(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)からなる群より選択される単離された核酸分子：
(a)  配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
(b) (a)の核酸分子を含む変性した二本鎖DNAのいずれかの鎖に対してハイブリダイズする核酸分子であって、該ハイブリダイゼーション条件が50％ホルムアミドおよび6×SSC、42℃で、かつ68℃、0.2×SSC、0.1％SDSの洗浄条件を含むものであり、さらに該核酸分子またはその相補体がIL-1δカウンター構造に結合するポリペプチドをコードするものである、上記核酸分子；および
(c)  配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、該ポリペプチドがIL-1δカウンター構造に結合するものである、上記核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１または２に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜155を含むポリペプチド。
【請求項７】
IL-1δカウンター構造に結合する、請求項６に記載のポリペプチドの可溶性断片。
【請求項８】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載のポリペプチドと結合する抗体。
【請求項１０】
モノクロナール抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなる核酸分子または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は精製かつ単離された新規ＩＬ−１δポリペプチドおよびその断片、該ポリペプチドをコードする核酸、組み換え型の該ポリペプチドの製造方法、これらのポリペプチドに対して産生された抗体、これらのポリペプチドから得た断片化ペプチド、およびそれらの使用に関する。
【０００２】
関連技術の説明
１．ＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒ
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は免疫反応および炎症反応を媒介することを主な作用とするサイトカインの大きな１グループのメンバーである。ＩＬ−１リガンドファミリーはＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、およびＩＬ−１８（ＩＧＩＦおよび時にはＩＬ−１γとして知られていたもの）、ＩＬ−１イプシロン（ＩＬ−１ε）、およびＩＬ−１ゼータ（ＩＬ−１ζ）を含む。マクロファージにより分泌されるＩＬ−１は、実際はＩＬ−１βが大部分と幾らかのＩＬ−１αの混合物である（Ａｂｂａｓら， １９９４）。初めシグナル配列を欠いた３３ｋＤの前駆体として産生されるＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、さらにタンパク質分解切断によってプロセッシングされ、各約１７ｋＤの分泌活性型が産生される。さらには、ＩＬ−αの３３ｋＤの前駆体も活性がある。両種類のＩＬ−１は第２染色体上に位置する２つの異なる遺伝子の産物である。この２種類は相同性が互いに３０％未満であるが、それらはどちらも同じ受容体に結合し類似の活性を有する。
【０００３】
ＩＬ−１ｒａすなわちＩＬ−１の生物学的不活性型は、構造的にはＩＬ−１と相同であり同じ受容体と結合する。さらに、ＩＬ−１ｒａはシグナル配列を保持する形で産生されるため、細胞外領域に効果的に分泌され、そこでＩＬ−１と競合的競争をする（Ａｂｂａｓら， １９９４）。
【０００４】
ＩＬ−１のタイプＩ受容体はＩＬ−１の生物学的効果を媒介する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに帰する活性には炎症性サイトカインの誘導、プロスタグランジン、一酸化窒素、メタロプロテイナーゼ、接着分子、急性期タンパク質の誘導を含む他の炎症性応答、造血、発熱、骨吸収、ならびにＴｈ２細胞の増殖および分化が含まれる。
【０００５】
ＩＬ−１はリウマチ性関節炎および炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患に関連があるとされている。ＩＬ−１が骨粗鬆症において何らかのはたらきをするという証拠が増えている。これらの活性はすべて、タイプＩ型ＩＬ−１Ｒの細胞質部分のシグナル伝達機能によって引き起こされる。
【０００６】
ＩＬ−１８はＩＬ−αおよびＩＬ−βの相同体であり、ＩＬ−１ファミリーメンバーのＩＬ−１受容体関連タンパク質１すなわちＩＬ−１Ｒｒｐ１（Ｐａｒｎｅｔら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：３９６７， １９９６，およびＴｏｒｉｇｏｅら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２５７３７， １９９７を参照のこと）およびＡｃＰＬ（Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ６０／０７２，３０１（Ｊｏｈｎ Ｅ．ＳＩＭＳおよびＴｅｒｅｓａ Ｌ． ＢＯＲＮによる１９９８年１月２３日出願のＡＣＰＬ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ），および Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／０７８，８３５ （Ｊｏｈｎ Ｅ．ＳＩＭＳおよびＴｅｒｅｓａ Ｌ． ＢＯＲＮによる１９９８年３月２０日出願のＡＣＰＬ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）を参照のこと，この両方を本明細書に参照により組み入れるものとする）を含んでなる受容体に結合し、またその受容体を介してシグナル伝達する。ＩＬ−１８はＴｈ１細胞増殖および分化の刺激因子として作用し、またＴｈ１細胞からのγ−インターフェロンの強力な誘導因子である。それはＮＫ細胞の傷害活性を増強する。それは敗血症性ショック、肝臓破壊、炎症性腸疾患、および糖尿病に関連があるとされている。
【０００７】
ＩＬ−１リガンドは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである２種類のＩＬ−１受容体に結合する。ＩＬ−１受容体は８０ｋＤａのタイプＩ受容体（ＩＬ−１ＲＩ）および６８ｋＤａのタイプＩＩ受容体（ＩＬ−１ＲＩＩ）を含む。ＩＬ−１リガンドはまた、ＩＬ−１ＲＩＩのタンパク質分解可溶断片（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）にも結合し得る（Ｃｏｌｏｔｔａら， １９９３）。
【０００８】
ＩＬ−１受容体はサイトカイン受容体の大きなＩｇスーパーファミリーのメンバーである。該スーパーファミリーの多くは免疫系細胞、特にリンパ球の応答を媒介する。近年、これらの受容体に結合するリガンドのメンバーが、加速されたペースで発見されている。公知のＩＬ−１リガンド数の増加は、遺伝子クローニングと配列決定技術の誕生に大きく因るものである。ヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列は、それらが他の公知のＩＬ−１リガンドと相同性を共有するならば、ＩＬ−１リガンドを表わすものと考えられる。
【０００９】
ＩＬ−１の主な起源は活性化したマクロファージまたは単核食細胞である。ＩＬ−１を産生する他の細胞としては、上皮細胞および内皮細胞が挙げられる（Ａｂｂａｓら， １９９４）。マクロファージからのＩＬ−１分泌は、マクロファージがグラム陰性細菌と遭遇しこれを捕食した後に起こる。このような細菌は、細菌の細胞膜中にエンドトキシンとしても知られるリポ多糖（ＬＰＳ）分子を含む。ＬＰＳ分子はマクロファージを刺激し腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＬ−１を産生させる活性成分である。この場合、ＩＬ−１はＬＰＳおよびＴＮＦ産生に応じて産生される。低濃度では、ＬＰＳはマクロファージを刺激し、Ｂ細胞および細菌感染を排除するのに必要な他の宿主反応を活性化する。しかしながら高濃度では、ＬＰＳは激しい組識損傷、ショック、および死さえ引き起こし得る。
【００１０】
ＩＬ−１の生物学的作用には、血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、局所組識破壊、ならびに発熱が含まれる（Ｊａｎｅｗａｙら， １９９６）。低レベルでは、ＩＬ−１はマクロファージおよび血管内皮細胞を刺激してＩＬ−６を産生させ、血管内皮細胞表面の分子をアップレギュレーションして白血球接着を増加させ、さらに炎症性白血球を活性化させる特定のケモカインを産生する単核食細胞および他の細胞を刺激することによって炎症性白血球を間接的に活性化する。さらに、ＩＬ−１はプロスタグランジン、一酸化窒素合成酵素、およびメタロプロテイナーゼの誘導などの他の炎症反応にも関わる。これらのＩＬ−１作用は低レベルの微生物感染の際に重要である。しかしながら、微生物感染が拡大する場合、ＩＬ−１は発熱を起こし、単核食細胞を刺激してＩＬ−１およびＩＬ−６を産生させ、肝細胞からの血清タンパク質の産生を増加させ、凝固系を活性化することによって、全身的に作用する。さらにＩＬ−１は腫瘍の出血性ネクローシスまたは骨髄幹細胞の分裂増殖の抑制を引き起こさず、また高濃度ではＩＬ−１はヒトに対して致死的である。
【００１１】
ＩＬ−１媒介性細胞シグナル伝達はしばしば分子活性化カスケードを伴い、このカスケードにおいて、受容体は、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特に活性化することによってリガンド−受容体媒介シグナルを伝達する。ＩＬ−１媒介性細胞シグナル伝達により、転写因子ＮＦｋＢおよびＡＰ１（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３０： １０７５−１０７９， １９９８）、タンパク質キナーゼであるＪｕｎ Ｎ末端キナーゼおよびｐ３８ｍａｐキナーゼ（Ｏ’Ｎｅｉｌら， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６３： ６５０−６５７， １９９８）、プロスタグランジンを産生させるＣＯＸ−２酵素（Ｃｒｏｆｆｏｒｄ， Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２４ Ｓｕｐｐｌ． ４９： １５−１９， １９９７）および一酸化窒素を産生させるｉＮＯＳ酵素（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １４： ３７６−９０， １９９８）ならびに一般的炎症が活性化される。
【００１２】
ＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒの重要な作用を考慮すると、当技術分野ではＩＬ−１リガンドファミリーのメンバーをさらに必要としている。膨大になりつつある知見にも関わらず、細胞応答および免疫応答に関わるタンパク質の同一性および機能に対する必要性は当技術分野において依然存在している。
【００１３】
２．タンパク質の同定
もう一つの態様において、未知のタンパク質の一次構造または配列の同定は、最も骨の折れる実験工程である。未知のタンパク質を同定するために、研究者は、当業者に公知の種々の技術を使用した、この未知のタンパク質と既知のペプチドとの比較を利用することができる。例えば、タンパク質は通常、電気泳動、沈降、クロマトグラフィー、配列決定及び質量分析等の技術を使用して分析される。
【００１４】
特に、分子量既知のポリペプチドと未知のタンパク質とを比較することにより、未知のタンパク質のみかけの分子量を決定できる（Ｔ． Ｄ． Ｂｒｏｃｋ及びＭ． Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７ （Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，第６版 １９９１））。タンパク質の分子量標準は市販されており、未知のタンパク質の分子量概算に役立つ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ． Ｃａｔａｌｏｇ：１３０−１３１， １９９５； Ｊ． Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ， 米国特許第５，４４９，７５８号）。しかしながら、分子量標準は、みかけの分子量の正確な算定が可能なほどには未知のタンパク質にサイズが十分近接していない場合がある。化学的または酵素的手段によって断片化されているタンパク質、翻訳後修飾またはプロセシングによって修飾されているタンパク質、及び／または他のタンパク質と非共有的複合体として結合しているタンパク質の場合には、分子量算定の困難さは複雑になる。
【００１５】
更に、その特定のアミノ酸成分に関してタンパク質の組成が独自の性質を有することから、そのタンパク質内の切断部位が独特な位置に生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質の特異的断片化によって、独特な「ペプチドフィンガープリント」が生じる（Ｄ． Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６， １９７７； Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６， １９８０）。従って、特異的部位における切断から、所与のタンパク質から正確な分子量を有するペプチドへの再現性のある断片化が生じる。更に、これらのペプチドは、そのペプチドの等電点ｐＨを決定する独特な電荷特性を有している。これらの独特な性質を、種々の電気泳動及び他の技術を使用して利用することができる（Ｔ． Ｄ． Ｂｒｏｃｋ及びＭ． Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７ （Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， ６ｄ ｅｄ． １９９１））。
【００１６】
タンパク質の断片化は、アミノ酸組成分析及びタンパク質の配列決定、特に「ブロックされた」Ｎ末端を有するタンパク質からの断片の作製に更に使用できる（Ｐ． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１００３５−１００３８， １９８７； Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９８８， ９：８３０−８３８， １９８８）。更に、断片化タンパク質は、免疫感作、アフィニティー選択（Ｒ． Ａ． Ｂｒｏｗｎ， 米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾部位（例えばリン酸化）の決定、活性な生物学的化合物の作製（Ｔ． Ｄ． Ｂｒｏｃｋ及びＭ． Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ３００−３０１ （Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， ６ｄ ｅｄ． １９９１））、及び相同タンパク質の分化（Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５０：３０９−３１６， １９８０）のために使用することができる。
【００１７】
更に、未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られた場合、質量分析を使用した未知のタンパク質の同定を補助するために、これを既知タンパク質のデータベースと比較することができる（Ｗ． Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５， １９９３； Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：９９８−１００５， １９９８）。これらの比較を容易にするための種々のコンピューターソフトウェアプログラムにインターネットを通じてアクセスでき、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ…ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＃ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ Ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、及びＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。これらのプログラムによって、ユーザーは示された許容範囲内で開裂剤及び断片化ペプチドの分子量を指定することができる。これらのプログラムによって、データベースに保存されたタンパク質分子量情報とこれらの分子量を比較して、未知のタンパク質のアイデンティティーの決定が援助される。正確な同定のためには、断片化ペプチドの数、及びこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。従って、断片化ペプチドの数及びそれらの分子量の決定における正確さが上がれば、未知のタンパク質の同定の成功確率が増大する。
【００１８】
更に、未知のタンパク質のペプチド分解物はタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用して配列決定することができ、得られた配列をデータベースで検索することができる（Ｊ． Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９ （１９９４）； Ｍ． Ｍａｎｎ及びＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４３９０−４３９９ （１９９４）； Ｊ． Ａ． Ｔａｙｌｏｒ及びＲ． Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５ （１９９７）。この方法において使用できる検索プログラムはインターネット上に存在しており、例えばＬｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．１ｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、及び上記のｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ及びＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムが挙げられる。従って、遺伝子の配列及びその推定タンパク質配列及びペプチド断片を配列データベースに追加することによって、タンデム質量分析を使用した未知のタンパク質の同定において役立ち得る。
【００１９】
従って、当分野において、ぺプチド断片化研究における使用のため、分子量測定における使用のため、及びタンデム質量分析を使用したタンパク質配列決定における使用のために好適なポリペプチドに対する需要は存在する。
【００２０】
発明の概要
本発明は、単離されたＩＬ−１δ核酸、及びこれらの核酸によってコードされたポリペプチドを提供することによって、当分野におけるこれら種々の需要を満たす一助となる。本発明の特定の実施形態は、配列番号１のマウスＤＮＡ配列及び配列番号３のヒトＤＮＡ配列を含む単離されたＩＬ−１δ核酸分子、並びに配列番号２または配列番号４の対応するアミノ酸配列をコードする単離されたＩＬ−１δ核酸分子、並びにこれらの配列に相補的な核酸分子に関する。本発明には一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ及びＤＮＡ核酸分子の双方、並びに配列番号１または配列番号３の全てまたは一部を含む変性した二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子が包含される。更に、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸分子からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって誘導される単離された核酸分子、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸分子と縮重した単離された核酸分子、及び本発明のＤＮＡの対立遺伝子変異型である単離された核酸分子も包含される。本発明はまた、これらの核酸分子の発現を指令する組み換えベクター、及びこれらのベクターで安定に、または一時的に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も包含する。
【００２１】
更に、本発明は、ＩＬ−１δ活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するため、ヒト第２染色体を同定するため、ヒト第２染色体上の遺伝子をマッピングするため、ヒト第２染色体と関連するある種の疾患、症候群、または他のヒトの状態と関連する遺伝子を同定するため、更に細胞のシグナル伝達及びＩＬ−１δ系を研究するために、上記の核酸を使用する方法を包含する。
【００２２】
本発明はまた、ＩＬ−１δ遺伝子によってコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するための、配列番号１または配列番号３の核酸由来のセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用をも包含する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号２または配列番号４の可溶性ポリペプチド部分を含む、これらの核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド及びその断片を包含する。本発明は更に、発現を促進する条件下で宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収することを含む、これらのポリペプチドの製造方法を包含する。特に、これらのポリペプチドの細菌、酵母、植物、昆虫、及び動物細胞における発現が本発明に包含される。
【００２４】
一般に、本発明のポリペプチドは、免疫調節、細胞増殖、細胞死、細胞移動、細胞−細胞相互作用、及び炎症性応答等の細胞プロセスを研究するために使用することができる。更に、これらのポリペプチドを使用して、ＩＬ−１δリガンド及びＩＬ−１δ受容体と関連するタンパク質を同定することができる。
【００２５】
更に本発明は、ポリペプチドの逆構造分子（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）と結合する潜在的活性阻害剤をスクリーニングするためにこれらのポリペプチドを利用するアッセイ、及びＩＬ−１δポリペプチドの逆構造分子によって媒介される疾患の治療のための治療剤として、これらのポリペプチドを使用する方法を含む。更に、これらのポリペプチドの阻害剤の設計においてこれらのポリペプチドを使用する方法も本発明の一態様である。
【００２６】
本発明は更に、タンパク質または断片化タンパク質の分子量の算定を可能にする分子量マーカーとしてこれらのポリペプチドを使用する方法、並びに電気泳動を使用して本発明の分子量マーカーを視覚化する方法を提供する。本発明は更に、未知のタンパク質の等電点の決定のためのマーカー、並びにタンパク質の断片化の程度を確認するための対照として本発明のポリペプチドを使用する方法を包含する。
【００２７】
更に、これらの決定において有用なキットが本発明に包含される。
【００２８】
本発明に更に包含されるものとしては、電子的データベースを検索してサンプル核酸及び／またはタンパク質の同定に役立てるための、ＩＬ−１δ核酸配列、ポリペプチドもしくはその断片の推定アミノ酸配列、またはポリペプチド及びその断片の推定アミノ酸配列の組み合わせの使用である。
【００２９】
これらのポリペプチドに結合する単離されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、更にＩＬ−１δポリペプチドの精製に役立てるためのこれらの抗体の使用もまた、本発明に包含される。
【００３０】
本発明はまた、これらの核酸配列によってコードされた単離されたポリペプチド、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された分子量約１７ｋＤの単離されたポリペプチド、および非グリコシル化形態の単離されたポリペプチドも包含する。
【００３１】
