【手続補正書】
【提出日】平成29年9月8日(2017.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のシステイン残基および／または第一の非天然アミノ酸を、（ｉ）タワードメインまたは（ｉｉ）ピンドメインまたは（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに含む、修飾されたＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼであって、
前記第一のシステイン残基および／または第一の非天然アミノ酸は、（ｉ）タワードメインまたは（ｉｉ）ピンドメインまたは（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン内で第二のシステイン残基および／または第二の非天然アミノ酸に連結されており、
ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力は、前記第一および／もしくは第二のシステイン残基ならびに／または前記第一および／もしくは第二の非天然アミノ酸を含まない非修飾ヘリカーゼと比較して低下しており、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているヘリカーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のヘリカーゼであって、
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６０〜Ｐ２７４およびＮ２９２〜Ａ３８９）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｅ１０２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＶ１０３〜Ｋ１７７）に導入されている配列番号８の変種；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９５〜Ｎ３０９およびＦ３１６〜Ｙ４２１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（Ｙ８５〜Ｌ１１２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｉ８４およびＲ１１３〜Ｙ２１１）に導入されている配列番号９の変種；
（ｃ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ３２８〜Ｐ３４２およびＮ３６０〜Ｙ４４８）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ１４８〜Ｎ１６５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１４７およびＳ１６６〜Ｖ２４０）に導入されている配列番号１０の変種；
（ｄ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２６１〜Ｔ２７５およびＴ２８５〜Ｙ３７０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９１〜Ｅ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９０およびＥ１０８〜Ｈ１７３）に導入されている配列番号１１の変種；
（ｅ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９４〜Ｉ３０７およびＴ３１４〜Ｙ４０７）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ１１６〜Ｔ１３５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１１５およびＮ１３６〜Ｖ２０５）に導入されている配列番号１２の変種；
（ｆ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ２８８〜Ｅ３０１およびＮ３０７〜Ｎ３９３）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９７〜Ｐ１１３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９６およびＦ１１４〜Ｖ１９４）に導入されている配列番号１３の変種；
（ｇ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｓ２５０〜Ｐ２６４およびＥ２７８〜Ｓ３７１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ７８〜Ｅ９５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ７７およびＶ９６〜Ｖ１６６）に導入されている配列番号１４の変種；
（ｈ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｋ２５５〜Ｐ２６９およびＴ２８４〜Ｓ３８０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８２〜Ｋ９８）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ８１およびＬ９９〜Ｍ１７１）に導入されている配列番号１５の変種；
（ｉ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２４２〜Ｐ２５６およびＴ２７１〜Ｓ３６６）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ６９〜Ｋ８５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ６８およびＭ８６〜Ｍ１５８）に導入されている配列番号１６の変種；
（ｊ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｔ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ｐ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１７の変種；
（ｋ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ａ３９１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１８の変種；
（ｌ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２５８〜Ｐ２７２およびＮ２９０〜Ｐ３８６）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｇ１０２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＴ１０３〜Ｋ１７６）に導入されている配列番号１９の変種；
（ｍ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｌ２６６〜Ｐ２８０およびＮ２９８〜Ａ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ９２〜Ｄ１０８）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９１およびＶ１０９〜Ｍ１８３）に導入されている配列番号２０の変種；
（ｎ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６２〜Ｐ２７６およびＮ２９４〜Ａ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｅ１０４）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＭ１０５〜Ｍ１７９）に導入されている配列番号２１の変種；
（ｏ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６１〜Ｐ２７５およびＮ２９３〜Ａ３８９）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｋ１７８）に導入されている配列番号２２の変種；または
（ｐ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｅ２６１〜Ｐ２７５およびＴ２９３−Ａ３９０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｍ１７８）に導入されている配列番号２３の変種を含み、任意に、前記ヘリカーゼは、
