(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然原料から得たカロチノイド組成物であって、組成物のカロチノイド含量の少なくとも50重量％がシス−β−カロチンである組成物。
【請求項２】
組成物中のシス−β−カロチン含量が少なくとも50％から80％である請求の範囲第１項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項３】
組成物中のシス−β−カロチン含量が60％から70％である請求の範囲第１項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項４】
組成物中のシス−β−カロチン含量が60％から85％である請求の範囲第１項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項５】
組成物が主として９−シス−β−カロチンである請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項６】
組成物が70％の９−シス−β−カロチンからなる請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項７】
９−シス−β−カロチンの原料をアンズ、アカシア属のある種の花、ウリ科及びDunaliella  salinaを含む植物物質及びその混合物から選択する請求の範囲第５項または第６項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項８】
９−シス−β−カロチンの原料がDunaliella  salinaである請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項９】
組成物が、動物、植物及び／または鉱物起源の天然の担体油に分散している請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項１０】
担体油をオリーブ油、コーン油、大豆油、精油、テルペン油、魚油及びその混合物から選択する請求の範囲第９項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項１１】
組成物がさらに、0.01重量％−1.0重量％の範囲の少量の油溶性の純粋な抗酸化剤も含む請求の範囲第１項から第10項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項１２】
組成物がさらに、0.01重量％−0.05重量％の範囲の少量の油溶性の純粋な抗酸化剤も含む請求の範囲第１項から第10項のいずれかに記載のカロチノイド組成物。
【請求項１３】
抗酸化剤を、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピルエステル、エトキシキン、パルミチン酸アスコルビルエステル、天然のトコフェロール、その他の天然抗酸化剤抽出物、及び、それらの混合物から選択する請求の範囲第11項または第12項に記載のカロチノイド組成物。
【請求項１４】
天然原料から得たカロチノイド組成物の製法であって、組成物中のカロチノイド含量の少なくとも50重量％がシス−β−カロチンであり、
（ａ）密度の差による分離手段を使ってトランス形異性体カロチノイドからシス形異性体カロチノイドを分離する処理が可能なカロチノイド含有物質を天然原料から製造する過程と
（ｂ）この物質に含まれたトランス形異性体カロチノイドからシス形カロチノイドを密度の差による分離手段を使って分離すべく物質を処理する過程
とを含む製法。
【請求項１５】
密度の差による分離手段が遠心分離器を含む請求の範囲第14項に記載のカロチノイド組成物製法。
【請求項１６】
天然原料から得たカロチノイド組成物の製法であって、組成物中のカロチノイド含量の少なくとも50重量％がシス−β−カロチンであり、
（ａ）濾過手段を使ってトランス形異性体カロチノイドからシス形異性体カロチノイドを分離する処理が可能なカロチノイド含有物質を天然原料から製造する過程と
