【手続補正書】
【提出日】平成29年4月10日(2017.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞がホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、前記ポリペプチドが配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる、組換え細胞。
【請求項２】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞が、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する、組換え細胞。
【請求項３】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号８と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する、組換え細胞。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１の１つまたは複数と少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、前記ポリペプチドが、配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなる、組換え細胞。
【請求項６】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを含んでなる前記組換え細胞が、（ａ）グルコース上の細胞増殖、（ｂ）キシロース上の細胞増殖、（ｃ）細胞内アセチルリン酸の産生、または（ｄ）グルコース−６−リン酸上の細胞増殖のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する、組換え細胞。
【請求項７】
ホスホケトラーゼ経路を通過する炭素流を増大できる組換え細胞であって、前記組換え細胞が、（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有して配列番号１１と少なくとも６５％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードする異種核酸配列、および（ｉｉ）完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、（ｉ）のホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）タンパク質溶解度、（ｂ）タンパク質発現、または（ｃ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）比活性のパラメータの１つまたは複数で、１．０を超える性能指標値を有する、組換え細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含んでなる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９】
前記組換え細胞を適切な培地中で培養するステップが、エリスロース−４−リン酸の細胞内量、グリセルアルデヒド−３−リン酸の細胞内量、またはリン酸の細胞内量の１つまたは複数を増大させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
ホスホケトラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、（ａ）キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる、または（ｂ）フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
完全ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えばＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項２〜４および６〜１０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
イソプレンを産生できる組換え細胞であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え細胞が、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が、（ａ）イソプレン収率または（ｂ）イソプレン比生産性のパラメータの１つまたは複数で１．０を超える性能指標値である、イソプレンの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１３】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドである、請求項１２に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記組換え細胞が、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞が適切な培地中で培養されて、前記イソプレノイド前駆体を産生する、組換え細胞。
【請求項１６】
イソプレノイドを産生できる組換え細胞であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞が、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなり、適切な培地中の組換え細胞の培養がイソプレノイドの生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１７】
アセチルＣｏＡ由来代謝産物を産生できる組換え細胞であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞を適切な培地中で培養するステップが、アセチルＣｏＡ由来代謝産物の生産を提供する、組換え細胞。
【請求項１８】
核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれ、および、任意に、（ｉ）１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化され、または（ｉｉ）細胞染色体に組み込まれる、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
前記組換え細胞が、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リ
ーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン（ｓｅｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）、およびポリテルペンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
前記アセチルＣｏＡ由来代謝産物が、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記アセチルＣｏＡ由来代謝産物が、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、プロペン、およびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
（ａ）請求項１２に記載の組換え細胞をイソプレンを生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法。
【請求項２６】
（ａ）請求項１５に記載の組換え細胞をイソプレノイド前駆体を生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項１６に記載の組換え細胞をイソプレノイドを生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１７に記載の組換え細胞をアセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するのに適した条件下で培養するステップと、（ｂ）アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来代謝産物を生産する方法。
【請求項２９】
（ａ）前記ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなる組換え細胞を培養するステップであって、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で前記組換え細胞にトランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）欠陥がある、ステップと；（ｂ）前記組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと、（ｃ）細胞増殖の存在に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を検出するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性を組換え細胞内で検出する方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法によって検出される、ホスホケトラーゼ活性がある単離されたポリペプチド。