【手続補正書】
【提出日】平成29年3月10日(2017.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の製造のための方法において、前記方法は、
ａ）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む不純な水溶液を疎水性相互作用担体に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させる工程と、
ｂ）前記結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記疎水性相互作用担体から溶離する工程と、
ｃ）工程（ｂ）からの前記溶離されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、（ｉ）第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂および（ｉｉ）第４級アミン官能基を有するポリエーテルスルホン膜からなる群から選択される陰イオン交換担体に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させる工程と、
ｄ）前記結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記陰イオン交換担体から溶離する工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
（ｉ）工程（ａ）の前に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む前記不純な水溶液を接線流濾過に供する工程、および／または（ｉｉ）工程（ｄ）に続いて、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を回収する工程、
をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａまたは毒素Ｂであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記疎水性相互作用担体が、結合したブチルＳ基を有するマトリックスまたは結合したプロピル基を有するマトリックスである、および／または（ｉｉ）工程（ｂ）が有機溶媒の不存在下で行われる、
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性相互作用担体が、結合したプロピル基を有するマトリックスであり、かつ前記不純な水溶液が、硫酸アンモニウムの存在下で疎水性相互作用担体に適用されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不純な水溶液が、約０．８〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウムの存在下で前記疎水性相互作用担体に適用されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）前記疎水性相互作用担体が、結合したブチルＳ基を有するＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂である、および／または（ｉｉ）前記不純な水溶液中の前記毒素Ａの約７０％および／または前記毒素Ｂの約９０％が、工程（ａ）および（ｂ）後に回収される、
ことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む前記水溶液が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含み、工程（ｃ）において、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂが、陰イオン交換担体から別個に溶離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記陰イオン交換担体が、非多糖ベースの物質である、および／または（ｉｉ）前記陰イオン交換担体が、結合した第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂である、
ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換担体が、強陰イオン交換体である部分−Ｏ−Ｒ−Ｎ＋−（ＣＨ３）３（式中、Ｒはポリマーである）を含み、かつ／または前記陰イオン交換担体が、Ｔｏｓｏｈ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）毒素Ａが、低塩緩衝液を用いて溶離される、および／または（ｉｉ）毒素Ｂが、高塩緩衝液を用いて溶離される、
ことを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記毒素Ａが、２〜約３２ｍＭのＭｇＣｌ２または約１２５〜約１６０ｍＭのＮａＣｌを含む塩緩衝液を使用して溶離されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記毒素Ｂが、約１２０〜約１５０ｍＭのＭｇＣｌ２または約４５０〜約５５０ｍＭのＮａＣｌを含む塩緩衝液を使用して溶離されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の前記不純な水溶液が、増殖培地中でＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の細胞を培養してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素および培養細胞を含有する培養ブロスを供給し、前記培養ブロスを前記培養細胞から分離してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の前記不純な水溶液を供給することにより得られることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖培地が、ソルビトールを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に従って得られる精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素において、前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、約９０％、９４％、９８％、または９９％以上の純度を有することを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【請求項１７】
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａまたは毒素Ｂであることを特徴とする、請求項１６に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って得られる精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素において、（ｉ）前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、溶媒を実質的に含まない、および／または（ｉｉ）前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、検出可能なアルコールデヒドロゲナーゼを全く有さない、
ことを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【請求項１９】
回収された精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を化学薬剤で不活性化してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを供給する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）前記回収された精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が、ホルムアルデヒドで不活性化されてＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを供給する、および／または（ｉｉ）前記毒素が、医薬組成物で処方される、
ことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法に従って得られることを特徴とする、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド。
【請求項２２】
前記トキソイドが、トキソイドＡまたはトキソイドＢであることを特徴とする、請求項２１に記載のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド。
【請求項２３】
請求項１９に記載のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物であって、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、
ことを特徴とする、組成物。
【請求項２４】
（ｉ）前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドが、トキソイドＡまたはトキソイドＢである、または（ｉｉ）前記組成物が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｂを、３：２の重量比で含む、
ことを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｉ）被験体において免疫応答を誘発する方法、または（ｉｉ）被験体において症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防または処置する方法、
において使用するための請求項２３または２４に記載の組成物であって、
前記被験体が、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の症状を有していないが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を発現させる危険性がある、または前記被験体が、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹っている、
ことを特徴とする組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】トキソイド、組成物および関連方法
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９３，３７６号に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願は、これによりその全体が本出願中に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、一般的に、タンパク質精製の分野に関する。より具体的には、本開示は、精製されたクロストリジウム菌毒素、トキソイド、精製された毒素またはトキソイドを含む組成物、ならびに精製された毒素およびトキソイドを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
培養物濾過液から調製されるクロストリジウム菌毒素は、インビボでの使用に適したものとなるためには、濾過液中に存在する様々な細胞成分（例えば、細胞ＤＮＡ、細胞タンパク質、培地成分）を分離するための徹底的な精製を必要とする。確かに、多くの精製技術が、この目的のために開発されてきた。しかしながら、これらの技術に従って調製された毒素は、依然として、感知できるほどの量の工程内不純物を含有し得る。培養物濾過液からＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを精製するための様々な試みがなされてきた。
【０００４】
１つのプロセスにおいて、培養物濾過液は、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび酢酸沈澱により精製された。毒素Ｂは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析された時にこの毒素をいくつかの汚染タンパク質から区別することができなかったことから明らかなように、このプロセスにより、部分的にしか精製され得なかった。［（非特許文献１）；（非特許文献２）］。このプロセスのその後の修正は、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の透析濾過からの毒素の精製を含んだ（非特許文献３）。しかしながら、このプロセスもまた、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方の高度に精製された形態をもたらすことはできなかった。
【０００５】