（ｂ）その物質に含まれたトランス形異性体カロチノイドからシス形異性体カロチノイドを濾過手段を使って分離すべくその物質を処理する過程
とを含む製法。
【請求項１７】
濾過手段がフィルタ・プレス、ドラム・フィルタ、フィルタ・ベッド、フィルタ・カートリッジ・システム、メンブレン型フィルタ、又はこれらを組み合わせた手段を含む請求の範囲第16項に記載のカロチノイド組成物製法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、シス−β−カロチン濃度の高い天然原料由来のカロチノイド組成物及びその天然原料からの製法、より好ましくは９−シス−β−カロチン組成物及びその天然原料からの製法に係る。
発明の背景
本明細書中、カロチンの天然原料には果実、野菜及び他の植物組織、並びに動物組織を含むものと理解するべきである。カロチンの特に重要な市販原料はある種の藻類である。
β−カロチンは多様な化学異性体の形をとり、その中には、分子の共役二重結合構造中の二重結合の１つの周りの配向が異なる幾何異性体がある。
これは共役骨格に沿った多くの位置で起こりうるため、多様な幾何異性体が生じる。複数の二重結合で配向の変化が起こることさえある。
最も一般的な幾何異性体は、下記に示す構造を有する全トランス形異性体であり、分子の主炭素鎖がトランス（交差）または直線的立体配置をとる。
0003547741.tif 000002
しかし、天然のシス−β−カロチンもあり、これは化学合成で製造でき、または、全トランス形異性体から加熱のような物理的方法で形成できる。この場合、分子の主炭素鎖は湾曲した（シス）または横方向の立体配置をとる。天然のシス−β−カロチンは全カロチノイドの約30重量％から50重量％未満しか存在しないことが知られている。
種々の幾何異性体はさまざまな特性を持ち、恐らく多様な機能を持つため、シス形異性体含量を比較的高くすると有益である可能性がある。
天然物質、例えば果実、野菜、藻類及び他の植物及び動物物質中では、カロチノイドは細胞器官にあるミクロンまたはサブミクロン単位の小さな粒子の細胞構造の一部として安定化されており、また、生物の生化学的経路で作られる異性体形を安定化する他の分子と結合することによって安定化されていることさえある。しかし、天然原料から得ることが望ましい市販製品用にこれらの物質を濃縮した形で製造する場合、カロチノイドの抽出や濃縮の過程で細胞構造の天然の安定化能が消失または低下する可能性がある。
さらに、カロチノイド物質を濃縮して、β−カロチン濃度を高め、製品中に含まれることが望ましくない他の細胞成分を除去すると、ある種の異性体が析出してくる自然の傾向がある。
結晶したものは比較的溶解度が低く、用途によっては、有効利用できず、結晶化が問題になる。特に全トランス形β−カロチンで結晶化が起こり、そのため、全トランス形β−カロチンは、例えば、生物学的用途には利用しにくい。
一方、シス形異性体は結晶化することが非常に少なく、そのため、トランス形異性体よりはるかに溶解しやすい。従って、種々の用途で、シス形異性体の濃度のより高いβ−カロチン含有組成物の方が望ましいことが多い。例えば、９−シス形異性体は全トランス形異性体に比べ、非常に容易に油に溶解する。事実、天然油から９−シス形異性体を晶出することは非常に難しく、従って、大規模に精製するのは困難で、経費がかかる。
トランス形異性体とは異なり、シス形異性体には、水分散性食用着色料や錠剤形成用粉末への使用を含む多数の用途がある。シス形異性体は水分散性の形で着色用エマルジョンとして、また、飲料にも使用できる。シス形異性体は直接的な栄養補給用や食品の一部としても、濃縮物として特別なビタミン補給剤に使用できる。
天然物質中ではシス形異性体の割合は低い。しかし、シス形異性体を最も高率に含むものの１つに好塩性藻類Dunaliella  salinaがあり、この場合、通常、総カロチノイド含量の30％から50％未満が９−シス形である。
従って、本発明は、天然原料由来の高シス−β−カロチン組成物にかかる。
発明の説明
従って、本発明の１つの形では、組成物のカロチノイド含量の少なくとも50重量％がシス−β−カロチン、好ましくは９−シス−β−カロチンである、天然原料から得たカロチノイド組成物を製造する。一般に、含有するβ−カロチンの大部分は９−シス−β−カロチンである。
