(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＤＮＡが大腸菌ＢＬ２１宿主細胞  ＮＥＢ＃７２５：ＡＴＣＣ６９０２８から得られることを特徴とするＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡセグメント。
【請求項２】
大腸菌ＢＬ２１宿主細胞  ＮＥＢ＃７２５：ＡＴＣＣ６９０２８から得られることを特徴とするＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３】
単離ＤＮＡが大腸菌ＢＬ２１宿主細胞  ＮＥＢ＃７２５：ＡＴＣＣ６９０２８から得られることを特徴とするＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡセグメント。
【請求項４】
請求項３において定義されたＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項６】
ＡａｔＩＩＭ遺伝子の核酸配列が下記に示される、請求項３に記載の単離ＤＮＡセグメント。
【化１】
0003592350.tif 000002
0003592350.tif 000003
【請求項７】
（ａ）請求項３に記載のＤＮＡおよび制限エンドヌクレアーゼの発現を制御するためのベクターで形質転換し、
（ｂ）発現したＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを取得するためにステップ（ａ）の宿主細胞を培養するステップを含む、ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造並びにエンドヌクレアーゼの過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）に関する関連方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、天然で微生物中に存在する酵素の一種である。これらを他の微生物が混ざった成分から精製すると、制限エンドヌクレアーゼは、研究室で、ＤＮＡ分子を分子クローニング及び遺伝子キャラクタリゼーション用に小さなフラグメントに切断するために使用し得る。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ってヌクレオチドの特定の配列（制限配列）を識別し且つ結合することにより作用する。一旦結合すると、これらは、制限配列の内部またはこの一端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を持つ。今日まで、実験された数百種の微生物種の中で特徴的な特異性を持つ１５０種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、同定された。
【０００４】
微生物は、１種当たりせいぜい数種の制限エンドヌクレアーゼしか持っていない。通常、エンドヌクレアーゼは、それらが誘導された微生物にちなんで名付けられている。従って、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと名付けられた３種類の制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、各々配列ＴＴＴＡＡＡ、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ及びＣＡＣＮＮＮＧＴＧを認識し且つ切断する。他方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＹ１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識するたった１種の酵素ＥｃｏＲＩを合成する。
【０００５】
理論に拘束されるつもりはないが、実際に制限エンドヌクレアーゼは微生物細胞の繁栄（ｗｅｌｆａｒｅ）に保護的な役割を示すと考えられている。これらのエンドヌクレアーゼは、微生物を破壊または寄生するウイルス及びプラスミド等の外来ＤＮＡ分子に感染しないようにする。これらは、認識配列が発生する度に侵入する外来ＤＮＡ分子を切断することにより耐性を付与する。切断が起きると、多くの感染遺伝子が無能になり、ＤＮＡを非特異的なエンドヌクレアーゼによりさらに分解し易くする。
【０００６】
微生物保護系の第２の成分は、修飾メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼに対して相補的であり、これら自身のＤＮＡを保護し、外来の感染ＤＮＡを区別する手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同一ヌクレオチド認識配列を認識且つ結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、これらはメチル基を付加することにより配列内で１個以上のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化後、認識配列は制限エンドヌクレアーゼによってもはや結合も切断もしない。微生物細胞のＤＮＡは通常、その修飾メチラーゼの活性により完全に修飾されている。従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在には、全く感受性がない。制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感受性であるのは、未修飾で識別可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、現在では、遺伝子をクローニングし且つ慣用の精製技術で得られるよりももっと多量に該遺伝子によってコードされる蛋白質及び酵素を産生し得る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する解決策は、該クローンが１０−３〜１０−４ぐらいの低い頻度で生じる際には、複雑な「ライブラリー」即ち「ショットガン」法により誘導したクローン集団内でこのようなクローンを識別する簡単且つ信頼性の高い方法を開発することである。好ましくは、本方法は、望ましくない多くのクローンを破壊し、望ましい希なクローンを生存させるように選択的でなければならない。
【０００８】
ＩＩ型制限−修飾系は、高頻度でクローニングされている。第１のクローニング系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染が使用された［ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  １７８：７１７−７１９，（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ３：９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８  １５０３−１５０７（１９８１）］。微生物中に制限−修飾系が存在するとバクテリアオファージによる感染に耐えられるので、クローニングした制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、一般に、ファージに暴露されたライブラリーから残存物として選択的に単離し得る。しかしながら、この方法では、非常に少量しか得られない。特に、クローニングした制限−修飾遺伝子は、常に選択的に生存させるのに十分ファージ耐性であるとは限らないことが明らかになった。
【０００９】
もう一つのクローニングの試みとしては、大腸菌クローニングプラスミドへのプラスミド−ボーン（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）として最初に特徴付けられたトランスファー系を包含する［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６，（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０２−４０６，（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ  １９：３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９，（１９８５）］。
【００１０】
第３の試みは、多くの系をクローニングするのに使用されており、この系は、現在活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によりクローニングされている［本出願人の欧州特許出願公開第１９３，４１３号（１９８６年９月３日）及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５）参照］。制限及び修飾遺伝子は近接して結合していることが多いため、両方の遺伝子は同時にクローニングされ得る。この選択は、完全な制限系を常に与えるとは限らないが、その代わりメチラーゼ遺伝子のみを与える［ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ  １０：２１９−２２５，（１９８０）；Ｂｃｎ  Ｉ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ  ２０：１９７−２０４（１９８２）；Ｂｓｕ  ＲＩ：Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ  ２１：１１１−１１９，（１９８３）；及びＭｓｐ  Ｉ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１９８３）］。
【００１１】
ある系に於いては、修飾によっては通常保護されない宿主に、エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすると、クローニングに問題がある。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメントに導入する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する前に、メチラーゼ遺伝子は宿主を修飾または保護しなくてはならない。
【００１２】
大腸菌でこれらの系をクローニングするもう一つの障害が、種々のメチラーゼをクローニングする方法で知見された。多くの大腸菌株（クローニングで通常使用するものを含む）は、シトシンメチル化を含むＤＮＡの導入に耐える系を有する［Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８３：９０７０−９０７４，（１９８６）］。従って、クローニングに使用するためには大腸菌株を注意深く考慮する必要がある。
【００１３】
外来の制限修飾系をクローニングし、大腸菌に導入する場合、大腸菌での遺伝子の転写または翻訳が不十分なため、エンドヌクレアーゼの収量は、天然のエンドヌクレアーゼ産生株と比較して非常に低いこともある。クローニングされた制限修飾系を保持する大腸菌細胞が、殆ど生長しない場合もある。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の不十分なメチル化保護及び未制御の構成発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によるものと考えられる。従って、よく制御された発現系は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などの大腸菌毒性遺伝子中で発現させるのに望ましい。
【００１４】
非誘導条件下ではエンドヌクレアーゼを最小レベルで産生し、誘導時に所望のエンドヌクレアーゼを多量に産生する発現系が望ましい。このようにして外来制限修飾系は、大腸菌宿主に安定して保持され得る。
【００１５】
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは、研究室での遺伝子の特徴付けに有用な道具であり、多量にこれらの酵素を合成する組換えＤＮＡ技術により細菌株を得るための商業的誘因である。このような株は、精製を簡便化し、並びに商業的に有用な量を産生する手段を提供するため、有用である。
【００１６】
