(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるポリメラーゼの機能性アミノ酸断片からなるポリメラーゼキメラであって、これらの機能性アミノ酸断片が該ポリメラーゼキメラ中で活性であり、ポリメラーゼ活性をもつドメインが第１のポリメラーゼに由来し、3'−5'エキソヌクレアーゼ活性をもつドメインが第２のポリメラーゼに由来し、そして該ポリメラーゼキメラのアミノ酸配列が配列番号10に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、上記ポリメラーゼキメラ。
【請求項２】
前記キメラがさらにRT活性をもつ、請求項１項記載のポリメラーゼキメラ。
【請求項３】
前記キメラのアミノ酸配列にヒスチジンタグが組み込まれている、請求項１または２記載のポリメラーゼキメラ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラをコードするDNA。
【請求項５】
配列番号４に示されるポリメラーゼキメラをコードするDNA。
【請求項６】
請求項４または５記載のDNA配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含む形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラの作製方法であって、次のステップ：
−  アミノ酸配列アライメント、３次元モデル、または実験的に決定された３次元構造の助けをかりて変異体を設計すること、
−  遺伝子工学的操作によりドメイン交換変異体を作製すること、
−  出発ベクターに該DNA断片を連結すること、
−  該DNA断片を担うベクターにより形質転換された宿主において該キメラを発現させること、
−  発現されたポリメラーゼキメラを精製すること、
を含んでなる方法。
【請求項９】
PCRのための請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラの使用。
【請求項１０】
DNA断片の配列を決定するための請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラの使用。
【請求項１１】
RNA鋳型により開始するRT-PCRのための請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラの使用。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリメラーゼキメラを含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特定の用途に対して有利である、天然ポリメラーゼの諸性質を合わせもつ、ドメインを表すアミノ酸断片から構成されるポリメラーゼキメラに関するものである。驚いたことに、各種の酵素からのドメインは該キメラ中で活性であり、協働作用を示すことがわかった。本発明は特に、ポリメラーゼ活性を有するドメインと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインが異なる酵素に由来するようなポリメラーゼキメラに関する。この種のキメラはＲＴ活性をもつこともできる。さらに、本発明は、本発明によるキメラの作製方法、並びに、例えばポリメラーゼ連鎖反応において、核酸を合成するための該キメラの使用に関する。また、本発明は、本発明のポリメラーゼキメラを含有するキットに関する。
【０００２】
Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ， Ｄ．Ｋ．およびＩｔｏ， Ｊ． （１９９３） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１， ７８７−８０２によると、ＤＮＡポリメラーゼはそれらのアミノ酸配列の類似性に従って３つの主要なファミリー（サブクラスを含む）に分類される。Ｊｏｙｃｅ， Ｃ．Ｍ．およびＳｔｅｉｔｚ， Ｔ．Ａ． （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３， ７７７−８２２には、見出されたモチーフと保存アミノ酸がまとめて記載されている。原核生物においては、主に３種類のポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩに区別される。これらのポリメラーゼは細胞内でのそれらの機能の点で相違し、またそれらの性質の点でも相違する。ＤＮＡポリメラーゼＩは修復酵素であると考えられており、しばしば５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ。ポリメラーゼＩＩは損傷した鋳型鎖から開始するＤＮＡ合成を促進すると考えられており、それゆえに突然変異を防止する。ポリメラーゼＩＩＩは細胞の複製酵素であり、ヌクレオチドを高速（約３０，０００／分）で合成し、非常に高いプロセッシビティー（連続的合成能）をもつと考えられている。ポリメラーゼＩＩＩは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもっていない。ポリメラーゼ類のその他の性質は、それらの起源、例えば熱安定性またはプロセッシビティーによるものである。
【０００３】
ポリメラーゼの特定の性質はその用途に従うことが望ましい。例えば、熱安定性で、忠実度が高く（すなわち、プルーフリーディング活性をもつポリメラーゼ）、プロセッシブで、高速合成能のポリメラーゼはＰＣＲに適している。ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドをそれほど区別しない酵素は配列決定に適している。これに対して、ポリメラーゼのプルーフリーディング（校正）活性、すなわち３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は配列決定には好ましくない。ＰＣＲなどのいくつかの用途においては、ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（５’ヌクレアーゼ活性）を全くもたないか、ほとんどもたないことが望ましい。
【０００４】
ポリメラーゼはまた、鋳型としてＲＮＡを受け入れるその能力、すなわちその逆転写酵素（ＲＴ）活性の点で相違しうる。ＲＴ活性はマンガンおよび／またはマグネシウムイオンの存在に依存性でありうる。多くの場合、ポリメラーゼのＲＴ活性はマンガンイオンに非依存性であることが望ましい。なぜならば、ポリメラーゼのリーディング精度はマンガンイオンの存在下で低下するからである。さらに、ポリメラーゼはそのプロセッシビティーの点でも相違し、プロセッシビティーは多くの用途にとって望ましい性質である。
【０００５】
したがって、特定の用途に関してポリメラーゼの性質を最適化するという必要性が存在する。以前には、かかる必要性はしばしばポリメラーゼに突然変異を導入したり、ポリメラーゼの機能を欠失させたりすることによって達成されていた。
【０００６】
こうして、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、突然変異の導入（Ｍｅｒｋｅｎｓ， Ｌ．Ｓ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２６４， ２４３−２４８）またはトランケーション（Ｊａｃｏｂｓｅｎ， Ｈ． （１９７４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５， ６２３−６２７； Ｂａｒｎｅｓ， Ｗ．Ｍ． （１９９２） Ｇｅｎｅ １１２， ２９−３５）によって除去された。ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドを区別するポリメラーゼの能力は、点突然変異を導入することによって低下させた（Ｔａｂｏｒ Ｓ．およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｃ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２， ６３３９−６３４３）。ＴａｂｏｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎは、活性部位ハイブリッドの構築について記載している。
【０００７】
最適化された性質をもつポリメラーゼを提供する目的は、構造的および機能的に互いに独立しているドメインを交換することによりポリメラーゼのキメラを作製することで、初めて本発明により達成された。本発明においてドメインとは、そのドメインが本質的にその機能を保持するように、全ての必須中心または全ての機能的に重要なアミノ酸を含む領域として理解される。それゆえ、ドメインの一部のみ、つまりドメインの機能性断片を交換することも可能である。かくして、本発明においては、これらのドメインを機能性アミノ酸断片ということができる。さらに、突然変異またはトランケーションによって前記キメラを改変することもできる。それが有利であると考えられるならば、それぞれの用途に応じてその性質をさらに最適化する突然変異を前記キメラに導入することも可能である。例えば、ポリメラーゼのジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとを識別する能力を低減させる突然変異を導入することができる。あるいはまた、プロセッシビティーのような望ましい性質を、突然変異の導入またはトランケーションによって強化したり、導入したりすることもできる。また、突然変異やトランケーションの導入によって、５’ヌクレアーゼ活性などの望ましくない性質を取り除くことも可能である。
【０００８】
かくして、本発明の主題は、特定の用途に応じて天然のポリメラーゼの有利な性質を合わせもつポリメラーゼキメラである。本発明によるポリメラーゼキメラは、異なる酵素の機能性アミノ酸断片（好ましくは、異なる酵素のドメインを表すもの）から構成される。本発明では、驚いたことに、異なる酵素からのドメインが該キメラ中で活性であり、ドメイン間で協働作用を示すことが見出された。本発明はまた、最適化された性質をもつポリメラーゼキメラの一般的な作製方法に関する。それゆえ、この本発明方法は、ドメインを交換することにより酵素の任意の組合せからキメラを設計することを可能にする。さらに、ドメイン間の接触部位での相互作用を種々の方法で調和させることが好適である。これは例えばキメラの熱安定性の向上をもたらす。本発明の更なる主題は、本発明によるキメラを含む核酸合成用のキットである。
【０００９】
プルーフリーディング機能をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて実際に用いられる機会が増えつつある。Ｔａｑポリメラーゼと熱安定性プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ）の混合物を使用すると、特に長いＤＮＡ分子をうまく増幅できることがわかった。したがって、本発明の更なる主題は、Ｔａｑポリメラーゼの高いプロセッシビティーおよび熱安定性と、別のＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とを、１つの酵素にまとめることであった。それゆえ、本発明は特に、少なくともＴａｑポリメラーゼのプロセッシビティーに相当するプロセッシビティーを有し、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性）の存在ゆえに増幅反応中にポリマー鎖にヌクレオチドを組み込むときの誤差率が低い熱安定性ポリメラーゼキメラに関する。これら２つの性質を組み合わせることにより、例えば長いＰＣＲ産物、すなわち２ｋｂ以上の核酸断片を作る能力を備えたキメラを作製することが可能となる。本発明によるキメラは比較的短い断片にも適している。
【００１０】
かくして、本発明は特に、２つの異なるポリメラーゼの機能性アミノ酸断片から成るポリメラーゼキメラに関し、ここで第１または第２ポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、それゆえ該ポリメラーゼキメラは５’−３’ポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものである。ポリメラーゼは天然のポリメラーゼであっても、組換え体のポリメラーゼであってもよい。本発明によるポリメラーゼキメラは２種類または数種類の異なるポリメラーゼに由来する機能性アミノ酸断片から構成することができる。本発明によるポリメラーゼキメラは異なるポリメラーゼに由来する２種類または数種類の機能性アミノ酸断片から構成することができる。該断片のアミノ酸配列は天然のポリメラーゼの配列または突然変異によって改変された配列に相当するものであり得る。
【００１１】
ポリメラーゼキメラ構築用のアミノ酸断片は、第１または第２ポリメラーゼの機能性ポリメラーゼドメインに各々一致することが好ましい。本発明の意味する機能性ポリメラーゼドメインは、活性にとって必須である全てのアミノ酸を含有する領域であり、以下ではドメインと省略するものとする。
【００１２】
