨン培地（肉エキス１％、ペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％含有）の入った坂口フラスコ（５００ｍＬ容）に植菌後、振幅１０ｃｍ、回転数１２０ｒｐｍの往復振盪機を用いて３０℃で１日間培養した。得られた培養物３００ｍＬを培地（グルコース２％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％）１５Ｌの入った３０Ｌ容の発酵槽に植菌し、好気的条件下で１８時間培養して培養液を得た。得られた約１５Ｌの培養液を常法に従って遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０分間）して培養上清と菌体沈殿物に分離した。培養上清を除去後、菌体沈殿物を水で洗浄し、湿重量約６００ｇの湿菌体（生菌体画分）を得た。この生菌体画分は、バチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子を乾燥重量で３重量％含有するものである。
【００３８】
次に、上記実施例で得られたバチルス属に属する細菌の胞子画分を含有する本発明の農園芸用殺菌剤組成物の実施例及び上記比較例のバチルス属に属する細菌の生菌体画分を含有する比較例組成物について説明する。
【００３９】
【実施例４〜５】
懸濁液剤
上記実施例２で得られた粉末胞子の約３ｇを２Ｌの水に懸濁して約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬのバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子懸濁液を製造した（実施例４）。同様にして、実施例３で得られた粉末胞子より約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ濃度のバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４６株の胞子懸濁液を得た（実施例５）。
【００４０】
【実施例６】
ペースト液剤
上記実施例１によって得られた粉末胞子約１２ｇを３００ｍＬの水に懸濁して約４×１０１０ＣＦＵ／ｍＬのバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の胞子ペースト液を得た。
【００４１】
【実施例７】
水和剤
実施例２によって得られた粉末胞子５０重量部にタルク５０重量部を混和してバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の粉末胞子含有の水和剤を得た。
【００４２】
【実施例８】
粒剤
実施例１によって得られた粉末胞子０．５重量部、ベントナイト５０重量部、カオリンクレー４９．５重量部を加えよく混和した。これに水１０重量部を加えよく練合した後、直径０．８ｍｍのスクリーンの付いた押し出し造粒機で造粒し、室温条件下にて乾燥した。これを３００〜１７００μｍの粒径となるように製粒してバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の粉末胞子含有の粒剤を得た。
【００４３】
【実施例９】
粉剤
実施例２によって得られた粉末胞子１重量部にタルク９９重量部を混和してバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の粉末胞子含有の粉剤を得た。
【００４４】
【比較例３】
生菌体懸濁液
上記比較例２によって得られたバチルス  ズブチリス  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４７株の生菌体画分約１００ｇを水１０Ｌに懸濁させて生菌体懸濁液を得た。
【００４５】
次に、上記実施例４〜９で得られた農園芸用殺菌剤組成物及び比較例１、３で得られた抗生物質画分、生菌体懸濁液を用いて農園芸植物の病害防除の試験を行った。以下に、この実施例について説明する。
【００４６】
【実施例１０】
芝草ブラウンパッチ病防除試験
砂、フスマ培地で１０日間培養した病原菌リゾクトニア  ソラニを接種源とした。稲用育苗箱で播種後６０日間育成した芝（ベントグラス）に、上記の様にして調製した接種源をコルクボーラーを用いて試験区（４００ｃｍ２／区、３反復）の２ヶ所に接種し、目土を処理し供試した。この試験区に実施例４で得られた胞子懸濁液を病原菌接種の１日後に小型噴霧器を用いて１Ｌ／ｍ２の量で７日間隔で２回、土壌潅注した。最終処理の３週間後に被害度測定表示盤（１６×２５ｃｍ、３２マス）を用いて発病を程度別に調査し、下記式により発病度を算出した。
【００４７】
【数１】
発病度＝Σ（程度別発病マス数×発病指数）／（調査マス数×４）
0003554592.tif 000002
【００４８】
また、上記試験区と同様に病原菌を接種し、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかった区を無処理区として、次式により試験区の防除価を算出した。
【００４９】
【数２】
防除価（％）＝（１−（試験区の発病度／無処理区の発病度））×１００
【００５０】
