(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌカボ属のベントグラス以外の植物から分離されたエンドファイトの菌糸が宿主植物であるベントグラスの細胞間隙に伸長して感染共生しているベントグラス。
【請求項２】
ヌカボ属のベントグラス以外の植物に共生しているエンドファイトを分離して人工増殖するか、またはヌカボ属のベントグラス以外の植物にエンドファイトが共生した状態で人工増殖する工程と、
人工増殖したエンドファイトをベントグラスの植物体の茎、葉、ほふく、種子、またはカルスに接触または浸漬して接種する工程と、
接種したエンドファイトをベントグラスの植物体の茎、葉、ほふく、種子、またはカルスに感染させ、菌糸が宿主植物であるベンドグラスの細胞間隙に伸長した状態で共生に至らしめる工程と、
を具備するベントグラスへのエンドファイトの導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はエンドファイトに感染しているベントグラスとベントグラスへエンドファイトを感染させて導入する導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ライグラスやフェスク類等の寒冷地型の芝草では、内部共生菌であるエンドファイト（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）が植物組織中の細胞間に生育している場合がある。しかしながらこのような植物個体から他の植物個体へのエンドファイトの感染は、自然条件下では生じ得ない。
【０００３】
ところがエンドファイトは植物体内に共生している糸状菌であって、植物体に対して悪影響を及ぼさないばかりか、植物に対して有用な物質を提供し、植物を虫や病気の害から守ろうとする機能をもっている。そこでエンドファイトが共生していないペレニアルライグラスへ、共生しているペレニアルライグラスから単離したエンドファイトを人工的に感染させた例がある（日本植物病理学会報５８，１０２，１９９２年）。しかしエンドファイトは、人工的な接種法においても、その感染する植物に対して特異性を有しており、ペレニアルライグラスにおいても、その種間または品種間において、感染しない場合が多く観察された。
【０００４】
またベントグラスにおいては、栽培品種の中には、エンドファイトが共生している植物は発見されておらず、エンドファイトを共生させることによってベントグラスの特性を向上させることが不可能であった。
【０００５】
さらに現在発見されているペレニアルライグラスやフェスク、チモシー、ヤマカモジクサ、オーチャードグラス等から単離されたエンドファイトはその特性のために、ベントグラスに感染させることが困難なため、エンドファイトが共生しているベントグラスの開発が不可能であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これまでのペレニアルライグラスへのエンドファイトの導入法は、エンドファイトが共生する個体と共生させたい個体とを交配させ、その種子の中からエンドファイトが共生している個体を選抜する方法がほとんどであった。この手法は効率が悪いばかりでなく、有用な形質を有する個体へ直接導入できない等の問題があった。またベントグラスにおいては、エンドファイトが共生する近縁種が発見されていなかったため、交配による手法をベントグラスに適用するのは不可能であった。
【０００７】
さらにペレニアルライグラス等のエンドファイトの共生する植物から単離したエンドファイトを、ベントグラスへ人工的に導入することは、エンドファイトの種々の特性のために困難であった。具体的には、他の植物から単離されたエンドファイトをベントグラスへ接種しても、感染しないか、万一感染しても共生せず、エンドファイトが脱出してしまい、これによってエンドファイトをベントグラスへ安定的に導入することができなかった。
【０００８】
【本発明の目的】
本発明は、エンドファイトに感染しているベントグラスと、ベントグラス以外の植物に共生しているエンドファイトをベントグラスへ人工的に導入する方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願の主たる発明は、ヌカボ属のベントグラス以外の植物から分離されたエンドファイトの菌糸が宿主植物であるベントグラスの細胞間隙に伸長して感染共生しているベントグラスに関するものである。ここで人工的にエンドファイトが導入された後代のベントグラスも本発明に含まれるものである。
【００１０】
このようなベントグラスは方法に係る発明によって得られる。この方法は、ベントグラス以外の植物に共生しているエンドファイトを分離して人工的に増殖するとともに、人工増殖したエンドファイトをベントグラスの植物体または培養物に接種し、接種したエンドファイトをベントグラスの植物体または培養物で感染させるようにしたエンドファイトの導入方法に関するものである。とくにカラスムギ連の植物であってベントグラス以外の植物から分離されたエンドファイトが上記の方法に好ましく用いられる。さらにヌカボ属内の野生植物であってベントグラス以外の植物体の野生種から単離されたエンドファイトがベントグラスのカルス等の培養組織または植物体への人工的な感染にとくに有用である。
