(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性耐性、アルミニウム耐性およびマンガン耐性を有し、アンモニアを産生するとともに、アルミニウムイオン又はマンガンイオンを取り込み、あるいはアルミニウムイオン又はマンガンイオンを吸着する菌体外蛋白質を産生する新規微生物であって、コリネバクテリウム  ｓｐ．ＳＳ−６９９４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６１４９）である新規微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グラム陽性菌でアンモニアを産生するコリネバクテリウム属の新規微生物に係り、特に酸、アルミニウムおよびマンガンに強い耐性を有するため、強酸性土壌や強酸性河川での生育が可能であり、しかもその生育中にアルミニウムやマンガンを菌体内に取り込み、あるいはこの菌が産生する菌体外蛋白質に吸着させることにより、植物の生育障害となるアルミニウム等を土壌または河川から取り除く働きを有する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌や河川の酸性化は、植物や微生物の生育を阻害することが知られており、大きな問題となっている。これは、多雨による塩基の流出あるいは酸性物質の蓄積の結果生じる変化であり、たとえば大気汚染や火山活動によって拡散される窒素酸化物や硫黄酸化物が溶け込んだいわゆる酸性雨が土壌や河川を汚染することによるものである。土壌が酸性化しｐＨが５以下になると、土壌中のアルミニウムやマンガンがイオン化する。特に、酸性雨や火山活動により排出された硫酸により酸性化した土壌中には、水素イオンと共にアルミニウムイオンが溶出しており、この活性化したアルミニウムイオンが植物や微生物の生育を阻害する。また、土壌が酸性化すると、イオン化し可溶化したアルミニウムイオンがリン酸と結合してリン酸が不溶化したり、カルシウム、マグネシウム、マンガン等の流亡溶脱が生じるため、このような酸性土壌での植物の生育は極めて困難となる。
【０００３】
上記の酸性土壌の問題を解決するために、一般には石灰肥料が用いられいる。この石灰肥料は石灰を主成分とするものであり、水に溶けてアルカリ性となるため、土壌の酸性化を防止したり、酸性土壌を中性化することができる。
【０００４】
一方、特開平７−２１３２７９号公報には、強酸性かつ多量のアルミニウムを含有する土壌中で生育可能な微生物Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＴ−３９９１株を土壌中で生育させ、この微生物の働きにより、土壌を改良する方法が開示されている。この菌は、アルミニウムを添加しない場合はｐＨ３．０でも生育がみられ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の標準株との比較では、明らかに強い酸性耐性を有することが認められる。また、この菌はアルミニウム耐性を有し、アルミニウム濃度１００ｐｐｍで生育が盛んである。そして、生育中にアンモニアを産生して土壌のｐＨを上昇させると共に、ポリマーを産生しこの物質に土壌中のアルミニウムを吸収・吸着させて土壌を改良することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来の技術では次のような問題点がある。
石灰肥料を用いる方法では、土壌中に新たに合成化合物を添加することになり、自然環境の保全の観点からは、必ずしも好ましい方法と言えない。またこの方法は、主にわが国や諸外国の農耕地で用いられているが、その他の広大な自然生態系においては有効な方法ではない。
【０００６】
また、耐酸性菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＴ−３９９１  株を用いる方法では次のような問題がある。
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＴ−３９９１  株の酸性耐性はアルミニウムを添加しない場合でｐＨ３．０を限度としており、これよりも強い酸性領域での生育はみられない。したがってこの菌は、ｐＨ３．０以上の強酸性領域では酸性土壌や酸性河川を改良する効果を発揮することができない。
また、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＴ−３９９１  株はアルミニウム耐性を有し、アルミニウム２０００ｐｐｍでも生育がみられるが、アルミニウムを添加した場合の酸性耐性はｐＨ３．５を限界とし、これよりも強い酸性領域では生育がみられない。そのため、高濃度のアルミニウムを含む土壌中では、この菌の効果はさらに制限される。
【０００７】
