(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物宿主中でのフィターゼの発現を起こし得る調節配列に機能的に結合するフィターゼをコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物でイネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物宿主をトランスホームし、該植物をフィターゼコードＤＮＡ配列が発現する条件下で生育すること、及び、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであることを特徴とする、フィターゼを含むトランスジェニック植物または植物器官の生産方法。
【請求項２】
前記発現構築物がフィターゼの構成的発現を起こし得る調節配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記発現構築物がフィターゼの組織特異的発現を行ない得る請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記フィターゼコードＤＮＡ配列が繊維状菌類に由来する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記フィターゼコードＤＮＡ配列がアスペルギルスに由来する請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記フィターゼコードＤＮＡ配列がＡ．フィカム、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリおよびＡ．ニズランスからなる群から選ばれるアスペルギルスに由来する請求項５記載の方法。
【請求項７】
植物または植物器官が該植物宿主中でフィターゼの発現を起こし得る調節配列と機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物を含むこと、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであること、及び該トランスジェニック植物または植物器官がイネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物由来のものであることを特徴とする、トランスジェニック植物または植物器官。
【請求項８】
請求項７に記載のトランスジェニック植物または植物器官又は請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法で生産されるフィターゼを含むトランスジェニック植物又は植物器官をフィチン酸塩を含む基質に作用させること及び該トランスジェニック植物または植物器官がイネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物由来のものであることを特徴とする、フィチン酸塩のイノシトールおよび無機リン酸への変換方法。
【請求項９】
飼料が請求項７に記載のトランスジェニック植物または植物器官又は請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法で生産したフィターゼを含むトランスジェニック植物又は植物器官を含むこと及び該トランスジェニック植物または植物器官がイネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物由来のものであることを特徴とする、動物の飼料組成物。
【請求項１０】
飼料を摂取したヒトを除く動物の成長増進に効果的な量の請求項９記載の飼料組成物を含む飼料で動物を飼育することを特徴とする、ヒトを除く動物の成長の増進方法。
【請求項１１】
試料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸に変換するのに有効な量の請求項９記載の飼料組成物を含む飼料でヒトを除く動物を飼育することを特徴とする、ヒトを除く動物排泄物中のフィチン酸塩レベルの減少方法。
【請求項１２】
フィターゼの生産方法であって、
ａ) イネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物宿主中、フィターゼを発現し得る調節配列に機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物でイネ及びトウモロコシからなる群より選ばれる単子葉植物宿主をトランスホームし、植物組織中でフィターゼコードＤＮＡ配列が発現される条件下で該トランスホーム植物を生育させる工程であって、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであることを特徴とする工程、および
ｂ)該トランスジェニック植物からフィターゼを抽出する工程、
以上ａ)およびｂ)の工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスジェニック植物におけるフィターゼの産生および工業における該フィターゼの使用に関する。
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
リンは、あらゆる生物の生育に必須の元素である。畜産においては、単胃動物（例えば、ブタ、家禽および魚）を良く生育させるために、飼料に無機リンを補わなければならない。これに対し反芻動物の飼料には無機リンを添加する必要はない。ルーメン内に存在する微生物が、フィチン酸塩（ｍｙｏ−イノシトールヘキサキス−ホスフェート）をイノシトールと無機リン酸塩に変換する酵素を生産する。フィチン酸は、植物に由来する全ての飼料物質中に貯蔵リンとして存在する（レヴュー：Ｐｈｙｔｉｃ  ａｃｉｄ，  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｅ．グラフ（Ｇｒａｆ）編，  Ｐｉｌａｔｕｓ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６））。フィチン酸は、あらゆるナッツ、穀類、マメ類、種、胞子および花粉に１−３％含まれている。フィチン酸の複合塩は、フィチンと呼ばれる。フィチン酸は、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、鉄などのミネラルをキレートし、また蛋白質と反応して、蛋白質や栄養的に重要なミネラルの利用を減少させることから、反栄養因子と考えられている。フィチン酸塩のリンは、単胃動物の胃腸を通過し、排泄される。フィチン酸塩は、結腸でいくらか加水分解されるが、無機リンは、小腸でのみ吸収されることからこのようにして放出される無機リンは栄養的な価値はない。結論として、飼料中に存在していたとしても、単胃動物は、栄養的に重要なリンを使用できない。
フィチン酸塩のリンの排泄は、重大な問題を含んでいる。この十年、畜産は非常に盛んになってきている。結果的に生産される排泄物の量は、それに応じて増加しており、世界中のいろいろな所で環境問題を引き起こしている。これは、一部は表面水中における排泄物由来のリン酸の蓄積によるもので、これが冨栄養化を起こしている。
フィチン酸塩をイノシトールと無機リン酸に変換する微生物出来の酵素は、フィターゼとして広く知られている。フィターゼ産生微生物には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｖ．Ｋ．ペーパー（Ｐａｐｅｒ）およびＶ．Ｊ．ジャガナサン（Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）（１９８２）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５１，  １１０２）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｄ．Ｊ．コスグローブ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）（１９７０）Ａｕｓｔｒａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３，  １２０７）などのバクテリア；サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｎ．Ｒ．ナイーニ（Ｎａｙｉｎｉ）およびＰ．マーカキス（Ｍａｒｋａｋｉｓ）（１９８４）Ｌｅｂｉｎｓｍｉｔｔｅｌ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ｕｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  １７，  ２４）などのイーストおよびアスペルギラス  テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｉｓ）（Ｋ．ヤマダ（Ｙａｍａｄａ），Ｙ．ミノダ（Ｍｉｎｏｄａ）およびＳ．ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）（１９８６）Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３２，  １２７５）などの菌類が含まれる。その他のアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種でもいろいろなものがフィターゼを生産していることが知られており、その中でも、アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）によって生産されるフィターゼは、他の微生物によって生産されるフィターゼよりも熱安定性が高いことと同時に、比活性がもっとも高いものの一つであることが分かった（ファンゴルコム（ｖａｎ  Ｇｏｒｃｏｍ）等（１９９１）ヨーロッパ特許出願８９２０２４３６．５，  刊行番号０  ４２０  ３５８，  １９８９年９月２７日登録）。
【０００２】
また、フィターゼは、多くの植物の内部に存在する（ローワス（Ｌｏｅｗｕｓ），Ｆ．Ａ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  ９  ：“植物中のイノシトール代謝”（Ｋ．Ｊ．モア（Ｍｏｒｒｅ），Ｗ．Ｆ．ボス（Ｂｏｓｓ），Ｆ．Ａ．ローワス（Ｌｏｅｗｕｓ）編）１３）。ゲラトリー（Ｇｅｌｌａｔｌｙ），Ｋ．Ｓ．およびレフェブレ（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ），Ｄ．Ｄ．（（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（増補），９３，  アブストラクト５６２）は、じゃがいもの塊茎由来のフィターゼｃＤＮＡクローンの単離および特性について報告している。ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ），Ｄ．Ｍ．等およびクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ），Ａ．Ａ．等（（１９８８）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｍ．，  １２Ｃ，  アブストラクトＬ４０７およびＬ４０２）は、大豆の種の発芽の際の内在性フィターゼの合成について報告している。しかし、植物性フィターゼは、通常工業的な用途に使用するには生産量が不十分である。
単胃動物の飼料に微生物性フィターゼを添加するという考え方は、以前からある（ウエア（Ｗａｒｅ），Ｊ．Ｈ．，  ブラック（Ｂｌｕｆｆ），Ｌ．およびシェー（Ｓｈｉｅｈ），Ｔ．Ｒ．（１９６７）米国特許第３，２９７，５４８；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），Ｔ．Ｓ．，  シェー（Ｓｈｉｅｈ），Ｔ．Ｒ．，  ウォジンスキー（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ），Ｒ．Ｊ．およびウエア（Ｗａｒｅ），Ｊ．Ｈ．（１９７１）Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １０１，  １２８９）。しかし、今日までこの酵素の生産コストが高いという理由から、この考えの応用は、商業的にうまくいっていない（Ｙ．Ｗ．ハン（Ｈａｎ）（１９８９）Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ，  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４，  ３４５）。経済的理由から、今でも無機リンが単胃動物の飼料に添加されている。
