(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボース―１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物またはヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物を用い、酵素反応にて5-メチルウリジンを製造する方法において、当該微生物を培養した後、
（イ） 該培地成分の一部、または全部を除去し、次いで
（ロ） 該微生物にリボース一燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルまたはヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルを作用せしめ、５−メチルウリジンを生成させた後、次いで
（ハ） 生成した5−メチルウリジンを晶析し、分離する
ことを特徴とする５−メチルウリジンの製造方法
【請求項２】
培地成分の除去率が５０％から９９％である請求項１の方法。
【請求項３】
５−メチルウリジンを晶析し、分離する際に５−メチルウリジンの結晶を沈降速度差で他の不純物結晶と分離することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
分離方法がデカンテーション法または機械的分離方法であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬品原料として有用な５−メチルウリジン（５ーｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）の製造方法に関するものである。５−メチルウリジンは、エイズ薬として市販されているアジドチミジン、また同じく臨床試験中のｄ４Ｔ（２’，３’ーｄｉｄｅｈｙｄｒｏｘｙ−２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の合成中間体として有望視されている。
【０００２】
【従来の技術】
５−メチルウリジンは従来、化学的合成法で製造されており、そこでの精製は、主として、メタノール、エタノール等の有機溶剤を用いた結晶化により行われていた。（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，２１１７（１９５６）；特開昭６３ー６３６６８；Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２１７９（１９８０）；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２５９（１９８２））
【０００３】
これらの技術は、核酸を原料とし、微生物を用いて変換する方法とは副生する不純物が異なるため、精製を含めた５−メチルウリジンの製造方法としては参考にならない。
【０００４】
微生物を利用する５−メチルウリジンの製造方法としては、ヌクレオシド、またはリボースー１ーリン酸に５ーメチルウラシルを微生物存在下に作用させる事により製造する方法が知られている。（特開平２ー２３８８２）
【０００５】
しかしながら、この特許には５−メチルウリジンの精製法に関する具体的な記述が無く、製品としての５−メチルウリジンを製造するには不十分である。
【０００６】
とりわけ、５−メチルウリジンの大きな結晶を晶析により得る事は、結晶の分離性を良くして分離に必要な装置の規模を小さくする事ができ、また、不純物との分離も良くなり、高純度の製品を得るには必要不可欠であるが、それに関するなんらの記述もされていない。
【０００７】
通常、結晶成長には過飽和の大きさと不純物が大きな影響を与え、とりわけ、不純物の組成は晶析せんとする系によって全く事なり、この制御が晶析の可不可を決める重要な鍵であり、与えられた系での特徴的な制御が必要である場合が多い。
【０００８】
よって、微生物を利用した５−メチルウリジンの場合、生物化学的生産に必要な情報は公知であるが、反応液よりの精製については、独自に方法を開発する必要があった。
【０００９】
反応液より、若干の前処理を経て濃縮により５−メチルウリジンを晶析した所、２０から３０マイクロメーター（μｍ）の大きさの結晶しか得られず、これでは分離速度が非常に遅く、分離装置が大きな物になる事が判明した。更に、この大きさでは、後述する結晶の粒度の差を利用した不純物の分離には全く不適切である事が判明した。
【００１０】
