(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列のうち、少なくとも27番目の塩基を含み、かつ連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片。
【請求項２】
請求項１記載のDNA断片を含むプライマー。
【請求項３】
請求項１記載のDNA断片を含むプライマーを用い、識別対象の米のDNAに対してPCRを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別する方法。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列を有するDNA断片を含むプライマーをさらに用いる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
配列番号３に示す塩基配列のうち連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片を含むプライマー、及び配列番号４に示す塩基配列のうち連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片を含むプライマーをさらに用いる、請求項３又は４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ断片、プライマー及び品種識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
米は胚乳デンプンを構成するアミロースとアミロペクチンの含有割合によって「もち米」と「うるち米」に大別される。「もち米」ではデンプンがアミロペクチンのみで構成されているが、「うるち米」のデンプンは約２０％のアミロースと約８０％のアミロペクチンから構成されており、米の胚乳デンプンに占めるアミロース成分の割合、すなわちアミロース含量は、デンプン粒結合型のアミロース合成酵素をコードする構造遺伝子であるｗｘ座の対立遺伝子によって決定される。ｗｘ座は、胚乳デンプンのもち性及びうるち性を支配し、うるち性遺伝子（Ｗｘ）がもち性遺伝子（ｗｘ）遺伝子に対して優性である。この米のアミロース含量は、炊飯米の食味の良否に影響を与える重要な形質である。
【０００３】
粘りの強い良食味米は、胚乳のアミロース含量を低減させることによって得ることができるので、近年、各種研究機関において、種々の低アミロース米品種が育成され、その作付面積は現在増加傾向にある。低アミロース米品種とは、通常のうるち米品種よりもアミロース含量が低い品種のことであり、具体的には、アミロース含量が０以上〜１５％未満の品種である。低アミロース品種としては、例えば、「コシヒカリ」に受精卵メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）処理を行い、アミロース含量に着目して選抜、育成された品種「ミルキークイーン」、低アミロース系統「７４ＷＸ２Ｎ−１」に「レイメイ」を交配して育成された品種「スノーパール」、低アミロース由来系統「永系８４２７１」に「キタアケ」を交配し、葯培養によって得られた植物体から選抜して育成された品種「彩」、低アミロース系統「探系２０２１」に「ニシホマレ」を交配して育成された「柔小町」、「研系２０７８」に「北陸１２７号」を交配して育成された品種「ソフト１５８」などがある。
【０００４】
これら低アミロース米品種を通常のうるち米品種と識別する方法としては、１）低アミロース米品種の種子胚乳が白濁することに基づいた肉眼による識別法と、２）胚乳のアミロース含量を測定する方法の２つがある。しかしながら、胚乳の白濁度及びアミロース含量は、産地、生産年、栽培法及び収穫物の乾燥方法等によって変動するため、前記した２方法で低アミロース米品種と通常のうるち米品種の仕分けを確実に行うのは困難である。
【０００５】
一方、遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法が開発され、特定品種奥羽３４４号（現在の品種名はスノーパール）及び同品種と系譜が同じ品種をＤＮＡ配列に基づいて識別する方法が知られている（特開平１２−２０１６７９号公報）。しかしながら、この方法は、奥羽３４４号を含む同系統における特異的な塩基配列に基づいた品種判別方法であるため、奥羽３４４号及び同系統品種と他品種とを識別することは可能であっても、奥羽３４４号以外の他系統の低アミロース米を識別することはできない。
【０００６】
現在、米の品種等の農産物検査において、各品種に対する確実な検査方法の確立が望まれているが、未だ、低アミロース米品種のうち、ミルキークイーン及び同系統品種を他の低アミロース米及び通常のうるち米品種と識別する方法は報告されていない。このため、ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法を確立するためには、前記の遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法と同様に、ミルキークイーンに特異的な遺伝子を特定し、それに基づいた識別方法を開発する必要がある。しかしながら、ミルキークイーンはコシヒカリにＭＮＵ処理して育成された品種であるため、両者が非常に類似した特性及び遺伝子を有しており、ミルキークイーンとコシヒカリとの遺伝上の差異を明確にしなければ、ミルキークイーン及び同系統品種のみを特異的かつ効率的に他品種と識別することが困難であるため、コシヒカリと同品種の差別化が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ断片、プライマー及び品種識別方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、低アミロース米品種ミルキークイーンが保有するＤＮＡ塩基配列に着目し、ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なＤＮＡ配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片である。
【０００９】
また、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより特異的に増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーである。
【００１０】
さらに、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のＤＮＡに対してＰＣＲを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別する方法である。
【００１１】
【本発明の実施形態】
本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法についてさらに詳細に説明する。
