(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体からアリル保護基を除去する方法であって、下記の工程ａ）〜ｃ）を不活性大気中で行なう当該方法：
ａ）可溶性有機パラジウム触媒を供給し、
ｂ）該触媒をアリル保護したアミノ酸誘導体と接触させ、
ｃ）アリル保護したアミノ酸を該触媒と、アリル保護基がアミノ酸誘導体から触媒的に除去されてアリル脱保護されたアミノ酸誘導体が得られるのに十分な時間インキュベートし、そして
ｄ）アリル脱保護されたアミノ酸誘導体を触媒から分離する。
【請求項２】
可溶性有機パラジウム触媒が有機パラジウム（０）触媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性有機パラジウム触媒がテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
可溶性有機パラジウム触媒がテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
可溶性有機パラジウム触媒を、有機酸とラジカル掃去剤とを含む溶媒中で供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
溶媒がクロロホルム、塩化メチレン又はベンゼンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有機酸が蟻酸、酢酸又はプロピオン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ラジカル掃去剤がジメドン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツル酸、モルホリン又はＮ−メチルモルホリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
可溶性有機パラジウム触媒がテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）であり、該触媒を、クロロホルム中の酢酸及びＮ−メチルモルホリンを含む溶媒中で供給し、該可溶性触媒を不活性大気中で供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記の溶媒が、クロロホルム中の約５％酢酸及び約２．５％Ｎ−メチルモルホリンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の工程を含む、生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体からアリル保護基を除去する方法：
ａ）テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）触媒を供給し（該触媒をクロロホルム中の酢酸及びＮ−メチルモルホリンを含む溶媒中で供給し、該触媒を更に不活性大気中で供給する）、
ｂ）該触媒をアリル保護したアミノ酸誘導体と不活性大気中で接触させ、
ｃ）アリル保護したアミノ酸誘導体を該触媒と不活性大気中で、アリル保護基がアミノ酸誘導体から触媒的に除去されてアリル脱保護されたアミノ酸誘導体が得られるのに十分な時間インキュベートし、そして
ｄ）アリル脱保護されたアミノ酸誘導体を触媒から分離する。
【請求項１２】
前記の溶媒が、クロロホルム中の約５％酢酸及び約２．５％Ｎ−メチルモルホリンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンの誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体のＮα官能基がアリル基により保護されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が更に、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンタニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル、２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−プロピル−オキシカルボニル、ジチアスクシノイル、ビフェニリルイソプロピル−オキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル又はフェニルイソプロピルオキシカルボニル基により保護されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、メチオニン、オルニチン、セリン、スレオニン若しくはチロシンの誘導体であり、その側鎖官能基がアリル保護基により保護されており、且つそのＮα官能基がｔ−ブチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンタニルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、ジチアスクシノイル、ビフェニリルイソプロピルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル若しくはフェニルイソプロピルオキシカルボニル基により保護されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、メチオニン、オルニチン、セリン、スレオニン若しくはチロシンの側鎖を硫酸化、グリコシル化、ホスホリル化、ヨウ素化、アルキル化若しくは脂質化した誘導体であり、該修飾アミノ酸側鎖がアリル保護基により保護され、更に、該アミノ酸誘導体のＮα官能基がｔ−ブチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンタニル−オキシカルボニル、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル、２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−プロピルオキシ−カルボニル、ジチアスクシノイル、ビフェニリルイソプロピルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル若しくはフェニルイソプロピルオキシカルボニル基により保護されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が固体支持体に結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記の生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体のＮα官能基がアリル基により保護されており、該アリル基が、保護されているアミノ酸誘導体の固体支持体への結合を媒介している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
固体支持体が、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトコポリマー支持体又はポリスチレン支持体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、５−（４−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）吉草酸、５−［（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノキサンテン−２−オキシ］吉草酸又はｐ−アルコキシベンジルアルコールリンカー又はハンドルを介して固体支持体に結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、ペプチド結合により一つに繋った生物関連アミノ酸残基で形成された合成ペプチド中に存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体が、ペプチド結合により一つに繋った生物関連アミノ酸残基で形成された合成ペプチド中に存在し、該ペプチドが、５−（４−（９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル）アミノメチル−３，５−ジメトキシ−フェノキシ）吉草酸ハンドル若しくはリンカーを介してポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトコポリマー支持体に結合し、該ペプチドが生物関連アミノ酸誘導体から形成されたものであり、そのＮα官能基が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基若しくはアリル基により保護された、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
不活性大気中で溶媒に溶解させた有機パラジウム化合物を含むアリル保護基の除去のための組成物であって、該溶媒が有機酸とラジカル掃去剤とを含む当該組成物。
【請求項２５】
有機パラジウム（０）化合物を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
テトラキストリフェニル−ホスフィンパラジウム（０）を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
溶媒がクロロホルム、塩化メチレン又はベンゼンである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
有機酸が蟻酸、酢酸又はプロピオン酸である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
ラジカル掃去剤がジメドン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツル酸、モルホリン又はＮ−メチルモルホリンである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
不活性大気中でクロロホルム溶媒に溶解させたテトラキストリフェニル−ホスフィンパラジウム（０）を含み、該溶媒が更に酢酸とＮ−メチルモルホリンとを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記のクロロホルム溶媒が約５％酢酸と約２．５％Ｎ−メチル−モルホリンとを含む、請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
過去１／４世紀にわたって、生物関連の種々の分子の有機合成の技術が開発され、洗練されてきた。特に、ペプチド合成のための洗練された方法が開発された。これらの方法は、研究若しくは治療目的上興味ある天然のペプチドの化学合成を可能にした。更に、天然の対応物の知られない多くのペプチド構造が合成された。今や、分枝若しくは環状ペプチド、又は１つ以上のアミノ酸残基をグリコシル化、硫酸化、ホスホリル化若しくは他の誘導体化したペプチドを合成により製造することが可能である。ペプチド合成分野の状況は、Ｂａｒａｎｙ等、  （１９８７），  ３０  ＩＮＴ．  Ｊ．  ＰＥＰＴ．  ＰＲＯＴ．  ＲＥＳ．  ７０５−７３９  及び  Ｆｉｅｌｄｓ  等、  （１９９２），  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ中：  Ａ  ＵＳＥＲ’Ｓ  ＧＵＩＤＥ，  ７７−１８３  （Ｇｒａｎｔ  等）  において総説されている。