本発明は更に、化学的または酵素的処理によりＩＬ−１δポリペプチドから生成される断片化ペプチドも含む。また、ＩＬ−１δポリペプチド分子量マーカーおよびその断片化ペプチドの形態であって、化学的または酵素的手段による断片化に必要な部位の少なくとも１ヶ所が突然変異しているものも、本発明の１つの態様である。
【００３２】
発明の詳細な説明
マウスＩＬ−１δポリペプチドをコードするｃＤＮＡを単離し配列番号１に開示する。
0003602442.tif 000002
（配列番号１）
【００３３】
ヒトＩＬ−１δポリペプチドをコードするｃＤＮＡを単離し配列番号３に開示する。
0003602442.tif 000003
（配列番号３）
【００３４】
この、ＩＬ−１δポリペプチドをコードするｃＤＮＡの開示によって、ＩＬ−１δポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター、その発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞、生物活性を有するＩＬ−１δポリペプチドおよびＩＬ−１δ分子量マーカーであって単離精製したタンパク質、ならびにＩＬ−１δポリペプチドと免疫反応する抗体を構築できる。さらに、ＩＬ−１シグナル伝達におけるＩＬ−１δの作用機構を理解することによって、ＩＬ−１活性の阻害因子を検出するアッセイをデザインすることができる。
【００３５】
マウスＩＬ−１δＤＮＡは、元々公式データベース中の部分的ＥＳＴクローン（マウスＥＳＴ Ｗ０８２０５）として見出されたものである。ＩＭＡＧＥクローン全体のＤＮＡ配列が決定された。ＥＳＴクローンＷ０８２０５およびＷ２０５９４の配列は、マウスＩＬ−１δＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチドと重複している。他の相同なＥＳＴ配列は同定されていない。
【００３６】
マウスｍＲＮＡ発現は、ＣＤ４０Ｌによって刺激された脾臓細胞中で示される。その発現はリポ多糖（ＬＰＳ）およびＣＤ４０Ｌの両方による刺激によってさらに増大する。ｍＲＮＡ発現は、ＬＰＳにより刺激されたマウスマクロファージ系（ＲＡＷ）において、またマウス胎盤および１４日齢胚の卵黄嚢の両方において示される。前記ｃＤＮＡは腎臓ｃＤＮＡライブラリーにおいて見出される。
【００３７】
ヒトＩＬ−１δＲＮＡ発現は、リンパ節、胸腺、扁桃腺、脳、胎盤、肺、骨格筋、前立腺、および精巣で検出され得る。
【００３８】
配列番号１によってコードされる好適なポリペプチドを以下に記載する。：
0003602442.tif 000004
（配列番号２）
【００３９】
配列番号３によってコードされる好適なポリペプチドを以下に記載する。：
0003602442.tif 000005
（配列番号４）
【００４０】
マウスＩＬ−１δポリペプチドはＩＬ−１ファミリーメンバー（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１８）の成熟型部分と相同である。マウスＩＬ−１δアミノ酸配列をＵＷＧＣＧコンピュータープログラム「ｇａｐ」を用いて他のマウスＩＬ−１ファミリーメンバーの成熟型と比較した。マウスＩＬ−１δポリペプチドは、ＩＬ−１αとの間で２３％、ＩＬ−１βとの間で３０％、ＩＬ−１ｒａとの間で４８％、ＩＬ−１８との間で１８％の同一性を示した。
【００４１】
ヒトＩＬ−１δアミノ酸配列を他のヒトＩＬ−１ファミリーメンバーの成熟型と比較した。ヒトＩＬ−１δポリペプチドは、ＩＬ−１αとの間でごく低い相同性、ＩＬ−１βとの間で２９％の相同性、ＩＬ−１ｒａとの間で５０％の相同性、ＩＬ−１８との間でごく低い相同性、ＩＬ−１εとの間で３１％の相同性、ＩＬ−１ζとの間で３４％の相同性を示した。これらの値はＵＷＧＣＧプログラムＧＡＰにより決定されたものであり、ギャップ設定ペナルティーを１２、ギャップ延伸ペナルティーを４とした。
【００４２】
ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８とは違って、ＩＬ−１δポリペプチドは「前駆体」領域（タンパク質分解性プロセッシングにより除去されるＮ末端部分）を含まない。ＩＬ−１ｒａと違い、ＩＬ−１δポリペプチドはシグナルペプチドを含まない。
【００４３】
マウスＩＬ−１δの分泌型はＩＬ−１ｒａシグナルペプチドをコード領域に融合させることにより生成された。非有効なタンパク質産物は、ＣＯＳおよびＣＶ１／ＥＢＮＡ哺乳動物系および細菌系において見出された。
【００４４】
ヒトＩＬ−１δは、外来性シグナルペプチドが存在しなくても、トランスフェクトしたＣＯＳまたはＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞から適当な効率で分泌される。Ｎ末端の配列決定により、切断は起こらなかったことが示される。したがって天然ＩＬ−１δは、シグナルペプチドまたは「前駆体」領域が存在しなくても、細胞から分泌され得る。
【００４５】
可溶型のＩＬ−１δ受容体ＩＬ−１δは、他の活性サイトカインに対するアンタゴニストとしてはたらくが、それはＩＬ−１ｒａがＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの作用に対するアンタゴニストであるのと同様である。
【００４６】
本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターの構築、該発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞、単離され精製された生物学的に活性なポリペプチド及びその断片、ＩＬ−１δ活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしての核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用が提供される。本発明はまた、ヒト第２染色体を同定し、ヒト第２染色体上の遺伝子をマッピングし、ヒト第２染色体、特に領域２ｑ１１−１２と関連付けられる特定の疾患、症候群または他のヒトの状態、例えば緑内障、外胚葉性形成異常、インスリン依存性糖尿病、皺状皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、および脛筋ジストロフィーなどと関連する遺伝子を同定するための、核酸またはそのオリゴヌクレオチドの使用を提供する。別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１δ遺伝子によってコードされたポリヌクレオチドの発現を阻害するために、核酸から得た一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することを記述している。また、本発明により該ポリペプチドおよび可溶性断片を分子量マーカーとして、ペプチド断片化の対照として使用することもでき、さらにこれらの試薬を含むキットも提供され得る。最後に、本発明は、抗体産生を目的とした該ポリペプチドおよびその断片の使用、およびＩＬ−１δポリペプチド精製を目的とした抗体の使用を提供する。
【００４７】
核酸分子
特定の実施形態において、本発明は、内在性物質が混入していない特定の単離ヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」とは、分離断片の形態をとるポリヌクレオチド分子、またはより大きな核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、標準的な生化学的方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｓｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に概説されたもの）を用いて、少なくとも一度は、その構成要素であるヌクレオチド配列の同定、操作および回収が可能な量または濃度で、また実質的に純粋な形態として単離された、ＤＮＡまたはＲＮＡから得る。このような配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列すなわちイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供および／または構築されることが好ましい。非翻訳ＤＮＡの配列がオープンリーディングフレームの５’側または３’側に存在する場合は、コード領域の操作または発現を妨害しない。
【００４８】
本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖の両形態のＤＮＡ、ならびにこれらのＲＮＡ相補体を含む。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、およびこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、従来方法、例えば、配列番号１または配列番号３のｃＤＮＡ、またはこれらの適切な断片をプローブとして用いることにより、単離されうる。
【００４９】
本発明のＤＮＡ分子は、完全長遺伝子、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよび断片を含む。本発明の核酸はマウスまたはヒトのいずれかの供給源に由来するが、他の供給源に由来するものも同様に本発明に含まれる。
【００５０】
好適な配列
本発明の特に好適な核酸配列は、配列番号１に記載のマウス配列および配列番号３に記載のヒト配列である。配列番号１および配列番号３のＤＮＡにコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４に示されている。これらの配列により、ＩＬ−１δポリヌクレオチドはＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーとして同定される。
【００５１】
さらなる配列
２つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードしうるという公知の遺伝子コードの縮重により、ＤＮＡ配列は、配列番号１または配列番号３に示すものとは異なりながら、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。このような変異ＤＮＡ配列は、サイレント突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の過程で生じるもの）に起因するものであるか、または天然配列の意図的に突然変異誘発させた産物でありうる。
【００５２】
従って、本発明は、以下から選択される、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列を提供する。すなわち、（ａ）配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、（ｂ） 配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ、（ｃ）中度のストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能で、かつ本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、（ｄ） 高ストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能で、かつ本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ならびに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で定義したＤＮＡに対して遺伝子コードの結果として縮重し、かつ本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ。当然、上記ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは本発明に包含される。
【００５３】
従って、本発明は、以下から選択される、生物活性を有するＩＬ−１δポリペプチドをコードする等価な単離ＤＮＡ配列を提供する。すなわち、（ａ）天然哺乳動物ＩＬ−１δ遺伝子のコード領域由来のＤＮＡ、（ｂ）配列番号１または配列番号３からなる群より選択されるＤＮＡ、（ｃ）中度のストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能で、かつ生物活性を有するＩＬ−１δポリペプチドをコードするＤＮＡ、ならびに（ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義されるＤＮＡに対して遺伝子コードの結果として縮重し、かつ生物活性を有するＩＬ−１δポリペプチドをコードするＤＮＡ。上記ＤＮＡ等価物の配列によってコードされるＩＬ−１δポリペプチドは、本発明に包含される。他の哺乳動物種に由来し、配列番号１または配列番号３のＤＮＡの相補体とハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるＩＬ−１δポリペプチドも包含される。
【００５４】
本明細書で使用する、中度のストリンジェンシー条件は、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者が容易に決定できる。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版 Ｖｏｌ．１， ｐｐ．１．１０１−１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、これには、ニトロセルロースフィルターの前洗浄溶液として５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）を使用すること、約４２℃で、５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（あるいは、約４２℃、約５０％ホルムアミド中でのスターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）でのハイブリダイゼーション条件、ならびに約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの洗浄条件が含まれる。高ストリンジェンシー条件も、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者が容易に決定できる。一般的に、このような条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義されており、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を含む。当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因に応じて、必要であれば、調節できることを理解するであろう。
【００５５】
また本発明の実施形態には、以下に記載するように、不活性化Ｎ−グリコシル化部位、不活性化プロテアーゼプロセッシング部位または保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。
【００５６】
別の実施形態では、本発明の核酸分子はまた、天然配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また、核酸分子が、天然配列に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または少なくとも９９．９％の同一性を有する配列を含む実施形態も包含される。
【００５７】
同一性％は、目で見て調べ、かつ数学的に算出することによって決定できる。あるいはまた、２つの核酸配列の同一性％は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）に記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧＣＧ）から入手可能な、ＧＡＰコンピュータプログラム（バージョン６．０）を使用して配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。（１）ヌクレオチドについての単一分子比較マトリクス（ｕｎａｒｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）（同一の場合１、非同一の場合０の値を含める）、ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重比較マトリクス（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）。これらはＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３−３５８， １９７９に記載されている。（２）各ギャップに対して３．０のペナルティ、および各ギャップにある各記号に対して０．１０の追加ペナルティ。ならびに（３）エンドギャップに対してはペナルティ無し。配列比較の当業者によって使用される他のプログラムも使用できる。
【００５８】
本発明はまた、ポリペプチドの生成に有用な単離核酸を提供する。このようなポリペプチドは、数ある従来技術のいずれによって調製してもよい。ＩＬ−１δポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはこれらの所望の断片を、発現ベクター中にサブクローニングし、該ポリペプチドまたは断片を生成してもよい。ＤＮＡ配列は、適切なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合するのが都合がよい。あるいはまた、所望の断片を、公知技術を用いて化学的に合成してもよい。また、ＤＮＡ断片は、完全長クローン化ＤＮＡ配列を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって生成でき、アガロースゲル上での電気泳動によって単離できる。必要に応じて、所望位置に対して５’または３’末端を再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化によって生成されたＤＮＡ断片と連結してもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含み、コード配列のＮ−末端に開始コドン（ＡＴＧ）を配置してもよい。
【００５９】
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を利用して、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離および増幅してもよい。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。該オリゴヌクレオチドに、制限エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含ませて、増幅されたＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入し易くしてもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｗｕら， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ （１９８９）， ｐｐ．１８９−１９６、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９９０） に記載されている。
【００６０】
ポリペプチドおよびこれらの断片
本発明は、様々な形態（天然に存在するもの、または組換えＤＮＡ技術を伴う方法などの様々な技術により生成されたものなど）のポリペプチドおよびこれらの断片を包含する。例えば、ＩＬ−１δポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により、配列番号１または配列番号３から誘導できる。上記形態には、誘導体、変異体、オリゴマー、ならびにこれらの融合タンパク質または断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ポリペプチドおよびこれらの断片
本発明のポリペプチドには、上記の核酸配列によってコードされる完全長タンパク質が含まれる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、膜結合型でもよいし、または分泌型つまり可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌されうる。一般的に、可溶性ポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現する生細胞を培養培地から分離し（例えば、遠心分離により）、所望のポリペプチドの存在について培地（上清）をアッセイすることによって同定され、他方の不溶性膜結合型と区別されうる。培地中にポリペプチドが存在するということは、ポリペプチドがその細胞から分泌されており、従ってそれが可溶型タンパク質であることを示す。
【００６３】
一般的に、可溶型の使用は、特定の用途において有利である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチド精製が容易になる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に静脈内投与により適している。
【００６４】
本発明はまた、所望の生物活性を保持するＩＬ−１δのポリペプチドおよび断片を提供する。特定の実施形態は、ＩＬ−１δカウンター構造（ＩＬ−１ファミリーメンバーなど）に結合する能力を保持するポリペプチド断片に関する。上記断片は、上記したような可溶性ポリペプチドでもよい。別の実施形態において、ポリペプチドおよび断片は、上記したようなＩＬ−１δファミリーに保存される領域を有利に含む。
【００６５】
また本明細書では、様々な長さのポリペプチド断片を提供する。ある実施形態では、好適なＩＬ−１δポリペプチド断片は、アミノ酸配列の少なくとも６個連続したアミノ酸を含む。他の実施形態においては、好適なＩＬ−１δポリペプチド断片は、配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列の、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含んでなる。これらのポリペプチドは可溶型で産生させることができる。さらに、断片はシグナル伝達の研究、および生物シグナルの伝達が関連する細胞過程の調節に、用いることができる。ポリペプチド断片はまた、抗体を生成するための免疫原として使用してもよい。
【００６６】
変異体
上記ポリペプチドおよび断片の天然型変異体および誘導型変異体も本明細書中で提供する。
【００６７】
本明細書でいう「ＩＬ−１δ変異体」とは、天然ＩＬ−１δポリペプチドと実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入または置換のために、天然ＩＬ−１δポリペプチド（ヒト、マウスまたは他の哺乳動物種）とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異体は、天然ＩＬ−１δポリペプチドアミノ酸配列と好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。同一性％は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）に記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム（バージョン６．０）を使用し、配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０）のアライメント法をＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２， １９８１）が改良したものを、利用する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。（１）ヌクレオチドについての単一分子比較マトリクス（同一の場合１、非同一の場合０の値を含める）、ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重比較マトリクス。これらはＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３−３５８， １９７９に記載されている。（２）各ギャップに対して３．０のペナルティ、および各ギャップにある各記号に対して０．１０の追加ペナルティ。ならびに（３）エンドギャップに対してはペナルティ無し。
【００６８】
