(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０６２４を有する形質転換ヒトＢ細胞８８ＢＶ５９。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞によって産生されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
下記配列：
【化１】
0003539985.tif 000006
におけるＶＨ可変域アミノ酸１〜１１３のアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項４】
下記配列：
【化２】
0003539985.tif 000007
におけるＶＫ鎖可変域アミノ酸１〜１０８のアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、自己癌抗原（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）を用いて能動免疫された癌患者のＢ細胞から誘導される形質転換Ｂ細胞によって産生されるモノクローナル抗体に係わる。このモノクローナル抗体は、ヒト癌における診断法及び治療の両方に使用することができる。更に、Ｈ鎖及びＬ鎖可変域の単離及び配列決定、並びにこれらに含まれる相補性決定域の同定も本発明の一部である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、特定の癌に関係する抗原に特異的に反応する新規のヒトモノクローナル抗体と、能動免疫された患者の末梢血Ｂ細胞から誘導される形質転換Ｂ細胞系の製造とに係わる。本発明は更に、かかるモノクローナル抗体を使用する診断法及び癌治療にも係わる。
【０００３】
現在使用可能な癌治療、特に放射線療法及び化学療法は、癌細胞が正常細胞と比較してかかる処置に対してより感受性であるという原理に基づいている。しかしながら、正常組織に対するかなりの毒性のためにかかる療法は大分制限されている。これとは対照的に、抗体分子はそれらの抗原に著しい特異性を示す。従って研究者らは、「癌治療における待望の“魔法の弾丸（ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔ）”」として、癌細胞に特異的な抗体を単離しようと試みた（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１６：２８３）。
【０００４】
抗体は、通常は骨髄によって産生されるＢ細胞リンパ球によって合成され、血流中を運搬されるタンパク質分子である。体内に侵入したいかなる抗原、即ち単純有機化学物質から複雑なタンパク質までいかなる外来分子に対しても、その特定の化学構造を認識し且つ攻撃する抗体が産生される。特定の抗体が結合し得る抗原上の固有の化学構造は抗原決定基またはエピトープと称されている。Ｂ細胞、リンパ球または白血球と称される体内のＢ細胞リンパ球は、各々が異なる決定基に特異的な抗体を産生する膨大な数の異なる遺伝的にプログラムされた細胞として存在している。抗体産生を刺激する抗原はその表面上に幾つかの決定基を有し得る。抗原上の１つの決定基に特異的な抗体をその表面上に保有するＢ細胞は、その抗原に遭遇すると複製する。このクローナル増殖の結果、かかる抗体を血流中に分泌する多数の娘細胞がもたらされる。
【０００５】
抗原を認識し且つそれに結合する抗体の特異性から、単一決定基に特異的であり、従ってその特定の決定基を有する抗原または組織のみに結合する抗体を多量に製造することが望まれた。
【０００６】
Ｂ細胞は、“無限増殖（ｉｍｍｏｒｔａｌ）”細胞とハイブリダイズするかまたはウイルスもしくは腫瘍ＤＮＡを用いて形質転換することにより変性しないと、連続培養において増殖しない。モノクローナル抗体は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）のようなリンパ趨向性ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ）によって偶発的にまたは計画的に形質転換されたＢ細胞リンパ球によって産生される。形質転換は、ウイルスＤＮＡ及び細胞ＤＮＡのような他の形質転換作用物質を使用しても行ない得る。このような細胞は、ハイブリドーマ細胞とは違って、正常なヒト二倍体の数（４６）の染色体を有する。
【０００７】
モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混じらない純粋形態で合成される。モノクローナル抗体産生細胞を用いて、特定の抗原上の１つの決定基に特異的な抗体を実質的に無制限な量で製造し得る。
【０００８】
特定の癌細胞に特異的な抗体が入手できれば、それらを種々の治療及び診断法に使用し得ると考えられる。このような抗体は特定の腫瘍細胞を、該抗体が特異性を示す該細胞の決定基のところを攻撃するだけで失活または死滅させ得る。或いはかかる抗体はエフェクターリンパ球またはマクロファージの表面に結合し、それらを腫瘍抗原特異的キラー細胞に変換し得る。
【０００９】
モノクローナル抗体は、化学療法薬剤、毒素及び放射性アイソトープに結合することによりそれらの特異性を増大し、従ってそれらの効能を増大する一方で、その毒性を低下させることもできる。更に、放射性核種または金属微量元素に結合させた抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び転移部の位置確認のためのプロトン放出（ＰＥＴ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）による画像化に使用することができる。更に抗体は、癌の診断及び／または予後テストとして、血液中の腫瘍抗原の存在を検出するのに使用することもできる。更にモノクローナル抗体を使用して、標準化ワクチンに使用できそうな腫瘍抗原を単離することもできる。
【００１０】
種に特有の一定域に加えて、抗体はＨ鎖（ＶＨ）及びＬ鎖（ＶＬ）の両方に可変域を含む。かかる可変域は抗体の結合特異性を決定する部分であり、全ての抗体上の特定のエピトープに結合する可変域は、抗体上の別のエピトープに結合する可変域とは異なる。治療及び画像化用の薬剤及び放射性金属の送達ために抗体の特異性を利用することにおいて、本発明者らは、免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を調製する上で抗体の結合に活性な部分のみを使用することが有益となり得ると考えた。Ｈ鎖及びＬ鎖の相補性決定域を同定及び配列決定すると、多官能キメラ抗体を合成するための情報が得られる。このため、本発明者らは可変域を単離及び配列決定し、エピトープに結合するよう機能する領域を配列中で決定した。