透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈澱およびゲルクロマトグラフィー（Ｓ−３００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌサイズ排除カラム）を用いてＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養物濾過液から毒素ＡおよびＢを共精製する方法が、（特許文献１）に記述されている。この方法により調製された毒素は、５０％〜６０％（またはそれ未満、例えば、４４％）の純度を有し、多くの不純物（例えば、約３５ｋＤａの不純物、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）３−ヒドロキシブチルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、４５〜４７ｋＤａの不純物（Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、および６０〜７０ｋＤａのタンパク質（ｇｒｏＥＬのホモログまたは細菌ｈｓｐ６０タンパク質ファミリー））を含んでいた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，９６９，５２０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８１，６：２２１−２２４
【非特許文献２】Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８２，３５：１０３２−１０４０
【非特許文献３】Ｒｏｔｈｍａｎ  Ｓ．Ｗ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８４、ｐ．３２４−３３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在利用可能な方法は、大規模生産には向いていない。したがって、精製毒素の代替的な調製方法の必要性が当該技術分野に存在する。大規模に精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を供給するための方法が、本開示により提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、高度に精製された毒素およびトキソイドを調製する方法を提供する。本明細書に記載の方法を用いることにより、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素およびトキソイドが、精製された形態でかつ十分な収率で得られる。一部の実施形態において、本開示は、任意選択で特定の賦形剤の存在下において、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組合せにより不純な水溶液から毒素を精製することによる、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の製造のための方法を提供する。特定の実施形態において、当該方法は、非多糖ベースの担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを含み得る。一部の実施形態において、当該方法はまた、結合したフェニル基、ブチル基またはプロピル基を有する疎水性相互作用担体を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを含み得る。不純な水溶液は、一部の実施形態においては、（例えば、接線流濾過による）限外濾過および／または透析濾過工程に供され得る。本明細書に記載の方法は、約≧９０％（例えば、約９０％、約９４％、約９５〜９７％、約９８％、約９９％以上）の純度レベルの（例えば、「不純物を実質的に含まない」）毒素をもたらす。精製された毒素は、当業者に利用可能な化学薬剤または他の方法（例えば、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはβ−プリオピオラクトンなど）を用いて（例えば、「トキソイド」を生成するために）不活性化され得る。高度に精製された毒素およびトキソイドならびにそのような毒素またはトキソイドを含む組成物もまた提供される。そのような高度に精製された成分（および関連組成物）は、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症から被験体を保護するかつ／または症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹っている被験体を処置するために（例えば、免疫学的組成物および／またはワクチンとして）使用され得る。例示的な方法、毒素、トキソイド、それらの組成物、およびそれらの用途としては、実施例において記述されるものを含み得るが、それらに限定されない。他の実施形態は、本開示から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】例示的な毒素精製プロセス。
【図２】トキソイドの免疫原性。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、高度に精製された毒素およびトキソイドを調製する方法を提供する。本発明において特に関心のあるものは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび／もしくはＢならびに／またはそれらの誘導体（例えば、遺伝子的に無毒化された異形、切頭型、断片など）である。本開示において、毒素Ａおよび／または毒素Ｂは、当該技術分野における標準的な技術を用いて毒素Ａおよび／または毒素Ｂとして同定され得る全てのＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含み得る。例示的な技術としては、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロットまたはインビボアッセイ）を挙げることができる。そのような同定を行うのに有用な試薬としては、例えば、抗毒素Ａウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ３５０２１またはＡｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ９３３１８）または抗毒素Ａマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ１９９５３（ｍＡｂ  ＰＣＧ４）またはａｂ８２２８５（ｍＡｂ  Ｂ６１８Ｍ）のいずれか）、抗毒素Ｂウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ８３０６６）または抗毒素Ｂマウスモノクローナル抗体（例えば、Ａｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ７７５８３（ｍＡｂ  Ｂ４２８Ｍ）、ａｂ１３０８５５（ｍＡｂ  Ｂ４２３Ｍ）、またはａｂ１３０８５８（ｍＡｂ  Ｂ４２４Ｍ）のいずれか）（全てＡｂｃａｍ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能）を挙げることができる。
【００１２】
分析規模から生産規模まで規模拡張可能な方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、当該方法は、約９０％以上（例えば、約９０％、約９５〜９７％、約９８％、約９９％以上）の純度レベルの毒素をもたらす。一部の実施形態において、そのような純度レベルの毒素および／またはトキソイドを含む組成物は、「不純物を実質的に含まない」と見なされ得る。精製毒素を不活性化してトキソイドにするための方法もまた提供される。そのような毒素およびトキソイドを使用するための方法もまた提供される。これらの方法、毒素、トキソイド、組成物、およびそれらを使用するための方法が、本明細書において提供される。
【００１３】
本明細書に記載の方法は、典型的に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の不純な水溶液からのＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の精製を含む。当該方法は、実質的に全てのＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌株からの毒素に適用可能である。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の好ましい菌株は、毒素Ａおよび／またはＢを産生する菌株であり、例えば、トキシノタイプ０（例えば、ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５、６３０）、ＩＩＩ（例えば、０２７／ＮＡＰ／Ｂ１）、Ｖ（例えば、０７８）およびＶＩＩＩ（例えば、０１７）の菌株であり得る。
【００１４】
典型的に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ＯＤ測定により決定される所望の細胞濃度に達するまで、制御条件下において発酵槽中で培養される。発酵槽ブロスが採取され、細胞および細胞残屑不純物の大半を（例えばメンブランフィルターを用いる）濾過により除去することにより清澄化される。濾過は、デプスフィルター（例えば、高性能デプスフィルター（例えばＰａｌｌ  Ｓｔａｘなど））などのフィルターを用いて行われ得る。濾過されたブロスは、次いで、好ましくは約０．２μｍの細孔径のメンブランフィルターを用いる、微細濾過により滅菌され得る。結果として生じるブロス濾過液は、典型的に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（例えば、毒素Ａおよび／または毒素Ｂ）および他の不純物を含んでおり、これが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の不純な水溶液である。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を精製する（または実質的に精製する）ために、複数の段階（例えば、工程）を含む方法が提供される。
【００１５】
一部の実施形態において、第１の段階は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含有するブロスの濃縮、限外濾過および／または透析濾過を含み得る。この濃縮、限外濾過および透析濾過は、接線流濾過（ＴＦＦ）（例えば、クロスフロー濾過）により行われ得る。濃縮は、一般的に、好適な（例えば、約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａの間の）カットオフ閾値を有する膜上での限外濾過により実施され得る。ＴＦＦは、当業者によく知られており、その実施のための装置およびプロトコルは、様々な製造業者（これらに限定されないが、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ）およびＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）を含む）から市販されている。これらの方法は、いくつかの広く入手可能な系（例えば、平板膜または中空繊維膜を含むもの）のいずれかを用いて実施され得る。例示的な膜としては、例えば、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ膜およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅによるＢｉｏｍａｘ膜を挙げることができる。大規模生産においては、毒素に対する過度の剪断力を防ぐ能力を有する（例えば、オープンフローチャネルを有する）平板系が使用され得る。接線限外濾過は、平板の形態の適切なカットオフ閾値（例えば、５０〜１００ｋＤａのいずれかの辺り）を有する膜を用いて行われ得る。
【００１６】
（例えば、上記のように生成された）濾過液は、好適な緩衝液（例えば、約７．０〜約８．０のｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）を有する、任意選択で塩（例えば、２５ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ（例えば、０．２ｍＭ）を含む、トリス緩衝液（例えば、２５ｍＭ〜５０ｍＭのいずれかの辺り）など）中に透析濾過され得る。この緩衝液はまた、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含み得るが、これは、必ずしも必要でない場合がありかつ／または必ずしも勧められない場合がある。一部の好ましい実施形態において、その場合には、ＤＴＴは、これはプロセス結果に対して負の影響を及ぼし得るため、明確に排除される。透析濾過物は、次いで、適切な系（例えば、０．８μｍ膜および０．２μｍ膜を含むフィルターカプセル（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｐａｌｌ  ＥＫＶ、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター））を用いて１回以上濾過され得る。
