【手続補正書】
【提出日】平成29年3月14日(2017.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性を増大させる方法であって、前記細胞と、選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡとを接触させることを含む、方法。
【請求項２】
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域に切断を誘発する方法であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼと、
二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項３】
細胞内の二本鎖ＤＮＡ分子の標的領域を修飾する方法であって、
ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）と、
選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むガイドＲＮＡと
を前記細胞内で発現させるか、前記細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡが、
（ｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含む単一ガイドＲＮＡまたは
（ｉｉ）選択される標的ゲノム配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な１７〜１８ヌクレオチドからなる相補性領域を含むｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡが、
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなる群より選択されるリボ核酸であるか、これを含み、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な相補性領域であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性領域を有する、ガイドＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドからなる、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項８】
前記標的相補性領域が１７〜１８ヌクレオチドの標的相補性からなる、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項９】
以下の配列
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）；
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）；または
（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜１８）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）
からなり、
Ｘ１７〜１８が、選択される標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する標的配列の相補鎖の連続する１７〜１８ヌクレオチドに相補的な配列であり、ＸＮが、前記リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり、Ｎが０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る、
請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１０】
前記リボ核酸が、前記分子の３’末端に１つまたは複数のＵを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
【請求項１１】
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
【請求項１２】
前記リボ核酸が、前記ＲＮＡ分子の５’末端に前記標的配列に相補的ではない１つ、２つまたは３つの追加のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法または請求項６に記載のリボ核酸。
【請求項１３】
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１７ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１４】
前記相補性領域が、選択される標的配列の相補鎖の連続する１８ヌクレオチドに相補的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸をコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
【請求項１８】
前記標的領域が標的ゲノム配列内にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１９】
前記標的ゲノム配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または請求項６〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項２０】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、以下の配列
ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）もしくはその活性部分；
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０７）もしくはその活性部分；
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０９）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ（配列番号２４１０）もしくはその活性部分；
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ（配列番号２４１１）もしくはその活性部分；または
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号２４１２）もしくはその活性部分
からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２４０７）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）であるか；前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２４０４）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０５）であるか；または前記ｃＲＮＡが（Ｘ１７〜１８またはＸ１７〜１９）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２４０８）であり、前記ｔｒａｃｒＲＮＡがＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２４０６）である、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｄＣａｓ９−異種機能ドメイン融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）が、遺伝子発現、ヒストンまたはＤＮＡを修飾するＨＦＤを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種機能ドメインが、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化を触媒する酵素、ヒストン修飾を触媒する酵素、または転写サイレンシングドメインである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５由来のものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒストン修飾を触媒する酵素が、ＬＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＮＭＴ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写サイレンシングドメインが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ１αまたはＨＰ１β由来のものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記選択される標的ゲノム配列に挿入欠失変異または配列変化を生じさせる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が真核細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法。