(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のヌクレオチドと前記第１のヌクレオチドと相補的な第２のヌクレオチドとのハイブリダイゼーション方法であって、
前記第１のヌクレオチドが固定化された基盤上に、前記第２のヌクレオチドを含む溶液を添加し、
微粒子を用いて前記溶液を攪拌しながらハイブリダイゼーションを行う、
ことを含み、前記微粒子が重力方向に落下することによって攪拌が行われることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
前記微粒子がビーズであることを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記微粒子の直径が０．０１μｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記微粒子の表面が親水基によって被覆されていることを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記微粒子の比重が前記溶液より高いことを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記微粒子が磁気微粒子であることを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項７】
前記基盤を回転させることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
前記微粒子が溶液内で前記回転の回転中心方向への移動及び回転中心とは逆の方向への移動をすることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項９】
前記基盤を振動させることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１０】
前記微粒子は、前記第２のヌクレオチドに対し非吸着性であることを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１１】
前記混合の後、前記溶液をとじこめるために前記基盤上にカバー材をのせてシールドし、前記シールドした基盤を回転及び／または振動させることによって、前記溶液を攪拌することを特徴とする、請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１２】
第１のヌクレオチドが固定化された基盤と、前記第１のヌクレオチドと相補的な第２のヌクレオチド及び微粒子を含む溶液とを保持するための容器と、
回転時に前記微粒子が重力方向に落下するように前記容器を回転させるための回転機構と、
を含むことを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記回転機構による回転の回転方向及び回転速度を制御するための制御機構とを有することを特徴とする、請求項１２記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
前記回転速度は１ｒｐｍ以上６０ｒｐｍ以下に制御されることを特徴とする、請求項１２記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１５】
前記装置には、更に容器内の湿度を制御する手段を備えていることを特徴とする、請求項１２記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１６】
前記装置には、更に容器内の温度を制御する手段を備えていることを特徴とする、請求項１２記載のハイブリダイゼーション装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
ＤＮＡチップは、ガラス基盤上に数千〜数万の遺伝子ＤＮＡを高密度に配列・固定したデバイスである。表面を特殊加工したスライドガラスなどの固相基盤上に複数の異なるＤＮＡプローブを高密度に固定する。ＤＮＡチップに対して、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡから逆転写反応により蛍光標識した試料を滴下し、ハイブリダイゼーションを行うことで、多数の遺伝子の発現情報を大規模に同時並行で解析できる。ヒトゲノム計画の進展に伴い、遺伝子を個々として捉えるのではなく、ゲノム中に存在する全ての遺伝子の機能とネットワークを網羅的に解明することに主眼が置かれるようになってきた。
【０００２】