【０００２】
多年にわたって、ペプチド構造は手作業で合成され、相当のレベルの専門技術を必要とする骨の折れる工程であり、間違いが生じることに対して無防備であった。最近、自動ペプチド合成用の器械が開発され、製造し得るペプチド構造の範囲及び種類が広がった。自動化は、以前に試みることの出来た規模より一層大規模のペプチド生産を可能にする。自動化ペプチド合成器械装置及びソフトウェアは、有機合成及び蛋白質化学を超える分野における学問的及び産業上の研究のためのペプチド合成の利用し易さを大いに拡大した。合成したペプチド構造は、今や、栄養学、微生物学、免疫学、生理学及び医学等の様々な分野において道具として利用される。
【０００３】
しかしながら、報告されたペプチド合成技術の洗練度及び多様性が増すにつれて、多くの限界及び誘発され得る望ましくない副反応が知られるようになった。これらの多くは、特定の合成試薬又はアミノ酸誘導体の型に特有であり、かかる試薬を使用し得る条件及び組合せの範囲を実際上制限する。多くの試薬特異的及びアミノ酸特異的な望ましくない副反応も又、Ｂａｒａｎｙ等、（１９８７）  同書  ７２７−７３０頁において総説されている。
【０００４】
手作業のペプチド合成技術に適応している人々は、自動化ペプチド合成用器械において、多くの更なる予想外の制限及び望ましくない副反応に遭遇した。現存するペプチド合成法を自動化設定での使用に適合させるため、及び自動化器械に特に適した新規な方法を開発するための努力が現在進行中である。こうして、多くの望ましい技術は、自動化器械と非適合性であることが判明した。
【０００５】
例えば、アリル保護されたアミノ酸誘導体を含む合成反応は、自動化設定に対する適合性に乏しいことが判明した。アリル基の除去は、アリル脱保護用の触媒の性質及び物理的特性のために、自動化した合成においては特に困難であることが判明した。
【０００６】
【発明の要約】
本発明は、生物関連アミノ酸のアリル保護された誘導体からアリル保護基を除去するための方法に関する。この方法は、可溶性有機金属触媒を供給し、該触媒をアリル保護されたアミノ酸誘導体と接触させ、及びそのアリル保護されたアミノ酸誘導体を該触媒と、アリル保護基をアミノ酸誘導体から触媒的に除去するのに十分な時間インキュベートしてアリル脱保護したアミノ酸誘導体を得る工程を含む。その後、アリル脱保護したアミノ酸誘導体を触媒から分離する。最も有利なことには、本発明のアリル脱保護法は、自動ペプチド合成用器械において用いるのに適している。これは、主に、ここで述べる有機金属触媒が可溶性となる条件の発見によるものである。自動化器械の反応容器又はカラム内で固相支持体が汚れ又は背圧が生じるのを回避するために、自動化固相ペプチド合成反応において均質液相条件を達成することは特に重要である。
【０００７】
１つの実施態様において、可溶性有機金属触媒は有機パラジウム触媒である。好ましくは、有機パラジウム（０）触媒を用いる。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）が、特に、好ましい。本発明の有機金属触媒を有機酸及び受容体を含む溶媒中で供給する。適当な有機酸は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸等を含む。酢酸は、本発明の目的のために適した有機酸であることが示された。適当な受容体は、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジメドン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツル酸を含む。Ｎ−メチルモルホリンは、特に適当な受容体であることが示された。本発明の有機酸及び受容体は、有利に、クロロホルム、塩化メチレン又はベンゼン溶媒中に含まれ得る。本発明の触媒を供給して、不活性大気中でアリル保護されたアミノ酸誘導体と接触させる。アリル脱保護インキュベーションも又不活性大気中で行なう。可溶性テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）触媒を、更に約５％酢酸及び約２．５％Ｎ−メチルモルホリンを含むクロロホルム溶媒中で、不活性大気中で供給したときに、満足なアリル脱保護結果が得られた。
【０００８】
ここに開示する自動化可能なアリル脱保護法は、固体支持体に結合した生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体の脱保護のために用いることが出来る。この方法は、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトコポリマー支持体又はポリスチレン支持体と共に用いるのに適している。生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体を、ヘテロ二官能性のハンドル又はリンカー、例えば、５−（４−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノメチル−３，５−ジメトキシ−フェノキシ）吉草酸、５−［（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノキサンテン−２−オキシ］吉草酸又はｐ−アルコキシベンジルアルコールを介して固体支持体に結合することが出来る。更に、生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体は、ペプチド結合で一つに繋がった生物関連アミノ酸残基で形成された合成ペプチド中に存在してよい。かかる合成ペプチドのアリル脱保護は、ペプチドの支持体からの開裂の前又は後の何れかにおいて行なうことが出来る。ここに開示するように、本発明の自動化可能なアリル脱保護法は、頭−尾（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）環状ペプチドを含む環状ペプチド、分枝ペプチド及び複数抗原（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ）ペプチドの自動生成において最も有利に用いることが出来る。アリル保護基がアリル保護したアミノ酸誘導体のアルファ炭素官能基上に存在するか側鎖官能基上に存在するかに関係なく、アリル脱保護を、本方法によって行なうことが出来る。
【０００９】
第２の一般的面において、本発明は、可溶性有機パラジウム触媒の製造方法に関係する。本方法は、固体有機パラジウム化合物例えばテトラキストリフェニル−ホスフィンパラジウム（０）を供給し、溶媒が不活性ガス源と接触することにより不活性条件が確立された有機酸及び受容体を含む溶媒を供給し、及び固体有機パラジウム化合物を不活性ガス大気中で溶媒と合わせて、混合物を形成する工程を含む。この混合物を、不活性ガス大気中でインキュベートし、固体有機パラジウム化合物が溶媒に溶解し、それにより可溶性有機パラジウム触媒を形成するのに十分な時間維持する。その結果生成した可溶性触媒は、生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体を用いる自動ペプチド合成手順（環状ペプチド、分枝ペプチド及び複数抗原ペプチドの合成を含む）で用いるのによく適合している。本発明の触媒製造方法は、自動ペプチド合成用器械において実施することが出来る。
【００１０】
第３の一般的面において、ここで開示する発明は、可溶性有機金属触媒組成物に関する。好ましくは、この組成物は、有機パラジウム化合物、例えば、不活性大気中で、有機酸及び受容体を有する溶媒に溶解したテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）を含む。好ましくは、溶媒は、酢酸及びＮ−メチルモルホリンを有するクロロホルム溶媒である。上述のように、本発明の可溶性触媒は、この分野における重要な進歩を代表し、環状ペプチド、分枝ペプチド及び複数抗原ペプチドの合成を含む多くの所望のペプチド合成手順の自動化を可能にする。実際、アリル保護は、直鎖状ペプチドの合成においてさえ大いに望ましいことであり、該合成において、アリル基は、他の広く用いられているアミノ酸保護基、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基と共に用いたとき更なる直交性を与える。本発明において、アリル保護化学は、今や、合成ペプチドの直鎖延長におけるアルファアミノ基の一時的保護のためのｔ−ブチルオキシカルボニル及び９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル化学に対する代替戦略と見ることが出来る。
【００１１】
【好適実施態様の詳細な説明】
本発明は、上記のアリル脱保護用有機金属触媒例えば有機パラジウム触媒が可溶性となる条件の発見を利用している。固相ペプチド合成のための自動化システムにおいて、固体支持体以外のすべての成分について均質（即ち、液相）反応条件を達成することは重要である。従って、本願の可溶性有機パラジウム触媒の製造方法及び使用方法の開示、並びに可溶性触媒組成物の開示は、自動化に適した合成化学の幅の重大な拡張を意味する。手作業の合成も又、当然、本発明のアリル脱保護用可溶性触媒を利用することにより大いに単純化される。
【００１２】
アリル保護化学は、多くの複雑若しくは不安定なペプチドの合成において用いるために望ましい道具と認められるが、長い間、必要とされる専門技術のレベル並びに可溶性物質をペプチド合成反応に導入しその後固体副生物を所望の生成物から分離することの困難性のために十分に活用されなかった。固相ペプチド合成におけるアリル保護及びそのための試薬は、米国特許出願第０７／７１５，２９７号に開示されており、その教示を本明細書中に参考として援用する。
【００１３】
アリル保護基は、下記の一般的化学構造を有する
【化１】
0003600268.tif 000002
（式中、Ｘは保護基の生物関連アミノ酸若しくはその誘導体への結合部位を示し、Ｒ１  、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  及びＲ５  は独立に、水素、Ｃ１  〜Ｃ８  の直鎖状若しくは分枝アルキル基、Ｃ６  〜Ｃ１０のアリール基、Ｃ１  〜Ｃ８  の直鎖状若しくは分枝した置換されたアルキル基及びＣ６  〜Ｃ１０の置換されたアリール基からなる群より選択する）。小サイズのアリルコア構造は、アリル保護を、立体障害が関係する合成において望ましいものとする。従って、一層小さい置換基例えば水素は、Ｒ１  、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  及びＲ５  について好ましい。アリル基は、アミノ酸側鎖の保護のために望ましいが、アルファカルボキシ及びアミノ置換基を保護するためにも用いることが出来る。従って、アリル基は、所望のペプチドの合成においてアルファアミノ官能基の一時的保護のために用いることが出来る。
【００１４】
