(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物またはそれらの混合物の含有培地で、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有するバチルス・ズブチリスを培養することを特徴とするガンマーポリグルタミン酸の生産法。
【請求項２】
醤油醸造物が、醤油麹仕込液、醤油諸味、醤油、醤油おりまたは醤油粕もしくはその抽出物であることを特徴とする請求項１記載のガンマーポリグルタミン酸の生産法。
【請求項３】
バチルス・ズブチリスが新規変異株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＲ１４１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９２）であることを特徴とする請求項１記載のガンマーポリグルタミン酸の生産法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はガンマーポリグルタミン酸の生産法、特に微生物によるガンマーポリグルタミン酸の生産法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンマーポリグルタミン酸は食品、化粧品、医薬品などの分野で、各種用途があるものと期待されている。
現在、ガンマーポリグルタミン酸は主に該物質生産性を有する微生物、例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養することによって製造されている（月刊組織培養、１６巻、Ｎｏ．１０、３６９〜３７２頁、１９９０年）。
【０００３】
しかしながら、本物質を各種用途に幅広く用いるためには、更に生産収量を増大させてより安価に供給することが必要であると認識されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前記問題を解決するためになされたもので、微生物によるガンマーポリグルタミン酸の生産法において、その生産収量を増大させる方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物またはそれらの混合物の含有培地で、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有する微生物を培養することによりガンマーポリグルタミン酸の生産収量が格段に増大するとの知見を得た。本発明はその知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有する微生物を、醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物またはそれらの混合物の含有培地で培養することを特徴とするガンマーポリグルタミン酸の生産法に関するものである。そして醤油醸造物が、醤油麹仕込液、醤油諸味、醤油、醤油おりまたは醤油粕もしくはその抽出物であり、また、微生物がバチルス・ズブチリスであることを特徴とするものである。更に、バチルス・ズブチリスが新規変異株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＲ１４１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９２）であることを特徴とするものでもある。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の特徴は、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有する微生物を培養して、ガンマーポリグルタミン酸を培地中に生産させるにあたり、醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物またはそれらの混合物を培地に含有させて、培養することにある。
【０００８】
本発明に用いる醤油麹とは、醤油醸造に使用される麹であり、通常の公知の醤油麹製造法で製造されるものである。例えば、蛋白質原料（例えば、大豆、脱脂大豆、脱脂加工大豆など）と炭水化物原料（例えば、小麦、大麦など）を、各々変性処理（例えば、蛋白質原料では蒸煮、高圧高温短時間処理など、炭水化物原料では、炒ごうなどによるα化処理など、またその後の割砕処理など）を施した後、通常の割合（例えば、原料処理前の重量比で、蛋白質原料：炭水化物原料＝４０〜６０：６０〜４０）で配合し、醤油麹菌｛例えば、アスペルギルス・ソーヤ１−１１２（ＦＥＲＭ−Ｐ  Ｎｏ．５０４），１−１９０（ＲＥＲＭ−Ｐ  Ｎｏ．５０５）、アスペルギルス・オリーゼ  ＡＴＣＣ２０３８６、ＩＡＭ２６１６など｝を用いて常法により製麹して得られるものである。なお、上記の蛋白質原料、炭水化物原料において、各種穀類から得られるふすまを使用するふすま麹も本発明においては、好適に用いることができる。
