(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞及び／又は培養組織を環状多糖類を含む組織培養培地中で組織培養し、得られる組織培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項２】
タキサン型ジテルペンが、タキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、７−エピバッカチンＩＩＩ、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、タキサン１ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、及びキシロシルタキソールよりなる群から選ばれる少なくとも１種類以上であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項３】
環状多糖類がα−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項４】
環状多糖類がβ−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項５】
環状多糖類がγ−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項６】
環状多糖類がサイクロフラクタンであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項７】
タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチイ属植物であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項８】
組織培養培地中の環状多糖類の濃度が０．０１〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項９】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
0003549594.tif 000020
［式中、Ｒ０は次式：
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ, Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１a、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６アルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６ａは、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ６ｂは、水酸基又は−Ｏ−グルコピラノシル基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項１０】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（II） :
【化２】
0003549594.tif 000021
［式中、Ｒ０は次式：
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ,Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１a、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項１１】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び／又は細胞を下記の一般式（III) ：
【化３】
0003549594.tif 000022
［式中、Ｒ０は次式：
-（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ, Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又はグルコピラノシル基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１a、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型ジテルペンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール（Ｔａｘｏｌ）は、イチイ科イチイ属植物であるタイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ）より単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関連する複雑なエステルグループを有している。タキソールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。現在、タキソールの製造は天然のまたは栽培された植物体中から採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキソールまたはタキソールの前駆物質であるバッカチンＩＩＩ等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養を利用して行なうことができれば、樹木を伐採する事なく、大量のタキソールを容易に得ることができるので有利である。
【０００３】
これまでの植物の培養細胞を利用したタキソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ）培養細胞によるタキソール生産が米国で特許〔ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ：５０１９５０４〕になっており、そして、そのタキソール生産量は１〜３ｍｇ／ｌと記載されているが、工業的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソールの生産性は不安定であり、選抜で一次的には生産性の高い細胞が得られるが、継代培養してその含量を維持することは難しい〔Ｅ．Ｒ．Ｍ．Ｗｉｃｋｒｅｍｅｓｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９９２）〕。
【０００４】
一方、タキソール生産法の先行技術としては、タキソール生合成前駆体であるバッカチンＩＩＩ（ｂａｃｃａｔｉｎ  ＩＩＩ）  からの半合成法がＨｏｌｔｏｎらの米国特許に開示されている〔ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ：５０１５７４４〕。植物の組織培養法を用いれば、半合成原料の生産も可能であり、さらにタキソール生産に有利である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物組織培養により、タキサン型ジテルペンの簡便な製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
タキサン型ジテルペンは、水に対して難溶性であり、また、水溶液中の安定性も低い。タキサン型ジテルペンの水に対する溶解性を向上させるとともに、安定化させることができれば生産性を向上させることが可能と考えられる。
本発明者らは、鋭意研究の結果、タキサン型ジテルペン産生植物の培養細胞又は培養組織の組織培養培地中に環状多糖類を添加して組織培養を行なうと、培養物中のタキサン型ジテルペン生産性が向上することを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明はタキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞又は培養組織を環状多糖類を含む組織培養培地中で組織培養し、得られる組織培養物よりタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はなく、例えばタキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、７−エピバッカチンＩＩＩ、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、タキサギフィン及びその類縁体、タキサン１ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール等が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法において組織培養に用いられるタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、例えばセイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ  ＬＩＮＮ）、イチイ（Ｔ．  ｃｕｓｐｉｄａｔａ  ＳＩＥＢ．ｅｔ  ＺＵＣＣ）、キャラボク（Ｔ．  ｃｕｓｐｉｄａｔａ  ＳＩＥＢ．ｅｔ  ＺＵＣＣ  ｖａｒ．  ｎａｎａ  ＲＥＨＤＥＲ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔ．  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ）、カナダイチイ（Ｔ．  ｃａｎａｄｉｅｎｓｉｓ  ＭＡＲＳＨ）、中国イチイ（Ｔ．  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｔ．  ｍｅｄｉａ等のイチイ属植物をあげることができる。
