(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離し、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列か、又はその酵素活性を保持する範囲で配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
酵素の分子量が約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
酵素の等電点が約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡが配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列か、コードする酵素の酵素活性を保持する範囲で配列表における配列番号３又は４の塩基配列における塩基の１個又は２個以上が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】
遺伝子コードの縮重に基づき、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項１乃至４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列を有する請求項１乃至５のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項７】
リゾビウム属又はアルスロバクター属の微生物に由来する請求項１乃至６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】
自律複製可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）である請求項８に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１１】
宿主が大腸菌である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードする請求項１乃至７のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなるＤＮＡ断片。
【請求項１３】
請求項１２のＤＮＡ断片を含んでなる組換えＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードする新規なＤＮＡと、そのＤＮＡを含む組換えＤＮＡ並びに形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなかった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物がグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などが産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６もこれら酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、そのＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、その組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１０】
この発明は、前記第二の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第三の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１２】
【作用】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、本来、当該酵素を産生しないけども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１３】
この発明の組換えＤＮＡは、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とし、この形質転換体を培養することにより、コードされた当該酵素の産生を発現する。
【００１４】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該酵素を産生する。
【００１５】
この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の培養物から得ることができ、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１）    作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。
（２）    分子量
約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（３）    等電点
約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
（４）    至適温度
ｐＨ７．０で３０分間インキュベートすると、３５乃至４５℃付近に至適温度を示す。
（５）    至適ｐＨ
４０℃で３０分間インキュベートすると、ｐＨ６．０乃至７．５付近に至適ｐＨを示す。
（６）    熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３０乃至４５℃付近まで安定である。
（７）    ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至１０．０付近まで安定である。
【００１６】
次に、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１又はアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する酵素（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３６」と言う。）の理化学的性質を解明すべく行なった実験について説明する。
【００１７】
【実験例１  酵素の精製】
【００１８】
【実験例１−１  酵素Ｍ−１１の精製】
５００ｍｌ容三角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００１９】
次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比活性は約２４０単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約６５０単位であった。
【００２０】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、α−マルトトリオシルトレハロースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で３０分間インキュベートして反応させる。そして、反応液を１ｍｌとり、ソモギ銅液２ｍｌに加えて反応を停止させた後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。対照には、予め１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素を上記と同様に処理する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素の量と定義する。
【００２１】
【実験例１−２  酵素Ｑ３６の精製】
実験例１−１と同様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、培養物を処理したところ、比活性約４５０単位／ｍｇ蛋白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約６５０単位の収量で得られた。
【００２２】
【実験例２  酵素の理化学的性質】
【００２３】
【実験例２−１  作用】
特開平７−１４３８７６号公報（特願平５−３４９２１６号明細書）に開示された方法により、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当たり９８％以上含む非還元性糖質を調製した。そして、そのいずれかを基質として５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に濃度２０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、溶液に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は酵素Ｑ３６を基質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させた。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、反応物に含まれる糖質を分離した。別途、非還元性糖質に代えて高純度のマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースのいずれかを含む水溶液を上記と同様に処理し、処理物を分析して対照とした。表１及び表２に、それぞれ、Ｍ−１１及びＱ３６を加えた場合の基質並びに反応物の糖組成を示す。
【００２４】
【表１】
0003557276.tif 000002
【００２５】
【表２】
0003557276.tif 000003
【００２６】
表１及び表２に示すように、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースとグルコース又はマルトオリゴ糖をほぼ定量的に遊離した。一方、グルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖を基質にすると、両酵素とも全く作用を示さなかった。これらの事実は、当該酵素が末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に選択的に作用し、そのトレハロース残基とグリコシル残基間のグリコシド結合を特異的に加水分解することを示唆している。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規な作用機序を辿るものと推定される。
【００２７】
【実験例２−２  分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトンに相当する位置に単一バンドを示した。なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００２８】
【実験例２−３  等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．３乃至４．６に等電点を示した。
【００２９】
【実験例２−４  至適温度】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分間インキュベートする条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４５℃付近に至適温度を示した。
【００３０】
【実験例２−５  至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で３０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．０乃至７．５付近に至適ｐＨを示した。
【００３１】
【実験例２−６  熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３０乃至４５℃付近まで安定であった。
【００３２】
