(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイタケの菌糸、菌糸培養物若しくは/及び菌床を、PCBで汚染された土壌または水域に投与することにより、PCBを分解処理することを特徴とするPCB分解処理方法。
【請求項２】
マイタケがマイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans）、チョレイマイタケ（Grifola umbellatus）、トンビマイタケ（Grifola gigantea）のいずれか１以上であることを特徴とする請求項１記載のPCB分解処理方法。
【請求項３】
マイタケの菌糸、菌糸培養物若しくは/及び菌床を、PCBで汚染された土壌または水域に投与するにあたり、投与時あるいはその前後にリグノスルホン酸若しくはリグニン含有物質のスルホン酸化物を添加若しくは投与することを特徴とするPCB分解処理方法。
【請求項４】
マイタケ栽培後の廃菌床を、PCBで汚染された土壌または水域に投与することにより、PCBを分解処理することを特徴とするPCB分解処理方法。
【請求項５】
マイタケ栽培後の廃菌床を、PCBで汚染された土壌または水域に投与するにあたり、投与時あるいはその前後にリグノスルホン酸若しくはリグニン含有物質のスルホン酸化物を添加若しくは投与することを特徴とする請求項４記載のPCB分解処理方法。
【請求項６】
マイタケ栽培後の廃菌床を、そのまま、適当な大きさのブロックに切断、あるいは小片乃至粉状とし、PCBで汚染された土壌に敷設、埋設若しくは散布することを特徴とする請求項４または５記載のPCB分解処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食用キノコの菌糸、菌糸培養物、菌床若しくは／及び栽培後の廃菌床を利用した有害環境汚染物質分解処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の環境調査により有害で難分解性な芳香族化合物の広範囲な汚染が明らかにされ、これらの環境汚染物質の生態系に与える悪影響が懸念されている。これらの難分解な化学物質は微生物による分解を受けにくいため汚染された土壌や水域において長期に渡り残留蓄積しており、汚染された環境を修復するための有害環境汚染物質分解処理技術の開発が強く望まれている。
【０００３】
汚染環境を修復する技術には土壌中の微生物の分解能力を高めて汚染物質を分解、無害化する技術が開発されており、これは生態系の自浄能力を強化することにより汚染物質の分解を促進することを狙いとしている。しかしながら、汚染物質の土壌中での濃度が高い場合や、汚染物質が極めて難分解な物質である場合、生態系の自浄作用だけでは十分な効果が得られない場合が多い。
生態系の自浄作用だけでは十分な浄化が認められない場合は、汚染物質を分解する能力を有する有用微生物を積極的に汚染サイトに投与する方法も考えられる。
【０００４】
実際に下水処理場等の閉鎖系では活性汚泥等の微生物が積極的に利用され効果を挙げている。しかしながら、開放系への分解微生物の放出はパブリックアクセプタンスの問題から容認されていないのが実状である。近年、半導体工場等の地下水域でトリクロロエチレンやテトラクロロエチレン等の有害化学物質による広範囲で高濃度の汚染が明らかにされているが、これらのケースでも栄養源の供給等による土着微生物の自浄作用の活性化にとどめられ、十分な効果が認められていない。
【０００５】
有機塩素化合物、特に塩素化芳香族化合物の中でも極めて難分解性なポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢ）による汚染の場合、ポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＰＣＤＤ）やポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）等ダイオキシン類と同様に、自然界の微生物による分解を受けにくいため、分解能力を有する有用微生物の積極的な利用が必要である。これまでに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属等のＰＣＢを分解する細菌群が自然界から単離されてきたが、これらのＰＣＢ分解菌はそのほとんどが塩素置換数の多い（例えば４塩素置換以上）ＰＣＢに対する分解能力が低く、限られた構造のＰＣＢを分解するのみであった。
【０００６】
また、近年、一部のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌が高塩素置換までのＰＣＢ異性体を分解することが確認されたが、高濃度のＰＣＢ（例えば１００ｐｐｍ）の添加により菌体増殖およびＰＣＢ分解能が完全に阻害されることも明らかにされ、微生物による環境修復の実用化における問題点が指摘されてきた（Ｍ．Ｓｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１１，ｐ１３０５−１３０８（１９９６））。
【０００７】