本発明は特に、少なくとも２つの異なるポリメラーゼからの機能性アミノ酸断片（短いドメイン中の）からなるポリメラーゼキメラに関し、ここでポリメラーゼ活性を有するドメインは１つのポリメラーゼと相同であり、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインはもう１つのポリメラーゼと相同である。さらに、このキメラは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインが第１または第２ポリメラーゼと相同であり得る場合、５’エキソヌクレアーゼ活性をも有する可能性がある。しかし、５’エキソヌクレアーゼドメインが部分的もしくは完全に欠失するか、または点突然変異を有する可能性もある。本発明によるポリメラーゼキメラは、逆転写酵素（ＲＴ）活性をさらに有することができる。
【００１３】
ポリメラーゼキメラのアミノ酸断片の一部がＴａｑポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に一致していることがさらに好ましい。
【００１４】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインまたはアミノ酸断片が該キメラに組み込まれたポリメラーゼは、例えば、Ｐｏｌ−Ｉ型ポリメラーゼか、またはＰｏｌ−ＩＩ型ポリメラーゼでもあり得る。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｏｌ−Ｉ型ポリメラーゼの代表的なものは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ポリメラーゼ（Ｅｃ．１）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ポリメラーゼＩ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ポリメラーゼＩ、テルモシフォン（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏｎ）ポリメラーゼＩおよびテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ポリメラーゼ（Ｔｎｅ）である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｏｌ−ＩＩ型ポリメラーゼの代表的なものは、例えば、ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）ポリメラーゼ（Ｐｗｏ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ポリメラーゼ（Ｔｌｉ）、ピロディクタム・アビシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｕｍ ａｂｙｓｓｉ）ポリメラーゼである。
【００１５】
例として挙げた代表的なＰｏｌ−Ｉ型およびＰｏｌ−ＩＩ型ポリメラーゼを、以下でさらに詳しく説明する。
【００１６】
テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌＩ）およびテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅポリメラーゼ）は、Ａファミリー由来の細菌のＤＮＡポリメラーゼである。それらはｐｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼである。何故なら、様々な酵素活性が、大腸菌 ｐｏｌＩに見られるものとかなり類似した様式で様々なドメインに位置しているからである。ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏポリメラーゼ）は、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ）およびピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）と同様、Ｂファミリーの古細菌のＤＮＡポリメラーゼである。
【００１７】
Ｔａｑポリメラーゼは、Ｃｈｉｅｎ， Ａ．ら（１９７６）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２７， １５５０−１５５７、Ｋａｌｅｄｉｎ， Ａ．Ｓ．ら（１９８０）、Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ４５， ６４４−６５１およびＬａｗｙｅｒ， Ｆ．Ｃ．ら（１９８９）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， ６４２７−６４３７により記載されている。それは、もともと好熱性真正細菌であるテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離され、後に大腸菌中にクローニングされた。該酵素は９４ ｋＤａの分子量を有し、モノマーで活性である。Ｔａｑポリメラーゼは、高い熱安定性（９５℃で４０分／１００℃で５分の半減期）および高度にプロセッシブな５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ（ポリマー化速度：１秒あたり７５ヌクレオチド）を有するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用するのに適している。ポリメラーゼ活性とは別に、５’ヌクレアーゼ活性がＬｏｎｇｌｅｙら（１９９０）、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８、７３１７−７３２２により検出された。この酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を全く有していないため、ポリヌクレオチド鎖を連続的に伸長させるための４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の取り込み中にエラーが生じ、これが遺伝子増幅を妨げる（エラー率：２ ｘ １０−４エラー／塩基、Ｃｈａ， Ｒ．Ｓ．およびＴｈｉｌｌｙ， Ｗ．Ｇ．（１９９３）、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ３， １８−２９）。Ｔａｑポリメラーゼの三次構造は、１９９５年以来公知である（Ｋｉｍら、１９９５、Ｋｏｒｏｌｅｖら、１９９５）。
【００１８】
大腸菌ｐｏｌＩは、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ， Ａ．およびＢａｋｅｒ， Ｔ．Ａ．（１９９２）、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１１３‐１６５に記載されている。この酵素は、１０３ ｋＤａの分子量を有し、モノマーで活性である。大腸菌ｐｏｌＩは、５’ヌクレアーゼ活性および５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。Ｔａｑポリメラーゼとは対照的に、大腸菌ｐｏｌＩはプルーフリーディング機能としての３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をさらに有する。大腸菌ｐｏｌＩおよびそのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎ， Ｈ．ら（１９７４）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５， ６２３−６２７）を、Ｔａｑポリメラーゼの導入の前にＰＣＲに用いた。しかし、その低い熱安定性により、それらはあまり適していない。何故なら、各サイクルでそれらを新しく添加する必要があるからである。大腸菌ｐｏｌＩのクレノー断片の三次構造は、１９８３年以来公知である（Ｂｒｉｃｋ， Ｐ．ら（１９８３）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６， ４５３−４５６、Ｏｌｌｉｓ， Ｄ．Ｌ．ら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１３， ７６２−７６６およびＢｅｅｓｅ， Ｌ．Ｓ．ら（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０， ３５２−３５５）。
【００１９】
Ｔｎｅポリメラーゼは、好熱性真正細菌であるテルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）から単離され、後に大腸菌中にクローニングされた。Ｔｎｅポリメラーゼのアミノ酸配列は、テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＩＴｍａ（登録商標）ポリメラーゼ）のものと類似している（Ｂ． Ｆｒｅｙ博士からの個人的情報）。それは、高い熱安定性、５’ヌクレアーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。不利な点は、Ｔａｑポリメラーゼと比較してポリマー化速度が遅いことである。高い忠実度を要する場合、同様のアミノ酸配列を有するＵＩＴｍａ（登録商標）ポリメラーゼをＰＣＲに用いる。Ｔｎｅポリメラーゼの構造のうち、現在までに公知であるのはアミノ酸配列のみである（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。しかし、この酵素は大腸菌ｐｏｌＩと相同であるため、三次構造は未知であるが、相同性モデリングは可能である。
【００２０】
Ｐｆｕポリメラーゼは、超好熱性海生古細菌であるピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離された。それは、高い熱安定性（９５℃で１時間後に９５％の活性）、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ， Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）、Ｇｅｎｅ １０８， １−６）。ＤＮＡ合成の忠実度は、Ｔａｑポリメラーゼの約１０倍高い。高い忠実度を要する場合、ＰｆｕポリメラーゼをＰＣＲに用いる。構造のうち、現在までに公知であるのは、アミノ酸配列のみである。
【００２１】
Ｐｗｏポリメラーゼ（ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、２８‐３２）は、もともと超好熱性古細菌であるピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）から単離され、後に大腸菌中にクローニングされた。この酵素は、約９０ ｋＤａの分子量を有し、モノマーで活性である。Ｐｗｏポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも高い熱安定性（半減期は１００℃で２時間以上）、高度にプロセッシブな５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ合成の忠実度を増大させる高い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有さない。ポリマー化速度（１秒あたり３０ヌクレオチド）は、Ｔａｑポリメラーゼのものより小さい。高い忠実度を要する場合、この酵素をＰＣＲに用いる。ＤＮＡ合成の忠実度は、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合よりも１０倍以上高い。
【００２２】
Ａｔｈポリメラーゼは、好熱性古細菌であるアネロセルム・テルモフィルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）から単離され、後に大腸菌中にクローニングされた。Ａｔｈポリメラーゼは、高い熱安定性を有し、安定化させる界面活性剤の非存在下で、８０℃で３０分間インキュベートした後にも元の活性の少なくとも９０％の活性を依然として有する。このポリメラーゼは、マグネシウムイオンの存在下ではＲＴ活性をも有する。Ａｔｈポリメラーゼは、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ」、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＤＳＭの受託番号８９９５に寄託されている。Ａｔｈポリメラーゼは、５’−３’ポリメラーゼ活性、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は有さない。
【００２３】
ヒスチジンタグまたは他の精製補助剤を、ポリメラーゼキメラのアミノ酸配列中にさらに組み込んで、精製を改良することができる。
【００２４】
ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を別のポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）中に導入するための主な方法は４つあり、これらも本発明の主題である。
