(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法であって、下記の塩基配列：
0003549201.tif 000013
から選ばれるプローブを用いることを特徴とするDNA−DNA、DNA−RNA又はRNA−RNAハイブリダイゼーションに基づく、下記の配列Ｎ−１〜Ｎ−12:
0003549201.tif 000014
0003549201.tif 000015
0003549201.tif 000016
0003549201.tif 000017
0003549201.tif 000018
0003549201.tif 000019
0003549201.tif 000020
0003549201.tif 000021
0003549201.tif 000022
0003549201.tif 000023
0003549201.tif 000024
0003549201.tif 000025
の内の１つの配列を含む血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法。
【請求項２】
下記の塩基配列：
0003549201.tif 000026
から選ばれるプローブ及び下記の塩基配列：
0003549201.tif 000027
から選ばれるプライマーを含んで成ることを特徴とする下記の配列Ｎ−１〜Ｎ−12
0003549201.tif 000028
0003549201.tif 000029
0003549201.tif 000030
0003549201.tif 000031
0003549201.tif 000032
0003549201.tif 000033
0003549201.tif 000034
0003549201.tif 000035
0003549201.tif 000036
0003549201.tif 000037
0003549201.tif 000038
0003549201.tif 000039
の内の１つの配列を含む血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法並びに検出用試薬に関する。詳しくは血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするDNA配列の全部又は一部を用いることを特徴とする血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法並びに検出用試薬に関する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕
ウイルス性肝炎のうちＡ型及びＢ型についてはすでにそのウイルスが発見され免疫学的な方法による診断も可能となっており、これらのウイルスに対するワクチンも開発されている。しかしながらＡ型でもなくＢ型でもないいわゆる非Ａ非Ｂ型といわれる肝炎に関しては病因ウイルス量が生体内で極めて微量であるため実体が明らかにされていないのが現状である。血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎は輸血後肝炎の90％以上を占め、輸血をうけた人の10〜20％にこの肝炎が発症する〔実験医学７巻、196−201（1989）〕。
血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎に関連した抗原蛋白質の検索はいくつかの研究者により患者の血液を材料として展開されている。例えばChooら（Science,244巻、359−362（1989））及びヨーロッパ出願公開0318 216 A1により血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血液をチンパンジーに移入して感染させた後その血清からRNAを抽出し、このRNAから調製されるcDNAライブラリーより非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の一部を単離した旨の報告がなされている。このウイルス遺伝子断片を基にして作られた免疫学的手法による診断試薬を用いて我国の血液サンプル試薬の結果非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに感染した血液を60〜70％の確率で診断できるとの報告もされている（厚生省肝炎研究連絡協議会報告1989,3.13）。
一方、特開昭64−2576には、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血液をチンパンジーに移入して感染させた後、その肝細胞からRNAを抽出し、このRNAを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質遺伝子をクローン化した旨述べられている。
前者においては診断試薬の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染血液に対する診断確率が低いこと、又該報告者がその論文中でも述べている如くクローン化された遺伝子が血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の想定塩基数に比べ充分な数でないこと、血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは２種以上存在する可能性のあることなどを考え合せると得られた知見はきわめて不十分なものである。
後者においてはクローン化された遺伝子がヒト非Ａ非Ｂ型肝炎特異的である直接的証拠が示されていない。
上記いずれの場合にもチンパンジーを介して得られたRNAが使用されており、ヒト血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎ヒト患者から直接的にRNAを抽出したものではないため、クローン化されたDNAがヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子を忠実に反映しているか否か明らかでなく、確度の高い診断試薬さらにはワクチン開発が要望されていることを考えると新たなアプローチが必須である。