５−メチルウリジンは微生物を用い、核酸類を原料として、酵素反応により製造することができるが、そのとき反応生成物中には、未反応物である核酸類および副生物である核酸類が不純物として含まれている。５−メチルウリジンを製造するのに５ーメチルウラシル（チミン）とグアノシンを原料として用いる場合、反応液中の不純物としては、主としてチミン、グアニン、グアノシン、および、２−Ａｍｉｎｏ−７−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−７Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−６（１Ｈ）ｏｎｅ（シュドグアノシン）が存在する。このうち、例えば、チミンは温度、ｐＨ等に対する溶解度変化のパターンが５−メチルウリジンに類似しているため、結晶化によって除去する事は難しい。また、イオン解離パターンも類似しているのでイオン交換樹脂等の処理による除去も困難である。
【００１１】
これら核酸系の不純物は、核酸を原料とした微生物による製造法に特有のものであり、公知の知識を活用する事ができない。また、公知文献ではこれらを分離する方法は記述されていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
５−メチルウリジンを効率よく生産し、かつ、純度の高い物になるよう、微生物を用いた反応液からの５−メチルウリジン結晶の粒度を大きくして結晶と母液の分離効率を高め、さらには、この結晶と他の不純物結晶との分離効率をよくする方法を開発する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
発明者は、微生物を培養し、核酸類を原料として酵素反応にて５−メチルウリジンを製造し、その晶析お呼び分離方法を検討した際、微生物の培養液の処理方法により、後工程の５−メチルウリジンの晶析で得られる結晶の粒度に大きな差のある事を見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、リボース−１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物またはヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物を用い、酵素反応にて５−メチルウリジンを製造する方法において、該微生物を培養した後、
（イ）該培地成分の一部、または全部を除去し、次いで
（ロ）該微生物にリボース−１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルまたはヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルを作用せしめ、５−メチルウリジンを生成させた後、次いで
（ハ）生成した５−メチルウリジンを晶析し、分離する
ことを特徴とする５−メチルウリジンの製造方法に関するものである。
【００１４】
本発明に用いられる微生物は、リボース−１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物またはヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルから５−メチルウリジンを生成する能力を有する微生物であれば、使用可能である。例えば、アクロモバクター属、アシネトバクター属、エアロモナス属等、特許公報特開平２−２３８８２号に記載の微生物を挙げることができる。特に好ましい微生物としては
、アースロバクター属、セルロモナス属、フラボバクテリウム属、クレブジェラ属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、サルシナ属に属する微生物を例示することができる。その具体例として、下記の微生物が挙げられる。
アースロハ゛クター シンフ゜レックス(Arthrobacter simplex) FERM P-10068
セルロモナス フラヒ゛ケ゛ナ(Cellulomonas flavigena) ATCC 486
フラホ゛ハ゛クテリウム レナナム(Flavobacterium rhenanum) FERM BP-1862
クレフ゛シ゛ェラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) ATCC 8308
ミクロハ゛クテリウム ラクチカム(Microbacterium lacticum) ATCC 8180
ミクロコッカス ルテウス(Micrococcus luteus) FERM P-7399
サルシナ ルテア(Sarcina lutea) FERM P-7400
【００１５】
上記微生物の培養は、炭素源、窒素源、Ｐ、Ｓ、Ｆｅ、Ｍｎ等の無機イオン、さらに必要ならば、ビタミン等の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスのような有機窒素源を含有する通常の培地を用い、通常の培養方法で行なえば良い。
【００１６】