一態様に於いて、本発明は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるための発現ベクターと、大腸菌で当該制限エンドヌクレアーゼに対してＤＮＡを保護し得るレベルにメチラーゼ遺伝子を発現し得るメチラーゼ遺伝子を発現させるための中（ｍｅｄｉｕｍ）または高（ｈｉｇｈ）コピー数適合性ベクターとを含む制限エンドヌクレアーゼを過剰発現させる方法に関する。好ましい発現系は、発現ベクター（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入するためのＴ７発現ベクター）、発現ベクターを制御する第２の適合性ベクター（例えば、その遺伝子産物がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、Ｔ７  ｌａｃプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子発現を減少させるＴ７  リゾチーム遺伝子を含むベクター）及びメチラーゼ遺伝子をクローニングするための第３の適合性プラスミドからなる。好ましい態様に於いて、メチラーゼ遺伝子をクローニングするための第３のプラスミドは、好ましくはコピー数を増やすためにＵＶ突然変異誘発により突然変異したコピー数変異株（ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｍｕｔａｎｔ）である［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９７２  ｐ．１２１−１２４］。本発明の発現系では、低レベルの構成発現を有する高レベルの誘導を可能にするので、大腸菌（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）での毒性蛋白質の発現には有用である。
【００１７】
もう一つの態様に於いて、本発明は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉから得られるＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼに関する遺伝子をコードする組換えＤＮＡ並びに、組換えＤＮＡからのＡａｔＩＩ制限酵素の製造の関連方法に関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼＡａｔＩＩを発現する形質転換宿主、ＤＮＡ配列５’−ＧＡＣＧＴＣ−３’を認識し、両方のＤＮＡ鎖のＴとＣの間で切断して、３’から突き出る４個の塩基を放出する酵素にも関する［Ｓｕｇｉｓａｋｉ，Ｈら，Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：５７４７−５７５２］。本発明により産生したＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１に記載の慣用方法により製造した制限エンドヌクレアーゼ製剤で通常知見された汚染源を含まない。
【００１８】
ＡａｔＩＩ制限−修飾系をクローニングするための好ましい方法の一つは、好適なベクターを選択し、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  Ａｃｅｔｉ由来のＤＮＡを含む幾つかのライブラリーを形成し、ＡａｔＩＩ修飾メチラーゼをコードするＤＮＡを含むこれらのクローンを単離し、ベクターを使用してメチラーゼ遺伝子に隣接する付加的染色体ＤＮＡをクローニングし、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを産生するこれらのクローンをスクリーニングし、クローンの上にａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭ遺伝子をマッピング（ａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭは、各々ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ及びＡａｔＩＩメチラーゼをコードする遺伝子である）し、ａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、次いで大腸菌でａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭ遺伝子を過剰発現させることからなる。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が発現ベクターに含まれ、メチラーゼ遺伝子が発現ベクターと適合性である別個の中コピー数または高コピー数ベクター上に含まれている発現系を使用することからなる制限エンドヌクレアーゼの過剰発現方法に関する。
【００２０】
好ましい一態様としては、以下のものがある。
【００２１】
１）エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためのＴ７ｌａｃプロモーター及びＣｏｌＥＩ複製開始点を含むＴ７発現ベクター［Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ及びＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：４５−５９，（１９９１）］並びに、ｐ１５Ａ複製開始点及び、その遺伝子産物がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを阻害し且つＴ７プロモーターからの基底レベル（ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌ）のターゲット遺伝子発現を減少させるＴ７  リゾチーム遺伝子を含む第２の適合性ベクター［Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７−４４，（１９９１）］。他の発現ベクター、例えば、Ｐｌａｃ、ＰｌａｃＵＶ５、Ｐｔａｃ及びλＰＬなどのエンドヌクレアーゼ発現に使用し得るプロモーターを含むｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２誘導体も使用し得る。
【００２２】
２）ｌａｃ  プロモーターから発現されるメチラーゼ遺伝子をクローニングするためのｐＳＣ１０１複製開始点を含む中コピー数クローニングベクター［Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．及びＫｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｇｅｎｅ  １００：１９５−１９９，（１９９１）］。他の増加されたコピー数の適合性クローニングベクターは、例えば突然変異の誘発、好ましくはＵＶ突然変異の誘発（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，上掲）を用いて、例えば、ＲＰ４、ＲＰ１、Ｒ１８、Ｒ６８、ＲＳＦ１０１０、Ｒ１１６２及びＲ３００Ｂ［Ｋｕｅｓ．，Ｕ及びＳｔａｈｌ，Ｕ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４９１−５１６  １９８９］のような低コピー数の適合性ベクターから製造し得た。
【００２３】
本発明は、ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びに、このような組換えＤＮＡからＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
【００２４】
本明細書中に記載する方法により、ＡａｔＩＩ制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子は、図１に記載の如くクローニング及び発現されるのが好ましい。本方法は以下の段階を含む。
【００２５】
１．Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉのゲノムＤＮＡを精製する。
【００２６】
２．ＤＮＡを、無傷のＡａｔＩＩメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを産生する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）またはその任意のアイソシゾマーで一部消化する。あるいは、完全制限修飾系［例えば、ＮｄｅＩゲノムライブラリー］を含むライブラリーを作成し得る（段階７にスキップする）。フラグメントは、クローン化可能なサイズ、即ち１．５〜１４ｋｂでなければならない。
【００２７】
３．ＨｉｎｄＩＩＩ−消化ゲノムＤＮＡをｐＵＣ１９クローニングベクターに連結する。得られた混合物を使用して、好適な宿主、即ちｈｓｄＲ−、ｍｃｒＢＣ−、ｍｒｒ−株、例えば大腸菌株ＲＲ１を形質転換する。ＤＮＡ／細胞混合物を、形質転換細胞用のアンピシリン選択培地にプレートする。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーを一緒に収穫して、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）細胞ライブラリーを形成する。上記の如く、このような一次細胞ライブラリーを全部で１０個を、個々のクローニングエンドヌクレアーゼによるＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ＤＮＡの完全または部分消化物及び宿主株を使用することにより構築した。
【００２８】
４．組換えプラスミドを一次細胞ライブラリーからｉｎ  ｔｏｔｏで精製し、一次プラスミドライブラリーを作成する。精製したプラスミドライブラリーを、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ細胞または任意のＡａｔＩＩアイソシゾマーから調製されるＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼでｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全に消化する。ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ消化により、未修飾の、非メチラーゼ含有クローンを選択的に破壊し、ＡａｔＩＩメチラーゼ−保持クローンの相対頻度を高める。
【００２９】
５．ＡａｔＩＩメチラーゼクローンの同定：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを宿主（例えば、大腸菌株ＲＲ１）に戻し形質転換し、形質転換したコロニーを再びアンピシリンプレートにプレートして得る。コロニーを拾い出し、そのＤＮＡをＡａｔＩＩメチラーゼ遺伝子の存在に関して、精製したプラスミドＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼとインキュベートし、ＡａｔＩＩ消化に対して耐性であるかどうかを決定することにより分析する。
【００３０】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングしたことが確認できたら、クローンをＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関して分析する。活性が検出される場合、ＡａｔＩＩ制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に結合しており、そのクローン中に存在する。このような場合には、以下の段階にスキップする。しかしながら、本発明の方法では、全く制限活性は検出できなかった。制限活性の欠失は、制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合していないか、結合していてもメチラーゼ遺伝子と共に完全にクローニングされていないか、完全にクローニングされていても発現されていないか、若しくは完全系がクローニングされていてもメチラーゼ遺伝子の発現が制限エンドヌクレアーゼに対して十分に保護するのに不十分であるということ、即ち、選択から生存するクローンだけがエンドヌクレアーゼ遺伝子に於いて自然発生的突然変異若しくは欠失を起こしたということを示している。上記のどの可能性がこの場合であるかを検出するために、クローニングしたフラグメントを制限−マッピングし、クローニングフラグメント内でメチラーゼ遺伝子の相対位置がどこであるかを決定するために欠失を行なう。次いで情報を使用して、結合している場合、メチラーゼ遺伝子のいずれかの側に制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡが存在するかどうかを検出する。十分な長さのＤＮＡがある場合、制限遺伝子は結合していないか、発現せずにクローン内に存在すると想定される（段階１０にスキップする）。クローニングしたＤＮＡのメチラーゼ遺伝子の両側に、結合した制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡが無い場合、本発明のＨｉｎｄＩＩＩクローン、ｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＭ１８に関して知見されるように、メチラーゼ遺伝子の一部を使用して、存在するクローン化ＤＮＡの境界を越えて伸長する領域のゲノムマップをサザンハイブリダイゼーションにより作成するためにＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ染色体の消化物を精査する。このデータは、ある種のエンドヌクレアーゼ、例えば、メチラーゼ遺伝子並びに多量の隣接ＤＮＡを保持する個々のフラグメントに制限−修飾領域を切断するＮｄｅＩの同定に役立つ。このようなエンドヌクレアーゼにより生成したフラグメントの正確なサイズは、同様にデータから計算される。制限及び修飾遺伝子が結合していることが知見される場合、このようなフラグメントは制限遺伝子もコードするだろう。
