(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜関連タンパク質を発現し、水泡性口内炎ウィルス（VSV）由来の宿主域を有するエンベロープ保有ベクター粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって：
レトロウィルスを起源とするヌクレオキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；及び、
該第一の核酸の由来となるレトロウィルスの宿主域とは異なる宿主域を決定する膜関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸を含み、かつ、該膜関連タンパク質がVSV  Ｇタンパク質であり、該細胞が該第一の核酸および該第二の核酸により安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞株。
【請求項２】
第三の核酸によってトランスフェクトされた細胞株であって、該第三の核酸は治療剤をコードする請求項１の細胞株。
【請求項３】
gag、pol、及び、キメラ膜関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む哺乳類パッケージング細胞であって、該キメラ膜関連タンパク質が、外側結合ドメイン、膜関連ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該膜関連ドメインがVSV  Ｇの膜関連ドメインであり、該細胞質ドメインがVSV  Ｇの細胞質ドメインであり、かつ、該外側結合ドメインがリガンドまたはレセプターに結合する哺乳類パッケージング細胞。
【請求項４】
前記外側結合ドメインが非ウィルス性タンパク質のレセプター結合ドメインである請求項３の細胞。
【請求項５】
前記非ウィルスタンパク質がCD4である請求項４の細胞。
【請求項６】
前記非ウィルスタンパク質がエリスロポエチンである請求項４の細胞。
【請求項７】
gagおよびpolレトロウィルスタンパク質、ベクター粒子内部の核酸、キメラ膜関連タンパク質を含むエンベロープ、を含む組換えベクター粒子であって、該キメラ膜関連タンパク質が、外側結合ドメイン、膜関連ドメイン、細胞質ドメインを含み、かつ、該膜関連ドメインがVSV  Ｇの膜関連ドメインであり、該細胞質ドメインがVSV  Ｇの細胞質ドメインであり、該外側結合ドメインがリガンドまたはレセプターに結合する組換えベクター粒子。
【請求項８】
前記外側結合ドメインが非ウィルス性タンパク質のレセプター結合ドメインである請求項７の組換えベクター粒子。
【請求項９】
前記非ウィルス性タンパク質がCD4である請求項８の組換えベクター粒子。
【請求項１０】
前記非ウィルス性タンパク質がエリスロポエチンである請求項８の組換えベクター粒子。
【請求項１１】
哺乳類パッケージング細胞から組換えエンベロープ保有ベクター粒子を産生する方法であって、該組換えビリオンは異種キメラ膜関連タンパク質を含み、その方法が、
レトロウィルスベクターを哺乳類パッケージング細胞に導入し、ここで、該細胞はgagおよびpolを安定に発現し、かつ、キメラ膜関連タンパク質を発現し、該キメラ膜関連タンパク質は、外側結合ドメイン、膜関連ドメイン、細胞質ドメインを含み、該膜関連ドメインはVSV  Ｇの膜関連ドメインであり、該細胞質ドメインはVSV  Ｇの細胞質ドメインであり、該外側結合ドメインはリガンドまたはレセプターに結合するものであって；
該哺乳類パッケージング細胞を培養し；
その細胞により産生された組換えエンベロープ保有ベクター粒子を単離する工程を含む方法。
【請求項１２】
レトロウィルスのgagおよびpolをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を安定に発現し、かつ、VSV  Ｇをコードするヌクレオチド配列を含む第二の異種核酸を誘導発現する安定な哺乳類パッケージング細胞であって、VSV  Ｇは該第一の核酸の由来となるレトロウィルスの宿主域とは異なる宿主域を決定するものであって、該第二の核酸は誘導的プロモーターに動作可能に連結されており、前記細胞は前記第一の核酸および前記第二の核酸により安定にトランスフェクトされた安定な哺乳類パッケージング細胞。
【請求項１３】
前記誘導的プロモーターがMMTVプロモーターである請求項12のパッケージング細胞。
【請求項１４】
前記細胞がBHK細胞である請求項12のパッケージング細胞。
【請求項１５】
哺乳類パッケージング細胞株からエンベロープ保有ベクター粒子を産生する方法であって、その方法が、
gagおよびpolをコードする配列を含む第一の核酸とVSV  Ｇをコードする配列を含む第二の核酸を含む安定な哺乳類パッケージング細胞であって、該VSV  Ｇが該第一の核酸の由来となるレトロウィルスの宿主域と異なる宿主域を決定し、前記細胞は前記第一の核酸および前記第二の核酸により安定にトランスフェクトされており、該第二の核酸が誘導的プロモーターに動作可能に連結されている安定な哺乳類パッケージング細胞に、レトロウィルスベクターを導入し；
該誘導的プロモーターからのVSV  Ｇの発現を誘導する条件下で細胞を培養し；
該細胞により産生されるベクター粒子を単離する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記誘導的プロモーターからの発現が温度依存性である請求項15の方法。
【請求項１７】
前記誘導的プロモーターからの発現が少なくとも一つの化合物の存在に依存している請求項15の方法。
【請求項１８】
前記誘導的プロモーターがMMTV、前記化合物がコルチコステロイドである請求項17の方法。
【請求項１９】
膜関連タンパク質を発現し、水泡性口内炎ウィルス（VSV）由来の宿主域を有するエンベロープ保有ベクター粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって：
レトロウィルスを起源とするヌクレオキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸；及び、
該第一の核酸の由来となるレトロウィルスの宿主域とは異なる宿主域を決定する膜関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸を含み、かつ、該膜関連タンパク質がVSV  Ｇタンパク質であり、該細胞が該第一の核酸および該第二の核酸により安定にトランスフェクトされており、水泡性口内炎ウィルス（VSV）ビリオン由来の宿主域を有するベクター粒子が産生されているパッケージング細胞株。
【請求項２０】
gag、pol、及び、キメラ膜関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む哺乳類パッケージング細胞であって、該キメラ膜関連タンパク質が、外側結合ドメイン、膜関連ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該膜関連ドメインがVSV  Ｇの膜関連ドメインであり、該細胞質ドメインがVSV  Ｇの細胞質ドメインであり、かつ、該外側結合ドメインがリガンドまたはレセプターに結合し、水泡性口内炎ウィルス（VSV）ビリオン由来の宿主域を有するベクター粒子が産生されている哺乳類パッケージング細胞。
【請求項２１】
gagおよびpolレトロウィルスタンパク質、ベクター粒子内部の核酸、キメラ膜関連タンパク質を含むエンベロープ、を含む組換えベクター粒子であって、該キメラ膜関連タンパク質が、外側結合ドメイン、膜関連ドメイン、細胞質ドメインを含み、かつ、該膜関連ドメインがVSV  Ｇの膜関連ドメインであり、該細胞質ドメインがVSV  Ｇの細胞質ドメインであり、該外側結合ドメインがリガンドまたはレセプターに結合し、水泡性口内炎ウィルス（VSV）ビリオン由来の宿主域を有するベクター粒子が産生されている組換えベクター粒子。
【請求項２２】
レトロウィルスのgagおよびpolをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を安定に発現し、かつ、VSV  Ｇをコードするヌクレオチド配列を含む第二の異種核酸を誘導発現する安定な哺乳類パッケージング細胞であって、VSV  Ｇは該第一の核酸の由来となるレトロウィルスの宿主域とは異なる宿主域を決定するものであって、該第二の核酸は誘導的プロモーターに動作可能に連結されており、前記細胞は前記第一の核酸および前記第二の核酸により安定にトランスフェクトされており、水泡性口内炎ウィルス（VSV）ビリオン由来の宿主域を有するベクター粒子が産生されている安定な哺乳類パッケージング細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、概ね変更宿主域を有するウィルスベクターに関する。より詳しくは、本発明は、外来の膜関連タンパク質を有するウィルスエンベロープを含むベクター粒子及び、安定な細胞株からのこれらの粒子の産生に関する。
発明に係る政府の権利
本発明は、国立衛生研究所から得られた米国公衆衛生サービスグラントHD20034による政府の支援を受けて行われた。合衆国政府が本発明における一定の権利を有する。
発明の背景
エンベロープ保有（enveloped）動物ウィルスのアッセンブリは、出芽ウィルス粒子へのウィルスのゲノム及び付属ウィルスタンパク質の選択的封入（inclusion）によって特徴付けされる。選択的な被包化（encapsidation）又はパッケージングの機構は十分に特徴付けされていないが、ウィルスのヌクレオキャプシドによる細胞質膜内部のウィルスエンベロープタンパク質の認識が、パッケージング特異性における一つの有望な制御ポイントを表していると、仮定されている。
内部画像抗イディオタイプ抗体を用いて、ヴァウクス（Vaux）らはセムリキ森林熱ウィルス（Semliki Forest virus;SFV）のヌクレオキャプシドがビリオンE2スパイク糖タンパク質の細胞質尾部に対する特異的リセプターを含むことを示した（Nature（London）,336:36−42（1988））。ヴァウクスらは、この両者間の特異的リセプター−リガンド様相互作用が、感染細胞からのSFV及び関連ウィルスの発芽の機構において重要であるらしいことを示唆した。
E2タンパク質に対するSFVの高程度の特異性と明らかに対象的に、周知の現象である”シュードタイプ”形成があり、この現象では、あるウィルス及びレトロウィルスによる細胞の混合感染が、一方のエンベロープタンパク質によって被包化された他方のウィルスのゲノムを産生する子孫ビリオンの生成を起こす。これらの表現型的に混合されたウィルスは、適当な指示細胞においてプラークを形成し、特異的なエンベロープタンパク質に対して得られた血清によって中和され得る。シュードタイプ形成に関連することが知られているウィルスは、ラブドウィルス科のメンバーである水疱性口内炎ウィルス（vesicular stomatitis virus;VSV）である。