そのひとつとして本発明者の１人はすでに非Ａ非Ｂ型肝炎患者血液より直接RNAを抽出し、本発明人が後述する方法を用いてその成果を報告している〔実験医学７巻、196−201（1989）〕。
本発明者は鋭意研究を行った結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の肝細胞、または血液から直接RNAを抽出し、このRNAに基づいて血液伝播性非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするDNAのクローニングに成功し、それらのDNAを大腸菌にて発現することに成功した。この様にして得られた非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質は、血液試料あるいは組織試料を用いて、これらの抗原蛋白質に対する抗体を測定することによる非Ａ非Ｂ型肝炎の診断に有用な試薬となる。
一方、Ｂ型肝炎においてはウイルス抗原蛋白質に対する抗体の出現時期、あるいはその量は患者の経過により異なり、また抗原蛋白質の種類においても異なる。一般的に、感染初期には抗体の出現はなく、約３カ月以降にHBc（Ｂ型肝炎ウイルスコア蛋白）、HBe（Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白）に対する抗体が出現し、さらに数カ月後、HBs（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）抗体が出現すると言われている（鈴木宏編、肝炎、南雲堂、1989）。
非Ａ非Ｂ型肝炎においても、ある特定の抗体の出現とその抗原遺伝子の存在が必ずしも一致しないと言う報告がある（A.J.WeinerらLancet 335巻１頁（1990）;J.A.GarsonらLancet 335巻1419頁（1990））。
以上のことを考慮すると、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの存在を直接確かめることによる、非Ａ非Ｂ型肝炎の確定診断法の開発が望まれる。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者は非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在を直接判定する手段として、本発明者がクローニングに成功したDNAクローニングの塩基配列に基づくプローブ及び／又はプライマーを利用することにより、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出が可能との知見を得、それに基づき本発明を完成した。
即ち本発明はプライマーを用いた特異的な遺伝子増幅法とプローブを用いたハイブリダイゼーション（二本鎖形成）法による非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出法において、第１表に示すファージクローンのいずれかに挿入されているcDNAの塩基配列又はその一部をプローブ及び／又はプライマーとして用いることを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法及びそのための試薬に関する。
〔具体的な説明〕
本発明におけるプローブ及び／又はプライマーを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出法は、核酸の分子ハイブリダイゼーション（二本鎖形成）の原理（Maniatis T.等Molecular Cloning Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press）に基づいている。
この方法によれば、変性させた核酸試料に外来性ヌクレオチド鎖（プローブ）を導入した際、これらの変性した核酸と相補的な配列部分に外来性プローブが結合し二本鎖を生じる。この反応はその核酸がRNAでもDNAでも原理的には同じである。しかし、生じた二本鎖の安定性の程度は、この二本鎖内の核酸配列の相補性の程度により異なる。従って効率よく非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出を行なうには、検定される核酸試料に対して極めて特異的に二本鎖形成するプローブ及び／又はプライマーを用いることが重要となる。
二本鎖形成の条件はこの分野において用いられている参考書等（J.Sambrook等Molecular Cloning 9,47,11.45,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））に詳細に述べられているが、いずれにしても用いるプローブ又はプライマーが検定される核酸試料の塩基配列に特異的であり、鎖長が十分長ければ、他の類縁核酸配列と区別して特異的かつ安定な二本鎖形成が達成され、例えばプローブに標識された物質（色素、化学発光物質あるいは放射性物質）を適宜測定して、与えられた核酸試料中に特異的な核酸配列の存在を確定することができる。
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスあるいは特異的核酸は、血液や組織中に極微量にしか存在しないと言われている。このような微量の核酸を同定する場合、それらの核酸を直接上記の如くのプローブにて検出することは困難が伴う。従ってこのような場合、特異的な配列からなるプライマーを用いて標的とする核酸を増幅したのち、プローブと二本鎖形成することにより、より鋭敏に目的核酸を同定することができる。また、前記の如きプライマーを用いて標的とする核酸を十分に増幅したのち、エチジウムブロマイド等を用いて核酸を染色することにより目的の核酸を同定することもできる。このような核酸の遺伝子増幅法は既にいくつかの方法が知られており（実験医学Vol.8 No.9（1990）羊土社PCRとその応用）、それらの遺伝子増幅方法を適用できる。
