【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年10月20日(2017.10.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類により産生される、ルテインに富む組成物を調製する方法において、
１）前記微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製すること、
２）ルテインおよび脂質を含有するオレオレジンを最初のバイオマスから得るために、溶解した前記微細藻類のバイオマスを極性溶媒で処理すること、
３）ステップ２）で得られるオレオレジンを、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒を用いて抽出することにより、超臨界圧の無極性溶媒により同伴される画分として、主としてトリグリセリド類から成る無極性脂質に富む画分を得ること、および超臨界圧の無極性溶媒により同伴されなかったオレオレジンの画分として、ルテインに富む不溶性画分を得ること、ならびに、
４）このようなルテイン富化画分を回収すること、
を含み、
ステップ２）の極性溶媒が、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルおよびシクロヘキサノンからなる群から、単独でまたは組み合わせて、選択され、
ステップ３）において、超臨界圧で流体の形の無極性溶媒は、２５〜４０ＭＰａの圧力および４０〜７０℃の温度になることを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップ２）の極性溶媒が酢酸エチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
臨界圧で流体の形の前記無極性溶媒が二酸化炭素であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ１）で、前記細胞可溶化物が、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類のバイオマスを粉砕することにより得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ２）が実施される前に、ステップ１）で得られる前記細胞可溶化物が、重量基準で１５％超の乾燥物質含量まで濃縮される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ２）が、極性溶媒で、前記細胞可溶化物を抽出する少なくとも１つのステップ、および得られた有機相から前記極性溶媒を除去することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ１）で得られる前記細胞可溶化物が、重量基準で２０％〜３０％の範囲の乾燥物質含量まで濃縮される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
医薬組成物、栄養補助食品または食品を調製するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られるルテイン富化組成物の使用。
【請求項１０】
栄養補助食品、食品および医薬組成物から選択される、ルテインを含む組成物を調製する方法であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、微細藻類のバイオマスから、ルテイン富化画分を調製すること、および
ｂ）ステップａ）で得られるルテイン富化画分から、前記組成物を得ること、
を含む、方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
最新技術の提示
カロチノイド類は、非常に多数の生体に存在する、幾らかオレンジ色または黄色の色素である。それらは脂溶性であり、一般に生物によって容易にシミュレートされ得る。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
カロチノイド類はテルペノイド類の化学族に属し、脂肪族構造または脂環構造を有するイソプレン構造の重合から形成される。それらが脂質の代謝経路に似た代謝経路に従うことは、一般に認められている。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
カロチノイド類は抗酸化性を有し、癌および他のヒト疾患の予防のために研究されてきた。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
カロチノイド類は、食用の葉、花および果実に自然に存在し、花（たとえば、マリゴールド）、ベリーおよび根組織（たとえば、ニンジン）から容易に得られる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
カロチノイド類の代表例としては、α−カロチン、β−カロチンおよびリコピンなどがある。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
概して、遊離型のカロチノイド類は、アルファルファ、ホウレン草や縮緬キャベツ、緑葉および緑色植物性物質ｇｒｅｅｎ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｍａｔｔｅｒ）等の、緑色植物の葉緑体にも存在する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
遊離型のカロチノイド類は、食品でまたは栄養補助食品として消費されるとき、より良く吸収される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
最も一般的なルテインエキス源は、正確にはキンセンカであって、それは既知の最高レベルのルテインの１つを含み、かつ他のカロチノイドは低濃度だけ含有するという利点を有する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
したがって、このカロチノイドの代替源として微細藻類を使用することに対する関心が高まっている。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