医薬品の作用をＤＮＡチップによって解析する道も開かれてきた。免疫抑制剤ＦＫ５０６の作用メカニズムは既に詳しく解析されており、ＦＫ５０６はＦＫ結合タンパク質  （ＦＫ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＦＫＢＰ）  に結合し、ＦＫＢＰのｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  （ＣＮ）  活性化を阻害する。その結果、転写因子ＮＦＡＴの活性化が阻害されてリンパ球の活性化が抑制されることがわかっている。Ｍａｒｔｏｎらは酵母の全遺伝子に近い６０００余のｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップを用いて、この作用点について解析した。その結果、ＦＫ５０６の作用により、３６遺伝子（約０．６％）が２倍以上の変動を示した。その変動プロファイルは、野生株とＣＮ欠損株の遺伝子発現プロファイルの差異に酷似していた。この成果について、マートンらがネイチャー・メディシン第４号（２０００年）第１２９３頁から第１３０１頁  （Ｍａｒｔｏｎ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ４，（１９９９），  １２９３−１３０１）  に報告している。
【０００３】
また、ＤＮＡチップを用いた癌細胞の遺伝子発現プロファイルから、新しい分類により患者の予後を推定できることが示された。アリザドらは１８０００クローンのｃＤＮＡを固定したＤＮＡチップを作製し、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫  （ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｏｍａ  ；  ＤＬＢＣＬ）  患者の癌細胞における遺伝子発現を解析した。その結果、患者は２群に分けられ、一方は胚中心Ｂ細胞の遺伝子発現によく似た発現プロファイルを示し、他方は末梢血を活性化したＢ細胞によく似た発現プロファイルを示した。しかも、前者は後者よりも生存率が明らかに良好であった。このような分類は既存の病理学的診断では行えなかったことである。これらの成果についてはアリザドらがネイチャー第４０３号（２０００）第５０３頁から第５１１頁  （Ａｌｉｚａｄｅｈ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０３，（２０００），  ５０３−５１１  ）に報告している。
以上のような状況のもと、包括的遺伝子発現モニタリング法として、ＤＮＡチップ技術に対する期待が高まっている。
【０００４】
ＤＮＡチップの代表的なものとして、アフィメトリックス社のＤＮＡチップがある。アフィメトリックス社のＤＮＡチップは固相でＤＮＡプローブを合成するため、プローブ長を高々２５  ｍｅｒ  までしか伸長できない。従って蛍光検出感度が、スポットタイプのＤＮＡチップと比較して低い。これを克服するために、アフィメトリクス社の実験プロトコルでは、ハイブリダイゼーションにおいて毎分６０回の速度でＤＮＡチップを回転させている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡチップによる計測のメリットは数千から数万の遺伝子の発現状態を同時に解析可能な点である。一方、デメリットとして、他の遺伝子発現解析技術であるノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ボディマップ法と比較して、データの再現性・定量性が低いという点が挙げられる。ＤＮＡチップの再現性・定量性が低い原因の一つとして、投与したターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションの効率が低いという問題を挙げることができる。ハイブリダイゼーションの効率が低いため、特に発現量の少ない遺伝子については、検出される蛍光強度が微弱となり、データの定量性・再現性は著しく低下する。
【０００６】
以下にＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションの効率を計算する。一般に水溶液中でのｍＲＮＡの拡散定数はＤ  ＝  １０  μｍ２  ／  ｓ  程度であることについて、ポリッツらが米科学アカデミー紀要第９５号（１９９８年）第６０４３頁から第６０４８頁（  Ｐｏｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎｔａｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５  （１９９８）  ｐｐ６０４３−６０４８  ）  に報告している。また、ＤＮＡチップを用いた解析におけるハイブリダイゼーションに要する時間は一般的に６時間程度であるので、溶液中のターゲットＤＮＡがスライドガラス表面上で、ハイブリダイゼーション中に移動可能な距離は、
【数１】
＜  ｒ  ２＞１／２  ＝  ＜  ｘ２  ＋ｙ２  ＞１／２  ＝  ４Ｄｔ  １／２  ＝  （  ４×１０×６０×６０×６）  １／２  ＝  ９２９  ［  μｍ  ］
となる。
これはあるターゲットＤＮＡ分子がハイブリダイゼーション時間中にある位置から平均してｒ  ＝  ９２９  μｍ  しか移動できないことを意味する。一方、スライドガラス上で２４×５０  ｍｍ  程度のカバーガラスを用いて、ターゲットＤＮＡ溶液を押し広げることでハイブリダイゼーションを行う。従って、ターゲットＤＮＡがガラス上の相補的なプローブＤＮＡに全てハイブリダイズすると仮定した場合でも、投与した全ターゲットＤＮＡに対して、ＤＮＡチップ上の１つのスポットにおいてハイブリダイゼーションに寄与するターゲットＤＮＡの割合は、
【数２】
