(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート本体に複数備えられるウェルが、外壁と、該外壁の内側に備えられて外壁より高さが低く且つ内側が貫通して観察用照明穴を形成する内壁と、外壁下端と内壁下端の間を閉塞する底壁とにより環状溶液室を形成しており、更に、前記外壁の上端を密閉するアッパーガラスと、内壁の上端を密閉するロワーガラスとを備えたことを特徴とする結晶化探索プレート。
【請求項２】
前記アッパーガラスとロワーガラスの間隔が、環状溶液室の半径方向幅と同等或いはそれ以上の大きさを有することを特徴とする請求項１記載の結晶化探索プレート。
【請求項３】
前記環状溶液室が円筒形溶液室であることを特徴とする請求項１記載の結晶化探索プレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、構造ゲノム科学等において結晶化条件を探索するのに用いられる結晶化探索プレートに関し、特にウェル内に形成した混合ドロップが精度良く観察できて結晶の生成を確実に検出でき、且つ複数のドロップ形成方式に共用できるようにした結晶化探索プレートに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、構造生物学、特にタンパク質の立体構造を明らかにして物理化学的に生体の全機能を解明しようとする構造ゲノム科学が盛んに進められている。
【０００３】
タンパク質の立体構造を明らかにするには、まずタンパク質を結晶化させる試験を実施し、その後、得られたタンパク質結晶をＸ線構造解析することによってその立体構造を測定する。
【０００４】
従って、タンパク質の立体構造を明らかにするには、まずそのタンパク質の結晶を造る必要がある。タンパク質を結晶化させる方法としては、良質な結晶が得られ易い蒸気拡散法が知られており、この蒸気拡散法には図６に示すハンギングドロップ蒸気拡散方式、図７に示すシッティングドロップ蒸気拡散方式、図８に示すサンドイッチドロップ蒸気拡散方式等が知られている。
【０００５】
ハンギングドロップ蒸気拡散方式は、図６に示すように、結晶化探索のための容器５０（以下ウェルと言う）に所定量の結晶化剤溶液５１を収容し、ウェル５０の上部にはグリース５９を介してウェル５０を密閉するアッパーガラス５２を備える。アッパーガラス５２の下面には、タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液５１とを混合した混合ドロップ５３をぶら下げる。これにより、気相で隔てられた混合ドロップ５３と結晶化剤溶液５１との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、緩やかに混合ドロップ５３内でタンパク質の過飽和状態がつくり出されて結晶化が実現される。
【０００６】
シッティングドロップ蒸気拡散方式は、図７に示すように、ウェル５０に結晶化剤溶液５１を収容し、ウェル５０の上部にはグリース５９を介してウェル５０を密閉するアッパーガラス５２を備える。タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液５１を混合した混合ドロップ５３は、ウェル５０内に備えたガラス製等の透光性のドロップ台５４上に形成する。これにより、気相で隔てられた混合ドロップ５３と結晶化剤溶液５１との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、緩やかに混合ドロップ５３内でタンパク質の過飽和状態がつくり出されて結晶化が実現される。
【０００７】
又、サンドイッチドロップ蒸気拡散方式は、図８に示すように、ウェル５０に結晶化剤溶液５１を収容し、ウェル５０の上部にはグリース５９を介してウェル５０を密閉するアッパーガラス５２を備える。タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液５１を混合した混合ドロップ５３は、ウェル５０の内部に備えたインナーガラス５５と前記アッパーガラス５２との間に挾持されるように形成する。これにより、気相で隔てられた混合ドロップ５３と結晶化剤溶液５１との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、緩やかに混合ドロップ５３内でタンパク質の過飽和状態がつくり出されて結晶化が実現される。
【０００８】
