(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器特異的物質が過テクネチウム−９９ｍ酸塩および錯体安定化還元剤と混合される、テクネチウム−９９ｍで標識され、予めテクネチウム−９９ｍに対する錯化剤により前処置または結合された臓器特異的物質を製造する方法において、還元剤に必要な錯化剤を還元剤に対して化学量論量で使用することからなる上記の方法。
【請求項２】
化学量論量の使用により特定の組成の錯体が導かれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
還元剤の錯体はpＨ３〜１１の範囲で安定である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
錯体は陰イオン錯体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
還元剤として錫（II）イオンが用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
錯化剤としてクエン酸および／または１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸が用いられる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
臓器特異的物質として蛋白質、酵素、糖またはポリマーが用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体またはそのＦ(ａｂ′)2フラグメントを使用する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
腫瘍関連抗原に対する抗体またはそのＦ(ａｂ′)2フラグメントを使用する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
臓器特異的物質を含有する成分を最初に錯体安定化還元剤の溶液中に溶解し、ついでテクネチウム−９９ｍ−過テクネチウム酸塩溶液を添加することにより臓器特異的物質をテクネチウムで標識することによって製造された診断補助剤。
【請求項１１】
錯体安定化還元剤は錫（II）とクエン酸または１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸の化学量論的錯体であり、この還元剤をいずれの場合も、臓器特異的物質のテクネチウム−９９ｍによる安定な標識のために、臓器特異的物質１mgあたり錫（II）に基づいて１〜１００μg添加する請求項１０に記載の診断補助剤。
【請求項１２】
錯体安定化還元剤は錫（II）とクエン酸または１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸の化学量論的錯体であり、この還元剤をいずれの場合も、臓器特異的物質のテクネチウム−９９ｍによる安定な標識のために、臓器特異的物質１mgあたり錫（II）に基づいて５〜１０μg添加する請求項１０に記載の診断補助剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、テクネチウム−９９ｍで標識され、予めテクネチウム−９９ｍに対する錯化剤により前処置または結合された臓器特異的物質を製造するにあたり、臓器特異的物質を過テクネチウム酸塩および錯体安定化還元剤と混合する製造方法に関する。
【０００２】
放射性核種による医学診断には、何年も前から、蛋白質が使用され、成功している。たとえば、心臓の検査はテクネチウム−９９ｍまたは他の適当な核種で標識されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）によって実施することができる。
【０００３】
最近、免疫グロブリンが最も重要になってきて、とくにモノクローナル抗体が悪性病変の診断に使用されている。モノクローナル抗体はまた、他の核医学診断の領域、たとえば炎症フォーカスの部位決定に有用なことが証明されている。
【０００４】
初期には、抗体が様々なヨウ素同位元素（ヨウ素−１２３またはヨウ素−１３１）またはインジウム−１１１で標識された。しかしながら、臨床試験により、寿命の極めて短い核種、テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）も同様に使用できることが明らかにされた。この核種は、極めて好ましい核物理学的性質を有することから、核医学において傑出した地位を占めている。さらに、Ｍｏ−９９／Ｔｃ−９９ｍ発生装置は、実際に、いつでもどこでも使用できる。
【０００５】
これが、蛋白質のテクネチウム−９９ｍによる標識方法が数多く報告されてきた理由である。これらの方法は、大きく２群に分けることができる。
【０００６】
