【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年10月18日(2017.10.18)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＫＴへの変異の存在を決定することを含む、ＡＫＴ阻害剤に対する腫瘍細胞の増殖の感受性を予測する方法であって、
ＡＫＴへの変異の存在がＡＫＴ阻害剤に対する細胞の感受性と相関し、
ＡＫＴ阻害剤が（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（（５Ｒ、７Ｒ）−７−ヒドロキシ−５−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−３−（イソプロピルアミノ）プロパン−１−オン又はその薬学的に許容される塩であり、
変異が、Ｌ５２、Ｋ１８９又はＤ３２３に一致し、
腫瘍細胞が卵巣癌腫瘍細胞、前立腺癌腫瘍細胞、乳癌腫瘍細胞、結腸直腸癌腫瘍細胞、胃癌腫瘍細胞、子宮内膜癌腫瘍細胞、膵臓癌腫瘍細胞からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
ＡＫＴへの変異の存在が、ＡＫＴ阻害剤に対する細胞の感受性の増加と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＫＴがＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＫＴがＡＫＴ１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＫＴへの変異がＡＫＴのＰＨ−ドメインとキナーゼドメインの間の相互作用を破壊する、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＫＴへの変異がＡＫＴのリン酸化を増加させる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
リン酸化の増加が恒常的リン酸化に起因する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
方法が細胞のＰＴＥＮの状態を決定することを更に含み、ＰＴＥＮの欠損が阻害剤に対する感受性の増加と相関する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が卵巣癌又は前立腺癌腫瘍細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
方法が細胞のＰＩ３Ｋの変異の存在を決定することを更に含み、ＰＩ３Ｋの変異の存在が阻害剤による阻害に対する感受性の増加と相関する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＩ３Ｋの変異が、Ｈ１０４７Ｒ及びＨ１０４７Ｌのうち一つ又は両方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
方法が細胞のｐＡＫＴプロファイルを決定することを更に含み、ｐＡＫＴの高活性プロファイルが阻害剤による阻害に対する感受性の増加と相関する、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が細胞のｐＡＫＴプロファイルを決定することを更に含み、ｐＡＫＴの低活性プロファイルが阻害剤による阻害に対する感受性の低下と相関する、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
方法が細胞のＨｅｒ２及び／又はＨｅｒ３の状態を決定することを更に含み、細胞のＨｅｒ２＋及び／又はＨｅｒ３＋状態が阻害剤による阻害に対する感受性の増加と相関する、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
方法が細胞のＭｅｔキナーゼの変異の存在を決定することを更に含み、Ｍｅｔキナーゼの変異の存在がＡＫＴ阻害剤に対する細胞の感受性と相関する、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