【００１１】
ヒト癌に特異的なモノクローナル抗体を誘導する従来の試みはＢ細胞に関して２つの経路、即ち、１）ヒト腫瘍に対して免疫したマウスの脾臓からＢ細胞を抽出する経路〔米国特許第４，１７２，１２４号〕、及び２）癌患者の末梢血または腫瘍流出リンパ節からＢ細胞を抽出する経路をとっていた。しかしながらいずれの方法も満足の行く結果を与えていない。
【００１２】
ヒト腫瘍に対して免疫されたマウスはあまりに広域な反応性を有する。即ち、産生されたマウスモノクローナル抗体のほとんどが、正常及び腫瘍組織上に存在するヒト抗原と反応する。産生されたかなり多種の抗体の中から、腫瘍細胞のみと反応する抗体を選択することは極めて困難である。例えば、ヒト小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を用いて免疫したマウスから誘導した２０，０００個のハイブリドーマを、腫瘍細胞との反応性に対してスクリーニングしている〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１６：２８３〕。この研究グループによって認められたのが極低頻度（＜０．４％）であったのに対して、本発明に使用される方法によって活性化Ｂ細胞を得ると、免疫結腸患者由来の無限増殖Ｂ細胞の１６％が、腫瘍細胞と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する結果となった。更に、マウスＢ細胞由来のモノクローナル抗体は、癌治療に適用し得る可能性は小さい。これらは、繰り返して投与するとヒト免疫系を刺激して“抗マウス”抗体を産生し、臨床試験において、これがマウスモノクローナル抗体の効能を著しく低下させることが判明している。本発明者らのヒトモノクローナル抗体を使用するとかかる問題を解消し得る。可変域のみまたは相補性決定域（ＣＤＲ）を使用すると免疫原となる可能性がずっと小さくなるし、他の利点も与えられる。ＶＨまたは単一ＣＤＲのようなより小さい分子の体内から迅速に消え去る能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断薬に即効性を付与することにおいて有用となり得る。
【００１３】
ヒトとマウスのモノクローナル抗体の他の明らかな相違はそれらの免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）染色パターンにある。マウス抗体を用いたこれまでの研究では、腫瘍区画内で細胞の異種染色がよく起こることが示されている。この反応性パターンは腫瘍細胞の抗原異種性に起因するとみなす研究者もいる〔Ｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：７２８−７３５，１９８３〕。これに反して、本発明者らの方法によって製造されたヒトモノクローナル抗体は、それらが反応した腫瘍との反応性の点では同種であった。マウスモノクローナル抗体の異種染色は、推定腫瘍関連抗原よりはむしろ腫瘍細胞上に豊富にある相特異的または細胞周期特異的な分化抗原をネズミ免疫が認識することを反映しているというのが妥当な説明である。マウスにヒト腫瘍細胞を免疫したときに実質的な抗原競合が起こり、宿主による免疫応答性において、より豊富であり従ってより優勢な組織タイプ及び分化抗原が、比較的少量の腫瘍関連抗原に打ち勝つと推定することは不合理ではない。即ち、ヒトの自己免疫が、マウスにおいては通常は免疫原性が乏しい抗原群に対する抗体を誘導し得る。これは、ヒトとマウスが異なる腫瘍抗原に応答し得ることを示唆している。本発明者らが製造した最初の３６個のヒトモノクローナル抗体のいずれも、ヒト腫瘍細胞に対して産生されたマウスモノクローナル抗体によってしばしば認識される抗原である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と反応しないという本発明者らの新規知見はこの仮説と一致する。
【００１４】
ヒトモノクローナル抗体を製造しようとする従来の試みの大半は、腫瘍を保有する患者由来の末梢血またはリンパ節のいずれかから抽出したＢ細胞を使用している。抗原性腫瘍が存在すると、腫瘍保有個体に自己の腫瘍に対する免疫応答を起こさせ、特異的免疫Ｂ細胞を産生させると考えられている。従って、癌患者の腫瘍流出リンパ節または末梢血中に認められる循環リンパ球からＢ細胞を採取する。しかしながら、本発明以前には、腫瘍特異的モノクローナル抗体を製造することはあまりうまくいっていない。
【００１５】
ヒト腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体を製造する上での主要な問題は、特異的免疫Ｂ細胞源を見付け出せないことであった〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１６：２８５〕。ヒトにおいては、癌細胞の初期病巣はヒトの寿命の１％〜１０％の長期にわたって増殖する傾向にあり、それで初めて疾患の何等かの触診臨床症状が現れる。このときまでに患者は腫瘍に対して免疫応答低下状態になっているか、または場合によっては免疫寛容になっている。即ち本発明以前には、腫瘍細胞に反応性を示すヒトモノクローナル抗体は再現可能に入手することはできなかった。
【００１６】
本発明者らは、特異的ワクチン製造において、患者自身の腫瘍由来の細胞を用いて免疫した患者から得た末梢血Ｂ細胞を使用することによりモノクローナル抗体を得る新規のより有効な方法を開発した。能動特異的免疫療法を行なうために、患者を、自己腫瘍細胞（ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、即ち患者自身の腫瘍由来の細胞を用いて免疫する。この方法は、腫瘍細胞が腫瘍特異的抗原を発現するという本発明者らの理論に基づいて行なわれる。
【００１７】
腫瘍細胞に対して他覚的免疫応答を起こすヒトは明らかに、活性化Ｂ細胞の優れた供給源であることが判った。本発明者らは、患者自身の腫瘍に対して能動免疫された患者の末梢血がかかる活性化Ｂ細胞の豊富な供給源であることを見い出した。
【００１８】
本発明者らは臨床試験において、特定の癌を有する患者を処置したときに他覚的免疫応答が起こることを、皮膚テスト、即ち遅延型皮膚過敏症（ＤＣＨ）によって明らかにした。免疫患者は、患者自身の結腸直腸癌に対して遅延型皮膚過敏症を示した。更に、免疫患者のＢ細胞から製造されたモノクローナル抗体は、他の患者における同じ組織型の腫瘍と反応した。かかる結果は、患者の体液性免疫応答、即ち抗体の産生が結腸直腸癌全般に対するものであり、免疫患者自身の癌に固有のものではないことを示している。この一般応答は、標準化ワクチンの開発には特に重要である。
