【手続補正書】
【提出日】平成29年9月15日(2017.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドのテンプレートをコピーする方法であって：
熱サイクリングの無い条件下でポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物をインキュベートすることを含み、ここで：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分及び第二の部分を含み；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの複数のコピーが生成される、
方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物であって：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である、
反応混合物。
【請求項３】
ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅のためのキットであって：
第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、ここで：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する、
キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、様々な修正、及び代替的な形態を含むが、その特定の実施形態は、図面において例として示され、並びに本明細書において詳細に記載される。しかしながら、本発明を開示された特定の形態に限定する意図はなく、それどころか、本発明は、特許請求の範囲により定義される、本発明の趣旨、及び範囲に該当する、全ての修正、等価物、及び代替物を包含すべきものであることを理解されたい。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ポリヌクレオチド・テンプレートをコピーする方法であり、前記方法は以下を含む方法：第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物で、前記ポリヌクレオチド・テンプレートをインキュベートすることであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマー
の第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的な配列を含み；
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマー
の第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマ
ーとのインキュベーションの差異に、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
（項目２）
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、第二のコンカテマー鎖も形成され、前記第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃを有する、ヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔ’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は、前記Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｘが、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]を有する配列を含み、Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＮは０及〜１０００の間の整数である、項目１に記載の方法。
（項目４）
Ｘが０個のヌクレオチドを表す、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記反応混合物が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがＲＮＡ分子である、項目１に記載の方法。
（項目８）
Ｔが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ配列に類似のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの一本の鎖を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記反応混合物のインキュベーションの間に、前記反応混合物の温度が、８０Ｃを超えない項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第一のプライマーの第一の領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、１０〜１０００のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記反応混合物が更に核酸染料を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記反応混合物中の、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのコピー数が、前記方法の開始から６０分以内に、少なくとも１０倍増大される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
生物学的サンプル中の標的のポリヌクレオチド・テンプレートの検定のための方法であって、前記方法は以下を含む方法：
Ａ）前記生物学的サンプル又はその一部分を、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中でインキュベートすることであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有する、ヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
Ｂ）Ａ）の前記反応混合物の増幅された核酸を、Ａ）のステップのインキュベーションの開始後の、１つ以上の点において測定すること。
（項目１７）
前記反応混合物中の増幅された核酸の量を測定することが、前記反応混合物中の蛍光のレベルを定量することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記反応混合物の核酸増幅の変曲時間を決定することを更に含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記生物学的サンプル又はその一部分が、ヒトからのものである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は、以下を含む方法：
反応混合物中で、少なくとも第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子をインキュベートすることであって：
前記第一のテンプレート分子は、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：
前記第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ１はヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈを有するヌクレオチド配列を含み：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列及び第二の相同配列は互いに相補的であり、Ｙ１’は前記Ｙ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖及び第二の鎖は互いに相補的であり；及び
第二のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：
前記第二のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｈ’は、前記第一の相同配列ヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ２は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈを有する、ヌクレオチド配列を含み、：Ｈは、前記第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｙ２’は、Ｙ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレート第二の鎖のヌクレオチド配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子と第二のテンプレート分子の前記反応混合物中でのインキュベーションすると、前記二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含む少なくとも１つのコンカテマーが生成され、前記コンカテマーは、第一のコンカテマー鎖及び第二のコンカテマー鎖を含み、前記第一のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表し；及び第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈを有する配列を含み、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表す。
（項目２１）
Ｙ１及びＹ２の内の少なくとも１つが、０ヌクレオチドを表す項目２０に記載の方法。
（項目２２）
Ｙ１及びＹ２の両方が０ヌクレオチドを表す項目２０に記載の方法。