【００１７】
次いで、透析濾過液は、親水性および僅かに疎水性の不純物を除去するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供され得る。ＨＩＣの原理は、当該技術分野においてよく知られている。簡潔に、そしていかなる特定の作用機序にも拘束されるものではないが、ＨＩＣは、タンパク質上の疎水性基と適用可能な固体担体上の疎水性リガンドとの間の相互作用に基づくものである。担体上の疎水性リガンドへのタンパク質上の疎水性基の吸着は、リオトロピック塩（例えば、これらに限定されないが、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなど）の添加により促進され得る。結合した溶質の脱着は、低塩濃度の緩衝液を用いた段階または勾配溶離によって達成され得る。疎水性担体へのタンパク質の結合は、ｉ）リガンドの種類、特にその疎水性（例えば、エーテル、フェニル、ブチル、またはプロピル）；（ｉｉ）固体担体のリガンド密度；（ｉｉｉ）マトリックスの中心材料；（ｉｖ）タンパク質の疎水性性質；および（ｖ）使用される塩の種類を含む、多くの要因によって影響され得る。それほど疎水性の高くないカラムは、典型的に、結合のためにより高い塩濃度を必要とするであろう。疎水性相互作用を促進するために、硫酸アンモニウムが、透析濾過液溶液に（例えば、適切な最終濃度（例えば、０．４〜１．２Ｍのいずれかの辺りまたは約０．４〜約０．９Ｍ、例えば、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、または１．２Ｍのいずれかの辺り）となるように）添加され得る。この溶液が、（例えば、結合したフェニル、ブチル、エーテルまたはプロピルリガンド、好ましくはブチル、エーテルまたはプロピルを有する）疎水性相互作用担体（例えば、樹脂または膜）（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上でクロマトグラフィー分析され得る。特定の最も好ましい実施形態において、この担体は、ブチルリガンドを含み得る（例えば、ブチルＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）。そのようなクロマトグラフィー担体の使用は、溶媒（例えば、イソプロパノール（ＩＰＡ））の使用を伴わないおよびＤＴＴの添加を伴わない、担体からの毒素の溶離をもたらし得る（例えば実施例を参照されたい）。実施例において示されるように、ブチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  ＨＩＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いるＨＩＣは、毒素の回収率の上昇ならびに溶媒（例えば、ＩＰＡ）の使用を伴わない毒素ＡおよびＢの溶離をもたらし得る。
【００１８】
カラム平衡化に続いて、溶液は、カラム上に直接負荷され得る。使用されるカラム担体材料への毒素の結合を可能にするために、負荷用緩衝液が使用され得る。好適な負荷用緩衝液は、例えば、好適な緩衝化成分（例えば、約７．０〜約８．０の典型的なｐＨ（好ましくは、ｐＨ８．０）の好適な濃度（例えば、約１５ｍＭ〜５０ｍＭのいずれか、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＭのいずれかの辺り、好ましくは、約２５ｍＭ）のトリスなど）を、適量の塩（例えば、０．８Ｍ〜１．０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ２、例えば、０．８、０．９または１．０Ｍのいずれかの辺り、好ましくは、約０．９Ｍ）と共に含み得る。当業者により理解されるであろうように、多くの他の塩（例えば、ＨＩＣにおいて典型的に使用されるもの、例えば、硫酸ナトリウムおよび／またはＮａＣｌ（例えば、２５ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、例えば、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＭのいずれかの辺りのＮａＣｌ）など）もまた、適切であり得る。他の成分（例えば、ＥＤＴＡ（例えば、約０．２ｍＭ））もまた含まれ得る。ＤＴＴもまた、（例えば、これは毒素自己タンパク質分解活性に影響し得るため）含まれる場合もあれば含まれない場合もある。上述のように、ＤＴＴは、好ましくは排除される（したがって、このプロセスは、好ましくはＤＴＴを含めることなしにかつ／またはＤＴＴの不在下で実施される）。
【００１９】
カラム負荷の後に、典型的に、好適な緩衝化成分（例えば、好適な濃度のトリス（例えば、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭのトリス（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＭのいずれかの辺り、好ましくは、約２５ｍＭのトリス；０．８Ｍ〜１．０Ｍの硫酸アンモニウム（好ましくは、０．９Ｍ）、ｐＨ約７．５〜８．０（例えば、ｐＨ７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０のいずれかの辺り））など）を含む、不純物を洗い流すのに適した緩衝液を用いる、洗浄工程が続き得る。結合した毒素は、次いで、好適な緩衝液（例えば、１０〜４０ｍＭのトリス（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０ｍＭのいずれかの辺りのトリス、好ましくは、約２５ｍＭのトリス）、ｐＨ７．５〜８．０（例えば、ｐＨ７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０のいずれかの辺り））を用いて、１つ以上の画分として溶離され得る。次いで、溶離された毒素画分の導電率（イオン強度）が、適切な希釈剤（例えば、注射用水（ＷＦＩ）など）を用いて適切なレベル（例えば、６〜８ｍＳ／ｃｍ（導電率単位）以下、例えば、約６、６．５、７．０、７．５または８．０ｍＳ／ｃｍのいずれかなど）まで下げられ得る。
【００２０】
次いで、（溶離液中の）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によりさらに精製され得る。ＡＥＸの原理は、当該技術分野においてよく知られている。いかなる特定の作用機序にも拘束されるものではないが、この方法は、典型的に、単離されるべき溶質／分子と使用される陰イオン交換担体材料（例えば、樹脂、膜）上の電荷との間の電荷−電荷相互作用に依拠するものである。毒素は生理学的ｐＨ範囲において負荷電であるので、担体は、固定された正荷電イオン交換基／部分を含有し得る。正荷電部分は、一般的に、第４級アミノ基またはジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）基である。したがって、溶離水溶液は、毒素を担体に結合させる条件下において正荷電イオン交換基を有する陰イオン交換担体（例えば、樹脂、膜）と接触させられ得る。ＡＥＸは、多糖ベースの担体（例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、ＧＥ（Ｑ、ＤＥＡＥ、ＤＥＡＰ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、および／またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ膜など）を用いて行われ得るが、非多糖ベースの担体（例えば、合成ポリマー、および無機物質）が毒素の純度および収率を改善することが、本発明において発見された。使用され得る好適な例示的な膜としては、例えば、架橋されて正荷電イオン交換基を有する第４級アミン表面を生じるポリマーで化学修飾された微孔性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）からなるもの（例えば、ＰａｌｌまたはＮａｔｒｉｘによる膜など）が挙げられる。例えば、使用に好適な例示的な樹脂としては、第４級アミン官能基が結合したメタクリレートベースの樹脂（例えば、Ｔｏｓｏｈ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ樹脂（Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｑ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）など）が挙げられる。実施例において示されるように、そのようなクロマトグラフィー担体（樹脂、膜）は、従来技術と比較して効率的なかつ／または改善された毒素からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）不純物の分離をもたらし得る。
【００２１】
ＡＥＸクロマトグラフィー担体は、適切な緩衝液（例えば、２５ｍＭのトリス、０ｍＭのＭｇＣｌ２）を用いて平衡化され得る。カラム平衡化に続いて、毒素を含む溶液は、カラム上に直接負荷され得る。カラム担体への毒素の結合を可能にする導電率および／またはｐＨを有する負荷用緩衝液が、典型的には使用される。毒素Ａおよび毒素Ｂは、適切な塩濃度を有する（例えば、増大していくイオン強度の）適切な緩衝液を用いて別個に溶離され得る。例えば、毒素Ａは、毒素Ｂと比較してより低い塩濃度の緩衝液で溶離され得る。一部の実施形態において、毒素Ａは、１種以上のナトリウム塩および／またはマグネシウム塩（例えば、約２〜約３２ｍＭのＭｇＣｌ２、好ましくは、約２７ｍＭのＭｇＣｌ２、または約１２５〜約１６０ｍＭもしくは約１４０ｍＭ（例えば、１４１ｍＭ）のＮａＣｌなど）を含む低塩緩衝液で溶離され得る。毒素Ｂは、１種以上のナトリウム塩および／またはマグネシウム塩（例えば、約１２０〜約１５０ｍＭもしくは約１２２〜約１４８ｍＭのＭｇＣｌ２、好ましくは、約１３５ｍＭのＭｇＣｌ２、または約４５０〜約５５０ｍＭもしくは約５００ｍＭ（例えば、４８８ｍＭ））のＮａＣｌなど）を含む高塩緩衝液で溶離され得る。不純物は、典型的に、高塩のものと低塩緩衝液との間の塩濃度（例えば、６５〜７９ｍＭのＭｇＣｌ２、典型的には、約７２ｍＭのＭｇＣｌ２）で溶離され得る。多くの異なる成分（例えば、好適な量（例えば、約２５〜約５０ｍＭ）のトリスなど）が、緩衝化（例えば、ｐＨの安定化）における使用に好適であり得る。当業者により理解されるであろうように、他の緩衝液および塩もまた使用され得る。一部の実施形態において、毒素濃度が高い場合および／または毒素の水溶液が特定の不純物（例えば、ＡＤＨ、ｈｓｐ６０）を含む場合は、ＭｇＣｌ２を用いたＡＥＸ担体からの溶離が好ましい。下記の実施例において示されるように、そのような状況は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）がソルビトールを補充した培地を用いて培養される場合に遭遇され得る。
【００２２】
クロマトグラフィーは、典型的に、タンパク質変性を回避するために水性緩衝液系の存在下で実施される。例えば、任意の従来の緩衝液（例えば、トリス、トリシン、リン酸塩（ＰＢＳ）、グリシルグリシン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ビス−トリス−プロパン−ＨＣｌ、または他のもの）が、ＡＥＸのために適切であり得る。官能基との相互作用または結合を回避するために、陰イオン交換体に対しては正荷電の緩衝化イオンが使用されるべきである。一部の実施形態において、例えば、トリス（ｐＫａ８．２）が、対イオンとしてのＣｌ−と共に使用され得る。
【００２３】
好ましくは、精製された（または実質的に精製された）毒素Ａおよび／または精製された（または実質的に精製された）毒素Ｂは、濃縮され、適切な貯蔵緩衝液（例えば、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、炭酸塩、重炭酸塩緩衝液）中に透析濾過され得る。クエン酸塩緩衝液を用いて減少した毒素分解が観察されたので、クエン酸塩緩衝液が好ましくあり得る（例えば実施例を参照されたい）。
【００２４】
最終精製毒素は、標準的な技術（例えば、キャピラリーゲル電気泳動および／またはＳＤＳ／ＰＡＧＥアッセイ）を用いて測定される場合に、一般的に、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、または１００％のいずれかの辺りまで精製されている）。実施例において示されるように、本明細書に記載の方法は、約９９％まで精製された毒素Ａおよび約９８％まで精製された毒素Ｂを生成するために使用され得る。
【００２５】
本明細書に記載の方法はまた、向上した規模拡張可能性、プロセス制御、生成物純度および生成物安定性も提供する。例えば規模を拡大するためには、拡大された寸法のカラムが使用され得、それに応じて流量が調整され得る。
【００２６】