【００１９】
腫瘍細胞関係抗原、特にほとんどのケースにおけるような細胞表面抗原上のエピトープに特異的な反応性を示す抗体を産生するＢ細胞の生成は、免疫研究が開始されたときは想像に過ぎなかった有利な成果である。癌特異的抗体の製造ではなくて、ヒト免疫法の基準となる免疫の治療効果のみが動物実験を通して確認及び測定された。
【００２０】
被検体の症状改善を伴なう一般免疫応答は、マクロファージ及びＴ細胞が癌細胞抗原の存在下に活性化され、腫瘍細胞を破壊する細胞性応答の指標である。ほとんどの環境下で免疫によって抗体応答が誘起されると推定されるが、抗体応答と細胞性応答の経時的様相はほとんどの場合に異なる。更に、患者が自己腫瘍細胞、即ち患者自身の腫瘍細胞を用いて免疫されたという事実、及び、患者自身の腫瘍によっては抗体はわずかしかまたは全く産生されないという従来の研究者らの経験から、免疫後に腫瘍特異的抗体を産生するＢ細胞が生成されるという本発明者らの新規知見は予想外に有益な結果であったと言える。
【００２１】
本発明は、能動特異的免疫に好結果を与えるワクチンを調製すること、免疫ヒトＢ細胞を抽出する方法を開発すること、並びにヒトモノクローナル抗体産生細胞系の持続的連続製造及びモノクローナル抗体製造の方法を開発する本発明の研究過程の産物である。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの目的は、腫瘍関連抗原には特異的反応性を示すが非腫瘍組織上に提示された抗原には最小の反応性しか示さないヒトモノクローナル抗体を製造することである。このような抗体は、腫瘍を検出及び診断し且つ特定タイプの癌を有する患者を治療する手段を与える。本発明の別の目的は、上記特性を示すヒトモノクローナル抗体を同定し、単離し、無限増殖化し、この抗体を産生する細胞系を培養することである。本発明の別の目的は、選択された抗体の可変域を配列決定し、かかる抗原上のエピトープに実際に結合するＨ鎖及びＬ鎖の部分、即ち相補性決定域を単離及び同定することである。
【００２３】
本発明は、ヒト結腸腫瘍抗原上に認められるエピトープに特異的反応性を示す、ヒトＩｇＧ３κを産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系ＣＯ８８ＢＶ５９と、この抗体の相補性決定域を同定及び配列決定することからなる。
【００２４】
本発明は特に、ヒト二倍体細胞系、即ち本発明者らがＥＢＶに暴露することにより形質転換した、ＣＯ８８ＢＶ５９と称される無限増殖ヒトＢ細胞系である。この細胞系は、１９８９年２月２８日出願の一部係属出願ＵＳＳＮ０７／３４３，４７５号において定義された結腸腫瘍抗原上のエピトープに特異的反応性を示すヒトＩｇＧ３κ抗体を産生する。この抗原は最初は、１９８７年４月１５日出願の本出願人らの同時係属出願ＵＳＳＮ０７／０３８，８１１号に基づき特許された米国特許第４，９９７，７６２号（この特許は参照により本明細書の一部を構成するものとする）に定義されたヒトＩｇＭ抗体１６−８８を使用して同定された。ＩｇＧ３κ８８ＢＶ５９及びＩｇＭ１６−８８は同じ腫瘍関連抗原を認識するが、該抗原上の異なるエピトープと反応する。
【００２５】
実施例Ｉ：感作Ｂ細胞の調製
Ａ．患者選出
結腸または直腸癌の外科切除を受けた患者を、能動特異的免疫療法のランダム抽出検査のために選出した。病理学的段階に従う層形成によってランダム抽出を行ない、臨床基準を満たした全ての患者から腫瘍を入手した。検査候補者は、癌の前歴がなく、以前に化学療法及び放射線療法のいずれも受けたことがなく、外来治療プロトコルに従うのに適当な病状の結腸直腸癌患者であった。検査に適格な患者は、腫瘍が腸壁を貫いて広がっている患者（Ａｓｔｌｅｒ−ＣｏｌｌｅｒＢ２）、リンパ節陽性の患者（第Ｃ１，Ｃ２期）または転移性疾患を有する患者（第Ｄ期）であった。かかる分類において、治療グループ及び非治療グループに参加する患者をランダムに選択した。ランダム抽出カードをコンピュータ生成し、手術後に各カテゴリーから順番に引いた。
【００２６】
Ｂ．腫瘍入手
外科切除後、腸標本を即座に病院病理部に持ち込み、無菌条件下に開いた。腫瘍組織を切り取り、１ｍｌ当たり５０μｇのゲンタマイシンを含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を含む無菌試験管内に入れ、氷冷しながら処理及び凍結用の実験室に即座に運んだ。
【００２７】
Ｃ．固体腫瘍と結腸粘膜の解離
層状フローフード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）下に無菌技術を用い、ピーターら〔Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１３５３−１３６０，１９７９〕の組織解離法を使用した。腫瘍組織を遠心管内でＨＢＳＳ及びゲンタマイシンを用いて３回濯ぎ、氷上のペトリ皿に移した。メスで切除した生体外組織と腫瘍とを直径約２〜３ｍｍの小片に刻んだ。組織フラグメントを、２０〜４０ｍｌの０．１４％（２００単位／ｍｌ）コラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−０１３０）と０．１％（５００Ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍｌ）デオキシリボヌクレアーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−０８７６）（ＤＮａｓｅ  Ｉ，Ｓｉｇｍａ  Ｄ−０８７６）を含む、予め３７℃に暖めておいた７５ｍｌフラスコ内に入れた。フラスコを、撹拌するが起泡しないような速度の浸没磁気撹拌子を備えた３７℃の水浴中に入れた。３０分間インキュベートした後、遊離細胞を、３つの適度に湿った無菌ナイロンメッシュ層（１６６ｔ：Ｍａｒｔｉｎ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を通して５０ｍｌ遠心管内にデカントした。細胞を、冷却遠心機において１２００ｒｐｍ（２５０×ｇ）で１０分間遠心した。上清を空け、細胞を５〜１０ｍｌのＤＮａｓｅ（ＨＢＳＳ中で０．１％）中に再懸濁させ、５〜１０分間３７℃に維持した。試験管にＨＢＳＳを満たし、遠心によって洗浄し、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ１５ｍｌとし、氷上に維持した。この作業を、十分な細胞が得られるまで、腫瘍細胞に対しては通常は３回、繰り返した。種々の消化物由来の細胞をプールし、カウントし、トリパンブルー排除試験によって細胞生存率を評価した。最終洗浄のために細胞を遠心してから凍結保存した。