非関連ウィルスのビリオンへのあるウィルスのエンベロープタンパク質の封入の機構は、明らかではない。VSV Gタンパク質とレトロウィルスエンベロープタンパク質の配列比較は、これらのタンパク質の間において顕著な配列類似性がないことを明らかにした。今まで、他のVSVコードタンパク質の非存在下においてＧタンパク質だけがシュードタイプ形成に関連することができるか否かについて決定することも、また困難であった。シュードタイプが２つのアルファウィルス間又はアルファウィルスと日本脳炎ウィルスのような関連フラビウィルスとの間で形成することができるとしても、シュードタイプは、VSVとSFVのようなアルファウィルスとの間では形成することはできない。
あるケースでは、VSVと家禽ペストウィルス（fowl plaque virus;FPV）又は、VSVとシンドビスウィルスの場合にあるとき、表現型混合が一方になる。FPVのエンベロープタンパク質によって被包化されたVSVゲノムを含むシュードタイプウィルス粒子VSV（FPV）及び、シュードタイプウィルス粒子VSV（シンドビス）が試行されたが、逆行シュードタイプ、即ちVSV Gタンパク質と共にFPV又はシンドビスウィルスゲノムとを含むFPV（VSV）及びシンドビスウィルス（VSV）は検出されなかった。
レトロウィルス及びVSVを用いた細胞の混合感染は、通常、同一細胞から生成されるVSVの力価よりもかなり低い力価を有するシュードタイプの形成を起こす。これが、レトロウィルスのヌクレオキャプシドとＧタンパク質との間の相互作用の特異性によるものか又は他の因子によるものかは明らかでない。
レトロウィルスベクターは、ウィルス感染工程の利用によって、効率よく遺伝子を転移するために用いられている。レトロウィルスのゲノムにクローン化された外来遺伝子は、レトロウィルスによって感染の感受性（susceptible）細胞に効率よく運ばれ得る。他の遺伝子操作を通して、レトロウィルスゲノムの複製能は破壊され得る。ベクターは細胞に新しい物質を導入するが、複製することはできない。ヘルパーウィルス又はパッケージングシステムは、ベクター粒子をアッセンブリすること及び放出させる（egress）ことを可能にするために用いられ得る。ここで用いられる場合、”ベクター粒子”は、ウィルス様のエントリー機構を通じて、細胞へ核酸を導入することができるウィルス様粒子を表す。このようなベクター粒子は、これらが感染した細胞へ遺伝子の転移を、特定の状況下で仲介することができる。
他の密接に関連したウィルスのエンベロープ遺伝子を含めることによって、これらのベクターが感染できる細胞の範囲を変えることは可能である。ミラー（Miller）らは、感受性細胞へ、選択可能マーカーであるジヒドロ葉酸還元酵素を導入するためMoMLV由来ベクターを構築し、ベクターの宿主域を広げるために、関連するアンホトロピックレトロウィルス4070Aからのエンベロープ領域を含んだ（Mol.Cell.Biol.,5:431−437（1985））。
上述したように、どのシグナルが、ベクター粒子の機能的アッセンブリを指示するために必要であるかは明らかでなく、また、どの因子が、ヌクレオキャプシド及び膜関連タンパク質を相互作用及び完全なパッケージングを可能にするかも知られていない。従って、これまでに宿主域における変更は、ベクター粒子内部で、異種膜関連タンパク質を含むことによって作用されなかった。”異種膜関連タンパク質”は、ベクター粒子のヌクレオキャプシドタンパク質の起源と同一ウィルス科以外のウィルスの少なくとも１つを起源とする膜関連タンパク質を意味する。ここで用いられる場合、ウィルス”科”は、国際ウィルス分類委員会によって指定された分類ランクの科を参照するように用いられねばならない。
発明の概要
まとめると、本発明は、好ましくはレトロウィルスである第１のウィルスを起源とするヌクレオキャプシドタンパク質を含むヌクレオキャプシド；ヌクレオキャプシドと関連する機能的核酸配列；及び宿主域を決定する膜関連タンパク質を含み、この膜関連タンパク質が第１のウィルスと同一の分類科以外のウィルスを起源とするエンベロープ保有ベクター粒子を提供する。好ましくは、この膜関連タンパク質は、例えばVSV Gタンパク質である天然に生じる膜関連タンパク質のような、第１のウィルスとな異なる宿主域を有する第２のウィルスからのものである。
本発明のベクター粒子の他の好ましい形態は、膜関連タンパク質が、外部リセプター結合ドメイン及び膜関連ドメインを含むキメラタンパク質であり、外部リセプター結合ドメインの少なくとも一部は、膜関連ドメインの少なくとも一部と異なる起源に由来している。キメラタンパク質は、好ましくは、２つの起源に由来し、この場合に２つの起源のうち１以下はレトロウィルスであり、外部リセプター結合ドメインの少なくとも一部はVSV Gタンパク質からのものである。
本発明のベクター粒子の機能的核酸配列は、好ましくは、レトロウィルスからの長末端反復を含み、また第１のウィルスとは別の起源を有する遺伝子をコードし、この遺伝子は、選択可能マーカーのようなポリペプチドに発現可能である。好ましい選択可能マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子である。ポリペプチドをコードする遺伝子は、長末端反復又は、転写を指示できる内部プロモーターにより発現され得、好適実施例においては、これは組織特異的プロモーターからのものである。
本発明の他の態様においては、外来ベクター粒子を産生する細胞株が提供される。好ましくは、細胞株は、機能的核酸及び膜関連タンパク質をコードしている核酸によって安定してトランスフェクションされる。安定にトランスフェクトされる機能的核酸は、好ましくは、ヌクレオキャプシドタンパク質の生成に対する機能をコードしている。膜関連タンパク質は、或いは、例えば誘導可能プロモーターから発現され得る。このような安定な細胞株は、如何なる所望された機能的核酸も本質的に有するベクター粒子の産生を可能にする。所望された機能的核酸は、例えば、ヌクレオキャプシド及び膜関連タンパク質を発現するこれらの安定な細胞株へのトランスフェクションによって導入され得、これによって、ベクター粒子の付随生成と共に所望された機能的核酸のパッケージングが生じる。
本発明の他の態様に従えば、細胞への外来核酸の導入方法が提供され、これは、機能的核酸配列、第１のウィルス由来ヌクレオキャプシドタンパク質及び、この膜関連タンパク質が異種膜関連タンパク質を有するベクター粒子を作成し、この細胞を含む宿主域を決定すること；並びに、ベクター粒子によって細胞を感染することを含む。この作製ステップは、好ましくは、ヘルパーウィルス又はヘルパーウィルスゲノムの機能的一部による同時トランスフェクションを含む。好適実施例では、細胞は、第１のウィルスの宿主域の外にある。好ましくは、膜関連タンパク質は、この細胞に感染できる第２のウィルス由来のものであり、この第２のウィルスは、第１のウィルスとは異なる分類科のものである。この発明の特定の態様では、膜関連タンパク質は、外部リセプター結合ドメイン及び膜関連ドメインを含むキメラタンパク質であり、外部リセプターの少なくとも一部は、膜関連ドメインの少なくとも一部とは異なる起源を由来とする。キメラタンパク質は、好ましくは、２つの起源に由来し、２つの起源の１以下はレトロウィルスのものである。好適実施例では、外部リセプター結合ドメインの少なくとも一部は、VSV Gタンパク質からのものであり、第１のウィルスは、ヒト細胞又はヒト細胞のサブセットを含まない宿主域を有する、MoMLVのようなレトロウィルスである。
本発明のまた他の態様では、生きている生物の一部であり得る細胞への核酸の導入方法が提供され、これは、ヌクレオキャプシド及び脂質エンベロープ内部に核酸を有するベクター粒子による細胞の感染を含み、ここで、ヌクレオキャプシドは第１のウィルスを起源とし、エンベロープは、この細胞を組む宿主域を決定する関連異種膜関連タンパク質を有し、またここで、この核酸は追加核酸へ転写可能である。この方法の特定の好ましい形態では、この方法は、相補的核酸への核酸の転写も含む。この方法の好適形態では、核酸はポリペプチドをコードし、この方法は、相補的核酸の翻訳を通してポリペプチドを発現することを含む。
この方法で用いられる核酸は、治療剤をコードすることができる。ある形態では、この方法は、ポリペプチドが活性体として十分な量に発現していない遺伝子欠損のための治療として用いることができ、ここで、この核酸によってコードされるポリペプチドは、十分な量に発現していないポリペプチドの活性形であり、ここでベクター粒子によって感染された細胞は、哺乳類からの細胞である。
好ましくは、この方法は、この核酸を導入することを所望されている生物内の標的細胞の同定を含み、ここで、膜関連タンパク質は、標的細胞上のリセプターを認識し、また、この方法は細胞のゲノムへの核酸の組み込みを含む。
本発明の更なる目的、特徴及び他の利点は、添付図面と共に考慮して、次の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、スケールは示していないが、特定レトロウィルスベクター粒子の作製における、pLRNL、pLARNL、pLGRNL、pSVGP及びpSAMのレトロウィルスベクター及びパッケージングコンストラクトの構成図である。
図２は、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとして用いたLGRNL感染細胞のサザンブロット解析を示している。
図３は、SDS−PAGEによって分離され、蛍光間接撮影法によって可視化された免疫沈降物を示している。レーン１及び２は、抗VSV G及び正常ウサギ血清で各々免疫沈降されたポリクローナル細胞株を示している。レーン３は、抗VSV G抗体で免疫沈降された偽の感染MDCK細胞である。
図４は、集められ、１週間成長させ、それからFACSソーティングによって再単離された選択細胞の免疫沈降を示している。レーン１は、抗VSVG抗体によって免疫沈降された２回ソートされた細胞の抽出液を示し、レーン２、３及び４は、各々図３のレーン３、２及び１に対応している。
発明の詳細な説明
我々は、広範囲の種類の細胞についての変更宿主域を提供するために、非関連ウィルスの特異的膜関連タンパク質を、レトロウィルスベクター粒子中に取り込ませることができることを発見した。
モデルシステムとして、我々は、VSV G膜関連タンパク質をモロニーマウス白血病ウィルス（MoMLV）を基にしたベクター粒子に取り込ませ、そのエンベロープ内に、MLV由来のヌクレオキャプシドと、VSV G膜関連タンパク質を有するレトロウィルスベクター粒子を生成した。そのようなベクター粒子は、本明細書中ではMLV〔VSV G〕とう名称で呼ばれる。この名称は、本明細書中では一般に、ある種のウィルスのヌクレオキャプシドと他のウィルスの膜関連タンパク質を有するベクター粒子を指すために用いられるが、該名称の非括弧部分においてキャプシドの起源を、更に括弧部分においてベクター粒子のエンベロープ内の膜関連タンパク質を示している。
