【手続補正書】
【提出日】平成29年5月25日(2017.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）、式（II）、式（III）または式（IV）で示される構造の化合物：
【化１】
2017514812.tif 000001
2017514812.tif 000002
または薬学的に許容されるその塩［式中、
PCAはリガーゼが特異的に認識する基質にある配列であり；
LA1、LA2は連接ドメインであり；
a、pは独立に0または１であり、即ち、LA1またはLA2の有無が独立となり；
CCA’ は化学カップリングドメインであり；
2017514812.tif 000003
は単結合または二重結合を指し；
Yはペイロードであり、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、低分子化合物、生物物質から選ばれ；
ｚは1−1000までの任意の整数である］。
【請求項２】
リガーゼはSortase酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
PCAリガーゼが特異的に認識する基質にある配列であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
PCAが、グリシンまたはアラニンからの一つまたは多数のユニットを1−100まで直列接続して構成されることを特徴とする、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Yが放射性マーカー、蛍光マーカー、親和性精製マーカー、トレーサー、抗腫瘍薬物または細胞毒素分子であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Yがメイタンシンまたはその誘導体、パクリタキセルまたはその誘導体、オーリスタチンまたはその誘導体、エポチロンまたはその誘導体、ビンブラスチン類化合物であることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
下記に示す化合物から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の化合物：
【化２】
2017514812.tif 000004
2017514812.tif 000005
2017514812.tif 000006
2017514812.tif 000007
2017514812.tif 000008
2017514812.tif 000009
2017514812.tif 000010
［式中、ｎは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、ｘは−ＯＨ又は−ＮＨ２基である］。
【請求項８】
下記に示す方法で作製することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物が含まれる組成物：
A）Y溶液と
2017514812.tif 000011
溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
2017514812.tif 000012
溶液を得る；
または、
Y溶液と
2017514812.tif 000013
溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
2017514812.tif 000014
溶液を得る。この条件下、Yに-S-(LA2)pグループが付加される；
または、
Y溶液と
2017514812.tif 000015
溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
2017514812.tif 000016
溶液を得る；
または、
Y溶液と
2017514812.tif 000017
溶液と混合し、インキュベートした後、複合物質
2017514812.tif 000018
溶液を得るステップ（この条件下、Yに
2017514812.tif 000019
グループが付加される）；
B）ステップA)で作製した複合産物
2017514812.tif 000020
溶液または
2017514812.tif 000021
溶液に、開環反応を促進するトリスベース溶液またはほかの開環反応促進溶液を加えるステップ。
【請求項９】
得られた産物をさらにHPLCで精製することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
式（I）、式（II）、式（III）または式（IV）で示される化合物の総量が50％モル比を超えることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される構造の化合物：    
【化３】
2017514812.tif 000022
または薬学的に許容されるその塩［式中、
Aはタンパク質、ペプチド、シグナル伝達因子、細胞増殖因子、免疫グロブリンまたは抗体であり；
LA1、LA2、LA3はそれぞれ独立的な連接ドメインであり、LA3はグリシンまたはアラニンからの一つまたは多数のユニットを1−100まで直列接続して構成され；
a、bとpは独立に0または１であり、即ち、LA1、LA2 またはLA3の有無が独立となり；
PCAとFはリガーゼが認識する特異的な認識配列であり、前記リガーゼの作用により、PCAはFと特異的に結合し；
CCA’ は化学カップリングドメインであり；
2017514812.tif 000023
は単結合または二重結合を指し；
Yはペイロードであり、水素、核酸配列、短ペプチド配列、ポリペプチド、タンパク質、化合物、生物物質から選ばれ；
ｚは1−20までの任意の整数であり；
ｄは1−20までの任意の整数である］。
【請求項１２】
Aが抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
FがLA3を介して、または直接に共有結合により、Aの重鎖または軽鎖のC末端に連接することを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
リガーゼがSortase酵素または改変型ペプチド転移酵素を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
Fがリガーゼのドナー基質に特異的な認識配列であり、PCAはリガーゼの受容体基質に特異的な認識配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
FがX1X2X3TX4X5であることを特徴とする、請求項１５に記載の化合物［式中、X1はロイシンまたはアスパラギンであり、X2はプロリンまたはアラニンであり、X3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つであり、Tはスレオニンであり、X4はグリシン、セリン、アスパラギンまたは存在せず、X5は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つまたは存在しない］。
【請求項１７】
FがLPX3T或いはLPX3TGGであることを特徴とする、請求項１６に記載の化合物［式中、Lはロイシンであり、Pはプロリンであり、X3は天然または非天然アミノ酸のうちのいずれか１つであり、Tはスレオニンであり、Gはグリシンである］。
【請求項１８】
PCAがグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成されることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１９】
ｄが1−20までの任意の整数であることを特徴とする、請求項１１〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
Yが放射性マーカー、蛍光マーカー、親和性精製マーカー、トレーサー、抗腫瘍細胞薬物または細胞毒素分子であることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２１】
Yがメイタンシンまたはその誘導体、パクリタキセルまたはその誘導体、オーリスタチンまたはその誘導体、エポチロンまたはその誘導体、ビンブラスチン類化合物であることを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
