(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において細胞死を調節する方法であって、
DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０からなる核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドで、植物細胞を形質転換する工程；および
該形質転換した植物細胞を再分化させて、植物を得る工程、
を包含し、
ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物細胞中でＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテイナーゼの産生を増大させ、それによって該植物中の細胞の細胞死が抑制される、方法。
【請求項２】
植物において細胞死を調節する方法であって、DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０からなる核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドの相補配列からなるアンチセンスを含むポリヌクレオチドで、植物細胞を形質転換する工程；および
該形質転換した植物細胞を再分化させて、植物を得る工程、
を包含し、
ここで、該植物中の細胞の細胞死が促進される、方法。
【請求項３】
植物の細胞死を促進することにより植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方法であって、DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドの相補配列からなるアンチセンスを含むポリヌクレオチドで、植物細胞を形質転換する工程；および
該形質転換した植物細胞を再分化させて、植物を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０からなる核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドの選択的な阻害剤をスクリーニングする方法であって、
該DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０からなる核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドを有する植物細胞に、阻害剤候補物質を暴露する工程；および、
該植物細胞において該DS9をコードする配列番号１の４１１〜２２４０からなる核酸配列、または該配列番号１の４１１〜２２４０からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、葉緑体の恒常性を維持するために機能するメタロプロテイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列からなるポリヌクレオチドがコードするタンパク質の産生が選択的に減少したか否かを同定する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死を調節する方法に関する。さらに詳しくは、細胞死調節遺伝子の発現レベルを調節することにより、様々な環境ストレスに対して、植物に抵抗性を付与する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、糸状菌およびウイロイド）に感染すると、１）病原体が全身に広がって、増殖することにより病気になるか、または、２）感染部位に病原体を封じ込め、全身への広がりを抑えることにより病原体に対して抵抗性になるかのいずれかの反応を示す。病原体に対する植物の後者のような反応は、超過敏反応（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＨＲ）と呼ばれる。この反応においては、感染した部位に局所的な細胞死が生じ、壊死病斑が形成されることが知られている。このような病原体感染に伴う壊死病斑形成は植物の典型的な抵抗性反応であり、プログラム細胞死と考えられる。しかし、その分子機構はほとんど解っていない。
【０００３】
ＨＲは、全ての植物において生じるわけではない。植物において、感染した病原体に由来する病原性遺伝子の産物を認識する遺伝子が、内因的に存在する場合に生じる。このような遺伝子が存在しない場合、ＨＲは生じず、植物は病原体感染に対して非抵抗性である。
【０００４】
タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）感染に対するタバコのＨＲは、従来から植物のＨＲを研究するために用いられてきたモデル系である。
【０００５】
Ｎ遺伝子は、ＴＭＶの感染によるＨＲ（すなわち、細胞死）に関与する細胞死調節遺伝子の１つである。ＴＭＶ感染に対して、Ｎ遺伝子を有するタバコ（ＮＮタバコ）はＨＲを生じるが、Ｎ遺伝子を有さないタバコ（ｎｎタバコ）はＨＲを生じない（Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２８，  ５５３，  （１９３８））ことが報告されている。ＮＮタバコのＨＲは、２４℃以下の温度においてのみ生じ、２８℃以上では生じない。それゆえ、Ｎ遺伝子および温度条件の両方が、ＴＭＶに感染した細胞におけるＨＲの誘発に必須であると考えられてきた。
【０００６】
しかし、本発明者らの研究により、アクチノマシシンＤ（ＡＭＤ）および熱（５０℃、２分）で処理した場合、通常はＨＲを生じない３０℃の温度条件下でも、ＮＮタバコにおいて、ＴＭＶ感染に対するＨＲが誘発されることが見出された。さらに、ＴＭＶ感染に対するＨＲは、ＡＭＤおよび熱での同様な処理によって、Ｎ遺伝子を有さないｎｎタバコにおいても誘発された。これらにより、ＴＭＶ感染に対する細胞死が、Ｎ遺伝子の存在および非存在、ならびに温度とは無関係に生じ得ることが明らかになった（ＳｈｉｍｏｍｕｒａおよびＯｈａｓｈｉ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４３，  ５３１，（１９７１）；ＯｈａｓｈｉおよびＳｈｉｍｏｍｕｒａ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４８，  ６０１（１９７２））。ＡＭＤは核におけるＤＮＡ依存性のＲＮＡ合成を阻害することが知られている。従って、植物において新規な細胞調節遺伝子が存在し、その転写および引き続くタンパク質合成の抑制によりＨＲが誘発される可能性が示された。
【０００７】
このような細胞死調節遺伝子が同定されれば、その発現レベルをコントロールすることにより、植物細胞死を調節（促進または抑制）することが可能であると考えられる。特に、細胞死を調節することにより、環境ストレスに対する抵抗性を植物に付与することは、農業の分野において重要な課題である。
【０００８】
しかし、このような細胞死調節遺伝子はこれまでに同定されておらず、発現レベルを調節して細胞死を促進または抑制することにより、環境ストレスに対して抵抗性を付与するという研究は、全くなされていないのが現状である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、細胞死調節遺伝子の発現レベルを調節して、細胞死を促進または抑制する方法を提供することにある。また、本発明は、細胞死を調節することにより、環境ストレス（例えば、病害体感染）に対して抵抗性が付与された植物を作出する方法を提供する。さらに、本発明は、細胞死調節遺伝子の選択的な阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子、または、その一部を含むポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換する工程、および上記の形質転換した植物細胞を再分化させて植物を得る工程、を包含する、植物において細胞死を調節する方法に関する。上記のＤＳ９もしくはそのホモログはＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼであり、上記のポリヌクレオチドは、植物細胞中でＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼの産生を減少または増大させ、それによって植物中の細胞の細胞死が促進、または抑制される。ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子、またはその一部を含むポリヌクレオチドは、公知の遺伝子組換え技術により、植物細胞中の核内のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合体を意味し、特定の鎖長に限定されない。
【００１１】
１つの実施態様においては、上記のポリヌクレオチドは、上記のＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子、またはその一部をアンチセンスで含み、上記の植物中の細胞の細胞死が促進される。
【００１２】
本発明はまた、ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子、またはその一部を含むポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換する工程、および上記の形質転換した植物細胞を再分化させて植物を得る工程を包含する、植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方法に関する。ここで、上記のＤＳ９もしくはそのホモログは、ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼであり、上記のポリヌクレオチドは、植物細胞中でＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼの産生を減少または増大させる。
【００１３】
１つの実施態様においては、上記の環境ストレスは、病原体感染である。
【００１４】
１つの実施態様においては、上記のポリヌクレオチドは、上記のＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子、またはその一部をアンチセンスで含む。