更に、比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を市販のバシタック（主成分；メプロニル、クミアイ化学製、１５００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
0003554592.tif 000003
【００５２】
【実施例１１】
芝草ラージパッチ病防除試験
日本シバを用いて栽培管理しているゴルフ場のフェアウェイを用いて試験を行った（試験区：２５ｍ２／区、２連制）。試験場所は、毎年ラージパッチ病害が多発している所を選定した。実施例７で得られた水和剤の１０００倍希釈液を上記試験区に、動力噴霧器を用いて１Ｌ／ｍ２の割合で１４日間隔で２回、土壌潅注した。最終処理後、１ヶ月目に発病状態を調査した。調査は発病面積を測定し、発病面積率（％）を算出して行った。また、上記実施例７で得られた水和剤による処理を行わなかった区を無処理区として、上記実施例１０と同様にして試験区の防除価を算出した。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
0003554592.tif 000004
【００５４】
【実施例１２】
芝草葉枯性病害防除試験（圃場試験）
ベントグラスを５ｍｍの長さに管理しているゴルフ場のグリーンを用いて試験（試験区：１ｍ２／区、３連制）した。なお、試験場所とした上記グリーンには、毎年葉枯性病害が多発している。この試験区に実施例４で得られた胞子懸濁液を１Ｌ／ｍ２の量で７日間隔で３回、土壌潅注し、最終処理の２週間後に発病状態を発病面積を測定して調査し、発病面積率（％）を求めた。また、上記実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかった区を無処理区として、上記実施例１０と同様にして試験区の防除価を算出した。更に、比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を市販のバシタック（１５００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病面積率及び防除価を算出した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
0003554592.tif 000005
【００５６】
【実施例１３〜１５】
ホウレンソウ立枯病防除試験
砂、フスマ、水（容量比＝３：１：１）を混合後、オートクレーブ（１２１℃、６０分）滅菌し、フスマ培地とした。このフスマ培地にリゾクトニア菌を植菌し、培地全体にリゾクトニア菌の菌糸が蔓延するまで培養した。これを殺菌土壌で所定濃度に希釈し、汚染土壌とした。この汚染土壌に実施例４で得られた胞子懸濁液を２Ｌ／ｍ２の量で土壌潅注処理した。また、別の試験区に実施例９で得られた粉剤を２０ｇ／ｍ２の割合で土壌混和処理した。その後、これらの処理が施された２種類の土壌にホウレンソウ種子を播種した。また、これらとは別に、実施例９で得られた粉剤をホウレンソウ種子に種子重量に対して１重量％の割合で粉衣処理し、この種子を無処理の汚染土壌に播種した。これら３種類の試験区について播種後、１週間目に発芽率を調査した。
【００５７】
更に無処理の汚染土壌に、無処理のホウレンソウ種子を播種したコントロールについても同様に播種後、１週間目の発芽率を調査した。結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
0003554592.tif 000006
【００５９】
【実施例１６】
キュウリ灰色かび病防除試験
培土を詰めたプラスチックポット（径６ｃｍ）にキュウリ（光３号Ｐ型）を播種し、温室内で１２から１４日間育成した。子葉が展開したキュウリの幼苗に実施例４によって調製した胞子懸濁液を葉面に十分付着するように噴霧処理した。処理後、葉面を風乾し、明（２５℃、１２時間）、暗（１８℃、１２時間）乾燥条件下１〜２日間置いた。キュウリ子葉を胚軸より切断し、キュウリ灰色かび病菌胞子を含んだ寒天プラグ（径６ｍｍ）を子葉中央に接種した。接種後、１８℃、暗黒、多湿条件下３日間置いた後、発病斑径を測定した。
【００６０】
また、上記実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったキュウリ子葉についても同様の試験を行い発病斑径を測定し、これを用いて上記実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。更に、比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液をポリオキシン（主成分；ポリオキシン複合体、クミアイ化学製）、ダコニール（主成分；ＴＰＮ、武田薬品製）を各々６００倍（１６６７ｐｐｍ）、１０００倍（１０００ｐｐｍ）の希釈液に替えて同様の試験を行い、発病斑径及び防除価を算出した。結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
0003554592.tif 000007
【００６２】
【実施例１７】
キュウリ灰色かび病防除試験
