【手続補正書】
【提出日】平成29年4月27日(2017.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項２】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項３】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも１つ、好ましくは２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間  にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項４】
該１つまたは複数の出発細胞が、ヒトのものである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の出発細胞が、マウスのものである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の出発細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択される、少なくとも１つの細胞のクラスを含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項７】
ＳＭＡＤ阻害剤と接触させる前記ステップおよびＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させる前記ステップを同時または逐次的に実行し、各ステップの持続期間が、約５日間〜約３０日間の間である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＢ４３１５４２が、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１ｍＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＬＤＮ−１９３１８９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３、Ｄｋｋ−４、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＸＡＶ９３９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１０ｎＭ〜約５００μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンの両方を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換えＳＨＨが、前記細胞を含有する培養培地中に約５ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
プルモルファミンが、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約２０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で２０日後に開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約８〜約１８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約１６日後の間に終了する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
皮質介在ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも１日後かつ最大で４日後に開始する、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約１〜約４日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２０日後の間に終了する、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
視床下部ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で１０日後に開始する、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約４〜約８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２４日後の間に終了する、請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＬＨＸ８、Ｉｓｌ１、ｐ７５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ニューロン前駆体細胞が、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ａ）および（ｂ）のうちの１つまたは複数と、存在する場合、任意選択の前記ステップ（ｃ）とを、フィーダー細胞の存在下で実行する、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項３３】
前記フィーダー細胞が、マウス皮質錐体ニューロンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マウス皮質錐体ニューロンが、マウスＥＳＣから導出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
【請求項３６】
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、皮質介在ニューロンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞のうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋皮質介在ニューロンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記皮質介在ニューロンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性抑制性介在ニューロンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
【請求項４０】
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視床下部ニューロンである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
【請求項４２】
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視索前野コリン作動性ニューロンである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記細胞が、ヒトのものである、請求項３５、３９、４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記細胞が、マウスのものである、請求項３５、３９、４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｗｎｔアンタゴニストと接触させる前記ステップを、ステップ（ａ）の開始後５日以内に、好ましくは、ステップ（ａ）の開始の０〜１日後に開始する、請求項７に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＢ４３１５４２を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１０に記載の方法。
【請求項４７】
ＬＤＮ−１９３１８９を、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項４８】
ＸＡＶ９３９を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．２μＭ〜約２００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも６日後かつ最大で２０日後に開始する、請求項１９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも８日後かつ最大で１８日後に開始する、請求項１９に記載の方法。
【請求項５１】
前記培養培地が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地およびＫＳＲベースの培地からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項５２】
前記皮質介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞が、検出マーカーを発現するトランス遺伝子で改変されている、請求項３５に記載の組成物。
【請求項５３】
前記検出マーカーが、ＣＴ−２およびＧＦＰからなる群から選択される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記皮質介在ニューロン前駆体細胞が、培養物中で、数週間〜数カ月間にわたり維持されうる、請求項２０に記載の方法。
【請求項５５】
前記皮質介在ニューロンが、培養物中またはｉｎ  ｖｉｖｏで、何カ月間にもわたり維持されうる、請求項２０に記載の方法。
【請求項５６】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、前脳前駆細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、血清を補充した培養培地中で、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該前脳前駆細胞を、ニューロンへのそれらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項５７】
前脳前駆細胞視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ａ）において、前記細胞を、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２と接触させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項６０】
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項６１】
前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ．１つまたは複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた前脳前駆体細胞を非ヒト動物の腹側終脳に注射するステップと、
ｂ．薬剤を該動物に投与するステップと、
ｃ．該薬剤が、前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項６２】
ポリヌクレオチドを非ヒト動物の皮質に送達する方法であって、該方法は、
ａ．該ポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの分化させた前脳前駆体細胞を非ヒト哺乳動物の腹側終脳に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで注射するステップと、
ｂ．該少なくとも１つの細胞が、該哺乳動物の皮質に遊走するのかどうかを検出するステップと、
ｃ．遊走した該少なくとも１つの細胞が、該ポリヌクレオチドを含有するのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本開示のこれらの態様および他の態様は、多様な実施形態のある特定の態様を例示する、以下の図面と併せると最もよく理解される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目２）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目３）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも１つ、好ましくは２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目４）