ベクター粒子の産生のために、本発明のベクター粒子の核酸を、適切な細胞株にDNA感染させる（トランスフェクト）ために用いることができる。ベクター粒子はトランスフェクトされた細胞の上清中に放出され、所望の細胞型の感染に用いられる。トランスフェクションに用いられる核酸は、単離された形態であっても、またベクター粒子中に既にパッケージングされてあってもいずれにもし得る。いくつかの例では、ウィルス粒子（ビリオン）の組み立て（アッセンブリ）を促進するためにヘルパーウィルスが必要とされる。従って、例えば、gag及びpol遺伝子をコードする遺伝子は、ヘルパーウィルスの核酸へ取り込ませることができ、別のウィルスの機能的配列はベクター粒子にパッケージングされる核酸へ取り込ませることができる。
膜関連エンベロープタンパク質をコードする遺伝子は、ベクター粒子の又はヘルパーウィルスのいずれかの核酸内に取り込ませることができる。また別に、このエンベロープタンパク質の遺伝子は、核酸の第三フラグメント又は産生細胞のゲノムから発現させることもできるであろう。本発明の好ましい形態では、ベクター粒子内の核酸は、ベクター粒子によって感染された細胞の細胞ゲノムに組み込まれ、エンベロープ遺伝子は、ベクター粒子ゲノムである核酸以外の核酸の、異なるフラグメントに局在する。従って、この好ましい具体例では、膜関連タンパク質は、ベクター粒子の組み込まれた核酸を含むベクター粒子感染細胞によって産生されないであろう。
以下に述べるように、我々は、MLV〔VSV G〕ベクター粒子の形成において、MoMLVのヌクレオキャプシドと相互作用するためには、VSV Gタンパク質だけで十分であることを発見した。VSV Gタンパク質のベクター粒子中への取り込み過程は効率的であり、完全なレトロウィルスのそれに匹敵する力価を有する感染性ベクター粒子の産生をもたらす。従って、我々は、エンベロープ保有ウィルスのエンベロープ内に、他の異種膜関連タンパク質も能率的に取り込ませることができると考える。
MoMLVは、マウスの細胞以外では感染性が低いマウスレトロウィルスである。このエコトロピックウィルスが、例えばN2ベクターゲノムを運ぶレトロウィルスベクター粒子を産生するように適合される場合、このベクターは、マウス細胞にのみにかなりの効率で感染するであろう。関連のあるアンホトロピックN2ウィルスは、ヒト、マウス及び他の生物の細胞に感染するであろう。この違いは、エコトロピックなエンベロープタンパク質をアンホトロピックなエンベロープタンパク質と置き換えたことによる。両タイプのウィルスベクター粒子は、本質的に同一なMoMLV由来のヌクレオキャプシドを有する。しかし、エコトロピックN2ウィルスもアンホトロピックN2ウィルスも、ハムスター細胞に感染しない。以下の実施例で示すように、我々は、ハムスター細胞が、MLV〔VSV G〕ベクター粒子によって感染されることができ、更に、これらウィルス粒子の調製物に対する抗VSV血清によって、その感染性が完全に阻止され得ることを見出した。従って、ベクター粒子中のVSV Gタンパク質の存在により、エンベロープ内に取り込まれた膜関連タンパク質の起源であるVSV由来の宿主域をもつベクターを生じるということを示した。
異種膜関連タンパク質を含むベクターが効率よくアッセンブリされ得るか否かを調べるために、我々は、VSV Gタンパク質がMoMLVのヌクレオキャプシドと共にアッセンブリされ得るか否かを試験した。我々は、まず初めに、アンホトロピックパッケージング細胞株PA317に、ベクター粒子に対する選択可能マーカーとして、ネオマイシン耐性を付与するネオマイシンフォスホトランスフェラーゼ遺伝子（Neo）を導入した。得られたベクター粒子は、アンホトロッピクMLV感染を維持できない細胞に加えられた。ベビーハムスター腎（BHK）細胞は、アンホトロピック細胞表面レセプターを欠き、従って、実施例１の実験で示されるように、アンホトロピックMLV由来レトロウィルス感染に感受性をもたない。
最初の実験では、我々は、この細胞株が、アンホトロピックMLVレトロウィルスによる感染に対して、本当に抵抗性であることを確認した。最初の実験の次のセットは、実施例１に示されている。これらの実験では、我々は、Neo遺伝子を含むアンホトロピックN2ウィルスがラット208F線維芽細胞で成長するが、BHK細胞では成長しないことを確認した。
実施例１
ラット208F線維芽細胞でのN2ウィルスの成長
MoMLVの長末端反復（LTRs）の間に挿入されたNeo遺伝子を含むアンホトロピックN2ウィルスは、産生細胞株PA317/N2から調製され、BHK細胞及びMoMLVレトロウィルス感染に感受性をもつ細胞株であるラット208F線維芽細胞において力価評価された（titered）。ラット208F細胞のそれと比べて、BHK細胞ではNeo耐性（Neor）コロニー形成単位（CFU）において105倍の減少が観察された。従って、我々が使用したBHK細胞は、アンホトロピックレトロウィルスエンベロープタンパク質を含むN2ウィルスによる感染を維持することができなかった。
最初の研究を完全にすると共に、我々は、異種膜関連タンパク質を含むエンベロープ保有ベクター粒子を作成した。そのような作成の例として、VSV Gタンパク質をコードするMLV由来レトロウィルスベクターを用いたアンホトロッピックN2MLV〔VSV G〕ベクター粒子の生成を示すために、実施例２が提供される。これらのベクター粒子の宿主域がアンホトロピックMLVと比べて変更しているか否かを決定するために、我々は、BHK細胞においてMLV〔VSV G〕ベクター粒子をアッセイした。
実施例２
MLV〔VSV G〕ベクター粒子の作製
MLV〔VSV G〕ベクター粒子を作成するために、図１（正確なスケールで描かれていない）に説明されるように、我々は、MoMLV由来レトロウィルスベクターを用いた。pLRNLでは、ラウス肉腫ウィルス（RSV）プロモーターから発現されるNeor遺伝子は、MoMLVのLTRsの間に挿入された。MoMLV由来レトロウィルスベクターであるpLRNLは、RSVのプロモーターの制御下にあるNeo耐性（Neo）遺伝子を含む。このベクターはリー（Li）ら、Virology 171:331−341（1989）に記載され、その内容は援用して本明細書の一部としている。ただ１つのBamH I部位は、RSVのプロモーターの直ぐ上流にある。このBamH I部位に、VSV G遺伝子の全コード領域を含む1.7キロ塩基対（kb）のBamH Iフラグメントを挿入し、pLGRNLコンストラクトを得た。このVSV G遺伝子は、ローズ（Rose）ら、Cell 30:753−762（1982）及びローズ（Rose）ら、J.Virol.,39:519−528（1981）に記載されたが、その内容は、援用して本明細書の一部としている。プラスミド、pSAM（これも図１に示されている）は、MoMLVのgag領域、MoMLVとアンホトロッピクウィルス4070Aとのハイブリッドpol領域及び4070Aのenv領域を含むが、このプラスミドは、ミラー（Miller）ら、Science,225:630−632、に記載されており、この内容は援用して本明細書の一部としている。
HRRT欠損208F細胞は、クエード（Quade）,K.Virology,98:461−465（1979）によって記載されたように、６−チオグアニン中での選択によってフィッシャーラットから得られた。この文献の内容は援用して本明細書の一部としている。チミジンキナーゼ（TK）欠損BHK細胞は、リトルフィールド（Littlefield）ら、Nature,211:250−252（1962）に記載されたように、５−ブロモデオキシウリジンを用いた選択によりBHK21細胞から得られた。この内容は援用して本明細書の一部としている。これらBHK細胞及び208F線維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）で添加された高濃度グルコースのダルベッコー修飾イーグル培養液（DME）で成長させた。
感染性ベクター粒子を生成させるため、MoMLVのgagタンパク質、ポリメラーゼ遺伝子及びSV40初期プロモーターのアンホトロピックエンベロープタンパク質を発現しているヘルパーベクターpSAMと共に、pLGRNL又はpLRNLのいずれかがBHK細胞に同時トランスフェクトされた。トランスフェクトされたBHK細胞の上清は、トランスフェクション後48時間で集められ、感受性208F細胞及び耐性BHK細胞に感染させるために使用した。ウィルスの力価を測るため、4mg/mlのポリブレン存在下で、濾過上清によって一晩、細胞を感染させた。感染細胞は400mg/mlのG418を含む培養液中で選択され、感染後およそ14日にコロニーを計測した。この実施例の実験結果は表１に示されている。
0003547129.tif 000002
表１から、VSV Gタンパク質を欠くpLRNL由来ベクター粒子は208F細胞に効率よく感染し得るが、BHK細胞には感染できないことが分かる。反対に、VSV Gタンパク質を有するpLGRNLから得られたベクター粒子は、208F細胞だけでなく、Neorコロニーの出現によって示されるように、BHK細胞にも感染することができる。従って、MLV〔VSV G〕ベクター粒子の宿主域は、アンホトロピックMLVと比べて変化していた。
従って、実施例２のpLGRNLトランスフェクトBHK細胞によって産生されたVSV Gタンパク質は、レトロウィルスベクター粒子の少なくともいくつかに取り込まれ、ハムスター細胞に感染することができるMLV〔VSV G〕ベクター粒子を生成したと考える。pLGRNLによってコードされるVSVタンパク質だけがVSV Gタンパク質であるので、表１に示された実施例２の結果は、また、他のVSVコードタンパク質の参加がなくとも、Ｇタンパク質だけでMLV〔VSV G〕ベクター粒子の形成には十分であることを示している。従って、実施例２は、感染性ベクター粒子が、１種のウィルスのヌクレオキャプシド及び異種膜関連タンパク質を有すようにアッセンブリされ得ることを示している。
上記の発明の背景で述べたように、VSVとレトロウィルスの混合感染は、VSV感染のみで得られるものより、より低いベクター粒子力価をもたらす。この力価の低さは、Ｇタンパク質とレトロウィルスのヌクレオキャプシドとの間の低い特異性によって生じるビリオンへの非効率的取り込みの結果であるというよりはむしろ、VSV Gタンパク質の毒性の結果、レトロウィルスによりコードされるタンパク質も含めて、進行的な細胞タンパク質合成の抑制によるものと我々は考えている。
従って、ヌクレオキャプシドの起源と同じ科のウィルスからの膜関連タンパク質の存在がベクター粒子の形成に必要であるか否かを調べるために、MLVと同じ科を起源とする如何なるエンベロープタンパク質もないMLV〔VSV G〕ベクター粒子を形成する実験を行った。そのような実験例は実施例３に示されている。