【００３１】
７．豊富なライブラリーを、ＮｄｅＩでＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ＤＮＡを消化し、次いで生成したフラグメントを例えばｐＵＣ１９などの好適なベクターに連結することにより構築する。ＤＮＡ、メチラーゼ遺伝子並びに隣接領域を保持するクローンを、メチラーゼ選択により単離する［欧州特許出願公開第１９３，４１３号（１９８６年９月３日）及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１，（１９８５）］。
【００３２】
８．制限遺伝子クローンの同定：メチラーゼ選択及び形質転換後、アンピシリン耐性形質転換細胞を、存在するメチラーゼクローンの境界を越えて伸長するＤＮＡ挿入物に関してスクリーニングする。このようなクローンを同定したら、粗な細胞抽出物をこれらのクローンから調製し、細胞抽出物を連続希釈し、次いでＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイする。ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子の両方を保持するクローンを、これらの細胞抽出物のＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性アッセイ及びＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ切断に対するベクターバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）耐性を与える活性により同定する。
【００３３】
９．ａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭ遺伝子を含む領域を、欠失マッピングによりマップ化し、サブクローニングし、ジデオキシヌクレオチド終止法によりＤＮＡ配列を決定した［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９７７，７４：５４６３−５４６７］。
【００３４】
１０．過剰発現：本発明のもう一つの好ましい態様によると、ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及び／または他の制限エンドヌクレアーゼに関する好ましい一つのアプローチとしては、以下のものが挙げられる。
【００３５】
１）例えば、ｐＳＣ１０１複製開始点を含む増加コピー数の変異株を構築し、ａａｔＩＩＭ遺伝子または他のメチラーゼ遺伝子を上記で作成した中コピー数のプラスミドにクローニングして、大腸菌宿主を予備修飾且つ保護する。ａａｔＩＩＭ遺伝子（または他のメチラーゼ遺伝子）をｌａｃプロモーターから発現する。
【００３６】
２）ａａｔＩＩＲに関しては、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベクター［例えば、ｐＳＹＸ２２（ｐＳＹＸ２２の構築に関しては実施例１に詳細を説明する）］上のＴ７  ｌａｃプロモーターの下流に挿入し得る。これは、ポリメラーゼ連鎖反応によりエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するためのプライマー中に制限部位を組み込む（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４）か、または特定部位の突然変異誘発によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の始めと終わりに制限部位を組み込む［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２．（１９８５）］ことにより実施し得る。さらに、強力なリボソーム結合部位［Ｓｈｉｎｅ＆Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７１，１３４２−１３４６（１９７４）］を遺伝子の前に配置して、翻訳効率を高め得る。エンドヌクレアーゼ発現に使用し得る他のプロモーターとしては、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２誘導体上のＰｌａｃ、ＰｌａｃＵＶ５、Ｐｔａｃ、ＰＲ、Ｔ３及びλＰＬが挙げられる。しかし、これらのプロモーターは、非誘発条件下では厳格に抑制されないので、低い誘発率を与える。
【００３７】
ａａｔＩＩＲ及びａａｒＩＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌でより効率良く使用されるコドンを使用する慣用のホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）またはホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）化学により合成し得る［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｕｓｅｒ  ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ  ＃１３，１９８８；Ｕｓｍａｎ，Ｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５−７８５４，１９８７］。
【００３８】
１１．ＡａｔＩＩ産生及び精製：ＡａｔＩＩメチラーゼまたはエンドヌクレアーゼは、抗生物質（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール及びカナマイシン）を含む富裕培地中、発酵器で増殖することにより、ＡａｔＩＩメチラーゼ遺伝子（または異種メチラーゼ）及び過剰発現制限エンドヌクレアーゼを保持するクローンから産生し得る。その後、細胞を遠心分離して収穫し、超音波処理して破壊して、ＡａｔＩＩメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗な細胞抽出物を得る。ＡａｔＩＩメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む粗な細胞抽出物を、標準蛋白質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー）により精製する。
【００３９】
上記概略の段階は本発明を実施するための好ましい態様であるが、上記のアプローチは、当業界で公知の技術に従って改変し得ることは当業者には公知である。
【００４０】
以下の実施例は、実施するのに好ましい本発明の態様を説明するものである。この実施例は単なる説明であり、特許請求の範囲に示されるものを除いて、本発明は実施例によって制限されるものではない。
【００４１】
【実施例】
実施例１
１．ＡａｔＩＩ制限及び修飾系のクローニング：まずａａｔＩＩＭ遺伝子を、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼでプラスミドライブラリーをチャレンジすることによるメチラーゼ選択を使用してＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにクローニングし、次いで形質転換後の生存物を探した。後に、ａａｔＩＩＲ遺伝子のほんの一部がこのＨｉｎｄＩＩＩ挿入物中に存在することが知見された。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉゲノムＤＮＡの制限マッピングにより、ＮｄｅＩフラグメントは、ａａｔＩＩＲ遺伝子の隣のＤＮＡの一端を伸長すべきであることが示された。ＡａｔＩＩ制限−修飾系、ａａｔＩＩＲ及びａａｔＩＩＭ遺伝子を、メチラーゼ選択法によりｐＵＣ１９ベクター中のＮｄｅＩ制限フラグメントにクローニングした。このクローンをｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋１８と名付けた。これは、湿潤大腸菌細胞１グラム当たりＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ２００単位を作る。ｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋２１は、同一ＮｄｅＩ挿入物を含んでいたが、反対方向であった。
【００４２】
２．ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子の制限マッピング：ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子を以下のようにマッピングした。５５００−ｂｐ  ＮｄｅＩフラグメント挿入物には２個のＸｂａＩ部位（約３００ｂｐ離れている）があり、ｐＵＣ１９の多重クローニング部位には１個のＸｂａＩ部位がある。２個のＸｂａＩ制限フラグメントを欠失するＸｂａＩフラグメント欠失サブクローン（約１０００ｂｐの欠失）を構築した。ｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋１８  ２μｇを、１×制限緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ジチオスレイトール）５０μｌ中、３７℃で１時間、ＸｂａＩ  ２０単位で消化した。消化したＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３の等容量で抽出し、エタノールで沈澱させて乾燥した。得られたＤＮＡ０．２μｇを、１×連結緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ジチオスレイトール、ウシ血清アルブミンの１ｍＭ  ＡＴＰ  ２５μｇ／ｍｌ）５０μｌ中、１６℃で一晩、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。連結したＤＮＡに、滅菌−蒸留水を等量添加して希釈した。希釈したＤＮＡ１０μｌを、ＥＲ１８２１  Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）コンピテント細胞０．１ｍｌと混合し、４℃で３０分間、４２℃で３分間インキュベートした。ＬＢ培地０．１ｍｌを添加して、３７℃で１時間インキュベートした後、細胞／ＤＮＡ混合物をＬＢ寒天プレート＋アンピシリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌ上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。１２個の個々のアンピシリン耐性（Ａｐｒ）形質転換細胞を拾いだし、ＬＢ＋Ａｐ  ２ｍｌ中に接種し、３７℃で一晩振蕩した。各細胞１．５ｍｌを、１．５ｍｌエッペンドルフ管中で遠心分離し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法により改造したミニプレパレーション方法によりプラスミドＤＮＡを作成した［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３（１９７９）］。
【００４３】
