(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:4で示されるアミノ酸配列を有する単離IKK−αポリペプチドを含んでなり、NIKと相互作用する薬剤をスクリーニングするための薬剤。
【請求項２】
IKK−αポリペプチドのNIKに対する相互作用を変調する薬剤のスクリーニング方法において、
配列番号:4で示されるアミノ酸配列を有する単離IKK−αポリペプチド、前記NIK、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤が存在しない場合に前記ポリペプチドが基準親和性をもって前記NIKに結合する条件下でインキュベートし、
前記NIKに対する前記記ポリペプチドの結合親和性を検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、
薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、前記NIKに対する前記ポリペプチドの結合を前記薬剤が変調することを示す方法。
【発明の詳細な説明】
緒言
発明の分野
この発明の分野は転写因子の活性化に関与するタンパク質である。
背景
サイトカイン類は、潜伏転写因子の活性等を改変することにより遺伝子発現における変化をトリガーする（HillとTreisman,1995）。核因子κＢ（NF−κＢ）は如何にそのような外部刺激が活性な転写因子に転換されるかの顕著な例である（Vermaら,1995）。NF−κＢ系は、数多くの免疫及び炎症性応答遺伝子並びに重要なウィルス遺伝子の発現を制御する関連転写因子のRelファミリーのメンバーのホモ及びヘテロダイマーからなる（LenardoとBaltimore,1989;BaeuerleとHenkel,1994）。NF−κＢ転写因子の活性はその細胞下局性化により調節される（Vermaら,1995）。大抵の細胞型において、NF−κＢは50kDaと65kDaのサブユニットからなるヘテロダイマーとして存在する。このヘテロダイマーは抑制タンパク質のＩκＢファミリーのメンバーであるＩκＢαと結合して細胞質に隔絶される（FincoとBaldwin,1995;ThanosとManiatis,1995;Vermaら,1995）。ＩκＢαはNF−κＢの核局在化シグナルをマスクし、それによってNF−κＢの核トランスロケーションを防ぐ。核中に転位置し同族DNA配列に結合する活性な転写因子へのNF−κＢの転換には、26sプロテアソームでのＩκＢαのリン酸化と続くユビキチン依存性分解が必要となる。ＩκＢαのシグナル誘導リン酸化はセリン32と36で起こる。これらのセリンの一方又は両方の突然変異により、ＩκＢαはユビキチン結合とタンパク質分解性分解に対して耐性にする（Chenら,1995）。
多面的サイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）及びインターロイキン−１（IL−１）はＩκＢリン酸化と続くNF−κＢ活性化の生理的誘導物質である（Osbornら,1989;Begら,1993）。TNF及びIL−１は細胞表面レセプターの異なるファミリーを介してNF−κＢ活性化を導くシグナル伝達カスケードを開始させるが（Smithら,1994;Dinarello,1996）、両方の経路は、シグナルトランスデューサーとしてアダプタータンパク質のTNFレセプター関連因子（TRAF）ファミリーのメンバーを利用する（Rotheら,1995;Hsuら,1996;Caoら,1996b）。TRAFタンパク質は元来は、75kDaのTNFレセプター（TNFR2）、CD40、CD30、及びリンホトキシン−βレセプターを含むTNFレセプターファミリーの幾つかのメンバーの細胞質ドメインに直接随伴することが見出された（Rotheら,1994;Huら,1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;SongとDonner,1995;Satoら,1995;Leeら,1996;Gedrichら,1996;Ansieauら,1996）。また、TRAFタンパク質はアダプタータンパク質TRADDにより55kDaのTNFレセプター（TNFR1）に間接的に補充される（Hsuら,1996）。TNFよるNF−κＢの活性化にはTRAF2が必要となる（Rotheら,1995;Hsuら,1996）。TRAF5もまたTNFレセプターファミリーのメンバーによるNF−κＢ活性化に関係していた（Nakanoら,1996）。これに対して、TRAF6はIL−１によりNF−κＢ活性化に関与する（Caoら,1996b）。IL−１処理の際、TRAF6は、IL−１レセプター複合体に結合するセリン−スレオニンキナーゼであるIRAKに付随する（Caoら,1996a）。
NF−κＢ−誘導キナーゼ（NIK）はTRAF2−相互作用タンパク質として同定されたMAPキナーゼキナーゼキナーゼ（MAP3K）ファミリーのメンバーである（Malininら,1997）。NIKは過剰発現されたときNF−κＢを活性化し、そのTRAF2−相互作用Ｃ末端ドメインを含む（NIK(624-947)）又はそのキナーゼドメインに２つの重要なリシン残基を欠く（NIK(KK429-430AA)）NIKのキナーゼ不活性突然変異体が、TNF−、IL−１−、及びTRAF2−誘導NF−κＢ活性化を抑制するドミナントネガティブ阻害剤として挙動する（Malininら,1997）。最近、NIKは、TRAF5及びTRAF6を含むTRAFファミリーの更なるメンバーと結合することが見出された。NIKの触媒的に不活性な突然変異体もまたTRAF5−及びTRAF6−誘発NF−κＢ活性化を抑制し、よってTRAFの下流のTNF及びIL−１によりトリガーされるNF−κＢシグナル伝達カスケードにおける共通のメディエータとしての統一概念をNIKに提供する。