当該方法は、限られた不純物および十分な効力／細胞毒性と共に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の良好な収率を結果としてもたらす。例えば、本明細書に記載の方法による（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または非多糖ベースの担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた）精製は、大量の汚染物質（例えば、ＤＮＡ、脂質およびタンパク質を含む生体分子）を培養物濾過液から除去することが見出された。ＡＥＸは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の前または後に行われ得ることが特筆される。例えば、ＨＩＣがＡＥＸの前に行われてもよいし、ＡＥＸがＨＩＣの前に行われもよい。ＡＥＸはまた、純度レベルをさらに改善するために、使用者により所望されるとおりに繰り返され得る。
【００２７】
精製された毒素は、例えば化学薬剤（例えば、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはＢ−プリオピオラクトン）を用いることによるなどの、当業者に公知である技術を用いて（例えば、トキソイドを生成するために）不活性化され得る。例えば、毒素はホルムアルデヒドを用いて不活性化され得る。精製された毒素は、適用可能な標的毒素Ａ：毒素Ｂ比（例えば、３：１、３：２）で混合されてから不活性化されてもよいし、別個に不活性化されてもよい。例えば、毒素を不活性化するために、約４ｍｇ／ｍｌのホルムアルデヒドが約０．５ｍｇ／ｍｌの毒素に添加され得る。不活性化は、適切な時間量（例えば、約１８〜２１日）の間、適切な温度（例えば、約２〜８℃、約２５℃以下）および適切なｐＨ（例えば、約ｐＨ７．０）で進行し得る。不活性化（例えば、「トキソイド化（ｔｏｘｏｉｄｉｎｇ）」）の好ましい方法としては、２０１３年３月１５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７９０，４２３号に記述されているものが挙げられ、この仮特許出願は、参照によりその全体が本出願中に援用される。
【００２８】
結果として生じるトキソイド調製物は、ｐＨ８．０以下（例えば、６．５〜７．５）の毒素へのトキソイドの逆戻りを防ぎ得る貯蔵緩衝液（例えば、これらに限定されないが、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、炭酸塩または重炭酸塩など）中で貯蔵され得る。緩衝液は、好ましくは、トキソイドの安定性を高めかつ／またはトキソイドの凝集を遅らせるもしくは減じる少なくとも１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。有用な賦形剤としては、例えば、糖（例えば、トレハロース、スクロース）または糖アルコール（例えば、ソルビトール）、塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム）、ホルムアルデヒド（０．００１〜０．０２％）、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。使用に好適な他の賦形剤は、当該技術分野（例えば、その全体が本明細書に援用される国際公開第２００９／０３５７０７号（米国特許出願公開第２０１１／０４５０２５（Ａ１）号明細書）において記述されている。
【００２９】
トキソイド調製物は、貯蔵緩衝液と直接混合されてもよいが、当該調製物は、濃縮され、適切な緩衝液溶液中に透析濾過されてもよい。好ましくは、濃縮および透析濾過は、ホルムアルデヒドの除去および貯蔵緩衝液への交換を確実にしつつタンパク質剪断を最小限にするために、接線流濾過を用いて行われる。例示的な貯蔵緩衝液は、適切な量のクエン酸塩（例えば、２０ｍＭ）、適切なｐＨ（例えば、ｐＨ７．５）、適切な量の少なくとも１種の糖（例えば、４％〜８％のスクロース、例えば、５％）、および約０．０１６±０．００４％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）を含む。ホルムアルデヒドの濃度は、逆戻りを防ぐためのホルムアルデヒドの標的濃度（例えば、０．０１６±０．００４％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ））を維持するように、必要であれば調整され得る。一部の実施形態において、ホルムアルデヒドは、より低いレベル（例えば、０．００８％（ｗ／ｖ）または０．００４％（ｗ／ｖ）など）でそのような組成物中に存在し得る。好ましい貯蔵方法としては、２０１３年３月１５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７９０，４２３号に記述されているものが挙げられ、この仮特許出願は、参照によりその全体が本出願中に援用される。
【００３０】
トキソイド調製物はまた、２８０ｎｍでの吸光度（ａｄｓｏｒｂａｎｃｅ）によるタンパク質濃度に影響し得る小さなタンパク質凝集体を除去して意図されたトキソイドＡ：トキソイドＢ比での医薬組成物の処方を可能にするために、（例えば、０．２μｍのメンブランフィルターを用いて）濾過され得る。トキソイドＡおよびトキソイドＢは、貯蔵の前に、意図されたトキソイドＡ：トキソイドＢ比で組み合わされ得る。組み合わされたトキソイドまたは個々のトキソイドの組成物は、（例えば、ホルムアルデヒドが例えば約０．０１６％（ｗ／ｖ）で存在し得る）液体または凍結乾燥形態において、例えば２〜８℃で貯蔵され得る。液体形態にある場合は、トキソイドは、好ましくは＜−６０℃で貯蔵される。
【００３１】
トキソイドは、医薬組成物（例えば、免疫原性および／またはワクチン組成物）としての使用のために処方され得る。例えば、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤（例えば、生理食塩水）へのトキソイドの懸濁によりおよび／またはトキソイドと薬学的に許容されるキャリアとの結合により、投与のために調製され得る。そのような薬学的処方物は、１種以上の賦形剤（例えば、希釈剤、増粘剤、緩衝剤、保存剤、アジュバント、デタージェントおよび／または免疫賦活剤）（例えば、当業者に公知でありかつ／または利用可能なもの）を含み得る。好適な賦形剤は、典型的に、（例えば、アジュバント添加組成物中の）トキソイドおよびアジュバントと適合性があるものであり、その例は、当業者に公知であり、入手可能である。組成物は、液体形態であるか、または（標準的な方法に従って）凍結乾燥されたものもしくは（例えば、その全体が本開示中に援用される米国特許出願公開第２００９／１１０６９９号明細書により記述されているように）発泡乾燥されたものであり得る。上述のように、組成物は、凍結乾燥されたものであってもよい。一部の実施形態において、凍結乾燥された組成物は、約２℃〜約８℃の間で貯蔵され得る。
【００３２】
投与のためのワクチンを調製するために、乾燥組成物が、水溶液（例えば、注射用水など）または好適な希釈剤もしくは緩衝液溶液で再構成され得る。特定の例において、希釈剤は、本明細書に記載のようにホルムアルデヒドを含み得る。希釈剤は、ホルムアルデヒドと共にまたはホルムアルデヒド無しで、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）を含み得る。例示的な希釈剤は、ＮａＣｌおよび水酸化アルミニウムの水溶液であり得る。そのような希釈剤が、乾燥組成物を再構成するために使用され得る。医薬組成物は、約１０〜１５０μｇ／ｍＬ（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｇ／ｍＬのいずれか）の用量のトキソイドを含み得る。典型的に、注射のための用量の体積は、約０．５ｍＬまたは１．０ｍＬである。投薬量は、被験体における免疫応答を調節するために（および／または副作用が観察される場合に）必要に応じて増大または低減され得る。トキソイドは、アジュバントの存在下または不在下で、当業者により決定され得る量で投与され得る。例示的なアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）を挙げることができる。
【００３３】
ワクチン組成物は、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹っているまたは症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を発現させる危険性のある被験体に、当業者により適切であると判断された量およびレジメンで、経皮（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下）経路、経皮経路、および／または粘膜経路により投与され得る。これらの個体群には、例えば、広域抗生物質を受けた被験体（例えば、入院している高齢患者、老人ホーム居住者、慢性疾患患者、癌患者、ＡＩＤＳ患者、集中治療室中の患者、および透析処置を受けている患者）が含まれる。ワクチンは、１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与され得る。複数の用量が投与される場合、それらの用量は、例えば、１〜６日、１週間、２週間、３週間、または１ヶ月以上（例えば数ヶ月）のいずれかの間、互いに離され得る。したがって、本開示はまた、医薬組成物を被験体に投与することにより、毒素、トキソイドおよび／またはそれらを含む感染性生物に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。これは、被験体の免疫系へのトキソイドの曝露をもたらすための本明細書に記載の医薬組成物（例えば、免疫原性組成物および／またはワクチン）の被験体への投与により達成され得る。このように、当該免疫原性組成物および／またはワクチンは、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防および／または処置するために使用され得る。
【００３４】
したがって、本開示は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む不純な水溶液を疎水性相互作用担体（例えば、ＨＩＣ）に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させ、結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を疎水性相互作用担体から溶離し、溶離されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、（ｉ）第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂および（ｉｉ）第４級アミン官能基を有するポリエーテルスルホン膜からなる群から選択される陰イオン交換担体（例えば、ＡＥＸ）に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させ、そして結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を陰イオン交換担体から溶離することによる、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の製造のための方法を提供する。一部の実施形態において、当該方法は、ＨＩＣの前にＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む不純な水溶液を接線流濾過に供する工程および／またはＡＥＸ溶離液から精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を回収する工程をさらに含む。毒素は、典型的に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡまたはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂである。一部の実施形態において、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む水溶液は、陰イオン交換担体から別個に溶離され得るＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含む。一部の実施形態において、ＨＩＣのための疎水性相互作用担体は、結合したフェニル基を有するマトリックス、結合したブチルＳ基を有するマトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックス）、または結合したプロピル基を有するマトリックスである。一部の実施形態において、陰イオン交換担体は、結合した第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂であり得、部分−Ｏ−Ｒ−Ｎ＋−（ＣＨ３）３（式中、Ｒはポリマーである）を含み得、かつ／または陰イオン交換担体は、Ｔｏｓｏｈ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍである。