【手続補正書】
【提出日】平成28年12月12日(2016.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質の製造方法であって、該方法は、結節ペプチドとリポカリンタンパク質とを含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、それにより融合タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
更にリポカリンタンパク質から結節ペプチドを分離し、それにより結節ペプチドを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、更に開裂サイトを持っている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記開裂サイトはフューリン開裂サイト、トリプシン開裂サイト、またはＴＥＶ開裂サイトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リポカリンタンパク質からの結節ペプチドの分離は、融合タンパク質における該開裂サイトでの開裂の結果によって起こることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
リポカリンタンパク質からの結節ペプチドの分離は、該融合タンパク質の細胞からの分泌に続いて起こる、請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質、またはコノトキシンＣＶＩＣである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリン、チキンＥｘ−ＦＡＢＰまたはウズラＱ８６を含み、前記融合タンパク質は、構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−リポカリンタンパク質−ＴＥＶ−ペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
融合タンパク質組成物であって、該組成物は結節ペプチドとリポカリンタンパク質とを含む組成物。
【請求項１１】
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質及びコノトキシンＣＩＶＣからなる群から選ばれる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リポカリンタンパク質はシデロカリン、チキンＥｘ−ＦＡＢＰまたはウズラＱ８６を含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳまたはＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記融合タンパク質は各サブユニットの隣接するサブユニットとの直接融合により生成される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
更にリポカリンタンパク質と結節ペプチドとの間にリンカー配列を含んでいる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポカリンタンパク質が、シデロカリンを含み、前記方法がさらに、前記シデロカリンにリガンドを負荷することをさらに含んでいる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リガンドが、化学治療的または放射性の試薬を含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結節ペプチドと前記リポカリンタンパク質との間に開裂サイトをさらに含んでいる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記切断サイトが、フューリン開裂サイト、トリプシン開裂サイト、またはＴＥＶ開裂サイトである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記リポカリンタンパク質が、リガンドが負荷されたシデロカリンを含んでいる、請求項１０〜１５および１８〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記リガンドが、化学治療的または放射性の試薬を含んでいる、請求項２０に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明はリポカリンタンパク質と、ペプチドまたはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の組成物に関する。いくつかの実施形態において、本発明は少なくとも１つのネイティブリジン残基を欠く複数のペプチドを更に含むペプチドライブラリーを含む組成物に関する。また、本発明はペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を含む組成物に関する。
（項目１）
融合タンパク質の製造方法であって、該方法は、ペプチドまたはタンパク質ドメインとリポカリンタンパク質とを含む融合タンパク質を細胞内で発現させ、それにより融合タンパク質を製造する方法。
（項目２）
更にリポカリンタンパク質からペプチドまたはタンパク質ドメインを分離し、それによりペプチドまたはタンパク質ドメインを製造する、項目１記載の方法。
（項目３）
前記ペプチドまたはタンパク質ドメインは抗体断片である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記抗体はトラスツズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＯＫＴ３、またはＦｃである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ペプチドまたはタンパク質ドメインは、ヒトヘムオキシゲナーゼ１またはマウスヘムオキシゲナーゼ１である、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記融合タンパク質は、更に開裂サイトを持っている、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記開裂サイトはフューリン開裂サイト、トリプシン開裂サイト、またはＴＥＶ開裂サイトである、項目６に記載の方法。
（項目８）
リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメインの分離は、融合タンパク質における該開裂サイトでの開裂の結果によって起こることを特徴とする、項目７に記載の方法。
（項目９）
