(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒型のウシウィルス性下痢性（ＢＶＤ）ウィルスであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６の配列又はその縮重変異体を含んで成るゲノム核酸を有するウィルス。
【請求項２】
前記ウィルスがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６の配列又はその縮重変異体から本質的に成るゲノム核酸配列を有する、請求項１記載の弱毒型ＢＶＤウィルス。
【請求項３】
実質的に純粋な形態の請求項１記載のウィルス。
【請求項４】
請求項１記載のウィルスで感染された宿主細胞。
【請求項５】
請求項４記載の宿主細胞により生産された子孫ウィルス。
【請求項６】
請求項１記載の弱毒型ＢＶＤウィルス及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６の配列又はその縮重変異体を含んで成る核酸分子。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６の配列又はその縮重変異体から本質的に成る、請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
実質的に純粋な形態の請求項７記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸分子から本質的に成る独立のコード要素を含んで成るベクター。
【請求項１１】
プラスミドｐＢＶＤｄＮ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ２０３３５４）である、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項７記載の核酸分子又は請求項１０記載のベクターで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２記載の宿主細胞により生産された子孫ＢＶＤウィルス。
【請求項１４】
請求項７記載の核酸分子及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
【請求項１５】
反芻動物（ｃａｔｔｌｅ）において免疫応答を誘導する方法であって、請求項６又は１４記載のワクチンをＢＶＤウィルスによるその後の感染に対する保護免疫力を誘導するのに十分な用量で前記反芻動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項１６】
前記保護免疫力が体液性及び細胞媒介型免疫応答の双方に由来する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗体生産可能なヒトを除く動物においてＢＶＤウィルスに対する抗体の生産を誘導する方法であって、（ａ）請求項１記載のウィルス；（ｂ）請求項７記載の核酸分子；又は（ｃ）請求項１０記載のベクターを当該抗体生産を誘導するのに有効な用量で当該動物に投与することを含んで成る、方法。
【請求項１８】
前記抗体を反芻動物において生産させる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記動物から前記抗体を単離することを更に含んで成る、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は弱毒型のウシウィルス性下痢性（ＢＶＤ）ウィルスを、ウィルスゲノム内の特定の遺伝子を不活性化させることにより生産する方法に関する。この弱毒化ウィルス又はその突然変異ウィルスゲノムはＢＶＤウィルスに対する抗体を生産するため又は反芻動物（ｃａｔｔｌｅ）をウィルス感染症から守るようにデザインされたワクチンにおいて使用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ウシウィルス性下痢性（ＢＶＤ）ウィルスはペスチウィルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属及びフラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科に分類される。それはヒツジ及び古典型的なブタ熱病における周辺疾患（ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）を惹起するウィルスに近似する。感染した反芻動物は、高熱、下痢、せき及び消化器官粘膜の潰瘍を特徴とする「粘膜疾患」を示す（Ｏｌａｆｓｏｎ  ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．  ３６  ：  ２０５−２１３  （１９４６）  ；  Ｒａｍｓｅｙ  ら、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  ３４  ：  ６２９−６３３  （１９５３））  。ＢＶＤウィルスは妊娠した反芻動物の胎盤を横断することができ、そして永続感染（Ｐ１）した子ウシ等の誕生を招いてしまうことがある（Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ａｓｓｏｃ．  １５２  ：  ７６３−７６８  （１９６８）  ；  Ｒｏｓｓ  ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  １８８  ：  ６１８−６１９  （１９８６））  。これらの子ウシはこのウィルスに対して免疫寛容となっており、そしてその残りの命の間永続的ウィルス血症（ｖｉｒｅｍｉｃ）を有する。これらは粘膜病の突発の起源を司り（Ｌｉｅｓｓ  ら、Ｄｔｓｃｈ．  Ｔｉｅｒａｅｒｚｔｌ．  Ｗｓｃｈｒ．  ８１  ：  ４８１−４８７  （１９７４））、そして肺炎又は腸内疾患の如き疾患の原因となる微生物による感染に極めてかかり易くなる（Ｂａｒｂｅｒら、Ｖｅｔ．  Ｒｅｃ．  １１７  ：  ４５９−４６４  （１９９５））  。
【０００３】
ＢＶＤウィルスは２通りの生物型の一方を有するものとして分類される。「ｃｐ」生物型のものは培養細胞において細胞病理作用を誘導し、一方「ｎｃｐ」生物型のウィルスはそのようでない（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．  ５０  ：  ７３−７９  （１９６０））  。更に、２種類のゲノタイプ（Ｉ型及びＩＩ型）が認められており、共に様々な臨床症候群を惹起することが示されている（Ｐｅｌｌｅｒｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０３  ：  ２６０−２６８  （１９９４）  ；  Ｒｉｄｐａｔｈ  ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０５  ：  ６６−７４  （１９９４））。
【０００４】
ＢＶＤウィルスのゲノムは長さ約１２．５ｋｂであり、そしてその５′及び３′非翻訳領域（ＮＴＲ）の間に位置する単一のオープンリーディングフレームを含む（Ｃｏｌｌｅｔｔ  ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５  ：  １９１−１９９  （１９８８））。約４３８ｋＤのポリタンパク質がこのオープンリーディングフレームから翻訳され、そして細胞及びウィルスプロテアーゼによってウィルス構造及び非ウィルス構造タンパク質へとプロセシングされる（Ｔａｕｔｚ  ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１  ：  ５４１５−５４２２  （１９９７）  ；  Ｘｕら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１  ：  ５３１２−５３２２  （１９９７）  ；  Ｅｌｂｅｒｓら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０  ：  ４１３１−４１３５  （１９９６）  ；  及びＷｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４  ：  ３４１−３５０  （１９９１））。ウィルス酵素のうちでこのプロセシングに関与するものはとりわけプロテアーゼＮｐｒｏ  及びＮＳ３である。Ｎｐｒｏ  はウィルスオープンリーディングフレームによりコードされる第一のタンパク質であり、そしてそれ自体を合成ポリタンパク質の残りから切断する（Ｓｔａｒｋ  ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７  ：  ７０８８−７０９３  （１９９３）  ；  Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、Ｖｉｒｏｌ．  ６５  ：  ４５０８−４５１４  （１９９１））  。
