【手続補正書】
【提出日】平成29年2月15日(2017.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株の生成方法であって、
（ａ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように組換えされていない第１のフィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ、並びにＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含む培地を含むことと、
（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を、ＬＩＦを発現するように組換えされていない第２のフィーダー細胞層を含む試験管内培養ウェルに移すことと、
（ｃ）約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ、並びにＭＥＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含む培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞の多能性を維持することと、
（ｄ）ラットＥＳ細胞を組換えて、ラットＥＳ細胞のゲノムへの、選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む標的とされた遺伝子組換えを含むようにすることであって、ここで、ラットＥＳ細胞が
（ｉ）標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、
（ｉｉ）ｃ−Ｍｙｃの発現を欠く、
（ｉｉｉ）正常な核型を有する、および
（ｉｖ）培養物において自由に浮かんでいる球形のコロニーを形成する、
こととを含む、前記方法。
【請求項２】
（ａ）ラットＥＳ細胞株がＡＣＩラットに由来するかまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；および／または
（ｂ）ラットＥＳ細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期の胚に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的とされた遺伝子組換えが、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換え工程（ｄ）が、前記ラットＥＳ細胞を、２以上の標的とされた組換えを含むように組換えることを含み、前記ラットＥＳ細胞が、２以上の標的とされた遺伝子組換えを、生殖系列を通して伝達することが可能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ラットＥＳ細胞が、オス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞またはメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が約７５Ｕ／ｍＬ〜約１２５Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、約９０Ｕ／ｍＬ〜約１１０Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が約１００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１及び第２のフィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む、および／またはＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
培地中のＬＩＦの濃度が約１００Ｕ／ｍＬであり、ＭＥＫ阻害剤が約１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、ＧＳＫ３阻害剤が約３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
培地が表２に示される成分を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
組換え工程（ｄ）が、
（ｉ）選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドをラットＥＳ細胞に導入することであって、この際、前記選択マーカーは、前記ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結されていることと、
（ｉｉ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にて前記ラットＥＳ細胞を試験管内で培養し、それによって前記非相同のポリヌクレオチドがそのゲノムの中に安定的に統合されているラットＥＳ細胞を選択することとを含み、その際、前記第１の培養培地は第１の期間、有効量の選択剤を含み、前記第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与し、そして第１の培養培地と第２の培養培地が２４時間ごとに交互に入れ替えられる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
選択マーカーが以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：
（ａ）選択マーカーが非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む；
（ｂ）選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び
（ｃ）ラットＥＳ細胞が、ゲノムに安定的に組み込まれた選択マーカーの複数のコピーを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって作出された１以上のラットＥＳ細胞の集団。
【請求項１７】
（ｅ）工程（ｄ）からの組換えられたラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｆ）Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｇ）代理母にてＦ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；
（ｈ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）工程（ｈ）において特定されたオスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも３％が標的とされた遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも６０％が標的とされた遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
試験管内培養物であって、
（ａ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）を発現するように組換えられていないフィーダー細胞層と；
（ｂ）約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ、並びにＭＥＫ阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含む培地と；
（ｃ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって作出された１以上のラットＥＳ細胞の集団と
を含む試験管内培養物。
【請求項２２】
培地が、約７５Ｕ／ｍＬ〜約１２５Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む請求項２１に記載の試験管内培養物。
【請求項２３】
培地が、約９０Ｕ／ｍＬ〜約１１０Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む請求項２２に記載の試験管内培養物。
【請求項２４】
培地が、約１００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦを含む請求項２３に記載の試験管内培養物。
【請求項２５】
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
【請求項２６】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む、および／またはＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
【請求項２７】
培地中のＬＩＦの濃度が約１００Ｕ／ｍＬであり、ＭＥＫ阻害剤が約１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１であり、ＧＳＫ３阻害剤が約３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
【請求項２８】
培地が、表２に示される成分を含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
特許または出願のファイルはカラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴った本特許または特許出願公開のコピーは要請及び必要な料金の支払いがあると特許庁によって提供されるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＡＣＩラットまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットから選択される系統の単離されたラットＥＳ細胞であって、前記単離されたラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である、前記単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目３）
ラットＥＳ細胞がＤＡラットに由来する項目１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目４）
ラットＥＳ細胞が正倍数体であり、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目１、２または３に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目４に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目１〜６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目８）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目１〜７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目９）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目１〜８のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目９に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１１）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目９に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目１１に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非減衰性の選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目１２に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１５）