下記に示す化合物から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物：
【化４】
2017514812.tif 000024
2017514812.tif 000025
2017514812.tif 000026
2017514812.tif 000027
2017514812.tif 000028
2017514812.tif 000029
［式中、ｎは1−100までの任意の整数であり、ｍは0または1−1000までの任意の整数であり、ｄは1−20までの任意の整数であり、Aは抗体であり、LA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成され、ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無が独立となり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸であり、ｘは−ＯＨ又は−ＮＨ２基である］。
【請求項２３】
下記に示す方法で作製することを特徴とする、請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物が含まれる組成物：
i) 請求項１〜７のいずれかに記載の式（I）、式（II）、式（III）或いは式（IV）に示す化合物を作製するステップ；
ii) 請求項１１〜２２のいずれかに記載のA-（LA3）b-Fを作製するステップ；
iii）リガーゼを加え、ii)で得られたA-（LA3）b-Fをステップｉ）の式（I）、式（II）、式（III）或いは式（IV）に示す化合物と、前記リガーゼの作用に適切な条件下で連接するステップ。
【請求項２４】
式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される化合物の総量が80％モル比を超えることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
動物における細胞増殖を抑制するための、請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物または請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
動物が哺乳類動物であることを特徴とする、請求項２５に記載の化合物又は組成物。
【請求項２７】
動物がヒトであることを特徴とする、請求項２６に記載の化合物又は組成物。
【請求項２８】
ヒトの疾病予防と治療に用いる薬物を製造するための、請求項１１〜２２のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２９】
疾病が腫瘍または自己免疫疾病を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
腫瘍細胞表面が化合物または組成物が認識、結合する特異的抗原または受容体タンパク質を有することを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
腫瘍細胞表面が有する特異的抗原または受容体タンパク質はErbB2/Her2であることを特徴とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
腫瘍が乳がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、または食道がんであることを特徴とする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
請求項１１〜２２のいずれかに記載の式（V）、式（VI）、式（VII）または式（VIII）で示される構造の化合物または薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３４】
冷凍乾燥粉末注射剤または注射液であることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【化４】
2017514812.tif 000030
2017514812.tif 000031
2017514812.tif 000032
2017514812.tif 000033
2017514812.tif 000034
2017514812.tif 000035
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
その中で、ｎは1−100までの任意の整数であり、ｍは0または1−1000までの任意の整数であり、ｄは1−20までの任意の整数である。LA3はグリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】開環反応模式図。
【図２】リガーゼの触媒反応による連接技術模式図。
【図３】リンカー1の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図４】リンカー2の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図５】リンカー3の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図６】リンカー4の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図７】リンカー5の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図８】リンカー6の構造（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図９】リンカー7の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１０】リンカー8の構造（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１１】リンカー1-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１２】リンカー2-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１３】リンカー3-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１４】リンカー4-DM1中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図１５】リンカー1-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図１６】リンカー2-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図１７】リンカー3-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図１８】リンカー4-DM1中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図１９】リンカー5-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図２０】リンカー6-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図２１】リンカー7-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図２２】リンカー8-MMAE中間物の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基である）。
【図２３】リンカー5-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図２４】リンカー6-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図２５】リンカー7-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、AとBは異性体である）。
【図２６】リンカー8-MMAE中間物の開環構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、Xは-OHまたは-NH2基であり、mは0または1−1000までの任意の整数であり、AとBは異性体である）。
