(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルが充填された複数のキャピラリーカラムが配列され、複数種類の蛍光物質により識別可能に標識された４種類の末端塩基の異なるＤＮＡフラグメントを含む複数の試料が１つずつ前記キャピラリーカラムに注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気泳動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、前記マルチキャピラリーアレイ泳動部でキャピラリーカラムが１列に配列された被検出部においてキャピラリーアレイの面に対し、その垂直方向から泳動方向と直交する１直線上に励起光を照射し、励起光により励起された試料からの蛍光を受光し、その蛍光の波長特性を検出する励起・受光光学系と、前記励起・受光光学系による検出結果に基づいて各キャピラリーカラムで検出された塩基を識別して塩基配列を決定するデータ処理装置と、そのデータ処理装置による識別結果を表示する表示装置とを備えたマルチキャピラリー電気泳動装置において、
前記マルチキャピラリーアレイ泳動部は、キャピラリーアレイの一端側が試料注入側となってキャピラリーカラム端が２次元的に配列されて下向きに固定され、そのキャピラリーカラム端の下方には、そのキャピラリーカラム端の配列と対応して試料が収容されたウエルが２次元的に配列されてウエル内に挿入された各キャピラリーカラム端に電圧が印加される試料容器、及び泳動用バッファ液が収容されて全キャピラリーカラムに電圧が印加される泳動用リザーバが配置されて試料容器と泳動用リザーバのいずれかが選択的にキャピラリーカラム端と接触させられ、キャピラリーアレイの他端側が電圧の印加される別のバッファ液に浸されて、キャピラリーアレイの両端間に泳動電圧が印加されるようになっており、
前記表示装置は前記試料容器のウエルの配列に対応した画面を有し、その画面の各ウエルの位置を検出された末端塩基に応じて４種類の色別で表示していくものであることを特徴とするマルチキャピラリー式塩基配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はサンガー反応を用い、プライマー又はターミネータを蛍光物質で標識したＤＮＡフラグメント（断片）試料を電気泳動させ、泳動途中でＤＮＡフラグメント試料からの蛍光を検出して塩基配列を決定するオンライン式の塩基配列決定装置に関し、特に、泳動ゲルを充填した複数のキャピラリーカラムを用いて複数の試料を同時に電気泳動させるマルチキャピラリー式塩基配列決定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
人ゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配列したマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサが提案されている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少なく高感度検出ができるのである。
【０００３】
サンガー法によって処理すれば、その末端がＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）からなる４種類のＤＮＡフラグメント試料が生成される。処理能力を上げるためには複数のキャピラリーカラムで同時に電気泳動させる必要があるが、その場合、末端塩基別の試料を異なるキャピラリーカラムで泳動させると、キャピラリーカラム間の泳動速度の差が塩基配列決定の誤差となる。そのため、各キャピラリーカラムには４種類の末端塩基のＤＮＡフラグメントを含んだ試料を注入し、複数のキャピラリーカラムで同時に泳動させなければならない。その際、末端塩基の異なる４種類のＤＮＡフラグメントを識別するために、２種類以上の蛍光物質で標識することが行なわれている。
【０００４】
