(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）細胞毒性剤；
（２）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質であり、（ａ）チミジン、（ｂ）ウリジン、及び（ｃ）フォリン酸から選択される物質；及び
（３）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な前記物質を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換することの可能な酵素的に活性な分子を接合した、ターゲット細胞特異性抗原に結合可能な抗体または抗体の一部；
を含む、腫瘍細胞を治療するための薬剤組成物。
【請求項２】
前記抗体または抗体の一部が選択的に細胞表面エンティティ（entity）に結合可能である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記細胞表面エンティティが腫よう適合抗原である、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記細胞表面エンティティが細胞表面リセプタである、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記物質が（ａ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、チミジン分解酵素またはチミジンキナーゼの少なくとも触媒部を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記物質が（ｂ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、ウリジン分解酵素またはウリジンキナーゼの少なくとも触媒部を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記物質が（ｃ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、カルボキシペプチダーゼG2の少なくとも触媒部を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
（１）細胞毒性剤；
（２）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質であり、（ａ）チミジン、（ｂ）ウリジン、及び（ｃ）フォリン酸から選択される物質；及び
（３）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な前記物質を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換することの可能な酵素的に活性な分子を接合した、ターゲット細胞特異性抗原に結合可能な抗体または抗体の一部；
を含む、腫瘍細胞を治療するためのパーツのキット。
【請求項９】
前記抗体または抗体の一部が選択的に細胞表面エンティティ（entity）に結合可能である、請求項８に記載のパーツのキット。
【請求項１０】
前記細胞表面エンティティが腫よう適合抗原である、請求項９に記載のパーツのキット。
【請求項１１】
前記細胞表面エンティティが細胞表面リセプタである、請求項９に記載のパーツのキット。
【請求項１２】
前記物質が（ａ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、チミジン分解酵素またはチミジンキナーゼの少なくとも触媒部を含む、請求項８から11のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１３】
前記物質が（ｂ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、ウリジン分解酵素またはウリジンキナーゼの少なくとも触媒部を含む、請求項８から11のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１４】
前記物質が（ｃ）である場合、前記酵素的に活性な分子が、カルボキシペプチダーゼG2の少なくとも触媒部を含む、請求項８から11のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１５】
前記細胞毒性剤が葉酸アンタゴニストであり、前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質がフォリン酸である、または前記細胞毒性剤がチミジンアンタゴニストであり、前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質がチミジンである、または両者の前記アンタゴニストの組み合わせである、請求項８に記載のパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、主に、選択された細胞をターゲットとすることが可能な細胞毒性剤、および、特に、ガンの治療に使用される薬剤の作用に関する。
ガンのほとんどの形態は、初期の段階で体内に分散している傾向にあり、ガン治療の最終目標は、好ましくはホストシステムに重大な毒性を示すことなく、ガンの除去を達成することである。細胞毒性剤を組み合わせると、比較的一般的ではないガンの狭い範囲においては治癒性が証明されているが、単独の細胞毒性剤およびそれらの組み合わせでは、肺、胸、結腸、直腸、すい臓、前立腺などの一般的なガン患者にはほとんど、主な治療効果が見られないものである。
細胞毒性剤は、消化管の上皮および造血組織等の細胞再生を活性化する正常の組織に影響を及ぼすため、断続的な投与スケジュールで投与されることのみ可能である。細胞毒性物質の影響からこれらの正常な組織を回復させるために必要な、投与処理の中断期間は、細胞毒性剤の投与期間よりも、より長い傾向にある。
細胞分裂において含有される物質が、細胞毒性剤の最も一般的なターゲットであり、これらのなかには、DNAおよびRNAの基礎成分である、ヌクレオチドの合成において含有される物質がある。リボヌクレオチドレダクターゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、およびチミジンシンセターゼ酵素が、典型的なターゲットである。ジヒドロ葉酸還元酵素は食物要因、葉酸に作用し、活性補酵素、5,10−メテニルテトラヒドロフォレートを合成するものである。この補酵素は、DNA合成に必要とされるピリミジンのそれを含有する種々の合成において１炭素転移（カーボントランスファー）に必要である。広く使用されている薬剤、メトトレキサート（2,4−ジアミノ−N10−メチルプテロイルグルタミン酸）は、活性テトラヒドロフォレートの再生を妨げ、DNA合成を中断させ、DNAが複製される細胞サイクルのＳフェーズに入る細胞を死に至らしめる、ジヒドロ葉酸還元酵素に、強力に結合することにより作用する。メトトレキサートは一般的にはたとえば、サイアナミドインコーポレーション（Cyanamid  Inc.）から入手可能である。
トリメトレキサート薬剤（NSC352122;2,4−ジアミノ−５−メチル−６−［3,4,5−トリメトキシアニリノメチル］キナゾリン）もまた、ジヒドロ葉酸還元酵素に結合することにより作用する。ただし、メトトレキサートはフォレートレセプタを経由して細胞に入るが、トリメトレキサートは他のメカニズムによって入るものである。トリメトレキサートの合成は、ベーカー（1967）による、デザイン  オブ  サイト−ディレクティッド  イリバーシブル  エンザイム  インヒビターズ、ワイレイ、ニューヨーク、および、エルスレガーら（1974）による、レクチャーズ  イン  ヘテロサイクリック  ケミストリ、２巻、97/5−133ページ（キャッスル  アンド  タウンセンド）に開示されている。トリメトレキサートは一般には、USバイオサイエンシーズ、ワン  タワー  ブリッジ、100フロント  ストリート、スート400、ウエスト  コンショホッケン、PA  19428、米国から、入手可能である。
メトトレキサートは、カルボキシペプチダーゼG2により切断可能な、末端グルタミン酸部を有する点で、天然フォレート（folate）に類似している。一方、トリメトレキサートは、この酵素の作用を受けにくいものである（バッグシャウ（1985）クリニカル  ラジオール、36巻、545−551ページ）。我々は以前に、インビトロで腸ガン細胞におけるトリメトレキサートの作用が、酵素カルボキシペプチダーゼG2を分解するフォレートの培地に添加することにより増強可能であることを報告した（シールらによる文献:Searle  et  al（1990）バイオケミカル  ファーマコロジー、39巻、1787−1791）。我々はまた、この酵素が、抗体または抗体フラグメントに接合したとき、活性を維持することを示した（シールらによる文献:Searle  et  al（1988）Bact.J.Cancer,53,377−384）。