本発明において識別の対象となる低アミロース米品種は、ミルキークイーン及び同系統品種である。本発明における低アミロース米品種ミルキークイーンは、１９９８年５月に第６３８５号として品種登録されている、コシヒカリに受精卵メチルニトロソウレア処理を行い、変異第２代でアミロース含量に着目した個体選抜を行って育成されたアミロース含量が通常のうるち米よりも低い品種である。具体的には、アミロース含量がコシヒカリの３／５程度の約１０％である品種である。ここで、品種とは、重要な形質に係る特性の全部又は一部によって他の植物体の集合と区別することができ、かつ、その特性の全部を保持しつつ繁殖させることができる一の植物体の集合を意味する。
【００１２】
また、同系統品種とは、ミルキークイーンを交配親に用いて育成され得る品種のことを意味する。例えば、ミルキークイーンの食味をそのままに栽培特性を改良した新系統「越南ｄ１９０号」、「上育４３６号」等がある。
一方、うるち米他品種とは、上記のミルキークイーン及び同系統品種以外の品種を意味し、通常のコシヒカリ等のうるち米、並びに、ミルキークイーン及び同系統品種以外の低アミロース米を含む。
【００１３】
品種識別対象となる米のＤＮＡの採取源としては特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できるが、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。遺伝子を調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいずれの方法（例えば、ＣＴＡＢ法）をも利用できる。
本発明の品種識別には、低アミロース米品種ミルキークイーンにおけるアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列と、通常のうるち米のアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列の相違を利用する。
【００１４】
コシヒカリ等の通常のうるち米品種は、ｗｘ座に優性のうるち遺伝子Ｗｘを保有していることが知られている（文献：奥野（１９９５）「米の科学」竹生新治郎編  朝倉書店Ｐ６１−７６）。一方、ミルキークイーンの低アミロース性は、ｗｘ座の劣性遺伝子ｗｘ−１（ｔ）によって支配されていることがわかった。この低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）の全塩基配列は、配列番号５に示すとおりである。ｗｘ−１（ｔ）とＷｘのＤＮＡ配列を比較すると相違する特異的塩基はわずかに２塩基である。第１相違塩基は、Ｗｘの第４エクソン中のコドン１５８部位のＧがミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）ではＡであり、そのアミノ酸はアルギニンがヒスチジンに変化している。また、第２相違ＤＮＡは、Ｗｘの第５エクソン中のコドン１９１部位のＴがｗｘ−１（ｔ）ではＣであり、そのアミノ酸はチロシンがヒスチジンに変化している。
【００１５】
本発明では、前記の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のＤＮＡに対してＰＣＲを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別することができる。
【００１６】
本発明のＰＣＲに用いるプライマーは、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、通常のうるち米品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーであれば任意に設計することができる。具体的には、前記ＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーを用いることができ、１）第１相違塩基のみを含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー、２）第２相違塩基のみを含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー、３）第１相違塩基及び第２相違塩基の両方を含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマー等が含まれる。これらプライマーは、通常の化学合成により得ることができ、その位置は適宜設定可能であるが、相違塩基を含むプライマーが好ましく、そのうち、変異遺伝子の検出感度を増すために、３’末端を識別目的の前記相違塩基となるように設計するのがさらに好ましい。また、そのサイズは２０〜３０ｍｅｒ程度が適当である。なお、これらのプライマーのうち、１）のプライマーは、第１相違塩基部位と第２相違塩基部位が近接しているため、後述する電気泳動を行う際に支障をきたす可能性があり、また、２）のプライマーは、第２相違塩基部位付近のＧＣ含量及びＴｍ値の関係から、３’末端を識別目的にあわせて設計するのが難しいことから、３）のプライマーを利用するのが好適である。なお、３）の第１相違塩基及び第２相違塩基の両方を含むＤＮＡ配列を増幅し得るプライマーとしては次のプライマーセットがある。
【００１７】
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【００１８】
また、プライマーは、上記の低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）に特異的なＤＮＡマーカーを増幅し得るプライマーだけでなく、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）とに共通なＤＮＡ領域を増幅し得るプライマーとを組み合わせて用いることができる。一例として、次のプライマーセットを上記Ｗ１及びＷ２と組みあわせて用いることができる。
【００１９】
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【００２０】
低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むＤＮＡの検出は、基本的に前述のＷ１及びＷ２のプライマーセットのみの使用でも可能であるが、ＰＣＲの機種や反応条件によっては、うるち米他品種においてもＷ１及びＷ２のプライマーセットによる薄いバンドが得られることもあるので、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのｗｘ−１（ｔ）とに共通なＤＮＡ領域を増幅し得るＷ３及びＷ４などのプライマーセットを用いて対照区を設定することによって、ＰＣＲ反応の成否を更に精度よく確認することができる。
【００２１】
ＰＣＲの反応工程は、熱変性：９３〜９５℃で３０〜６０秒、アニーリング：６０〜７０℃で３０〜６０秒、伸長反応：７２℃で６０〜３００秒で行う。好ましくは、熱変性：９４℃で６０秒、アニーリング：６９℃で６０秒、伸長反応：７２℃で１２０秒を１サイクルとし、これを２５〜３５回、好ましくは  ２８〜３０回行う。
