【手続補正書】
【提出日】平成29年7月11日(2017.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物集団から可溶性タンパク質を抽出する方法であって、
−可溶性タンパク質を発現する微生物集団と、微生物集団から可溶性タンパク質を抽出するのに有効な量の、約1％（v/v）以上50％（v/v）未満のカルボン酸を含む溶液とを接触させることを含み；
−ここで可溶性タンパク質がトロポエラスチンまたはそのフラグメントもしくは誘導体である、方法。
【請求項２】
溶液が約1％（v/v）〜約40％（v/v）のカルボン酸を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
溶液が約25％（v/v）〜約37.5％（v/v）のカルボン酸を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
カルボン酸を約1：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g））〜約20：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g)）の溶解率で添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
カルボン酸が少なくとも約3のpKaを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
カルボン酸が酢酸またはギ酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
カルボン酸が酢酸である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
微生物集団と溶液とを約5時間以下接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
さらに微生物集団と界面活性剤とを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
微生物集団が細菌、酵母または糸状菌の集団である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
組成物を製造する方法であって、請求項1に記載の方法によって製造したトロポエラスチンを取得すること、およびトロポエラスチンを組成物に配合することを含む方法。
【請求項１２】
固体または半固体支持体を製造する方法であって、請求項1に記載の方法によって製造したトロポエラスチンを取得すること、およびトロポエラスチンを固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本開示は、本発明者によるタンパク質の抽出を可能にする方法の開発に基づいている。例えば、微生物から可溶性タンパク質を抽出する方法であって、微生物由来の膨大な量の細胞内タンパク質、核酸、および／または脂質が凝集している状態で、当該タンパク質が可溶性のままである方法である。本方法によって、他の方法と同濃度のタンパク質を抽出しながら、より高純度の可溶性タンパク質を抽出することが可能になった。このように、本発明者によって開発された方法は、コンタミネーションを低減し、タンパク質を高収量で回収することによって、下流の精製工程を容易にする。本明細書に例示するように、本発明者は、可溶性タンパク質を大腸菌（Escherichia coli）のような細菌より抽出するために、多様なカルボン酸を用いた。本結果は、広く微生物のモデルとして用いられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本開示はまた、微生物集団から可溶性タンパク質を精製する方法であって、本明細書に記載のタンパク質抽出方法を実施すること、および本方法により抽出したタンパク質を精製することを含む方法を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【図１】大腸菌（E.coli）から様々な方法で抽出した組換えタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。レーン1、サイズマーカー；レーン2、15mM NaOH抽出；レーン3、0.57％（v/v）酢酸抽出（常温）；レーン4、0.57％（v/v）酢酸抽出（4℃）；レーン5、10％（w/v）ギ酸抽出；レーン6、尿素抽出；レーン7、n−プロパノール抽出。
【図２】大腸菌（E.coli）から様々な方法で抽出した組換えタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。レーン1、サイズマーカー；レーン2、10％（v/v）酢酸抽出；レーン3、5％（v/v）酢酸抽出；レーン4、2％（v/v）酢酸抽出；レーン5、尿素抽出。
【図３】酢酸濃度（v/v）、溶解率、および発酵液1リットルあたりの組換えタンパク質回収量（g）の関係を示すグラフである。
【図４】酢酸濃度（v/v）、溶解率、および抽出した組換えタンパク質の純度の関係を示すグラフである。
【図５】組換えタンパク質を発現した大腸菌（E.coli）抽出物のSDS-PAGEの結果を示す写真である。抽出物は図の上部に示した様々な濃度（v/v）の酢酸を用いて作製した
【図６】RP-HPCLで測定した大腸菌（E.coli）抽出物中の組換えタンパク質の収量と純度を示すグラフである。抽出物は図に示した様々な濃度（v/v）の酢酸を用いて作製した。
【図７】RP-HPCLで測定した大腸菌（E.coli）抽出物中の組換えタンパク質の収量（左図）と純度（右図）を示す2つのグラフである。抽出物は様々な濃度（v/v）の酢酸を用いて、図に示した様々な時間をかけて作製した。
【図８】組換えタンパク質を発現した大腸菌（E.coli）抽出物のSDS-PAGEの結果を示す写真である。抽出物は図の上部に示した様々な濃度（v/v）の酢酸を用いて20分間抽出して作製した。
【図９】ペプチドのコピーを複数含む組換え融合タンパク質を発現する大腸菌（E.coli）からの抽出物のSDS-PAGEの結果を示す写真である。レーン1、サイズマーカー；レーン2、細胞溶解物；レーン3、25％（v/v）酢酸抽出。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
典型的なカルボン酸とpKaを表1に示す。
【表１−１】
2016536275.tif 000001
【表１−２】
2016536275.tif 000002
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
