(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のDNAシーケンスからなるストレプトリシンＯ変異体をエンコードするDNA。
0003557431.tif 000013
0003557431.tif 000014
【請求項２】
前記ストレプトリシンＯ変異体は野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の1.5％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
前記ストレプトリシンＯ変異体が野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.5％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項４】
前記ストレプトリシンＯ変異体が野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.1％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項５】
ストレプトリシンＯ変異体を発現することができるように請求項１に記載のDNAシーケンスで軽質転換されまたはトランスフェクションされた、原核または真核ホスト細胞。
【請求項６】
DNAベクターおよび請求項１に記載のDNAシーケンスを含有してなるDNAプラスミド。
【請求項７】
請求項６に記載のDNAプラスミドで形質転換されまたはトランスフェクションされた、原核または真核ホスト細胞。
【請求項８】
前記DNAベクターがさらにプロモーターを含有してなる、請求項６に記載のDNAプラスミド。
【請求項９】
前記DNAベクターがさらに調節されたプロモーターを含有してなる、請求項６に記載のDNAプラスミド。
【請求項１０】
前記DNAベクターがさらに、PL、PtacおよびPT7からなる群から選ばれる調節されたプロモーターを含有してなる、請求項６に記載のDNAプラスミド。
【請求項１１】
下記のアミノ酸シーケンスからなるストレプトリシンＯ変異体のポリペプチドをエンコードするDNA。
0003557431.tif 000015
0003557431.tif 000016
0003557431.tif 000017
【請求項１２】
前記ストレプトリシンＯ変異体が野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の1.5％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項11に記載のDNA。
【請求項１３】
前記ストレプトリシンＯ変異体が野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.5％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項11に記載のDNA。
【請求項１４】
前記ストレプトリシンＯ変異体が野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.1％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項11に記載のDNA。
【請求項１５】
下記のアミノ酸シーケンスのアミノ酸１乃至473からなるストレプトリシンＯ変異体の蛋白質。
0003557431.tif 000018
0003557431.tif 000019
0003557431.tif 000020
【請求項１６】
請求項11に記載のアミノ酸シーケンスからなるストレプトリシンＯ変異体のポリペプチドをエンコードするcDNA。
【請求項１７】
野生型ストレプトリシンＯの特性を示す少なくとも１つのエピトープを含有してなり、発現すると可溶性となり、かつ、１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の1.5％未満を示す、請求項15に記載のストレプトリシンＯの変異体。
【請求項１８】
野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.5％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項17に記載のストレプトリシンＯの変異体。
【請求項１９】
野生型ストレプトリシンＯの溶血活性の0.1％未満を示し、前記野生型ストレプトリシンＯが１ミリグラム当たり4x105溶血単位の溶血活性を有する、請求項17に記載のストレプトリシンＯ変異体。
【請求項２０】
400HU/mg未満の比溶血活性を有し、かつ発現すると可溶性となる、請求項15に記載のストレプトリシンＯ変異体。
【請求項２１】
0003557431.tif 000021
0003557431.tif 000022
のアミノ酸シーケンスからなり、発現すると可溶性となるストレプトリシンＯの精製されかつ実質的に非溶血活性な変異体を得るための方法であって、
（ａ）融合されまたは融合されない可溶性の翻訳形態にあるストレプトリシンＯ遺伝子であって、
0003557431.tif 000023
0003557431.tif 000024
のアミノ酸シーケンスを有するrSLO.3タンパク質と同様の可溶性及び溶血活性を有する可溶性の溶血活性ストレプトリシンＯを生産することができるストレプトリシンＯ遺伝子のフラグメントを、高レベルの突然変異活性を生ずることができるホストに導入して突然変異フラグメント候補を得る工程と、
（ｂ）前記突然変異フラグメント候補を適宜のベクターに導入してプラスミドを得る工程と、
（ｃ）突然変異フラグメント候補を発現することができるホストを該プラスミドで形質転換して突然変異蛋白質候補を得る工程と、
0003557431.tif 000025
0003557431.tif 000026
のアミノ酸シーケンスからなるストレプトリシンＯの変異体の溶血活性を有するように前記突然変異蛋白質候補をスクリーニングする工程とを含有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
本特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象となる要素を含んでいる。本著作権所有者は、特許商標庁のファイルまたは記録に表れるような特許文書または特許開示の何人かによる転載に異議はないが、その他の場合は、すべての著作権の権利を保持するものである。
関連出願
本出願は、クレイグW.アダムス（Craig  W.Adams）およびエバ  Y.ワン（Eva  Y.Wang）による『ストレプトリシンＯ誘導体（Streptolysin  Ｏ  Derivatives）』と表題のついた米国特許第07/752,429号（1991年８月30日出願）（Beckman  Docket  No.128D−104）およびクレイグW.アダムス（Craig  W.Adams）およびパティ・パング（Patty  Pang）による『ストレプトリシンＯ誘導体およびバリエントの抗体（Antibodies  to  Streptolysin  Ｏ  Derivatives  and  Varients）』と表題のついた米国特許第07/753,289号（Beckman  Docket  No.128D−123）に関連する。この二つの出願は、今回同時に提出されていて、ここでは参考のために記載した。
発明の分野
本発明は、ストレプトリシンＯ一般に関し、さらに詳細には、組換えDNA技術により産生されたストレプトリシンＯ変異体に関する。
発明の背景
本明細書には、抗原物質であるストレプトリシンＯの変異体バージョンが開示されている。ストレプトリシンＯは、人間の場合、たとえば、リウマチ熱と関連しているので、ストレプトリシンＯに対する免疫応答の証拠についての免疫診断アッセイが、日常的に用いられている。ストレプトリシンＯの開示した変異体バージョンは、組換えDNA技術により製造され、軽質発現により可溶であり、野生型SLOに結合し得る少なくともひとつの抗体により束縛され得るものであり、溶血活性である。本発明以前は、ストレプトリシンＯは、バクテリアストレプトコッカスピヨゲネス（streptococcus  pyogenes）を経て得ることができた。ストレプトリシンＯの毒性と病原特性は、赤血球の溶菌により典型的にモニターされる。
I.遺伝暗号（コード）
特定のたんぱく質たとえばストレプトリシンＯ（以下『SLO』とする）の遺伝コードは、『コドン』と呼ばれる３つのヌクレオチドの逐次群別とそのようなコドンの相互の関係の配列に依存する。
『ヌクレオチド』は、ヌクレオチドと１つまたはそれ以上のりん酸基からなっている。『ヌクレオチド』は、ペントース糖に結合した窒素性塩基からなっている。『ペントース』糖は、５つの炭素原子を含んでいる。デオキシリボ核酸すなわち『DNA』の分子中では、ペントース糖は、『デオキシリボース』であり、窒素性塩基は、アデニン（『Ａ』）、グアニン（『Ｇ』）、チミン（『Ｔ』）またはシトシン（『Ｃ』）である。リボ核酸すなわち『RNA』の分子中では、ペントース糖は、『リボース』であり、窒素性塩基は、ウラシル（『Ｕ』）がチミンに取って替わること以外DNAについてと同じである。３つの種類のRNAである、メッセンジャーRNAすなわち『mRNA』、転移RNAすなわち『tRNA』およびリボソームすなわち『rRNA』は、RNA中のコード化した遺伝情報をたとえばポリペプチドまたはたんぱく質に翻訳する。このように遺伝情報は、通常、次のように転移される:DNA→RNA→たんぱく質。
DNA分子の窒素性塩基の配列は、その分子に含まれる遺伝情報をコード化する。DNA分子の糖およびりん酸基は、構造的な役割を行い、DNA『巨大分子』と呼ばれる一連のDNA分子の主鎖を形成する。DNAは、ヌクレオチド鎖の２つの相補鎖からなり、これらの鎖は、（比較的に）弱い水素結合により一緒に保たれている。それぞれのDNA分子の塩基は互いに結合している:Aは、常にＴと、Ｃは、常にＧと結合している。したがって、第１の鎖の配列5'−ATCG−3'は、他方の鎖の相補配列5'−TAGC−3'とすぐに向き合っている。これは、『相補塩基対合』と呼ばれる。相補塩基対合のプロセスは、『ハイブリッド形成』と呼ばれ、安定なDNA巨大分子の形成をもたらす。
それぞれのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。『アミノ酸』は、たんぱく質の主要成分であり、『たんぱく質』はすべての生きている細胞の必須成分である。20の天然のアミノ酸がある。４つのヌクレオチド塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）と３つのヌクレオチドがコドン１つ当たりにあるので、64の可能なコドン（43）がある。したがって、わずか20個の天然のアミノ酸があるだけなので、ほとんどのアミノ酸は、２つ以上のコドンにより指定される。これは、『重複性』または『縮退』と呼ばれる。たとえば、コドンGCG、GCA、GCTおよびGCCはすべて、アミノ酸アラニンについてコード化する。
コドンATG（Metアミノ酸コドン）は、正常な『読み始め』コドンである。アミノ酸に対してコード化しないコドンTAA、TAGおよびTGAは、正常な『停止』コドンである。mRNAの情報は、得られる１本鎖mRNAがDNAの１本鎖の配列に相補的なヌクレオチド配列を持つように２本鎖DNA巨大分子の１本の鎖の読み始めコドンに基づいて確立される。停止コドンが、DNA分子に沿いmRNAにより到達されると、翻訳は停止する。
mRNAから翻訳されたDNA巨大分子に沿う領域は、真核生物については『エクソン』と呼ばれ、原核生物については『翻訳された領域』と呼ばれる。『遺伝子』は、エクソン（真核生物）および翻訳された領域（原核生物）を含む。したがって、遺伝子は、たんぱく質および／またはポリペプチドについてコード化する。たとえば、ほ乳動物は、真核生物であり、バクテリアは、原核生物である。たんぱく質の天然の合成は、一連のいくつかの段階にわたり起こる。第１の段階は、上記したようにDNA巨大分子に相補的なmRNAの形成である。その後、tRNAが形成される;tRNAは、mRNA巨大分子上のそれぞれのコドンについて相補的なコドン（『アンチコドン』）を与える。その後、rRNAは、mRNA:tRNAから生じたコドン特異性アミノ酸（codon−specific  amino  acids）の集合を触媒してたんぱく質および／またはポリペプチドにすることになる。
II.組み換えDNA技術
ほとんどのたんぱく質は、非常に少量、天然につくられる。組み換えDNA技術の出現は、以前のそのような少量でのみ得られたたんぱく質の多量の産生を可能とした。