【０００５】
ＢＶＤワクチンのうちで現状有用なものはウィルスが化学的に不活性化されたものである（ＭｃＣｌｕｒｋｉｎ  ら、Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５８  ：  １１９  （１９７８）  ；  Ｆｅｒｎｅｌｉｕｓら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３３  ：  １４２１−１４３１  （１９７２）；及びＫｏｌａｒ  らＡｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３３  ：  １４１５−１４２０  （１９７２））  。このようなワクチンは典型的には一次免疫を達成するために複数回の投与を必要とし、短期間の免疫力を供し、そして胎児伝染に対する保護を供しない（Ｂｏｌｉｎ，  Ｖｅｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍ．  Ｐｒａｃｔ．  １１  ：  ６１５−６２５  （１９９５））。ヒツジにおいて、精製されたＥ２タンパク質を基礎とするサブユニットワクチンが報告されている（Ｂｒｕｓｃｈｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５  ：  １９４０−１９４５  （１９９７））。残念ながら、かかるワクチンのうちの一つのみが胎児を感染から保護し、そしてこの保護は同族ウィルスのうちの１つの株に限られている。抗体力価とウィルス感染症からの保護との間での相関はない。
【０００６】
更に、ＢＶＤウィルスを利用して修飾型生存ウィルス（ＭＬＶ）ワクチンが作られているが、それはウシ又はブタ細胞内での反復継代により弱毒化される（Ｃｏｇｇｉｎｓ  ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．  ５１  ：  ５３９  （１９６１）；及びＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３６  ：  １３５  （１９７５））  、又はこのウィルスに温度感受性表現型を供与する化学誘導修飾により弱毒化されてしまう（Ｌｏｂｍａｎｎ  ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４５  ：  ２４９８  （１９８４）  ；  及びＬｏｂｍａｎｎ  ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４７  ：  ５５７−５６１  （１９８６））  。ＭＬＶワクチンの一回の投与が免疫のために十分であることが証明され、そして免疫力の持続期間は腫痘を受けた反芻動物において何年も延長できうる（Ｃｏｒｉａ  ら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃｏｎ．  Ｍｅｄ．  ４２  ：  ２３９  （１９７８））。更に、ＭＬＶ型ワクチンで腫痘の施された子ウシから交差保護が報告されている（Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｓ．  Ｗｏｒｋｅｒｓ’  Ａｎｉｍ．  Ｄｉｓ．  ７５  ：  １８３  （１９９４））  。しかしながら、安全性の問題、例えばウィルスの胎児伝染の可能性がこのようなワクチンの利用に関する大きな問題となっている（Ｂｏｌｉｎ．  Ｖｅｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍ．  Ｐｒａｃｔ．  １１  ：  ６１５−６２５  （１９９５））。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＢＶＤウィルスの流布を制御するための新規且つ有効なワクチンについての明確なニーズがある。このウィルスにより惹起される疾患が反芻動物の最も世界中に広がった且つ経済的に重要なものの一つとなっているため、かかるワクチンは牧場における著しい進歩を供するであろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は弱毒型ＢＶＤウィルスがＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の欠失又は不活性化により生産できるという発見に基づく。このようなウィルスはウシ細胞系におけるその野生型対応物よりもはるかに感染性が弱く、そして反芻動物のためのワクチンにおける使用に適当である。一のかかる弱毒化ウィルスの安全ゲノム配列を本明細書において開示し、そしてこのウィルスをコードするプラスミド、即ちｐＢＶＤｄＮ１がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ２０３３５４として寄託されている。
【０００９】
Ａ．ＢＶＤｄＮ１弱毒化ウィルスを基礎とする組成物及び方法
第一の観点において、本発明は特異的に弱毒化したＢＶＤウィルス株の開発を基礎とする。この株は野生型ウィルスゲノムを突然変異させてＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子を欠失させることにより作られ、そしてその全長配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １及び図２〜２４に示すｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６である。かくして、本発明はそこに示すゲノム配列を有するウィルス、そして好ましくはそれから本質的に成るウィルスに関する。通常、ＢＶＤウィルスはＲＮＡの形態におけるゲノムを有する。クローニングすると、これはより典型的にはＤＮＡの形態となるであろう。何らかのことわりのない限り、「核酸」なる語はＢＶＤウィルス性ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の双方を意味する。便宜上、添付の配列表はＤＮＡ配列のみを示しているが、各々の対応のＲＮＡ配列は当業者にとって容易に明らかとなるであろう。「から本質的に成る」とは配列が構造及び機能の双方の点で特定した配列と実質的に同じであることを意味する。かくして、本発明は表示の配列のみならず、非実体的な１もしくは複数個のヌクレオチドの付加又は置換（あるいは欠失）を導入することにより作製した対応の配列も含む。特に、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １と同じＢＶＤタンパク質をコードする縮重核酸配列を含む。この特定の配列、即ちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６及びそれがコードする対応のウィルスは、便宜上「ＢＶＤｄＮ１」ゲノム及びウィルスと命名した。ウィルスは大きな調製物の一部として、又は実質的に純粋な形態で、即ち、任意のその他のウィルス型のものを本質的に含まない態様で提供されうる。
【００１０】
本発明は本発明のＢＶＤｄＮ１核酸分子を担持する宿主細胞を含む。「宿主細胞」とはＢＶＤｄＮ１核酸分子を担持する任意の原核細胞、及びＢＶＤｄＮ１核酸分子を担持するウィルス又は何らかのもので感染された任意の真核細胞を含むことを意味する。原核細胞に関して、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳＴＢＬ  ２株（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）がこのプラスミドの増幅に関して最良の結果を供することが認められ、そして一般的に好ましいとされる。真核細胞に関しては、哺乳動物細胞、例えばＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２）及びＲＤ細胞（安定な形質転換精巣細胞）が一般的に好ましい。しかしながら、その他の培養細胞が同様に利用できうる。本発明は更にかかる宿主細胞において生産された子孫ウィルスを含む。
【００１１】