【０００９】
醤油麹の抽出物とは、上記のように製造された麹を１〜５倍量の水、または緩衝液（例えば、１０〜１００ｍＭのリン酸、トリス塩酸、酢酸など、ｐＨ５〜９など）などを加え、３０〜８０℃、３０分〜２４時間抽出したものである。そして、残渣を除いたものも好適に用いられる。
【００１０】
また、本発明においては、醤油醸造物とは、前記のようにして製造された醤油麹を、公知の各種醤油醸造法で仕込んで得られる全てのもの、またはそれらからの派生物と定義される。各種醤油醸造法とは、例えば、濃口醤油、淡口醤油、たまり醤油、減塩醤油、各種蛋白質分解物などの各種調味料の製造に関するものである。そして、醤油醸造物の例示として、各種醸造法における、醤油麹を常法に従って仕込んだ仕込液、また仕込液を常法に従って、発酵した諸味、また熟成させた諸味である。これらの工程のいずれかの段階で蛋白質原料を添加した仕込液、諸味も本発明に当然含まれる。またそれらから圧搾、慮過、遠心分離などの処理で得た上澄液（生醤油）もしくはその上澄液を静置したときに沈降してくる物質を各種方法（例えば、慮過操作、遠心操作）で採取して得られるおり（例えば一次おり、二次おりなど）などである。また、諸味から上澄液を分離して得られる粕もしくはその抽出物などを本発明の醤油醸造物として挙げることができる。更に、それらのものを公知の条件で火入れ（例えば、１２１℃、３０分間）を行なったもの、またそれらのものを適当な割合で混合したものも本発明の醤油醸造物である。なお、醤油粕の抽出物とは、前記醤油麹の抽出物と同様にして、醤油粕から抽出して得られるものである。
【００１１】
前記醤油醸造法おいて、前記仕込および発酵は、通常、例えば、次のように行なわれる。すなわち、麹１〜２ｋｇを２〜６ｋｌの２０％（ｗ／ｖ）以下の水または食塩水で仕込む。その後、ペドオコッカス・ハロヒラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｕｓｓ  ｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）などの乳酸菌類、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの酵母類を常法通りに添加するか、せずして  、１０〜４０℃で、１０〜９０日間常法通りに発酵させる。さらに、１０〜５０℃で３０〜９０日間熟成させる。勿論、本発明においては、発酵、熟成の中途のものも好適に用いることができる。なお、麹の仕込後、５０〜６０℃で３〜１００時間、蛋白質原料を分解し、それから食塩を追加してもよい（特開昭６４−２５５０号公報、特開平１−２５２２６９号公報）。この仕込操作において、変性処理した蛋白質原料を添加してもよい。
本発明においては、醤油麹もしくはその抽出物と醤油醸造物の適当な割合の混合物も好適に用いることができる。
なお、前記に挙げたもの中で、特に最も好適に用いることができるのは、醤油おり、または生醤油である。
【００１２】
本発明において、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有する微生物を培養するにあたり、その培地に前記の醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物またはそれらの混合物（以下、これらのものを総称して、単に醤油麹または醤油醸造物という）の含有培地を用いるのであるが、それらの含有量は、通常、全窒素（ＴＮ）として、０．００１〜５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜２％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．１〜１％（ｗ／ｖ）である。
なお、０．００１％（ｗ／ｖ）未満の場合は、ガンマーポリグルタミン酸の生産量の増大は期待できない。５．０％（ｗ／ｖ）を越える場合は、ガンマーポリグルタミン酸の生産が阻害されるようになる。
【００１３】
また醤油麹または醤油醸造物を培地に含有させるには、培地調製時に培地に添加してもよいが、培養開始時またその途中で培養液中に添加してもよい。その培養液中へ添加の場合、それらのものをオートクレーブなどの通常の殺菌処理を施してから添加するのが好適である。またこの場合、培養液のｐＨが変化しないように、必要に応じて醤油麹または醤油醸造物のｐＨを予め調整しておく方がよい。