プラスミドミニプレパレーション法：一晩培養した培地１．５ｍｌを、６，０００×ｇで３分間ペレット化した。上清を捨て、細胞ペレットを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  グルコース、２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡの０．２ｍｌ中に再懸濁させた。室温で５分後、０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳの０．２ｍｌを添加し、細胞を溶解させるために管を逆さにした。室温で５分後、３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）０．１５ｍｌを添加し、逆さにして十分に混合した。形成した沈澱を１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を除去し、等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。層を、１２，０００×ｇで５分間遠心分離することにより分離した。上層を新しい遠心分離管に取り出し、等容量のクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを９５％  エタノール０．９ｍｌと混合した。管を１２，０００×ｇで１０分間回転させ、沈澱した核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレットを再び７０％  エタノール１ｍｌで洗浄し、再ペレット化し、１５分間真空下で乾燥した。一旦乾燥させたら、ペレットはＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）１００μｌ中に再懸濁させた。
【００４４】
１２個のプラスミドＤＮＡをＸｂａＩエンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動により分析し、ＸｂａＩ欠失を確認した。これら総ては正しいサイズの欠失を含んでいた。ＸｂａＩ欠失クローン、即ちｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＭ＋（ＸｂａＩΔ）は、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼでチャレンジしてもプラスミドＤＮＡがＡａｔＩＩ開裂に対して耐性であることから、まだ無傷のａａｔＩＩＭ遺伝子を含んでいた。さらにａａｔＩＩＭ遺伝子のサイズを小さくするために、Ｅｃｏ０１０９ＩフラグメントをベクターのＥｃｏ０１０９Ｉ部位と残りの挿入物のＥｃｏ０１０９Ｉ部位の間で欠失した。この欠失は、Ｅｃｏ０１０９Ｉ末端がまず大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて充填され、次いで自己連結された以外にはＸｂａＩ欠失と同一方法で構築した。得られたＥｃｏ０１０９Ｉ欠失クローンは、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ消化に対して一部耐性であり、ａａｔＩＩＭ遺伝子がまだクローン中に含まれていることを示している。ＸｂａＩ欠失クローン及びＥｃｏ０１０９Ｉ欠失クローンは、約１８００ｂｐのＤＮＡフラグメント内にａａｔＩＩＭを規定した。ＸｂａＩ欠失クローンを、これが無傷のａａｔＩＩＲ遺伝子を含んでいるかどうかに関してＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関してもアッセイした。粗な細胞抽出物を以下のようにして調製した。ＬＢ＋Ａｐ  ２００ｍｌを細胞２ｍｌと一晩接種し、３７℃で一晩振蕩した。細胞を遠心分離し、細胞ペレットを超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）２０ｍｌ中に再懸濁させ、３０秒間１０回超音波処理し、１５０００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞片を分離した。細胞抽出物１μｌ、２μｌ、４μｌ及び８μｌを、１×ＡａｔＩＩ制限緩衝液（５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸塩、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール）３０μｌ中で３７℃１時間、λＤＮＡ  １μｇと一緒にインキュベートした。停止溶液３ｍｌを添加し、ＤＮＡをアガロース電気泳動により分析した。ＸｂａＩ欠失クローン中にはＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性は検出されず、エンドヌクレアーゼ遺伝子の一部が欠失したことを示していた。
【００４５】
ａａｔＩＩＲ遺伝子の境界をマッピングするために、ａａｔＩＩＭ遺伝子をまずＰｔａｃ及び多重クローニング部位を含むベクターｐＲ９７６、即ちｐＡＣＹＣ１８４誘導体（Ｐａｕｌ  Ｒｉｇｇｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡにより構築されたもの）にクローニングした。ａａｔＩＩＭ遺伝子を含む３０００ｂｐ  ＰｓｔＩフラグメントをｐＲ９７６のＰｓｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミド、即ちｐＲ９７６ＡａｔＩＩＭ＋を、大腸菌株ＥＲ１８２１Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）に形質転換した。欠失サブクローンを予備修飾したＥＲ１８２１［ｐ（Ｒ９７６）ＡａｔＩＩＭ＋］に形質転換し、無傷のａａｔＩＩＲ遺伝子を含むかどうかを見た。
【００４６】
ｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋１８にはＨｉｎｃＩＩ部位が２個、ベクターの多重クローニング部位に１個及び挿入物にもう１個ある。ＨｉｎｃＩＩ欠失、則ち約４５００ｂｐの欠失は、ＸｂａＩ欠失クローンと同一方法で構築した。このプラスミドをＥＲ１８２１［ｐ（Ｒ９７６）ＡａｔＩＩＭ＋］細胞に形質転換し、細胞抽出物を形質転換細胞から調製したが、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。もう１つの欠失クローンは、約４２００ｂｐのＤＮＡを欠失したＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩフラグメント欠失を含んでいる。この欠失クローンは、粗な細胞抽出物中にＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性を示す。これらの結果から、ａａｔＩＩＲ遺伝子は、約１３００ｂｐのＤＮＡフラグメント内にあることが解った。
【００４７】
３．ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列分析：ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子の両方を含むＤＮＡ領域を配列決定するために、さらに４つの欠失サブクローン（ＢａｍＨＩフラグメント欠失、ＥｃｏＲＩフラグメント欠失、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント欠失及びＰｓｔＩフラグメント欠失）を個々のエンドヌクレアーゼ開裂及び自己連結によりＸｂａＩフラグメント欠失で実施したのと同一方法で構築した。全部で３３６５ｂｐのＤＮＡを、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ−終止配列決定方法により両方の鎖上で配列決定した［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７］。２個の大きな読み取り枠、則ち各々９９６ｂｐ及び１０３８ｂｐは、ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子がマッピングされる領域に知見された。プラスミド中で９９６ｂｐ読み取り枠をサブクローニングすると、ＡａｔＩＩ部位修飾を示し、この読み取り枠をａａｔＩＩＭ遺伝子と帰属した（図２）。ａａｔＩＩＭ遺伝子から予想されたアミノ酸配列から、これがＮ−６アデニンメチラーゼに関する保存されたモチーフ（モチーフＤＰＰＹ及びＤＰＦ−ＧＳＧ−Ｔ）を含むことが解った。プラスミド中で１０３８ｂｐ読み取り枠をサブクローニングし、ＡａｔＩＩメチラーゼ−修飾細胞を形質転換すると、粗な細胞抽出物中にＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性が見られた。従って、この読み取り枠を、ａａｔＩＩＲ遺伝子と帰属した（図３）。
【００４８】
４．大腸菌でのａａｔＩＩＲ遺伝子の過剰発現：
Ａ．λＰＬプロモーター下でのａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子の過剰発現：ａａｔＩＩＭ及びａａｔＩＩＲ遺伝子の両方を含むＢｓｐＥＩ／ＮｄｅＩ  ＤＮＡを、発現ベクターｐＤＮＥＶ５、則ちλＰＬプロモーター及びλ温度−感受性リプレッサ−遺伝子ｃＩ８５７を含むｐＵＣ１９誘導体（Ｄｏｎａｌｄ  Ｎｗａｎｋｗｏ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡにより構築されたｐＤＮＥＶ５）にクローニングした。得られたプラスミドをｐ（ＤＮＥＶ５）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋と名付けた。ＥＲ１８２１［ｐ（ＤＮＥＶ５）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋］細胞は、４３℃で一晩インキュベーション後に湿潤細胞１ｇ当たりＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを４０，０００単位製造した。収率は、天然のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ株の２０倍以上であった。しかしながら、この過剰産生株は不安定である。これは、１００リットル発酵器中で殆ど生長せず、幾つかの細胞は培地で溶解した。従って、より安定なクローンの構築を試みた。
【００４９】
Ｂ．Ｐｔａｃプロモーター下でのａａｔＩＩＲ遺伝子の発現：ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ産生クローンを安定化させるために、ＰｓｔＩ／ＮｄｅＩフラグメント中に含まれていたａａｔＩＩＭ遺伝子をｐＵＣ１９にサブクローニングした。得られたプラスミド、則ちｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＭ＋（ＰｓｔＩ／ＮｄｅＩ）の４つのＡａｔＩＩ部位を、ＡａｔＩＩメチラーゼにより完全に修飾した。ａａｔＩＩＲ遺伝子を保持するＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、Ｐｔａｃプロモーター及びＬａｃリプレッサ制御下で、適合性発現プラスミドｐＲ９７６にクローニングした。大腸菌細胞ＥＲ２２６７［ｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＭ＋（ＰｓｔＩ／ＮｄｅＩ）、ｐ（Ｒ９７６）−ＡａｔＩＩＲ＋（ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ）］を１リットル細胞培地中０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより誘発すると、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼの収率は、湿潤細胞１ｇ当たり１０，０００単位であり、天然のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ株の５倍の過剰発現であった。しかしながら、培地を１００リットルの発酵器にスケールアップすると、収率は湿潤細胞１ｇ当たり２０００単位に減少した。スケールアップに失敗した原因は解らない。
【００５０】
Ｃ．発現ベクターｐＲＲＳ上でのＰｌａｃＵＶ５プロモーター下でのａａｔＩＩＲ遺伝子の発現：
１）ａａｔＩＩＭ遺伝子のｐＷＳＫ１２９へのクローニング