ＢＶＤｄＮ１ウィルスは動物を有効用量で、即ち、抗体生産を誘導するのに十分高い用量で感染させることによって抗体の生産を誘導するのに利用できうる。この抗体はこの目的のために通常利用されている任意の動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ）において作られることができるが、好ましくは抗体は反芻動物で作られるであろう。本明細書で用いる「ＢＶＤウィルスに対する抗体」とは、任意のその他の非ＢＶＤウィルスと比べＢＶＤウィルスの株に対して少なくとも１００倍超の親和力を有するという観点で優先的に反応する抗体を意味する。好適とはされないが、ウィルスは動物に抗体する前にホルマリン、パラホルムアルデヒド、フェノール、ラクトプロピオネート、プソラレン、プラチナ錯体、オゾン又はその他の殺ウィルス剤を利用して更に不活性化してよい。このような手順により作製した抗体はそれ自体本発明の範囲に含まれ、そして当業界において周知の技術を利用して単離できる（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）を参照のこと）。このような抗体はとりわけ、生物学又は実験室サンプル中のＢＶＤの存在を検定するようにデザインされた方法において利用できる。
【００１２】
別の観点において、本発明はＢＶＤｄＮ１ウィルス及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチンに関する。このワクチンは任意のアジュバント及びかかる調製物において典型的に使用されるその他の試薬を含みうる。免疫応答はこのワクチンを、ＢＶＤウィルスによるその後の負荷に対する保護免疫力を誘導するのに十分な用量で投与することにより反芻動物において誘導できうる。典型的には、このワクチンは非経口的に投与するが、その他の投与ルートも本発明に適応する。必要なら、２回以上の接種を規則的な間隔を置いて、例えば２〜８週間置いて付与することができる。当業界において周知の標準的な手順を免疫プロトコールを最適化するために利用できる。
【００１３】
Ｂ．ＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸を基礎とする組成物及び方法
最近の研究は動物に免疫原をコードする核酸を注射することによって有効なワクチンを調製することが可能であることを実証している。このような「ＤＮＡワクチン」を作製及び投与するための方法は詳細に発表されており（例えば米国特許第５，５８９，４６６；同５，５８０，８５９号；及び同５，７０３，０５５号を参照のこと）、そしてＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸に適用できる。かくして、別の観点において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １の配列のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６又はその縮重変異体を含んで成る好ましくは実質的に純粋な形態の核酸分子に関する。好適な態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １の配列のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６から本質的に成る好ましくは実質的に純粋な形態の核酸分子に関する。本明細書でいう「実質的に純粋な」核酸分子とは、他の夾雑核酸分子を本質的に含まず、そして典型的にはサンプル中に少なくとも８５重量％の当該核酸分子を含んで成り、更に高いパーセンテージが好適とされる。核酸の純度を決定するための一の方法は調製物をポリアクリルアミド又はアガロースの如きマトリックスで電気泳動することによる。純度は染色の後の単一バンドの出現により証明される。純度を評価するためのその他の方法にはクロマトグラフィー及び分析遠心分離が挙げられる。
【００１４】
ＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸は独立のコード要素としてベクターに組込むことができる。「独立のコード要素」とはウィルス性ポリペプチドへと翻訳されるベクターの部分を意味し、そして事実上はウィルスである。それはＢＶＤｄＮ１生成物を実質的に改変してしまう任意のその他の翻訳された要素を含まない点で独立である。このベクター又はＢＶＤｄＮ１核酸自体は子孫弱毒化ウィルスを生成するために宿主細胞をトランスフェクションするのに利用できる。
【００１５】
本発明は更に、ＢＶＤｄＮ１核酸、又はこの核酸を含むベクターを動物に直接注射することによるＢＶＤウィルスに対する抗体の生産方法も含む。抗体を作ることのできる任意の動物を利用してよいが、反芻動物が一般的に好ましい。このようにして作った抗体は本発明の一部を構成し、そして動物から精製することができ、そして例えば培養培地又は生物学的流体中のＢＶＤウィルスの存在を検定するようにデザインされたアッセイに利用されうる。
【００１６】
反芻動物に投与するためのワクチンは獣医学的に許容される担体との組合せにおいてＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸に基づいて調製でき（前述の文献を参照のこと）、そしてその後のウィルス感染に対する保護免疫力を誘導するために最適化された免疫プロトコールに利用される。
【００１７】
Ｃ．野生型ＢＶＤゲノムを突然変異させる方法
より一般的な観点において、本発明はゲノムを実質的に純粋な野生型ＢＶＤウィルスからそれをワクチンにおける使用のために適当なものとするように修飾する方法に関する。これとの関連で使用する「実質的に純粋」とは、好ましくは単一のＢＶＤウィルス株から成り、その他のタイプのウィルスが存在しないウィルス調製品を意味する。この手順の主たる際立った特徴はゲノム核酸が突然変異されてＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子が不活性化されている点にある。これとの関連で、遺伝子は、生成物ができない（例えばこの遺伝子が欠失している）、又はでき上がった生成物がもはやその正常な生物学的機能をもたない（例えばタンパク質分解切断）、又はでき上がった生成物がその正常な生物学的機能をもつが著しく低まった割合となっている場合のいずれかのときに不活性化されていると考える。Ｎｐｒｏ  プロテアーゼの不活性化をもたらす任意の方法を利用してよい。例えば、ゲノムＲＮＡを野生型ＢＶＤウィルスから単離し、逆転写させてｃＤＮＡを形成し、次いで標準の手順を利用してクローニングすることができる。次いで突然変異をＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の中に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、部位特異的突然変異誘発、Ｎｐｒｏ  が部分的もしくは完全に消失するようにＤＮＡフラグメントを合成及びライゲーションさせること、又は当業界に公知の化学突然変異原もしくは放射線に対する曝露等を含むランダム突然変異誘発技術の如き手順により、又はかかる手順の組合せにより導入することができる。
【００１８】
ＢＶＤウィルスゲノムをＮｐｒｏ  遺伝子が不活性化されるように修飾できたら、それを適当なベクターの中にクローニングし、そして大量生産することができる。前述の通り、ベクターはＢＶＤ配列を独立要素として、突然変異させた野生型ウィルスを含んで成る配列又はそれから本質的に成る配列を伴って含むべきである。突然変異されたＢＶＤゲノム又はそのゲノムを含んで成るベクターを、大量のウィルス性核酸又はウィルス自体を生産する目的で宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションすることができる。
【００１９】
ＢＶＤｄＮ１ゲノムＤＮＡとの関連で前述した通り、ＢＶＤウィルスに対する抗体は、前述したように状況で突然変異させた任意の野生型ＢＶＤウィルスゲノムを投与することによって動物において生産されうる。一般に、抗体生産は反芻動物において行われるのが好ましいが、その他の動物も同様に利用できる。
【００２０】
突然変異したＢＶＤゲノム核酸の組込まれたワクチンは標準のＤＮＡ免疫手順（例えば、米国特許第５，５８９，４６６；５，５８０，８５９；及び５，７０３，０５５号に論ぜられているもの）を利用して生産し、そして反芻動物における免疫応答を誘導するのに利用できる。ここに論ぜられている方法により作られたワクチン、抗体及び核酸は本発明の全体を構成する。
【００２１】
Ｄ．弱毒化ＢＶＤウィルスの作製方法