本発明の別の形では、シス−β−カロチンの好適範囲は少なくとも50％から80％であり、より好ましくは60％から70％である。別の好適範囲は60％から85％である。
本発明のさらに別の好ましい形では、天然原料由来の高シス−β−カロチンは、シス−β−カロチン濃度の低い物質から、例えば物理的手段による濃縮や精製により、シス−β−カロチン濃度を少なくとも70％にして得る。好ましくは、この操作は物理的方法を使用し、実質的に全トランス形β−カロチンを除去して実施できる。
これらのシス形異性体の割合の高い組成物は溶解度が高く、生理活性な目的に容易に利用できることが知られている。これは特に、次の要因に起因すると思われる。
（ａ）シス形異性体は人の体組織中に大量に存在し、組織中で代謝作用が起こるため、シス形異性体が生理学的機能を有する可能性がある。
（ｂ）シス形異性体は一般に血中濃度が低く、血中では全トランス形異性体濃度の方が高い。このことは、シス形異性体が急速に組織に取り込まれることを示唆している。
（ｃ）シス形異性体は小腸から吸収され易いように思われる。
例えば、シス形異性体の割合が高くなると、医療用途、例えば癌、心血管疾患、その他の疾患の治療や予防により優れた効果を持つと予想される。これは、シス形異性体はその溶解性から、トランス形に比べ、血中から除去され、組織に蓄積されやすいためである。
溶解性が優れているため、高濃度のシス形異性体を局所用組成物に使用しやすくなり、食用色素用途での製造が容易になると思われる。シス形異性体は、その溶解特性からも、市販用β−カロチンエマルジョンまたは粉末の安定性を高めることもできる。
β−カロチンの９−シス形異性体の構造は次の通りである。
0003547741.tif 000003
このβ−カロチンの９−シス形異性体は特別な植物の天然原料、例えばピーマン、アンズ、アカシア属のある種の花、ウリ科及びそのような原料中９−シス形異性体濃度が最も高い藻類Dunaliella  salinaから得るのが好ましい。この点に関しては、Ami  Ben−Amotz,Amnon  Lers  and  Mordhay  Aron:"Stereoisomers  of  Beta−Carotene  and  Phytoene  in  the  Alga  Dunaliella  bardawil"Plant  Physiol.（1988）86,1286−1291を参照のこと（その後、Dunaliella  bardawilはAmi  Ben−Amotzにより天然のDunaliella  salinaとして認められた）。
藻類Dunaliella  salinaの総カロチノイド含量中の総シス形異性体（主として９−シス−異性体）の割合は、高圧液体クロマトグラフィ（この方法については９ページ以降参照）及び可視光分光光度法で測定した重量に基づき、通常約30％から50％以下であることが知られている。
組成物中の９−シス形異性体を総カロチノイドの吸光度の約70％まで増加することが好ましく、より好ましくは総カロチノイド含量の80％まで増加する。残りの20％は一般に、全トランス形β−カロチン（例えば10％）、他のシス形（例えば５％）及び他のカロチノイド（例えば５％）からなる。
最終製品は動物、植物及び鉱物起源の天然の担体油、特にオリーブ油、コーン油、大豆油、精油、テルペン油及び魚油に分散することが好ましい。
製品の用途によっては少量の油溶性抗酸化剤を含有することが好ましい。これらの例には、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピルエステル、エトキシキン及びパルミチン酸アスコルビルエステルと例えば他の天然抗酸化剤抽出物例えば香草由来の抗酸化剤抽出物、好ましくは天然のトコフェロールがある。
抗酸化剤は高シス−β−カロチン製品を酸化から保護するために使用でき、このことは総β−カロチン濃度の低い製品、例えば製品中のβはカロチン濃度が５％未満の場合に比較的重要性が高くなる。しかし、β−カロチン濃度が高い場合でも、β−カロチン製品を酸化から保護することは重要である。