【００１５】
１つの実施態様においては、上記のホモログが、ＤＳ９に対して、ＡＴＰａｓｅ領域において約７０％以上の相同性を有する。
【００１６】
さらに、本発明は、ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子を有する発現系に、阻害剤候補物質を導入する工程、および、上記の発現系においてＤＳ９またはそのホモログの産生が選択的に減少したか否かを同定する工程、を包含する、ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子の選択的な阻害剤をスクリーニングする方法に関する。ここで、上記のＤＳ９もしくはそのホモログは、ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、高等植物から新たに単離したＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼの１種であるＤＳ９およびそのホモログが、細胞死を調節する因子であることを解明した。この調節は、例えば、環境ストレス下においてＤＳ９またはそのホモログの産生が抑制されることにより、植物細胞における細胞死が誘発されることで行われる。本発明は、この新規な知見に基づいて完成された。
【００１８】
本発明者らは、タバコにおいてＨＲが生じる際に特異的に発現する６つのクローンを単離した。単離したクローンの１つを「ＤＳ９遺伝子」と名付け、その全塩基配列を決定した。
【００１９】
ＤＳ９遺伝子がコードする推定のアミノ酸配列について、ホモロジー検索を行った。その結果、ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼである、大腸菌のＦｔｓＨ、酵母のＯｓｄ１ｐ、シロイヌナズナのＡｒＦｔｓＨ、およびレッドペパーのＰｆｔｆのアミノ酸配列と、それぞれ、４０％、３０％、７９％および４２％の相同性を示した。特に、ＡＴＰａｓｅに特有の保存性領域において相同性が高かった。表１は、本発明におけるＤＳ９と、大腸菌のＦｔｓＨ、酵母のＯｓｄ１ｐ、シロイヌナズナのＡｒＦｔｓＨ、およびレッドペパーのＰｆｔｆとの間のアミノ酸配列を比較した表である。各アミノ酸は１文字表記で表している。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
ＤＳ９には、他のＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼと同様に、Ｎ末端側の膜を貫通すると考えられる疎水性領域（表中「ＷａｌｋｅｒモチーフＡ」および「ＷａｌｋｅｒモチーフＢ」で示す）、および中央部のＡＴＰａｓｅ領域（「ＳＲＨ」で示す）、ならびにＣ末端側のＺｎ２＋結合モチーフが存在した（図１）。また、大腸菌において組換え発現したＤＳ９は、実際にＡＴＰａｓｅ活性を示した（図２）。これらのことは、本発明におけるＤＳ９が、ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼであることを示している。
【００２２】
ＤＳ９遺伝子のＨＲ誘発時における挙動を解析した結果、ＤＳ９遺伝子は、ＨＲが生じるまでの間に、転写レベルおよび翻訳産物であるタンパク質量の両方において抑制されていることが示された（図３および図４）。ＴＭＶ感染したＮＮタバコの葉においては、３０℃から２０℃への温度シフト後１時間以内に、その転写レベルおよびタンパク質量が減少した。一方、模似感染した葉においては、ＤＳ９遺伝子の転写レベルおよびタンパク質量は一定であった（実施例４および６を参照）。また、ＨＲを誘発することが知られているアクチノマイシン（ＡＭＤ）および熱ショック（ＨＳ）処理を行うと、ＤＳ９のタンパク質量が劇的に減少した（実施例７を参照）。
【００２３】
上記実験結果に基づいて、本発明者らは、ＤＳ９が植物において細胞死を調節する機能を有する因子であることを確認し、その利用方法を開発するために、さらに種々の実験を行った。その結果、以下のことを見出した。
【００２４】
１）壊死病斑形成の誘導における各種プロテアーゼ阻害剤の効果を試験した結果、メタロプロテアーゼ阻害剤を用いた場合においてのみ、ＴＭＶ感染タバコにおいて細胞死が誘導されたこと。
【００２５】
２）ＤＳ９が葉緑体に局在すること。
【００２６】
３）ＨＲを生じるための条件とされている温度にシフトしなくても、メタロプロテアーゼ阻害および葉緑体の機能の低下のいずれの場合においてもＨＲが誘発されること。
【００２７】
４）ＨＲ誘発における葉緑体の機能の低下は、ＤＳ９タンパク質量の減少と相関すること。
【００２８】
５）アンチセンス方向でＤＳ９遺伝子を導入して、ＤＳ９遺伝子の転写レベルおよびタンパク質量が減少された植物においては、細胞死が促進されること。このアンチセンス植物は、病害抵抗性を獲得したこと。
【００２９】
６）センス方向でＤＳ９遺伝子を導入してＤＳ９遺伝子の転写レベルおよびタンパク質量が増加された植物においては、細胞死が抑制されること。このセンス植物は、スーパーオキシド発生型除草剤に対して、耐性を獲得したこと。
【００３０】
ＤＳ９ホモログであるＦｔｓＨは細菌由来である。ＤＳ９が細菌起源とされる葉緑体において見出されたことは、その起源を考える上で興味深い。ＤＳ９のホモログであるＡｒＦｔｓＨもまた、葉緑体に局在することが報告されている（Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ｖｏｌ  ２７１，  ｐｐ２９３２９−２９３３４（１９９６））。従って、ＤＳ９ホモログが、全般に葉緑体で機能している可能性が示唆される。また、植物中で、ＤＳ９およびそのホモログは、同じく細菌起源と考えられるミトコンドリアにおいても機能をしていることが想定される。実際、酵母ミトコンドリアでは、未会合のチトクロームＣオキシダーゼのサブユニット２の分解にＦｔｓＨホモログが関与することが示されている（Ｎａｋａｉ，  Ｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  １５，  ４４４１−４４５２  （１９９５））。
【００３１】
哺乳動物において、アポトーシスがミトコンドリアにおける電子伝達系の阻害による膜電位の低下によって引き起こされること、およびこの膜電位の低下が細胞死抑制遺伝子産物であるＢｃｌ−２などにより阻害されることが報告されている（Ｚａｍｚａｍｉ，  Ｎ．ら、Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８２，  ３６７−３７７（１９９５））。また、哺乳動物において、ミトコンドリアにおける電子伝達系が首尾良く機能しない場合に細胞死が生じることは、Ｋｒｉｐｐｅｒら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７１，  ２１６２９，  （１９９６））およびＱｕｉｌｌｅｔ−Ｍａｒｙら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７２，  ２１３８８，  （１９９７））によっても報告されている。一方、葉緑体において、ある種のプロテアーゼが働くことにより、その恒常性が維持されていることが報告されている（Ｚａｔｃｈ  Ａｄａｍ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２：７７３−７８３，  １９９６）。
【００３２】
これらを考慮すれば、本発明において調節される細胞死の機構は、下記のように説明することができる。もっともこれは、本発明の方法の範囲が、以下の機構によって限定または束縛されることを意図するものではない。
【００３３】
メタロプロテアーゼであるＤＳ９またはそのホモログは、未会合タンパク質または異常タンパク質などを分解することによって、葉緑体およびミトコンドリアの恒常性を維持している。環境ストレス下に植物がおかれると、葉緑体およびミトコンドリア中のＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子の転写が抑制され、翻訳産物のタンパク質レベル（すなわち活性レベル）が低下した組織が現れる。これらの組織では、本発明者により示されたように細胞死が誘導される。葉緑体およびミトコンドリアにおいて未会合タンパク質もしくは異常タンパク質などが増加し、そしてこれらが蓄積されて、葉緑体およびミトコンドリアの機能（ＡＴＰまたはＮＡＤＰＨ生産）の低下が引き起こされる。光合成の場である葉緑体においては、この機能の低下により光エネルギーが首尾良く葉緑体の中で処理されなくなり、その結果、活性酸素が植物細胞内に発生する。このような細胞内の恒常性の崩壊（電子伝達系の崩壊およびそれによる活性酸素の蓄積）が生じることにより、細胞は最終的に死に至る。ＤＳ９もしくはそのホモログはこれらの不要なタンパク質を分解することによって細胞を死から救い、恒常性を維持させるために機能していると考えられる。
【００３４】
従って、種々の要因により、同様な細胞死の機構は、植物細胞に限らず、真核細胞全般において存在する可能性が予想される。
【００３５】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３６】
本発明者らは、上述のように、その発現レベルに応じて、細胞死を促進または抑制する、細胞死調節遺伝子の機能を解明し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００３７】
本発明は、細胞死調節遺伝子の発現レベルを調節して、細胞死を促進または抑制する方法を提供する。本発明は、さらに、細胞死を調節することにより、環境ストレスに対して抵抗性が付与された植物を作出する方法を提供する。
【００３８】
本明細書において、「細胞死調節遺伝子」とは、その発現レベルに応じて、細胞死を促進または抑制する遺伝子をいう。ＤＳ９およびそのホモログをコードする遺伝子、ならびにその一部は、本発明において意図される細胞死調節遺伝子である。
【００３９】
遺伝子についての「発現」とは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写をいう。ｍＲＮＡへの転写の程度を発現レベルとして示す。従って、転写が抑制される場合は発現レベルが減少されることを、および転写が促進される場合は発現レベルが増大されることをいう。