ＢＶＤウィルスの核酸をＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子が不活性化されるように突然変異させると、細胞培養においてはるかに弱い感染能の弱毒化ウィルスが生産されることが発見された。このような弱毒化ウィルスの比較的遅い複製は、急速増幅する野生型ウィルスでは可能でない状況で動物がその免疫防御を発揮することを可能にする。かくして、ＢＶＤｄＮ１について前述した突然変異したウィルスゲノムを生産するための方法は、ワクチンにおいて使用するのに適当なものとなるようにＢＶＤウィルスを弱毒化する一般的方法に直接結びつく。一般に、この手順は野生型ＢＶＤウィルスを単離し、そのゲノム核酸をクローニングし；そのクローニングした核酸を突然変異させてＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子を不活性化し；次いでこの突然変異させた核酸を宿主に形質転換又はトランスフェクションさせて弱毒化ウィルスを供することを包括する。突然変異を施すための上記の任意の方法が利用されるが、好適な方法はＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の全体又は一部の欠失であろう。
【００２２】
本発明は弱毒化ウィルスを作るための方法のみならず、そのウィルス自体、このウィルスにより感染された宿主細胞、及びこのような宿主細胞により生産された子孫ウィルスも包括する。弱毒化ウィルスに対する抗体は動物、好ましくは反芻動物を有効用量で感染させることにより作ることができる。このようにして作った抗体は本発明の一部を構成し、そして単離して診断手順、又は細胞培養物におけるＢＶＤの存在の検定のために利用されうる。
【００２３】
ＢＶＤｄＮ１ウィルスとの関連で論じた通り、不活性化Ｎｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子を特徴とする弱毒化ウィルスをワクチンに組込み、そして反芻動物における免疫応答を誘導するために利用されうる。用量及び免疫プロトコールは、動物の接種がその後のウィルス負荷に対する保護免疫力をもたらすように最適化されうる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
Ａ．ＢＶＤｄＮ１及び当該ウィルスをコードする核酸の生産
本発明はＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の欠失により弱毒化されたＢＶＤウィルスに関する。このウィルスはＢＶＤｄＮ１と命名し、そして「弱毒化」する語で示唆されている通り、それは感受性細胞系（例えばウシ精巣細胞系（ＲＤ）、ウシ腎細胞系（ＭＤＢＫ））において、その野生型対応物よりもｉｎ  ｖｉｖｏではるかに遅い速度で複製することが認められた。更に、ＢＶＤｄＮ１は胎芽ウシ気管細胞（ＥＢＴｒ）又はウシ鼻甲介細胞（ＢＴ−２）において生産性感染を引き起こさず、このことは野生型ウィルスによる感染を経て引き起こさせる生産性感染とは対照的でありうる。いく通りかの異なるウシ細胞系におけるＢＶＤｄＮ１ウィルスの遅い増殖力は動物における広域な組織向性弱毒化を示唆する。ＢＶＤｄＮ１は遺伝子的に安定であり、なぜならＮｐｒｏ  欠失はウシＲＤ細胞において１０回の継代まで維持されるからである。天然ウィルスのゲノムはＲＮＡから成るが、これをＤＮＡへ逆転写させ、そしてクローニングすることができる。本明細書における核酸及びＢＶＤウィルス配列についての言及はウィルス性ＲＮＡ配列に由来する逆転写ＤＮＡ配列及びその対応のＲＮＡ自体の双方を包括することが理解されるであろう。
【００２５】
ＢＶＤｄＮ１ウィルス性ゲノムの完全ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １のｎｔ３９〜ｎｔ１２１１６において示す。本発明はまさに示している配列を有するウィルスゲノムのみならず、構造又は機能の点で実体的に相違しないその他の配列、例えば遺伝子コードの縮重に基づきＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １と同じＢＶＤタンパク質をコードする配列も含む。更に、例えば部位特異的突然変異誘発の如き技術が核酸の構造の中に変異を導入するために利用できることが周知である。この方法もしくはその他の似かよった方法によって又は当業界に公知のランダム突然変異誘発によって導入されたＢＶＤウィルス核酸内の突然変異誘発は、得られるウィルスの少なくとも一の主要生物学的特徴がそれが誘導されたウィルスのそれと実質的に同一である限り、本発明に包括される。詳しくは、感染力の観点でＢＶＤｄＮ１の特徴を実質的に改変しない突然変異は本発明の範囲に属する。
【００２６】
突然変異させたＢＶＤｄＮ１核酸はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られたＢＶＤのナショナル・アニマル・ディシーズ・ラボラトリー（国立動物疾患研究所）（ＮＡＤＬ）株（ＶＲ−５３４）に由来する。これを下記の実施例に記載の通りにしてベクターの中に組込み、そして全長Ｎｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子を選択的ＰＣＲにより欠失させ、そして再ライゲーションさせる。この手順はウィルスゲノム及び最終的にはウィルス自体を得るために利用できるか、ｐＢＶＤｄＮ１と命名した完全ＢＶＤｄＮ１ゲノム配列を含むプラスミドをＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ２０３３５４として寄託し、そしてこれが単離手順のための好適な起源とされる。標準的な方法論がプラスミドを増幅及び精製し、そしてそれをウィルス生産を支持できる宿主細胞にトランスフェクションするのに利用できる。プラスミド増幅のために好適な原核宿主細胞はＥ．コリＳＴＢＬ２細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬより入手可能）であるが、その他の細胞タイプも利用できうる。このウィルスは真核細胞、例えばＲＤ又はＭＤＢＫ細胞において生産されることができ、公知の技術、例えばスクロース勾配遠心分離を利用して高度に精製された形態でそれから単離でき、そしてワクチンにおいて又は抗体を作製するために利用される。他方、ＢＶＤｄＮ１ゲノム配列を単離するためにプラスミドを使用でき、そしてこれは抗体又はワクチンの作製に直接使用できる。
【００２７】
Ｂ．その他の弱毒化ＢＶＤウィルス株の作製
ＢＶＤｄＮ１ウィルス及びゲノム核酸を作製するために利用する同じ基本的な手順をＢＶＤのその他の野生型株に関して利用できる。各ケースにおいて、野生型ウィルスを単離し、そして弱毒化はＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の不活性化により成し遂げられる。これは好ましくはＢＶＤｄＮ１について本明細書の中で論ずるＰＣＲベース戦略を利用して全体遺伝子を欠失させることにより成し遂げられる。しかしながら、例えば配列の一部の欠失又はランダムにもしくは特定の部位での突然変異の導入により遺伝子を不活性化させるその他の方法も利用できうる。全てのケースにおいて、その目的は感染後ゆっくりとした速度で増幅する突然変異ウィルスの提供にある。実施例の欄に記載の通り、ウィルスの感染力はＢＶＤウィルスに特異的なモノクローナル抗体を利用する免疫組織化学の実施によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定できうる。
【００２８】
Ｃ．弱毒化ＢＶＤウィルスに対する抗体の作製
ＢＶＤウィルスに対する抗体は抗体の生産のために一般的に利用されている任意の動物、例えばマウス、ウサギ等において生産されうる。しかしながら、抗体は反芻動物において生産するのが好ましい。当該ウィルスを含む組成物は動物に任意のルートにより投与してよいが、典型的には動物に筋肉的、皮下又は静脈内注射する。一般に、ウィルス調製物はアジュバント、例えばフロインドの完全又は不完全アジュバントを含むであろう。注射のために適当な調製物、注射のスケジュール等は当業界において周知であり、そして採用されうる（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８８）  ；  Ｋｌｅｉｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  （１９８２）  を参照のこと。モノクローナル抗体は標準の手順を利用しても調製できる（Ｋｅｎｎｅｔｔ  ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  （１９８０）  ；  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８４））  。
【００２９】
