【手続補正書】
【提出日】平成29年6月19日(2017.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが仲介するプロセスにより、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端の二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）； コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ−３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４1株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ１  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）； ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  （ＮＥＭ３１６株；（Streptococcus agalactiae ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii Challis subst）ＣＨ１株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）Ｎ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ５００５；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ−１；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ−９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉｌ株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ  １８株；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ−１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エ���セニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１−２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ１４株；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ２６３８株；キャンピロバクター・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９  ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）； ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）ＦＳＣ１９８株；フランシセラ・ツラレンシス；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６−３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
実施例Ｉ
酵母におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた多重遺伝子編集の一般的プロセス
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣＲＩＳＰＲ免疫系由来のＣａｓ９を用いて、相同組換えを促進し、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において形質転換ＤＮＡを組み換えない細胞に対して選択する。Ｃａｓ９を用いたＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断の一般的な方法を図１に示す。Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡの間で共局在複合体が形成される。Ｃａｓ９により標的ＤＮＡ中に二本鎖切断が生じる。次に、相同組換えによりドナーＤＮＡがＤＮＡに挿入される。ドナーＤＮＡには、切断部位の両側に隣接配列、およびＣａｓ９切断部位を除去する配列が含まれる。その結果、ドナーＤＮＡが、ゲノムＤＮＡであってもよいＤＮＡ中に組み込まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡと共局在複合体を形成、且つ前記標的ＤＮＡを部位特異的に切断する酵素を発現する細胞において前記標的ＤＮＡに複数の変化を生じさせる方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡに相補的であり且つ前記酵素を前記標的ＤＮＡにガイドする、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が、前記標的ＤＮＡへの共局在複合体の構成要素である、
１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸の配列が発現し、前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記酵素が前記標的ＤＮＡに共局在し、前記酵素により前記標的ＤＮＡが切断され、前記ドナー核酸が前記標的ＤＮＡに挿入されて前記細胞中に変化したＤＮＡが生成する、および、
ステップ（ａ）を複数回繰り返して前記細胞において前記ＤＮＡに複数の変化を生じさせることを含む、方法。
【請求項２】
前記酵素が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、１０〜５００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡが、２０〜１００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１種類または複数種類のＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種類または複数種類のＲＮＡおよび前記１種類または複数種類のドナー核酸配列が、１種類または複数種類のプラスミド上に存在する、請求項１に記載の方法。