【００４０】
「ＤＳ９」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼである。「ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼ」とは、その酵素作用のためにＡＴＰを必要とし、活性中心に２価の金属イオン（代表的にはＺｎ２＋）を含むプロテアーゼをいう。この酵素は、そのアミノ酸配列において、Ｎ末端側に１つ以上の疎水性領域、Ｃ末端側に金属イオン結合領域（代表的にはＺｎ２＋結合領域）、その中間にＡＴＰａｓｅ領域を有する。代表的には、Ｎ末端側に２つの疎水性領域を有し、そしてＣ末端側にＺｎ２＋結合領域を有する。
【００４１】
「ＤＳ９のホモログ」とは、ＤＳ９と同様のＡＴＰ依存性メタロプロテアーゼであって、ＤＳ９と比較して、全アミノ酸配列について少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％以上の相同性を有し、さらにＡＴＰａｓｅ領域のアミノ酸配列について少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上の相同性を有するタンパク質をいう。このようなホモログとしては、大腸菌のＦｔｓＨ、酵母のＯｓｄ１ｐ、シロイヌナズナのＡｒＦｔｓＨ、およびレッドペパーのＰｆｔｆが挙げられる。
【００４２】
ＤＳ９およびそのホモログをコードする天然由来の遺伝子を単離する方法としては、例えば、ｍＲＮＡ量の変化を示す遺伝子をクローニングするのに有効なディファレンシャルスクリーニングを用い得る。ディファレンシャルスクリーニングを行うための遺伝子ライブラリーの作製法、プローブとのハイブリダイゼーションに使用するストリンジェントな条件、および遺伝子のクローニング法は当業者に周知である。例えば、マニアティスらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照。
【００４３】
新規なＤＳ９のホモログをコードする遺伝子もまた、細胞死調節遺伝子として使用され得る。このような新規遺伝子は、ＤＳ９もしくは公知のそのホモログをコードする遺伝子、またはその断片をプローブとして、種々の生物の遺伝子ライブラリーから得ることができる。例えば、植物の遺伝子ライブラリー、大腸菌遺伝子ライブラリー、および酵母遺伝子ライブラリーが使用され得る。ライブラリーをスクリーニングするためのストリンジェントな条件は、当業者により適宜選択される。
【００４４】
得られた遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、ＤＳ９のホモログであるか否かは、得られた遺伝子にコードされるアミノ酸配列とＤＳ９のアミノ酸配列とを、市販のコンピューター解析ソフト（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｗｏｒｋｓ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））を使用してアラインメントし、両者の相同性を調べることにより、容易に決定され得る。
【００４５】
ＤＳ９もしくはそのホモログをコードする遺伝子（以下、必要に応じて「ＤＳ９関連遺伝子」という）、またはその一部としては、天然由来の遺伝子だけでなく、人工的に合成した遺伝子またはその一部も用い得る。
【００４６】
「その一部」とは、ＤＳ９またはそのホモログの細胞死調節機能を再現するのに十分な程度の長さを有する本発明における遺伝子の断片をいう。
【００４７】
アンチセンスでＤＳ９関連遺伝子を導入する場合における「その一部」は、植物内において、その一部から産生されるアンチセンスＲＮＡが、センス鎖からなるｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに十分な相補性および長さを有する断片をいう。断片は、当該植物中に存在する内因性のＤＳ９関連遺伝子の相補的な領域と、塩基配列レベルで代表的には５０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％以上の同一性（センス鎖として）を有する。断片の長さは、代表的には約２０ヌクレオチド以上であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以上、より好ましくは約１００ヌクレオチド以上、さらにより好ましくは２００ヌクレオチドである。
【００４８】
センスでＤＳ９関連遺伝子を導入する場合における「その一部」とは、発現産物であるＤＳ９またはそのホモログがメタロプロテアーゼ活性を有するに十分な領域をコードする配列を含む、当該遺伝子の断片をいう。この断片は、好ましくは、メタロプロテアーゼの金属イオン結合領域およびＡＴＰａｓｅ領域をコードし、より好ましくは、目的のオルガネラに存在するための領域をさらにコードする。
【００４９】
ＤＳ９関連遺伝子、またはその一部は、細胞死調節の目的に応じて、センスまたはアンチセンスで、適切な植物発現ベクターに組み込まれて植物に導入され得る。ＤＳ９関連遺伝子またはその一部をアンチセンスで導入する場合、代表的には、細胞死が促進される。ＤＳ９関連遺伝子またはその一部をセンスで導入する場合、代表的には、細胞死が抑制される。もっとも、導入遺伝子の発現レベルの程度に応じてコサプレッションが生じ得ることは、当該分野において周知の事項である。コサプレッションは、導入遺伝子のｍＲＮＡが過剰に産生される結果、導入遺伝子およびその相同遺伝子である内因性遺伝子の発現レベルが、両方とも抑制されることにより導かれ得る現象である。コサプレッションが生じると、ＤＳ９関連遺伝子の発現レベルが抑制されて、細胞死が促進され得る。
【００５０】
当業者に明らかなように、コサプレッションにより本発明の効果が得られる場合には、上記の「その一部」は、メタロプロテアーゼ活性を有するに十分な領域をコードする必要はなく、アンチセンスの場合における「その一部」の定義が援用される。
【００５１】
本願発明の方法が適用される「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。特に好ましい植物としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、イネ、ジャガイモ、オオムギ、コムギおよびリンゴが挙げられる。また、特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００５２】
本発明の方法に用い得る細胞死調節遺伝子が、対象となる植物と同一種または近縁の種（例えば、同一の属、または同一の科に分類される種）に由来することは、好ましい態様であり得るが、必ずしも必要ではない。
【００５３】
本発明に用いられる「ポリヌクレオチド」は、ＤＳ９感染遺伝子またはその一部、および所望の形質転換を達成するために必要な任意の付加的配列を有する。代表的には植物発現ベクターである。
【００５４】
「植物発現ベクター」とは、目的の遺伝子の発現レベルを調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが、宿主植物細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列の組換え構築物をいう。好適には、植物プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子、およびエンハンサーを含み得る。より好適には、複製起点を含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの好適な種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００５５】
当業者は、本発明の実施にあたって、プロモーター、エンハンサーなどの調節エレメントを適宜選択することにより、細胞死の程度を調節し得る。
【００５６】
本発明に用いる植物発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００５７】
「植物プロモーター」とは、植物細胞において機能し得るプロモーターをいう。例えば、タバコの感染特異的タンパク質ＰＲ−１のプロモーター（以下、タバコＰＲ−１プロモーターという）、熱ショックにより誘導されるプロモーターなどの、ある種のストレスにより発現が誘導されるプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター（Ｐｎｏｓ）のような恒常的なプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ−１遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にする遺伝子であることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェレースＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェレース遺伝子などが好適に用いられ得る。
【００６０】
薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモーターの例としては、上記植物プロモーター、例えば、タバコＰＲ−１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの目的遺伝子について複数個用いられ得る。
【００６２】
植物発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターあるいはｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられ得る。
【００６３】
ｐＢＩ系およびｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の遺伝子を導入し得る。ｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ得る。例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが挙げられる。これらのベクターは、植物に導入され得る領域（Ｔ−ＤＮＡ領域）の遺伝子と、マーカー遺伝子として植物プロモーターの支配下で発現されるＮＰＴＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性を付与する）とを含む。