メトトレキサートおよびトリメトレキサートの双方の生物学的効果は、それらがブロックする反応の最終生成物を投与することにより、またはフォリン酸［５−ホルミルテトラヒドロ葉酸］として知られているより入手可能な類似体により、逆転させることが可能である。フォリン酸は広く入手可能であり、たとえば、シアナミド  インコーポレーション、また、ウエルカム  インコーポレーションおよびファルミタリアからロイコボリン（Leucovorin）として、入手可能である。フォリン酸が、メトトレキサートまたはトリメトレキサートとともに十分な投与量で投与されると、これらの作用がブロックされる。フォリン酸を、定められた時間で抑制された投与量で、メトトレキサートとともに使用すると、ある種のガンの治療に有用であることが見いだされている。メトトレキサート−フォリン酸の組み合わせは、ある種のガンに対しては、メトトレキサート単独と比較して、治療率の向上が可能であり、一般的には、レスキューセラピーとして知られているものである。ある種のガン細胞よりもより容易に正常なクローン発生細胞を救うことは、フォリン酸の能力に依存するようである。ある実施例は、ある種の栄養芽腫ようの治療に際して、メトトレキサートとフォリン酸を使用して成功している（文献:Bagshawe  et  al（1989）Brit.J.Ob.＆  Gvnaecol.）。しかしながらこのアプローチは、ガンの制限された範囲でのみ有用であることが証明されており、正常な細胞を保護するのに必要なフォリン酸の濃度Ｘ時間もまた、アンチ−フォレートの作用からある種のガン細胞を保護するようである。
さらに、アンチ−フォレートの作用の持続性が細胞毒性度を決定することが示されているため、メトトレキサート（MTX）を長期間連続して投与するとより優位ではある一方、このようなフォリン酸の使用においては、メトトレキサート（MTX）の断続投与が必要となる。類似のことが、他の細胞毒性剤にもいえる。
本発明によれば、ターゲット細胞特異性部と、未変性状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換することの可能な不活性部とからなる、化合物を提供する。
不活性部は、直接的または間接的に不活性であってもよい。
”直接的に不活性”とは、その部分自体が、たとえば、それに結合することにより、またはそれを不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活性にすることができることを意味する。
”間接的に不活性”とは、ターゲット細胞にその部分を送達すると、細胞毒性剤が不活性となることを意味する。たとえば、その部分は、核酸、DNAまたはRNAのいずれかであってもよく、これは、たとえばそれに結合することにより、またはそれを不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活性にすることができるポリペプチドをコード化するものである。
前記ポリペプチドは、細胞内的に発現されても、細胞表面に発現されても、または細胞から分泌されてもよい。”ポリペプチド”とは、タンパク質および糖タンパク質を含有する。
好ましくは、不活性部は、酵素的活性部である。
細胞毒性剤の効果を”抑制”する物質は、ターゲット細胞を破壊する細胞毒性剤の能力を、有用な範囲にまで減少させるものである。好ましくはこの能力は、実質的にゼロまで減少させるものである。同時に、不活性部は、有用な範囲まで抑制し、好ましくは実質的にゼロにまで減少させるものである。
ターゲット細胞−特異性部により認識されたエンティティ（entity）は、腫よう細胞、ウイルス感染細胞、病原性微生物、遺伝子治療の一部として導入された細胞、または特別な理由から破壊したい生態の正常細胞により、発現される、適当なエンティティならばなんでもよい。エンティティは好ましくは、他の治療手段により機能的に置換できないホストの正常組織においてよりも、破壊されるべき細胞内または細胞上において、より濃度が高い状態で、ターゲット部に近づきやすいまたは存在するべきものである。ガン細胞により発現されたターゲットの使用は、たとえば、内分泌組織または器官に等しくまたはより多く発現されることにより阻害されなくなるものである。存命状態においては、器官が犠牲にされるが、その機能は、たとえば、テストの場合には、生存に本質的ではない、またはホルモン置換治療により供給可能なもののいずれかである。このような考え方は、たとえば、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、および卵巣に適用される。
認識されるエンティティはしばしば、抗原である。腫よう−接合抗原は、これらが細胞膜上に発現されるときまたは腫よう外細胞流動体に分泌する時、抗体用ターゲットに加わるものである。
”腫よう”とは、肺、肝臓、血液細胞（白血球）、皮膚、すい臓、結腸、前立腺、子宮、または胸の腫ようを含有する、腫よう性細胞成長の形態をいう。
抗原−特異性部は、全抗体（通常、便宜上、特に、モノクローナル抗体）、それらの部分（たとえばFabフラグメントまたはＦ（ab'）２）、または合成抗体またはそれらの部分であってもよい。抗体の部分のみからなる接合体は、血液からのクリアランスの速度を見積ることによってより優位であり、Fc部による非特異的結合を受けにくくなる可能性がある。選択された抗原に対する適当なモノクローナル抗体は、公知の技術、たとえば、”モノクローナル  アンチボディーズ：ア  マニュアル  オブ  テクニックス”、H.ゾラ（CRCプレス、1988）および、”モノクローナル  ハイブリドーマ  アンチボディーズ：テクニックス  アンド  アプリケーションズ”、J.G.R.ハーレル（CRCプレス、1982）により調製可能である。本明細書に記載されたすべての文献は、本明細書に組み入れられているものである。二特異性抗体（bispecific  antibodies）は、細胞融合、一価フラグメントの再連合、または全抗体の化学交差結合により調製可能であり、得られた二特異性抗体の一部は細胞特異性抗原に向い、他のものは酵素に向かう。この二特異性抗体は、酵素に結合して投与しても、または、まず抗体が投与されて次いで酵素が投与されてもよい。二特異性抗体がまず投与され、腫よう細胞に局在化した後、酵素が、腫よう局在化抗体により捕えられるように投与されるのが好ましい。二特異性抗体の調製方法は、コルバランらによる文献：（1987）Cancer  Immunol.Immunother.24,127−132、および133−137、および138−143、およびギルスランドらによる文献：（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7719−7723に開示されている。
抗体の可変重（VH）および可変軽（VL）領域は、抗原認識に含有される。この事実は、プロテアーゼ消化実験により最初に認識されたものであり、さらに、げっ歯類抗体の”ヒューマニゼーション”により確信された。げっ歯類由来の可変領域は、得られた抗体がげっ歯類源抗体の抗原特異性を保持するような、ヒト由来の定常領域に融合可能である（モリソンらによる文献：（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81、6851−6855）。
抗原特異性は可変領域により与えられ、定常領域に依存しないことが、１以上の可変領域を含有する抗体フラグメントのバクテリアの発現に関する実験から知られている。これらの分子は、Fab状分子（ベターら（1988）サイエンス240、1041）;Fv分子（スケラら（1988）サイエンス240、1038）；単鎖Fv（ScFv）分子、ここでVHとLHパートナー領域は、フレキシブルなオリゴペプチドを介して結合する（バードら（1988）サイエンス242、423;ヒューストンら（1988）による文献:Proc.Natl.Acad.Sci.米国、85、5879）および、単離されたＶ領域からなるシングル領域抗体（dAbs）（ワードら（1989）ネーチャー341、544）を含有する。特異結合部位を保持する抗体フラグメントの合成において含有される一般的な技術は、ウインター＆ミルステイン（1991）ネーチャー349、293−299に記載されている。
"ScFv分子”とは、VHおよびVLパートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドを介して結合する分子を意味する。
