【手続補正書】
【提出日】平成28年12月9日(2016.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列断片ｔｎ−ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’−ｔｎ’に含まれる標的核酸配列ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’を増幅するための、複数の増幅反応を含む方法であって、
前記増幅反応の各々は、
i．  配列ｍａ−Ｋ−ｐｃを含む、左側の（フォワード）第１段階目のプライマーと、
ii．  配列ｍａ−Ｋ’−ｐｃ’を含む、右側の（リバース）第１段階目のプライマーと、
を用いて前記標的核酸配列を増幅して、第１の増幅産物を生成する第１段階目の増幅反応、及び
iii．  配列ａＬ−ａＰ−ａＫを含む、左側の（フォワード）アダプタープライマーと、
iv．  配列ａＬ’−ａＰ’−ａＫ’を含む、右側の（リバース）アダプタープライマーと、
を用いて前記第１の増幅産物を増幅して、第２の増幅産物を生成する第２段階目の増幅反応を含み、
ここで、
ｔＶは、前記標的核酸配列における可変領域であり、
ｐｃは配列要素ｔＣと同一の配列を有し、かつｐｃ’はｔＣ’に対する逆相補配列を有し、
Ｋは配列要素ｋ１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は配列要素ｋ１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
ここで、
ｋ１及びｋ１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
ｓ及びｓ’は、配列要素ｔｎ及びｔｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
ａＫの配列は配列要素ｋ１の配列と同一の配列であり、かつａＫ’の配列は配列要素ｋ１’の配列と同一の配列であり、
ａＰ−ａＫはｍａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａＰ’−ａＫ’はｍａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
ｐｃ、ｐｃ’、ｍａ−Ｋ及びｍａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａＬ及びａＬ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
ここで、
前記複数の増幅反応の各々には、特有のプライマーのセットを用い、該プライマーのセットの各々において、
ｋ１は、他のプライマーセットのｋ１と異なるものである、
及び／又は
ｋ１’は、他のプライマーセットのｋ１’と異なるものである。
【請求項２】
Ｋは３’末端配列ｋ１−ｋ２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ１’−ｋ２’−ｓ’を含み、
ここで、ｋ２の長さ及びｋ２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
ａＫ及びａＫ’はそれぞれ、ｋ２及びｋ２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
前記プライマーのセットの各々の間で、ｋ２及びｋ２’はそれぞれ、他のｋ２及びｋ２’とは異なるものである、及び
ｋ１、ｋ１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーのセットは、
配列番号００１から０４５から選択されるｐｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０４６から０５８から選択されるｐｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１８９から２３２から選択されるｐｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号２３３から２４６から選択されるｐｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号０５９から０８５から選択されるｍａを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０８６から１１７から選択されるｍａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
配列番号１１８から１４９から選択されるａＬ−ａＰを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号１５０から１８２から選択されるｍａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマーを含む、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１段階目の増幅及び／又は前記第２段階目の増幅において、３’末端から５’末端方向のエキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列断片ｔｎ−ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’−ｔｎ’に含まれる標的核酸配列ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’をシーケンシングする方法であって、
ａ）請求項１、３又は４のいずれか１項に記載の方法を用いて前記標的核酸配列を増幅する工程、及び
ｂ）配列要素ｍａ−Ｋ及び／又はｍａ−Ｋ’を含む前記第２の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列のセットを生成する工程
を含む、方法。
【請求項６】
更に、
ｃ）  前記配列のセットに含まれる各配列を、第１段階目のプライマーに含まれるｍａ−Ｋ及び／又はｍａ−Ｋ’とアライメントする工程、及び
ｄ）  コンタミネーションの指標として、前記配列のセットに含まれる各配列に対し０又は１の値を割り当てる工程であって、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）がｍａ−Ｋ及び／又はｍａ−Ｋ’と完全にアライメントした場合は値０を割り当て、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）とｍａ−Ｋ及び／又はｍａ−Ｋ’とのアライメントが不完全だった場合は値１を割り当てる工程
を含み、
ここで、
（i）工程ｄ）で割り当てた値を全て加算し、読み取った全配列数で前記加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び／又は
（ii）前記配列のセットから、値１を割り当てた配列を削除する、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔｎ−ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’−ｔｎ’に含まれる標的核酸配列ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するためのプライマーのセットのコレクションであって、
前記プライマーのセットの各々において、  
i．配列ｍａ−Ｋ−ｐｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍａ−Ｋ’−ｐｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
ii．配列ａＬ−ａＰ−ａＫを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａＬ’−ａＰ’−ａＫ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
を含み、
ここで、
ｐｃは標的配列のｔＣに対し相補的な配列を有し、かつｐｃ’はｔＣ’に対する逆相補配列を有し、
Ｋは配列要素ｋ１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
ここで、
ｋ１及びｋ１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