灰色かび病原菌として薬剤耐性菌を用いて発病させた以外は実施例１６と同様に実施した。用いた薬剤耐性菌はベンズイミダゾール系薬剤（商品名：トップジンＭ、ベンレート）及びジカルボキシイミド系薬剤（商品名：ロブラール、スミレックス、ロニラン）に対して各々１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ濃度で生育阻害を受けない耐性菌である。
【００６３】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液をトップジンＭ（日本曹達製、６６７ｐｐｍ）、ベンレート（デュポン製、１０００ｐｐｍ）、ロブラール（武田薬品製、１０００ｐｐｍ）、スミレックス（北興化学製、１０００ｐｐｍ）、ロニラン（三共製、１０００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病斑径及び防除価を算出した。結果を表６に示す。
【００６４】
【表６】
0003554592.tif 000008
【００６５】
【実施例１８】
キュウリうどんこ病防除試験
キュウリうどんこ病に対する防除効果をガラス温室において試験した。径９ｃｍのビニール鉢を用いて栽培した第２本葉時のキュウリ（品種：相模半白節成、試験区：１本／鉢、４鉢／区）に実施例４によって得られた胞子懸濁液を小型噴霧器を用いて７日間隔で２回、１鉢当たり５０ｍＬ散布し、最終処理の２週間後にキュウリうどんこ病の発病の様子を調査し、下記式により発病度を算出した。
【００６６】
【数３】
発病度＝Σ（程度別発病葉数×発病指数）／（調査葉数×４）
0003554592.tif 000009
【００６７】
また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったキュウリについても上記同様に実験を行い、発病度を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表７に示す。
【００６８】
【表７】
0003554592.tif 000010
【００６９】
【実施例１９、２０】
ナス灰色かび病防除試験ナス灰色かび病に対する防除効果をガラス温室において試験（品種：千両、試験区：８株／区、３反復）した。ナス灰色かび病菌の接種は、灰色かび病菌を感染させ培養したナス果実を温室内に吊り下げて行った。ナスの開花結実期に実施例７で得られた水和剤の５００倍希釈液を７日間隔で３回全面散布（株全体（茎葉）噴霧処理、散布液量は１５０Ｌ／１０ａ）した。他の試験区には、実施例７で得られた水和剤の５００倍希釈液を開花したナスの花毎に十分量散布する単花処理（散布液量は１０Ｌ／１０ａ）を行った。最終散布の７日後に発病果・花を測定した。また、実施例７で得られた水和剤による処理を行わなかったナスについても上記同様に実験を行い、発病果・花を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表８に示す。
【００７０】
【表８】
0003554592.tif 000011
【００７１】
【実施例２１】
ナス灰色かび病防除試験
ナス灰色かび病に対する防除効果をガラス温室において試験（品種：千両、試験区：８株／区、３反復）した。ナス灰色かび病菌の接種は、灰色かび病菌を感染させ培養したナス果実を温室内に吊り下げて行った。ナスの開花結実期後期、株の下から発生した徒長枝を残して主枝、第１側枝、第２側枝を剪定した。実施例６で得られた胞子懸濁ペースト液を前記の様に剪定した切断面に７日間隔で２回塗布した。最終塗布の２週間後に試験部位の発病度を測定した。また、実施例６で得られたペースト液による処理を行わなかったナスについても上記同様に実験を行い、発病度を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表９に示す。
【００７２】
【表９】
0003554592.tif 000012
【００７３】
【実施例２２、２３】
トマト灰色かび病防除試験
トマト灰色かび病に対する防除効果をガラス温室において試験（品種：瑞健、試験区：１２株／区、３反復）した。トマト灰色かび病菌は灰色かび病菌を感染させ培養したミカン果実を温室内に吊り下げて行った。トマトの第３果房開花期に、実施例４、５で得られた胞子懸濁液をそれぞれ施用量２００Ｌ／１０ａにて７日間隔で３回散布（茎葉部噴霧処理）した。最終散布の７日後に発病果・花を測定した。また、実施例で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったトマトについても上記同様に実験を行い、発病果・花を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表１０に示す。
【００７４】
【表１０】
0003554592.tif 000013
【００７５】
【実施例２４、２５】
インゲン灰色かび病防除試験
インゲン灰色かび病に対する防除効果をガラス温室において試験（品種：さつきみどり、試験区：６０株／区）した。発病は自然発生とした。インゲンの開花期に実施例４及び実施例５で得られた胞子懸濁液を施用量１５０Ｌ／１０ａの割合で７日間隔で２回散布（茎葉部噴霧処理）した。最終散布の２週間後にインゲン莢について発病の有無を調査し、発病莢率を求めた。また、実施例で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったインゲンについても上記同様に実験を行い、発病莢率（％）を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表１１に示す。