【００２５】
１．Ｔａｑポリメラーゼの分子領域の交換による別のＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ領域の挿入
Ｔａｑポリメラーゼは、機能的および構造的に独立した（Ｊｏｙｃｅ， Ｃ．Ｍ．およびＳｔｅｉｔｚ， Ｔ．Ａ．（１９８７）、ＴＩＢＳ １２、２８８‐２９２）ならびに他のＤＮＡポリメラーゼのモデルとして役に立つ（Ｊｏｙｃｅ， Ｃ．Ｍ．（１９９１）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １、１２３‐１２９）ドメインからなる大腸菌ｐｏｌＩと相同であるので、この手法は特に適している。交換に適したＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼが実証されており、そのＤＮＡ配列が公知であり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺伝子が利用可能であるものである。モデル構造に基づく合理的タンパク質設計については、３’−５’エキソヌクレアーゼ領域およびポリメラーゼ領域が大腸菌ｐｏｌＩと相同であることがさらに有利である。３’−５’エキソヌクレアーゼ領域は、大腸菌ｐｏｌＩの構造によく合致し、Ｔａｑポリメラーゼのポリメラーゼ領域に隣接するのが好ましい。さらなる利点は、タンパク質の構造データおよび高い熱安定性が利用可能であるとともに三次構造が解明されているということである。
【００２６】
従って、例えば以下のＤＮＡポリメラーゼが適している。
【００２７】
ａ． 大腸菌ｐｏｌＩ
熱安定性の他に、大腸菌ｐｏｌＩは、上記の条件を全て満たす。クレノー断片の三次構造は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータバンクにおいて利用可能であり、Ｔａｑポリメラーゼと同様、ＡファミリーのＤＮＡポリメラーゼに属する。アミノ酸配列の同一性は、３２％である。公知のドメイン構造を考慮すると、最大の一致は、２つのタンパク質のＮ末端およびＣ末端領域に認められる（５’ヌクレアーゼドメインにおいては３２％の同一性、ポリメラーゼドメインにおいては４９％の同一性）。より短いＴａｑポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの領域にいくつかの欠失を有している（３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび中間ドメインにおいて１４％の同一性）。大腸菌ｐｏｌＩは熱不安定性であり、キメラタンパク質の２つのドメイン間の境界における相互作用はもはや最適ではないので、おそらく、タンパク質キメラもＴａｑポリメラーゼより熱安定性が低いであろう。これは、境界におけるアミノ酸を続いて改変することにより回復させることができる。
【００２８】
ｂ． 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
現在ＰＣＲに用いられる３’−５’エキソヌクレアーゼを有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの中では、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、ＴｎｅポリメラーゼおよびＵＩＴｍａ（登録商標）ポリメラーゼがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの組合わせに適しているようである。ＰｗｏポリメラーゼおよびＴｎｅポリメラーゼの遺伝子は入手可能である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｍｐａｎｙを介して）。Ｐｆｕポリメラーゼは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．から取得できる。Ｔｎｅポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼおよび大腸菌ｐｏｌＩとの相同性により、合理的タンパク質設計によく適する。Ｐｆｕポリメラーゼを用いる場合、アミノ酸配列のアラインメントに基づいてのみ設計が可能であり、公知の保存的アミノ酸および機能にとって必須であるモチーフを考慮に入れる。
【００２９】
２．中間ドメインにおけるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの改変
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を挿入するためには、活性にとって必須である全てのアミノ酸を構造中に挿入する必要がある。現在の知識によると、これは特にＥｘｏ Ｉ、Ｅｘｏ ＩＩおよびＥｘｏ ＩＩＩの３つのモチーフに当てはまる。触媒作用に必要な空間的位置に置くためには、必須モチーフを適当な方法でさらに結合しなければならない。
【００３０】
ポリメラーゼ領域においてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを改変することも可能である。ポリメラーゼの新規の（ｄｅ ｎｏｖｏ）設計も原理的には考えられる。
【００３１】
本発明によるキメラは、
１．５’ヌクレアーゼドメインを除去すること（タンパク質溶解的にも可能）、または後に５’ヌクレアーゼ活性を不活化すること（Ｍｅｒｋｅｎｓ， Ｌ．Ｓ．（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２６４， ２４３−２４８に記載されている）、
２．点突然変異または断片交換により改変すること、
３．キメラの境界での構造を最適化すること、
４．ランダム突然変異誘発および／または他のポリメラーゼ遺伝子とのランダム組換えにより最適化すること（分子進化）、
によりさらに最適化できる。
【００３２】
本発明によるポリメラーゼキメラの例を以下に挙げる。
【００３３】
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｖ３０７） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ３５５−Ｄ５０１） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ４０６−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｋ５１１） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ４１６−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｈ５１９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）：点突然変異 Ａ６４３Ｇ； Ｉｌｅ４５５Ｖａｌ 配列番号１
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｖ５３６） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ４４１−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｇ５４４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）；配列番号２
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ３０２） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ３４８−Ｓ３６５） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ３１９−Ｅ３４７） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ４５０−Ｔ５０５） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４１０−Ｅ４８３２）；
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｖ３０７） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ３２３−Ｄ４６８） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ４０６−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｉ４７８） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ４１６−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｅ４８５） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）；サイレント突然変異 Ａ１４４９Ｃ 配列番号３
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｖ５０２） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ４４１−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｇ５１０） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）；サイレント突然変異 Ｃ１７６７Ｔ 配列番号４
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ３０２） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ３１６−Ｄ３３３） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ３１９−Ｅ３４７） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ３８１−Ｍ３９４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ３６２−Ｌ３８０） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４１５−Ｔ４７２） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４１０−Ｅ８３２）；
・Ｇ３０８Ｄ／Ｖ３１０Ｅ／Ｌ３５２Ｎ／Ｌ３５６Ｄ／Ｅ４０１Ｙ／Ｒ３０５Ｄ
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｒ３４６） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１０３−Ｓ３３４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）；配列番号５
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｆ３８９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｆ３８９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）；配列番号６
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｆ３８９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）
上記のポリメラーゼキメラのうち、以下のものをさらに詳しく試験した。
【００３４】
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｈ５１９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）：点突然変異 Ａ６４３Ｇ； Ｉｌｅ４５５Ｖａｌ（Ｔａｑ Ｅｃ１） 配列番号１
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｇ５４４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２），（Ｔａｑ Ｅｃ２） 配列番号２
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｅ４８５） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）；サイレント突然変異 Ａ１４４９Ｃ（Ｔａｑ Ｔｎｅ１） 配列番号３
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｇ５１０） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）；サイレント突然変異 Ｃ１７６７Ｔ（Ｔａｑ Ｔｎｅ２） 配列番号４
