(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
0003602848.tif 000008
［式中、R1、R2、R5およびR6は、独立に、H;カルボキシル;C1〜C3アルキル；およびヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシルおよびアミノカルボニルから選ばれる基で置換されたC1〜C3アルキル；並びに場合により標的分子を結合した複合体形成基からなる群から選ばれ；
R3およびR4は、独立に、Ｈおよび硫黄保護基からなる群から選ばれ；
Ｘは、Ｏ、CH2、NH2+または場合により標的分子を結合した複合体形成基から選ばれ；
ＹおよびＺは、それぞれNR7であり、但し、ＹおよびＺのうち少なくとも一方についてNR7はNHであり；そして
R7は、H;カルボキシル；ヒドロキシル、カルボキシルおよびハロゲンで置換されたC1〜C3アルキルからなる群から選ばれる］で示される化合物。
【請求項２】
R1、R2、R5、R6またはＸの少なくとも一つが標的分子を結合した複合体形成基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1、R2、R5およびR6が、水素である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
R1、R2、R5、R6およびR7が、水素である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−カルボヒドラジド、及び
塩酸N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノグアニジンから選ばれる請求項４記載の化合物。
【請求項６】
金属放射性核種またはその酸化物もしくは窒化物と錯形成した形態の請求項１記載の化合物。
【請求項７】
99mTcまたはその酸化物と錯形成した形態の請求項１記載の化合物。
【請求項８】
複合体形成基が、カルボキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびプロパン酸メチルからなる群から選ばれる請求項１記載の化合物。
【請求項９】
R1、R2、R5およびR6が水素であり、かつＸが標的分子を結合した複合体形成基である請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
標的分子が蛋白質またはペプチドである請求項２記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
［発明の分野］
本発明は、診断用造影法の分野のものであり、診断の対象となる組織を標的とする薬剤の放射能標識に役立つ化学的キレート化剤に関する。
［発明の背景］
診断用造影法の技術は、体内のある部位に選択的に結合したりまたは局在して、診断上の対象となる画像を解像しやすくするコントラスト剤を利用する。例えばクエン酸ガリウム−67は、腫瘍や感染組織との親和性を有し、走査断層撮影法を用いて、罹患している身体領域を医師に示すことができる。その他のコントラスト剤は、テクネチウム−99mやレニウム−186/188のような金属の放射性核種を包含し、これらは、人体の所望の領域に局在する標的分子、例えば蛋白質、ペプチドおよび抗体を標識するのに用いられている。
標的剤として、蛋白質その他の巨大分子は、診断の精度に必要とされる組織特異性を与えることができるが、これらの物質を金属の放射性核種で標識することは、それらの物理的構造によって困難である。特に、蛋白質やペプチドのような標的剤は、放射性核種の結合が生じ得る多数の部位を提示し、不均一に標識された生成物を結果的に生じる。また、おそらくはそれらの大きさにもかかわらず、蛋白質は、放射性核種の高親和性結合に最も適した構造的立体配置、すなわち五員環を形成する４個またはそれ以上の供与体原子を取り込む領域を示すことがほとんどない。その結果、放射性核種は、一般的に、より豊富な低親和性部位で結合して、不安定な錯体を形成する。
このバックグラウンドの結合の問題を処理するために、Paikら［Nucl.Med.Biol.1985,12:3］は、抗体の標識化を過剰なDPTA（ジアミントリメチレン五酢酸）の存在下で実施して、低親和性結合部位を遮蔽する方法を提唱した。この方法によって、低親和性結合の問題は緩和されたが、放射性核種、この場合はテクネチウムの実際の結合も、結果的に非常に低率であった。高い比率のシステイン残基を有する蛋白質の直接標識化も発表されている［Dean et al.;WO 92/13,572］。このアプローチは、放射性核種の結合のための高親和性部位として、システイン残基のチオール基を利用し、必然的に、必要とされるチオール構造を有する標的剤への適用に限定されてしまう。