リポカリンタンパク質からのペプチドまたはタンパク質ドメインの分離は、該融合タンパク質の細胞からの分泌に続いて起こる、項目２〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞は哺乳動物細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ペプチドは、約５００ｍｇ／リットル未満、約４００ｍｇ／リットル未満、約３００ｍｇ／リットル未満、約２００ｍｇ／リットル未満、約１００ｍｇ／リットル未満、または約５０ｍｇ／リットル未満の濃度で作られる、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ペプチドは、ジスルフィド結節ペプチドである、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質、またはコノトキシンＣＶＩＣである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンを含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳ、シデロカリン、ＴＥＶと興味対象の結節ペプチド配列からなる群から選ばれるペプチドを含んでいる、
項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ペプチドはノッチンを含んでいる、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
融合タンパク質組成物であって、該組成物はリポカリンタンパク質とペプチドまたはタンパク質ドメインとを含む組成物。
（項目１９）
前記ペプチドは結節ペプチドである、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記結節ペプチドはＰＭＰ−Ｄ２、ポテトカルボキシペプチダーゼ、フエントキシン、インペラトキシン、エピレグリン、ミドカイン、気泡タンパク質及びコノトキシンＣＩＶＣからなる群から選ばれる、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンである、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２２）
前記リポカリンタンパク質はヒトシデロカリン、マウスシデロカリン、チキンＥｘ−ＦＡＢＰまたはウズラＱ８６である、項目１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２３）
前記結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド結合を含む、項目１９または２０に記載の組成物。
（項目２４）
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、項目１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２５）
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記融合タンパク質は各サブユニットの隣接するサブユニットとの直接融合により生成される、項目１８〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２７）
更にリポカリンタンパク質とペプチドまたはタンパク質ドメインとの間にリンカー配列を含んでいる、項目１８〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２８）
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、項目１８〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２９）
ペプチドライブラリーを含んでいる組成物であって、該ペプチドライブラリーは更に少なくとも１つの天然リジン残基を欠いている複数のペプチドを含んでいる組成物。
（項目３０）
前記ペプチドはアダプター分子と結合されている、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記アダプター分子はペプチドである、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
前記ペプチドは質量分光分析で測定される独自のサインを持っている、項目２９または３０に記載の組成物。
（項目３３）
ペプチドの製造方法であって、該方法は、ペプチドとリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を細胞内で発現させることと、該ペプチドを該リポカリンタンパク質から分離し、それによりペプチドを製造すること、とを含む方法。
（項目３４）
前記ペプチドはタンパク質加水分解によりまたは融合タンパク質のフューリン開裂サイトにおける開裂によってリポカリンタンパク質から分離される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞は哺乳動物細胞である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ペプチドは約２００ｍｇ／リットル未満の濃度で作られる、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン及びエピレグリンからなる群から選ばれる、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンを含んでいる、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
前記融合タンパク質は更にＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＰ−ペプチドを含んでいる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ペプチドは結節ペプチドである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ペプチドとリポカリンタンパク質を含んでいる融合タンパクを含んでいる組成物。
（項目４４）
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記結節ペプチドはカイモトリプシン阻害因子、ヘフトキシン、気泡タンパク質、ミドカインのＣ末端ドメイン、ポテトカルボキシペプチダーゼ阻害因子及びエピレグリンからなる群から選ばれる、項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記リポカリンタンパク質はシデロカリンである、項目４４に記載の組成物。
（項目４７）
