【手続補正書】
【提出日】平成29年3月3日(2017.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌。
【請求項２】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸配列が、前記メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、請求項１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項３】
（ａ）コードされる前記イソプレンシンターゼが、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない；
（ｂ）イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されており、必要に応じて、前記発現制御配列は、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである；ならびに／あるいは
（ｃ）前記外因性核酸が、配列番号１〜６および１４〜１９のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列をコードする、請求項１または２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項４】
（ａ）前記メタン資化性細菌が、親メタン資化性細菌による内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せであり、必要に応じて、ここで、前記ＤＸＰ経路酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである；あるいは
（ｂ）前記メタン資化性細菌が、親メタン資化性細菌による内因性メバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現することができるか、メバロン酸経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せであり、必要に応じて、ここで、前記メバロン酸経路酵素が、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼまたはこれらの組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項５】
前記イソプレンシンターゼをコードする前記核酸が、Pueraria  montana、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項６】
前記メタン資化性細菌が、
（ａ）バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸で形質転換されており、必要に応じて、ここで、少なくとも１種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、２種のバリアントＤＸＰ経路酵素を含み、前記２種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含む；
（ｂ）約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンを産生することができる；
（ｃ）Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocella、Methylocapsaである；ならびに／あるいは
（ｄ）Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
【請求項７】
炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、請求項１〜６のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、イソプレンを産生する方法。
【請求項８】
前記炭素供給原料が、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メタン資化性細菌が、発酵により培養され、前記発酵により産生される前記イソプレンが、オフガスとして回収され、
必要に応じて、ここで、
（ａ）前記回収されたイソプレンが、二量体（１０炭素）炭化水素、三量体（１５炭素）炭化水素またはこれらの組合せへとさらに改変される；
（ｂ）前記回収されたイソプレンが、二量体（１０炭素）炭化水素、三量体（１５炭素）炭化水素またはこれらの組合せへとさらに改変され、そして前記二量体炭化水素、三量体炭化水素またはこれらの組合せが、長鎖分枝状アルカンへと水素化される；または
（ｃ）前記回収されたイソプレンが、イソプレノイド産物へとさらに改変される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
イソプレン組成物であって、前記イソプレンが、約−３０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、イソプレン組成物。
【請求項１１】
前記イソプレンが、約−４０‰〜約−５０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、請求項１０に記載のイソプレン組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本開示は、また、イソプレンが約−３０％〜約−５０％の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、イソプレン組成物を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌であって、炭素供給原料をイソプレンに変換することができるメタン資化性細菌。
（項目２）
前記イソプレンシンターゼをコードする前記核酸が、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する、項目１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目３）
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸配列が、前記メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、項目１または２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目４）
前記イソプレンシンターゼが、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない、項目１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目５）
前記核酸が、配列番号１〜６のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列をコードする、項目２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目６）
前記核酸が、配列番号１４〜１９のうちいずれか１種に示されている配列を含む、項目２に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目７）
イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されている、項目１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目８）
前記発現制御配列が、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーター、セリン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、項目７に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目９）
親メタン資化性細菌による内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、項目１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１０）
親メタン資化性細菌による内因性メバロン酸経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性メバロン酸経路酵素を過剰発現することができるか、メバロン酸経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、項目１に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１１）
前記ＤＸＰ経路酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである、項目９に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１２）
前記メバロン酸経路酵素が、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼまたはこれらの組合せである、項目１０に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１３）
バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸で形質転換されている、先行する項目のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１４）
少なくとも１種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、２種のバリアントＤＸＰ経路酵素を含み、前記２種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含む、項目１３に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１５）
約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンを産生することができる、先行する項目のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１６）
Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocella、Methylocapsaである、項目１〜１５のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１７）
Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium  petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである、項目１〜１６のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１８）
前記炭素供給原料が、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである、項目１〜１７のいずれか一項に記載の天然に存在しないメタン資化性細菌。
（項目１９）
炭素供給原料の存在下、イソプレンの産生に十分な条件下で、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸を含む天然に存在しないメタン資化性細菌を培養するステップを含む、イソプレンを産生する方法。
（項目２０）