プラスミドｐＷＳＫ１２９は、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２２誘導ベクター上に保持したＣｏｌＥＩオリジンと適合性であるｐＳＣ１０１複製開始点並びにカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）遺伝子を含む低コピー数のプラスミドである［Ｗａｎｇ  Ｒ．Ｆ．及びＫｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｇｅｎｅ，１００：１９５−１９９，１９９１］。プラスミドｐＷＳＫ１２９も、Ｔ７及びＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによりフランキングされた多重クローニング部位を含む。ａａｔＩＩＭ遺伝子は、２個のプライマー（プライマー１は、５’末端付近にＢａｍＨＩ部位を有する：５’  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：１，プライマー２は、５’末端付近にＰｓｔＩ部位を含む：５’  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＧ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：２）を使用してｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋２１からＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩで消化したｐＷＳＫ１２９に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＥＲ２２０６細胞を形質転換し、形質転換細胞をカナマイシン耐性に関して選択した。１８個の個々の形質転換細胞を、ミニプレパレーションプラスミドＤＮＡ中でａａｔＩＩＭ挿入物に関してスクリーニングした。１１個の形質転換細胞は正しいサイズの挿入物を含んでおり、得られたプラスミドをｐ（ＷＳＫ１２９）ＡａｔＩＩＭ＋と名付けた。プラスミドは、ＡａｔＩＩの消化に対して耐性であり、ＡａｔＩＩメチラーゼにより十分に修飾されていることを示している。
【００５１】
２）発現ベクターｐＲＲＳ２へのａａｔＩＩＲ遺伝子のクローニング
発現ベクターｐＲＲＳは、ｌａｃＵＶ５プロモーター、多重クローニング配列及び多重クローニング部位の下流に正のレトロ制御（ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ステム−ループ要素を含むｐＵＣ１９−誘導ベクターである［Ｓｋｏｇｌｕｎｄ  Ｃ．Ｍ．ら，Ｇｅｎｅ，８８：１−５（１９９０）］。ｐＲＲＳ誘導体、即ちｐＲＲＳ２を、ｌａｃＵＶ５プロモーターに対し遠位のＥｃｏＲＩ部位に充填し、次いで新しいＲｃｏＲＩリンカーをプロモーター近辺のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより構築した。２個のプライマーを使用してｐ（ＵＣ）ＡａｔＩＩＲ＋Ｍ＋２１からのａａｔＩＩＲ遺伝子を増幅した。プライマー１は、ＥｃｏＲＩ部位とリボソーム結合部位を含んでいた（５’  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：３）。ＳａｌＩ部位をプライマー２に作成した（５’  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：４）。ａａｔＩＩＲ遺伝子を、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応により増幅した（９５℃で１分間，５０℃で２分間，７２℃で１分間，２０サイクル）。ＤＮＡ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３で２回、ＣＨＣｌ３で２回抽出し、エタノール沈澱させた。ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで３７℃で１時間制限消化後、ＤＮＡを再びフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノールで沈澱させ、乾燥させ、次いでＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。ａａｔＩＩＲ遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断したｐＲＲＳ２に連結し、ＥＲ２２０６［ｐ（ＷＳＫ１２９）ＡａｔＩＩＭ＋］／Ｆ’  ｌａｃＩｑ，Ｔｎ１０（Ｔｃｒ）に形質転換した。２種類のコロニーモルフォロジーが形質転換細胞中に知見され、その一方は通常のコロニーであり、他方は平坦で透明なコロニーであった。後者のコロニーは、ｐＲＲＳ２にａａｔＩＩＲ挿入物を含んでおり、１０ｍｌの小培養中にＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを産生した。これは２００ｍｌサブカルチャー中でＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼの産生に失敗したが、これはクローンが不安定であることを示す。この不安定性は、多分、メチル化条件下では、ｐＵＣ１９−誘導ベクターのコピー数が細胞１個当たり４００と多すぎたためと予想されたが、プラスミドを含むメチラーゼのコピー数が細胞１個当たりたったの約６〜８コピーである。他の理由としては、ｌａｃＩｑ遺伝子がＦ’低コピー数プラスミド上に保持されているので、非誘導条件下ではａａｔＩＩＲ遺伝子の発現を抑制するのに十分なＬａｃリプレッサーが細胞中に産生しなかったことが考えられる。厳格に制御された発現系がＡａｔＩＩ発現に必要である。
【００５２】
Ｄ．大腸菌中でａａｔＩＩＭ遺伝子を発現するための中コピー数のベクターの構築：安定してＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを過剰発現させるために、増加コピー数の変異プラスミドを以下のようにｐＷＳＫ１２９から単離した。ｐＷＳＫ１２９を保持するＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を増殖させて、ＬＢ＋カナマイシン（Ｋａｎ）５０μｇ／ｍｌ中に２×１０８細胞／ｍｌとし、細胞を回転させて１０倍に濃縮し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ｐＨ７．８）の１／１０倍容量に再懸濁させた。細胞を１５秒間ＵＶ処理で突然変異を誘発させた（６  Ｊ／秒）。突然変異誘発した細胞を、通常のＫａｎプレートより４０倍もＫａｎが多い２ｍｇ／ｍｌＫａｎプレートにプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。３５個のＫａｎｒコロニーが知見され、これを一緒にプールして、ＬＢ＋２ｍｇ／ｍｌ  Ｋａｎ  １０ｍｌに接種した。宿主の突然変異のため２ｍｇ／Ｋａｎで増殖し得るコロニーを除去するために、プラスミドＤＮＡを１．５ｍｌの一晩培養物から調製し、新しい宿主ＥＲ１８２１に形質転換し、２ｍｇ  Ｋａｎ／ｍｌプレートにプレートした。プラスミドのコピー数を評価するために、Ｋａｎｒ形質転換細胞をＬＢ＋Ｋａｎ中で生長させ、プラスミドＤＮＡを、ｐＷＳＫ１２９及びｐＢＲ３２２プラスミドを用いて平行的にミニプレパレーション法により等数の細胞から調製した。ｐＷＳＫ１２９  ５ｍｌ、コピー数変異体及びｐＢＲ３２２  ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル中で臭化エチジウムで染色したＤＮＡの写真を撮った。写真のネガを、各レーンのＤＮＡの相対量を評価するためにデンシトメトリーでスキャンした。変異体１個（＃３）はプラスミドのコピー数を３倍（細胞１個当たり１８〜２４個）に増加させることが知見された。このプラスミドをｐＳＹＸ１９と名付けた。ａａｔＩＩＭ遺伝子をｐＳＹＸ１９にクローニングするために、２個のプライマーを設計してａａｔＩＩＭ遺伝子を、第１のプライマーが上端ストランド（Ｗａｔｓｏｎストランド）上のａａｔＩＩＭ遺伝子の開始部分にアニールし、第２のプライマーが底部ストランド（Ｃｒｉｃｋストランド）上のａａｔＩＩＭ遺伝子の末端にアニールするようにして、ａａｔＩＩＭ遺伝子を増幅した。プライマー１（５’  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：１）は、ＢａｍＨＩ部位とＡＴＧ開始コドンの６塩基上流の部位に結合する有効なリボソーム結合部位を含む。プライマー２（５’  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＧ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：２）は、５’末端の近くにＰｓｔＩ部位を含む。ａａｔＩＩＭ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応によりＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で増幅した（９５℃１分間，５０℃２分間，７２℃１分間，２０サイクル）。ＤＮＡ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３で２回、ＣＨＣｌ３で２回抽出し、エタノールで沈澱させた。ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで、３７℃で１時間制限消化した。ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で再び抽出し、エタノールで沈澱させ、��燥させ、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。ｐＳＹＸ１９ベクターＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでも切断し、フェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。ａａｔＩＩＭＤＮＡ１０μｌ及びｐＳＹＸ１９ベクターＤＮＡ１０μｌを、全容量３０μｌ中１×連結緩衝液中、１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌−蒸留水７０μｌを添加して希釈し、ＤＮＡ１０μｌを使用してＥＲ１８２１細胞を形質転換し、Ｋａｎ（５０μｌ／ｍｌ）プレートにプレートした。１８個のＫａｎｒ形質転換細胞を１．５ｍｌ  ＬＢ＋カナマイシンで一晩生長させ、プラスミドＤＮＡをこれらの一晩生長させた培養物から調製した。１８個の内１１個が、ＢａｍＨＩ及びＰａｔＩ制限消化による正しいサイズの挿入物を含んでいる。これらのうち５個をＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼで消化した時、これらの５個全部のプラスミドはＡａｔＩＩ消化に対して耐性であった。１個のプラスミドをｐ（ＳＹＸ１９）ＡａｔＩＩＭ＋と名付け、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼの共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用した。
【００５３】