純粋な活性抗酸化剤は、実際に選択した抗酸化剤や用途に応じて、一般に、0.01％−1.0％、好ましくは0.01％−0.5％の濃度で使用する。この濃度範囲は、在庫期間の間、最終的な組成物を正常に保護するのに十分なものであることが経験的に判っている。
高シス形異性体組成物の製法の例
この生成物は一連の物理的操作で製造する。高シス形異性体組成物の製造、好ましくは高９−シス形異性体組成物の製造に使用する方法の例を次の実施例Ａ及びＢに示す。
実施例Ａは（密度の差による分離の原理による）遠心分離を使用する方法を示している。トランス形結晶を含む結晶成分をシス形異性体の可溶な油性成分から分離する。
この種の分離は、通常小規模な、または実験用のバッチ型遠心分離器、または工業規模で大量処理を行う連続的な機械のどちらでも実施できる。
相対密度約0.92g/cm3の植物油に溶解すると、全トランス形異性体結晶の密度はシス形異性体（９−シス形異性体を含む）より大きい。担体の植物油がその温度または融点で液体となり、遠心力をかけたときに全トランス形結晶が沈澱する粘度を持つ場合、遠心分離するとシス形異性体と全トランス形異性体が分離される。全トランス形結晶の方が密度が高いため、全トランス形結晶は沈澱作用で分離され、遠心分離器に重成分として残り、シス形異性体は植物油に溶解した状態または軽成分に残る。
ボールをあけて、半固体の重質スラッジを除去できる遠心分離器（例えば、Alfa  LavalのFUVPX207型）はこのスラッジ中に全トランス結晶を濃縮し、シス形を多く含む軽成分の収率を上げることができる。物質が遠心分離器を通る流速が結果に大きな影響を与えるため、使用する機器に応じてその流速を最適化しなければならない。
実施例Ｂはバスケット型の遠心分離器及びフィルタを使用する濾過によるものである。濾過操作は、フィルタ・プレス、ドラム・フィルタ、フィルタドラム、フィルタ・カートリッジ・システム及びさらに改良されたメンブレン型フィルタ等の広範なフィルタ材料を使用して実施できることは当業者には容易に理解されよう。パッド、紙、カートリッジ・フィルタを使用する任意のフィルタ・システムまたはバスケット型遠心器にフィルタを使用する遠心濾過を使用できる。
全トランス形β−カロチンの結晶はフィルタ物質に保持されるが、可溶性の全シス形物質はフィルタを通過でき、そのため、濾液中のシス形異性体の割合が上昇する。すなわち、製品がフィルタ物質を通過する。
実施例Ａ
大豆油中の４％の天然β−カロチン（Betatene社から、「Betatene  Limited  ４％  Natural  Beta−Carotene  in  Soya  Bean  Oil」の商品名で市販されている）10gを直径18mmのガラスの遠心分離管に入れ、Clements  2000実験用遠心分離器を使用して、21℃で15分間、200rpmで遠心した。
最後に、上清の油（軽分画）をパスツール・ピペットで取り出して回収し、シス及びトランス形β−カロチンの含有量を定量した。重成分から残りの上清を排出させた後、ペレット状になった重成分について同じ分析を行った。
９−シス形を含むシス−β−カロチンと全トランス形β−カロチンの百分率（９ページ以降に記載した降圧液体クロマトグラフィ法で測定）は次の通りであった。
0003547741.tif 000004
結晶は重成分またはスラッジ成分中に集まり、高シス物質は軽成分に集った。残渣には他のカロチノイドが含まれる。
Alfa  LavalのFUVPX  207型のような開放ボール型脱スラッジ遠心分離器を使用する連続的製造の規模で同じ手順を行うことができる。遠心分離器に供給する流速、高シス成分を回収するためのスキマーの設定及びスラッジ除去のタイミングをこの機械または同様の他の機械用に合わせて最適に調整する必要があろう。このことは当業者によく理解されよう。
実施例Ｂ
カロチノイドを全体として21％含有する大豆油中のβ−カロチンの結晶性懸濁液を濾過し、結晶を残し、可溶性成分を通過させた。油の粘度が高すぎて濾床を通過する油の動きが制限される場合には、全トランス形結晶を油ベースのマトリックスから分離してもよい。出発材料はBetatene社から入手でき、「Betatene  Limited  20％  Natural  Beta−Carotene  in  Soya  Bean  Oil」の商品名で販売されている。