ＢＶＤウィルスに対して特異性をもって反応する抗体又は抗体のフラグメント（即ち、任意のその他のタイプのウィルスと比べＢＶＤに対して１００倍以上の親和力を有するもの）が任意の様々なイムノアッセイに利用できる。例えば、抗体は「二部位」又は「サンドイッチ」アッセイとしても知られるラジオイムノアッセイ又はイムノメトリーアッセイにおいてＢＶＤウィルスを検定するために利用できる（Ｃｈａｒｄ  「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  」Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｙ．  （１９７８）を参照のこと）。典型的なイムノメトリーアッセイにおいて、所定量の未ラベル抗体を検査する流体、例えば血液、リンパ液、細胞エキス等の中で不溶性である固相支持体に結合させる。固定化抗体に対する抗原の一次結合の後、所定量の検出可能式にラベルした第二抗体（これは最初のものと同一でもそうでなくてもよい）を加え、抗原の検出及び／又は定量を行う（例えば、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｋｉｒｋｈａｍら編  ｐｐ．１９９−２０６，  Ｅ  ＆  Ｓ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  （１９７０）  参照のこと）。このようなタイプのアッセイの数多くの変法が当業界において公知であり、そしてＢＶＤウィルスの検定のために採用できうる。
【００３０】
Ｄ．汎用ワクチン及び種痘手順
ＢＶＤウィルスを利用するワクチン及び種痘手順は数多くの文献において論じられている（例えば、Ｆｅｒｎｅｌｉｕｓ  ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３３  ：  １４２１−１４３１  （１９７２）  ；  Ｋｏｌａｒら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３３  ：  １４１５−１４２０  （１９７２）  ；  ＭｃＣｌｕｒｋｉｎら、Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５８  ：  １１９  （１９７８）  ；  Ｃｏｇｇｉｎｓら、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．  ５１  ：  ５３９  （１９６１）  ；  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ３６  ：  １３５  （１９７５）  ；  Ｌｏｂｍａｎｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４５  ：  ２４９８  （１９８４）  ；  Ｃｏｒｉａ  ら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｍｅｄ．  ４２  ：  ２３９  （１９７８）  ；  Ｍａｒｔｉｎ  ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｓ．  Ｗｏｒｋｅｒｓ  Ａｎｉｍ．  Ｄｉｓ．  ７５  ：  １８３  （１９９４）  ；  及び米国特許第４，６１８，４９３号参照のこと）。典型的には、ワクチンは０．５〜５ｍｌの容量において約１×１０６  〜約１×１０８  個のウィルス粒子を獣医学的に許容される担体と共に含むであろう。処方は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ、第１６版、（１９８２））に記載の方法を利用して実施することができる。本発明は様々な賦形剤及びアジュバントに適応し、そしてこれらは所望するなら調製物の中に組込んでよい。例えば、本発明のワクチン組成物は標準のバッファー、担体、安定剤、希釈剤、保存剤及び可溶化剤を利用して許容の方式に従って処方でき、そしてまた持放性を促進するために処方できうる。希釈剤には水、食塩水、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースがとりわけ挙げられる。安定剤にはとりわけアルブミンが挙げられる。アジュバントの非限定的な例にはＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、みょうばん、水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルション、油中水エマルション、例えばフロインドの安全及び不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）又はその他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、Ｅ．コリ由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換体等）、コレラ毒素又はムラミルジペプチドがとりわけ挙げられる。このワクチンは更に１又は複数種のその他の免疫調節因子、例えばインターロイキン、インターフェロン又はその他のサイトカインを含んで成ってよい。ワクチンは一般に非経口投与のためにデザインされるであろうが、本発明はその他の投与方式、例えば経口、鼻内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、直腸もしくは経膣投与による、又は併合ルートによる投与方式にも適応する。当業者は選定のルートに従ってワクチン組成物を容易に処方できるであろう。
【００３１】
免疫化手順は当業界に周知の手順を利用して最適化できる。一回の投与を動物に対して施してよいが、又は２〜１０日の間隔をあけて２回以上の接種をワクチンで施してもよい。所望するなら、接種を施した動物から血清を集め、そしてＢＶＤウィルスに対する抗体の存在について検査してよい。
「免疫応答の誘導」なる語等は本明細書では広義に、種痘に応答する反芻動物における任意の免疫を基礎とする応答、例えば抗体もしくは細胞媒介型免疫応答、又はその両者であってＢＶＤウィルスに対する種痘を施した動物の保護を担うものを含む。「保護免疫」、「保護免疫応答」、「保護」等の語は反芻動物におけるウシウィルス性下痢の絶対的予防、又はＢＶＤウィルスによる反芻動物の感染症の絶対的予防のみならず、種痘を施していない感染コントロール動物において認められるものと比較して、病原体による感染の度合もしくは率の任意の低下、又は病原体による感染に由来する病気の症度もしくは任意の症状もしくは状況の任意の低下をも意味する。
【００３２】
Ｅ．ＤＮＡワクチン
核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を利用するワクチン及び種痘手順を説明している文献には米国特許第５，７０３，０５５号、同５，５８０，８５９号、同５，５８９，４６６号、国際特許出願公報ＷＯ９８／３５５６２並びに様々な科学文献、例えばＲａｍｓａｙら、１９９７，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７５  ：  ３６０−３６３  ；  Ｄａｖｉｓ，  １９９７，  Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８  ：  ６３５−６４０  ；  Ｍａｎｉｃｋａｎら、１９９７，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７  ：  １３９−１５４  ；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  １９９７，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５  （８）  ：  ７８５−７８７  ；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ら、１９９６，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒ．  １２  （５）  ：  ４５５−４５７  ；  Ｌａｉ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  １９９８，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８  ：  ４４９−４８４；及びＶｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｒｖｅｒ，  １９９５，  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８  （３）  ：  ４０６−４１０  が挙げられる。これらは引用することで本明細書に組入れる。このような手順は、核酸がＢＶＤｄＮ１核酸に対応しているＢＶＤウィルスに対するワクチンを作るため、又はそのＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子もしくはその縮重変異体の不活性により弱毒化されている類似のＢＶＤウィルスゲノムを反芻動物に投与するために利用できうる。このような核酸分子を含むベクターも利用できうる。このようにして導入した免疫原は一般に体液及び細胞媒介型免疫応答を誘導する。