ここで、我々は、NIK−相互作用タンパク質として新規なヒトキナーゼＩκＢキナーゼであるIKK−αを開示する。IKK−αは未知の機能のセリン−スレオニンキナーゼをコードすると推論された過去に同定されたオープンリーディングフレームの概念的翻訳物（配列番号:5）と配列類似性を有する（「保存されたヘリックス・ループ・ヘリックス偏在性キナーゼ（Conserved Helix−loop−helix Ubiquitous Kinase）」又はCHUK,ConnellyとMarcu 1995;Mockら,1995）。IKK−αの触媒的に不活性な突然変異体は、TNF及びIL−１刺激により並びにTRAF及びNIK過剰発現により誘発されるNF−κＢ活性化を抑制することが示され；一過性に発現したIKK−αは内在性ＩκＢα複合体に随伴することが示され；そしてIKK−αがＩκＢαをセリン32及び36上でリン酸化することが示される。
発明の概要
本発明は、IKK−αポリペプチド、関連する核酸、及びIKK−α−特異的構造及び活性及びIKK−α機能、特にＩκＢキナーゼ活性を有するそのポリペプチドドメインに関する方法及び組成物を提供する。IKK−αポリペプチドは、NFκＢ活性化を調節することができ、よって細胞機能の重要な調節因子を提供する。該ポリペプチドは、主題のIKK−αポリペプチドコード核酸由来の形質転換宿主細胞から組換え的に産生されても哺乳動物細胞から精製されてもよい。本発明は、開示されたIKK−α遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離IKK−αハイブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗体のようなIKK−α−特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法（例えば、IKK−α転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーン）、治療法（例えばTNFシグナル伝達を阻害するIKK−αキナーゼ阻害剤）及び生物薬剤工業（例えば免疫原、他の転写調節因子を単離するための試薬、薬理学的リード薬剤のために化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等々）に使用する方法を提供する。
発明の詳細な説明
ヒトIKK−αポリペプチドをコードしている天然cDNAの核酸配列は配列番号:3として示され、概念的全長翻訳物は配列番号:4として示される。本発明のIKK−αポリペプチドは配列番号:3の不完全翻訳物、特に配列番号:3の残基１〜638を含み、その翻訳物及び配列番号:4の欠失変異体はヒトIKK−α−特異的アミノ酸配列、結合特異性又は機能を有し、Cys30、Glu543、Leu604、Thr679、Ser680、Pro684、Thr686及びSer687の少なくとも一つを含む。好ましい翻訳物／欠失変異体は、配列番号:4の６つの残基Cys30、Glu543、Leu604、Thr679、Ser680、Pro684、Thr686又はSer687含有ドメインを含み、該残基に直ぐ隣り合う少なくとも８、より好ましくは少なくとも約12、最も好ましくは少なくとも20の連続残基の配列を含んでなるもので、該残基は、上記連続残基内に好ましくはあり（例えば表Ｉを参照されたい）；この変異体がhIKK−α特異的エピトープ及び免疫原を提供する。
表1.  IKK−α結合特異性を有するIKK−αポリペプチドの例
hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基１−30）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基686−699）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基22−31）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基312−345）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基599−608）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基419−444）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基601−681）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基495−503）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基604−679）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基565−590）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基670−687）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基610−627）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基679−687）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基627−638）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基680−690）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基715−740）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基684−695）hIKK−αΔ１（配列番号:4、残基737−745）