一群に分類される方法はすべて、広範囲の種類の錯化剤をまず抗体にカップリングさせ、これらを介して、テクネチウム−９９ｍを安定に結合させるものである。しかしながら、この方法は、標識収率が不適当に高く、したがってそのまま投与できる製品を製造するためには精製工程が必要になる。
【０００７】
テクネチウム−９９ｍを直接抗体に結合させる方法は、第二群に属する。この目的では、抗体に反応性の基を生成させる。これらは一般に、ジスルフィド橋の適当な還元剤（たとえば、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１,２−プロパンジオール、システイン等）による還元で生成されるＳＨ基である。この方法で標識された蛋白質は特殊な精製工程を必要とせず、直接注射することができる。この群からは、とくに、以下の方法を挙げることができる。
【０００８】
B.A. Rhodesは抗−ｈＣＧ抗体のＴｃ−９９ｍによる標識を記載している（ＵＳＡ−４,４７２,３７１）。この場合は、抗体は過剰の錫（II）で処理されこれが生成物中に残る。錫（II）イオンは、抗体中のジスルフィド橋のＳＨ基への還元をもたらすと同時に、他方では、過テクネチウム酸塩をＴｃ(IV)−９９ｍに還元する。この型のＴｃ−９９ｍは抗体に結合できる。大過剰の錫（II）イオンはＴｃ−９９ｍを抗体に結合させるのみでなく、除去しなければならないＴｃ化合物も生成させる（ＵＳ−Ａ−４,４７２,３７１：実施例II参照）。しかしながら、これは、検査室に維持しなければならない条件という点で、重大な欠点である。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０,２７１,８０６には、錫（II）イオンが抗体とは別個に錯体化された型で保存される標識方法が記載されている。標識の直前に２つの成分を混合する。したがって、標識ユニットは２つの瓶からなる。混合してはならない２つの瓶を操作しなければならないことは、使用者にとって不便である。
【００１０】
この場合には、錯体安定化錫（II）イオンが還元剤としても用いられる。錯化剤は錫（II）イオンに対して過剰に用いられ、すなわち、錯体の形成は錫（II）イオンとに止まらず、Ｔｃ−９９ｍとも起こる。
【００１１】
他の先行技術刊行物では、生成されたＴｃ−９９ｍ錯体〔錫（II）の錯化剤との〕を予め発生させ、この生成された錯体によりＴｃ−９９ｍが抗体に移送されている。この方法は錯体交換（transcomplexation）と呼ばれる。
【００１２】
ＥＰ−Ａ−０,２３７,１５０によれば、Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩またはグルコヘプトン酸塩が抗体のＴｃ−９９ｍによる標識に使用されている。
【００１３】
ＷＯ８８／０７３８２では、同じ目的に、スクロース、グルコヘプトン酸塩、酒石酸塩およびアラボン酸塩とのＴｃ−９９ｍ錯体が用いられている。実際には、これらの錯体の安定性がとくに重視される。
【００１４】
ＷＯ８９／０７３８２では、Ｔｃ−９９ｍ酒石酸塩が同じく錯体交換に使用されている。ここには、抗体を最初に錯化剤に結合させる方法が記載されている。
【００１５】
Ｔｃ−９９ｍを錯体交換により抗体に移送する上述の方法は、最終生成物が、制御不能の反応の結果として、望ましくないＴｃ−９９ｍ化合物を含有するという、そのシステムに基づく欠点を有する。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、望ましくないＴｃ−９９ｍ化合物が抗体に結合していない、Ｔｃ−９９ｍで標識された臓器特異的物質の製造方法を提供することにある。
【００１７】
この目的は、本明細書の導入部に記載した種類の方法において、還元剤に必要な錯化剤を還元剤に対して化学量論量で使用することからなる方法を提供することによって達成された。
【００１８】
従来の概念に反して、驚くべきことに、Ｔｃ−９９ｍを抗体に移送するのに錯体交換は必要ではないことが見出されたのである。
【００１９】
錯化剤は、溶液中の錫（II）イオンの錯体中への保持、すなわち、その水酸化錫（II）としての沈殿を防止する役目しか果たしていないという事実が明らかになったことは全く驚くべきことであった。これまで用いられてきた、錯体交換を開始させる錯化剤は必要ではなく、それが最終分析においてかなりの欠点ともなり、とくに錫(II)イオンと抗体とを２つの別の容器に保存する必要があった。
【００２０】
これに対して、本発明によれば、錫（II）錯体と抗体を１つの容器に保存することが可能になる。
【００２１】
還元剤としては亜ジチオン酸塩（dithionite）または錫（II）イオンの使用が好ましい。
【００２２】
錯化剤の「化学量論」量とは、錫（II）イオンの原子価を完全に飽和し、しかしながら同時に特定の組成の錯体を達成するのに必要な量を意味する。
【００２３】
化学量論的錫（II）錯体は３〜１１、好ましくは４〜７のpH範囲において安定でなければならない。
【００２４】
錫（II）イオンと錯化剤の特定の化学量論比は、各場合に選択された錯化剤に依存するので、それについての一般的記述を与えることはできない。
