【手続補正書】
【提出日】平成29年2月23日(2017.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１Ａ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｂ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図１Ｃ】ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０〜１５）。
【図２】ライブラリ継代の概略と高収率候補の識別。
【図３】特定のＨＡ力価を有するランダム変異を伴うクローン数。
【図４】選択的変異を有するクローンの力価。
【図５Ａ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｂ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｃ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図５Ｄ】ＰＢ２（Ａ）ＰＢ１（Ｂ）、ＰＡ（Ｃ）、ＮＰ、Ｍ又はＮＳ１（Ｄ）において以前に同定された変異を有するＵＷ−ＰＲ８ウイルスの成長曲線。
【図６】ＭＤＣＫ細胞内で高い複製特性を付与する変異の概要。
【図７Ａ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図７Ｂ】Ａ）ＨＡ力価（２ｎ単位）及びウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ単位）に関してウイルス株を試験した。Ｂ）ＭＤＣＫ細胞における成長曲線。
【図８Ａ−Ｂ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図８Ｃ】Ａ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）とクローン＃４のＨＡ力価。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と＃４のウイルスタンパク質。Ｃ）野性型及び＃４のウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図９Ａ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図９Ｂ】Ａ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）とＭ１に変異を有する高複製ウイルスとの力価の比較。Ｂ）野生型ウイルス（ＵＷ−ＰＲ８）及びＭ１に変異を有する高複製ウイルスの成長速度。
【図１０Ａ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｂ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｃ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｄ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｅ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列。
【図１０Ｆ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｇ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｈ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｉ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｊ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｋ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｌ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１０Ｍ】Ａ）イヌのコドン利用表。Ｂ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「希少（ｒａｒｅ）」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｃ）野性型（ＵＷ−ＰＲ８）と「全」コドン最適化ＰＢ２ウイルスとの相対適応性。Ｄ）ＰＢ２コドン最適化ウイルスの成長速度。Ｅ）コドン最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ又はＮＰ遺伝子セグメント又はセグメントの組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｆ）ＵＷ−ＰＲ８のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号３、２、１、及び４）とＵＷ−ＰＲ８のイヌコドン利用最適化ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子セグメントの配列（それぞれ、配列番号２５、２６、２７及び２８）。
【図１１Ａ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｂ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１１Ｃ】Ａ）ＰＲ８及びＩｎｄｏ／ＮＣ／０９の各遺伝子のヌクレオチド４位。Ｂ）すべての３’Ｃ４Ｕ変異株。Ｃ）ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡ遺伝子の４位に「Ｃ」をコードする組換えＵＷ−ＰＲ８ウイルス（黒色）及び８つのセグメントすべての４位に「Ｕ」をコードする変異株（赤）の成長速度。
【図１２Ａ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｂ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１２Ｃ】ワクチン向けの高力価インフルエンザウイルスを提供するのに有効な、本明細書中に開示した内部遺伝子セグメント配列と共に使用するための代表的な配列であるＨ７及びＮ９のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図１３Ａ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１３Ｂ】Ａ）ウイルス力価を増強するキメラＨＡ及びＮＡ遺伝子の図解。Ｂ）キメラウイルスの成長速度。
【図１４Ａ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１４Ｂ】Ａ）変異の組み合わせを有するウイルスの成長速度。Ｂ）変異の組み合わせを有するウイルスのＰＦＵ及びＨＡ力価。
【図１５】卵におけるスクリーニング。
【図１６】ベロ細胞から単離された２１６個のクローンのＨＡ力価。
【図１７】異なるＰＲ８バックボーン変異を用いて作出した組換えウイルス。
【図１８Ａ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【図１８Ｂ】ＭＤＣＫ細胞及びベロ細胞内で成長促進があるウイルス作出の概略。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016524915000001.app
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｆ】
2016524915.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｇ】
2016524915.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｈ】
2016524915.tif 000003
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｉ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｉ】
2016524915.tif 000004
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｊ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｊ】
2016524915.tif 000005
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｋ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｋ】
2016524915.tif 000006
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｌ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｌ】
2016524915.tif 000007
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｍ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｍ】
2016524915.tif 000008