(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたエプスタイン・バーウイルス構造タンパク質の少なくとも一部と精製されたエプスタイン・バーウイルスＥＢＮＡタンパク質の少なくとも一部の組み合わせからなることを特徴とする、エプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出用診断試薬。
【請求項２】
ウイルス構造タンパク質がＭＡ−タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の診断試薬。
【請求項３】
ＭＡ−タンパク質がＭＡ−ｇｐ３５０／２２０タンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載の診断試薬。
【請求項４】
ウイルス構造タンパク質がＶＣＡ−タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の診断試薬。
【請求項５】
ＶＣＡ−タンパク質がＶＣＡ−ｐ１８タンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載の診断試薬。
【請求項６】
前記試薬が、配列番号１に示すようなアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドからなることを特徴とする、請求項５に記載の診断試薬。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号２、３又は４に示すようなアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の診断試薬。
【請求項８】
ＥＢＮＡタンパク質がＥＢＮＡ−１タンパク質であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の診断試薬。
【請求項９】
前記試薬が、配列番号５に示すようなアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドからなることを特徴とする、請求項８に記載の診断試薬。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号６、７、８又は９に示すようなアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の診断試薬。
【請求項１１】
配列番号４に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号９に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドを含む請求項４に記載の診断試薬。
【請求項１２】
前記試薬が、配列番号９に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドからなることを特徴とする、請求項３に記載の診断試薬。
【請求項１３】
サンプル中のエプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出方法であって、前記サンプルを請求項１から１２のいずれか一項に記載の診断試薬と接触させ、前記試薬と抗体との間で形成された免疫複合体を検出することを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の診断試薬を含むことを特徴とする、サンプル中のエプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はエプスタイン・バーウイルスに対する抗体を検出するための診断試薬及びサンプル中のエプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出方法に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＥＢＶはアフリカ（地方病即ちｅ）型バーキット・リンパ腫（ＢＬ）に関連して最初に発見された偏在性ヒトヘルペスウイルスである。その後、該ウイルスは鼻咽頭癌（ＮＰＣ）にも関連することが知見され、感染性単核細胞症（ＩＭ）の原因物質であることが示された。感染は通常は初期幼年期に生じ、一般に無症状であるが、軽い症状を示す場合もある。しかしながら、青年期又は成人期の感染は、末梢の非定型リンパ球の存在により特定されるＩＭを誘発し得る。これらのリンパ球の大部分はＴリンパ球であるが、ＥＢＶに感染したＢリンパ球の小集団も含まれる。Ｂリンパ球の感染はｉｎ  ｖｉｔｒｏでも達成され得る。このような細胞は培養中にトランスフォームして無制限に増殖し、「不死化」、「潜伏感染」又は「増殖トランスフォーム」すると言われている。知られている限りでは、ＥＢＶに感染した個体は総て一生、潜伏感染し続ける。これは、循環末梢血液リンパ球中の少数のＥＢＶ−ゲノム陽性トランスフォームＢ細胞が一生継続して存在し、中咽頭に継続的且つ周期的にウイルスを放出することを意味する。
【０００３】
症例の大部分は、ＥＢＶ感染はリンパ増殖疾患を誘発し、該疾患は一時的に衰弱をもたらす場合もあるが、常に良性且つ自己限定的である。しかしながら、免疫抑制された個体では、悪性変換する場合もある。これは、故意に免疫抑制された個体で生じ、特に臓器移植を受け、シクロスポリンＡで治療した幼児、又は便宜的にはＨＩＶ感染個体の場合、又は遺伝学的にはＸＬＰ（ｘ連関リンパ増殖症候群）遺伝子を有する男子患者の場合などに生じる。これらの場合、悪性変換はＥＢＶ感染Ｂ細胞のポリクローナル増殖に起因する。更に、このような患者では口腔毛状白斑症の病巣にウイルスの無制御な上皮複製が検出可能である。従って、免疫応答はＥＢＶ感染の抑制に主要な役割を果たす。
