(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌株カンジダ・マグノリア (寄託番号KCCM-１０２５２号)を用いた、高収率かつ高生産性のマンニトール製造方法であって、
ｉ）以下の発酵条件
ａ）マンニトール高収率かつ高生産のための培地組成は、ブドウ糖５０〜１００g/L、果糖５０〜１２０g/L、酵母抽出物５〜２０g/L、硫酸アンモニウム１〜５g/L、二リン酸カリウム１．０〜５．０g/L及び硫酸マグネシウム０．１〜０．５g/Lを含み、
ｂ）pHは４．５〜５．５であり、
ｃ）培養温度は２７〜３５℃であり、
ｄ）通気量は０〜０．５vvmであり、
ｅ）発酵培養時の撹拌速度は２００〜５００rpmである
を調整することによって前記菌株によりブドウ糖又は果糖培地を発酵させるステップと、
ｉｉ）発酵培地から細胞及び他の残渣を取り除くステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の発酵培地からマンニトールを分離し回収するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記新菌株カンジダ・マグノリアの種培養はブドウ糖１５〜２５g/L、酵母抽出物７〜１３g/L及びペプトン１５〜２５g/Lが含まれたYPD培地で行い、菌体濃度が３〜５g/Lで増殖するまで振とう培養することを特徴とする請求項１に記載のマンニトールの製造方法。
【請求項３】
天然スラッジの試料を希釈した後、ブドウ糖１０〜２０g/L、果糖１８〜２２g/L、ペプトン１５〜２５g/L、酵母抽出物７〜１５g/L、寒天(agar)１２〜１７g/Lが含まれた平板を使用して、２７〜３３℃で速く増殖する菌株を中心に単一コロニーを選別し、これらの選別された菌株をブドウ糖３０〜７０g/L、果糖５０〜１００g/L、酵母抽出物５〜２０g/L、硫酸アンモニウム１〜５g/L、二リン酸カリウム１〜５g/Lとから構成された培地で６８〜７６時間発酵させた後にマンニトールを最も多く生成する菌を選別することを特徴とする新菌株カンジダ・マグノリア (寄託番号KCCM-１０２５２号）の分離方法。
【請求項４】
請求項３の方法によって分離されたマンニトール生成新菌株カンジダ・マグノリア (寄託番号KCCM-１０２５２号)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は天然から分離した、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）を高収率かつ高生産性で生産する新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）、及びこれを使用して果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）からマンニトールを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マンニトールは、六炭糖糖アルコールとして自然界では褐藻類、きのこ類、菌類等に含まれている。マンニトールは、砂糖の３０〜４０％の甘美度を有しており、砂糖の使用が制限される食品製造で代替甘味料で使われているだけでなく、冷飲昧、低吸湿性、流動性などの優秀な特性により製菓類の添加剤、医薬品の充填剤、界面活性剤、防水剤等でたくさん利用されている。また、低血圧治療剤の中間物質として使われて、各種医薬品製剤の製造工程で苦味を軽減させるためのコーティング剤としても利用されている等食品及び医薬品産業で広範囲に使われている。
【０００３】
マンニトールは色々な果物や野菜に天然に存在するが、この場合にはきわめて微量にしか存在しないために、果物や野菜から抽出することは産業的に経済性がない。したがって、マンニトールの商業的生産方法は砂糖等から加水分解によって生成された果糖を分離して、この果糖に高温・高圧下の触媒下で化学的に水素を添加して製造する。しかし、副産物としてソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）が作られるため別の精製工程を必要とするだけでなく、転換収率が非常に低くて製造原価が高い。また高温高圧の反応であるために危険性と廃棄物処理の問題が存在する短所がある。
【０００４】
このような短所を解決するために、微生物によるマンニトール生産方法に対する多くの研究が進行されている。マンニトール生産に関連された微生物としては、酵母の場合、カンジダ・ゼイラノイド（Ｃａｎｄｉｄａ  ｚｅｙｌａｎｎｏｉｄｅ）、カンジダ・リフォリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）、クリプトコッカス・ネオフォマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トルロップシス・マンニトパシエンス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｍａｎｎｉｔｏｆａｃｉｅｎｓ）などがあり、細菌の場合、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、リューコノストック・メセンテリオド（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅ）とマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などがあり、かびの場合ミュコ・ラウジ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ペニシリウム・カブロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｓｃａｂｒｏｓｕｍ）などがある。