全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用すると何倍もの優位点が得られるものである。フラグメントがより小さいサイズであると、固体組織の良好な浸透性などの、良好な薬理特性を示すことが可能となる。相補結合などの全抗体のエフェクター機能が除去される。Fab、Fv、ScFv、およびdAbフラグメントは全て、発現されて、大腸菌から分泌可能であり、これによって、大量の前記フラグメントが容易に製造可能となる。
全抗体、およびＦ（ab'）２フラグメントは"2価”である。"2価”とは、前記抗体およびＦ（ab'）２フラグメントが部位を結合する２つの抗原を有することを意味する。これに対して、Fab、Fv、ScFv、およびdAbフラグメントは、部位を結合する１つのみの抗原を有する１価である。Ｆ（ab'）２フラグメントを製造するための完全な免疫グロブリンの断片化（fragmentation）は、ハルウッドら（1985）による文献:Eur.J.Cancer  Clin.Oncol.21、1515−1522に開示されている。
IgGクラス抗体が好ましい。
また、認識されるエンティティは、抗原性であってもなくてもよいが、認識可能で、他の方法で選択的に結合可能なものである。たとえば、メラノーマ細胞において多く発現されるメラノシト−刺激ホルモン（MSH）用レセプタなどの特性細胞表面レセプタであってもよい。細胞特異性部は、たとえば、メッセンジャとして、または、細胞表面酵素用物質またはその類似体として、非免疫センスにおいて、特異的にエンティティに結合する、化合物またはその一部である可能性がある。
ウイルス直接酵素プロドラッグ治療（VDEPT）が、プロドラッグを細胞毒性剤に変換可能な酵素を選択的に発現するために、正常な細胞と腫よう性細胞との転写差異を用いて腫よう性細胞を選択的に殺すとして記載されている（ハーバーらの文献（1991）:Proc.Natl.Acad.Sci.米国88、8039−8043）。
同様に、正常な細胞と腫よう物性の細胞との転写差異は、ここに開示されたインヒビター物質を不活性にすることの可能な酵素の発現を選択的に行うのに使用可能である。酵素は腫よう細胞により分泌されることが好ましく、これによって、インヒビター物質が自由に不活性となるものである。
細胞間の転写における差異は、組織特異性プロモータと関連づけることが可能であり、または、腫よう性状態におけるアクティベータまたはレプレッサ分子の変化によるものである可能性がある。したがって、ある実施例においては、肝臓関連アルブミン転写調節配列が、肝細胞ガン腫を有する患者の治療において、酵素を含有するインヒビター不活性タンパク質を発現するのに有用である。正常な細胞と腫よう性細胞とのさらなる転写差異は、常に発見されており、これらの差異の多くは、本発明の方法において開発可能であると考えられる。
ターゲット細胞に対して遺伝子構成物を送達するのに適当な組み替え、複製欠陥レトロウイルス（すなわち、プロモータプラス遺伝子コード化インヒビター不活性タンパク質）が開示されている（（ハーバーらの文献（1991）:Proc.Natl.Acad.Sci.米国88、8039−8043）。
ウイルスまたは他の核タンパク質粒子、またはリポソームは、間接的に不活性部を前記細胞に送達するのに適当なターゲット細胞−特異性部を提供可能である。
インヒビター不活性タンパク質は、前記インヒビターを不活性形態に代謝可能な酵素であってもよいし、また、前記インヒビターと結合可能で不活性にすることの可能なタンパク質であってもよい。
腫よう関連抗原に対する抗体およびそれらのフラグメントに関して、かなりの研究が既に行われており、ガン胎児性抗原（CEA）に対する抗体またはそれらのフラグメント、および、ヒトじゅう毛性腺刺激ホルモン（hCG）に対する抗体またはそれらのフラグメントは、カルボキシペプチダーゼG2に接合可能で、得られた接合体は、抗原結合および触媒機能の双方を保持しているものである。これらの接合体を静脈注射した後、これらはそれぞれ、CEAまたはhCG発現腫ように局在する。他の抗体は、対応する抗原を発現する腫ように局在することが知られている。これらの腫ようは、ヒトにおける原発性転移直腸ガン（CEA）およびじゅう毛性ガン腫（hCG）、またはその他の形態のガンである可能性がある。このような抗体−酵素接合体はまた、各々の抗原を発現する正常組織に局在可能であるが、抗原発現は、正常組織においてより分散するものである。このような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を介して細胞膜に結合可能であり、または細胞間に分泌された抗原によりトラップ可能である。
腫よう関連、免疫細胞関連、および感染薬剤関連抗原の例を表１に示す。
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腫よう関連抗原に対する抗体との接合体の投与の前に、腫よう部位における抗原の発現を増加させることが優位である。というのは、これによって、腫よう部位に保持されている接合体の量を増加させることが可能であるからである。いくつかの薬剤は、腫よう壊死ファクタ（TNF）（フォルシらによる文献（1988）:Cancer  Res.48、3607−3612）およびインターフェロン（ボーデンの文献（1988）:J.Nat.Cancer Inst.80、148−149）を含有する抗体取り込みを増加させることが可能であるとされている。
したがって、腫よう細胞抗原の発現を、本発明の化合物の投与前または投与中、１以上の薬剤を使用して促進することが好ましい。
抗体、抗体フラグメントの取り込み、またはそれらの種々の取り込みもまた、毛細管透過性を変えることにより、または、腫よう血液の変化による血管作用性剤により、変更可能である。このような薬剤としては、ヒスタミンおよびインターロイキン−２（ヘニガンらによる文献：（1991）Brit.J.Cancer  64、872−874））、フラボン酢酸（ビビーらによる文献：（1989）J.Natl.Cancer  Institute  81、216−219）が挙げられるが、保護代謝物により腫よう部位の透過を阻害する、または腫よう部位における酵素保持の増加を助力するように、腫よう血流または毛細管透過性を変化させるのに、他の薬剤も使用可能である。
したがって、腫よう血流を、本発明の化合物の投与中、または投与前に、１以上の薬剤を用いて変化させることがさらに好ましい。
未変性状態で細胞毒性剤の効果を阻害することの可能な物質は、前記細胞毒性剤における効果をより示さない物質に変換可能である、十分に無毒な物質であってもよい。適当な化合物は、フォリン酸である。フォリン酸は、たとえばジヒドロフォレートレドクターゼ酵素に作用する、トリメトレキサート細胞毒性剤の生物学的効果を逆にするものである。フォリン酸は、脱グルタミン化されて、カルボキシペプチダーゼG2および他の脱グルタミン化酵素により、トリメトレキサートに対して不活性にするものである。
同様の原理が、他の抗細胞毒性剤に対しても適用可能である。たとえば、チミジンは、チミジレートシンセターゼ酵素に作用する、CB3717およびICI  D1694（ジョドレルらによる文献：（1991）BJC64、833−8;ジョーンズらの文献（1986）:J.Med.Chem.29、468−472）などの細胞毒性剤の効果をブロックする。したがって、チミジン分解酵素（たとえばジヒドロチミン  デヒドロゲナーゼ、シオタニおよびウエバーによる文献（1981）:J.Biol.Chem.256、219−224）、またはチミジンキナーゼ（シオタニらによる文献（1989）:Cancer  Res.49、1090−1094））が、細胞毒性剤に対して、チミジンを効果的でなくするため、本発明の化合物の不活性部として使用可能である。
同様の考え方が、DNAまたはRNAへのヌクレオチド取り込みの正常なプロセスを妨げる、他の薬剤に関しても適用される。というのは、腫よう部位をターゲットとする適当な酵素により次いで分解可能である正常な代謝物によって、この取り込みは可逆的であるからである。
たとえば、広く使用されている細胞毒性５−フルオロウラシル（ロッシュプロダクツ  インコーポレーションから入手可能）の細胞毒性効果は、少なくとも部分的にウリジンにより減ずることが可能である（グロアニンゲンらによる文献：（1989）J.Natl.Cancer  Inst.81、157−162）。ウリジン分解酵素と抗腫よう抗体の接合は、５−フルオロウラシルおよびウリジンとの接合において使用可能である。このような組み合わせは特に、５−フルオロウラシルが最も効果的な細胞毒性剤の１つであるため、直腸および肺ガン腫に関連するものである。このような薬剤の組み合わせは、５−フルオロウラシルの細胞毒性を増すフォリン酸と、またはさらには、チミジンおよびチミジン不活性酵素と組み合わせることが可能である。
この化合物の不活性部は、抗細胞毒性剤物質に関して選択される。
カルボキシペプチダーゼG2以外の酵素およびその等価体が使用可能である。これらは、ターゲットとした代謝物に特異的であるべきであるが、ヒトまたは非ヒト起源のものであってもよい。