【０００４】
細胞又は組織中のＥＢＶの存在は、ウイルスゲノムの検出によるか又は、ＥＢＶ感染細胞中に普遍的に発現される唯一の潜伏感染に関連するタンパク質産物であるＥＢＮＡ−１タンパク質の実証により立証することができる。
【０００５】
上述のように、ＥＢＶはヘルペスウイルスの１員である。ＥＢＶは以下の構造特徴を有する。
【０００６】
−ＥＢＶゲノムは直鎖状２本鎖ＤＮＡ分子（１７２，０００塩基対）から構成される。
【０００７】
−ビリオンは正二十面体キャプシドにより包囲されたコア（タンパク質及びＤＮＡ）とキャプシドを包囲する膜エンベロープとから構成される。正二十面体キャプシドは六量体及び五量体キャプソメアから構成される。膜エンベロープは外側表面にスパイクを有するタンパク質／脂質二重層膜から構成される。キャプシド殻とエンベロープとの間のスペースはテグメントと呼称される非晶質タンパク質で充填されている。
【０００８】
−全ヘルペスウイルスと同様に、ＥＢＶは一次感染後にその宿主に潜伏終生感染をもたらすことが可能である。この潜伏は宿主免疫系により制御されるＥＢＶとそのヒト宿主との間の完全な均衡を意味する。
【０００９】
従来のほとんどの生化学及び生物学研究はＢ９５−８（マーモセット細胞系中で産生されるトランスフォーミングウイルス）、Ｐ３ＨＲ１（バーキット・リンパ腫細胞系により産生される非トランスフォーミングウイルス）及びＲａｊｉ（バーキット・リンパ腫細胞系における潜伏ウイルス）の３種の原型ＥＢＶ株で行われている。
【００１０】
過去数年の間に原型ウイルス株Ｂ９５−８の完全なＤＮＡ配列が決定された。この配列の分析の結果、８０を越えるオープンリーディングフレームが確認された（Ｂａｅｒら，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０，  ｐ．２０７−２１１）。
【００１１】
ＥＢＶは、生物学的特徴（潜伏感染）が慣用ウイルス分析に適していないため、その生物学的研究には特殊な問題がある。更に、その細胞及び宿主範囲は一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養できないヒト（及び数種の高等霊長類）Ｂリンパ球及び上皮細胞に事実上制限されている。更に、ウイルスがその中で溶菌的に複製する細胞である完全許容細胞型がないので、大量のウイルスを製造する能力は著しく制限されていた。
【００１２】
Ｂ９５−８、Ｐ３ＨＲ１及びＲａｊｉ単離株のＤＮＡ分子は、詳細な制限エンドヌクレアーゼマッピング、大腸菌プラスミド及びバクテリオファージλへのクローニング、並びにヌクレオチド配列決定のための原型であった。
【００１３】
ＥＢＶ−ゲノムは固有のＤＮＡエレメントとタンデムに反復するＤＮＡエレメントを有する単一の二重鎖ＤＮＡ分子構造から構成される。ＤＮＡ分子の各末端はゲノムの共有結合及び閉環を可能にする多重末端配列を含む。ウイルス粒子においてＥＢＶ−ゲノムは直鎖形態でのみ検出可能である。他方、ＥＢＶ−ゲノムは潜伏感染細胞の核の内側で環状エピソームとして存在し、場合によっては宿主細胞染色体に組込まれる。
【００１４】
内部反復配列ＩＲ１〜ＩＲ４はＥＢＶ−ゲノムを５つのユニークな領域に分離する。Ｕ２及びＵ３領域はＥＢＶ単離株により著しく異なり、前者はＥＢＶのＰ３ＨＲ−１株ではほぼ完全に欠失している。
【００１５】
ＥＢＶ読み枠の命名法はウイルスゲノム中のその位置に基づく。名称は発現が開始するＢａｍＨ１又はＥｃｏＲ１制限フラグメントの頭文字で始まる。名称の３番目の文字は、発現が標準地図上で左向きか右向きかに従ってＬ又はＲである（従って、ＢＬＬＦ２はＢａｍＨ１制限フラグメントＬで開始する第２番目の左向き読み枠である）。
【００１６】
ＥＢＶの産生サイクルにおけるウイルス抗原の血清学的分類は種々の蛍光法に基づく。
【００１７】
固定した潜伏感染Ｂ細胞（例えばＲａｊｉ細胞）の核中で抗補体免疫蛍光法により特異的に検出される抗原をエプスタイン・バーウイルス核内抗原（ＥＢＮＡ）として分類する。
【００１８】
化学的又はウイルス因子によりウイルス遺伝子発現が活性化されると、ウイルスＤＮＡ合成の阻害により合成を妨げられない初期抗原（ＥＡ）類が検出される。使用する固定液の型（メタノール又はアセトン）に依存してＥＡＲ及びＥＡＤの異なる２組のＥＡが検出可能である。ＥＡは誘導細胞の細胞質及び核内で間接免疫蛍光により検出可能である。ウイルスＤＮＡ合成の開始後（及びこの合成に依存して）間接免疫蛍光により検出可能な（膜抗原（ＭＡ）及びウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）を含む）ウイルス構造タンパク質が合成される。ウイルス産生細胞（例えばＰ３ＨＲ１細胞）の細胞質及び核内では１組のＶＣＡが間接免疫蛍光により検出可能である。ウイルス産生のために誘導された生存可能な感染細胞の表面には１組の抗原（ＭＡ）が間接免疫蛍光により検出可能である。これらの抗原はウイルスエンベロープ上にも検出することができ、ウイルス中和の重要な標的である。
【００１９】
ヒト血清中のＥＢＶ特異的抗体の検出は、Ｈｅｎｌｅ及びＨｅｎｌｅ（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ５，  ５５１−５６５，  １９７４）により記載されている血清学的方法により常法で実施することができる。
【００２０】
生化学及び免疫蛍光データに基づき、５種類の異なる抗原分子を区別することが可能である。種々のウイルスポリペプチドはその分子量により呼称され、全ＥＢＶ−タンパク質を独自に記述できるような共通の命名法は確立されていない。
【００２１】
異なる５群の抗原は、
Ａ．潜伏段階中に発現される抗原群（ＥＢＮＡ及びＬＭＰ）、