前記結節ペプチドは少なくとも２つのジスルフィド結合を含んでいる、項目４３に記載の組成物。
（項目４８）
前記融合タンパク質はＩｇＫスターター配列、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳとＴＥＶのうちの少なくとも１つを含んでいる、項目４３に記載の組成物。
（項目４９）
前記融合タンパク質は次の構造：ＩｇＫ  ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ペプチドを含んでいる、項目４３に記載の組成物。
（項目５０）
前記ペプチドは結節ペプチドを含んでいる、項目に４９記載の組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従った、多様なスカフォールドを示すゲル画像である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従った、ペプチドライブラリー製造方法の一例を示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従った、ノッチン（例えば、気泡タンパク質）を作るのに用いられ得る融合システムの一例を図示している。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従った、質量分析法による大きなペプチドライブラリーの分析を示す。
【図５】図５は、本発明の実施形態に従った、ノッチン変異型を発現させるシデロカリン融合を用いる方法の一例を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従った、ノッチンスカフォールドを発現させるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示している。
【図７Ａ】図７は、本発明の実施形態に従った、プールされたライブラリー作成の概略図である。図７Ｂは図７Ａの拡大図である。図７Ａは、出現する順に、それぞれ、SEQ  ID  NOS  121〜124を開示する。図７Ｂは、出現する順に、それぞれ、SEQ  ID  NOS  125〜126を開示する。
【図７Ｂ】図７は、本発明の実施形態に従った、プールされたライブラリー作成の概略図である。図７Ｂは図７Ａの拡大図である。図７Ａは、出現する順に、それぞれ、SEQ  ID  NOS  121〜124を開示する。図７Ｂは、出現する順に、それぞれ、SEQ  ID  NOS  125〜126を開示する。
【図８】図８は、本発明の実施形態に従った、クローンノッチンライブラリーから得られた代表的な配列データを示す。図８は、出現する順に、それぞれ、SEQ  ID  NOS  127〜155を開示する。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従った、３０００の構成要素を含むノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】図１０は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。図１０は、「6xHis」をSEQ  ID  NO:93として開示する。
【図１１】図１１は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。
【図１２】図１２は、本開示の一つの様相に従った、一般的なノッチン作成方法を示す。この側面によれば、フューリンとノッチンの界面に開裂が起こる。
【図１３】図１３は、本開示の一つの様相に従った、ダイダロスシステムによって作られたノッチンの例と対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ダイダロスシステムは、Ｂａｎｄａｒａｎａｙａｋｅ  Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（２１）：ｅ１４３に述べられている。
【図１４−１】図１４は、１８の種から得られたＳｃｎ配列アライメント(それぞれ、出現する順に、SEQ  ID  NOS  39、40、47、51、45、49、43、44、52、54、42、156、46、157、50、53、48および41)を示す。該アライメントは、認識可能な相同分子種を持つ１８種間で、高次の配列保存性を示している。星印の位置は、配位子結合可能なサイトを示す。Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．＆  Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．（２０１３）‘Ｉｒｏｎ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ’Ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．＆  Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ａ．，ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐｐ．３４９−５９
【図１４−２】図１４は、１８の種から得られたＳｃｎ配列アライメント(それぞれ、出現する順に、SEQ  ID  NOS  39、40、47、51、45、49、43、44、52、54、42、156、46、157、50、53、48および41)を示す。該アライメントは、認識可能な相同分子種を持つ１８種間で、高次の配列保存性を示している。星印の位置は、配位子結合可能なサイトを示す。Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．＆  Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｋ．（２０１３）‘Ｉｒｏｎ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ’Ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（Ｃｕｌｏｔｔａ，Ｖ．＆  Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ａ．，ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｐｐ．３４９−５９
【図１５】図１５は、本開示の一つの様相に従った、超安定Ｓｃｎの３Ｄモデルを示す。このＳｃｎ形において、Ｎ末端を確保し、熱安定性を高めるため、第二のジスルフィド結合がなされた。
【図１６】図１６は、本開示の種々の様相において用いることのできる一般的なＳｃｎ融合の概略図を示す。精製を促進するため、ネイティブシグナルペプチドは除かれ外因性ｓＦＬＡＧとＨＩＳタグが加えられた。これらの変更は、本開示の種々の様相において任意になされる。