Ｔ７ｌａｃプロモーター下での中コピー数プラスミドに於けるａａｔＩＩＲ遺伝子の発現：ｐＥＴ−ｌｌａは、Ｔ７  プロモーター（このＴ７プロモーター＋ｌａｃオペレーターは、Ｔ７ｌａｃプロモーターと呼ばれる）の４ｂｐ下流のｌａｃオペレーター、ｌａｃＩｑ遺伝子及びクローニングするための２個の制限部位（即ち、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）を含むｐＢＲ３２２から誘導したＴ７発現ベクターである（Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．及びＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：４５−５９，１９９１）。ｐＥＴ−ｌｌａ誘導体、即ちＴ７プロモーターの上流にｒｒｎＢ転写ターミネーターのコピーを４個含むｐＡＩＩ１７（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊａｃｋ  ａｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡにより構築されたｐＡＩＩ１７）を構築した。Ｔ７プロモーターの上流の転写ターミネーターはさらに、ターゲット遺伝子の発現を基底レベルに減少する。ＢａｍＨＩ部位はａａｔＩＩＲ遺伝子中に生じるため、ベクター上のＢａｍＨＩ部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、ＳａｌＩリンカーを挿入してＢａｍＨＩ部位を置き換えた。このプラスミドをｐＳＹＸ２２と名付けた。２個のプライマーを、第１のプライマーがａａｔＩＩＲ遺伝子の開始部分にアニールするＮｄｅＩ部位を含み、ＳａｌＩ部位はａａｔＩＩＲ遺伝子の末端に相補的である第２のプライマー中に作成されるように設計される（プライマー１：５’  ＣＡＡ  ＣＡＴ ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：５；プライマー２：５’  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：６）。ａａｔＩＩＲ遺伝子を、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲで増幅した（９５℃１分間，５０℃２分間，７２℃１分間，２０サイクル）。ＰＣＲ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した。ＤＮＡを再びフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、次いでＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させることにより精製した。ａａｔＩＩＲ  ＤＮＡ１０μｌをＮｄｅＩ／ＳａｌＩで処理したｐＳＹＸ２２  ０．５μｇに、１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌−蒸留水７０μｌを添加して希釈して、このうち１０μｌを使用してＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ１９）ＡａｔＩＩＭ＋，Ｋａｎｒ；ｐＬｙｓＳ，Ｃｍｒ］を形質転換し、ＬＢ寒天＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）上にプレートした。プラスミドｐＬｙｓＳは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラ−ゼを阻害してＴ７ｌａｃプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子の発現を減少させるファージＴ７リゾチームをコードする（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７−４４，１９９１）。プラスミドＤＮＡは、１２個の個々の形質転換細胞の１．５ｍｌ培養物から調製し、ａａｔＩＩＲ  ＤＮＡ挿入物に関して分析した。４個のプラスミドは正しいサイズの挿入物を含んでいる。１個のクロー���、即ちｐ（ＳＹＸ２２）ＡａｔＩＩＲ＋を以下の如くＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関して試験した。２００ｍｌの富裕なブロス培地＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）を２ｍｌ、細胞に一晩接種し、３７℃で振蕩してＫｌｅｔｔ  １００の細胞密度とした（中間対数増殖期（ｍｉｄｌｏｇ  ｐｈａｓｅ））。ＩＰＴＧインデューサーを培養物に添加して、終濃度０．５ｍＭとした。細胞を２時間誘発し、Ｋｌｅｔｔ  １７５で収穫した。細胞を４℃、５０００×ｇで１５分間遠心分離してペレット化し、２０ｍｌ超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）２０ｍｌ中に再懸濁させ、氷上で３０秒間で１０回超音波処理した。細胞破砕片を４℃１５０００×ｇで３０秒間遠心分離することにより除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液中１０１、１０２、１０３及び１０４倍に希釈し、希釈した抽出物２μｌを使用して、全容量３０μｌの１×ＡａｔＩＩ制限緩衝液中ＨｉｎｄＩＩＩ−直線化ｐＵＣ１９  １μｇを切断した。ｐＵＣ１９には単一ＡａｔＩＩ部位があった。ＨｉｎｄＩＩＩ−直線化ｐＵＣ１９をＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼで切断すると、２個のフラグメント、即ちサイズ５１６ｂｐ及び２１７０ｂｐができた。３７℃で１時間後、反応を停止溶液３μｌを添加して停止し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。１００倍に希釈した細胞抽出物を用いて完全な消化が達成されたことが知見された。このクローンは湿潤細胞１ｇ当たりＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを１０６単位作成すると評価された。ＡａｔＩＩの１単位は、５０μｌの反応液中、３７℃で１時間λＤＮＡ１μｇを完全に消化する酵素量である。
【００５４】
５．安定性試験：ＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ２２）ＡａｔＩＩＲ＋，ｐ（ＳＹＸ１９）ＡａｔＩＩＭ＋，ｐＬｙｓＳ］細胞を２５％グリセロール中、−７０℃で一晩凍結した。細胞を凍結ストックからＬＢ寒天＋Ａｐ、Ｃｍ及びＫａｎ上に画線培養し、単一コロニーを得た。５００ｍｌの富裕なブロス＋抗生物質を、単一コロニーに接種し、一晩振蕩した。コロニー形成単位を、富裕な寒天プレートまたは、Ａｐ、Ｃｍ及びＫａｎを補った富裕な寒天プレート上で一晩培養した培養物から決定した。過剰産生株は両方のプレート上で同一プレート率を有することが知見された（１．５×１０９コロニー形成単位／ｍｌ）。一晩培養した培養物５ｍｌを、５００ｍｌの新しい、富裕なブロス＋抗生物質に接種し、Ｋｌｅｔｔ単位が１００になるまで生長させた。培養物にＩＰＴＧを０．５ｍＭまで添加して誘発し、３７℃でインキュベーションを継続した。細胞を遠心分離により収穫した。細胞抽出物を調製し、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性を直線化したｐＵＣ１９  ＤＮＡ上で決定した。少なくとも１０６単位のＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ／湿潤細胞ｇが検出された。
【００５５】
６．ＡａｔＩＩ過剰産生株（ＮＥＢ  ＃７２５）由来のＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼの精製（Ａｍｅｒｉｃｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９２年７月７日に寄託し、受託番号＃ を受けた）：富裕なブロス培地２リットルに５０μｇ／ｍｌ  Ａｐ、３０μｇ／ｍｌ  Ｃｍ及び５０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎを足したものを、ＡａｔＩＩ過剰産生プラスミドｐ（ＳＹＸ２２）ＡａｔＩＩＲ＋、ｐ（ＳＹＸ１９）ＡａｔＩＩＭ＋及びｐＬｙｓＳを保持するＢＬ２１細胞を２０ｍｌと一晩インキュベートした。細胞をｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ（Ｋｌｅｔｔ単位１００）まで３７℃で生長させた。ＩＰＴＧインデューサーを培養物に添加し、終濃度０．５ｍＭとし、２時間インキュベーションを継続した。細胞を４℃で５０００×ｇ，２０分間遠心分離し、細胞ペレットを超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）８０ｍｌ中に再懸濁させ、超音波処理した。以下の精製方法を４℃で実施した。抽出物を１５０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をＤＥＡＥセファロースカラム（１．５×１５ｃｍ）に載置した。塩勾配液０〜１Ｍ  ＮａＣｌを適用し、画分を収集し、ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液で透析した。酵素混合物をヘパリンセファロースカラム（１．５×１５ｃｍ）に載置し、ＮａＣｌ  ０〜１Ｍの勾配液で蛋白質を溶離した。ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを含む画分を同様にプールし、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液に対して透析した。溶液を１．５×１５ｃｍのホスホセルロースカラムに載置し、ＮａＣｌの０．１５Ｍ〜１Ｍの勾配液を適用した。ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、貯蔵緩衝液（５０％グリセロール，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ及び２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）に対して透析した。最終収量は、細胞９ｇからＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼが１０６単位であった（２４０，０００単位ＡａｔＩＩ／ｍｌ）。酵素を１０倍に希釈して２４，０００単位／ｍｌとし、希釈した酵素２μｌ〜１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。ＩＰＴＧ−誘導及び未誘導細胞抽出物も同一ゲルに載置した。図４に示された結果から、精製したＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質は少なくとも９０％の純度であったことが解った（注：６８，０００ダルトンウシ血清アルブミンは汚染蛋白質ではなかった。これはＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼを安定化するためにＡａｔＩＩ酵素製剤に添加した。）。
【００５６】
この精製法から得られたＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋で非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度を以下の基準に従ってチェックした。
【００５７】
１）連結：λＤＮＡの１０倍過剰消化後、生成したＤＮＡフラグメントの９０％以上をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した。連結したフラグメントの９５％は、ＡａｔＩＩで再切断可能であった。
【００５８】
２）長時間の消化：λＤＮＡ１μｇ及び酵素７２単位を含む反応液５０μｌを１６時間インキュベーション後、酵素１単位で１時間実施した反応と同一のＤＮＡバンドパターンが生じた。
【００５９】
３）エキソヌクレアーゼ活性：１μｇの超音波処理した３Ｈ  ＤＮＡ（１０５ｃｐｍ／μｇ）を含む５０μｌ反応液中酵素７２単位と３７℃で４時間インキュベーション後、０．０１％未満の放射能が放出された。試験は総て以下の緩衝液（５０ｍＭ  酢酸カリウム，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，１ｍＭ  ジチオスレイトール）中で実施した。
【００６０】
実施例２
大腸菌に於けるＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼの過剰発現：ＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子（ｎｌａＩＩＩＭ）及びＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｎｌａＩＩＩＲ）をクローニングし（欧州特許出願公開第４７７，５３２号，１９９２年４月１日）、次いで配列決定した。ＮｌａＩＩＩクローニング及びクローンからのＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼの産生法に関する特許出願は為されている（特許出願番号第０７／５７５，２８５号）。以下に本出願人は、本発明の発現系を使用する大腸菌に於けるＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼの過剰発現方法について記載する。
【００６１】