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｒ３４６） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２），（Ｔａｑ Ｐｆｕ１） 配列番号５
・Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｆ３８９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２），（Ｔａｑ Ｐｆｕ２） 配列番号６
【００３５】
適当なＤＮＡポリメラーゼを選択するために、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質の利用可能な配列のうちの複数のアミノ酸配列アラインメントを、例えばプログラムＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２、３８７−３９５）を用いて確立する。好適なアラインメントを見つけるためには、二次構造推定、既知構造に基づく配列アラインメント、既知モチーフおよび機能的に必須なアミノ酸、ならびに系統発生的側面を考慮に入れることが必要である。該タンパク質が機能的および構造的に独立したドメインからなる場合、個々のドメインに関してまずアミノ酸配列アラインメントを確立し、その後にのみそれらを完全な配列アラインメントに組合わせることが適当である。
【００３６】
三次構造が既知である相同な配列が見つかった場合、該相同タンパク質から３Ｄモデル構造を誘導することが可能である。プログラムＢＲＡＧＩ（ＲｅｉｃｈｅｌｔおよびＳｃｈｏｍｂｕｒｇ、１９８８、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． ６、１６１‐１６５）を用いてモデルを作成することができる。プログラムＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら、１９８４、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０６、７６５‐７８４）を、個々の分子領域および分子全体の構造のエネルギー最小化のために用いることができ、プログラムＰｒｏｃｈｅｃｋを用いてモデルの質を調べることができる。初めのタンパク質の構造のＣα座標のみが利用可能である場合、例えばプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、１９９１、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ａ４７、１１０‐１１９）を用いて該構造を再構築することができる。タンパク質データバンクにおいては利用不可能であるが立体写真の走査および座標のピックアップ（例えば、プログラムＭａｇｉｃｋを用いる）およびｚ座標の計算（例えば、プログラムｓｔｅｒｅｏを用いる）により立体写真として既に公表されているＣα座標を取得することも可能である。アミノ酸配列アラインメント、３Ｄモデル、または実験的に決定した３Ｄ構造に基づいて、変異体を設計することができる。
【００３７】
更に、ポリメラーゼ活性をもつドメインが逆転写酵素活性を有するキメラ変異体を作製した。適切なポリメラーゼの例としては、Ａｔｈ（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）またはＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のポリメラーゼが挙げられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に、例えばＴｎｅポリメラーゼまたはＰｆｕ若しくはＰｗｏポリメラーゼなどの他のポリメラーゼ由来のドメインを挿入する。このキメラは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインが第１ポリメラーゼ並びに第２ポリメラーゼ由来でありうる場合に、更に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有することができる。
【００３８】
組換えハイブリッドポリメラーゼＨＹＢおよびＨＹＢｄ５は、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のＤＮＡポリメラーゼのように、マグネシウムイオンの存在下およびマンガンイオンの存在下で比較的強い逆転写酵素活性を有する。図２２に示すように、逆転写酵素活性に対するポリメラーゼ活性の比は、このタイプの酵素で最も一般的で公知のＴｔｈポリメラーゼを用いた場合よりも有利である。 この知見をマグネシウム依存性逆転写酵素活性およびマンガン依存性逆転写酵素活性に当てはめると、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍポリメラーゼ由来のポリメラーゼドメインもまたハイブリッド酵素中で完全な活性を示すと結論づけることができる。更に変異体ＨＹＢｄ５は、図２１に示すように３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この活性は、典型的な「プルーフリーディング活性」について予想されるように、デオキシヌクレオシド三リン酸の存在によって阻害される。従って、テルモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇｅ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）のＤＮＡポリメラーゼ由来のエキソヌクレアーゼドメインもまたハイブリッド分子中で活性である。エキソヌクレアーゼ活性を阻害する能力はまた、ハイブリッドポリメラーゼ分子の両方のドメインが相互作用し、これゆえハイブリッドポリメラーゼが機能的に天然酵素と非常に類似するということを示す。
【００３９】
遺伝子工学的操作によるドメイン交換変異体の作製を、化学的に合成されたオリゴデオキシヌクレオチドで補助して、ＳＯＥ法（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９） Ｇｅｎｅ ７７、６１−６８）に従うＰＣＲ突然変異誘発、またはその改良法 （実施例におけるスキームを参照のこと）を用いて実施することができる。各ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離させ、単離し、出発ベクターにライゲートする。ｐＴＥ、ｐＴａｑ、ｐＰＬ、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど適切なプロモーターを有するｐＵＣ誘導体を、大腸菌用の出発ベクターとして用いることができる。プラスミドＤＮＡを、ＸＬ１−ｂｌｕｅなどの大腸菌株中に形質転換し、いくつかのクローンを選択して、それらのプラスミドＤＮＡを単離する。Ｎｏｖａ Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１（ＤＥ）、ＭＣ１０００などの他の菌株を用いることも可能である。もちろん、酵母、植物および哺乳動物細胞などの、他の生物中にクローニングすることも可能である。改変領域において、プラスミドＤＮＡが配列決定されているクローンの前選択を、制限酵素分析によって実施する。
【００４０】
標的タンパク質中の遺伝子発現を、Ｐｂｔａｑなどの多くのプラスミド中でＩＰＴＧで誘発することができる。多くの種々の変異体を作製する場合、万能な精製法を確立するのが適切である。例えばＰＣＲによって、タンパク質にヒスチジンタグを結合した後に使用することができる、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニッケルニトリロ三酢酸）アガロース上でのアフィニティークロマトグラフィーは非常に適したものである。タンパク質濃度をタンパク質アッセイＥＳＬ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて測定することができ、また調製物の副活性による汚染は、市販のＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）について記載のように測定することができる。ポリメラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性および熱安定性試験を行って更に変異体を特性決定し、それぞれの最適温度を決定する。キメラのポリメラーゼ活性を、例えばＤＮアーゼ活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡへのＤｉｇ−ｄＵＴＰの組み込み率を測定することによって、非放射性試験系で測定することができ、あるいは、例えばＭ１３ ｍｐ９ ｓｓＤＮＡへのα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰの組み込み率を測定することによって、放射性試験系で測定することができる。キメラのポリメラーゼ活性の最適温度を決定するために、ポリメラーゼ反応を種々の温度で実施し、比活性を算出する。熱処理後の残存活性（すなわち熱処理をしない場合の初期活性の％）を測定して熱安定性を決定する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、３’末端で開始するＤＮＡ鋳型鎖にアニーリングする５’−Ｄｉｇ標識化プライマーの組み込みによって示すことができる。３’ミスマッチプライマーの修正およびそれらの伸長（プルーフリーディング）は、制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）の認識配列における、鋳型鎖にアニーリングするミスマッチ５’−Ｄｉｇ標識化プライマーの伸長によって示すことができる。酵素によってミスマッチが修正される場合のみ制限酵素による切断が可能である。ＰＣＲで変異体を用いることによって、プロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を試験することができる。酵素がＰＣＲで使用するのに十分に熱安定性ではない場合、伸長温度として最適な温度で、酵素を連続添加しながらＰＣＲを実施することができる。キメラのエキソヌクレアーゼ活性を、放射性試験系で測定することができる。この試験には、キメラポリメラーゼの一定量（通常２．５Ｕ）を、標識化ＤＮＡ（各試験バッファー中５μｇ ［３Ｈ］ＤＮＡ）と共に種々の温度で４時間インキュベートする。任意にｄＮＴＰを種々の濃度（０〜０．２ｍＭ）で添加してもよい。反応終了後、放射性標識化ヌクレオチドの放出を測定する。
【００４１】
本発明の更なる主題は、上述のポリメラーゼキメラのＤＮＡ 配列である。特に、ＤＮＡ配列（配列番号１〜６）は本発明の主題である。本発明は更に、上述のポリメラーゼキメラのアミノ酸配列に関する。特に、アミノ酸配列（配列番号７〜１２）は本発明の主題である。更に、ＤＮＡ配列（配列番号１７）は本発明の主題である。
【００４２】
上述のＤＮＡ配列を含むベクターを更に本発明の主題とする。好ましいベクターとしては、ｐＢＴａｑ（プラスミド Ｐｂｔａｑ４＿オリゴ６７（Ｖｉｌｌｂｒａｎｄｔ（１９９５）、学位論文、ＴＵ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ））である。
【００４３】
大腸菌株、特にポリメラーゼキメラ遺伝子を有するベクターを含む大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を更に本発明の主題とする。以下の菌株をＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託した：
・大腸菌 ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｘ ｐＢＴａｑＥｃ１： ＴａｑＥｃ１ ＤＳＭ番号 １２０５３
・大腸菌 ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｘ ｐＢＴａｑＴｎｅ１：ＴａｑＴｎｅ１ ＤＳＭ番号 １２０５０
・大腸菌 ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｘ ｐＢＴａｑＴｎｅ２：ＴａｑＴｎｅ２ ＤＳＭ番号 １２０５１
・大腸菌 ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｘ ｐＢＴａｑＰｆｕ１：ＴａｑＰｆｕ１ ＤＳＭ番号 １２０５２
【００４４】
本発明のポリメラーゼキメラは、例えばポリメラーゼ連鎖反応など、ＤＮＡ断片を増幅するのに特に適している。更なる応用として、例えばＤＮＡ断片の配列決定がある。
【００４５】
Ａｔｈ−Ｔｎｅキメラ用の好ましいベクターには以下のものがある：
大腸菌 ＢＬ ２１ （ＤＥ３） ｐｌｙｓＳ ｘ ｐＥＴＨＹＢＲ：ＨＹＢＲ
大腸菌 ＢＬ ２１ （ＤＥ３） ｐｌｙｓＳ ｘ ｐＥＴＨＹＢＲ ｄ５：ＨＹＢＲ ｄ５
【００４６】