本発明者は、先にも述べた如く、非Ａ非Ｂ型肝炎由来肝癌患者の肝細胞及び血液試料を基にして非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白をコードするDNAクローン61個を単離することに成功している。これらのDNAクローンは第１表に示すとおりであり、それぞれファージに挿入して組換えファージλHCとして微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託してあり、更にその一部はブダペスト条約に基づき国際寄託してある。
0003549201.tif 000002
0003549201.tif 000003
0003549201.tif 000004
0003549201.tif 000005
これらの各クローンに含まれるcDNAのコードする蛋白質の血清学的反応は、きわめて非Ａ非Ｂ型肝炎特異的であったことから、これらのクローンに含まれるDNA配列は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス自身の一部か、密接に関連した核酸であるといえる。従って、第１表に示すクローンのいずれかに含まれるDNA配列またはその一部あるいはこのDNAに対応するRNAは、DNA−DNA,DNA−RNAまたはRNA−RNAハイブリダイゼーションに基づく非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出法において、きわめて特異的の高いプローブになりうる。また第１表のクローンのいずれかに含まれるDNA配列の一部およびそれらの相補鎖は、遺伝子増幅法におけるプライマーとなる。
これらのファージクローンの内、国内寄託されている18株については、そのcDNA挿入部の塩基配列が第１図〜第18図に示されている。これらの配列の相互の相同性を比較し相同性の高いcDNAの塩基配列を並置したものを第19図Ａ及び第19図Ｂに示す。この様な塩基配列の比較から、これらのクローンは、限られた一定の領域をコードしていることが明らかである。例えば、クローンλHC 2256,λHC 2207およびλHC 2244は一部分で重なっており、またλHC 2232,λHC 2230,λHC 2206,λHC 2258,λHC 2248,λHC 2220,λHC 2216,λHC 2246及びλHC 2211はほとんど重なっている。しかしながら、このクローンの塩基配列が対応している部分は、それらの塩基配列が必ずしも同一ではなく、かなりの変異が存在する。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子を検出するためのプローブ又は肝炎特異的遺伝子増幅用のプライマーとしては、できるだけ広範な変異体とハイブリダイズし得るプローブ又はプライマーを使用するのが好ましい。このためには、各クローンの上記配列の内、変異の少ない塩基配列部分を用いればよい。
この様な塩基配列部分を選択するには、例えば第９図Ａ及び第９図Ｂ中の対応する２種類以上の塩基配列が示されている領域において、任意に２種類の塩基配列を選択してそれらの間の塩基配列の相同性を調べ、上記２種類の塩基配列をどのように選択しても相同性が所定の値以上である様な領域を選択すればよい。この様な相同性の程度は80％以上であり、好ましくは90％以上であり、そしてさらに好ましくは95％以上である。上記の様な条件を満たす相同性領域の長さは一般に25mer以上であり、好ましくは30mer以上である。
この様な観点から、プローブ用の塩基配列を選択すれば、例えば、第９図Ａにおいては、λHC 2256とλHC 2207の共通部分として、塩基番号300番から343番、348番から412番、414番から442番、453番から485番、及び498番から526番、また、λHC 2256,λHC 2207及びλHC 2244の共通部分として、678番から703番、714番から739番、783番から847番、さらには854番から884番の塩基配列が挙げられる。さらに、277番から307番の配列においては、299番の塩基がλHC 2256ではＴ、λHC 2207ではＡとなっている。また750番から781番の配列においては、758番の塩基がλHC 2256ではＣ、λHC 2207およびλHC 2244ではどちらもＴとなっている。この場合、前者の場合は299番の塩基がＡ、また後者の場合は758番の塩基がＴとなるようなプローブを作製して用いても、30merのプローブならばミスマッチの率が約3.3％となり、λHC 2256は十分に検出可能である。同様に、第19図Ｂに示した９クローンの領域において、同じ様な考え方を適用すると、これらの９クローンの塩基配列上に30mer以上の長さですべて共通の一致した配列は存在しない。しかしながら、１番から30番の30merの配列、22番から50番の29merの配列、67番から113番の47merの配列、155番から191番の37merの配列、226番から266番の41merの配列、296番から332番の37merの配列、340番から371番の32merの配列、361番から443番の83merの配列などは比較的変異が少ない。比較的変異の少ない配列としてはこれらの他、取り方によって例えば235番から269番の配列も比較的変異の少ない配列として取ることができるので、上記に示した配列は一例であることが容易に理解される。これらの配列の中で、例えば、22番から50番の配列を見ると、27番の位置ではλHC 2246のみがＡとなっており他のクローンではＧ、31番ではλHC 2248,λHC 2220およびλHC 2216がＴとなっており他はＣ、33番ではλHC 2211のみがＡで他はＧとなっている。各クローンの間ではお互いに１塩基の違いになっていることから、ミスマッチの率は約3.4％におさまるので、たとえ完全に一致した共通配列がなくてもプローブとして十分機能する。また67番から103番の配列において、プローブとしてλHC 2206の配列を選ぶと各クローン間ではそれぞれ１塩基の違いとなるので、30mer以上の長さを持つ有効なプローブを作ることができる。