上記のように、Ｘはアリル保護基の生物関連アミノ酸若しくはその誘導体への結合部位を示す。生物関連アミノ酸は、生体系内に天然に存在するアミノ酸、例えば天然のペプチド及び蛋白質中に見出される２０種類のアミノ酸を含む。即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンは、生物関連アミノ酸と考えられる。この用語は、更に、アミノ酸代謝産物であるアミノ酸例えば、尿素サイクルの成分であるオルニチンを含む。天然の系においては余り用いられないが、オルニチンは、合成ペプチドの配列に含まれ、続いてアルギニンに変換され得る。前述のアミノ酸のＬ及びＤ配置の両者は、下記においては特に指定しない限りＬ配置が意図されるにもかかわらず、この用語に含まれる。天然には見出されないが生物関連性例えば生物活性を有するアミノ酸も又この用語に含まれる。前述の各々は、ここでは、247 J. BIOL. CHEM. 997-983 (1972) に示されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の規則（その教示を本明細書中に援用する）に従って略書きして表す。
【００１５】
生物関連アミノ酸のある種のものは、官能基として言及される側鎖置換基を有するが、それについて、ペプチド合成中に、アリル保護が望ましい。従って、アスパラギン酸及びグルタミン酸の酸性（カルボキシル）側鎖官能基、並びにセリン及びスレオニンのヒドロキシル側鎖官能基は、チロシンのフェノール性側鎖官能基と共に、アリル基によって保護され得る。これらのアミノ酸について、アリル基のアミノ酸への直接的結合部位（Ｘ）は酸素原子である。アリル保護基は、同様に、リジン及びオルニチンの塩基性（アミノ）側鎖官能基に存在する窒素原子、アスパラギン及びグルタミンのアミド側鎖官能基、ヒスチジンのイミダゾール側鎖官能基、及びアルギニンのグアニジノ側鎖官能基に下垂する。同様にして、アリル保護基は、システインのスルフヒドリル側鎖官能基若しくはメチオニンのチオエーテル側鎖官能基に存在する硫黄原子に結合することが出来る。更に、前記の側鎖官能基は、生体系に見出される型の更なる置換基により、又は天然には存在しないが興味ある置換基によって誘導体化することが出来る。従って、アミノ酸側鎖官能基は、硫酸化され、グリコシル化され、ホスホリル化され、ヨウ素化され、アルキル化され、又は脂質化され得る。
【００１６】
本発明の生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体は、固相ペプチド合成に適している。例えば、アリル置換基により保護された基以外の１つ以上の官能基例えば、アルファ炭素のアミノ置換基（本明細書中では、Ｎα官能基として言及する）が、ペプチド合成反応に適した円滑に開裂し得る一時的保護基によって保護されているアミノ酸誘導体。例えば、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンタニル−オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２−（３，５−ジメチトキシフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、ジチアスクシノイル、ビフェニリルイソプロピル−オキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル又はフェニルイソプロピルオキシカルボニル基は、かかる一時的保護基の典型である。
【００１７】
好ましくは、一時的保護基は、ここに開示するアリル基を除去するために用いる第１の条件の組においてアミノ酸誘導体に安定に結合され続けるが、アリル基がアミノ酸誘導体に安定に結合され続ける第２の条件の組にさらすことによりアミノ酸誘導体から円滑に遊離されるものである。この脱保護条件の相互的排他性を直交性と呼ぶ。従って、以下に一層完全に説明するように、アリル保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル基及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基に対して直交性である。これらの内では、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基が好ましい。
【００１８】
本発明のアミノ酸誘導体は、固体支持体例えば固相ペプチド合成用の支持体に結合することが出来る。適当な支持体は、樹脂、膜、多孔性ガラス、シリカ、ポリジメチルアクリルアミド、綿、紙、ポリスチレン及びポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトコポリマーを含む。これらの内、米国特許出願第０７／５７６，６３４号により開示された型のポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトコポリマー支持体が好ましい（その教示を本明細書中に参考として援用する）。アミノ酸誘導体は、典型的には、共有結合により支持体に結合する。この共有結合は、直接的であっても間接的であってもよい。従って、固相ペプチド合成用のアミノ酸誘導体は、ヘテロ二官能性架橋基（ハンドルとも呼ぶ）を介して、支持体に間接的に結合してよい。このハンドルは、支持体に結合したアミノ酸誘導体のペプチド合成反応のための立体的な接近可能性を増大させるように働き、合成の終了において円滑に開裂し得る。このアリル保護基は、もしペプチド合成中のアルファカルボン酸置換基の保護のために用いるならば、ハンドル内に含まれ得る。適当なハンドル又はリンカーは、５−（４−（９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル）アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）−吉草酸、５−［（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノキサンテン−２−オキシ］吉草酸及びｐ−アルコキシベンジルアルコールを含む。これらのハンドルは、米国特許出願第０７／５７６，２３２号及び０７／５７６，２３３号に記載されており、各教示（本明細書中に参考として援用する）も又適当である。
【００１９】
本発明の生物関連アミノ酸のアリル保護した誘導体は、ペプチド結合で一つに繋がった生物関連アミノ酸残基で形成された合成ペプチド中に存在してよい。かかるペプチドを形成するペプチド合成技術は周知である。ここに記載した技術は、多くの合成方法及び利用可能なそれらの組合せ及び変法の１つの典型例を与える。本発明のペプチドは、固体支持体に結合することが出来、又は可溶性であってよい。殆どの場合、このペプチドは固体支持体に結合することが予想される。このペプチドは、ペプチド結合が一連のアミノ酸残基のアルファ炭素原子を繋いだ直鎖状ペプチドであってよく、該ペプチドはアルファ炭素のカルボキシ置換基（Ｃαカルボキシル基）を有する１つの末端アミノ酸残基を有し、該置換基は、溶液中に解放されている又は、適宜上記のハンドルを介して、固体支持体に共有結合されている。かかる直鎖状ペプチドの他の末端アミノ酸残基は、溶液中に解放されているか又は適当な一時的保護基例えばアリル基若しくは上記した従来の基の１つにより保護されたＮα官能基を有する。かかるペプチド中に存在するアリル保護したアミノ酸誘導体のアリル脱保護は、その側鎖官能基を解放することが出来る。或は、アリル保護基は、末端Ｎα官能基上又はＣα官能基上に存在してよい。
【００２０】
或は、本発明のペプチドは、ペプチド結合で一つに繋がったアミノ酸残基の少なくとも１本の追加の列が、第１の支持体結合したアミノ酸残基から始まる連続ペプチド結合鎖中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖官能基から下垂している分枝ペプチドであってよい。例えば、ペプチド分枝は、リジンのＮα及び側鎖（エプシロン、Ｎε）官能基の両者から下垂してよい。ここに記載したように、Ｎα及びＮεの両部位でペプチド結合により一つに繋がったリジン残基のマトリックスから多重分枝構造を形成することが出来る。かかる多重分枝構造を複数抗原ペプチドとして以下に説明する。
【００２１】
更に又、本発明のペプチドは、環状ペプチドであってよく、例えば、ペプチド結合で一つに繋がったアミノ酸残基の鎖の一端若しくは両端が同じペプチド内の他のアミノ酸残基とのペプチド結合に参加し得ることを意味する。環状ペプチドは又、同じペプチド内に存在するアミノ酸置換基の２つの側鎖官能基をペプチド結合にて結合して形成することも出来る。かかるループした構造は、アスパラギン酸又はグルタミン酸及びリジン又はオルニチンの側鎖の間で形成することが出来る。１つのアミノ酸残基の側鎖官能基を末端Ｎα若しくはＣα官能基に結合した幹とループのペプチド構造を形成することが出来る。頭−尾環状ペプチドは、末端カルボキシ及びアミノ基を一緒に結合したものである。頭−尾環状ペプチドは、固体支持体に、側鎖官能基例えばアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の部位で結合することが出来る。
【００２２】
かかるペプチドのアリル保護基が側鎖上に存在するかアルファ末端官能基に存在するかに関係なく、本発明によるアリル脱保護は、環状又は分枝ペプチド構造（複数抗原ペプチドを含む）を形成するための手順に先立って、引き続いて又は共に用いることが出来る。
【００２３】
上に要約したように、本発明は、アリル基除去に用いる触媒が可溶性となる条件の発見を利用している。多くの企図する実施態様において、本発明の触媒は、有機パラジウム触媒好ましくは有機パラジウム（０）触媒である。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）［Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  ］は、本発明の好適触媒である。従来知られている方法においては、この触媒は懸濁固体として用いられた。ペプチド合成反応で用いるのに適しており、好適触媒が可溶性となる条件を今から説明する。従って、本発明は、アリル脱保護が必要若しくは望ましいペプチド合成の自動化を可能にする。
【００２４】
本発明の触媒は有機酸及び適当な受容体が更に存在する溶媒に溶解し得ることをここに開示する。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）に適した溶媒は、クロロホルム、塩化メチレン及びベンゼンを含む。これらの内、クロロホルム（ＣＨＣｌ３  ）が好ましい。ジメドン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルバルビツル酸、モルホリン又はＮ−メチルモルホリンを受容体として用いることが出来るが、モルホリン及びＮ−メチルモルホリンが好ましい。Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル保護化学の望ましくない干渉のない受容体として機能することが示されており、特に好ましい。従って、適当な条件下において、アリル化学は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学に対して完全に直交性となり得る。ここに開示するように、Ｎ−メチルモルホリンは特に好ましく、それは触媒作用の間、アリルラジカルの受容体若しくは掃去剤としてではなく塩基として作用する望ましくない傾向を示さない。本発明の溶媒に混和性の任意の適当な有機酸を、本発明において用いることが出来る。蟻酸、酢酸及びプロピオン酸を用いることが出来るが、これらの内、酢酸（ＨＯＡｃ）が特に適していることが示された。