【図１７】図１７は、本開示の一つの様相に従った、Ｓｃｎと軽鎖抗体の融合の概略図と対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。図１７は、SEQ  ID  NO:158を開示する。
【図１８】図１８は、本開示の一つの様相に従った、開裂前と後のＳｃｎ融合の発現と細胞質酵素、ＨＭＯＸ１、を比較するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１９】図１９は、本開示の一つの様相に従った、細胞質ウイルス性タンパク質Ａｄｖ２とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２０】図２０は、本開示の一つの様相に従った、細胞外ウイルス性糖タンパク質ＨＩＶ  ｇｐ１２０とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２１】図２１は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンタンパク質、すなわち、インペラトキシンとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２２】図２２は、本開示の一つの様相に従った、細胞外チロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１の小サブドメイン（すなわち、クリングルドメイン）とのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２３】図２３は、本開示の一つの様相に従った、７量体及び３量体サブドメインとのＳｃｎ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２４】図２４は、本開示の一つの様相に従った、ノッチンとのＥｘＦＡＢＰ融合の発現と、対応するＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。ＥｘＦＡＢＰは機能性Ｓｃｎの別のものである。本開示に従って、この組み立ては周辺質細菌システムにおいて用いられ、多様なクライアントタンパク質を分泌することができる。
【図２５】図２５は、Ｔｈ配位子とＳｃｎの結晶構造を示す。
【図２６】図２６蛍光性シデロホアを捉えた図を示す。左図はタンパク質シデロホア複合体のサイズ排除精製を示し、右図は概略図である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ある実施形態において、ＳＣＮとの融合体としてペプチド（例えば、結節ペプチド）の発現は、内因的なＳＣＮ開裂、すなわちＣＩＤＧ(SEQ  ID  NO:  101)直後のＲＡＲＹＫＲ(SEQ  ID  NO:  98）と、外因的に開裂されたもの、すなわちその位置にあるＥＮＬＹＦＱ(SEQ  ID  NO:  95)とともに利用することができる。タンパク質輸送（例えば、フューリンによる）の際、前者は哺乳動物細胞により開裂され、遊離ＳＣＮと結節ペプチドは周辺の媒体に分泌され得る。ＥＮＬＹＦＱ(SEQ  ID  NO:  95)はタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）タンパク質分解酵素部位であるが、この部位は哺乳動物細胞内では内因的には見つけられない。後に外因的ＴＥＶタンパク質分解酵素を加えることによって結節ペプチドが開裂し除かれることができるように、このシステム内の構造体が融合体として分泌され得る。このことがノッチンの回復のために有用であり得る。ある実施形態において、ポリヒスチジンやポリアルギニンなどの精製「ハンドル」がＳＣＮに加えられ、その後タンパク質加水分解によって除かれ得る。結節ペプチドに加え、これらの融合システムはケモカイン、インターロイキン、ペプチドホルモンなどの難発現性の医療的に興味あるタンパク質にも利用することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
典型的な様相において、リポカリン融合タンパク質は次のようなタンパク質配列を持っていてもよい。
MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG  (SEQ  ID  NO:  102)
この配列において、注記はシグナルペプチド、グリコシル化サイト、ジスルフィド結合、とＣ８７Ｓ変種を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
典型的な様相において、融合タンパク質を製造するため自己開裂ＳＣＮアイソフォームを興味対象のペプチドまたはタンパク質に添加することができる。例えば、自己開裂ＳＣＮアイソフォームはＣＩＤＧ(SEQ  ID  NO:  101)アミノ酸配列に直ちに続くＲＡＲＹＫＲ(SEQ  ID  NO:  98)アミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、ＲＡＲＹＫＲ(SEQ  ID  NO:  98)アミノ酸配列は、融合タンパク質を送出する間に、内因的酵素によってタンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）へ付着させられ得る。例えば、フューリンは、ＲＡＲＹＫＲ(SEQ  ID  NO:  98)アミノ酸配列を開裂することができる。この場合、ＳＣＮと興味対象のペプチドまたはタンパク質は遊離し細胞外スペースにあり得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
典型的な様相において、融合タンパク質を作り出すため、外因的に開裂されたＳＣＮアイソフォームは興味対象のペプチドまたはタンパク質に加えてもよい。例えば、外因的に開裂されたＳＣＮアイソフォームはＣＩＤＧ(SEQ  ID  NO:  101)アミノ酸配列に直ちに続くＥＮＬＹＦＱ(SEQ  ID  NO:  95)アミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、ＥＮＬＹＦＱ(SEQ  ID  NO:  95)アミノ酸配列は、融合タンパク質を送出する間または後に、外因的酵素によってタンパク質発現システムの細胞（例えば、哺乳動物細胞）へ付着させられ得る。例えば、タバコエッチタンパク質分解酵素は、ＥＮＬＹＦＱ(SEQ  ID  NO:  95)サイトを開裂することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