フィターゼには、他の工業的用途がある。その例には、とうもろこしや小麦等の穀類から澱粉を生産する工業的プロセスに使用することが挙げられる。このような湿式製粉プロセスから得られるコーングルテン等を含む廃棄産物が、動物飼料として売られている。浸せきプロセスの際に、フィターゼを補うことが出来る。
その条件（Ｔ＝５０℃およびｐＨ＝５．５）は、菌類フィターゼに理想的なものである（ヨーロッパ特許出願０  ３２１  ００４  アルコ社）。都合がよいことに、このプロセスの廃棄産物に由来する動物飼料にはフィチン酸塩の代わりにリン酸塩を含む。
また、フィターゼは、大豆処理にも使用できると考えられてきた（アルコ社製フィナーゼ（Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）），フィンランド、ラジャマキ、アルコ社から刊行されている製品情報パンフレット参照）。大豆食には、この蛋白質源をベビーフードや魚、牛および他の反芻動物用の飼料への使用に適さないものにする高レベルの反栄養因子フィチン酸塩が含まれている。この高蛋白質源の酵素的変換で、この原料の栄養的および商業的価値が増加する。
【０００３】
高価な蛋白質の生産システムとしてトランスジェニック植物を使用が提唱された。今日までの例としては、タバコにおけるインターフェロン（グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ），Ｒ．Ｍ．，  クノーフ（Ｋｎａｕｆ），Ｖ．Ｃ．，  フーク（Ｈｏｕｃｋ），Ｃ．Ｍ．およびコマイ（Ｃｏｍａｉ），Ｌ．（１９８７）  ＰＣＴ／ＷＯ８７／００８６５），タバコ、ブラシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）およびアラビドシス  サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるエンカファリン（バンデカークホーブ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ），Ｊ．，  ファンダメ（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ），Ｊ．，  ファンリセベテンス（Ｖａｎ  Ｌｉｊｓｅｂｅｔｔｅｎｓ），Ｍ．，  ボターマン（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ），Ｊ．，  デブロック（ＤｅＢｌｏｃｋ），Ｍ．，  デクラーク（ＤｅＣｌｅｒｑ），Ａ．，  リーマンス（Ｌｅｅｍａｎｓ），Ｊ．ファンモンターギュ（Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ），Ｍ．およびクレバース（Ｋｒｅｂｂｅｒｓ），Ｅ．（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ７，  ９２９），タバコにおける抗体（ハイアット（Ｈｉａｔｔ），Ａ．，  カファキー（Ｃａｆｆｅｒｋｅｙ），Ｒ．およびボーディッシュ（Ｂｏｅｄｉｓｈ），Ｋ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ７６）およびタバコおよびポテトにおけるヒト血清アルブミン（シモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ），Ｐ．Ｃ．，  デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ），Ｂ．Ｍ．Ｍ．，  シラメイヤー（Ｓｃｈｒａｍｍｅｒｊｅｒ），Ｂ．バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ），Ｔ．Ｃ．，  ファンデンエルゼン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ），Ｐ．Ｊ．Ｍ．  およびホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ８，  ２１７）の生産がある。
実際に、多くの植物種、特に双子葉植物種（例えば、タバコ、ポテト、トマト、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ），ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））のトランスホーメーションは、当分野においてルーチンになっている（クリー（Ｋｌｅｅ），Ｊ．，  ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ），Ｒ．およびロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ），Ｓ．（１９８７）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ３８，  ４６７；ガサー（Ｇａｓｓｅｒ），Ｃ．Ｓ．およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ），Ｒ．Ｔ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，  １２９３）。植物において外来遺伝子を発現させる方策は、確立されている（ガサー（Ｇａｓｓｅｒ）およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ），上述）。植物および植物細胞内で機能的に発現されえるキメラ遺伝子の構築に用いられる植物遺伝子由来の調節遺伝子が同定されている。この遺伝子構築物の植物への導入のために、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム  リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたトランスホーメーションなど幾つかの方法が使用できる。この方策を用いて、幅広い植物組織が使われてきたが、その選択は、その植物種や組織培養の容易さに依存する。うまくいった例には、プロトプラスト、ミクロスポア、または花粉および築、茎、根、胚軸および子葉等のイクスプラントのトランスホーメーションがある。さらに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝突および直接的ＤＮＡ取り込み等、プロトプラストや植物細胞または組織への直接的ＤＮＡ導入が使用される（ガサー（Ｇａｓｓｅｒ）およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）、上述）。
【０００４】
種々の発現システムを用いて、植物中で蛋白質を生産し得る。例えば、カリフラワー  モザイク  ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の構成的プロモーターを用いると、トランスジェニック植物の全ての器宮中に発現した蛋白質が蓄積される（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ），Ｈ．，  ダドリー（Ｄｕｄｌｅｙ），Ｒ．Ｋ．，  ジョナード（Ｊｏｎａｒｄ），Ｇ．，  バラズ（Ｂａｌａｚｓ），Ｅ．およびリチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ），Ｋ．Ｅ．（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０，  ７６３）。それとは別に、非常に組織特異的でステージ特異的に発現される蛋白質をコードする遺伝子、即ち、標的組織でのみ、かつ、分化の所定の段階でのみ発現される遺伝子（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｔ．Ｊ．Ｖ．，  （１９８４）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏ１．  ３５，  １９１；ショットウェル（Ｓｈｏｔｗｅｌｌ），Ｍ．Ａ．およびラーキンス（Ｌａｒｋｉｎｓ  ９，ｂ．ａ．（１９８９）“植物の生化学”ｖｏ１．１５（アカデミックプレス、サンディエゴ：スタンフ（Ｓｔａｍｐｆ），Ｐ．Ｋ．およびコン（Ｃｏｎｎ），Ｅ．Ｅ．，  編）由来のプロモーターも使用しえる。
フィターゼ生産の経済的方法は、とりわけ動物飼料工業に有益であると考えられる。より経済的にフィターゼを生産する方法は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、例えば動物が直接摂取するための動物飼料に添加しえるフィターゼを発現できるトランスジェニック植物または植物器官を生成するものとなるであろう。それとは別に、これらのトランスジェニック植物または植物器官で発現されるフィターゼを抽出し、場合によっては、所望される用途に合うように精製することが出来る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるフィターゼの発現およびこれらの植物の生産方法を提供する。この事は、フィターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を植物に導入することによって行われる。
本発明により提供される植物のトランスホーメーションを目的としたＤＮＡ発現構築物は、フィターゼの発現を指示しえる調節配列のコントロール下にある。これらの調節配列は、その植物またはその一部分を使用するかに存在して、構成的または段階的および、または組織特異的に、植物における転写を指示しえる配列も含む。
本発明により提供されるトランスジェニック植物および植物器官は、例えば動物飼料に直接使用する様式で、工業プロセスに使用することもできるし、また、そこから発現したフィターゼを抽出したり、場合によっては精製することもできる。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）単子葉植物宿主中でのフィターゼの発現を起こし得る調節配列に機能的に結合するフィターゼをコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物で単子葉植物宿主をトランスホームし、該植物をフィターゼコードＤＮＡ配列が発現する条件下で生育すること、及び、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであることを特徴とする、フィターゼを含むトランスジェニック植物または植物器官の生産方法；
（２）前記発現構築物がフィターゼの構成的発現を起こし得る調節配列を含む前記（１）に記載の方法；
（３）前記発現構築物がフィターゼの組織特異的発現を行ない得る前記（１）に記載の方法；
（４）前記フィターゼコードＤＮＡ配列が繊維状菌類に由来する前記（３）に記載の方法；
（５）前記フィターゼコードＤＮＡ配列がアスペルギルスに由来する前記（４）に記載の方法；
（６）前記フィターゼコードＤＮＡ配列がＡ．フィカム、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリおよびＡ．ニズランスからなる群から選ばれるアスペルギルスに由来する前記（５）に記載の方法；
（７）植物または植物器官が該植物宿主中でフィターゼの発現を起こし得る調節配列と機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物を含むこと、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであること、及び該トランスジェニック植物または植物器官が単子葉植物由来のものであることを特徴とする、トランスジェニック植物または植物器官；
（８）前記（７）に記載のトランスジェニック植物または植物器官又は前記（１）乃至（６）のいずれか１つに記載の方法で生産されるフィターゼを含むトランスジェニック植物又は植物器官をフィチン酸塩を含む基質に作用させること及び該トランスジェニック植物または植物器官が単子葉植物由来のものであることを特徴とする、フィチン酸塩のイノシトールおよび無機リン酸への変換方法；
（９）飼料が前記（７）に記載のトランスジェニック植物または植物器官又は前記（１）乃至（６）のいずれか１つに記載の方法で生産したフィターゼを含むトランスジェニック植物又は植物器官を含むこと及び該トランスジェニック植物または植物器官が単子葉植物由来のものであることを特徴とする、動物の飼料組成物；
（１０）飼料を摂取したヒトを除く動物の成長増進に効果的な量の前記（９）に記載の飼料組成物を含む飼料で動物を飼育することを特徴とする、ヒトを除く動物の成長の増進方法；
（１１）試料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸に変換するのに有効な量の前記（９）に記載の飼料組成物を含む飼料でヒトを除く動物を飼育することを特徴とする、ヒトを除く動物排泄物中のフィチン酸塩レベルの減少方法；及び
（１２）フィターゼの生産方法であって、