方法が細胞のＢ−Ｒａｆ又はＫ−Ｒａｓの変異の存在を決定することを更に含み、Ｂ−Ｒａｆ又はＫ−Ｒａｓの変異の存在がＡＫＴ阻害剤に対する細胞の感受性の低下と相関する、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、細胞におけるＦＯＸＯ３ａの局在化プロファイルを決定することを更に含み、
ＦＯＸＯ３ａの細胞質局在化プロファイルがＡＫＴ阻害剤による阻害に対する細胞の感受性と相関する、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞が内分泌抵抗性乳癌細胞である、請求項１から８又は１０から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が細胞のＩＮＰＰ４Ｂ、ＰＨＬＰＰ、及び／又はＰＰ２Ａの状態を決定することを更に含み、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＰＨＬＰＰ、及び／又はＰＰ２Ａの欠損が阻害剤に対する感受性の増加と相関する、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
患者由来の生理学的サンプル中でＡＫＴへの変異の存在を決定することを更に含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＫＴへの変異の存在を決定するための１以上の薬剤を含む、ＡＫＴ阻害剤に対する腫瘍細胞の増殖の感受性を予測するためのキットであって、
ＡＫＴへの変異の存在がＡＫＴ阻害剤に対する細胞の感受性と相関し、
ＡＫＴ阻害剤が（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（（５Ｒ、７Ｒ）−７−ヒドロキシ−５−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−３−（イソプロピルアミノ）プロパン−１−オン又はその薬学的に許容される塩であり、
変異が、Ｌ５２、Ｋ１８９又はＤ３２３に一致し、
腫瘍細胞が卵巣癌腫瘍細胞、前立腺癌腫瘍細胞、乳癌腫瘍細胞、結腸直腸癌腫瘍細胞、胃癌腫瘍細胞、子宮内膜癌腫瘍細胞、膵臓癌腫瘍細胞からなる群から選択される、キット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
出願人は、ＡＫＴの特定の変異は、ＡＫＴのＰＨドメインとキナーゼドメイン間の相互作用を妨害する可能性があることを発見した。これらのドメイン間の分裂は、その変異（単数又は複数）によって引き起こされ、ＡＫＴの恒常的リン酸化および恒常的ＡＫＴシグナル伝達をもたらすと思われる。これらの効果はまた、細胞の形質転換を可能にする。これらの変異は、ＰＩ３Ｋ及びアロステリックＡｋｔ阻害剤に対する耐性を付与する。従って、そのような変異の存在は、ＰＩ３Ｋ及びアロステリックＡｋｔ阻害剤の有効投与量が多くなるであろうことを示し、また、ＡＴＰ競合的Ａｋｔ阻害剤など、ＰＩ３Ｋ及び／又はアロステリックＡｋｔ阻害剤以外の阻害剤が使用されるべきであることを示している。単独で、又は本明細書に記載の他のバイオマーカーと組み合わせたこのバイオマーカーの使用は、単独で、又は、５−ＦＵ、白金剤（カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンなど）イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ＳＮ−３８、カペシタビン、テモゾロミド、エルロチニブ、ＰＤ−０３２５９０１、パクリタキセル、ベバシズマブ、ペルツズマブ、タモキシフェン、ラパマイシン、ラパチニブ、ＰＬＸ−４０３２、ＭＤＶ３１００、アビラテロン、及びＧＤＣ−０９７３と他のＭＥＫ阻害剤などの別の治療用化合物と組み合わせて投与される、ＡＫＴ阻害剤に対する腫瘍細胞の増殖の感受性を予測するために有用である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