実施例３
env遺伝子産物のないMLV〔VSV G〕ベクター粒子の形成
この実験のために、図１に示した更に２種のベクター、pLARNL及びpSVGPを作製した。pLARNLは、pLGRNLの作成と同じ方法でpLRNLから作成させたが、アンホトロピックレトロウィルス4070Aのエンベロープ（env）遺伝子を含む2.7kbのXba Iフラグメントが、pLRNLのBamH I部位に挿入されている。pSVGPは、pSAMのSV40初期プロモーター並びにgag及びpol領域を含む5.8kbのHind III−Sca Iフラグメントを、哺乳類発現ベクターpcDに挿入することによって構築した。これはオカヤマ（okayama）ら、Mol.Cell.Bil.,3:280−289（1983）に記載されており、その内容は援用して本明細書の一部としている。図１の"PolyA"は、SV40由来のポリアデニル化シグナルを示している。
この実施例では、pSVGPと共に、pLRNL、PLARNL又はpLGRNLをBHK細胞に同時トランスフェクトした。ベクター粒子を生成するために、10μｇのpSVGPとともに10μｇのベクターDNAを、リン酸カルシウム沈殿法（グラハム（Graham）ら、Virology 52:456−457、これは援用して本明細書の一部としている）を用いて、細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後36時間で培養液は集められ、0.45mmのフィルターで濾過された。
pSVGPコンストラクトは、SV40初期プロモーターから発現されるgag及びpol遺伝子を含むが、MoMLVのenv遺伝子は含まれていない。Neorマーカーを発現しているベクター粒子（pLARNL又はpLGRNL）は、上記のように208F及びBHK細胞において別々に力価を調べられた。得られた力価は表２に示されている。
0003547129.tif 000003
表２の結果から、MoMLVのenv遺伝子がpLRNL及びpSVGPには存在しないので、感染性ベクター粒子は、両プラスミドの同時トランスフェクト細胞からは検出されなかったことが理解され得る。アンホトロピックMLVのenv遺伝子を含むpLARNLとpSVGPとで同時トランスフェクトした208F細胞は、Neor力価200−300CFU/mlを産生するが、この調製物は、BHK細胞に感染することはできなかった。しかし、208F及びBHK細胞は共に、pSVGPと同時トランスフェクトされた、VSV G遺伝子を含むpLGRNL由来ベクター粒子により同様の効率で感染した。LGRNLベクター粒子が、MoMLVのenvタンパク質が全く存在しない中で生成されたので、表２に示された実施例３の結果により、異種膜関連タンパク質が、ヌクレオキャプシドの起源と同じ科から得られたいずれかのエンベロープタンパク質の関与なしに、ベクター粒子はアッセンブリされるという結論が得られる。Ｇタンパク質はまた、この実施例で用いられる唯一のVSVコードタンパク質であるので、このことは、Ｇタンパク質以外のVSV遺伝子産物が、MLV〔VSV G〕ベクター粒子の形成には必要でないということを確認するものである。従って、我々は、ベクター粒子中への外来膜関連タンパク質の導入に、更に別の遺伝子産物は一般に必要ではないと考える。
我々は、一過性的に生成されたLGRNL及びLARNLベクター粒子が208F細胞においてアッセイされたとき、同様のNeo耐性力価を得た。レトロウィルスのenv遺伝子及びVSV G遺伝子の発現が、共にこれらコンストラクトにおいて同じMoMLVのLTRによって調節されているので、トランスフェクトBHK細胞で一過性に産生されるタンパク質量は同じであると考えられる。しかし、２種のタンパク質の安定性は異なるかもしれないという可能性は排除することはできない。いずれの場合にも、これら及び同様なコンストラクトを用いて他の膜関連タンパク質は同様に発現され得ると考えている。
従って、ヌクレオキャプシドとこの異種膜関連タンパク質との間の相互作用は、異種膜関連タンパク質とのそれよりも少なくとも同等か、又はより効率的であり得ると、我々は考えている。MLV〔VSV G〕ベクター粒子の場合、MLV由来のヌクレオキャプシドと膜関連タンパク質とをもつベクター粒子の場合よりも低い力価で、MLV〔VSV G〕ベクター粒子によるはるかに高い効率の208F細胞の感染を、我々は観察した。例えばMLVのようなマウスレトロウィルスに対するレセプターは、細胞表面タンパク質であることが示され、一方、膜リン脂質がVSVのレセプターであるといういくつかの証拠があり、おそらく、これはVSVの宿主域の広さの説明となる。従って、我々が観察したMLV〔VSV G〕ベクター粒子のNeor力価は、env含有MoMLVベクター粒子によるものよりも、MLV〔VSV G〕ベクター粒子による感染に対する細胞性の感受性が増加したことを反映するものと考える。
例えばMLV〔VSV G〕のようなベクター粒子による感染の特異性が、膜関連タンパク質によって決定されるか否かを確認するために、ベクター粒子は、膜関連タンパク質に対して特異性を有する中和抗体で処理され得る。特異性が膜関連タンパク質によって決定されるならば、そのような中和抗体は、中和された粒子による感染を阻止するであろう。従って、異種膜関連タンパク質を有するベクター粒子が、膜関連タンパク質によって決定される感染特異性を提供したか否かを決定するために、我々は実施例４の実験を実施した。実施例４では、抗−VSV血清を、MLV〔VSV G〕ベクター粒子の感染性を中和するために用いた。
実施例４
MLV〔VSV G〕ベクター粒子の中和
pSVGPとpLARNL又はpLGRNLとの同時トランスフェクトにより一過性的に生成されたベクター粒子は、正常ウサギ血清又は種々の稀釈（1:500、1:100及び1:20）のウサギ抗VSV血清（Lee Biomolecular Research Laboratories,Inc.から購入）のいずれかと共に、37℃45分培養した。pSVGPとpLARNL又はpLGRNLとをBHK細胞に同時トランスフェクトした後48時間で上清は採集しされた。上記のように、208F細胞及びBHK細胞においてNeorコロニーの形成についてアッセイすることにより、ベクター粒子は定量された。結果は表３に示されている。
0003547129.tif 000004
表３に示した結果から、1:100稀釈における抗VSV血清は、両細胞型においてLGRNLベクター粒子の感染性を顕著に減少させ、一方、208F細胞におけるLARNLの力価は、VSV抗血清に曝しても影響されなかったことが理解され得る。この観察は、さらに、VSV Gタンパク質がLGRNLのベクター粒子へアッセンブリされるという、我々の説を指示する。
表２に詳述した実施例３の結果が示すように、pSVGPとpLGRNL又はpLARNLとを同時トランスフェクトすることによって一過性的に生成されるベクター粒子が、208F細胞において同種のNeor力価を得たので、ベクター粒子へのVSV Gタンパク質の取り込みは効率的であった。次に我々は、例えばVSV Gタンパク質のような膜関連タンパク質の粒子エンベロープへの取り込み過程が、本来の粒子エンベロープタンパク質の存在下で等しく効率的であるか否かを調べた。これは、pSAMと共にpLGRNLをBHK細胞に同時トランスフェクトすること及び、抗−VSV抗体による補体仲介細胞溶解による純粋なベクター粒子と表現型混合粒子との割合を分析することによって行われた。これらの実験は実施例５に示されている。
実施例５
MLV〔VSV G〕ベクター粒子の補体仲介細胞溶解
種々の量の特異抗血清、補体又は等容量の正常血清を含む最終容量200μm1のDME−10％FCS中のベクター粒子を含む細胞上清を、37℃45分で加熱した。続いてこの混合物は、４μg/mlのポリブレンの存在下の培養液に加えた。上記のように、感染細胞はG418含有培地で選別された。pSAMとpLARNL又はpLGRNLとのBHK細胞への同時トランスフェクト後48時間で、ウィルス上清が採集された。上清を、10μｌのウサギ血清又は1:20稀釈の10μｌ抗VSV血清によって、10μｌの補体の存在下又は非存在下で処理された。すべての反応は最終容量200μｌで行われ、37℃45分で加熱された。結果は表４に示されている。
0003547129.tif 000005
表４から、いずれの処理も行わなければ、一過性に生成されたLGRNLベクター粒子は、208F細胞において380CFU/ml、BHK細胞において260CFU/mlのNeor力価を示したことが理解され得る。同じベクター粒子調製物への正常ウサギ血清の添加は力価に影響を与えなかった。反対に、ベクター粒子が1:20稀釈の抗VSV抗体によって前処理されたとき、力価は、208F細胞において270CFU/mlに、BHK細胞においてバックグラウンドレベルまで低下した。この結果は、この調製物にVSV Gタンパク質のみを含むLGRNLベクター粒子の力価が、208F細胞において約110CFU/mlであることを示している。この調製物において、レトロウィルスエンベロープタンパク質のみを含むベクター粒子のフラクション、及びレトロウィルスエンベロープタンパク質のVSV Gタンパク質との両方を含むベクター粒子のフラクションを決定するために、ウサギ補体及び抗VSV抗体の組み合わせによって、このベクター粒子調製物を処理した。
補体仲介細胞溶解の潜在的影響は、MLV〔VSV G〕ベクター粒子を効率よく排除するために、他の者によって以前に示された。ベクター粒子調製物へのウサギ補体のみの添加は、おそらくウサギ補体との培養液中のウシ胎児血清の非特異的反応のため、Neor力価を、208F細胞において320CFU/mlまで、BHK細胞において230CFU/mlまで僅かに減少させた（表４参照）。ウサギ補体と共に1:20稀釈の抗VSV抗体によって前処理されたベクター粒子は、208F細胞において90CFU/mlのNeor力価を示した。従って、Neorベクター粒子の非中和集団は、レトロウィルスエンベロープタンパク質のみを含んでいると我々は考えている。この説明は、表４に示した結果と一致する。ここでは、レトロウィルスエンベロープタンパク質のみを含むLARNLベクター粒子の同様な処理は、208F細胞において測定した場合、そのNeor力価には殆ど影響しない。従って、VSV Gタンパク質及び他の膜関連タンパク質は、本来のエンベロープタンパク質が存在していても、ベクター粒子内に効率よく取り込まれ得ることはありそうなことである。
レトロウィルスDNAは、プロウィルス配列と呼ばれる配列のウィルスゲノムの直線状構造を維持する態様で、宿主染色体に組み込まれる（インテグレート）。異種膜関連タンパク質を有するエンベロープ保有ベクター粒子による感染から得られる細胞クローンが、ベクター粒子の核酸の直線状構造を維持するプロウィルス配列を含んでいるということを確定するために、我々は、LGRNL感染クローンのサザンブロット分析を実施した。これらの実験は実施例６に示されている。