構成発現ベクターを構築するために、ｌａｃＺａ遺伝子を含むＢｓｓＨＩＩ制限フラグメントをｐＳＹＸ１９から欠失し、テトラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）遺伝子を保持するＳｓｐＩ／ＰｖｕＩＩ制限フラグメントを残りのＤＮＡと連結した。得られたプラスミドｐＳＹＸ２０は、Ｋａｎｒ遺伝子及びＴｃｒ遺伝子の両方を含んでいた。これをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９２年７月７日に寄託し、受託番号＃ を受けた。ＤＮＡをＴｃｒ遺伝子にクローニングするとこれを不活化し、挿入物を検出するのに容易なスクリーニング方法を提供する。単一のＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ及びＳｐｈＩ制限部位は、Ｔｃｒ遺伝子にクローニングするのに都合の良い部位である。挿入された外来遺伝子は、Ｔｃプロモーターから構成的に発現され得る。
【００６２】
１．ｎｌａＩＩＩＭ遺伝子のｐＳＹＸ２０ベクターへのクローニング：プラスミドｐＳＹＸ２０は、Ｋａｎｒ及びＴｃｒ遺伝子並びにｐＳＣ１０１複製開始点を保持する中コピー数プラスミドである。Ｔｃｒ遺伝子に挿入されたｎｌａＩＩＩＭ遺伝子は、Ｔｃプロモーターから構成的に発現され得る。２個のプライマーを使用してｐ（ＵＣ）ＮｌａＩＩＩＲ＋Ｍ＋からｎｌａＩＩＩＭ遺伝子を増幅した。プライマー１は、５’末端の近くにＢａｍＨＩ部位及びＡＴＧ開始コドンの７ｂｐ上流に効率のよいリボソーム結合部位を含んでいる（５’  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：７）。プライマー２は、５’末端の近くにＳａｌＩ部位を有する（５’  ＣＡＡ  ＧＴＣ ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：８）。ｎｌａＩＩＩＭ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応によりＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで増幅した（９５℃１分間、５０℃２分間、７２℃１分間、２０サイクル）。ＰＣＲ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３で２回、ＣＨＣｌ３で２回抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液１００μｌで再懸濁させた。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで３７℃１時間制限消化させた後、ＤＮＡを再びフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μｌに再懸濁させた。ｐＳＹＸ２０ベクターＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、フェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。ｎｌａＩＩＩＭＤＮＡ１０μｌ及びｐＳＹＸ２０ベクターＤＮＡ１０μｌを、全容量３０μｌ中で１×連結緩衝液中１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌−蒸留水７０μｌを添加して希釈し、ＤＮＡ１０μｌを使用してＥＲ１８２１細胞を形質転換し、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）プレートにプレートした。１８個のＫａｎｒ形質転換細胞を１．５ｍｌＬＢ＋Ｋａｎで一晩生長させ、プラスミドＤＮＡを製造し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限消化により分析した。４個のクローンが正しいサイズの挿入物を含んでいた。これらをＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼでチャレンジすると、４個全部のプラスミドはＮｌａＩＩＩの消化に対して耐性であり、ＮｌａＩＩＩメチラーゼによる完全な修飾を示した。１個のプラスミドをｐ（ＳＹＸ２０）ＮｌａＩＩＩＭ＋と名付け、ＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐＬｙｓＳ］細胞を形質転換するのに使用し、ＬＢ寒天プレート＋３０μｇ／ｍｌ  Ｃｍ、５０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎにプレートした。Ｃｍｒ及びＫａｎｒ形質転換細胞が得られ、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼの発現用宿主として後で使用した。
【００６３】
２．発現ベクターｐＳＹＸ２２へのｎｌａＩＩＩＲ遺伝子のクローニング：発現ベクターｐＳＹＸ２２は、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｌａｃＩｑ遺伝子、翻訳融合クローニング用の２個の制限部位（ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ）を含んでいる。ｐＳＹＸ２２の構築は実施例１に記載した。２個のプライマーを、第１のプライマーがｎｌａＩＩＩＲ遺伝子の開始部分にアニールされているＮｄｅＩ部位を含み、ＳａｌＩ部位がｎｌａＩＩＩＲ遺伝子の末端に相補的である第２のプライマーに作成されるように設計した（プライマー１：５’  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：９，プライマー２：５’  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ３’，ＳＥＱ  ＩＤ：１０）。ｎｌａＩＩＩＲ遺伝子を、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲでｐ（ＵＣ）ＮｌａＩＩＩＲ＋Ｍ＋から増幅した（９５℃で１分、５０℃で２分、７２で１分、２０サイクル）。ＰＣＲ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した。ＤＮＡを再びフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させた。ｎｌａＩＩＩＲＤＮＡ１０μｇを、ＮｄｅＩ／ＳａｌＩで処理したｐＳＹＸ２２  ０．５μｇに１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌−蒸留水７０μｌを添加して希釈し、その１０μｌを使用して、大腸菌株ＥＲ２２６７  ｒｅｃＡ１  Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）を形質転換し、Ａｐプレートにプレートした。４８個の個々の形質転換細胞を２ｍｌ  ＬＢ＋Ａｐに接種し、３７℃で一晩振蕩した。プラスミドＤＮＡを製造し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ制限消化により分析した。プラスミドは、正しいサイズの挿入物を含んでいた。１個のクローンｐ（ＳＹＸ２２）ＮｌａＩＩＩＲ＋（＃４）を使用して、ＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ２０）ＮｌａＩＩＩＭ＋，ｐＬｙｓＳ］を形質転換し、ＬＢ寒天＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）上で形質転換細胞を選択した。プラスミドｐＬｙｓＳは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラ−ゼを阻害してＴ７ｌａｃプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子の発現を減少させるファージＴ７リゾチームをコードする（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７−４４，１９９１）。大腸菌株ＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ２２）ＮｌａＩＩＩＲ＋，ｐ（ＳＹＸ２０）ＮｌａＩＩＩＭ＋，ｐＬｙｓＳ］を以下のようにＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ産生に関して試験した。富裕なブロス培地２００ｍｌ＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）に細胞２ｍｌを一晩接種し、Ｋｌｅｔｔ  ７５の細胞密度に到達するまで３７℃で振蕩した。ＩＰＴＧインデューサーを培地に添加し、終濃度０．５ｍＭとした。細胞を２時間誘導し、Ｋｌｅｔｔ  １７５で収穫した。細胞を、４℃、５０００×ｇで１５分間遠心分離することによりペレット化し、超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ��ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）２０ｍｌに再懸濁させ、３０秒間１０回氷上で超音波にかけた。細胞片を４℃１５０００×ｇで３０分間遠心分離して除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液中１０１、１０２、１０３及び１０４倍に希釈し、希釈した抽出物５μｌを使用して、全容量３０μｌの１×ＮｌａＩＩＩ制限緩衝液中λＤＮＡ  １μｇを切断した。３７℃で１時間消化後、停止溶液３μｌを添加して反応を停止し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。細胞抽出物１０３倍希釈で完全に消化できたことが知見された。このクローンは湿潤細胞１ｇ当たりＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ２×１０６単位を生成した。非誘導条件下で生長時にＮｌａＩＩＩ過剰産生株をＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ産生に関して分析すると、細胞抽出物は、湿潤未誘発細胞１ｇ当たりたったの１０００単位しか含んでいなかった。従って、誘導比は２０００倍である。高レベルの誘発及び低基底レベル発現を特徴とする本発明の発現系は、例えば大腸菌に於ける制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などの毒性遺伝子の発現に対して非常に有用な発現系である。
【００６４】
３．ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼの精製：１リットルの培養物からの細胞約５ｇを超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）７５ｍｌに再懸濁させ、超音波処理した。細胞片を１５０００×ｇで３０分間遠心分離して除去し、１０％  グリセロールを添加して、上清を−７０℃で凍結した。融解時、ＫＣｌを添加して終濃度０．２Ｍとし、細胞抽出物をホスホセルロースカラム（２．５×７ｃｍ）に載置した。次いで、塩勾配液（０．２Ｍ〜２Ｍ  ＫＣｌ）を適用し、画分を収集して、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ活性に関して分析した。ＮｌａＩＩＩ活性を有するこれらの画分をプールした。ＢＳＡ  ２００μｇ／ｍｌを添加後、これらを緩衝液（１０ｍＭ  ＫＰＯ４，ｐＨ７，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．３Ｍ  ＮａＣｌ，１０％  グリセロール）で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラムに載置した。酵素をホスフェート勾配液１０ｍＭ〜０．７  ＫＰＯ４で溶離した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％  グリセロール）で透析した。ＢＳＡ  ２００μｇ／ｍｌをプールしておいた酵素に再び添加して、これをＤＥＡＥセファロースカラム（２．５×４．５ｃｍ）に適用した。酵素を流し、ヒドロキシアパタイトカラムにすぐに適用した。酵素をホスホネート勾配液１０ｍＭ〜０．７Ｍ  ＫＰＯ４で溶離した。ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼを有する画分をプールし、貯蔵緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．２Ｍ  ＫＣｌ，５０％  グリセロール）で透析し、−７０℃で貯蔵した。上記精製法により、総収量４００，０００単位のＮｌａＩＩＩが得られた。精製したＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。明らかに分子量２７０００ダルトンを有するＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質は少なくとも９０％の純度であった（図５．注：６８０００ダルトンＢＳＡ蛋白質は、汚染蛋白質ではない。これをエンドヌクレアーゼを安定化するためにＮｌａＩＩＩ調製物に添加した。）。