ａ）単子葉植物宿主中、フィターゼを発現し得る調節配列に機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物で単子葉植物宿主をトランスホームし、植物組織中でフィターゼコードＤＮＡ配列が発現される条件下で該トランスホーム植物を生育させる工程であって、該フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来のものであることを特徴とする工程、および
ｂ）該トランスジェニック植物からフィターゼを抽出する工程、
以上ａ）およびｂ）の工程を含む方法
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に従い、フィターゼを生産するトランスジェニック植物または植物器官が得られる。この事は、フィターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物の植物への導入で行われる。
本発明により、フィターゼをコードする遺伝子による植物の安定なトランスホーメーションを目的としたＤＮＡ発現構築物が提供される。これらの構築物は、フィターゼの発現を指示しうる調節配列と機能的に結合したフィターゼをコードするＤＮＡ遺伝子を含む。また、これらの調節配列には、その植物またはその一部分を使用するかに従って、構成的に、または段階的および、または組織特異的に植物中での転写を指令しえる配列も含む。
本発明で提供される発現構築物は、選択された植物宿主のバクテリア依存のトランスホーメーションで使用するベクター、好ましくはプラスミドに挿入しえる。さらに、この発現構築物はその植物の宿主のゲノムに組み込まれることが好ましい。
本発明の範囲において、フィターゼという言葉は、種々のｍｙｏ−イノシトールリン酸塩から無機リンを放出する反応を触媒する一連の酵素が含まれる。この事は、フィターゼ活性を有する全ての蛋白質が含まれると理解される。
フィターゼをコードするＤＮＡ配列は、微生物、植物または動物など種々の生物から得ることが出来る。このＤＮＡ配列は、繊維状菌類アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の微生物から得ることが望ましい。更に、このＤＮＡは、アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギラス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）およびアスペルギラス  ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）から得ることが望ましい。
フィターゼ蛋白質をコードする遺伝子またはｃＤＮＡのクローニングは、種々方法で行いえる。一つの方法は、フィターゼ蛋白質の精製、Ｎ−末端および幾つかのアミノ酸配列の決定、およびそのアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いたフィターゼ産生生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを含むものである。
もし、少なくともその遺伝子の部分的配列が分かっているなら、この情報を用いてポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）等によりそれに対応するｃＤＮＡをクローン化することが出来る（ＰＣＲ技術：原則およびＤＮＡ増幅への応用、（１９８９）Ｈ．Ａ．
アーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）編、ストックトンプレス、ニューヨーク）。
【０００８】
上述のクローン化したフィターゼ遺伝子は、他の微生物からのフィターゼコード遺伝子の単離を目的とした異種ハイブリダゼーション実験に使用しえる。
別の特徴として、上述のクローン化フィターゼ遺伝子は、第二世代フィターゼの構築の原料として使用しえる。第二世代フィタ−ゼとは、突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発）で変化し野生型のフィターゼまたは本発明により生成された組み換えフィターゼとは異なる性質を有するフィターゼである。例えば、至適濃度またはｐＨ、比活性または基質親和性を所定の過程に使用するのにより適したものになるように変えることが出来る。
フィターゼをコードするｃＤＮＡを単離すれば、例えば、プロモーター、分泌シグナル、またはそれらの組み合わせたもののような調節要素の交換などの組み換えＤＮＡ技術を使用して、選択された植物宿主におけるフィターゼの生産を指令しえる発現構築物を構築できる。
フィターゼは、このトランスジェニック植物において、分化のあらゆる段階で構成的に生産される。この酵素は、植物または植物の器官の使用に依存して、例えば、塊茎形勢または果実分化の際など、段階特異的に発現しえる。また、その使用に依存して、この酵素は、たとえば、果実、塊茎、葉または種子など植物器宮内に組織特異的に発現される。
本発明の範囲のトランスジェニック植物には、所望の植物または植物器官内のフィターゼ生産の開始や増加を起こすように組み換えＤＮＡ技術により遺伝的に修正された植物（外植物の一部および細胞も同様に）およびそれらの子孫も含まれる。
本発明において、フィターゼの増加という語句は、同量の未修正植物組織に見られる平均的フィターゼ酸素量と比較して統計的に有意に増加したフィターゼを含む統計的に有意な量の植物組織を示す。
【０００９】
本発明において、選択される植物には、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）およびチョウセンアザミ（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）のような食用花、リンゴ（Ｍａｌｕｓ，  例えばｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ），バナナ（Ｍｕｓａ，  例えばａｃｕｍｉｎａｔａ），ベリー（スグリ等、Ｒｉｂｅｓ，  例えばｒｕｂｒｕｍ），チェリー（スィートチェリー等、Ｐｒｕｎｕｓ，例えばａｖｉｕｍ），キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ，例えばｓａｔｉｖｕｓ），ブドウ（Ｖｉｔｉｓ，例えばｖｉｎｉｆｅｒａ），レモン（Ｃｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ），メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ），ナッツ（ウォールナッツ等、Ｊｕｇｌａｎｓ，例えばｒｅｇｉａ；  ピーナッツ、Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇｅａｅ），オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ，  例えばｍａｘｉｍａ），ピーチ（Ｐｒｕｎｕｓ，  例えばｐｅｒｓｉｃａ），ナシ（Ｐｙｒａ，  例えばｃｏｍｍｕｎｉｓ），プラム（Ｐｒｕｎｕｓ，例えばｄｏｍｅｓｔｉｃａ），ストロベリー（Ｆｒａｇａｒｉａ，  例えばｍｏｓｃｈａｔａ），トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ，  例えばｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ），アルファルスァ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ，  例えばｓａｔｉｖａ）、キャベツ（例えばＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ），エンジブ（Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ，  例えばｅｎｄｉｖｉａ），リーク（Ａｌｌｉｕｍ，  例えばｐｏｒｒｕｍ），レタス（Ｌａｃｔｕｃａ，  例えばｓａｔｉｖａ），ほうれん草（Ｓｐｉｎａｃｈａ，  例えばｏｌｅｒａｃｅａｅ），タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，  例えばｔａｂａｃｕｍ）等の葉、アロールート（Ｍａｒａｎｔａ，  例えばａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ），ビート（Ｂｅｔａ，  例えばｖｕｌｇａｒｉｓ），ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ，  例えばｃ  ａｒｏｔａ），キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ，  例えばｅｓｃｕｌｅｎｔａ），ターニップ（Ｂｒａｓｓｉｃａ，  例えばｒａｐａ），ラディッシュ（Ｒａｐｈａｎｕｓ，  例えばｓａｔｉｖｕｓ），ヤム（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ，  例えばｅｓｃｕｌｅｎｔａ），スィートポテト（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）等の根およびビーン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ，  例えばｖｕｌｇａｒｉｓ），ピー（Ｐｉｓｕｍ，  例えばａｓｔｉｖｕｍ），大豆（Ｇｌｙｃｉｎ，  例えばｍａｘ），小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ，  例えばａｅｓｔｉｖｕｍ），大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ，  例えばｖｕｌｇａｒｅ），コーン（Ｚｅａ，  例えばｍａｙｓ），米（０ｒｙｚａ，  例えばｓａｔｉｖａ），レープシード（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ），ミレット（Ｐａｎｉｃｕｍ  Ｌ．），ひまわり（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ），オーツ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）等の種子、コールラビ（Ｂｒａｓｓｉｃａ，  例えばｏｌｅｒａｃｅａｅ），ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ，  例えばｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等の塊茎が含まれるが、これらの限られるわけではない。
基本的に、植物種の選択は、その植物またはその一部のトランスホーメーションの容易性により決定する。
フィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物の標的植物への導入法には幾つかある。これらの方法には、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションまたは（コート化）粒子衝突（ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ），Ｉ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．  ８，  ５３５）等を用いたプロトプラストのトランスホーメーションが含まれる。
【００１０】
これらのいわゆる直接的ＤＮＡトランスホーメーション法に加えて、ウイルスベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ））およびバクテリアベクター（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属）（ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ），上述）等のベクターを含むトランスホーメーションシステムが広く使われている。選択および、またはスクリーニングの後、トランスホームしたプロトプラスト、細胞または植物の一部分を当分野でよく知られている方法を用いて完全な植物体に再生する（ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ），Ｒ．Ｂ．，  フライ（Ｆｒｙ），Ｊ．Ｅ．，  ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ），Ｎ．Ｌ．，  アイクホルツ（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ），Ｄ．，  ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ），Ｓ，Ｇ，  およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ），Ｒ．Ｔ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，  １２２９）。トランスホーメーションおよび、または再生の方法の種類は、本発明に本質的ではない。