【００２８】
Ｄ．凍結保存
最適な凍結保存は極めて重要である。ワクチン調製においては、解離した腫瘍細胞をＨＢＳＳ中で５〜８×１０７／ｍｌに調整し、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び４％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む冷たい凍結媒質（２Ｘ）に同量で加えた。２〜４×１０７細胞／ｍｌの最終懸濁液を１．２ｍｌ  Ｎｕｎｃフリーザーバイアルに入れた。ＤＣＨ細胞試験に対しても作業手順は同じであったが、但しＨＳＡは使用しなかった。両ケースにおいて、凍結準備のために、Ｎｕｎｃバイアルを氷冷しながら、制御速度凍結のためにモデル７００コントローラー及びモデル５００温度レコーダーを備えたＣｒｙｏ−Ｍｅｄモデル９９０Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｒｅｅｚｅｒに移した。モニターバイアルを含む個々のバイアルの温度が凍結過程の開始時に均一であるように注意を払った。バイアルを１℃／分の制御速度で最終温度−８０℃まで冷却した。バイアルを液体窒素に入れて液体窒素貯蔵庫に移した。
【００２９】
Ｅ．臨床プロトコル
適当な病理段階の腫瘍を有する患者を、自己腫瘍細胞−ＢＣＧワクチンを受容するものと、更なる治療を受けないものとにランダムに分けた。第Ｄ期の患者は全てが５−フルオロウラシル化学療法を受け、腹膜反転部（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）以下の病巣（直腸癌）を有する全ての患者は、免疫療法が終了した２週間後に５０４０ラッドの骨盤Ｘ線照射を受けた。麻酔及び手術によって誘導される免疫抑制の回復に十分な時間を与えるため、腫瘍切除の４〜５週間後にワクチンを開始した。切除の３〜４週間後に、対照及び治療患者の両方に、標準的なリコール抗原（ｒｅｃａｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）及び段階的用量の各自の自己腫瘍細胞によって皮膚テストした。使用したリコール抗原は、おたふくかぜ皮膚テスト抗原，ＵＳＰ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ；Ａｐｌｉｓｏｌ，ＰＰＤ，（ツベルクリン精製タンパク質誘導体），Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ，１：３０に希釈したもの，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ，１：１００に希釈したもの，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋであり、それぞれ０．１ｍｌを前腕に皮内注射し、２４及び４８時間後に紅斑及び硬結を調査した。
【００３０】
治療プロトコルに対して選択された患者に１週間の間隔で３回の皮内ワクチン注射を行なったが、最初の２回のワクチンは１０７の放射線照射自己腫瘍細胞及び１０７のＢＣＧを含み、最後のワクチンは１０７の腫瘍細胞のみを含んだ。Ｄｒ．Ｒａｙ  Ｃｒｉｓｐｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓによって提供された新鮮な凍結ＴｉｃｅＢＣＧは−７０℃で保管してあった。第１回ワクチンは、鼠径部から約１０ｃｍ下方の左前側大腿部に、第２回ワクチンは右大腿部の同様の位置に、そして第３回ワクチンは右三角筋領域に接種した。
【００３１】
Ｆ．ワクチン調製
好結果を与えるワクチンの基準を表１に列挙する。第１回及び第２回ワクチン接種の当日に、バイアルを３７℃の水浴中で迅速に溶かし、腫瘍細胞をＨＢＳＳ中にゆっくり希釈し１５ｍｌとし、１２００ｒｐｍで遠心することにより１回洗浄し、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ１５ｍｌとした。トリパンブルー排除試験を使用して細胞をカウントし、生存率を決定した。生存率は７０〜９０％の範囲であり、平均で８０％であった。１２００ｒｐｍで遠心することにより細胞を１回洗浄し、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ１５ｍｌとした。腫瘍細胞の懸濁液を氷上に置き、４０２０ｒａｄ／分で合計２０，０００ｒａｄまで照射した。細胞懸濁液の容積を、１０７個の生存腫瘍細胞が試験管内に残るように調整した（試験管及びシリンジ内での細胞損失及びリンパ球の約２０％の誤認の可能性を許容するために１．３×１０７個の生存細胞を含ませた）。細胞を遠心し、上清を除去し、１０７個のＢＣＧを容積０．１ｍｌで加えた。終容積０．２ｍｌとするのに十分な量のＨＢＳＳを加えた。第３回ワクチンも同様に調製したが、但しＢＣＧは除外した。
【００３２】
ワクチン懸濁液を２０ゲージニードルによって１．０ｍｌツベルクリンシリンジ内に吸引した。皮下注射のために、２０ゲージニードルを２７ゲージニードルと置き換え、病院に輸送するためにシリンジを氷冷した。
【００３３】
各ワクチンの後、注射部位における紅斑及び硬結、発熱、リンパ節障害または他の有害反応について患者を精査した。最初の２回のワクチン部位は２〜３週間後に潰瘍化したが、１０〜１２週間以内に必ず治癒した。
【００３４】
実施例ＩＩ：ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞の製造
Ａ．患者由来の感作Ｂ細胞の取出し及び処理
第１回免疫の１週間後の第２回免疫時と、第２回免疫の１週間後の第３回免疫時とに、患者から採決した。終濃度１７単位／ｍｌの保存剤非含有のヘパリン（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下に、静脈血を無菌状態で採取した。血液を室温に維持し、採取後数時間以内に実験室に迅速に運んだ。
【００３５】