πｒ２  ／（２２×５０）  ＝π（０．９２９）２  ／（２２×５０）  ＝  ２．２６×１０−３
となる。
これは、ターゲットＤＮＡ溶液内の高々  ０．２  ％  しかハイブリダイゼーションに寄与していないことを示す。
【０００７】
また、ＤＮＡチップは、ｃＤＮＡあるいは合成したオリゴヌクレオチドをスポットするものと、基盤上でリソグラフィーを用いて固相合成するものの２種類に大別することが可能である。後者のＤＮＡチップはアフィメトリックス社により製造されるものであるが、基盤上での固相合成のため作成可能なオリゴヌクレオチドの長さは２５  ｍｅｒ  が限界とされている。しかし、２５  ｍｅｒ  のオリゴヌクレオチドは３００  ｍｅｒ  以上の長さを持つ  ｃＤＮＡ  のＤＮＡプローブと比較すると、ハイブリダイゼーションの効率が極端に低下する。これについて、増保が『ＤＮＡチップと最新ＰＣＲ法』（秀潤社）第７頁から１２頁において報告している。これを改善するために、アフィメトリックス社の実験プロトコルでは、サンプルｃＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｃＲＮＡとして増幅し、更にハイブリダイゼーションにおいて毎分６０回の速度でＤＮＡチップを回転させている。しかし、上述したプロトコルを用いた場合でも、発現量が低い遺伝子については３倍以上のばらつきがみられ、出芽酵母遺伝子の２割について遺伝子発現量の測定が困難であることについて、村上らが『現代化学』（東京化学同人）（  ２０００年７月号  ）  第６０頁から６８頁において報告している。従って、ＤＮＡチップによる計測におけるハイブリダイゼーションの効率の低さは、大きな課題の一つとなっている。
【０００８】
本発明の目的は、従来技術の限界である高々０．２％のハイブリダイゼーション効率を高め、定量性・再現性の高い信号を得ることのできる、安価かつ簡易で汎用性のあるハイブリダイゼーション方法および装置を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のハイブリダイゼーション方法および装置は、上記目的を達成するため、微粒子と、試料と、前記微粒子と前記試料を含む流体を保持する容器と、前記容器を複数固定する手段と、前記容器の湿度を制御する手段と、前記容器の温度を一定に保つ手段と、前記容器を回転させる手段を有する。
【００１０】
すなわち本発明は以下の（１）〜（１６）を提供する。
（１）  第１のヌクレオチドと前記第１のヌクレオチドと相補的な第２のヌクレオチドとのハイブリダイゼーション方法であって、
前記第１のヌクレオチドが固定化された基盤上に、前記第２のヌクレオチドを含む溶液を添加し、
微粒子を用いて前記溶液を攪拌しながらハイブリダイゼーションを行う、
ことを含み、前記微粒子が重力方向に落下することによって攪拌が行われることを特徴とする、上記方法。
（２）  前記微粒子がビーズであることを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（３）  前記微粒子の直径が０．０１μm以上１０μm以下であることを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
【００１１】
（４）  前記微粒子の表面が親水基によって被覆されていることを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（５）  前記微粒子の比重が前記溶液より高いことを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（６）  前記微粒子が磁気微粒子であることを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
【００１２】
（７）  前記基盤を回転させることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（８）  前記微粒子が溶液内で前記回転の回転中心方向への移動及び回転中心とは逆の方向への移動をすることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、上記（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（９）  前記基盤を振動させることによって前記攪拌を行うことを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
【００１３】
（１０）  前記微粒子は、前記第２のヌクレオチドに対し非吸着性であることを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１１）  前記混合の後、前記溶液をとじこめるために前記基盤上にカバー材をのせてシールドし、前記シールドした基盤を回転及び／または振動させることによって、前記溶液を攪拌することを特徴とする、上記（１）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１２）  第１のヌクレオチドが固定化された基盤と、前記第１のヌクレオチドと相補的な第２のヌクレオチド及び微粒子を含む溶液とを保持するための容器と、