主題ドメインは、IKK−αドメイン特異的活性又は機能、例えばIKK−α−特異的キナーゼ又はキナーゼ抑制活性、NIK−結合又は結合抑制活性、ＩκＢ−結合又は抑制活性、NFκＢ活性化又は抑制活性又は抗体結合性を提供する。好ましいドメインはＩκＢのセリン32と36の少なくとも一方、好ましくは両方をリン酸化させる（Verma,I.M.ら（1995））。本明細書において、ＩκＢのセリン32とセリン36とは、コンセンサス配列DSGL/IXSM/Lの一部である２つのセリン残基（例えばＩκＢαのser32と36、ＩκＢβのser19と23、及びメチオニンの使用に応じてＩκＢεのser157と161あるいは18と22）を集合的に指す。
IKK−α−特異的活性又は機能は、簡便なインビトロ、細胞ベース、又はインビボアッセイ：例えば動物でのインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ（例えば遺伝子療法、遺伝子組換え等々）等々により決定することができる。結合アッセイは、結合標的とのIKK−αポリペプチドの分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを包含する。結合標的は、例えばIKK−α基質のような天然の細胞内結合標的、IKK−α調節タンパク質あるいはIKK−α活性又はその局在化を直接変調するその他の制御因子；あるいは抗体のような特異的免疫タンパク質、又は以下に記載するようなスクリーニングアッセイにおいて同定されるもののようなIKK−α特異的薬剤のような非天然結合標的でもよい。IKK−α−結合特異性は、キナーゼ活性又は結合平衡定数（通常少なくとも約107M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より好ましくは少なくとも約109M-1）により、IKK−α−発現細胞におけるネガティブ変異体として機能し、異種性宿主（例えばげっ歯類又はウサギ）中でIKK−α特異的抗体を誘発する等々の主題タンパク質の能力により、検定することができる。とにかく、主題IKK−αポリペプチドのIKK−α結合特異性はCornellyとMarcu（1995）のマウス及びヒトCHUK配列並びにIKK−β（配列番号:2）を必ず区別する。
本発明に係わるIKK−αポリペプチドは単離されるか純粋である：「単離」ポリペプチドは、天然の状態では付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、与えられた試料中の全ポリペプチドの好ましくは少なくとも約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、純粋なポリペプチドは与えられた試料中の全ポリペプチドの少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約99％を構成する。特定の実施態様では、IKK−αポリペプチドは、IKK−βから単離され、及び／又はIKK複合体から単離されたMKP−１沈降性複合体から単離される。IKK−αポリペプチドとポリペプチドドメインは合成されても、組換え技術により産生されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞から精製されてもよい。非常に広範な分子及び生化学的方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及び精製に利用でき、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual（分子クローニング、実験室マニュアル）（Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコール）（Ausubelら編、Greene Publ.Assoc.,Wiley−Interscience,NY）あるいは当該分野でその他知られているものを参照されたい。
本発明は、IKKポリペプチド、好ましくはIKK−αポリペプチドに特異的な結合薬剤で、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然細胞内結合標的等々を含むもの、かかる薬剤を同定し調製する方法、及び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用途を提供する。例えば、特異的結合薬剤は、様々な診断及び治療用途、特に疾病又は疾病予後に例えばNF−κＢ活性化のような主題タンパク質を含む経路の不適切な利用に関与する場合に有用である。新規なIKK特異的結合薬剤には、IKK特異的レセプター、例えば特異的抗体のような体細胞性組換えポリペプチドレセプター又はＴ細胞抗原レセプター（例えばHarlowとLane（1988）Antibodies,A Laboratory Manual（抗体、実験室マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同定されるその他の天然の結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリのスクリーニングで同定される非天然細胞内結合薬剤等々が包含される。特に興味深い薬剤はIKK機能、例えばIKK依存性転写活性化を変調する。例えばIKK  ＩκＢキナーゼ活性の広範な阻害剤を、ＩκＢを含むシグナル伝達を調節するために使用しても良い。IKK  ＩκＢキナーゼ阻害剤の例には、セリン／スレオニンキナーゼ（例えばPKC）阻害剤の既知のクラス、例えばATPと基質結合の競合阻害剤、抗生物質、IKK誘導ペプチド阻害剤等々が含まれる。表IIおよびIIIを参照されたい。IKK特異性と活性は、プロテインキナーゼのパネルを使用する高収量キナーゼアッセイにおいて即座に定量される（引用文献と実施例を参照されたい）。