【００６４】
ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。
【００６５】
本発明の植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。好適には、上記ベクターのプロモーター下流にＤＳ９関連遺伝子、またはその一部が、センスまたはアンチセンスで組み込まれる。
【００６６】
植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ６７，  ３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法では、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓ．  Ｂ．  Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法の他、リン酸カルシウム法およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法などがある。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００６７】
植物発現ベクターを導入することにより形質転換した細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性を指標として選択される。次いで、常法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、再生された植物体から種子が取得され得る。このようにして、細胞死調節遺伝子を細胞内に有する植物が得られる。
【００６８】
得られた植物において、ＤＳ９関連遺伝子、またはその一部が発現することにより、植物中の細胞の細胞死が促進または抑制され得る。
【００６９】
ＤＳ９またはそのホモログの産生（すなわち、メタロプロテアーゼの産生）が減少された植物においては、通常、細胞死が促進される。細胞死を起こす傾向が適度に強められた植物においては、ある種の環境ストレスに対する抵抗性、特に、病斑形成による病害抵抗性が示され得る。これは主として、局所的な細胞死が促進されて感染領域で増殖する病原体が封じ込められることにより、感染部位の広がりが阻止されることによると考えられる。もともと天然の植物においても、病原体感染を受けた部位の細胞ではＤＳ９のｍＲＮＡやタンパク質が減少するので、その部位のみが細胞死を起こし得る。ＤＳ９またはそのホモログの産生が減少するように作出された形質転換植物においては、病原体感染細胞はさらに死にやすくなり、その結果感染細胞の細胞死の反応が促進される（すなわち、抵抗性になる）。
【００７０】
ＤＳ９またはそのホモログの産生が増大された植物においては、通常、細胞死が抑制される。細胞死を起こす傾向が適度に弱められた植物においても、様々な環境ストレスに対する抵抗性が示され得る。環境ストレス下に植物が曝されると、内因性のＤＳ９関連遺伝子が不活性化されて、それによりオルガネラの恒常性が維持できなくなり、植物細胞中に有害な活性酸素が生じ得る。本発明の方法により、ＤＳ９またはそのホモログの産生が増大されてメタロプロテアーゼの活性値が上昇することより、オルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）の恒常性維持機能が向上する結果、活性酸素の発生が低くおさえられて細胞死が抑制されると考えられる。
【００７１】
本明細書において、「環境ストレス」とは、自然界で植物が受け得る、その生育を妨げる任意のストレスをいう。環境ストレスの例としては、病原体感染、強光、低温、凍結、乾燥、高温、高塩濃度、ＵＶ照射、オゾン、および除草剤などが挙げられる。
【００７２】
環境ストレスに対しての「抵抗性の付与」とは、植物に新たな抵抗性を付与すること、または既に抵抗性を有する植物のその抵抗性を増強することをいう。
【００７３】
「病原体感染」とは、植物の病原因子による感染をいい、ウイルス、ウイロイド、糸状菌および細菌による感染を含む。
【００７４】
環境ストレスに対する抵抗性の有無は、植物がある環境ストレス下におかれた場合の、形質転換植物とコントロール植物との間に観察され得る差異を評価することにより、確認できる。
【００７５】
例えば、病原体感染に対する形質転換植物の病害抵抗性は、病原体（例えば、ＴＭＶなどのウイルス、およびキュウリ立ち枯れ病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）などの糸状菌）感染における、形質転換植物とコントロール植物との間の形態学的変化の差異として評価される。例えば、病原体感染後の形質転換植物において観察され得る病斑の程度が、コントロール植物に比べて有意に抑制されている場合は、その形質転換植物には抵抗性が付与されている。
【００７６】
本発明に従って病原体感染に対する抵抗性が付与された形質転換植物には、ＴＭＶに対する抵抗性およびキュウリ立ち枯れ病菌に対する抵抗性の少なくとも１つについて抵抗性である植物が含まれる。
【００７７】
除草剤に対する形質転換植物の抵抗性は、例えば、スーパーオキシド発生型除草剤（例えば、パラコート（商品名）（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ））などの公知の除草剤処理に対する抵抗性として評価される。例えば、除草剤処理後の形質転換植物において、クロロフィルａおよびｂの分解の程度が、コントロール植物に比べて有意に抑制されている場合は、その形質転換植物は抵抗性が付与されている。
【００７８】
上述のように、（ＤＳ９に代表される）ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼによる細胞死の調節は、植物に限らず真核生物全般においてその生体機能に深く関与していることが示唆される。従って、ＤＳ９関連遺伝子の選択的な阻害剤は、生体機能の選択的な抑制のための手段として重要であり得る。例えば、このような阻害剤は、農薬および医薬の候補物質として利用される。
【００７９】
ＤＳ９関連遺伝子の選択的な阻害剤のスクリーニングは、ＤＳ９関連遺伝子を有する植物細胞に、阻害剤候補物質を導入して、上記の植物細胞においてＤＳ９またはそのホモログの産生が選択的に減少したか否かを同定することにより行われる。このスクリーニングの方法を実施するための条件は、当業者により適宜選択され得る。スクリーニングは、例えば、Ｎ遺伝子を有さないタバコにＴＭＶを接種した後に阻害候補物質で処理した場合に、ＴＭＶ感染部に壊死病斑が形成されるかどうかを試験することにより行われる。処理葉片のみにおいてＴＭＶ感染部に壊死病斑が形成され、かつＴＭＶ感染していない処理葉片においては有意な形態学的変化が認められない場合には、この阻害剤候補物質はＤＳ９関連遺伝子に対して選択的であるとする。
【００８０】
例えば、スクリーニングに使用する植物細胞は、任意の形態の植物中に存在する。好ましくは、遊離の植物細胞として、インビトロで用いられる。植物細胞は、好ましくは、ＤＳ９関連遺伝子を内因性の遺伝子として有する。阻害剤候補物質は、タンパク質、核酸、糖、脂質などを含むが、これらに限定されない。植物細胞への導入のために、当業者は阻害剤の種類に応じて、適切な送達手段を選択し得る。
【００８１】
阻害候補物質で処理した植物細胞においてＤＳ９またはそのホモログの産生が減少したか否かは、当業者に周知の方法により適宜同定され得る。例えば、ウェスタンブロット解析により、阻害候補物質で処理した植物細胞と未処理の植物細胞との間の、ＤＳ９またはそのホモログのタンパク質量を比較することにより、容易に決定され得る。ＤＳ９およびそのホモログの産生が有意に減少した場合、その候補物質は、ＤＳ９関連遺伝子の阻害剤であると考えられる。
【００８２】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミドなどは商業的な供給源から入手可能である。
【００８３】
（実施例１：ＤＳ−９遺伝子の単離）
Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮおよびＳａｍｓｕｎ  ｎｎを、温度を調節した温室において、２５℃、１６時間の日長下、１２０μＥ／ｍ２／ｓの強度にて生長させた。ＴＭＶのＯＭ株（農水省生物研ジーンバンク）をこの実施例において使用した。温度シフトアッセイのために、タバコの葉を、葉の上部表皮と、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の十分な濃度のウイルス懸濁物とを穏やかに擦り合わせ、Ｃａｒｂｏｒｕｎｄｕｍ（６００番、Ｋｉｓｈｉｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を湿らして、３０分間室温に保ち、ウイルスの侵入を可能にすることによりＴＭＶを接種した。感染した葉を水で洗浄してＣａｒｂｏｒｕｎｄｕｍを除去した後、それらを含む透明なプラスティックボックスを、３０℃で、２４時間の日長下、６０μＥ／ｍ２／ｓの強度にて維持したインキュベーターに移した。４８時間インキュベーションした後、２０℃、６０μＥ／ｍ２／ｓの光強度で維持したインキュベーターに移した。２０℃および３０℃両方のインキュベーションの間、湿らせたティッシュペーパーで覆うことにより、葉柄に水を与えた。
【００８４】