また、変異体の実施形態には、好ましいポリペプチドまたはこれらの断片と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは断片も包含される。同一性％は、上記したように決定できる。あるいはまた、２つのタンパク質配列の同一性％は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ４８：４４３， １９７０）のアルゴリズムに基づき、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが含まれる。（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５， １９９２）に記載される点数マトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）であるｂｌｏｓｕｍ６２、（２）ギャップ加重：１２、（３）ギャップ長加重：４、ならびに（４）エンドギャップにはペナルティ無し。配列比較の当業者に使用される他のプログラムも使用できる。
【００６９】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象、またはタンパク質分解切断により生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、例えば、末端切断型だが生物活性を有するタンパク質（例えば、天然性可溶型タンパク質）が産生される。タンパク質分解による変異には、例えば、異なる種類の宿主細胞における発現の際に、タンパク質分解により１つ以上の末端アミノ酸（通常、１〜５の末端アミノ酸）がタンパク質から除去されることにより生じる、Ｎ−末端またはＣ−末端の違いが含まれる。遺伝子多型（タンパク質を生成する個体間での対立遺伝子多様性）によりアミノ酸配列に差異を有するタンパク質も本発明に包含される。
【００７０】
上記したように、本発明は、単離および精製された、または均一のＩＬ−１δポリペプチドを、組換えおよび非組換えの両方の形態で提供する。所望の生物活性を保持する天然ＩＬ−１δタンパク質の変異体および誘導体は、天然ＩＬ−１δポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。天然アミノ酸配列の変化は、数ある従来方法のいずれによって達成されてもよい。天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接して変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、突然変異を特定の遺伝子座に導入できる。ライゲーションの後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
【００７１】
あるいはまた、所定のコドンを置換、欠失または挿入することにより変異させるオリゴヌクレオチド指向型部位特異的突然変異誘導方法を利用して、変異遺伝子が得られる。上記変異を得るための典型的方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３， １９８６）、Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３， １９８５）、Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｊａｎｕａｒｙ １９８５， １２−１９）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９８１）、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３６７， １９８７）、ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
ＩＬ−１δポリペプチドは、他の化学部分（例えば、グリコシル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、脂質、リン酸基、アセチル基など）と共有結合または凝集によるコンジュゲートを形成することによって修飾されて、ＩＬ−１δ誘導体が作製できる。ＩＬ−１δポリペプチドの共有結合による誘導体は、化学部分を、ＩＬ−１δアミノ酸側鎖上、またはＩＬ−１δポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはこれらの細胞外ドメインの官能基と結合させることによって生成できる。本発明の範囲内にあるＩＬ−１δポリペプチドの他の誘導体としては、組換え培養株中でのＮ末端またはＣ末端融合体の合成などにより得られる、ＩＬ−１δポリペプチドまたはこれらの断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合もしくは凝集によるコンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲートは、ＩＬ−１δポリペプチドのＮ末端において、シグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダー）を含みうる。シグナルまたはリーダーペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、コンジュゲートを合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部位まで輸送する。
【００７３】
診断（検出可能）用または治療用薬剤が結合したコンジュゲートも本明細書に含まれ、以下に詳細に説明する。
【００７４】
他の誘導体としては、組換え培養株中でＮ末端またはＣ末端融合体として合成することなどにより得られた、ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または凝集によるコンジュゲートが含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと関連させて以下に記載する。さらに、融合タンパク質は、精製および同定し易くするために付加されるペプチドを含んでいてもよい。このようなペプチドには、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４， １９８８に記載されているポリ−Ｈｉｓまたは抗原同定ペプチドが含まれる。このようなペプチドの１つは、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）である。このペプチドは、高い抗原性を有し、特異的なモノクローナル抗体によって可逆的に結合されたエピトープを提供して、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ、および容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるマウスハイブリドーマは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドと結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＨＢ９２５９として寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドと結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔから入手可能である。
【００７５】
本明細書中で提供する変異ポリペプチドには、天然生物活性を保持する天然型ポリペプチドの変異体、またはこれらの実質的等価物がある。一例として、天然型と本質的に同じ結合親和性を有して結合する変異体が挙げられる。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号および以下に記載するような、従来方法によって測定できる。
【００７６】
変異体には、天然型と実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入または置換のために天然型のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。特定の実施形態は、天然配列と比較した場合に、１〜１０のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
所定のアミノ酸を、例えば、類似した物理化学的（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）特性を有する残基によって置き換えてもよい。このような保存的置換の例としては、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基と（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａを互いに）置換すること、ある極性残基を別の極性残基と（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、もしくはＧｌｎとＡｓｎとを）置換すること、または芳香族残基を別の芳香族残基と（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒを互いに）置換すること、が挙げられる。その他の保存的置換、例えば類似した疎水性特性を有する領域全体の置換が関与するものなどは、よく知られている。
【００７８】
同様に、本発明のＤＮＡには、１つ以上の欠失、挿入または置換のために天然ＤＮＡ配列と異なるが、生物活性を有するポリペプチドをコードする、変異体が含まれる。
【００７９】
本発明は、関連する天然型パターンのグリコシル化を伴うまたは伴わない本発明のポリペプチドをさらに含む。酵母または哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−１もしくはＣＯＳ−７細胞）中で発現されたポリペプチドは、発現系の選択によって、分子量およびグリコシル化パターンが、天然型ポリペプチドと類似するか、または有意に異なりうる。本発明のポリペプチドを、細菌発現系（大腸菌など）中で発現すると、非グリコシル化分子が得られる。さらに、得られる調製物は、異なってグリコシル化された複数種の該タンパク質を含み得る。グリコシル基は、従来方法（特に、グリコペプチダーゼを使用する方法）によって除去できる。一般的に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰量のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベートされ得る。
【００８０】
同様に、アミノ酸残基もしくは配列の様々な付加または置換を、あるいは末端もしくは内部の残基または配列の欠失を、コードしている類似したＤＮＡ構築物も本発明に包含される。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインにあるＮ−グリコシル化部位を、グリコシル化を阻むように修飾して、哺乳動物および酵母発現系において炭水化物が低減した類似体を発現させることもできる。真核生物ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（ただし、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）によって特徴付けられる。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる。Ａｓｎを異なるアミノ酸によって置き換えるために選択された単一ヌクレオチドの変化は、例えば、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいはまた、ＳｅｒまたはＴｈｒを、別のアミノ酸（Ａｌａなど）と置換してもよい。タンパク質におけるＮ−グリコシル化部位を不活性化するための公知の方法としては、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，０７１，９７２号および欧州特許第２７６，８４６号に記載されるものが挙げられる。
【００８１】
変異体の別の例では、生物活性のために必須ではないＣｙｓ残基をコードする配列を変化させて、Ｃｙｓ残基が欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換されるようにして、折りたたみまたは再生の際の不適切な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。
【００８２】
その他の変異体は、隣接する二塩基性アミノ酸残基を改変して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増強することによって作製できる。欧州特許第２１２，９１４号は、部位特異的突然変異誘発を使用して、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活性化することを開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、残基を欠失、付加または置換し、Ａｒｇ−Ａｒｇ対、Ａｒｇ−Ｌｙｓ対、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変化させて、これらの隣接塩基性残基の発生を排除することによって不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断を極めて受け難く、またＡｒｇ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−ＡｒｇをＬｙｓ−Ｌｙｓに転換することは、ＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的かつ好ましいアプローチである。
【００８３】
オリゴマー
本発明には、ＩＬ−１δポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパク質が包含される。このようなオリゴマーは、共有結合または非共有結合した多量体（二量体、三量体、またはより高位のオリゴマー）の形態で存在しうる。上記したように、好ましいポリペプチドは、可溶性であり、従ってこれらのオリゴマーは、可溶性ポリペプチドを含みうる。本発明の一態様において、オリゴマーは、ポリペプチド構成要素の結合能を保持し、従って二価、三価などの結合部位を提供する。
【００８４】
本発明の一実施形態は、ポリペプチドに融合されたペプチド部分間の共有結合的または非共有結合的相互作用を介して結合された複数のポリペプチドを含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー形成を促す性質を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー、および抗体から誘導された特定のポリペプチドは、結合したポリペプチドのオリゴマー形成を促し得るペプチドの１つであり、以下により詳細に説明する。
【００８５】
免疫グロブリンをベースとするオリゴマー
１つの選択肢として、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して作製できる。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の作製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５， １９９１）、Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７， １９９０）、ならびにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌ． ４， ｐａｇｅｓ １０．１９．１−１０．１９．１１， １９９２）に記載されている。
【００８６】
本発明の一実施形態は、本発明のポリペプチドを、抗体から誘導したＦｃポリペプチドに融合させることによって作製された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクターに挿入する。ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で発現されて、より抗体分子らしくアセンブルされ、この時Ｆｃ部分間で鎖内ジスルフィド結合が形成されて二価分子を産生する。
【００８７】
本明細書で使用する「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたは全てを含む抗体のＦｃ領域からなる天然型およびムテイン型のポリペプチドを含む。二量体化を促すヒンジ領域を含む、上記ポリペプチドのトランケート型形態も含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導されたＦｃポリペプチドを含む。
【００８８】
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される適切なＦｃポリペプチドの一つは、Ｎ−末端ヒンジ領域から、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然型Ｃ−末端まで延びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００１， １９９４）に記載されているＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変わり、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変わり、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変わること以外は、ＷＯ９３／１０１５１に提示されている天然型Ｆｃ配列のものと同一である。ムテインは、Ｆｃ受容体に対して低い親和性を示す。
【００８９】
Ｆｃ部分（およびこれらから形成されるオリゴマー）を含む前述した融合タンパク質により、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点が得られる。
【００９０】
別の実施形態において、抗体の重鎖または軽鎖の可変部分を本発明のポリペプチドと置き換えてもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方からなる場合、４つのＩＬ−１δ細胞外領域を有するオリゴマーを形成することができる。
【００９１】
ペプチド−リンカーをベースとするオリゴマー
あるいはまた、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまたは含まない、複数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーの１つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されているものである。所望のペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を、任意の適切な従来技術を用いて、本発明のＤＮＡ配列の間に、それと同じリーディングフレーム内に挿入しうる。例えば、リンカーをコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを配列間に連結してもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ペプチドリンカーで隔てられた２〜４つの可溶性ＩＬ−１δポリペプチドを含む。
【００９２】
ロイシンジッパー
本発明のオリゴマーを作製するための別の方法では、ロイシンジッパーを使用する。ロイシンジッパードメインは、それらが内在するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、初めいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９， １９８８）、以来、様々な異なるタンパク質中で見出されている。公知のロイシンジッパーの１つは、二量体化または三量体化する、天然に存在するペプチドおよびこれらの誘導体である。
【００９３】
ジッパードメイン（本明細書中で、オリゴマー化ドメインまたはオリゴマー形成ドメインとも称する）は、通常４〜５のロイシン残基に他のアミノ酸が散在している反復する７つ組反復（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）を含む。ジッパードメインの例として、酵母転写因子ＧＣＮ４で見とめられるもの、およびラット肝臓で見とめられる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８１， １９８９）が挙げられる。ｆｏｓおよびｊｕｎの２つの核トランスフォーミングタンパク質も、マウス癌原遺伝子の遺伝子産物であるｃ−ｍｙｃと同様にジッパードメインを示す（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９， １９８８）。核癌遺伝子であるｆｏｓおよびｊｕｎの産物は、ヘテロダイマーを優先的に形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：６４６， １９８９、ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９， １９８９）。ジッパードメインは、これらのタンパク質の生物活性（ＤＮＡ結合）のために必要である。
【００９４】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスなどを含むいくつかの異なるウイルスの融合誘導（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質も、ジッパードメインを有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５４７， １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：３９４， １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ６：７０３， １９９０）。これらの融合誘導ウイルスタンパク質中のジッパードメインは、タンパク質の膜貫通領域付近にある。ジッパードメインは、融合誘導タンパク質のオリゴマー構造に寄与しているかもしれないと示唆されている。融合誘導ウイルスタンパク質のオリゴマー形成は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓｐｒｕｃｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８８：３５２３， １９９１）。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリゴマー形成に役割を果たすことも報告されている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：２３０， １９９３）。
【００９５】
ジッパードメインは、短い平行コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌｓ）として折りたたむ（Ｏ’Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５３９； １９９１）。平行コイルドコイルの一般的な構造は、よく特徴づけされており、１９５３年にＣｒｉｃｋ（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６：６８９）によって提案されたように「ノブが孔に（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」嵌合したものである。ジッパードメインにより形成される二量体は、７つ組反復 （ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗａｒｔ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８：２９３； １９７５）の表記法に従い （ａｂｃｄｅｆｇ）ｎと称される）により安定化される。このうち残基ａおよびｄは、通常、疎水性残基（ｄはロイシン）であり、ヘリックスの同じ面上で並ぶ。反対の電荷を帯びた残基は、通常、ｇおよびｅの位置で生じる。従って、２つのヘリカルジッパードメインから形成された平行コイルドコイルにおいて、第１のヘリックスの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は、第２のらせんの側鎖間に形成された「孔」に嵌合される。
【００９６】
ｄの位置にある残基（ロイシンである場合が多い）は、大きい疎水性安定化エネルギーに寄与し、オリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ３８：２２９， １９９１）。Ｌｏｖｅｊｏｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８， １９９３）は、最近、らせんの方向が上−上−下である三本鎖αヘリカル束（ｂｕｎｄｌｅ）の合成を報告している。彼らの研究は、疎水性安定化エネルギーが、ヘリカル単量体からコイルドコイルを形成するための主要推進力を提供することを確認している。これらの研究はまた、静電相互作用が、コイルドコイルの化学量論および幾何学に寄与することも示している。ロイシンジッパーの構造に関するさらなる論議は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１， １９９３年１１月２６日）に記載されている。