好適な阻害剤には、海生生物により生産されたスタウロスポリン（Omura Sら,J Antibiot（Tokyo）1995 Jul;48（７）:535−48）のような天然化合物、及びEGFレセプタープロテインキナーゼをまた強力に阻害するPD153035のような合成化合物（Fry DWらScience 1994 Aug 19;265（5157）:1093−５）が含まれる。合成プロテインキナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーのメンバーもまた有用である；これらには純粋なATPコンピティターである化合物、純粋な基質コンピティターである化合物、及びATPと基質の両方と競合する混合コンピティターである化合物が含まれる（Levitzki AとGazit A,Science 1995 Mar 24;267（5205）:1782−８）。更なるIKK阻害剤には、哺乳動物細胞により内在的に生産されるペプチド系基質コンピティター、例えばPKI（プロテインキナーゼ阻害剤,Seasholtz AFら,Proc Natl Acad Sci USA 1995 Feb 28;92（５）:1734−８）、又はcdcキナーゼを阻害するタンパク質（Correa−Bordes J及びNurse P,Cell1995 Dec 15;83（６）:1001−９）が含まれる。更なる小ペプチドベース基質競合性キナーゼ阻害剤とアロステリック阻害剤（ATP又は基質競合と独立の抑制機構）は確立された方法（Hvalby OらProc Natl Acad Sci USA 1994 May 24;91（11）:4761−5;Barja Pら,Cell Immunol 1994 Jan;153（１）:28−38;Villar−Palasi C,Biochim Biophys Acta 1994 Dec 30;1224（３）:384−8;Liu WZら,Biochemistry 1994 Aug 23;33（33）:10120−６）により直ぐに産生される。
0003549899.tif 000002
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従って、本発明は、例えばセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤に細胞を接触させることにより、IKKキナーゼ活性を変調する工程を含む細胞中にＩκＢを含むシグナル伝達を変調する方法を提供する。細胞は培養中かインサイツ、すなわち天然宿主内に常在していてもよい。好適な阻害剤は哺乳動物宿主において経口的に活性である。診断用途に対しては、阻害剤又は他のIKK結合剤は、例えば蛍光、放射性、化学発光、又は、結合薬剤に直接抱合されるか結合薬剤に特異的なプローブに抱合される他の容易に検出可能な分子でしばしば標識される。
開示したIKK−αポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系に対して最適化されたIKK−αポリペプチドコード核酸を逆翻訳するために使用されるか（Hollerら（1993）Gene136,323−328;Martinら（1995）Gene154,150−166）、天然のIKK−αコード核酸配列の単離に使用される変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを産生するために使用される（「GCG」ソフトウェア、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インク、マディソンWI）。IKK−αコード核酸配列は、IKK−α発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニングのために組換え宿主細胞に、例えばIKK−α変調細胞機能に関与する疾患に対する候補薬の効能等の機能性研究等々のための遺伝子組換え動物に導入される。
本発明はまた、配列番号:3のストランドの少なくとも12、好ましくは少なくとも24、より好ましくは少なくとも36、最も好ましくは少なくとも96の近接塩基、特に配列番号:2のヌクレオチド１−1913のもの、好ましくは塩基１−92、1811、1812、1992、1995、2034、2035、2039、2040、2055及び2060を含むIKK−α  cDNA特異的配列を有し、（配列番号:5）を含む第３核酸の存在下で配列番号:3の相補ストランドを含む第２核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。特異的ハイブリダイゼーションを実証するには一般にストリンジェントな条件、例えば42℃の温度で5xSSPE（0.18M NaCl、0.01M NaPO4、pH7.7、0.001M EDTA）バッファー中に30％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃において0.2xSSPEで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好ましくは42℃の温度で5xSSPE中に50％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし42℃において0.2xSSPEバッファーで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件が必要となる。IKK−α核酸はまた例えばBLASTX（Altschulら（1990）Basic Local Alignment Search Tool,J Mol Biol 215,403−410）のような整合化アルゴリズムを使用して区別することもできる。