本発明は、上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は強酸性でかつ高濃度のアルミニウム又はマンガンを含有する土壌もしくは河川で生育可能であり、アルミニウムイオンやマンガンイオンを吸収、吸着あるいは水酸化物として不溶化する特性を有する新規微生物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、本発明は、酸性耐性、アルミニウム耐性およびマンガン耐性を有し、アンモニアを産生するとともに、アルミニウムイオン又はマンガンイオンを取り込みあるいはアルミニウムイオン又はマンガンイオンを吸着する菌体外蛋白質を産生するコリネバクテリウム属の新規微生物を提供するものである。
【０００９】
そして、秋田県玉川温泉付近の玉川で採取した河川水から分離された上記コリネバクテリウム属の新規微生物をコリネバクテリウム  ｓｐ．ＳＳ−６９９４と命名する。この菌株は、工業技術院生命工学研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１６１４９である。
【００１０】
この菌は、次のような方法により単離されたものである。
一般土壌１００ｇを減菌し、純水１リットルを加えて３０分間振盪し、０．４５μｍのフィルターで濾過して土壌溶液を得る。この土壌溶液にＮａＣｌを１％、ペプトンを０．０５％、イーストエキストラクトを０．０２５％添加し、液体培地（以下Ｓ−ＬＢ培地という）とする。このＳ−ＬＢ培地に１００ｐｐｍのアルミニウムを加えるとともに、ｐＨを３．３に調整する。この液体培地を試験管に１０ミリリットルずつ入れ、これに採取された河川水を１ミリリットルずつ注入し、２５℃の環境下で９６時間、１００ｒｐｍの振盪培養を行なう。９６時間培養後、菌の生育により培地の白濁が生じたサンプルから１ミリリットルを採取し、Ｓ−ＬＢ寒天培地に入れて菌を培養する。このＳ−ＬＢ寒天培地は、１００ｐｐｍのアルミニウムが添加され、ｐＨが３．８に調整されたものである。これらのＳ−ＬＢ寒天培地上で生育したコロニーを採取し、同じ条件で培養を繰り返し、単一菌を分離したものである。
【００１１】
上記のようにして単離されたコリネバクテリウム  ｓｐ．ＳＳ−６９９４の細菌学的性質は、次に示すとおりである。
【００１２】
Ａ．形態
（１）  形状                ：        桿菌
（２）  芽胞                ：        （＋）
（３）  大きさ（μｍ）      ：幅１．５  〜３．０  、長さ２．５  〜４．０
Ｂ．培地における生育状態
（１）  生育温度範囲（至適発育温度範囲）：２０〜３０  Ｃ
【００１３】
Ｃ．生理的性質
（１）  グラム反応          ：        陽性
（２）  運動性              ：        （−）
（３）  好気性状態での発育  ：        （＋）
（４）  カタラーゼ反応      ：        （＋）
（５）  オキシダーゼ反応    ：        （−）
（６）  蛍光色素産生        ：        （−）
（７）  ＯＦ培地            ：        酸化的
（８）  ４１℃での生育      ：        （＋）
（９）  ４  ℃での生育      ：        （−）
（１０）ＧＣ含量（ｍｏｌ％）    ：          ６２．４
（１１）インドール産生      ：        （−）
（１２）硝酸塩産生          ：        （−）
（１３）ゼラチンの加水分解  ：        （＋）
（１４）ＯＮＰＧ            ：        （＋）
（１５）Ｈ２  Ｓ産生          ：        （−）
（１６）エスクリン加水分解  ：        （＋）
（１７）アルギニンジヒドロラーゼ：    （−）
（１８）ウレアーゼ産生      ：        （−）
【００１４】
（１９）炭素源からの酸生成
キシロース      ：        （＋）
グルコース      ：        （＋）
マンノース      ：        （＋）
アラビノース    ：        （＋）
フラクトース    ：        （＋）
サッカロース    ：        （＋）
トレハロース    ：        （＋）
メレテトース    ：        （＋）
ラフィノース    ：        （＋）
トラノース      ：        （＋）
フコース        ：        （＋）
エスクリン      ：        （＋）
５−シトーグルコネート：  （＋）
ガラクトース    ：        （＋）
【００１５】
（２０）炭素源の使用
キシロース      ：        （−）
マンノース      ：        （−）
グルコース      ：        （−）
アラビノース    ：        （−）
フラクトース    ：        （−）
マルトース      ：        （−）
ラムノース      ：        （−）
マンニット      ：        （−）
白糖            ：        （−）
【００１６】