微生物集団を一定期間組成物と接触させる本開示の実施例においては、カルボン酸は約1％以上100％未満の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約95％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約90％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約85％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約80％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約75％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約70％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約65％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約60％の％（v/v）で用いられる。例えば、カルボン酸は約1％から約55％の％（v/v）で用いられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は幅広い意味に解釈され、TATAボックスまたは開始因子を包含するゲノム遺伝子の転写制御配列を含む。これらは正確な転写開始に必要であり、例えば、発展的および／または外因的な刺激に反応して、または組織特異的な方法で、核酸の発現に変化をもたらす他の制御因子（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーまたはサイレンサー）を必要とする場合としない場合がある。本文脈において、「プロモーター」という用語はまた、作動可能に連結された核酸の発現を実行、活性化、または促進する、組換え、合成、または融合した核酸または誘導体に言及するために使用される。好ましくは、プロモーターは、発現をさらに増強する、および／または上述の核酸の空間的発現および／または時間的発現を変化させる特異的制御因子のコピーを、一つ以上含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
さらに別の例として、融合タンパク質は互いに融合した2つのペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、融合タンパク質は抗体、例えばIgG抗体のFc領域と融合したペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、融合タンパク質は、抗体のFc領域に融合する一つ以上（例えば、2つ）のトロンボポエチン受容体結合領域を含む。例えば、融合タンパク質はロミプロスチムである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
例えば、他の化合物は、放射性同位元素、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象内のタンパク質の半減期を延ばす化合物およびこれらの混合物から成る群より選択される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
投与される組成物は一般的に、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶解したタンパク質の溶液を含む。様々な水性担体が使用可能である。例えば、緩衝食塩水などである。他の典型的な担体は、水、食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液および5%のヒト血清アルブミンを含む。混合油およびオレイン酸エチルのような非水性溶媒もまた使用してもよい。リポソームもまた担体として使用してもよい。担体は、等張性および化学安定性を強化する少量の添加物、例えば、緩衝液と防腐剤を含んでもよい。組成物は、pH調整剤、緩衝剤および毒性調整剤のような生理的状態に近づけるのに必要な医薬上許容される補助剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
本明細書に記載されるいずれかの例による方法で抽出、単離または精製したタンパク質はまた、固体または半固体支持体の上部または内部に固定化できる。典型的な半固体支持体は、一般的に物質から成るマトリックスで、たいていの場合はポリマーであり、酵素的または酸／塩基の加水分解または溶解によって分解可能である。一度体内に挿入されると、マトリックスは酵素および体液によって影響を受ける。徐放性マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド-コ-グリコリド（乳酸とグリコール酸のコ-ポリマー）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンのような生体適合性の物質から選択することが望ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
実施例５：酢酸を用いた融合タンパク質の抽出
3つのペプチドのコピーを持ち、且つ約4.6の等電点を示す融合タンパク質を発現する微生物細胞を増殖、回収および凍結した。その後細胞を溶解、または、25％（v/v）酢酸溶液と1時間接触させることにより融合タンパク質を抽出し、遠心分離して上清を回収した。得られた組成物のSDS-PAGE解析の結果を図9に表している。本データは酢酸抽出が宿主細胞のタンパク質による夾雑物を実質的に減らしたことを示している。本データはまた、本明細書に記載の抽出方法が融合タンパク質および／または酸性の等電点を示すタンパク質にも適用可能であることを示している。
さらに本願発明は次の態様を含む。
項１. 微生物集団から可溶性タンパク質を抽出する方法であって、可溶性タンパク質を発現する微生物集団と、微生物集団から可溶性タンパク質を抽出するのに有効な量の、約1％（v/v）以上50％（v/v）未満のカルボン酸を含む溶液とを接触させることを含む方法。
項２. 溶液が約1％（v/v）〜約40％（v/v）のカルボン酸を含む、項1に記載の方法。
項３. 溶液が約25％（v/v）〜約37.5％（v/v）のカルボン酸を含む、項1に記載の方法。
項４. カルボン酸を約1：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g））〜約20：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g)）の溶解率で添加する、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
項５. カルボン酸を約5：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g)）〜約10：1（カルボン酸（ml）：微生物（湿重量，g)）の溶解率で添加する、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