ディファレンシャルスクーリーニングを、Ｓｅｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２７０，  １９９５）に記載されるように行った。簡単には、ＴＭＶ（１０μｇ／ｍｌ）で感染し、３０℃から２０℃に温度シフトした３時間後または５２時間後に採集した葉からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。これらのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、放射標識した１本鎖ｃＤＮＡプローブを２種類（プラスプローブ（温度シフト３時間後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製）およびマイナスプローブ（温度シフト５２時間後のポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製））合成した。次いで、プラスプローブの合成について使用したポリ（Ａ）＋ＲＮＡから常法により調製したｃＤＮＡライブラリーに対して、これらの２種類のプローブを用いて、ディファレンシャルスクリーニングを行った。その結果、６つのクローンがプラスプローブにのみハイブリダイズすることが見出された。１つのｃＤＮＡをＤＳ９と名付けた。このｃＤＮＡを、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の使用説明書にしたがって、Ｒ４０８ヘルパーファージで切り出し、そして再び環化させてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−ファージミドベクターにサブクローニングした。
【００８５】
ＤＳ９の両方の鎖を、３７３Ａ型  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてダイデオキシチェーンターミネーション法により配列決定した。核酸およびアミノ酸配列を、ＧＥＮＥ  ＷＯＲＫＳソフトウエアシステム（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて解析した。
【００８６】
ＤＳ９  ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、ＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼである、大腸菌のＦｔｓＨ、酵母のＯｓｄ１ｐ、シロイヌナズナのＡｒＦｔｓＨ、およびレッドペパーのＰｆｔｆのアミノ酸配列と、それぞれ、４０％、３０％、７９％および４２％の相同性を示し、特にＡＴＰａｓｅの保存性領域において高かった。ＤＳ９は、他のＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼと同様に、Ｎ末端側の膜を貫通すると考えられる疎水性領域、および中央部のＡＴＰａｓｅ領域、Ｃ末端側のＺｎ２＋結合モチーフが存在した（図１）。
【００８７】
（実施例２：細菌における組換えＧＳＴ−ＤＳ９タンパク質の発現）
ＧＳＴ−ＤＳ９融合遺伝子を作製するために、ＤＳ９コード領域（配列表の配列番号４１１〜２２４０）を、プライマー：５’−ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡ−３’および５’−ＡＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣ−３’を用いてＰＣＲにより増幅した。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；  Ｓｍｉｔｈ  および  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇｅｎｅ，  ６７，  ３１（１９８８））のＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ＧＳＴタンパク質のＣ末端に融合した。得られた構築物（ｐＧＥＸ−ＤＳ９）をＧＳＴ領域とＤＳ９領域との間の接合部位周辺を配列決定して、それぞれのコード領域がインフレームで接合されていることを確認した。ほとんど全てのＧＳＴ−ＤＳ９融合遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて不溶性タンパク質として産生されたので、タンパク質を以下の手順のようにして不溶性画分から精製した。ｐＧＥＸ−ＤＳ９を、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧとともに、１２時間インキュベートすることによりＥ．ｃｏｌｉ株  ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において発現させた。細胞をペレット化し、洗浄し、そして緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  ３０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中に懸濁した。１０分の１容量のリゾチーム（緩衝液Ａ中の２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた後、懸濁液を１時間氷上でインキュベートし、そして大腸菌を超音波により破砕した。不溶性画分を６，０００×ｇ、１０分間、４℃での遠心分離により回収し、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５，  ３０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。次いで、不溶性画分を８，０００×ｇ、１０分間、４℃での遠心分離により回収し、そして１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。最終濃度が６．２２Ｍになるように、８Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を添加した後、溶解物を、１２，０００×ｇ、３０分間、４℃での遠心分離に供した。上清を、最初に緩衝液Ｃ（２Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ，  ０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０，  ５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に対して２時間、４℃にて透析し、次いで、緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ７．５，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に対して４時間以上、４℃にて透析した。１００，０００×ｇ、３０分間、４℃での遠心分離による回収後、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎら（前出の文献）の方法に従って、グルタチオン−アガロースビーズを用いる親和精製に供した。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｄｙｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により決定した。
【００８８】
（実施例３：ＡＴＰａｓｅ活性のアッセイ）
ＤＳ９がＡＴＰａｓｅ活性を有するか否かを調べるために、３７℃でＡｒｍｏｎら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６５，  ２０７２３（１９９０））により記載されるようにＡＴＰａｓｅ活性の測定を行った。ＡＴＰ加水分解をアッセイするための、２５μｌの反応混合物以下の成分を含んだ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ２ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ），１ｍＭ  ＡＴＰ，  １ｍＭ  ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（約１４８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）および６μｇ／ｍｌ  ＧＳＴ−ＤＳ９タンパク質を含んだ。放射活性を、チェレンコフ放射によって常法により測定した。
【００８９】
結果を図２に示す。大腸菌内で発現させた組換えＤＳ９タンパク質は、ＡＴＰａｓｅ活性を有することが示された。
【００９０】
（実施例４：ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける温度シフト後のＤＳ９転写レベルの変動）
ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける温度シフト後のＤＳ９の転写レベルの変動を調べるために、ノザン解析を行った。
【００９１】
タバコ（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ）の葉を、実施例１に記載のようにＴＭＶで感染し、３０℃で４０時間培養した後、２０℃への温度シフトを行った。また、ＴＭＶで感染せず、傷のみをつけたタバコの葉をコントロールとして用いた（模似）。
【００９２】
２０℃に温度シフトした後、０、１、３、４、８および２４時間目の葉を回収し、全ＲＮＡを、Ｓｅｏら（前出の文献）の方法に従ってそれぞれ調製した。
【００９３】
ＤＳ９  ｃＤＮＡについてはｃＤＮＡの３’非コード領域に対応する部分ＤＮＡ断片を、プローブとして用いた。
【００９４】
感染時特異的に発現する酸性タンパク質ＰＲ−１をコードするｃＤＮＡおよび塩基性タンパク質ＰＲ−１をコードするｃＤＮＡを、コントロールプローブとして用いた。酸性タンパク質ＰＲ−１をコードするｃＤＮＡプローブは、Ｍａｔｓｕｏｋａら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ８５，  ９４２（１９８７））に従い、プライマーＡ、５’−ＴＡＣＴＡＡＴＴＧＡＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＧＴＣＣ−３’；プライマーＢ、５’−ＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＧＣ−３’を用いて常法によりＰＣＲを行って合成した。また、塩基性ＰＲ−１タンパク質（Ｅｙａｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９，  ５８９（１９９２））をコードするｃＤＮＡは、報告されている配列データから設計した合成プライマー（プライマーＡ、５’−ＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＴＴＧＧ−３’；プライマーＢ、５’−ＣＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣ−３’）を用いて、常法によりＰＣＲを行って合成した。