【００９７】
可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ） （ＳＰＤ）から誘導されるロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１， １９９４）に記載されている。上記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。融合している異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７−２７８， １９９４）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合した可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、形成される可溶性オリゴマーが培養上清から回収される。
【００９８】
特定のロイシンジッパー部分は優先的に三量体を形成する。一例として、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１， １９９４）および米国特許第５，７１６，８０５号（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来のロイシンジッパーが挙げられる。この肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒを含む。
【００９９】
三量体形成を促すロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８０５号に記載されている、アミノ酸配列Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇを有するペプチドである。１つの代替的な実施形態では、Ｎ−末端Ａｓｐ残基が追加され、別の実施形態では、ペプチドはＮ−末端Ａｒｇ残基を欠く。
【０１００】
オリゴマー形成を促す性質を保持する、前記ジッパーペプチドの断片も同様に使用できる。このような断片の例としては、前記アミノ酸配列に示すＮ−末端またはＣ−末端残基の１つまたは２つを欠くペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ロイシンジッパーは、天然に存在するロイシンジッパーペプチドから（例えば、天然型アミノ酸配列の保存的置換を介して）、ペプチドのオリゴマー形成促進能力は保持されたままで誘導できる。
【０１０１】
天然に存在する三量体タンパク質から誘導される他のペプチドは、三量体ＩＬ−１δを作製するのに使用できる。あるいはまた、オリゴマー化を促す合成ペプチドが使用できる。特定の実施形態では、ロイシンジッパー部分にあるロイシン残基は、イソロイシン残基で置き換えられる。イソロイシンを含むこのようなペプチドは、イソロイシンジッパーと称することができるが、本明細書で使用する「ロイシンジッパー」という用語に包含する。
【０１０２】
ポリペプチドおよびその断片の作製
本発明のポリペプチドおよびその断片発現、単離および精製を、限定するものではないが、以下のものを含む適切な技術によって実施し得る。
【０１０３】
発現系
本発明は、ＤＮＡを含む組換えクローニングベクターおよび発現ベクター、ならびに組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターは、ＤＮＡによってコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を作製するために使用できる。ポリペプチドを作製するための方法は、ポリペプチドの発現を促す条件下で、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、次いで、発現されたポリペプチドを培養液から回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための方法が、使用する宿主細胞の種類に応じて、ならびにポリペプチドが膜結合型か、宿主細胞から分泌される可溶性型かに応じて異なることを理解するであろう。
【０１０４】
適切な発現系のいずれを使用してもよい。ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子などに由来する適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に結合した、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡが含まれる。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。調節配列がＤＮＡ配列と機能的に関連していれば、ヌクレオチド配列は機能可能に結合する。つまり、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御すれば、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に機能可能に結合している。所望の宿主細胞中で複製する能力を付与する複製起点、ならびに形質転換体を同定するための選択遺伝子が、通常発現ベクターに導入される。
【０１０５】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然型または異種型）をコードする配列を発現ベクターに導入できる。シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードするＤＮＡ配列を、本発明の核酸配列とフレームを合わせて融合することにより、ＤＮＡがまず転写され、ｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されてもよい。目的とする宿主細胞中で機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促す。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌する際にポリペプチドから切断される。
【０１０６】
ポリペプチド発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物の細胞が含まれる。一般的に、哺乳動物または昆虫の細胞が宿主細胞として使用されることが好ましい。細菌、菌類、酵母、および哺乳動物の細胞宿主と共に使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８５）に記載されている。非細胞含有翻訳系も、本明細書中に開示するＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用いて、ポリペプチドを作製するために使用できる。
【０１０７】
原核生物系
原核生物には、グラム陰性生物およびグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適切な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する他の様々な種が含まれる。大腸菌などの原核生物宿主細胞中では、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含むことにより、原核生物宿主中での組換えポリペプチドの発現を容易にできる。Ｎ−末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断されうる。
【０１０８】
原核生物宿主細胞で使用される発現ベクターは、通常、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与する、または独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞の有用な発現ベクターの例として、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）などの市販のプラスミドに由来したものが挙げられる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性用の遺伝子を含んで、形質転換された細胞を同定するための簡易な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列を、ｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）が挙げられる。
【０１０９】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ （ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７， １９８０；および欧州特許出願第３６７７６号）、ならびにｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ． ４１２， １９８２）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を使用する。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込まれた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ３７０９２中に存在）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ５３０８２中に存在）を含む。
【０１１０】
ＩＬ−１δＤＮＡを、通常の細菌発現ベクターの複数のクローニング部位に、フレームを合わせてクローニングしてもよい。理想的には、ベクターは、クローニング部位の上流に誘導可能なプロモーターを含み、これにより、調査者の選択時に誘導物質を加えて組換えタンパク質の高度な作製が可能になる。タンパク質によっては、プロモーターと目的の遺伝子との間に、融合パートナー（例えば、ヘキサヒスチジンなど）をコードするコドンを組み込むことによって、発現レベルが増大する。得られる「発現プラスミド」は、様々な大腸菌株において増幅されうる。
【０１１１】
組換えタンパク質の発現のために、細菌細胞を、増殖培地中で、所定の光学密度に達するまで増殖させる。次に、例えば、ｌａｃオペレーター／プロモーターを含むプラスミドからのタンパク質の発現を活性化するＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加することによって、組換えタンパク質の発現を誘導する。誘導後（通常１〜４時間後）、遠心分離（例えば、５，０００×Ｇ、４℃にて２０分間）でペレット化することによって細胞を収穫する。
【０１１２】
発現されたタンパク質を回収するために、ペレット化された細胞を、１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）／１Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁し、フレンチプレスに２、３回かける。最も高度に発現した組換えタンパク質は、封入体として知られる不溶性凝集体を形成する。封入体は、遠心分離器で（５，０００×Ｇ、４℃にて２０分間）ペレット化することによって可溶性タンパク質から精製除去できる。封入体ペレットは、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）／１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗浄され、次いで５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）／８ Ｍ尿素／０．１ Ｍ ＤＴＴｆ中に溶解される。溶解不可能な物質はいずれも遠心分離（１０，０００×Ｇ、２０℃にて、２０分間）により除去される。目的のタンパク質は、ほとんどの場合、最終的な清澄上清中で最も豊富なタンパク質となる。このタンパク質は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）／５ ｍＭ ＣａＣｌ２／５ ｍＭ Ｚｎ（ＯＡｃ）２／１ ｍＭ ＧＳＳＧ／０．１ ｍＭ ＧＳＨに対して透析することにより、活性立体構造に「再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）」されてもよい。再生後、種々のクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換またはゲル濾過など）により精製を行うことができる。プロトコールによっては、再生前に初期精製を行っても良い。例えば、ヘキサヒスチジンをタグ付けした融合タンパク質を、固定化ニッケル上で部分的に精製できる。
【０１１３】
先行する精製および再生処置は、タンパク質が封入体から回収されることを最善であると意図して行われているが、タンパク質精製技術の当業者は、多くの組換えタンパク質が、細胞溶解産物の可溶性分画から精製されることが最も良いことを理解するであろう。この場合、再生は必要でない場合が多く、標準的なクロマトグラフィー法による精製を直接行うことができる。
【０１１４】
酵母系
あるいはまた、ポリペプチドは、酵母宿主細胞、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現されてもよい。ＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓなどの他の酵母属も使用できる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカー遺伝子を含むことが多い。酵母ベクターのために適したプロモーター配列は、とりわけメタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３， １９８０）、または他の解糖酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、およびグルコキナーゼなど）（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９， １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００， １９７８）のためのプロモーターを含む。酵母発現に使用できるその他の適切なベクターおよびプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ、欧州特許出願第７３，６５７号に記載されている。別の選択肢としては、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：２６７４， １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４， １９８２）に記載されているグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターがある。大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記酵母ベクターに挿入することにより、酵母よび大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築してもよい。
【０１１５】
酵母α−因子リーダー配列を、ポリペプチドの分泌を指示するために使用できる。α−因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される場合が多い。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９８２およびＢｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易化するのに適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、３’側付近において１つ以上の制限部位を含むように修飾されてもよい。これにより、リーダー配列の構造遺伝子への融合が容易になる。
【０１１６】
酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。このようなプロトコールの１つは、Ｈｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９， １９７８に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコールによれば、０．６７％酵母窒素原基礎培地、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２０ ｍｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【０１１７】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「富化（ｒｉｃｈ）」培地中で発現を誘導するために増殖されうる。富化培地の例として、１％酵母抽出液、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものに、８０ ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ ｍｇ／ｍｌウラシルを添加したものが挙げられる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から無くなったときに生じる。
【０１１８】
哺乳動物系または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系も、組換えポリペプチドを発現するために使用できる。昆虫細胞中で異種タンパク質を作製するためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に概説されている。樹立された哺乳動物由来源細胞系も使用できる。適切な哺乳動物宿主細胞系には、サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、ならびにＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１， １９９１）に記載されているようにアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）から誘導したＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系が含まれる。
【０１１９】
哺乳動物細胞にＤＮＡを導入するために確立された方法は記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０， ｐｐ． １５−６９）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬などの市販の試薬を使用した別のプロトコールを、細胞をトランスフェクトするために使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７， １９８７）。さらに、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ ｅｄ． Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されるような従来方法により、エレクトロポーレーションを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトできる。例えば、細胞傷害性薬剤に対する耐性など当該分野で公知の方法を用いて、安定な形質転換体の選択を行える。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１， １９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択スキームを記載している。ＤＨＦＲ選択のために適切な宿主株は、ＤＨＦＲが不足しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１でもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入し、プラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖できる。発現ベクターに組み込める選択マーカーの他の例として、抗生物質（Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなど）に対する耐性を付与するｃＤＮＡが挙げられる。ベクターを保持する細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択できる。
【０１２０】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。一般的に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマイウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位などは、哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列を発現するための他の遺伝子エレメントを提供するために使用できる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方ともウイルスゲノムから断片として容易に得られるために、特に有用であり、さらにウイルス複製起点を含んでいてもよい（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３， １９７８；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に配置されたＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にわたる約２５０ｂｐの配列が含まれれば、大小のＳＶ４０断片も使用できる。
【０１２１】
哺乳動物発現ベクターから異種遺伝子を発現することを改善することが示されている別の調節配列は、ＣＨＯ細胞由来の発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７， ｐｐ． ５２９−５３４およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／２５４２０）、ならびにアデノウイルス２由来の三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３４７５−１３４９１， １９８２）などのエレメントを含む。ウイルス起源の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列により、ジシストロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００， １９９３；Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００， １９９６）。ジシストロンｍＲＮＡの一部および後続する選択マーカー用の遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）として異種ｃＤＮＡを発現することは、宿主のトランスフェクト性および異種ｃＤＮＡの発現を改善することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。ジシストロンｍＲＮＡを使用する発現ベクターの例として、Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１， １９９７に記載されているｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７， ｐｐ． ５２９−５３４に記載されているｐ２Ａ５Ｉが挙げられる。
【０１２２】
有用な高度発現ベクターであるｐＣＡＶＮＯＴが、Ｍｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９：３３５−３４８， １９８９に記載されている。哺乳動物宿主細胞に使用できる他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０， １９８３）に開示されているように構築できる。Ｃ１２７マウス乳上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高度発現のために有用な系は、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５， １９８６）に記載されているように実質的に構築できる。Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８， １９８４に記載されている有用な高度発現ベクターであるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。別の有用な哺乳動物発現ベクターは、参照により本明細書中に組み込まれる欧州特許出願第０３６７５６６号、およびＷＯ９１／１８９８２に記載されている。さらに別の選択肢として、ベクターはレトロウイルスから誘導できる。