実施例６
LGRNL感染細胞のサザンブロット分析
本明細書に援用して一部としているマニアティスら、"Molecular Cloning,A Laboratory Manual"、コールドスプリングハーバー研究室、コールドスプリングハーバー、NY（1982））に記載されたようにゲノムDNAを調製した。DNA試料は適切な制限酵素で消化され、0.8％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に移した。ランダムデオキシヘキサヌクレオチド（アマシャム社製）によるプライミングによって調製された、完全なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む32P−標識化DNAプローブが、このフィルターとのハイブリダイゼーションプローブとして用いられた。フィルターは0.1×SSC−0.5％SDSで53℃で数回洗浄され、オートラジオグラフィーに施された。
ゲノムDNAは、LGRNLベクター粒子で感染された２つの異なるNeorクローン（レーンＢ及びＣ）及び２つの異なるNeorBHKクローン（レーンＤ及びＥ）から単離された。DNA（10μｇ）をSst Iで切断し、１％アガロースゲルに流し、ナイロンタイプのフィルターに移し、Neo遺伝子特異性プローブで調べた。Sst Iで消化された5ngのpLGRNLプラスミドDNAは、マーカーとしてレーンＡに流された。得られたサザンブロットは図２に示されている。
Sst Iは、LGRNLの各LTRで１箇所のみ切断し、従って、5kbフラグメントを生じることが予想される（図１参照）。図２のレーンＢからＥにおいて理解されるように、２つのBHKクローン及び２つの208Fクローンからの染色体DNAがSst Iで切断され、Neo遺伝子を含むプローブに対してハイブリダイズした場合に、約5kbのフラグメントが検出された。このフラグメントのサイズは、レーンＡにおいて分かるように、Sst I開裂pLGRNLプラスミドDNAのそれと同一であった。従って、実施例６の結果は、LGRNLのプロウィルスDNAは、感染細胞において中断されず、更に再編成されない構成を有するらしいことを示している。この結果は野性型レトロウィルス感染で見られるものと同一である。従って、我々は、他の組み換えベクター粒子も同様に中断されていない非再編成のプロウィルスDNA配列を形成するであろうと考えている。
そのような組み換えベクター粒子が、そのエンベロープ中に存在する膜関連タンパク質の宿主域を獲得するということを説明するために、我々は、種々の細胞株をpLGRNL及びpLARNL由来ベクター粒子で感染させた。これらの研究は実施例７に示されている。
実施例７
MLV〔VSV G〕の宿主域の決定
HeLa細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。LNSV細胞は、SV40形質転換HPRT欠損レッシューナイハン（Lesch−Nyhan）細胞から得た（ジョリー（Jolly）ら、Mol.Cell.Biol.,6:1141−1147（1986）、その内容は援用して本明細書の一部とする）。ラット208F及びBHK細胞は先に記載した。BHK細胞にpLARNL又はpLGRNLとpSVGVとを同時トランスフェクトした後、48時間で上清は採集された。続いて等容量の各上清が４種の異なる細胞型に適用され、G418選択後２週間でNeor力価が測定された。この実験は３回繰り返され、そのような実験のうち１つの結果が表５に示されている。
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上記のように、この研究で用いられたLARNLのレトロウィルスenv遺伝子はアンホトロピックウィルス4070Aのenv領域に由来する。この遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質は、ヒト細胞を含む広範囲の哺乳類種からの細胞上に存在する細胞表面レセプターに結合することができる。しかし、いくつかのヒト株は、ネズミ細胞に比べ、アンホトロピックウィルス感染に対して比較的抵抗性があった。表５に示したように、例えばHeLa細胞又はLNSV線維芽細胞のようなヒト細胞株におけるLARNLのNeor力価は、ラット208F細胞のそれに比べ、およそ20倍低い。また表５に示したように、LGRNLベクター粒子は、LARNLベクター粒子よりもわずかに高い効率でHeLa細胞に感染したが、それらは、LNSV線維芽細胞にLARNLベクター粒子よりもかなり高い効率で感染した。
LNSV細胞におけるpLGRNL由来MLV〔VSV G〕ベクター粒子の優れた感染性のため、我々は、レトロウィルスによるLNSV細胞の感染に対する主な障害は、レトロウィルスエンベロープタンパク質との細胞表面レセプターの非効率的な相互作用のためと考えている。細胞表面レセプターと相互作用することが知られている膜関連タンパク質のレトロウィルス内封入は、この障害を克服するように思える。従って、我々は、異種膜関連タンパク質をベクター粒子のエンベロープ内に封入させることによって、このエンベロープを有するベクター粒子の宿主範囲を変更させる一般的方法を見出したと考えている。
LGRNLのMLV〔VSV G〕ベクター粒子によるHeLa細胞の感染で認められた比較的低い効率は、HeLa細胞表面レセプターとの貧弱な相互作用によるものとは、我々は考えていない。むしろ、VSVがHeLa細胞に効率よく感染するので、上記で観察された低い効率は、おそらく侵入後の現象によるものと考えている。
現在、レトロウィルスベクターは、新規な遺伝情報を哺乳類細胞に導入する最も有効な方法を提供する。アンホトロピックエンベロープタンパク質を含むベクター粒子が、ヒト細胞に感染させることができるので、もしかするとそれらは、ヒトの遺伝疾患の治療において有用な手段となるかもしれない。しかし、表５に示したように、いくつかのヒト細胞は、アンホトロピックレトロウィルス感染に対して比較的抵抗性であり得る。ヒト細胞において、アンホトロピックレトロウィルスレセプターの比較的少ない存在、細胞質における不十分な逆転写、又は組み込まれていないウィルスDNAの加速された分解は、いずれも、レトロウィルスベクターによるヒト細胞の非効率的感染の理由となり得る。
我々の発見は、同じ科のウィルスに由来する膜関連タンパク質によって提供される制限された宿主域を越えて、ヒト及び他の細胞のレトロウィルス感染の効率を増加させる方法を提供する。この発見は、レトロウィルスへ膜関連タンパク質を取り込ませることが、レトロウィルスベクターの宿主域を変更することによって、従って、これらの細胞により効率のよい外来遺伝の移転を促進することによって、感染に対する潜在的障害の少なくともいくつかを克服できるということである。このシステムは、感染単位を作成するためにヘルパーウィルスを用いる。この単位は、宿主ゲノムに組み込みを許容するレトロウィルスのエレメント、外来遺伝子の発現を制御する調節エレメント、選択細胞マーカー及び／又は他の外来遺伝子を含む。この単位は与えられた細胞を標的とするように設計されている。感染性の広さは、ある範囲の細胞型を結合できる生成されたタンパク質の能力によって決定される。これらの遺伝子成分は、当業者に既知の方法によって生じたベクターへ導入され得る。
他のウィルスもこのシステムに用いることができると思われる。他のレトロウィルスの長末端反復は、RSV、HIV、ニワトリ白血病ウィルス及び他のマウス白血病ウィルスから成る群から用いることができるが、これらに制限されることはない。キャプシドタンパク質もまたこれらのウィルス又は他のウィルスから得ることができる。
本発明者らは、そのモデルにおいて、ネオマイシン耐性の発現を制御するためにRSVプロモーターを用いた。他のマーカーには、ハイグロマイシン耐性及びジヒドロ葉酸還元酵素（メトトレキサート耐性）が含まれる。同様に、他のプロモーターも使用できるであろうが、これらには、サイトメガロウィルスの極初期のプロモーター、SV40が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。プロモーターを、所望するならば、強力に発現を行うため又は比較的弱い発現を起こさせるために選ぶことができるであろう。
更に、下記に詳細に述べるように、標的細胞集団内での発現のためには外来遺伝子がベクターに加えられ得る。与えられた組織に特異性を有するプロモーターもまた、与えられた細胞型に対してそのような外来遺伝子の発現を制限するために用いられ得る。例えば、膵エラスターゼプロモーターは、膵の組織での発現に特異的である。また別の例は、肝に特異的な態様で遺伝子発現を制御する、ヒトＢ型肝炎のコアー遺伝子の内部プロモーターであろう。他の組織特異的プロモーターは、脳及び他の組織において存在する。
VSV Gタンパク質の例で述べたように本発明に従って用いるとき、変更宿主域を提供する有望な候補であるVSV Gタンパク質以外の膜関連タンパク質は、宿主レセプターに結合し、感染を促進する他のエンベロープを有するウィルスからのその様なタンパク質を含む。我々の発見は、どのような膜関連タンパク質の選択的除去及び、変更された範囲の細胞を標的とする核酸デリバリシステムを作るためのこのタンパク質の使用を可能にする。１例として、HSV（単純疱疹ウィルス）のgD遺伝子は、ヒト組織の神経節を含む宿主域を得るために用いられ得るであろう。当業者にとって、そのような多数のウィルス性及び非ウィルス性の例は容易に知りえるであろう。
非ウィルス性膜関連タンパク質もまた、ベクター粒子の宿主域を変更するために用いられ得るであろう。我々は、与えられた細胞レセプター又は細胞表面部分とのリガンドとして相互作用するタンパク質が、ベクター粒子における、与えられた細胞レセプター又は細胞表面部分を有する細胞の宿主域への標的化のための候補であると考えている。適切なタンパク質は、ベクター粒子のための宿主域を同定するために役立つ結合領域を含むであろう。問題となっているタンパク質に対するレセプターの偏在性に依存して、ウィルスベクターを、広範囲のヒト細胞、細胞のサブセット又は単一細胞型を標的とすることができる。従って、例えば、潜在的には全てのヒト細胞を標的とすることも、全白血球又はＴヘルパー細胞のみを標的とすることもできる。
本発明の１具体例では、そのようなタンパク質は特定の細胞型に感染することが知られているウィルスから得られる。しかし、本発明は、ウィルス由来タンパク質の使用に限られるものではない。このシステムでは、いずれのリガンド／レセプター対も開発可能であろうと思われる。実施可能なシステムのために必要なことは、治療のためのリガンド／レセプター対を決定することであり、少なくともリガンドと相互作用し得る細胞の型の広さを理解することである。このシステムの有用性は、リガンドに対するリセプターの利用可能性及びそのリガンドに対する与えられたレセプターの親和性に依存するであろう。従って、例えば、HIV感染細胞表面のHIVgp120と相互作用することが知られているCD4は、これらの細胞に外来遺伝子を運ぶための組み換えベクター粒子として使用される候補である。