【００２５】
陰イオン錯体がとくに好ましい。一方、これらの中でも４個〜８個の陰電荷をもつ錯体が好ましい。電荷の中和は、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムイオンによって行われる。
【００２６】
とくに、錫（II）イオンとクエン酸の錯体は極めて好ましい。生成する化学量論的陰イオン性錫（II）−クエン酸錯体、〔錫（クエン酸)2〕4-は公知である〔Gmelin, Handbuch der Anorganischen Chemie, Zinn（無機化学ハンドブック）Ｃ部、２１７〜２２９頁、Heidelberg, １８７５〕。
【００２７】
これに対して、同様にとくに好ましい、錫（II）イオンと１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸との錯体はこれまで記載されていない。しかしながら、本技術分野における熟練者には知られている方法により、１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸を錫（II）と互いに２：１のモル比で反応させることにより得られ、このモル比に相当する組成の錯体が生成する（下記参照）。一方、これより低いモル比では１分子のホスホン酸が４個の錫（II）イオンを結合した難溶性の化合物の生成を招く。
【００２８】
本発明の方法によって製造される本発明の臓器特異的物質は、一般的に、それらの分子内に錯体形成作用をもつ官能基少なくとも１個を有する担体物質である。これらの基は通常、電子対を与えるように働く原子またはイオン（ルイス酸）である。錯体形成作用をもつこのような官能基には、たとえば、−ＳＣＮ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＣＯＯ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、−ＮＯ基がある。
【００２９】
このような錯体形成作用を有する官能基をもつ物質の代表的な例としては、蛋白質（−ＮＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯ基）、酵素（−ＮＨ2、−ＯＨ、−Ｐ＝Ｏ基）、糖（−ＯＨ基）または側鎖に適当な官能基を有するポリマーを挙げることができる。
【００３０】
標識すべき化合物がこのような官能基をもたない場合は、その物質を、標識前に適当な錯化剤により前処置するかまたはそれにカップリングさせなければならない。
【００３１】
「前処置」の語は、本発明の範囲内においては、標識すべき分子中に錯体形成作用を有する官能基の生成を招く手段を行うことを意味する。たとえば抗体はジスルフィド橋を含有する。しかしながら、互いに共有結合した２個の硫黄原子はテクネチウム−９９ｍの錯体を形成させることはできない。しかし、ジスルフィド橋を還元して２個のＳＨ基を生成させれば、これらはそれ自体テクネチウム−９９ｍの優れた錯体形成リガンドであり、しかもテクネチウム−９９ｍを好収率で結合する。
【００３２】
テクネチウム−９９ｍを錯体形成作用を有する官能基をもたない臓器特異的物質に結合させる他の可能性としては、その分子へのこのような官能基の導入、またはその分子への錯化剤の化学的結合がある。
【００３３】
抗体のテクネチウム−９９ｍ体標識方法はとくに興味がある。抗体またはＦ(ａｂ′)2抗体フラグメントのＳ−Ｓ結合の部分還元は、室温における緩和な還元剤への暴露（臓器特異的物質の前処置）によって達成される。とくに適当な還元剤は、たとえば２−メルカプトエタノールまたは２−メルカプトエチルアミン（システアミン）のようなモノチオールである。この場合には、免疫学的反応性は失われず、小さなフラグメントに断片化されてもいない反応性抗体分子が得られる。抗体またはＦ(ａｂ′)2抗体フラグメントの部分還元には、長時間暴露しても一部のＳ−Ｓ結合しか切断せず、抗体成分の断片化を招かないすべての還元剤が、原理的に適当である。抗体成分がこの種類の還元剤に暴露される時間は、１時間を越す必要はない。一般的に、結合させる適当量のテクネチウム−９９ｍ陽イオンに十分なＳＨ基は、わずか１０〜３０分には生成する。過剰の還元剤をついで除去し、部分還元抗体を緩衝溶液（たとえば０.０２Ｍ リン酸塩溶液 pH７.２）中に単離し、直ちに凍結乾燥する。この間、抗体中の遊離チオール基の空気中酸素による再酸化を防止する必要がある。緩衝物質を除いて他の添加物を含まず、保護気体としての窒素気体で覆った凍結乾燥抗体は、変化することなく何週間も冷蔵温度（−５〜＋５℃）に保存することができる。すなわち、等張性食塩溶液を添加すると期待どおりに再溶解する。
【００３４】
この方法で製造した部分還元抗体成分（前処置された臓器特異的物質）はついで、本発明の方法により、それに過テクネチウム酸塩と化学量論量の錫（II）イオンの混合物を加えた場合、Ｔｃ−９９ｍによって円滑に標識される。