４つのスカフォールドが定義されたライブラリー、すなわち、ヘフトキシン、ＣＴＩ、ノッチンとエピレグリン、の生成のため選らばれた。標的アミノ酸配列のリストがコンピュータ上（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）に作られ、それによって各ライブラリーの全メンバーは独自の質量のトリプシン断片を持つことになり、また結合する抗原決定基を発生させるため、突然変異体は構造的に隣接するように選ばれた。Ｎ−末端結合を不明確にするため、システインは変異されず、リジンは特に避けられた。各スカフォールドの３０００の変異体が生成され、そして各スカフォールドはＰＣＲプライマーサイトの特異な組み合わせによって並べられそれによって４のサブライブラリーの各々は独立して増幅することができた。全ての構造は、Ｎ−末端ＢａｍＨＩサイトとＣ−末端ＮｏｔＩサイトを持っていた、そして１２０００のオリゴヌクレチドプールからの各サブライブラリーのＰＣＲ増幅に続いて、各サブライブラリーは、確立された技術によって制限的に消化され、ＳＣＮ融合タンパク質としてカットされた親ベクター（両フューリン開裂及びＴＥＶ−開裂形）にクローン化された。ＨＥＫ２９３はダイダロス発現のために必要とされるこのプラスミドライブラリーとアクセサリプラスミドによって形質移入され、そして、３から４日後にウイルスが媒体の中で収穫された。ウイルスは遠心分離により濃縮され確立された手順に従ってタンパク質生成用のＨＥＫ２９３細胞を感染させるために用いられた。本発明者は、ライブラリーを作る際、ＴＥＶ−開裂性構造がニッケル樹脂上のＩＭＡＣにより融合体が容易に回収されるので、ＴＥＶ−開裂性構造が技術的により取り扱いやすいことが分かった。ＩＭＡＣに引き続き、融合タンパク質は透析されＰＢＳとなり、６ｘＨｉｓ(SEQ  ID  NO:  93)で標識化されたＴＥＶタンパク質分解酵素により一晩開裂するようにされ、そして、その後ＳＣＮとタンパク質分解酵素は物質を再びニッケル樹脂に通すことによって除かれた。開裂したペプチドライブラリーを含む通過分画は更に精製されバッファがサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）によって１０ｍＭ蟻酸アンモニウムに替えられ、ペプチドを含む分画は一つに集められ凍結乾燥された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
図１０〜１２は、ノッチンペプチドの効率的製造を可能にする本開示に従った種々の製造方法を示している。図１０は、シデロカリン融合タンパク質の要素及びノッチンペプチド作成のためのその使用を示している。この実施例では、ノッチンはシデロカリンとの融合タンパク質として分泌されている。ＩｇＫシグナルペプチドはマウスの軽鎖ＩｇＧから派生している。ｓＦＬＡＧは、長ＦＬＡＧシグナルペプチドに関連するシグナルペプチドの開裂増強のための短ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＥ）(SEQ  ID  NO:  91)である。Ｈｉｓはヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）(SEQ  ID  NO:  93)であり、ＴＥＶはタバコエッチ病ウイルスタンパク質分解酵素部位（ＥＮＬＹＦＱ）(SEQ  ID  NO:  95)である。本方法により、図１２に示されているように、開裂と分離に続いて、融合タンパク質が分泌される。ＩｇＫＳＰは、マウスＩｇＫ軽鎖シグナルペプチド、ｓＦＬＡＧは短くされたＦＬＡＧ抗原決定基、ＨＩＳは６ｘヒスチジンタグ(SEQ  ID  NO:  93)、ＴＥＶはタバコエッチ病ウイルスタンパク質分解酵素（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）認識部位、ＦｕｒｉｎはＢａｍＨＩ部位を持つフューリン開裂サイトである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
図１０は、シデロカリン融合タンパク質の要素及びノッチンペプチド作成のためのその使用を示している。この実施例では、ノッチンはＨＩＳ−タグをつけられたシデロカリンとして分泌されている。ＨＩＳタグは、可逆的にニッケルをつなぐ６つのヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ）(SEQ  ID  NO:  93)のことであり、それゆえ、固定化金属クロマトグラフ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ））のための有用な精製タグである。ＩＭＡＣによる融合タンパク質の分離に続いて、融合体がＴＥＶタンパク質分解酵素で開裂され、開裂されたシデロカリンは別の回のＩＭＡＣで除かれ、純粋なノッチンが残る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
以上、本発明の好ましい実施形態を述べてきたが、そのような実施形態は例としてのみ述べられていることは当業者にとって明らかである。種々の変更、変化、置き換えは、本
発明から逸脱することなく当業者に想起される。本発明の実施に当たり、本発明の実施形態への種々の変更が可能であると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、またそれによって特許請求の範囲及びそれらの均等物内での方法、構成を網羅するものである。
配列
以下は対象の遺伝子、及び本明細書に定義される構成のＤＮＡ及び／またはアミノ酸配列である。
シームレスクローニングのための親構成の構成：
SEQ  ID  NO:  1  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-PARENTAL  for  Xho/Bam  cut  from  pUC57  and  ligation  into  pCVL
【化１】
2016505251.tif 000001
Fusion  protein  Sequences  −  original  set  of  10  −  cloned  into  NotI  cut  parent  above  by  seamless  cloning:
SEQ  ID  NO:  2  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-BubbleProtein 
【化２】
2016505251.tif 000002
SEQ  ID  NO:  3および105  -    
【化３】
2016505251.tif 000003
SEQ  ID  NO:  4  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Attractin 
【化４】
2016505251.tif 000004