双子葉植物の場合、本発明の好ましい態様では、バイナリーベクターシステムを使用する（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．ハーシュ（Ｈｉｒｓｃｈ），Ｐ，  Ｒ，  ホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ），Ｐ．Ｊ．Ｊ．およびシルパルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ），Ｒ．Ａ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，１７９；シルパルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ），Ｒ．Ａ．，  ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．およびホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ），Ｐ．Ｊ．Ｊ．（１９８４）ヨ−ロッパ特許出願Ｎｏ．０  １２０  ５１６）。このシステムでは、毒性遺伝子を含むｖｉｒプラスミドおよび転移すべき遺伝子構築物を含む適合プラスミドを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する。このベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の両方で複製でき、かつ、本発明に関係ない詳細な修正を行えるバイナリーベクターＢｉｎ１９（ビーバン（Ｂｅｖａｎ），Ｍ．（１９８４）Ｎｕｃｌ，  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ８７１１）から誘導される。本実施例で使用されているように、このバイナリーベクターには、Ｔ−ＤＮＡの左−および右−境界配列のあいだに、カナマイシン耐性をコードするＮＰＴＩＩ−遺伝子（ビーバン（Ｂｅｖａｎ）上述）および必要とされる遺伝子構築物をクローニングするための多重クローニング部位がある。
【００１１】
単子葉穀物のトランスホーメーションおよび再生は、標準的方法ではない。しかし、最近の科学の進歩は、原則的に、単子葉植物はトランスホームしやすく、かつ、トランスジェニック植物は、トランスホーム細胞から再生しえることを示した。遺伝子物質の植物への導入に関する強力な方法とともに、これらの穀物の再生産可能な組織培養システムの発展が、トランスホーメーションを容易にした。現在、単子葉植物のトランスホーメーション法の選択には、植物片または懸濁細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメントおよびプロトプラストの直接的ＤＮＡ取り込み、またはエレクトロポレーションがある。例えば、トランスジェニック稲植物は、選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性をコードするバクテリアｈｐｈ遺伝子を用いてうまく得ることが出来る。この遺伝子は、エレクトロポレーションにより導入する（シマモト（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ），Ｋ．，  テラダ（Ｔｅｒａｄａ），Ｒ．，  イザワ（Ｉｚａｗａ），Ｔ．およびフジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ），Ｈ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，  ２７４）。トランスジェニックトウモロコシは、微粒子衝突によりトウモロコシ懸濁培養物の胚細胞に、（除草剤ホスフィノスリシンを不活性化する酵素）ホスフィノスリシン  アセチルトスンスフェラーゼをコードするストレプトミセス  ハイグロスコピ力ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）  ｂａｒ遺伝子を導入することによって得られる（ゴードンカム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ），Ｗ．Ｊ．，  スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ），Ｔ，  Ｍ．，  マンガノ（Ｍａｎｇａｎｏ），Ｍ．Ｌ．，  アダムス（Ａｄａｍｓ），Ｔ．Ｒ．，  デイネス（Ｄｅｎｅｓ），Ｒ．Ｊ．，  スタート（Ｓｔａｒｔ），Ｗ．Ｇ．，  オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ），  Ｊ．Ｖ．，  チャンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ），Ｓ．Ａ．，  アダムス（Ａｄａｍｓ）Ｊｒ．，  Ｒ．Ｗ．，  コーシュ（Ｋａｒｓｃｈ），  Ａ．Ｐ．およびレモークス（Ｌｅｍａｕｘ），Ｐ．Ｇ．（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，  ６０３）。小麦や大麦などのその他の単子葉穀物のアルローンプロトプラストヘの遺伝子物質の導入も報告されている（リー（Ｌｅｅ），Ｂ．，  マードック（Ｍｕｒｄｏｃｈ），Ｋ，  卜ッピング（Ｔｏｐｐｉｎｇ），Ｊ．，  クレイス（Ｋｒｅｉｓ），Ｍ．およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），・Ｍ．Ｇ．Ｋ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３，  ２１）．小麦は、胚懸濁培養を行うための成熟した緻密でこぶのある胚形成カルス組織を選択することによって、胚懸濁培養物から再生する（バシル（ｖａｓｉｌ），Ｖ．，  レドウェイ（Ｒｅｄｗａｙ），Ｆ．およびバシル（Ｖａｓｉｌ），Ｉ．Ｋ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ８，  ４２９）。この穀物に対して幾つかのトランスホーメーションシステムを組み合わせて用いることは、本発明の単子葉植物への応用を可能にする。また、これらの方法は、双子葉植物のトランスホーメーションおよび再生にも適用しえる。
【００１２】
このフィターゼ構築物の発現には、組み替えＤＮＡ技術の分野でよく知られている植物ポリメラーゼによる遺伝子の転写やｍＲＮＡの翻訳などの詳細な事項が含まれる。本発明の理解に関連する事項のみを以下に説明する。
本発明では、フィターゼの発現を起こすことが知られている調節配列を用いている。使用する調節配列の選択は、所望する標的穀物および、または標的器官に依存する。このような調節配列は植物体または植物ウイルスから得ることが出来るし、また、化学的に合成することもできる。このように調節配列には、植物または植物の一部分の使用に依存して、構成的にまたは段階的および、または組織特異的に植物における転写を指令するプロモーターがある。これらのプロモーターには、これらに限られるわけではないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の構成的発現を示すプロモーター（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、（１９８２）ｃｅｌｌ  ３０，  ７６３）、ノブロース  ビスホスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニット遺伝子のプロモーターなどの葉特異的なもの（コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）等、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３，  （１６７１），グルタミンシンテース遺伝子出来のプロモーターなどの根特異的発現に関するもの（チンゲイ（Ｔｉｎｇｅｙ）等、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６，  ３５６５），ブラシカ  ナパスー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のクルシフェリンＡプロモーターなどの種子特異的発現に関するもの（ライアン（Ｒｙａｎ）等、（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７，  ３５８４）、ポテトのクラス−Ｉパタチンプロモーター等の塊茎特異的発現に関するもの（ロカ−ソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ）等、（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８，  ２３；ウェンズラー（Ｗｅｎｚｌｅｒ）等、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  ４１）または、トマトのポリガラクトウロナーゼ（ＰＧ）プロモーターなどの果実特異的発現に関するもの（バード（Ｂｉｒｄ）等、（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ６５１）などがある。
ターミネーターやポリアデニレーションシグナル等その他の調節配列には、植物中でそのような機能を果たすものが含まれ、その選択は当業者によって行いえる。このような配列の例には、アグロバクテリウム、ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンテース（ｎｏｓ）遺伝子の３’隣接領域がある（ビーバン（Ｂｅｖａｎ），Ｍ．上述）。
【００１３】
また、調節配列には、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターに見られるエンハンサー配列、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）ＲＮＡ４のリーダー配列などのｍＲＮＡ安定化配列（ブレデロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ），Ｆ．Ｔ．，  コパーワルトフ（Ｋｏｐｅｒ−Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ），Ｅ．Ｃおよびボル（Ｂｏｌ），  Ｊ．Ｆ．  （１９８０）  Ｎｕｃｌ．  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８，  ２２１３）または、同様の機能を果たすその他の配列が含まれる。
フィターゼは、発現された蛋白質の安定性が保証される環境に発現されなければならない。本発明においてフィターゼの生物物理学的パラメーターに依存して、細胞質ゾル、小胞体、液胞、プロテインボディー、または細胞周辺腔等の細胞部分を選択することでそのような安定した環境を作ることが出来る。このようなパラメータには、至適ｐＨ、プロテアーゼに対する感受性または所望される細胞部分のモル濃度に対する感受性などが含まれる。
この細胞の細胞質で発現させるためには、発現される酵素は分泌シグナルペプチドまたはその他の標的配列を含むべきではない。葉緑体およびミトコンドリアでの発現のためには、発現される酵素はこれらのオルガネラに移行させるための特異的ないわゆるトランジットペプチドを含むべきである。この事を行うための、目的の酵素に結合しうる標的配列は、良く知られている（スミーケンズ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、（１９９０）Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．  １５，  ７３；ファンデンブルーク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）等、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，  ３５８；シュレーヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）等、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４，  ２５）。もし、液胞内でこの酵素の活性が望まれるなら、この酵素を液胞に送る特異的標的配列と同時に、分泌シグナル配列が存在しなければならない（タグー（Ｔａｇｕｅ）等、（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．  ８６，  ５０６）。種子におけるプロテインボディーについても同じことが言える。目的の酵素をコードするＤＮＡ配列は、この酵素が細胞中の所望される位置で作用できるように、修正されなければならない。