従来の酵素を使用することは必ずしも必要ではない。触媒能力を有する抗体が開発されており（トラモンタノら、サイエンス234、1566−1570）、”アブザイム（abzymes）”として知られている。これらは、ヒューマナイズさせて免疫原性を減少させることが可能であるという優位性を有する。
ヒトリンパ球から誘導され、チミジンを分解可能な酵素が、開示されている（シオタニらによる文献：（1989）Cancer  Res.49、1090−1094）。ジヒドロチミン  デヒドロゲナーゼおよびチミジン  キナーゼが、チミジン  インセターゼのインヒビターとともに使用される、ここに開示されているようなタイプのシステムにおいて使用可能である。
チミジン分解およびリン酸化酵素が、チミジン再利用経路をブロックすることにより、ここに開示されているようなアンチ−フォレート治療におけるさらなる要素として使用可能である。これらはまた、細胞毒性剤、５−フルオロウラシルを用いたウリジン触媒酵素とともに使用可能である。
最近酵素、カルボキシペプチダーゼG1およびG2（CPG1およびCPG2）は、末端グルタミン酸の切断により、メトトレキサートを含有するフォレートを分解する。これら２つの酵素の作用は、同じであると考えられる。本発明の好ましい例は、CPG2に関するものであるが、CPG1にも同様に適応可能であり、同じ物質に作用する他の酵素にも、同じ物質に作用するアブザイムにも、適用可能である。
プソイゾモナスsp.株RS−16からのカルボキシペプチダーゼG2の単離、精製、およびいくらかの特性が、シェルウッドらの文献：（1984）E.J.Biochem.148、447−453に開示されている。前記カルボキシペプチダーゼG2をコード化する遺伝子のクローン化、そのヌクレオチド配列、およびその大腸菌における発現は、ミントンらによる文献：（1984）Gene31、31−38およびミントンらによる文献：（1983）J.Bacteriol.156、1222−1227に開示されている。CP2G2は、バイオテクノロジ部、センター  オブ  アプライド  ミクロバイオロジカル  リサーチ、ポートンダウン、サリスバリ、英国から入手可能である。カルボキシペプチダーゼG1（CPG1）は、チャブナーらによる文献：（1972）Cancer  Res.32、2114−2119に開示されている。
化合物の不活性部が、酵素的に活性部である場合には、細胞特異性部からの単離の際に、酵素的に活性であるが、（ａ）細胞特異性部と組み合わせる、および（ｂ）化合物がターゲット細胞に接着または隣接するとき、酵素的に活性となることが必要である。
本発明の化合物の２つの部分は、オスリヴァンらによる文献：（1979）Anal.Biochem.100、100−108に一般的に記載されているような、ポリペプチド架橋の常法により、ともに結合可能である。たとえば、抗体部には、チオール基が多く存在し、酵素部は、たとえば、ヨード酢酸（NHIA）またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの、これらのチオール基と反応可能な二官能性剤と反応することが可能である。たとえばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの、アミドおよびチオエステル結合は、一般的に、ジスルフィド結合よりも生体内でより安定である。
酵素全体が、本発明の化合物に存在する必要はかならずしもないが、無論、触媒部は存在しなければならないものである。
または、化合物は、DNA組み替え法により融合化合物として製造可能であり、ここで、DNAの長さは、互いに隣接する本発明の化合物の２つの部分をコード化する各々の領域からなり、化合物の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域により分離される。考えられるところでは、本願化合物の２つの部分は、全体的に、または部分的にオーバーラップ可能である。融合体の抗体成分は、少なくとも１つの結合部位により表される。抗体（または抗体フラグメント）−酵素融合体の構成例は、ノイベルガーらによる（1984）ネイチャー  312、604により開示されている。
DNAは次いで、本発明の化合物からなるポリペプチドを製造するため、適当なホストに発現される。本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化するDNAは、ここに含有された教示を考慮して適当に変更された公知の方法にしたがって発現ベクターを構成すべく使用可能である。この発現ベクターは次いで、本発明のポリペプチドの製造と発現用の適当なホスト細胞に形質転換するのに使用される。このような方法は、以下の文献：ラッターらによる1984年４月３日付けの米国特許第4440859号、バイスマンによる1985年７月23日付けの米国特許第4530901号、クロールらによる1986年４月15日付けの米国特許第4582800号、マークらによる1987年６月30日付けの米国特許第4677063号、ゴードレルによる1987年７月７日付けの米国特許第4678751号、イタクラらによる1987年11月３日付けの米国特許第4704362号、マレイによる1987年12月１日付けの米国特許第4710463号、ツール,Jr.らによる1988年７月12日付けの米国特許第4757006号、ゴエデルらによる1988年８月23日付けの米国特許第4766075号、およびスタルカーによる1989年３月７日付けの米国特許第4810648号、に記載されたものを含むものであり、これらは全て、ここに参照されるものである。
本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化するDNAは、適当なホストに導入するため他の種々のDNA配列に結合可能である。これらの他のDNA（companion  DNA）は、ホストの特性、DNAのホストへの導入方法、およびエピソーム保持または組み込みが所望であるかいなかに依存する。
一般的には、DNAは、プラスミドなどの、発現の正しい読み枠と正確な方向で、発現ベクターに挿入される。必要であれば、DNAは、所望のホストにより認識された、適当な転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に結合可能であるが、これらの調節は一般的には、発現ベクターに有用である。このベクターは次いで標準法によりホストに導入される。一般的には、全てのホストがベクターにより形質転換されるわけではない。したがって、形質転換されたホスト細胞用に選択することが必要である。ある選択法によれば、抗生物質耐性などの、形質転換された細胞における選択可能な形質用にコード化する、必要な調節エレメントとともに発現ベクターにDNA配列を組み入れるものである。または、選択可能な形質用遺伝子が他のベクターに存在可能であり、このベクターは、所望のホスト細胞を同時形質転換するために使用されるものである。
本発明の組み替えDNAにより形質転換されたホスト細胞は次いで、回収可能なポリペプチド発現を許容するため、ここに記載された教示によって、当業者に公知の適当な条件下、十分な時間、培養された。
バクテリア（たとえば大腸菌および枯草菌）、酵母菌（たとえばサッカロミセス  セレヴィジエ（Saccharomyces  cerevisiae））、糸状菌（たとえばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む、多くの発現システムが知られている。
ベクターは、たとえベクターが、他の非原核細胞タイプにおける発現に使用されるべきものであっても、ColEl  oriなどの、原核における伝播用原核レプリコンを含有する。ベクターはまた、それを用いて形質転換された、大腸菌などの、細菌性ホスト細胞における遺伝子の発現（転写および翻訳）原核プロモーターなどの適当なプロモーターを含有可能である。
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合と転写がおこることを許容するDNA配列により形成された発現調節エレメントである。典型的な細菌性ホストと適合可能なプロモーター配列は、典型的には、本発明のDNAセグメントの挿入に関して有利に制限された部位を含有するプラスミドベクターに存在するものである。
典型的な原核ベクタープラスミドは、バイオラド  ラボラトリーズ（リッチモンド、CA、米国）から入手可能な、pUC18、pUC19、pBR332、およびpBR329、ファルマシア、ピスカタウエイ、NJ、米国から入手可能なpTrc99AおよびpKK223−３である。
典型的なほ乳類細胞ベクタープラスミドは、ファルマシア、ピスカタウエイ、NJ、米国から入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化された遺伝子を発現させるために、SV40後期プロモーターを使用し、発現の最高レベルは、COS−１細胞などのＴ−抗原形成細胞において見られるものである。