ｓ及びｓ’は、配列要素ｔｎ及びｔｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
ａＫの配列は配列要素ｋ１の配列と同じあり、かつａＫ’の配列は配列要素ｋ１’の配列と同じであり、
ａＰ−ａＫはｍａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａＰ’−ａＫ’はｍａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
ｐｃ、ｐｃ’、ｍａ−Ｋ及びｍａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａＬ及びａＬ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
ここで、
前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、全てのｐｃは同じ配列を有し、かつ全てのｐｃ’は同じ配列を有し、
前記プライマーのセットの各々において、
ｋ１は、他のプライマーのセットのｋ１と異なるものである、及び／又は
ｋ１’は、他のプライマーのセットのｋ１’と異なるものである、
プライマーのセットのコレクション。
【請求項８】
前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐｃは配列番号００１から０４５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐｃ’は配列番号０４６から０５８から選択され、及び／又は
前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐｃは配列番号１８９から２３２から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐｃ’は配列番号２３３から２４６から選択され、及び／又は
前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｍａは配列番号０５９から０８５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｍａは配列番号０８６から１１７から選択され、及び／又は
前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるａＬ−ａＰは配列番号１１８から１４９から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｍａは配列番号１５０から１８２から選択される、
請求項７に記載のプライマーのセットのコレクション。
【請求項９】
Ｋは３’末端配列ｋ１−ｋ２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ１’−ｋ２’−ｓ’を含み、
ここで、ｋ２の長さ及びｋ２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
ａＫ及びａＫ’はそれぞれ、ｋ２及びｋ２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものであり、
前記プライマーのセットの各々において、
ｋ２は、他のプライマーのセットのｋ２と異なるものである、及び／又は
ｋ２’は、他のプライマーのセットのｋ２’と異なるものであって、
ｋ１、ｋ１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
請求項８に記載のセットのコレクション。
【請求項１０】
４、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、１６０、２００、２５６又は１０２４個の相異なるプライマーのセットを含む、
請求項７〜９のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
【請求項１１】
ｋ１及びｋ１’並びに／又はｋ２及びｋ２’は、ｔｎ及びｔｎ’とはハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
配列要素ａＰの配列は全て同じであり、配列要素ａＰ’の配列は全て同じである、及び／又は
ａＫ及びａＫ’はそれぞれ、ｋ２及びｋ２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを複数含む、コレクション集合であって、前記コレクションの各々は、相異なるｐｃ及びｐｃ’の組み合わせによって特徴付けられる、コレクション集合。
【請求項１３】
各ｐｃは、配列番号００１から０４５から選択される配列を含む、若しくは各ｐｃの配列は配列番号００１から０４５から選択される配列であり、かつ、各ｐｃ’は配列番号０４６から０５８から選択される配列を含む、若しくは各ｐｃ’の配列は配列番号０４６から０５８から選択される配列である、又は、
各ｐｃは、配列番号１８９から２３２から選択される配列を含む、若しくは各ｐｃの配列は配列番号１８９から２３２から選択される配列であり、かつ、各ｐｃ’は配列番号２３３から２４６から選択される配列を含む、若しくは各ｐｃ’の配列は配列番号２３３から２４６から選択される配列である、
請求項１２に記載のコレクション集合。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔｎ−ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’−ｔｎ’に含まれる標的核酸配列ｔＣ−ｔＶ−ｔＣ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するための、複数のプライマーのセットのコレクションであって、ここでプライマーのセットの各々は、
i．配列ｍａ−Ｋ−ｐｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍａ−Ｋ’−ｐｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
ii．配列ａＬ−ａＰ−ａＫを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａＬ’−ａＰ’−ａＫ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
を含み、
ここで、
ｐｃは標的配列のｔＣに対し相補的な配列を有し、かつｐｃ’はｔＣ’に対する逆相補配列を有し、
Ｋは配列要素ｋ１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
ここで、
ｋ１及びｋ１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
ｓ及びｓ’は、配列要素ｔｎ及びｔｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
ａＫの配列は配列要素ｋ１の配列と同じあり、かつａＫ’の配列は配列要素ｋ１’の配列と同じであり、
ａＰ−ａＫはｍａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａＰ’−ａＫ’はｍａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
ｐｃ、ｐｃ’、ｍａ−Ｋ及びｍａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａＬ及びａＬ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
ここで、
前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、配列要素Ｋ及びＫ’は全て同じであり、
前記プライマーのセットの各々において、
ｐｃは他のプライマーのセットのｐｃと異なる、及び／又は
ｐｃ’は他のプライマーのセットのｐｃ’と異なる、
複数のプライマーのセットのコレクション。
【請求項１５】
患者のＴ細胞受容体β鎖のレパトアをex vivoで分析する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法、又は請求項７〜１４のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを使用する、方法。