カルシウム及びマンガン非含有のＨＢＳＳを用いて１：２に希釈した血液を、３ｍｌのリンパ球分離媒質（ＬＳＭ，Ｌｉｔｔｏｎ  Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）上に層状に重ね（４ｍｌ）、１５ｍｌ遠心管において４００×ｇで３０分間遠心した。界面にある細胞を取り出し、その３倍量のＨＢＳＳで希釈し、ペレット化した（１０００ｒｐｍで１０分間）。末梢血リンパ球を１０ｍｌの血清非含有ヘペス緩衝ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中に再懸濁させ、カウントし、生存率を決定した。
【００３６】
Ｂ．ＥＢＶ形質転換方法
免疫患者由来の末梢血Ｂ細胞を形質転換剤に意図的に暴露すると、モノクローナル抗体を産生する連続増殖細胞系を生じる結果となった。本発明者らはＥＢＶを形質転換物質として使用したが、連続培養において増殖し且つ腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するようにＢ細胞を形質転換し得る任意の有効なリンパ趨向性ウイルスまたは他の形質転換物質を使用し得る。
【００３７】
本発明者らの方法によれば、ＬＳＭ勾配においてヘパリン化血液を分離し、単核細胞フラクションを界面において回収した。単核細胞フラクションはこの時点で使用することもできるし、あとで形質転換するために凍結保存することもできる。
【００３８】
新鮮なまたは凍結保存されていた、分画化されていないまたは非Ｂ細胞の一部が取り除かれたリンパ球をカウントし、２〜６×１０６個の細胞をペレット化した。ペレット化した細胞を、４〜６日たったＢ９５−８細胞培養液から回収した未希釈のＢ９５−８上清液を２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心することにより清澄化し、次いで全ての細胞を確実に除去するために０．８ミクロンフィルターで濾過した形態の、新たに回収したエプスタイン−バールウイルス５ｍｌ中に懸濁させた。Ｂ９５−８細胞系はＤｒ．Ｇ．Ｔｏｓｔａｄｏ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ＦＤＡから入手した。細胞及びＥＢＶを、ウイルス吸着のために３７℃で９０分間インキュベートした。ウイルス吸着の間、細胞を定期的に振盪した。
【００３９】
細胞を、放射線照射支持細胞（例えばＪ７７４）を含むウェル内に塗り広げた。マウスマクロファージ系Ｊ７７４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）は放射線照射（２０，０００ｒａｄ）してから凍結保存されていた。このため、Ｂ細胞系をＥＢＶで形質転換する前日に、支持細胞を溶かし、次いで９６ウェルプレート内に塗り広げた（５×１０３細胞／ウェル）。
【００４０】
６〜８週間の間、細胞培地を１週間に２回変えた。米国特許第４，８２８，９１１号に記載のモノクローナル抗体産生細胞の選択及び培養の方法に従って、著しい細胞増殖を示すウェルから得た上清液をスクリーニングしてヒト免疫グロブリンを合成するものを選択し、選択した細胞系を培養した。
【００４１】
ヒト免疫グロブリンを産生するとして選択した細胞を培養し、ヒト腫瘍異種組織片に対してスクリーニングすることにより腫瘍反応性について選択した。８８ＢＶ５９を、ヌードマウス由来のヒト結腸癌異種組織片の４つの凍結セクションからなるブロックに対してスクリーニングした。ヒト免疫グロブリンの存在を避けるため、異種組織片セクション及び抗体の直接標識を使用した。
【００４２】
Ｃ．モノクローナル抗体の製造
ヒトモノクローナル抗体産生細胞を、１０％ウシ胎児血清、３ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で増殖させた。幾つかのケースでは培地に更に２５％Ｄ−グルコース（終濃度０．２５％）を補充した。細胞を、空気中に７．５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気下で３７℃（３５〜３８℃）に維持した。細胞を含まない培地をペレット化する（例えば５００ｒｐｍで１５分間遠心する）ことにより、高度に代謝が行われて使用された培地から抗体を回収した。
【００４３】
実施例ＩＩＩ：正常組織及び腫瘍組織に対するモノクローナル抗体の反応性
ほとんどの抗体は、正常結腸粘膜への結合性は実質的に低下していた。パラフィンセクションに反応性を示す抗体を更に正常組織との反応性についてテストした。８８ＢＶ５９は以下の正常ヒト組織に対して陰性反応性を示した：卵巣、子宮、精巣、腟、副腎、前立腺、甲状腺、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、心筋、大脳皮質細胞、皮膚、筋肉及び造血細胞。８８ＢＶ５９は以下の組織に対しては若干の反応性を示した：結腸（刷子縁及び表在の腺）、小腸（刷子縁及び表在の腺）、胃（胃小窩及び表在腺）、食道（腺）、膵（管及び外分泌腺上皮の一部）、腎（細管（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｅｓ）の５０％）、頚部（上皮裏側（２／３の組織が陽性であった））、乳（腺房及び管上皮）、肺（肺胞及び気管支細胞）、脳（星状細胞（２／３の組織が陽性であった））、脊髄（神経線維網）、皮膚（真皮内腺の５０％）、及び肝（胆管）。ヒト腫瘍細胞系に対する８８ＢＶ５９の反応性を表２に示す。表３は、腫瘍組織標本に対する８８ＢＶ５９の反応性を示す。
【００４４】
癌のｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び免疫療法のために腫瘍細胞表面抗原に反応性を示すモノクローナル抗体を提供することに加え、本発明は、ヒト癌免疫に関係する抗原を単離及び特性分析するためのプローブとして有効なモノクローナル抗体を提供する。かかる抗原は、最終的には腫瘍ワクチンとして有効となるであろう。更に、抗体産生二倍体細胞の生成は、腫瘍細胞表面抗原に反応性を示すヒトモノクローナル抗体の製造に、多大な遺伝学的安定性を与える。
【００４５】
以上、所定の腫瘍に特異的な新規のモノクローナル抗体の形成、モノクローナル抗体産生細胞系及びそれらの製造方法を記述した。本明細書に記載の技術の多数の変形及び変更が当業者には可能であり、このような変形及び変更も本発明の範囲内であることが理解される。
【００４６】
本発明は特に、１９９０年１２月１３日付けでｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，ＵＳＡに寄託されているＩｇＧ３κヒトモノクローナル抗体８８ＢＶ５９を産生する細胞系に係わる。８８ＢＶ５９は、１９８５年１月３１日出願のＵＳＳＮ  ６９７，０７８号の分割出願である１９８７年４月１５日出願の米国特許出願第０３８，８１１号に基づき特許された米国特許第４，９９７，７６２号に教示されている二倍体細胞系ＬｉＣｏ１６−８８によって産生されるヒトＩｇＭ１６−８８に反応性を示す抗原を使用して同定された。寄託されている細胞系は、