ラットＥＳ細胞が、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１６）
ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１７）
ラットＥＳ細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１８）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目１９）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２０）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２１）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目１〜２０のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２２）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２３）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目１〜２２のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２４）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目１〜２３のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２５）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目１〜２４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２６）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目１〜２５のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２７）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リ
ソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、及びそれらの組み合わせの１以上から選択されるラットＥＳ細胞に特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目１〜２６のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目２８）
ラットＥＳ細胞の単離された集団であって、前記ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置くと球形様のコロニーを形成する、前記ラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目２９）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３０）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目２８に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３１）
ラットＥＳ細胞が、生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目２８〜３０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３２）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３３）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目２８〜３１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３４）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目２８〜３３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３５）
ラットＥＳ細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目２８〜３４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３６）
ラットＥＳ細胞が１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することができる項目２８〜３５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３７）
標的とされた遺伝子組換えがラットのＲｏｓａ２６遺伝子座におけるものである項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３８）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目３９）
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目３６に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４０）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目３９に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４１）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または
（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４２）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目４０に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４３）
細胞が、ＬＩＦポリペプチド、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目２８〜４２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４４）
細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目２８〜４３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目２８〜４４のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４６）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４７）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目２８〜４５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目２８〜４７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目４９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目２８〜４８のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目２８〜４９のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５０のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目２８〜５１のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目２８〜５２のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５４）
ラットＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目２８〜５３のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、及びそれらの組み合わせから選択される１以上のラットＥＳ細胞に特異的な遺伝子の発現を特徴とする項目２８〜５４のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞。
（項目５６）
集団が少なくとも１０４個の細胞を含む項目２８〜５５のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５７）
ラットＥＳ細胞が、
ａ．ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
ｂ．ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
ｃ．ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
ｄ．ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する；及び／または
ｅ．ラットＥＳ細胞はＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＬＩＦ及びＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養すると多能性を維持する；を含む１以上の特徴を有する項目２８〜５６のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５８）
（ａ）ラットＥＳ細胞がラット胚盤胞に由来する、（ｂ）ラットＥＳ細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び／または（ｃ）ラットＥＳ細胞が過排卵ラットに由来する項目２８〜５７のいずれか１項に記載のラットＥＳ細胞の単離された集団。
（項目５９）
フィーダー細胞層と、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞の集団と、白血病阻害因子（ＬＩＦ）