【００２５】
従って、好適実施態様において、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）は、クロロホルム中の酢酸及びＮ−メチルモルホリンを含む溶媒に溶解させる。酢酸は、約３〜７％、好ましくは約４〜６％、最も好ましくは約５％の濃度でこの溶媒中に存在してよい。Ｎ−メチルモルホリンは、その中に、約１〜４％、好ましくは約２〜３％、最も好ましくは約２．５％の濃度で存在してよい。従って、好適実施態様において、本発明の触媒は、約５％の酢酸及び約２．５％のＮ−メチルモルホリンを更に含むクロロホルム溶媒中に溶解させる。
【００２６】
本発明の可溶性有機パラジウム触媒は、通常大気条件下で用いることが出来るが、好ましくは不活性ガスの大気下で用いる。不活性条件は、好ましくは、溶媒中で、例えば、溶媒を固体テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）と接触させる前にそれを通してアルゴン（Ａｒ）ガスを泡立てることにより確立する。その後、不活性条件を、アリル脱保護用の可溶性触媒の使用中維持する。任意の不活性ガスを用いて、本発明の可溶性触媒のための不活性ガスの大気を確立することが出来る。
【００２７】
十分量の固体有機パラジウム触媒をここに記載する溶媒に溶解して所望のレベル及び割合のアリル脱保護を与える。適当な量の触媒は、特定の脱保護反応に必要な可溶性触媒の所望の容量及び終濃度による。脱保護すべきアリル保護したアミノ酸誘導体の特定の型、容量及び濃度も又、本発明の溶媒中に溶解すべき固体触媒の量に影響するであろう。特定の脱保護反応のための適当な触媒のレベルを、常例的実験法によって決定することが出来る。典型的には、本発明の可溶性有機パラジウム触媒の所望量を、除去（脱保護）しようとするアリル保護基の化学当量に対して過剰の化学当量数で計算する。この実施を下記の調査研究及び代表例においてたどることにする。
【００２８】
ここで述べる発明及びその固相合成分野における進歩としての意義は、下記の検討及び説明用研究により一層完全に理解されるであろう。
【００２９】
有機分子及び生化学分子の合成におけるアリル保護化学の出現
１９５０年に、Ｓｔｅｖｅｎｓ  とＷａｔａｎａｂｅは、アミン及びアルコール部分の保護のためにアリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）基を導入した。Ｓｔｅｖｅｎｓ  及びＷａｔａｎａｂｅ（１９５０）、  ７２  Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．  ７２５−７２７。Ａｌｏｃ基の開裂を、プラチナ若しくはパラジウム触媒を用いる触媒的水添分解、液体アンモニア中での金属ナトリウムの利用、又は氷酢酸（ＨＯＡｃ）中でのヨウ化ホスホニウムの利用により達成した。あいにく、これらのＡｌｏｃ基除去のための方法は、回りくどいものであり、有機合成におけるこの基の有用性を制限するものであった。続いて、Ｔｓｕｊｉ  とＴｒｏｓｔ  は、パラジウム触媒によるアリル脱保護のための改良された反応条件を開発したが、そこで有機合成におけるアリル（Ａｌ）保護基の可能性が認識された。Ｔｓｕｊｉ  （１９８０）、  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＷＩＴＨ  ＰＡＬＬＡＤＩＵＭ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ｐｕｂ．）；  Ｔｒｏｓｔ  （１９８０），  １３  ＡＣＣ．  ＣＨＥＭ．  ＲＥＳ．  ３８５−３９３  。
【００３０】
Ｈａｙａｋａｗａ等は、Ａｌｏｃ基及びアリル基戦略を、核酸の溶液及び固相合成におけるヌクレオチド間結合及びヌクレオシド塩基の保護用に拡張した。Ｈａｙａｋａｗａ等、（１９９０），  １１２  Ｊ．  ＡＭ．  ＣＨＥＭ．  ＳＯＣ．  １６９１−１６９６  。アリル保護したホスフェート及びＡｌｏｃ保護したアミンオリゴマーの同時脱保護を、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、トリフェニルホスフィン及び大過剰のブチルアミン及び蟻酸のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の混合物を用いて、５０℃にて、０．５〜１時間で達成した。
【００３１】
Ｇｕｉｂｅ  等は、生物関連アミノ酸のα−アミノ及び側鎖機能それぞれについて、Ａｌｏｃ基及びアリル基の選択的開裂を研究した。Ｄａｎｇｌｅｓ  等、（１９８７），  ５２  Ｊ．  ＯＲＧ．  ＣＨＥＭ．  ４９８４−４９９３；  Ｇｕｉｂｅ  等、  （１９８６），  ２７  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ２３６５−２３６８；  Ｍｅｒｚｏｕｋ  及びＧｕｉｂｅ  （１９９２），  ３３  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ４７７−４８０。Ｇｕｉｂｅ  は、種々の受容体のアリル基掃去剤としての効果を研究し、水素化トリブチル錫（Ｂｕ３  ＳｎＨ）及びシリルアミンの利用が望ましくないアリルアミンの形成を抑制することを見出した。
【００３２】
初めに、アリル化学の可能性は、固相ペプチド化学において、延長中のペプチドを樹脂に結合させるために働くハンドルとして認識された。ＫｕｎｚとＢｉｒｒは、アミノメチルポリスチレン樹脂と結合した４−ブロモクロトン酸のアリルアンカーとしての利用を導入した。Ｋｕｎｚ及びＤｏｍｂｏ  （１９８８），  ２７  ＡＮＧＥＷ．  ＣＨＥＭ．  ＩＮＴ．  ＥＤ．  ＥＮＧＬ．  ７１１−７１３；  Ｋｕｎｚ等  （１９８８），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９８８中：ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＩＥＴＨ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  １５４−１５６  （Ｊｕｎｇ及びＢａｙｅｒ  編）；  Ｂｅｃｋｅｒ  等（１９８８），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９８８：ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＩＥＴＨ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  １５７−１５９（Ｊｕｎｇ及びＢａｙｅｒ  編）  。ペプチドを樹脂から、ＴＨＦ中で及びモルホリン、ジメドン、Ｎ−メチルアニリン若しくはＮ，Ｎ’−ジメチルバルビツル酸等の受容体の存在下でテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）［Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  ］で処理することにより分離した。これらの穏やかな、中性の条件を用いて、敏感なＯ−グリコシド結合を含む糖ペプチドの製造が可能になった。更に、Ｋｕｎｚは、Ｃ−末端アリルエステルと組み合わせたＮα−末端９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基の利用を、溶液中でのＯ−糖ペプチド製造の別法として報告した。Ｃｉｏｍｍｅｒ  及びＫｕｎｚ  （１９８９），  ５４  Ｊ．  ＯＲＧ．  ＣＨＥＭ．  ７５１−７５６  。
【００３３】
Ｂｌａｎｋｅｍｅｙｅｒ−Ｍｅｎｇｅ  とＦｒａｎｋ  は、幾つかの保護したペプチド断片の、４−（４’−メトキシトリチルオキシ）−ブト−２−エニルオキシヘキサン酸をアリルアンカーとして含むセルロースディスク上での合成を記載した。Ｂｌａｎｋｅｍｅｙｅｒ−Ｍｅｎｇｅ  及びＦｒａｎｋ  （１９８８）、２９  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ５８７１−５８７４  。アリルエステル結合の脱保護を、ＴＨＦ中のＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  で処理し次いでＴＨＦ中の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）溶液を添加することによって達成した。Ｆｍｏｃ基の開裂を避けるために、モルホリンではなくＨＯＢｔを受容体として用いた。Ｇｕｉｂｅ  とＬｏｆｆｅｔは、アミノメチルポリスチレンと結合した４−トリチルオキシ−ブト−（Ｚ）−２−エニルオキシ酢酸をアリル性ハンドルとして用いた。Ｇｕｉｂｅ  等  （１９８９），  ３０  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ２６４１−２６４４；  Ｌｏｆｆｅｔ  等  （１９９０），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中：ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＥＬＥＶＥＮＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  １０１５−１０１６  （Ｒｉｖｉｅｒ  及びＭａｒｓｈａｌｌ編）  。このハンドルを、Ｂｕ３  ＳｎＨを用いる水素化錫分解（ｈｙｄｒｏｓｔａｎｎｏｌｙｓｉｓ）によって開裂した。続いて、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  は、ＫｕｎｚとＦｒａｎｋ  により記載された２つのアリルアンカー基、４−ブロモクロトン酸及び４−トリチルオキシ−ブト−（Ｚ）−２−エニルオキシ酢酸の開裂条件を研究した。Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ等  （１９９１）、  ３３  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ４２０７−４２１０  。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  は、アリルアンカー基を、モルホリンを受容体として及びＰｄ（ＰＰＨ３  ）４  を触媒として用いて、ＴＨＦ：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：０．５Ｍ  ＨＣｌ（２：２：１）で処理するにより開裂反応を行なうと最適結果を与えることを見出した。
【００３４】