【００１０】
前記植物の組織培養は、本発明により環状多糖類を添加する以外は、従来から知られている方法によって行なうことができる。
【００１１】
本発明で使用される環状多糖類としては、サイクロデキストリン、サイクロフラクタン、それらの誘導体を例示することができる。
環状多糖類は、環状構造のため内部には空洞があり、空洞開口部と外側は親水性、環の内側は水になじみにくい性質を示し、この空洞内に油性物質などを取り込む包接作用がある。この性質を利用して、水に難溶性の物質を水溶性に変えたり、不安定物質の安定化、香料などの揮発性物質の保持、特異臭の抑制など多くの用途があり、商業的にはフリーズドライ紅茶、ハム・ソーセージなどの特異臭抑制などの食品向けとして使われている。
サイクロデキストリンは、グルコースが６個から８個ドーナツ状に結合した物質で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓなどの特殊な微生物が生産するサイクロデキストリン合成酵素の作用により、デンプンから合成される。また、サイクロフラクタンは、フルクトースが６個から８個ドーナツ状に結合した物質で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓなどの特殊な微生物が生産するサイクロフラクタン合成酵素の作用により、イヌリンから合成される。
本発明の対象となるサイクロデキストリン又はその誘導体としては、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリン、或いはそれらの分枝サイクロデキストリン、部分メチル化サイクロデキストリンなどいずれも利用可能である。分枝サイクロデキストリンとしては、例えばグリコシル−α−サイクロデキストリン、マルトシル−α−サイクロデキストリン、マルトトリオシル−α−サイクロデキストリン、グリコシル−β−サイクロデキストリン、グリコシル−γ−サイクロデキストリン、ガラクトシル−α−サイクロデキストリン等、環に糖が分枝上に結合した化合物が挙げられる。また、サイクロフラクタン又はその誘導体としては、果糖が６〜８個、β２−１フラクシド結合した化合物、それらの分枝サイクロフラクタン、部分メチル化サイクロフラクタン等のいずれも利用可能である。
【００１２】
上記環状多糖類は、培地における濃度が０．０１〜５０ｍＭとすることが好ましく、この中でも特に０．１〜３０ｍＭの範囲に調製することが本発明の方法にとって更に好ましい。
【００１３】
従来、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培養において培地添加物として環状多糖類を存在させて組織培養をおこなった例は報告されておらず、しかもそれによりタキサン型ジテルペンの培地への漏出が促進され、かつ産生量が増大することは予想外のことであった。
【００１４】
本発明の組織培養に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ（１９６２年）〔Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（１９６５年）〔Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  Ｓｋｏｏｇ〕の培地、ウッディー・プラント・メディウム（１９８１年）  〔Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〕の培地、ガンボルグ〔Ｇａｍｂｏｒｇ〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等が挙げられる。
これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。
【００１５】
炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。
【００１６】
無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００１７】
植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。
【００１８】
ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。
【００１９】
アミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
一般に前記の各成分は、無機成分が約０．１μＭ、ないし１００ｍＭ、炭素源が約１〜約３０ｇ／ｌ、植物ホルモン類が約０．０１〜約１０μＭ、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００２０】
尚、本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常０．１〜１％含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。
本発明の組織培養においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。
また、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ或いはＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを植物組織に感染することによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根にも使用できる。
【００２１】
これらの組織または細胞を本発明により環状多糖類を添加した培地を用いて組織培養すると、無添加の場合と比較してタキサン型ジテルペンの高生産性培養組織又は培養細胞が得られる。
【００２２】
本発明の効果を高める方法として、特願平６−３６１５６、６−１０４２１１、６−１０４２１２、６−１０４２１３号明細書にタキサン系化合物の生産促進物質として開示されている、ジャスモン酸及びその誘導体の存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ジャスモン酸類としては、例えば、一般式（Ｉ）：
【００２３】
【化４】
0003549594.tif 000002
【００２４】
［式中、Ｒ０は次式：
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７  
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ，  Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６ａは、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ６ｂは、水酸基又は−Ｏ−炭水化物残基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物、または一般式（ＩＩ）：
【００２５】
【化５】
0003549594.tif 000003
【００２６】
［式中、Ｒ０は次式：
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７  
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ，  Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物、又は一般式  （ＩＩＩ）：
【００２７】
【化６】
0003549594.tif 000004
【００２８】
［式中、Ｒ０は次式：
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｒ７  
｛式中、Ｒ７は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４を表す。）、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ，  Ｒ８ｂは、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ９（ここで、Ｒ９は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜７の整数を表す。｝で示される基を表し；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物等が挙げられる。
【００２９】