更に、微生物によるＰＣＢもしくはダイオキシン類分解において特に問題となるのは、様々な置換塩素数および置換塩素位置から成る混合物であることから（理論上ＰＣＢは２０９種類、ダイオキシン類のＰＣＤＤ、ＰＣＤＦは合わせて２１０種類）、既に確認されている分解微生物の持つ基質特異性の限られた分解酵素を利用したＰＣＢもしくはダイオキシン類処理だけでは、処理されない残留成分が多いため環境浄化への適用において不十分であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、人体および生態系に悪影響を与えることなく、土壌または水域における有害環境汚染物質の除去を達成できる方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【議題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、食用キノコの菌糸、菌糸培養物、菌床、特に栽培後の廃菌床が有効であることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）食用キノコの菌糸、菌糸培養物若しくは／及び菌床を、汚染された土壌または水域に投与することにより、汚染物質を分解処理することを特徴とする有害環境汚染物質分解処理方法、
【００１０】
（２）食用キノコがマイタケ、シイタケ、ブナシメジ、エノキタケのいずれかであることを特徴とする（１）記載の有害環境汚染物質分解処理方法、
（３）マイタケがマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、白マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、チョレイマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ）、トンビマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｅａ）のいずれか１以上であることを特徴とする（２）記載の有害環境汚染物質分解処理方法、
（４）汚染物質が有機塩素化合物であることを特徴とする（１）記載の有害環境汚染物質分解処理方法、
【００１１】
（５）有機塩素化合物がＰＣＢ及び／又はダイオキシン類であることを特徴とする（４）記載の有害環境汚染物質分解処理方法、
（６）食用キノコの菌糸、菌糸培養物若しくは／及び菌床を、汚染された土壌または水域に投与するにあたり、投与時あるいはその前後にリグノスルホン酸若しくはリグニン含有物質のスルホン酸化物を添加若しくは投与することを特徴とする有害環境汚染物質分解処理方法、
（７）食用キノコの栽培後の廃菌床を、汚染された土壌または水域に投与することにより、汚染物質を分解処理することを特徴とする有害環境汚染物質分解処理方法、
【００１２】
（８）食用キノコの栽培後の廃菌床を、汚染された土壌または水域に投与するにあたり、投与時あるいはその前後にリグノスルホン酸若しくはリグニン含有物質のスルホン酸化物を添加若しくは投与することを特徴とする（７）記載の有害環境汚染物質分解処理方法、
（９）食用キノコ栽培後の廃菌床を、そのまま、適当な大きさのブロックに切断あるいは小片状乃至粉状とし、汚染された土壌に敷設、埋設若しくは散布することを特徴とする（７）又は（８）記載の有害環境汚染物質分解処理方法
に関する。
【００１３】
本発明は、次のような知見に基づいてなされた。
すなわち、リグニン分解性の担子菌の一種であるＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍが、ダイオキシン等の有害な塩素化芳香族化学物質を分解することが明らかにされ、本菌株の分泌するペルオキシダーゼ活性とダイオキシン分解能との間に相関性が認められたことが報告されている（橘等、紙パルプ技術協会誌、第５０巻第１２号Ｐ１８０６−１８１５、（１９９６））。
【００１４】
一方、キノコの栽培には培地中にオガ粉の添加を必要とするが、キノコの菌糸は木質に強度を与える難分解性のリグニンをペルオキシダーゼおよびラッカーゼ等の酵素を利用して分解していることが明らかにされている。これらの酵素はＨ２Ｏ２とともにリグニンの三次元網状構造を非特異的に分解していると考えられているが、近年、担子菌類の一種であるＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍの分泌するこれらの酵素がダイオキシン等の有害な塩素化学物質を広範囲に分解することが明らかにされた（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．    Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．  ６２，  ｐ４３２３（１９９６））。
しかし、安全性の点や量的確保の点で必ずしも充分とは言えない。
【００１５】
本発明者等は、食用キノコについても有害化学物質分解能を有するのではないかと考え、以下に記述するように実施したところ、充分な成果をえることができた。
そして、実際の汚染環境下（開放系）でのバイオレメディエーションを可能にするためには菌株が優れた分解能を有するだけではなく、菌株としての安全性が確認されていることが重要な要因であるが、この点もキノコの菌糸またはキノコ栽培後の廃菌床は安全性が確認されているので、開放系での使用におけるパブリックアクセプタンスの問題は十分に容認される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明においては、食用キノコの菌糸、菌糸培養物、菌床を使用する。菌床には、キノコ栽培のためにキノコの菌糸を植え付けたものから、キノコ栽培後の廃菌床に至るまでが包含まれる。