回転時に前記微粒子が重力方向に落下するように前記容器を回転させるための回転機構と、
を含むことを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【００１４】
（１３）  前記回転機構による回転の回転方向及び回転速度を制御するための制御機構とを有することを特徴とする、上記（１２）記載のハイブリダイゼーション装置。
（１４）  前記回転速度は１ｒｐｍ以上６０ｒｐｍ以下に制御されることを特徴とする、上記（１２）記載のハイブリダイゼーション装置。
（１５）  前記装置には、更に容器内の湿度を制御する手段を備えていることを特徴とする、上記（１２）記載のハイブリダイゼーション装置。
（１６）  前記装置には、更に容器内の温度を制御する手段を備えていることを特徴とする、上記（１２）記載のハイブリダイゼーション装置。
【００１５】
以下、本発明の構成についてより具体的に説明する。
１）ＤＮＡチップの構成
蛍光標識されたターゲットＤＮＡを含むサンプル内に微粒子を混入させ、ピペッティングによりサンプルチューブ内で微粒子を分散させる。ターゲットＤＮＡをＤＮＡチップ上に滴下し、カバーガラスを被せ、ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションを行う領域にターゲットＤＮＡを押し広げる。シール剤を用いてＤＮＡチップに対してターゲットＤＮＡを固定する。ターゲットＤＮＡ及び微粒子をカバーガラスとＤＮＡチップにより挟み、これをシール剤で固定する。
【００１６】
微粒子を使う方法について、具体的な性質および数値を以下に述べる。
微粒子の表面はカルボキシル基、ヒドロキシル基などの親水基で被覆されていることが好ましい。これにより、微粒子とターゲットＤＮＡの非特異的な吸着を防ぎ、ハイブリダイゼーションに寄与するターゲットＤＮＡの量を低減させることなく、効率よくハイブリダイゼーションを行える。また、微粒子の組成は特に限定されず、市販のビーズ等を好適に使用することができる。特に好適に使用されるものとして磁気ビーズが挙げられる。ポリスチレンビーズでも効果があることが実験で確認されており、金微粒子等の金属粉末でも、ほぼ同様の効果が得られる。
【００１７】
微粒子の直径として、約０．０１  〜１０  μｍ  の範囲のものが使用可能であり、４〜１０μｍの範囲が好ましい。その中でもっとも効果が高かったのは直径  １０  μｍ  の微粒子である。ここで、ＤＮＡチップとカバーガラスで形成される間隙は約２０μｍであるため、直径が大きくなりすぎると動きが制限されてしまうため、あまり好ましくない。水の比重と比較して、微粒子の比重は大きいものが望ましい。使用可能な微粒子の比重は、１〜２０、好ましくは１．０５〜１９．３、最も好ましくは約１．５  ｇ／ｃｍ３である。また、微粒子の濃度としては１μｌ当たり数万個程度で用いることが好適である。
スライドの設置位置は、回転方向の面内に対して垂直方向よりも水平方向が効果的である。
【００１８】
２）ハイブリダイゼーション装置について
ハイブリダイゼーションインキュベータ（撹拌装置）は、ＤＮＡチップを保持するハイブリダイゼーションチャンバを保持できる１または複数の保持軸と、保持軸を回転させる回転軸より構成される。保持軸および回転軸はそれぞれ独立に回転することが可能である。回転軸の回転速度は任意に設定可能である。また、時間に対して回転速度を一定、あるいは可変に設定することが可能である。プログラムにより回転速度を時々刻々制御することも可能である。また、回転の方向も任意に設定できる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションの際の温度は、通常ハイブリダイゼーションにおいて使用する温度範囲内で任意に設定し得る。またハイブリダイゼーションに至適な温度として設定した温度に対して、±０．１℃の精度で一定に保つことが可能な温度制御手段を設けることができる。
【００２０】
容器の回転速度としては  １  〜６０  ｒｐｍ  まで可能である。もっとも高いハイブリダイゼーション効率を行えるのは６０  ｒｐｍ  である。回転速度をプログラムにより変化させたり、一定時間毎に回転方向を反転させることでより効果的な撹拌効果を得られると考える。
【００２１】
具体的には、逆転写反応により蛍光標識されたターゲットＤＮＡを作成し、９５℃、２分の熱変性によるプレハイブリダイゼーションを行う。その後、ターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液に対して、微粒子を混ぜ、ＤＮＡチップに滴下する。カバーガラスを被せ、シール剤でハイブリダイゼーション溶液をＤＮＡチップに対して固定する。ハイブリダイゼーションインキュベータ内でハイブリダイゼーションチャンバにＤＮＡチップを固定、密封する。そして、ハイブリダイゼーションチャンバをハイブリダイゼーションインキュベータ内の保持軸に固定し、保持軸の回転を開始する。ハイブリダイゼーションチャンバはＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防止するため、３×ＳＳＣを含んだ保湿剤を含む。ハイブリダイゼーションインキュベータは至適の温度でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションインキュベータはハイブリダイゼーションチャンバを複数固定可能であり、それぞれのチャンバを回転させる回転軸を持つ。回転時、ハイブリダイゼーション溶液内の微粒子は重力方向に絶えず落下し続けるため、ターゲットＤＮＡを攪拌する効果を持つ。結果として、ハイブリダイゼーション溶液中のターゲットＤＮＡと、スライドガラス上に固定されたＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションの効率を高めることができる。