【図１】図１は、ＡＫＴ、及びＰＨとキナーゼドメインの相互作用を示し（図１Ａ及び１Ｂ）、また、これらのドメイン間の相互作用の位置を示している（１Ｃ）。
【図２】図２は、ＰＨドメインのキナーゼドメインとの相互作用を破壊すると考えられる場所での合成変異が、Ａｋｔの恒常的リン酸化を生じることを表す結果を示す。
【図３】図３は、体細胞変異を示す。
【図４】図４は、恒常的Ａｋｔリン酸化につながる体細胞変異は、恒常的ＡＫＴシグナルを導くことを示す結果を示す。
【図５】図５は、Ａｋｔ１の変異体は細胞を形質転換することができることを示す結果を示す。
【図６】図６は、Ａｋｔ１の変異体はＰＩ３Ｋ阻害剤とＡＫＴアロステリック阻害剤に対する耐性を付与することを示す結果を示す。
【図７】図７は、ＧＤＣ−００６８で処置された患者からの腫瘍におけるｐＰＲＡＳ４０  Ｔ２４６の変化を示す。
【図８】図８は、活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を持つ腫瘍を示す。
【図９】図９は、高ＡＫＴ活性プロファイルがＧＤＣ−００６８に対する感受性を予測することを表す結果を示す。
【図１０】図１０は、前立腺及び卵巣細胞株において、ＰＴＥＮ欠損とＧＤＣ−００６８に対する感受性との強い相関を実証する結果を示す。結果は、ＧＤＣ−００６８において正規化された単一化合物の用量応答のものである。
【図１１】図１１は、ＰＴＥＮ欠損とＰＩＫ３ＣＡ変異がインビトロでＧＤＣ−００６８単剤と強く相関していることを実証する結果を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａと１２Ｂは、異種移植片モデルにおけるＧＤＣ−００６８単剤活性の結果とインビトロでの細胞株スクリーニングデータを示し、腫瘍増殖阻害の割合が最も高いことはまた、ＰＴＥＮの欠損又はＰＩ３Ｋ変異のどちらかによる経路活性化の証拠を有することを示している。強い有効性が、ＡＫＴ経路の活性化を持ち（かつＭＥＫ経路活性化を持たない）モデルで観察される。
【図１３】図１３は、様々な細胞株の感受性に対するＧＤＣ−００６８とＭＥＫ阻害剤の間の負の相関を示す結果を示す。
【図１４】図１４は、ＡＫＴ経路活性化（ＰＴＥＮ欠損、ＰＩ３Ｋ変異）を持つ細胞株における強い相乗効果を実証する結果を示す。ＢＬＩＳＳ解析は、ＭＥＫ阻害剤（ＧＤＣ−０９７３）と組み合わせたＧＤＣ−００６８の広い相乗効果を示している。
【図１５】図１５は、シスプラチン＋５ＦＵの併用効果はＡＫＴ経路活性化と関連していることの結果を示す。５ＦＵ／シスプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）の組み合わせスクリーニングは、相加効果の証拠を示している。相加効果は経路活性化と関連している：ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ変異。
【図１６】ＰＨ−キナーゼドメインの接触部位の変異はＡＫＴ活性化へと導く。（Ａ）空ベクター（ＥＶ）、野生型（ＷＴ）、ミリストイル化（Ｍｙｒ）又はＥ１７Ｋ ＡＫＴ１を単独又はＭＥＫ１ Ｎ３と一緒に安定的に発現する、ＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性増殖。（Ｂ）アロステリック阻害剤と複合体化したＡＫＴのＰＨ及びＫＤの「明白な」表示（ＰＤＢ受託番号３Ｏ９６）。（Ｃ）ＡＫＴ１ ＰＨ−ＫＤ界面の変異の影響を評価するために用いられるスクリーニングを示す模式図。（Ｄ）ＰＨ−ＫＤ界面の変異はＢａＦ３細胞のＩＬ−３非依存性増殖を促進する。（Ｅ）空のベクター及び示されたＡＫＴ１コンストラクトを安定的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫ブロット解析。
【図１７】図１７ヒト癌における体細胞のＡＫＴ変異。ＡＫＴファミリーのメンバーでの体細胞変異。水平の黒い棒はＡＫＴ１、２、及び３にわたって保存される残基を示す。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９３】
ＡＫＴ１活性化変異