ポリメラーゼキメラ遺伝子を有するベクターを含む大腸菌株を更に本発明の主題とする。以下の菌株をＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２９ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託している：ＨＹＢＲ （ＤＳＭ番号 １２７２０）；ＨＹＢＲ ｄ５ （ＤＳＭ番号 １２７１９）。
【００４７】
上述のＡｔｈ−Ｔｎｅキメラの作製について実施例８〜１１に例示している。ＲＴ活性を有する本発明のキメラは、ＲＮＡの逆転写に特に適している。
【００４８】
本発明の更なる主題は、少なくとも１つの本発明のポリメラーゼキメラを含むＤＮＡ断片を増幅するためのキットである。
【００４９】
実施例１： 構築とクローニング
普遍的精製法の確立
Ｎｉ−ＮＴＡ（ニッケル−ニトリロトリ酢酸）アガロースでのアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ドメイン交換変異体のための精製プロトコルを標準化した。タンパク質変異体を作製する前に、Ｈｉｓタグを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合するかまたは該ポリメラーゼの内部に挿入することが必要であった。プラスミドＰｂｔａｑ４＿ｏｌｉｇｏ６７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中に２つの異なったＨｉｓタグ変異体を設計し作製した。変異体ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌは、Ｎ−末端のＨｉｓタグ、Ｈｉｓタグを場合により切断するためのエンテロキナーゼ切断部位およびＨｉｓタグタンパク質を抗体（Ｑｕｉａｇｅｎ）で検出するためのエピトープを有している。これをＥｃｏＲＩ部位からＰｓｔＩ部位までのＰＣＲにより作製した。Ｎ−末端タンパク質の配列決定において、変異体ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌの２０個のＮ−末端アミノ酸が正しいことを確認した。
【００５０】
配列：ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌ
0003553018.tif 000002
【００５１】
変異体５ＤＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼドメインのフレキシブルループ中のグリシン７９とグリシン８０の間にＨｉｓタグを有し、ＥｃｏＲＩ部位からＰｓｔＩ部位までのＰＣＲ突然変異誘発により作製した。
【００５２】
配列：５ＤＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌ
配列番号１５
配列番号１６
0003553018.tif 000003
【００５３】
２つの新遺伝子の各改変領域中の、プラスミドＤＮＡの正確さをＤＮＡ配列決定により確認した。改変遺伝子の両方を、Ｈｉｓタグなしの初期タンパク質と同一の割合および同一の条件下で発現させた。それらはＮｉ−ＮＴＡアガロースにより容易に精製でき、標準ＰＣＲにおいてＨｉｓタグのないＴａｑポリメラーゼと同じ挙動を示した。Ｎ−末端Ｈｉｓタグを、ドメイン交換変異体を精製するために使用した。
【００５４】
アミノ酸配列のアライメント
以下のアミノ酸配列のアライメントは、ドメイン交換変異体を設計するために行った：
１． Ｔｎｅ， 大腸菌 ＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
２． Ｐｆｕ， 大腸菌 ＩおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
３． ＤＮＡポリメラーゼの複数のアミノ酸配列アライメント
アライメントは個々の分子領域（ドメイン）に関連してプログラムＧＣＧを用いて確立し、完全な配列アライメントを形成するように組み立てた。その際、既知の２次構造、モチーフおよび必須アミノ酸を考慮に入れ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの対応するドメインの配列とクレノウ断片の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの配列との、構造に基づいた配列アライメントを用いた（Ｋｉｍら、（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６１２−６１６中の図２ｄ）。
【００５５】
相同性モデリングのためのクレノウ断片の最初の構造を選択するために、その時に利用可能であった大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼＩの構造を、プログラムＢｒａｇｉおよびＲＭＳ ｆｉｔを用いて比較した：
クレノウ断片−ｄＣＭＰ複合体（ＰＤＢコード：１ｄｐｉ）、２．８オングストローム（１９８７）、クレノウ断片−ｄＣＴＰ複合体（ＰＤＢコード：１ｋｆｄ）、３．９オングストローム（１９９３）およびクレノウ断片Ｄ３５５Ａ−ＤＮＡ複合体（ＰＤＢコード：１ｋｌｎ）、３．２オングストローム（１９９４）。クレノウ断片（ＰＤＢコード：１ｋｌｎ）構造を選択した。座標が存在しない（Ｂｒａｇｉプログラム）２つの領域中に、２つのループを組み込み、エネルギーを最小化した（Ａｍｂｅｒプログラム）。タンパク質構造の質をチェックした（Ｐｒｏｃｈｅｃｋプログラム）。
【００５６】
３次元モデルの構築
アミノ酸２９２−８３２を含むＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの分子領域の３次元モデルを、クレノウ断片（ＰＤＢコード：１ｋｌｎ）の構造との相同関係においてＢｒａｇｉプログラムを用いて構築した。このモデリングは、アミノ酸置換、挿入および欠失の導入、新ループ領域のエネルギー最小化ならびに分子全体のエネルギー最小化を含んでなるものである（Ａｍｂｅｒプログラム）。
【００５７】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの構造は、モデリング作業の時点で既に発表されていたが、タンパク質データバンクにおいては利用可能ではなかった。クレノウ断片の３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン（アミノ酸２９２−４２３）に相当するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの中間ドメインのモデルを作製するために、立体写真（Ｋｉｍら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６１２−６１６中の図２ｃ）をスキャンし、Ｃα座標をスクリーン上に選び出し（左および右の写真に対してのｘ座標およびｙ座標）（Ｍａｇｉｃｋプログラム、Ｊｏｈｎ Ｃｒｉｓｔｙ， Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））、ｚ座標を計算し（Ｓｔｅｒｅｏプログラム，（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ ４ （１９９４） Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ｄ５０， ７６０−７６３））、タンパク質主鎖をポリアラニンの生成（プログラムＯ） により再構築し、アミノ酸置換を行い（Ｂｒａｇｉプログラム）、そして分子全体のエネルギー最小化を行った（Ａｍｂｅｒプログラム）。アミノ酸残基２９２−４２３（上記参照）のモデルを、ポリメラーゼドメイン（アミノ酸４２４−８３２）（上記参照）のモデルに結合させ、一方でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとクレノウ断片との構造アライメントを可能とした（Ｋｉｍら、（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ６１２−６１６中の図２ｂおよび２ｃ）。モデル構造の全体をエネルギー最小化し（Ａｍｂｅｒプログラム）、モデル構造の質をチェックした（Ｐｒｏｃｈｅｃｋプログラム、（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ， Ｒ．， Ａ．，ら、（１９９３） Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ． ２６， ２８３−２９１））。
【００５８】
Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（残基２９７−８９３）の３次元モデルを、クレノウ断片（ＰＤＢコード：１ｋｌｎ）の構造との相同関係において構築した。このモデリングは、アミノ酸置換、挿入および欠失の導入（Ｂｒａｇｉプログラム）、新ループ領域のエネルギー最小化、分子全体のエネルギー最小化（Ａｍｂｅｒプログラム）およびモデル構造の質のチェック（Ｐｒｏｃｈｅｃｋプログラム）を含んでなるものである。
【００５９】
２０種類のタンパク質変異体を設計した。それらは大腸菌 ｐｏｌＩおよびＴｎｅポリメラーゼを用いた場合には３次元構造に基づき、Ｐｆｕポリメラーゼを用いた場合にはアミノ酸アライメントに基づいた。
【００６０】
遺伝子操作によるドメイン交換変異体の作製
Ｎ−末端ＨｉｓタグをＰＣＲにより挿入し、ドメイン交換変異体を、化学合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いて改変ＳＯＥ法（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９） Ｇｅｎｅ ７７， ６１−６８）によりスキーム中に示されているように作製した。それぞれのＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を付随するプロトコルに従って使用して単離し、後続のＰＣＲ反応ＩからＩＶにおいて使用した。また、ＰＣＲ反応Ｖの場合は、認識配列がフランキングプライマー中に位置する２種の制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）によってそれらを再切断した。ＤＮＡ断片のライゲーション、およびコンピテントＸＬ１ Ｂｌｕｅ 大腸菌細胞の作製と該細胞のエレクトロポレーションによる形質転換を、Ｖｉｌｌｂｒａｎｄｔ（１９９５， Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ， ＴＵ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に記載された通りに行った。いくつかのクローンを選び出し、それらのプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を付随するプロトコルに従って用いて単離した。微生物学的実施方法、および液体培地またはプレート培地の調製のための配合、並びにグリセリン培養物の確立は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらのハンドブック（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ − ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されたように実施した。ドメイン交換変異体は、初期タンパク質と同じ割合で発現させた。
【００６１】
実施例２： 精製（１つのキメラについて）
ドメイン交換変異体の精製
全てのドメイン交換変異体を、同一のプロトコルにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＸＬ１−Ｂｌｕｅから単離した。発酵は、３７℃で１６時間、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で、１リッタースケールで行った。細胞を遠心分離し、２０ｍｌの溶菌緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に取り上げ、−７０℃で少なくとも１６時間以上凍結し、１０分間超音波処理した。細胞破片を遠心分離により除き、滅菌濾過した上清をカラム容量が３．５ｍｌ（半径０．６５ｃｍ、高さ２．７ｃｍ）のＮｉ−ＮＴＡ（ニッケル−ニトリロ酢酸）アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。カラムを４０ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で洗浄し、続いて１０ｍｌのバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、１Ｍ ＫＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で洗浄し、そして再び１０ｍｌのバッファーＡで洗浄した。１５ｍｌのバッファーＣ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で溶出させた。流速は毎分０．５ｍｌで、画分のサイズは、洗浄画分の場合が１０ｍｌ、溶出画分の場合が１ｍｌとした。プールした画分を保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５０％グリセロール）に対して透析し、２００μｇ／ｍｌのゼラチン、および最終濃度が０．５％となるようにＮｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ４０を添加した。このタンパク質溶液を−２０℃で保存した。