、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、ラットＥＳ細胞が球形様のコロニーを形成する、前記試験管内培養物。
（項目６０）
ラットＥＳ細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する項目５９に記載の試験管内培養物。
（項目６１）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目５９または６０に記載の試験管内培養物。
（項目６２）
ラットＥＳ細胞がＡＣＩラットに由来する項目５９〜６１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６３）
ラットＥＳ細胞がダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する項目５９〜６１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６４）
ラットＥＳ細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目５９〜６３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６５）
ラットＥＳ細胞が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６６）
ラットＥＳ細胞が少なくとも６０％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目６４に記載の試験管内培養物。
（項目６７）
ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す項目５９〜６６のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６８）
ラットＥＳ細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目５９〜６７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目６９）
ラットＥＳ細胞が、１以上、２以上または３以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目５９〜６８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７０）
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７１）
標的とされた遺伝子組換えがラットＥＳ細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも１回の挿入を含む項目６９に記載の試験管内培養物。
（項目７２）
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーである項目７１に記載の試験管内培養物。
（項目７３）
（ａ）選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または（ｂ）ラットＥＳ細胞が選択マーカーをコードする少なくとも２コピーのポリヌクレオチドを含む項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７４）
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目７２に記載の試験管内培養物。
（項目７５）
細胞が多能性を維持するために傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要としない項目５９〜７４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７６）
ラットＥＳ細胞がオス（ＸＹ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７７）
ラットＥＳ細胞がメス（ＸＸ）ラットＥＳ細胞である項目５９〜７５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７８）
ラットＥＳ細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む培地にて少なくとも１１回まで継代することができる項目５９〜７７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目７９）
ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する項目５９〜７８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８０）
ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏ１及びそれらの組み合わせから選択される１以上の多能性マーカーを発現しない項目５９〜７９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８１）
ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２及びそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８２）
ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７及びそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉マーカーを発現しない項目５９〜８１のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８３）
ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６及びそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない項目５９〜８２のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８４）
細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目５９〜８３のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８５）
ラットＥＳ細胞が、接着接合関連タンパク質（Ａｊａｐ１）、クラウジン５（Ｃｌｄｎ５）、Ｃｄｃ４２グアニンヌクレオチド交換因子９（Ａｒｈｇｅｆ９）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＶ（Ｃａｍｋ４）、エフリン−Ａ１（Ｅｆｎａ１）、ＥＰＨ受容体Ａ４（Ｅｐｈａ４）、ギャップ接合タンパク質ｂｅｔａ５（Ｇｊｂ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質様１（Ｉｇｆｂｐｌ１）、インターロイキン３６ｂｅｔａ（Ｉｌ１ｆ８）、インターロイキン２８受容体ａｌｐｈａ（Ｉｌ２８ｒａ）、左右決定因子１（Ｌｅｆｔｙ１）、白血病阻害因子受容体ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｒ）、リソホスファチジン酸受容体２（Ｌｐａｒ２）、ニューロンペントラキシン受容体（Ｎｔｍ）、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型１８（Ｐｔｐｎ１８）、尾型ホメオボックス２（Ｃｄｘ２）、フィブロネクチンＩＩＩ型及びアンキリン反復ドメイン１（Ｆ
ａｎｋ１）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）（Ｆｏｘｅ１）、ＹＲＰＷモチーフ２に関連したヘアリー／エンハンサ−オブ−スプリット（Ｈｅｙ２）、リンパエンハンサ−結合因子１（Ｌｅｆ１）、Ｓａｌ−様３（ショウジョウバエ）（Ｓａｌｌ３）、ＳＡＴＢホメオボックス１（Ｓａｔｂ１）、ｍｉＲ−６３２、またはそれらの組み合わせから選択されるラットＥＳＣに特異的な遺伝子の１以上の発現を特徴とする項目５９〜８４のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８６）
ＬＩＦの濃度が約５０Ｕ／ｍｌ〜約１５０Ｕ／ｍｌである項目５９〜８５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８７）
ＬＩＦの濃度が約１００Ｕ／ｍｌである項目５９〜８５のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８８）
ＬＩＦがマウスに由来するまたは配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を含む項目５９〜８７のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目８９）
フィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目５９〜８８のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９０）
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目５９〜８９のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９１）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目５９〜９０のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９２）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目５９〜９１のいずれか１項に記載
の試験管内培養物。
（項目９３）
ラットＥＳ細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する項目５９〜９２のいずれか１項に記載の試験管内培養物。
（項目９４）
胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む項目９３に記載の試験管内培養物。
（項目９５）
ラットＥＳ細胞の集団がラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む項目９３に記載の試験管内培養物。
（項目９６）
ラットの胚性幹（ＥＳ）細胞株の生成方法であって、
（ａ）フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットＥＳ細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）または配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有し、且つＬＩＦ活性を有する配列、及びＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を有する培地を含むことと、