以下は、クローニングに用いられる典型的なバクテリアホストである大腸菌、エスケリチア  コリ（Escherichia  coli）に適用されるであろう『典型的な』遺伝子操作についての説明である。遺伝子を単離するためすなわち『クローン化』するため、DNAライブラリーは、ベクターを用いてDNA配列（ゲノムと呼ばれる）から構成される。『ベクター』は、バクテリア、イーストおよびほ乳動物の細胞に天然に存在する２本鎖DNAの小さな円形の分子である。ベクターは、通常、次に示す性質を有している：（ｉ）ベクターが、適当なホスト細胞（たとえばE.コリ（E.coli）に保持されるであろうことを確実にする選択可能な『マーカー』をコード化するDNA配列；（ii）調節可能な転写プロモーター−−『調節可能な』とは、たとえばベクターの環境の操作によりプロモーターが『スイッチを入れられる』ことができることを意味し；『プロモーター』は、スイッチが入れられるとベクターに組み込まれた関心のもたれる遺伝子から多量のmRNAを生じるDNA配列の領域である−−異なるプロモーター（たとえば、lac、trp、tacなど）は、mRNA産生の異なる速度を有する；（iii）翻訳調節配列、たとえば、適当に位置したATG読み始めコドン；および（iv）ポリリンカー；『ポリリンカー』は、ベクター内の正しい配向での関心のもたれる遺伝子の組み込みを単純化する。ベクターは、関心のもたれる遺伝子が、読み始めコドンの隣に組み込まれるようにベクターに位置したATG読み始めコドンの両側に制限エンドヌクレアーゼ部位を与えるように仕組まれ得る；このことは、プロモーター遺伝子の活性化で遺伝子の即座の転写を考慮する。
『制限エンドヌクレアーゼ』は、長さが４〜８のヌクレオチドの指定された配列で２本鎖のDNAを切断する酵素であり、多くの制限エンドヌクレアーゼは、切断箇所で短い１本鎖のテイルをのこすスタガードカットをつくる。この末端は、他の粘着性の末端と相補的な塩基対を形成し得るので『粘着末端（cohesive  endまたはsticky  end）』と呼ばれる。ゲノムは、ベクターを切断するために用いた制限エンドヌクレアーゼに相当する指定された制限エンドヌクレアーゼにより切断され（cut−up）、切断されたゲノムのそれぞれの小片は、ベクターに組み込まれる。特定の制限エンドヌクレアーゼによる細胞の全ゲノムを無作為的に切断することは、ゲノムクローニングへの『ショットガン』アプローチと典型的に呼ばれる。ショットガンアプローチは、非常にたくさんのDNA断片を生じさせ得、そのすべてが、ベクターに組み込まれる。
個々の小片のゲノムおよびベクター（対応する粘着末端を有する）は、互いに『融合され』すなわち『アニールされ』て、ベクターとゲノムの一部を含んでなる円形ハイブリッドDNA『プラズミド』を形成する。
プラズミドは、次に、ホスト細胞に導入される。２種類のホスト細胞『真核ホスト細胞』と『原核ホスト細胞』がある。真核ホスト細胞の例は、チャイニーズハムスター（『CHO』）であり、原核ホスト細胞の例は、E.コリバクテリアである。以下の説明の目的から、原核ホスト細胞に特に注目する。
プラズミドが、ホスト細胞に導入されると、これらの細胞は、プラズミドにより『形質転換』されていると呼ばれる。細胞が成長し、分裂すると、プラズミドは、同様に複製して、DNA断片を含むプラズミドのコピーを生じる。それぞれの形質転換された細胞は、『ゲノムDNAクローン』と呼ばれ、異なるDNA断片のすべてを含む形質転換された細胞の全集合は、『ゲノムDNAライブラリー』と呼ばれる。
どのゲノムDNAクローンが、対応するmRNAにコピーされ得るDNA配列を含むかを決定するのには、ゲノムDNAクローンを分離すなわち『スクリーニング』する必要がある。これを行うのには、いくつかの方法があり、たとえば、放射性DNAプローブまたは免疫反応性の証拠の使用がある。認められるように、定義よりショットガンアプローチが、かなりの数のゲノムDNAクローンの形成をもたらし、これは、関心のもたれる可能性のある候補を見つけるようにスクリーニングされねばならないので、スクリーニングは、極端に労働集約的なプロセスとなろう。
III.突然変位
DNA高分子は、化学的には互いに著しく類似している。ＡとＧは科学組成が著しく類似しており、Ｃ、ＴおよびＵは同様に類似している。かくして、特定のシーケンスにおいては、ＧのＡによる置換またはＴのＣによる置換が生ずる場合がある。かかる置換が、該置換によりエンコードされるアミノ酸が同一性を保つようにコドン内で起こる場合、この置換は「サイレント（"silent"）」置換と呼ぶことができ、即ち、ヌクレオチドは異なるが、エンコードされたアミノ酸は同じである。しかしながら、その他の置換はコドンによりエンコードされるアミノ酸を変えることができ、ヌクレオチドの変化（alteration）により化学的に類似のアミノ酸が生ずる場合、これは「保存（"conservative"）」変化と呼ばれ、一方、変化により生ずる化学的に異なるアミノ酸は「非保存（"non−conservativen"）」変化と呼ばれる。アミノ酸の非保存変化により、元の蛋白」質分子とは全くことなる分子とすることができる。
アミノ酸が変化した蛋白質は、「突然変異体」（"mutant"）、「突然変異」（"mutation"）または「変異体」（"variant"）と呼ぶことができる。突然変異は自然に起こり、かかる突然変異を経験する生体に正、負または中立の作用を及ぼすことができる。しかしながら、かかる突然変異率は一般には著しく低く、即ち、複製された塩基（base replicated）当たり約10-9乃至約10-10の突然変異である。
IV.ストレプトリシンＯ
ストレプトリシンＯ（「SLO」）は、約65,000乃至約70,000ダルトンの近似分子量を有している。SLOは、４つの異なる属（ストレプトコッカス、バシラス、クロストリジウムおよびリステリア）に属するグラム陽性細菌種により生成される酸素感受性［チオール活性化（"thiol−activated"）］、細胞破壊［「細胞溶解」（"cytolytic"）］毒素［「細胞毒素」（"cytotoxin"）］の網に属する。
SLOは膜コレステロールと相互に作用し、広範囲に亘る哺乳動物の細胞に細胞溶解−細胞障害作用を及ぼす。更に、SLOは非常に重要な心臓毒素特性を有している。SLOと関連する毒性および病原性特性の１つに溶血活性があり、即ち、SLOは赤血球を溶解することによりヘモグロビンの解放を行なう。SLOは、比較的少量の投与をもって実験室動物を死に至らしめることができる。SLOを動物に注射すると、一般に、動物を直ちに死に至らしめる。
SLOは特定の細菌種により生産されるので、これらの種が哺乳動物の宿主に「侵入する」（"invade"）と、細菌により放出されるSLOは異種蛋白質として宿主により処理される。更に、SLOは抗原である。「抗原」は、脊椎の血液流に入ると、Ｂタイプの小さなリンパ球をリンパ芽球に形質転換するように刺激を与える高分子量の化合物である。リンパ芽球は、抗原刺激体に特有の抗体を分泌する。抗体は刺激を与える抗原の反応特徴部または部位に対して特定の相補性を有する反応部位を持つ蛋白質である。抗体は一般に、抗原粒子または分子の免疫学的活性部位即ち「エピトープ」（"epitope"）を示すことにより、抗原を宿主生物に対して無害にする特性を有している。従って、抗SLO抗体（「ASO」）が、SLOの宿主への分泌に応答して宿主により生産される。現在連鎖球菌に感染しあるいはこれらの余病（病気またはけがの後効果）に罹っている固体の約80−85％が、高レベルのASOを示す。
SLO生産細菌［S.ピオゲン（S.pyogene）］による以前のおよび／または現在の感染の決定は、例えば、SLOの溶血特性およびASOのSLOへの結合に基づく免疫診断検定技術を使用して行なうことができる。SLOに関する溶血免疫診断検定に焦点を当てると、患者のサンプルを患者以外の源から得られた既知量のSLOに加え、この混合物を、例えば、うさぎの赤血球細胞のような既知量の赤血球細胞に加える。SLOは溶血特性を有しているので、これらの赤血球細胞を溶解する。しかしながら、ASOがSLOに結合すると、SLOの溶血特性は中和される。かくして、サンプルが現在連鎖球菌に感染しあるいは余病に罹っている患者から得る場合には、サンプル内のASOのレベルが高くなる。したがって、混合物が、高いレベルの溶血活性をもたらすなら、このことは、あるとしても血清サンプル中にASOがほとんどないことを示し（したがって、SLO分泌バクテリアからの感染があったとしてもほとんどない）、その理由は、混合物中のSLOの既知量は、混合物中の既知量の赤血球を溶解し得るからである。混合物が、溶血活性につながらないなら、このことは、サンプル中のASOの量が、混合物中のSLOの既知量を不活性化するのに十分であることを示す。研究者は、ASOのそのような量を『タイター』と呼ぶ。典型的には約300国際単位/mlより大きいASOタイターは、SLOを分泌し得るバクテリア源による感染を示す。SLOを分泌するバクテリアによる感染を測定する他の免疫診断アッセイには、比濁プロトコールおよび混濁度プロトコールがある。
上記に概説した免疫診断アッセイ法を用いるためには、混合物に加える十分なSLOへの到達が必要である。SLOの１つの給源は、バクテリアストレプトコッカスピヨゲネス（Streptococcus  pyogenes）（『S.ピヨゲネス』）を含む培養ブイヨンである。しかしながら、このようにしてSLOを得ることは、極めて困難であり費用がかかる:S.ピヨゲネス培養ブイヨン１リッターに対し、わずか約0.5mgのSLOが期待でできるだけである;S.ピヨゲネスを成長させる典型的な媒体は、高価である;S.ピヨゲネスは、クラス２病原体である；このようにして得られるSLOは、多くの他の抗原物質を含んでいる。さらに、この手順で得られるSLOは、液体の状態において不安定である傾向がある。したがって、そのようなSLO調剤（preparations）は、薬ビンに入れた乾燥凍結粉末としておおくは典型的に供給される。使用前に、凍結乾燥粉末は、適当な溶剤で元に戻すことが必要である。残念なことには、そのような元に戻されたSLOは、その溶血活性を迅速に失い、したがって、元に戻されてから短期間で使用されないなら廃棄されなくてはならない。このことは１つの顕著な否定的な結果を有する：個々の血清サンプルを入手すると直にテストすることは通常不可能である。よって、溶血活性に基づいてASOアッセイを行う実験室は、凍結乾燥したSLOの経済的な使用を可能とするように十分な数が集まるまで個々のサンプルを保存するのが典型的である。このことは、テスト結果を得るのに過度な後れをもたらし得る。
比濁プロトコールまたは混濁度プロトコールに依存するASOアッセイは、有意的な量の精製SLOを必要とする。S.ピヨゲネスから有意的な量の精製SLOを得ることに関連する費用は、多くかかるので、上記の溶血性に基づくアッセイは、商業的に得られる第１のASOアッセイであった。
最後に、S.ピオゲンにより生産されるSLOは定義によれば、野生型SLOであるので、溶血活性があり、従って、極めて注意して取り扱わなければならない。
SLO融解生成物を得るための組換えDNA技術は、比較的多量のかかる生成物を得ることができるという利点を有する。かかる技術を使用することにより、S.ピオゲンからSLOを得る場合に時間を要しかつ経済的効果がないという欠点をなくすことができる。上記した同時係属の出願には、SLO誘導体が開示されている。本明細書において使用されている「SLO誘導体」なる語は、可溶性でありかつ溶血活性があり、しかもASOにより認識されるSLO融解生成物（fusion product）である。SLO誘導体は、本明細書においては「rSLO」として示されている。これらのSLO誘導体は大量に提供され、実質上純粋であり、しかも溶血活性を保持している。
かかる組換えDNA技術により得られるSLO誘導体の「変異体」を得ることは有利であると考えられる。本明細書において使用されている「変異体」、「突然変異」または「突然変異体」なる語は同義である。SLO変異体は、本明細書において「mSLO」として示されている。mSLO融解生成物は幾つかの利点を提供するものと考えられ、免疫診断検定の製造において最も顕著であると考えられる。これは、ASO抗体により認識されると考えられるが、野生型SLOの溶血活性とは関連しないものと考えられるMSLO融解が形成されることによるものである。
発明の概要
本発明は、SLO変異体を提供する。本明細書において「mSLO」として表わされているこれらの変異体は、（ｉ）野生型抗ストレプトリシンＯ抗体（ASO）により認識され、即ち、野生型ストレプトリシンＯの少なくとも１つのエピトープ特性を有し、かつ、（ii）実質上非溶血活性であるという特徴を備えるとともに、かかる特徴により広く定義されるものである。本明細書において使用されている「認識される」（"recognized"）なる語は、野生型SLOに対して向けられている少なくとも１つの抗体により結合されることができることを意味し、「実質上非溶血活性」なる語は野生型SLOの同等の力価（titer）では赤血球を溶解することができないことを意味し、「野生型SLO」なる語は、かかる語についての通常の定義の通りであり、即ち、可能な細菌源により自然に分泌されるSLOである。「野生型SLO」とは、定義によれば、例えば、組換えDNA技術により得られるSLO融解生成物は含まない。