各クローン間で同じ位置にいくつかの変異が起こっているような場合には、該当する位置に５−フルオロウラシル（５−FU）あるいはイノシン（Ｉ）塩基を入れることにより、ハイブリダイゼーションに影響を与えずに、プローブの機能を維持することができる（Y.Takahashiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82巻1931−1935頁（1985）;T.Kodamaら、Nature 343巻531頁（1990））。この様な手法を応用すると、プローブとなりうる場所の範囲はさらに広げることができる。例えば、第19図Ａ及びＢ中の対応する２種類以上の塩基配列が並記されている領域において、これらの塩基配列相互間で塩基が異る場合、その異る塩基のいずれか一方を５−フルオロウラシル又はイノシンにより置換するとして、任意に選択された２種類の塩基配列間の相同性がいずれの２種類の塩基配列を選択しても80％以上であるような25mer以上の領域を選択し、この領域に属する前記５−フルオロウラシル又はイノシンで置換された塩基配列を有するDNAを用いることができる。この場合、４個以下の塩基の置換によって上記の条件を満たす領域を用いることが好ましい。この様な例として、301番から330番の配列を例にとると、306番、309番、318番、及び324番に５−FUあるいはＩを入れ、30merのプローブを作ることができる。
さらに各クローンの塩基配列の一部分は当然のことながら、それらのクローンを検出するための最適のプローブであるが、プローブの長さが充分であれば、１塩基や２塩基の違いのある標的塩基配列を検出することができる。もちろん、このようにして選んだプローブの塩基配列は非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的であることが前提であり、プライマーの選択についても同様に考えられる。プローブあるいはプライマーに利用する塩基配列中の塩基の変異の程度は、特異的な診断に利用することからプローブあるいはプライマーの塩基配列の10〜15％以内（すなわち相同性が85〜95％以上）にしておくことが望ましい。
実際に、これらのプローブを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎を診断するには、試料中の核酸とハイブリッド形成をしたプローブを検出することが必要であり、そのためにプローブにはしかるべき標識が施されていなければならない。標識にはさきに述べたように、32Pによる放射標識のほか、非放射標識もよく知られており（高橋豊三著、DNAプローブ−技術と応用−、シーエムシー、1988）、ハイブリダイゼーションの効率を損なわないようにして、非放射標識化のための工夫がプローブに施されている。例えば、DNAプローブの塩基配列の塩基と塩基の間に、化学発光物質あるいは蛍光色素などが結合できるような特殊なリンカーを挿入し、検出効率の高いプローブを作製することもできる（Arnoldら、Clinical Chemistry 35巻1588（1989））。
標的とするRNAあるいはDNAがきわめて微量にしか存在しないような試料では、それらのRNAあるいはDNAを直接、プローブで検出することは困難な場合がある。このような場合、さきに述べたように標的塩基配列を含む領域を遺伝子増幅して検出することができる。遺伝子増幅される領域は通常100塩基以上の長さを持つ領域で、プライマーを用いて酵素化学的に遺伝子増幅される。
プローブあるいはプライマーを構築する場合の一つの目安として、上述の如き指標を示したが本発明にあっては、必ずしもこの考え方に従うものではなく、この考え方に合致しないプローブあるいはプライマーであっても、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出に使用しうる。第19図Ａ及び第19図Ｂに示した各クローンの中から、好ましいプローブの例を第２表に示した。また、好ましいプライマーの例としては第３表に示した各塩基配列及びその相補鎖の塩基配列を挙げることができる。
なお、第２表に示された各プローブの塩基配列中、５で示された位置は発色物質、蛍光物質、又は化学発光物質による検出を行う際にその物質を結合するためのリンカー挿入位置の例である。これ以外の位置に挿入してもよい。
リンカーはNH2基又はCOOH基等を含み、これらの基に発色物質、蛍光物質、化学発光物質などを結合させることにより非放射性物質標識プローブを作製できる。リンカーは一般に市販されているものが使用でき、例えば「アミノモディファイア−II」（Clontech社）「アミノリンクII」（アプライド・バイオシステムズ社）が挙げられる。32Pによる放射標識プローブの場合は５で示したリンカーはなくてもよい。
0003549201.tif 000006
0003549201.tif 000007
0003549201.tif 000008
名称の末尾にＲの付くものは下流から上流の、Ｒのないものは上流から下流のプライマーである。
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的な核酸の同定を行うため、血液試料や組織試料中から核酸を抽出する方法は、例えば前出‘Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）’などにも記載され広く知られており、本発明の実施に何ら困難を伴うものではない。
以下に実施例によって本発明を説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
実施例１  血清及び肝組織よりのRNAの抽出
血清及び肝組織よりのRNAの抽出は、チオシアン酸グアニジン（GTC）を用いてP.Chomczynski等の方法（Analitical Biochemistry 162巻156頁1987年）に従って行った。
