【手続補正書】
【提出日】平成29年1月30日(2017.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を作製するための方法であって、該方法は、
ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程；
２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で該胚様体を培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含み；かつ（ｄ）約１〜約３％のノックアウト血清代替物を含む第２の培地中の、マトリゲルがコーティングされた組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中のＲＰＥ細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中のＲＰＥ細胞を培養する工程；
次いで、約５％の胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む第４の（ＲＰＥ）細胞培地中で該細胞を培養する工程
を含み、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を作製する、方法。
【請求項２】
前記Ｗｎｔ経路阻害剤のうちの１つが、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド（ＣＫ１−７）、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ）１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４またはＳＦＲＰ−５である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｎｏｄａｌ経路阻害剤が、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物（ＳＢ−４３１５４２）、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）または２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５２を含む、請求項１または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の培地が、血清の非存在下においてダルベッコ改変イーグル培地およびＦ１２を約１：１の比で含む網膜細胞誘導培地であるか、またはｂＦＧＦの前記阻害剤が、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）もしくは６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の培地が、約０．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１を含むか、または該第２の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７および約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５４２を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の培地が、約５０ｎｇ／ｍｌのＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第３の培地が、約１００〜約２００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａを含み、
かつ／あるいは該第３の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを含み、
かつ／あるいは前記カノニカルＷｎｔ阻害剤が、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）であり、特に該第３の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を含み、
かつ／あるいは前記非カノニカルＷｎｔ誘導物質が、ＷＮＴ５ａであり、
かつ／あるいは第４の（ＲＰＥ）培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ５ａ、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１、約５μＭシクロパミンおよび／もしくは約１０μＭのＳＵ５４０２を含むか、または工程（ａ）が、約１．５％ノックアウト血清代替物の存在下において該細胞を培養する工程を含み、
かつ／あるいは前記基材が、トランスウェルである、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト胎児ＲＰＥ細胞においてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８およびＮａｎｏｇを発現させることにより、前記ヒト人工多能性幹細胞を作製する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト人工多能性幹細胞が、ＲＰＥ細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸を含み、特に前記網膜特異的プロモーターが、チロシナーゼプロモーターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚様体が、前記第１の培地中で約４８時間培養され、かつ／または該胚様体が、前記第２の培地中で約１８〜約２４日間培養され、特に該胚様体が、該第２の培地中で約３週間培養され、かつ／または前記分化中のＲＰＥ細胞が、前記第３の培地中で約１８〜約２４日間培養され、特に該分化中のＲＰＥ細胞が、該第３の培地中で約３週間培養され、かつ／または該細胞が、前記第４の（ＲＰＥ）培地中で約１２〜約１６日間培養され、特に該細胞が、該第４の（ＲＰＥ）培地中で約２週間培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＰＥ細胞を、約５％胎児血清を含む第４の（ＲＰＥ）培地中で維持する工程をさらに含み、特に該細胞が、約５％胎児血清を含む第４の（ＲＰＥ）培地中で該ＲＰＥ細胞を約６〜約８週間維持する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
目的の作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化を増加させるかを判定するための方法であって、該方法は、
ＲＰＥ細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第２のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；かつ（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含む第２の培地中の組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中のＲＰＥ細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中のＲＰＥ細胞を培養する工程；
約５％胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む第４の（ＲＰＥ）培地中で、該目的の作用物質の存在下において該細胞を培養し；それにより、ヒトＲＰＥ細胞を作製する工程；ならびに
該ＲＰＥ細胞における該第１のマーカーの発現を該第２のマーカーの発現と比べて評価する工程
を含み、ここで、該第２のマーカーと比較したときの該第１のマーカーの発現の増加は、該作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化を増加させることを示す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法であって、該方法は、
ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程；
２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で該胚様体を培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含み；かつ（ｄ）約１〜約３％のノックアウト血清代替物を含む第２の培地中の、マトリゲルがコーティングされた組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程；
次いで、約５％の胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞培地中で該細胞を培養する工程
を含み、それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する、方法。
（項目２）
前記Ｗｎｔ経路阻害剤のうちの１つが、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド（ＣＫ１−７）、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ）１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４またはＳＦＲＰ−５である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７を含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｎｏｄａｌ経路阻害剤が、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物（ＳＢ−４３１５４２）、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）または２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５２を含む、項目１または項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第１の培地が、血清の非存在下においてダルベッコ改変イーグル培地およびＦ１２を約１：１の比で含む網膜細胞誘導培地である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