末端塩基の異なるＤＮＡフラグメントを識別するための標識物質としてＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸの４種類の発蛍光団をそれぞれ異なるＤＮＡフラグメントに標識として用いる方法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４，  ６６，  １０２１−１０２６（以下、引用例１という）参照）や、ＦＡＭとＪＯＥの２種類を比率を異ならせて用いることによりコード化して４種類のＤＮＡフラグメントを識別する方法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９２，  ６４，  ２１４９−２１５４（以下、引用例２という）参照）が提案されている。いずれにしても、マルチキャピラリーＤＮＡシーケンサの処理能力を上げるためには、多色蛍光標識によって識別できるようにした末端塩基の異なる４種類のＤＮＡフラグメントを含む試料を各キャピラリーカラムに注入し、複数のキャピラリーカラムで複数の試料を同時に泳動させることが背景となっている。
【０００５】
このようなマルチキャピラリー式塩基配列決定装置では、末端塩基に対応して設定された蛍光波長ごとの４種類の検出信号が得られる。泳動途中で各キャピラリーカラムではいまどの塩基が検出されているかという状態を表示するために、末端塩基別の４種類の信号波形をそのまま表示装置の画面に表示している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
多数のキャピラリーカラムを用いて電気泳動を行なう場合、検出された波形をそのまま表示していたのでは、どれがどのキャピラリーカラムに対応する信号であるかがわからず、さらに各キャピラリーカラムでいまどの塩基が検出されているのかもわかりにくく、泳動状態を把握するのが容易ではないという問題がある。
そこで、本発明は多数のキャピラリーカラムを用いて電気泳動を行なう場合に、各試料での泳動状態をリアルタイムで容易に把握できるようにすることを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明のマルチキャピラリー式塩基配列決定装置では、そのマルチキャピラリーアレイ泳動部は、キャピラリーアレイの一端側が試料注入側となってキャピラリーカラム端が２次元的に配列されて下向きに固定され、そのキャピラリーカラム端の下方には、そのキャピラリーカラム端の配列と対応して試料が収容されたウエルが２次元的に配列されてウエル内に挿入された各キャピラリーカラム端に電圧が印加される試料容器、及び泳動用バッファ液が収容されて全キャピラリーカラムに電圧が印加される泳動用リザーバが配置されて試料容器と泳動用リザーバのいずれかが選択的にキャピラリーカラム端と接触させられ、キャピラリーアレイの他端側が電圧の印加される別のバッファ液に浸されて、キャピラリーアレイの両端間に泳動電圧が印加されるようになっており、表示装置は試料容器のウエルの配列に対応した画面を有し、その画面の各ウエルの位置を検出された末端塩基に応じて４種類の色別で表示していくものである。
【０００８】
【実施例】
図１は一実施例を概略的に示す斜視図である。
キャピラリーアレイ２は分離媒体のゲルが充填された複数のキャピラリーカラムが配列されたものであり、その一端側（下端側）２ａが試料注入側となってカセットホルダー４により二次元的に配列されて固定されており、試料注入用サンプルプレート６４のウエル内の試料又は泳動用の下側リザーバ６２のバッファ液と接触する。キャピラリーアレイ２の他端側（上端側）２ｂはキャピラリーカラムが一列に配列されており、先端で上側リザーバ５６のバッファ液と接触する。キャピラリーアレイ２の他端側にはキャピラリーカラムが一列に配列されてカセットホルダー６により支持されている被検出部２ｃが設けられている。
【０００９】
キャピラリーカラムは、石英ガラスやホウケイ酸ガラス（例えばパイレックス）等を材質とするものであり、外形が２００〜３００μｍ、内径が７５〜１００μｍのものである。キャピラリーカラムはその外周をＳｉＯ２など、紫外領域から近赤外領域の励起光によっては蛍光を発生しないか、発生しても蛍光測定の妨げにならない程度である無蛍光材質の被膜により被覆されたものが好ましい。その場合には、被検出部２ｃでもキャピラリーカラムの被膜を除去する必要がない。それに対し、キャピラリーカラムが被膜として蛍光を発する樹脂被膜をもったものである場合は、被検出部２ｃではその被膜を除去しておくのが好ましい。キャピラリーアレイ２にはそのようなキャピラリーカラムが９６〜４８０本配列されている。
【００１０】