Ｈｕｄｓｏｎ及びＬｏｆｆｅｔは、独立に、固相ペプチド合成におけるアリル基の側鎖保護基としての利用を研究した。Ｂｉａｎｃａｌａｎａ等  （１９９２），  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥＳ  ＩＮ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：  ＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＡＮＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  １３５−１５２  （Ｅｐｔｏｎ編）；  Ｌｙｔｔｌｅ  及びＨｕｄｓｏｎ  （１９９２），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中  −  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＬＦＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ５８３−５８４  （Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｅｒ  編）；  Ｌｏｆｆｔｅ  及びＺｈａｎｇ  （１９９２），  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥＳ  ＩＮ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ中：  ＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＡＮＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，  ７７−８２  （Ｅｐｔｏｎ編）  。アリル機能を脱保護するための穏やかな条件は、古典的なＦｍｏｃ／ｔ−ブチル（ｔＢｕ）に基く方法に適合性であり、従って、ペプチド構築のための保護計画に第三次元の直交性を与えた。
【００３５】
最近、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  等は、Ｆｍｏｃ、ｔＢｕ及びアリル保護基の利用を含む三次元直交固相戦略による、「頭−尾」環状ペプチド、側鎖ラクタムペプチド、糖ペプチド及びスルホペプチド並びに分枝ペプチドの製造を報告した。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  （１９９３），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９９２  中：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＣＯＮＤ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  （Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ及びＥｂｅｒｌｅ編）；  Ｋａｔｅ  等  （１９９３），  ３４  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  １５４９−１５５２  。そこに記載された研究は殆ど完成していたので、同じ戦略がＴｒｚｅｃｉａｋとＢａｎｎｗａｒｔｈ  によって頭−尾環状ペプチドを製造するためにアリル化学を用いて報告された。Ｔｒｚｅｃｉａｋ及びＢａｎｎｗａｒｔｈ  （１９９２），  ３２  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ４５５７−４６６０。
【００３６】
ペプチド合成のためのポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト支持体と共に用いるアリル脱保護化学の利用
ポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト支持体の新規なファミリーが、最近、Ｂａｒａｎｙによって記載された。これらの支持体は、合成効率及び樹脂に結合したペプチド鎖において実施し得る反応の範囲を改良する。Ｂａｒａｎｙ等  （１９９３）  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９９２  中：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＣＯＮＤ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  （Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ及びＥｂｅｒｌｅ編）；  Ｂａｒａｎｙ  等  （１９９２），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中  −  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＬＦＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ６０３−６０４  （Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｅｒ  編）；  Ｚａｌｉｐｓｋｙ  等  （１９８５），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中  −  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＩＮＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ２５７−２６０  （Ｄｅｂｅｒ  等編）  。各ＰＥＧ−ＰＳ支持体は、２０〜７０重量パーセントのポリエチレングリコールを含む限定された再生可能な構造を有する。これらの支持体は、ペプチド鎖の段階的組立てに最適な溶媒の範囲においてかなり膨潤する。ＰＥＧ−ＰＳ支持体は、背圧の無視出来る回分流反応器又は連続流反応器において用いられてきた。
【００３７】
これらの支持体の範囲及び固相ペプチド合成におけるそれらの利点を拡大するために、ＰＥＧ−ＰＳ上でのアリル基の脱保護を探索した。配列Ｙ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ２  （式中、Ｘａａ＝Ａｌａ、Ｍｅｔ又はＴｒｐであり、Ｙ＝Ｆｍｏｃ又は水素である）を有する幾つかのモデルペプチドをＰＥＧ−ＰＳ上で及びメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で並行して、ペプチドの支持体への結合を媒介する５−（４−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノメチル−３，５−ジメトキシ−フェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ）ハンドル若しくはリンカーを用いて製造した。これらのモデルペプチドを用いて、Ｍｅｔの酸化及びＴｒｐのバックアルキル化の抑制と共に用いるアリル基の脱保護のための条件を試験した。
特定のペプチド合成を以下に示す：
【００３８】
材料  Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＡｌをそれぞれ以前に公表された手順に従って製造した。Ｌｙｔｔｌｅ及びＨｕｄｓｏｎ  （１９９２），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中  −  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＬＦＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ５８３−５８４  （Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｅｒ  編）；  Ｂｅｌｓｈａｗ等  （１９９０），  ２０  ＳＹＮ．  ＣＯＭＭ．  ３１５７−３１６０）  。Ｆｍｏｃ−アミノ酸及び他のすべてのペプチド合成試薬の残りは  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から得た。Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ及びＴｙｒの側鎖官能性部分の保護のためにｔＢｕを用い、Ｌｙｓ用にはｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を、Ａｒｇ用には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）を用いた。Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐの側鎖は保護しなかった。すべての溶媒は、ＨＰＬＣ等級若しくは同等の純度であり、更に精製することなく使用した。
【００３９】
ペプチド合成：  標準的鎖延長
連続流固相合成を、図１に示す型のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９０５０  Ｐｌｕｓ  （商標）ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて自動的に行なった。合成は、別の指示がない限り、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ支持体（０．２７ｍモル  Ｆｍｏｃ／ｇ樹脂）上で行なった。この支持体は公知の手順に従って製造した。Ｂａｒａｎｙ等  （１９９３）  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９９２  中：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＣＯＮＤ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  （Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ及びＥｂｅｒｌｅ編）  。ユニットポンプの流量は、５．０ｍＬ／分に設定した。保護したアミノ酸残基を次のプロトコールに従って樹脂に加えた：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２％  １，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］−ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）及び２％  ピペリジンを用いるＦｍｏｃ基脱保護を７分間行ない、その後、ＤＭＦ洗浄を１２分間行ない、続いて、アミノ酸のカップリングを３０分間行ない、その後、ＤＭＦ洗浄を更に８分間行なう。それから、各４当量のＦｍｏｃ−アミノ酸及びＨＯＢｔを十分なベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）と共に（終濃度０．３Ｍを与える）ＤＭＦ中の０．６Ｍ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）溶液に溶解して、延長中のペプチドの支持体に送達した。Ａｓｎ及びＧｌｎを、４当量のＨＯＢｔを含むＤＭＦ中のペンタフルオロフェニルエステルとして取り込んだ（０．３Ｍ溶液）。この方法を、種々の予備選択したＦｍｏｃ保護したアミノ酸を用いて、所望のペプチドが得られるまで繰り返した。
【００４０】