ｂＦＧＦの前記阻害剤が、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）または６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記第２の培地が、約０．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記第１の培地が、約５０ｎｇ／ｍｌのＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第２の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７および約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５４２を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記第３の培地が、約１００〜約２００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記第３の培地が、約７５〜１５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記カノニカルＷｎｔ阻害剤が、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記第３の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記非カノニカルＷｎｔ誘導物質が、ＷＮＴ５ａである、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記第４の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ５ａ、７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１、約５μＭシクロパミンおよび／または約１０μＭのＳＵ５４０２を含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
工程（ａ）が、約１．５％ノックアウト血清代替物の存在下において前記細胞を培養する工程を含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記基材が、トランスウェルである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
ヒト胎児網膜色素上皮細胞においてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８およびＮａｎｏｇを発現させることにより、前記ヒト人工多能性幹細胞を作製する工程を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト人工多能性幹細胞が、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記網膜特異的プロモーターが、チロシナーゼプロモーターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
目的の作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法であって、該方法は、
網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第２のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；かつ（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含む第２の培地中の組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程；
約５％胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む第４の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で、該目的の作用物質の存在下において該細胞を培養し；それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する工程；および
該網膜色素上皮細胞における該第１のマーカーの発現を該第２のマーカーの発現と比べて評価する工程
を含み、ここで、該第２のマーカーと比較したときの該第１のマーカーの発現の増加は、該作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す、方法。
（項目２３）
目的の細胞が網膜色素上皮細胞であることを立証するための方法であって、該方法は、該目的の細胞における、ＭＩＴＦ（ＮＭ＿０００２４８）、ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）、ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）、ＴＦＥＣ（ＮＭ＿０１２２５２）、ＣＤＨ１（ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ３（ＮＭ＿００１７９３）、ＣＬＤＮ１０（ＮＭ＿１８２８４８）、ＣＬＤＮ１６（ＮＭ＿００６５８０）、ＣＬＤＮ１９（ＮＭ＿１４８９６０）、ＢＥＳＴ１（ＮＭ＿００４１８３）、ＴＩＭＰ３（ＮＭ＿０００３６２）、ＴＲＰＭ１（ＮＭ＿００２４２０）、ＴＲＰＭ３（ＮＭ＿０２０９５２）、ＴＴＲ（ＮＭ＿０００３７１）、ＶＥＧＦＡ（ＮＭ＿００３３７６）、ＣＳＰＧ５（ＮＭ＿００６５７４）、ＤＣＴ（ＮＭ＿００１９２２）、ＴＹＲＰ１（ＮＭ＿０００５５０）、ＴＹＲ（ＮＭ＿０００３７２）、ＳＩＬＶ（ＮＭ＿００６９２８）、ＳＩＬ１（ＮＭ＿０２２４６４）、ＭＬＡＮＡ（ＮＭ＿００５５１１）、ＲＡＢ２７Ａ（ＮＭ＿１８３２３６）、ＯＣＡ２（ＮＭ＿０００２７５）、ＧＰＲ１４３（ＮＭ＿０００２７３）、ＧＰＮＭＢ（ＮＭ＿００２５１０）、ＭＹＯ６（ＮＭ＿００４９９９）、ＭＹＲＩＰ（ＮＭ＿０１５４６０）、ＲＰＥ６５（ＮＭ＿０００３２９）、ＲＢＰ１（ＮＭ＿００２８９９）、ＲＢＰ４（ＮＭ＿００６７４４）、ＲＤＨ５（ＮＭ＿００２９０５）、ＲＤＨ１１（ＮＭ＿０１６０２６）、ＲＬＢＰ１（ＮＭ＿０００３２６）、ＭＥＲＴＫ（ＮＭ＿００６３４３）、ＡＬＤＨ１Ａ３（ＮＭ＿０００６９３）、ＦＢＬＮ１（ＮＭ＿００１９９６）、ＳＬＣ１６Ａ１（ＮＭ＿００３０５１）、ＫＣＮＶ２（ＮＭ＿１３３４９７）、ＫＣＮＪ１３（ＮＭ＿００２２４２）、ＣＦＴＲ（ＮＭ＿０００４９２）を含むマーカーセットの発現をアッセイする工程；該目的の細胞におけるｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現をアッセイする工程；
該目的の細胞の分極をアッセイする工程；
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程；および
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
を含み、ここで、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位、ならびに約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、方法。
（項目２４）
前記目的の細胞における、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現をアッセイする工程；
該目的の細胞におけるｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現をアッセイする工程；
該目的の細胞の分極をアッセイする工程；
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程、および；
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
をさらに含み、ここで、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位ならびに約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記胚様体が、前記第１の培地中で約４８時間培養される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記胚様体が、前記第２の培地中で約１８〜約２４日間培養される、項目１〜２１または２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記胚様体が、前記第２の培地中で約３週間培養される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第３の培地中で約１８〜約２４日間、項目１〜２１または２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第３の培地中で約３週間、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で約１２〜約１６日間培養される、項目１〜２１または２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で約２週間培養される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記網膜色素上皮細胞を、約５％胎児血清を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で維持する工程をさらに含む、項目１〜２１または２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、約５％胎児血清を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で前記網膜色素上皮細胞を約６〜約８週間維持する工程を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
発現をアッセイする工程が、マルチプレックスアッセイの使用を含む、項目２３または２４に記載の方法。
（項目３５）
項目１〜２１または２５〜３４のいずれか１項に記載の方法によって作製された網膜色素上皮細胞。
（項目３６）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目３５に記載の網膜色素上皮細胞。
（項目３７）
有効量の項目３５または項目３６に記載の網膜色素上皮細胞を含む薬学的組成物。
（項目３８）
医薬を製造するための、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
網膜変性疾患、網膜機能不全、網膜退化、網膜損傷または網膜色素上皮の喪失を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目３７に記載の薬学的組成物を該被験体に投与し、それにより、該被験体を処置する工程を含む、方法。
（項目４０）
前記網膜変性疾患が、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性（ｈｅｒｉｄｉｔａｒｙ）黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記網膜損傷が、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害によって引き起こされる、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記網膜色素上皮細胞が、眼の網膜下腔、硝子体腔、網膜の内側もしくは外側、網膜周辺部または脈絡膜内に導入される、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記網膜色素上皮細胞が、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入される、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記網膜色素上皮細胞が、細胞外マトリックス上に接着されている、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記網膜色素上皮細胞が、生分解性ポリマーなどの基材上に提供されている、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。