Ｂ．ゲノム活性化及びウイルス複製の初期誘導に関与する抗原群（ＩＥＡ）、
Ｃ．ＩＥＡ−遺伝子産物により誘導され、ウイルスＤＮＡの複製に必要であり、大部分がウイルス酵素である抗原群（ＥＡ）、
Ｄ．ウイルス粒子の構造成分であり、ウイルスＤＮＡ合成の開始後にウイルス複製サイクルで後期発現される抗原群（ＶＣＡ）、
Ｅ．感染細胞の細胞膜中で発現される抗原群（ＭＡ）である。
【００２２】
Ｄ及びＥ群は所謂「ウイルス構造タンパク質」である。
【００２３】
エプスタイン・バーウイルス核内抗原（ＥＢＮＡ）
読み枠ＢＫＲＦ１内でコードされるエプスタイン・バーウイルス核内抗原１（ＥＢＮＡ−１）は、全潜伏感染腫瘍関連細胞中で普遍的にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現される唯一のＥＢＶコード化タンパク質であり、ＤＮＡ複製及び遺伝子活性化の機序の研究のために重要な標的分子を形成する。
【００２４】
２種のＥＢＶ陰性ヒト血清に比較して４種のＥＢＶ陽性ヒト血清を使用し、イムノブロッティング及びラジオイムノ電気泳動を行った場合、ＥＢＶ−陽性細胞系ではＥＢＮＡ−１が同定されたが、３種のＥＢＶ陰性細胞系では同定されなかった。同定された抗原は、分析した細胞系により異なる６５，０００〜７３，０００の分子量を有していた。補体固定抗原は予め２００倍以上部分精製しておいたが、イムノブロッティングにより同定された６５ｋＤａ  ＥＢＮＡと同時精製されることが判明した。ＥＢＮＡは抗補体免疫蛍光（ＡＣＩＦ）で特定されるので、６５ｋＤａ抗原はＥＢＮＡの主要成分であると予想された。
【００２５】
マウス細胞をＥＢＶ  ＤＮＡのクローン化ＢａｍＨＩ  Ｋ制限酵素フラグメントでトランスフェクトすることによりＥＢＮＡ遺伝子をマッピングした。マウス繊維芽細胞系を優性選択可能なマーカーと共にこのフラグメントでトランスフェクトした場合、ＡＣＩＦでＥＢＮＡ陽性ヒト血清では同定されるが、ＥＢＮＡ陰性ヒト血清では同定されない核内抗原が安定的に発現された。その後の研究で、Ｂａｍ  Ｋトランスフェクト細胞はＢ９５−８細胞のＥＢＮＡ−１ポリペプチドと同時に泳動する７８ｋＤａポリペプチドを発現することが判明した。
【００２６】
より最近の研究によると、グリシン−アラニン反復領域の内側にはヒト血清に対して高反応性のｐ６２又はｐ１０７と通常呼称される免疫優性領域が存在することが判明した。しかしながら、このｇｌｙ−ａｌａフラグメントは正常ヒトタンパク質内に含まれることが示され、自己抗体の標的であることが判明した。更に研究を進めた結果、特に活性なＣＭＶ、ＨＳＶ又はトキソプラズマ感染患者からの血清中のＩｇＭ抗体は場合によりこのペプチドに対して交差反応を示すことが判明した。更に、大腸菌中で発現されるＥＢＮＡ−１のＡＡ４６１−６４１をコードする２８ｋＤのＣ末端フラグメントはヒト血清抗体に対して反応性があることが判明した。更に研究が進められたが、診断法において無傷のＥＢＮＡ−１タンパク質の代わりに使用可能なＥＢＮＡ−１タンパク質のより小さいフラグメントは現時点では同定されていない。
【００２７】
ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）
この抗原複合体については、使用するポリアクリルアミドゲル系、細胞系及び化学的インデューサー並びに使用する血清が異なるため、異なる試験で同定したＥＢＶ特異的タンパク質を比較するのは困難であるという問題がある。
【００２８】
Ｄｏｌｙｎｉｕｋら（１９７９）は、精製ビリオンに関連する合計３３個のタンパク質を記載している。界面活性剤による分別可溶化によると、ヌクレオキャプシドは少なくとも７個のタンパク質から構成されると予想される。ＶＣＡ複合体の重要な成分は主要キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）である。ＥＢＶ−ＭＣＰはウイルスゲノムのＢｃＬＦ１読み枠内でコードされ（Ｂｅａｒら，  １９８４）、ｐＩ７．５〜９．０のＥＢＶ産生細胞系中で１５３〜１６０ｋＤａの非グリコシル化タンパク質として発現される。このタンパク質は細胞質中で可溶性形態で合成された後、核に輸送されてキャプシドに融合すると、もはや界面活性剤により可溶化されない。別の主要ＶＣＡ成分は１２５ｋＤａの分子量を有しており、グリコシル化されている。このタンパク質はウイルスゲノムのＢＡＬＦ４読み枠内でコードされる。この糖タンパク質は最初はＶＣＡ成分として分類されたが、最近の知見によると実際には細胞質及び核膜構造に関連すると思われる。
【００２９】
従来報告されている実験（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ及びＰ．Ｈｅｒｂｒｉｎｋ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，  ２１，  １３３−１４６，  １９８８）は種々のＥＢＶ疾患に関して診断的に関連するＥＢＶマーカータンパク質の同定及び特定を目的とするものであった。
【００３０】
これは、ＶＣＡ／ＥＡ又はＥＡの発現のために誘導されたウイルス産生細胞系ＨＨ５１４−Ｃ１６（Ｐ３ＨＲ１の再追加誘導体）と、ＥＢＶ陰性細胞系Ｒａｍｏｓ及びＢｊａｂとから調製された抗原を含むイムノブロットストリップを使用することにより実施された。ＥＢＶゲノム（完全に）潜伏状態で含む細胞系であるＸ５０−７及びＪＣ−５を使用してＥＢＮＡ／ＬＭＰを特定的に試験することができる。
【００３１】