手作業でのアリル脱保護  ここでは、以前に  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏにより開発されその後別の者により改変された一般的アリル脱保護条件をある部分を一層洗練させて用いた。Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ等  （１９９１）、  ３３  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ４２０７−４２１０；  Ｂｉａｎｃａｌａｎａ  等  （１９９２），  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥＳ  ＩＮ  ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  中：  ＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ，  ＡＮＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  １３５−１５２  （Ｅｐｔｏｎ  編）  。アリル基の側鎖脱保護を、ポリエチレンディスク及びＡｒガス入口に適合する５ｍＬポリプロピレンシリンジ中で手作業で行なった。典型的研究において、樹脂に結合したペプチド（５０ｍｇペプチド樹脂、１５μモルのペプチド）を、ＤＭＳＯ：ＴＨＦ：０．５Ｎ  ＨＣｌ（２：２：１、２ｍＬ全量）中のＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  （５０ｍｇ、４３μモル）及びモルホリン（５０μＬ、０．５７ｍモル）で、Ａｒ下で２５℃で２時間処理した。この樹脂を１洗浄当り２分で３回連続して、それぞれ、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＣＨ２  Ｃｌ２  及びＣＨ２  Ｃｌ２  中の０．５％ＤＩＥＡにより洗浄した。その後、樹脂をＤＭＦ中の０．０２Ｍジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで１洗浄当り１５分で３回洗浄し、ＤＭＦで１洗浄当り２分で５回洗浄し、及びＣＨ２  Ｃｌ２  で１洗浄当り２分で３回洗浄した。この方法において、金属イオン及び他の副生物を除去した。次いで、樹脂を真空下で乾燥した。乾燥した樹脂を２つの試料に分離した。こうして得られたペプチド−樹脂試料を、最初にピペリジン−ＤＭＦで処理し次いで上記の標準手順で処理してＦｍｏｃ基を除去するか、又は支持体からの開裂の前にＤＭＦで洗浄した。
【００４１】
開裂条件  ペプチド−樹脂試料を、ＴＦＡ：アニソール：β−メルカプトエタノール（９５：３：２）の混合物（試薬Ｒと呼ぶ）で２時間処理した。濾液を集め及び樹脂を更にＴＦＡで洗った。冷エーテルを合わせた抽出物に加え、その溶液を−７０℃に冷却した。上清を除去した後、得られた沈殿を冷エーテルで数回洗い、酢酸中に溶解させて凍結乾燥した。
【００４２】
合成したペプチドの構造及び物理的分析：アミノ酸分析  ペプチド及びペプチド樹脂を塩酸ガス（ＨＣｌ）で加水分解した。Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ等  （１９８４），  ３３６  Ｊ．  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲ．  ９３−１０４。アミノ酸分析を  Ｗａｔｅｒｓ  Ｆｅｍｔｏｔａｇ（商標）化学キットを用いて行なった。
【００４３】
質量分析  レーザー脱着補助付きＷａｔｅｒｓプロトタイプマトリックス（ＬＤ−ＭＳ）飛行時間測定器にて質量スペクトルを記録した。
【００４４】
ＨＰＬＣ  ＨＰＬＣを、２つの６００  モデル溶媒送達システム、Ｗｉｓｐ  ７１２モデル自動注入器、４９０  モデルプログラム可能波長ＵＶ検出器若しくは９９４  モデルプログラム可能フォトダイオード配列検出器及びシステムの運転を制御しデータを集めるための８６０  ネットワークコンピューターの付いたＷａｔｅｒｓ装置にて行なった。ここで用いたＨＰＬＣ分析カラムは、Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８  （３．９×１５０ｍｍ、５μｍ）１００Åカラムであった。逆相分析用溶液Ａは、Ｈ２  Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、溶液Ｂは、ＣＨ３  ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであった。
【００４５】
上記の特定の条件及び装置は、ペプチド合成及び手作業でのアリル脱保護を実施するための多くの許容し得る方法の内の１つを代表しているということは理解されるべきである。従って、上記の手順を如何なる方法においても制限するものと見るべきではない。
【００４６】
上記のプロトコールによって得られたモデルのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラフィーは、アリル保護側鎖基の開裂がＰＥＧ−ＰＳ及びＰＳ支持体の両者において生じることを示した。しかしながら、ペプチドの純度は、図２に示すように、ＰＥＧ−ＰＳ支持体を用いたときには一層高かった。各モデルペプチドのＨＰＬＣクロマトグラム追跡において、溶液Ｂと溶液Ａとを用いる直線状勾配（初期比率１：９、最終比率７：３）を３０分にわたって流量１．０ｍＬ／分で送達した。すべてのペプチドは、ＬＤ−ＭＳにおいて予想された結果を与えた。ポリエチレングリコールの大量の取り込みのために、ＰＥＧ−ＰＳは膨潤した状態で存在する。この樹脂のポリエチレングリコールスペーサーは、反応性部位の完全な可溶化を与え、一層効率的なペプチド合成反応を生じた。
【００４７】
しかしながら、これらの用いた条件は又、多くの場合においてＮα−Ｆｍｏｃ基の望ましくない脱保護をも生じた。Ｎα−Ｆｍｏｃ基の脱保護は、モルホリンが塩基として作用し得るので驚くべきことではなかった。更に、これらの脱保護条件におけるＤＭＳＯの溶媒としての利用は、Ｍｅｔ含有ペプチドに適合性でないことが判明した。アリル脱保護は達成されたが、第２の生成物（Ｍｅｔ残基の酸化により生じたものと同定された）も又得られた。これらのアリル脱保護条件は、Ｔｒｐのバックアルキル化は認められなかったので、Ｔｒｐ含有ペプチドに適合性であり、以前に報告された発見が確証された。Ｌｙｔｔｌｅ及びＨｕｄｓｏｎ  （１９９２），ＰＥＰＴＩＤＥＳ中  −  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＬＦＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ５８３−５８４  （Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｅｒ  編）  。最後に、アリル脱保護の効率は、不活性大気中で実施する場合、他の者により報告されたものを超えて改良された。
【００４８】
アリル保護化学を自動化合成に適合させる際に遭遇する障害
公知の及び上記の技術による標準的アリル脱保護は、適当な溶媒中に懸濁させて不活性大気中に維持した固体パラジウム触媒を用いる。このアプローチは、回分及び連続流ペプチド合成機に適用する場合には、反応容器に不溶性パラジウム触媒を送達する際に遭遇する問題のために適当でない。例えば、パラジウム触媒から多量に生成する望ましくない固体副生物の完全な除去は、アリル脱保護工程の終了時に完全に除去されていなければならない。これらの問題の各々は、図１に示した型の装置におけるペプチド延長で用いるのと同じ反応カラム若しくは容器におけるアリル基の除去を可能にする自動化プロトコールの開発に対する難しい障害を提出した。合成プロトコールの任意の段階で実行し得る自動化可能な脱保護手順が必要とされた。
【００４９】
【実施例】
実施例１
自動化に完全に適合性のアリル脱保護条件の発見；その敏感な糖ペプチド及びスルホペプチド製造への利用
アリル基を除去するために自動化設定で用いる選択的脱保護条件は、他の保護基（例えば、Ｆｍｏｃ）に対する完全な直交性を維持し且つ不安定なアミノ酸（例えば、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ（ＳＯ３  Ｈ））を保存し、並びに自動化ペプチド合成機での実施に容易に適用し得る均質な反応条件を与えることが重要であった。本発明は、これらの特徴を満たす完全自動化可能なアリル脱保護戦略の開発のゴールを保証された研究の成功の頂点を具体化する。特に、パラジウム触媒が可溶性となり且つ望ましくないＦｍｏｃ脱保護を防ぐ条件が発見された。今述べた条件は、糖及びスルホペプチドの合成に完全に適合性である。これらの特定の条件及び装置の説明は、本発明の実施のための多くの許容し得る戦略の内の１つを代表するものである。従って、下記の説明は、何れにせよ、請求される発明の範囲を制限するものと見てはいけない。
【００５０】
連続流  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９０５０  Ｐｌｕｓ（商標）ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを図１に示すように変更して本発明のアリル脱保護計画を実施する新規な条件に合わせた。この発明による複合ペプチドの製造に適したソフトウェアの利用により自動化を更に容易にした。以下に一層完全に説明するように、本発明の合成プロトコールを、「頭−尾」環状ペプチド、分枝ペプチド及び複数抗原ペプチド（ＭＡＰ）の合成に適した生物関連アミノ酸及びそれらの誘導体中に存在する酸、塩基、グアニジノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル及びその他の官能基の自動化アリル基脱保護に適用した。本発明の自動化可能なアリル脱保護戦略の発見において頂点に達したこれらの研究を今一層完全に説明する。
【００５１】
アリル基の自動脱保護は、先ず、固体パラジウム触媒を反応カラムに運ぶ問題及び不溶性の触媒に由来する副生物を除去する問題が解決されることを必要とした。その場での自動アリル脱保護は、触媒が溶液中にあるならば、「固体状態」脱保護反応を回避して一層高い効率で進行することが予想された。その上更に、自動装置のカラム若しくは反応容器内の不溶性物質の存在は、引き続く工程において、背圧を生じることにより、溶媒の送達を有意に紛糾させることが予見出来た。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  により記載されたアリル脱保護工程で用いるための溶媒カクテルは、２相性であって均質ではなく、触媒は固体形態で懸濁されていた。Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ等  （１９９１），  ３３  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ４２０７−４２１０  。前述の節で説明したプロトコールに従ってＡｒを混合物に通して泡立てる手作業での脱保護において、反応は、溶液を効率的に攪拌したので固体状態の触媒の存在により悪影響を受けなかった。しかしながら、自動化連続流装置、例えば  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９０５０  Ｐｌｕｓ（商標）ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいては、樹脂上での脱保護溶液の等しい分散のために均質な溶液を有することは決定的に重要である。