【００１１】
この方法の発明によって人工的にエンドファイトに感染したベントグラスは種子感染によって第２世代以降の後代の植物体に感染した状態が伝えられる。本発明による方法はこのような後代の植物にも及ぶものである。
【００１２】
ゴルフ場等において、環境上の理由から農薬の散布が最大の問題になっている。農薬は殺虫剤、殺菌剤、除草剤等を含むものである。虫による害を防ぐために殺虫剤を散布し、病気による害を防ぐために殺菌剤を散布する。また雑草を枯死させるために除草剤が散布される。またこのような農薬の低減の方法として、耐虫性、耐病性、アレロパシー性のベントグラスの開発が切望されている。
【００１３】
エンドファイトは植物体内に共生している糸状菌（カビの一種）であって、その共生の言葉通り、植物体に悪影響を及ぼさないばかりか、その植物体に対して有用な物質を提供するものである。エンドファイトにとって、自分が生活する宿主植物が枯れれば、自分自身も生存できなくなるために、植物を虫や病気の害から守ろうとする機能をもっている。
【００１４】
例えば耐虫性については、共生している植物を虫や動物が食べた場合に、そのエンドファイトの中のアルカロイド等によって虫を殺したり弱らせたりする。また病気に対しては、病原菌が植物体中でエンドファイトと拮抗作用を生じ、その病原菌の繁殖を抑えるように働く。さらにエンドファイトが生産する物質が、植物の活性を高め、成長を向上させる。またアルカロイド等の毒物をエンドファイトが生産するために、共生している宿主植物の周辺には草や虫が発生し難くなる。
【００１５】
従ってエンドファイトをベントグラスに導入することにより、ベントグラスに対して耐虫性や耐病性を付与するとともに、ベントグラスの成長を促進することが可能になる。しかしエンドファイトはどの植物にも共生しているものではなく、特定の植物にしか存在していないばかりでなく、他の植物への感染は、自然界においては生じていない。またエンドファイトは弱い菌であるために、土や空気中を伝わって植物に感染することがなく、種子等によって増える場合を除いては、ほとんど外部へ増殖することはない。
【００１６】
現在までのところ、エンドファイトが共生しているベントグラス類の植物は見出されていない。そこで本願発明者等は、エンドファイトが共生している植物がないかどうかをスクリーニングした。対象としては、できる限り自生している野生種を中心として行なった。野生種を対象とした理由は、栽培植物よりも野生種、つまり雑草の方がこのような特性をもっているものと推定されたからである。スクリーニングの結果、ベントグラスが属しているカラスムギ連の植物、とくにベントグラスが属しているヌカボ属内の野生種であるヤマヌカボ等の野生植物からエンドファイトが発見された。
【００１７】
そこでこのようなヌカボ属内の野生種から発見されたエンドファイトをベントグラスの主要品種であるクリーピングベントグラスの品種ペンクロス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｌａ  Ｌ．  ｃｖ  Ｐｅｎｎｃｒｏｓｓ）の無菌のカルスおよび植物体にそれぞれ人工的に接種を行なった。その結果カルスおよび植物体中にエンドファイトが感染導入されるとともに、宿主植物それ自体も生存しており、むしろ宿主植物の成長が促進されることが確認された。
【００１８】
本願発明において適用されるベントグラスを例示すれば、次のようなものがある。
【００１９】
ハイコヌカグサ          Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ  Ｌ．
コヌカグサ              Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ｒｏｔｈ．
コヌカグサ              Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．
ヒメコヌカグサ          Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ  Ｌ．
コロニアルベントグラス  Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ  ＳＩＢＴＨ．
またこれらのベントグラスの交配品種も本発明に適用可能である。
【００２０】
次にエンドファイトが分離抽出されるベントグラス以外の植物としては、カラスムギ連の植物の野生種であってよく、とくにヌカボ属内の野生種が用いられてよい。その一例を示すと次の通りである。
【００２１】
ユキクラヌカボ    Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｈｉｄｅｏｉ  Ｏｈｗｉ．
ミヤマヌカボ      Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｆｌａｃｃｉｄａ  Ｈａｃｋ．