環境の汚染は広範囲に及びこれら汚染物質を分解処理するには安価で大量に得られるものを利用して行うのが理想的であり、キノコは我が国で大量に生産されており菌床、就中廃菌床を利用するのが経済的で一石二鳥である。
【００１７】
本発明において、使用する食用キノコとしては、マイタケ、シイタケ、ブナシメジ、エノキタケ等のキノコが、最近はオガ粉を利用した袋栽培やビン栽培で生産されており、例えば袋栽培の場合、キノコの子実体を収穫後、ブロック状の廃菌床から袋を取り除いた後にそのまま、あるいは適当な大きさのブロックに切断し、汚染土壌に敷設若しくは埋設する。
敷設する場合は、単に土壌の上に置くだけでもよいが、ブロックが地表面より若干出るか若しくはすれすれになるような穴を掘り固定するのが好ましい。更に、その上に土壌をふりかけてもよい。
【００１８】
汚染土壌が広範囲に及ぶ場合は、汚染範囲を囲い込む形でより深く廃菌床のブロックを埋設すると効果的である。また、汚染の状況によっては、２層、３層と多層に埋設することもできる。
廃菌床はブロック状以外に小片乃至粉状として、汚染土壌に散布、埋設することも可能である。
廃菌床は、キノコ菌糸が土壌中でも生育できる好ましい条件を保持することができ、しかも土壌と馴染みやすく、いわゆる「個体処理」、「原位置処理」といわれる汚染土壌の処理法に好適である。
【００１９】
一方、キノコの菌糸を栄養物質とともに、あるいはキノコ菌糸の培養物を汚染された水域あるいは土壌等の環境または回収された汚染土壌に投与して、有害汚染物質を分解処理することもできる。例えば、汚染土壌に適度の水を加えスラリー状にして反応槽に移し、キノコ菌糸と栄養物あるいはキノコ菌糸培養物を加え、攪拌処理することにより有害汚染物質を分解処理する（「スラリー処理」）こともできる。
【００２０】
食用キノコの菌糸、菌糸培養物、菌床、栽培後の廃菌床に予め、有害汚染物質を分解処理する酵素を誘導する物質を添加しておくのが効果的であると考え、本発明者等は種々検討の結果、リグノスルホン酸若しくはリグニン含有物（例えば紙パルプ等）のスルホン酸化物が有用であることを見出した。更にその際炭素源となるグルコースや、窒素源となる酒石酸アンモニウムと一緒に加えるとより効果的である。
【００２１】
リグノスルホン酸若しくはリグニン含有物のスルホン酸化物は、菌糸等と同時に土壌あるいは水域に投与しても良いし、また場合によっては、菌糸等に投与後でも良い。その場合、炭素源となるグルコースや、窒素源となる酒石酸アンモニウム等キノコ菌の発育の栄養源と一緒に投与しても良い。
添加量は培地、菌床、廃菌床の量に対して０．１％前後の程度で良い。
【００２２】
食用キノコとしては、上述のようにマイタケ、シイタケ、ブナシメジ、エノキタケ等使用しうるが、特にマイタケはその分解処理能力が他のキノコより格段に優れていることと、マイタケは工場生産されているため、大量の廃菌床が出るので量的確保ができ、特に好ましい。
マイタケとしては、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、白マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、チョレイマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ）、トンビマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｅａ）等が挙げられるが、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、白マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が特に好ましい。
【００２３】
本発明に係わる有害環境汚染物質としては、例えばＰＣＢ、ＰＣＤＤやＰＣＤＦ等ダイオキシン類等塩素化芳香族化合物、ＤＤＴやその類似物質ヘキサクロロシクロヘキサン、ディルドリン等の有機塩素系農薬、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、四塩化炭素、塩化メチル等塩素置換有機溶媒が挙げられる。更に、ベンゼン、トルエン等芳香族化合物、フェノール、クレゾール類、クレオソート等多環芳香族炭化水素が挙げられるが、その他一般に環境を汚染していると見られる物質も含まれる。
以下、実施例を示し、さらに詳しく本発明の実施の形態と効果について説明する。
【００２４】
（実施例１）
マイタケ子実体を収穫した後の廃菌床を用意し、５０ｍｌの無機培地に対し２５ｇの菌糸塊を無菌的に添加した。ワーリングブレンダーにより１０，０００ｒｐｍで１０分間、氷冷しながら菌糸塊をミキシングした後、１５ｍｌの滅菌済み培養試験管に上記の菌糸けん濁液を５ｍｌずつ分注した。菌糸けん濁液に対し最終濃度が０．１ｐｐｍとなるように各種ＰＣＢ標準溶液をマイクロシリンジにより添加し、２５℃にて振盪培養を行った。７日間培養後、ポリトロン式のハンディーミキサーにより菌糸培養液をミキシングし、塩酸添加により酸性化処理した後に、培養液中に残存するＰＣＢ成分を酢酸エチルにより抽出した。抽出溶媒を１００μｌに濃縮した後に、質量分析計付き−ガスクロマトグラフィーにより残存するＰＣＢ成分を分析した。滅菌後の菌糸けん濁液を用いて７日間の培養後に残存するＰＣＢ量を算出した対照系と比較することにより、廃菌床由来のマイタケ菌糸によるＰＣＢ分解量を算出した。この結果を表１に示す。