識別名    ヒトＢ細胞誘導細胞系ＣＯ８８ＢＶ５９−１
受託番号  ＣＲＬ  １０６２４
で同定される。
【００４７】
実施例ＩＶ：８８ＢＶ５９のクローニング及び配列決定
８８ＢＶ５９（二倍体）由来の全ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１６２：１５６−１５９，１９８７〕によって調製した。簡単に説明すると、細胞をペレット化し、４モルのグアニジンイソシアネート、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．５％サルコシル及び０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール中で内破させ、０．０２Ｍ  酢酸ナトリウムｐＨ４．０、１倍量のフェノール及び０．２倍量のクロロホルムを加えた後にＲＮＡを抽出した。試料を１０，０００×Ｇ、４℃で２０分間遠心し、水性相を新しい試験管に移し、１倍量のイソプロパノールを用いて−２０℃で１時間再沈澱させた。グアニジンイソシアネートベースの溶液中に再懸濁させ、イソプロパノールを用いて再沈澱させた後、細胞ペレットを７５％エタノールで洗浄し、０．５％ＳＤＳ中に再懸濁させた。標準方法に従ってポリ（＋）ｍＲＮＡを選択するため、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー〔Ａｖｉｖ  ａｎｄ  Ｌｅｄｅｒ  ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．６９：１４０８−１４１２，１９７２〕を行った。
【００４８】
Ａ．ｃＤＮＡ合成
１．２μｇの８８ＢＶ５９ポリＡ（＋）を、１μｇのＰｒｏｍｅｇａ  ＮｏｔＩオリゴｄＴプライマーアダプター（５’ＣＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）１５３’）と、７０℃で加熱し、次いで氷上で急冷することにより連結した。（５００μＭ）ｆのｄＮＴＰと２００単位のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＴＭとを加え、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．３，７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ  ｄＴＴ中で３７℃で６０分間インキュベートした。１９ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ６．９、９０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２５μＭ  β−Ｎａｄ及び５０ｍＭ硫酸アンモニウム中で、１８７μＭのｄＮＴＰ、４０単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ、１５単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ及び１．４単位のＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅ  Ｈを加えることにより第２鎖を合成した。１６℃で２時間インキュベートした後、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて反応を停止させ、フェノール抽出及びエタノール沈澱によってｃＤＮＡを精製した。０．３倍量の第２鎖ｃＤＮＡ合成緩衝液中の２２５μＭ  ｄＮＴＰの存在下に１０単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加えることにより、二重鎖ｃＤＮＡの５’末端を切り揃えた（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）。３７℃で１０分間インキュベートした後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳを用いて反応を停止させ、フェノール抽出し、エタノール沈澱させた。末端を切り揃えて得られたブラント末端二重鎖ｃＤＮＡをＨ２Ｏ中に再懸濁させ、更に使用した。
【００４９】
ＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂａｃｌｏｎｅＴＭＥｃｏＲＩリンカー連結系Ｉを使用して、二重鎖ｃＤＮＡ中の全ての中間ＥｃｏＲＩ部位をメチル化し、次いでＥｃｏＲＩ部位をブラント末端化した二重鎖ｃＤＮＡ末端に付加した。ｃＤＮＡに１０単位のＥｃｏＲＩメチラーゼと（１００μＭ）ｆＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で加え、３７℃で１５分間インキュベートした。７０℃で１０分間熱失活化し、フェノール抽出した後に、メチル化ｃＤＮＡをエタノール沈澱させた。半分のメチル化ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカーを、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ中で加え、１５℃で一晩インキュベートすることにより、２５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼの触媒作用によって５０倍のモル過剰で存在するＥｃｏＲＩリンカーがｃＤＮＡ末端に付加された。７０℃で１０分間連結反応を熱失活してから、ｃＤＮＡを、各々２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて３７℃で２時間消化した。ＥＤＴＡ及びＳＤＳをそれぞれ（２０ｍＭ）ｆ及び（０．２％）ｆまで加え、フェノール抽出した後、水性相をＳｅｐｈａｒａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−４００スピンカラムに通して過剰なリンカー及び極小のｃＤＮＡを除去した。（２Ｍ）ｆ酢酸アンモニウム及び２容積のエタノールを加えて、ｃＤＮＡを沈澱させ、１０μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁させた。
【００５０】
Ｂ．ライブラリー構築