コミヤマヌカボ    Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｍｅｒｔｅｎｓｉｉ  Ｔｒｉｎ．
エゾヌカボ        Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｃａｂｒａ  Ｗｉｌｌｄ．
エゾヌカボ        Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｈｉｅｍａｉｌｉｓ．
ヤマヌカボ        Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃｌａｖａｔａ  Ｔｒｉｎ．
ヌカボ            Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃｌａｖａｔａ  Ｔｒｉｎ．  ｓｕｂｓｐ．
ヒメコヌカグサ    Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｖａｌｖａｔａ  Ｓｔｅｎｄ．
バケヌカボ        Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｌｅｍｍａ  Ｏｈｗｉ．
次に上記のような植物から分離されるエンドファイトを例示すれば、次のような種類がある。
【００２２】
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．
Ｅｐｉｃｈｌｏё  ｓｐ．
Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｌａ  ｓｐ．
Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．
Ｂａｌａｎｓｉａ  ｓｐ．
Ｂａｌａｎｓｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．
Ａｔｋｉｎｏｓｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．
Ｍｙｒｉｏｇｅｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．
ベントグラスへのエンドファイトの感染のための接種方法としては、ベントグラスの植物体にメスで傷をつけ、そこにエンドファイトを直接接種する方法、あるいはまたエンドファイトを培養した液体中に傷をつけたベントグラスを浸漬し、感染させる方法、脱分化した組織であるカルスにエンドファイトの培養液または直接エンドフィイトを接種する方法等がある。
【００２３】
このようなエンドファイトの感染のための接種方法は、必ずしも無菌条件下である必要はないが、他の雑菌によるコンタミネーション（汚染）が発生し易いために、無菌条件下で行なうことがより好ましい。
【００２４】
また使用するエンドファイトは長期培養したものは変異を生ずる可能性が高く、このために単離直後か、乾燥状態あるいは低温状態で異変を除く処理をしたものを用いることが好ましい。また接種時の温度は０〜３０℃の温度が好ましい。３０℃以上の高温下で長期間の培養を行なうと、エンドファイトの活性が低下するばかりでなく、死滅する可能性がある。
【００２５】
エンドファイトを接種したベントグラスまたはその培養物は適当な培地上において数日から数週間培養される。すると植物体それ自体が生育するとともに、感染したエンドファイトが生育してベントグラスに共生するようになる。
【００２６】
ベントグラスにエンドファイトが感染して共生したかどうかは、例えばベントグラスの植物体の一部をアニリンブルー水溶液等の染料を用いて染色し、光学顕微鏡によって観察することにより確認される。ベントグラスの細胞組織は上記の染料に染まらず、エンドファイトのみが選択的に染色されるために、エンドファイトが感染して共生された場合には、細胞間隙を菌糸が伸長しているのが観察される。感染していないものは、菌糸が全く見られないか、見られたとしても、組織の表面上をはい、細胞間隙に達していないものである。
【００２７】
【実施例】
実施例１
（１）ベントグラスからのカルスの誘導
ベントグラスの種子または生長点を含む組織を、７０％エチルアルコール、次亜塩素酸ナトリウム水溶液等で滅菌し、カルス誘導培地へ置床した。ここで言うカルス誘導培地は、公知のＭＳ基本培地等にショ糖等の糖を３％加え、オーキシンとして、２，４−Ｄ、ピクロラム、ジカンバ等を加え、好ましくはサイトカイニンとして、カイネチン、ＢＡＰ等を添加する。
【００２８】
さらに培地の固化剤として、寒天またはゲランガム等を添加した。ベントグラスの組織をカルス誘導培地で、１〜２ケ月間、２５℃暗黒下で無菌条件下で培養することにより、カルスが形成される。このカルスの中から植物体を再生する能力をもったＥカルスを選別し、接種に用いた。
【００２９】
（２）エンドファイトの単離