キャピラリーカラム内には分離媒体のゲルとして、ポリアクリルアミドゲル、リニアアクリルアミドゲル、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）ゲルなどが充填されている。各キャピラリーカラムには末端塩基別に異なる螢光物質ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＡＢＩ、Ｒ６Ｇ、Ｒ−１１０などの螢光物質から選ばれた４種類の蛍光物質により標識された４種類のＤＮＡフラグメント、又は引用例２のように２種類の蛍光物質を比率を異ならせて用いることによりコード化された４種類のＤＮＡフラグメントを含む試料がそれぞれ注入され、同時に電気泳動がなされる。
【００１１】
標識蛍光物質を励起するための励起光源として、アルゴンガスレーザ装置８が設けられている。アルゴンガスレーザ装置８は出力が４０〜１００ｍＷで、マルチラインタイプであり、４８８ｎｍと５１４．５ｎｍの２種類の波長のレーザ光を同時に発振する。励起・受光光学系１０は後で図２により一例が示されるように、被検出部２ｃのキャピラリーカラムに励起光のアルゴンレーザビームを照射し、試料からの蛍光を検出するものであり、キャピラリーアレイの配列面に平行で泳動方向に直交する方向に走査される。レーザ装置８からの励起光ビームが励起・受光光学系１０の走査によってもずれないようにするために、ここではレーザ装置８からのレーザビームがカップラーにより結合された光ファイバ９を経て励起・受光光学系１０に導かれている。
【００１２】
キャピラリーアレイ２を一定温度に保つために、発泡ポリウレタンなどの断熱材で囲まれた泳動チャンバー４２が設けられ、キャピラリーアレイ２はその泳動チャンバー４２内に収容されている。泳動チャンバー４２にはペルチェ素子が設けられて電子加熱冷却が行なわれるようになっている。泳動チャンバー４２内には温度センサーとして白金抵抗体や熱電対が設けられており、その温度センサーの検出出力をペルチェ素子にフィードバックしてＰＩＤ制御することにより、泳動チャンバー４２内を一定温度に保つようになっている。
【００１３】
キャピラリーアレイ２の下端２ａの下方には、泳動用リザーバ６２と試料容器としてのサンプルプレート６４が水平面内でＸＹＺ可動ステージ６８上に並んで支持されている。可動ステージ６８は、リザーバ６２とサンプルプレート６４のいずれかをキャピラリーアレイ２の下端２ａの下方に位置決めする水平方向（Ｘ，Ｙ方向）の移動と、サンプルプレート６４のウエルの試料又はリザーバ６２内のバッファ液をキャピラリーアレイ２の下端２ａに接触させたり、下端２ａから引き離したりするための垂直方向（Ｚ方向）の移動を行なう。
【００１４】
サンプルプレート６４は縦方向に２４個、横方向に１６個のウエルが規則的に配列された３８４個のウエルを備えており、キャピラリーアレイ２の下端２ａのキャピラリー端の配列はそのサンプルプレート６４のウエル配列に対応している。そのようなサンプルプレート６４は、ウエルの底が貫通し、その貫通した底にはメンブレンが張られ、それぞれのウエルのメンブレン上には試料が吸着されたものを使用することができる。そのサンプルプレート６４を他のリザーバに乗せ、そのリザーバ６４中にバッファ液をいれてそのバッファ液をメンブレンと接触させることにより、バッファ液を通してキャピラリーアレイ２の下端２ａのキャピラリー端に試料注入用の電圧を印加することができる。
【００１５】
リザーバ６２には泳動用バッファ液が入れられ、そのバッファ液を通してキャピラリーアレイ２の下端２ａのキャピラリー端に泳動用電圧を印加することができる。
サンプルプレート６４は貫通したウエルの底に試料を吸着させたメンブレンを設けたもののほか、底をもつウエルに試料を入れ、各ウエルに泳動電圧が印加されるようにしたものでもよい。
【００１６】
上側リザーバ５６のバッファ液には上側電極５４が接触し、下側リザーバ６２のバッファ液とサンプルプレート６４のウエルの試料には下側電極５８が切り換えて接触するように設けられており、両電極５４，５８には高圧電源６０から試料注入時又は泳動時の電圧が印加される。その電圧は例えば３０ｋＶで、電流は１０〜３０ｍＡである。
【００１７】
励起・受光光学系１０による検出結果に基づいて各キャピラリーカラムで検出された塩基を識別して塩基配列を決定するデータ処理装置５０と、そのデータ処理装置５０による識別結果を表示するＣＲＴなどの表示装置５２が設けられている。
【００１８】
励起・受光光学系１０の一例を図２（Ａ）に詳細に示す。