該１つまたは複数の出発細胞が、ヒトのものである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
前記１つまたは複数の出発細胞が、マウスのものである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目６）
前記１つまたは複数の出発細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択される、少なくとも１つの細胞のクラスを含む、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目７）
ＳＭＡＤ阻害剤と接触させる前記ステップおよびＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させる前記ステップを同時または逐次的に実行し、各ステップの持続期間が、約５日間〜約３０日間の間である、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目８）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目９）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ＳＢ４３１５４２が、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１ｍＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ＬＤＮ−１９３１８９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３、Ｄｋｋ−４、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ＸＡＶ９３９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１０ｎＭ〜約５００μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１６）
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンの両方を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
組換えＳＨＨが、前記細胞を含有する培養培地中に約５ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの間の範囲内の濃度で提供される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
プルモルファミンが、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約２０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で２０日後に開始する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約８〜約１８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約１６日後の間に終了する、項目１に記載の方法。
（項目２２）
皮質介在ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも１日後かつ最大で４日後に開始する、項目２に記載の方法。
（項目２４）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目２に記載の方法。
（項目２５）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約１〜約４日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２０日後の間に終了する、項目２に記載の方法。
（項目２６）
視床下部ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目２７）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で１０日後に開始する、項目３に記載の方法。
（項目２８）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目３に記載の方法。
（項目２９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約４〜約８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２４日後の間に終了する、項目３に記載の方法。
（項目３０）
視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＬＨＸ８、Ｉｓｌ１、ｐ７５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目３１）
前記ニューロン前駆体細胞が、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目３２）
前記ステップ（ａ）および（ｂ）のうちの１つまたは複数と、存在する場合、任意選択の前記ステップ（ｃ）とを、フィーダー細胞の存在下で実行する、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目３３）
前記フィーダー細胞が、マウス皮質錐体ニューロンである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記マウス皮質錐体ニューロンが、マウスＥＳＣから導出される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目３６）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、皮質介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記細胞のうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋皮質介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３８）
前記皮質介在ニューロンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性抑制性介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３９）
視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目４０）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視床下部ニューロンである、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目４２）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視索前野コリン作動性ニューロンである、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記細胞が、ヒトのものである、項目３５、３９、４１に記載の組成物。
（項目４４）
前記細胞が、マウスのものである、項目３５、３９、４１に記載の組成物。
（項目４５）
前記Ｗｎｔアンタゴニストと接触させる前記ステップを、ステップ（ａ）の開始後５日以内に、好ましくは、ステップ（ａ）の開始の０〜１日後に開始する、項目７に記載の方法。
（項目４６）
ＳＢ４３１５４２を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１０に記載の方法。
（項目４７）
ＬＤＮ−１９３１８９を、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１１に記載の方法。
（項目４８）
ＸＡＶ９３９を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．２μＭ〜約２００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１４に記載の方法。
（項目４９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも６日後かつ最大で２０日後に開始する、項目１９に記載の方法。
（項目５０）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも８日後かつ最大で１８日後に開始する、項目１９に記載の方法。
（項目５１）
前記培養培地が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地およびＫＳＲベースの培地からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目５２）
前記皮質介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞が、検出マーカーを発現するトランス遺伝子で改変されている、項目３５に記載の組成物。
（項目５３）
前記検出マーカーが、ＣＴ−２およびＧＦＰからなる群から選択される、項目５３に記載の組成物。
（項目５４）
前記皮質介在ニューロン前駆体細胞が、培養物中で、数週間〜数カ月間にわたり維持されうる、項目２０に記載の方法。
（項目５５）
前記皮質介在ニューロンが、培養物中またはｉｎ  ｖｉｖｏで、何カ月間にもわたり維持されうる、項目２０に記載の方法。
（項目５６）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、前脳前駆細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、血清を補充した培養培地中で、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該前脳前駆細胞を、ニューロンへのそれらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目５７）
前脳前駆細胞視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ａ）において、前記細胞を、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２と接触させる、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目６０）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目６１）
前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ．１つまたは複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた前脳前駆体細胞を動物の腹側終脳に注射するステップと、
ｂ．薬剤を該動物に投与するステップと、
ｃ．該薬剤が、前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
（項目６２）
ポリヌクレオチドを動物の皮質に送達する方法であって、該方法は、
ａ．該ポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの分化させた前脳前駆体細胞を哺乳動物の腹側終脳に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで注射するステップと、
ｂ．該少なくとも１つの細胞が、該哺乳動物の皮質に遊走するのかどうかを検出するステップと、
ｃ．遊走した該少なくとも１つの細胞が、該ポリヌクレオチドを含有するのかどうかを決定するステップと
を含む方法。