（１）（ｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｉｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｖｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｖｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｘｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｘｉｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｘｉｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｖｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＧ３５７Ｃ；（ｘｘｖｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００Ｃ；（ｘｘｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｉｘ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００ＣおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＦ３７７Ｃ；（ｘｘｘｉ）Ｎ９５Ｃ；（ｘｘｘｉｉ）Ｔ９１Ｃ；（ｘｘｘｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＣおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｉｖ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖ）Ａ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｃ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０ＣおよびＦ２７６Ａ；（ｘｘｘｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５６Ｃ；（ｘｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３５６Ｃ；（ｘｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＧ３５７Ｃ；（ｘｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｌｉｉｉ）Ｎ９５Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｉｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｖｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｘｌｖｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｘｌｉｘ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｌｉｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｌｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｌｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｘ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｌｘｉ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｌｘｉｉ）Ｔ２Ｃ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
を含む配列番号８の変種； 
（２）配列番号８における（ｉ）から（ｘｘｉｘ）のいずれかに定義のものに対応する位置にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種、または
（３）（ａ）から（ｐ）のいずれかの変種であって、非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、またはＦａzがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている（１）もしくは（２）の変種を含む、請求項１に記載のヘリカーゼ。
【請求項３】
前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、
（Ａ）前記ヘリカーゼは、前記ピンドメインおよび／またはフックドメインからの１つまたは複数の単一のアミノ酸欠失をさらに含み、任意に、前記ヘリカーゼは、
（１）Ｅ９３の欠失および／もしくはＥ９５の欠失を含む配列番号８の変種；または
（２）配列番号８中のＥ９３に対応する位置の欠失および／もしくは配列番号８中のＥ９５に対応する位置の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み；
（Ｂ）前記フックドメインおよび／または前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、任意に、前記ヘリカーゼは、
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７５〜Ｆ２９１）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７８〜Ｔ２５９およびＬ３９０〜Ｖ４３９）にさらに導入されている配列番号８の変種；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ａ３１０〜Ｌ３１５）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２１２〜Ｅ２９４およびＧ４２２〜Ｓ６７８）にさらに導入されている配列番号９の変種；
（ｃ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ３４３〜Ｌ３５９）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２４１〜Ｎ３２７およびＡ４４９〜Ｇ４９６）にさらに導入されている配列番号１０の変種；
（ｄ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｗ２７６〜Ｌ２８４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７４〜Ｄ２６０およびＡ３７１〜Ｖ４２１）にさらに導入されている配列番号１１の変種；
（ｅ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｒ３０８〜Ｙ３１３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２０６〜Ｋ２９３およびＩ４０８〜Ｌ５００）にさらに導入されている配列番号１２の変種；
（ｆ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｍ３０２〜Ｗ３０６）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１９５〜Ｄ２８７およびＶ３９４〜Ｑ４５０）にさらに導入されている配列番号１３の変種；
（ｇ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２６５〜Ｉ２７７）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１６７〜Ｔ２４９およびＬ３７２〜Ｎ４２１）にさらに導入されている配列番号１４の変種；
（ｈ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２７０〜Ｆ２８３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７２〜Ｔ２５４およびＬ３８１〜Ｋ４３４）にさらに導入されている配列番号１５の変種；
（ｉ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２５７〜Ｆ２７０）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１５９〜Ｔ２４１およびＬ３６７〜Ｋ４２０）にさらに導入されている配列番号１６の変種；
（ｊ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９３〜Ｖ４４３）にさらに導入されている配列番号１７の変種；
（ｋ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９２〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号１８の変種；
（ｌ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７３〜Ｆ２８９）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７７〜Ｎ２５７およびＬ３８７〜Ｖ４３８）にさらに導入されている配列番号１９の変種；
（ｍ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２８１〜Ｆ２９７）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８４〜Ｔ２６５およびＬ３９３〜Ｉ４４２）にさらに導入されている配列番号２０の変種；
（ｎ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｈ２７７〜Ｆ２９３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８０〜Ｔ２６１およびＬ３９３〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号２１の変種；
（ｏ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９０〜Ｉ４３９）にさらに導入されている配列番号２２の変種； 