一部の実施形態において、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の不純な水溶液は、増殖培地中でＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の細胞を培養してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素および培養細胞を含有する培養ブロスを供給し、そして培養ブロスを培養細胞から分離してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の不純な水溶液を供給することにより得られる。一部の実施形態において、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の不純な水溶液は、ソルビトールを含む。これらの方法のうちのいずれかに従って得られた（例えば、約９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれかの辺り）の純度を有する）精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素もまた提供される。一部の実施形態において、当該方法は、約９２．８％まで精製されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａをもたらし得る。一部の実施形態において、当該方法は、約９１％まで精製されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂをもたらし得る。一部の実施形態において、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、溶媒および／または検出可能なアルコールデヒドロゲナーゼを実質的に含まないものであり得る。当該方法はまた、回収された精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を化学薬剤（例えば、ホルムアルデヒド）で不活性化してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを供給する工程も含み得る。本開示はまた、これらの方法のうちのいずれかに従って得られたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドも提供する。トキソイド（例えば、トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢ）はまた、医薬組成物（例えば、免疫原性組成物および／またはワクチン）を提供するために薬学的に許容される賦形剤と組み合わされ得る。一部の実施形態において、そのような組成物は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｂを、３：２の重量比で含み得る。本開示はまた、本明細書において提供される組成物のうちの任意の１つ以上を被験体に投与することにより、被験体において（例えば、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する）免疫応答を誘発するための方法も提供する。一部の実施形態において、当該方法は、被験体において症候性および／または無症候性のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防または処置することを含む。当該方法はまた、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹ってはいないが症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を発現させる危険性があり得る被験体を処置するために使用され得る。
【００３５】
好ましい実施形態が本明細書に記述されてきたが、変更および修正が企図されており、それらは当業者には容易に明らかになることが理解される。
【００３６】
用語「約」、「およそ」などは、数値の列挙または範囲の前に来る場合、まるでその用語がその列挙または範囲の中の各個々の値の直前に来るかのように、その列挙または範囲の中の各個々の値に個別的に関係する。これらの用語は、それらが関係する値が正確にその値である、その値に近い、またはその値と類似していることを意味している。例えば、「約」または「およそ」は、示された値の１０％の範囲内の値を示し得る（例えば、「約３０％」は、２７％から３３％までの任意のところを含み得る）。
【００３７】
本明細書で使用される場合、被験体または宿主とは、個体であることが意図される。被験体には、飼い慣らされた動物（例えば、ネコおよびイヌ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）およびトリが含まれ得る。一態様において、被験体は、哺乳動物（例えば、霊長類またはヒト）である。
【００３８】
任意選択のまたは任意選択でとは、その後に記述される事象または状況が、起こってもよいし起こらなくてもよいこと、および、その記述には、その事象または状況が起こる場合とそれが起こらない場合とが含まれることを意味している。例えば、任意選択で組成物はある組合せを含み得るという語句は、その組成物が、異なる分子の組合せを含んでもよいし、組合せを含まなくてもよいことを意味しており、その結果、この記述には、組合せと組合せの不在（すなわち、組合せの個々の構成要素）との両方が含まれることとなる。
【００３９】
範囲は、本明細書において、約ある特定の値から、および／または約別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の態様は、そのある特定の値からおよび／またはその他方の特定の値までを含む。同様に、既述の約またはおよそというの使用により値が概数として表される場合、その特定の値は別の態様を構成することが理解されよう。さらに、各範囲の端点は、他方の端点との関連でも他方の端点から切り離しても意味があることが理解されよう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、その範囲自体に加えてその範囲内の各個別の値もまるで各値が個々に列挙されているかのように含むことが意図される。
【００４０】
予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という用語が所与の状態のための所与の処置に関連して本明細書において使用される場合（例えば、感染症を予防する）、処置された被験体が臨床的に観察可能なレベルの状態を全く発現させないか、彼／彼女が処置の無い場合に罹るであろうよりも緩慢にかつ／または劣る程度にそうした状態を発現させるかのいずれかであることを意味することが意図される。これらの用語は、被験体がそうした状態の態様を全く経験しない状況のみに限定されるものではない。例えば、処置は、それが、状態の所与の発現を生じさせることが予想されたであろう刺激への被験体の曝露の間与えられ、そうでない場合に予想されるよりも少ないかつ／または軽いその状態の症状を被験体が経験することを結果としてもたらすならば、その状態を予防したと言われるであろう。処置は、被験体が感染症の軽度の顕在症状しか示さないことを結果としてもたらすことにより症候性感染症を「予防」し得るのであり、これは、感染微生物による任意の細胞への侵入が全く存在してはならないということを含意するものではない。
【００４１】
同様に、所与の処置に関して症候性感染症の危険性に関連して本明細書において使用される低減する（ｒｅｄｕｃｅ）、低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、および低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）（例えば、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性を低減する）とは、典型的に、被験体が、処置（例えば、開示される毒素またはトキソイドを用いた投与またはワクチン接種）の不在下における症候性感染症発現のコントロールまたは基礎レベルと比較してより緩慢にまたはより劣る程度に症候性感染症を発現させることをいう。症候性感染症の危険性の低減は、被験体が感染症の軽度の顕在症状または感染症の遅延した症状しか示さないことを結果としてもたらし得るのであり、これは、感染微生物による任意の細胞への侵入が全く存在してはならないということを含意するものではない。
【００４２】
本開示および添付の特許請求の範囲において使用される場合、名詞は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むこともまた留意されなければならない。
【００４３】
本開示内において引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書により援用される。特定の実施形態が、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施形態は、例として提供されるにすぎず、決して特許請求の範囲の範囲を限定することが意図されるものではない。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、説明目的のためだけに提供されるものであり、本開示の範囲を限定することが意図されるものではない。形態の変更および等価物の代用は、状況が示唆し得るまたは好都合とし得る場合に企図されている。本明細書においては特定の用語が採用されてきたが、そのような用語は、説明的な意味で解釈されるものであり、限定目的のものではない。本開示およびこれらの実施例において使用されるが明示的に説明されていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告されており、当業者の能力の範囲に十分に入る。
【００４５】
実施例１
本実施例は、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素およびトキソイドを製造するための方法を説明するものである。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワーキングシード（菌株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を、ダイズペプトン、酵母抽出物、リン酸塩緩衝液および重炭酸ナトリウム含む予め状態調整された培養培地、ｐＨ６．３５〜７．４５（ＳＹＳ培地）に接種するために使用し、４ｍＬワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルから１６０Ｌ培養物に規模を拡大した。所望の密度および１０〜１２時間のインキュベーション期間に達した時に、１６０Ｌ培養物全体を、清澄化および０．２μｍ濾過のために処理した。もう１つの生産発酵槽からの培養物を採取し、（例えば、Ｍｅｉｓｎｅｒメンブランフィルターを用いる）膜濾過に供してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および細胞残屑不純物を除去した。結果として生じた清澄化された培養物濾過液を濃縮し、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡおよびＤＴＴを含んだトリス緩衝液中に接線流濾過により透析濾過した。結果として生じた溶液をメンブランフィルターを用いて濾過し、硫酸アンモニウムの濃度を（例えば、約０．４Ｍまで）高め、次いで、さらなる濾過を（例えば、メンブランフィルターを用いて）行った。この水溶液は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを含有していた。この水溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。
【００４６】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をＰｈｅｎｙｌ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合させた。カラムをトリス緩衝液中の０．２ｍＭ硫酸アンモニウムで洗浄し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の２つの画分をトリス緩衝液およびＩＰＡで溶離した。ＨＩＣから溶離された２つの毒素画分をプールし、ＷＦＩを用いて導電率を９ｍＳ以下に調整した。（プールされた溶離液中の）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。溶離された水溶液を、陰イオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に通してカラムに毒素を結合させた。トリス緩衝液（５０ｍＭのトリス／５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．５）でカラムを平衡化し、低塩トリス緩衝液（１４１ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）で毒素Ａを溶離し、高塩トリス緩衝液（４８８ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）で毒素Ｂを溶離した。精製毒素Ａおよび精製毒素Ｂを各々濃縮し、１００ｍＭのＰＯ４、ｐＨ７中に透析濾過した。これらの工程（例えば、清澄化、ＴＦＦ、ＨＩＣ、ＡＥＸ）は、各々周囲温度（すなわち、約３７℃〜２６℃）で行われた。毒素Ａの平均収量は、発酵物１Ｌ当たり約０．００７５ｇの純粋な毒素であり、ＳＤＳ  Ｐａｇｅにより評価した場合の純度は平均して約９２．８％であった。毒素Ｂの平均収量は発酵物１Ｌ当たり約０．００３５ｇの純粋な毒素であり、ＳＤＳ  Ｐａｇｅにより評価した場合の純度は平均して約９１％であった。タンパク質の濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により吸光度単位を用いて決定した。