血清1mlに160μlの50％ポリエチレングリコール4000と5M NaCl40μlを加えて混合し、４℃１時間静置後、遠心により沈殿を得た。この沈殿もしくは肝組織100mgを溶液Ｄ（4M GTC、25mMクエン酸ナトリウムpH7.0、0.5％ザルコシル、100mM 2−メルカプトエタノール、）300μlに溶解させ、2M酢酸ナトリウム（pH4）45μl、水飽和フェニル300μl、及びクロロホルム・イソアミルアルコール（49:1）60μlを加えてRNAを抽出した。遠心後、水層に20μg/μlのGlycogen1μlと2.5倍量のエタノールを加えて、−20℃に静置した後、遠心により沈殿を得た。この沈殿を80％エタノールで洗浄することによりRNAを得た。また、血清100μlにGTC溶液1mlを混合することによってもRNAを得た。
実施例２  組換えファージλHC 2232,λHC 2230,λHC 2206,λHC 2258,λHC 2248,λHC 2220,λHC 2246,λHC 2211,λHC 2216に挿入されたcDNAに対応する非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の増幅と検出
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするcDNAを含む組換えファージのうち、λHC 2232,λHC 2230,λHC 2206,λHC 2258,λHC 2248,λHC 2220,λHC 2246,λHC 2211及びλHC 2216は、cDNAの塩基配列に高い相同性が認められる。これらcDNAに対応する遺伝子を検出するため、各cDNAの塩基配列で特に相同性の高い領域より、下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマー及びプローブとして合成した。合成はDNA自動合成機（アプライドバイオシステムズ社;380A型）を用いて行った。
0003549201.tif 000009
0003549201.tif 000010
実施例１にて調製されたRNAとランダムプライマー0.5μｇを混合し、常法（J.Sambrook等、Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））に従い、65℃、５分間アニーリングを行ったのち逆転写酵素（宝酒造）100ユニットを用いて37℃、１時間反応させ、一本鎖相補DNA（scDNA）を合成した。得られたscDNAにプライマー「PR1」及び「PR4」をそれぞれ100pmol加え、DNA Amplification System（宝酒造）によりTaqDNAポリメラーゼを用いてPCR法による遺伝子増幅を行なった。反応は92℃３分間の加熱後、92℃２分間、40℃２分間、72℃２分間の反応を30−40サイクル繰り返し行なった。
上記PCR反応液10μlを100℃、５分間加熱後急冷し、ハイブリダイゼーション緩衝液（60mM Tris−HCl（pH8.0）,160mM NaCl,6.7mM MgCl2）、５′端32Pラベル化プローブを加え、60℃、15分間加熱した。この混合液を10mM Tris−HCl（pH7.5）,300mM NaCl,1mM EDTAにて平衡化Sephadex G−75（ファルマシア）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、PCR法に遺伝子増幅の期待される非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子に対応する約330塩基のDNA分画を分取し、その放射活性を測定した。その結果、同様に処理した健常人の血清由来RNAにおいては検出されなかった放射活性が非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清並びに肝組織より抽出したRNAを用いた場合には、特異的に検出され、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。
また、上記PCR反応液にプライマー「PR2」及び「PR3」を加え、同様にして30−40サイクルの遺伝子増幅を行なった。得られた反応液を８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、泳動後、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清並びに肝組織より抽出したRNAを用いた場合に、特異的にプライマー「PR2」及び「PR3」によって遺伝子増幅される約200bpのバンドが見られたが、同様に処理した健常人の血清由来RNAにおいては検出されなかったことにより、非Ａ非Ｂ型肝炎患者に特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。
実施例３  組換えファージλHC 2256,λHC 2244、及びλHC 2207に挿入されたcDNAに対応する非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の増幅と検出
非Ａ非Ｂ型肝炎特異的抗原蛋白質をコードするcDNAを含む組換えファージのうち、λHC 2256,λHC 2244、及びλHC 2207のcDNAに対応する遺伝子を検出するため、実施例２と同様にプライマー及びプローブとして、下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003549201.tif 000011
0003549201.tif 000012
実施例１にて調製されたRNAとランダムプライマー0.5μｇを混合し、実施例２と同様にしてscDNAを合成した。得られたscDNAにプライマー「PR5」及び「PR6」を加え、実施例２と同様にして遺伝子増幅を行なった後、プローブ「PB2」とハイブリダイズさせ、増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出を試みた。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者より抽出されたRNAを用いた場合に特異的に放射活性が検出され、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。