本発明の別の観点は、mSLOを製造する方法に向けられている。この方法は、融解または非融解の翻訳形態にあるSLO（例えば野生型又はrSLO）の可溶性のある溶血活性フラグメントを高レベルの突然変異活性を発揮することができる宿主に導入して突然変異フラグメント候補（candidate）を得る工程と、該突然変異フラグメント候補を適宜のベクターに導入してプラスミドを得る工程と、突然変異フラグメント候補をプラスミドをプラスミドを用いて発現させて突然変異蛋白質候補を得る工程と、赤血球の溶血がないように前記突然変異蛋白質候補をスクリーン処理する工程とを備える。好ましくは、溶解度に関する前記候補のスクリーン処理は、本明細書において使用されている「高レベルの突然変異活性」なる語は、複製された塩基当たり約10-9ないし約10-10突然変異よりも大きいことを意味する。
本発明の別の観点は、例えば、ASO力価測定用の試験キット、検量キットおよび制御キットのような種々のキットを含む。ASO力価測定用の試験キットは、液体または非液体形態のmSLOからなる。最も好ましいのは、mSLOが液体の形態をなすことであり、これはパーテスト（per−test）サンプル基準でASO力価を測定することができるからである。検量および制御キットは、ASO力価分析の検量および制御を行なうことができるように種々の濃度のmSLOからなる。
本明細書の開示に係る特に有用なmSLOは、本明細書においては、純粋な形態でmg当たり14溶血ユニット（「HU」）の比溶血活性（specific hemolytic activity）を有するmSLO.3/6として示されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、mSLO.3/6として示されるSLO変異体の最も好ましい実施例の核酸シーケンスであり、
図２は、mSLO.3/6のアミノ酸シーケンスであり、
図３は、rSLO.3/6として示されるSLO誘導体の最も好ましい実施例の核酸シーケンスであり、
図４は、rSLO.3のアミノ酸シーケンスであり、
図５は、0.2μｌ、2.0μｌ、10μｌのrSLO.3およびmSLO.3/6からなる上澄みのウエスタンブロット（Western blot）分析の比較結果であり、
図６は、mSLO.3/6（Ａ）およびrSLO.3（Ｂ）のゲル電気泳動の結果であり、
図７は、mSLO.3/6、rSLO.3/6、rSlO.3および商業的に入手することができるSLOの溶血活性の力価実験の結果であり、
図８は、異なるベクターにおけるrSLO.3およびmSLO.3/6のウエスタンブロット分析の結果である。
好ましい態様の詳細な説明
本明細書において使用されているように、ストレプトリシンＯ変異体即ち「mSLO」は、（ｉ）野生型抗ストレプトリシンＯ抗体（ASO）により認識され、かつ、（ii）実質上非溶血活性であるという特徴を備えるとともに、かかる特徴により広く定義されるものである。本明細書において使用されている「認識される」なる語は、野生型SLOに対して向けられる少なくとも１つの抗体により結合されることができることを意味し、「実質上非溶血活性」なる語は、野生型SLOの同等の力価で赤血球細胞を溶解することができないことを意味し、「野生型SLO」なる語は、かかる語と関連する通常の定義に従うもので、即ち、かかる蛋白質を分泌することができる細菌源により自然に分泌されるSLOである。好ましくは、mSLOは、野生型SLOのmg当たり4x105溶血単位の野生型SLOの比活性に基づいて約1.5％未満、より好ましくは約0.5％未満、最も好ましくは約0.1％未満のパーセント野生型SLO比活性を有する。これらの値は相対的なものであり、かくして、パーセント野生型SLO比活性が1x106溶血単位/mgの野生型SLO比活性に基づいている場合には、上記値は2.5分の１まで減少する（即ち、1.5％が0.6％となり、0.5％が0.2％となり、0.1％が0.04％となる）。
上記が、詳述されるのは、野生型SLOの『比活性』が、約1x106溶血単位/mgもあると記載されているからであるが、約4x105溶血単位/mgの比活性も記載されている。アロフ、J.E.（Alouf）,J.E.）『ストレプトコッカルトキシン（Streptococcal  Toxins）（ストレプトリシンＯ、ストレプトリシンＳ、エリスロゲニックトキシン（Erythrogenic  Toxin）』Pharmac.Ther.II:661−717（1980）（参考のためにここに記載した）。したがって、野生型SLOの報告されている『比活性』は、説明しがたいので、前記のパーセントは、この事実に合う。
便宜上、ここで用いているように、用語『ベクター』は、少なくとも１つの制限部位を少なくとも１つのプロモーター遺伝子とを含む円形DNA巨大分子を意味する。用語『プラズミド』は、特に遺伝子を含む関心のもたれるゲノムの一部を更に含んでなるベクターを意味する。用語『ホスト』は、プラズミドにより移入（transfect）され得る細胞を意味する。
本分野で認められているように、ほとんどのベクターは、所望の結果に関連して選択される。たとえば、商業的な環境では、関心のもたれる遺伝子の高いレベルの形質発現は、そのような形質発現に伝導性（conductive）のある適当なプロモーターを有するベクターが選択されるようにすることが典型的には好ましいであろう；一方、研究環境では、ホストの調節要素の支配下にある翻訳信号と転写信号とを有するベクターが適当であるようにそのような高いレベルの形質発現が臨界的でなくてもよい。したがって、所望の結果に適当なベクターの選択では、関心のもたれるベクターのプロモーター遺伝子に同時に焦点を当てることがしばしば有用である。
非常に高いレベルのmRNA産生を達成するプロモーター遺伝子には、たとえば、pL、ptacおよびpT7がある。このリストは、余すところのないリストを意図したものでもそのように解釈されるべきものでもない。むしろこれらのプロモーターは、以下の説明のための代表例として用いられている。当業者は、リストにあげたプロモーターと関連する同等な結果を与え得る所望のプロモーターを有する適当なベクターを容易に選択できる。
たとえば、pT7は、E.コリRNAポリメラーゼの割合の数倍の割合でRNAを合成し、E.コリRNAポリメラーゼよりも転写を少ない頻度で終わらせるT7RNAポリメラーゼと共に用いられる。T7RNAポリメラーゼは、それ自体のプロモーター配列で開始に関しかなり選択的であり；したがって、これは、E.コリDNAへの配列からの転写を開始しない。さらに、T7RNAポリメラーゼは、E.コリRNAポリメラーゼを抑制するファンピシンのような抗生物質に抵抗性である。したがって、たとえばT7RNAポリメラーゼを促進する細胞へのリファンピシンの添加は、T7RNAポリメラーゼプロモーター、すなわち、pT7の支配下の遺伝子の独占的な形質発現をもたらす。
T7RNAポリメラーゼ/pT7システムを用いる形質発現は、（典型的に）２プラズミドシステムに依存する：第１のプラズミドは形質発現される遺伝子及びpT7を含み、第２のプラズミドは、T7RNAポリメラーゼについての遺伝子を含む。第２のプラズミド、たとえば、pGP1−２（これは、T7RNAポリメラーゼについての遺伝子を含む；タバー（Tabor）およびリチャードソン（Richardson）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:1074−1078（1985）参照）は、E.コリに永久的に存在し得るかまたは、特殊化したファージたとえばM13ベクター（例として、mGP1−２、ターバーおよびリチャードソンを参照）またはT7RNAポリメラーゼ遺伝子を含むλベクター（例として、CE6、スタディアー（Studier）およびモフェット（Moffett）、J.Mol.Biol.,189:113−130（1986）参照）によりE.コリに導入され得る。
典型的には、T7RNAポリメラーゼ遺伝子を含む第２のプラズミドは、熱を誘導し得るE.コリプロモーターの支配下にあり、すなわちたとえば30℃から42℃に温度を上げることにより、熱を誘導し得るE.コリプロモーターは、スイッチが入れられ、これは、次に第１のプラズミドのpT7プロモーターのスイッチを入れ、これにより、たとえば関心のもたれる遺伝子の形質発現がもたらされる。このように、T7RNAポリメラーゼ/pT7形質発現システムを用いることにより、E.コリシステムは、熱を誘導し得るプロモーターたとえばCI857リプレッサーを有するラムダPLを含む。
pT7を含むベクターの例は、例えば、pT7シリーズ（pT7−５、pT7−６およびpT7−７、これらは、pT7−１の誘導体である；上記のターバーおよびリチャードソンを参照）およびpETシリーズ（スタディアー（Studier）ら、Methods  Enzymol  185:60−89（1990）参照）である。
もう１つのベクターシステムは、pLプロモーター遺伝子を含む。pLプロモーターは、λバクテリオファージから誘導され、最も強力な調節されたE.コリプロモーターのひとつである。pLからの転写は、十分に抑圧され得、したがってpLを含んでなるプラズミドは、λリプレッサーcIにより安定化され得る。このリプレッサーは、λゲノムの一部の一体化コピーを含んでなるE.コリホストにより典型的には供給される。そのようなE.コリホストは、『E.コリリゾゲン』と呼ばれ、次のような性質を有する：（ｉ）これは、λ調節たんぱく質cIおよびＮ（終結抑止機能）を供給する；そして（ii）これは、通常、細胞溶解（cell  lysis）に通じる溶解成分を与えない。したがって、たとえば関心のもたれるゲノムおよびpLを含んでなるプラズミドにより移入されたE.コリリソゲンは、遺伝子の形質発現なしで高い密度に初期的に成長され得、リプレッサーの不活性化の下でたんぱく質を合成するように後に誘導される。PL系ベクターの例は、たとえば、米国特許第4,925,799号（『pASI』）、シャツズマン（Shatzman）およびロゼンバーグ（Rosenberg）による"The  pAS,Vector  System  and  Its  Application  to  Heterologus  Gene  Expression  in  Eschericia  Coli."Heptalogy  ７:305−355（1987）およびロゼンバーグらによる"The  Use  of  pKC30  and  its  Derivatives  for  Controlled  Expression  of  Genes."  Methods  Enzymol  101:123−139（1983）に記載されている。
ptacプロモーターは、tacおよびlacプロモーターに基づくハイブリッドプロモーターである。デボアー（de  Boer）らの"The  tac  promoter:A  functional  hybrid  derived  from  the  trp  and  lac  promoters."Proc.Natl.Acad.Sci.USA  80:21−25（1983）；およびアマン（Amann）らの"Vectors  bearing  ａ  hybrid  trp−lac  promotor  useful  for  regulated  expression  of  cloned  genes  in  Eschericia  coli."Gene  25:167−178を参照。ptacは、lacオペレーター領域を含むので、これは、lacリプレッサーを著量蓄積するE.コリ株により抑制され得、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラロクトシド（IPTG）の添加により完全に誘導される。
上記の引例は、参考のためにここに記載した。
適当なベクター／ホストシステムの選択は、精通した者の特定の要求の範囲に入る。最も好ましいベクターは、pLプロモーターに基づいている。表Ｉは、適当なベクターとホストおよびその給源の代表的な（限定する者ではない）リストを示す。
0003557431.tif 000002
以下の例においては、ベクターｐΔ33およびpBTac2のDNAが、mSLO.3/6の（最初はpUC19ベクターからの）サブクローニングおよび発現について、宿主菌株AR120およびJM105に関してそれぞれ利用された。
例
好ましい実施態様を示す以下の例は、請求の範囲の開示を限定することを意図するものでもなくまた限定するように解釈されるべきものでもない。
例１
部分消化されたゲノムストレプトリシンO DNAの準備
引例として示すケホエＭ（Kehoe,M）らによりInfect.Immun.,55:3228−3232（1987）（以下『ケホエ1987』）により示された方法を用いてストレプトコッカスピヨゲネス（ATCC＃10389）からゲノムDNAを単離した。約1mgのS.ピヨゲネスDNAが、この手順を用いて得られた（925μｇ）。
S.ピヨゲネス（S.pyogenes）DNA（2.5μg/μｌ）370μｌへ、300μｌの10Xの高塩緩衝液（10X  High  Salt  Buffer）（1.0MのNaCl;100mMのトリスヒドロキシアミノメタンクロリド（『TRIS−Cl』）、pH7.5;100mMのMgCl2;および10mMのジスリオスレオトール（『DTT』））、2310μｌの脱イオンH2Oおよび20μｌのBgl  II（BRL、ガイザースバーグ（Gaithersburg）、MD,Cat.＃5213SAを加え、最終容量を3000μｌとした。この混合物を37℃に保ち、夜通し温置した。