【００６２】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースでのドメイン交換変異体ＴａｑＥｃ１の精製の分析を、図７に示す。
【００６３】
タンパク質濃度の測定
ＯＤ２８０の測定と、タンパク質アッセイＥＳＬ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とによりタンパク質濃度を測定した。図８は、タンパク質純度の測定を示す：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ， Ｐｈａｓｔ ｓｙｓｔｅｍ（１０−１５％）：銀染色。
【００６４】
実施例３： キメラのポリメラーゼ活性の至適温度
キメラのポリメラーゼ活性を、非放射性試験システムにおいて測定した。放射性試験システムを使用して数値を調整した。ＤＮ’ａｓｅ−活性化ウシ胸腺ＤＮＡへのＤｉｇ−ｄＵＴＰの取込み速度を非放射性試験システムにおいて測定した。５０μｌの試験混合物は、５μｌのバッファー混合物（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ ＫＣｌ、７０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ｐＨ ８．５）、１００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３６ｎＭ Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１２μｇのウシ胸腺ＤＮＡ（ＤＮ’ａｓｅ−活性化したもの）、１０μｇのウシ血清アルブミン、および２μｌのキメラ酵素または基準としての０．０２ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を希釈バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ ゼラチン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、５０％グリセロール）中に含有していた。反応混合物を３０分間様々な温度でインキュベートした。反応は氷上で停止させた。各反応混合物５μｌを白色膜被膜マイクロタイタープレート（Ｐａｌｌ ＢｉｏＳｕｐｐｏｒｔ， ＳＭ０４５ＢＷＰ）に分注し、７０℃で１０分間焼いた。マイクロタイタープレートの膜を、付属の吸引槽（Ｐａｌｌ ＢｉｏＳｕｐｐｏｒｔ）を使用して下記の通り処理した。すなわち、１００μｌのバッファー１（０．１Ｍ マレイン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５中の１％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を添加し、２分間インキュベートし、吸引し、もう一度繰り返した；１００μｌのバッファー２（バッファー１中の１：１００００に希釈した抗−Ｄｉｇ−ＡＰ−Ｆａｂフラグメント抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を添加し、２分間インキュベートし、吸引し、もう一度繰り返した；２００μｌのバッファー３（０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むバッファー１） を減圧下で添加し、もう一度繰り返した；２００μｌのバッファー４（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ９．５） を減圧下で添加した；５０μｌのバッファー５（バッファー４中の１：１００に希釈したＣＳＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）） を添加し、５分間インキュベートし、吸引した。サンプルをルミノメーター（Ｍｉｃｒｏｌｕｍｉｎａｒ ＬＢ ９６Ｐ， ＢｅｒｔｈｏｌｄまたはＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ）中で測定した。
【００６５】
放射性試験システムにおいては、１μｇのＭ１３ｍｐ９ ｓｓ−ＤＮＡへのα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰの取込み速度を測定した。５０μｌの試験混合物は、バッファー混合物５μｌ（６７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２％ Ｔｅｓｉｔ、２ｍｇ／ｍｌ ゼラチン、ｐＨ ８．８）、１０μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５μＭのＣＴＰ、０．１μＣｉのα−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．３μｇのＭ１３プライマーとアニーリングした１μｇのＭ１３ｍｐ９ ｓｓ ＤＮＡ、および１μｌのキメラ酵素または基準としての０．０１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を希釈バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ ゼラチン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、５０％グリセロール）中に含有していた。ＤＮＡプライマー混合物を調製するために、Ｍ１３ｍｐ９ ｓｓＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２７７．２μｇ、およびＭ１３配列決定用プライマー（１７ｍｅｒ）１５６μｇを、３０分かけて５５℃まで加熱し、３０分かけて室温まで冷却した。反応混合物を３０分間６５℃でインキュベートした。反応を氷上で停止させた。各反応溶液２５μｌを２５０μｌの１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）／０．０１Ｍ ピロリン酸ナトリウム（ＰＰｉ）中に分注し、混合し、３０分間氷上でインキュベートした。サンプルを、予め浸漬させたＧＦＣフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上で吸引濾過し、反応容器を５％ ＴＣＡ／ＰＰｉで洗浄し、フィルターを少なくとも３回、同じ溶液で洗浄した。乾燥させた後、５ｍｌのシンチレーション液体を用いてフィルターをβ−カウンターで測定した。酵素サンプルを酵素希釈バッファー中に希釈した。希釈物の１μｌアリコートを使用した。２回または３回の反復測定を行った。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社からのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを基準として使用した。
【００６６】
１ユニットは、６５℃で３０分間に、１０ｎＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を酸沈殿性ＤＮＡ中に取り込むために必要な酵素量として定義した。標準値を決定するために、全混合物の２μｌアリコートを乾燥フィルター上に分注して乾燥させた。ブランク値は酵素を含まないサンプルを、同様にインキュベートし洗浄することによっても測定した。
【００６７】
至適温度は非放射性ＤＮＡポリメラーゼ試験を様々な温度で行って決定した。
【００６８】
様々な温度での比活性
0003553018.tif 000004
【００６９】
実施例４： キメラのポリメラーゼ活性の熱安定性
熱安定性は、反応混合物を８０℃と９５℃で１分間、３分間または６分間加熱し、続いて残存活性を、非放射性ＤＮＡポリメラーゼ試験により計測して測定した（図９参照）。
【００７０】
表： Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＰｏｌ）、Ｈｉｓタグを有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌ）、および３種類のドメイン交換変異体（ＴａｑＥｃ１、ＴａｃＴｎｅ１、ＴａｑＴｎｅ２） の熱処理後の７２℃での残存活性（熱処理なしの初期活性に対するパーセント）
（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰのＤＮ’ａｓｅ−活性化ウシ胸腺ＤＮＡへの取込み）
0003553018.tif 000005
【００７１】
実施例５： 酵素の連続添加を伴うＰＣＲ
ＰＣＲにおいて酵素を連続的に添加してポリメラーゼキメラを試験した。伸長反応を７２℃（図１０）と５５℃（図１１）で行った。反応容量１００μｌの各反応混合物は、λＤＮＡまたはｐａ−ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ（ＢＭ Ｃｏ．）を１ｎｇ、各プライマー（２５−ｍｅｒ）を１μＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、およびＭｇＣｌ２含有標準ＰＣＲバッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含んでいた。反応条件は下記の通りである。
【００７２】
７２℃での伸長反応の場合：９４℃で１分／５０℃で３０秒／７２℃で１分／／２５サイクル、ＰＣＲ反応前に９４℃で２分、ＰＣＲ反応後に７２℃で７分。０．５μｌのドメイン交換変異体を各サイクルごとに５０℃で添加。
【００７３】
５５℃での伸長反応の場合：９５℃で１分／５０℃で３０秒／５５℃で１分／／２５サイクル、ＰＣＲ反応前に９５℃で２分、ＰＣＲ反応後に５５℃で７分。０．５μｌのドメイン交換変異体を各サイクルごとに５０℃で添加。
【００７４】
実施例６： ３’−５’エキソヌクレアーゼ試験−ＴａｑＥｃ１変異体
サンプルを、ヌクレオチド不存在下で、ＤＮＡ鋳型鎖とアニールする ５’−Ｄｉｇ標識プライマーと共にインキュベートした。１０μｌの試験混合物は、１μｌ バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５００ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ｐＨ ８．３）、１μｌ 酵素ＴａｑＥｃ１（５００ユニット／μｌ）、１ｐｍｏｌ 鋳型鎖（５０ｍｅｒ，スキーム参照のこと）および５００ｆｍｏｌの５’−Ｄｉｇ標識プライマーＰ１（マッチプライマー， ２３ｍｅｒ， スキーム参照のこと）もしくはＰ２（ミスマッチプライマー， ２３ｍｅｒ， スキーム参照のこと）を含んでいた。これらの反応混合物は、５０℃で、様々なインキュベート時間にてインキュベートした。ＤＮＡ断片は、１２．５％アクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ Ｋｉｔ， Ｍｅｄｃｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）にて分離し、接触ブロッティングによってナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に転写した。該ナイロン膜を以下のように処理した：１００ｍｌ バッファー１（０．１Ｍ マレイン酸， ０．１５Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５中、１％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））中での３０分間のインキュベート；１００ｍｌ バッファー２（抗Ｄｉｇ−ＡＰ Ｆａｂフラグメント抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をバッファー１中に１：１００００で希釈したもの）中での３０分間のインキュベート；各回毎１３５ｍｌのバッファー３（０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むバッファー１）での３０分間の洗浄を３回；５０ｍｌ バッファー４（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ０．１Ｍ ＮａＣｌ， ５０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ｐＨ９．５）中での５分間のインキュベート；５０ｍｌ バッファー５（ＣＰＤ ｓｔａｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をバッファー４中に１：１０００で希釈したもの）中での５分間のインキュベート。上記ナイロン膜をＷａｔｍａｎろ紙上で乾燥させ、化学発光検出のために、化学発光フィルム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に３０〜６０分間曝露した。３’−５’エキソヌクレアーゼが存在すれば、プライマーの３’末端での分解が可視化される（図を参照のこと）。Ｈｉｓタグを有するＴａｑポリメラーゼ（ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌ）を陰性対照として使用し、またＵＩＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを陽性対照として使用した。両対照酵素に対しては、反応混合物を７２℃にてインキュベートした。ＵＩＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼに対しては、メーカーの反応バッファーを用いた。図１２および１３は、３’−５’エキソヌクレアーゼ試験の変異体ＴａｑＥｃｌを示す。