フィターゼの細胞外発現を行うために、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列を使用する．植物宿主と同種（天然）のシグナル配列が望ましいが、異種配列、すなわち、他の植物種または微生物起源のものも同様に使用できる。このようなシグナル配列は当分野でよく知られている。本発明で使用しえる適当なシグナル配列は報告されている。ウォルター（Ｗａｌｔｅｒ），Ｐ．およびブロベル（Ｂｌｏｂｅｌ），Ｇ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｓｙｍｐ．，  ４７，  １８３；ホンハイン（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ），Ｇ．（１９８６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １８９，  ２３９；およびシモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ），Ｐ．Ｃ．，  デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ），Ｂ．Ｍ．Ｍ．，  シュラメイアー（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ），Ｂ．，  バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ），Ｔ．Ｃ．，  ファンデンエルゼン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ），Ｐ．Ｊ．Ｍ．およびホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ），Ａ．（１９９０）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ８，  ２１７。
【００１４】
本発明の関連するＤＮＡ構築物のあらゆる部分（プロモーター、調節、分泌、安定化、ターゲッティング、またはターミネーション配列）は、望ましいなら当分野でよく知られている方法を用いてそれらのコントロール特性を変えることができる。
本発明を用いて得られるフィターゼを含む植物用いて、より高レベルのフィターゼを有する植物または植物器官を得ることが出来ることが指摘される。例えば、ソモクローナル変化技術または交配技術により、このような植物または植物器官を得ることが出来る。これらの技術は当分野でよく知られている。
本発明の態様においては、アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）から単離したｍＲＮＡからフィターゼをコードする二本鎖ｃＤＮＡを調製する。このＤＮＡ構築物は、ブラシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の１２Ｓ貯蔵蛋白質をコードする遺伝子の調節配列のコントロール下に置く。それからこの構築物をｐＭＯＧ２３（大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５α中、１９９０年１月２９日オランダ、バーン、セントラルブリューボアシメルカルチャーズに受理番号ＣＢＳ  １０２．９０で登録された）等のバイナリーベクターにサブクローニングした。このベクターをジスアームドＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコまたはブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来の組織と共培養し、そして、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択してから、誘導してこのような培地で分化した植物に再生する。生成した植物は、このＤＮＡ構築物を発現する種子を生産する。
本発明の別の態様においては、このフィターゼコードＤＮＡ構築物は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター由来の調節配列のコントロール下に置く。その後、このベクターをジスアームドＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコまたはブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来の組織と共培養し、そして、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択してから、誘導してこのような培地で分化した植物に再生する。生成した植物は、構成的にこのＤＮＡを含み、これを発現する。
【００１５】
フィターゼ活性は、多くの検定法で測定できるが、その選択は、本発明にとって重要ではない。例えば、トランスジェニック植物組織のフィターゼ酵素活性は、比色技術やゲル検定法を用いたＥＬＩＳＡ検定法、ウエスタンブロッティング、または直接的酵素検定法で試験する。
本発明で生産されるフィターガを含む植物または植物器官は、フィターゼの作用を必要とする種々の工業的プロセスで使用しえる。このような応用の例には、非反芻動物の飼料添加物、大豆処理、またはフィチン酸塩からのイノシトールまたはイノシトールホスフェートの生産がある。その他には、澱粉工業や醸造工業のような醗酵工業のようなフィチン酸塩を含む基質を用いる工業プロセスがある。フィチン酸塩による金属イオンのキレート化は、これらのミネラルを生産微生物に使用できなくしてしまう。フィチン酸塩の酵素的加水分解は、この問題を回避する。
また、植物中で生産されるフィターゼは、トウモロコシやサトウモロコシの穀粒の浸せき処理に使用しえる。この植物組織は、浸せきトウモロコシに添加する前に粉砕する。植物組織から放出されたフィターゼは、多くのトウモロコシ調製物に存在するフィチンに作用する。浸せきコーン中のフィチンの分解は、動物飼料や微生物醗酵の栄養として使用されるコーン浸せき液の商品価値を高くする。さらに、フィチンの分解は、コーン浸せき液の濃縮、輸送および貯蔵の際のフィルター、パイプ、反応容器などのゴミの蓄積に関する問題を回避できる（バーラ（Ｖａａｒａ），Ｔ．等、（１９８９）ヨーロッパ特許出願０  ３２１  ００４）。また、フィターゼの作用は、コーン湿式粉砕における浸せき過程および分離過程を促進する。
この植物または植物器官は、直接すなわちさらに処理することなく使用できるか、または、まず使用する前に望ましい固さにまで粉砕するような従来取られている処理を行うこともある。
これとは別に、このフィターゼを、この植物または植物器官から抽出したり、また、望ましい場合は使用する前に従来の抽出法や精製法で精製することもある。
意図した応用にかなう植物中でのフィターゼの生産は、非常に便利であり、また、たとえば動物飼料などに経済的に使用できる点で、微生物フィターゼに比べて生産コストを押さえることが出来、事実上、無機リン酸と争えるほどのコストパーホーマンスを得ることが出来る。さらに、排泄物中のリン含量をかなり低く出来るというメリットがある。
無機リンとコストを争えるフィターゼの使用は、高品質の飼料を生産する混合飼料工業の自由度を増すと考えられる。例えば、飼料にフィターゼを補う場合、無機リンの添加を省略することが出来るし、また、フィチン酸を含む種々の物質の含量を増やすことが出来る。
以下の実施例は、本発明の完全な公開およびその内容の製造法および使用法の説明を当業者を対象にして示したものであり、本発明の範囲を制限するものではない。使用している数値（例えば、量、温度、ｐＨ）は、正確を期するよう配慮したが、ある程度の実験誤差やばらつきを考慮しなければならない。特記しないかぎり、温度は、℃で表し、また、圧力は、大気圧付近である。
【００１６】
【実施例】
（実施例１）
アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）からのポリＡ＋ＲＮＡの単離
２２．７２ｇ／ｌトウモロコシ粉（ｐＨ７，  ８５℃で１５分間アミラ−ゼ処理したもの）、９．３６ｇ／ｌグルコース、２．９ｇ／ｌ  ＫＮ０３，  ０．１４２ｇ／ｌ  ＫＣｌ，  ０．１４２ｇ／ｌ  ＭｇＳ０４・７Ｈ２０および５６．８ｍｇ／ｌ  ＦｅＳ０・７Ｈ２０を含む培地中でアスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）ＮＲＲＬ３１３５株を培養する。６日後、その菌糸体を収穫する。
乾燥菌糸体（０．５ｇ）を液体窒素で凍結し、粉砕する。つづいてオーフレー（Ａｕｆｆｒａｙ）およびロージャン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）（１９８０）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７，  ３０３に報告されているように、この物質をウルトラツラックス（１分間、最高速度）を用い、３Ｍ  ＬｉＣｌ，  ６Ｍ尿素中、０℃で、ホモジナイズし、ついで、４℃で、一晩放置する。全細胞ＲＮＡは、１６０００×ｇの遠心と、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４８：２）による二回の抽出で得られる。このＲＮＡをエタノールで沈殿させ、１ｍｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳに溶解する。ポリＡ＋選択のため、全ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱し、０．５Ｍ  ＮａＣｌに調製してから、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかける。１０ｍＭ  トリスｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液で、数回洗浄した後、１０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出する事によりポリＡ＋ＲＮＡを回収した。
【００１７】
（実施例２）
フィターゼをコードするｃＤＮＡの調製およびクローニング
ｃＤＮＡの第一鎖合成のために、実施例１にしたがって単離した５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを１６．５μｌの水に溶解し、以下の成分を添加した：２．５μｌ  ＲＮａｓｉｎ（３０Ｕ／μｌ）、１０μｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２および４０ｍＭ  ＫＣｌを含むバッファ、２μｌの１Ｍ  ＫＣｌ、５μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．５μｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（２．５  ｍｇ／ｍｌ）、５μｌの８ｍＭ  ｄＮＴＰ−ミックス、５μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）および２．５μｌのモロニーＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）。この混合物を３７℃で、３０分間インキュベートし、反応を、１０μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡおよび５０μｌのＨ２Ｏを添加して停止する。１１０μｌのクロロホルムを用いて抽出を行い、５分間遠心したのち、上清に５Ｍ  ＮＨ４Ａｃおよび４４０μｌエタノール（−２０℃）を添加する。ドライアイス／エタノール溶液中３０分間かけて沈殿化を行う。遠心後（０℃、１０分間）、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡペレットを、７０％エタノールで洗浄する。ペレット乾燥後、２０μｌの水に溶解する。
フィターゼをコードするｃＤＮＡは、二つのフラグメントとして、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）で単離する。これらの二つのフラグメントをこの遺伝子内のＢａｍＨＩ部位を用いて、結合し、完全な長さのｃＤＮＡを得る。フィターゼｃＤＮＡのクローニング法を第１図に示す。