微生物による方法は経済性が高く、ブドウ糖または果糖から特異的にマンニトールのみ生産させることができ、反応後マンニトールの分離精製過程を非常に容易にすることができるが、その生産性または収率が低いという短所を有するために産業化に難しさがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき技術的課題は、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）製造会社（Ｂｏｌａｋ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．烏山）の発酵スラッジから高収率のマンニトール生産新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）を分離同定して、培養条件を最適化することによって、マンニトールを高生産性かつ高収率で製造する方法を開発したものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）（寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５２号）を種培養し、種培養された菌株をブドウ糖、果糖、窒素源及び無機塩類を含有する培地で発酵培養させて生成されたマンニトールを分離精製することを特徴とする高収率かつ高生産性のマンニトール製造方法及びその方法で製造されたマンニトールを提供することである。
【０００７】
また前記発酵培地はブドウ糖５０〜１００ｇ／Ｌ、果糖５０〜１２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５〜２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１〜５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム１．０〜５．０ｇ／Ｌ及び硫酸マグネシウム０．１〜０．５ｇ／Ｌを含むことを特徴とし、前記発酵培養時の撹拌速度は２００〜５００ｒｐｍであり、通気量は０〜０．５ｖｖｍであり、ｐＨは４．５〜５．５であり、培養温度は２７〜３５℃であることを特徴とする。
【０００８】
一方、前記新菌株カンジダ・マグノリアの種培養はブドウ糖１５〜２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物７〜１３ｇ／Ｌ及びペプトン１５〜２５ｇ／Ｌが含まれたＹＰＤ培地で行い、菌体濃度が３〜５ｇ／Ｌで増殖するまで振とう培養することを特徴とする。
【０００９】
また、天然スラッジの試料を希釈した後、ブドウ糖１０〜２０ｇ／Ｌ、果糖１８〜２２ｇ／Ｌ、ペプトン１５〜２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物７〜１５ｇ／Ｌ、寒天１２〜１７ｇ／Ｌが含まれた平板を使用して２７〜３３℃で速く増殖する菌株を中心に単一コロニーを選別して、これら選別された菌株をブドウ糖３０〜７０ｇ／Ｌ、果糖５０〜１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物５〜２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１〜５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム１〜５ｇ／Ｌで構成された培地で発酵時間６８〜７６時間後にマンニトールを最も多く生成する菌を選別することを特徴とする新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）（寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５２号）の分離方法及び分離されたマンニトール生成新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）（寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５２号）を提供する。
【００１０】
以下、本発明の新菌株カンジダ・マグノリアの分離方法を説明すれば次の通りである。
【００１１】
キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）製造会社の発酵スラッジ試料を適当に希釈した後、ブドウ糖２００〜４００ｇ／Ｌ、ペプトン１５〜２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物７〜１５ｇ／Ｌ、寒天（ａｇａｒ）１２〜１７ｇ／Ｌが含まれた平板を使用して２７〜３３℃で速く生長する菌株を中心に単一コロニーを選別し、これらの選別された菌株をブドウ糖３０〜７０ｇ／Ｌ、果糖５０〜１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物５〜２０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１〜５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム１〜５ｇ／Ｌとから構成された培地で発酵時間６８〜７６時間後にマンニトールを最も多く生産する菌を最終的に選別した。
【００１２】