なお、醤油麹または醤油醸造物を添加する場合、溶液の場合は溶液の状態で、固体の場合は固体の固体の状態で、懸だく状態の場合は懸だくの状態で添加してよい。
【００１４】
本発明に用いる培地およびその成分は、通常のガンマーポリグルタミン酸の生産に使用されるものでよい。
例えば、液体培地の場合、成分としては、次のようなものを用いられる。
（１）炭素源：ブドウ糖、果糖、庶糖、マルトース、粗糖類、糖密類（例えば、甜菜糖密、甘藷糖密）、各種澱粉類（例えば、タピオカ、サゴヤシ、甘藷、馬鈴薯、トウモロコシ）またはその酸糖化液類、酵素糖化液類。
（２）窒素源：ペプトン、大豆粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、大豆そのものまたは脱脂大豆またはそれらの粉体または粒体またはそれらの抽出液、尿素などの有機窒素源類、また硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩類、アンモニヤガス、アンモニヤ水などの無機窒素源類。
（３）その他：本発明のガンマーポリグルタミン酸生産性を有する菌の生育に必要な各種無機塩類、例えば、カルシウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛などの硫酸塩類、塩酸塩類、リン酸塩類、酢酸塩類。また、アミノ酸類、ビタミン類。アミノ酸類としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジンなど、ビタミン類としてはビオチン、サイアミンなどを挙げることができる。
固体培地の場合は、培地素材として、蒸煮した大豆、大麦、小麦、そば、トウモロコシまたはそれらの混合物が好適なものとして用いられる。
【００１５】
これらの成分もしくは素材または本発明の醤油麹もしくは醤油醸造物が適当に選択され、単独または組合せて、かつ醤油麹または醤油醸造物のＴＮが前記範囲になるように含有せしめて、無機もしくは有機合成培地または天然培地の液体培地もしくは固体培地が製造される。その際、培地のｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８に苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニヤなどで調整される。培地の殺菌は、通常の方法、１１０〜１４０℃、８〜１５分で行なえばよい。なお、本発明の醤油麹または醤油醸造物単独で培地を製造しても本発明においては、好適に用いられる。
【００１６】
培養は、液体培養の場合、振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で行なう。培養温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃が適当である。培養時のｐＨは５〜９、好ましくは６〜８が適当である。ｐＨの調節は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニヤ、またはそれらの水溶液によって行なう。培養期間は通常２〜３日間である。
固体培養の場合、培養温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃が適当である。培養時のｐＨは５〜９、好ましくは６〜８が適当である。
【００１７】
本発明の製造法に用いられる微生物は、ガンマーポリグルタミン酸生産性を有するものであればよく、その分類上の位置は問われないが、特にバチルス属に属する細菌が好適に用いることができる。このようなバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などの細菌をあげることがことができる。
その他に、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム・チュバクロセス（Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などをもあげることができる。
【００１８】
それらの細菌の中で、具体的には、例えば、バチルス・ズブチリス  ＭＲ１４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９２、特願平６−３３０８８５号）、バチルス・ズブチリスＳ−２（ＩＦＯ１４８９８、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５２８、特開平３−１３００９０号公報）、バチルス・ズブチリス  ＩＦＯ１４１８７（特開昭５９−４２８９５号公報）、バチルス・ズブチリスＴＴＣＣ１６２（微工研寄託第１１０５２号、特開平４−１７３０６９号公報）、バチルス・ズブチリス  Ｋ−２（微工研寄託第９７６８号、特公平５−６０３３５号公報）、バチルス・ズブチリスＦ−２−０１｛微工研寄託第９０８２号（ＦＥＲＭ  Ｐ−９０８２）、特開平１−１７４３９７号公報｝など、その他納豆製造に使用されている宮城野納豆菌、高橋菌、旭川菌、松村菌、成瀬菌などの市販のものを挙げることができる。