標的剤の直接標識化に代わる有望な代替策は、標的剤と放射性核種とをキレート化剤を用いて複合させる、間接的なアプローチである。キレート化剤として用いるための候補は、選ばれた金属放射性核種と強固に結合し、標的分子との複合に反応性である官能基をも有する化合物である。ペプチドおよび蛋白質に基づく標的剤を標識するのに用いるには、キレート化剤も理想的にはペプチドに基づくものであって、ペプチド合成の手法を用いて、キレート化剤／標的剤複合体を全体として合成できるものがよい。診断用造影に利用するには、キレート化剤は、その生体内での使用に適した特徴、例えば血液および腎クリアランスならびに血管外拡散性を有するのが望ましい。
［発明の概要］
本発明は、診断および治療に役立つ金属放射性核種と結合し、かつ診断および治療の対象となる身体の部位に局在することが可能な標的薬剤と複合できる、キレート化剤を提供する。本発明のキレート化剤は、テクネチウム−99mおよびレニウム−186/188のオキソ、ジオキソおよびニトリドイオンに結合することが可能なN2S2立体配置を提示するよう構造的に設計されたペプチド類似体である。
より詳しくは、そして本発明の一面によれば、式（Ｉ）：
0003602848.tif 000002
［式中、R1、R2、R5およびR6は、独立に、H;カルボキシル:C1〜C3アルキル；ならびにヒドロキシル、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシルおよびアミノカルボニルから選ばれる基で置換されたC1〜C3アルキル；から選ばれ、
R3およびR4は、独立に、Ｈおよび硫黄保護基から選ばれ、
Ｘは、Ｏ、基NH2+および基CH2から選ばれ、
ＹおよびＺは、独立に、基CR1R2およびNR7から選ばれ、そして
R7は、H;カルボキシル;C1〜C3アルキル；ならびにヒドロキシル、カルボキシルおよびハロゲンから選ばれる基で置換されたC1〜C3アルキル；から選ばれる］
で示される金属放射性核種キレート化剤が提供される。
本発明のもう一つの面によれば、上式のキレート化剤は、金属放射性核種と錯形成した形態で提供される。
本発明のもう一つの面では、該キレート化剤は、診断に役立つ標的分子と結合するための複合体形成基を結合させた形態で、かつ、場合により、造影に用いるために錯形成した金属放射性核種と組合せた形態で提供される。
［発明の詳細な説明］
本発明は、放射性核種と錯形成し、かつ標的分子と複合したときに、治療または診断の対象となる身体の部位に該放射性核種を送達するのに役立つ、金属放射性核種キレート化剤を提供する。上式に示したとおり、該キレート化剤は、該放射性核種が錯形成されるN2S2立体配置を有する。
ここで用いられる限りで、可変要素R1〜R7を定義する用語は、下記の意味を有する：
「アルキル」は、直鎖または分岐C1〜C8鎖を指し、直鎖または分岐C1〜C3鎖を指す用語「低級アルキル」を包含し；
「ハロゲン」は、Ｆ、Cl、BrおよびＩを指し；
「硫黄保護基」は、酸化を阻害する化学基、特に金属のキレート化の際に開裂されるものを指す。硫黄保護基は、公知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリーロイル、メルカプトアシルおよび有機チオ基を包含する。
本発明の好適実施態様では、キレート化剤は、
R1、R2、R5およびR6が、独立に、Ｈ、ならびにエチルおよびプロピルから選ばれる低級アルキル基から選ばれ；最も好ましくは、すべてＨであり；
R3およびR4が、水素原子であるか、またはベンゾイル、アセトアミドメチルおよび置換もしくは非置換テトラヒドロピラニル基から選ばれる硫黄保護基であり；
Ｘが、Ｏ、基CH2、および最も好ましくは基NH2+から選ばれ；
ＹおよびＺが、独立に、基CR1R2およびNR7から選ばれるが、ＹおよびＺのうち少なくとも一方は、そして最も好ましくは双方が、NR7であり；そして
R7が、カルボキシル、低級アルキル、および最も好ましくは水素から選ばれる上式のキレート化剤に一致する。
アキラルな炭素中心を有するキレート化剤は、様々な立体異性体の異なる生体内分布に付随する問題を、好都合に緩和すると思われる。アキラリティーを維持するには、複合体形成基を、Ｘの部位で本発明のキレート化剤に結合していなければならない。Ｘ部位での複合体形成基の結合は、Ｘが基NH2+であるときに最も安定である。したがって、アキラルな炭素中心を有するキレート化剤を提供し、複合体形成基をＸ部位のNH2+基に結合させることが本発明の好適実施態様である。