【００９５】
ノザンハイブリダイゼーションを、Ｓｅｏら（前出の文献）に記載されるように行った。各ブロットをＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に、Ｉｎｔｅｎｓｙｆｙｉｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｋｏｄａｋ）を用いて、−８０℃にて４８時間、露光した。ＤＳ９転写産物の相対的な強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）プログラムを用いて決定した。
【００９６】
結果を図３に示す。ＨＲが生じるまでの間に、ＤＳ９遺伝子の転写が抑制されていることが見出された。ＴＭＶ感染した葉においては、３０℃から２０℃への温度シフト後１時間以内に、ＤＳ９  ｍＲＮＡの発現レベルが減少した。さらに、温度シフト後８時間目には、ＤＳ９  ｍＲＮＡの発現は検出されなかった。一方、模似感染した葉は、ＤＳ９遺伝子の転写は一定であり、抑制されなかった。
【００９７】
（実施例５：抗ＤＳ９タンパク質抗体の産生）
抗体産生のために、２匹のウサギに、実施例２で得た組換えタンパク質（４００μｇ／ウサギ）を腹腔内注射した。７日間の間にさらに３回の注射を行った（各１００μｇ／ウサギ）。抗血清を、最後の注射の２週間後に得、そして免疫グロブリン画分をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるクロマトグラフィーにより精製した。抗ＤＳ９抗体を含有する画分を、ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．４）に対して透析した。抗体を、画分化したＥ．ｃｏｌｉの全タンパク質を含むイムノブロットに対する、ＤＳ９タンパク質との交差反応性について試験した。
【００９８】
（実施例６：ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける温度シフト後のＤＳ９タンパク質量の変動）
ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける温度シフト後のＤＳ９タンパク質量の変動を調べるために、ウエスタンブロッティングを行った。
【００９９】
タバコ（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ）の葉を、実施例１に記載のようにＴＭＶで感染し、３０℃で４０時間培養した後、２０℃への温度シフトを行った。また、ＴＭＶで感染せず、傷のみをつけたものをコントロールとして用いた（模似）。
【０１００】
２０℃に温度シフトした後、０、３、４、６時間目（模似については、０および６時間目）、の葉を回収した。回収した葉から常法により得たタンパク質サンプルを、８％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離し、そして２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、および２０％  メタノールを含有する溶液中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の２％  ＢＳＡでブロッキングした後、メンブレンを実施例５で調製した抗ＤＳ９抗体（１：３０００希釈）とともに１時間、インキュベートした。メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで大量に洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｄｕｒｈａｍ）（１：２０００希釈）とともに、３０分間、インキュベートした。反応を基質としてテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸の加水分解により可視化した。ＤＳ９タンパク質の相対的な強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）プログラムを用いて決定した。
【０１０１】
結果を図４に示す。２０℃への温度シフト後、４および６時間目で、ＴＭＶ感染した葉におけるＤＳ９のタンパク質量は、それぞれ、７８％および６２％まで減少した。ＤＳ９タンパク質量はＨＲ進行時に特異的に減少することが示された。
【０１０２】
（実施例７：ＡＭＤおよび熱処理後のＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける、ＤＳ９の転写レベルおよびタンパク質の変動）
試薬処理の前に、タバコの葉を分離してＴＭＶ（リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の８μｇ／ｍｌ）で接種するか、または模似（緩衝液のみ）接種し、３０℃で、４０時間、インキュベートした。インキュベーション後、葉の葉柄を０．５ｍｌの阻害剤溶液を含有するバイアルにおいた。ＡＭＤ処理については、ＡＭＤ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液として使用した。溶液を葉柄から吸収させ、そして１時間以内に滅菌水をバイアルに加えた。熱処理については、５０℃で２分間処理することにより、ＴＭＶ感染ＮＮタバコに熱ショックを与えた。次いで処理した葉を、それぞれ、３０℃にてさらにインキュベートした。ノザン解析およびウェスタンブロット解析は、実施例４および６に記載の方法と同様に行った。また、水処理したものコントロールとして用いた。
【０１０３】
結果を図５に示す。ＨＲを誘発することが知られているＡＭＤおよび熱処理により、ＴＭＶ感染ＮＮタバコのＤＳ９の転写レベルおよびタンパク質量が非常に減少されることが示された。
【０１０４】
（実施例８：壊死病斑形成の誘導における各種プロテアーゼ阻害剤の効果）
セリンプロテアーゼ阻害剤としてＡＰＭＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎおよび３，４−Ｄを、システインプロテアーゼ阻害剤としてＥ−６４を、メタロプロテアーゼ阻害剤としてＥＤＴＡを、ならびにセリン／システインプロテアーゼ阻害剤としてロイペプチンを用いた。各阻害剤は、以下のように調製した。
【０１０５】
ＥＤＴＡ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．  Ｉｎｄ．  （Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）は、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調製した水性溶液として使用した。
【０１０６】
Ｅ−６４は、メタノール／水（１：１，  ｖ／ｖ）中の５０ｍＭ  Ｅ−６４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）をストック溶液として使用し、続いて水中で希釈して示した濃度にした。
【０１０７】
３，４−Ｄは、ジメチルスルホキシド中の５０ｍＭ  ３，４−Ｄ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）をストック溶液として使用し、続いて水中で希釈して示した濃度にした。
【０１０８】
ロイペプチンおよびＡＰＭＳＰは、水溶液として使用した。
【０１０９】
この実施例において、ＥＤＴＡは、１ｍＭ、１０ｍＭおよび５０ｍＭの濃度で使用し、他の阻害剤は、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭおよび１ｍＭの濃度で使用した。
【０１１０】
試薬処理の前に、タバコの葉を分離してＴＭＶ（リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の８μｇ／ｍｌ）で接種するか、または模似（緩衝液のみ）接種し、３０℃で、４０時間、インキュベートした。インキュベーション後、葉柄を０．５ｍｌの阻害剤溶液を含有するバイアルにおいた。溶液を葉柄から吸収させ、そして１時間以内に滅菌水をバイアルに加えた。次いで処理した葉を、３０℃にて、さらにインキュベートした。結果を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
ＥＤＴＡで処理した場合に、壊死病斑が誘導された。さらに、Ｎ遺伝子を保持しないｎｎタバコにおいて、同様の病斑形成が観察された。また、他の各種プロテアーゼ阻害剤を用いた場合、壊死病斑は観察されなかった。これらの結果から、ＤＳ９タンパク質を含む少なくとも植物のメタロプロテアーゼ活性が阻害されると、細胞死が誘導されることが示される。
【０１１３】
（実施例９：ＤＳ９の細胞内の局在場所）
（９−１）免疫電子顕微鏡による実験
免疫電子顕微鏡研究を、葉を１×１ｍｍ片に切断し、そして減圧条件下、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中の０．１％グルタルアルデヒドよび４％パラホルムアルデヒドで固定した以外は、基本的には、ＳｕｚｕｋｉおよびＫａｔａｏｋａ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４０，３７９（１９９２））、ならびにＴｏｍｏｙａｓｕら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７５，  １３５２（１９９３））に記載されるように行った。次いで、−２０℃でＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂（Ｔｈｅ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎ  Ｃｏ．，  Ｌｏｎｄｏｎ）中に包埋した組織を超ミクロトームで切断した。切片を抗ＤＳ９抗体（１：２５０希釈）とともにインキュベートし、次いで１０ｎｍ  金結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００希釈、Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｒｄｉｆｆ）と、３０分間、３７℃で反応させた。免疫標識化した後、切片を酢酸ウラニルで染色した。