【００５２】
２相溶液を避けるために、有機酸を、０．５Ｍ  ＨＣｌ水溶液と置き換えることが必要であった。０．５Ｍ  ＨＣｌ水溶液を置換するのに適した有機酸は、ＨＯＡｃであった。従って、５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  モルホリンを含むＤＭＳＯ：ＴＨＦ（１：１）の混合液を調製した。これは、配列Ｈ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＡｌ）−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ２  を有するモデルペプチド上のアリル基を手作業において脱保護した混和性溶液を与えた。このモデルペプチドを、一般に、上記のプロトコールに従って、手作業での脱保護工程に対する本発明の変法を用いて製造した。
【００５３】
この変法を用いて、やはりモデルペプチドの７位のＭｅｔ残基の酸化が認められた。それ故、ＤＭＳＯ：ＴＨＦ（１：１）混合物をＤＭＦと置き換えた。この更なる改変により、５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  モルホリンを含むＤＭＦを用いて、アリル脱保護が、Ｍｅｔ酸化を伴わずに生じた。あいにく、この触媒は、この混合物に不溶性のままであり、その自動化装置における利用を妨げた。
【００５４】
本発明の触媒、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  は、ＣＨＣｌ３  及びＣＨ２  Ｃｌ２  に可溶性であり、ベンゼンには中程度に可溶性である。以前の研究は、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  が５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  モルホリンを含むＣＨＣｌ３  溶液に完全に可溶性であることを示した。この結果は、ＣＨＣｌ３  が固相ペプチド合成及びＰＥＧ−ＰＳに適合性の溶媒であるので魅力的であった。更なる改変において、このモデルペプチドを、５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  モルホリンを含むＣＨＣｌ３  の溶液中でＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  で処理した。これらの条件は、アリル基の脱保護を達成したが、やはりＮα−Ｆｍｏｃ基に適合性ではなかった。
【００５５】
望ましくないＮα−Ｆｍｏｃ脱保護を排除するための引き続いての努力において、モルホリンをアリル脱保護溶液から除去した。５％  ＨＯＡｃを含むＣＨＣｌ３  の溶液中でのモデルペプチドのＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  での処理は、所望の非保護ペプチド及び特徴不明のペプチドを与えた。この結果は、モルホリンが受容体として優勢に作用することはなく、Ｎα−Ｆｍｏｃ基を脱保護する塩基として作用することを示唆した。
【００５６】
従って、アリル脱保護条件の最後の改変において、モルホリンを第３アミン、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）と置き換えた。５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  ＮＭＭを含むＣＨＣｌ３  の溶液中におけるモデルペプチドのＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  での処理は、非保護ペプチド及び付随的に保存されたＮα−Ｆｍｏｃ基を与えた。この上首尾の結果は、もし受容体がアリル脱保護が生じることを必要とするならば、触媒由来の汚染物質又は副生物が主な源であることを示唆した。
【００５７】
アリル脱保護を行なう条件の上記の改変及び洗練から、下記の及び代表例中に示した脱保護プロトコールが、本研究の上首尾の完全に自動化可能な頂点として浮かび上がった。本発明の好適な自動化可能なアリル脱保護プロトコールを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９０５０  Ｐｌｕｓ  （商標）ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおける自動化にも適した前記した直鎖状ペプチドの合成手順と統合し、それにより、完全に自動化したペプチド合成をアリル保護したアミノ酸誘導体を用いて行なった。
【００５８】
自動化のために用いる戦略は、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  を標準アミノ酸として扱い及び触媒をアミノ酸バイアル中に蓄積することであった。不活性大気を維持するために、このバイアルをＡｒでパージしてシールした。本発明の好適アリル脱保護溶液、例えば５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  ＮＭＭを含むＣＨＣｌ３  をシリンジ３内に展開させ、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  を含むアミノ酸バイアルに送達した。その結果生じた混合物を、次いで、少なくとも１つの泡立ちサイクルにかけて触媒が反応カラムへの送達前に完全に溶解（可溶化）することを確実にした。アリル脱保護溶液を、このカラムを通して約２時間再循環させた。アリル脱保護用のシリンジ３の使用は、シリンジ２に後続のペプチド鎖延長のための単一活性化化学に適した試薬を充填することを必要とした。環状ペプチドの製造（後述）のために、シリンジ２にはＤＩＥＡを充填し、及びホスホニウム若しくはウロニウム塩をペプチド延長及び環化工程の両方において活性化用に用いる。米国特許出願第０７／７６６，８９５号に記載されたホスホニウム及びウロニウム塩はこの目的のために適している。合成モジュールの右上隅（図１）に示した助剤（Ａｕｘ）ボトルは、背圧を誘発し得る副生物を除去するためのＤＭＦ中の０．５％  ＤＩＥＡ及び０．５％  ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム溶液を含んだ。この溶液を再循環の後に反応カラムに送達した。上記した手作業による脱保護プロトコールにおいて、樹脂をＣＨ２  Ｃｌ２  中の０．５％  ＤＩＥＡ及びＤＭＦ中の０．５％  ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの別々の溶液で洗った。これらの２つの溶液を本発明の自動化脱保護戦略において合わせたが、何ら悪影響は検出されなかった。最終的ＤＭＦ洗浄を、合成プロトコールを続ける前に用いた。以下に示す代表例は、本発明のアリル脱保護戦略を実施するための１つの特定のプロトコールを説明する。
【００５９】
代表例に示した自動脱保護プロトコールを用いた場合には、モデルペプチドの合成中に試薬が副生物を与えないことが認められた。更に、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  の異なる源及びロットが同様の結果を与え、求核性種がパラジウム触媒中の汚染物質から生じるのではなくパラジウム触媒自身に関係することを示した。
【００６０】
糖及びスルホペプチドは、特に困難な合成研究を与える。Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  等  （１９９３），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  １９９２中：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＮＴＹ−ＳＥＣＯＮＤ  ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ，  （Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  及びＥｂｅｒｌｅ編）  。従って、これらの困難なペプチド合成に対する本発明の自動アリル脱保護戦略の応用可能性に強い興味がある。
【００６１】
硫酸化チロシンペプチドの合成のために、アリル基の除去は、穏やかな開裂条件を必要とする。敏感な硫黄−酸素結合は、公知の脱保護法によるプロトン源としての０．５Ｍ  ＨＣｌの使用に対して不安定であることが判明した。一般的に上記した合成プロトコールにおいて、及び穏やかな開裂条件を必要とするペプチドアミドリンカー｛［５−［（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノキサンテン−２−オキシ）吉草酸（ＸＡＬと呼ぶ）｝と共に用いる、本発明の５％  ＨＯＡｃ及び２．５％  ＮＭＭを含むＣＨＣｌ３  溶液中でのＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  触媒による脱保護の条件は、硫酸化ペプチドの合成のための方法を与えた。糖及びスルホペプチドの合成については、Ｂｏｔｅｍｓ等  （１９９２），  ＰＥＰＴＩＤＥＳ  中  −  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＴＷＥＬＦＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ６０１−６０２  （Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｉｅｒ編）；印刷中の  ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＦＩＲＳＴ  ＣＨＩＮＥＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  （Ｙｕ−ｃａｎｇ編）  中の  Ｈａｎ等  （１９９３）  をも参照されたい。
【００６２】
実施例２
環状ペプチドの合成における本発明の自動アリル脱保護戦略の利用
本発明の自動アリル脱保護条件の有効性を更に示すために、本発明のアリル戦略を環状ペプチドの自動合成に適用した。Ｒｏｖｅｒｏは、最近、タキキニンアゴニストペプチド  ＭＥＮ  １０３５５、シクロ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ）の合成を公表した。Ｒｏｖｅｒｏ  （１９９１），  ３２  ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．  ２６３９−２６４２  。これを、モデル頭−尾環状ペプチドとして選択した。この環状ヘプタペプチドの合成のために選択したアプローチは、上で概説した自動アリル脱保護戦略に基づくものであり、図３に図式表示してある。
【００６３】