本発明の特定の実施態様では、キレート化剤は、R3およびR4がＨまたは硫黄保護基であり;R1、R2、R5およびR6が、それぞれＨであり;XがＯ、CH2またはNH2+であり；そしてＹおよびＺがCH2またはNHである上記一般式に一致する。特定の例は、
N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）カルボヒドラジド；
塩酸N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノグアニジン；および
N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノアセトンを包含する。
標的分子と結合させるには、Ｘか、またはR1、R2、R5およびR6のうち１個に、キレート化剤と標的分子との結合を可能にする、化学的に反応性である基を指す以下で用いる用語「複合体形成基」を組み込むのが望ましい。標的分子がペプチドまたは蛋白質である好適な例では、複合体形成基は、該ペプチドまたは蛋白質を変性させないか、そうでなくともそれらに不都合には作用しない条件のもとで反応性である。本発明の一実施態様では、複合体形成基は、アミノ末端基またはリシン残基のε−アミノ基のようなペプチド／蛋白質の官能基と反応性であるため、反応が実質的に水溶液中で実施できる。有用な複合体形成基は、カルボキシル基、活性エステル、カルボキシメチルチオ基、チオシアネート、アミン、ヒドラジン、マレイミド、チオールおよび活性ハロゲン化物を包含するが、それらに限定されない。本発明の好適実施態様では、複合体形成基は、プロパン酸メチル、カルボキシル基およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから選ばれる。カルボキシルである複合体形成基は、カルボジイミドおよびアルコールで活性化して、ペプチドやアミノ糖のような標的分子上の利用できるアミノ基と反応性である活性エステルを形成して、これが標的分子とキレート化剤の複合体形成基との間にアミド結合を形成してよい。
ある一定の実施態様では、本発明のキレート化剤は、ＸがCH2またはオキソ基である形で提供される。好適実施態様では、ＸはNH2+基を形成し、複合体形成基をそれに結合させて、基NH2+−複合体を形成してよい。複合体形成基は、ジアミノグアニジンである中間体の標準的な合成の際に、この形式のキレート化剤に導入してよい。略述すると、ヨウ化メチルによる置換によって、チオカルボヒドラジンをメチルチオカルボヒドラジンへと転換する。選ばれたアミノ置換複合体形成基をメチルチオカルボヒドラジンへ付加して中間体が形成され、次いで、Ｘが複合体形成基を結合した形のNH2+であるキレート化剤の製造に、この中間体を用いる。複合体形成基が結合した中間の製造法を、下記に示す。
0003602848.tif 000003
対称的である、すなわちR1とR2とがそれぞれR5とR6とに対応する、本発明のキレート化剤は、下記の一般的手順によって製造できる。商業的に入手できるヨード酢酸、または所望のように置換されたその変種を、チオ安息香酸カリウムと反応させて、ベンゾイルメルカプト酢酸を得る。次いで、この中間体を、ジオキサン中でジシクロカルボジイミドを用いて、対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへと変換する。この活性エステルを、選ばれたカルボヒドラジドまたはジアミノグアニジンもしくはジアミノアセトンと反応させて、対称なキレート化剤を得る。対称キレート化剤のこの製造法を下記に示す：
0003602848.tif 000004
対称的でない、すなわちR1とR2とがR5T6とに対応しない、本発明のキレート化剤の製造は、上のスキームに提示されたものに追加される段階を必要とする。ある特定の方法では、上記のとおりにして製造したベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを、一般式：
0003602848.tif 000005
で示される選ばれたカルボヒドラジド、ジアミノグアニジンまたはジアミノアセトンと反応させる。
得られるベンゾイルメルカプトアセチル−カルボヒドラジドまたは−ジアミノグアニジンまたは−ジアミノアセトンを脱保護し、次いで、選ばれたR5およびR6を有するベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、非対称N2S2キレート化剤を得る。