以上の諸性質をバージェイのマニュアル  オブ  ディターミナティブ  バクテリオロジー  第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ    Ｍａｎｕａｌ    ｏｆ    ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ    ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，    ８  ｔｈ    ｅｄｉｔｉｏｎ  ）に基づいて検索したところ、本菌はコリネバクテリウム属の細菌であることが確認された。しかし、コリネバクテリウム属の公知の菌とは、アルミニウム耐性、マンガン耐性等に差異があり、新規な菌株と考えられる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る新規微生物の性質を試験の結果に基づいて説明する。
（１）アルミニウムの存在する環境下における培養
培養温度はアルミニウムの量、培地の組成、ｐＨその他の条件によって異なるが、たとえば１０〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃に設定することができる。また、ｐＨは２．５程度以上に設定する。培養は好気的条件が適しており、このためにたとえば振盪培養法、通気攪拌法などが利用できる。培地に添加する無機塩としては硫酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩等を用いることができ、その他必要に応じて微量金属塩が培地に添加する。窒素源は、使用菌が資化し得るものであればよく、たとえばペプトン、イーストエキストラクト、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム並びに各種アミノ酸を用いることができ、これらの窒素源のうち一種類または二種類以上を組み合わせて用いる。さらに、使用菌の成長を促進するための栄養源としてビタミン、酵母エキス、麦芽エキスなどを適量添加してもよい。
【００１８】
（２）アルミニウム耐性およびマンガン耐性
アルミニウム耐性およびマンガン耐性については、次のような試験を行なうことによって評価した。
培養フラスコにＳ−ＬＢ液体培地を入れ、１Ｎの塩酸および１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ２．２から４．０までに調整し、滅菌した後アルミニウムイオンを０、１００、５００、１，０００および２，０００ｐｐｍの各濃度となるように添加して最終量を１００ｍｌとした。また、上記のアルミニウムイオンの代わりにマンガンイオンを０、１００、５０、１，０００および２，０００ｐｐｍの各濃度となるように添加した培地も併せて調整した。
【００１９】
一方、分離した菌ＳＳ−６９９４は、１００ｐｐｍのアルミニウムイオンを添加し、ｐＨ４．０に調整したＳ−ＬＢ液体培地を用い、２５℃の環境下、１００ｒｐｍで振盪しながら４８時間の前培養を行った。そして、この培養液を各耐性試験用に調整した上記Ｓ−ＬＢ液体培地に１ミリリットルずつ加え、３０℃で７２時間培養した。培養終了後、これらの培養液を２００倍に希釈し、濁度計（７６０ｎｍ）を用いて培養液の濁度を測定した。判定は、２００倍希釈液の濁度が０．５以上のものを耐性を有するものとした。
なお、本試験では、従来から知られている菌との比較を行なうために、特開平７−２１３２７９号公報で開示されているフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＴ−３９９１およびフラボバクテリウム標準菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ    ａｑｕａｔｉｌｅ    ＩＦＯ−１５０５２）についても同じ方法で耐性試験を行なった。
【００２０】
この試験の結果は、表１に示すとおりである。
【表１】
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【００２１】
この表に示されるように、本発明に係る耐性菌であるＳＳ−６９９４は、高濃度のアルミニウムイオンを含む強酸性培地中で生育する。これに対しフラボバクテリウム標準菌ＩＦＯ−１５０５２は、この実験の条件ではまったく生育せず、また酸およびアルミニウム耐性菌であるＳＴ−３９９１は、ｐＨ３．０でアルミニウムイオン１００ｐｐｍを添加した培地で生育が認められたが、それ以外の条件では生育がみられなかった。
したがって、本発明に係る分離菌ＳＳ−６９９４は、強酸性および高濃度のアルミニウムに耐性を有し、その耐性は既知の酸およびアルミニウム耐性菌と比較しても優れていることが確認された。
【００２２】
さらに、分離した菌の高濃度のアルミニウム又はマンガンを含む強酸性培地中での生育範囲を詳しく検討すると、表２および表３に示すとおりとなる。
【表２】
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【００２３】
【表３】