健康な血清反応陽性供血者の血清と、ＩＭ患者及び慢性ＩＭ患者又はＥＢＶ関連腫瘍様鼻咽頭癌患者の血清中でＥＢＶ抗体応答のパターンが研究された。特定のＥＢＶ−ゲノム産物に対して反応性のポリクローナル及びモノクローナル抗体を使用して、この実験系で検出されるタンパク質バンドのいくつかを特定することができる。しかしながら、これらの研究は所定の分子量を有するタンパク質又はポリペプチドしか記載していない。これらのタンパク質をコードするＥＢＶゲノム上の配列については何ら開示していない。更に、イムノブロット上の免疫反応性バンドが同一分子量の単一タンパク質との反応性に起因するのか、あるいは複数のタンパク質との反応性に起因するのかについても解明されていない。
【００３２】
イムノブロット法を使用すると、１８ｋＤａの分子量を有するＥＢＶ抗原を検出することが可能である。このタンパク質はウイルスＤＮＡ合成を阻止するためにホスホノ酢酸（ＰＡＡ）を使用する場合には発現されず、抗ＶＣＡ抗体を含む全血清により検出されるので、ＶＣＡ関連成分であると思われる。別のＶＣＡ成分は４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。ウイルスキャプシド抗原の多くは核ペレットに関連付けられる。
【００３３】
膜抗原（ＭＡ）
エプスタイン・バーウイルス膜抗原（ＥＢＶ−ＭＡ）はビリオンエンベロープ内で感染細胞外層膜及び細胞内膜構造上に存在する。数種の糖タンパク質と１種の非グリコシル化タンパク質はＢＬＬＦ１読み枠内でコードされるＭＡ−複合体（最も研究されているのはｇｐ３５０／２２０）を構成することが記載されている。ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０はＥＢＶを細胞レセプターＣＲ２（ＣＤ２１）に結合するために不可欠であり、抗ｇｐ３５０／２２０抗体がビリオン上でｇｐ３５０／２２０と結合すると、前者の結合を妨げ、ＥＢＶの細胞侵入を阻止する（ウイルス中和）。他方、抗ｇｐ３５０／２２０抗体が細胞形質膜上でｇｐ３５０／２２０と結合すると、補体又はＴキラーリンパ球の活性化によりウイルス感染細胞の溶解を媒介し得る。この機序により、ウイルスエピトープも破壊され（ウイルス溶菌）、ウイルス感染性が破壊される。生きたＥＢＶ産生細胞上の間接免疫蛍光又は精製形態のｇｐ３５０／２２０及び他のＭＡ複合体成分を使用する酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりこれらのタンパク質に対する種々の抗体がヒト血清中で検出されている。
【００３４】
このような抗体はウイルス侵入及び分散を阻止することにより宿主防御において重要な役割を果たし得る。従って、ＥＢＶ−ＭＡ、特にｇｐ３５０／２２０はＥＢＶ感染の予防用サブユニットワクチンの開発を目的とする広範な研究の対象となっている。
【００３５】
このアプローチは動物モデルで実現可能であることが示されており、最近では中国で小規模の実地試験に導入され、表面的な成功を収めている。
【００３６】
現在、ＥＢＶ特異的血清診断はかなり主観的な免疫蛍光試験により実施されている。より単純で標準的な実験（例えばＥＬＩＳＡ）への発展が阻まれているのは、標準ウイルス産生細胞系を使用してウイルス抗原の大量生産及び精製が不可能なためである。
【００３７】
これを実現するための唯一の手段は別の方法で製造されたＥＢＶ抗原を使用することであると思われる。これらのＥＢＶ抗原は遺伝子工学技術又は合成ペプチド技術を使用して製造することができる。
【００３８】
ＥＢＶ感染の種々の段階で信頼性の高い診断を実施できるように特異的且つ高感度の方法を開発するためには、免疫優性ウイルスタンパク質及びそのエピトープを同定することが極めて重要である。
【００３９】
エプスタイン・バーウイルスに対する抗体を検出するために使用可能なタンパク質及びペプチドは、参考資料として本明細書の一部とする本願と同一所有権者の２件の同時継続出願に記載されている。これらの出願の一方はＥＢＶゲノムのＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１読み枠内で夫々コードされるＶＣＡ−ｐ１８タンパク質及びＶＣＡ−ｐ４０タンパク質に係り（ＥＰ  ０  ５７４  ０４８）、他方の出願（ＥＰ  ９２２０２７９７．４）はＢＫＲＦ１読み枠内でコードされるＥＢＮＡ−１タンパク質に関する。
【００４０】
膜抗原群からの１組のタンパク質とペプチドの組み合わせ、好ましくはｇｐ３５０／２２０を使用してエプスタイン・バーウイルスに対する抗体を検出することができる。
【００４１】
これらのタンパク質内には、合成ペプチド分子に組込まれると、診断の感受性を低下することなく診断において無傷なタンパク質に置き換えることが可能な免疫優性エピトープが同定された。
【００４２】
ＥＢＶ血清反応陽性を調べるために現在好適な診断試験は、（１）ウイルス産生細胞系（例えば−Ｐ３ＨＲ１）上の間接免疫蛍光分析によるＩｇＧ抗ウイルス構造タンパク質（ウイルスキャプシド抗原及び膜抗原を含む）の検出と、（２）潜伏感染細胞系（例えばＲａｊｉ）上の抗補体免疫蛍光によるＩｇＧ抗ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核内抗原）の検出に依存している。各アッセイは感染細胞中でタンパク質の複合組に対する抗体を別々に検出する。これらの型のＩｇＧ抗体は、各個体型が９０〜９８％の感度で検出可能であるという制限付きで全ＥＢＶ感染患者内に存在する。
【００４３】
ＥＢＶ血清反応陽性血清は通常、抗ウイルス構造タンパク質（ＶＣＡ及びＭＡ）と抗ＥＢＮＡ抗体の併存により特定されることがここに判明した。
【００４４】
ほとんどの場合、ＥＢＶ血清反応陽性供血者からの血清はＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１に対する抗体を含む。場合により、ＥＢＶ血清反応陽性供血者は低レベル又は負のレベルのＥＢＮＡ−１抗体の存在下でＶＣＡ−ｐ１８抗体を有しており、逆も言える。これは真のＥＶＢ血清反応陽性供血者を同定するために９５〜９８％の感度を各々有する公知ＶＣＡ及びＥＢＮＡ免疫蛍光血清診断法に対応する。更に、約９０％の感度で抗ＭＡ抗体を検出することができる。