【００７５】
実施例７： ３’−ミスマッチプライマーの修正および伸長−ＴａｑＥｃ１変異体（３’−ミスマッチプライマー修正アッセイ）
鋳型鎖にアニールするＤｉｇ標識プライマー（５０ｍｅｒ， スキーム参照のこと）を４つの異なる実験において伸長させた。該プライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列にアニールするマッチプライマー（Ｐ１， ２３ｍｅｒ， スキーム参照のこと）および２種類の異なるミスマッチプライマー（Ｐ２， Ｐ３， ２３ｍｅｒ， スキーム参照のこと）であった。２０μｌの試験混合物は、１μｌ バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５００ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ｐＨ ８．３）、１μｌ 酵素ＴａｑＥｃ１（５００ユニット／μｌ）、ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰを各々１０μＭ、１ｐｍｏｌ 鋳型鎖、および５００ｆｍｏｌの５’−Ｄｉｇ標識プライマーＰ１（マッチプライマー）、Ｐ２（ミスマッチプライマー）もしくはＰ３（ミスマッチプライマー）を含んでいた。これらの反応混合物は５０℃で６０分間インキュベートした後、５分間で９５℃まで加熱した。１０μｌアリコートを取り、これを１０ユニットのＥｃｏＲＩによって３７℃で３０分間切断した。そのＤＮＡ断片を１２．５％アクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ Ｋｉｔ， Ｍｅｄｃｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）にて分離し、接触ブロッティングによりナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）上に転写した。該ナイロン膜は上記のように処理し、化学発光フィルム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に３０〜６０分間曝露した。マッチプライマーを用いた場合、ＥｃｏＲＩを用いた消化によって２８ｂｐおよび１８ｂｐの断片が生じた。ミスマッチプライマーでは、ミスマッチヌクレオチドがマッチヌクレオチドによって置換される場合のみ、そのような結果を生じた（図１４を参照のこと）。
【００７６】
実施例８： Ａｔｈ ＰｏｌとＴｎｅ Ｐｏｌのハイブリッドポリメラーゼ遺伝子についての組換えＤＮＡポリメラーゼ設計の改変
コンピューター予測
キメラポリメラーゼ遺伝子の構造は、前記ポリメラーゼと大腸菌ＰＯＬＩ遺伝子−この配列は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎのデータバンク中の解明された三次元構造（クレノウ断片についてのもの）と最も高度に一致している−との配列アライメント（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．Ｄ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＧｉｂｓｏｎ， Ｔ．Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， ２２： ４６７３−４６８０）から導き出した。そのペアアライメントは約４０％の一致を示し、したがって１ＫＬＮ構造がおそらく最も可能性の高い基本型であるとみなすことができる。一方の構造から他方の構造へのスムーズな移行を確実にするためには、マルチプルアライメントの観点からみて、３種のタンパク質全てと高度な類似性を有する部位に交点を配置するべきである。それゆえ、交点はポリメラーゼドメインと３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの間とするべきである（図１７、１８）。
【００７７】
ハイブリッドポリメラーゼ遺伝子および発現ベクターの構築
コンピューター予測およびシミュレーションは、ハイブリッド遺伝子の構築のための基礎として役立つ。ＡＴＨ ＰＯＬドメインおよびＴＮＥ ＥＸＯドメインを得るための手法として、図１８に示した構造を有する２つのプライマー対を使用したＰＣＲ増幅およびサブクローニングを用いた。これらのプライマーは、図２Ｂ、Ｃに示されるように各々の遺伝子のＮ末端およびＣ末端ならびに遺伝子中央の連結配列に特異的な配列を有している。ＡＴＨＵＰおよびＴＮＥＬＯＷプライマーの１２塩基の重複部分は、後のハイブリッド遺伝子の再構築用に設計し、さらに、ポリメラーゼドメインに対する更なる改変のために使用しうる明確なＳａｌＩ制限部位に挿入したものである。ＴＮＥＵＰおよびＡＴＨＬＯＷプライマーの５’側配列のオーバーハングは、必要な断片を後に発現ベクターにサブクローニングするためのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位をコードしている。
【００７８】
しかしながら、この方法の適用では、サブクローン化領域の広範囲な配列決定が必要になる。そのため更なる構築物を作製し、その遺伝子間のスプライス結合部を別の位置に、すなわち、当初の結合位置よりもさらに４２アミノ酸下流から、より高度な類似性を有するポリメラーゼ間の領域に移した。新しい設計の利点は、提示したスプライス結合部を含むＴＮＥポリメラーゼ配列内に明確なＢａｍＨＩ配列が存在することである。ハイブリッド遺伝子を構築するために、ＡＴＨポリメラーゼ配列中に、ＢａｍＨＩ配列を組み込み、後に特異的突然変異誘発により遺伝子の部品を組立てるために用いた。この新規化合物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は図１９に示す。
【００７９】
ハイブリッドポリメラーゼ遺伝子は、複数回のサブクローニング、特異的突然変異誘発、および配列決定の各工程により、図２０に記載の通りに構築した。
【００８０】
ＰＣＲ増幅により得られた断片全てについて、その末端から始めて、後のサブクローニング工程にて用いられる明確な制限部位までを配列決定した。増幅の正確さを確保するために、ＰＣＲ反応はＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行った。特異的突然変異誘発は、「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。
【００８１】
実施例９： 大腸菌におけるハイブリッドポリメラーゼ遺伝子の発現
プラスミドｐＥＴＨＹＢＲおよびｐＥＴＨＹＢＲｄ５は、Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳＳ株中へ形質転換して、Ｔ７ポリメラーゼの発現を引き起こした。
【００８２】
このハイブリッドＰＯＬ遺伝子の発現は、活性化ＤＮＡアッセイを用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定することにより組換え株の抽出物においてモニターした。以下の条件を用いた。
【００８３】
（１） 組換え大腸菌株を、１００ｍｃｇ／ｍｌのアンピシリン＋３０ｍｃｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ中のｐＥＴＨＹＢＲおよびｐＥＴＨＹＢＲｄ５に対して）または１００ｍｃｇ／ｍｌのアンピシリン＋３０ｍｃｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２０ｍｌのＬＢ培地（ＪＭ１０９／ｐＳＢ１６１１中のｐＡＲＨＹＢｄ５に対して）中で培養した。
【００８４】
（２） 前記培養物は、光学密度ＯＤ ５５０が約０．６〜０．７に達するまで３７℃で振とうした。次いで該培養物を２５〜２８℃に冷却し、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるよう加えた。続いてインキュベーションを２５〜３０℃で継続した。４時間のインキュベート後の非誘導培養物の密度は、２種類のｐＥＴベクターに関してＯＤ ５５０が約２．２であり、誘導培養物については約１．５であった。
【００８５】
（３） ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ株のタンパク質抽出物は、前記培養物の５ｍｌアリコートをペレット化することにより調製した。次いで該細胞ペレットを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０， ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ， ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール， ０．２ｍＭ ＰＭＳＦ， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む停止バッファー１００μｌ中に再懸濁した。細胞抽出物は、液体窒素／温水バス中での細胞懸濁液の凍結と解凍を２サイクル行うことによって調製した。続いてＫＣｌ溶液を最終濃度０．７５Ｍになるよう加え、誘導培養物および非誘導培養物の抽出物を７２℃で１５分間加熱し、ペレット化し、そのポリメラーゼ活性を測定するために用いた。この活性測定は、活性化ＤＮＡアッセイ（１００ｍｃｇ／ｍｌ 活性化ＤＮＡ， ３ｍＭ ＭｇＳＯ４， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．９， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ７０μＭ ｄＡ−Ｐ３３， ５−１０μＣｉ／ｍｌ）において、２μｌの加熱した細胞抽出物を用いて体積２０μｌにて行った。
【００８６】
結果は以下の表に示す：
組換え株の抽出物における相対的ＤＮＡポリメラーゼ活性（標識の組み込み％， ３回の独立した測定の平均）
0003553018.tif 000006
これらのデータは、ハイブリッドポリメラーゼ遺伝子はどちらの種類もｐＥＴベクター系を用いて発現されうることを示している。
【００８７】
組換えハイブリッドポリメラーゼの特性づけ
熱安定性
組換えポリメラーゼの熱安定性は、大腸菌株の抽出物を９５℃で様々な時間（１０、３０、６０、１２０分間）加熱することによって測定した。完全型および切詰め型ハイブリッドポリメラーゼは十分に安定ではない（９５℃にて１０分間インキュベートした後、１００％が不活性である）ことが分かった。組換えポリメラーゼの発現の程度を、１０％ ＳＤＳ ＰＡＡＧにおいて加熱した細胞抽出物を解析することにより評価した。誘導培養物と非誘導培養物との間に目に見える差違が認められなかったので、ハイブリッドポリメラーゼの産生は全可溶性タンパク質の１％を上回ることはないと結論づけられるであろう。
【００８８】
プルーフリーディング活性
ｐＥＴＨＹＢＲｄ５に由来する、例えばクレノウ断片などの組換えＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性を、古細菌のＤＮＡに対して用いられるのと同一のプロトコルに従って試験した。組換え酵素はプルーフリーディング活性を有することが分かった。
【００８９】
逆転写酵素活性
以下の反応混合物を用いて、逆転写酵素活性を測定した：１μｇ ポリｄＡ−（ｄＴ）１５， ３３０μＭ ＴＴＰ， ０．３６μＭ ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ， ２００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５， ２０ｍＭ ＫＣｌ。反応混合物中のＭｇＣｌ２の濃度は０．５〜１０ｍＭの間で変化させた。ＤＴＥを濃度１０ｍＭにて加えた。
【００９０】
２μｌの組換えＤＮＡポリメラーゼ（ｐＥＴＨＹＢＲｄ５に由来するもの， 例えばクレノウ断片）を反応混合物に加え、５０℃で１５分間インキュベートした。Ｍｎ２＋を含むＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを陽性対照として加えた。反応を停止させた後、該混合物を正に荷電したナイロン膜（ＢＭ）にアプライした。組み込まれたジゴキシゲニンを１９９５年のＢＭプロトコルにより検出した。