【００７６】
【表１１】
0003554592.tif 000014
【００７７】
【実施例２６】
キク灰色かび病防除試験
キク灰色かび病に対する防除効果をビニールハウスにおいて試験（品種：秀芳の力、試験区：１０株／区、３反復）した。キク灰色かび病菌の接種は灰色かび病菌に感染したキクを植えたプランターを試験区内に並べることにより行った。キクの生育中期（開花期）に、実施例４によって得られた胞子懸濁液をキクの花弁に７日間隔で３回散布し、最終散布の７日後に発病度を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったキクについても上記同様に実験を行い、発病度を調査し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００７８】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を、市販のダコニール（武田薬品製、１０００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。結果を表１２に示す。
【００７９】
【表１２】
0003554592.tif 000015
【００８０】
【実施例２７】
キク白さび病防除試験
キク白さび病に対する防除効果をビニールハウスにおいて試験（品種：秀芳の力、試験区：１０株／区、３反復）した。キク白さび病菌の接種は白さび病菌に感染したキクを植えたプランターを試験区内に並べることにより行った。キクの生育中期に、実施例４で得られた胞子懸濁液を７日間隔で３回散布（株全体噴霧処理）し、最終散布の７日後に発病葉率を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったキクについても上記同様に実験を行い、発病葉率を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００８１】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を、市販のサプロール（主成分；トリホリン、武田薬品製、１０００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病葉率及び防除価を算出した。結果を表１３に示す。
【００８２】
【表１３】
0003554592.tif 000016
【００８３】
【実施例２８】
シクラメン灰色かび病防除試験
シクラメン灰色かび病に対する防除効果を温室において試験（品種：ボレロ、試験区：５鉢／区）した。シクラメンの開花期に、実施例４で得られた胞子懸濁液を花弁部に噴霧処理した。シクラメン灰色かび病菌の接種は、胞子懸濁液処理から７日後に灰色かび病菌胞子懸濁液（１．０×１０９個／Ｌ）を鉢全体に噴霧して行った。管理は１鉢毎ビニール袋で覆い多湿条件下で行った。病原菌接種７日後、花弁部での発病度を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わずに病原菌を接種したシクラメンについても上記同様に実験を行い、発病度を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００８４】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を、市販のトップジンＭ（日本曹達製、６６７ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。結果を表１４に示す。
【００８５】
【表１４】
0003554592.tif 000017
【００８６】
【実施例２９】
シクラメン灰色かび病防除試験
シクラメン灰色かび病に対する防除効果を温室において試験（品種：ボレロ、試験区：５鉢／区）した。シクラメンの開花期に実施例４によって得られた胞子懸濁液をシクラメンの株もとに噴霧処理した。シクラメン灰色かび病菌の接種は、胞子懸濁液処理から７日後に灰色かび病菌胞子懸濁液（１．０×１０９個／Ｌ）を鉢全体に噴霧して行った。管理は１鉢毎ビニール袋で覆い多湿条件下で行った。病原菌接種１４日後、株もとでの発病度を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わずに病原菌を接種したシクラメンについても上記同様に実験を行い、発病度を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表１５に示す。
【００８７】
【表１５】
0003554592.tif 000018
【００８８】
【実施例３０】
スターチス灰色かび病防除試験
スターチス灰色かび病に対する防除効果をビニールハウスにおいて試験（試験区：１．５ｍ２／区）した。発病は自然発生とした。スターチスの開花期に、実施例７で得られた水和剤の５００倍希釈液を上記試験区に７日間隔で２回散布し、最終散布の２週間後に発病度を調査した。また、実施例７で得られた水和剤による処理を行わなかったスターチスついても上記同様に実験を行い、発病度を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００８９】