実施例８は、HIV感染細胞を標的とするベクターの調製を説明するために提供される。Ｔヘルパー細胞膜関連表面抗原であるCD4は、主要なHIV細胞表面レセプターであることが知られている。CD4抗原は、HIV産生タンパク質であるgp120とのリガンド／レセプター相互作用を有する。従って、それらのウィルスエンベロープに関連するCD4を有するベクター粒子は、HIV感染細胞を標的とするであろう。
実施例８
標的化HIV用ベクター粒子
CD4をコードする配列をＴ細胞株からまず得る。簡単にいえば、細胞を培養して成長させ、溶解させる。全RNAは、塩化セシウム濃度勾配を用いて、これらの細胞から精製される。全RNAは洗浄され沈澱され、リバーストランスクリプターゼ及びオリゴdTプライマーを用いて、それらからcDNAが合成される。得られたcDNA/RNAハイブリッドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のための鋳型として用いられる。PCRには、CD4配列の5'及び3'末端に共に相補的であり、BamH I制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする尾部を含む、CD4のための適切なプライマーペアーを用いる。PCR産物はアガロースゲルに流され、予想されるサイズ（約1.2kb）のフラグメントがゲルから切り出され溶出される。溶出DNAはBamH Iで消化され、このCD4コード配列の5'末端にプロモーターが付加される。得られた配列はpLRNLのBamH I部位にクローニングされる。
従って、実施例８は、天然に生じる膜関連タンパク質によって決定される宿主域を有するベクター粒子の作成を示す。ウィルスエンベロープ内に含まれるべきリガンドが天然に生じる膜関連タンパク質でないとき、膜内にリガンドを会合させることが必要である。これを達成させるために、リガンドをコードする遺伝子は、膜関連ドメインをコードする配列と組み合わされ得る。”天然に生じる膜関連タンパク質”とは、例えば細胞膜又はウィルスエンベロープと関連して見出されるような、天然の状態で脂質膜と関連して生体内に存在するタンパク質を指す。
本発明の好ましい形では、これは、VSV Gタンパク質に対する膜結合ドメインのリガンド近傍をコードする遺伝子、又は与えられたキャプシドタンパク質の安定なアッセンブリが行われる他のウィルス由来エンベロープタンパク質をコードする遺伝子の組み換え体を得ることによって達成される。従って、タンパク質、例えば筋肉及び脂肪細胞上のレセプターと相互作用することが知られているインシュリンは、膜関連ドメインをコードするVSV G配列、又は安定なベクター粒子を形成する他の膜関連タンパク質の膜関連配列と共に、インシュリン遺伝子を含むことによって、適切なインシュリンレセプターをもつ細胞の感染性を得るためのビヒクルを提供するかもしれない。
上記に述べたように、我々は、エンベロープを有するベクター粒子による細胞感染の主要な障害は、細胞表面レセプターとウィルスエンベロープとの非効率的な相互作用によると考えている。従って、これらタンパク質の外部ドメインは、機能的なベクター粒子を作製するために膜又は内部ドメインに連結させられ得る。リガンド／レセプター相互作用は、タンパク質／ヌクレオキャプシド間の相互作用を伴うようには思えない。
セムリキ森林ウィルスのヌクレオキャプシドは、ウィルスE2スパイク糖タンパク質の細胞質尾部に対する特異的レセプターを含むが、このメカニズムは、他のエンベロープを有するウィルスに、必ずしも直接応用できるものではない。従って、SFV及び他のアルファウィルスについては、E2スパイク糖タンパク質又は同様なタンパク質は、効率的な感染に必要であるらしい。従って、SFV又は他のアルファウィルス由来ベクター粒子が本発明の範囲内で用いられる場合は、ヌクレオキャプシドとの効果的な相互作用において重要なE2スパイク糖タンパク質のそのような部分を含むことが必要である。
レトロウィルス、例えばラウス肉腫ウィルスは、細胞質尾部を欠くエンベロープタンパク質の変異型を用いて、ベクター粒子を生成することができる。従って、我々は、レトロウィルスのエンベロープタンパク質とそのヌクレオキャプシドとの相互作用が、発芽ウィルス粒子のエンベロープ中への糖タンパク質の取り込みを仲介するために必要であるなら、そのような相互作用は、脂質二重層内又はその近くで起こるであろうと考える。おそらく、この相互作用は、エンベロープタンパク質の疎水性膜関連ドメイン内で起こるであろう。従って、我々は、多くのシステムについて、膜関連タンパク質のいずれかの部分ベクター粒子アッセンブリに重要であるならば、この部分は、膜関連ドメイン内又はそのドメインの近くで生じるであろうと考えている。
従って、パッケージングを指示する能力のあるタンパク質（それが膜関連性であろうとなかろうと、例えばVSV Gタンパク質及び他のリガンドの少なくともレセプター結合部分）からの膜関連ドメインとの組み換えタンパク質の形成は、ベクター粒子の所望細胞型への標的化を可能にするであろうと、我々は考えている。
従って、本発明の具体例の１つとして、カセットタイプシステムが提供されるが、ここでは、VSV Gタンパク質又は他の膜関連タンパク質からの膜関連ドメインをコードする遺伝子部分が、カセットベクターの定常部分として残存する。この定常領域へ、所望のリガンドの部分が挿入される。これら２つのドメインは、組み換えタンパク質を形成し、これは、単数又は複数の所望の細胞型に対して効果的な的中能力をもつ構造的に無傷のベクター粒子を提供するために、ヌクレオキャプシドと相互作用する。このカセットへリガンドを挿入する場合、完全な長さの、２つの機能を有する組み換えタンパク質キメラを得るために、翻訳のための読み取り枠を維持することが重要である。”タンパク質キメラ”とは、２以上のタンパク質からの核酸配列領域を遺伝子連結することによって、組み換え的により生成された産物を表すために用いられる。即に、コード産物（一続きのタンパク質であるが）が、これらのタンパク質のアミノ酸配列を複製するドメインを含んでいる。結果として、十分なリガンドレセプター相互作用が残っている限り、完全な長さのエンベロープタンパク質又は非膜結合性タンパク質を用いる必要はない。
従って、本発明は、第一のウィルスの機能的配列と該核酸を含むベクター粒子の宿主域を決定するリガンドをコードする配列とを有する核酸を提供する。”機能的”とは、典型的な野性型成長又はそのウィルスによる感染に係わる一切の配列を意味する。典型的な野性型複製又は感染に関連する配列以外の配列も、ここで提供される機能的核酸に含まれ得る。
この核酸は、それ自体でベクター粒子の生成を誘導することができるか、又は、pSVGPと共にLGRNLを使用することに関連して上記で述べたように、ヘルパーウィルスとの同時トランスフェクションを必要とし得る。これらの核酸配列の使用により、遺伝子デリバリにおいて、与えられた細胞に与えられた粒子を的中させるために、ハイブリッド組み換えタンパク質として、あるいは完全な長さの発現産物として、これらの宿主変更膜関連タンパク質を含むベクター粒子はアッセンブリされ得る。
例えばMoMLVのような典型的なレトロウィルスからのエンベロープタンパク質は、３つのドメインを含んでいる：外部レセプター結合ドメイン、膜関連ドメイン及び内部（細胞質）ドメインである。従って、細胞質ドメインは効率のよい粒子パッケージングのためにヌクレオキャプシドタンパク質と相互作用することが要求されると考えられた。実施例９は、レトロウィルスエンベロープタンパク質ドメインが、レトロウィルス由来ヌクレオキャプシドをもつベクター粒子の効果的パッケージングにおいて全く必要ではないということを確証する実験結果を示している。実施例９の実験では、種々のレトロウィルスドメインをもつ組み換えキメラタンパク質が構築され、得られたベクター粒子のパッケージング効率は、該コンストラクトのCOS細胞にVSV免疫反応性を導入する能力によって調べた。
実施例９
レトロウィルス/VSV Gキメラ膜関連タンパク質をもつベクター粒子のパッケージング効率
２種のキメラ膜関連タンパク質遺伝子コンストラクトが調製された。M2コンストラクトは、MLVエンベロープタンパク質の膜関連ドメイン及び細胞質ドメインに融合されたVSV G外部レセプター結合ドメインを含んでいた。M9コンストラクトは、MLVエンベロープタンパク質の細胞質ドメインをコードする配列に融合された、VSV Gタンパク質の外部レセプター結合ドメインと膜関連ドメインを含んでいた。
M2及びM9コンストラクトは、２種の発現ベクターの各々に導入された。第一のベクター即ちpSVLはSV40後期プロモーター及び後期タンパク質ポリアデニル化シグナルを含んでいた。第二のベクター即ちpFR400は、SV40初期プロモーター及びHBVポリアデニル化シグナルを含んでいた。従って、４つの発現コンストラクトが作製された:pSVLM2、pSVLM9、pFR4M2及びpFR4M9である。これらの発現ベクターは、COS細胞に導入された。完全な長さのVSV G膜関連タンパク質を含むプラスミド（pJM）及び完全な長さのMLVエンベロープタンパク質を含むプラスミド（pSVLENV）もまた導入された。ウサギ抗VSV Gタンパク質を用いた間接免疫蛍光アッセイが、これらの細胞内のVSV Gタンパク質の免疫反応性の生成の分析に使用された。表６はこれらの実験結果を示す。
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pJMの完全な長さのVSV Gタンパク質を、細胞内及び細胞表面上の両方で見ることができた。ハイブリッドM9タンパク質は、周辺領域においてのみ見ることができた。蛍光色素活性化セルソーティング（FACS）によって、これらの細胞のわずか10％がその細胞表面にハイブリッドM9タンパク質を発現していることが分かった。ハイブリッドタンパク質の分子量は、ウサギ抗VSV Gを用いて免疫沈降反応によって確認された。移動度は、このヌクレオチド配列から予想されたタンパク質サイズと一致した。
実施例９の実験結果は、最も効率のよいパッケージングは、完全な長さのVSV Gタンパク質から得られ、MLV細胞質ドメインとのハイブリッドタンパク質はいずれも、細胞表面でより低い効率で発現されることを示した。上記で検討したように、この発見は、レトロウィルス細胞質ドメインが、レトロウィルス由来ヌクレオキャプシドをもつベクター粒子の効率のよいベクター粒子パッケージングに必要であると専ら信じられてきたので、予想されないことであった。従って、実施例９は、特定のウィルスに由来するヌクレオキャプシドをもつエンベロープ保有ベクター粒子は、異種膜関連タンパク質と効率よくパッケージングが行われるという、我々の驚くべき発見を確認するものである。