主題の核酸は、合成／非天然配列のものであり、及び／又は単離される、すなわちその天然の状態で付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、好ましくは与えられた画分中に存在する全核酸の少なくとも約0.5％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、通常は、天然染色体上に結合しているもの以外のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番号３の核酸配列又はそのフラグメントを含んでなる組換え核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に（すなわち、近接して）位置している末端か、天然染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある10kb、好ましくは2kbよりも小さい負のフランキング領域が隣に位置している末端に含んでいる。核酸は通常はRNAもしくはDNAであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばしば好適である。
主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、診断用核酸等々としての使用;IKK−α遺伝子及び遺伝子転写物の存在を検出し、更なるIKK−α相同体及び構造類似体をコードする核酸を検出又は増幅するための使用を含む広範な応用範囲が見出される。診断法では、IKK−αハイブリダイゼーションプローブが、臨床及び実験室試料中の野生型及び変異体IKK−α対立遺伝子を同定する際に使用される。変異体対立遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブを産生するために使用される。治療法では、治療用IKK−α核酸が活性なIKK−αの細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために使用される。
本発明はIKK変調性細胞機能のレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤用のリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング法は、天然のIKK結合標的との相互作用を変調する化合物、特にＩκＢ誘導基質、特にＩκＢ及びNIK基質とのIKKリン酸化を変調する化合物に対するアッセイを含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等々を含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。該方法は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動でコスト性能の良い高処理スクリーニングに受け入れられる。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業で使用される；例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のための活性を最適化し毒性を最小化することができる。
インビトロ結合アッセイでは、他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ等との融合産物の一部であってもよいIKKポリペプチドを含む成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は、天然の細胞内IKK結合標的を含む。特定の実施態様では、結合標的はＩκＢセリン32及び／又は36を含んでなる基質である。このような基質は、セリン32及び／又は36残基と、少なくとも５、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも20の天然に生じる直ぐ隣りに位置する残基（例えば、セリン36ペプチドに対して、ＩκＢα、βもしくはε由来基質に対してそれぞれ残基26−46、22−42、又は12−32もしくは151−171の残基）を各側に含むＩκＢα、βもしくはεペプチドを含んでなる。天然の全長結合標的を使用することもできるが、その部分がアッセイにおいて簡便に測定可能な主題IKKポリペプチドに対して結合親和性とアビディティをもたらす限り、かかる部分（例えばペプチド）を使用することがしばしば好ましい。アッセイ混合物はまた候補薬理剤を含有する。候補薬剤には、典型的には有機化合物であるが、数多くの化学クラスが包含され、好ましくは小さな有機化合物が含まれ、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られる。様々な他の試薬もまた混合物に含めても良い。これらには、（キナーゼアッセイに対する）ATP又はATP類似体、塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様々なその他の試薬を含有する。