（ｂ）ラットＥＳ細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第２のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移すことと、
（ｃ）マウスＬＩＦまたはマウスＬＩＦの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットＥＳ細胞の多能性を維持し、それからラットＥＳ細胞株を樹立することとを含む、前記方法。
（項目９７）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも５回継代される項目９６に記載の方法。
（項目９８）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも１０回継代される項目９６または９７に記載の方法。
（項目９９）
培地が約５０Ｕ／ｍＬ〜約１５０Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９６、９７または９８に記載の方法。
（項目１００）
培地が約１００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦを含む項目９６〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
第１及び第２のフィーダー細胞層がＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされない項目９６〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
第１及び第２のフィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単層を含む項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１を含む項目９６〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
ＧＳＫ-３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１を含む項目９６〜１０３のいずれか１項に記
載の方法。
（項目１０５）
（ａ）ラットＥＳ細胞株がＡＣＩラットに由来するまたはダークアグーチ（ＤＡ）ラットに由来する；及び／または（ｂ）ラットＥＳ細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する項目９６〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
培地がさらに、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤またはＡＬＫ阻害剤の少なくとも１つを含む項目９６〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
ＦＧＦ受容体阻害剤がＰＤ１８４３５２を含み、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２を含み、またはＡＬＫ阻害剤がＡ−８３−０１を含む項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
ラットＥＳ細胞株が少なくとも３％の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目９６〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも６０％である項目９６〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹（ＥＳ）細胞の選択方法であって、（ａ）ラットＥＳ細胞の試験管内集団を提供することと、（ｂ）前記ラットＥＳ細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも１つのラットＥＳ細胞に導入することと、（ｃ）交互に入れ替える第１と第２の培養培地にて前記ラットＥＳ細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に前記非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットＥＳ細胞を選択することとを含み、その際、前記第１の培養培地は第１の期間、有効量の選択剤を含み、前記第２の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、前記方法。
（項目１１１）
第１の培養培地と第２の培養培地が２４時間ごとに交互に入れ替えられる項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する項目１１０または１１１に記載の方法。
（項目１１３）
抗生剤がＧ４１８を含む項目１１０〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、プロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）またはそれらの組み合わせを含む項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
（ａ）選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び／または（ｂ）選択マーカーの複数のコピーがラットＥＳ細胞のゲノムに安定的に組み込まれる項目１１０〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞の遺伝子組換え方法であって、項目１〜２７のいずれか１項に記載の単離されたラットＥＳ細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞を形成することを含む、前記方法。
（項目１１８）
遺伝子組換えしたラットの作製方法であって、
（ａ）項目１〜２７のいずれか１項に記載の単離されたラット胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットＥＳ細胞を形成することと；
（ｂ）標的とされた遺伝子組換えを含むラットＥＳ細胞の少なくとも１つをラット宿主胚に導入してＦ０胚を作出することと；
（ｃ）Ｆ０胚を代理母に移植することと；
（ｄ）代理母にてＦ０胚を出産予定日まで妊娠維持させることと；（ｅ）標的とされた遺伝子組換えを有するＦ０ラットを特定することとを含む、前記方法。
（項目１１９）
オスＦ０ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるＦ１子孫を作出することをさらに含む項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
Ｆ１子孫のオスラットをＦ１子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるＦ２子孫を得ることをさらに含む項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも３％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも１０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
遺伝子組換えを有するＦ０ラットの少なくとも６０％が遺伝子組換えをＦ１子孫に伝達する項目１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する項目１
１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
遺伝子組換えしたラットＥＳ細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する項目１１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２６）
集団におけるラットＥＳ細胞が、
(ａ)ラットＥＳ細胞の少なくとも９０％が正倍数体である；
(ｂ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が少なくとも１つの多能性マーカーを発現し、前記少なくとも１つの多能性マーカーはＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む；
(ｃ)ラットＥＳ細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットＥＳ細胞株のゲノムを子孫に伝達する；
(ｄ)ラットＥＳ細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する；
(ｅ)ラットＥＳ細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する；
(ｆ)ラットＥＳ細胞がＧＳＫ３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、ＬＩＦと、ＬＩＦを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層とを含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する；
(ｇ)ラットＥＳ細胞が少なくとも２％の相同組換えの標的化効率を示す；
(ｈ)傍分泌のＬＩＦシグナル伝達を必要とすることなく、ラットＥＳ細胞が試験管内で多能性を維持する；
(ｉ)ラットＥＳ細胞の少なくとも７０％が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する；
(ｊ)ラットＥＳ細胞が、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｒｒ−ｂｅｔａ、Ｆｂｘｏ１５、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆ１、ＬＩＦ受容体、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ２、Ｕｔｆ１、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する；
(ｋ)ラットＥＳ細胞が、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘｏｌから選択される１以上の分化マーカーを発現しない；
(ｌ)ラットＥＳ細胞が、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｂｍｐｒ２またはそれらの組み合わせから選択される１以上の中胚葉性マーカーを発現しない；
(ｍ)ラットＥＳ細胞が、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ７またはそれらの組み合わせから選択される１以上の内胚葉性マーカーを発現しない；及び／または
(ｎ)ラットＥＳ細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ６またはそれらの組み合わせから選択される１以上の神経マーカーを発現しない；を含む、上記項目のいずれかに記載のラットＥＳ細胞の単離された集団、上記項目のいずれかに記載の試験管内培養物、または上記項目のいずれかに記載の方法。