0003554842.tif 000004
【００２４】
表２に示されるように、ｐＨ２．４以上のすべてのアルミニウムイオン濃度（０、１００、５００、１，０００および２，０００ｐｐｍ）で生育が認められた。また、マンガンイオンを添加した場合もアルミニウムイオンを添加した結果と同様で、表３に示すようにｐＨ２．４以上のすべてのマンガンイオン濃度（０、１００、５００、１，０００および２，０００ｐｐｍ）で生育が認められた。
したがって、本発明に係る分離菌ＳＳ−６９９４は強酸性、高濃度のアルミニウムおよびマンガンに耐性を有し、強酸性と高濃度のアルミニウムイオンあるいはマンガンイオンとを組み合わせた条件下でも強い耐性を有することが確認された。
【００２５】
（３）アルミニウムイオンの吸着およびアンモニアの産生
アルミニウムイオンの吸着量およびアンモニアの産生量についての試験は次のような方法により行なった。
２００ミリリットルの培養フラスコにＳ−ＬＢ液体培地を１００ミリリットル入れ、１Ｎの塩酸および１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ３．３に調整し、滅菌した後アルミニウムイオンを各々１００ｐｐｍ、３００ｐｐｍとなるように添加した。この培地のｐＨを設定するに当たっては、ｐＨ３．８から４．０付近では培地中に水酸化アルミニウムが生成され培地が白濁するため、このような影響がなく、分離した耐性菌が良好に生育できるｐＨ３．３を選択した。
【００２６】
この試験においても分離した耐性菌は、前記のアルミニウム耐性試験およびマンガン耐性試験と同様の条件で前培養を行う。そして、この培養液０．１ミリリットルずつを上記の２種類の液体培地各１００ミリリットル中に添加し、２５℃、１００ｒｐｍで１０日間振盪培養した。培養期間中０、１、４、８および１０日目に培養液のｐＨを測定した後、培養液を８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、原子吸光光度計（バリアン製ＡＡ−２０００）で上澄み液のアルミニウム量を測定し、アルミニウム吸着量を算出した。また、このようにして遠心分離した培養液の上澄みに含まれるアンモニアの量をアニオン分析用カラム付きの高速液体クロマトグラフィーで測定した。
【００２７】
これらの結果は、表４に示すとおりであり、本発明に係る分離菌のアルミニウムイオン吸着量は、アルミニウムイオンの添加量が１００ｐｐｍの場合および３００ｐｐｍの場合に共通して培養日数の経過と共に増加し、これに伴って培養液のｐＨは上昇することが確認された。また、この分離菌の生育中にアンモニアが産生され、培地の酸性度が改善される。
【００２８】
【表４】
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【００２９】
（４）酸性土壌におけるアンモニアの産生
分離した耐性菌を実際に酸性土壌中で培養し、この菌の生育中に産生されるアンモニア量の変化と培地のｐＨとの関連を調べるために以下の実験を行った。
１００ミリリットルの培養フラスコにｐＨ３．３の乾燥酸性土壌５ｇを入れ、０．１ｇのペプトン、０．０５ｇのイーストエキストラクトおよび純水５ミリリットルを加え、１２１℃で１５分間滅菌し、培地を作成した。分離した耐性菌は、前記のアルミニウム耐性試験およびマンガン耐性試験と同様の条件で前培養を行った後、この培養液を０．００５まで希釈した。
この希釈培養液１ミリリットルを培地に加え、２５℃で静置培養し、培養０、１、２、３、４および５週間目に培地のｐＨおよびアンモニア量を測定した。
ｐＨの測定は培地に滅菌水２０ミリリットルを加え、懸濁させてから直接測定した。また、アンモニア量はｐＨ測定後、培地を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を試料としアニオン分析用カラム付き高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
【００３０】
この結果は、表５に示すとおりであり、本発明に係る分離菌を酸性土壌中で培養すると、培地中のアンモニアは培養１週間目にはかなり増加しており、培養３〜４週間目にはほぼピークに達した。培地のｐＨはこれと対応して上昇し、最終的にｐＨ５．０となってこの値が５週間の実験終了まで維持された。したがって、分離した耐性菌を強酸性土壌中で培養した場合、培養１週間目から土壌のｐＨ上昇効果があらわれ、この効果が持続することがわかった。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、本願発明に係る新規微生物は、アンモニア産生菌であり、強酸性、アルミニウムおよびマンガンに耐性を有するため強酸性の土壌や河川で生育してアンモニアを産生し、このアンモニアの作用により酸性土壌や酸性河川のｐＨを上昇させることができる。また、この新規微生物は、酸性土壌中に存在して植物の生育を障害するアルミニウムイオンを菌体内に取り込み、あるいはこの新規微生物が産生する菌体外蛋白質に吸着させることにより土壌から取り除き、土壌を改善することができる。