【０１２３】
別の有用な発現ベクターであるｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１も使用できる。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）で、親水性のＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターで発現された組換えタンパク質のＮ−末端に融合することを中心に構成されている。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞においてタンパク質を発現するために使用される別の専用ベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子、およびＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位を有するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含むバイシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）配列、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三部分リーダー配列、ならびにポリアデニル化部位によって特徴付けられる。
【０１２４】
使用できるシグナルペプチドに関して、所望であれば、異種シグナルペプチドまたはリーダー配列を用いてもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを内部で生成する宿主細胞の種類などの要因に依存する。例示すると、哺乳動物宿主細胞において機能する異種シグナルペプチドの例として、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のためのシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載のインターロイキン−２受容体のためのシグナル配列、欧州特許第３６７，５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、ならびに欧州特許第４６０，８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【０１２５】
精製
また、本発明は、ポリペプチドおよびそれらの断片を単離精製する方法も包含する。本発明による単離精製ＩＬ−１δポリペプチドは、前述したように組換え発現系によって生成するか、または天然に存在する細胞から精製される。ＩＬ−１δポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の際に単一タンパク質バンドとして示されて、実質的に精製できる。ＩＬ−１δを生成するためのプロセスの１つは、ＩＬ−１δの発現を促すのに十分な条件下で、ＩＬ−１δポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む。その後、ＩＬ−１δポリペプチドを、使用する発現系に応じて、培養培地または細胞抽出物から回収する。
【０１２６】
単離精製
本明細書中で使用する「単離精製」という表現は、ＩＬ−１δが、例えば、他のＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に会合せずに、組換え宿主細胞培養物の精製産物または非組換え起源からの精製産物であることを意味する。本明細書中で使用する「実質的に精製された」という表現は、ＩＬ−１δを含み、特異的な抗体を用いて除去できる公知のＤＮＡまたはタンパク質の存在以外には他のＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に会合しない混合物を指す。この実質的に精製されたＩＬ−１δタンパク質は、生物活性を保持する。「精製ＩＬ−１δ」という用語は、「単離精製」形態のＩＬ−１δまたは「実質的に精製された」形態のＩＬ−１δのいずれか（ともに本明細書中に記載）を指す。
【０１２７】
ＩＬ−１δタンパク質に関して使用される「生物活性」という用語は、ＩＬ−１δタンパク質が、ＩＬ−１δカウンター構造と会合可能、またはＩＬ−１δカウンター構造に対する抗体を使用してＩＬ−１δカウンター構造と同時免疫沈降されることを意味する。
【０１２８】
１つの好適な実施形態では、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発明のポリペプチドまたは断片と別のポリペプチドとの融合体を使用し、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を補助することによって達成される。このような融合体パートナーとしては、前述したポリ−Ｈｉｓまたは他の抗原同定ペプチド、ならびに先に記載したＦｃ部分が挙げられる。
【０１２９】
組換えポリペプチドまたは断片の精製方法は、いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られているように、使用される宿主細胞の種類、および組換えポリペプチドまたは断片が培養培地中に分泌されるか否かなどの要因に応じて、異なる。
【０１３０】
一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合は宿主細胞から単離され、または可溶性で分泌される場合は培地もしくは上清から単離できる。その後、濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップのうちの１つ以上を行う。これらのステップを行うための具体的な手段については、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットなど）を使用して、培養培地を濃縮してもよい。濃縮ステップの後、濃縮物を、ゲル濾過媒体などの精製マトリックスに塗布してもよい。あるいはまた、陰イオン交換樹脂（例えば、ジエチルアミノエチル側基を有するマトリックスまたは基質）を使用できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または、タンパク質精製に一般的に使用されている他の種類のものでもよい。あるいはまた、陽イオン交換ステップを利用できる。適切な陽イオン交換材として、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。また、等電点クロマトグラフィーステップを利用できる。あるいはまた、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップも利用できる。適切なマトリックスは、樹脂に結合したフェニル部分またはオクチル部分でもよい。さらに、組換えタンパク質を選択的に結合するマトリックスでのアフィニティークロマトグラフィーを利用できる。使用される上記樹脂の例として、レクチンカラム、ダイカラム、および金属キレートカラムが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、シリカゲル、またはメチル、オクチル、オクチルデシルもしくは他の脂肪族側基を有するポリマー樹脂）を使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを１回以上利用して、ポリペプチドをさらに精製できる。上記した精製ステップの一部または全てが、様々な組み合わせにおいて周知であり、単離精製組換えタンパク質を得るために使用できる。
【０１３１】
細菌培養液中で生成された組換えタンパク質は、通常、宿主細胞の最初の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドであれば細胞ペレットからの抽出あるいは可溶性ポリペプチドであれば上清液からの抽出、そして、濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップのうちの１つ以上によって単離される。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣを、最終的な精製ステップのために利用できる。微生物細胞は、任意の使いやすい方法によって破壊でき、これには、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。
【０１３２】
精製を簡易化するために、形質転換された酵母宿主細胞を、ＩＬ−１δを分泌ポリペプチドとして発現するために使用することが好ましい。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ２９６：１７１， １９８４）に開示されているものと類似した方法により精製できる。Ｕｒｄａｌらは、組換えヒトＩＬ−２を分離用ＨＰＬＣカラム上で精製するための、２つの連続した逆相ＨＰＬＣステップを記載している。
【０１３３】
また、本発明のポリペプチド結合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体など）を含むアフィニティーカラムを利用して、発現したポリペプチドをアフィニティー精製してもよい。これらのポリペプチドは、従来技術を用いてアフィニティーカラムから除去できる（例えば、高塩濃度溶出緩衝液において、その後低塩濃度緩衝液に透析して使用するか、または使用するアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他の要素を変化させる）。あるいはまた、本発明で得たポリペプチドなど親和性部分の天然に存在する基質を使用して競合的に除去することができる。
【０１３４】
本発明のこの態様では、本発明の抗ポリペプチド抗体、または本発明のポリペプチドと相互作用しうる他のタンパク質などのポリペプチド結合タンパク質を、本発明のポリペプチドを表面上で発現する細胞の同定、分離または精製に適したカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは類似した基質などの固相支持体に結合させてもよい。本発明のポリペプチド結合タンパク質の固相接触面への接着は、例えば、磁気マイクロスフィアを上記ポリペプチド結合タンパク質で被覆し、インキュベーション容器中に入れて磁界下に置くなどの任意の手段によって行うことができる。細胞混合物の懸濁液を、上記ポリペプチド結合タンパク質を表面上に有する固相と接触させる。表面上に本発明のポリペプチドを有する細胞は、固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、その後未結合細胞は洗浄される。この親和性結合方法は、上記ポリペプチド発現細胞を溶液から精製、スクリーニング、または分離するのに有用である。陽性選択された細胞を固相から離す方法は、当該分野で公知であり、例えば、酵素の使用が挙げられる。このような酵素は、好ましくは細胞に対して非毒性および無害であり、好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するようにされている。
【０１３５】
あるいはまた、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと思われる細胞の混合物を、まず、本発明のビオチン化ポリペプチド結合タンパク質とインキュベートしてもよい。インキュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするために、典型的に少なくとも１時間継続する。得られた混合物を、次いで、アビジンで被覆されたビーズを充填したカラムに通し、ビオチンのアビジンに対する高親和性によりポリペプチド結合細胞をビーズに結合させる。アビジン被覆ビーズの使用は当該分野において公知である。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照のこと。未結合物質の洗浄、および結合細胞の分離は、従来方法を用いて行う。
【０１３６】
上記方法では、適切なＩＬ−１δ結合ポリペプチドは、抗−ＩＬ−１δ抗体およびＩＬ−１δを高い親和性により結合できる他のタンパク質である。好ましいＩＬ−１δ結合タンパク質は、抗−ＩＬ−１δモノクローナル抗体である。
【０１３７】
望ましい純度は、意図するタンパク質の用途に依拠する。例えば、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合には比較的高い純度が望ましい。この場合、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の際に他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検出されないくらいにポリペプチドを精製する。関連分野の当業者は、示差的グリコシル化、示差的翻訳後プロセシングなどにより、ポリペプチドに対応する複数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化できることを理解するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の際に単一タンパク質バンドとして示される実質的に均質な状態に精製される。タンパク質バンドは、銀染色法、クーマシーブルー染色法、または（タンパク質が放射性標識されてる場合には）オートラジオグラフィー法によって可視化してもよい。
【０１３８】
アッセイ
従来の結合アッセイなどの任意の適切なアッセイにより、本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の形態のものを含む）を、ＩＬ−１δカウンター構造分子を結合する能力について試験できる。例示すると、ポリペプチドを検出可能な試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光反応などを触媒する酵素）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、ＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する細胞と接触させる。次いで細胞を洗浄して、未結合標識ポリペプチドを除去し、標識の性質に応じて適切な技術により細胞結合標識の存在を決定する。
【０１３９】
結合アッセイ法の一例は以下の通りである。ＩＬ−１δカウンター構造分子 ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。例えば、ＯＸ４０−Ｆｃについて先に記載されているように（Ｂａｕｍら， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００１， １９９４）、ＩＬ−１δカウンター構造分子の細胞外ドメインをＩｇＧ−Ｉ Ｆｃ（突然変異タンパク質形態）に融合する。１０ ｃｍ２皿中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を組換え発現ベクターでトランスフェクトする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーターから誘導されたＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１， １９９１）に記載されているように、アフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）から誘導する。
【０１４０】
トランスフェクトされた細胞を、２４時間培養し、次いで各皿の細胞を２４ウエルプレートに配分する。さらに４８時間培養した後、トランスフェクトした細胞（約４×１０４細胞／ウエル）を、５０ ｍｇ／ｍｌの乾燥脱脂乳を添加された結合媒体（２５ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，２ ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２を含むＲＰＭＩ １６４０）であるＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。次に、細胞を、例えば、前述したように作製された様々な濃度の可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質と、３７℃にて１時間インキュベートする。次に、細胞を、結合媒体中に一定飽和濃度で存在する１２５Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧで、３７℃にて１時間緩やかに攪拌して洗浄およびインキュベートする。十分に洗浄した後、トリプシン処理により細胞を解離する。
【０１４１】
上記利用したマウス抗−ヒトＩｇＧを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して用いる。これは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡから得られる。抗体を、標準的クロラミンＴ法を使用して放射性ヨウ素化する。抗体は、細胞に結合した任意のポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分に結合する。全てのアッセイにおいて、Ｆｃ融合タンパク質の不在下、ならびにＦｃ融合タンパク質および２００倍モル過剰量の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下における、１２５Ｉ−抗体の非特異的結合についてアッセイした。
【０１４２】
細胞結合１２５Ｉ−抗体を、Ｐａｃｋａｒｄオートガンマカウンターで定量した。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０， １９４９）は、Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピュータ上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）で求められる。
【０１４３】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例示すると、ＩＬ−１δカウンター構造またはＩＬ−１δカウンター構造を発現する細胞と結合する際の、天然型タンパク質と競合する能力について変異体をアッセイすることによって、変異体の生物活性を決定できる。
【０１４４】
競合結合アッセイは、従来方法によって行うことができる。競合結合アッセイ利用できる試薬としては、放射性標識されたＩＬ−１δ、および細胞表面上で（内因性または組換えの） ＩＬ−１δカウンター構造を発現する無傷の細胞が挙げられる。例えば、放射性標識された可溶性ＩＬ−１δ断片を、細胞表面（結合パートナー）との結合を可溶性ＩＬ−１δ変異体と競合させるために使用できる。無傷細胞の代わりに、プロテインＡまたはプロテインＧとＦｃ部分との（固相上での）相互作用を介して固相と結合した可溶性ＩＬ−１δカウンター構造／Ｆｃ融合タンパク質で置き換えてもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムとしては、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪから入手可能なものが挙げられる。
【０１４５】
別の種類の競合結合アッセイは、放射性標識された可溶性ＩＬ−１δカウンター構造（例えば、可溶性ＩＬ−１δカウンター構造／Ｆｃ融合タンパク質など）およびＩＬ−１δを発現する無傷の細胞を利用する。競合オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより定性結果が得られ、またＳｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０， １９４９）を利用して定量結果を生成してもよい。
【０１４６】
ＩＬ−１δ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用
前述したようにポリペプチドを発現するために使用する以外に、ＤＮＡおよびそのオリゴヌクレオチドを含む本発明の核酸は、以下のことにも使用できる。
【０１４７】
− ＩＬ−１δ活性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとして使用できる。
【０１４８】
− ヒト第２染色体を同定するために使用できる。
【０１４９】
− ヒト第２染色体上の遺伝子をマッピングするために使用できる。
【０１５０】
− ヒト第２染色体に関連した特定の疾患、症状または他の状態を伴う遺伝子を同定するために使用できる。
【０１５１】
− 一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＩＬ−１δ遺伝子にコードされたポリペプチドの発現を阻害するために使用できる。
【０１５２】
− 個体における欠陥遺伝子を検出するのを助けるために使用できる。
【０１５３】
− 遺伝子治療のために使用できる。
【０１５４】
プローブ
本発明の核酸の使用の１つは、断片をプローブまたはプライマーとして使用することである。このような断片は、一般的に、ＤＮＡ配列のうちの少なくとも約１７の連続するヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の連続するヌクレオチドを含む。
【０１５５】
他の哺乳動物種に由来する、配列番号１および配列番号３の相同体も本明細書に含まれるため、配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列に基づくプローブを使用し、従来の交差種（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーション技術を使用して他の哺乳動物種に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１５６】
前述したアミノ酸配列と合わせて遺伝子コードの知識を使用し、縮重オリゴヌクレオチドのセットが作製できる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのプライマーとして有用であり、これによりＤＮＡ断片が単離され増幅される。
【０１５７】
ＩＬ−１δのＲＮＡ発現パターンによって、配列番号３のＤＮＡ配列に基づくプローブを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような方法により、リンパ節、胸腺、扁桃腺、脳、胎盤、肺、骨格筋、前立腺および精巣組織、ならびに細胞型を検出することができる。
【０１５８】
染色体マッピング
ヒトＩＬ−１δ遺伝子は染色体２ｑ１１−１２にマッピングされる。オリゴヌクレオチドを含む、配列番号３の核酸の全てまたは一部は、周知の技術を用いて当該分野の当業者によって使用されて、ＩＬ−１δファミリーメンバーのＤＮＡを含むヒト第２染色体およびその特定の遺伝子座を同定することができる。有用な技術には、放射性ハイブリッドマッピング（高分離度）、染色体長（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中度の分離度）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞系に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低分離度）などの様々な周知技術において、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分をプローブとして使用することが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５９】