ヌカボ属内の野生種であるヤマヌカボの完熟種子を、７０％エチルアルコールおよび次亜塩素酸ナトリウムの水溶液で滅菌し、発芽培地に置床した。発芽培地には、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロースアガー）またはＭＳ基本培地に３％ショ糖、寒天１０％を添加した培地を使用した。培地は、２５℃、暗黒下で無菌条件下で行なった。ヤマヌカボは１０〜２０日程度で発芽し、その種子からエンドファイトが成長し始めた。培地で成長してきたエンドファイトを接種に使用した。
【００３０】
（３）ベントグラスヘのエンドファイトの接種
ベントグラスのＥカルスを接種培地であるＭＳ基本培地に３％ショ糖、寒天０〜１．５％またはゲランガム０〜０．７％を添加した固形培地に置床し、そのＥカルスに接触する前にエンドファイトを置床した。培養は２５℃、１０００ｌｕｘ、１６時間日長で行ない、ベントグラスへエンドファイトを接種した。
【００３１】
（４）ベントグラスの再分化と検定法
接種後に培養することによって、カルスはグリーンスポットを形成して再分化した。一方エンドファイトはカルス中に感染して侵入し、ベントグラス植物へ導入された。
【００３２】
エンドファイトを接種したベントグラスの葉鞘裏面表皮をピンセットによって剥ぎ取り、アニリンブルー水溶液（乳酸１００ｍｌ、グリセリン２００ｍｌ、水１００ｍｌ、アニリンブルーＯ  ０．４ｇ）を数滴滴下したスライドグラスに表皮をのせ、カバーグラスをかけて、ガスバーナであぶり、染色液を煮沸して染色後、光学顕微鏡によって観察を行なった。
【００３３】
細胞組織は染まらず、エンドファイトのみが上記の染料液によって青色に染まる。従ってエンドファイトが感染している場合には、細胞間隙を菌糸が伸長しているのが観察される。感染していないものは菌糸が全く見られないか、見られたとしても組織の表面上をはい、細胞間隙には達していないものである。本実施例によれば、エンドファイトが感染している状態が明確に確認された。
【００３４】
実施例２
（１）エンドファイトの単離
ヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃｌａｖａｔａ  Ｌ．）の完熟種子を７０％エタノール水溶液と次亜塩素酸ナトリウム水溶液にて滅菌し、滅菌水で洗浄し、ポテトデキストロースアガー培地（以下ＰＤＡ培地）に置床し、２５℃暗黒下で培養した。
【００３５】
種子は数日で発芽し、エンドファイトが種子中より培地へ繁殖し始めるが、他の糸状菌に比べて成育速度が遅いことが１つの特徴になっている。色は乳白色であり、菌糸を光学顕微鏡下で観察すると、分岐が少ない直線状の菌糸が確認された。
【００３６】
（２）ベントグラスの植物体への接種
クリーピングベントグラス（品種ペンクロス）の完熟種子または植物体を７０％エタノール水溶液と次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄したもの、または無菌下で栄養繁殖させた植物を接種に供試した。
【００３７】
▲１▼  無菌の植物体のほふくをメスによって切断したサンプルをＰＤＡ培地中に繁殖したエンドファイト中に差込み、植物体の切断面がエンドファイト中に浸漬されるようにした。
【００３８】
▲２▼  ＭＳ培地中に３％シュクロース、０〜１．５％アガーを添加した培地に無菌の植物体を差し、切断面にＰＤＡ培地中で繁殖したエンドファイトを接触させて培養した。
【００３９】
▲３▼  ＭＳ基本培地に３％シュクロース、０〜１．５％アガーを添加した培地に、無菌植物体を差し、葉をメスによって切断し、その切断面にＰＤＡ培地中で繁殖したエンドファイトを接触させて接種した。
【００４０】
▲４▼  ＭＳ基本培地に３％シュクロース、０〜１．５％アガーを添加した培地に、無菌植物体を差し、茎または葉の一部を切断し、その切断面に無菌条件下で播種したエンドファイトの共存しているヤマヌカボの植物体の一部を切出した切片を接触させた。
【００４１】
（３）培養
上記の▲１▼〜▲４▼の方法によってエンドファイトを感染接種させたベントグラスを、２５℃、３０００ｌｕｘ、１６ｈｒ照明下において１〜３週間培養し、植物体を生育させた。この時点では培地中にエンドファイトとベントグラスとが共存していることになる。
【００４２】
（４）検定
▲１▼  培養法
接種後に成長したベントグラスの先端部の葉または茎をメスで切出し、組織を細断した後に新しいＰＤＡ培地中へ置床した。培養は２５℃、暗黒下において５〜２０日間培養することにより、組織の断面よりエンドファイトが放出され、ＰＤＡ培地中で繁殖するのが確認された。もし、ベントグラスがエンドファイトに感染していれば、組織層よりエンドファイトが観察されることになる。
【００４３】
▲２▼  顕微鏡観察法
実施例１と同様の方法で染色したエンドファイトを光学顕微鏡で観察できる。
【００４４】
この他にＥＬＩＳＡ（エライザ法）を用いて検定を行なうことも可能である。
【００４５】
実施例３
（１）カルスの培養