【００２２】
次に、このＰＣＲによって得られた反応産物は、電気泳動及び分光光度計によって分析することができるが、このうち、電気泳動が好ましい。電気泳動分析は常法によって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したＤＮＡパターンを分析する。前記Ｗ１及びＷ２のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、電気泳動分析により、ｗｘ−１（ｔ）を保有するミルキークイーン及び同系統品種では７４１ｂｐのバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種ではバンドは出現しない。また、前記Ｗ１〜Ｗ４のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ｗｘ−１（ｔ）を保有するミルキークイーン及び同系統品種では７４１ｂｐと４６９ｂｐの２本のバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種では７４１ｂｐのバンドは出現せず、４６９ｂｐの１本のバンドのみが出現する。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］  ｗｘ−ｌ（ｔ）遺伝子及びＷｘ遺伝子のＤＮＡ配列の決定
ミルキークイーン及び比較品種であるコシヒカリの出穂１４日後の穂からそれぞれＲＮＡを抽出した。抽出にはＱｉａｇｅｎ社のＲｎｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用した。得られたＲＮＡは、タカラ（株）のＨｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲキットを用いた逆転写反応に供し、ｗｘ−１（ｔ）及びＷｘ遺伝子の全長ｃＤＮＡをそれぞれ得た。
【００２４】
逆転写反応に必要な機材には，タカラ（株）のＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰを用いた。次に、得られたｃＤＮＡをそれぞれＮｏｖａｇｅｎ社のプラスミドベクターｐＴ−７  ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、シークエンスプライマーを用いた塩基配列の決定操作を行った。塩基配列の決定にはＡＢＩ社の３７７オートシークエンサーを用いて解析を行った。その結果、塩基配列ｗｘ−１（ｔ）（配列番号５）及び対応するアミノ酸配列（配列番号６）、並びに塩基配列Ｗｘ（配列番号７）及び対応するアミノ酸配列（配列番号８）が得られた。
これらのＤＮＡ配列を比較したところ、両配列の相違はわずか２塩基であることが判明した。すなわち、ｗｘ−１（ｔ）はこの相違部位にＡとＣを保有し、一方、ＷｘはＧとＴを保有することが分かった（図１）。
【００２５】
［実施例２］ｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を利用した品種識別法
（１）プライマー
ＰＣＲを用いた品種識別を行うため、以下の４つのプライマーを設計した。
すなわち、Ｗ１及びＷ２は、ミルキークイーン及び同系統品種が保有するｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的な部位を増幅可能なプライマーであり、ＰＣＲにより７４１ｂｐの増幅産物が得られる。なお、Ｗ１はＷｘ−１（ｔ）に特異的な第１相違塩基「Ａ」を末端に含んでいるプライマーである。
また、Ｗ３及びＷ４は、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種に共通の部位を増幅可能なプライマーであり、ＰＣＲにより４６９ｂｐの増幅産物が得られる。
【００２６】
0003569746.tif 000004
【００２７】
（２）ＰＣＲ
パーキンエルマー社のＡｍｐｌｉｔａｑ  ２．５Ｕ、Ａｍｐｌｉｔａｑ  に付属の１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、５０ｎｇ  ＤＮＡ、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３及びＷ４プライマー各２０ｐｍｏｌを含む最終容量５０μｌの反応液を調製した。ＰＣＲ反応に必要な機材には前記したタカラ（株）のＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰを用い、９４℃で１分間反応後、９４℃で１分間、６９℃で１分間及び７２℃で２分間の一連の反応を２８回行い、最後に７２℃で４分間反応させた。
【００２８】
（３）電気泳動分析
反応液を５μｌ採り、０．８％アガロースゲルにローディングし、１００Ｖで４０分間電気泳動を行った。ＤＮＡ分子量マーカーとしては、φｘ１７４／ＨａｅＩＩＩを用いた。得られた結果を図２に示す。
【００２９】
ミルキークイーンにおいては、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の４つのプライマーの配列が全てｗｘ−１（ｔ）遺伝子の塩基配列に含まれるため、ＰＣＲにより７４１ｂｐと４６９ｂｐの２つのバンドが増幅した。一方、コシヒカリ等の通常のうるち米品種においては、Ｗ１プライマーのみ配列がＷｘ遺伝子の塩基配列と異なり、ＰＣＲにより７４１ｂｐのバンドは増幅せず４６９ｂｐのバンドのみが増幅した。
【００３０】
【発明の効果】
以上のことから、本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種と通常のうるち米品種を識別し得るプライマーを用いてＰＣＲにより増幅したバンドを確認することによって、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種とを識別することが可能である。
【００３１】
【配列表】
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【００３２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】ｗｘ−１（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を検出し得るプライマー、Ｗ１〜Ｗ４の配置図及び品種識別の原理を示す図である。
【図２】ｗｘ−ｌ（ｔ）遺伝子に特異的なＤＮＡ配列を検出し得るプライマーの一例を用いたＰＣＲ反応結果を示す図である。図中、Ｋはコシヒカリ、Ｍはミルキークイーンを示す。また、マーカーはφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩである。
【図１】
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【図２】
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