（項目２３）
Ｙ１が５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]を有する配列を含み、Ｈ’は第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
Ｙ１は、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]を有する配列を含み、Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり、及びＹ２がは、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ２]を有する配列を含み、Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレート第一の鎖ヌクレオチド配列を表し、及びＮ２は０〜２０００の間の任意の整数である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
Ｎ１及びＮ２が異なる整数である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
Ｎ１が０であり、及びＮ２が、１〜２０００の間の整数である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子の両方が二本鎖のＤＮＡ分子である項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記第一の相同配列が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）二本鎖の核酸テンプレートを含む、一次二本鎖の核酸を、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールされた、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が合成される条件で処理することであって、
前記第一のプライマーは５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、
前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、
前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールし、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、ｏｆ第二のプライマーの伸長された生成物の前記３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む二次核酸第一のコピーを生成するために、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマーの伸長された生成物にアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼで処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物前記３’末端のヌクレオチドであり、
（Ｄ）ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を１つ以上の追加的な回数繰り返すこと、
（Ｅ）前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピー第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの伸長された生成物３’末端領域にアニールする条件下で処理すること、
（Ｆ）ステップ（Ａ）の前記二本鎖の核酸テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼにより処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の、第一のコピーの、第一のプライマーの、第二のコピーの、伸長された生成物の、伸長された生成物、及び前記二次核酸の、第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物を含む。
（項目３０）
ステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記方法の全てのステップが、８０Ｃ未満の温度で行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記ステップの２つ以上が同時に生じる、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のを含むコンカテマーを生成するための方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む一次核酸を、前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールされた前記第一のプライマーの第一のコピーの合成された伸長された生成物が合成される条件下で第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第一のプライマーは５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域
：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、ａｎｄ
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチド、１つ以上のヌ
クレオチドを含む中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールし、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物にアニールした前記第二のプライマーの伸長された生成物が、合成される条件下で第二のプライマー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーテール領域ヌクレオチド配列相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物、及び前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピーを生成するために、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマー伸長された生成物を、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマー伸長された生成物にアニールした前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物が合成される条件下で、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｄ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物及びステップ（Ｃ）の前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を１つ以上の追加回数繰り返すこと、
（Ｅ）前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、前記二次核酸第二のコピー第二のプライマー、伸長された生成物３’末端領域とアニールする条件下で勝利すること、
（Ｆ）ステップ（Ａ）の前記ポリヌクレオチド・テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸第一のコピー前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼと処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの、第二のコピーの伸長された生成物伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。
（項目３４）
ステップ（Ａ）前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記方法の全てのステップが８０Ｃ未満の温度で遂行される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記方ステップの２つ以上が同時に生じる、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：
（ｉ）前記二本鎖の核酸テンプレートを含む一次核酸、
（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを１つ以上含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的で
あり、
（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを１つ以上含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第二の鎖に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
（Ｂ）前記反応混合物を、少なくとも３分間、８０Ｃ未満の温度でインキュベートすること。
（項目３９）
ポリヌクレオチド・テンプレート２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：
（ｉ）前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む核酸
（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補
的であり、
（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