このように、米国特許第６１０６７２０号明細書には、たとえば、カロチノイドを、藻類から、ニンジンジュースからまたはトマトの皮から抽出する方法が記述されており、前記方法は、特に高圧および高温条件（４５０〜１２００ｂａｒおよび５０〜３００℃）のカラム内に、水で事前飽和した超臨界二酸化炭素流を含む。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
ステップ１）で、細胞可溶化物は、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）科の微細藻類のバイオマスを粉砕することにより得られる。ステップ２）を実施する前に、ステップ１）で得られる細胞可溶化物を、乾燥物質含量が重量基準で１５％超まで、好ましくは重量基準で２０％〜３０％の範囲まで、濃縮することができる。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
【図１】バイオマスの粉砕前（ダークグレイの図表）および粉砕後（ライトグレイの図表）の、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の総カロチノイド（カロチンおよびルテイン）のアッセイを示す。結果は、バイオマスの乾燥重量と比較して、ルテインまたはカロチンの質量百分率として表される。本方法のステップ２）を実施するために、様々な抽出溶媒をテストした。
【図２】様々な溶媒による細胞可溶化物の抽出により得られた、ルテイン（ライトグレイの図表）およびカロチン（ダークグレイの図表）の抽出結果を表す。左から右へ：酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサンおよびシクロヘキサノン。収率を、ルテインまたはカロチンの質量百分率として表す。
【図３】細胞可溶化物の乾燥物質が、ステップ２）で得られるカロチン（ダークグレイの図表）およびルテイン（ライトグレイの図表）抽出収率に及ぼす影響を図示する。左から右へ：乾燥物質２４％を含有する濃縮クロレラ細胞可溶化物（クロレラＤＭ：２４％）、乾燥物質１１％を含有する濃縮クロレラ細胞可溶化物（クロレラＤＭ：１１％）および未粉砕未溶解バイオマス（対照）。
【図４】出発バイオマス中（ライトグレイの図表）およびこれらのバイオマスから得たオレオレジン中（ダークグレイの図表）のルテイン含量（乾燥重量と比較した質量％）を表す。左から右へ：粉砕して遠心分離したクロレラバイオマス（乾燥物質（ＤＭ）２４％を含有する濃縮細胞可溶化物）、未遠心分離の、粉砕したクロレラバイオマス（乾燥物質１１％を含有する細胞可溶化物）、未溶解クロレラバイオマス（対照）。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
カロチノイドを含む、対象の分子を抽出するために、細胞粉砕ステップ（すなわち、細胞可溶化物を調製するステップ）は多くの場合不可欠である。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６８】
非変性条件下で対象の分子を抽出するために、多分、低温条件下、不活性雰囲気かつ暗所で、細胞粉砕を実施することが好ましい。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
したがって、本発明による方法の幾つかの実施形態では、ステップ１は、粉砕によって微細藻類のバイオマスから細胞可溶化物を調製することを含む。好ましくは、微細藻類のバイオマスは、その総重量に関して、重量基準で１０％〜１５％の範囲の乾燥物質含量を有する。別の好ましい実施形態では、低温条件下、暗所かつ不活性雰囲気で、粉砕ステップが実施される。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
以下で例示する通り、出願人企業は、再循環またはパスモードで、ビーズミルテクノロジーを使用することを推奨する。しかし、対象の分子抽出収率を高めるために、濃縮微細藻類のバイオマスを粉砕することが想定され、粉砕は溶媒相で実施することが可能である。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
粉砕の有効性を光学顕微鏡（倍率×４０）でモニターし、もはや完全な細胞が顕微鏡の視野に１つも見えないとき、溶解は完全である。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
以下で例示する通り、この粉砕ステップは、せいぜい総カロチノイドの１０％を損失するに過ぎない。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０２】
１つの特定の実施形態では、本発明による方法は、下記の特徴の１つまたは複数（１、２、３、４、５または６）を含む：
−  微細藻類はクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属のもの、より具体的にはクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）種のものであり、かつ／または
−  ステップ１）は、重量基準で１０％〜１５％の範囲、一般にほぼ１１％の乾燥物質含量を有する微細藻類のバイオマスから、粉砕によって細胞可溶化物を調製することを含み、かつ／または
−  ステップ１で得られる細胞可溶化物は、重量基準で１５％超、好ましくは２０％〜３０％の範囲の乾燥物質含量を有するために濃縮され、かつ／または
−  極性溶媒、好ましくは酢酸エチルで細胞可溶化物を抽出する少なくとも１つのステップ、およびオレオレジンを得るために得られた有機相から極性溶媒を除去することを含むステップ２）、および／または
−  ステップ２）で、細胞可溶化物中に最初に含まれていたルテインの重量と比較して、重量基準で少なくとも５０％のルテイン抽出収率が得られるまで抽出ステップが繰り返され、かつ／または
−  ステップ３）では、ステップ２）で得たオレオレジンが、超臨界圧、好ましくは圧力１０〜５０ＭＰａ、より好ましくは２５〜４０ＭＰａ、および温度３５〜９０℃、好ましくは４０℃〜７０℃のＣＯ２で抽出される。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１２】
＃ステップ２：細胞粉砕
このように培養してその後ステップ１の動作条件に従って濃縮した微細藻類のバイオマスを、次にはネッツ・ラブスタ（Ｎｅｔｚｓｃｈ  Ｌａｂｓｔａｒ）撹拌機ビーズミルシステムを使用して処理する。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
