【手続補正書】
【提出日】平成29年3月3日(2017.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの断片、またはＦｃドメインの変異体に融合したアぺリンペプチドを含む、ポリペプチドであって、前記アぺリンペプチドのＮ末端は、前記Ｆｃドメインまたはその断片もしくは変異体のＣ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して、融合される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記アぺリンペプチドは、アぺリン４２〜７７（アぺリン−３６）、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７）、アぺリン６３〜７７（アぺリン−１５）、アぺリン６４〜７７（アぺリン−１４）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１）、アぺリン６８〜７７（アぺリン−１０）、アぺリン７３〜７７（アぺリン−５）、アぺリン６１〜７６（アぺリン−Ｋ１６Ｐ）、アぺリン６１〜７５（アぺリン−Ｋ１５Ｍ）、アぺリン６１〜７４（アぺリン−Ｋ１４Ｐ）、アぺリン−Ｆ１３Ａ、アぺリン６５〜７６、アぺリン６５〜７５、アぺリン６６〜７６、アぺリン６７〜７６、アぺリン６６〜７５、アぺリン６７〜７５、および［Ｐｙｒ1］アぺリン−１３、またはその断片もしくは誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アぺリンペプチドは、アぺリン−１３、またはその断片もしくは誘導体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記アぺリンペプチド誘導体は、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アぺリンペプチドは、１つ以上のペプチドリンカーを介して、前記Ｆｃドメイン、またはその断片に融合される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アぺリンペプチドは、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、前記Ｆｃドメイン、またはその断片に融合される、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記アぺリンペプチドは、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、前記Ｆｃドメインまたはその断片のＣ末端に融合される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン；ならびにＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧヒンジドメイン、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２２を含むＩｇＧヒンジドメインを含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、二量体を形成することができる単量体融合ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、配列番号２を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２を含む前記アミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
アぺリンペプチドに対して血清安定性が増強されており、そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＰＬＮＲ活性化アッセイで測定した場合、１ｎＭ未満のＥＣ５０を示す、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むタンパク質。
【請求項２１】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結された、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２２】
配列番号２５のヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１９、２１および２２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２４】
前記核酸分子は、宿主細胞における発現に適した発現制御配列に作動可能に連結されて
おり、任意選択的に、前記発現制御配列は：（ａ）ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、ＨＩＶ  ＬＴＲ、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯハイブリッドプロモーター、およびＣＭＶ−ＭＩＥ／Ａｒｃハイブリッドプロモーターからなる群から選択されるプロモーター；ならびに／または（ｂ）ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動されるＴｅｔＲ−ＥＲLBDＴ２融合遺伝子、ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるブラストサイジン抵抗性遺伝子、およびＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動されるＡｒｃ−ＥＲLBDＴ２融合遺伝子からなる群から選択される発現カセット；ならびに／または（ｃ）ｂｌａ、ｂｌｓ、ＢＳＤ、ｂｓｒ、Ｓｈ
ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲ、およびｐａｃからなる群から選択される１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子；を含む、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１９、２１および２２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項２６】
請求項２３または２４に記載のベクターを含む、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記核酸は、前記細胞のゲノムに組み込まれ、任意選択的に、前記細胞は、タンパク質発現エンハンサーをコードする核酸、および／またはＸＢＰポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項２５または請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞は、真核細胞であり、任意選択的に、前記細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、上記細胞のいずれかに由来する細胞株、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される、前記細胞。
【請求項２９】
ＡＰＬＮ受容体（ＡＰＬＮＲ）の活性化を決定するためのプロセスであって、
ａ．ＡＰＬＮＲの活性化を可能にする条件下で、ＡＰＬＮＲを発現する細胞を試験分子と接触させることと、
ｂ．ＡＰＬＮＲ活性を測定することと、
ｃ．ステップ（ａ）と同じ条件下で、ＡＰＬＮＲを発現する細胞をアぺリンＦｃ融合タンパク質と別個に接触させることと、
ｄ．ステップ（ｂ）と同じ様式で、ステップ（ｃ）において前記細胞のＡＰＬＮＲ活性を測定することと、を含み、
ステップ（ｄ）におけるＡＰＬＮＲ活性の測定値と比較したステップ（ｂ）におけるＡＰＬＮＲ活性の測定値が、前記試験分子が前記ＡＰＬＮＲを活性化することを決定する、前記プロセス。
【請求項３０】
ステップ（ｄ）と比較してステップ（ｂ）においてより高いＡＰＬＮＲ活性の測定値は、前記試験分子がＡＰＬＮＲアゴニストであることを示唆する、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）におけるより高い活性の測定値は、約５０ｎＭ未満のＥＣ５０である、任意選択的に、約１ｎＭ未満のＥＣ５０である、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
ステップ（ａ）は、細胞を前記試験分子と前記アぺリンＦｃ融合タンパク質の両方と接触させることを含み、ステップ（ｄ）と比較してステップ（ｂ）においてより低いＡＰＬＮＲ活性の測定値は、前記試験分子がＡＰＬＮＲアンタゴニストであることを示唆する、
請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３３】
アぺリンペプチドを含む単離された融合タンパク質を作製する方法であって、
ａ．宿主細胞を、前記融合タンパク質をコードする核酸分子でトランスフェクトすることとであって、前記核酸分子は、ｉ）前記アぺリンペプチドのＮ末端で、アぺリンペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結されたヒトＩｇＧのＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列に融合された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、および、
ｂ．前記宿主細胞において（ａ）の核酸分子を発現させることによって前記融合タンパク質を作製することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記シグナルペプチドは、配列番号９を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質は、前記シグナルペプチドのＣ末端に融合されたペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を任意選択的に含む、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）の前記宿主細胞を培養するステップであって、前記宿主細胞は前記融合タンパク質を細胞培養培地に分泌する、前記ステップ；および、前記細胞培養培地から前記融合タンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記単離された融合タンパク質は、配列番号２、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記融合タンパク質は、二量体を形成することができる単量体融合ポリペプチドを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、上記細胞のいずれかに由来する細胞株、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
それを必要とする対象のアぺリンに関連する疾患または状態の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４１】
前記疾患または状態は、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、肥満、癌、転移性疾患、体液ホメオスタシス、のぼせ症、病的血管新生、網膜症、線維症、およびＨＩＶ感染からなる群から選択される、請求項４０に記載の使用。