上記した蒸気拡散法では、タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液５１（ｐＨを合わせ、適当な濃度の沈殿剤や添加剤等を含んだ溶液）を混合することにより混合ドロップ５３を形成し、この混合ドロップ５３を結晶化剤溶液５１が収容されて密閉したウェル５０内に設置することにより、混合ドロップ５３を結晶化剤溶液５１に対して蒸気平衡させる。最初は、混合ドロップ５３中の沈殿剤濃度のほうが低いので混合ドロップ５３から結晶化剤溶液５１へ水が少しずつ蒸発して移動する。その結果、混合ドロップ５３中のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に上昇してタンパク質の過飽和溶液ができる。この時、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度等が適切であれば、混合ドロップ５３に結晶が析出する。
【０００９】
蒸気拡散法によりタンパク質が結晶化する条件を探索するためには、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度等の条件を細かく変え、更にその条件を組合わせた非常に多くの試験を実施する必要がある。従って、この結晶化条件の探索作業を単独の容器を用いて行っていたのでは膨大な時間と手間を要してしまう。
【００１０】
このため、結晶化条件の探索作業の能率を高める方法として、図９に示すようにプレート本体５６に対して図６、図７、図８に示したようなハンギングドロップ、或いはシッティングドロップ、或いはサンドイッチドロップを形成するためのウェル５０を縦横に多数形成した透光性を有する合成樹脂製の結晶化探索プレート５７（結晶化条件探索用キット）が用いられている。この結晶化探索プレート５７によれば、多数備えられている各ウェル５０におけるｐＨや沈殿剤の種類・濃度等の条件を少しずつ変えることにより、多数の結晶化条件の探索試験を一つの結晶化探索プレート５７で効率的に行える。
【００１１】
一方、上記したようなタンパク質の結晶化条件を探索する試験においては、混合ドロップ５３にいつ結晶が析出するかは分からないために、各ウェル５０の混合ドロップ５３に対して長い時間に亘って結晶生成の有無を観察する必要があり、又、結晶が生成した場合にもその結晶の成長を観察する必要がある。又、タンパク質によっては一旦生成した結晶が消失してしまうことがあるため、こうした動向も観察する必要がある。
【００１２】
混合ドロップ５３に結晶が生成したか否かを観察したり或いは生成した結晶の成長等を観察する手法としては、結晶化探索プレート５７の各ウェル５０に対して上下方向から透過照明を当てることにより、透過光が結晶の存在によって偏光することを利用して、結晶の生成の有無や結晶の大きさ等を検出する方法がある。
【００１３】
一般には図６、図７、図８に矢印で示すように、ウェル５０の下方から透過照明５８を当てることによりウェル５０の樹脂底壁と結晶化剤溶液５１を通して透過照明５８を混合ドロップ５３に当て、ウェル５０の上部においてその透過光を観察することにより、結晶の生成を検出するようにしている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記従来の結晶化探索プレート５７に備えられるウェル５０は、混合ドロップ５３に当てる透過照明５８の観察光路上にウェル５０の樹脂底壁と結晶化剤溶液５１とがあるために、ウェル５０の樹脂底壁で偏光し、且つ結晶化剤溶液５１で揺れや干渉を起こすことにより光学的な外乱を生じ、このために混合ドロップ５３における変化を精度良く観察することが困難であり、よって混合ドロップ５３における結晶生成の有無を確実に検出することが困難であった。
【００１５】
又、特に図８のサンドイッチドロップ蒸気拡散方式の場合には、アッパーガラス５２とインナーガラス５５との間隔が小さいために混合ドロップ５３からの蒸気拡散が行われ難く、このために、蒸気拡散が行われ易い形状を有する図６のハンギングドロップ蒸気拡散方式及び図７のシッティングドロップ蒸気拡散方式に比して問題があった。
【００１６】
又、図６のハンギングドロップ蒸気拡散方式と図７のシッティングドロップ蒸気拡散方式において、同一のタンパク質溶液のサンプルを用いた試験を行っても、結晶の生成が異なる場合があり、このためにハンギングドロップ蒸気拡散方式とシッティングドロップ蒸気拡散方式による両方の試験が要求される場合がある。しかし従来の結晶化探索プレート５７は、各々のドロップ形成方式のための専用の構造を有しており、ハンギングドロップ蒸気拡散方式とシッティングドロップ蒸気拡散方式の両方の作業に一つの結晶化探索プレート５７を共用することはできなかった。
【００１７】