クリーピングベントグラス（品種ペンクロス）の完熟種子を７０％エタノール水溶液と次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄後、カルス誘導培地（ＭＳ培地、３％シュクロース、２〜５ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、または２〜５ｍｇ／ｌ  Ｐｉｃｌｏｒａｍ、または２〜１０ｍｇ／ｌ  ｄｉｃａｍｂａ、０．８〜１．５％アガーまたは０．２〜１．０％ゲランガムを添加し、オートクレーブにおいて１２１℃で１５分間加熱したもの）に置床し、２５℃で暗黒下でカルスの誘導を行なった。
【００４６】
（２）エンドファイトの接種
▲１▼  ＭＳ基本培地に３％シュクロース、０．８〜１．５％アガーを添加した培地に誘導したカルスまたは増殖させたカルスを置床し、さらに別に培養したエンドファイトを接触させて培養した。
【００４７】
▲２▼  誘導したカルスを液体増殖培地（例えば、ＡＡ培地に２％シュクロース、３％ソルビトール、２〜５ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄまたは２〜５ｍｇ／ｌ  Ｐｉｃｌｏｒａｍ、または２〜１０ｍｇ／ｌ  ｄｉｃａｍｂａ、カゼイン加水分解物２００ｍｇ、ＭＥＳ１ｇ／ｌ、ＡＡ培地のアミノ酸を添加した培地）にて培養し、増殖させたカルスに上記の方法にてエンドファイトを接種した。
【００４８】
▲３▼  液体増殖培地において増殖したカルスを、胚様体誘導培地（例えばＮ６基本培地、５％シュクロース、３％ソルビトール、２００〜１０００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、１ｇ／ｌ  ＭＥＳ、ＡＡ培地のアミノ酸を添加した培地）において培養し、カルスを胚様体化させ、その胚様体に上記の方法によってエンドファイトを接種した。
【００４９】
（３）検定
上記実施例２において述べた検定法と同様の手法によってエンドファイトの存在の検定を行なった。この検定においても、エンドファイトが接種感染されていることが確認された。
【００５０】
実施例４
ＭＳ基本培地に３％シュクロース、０〜０．７％ゲランガムまたは０〜１．５％アガーを添加した培地に無菌条件下にて播種し、発芽させたエンドファイトが共生しているヤマヌカボ植物体を無菌的に傷つけ、その傷の部分に無菌植物体（ほふく茎）の切断面を接触させた。
【００５１】
ＭＳ基本培地に３％シュクロース、０．２５〜０．７％ゲランガムまたは０．７〜１．５％アガーを添加した培地に、無菌条件下で播種し、発芽させたエンドファイトが共生しているヤマヌカボ植物体の根から出ているエンドファイトに、無菌植物体の切断面を接触させた。
【００５２】
共存培養の条件は１０〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃であって、明条件であっても、暗条件であってもよい。共存培養の期間は１〜６０日、好ましくは７〜３０日がよい。またこのときのｐＨを３〜８、より好ましくは４〜６の値に調整される。
【００５３】
無菌植物をエンドファイトまたはエンドファイトが共生しているヤマヌカボの植物体に接触させる際に、無菌植物の切断面を更新する。すなわち接触させる直前にもう一度切って切断面を新鮮な状態にすることが感染の効率をより高めることが確認された。
【００５４】
次に上記実施例１〜４において使用されている培地の組成を説明する。  １）ポテトデキストロースアガー培地（ＰＤＡ）
栄研化学株式会社製
0003549122.tif 000002
２）  育苗培地
ＭＳ基本培地（無機塩とビタミン）
３％シュクロース
０．８〜１．５％アガーまたは０．１〜１．０％ゲランガム
ｐＨ  １．６
３）  ポテトシュクロース培地
バレイショ抽出液      １０００ｍｌ
シュクロース          １０ｇ
ｐＨ                  ５．６
なお各培地ともに調整後に、オートクレーブで１２１℃で１５分間滅菌処理した。
【００５５】
次に上記実施例１〜４において用いられている略称の物質名は次の通りである。
【００５６】
２，４−Ｄ；  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
Ｐｉｃｌｏｒａｍ；  ４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸
ｄｉｃａｍｂａ；  ３，６−ジクロロ−２−メチルベンゼン酸
ＭＥＳ；  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（一水和物）
アガー；  寒天
【発明の効果】
以上のように本発明は、ヌカボ属のベントグラス以外の植物から分離されたエンドファイトの菌糸が宿主植物であるベントグラスの細胞間隙に伸長して感染共生しているベントグラスおよびベントグラスへのエンドファイトの感染方法に関するものである。
【００５７】
従って本発明に係るベントグラスによれば、感染して共生されたエンドファイトによって耐虫性および耐病性を付与することが可能になるとともに、エンドファイトが生産する物質によってベントグラスの活性を高め、その生長を促進する効果を生ずる。従って殺虫剤、殺菌剤、除草剤等の農薬を散布する必要がないベントグラスを提供することが可能になる。