得られた微生物の培養液からの培地成分の除去方法としては、培養液を自然沈降後の上澄み除去、遠心分離ないしはろ過等の通常の方法を使用できる。これらの方法により、菌体と母液とに容易にかつ任意の割合に分ける事ができる。培地成分の除去量の割合は、培養液の５０〜９９容量％が好ましく、特に好ましくは７０〜９０容量％である。
【００１７】
培養液から培地成分を一部ないしは大部分を除去した後、微生物含有液に直接あるいは微生物含有液を無機燐酸緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液で希釈したものに、反応基質である、リボース−１−燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシル、または、ヌクレオシド、無機燐酸若しくはその塩及び５−メチルウラシルを添加し、酵素反応を行い、５−メチルウリジンを生成する。反応は、ｐＨ範囲は４〜１０、好ましくは６〜８、温度範囲は、２０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃の条件下、静地あるいは撹拌しながら、１０分〜１０日間行われる。
【００１８】
培養液の培地成分を除去する事無く、培養液にそのまま核酸類の基質を添加した後反応させた場合、得られる結晶の粒度は長径で２０から３０μｍであった。この粒径では、結晶の例えば遠心ろ過を行った場合の分離速度が非常に遅く、大きな装置が必要である事が判明した。
【００１９】
これに対し、培養液の培地成分を一部、または大部分を除去した後に核酸類の基質を添加し、反応を行った場合には、５０から５５０μｍの粒径の結晶の得られる事を発見した。この粒径であれば、結晶の分離速度が速くなり、かつ後述の他の不純物核酸との粒径を利用した分離が可能になる。
【００２０】
発明者は５−メチルウリジンの精製を検討した際、上記の様に、培養液から培地成分を一部ないしは大部分を除去した後基質を加えて反応させると、後工程で得られる５−メチルウリジンの結晶が比較的大きく成る事を発見し、この性質が５−メチルウリジンの精製に活用できうるとの着想を得た。一般的に言って、工業的に粒度の揃った結晶を得ようとする場合、被晶析流体をその流体自体で下方より流動させ、大きな結晶を下部に、細かい結晶を上部に分級させ、上部の細かい結晶を系外で溶解、再循環させる方法が取られるが、本発明のように、製品結晶と不純物結晶を沈降速度で分ける方法は数少ない。その理由は、そのような粒度分布を持った系が無い事、製品結晶中に不純物結晶が取り込まれ、たとえ分ける事ができたとしても純度が上がらない事、および、たとえ分級する事が可能な粒系、結晶の質であっても、発想がそこに至らない為と考えられる。
【００２１】
５−メチルウルジンの場合、市販試薬の結晶粒系は大きくとも５０μｍ程度であったが、発明者がこれを水より再晶析したところ、５００μｍ程の結晶が得られた。
【００２２】
一方、不純物を含む実液系から得られた５−メチルウリジン結晶の粉末Ｘ線回折の結果、５−メチルウリジンは他の不純物と”混晶”を作らず、混合した結晶群の中から５−メチルウリジンの結晶のみを取り出す事ができれば、高純度の製品の得られる事を見いだした。また、実液系での５−メチルウリジンの結晶粒系は通常、３００から６００μｍ、特に小さい場合でも５０から１００μｍの範囲にあり、この時、不純物側の結晶粒系は５から５０μｍであった。さらに、撹判後静置した晶析スラリーの観察により、５−メチルウリジン結晶がガラス容器の下部にあり、上部の液は短時間であれば濁っている事を見いだし、沈降速度の差を使えば、他の結晶を分離できる着想を得た。
【００２３】
具体的に結晶同志を沈降速度で分離する方法としては、一つにはデカンテーション法がある。結晶スラリーをよく混合し、しかる後静置し、５−メチルウリジンが大方沈降し、他の結晶が浮遊してる間に５−メチルウリジン以外の層を容器を傾けて流し去る方法である。流出液を結晶分離し、その母液を元の容器に戻し、再度上記の操作を繰り返す操作を何回か繰り返す事により、不純物結晶を含まない５−メチルウリジン結晶を取得できる。
また、大きな装置では、容器を傾けるのは難しいので、機械力に頼らざるを得ない。たとえば、非沈降層をポンプを用いて吸い出す、あるいは、適当な位置にオーバーフロー口を設けておいて、沈降後、そこから上部の液をオーバーフローさせる等の方法が考えられる。また、一般的な流動層型連続晶析槽を改良し、清澄母液を槽の下部から流し、５−メチルウリジンの結晶は流出させず、不純物結晶のみを流出させる方法、または、いわゆるスーパーデカンター、ハイドロサイクロン等の結晶の分級分離が可能な遠心分離機で一気に、大きな結晶と小さな結晶を分ける方法が考えられる。
【００２４】