例えば、放射性ハイブリダイゼーションにより染色体をマッピングしてもよい。９３の放射性ハイブリッドを含むＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ ｈｕｍａｎ＃ＳＴＳ＃ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ）を使用してＰＣＲを行う。目的の遺伝子の推定上のエキソンに存在し、ヒトゲノムＤＮＡ由来の産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡは増幅しないプライマーを使用する。ＰＣＲの結果を、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）上でＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｓｉｔｅに寄託されたデータベクターに変換する。データをスコア付けし、公知の配列タグ部位（ＳＴＳ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ Ｓｉｔｅ）マーカーに関連づけて、放射性ハイブリットマップ上での染色体評価および位置付けを行う。以下のウェブサイトは、放射性ハイブリッドマッピングについてさらなる情報を提供している：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＃ＳＴＳ＃ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）。
【０１６０】
関連疾患の同定
前記のように、配列番号３は、第２染色体の２ｑ１１−１２領域にマッピングされた。ヒト第２染色体は、緑内障、外胚葉性形成異常、インシュリン依存性糖尿病メリタス（ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、皺状皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、および脛筋ジストロフィーなどを含む（がこれらに限定されない）特定の疾患と関連している。従って、配列番号３の核酸、またはそれらの断片を、周知技術を利用して当業者によって使用して、第２染色体への遺伝子マッピングに関連した異常を分析できる。これにより、該マーカーが再配列または欠失された状態を区別することが可能になる。さらに、配列番号３のヌクレオチドまたはこれらの断片を位置マーカーとして使用して、他の未知配置の遺伝子をマッピングできる。
【０１６１】
上記ＤＮＡは、本発明の核酸に対応する遺伝子の欠陥または不足によって（直接的または間接的に）媒介される任意の障害の治療を開発するために使用できる。天然型ヌクレオチド配列についての本明細書の開示は、欠陥遺伝子の検出、および該遺伝子の正常遺伝子との置換を可能にする。欠陥遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、また、本明細書に開示する天然型ヌクレオチド配列を、欠陥遺伝子を保持していると思われるヒトから得た該遺伝子のヌクレオチド配列と比較することによって検出できる。
【０１６２】
センス−アンチセンス
他の有用な核酸断片としては、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によれば、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ（配列番号１または配列番号３）の断片を含む。該断片は、通常、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０ヌクレオチドを含む。任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９， １９８８）ならびにｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８， １９８８）に記載されている。
【０１６３】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、いくつかある手段（ＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡの増強された分解、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未成熟終結、または他の手段を含む）のうちの１つにより、タンパク質発現をブロックまたは阻害する二重らせんを形成する。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、タンパク質の発現をブロックするために使用してもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（またはＷＯ９１／０６６２９に記載のような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。この糖結合は、内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を有する上記オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち、酵素分解に耐性である）が、配列特異性は保持して標的ヌクレオチド配列に結合できる。
【０１６４】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例として、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるような有機部分、およびポリ（Ｌ−リシン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加するような他の部分と共有結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、エリプチシンなどの介在物質、およびアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に対する結合特異性を変えてもよい。
【０１６５】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、任意の遺伝子導入方法、例えばリポフェクション、ＣａＰＯ４−媒介型ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポーレーション、またはエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用によって、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。
【０１６６】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを適切なレトロウイルスベクターに挿入し、その後、挿入配列を含むレトロウイルスベクターに細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで接触させることによって標的核酸配列を含む細胞に導入されることが好ましい。適切なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称されるダブルコピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子と複合体を形成して、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入できる。適切なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体と結合する他のリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の複合体は、リガンド結合分子が対応する分子または受容体と結合する能力を実質的に妨害したり、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこれらの複合体形態が細胞に侵入するのをブロックしない。
【０１６８】
あるいはまた、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド脂質複合体は、内因性リパーゼにより、細胞内で解離されることが好ましい。特定の細胞型を指向させたモノクローナル抗体に。
【０１６９】
ＩＬ−１δポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの用途
用途には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
・タンパク質の精製およびその活性の測定
・送達剤
・治療薬
・合理的な薬剤設計
・研究試薬
・分子量および等電点電気泳動マーカー
・ペプチド断片化の対照
・未知のタンパク質の同定
・抗体の調製
精製試薬
本発明のポリペプチドの各々は、タンパク質精製試薬として使用することができる。これらのポリペプチドは、固相支持物質に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーによりＩＬ−１δのカウンター構造分子（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を精製するために使用することができる。特定の実施形態において、ポリペプチド（本明細書中に記載される、ＩＬ−１δカウンター構造分子に結合することができるあらゆる形態のもの）を、従来法により固相支持体に結合させる。１つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含むクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ． ニュージャージー州ピスカタウェイ）。別法において、（上記の）ポリペプチド／Ｆｃタンパク質を、Ｆｃ部分との相互作用によりタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇを含むクロマトグラフィーカラムに結合させる。
【０１７０】
該ポリペプチドは、細胞表面上にＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する細胞を精製または同定するのに使用することもできる。ポリペプチドを、例えばカラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の好適な基質などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球を該ポリペプチドでコーティングし、磁場を通してインキュベーション容器中に保つことができる。ＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する細胞を含む細胞混合物の懸濁液を、該ポリペプチドを表面上に有する固相に接触させる。細胞表面上にＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する細胞は、この固定されたポリペプチドに結合し、その後結合しなかった細胞を洗い流す。
【０１７１】
あるいは、該ポリペプチドを検出可能な成分にコンジュゲートさせたあと、ＩＬ−１δカウンター構造分子の発現について検査しようとする細胞と共にインキュベートすることができる。インキュベーション後、結合しなかった標識物を除去し、その細胞上の該検出可能成分の存在または不在を測定する。
【０１７２】
さらに別法において、ＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する細胞を含むと思われる細胞の混合物を、ビオチン化ポリペプチドと共にインキュベートする。インキュベーションの時間は、十分な結合のために典型的には少なくとも１時間である。つぎに、アビジンでコーティングしたビーズを中に詰めたカラムにこの得られた混合物を通過させると、アビジンに対するビオチンの高い親和性により、所望の細胞が該ビーズに結合する。アビジンでコーティングしたビーズを使用する方法は公知である（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９， １９８６を参照のこと）。結合しなかった物質を除去するための洗浄、および結合した細胞の解放は、従来法を用いて行う。
【０１７３】
活性の測定
ポリペプチドは、その結合親和性の観点から、ＩＬ−１δカウンター構造分子の生物学的活性を測定するのに使用することもできる。このように、該ポリペプチドは、例えば異なる条件下におけるタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするために、「品質保証」検査を行う場合に使用され得る。例えば、該ポリペプチドは、異なる温度で保存された、あるいは異なる細胞型において産生された、ＩＬ−１δカウンター構造分子の生物学的活性を測定するための結合親和性検査で使用することができる。このタンパク質は、ＩＬ−１δカウンター構造分子を改変（例えば化学的修飾、末端切断、突然変異など）した後に生物学的活性が維持されたかどうかを決定するために使用することもできる。改変されたＩＬ−１δカウンター構造分子の結合親和性を未改変のＩＬ−１δカウンター構造分子の結合親和性を比較して、その改変がＩＬ−１δカウンター構造分子の生物学的活性に及ぼす悪影響を検出する。こうしてＩＬ−１δカウンター構造分子の生物学的活性を、例えば調査研究で使用する前に確かめることができる。
【０１７４】
送達剤
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ手法において、細胞表面上にＩＬ−１δカウンター構造分子を発現することが判明したこのような細胞または細胞型に、診断薬または治療薬を送達するために、該ポリペプチドを使用することができる。従って、ＩＬ−１δポリペプチドを毒素に結合させて、ＩＬ−１δカウンター構造分子を細胞表面上に発現する細胞に結合させ、これらの細胞を特異的に殺すことができる。この方法論は、ＳＣＩＤマウスにおける治療抵抗性Ｂ系急性リンパ芽球性白血病を治療するための抗ＣＤ７２イムノトキシンの効果的な使用に類似しているかもしれない（Ｍｅｙｅｒｓら， Ｌｅｕｋ． ａｎｄ Ｌｙｍｐｈ． １８： １１９−１２２）。
【０１７５】
ポリペプチドに結合させることができる検出可能薬（診断薬）および治療薬には、毒素、他の細胞傷害薬、薬物、放射性核種、発色団、比色または蛍光反応を触媒する酵素などが含まれるが、これらに限定されない。具体的な薬は、意図される用途に応じて選択される。毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリアトキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエンドトキシンＡ、リボソーム不活化タンパク質、トリコテセン等のマイコトキシン、ならびにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖等）が挙げられる。診断に使用するのに適した放射性核種には、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎおよび７６Ｂｒが挙げられるがこれらに限定されない。治療的用途に適した放射性核種の例としては、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。
【０１７６】
このような薬は、好適な従来法により該ポリペプチドに結合させることができる。該ポリペプチドは、所望の薬剤上の官能基と反応して例えば共有結合を形成することができる官能基を、アミノ酸側鎖上に含む。あるいは、該タンパク質または薬剤は、誘導体化されて、所望の反応性官能基を生成または結合することができる。この誘導体化は、種々の分子をタンパク質に結合させるのに利用することができる二官能性カップリング試薬のうちの１つの結合を含んでいても良い（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， イリノイ州ロックフォード）。タンパク質を放射性標識するための多くの技法が知られている。放射性核種金属は、例えば好適な二官能性キレート剤を用いてポリペプチドに結合させることができる。
【０１７７】
このように、（好ましくは共有結合された）ポリペプチドおよび好適な診断薬または治療薬を含むコンジュゲートを調製する。このコンジュゲートは、具体的な用途に適した量で投与または使用される。
【０１７８】
治療剤
本発明の別の実施形態は、ＩＬ−１δの治療での使用に関する。ＩＬ−１リガンドは、感染応答および免疫炎症応答（細胞シグナル伝達、血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、炎症サイトカイン、急性期タンパク質、造血、熱、骨吸収、プロスタグランジン、メタロプロテイナーゼ、および接着分子の誘導を含む）に対する防御において中心的な役割を果たす。増加し続けている公知のＩＬ−１ファミリーのメンバーの数に関して、好適な分類スキームは、ポリペプチド構造並びに機能（活性化および制御特性）の比較に基づくものである。このように、ＩＬ−１δに対するリガンドは、ＩＬ−１ α、ＩＬ−１ β、およびＩＬ−１８と同様に、炎症応答を促進するのみならず、上記の機能の多くに関与すること、およびそれ故に恐らくは、炎症疾患および／または自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、炎症腸疾患、および乾癬等）の原因および維持に関与していることが考えられる。例えば、ＩＬ−１δ等のＩＬ−１Ｒファミリーメンバーの発現および／または活性化の変化は、過剰の細胞過程、例えば、限定するものではないが、シグナル伝達の変化に基づく炎症反応、増殖、細胞特異的反応の活性化または阻害に対して多大な影響を及ぼし得る。
【０１７９】
ＩＬ−１媒介性の細胞シグナル伝達は、分子活性化カスケードを伴うことが多く、カスケードの間に、レセプターはリガンド−レセプター媒介シグナルを、標的物質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することにより増加させ、その結果、転写因子ＮＦκＢおよびＡＰ１、プロテインキナーゼ Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼおよびｐ３８ ｍａｐキナーゼ、プロスタグランジン生産につながるＣＯＸ−２酵素、および一酸化窒素産生につながるｉＮＯＳ、および炎症一般を活性化することとなる。ＩＬ−１δは同様の様式でシグナルを送ることが考えられる。それ故に、ＩＬ−１δの投与は一酸化窒素、接着分子、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性等の増加が免疫応答または炎症応答の刺激等に助力となる場合において有用であり得る。
【０１８０】
他には、ＩＬ−１δは、ＩＬ−１ｒａがＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの作用のアンタゴニストであるのと同様の様式で、他の活性なサイトカインのアンタゴニストとして作用する可能性がある。故に、ＩＬ−１δの投与は、転写因子ＮＦκＢおよびＡＰ１、プロテインキナーゼ Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼおよびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ、プロスタグランジン生産につながるＣＯＸ−２酵素、および酸化窒素産生につながるｉＮＯＳ、および炎症一般の活性化を含む炎症応答をブロックすることにおいて、治療的用途を有する可能性がある。
【０１８１】
このように、本発明の、単離、精製されたＩＬ−１δポリペプチドまたはその断片は、シグナル伝達の阻害における治療剤として有用であり得る。可溶性ＩＬ−１δポリペプチドはＩＬ−１δカウンター構造と相互作用する可能性があり、細胞関連ＩＬ−１δを介した細胞の活性化を阻害する可能性がある。
【０１８２】
ポリペプチドは、細胞外環境へ、タンパク質の静脈内投与、または特定の細胞型を標的としたモノクローナル抗体とタンパク質との結合等の、公知の手段により導入可能であり、それによりシグナル伝達に影響を与え得る。治療剤として使用される場合には、本発明のポリペプチドは薬用組成物に、公知の方法に従って製剤化することができる。ポリペプチドは、単一の活性物質として、または他の公知の活性物質とともに、薬学的に好適な希釈剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸等）、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類等）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／または担体と組み合わせて混合物にすることができる。好適な担体とそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６版、１９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。さらに、そのような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合化された、またはポリマー性化合物（ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等）に組み込まれた、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単ラメラ（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）もしくは多重ラメラ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）に組み込まれたポリペプチドを含み得る。そのような組成物は、本発明のポリペプチドの、物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響するであろう。
【０１８３】
組成物の用量は、当業者によって容易に決定され得る。投与されるべき量および投与の頻度は、経験的に決定され得、治療を要する患者の年齢および身体の大きさならびにかかる治療を要する病気が考慮されるであろう。
【０１８４】
治療は、組成物を、当業者によく知られた任意の方法（静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、クモ膜下腔内、筋内、皮下、局所的、扁桃、鼻腔内、膣内、経口等）によって投与することを含む。この組成物はまた、筋内または皮下のいずれかでの特定の領域への注射などにより、局所的に投与され得る。
【０１８５】
合理的な薬剤設計
さらに、ＩＬ−１δポリペプチドは、ＩＬ−１δインヒビターの構造に基づく設計に使用することもできる。このような構造に基づく設計は、「合理的薬剤設計」としても知られる。ＩＬ−１δポリペプチドは、例えばＸ線結晶学、核磁気共鳴、または相同性モデリング（全て公知方法である）等により３次元解析することができる。インヒビターの設計およびインヒビター／ＩＬ−１δ相互作用を支援するための分子モデリング・ソフトウェアシステムにおけるＩＬ−１δ構造情報の使用も、本発明に包含される。このようなコンピューター支援モデリングおよび薬剤設計は、化学的な立体構造分析、分子の静電位、タンパク質の折畳み等の情報を使用することができる。例えば、メタロプロテアーゼのクラス特異的インヒビターの設計の多くは、触媒作用に関与する亜鉛原子をキレートまたは結合することに焦点を当てたものであった。合成インヒビターは通常、特定のプロテアーゼの特異性ポケットにフィットするように設計された一連の他の基が結合する負に荷電した部分を含むように設計される。本発明の具体的な方法は、基質の結合部位であると思われる箇所についてＩＬ−１δの３次元構造を分析し、予想反応性部位を組み込んだ新しい分子を合成し、および先に記載したようにこの新しい分子をアッセイすることを含む。
【０１８６】
研究試薬
本発明のポリペプチドの他の用途は、ＩＬ−１δ／ＩＬ−１δカウンター構造相互作用によりもたらされる、異なる細胞型に及ぼす生物学的影響を研究するための研究手段としてである。他には、ＩＬ−１δがアンタゴニスト活性を有する場合には、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−１δカウンター構造とそのアゴニストリガンドとの相互作用を阻害した結果である生物学的効果を研究するための研究用のツールとして使用できるであろう。ポリペプチドは、ＩＬ−１δカウンター構造分子、ＩＬ−１δポリペプチド、またはその相互作用を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用することもできる。
【０１８７】
ＩＬ−１δは、（ａ）ＩＬ−１δシグナル伝達に関与する、ＩＬ−１δが結合するタンパク質、および（ｂ）シグナル伝達経路に関与する、ＩＬ−１δが相互作用する可能性がある他のタンパク質、を同定するための試薬として使用することもできる。これらの他のタンパク質は、シグナル伝達の他のインヒビターの研究に有用な手段となるであろう。ＩＬ−１δは、組換えタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させることにより、またはそれをツーハイブリッド系におけるベイト（ｂａｉｔ）として使用することにより、使用することができる。
【０１８８】
ＩＬ−１δポリペプチドとそのカウンター構造との間の相互作用は、ＩＬ−１δポリペプチド／ＩＬ−１δカウンター構造の会合を邪魔し、そしてそれ故に、（ｉ）ＩＬ−１δがアゴニストである場合にはＩＬ−１δポリペプチドもしくはそのカウンター構造の活性を阻害する、または、（ｉｉ）ＩＬ−１δがアンタゴニストである場合にはＩＬ−１δカウンター構造リガンドの結合およびシグナル伝達活性を生じさせる、小さな分子のスクリーニングを可能とする。