５μｌの８８ＢＶ５９  ｃＤＮＡを、１μｇのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製λｇｔ１１  Ｎｏｔ１−ＥｃｏＲＩアームに連結し、得られたＤＮＡを、製造業者指示に従ってＧｉｇａｐａｋ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してファージ粒子中にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入した。ファージに導入したＤＮＡを１５０ｍｍ寒天プレート上に、１プレート当たり約５０，０００の密度で塗り広げた。
【００５１】
ヒトＩｇＧ３Ｈ鎖一定域特異的プローブを、未結合８８ＢＶ５９  ｃＤＮＡから直接誘導した。３’方向に伸びるＩｇＧ３Ｈ鎖のＣＨ１領域のアミノ酸１１５〜１２１、即ち５’ＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ３’と相補的なオリゴヌクレオチド、及び５’方向に伸びるアミノ酸２２２〜２１７、即ち５’ＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴ３’と相補的な別のオリゴヌクレオチドをＭｉｌｌｉｇｅｎ合成装置において合成し、製造業者仕様に従って精製した。１００ｐＭのオリゴヌクレオチドを標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）に使用した。このＰＣＲにおいては、ＣｅｔｕｓのＡｍｐｌｉ−ＴａｑＴＭポリメラーゼを使用し、１μｌの８８ＢＶ５９  ｃＤＮＡを９４℃で１分間変性し、５２℃で１分間アニーリングし、７２℃で１分間伸長させた。ＰＣＲによって２９１塩基対のヒトＩｇＧ３  ＣＨ１特異的フラグメントが生成された。フラグメントを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍのランダムプライミングキット〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ〕を用いて製造業者プロトコルに従って３２Ｐ放射性標識し、３２Ｐ標識ＩｇＧ３フラグメントを用いて５００，０００個のファージをスクリーニングした。６倍量のＳＳＣ、１倍量のＤｅｎｈａｒｄｔｓ試薬、０．０１％ＳＤＳ及び５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でプラークハイブリダイゼーションを６５℃で１８時間実施した。６１℃の０．１倍量ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で最終洗浄した。
【００５２】
ヒトＣκ遺伝子中の１０９〜１１４位、即ち５’ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴ３’と相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて５’末端を標識し、これを使用して１５０，０００個のプラークをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションはＨ鎖と同一としたが、但し４２℃で１６〜１８時間実施した。Ｌ鎖プローブの最終洗浄は、４２℃の１倍量のＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で行なった。
【００５３】
オートラジオグラフィー後に両ライブライーから陽性クローンを同定し、プラーク精製を３回行って（Ｌ鎖においては）７つまたは（Ｈ鎖においては）８つのプラークを単離した。４２℃でアニーリングしたＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのλｇｔ１１の順方向及び逆方向プライマーを使用するＰＣＲ増幅を、各λクローンの１ｍｌ溶解物のアリコートを使用して実施した。挿入物サイズはアガロースゲル電気泳動によって決定した。
【００５４】
ｃ．ファージＤＮＡのサブクローニング
各々が全長ＩｇＧ３またはκＬ鎖に推定されるサイズの挿入物を含む独立ファージを、４０ｍｌ培養液中で、１個のファージに対して１００個の細胞の感染多重度で、３７℃で６時間増殖させた。砕片を除去した後、上清を１μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを用いて３７℃で２時間消化し、５％ポリエチレングリコール及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを用いて４℃で２時間、ファージを沈澱させた。ファージをペレット化し、クロロホルム抽出して過剰なポリエチレングルコールを除去した後、ファージＤＮＡを同量のフェノールを用いて２回抽出し、次いでクロロホルムで１回抽出した。２倍量のエタノールを加えることでλＤＮＡを容易に巻き付け、運搬し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４  １ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解した。λＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ（各々２０〜４０単位）を用いて３７℃で２時間切断した。Ｉｇ  ｃＤＮＡ挿入物を、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥのプロトコルに従って０．７％低温溶融アガロースゲルで精製した。ｐＧＥＭ１１ｆＺ（−）（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて二重に切断し、酵素を熱失活させた後に、５’末端のリン酸をウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で０．５単位のＣＩＡＰを３７℃で３０分間インキュベートすることにより除去した。エタノール沈澱後、ゲル精製した挿入物にベクターを室温で２〜３時間かけて連結し、連結物をＭａｎｉａｔｉｓらに従ってコンピテントＴＧ−１細胞（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に形質転換した。免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖挿入物を含むクローンを、小規模プラスミド増殖し、Ｍａｎｉａｔｉｓらに記載されているようにＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて切断してアガロースゲル上で展開したプラスミドＤＮＡを分析することにより同定した。