したがって、生成物は、Ｚｅｔａビーズタイプ（Ｎｅｔｚｓｃｈ）粒径６００μｍのセラミックビーズで８５％満たされた、０．５４リットル粉砕チャンバを繰り返し通過する。これらのビーズを周速１２ｍ／秒で撹拌し、これによって実質的に全ての微細藻類の細胞を２時間で粉砕することが可能になる。細胞が顕微鏡の視野に見えなくなるまで、粉砕の品質を顕微鏡観察でモニターする。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１５】
生成物の温度上昇を制限するために、粉砕チャンバは、低温条件の維持を可能にするジャケットを有する。ミル供給タンクはまた、ＪｕｌａｂｏタイプＦ３２低温槽によって供給される４℃の冷水の再循環により冷却される。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１６】
この細胞粉砕ステップ中に得た総カロチノイドのアッセイ結果を図１に示す。図１は、粉砕前後の、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の総カロチノイド（カロチンおよびルテイン）のアッセイを示す（乾燥重量と比較した、質量％）。細胞粉砕は、合理的な１０％ルテイン損失および２０％カロチン損失を生じる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１７】
＃ステップ３：溶媒による抽出
下記ステップ２で得られる粉砕した微細藻類材料を、次には様々な極性の溶媒、たとえば酢酸エチル、酢酸プロピルおよび酢酸ブチルを含む、エステル類、シクロヘキサノン等のケトン類およびヘキサン等の無極性溶媒等で希釈する。１：１（Ｖバイオマス／Ｖ溶媒）体積比で、各溶媒を単独でテストした。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１９】
１時間の接触後、混合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６４Ｒ遠心分離機で、２００００ｇにて１５分間遠心分離することにより分離する。単回抽出後に、テストした各溶媒の上澄にカロチノイドアッセイを実施した。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２１】
図２は、様々な溶媒の、総カロチノイド（ルテインおよびカロチン）抽出収率を示す：酢酸エチル（純度＞９９．５％）、酢酸プロピル（純度＞９９．５％）、ヘキサン（純度＞９５％）およびシクロヘキサン（純度＞９５％）。Ｙ−軸：抽出パーセンテージ。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２６】
＃ステップ４：粉砕した細胞材料の濃縮
ステップ２で得られる粉砕した細胞材料の一部を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｊ２０ＸＰローターＪＬＡで、６０００ｇにて３分間の遠心分離により濃縮する。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２７】
異なる３試料：
−  粉砕し、その後遠心分離で濃縮したバイオマス（乾燥物質２４％）、
−  粉砕し、濃縮していないバイオマス（乾燥物質１１％）、
−  粉砕せず、濃縮していない対照（乾燥物質１１％）、
で、オレオレジンの調製を実施した。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
＃ステップ５：オレオレジンの調製−完全消耗による酢酸エチルでの抽出
体積比１：１の粉砕バイオマスと酢酸エチル（最小純度９９．８％）を、化学製品に強い１リットルポリプロピレン製フラスコ内で混合する。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３２】
図３は、ステップ４で調製されたバイオマスの完全消耗により、抽出中に得られた３画分の、すなわち、粉砕バイオマス（乾燥物質含量（ＤＭ）２４％および１１％を有する）および非粉砕バイオマスの、酢酸エチルを使用したルテインおよびカロチン抽出収率を示す。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３３】
ＤＭ  ２４％を含有するバイオマスのサンプルでは、最良抽出収率は、ルテイン回収８０％およびカロチノイド回収９０％に達する。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３６】
未粉砕対照ではルテインおよびカロチンが全くないことは、対象の分子の回収に関して、細胞溶解が重要なことを示す。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３７】
＃ステップ６：オレオレジンの調製−総カロチノイドの濃縮
次いで、真空下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２１５タイプの、Ｂｕｃｈｉ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄロータリー・エバポレーターに接続された、２リットルの褐色丸底フラスコに、ステップ５で調製される様々な画分Ｆを移す。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
ＤＭ  ２４％を含有する濃縮した粉砕クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）材料からのオレオレジンの抽出により、ルテインの７倍濃縮が可能である。
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４４】
ステップ２：オレオレジンの取得
ルテイン３６８ｍｇを含む、総カロチノイド１２６０ｍｇを含有するバイオマス１０５０ｇと、酢酸エチル５００ｇの割合で、溶解したバイオマスと酢酸エチルとを、３リットルフラスコ内で、メカニカルスターラーで２時間撹拌しながら混合する。このようにして得た混合物を、遠心分離によりデカントする：上澄を回収し、ペレットを第２回抽出にかける。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４８】
このようにして得たオレオレジンの質量は１１．９５ｇであり、ルテイン３１０ｍｇを含む、総カロチノイド５５０ｍｇを含有する。