フィターゼ遺伝子の部分的シーケンシングは（ファンゴルコム（Ｖａｎ  Ｇｏｒｏｍ）等、上述）、開始コドンから約８００塩基対のところのＢａｍＨＩ部位の存在を示している。フィターゼ遺伝子の開始コドンの前のヌクレオチド配列および終止コドンの後のヌクレオチド配列同様、このＢａｍＨＩ部位付近のヌクレオチド配列を用いてＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドを設計した。
【００１８】
第一鎖合成の反応産物および０．５μｇの各オリゴヌクレオチドを含む１．５μｌの溶液を用い、Ｔａｑ−ポリメラーゼの製造元（シータス）の指示にしたがい、ポリメレースチェーンリアクションを行う。増幅は、パーキンエルマー／シータスのＤＮＡ増幅器で行う。９４℃、２分間、５５℃、２分間、７２℃、３分間の２５サイクル後、この反応物にフェノールおよびクロロホルム抽出による脱蛋白質処理を行う。このＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファに溶解してから、適当な制限酵素で消化する。
この蛋白質のＮ−末端部分をコードするフラグメントを増幅するために、以下の二つのオリゴヌクレオテドを使用する：
オリゴ１：５’ＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡ  ３’
オリゴ２：５’ＡＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＧ  ３’
増幅したフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシアから購入）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化する。制限地図およびヌクレオチドシーケンシングは、このフラグメントの正当性を示している。このプラスミドをｐＧＢ９２５と命名する。第二のフラグメントを増幅するために、以下の二つのオリゴヌクレオチドを使用する：オリゴ３：５’ＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＣ  ３’
オリゴ４：５’ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＧ  ３’
増幅したフラグメントをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、予めＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＴＺ１８Ｒにクローン化する。制限地図およびヌクレオチドシーケンシングは、このフラグメントが正しいものであることを示している。このプラスミドをｐＧＢ９２６と命名する。
完全な長さのｃＤＮＡを単離するために、ｐＧＢ９２５をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、フィターゼコードＤＮＡを含むフラグメントを単離する。このフラグメントを予めＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＧＢ９２６にクローン化し、プラスミドｐＧＢ９２７とする。プラスミドｐＧＢ９２７は、１．８ｋｂｐという適当な長さで、フィターゼをコードする完全な長さのｃＤＮＡを含む。フィターゼ蛋白質をコードするｃＤＮＡ領域の配列および誘導されるフィターゼ蛋白質のアミノ酸配列を第２図に示す。
【００１９】
（実施例３）
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３の構築
本実施例では、バイナリーベクターｐＭＯＧ２３（大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５α中、１９９０年１月２９日受理番号ＣＢＳ  １０２．９０で、セントラルブリューボアシメルカルチャーズに登録）の構築について説明する。
このバイナリーベクターｐＭＯＧ２３（第２図）は、ベクターＢｉｎ１９（ビーバン（Ｂｅｖａｎ），Ｍ．，  上述）の誘導体である。ｐＭＯＧ２３を得るために、分子生物学の分野でよく使われている方法を用いて、本発明に影響しないようにベクターＢｉｎ１９を修正する。
まず、レフトボーダー（ＬＢ）とライトボーダー（ＲＢ）の位置をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＩＩ（ＮＰＲＩＩ遺伝子）に関して交換する。第二に、そのＭＰＴＩＩ遺伝子の方向をＬＢの転写の方向について逆向きにする。最後に、Ｂｉｎ１９のポリリンカーを以下の制限酵素認識部位：ＥｃｏＲＩ，  ＫｐｎＩ，  ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ，  ＸｂａＩ，  ＳａｃＩ，  ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含むポリリンカーと交換する。
【００２０】
（実施例４）
植物における構成的発現を目的とした発現構築物へのアスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼｃＤＮＡのクローニング
アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ遺伝子を加工し、構成的発現を目的とした発現構築物内のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流に、クローニングする。また、この発現構築物は、植物起源のシグナルペプチド配列のコーディング情報を含んでいる。
このフィターゼｃＤＮＡをプラスミドｐＭＯＧ２９（以下のａ）に述べる）に存在するように発現構築物にクローン化する。つづいて、この構築物全体を、バイナリーベクターｐＭＯＧ２３に導入し、それをアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に移行させる。
ａ）発現ベクターｐＭＯＧ２９の構築
ＲＯＫ１（ボールカム（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）等、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ４４６）の発現構築物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＵＣ１８１クローン化する。この構築物には、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを含んでおり、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上にノパリンシンテース（ｎｏｓ）転写ターミネーターを含んでいる。このプロモーターフラグメントには、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの−８００から＋１迄の配列を含んでいる。含まれている部位＋１は、転写開始部位である（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、上述）。部位−５１２のＮｃｏＩ部位の上流の配列を欠失させ、この部位をＥｃｏＲＩ部位に変える。これは、ｐＵＣ１８に存在する発現構築物をＮｃｏＩで切断し、クレノーフラグメントで一本鎖末端を充填し、ＥｃｏＲＩリンカーをライゲーションすることによって行う。このプラスミドを、ＥｃｏＲＩで切断し、元のＮｃｏＩ部位の上流にある３５Ｓプロモーターの配列を有するＥｃｏＲＩフラグメントを欠失させる。ｎｏｓターミネーターを含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）のＲＮＡ４のリーダー配列を含む合成ＤＮＡフラグメント（第４図、オリゴヌクレオチド二本鎖Ａ）と置き換える（ブレデロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、上述）。このことは、ＢａｍＨＩとそれにつづくＨｉｎｄＩＩＩによる切断、および合成ＤＮＡフラグメントとのライゲーションによって行われる。このＢａｍＨＩ部位および上流の三個のスクレオチドを部位特異的突然変異誘発で欠失させる。このプラスミドには、ｎｏｓターミネーター配列を含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが、再導入されている。ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２７５由来、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ５，  ３８７）をライゲーションして、プラスミドｐＭＯＧ  １４を作製した。文献から、−３４３と−９０の間の配列の重複は、３５Ｓプロモーターの活性を増加することが知られている（ケイ（Ｋａｙ），Ｒ．チャン（Ｃｈａｎ），Ａ．，  デイリー（Ｄａｙｌｙ），Ｍ．およびマクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ），Ｊ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，  １２９９）。二重の、いわゆるエンハンサー配列を含むプロモーターフラグメントを得るために、当分野では良く知られている以下の操作を行う。プラスミドｐＭＯＧ１４から、ＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして、エンハンサーフラグメントを単離し、つづいて、クレノーフラグメントで平滑末端化する。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断し、平滑末端化したｐＭＯＧ１４に導入し、平滑末端化したＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩ部位の間の境界に新しいＥｃｏＲＩ部位を作る。このプラスミド（ｐＭＯＧ１８）は、二個のエンハンサー配列を持つ３５Ｓプロモーター、ＡｌＭＶ由来のＲＮＡ４のリーダー配列、およびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上になお存在する発現構築物中のｎｏｓタ���ミネーターを含んでいる。最後にβ−グルクロニダーゼをコードするＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＲＯＢ１２  ｃＤＮＡから誘導した合成ＤＮＡフラグメントＢ（第４図）と置き換える（コーネリセン（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ），Ｂ．Ｊ．Ｃ．，  フートファンフズイネン（Ｈｏｏｆｔ  ｖａｎ  Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ），Ｒ．Ａ．Ｍ．およびボル（Ｂｏｌ），Ｊ．Ｆ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ５３１）。このフラグメントＢは、タバコ  サムサンＮＮのＰＲ−蛋白質  ＰＲ−Ｓシグナルペプチド配列をコードしている。一つのヌクレオチドを変えることによって、シグナルペプチドコードＤＮＡ配列中にＳｐｈＩ部位を作製する。この変化では、コードされているＰＲ−Ｓシグナルペプチドのアミノ酸配列は、変化しない。このプラスミドをｐＭＯＧ２９と呼ぶ（第４図）。
【００２１】
ｂ）アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ遺伝子のバイナリーベクターへのクローニング
オリゴヌクレオテド二本鎖Ｃ（第４図）を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＭＯＧ２９にクローン化して、プラスミドｐＭＯＧ４０７を作製する。このオリゴヌクレオチド二本鎖は、成熟フィターゼの最初の６個のアミノ酸の前のＰＲ−Ｓのシグナルペプチドの最後の二個のアミノ酸に関するコード情報を含んでいる。