SEQ  ID  NO:  5および106  -
【化５】
2016505251.tif 000005
SEQ  ID  NO:  6  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Hefutoxin 
【化６】
2016505251.tif 000006
SEQ  ID  NO:  7および107  -    
【化７】
2016505251.tif 000007
SEQ  ID  NO:  8  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Hanatoxin 
【化８】
2016505251.tif 000008
SEQ  ID  NO:  9および108  -
【化９】
2016505251.tif 000009
SEQ  ID  NO:  10  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-ChymotrypsinInhibitor 
【化１０】
2016505251.tif 000010
SEQ  ID  NO:  11および109-    
【化１１】
2016505251.tif 000011
SEQ  ID  NO:  12-      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-ToxinK
【化１２】
2016505251.tif 000012
SEQ  ID  NO:  13および110  -    
【化１３】
2016505251.tif 000013
SEQ  ID  NO:  14  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-EGFepiregulinCore
【化１４】
2016505251.tif 000014
SEQ  ID  NO:  15および111  -    
【化１５】
2016505251.tif 000015
SEQ  ID  NO:  16  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Circulin 
【化１６】
2016505251.tif 000016
SEQ  ID  NO:  17および112  -
【化１７】
2016505251.tif 000017
SEQ  ID  NO:  18  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Brazzein 
【化１８】
2016505251.tif 000018
SEQ  ID  NO:  19および113-
【化１９】
2016505251.tif 000019
SEQ  ID  NO:  20および114  -    
【化２０】
2016505251.tif 000020
Construction  of  parental  construct  for  BamH1/NotI  cloning:
SEQ  ID  NO:  21  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-PARENTAL
【化２１】
2016505251.tif 000021
BamHI  site:  GGATCC
NotI  site:  GCGGCCGC
A  BamHI  site  adds  “GS”  before  a  knottin.    This  construct  can  be  used  for  cloning  libraries.
Construction  of  parental  construct  for  furin  cleavage,  BamHI/NotI  cloning  can  include  an  idealized  furin  cut  site  is  RARYKRS（SEQ  ID  NO:115）  −RARYKRGS（SEQ  ID  NO:99）  can  be  used  for  a  Bam  HI  site.
SEQ  ID  NO:  22  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-furin-GS-PARENTAL
【化２２】
2016505251.tif 000022
SEQ  ID  NO:  23-      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-MIDKINE
【化２３】
2016505251.tif 000023
SEQ  ID  NO:  24および116  -    
【化２４】
2016505251.tif 000024
SEQ  ID  NO:  25  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Violacin  A 
【化２５】
2016505251.tif 000025
SEQ  ID  NO:  26および117  -    
【化２６】
2016505251.tif 000026
SEQ  ID  NO:  27  -    
IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Lambda  Toxin 
【化２７】
2016505251.tif 000027
SEQ  ID  NO:  28および118  -    
【化２８】
2016505251.tif 000028
SEQ  ID  NO:  29  -    IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Lambda  Toxin  NG 
【化２９】
2016505251.tif 000029
SEQ  ID  NO:  30および119  -    
【化３０】
2016505251.tif 000030
SEQ  ID  NO:  31  -      IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-Potato  Carboxypeptidase  Inhibitor 
【化３１】
2016505251.tif 000031
SEQ  ID  NO:  32および120  -    
【化３２】
2016505251.tif 000032
Anti-CD3-STa  bispecific
The  anti-CD3  is  an  OKT3  variant  from  the  C-terminus  of  patent  7635462.    It  is  supposed  to  work  as  either  N-  or  C-  terminal.