【００１９】
また、前記の菌から各種変異処理法を用いて得られる変異株も、好適に用いることができる。
変異処理法としては、通常公知の方法、例えば、遺伝子操作による法、細胞または胞子に、変異源性のある薬剤を接触させる法、またＸ線、紫外線、放射線、光などを照射する法、を挙げることができる。
本発明においては、変異源性のある薬剤を用いる方法が好適に採用できる。該薬剤としては、公知のもの、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メチルエチル硫酸を挙げることができる。
そして、これらの薬剤を納豆菌の細胞または胞子に接触させる際、通常、その薬剤濃度は、細胞１０８〜１０９個／ｍｌの細胞懸濁液において、１０〜１０００γ／ｍｌである。また接触は、通常、０〜５０℃で、１０〜１４００分である。
【００２０】
変異処理された細胞または胞子は、通常の公知の栄養培地、例えば、肉汁、ペプトン、大豆粉、酵母エキス、カザミノ酸、アミノ酸類またはそれらの混合物などが含有する培地、または必要な栄養素類を含有する無機合成培地などの液体培地で３〜２４時間培養する。
そして、培養物中のガンマーポリグルタミン酸の量を下記の方法で測定し、ガンマーポリグルタミン酸の生産性の高い菌株を選択することにより目的の変異株が得られる。
【００２１】
（ガンマーポリグルタミン酸の測定法）
液体培養物から菌体を遠心分離などの操作で除き、清澄化した試料液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド板上に乗せ、電気泳動を行なった後、該板をアルシアンブルーで染色し、染色されたＰＧＡのバンドの色度をデンシトメトリーで測定する。
【００２２】
前記の方法で得られた新規変異株の一例として、ＭＲ１４１（以下、この株を単にＭＲ１４１という）を挙げることができる。ＭＲ１４１は、親株として宮城野納豆菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（以下、単にＭＲ−１いう）を用いて、得られたものである。
【００２３】
ＭＲ１４１の菌学的性質をＭＲ−１のものと比較した結果を表１に示す。なお、菌学的性質を調べる実験は、「微生物の同定法」（衛生技術会刊行、１９８３年）に記載されている方法に従った。
【００２４】
0003547839.tif 000002
【００２５】
上記以外の性質、例えば、ビオチン要求性、細胞の大きさ（１×２〜３μｍ）、胞子の大きさ（０．８×１．６〜１．８μｍ）、肉汁寒天培地での生育状態（２５℃で２５時間培養）、ゼラチン穿刺培養の生育状態、リトマスミルクでの生育状態およびリトマス還元性、各種糖類からの酸の生成、生育適温範囲、ＤＮＡのＧＣ含量、などの性質についても実験を行なったが、それらの性質はＭＲ−１と一致した。よって、ＭＲ１４１はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに属することは明らかである。
【００２６】
しかし、ＭＲ１４１を液体培地で培養したとき、ＰＧＡ含有量は２〜３％（ｗ／ｖ）で、ＭＲ−１のものより、１．８〜３．５倍も高い。またＭＲ１４１の培養物のプロテアーゼ活性は、ＭＲ−１に較べて２〜３倍強い。また、この菌株を用いて常法通りに納豆を製造すると納豆のアンモニヤ含有量が６５ｍｇ％（ｗ／ｗ）以下になる。この点がＭＲ１４１と親株であるＭＲ−１との明確な相違点である。
【００２７】
このような特質を有する納豆菌または納豆菌変異株は現在まで、全く知られていない。よってＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＲ１４１を新規変異株と認定し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９２なる受託番号で寄託している（特願平６−３３０８８５）。
【００２８】
前記培養において、ガンマーポリグルタミン酸は主として菌体外に蓄積される。培養物からのガンマーポリグルタミン酸の単離は、従来から行なわれている公知の分離採取法によって行なう。
すなわち、
（１）固体培養物からの２０％以下の食塩水による抽出分離法（特開平３−３０６４８）、
（２）■硫酸銅による沈殿法（Ｔｈｒｏｎｅ．Ｂ．Ｃ．，  Ｃ．Ｃ．Ｇｏｍｅｚ，Ｎ．Ｅ．Ｎｏｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｖｒｉｇｈｔ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６８巻、３０７ページ、１９５４年）、
