(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸  α−ｐ−ニトロアニリドを有効成分とするアルツハイマー病診断薬。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン酸  α−ｐ−ニトロアニリドを含有するアルツハイマー病診断薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＬ−グルタミン酸  α−ｐ−ニトロアニリド（以下、「Ｇｌｕ−ｐＮＡ」と略す）を有効成分とするアルツハイマー病診断薬および当該有効成分を含有するアルツハイマー病診断薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
我が国では、近年、人口の高齢化とともに老年期の痴呆症が大きな社会問題となっている。痴呆症のうち多くは脳血管性痴呆とアルツハイマー病が占めている。前者は血圧管理や再発予防などの医学的対処が可能となってきたが、アルツハイマー病では未だに原因、治療法、予防法が明らかでなく、早急な医学的解決が求められている。もし、障害となるような痴呆症状が出現する前にアルツハイマー病を確定診断できれば、現在試みられている治療法をより早期に開始することができ、痴呆の進行を遅らせることが可能であると考えられる。
【０００３】
アルツハイマー病では老人斑アミロイドと神経原線維変化の２つの病理学的変化が知られているが、これらのうち老人斑が最も早期に出現し、アルツハイマー病に特徴的な変化であること、常染色体優性遺伝を示す家族性アルツハイマー病でＡβの前駆体遺伝子（βＡＰＰ）に変異があることなどから、老人斑アミロイドを形成するβ蛋白の過剰な沈着がアルツハイマー病における最も重要な変化と考えられている。
【０００４】
アルツハイマー病の発見のための診断マーカーとして現在までに種々の手法が提唱されている。
【０００５】
（１）脳脊髄液を用いた蓄積蛋白および関連蛋白（Ａｌｚ−５０（Ａ６８蛋白）、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、β蛋白（Ａβ）、分泌型βＡＰＰ、タウ蛋白等）あるいは神経活性物質（アセチルコリン、アセチルコリントランスフェラーゼ活性、アセチルコリンエステラーゼ活性、ソマトスタチン、バゾプレッシン等）の測定
（２）生検による蓄積物質の同定（例えば、皮膚生検によるβ蛋白の沈着の同定、嗅上皮生検による病理変化の同定等）
（３）遺伝子診断（例えば、βＡＰＰ遺伝子の点変異の検索、アポリポプロテインＥ４遺伝子の頻度増加、第１４染色体上のアルツハイマー病原因遺伝子等）
しかしながら、これらのマーカーはいずれもアルツハイマー病の確定診断には不十分であり、現在まで決定的なアルツハイマー病診断のためのマーカーは見いだされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便で大量処理が可能であり、しかも信頼性の高いアルツハイマー病診断薬および診断薬キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
アルツハイマー病発症機構においてβアミロイド蛋白が中心的役割を担うと考えられている。本発明者らは、先に、多くの老化脳やダウン症脳において、アミノ末端が修飾（ピロ化等）を受けたβアミロイド蛋白が初期に脳に蓄積することを報告した。これらは脳内で定常的に分泌されるものとは明らかに異なる。このため、本発明者らは、生体内におけるβアミロイド蛋白の代謝の律速過程の一つをアミノペプチダーゼが担っている可能性があるものと考えた。すなわち、老人斑の著しい人ほど脳脊髄液あるいは血漿中のある種のアミノペプチダーゼ活性が低下していることが予想された。
【０００８】
この発想に基づき鋭意検討を行った結果、本発明者は、健常人に比較してアルツハイマー患者において血漿中のグルタミン酸アミノペプチダーゼの有意な低下を見い出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
本発明は、Ｇｌｕ−ｐＮＡを有効成分とするアルツハイマー病診断薬を提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｇｌｕ−ｐＮＡを含有するアルツハイマー病診断薬キットを提供する。
【００１１】
Ｌ−ロイシン  ｐ−ニトロアニリドを基質とするロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）は肝、胆道系疾患の検査に使用されている。また、Ｇｌｕ−ｐＮＡを分解する生体内のアミノペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼの活性測定法は公知である。しかし、Ｇｌｕ−ｐＮＡを診断薬として用いたアミノペプチダーゼ活性の測定に基づくアルツハイマー病の診断方法はこれまで知られていなかった。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