【０１１４】
細胞化学的コントロールとして、標本を前血清（非免疫ウサギＩｇＧ）とともにインキュベートするか、または標識化プロセスを省略した一次抗体とともにインキュベートした。極薄の凍結切片を用いる免疫電子顕微鏡のために、Ｔｏｋｕｙａｓｕ（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２１，  １６３，  １９８９）に記載される方法を用いて、固定化した組織のいくつかの小片に、２０％  ポリビニルピロリドン（分子量１０，０００：Ｓｉｇｍａ）および１．６Ｍ  スクロースの混合物をを侵入させ、液体プロパン中で凍結させた。そして、これを低温切片化（ｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）した。上述のＬＲ  Ｗｈｉｔｅで包埋したサンプルについてと同じ手順によりイムノゴールド標識し、そしてポリビニルアルコール（分子量１０，０００；Ｓｉｇｍａ）で吸着染色させた。サンプルを、透過型電子顕微鏡（Ｈ−７１００、Ｈｉｔａｃｈｉ，  Ｊａｐａｎ）により観察した。
【０１１５】
（９−２）金粒子の画像化による実験
電子顕微鏡写真のネガを平盤型スキャナー（ＧＴ−９０００、Ｅｐｓｏｎ；１８００ｄｐｉ）により数値化し、そしてＴＩＦＦフォーマットに保存した。コントラストを増強するために、Ｆｕｋｕｉ（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ７２，  ２７（１９８６））の方法に従って、数値化した画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖｅｒ．３．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃｏｒｐ．）により標準化した。核、葉緑体、ミトコンドリア、およびミクロソームの境界を各電子顕微鏡写真についてトレースし、そしてオルガネラの面積を数値化して計算した。次いで、金粒子の数をオルガネラのそれぞれについて視覚的にカウントした。
【０１１６】
これらの結果から、ＤＳ９が葉緑体に局在して存在することが示された（図６を参照）。
【０１１７】
（実施例１０：ＥＤＴＡおよびＤＣＭＵ処置によるＨＲの誘発）
メタロプロテアーゼ阻害剤であるＥＤＴＡ、および光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）における電子伝達の阻害剤であるＤＣＭＵ（３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチルウレア）（ＤＣＭＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を用いて、実施例８に記載のように、ＮＮタバコおよびｎｎタバコを用いて、阻害剤処理を行った。ＥＤＴＡは実施例８に記載のように調製し、およびＤＣＭＵはメタノール溶液として調製した。阻害剤の濃度は、ＥＤＴＡおよびＤＣＭＵについて、それぞれ、５ｍＭおよび１００ｍＭであった。処理した葉を、３０℃にて、さらにインキュベートした後、壊死病斑の形成、ＨＲタンパク質のマーカー遺伝子であるＰＲ−１タンパク質の発現、およびＨＲのマーカーとして知られているサリチル酸の蓄積を調べた。ＰＲ遺伝子の発現については、実施例４に記載のようにノザン解析を行った。また、サリチル酸の定量については、以下のように行った。
【０１１８】
遊離サリチル酸を、Ｍａｌａｍｙら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ４  ，３５９（１９９２））により記載されるようにして、抽出および定量した。ＨＰＬＣ分析を、４０℃に維持したμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ、５−μｍ  Ｃ−１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ）カラムに対して行った。Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ分離を、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の２３％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて行った。蛍光検出を、Ｍｏｄｅｌ  ＲＦ−５５０Ａ（Ｓｈｉｍａｚｕ，  Ｊａｐａｎ）を用いて１ｍ／分で行った。全てのデータを、ｌｏｓｓについて補正した。結果を図７、８および９に示す。ＮＮタバコおよびｎｎタバコの両方において、ＥＤＴＡおよびＤＣＭＵの両方が、それぞれ、ＨＲを誘発し、メタロプロテアーゼの阻害および葉緑体の機能の低下により、ＨＲが誘発されることが示された。
【０１１９】
（実施例１１：ＨＲ誘発時の葉緑体の機能）
ＨＲ誘発時に葉緑体の機能の低下を、ＰＳＩＩ活性を指標にして測定した。
【０１２０】
クロロフィル蛍光導入の動力学をｐｕｌｓｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＰＡＭ−２０００，  Ｈｅｉｎｚ  Ｗａｌｚ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。ＴＭＶ感染は、実施例１に記載のように行った。葉サンプルを葉表面に対して６０℃の角度に保ち、そして葉の半分を化学光（６００μＥ／ｍ２／ｓ）に曝露した。蛍光導入の動力学を、Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＡ−２０００，  Ｈｅｉｎｚ  Ｗａｌｚ）をインストールした携帯用コンピューターに記録した。結果を図１０に示す。ＴＭＶで感染したＮＮタバコの葉におけるＰＳＩＩ活性は、３０℃での培養のみでは低下しなかった。しかし、２０℃に温度シフトした後４時間目から、ＰＳＩＩ活性は低下し始めた。この時間はＤＳ９タンパク質量が減少する時間に一致する。この結果から、葉緑体の機能の低下は、ＤＳ９タンパク質量の減少と相関することが示された。
【０１２１】
（実施例１２：トランスジェニック植物の作出）
ＤＳ９コード領域（配列番号１の２１〜２２４０位）を、プライマーＡ、５’−ＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣ−３’およびプライマーＢ、５’−ＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣ−３’を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１２２】
センス構築物については、プライマーＡおよびＢの５’末端それぞれにＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位を連結した。アンチセンス構築物については、プライマーＡおよびＢの５’末端それぞれにＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を連結した。
【０１２３】
ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定により確認した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、次いで、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに対してセンス方向およびアンチセンス方向に、予めＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したバイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に連結した。センスおよびアンチセンスＤＳ９発現構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４（Ｏｏｍｓら、Ｇｅｎｅ，  １４，  ３３（１９８１））にエレクトロポレーション（Ｗｅｎ−ＪｕｎおよびＦｏｒｄｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １７，  ８３８５（１９８９））により導入した。Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮタバコの形質転換を、葉片共存培養法（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １２２９（１９８５））により行った。葉片を、細菌溶液中に浸し、次いで、ナフタレン酢酸（１００μｇ／Ｌ）およびベンゾアミノプリン（１ｍｇ／Ｌ）を含有するインキュベーション培地（３％スクロースおよびＢ５ビタミンを有するＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）基本培地）に、２日間、２５℃、白色蛍光灯の連続的な照射下、１２０μＥ／ｍ２／ｓの強度でおいた。次いで、この葉片を５００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンをさらに含有した上述のインキュベーショ培地に移した。２日後、葉片を選択培地（５００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するインキュベーション培地）に移した。センスＤＳ９遺伝子を発現する形質転換体の作出については、葉片を含むプレートを２５℃、１６時間の日長下、１２０μＥ／ｍ２／ｓの強度でインキュベートした。アンチセンスＤＳ９遺伝子を発現する形質転換体の作出については、インキュベーションを、２５℃、２４時間の日長下、１０μＥ／ｍ２／ｓの強度で行った。カナマイシンを含有する培地中で形成されたシュートを、ホルモンを減少させた選択培地に移した。根形成後、植物を土の入ったポットに移した。
【０１２４】
（実施例１３：トランスジェニック植物における細胞死調節の解析）
（ＴＭＶ感染）