この温置した混合物に、3000μｌの試薬Ａ（250μｌのフェノール、250μｌのクロロホルム、10μｌのイソアミルアルコール、１μｌのβ−メルカプトエタノール）を加えた。水性層と有機層とを分けるためにこの混合物を、遠心分離に先立って、攪拌した。水性の上澄み液を、0.3MのNaOAcと95％エタノールとを用いて沈殿させた。この沈殿を、次に、250μｌのTE（10mMのTRIS−Cl、pH7.5;1mMのEDTA）に再び溶解させ、25μｌの10Xのローディングダイ（0.2MのEDTA;50％のグリセロール;0.25％のキシレンシアノール;0.25％のブロモフェノールブルー）をこれに加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。次に、Bgl  II部分消化S.ピヨゲネスゲノムDNAフラグメントを大きさに従って評価した。
認められるように、SLOは、およその分子量65000〜70000ダルトンを有している。各アミノ酸は、およその分子量110ダルトンを有するので、（内輪の見積で）70000ダルトンたんぱく質は、およそ636のコドンまたは1909塩基対によりコード化される。したがって、上記のゲル電気泳動法により測定される約2000ないし2500の塩基対（すなわち、2.0〜2.5Kb）の塩基対の部分消化フラグメントが精製された。精製されたフラグメントは、次に、150μｌのTEに再び懸濁させた。便宜上、これらは、ここでは、『SLOインサート（insert）』と呼ぶ。
例２
プラズミドを含むストレプトリシンＯの準備
使用したベクターは、Bam  H I（BRL、Cat.＃5201SA）により切断したpUC19（BRL、Cat.＃5364SA）であった。
１μｌの切断したpUC19ベクターに、15μｌのSLOインサート、３μｌの10Xのリガチオン緩衝液（660mMのTRIS−Cl、pH7.5;50mMの塩化マグネシウム;10mMのDTT;10mMのATP）を加えた。８μｌの脱イオンH2Oを加えることにより最終容量を30μｌとした。この混合物に、２μｌのT4リガーゼ（USB、５μg/μｌ）を加えた；夜通し室温でさらに温置した。便宜上、得られたものを『SLOプラズミド候補』と呼ぶ。
例３
SLOプラズミド候補のスクリーニング
ホスト細胞E.コリ株JM105を、次のようにSLOプラズミドにより形質転換させた。300μｌの凍結JM105受容細胞を含むバイアルを解かし、16.0μｌのSLOプラズミド候補をそれに加えた。この混合物を30分間氷上で培養し、37℃の水浴で２分間熱ショックを与えた。その後、移入されたJM105溶液を2mlのLB培地（10gのバクト−トリプターゼ（Bacto−triptase）;5gのバクトイースト抽出物;10gのNaCl;1リッターの脱イオン水；水酸化ナトリウムによりpH7.5）に加えてから37℃で30分間攪拌（200RPM）した。その後、LBアンピリシンプレートに塗布を行い、37℃で夜通し温置した；便宜上これらは、『SLO形質転換体』と呼ぶ。
スクリーニングは、独特な手順を用いて行った。夜通し増殖させた後、PBS/10mMDTT中に0.8％アガロースに含むように」した2.5％の洗浄済うさぎ赤血球でコロニーを覆い、これをプレートを覆うように広げた。37℃で40分の培養の後、SLOを含むコロニーは、溶血の小さなゾーンにより囲まれた。これらのコロニーがSLOを含んでなることを確認するために、SLOの報告されたDNA（ケホエ（Kehoe）、1987参照）を含めたヌクレオチド670−694から誘導された25−merオリゴヌクレオチドプローブを、プローブとして用いた。このプローブを、バイオサーチ（BioSearch）8600DNAシンセシザーにより準備し、マニアチス（Maniatis）らのMolecular  Cloning,CSPL（1982）、122−126ページ（以下『Molecular  Cloning』）に記載のT4ポリヌクレオチドキナーゼ手順により32Pでラベルした。
血液オーバーレイスクリーニング法は、SLO形質転換体により形質発現されたSLOを迅速にスクリーニングする有効で正確な方法であることがわかった。SLOの性質は、赤血球を溶解するその能力であるので、いずれの給源からの赤血球も用いられ、すなわち人、マウス、山羊、うさぎなどからの赤血球が用いられ得る。うさぎの赤血球が、その入手のしやすさから好ましい。
溶血活性を証明し、25−merプローブとハイブリッド形成しているたんぱく質の発現をもたらしたSLOクローンを、『pUC19−SLO−Ｂ』と呼ぶようにした。便宜上、そのノンベクターDNA配列をここでは『rSLO−候補』と呼ぶ。
例４
発現の最適化と溶解度の測定
rSLO候補の発現を最適化するため、Bal−31を用いてrSLO−候補の時限消化（timed−digestion）を行った。さらに、上記したように、始めからの、すなわち、一度発現されたさらに化学的な修飾のない、発現したたんぱく質の溶解度は、重要である。これは、非溶解性SLOは定義により活性でないからである。したがって、発現したたんぱく質が可溶であったかどうが、すなわち、遠心分離の後に、ペレットとは反対に上澄み液にあったかどうかを測定する分析を行った。
pUC19−SLO−Ｂを次のようにしてBstE  II（New  England  Bio  Labs,Cat.＃162,10U/μｌ）によりまず切断した。40μｌの40Xの高塩緩衝液、335μｌの脱イオンH2Oおよび５μｌのBstE  IIを、20μｌのpUC19−SLO−Ｂ（2.5μg/μｌ）に加えた。この混合物を、２時間60℃で設置し、次に、試薬A400μｌで抽出してから、98％エタノール888μｌに含むようにした3MのNaOAc（pH4.8）44μｌで沈殿させた。次に、沈殿剤は、40μｌのH2Oに再溶解させた。その後、90μｌのH2O、20μｌの10XのBa1−31緩衝液（120mMのCaCl2;120mMのMgCl2、2.0MのNaCl;0.2MのTRIS−Cl、pH8.0;10mMのEDTA）および50μｌの1mg/mlのウシ血清アルブミンを、再溶解した沈殿剤と混合した。さらに10μｌのBal−31（New  England  Bio  Labs,Cat.＃213,100U/ml）を加えて全量を210μｌとし、室温で培養した。Bal−31の効果を調節するために、210μｌの全量のうちの30μｌのアリコートを、Bal−31添加後、の30分、45分、60分、80分、105分、130分および160分で取り除き、これらのアリコートのそれぞれを0.2MのEGTAの3.3μｌと混合し、氷上で保存した。最後のアリコートの準備と保存の後、すべて７つのアリコートをプールし、試薬A230μｌにより抽出してから、95％エタノール506μｌに含むようにした3MのNaOAc23μｌにより沈殿させた。次に沈殿は、75μｌのH2Oに再び溶解させた。
フィルイン反応（fill−in  reaction）を、５μｌの2.5mMのdXTP、10μｌの10Xの中塩緩衝液（500mMのNaCl;100mMのTRIS−Cl、pH7.5;100mMのMgCl2;10mMのDTT）および100mMのDTTの10μｌを再溶解沈殿剤の75μｌへの添加により行い、これにクレノウポリメラーゼ（Klenow  polymerase）（5U/μｌ）６μｌを添加し、次に４時間室温で温置した。この混合物を試薬A100μｌで抽出し、100％エタノール22μｌに含むようにした3MのNaOAc11μｌで沈殿させ、次に、40μｌのH2O中に沈殿を懸濁させた。
フィルイン反応に続き、５μｌの5Xのリンカー連結反応緩衝液（linker  ligation  buffer）（250mMのTRIS−Cl、pH7.6;50mMのMgCl2;5mMのDTT;5mMのATP;2.5％（w/v）PEG8000（J.T.Baker,Cat.＃U222−09））と17μｌの再懸濁沈殿を混合した。これに、T4リガーゼ（5U/μｌ）２μｌを加え、室温で６時間温置した。便宜上、得られた物質を『ca/ew』と呼ぶ。
E.コリ株JM105を、上記のca/ewで形質転換し、次に、例１で上記したように夜通し増殖させた。プラズミドがBam  H Iリンカーを含んでなるかどうかを測定するため、40μｌの10Xの中塩緩衝液および320μｌ脱イオンH2Oを40μｌのca/ew（0.5μg/μｌ）に加えた。この混合物へ、５μｌのEcoR I（BRL,Cat  ＃5202  SA,10U/μｌ）を加えてから、37℃で２時間温置した。プラズミドが切断されることを確実にするために、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った；これにより、さまざまな大きさのスミア（smear）ができ、切断がうまくいったことを示した。切断したプラズミドに、5MのNaClの８μｌを加えてから、さらに、５μｌのBam  H I（10U/μｌ）を加えた。この混合物を37℃で２時間温置した。Bal−31消化を行ったrSLO−候補配列の大きさの測定は、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）により行った。これは、rSLO−候補を含む約1.2ないし約2.0Kbで関心のもたれるバンドをもたらした。このように溶血活性を証明した2.0−2.5Kbの初期断片が、大きさを有意的に増した。
rSLO−候補を含んでなるバンドをゲルから切断し、Bam  H IおよびECoR Iにより先に切断したpUC19ベクター中の連結にrSLO−候補が利用できるようにTE15μｌで精製した。そのような連結を達成するように、ゲルで精製したrSLO−候補10μｌを、先に準備したベクター４μｌ、10Xの連結緩衝液２μｌ、10mMのATP2μｌおよび脱イオンH2O2μｌと混合した。この混合物へ、T4リガーゼ２μｌを加えてから、６時間室温で培養した。E.コリホスト細胞株JM105を、上記のようにこれらのプラズミドにより形質転換し、活性なコロニーを、上記の赤血球オーバーレイ法によりスクリーニングした。次に活性なコロニーを選択し、LB培地/100μg/mlアンピシリンに接種し、上記の条件で夜通し増殖させた。
夜通し増殖させた後、細胞は、４℃で8000RPMで５分間遠心分離させ、得られたペレットを2mlの試薬Ｂ（150mMのNaCl;20mMのTRIS、pH7.0;1mMのEDTA）に懸濁させた。その後、懸濁細胞を、氷上で2X30秒間音波処理にかけた後、ベックマンJA20.1遠心機を用いて４℃で40分間9500RPMで遠心分離して発現したたんぱく質を得た。
この段階で、rSLO−候補が可溶性のたんぱく質の発現をもたらせば、そのたんぱく質は、上澄み液にあることになる。したがって、抗体活性たんぱく質の測定のための標準ウエスタンブロットプロトコールを用いて上澄み液中のrSLO−候補の存在の分析を行った。そのようなウエスタンブロット分析の結果は、馬抗SLO抗体（horse  anti−SLO  antibodies）により認められる上澄み液中のSLO融合生成物があったことを示した。１つのそのような融合生成物を選択し、『rSLO.3』と名づけた。便宜上、rSLO.3の発現をもたらすDNA配列もrLSO.3と呼ぶ。rSLO.3の高いレベルの発現をその後試みた。
例５
rSLO.3の高いレベルの発現
pUC19ベクターを含んでなるプラズミドからのrSLO.3の除去は、次のようにして行った。40μｌの10XのSma  Ｉ緩衝液（200mMのKCl;100mMのTRIS−Cl、pH8.0;100mMのMgCl2;10mMのDTT）および345μｌの脱イオンH2Oを、rSLO.3（0.5μg/μｌ）を含んでなるプラズミド15μｌに加えた。この混合物に、５μｌのSma  Ｉ（BRL,Cat  ＃5228  SA,10U/μｌ）を加えた、次に、２時間37℃で培養した。プラズミドが切断されることを確実にするように、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った；これは単一バンドをもたらし、切断がうまくいったことを示した。この切断プラスミドに、８μｌの5MのNaClを加え、さらに、５μｌのBam  H I（10U/μｌ）を加えた。この混合物を、２時間37℃で培養した。rSLO.3配列が約2.7Kb  pUC  19ベクターから好首尾に切断されることを確実にするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行った。これは、２つのバンドをもたらし、１つは約2.7Kb（ベクター）で、もう１つは、約1.4Kb（rSLO.3）であった。このバンドは、rSLO.3がBam  H IおよびSma  Ｉにより先に切断したｐΔ33ベクターの連結に利用できるようにゲルから切断し、15μｌの脱イオンH2Oで精製した。