尚、これら全体の工程を示すフローチャートを図８に示す。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のハイブリダイゼーション方法および装置の第一の実施例について図１、２、３、４を用いて説明する。
図１のハイブリダイゼーション溶液１０７内は、蛍光標識され、精製を経て、熱変性を完了したターゲットＤＮＡ１０３を含む。ハイブリダイゼーション溶液１０７に微粒子１０４を混入させ、サンプルチューブ１０２内でピペッティングを行い、ハイブリダイゼーション溶液１０７中で微粒子１０４を均一に分散させる。なお、微粒子１０４は表面にカルボキシル基を有しているため、ターゲットＤＮＡ１０３と非特異的に吸着しないという特性を持つ。従って、プローブＤＮＡに対するターゲットＤＮＡ１０３のハイブリダイゼーションの量は減少しない。
【００２３】
次に、ハイブリダイゼーション溶液１０７をＤＮＡチップ１０１に滴下し、カバーガラス１０５を被せ、ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションを行う領域にハイブリダイゼーション溶液１０７を押し広げる。シール剤１０６を用いてカバーガラス１０５下のハイブリダイゼーション溶液１０７をＤＮＡチップ１０１に対して固定する。
【００２４】
図２を用いてハイブリダイゼーションチャンバ２０１へのＤＮＡチップ２０３の固定法について説明する。ハイブリダイゼーションチャンバ２０１にはＤＮＡチップ２０３上のハイブリダイゼーション溶液の乾燥を防止するため、３×ＳＳＣ  （Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）  を含む保湿剤２０２が付加されている。ハイブリダイゼーションチャンバ２０１に蓋２０５を付加することにより、ハイブリダイゼーションチャンバ２０１内の湿度を飽和蒸気圧に保ち、ハイブリダイゼーション溶液の乾燥を防止できる。また、ハイブリダイゼーションチャンバ２０１は後述する回転状態においてもＤＮＡチップ２０３を強固に保持できる。尚、２０６はストッパーであるが、チャンバ内におけるＤＮＡチップの固定方法は特に限定されるものではない。
【００２５】
図３を用いて、ハイブリダイゼーションの効率を向上させる方法および装置について説明する。本装置は、温度を一定に保つハイブリダイゼーションインキュベータ３０４、ハイブリダイゼーションチャンバ３０３を固定する保持軸３０２、保持軸３０２を回転させる回転軸３０１から構成される。回転軸３０１および保持軸３０２は、矢印３１１、矢印３１２の方向にそれぞれ独立に回転できる。
【００２６】
また、ハイブリダイゼーションインキュベータ３０４は、プログラムにより任意の時刻における回転軸３０１および保持軸３０２の回転数および回転方向をそれぞれ独立に、任意に設定できる。また、保持軸３０２は複数のハイブリダイゼーションチャンバ３０３を同時に保持できる。また、ハイブリダイゼーションチャンバ３０３は円形の形状を持つので、回転軸３０１の回転方向に対してＤＮＡチップを垂直あるいは平行といった任意の方向に保持できる。
【００２７】
図３においてはＤＮＡチップ３０６を回転軸３０１の回転方向に対して水平に配置した例について説明する。ＤＮＡチップ３０６上において、ハイブリダイゼーション溶液がカバーガラス３０５とシール剤３０８により密封された状態でハイブリダイゼーションが進行している。ＤＮＡチップ３０６を保持したハイブリダイゼーションチャンバ３０３は回転軸３０１を中心として矢印の方向に毎秒６０回転の速度で回転している。ＤＮＡチップ３０６、３１０に保持されたハイブリダイゼーション溶液中には微粒子３０７、３０９が含まれている。微粒子３０７，３０９はいずれの回転状態においても重力方向へ落下する。従って、微粒子３０７、３０９は、移動する領域のハイブリダイゼーション溶液を体積分排除し、ハイブリダイゼーション溶液を攪拌する効果を持つ。ＤＮＡチップ３０６を静置する場合と比較して、ハイブリダイゼーション溶液中のＤＮＡターゲットの拡散距離が増加するため、ハイブリダイゼーションの効率が上昇する。従って、得られる信号が増加し、ＤＮＡチップ計測における再現性・定量性を向上させるという効果をもたらす。
【００２８】
上記の例では回転軸の回転のみについて説明したが、更に保持軸の回転も同時に加えることにより、更にハイブリダイゼーションの効率を上昇させることが可能である。
【００２９】