この操作は、直径900mmのボールを持つBroadbent、Burton用Tolhurstのような型のバスケット型遠心分離器または同様な機械で実施できる。ボールは穴の開いたステンレス板でできており、繊維間のすきまが幅約20−25ミクロンで編んだ繊維のバッグをボール内に入れる。大豆油中の20％の天然β−カロチンをバッグに入れると、高トランス形結晶はバッグに残り、可溶性の高シス形成分はバッグとボールの穴を通過する。最初の段階では濾液にはまだ少量の結晶が残っている可能性があるが、遠心分離器を再度循環させることにより克服できる。直ちにバッグの内側表面上の結晶床が主要フィルタとして作用し、小さな結晶を除去する。バッグを通過する濾液の流速が遅くなるまで操作を続ける。操作終了時に残った結晶と同様に濾液を集め、β−カロチン及びシス−トランス形異性体プロフィールについて分析する。
シス−β−カロチン及び全トランス形β−カロチンの百分率（９ページ以降に記載した高圧液体クロマトグラフィ法で測定）は次の通りであった。
0003547741.tif 000005
残渣は他のカロチノイドを含んでいる。
実施例Ａは実験室規模で実施した方法の実例であり、実施例Ｂは製造規模で実施した。
分離用高圧液体クロマトグラフィを使用するとシス形異性体がより大きな規模で分離できることも当業者には理解されよう。例えば、９−シス形異性体含量が50％以下のDunaliella  salina藻類を分離用高圧液体クロマトグラフィ手法で処理し、異性体を分離し、非常に高純度の９−シス形異性体（例えば、９−シス形異性体80％以上）を得ることができる。この分離手法は、種々の揮発性有機溶媒混合物に物質を入れて、カラム内の通常は球状の固体相にポンプで通したときに、種々の化学物質の固体相への保持が異なることによるものである。カラムの最後で成分を集めることにより、化学物質を互いに分離することができる。純粋な化学物質から揮発性有機溶媒を蒸発させると、溶媒を含まない製品が得られる。
高圧液体クロマトグラフィを使用するカロチノイド組成物の異性体分析の例
β−カロチンのシス形異性体及び全トランス形β−カロチンの含量の百分率を測定するための高圧液体クロマトグラフィを使用するカロチノイド組成物の異性体分析の標準法の例を次に示す。これは、上記実施例Ａ及び実施例Ｂで異性体の割合を分析するために使用した方法であった。
簡単に述べると、油中のβ−カロチン含有組成物の試料をシクロヘキサンに溶解し、適切な濃度に希釈する。得られた溶液を高圧液体クロマトグラフィに注入する前に、試料を移動相で希釈しなければならない。β−カロチン濃度は、既知の吸光係数を使用して特別な波長での吸光度を得ることにより測定する。シス形及びトランス形の含量は異性体を高圧液体クロマトグラフィで分離して測定する。次に、シス形異性体及びトランス形異性体の百分率を総カロチノイド含量に対する百分率として測定する。
（ｉ）試薬及び機器
分析に使用できる試薬及び機器のリストを次に示す。
分光光度計と10mmのガラスセル
分析用の計り
シクロヘキサン（AR級）
100mlのメスフラスコ
50mlのメスフラスコ
2.0mlのバルブ・ピペット
クロロホルム（AR級）
高圧液体クロマトグラフ（次の物を含む）
イソクラティック・ポンプ
50μｌまで操作できるインジェクタ
453nmに設定したUV/Vis検出器
Vydac  201TP54逆相カラム250mm
アセトニトリル（HPLC級）
メタノール（HPLC級）
10mlメスフラスコ
（ii）移動相の調製
分析を実施する前に、1000mlの保存ビンにアセトニトリル400gを計り入れ、メタノール300gを加え、よく混合することにより移動相を調製しなければならない。得られた混合物を分析に使用する前に室温に調整する必要がある。
（iii）手順
次に実際の分析に使用する方法を述べる。