上記の誘導したrSLO.3DNA2μｌに、上記のベクター２μｌ、10Xの連結緩衝液1.5μｌ、10mMのATP1.5μｌおよび脱イオンH2Oを加えた。この混合物に、T4リガーゼ（10U/μｌ）２μｌを加え、次に５時間室温で培養した。この培養は、rSLO.3およびｐΔ33ベクターを含んでなるプラズミドをもたらした。
E.コリ株AR120を、E.コリ株JM105について概説してある手順に従い上記のプラズミドにより形質転換した。その後、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Auschel,F.M.et  al.,Eds,John  Wiley  ＆  Sons（New  York）（1987）,Section  1.6.に記載されたDNAミニ準備（mini  prep）を行い、次に、プラズミドがrSLO.3を含んでなるかどうか測定するためBam  H IとSal  Ｉ（BRL,Cal.＃5217  SA）によりプラズミドを切断した。rSLO.3を含んでなるプラズミドにより形質転換されたこれらのホスト細胞を、ナリジキシン酸プロトコールを介して誘導にかけた。参考としてあげる、モットJ.E.（Mott,J.E.）らの『λpLプロモーターを含むプラズミドベクターからの遺伝子発現の最大限化：転写終了因子ｐを著量蓄積する方法（Maximizing  gene  expression  from  plasmid  vectors  containing  the  λpL  promoter:Strategies  for  overproducing  transcription  termination  factor  ｐ）』PNAS  USA  82:88−92（1985）を参照。本分野のものに理解されるように、DNAを損傷するナリジキシン酸は、E.コリに対するリカバリーたんぱく質であるrecAたんぱく質を誘導する。誘導された利益対オーバー発現（derivative  benefit  vis−ａ−vis  overexpression）は、recAが、プロテアーゼ活性を有することであり、これは、特に、λcI+リプレッサーの不活性化をもたらし、この不活性化は、pLプロモーターによるオーバー発現につながる。
特に、形質転換されたAR120を含んでなるコロニーは、寒天平板から引き上げられ、A650での培地の光学密度が、0.4になるまで、スーパーボス（Superboth）（塩基−12gのトリプトン、24gのイースト抽出物、5mlのグリセロール、900mlの蒸留H2O;塩（塩基１リッター当たり）−1.7gのKH2PO4、15.8gのK2HPO4（無水物）、100mlの蒸留H2O）および100μg/mlのアンピシリン中に37℃で接種した。その後、ナリジキシン酸を、最終濃度60μg/mlで接種した混合物へ加え、４時間37℃で培養した。上澄み液のウエスタンブロット分析は、rSLO.3の存在を証明した。
例６
rSLO.3の突然変異
当業者であれば理解することができるように、生体には、統計学上の観点から、DNA突然変異率を低く保持する精巧な機構が装備されている。DNA複製の際に突然変異が生ずるのを防止するのに少なくとも３つの工程、即ち、（ｉ）DNAポリメラーゼ（DNA鎖の3'端部へのヌクレオチドの付加を触媒する酵素）により鋳型（即ち、複製されているDNA高分子）に対して相補性を有するヌクレオチドの選定、（ii）「修正ヌクレアーゼ（editing  nuclease）（即ち、例えばヌクレオチドを分解することができる酵素）による非相補性塩基の除去および（iii）誤って組み込まれたヌクレオチドの補正が必要となる。
当業者であれば更に理解することができるように、「ミューテータ」（"mutator"）は、種々の遺伝子を不安定にする特殊な網の突然変異である。細菌ミューテータ菌株、例えば、大腸菌（E.coli）ミューテータ菌株が、生体の突然変異率を制御する該菌株の機構を研究するのに利用されている。従って、例えば、大腸菌の突然変異を有する菌株内の特定の遺伝子を同定すると、ミューテータ活性を調査することができる。
dam、mutS、mutR、mutLおよびuvrD遺伝子は不適正修正方法に関連し、従って、これらの遺伝子の不良バージョン（defective version）を含む大腸菌は中程度に高いミューテータ活性を発揮する。幾つかの大腸菌ミューテータ遺伝子は、複製されているDNAシーケンスに特有の変化を引き起こす。例えば、大腸菌のmutS3ミューテータ菌株は２方向トランジションを生じ、１つのA:T塩基対を突然変異させるが、50未満のヌクレオチドが配置されている第２のA:T塩基対は突然変異させないという点で、塩基シーケンスに対して明らかに感受性を有している。大腸菌のmutTミューテータ菌株は、厳しい特異性を示す、即ち、A:T→C:Gトランジションだけが誘起されるという点で独特である。大腸菌のmutDミューテータ菌株もまた、野生型大腸菌の103乃至105倍の突然変異頻度をもたらすので、注目されるものである。A:T→G:Tのトランジション、A:T→T:AのトランジションおよびA:T→C:G置換はmutD菌株と関連するものである。ある種のミューテータ菌株の傾向は公知であるが、DNA高分子に沿って突然変異が行なわれる時期および個所を正確に予測することを合理的に行なうことはできない。
rSLO.3（所望の目的物として突然変異された形態のものが得られた）の突然変異を行なわせようとする場合、大腸菌ミューテータ菌株mutDおよびmutTが利用された。最も好ましいミューテータ菌株はmutDである。それぞれ300μｌの凍結されたコンピテント細胞（competent cell）mutDおよびamutT菌株を溶かし、実施例４からのプラスミド１μｌを加えた。この混合物を氷上で30分間培養し、次いで、37℃の水浴において２分間熱ショックに供した。その後、形質転換されたmutDおよびmutT宿主細胞をLB培地2mlに加え、次いで、30分間37℃で振とう（200RPM）した。接種を次のようにして行なった。培養された混合物にLB培地/100μg/mlアンピシリン（Ampicillin）10mlを加え、次いで、37℃で一晩生長させた。接種を５回繰り返し、水で、上記したDNAミニプリップ（mini−prep）手順を行なった。これにより、rSLO.3突然変異候補からなるプラスミドが得られた。
次に、上記したこれらのプラスミドを用いて大腸菌菌株JM105の形質転換を行ない、次いで、プレーティング（plating）を行なうとともに、上記したように一晩生長させた。スクリーン処理を、上記した独特の血液オーバーレイプロトコールを使用して行なった。得られたコロニーのほとんどは活性があった（即ち、非突然変異体であった）が、得られたコロニーの幾つかは赤血球細胞の溶解を起こさなかった。これらは、本明細書においてはmSLO候補と呼ばれる。mSLO候補からなるコロニーを、免疫活性を測定するため抜き取った。これは、標準的なウエスタンブロットプロトコール（ホース（horse）ASO）を使用して行なった。ホースASOにより免疫反応性が明らかになったmSLO候補の１つを高レベルの発現のために選んだ。
例７
mSLOの高レベル発現
mSLOに関して遺伝子をクローニングし、pLに基づくベクターを使用して高レベルの発現を行なった。ベクターはｐΔ33であった。大腸菌宿主菌株はAR120であった。
pUC19ベクターからなるプラスミドからのmSLOの除去を次のようにして行なった。mSLO（0.5μg/μｌ）からなるプラスミド15μｌに、10X・Sma・Ｉバッファ40μｌと脱イオンH2O345μｌを加えた。この混合物にSma・Ｉを５μｌ加え、次いで、37℃で２時間培養を行なった。プラスミドがカットされるようにするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行ない、これにより単一のバンドが得られたが、これはカットが首尾よく行なわれたことを示すものである。カットされたプラスミドに5MのNaClを８μｌ加え、次いで、Bam;HI810U/μｌ）を５μｌ加えた。この混合物を37℃で２時間培養に供した。mSLOシーケンスが約2.7Kb・pUC19ベクターから首尾よくカットされるようにするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行なった。これにより２バンドが得られ、一方は約2.7Kb（ベクター）であり、他方は約1.4Kbであった。このバンド内のDNAは、本明細書において「mSLO.3/6」と呼ばれており、このDNAにより発現される蛋白質もまたmSLO.3/6と呼ばれている。このバンドをゲルからカットし、15μｌの脱イオンH2Oにおいて精製して、Bam・H IおよびSma・Ｉを用いて予めカットしたｐΔ33ベクターにおける連結反応に利用することができるようにした。
上記のようにして得られたmSLO.3/6の２μｌに上記したベクター２μｌと、10X連結反応バッファ1.5μｌと、脱イオンH2O8μｌとを加えた。この混合物に、T4リガーゼ２μｌを加え、次いで、５時間室温で培養を行なった。かかる培養によりmSLO.3/6とｐΔ33ベクターとからなるプラスミドが得られた。
大腸菌菌株AR120の形質転換を、大腸菌菌株JM105に関して概説した手順に従って上記プラスミドにより行なった。その後、上記したDNAミニプリップを行ない、次いで、Bam・H IおよびSal・Ｉ（BRL,Cat.＃5217SA）でプラスミドをカットし、プラスミドがmSLO.3/6からなるものかどうかを同定した。mSLO.3/6からなるプラスミドで形質転換を行なったこれらの宿主細胞を次にナリジキシン酸に曝し、上記した接種手順に供した。rSLO.3の場合と同様に、上澄みのウエスタンブロット分析を行なったところmSLO.3/6の存在が明らかになった。
例８
mSLO.3/6の比活性
例７から得られた未精製mSLO.3/6の蛋白質濃度および非活性を測定し、かつ、未精製mSLO.3/6と未精製rSLO.3のそれぞれのナリジキシン酸誘導直後に、未精製rSLO.3の蛋白質濃度および比活性の比較を行なった。
rSLO.3とmSLO.3/6の双方の粗抽出物の蛋白質濃度は、バイオラッド・プロテイン・アッセイ（BioRad Protein Assay）法［クーマシー・ブルー（coomassie Blue）Ｇ−250］を使用して得た。ナリジキシン酸誘導蛋白質混合物を8000RPMで５分間４℃において遠心分離し、ペレットを500μｌの超音波バッファ（sonification buffer）（40mMのTRIS、pH7.5;1mMのEDTA;1mMのDTT;200mMのNaCl）に再懸濁させた。再懸濁されたペレットを次に2x30秒間氷上で超音波処理し、次いで、12,000RPMで40分間４℃において遠心分離処理を行なった。その後、再懸濁されたrSLO.3とmSLO.3/6の混合物５μｌを蛋白質濃度（A595でのODの読み）を測定するための分析に供し、それぞれの蛋白質濃度の測定値は4.6μg/μｌであった。ウエスタンブロット分析を各サンプルに関して行なったところ、各蛋白質の.2μｇ（C,C'）、２μｇ（B,B'）および10μｇ（A,A'）に関するゲルパターン（A,B,D＝mSLO.3/6;A'B'C'＝rSLO.3;S＝標準マーカ）は、図５から明らかなように同じであった。
比活性の比較を、上記した粗抽出物を連続して希釈し、かつ、これに洗浄したうさぎの赤血球細胞（「RRBC」）を添加し、次いで、分光光度分析での読み（A541でのODの読み）を行なうことにより実施した。新鮮なうさぎの血液5mlを、10mMのDTTを含むPBS45mlで２回洗浄し、次いで、2000RPMで５分間４℃において遠心分離処理を行なった。その後、洗浄されたうさぎの赤血球細胞（「RRBC」）1.125mlをチューブの底部から抜き出し、PBS/10mMのDTT48.875をこれに加えた。これにより、2.25％RRBCからなる溶液が得られた。溶血検定を行なうため、2.25％RRBCの500μｌを、PBS/10mMのDTTにおいて1:2の連続して希釈された500μｌのrSLO.3およびmSLO.3/6に加え、次いで、37℃で30分間培養を行なった。
これらの一連の希釈物を分光光度分析に供した（A541でのODの読み）。この分析により、希釈されたrSLO.3の粗抽出物.2μｌはRRBCを50％溶血させることがわかった。この希釈抽出物.2μｌは、抽出物自体の２μｌと等価である。従って、rSLO.3粗抽出物は２マイクロリットル当たり１溶血単位（「HU」）即ち500HU/mlであることがわかった。mSLO.3/6粗抽出物は実質上溶血活性を持たず、即ち、再懸濁mSLO.3/6培地100μｌによれば、RRBCの溶血は６％未満即ち.2HU/ml未満とされた。従って、mSLO.3/6の溶血活性はrSLO.3/6と比較すると2,700倍も小さい。
わかるように、粗抽出物の蛋白質濃度は4.6mg/mlであると測定された。従って、ｐΔ33−AR120発現系から得られたrSLO.3の溶血活性は108.7HU/mgであり、一方、この系から得られるmSLO.3/6の比溶血活性は.04HU/mgであった。これらは粗（即ち、非精製）抽出物に関する値であるので、これらの値は抽出物の全蛋白質濃度に基づくものである。精製された抽出物に関しては、非活性値は増加する。