図４を用いて、上記図３とは異なる回転方法について説明する。同様にハイブリダイゼーションインキュベータ４０５はハイブリダイゼーション温度を至適の温度に精度よく保つ。ハイブリダイゼーションインキュベータ４０５内にはロータ４０１が並列に配置されており、一方向に回転できる（４０２）。ロータ４０１上にハイブリダイゼーションチャンバ４０４を接地させると、ハイブリダイゼーションチャンバ４０４は一方向に回転する。ハイブリダイゼーションチャンバ４０４内に保持されたＤＮＡチップ４０３内には前述したようにターゲットＤＮＡ内に微粒子を保持している。微粒子は重力方向に落下し、ターゲットＤＮＡを攪拌するため、ハイブリダイゼーション効率が上昇する。
【００３０】
また、ロータ４０１を矢印４０６で示されるようにシーソ状に移動させることも、ハイブリダイゼーションの効率を更に上昇させる。また、ロータ４０１に振動を加えることも可能であり、ハイブリダイゼーションの効率を更に上昇させる。ロータ４０１の回転速度、回転方向、シーソ状の振幅距離、振幅速度および振動は任意の時間に任意の状態に設定することが可能である。
【００３１】
図５に磁気微粒子をスターラにより回転させ、ハイブリダイゼーション効率を上昇させる方法について説明する。上述した方法によりＤＮＡチップ上のターゲットＤＮＡ内には既に磁気微粒子５０３が分散されている。磁気微粒子５０３がＤＮＡチップ５０２表面で回転すると、磁気微粒子５０３がＤＮＡプローブと接触し、ＤＮＡプローブの剥がれおよび効率良いハイブリダイゼーションの阻害などの問題が発生する。これらの問題を回避するために、本実施例では、ＤＮＡチップ５０２のカバーガラス面を下にした状態でスターラ５０１と接地させる。
【００３２】
磁気微粒子５０３はカバーガラス表面に落下し、微小なスターラ回転子として、回転をする。ターゲットＤＮＡ溶液が効率よく攪拌するため、ハイブリダイゼーションの効率を上昇させる。
【００３３】
図６に対流によりハイブリダイゼーションの効率を上昇させる方法について説明する。高熱源６０１上にターゲットＤＮＡをシールされた状態のＤＮＡチップ６０３を接地させる。次にＤＮＡチップ６０３の上面にペルチェ素子などの低熱源６０２を接地させる。ＤＮＡチップの上面と下面に温度差が生じ、ターゲットＤＮＡの対流が発生する。ターゲットＤＮＡ溶液が効率よく攪拌するため、ハイブリダイゼーションの効率を上昇させる。
【００３４】
図７に、従来方法と上述した新規方法によるハイブリダイゼーションの実験結果の一例を示す。実験はサンプルとしてＩＦＩ  ５６（インターフェロン誘導性タンパク質５６の遺伝子）を用い、以下の組成のバッファー中で６２℃、６時間のハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】
0003557419.tif 000002
【００３６】
図７の縦軸は蛍光強度を示す。従来の方法と比較して、本方法では５倍の蛍光強度を得ることができる。なお、エラーバーはスポット数２０の信号の標準偏差である。
【００３７】
【発明の効果】
以上詳述したように本発明を用いることによって、ＤＮＡチップ上のターゲットＤＮＡを攪拌し、ハイブリダイゼーションの効率を向上することができ、ターゲットＤＮＡの検出感度を上昇させることができ、またハイブリダイゼーション時間を短縮することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハイブリダイゼーション溶液のＤＮＡチップに対する固定の一例を示す。
【図２】ハイブリダイゼーションチャンバへのＤＮＡチップの固定法の一例を示す。
【図３】本発明のハイブリダイゼーション装置の一例を示す。
【図４】異なる回転方法を用いた本発明のハイブリダイゼーション装置の一例を示す。
【図５】スターラによる磁気微粒子の回転を用いた本発明のハイブリダイゼーション方法を示す。
【図６】対流によるハイブリダイゼーションの効率を上昇させる方法を示す。
【図７】従来方法と本発明のハイブリダイゼーション方法による実験結果の一例を示す。
【図８】全体の工程を示すフローチャートを示す。
【符号の説明】
１０１…ＤＮＡチップ、１０２…サンプルチューブ、１０３…ターゲットＤＮＡ、１０４…微粒子、１０５…カバーガラス、１０６…シール剤、１０７…ハイブリダイゼーション溶液、
２０１…ハイブリダイゼーションチャンバ、２０２、２０４…保湿剤、２０３…ＤＮＡチップ、２０５…蓋、２０６…ストッパー、
３０１…回転軸、３０２…保持軸、３０３…ハイブリダイゼーションチャンバ、３０４…ハイブリダイゼーションインキュベータ、３０５…カバーガラス、３０６、３１０…ＤＮＡチップ、３０７、３０９…微粒子、３０８…シール剤、３１１…回転軸の回転方向、３１２…保持軸の回転方向
４０１…ロータ、４０２…ロータの回転方向、４０３…ＤＮＡチップ、４０４…ハイブリダイゼーションチャンバ、４０５…ハイブリダイゼーションインキュベータ、４０６…シーソの振動方向
５０１…スターラ、５０２…ＤＮＡチップ、５０３…磁気微粒子、
６０１…高熱源、６０２…低熱源、６０３…ＤＮＡチップ
【図１】
0003557419.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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