得られた混合物は、候補の薬理剤が存在しなかったらIKKポリペプチドが細胞結合標的、部分又は類似体に基準結合親和性をもって特異的に結合するような条件下でインキュベートされる。混合物成分を、要求された結合をもたらす任意の順序で添加することができ、最適な結合を容易にする任意の温度でインキュベーションを実施することができる。インキュベート期間は同様に最適結合となるように選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを容易にするように最小化される。
インキュベート後、IKKポリペプチドと一又は複数の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便な方法で検出される。IKKキナーゼ活性に対しては、「結合」はIKK−α基質のリン酸化の変化により一般に検出される。この実施態様では、キナーゼ活性は標識リン酸塩の基質への移動により定量することができ、ここで、標識は、放射能、発光、光学もしくは電気密度等々のような直接的検出をもたらすものでも、あるいはエピトープタグ等々のような間接的検出をもたらすものでもよい。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子密度、放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応じて、様々な方法を使用して標識を検出することができ、あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。
薬剤の存在下での結合アフィニティーと比較して薬剤の非存在下における標的に対するIKKポリペプチドの結合アフィニティーの差は、薬剤がIKK結合標的に対するIKKポリペプチドの結合を変調することを示している。同様に、以下に記載される細胞ベースアッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下におけるIKK−α依存性転写活性化の差は、薬剤がIKK機能を変調することを示している。本明細書において使用される差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％の差を表す。
次の実験部分と実施例は例証のために提供するもので限定をなすものではない。
実験
IKK−αの同定
NIK媒介NF−κＢ活性化のメカニズムを調べるために、我々は、酵母二重ハイブリッドタンパク質相互作用クローニングによりNIKに直接結合するタンパク質を同定した（FieldとSong,1989）。酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインに融合したNIKをコードする発現ベクターを産生した。このベクターはヒトＢ細胞cDNAライブラリの二重ハイブリッドスクリーニングにおいて餌として使用した。およそ600万の形質転換体から、his及びlacZレポーター遺伝子の活性化により測定して８つの陽性のクローンを得た。これらのクローンから、３つがTRAFファミリーのメンバーであるTRAF3をコード化し（Huら,1994;Chengら,1995;Mosialosら,1995;Satoら,1995）、一つがIKK−αと我々が呼ぶ新規なタンパク質をコード化した。酵母細胞への再形質転換によりNIKとIKK−αの間の相互作用が証明された。全長ヒトIKK−αクローンは、IKK−αの二重ハイブリッドクローンの5'末端から産生したプローブでジャーカットcDNAライブラリをスクリーニングすることにより単離した。IKK−αは、Ｎ末端セリン−スレオニンキナーゼ触媒作用ドメイン、Ｃ末端ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン及びヘリックス・ループ・ヘリックスとキナーゼドメインの間に並列したロイシンジッパー様両親媒性αヘリックスを含む。
ヒト細胞におけるIKK−αとNIKの相互作用
IKK−αのNIKとの相互作用は、哺乳動物細胞免疫共沈降アッセイにおいて確認された。Ｎ末端フラッグエピトープタグを含むヒトIKK−αをMycエピトープタグNIK又はHAエピトープタグTRAFタンパク質での293ヒト胚性腎臓細胞において一過性に同時発現させた。細胞溶解物をフラッグエピトープに対するモノクローナル抗体を使用して免疫沈降させ、共沈するNIK又はTRAFタンパク質を抗Myc又は抗HAモノクローナル抗体での免疫ブロット分析により検出した。このアッセイにおいて、IKK−αはNIKを共沈させることができ、酵母二重ハイブリッド分析によるIKK−αについて検出した両タンパク質の相互作用を確認する。また、殆どのＮ末端キナーゼドメイン（IKK−α(307-745)）を欠く欠失変異体IKK−αタンパク質はNIKと結合することができ、IKK−αのα−ヘリックスＣ末端の半分がNIKとの相互作用を媒介することを示している。NIKに対して、IKK−αはTRAF2又はTRAF3の何れにも結合しなかった。しかしながら、NIKをIKK−αとTRAF2と共に同時発現させたとき、IKK−αでのTRAF2の強い共沈が検出され、IKK−α、NIK及びTRAF2の間の三元複合体の形成を示している。
NF−κＢ活性化に対するIKK−α及びIKK−α変異体の影響
NF−κＢ活性化におけるIKK−αの可能な役割を調べるために、我々は、IKK−αの一過性過剰発現がNF−κＢ依存性レポーター遺伝子を活性化させるかどうかを調べた。Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター作成物（SchindlerとBaichwal,1994）及びIKK−α発現ベクターをHeLa細胞中に同時形質移入した。IKK−α発現はレポーター遺伝子を用量依存的に活性化させ、ルシフェラーゼ活性の最大の誘導はベクター対照と比較して約６ないし７倍であった。同様な結果は293細胞において得られ、そこではIKK−αの過剰発現がおよそ４倍のレポーター遺伝子活性を誘導した。TNF処理はレポーター遺伝子アッセイにおいて過剰発現されたIKK−αの弱いNF−κＢ誘導活性を刺激しなかった。従って、IKK−αは過剰発現したときNK−κＢの活性化を誘発する。