本発明は、かかる従来方式のもつ問題点を解決すべくなしたもので、混合ドロップが精度良く観察できて結晶の生成を確実に検出することができ、且つ複数のドロップ形成方式に共用でき、蒸気拡散が等方的・効率的に行われる結晶化探索プレートを提供することを目的としている。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、プレート本体に複数備えられるウェルが、外壁と、該外壁の内側に備えられて外壁より高さが低く且つ内側が貫通して観察用照明穴を形成する内壁と、外壁下端と内壁下端の間を閉塞する底壁とにより環状溶液室を形成しており、更に、前記外壁の上端を密閉するアッパーガラスと、内壁の上端を密閉するロワーガラスとを備えたことを特徴とする結晶化探索プレート、に係るものである。
【００１９】
上記手段において、前記アッパーガラスとロワーガラスの間隔が、環状溶液室の半径方向幅と同等或いはそれ以上の大きさを有することが好ましく、又、前記環状溶液室が円筒形溶液室であることが好ましい。
【００２０】
上記手段によれば、以下のように作用する。
【００２１】
プレート本体に複数備えるウェルが、外壁と、該外壁の内側に備えられて外壁より高さが低く且つ内側が観察用照明穴を形成する内壁と、外壁と内壁の下端を閉塞する底壁とにより環状溶液室を形成しており、更に、前記外壁の上端を密閉するアッパーガラスと、内壁の上端を密閉するロワーガラスとを備えた構成を有しているので、上記ウェルを備えた結晶化探索プレートは、アッパーガラスとロワーガラスを用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散方式とシッティングドロップ蒸気拡散方式の両方に共用することができる。
【００２２】
更に、内壁内部の観察用照明穴を通して混合ドロップに照明を当てて混合ドロップを観察できるため、観察光路上に光学的な外乱が殆ど無いアッパーガラス及びロワーガラスと混合ドロップしか存在しておらず、よって従来のように観察光路上にウェルの樹脂底壁と結晶化剤溶液が存在することによって光学的な外乱を生じる問題がない。従って、理想的な観察状態を可能にして混合ドロップの変化を高精度に観察することができ、混合ドロップにおける結晶の生成を確実に検出できる。
【００２３】
混合ドロップを取り囲むように環状溶液室が形成され、更にアッパーガラスとロワーガラスの間隔が、環状溶液室の半径方向幅に対し同等或いはそれ以上の大きさとしてあることにより、混合ドロップから環状溶液室への蒸気拡散が等方的・効率的に行われるようになる。
【００２４】
環状溶液室の形状が円筒形溶液室であることにより、混合ドロップから円筒形溶液室への蒸気拡散が周方向で均一に行われるようになる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００２６】
図１は本発明の結晶化探索プレートの一例を示す切断側面図、図２は図１の平面図、図３は図１の結晶化探索プレートにおける一つのウェルを拡大して示した切断側面図、図４は図３のウェルの平面図である。
【００２７】
図１、図２に示すように、結晶化探索プレート１は、合成樹脂により矩形に形成されたプレート本体２の面内に、上部が開口したウェル３を縦横に複数整列した状態に形成している。又、前記プレート本体２の外周端部には周壁部４が形成されており、該周壁部４の上端には周外側に突出する張出部５が形成されている。前記結晶化探索プレート１は、ウェル３の開口が上側に向くようにして張出部５を図示しない作業台等の支持部材上に載置することにより略水平に支持される。
【００２８】
結晶化探索プレート１に形成される各ウェル３は、図３、図４に詳細を示すように、上端６ａがプレート本体２の上面から突出し下端がプレート本体２の下側に延長された環状の外壁６と、該外壁６の内側に所要の間隔を有して配置され下端が環状の底壁７により前記外壁６の下端に固定された環状の内壁８とを備えて環状溶液室９を形成している。
【００２９】
図３に示すように、内壁８の上端８ａは外壁６の上端６ａよりも低い高さに形成されており、又、内壁８の内部空間は観察用照明穴１０となっている。前記環状溶液室９は、外壁６と内壁８の平面形状が三角形や四角形等の多角形状を有する多角筒形溶液室としてもよく、又、図４に示すように外壁６と内壁８が円筒形状を有する円筒形溶液室９’としてもよい。尚、周方向への均一な蒸気拡散を行わせるためには円筒形溶液室９’とするのが好ましい。
【００３０】
更に、前記外壁６の上端６ａは、グリース１１を介してアッパーガラス１２により密閉できるようになっており、又、内壁８の上端８ａはグリース１１を介してロワーガラス１３により密閉できるようになっている。このアッパーガラス１２及びロワーガラス１３はシリコナイズされていてもよい。
【００３１】
前記ウェル３は、アッパーガラス１２とロワーガラス１３の間隔Ｌ１が、環状溶液室９の半径方向幅Ｌ２と同等或いはそれ以上の大きさになるよう構成している。