実施例１２により得られた、ＤＳ９  ｃＤＮＡをセンスまたはアンチセンスで発現させたトランスジェニックタバコの自殖次世代の系統（センス植物；Ｓ１、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ９；アンチセンス植物；Ａ９、Ａ１２）を用いて、実施例６に記載のようにウエスタンブロット解析を行い、タンパク質量を調べた（図１１）。また、各系統を実施例１に記載のようにＴＭＶで感染し、感染に対する病斑の大きさの変化を観察した（図１２および１３）。いずれの実験も、コントロールとして野生型タバコを用いた。
【０１２５】
野生型タバコの２倍のＤＳ９タンパク質量を有するセンス系統（Ｓ６）では、壊死病斑の大きさが野生型の２倍に達した。一方、野生型タバコの半分のタンパク質量を有するアンチセンス系統（Ａ９）では、壊死病斑の大きさ（すなわち、細胞死）は、野生型の約半分であった。壊死病斑が小さいことは、細胞死が速やかに生じ（すなわち、促進され）、感染した菌の広がりを阻止していることを示す。この結果から、ＤＳ９タンパク質量が少ない細胞においては、細胞死が促進され、タンパク質量が多い細胞においては、細胞死が抑制されることが示された。また、ＤＳ９  ｃＤＮＡをアンチセンスで発現させたトランスジェニックタバコは、ＴＭＶ感染に対する抵抗性が増強されたことが明らかである。
【０１２６】
（キュウリ立ち枯れ病菌感染）
カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む寒天培地に、Ａ９（実施例１２により得られた、ＤＳ９  ｃＤＮＡをアンチセンスで発現させたトランスジェニックタバコ）の自殖次世代の系統の種子、およびコントロールとして３５Ｓ−ＧＵＳを導入したタバコの種子を、ＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．およびＳｋｏｏｇ，Ｆ．  （１９６２）  Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｕｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５巻  ４７３−４９７頁を参照）を含む直径９ｃｍのシャーレに播種した。キュウリ苗立ち枯れ病菌をＰＤＡ培地（３９ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ（登録商標）Ｐｏｔｅｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ）で５日間、２５℃で前培養した。次いで、播種の７日目の芽生え、それぞれ３０個体に、前培養により得られる菌そうを３ｍｍ角に切り取り、シャーレ当たり１片を寒天上に置くことにより、菌を接種して、これを２５℃に保温した。接種後７日目に緑色を示して生存している個体を抵抗性植物体とした。結果を図１４に示す。７日目の生存率は、Ａ９植物が６３％（３０個体中の１９個体）およびコントロール植物が０％（３０個体中の０個体）であった。
【０１２７】
ＤＳ９  ｃＤＮＡをアンチセンスで発現させたトランスジェニックタバコは、キュウリ立ち枯れ病菌に対して抵抗性を示した。
【０１２８】
（実施例１４：トランスジェニック植物におけるパラコート（商品名）耐性）
パラコートは、クロロプラスト中でスーパーオキシドを発生する除草剤である。Ｓ４トランスジェニック植物（実施例１２により得られたＤＳ９  ｃＤＮＡをセンスで発現させたトランスジェニックタバコ）および野生型タバコ（コントロール）を、温室において生長させた。次いで、０、１０、および２０μＭのパラコート溶液中に円形に切り取ったタバコ葉片を浸漬し、２５℃、５０００ｌｕｘにて４５時間処理した。結果を図１５に示す。野生型タバコでは、１０μＭの濃度におけるパラコート処理において、重度の白変化が生じたのに対して、Ｓ４トランスジェニック植物では、２０μＭの濃度におけるパラコート処理後も緑色を示し、葉緑体の分解が顕著に抑制された。
【０１２９】
ＤＳ９  ｃＤＮＡをセンスで発現させたトランスジェニックタバコは、パラコートに対して抵抗性を示した。
【０１３０】
【発明の効果】
本発明により、細胞死調節遺伝子の発現レベルを調節することにより細胞死を調節する方法が提供される。さらに、細胞死を調節することにより、様々な環境ストレスに対して、植物に抵抗性を付与する方法が提供され、農業上および育種上有用な植物が作出され得る。また、ＤＳ９関連遺伝子の選択的な阻害剤をスクリーニングする方法が提供される。
【０１３１】
【配列表】
【０１３２】
【配列番号：１】
0003586706.tif 000004
0003586706.tif 000005
0003586706.tif 000006
0003586706.tif 000007
0003586706.tif 000008
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【０１３３】
【配列番号：２】
0003586706.tif 000010
0003586706.tif 000011
0003586706.tif 000012
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＳ９と他のＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼとの構造比較を示す模式図である。ＤＳ９は、他のＡＴＰ依存性Ｚｎ型メタロプロテアーゼと同様に、Ｎ末端側の膜を貫通すると考えられる疎水性領域、および中央部のＡＴＰａｓｅ領域、ならびにＣ末端側のＺｎ２＋結合モチーフが存在した。
【図２】ＧＳＴ−ＤＳ９融合タンパク質のＭｇ２＋依存性のＡＴＰａｓｅ活性を示す図である。
【図３】ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける、３０℃から２０℃への温度シフト後のＤＳ９の転写の変動を示したノザン解析の結果を示す電気泳動写真である。変動のコントロールとして、傷をつけたのみの葉（模似）を用いた。発現のコントロールとしてｒＲＮＡを用いた。そしてＨＲの指標を示すコントロールとして感染時特異的に発現するＰＲ−１を用いた。また、上部の各数字は３０℃から２０℃への温度シフト後の時間を示す。
【図４】ＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける、３０℃から２０℃への温度シフト後のＤＳ９タンパク質量の変動を示したウエスタンブロット解析の結果を示す電気泳動写真である。変動のコントロールとして、傷をつけたのみの葉（模似）を用いた。抗体として、抗ＤＳ９抗体を用いた。また、上部の各数字は３０℃から２０℃への温度シフト後の時間を示す。また、下部の各数字は、模似の感染後０時間目のタンパク質量を１００％としたときの、各時間におけるタンパク質量を示す。
【図５】ＡＭＤおよび熱処理後のＴＭＶ感染ＮＮタバコにおける、ＤＳ９の転写レベルおよびタンパク質の変動を示したノザン解析およびウエスタンブロット解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図６】ＤＳ９が葉緑体に局在して存在することが示す電子顕微鏡写真である。図６Ａは、抗ＤＳ９抗体および１０ｎｍ金粒子結合抗ウサギＩｇＧで処理した葉肉細胞におけるＤＳ９タンパク質の局在を示す電子顕微鏡写真である。横棒は１μｍを示す。図６Ｂは、図６Ａの高倍率の電子顕微鏡写真である。横棒は０．１μｍを示す。図６Ｃは、前血清（コントロール）および１０ｎｍの金粒子結合抗ウサギＩｇＧで処理した葉肉細胞の電子顕微鏡写真である。横棒は０．１μｍを示す。図６Ｄは、抗ＤＳ９抗体および１０ｎｍ金粒子結合抗ウサギＩｇＧで処理した葉肉細胞の凍結切片におけるＤＳ９タンパク質の局在を示す電子顕微鏡写真である。横棒は０．１μｍを示す。
【図７】ＴＭＶ感染タバコ（ＮＮおよびｎｎ）を、３０℃で４０時間培養し、メタロプロテイン阻害剤（ＥＤＴＡ）および葉緑体電子伝達系阻害剤（ＤＣＭＵ）処理して、さらに３０℃で培養した２４時間後の壊死病斑の程度を示す生物の形態を示す写真である。
【図８】ＴＭＶ感染タバコ（ＮＮおよびｎｎ）を、３０℃で４０時間培養し、メタロプロテイン阻害剤（ＥＤＴＡ）および葉緑体電子伝達系阻害剤（ＤＣＭＵ）処理して、さらに３０℃で培養した２４時間後のＰＲ−１の発現レベルの程度を示したノザン解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図９】ＴＭＶ感染タバコ（ＮＮおよびｎｎ）を、３０℃で４０時間培養し、メタロプロテイン阻害剤（ＥＤＴＡ）および葉緑体電子伝達系阻害剤（ＤＣＭＵ）処理して、さらに３０℃で培養した２４時間後のサリチル酸量を示す図である。
【図１０】ＨＲ誘発時に葉緑体の機能が低下することを、ＰＳＩＩ活性を指標にして測定した図である。
【図１１】ＤＳ９遺伝子を、センス（Ｓ）およびアンチセンス（Ａ）で導入したトランスジェニックタバコにおけるＤＳ９タンパク質量を示すウエスタンブロット解析の結果を示す電気泳動写真である。抗体として抗ＤＳ９抗体を用いた。タンパク質量のコントロールとして、野生型タバコを用いた。
【図１２】ＤＳ９遺伝子を、センス（Ｓ）およびアンチセンス（Ａ）で導入したトランスジェニックタバコにおけるＴＭＶ接種５日後の壊死病斑の直径を示すグラフである。コントロールとして、野生型タバコを用いた。
【図１３】ＤＳ９遺伝子を、センス（Ｓ）およびアンチセンス（Ａ）で導入したトランスジェニックタバコ（Ａ９およびＳ６）における、ＴＭＶ感染後５日目の壊死病斑形成の程度を示す生物の形態を示す写真である。壊死病斑形成の程度のコントロールとして、野生型タバコを用いた。
【図１４】ＤＳ９遺伝子を、アンチセンスで導入したトランスジェニックタバコ（Ａ９）における、キュウリ立ち枯れ病菌感染後７日目の生物の形態を示す写真である。コントロールとして、３５Ｓ−ＧＵＳを導入したトランスジェニックタバコを用いた。
【図１５】ＤＳ９遺伝子を、センスで導入したトランスジェニックタバコ（Ｓ４）における、パラコート処理後の生物の形態を示す写真である。コントロールとして、野生型タバコ（ＷＴ）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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