比較のために実施例７で得られた水和剤を、市販のトップジンＭ（日本曹達製、６６７ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。結果を表１６に示す。
【００９０】
【表１６】
0003554592.tif 000019
【００９１】
【実施例３１】
バラうどんこ病防除試験
バラうどんこ病に対する防除効果をビニールハウスにおいて試験（品種：クリスチャンディオール、試験区：１株／区、３反復）した。バラうどんこ病の接種は、うどんこ病に感染した鉢を試験区の間に並べることにより行った。新梢伸長期から展葉期のバラに、実施例４で得られた胞子懸濁液を７日間隔で３回散布し、最終散布の７日後に発病葉率を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わず上記同様に実験を行ったバラについても発病葉率を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００９２】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を、市販のサプロール乳剤（武田薬品製、１０００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病葉率及び防除価を算出した。結果を表１７に示す。
【００９３】
【表１７】
0003554592.tif 000020
【００９４】
【実施例３２】
ナシ赤星病防除試験
ナシ赤星病に対する防除効果を野外の果樹園において試験（品種：長十郎、樹齢：１０年生、試験区：３成木／区）した。発病は自然感染とした。ナシの開花期に、実施例４で得られた胞子懸濁液を肩掛式噴霧器で７日間隔で２回散布（２Ｌ／本）した。最終処理の２週間後に、発病の程度を調査し、以下の式を用いて発病度を算出した。
【００９５】
【数４】
発病度＝Σ（程度別発病葉数×発病指数）／（調査葉数×３）
0003554592.tif 000021
【００９６】
また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったナシの木についても上記同様に実験を行い、発病度を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。結果を表１８に示す。
【００９７】
【表１８】
0003554592.tif 000022
【００９８】
【実施例３３】
レタス菌核病防除試験
レタス菌核病に対する防除効果を試験（品種：シスコ、試験区：４０株／区、３反復）した。レタス菌核病菌の接種は素焼き鉢で形成させたレタス菌核病菌子のう盤を試験区内に均等に配置することによって行った。レタスの結球初期に、実施例４で得られた胞子懸濁液を２５０Ｌ／１０ａの割合で７日間隔で３回散布した。最終散布の７日後に発病度を調査した。また、実施例４で得られた胞子懸濁液による処理を行わなかったレタスについても上記同様に実験を行い、発病度を測定し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価を算出した。
【００９９】
比較のために実施例４で得られた胞子懸濁液を、市販のトップジンＭ（日本曹達製、６６７ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。結果を表１９に示す。
【０１００】
【表１９】
0003554592.tif 000023
【０１０１】
【実施例３４】
ナス灰色かび病に対する防除効果をガラス温室において試験（品種：千両、試験区：８株／区、３反復）した。ナス灰色かび病菌の接種は、灰色かび病菌を感染させ培養したナス果実を温室内に吊り下げて行った。ナスの開花結実期に、実施例７で得られた水和剤の５００倍希釈液（１×１０１２ＣＦＵ／Ｌ）を７日間隔で３回散布（株全体に噴霧処理、３００Ｌ／１０ａ）した。最終散布の１週間後、２週間後に発病果・花率（％）を算出した。また、実施例７で得られた水和剤による処理を行わなかったナスについても同様に実験を行い、発病果・花率を算出し、これを用いて実施例１０と同様にして実施例の防除価（％）を算出した。
【０１０２】
比較のために実施例７で得られた水和剤を、比較例３で得られた生菌体懸濁液及び比較例１で得られた培養液上清（抗生物質画分）に替えて同様の試験を行い、発病果・花率及び防除価を算出した。結果を表２０に示す。
【０１０３】
【表２０】
0003554592.tif 000024
【０１０４】
これらの結果から明らかなうように、本発明のバチルス属に属する細菌の胞子画分を含有する農園芸用殺菌剤組成物は、病害防除作用に優れ、更に、定着性、持続安定性がよい。また、本発明の植物病害防除法によれば、各種植物の病害を効果的に防除することが可能である。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明の農園芸用殺菌剤組成物は、バチルス属に属する細菌の胞子画分を含有することで病害防除作用に優れ、更に、定着性、持続安定性がよい。また、このバチルス属に属する細菌の胞子画分を含有した農園芸用殺菌剤組成物を用いた本発明の植物病害防除法は、非常に効果的に植物を各種病害から保護することができる。