我々は次に293細胞中のレポーター遺伝子アッセイにおけるシグナル誘導NF−κＢ活性化の際にNIKになお随伴するキナーゼ不活性IKK−α(307-745)の過剰発現の影響を決定した。IKK−α(307-745)の過剰発現はNIK(624-947)の過剰発現と同様なTNF−及びIL−１−誘導レポーター遺伝子活性化を阻止した。IKK−α(307-745)はTRAF2、TRAF6及びNIKの過剰発現により誘発されるNF−κＢ依存性レポーター遺伝子活性を阻害したことがまた見出された。これらの結果を併せると、触媒的に不活性なIKK−α突然変異体はTNF−、IL−１、TRAF−及びNIK−誘発NF−κＢ活性化のドミナントネガティブな阻害剤である。これは、IKK−αがNIKの下流のTNF及びIL−１によるNF−κＢ活性化の共通のメディエータとして機能することを示している。
括弧内の文献
Ansieau,S.ら（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,14053−14058。
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Song,H.Y.とDonner,D.B.（1995）Biochem.J.809,825−829。
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実施例
1.  IKK−α−ＩκＢαリン酸化アッセイに対するプロトコール
A.  試薬：
−ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−キナーゼ:PBSに20μg/mlで入れた10-8−10-5MのIKK−α（配列番号:4）。
−基質:PBSに40μg/mlで入れた10-7−10-4Mのビオチン化基質（ヒトＩκＢαの残基26−46からなる21残基ペプチド）。
−阻害バッファー:PBS中に５％BSA、0.5％トウィーン20;室温で１時間。
−アッセイバッファー:100mMのKC1、10mMのMgCl2、1mMのMnCl2、20mMのHEPES、pH7.4、0.25mMのEDTA、１％のグリセロール、0.5％のNP−40、50mMのBME、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤カクテル。
−［32P］γ−ATPの10x保存液:100μCi［32P］γ−ATPを伴う2x10-5Mの非放射性ATP。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X）:10mlのPBS中に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのアプロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃1017128）、10mgのAPMSF（BMB＃917575）、及び2mMのNaVo3（シグマ＃Ｓ−6508）。
B.  アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り120μｌの保存Ｎアビジンでコーティング。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
−150μｌの阻害バッファーで阻害。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
C.  アッセイ：
−40μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−40μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に２−200pmol/40ul）を添加。
−40μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に0.1−10pmol/40ul）を添加。
−10μｌの化合物又は抽出物を添加。
−10μｌの［32P］γ−ATPの10x保存液を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−200μｌのPBSで４回洗浄することにより反応を停止。
−150μｌのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D.  （各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
a.非特異的結合
b.80％阻害の非放射性ATP。
2.  高収量IKK−α−NIK結合アッセイに対するプロトコール
A.  試薬：
−ニュートラライトアビジン:PBS中に20μg/ml。
−阻害バッファー:PBS中に５％のBSA、0.5％のトウィーン20;室温で１時間。
−アッセイバッファー:100mMのHEPES、pH7.6、1mMのMgCl2、１％のグリセロール、0.5％のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
−32P  IKK−αポリペプチドの10xストック:200,000−250,000cpmの標識IKK−α（ベックマンカウンター）が補填された10-8−10-6Mの「非放射性」IKK−α。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（1000X）:10mlのPBS中に10mgのトリプシン阻害剤（BMB＃109894）、10mgのアプロチニン（BMB＃236624）、25mgのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−6506）、25mgのロイペプチン（BMB＃1017128）、10mgのAPMSF（BMB＃91575）、及び2mMのNaVo3（シグマ＃Ｓ−6508）。