（３）アルコール沈殿法（Ｒ．Ｍ．Ｖａｒｄ，Ｒ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｋ．Ｄｅａｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ５巻、４１ページ、１９６３年；沢純彦、村川武雄、村尾沢夫、大亦正次郎：農化、４７巻、１５９〜１６５ページ、１９７３年；藤井久雄：農化、３７巻、４０７〜４１２ページ、１９６３年）、
（４）架橋化キトサン成形物を吸着剤とするクロマトグラフィー法（特開平３−２４４３９２号公報）、
（５）分子限外濾過膜を使用する分子限外濾過法、
（６）（１）〜（５）の方法の適当な組合せ
なである。
その結果、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩として分離される。そして、濃縮、熱風乾燥、凍結乾燥などの操作を施して、含有液、または粉末として製品とされる。
そして、これらの製品は、各種食品の増粘剤として用いられる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明法は、ガンマーポリグルタミン酸の生産収量を格段に増加させることができる。ガンマーポリグルタミン酸の生産価格が高くて、食品製造においては増粘剤などとして各種用途があってもそれらに使用できなかったが、本発明はその障害を取除いたものである。
【００３０】
【実施例】
以下本発明を実施例をもって説明する。
なお、本実施例においてガンマーポリグルタミン酸の測定法は前記記載と同様とした。
実施例１
３％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、表２に示す醤油醸造物（生醤油、醤油おり）または対照としての酵母エキス（各々の含有量は表２に示した）、ｐＨ８．０（３Ｎ苛性カリ）なる組成の培地２０ｌを３０ｌジャーに加えて、１２１℃、１５分間殺菌した。ガンマーポリグルタミン酸生産性を有するバチルス・ズブチリス  ＭＲ１４１（ＦＲＥＭ  Ｐ−１４６９２）を、前培養培地（前記と同じ組成、１００ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ）で３７℃、２４時間培養し、前記調製ジャー培地に接種量１％（ｖ／ｖ）の割合で添加した。ジャーを４００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、４０℃なる条件で７２時間培養した。遠心分離操作で培養液から菌体を除いた上澄液について、ガンマーポリグルタミン酸を測定した。その結果を表２に示した。なお、対照として、醤油醸造物の代りに、酵母エキスを添加した培地を用いた。また、醤油醸造物、酵母エキスの添加量は全窒素（ｔｏｔａｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ）として、０．２５％（ｗ／ｖ）となるようにした。
【００３１】
なお、本実施例における醤油醸造物、すなわち、生醤油、醤油おりは次のようにして調製された。
脱脂加工大豆を常法により蒸煮変性処理したものと、小麦を常法により炒ごう割砕処理したものを処理前の重量として５：５の割合で混合し、更に麹菌アスペルギルス・ソーヤ１−１１２（ＦＥＲＭ−Ｐ  Ｎｏ．５０４）の胞子を接種し、通常の条件で製麹を行なって醤油麹を得た。
該醤油麹に４６℃に加温した２４％（ｗ／ｖ）の食塩水を１．２倍容加え、混合し、麹を仕込んだ。この仕込と同時にチゴサッカロミセス・ルーキシＩＦＯ０４９５培養細胞を添加した（仕込後の細胞数１×１０６個／仕込物１ｇ）。適宜通気、攪拌を行ないながら３０〜３７℃で１２０日間発酵させた。さらに３０日間２０〜３０℃で熟成させた。この諸味をナイロン製濾布で包み、油圧圧搾機で圧搾して液汁を得た。液汁を静置し、分離してくる油を除去し、生醤油を得た。該生醤油を１１５℃で５秒の条件で火入れ処理して、静置した。凝固沈殿物区分を採取した。該区分を更に静置して上澄区分を除いて、本実施例の醤油おりとした。
なお、本実施例の生醤油と醤油おりのＴＮは各々１．７２％（ｗ／ｖ）、１．７５％（ｗ／ｖ）、食塩は１５．８２％（ｗ／ｖ）、１５．７８％（ｗ／ｖ）であた。
【００３２】
0003547839.tif 000003
【００３３】
表２から分るように、培地に醤油醸造物、すなわち生醤油、醤油オリを含有せしめて、バチルス・ズブチリス  ＭＲ１４１を培養した培養液中のガンマーポリグルタミン酸の量は、対照のものに較べて、２２〜３３％も多かった。