SEQ  ID  NO:  33-    
GSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSNSSNYCCELCCNPACTGCY
This  is  designed  to  be  dropped  into  the  Bam/Not  cut  library  vector  as  a  TEV-cleavable  siderocalin  fusion:
SEQ  ID  NO:  34  -    
【化３４】
2016505251.tif 000033
Parental  cloning  construct  1  for  downstream  fusions:
【化３５】
2016505251.tif 000034
Parental  cloning  construct  2  for  downstream  fusions:
【化３６】
2016505251.tif 000035
【化３７】
2016505251.tif 000036
【化３８】
2016505251.tif 000037
SEQ  ID  NO:  39  -    
Homosapiens
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  40  -    
Pantroglodytes
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGRQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELQENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  41  -    
Canisfamiliaris  
QDSTPSLIPAPPPLKVPLQPDFQHDQFQGKWYVIGIAGNILKKEGHGQLKMYTTTYELKDDQSYNVTSTLLRNERCDYWNRDFVPSFQPGQFSLGDIQLYPGVQSYLVQVVATNYNQYALVYFRKVYKSQEYFKITLYGRTKELPLELKKEFIRFAKSIGLTEDHIIFPVPIDQCIDE
SEQ  ID  NO:  42  -    
Bostaurus
RSSSSRLLRAPPLSRIPLQPNFQADQFQGKWYTVGVAGNAIKKEEQDPLKMYSSNYELKEDGSYNVTSILLKDDLCDYWIRTFVPSSQPGQFTLGNIKSYRGIRSYTVRVVNTDYNQFAIVYFKKVQRKKTYFKITLYGRTKELTPEVRENFINFAKSLGLTDDHIVFTVPIDRCIDDQ
SEQ  ID  NO:  43  -    
Musmusculus
QDSTQNLIPAPSLLTVPLQPDFRSDQFRGRWYVVGLAGNAVQKKTEGSFTMYSTIYELQENNSYNVTSILVRDQDQGCRYWIRTFVPSSRAGQFTLGNMHRYPQVQSYNVQVATTDYNQFAMVFFRKTSENKQYFKITLYGRTKELSPELKERFTRFAKSLGLKDDNIIFSVPTDQCIDN
SEQ  ID  NO:  44  -    
Rattusnorvegicus
QDSTQNLIPAPPLISVPLQPGFWTERFQGRWFVVGLAANAVQKERQSRFTMYSTIYELQEDNSYNVTSILVRGQGCRYWIRTFVPSSRPGQFTLGNIHSYPQIQSYDVQVADTDYDQFAMVFFQKTSENKQYFKVTLYGRTKGLSDELKERFVSFAKSLG
LKDNNIVFSVPTDQCIDN
SEQ  ID  NO:  45  -    
Macacamulatta
QDSSSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLSGNAVGRKDEAPLKMYATIYELKEDKSYNVTSILFRKEKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIQNHPGLTSYVVRVVSTNYKQYAMVFFKKVSQNKEYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFSVPIDQCING
SEQ  ID  NO:  46  -    
Tursiopstruncatus
QDSTPNLIPAPPLFRVPLQPNFQPDQFQGKWYIVGLAGNAFKKEKQGQFKMYATTYELKEDRSYNVTSALLRGKTQRCDHWIRTFVPSSRPGQFTLGNIKGFPGVQSYTVRVATTNYNQFAIVYFKKVYKNQEYFKTTLYGRTKELTPQLKENFIHFAKSLGLTDEYILFPVPIDKCIDDQ
SEQ  ID  NO:  47  -    
Gorillagorilla
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFREKAQKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  48  -    
Procaviacapensis
QEPTPTLIPAPPLSSIPLKPNFHNDKFQGKWYVVGVAGNAITKEKDPSLMYTTTYELRDDGSYNVTSTQFREKINCTHWTRTFVPTSQPGQFSLGNIDKYPHLSSYTVRVTATNYNYFAIVYFKKVSKNQEYFKTTLYKRIKKLTHGLKKHFIQFAKSLGLPDNHITFLVPTDRCIDDA
SEQ  ID  NO:  49  -    
Callithrixjacchus
QDSPSPLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAIRREDQDSLKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKAQKCDYWIRTFVPSSRPGEFKLGNIESHPGLTSYIVRVVNTDYKQHAMVFFMKASHNRKYFKVTLYGRTKELTSDLKENFTSFSKSLGLTENHIIFPVPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  50  -    
Microcebusmurinus
QDSKEKLIPAPPLLRVPLQPDFQDDQFRETSWPRGSKMKETPAGSRDAGTGWATTYELKDHSYNVTSTLLRQNGKCDYWIRTFVLTSQPGQFALGNINRYPGIQSYTVRVVTTNYNQFAIVFFKKVSENKEYFKTTLYGRTKELPPELKENFIRFAKSLGLTEDHIIYPVPIDQCIDD