【００３３】
弱毒化ＢＶＤウィルスゲノムをコードするＤＮＡ又はＲＮＡをワクチンに利用できる。このＤＮＡ又はＲＮＡ分子は「むき出し」状で存在していてよく、又は細胞取り込みを促進する因子（例えばリポソーム又は陽イオン脂質）と共に投与してよい。典型的な投与ルートは約０．１〜約５ｍｌのワクチンの筋肉内注射であろう。ワクチン中の総ポリヌクレオチドは一般に約０．１μｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌとすべきであろう。ポリヌクレオチドは懸濁物、溶液又はエマルションの一部として存在していてよいが、水性担体が一般に好ましい。免疫は一回の接種の結果、又は複数回の接種により達成されうる。所望するなら、血清を接種を施した動物から集め、そしてＢＶＤウィルスに対する抗体の存在を検定してよい。
【００３４】
以下の実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
【実施例】
例１：アッセイ及び実験方法
ＤＮＡ
感染性全長クローンｐＶＶＮＡＤＬを図１に模式的に示す。このプラスミドはｐＧＥＭ４（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）由来のＣｏｌＥ１レプリコンを含み、そして長さ１４，５７８ｂｐである（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１  ：  ４７１−４７８  （１９９７））。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＢＶＤウィルスゲノムの上流に挿入されており、そしてこのプロモーターはウィルス性ＲＮＡ合成を指令できる。ＢＶＤウィルスゲノムの配列はＢＶＤウィルスのＮＡＤＬ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３４）から誘導した。
【００３６】
Ｅ．コリにおけるｐＶＶＮＡＤＬの増幅
一般に、Ｅ．コリ内での全長ｐＶＶＮＡＤＬクローンの増幅は困難であることが証明されている。Ｅ．コリ内での増殖の際の長いペスチウィルスｃＤＮＡ及び全長クローンの有害な効果が今まで認識されていた（Ｍｏｏｒｍａｎｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０  ：  ７６３−７７０  （１９９６）  ；  Ｒｕｇｇｌｉｅ  ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０  ：  ３４７８−３４８７  （１９９６））。ｐＶＶＮＡＤＬの安定性をＥ．コリＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）；及びＳＴＢＬ２細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）等のいくつかの細菌宿主で試験した。このような株のそれぞれにおけるプラスミドＤＮＡの形質転換の後、コロニーサイズをモニターし、そして大まかなプラスミド構造を制限マッピングにより分析した。最良の結果はＳＴＢＬ２細胞により得られた。このような細胞へのｐＶＶＮＡＤＬの形質転換は比較的均質な小コロニー集団を供し、制限増殖条件下（３０℃で２０時間以内）でＤＮＡ転位の徴候はなく、妥当なＤＮＡ収量が得られた。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及びＲＮＡトランスフェクション
ＲＮＡ転写体をＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、その製造者のプロトコールに従ってＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ｐＶＶＮＡＤＬ  ＤＮＡ鋳型をＳａｃＩＩで線形にし、そしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して３′突き出しを除去した。転写反応生成物をゲル電気泳動により分析した。１〜５μｇの転写ＲＮＡを６μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に加え、そしてＲＮＡ／脂質サンプルを室温で１０〜１５分インキュベーションした。その間、６ウェルプレート中で増殖させたＭＤＢＫ（ＭａｄｉｎＤａｒｂｙウシ腎細胞（クローン６））又はＲＤ（安定形質転換ウシ精巣細胞系）単層（集密度５０〜６０％）をＲＮＡ非含有ＰＢＳで２回、そしてＯｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗った。最後の洗浄の後、トランスフェクション混合物を各ウェルに加え、それを室温で１０分間軽く揺らしながらインキュベーションした。次いでそのウェルに１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加え、そして３７℃で更に３時間インキュベーションした。５％の胎児ウマ血清（ＲＤ細胞用）又は脂質ウシ血清（ＭＤＢＫ細胞）を含む３ｍｌの容量のＯｐｔｉ−ＭＥＭを各ウェルに加えた。３７℃で１〜４日間のインキュベーションの後、細胞を８０％のアセトンで固定し、そして免疫組織化学アッセイを実施してＢＶＤウィルスプラークの視覚化を助長した。
【００３８】
例２：Ｎｐｒｏ  遺伝子欠失ＢＶＤウィルスクローンの構築
Ｎｐｒｏ  遺伝子がそのゲノムから欠失したＢＶＤウィルスを構築するため、まず３つのＤＮＡフラグメントを作製し、次いで互いとライゲーションさせた。正確な手順は下記の通りである。
【００３９】
ＰＣＲフラグメントＩの作製
Ｎｐｒｏ  のコード配列の欠失を含むように「ＰＣＲフラグメントＩ」をデザインした。３回のＰＣＲ増幅をこのフラグメントの作製に包含させた。第一の増幅においては、プライマー５ＮＴＲ３（＋）及び５ＮＴＲ４（−）をＮｐｒｏ  コード配列の上流の５′ＮＴＲ領域の片側を増幅するために用いた。５′ポジティブセンスプライマー５ＮＴＲ３（＋）は次の配列を有する：５′ａａａｇｇｔｃｔｃｇａｇａｔｇｃｃａｃｇ−３′（オリゴヌクレオチド２１８−２３７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ２）。３′ネガティブセンスプライマー５ＮＴＲ４（−）は次の配列を有する：５′−ｇｔｃｔｇａｃａｔｇｔｇｃｃａｔｇｔａｃａｇｃａｇａｇａｔｔｔｔｔａｇｔａｇｃ  −３′（オリゴヌクレオチド８９５−８９０＋３８８−３５６，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ３）。両プライマーはウィルスゲノムの５′ＮＴＲ領域に位置し、そしてプライマー５ＮＴＲ３（＋）は固有の制限酵素部位ＸｈｏＩを含む。プライマー５ＮＴＲ４（−）はその５′末端において６個の追加オリゴヌクレオチドを含み、それはＢＶＤウィルスＣプロテインのコード配列の５′末端と相同性である。ＰＣＲ増幅はプライマーを０．５μＭの最終濃度において、鋳型としての１０ｎｇのプラスミドｐＶＶＮＡＤＬ  ＤＮＡ及び２．５単位のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて実施した。下記の条件を利用して２０サイクルの増幅を実施した：９４℃で３０秒の変性；５５℃で１分のアニーリング；及び７２℃で２分の伸長。アガロースゲル電気泳動による精製の後、得られる１７７塩基対フラグメント（フラグメントＡ）をＴＥバッファーの中に再懸濁した。
【００４０】
