【手続補正書】
【提出日】平成29年3月21日(2017.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非哺乳動物の宿主細胞培養抽出物又はホモジネートに含まれる、組換え発現された三重らせんタンパク質を精製するための方法であって、
（ｉ）酸性条件下で、かつ三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、三重らせんタンパク質から宿主細胞物質を沈殿させ、その後に
（ｉｉ）沈殿させた宿主細胞培養抽出物又はホモジネート中に存在する宿主細胞物質を、プロテアーゼを添加することにより消化し、ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が前記消化に対して耐性である、そして、
（ｉｉｉ）精製した三重らせんタンパク質を収集する
工程を含み、前記三重らせんタンパク質が、少なくとも工程（ｉ）から（ｉｉ）の全体にわたり可溶性の状態を保つ、方法。
【請求項２】
前記三重らせんタンパク質が、工程（ｉ）から（ｉｉｉ）の全体にわたり可溶性の状態を保つ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記消化が、酸性プロテアーゼを用いて実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が、細菌、酵母菌、又は植物の宿主細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酸性条件は、７未満のｐＨを意味する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記沈殿させる工程が、前記三重らせんタンパク質の融解温度より低い温度、好ましくは、前記組換え三重らせんタンパク質の融解温度（Ｔｍ）よりも少なくとも１０℃以上低い温度、で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記沈殿させる工程と前記消化する工程との間に、沈殿させた宿主細胞物質から前記三重らせんタンパク質を物理的に分離する追加の中間の分離工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
中間の前記分離工程が、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過、又は沈降のうちの１つ又は複数より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）  前記ｐＨが２から４の間であり、及び前記宿主細胞が細菌宿主細胞である；
（ｉｉ）前記ｐＨが４から６の間であり、及び前記宿主細胞が酵母菌宿主細胞である；あるいは、
（ｉｉｉ）前記ｐＨが２から４．５の間であり、及び前記宿主細胞が植物宿主細胞である、
請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解作用に対して不安定なタンパク質よりも、タンパク質分解作用に対して安定なタンパク質が選択的に精製される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記三重らせんタンパク質の沈殿が、硫酸アンモニウムの添加により、ｐＨ調整又は温度調整により、及び／又はポリマー（例えばポリエチレングリコール）の使用により達成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
収集された前記三重らせんタンパク質が、安定化剤により安定化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記三重らせんタンパク質が、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ反復モチーフを含み、式中ｎは、５から６００の間であり、そして、Ｘ及びＹは独立して、任意の天然又は非天然のイミノ酸又はアミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記三重らせんタンパク質が、コラーゲンである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記三重らせんタンパク質の配列が、細菌、酵母菌、植物、昆虫、又はカイコに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
本開示の幅広い一般的範囲から逸脱せずに、上記実施形態に対して非常に多くの変更及び／又は修正を加えることができるものと、当業者には認識される。したがって本実施形態は、あらゆる観点において説明を目的としており、制限的ではないとみなされる。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
非哺乳動物の宿主細胞培養抽出物又はホモジネートに含まれる、組換え発現された三重らせんタンパク質を精製するための方法であって、
（ｉ）酸性条件下で、かつ三重らせんタンパク質が熱的に安定な状態を保つ温度で、三重らせんタンパク質から宿主細胞物質を沈殿させ、その後に
（ｉｉ）沈殿させた宿主細胞培養抽出物又はホモジネート中に存在する宿主細胞物質を、プロテアーゼを添加することにより消化し、ここにおいて、前記三重らせんタンパク質が前記プロテアーゼに対して耐性である、そして、
（ｉｉｉ）精製した三重らせんタンパク質を収集する
工程を含み、前記三重らせんタンパク質が、少なくとも工程（ｉ）から（ｉｉ）の全体にわたり可溶性の状態を保つ、方法。
［態様２］
前記三重らせんタンパク質が、工程（ｉ）から（ｉｉｉ）の全体にわたり可溶性の状態を保つ、態様１に記載の方法。
［態様３］
前記消化が、酸性プロテアーゼを用いて実施される、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
前記宿主細胞が、細菌、酵母菌、又は植物の宿主細胞である、態様１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［態様５］
酸性条件は、７未満のｐＨを意味する、態様１〜４のいずれか一項に記載の方法。
［態様６］
前記沈殿させる工程が、前記三重らせんタンパク質の融解温度より低い温度で実施される、態様１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［態様７］
前記沈殿させる工程と前記消化する工程との間に、沈殿させた宿主細胞物質から前記三重らせんタンパク質を物理的に分離する追加の分離工程をさらに含む、態様１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［態様８］
中間の前記分離工程が、遠心分離、濾過、クロスフロー濾過、又は沈降のうちの１つ又は複数より選択される、態様７に記載の方法。
［態様９］
前記発現された三重らせんタンパク質が、前記宿主細胞中で細胞内生産される、態様１〜８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］
前記発現された三重らせんタンパク質が、前記宿主細胞から分泌される、態様１〜８のいずれか一項に記載の方法。
［態様１１］
前記三重らせんタンパク質を含有する宿主細胞培養抽出物又はホモジネートを生産する追加の工程を含む、態様１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［態様１２］
前記組換え三重らせんタンパク質の融解温度（Ｔｍ）で実施される、態様１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１３］
前記温度が、前記組換え三重らせんタンパク質のＴｍよりも少なくとも１０℃以上低い、態様１２に記載の方法。
［態様１４］
前記ｐＨが、２から４の間であり、及び前記宿主細胞が、細菌宿主細胞である、態様５に記載の方法。
［態様１５］
前記ｐＨが、４から６の間であり、及び前記宿主細胞が、酵母菌宿主細胞である、態様５に記載の方法。
［態様１６］
前記ｐＨが、２から４．５の間であり、及び前記宿主細胞が、植物宿主細胞である、態様５に記載の方法。
［態様１７］
前記三重らせんタンパク質が、タンパク質分解作用に対して安定である、態様３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
［態様１８］
タンパク質分解作用に対して不安定なタンパク質よりも、タンパク質分解作用に対して安定なタンパク質が選択的に精製される、態様３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
［態様１９］
収集された前記三重らせんタンパク質から、宿主細胞の核酸が除去される、態様１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［態様２０］
前記三重らせんタンパク質の沈殿が、硫酸アンモニウムの添加により、ｐＨ調整又は温度調整により、及び／又はポリマー（例えばポリエチレングリコール）の使用により達成される、態様１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
［態様２１］
収集された前記三重らせんタンパク質が、安定化剤により安定化される、態様１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
［態様２２］
前記三重らせんタンパク質が、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ反復モチーフを含み、式中ｎは、５から６００の間である、態様１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
［態様２３］
前記三重らせんタンパク質が、コラーゲンである、態様１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
［態様２４］
前記三重らせんタンパク質の配列が、細菌、酵母菌、植物、昆虫、又はカイコに由来する、態様１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
［態様２５］
態様１〜２４のいずれか一項に記載の方法により精製された、三重らせんタンパク質。
［態様２６］
態様１〜２４のいずれか一項に記載の方法により取得された、精製された三重らせんタンパク質。
［態様２７］
熱的又は化学的変性によりゼラチンに変換される、態様２５又は２６に記載の三重らせんタンパク質。