励起光源のレーザ装置８からのレーザビームがカップラー９ａにより結合された光ファイバ９を経てコリメータ９ｂからトンネルミラー１６に入射される。コリメータ９ｂは走査される励起・受光光学系１０に固定されており、レーザ装置８は励起・受光光学系１０の外部で固定されている。コリメータ９ｂはレーザビーム１２を被検出部２ｃのキャピラリーアレイの面に垂直に照射するように方向が定められている。１６は中央部に穴をもち、その穴から励起光ビームを透過させ、鏡面で蛍光を反射させるトンネルミラー、１８は励起光を１本のキャピラリーカラムに集光して投光するとともに、そのキャピラリーカラムを泳動中の試料から発生する蛍光を受光する集光レンズである。集光レンズ１８は励起光の投光と蛍光の受光を同じレンズで行なうものであり、落射光学系を構成している。集光レンズ１８で集光された蛍光はトンネルミラー１６の鏡面で反射される。
【００１９】
２０はその反射光から励起光成分を遮蔽し、蛍光を透過させる光学フィルター、２２は検出視野を限定するためのピンホールスリット、２４は光学フィルター２０を透過した蛍光をピンホールスリット２２の位置に結像させる絞りレンズ２４である。キャピラリーカラムでの蛍光発生点がピンホ−ルスリット２２の位置に結像されることにより、共焦点光学系を構成している。励起光除去のための光学フィルター２０としては、エッジフィルターや色ガラスを利用することができる。ピンホールスリット２２は検出視野を小さくして隣接するキャピラリーカラムからの迷光侵入を防ぐためのものである。
【００２０】
一実施例として、４種類の蛍光物質で標識されたＤＮＡフラグメント試料を電気泳動させる。その場合に、ピンホールスリット２２での蛍光像を４つの光束に分割するために、図２（Ｂ）に示されるレンズパネル２６が配置されている。レンズパネル２４は単レンズをカットして張りあわせたものや、ガラスモールド成形品として製作することができる。その４つに分割された光束のそれぞれの光路上には図２（Ｃ）に示される各標識蛍光物質用の異なる分光用フィルターからなるフィルターパネル２８が配置されている。フィルターパネル２８は各標識蛍光物質に対応した４種類の波長特性の異なるバンドパスフィルターがそれぞれの光路上にくるように並列配置されたものである。各バンドパスフィルターの透過波長は、塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔを標識している蛍光物質の発光波長に対応したものである。それぞれのバンドパスフィルターを透過した蛍光を検出するために、それぞれの光路上には４つの光電子増倍管３０が配置されている。
【００２１】
コリメータ９ｂ、トンネルミラー１６、集光レンズ１８、光学フィルター２０、ピンホールスリット２２、絞りレンズ２４、レンズパネル２６、フィルターパネル２８及び光電子増倍管３０を含む励起・受光光学系１０は、走査機構のステージに取りつけられており、被検出部２ｃでの全てのキャピラリーカラムからの蛍光を検出するために、被検出部２ｃでのキャピラリーアレイの面に平行で、泳動方向と直交する一直線に沿って往復方向に移動させられるようになっている。
【００２２】
図には示されていないが、この電気泳動装置には、試料注入及び泳動用の高圧電源のほか、レーザ装置の電源装置や制御基板を備えている。その制御基板は、図３に示されるように、ＣＰＵ８０、光電子増倍管３０からの検出信号をデジタル信号に変換してＣＰＵ８０に取り込むＡ／Ｄ変換器８２、ＣＰＵ８０からの指示により各部と信号の授受を行なうＩ／Ｏインターフェース８４、及び泳動チャンバー４２の温度制御を行なう温度コントローラ８６を備えている。Ｉ／Ｏインターフェース８４は、温度コントローラ８６、試料注入用及び泳動用の高圧電源、走査機構３２のセンサー及びモータ、Ｘ−Ｚサンプルステージ６８のセンサー及びモータ、レーザ装置の電源、インターロック用安全スイッチ、表示灯などと接続されている。ＣＰＵ８０は外部のパーソナルコンピュータ８８と接続されている。パーソナルコンピュータ８８は図１に示されたデータ処理装置５０に対応し、そのディスプレーは表示装置５２に対応する。
【００２３】
次に、この実施例の動作について説明する。
試料はサンガー反応を用いて調製されたＤＮＡ断片試料であり、末端塩基の種類に応じてプライマー又はターミネータが異なる蛍光物質で標識されている。その試料はサンプルプレート６６に用意する。
キャピラリーアレイ２の各キャピラリーカラムにはアクリルアミドモノマー溶液又はロングレンジャー（アクリルアミドを主成分とするゲル原料で、アメリカＦＭＣ社の商品名）モノマー溶液を電気泳動ゲル組成に調製したものを真空ポンプやアスピレーターを用いて負圧吸引し、ゲル重合させる。キャピラリーアレイ２をカセットホルダー４，６により図１の泳動装置の所定の位置に装着する。