【００４５】
精製した優性ＥＢＶ診断マーカー分子の組み合わせ、即ちＶＣＡ−ｐ１８又はＭＡ−ｇｐ３５０／２２０とＥＢＮＡ−１を単一の診断アッセイで併用すると、ＥＢＶ血清反応陽性を決定するためにより高感度のアッセイが実現される。単一アッセイ（例えばイムノブロット、Ｅｌｉｓａ、Ｓｐｉａ等）でＶＣＡ−ｐ１８又はＭＡ−ｇｐ３５０／２２０とＥＢＮＡ１の両者に対する抗体応答を同時に評価することにより、ＥＢＶ血清反応陽性状態を決定するための感度及び精度の双方を増加することができる。
【００４６】
このような組み合わせは現在の免疫蛍光に基づく診断法では不可能である。
【００４７】
これらのマーカー分子はＥＢＶ感染細胞から精製した無傷のタンパク種でもよいし、組換えＤＮＡ技術を使用することによりこれらのタンパク質を産生するように操作された細胞系又は微生物から精製してもよい。あるいは、これらのタンパク質の各々の免疫優性領域（エピトープ）に相当する合成ペプチドをこの目的に使用してもよい。
【００４８】
従って、本発明の目的は、（ＥＢＶゲノムのＢＦＲＦ３読み枠内でコードされる）ＶＣＡ−ｐ１８、（ＥＢＶゲノムのＢｄＲＦ１読み枠内でコードされる）ＶＣＡ−ｐ４０、（ＥＢＶ−ゲノムのＢｃＲＦ１読み枠内でコードされる）ＥＢＶ−ＭＣＰ、（ＥＢＶ−ゲノムのＢＡＬＦ４読み枠内でコードされる）ｇｐ１２５のようなＶＣＡタンパク質又は（ＥＢＶ−ゲノムのＢＬＬＦ１読み枠内でコードされる）ｇｐ３５０／２２０のようなＭＡタンパク質の少なくとも一部と、ＥＢＮＡタンパク質の少なくとも一部を単一診断アッセイで併用することにより、現用方法よりも高感度且つ高精度のＥＢＶ抗体検出方法を実現することである。
【００４９】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はヒトにおいてエプスタイン・バーウイルス血清反応陽性をより高感度且つ高信頼度で検出するための、単一診断アッセイフォーマットでの２種の別個の診断マーカー分子の組み合わせに関する。
【００５０】
本発明は、エプスタイン・バーウイルス構造タンパク質の少なくとも一部とエプスタイン・バーウイルスＥＢＮＡタンパク質の少なくとも一部の組み合わせからなることを特徴とする、エプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出用診断試薬を提供する。
【００５１】
診断試薬で使用するために特に適切であることが判明したタンパク質及びペプチドは、ＥＢＶ核内抗原（ＥＢＮＡ）と、これと組み合わせて使用される膜抗原及びウイルスキャプシド抗原を含むウイルス構造タンパク質である。膜抗原群のうちではＭＡ−ｇｐ３５０／２２０タンパク質が好適である。
【００５２】
従って、本発明はＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１に由来するペプチドの組み合わせを含む診断試薬に関する。
【００５３】
本発明の別の好適態様は、配列番号１（ＶＣＡ−ｐ１８）又は配列番号５（ＥＢＮＡ−１）に示すようなアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１に由来するペプチドの組み合わせを含む診断試薬に関する。
【００５４】
本発明の診断試薬の好適態様でＥＢＮＡ−１に由来するペプチドと併用し得るＶＣＡ−ｐ１８に由来するペプチドは、配列番号２〜４に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドである。最適には、配列番号４に示すようなアミノ酸配列を含むペプチドを使用し、この配列は配列番号２及び３に示すようなＶＣＡ−ｐ１８タンパク質上の２つの反応性ドメインの組み合わせである。
【００５５】
本発明の診断試薬で使用すると好ましいＥＢＮＡ−１に由来するペプチドは、配列番号６〜９に示すようなアミノ酸配列の１種以上を含むペプチドである。最適には、配列番号９に示すような配列を有するペプチドを使用し、この配列は配列番号６〜８に示すようなＥＢＮＡ−１タンパク質上の反応性ドメインの組み合わせである。
【００５６】
当業者に自明の通り、前記ポリペプチドの保存変種も本発明に含まれる。本明細書中で使用する「保存変種」なる用語は、あるアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基に置換していることを意味する。保存変種の例としては、１個の疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）と別の残基との置換、又は１個の極性残基と別の残基との置換（例えばリシンとアルギニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、又はアスパラギンとグルタミン等）を挙げることができる。「保存変種」なる用語は、置換ポリペプチドに対する抗体が非置換ポリペプチドに対しても免疫反応するという条件下で、置換アミノ酸による非置換親アミノ酸の代用も包含する。従って、保存変種ポリペプチドをＥＢＶ関連疾患患者からの血清で試験するなどの慣用スクリーニング方法を使用することにより、当業者は不当な実験に頼ることなく変種ポリペプチドが本発明のポリペプチドの必要な生物活性を有するか否かを容易に決定することができる。
【００５７】
本発明の診断試薬は通常、１種以上のペプチドと適切な支持体又は標識物質を含む。
【００５８】