第二のＰＣＲ増幅はＮｐｒｏ  コード配列の下流のフラグメントを増幅するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドＮＡＤＬＣ６（＋）及びＳｅｑ２３（−）を用いて実施した。５′ポジティブセンスプライマーＮＡＤＬＣ６（＋）は次の配列を有する：５′−ｃａｃａｔｇｔｃａｇａｃａｃｇａａａｇａａｇａｇｇｇａｇｃ  −３′（オリゴヌクレオチド３８３−３８８＋８９０−９１３，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ４）。３′ネガティブセンスプライマーＳｅｑ２３（−）は次の配列を有する：５′ｃａｇｇｔｔｔｇｃａａｔｃｃａａｇｔｇｃｃｃ−３′（オリゴヌクレオチド２４８０−２４５９，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ５）。プライマーＮＡＤＬＣ６はタンパク質ＣのＮ末端に位置する。それは５′ＮＴＲの３′末端に相同性な３個の追加のヌクレオチドを含み、そして開始コドンＡＴＧは５′末端に位置する。プライマーＳｅｑ２３（−）はタンパク質Ｅ２のＮ末端付近に位置する。プラスミドｐＶＶＮＡＤＬを増幅反応における鋳型として用い、そして条件は前述のものと同じとした。得られるＤＮＡフラグメント（フラグメントＢ）はアガロースゲル電気泳動により精製し、そして１５９６ｂｐのサイズを有した。
【００４１】
第三の増幅はオリゴヌクレオチド５′ＮＴＲ３（＋）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ２）及びＳｅｑ２３（−）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ５）をプライマーとして０．５μＭの濃度で、鋳型としてフラグメントＡ及びＢ（０．５μｇ）、並びに２．５単位のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて実施した。最初の４サイクルの増幅については条件は次の通りとした：９４℃で３０秒の変性、４０℃で１分のアニーリング；及び７２℃で２分の伸長。これに次の条件の２０回のサイクルを続けた：９４℃で３０秒の変性；６０℃で１分のアニーリング；及び７２℃で２分の伸長。これは１７６７ｂｐのサイズを有する「ＰＣＲフラグメントＩ」と命名する最終生成物を供した。このフラグメントをＸｈｏＩ及びＰｖｕＩで消化し、ライゲーションの前に利用する１１７５ｂｐのフラグメントを形成した。
【００４２】
ＰＣＲフラグメントＩＩの作製
「ＰＣＲフラグメントＩＩ」はプライマーとしてオリゴヌクレオチドＳｅｑ２（＋）及びＳｅｑ２４（−）を用いて作製した。５′ポジティブセンスプライマーＳｅｑ２（＋）の配列は下記の通りである：５′−ｇｇａｇｃａｔａｃｇｃｔｇｃｔｔｃｃｃｃ−３′（オリゴヌクレオチド１８６５−１８８４，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ６）。３′センスプライマーＳｅｑ２４（−）は次の配列を有する：５′ｇｃｃｔｔｇｃｃｔａｔｇａｇｇｇａａｔｇｇ  −３′（オリゴヌクレオチド２９６３−２９４２，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ７）。オリゴヌクレオチドＳｅｑ２（＋）はＥ１のＮ末端付近に位置し、そしてオリゴヌクレオチドＳｅｑ２４（−）はＥ２領域の中央付近に位置する。増幅は鋳型としてプラスミドｐＶＶＮＡＤＬ  ＤＮＡを用い、フラグメントＡ及びＢを利用する増幅との関連で上記した条件で実施した。「ＰＣＲフラグメントＩＩ」と命名する得られるフラグメントは１０９８ｂｐのサイズを有した。それをＰｖｕＩ及びＲｓｒＩＩで消化し、ライゲーションの前に利用する長さ９２９ｂｐのフラグメントを形成した。
【００４３】
ベクターフラグメントＩＩＩ  の作製
１４５７９ｂｐのプラスミドｐＶＶＮＡＤＬをＸｈｏＩ及びＲｓｒＩＩで消化し、長さ１１９７４ｂｐのフラグメントを得た。これを「ベクターフラグメントＩＩＩ  」と命名した。
【００４４】
プラスミドｐＢＶＤｄＮ１の作製
ＰＣＲプラスミドＩ及びＩＩ並びにベクターフラグメントＩＩＩ  を２：２：１の分子比で一緒に混合し、そして２００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で１６℃で一夜かけてライゲーションした。このライゲーション生成物を次にＥ．コリＳＴＢＬ２細胞に形質転換し、そして異種コロニーをミニーＤＮＡ精製及び特異的制限酵素分析によりスクリーニングした。予測のサイズ（１４０７９ｂｐ）を有するプラスミドを配列分析により更に分析した。得られるプラスミドｐＢＶＤｄＮ１を図１Ｂに示し、そしてＢＶＤウィルスゲノムからのＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子の予測の欠失を含んだ。ｐＢＶＤｄＮ１についてのベクターバックグランドはｐＶＶＮＡＬについてのそれと同じである。
【００４５】
例３：Ｎｐｒｏ  遺伝子欠失ＢＶＤウィルスクローンの特性決定
Ｎｐｒｏ  遺伝子欠失ＢＶＤウィルスクローンｐＢＶＤｄＮ１の感染能
ｐＢＶＤｄＮ１及びｐＶＶＮＡＤＬ（陽性コントロール）由来のＲＮＡを前述の通りにしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、そしてＲＮＡトランスフェクションをＲＤ細胞単層に対してＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを用いて実施した。トランスフェクションして４８，７２及び９６時間後、上清液をトランスフェクション化細胞から集め、そして新たなＲＤ単層を再感染するのに用いた。トランスフェクション化細胞を８０％のアセトンで固定し、次いでＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＥｌｉｔｅＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫組織化学アッセイを実施した。ＢＶＤ特異的ウィルスタンパク質を検定するために用いたモノクローナル抗体は１５Ｃ５（ＥＯに対して特異的）及びＣＡ３（Ｅ２に対して特異的）（ファイザー社内）としたが、これらの抗原に対して生起させたその他のモノクローナル抗体が標準の技術により調製でき、そしてこれらと同じ手順に用いることができる。これらの抗体は１：１０００の希釈率で使用した。エンベロープタンパク質Ｅ０及びＥ２が検出され、そしてウィルスは親ウィルスに由来するＲＮＡによるトランスフェクションの２４時間後に生産された。対照的に、ウィルスタンパク質Ｅ０及びＥ２はｐＢＶＤｄＮ１に由来するＲＮＡで処理した細胞においてトランスフェクション後４８時間目にはじめて検出された。ＢＶＤｄＮ１ウィルスはトランスフェクション後７２時間まで取り出すことができなかった。
【００４６】
表現型分析
早期継代ＢＶＤｄＮ１ウィルスストック（３継代目）をＲＤ及びＭＤＢＫ細胞単層の接種のために用いた。これらの細胞を親ウィルスを接種したコントロールと比較した。細胞単層をトランスフェクション後２０時間（ＲＤ細胞）目又はトランスフェクション後２４時間（ＭＤＢＫ細胞）目において８０％のアセトンで固定した。固定細胞を次にＥ２特異的モノクローナル抗体ＣＡ３により１：１０００の希釈率で免疫組織化学により分析し、そして顕微鏡観察した。両方の細胞タイプについて、親ウィルス複製がＢＶＤｄＮ１ウィルスにより示される複製速度よりも有意に速いことが認められた。
【００４７】
ゲノタイプ分析
親ウィルス及びＢＶＤｄＮ１（３継代目）の双方のＲＮＡをＵｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ試薬（Ｂｉｏｔｅｃｔ）を用い、その製造業者の仕様書に従って感染ＲＤ単層から精製した。ＲＴ／ＰＣＲ実験をＲＴ−ＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）並びにオリゴヌクレオチドＮＡＤＬＥ０７（−）及び５ＮＴＲ３（＋）を用いて実施した。５ＮＴＲ３（＋）オリゴヌクレオチドの配列及び位置は前述の通りである。オリゴヌクレオチドＮＡＤＬＥ０７（−）の配列は下記の通りである：５′−ｃａｃｔｔｇｃａｔｃｃａｔｃａｔａｃｃ  −３′（ネガティブセンス、オリゴヌクレオチド１３７９−１３６１，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ８）。このオリゴヌクレオチドはＥＯのＮ′末端から約１５０ｂｐに位置する。親ＲＮＡ由来のＲＴ／ＰＣＲはサイズが１１６２ｂｐのフラグメントを生み出すことが認められた。ＢＶＤｄＮ１  ＲＮＡ由来のＲＴ／ＰＣＲはサイズ６６１ｂｐのフラグメントを生み出し、これはＮｐｒｏ  プロテアーゼ遺伝子が欠失したフラグメントについて予想された通りである。親及びＢＶＤｄＮ１  ＲＮＡの双方から作製したＲＴ／ＰＣＲフラグメントを配列決定した。双方のケースにおいて、得られた配列は予測通りであり、そして図１に示す要素の配位と対応した。ＢＶＤｄＮ１の完全配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  １においてｎｔ３９〜１２１１６で示す。