mSLO.3/6のDNAおよびアミノ酸シーケンスがその後測定され［テキサス州、ヒューストンのラーク・シーケンシング・テクノロジーズ（Lark Sequencing Technologies）］、その結果が図１および図２にそれぞれ示されている。図１において、第１のコドン（ATG）はｐΔ33ベクターにより得られ、第２のコドン（GAT）はBam・H1リンカーからのものであった。比較のため、rSLO.3のDNAおよびアミノ酸シーケンスが、図３および図４に示されている。
rSLO.3のシーケンスとmSLO.3/6のシーケンスとの間には単一のコドン差異がある。rSLO.3の場合には、このコドンはGAA（Gluアミノ酸）であり、一方、mSLO.3/6の場合にはこのコドンはAAA（Lysアミノ酸）である。
例９
mSLO.3/6の回収
以下の手順は、約200グラムの形質転換された宿主細胞（即ち、約６グラムの全蛋白質）に関するものである。
形質転換された宿主細胞を、200mlの試薬Ｃ（Reagent C）（40mMのTRIS、pH7.5;1mMのEDTA;0.1％の２−メルカプトエタノール）に再懸濁させ、次いで、100mMのPMSFを加えた。その後、細胞を超音波により粉砕し、次いで、100mMのPMSFを4ml加えた。この混合物を30分間４℃において15,000RPMで遠心分離に供した。
得られた上澄みを取り出して保存し、試薬C200mlをペレットに加え、次いで、100mMのPMSFを4ml加えた。再懸濁されたペレットを次に超音波処理し、次いで、上記した遠心分離を行なった。得られた上澄みをその後取りだし、前の上澄みとともに溜め、次いで、そのpHをNaOHで7.0に調整した。
最終容量の上澄みにポリミンＰ（Polymin P）［アルドリッチ・ケミカルズ（Aldrich Chemicals）］を0.75％の最終濃度となるまで（室温で撹拌しながら）加えた。この混合物を次に30分間室温で10,000RPMで遠心分離し、次いで、上澄みを回収した。固体の硫酸ナトリウムを、撹拌しながら80％飽和の上澄みにゆっくりと加えた。
その後、混合物を２時間４℃で撹拌し、次いで、30分間４℃において15,000RPMで遠心分離した。次に、ペレットを回収し、pH7.0の飽和硫酸アンモニウム400mlにおいて再懸濁させた。次に、混合物を30分間４℃において10,000RPMで遠心分離し、次いで、ペレットを回収し、試薬Ｄ（20mMのTRIS、pH7;1mMのEDTA;0.1％の２−メルカプトエタノール）200mlに再懸濁させた。
再懸濁させたペレットを次に試薬D2リットルに対して、４回変えながら４℃において透析させた。透析後に、サンプルのpHを検査し、NaOHで7.0に調整した。
次に、サンプルを試薬Ｄにおいて平衡にされたファーマシア・ファスト・フロー・Ｓ−セファローズ（Pharmacia Fast Flow S−Sepharose）カラムに装填した。サンプルからmSLO.3/6を取り出すのに400mlのベッド容積（bed volume）で十分であることがわかった。大腸菌蛋白質からなるフロースルー（flow through）を集めて廃棄し、カラムを約１リットルの試薬Ｄで洗浄した。
mSLO.3/6をバッファＢにおいて2x1リットルの0.0乃至0.4M NaCl勾配で溶出を行なった。SDSアクリルアミドゲル（９％）により分析を行ない、多量のmSLO.3/6を有するフラクションを溜めた。約250mlの溜ったmSLO.3/6を回収した。
上記した手順を使用して、元の全蛋白質約60％（即ち、約0.36グラム）はmSLO.3/6であったが、これは必要があるまで４℃で保存することができる。
例10
mSLO.3/6の精製
mSLO.3/6の精製を、以下のプロトコールを使用して少なくとも80％の純度まで行なった。
例９に記載のプロトコールに従って得られた凍結細胞ペースト約600gを融解し（37℃）、冷溶解バッファ（40mMのTRIS−Cl、pH7.0;1mMのEDTA;1％２−メルカプトエタノール;2MのNaCl;4℃）３リットルに再懸濁し、60分間４乃至10℃でヒート・システムズ・ウルトラソニックス・コンティニュアンス・フロー（Heat Sytems Ultrasonics Continuous Flow）超音波器［ニューヨーク州のファーミングデール（Farmingdale）、No.W−385］を用いて超音波処理した。その後、物質をベックマン（Beckman）JA10遠心分離器により9500RPMで40分間20乃至26℃において遠心分離に供した。
上澄みに、ポリミンＰ沈降剤（ウイスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッチ（Aldrich））の12.5％原液を最終濃度が0.2乃至0.3％になるまで加えた。次に、溶液を１時間室温で撹拌し、沈澱物を廃棄した。次に、液体部分のpHを、NaOHを用いて7.0に調整した。次いで、この液体を室温で一晩放置した。
その後、溶液を上記のように遠心分離、清澄な上澄みを取り出した。次に、上澄みを１リットルのフェニルセファローズHICカラム（ニュージャージー州、ピスカッタウエイのファーマシア（Pharmacia））に2ml/分で室温において充填した。その後、カラムを溶離バッファ（20mMのTRIS−Cl、pH7.0;1mMのEDTA;0.1％BME）を用いて7ml/分で洗浄した。フラクションを、ファーマシアのファースト−ペイジ（Phast−Page）（登録商標）SDS−PAGE電気泳動により監視した。蛋白質濃度を、バイオラッド・プロテイン・アッセイ・キット（BioRad Protein Assay Kit）により測定した。次いで、蛋白質を含むフラクションを溜めた。
次に、溜まったフラクションを１リットルのブルー・アフィニティ・カラム（Blue Affinity Column）（カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッド）に2ml/分で室温において充填し、次いで、２カラム容積に関して上記した溶離バッファを用い2ml/分で室温において洗浄した。
結合蛋白質の溶離を、密度勾配が0.0乃至0.8MでpHが7.0のNaClを使用して行なった。フラクションをファスト−ペイジシステムを用いて監視し、蛋白質濃度をバイオラッド・プロテイン・アッセイ・キットを用いて測定した。単一のピークがこのNaCl密度勾配において0.3−0.4Mで得られた。
溶離されたmSLO.3/6の純度を、６つの異なる溶離されたmSLO.3/6（16、８、４、２、１、.5μｇのmSLO.3/6）のゲル電気泳動により得られた主バンド均質性の分析に基づき、ベックマンDU7500分光光度系を使用して評価した。主バンド均質性に基づくmSLO.3/6（および比較のためのrSLO.3）の評価された純度を第２表に示す。
0003557431.tif 000003
ゲル電気泳動の結果が図６に示されており、図６においてＡはmSLO.3/6であり、ＢはrSLO.3である。
例11
精製されたmSLO.3/6の比溶血活性（力価）
図７は、96−溜めのマイクロタイタ（microtiter）プレートの写真を示す。マイクロタイタの溜めはrSLO.3と、商業的に入手することができるワイルドタイプバージョンのSLO（シグマ（Sigma）の製品No.S−5265）と、mSLO.3/6の（力価による）溶血活性の分析結果を示している。
溶血検定力価に関しては、0.154gのDTTを１力価のPBSに加えた。新鮮なうさぎの赤血球細胞（2.5％）をPBSで洗浄し、次いで、2000RPMで20分間４℃において遠心分離を行なった。このプロトコールを３回行なった。サンプルの最初の希釈は、サンプルの10μｌに対する500μｌのPBS−DTT溶液に基づく上記したPBS−DTT溶液において1:50であり、1:2希釈シリーズを12の希釈に関して行なった。
図７について説明すると、溜めA1においては、200μｌの希釈したrSLO.3をこれに加え、B1においては200μｌの希釈されたmSLO.3/6を加え、C1においては200μｌの希釈したシグマSLOを加えた。残りの溜めにおいては、100μｌのPBS−DTT溶液を加えた。その後、A1から溶液100μｌをピペットによりA2に加え、この手順を繰り返して、各溜めが100μｌの溶液混合物を有するようした。その後、８チャンネルのピペッタ（pipettor）を使用して、洗浄されたうさぎの赤血球細胞100μｌを各溜めに加え、次いで、穏やかに振とうするとともに室温で20分間培養を行なった。その後、プレートを500rpmでベックマンJ4.2遠心分離器を用い５分間４℃において遠心分離した。
希釈を、図７に示すマイクロタイタの溜めに関して第３表に次のとおり示す。
0003557431.tif 000004
図７において、Ａ、A'はrSLO.3であり、Ｂ、B'はmSLO.3/6であり、Ｃ、C'はシグマSLOであり、Ｄは負の対照（SLOなし）である。Ｂ、B';C、C';およびＤの希釈は、シグマSLOが1.0x10-3μl/mlを越えずかつ負の対照がD6を越えていないことを除いてＡ、A'と同じであった。
プレートの読みは、希釈範囲のどの溜めが赤血球細胞の溶解を示さなかったを測定することにより行なった。溶解が生じた場合には、溜めは赤となり、溶解がない場合は、各溜めの底部（即ち、各溜めの「中央」）に位置する赤血球細胞のペレットにより示される。
図７から明らかなように、mSLO.3/6に関してはどの力価でも溶解は生じておらず、一方、rSLO.3およびシグマSLO.の双方に関してはほぼ同じ力価で溶解が生じていた。従って、mSLO.3/6は商業的に入手することができるSLOおよびrSLO.3の同じいずれの力価においても溶血活性を実質上示していない。
溶血活性を測定するため、精製されたmSLO.3/6の濃度を測定した（1.2mg/ml）。2.5％RRBCの50％を越える溶解を得るためには、mSLO.3/6の1:16.7力価が必要であった。従って、精製されたmSLO.3/6の比溶血活性は14HU/mg（16.7÷1.2）である。比較のため、rSLO.3の溶血活性も同様に測定した。2.5％RRBCの50％を越える溶解を得るためには、.7mg/mlの精製されたrSLO.3の1:25,600力価が必要であった。従って、精製されたrSLO.3の比溶血活性は3.6x104HU/mgである。これは、比活性が2600倍異なることを意味し、実施例８の粗（未精製）抽出物から得られた2700倍の相違と相関関係を有するものである。
例12
mSLO.3/6のサブクローニング
mSLO.3/6を得て、測定を行ないかつシーケンス処理を行なってから、別の発現／ベクター系を使用してそのサブクローニングおよび発現を開始させた。ベクターpBTac2・DNA［ボーエリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）Cat.No.1081、10μｇ］について、Hind III（BRL,Cat.No.52075A、10U/ml）を用い、pBTac2・DNA（１μg/μｌ）30μｌと、10x培地塩バッファ30μｌと、脱H2O240μｌとを混合し、次いで、これにHind III（BRL,Cat.＃5207SA、10U/ml）を加えることによりカットを行なった。この混合物を２時間37℃で培養した。その後、混合物をアガロース電気泳動（１％アガロースゲル）により分析を行ない、ベクターが首尾よくカットされたかどうかを測定したところ、単一バンドが得られ、カットが首尾よく行なわれたことがわかった。
この混合物305μｌに、試薬Ａを300μｌ加えた。次に、この混合物をベックマンのマイクロ遠心分離器を用い、５分間12,000RPMで遠心分離に供し、次いで、上部液体層を取り出した。この液層に3MのNaOAc（pH4.8）33μｌとエタノール660μｌを加え、次いで、−20℃で一晩沈降させた。この後、ベックマンのマイクロ遠心分離器により10分間12,000RPMで遠心分離を行なった。ペレットを取り出し、空気により乾燥を行なった。乾燥されたペレットを次に150μｌの脱イオン水に再懸濁させた。
Hind IIIのカットされたベクターの一端をブラント（blunt）（充填）させるため、再懸濁させたペレットからなる溶液150μｌを20x・dNTP（2.5mM）10μｌおよび100mMのDTT20μｌと混合した。次いで、クレノウ（Klenow）ポリメラーゼ［ニューイングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）のCat.No.210、5U/ml］を４μｌ加え、室温で７時間培養を行なった。その後、試薬A300μｌを培養された混合物に加え、次いで、５分間12,000RPMで遠心分離に供した。上部液体層を取り出し、上記のように沈降させた。乾燥されたペレットを次に30μｌの脱H2Oに再懸濁させた。便宜上、充填したHind IIIのカットされたベクターを「vec.rb］と呼ぶ。