（ｐ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９１〜Ｖ４４１）にさらに導入されている配列番号２３の変種； 
（ｑ）（ｉ）Ｉ１８１Ｃ；（ｉｉ）Ｙ２７９Ｃ；（ｉｉｉ）Ｉ２８１Ｃ；および（ｉｖ）Ｅ２８８Ｃの１つまたは複数を含む配列番号８の変種であって、任意にＦａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されており；または
（ｒ）配列番号８における（ｉ）から（ｉｖ）に定義のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み、任意に、Ｆａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている、ヘリカーゼ。
【請求項４】
前記請求項のいずれかに記載のヘリカーゼであって、ヘリカーゼは、
（ａ）表面負電荷を低減するようにさらに修飾されており、任意に、
（ｉ）１つまたは複数の表面負電荷が、１つもしくは複数の負に荷電したアミノ酸を１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸、無電荷アミノ酸、非極性アミノ酸および／もしくは芳香族アミノ酸で置換することによって、または１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸を１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸に隣接して導入することによって中和されており、および/または
（ｉｉ）ヘリカーゼは、配列番号８の変種を含み、前記１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸がＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２およびＤ２１２の１つまたは複数であり、および／または
（ｂ）１つまたは複数の天然システイン残基の除去によってさらに修飾されており、任意に、
（ｉ）１つまたは複数のシステイン残基が置換によって除去されており、任意に、前記１つまたは複数のシステイン残基がアラニン、セリンまたはバリンで置換されており、および／または
（ｉｉ）ヘリカーゼは、
（１）配列番号８の変種を含み、前記１つまたは複数の天然システイン残基がＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数であり；
（２）配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み、前記１つまたは複数の天然システイン残基が配列番号８中のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数に対応する、
ヘリカーゼ。
【請求項５】
前記第一のシステイン残基および／または前記第一の非天然アミノ酸が前記タワードメイン内にあり、任意に、前記ヘリカーゼは、請求項２に記載のいずれかのタワードメイン変種または請求項２に記載のいずれかの変異を含む、請求項１に記載のＤｄａヘリカーゼ。
【請求項６】
前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項７】
（ａ）Ｄｄａヘリカーゼ由来のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まないポリペプチドであって、前記ピンドメインおよび／または前記１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、任意に、前記ポリペプチドは、請求項２に記載のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインのいずれかの変種ならびに請求項２に記載のいずれかのピンドメインおよび／または１Ａドメイン変異、または
（ｂ）Ｄｄａヘリカーゼ由来の２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメインおよびフックドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まないポリペプチドであって、前記タワードメインは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、任意に、前記ポリペプチドは、請求項２に記載のタワードメインのいずれかの変種または請求項２に記載のいずれかのタワードメイン変異を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７（ｂ）に記載のポリペプチドに共有結合的に付着している請求項７（ａ）に記載のポリペプチドを含むヘリカーゼであって、ピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン内の少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメイン内の少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸に連結されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、前記ヘリカーゼ。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、前記ポリヌクレオチドをＤｄａヘリカーゼに接触させるステップおよびそれにより前記ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含み、任意に、前記方法は、膜貫通ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためである、前記方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＤｄａヘリカーゼに、前記ヘリカーゼが前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、前記測定値が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
（ａ）前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択され、任意に、前記標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されており、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの前記１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定され、任意に、前記電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定であり、ここで、前記方法は、
（１）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＤｄａヘリカーゼに接触させて、前記ヘリカーゼが前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
（２）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに関して移動するときに前記ポアを通過する電流を測定するステップであって、前記電流が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含み、
（ｃ）前記方法は、前記ポアに電圧を印加して、前記ポアと前記ヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含み、
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、および／または
（ｅ）前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであり、任意に、前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来であり、任意に、前記膜貫通タンパク質が、
（１）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または
（２）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、または
（３）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または
（４）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、
前記方法。
【請求項１２】
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＤｄａヘリカーゼの使用。
【請求項１３】
（ａ）ポアおよび（ｂ）請求項１から６および８のいずれか１項に記載のＤｄａヘリカーゼを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットであって、任意に、両親媒性膜を含むチップをさらに含む、前記キット。
【請求項１４】
（ａ）Ａ３６０Ｋ；（ｂ）Ｙ９２Ｌおよび／もしくはＡ３６０Ｙ；（ｃ）Ｙ９２Ｌ、Ｙ３５０ＮおよびＹ３６３Ｎ；（ｄ）Ｙ９２Ｌおよび／もしくはＹ３６３Ｎまたは（ｅ）Ｙ９２Ｌを含む配列番号８の変種を含むＤｄａヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているヘリカーゼ。
【請求項１５】
１つ以上のヘリカーゼのシリーズに連結され、ポリヌクレオチドに付着している、請求項１から６、８および１３のいずれか一項に記載のＤｄａヘリカーゼ。