誘導可能なほ乳類発現ベクターの例は、pMSGであり、これもまたファルマシアから入手可能である。このベクターは、クローン化された遺伝子を発現するため、マウスほ乳類腫ようウイルス長末端重複のグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用する。
有用な酵母菌プラスミドベクターは、pRS403−406およびpRS413−416であり、一般的には、ストラタジーン  クローンニング  システムズ、ラ  ジョラ、CA  92037、米国から入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、イースト  インテグレーティング  プラスミド（YIps）であり、酵母菌選択可能な標識his3、trp1、leu2、およびura3を取り込んでいる。プラスミドpRS413−416は、イースト  セントロメール  プラスミド（YCps）である。
相補的付着末端を経由してDNAをベクターに結合させるために、種々の方法が開発されている。たとえば、相補的ホモポリマートラクトは、ベクターDNAに挿入されるべきDNAセグメントに添加可能である。ベクターおよびDNAセグメントは次いで、組み替えDNA分子を形成するため、相補的ホモポリマー末端間における水素結合により結合する。
１以上の制限部位を含有する合成リンカーは、DNAセグメントをベクターに結合させる他の方法を提供する。上記したようなエンドヌクレアーゼ制限消化により得られたDNAセグメントは、3'−5'−エキソヌクレオリティックな活性を有する3'−シングル鎖末端の突出を除去し、重合活性を有する凹んだ3'−末端を埋める酵素、大腸菌DNAポリメラーゼＩまたはバクテリオファージT4DNAポリメラーゼで処理される。
これらの活性の組み合わせはしたがって、平滑断端DNAセグメントを形成する。平滑断端セグメントは次いで、バクテリオファージT4DNAリガーゼなどの平滑断端DNA分子の連結反応を触媒することの可能な酵素の存在下、過剰モルのリンカー分子でインキュベートされる。この反応により得られたプロダクトは、末端において重合性リンカー配列を運ぶDNAセグメントである。これらのDNAセグメントは次いで、適当な制限酵素により分解され、DNAセグメントのそれらと適合する末端を製造する酵素で既に分解された発現ベクターに結合する。
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、たとえばインターナショナル  バイオテクノロジーズ  インコーポレーション、ニューヘブン、CN、米国等、種々のところから商業的に入手可能である。
本発明のポリペプチドをコード化するDNAを修飾する所望の方法は、サイキら（1988）、サイエンス239、487−491に記載されたようなポリメラーゼ鎖反応を使用することである。
この方法においては、酵素的に増殖するDNAは、それ自身が増殖したDNAに取り込まれる２つの特異性オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する。前記特異性プライマーは、常法を用いて、発現ベクターへのクローン化に使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有可能である。
本発明の実施において有用であると考えられる酵母菌の典型的な属は、ピシア（Pichia）、サッカロミセス、クルイブエロミセス（Kluyveromyces）、カンジダ、トルロプシス、ハンセヌラ（Hansenula）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、シテロミセス（Citeromyces）、パチソレン（Pachysolen）、デバロミセス（Debaromyces）、メトシュニコビア（Metschunikowia）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）、ボトリオアスクス（Botryoascus）、スポリドボラス（Sporidiobolus）、エンドマイコプシス（Endomycopsis）、などである。好ましい属は、ピシア（Pichia）、サッカロミセス、クルイブエロマイシス（Kluyveromyces）、ヤロビア（Yarrowia）、およびハンセヌラ（Hansenula）からなる群から選択されたものである。サッカロミセスの例としては、サッカロミセス  セレビジアエ（Saccharomyces  cerevisiae）、サッカロミセス  イタリクス（Saccharomyces  italicus）、サッカロミセス  ロキシ（Saccharomyces  rouxii）があげられる。クルイブエロミセスの例としては、クルイブエロミセス  フラジリス（Kluyveromyces  fragilis）およびクルイブエロミセス  ラクチス（Kluyveromyces  lactis）があげられる。ハンセヌラの例としては、ハンセヌラ  ポリモルファ（Hansenula  polymorpha）、ハンセヌラ  アノマラ（Hansenula  anomala）、およびハンセヌラ  カプスアタ（Hansenula  capsulata）があげられる。
S.セレビジアエ（cerevisiae）の形質転換方法は、一般的には、EP251744、EP258067、およびWO90/01063に教示されており、これらの文献全ては、ここに組み入れられるものである。
S.セレビジアエ（cerevisiae）用の適当なプロモータは、PGK1遺伝子、GAL1またはGAL10遺伝子、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベイト  デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、トリオース  ホスフェート  イソメラーゼ、ホスホグルコース  イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−メーティングファクターフェロモン、およびａ−メーティングファクターフェロモンの遺伝子を連合したプロモーター、PRB1プロモーター、GUT2プロモーター、および、他のプロモーターの5'調節領域を有するまたは上流活性部を有する（たとえばEP−Ａ−258067のプロモータ）5'調節領域の部分のハイブリッドを含有するハイブリッドプロモーターを含有する。
転写締結シグナルは好ましくは、ポリアデニル化および転写終用の正確なシグナルを含有する真核遺伝子の3'隣接配列である。適当な3'隣接配列は、たとえば、使用された発現制御配列に自然に結合した遺伝子のものであってもよく、すなわち、プロモーターに相当するものである。または、これらは、S.セレビジアエ（cerevisiae）AHD1遺伝子の締結シグナルが好ましい場合には、異なっていてもよい。
本発明によればさらに、ホストにおけるターゲット細胞の破壊方法が提供され、この方法は、ホストに、（ｉ）本発明による化合物、（ii）細胞毒性剤、および、（iii）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部により前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されることの可能な物質を投与することからなる。
好ましくは、本発明の化合物が投与され、一旦、腫ように接合した化合物の絶対レベルと化合物の正常細胞に対する腫ようの比率との間の最適バランスが生じると、細胞毒性剤の効果をブロック可能な物質とともに細胞毒性剤が投与される。しかしながら、他の投与方法も適用可能である。血液で循環する本発明の化合物の量は、酵素部の活性を測定することにより定めることができる。
好ましくは、本発明は、腫ようを有するほ乳類の治療方法を提供する。適当には、ほ乳類をまず、本発明による化合物を投与し、ターゲット細胞に結合していない化合物に対するターゲット細胞に結合する化合物の比率を所望の値にすることにより、腫よう治療用に調製する。この方法はさらに、ほ乳類に、細胞毒性剤、および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記化合物の不活性部により前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質を発生可能な、物質を投与することからなる。