本発明のある特定の実施態様では、Ｎ保護したジアミノグアニジンは、ヒドラジンエステルのOR基をＮ保護したヒドラジンで置換したものから製造して、モノＮ保護ジアミノグアニジンを得る。当技術に一般的であるＮ保護基、例えばtert−ブチルオキシカルボニル（ｔ−BOC）または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）を用いてよい。ｔ−BOC保護基の除去は、酢酸中でHClのような酸の無水物の付加によって達成できるが、FMOCは、ピペリジンおよびジヨードメタン、またはピペリジンジメチルホルムアミドで開裂してよい。
本発明のキレート化剤は、ＹとＺとに関して非対称であってもよい。すなわち、ＹまたはＺは、一方が基CR1R2であり、他方がNR7であってよい。この形式の非対称性は、中間体1,3−ジアミノアミジンまたはその誘導体を、中間体1,3−ジアミノグアニジンに代えて前述の合成工程で用いることによって、導入される。
R1、R2、R5およびR6での変化は、ヨード酢酸の変種を用いることによって導入できることを理解すべきである。例えば、α炭素は、ヨウ素はもとより、低級アルキル、置換低級アルキルまたは複合体形成基のような、１個または２個の置換基を有してよい。ＹおよびＺでの変化は、カルボヒドラジド、ジアミノグアニジンおよびジアミノアセトンの誘導体を用いることによって導入してよい。例えば、カルボヒドラジドおよびジアミノグアニジン中間体は、α窒素の一方または双方にカルボキシル、低級アルキル、置換低級アルキルまたは複合体形成基を有してよいが、ジアミノアセトンも、α炭素の一方または双方にカルボキシル；低級アルキル；置換低級アルキルまたは複合体形成基を有してよい。
本発明の非対称キレート化剤の製造法を下記に示す：
0003602848.tif 000006
診断用造影の目的のためには、キレート化剤それ自体を金属放射性核種と一緒にして用いてよい。適切な放射性核種は、99mTcO3+、99mTcO2+、ReO3+およびReO2+のような、様々な形態でのテクネチウムおよびレニウムを包含する。最も望ましくは、そして本発明のもう一面によれば、キレート化剤は、その複合体形成基を介して標的分子に結合し、哺乳類の所望の部位にキレート化した放射性核種を局在させるのに役立つ。標的分子の例は、ステロイド、蛋白質、ペプチド、抗体、ヌクレオチドおよび糖類を包含するが、それらに限定されない。好適な標的分子は、蛋白質およびペプチド、特に、特定の病理学に特徴的な細胞表面受容体に特異的に結合することが可能なものを包含する。例えば、特定の蛋白質受容体の過剰発現に付随する病態は、本発明に従って、その蛋白質、または受容体に結合するその断片を標識することによって造影できる。ある一定の医学的状態や組織を造影するのに役立つ標的ペプチドを下記に示す：
アテローム性動脈硬化斑に対して：
YRALVDTLK
RALVDTLK
RALVDTLKFVTQAEGAK
YAKFRETLEDTRDRMY
AKFRETLEDTRDRMY
AALDLNAVANKIADFEL
YAALDLNAVANKIADFEL
YRALVDTLKFVTEQAKGA
RALVDTLKFVTEQAKGA
YRALVDTEFKVKQEAGAK
RALVDTEFKVKQEAGAK
YRALVDTLKFVTQAEGAK
感染およびアテローム性動脈硬化斑に対して：
VGVAPGVGVAPGVGVAPG
ホルミル.Nleu.LF.Nleu.YK
VPGVGVPGVGVPGVGVPGVG
ホルミルMIFL
ホルミルMLFK
ホルミルMLFI
ホルミルMFIL
ホルミルMFLI
ホルミルMLIF
ホルミルMILF
ホルミルTKPR
VGVAPG
ホルミルMLF
YIGSR
CH2CO.YIGSRC
血栓症に対して：
NDGDFEEIPEEYLQ
NDGDFEEIPEEY（SO3Na）LQ
GPRG
血小板に対して：
Ｄ−Phe.PRPGGGGNGDFEEIPEEYL
RRRRRRRRRGDV
PLYKKIIKKLLES
RGD
RGDS
アミロイド斑（アルツハイマー病）に対して：
EKPLQNFTLSFR。
キレート化剤への結合のためには、標的分子は、キレート化剤と標的分子との間に物理的な分離を作り出す「スペーサー」を含んでよい。適切なスペーサーは、標的分子が生体内でのその局在特性を保持するのを許し、一般的には、キレート化剤と結合するよう誘導化したアルキル鎖のような、化学的に不活性な基であるものである。標的分子がペプチドである場合は、スペーサーは、適切には、１個またはそれ以上のアミノ酸残基であってよい。好ましくは、ペプチドである標的分子は、化学的に不活性なα炭素側鎖を有するような１〜５個のアミノ酸、例えばグリシンまたはβアラニン残基のスペーサーを組み込んでいる。