実施例９はまた、VSV Gタンパク質の細胞質ドメイン及び膜ドメインは、細胞表面にタンパク質を指向することに有効であることを示している。従って、ハイブリッドタンパク質は、実施例９の態様と同様な態様で作製でき、ここで、VSV Gタンパク質の細胞質ドメイン及び膜ドメインは、ベクター粒子標的化のためのカセットを作製するために組み合わせられ、またここで、種々の無関係なタンパク質から得られた外部レセプタードメインがカセットと共に用いられ得ると、考えられている。
上記で述べたように、ベクター粒子形成に係わる膜関連タンパク質の領域は、主に、そのタンパク質の膜関連ドメイン内にあると、我々は考えている。従って、本発明のベクター粒子として有用な組み換えキメラ膜関連タンパク質は、ベクター粒子へ効果的にパッケージングされることが示されている膜関連タンパク質の膜関連ドメインを含む。これらのキメラタンパク質の外部レセプタードメインは、上記で述べたように、宿主域を決定するために、いずれのリガンド／レセプターからも選ばれ得る。実施例10は、組み換えキメラ膜関連タンパク質を有するベクター粒子の生成の１例として提供される。
実施例10
キメラ膜関連タンパク質を有するベクター粒子生成用カセット
ハイブリッド膜関連糖タンパク質は、実施例９で説明したガイドラインに従って構築される。本実施例のモデルとして、VSV G細胞質及び膜ドメインが、エリスロポイエチン（EPO）をコードする遺伝子と遺伝子組み換えされる。この組み換えキメラは、実施例９の発現ベクターpSVLに挿入される。更に、ベクターpLRNL及びベクターpSVGPは産生細胞にトランスフェクトされる。得られた上清は集められ、ベクター粒子はB6SutA細胞を感染させるために用いられる。B6SutA細胞はEPOレセプターを含み、ネオマイシン選択下で、EPOハイブリッドタンパク質及びpLRNLベクター粒子ゲノムを含むベクター粒子を取り込んだ細胞のみが生存する。
実施例10で述べた方法を用いて、所望のレセプター結合ドメインのいずれもが、VSV Gタンパク質の膜関連ドメイン又は他の膜関連ドメインと組み換えられ得るカセットシステムを作製し得る。従って、実施例10は、該カセットに挿入されたレセプター結合ドメインによって決定される宿主域をもつ種々のベクター粒子の迅速な作成方法を提供する。
ここに述べたような非天然膜関連リガンドをもつベクター粒子は、有利的には、膜関連タンパク質のリガンド−レセプター相互作用によって決定される宿主域を有するであろう。例えば、膜関連タンパク質がヒト細胞に感染できるエンベロープ保有ウィルスから得られる場合、該ベクターは、極めて増加された効率でヒト細胞に外来遺伝子を導入することができるであろう。先の実施例で用いられたネオマイシン遺伝子は、RSVプロモーターの制御下においても可能な治療用遺伝子と置き換えることができるであろう。同様に、治療用遺伝子は、ネオマイシン遺伝子に加えて導入してもよい。前述のように、このシステムに用いることができる多くのプロモーター及びマーカー遺伝子がある。治療用遺伝子は、タンパク質をコードする核酸配列の形態、又は固有の調節価をもつ核酸配列の形態を取ることができる。
タンパク質をコードする治療用遺伝子は、免疫機能又は特異的タンパク質若しくはタンパク質セットを不活性化する機能を、改善又は変化させるために、与えられたタンパク質欠損を補充するポリペプチドの形をとることができる。治療用タンパク質は、タンパク質若しくはタンパク質セットを刺激又は抑制する調節活性を有するものであるかもしれない。治療用タンパク質は、また、与えられた細胞の機能を刺激し、又は抑制するものであるかもしれない。換言すれば、治療用遺伝子は、ここで述べられたものに必ずしも限られず、当業者が選択できるある範囲の活性を有するポリペプチドをコードすることができるものであろう。
該核酸は、また、核酸としての活性をもつ生成物をコードすることもできる。例えば、この核酸は、与えられたタンパク質の翻訳を防止するアンチセンス活性を有することができ、また、タンパク質若しくはタンパク質セットの発現を促進若しくは抑制し、又は与えられた細胞機能を促進若しくは抑制するDNA結合能を有するものであってもよい。繰り返せば、選択される配列は、当業者には明白なものであろう。
従って、標的化遺伝子治療にとって、変更宿主域を有するベクター粒子は、本発明の方法を用いて作成され得る。リガンドは、標的細胞型を含む宿主域を提供するために選択されるであろう。従って、ポリペプチドが十分量で、又は十分量の活性形で発現されない遺伝的欠損の治療を提供するために、該リガンドは、正常にそのポリペプチドを産生する細胞型を標的とするように選択されるであろう。このポリペプチドの遺伝子は、また、適切なウィルスプロモーターの制御下に導入されるべきである。
また別に、治療は、例えば望ましくないポリペプチドをコードするmRNAの翻訳に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成を介して、望ましくないポリペプチドの発現を抑制することによって、提供される。実施例11は、HIV感染のための治療用オリゴヌクレオチドを運ぶ標的化ベクター粒子の作成を説明するために提供される。
実施例11
抗HIV治療剤のためのデリバリービヒクル
実施例８からのベクター粒子は、主要なHIVプロテアーゼのmRNAに相補的な領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列と、Neo遺伝子とを置換することによって変更された。得られたベクター粒子は、膜関連タンパク質としてCD4を含み、HIVの複製を制限するためにHIVのmRNAとハイブリダイズするアンチセンスmRNAの転写を指示する。
従って、実施例10はベクター粒子ゲノムが特定の細胞型に対する特定の治療を指示するように改変する手法を示している。本発明が、前駆細胞の標的化を含むことも予想される。例えば、血液細胞に分化する骨髄に、多くの前駆細胞型が見出される。多くの血液細胞が比較的短い生涯を有し、従って、前駆細胞は、死滅細胞と入れ代わるために連続して分裂し分化する。血液細胞に向けられた治療は、前駆細胞を標的にするのであれば、最も有効であろう。これらの細胞は、組織学的な同定が可能であり本発明のベクター粒子の膜関連タンパク質に対する細胞リセプターとして用いられ得る、独特な細胞決定基を有することが知られている。ベクターは、このような前駆細胞型の独特な細胞決定基に結合する膜関連タンパク質をコードしている発現可能遺伝子を含むことによって、遺伝子デリバリにおいてこれらの細胞型を標的とするように構築され得る。本発明のベクター粒子を用いて標的とされ得るこの様な前駆細胞型の例には、多機能幹細胞、赤血球幹細胞、リンパ幹細胞、骨髄間細胞及び巨核芽球が含まれる。
本発明の治療は生体内と試験管内のいずれでも行われることが、更に想像される。生物の試験管内治療においては、細胞は取り出され、試験管内において、ベクター粒子によって感染され得る。適当な宿主域を決定する膜関連タンパク質を有するベクター粒子においては、ウィルスベクターが該当細胞に特異的に感染し得るため、試験管内において標的とされる細胞を精製する必要はない。従って、骨髄試料が検体から取り出され、所望の細胞型がトランスフェクトされ得る。これらのトランスフェクトされた細胞は、それから、その細胞の起源である生物又は、細胞の拒絶が問題にならないと予想される場合では他の生物に戻され得る。標的にされるか検体生物に戻されるかのいずれかとなる細胞の数を増加するために、トランスフェクションの前又は後のいずれかに、この試料は生体内において成長因子により処理され得る。
これらのウィルスベクターの宿主域の変更における更なるゴールのために、膜関連タンパク質を構造的に発現する安定なパッケージング細胞株の開発が、広い宿主域を有し且つヒト及び他の細胞において増加された感染効率を有するレトロウィルスベクターの生成を、もっと更に促進し得ることを我々は発見した。VSV Gエンベロープタンパク質を含んでいるこれらの膜関連タンパク質の多くは、細胞に対して有毒である。前駆体株におけるこの結果は、発現細胞が直ちに死滅するため不変の問題であり、一過性産生以上をつくり出すことに困難が生じている。ある細胞株（例えば、ヒト293、MLVからのgag及びpolタンパク質を作るその誘導体２−３又はハムスターBHK細胞）は、ベクター粒子LGRNLによる形質導入及びneo選択の後に成長するであろうが、この成長は、４週間のみ続き、それから細胞は死滅する。他の細胞型は、更により迅速に死滅する。従って、安定なパッケージング細胞株の開発が強く要請されている。
安定なパッケージング細胞株の産生方法の１つは、エンベロープタンパク質が誘導可能なプロモーターに付されるパッケージングコンストラクトを開発することであり、ここで、エンベロープタンパク質の発現が、存在又は非存在下の粒子成分を通じて、或いは温度のような環境における変化を通じて、オン又はオフされ得る。このような誘導可能プロモーターの１例は、マウス乳腺癌ウィルス（MMTV）プロモーターである。MMTVプロモーターは、十分な量のグルココルチコイドリセプタータンパク質を合成する細胞において、コルチコステロイド及びそれらのアナログにより強く誘導可能である。
例えばMMTVプロモーターのような誘導可能プロモーターによりベクター粒子遺伝子の発現能を有する細胞株は、例えばMMTVプロモーターに対するコルチコステロイドの存在のような適当な誘導条件による誘導なしでは、ベクター粒子を産生しない。従って、ベクター粒子の産生能を有する細胞株は、ベクター粒子の産生なしに、安定して維持され得る。細胞株からの亜集団は、次いで、所望された場合に、該当する条件によってベクター粒子の産生を誘導され得る。誘導可能プロモーターの制御下で、ベクター粒子遺伝子の発現能を有する安定なパッケージング細胞株の産生の例が、実施例12に示されている。
実施例12
誘導可能プロモーターによる安定パッケージング・コンストラクトの産生
コルチコステロイドの存在下でMMTVプロモーターの誘導を十分に提供する量のグルココルチコイドリセプタータンパク質を合成する細胞株を同定するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子のようなマーカー遺伝子の転写を指示するMMTVプロモーターを有しているコンストラクトが産生される。このコンストラクトは、デキサメタゾン処理を伴って又は伴わず、種々の細胞株に導入される。
25:1よりも大きいデキサメタゾン処理細胞の未処理細胞に対するCAT活性の率を示す細胞株を、誘導可能MMTVプロモーターの制御下で、安定なパッケージング細胞株として用いることが好ましい。このような率を示す細胞株は、BHK細胞株である。