デカンテーションないしは上記遠心分離器等を使用する機械的分離を繰り返すことにより、所定の分離の効率と、所定の製品純度を得ることが可能である。
【００２５】
これらのいずれの方法も、分離された不純物結晶を含む流体を遠心分離機、ろ過等で結晶分離し、その母液を元の装置にもどす操作があれば不純物結晶分離効率をより高める事が可能になる。
【００２６】
分離した５−メチルウリジン側の結晶の層を遠心分離、ろ過等で分離し、さらにこの時、結晶を水で、可能ならば冷水で洗浄すれば、より純度の高い結晶が得られる。
【００２７】
５−メチルウリジンを製造するに当たり、核酸を原料とし、微生物を用いて変換する方法の代表例として、ヌクレオシド、無機リン酸および５ーメチルウラシル（チミン）を微生物存在下で作用させる方法がある。ここで、ヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、イノシン、ウリジン、シチジンまたはキサントシンが例示される（特開平２−２３８８２）。この反応において、不純物としてそれぞれの残留ヌクレオシド、５ーメチルウラシル（チミン）、使用したヌクレオシドから副成した塩基およびリン酸が存在する。これらの不純物を５−メチルウリジンとの溶解度の差で分離する事は容易に考えられるが、核酸成分の温度、ｐＨに対する溶解度変化のパターンはお互いに類似しており、これ以上分ける事は容易ではない。
【００２８】
この反応液中で、不純物核酸の除去を検討する過程で、発明者は５−メチルウリジンの結晶が比較的大きくなるのに対し、他のものが大きくならない事を見いだした。さらに、５−メチルウリジンの流体中での沈降速度が他の結晶に比べ、著しく大きい事を発見した。
【００２９】
特開平２−２３８８２の条件に加え、培養液から培地成分を一部ないしは大部分を除去した後基質を加えて反応させた後、反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過して得たろ液を濃縮し、３から１５℃の範囲に冷却晶析して、何等他の溶媒を加える事無く析出してくる結晶のうち、５−メチルウリジン結晶の平均的粒系が５０から５５０μｍであるのに対し、不純物のそれは１０から３０μｍ程度であった。
【００３０】
そこで、流体中の５−メチルウリジン結晶を５分から１０分で沈降させておいた後、５−メチルウリジン結晶層以外の部分を容器を傾けて流出させ（デカンテーション）、さらに流出液中の結晶を分離後、その母液を容器に戻し、撹判後、再びデカンテーションする操作を繰り返したところ、他の結晶をあまり含まない高純度の５−メチルウリジンが得られた。
【００３１】
晶析装置の規模または結晶粒径により、５−メチルウリジンの沈降に要する時間は変化するが、その時の所用時間は、晶泥の一部を抜き取り、メスシリンダー等の中で実際に沈降させ、それに要した時間と沈降距離を計り、これから実際の装置中での所用沈降速度を計算する事により、容易に沈降時間を設定する事ができる。
【００３２】
一方、不純物の結晶粒径は、常にほぼ一定であるから、沈降時間は５−メチルウリジン側だけを考えれば良い。あまり長い時間沈降時間を取ると、不純物結晶も多少沈降してくる。メスシリンダーのような小さな装置では、３０分程度で微結晶の沈降層が形成された。この場合にも、不純物結晶が沈降してくる時間は、装置の規模に基づいて容易に計算でき、沈降時間の限度はこれにより決める事ができる。
【００３３】
流動層型連続晶析槽を改良、あるいは流動層分級型晶析缶を設計して用いる場合には、清澄母液を槽の下部から流し、５−メチルウリジンの結晶は流出させず、不純物結晶のみを流出させるに必要な流体の線速度を測定する事により、容易に実装置での線速度を決定する事ができる。
【００３４】
また同様に、いわゆるスーパーデカンターを用いる場合、小型機を用い、沈降面積あたりの流体フィード流速と結晶の分離性を測定する事により、容易に実機でのフィード流量を設定する事ができる。
【００３５】
ここに、われわれは結晶の沈降速度の差を利用する方法が、５−メチルウリジンと他の核酸成分とを分離する有効な方法である事を見いだした。
【００３６】
上記の方法は、５−メチルウリジンとの分離が極めて難しいチミンの分離に特に大きな効力を発揮した。チミンは溶解度の温度、ｐＨに対する変化のパターンが５−メチルウリジンに相似であり、分離が困難であり、また、イオン解離のパターンも似ており、イオン交換樹脂等でも分離が困難であるため、本発明の方法法は、非常に有効であった。
【００３７】
また、共存する他の核酸であるグアノシン、グアニン、シュドグアノシンについても非常に有効な分離手段であった。
【００３８】