ペプチドをベースとする標的分子は、確立された様々な手法を用いて作製することができる。それらは固相合成法に従うことから、FMOCによる保護と脱保護とを交互に行うことが、短いペプチドを作製する好適な方法である。組換えDNAの技術は、蛋白質およびその長い断片を生成するのに好適である。本発明のキレート化剤は、放射性核種による標識化の前に標的分子と結合させることができ、これが「二官能性キレート（bifunctional chelate）」法と呼ばれる方法である。これに代わるアプローチとしては、キレート化剤を最初に放射性核種で標識し、次いで標的分子と結合させる「前標識リガンド（prelabelled ligand）」法である。
選ばれた放射性核種のキレート化は、様々な方法によって達成できる。ある特定の方法では、場合により標的分子を結合させたキレート化剤を、アルコール水溶液、例えばエタノール−水1:1溶液に溶解することによって、まずキレート化剤の溶液を形成する。この溶液を、ガス抜きして酸素を除去し、次いで、水酸化ナトリウムのような適切な試薬を用いるか、または加熱によってチオール保護基を除去し、次いで、得られた混合物を酢酸（pH6.0〜6.5）のような有機酸を用いて中和する。キレート化段階では、過テクネチウム酸ナトリウムを、テクネチウムを還元するのに充分な量の塩化第一スズのような還元剤とともにキレート化剤溶液に加える。溶液を混合し、室温で放置して反応させ、次いで、水浴で加熱する。代替法では、pH8に調整したキレート化剤溶液を用いて、標識化を達成できる。この場合、過テクネチウム酸塩を、化学的に不安定で、所望のキレート化剤と交換できるリガンドで錯形成したテクネチウムの溶液で置き換えてよい。適切なリガンドは、酒石酸塩、クエン酸塩またはヘプタグルコン酸塩を包含する。もう一つの代替法としては、亜ジチオン酸ナトリウムを還元剤として用いてよく、この場合、キレート化剤溶液は、標識化段階に向けて、pH12〜13に調整するのが好ましい。すべての場合に、標識されたキレート化剤は、クロマトグラフィーによって、例えば、エタノール、次いで希HClで活性化したＣ−18 SepPakカラムを用いて、混在物質である99mTcO4やコロイド状99mTcO2から分離してよい。希HClによる溶離で99mTcO4を分離し、1:1のEtOH−食塩水による溶離でキレート化剤を取り出し、コロイド状99mTcO2はカラムに残留させる。
製造し終わったならば、標識されたキレート化剤またはキレート化剤−標的剤複合体を、放射線診断用造影法や放射線療法の技術において充分確立された手法によって、患者に投与する。代表的には、標識されたキレート化剤溶液を食塩水または血漿の媒体のような薬学上許容し得る溶液として、静脈内、動脈内、腹腔内または腫瘍内への注射によって投与する。投与される標識された複合体の量は、金属の特性および、選ばれた標的分子の毒性特性像に依存し、一般的には、約５〜50mCi/70kgの範囲内、より代表的には25〜35mCi/70kgの範囲内である。生体内での金属の局在は、標準的なシンチグラフィーの手法によって、その投与後の適切な時間に追跡する。影像を得てよい時間は、大部分は、標的分子の組織分布およびクリアランス特性に依存すると思われ、例えば、ほとんどのペプチドは、急速に局在して、３時間以内、しばしば１時間以内に影像を得ることを可能にすると思われる。
本発明のある一定の実施態様を説明するために、下記の実施例を提示する。
実施例1:N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）カルボヒドラジド、RP−021の製造
エタノール（100ml）中のチオ安息香酸（5.74g、41.6ミリモル）を０℃でパージした攪拌溶液に、水酸化カリウム（27.8ml、３規定、83.2ミリモル）、次いで、エタノール（30ml）中のヨード酢酸（7.70g、41.6ミリモル）を加えた。アルゴン下で溶液を室温で10時間攪拌した。エタノールを回転蒸発させ、橙色の固体生成物を水（40ml）に溶解した。この溶液をpH2.0に酸性化したところ、橙色の沈澱が形成された。沈澱物を濾取し、水洗し、減圧下で乾燥して、ベンゾイルメルカプト酢酸を得た（7.98g、収率99％）。