【００３２】
以下に、上記結晶化探索プレート１を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散方式によりタンパク質の結晶化条件を探索する手順の一例を説明する。
【００３３】
結晶化探索プレート１のウェル３の開口が上側に向くようにして張出部５を図示しない支持部材に載置して略水平に支持させた結晶化探索プレート１の各ウェル３の環状溶液室９に、所要量の結晶化剤溶液１４を注入する。又、この時内壁８の上端８ａをグリース１１を介してロワーガラス１３により密閉しておく。
【００３４】
アッパーガラス１２上でタンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液１４（ｐＨを合わせ、適当な濃度の沈殿剤や添加剤を含む溶液）を混合することにより混合ドロップ１５を形成し、混合ドロップ１５が形成されたアッパーガラス１２を上下反転し、グリース１１を介して外壁６の上端６ａに設置してウェル３を密閉する。これにより混合ドロップ１５はウェル３内においてアッパーガラス１２に吊り下げられるようになる。
【００３５】
上記によれば、アッパーガラス１２に吊り下げられた混合ドロップ１５と気相で隔てられた結晶化剤溶液１４との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、混合ドロップ１５中のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に上昇し、緩やかに混合ドロップ１５内でタンパク質の過飽和状態がつくり出され、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度或いは温度条件等が適切であると、混合ドロップ１５内に結晶１５ａが析出する。
【００３６】
次に、上記結晶化探索プレート１を用いて、シッティングドロップ蒸気拡散方式によりタンパク質の結晶化条件を探索する手順の一例を説明する。
【００３７】
ウェル３の開口が上側に向くように略水平に支持した結晶化探索プレート１の各ウェル３の環状溶液室９に、所要量の結晶化剤溶液１４を注入する。
【００３８】
内壁８の上端８ａにグリース１１を介してロワーガラス１３を載置することにより内壁８を密閉した後、ロワーガラス１３上でタンパク質のサンプルと結晶化剤溶液１４（ｐＨを合わせ、適当な濃度の沈殿剤や添加剤を含む溶液）を混合することにより混合ドロップ１５を形成する。この時、上面に混合ドロップ１５を予め形成したロワーガラス１３を、グリース１１を介し内壁８の上端８ａに載置することにより密閉してもよい。
【００３９】
続いて、外壁６の上端６ａに、グリース１１を介してアッパーガラス１２を設置しウェル３を密閉する。
【００４０】
上記によれば、ロワーガラス１３上に形成した混合ドロップ１５と気相で隔てられた結晶化剤溶液１４との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、混合ドロップ１５中のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に上昇し、緩やかに混合ドロップ１５内でタンパク質の過飽和状態がつくり出され、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度或いは温度条件等が適切であると、混合ドロップ１５内に結晶１５ａが析出する。
【００４１】
上記したように結晶化探索プレート１は、プレート本体２に、高い高さを有する外壁６と低い高さを有する内壁８を備えて環状溶液室９を構成し、且つ外壁６の上端６ａをアッパーガラス１２で密閉し内壁８の上端８ａをロワーガラス１３で密閉するようにしたウェル３を複数備えた構成を有するので、アッパーガラス１２とロワーガラス１３を用いて、一つの結晶化探索プレート１により、ハンギングドロップ蒸気拡散方式とシッティングドロップ蒸気拡散方式の両方に共用することができる。
【００４２】
更に、図３に示すように混合ドロップ１５を取り囲むように環状溶液室９が形成されていることと、アッパーガラス１２とロワーガラス１３との間隔Ｌ１が、環状溶液室９の半径方向幅Ｌ２に対して同等或いはそれ以上の大きさになるように形成していることにより、混合ドロップ１５から環状溶液室９の結晶化剤溶液１４への蒸気拡散が等方的・効率的に行われるようになる。
【００４３】
又、前記環状溶液室９の形状を円筒形溶液室９’としたことにより、混合ドロップ１５から円筒形溶液室９’の結晶化剤溶液１４への蒸気拡散が周方向で均一に行われるようになる。
【００４４】