−NIK:PBS中の10-7−10-5Mのビオチン化NIK
B.  アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り120μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティング。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
−150μｌの阻害バッファーで阻害。
−200μｌのPBSで２回洗浄。
C.  アッセイ：
−40μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−10μｌの化合物又は抽出物を添加。
−10μｌの33P−IKK−α（20−25,000cpm/0.1−10pmol/ウェル＝10-9−10-7M最終濃度）を添加。
−25℃で15分間振とう。
−25℃で更に45分間インキュベート。
−40μＭのビオチン化NIK（アッセイバッファー中に0.1−10pmol/40ul）を添加。
−室温で１時間インキュベート。
−200μＭのPBSで４回洗浄することにより反応を停止。
−150μＭのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント。
D.  （各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
a.非特異的結合
b.80％阻害の可溶性（非ビオチン化NIK）。
本明細書において引用した刊行物と特許出願の全てを、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典明示により特に個々に取り込まれることが示されているように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かるであろう。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人:Rothe,Mike
Cao,Zhaodan
0003549899.tif 000004
（ii）発明の名称:IKK−αタンパク質、核酸及び方法
（iii）配列の数:5
（iv）通信宛先：
（Ａ）宛先:SCIENCE ＆ TECHNOLOGY LAW GROUP
（Ｂ）通り:268 BUSH STREET,SUITE 3200
（Ｃ）都市:SAN FRANCISCO
（Ｄ）州:CALIFORNIA
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）ジップ:94104
（ｖ）コンピューター読取可能形態：
（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパチブル
（Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.30
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人情報
（Ａ）氏名:OSMAN,RICHARD  Ａ
（Ｂ）登録番号:36,627
（Ｃ）参照／書類番号:T97−006−１
（ix）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：（415）343−4341
（Ｂ）テレファックス：（415）341−4342
（２）配列番号:1
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:2268塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型:cDNA
（xi）配列：
0003549899.tif 000005
（２）配列番号:2
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:756アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列：
0003549899.tif 000006
0003549899.tif 000007
0003549899.tif 000008
（２）配列番号:3
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:2238塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型:cDNA
（xi）配列：
0003549899.tif 000009
（２）配列番号:4
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:745アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列：
0003549899.tif 000010
0003549899.tif 000011
0003549899.tif 000012
（２）配列番号:5
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:2146塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型:cDNA
（xi）配列：
0003549899.tif 000013