【手続補正書】
【提出日】平成29年11月14日(2017.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) プラスモジウム属原虫を含むサンプルを準備する工程、及び
(b) 前記サンプル中の変異型K-13プロペラ核酸又はタンパク質の存在を検出する工程
を含む、プラスモジウム属原虫を遺伝子型決定する方法。
【請求項２】
(a) 患者由来の血液サンプルを準備する工程、及び
(b) 前記血液サンプル中の野生型又は変異型K-13プロペラ核酸又はタンパク質の有無を検出する工程
を含む、患者のプラスモジウム属原虫感染を検出する方法。
【請求項３】
前記プラスモジウム属原虫が熱帯熱マラリア原虫である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の変異型K-13プロペラ核酸の存在がシーケンシングにより検出される、及び/又はPCRにより検出される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル中の変異型K-13プロペラ核酸の存在又は野生型K-13プロペラ核酸の存在が、シーケンシングにより検出される、及び/又はPCRにより検出される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記プラスモジウム属原虫が野生型のK-13プロペラ核酸若しくはタンパク質配列を有するか、又は変異型のK-13プロペラ核酸若しくはタンパク質配列を有するかを判定する工程を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
K-13プロペラ核酸の変異が、K-13プロペラタンパク質内のアミノ酸残基の違いをもたらす非同義的SNPであり、前記非同義的SNPが、以下：
【表１】
2016537030.tif 000001
のうちの1つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
K-13プロペラ核酸を増幅するためのプライマー及び増幅産物を検出するための試薬を含む、プラスモジウム属原虫感染を検出するためのキット。
【請求項９】
変異型K-13プロペラ核酸を検出するためのプローブを含み、前記プローブが、蛍光標識、放射性標識、又は酵素標識で標識されていてもよい、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
Y493H、R539T、I543T、及びC580Yアレルをコードする変異型K-13プロペラ核酸を検出する、請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも1個の以下のプライマー
5'-cggagtgaccaaatctggga-3’ (配列番号：9)、
5'- gggaatctggtggtaacagc-3’ (配列番号：10)、
5'-cgccagcattgttgactaat-3’ (配列番号：11)、
5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’ (配列番号：12)、
5'- gccaagctgccattcatttg -3’ (配列番号：13)、及び
5'- gccttgttgaaagaagcaga -3’ (配列番号：14)
を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
F446I、N458Y、C469Y、Y493H、K503N、R539T、I543T、P553L、P574L、A578S、C580Y、及びD584Vアレルをコードする変異型K13プロペラ核酸を検出する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470stop、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E、及びD641Gアレルをコードする変異型K13プロペラ核酸を検出する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
少なくとも1組の以下のプライマーの対
ペアPCR1
5’ AGGTGGATTTGATGGTGTAGAAT 3’ (フォワード) (配列番号：15)
5’ CATACACCTCAGTTTCAAATAAAGC 3’ (リバース) (配列番号：16)
ペアPCR2
5’ AATTTCTTATACGTTTTTGGTGGTAA 3’ (フォワード) (配列番号：17)
5’ CTCTACCCATGCTTTCATACGAT 3’ (リバース) (配列番号：18)
ペアPCR3
5’ GGATATGATGGCTCTTCTATTATACCG 3’ (フォワード) (配列番号：19)
5’ ACTTCAATAGAATTTAATCTCTCACCA 3’ (リバース) (配列番号：20)
ペアPCR4
5’ ATGTCATTGGTGGAACTAATGGT 3’ (フォワード) (配列番号：21)
5’ TTAAATGGTTGATATTGTTCAACG 3’ (リバース) (配列番号：22)
ペアPCR5
5’ TTCAGGAGCAGCTTTTAATTACC 3’ (フォワード) (配列番号：23)
5’ CTGGTGAAAAGAAATGACATGAA 3’ (リバース) (配列番号：24)
ペアPCR6
5’ CCTTGTTGAAAGAAGCAGAATTT 3’ (フォワード) (配列番号：25)
5’ ATTCAATACAGCACTTCCAAAATAA 3’ (リバース) (配列番号：26)
を含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
以下のSNPの1つとハイブリダイズする少なくとも1個のプローブを含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【表２】
2016537030.tif 000002
【請求項１６】
a)  プラスモジウム属原虫のDNAを含む生体サンプルを準備する工程、
b)  場合により前記生体サンプルからDNAを抽出する工程、
c)  プラスモジウム属原虫のDNAを、100 bp〜300 bpの範囲の距離をおいてK13プロペラ核酸と特異的にハイブリダイズする少なくとも一組のプライマーと接触させ、インターカレート染料の存在下でPCR反応を行う工程、
d)  増幅産物を融解ステップに供する工程、
e)  前記増幅産物の融解プロファイルを解析することにより変異型アレル又は野生型アレルの存在を判定する工程
を含む、プラスモジウム属原虫を含む生体サンプルにおいて野生型K13プロペラ核酸又は変異型K13プロペラ核酸の存在を検出するための方法であって、
f)  F446I、G449A、N458Y、C469Y、W470stop、A481V、Y493H、K503N、S522C、V534A、R539T、I543T、G548D、P553L、V555A、A557S、R561H、K563R、V568G、P574L、A578S、C580Y、F583L、D584V、V589I、Q613E、及びD641Gアレルをコードする変異型K13プロペラ核酸を検出する工程をさらに含んでもよい、方法。
【請求項１７】
検出されるK-13プロペラ核酸の変異が非同義的SNPであり、前記非同義的SNPが、以下：
【表３】
2016537030.tif 000003
のうちの1つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
変異型K13プロペラ核酸をPCR反応により増幅する工程及び増幅した核酸を変異型K13プロペラに特異的なプローブと接触させる工程を含む、プラスモジウム属原虫を含む生体サンプルにおいて変異型K13プロペラ核酸の存在を検出するための方法であって、前記増幅する工程を、少なくとも1個の以下のプライマー
5'-cggagtgaccaaatctggga-3’ (配列番号：9)、
5'- gggaatctggtggtaacagc-3’ (配列番号：10)、
5'-cgccagcattgttgactaat-3’ (配列番号：11)、
5'-gcggaagtagtagcgagaat-3’ (配列番号：12)、
5'- gccaagctgccattcatttg -3’ (配列番号：13)、及び
5'- gccttgttgaaagaagcaga -3’ (配列番号：14)
を用いて行ってもよい、方法。
【請求項１９】
変異型K13プロペラ核酸又はタンパク質の存在が、前記患者がアルテミシニン誘導体耐性のプラスモジウム属原虫に感染していることを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
アルテミシニン誘導体耐性のプラスモジウム属原虫に感染している前記患者に、通常のプロトコルよりも長期のアルテミシニン誘導体に基づく治療を施す工程及び/又は別の抗マラリア薬、好ましくはキニーネ、クロロキン、又はメフロキンを投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アルテミシニン誘導体耐性のプラスモジウム属原虫に感染している前記患者に、新規抗マラリア薬に基づく治療を施す工程、及び前記治療の施行後に請求項２に規定する工程a)及びb)を繰り返す工程をさらに含み、変異型K13プロペラ核酸又はタンパク質が存在しないことが、前記患者がもはやアルテミシニン誘導体耐性のプラスモジウム属原虫に感染していないこと、及び前記治療がアルテミシニン誘導体耐性のプラスモジウム属原虫に対して有効であることを示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブが蛍光ビーズに結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブを変異型K13プロペラドメイン核酸に結合させる工程、及び前記結合したK13プロペラドメイン核酸を、前記結合したK13プロペラドメイン核酸に結合する第二のプローブを用いて検出する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。