【００２５】
無機培地の組成（１リットル中）；
ＫＨ２ＰＯ４＝２０ｇ，    ＮａＨ２ＰＯ４＝０．２ｇ，    ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＝０．５ｇ，    ＣａＣｌ２＝１００μｇ，
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＝１００μｇ，    ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＝１０μｇ，    ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ＝２０μｇ
２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ＝１．４６ｇ，    Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ＝０．２ｇ，
Ｔｈｉａｍｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ＝１００μｇ，
【００２６】
【表１】
0003567091.tif 000002
【００２７】
この結果からみて、マイタケ廃菌床によるＰＣＢの分解は、塩素置換数が多くても、同様に効果的に分解されることがわかる。
（実施例２）
スラント保存してあるマイタケ菌糸（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）を１００ｍｌのポテト・デキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ社）にて２５℃で２週間振盪培養した。菌糸コロニーを無菌的にワーリングブレンダーにより１０，０００ｒｐｍで１０分間、氷冷しながらミキシングした。実施例１で示した無機培地によりミキシング後の菌糸片を２回洗浄した後、０．１ｇ／１０ｍｌの濃度になるように菌糸をけん濁した。炭素源としてグルコース（２０ｇ／ｌ）を、分解系酵素群の誘導を目的としてリグノスルホン酸（１ｇ／ｌ）を添加した。菌糸溶液に対し最終濃度が１０ｐｐｍとなるようにＰＣＢ４８（４塩素置換主体のＰＣＢ混合液）をマイクロシリンジにより添加し、２５℃にて振盪培養を行った。
【００２８】
また、１０日毎にグルコースを（２０ｇ／ｌ）添加した。６０日間培養後、ポリトロン式のハンディーミキサーにより菌糸培養液をミキシングし、塩酸添加により酸性化処理した後に、培養液中に残留するＰＣＢ成分を酢酸エチルにより抽出した。
抽出溶媒を１００μｌに濃縮した後に、質量分析計付き−ガスクロマトグラフィーにより残存するＰＣＢ成分を分析した。滅菌後の菌糸培養液を用いて６０日間の培養後に残存するＰＣＢ量を算出した対照系と比較することにより、マイタケ菌糸によるＰＣＢ分解量を算出した。
この結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
0003567091.tif 000003
【００３０】
この結果からわかるように、マイタケ菌糸によっても、ＰＣＢが効果的に減少している。
（実施例３）
スラント保存してあるマイタケ菌糸（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）を１００ｍｌのポテト・デキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ社）にて２５℃で２週間振盪培養する。菌糸コロニーを無菌的にワーリングブレンダーにより１０，０００ｒｐｍで１０分間、氷冷しながらミキシングする。上記の無機培地により２回菌糸を洗浄した後、０．１ｇ／１０ｍｌの濃度になるように菌糸をけん濁する。炭素源としてグルコース（２０ｇ／ｌ）を添加する。菌糸けん濁液に対し最終濃度が１０ｐｐｍとなるようにＰＣＢ４８（４塩素置換主体のＰＣＢ混合液）をマイクロシリンジにより添加し、２５℃にて振盪培養を行う。継時的にサンプリングし、培養液中に生成した代謝中間体を質量分析計付き−ガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、培地中でのｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｏｌの蓄積が明らかとなりマイタケ菌糸によりＰＣＢが単環化合物質へと分解されていることが明らかとなった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、食用キノコの菌糸、菌糸培養物、菌床及び／又は栽培後の廃菌床等を、有害環境汚染物質により汚染された土壌または水域に投与することで、食用キノコの菌糸の生産する有用な分解系酵素群により安全で効果的に有害な環境汚染物質の分解処理を行うことが可能となった。