油中のβ−カロチンの試料をβ−カロチン80mgに等しくなるよう正確に（0.01g以内）量り、100mlのメスフラスコに入れる。約5mlのクロロホルムを加え、試料が溶けるまでよく混合する。試料が完全に溶解したことを確認するため、光源に向けて見てみなければならない。試料が完全に溶けていないときには、約５分間置く必要がある。また、さらにクロロホルムを5ml加え、混合物を例えば熱い水道水で温めることもできる。
次に、その容量の混合物をシクロヘキサンで希釈し、よく混合する。これを溶液Ａとする。溶液A2mlをピペットで取り、50mlのメスフラスコに入れ、シクロヘキサンで容量まで希釈し、よく混合する。これを溶液Ｂとする。溶液B2mlをピペットで取り、50mlのメスフラスコに入れ、シクロヘキサンで容量まで希釈し、よく混合する。これを溶液Ｃとする。次に、シクロヘキサンブランクに対して、溶液Ｃの吸光度を455nmで測定する（総β−カロチン含量が得られたのであって、異性体の比を示すのではない）。次に、溶液B1mlをピペットで取り、10mlのメスフラスコに入れ、担体溶媒で容量まで希釈し、よく混合する。これを溶液Ｄとする。
（iv）標準物質
次に、比較のために標準物質を調製する。標準物質は、アッセイ用の既知濃度の標準物質を提供し、全トランス形異性体についての標準保持時間（「R.T.」）を測定するために調製する。標準物質は試料を作成するのに使用する方法と同じ方法で作成する。β−カロチン80mgに相当する量の標準物質（米国セントルイスのSigma社のSigma  all  trans  beta−carotene）を量り、次に、試料と同様に操作を進める。標準物質の濃度は試料の場合と同様に測定する。
（ｖ）測定
上記のように調製した標準と試料は注入できる状態にある。
高圧液体クロマトグラフィの流速は1.0ml/分に設定しなければならない。標準物質20mlを高圧液体クロマトグラフィに注入し、25分間操作する。注入濃度と容量を記録する。次に、溶液D20μｌも高圧液体クロマトグラフィに注入し、25分間操作する。注入濃度と容量を記録する。
典型的なクロマトグラムの一例を13ページに示す。
（vi）計算
Ｉ−β−カロチン濃度を決定するための計算
括弧内の数字は典型的な数値である。
455nmでの溶液Ｃの吸光度   Abs   （−0.4）
試料重量                  ｍ    （−0.5g）
吸光係数  Ｅ％            2500  cm−１％−１
注入濃度（mg/l）          Ｉ    （−４）
Ｉ＝Abs×25×10,000/（2,500×10）＝Abs×10
0003547741.tif 000006
II−シス及びトランスの百分率を決定するための計算
0003547741.tif 000007
上表に使用した保持時間は上記クロマトグラムで認められた保持時間である。上記クロマトグラムでは、未知のシス形異性体１のピーク（「C1ピーク」）は認められなかった。一般に、この異性体は保持時間約14分の後で認められる。上表に示す百分率は概数である。
個々のピーク面積は、個々のピーク面積を総ピーク面積で割り、それに100を掛けて、総カロチノイドに対する百分率を求めることにより、百分率として求められる。これらの百分率は13ページに例示したクロマトグラムの下に示した表の「濃度」に示す。
また、次の式を使用して総カロチノイド中のシス形異性体の百分率を計算することもできる。この式ではC1ピークがクロマトグラムに認められるものとしている。
シスの％＝（C1＋C2＋C3＋C4/（総ピーク面積））×100％
シス形異性体は完全に分解されているのではないが、シス形異性体の吸光度全体には影響を与えない。この点に関し、C1ピークは他のシス形異性体から常に完全に分解または分離されているのではない。この場合、C1ピークは計算から無視できる。
カロチノイド中で全トランス形異性体の占める百分率は次の式でも計算できる。
トランスの％＝（T/（総ピーク面積））×100％
この型の分析を行う場合、β−カロチンは光でゆっくりと分解されるため、吸光度の低いガラス水を使用することが薦められる。保持時間が温度に非常に依存するため、分析は２回ずつ行わなければならず、カラム及び溶媒は20℃に維持しなければならない。
従って、本発明は天然原料から得た、シス−β−カロチンの含量の高い、新規なカロチノイド組成物を提供する。