【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
[本発明1001]
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
[本発明1002]
外因性ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、細菌内でフコシル化オリゴ糖を生産する方法。
[本発明1003]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）FutX、ラクノスピラセアエ（Lachnospiraceae）種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）FutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス（Bacteroides）種FutZA、タネレラ（Tannerella）種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）+13 FutP、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）FutU、サルモネラ菌（Salmonella enterica）FutZ、メタノスファエルラ・パルストリス（Methanosphaerula palustries）FutR、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）FutV、アケルマンシア・ムシニフィリア（Akkermansia muciniphilia）FutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記細菌からまたは前記細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース（2'-FL）、ラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）、またはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記細菌がさらに、外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／または外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
外因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌（Helicobacter pylori）26695 futA遺伝子を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
外因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、ピロリ菌UA948 FucTa遺伝子またはピロリ菌株DMS6709 FucT III遺伝子を含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記細菌がさらに、減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化されたlacAまたはそれらの組み合わせを伴う、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で前記細菌を培養する工程をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、前記細菌の欠失もしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および／または欠失もしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を伴う、本発明1010の方法。
[本発明1013]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性がさらに、野生型細菌より低いβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを含む外因性lacZ遺伝子またはその変種を伴う、本発明1012の方法。
[本発明1014]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、野生型細菌より低い活性レベルを含む、本発明1010の方法。
[本発明1015]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、6,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、1,000単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記細菌が、lacY遺伝子の直接上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、本発明1010の方法。
[本発明1018]
不完全なコラン酸合成経路が、前記細菌のwcaJ遺伝子の不活性化を伴う、本発明1010の方法。
[本発明1019]
不活性化されたATP依存性細胞内プロテアーゼが、内因性lon遺伝子のヌル変異、不活性化変異、または欠失である、本発明1010の方法。
[本発明1020]
内因性lon遺伝子の不活性化変異が、機能性大腸菌（E.coli）lacZ+遺伝子の挿入を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細菌がさらに、機能性ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、本発明1010の方法。
[本発明1022]
前記細菌が、大腸菌lacYを含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記細菌がさらに、外因性大腸菌rcsAまたは大腸菌rcsB遺伝子を含む、本発明1010の方法。
[本発明1024]
前記細菌がさらに、thyA遺伝子内に変異を含む、本発明1010の方法。
[本発明1025]
前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、本発明1010の方法。
[本発明1026]
前記細菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、本発明1010の方法。
[本発明1027]
前記細菌が大腸菌である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
生産株が、バチルス（Bacillus）、パントエア（Pantoea）、ラクトバチルス（Lactobacillus)、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、プロプリオニバクテリウム（Proprionibacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、ミクロモモスポラ（Micromomospora）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ロドコッカス（Rhodococcus）、またはシュードモナス（Pseudomonas）属のメンバーである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1029]
生産株が、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、エルウイニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）からなる群より選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、本発明1030の方法。
[本発明1032]
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、またはプラスミド選択マーカーを含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記本発明のいずれかによって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖。
[本発明1034]
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
[本発明1035]
宿主細菌生産株内での該酵素の産生のための、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、核酸コンストラクト。
[本発明1036]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1034または1035のコンストラクト。
[本発明1037]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、本発明1034〜1036のいずれかのコンストラクト。
[本発明1038]
前記核酸が、細菌内での前記酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されている、本発明1034〜1037のいずれかのコンストラクト。
[本発明1039]
異種制御配列が、細菌プロモーターおよびオペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーター、プラスミド選択マーカー、および／または複製起点を含む、本発明1038のコンストラクト。
[本発明1040]
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutC（SEQ ID NO:1）に対して少なくとも22％の同一性を有する、単離された細菌。
[本発明1041]
ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む単離された細菌であって、該核酸によってコードされる酵素のアミノ酸配列がFutN（SEQ ID NO:3）に対して少なくとも25％の同一性を有する、単離された細菌。
[本発明1042]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX、ラクノスピラセアエ種FutQ、プレボテラ・メラニノゲニカFutO、プレボテラ種FutW、バクテロイデス種FutZA、タネレラ種FutS、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP、バクテロイデス・カカエFutU、サルモネラ菌FutZ、メタノスファエルラ・パルストリスFutR、ブチリビブリオFutV、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY、クロストリジウム・ボルテアエFutP、またはそれらの機能的変種もしくはフラグメントから選択されるいずれか一つを含む、本発明1040または1041の単離された細菌。
[本発明1043]
α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素が、アミノ酸配列SEQ ID NO:10〜21および292のいずれか一つまたはそれらの機能的変種もしくはフラグメントを含む、本発明1040〜1042のいずれかの単離された細菌。