微生物の培養液中の培地成分の一部ないしは大部分を除去した場合にのみ、５−メチルウリジンの大きな粒径の結晶が得られる理由は明確では無いが、酵素反応中に培地成分中に含まれるアミノ酸と他の成分、例えば糖が反応して、その生成物が５−メチルウリジンの結晶の成長を阻害しているのではないかと考えられる。本微生物を用いた反応の温度は６０℃であり、一般的な微生物を用いた生産に比べて温度が高く、この事が前述の副生反応を促進していると考えられ、本特許の培地成分の除去の必要性をもたらしているものと考えられる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に説明する。
【００４０】
実施例１
特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボバクテリウム  レナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体培養液を遠心処理し、培地成分の５０％を除去した。これにトリス緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、温度を６０℃に保って反応させた。反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮し、これを５℃迄冷却した。得られた晶析スラリー中の結晶の大きさは約８０μｍであった。また、５−メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然沈降で良く二層に分離していた。
【００４１】
実施例２
特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボバクテリウム  レナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体培養液を遠心処理し、培地成分の９０％を除去した。これにトリス緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実施例１と同様に反応と後処理を行った。得られた晶析スラリー中の結晶の大きさは約７０μｍであった。また、５−メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然沈降で良く二層に分離していた。
【００４２】
実施例３
特開平２−２３８８２号公報の実施例１に従い、フラボバクテリウム  レナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２を培養し、菌体培養液を調製した。この菌体培養液を遠心処理し、培地成分の９０％を除去した。これに無機リン酸緩衝液を加えて元の容量に戻し、基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実施例１と同様に反応と後処理を行った。得られた晶析スラリー中の結晶の大きさは約１００μｍであった。また、５−メチルウリジンと他の不純物核酸結晶とは自然沈降で良く二層に分離していた。
【００４３】
実施例４
実施例１から３の上層を下層の５−メチルウリジン層と上澄み分離し、この下層を遠心分離した所、いずれも速い速度で分離できた。
【００４４】
実施例５
特開平２−２３８８２号公報の実施例２に従い、ミクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）  ＦＥＲＭ  Ｐ−７３９９を培養し、菌体培養液を調製後、常法に従い洗浄菌体を得た。これにトリス緩衝液を加えて、元の容量に戻し、基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実施例１と同様に酵素反応を実施した。得られた酵素反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮して、５−メチルウリジン２５．５％、チミン１．９５％、グアノシン０．５７％含む濃縮液３８４．９ｇを得た。これをさらに５０ｒｐｍで撹判しながら徐徐に１０℃まで冷却し、結晶を析出させた。これを１０分間静置し、下部の５−メチルウリジン層以外の上部の微結晶懸濁部分をデカンテーション分離して流出させ、流出液中の結晶をろ過分離し、乾重量あたり５−メチルウリジンを２２．６％、チミンを５０．７％、グアノシンを１０．７％含む８．６２ｇの湿結晶を得た。この母液側を５−メチルウリジン結晶層の残っている元の容器に戻し、撹判し、再び１０℃に冷却した。これを再度、上記と同様にデカンテーション分離し、再び流出液中の結晶をろ過分離し、乾重量あたり５−メチルウリジンを４１．４％、チミンを２６．１％、グアノシンを１４．４％、グアニンを０．０５２％を含む乾燥状態で４．５７ｇの結晶を得た。この母液側を５−メチルウリジン結晶層の残っている元の容器に戻し、撹判しながら１０℃に冷却後、バスケット型遠心ろ過機で流体全量を分離した。分離時に結晶層を５７．８ｇの冷水で結晶を洗浄した。分離結晶を乾燥し、７５．