【実験例２−７  ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ５．５乃至１０．０付近まで安定であった。
【００３３】
【実験例２−８  Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、アプライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００３４】
同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００３５】
【実験例２−９  部分アミノ酸配列】
実験例１−１で得た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約４３分後又は約５７分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」又は「ペプチド断片Ｂ」と言う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００３６】
別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約４分後又は約２４分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は「ペプチド断片Ｄ」と言う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及びＤは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００３７】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１３０』で寄託されている。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１６』で寄託されている。特開平７−２１３２８３号公報（特願平５−３４０３４３号明細書）には、酵素の性質・性状とともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００３８】
そこで、本発明者が、実験例２−８又は２−９で明らかにした酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡを鋭意検索したところ、下記の配列表における配列番号３に示す塩基配列を有する１，７６７塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、酵素Ｍ−１１は５８９個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００３９】
一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡを同様に検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を有する１，７９１塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素Ｑ３６は５９７個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４０】
配列表における配列番号１乃至４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１）    供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解後、加水分解物より２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２）    別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断した約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３）    大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４）    形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００４１】
両供与体微生物の遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列表における配列番号１又は２に示すとおりであるが、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号１又は２に示すとおりのアミノ酸配列をコードするものは無論のこと、これらと相同的なアミノ酸配列を有するものをも包含するものとする。すなわち、組換えＤＮＡ技術の進歩により、斯界においては、酵素の作用を実質的に変えることなく、比較的容易にその構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換できるようになった。また、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの、配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個又２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる技術水準に鑑み、この発明でいう酵素とは、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をそのまま具備するものは言うに及ばず、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置き換わるか、欠失若しくは付加した変異体であっても、それが末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離するかぎり包含するものとする。
【００４２】
さらに、斯界においては、遺伝子コードの縮重により、コードするアミノ酸配列を変えることなく、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換することができる。これにより、この発明のＤＮＡは、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列をそのまま有するもののみならず、それが配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有する酵素若しくはその相同変異体をコードするものであるかぎり、遺伝子コードの縮重に基づき、塩基の１個又は２個以上が他の塩基に置き換わったものをも包含するものとする。
【００４３】
また、現在の組換えＤＮＡ技術に依るときには、一般に５′末端からの塩基配列が決まれば、これに相補的な塩基配列は一義的に定まる。したがって、この発明のＤＮＡは、上記いずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するものも包含するものとする。なお、この発明のＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。
【００４４】
この発明のＤＮＡは上記のごときものであるが、この発明のＤＮＡは、それが前記のごとき配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３１６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）及びミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）を含むリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、ミクロコッカス属の微生物が挙げられ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。
【００４５】
一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００４６】
さて、この発明は、本来、当該酵素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる微生物や動植物に導入すると当該酵素の産生を発現する複製可能な組換えＤＮＡに係わるものでもある。斯かる組換えＤＮＡは、通常、前述のごときＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の方法により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＴＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００４７】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００４８】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質を含む栄養培地で培養し、該非還元性糖質よりトレハロースを遊離するものを選択すればよい。
【００４９】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用すればよい。
【００５０】
前述のとおり、当該酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離するという、従来の酵素には見られない顕著な作用を有する。当該酵素のこの作用を利用することにより、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースなどの一連の非還元性糖質からトレハロースを収量良く、効率的に得ることができる。これら非還元性糖質は、特開平７−１４３８７６号公報（特願平５−３４９２１６号明細書）に開示された非還元性糖質生成酵素を使用することにより、澱粉又はアミロース、アミロペクチンなどの澱粉質に酸及び／又はアミラーゼを作用して得られる澱粉加水分解物から好収量で得ることができる。したがって、当該酵素と特開平７−１４３８７６号公報（特願平５−３４９２１６号明細書）に開示された非還元性糖質生成酵素を組合せて使用することにより、澱粉又は澱粉質を原料に、従来大量入手の難しかったトレハロースが比較的容易に所望量得られることとなる。
【００５１】
以下、２〜３の実施例に基づき、この発明を具体的に説明するが、これら実施例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００５２】
【実施例１  リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００５３】
【実施例１−１  染色体ＤＮＡの調製】
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。その後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５４】
【実施例１−２  組換えＤＮＡ  ｐＢＭＵ２７と形質転換体ＢＭＵ２７の調製】
実施例１−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ  ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ  ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４  ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５５】