前記イソプレンシンターゼをコードする前記核酸が、Populus  alba、Populus  trichocarpa、Populus  tremuloides、Populus  nigra、Populus  alba  x  Populus  tremula、Populus  ×  canescens、Pueraria  montana、Pueraria  lobata、Quercus  robur、Faboideae、Salix  discolor、Salix  glabra、Salix  pentandraまたはSalix  serpyllifoliaに由来する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸配列が、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、Ｎ末端色素体標的化配列を含まない、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記外因性核酸が、配列番号１〜６のうちいずれか１種に示されているアミノ酸配列をコードする、項目１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記外因性核酸が、配列番号１４〜１９のうちいずれか１種に示されている配列を含む、項目１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
イソプレンシンターゼをコードする前記外因性核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されている、項目１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記発現制御配列が、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、ヘキスロース６−リン酸シンターゼプロモーター、リボソームタンパク質Ｓ１６プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＴｒｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記メタン資化性細菌が、親メタン資化性細菌による内因性ＤＸＰ経路酵素の正常発現レベルと比較して前記内因性ＤＸＰ経路酵素を過剰発現することができるか、ＤＸＰ経路酵素をコードする外因性核酸で形質転換されておりこれを発現することができるか、またはこれらの組合せである、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記ＤＸＰ経路酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩＤＩ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨまたはこれらの組合せである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記メタン資化性細菌が、バリアントＤＸＰ経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸で形質転換される、項目１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
少なくとも１種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、２種のバリアントＤＸＰ経路酵素を含み、前記２種のバリアントＤＸＰ経路酵素が、突然変異ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）および突然変異３，４ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記メタン資化性細菌が、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocella、Methylocapsaである、項目１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記メタン資化性細菌が、Methylococcus  capsulatus  Bath株、Methylomonas  methanica  16a(ATCC  PTA  2402)、Methylosinus  trichosporium  OB3b(NRRL  B-11,196)、Methylosinus  sporium(NRRL  B-11,197)、Methylocystis  parvus(NRRL  B-11,198)、Methylomonas  methanica(NRRL  B-11,199)、Methylomonas  albus(NRRL  B-11,200)、Methylobacter  capsulatus(NRRL  B-11,201)、Methylobacterium  organophilum(ATCC  27,886)、Methylomonas  sp  AJ-3670(FERM  P-2400)、Methylocella  silvestris、Methylocella  palustris(ATCC  700799)、Methylocella  tundrae、Methylocystis  daltona  SB2株、Methylocystis  bryophila、Methylocapsa  aurea  KYG、Methylacidiphilum  infernorum、Methylacidiphilum  fumariolicum、Methyloacida  kamchatkensis、Methylibium
petroleiphilumまたはMethylomicrobium  alcaliphilumである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記炭素供給原料が、メタン、メタノール、天然ガスまたは非在来型天然ガスである、項目１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記メタン資化性細菌が、約１ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌのイソプレンを産生することができる、項目１９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記メタン資化性細菌が、発酵により培養され、前記発酵により産生される前記イソプレンが、オフガスとして回収される、項目１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記回収されたイソプレンが、二量体（１０炭素）炭化水素、三量体（１５炭素）炭化水素またはこれらの組合せへとさらに改変される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記二量体炭化水素、三量体炭化水素またはこれらの組合せが、長鎖分枝状アルカンへと水素化される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記回収されたイソプレンが、イソプレノイド産物へとさらに改変される、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
突然変異メタン資化性細菌をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記メタン資化性細菌を突然変異原に曝露して、突然変異メタン資化性細菌を生成するステップと、
（ｂ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸で、前記突然変異メタン資化性細菌を形質転換するステップと、
（ｃ）増殖に十分な条件下で、前記形質転換された突然変異メタン資化性細菌を培養するステップと
を含み、
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸を含有する参照メタン資化性細菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す突然変異メタン資化性細菌が、イソプレン前駆体合成の増加を示す方法。
（項目４０）
前記突然変異原が、放射線、化学物質、プラスミドまたはトランスポゾンである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前に行われ、続いて前記形質転換された突然変異メタン資化性細菌が、増殖に十分な条件下で培養される、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
赤色色素沈着が増加した前記突然変異メタン資化性細菌またはそのクローン細胞が、イソプレンシンターゼをコードする外因性核酸で形質転換される、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする前記核酸のうち少なくとも１種が、前記突然変異メタン資化性細菌から除去されるかまたはこれにおいて不活性化される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
メタン資化性細菌におけるイソプレン経路遺伝子をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記メタン資化性細菌を、
（ｉ）イソプレン経路酵素をコードする少なくとも１種の外因性核酸、
（ｉｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、フィトエンシンターゼ（ＣＲＴＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣＲＴＩ）をコードする外因性核酸
で形質転換するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記メタン資化性細菌を、増殖に十分な条件下で培養するステップと
を含み、
ＧＧＰＰＳ、ＣＲＴＢおよびＣＲＴＩをコードする外因性核酸を含有し、イソプレン経路酵素をコードする外因性核酸を含有しない参照メタン資化性菌と比較して赤色色素沈着の増加を示す前記形質転換されたメタン資化性細菌が、イソプレン前駆体合成の増加を示す方法。
（項目４５）
前記イソプレン経路酵素が、ＤＸＰ経路酵素またはメバロン酸経路酵素である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、異種核酸である、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、宿主メタン資化性細菌における発現のためにコドン最適化される、項目４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、同種核酸である、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４９）
前記同種核酸が、前記メタン資化性細菌において過剰発現される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
イソプレン経路酵素をコードする前記少なくとも１種の外因性核酸が、天然に存在しないバリアントである、項目４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記天然に存在しないバリアントが、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発またはこれらの組合せにより作製される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記天然に存在しないバリアントが合成される、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
前記天然に存在しないバリアントが、イソプレン経路酵素をコードする参照核酸と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５４）
イソプレン組成物であって、前記イソプレンが、約−３０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、イソプレン組成物。
（項目５５）
前記イソプレンが、約−４０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、項目５３に記載のイソプレン組成物。
（項目５６）
前記イソプレンが、約−５０‰未満のδ１３Ｃ分布を有する、項目５３に記載のイソプレン組成物。
（項目５７）
前記イソプレンが、約−３０‰〜約−５０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、項目５３に記載のイソプレン組成物。
（項目５８）
前記イソプレンが、約−３０‰〜約−４０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、項目５３に記載のイソプレン組成物。
（項目５９）
前記イソプレンが、約−４０‰〜約−５０‰の範囲のδ１３Ｃ分布を有する、項目５３に記載のイソプレン組成物。