【００５５】
Ｄ．ファージＤＮＡのＰＣＲ誘導サブクローニング
４２℃でアニーリングしたλｇｔ１１順方向及び逆方向プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用する独立ファージ挿入物のＰＣＲ増幅によって、推定サイズの全長免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖ｃＤＮＡを含むファージを得た。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、精製し、ｐＧＥＭ１１ｆｚ（−）ＥｃｏＲＩ  ＮｏｔＩ切断ベクターに連結した。ＩｇＨまたはＬのいずれかの挿入物を含む形質転換体由来のＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓらに従って調製し、製造業者指示に従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いたジデオキシ法を使用して配列決定した。免疫グロブリン挿入物の５’末端に位置するＰｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴ７ポリメラーゼプロモーター特異的オリゴヌクレオチドを使用して、ＶＨ及びＶＬの両ｃＤＮＡの５’部分を配列決定した。ヒトＪＨのアミノ酸１１３〜１１０（即ち５’ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣ３’）と相補的なオリゴヌクレオチドを使用して更にＶＨ域を配列決定した。次いで、ＶＨ及びＶＬの両方のアミノ酸＋１〜＋６と相補的なオリゴヌクレオチドを別個に合成した。κＬ鎖をサブクローニングするＰＣＲにおいては、ＣＫ一定域のアミノ酸２１４〜２０９と相補的なオリゴヌクレオチドを、適当なＶＫアミノ酸１〜６に特異的なオリゴヌクレオチドと一緒にＰＣＲ反応に使用した。アミノ酸１〜２４１を含む変性Ｆａｂ’のＨ鎖フラグメントを、ＶＨのアミノ酸２４１〜２３６と相補的なオリゴヌクレオチド及びアミノ酸１〜６と相補的なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって誘導した。同様にＦａｂ構築においても、ＦｄＨ鎖フラグメントを、アミノ酸２２２〜２１６と相補的なオリゴヌクレオチド及び前述の５’ＶＨアミノ酸１〜６オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって誘導した。本発明者らの全てのアミノ酸番号はＫａｂａｔらの規約〔Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ，１９８７〕に従っている。ｔｈｅ  ＭＲＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＥｎｇｌａｎｄのＧｒｅｇ  Ｗｉｎｔｅｒ提供の細菌発現ベクターｐＳＷＶＨＰＯＬＹの変性型にサブクローニングするのを容易にするため、適当な制限酵素部位を各オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端に置いた。
【００５６】
Ｆａｓに対して２つ及びＦａｂ’に対して２つの個々のサブクローンを、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭを用いたジデオキシ法を使用して分析及び配列決定した。
【００５７】
ｐＳＷＶＨＰＯＬＹ中のＦａｂ’ｃＤＮＡは、ＰＣＲによって適当な制限部位を含むように変性された５’及び３’末端を有しており、ｐＳＷＶＨＰＯＬＹ  Ｆａｂ’ｃＤＮＡを使用し、このｃＤＮＡの全コーディング部分をｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に移入するＰＣＲを実施した。
【００５８】
ｐＥＴ系Ｆａｂにおいて全Ｌ鎖及びＦａｂ’Ｈ鎖の配列を決定し、ｐＳＷＶＨＰＯＬＹのＦａｂの全配列を２つの別個のサブクローンにおいて別々に決定した。これらのクローンを配列決定するのに使用した方法の概略説明を図１に示す。表４は、８８ＢＶ５９のＨ鎖及びＬ鎖の配列を有するのに使用したオリゴヌクレオチドの実際のヌクレオチド配列及び位置を示している。先導配列からアミノ酸２４２個にわたる全Ｈ鎖の配列を図２に示す。８８ＢＶ５９は、ＶＨＩＩＩと、Ｄ−Ｄ内組換え（ｉｎｔｒａ  Ｄ−Ｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）及び／または体細胞突然変異を伴なう遺伝子変換から生じ得るＤ領域とを使用する。これは、どんな生殖系列Ｄ域とも全く異なり、生殖系列ＪＨ３を使用する。
【００５９】
図３には、８８ＢＶ５９κＬ鎖の配列を、ＣＤＲの位置及び一定域エクソンの位置によって示してある。８８ＢＶ５９はＶＫＩ及びＪＫ５を使用する。ＮＨ２末端の最初の２２個の残基はアミノ酸配列決定によって確認した。
【００６０】
アミノ酸位置５９にあるシステインが８８ＢＶ５９ＶＨ内に存在することは特筆に値する。このシステインは、複数クローンのＰＣＲ誘導配列及び生物学的に増幅したサブクローンλファージの両方から確認された。他のヒト可変域Ｈ鎖でこの位置、即ちＫａｂａｔ位置５９にシステインを有するものはない。しかしながら、他の希少な免疫グロブリン、即ち約１％以下の免疫グログリンは、アミノ酸またはＤＮＡ配列決定によって決定されたところでは、ＣＤＲ内に位置するシステインを有する。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
【表２】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｈ鎖及びＬ鎖を配列決定するのに使用した方法を説明する図である。
【図２】８８ＢＶ５９−１Ｈ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図３】８８ＢＶ５９−１Ｈ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図４】８８ＢＶ５９−１κＬ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図５】８８ＢＶ５９−１κＬ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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