完全な長さのフィターゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＢ９２７をＸｈｏＩ（部分的）およびＰｓｔＩで消化する。アミノ酸６から先の成熟フィターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＸｈｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで線状化しだプラスミドにクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４１７を作製する。キメラフィターゼ遺伝子を含むこの構築物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで線状化したバイナリープラスミドｐＭＯＧ２３にクローン化する。生成したバイナリーベクターｐＭＯＧ４１３を、大腸菌Ｋ−１２  ＲＫ２０１３（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む）との三者交配において、植物へのＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に動員される（ジッタ（Ｄｉｔｔａ），Ｇ．，  スタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ），Ｓ．，  コービン（Ｃｏｒｂｉｎ），Ｄ．およびヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ），Ｄ．Ｒ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，  ７３４７）。
【００２２】
（実施例５）
タバコプロトプラストにおけるキメラフィターゼ遺伝子の一時的発現
タバコのプロトプラストを構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの調節下のキメラフィターゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡでトランスホームする。７２時間後フィターゼ活性検定を用い、処理したプロトプラストについて導入されたフィターゼ遺伝子の一時的発現を検定する。
プロトプラストは、無菌的に生育した月齢１−２才のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＳＲ１）から調製する。全操作は、ローデンバーグ（Ｒｏｄｅｎｂｕｒｇ），Ｋ．Ｗ．，  デグロート（ＤｅＧｒｏｏｔ），Ｍ．Ｊ．Ａ．，  シルペルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ），Ｒ．Ａ．およびホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ），Ｐ．Ｊ．Ｊ．（（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３，  ７１１）により報告されている。トランスホーメーションは、５×１０５個のプロトプラストを４０μｇのプラスミドｐＭＯＧ４１７  ＤＮＡでエレクトロポレーションする事によって行う。エレクトロポレーション後、プロトプラストを３ｍｌのＫ３Ｇ培地に懸濁する。フィターゼ活性検定するために、このプロトプラストをペレット化し、その上清３ｍｌを過剰の水に対して、一晩透析する。透析物を凍結乾燥し、３００μｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５に懸濁する。それから、２５０ｍＭグリシン−ＨＣｌバッファｐＨ２．５の代わりに、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ５．５を用いること以外、実施例１０に詳細に説明しているように、検定を行う。
これら実験において、フィターゼ１ユニット（ＰＴＵ）は、３７℃、ｐＨ５．５で、１．５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液から毎分１μｍｏｌのフィチン酸塩を放出すると定義する。
未処理のプロトプラストでは、活性は検出されない。プラスミドｐＭＯＧ４１７でエレクトロポレーションしたプロトプラストは上清中蛋白質１ｍｇ当たり０．２６ＰＴＵの活性を示す。
【００２３】
（実施例６）
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロール下のタバコ植物におけるキメラフィターゼ遺伝子の安定な発現
タバコを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下のキメラフィターゼ遺伝子を有するバイナリーベクターｐＭＯＧ４１３を含むアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株とその植物組織との共培養によりトランスホームする。トランスホーメーションは、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等の方法（上述）に従い、タバコ（ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＳＲＩ）葉ディスクの共培養によって行う。トランスジェニック植物を、選択培地（１００  ｍｇ／ｌ  カナマイシン）で生育した若芽から再生し、根づけ土壌に移す。この若い植物のＮＰＴＩＩ活性を検定し（カナマイシン耐性）、成熟させて自家授粉させて結実させる。
【００２４】
トランスジェニック植物の葉のフィターゼ活性を検定するために、若い葉の直径約５ｍｍの断片を各植物から採取し、３００μｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ５．５中でホモジナイズする。つづいて、一時的検定で説明したように、フィターゼ活性を検定する。３２個の独立したトランスホームタバコ植物をテストしてみると、最高の活性は、抽出物中の総可溶性蛋白質１  ｍｇ当たり２ＰＴＵであった。これは、総可溶性蛋白質の１．７％に相当する。これらのトランスホームタバコ植物の種子においては、最高総可溶性種子蛋白質の０．４％に当たるフィターゼ発現レベルが観測された。非トランスホーム植物では、フィターゼ活性は検出されなかった。二つのトランスジェニック植物系列、４１３．２５および４１３．３２を高いフィターゼ発現レベルに基づいて選択した。
【００２５】
（実施例７）
種子特異的発現構築物におけるアスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼｃＤＮＡのクローニング
ブラシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）１２Ｓ貯蔵蛋白質遺伝子クルシフェリン（ｃｒｕＡ；ライアン（Ｒｙａｎ）等、上述）の配列を用いて、種子特異的発現が行われるように発現構築物を構築する。これらの配列は、本発明と同じ目的を達成するために、同様の種子特異的遺伝子由来の配列と置き換えることが出来る。
フィターゼｃＤＮＡを、この発現構築物にクローン化する。最後に、全構築物をアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、これをトランスホーメーションに使用する。本実施例における全ての大腸菌のトランスホーメーションには、大腸菌Ｋ−１２  ＤＨ５αを用いる。
ａ）発現構築物の構築
種子特異的発現を目的とした発現構築物を構築するため、ブラシカナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ｃｖ．  Ｊｅｔ  ＮｅｎｆのクルシフェリンＡ（ｃｒｕＡ）遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターをテンプレートとして単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲで合成する（メトラー（ＭｅＨｌｅｒ），Ｉ．Ｊ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ５，  ３４６）。この遺伝子は種子特異的発現を示す。そのコード配列および隣接配列はシーケンシングされている（ライアン（Ｒｙａｎ）等、上述）。
２組のオリゴヌクレオチドを合成する。１組はＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩフラグメントとしてｃｒｕＡ  ５’隣接領域およびシグナルペプチドコード配列の一部を増幅するのに使用する。
５’ＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴＣＣＧＧ  ３’および
５’ＡＡＣＴＧＴＴＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣ  ３’
もう１組はＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして３’隣接配列の増幅に使用する。
５’ＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＡ  ３’および
５’ＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＣＧＴ  ３’
オリゴマーはその末端に適当な制限部位を含み、フラグメントを制限酵素で消化後直接発現構築物を構築できるように設計する。
【００２６】
シグナルペプチドをコードする５４ヌクレオチドの配列を含むｃｒｕＡ遺伝子の５’フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで切断したベクターｐＭＯＧ４４５（ＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで線状化したベクターｐＵＣ１８にオリゴヌクレオチド二本鎖Ｅ（第４図）をクローン化したもの）にクローン化し、ベクターｐＭＯＧ４２４を生成する。ブラシカナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）クルシフェリンのシグナル配列の最後の５個のコードトリプレット、成熟フィターゼのアミノ酸１〜６をコードする配列および多重クローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチド二本鎖Ｄ（第４図）をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＭＯＧ４２４にクローン化する。生成するベクターをｐＭＯＧ４２５と呼ぶ。ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして３’  ｃｒｕＡ  ＰＣＲフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＭＯＧ４２５にクローン化し、ｐＭＯＧ４２６を生成する。
ｂ）アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼ遺伝子のバイナリーベクターヘのクローニング
アスペルギラス  フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ）のフィターゼをコードする全配列を含むプラスミドｐＧＢ９２７をＸｈｏＩ（部分的）およびＰｓｔＩで消化する。アミノ酸６からの成熟フィターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＸｈｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントをＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで切断したベクターｐＭＯＧ４２６にクローン化する。このベクターｐＭＯＧ４２８からキメラフィターゼ遺伝子を含む全構築物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３に挿入する。このバイナリーベクターｐＭＯＧ４２９を大腸菌Ｋ−１２ＲＫ２０１３（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む）（ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、上述）と共に植物へのＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３、上述に導入して三者交配させる。
【００２７】
（実施例８）
クルシフェリンプロモーターのコントロール下のタバコ種子内におけるフィターゼの安定な種子特異的発現