菌株の同定は２６ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を分析する方法（Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ＆  Ｒｏｂｎｅｔｔ、１９９８）及び形態学的、培養学的及び生理学的特性をＹａｒｒｏｗ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８）の方法に準じて調べたＢａｒｎｅｔｔ等（Ｙｅａｓｔｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８３）の分類方法によって同定した。選別された菌株の２６ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列及び類似種との塩基配列の分析結果を各々表１と表２に表した。
【００１３】
【表１】
0003600803.tif 000002
【００１４】
【表２】
0003600803.tif 000003
【００１５】
また、形態学的特性、生理学的及び生化学的特性は表３に表し、新菌株の炭素源代謝の有無を表４に表した。
【００１６】
【表３】
0003600803.tif 000004
【００１７】
【表４】
0003600803.tif 000005
【００１８】
以上のような菌株の特性を同定した結果、本菌株はカンジダ・マグノリア種の菌株と判断され、新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）を韓国微生物保存協会に２００１年３月５日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５２号で寄託した。
【００１９】
本発明のマンニトール発酵生成法をさらに具体的に説明すれば次の通りである。
【００２０】
本菌株の種培養のための増殖培地としては、ブドウ糖１５〜２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物７〜１３ｇ／Ｌ及びペプトン１５〜２５ｇ／Ｌを含むＹＰＤ培地を使用し、フラスコの発酵培地としては炭素源でブドウ糖５０ｇ／Ｌ及び果糖１００ｇ／Ｌ、窒素源としては酵母抽出物及び硫酸アンモニウム、無機塩としては二リン酸カリウム、硫酸マグネシウムとから構成された培地を使用した。各成分の量はマンニトールの生産性を高めるために変更することができる。発酵槽で使用した培地は、流加式で総添加された濃度として３００ｇ／Ｌの果糖、ブドウ糖５０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌとから構成された最適培地であった。
【００２１】
種培養は冷凍保存された菌株をＹＰＤ培地５０ｍｌが入っている２５０ｍｌのフラスコに接種して振とう培養器で２３０〜２７０ｒｐｍ、２７〜３３℃で菌体濃度が３〜４ｇ／Ｌ（約２４時間）で増殖するまで行った。フラスコ培養では培地の５％に該当される種培養液を発酵培地５０ｍｌが入っている２５０ｍｌのフラスコに接種して振とう培養器で２１０〜２３０ｒｐｍ、２７〜３３℃で６８〜７６時間培養した。
【００２２】
流加式発酵槽培養では、発酵初期に１００ｇ／Ｌの果糖が含まれた２Ｌの培地を含む５Ｌ発酵槽（韓国培養器（株））を使用した。発酵過程中に撹拌速度は２００〜５００ｒｐｍに調節し、通気量は０〜０．５ｖｖｍに調節した。ｐＨは発酵全前過程の間４．５〜５．５に調節し、培養温度は２７〜３３℃であり、維持される果糖の濃度は５０〜１２０ｇ／Ｌに調節した。
【００２３】
ブドウ糖、果糖、マンニトールの濃度は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓカラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を装着したＨＰＬＣのＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ２４１０、ＵＳＡ）を使用して測定した。この時、溶媒はアセトニトリール（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水を８：２で混ぜて使用し、流速は１．５ｍｌ／分であった。菌体濃度は濁度計を使用して６００ｎｍで懸濁度を測定してあらかじめ測定した標準曲線を使用して乾燥重量に転換した。溶存酸素濃度はＩｎｇｏｌｄ社（Ｓｗｉｓｓ、ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｙｐｅ）の溶存酸素電極を使用して特定した。
【００２４】
以上のような本発明の目的と別の特徴及び長所等は、以下に参照する本発明の好適な実施例に対する以下の説明から明確になるであろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明を実施例によってより詳細に説明すれば次の通りである。
（実施例１）
種培養：キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）製造会社の発酵スラッジから分離した菌株カンジダ・マグノリア（ＫＣＣＭ−１０２５２号）をＹＰＤ培地５０ｍｌが入っている２５０ｍｌフラスコに接種して２５０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養した。
【００２６】
本培養：発酵培地５０ｍｌを含む２５０ｍｌフラスコに種培養液を接種した後、振とう培養器で２２０ｒｐｍで３０℃で果糖が完全に消費されるまで培養した。培地のｐＨは、発酵初期に５．０で調節し、その後の調節は行わなかった。この時、培地成分はブドウ糖５０ｇ／Ｌ、果糖１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌであった。時間の経過によるマンニトールの生産を観察した結果を表５に表した。分離菌株の最大非増殖速度は０．２６ｈ−１、最大菌体量は３．９ｇ／Ｌであり、４２ｇ／Ｌのマンニトールが生産された。