モデル環状ペプチドの直鎖合成を、一般的に上述した手順に従って統合したＦｍｏｃ／ｔＢｕ保護戦略をＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＰＡＣ−ＰＥＧ−ＰＳ）−ＯＡｌ開始樹脂と共に用いて行なった。ＰＡＣとは、ＰＥＧ−ＰＳ支持体へペプチドを結合するために用いるｐ−アルコキシベンジルアルコールハンドルのことを言う。このモデルのタキキニンアンタゴニストペプチドを合成するために、Ｎα−Ｆｍｏｃ、Ｃα−アリル保護したＡｓｐ誘導体をＰＡＣハンドルに側鎖カルボキシ機能を介して結合した。直鎖合成の終了時に、Ｃα−アリル保護基の脱保護を５％ＨＯＡＣ及び２．５％ＮＭＭを含むＣＨＣｌ３  中のＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  の好適溶液を用いて達成した。
そこでの自動環化を下記のプロトコールに従って行なった：
【００６４】
自動環化  このプロトコールは、Ｆｅｌｉｘ  等の自動化設定におけるアリル脱保護したペプチドで用いるための樹脂結合した環化のための最初の方法の改変である。Ｆｅｌｉｘ  等  （１９８８），  ３２  ＩＮＴ．  Ｊ．  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＥＳ．  ２３１−２３８。最後のアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ脱保護の後に、ＨＯＢｔ及びＰｙＢＯＰ（パラジウム触媒に対応するアミノ酸バイアルの次に位置させたアミノ酸バイアル中に貯蔵。図１参照。）の４つの同等物をＤＭＦ中の０．６Ｍ  ＤＩＥＡ溶液中に終濃度０．３Ｍに溶解させ、シリンジ２から送達した。その結果生じた溶液を、アリル脱保護した、支持体結合したペプチドに送達した。環化を、ニンヒドリン陰性になるまで進行させ、その後、ＤＭＦ洗浄（１５秒、３ｍＬ／分）及びＣＨ２  Ｃｌ２  洗浄（６分、３ｍＬ／分）を行なった。
【００６５】
Ｎα−Ｆｍｏｃの除去、ＰｙＢＯＰ−ＨＯＢｔ−ＤＩＥＡ媒介の環化、及びｔＢｕ側鎖保護基の除去の後に、環状ペプチドをここに提供する開裂プロトコールに従って支持体から解離させた。こうして得られた環状ペプチドの純度は、手作業で環化を行なって得られるものと同じであった。この自動化手順によって製造したモデルの頭−尾環状ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラフィー追跡を図４に示す。この追跡は、溶液Ｂと溶液Ａとの相対比率を１：３〜１１：９に調節した直線状勾配（流量１．０ｍＬ／分で３０分間送達）にさらすことにより支持体から開裂した直後の粗脱保護環状ペプチドのものである。粗環状ペプチドのＬＤ−ＭＳ分析は、マスイクイバレント１０９２．３ダルトンを与えた。
【００６６】
実施例３
分枝ペプチドの合成における本発明の自動アリル脱保護戦略の利用
本発明の自動アリル脱保護戦略は又、図５に示す型の分枝ペプチドの合成にも適用可能である。この発明のこの面を説明するために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂を調製した。プロトロンビンの直鎖合成を、一般に前述のプロトコールに従って、従来のペプチド延長のための統合したＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を用いて行なった。次に、ＬｙｓのＡｌｏｃ基の側鎖脱保護を、５％ＨＯＡｃ及び２．５％ＮＭＭを含むＣＨＣｌ３  の好適溶液中でＰｄ（ＰＰｈ３  ）４  を用いて達成した。続いて、Ｌｅｕ−エンケファリンの直鎖合成を、リジンの側鎖のエプシロンアミノ基（Ｎε）からの鎖延長によって行なった。所望の（側鎖）部位からの延長を確実にするために、プロトロンビンの最後のアミノ酸（９位のＡｌａ）を、Ｌｅｕ−エンケファリン合成の間、Ｎα−Ｂｏｃ保護した。
【００６７】
こうして、分枝ペプチドを、本発明に従って、下記のプロトコールをここに述べる自動アリル脱保護及びペプチド合成技術と統合することによって合成することが出来る：
【００６８】
分枝ペプチドの合成  第１の分枝の最後のアミノ酸を、最初の鎖の更なる延長を防ぐためにＦｍｏｃ基ではなくＢｏｃでＮα保護した。Ｂｏｃ−アミノ酸の樹脂結合したペプチドへの結合の後に、アリル側鎖保護基を、ここに開示する自動アリル脱保護条件を用いて除去した。続く第２分枝ポリペプチドのすべてのカップリングを上記の直鎖合成プロトコールに従って行なった（但し、第２分枝の第１のアミノ酸を４５分間にわたって結合させた）。
【００６９】
その結果生成した典型的な分枝ペプチドを一般的にここに開示する開裂プロトコールによって樹脂から分離した。ｔＢｕ側鎖保護基及びＮα−Ｂｏｃ基の除去は、所望の分枝ペプチドＣα−（プロトロンビン）−Ｎε−（Ｌｅｕ−エンケファリン）−Ｌｙｓ−ＮＨ２  を与えた。粗形態で得られ且つ樹脂からの分離後直ちに分析したこの生成物のＨＰＬＣクロマトグラム追跡を、図６に示す。この追跡は、粗分枝ペプチドを、溶液Ｂと溶液Ａとの相対比率を１：９〜９：１に調節した直線状勾配（流量１．０ｍＬ／分で３０分間）にさらすことによって生成した。この粗分枝ペプチドのＬＤ−ＭＳ分析は、マスイクイバレント（ＭＨ＋  ）１６７１．３ダルトンを与えた。
【００７０】
実施例４
複数抗原ペプチドの合成における本発明の自動アリル脱保護戦略の利用
上記の分枝ペプチドの合成の成功及び容易さは、本発明の戦略が、ＭＡＰとして知られる複数抗原ペプチドの合成によく適していることを例証した。Ｔａｍ  （１９８８），  ８５  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．  ＵＳＡ  ５４０９−５４１３；  Ｔａｍ    等  （１９９０），  １７１  Ｊ．  ＥＸＰ．  ＭＥＤ．  ２９９−３０６）。ウシ血清アルブミン、チログロブリン又はカサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｎｍｐｅｔ  ）のヘモシアニン等の蛋白質キャリアーを用いずに、ＭＡＰを用いてペプチド免疫原を生成する。その代りに、小さい分枝したリジンコアマトリックスを用いて複数コピーに対するペプチド抗原を増幅した。
【００７１】
１コピーを含むＭＡＰの調製のために、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、ここに記載した手順によって、それぞれＢｏｃ及びＦｍｏｃ化学用に用いることが出来る。２つのエピトープを含むＭＡＰを得るための現在の戦略は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを必要とするので、Ｂｏｃ化学が必要である。
【００７２】
本発明の戦略を用いて、２つのエピトープを含むＭＡＰの調製を、図７に示す一般的型のコアマトリックスを使用して、Ｆｍｏｃ化学を用いて達成し且つ自動化することが出来る。本発明のアリル脱保護戦略のこの応用を説明するために、［Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）］４  −β−Ａｌａ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳコア樹脂を調製した。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ保護を用いるプロトロンビンの直鎖合成を前節で記載したように行ない、その後、ＬｙｓのＡｌｏｃ基の側鎖脱保護及びリジンのＮε基からのＬｅｕ−エンケファリンの直鎖延長を行なった。これらの手順は、所望の２エピトープＭＡＰを与えた。
【００７３】
代表例
本発明の好適な自動アリル脱保護戦略を、下記のプロトコールに従って行なった（該プロトコールは、前記の自動化可能なペプチド合成手順と共に用いた）：
【００７４】
自動脱保護  ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを、アリル脱保護用に、図１に示すように構成した。典型的合成において、Ｐｄ（ＰＰｈ３  ）４  触媒（１２５ｇ、１０８μモル）をＡｒ下でシールしたアミノ酸バイアル中に蓄積した。この触媒を含むバイアルを、配列の最後のアミノ酸の次のアミノ酸モジュール内に位置させた。この触媒をシリンジ３（図１中の合成モジュールの左下に描いてある）中に溶解させて、ＣＨＣｌ３  中の５％ＨＯＡｃ及び２．５％Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）溶液で０．１４Ｍの濃度にした。２０回の泡立てサイクルを用いて触媒を完全に溶解させた。その結果生じたアリル脱保護溶液をペプチド樹脂（５００ｍｇ、０．３ｍモル／ｇ）に送達して２時間にわたってカラムを通して再循環させた。次いで、カラムをＤＭＦ中の０．５％ＤＩＥＡ及び０．５％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム溶液（Ａｕｘ  ボトルから送達。１０分間、６ｍＬ／分）及びＤＭＦ（１０分間、６ｍＬ／分）で洗浄して合成の次のサイクルのための支持体を調製した。
【００７５】
この代表的プロトコールの関係パラメーターは、次にまとめた通りである：
【表１】
0003600268.tif 000003
【００７６】
同等物
当業者は、常例的実験法を用いて、ここに記載した発明の特定の実施態様の多くの同等物を認め、或は、突きとめることが出来るであろう。それら及び他のかかる同等物は、前記の特許請求の範囲に含まれるものである。
【００７７】
0003600268.tif 000004
0003600268.tif 000005
【００７８】
0003600268.tif 000006
0003600268.tif 000007
【００７９】
0003600268.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による自動アリル脱保護用に構成した自動ペプチド合成機の流れ図である。
【図２】ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）支持体上での手作業によるアリル脱保護とポリスチレン（ＰＳ）支持体上での手作業によるアリル脱保護とを比較する高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のクロマトグラム追跡を示す図である。
【図３】タキキニンアンタゴニストペプチドのレトロ合成分析を示す図である。
【図４】ＰＥＧ−ＰＳ支持体から開裂した直後の粗モデル環状ペプチド（挿入図）のＨＰＬＣクロマトグラム追跡を示す図である。
【図５】分枝ペプチドの製造のための一般的戦略を示す図である。
【図６】支持体から開裂した直後の粗分枝ペプチド（挿入図）のＨＰＬＣクロマトグラム追跡を示す図である。
【図７】２エピトープＭＡＰの生成に適した複数抗原ペプチド（ＭＡＰ）コアを結合して有するＰＥＧ−ＰＳ樹脂を描いた図である。
【図１】
0003600268.tif 000009
【図２】
0003600268.tif 000010
【図３】
0003600268.tif 000011
【図４】
0003600268.tif 000012
【図５】
0003600268.tif 000013
【図６】
0003600268.tif 000014
【図７】
0003600268.tif 000015