クルシフェリンプロモーターのコントロール下のフィターゼｃＤＮＡを含むバイナリーベクターｐＭＯＧ４２９を有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株をトランスホーメーション実験に用いる。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＳＲ１）のトランスホーメーションはホーシュ（Ｈｏｒｓｅｈ）等（上述）の方法に従がい葉ディスクの共培養を用いて行う。トランスジェニック植物は選択培地（１００ｍｇ／ｌ  カナマイシン）で生育する若木から再生する。若木のＮＰＴＩＩ活性（カナマイシン耐性）を検定し、成熟させ、自家授粉により結実させる。各トランスホーマントの種子を集め、その一部でフィターゼの存在を検定する。トランスホームしていないコントロール種子と比較して、最も高い発現を示すクローンの残りの種子をカナマイシン存在下で（２００ｍｇ／ｌ）発芽させる。生成するＳ２種子のデータから、ＮＰＴＩＩと（同時にフィターゼと）同種の種子を選択し、最も多くフィターゼを生産し得る植物を大量に増やすのに使用する。これらは消化実験等に使用する。トランスジェニック種子に存在するフィターゼ活性を測定するため、約５０ｍｇの種子を採り、１ｍｌ  ２５ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．５）中、氷冷した乳鉢および乳棒でホモジナイズする。遠心後、一時的検定で説明した方法で上清を検定する。５５個のトランスホームしたタバコ植物で全可溶性種子タンパク質の０．１５％という最高フィターゼ発現レベルが観測された。フィターゼ活性はトランスジェニック植物の茎、根および葉には検出されず、またトランスホームしていない植物にも検出されなかった。
【００２８】
（実施例９）
ナタネ種子のトランスホーメーション
この実施例ではキメラフィターゼ遺伝子を含むバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と植物組織を共培養することによりナタネの種子のトランスホーメーションを行う。トランスジェニック植物は抗生物質で選択する。トランスジェニック植物のフィターゼ活性を検定する。高発現性をさらに解析し、次の実験に使用する。
バイナリーベクター（ｐＭＯＧ４２９）における同じキメラフィターゼ構築物を実施例７で説明した方法でアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に導入する。この株を用いてナタネの種子（ブラシカナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ｃｖ．ウェスター（Ｗｅｓｔｅｒ））をトランスホームする。この目的のため開花直前の週令５〜６才の植物から採った表面滅菌した茎断片を１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰを含むＭＳ培地（フライ（Ｆｒｙ）等，  （１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，  ３２１）中で２４時間前処理し、ついで同じ培地を入れた新しいプレート中、４８時間アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と共培養する。トランスジェニック植物は選択培地（５００ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリン４０ｍｇ／ｌ  パロモマイシン）で生育する若木から再生し、タバコについて実施例８で述べた方法でさらに分析した。
【００２９】
（実施例１０）
総計的０．２５ＰＴＵを含むトランスジェニック植物を粉砕した（ＰＴＵ＝フィターゼユニット。フィターゼ活性１ユニットは３７℃、ｐＨ２．５において１．５ｍＭ  フィチン酸ナトリウムから１μｍｏｌ／ｍｉｎの速度で無機リンを放出する酵素量と定義する）。それとは別に、この量のフィターゼを植物から抽出する。
粉砕植物を、０．８６ｇフィチン酸ナトリウム１１Ｈ２Ｏ  を含む２５０ｍＭグリシン／ＨＣｌバッファ（ｐＨ２．５）５０ｍｌ中でインキュベートする。アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）フィターゼは至適ｐＨ２．５または５．５で発現されるが植物のフィターゼ活性を排除するため低い方のｐＨを用いた。
生成する混合物を３７℃で１５分または６０分インキュベートする。インキュベート物５ｍｌを１０％  ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）５ｍｌと混ぜることにより反応を停止する。その後指示薬（２．５ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７０２４・４Ｈ２Ｏおよび８ｍｌ濃Ｈ２ＳＯ４を水で２５０ｍｌに希釈したモリブデン酸アンモニウム溶液５０ｍｌに３．６６ｇのＦｅＳ０４・７Ｈ２０を溶かしたもの）を反応液に加える。青色の強度を７００ｎｍにおける分光測定により測定する。
Ｔ＝０における無機リン含量をブランクとする。
０．１ｍＭ範囲のリン酸塩の校正曲線から、リン酸の放出量を得る。
【００３０】
（実施例１１）
飼料とニコチアナタバカム植物粉砕物のインキュベーション
典型的には０．２５ｇの溶媒抽出大豆ミールをフィチン酸ナトリウムを添加すること以外、先に述べたように約０．２５ＰＴＵを含む粉砕したニコチアナタバカムとインキュベーションする。この場合添加したインキュベーション試薬には４１０ｍｌバッファと９０ｍｌの水の混合物が含まれている。
溶媒抽出大豆ミールにおけるフィチン酸塩からのリン酸の放出を第６図に示す。粉砕植物を入れないと活性は観測されない。
実質的に同じ実験で基質としてトウモロコシグルテン飼料を用いても同じ結果を与える。トランスジェニック種子を用いた結果を第６図に示す。
粉砕植物が無い場合やフィターゼ活性を含まない植物を用いた場合活性は観測されなかった。
【００３１】
（実施例１２）
家禽の消化管をシミュレートした条件下でのフィターゼ含有トランスジェニック植物のインビトロテスト
トランスジェニックタバコ植物で生産されたフィターゼ効果を検定するためアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のフィターゼ活性を家禽の消化管の条件をシミュレートしだモデルで測定する。
まず標準的家禽飼料を３９℃で６０分間１ｇ／１５ｍｌ水の濃度でインキュベートし、家禽のエブクロの条件をシミュレートする。つづいて５ｍｌのペプシン溶液（メルク、５．２８ｇ／ｌ、ｐＨ３．０  −塩酸で調整）を添加し、ＨＣｌでｐＨ３．０でｐＨを調整した後、同温度でさらに９０分間インキュベートして胃の条件をシミュレートする。
このインキュベーションの際に、順次サンプルを採取して飼料に存在するフィチン酸塩から放出されるリン酸塩の量を測定する。菌類フィターゼの作用は第７図から明らかである。飼料１ｋｇ当り２５０ＰＴＵから１０００ＰＴＵへとフィターゼ投与量を増していくと飼料から放出されるリン酸塩が増加する。
種子または葉のトランスジェニックタバコ植物サンプルを（系列４１３．２５および４１３．３２、乳鉢で粉砕後）菌類フィターゼ代りに用いると、同様のリン酸放出の増加が見られる（第８図）。フィターゼを含まないコントロールのタバコ植物もテストしたが、ブランクコントロールと比較してリン酸の放出は観察されなかった。
ｋｇ当り５００および７００ＰＴＵの結果をｋｇ当り５０ｇのトランスジェニックタバコ種子の結果との比較は、このインビトロ家禽消化モデルにおいて１ｇのタバコ種子は約１２ＰＴＵに匹敵することを示している。葉を用いたサンプル比較は１ｇのタバコの葉は約２５ＰＴＵを含んでいる。
【００３２】
（実施例１３）
動物テスト
植物種子中で発現するフィターゼの効果および動物に対するタバコ種子の許容性を示すためブロイラーを用いたテストを行う。フィターゼ発現タバコ種子およびコントロール種子を収穫する。種子１００グラムを冷却に配慮しながら５００μｍのポアサイズのフルイ（レッチミルＺＭ１）で粉砕する。
日令１才の雄ブロイラーのヒヨコ（ハイブロ）を２つのケージ（０．４５ｍ２）に入れる。最初の２日の室温は３２℃で、次の１週間は４℃づつ下げていく。さらに１週間ごとに２℃づつ温度を下げていく。またブロイラーは１時間光を照らし、３時間暗闇に置くという条件で生育させる。
その鳥は１日目にクローン３０ワクチンでニューキャッスル病に対して免疫化する。実験中、このブロイラーには全てフスマとアドリビタムの実験飼料を与える。成長と飼料／重量増比を測定する。全リンの見かけの使用量を３日間測定し、その間乾燥物質としての飼料消費を測定し、その排泄物を定量する。
フィターゼを添加していない以下のコントロール飼料を使用する。
【００３３】
飼料  Ｃａ（％）  全リン（％）  フィチン酸のリン（％）
１    ０．６０        ０．４５          ０．３０
２    ０．７５        ０．６０          ０．３０
３    ０．９０        ０．７５          ０．３０
飼料１（基本飼料）には飼料用リン酸を添加しない。飼料２と３には無水リン酸二カルシウムおよびリン酸一アンモニウムの混合物（５：１）由来のカルシウムおよびリンを補う。全ての実験飼料は基本飼料への添加で得られる（第１表）。
実験飼料４にはファンゴルコム（Ｖａｎ  Ｇｏｒｃｏｍ）等（上述）の方法で調製した飼料ｋｇ当り４００ＰＴＵ濃度の微生物フィターゼを添加する。
実験飼料５は飼料９０ｋｇ当り３ｋｇの割合で非トランスジェニックタバコの種子粉砕物を添加すること以外は飼料４と同様である。
実験飼料６は９０ｋｇ飼料混合物に最終的に飼料ｋｇ当り４００ＰＴＵの濃度となるようにトランスジェニックタバコ（系列４１３．２５）種子粉砕物３ｋｇを添加すること以外飼料４と同様である。
実験は２４日まで１６のケージ中１７６羽（ケージ当り１１羽）のブロイラーを用いて行う。処理（飼料）は２度繰り返し、各段のケージはランダムに指定する。
リンの使用量は日令２１〜２４才のものについて測定する。
各々飼料４、５および６を供給した動物のリン使用量および成長の結果はフィターゼ添加のポジティブ効果を示す（第２表）。また、飼料４、５および６の比較は餌料中のタバコ種子がブロイラーなどの家畜の胃腸管における微生物フィターゼの作用を起こし、動物にネガティブな効果を起こさないことを示している。
本発明は特定の態様で説明しているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく変化や置換を行ない得ることは明白である。さらに本発明の目的、精神および範囲に対して特定の状況、物質、植物、種子、方法、操作に多くの修正を行うことができる。これらの変化も以下に示す特許請求の範囲内にある。
【００３４】
0003600614.tif 000002
【００３５】
＊飼料ｋｇ当りの量；１２０００ＩＵ  ビタミンＡ；２０００ＩＵ  ビタミンＤ３；５ＩＵ  ビタミンＥ；１．５ｍｇ  ビタミンＫ３；１ｍｇ  チアミン；５ｍｇリボフラビン；１ｍｇ  ピリドキシン；３０ｍｇ  ニコチン酸；７．５ｍｇ  Ｄ−パントテン酸；０．０１５ｍｇ  ビタミンＢ１２；０．５ｍｇ  葉酸；３５０ｍｇ  塩酸コリン；７５ｍｇ  エトキシキン；９．５ｇ  ＣａＣＯ３；２．５ｇＮａＣｌ；０．２６ｇ  ＦｅＳＯ４；０．２４ｇ  ＭｎＳＯ４；４５ｍｇ  ＣｕＳＯ４；６０ｍｇ  ＺｎＳＯ４；１０５ｍｇ  ＫＩ。
＊＊  （    ）は各々実験１および２の分析値。
【００３６】
第２表
全リンおよびカルシウムの見かけの使用量、排泄物中のリン含量およびブロイラーの品質に関するフィターゼの影響
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、フィターゼｃＤＮＡのクローニングの方法を示している。
【図２−Ａ】図２−Ａは、フィターゼｃＤＮＡフラグメントの翻訳領域のヌクレオチド配列および誘導されるフィターゼ蛋白質のアミノ酸配列を示している。成熟フィターゼ蛋白質の開始は＋１で示されている。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、フィターゼｃＤＮＡフラグメントの翻訳領域のヌクレオチド配列および誘導されるフィターゼ蛋白質のアミノ酸配列（続き）を示している。成熟フィターゼ蛋白質の開始は＋１で示されている。
【図３】図３は、バイナリーベクターｐＭＯＧ２３を示している。
【図４−Ａ】図４−Ａは、クローニングに使用するオリゴヌクレオチド二本鎖を示している。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、クローニングに使用するオリゴヌクレオチド二本鎖（続き）を示している。
【図５】図５は、プラスミドｐＭＯＧ２９を示している。植物中での構成的発現を目的とした発現カセットおよびタバコシグナルペプチドを含むプラスミドｐＵＣ１８。
【図６】図６は、フィターゼからの無機リンの放出に関するフィターゼ含有種子粉砕物の添加の効果を示している。
【図７】図７は、インビトロ消化モデルにおけるアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）フィターゼの投与−応答関係を示している。
【図８】図８は、インビトロ消化モデルにおけるアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）フィターゼおよびタバコ種子に含まれるフィターゼの投与−応答関係を示している。
【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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