ジオキサン（100ml）中のベンゾイルメルカプト酢酸（9.20g、46.9ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（5.41g、46.9ミリモル）の攪拌溶液に、ジオキサン（40ml）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（9.70g、47ミリモル）の溶液を加えた。反応を12時間攪拌し、次いで４℃に冷却し、濾過し、ジオキサンを回転留去して、白色固体を得た。この固体を冷イソプロパノールで摩砕し、濾過し、減圧下で乾燥して、10.8g、78％のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを得た。熱酢酸エチル中で500mgから200mgを再結晶させた。
ジオキサン（36ml）中のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（1.17g、4.0ミリモル）の攪拌溶液に、ジオキサン（10ml）中のカルボヒドラジド（180mg、2.0ミリモル）の溶液を加えた。１時間後、TLCは部分的反応を示し、トリエチルアミン（404mg、4.0ミリモル）を加えた。反応液を４時間攪拌した後、ジオキサンを回転留去し、水（5ml）を加えて、白色固体を得た。これを濾取し、水（5ml）で洗浄し、減圧下で乾燥して、772mg、86.5％のN,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）カルボヒドラジドを得た（融点:184〜190℃）。
実施例2:塩酸N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノグアニジン、RP−032の製造
エタノール（100ml）中のチオ安息香酸（5.74g、41.6ミリモル）の０℃のパージした攪拌溶液に、水酸化カリウム（27.8ml、３規定、83.2ミリモル）、次いで、エタノール（30ml）中のヨード酢酸（7.70g、41.6ミリモル）を加えた。アルゴン下で溶液を室温で10時間攪拌した。エタノールを回転蒸発させ、橙色の固体生成物を水（40ml）に溶解した。この溶液をpH2.0に酸性化したところ、橙色の沈澱が形成された。沈澱を濾取し、水洗し、減圧下で乾燥して、ベンゾイルメルカプト酢酸を得た（7.98g、収率99％）。
ジオキサン（100ml）中のベンゾイルメルカプト酢酸（9.20g、46.9ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（5.41g、46.9ミリモル）の攪拌溶液に、ジオキサン（40ml）中のジシクロロヘキシルカルボジイミド（9.70g、47ミリモル）の溶液を加えた。反応液を12時間攪拌し、次いで４℃に冷却し、濾過し、ジオキサンを回転留去して、白色固体を得た。この固体を冷イソプロパノールで摩砕し、濾過し、減圧下で乾燥して、10.8g、78％のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを得た。熱酢酸エチル中で500mgから200mgを再結晶させた。
メタノール（3ml）中の1,3−ジアミノグアニジン・HCl（200mg、1.59ミリモル）の攪拌溶液に、ジオキサン（30ml）中のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（936mg、3.19ミリモル）およびトリエチルアミン（322mg、3.19ミリモル）の溶液を加えた。反応液を一晩14時間攪拌して、微細な白色沈澱を形成した。溶媒を回転留去して、粘着性の白色固体を得た。この固体を冷イソプロパノールで摩砕し、濾過し、イソプロパノールで洗浄し、減圧下で乾燥して、155mg、32％の塩酸N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノグアニジンを得た（融点:126〜128℃）。
実施例3:N,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノアセトン、RP−042の製造
エタノール（100ml）中のチオ安息香酸（5.74g、41.6ミリモル）の０℃のパージした攪拌溶液に、水酸化カリウム（27.8ml、３規定、83.2ミリモル）、次いで、エタノール（30ml）へのヨード酢酸（7.70g、41.6ミリモル）を加えた。アルゴン下で溶液を室温で10時間攪拌した。エタノールを回転蒸発させ、橙色の固体生成物を水（40ml）に溶解した。この溶液をpH2.0に酸性化したところ、橙色の沈澱が形成された。沈澱を濾取し、水洗し、減圧下で乾燥して、ベンゾイルメルカプト酢酸を得た（7.98g、収率99％）。