その後、vec.rbをBamH I（BRL,Cat.No.5201SA、10U/μｌ）を用いてカットに供した。vec.rb30μｌに10Xハイソルトバッファ（High Salt Buffer）30μｌと240μｌの脱H2Oを加えた。この混合物のBamH I5μｌを加え、次いで、２時間37℃で培養を行なった。この培養混合物に試薬A300μｌを加え、次いで、上記のように遠心分離を行なった。上部液体層を上記のようにして取り出し、沈降させた。次に、乾燥させたペレットを脱H2Oに再懸濁させた。再懸濁されたペレットはカットされ充填されたHind IIIからなり、BamH IがpBTac2DNAをカットした。
mSLO.3/6を上記したプラスミドから次のようにして取り出した。mSLO.3/6（１μg/1μｌ）からなるプラスミド40μｌに、10X・Sma Iバッファと320μｌの脱H2Oを加えた。この混合物に、５μｌのSma I（10U/μｌ）を加え、次いで、37℃で２時間培養を行なった。プラスミドがカットされるようにするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行ない、これにより単一バンドが得られ、カットが首尾よく行なわれたことがわかった。カットされたプラスミドに5MのNaClを８μｌを加え、次いで、BamH I（10U/μｌ）５μｌを加えた。この混合物を37℃で２時間培養した。mSLO.3/6シーケンスが約6.3KbのｐΔ33ベクターから首尾よくカットされるようにするため、ゲル電気泳動（１％アガロースゲル）を行なった。これにより２つのバンドが得られ、一方は約6.3Kb（ベクター）であり、もう一方は約1.4Kb（mSLO.3/6）であった。1.4Kbのバンドがゲルからカットされ、mSLO.3/6が得られたpBTac2ベクターにおける連結反応に利用することができるように、20μｌの脱H2Oにおいて精製を行なった。
ベクター３μｌに２μｌのmSLO.3/6と、10x連結反応バッファ（0.66MのTORIS−Cl（pH7.5）、50mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのATP）1.5μｌと、10mMのATP1.5μｌと、脱H2O7μｌとを加えた。その後、T4リガーゼ1.5μｌを加え、次いで、室温で一晩培養を行なった。便宜上、この混合物を「サブクローンｍ」と呼ぶ。
大腸菌菌種JM105をサブクローンｍと次のようにしてトランスフェクションに供した（transfected）。凍結したJM105コンピテント300μｌを含むバイアルを融解し、8.0μｌのサブクローンｍを加えた。この混合物を氷上で30分間培養し、次いで、37℃の水浴において２分間熱ショックに曝した。その後、トランスフェクションを受けたJM105溶液をLB培地［バクト・トリプタン（Bacto−tryptane）10g、バクト酵母抽出物5g、NaCl10g、脱イオン水１l、水酸化ナトリウムでpH7.5）2mlに加え、次いで、30分間37℃で振とう（200RPM）を行なった。次に、プレーティングをLBアンピシリンプレート上で行ない、次いで、37℃で一晩培養を行なった。
得られたコロニーはmSLO.3/6からなっているので、血液オーバーレイスクリーン処理プロトコールは利用することができなかった（即ち、非生育性コロニーもまた非溶血活性を示していた）。従って、スクリーン処理は、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第132巻、第６−13頁（1983年）に掲載のランダムプライマラベリング集により標識が付された、BstE IIおよびEcoRE V（約1.1Kbプローブ）を用いてカットを行なったpUC−19−SLO−Ｂから得られた雑種形成プローブを使用して行なった。
これらのコロニーをスクリーン処理するため、ニトロセルロース転移膜［シュライハー・アンド・シュエル（Schleicher ＆ Schuell）、キーン（Keene）、NH、No.20440;ポアサイズ:0.45μｍ］をプレートに載置し、コロニーをプレートから持ち上げた。膜を変性バッファ（0.5MのNaOH;1.5MのNaCl）に５分間室温で曝した。その後、変性バッファ（1.5MのNaCl;1MのTRIS,pH8.0）を加えた。次に、膜を２時間80℃で焼成し、次いで、雑種形成バッファ（5X・SSPE;50％脱イオンホルムアミド;5X・デンハルツ（Denhardts）;100μg/mlの変性された鮭の睾丸DNA−モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）を参照）12mlを加え、１時間37℃で予備雑種形成に供した。その後、上記したプローブを加え、37℃で一晩雑種形成に供した。次いで、10mMのKPO4、pH7.0、1mMのEDTAを用いて３回洗浄（各10分）を行なった。次に、膜をＸ線フィルムに−70℃で一晩曝した。次に、上首尾の雑種形成を示す領域を使用してmSLO.3/6サブクローンからなるコロニーを得た。
mSLO.3/6サブクローンからなるスクリーン処理したコロニーを12mlのスーパーブロス（Superbroth）−アンピシリンブロスにおいて接種を行なった。培地ブロスが0.7のOD600の読みを持ったときに、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を1mMの最終濃度で培地のブロスに添加することにより誘導を行なった。得られた溶液12mlを8000RPMで10分間４℃において遠心分離に供し、得られたペレットを1.2mlのPBS/10mMDTTにおいて再懸濁させた。再懸濁されたペレットを1.5分間超音波処理し、超音波処理した抽出物の蛋白質濃度を、上記したバイオラッド・プロテイン・アッセイ・プロトコールを使用して測定した。mSLO.3/6からなる抽出物に関しては、蛋白質濃度は13mg/mlであった。このデータを使用し、上記した2.5％の洗浄されたうさぎ赤血球細胞プロトコールの50％溶解に基づく力価により超音波処理された抽出物の比溶血活性を測定した。
pBTac2−JM105を使用してmSLO.3/6の比溶血活性をrSLO.3の比溶血活性と比較するため、上記した特定の手順に従ってこの発現系を使用してrSLO.3を得た（rSLO.3からなる抽出物の得られた蛋白質濃度−9.3mg/ml）。結果を第３表に示す。
0003557431.tif 000005
上記データは、pBTac2−JM105発源系に関しては、mSLO.3/6からなる粗抽出物がrSLO.3からなる粗抽出物よりも溶血活性が約5,600倍少ないことを示している。
例12
発現系の比較分析
rSLO.3およびmSLO.3/6の発現に関して発現系を相対的に比較するため、ウエスタンブロット分析を、rSLO.3からなるｐΔ33ベクターとrSLO.3およびmSLO.3/6からなるpBTac2ベクターとに関して、ペレットと上澄みに対して行なった。同じプロトコールを並行比較研究に関して行ない、形質転換された各宿主をスーパーブロスにおいて接種するとともに、それぞれの誘導法、即ち、ｐΔ33に関してはナリジキシン酸およびpBTac2に関してはIPTGを使用した。図９は、示されている種々の物質からの粗抽出物のウエスタンブロットの結果を示す（Ｓ＝標準マーカ;A＝ｐΔ33−rSLO.3ペレット;A'＝ｐΔ33−rSLO.3上澄み;B＝pBTac2−mSLO.3/6ペレット;B'＝pBTac2−mSLO.3/6上澄み;C＝pBTac2−rSLO.3ペレット;C'＝pBTac2−rSLO.3上澄み）。
図９自体から明らかなように、ｐΔ33発現系は、SLO−物質のバンドが、pBTac2系の場合と略同じ水平なレーンに現われているが、pBTac2系と比較してペレットのSLOの量が多いことを示すものと考えられる点でpBTac2系とは異なるものと考えられる。これらの傾向を確かめるため、図９の結果を、上記したベックマンDU7000分光光度系により分析を行ない、各系の（ペレットと上澄みの双方に関する全ピーク面積の関数としての）SLO−物質の得られたピークの比較を行なった。これらの結果を下記の第４表に要約する。
0003557431.tif 000006
これらの結果は、ｐΔ33系に関しては、より多くのSLOがpBTac2系と比較してペレットに存在し、略２倍のSLO物質がペレットにおいてよりもpBTac2上澄みに存在し、略同等量のSLO物質が上澄みとペレットに存在することを示している。
例14
精製されたmSLO.3/6およびrSLO.3の比溶血活性の分析
野生型SLOの「比活性」に基づく、rSLOおよびmSLO（それぞれ、精製されたrSLO.3およびmSLO.3/6）の特定のバージョンの比活性およびパーセント溶血活性を第４表に示す。
0003557431.tif 000007
上記データは、mSLO.3/6が野生型SLOよりも溶血活性が約1.4x10-2％小さいことを示している。即ち、mSLO.3/6は１％未満の野生型SLOの溶血活性を有している。
例14
mSLO.3/6の生体内毒素作用
mSLO.3/6の生体内毒素作用を評価するため、Balb/cマウスに、mSLO.3/6の未希釈および希釈静脈注射により投与した。希釈されていないおよび希釈された対照懸濁バッファを、同等数のマウスに投与した。静脈注射を改善するため、マウスを注射前20乃至30分間熱ランプの下で暖めた。各条件に関して約20匹のマウスを使用した。
未希釈のmSLO.3/6に関しては、各マウスは約17mg/kgの投与を受け、一方、希釈されたmSLO.3/6に関しては、各マウスは約1000μg/kgの投与を受けた。対照溶液バッファは対照マウスに影響を及ぼさなかった。
注射後数分間の小さな動揺は別として、希釈されたあるいは未希釈のmSLO.3/6を受けたマウスはいずれも、静脈投与による疾病作用は示さなかった。このデータは、精製されたmSLO.3/6に関する比活性データを支持している、即ち、mSLO.3/6の非溶血活性は、希釈されたまたは未希釈の投与を受けたマウスが死なないあるいは何らの重大な副作用を示さないという点で明らかである。
上記した例はSLOゲノムライブラリの発生に向けられている。当業者が理解するように、ゲノムDNAライブラリよりも複雑性が著しく少ない別のタイプのライブラリは、「相補性DNA」または「cDNA」ライブラリである。cDNAはmRNAから直接得られ、従って、定義によれば、cDNAライブラリは翻訳の領域からなる。mSLO・DNAに対して相補性を有するmRNAに基づきcDNAを誘導する方法は、mSLOのcDNA基準ライブラリがこの開示の一部であるように当業者の範囲内にあるものと考えられる。
たんぱく質の折りたたみ
ヌクレオチドの直線状の配置は、特定のコドンを定めるので、アミノ酸の配置すなわち配列は、その特定の機能を含めてたんぱく質を定める。しかしながら、特定のアミノ酸配列が、たんぱく質の同定に関して重要であるのに対し、たんぱく質が示す特別な三次元の形も同様に重要である。本質的に、形の上での特異性は、たんぱく質の性質を共同定義（co−dfine）する：なぜなら、たんぱく質の形は、たんぱく質にその特定のたんぱく質の形を認識し得るだけの他の分子と特異的に相互作用させるからである。
たいていのたんぱく質は、その正しい形に自然と折れる。たんぱく質をある種の変性溶剤により処理することにより、たんぱく質は、柔軟な鎖へと『広がる』ことができる。変性剤を除くと、柔軟な鎖の一部は、その初めの構造へと再び折れる。これは、たんぱく質の折りたたみを支配する最も重要な因子のひとつが、そのたんぱく質のアミノ酸の極性（親水性すなわち『水を嫌う』）および非極性（疎水性すなわち『水を好む』）の側鎖の分布であるからである。変性溶剤は、アミノ酸側鎖の極性を妨害する。次のアミノ酸が極性側鎖を有する:ASn;Gln;Ser;Thr;およびTyr。次のアミノ酸が非極性の側鎖を有する:Gly;Ala;Val;Leu;Iso;Pro;Phe;Met;Trp;およびCys。塩基性側鎖および酸性側鎖を有するアミノ酸は、非常に極性である。次のアミノ酸は、塩基性側鎖を有する:Lys;Arg;およびHis。次のアミノ酸は、酸性側鎖を有する:AspおよびGlu。
たんぱく質が天然に存在する環境は、定義により、非変性環境であり、それは典型的には、水性である。したがって、たんぱく質の疎水性側鎖は、たんぱく質分子の内部で一緒に押し込められる傾向があり、このことは、疎水性の側鎖が水性の環境と接触するのを避けるのを可能とする。他方、極性の側鎖は、たんぱく質分子の外側近くで極性の側鎖自体配置する傾向があり、その位置で極性の側鎖は水および他の極性の分子と相互作用し得る。
線形DNAシーケンスを対応するポリペプチドの正確なアミノ酸シーケンスに転写しかつ翻訳する分子機構は十分に理解されているが、ポリペプチド鎖が同時にかつ自主的に折り重なってその三次元構造をどのようにして形成するのかは、正確には理解されていない。合成DNA、即ち、組換え技術を介して合成されるDNAの実際の可能性は、蛋白質構造の領域において実現されるものである。しかしながら、これを実現するためには、蛋白質折畳みの機構を一層簡潔に明らかにしなければならない。蛋白質構造をシーケンスから予測する一般的な問題は（原則的には、構造をシーケンスと関連づけることができる基準が明らかにされていないので）理解しにくいものであるが、シーケンスのある部分は構造にとって重要であり、他の部分は構造的な観点から比較的重要性がないので、置換または修正をこれらの部分で行なうことができることは明らかである。従って、蛋白質のシーケンスの部分は折畳まれた蛋白質構造の安定性に有意に寄与するものと考えられる。