出願人は、ＡＫＴ１の特定の変異は、ＡＫＴ１のＰＨドメインとキナーゼドメイン間の相互作用を妨害する可能性があることを発見した。これらのドメイン間の分裂は、その変異（単数又は複数）によって引き起こされ、ＡＫＴ１の恒常的リン酸化および恒常的ＡＫＴ１シグナル伝達をもたらすと思われる。これらの効果はまた、細胞の形質転換を可能にする。これらの変異は、ＰＩ３Ｋ及びアロステリックＡｋｔ阻害剤に対する耐性を付与する。従って、そのような変異の存在は、ＰＩ３Ｋ及びアロステリックＡｋｔ阻害剤の有効投与量が多くなるであろうことを示し、また、競合的Ａｋｔ阻害剤など、ＰＩ３Ｋ及び／又はアロステリックＡｋｔ阻害剤以外の阻害剤が使用されるべきであることを示している。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９５】
ＰＨドメインのキナーゼドメインとの相互作用を破壊すると考えられる場所での合成変異が、Ａｋｔの恒常的リン酸化を生じることを表す結果を図２に示す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９７】
出願人は、体細胞変異が恒常的Ａｋｔリン酸化を導き、また、Ａｋｔの恒常的シグナル伝達をもたらすことを見出した（図４参照）。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０２】
ＡＫＴの恒常的活性化をもたらす変異
タンパク質キナーゼＡＫＴは、細胞生存および増殖の重要な調節因子であり、しばしばヒトの癌において過剰に活性化される。分子内プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン−キナーゼドメイン（ＫＤ）相互作用は、非活性状態におけるＡＫＴの維持に重要である。キナーゼドメインからＰＨを押しのけるコンホメーション変化に続いてＡＫＴ活性化が進行する。これらの自己阻害的相互作用を理解するために、ＰＨ−ＫＤ界面において変異を生成したところ、それらの大部分がＡＫＴの恒常的活性化をもたらすことが見出された。このような変異は、活性化がヒトの癌及び他の疾患で発生し得る別のメカニズムである可能性がある。これを支持するものとして、ＰＨ−ＫＤ界面におけるＡＫＴ１における体細胞変異は、以前はヒトの癌においては記載されていないことが見出された。さらに、ＡＫＴ１体細胞変異体は、恒常的に活性であり、発癌性のシグナル伝達につながる。更に、ＡＫＴ１変異体はアロステリックＡＫＴ阻害剤により効果的には阻害されず、アロステリック阻害のためのインタクトなＰＨ−ＫＤ界面の必要性と一致している。これらの結果は、ＰＨ−ＫＤ界面でＡＫＴ変異を有する患者において、治療的介入の重要な意味を持っている。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０７】
さらに、ＰＨ−ＫＤ界面変異体の効果を理解するために、安定的に各々のＡＫＴ１突然変異体を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株が生成され、Ｔ３０８及びＳ４７３リン酸化状態（ｐＴ３０８およびｐＳ４７３）を評価した。生存アッセイスクリーニングと一致して、Ｎ５３Ａ、Ｆ５５Ｙ、Ｌ７８Ｔ、Ｑ７９Ｅ、Ｗ８０Ａ、Ｔ８１Ｙ、Ｅ１９１Ａ、Ｔ１９５Ｉ、Ｌ３２１Ａ、Ｄ３２３Ａ、Ｄ３２５ＡおよびＲ３２８Ａ変異体は、Ｔ３０８とＳ４７３においてリン酸化の上昇を示した。更に、ＡＫＴ１変異体Ｎ５４Ａ、Ｖ８３Ｄ、Ｅ１１４Ａ、Ｌ２０２Ｆ、Ｖ３２０Ａ、Ｎ３２４ＫおよびＹ３２６Ａは、生存スクリーニングでは軽度の濃縮（ＷＴに対して〜１．５−２倍）のみを示したものの、それらはｐＴ３０８とｐＳ４７３のレベルの上昇を示した。これらの結果は、ＰＨ−ＫＤ接触を破壊させることは、ＡＫＴの恒常的リン酸化につながることを示唆している。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０９】
