【手続補正書】
【提出日】平成29年5月22日(2017.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、
ａ．平面接着培養で増殖させた多能性幹細胞から多能性幹細胞の凝集集団を作り出す工程、
ｂ．前記平面接着培養から動的懸濁培養へ前記多能性幹細胞の集団を移植する工程、および
ｃ．前記動的に撹拌される懸濁培養系内で前記前記多能性幹細胞の集団を分化させることにより膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は、心筋前駆細胞集団を生成する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｃで前記前記多能性幹細胞の集団はＭＣＸ化合物で補充された培地中で培養することにより分化され、かつ膵臓前駆細胞集団が生成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
β細胞転写因子を発現する膵臓前駆細胞が生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記転写因子がＰＤＸ１及び／又はＮＫＸ６．１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｃで前記前記多能性幹細胞の集団はＬＤＮおよびＡｌｋＶｉで補充された培地中で培養することにより分化され、かつ神経前駆細胞集団が生成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＩＴＳ−ＸまたはＢ−２７で補充された培地で前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｃで前記前記多能性幹細胞の集団は１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンで補充された培地中で培養し、その後ＩＷＰ−４で補充された培地で培養することにより分化され、かつ心筋前駆細胞集団が生成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
Ｂ−２７で補充された培地で前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化工程は約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化工程は前記集団がマイクロキャリアに接着させることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞を凝集細胞集団として懸濁培養系で分化させる工程を含む、多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させる方法。
【請求項１３】
懸濁分化環境は、
（ｉ）ほぼ低酸素から周囲の約３０％の範囲の酸素、
（ｉｉ）０．１％〜約２％の範囲の脂質、
（ｉｉｉ）ほぼ低酸素から周囲の約３０％の範囲の酸素、および０．１％〜約２％の範囲の脂質の組み合わせ、または
（ｉｖ）１１ｍＭ未満のグルコース、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させる工程、
前記平面接着培養から動的懸濁液へ前記凝集細胞集団を移植する工程、および
ＭＣＸ及びＧＤＦ８又はＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡで補充した培地における動的懸濁液内で前記凝集細胞集団を胚体内胚葉へ分化させる工程、
を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化工程はＣｙｐ２６阻害剤の使用を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。
本発明は以下を提供する。
［１］
動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性幹細胞を平面接着培養下で凝集細胞集団に培養することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞集団を分化させることと、を含み、前記分化の工程がＣｙｐ２６阻害剤の使用を含む、方法。
［２］
前記方法が、細胞周期のＧ０／Ｇ１期の細胞の割合を増加させる、請求項１に記載の方法。
［３］
前記培養することが、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境を含む、請求項１に記載の方法。
［４］
前記環境が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項３に記載の方法。
［５］
前記多能性幹細胞が接着性である、請求項１に記載の方法。
［６］
前記細胞周期のＧ０／Ｇ１期内の細胞の割合を増加させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、小分子及び任意追加的にＴＧＦβファミリーメンバーを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。
［７］
前記小分子がＭＣＸであり、前記ＴＧＦβファミリーメンバーがＧＤＦ−８である、請求項６に記載の方法。
［８］
前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項６に記載の方法。
［９］
多能性幹細胞を胚体内胚葉へ分化させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、ＭＣＸ及びＧＤＦ８又はＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。
［１０］
前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項９に記載の方法。
［１１］
動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性幹を平面接着培養下で凝集細胞集団に増殖させることと、前期平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性幹細胞集団を分化させることと、を含み、前記細胞を、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内で凝集細胞集団に増殖させる、方法。
［１２］
前記多能性幹細胞集団が、膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は、心筋前駆細胞集団を生成するために分化される、請求項１１に記載の方法。
［１３］
前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
［１４］
請求項１１に記載の方法によって産生される、分化した膵臓前駆細胞の前記集団を含む、移植可能幹細胞由来の細胞産物。
［１５］
動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、
ａ．約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、前記多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、
ｂ．酵素又はキレート剤を使用して、前期平面接着培養から動的懸濁培養へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、
ｃ．動的に撹拌される懸濁培養系内で前記細胞集団を維持することと、
ｄ．膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は心筋前駆細胞集団を生成するために、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性幹細胞集団を分化させることと、を含み、
前記分化環境が、ほぼ低酸素から周囲の約３０％の範囲の酸素、０．１％〜約２％の範囲の脂質、又はそれらの組み合わせを含む、方法。
［１６］
前記幹細胞集団が、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、請求項１５に記載の方法。
［１７］
増殖させるための前記環境がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１５に記載の方法。
［１８］
前記分化環境が、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む、請求項１５に記載の方法。
［１９］
前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
［２０］
前記方法が、β細胞転写因子を発現する膵臓前駆細胞を生成する、請求項１５に記載の方法。
［２１］
前記転写因子がＰＤＸ１及び／又はＮＫＸ６．１である、請求項１５に記載の方法。