SEQ  ID  NO:  51  -    
QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVVGLAGNAIRREDKDSQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGSQPGEFTLGNTKGYPGLTSYLVRVVSTNYNQYAMVFFKKVSQNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPAPIDQCIDG
SEQ  ID  NO:  52  -    
Ochotonaprinceps
QELTTDLIPVPSLRKIHVQKNFQSDQFQGKWYVVGLAGNNIHNSDQEHQQMYSTTYELKEDGSYNVTSTLLRQRNQQCDHWIRTFVPGSKLGHFNLGNIKSYPTLKSYLIRVVTTDYNQFAIVFFRKVYKNNKKFFKIVLYGRTKELSPELRGRFTSFAKTLGLTDNHIVFPAPIGQCIDD
SEQ  ID  NO:  53  -    
Loxodontaafricana
QTHSPTLIPAPPLLRVPLQPDFQDDKFQGKWYVIGLAGNAVEKKEQGQFKMYTTTYELKEDGSYNVTSTLLQEDGKCSYWIRTFVPSFQPGQFNLGNIKNFPGLQSYTVRVTATNYNQFAIVFFKKVSKNGEYFKTTLYGRTKELTPELKERFIRFAKSLGLSDHIIFPVPIDRCIDD
SEQ  ID  NO:  54  -    
Oryctolaguscuniculus
QDPTPKLIPAPSLRRVPLQRNFQDEQFQGKWYVVGLAGNAVQKREEGQEPMYSTTYELNEDRSFNVTSTLLRDQRCDHWIRTFVPTSRPGQYNLGNIKSYPGVKNYIVRVVATDYSQYAMMFFRKGSRNKQFFKTTLYGRTKELSPELRERFTRFAKSLGLPDDRIVFPTPIDQCIDD  
SEQ  ID  NO:  55  -    
Murine  Scn  construct  for  downstream  viral  fusions:
【化５５】
2016505251.tif 000038
SEQ  ID  NO:  56  -    
【化５６】
2016505251.tif 000039
【化５７】
2016505251.tif 000040
【化５８】
2016505251.tif 000041
【化５９】
2016505251.tif 000042
【化６０】
2016505251.tif 000043
【化６１】
2016505251.tif 000044
【化６２】
2016505251.tif 000045
【化６３】
2016505251.tif 000046
【化６４】
2016505251.tif 000047
【化６５】
2016505251.tif 000048
【化６６】
2016505251.tif 000049
【化６７】
2016505251.tif 000050
Human  Scn  construct  for  downstream  viral  fusions:
【化６８】
2016505251.tif 000051
【化６９】
2016505251.tif 000052
【化７０】
2016505251.tif 000053
Human  Scn  construct  for  downstream  peptide  fusions:
【化７１】
2016505251.tif 000054
【化７２】
2016505251.tif 000055
【化７３】
2016505251.tif 000056
【化７４】
2016505251.tif 000057
【化７５】
2016505251.tif 000058
【化７６】
2016505251.tif 000059
Human  Scn  construct  for  downstream  HMOX1  fusions:
【化７７】
2016505251.tif 000060
【化７８】
2016505251.tif 000061
【化７９】
2016505251.tif 000062
【化８０】
2016505251.tif 000063
Human  Scn  construct  for  downstream  multimer  fusions:
【化８１】
2016505251.tif 000064
【化８２】
2016505251.tif 000065
【化８３】
2016505251.tif 000066
【化８４】
2016505251.tif 000067
【化８５】
2016505251.tif 000068
Human  Scn  construct  for  downstream  subdomain  fusions:
【化８６】
2016505251.tif 000069
【化８７】
2016505251.tif 000070
【化８８】
2016505251.tif 000071
SEQ  ID  NO:  89  -    
IgK  SP:  Murine  IgK  light  chain  signal  peptide:
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ  ID  NO:  90  -    
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT
SEQ  ID  NO:  91  -    
sFLAG:    Shortened  FLAG  epitope:
DYKDE
SEQ  ID  NO:  92  -    
GACTACAAGGACGAG
SEQ  ID  NO:  93  -    
HIS:  6xhistidine  tag
HHHHHH
SEQ  ID  NO:  94  -    
CATCATCATCATCATCAT
SEQ  ID  NO:  95  -    
TEV:    Tobacco  Etch  Virus  Protease  recognition  site:
ENLYFQ
SEQ  ID  NO:  96  -    
GAGAATTTATATTTTCAG
SEQ  ID  NO:  97  −
Furin  −  furin  cleavage  site  with  BamHI  site  (GGATCC):
SEQ  ID  NO:  99  −
RARYKRGS
SEQ  ID  NO:  100
CGGGCCCGGTATAAACGGGGATCC