【００４７】
毒素の不活性化
毒素ＡおよびＢを、ホルムアルデヒドでの処理により不活性化した。３７％ホルムアルデヒド溶液を、０．４２％の最終濃度が得られるように、毒素Ａ透析濾過液および毒素Ｂ透析濾過液の各々に無菌添加した。これらの溶液を混合し、次いで、１８〜２２日間にわたり２〜８℃で貯蔵した。不活性化に続いて、毒素透析濾過液を、処方緩衝液中に透析した。
【００４８】
実施例２
本実施例に記述される実験は、精製方法の規模拡張可能性、収率および純度を改善するために行われた。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワーキングシード（菌株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を、滅菌使い捨てバッグ中の予め状態調整された培養培地（ダイズペプトン、酵母抽出物、リン酸塩緩衝液およびＤ−ソルビトールを含む、ｐＨ７．１〜７．３）に接種するために使用し、培養物を、標的ＯＤが達成されるまで３５〜３９℃でインキュベートした。予め状態調整された培養培地にソルビトールを含めることで収量が著しく増加することが見出されたことが特筆される。３０Ｌのシード１培養物を、２５０Ｌ滅菌使い捨て培養バッグ中の培養培地に接種するために使用し、培養物を、標的ＯＤが達成されるまで３５〜３９℃でインキュベートした。シード２培養物を、１０００Ｌ滅菌使い捨て培養バッグに接種するために使用し、培養物を、標的ＯＤが達成されるまで３５〜３９℃でインキュベートした。もう１つの生産発酵槽からの培養物を採取し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および細胞残屑不純物を除去するために（例えば、Ｐａｌｌ  Ｓｔａｘデプスフィルターを用いる）デプス濾過に供し、プロテアーゼ活性を制限するために同時に冷却した（例えば、約３７℃〜１９℃）。結果として生じた清澄化された培養物濾過液を濃縮し、（規模拡大のために好ましい）フラットストックＭｉｌｌｉｐｏｒｅを用いた約４℃〜１０℃の温度（プロテアーゼ活性低減のため）での接線流濾過により２５ｍＭのトリス／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５〜８．０（ＤＴＴを含まない）中に透析濾過した。結果として生じた溶液をメンブランフィルターを用いて濾過し、硫酸アンモニウムの濃度を（例えば約０．４Ｍまで）高め、次いで、さらなる濾過を（例えば、メンブランフィルターを用いて）行った。この水溶液は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを含有していた。（ソルビトールを含んだ培地を利用する）この発酵プロセスは、実質的に実施例１に記述したとおりの発酵プロセスから得られる毒素収量の２〜３倍（すなわち、およそ５〜９μｇ／ｍＬの毒素Ａおよび１０〜１５μｇ／ｍＬの毒素Ｂの２〜３倍）をもたらす。培養物濾過液を、実質的に実施例１に記述したとおりのプロセスを用いて（上記の段落［００４５］におけると同様に）精製した。多くの不純物（毒素Ａ中のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を含む）が毒素ＡおよびＢにおいて明らかであった。ＨＳＰ６０および分解産物を表し得る約２１０ｋＤａ、８５ｋＤａおよび６０ｋＤａにおけるバンドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３つの不純物が、毒素Ｂにおいて明らかであった。このプロセスを何度も試みた。毒素純度がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価され、約７３．５〜８８．７％の範囲であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより可視化された主要バンドを測定することにより算出した場合の毒素Ａおよび毒素Ｂの純度が表１に記述されており、約７３．５〜８８．７％の範囲であった。毒素Ａについての主要不純物は（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１００ｋＤａにおけるバンドとして見られる）ＡＤＨであり、毒素Ｂにおいては多くの不純物が明らかであった。ＨＩＣ工程で得られた回収率は、＜５０％であった。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
一つには発酵プロセスの改善の結果としてもたらされる不純物負荷の増加に対処するために、下記のように精製プロセスに変更を加えた：（ｉ）ＨＩＣ工程において、トリス／２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび７％ＩＰＡを用いて溶離を実施し；（ｉｉ）ＡＥＸを、ＤＥＡＰを用いて実施した。
【００５１】
毒素分解
毒素分解は、特に毒素Ｂにおいて観察されたのであるが、これは、純度に関する問題であり得る。毒素Ｂにおいて、典型的な不純物バンドは、ＤＴＴの存在下における自己タンパク質分解の結果としてもたらされるものとして他の者により報告されたバンドと一致する２００ｋＤａ、８５ｋＤａおよび６０ｋＤａにおいて観察される。プロテアーゼの存在を評価するために、１つのロットからの中間試料を、数日間にわたり−８０℃、４℃および２５℃でインキュベートした。清澄化ブロスおよびＨＩＣ前試料において、小さなバンドパターン（ｂａｎｄｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）変化が認められ、２５℃および４℃試料においては増加（ｕｐ）を示すが−８０℃試料においては示さない、約２００ｋＤａおよび８５ｋＤａにおけるバンドが示された。毒素ＢのＴＦＦ２後試料は、室温での４日間にわたるインキュベーション後に完全に分解し、外因性プロテアーゼが示唆された。ＴＦＦ２後材料を用いた研究により、透析濾過緩衝液としてのＰＯ４の使用が分解に影響を及ぼし得ることが示唆された。１つのロットからのＴＦＦ２後材料を、異なるｐＨレベル（６．０、６．５、７．０、７．５、および８．０）において２０ｍＭのＰＯ４緩衝液中で透析した。さらなる試料を、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ７．５中に透析した。透析に続いて、ＰＯ４緩衝液中の各ｐＨにおいて、約２００ｋＤａおよび８５ｋＤａに、新しいバンドが観察された。驚くべきことに、２０ｍＭのクエン酸塩はこの結果を示さず、したがって、クエン酸塩緩衝液が有用な透析濾過緩衝液であり得ることが示唆された。
【００５２】
改善された精製プロセス
上述のように、精製プロセスを、収率および純度を改善するために修正した。異なるＨＩＣ樹脂をスクリーニングした。デプス濾過による清澄化後の培養物濾過液を、接線流濾過および膜濾過で処理し、いくつかのＨＩＣ担体（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ低疎水性、Ｐｈｅｎｙｌ高疎水性（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｎａｎｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｐｒｏｐｙｌ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のうちの１つを用いてＨＩＣにより精製した。これらの研究において、ＡＤＨの分離は、ＨＩＣ樹脂または膜のいずれを用いても達成されなかった。Ｂｕｔｙｌ  Ｓは、フェニル高置換（コントロール）と比較して約２倍高い能力、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥデータに基づく著しくより良好な毒素回収率（フェニルについての５０％に対して約９０％）という結果となった。この新規プロセスの他の利点は、イソプロピルアルコールが必要とされないこと、および生成物が溶離後の単一ピークで回収され得ることを含む。
【００５３】
１つの研究において、ＨＩＣ前材料を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｐｒｏｐｙｌカラム（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に流した。フェニルセファロース樹脂と比較して、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプロピルは、不活性担体（メタクリレート）を含むより弱い疎水性の樹脂であり、セファロースよりも高い圧縮性を有している（例えば、それゆえにタンパク質の二次的な結合を制限し得る）。プロピルおよびブチルのようなより弱い疎水性の樹脂の使用は、樹脂から生成物を完全に取り去るために水性溶離に続いて溶媒を使用する必要性を排除する。種々の負荷条件および線形勾配溶離を評価した。毒素からの不純物の分離のいくらかの改善に加えて、フェニルセファロースを用いたＨＩＣと比較して著しくより良好な毒素の回収率ももたらされた。結果は、（ｉ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｐｒｏｐｙｌ樹脂がフェニル樹脂の代わりになり得ること、（ｉｉ）１．２Ｍの硫酸アンモニウム濃度という負荷条件が、毒素をプロピル樹脂に結合させるのに十分であること、（ｉｉｉ）フェニル樹脂について現在見られるような溶媒が、溶離プロセスを完了するために必要とされないこと、そして（ｉｖ）後でＡＥＸクロマトグラフィーにより分離されなければならない両者の共溶離とは対照的な、毒素ＡおよびＢの分離が、プロピル樹脂を用いては可能であり得ることを示した。
【００５４】
別の研究において、ＨＩＣを、Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｈｉｔｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ−Ｓ）を用いて行った。ＨＩＣ前材料を、２．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５の１倍体積で希釈し、製造業者の指示に従って、直線勾配を用いてカラム上に流して、毒素を共溶離した。ブチル−Ｓセファロースクロマトグラフィー試験からのＨＩＣ後生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、フェニルセファロースクロマトグラフィー試験からのＨＩＣ後生成物と比較した。Ｂｕｔｙｌ−Ｓセファロースを用いたＨＩＣクロマトグラフィーは、著しくより低いレベルの分子量の不純物を有していた。Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  ＨＩＣからの溶離毒素は、フェニルセファロースを用いて精製された材料よりも低い割合の不純物を含有していた。フェニルセルロースを用いたＨＩＣおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌプロピルを用いたＨＩＣと比較して、著しくより良好な不純物からの毒素の分離が、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  ＨＩＣによりもたらされた。ＨＩＣ／フェニルセファロースとＨＩＣ／Ｂｕｔｙｌ  Ｓとを比較する１つの研究において、ＨＩＣ／フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅを用いては毒素Ａの１０％の回収率しか得られなかったのに対して、ＨＩＣ／Ｂｕｔｙｌ  Ｓは、同じ清澄化培養物濾過液出発物質を用いて、毒素Ａについてはほぼ７０％の回収率および毒素Ｂについてはほぼ９０％の回収率をもたらした。したがって、より疎水性の高いフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂と比較して、より疎水性の低い樹脂（例えば、ブチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、例えば、ＧＥ  Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなど）は、ＨＩＣ工程において著しく改善された回収率をもたらし、さらに、溶媒（例えば、ＩＰＡ）の使用を伴わない毒素の溶離も可能にした。