【００４８】
例４：ＢＶＤｄＮ１効能研究
本研究の目的はＢＶＤｄＮ１を含んで成るワクチンの子ウシにおけるセロコンバーションを及ぼす能力の評価にある。１５頭の動物（１０頭は２投与種痘、そして５頭は対照（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ））をランダムに第一室に割り当てた。他に１０頭の動物を第二室に割り当てた（１投与種痘、対照なし）。ＢＶＤｄＮ１ウィルスを動物に、２．０ｍｌのＭＤＢＫ細胞リゼート中で１０７  ＴＣＩＤ５０／動物の用量にて皮下投与した。免疫する日に、５頭の表示した対照動物をそれらの室から取り出した。残りの１０頭の子ウシによりＢＶＤｄＮ１ウィルスに種痘した。免疫後約２４時間してから、対照動物を処置室にもどした。２回目のワクチン投与を最初の１０頭の動物に、１回目の投与の約２８日後に同じようにして施した。
【００４９】
直腸温度を−１，０（種痘前），１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０日目（全グループ）に、そして２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７及び３８日目（２投与グループの動物）においてとった。血液サンプルを２投与グループの動物から０日目並びにその後毎週（７，１４，２１，２８，３５，４２，４９，５６，６３，７０，７７，８４及び９１日目）採取した。１投与グループの動物からは血液サンプルを０，７，１４，２１，２８，３５，４２，４９，５６及び６３日目に採取した。
【００５０】
期待の同族及び異種性保護を追跡するため、血清中和抗体をＳＮアッセイにより検定した（Ｉ型についてはＢＶＤウィルス単離５９６０、そしてＩＩ型については単離体８９０）。
【００５１】
一般観察又は直腸体温のいずれについても有意な変動は認められなかった。どの対照動物も研究の間セロコンバーションしなかった（データーは示さない）。
【００５２】
ＢＶＤｄＮ１ウィルス種痘動物は全て、Ｉ型血清中和アッセイによる決定に従い、セロコンバーションした。一回の投与種痘の後、６０％の動物が２８日目に１：８以上の陽性力価に達し；そして９０％の動物が３５日目に１：８以上の陽性力価に達し、その後高力価を保った（図２５Ａ）。ＩＩ型血清中和アッセイにおいては、７０％の動物が種痘後６３日目に陽性に達した（データーは示さない）。２投与種痘の後、動物は全てＩ型血清中和アッセイにより示される通り７日目に１：６４以上の陽性力価に達し、そしてその後類似のセロコンバーションレベルを維持した（図２５Ａ）。ＩＩ型血清中和アッセイに関しては、ほとんどの動物が２回目の種痘後７日目において陽性力価を有し、そして６０％以上の動物が２８日目に１：８以上の陽性力価に達した（図２５Ｂ）。これらの結果はＢＶＤｄＮ１ウィルスが反芻動物において複製でき、そして１型及び２型ウィルスの双方に関して陽性中和血清を誘導できることを示唆し、これはこのウィルスのＢＶＤＶ予防のための種痘剤としての利用を裏付する。
【００５３】
生物材料の寄託
プラスミドｐＢＶＤｄＮ１はカメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ  Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０，ＵＳＡに１９９８年１０月２０日に寄託し、そして受託番号ＡＴＣＣ  ２０３３５４が付与された。
【配列表】
0003602759.tif 000002
0003602759.tif 000003
0003602759.tif 000004
0003602759.tif 000005
0003602759.tif 000006
0003602759.tif 000007
0003602759.tif 000008
0003602759.tif 000009
0003602759.tif 000010
0003602759.tif 000011
0003602759.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】パネルＡはプラスミドｐＶＶＮＡＤＬの模式図を示す。このプラスミドは突然変異され、オープンリーディングフレームの第一遺伝子、即ち、Ｎｐｒｏ  プロテアーゼの遺伝子が欠失されている。得られる突然変異したプラスミド生成物ｐＢＶＤｄＮ１をパネルＢに模式的に示す。いくつかのその他の遺伝子領域も示す。ＣはゲノムＲＮＡをパッケージングし、そしてウィルス性ビリオンを形成する構造コアタンパク質をコードする遺伝子を表わす。これに３つのエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子、Ｅ０，Ｅ１及びＥ２が続く。Ｐ７は未知の機能をもつ非構造タンパク質をコードし、それに「ＮＳ２−挿入−ＮＳ３」と命名する領域が続く。ＮＳ２は亜鉛フィンガーモチーフを有する高度に疎水性なタンパク質をコードする。ＮＳ３は親水性であり、そして細胞病理ＢＶＤウィルスのマーカーである。感染動物におけるｎｃｐウィルスの複製は、ＮＳ２とＮＳ３コード領域との間での追加のウィルス性又は細胞性ＲＮＡ配列の挿入が関与する遺伝子組換を通じてｃｐ生物型へとウィルスを変換させることができる。組換の結果、遊離のＮＳ２及びＮＳ３タンパク質が放出される。後者ＮＳ３は、行われるほとんどの非構造タンパク質プロセシングを司るプロテアーゼである。ＮＳ４ＡはＮＳ３の隣りに位置し、そしてＮＳ３プロテアーゼ活性のための補因子をコードすることで知られる。ＮＳ４Ａの後に、機能の未知なウィルスタンパク質をコードする２種類の遺伝子ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ａがある。最後の遺伝子ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、そしてウィルス複製を司る。パネルＢに示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：  ９）はｐＢＶＤｄＮ１の開始コドンの周囲配列である。
【図２】プラスミドｐＢＶＤｄＮ１の完全ヌクレオチド配列の第１部である。ＢＶＤｄＮ１のゲノム配列はヌクレオチド３９〜１２，１１６で示されている。
【図３】図２の続き。
【図４】図３の続き。
【図５】図４の続き。
【図６】図５の続き。
【図７】図６の続き。
【図８】図７の続き。
【図９】図８の続き。
【図１０】図９の続き。
【図１１】図１０の続き。
【図１２】図１１の続き。
【図１３】図１２の続き。
【図１４】図１３の続き。
【図１５】図１４の続き。
【図１６】図１５の続き。
【図１７】図１６の続き。
【図１８】図１７の続き。
【図１９】図１８の続き。
【図２０】図１９の続き。
【図２１】図２０の続き。
【図２２】図２１の続き。
【図２３】図２２の続き。
【図２４】図２３の続き。
【図２５】ＢＶＤｄＮ１ウィルスの投与に応答する反芻動物におけるセロコンバーションを実証するデーター。
【図１】
0003602759.tif 000013
【図２】
0003602759.tif 000014
【図３】
0003602759.tif 000015
【図４】
0003602759.tif 000016
【図５】
0003602759.tif 000017
【図６】
0003602759.tif 000018
【図７】
0003602759.tif 000019
【図８】
0003602759.tif 000020
【図９】
0003602759.tif 000021
【図１０】
0003602759.tif 000022
【図１１】
0003602759.tif 000023
【図１２】
0003602759.tif 000024
【図１３】
0003602759.tif 000025
【図１４】
0003602759.tif 000026
【図１５】
0003602759.tif 000027
【図１６】
0003602759.tif 000028
【図１７】
0003602759.tif 000029
【図１８】
0003602759.tif 000030
【図１９】
0003602759.tif 000031
【図２０】
0003602759.tif 000032
【図２１】
0003602759.tif 000033
【図２２】
0003602759.tif 000034
【図２３】
0003602759.tif 000035
【図２４】
0003602759.tif 000036
【図２５】
0003602759.tif 000037