たんぱく質配列からたんぱく質構造を予測することは、とらえにくいが、定義から、たんぱく質は、測定することのできる独特な三次元構造を有している。たとえば、次の方法論が、たんぱく質構造の測定に用いることができる：結晶学、光学活性、核磁気共鳴分光学。
ａ）結晶学
たんぱく質は結晶を形成し得る。たんぱく質は、たんぱく質の溶解度に影響する多数の変数のうちの１つ以上を変えることにより達成され得る飽和または過飽和の状態で通常結晶する。したがって、溶液のイオン濃度を変えるか、または有機ポリマーたとえばポリエチレングリコールの利用により、たんぱく質は晶出し得る。たんぱく質結晶を成長させる技術は、Narang,S.A.Proten  Engineering;Approaches  to  the  Manipulation  of  Protein  Folding（Butternworth,Publisher,Soneham  MA.,1990）,Chpt.6（以下『Narang』とする）に記載されている。上記の本は、参考としてここに示した。たんぱく質を晶出したら、ｘ−線、中性子および電子回折法が用いられてたんぱく質の構造が測定できる（好ましくはｘ−線回折法が用いられる）。結晶のたんぱく質構造は、結晶形に対し分子の最小限立体配座フリーエネルギーにあるかまたはその近くにあると思われる。
ｂ）光学活性
アミノ酸の不斉中心に起因し、また、その不斉配座に起因してポリペプチド／たんぱく質の光学活性は、ポリペプチド／たんぱく質の構造の測定に用いることができる。不斉は、たんぱく質を右旋偏光および左旋偏光と異なるように相互反応させる:2つのビームがたんぱく質を異なる速度で結果的に進行すると、偏光は回転される。旋光分散（『ORD』）は、波長へのこの回転の依存である。たんぱく質分子が光を吸収しない波長域で、回転は、波長と共に漸進的に変化するが、吸収域では、回転は、１つの方向でまず鋭く増加し、吸収極大でゼロに下がり、次に反対方向で鋭くリスト（riste）する。左旋偏光および右旋偏光の不均等な吸収もあり、これは、円偏光２色性（『CD』）と呼ばれる。たんぱく質のCDおよびOESスペクトルは、その構造的な立体配座に非常に鋭敏である。折りたたまれたたんぱく質は、通常、近UV領域（250−300nm）で有意的に光学活性を有する。
ｃ）核磁気共鳴分光学
たとえば、1H、13C、15N、13pおよび2Hを用いる核磁気共鳴分光学は、溶液中のたんぱく質の構造を研究するのに大いに役に立つことが証明されている。1Hに関心を払うと、分子中のそれぞれの水素原子は、核磁気スピンを有している、すなわち、原子の核は、小さな磁石のようにふるまう。外部の磁界の不在下で、プロトンの磁気モーメントはランダムに配向している。核磁気共鳴の実験では、強い外部の磁界が、特定の方向に沿ってサンプルに加えられ、磁気モーメントと特定の方向の軸線に沿う正味巨視的磁化（net  macroscopic  magnetization）とが整合する；適当な強さの短いラジオ周波数パルスが加わり、磁化ベクターがこの軸線から離れるようにノックする。磁化が回復すると、過渡的なラジオ周波数信号が、時間の関数として記録される。この信号のフーリエ変換は、周波数スペクトルを生じる。分子のそれぞれのプロトンは、そのプロトンの局部電子環境により定められるある特徴的な共鳴周波数で起こるこのスペクトルでピークを生じさせる。特定のプロトンの共鳴周波数は、その『化学的シフト』と呼ばれ、ある基準周波数からのオフセットとして測定される。NMRからのストラクチャード情報（structured  information）は、核オーバーハウザー効果（nulcear  Overhauser  effect）（『NOE』、これは１対のプロトンが、空間で互いに近いかどうかを定める）と３つ以下の化学結合により分離されるプロトンの結合定数とから誘導される。NOEおよび結合定数は、一次元データを与える；二次元データは、特に核オーバーハウザーエンハンスメント分光法（NOESY）と二次元相関分光法（COSY）とにより与えられ、そしてそのようなデータから、三次元たんぱく質構造が決定され得る。
たんぱく質分子の三次元構造の決定について述べた上記の情報の点で、DNA巨大分子およびアミノ酸の後記の請求の範囲は、三次元構造をそれにより表されるたんぱく質分子と関連させて固有に含む。
本明細書に記載の例は、好ましい特定のベクター、プラスミドおよび宿主細胞に限定されるものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載のmSLOは、mSLO.3/6として示される好ましいmSLOだけに限定されるように解釈されるべきではない。同様に、好ましいmSLO.3/6は、DNAおよびそのアミノ酸シーケンスが本出願人が言及しているDNAおよびアミノ酸シーケンスだけであることを実際にあるいは言外に認めさせるものではない。出願人には、適用される特許法の下で全範囲の保護を受ける権利が与えられている。
表示により物質を主張するために、pBTac2/DNA−mSLO.3/6からなるプラスミドにより形質転換されたJM105およびｐΔ33−mSLO.3/6からなるベクターにより形質転換されたAR120が、1991年８月23日に、メリーランド州20852、ロックビル（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）12301に所在するジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（the American Type Culture Collection）（ATCC）に、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認のためのブタペスト条約の規定に基づき、寄託された。これらは、ATCCにより1991年８月27日に試験され、双方とも生育可能であることが確かめられた。ATCCは、これらの物質に、寄託番号ATCC68678およびATCC68676をそれぞれ付与した。
rSLO.3とmSLO.3/6との間の単一ヌクレオチド（およびアミノ酸）相違点を識別したが、当業者であれば、当業者に公知の種々の方法学、例えば、米国特許第4,351,901号（「単一ヌクレオチド変化方法」）に記載されている方法に供される野生型SLOを使用して、図１に示すDNAシーケンスを容易に得ることができる。この米国特許を引用して本明細書における説明に代える。ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、末端および中間部の変化および除去に関する別の方法学が当業者にとって容易に明らかになるものである。更にまた、DNA合成技術は、図１のDNAシーケンスの長さを有するオリゴヌクレオチドを容易に得ることができるように進歩するので、本技術分野におけるかかる進歩に伴ない適宜のシーケンスを合成することができる。
更にまた、本出願人は、特に、（図２に示すような単一のアミノ酸変化をもたらす）図１に同定されている単一のヌクレオチド置換が上記したようにSLO変異体の溶血活性を低減させることを見出したので、当業者であれば、フラグメントが野生型SLOの少なくとも１つのエピトープ特性を保持しかつ非溶血特性を保持し続けるように、（例えば、ヌクレオチドの除去を介して）DNAシーケンスのフラグメントを容易に得ることができる。更にまた、かつ、理解されるように、ヌクレオチドの保存置換を、アミノ酸シーケンスに付随した変化をもたらすことなく行なうことができるが、これは、当業者が理解することができるものである。例えば、「コンピュータ化されたバック翻訳」技術を使用することにより、アミノ酸シーケンスをコンピュータにより分析することができるとともに、コンピュータはかかるアミノ酸をエンコードするのに必要なコドンにおいて利用するのに最適なヌクレオチドを決定することができる。更に、図１のDNAシーケンスと好ましくは80％の相同を示し、該シーケンスとより好ましくは85％の相同を示し、最も好ましくは90％の相同を示すDNAシーケンスは、本発明の範囲に含まれるものと考えられる。
SLO変異体のスクリーン処理は上記した血液オーバーレイ技術を使用して容易に行なうことができるので、数多くのSLO変異体候補を素早く評価することができる。従って、特定のSLO変異体をもたらす特定の置換が確立されたので、当業者であれば、SLO変異体の相似体候補を得、非溶血活性を示すためにこれらの候補を素早くスクリーン処理し、かつ、本出願人のmSLOの定義に含まれる相似体の核酸およびアミノ酸シーケンスを定めるのに、本技術分野のかかる進歩を容易に使用することができる。
従って、本明細書に記載した例は特定のSLO変異体であるmSLO.3/6に向けられているが、統計学的に云えば、この変異体は野生型SLOと比較して溶血特性を持たず、しかも本技術分野おいてこのような進歩をもたらした事実に照らして、当業者であれば、かかる進歩を当業者の目的に適合させるよいうに公知の技術を利用することができるので、本発明は上記した特性を有するSLO変異体を含むように理解されるものであり、例に開示されている特定の変異体に限定されるものではない。
本発明をその好ましい例に関してかなり詳細に説明したが、本発明の教示の範囲内に含まれる他の例も可能である。かくして、特定のSLO変異体の生産について詳細に説明したが、これは例示として解釈されるべきである。従って、上記説明および下記の請求の範囲はいずれも、本明細書に含まれる好ましい例の説明により限定されるものと解されるべきではない。
シーケンスリスト
（１）一般情報
（ｉ）出願人：アダムズ、クレイグ・エム
（ii）発明の名称：ストレプトリシンＯ変異体
（iii）シーケンスの数:2
（iv）連絡宛先
（Ａ）宛名：ベックマン・インストルメント・インコーポレイテッド
（Ｂ）ストリート：ハーバー・ブールバード2500
（Ｃ）都市：フラートン
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:92634
（ｖ）コンピュータ読出し形態：
（Ａ）媒体のタイプ：ディスケット、3.5インチ、1.44Mb
（Ｂ）コンピュータ:IBM
（Ｃ）操作システム:MS.DOS
（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト5.1
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：第07/752,428号
（Ｂ）出願年月日:1991年８月30日
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）出願年月日：
（viii）弁護士／代理人情報：
（Ａ）名前：バーグーン、リチャード・ピー
（Ｂ）登録番号：第34,787号
（Ｃ）整理／書類番号:128D−1028
（ix）通信連絡情報：
（Ａ）電話：（714）773−7610
（Ｂ）ファックス：（714）773−7936
（２）シーケンス識別番号に関する情報:1
（ｉ）シーケンスの特徴：
（Ａ）長さ:1524ベース対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）撚：シングル
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ii）分子のタイプ：ゲノムDNA
（iv）最初の源：
（Ａ）生体：化膿連鎖球菌
（vii）即時源：
（Ａ）ライブラリ：ゲノム
（Ｂ）クローン:mSLO.3−６
（xi）シーケンスの説明：シーケンス識別番号:1
0003557431.tif 000008
0003557431.tif 000009
（３）シーケンス識別番号の情報:2:
（ｉ）シーケンスの特徴：
（Ａ）長さ:480アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：リニア
（ii）分子のタイプ：蛋白質
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：単一シーケンス
（Ｂ）位置:SLOのアミノ酸98対アミノ酸571（以下のシーケンスのアミノ酸304での突然変異を除く）
（Ｃ）識別方法：組換えベクターからの可溶性の非溶血活性SLOの生産に基づき実験的に定められる
（Ｄ）その他の情報：赤血球細胞を溶解しない
（xi）シーケンスの説明：シーケンス識別番号:2:
0003557431.tif 000010
0003557431.tif 000011
0003557431.tif 000012
【図５】
0003557431.tif 000027
【図８】
0003557431.tif 000028
【図１】
0003557431.tif 000029
【図２】
0003557431.tif 000030
【図３】
0003557431.tif 000031
【図４】
0003557431.tif 000032
【図６】
0003557431.tif 000033
【図７】
0003557431.tif 000034