Ｅ１７Ｋ変異のほかに、コドン５２、Ｌ５２ＲにおけるＡＫＴ１変異もある。Ｌ５２は、ｐＨ−ＫＤ界面にあり、Ｖ２７０、Ｖ２７１、Ｙ３２６およびキナーゼドメインにおけるＲ３２８のメチレン部分と疎水性接触を作る。Ｌ５２Ａ変異は、ＷＴと比較してＡＫＴ１のリン酸化のレベルを増加させたが、ＢａＦ３アッセイにおける生存の増加にはつながらなかった。しかしながら、Ｌ５２Ｒ変異は、好ましい疎水性相互作用が失われ、Ｒ３２８との好ましくない相互作用が導入されるため、ＰＨ−ＫＤ相互作用に有害である（従って、ＡＫＴ１活性を促進する）可能性がある。同様に、乳房腫瘍で同定されるＤ３２３Ｈ変異はＡＫＴ１キナーゼドメインに位置し、ＰＨドメインでの３塩基性残基（Ｋ１４、Ｒ２３とＲ２５）の近傍にある（図１Ｂ、２Ｂ）。合成変異体Ｄ３２３Ａは、恒常的に活性であり、ヒスチジンはアラニンよりもドメイン間接触にさらに破壊的（立体容積の増大；電荷反転の可能性）であるため、Ｄ３２３Ｈもまた恒常的に活性であることを示唆している。Ｒ９６残基は主要なＰＨドメインヘリックスに位置し、キナーゼドメイン界面から除かれ遠くに離れており、従って、ＰＨ−ＫＤ相互作用の破壊を介して活性化を促進する可能性は低い。全長のＡＫＴ１結晶構造において、電子密度は、残基Ｅ１９８からＫ１８９に関して観察されない。このキナーゼドメインループは、ＰＨドメインヘリックスのＣ末端の近傍であるが、Ｋ１８９Ｎ変異に関連したＡＫＴ１活性の変化の構造ベースの推定は不可能である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
ＡＫＴ１体細胞変異体は、恒常的に信号を送り、トランスフォーメーションにつながる。
ＡＫＴ１体細胞変異の機能的関連性を評価するために、ＰＨ−ＫＤの相互作用に影響を与えることが予測されるＬ５２ＲおよびＤ３２３Ｈ変異体を試験した。加えて、キナーゼドメインに生じるＫ１８９Ｎ変異を試験した。これらの変異体は、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ付きのＡＫＴ１ ＷＴ、ミリストイル化ＡＫＴ１（Ｍｙｒ ＡＫＴ１）、又は変異体Ｅ１７Ｋ、Ｌ５２Ｒ、Ｋ１８９Ｎ及びＤ３２３Ｈを安定的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、シグナル伝達に対するそれらの効力について試験された。イムノブロット分析は、形質導入されたベクター又はＡＫＴ１ ＷＴ細胞とは異なり、Ｋ１８９Ｎを除くすべての変異体は、Ｍｙｒ ＡＫＴ１に類似して、ｐＴ３０８及びｐＳ４７３両方の増加を示した。これと一致して、我々は、空のベクター、ＷＴ ＡＫＴ１、あるいはＫ１８９ＮのＡＫＴ１変異体を発現する細胞と比較して、Ｍｙｒまたは変異体ＡＫＴ１を発現する細胞内におけるＡｋｔ基質のＦＯＸＯとＳ６リボソームタンパク質のリン酸化の同時増加を観察した。興味深いことに、Ｍｙｒ ＡＫＴまたはＬ５２Ｒ変異体とは異なり、Ｅ１７ＫまたはＤ３２３Ｈの発現は、ＡＫＴ基質のＰＲＡＳ４０のリン酸化の上昇を生じず、これらの変異体は、異なる下流のエフェクター経路に係合することができることを示唆している。
ＡＫＴ１のＰＨ−キナーゼドメイン変異体は、ドメイン間の相互作用を弱め、細胞膜移行の障害を示す。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
Ｌ５２ＲのＰＨドメイン変異体は、ＧＦＰ−ＡＫＴ１のＰＨドメイン融合コンストラクトを用いて、細胞内局在および膜移行について試験された。ＷＴ及びＥ１７Ｋ ＡＫＴ１のＰＨドメインＧＦＰ融合コンストラクトは対照とした。増殖因子刺激の非存在下においては、ＷＴ ＡＫＴ１のＰＨドメインは、細胞質および核全体に分布するが、Ｅ１７Ｋ ＡＫＴ１のＰＨドメインは、恒常的に細胞膜に局在していた。Ｅ１７Ｋ ＡＫＴ１のＰＨドメインとは対照的に、Ｌ５２Ｒ ＡＫＴ１のＰＨドメインは、細胞質と核全体に分布し、ＷＴ ＡＫＴ１のＰＨドメインのように挙動していた。しかし、増殖因子刺激により、ＷＴ ＡＫＴ１のＰＨドメインとは異なり、Ｌ５２Ｒ変異体のＰＨドメインは細胞膜に移行しなかった。このことは、改変された脂質親和性と局在性に応答して活性化されるＥ１７Ｋ変異体とは異なり、Ｌ５２Ｒ変異体は、自己阻害的相互作用が存在しないことに起因して、細胞質で活性化される可能性が最も高いことを示唆している。