本発明の化合物は、適当な方法で、通常は非経口で、たとえば、静脈内、腹腔内に、またはぼうこう内に、希釈剤およびキャリアの標準無菌、非発熱原性製剤で、たとえば等張塩類溶液（静脈内投与の場合）で投与される。本発明はしたがって、ターゲットガンにより発現された細胞毒性剤の効果から正常組織を保護しつつ、腫よう部位における細胞毒性剤の連続した作用を保持する手段を提供する。未変性状態に於て細胞毒性剤の効果を抑制可能である物質が、正常な組織を保護するのに十分な投与レベルで投与される。しかしながら、腫ように至る物質は、それが細胞に入り、細胞毒性剤から細胞を保護することが可能となる前に、不活性となる。このように、保護分子は迅速に腫よう部位で分解される一方、正常な組織は細胞毒性剤の効果から保護される。
細胞毒性剤およびインヒビターは、本発明の化合物用に記載された種々のルートにより投与され、経口投与も可能である。
抗体−酵素接合体が、一般的には腫ようにおいてピーク濃度になるのは、24時間以内であり、酵素活性は、腫よう部位において７−８日まで存続するものである。抗体−酵素接合体はまた、数日間、血液および非腫よう組織において持続する。非腫よう組織における酵素は、インヒビター物質を分解するため、その保護効果が減少するかまたはその必要性が増す傾向にある。血液からの酵素のクリアランスは促進可能であり、または、酵素を、いくつかの方法により腫よう部位における酵素レベルを大きく変えることなしに不活性にすることが可能である。これらの技術は、他の成分に、添加的におよび有用に使用可能である。
抗体−酵素接合体において使用された抗体または抗体フラグメントは、（モリソンらの文献（1984）:Proc.Natl.Aad.Sci.米国、81、6851−6855およびリーシュマンらによる文献（1988）：ネーチャー、332、323−327に開示されているように）これらの免疫原性を減少させるために’ヒューマナイズ’されることが可能であるが、細菌性酵素CPG1およびCPG2は、ヒト類似体を有さず、人間において繰り返し使用するためには、免疫抑制または免疫寛容性を誘導する手段を使用するべくまたは免疫原性を減少させるべくそれらを変性することが望まれる。
抗体−酵素接合体に適用可能な、異質の蛋白質の免疫原性を減少させる方法としては、ポリエチレングリコールの形態に接合するものを含有する（ウイルキンソンらの文献（1987）:J.Immunol.139、326−331）。
または、免疫原性の問題は、免疫サプレッサーまたは免疫寛容誘導剤を投与することにより、解決可能することができる。シクロスポリンおよびFK506は、組織移植において免疫抑制を行うために広く使用される薬剤である。シクロスポリンは、異質の蛋白質へのホスト抗体反応を遅らせることが示されている（レーダーマンらによる文献（1988）:Br.J.Cancer、58、562−566および654−657）。ホストが、リンパ球におけるCD4エピトープに向かう抗体を受容後、最初に外的問題に出くわした時の異質蛋白質への許容が開示されている（ウオルドマンらによる文献（1988）、16−30ページ、プログレス  イン  アレルギー（シザタ  アンド  ウオクスマン、ニューヨーク）。これを達成するためのさらなる手段は、他のところにも開示されており、異質抗原へのホスト抗体反応の制御において改善がおこるとき、変化可能である。触媒抗体（アブジムズ）は、これらの免疫原生を減少または除去するために’ヒューマナイズ’可能である。
抗体−酵素接合体または抗原に結合した腫ように向かう抗体が、適当な腫ようを有するホストに投与されると、抗体または接合体の小さいフラクション部のみが、腫よう部位に局在し、そのほとんどは、数日間、血液中および他の正常組織に残存する。酵素の腫ようにおける濃度は、正常組織においてよりも高いが、正常組織の容量はより大きいものである。したがって、正常組織および血液に残存する酵素の量を最小限にするために、血液から過剰の抗原−酵素接合体を不活性化してクリアにするための、国際出願89/10140;バグシャウの文献（1989）:Brit.J.Cancer、60、275−281;およびシャルマらの文献（1990）:Brit.J.Cancer、60、659−662に記載された方法とともに、本発明の方法を用いることが望ましい。
ガン撲滅を達成する試みにおいて、腫ようターゲット（骨髄サプレッション）における効果は、ここに記載したシステムを用いるとより少なくなると予測されるが、造血機能の抑制を妨害することは不可能である。同様に、ある程度の骨髄サプレッションには、より多くの腫よう効果が予想される。造血組織に作用する成長ファクタは通常、ここに記載されたシステムと組み合わせて使用可能である。
ここに記載されたシステムは、他の治療形態とともに使用可能である。これらとしては、従来の細胞毒性剤、および１より多い代謝生成物を不活性にするための多酵素送達の使用を含むものである。
同様に、抗体により腫よう部位に運ばれた酵素は、正常組織を保護する代謝生成物を不活性にし、かつ、プロドラッグを活性化するために、機能可能である。ここに記載したようなカルボキシペプチダーゼG2は、トリメトレキサートに対して保護されていない腫よう細胞を残すために、腫よう部位におけるフォリン酸を不活性にするものである。同様の腫よう局在酵素は、（バグシャウの文献（1989）:Brit.J.Cancer、60、275−281に記載されているように）細胞毒性マスタードを形成すべく、安息香酸プロドラッグを活性化することが可能である。
むろん、１以上のプロドラッグが活性薬剤に変換され、１以上の保護剤が腫よう部位において分解されるように、１以上の酵素が、同じ又は異なった抗体により、腫よう部位に向かうことが可能である。したがって、２以上の酵素が同じ抗体に結合可能である。
抗体−酵素接合体は一般的には、12−24時間以内に腫よう部位において最大濃度に達し、プラズマおよび他の体液からなくなるのに数日かかるので、抗体−酵素接合体をクリアにすることを促進し、血液中に存在する特異性酵素を不活性にするのに、優位であることを示している。達成可能ないくらかの手段が開示されている（国際出願89/10140）。
抗体−酵素接合体をクリアにする、または不活性にするために使用された抗体は、抗腫よう抗体における抗原結合部位、または酵素の活性部位、または抗原−酵素接合体における他の部位に向かうことが可能である。このような抗体は、さらなるガラクトース残基または他のクリアランスを促進するために添加された糖を有することが可能であり、または脱シアル酸することが可能である。抗体のガラクトシル化によって、肝細胞におけるガラクトースリセプターによる取り込みを通して、血液からの早急なクリアランスをおこなうこととなる。または、抗体−酵素接合体がガラクトシル化され、肝ガラクトースリセプターが、アジアロ−ボビンの上顎の下の唾液腺のムコ蛋白質または、肝ガラクトースリセプターに向かう抗体、またはガラクトースリセプターとの高いアフィニティを有する他の分子によりブロックされている。このブロック物質は、抗体−酵素複合体が腫よう部位に局在するように24時間までの時間、プラズマに保持されるが、ガラクトースリセプターブロックの停止後、ガラクトシル化された抗体−酵素が即座に、有効なガラクトースリセプターを経由してクリアにされる。
本発明を、トリメトレキサートおよびフォリン酸レスキューを用いた細胞毒性治療に関する実施例によって、図面と共に例解する。
図１は、トリメトレキサート、メトトレキサート、フォリン酸、CB3717、およびICID1694の構造を示す。
図２は、ターゲット細胞特異性部が抗体であり、カルボキシペプチダーゼG2に結合し；フォリン酸が細胞毒性剤のインヒビターであり；トリメトレキサートが前記細胞毒性剤である、本発明を示す図である。
実施例1:トリメトレキサートおよびフォリン酸レスキュを用いた細胞毒性治療
本発明は、正常な組織を抗葉酸剤効果から保護しつつ、腫よう部位において連続して抗葉酸剤を保持し続ける手段を提供する。第１ステップは、免疫抑制または免疫耐性誘導剤をイニシエートさせることであり、これは通常、本発明の化合物が投与される２日以上前に行なわれるものである。抗体−酵素接合体が非免疫原性である場合には、このステップは省略される。抗体−CPG2接合体、または化学的にまたはDNA組み替えによりCPG2または類似の酵素に接合した抗体フラグメントは、静脈に投与、または他の適当なルートで投与され、抗体はターゲットであるガンにより発現された腫よう抗原に向かう。数時間で腫よう部位に接合体が局在した後、第２抗体が与えられる。これは、酵素の活性部位に直接向かうことが可能であり、この場合、ガラクトース残基が第２抗体に結合し、肝細胞ガラクトースレセプタを経由してその早急なクリアランスがおこなわれる。他の、非腫よう部位からの接合体の早急なクリアランスのメカニズムは、すでに記載されている。酵素レベルが、プラズマにおいて、非常に低くなったり、または検知不可能なレベルになると、トリメトレキサートが、一定のプラズマ濃度を保持する目的で、ボーラスまたは連続注入により投与される。トリメトレキサートとともに、フォリン酸が、トリメトレキサート毒性から正常な細胞を保護するのに十分な投与レベルで、静脈注入により投与される。CPG2が局在する腫よう部位に達するフォリン酸は、細胞に入り、トリメトレキサート毒性から細胞を保護する前に、脱グルタミン化されて不活性にされる。このようにして、保護分子が腫よう部位において急速に分解される一方、正常な組織は、トリメトレキサートの作用から、フォリン酸によって保護されることが可能である。トリメトレキサートがCPG2によって分解されないような、他の抗葉酸剤が、トリメトレキサートにとってかわってもよい。