【０１８９】
これを補助するために、（Ｆｉｅｌｄｓらの米国特許第５，２８３，１７３号に記載された）ＳＵＮＹで開発された酵母ツーハイブリッド系を使用して、以下のようにＩＬ−１δのインヒビターをスクリーニングすることができる。ＩＬ−１δポリペプチドおよびそのカウンター構造、またはこれらの相互作用に関与するこれらの部分を、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびＧａｌ４転写活性化ドメインにそれぞれ融合させ、ヒスチジンを含まないプレート上での増殖がＧａｌ４活性に依存する株の中に導入することができる。ＩＬ−１インヒビターを同定するためには、増殖を妨げる化合物をスクリーニングすればよい。あるいは、ＩＬ−１δポリペプチド／ＩＬ−１δポリペプチドカウンター構造の相互作用が増殖を阻害するように、そして相互作用の阻害により増殖が可能となるように、このスクリーニング法を改変してもよい。
【０１９０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ におけるＩＬ−１δ阻害の他のスクリーニング方法は、これらの成分のいずれか一方（ＩＬ−１δポリペプチドまたはそのカウンター構造のいずれか）をマイクロタイタープレートのウェル中に固定化し、簡単に検出されるインジケーターを他方の成分に結合させるものである。この相互作用のインヒビターは、ウェル中の検出可能インジケーターの不在により同定される。
【０１９１】
さらに、本発明のＩＬ−１δポリペプチドは、ＩＬ−１δインヒビターの構造に基づく設計に有用である。このような設計は、ＩＬ−１δポリペプチドの３次元構造を決定するステップ、基質結合部位であると思われる箇所の３次元構造を解析するステップ、予想反応性部位を組み込んだ分子を合成するステップ、および該分子の阻害活性を測定するステップを含む。
【０１９２】
ＩＬ−１δ ＤＮＡ、ＩＬ−１δポリペプチド、およびＩＬ−１δポリペプチドに対する抗体は、様々な研究プロトコルにおける試薬として使用することができる。このような研究プロトコルのサンプルは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｅｄ． Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９）に記載されている。例えば、これらの試薬はＲＮＡまたはタンパク質の細胞特異的発現または組織特異的発現についてのマーカーとして使用することができる。同様に、これらの試薬は、ＩＬ−１δ ＲＮＡまたはポリペプチドの構成的および一過性発現を研究するために使用することができる。ＩＬ−１δ ＤＮＡは、ＩＬ−１δＤＮＡに関連する配列の染色体位置を決定するため、およびこの染色体位置に関して遺伝子をマッピングするために、使用することができる。ＩＬ−１δ ＤＮＡは、遺伝子フィンガープリンティングなどの技法を使用して遺伝的な異種性および遺伝を調査するため、ならびに遺伝子疾患に関するリスクを同定するために、使用することもできる。ＩＬ−１δ ＤＮＡはさらに、ＩＬ−１δ ＤＮＡに関連する更なる遺伝子を同定するため、および配列比較に基づく進化系統樹を確立するために、使用することができる。ＩＬ−１δ ＤＮＡおよびポリペプチドは、ＩＬ−１δ ＤＮＡまたはポリペプチドに相同なこれらの遺伝子またはタンパク質を、陽性スクリーニング法（例えばサザンブロッティングおよびイムノブロッティングなど）並びに陰性スクリーニング法（例えばサブトラクションなど）により選択するために使用することができる。
【０１９３】
分子量、等電点マーカー
化学的および酵素的手段により本発明のポリペプチドを断片化してより小さなペプチドにし、こうして生成されたペプチド断片を他のタンパク質またはポリペプチドの分析に使用することができる。例えば、このようなペプチド断片を、ペプチドの分子量マーカー、ペプチド等電点マーカーとして、またはペプチド断片化の程度の分析において、使用することができる。このように、本発明は、これらのポリペプチドおよびペプチド断片、ならびに未知のタンパク質の見かけ分子量および等電点の測定に役立つキットおよび未知のタンパク質の断片化の程度を評価するためのキットも含む。
【０１９４】
全ての断片化方法は本発明に包含されるが、好ましい実施形態は化学的断片化であり、中性および酸性条件下においてメチオニン残基で特異的切断が起こるように切断を行うために臭化シアンを使用することを含む（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１：２３８−２５５， １９６７）。これはさらに、システイン残基を非反応種へと変換させるためのカルボキシメチル化ステップなどの追加ステップを含むことができる。
【０１９５】
他の好適な実施形態は酵素による断片化であり、特定のアミノ酸残基での切断が起こる従来条件下における、アスパラギニルエンド−ペプチダーゼ（Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、アルギニルエンド−ペプチダーゼ（Ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩ、トリプシン、黄色ブドウ球菌 Ｖ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ等のプロテアーゼの使用を含む。アスパラギニルエンドペプチダーゼは、本発明のポリペプチド内のアスパラギン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。アルギニルエンドペプチダーゼは、これらのポリペプチド内のアルギニン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩは、該ポリペプチド内のリシン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる（Ｓａｋｉｙａｍａ及びＮａｋａｔ， 米国特許第５，２４８，５９９号；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：４４−５０， １９８１； Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５５， １９８１）。トリプシンは、本発明のポリペプチド内のアルギニンおよびリシン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。酵素による断片化は、複数のアミノ酸残基で切断するプロテアーゼでも起こり得る。例えば、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼは、ポリペプチド内のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３：１１０２−１１０６， １９７７）。エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎは、ポリペプチド内のアスパラギン残基のアミノ側を特異的に切断することができる。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃは、本発明のポリペプチド内のリシン残基のカルボキシル側を特異的に切断することができる。これらのポリペプチドを特定のペプチドのユニークなセットに特異的に断片化するために、他の酵素的および化学的処理を同様に使用することもできる。
【０１９６】
もちろん、本発明のポリペプチドのペプチドおよび断片は、当技術分野で公知である従来の組換え法および合成法により生成することもできる。組換え法に関して、本発明により包含されるポリペプチドおよびペプチド断片は、それらが発現される宿主細胞に応じて、様々な分子量を有することができる。様々な細胞型における本発明のポリペプチドおよびペプチド断片のグリコシル化により、改変の程度に応じて、これらの片の分子量にばらつきが生じ得る。これらの片のサイズは、該ポリペプチドの細胞外部分に由来するポリペプチドの断片で最も不均一になり得る。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、専ら膜貫通領域および細胞質領域から得たポリペプチドを用いることにより、Ｎ−グリカナーゼで予め処理してグリコシル化を除去することにより、または細菌宿主中で該ポリペプチドを発現させることにより、得られ得る。
【０１９７】
これらのポリペプチドの分子量も、本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に更なるペプチド配列を融合させることにより、変えることができる。本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端への追加ペプチド配列の融合は、これらのポリペプチドの発現を増大させるため、または該タンパク質の精製を補助するために、使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端への追加ペプチド配列の融合によって、酵素処理または化学処理により生成する該ポリペプチドの断片化ペプチドはいくらか改変されるが、通常は全部を変えるものではない。もちろん、分子生物学の常套手段および公知方法を用いて、本発明のポリペプチドに突然変異を導入することができる。例えば、特定の酵素によるタンパク分解切断部位、または特定の化学的に誘導された断片化方法による切断部位を除去するように、突然変異を設計することができる。該部位の除去により、特定の酵素法または化学法を用いた断片化による本発明のポリペプチドのペプチド・フィンガープリントが改変される。
【０１９８】
該ポリペプチドおよび得られた断片化ペプチドは、沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー、および質量分析法などの方法により分析してそれらの分子量を決定することができる。各片の独特なアミノ酸配列で分子量が特定されるため、これらの片はその後でこのような分析法を用いた分子量マーカーとして使われ、未知のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の分子量を決定するのに役立つ。本発明の分子量マーカーは、同じような見かけ分子量を有するタンパク質の見かけ分子量を推定するための分子量マーカーとして特に役立ち、その結果タンパク質の見かけ分子量の決定がより正確に行えるようになる。
【０１９９】
本発明がＩＬ−１δポリペプチド断片および断片化ペプチドの分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカーは、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の大きさである。より好ましくは、これらの断片化ペプチド分子量マーカーは、１０〜１００アミノ酸の大きさである。さらにより好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０〜５０アミノ酸の大きさであり、特に１０〜３５アミノ酸の大きさである。最も好ましくは、断片化ペプチド分子量マーカーは、１０〜２０アミノ酸の大きさである。
【０２００】
分子量の測定方法としては、沈降法、ゲル電気泳動法、クロマトグラフィー、および質量分析法が挙げられる。特に好ましい実施形態は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動である（Ｕ．Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５， １９７０）。通常、この方法は、ドデシル硫酸ナトリウムを含み、６〜２０％のアクリルアミド濃度のゲルの２つの別々のレーンを使用する。ゲル上のタンパク質は従来の染色法を使用して可視化できる。同一条件下においてマーカーおよびサンプルを同時に分離する能力により、精度が増す。もちろん、本発明のポリペプチドを用いて未知のタンパク質の分子量測定を行うためには多くの異なる技術を使用することができること、およびこの実施形態が本発明の範囲を限定するものではないことは理解されよう。
【０２０１】
各非グリコシル化ポリペプチドまたはその断片は、その独特なアミノ酸配列により固有に決定されるｐＩを有する（ｐＩは当業者により、ｐＩ値を推定するために設計された現在入手可能な任意のコンピュータープログラムを用いて算定するか、任意の公知アミノ酸ｐＫａテーブルを用いて計算するか、または実験的に測定することができる）。従って、これらのポリペプチドおよびその断片は、等電点電気泳動などの技法を用いた未知のタンパク質、ポリペプチド、または断片化ペプチドの等電点の測定に役立つ特定のマーカーとして使用することができる。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーの見かけ等電点に近い見かけ等電点を有する未知のタンパク質の見かけ等電点の推定に特に役立つ。
【０２０２】
等電点電気泳動の技法はさらに、分子量および電荷に基づいてタンパク質を同時に分離するためのゲル電気泳動などの他の技法と組み合わせることができる。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を同一条件下にて同時に分離する能力は、未知のタンパク質の見かけ等電点の測定をより正確なものとする。これは、２次元電気泳動（Ｔ．Ｄ． Ｂｒｏｃｋ及びＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， ６ｄ ｅｄ． １９９１））等の技術において特に興味深く、当該文献では、該方法の特徴は、任意のマーカーを未知のタンパク質と同時に分離することであるとされている。さらに、このような方法を用いて、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質または断片化ペプチドの等電点および分子量の両方を測定することを支援できる。
【０２０３】
ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質と分子量マーカーの判別を可能とする２つの異なる方法を用いて、可視化することができる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生成された抗体および従来のイムノブロッティング法を用いて可視化することができる。この検出は、未知のタンパク質の検出に至らない従来条件下において行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まないものもあるので、本発明の全てのポリペプチド断片に対する抗体を作成することは不可能であるかも知れないことを理解されたい。さらに、全ての抗体がこのアッセイで役立つわけではないことを理解されたい。しかし、本発明のポリペプチドおよび断片に結合することができるこれらの抗体は、従来法を用いて簡単に測定することができる。
【０２０４】
未知のタンパク質も、従来の染色法を用いて可視化される。本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチドの分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰は、従来の染色法では該未知のタンパク質が主に検出されるようなものである。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドの分子量マーカーのレベルは、これらのマーカーが従来の染色法により僅かしか、または全く検出されないようなレベルである。本発明のポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好適なモル過剰は、２〜１００，０００倍である。より好ましくは、これらのポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好適なモル過剰は、１０〜１０，０００倍であり、特に１００〜１，０００倍である。
【０２０５】
もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用いて、未知のタンパク質、ポリペプチドおよびその断片化ペプチドの分子量および等電点を測定および検出するために、多くの技法を使用することができること、ならびにこれらの実施形態は本発明の範囲を限定するものではないことを、理解されたい。
【０２０６】
他の実施形態において、例えば断片化反応の時間または温度を変えること等による、特定のペプチドへの本発明のポリペプチドの漸進的な断片化（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の分析（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６， １９７７）を、未知のタンパク質の切断の程度についての対照として使用することができる。例えば、同一条件下において同量のポリペプチドおよび未知のタンパク質を切断することにより、断片化の程度の直接比較が可能となる。該ポリペプチドの完全な断片化を生じる条件は、未知のタンパク質の完全な断片化を生じさせることもできる。
【０２０７】
このように、本発明の好ましい実施形態においては、ＩＬ−１δポリペプチドを、ゲル電気泳動によるサンプルタンパク質の見かけの分子量を評価するための分子量マーカーとして使用し得る。本発明の、単離、精製されたマウスＩＬ−１δポリペプチド分子量マーカー（配列番号２）は、グリコシル化されていない状態でおよそ１７，１２４ダルトンの分子量を有する。故に、ＩＬ−１δポリペプチド分子量マーカーは、１７，１２４ダルトンに近い見かけの分子量を有するサンプルタンパク質の見かけの分子量を評価するための分子量マーカーとして特に好適に機能し、１７，１２４ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量を、より正確に決定することを可能とする。
【０２０８】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＩＬ−１δポリペプチドの化学的断片化によって生成されたＩＬ−１δ断片を、サンプルタンパク質のゲル電気泳動による見かけの分子量を評価するための分子量マーカーとして使用するものである。単離、精製されたＩＬ−１δポリペプチドは、ＩＬ−１δポリペプチド内部のメチオニン残基のカルボキシル側においての特異的加水分解によりＩＬ−１δポリペプチドの断片化が生じるような通常の条件下で臭化シアンで処理することができる（Ｅ．Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１：２３８−２５５， １９６７）。ＩＬ−１δポリペプチドのユニークなアミノ酸配列により、ＩＬ−１δポリペプチドを臭化シアンで断片化することで、ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーのユニークなセットが上記のように生成される。
【０２０９】
ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカー（マウスＩＬ−１δポリペプチドの臭化シアン処理により生成）のユニークなセットは、大きさが少なくとも１０アミノ酸である４種類の断片化ペプチドを含む。配列番号２のアミノ酸３〜１２によってコードされるペプチドは約１，０９５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１３〜８７によってコードされるペプチドは約７，８７１ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸８８〜１０６によってコードされるペプチドは約２，３４０ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１０７〜１５６によってコードされるペプチドは約５，６０９ダルトンの分子量を有する。故に、ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーは、約１，０９５；７，８７１；２，３４０；および５，６０９ダルトンの分子量を有する。
【０２１０】
ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーは、サンプルタンパク質とともに、上記のように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離できる。ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーは、１，０９５；７，８７１；２，３４０；および５，６０９ダルトンに近い見かけの分子量を有するサンプルタンパク質の見かけの分子量を評価するための分子量マーカーとして特に好適に機能する。勿論、ヒトＩＬ−１δポリペプチド（配列番号４）のユニークなアミノ酸配列を同様に使用してヒトＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーのユニークなセットを作成できることが理解される。この断片化のサイズは入手し得るコンピュータープログラムを用いて容易に決定できる。
【０２１１】
さらに、マウスまたはヒトＩＬ−１δポリペプチドの断片化の程度は、サンプルタンパク質の完全な断片化に関して予期される条件を決定するための対照として使用される。ＩＬ−１δポリペプチドを断片化するために多くの化学物質を使用できること、およびこの実施形態は本発明の範囲を何ら限定するものではないことが理解される。
【０２１２】
別の実施形態においては、ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーのユニークなセットは、ＩＬ−１δポリペプチドから、特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断する酵素を用いて生成できる。ＩＬ−１δポリペプチドのアミノ酸配列のユニークな性質のために、種々のアミノ酸残基での切断により、断片化ペプチド分子量マーカーの種々のセットが生成されるであろう。
【０２１３】
例えば、単離、精製されたＩＬ−１δポリペプチドは、通常の条件下で、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ プロテアーゼＩで上記のように処理することができ、その結果ＩＬ−１δポリペプチドが断片化される。ＩＬ−１δポリペプチドのユニークなアミノ酸配列のために、ＩＬ−１δポリペプチド分子量マーカーのＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ プロテアーゼＩでの断片化により、ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーのユニークなセットが生成される。リシン残基の分布が各々のペプチド中のアミノ酸数を決定し、各々のペプチドのユニークなアミノ酸組成がその分子量を決定する。
【０２１４】
ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカー（マウスＩＬ−１δポリペプチドのＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ プロテアーゼＩでの処理により生成）のユニークなセットは、大きさが少なくとも１０アミノ酸である５種類の断片化ペプチドを含む。ＩＬ−１δポリペプチドの酵素処理により５種類の断片化ペプチドが生成したことは、ＩＬ−１δポリペプチドの臭化シアン処理による４種類の断片化ペプチドと比較すると、断片化ペプチド分子量マーカーの大きさおよび数の双方が、ＩＬ−１δポリペプチドを断片化するために用いられた断片化処理に依存して変化するであろうことを明瞭に示している。さらに、ヒトＩＬ−１δポリペプチド（配列番号４）を断片化することにより、ＩＬ−１δポリペプチドのアミノ酸配列によって指令される、断片化ペプチドのユニークなセットが生じるという結果となる。
【０２１５】
特異的断片に関しては、配列番号２のアミノ酸１〜１３によってコードされるペプチドは約１，４８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１９〜３６によってコードされるペプチドは約１，９８９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸４０〜７５によってコードされるペプチドは約３，６１２ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸８１〜９４によってコードされるペプチドは約１，５８８ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸９８〜１５６によってコードされるペプチドは約６，８１３ダルトンの分子量を有する。
【０２１６】