また、上記PCR反応液にプライマー「PR7」及び「PR8」を加え、同様にして30−40サイクルの遺伝子増幅を行なった。得られた反応液を８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、泳動後、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清並びに肝組織より抽出したRNAを用いた場合に、特異的にプライマー「PR7」及び「PR8」によって遺伝子増幅される約150bpのバンドが見られたことにより、特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在が確認された。尚、同様に処理された健常人血清由来のRNAを用いた場合には15bpのバンドは認められなかった。
実施例４  特異的に増幅された非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子に対し化学発光物質の挿入されたプローブによる検出
実施例３で遺伝子増幅を行った反応液総量の10分の１を95℃、５分間熱処理した後急冷し、これに第２表で示したプローブCP5（プローブの塩基配列中５はリンカー（アミノモディファイア−II/Clontech社）の位置を示し、このリンカーにアクリジニウムエステルが標識されている。）をハイブリダイズ溶液（0.1M NaCl,10mM Tris−HCl（pH6.0）,1mM EDTA）で希釈したものを加え、60℃で30分間インキュベートした。これに0.1Mホウ酸ナトリウム（pH7.6）200μlを加え、60℃で10分間インキュベートし、目的物とハイブリダイズしないプローブのアクリジニウムエステルを加水分解したのち、H2O2及びNaOH溶液を加え、ルミノメーターにより、化学発光量を測定した（参照、前出のArnoldらの文献）。この結果非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清及び肝組織より抽出したRNAを用いて検出を行ったところ、特異的に化学発光が測定され非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子を鋭敏に検出することができたが、同様に処理された健常人血清由来RNAにおいては、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的遺伝子の存在を示す化学発光は認められなかった。
〔発明の効果〕
以上の如く、非Ａ非Ｂ型肝炎特異的蛋白質をコードするcDNAの塩基配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドをプライマー及びプローブとして用いることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎患者より抽出したRNA中に含まれる非Ａ非Ｂ型肝炎特異的な遺伝子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はファージクローンλHC 2211中の挿入部の塩基配列を示す。
第２図はファージクローンλHC 2246中の挿入部の塩基配列を示す。
第３図はファージクローンλHC 512中の挿入部の塩基配列を示す。
第４図はファージクローンλHC 2206中の挿入部の塩基配列を示す。
第５図はファージクローンλHC 2207中の挿入部の塩基配列を示す。
第６図はファージクローンλHC 2216中の挿入部の塩基配列を示す。
第７図はファージクローンλHC 2220中の挿入部の塩基配列を示す。
第８図はファージクローンλHC 2230中の挿入部の塩基配列を示す。
第９図はファージクローンλHC 2232中の挿入部の塩基配列を示す。
第10図はファージクローンλHC 2244中の挿入部の塩基配列を示す。
第11図はファージクローンλHC 2248中の挿入部の塩基配列を示す。
第12図はファージクローンλHC 2256中の挿入部の塩基配列を示す。
第13図はファージクローンλHC 2258中の挿入部の塩基配列を示す。
第14図はファージクローンλHC 2270中の挿入部の塩基配列を示す。
第15図はファージクローンλHC 2410C中の挿入部の塩基配列を示す。
第16図はファージクローンλHC 2533中の挿入部の塩基配列を示す。
第17図はファージベクターλHC 2607中の挿入部の塩基配列を示す。
第18図はファージベクターλHC 2610中の挿入部の塩基配列を示す。
第19図Ａ及び第19図ＢはファージベクターλHC 2232、同2230、同2206、同2258、同2248、同2220、同2246、同2211および同2216の挿入部の塩基配列の相同性を示す。
【図２】
0003549201.tif 000040
【図１】
0003549201.tif 000041
【図３】
0003549201.tif 000042
【図４】
0003549201.tif 000043
【図６】
0003549201.tif 000044
【図５】
0003549201.tif 000045
【図７】
0003549201.tif 000046
【図８】
0003549201.tif 000047
【図１１】
0003549201.tif 000048
【図９】
0003549201.tif 000049
【図１８】
0003549201.tif 000050
【図１０】
0003549201.tif 000051
【図１２】
0003549201.tif 000052
【図１３】
0003549201.tif 000053
【図１４】
0003549201.tif 000054
【図１５】
0003549201.tif 000055
【図１７】
0003549201.tif 000056
【図１６】
0003549201.tif 000057
0003549201.tif 000058
0003549201.tif 000059
0003549201.tif 000060
0003549201.tif 000061