【００５５】
多くの陰イオン交換担体もまた評価した。ＨＩＣ／Ｐｈｅｎｙｌ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＨＩＣ／Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる精製後の培養物濾過液を、いくつかのＡＥＸカラムのうちの１つを用いて精製した。１０カラム体積の勾配溶離を使用した。スクリーニング結果を表２に記述する。ＤＥＡＰカラムを用いてＡＥＸを行った場合に、試験されたｐＨの各々において、および０．５Ｍのアルギニンを含む溶離緩衝液を用いた場合に、ＡＤＨ不純物が毒素Ａと共に共溶離された。１Ｍの酢酸塩溶離緩衝液を用いたＤＥＡＰカラムの使用は、毒素ＡからのＡＤＨ不純物の分離をほとんど乃至全く示さなかった。Ｔｏｓｏｈ  ＤＥＡＥカラムを用いたＡＥＸクロマトグラフィーもまた、毒素ＡからのＡＤＨ不純物の分離をほとんど乃至全く示さなかった。Ｔｏｓｏｈ  Ｑ上で精製したＢｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶離材料の試験は、非常に純粋な材料を結果としてもたらし、毒素Ａは、９４％以上の純度を有していた。２０００Ｌ発酵ロットからのブロス濾過液であってＢｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたＨＩＣおよびＴｏｓｏｈ  Ｑを用いたＡＥＸを用いて精製されたブロス濾過液を用いた多くの試験が、９９％の平均純度を有する毒素Ａおよび９８％の平均純度を有する毒素Ｂをもたらした。毒素Ｂに関しては、（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと比較して）Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたＨＩＣおよび（ＤＥＡＰと比較して）Ｔｏｓｏｈ  Ｑを用いたＡＥＸが、純度および収率を改善した。毒素Ｂの分解および純度は、第２の接線流濾過工程におけるＤＴＴの除去およびリン酸塩緩衝液のクエン酸塩緩衝液への置換（但し、他の理由により、リン酸塩緩衝液の方が、典型的には好ましい）によりさらに改善された。したがって、毒素Ａからの１つの不純物（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ））の良好な分離が、非多糖ベースの担体（例えば、メタクリレートベースの樹脂、ポリエーテルスルホンベースの膜など）を用いて見られた。他の不純物（例えば、ＨＳＰ−６０および他のタンパク質）からの毒素Ｂの良好な分離もまた観察された。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂と比べて、これらの非多糖ベースの担体は、表２に示されるように、毒素の純度および収率を高めた。
【００５６】
【表２−１】
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【００５７】
【表２−２】
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【００５８】
【表２−３】
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【００５９】
【表２−４】
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【００６０】
２つの精製手順を、実質的に本実施例に記述したとおりに培養したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの２０Ｌの濾過ブロスを用いて比較した：（ｉ）第１のものは、ＨＩＣ工程にＢｕｔｙｌ  ＨＩＣ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＡＥＸ工程にＴｏｓｏｈ  Ｑ樹脂を用い；（ｉｉ）第２のものは、ＨＩＣ工程にＰｈｅｎｙｌ  ＨＩＣ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＡＥＸ工程にＤＥＡＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた。精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。第１のプロセスにより精製された毒素ＡおよびＢは、それぞれ＞９７％および９５％の純度を有していた。１週間にわたる２５℃での貯蔵に続いて、これらの毒素は、良好な安定性を示し、純度の変化を全く有さなかった。毒素は、クエン酸塩を含まない緩衝液中でさえも安定であった。第２のプロセスを用いた毒素純度はより低かった（例えば、毒素Ａについては７６％および毒素Ｂについては２８％）。４℃での１週間にわたる貯蔵に続くこれらの毒素の安定性は乏しかった。
【００６１】
ＨＩＣおよびＡＥＸの順序
ＨＩＣおよびＡＥＸのクロマトグラフィー工程の順序を、収率および純度に対する影響を評価するために変更した。清澄化された採取物を、まず（Ｔｏｓｏｈ  Ｑ樹脂を用いた）ＡＥＸクロマトグラフィーにより精製し、結果として生じた毒素Ａ生成物および毒素Ｂ生成物を、（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｐｒｏｐｙｌ樹脂を用いた）ＨＩＣクロマトグラフィーによりさらに精製した。直線勾配を用いて、ベースライン分離を有する２つの溶離ピークをＡＥＸカラムから観察した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、第１の溶離ピークが毒素Ａに対応し、第２の溶離ピークが毒素Ｂに対応することが確認された。各ピークについての汚染物質プロファイルは、著しく異なっていた。各ピークからの画分をプールして、ＨＩＣによるさらなる精製のための毒素Ａおよび毒素Ｂ出発物質を生成した。１つの主要な溶離ピークが各ＨＩＣ分離について観察され、それらのピーク画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された時に、毒素Ａまたは毒素Ｂを主として示した。本研究からの結果は、（ｉ）清澄化された採取物からの毒素ＡおよびＢが、ベースライン分離となるように分離され得ること、そして（ｉｉ）個々の毒素が、プロピル樹脂上でさらに精製および洗練され得ることを示す。
【００６２】
Ｂｕｔｙｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いるＨＩＣおよびＴｏｓｏｈ  Ｑを用いるＡＥＸ
ＨＩＣ工程にＢｕｔｙｌ  ＨＩＣ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＡＥＸ工程にＴｏｓｏｈ  Ｑ樹脂を用いる精製プロセスを確立した（図１）。複数の大規模試験（１６０Ｌ以上）を行った。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより評価した場合の純度は、毒素ＡおよびＢについて、それぞれ、平均して約９８％および９７％であった。平均収量は、毒素ＡおよびＢについて、それぞれ、実施例１に記述されたプロセスを用いて得られた収量と比較して３〜５倍の増加に相当する、（例えばソルビトールを含有する）発酵ブロス１Ｌ当たり０．０２４ｇおよび０．１２ｇの毒素であった。１０００Ｌ試験および２０００Ｌ試験において、同様の収量および純度の結果が得られた。したがって、ＨＩＣのためにフェニルセファロースの代わりにＢｕｔｙｌ  Ｓを用いることおよびＡＥＸのためにＤＥＡＰの代わりにＴｏｓｏｈ  Ｑを用いることは、毒素Ａおよび毒素Ｂの良好な純度および回収率（一つには培養培地にソルビトールを含めることによる）をもたらす。試料または緩衝液へのＤＴＴの添加を全く伴わずにかつＡＥＸ溶離緩衝液中にＭｇＣｌ２を用いて行われた、ＨＩＣにＢｕｔｙｌ  ＳおよびＡＥＸにＴｏｓｏｈＱを用いたその後の研究は、純度をさらに改善し、かつ毒素分解を低減した。
【００６３】
毒素の不活性化
上記のように精製した毒素ＡおよびＢを、ホルムアルデヒドでの処理により不活性化した。３７％ホルムアルデヒド溶液を、約０．２％〜０．４％の最終濃度が得られるように、毒素Ａ透析濾過液および毒素Ｂ透析濾過液の各々に無菌添加した。これらの溶液を混合し、次いで、６〜１３日間にわたり約２５℃で貯蔵した。不活性化に続いて、毒素透析濾過液を処方緩衝液中に透析し、実施例３に記述されるようにインビボでアッセイした。
【００６４】
実施例３
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＢを、実質的に実施例２に記述した方法に従って調製し、ワクチン組成物として処方した。トキソイドＡおよびＢを３：２の重量比で組み合わせ、スクロース（４．０％〜８．０％  ｗ／ｖ）およびホルムアルデヒド（０．０１２％〜０．０２０％  ｗ／ｖ）を含むクエン酸塩緩衝液を用いて処方し、凍結乾燥した。各組成物を、ワクチンとしての使用の前に希釈剤で再構成し、水酸化アルミニウムでアジュバント添加した。シリアゴールデンハムスターが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン開発のための強力なモデルを提供する。（例えばワクチン接種なしでは）ハムスターは、クリンダマイシン抗生物質の単一腹腔内（ＩＰ）用量で前処置した後、および毒素原性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）生物の胃内（ＩＧ）接種を受けた後に、激症下痢および出血性盲腸炎を迅速に発現させ、２〜４日以内に死亡する。再構成されたワクチンは、１００μｇ／用量のトキソイド、０．００８％のホルムアルデヒドおよび４００μｇ／用量のアルミニウムを含有していた。ハムスター（９匹のハムスター／群）に、異なる用量のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチン（ヒト用量（１００μｇ／用量）（ＨＤ）の４つの希釈物）での（０日目、１４日目、および２７日目における）３回の筋肉内免疫によりワクチン接種したか、またはプラセボ（ＡｌＯＨ）を注射した。４１日目に、ハムスターを、１０ｍｇ／ｋｇの２−リン酸クリンダマイシンという化学形態の抗生物質で、ＩＰ経路により前処置した。４２日目に、抗生物質を用いた前処置の２８時間後に、致死量の、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＡＴＣＣ４３２５５菌株由来の胞子調製物をＩＧ経路によりハムスターに負荷した。保護抗力を、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症と関係する症状の出現の動態および死亡率を測定することにより評価した。結果は、当該ワクチンがＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素原性細菌での致死的攻撃から用量依存的な様式でハムスターを保護することを証明するものであり、ＨＤ／２０（１００μｇ／ｍＬのＡｌＯＨの存在下における５μｇのトキソイドＡ＋Ｂ）という用量でのワクチン接種により、１００％保護が誘導された（図２）。免疫付与された動物は、死および疾患（体重減少および下痢）から保護された。本研究の結果は、いくつかのインビボ研究を代表するものである。したがって、開示される方法により調製されたトキソイドは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患に対する防御免疫を提供する。
【００６５】
好ましい実施形態に関して特定の実施形態を記述してきたが、変更および修正が当業者に思い浮かぶであろうことが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、以下の特許請求の範囲の範囲内に入る全てのそのような等価の変更を対象として含むことが意図されている。
【００６６】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００６７】
実施形態１
精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の製造のための方法において、前記方法は、
ａ）Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む不純な水溶液を疎水性相互作用担体に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させる工程と、
ｂ）前記結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記疎水性相互作用担体から溶離する工程と、
ｃ）工程（ｂ）からの前記溶離されたＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、（ｉ）第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂および（ｉｉ）第４級アミン官能基を有するポリエーテルスルホン膜からなる群から選択される陰イオン交換担体に適用してそれにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を結合させる工程と、