【００３５】
そのまま使用することができる診断補助剤は、最初に凍結乾燥抗体成分をテクネチウム−９９ｍ−過テクネチウム酸塩溶液中に溶解し、ついで錫（II）錯体の溶液を添加することにより還元および抗体へのテクネチウムの結合を達成させる操作によって製造できる。
【００３６】
しかしながら、診断補助剤はまた、抗体成分を錫（II）錯体含有溶液中に最初に溶解し、ついでテクネチウム−９９ｍ−過テクネチウム酸塩溶液を添加することにより凍結乾燥抗体成分を標識することによって製造できる。
【００３７】
テクネチウム−９９ｍ標識臓器特異的物質を含有する診断補助剤の製造には、臓器特異的物質または前処置された臓器特異的物質もしくはＴｃ−９９ｍのための錯化剤にカップリングした臓器特異的物質を含有し、適宜緩衝物質と混合したアッセイ、および臓器特異的物質上のテクネチウムを還元するのに必要な錯体安定化錫（II）塩とを組み合わせるのが便利である。凍結乾燥し、適宜前処置した臓器特異的物質を緩衝物質としてのリン酸水素二ナトリウム（pH７.２）と混合したアッセイはとくに有用なことが明らかにされている。この方法で、短時間たとえばわずか５分間反応させると、事実上定量的にテクネチウム−９９ｍで標識され、不純物としては１％未満の過テクネチウム酸塩と極めて少量のＴｃ−９９ｍで標識された錫（II）成分を含む物質が得られ、したがって以後の精製過程はもはや必要ではない。
【００３８】
本発明の方法によって製造される臓器特異的物質は、錫（II）錯体とともに１つの容器に保存されるにもかかわらず、凍結乾燥生成物の変わらぬ安定性が保証される。これは、臓器特異的物質の迅速な、簡単な、満足できる標識を保証する。
【００３９】
一部の標識キット中に存在する安定化剤は、注射溶液のさらに長期の安定性を保証するので、同様に有利である。
【００４０】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例１：錫（II）と１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸の安定な錯体の製造
０.５２４０ｇ（１.０mmol）の１,１,３,３−プロパンテトラホスホン酸四ナトリウム四水和物（ＰＴＰ）を１００mlの水に溶解する。０.２２５７ｇ（１.０mmol）の塩化錫（II）二水和物を１００mlの０.１Ｎ塩酸に溶解する。ビーカー中、２ml（０.０２mmol）のＰＴＰ溶液を１ml（０.０１mmol）の錫（II）溶液中に混合し、ついでpHを２Ｎ水酸化ナトリウム溶液で所望のpH値＝３〜１１に調整する。澄明な溶液が得られる。
【００４１】
１ml（０.０１mmol）のＰＴＰ溶液と１ml（０.０１mmol）の錫（II）溶液を混合すると直ちに沈殿を生じ、この沈殿はpHを３〜１１の範囲で変えても溶解させることはできない。上澄液中には錫（II）イオンは検出できないが、なお３当量のＰＴＰが検出される。
【００４２】
錫（II）クエン酸塩錯体の製造は実施例２に記載する。
実施例２：クエン酸塩との錫（II）錯体の製造
０.１２９５５ｇのクエン酸と０.０７６０３ｇの塩化錫（II）二水和物を１０mlの水に溶解する。この溶液を水で９００mlに希釈し、pHを２Ｎ水酸化ナトリウム溶液によってpH＝６.５〜７に調整し、ついで容量を水で正確に１リットルとする。１mlあたり４０μｇの錫（II）を含有し、そのまま抗体生成物の製造に使用できる。
【００４３】
以下の実施例は、モノクローナル抗体ＢＷ４９４／３２による標識キットの製造を示す。この抗体は主として乳癌または卵巣癌細胞によって発現される抗原と反応する。
実施例３：モノクローナル抗体ＢＷ４９４／３２による標識ユニットの製造
実施例１または実施例２からの溶液０.５mlを、１mgの免疫グロブリンを含有し、予め２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１,２−プロパンジオールまたは他の適当な還元剤で処理した抗体溶液１mlに加える。この溶液を互いに混合し、ついで凍結乾燥する。
【００４４】
Ｔｃ−９９ｍによる標識の操作は次のとおりである。
【００４５】
活性５００ＭＢｑ−１５００ＭＢｑの、市販の発生装置からの溶出液を凍結乾燥物に加える。この活性は容量１ml〜１０ml中に存在させることができる。５〜１０分経過すると、生成物を注射に使用できる。
【００４６】
放射化学的純度を、薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ ＳＧ／メチルエチルケトン）または高速液体クロマトグラフィー〔ゲル濾過カラム（たとえば、Bio Rad TSK 250）、０.１Ｍ リン酸緩衝液pH６.８、流速：１ml／min〕で調べたところ、添加した活性の９５％〜９８％が抗体に結合したことを示した。この溶液は２４時間経過するまで十分な安定性を維持した。
【００４７】
担癌ヌードマウスでの動物実験によれば、これらの生成物により、腫瘍１ｇあたり６〜７％の腫瘍内貯蔵レベルが達成された。