アミノペプチダーゼ活性の測定
材料
この測定にはアルツハイマー病患者由来の血漿９検体およびコントロール（対照）として健常者由来の血漿１２検体を用いた。
【００１４】
測定の原理
基質であるＬ−アミノアシル−α−ｐ−ニトロアニリドにアミノペプチダーゼを作用させると、ペプチド結合が切断されＬ−アミノ酸とｐ−ニトロアニリンが生じる。この反応におけるｐ−ニトロアニリンの増加量を４１０ｎｍの吸光度から求めた。その増加速度（△Ｅ／分）からアミノペプチダーゼ活性値を求めた。
【００１５】
測定法
１．血漿サンプルならびにブランクとする生理食塩水を１０μＬ（マイクロリットル）エッペンドルフチューブに分注した。
２．反応開始直前に反応緩衝液に基質を加え、反応液を調製した。
３．２の反応液を１のチューブに９０μＬ加え、３０℃でインキュベートした。
４．一定時間後３０％酢酸を２５μＬ加え、反応を停止させた。
５．１０ｍｍ光路長のキュベットを使用し、４１０ｎｍの吸光度を測定した。
６．ブランクの吸光度（ＢＬ１）ならびにサンプル由来の吸光度（ＢＬ２）を差し引き、酵素反応による実質的な吸光度変化を求めた。
７．以下の換算式にて、ＩＵ／Ｌを求めた。
ＩＵ／Ｌ＝△Ｅ／分×Ｖ×１０６／（ε×ｄ×υ）
△Ｅ／分：実質的な吸光度変化／反応時間
Ｖ      ：反応液総量（μＬ）  ＝１２５
ε      ：モル吸光係数  ＝７．１×１０３
ｄ      ：セル光路長（ｃｍ）  ＝１
υ      ：サンプル量（μＬ）  ＝１０
【００１６】
反応緩衝液
最終濃度が下記のものを用いた。
１０ｍＭ  ヘペス緩衝液ｐＨ７．４
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２ｍＭ  ＣａＣｌ２
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
【００１７】
基質
最終濃度が３ｍＭの下記の３種類の基質を用いた。
Ａ）Ｌ−アラニン  ｐ−ニトロアニリド（Ａｌａ−ｐＮＡ）
Ｂ）Ｌ−アルギニン  ｐ−ニトロアニリド（Ａｒｇ−ｐＮＡ）
Ｃ）Ｌ−グルタミン酸  α−ｐ−ニトロアニリド（Ｇｌｕ−ｐＮＡ）
Ａ、Ｃは株式会社ペプチド研究所より、Ｂはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社より，購入した。ＡならびにＢは３００ｍＭのＤＭＳＯ溶液を、Ｃは３０ｍＭの水懸濁液を調製しストック液とした（−２０℃に保存した）。これを反応直前に反応緩衝液に加えた。
【００１８】
反応時間
反応時間は、基質がＡｌａ−ｐＮＡの場合は４５分、基質がＡｒｇ−ｐＮＡおよびＧｌｕ−ｐＮＡの場合には６０分であった。
【００１９】
結果
各基質ごとに測定値をコントロールとアルツハイマー群とに分けてプロットしたものを図１〜図３に示す。グラフ中の（  ）内に各検体の年齢を示した。
【００２０】
図１〜図３から明らかなように、Ｇｌｕ−ｐＮＡを基質にした場合に、コントロール群に比較してアルツハイマー群で有意な酵素活性の低下を認めた。
【００２１】
本発明者らの一人である西道は、Ｎ末端にピログルタミン酸残基を有するβアミロイド蛋白がアルツハイマー病患者の脳内に多く蓄積していることを確認している。Ｎ末端よりグルタミン酸を遊離させるアミノペプチダーゼ（以下、「ＧＡＰ」と略す）の活性低下は、βアミロイドの代謝過程でＮ末端にグルタミン酸残基を有するものを蓄積させ、その後のピロ化反応によりピログルタミン酸残基を有するβアミロイド蛋白を蓄積させる可能性を有しているといえる。
【００２２】
Ｇｌｕ−ｐＮＡを基質にした場合にのみ、アルツハイマー病患者の血中におけるＧＡＰの活性低下が認められたことにより、アルツハイマー病の新しい生化学的診断基準となりうることが示された。コントロール群で２検体においてアルツハイマー群と同様の低い活性値が認められたが、これらの検体の提供者を追跡調査してアルツハイマー病の発症が確認されれば、アルツハイマー予備軍としての診断、すなわち予知の可能性を開くものである。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によるアルツハイマー病診断薬は、脳脊髄液を使用することなく血漿を用いてＧＡＰの活性低下を測定することができるため簡便であり、しかも検体を大量処理することが可能であるため、アルツハイマー病の有用な診断薬となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】基質にＡｌａ−ｐＮＡを用いた場合の各検体の酵素活性測定結果を示すグラフである。
【図２】基質にＡｒｇ−ｐＮＡを用いた場合の各検体の酵素活性測定結果を示すグラフである。
【図３】基質にＧｌｕ−ｐＮＡを用いた場合の各検体の酵素活性測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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