（Ｂ）前記反応混合物を、少なくとも３分間、８０Ｃ未満の温度でインキュベートすること。
（項目４０）
前記二本鎖の核酸テンプレート又はポリヌクレオチド・テンプレートが、前記方法の開始から６０分以内で少なくとも１０倍に増幅される、項目２９〜３９のいずれか１つに記載の方法。
（項目４１）
前記第一のプライマーのテール領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目２９〜３９のいずれか１つに記載の方法。
（項目４２）
その中の流体連通に以下を含む容器：
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、並びに前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域
を含み、並びに前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び
少なくとも１つのコンカテマー鎖であって、前記コンカテマー鎖５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔｒは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
（項目４３）
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記容器が更に第二のコンカテマー鎖を含み、前記第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃを有するヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔ’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は前記Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目４２に記載の容器。
（項目４４）
Ｘが、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]を有する配列を含み、Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポは０〜１０００の間の任意の整数である、項目４２に記載の容器。
（項目４５）
Ｘが０個のヌクレオチドを表す、項目４２に記載の容器。
（項目４６）
その中の流体連通の中に以下を含む容器：
（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（Ｂ）少なくとも第一の鎖を含む核酸テンプレート、
（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチド前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的で
あり、及び
（Ｄ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、３’末
端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
（項目４７）
前記容器が、鎖置換活性を有するDNＡポリメラーゼを含む、項目４２〜４６のいずれか１つに記載の方法。
（項目４８）
前記容器が更に逆転写酵素を含む、項目４７に記載の容器。
（項目４９）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがＲＮＡ分子である、項目４７に記載の容器。
（項目５０）
前記Ｔが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートＲＮＡ配列に類似の、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す、項目４９に記載の容器。
（項目５１）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、ＤＮＡ分子である、項目４２に記載の容器。
（項目５２）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの１つの鎖を含む、項目５１に記載の容器。
（項目５３）
前記第一のプライマーの第一の領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の容器。
（項目５４）
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の容器。
（項目５５）
前記第一のプライマーのテール領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の容器。
（項目５６）
前記第一のプライマーのテール領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が同じ数のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の容器。
（項目５７）
前記容器が更に核酸染料を含む、項目４２〜５６のいずれか１つに記載の容器。
（項目５８）
前記容器が、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目４２〜５７のいずれか１つに記載の容器。
（項目５９）
前記容器が、更に被験者からの生物学的サンプルの少なくとも一部分を含む、項目４２〜５８のいずれか１つに記載の容器。
（項目６０）
前記被験者がヒトである、項目５９に記載の容器。
（項目６１）
２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであって、前記コンテナは集合的に以下を含むキット：
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域
を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり；及び
単離されたＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を
有し：
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域は相補
的である。
（項目６２）
少なくとも第一の鎖を含む標的の目的の核酸を検出するためのキットであって、前記キットは２つ以上の流体的に分離された容器を含み、前記コンテナは集合的に以下を含む：
（Ａ）単離された鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
（Ｂ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的であり、
及び
（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び前記第二のプライマーのテール領域は前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列の相補的なヌクレオチド配列を含む。
（項目６３）
更に逆転写酵素を含む、項目６１又は６２に記載のキット。
（項目６４）
前記第一のプライマーの第一の領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目６１に記載のキット。
（項目６５）
前記第一のプライマーのテール領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目６２に記載のキット。
（項目６６）
前記標的の目的の核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を更に含む、項目６１〜６５のいずれか１つに記載のキット。
（項目６７）
ポリヌクレオチドのテンプレートをコピーする方法であって、以下を含む方法：
熱サイクリングの無い条件下でポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物をインキュベートすることであって：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分及び第二の部分を含み；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の領域に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの複数のコピーが生成される。
（項目６８）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、第三の部分を更に含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である項目６７の方法。
（項目６９）
ポリヌクレオチドのテンプレートを増幅する方法であって、前記方法は第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中に前記ポリヌクレオチドのテンプレートをインキュベートすることを含み：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分、第二の部分及び第三の部分を
含み、前記第三の部分は前記ポリヌクレオチドのテンプレートの中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
（項目７０）
ポリヌクレオチドのテンプレート中のヌクレオチド配列の中の目的の部分のヌクレオチドの同一性を評価する方法であって、以下を含む方法：
Ａ）少なくとも第一の反応混合物及び第二の反応混合物のそれぞれの中の前記ポリヌクレオチドのテンプレートのコピーを提供することであって：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；
前記第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーのコピーを含み：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり、