使用可能な支持体は例えば、微量試験ウェルもしくはキュベット、チューブもしくは毛管、膜、フィルター、試験ストリップの内壁、又は粒子（例えばラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒子としての金属化合物、キャリヤータンパク質（例えばＢＳＡ又はＫＬＨ））の表面である。
【００５９】
使用可能な標識物質は特に、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。
【００６０】
サンプル中でＥＢＶに対する抗体を検出するための方法においては、本発明の診断試薬をサンプルに接触させる。ペプチドとサンプル中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出し、この検出によりサンプル中のＥＢＶ抗体の存在を確認し、定量することができる。
【００６１】
試薬の種類及びその他の特徴に依存して、生じる免疫化学反応は所謂サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応である。
【００６２】
サンプル中のＥＢＶを検出するためには、１種以上のペプチドを含有する本発明の診断試薬をサンプル及び抗ＥＢＶと接触させた後、形成された免疫複合体の存在を検出し、この検出に基づき、サンプル中のＥＢＶの存在を決定する。
【００６３】
同様に、サンドイッチフォーマットを使用し、サンプルを固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）上にコートされた１種以上のペプチド及び１種以上の標識ペプチド又は標識抗抗体と接触させた後、固相上のラベルの存在を検出してもよい。
【００６４】
本発明は更に、サンプル中のエプスタイン・バーウイルスに対する抗体の検出方法に係り、該方法は、前記サンプルを本発明の診断試薬と接触させ、該試薬と抗体との間で形成された免疫複合体を検出することを特徴とする。
【００６５】
本発明のテストキットは、主構成要素として上記のような診断試薬を含む。ＥＢＶ抗体の検出のためにサンドイッチ反応を実施する場合には、テストキットは例えば、固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）上にコートされた本発明のペプチドと、本発明の標識化ペプチド又は標識化抗抗体を含み得る。
【００６６】
競合反応を実施するためには、テストキットは固体支持体にコートされた本発明のペプチドと、ＥＢＶに対する標識化抗体、好ましくは該ペプチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。
【００６７】
凝集反応の場合、テストキットは粒子又はゾルにコートされた本発明のペプチドを含み得る免疫化学的試薬を含む。
【００６８】
テストキットの別の態様では例えば、ＥＢＶに対する抗体上の結合部位を検出すべきＥＢＶ抗原との競合反応における免疫化学試薬として、固体支持体にコートされた本発明の標識化ペプチドを使用する。
【００６９】
上記開示は本発明を概説したものである。以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は単なる例示を目的とし、発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
【実施例】
実施例１
健康な供血者サンプルをランダムに採取し、イムノブロット分析により、ＥＢＶ−タンパク質（ＥＢＮＡ＋ＶＣＡ）に対する血清ＩｇＧの反応性を試験した。以下に詳述するようにタンパク質をウイルス産生細胞系Ｐ３ＨＲ１−ＨＨ５１４−Ｃ１６中で発現させ、還元条件下で変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移した。
【００７１】
ＥＢＶ産生細胞系ＨＨ５１４．ｃ１６（Ｐ３ＨＲ１由来）の核フラクションからタンパク質抽出物を調製し、１０％アクリルアミドスラブゲル中還元条件下で変性ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。電気泳動分離後、タンパク質をニトロセルロースシートに移し、その後、シートを小（３ｍｍ）ストリップに切断した。
【００７２】
ＥＢＶタンパク質を含むストリップを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝塩類溶液ｐＨ７．４（ＰＢＳ）（ブロッキング緩衝液）中の４％ドライミルク、５％ウマ血清に周囲温度で２時間浸漬させた。ブロッキング緩衝液で１：１００に希釈したヒト血清を個々のストリップと共に周囲温度で１時間インキュベートした後、ストリップをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗った。ペルオキシダーゼ標識化ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体及び発色用の４−クロロ−ナフトールを使用して結合した抗ＥＢＶ  ＩｇＧを検出した。
【００７３】
これらの手順はＪ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ  ２１（１９８８）１３３−１４６及びＪ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０（１９９３）１６１−１６９に詳述されている。
【００７４】
当該診断マーカー分子ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１の位置を矢印により示す。
【００７５】
対照血清は公知ＥＢＶ陰性（−）及び強ＥＢＶ陽性（＋）供血者から採取した。
【００７６】
血清１〜３７は健康な供血者からランダムに採取した血清サンプルを示す。
【００７７】
上記イムノブロット分析の結果を図１に示す。
【００７８】