上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培地上に形成された約６，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列における第８乃至１３番目のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏで表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＡＴＨＴＧＧＧＣＮＣＣ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた１４種類の形質転換体を選択した。
【００５６】
その後、常法により、これら１４種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列における第２乃至６番目のＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａで表される配列に基づき化学合成した５′−ＧＡＹＴＧＧＧＣＮＧＡＲＧＣ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＵ２７』又は『ＢＭＵ２７』と命名した。
【００５７】
上記で得た形質転換体ＢＭＵ２７をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ  ｐＢＭＵ２７は約５，７００塩基対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコードする１，７６７塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＶによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００５８】
【実施例１−３  形質転換体ＢＭＵ２７による酵素の産生】
松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例１−２で得た形質転換体ＢＭＵ２７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約４，０００単位の酵素が産生していた。
【００５９】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約２，０００単位と、形質転換体ＢＭＵ２７と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００６０】
その後、形質転換体ＢＭＵ２７が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電点を示すなど、酵素Ｍ−１１と同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６１】
【実施例２  リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例１−２で得た組換えＤＮＡ  ｐＢＭＵ２７を、常法に従って、各種制限酵素で分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にサブクローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６２】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ  ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水溶中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６３】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す２，１６１塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第８乃至２７番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第１０乃至３０番目又は第４９３乃至５０９番目の配列に一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６４】
【実施例３  アルスロバクター・スピーシーズＱ３６由来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００６５】
【実施例３−１  染色体ＤＮＡの調製】
実施例１−１と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００６６】
【実施例３−２  組換えＤＮＡ  ｐＢＲＴ３２と形質転換体ＢＲＴ３２の調製】
実施例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を実施例１−２と同様に部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実施例１−２と同様に制限酵素Ｂａｍ  ＨＩによるベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）の消化物に連結し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入した。得られた形質転換体を実施例１−２と同様に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約５，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第５乃至１０番目のＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表される配列に基づき５′−ＡＴＧＧＧＮＴＧＧＧＡＹＣＣＮＧＣ−３′で表される塩基配列のプローブ３を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた１０種類の形質転換体を選択した。
【００６７】
実施例１−２と同様にして、これら１０種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、これに配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第８乃至１２番目のＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａで表される配列に基づき化学合成した５′−ＴＡＹＧＡＹＧＴＮＴＧＧＧＣ−３′で表される塩基配列のプローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＲＴ３２』又は『ＢＲＴ３２』と命名した。
【００６８】
その後、この形質転換体ＢＲＴ３２をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地で実施例１−２と同様に培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ  ｐＢＲＴ３２は約６，２００塩基対からなり、図１０に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示すように、酵素Ｑ３６をコードする１，７９１塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００６９】
【実施例３−３  形質転換体ＢＲＴ３２による酵素の産生】
松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実施例３−２で得た形質転換体ＢＲＴ３２を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，９００単位の酵素が産生していた。
【００７０】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，８００単位と、形質転換体ＢＲＴ３２と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００７１】
その後、形質転換体ＢＲＴ３２が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電点を示すなど、酵素Ｑ３６と同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００７２】
【実施例４  アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実施例３−２で得た組換えＤＮＡ  ｐＢＲＴ３２を実施例２と同様に処理してテンプレートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。実施例２と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す２，０５６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号８のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第２乃至２１番目の配列に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第４７０乃至４８９番目又は第１１乃至３０番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２のアミノ酸配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００７３】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。しかも、この発明による形質転換体が産生する酵素は、全アミノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、食品等への配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使用し得るものである。
【００７４】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【００７５】
【配列表】
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【００７６】
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【００７７】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。
【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。
【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。
【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。
【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。
【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。
【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】この発明による組換えＤＮＡ  ｐＢＭＵ２７の制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した部分は酵素Ｍ−１１をコードするＤＮＡである。
【図１０】この発明による組換えＤＮＡ  ｐＢＲＴ３２の制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した部分は酵素Ｑ３６をコードするＤＮＡである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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