項６. カルボン酸が少なくとも約3のpKaを示す、項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
項７. カルボン酸が酢酸またはギ酸である、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
項８. カルボン酸が酢酸である、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
項９. 微生物集団と溶液とを約5時間以下接触させることを含む、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
項１０. 微生物集団と溶液とを約１時間以下接触させることを含む、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
項１１. さらに微生物集団と界面活性剤とを接触させる、項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
項１２. 可溶性タンパク質が微生物集団によって組換えタンパク質として発現される、項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
項１３. 微生物集団が細菌、酵母または真菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項１４. 微生物集団が細菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項１５. 微生物集団がグラム陰性細菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項１６. 微生物集団が大腸菌（Escherichia coli）である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項１７. 可溶性タンパク質が微生物集団から抽出される際に溶液中で可溶性を維持できる等電点を示す、項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
項１８. 可溶性タンパク質が7.5以上の等電点を示す、項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
項１９. 可溶性タンパク質が6以下の等電点を示す、項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
項２０. タンパク質が、硬タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド、シャペロニン、熱ショックタンパク質、インターロイキン、インターフェロン、融合タンパク質および抗体の様々なドメインを含むタンパク質からなる群から選択される、項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
項２１. 微生物集団から可溶性タンパク質を精製する方法であって、項1〜20のいずれか1項に記載の方法を実施することおよび前記の方法によって抽出した可溶性タンパク質を精製することを含む方法。
項２２. 可溶性タンパク質を他の化合物と混合することをさらに含む、項21に記載の方法。
項２３. 精製または抽出したタンパク質を修飾することをさらに含む、項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
項２４. 修飾タンパク質を製造する方法であって、項21〜23のいずれか1項に記載の方法によって精製したタンパク質を取得して修飾すること、または項1〜20のいずれか1項に記載の方法によって抽出したタンパク質を取得して修飾することを含む方法。
項２５. タンパク質の修飾が別の化合物をタンパク質へ結合させることを含む、項23または24に記載の方法。
項２６. タンパク質を組成物に配合することをさらに含む、項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
項２７. タンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することをさらに含む、項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
項２８. 組成物を製造する方法であって、項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製または製造したタンパク質を取得すること、および前記タンパク質を組成物に配合することを含む方法。
項２９. 固体または半固体支持体を製造する方法であって、項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製、または製造したタンパク質を取得すること、およびタンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することを含む方法。
項３０. 組成物、固体支持体または半固体支持体がヒトまたは非ヒト動物への投与または適用に用いられる、項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
項３１. 組成物、固体支持体または半固体支持体が医薬用途、化粧用途、薬用化粧用途、動物薬用途、または移植に用いられる、項26〜31のいずれか1項に記載の方法。
項３２. 項1〜31のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む方法を実施することによって製造される、タンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項３３. 医薬品に用いられる、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項３４. 医薬用途、化粧用途、薬用化粧品途、動物薬用途、または移植に用いられる、項32
に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項３５. 病態を治療する方法であって、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を、それを必要とする対象者に投与することを含む方法。
項３６. 病態を治療するための医薬の製造のための、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体の使用。
項３７. 項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を含む装置。
項３８. 注射器、パッチ、またはインプラントである項35に記載の装置。