一方、前記結晶化探索プレート１を用いた探索試験では、結晶が安定して生成する条件、更には大きな結晶が得られる条件を探索するために、前記混合ドロップ１５の変化を規定時間ごとに或いは常時観察する必要がある。
【００４５】
この観察を行う時、前記ウェル３を備えた結晶化探索プレート１によれば、例えば図５に示すように、ウェル３の上下一側に備えた照明装置１６により内壁８内部の観察用照明穴１０を通して混合ドロップ１５に透過照明等の照明１７を当てて、他側に備えた撮影装置１８により透過光を観察することができる。
【００４６】
このため、混合ドロップ１５の観察光路には、光学的な外乱が殆ど無いアッパーガラス１２とロワーガラス１３しか存在しないため、混合ドロップ１５に殆ど直接的に照明１７を当てることができ、よって従来のように観察光路上にウェル３の樹脂底壁と結晶化剤溶液１４が存在することによる光学的な外乱を生じることがなく、理想的な観察状態を得ることができる。前記混合ドロップ１５に当てる照明１７は、上下いずれの方向から当ててもよく、又、照明の１７の方法は任意に選定できる。
【００４７】
このように観察用照明穴１０を備えたウェル３の形状により、光学的外乱を生じることなく混合ドロップ１５の変化を高精度に観察することができ、よって混合ドロップ５３における結晶の生成を確実に検出できるようになる。
【００４８】
尚、本発明は上記形態例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、プレート本体に複数備えるウェルが、外壁と、該外壁の内側に備えられて外壁より高さが低く且つ内側が観察用照明穴を形成する内壁と、外壁と内壁の下端を閉塞する底壁とにより環状溶液室を形成しており、更に、前記外壁の上端を密閉するアッパーガラスと、内壁の上端を密閉するロワーガラスとを備えた構成を有しているので、上記ウェルを備えた結晶化探索プレートは、アッパーガラスとロワーガラスを用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散方式とシッティングドロップ蒸気拡散方式の両方に共用できる効果がある。
【００５０】
更に、内壁内部の観察用照明穴を通して混合ドロップに照明を当てて混合ドロップを観察できるため、観察光路上に光学的な外乱が殆ど無いアッパーガラス及びロワーガラスと混合ドロップしか存在しておらず、よって従来のように観察光路上にウェルの樹脂底壁と結晶化剤溶液が存在することによって光学的な外乱を生じる問題がなく、よって理想的な観察状態を可能にして混合ドロップの変化を高精度に観察することができ、混合ドロップにおける結晶の生成を確実に検出できる効果がある。
【００５１】
混合ドロップを取り囲むように環状溶液室が形成され、更にアッパーガラスとロワーガラスの間隔が、環状溶液室の半径方向幅に対し同等或いはそれ以上の大きさとしてあることにより、混合ドロップから環状溶液室への蒸気拡散が等方的・効率的に行われる効果がある。
【００５２】
環状溶液室の形状が円筒形溶液室であることにより、混合ドロップから円筒形溶液室への蒸気拡散が周方向で均一になる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の結晶化探索プレートの一例を示す切断側面図である。
【図２】図１の平面図である。
【図３】図１の結晶化探索プレートにおける一つのウェルを拡大して示した切断側面図である。
【図４】図３のウェルの平面図である。
【図５】本発明の結晶化探索プレートにおいて、混合ドロップの変化を観察する方法の一例を示す切断側面図である。
【図６】従来のハンギングドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図７】従来のシッティングドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図８】従来のサンドイッチドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図９】図６、図７、図８に示すウェルを備えるようにした従来の結晶化探索プレートの一例を示す斜視図である。
【符号の説明】
１    結晶化探索プレート
２    プレート本体
３    ウェル
６    外壁
６ａ                上端
７    底壁
８    内壁
８ａ                上端
９    環状溶液室
９’                円筒形溶液室
１０    観察用照明穴
１２    アッパーガラス
１３    ロワーガラス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003600868.tif 000009
【図９】
0003600868.tif 000010