MLV〔VSV G〕に対する安定なパッケージング細胞株を作成するために、BHK細胞は、パッケージングコンストラクト、即ちpSVGPによって、永久的にトランスフェクトされ、その後、VSV G遺伝子に及び選択可能マーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子を誘導するRSV  LTRにMMTVプロモーターを連結したコンストラクトで、トランスフェクトされる。ハイグロマイシン耐性細胞は選択され、プロープとして抗MLV 30を用いてウェスタンブロットによってGag及びPolの産生をチェックされる。これらの細胞は、また、サザンブロット解析によってMMTV−VSV G遺伝子の存在をチェックされる。
成長し続ける（そのためVSV−Ｇが非致死レベルとなる）細胞は、LRNLのようなベクターによる一過性トランスフェクションによって試験され、デキサメタゾンによって処理され又は処理されずに、neo耐性コロニー形成単位の率を測定される。最高の性能を有する細胞クローンは、核酸を産生するMLV〔VSV G〕ベクター粒子によって永久にトランスフェクトされる。感染性粒子産生は、デキサメタゾン処理によって、短期間（１−３日）で誘導される。
従って、実施例12は、誘導可能プロモーターの制御下で、安定なパッケージングコンストラクトの産生の一例を示している。MMTVプロモーター又は他の誘導可能プロモーターの制御下で、本発明の様々なベクター粒子を生成するために同様の手法が用いられ得る。
安定なパッケージングコンストラクトの生成の他の例は、膜関連タンパク質の産生を許容できる細胞の開発に関する。ある細胞株、MDCK（ATCC  No.CCL34）は、VSVの毒性効果に耐性であり、VSV Gの長期産生を維持することができると報告されている。他のこの様な細胞株が存在すると信じられている。しかし、このような細胞株によって産生される全てのVSV Gタンパク質が機能的であるわけではない。従って、機能的タンパク質を産生するクローンが選択されなければならない。機能的な膜関連タンパク質を産生する安定なパッケージング細胞株の産生例は、実施例13に示されている。
実施例13
許容細胞株における安定なパッケージングコンストラクトの産生
MDCK細胞は、VSV G膜関連タンパク質の安定な発現に対する許容性及びベクター粒子の産生能について試験された。VSV G許容性はMLV〔VSV G〕ベクター粒子によるMDCK細胞の感染及びG418耐性クローンにおける選択によって試験された。ベクター粒子は、レトロウィルスのgag及びpolタンパク質を安定して発現しているヒト293細胞へのpLGRNLの一過性トランスフェクションによって産生された。これらのトランスフェクト細胞の上清を含むベクター粒子がMCDK細胞の感染に用いられた。これらのベクター粒子は、ベクターゲノムとしてpLGRNLと、膜関連タンパク質としてVSV Gとを含む。
MDCK細胞は、G418における選択の24時間前まで培養された。感染後24時間で、細胞は、400μg/mlのネオマイシンアナログG418によって処理された。選択の約７−10日後、G418に耐性であるコロニーが出現し始めた。コロニーがはっきりと見られることができ、非耐性のコロニーと分離されるときに、それらは集められ追加解析のためにG418の存在下で二次培養された。
上述のポリクローナル細胞株は、pLGRNLベクターゲノムからのVSV Gの発現について試験された。まとめると、細胞は、60−70％のコンフレント状まで成長し、37℃において30分間、ウシ胎児血清を含まないメチオニン非含有培地（Met-DME）中で培養された。培地は、300μＣの35Sメチオニンを含むMet-DME2mlに置換され、更に４時間、培養された。細胞は、氷冷のPBSで洗浄され、1mMの濃度のプロテアーゼインヒビターPMSFを10μｌ含む、1mlのRIPA溶解バッファ（150mM NaCl、１％NP−40、0.5％デオキシコレート、0.19％SDS、50mMトリスpH8.0）が各プレートに添加された。プレートは、15−30分間、氷上で培養され、マイクロフュージ管へ溶解細胞物質を移動した後に、10分間の遠心を行った。上清が取り出され、−70℃で保存され又は、免疫沈降のために直接用いられた。これらの溶解物は、非特異的結合活性をプレクリアするために、非免疫ウサギ血清による第１の処理によって、免疫沈降のために調製された。
免疫沈降は、４℃１晩で、約５μｌのウサギ抗VSV G抗体と共に、１×107カウントのプレクリア溶解物溶液を培養することによって行われた。プロテインＡセファロース（RIPAバッファにおける10％溶液100μｌ）が、次いで添加され、４℃で１−２時間培養された。複合体（conjufates）はRIPAバッファで３回洗浄され、最終沈殿物は、30μｌのラエムリ（Laemmli）試料バッファに再懸濁された。免疫沈降物は、SDS−PAGEにおいて分離され、蛍光間接撮影法によって可視化された。結果は図３に示されている。レーン１及び２は、各々、抗VSV−Ｇ及び正常ウサギ血清によって免疫沈降されたポリクローナル細胞株を示している。レーン３は、抗VSV−Ｇ抗体によって免疫沈降された偽感染（mock infected）MDCK細胞である。およそ68kDのMrに移動したバンドはVSV Gタンパク質に対応しており、またこれらのMDCK細胞は、VSV Gの長期発現を維持していると証明されている。
MDCK/VSV Gポリクローナル細胞株は、また、VSV G含有ベクター粒子の生成能について試験された。これを行うために、細胞は、gag/pol機能を供給するためのpSVGPと、選択可能マーカーであるptkhygroとによって、同時トランスフェクトされた。
ポリカチオンポリブレン（the polycation Polybrene）（アルドリッヒ社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）は、MDCK/VSV G細胞の同時トランスフェクションに用いられた。まとめると、指数関数的に成長している細胞は、トリプシン付与によって採集され、10％FCSを含む10mlの培地中の100mmディッシュ当たり５×105細胞で、移し換えられた。培養物は、10％CO2の雰囲気下、37℃で18−20時間培養された。トランスフェクションDNA（２μｇのptkhygro及び18μｇのpSVGp）は、3mlの血清含有培地で混合され、30μｇのポリブレンを添加された。このトランスフェクション溶液は、培地を取り除いた後の細胞に加えられた。細胞は10時間培養された。DNA培地混合物は、吸引され、2mlのDMSO溶液（DMSO3:培地１）で混合された。細胞は、室温において５分間培養された。培地による３回の洗浄後に、細胞は、完全培地において更に48時間培養された。この時、細胞は、二重耐性細胞の選択を可能にするハイグロマイシン（400μg/ml）及びG418を含む選択培地において培養された。ハイグロマイシン耐性及びG418耐性コロニーは、上述のように集められ、VSV G含有ベクター粒子産生がBHK細胞において力価評価された。
耐性細胞由来のベクター粒子によるBHK細胞の感染は、10mlの培地当たり、約100−200のG418耐性コロニーを収穫した。この結果はMDCKポリクローナル細胞株がVSV−Ｇエンベロープ糖タンパク質とpLGRNLベクターゲノムとを含む機能的ベクター粒子を生成し得ることを示した。
パッケージングコンピテントベクター粒子ゲノムは含まないが、VSV−Ｇ、gag及びpolを安定して発現する安定なパッケージング細胞株は、それから、２ステップトランスフェクション手順において構築された。第１のステップでは、pTKhygro及びpSVG（SV40初期プロモーターの制御下のVSV G）は、MDCK細胞ヘポリブレンを用いて同時トランスフェクトされ、前述のようにハイグロマイシン耐性について選択された。耐性細胞は集められ、VSV Gを同時発現している細胞は、FACSによって単離された。まとめると、サブコンフレント状のプレートはPBSで一度洗浄され、それから、ディッシュから細胞を取り出すために、10mMのEDTAによって37℃で15分間処理された。細胞は、15mlの遠心管に移され、低速遠心によって沈殿させられ、２％FCSを添加したDMEに再懸濁され、再び遠心された。培地は取り除かれ、沈澱物は、0.5mlの1:200稀釈正常ウサギ血清又は1:200稀釈のウサギ抗VSV G抗体に再懸濁された。細胞は、氷上で30分間、抗体と共に培養され、それから5.0mlの２％FCS添加DMEで稀釈され、低速遠心に付された。得られた沈澱物は、5mlの２％FCS添加DMEで更に２回洗浄された。細胞沈澱物は、二次抗体を含む500μｌのPBS溶液に再懸濁され、30分間、氷上で培養された。この培養時間の後、細胞は、上述のように洗浄され、最終沈澱物はペニシリン／ストレプトマイシン及びファンギゾンと共に、0.5mlの２％FCS添加DMEに再懸濁され、セルソーターへ注入された。選択された細胞は集められ、１週間成長し、それからFACSソーティングによって再単離された。これらの２回ソート細胞は、既に述べたように、抗VSV G抗体を用いた免疫沈降によって、VSV G発現について解析された。結果は図４に示されており、ここで、レーン１は抗VSV G抗体によって免疫沈降された２回ソート細胞の抽出液を示し、レーン２、３及び４は、各々図３のレーン３、２及び１に対応している。これらの結果は、pSVGトランスフェクト細胞が実質的なレベルのVSV Gを安定して発現していることを証明している。
安定なパッケージング株を産生する第２にステップは、gag及びpol遺伝子の安定な発現を達成するために、pSVGPとジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を発現するプラスミドとを同時トランスフェクトすることであった。メトトレキサート（MTX）の存在下で成長させた場合に、DHFRは、安定なトランスフェクタントの選択に用いられる。プラスミドは、ポリブレンを用いて既に述べたように同時トランスフェクトされ、５μＭのMTXの存在下で、トランスフェクションの48時間後に移し換えられる。MTX耐性コロニーは、集められ、パッケージングコンピテントベクターゲノムによるこれらの細胞の一過性トランスフェクションによって、ベクター粒子の生成について試験される。上清は48時間で集められ、感染性ベクターの産生が、既に述べたように標的BHK細胞について力価評価される。
従って、実施例13は、VSV Gタンパク質の毒性効果に耐性である細胞株における、機能的VSV Gタンパク質の産生を選択的にスクリーニングすることによる永久VSV Gパッケージング株の産生を示している。当業者にすぐに明白となるように、種々の源からの機能的膜関連タンパク質を産生する細胞株を作成することに類似の方法が用いられ得る。
本発明の特定バリエーションが当業者に対して示唆され得ることは理解されるであろう。前記の詳細な説明は、図面を与えられて、明白に理解されるためのものであり、本発明の精神及び範囲は、添付されたクレームのみで制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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