標準免疫蛍光に基づく市販の診断法により試験した処、血清＃８はＥＢＶ血清反応陰性であったが、それ以外の全血清はＥＢＶ血清反応陽性であった。
【００７９】
マーカータンパク質ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１は指示されている。場合によりＥＢＶ特異的抗体を欠失するＥＢＶ血清反応陰性供血者（例えば＃８）を除き、ＥＢＶ血清反応陽性供血者からのＩｇＧは種々のＥＢＶタンパク質、最も顕著且つ高頻度でＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１（矢印参照）と反応することが判明した。
【００８０】
血清＃９、１２、１６、１８、１９、３１は抗ＶＣＡ−ｐ１８陽性であり、抗ＥＢＮＡ−１反応性は弱〜陰性であり、血清＃１１、１４、２１、２２、３０、３７は抗ＥＢＮＡ−１陽性であり、抗ＶＣＡ−ｐ１８反応性は低〜陰性である。
【００８１】
実施例２
図２は、ＶＣＡ−ｐ１８もしくはＥＢＮＡ−１単独又は組み合わせを特定する精製試薬を使用した酵素結合イムノソルベントアッセイの結果を示す。この実験では、ＶＣＡ−ｐ１８又はＥＢＮＡ−１コンビペプチドを０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの濃度で固相へのコーティングとして単独又は１：１組み合わせで使用した。実施例１（図１）に使用したと同一組の血清を使用して抗体反応性を評価した。ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８２】
実施例３
図３、図４及び図５は、ＶＣＡ−ｐ１８もしくはＥＢＮＡ−１単独又は組み合わせを特定する精製試薬を使用した酵素結合イムノソルベントアッセイの結果を示す。これらの実験では、ＶＣＡ−ｐ１８又はＥＢＮＡ−１コンビペプチドを０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの濃度で固相へのコーティングとして単独又は１：１組み合わせで使用した。
【００８３】
図３では、米国の健康な供血者からの１組の血清を使用して抗体反応性を評価した。ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８４】
図４では、香港の健康な供血者からの１組の血清を使用して抗体反応性を評価した。ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、著しく簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８５】
図５では、香港の鼻咽頭癌（ＮＰＣ）患者からの１組のヒト血清を使用して抗体反応性を評価した。ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。特に、ＶＣＡ−コンビペプチド単独（図の左部分）と、ＶＣＡ及びＥＢＮＡ併用コンビペプチド（図の右部分）との相違は顕著である。
【００８６】
以上の実験の結果、異なるＥＢＶ関連症候群を有する異なるヒト集団（又は健康な集団）においてＶＣＡ及びＥＢＮＡコンビペプチドの結果から明らかなように、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、より簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８７】
実施例４
図６、図７及び図８は、ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０もしくはＥＢＮＡ−１単独又は組み合わせを特定する精製試薬を使用した酵素結合イムノソルベントアッセイの結果を示す。この実験では、精製ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０タンパク質（Ｈｅｓｓｉｎｇら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  ５９９，  ｐｐ．２６７−２７２  （１９９２）に従って精製）又はＥＢＮＡ−１コンビペプチドを０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの濃度で固相へのコーティングとして単独又は１：１組み合わせで使用した。これらの実験で使用した血清組を図（図６、図７及び図８）に指示し、抗体反応性の評価に使用した。ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用してもほとんどの血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８８】
図６では、米国の健康な供血者からの１組の血清を使用して抗体反応性を評価した。ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００８９】
図７では、香港の健康な供血者からの１組の血清を使用して抗体反応性を評価した。ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、著しく簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００９０】
図８では、香港の鼻咽頭癌（ＮＰＣ）患者からの１組のヒト血清を使用して抗体反応性を評価した。ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１からの別々のデータを併用しても全血清が（ボーダーライン）ＥＢＶ血清反応陽性であることを示すことはできるが、２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、更に簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００９１】