ｄ）前記結合したＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記陰イオン交換担体から溶離する工程と
を含むことを特徴とする、方法。
【００６８】
実施形態２
工程（ａ）の前に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む前記不純な水溶液を接線流濾過に供する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００６９】
実施形態３
工程（ｄ）に続いて、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を回収する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１または２に記載の方法。
【００７０】
実施形態４
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａであることを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【００７１】
実施形態５
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂであることを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【００７２】
実施形態６
前記疎水性相互作用担体が、結合したブチルＳ基を有するマトリックスまたは結合したプロピル基を有するマトリックスであることを特徴とする、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【００７３】
実施形態７
請求項に記載の方法。
【００７４】
実施形態８
前記疎水性相互作用担体が、結合したプロピル基を有するマトリックスであり、かつ前記不純な水溶液が、硫酸アンモニウムの存在下で疎水性相互作用担体に適用されることを特徴とする、実施形態６に記載の方法。
【００７５】
実施形態９
前記不純な水溶液が、約０．８〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウムの存在下で前記疎水性相互作用担体に適用されることを特徴とする、実施形態８に記載の方法。
【００７６】
実施形態１０
工程（ｂ）が、有機溶媒の不在下で行われることを特徴とする、実施形態１〜５、８または９のいずれか一項に記載の方法。
【００７７】
実施形態１１
前記疎水性相互作用担体が、結合したブチルＳ基を有するＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂であることを特徴とする、実施形態６に記載の方法。
【００７８】
実施形態１２
前記不純な水溶液中の前記毒素Ａの約７０％および／または前記毒素Ｂの約９０％が、工程（ａ）および（ｂ）後に回収されることを特徴とする、実施形態６または１１に記載の方法。
【００７９】
実施形態１３
工程（ｂ）が、有機溶媒の不在下で行われることを特徴とする、実施形態６、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【００８０】
実施形態１４
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を含む前記水溶液が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを含み、工程（ｃ）において、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂが、陰イオン交換担体から別個に溶離されることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００８１】
実施形態１５
前記陰イオン交換担体が、非多糖ベースの物質であることを特徴とする、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【００８２】
実施形態１６
前記陰イオン交換担体が、結合した第４級アミン官能基を有するポリメタクリレート樹脂であることを特徴とする、実施形態１５に記載の方法。
【００８３】
実施形態１７
前記陰イオン交換担体が、強陰イオン交換体である部分−Ｏ−Ｒ−Ｎ＋−（ＣＨ３）３（式中、Ｒはポリマーである）を含み、かつ／または前記陰イオン交換担体が、Ｔｏｓｏｈ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍであることを特徴とする、実施形態１６に記載の方法。
【００８４】
実施形態１８
毒素Ａが、低塩緩衝液を用いて溶離されることを特徴とする、実施形態１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【００８５】
実施形態１９
前記低塩緩衝液が、２〜約３２ｍＭのＭｇＣｌ２または約１２５〜約１６０ｍＭのＮａＣｌを含むことを特徴とする、実施形態１９に記載の方法。
【００８６】
実施形態２０
毒素Ｂが、高塩緩衝液を用いて溶離されることを特徴とする、実施形態１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【００８７】
実施形態２１
前記高塩緩衝液が、約１２０〜約１５０ｍＭのＭｇＣｌ２または約４５０〜約５５０ｍＭのＮａＣｌを含むことを特徴とする、実施形態２０に記載の方法。
【００８８】
実施形態２２
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の前記不純な水溶液が、増殖培地中でＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の細胞を培養してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素および培養細胞を含有する培養ブロスを供給し、前記培養ブロスを前記培養細胞から分離してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の前記不純な水溶液を供給することにより得られることを特徴とする、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【００８９】
実施形態２３
前記増殖培地が、ソルビトールを含むことを特徴とする、実施形態２２に記載の方法。
【００９０】
実施形態２４
実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素において、前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、約９０％以上の純度を有することを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９１】
実施形態２５
前記毒素が、約９４％以上の純度を有することを特徴とする、実施形態２４に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９２】
実施形態２６
前記毒素が、約９８％以上の純度を有することを特徴とする、実施形態２５に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９３】
実施形態２７
約９９％以上の純度を有することを特徴とする、実施形態２６に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ。
【００９４】
実施形態２８
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａであることを特徴とする、実施形態２４に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９５】
実施形態２９
前記毒素が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂであることを特徴とする、実施形態２４に記載の精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９６】
実施形態３０
実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って得られる精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素において、前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、溶媒を実質的に含まないことを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９７】
実施形態３１
実施形態１〜２３のいずれか一項に従って得られる精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素において、前記精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、検出可能なアルコールデヒドロゲナーゼを全く有さないことを特徴とする、精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素。
【００９８】
実施形態３２
回収された精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を化学薬剤で不活性化してＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを供給する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【００９９】
実施形態３３
前記回収された精製Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が、ホルムアルデヒドで不活性化されてＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを供給することを特徴とする、実施形態３２に記載の方法。
【０１００】
実施形態３４
実施形態３２または３３に記載の方法に従って得られることを特徴とする、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド。
【０１０１】
実施形態３５
前記トキソイドが、トキソイドＡまたはトキソイドＢであることを特徴とする、実施形態３４に記載のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド。
【０１０２】
実施形態３６
実施形態３４または３５に記載のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドを含むことを特徴とする、組成物。
【０１０３】
実施形態３７
実施形態３４または３５に記載のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドと薬学的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする、組成物。
【０１０４】
実施形態３８
前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドが、トキソイドＡまたはトキソイドＢであることを特徴とする、実施形態３６または３７に記載の組成物。
【０１０５】
実施形態３９
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡおよびＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｂを、３：２の重量比で含むことを特徴とする、実施形態３６または３７に記載の組成物。
【０１０６】
実施形態４０
被験体において免疫応答を誘発する方法において、前記方法は、前記被験体に実施形態３６〜３９のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
【０１０７】
実施形態４１
被験体において症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防または処置する方法において、前記方法は、前記被験体に実施形態３６〜３９のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
【０１０８】
実施形態４２
前記被験体が、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の症状を有していないが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を発現させる危険性があることを特徴とする、実施形態４１に記載の方法。
【０１０９】
実施形態４３
前記被験体が、症候性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に罹っていることを特徴とする、実施形態４１に記載の方法。