[本発明1044]
α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはα(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、本発明1040〜1043のいずれかの単離された細菌。
[本発明1045]
大腸菌である、本発明1040〜1044のいずれかの単離された細菌。
[本発明1046]
減少したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、不活性化されたアデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼ、不活性化された内因性lacA遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに伴う、本発明1040〜1045のいずれかの単離された細菌。
[本発明1047]
遺伝子型ΔampC::PtrpBcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, PlacIqlacY+, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ+)を含む、本発明1046の単離された細菌。
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと類似または等価な方法および材料が使用され得るが、以下では適当な方法および材料が説明されている。本明細書で言及されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。齟齬が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１】図1は、ヒト乳に見られる主要中性フコシルオリゴ糖合成経路を示す概略図である。
【図２】図2は、代謝経路および大腸菌において2'-フコシルラクトース（2'-FL）合成を行うためにそれらに導入された変更点を示す概略図である。詳細には、ラクトース合成経路およびGDP-フコース合成経路が示されている。GDP-フコース合成経路において：manA = ホスホマンノースイソメラーゼ（PMI）、manB = ホスホマンノムターゼ（PMM）、manC = マンノース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（GMP）、gmd = GDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼ、fcl = GDP-フコースシンターゼ（GFS）およびΔwcaJ = 変異UDP-グルコース脂質キャリアトランスフェラーゼである。
【図３Ａ】図3は、4つの以前から公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列の配列同一性および多配列アラインメントを示す。図3Aは、4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼ：H.ピロリfutC（SEQ ID NO:1）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:4）の間の配列同一性を示す表である。
【図３Ｂ】図3は、4つの以前から公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列の配列同一性および多配列アラインメントを示す。図3Bは、4つの公知のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの多配列アラインメントを示す。楕円は、アラインメントにおける4つの酵素間の特に高い配列保存の領域を強調表示している。
【図４Ａ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｂ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｃ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｄ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｅ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図４Ｆ】図4は、4つの以前から公知のラクトース利用性α（1,2）-フコシルトランスフェラーゼタンパク質配列に沿う、12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンの配列アラインメントを示している。4つの公知のラクトース利用性α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼがボックスで囲まれており、H.ピロリfutC（SEQ ID NO:293）、H.ムステラエFutL（SEQ ID NO:2）、バクテロイデス・ブルガタスfutN（SEQ ID NO:3）および大腸菌O126 wbgL（SEQ ID NO:294）を含む。12個の同定されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼは以下の通りである：プレボテラ・メラニノゲニカFutO（SEQ ID NO:10）、クロストリジウム・ボルテアエ+13 FutP（SEQ ID NO:292）、ラクノスピラセアエ種FutQ（SEQ ID NO:12）、メタノスファエルラ・パルストリスFutR（SEQ ID NO:13）、タネレラ種FutS（SEQ ID NO:14）、バクテロイデス・カカエFutU（SEQ ID NO:15）、ブチリビブリオFutV（SEQ ID NO:16）、プレボテラ種FutW（SEQ ID NO:17）、パラバクテロイデス・ジョンソニイFutX（SEQ ID NO:18）、アケルマンシア・ムシニフィリアFutY（SEQ ID NO:19）、サルモネラ菌FutZ（SEQ ID NO:20）、バクテロイデス種FutZA（SEQ ID NO:21）。クロストリジウム・ボルテアエFutPの配列（N末端に13個の追加アミノ酸を有さない）（SEQ ID NO:11）も、このアラインメントに示されている。
【図５】図5Aおよび図5Bは、12個の新規のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの各々のシンジーンの構築を示す2つのゲルの写真である。図5Aは、ギブソンアッセンブリー後PCRを示している。図5Bは、ゲル精製されたRI/XhoIシンジーンフラグメントを示している。
【図６】図6Aおよび図6Bは、12個の新規のα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンを用いて大腸菌培養物中で生産されたフコシル化オリゴ糖産物の薄層クロマトグラムを示す2つの写真である。図6Aは、2μlの培養上清由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。図6Bは、総細胞熱抽出物の0.2 OD600細胞等価物由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図７】図7は、培養培地中ラクトース存在下でのトリプトファン誘導（すなわち、lac + trp）後のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子WbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを含むプラスミドを発現する宿主細菌の成長曲線を示すグラフである。
【図８】図8は、誘導後のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子WbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する宿主細菌から生産されたタンパク質を示すSDS-PAGEゲルの写真である。
【図９Ａ】図9は、誘導から7時間または24時間後の選択されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンWbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する大腸菌培養物由来のフコシル化オリゴ糖産物の生産を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。図9Aは、2μlの培養上清由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図９Ｂ】図9は、誘導から7時間または24時間後の選択されたα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼシンジーンWbgL、FutN、FutO、FutQおよびFutXを発現する大腸菌培養物由来のフコシル化オリゴ糖産物の生産を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。図9Bは、総細胞熱抽出物の0.2 OD600細胞等価物由来のフコシル化オリゴ糖産物を示している。
【図１０】図10Aおよび図10Bは、FutNを発現する大腸菌からの2つの異なる1.5L発酵実施:図10A）36Bおよび図10B）37A後のフコシル化オリゴ糖産物を示す薄層クロマトグラムの2つの写真である。実施36Bの培養収量は33g/Lであり、実施37Aの収量は36.3g/Lであった。
【図１１】図11は、B.ブルガタスFutN遺伝子を有するpG217のプラスミドマップである。
【図１２】図12は、LacIqプロモーター、機能的lacY遺伝子の挿入およびlacAの欠失を示す概要図である。
【図１３】図13は、FRT組み換えを用いた内因性wcaJ遺伝子の欠失を示す概要図である。
【図１４】図14は、カナマイシン耐性遺伝子（トランスポゾンTn5由来）および野生型lacZを有するDNAフラグメントのlon遺伝子への挿入を示す、大腸菌W3110染色体の概要図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
（表１）新規α(1,2)-フコシルトランスフェラーゼについてのPSI-BLAST多配列アラインメントクエリーからのヒット
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｃ】
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【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｄ】
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【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｅ】
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【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｆ】
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