２１ｇの含水和物結晶を得た。濃縮液からの５−メチルウリジンの収率は７１．４％であった。この結晶の純度は９３．２４％であり、不純物として、３．３３％のチミン、０．３４２％のグアノシンが含まれていた。５−メチルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮液で７．６％、製品で３．６％であり、晶析、デカンテーション工程で半減していた。更に言えば、定性的であるが、シュドグアノシンも大幅に減少していた。さらに、デカンテーションを繰り返す事により、不純物核酸は更に減少させ得たであろう。なお、この晶析での５−メチルウリジンの結晶平均粒径は約３５０μｍ、微結晶の平均粒径は１０μｍであった。
【００４５】
実施例６
本発明の実施例５と同様にして、菌体培養液を調製後、酵素反応を実施した。この酵素反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮して、５−メチルウリジン２３．０％、チミン１．７１％、グアノシン０．４５％含む濃縮液５８０Ｌを得た。これを晶析缶中で１００ｒｐｍで撹判しながら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出させた。撹判を停止し、約１５分間、５−メチルウリジン結晶を沈降させた後、微結晶を含んだ上部微結晶懸濁液をポンプを用いて機械的に分離した。この分離液中の微結晶をろ過分離し、この母液側を元の晶析缶に戻し、撹判し、再び５℃に冷却した。上記の撹判、静置、上部微結晶懸濁液分離、微結晶ろ過分離、再懸濁の一連の操作を４度繰り返した後、バスケット型遠心ろ過機で懸濁液全体を分離した。分離時に６０Ｌの水で結晶を洗浄した。分離結晶を乾燥し、９６Ｋｇの含水和物結晶を得た。濃縮液からの５−メチルウリジンの収率は７２．０％であった。この結晶の純度は９３．８％であり、不純物として、１．８％のチミン、０．１６％のグアノシンが含まれていた。５−メチルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮液で７．４％、製品で１．９％であり、晶析、デカンテーション工程で４分の１に減少していた。また、シュドグアノシンも大幅に減少していた。さらに、デカンテーションを繰り返す事により、不純物核酸は更に減少させ得たであろう。なお、この晶析での５−メチルウリジンの結晶平均粒径は約５５０μｍ、微結晶の平均粒径は１５μｍであった。
【００４６】
比較例１
本発明の実施例１と同様にして、フラボバクテリウム  レナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｅｎａｎｕｍ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８６２の菌体培養液を調製した。この菌体培養液の培地成分を除去することなく、基質の５−メチルウラシルとグアノシンを添加し、本発明の実施例１と同様に温度を６０℃に保って反応させた。反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮し、これを５℃迄冷却した。得られた５−メチルウリジンの結晶の大きさは２０から３０μｍであり、他の不純物核酸結晶との自然沈降による分離現象は見られなかった。また、遠心分離に非常に長時間要した。
【００４７】
比較例２
本発明の実施例５と同様にして、ミクロコッカス  ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）  ＦＥＲＭ  Ｐ−７３９９の菌体培養液を調製後、酵素反応を実施した。得られた酵素反応液を冷却、ろ過、活性炭脱色、ろ過、真空濃縮して、５−メチルウリジン２５．２％、チミン１．５５％、グアノシン０．４２％含む濃縮液７．０５ｋｇを得た。これをさらに撹判しながら徐徐に５℃まで冷却し、結晶を析出させた。この懸濁液を静置することなく、すぐにバスケット型遠心ろ過機で全量分離し、５−メチルウリジンを４．５％、チミンを０．２６％、グアノシンを０．１２％含む５２２３ｇの母液を得た。更に結晶層を８１４ｇの冷水で洗浄した。この洗浄時の母液は、５−メチルウリジンを５．１８％、チミンを０．３１％、グアノシンを０．１９％含み、１９２６ｇあった。分離結晶を乾燥し、１．５２ｋｇの含水和物結晶を得た。濃縮液からの５−メチルウリジンの収率は７６．３％であった。この結晶の純度は８９．２８％であり、不純物として、５．２１％のチミン、０．６９％のグアノシンが含まれていた。５−メチルウリジンに対するチミンの比率は、濃縮液で６．２％、製品で５．８％であり、晶析工程での減少は全くなかった。
【００４８】
【発明の効果】
産業上有用な５−メチルウリジンを、有機溶剤等特殊な溶媒を用いる事無く、かつ、簡便な方法で高純度に精製できる。