以上の実験の結果、異なるＥＢＶ関連症候群を有する異なるヒト集団（又は健康な集団）においてＥＢＮＡ−タンパク質の少なくとも一部と共にＶＣＡタンパクの少なくとも一部又はＭＡタンパク質の少なくとも一部を含む診断試薬の結果から明らかなように、これらの２種のマーカーを単一アッセイで併用することにより、より簡単で直接的な、より正確な判定が可能である。
【００９２】
以上の説明は当業者が本発明を実施するために十分であるとみなされる。以上の記載から図示及び記載以外の本発明の種々の変形が当業者に自明であり、このような変形は請求の範囲に該当する。
【００９３】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１７６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００９４】
【化１】
0003547493.tif 000002
【００９５】
配列番号：２
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００９６】
【化２】
0003547493.tif 000003
【００９７】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００９８】
【化３】
0003547493.tif 000004
【００９９】
配列番号：４
配列の長さ：５６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１００】
【化４】
0003547493.tif 000005
【０１０１】
配列番号：５
配列の長さ：１２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１０２】
【化５】
0003547493.tif 000006
【０１０３】
配列番号：６
配列の長さ：２４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１０４】
【化６】
0003547493.tif 000007
【０１０５】
配列番号：７
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１０６】
【化７】
0003547493.tif 000008
【０１０７】
配列番号：８
配列の長さ：３１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１０８】
【化８】
0003547493.tif 000009
【０１０９】
配列番号：９
配列の長さ：５８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【０１１０】
【化９】
0003547493.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】健康な供血者サンプルをランダムに採取し、ウイルス産生細胞系Ｐ３ＨＲ１−ＨＨ５１４−Ｃ１６中で発現されるようなＥＢＶ−タンパク質（ＥＢＮＡ＋ＶＣＡ）と血清ＩｇＧとの反応性を試験したイムノブロット分析結果を示す。
【図２】ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性に関するヒト血清サンプルのＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。◆はＶＣＡ抗体及びＥＢＮＡ抗体の両方について標準血清学的分析により判定される血清反応陰性を示し、□はＶＣＡ抗体及びＥＢＮＡ抗体の両方について標準血清学的分析により判定される血清反応陽性を示す。ＥＢＮＡコンビペプチドは配列番号９に示すようなアミノ酸配列を有するペプチド、ＶＣＡコンビペプチドは配列番号４に示すようなアミノ酸配列を有するペプチド、ＥＢＮＡ及びＶＣＡコンビペプチドは配列番号４及び９に示すようなアミノ酸配列を有する２種のペプチドの組み合わせを意味する。
【図３】米国の健康な供血者からの１組のヒト血清を、ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図４】香港の健康な供血者からの１組のヒト血清を、ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図５】香港の鼻咽頭癌（ＮＰＣ）患者からの１組のヒト血清を、ＶＣＡ−ｐ１８及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図６】米国の健康な供血者（ｎ＝３８）からの１組のヒト血清を、ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図７】香港の健康な供血者（ｎ＝３７）からの１組のヒト血清を、ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図８】香港の鼻咽頭患者（ｎ＝３７）からの１組のヒト血清を、ＭＡ−ｇｐ３５０／２２０及びＥＢＮＡ−１単独及び組み合わせに対するＩｇＧ反応性について試験したＥｌｉｓａ反応性（４５０ｎｍの光学密度）の結果を示す。
【図１】
0003547493.tif 000011
【図２】
0003547493.tif 000012
【図３】
0003547493.tif 000013
【図４】
0003547493.tif 000014
【図５】
0003547493.tif 000015
【図６】
0003547493.tif 000016
【図７】
0003547493.tif 000017
【図８】
0003547493.tif 000018