故に、ＩＬ−１δポリペプチドの、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩでの酵素処理にる切断により、約１，４８５；１，９８９；３，６１２；１，５８８；および６，８１３ダルトンの分子量を有するＩＬ−１δ断片のユニークなセットが生成される。
【０２１７】
当然、ヒトＩＬ−１δポリペプチドのユニークなアミノ酸配列（配列番号４）は、同じように使用してヒトＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーのユニークなセットを作成できることが理解される。この断片化のサイズは入手し得るコンピュータープログラムを用いて容易に決定できる。再び、ＩＬ−１δ断片化ペプチド分子量マーカーは、サンプルタンパク質とともに、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって従来技術で分離できる。
【０２１８】
最後に、本発明に包含されるキットについて、このようなキットの構成要素は多種多様であるが、典型的には、該ポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量マーカーを含む。また、このようなキットは、断片化に必要な部位が除去されたポリペプチドを含み得る。さらに、該キットは、該ペプチドおよび未知のタンパク質の化学的もしくは酵素的切断による特異的切断のための試薬を含み得る。キットはさらに、本発明のポリペプチドまたはその断片に対する抗体を含み得る。
【０２１９】
未知のタンパク質の同定
上記に記載したように、ポリペプチドまたはペプチドのフィンガープリントを、質量分析法を用いた未知のタンパク質の同定に役立てるために既知のタンパク質のデータベース中に入力したり、これと比較したりすることができる（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５０１１−５０１５， １９９３； Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：９９８−１００５， １９９８）。これらの比較を容易にするための様々なコンピュータソフトウェア・プログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ （インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ…ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＃ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）等に、インターネットでアクセスすることができる。これらのプログラムにより、ユーザーは切断剤および指定された許容差内の断片化ペプチドの分子量を特定することができる。これらのプログラムは観測した分子量を配列データベースから得た推定ペプチド分子量と比較して、その未知のタンパク質の同定の決定に役立てる。
【０２２０】
さらに、ポリペプチドまたはペプチド消化物は、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を用いて配列決定し、得られた配列をデータベースで検索することができる（Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． ５：９７６−９８９（１９９４）； Ｍ． Ｍａｎｎ及びＭ． Ｗｉｌｍ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ． Ｔａｙｌｏｒ及びＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５（１９９７））。このプロセスで使用することができる検索プログラムはインターネット上にあり、例えばＬｕｔｅｆｉｓｋ９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、ならびに上記のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ， Ｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラム等がある。
【０２２１】
従って、遺伝子の配列およびその推定タンパク質配列およびペプチド断片を配列データベースに追加すれば、質量分析法を用いた未知のタンパク質の同定に役立つであろう。
【０２２２】
抗体
本発明のポリペプチドに対して免疫反応性である抗体が本明細書中に記載される。このような抗体は、（非特異的結合と異なり）該抗体の抗原結合部位を介して該ポリペプチドに特異的に結合する。このように、上記ポリペプチド、断片、変異型、融合タンパク質などは、それに対して免疫反応性である抗体を作製する際の免疫原として使用することができる。より具体的には、ポリペプチド、断片、変異型、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘導するエピトープまたは抗原決定基を含む。
【０２２３】
これらの抗原決定基すなわちエピトープは、線状（ｌｉｎｅａｒ）であっても高次構造（非連続的）であってもよい。線状のエピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一のセクションからなるが、高次構造すなわち非連続的エピトープは、タンパク質の折り畳みにより互いに近接している、該ポリペプチド鎖の異なる領域からの複数のアミノ酸セクションからなる（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．及びＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９ （Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， ２ｎｄ ｅｄ． １９９６））。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多いが、タンパク質の立体構造および立体障害により、エピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．及びＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， ２ｎｄ ｅｄ． １９９６））。エピトープは、当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる。
【０２２４】
このように、本発明の一態様は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。このようなエピトープは、抗体、特にモノクローナル抗体を産生するたに有用であり、その詳細については以下に記載する。さらに、本発明のポリペプチドのエピトープは、アッセイの研究試薬として、およびポリクローナル血清または培養したハイブリドーマからの上清などの物質から特異的結合抗体を精製するために、使用することができる。このようなエピトープまたはその変異型は、当技術分野で公知の方法、例えば固相合成法、ポリペプチドの化学的または酵素的切断等を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、生成することができる。
【０２２５】
本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出すことができる抗体について、該エピトープが単離されているかまたは該ポリペプチドの一部として残っているかに関わらず、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は両方とも、従来法により下記のように調製することができる。
【０２２６】
本発明のこの態様において、ＩＬ−１δおよびＩＬ−１δのアミノ酸配列に基づくペプチドを使用して、ＩＬ−１δに特異的に結合する抗体を調製することができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片（例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片など）、ならびに組換えにより生成したあらゆる結合パートナーを含むものとする。抗体は、それが約１０７Ｍ−１以上のＫａでＩＬ−１δポリペプチドに結合するときに、特異的に結合すると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ５１：６６０（１９４９）に記載されたもののような従来法を用いて簡単に測定することができる。
【０２２７】
ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットなどの種々の起源から、当技術分野で公知の方法を用いて簡単に生成することができる。一般に、精製されたＩＬ−１δ、または適切にコンジュゲートされたＩＬ−１δポリペプチドのアミノ酸配列に基づくペプチドを、典型的には非経口注入により宿主動物に投与する。ＩＬ−１δポリペプチドの免疫原性は、例えばフロイントの完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用して強化することができる。ブースター免疫したあと、少量の血清サンプルを収集し、ＩＬ−１δポリペプチドに対する反応性について検査する。このような測定に有用な様々なアッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８に記載された方法や、向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、およびサンドイッチアッセイなどの方法が挙げられる。米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
【０２２８】
モノクローナル抗体は、公知方法を用いて簡単に調製することができる。例えば米国特許第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｅｎｎｅｔｔ， ＭｃＫｅａｒｎ， 及びＢｅｃｈｔｏｌ （ｅｄｓ．）， １９８０ に記載された方法を参照されたい。まとめると、マウス等の宿主動物に少なくとも１回、好ましくは約３週間間隔で少なくとも２回、単離精製したＩＬ−１δまたはコンジュゲート化ＩＬ−１δペプチドを、場合によりアジュバントの存在下にて、腹腔内注射する。次にマウス血清を従来のドットブロット法または抗体捕捉法（ＡＢＣ）により検査し、どの動物が融合に最も適しているかを決定する。およそ２〜３週間後、マウスの静脈内に、ＩＬ−１δまたはコンジュゲート化ＩＬ−１δペプチドのブースター投与を行う。後にマウスを犠牲にし、確立されたプロトコルに従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等の市販されている骨髄腫細胞に脾臓細胞を融合させる。まとめると、骨髄腫細胞を培地で数回洗浄し、マウス脾臓細胞に、骨髄腫細胞１に対して脾臓細胞約３の割合で融合させる。融合剤は、当技術分野で使用される任意の好適な薬剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等であってもよい。融合細胞の選択的増殖を可能とする培地を含むプレートに融合体をプレーティングする。つぎに、該融合細胞を約８日間増殖させ得る。得られたハイブリドーマから上清を収集し、まずヤギ抗−マウスＩｇでコーティングしたプレートに加える。洗浄したあと、１２５Ｉ−ＩＬ−１δ等の標識物を各ウェルに加え、インキュベートする。続いてオートラジオグラフィーにより陽性ウェルを検出する。陽性クローンを大量培養したあと、プロテインＡカラム（ファルマシア社）にて上清を精製することができる。
【０２２９】
本発明のモノクローナル抗体は、他の方法、例えばＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら， ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９（１９９０）に記載された方法（本明細書中に参考として組み込まれる）を用いて、生成することができる。同様に、組換えＤＮＡ技術を用いて、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むように、結合パートナーを構築することができる。このような技法は、Ｌａｒｒｉｃｋら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７：３９４ （１９８９）に記載されている。
【０２３０】
このような抗体の抗原結合断片（従来法により生成することができる）も、本発明に包含される。このような断片の例としては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作技術により生成される抗体断片および誘導体も提供される。
【０２３１】
本発明のモノクローナル抗体は、例えばマウスモノクローナル抗体のヒト化型などのキメラ抗体を含む。このようなヒト化抗体は既知の方法により調製することができ、該抗体をヒトに投与した場合に免疫原性が低いという利点を提供する。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を含まない）を含んでいてもよい。キメラ抗体およびさらに遺伝子操作されたモノクローナル抗体の製造方法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら （Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， １９８８）、Ｌｉｕら （ＰＮＡＳ ８４：３４３９， １９８７）、 Ｌａｒｒｉｃｋら （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， １９８９）、および Ｗｉｎｔｅｒ及びＨａｒｒｉｓ （ＴＩＰＳ １４：１３９， Ｍａｙ， １９９３）に記載されたものが含まれる。遺伝子導入によって（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ）抗体を生成する方法は、ＧＢ２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、ならびにこれらを優先権主張の基礎とする関連特許（これらは全て本明細書中に参考として組み入れられる）に記載されている。
【０２３２】
その用途
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ または ｉｎ ｖｉｖｏ において本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するためのアッセイで使用することができる。ＩＬ−１δのＲＮＡ発現パターンより、ＩＬ−１δポリペプチドは、リンパ節、胸腺、扁桃、脳、胎盤、肺、骨格筋、前立腺および精巣細胞および組織において発現されることが期待される。ＩＬ−１δポリペプチドに対する抗体は、リンパ節、胸腺、扁桃、脳、胎盤、肺、骨格筋、前立腺および精巣組織および細胞型を、従来の免疫組織化学的方法により検出するために使用し得る。該抗体は、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際に使用することもできる。
【０２３３】
さらに本発明のポリペプチドがＩＬ−１δカウンター構造分子に結合するのをブロックすることができるこれらの抗体を使用して、このような結合により生じる生物学的活性に影響を与えることができる。この抗体は（ｉ）ＩＬ−１δがアゴニストである場合にはＩＬ−１δポリペプチドの活性を阻害し得るか、または、（ｉｉ）ＩＬ−１δがアンタゴニストである場合にはＩＬ−１δカウンター構造リガンドの結合およびシグナル伝達活性を生じさせ得る。例えば、転写因子ＮＦκＢおよびＡＰ１、プロテインキナーゼ Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼおよびｐ３８ ｍａｐキナーゼ、プロスタグランジン生産につながるＣＯＸ−２酵素、および一酸化窒素産生につながるｉＮＯＳ、および炎症一般の活性化が阻害される可能性がある。このようなブロッキング抗体は、任意の好適なアッセイ手順を使用して、例えば抗体を、ＩＬ−１δカウンター構造分子を発現する特定の細胞へのＩＬ−１δポリペプチドの結合を阻害する能力に関して試験すること等により同定し得る。あるいは、ブロッキング抗体は、標的細胞へのＩＬ−１δカウンター構造分子の結合により生じる生物学的影響を阻害する能力についてのアッセイにおいて、同定することができる。例えば、ＩＬ−１δカウンター構造分子が媒介する細胞溶解を阻害する能力について抗体をアッセイすることができる。
【０２３４】
このような抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で使用したり、または該抗体を生成したもの（ｅｎｔｉｔｙ）により媒介される生物学的活性を阻害するためにｉｎ ｖｉｖｏ で投与したりすることができる。従って、ＩＬ−１δカウンター構造分子と細胞表面（結合パートナー）受容体との相互作用により（直接的または間接的に）引き起こされまたは悪化した障害を治療することができる。治療法は、ＩＬ−１δカウンター構造分子が媒介する生物学的活性を阻害するのに有効な量のブロッキング抗体を哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ 投与することを含む。モノクローナル抗体は、一般的にこのような治療法で使用するのに好適である。ある実施形態において、抗原結合抗体断片が使用される。
【０２３５】
ＩＬ−１δポリペプチドに対する抗体、および生理学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、または担体を含む組成物が、本明細書中に記載される。このような組成物に適した成分は、ＩＬ−１δポリペプチドを含む組成物について先に記載したものである。
【０２３６】
本明細書中には、該抗体に結合した検出薬（例えば診断薬）または治療薬を含むコンジュゲートも記載される。このような薬剤の例は、先に記載してある。該コンジュゲートはｉｎ ｖｉｔｒｏ または ｉｎ ｖｉｖｏ での方法において使用できる。
【０２３７】
本明細書中に引用した参考文献は、本明細書中に参考として全て組み込まれる。
【０２３８】
本明細書に記載した実施形態および以下の実施例は、本発明の実施形態の例を提供するものであって、本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。当業者であれば、他の多くの実施形態が、請求の範囲に記載された発明に包含されることが分かるであろう。
【０２３９】
実施例１  ヒトＩＬ−１δの組換え発現
全長ヒトＩＬ−１δ発現構築物を以下の様式で生成した。ＩＬ−１δポリペプチドをコードするＩＬ−１７ ＤＮＡを、フレーム中に、タグなしで、またはＣ−末端ＦＬＡＧ／ポリＨｉｓ タグとともに、発現ベクターｐＤＣ４１２のＳａｌＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にクローン化した。タンパク質はＣＯＳ細胞中にトランスフェクトすることにより産生した。ヒトＩＬ−１δは、適度な効率でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞またはＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞から分泌された。
【０２４０】
実施例２  ヒトＩＬ−１δＲＮＡの発現
ヒトＩＬ−１δ ｍＲＮＡの発現を、３個のＣｌｏｎｔｅｃｈ複数組織ｃＤＮＡパネル（３ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌｓ）を用いて、ネステッドＰＣＲ法により分析した。使用した３種類のパネルは以下のとおりである：
１．ヒトパネルＩ（Ｃａｔ．＃ Ｋ１４２０−１）は心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓の第１鎖ｃＤＮＡを含む。
【０２４１】
２．ヒトパネルＩＩ（Ｃａｔ．＃ Ｋ１４２１−１）は脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球の第１鎖ｃＤＮＡを含む。
【０２４２】
３．ヒトパネルＩＩＩ（Ｃａｔ．＃ Ｋ１４２６−１）は、脾臓、リンパ節、胸腺、扁桃、骨髄、胎児肝臓、および末梢血白血球の第１鎖ｃＤＮＡを含む。
【０２４３】
分析を、最初のＰＣＲラウンドとそれに続くネステッドプライマーを用いた第２のＰＣＲラウンドにより行った。
第１のラウンド：プライマー：５’センス＝ＢＲＲ４６４．２６（５’ＵＴＲ中のコード領域のすぐ上流）；３’アンチセンス＝ＢＲＲ４５３．２６（コード領域内、３’末端付近）
ＢＲＲ４６４．２６ ５’ ＧＧＧＡＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡ ３’
ＢＲＲ４５３．２６ ５’ ＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＧ ３’
反応条件（反応物５０μｌあたり）：
５μｌの各第１鎖ｃＤＮＡ（または陰性対照用の５μｌのＨ２０、または１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ）、１２．５ピコモルの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μｌのＫｌｅｎＴａｑ １とＶｅｎｔポリメラーゼの１６：１混合物、５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ９．２、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
サイクリングパラメーター：
１サイクル  ９８℃、３分；５８℃、４５秒；７２℃、４５秒
２８サイクル  ９８℃、４５秒；５８℃、４５秒；７２℃、４５秒
１サイクル  ９８℃、４５秒；５８℃、４５秒；７２℃、４５秒
第２のラウンド：第１のラウンド由来の反応物をＴＥ中に１：５０で希釈し、各々の希釈液１μｌをネステッドプライマーで増幅した。
プライマー：５’センス＝ＢＲＲ４６３．３０（開始ＡＴＧにわたる；第１センスプライマーの下流でありかつオーバーラップしている）。３’アンチセンス＝ＢＲＲ４６２．２８（コード領域内、３’末端付近；第１アンチセンスプライマーの下流）。
ＢＲＲ４６２．３０ ５’ ＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＴ ３’
ＢＲＲ４６２．２８ ５’ ＧＣＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＴ ３’
反応条件とサイクリングパラメーターは第１のラウンドと同一であった。第１ラウンドＰＣＲおよび第２ラウンドＰＣＲ由来の反応物各々の１０μｌを、１．２ ％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。生産物を臭化エチジウムで染色し、続いてＵＶ光により可視化した。発現は、リンパ節、胸腺、扁桃、脳、胎盤、肺、骨格筋、前立腺および精巣において検出された。
【０２４４】
実施例３  ヒトＩＬ−１δポリペプチドの精製
ポリＨｉｓタグを使用して、組換えタンパク質をニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ製， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／）に製造者の指示に従って結合させた。樹脂を３０カラム容積の２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌ ＋ ５ｍＭ イミダゾールにより洗浄する。続いて組換えタンパク質を、イミダゾール濃度を増加させて溶出させる。最初に５−２０ｍＭ イミダゾール ２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌのグラジエント、続いて２０ｍＭ イミダゾール ２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌ、続いて２０−１００ｍＭ イミダゾール ２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌのグラジエント、続いて１００ｍＭ イミダゾール ２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌ、続いて５００ｍＭ イミダゾール ２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ ７．４ ＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌにより行った。画分を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、組換体タンパク質を含むものを同定した。
【配列表】
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