【００２４】
上下のリザーバ５６，６２にバッファ液を入れて泳動装置に装着する。試料を入れたサンプルプレート６４は貫通したウエルの底にメンブレンを張ってそこに試料を吸着させたものであるとして、そのサンプルプレート６４を別のリザーバに装着して試料とそのリザーバ内のバッファ液とを接触させる。
【００２５】
その後、パーソナルコンピュータ８８からシーケンス開始が入力されると、可動ステージ６８がサンプルプレート６４をキャピラリーアレイ端２ａの下方に移動させ、サンプルプレート６４を上昇させてキャピラリーアレイ端２ａをサンプルプレート６６のウエル中の試料に接触させる。その後、両電極５４，５８を通してサンプルプレート６６のウエル中の試料とリザーバ５６のバッファ液と間に高圧が所定時間印加されて試料の注入が行なわれる。
【００２６】
試料注入後、可動ステージ６８が作動し、泳動用リザーバ６２がキャピラリーアレイ端２ａの位置に位置決めされてキャピラリーアレイ端２ａが泳動用リザーバ６２のバッファ液に浸された後、両電極５４，５８を通して両バッファ液間に高電圧が印加されて泳動が開始される。泳動中はコンプレッションを起こさないように泳動チャンバー４２内を４０〜６０℃の一定温度になるように制御される。
【００２７】
泳動分離されたＤＮＡ断片が被検出部２ｃを通過する際、励起・受光光学系１０が走査されて試料を標識している蛍光物質からの蛍光が検出される。このとき、フィルターパネル２８の４つのフィルターを通過して４つの光電子増倍管３０で検出された蛍光による信号は、それぞれ図４（Ａ）に示されるように得られる。図４（Ａ）のような信号はＤＮＡフラグメント試料の末端塩基の種類に応じて４組が得られる。それらの信号はＡ／Ｄ変換器を経てデータ処理装置であるパーソナルコンピュータ８８に取り込まれる。これらの信号は、ＤＮＡフラグメント試料を泳動させていないときの信号と対比され、ＤＮＡフラグメント試料のみの信号が図４（Ｂ）のように抽出される。その後、その４組の信号の内で最大強度をもち、かつ一定のしきい値以上の信号に対応した塩基が、各キャピラリーカラムでの塩基として認識される。
【００２８】
キャピラリーアレイ２の各々のキャピラリーカラムの同定は、励起・受光光学系１０を走査する走査機構にエンコーダを設けておき、そのエンコーダから得られる出力パルスを用いて行なうことができる。そのようにして求められたキャピラリーカラム位置と蛍光信号から得られた塩基の種類が対比させられ、図２（Ｃ）に示されるように、サンプルプレート６４のウエルの配列に対応した表示画面に、末端塩基に応じた４種類の色別で表示される。
【００２９】
励起・受光光学系１０は図２に示されたものに限られるものではない、例えば、ピンホールスリット２２に結像した蛍光像を凹面グレーティングで分割と分光を同時に行ない、分光の結像位置には、４つの標識蛍光物質に対応した波長位置からの蛍光を受光するバンドルファイバ一端を配置し、そのバンドルファイバの他端を４つの光電子増倍管に導くようにしてもよい。
【００３０】
【発明の効果】
本発明では泳動信号を末端塩基に対応する４色に色分けし、試料容器に対応した表示画面のそれぞれの試料の位置に表示させるようにしたので、泳動状態のリアルタイムで正確な把握が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例を概略的に示す斜視図である。
【図２】（Ａ）は一実施例における励起・受光光学系を示す側面断面図、（Ｂ）はそこで用いられるレンズパネルを示す斜視図、（Ｃ）はそこで用いられるフィルタパネルを示す斜視図である。
【図３】一実施例における制御基板を示すブロック図である。
【図４】一実施例の動作を示す図であり、（Ａ）は１つの光電子増倍管から得られる蛍光信号をしめす波形図、（Ｂ）はその信号からＤＮＡフラグメント試料のみの信号を抽出した信号の波形図、（Ｃ）は表示画面の例を示す概略正面図である。
【符号の説明】
２      キャピラリーアレイ
２ｃ    被検出部
８      アルゴンガスレーザ装置
１０      励起・受光光学系
１２      レーザビーム
５０      データ処理装置
５２      表示装置
５６，６２      リザーバ
６４      サンプルプレート
６８      可動ステージ
【図１】
0003544812.tif 000002
【図２】
0003544812.tif 000003
【図３】
0003544812.tif 000004
【図４】
0003544812.tif 000005