ジヒドロ葉酸還元酵素のトリメトレキサート妨害は、少なくとも部分的に、チミジンの内因性要因により回避することが可能であるため、チミジン−分解酵素は、抗体または他のリガンドによる腫よう部位をターゲットとすることも可能である。
細胞膜における腫よう−連合抗原の発現は不均一であるので、腫ようにおける抗体−酵素接合体の分布が均一ではないことが認識される。抗原の細胞外スペースへの分泌は、ターゲット抗原のより均一な分布を与えることとなり、分泌された抗原は、ターゲットとされた抗体−酵素接合体と複合体を形成する。腫よう細胞による抗体−酵素接合体の内在化は必要ではなく、必ずしも所望されるものでもない。
本発明による方法は、腫よう部位における葉酸アンタゴニストではなく、通常の代謝物（葉酸）およびレスキュ剤（フォリン酸）を分解する手段を導入することにより、フォリン酸レスキュおよびメトトレキサートを用いる通常の細胞毒性化学療法とは異なるものである。
ターゲットの抗原からの抗体の解離による、および生物学的分解による、腫よう部位からの酵素の損失は、幾日かの後、それらの部位において酵素のレベルが減少することとして現われる。酵素活性の減少速度は、踵ようおよび酵素のタイプによって様々である；カルボキシペプチダーゼ活性は、CEAに向かう抗体に結合した投与後、７日間、ヌードマウスにおけるヒト直腸ガン腫異種移植腫ようにおいて検知されるものである。したがって、約５日間、約24−48時間の中断を設けたトリメトレキサート治療を続けることは可能であるべきである。この間、さらなる抗体−酵素接合体が投与され、さらなるサイクルを用いて非腫よう部位からクリアにされる。ホスト抗体反応の効果的な制御または回避が行われるものである。
したがって、この提案は、断続的でない治療という結果にはならないが、従来の治療においては、治療期間の治療中断期間に対する比率が約1:7であったものが、約２−3:1に改善可能である。
実施例2:チミジレートシンセターゼインヒビターおよびチミジンレスキューを用いる細胞毒性治療
同様の原理が、他の抗代謝物治療に対して適用可能である。たとえば、CB3717およびICID1694（ジョッドレルらの文献（1991）、BJC、64、833−８）などのキー酵素のチミジレートシンセターゼをブロックする薬剤の開発に、近年、かなりの研究がなされている。このような薬剤は、正常な細胞におけるチミジレートシンセターゼもブロックする、従来の細胞毒性剤と同様の限定を受けやすい。これらの作用は、チミジンにより可逆性である。チミジン投与はしたがって、チミジレートシンセターゼインヒビターから正常な組織を保護するのに使用可能である一方、チミジンおよび内因性チミジンの保護効果が、腫よう細胞内にチミジンが入るのを抑制するチミジンキナーゼ、またはジヒドロチミン  デヒドロゲナーゼなどのチミジン分解酵素により腫よう部位に限定可能である。チミジンインヒビター酵素または薬剤は、抗体または他の適当なベクターにより送達される。
ジヒドロチミン  デヒドロゲナーゼは、正常なヒトのリンパ球から得ることが可能であり（シオタニおよびウエーバー（1989）の文献:Cancer  Res.49、1049−1094）、したがって、低い免疫原性の抗体−酵素接合体が、ヒトまたは’ヒューマナイズ’された抗体に接合することにより製造可能である。
アンチフォレート剤およびアンチ−チミジン剤の双方が、効果的な細胞毒性組み合わせとなる、適当なインヒビターおよびインヒビター分解酵素を用いて使用可能である。
実施例3:ADEPTを用いた組み合わせ治療
ADEPTコンセプトは、腫よう部位における不活性プリカーサーから細胞毒性薬剤を発生させるために、抗体−酵素接合体を使用する。本発明は、ADEPTとともに使用可能であり、この結果、組み合わせ化学療法の形態で、両活性薬物は、腫よう部位に閉じ込められているが、ある場合には活性剤を製造するために、および、その他の場合には保護剤を破壊するために、同じ又は異なった酵素を使用する。
ADEPT処理の場合には、じゅう毛上皮ガン腫（CC3）腫ようを有するヌードマウスが、抗HCG（国際出願88/07378に開示されているような、W14Fab2）に結合したCPG2の29単位を摂取し、24または48時間後、プロドラッグ（41μM/kg）を摂取した。保護剤の量は、抑制剤なしで最適な保護効果が得られるように調節される。
実施例4:肝転移および腹部腺ガン腫を有する患者の治療
大きな肝転移および直腸の再発腹部腺ガン腫を有する患者が、−２日目に、連続静脈注入により、免疫抑制剤、シクロスポリンを摂取した。０日目には、細菌性酵素カルボキシペプチダーゼG2に化学的に結合した、ガン胎児性抗原（CEA）を結合するA5B7として知られているモノクローナル抗体のＦ（ab'）２部を含有する化合物を摂取した。投与された酵素の量は、２時間かけて、静脈注入により、20000酵素単位（10000U/m2）であった。24時間（１日）後、酵素は、血液プラズマ中に1.0ユニット/ml存在し、次いで、そのクリアランスを促進するためにガラクトシル化されたモノクローナル抗体SB43を80mg（40mg/m2）摂取した。これは24時間かけて連続静脈注入することにより投与され、注入の最後の１時間、非ガラクトシル化されたSB43、10mgを注入液に添加した。SB43（２日）注入が完了した後、CPG2活性がプラズマ内に検知されなくなったとき、トリメトレキサートが、静脈ボーラスにより５％デキストローズに入れられた。フォリン酸、100mgの注入は、連続24時間注入により、この時点で開始された。トリメトレキサートは、４日間（２、３、４、５日目）、毎日投与された。
抗体酵素接合体で始まるサイクルは、７日目と14日目に再開された。毒性は、血清クレアチンの一時的な上昇、シクロスポリンを用いた公知の治療の複合により、確認される。細菌性酵素と腫よう抗体へのホスト抗体反応は、処理の３サイクルの完了後まで検知不可能である。
抹消血管白細胞および血小板計数は、この処理中および処理後、正常または正常以上のレベルのままである。その後の患者は、トリメトレキサートを多量に、またはフォリン酸を少量投与される。
ガン胎児性抗原（CEA）に対するマウスに発生した、モノクローナル抗体A5B7は、キャンサー  リサーチ  キャンペーン  テクノロジー、ケンブリッジ  ハウス、５−10ケンブリッジ  テラス、リージェンツ  パーク、ロンドンNW1  4JLから入手可能であり、ハルウッドらによる文献（1986）:Brit.J.Cancer  54、75−82および実施例５により開示された方法により調製されたものである。マウスのモノクローナル抗体SB43は、キャンサー  リサーチ  キャンペーン  テクノロジーから入手可能であり、シャーマらによる文献（1990）:Brit.J.Cancer  61、659−662および実施例８により開示された方法により調製されたものである。
実施例5:ガン胎児性抗原に対して反応するモノクローナル抗体の調製
精製したCEAが、結腸腫ようの転移部から調製された。６μCiμg-1の特異活性の125I標識が、ヨードゲン（iodogen）法により行われた。希釈緩衝液が、0.1％ウシ血清アルブミンを含有する0.15Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4として調製された。低いイオン強度における研究が、pH7.4で、0.02Mトリス−HCl緩衝液において行われた。
免疫化スケジュール：以下の方法を用いて、精製、加熱処理したCEAに対して、モノクローナル抗体A5B7を発生させた。1mgの精製CEAが、1mgml-1の濃度で、0.05Mリン酸塩緩衝液（pH7）中、85℃で35分間加熱された。10％の硫酸アルミニウムカリウム水溶液、1mlと混合した後、pHが、一定撹はんしながら、水酸化ナトリウム溶液を滴下することにより、6.5−７に調製された。室温で30分間撹はんした後、得られた沈殿は食塩水で３回洗浄された。次いで1010ホルマライズ（formalised）された百日咳菌（ウエルカム  リサーチ  ラボラトリーズから供給された）と混合した。３つの異なった免疫化スケジュールが使用された。
免疫化されたマウスからのひ臓細胞が、次いで、SP2/0−Ag14またはP3NS/1−Ag4−１ミエローマ細胞（フロー  ラボラトリーズ、英国）のいずれか、および、単細胞トランスファによりクローン化されたアンチ−CEAを産出するハイブリドーマを用いて、融合された。
実施例6:A5B7のＦ（ab'）２フラグメントの調製