【００６５】
この精製法から得られたＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、非特異的なエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。ＮｌａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度は、以下の基準に従ってチェックした。
【００６６】
１）連結：精製酵素でΦｘＤＮＡを２０倍過剰消化（２０−ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した後、産生したＤＮＡフラグメント９５％以上をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この３個の連結したフラグメントの内、９５％はＮｌａＩＩＩで再切断可能であった。
【００６７】
２）長時間の消化：Φｘ１７４  ＤＮＡ  １μｇ及び酵素２００単位を含む５０μｌ反応液を１６時間インキュベーション後、酵素１単位で１時間実施した反応と同一のＤＮＡバンドが生じた。
【００６８】
３）エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した３Ｈ  ＤＮＡ１μｇ（１０５ｃｐｍ／μｇ）を含む５０μｌ反応液中で、酵素２００単位を３７℃で４時間インキュベーション後、０．２１％の放射能が放出した。全試験は以下の反応緩衝液中で実施した：５０ｍＭ  酢酸カリウム，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，１ｍＭ  ジチオスレイトール。
【００６９】
実施例３
１．ｐＳＹＸ２０ベクターへのメチラーゼ遺伝子のクローニング：プラスミドｐＳＹＸ２０は、Ｋａｎｒ及びＴｃｒ遺伝子並びにｐＳＣ１０１複製開始点を保持する中コピー数プラスミドである。Ｔｃｒ遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子は、Ｔｃプロモーターから構成的に発現し得る。ｐＳＹＸ２０の構築は、実施例２に詳しく記載済みである。あるいは、ＣｏｌＥＩ及びｐ１５Ａと適合性である任意のプラスミドベクター、好ましくは、中コピー数ベクターは、メチラーゼ遺伝子のクローニングにも使用し得る。また、バクテリオファージベクターを使用して、メチラーゼ遺伝子をクローニングし、宿主ＤＮＡ修飾のために大腸菌宿主染色体に組み込むことも可能である。所望の制限部位を備えた２個のプライマーを使用して、プラスミドからまたはゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によりメチラーゼ遺伝子を増幅し得る。効率的なリボソーム結合部位、例えば、ＧＧＡＧＧＴは、ＡＴＧ開始コドンので７〜１０ｂｐ上流のプライマー中に作成し得る。ポリメラーゼ連鎖反応条件は、通常、９５℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で１〜２分間である。ＰＣＲ産物をフェノール−ＣＨＣｌ３で２回、ＣＨＣｌ３で２回抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。制限消化した後、ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。ベクターＤＮＡｐＳＹＸ２０を同一制限エンドヌクレアーゼで切断し、フェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。ｐＳＹＸ２０ベクターＤＮＡ及びメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを、１×連結緩衝液中で１６℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを必要により滅菌−蒸留水を添加して希釈し得、ＤＮＡ画分を使用して大腸菌細胞（ｍｃｒＡ−，ｍｃｒＢＣ−，ｈｓｄ−，ｍｒｒ−）を形質転換し、次いでＫａｎ（５０μｌ／ｍｌ）プレートにプレートした。Ｋａｎｒ形質転換細胞をプラスミドＤＮＡのミニプレパレーション及び制限消化により正しいサイズの挿入物に関してスクリーニングした。正しいサイズの挿入物を有するプラスミドを、完全な修飾を確認するために同種のエンドヌクレアーゼでチャレンジした。プラスミドを含むメチラーゼ遺伝子を使用して、例えばＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐＬｙｓＳ］細胞を形質転換し、ＬＢ寒天プレート＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ、Ｋａｎ  ５０μｇ／ｍｌにプレートした。Ｃｍｒ及びＫａｎｒ形質転換細胞が得られ、これを対応するエンドヌクレアーゼの発現用宿主として使用した。あるいは、無傷のメチラーゼ遺伝子を含む制限フラグメントを、制限部位（ＡａｔＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＣｌａＩ／ＢｓｐＤＩ，ＥｃｏＲＶ，ＢａｍＨＩ，ＳｐｈＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｈＡＩ，ＥａｇＩ，ＮｒｕＩ，ＢｓｐＭＩ，ＳｍａＩまたはＸｈｏＩ）を使用してｐＳＹＸ２０に直接クローニングし得る。
【００７０】
２．発現ベクターｐＳＹＸ２０への制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング：発現ベクターｐＳＹＸ２０は、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーターの上流のｒｒｍＢ転写ターミネーター、ｌａｃＩｑ遺伝子、翻訳融合クローニング用に２個の制限部位（ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ）を含む。ｐＳＹＸ２０の構築については実施例１に記載済みである。あるいは、ｐＳＹＸ２２の誘導体は、挿入物クローニング用にＮｃｏＩ、ＳｐｈＩ、ＢｓｐＨＩまたはＡｆｌＩＩＩ制限部位を含むように構築し得る。２個のプライマーは、第１のプライマーがエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始部分にアニールされたＮｄｅＩ部位及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の末端に相補的である第２のプライマー中に作成されたＳａｌＩ部位を含むように設計し得る。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばＶｅｎｔ（登録商標）でＰＣＲによりゲノムＤＮＡまたはプラスミドクローンから増幅し得る（９５℃１分間、５０℃２分間、７２℃１〜２分間、２０〜３０サイクル）。ＰＣＲ産物を、フェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した。ＤＮＡを再びフェノール−ＣＨＣｌ３及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈澱させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＮｄｅＩ／ＳａｌＩで処理したｐＳＹＸ２２に１６℃で一晩連結し得る。連結したＤＮＡを滅菌−蒸留水を添加して希釈し、この一部を使用して大腸菌細胞を形質転換し、Ａｐプレートにプレートした。個々の形質転換細胞をＬＢ＋Ａｐ２ｍｌに接種し、３７℃で一晩振蕩した。プラスミドＤＮＡを製造し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩ制限消化により分析し得る。あるいは、所望のエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む制限フラグメントを、ｐＳＹＸ２２発現ベクターのＴ７ｌａｃプロモーターの下流に直接クローニングし得る。正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを使用して、例えばＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ２０）メチラーゼ＋，ｐＬｙｓＳ］細胞を形質転換し、ＬＢ寒天プレート＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）にプレートした。大腸菌株ＢＬ２１（λＤＥ３）Δ（ｈｓｄ−ｍｒｒ−ｍｃｒＢＣ）［ｐ（ＳＹＸ２２）Ｒ＋，ｐ（ＳＹＸ２０）Ｍ＋，ｐＬｙｓＳ］を以下の如くエンドヌクレアーゼ産生に関して試験し得る。富裕ブロス培地２００〜１０００ｍｌ＋Ａｐ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ）に一晩増殖した細胞２ｍｌを接種し、Ｋｌｅｔｔ  ７５〜１００の細胞密度になるまで３７℃で振蕩し得る。ＩＰＴＧインデューサー（終濃度０．５ｍＭ）を培養物に添加し得る。この細胞を２〜１４時間誘導して収穫した。細胞を４℃、５０００×ｇで１５分間遠心分離してペレット化し、超音波緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に再懸濁させ、氷上で完全に細胞が溶解するまで超音波処理した。細胞片を４℃１５０００×ｇで３０分間遠心分離して除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液で希釈し、希釈抽出液１〜１０μｌを使用して、１×制限緩衝液中でλＤ���Ａまたは任意の基質ＤＮＡ１μｇを切断し得る。３７℃で１時間消化後、反応を停止溶液を添加して停止し、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ分析した。エンドヌクレアーゼの収量は、湿潤誘導細胞の１ｇ当たりで評価した。所望の制限エンドヌクレアーゼをイオン交換カラム、ゲル濾過またはアフィニティーカラムで精製し得る。精製した制限エンドヌクレアーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニング及び産生するためのスキームを示す図である。
【図２Ａ】ａａｔＩＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図２Ｂ】ａａｔＩＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図３Ａ】ａａｔＩＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図３Ｂ】ａａｔＩＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図４】ＩＰＴＧ−誘導及び未誘導細胞抽出物及び精製ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質を示す電気泳動写真である。矢印Ａ及びＢは、各々ＡａｔＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を示す。
【図５】ＩＰＴＧ−誘導及び未誘導細胞抽出物及び精製ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質を示す電気泳動写真である。矢印Ａ及びＢは、各々ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼ蛋白質及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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