ジオキサン（100ml）中のベンゾイルメルカプト酢酸（9.20g、46.9ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（5.41g、46.9ミリモル）の攪拌溶液に、ジオキサン（40ml）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（9.70g、47ミリモル）の溶液を加えた。反応液を12時間攪拌し、次いで４℃に冷却し、濾過し、ジオキサンを回転留去して、白色固体を得た。固体を冷イソプロパノールで摩砕し、濾過し、減圧下で乾燥して、10.8g、78％のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを得た。熱酢酸エチル中で500mgから200mgを再結晶させた。
ジオキサン（15ml）中のベンゾイルメルカプトアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（492g、1.68ミリモル）および塩酸1,3−ジアミノアセトン一水和物（150mg、0.84ミリモル）の攪拌溶液に、トリエチルアミン（850mg、8.40ミリモル）を加えた。反応液を3.5日間攪拌した後、ジオキサンを回転留去して、黄色の油を得、水（3ml）を加えて、黄色の固体を得た。固体を粉砕し、濾過し、水洗し、減圧下で乾燥して、242mg、65％のN,N'−ビス（Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチル）−1,3−ジアミノアセトンを得た（融点:134〜140℃）。
実施例4:99mTc標識化キレート化剤の製造
各キレート化剤約1mgを管内で食塩水200μｌまたはエタノール：水（1:1）200μｌに溶解した。この管に99mTc−過テクネチウム酸ナトリウム100〜300μｌ（５〜15mCi）、リン酸緩衝液100μｌ（0.25モル、pH7.4）、および塩化第一スズ二水和物50μｇおよび酒石酸ナトリウム二水和物40mgを含有する溶液200μｌを加えた。管を密封し、沸騰水浴中に10分間入れた。
冷却後、反応混合物を、メタノール5mlおよび１ミリモルHCl5mlで活性化しておいたＣ−18固相抽出カートリッジ（Sep−Pak）に装荷した。カートリッジを５ミリモルHClで洗浄し、溶出液を試験管内に捕集した。次いで、カートリッジを、空気を強制通気することによって乾燥した。生成物をエタノール：水（1:1）2mlで溶出させ、別の管内に捕集した。カートリッジをもう一つの管に入れ、３管を放射性核種線量測定装置（電離箱）で検定した。収率は、望みの生成物は相対的に親油性であるとの仮定のもとに、３管内の全活性で除したエタノール：水溶出液の活性として算出した。より親油性でないキレート化剤は、酸の洗液に部分的に溶出し、見かけの収率は低いものと思われた。
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実施例5:生体内分布
確立された実験手順を用いて、例示したキレート化剤および参照キレート化剤のラット体内での分布を決定した。略述すると、雄のウィスター系ラット（Charles River、200g）をソムニトール（40〜50mg/kg）で麻酔し、標識化キレート化剤200μｌ（すなわち200μCi）を尾静脈を介して静脈内に注射した。最初の10分後に逐次全身シンチグラフィー図を得た。60および120分目に更に影像を得、次いで、ラットを麻酔下で屠殺し、器官（血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、筋、消化管）の試料を秤量し、器官に応じてウエル型γ線計数装置またはγ線量測定装置のいずれかで計数した。投与量の算出は、ラットの体重を200g、血液量は体重の８％を占めるとの仮定に基づいて実施した。すべての結果は、尾における残留投与量について補正した。
調べた本キレート化剤はそれぞれ、望みどおり、比較的急速に血液から消失した。実施例１のキレート化剤については、消化管からの排出は、N2S2の参照キレート化剤と比較して著しく少ないことが見出された。消化管は、投与量の約９％を示し、約14％のみが血中に残留した。実施例２のキレート化剤は、主として消化管（30％）および尿（20％）に局在し、投与量の約10％のみが血中に残留した。実施例３のキレート化剤も、主として消化管（50％）および尿（25％）に局在し、血中は約３％のみにすぎなかった。
これらのキレート化剤のうち、実施例３のキレート化剤は、血液その他の組織からの最も速いクリアランスを示し、主として肝臓および消化管から除去された。実施例１および２のキレート化剤は、腎臓での蓄積がほぼ等しかった（７〜14％）。