【００２７】
【表５】
0003600803.tif 000006
【００２８】
（実施例２）
培養方法は実施例１と同様であり、ブドウ糖５０ｇ／Ｌ、果糖１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌの窒素含有量に準じるそれぞれの窒素源とから構成された発酵培地で発酵時間７２時間後、各種の窒素源がマンニトールの生産に及ぼす影響を観察した。各種の窒素源で培養した結果を表６に表した。マンニトールは酵母抽出物と酵母窒素（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ）を除く他の有機窒素源では低い濃度を表して、酵母抽出物が最も良い窒素源であった。
【００２９】
【表６】
0003600803.tif 000007
【００３０】
（実施例３）
培養方法は実施例１と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖５０ｇ／Ｌ、果糖１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、酵母抽出物、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌとして、このうち酵母抽出物の濃度を変化させて７２時間培養した結果を表７に表示した。
【００３１】
【表７】
0003600803.tif 000008
【００３２】
（実施例４）
培養方法は実施例１と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖５０ｇ／ｌ、果糖１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウムとして、このうち二リン酸カリウムの濃度を変化させながら７２時間培養した結果を表８に表示した。
【００３３】
【表８】
0003600803.tif 000009
【００３４】
（実施例５）
培養方法は実施例１と同様であり、本培養で発酵培地を果糖１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムとして、このうち硫酸マグネシウムの濃度を変化させながら３０時間培養した結果を表９に表示した。
【００３５】
【表９】
0003600803.tif 000010
【００３６】
（実施例６）
種培養は実施例１と同様であり、本培養で最適発酵培地（ブドウ糖５０ｇ／Ｌ、果糖１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ）が３Ｌである５Ｌ発酵槽を使用して培養した。培養温度３０℃でいろいろなｐＨ別の実験を行った。通気量は０．５ｖｖｍ、撹拌速度は２００〜５００ｒｐｍに調節して、ｐＨを変化させて果糖が完全に消費されるまで培養した結果を表１０に表示した。
【００３７】
【表１０】
0003600803.tif 000011
【００３８】
（実施例７）
培養方法と発酵培地は実施例６と同様であり、本培養で培養ｐＨは５．０として培養温度別実験を行い、その結果を表１１に表示した。
【００３９】
【表１１】
0003600803.tif 000012
【００４０】
（実施例８）
選定された最適培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム２．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ）で果糖の濃度を３００ｇ／Ｌで増加させて発酵槽で流加式培養を行った。この時、流加式培養を行った理由は、カンジダ・マグノリアの場合１００ｇ／Ｌ以上の果糖ではマンニトール生産速度が低下したためであった。培養は、発酵初期に炭素源として５０ｇ／Ｌのブドウ糖を含む２Ｌの培地を含む５Ｌ発酵槽（韓国発酵器（株））を使用した。発酵過程中に２２５ｇの果糖が含まれた２５０ｍｌの溶液を４回（２０ｈ，３６ｈ，６２ｈ，９０ｈ）追加して、最終培養液の体積が３Ｌ（総添加された果糖の濃度は３００ｇ／Ｌに該当）になる流加式培養をした。溶存酸素は撹拌速度を５００〜６００ｒｐｍで調節して培養初期には２０％以上維持させて菌体濃度が約５ｇ／Ｌになる時点で撹拌速度を２００〜３５０ｒｐｍに変化させて溶存酸素を制限した。ｐＨは発酵全過程の間５．０、培養温度は３０℃、通気量は０．５ｖｖｍで調節し、時間によるマンニトールの生産は表１２に表した。このように流加式培養方法により３００ｇ／Ｌの果糖から１２０時間後に２４８ｇ／Ｌのマンニトールを得た。このような結果は、果糖に対するマンニトールの収率８３％とマンニトールの生産性２．０７ｇ／Ｌ−ｈに該当するものである。
【００４１】
【表１２】
0003600803.tif 000013
【００４２】
【発明の効果】
本発明の効果は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）を使用してブドウ糖５０〜１００ｇ／Ｌ、果糖５０〜１２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５〜２０ｇ／Ｌ、二リン酸カリウム１．０〜５．０ｇ／Ｌ及び硫酸マグネシウム０．１〜０．５ｇ／Ｌを含有する培地で培養して、マンニトールを高収率かつ高生産性で生産することができる。これは従来の化学合成及び発酵方法に比べて選択的、経済的、効果的にマンニトールを発酵生産できるものであり、製品品質及び国際競争力でも比較優位を占めることができる。
【００４３】
以上では本発明を実施例によって詳細に説明したが、本発明は実施例によって限定されず、本発明が属する技術分野において通常の知識を有するものであれば本発明の思想と精神を離れることなく、本発明を修正または変更できるであろう。