この研究において使用されたモノクローナルアンチ−CEA（A5B7）は、前に開示されており、NCAとのその低い交差反応性、および、免疫精製および放射能標識におけるその安定性の観点から選択されるものである。Ｆ（ab'）２フラグメントは、ラモイおよびニソノフによる文献（1983）:J.Immunol.Methods  56、235−243の方法により調製された。セファクリルＳ−200において混合物を分離した後、フラクションは、7.5％ゲルを用いてSDS−PAGEにより分析された。Ｆ（ab'）２を含有するフラクションは、濃縮され、0.15Mリン酸塩緩衝液、pH7に対して透析された。完全なA5B7およびフラグメントの双方は、ニトロセルロース紙上のSDSゲルのエレクトロブロッティングし、125Iで標識化されたCEAを用いて上乗せすることにより、免疫学的に活性であり、比較的均一であることが示された。完全なA5B7およびそのＦ（ab'）２フラグメントは、クロラミルＴ方法により、放射能標識化し、それぞれ、5.6および5.2μCi/μｇの比活性とした。標識化された標品双方は、アミノ−セルロースに結合したCEAを用いて固相放射能線免疫検定により、免疫学的活性を保持することが示された（ロジャースらによる文献（1983）:Eur.J.Cancer  Clin.Oncol.19、629−639）。60％を越える活性が、各ケースにおいて保持された。
実施例7:A5B7−Ｆ（ab'）２のCPG2への接合
リン酸塩緩衝液（2.5ml、pH＝7.6、1mMのEDTA含有）におけるCPG2（2.15mg）の溶液に、カルボキシペプチダーゼに対して15モル過剰のエステルに相当する、４−（ｐ−マレイミドフェニル）洛酸Ｎ−ヒドロキシスシンイミドエステル（138μｇ）のDMF（13.5μｌ）溶液を添加した。溶液は、２時間放置した後、ゲルろ過（PD10カラム）により過剰なエステルを取り除き、3.2cmリン酸塩/EDTA緩衝液により溶出された−溶液１。
リン酸塩/EDTA緩衝液（1.2ml）中のA5B7−Ｆ（ab'）２（2.6mg）が、DMF（10μｌ）中のＳ−アセチルチオグリコール酸−Ｎ−ヒドロキシスシンイミドエステル（SATA）（90μｇ）で処理され、この混合物は、室温で１時間放置された。過剰のSATAが、ゲルろ過（PD10カラム、3.2cmリン酸塩緩衝液により溶出）により除去された。
使用の30分前に、ヒドロキシルアミン溶液（3.47g、Na3PO4Hおよび水酸化ナトリウム溶液により中性化され、930mgのEDTAを含有する水により100mlまでにする）が添加された−溶液２。
上記溶液１および２が次いで混合され、４℃で一昼夜放置された。濃縮（10倍）（ミニコン）後、接合体が、FPLC（フェルマシア）上でゲル−ろ過（Ｓ−12カラム）により単離された。接合体は、ミリポア0.22μｍフィルターを通してろ過された。蛋白質濃度が測定され、酵素活性が使用される前に分光光度検定法で測定された。
実施例8:CPG2に対して反応性のあるモノクローナル抗体の調製
CPG2に対して発生したモノクローナル抗体（SB43）が、二特異性抗体（次の実施例参照）を製造するために、および非腫よう部位における残余酵素活性のクリアランスと不活性化のために、使用される。
モノクローナル抗体は以下のように製造される。Balb/Cマウス（６−８週令）が、不完全フロイントアジュバントにおける50μgCPG2i.p.の２注入、次いで、完全フロイントアジュバントにおけるCPG2の２注入（50μgCPG2、各i.p.）を１箇月おきに、および融合の前２日間、２つの毎日注入（PBS、i.v.で50μｇおよび100μｇ）によって免疫化された。免疫すい臓細胞は、ケーラーおよびミルスタインの文献（1975）ネーチャー256、495のハイブリドーマ方法にしたがって、SP2/0ミエローマ細胞を分泌する非免疫グロブリンを用いて融合された。
アンチ−CPG2抗体の存在は、固相間接放射線免疫検定により検知された。0.05Mリン酸緩衝液におけるCPG2の１μgml-1溶液が、ポリビニルミクロタイタープレート（１ウエルあたり100ng）に置かれ、乾燥されて、メタノールを用いて固定し、0.05％トウイーン（Tween）および0.1％ウシ血清アルブミンを含有するPBS緩衝液で洗浄された。上澄み液または精製した抗体サンプルは、PBSで希釈され、CPG2コートミクロタイタープレート（１ウエルあたり100μｇ）において、37℃で４時間、次いで125Iで標識化されたラビットアンチ−マウスIgGを用いて１時間、培養された。ウエルは、３回、PBS−トウイーン緩衝液で、各ステージ間に洗浄され、最終洗浄後、各ウエルは、カットされ、ガンマーカウンターでカウントされた。
実施例9:CPG2およびCEAに対して反応性を有する二特異性抗体
A5B7産出ハイブリドーマ、CEAに対して反応性を有するモノクローナル抗体は、ハルウッドらによる文献（1986）:Brit.J.Cancer、54、75−82に開示されており、および、CPG2に対して反応性を有するモノクローナル抗体、SB43産出ハイブリドーマの発生方法は、実施例に開示されている。
融合プロトコールは、いずれか２つの抗体−産出ハイブリドーマを融合させるものであり、これは前に開示されている（クラークおよびウオルドマン（1987）による文献:J.Natl.Cancer  Inst.79、1393−1401）。ヒポキサンチン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ−陰性変異体を選択することによりヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（HAT）感受性をあらかじめ与えられた、１つの親（parental）ハイブリドーマの5X106から3.5X107細胞が、10mMヨードアセトアミドの致死量であらかじめ処理された第２親ハイブリドーマ細胞を用いて、50％（wt/vol）のポリエチレングリコール、1mlを用いて、11:1又は10:1の比率で融合した。過剰のポリエチレングリコールが洗浄除去され、細胞が、1mlあたり8X105から2X105の濃度で、５％（vol/vol）ウシ胎児血清を用いて補助された、重炭酸塩緩衝イスコブズ変性ダルベッコズ媒体（Iscove's  modified  Dulbecco's  medium、IMDM）における24−ウエルプレートにプレートされた。培養して24時間後、ハイブリッドハイブリドーマが、HATを含有する媒体において選択された。
実施例10:非腫よう部位における残余酵素活性の減少
腫よう部位ではなく、非腫よう部位における酵素−抗体接合体の酵素部を不活性にすることが望ましい。この効果を達成するある方法は、ガラクトース残基と接合した酵素部に対して発現する本発明の抗体の化合物を用いて処理されている患者に投与することである。
CPG2に向かうモノクローナル抗体（SB43）は、酵素を不活性にする。抗体が腫よう部位における酵素を不活性にするのを防除するために、さらなるガラクトース残基が、肝細胞上のプラズマおよびガラクトースリセプターから早急に不活性抗体を除去するが、静脈ルートにより与えられる時、プラズマ内において酵素を不活性にしておくことの可能なように、それに接合する。
ガラクトシル化SB43が、プラズマにおいて酵素活性を除去し、次いで、他の非組織における残余酵素活性を不活性にするための、非ガラクトシル化SB43の量を与えるために投与される。
モノクローナル抗体SB43は、以下のプロトコールを用いてガラクトシル化される。活性化された誘導体の株溶液は以下のようにして調製された。無水メタノール（10ml）中のシアノメチル2,3,4,6−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（シグマＣ−4141）［400mg］が、1mlの無水メタノール中の5.4mgのナトリウムメトキシドにより、室温で48時間処理された。この混合物は、グリースのついたストッパ付き25mlクイックフィット（商標）コニカルフラスコに保持された。
SB43（1.3mg/ml）の株溶液が、0.25Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5中で調製された。活性化されたガラクトシル誘導体の必要量の分割量（80、40、20、10μｌ）が、3mlのガラスアンプル内に分散され、窒素気流内でガラス状残さとなるまで乾燥された。抗体（200μｇ）溶液が、残さが溶解するまで添加された。室温にて２時間後、その溶液は、PBSの３回変化に対して、透析された。
上記容量を掛け合わせることによって、スケールアップして調製が行われた。
【図１】
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【図２】
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