【００９１】
この組換え酵素（クレノウ断片）は逆転写酵素活性を有することが分かった（図２２）。その活性はＭｎ２＋（最適濃度１ｍＭ）の存在に依存する。さらにＭｇ２＋の存在はさらなる刺激効果を有した（Ｍｇ２＋の最適濃度４ｍＭ）。
【００９２】
実施例１１： キメラポリメラーゼ遺伝子の構築（図２０を参照のこと）
制限配列に対する略語− Ｂ−ＢａｍＨＩ， Ｂｓｐ−ＢｓｐＨＩ， Ｈ−ＨｉｎｄＩＩＩ， Ｎ−ＮｃｏＩ， Ｒ−ＥｃｏＲＩ， Ｓ−ＳａｌＩ， Ｓｎ−ＳｎａＩ， Ｘ−ＸｈｏＩ， Ｘｍ−ＸｍａＩ
１．ベクターｐＴｒｃＨＩＳＢ中に完全なポリメラーゼ遺伝子を含むｐＡＲＨｉｓ１０プラスミド、ならびにプライマーＡＴＨ ＵＰおよびＡＴＨＬＯＷを用いたＡＴＨ ＰＯＬドメインのＰＣＲ増幅、およびｐＳＫ＋Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド中へのサブクローニング→ｐＢＳＡＴ。この挿入物をフランキングプライマーから配列決定したところ、プライマー合成の際の誤りが原因でＡＴＨＵＰプライマー配列中の１塩基が欠失していることが分かった。
【００９３】
２．１５３５位にＢａｍＨＩ配列を組み込むための、「Ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ」法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による、プライマーｍ１およびｍ２を用いたプラスミドｐＡＲＨｉｓ１０の特異的突然変異誘発→ｐＡＲＨｉｓ１０ｍｕｔ。
【００９４】
３．鋳型であるｐＴＮＥＣ２プラスミドに対しプライマーＴＮＥＵＰおよびＴＮＥＬＯＷを用いたＴＮＥ ＥＸＯドメインのＰＣＲ増幅、およびＳｍａＩ切断ｐｕＣ１９プラスミド中へのサブクローニング→組込みの方向性が異なるｐＴＥＸ１およびｐＴＥＸ２。
【００９５】
４．「ＬＯＮＧ」ＥＸＯドメインを含む、ｐＴＮＥＣ２プラスミドに由来する１４４４ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ切断プラスミドｐＴＥＸ１中へのサブクローニング→ｐＴＥＸＬ。
【００９６】
５．完全なＡＴＨポリメラーゼ遺伝子を、２５５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片としてＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＴＥＸＬ中に組み込む→ｐＴＥＸＬＡＴＦ。
【００９７】
６．ｐＴＥＸＬＡＴＦプラスミドのＸｍａＩ−ＳｎａＩ断片の、組み込みＢａｍＨＩ配列を含むｐＡＲＨｉｓ１０ｍｕｔプラスミド由来の１０９４ｂｐのＸｍａＩ−ＳｎａＩ断片による置換→ｐＴＥＸＬＡＴＦ＊。
【００９８】
７．ｐＴＥＸＬＡＴＦ＊に由来する４２１４ｂｐのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片の、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩ切断ｐＥＴ２１ｄベクター中への組込み→ｐＥＴＮＡＴ。
【００９９】
８．ｐＥＴＮＡＴプラスミドに由来する、ＡＴＨポリメラーゼのＮ末端ドメインをコードする１５３５ｂｐのＢａｍＨＩ断片の欠失。これによってＴＮＥ ＥＸＯＬおよびＡＴＨ ＰＯＬ配列のインフレームでの結合がなされる→ｐＥＴＨＹＢＲ。
【０１００】
９．ｐＥＴＨＹＢＲの１６６１ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の、ｐＥＴＮＡＴに由来する８２９ｂｐのＢｓｐＨＩ−ＢａｍＨＩ断片による置換。これにより、開始コドンとしてＴＮＥポリメラーゼのＭｅｔ２８４が使用され、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有すると仮定されるＮ末端ドメインの欠失が引き起こされる→ｐＥＴＨＹＢＲｄ５。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｈ５１９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列：点突然変異 Ａ６４３Ｇ；Ｉｌｅ４５５Ｖａｌ（配列番号１）；および対応するアミノ酸配列（配列番号７）。
【図２】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ３２７−Ｇ５４４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列（配列番号２）；および対応するアミノ酸配列（配列番号８）。
【図３】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｅ４８５） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列；サイレント突然変異 Ａ１４４９Ｃ（配列番号３）；および対応するアミノ酸配列（配列番号９）。
【図４】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１−Ｐ２９１） Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ２９５−Ｇ５１０） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ４４９−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列；サイレント突然変異 Ｃ１７６７Ｔ（配列番号４）；および対応するアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ （Ｈ１０３−Ｓ３３４） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ４２４−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列（配列番号５）；および対応するアミノ酸配列（配列番号１１）。
【図６】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１−２９１） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ１００−Ｆ３８９） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（−Ｖ４４９−Ｅ８３２）のＤＮＡ配列（配列番号６）；および対応するアミノ酸配列（配列番号１２）。
【図７】Ｎｉ−ＮＴＡアガロース上でのドメイン交換変異体ＴａｑＥｃ１の精製。クーマシーブルーで染色した８％ポリアクリルアミドゲル上での分析。
レーン１、８：広範囲タンパク質分子量マーカー（２００ｋＤａ、１１６．２５ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６．２ｋＤａ、４５ｋＤａ、３１ｋＤａ）
レーン２：可溶性タンパク質
レーン３：カラム素通り画分
レーン４：洗浄画分 バッファーＢ
レーン５：洗浄画分 バッファーＡ
レーン６、７：溶出画分 バッファーＣ
タンパク質収量（ＯＤ２８０）約７ｍｇ。
【図８】タンパク質純度の測定：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｐｈａｓｔシステム（１０〜１５％）：銀染色ＭＷ：タンパク質分子量マーカー；ＮＨｉｓ−ＴａｑＰｏｌ：Ｎ末端にヒスチジンタグを有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；ＴａｑＥｃ１、ＴａｑＴｎｅ１、ＴａｑＴｎｅ２：ドメイン交換変異体。
【図９】種々の温度におけるドメイン交換変異体の比活性。
【図１０】７２℃での伸長と酵素を連続添加するＰＣＲでのドメイン交換変異体の試験。
λＤＮＡ（左）：標的配列の大きさ ＝ ５００ｂｐ
プラスミドｐａ（右）：標的配列の大きさ ＝ ２５０ ｂｐ
レーン１：Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＭ Ｃｏ．）、１００ｎｇ、５ユニット
レーン２：ドメイン交換変異体 ＴａｑＥｃ１、５００ｎｇ、１．２５ユニット／サイクル
レーン３：ドメイン交換変異体 ＴａｑＴｎｅ１、５０ｎｇ、３．６ユニット／サイクル
レーン４：ドメイン交換変異体 ＴａｑＴｎｅ２、５０ｎｇ、３．５ユニット／サイクル
ＩＩＩ：ＤＮＡ長標準ＩＩＩ（ＢＭ Ｃｏ．）
ＶＩ：ＤＮＡ長標準ＶＩ（ＢＭ Ｃｏ．）。
結果：ドメイン交換変異体 ＴａｑＴｎｅ２を使用した場合、正しい大きさのＰＣＲ産物が形成された。
【図１１】５５℃での伸長と酵素を連続添加するＰＣＲにおけるドメイン交換変異体の試験。  λＤＮＡ（左）：標的配列の大きさ ＝ ５００ｂｐ
プラスミドｐａ（右）：標的配列の大きさ ＝ ２５０ｂｐ
レーン１：ドメイン交換変異体 ＴａｑＥｃ１、５００ｎｇ、６ユニット／サイクル
レーン２：ドメイン交換変異体 ＴａｑＴｎｅ１、５０ｎｇ、７．５ユニット／サイクル
ＩＩＩ：ＤＮＡ長標準ＩＩＩ（ＢＭ Ｃｏ．）
ＶＩ：ＤＮＡ長標準ＶＩ（ＢＭ Ｃｏ．）。
結果：ドメイン交換変異体 ＴａｑＥｃ１を使用した場合、正しい大きさのＰＣＲ産物が形成された。
【図１２】３’−５’エキソヌクレアーゼ試験変異体 ＴａｑＥｃ１、７２℃におけるインキュベーション、プライマーＰ１。
【図１３】３’−５’エキソヌクレアーゼ試験変異体 ＴａｑＥｃ１、５０℃におけるインキュベーション、プライマーＰ１（左）、プライマーＰ２（右）。
【図１４】３’ミスマッチプライマーの修正およびそれらの伸長−変異体 ＴａｑＥｃ１（３’ミスマッチプライマー修正アッセイ）
（−）：制限酵素消化なし
（＋）：ＥｃｏＲＩでの制限酵素消化。
【図１５】概略図。
３’末端におけるプライマーの分解（３’−５’エキソヌクレアーゼアッセイ）および３’ミスマッチプライマーの修正およびそれらの伸長（３’ミスマッチプライマー修正アッセイ）。
【図１６】概略図：簡易化したフローチャート、３’末端におけるプライマーの分解並びに３’ミスマッチプライマーの修正および伸長。
【図１７】Ａｔｈ、Ｔｎｅ、ＰｏｌＩポリメラーゼ遺伝子およびポリメラーゼキメラの推定遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ （１．５） 複数配列アライメント。キメラ配列のＴｎｅ由来部分に下線を付した。
【図１８】Ａ：Ｔｎｅ−ＥｘｏおよびＡｔｈポリメラーゼドメインのＰＣＲ増幅に用いたプライマーの構造。
Ｂ：選択された交差点を示した２つのポリメラーゼのアミノ酸配列アライメントの一部分。
Ｃ：ハイブリッドポリメラーゼ遺伝子の構築のために設計されたプライマーのヌクレオチド配列および位置。標的配列に相補的ではないプライマーの配列は、小文字で示す。ＴＮＥＬＯＷおよびＡＴＨＵＰプライマーにおける相補的な「重複」配列には二重線を付した。
【図１９】Ａ：２つのポリメラーゼのドメインと共にスプライシングに用いた相同領域を示す、ＡｔｈおよびＴｎｅアミノ酸配列のアライメントの一部分。
Ｂ： ２つのポリメラーゼのスプライシング領域中のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。図は、Ｔｎｅ ＤＮＡ配列中の単一のＢａｍＨＩ切断部位、およびＢａｍＨＩ切断部位をＡｔｈポリメラーゼに導入するために構築された２つのオリゴ配列を示す。
【図２０】ポリメラーゼキメラ遺伝子の構築（実施例８も参照のこと）。
【図２１】組換えＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性。
１：ＨｉｎｄＩＩＩで加水分解したλファージのＤＮＡ
２：ＨｉｎｄＩＩＩで加水分解したλファージのＤＮＡ、ｄＮＴＰ、および組換えＤＮＡポリメラーゼ
３：ＨｉｎｄＩＩＩで加水分解したλファージのＤＮＡ、ｄＮＴＰなし、組換えＤＮＡポリメラーゼあり
４：ＨｉｎｄＩＩＩで加水分解したλファージのＤＮＡ。
【図２２】組換えポリメラーゼＨＹＢおよびＨＹＢｄ５の逆転写酵素活性。大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐｌｙｓＳ ｘ ｐＥＴＨＹＢｒおよび大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐｌｙｓＳ ｘ ｐＥＴＨＹＢＲｄ５からの抽出物（２μｌ）のＤＮＡポリメラーゼ活性を、０．０５ユニットの精度で測定した。この量を使用して、ハイブリッドポリメラーゼの逆転写酵素活性、および１ｍＭマンガンイオンまたは４ｍＭマグネシウムイオンの作用を測定した。対照を、マンガン依存性逆転写酵素としてＴｔｈ （０．２５ユニット）、およびマグネシウム依存性逆転写酵素としてＣ． ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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