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；
前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第三のプライマー、及び第四のプライマーのコピーを含み：
前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第四のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；
前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第四のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチドの分だけ異なり、前記第二及び第四のプライマーにおける異なるヌクレオチドの位置は、前記第二のプライマーの第一の領域又は第四のプライマーのヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に対して、前記配列の最大の相補性により配向している場合には、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中の目的のヌクレオチドの位置に対応し；
Ｂ）熱サイクリングの無い条件下で前記第一の反応混合物及び第二の反応混合物をインキュベートすること；及び
Ｃ）前記第一の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度と比較することであって、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の速度又は量は、前記第二又は第四のプライマーの第一の領域及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列の間の相補性の程度を示す。
（項目７１）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートがＤＮＡ鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、ＲＮＡ鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、二本鎖ＤＮＡ分子の一つの鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７４）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分が、それぞれ長さにおいて６〜３０ヌクレオチドの間である、項目６７〜７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分が、長さにおいて４〜１４ヌクレオチドの間である、項目６７〜７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
前記反応混合物中のポリヌクレオチドのテンプレートのコピー数が、前記方法の開始から６０分以内に少なくとも１０倍に増加する、項目６７〜７５のいずれかに記載の方法。
（項目７７）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの少なくとも３つのコピーを含むコンカテマー鎖が、前記反応混合物のインキュベーション中に形成される、項目６７〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
二本鎖の核酸分子を増幅する方法であって、前記方法は第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中の二本鎖の核酸分子をインキュベートすることを含み：
前記二本鎖の核酸分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、前記第一の鎖は第一の部
分及び第三の部分を含み、及び前記第二の鎖は第二の部分を含み；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記第一の鎖の第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記第二の鎖の第二の部分に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は前記第一の鎖の第三の部分に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的である。
（項目７９）
前記反応混合物が、熱サイクリングなしでインキュベートされる、項目６９〜７８のいずれかに記載の方法。
（項目８０）
前記反応混合物が更に核酸染料を含む、項目６７〜７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目６７〜８０のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
以下を含む反応混合物：
ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含
み：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
（項目８３）
前記反応混合物が、更に鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む項目８２の反応混合物。
（項目８４）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目８２〜８３のいずれにかの反応混合物。
（項目８５）
前記反応混合物が、更に核酸染料を含む、項目８２〜８４のいずれにかの反応混合物。
（項目８６）
前記反応混合物が、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目８２〜８５のいずれにかの反応混合物。
（項目８７）
前記ポリヌクレオチドのテンプレーがＤＮＡ鎖である、項目８２〜８６のいずれにかの反応混合物。
（項目８８）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートがＲＮＡ鎖である、項目８２〜８７のいずれにかの反応混合物。
（項目８９）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが二本鎖ＤＮＡ分子の一部分である、項目８２〜８８のいずれにかの反応混合物。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分が、長さにおいて、６〜３０ヌクレオチドの間である、項目８２〜８９のいずれにかの反応混合物。
（項目９１）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分が、長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドの間である、項目８２〜９０のいずれかの反応混合物。
（項目９２）
ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅のためのキットであって、以下を含むキット：
第一のプライマー及び第二のプライマーであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。
（項目９３）
前記第一のプライマー及び前記第二のプライマーは、流体的に分離された容器中にある、項目９２のキット。
（項目９４）
２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであって、前記容器が以下のものを集合的に含むキット：
第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第四のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；
前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチドにより、前記第三のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは異なる。
（項目９５）
前記第二のプライマーの第一の領域及び前記第四のプライマーの第一の領域の両方が、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分が、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する、項目９４のキット。
（項目９６）
前記キットが、更に前記ポリヌクレオチドのテンプレートのヌクレオチド配列を含む対照核酸鎖を含む、項目９２〜９５のいずれかのキット。
（項目９７）
前記キットが、更に鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、項目９２〜９６のいずれかのキット。
（項目９８）
前記キットが、更に逆転写酵素を含む、項目９２〜９７のいずれかのキット。
（項目９９）
前記キットが、更に核酸染料を含む、項目９２〜９８のいずれかのキット。
（項目１００）
前記キットが、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目９２〜９９のいずれかのキット。
（項目１０１）
前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域が長さにおいて、６〜３０ヌクレオチドの間である、項目９２〜１００のいずれかのキット。
（項目１０２）
前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域が長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドの間である、項目９２〜１０１のいずれかのキット。