【図２７】優先的に選んだADC1の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図２８】優先的に選んだADC2の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図２９】優先的に選んだADC3の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。mは0または1−1000までの任意の整数であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図３０】優先的に選んだADC4の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。mは0または1−1000までの任意の整数であり、LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図３１】優先的に選んだADC5の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図３２】優先的に選んだADC6の構造模式図（nは1−100までの任意の整数であり、dは1−20までの任意の整数であり、リガーゼの認識配列LPXTにおけるXはグルタミン酸（E）またはほかの天然/非天然アミノ酸である。LA3は連接ドメインであり、グリシン及びアラニンの一つまたは多数からなるユニットを1−100まで直列接続して構成される。ｂは独立に0または１であり、即ち、LA3の有無がｂ値次第となる。Xは-OHまたは-NH2基であり、AとBは異性体である）。
【図３３】リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)におけるUPLC解析結果。
【図３４】リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)における質量分析解析結果。
【図３５】リンカー2-DM1中間物(n=3、閉環)開環反応のプロセス。A、B、C、DとEはそれぞれ開環反応が20分、40分、60分、2時間、4時間まで進行するUPLCの解析結果。
【図３６】リンカー2-DM1中間物（n=3、開環）におけるUPLC解析結果。
【図３７】リンカー2-DM1中間物(n=3、開環) における質量分析解析結果。
【図３８】ADC薬物GQ1001におけるSDS-PAGE解析結果。
【図３９】ADC薬物GQ1001 軽鎖におけるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）解析結果。 A、軽鎖の質量分析図；B，ProMass 2.8 ソフトで計算した畳み込みを除いた軽鎖における相対分子量（25281）。
【図４０】ADC薬物GQ1001におけるHIC-HPLC解析結果。
【図４１】ADC薬物GQ1001におけるSEC-HPLC解析結果。
【図４２】ADC薬物GQ1001はBT474細胞表面受容体ErbB2/Her2に対する結合親和性。
【図４３】ADC薬物GQ1001はSK-BR-3細胞表面受容体ErbB2/Her2に対する結合親和性。
【図４４】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のMCF-7細胞増殖に対する影響。
【図４５】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のMDA-MB-468細胞増殖に対する影響。
【図４６】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のBT-474細胞増殖に対する影響。
【図４７】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のSK-BR-3細胞増殖に対する影響。
【図４８】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のHCC1954細胞増殖に対する影響。
【図４９】GQ1001、Kadcyla、DM1のSK-OV-3細胞増殖に対する影響。
【図５０】GQ1001、Kadcyla、Herceptin、DM1のNCI-N87細胞増殖に対する影響。
【図５１】ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈投与による薬物動態学分析。SDラットにGQ1001（10mg/kg）またはKadcyla（10mg/kg）を尾静脈により投与し、ELISAでラット血中総ADC薬物濃度を測定した。
【図５２】ADC薬物GQ1001はHCC1954 移植ヌードマウスに対する腫瘍増殖抑制（n=10、Mean ± SEM.）。
【図５３】ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈により投与した後の体重変化。健康成年雌性ラットにGQ1001（6、60mg/kg）またはKadcyla（60mg/kg）を単回尾静脈により投与した。GQ1001投与群にラットの体重変化は溶媒投与群と比べ有意な差は示されなかった（P>0.05）。Kadcyla投与群にラットの体重は顕著に減少したことを発見した（P<0.05 vs Vehicle）。
【図５４】ラットにGQ1001またはKadcylaを単回尾静脈により投与した後のALTとAST変化。健康成年雌性ラットにGQ1001（6、60mg/kg）またはKadcyla（60mg/kg）を単回尾静脈により投与した。GQ1001投与群にラット血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）濃度およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）濃度は溶媒投与群と比べ有意な差は示されなかった（P>0.05）。Kadcyla投与群にラット血中ALTおよびAST濃度は顕著に上昇したことを発見した（P<0.05 vs Vehicle）。
【図５５】リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間体（n=3）開環反応液におけるHPLC解析結果。
【図５６】リンカー5-Mc-Val-Cit-Pab-MMAE薬物中間体（n=3）開環反応液におけるMALDI-TOF質量分析解析結果。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本発明は改良したカップリングシステムを提供し、ADC薬物においてリンカーの安定性と異質性の問題を解決する。本発明に提供した解決案は核酸ターゲット薬物の作製および診断用トレーサーの作製に応用できる。本発明にはリンカーとその作製方法、リンカー―細胞毒素中間物（Linker−Payload intermediate）とその作製方法、開環安定構造リンカー―細胞毒素中間物とその作製方法が含まれる。本発明には遺伝子工学的手段で改良したHerceptinまたはほかの抗ヒトErbB2 ／Her2抗体、リンカー（Linker）および修飾されたメイタンシンまたはその誘導体、オーリスタチン（Auristatins）またはその誘導体MMAEをLDC技術プラットフォームでカップリングすることによって形成した新世代ADC薬物およびその作製方法と応用が含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】
2017514812.tif 000036
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２８】
2017514812.tif 000037
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
2017514812.tif 000038
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３０】
2017514812.tif 000039
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３１】
2017514812.tif 000040
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２】
2017514812.tif 000041