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ０、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６ａ、Ｒ７、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、又はＲ９で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び  （ＩＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ又はＲ１ｆで表される炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ７がＯＭである場合において、Ｍで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。
Ｒ７がＮＲ８ａＲ８ｂである場合において、Ｒ８ａ，  Ｒ８ｂで表される炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基等が挙げられる。
【００３１】
Ｒ７がＮＲ８ａＲ８ｂである場合において、Ｒ８ａ，  Ｒ８ｂで表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。Ｒ７がＯＲ９である場合において、Ｒ９で表される炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ６ｂが−Ｏ−炭水化物残基である場合における炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。
【００３２】
前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は  （ＩＩＩ）で示される化合物の好ましいものとしては、Ｒ０が−（ＣＨ２）ｎ  ＣＯＯＨ又は−（ＣＨ２）ｎ  ＣＯＯＣＨ３  であり、Ｒ０、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６ａ、Ｒ６が、それぞれ水素原子を表すか、或いはＣ１とＣ２、Ｃ３とＣ４、又はＣ３とＣ４の間で二重結合を含んでいる化合物が挙げられる。
【００３３】
前記一般式（Ｉ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ａ）
【００３４】
【化７】
0003549594.tif 000005
【００３５】
（化合物Ｂ）
【００３６】
【化８】
0003549594.tif 000006
【００３７】
（化合物Ｃ）
【００３８】
【化９】
0003549594.tif 000007
【００３９】
（化合物Ｄ）
【００４０】
【化１０】
0003549594.tif 000008
【００４１】
前記一般式  （ＩＩ）  で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｅ）
【００４２】
【化１１】
0003549594.tif 000009
【００４３】
（化合物Ｆ）
【００４４】
【化１２】
0003549594.tif 000010
【００４５】
（化合物Ｇ）
【００４６】
【化１３】
0003549594.tif 000011
【００４７】
（化合物Ｈ）
【００４８】
【化１４】
0003549594.tif 000012
【００４９】
前記一般式（ＩＩＩ）で示されるジャスモン酸類の好ましい具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｉ）
Ｒ０：−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ又は−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＣＨ３
（ｎ＝１〜３）
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６：Ｈ
Ｃ３−Ｃ４間：二重結合
（化合物Ｊ）
Ｒ０：−ＣＨ２ＣＯＯＨ
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６：Ｈ
また、前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物は、５員環が、更に水酸基で置換されていてもよく、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。
【００５０】
５員環が、更に水酸基で置換された化合物、又は隣接する環員炭素原子間で二重結合が形成された化合物の具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｋ）
【００５１】
【化１５】
0003549594.tif 000013
【００５２】
（化合物Ｌ）
【００５３】
【化１６】
0003549594.tif 000014
【００５４】
（化合物Ｍ）
【００５５】
【化１７】
0003549594.tif 000015
【００５６】
（化合物Ｎ）
【００５７】
【化１８】
0003549594.tif 000016
【００５８】
前記ジャスモン酸類には種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。
以上のジャスモン酸類は、全てタキサン型ジテルペンの生産性向上に効果を有するが、中でも前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）  においてＲ０が−ＣＨ２ＣＯＯＨ又は−ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３であり、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６ａが水素原子であり、Ｃ３とＣ４の間で二重結合を形成している化合物であるジャスモン酸又はジャスモン酸メチル、ツベロン酸又はツベロン酸メチル、及びククルビン酸又はククルビン酸メチルが生産性向上に対する効果の大きさの点から特に好ましい。
【００５９】
これらジャスモン酸類は、合成により、又は植物からの抽出等により調製される（Ｈ．  Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４４，  ２８５７−２８６４（１９８０）  ）。一方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様物質として、種々の植物が自ら生産することが、吉原照彦著、植物細胞工学第２巻第４号５２３〜５３１頁（１９９０年）に記載されている。
【００６０】
従って、前記ジャスモン酸類は、培養系外から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法としては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物或いは植物抽出物などの培地への添加を例示することができ、具体的にはＭ．Ｊ．Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（１６），  ７４９０−７４９４  （１９９３）  に記載の、カビ細胞壁画分を添加する方法を例示することができる。更に、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えることによっても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めることが可能であり、具体的には、Ｒ．Ａ．Ｃｌｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１１），  ４９３８−４９４１  （１９８９）  に記載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例示することができる。
【００６１】
ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のため、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アルカリで中和して塩にして用いてもよい。
ジャスモン酸類は、５員環カルボニル基のα位が、酸、アルカリ、熱によってエピマー化を起こすため、不安定なシス型より安定なトランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン酸を用いた平衡実験では、トランス型が９０％、シス型が１０％の状態で存在する。一般にはシス型の方が活性が強いとされているが、本発明で使用することができるジャスモン酸類は、前記式（Ｉ）（ＩＩ）（ＩＩＩ）で示される全ての立体異性体化合物及びその混合物を包含する。
【００６２】
ジャスモン酸類は、培地における濃度が０．０１〜１０００μＭとすることが必要であり、この中でも特にジャスモン酸類の濃度を０．１〜５００μＭの範囲に調整することが好ましい。
ジャスモン酸類は、培養細胞の増殖期ないし定常期に添加することが効果的であり、この中でも特に増殖期から定常期に移行する時期にジャスモン酸類を添加することが好ましい。また、内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の時期についてもこれと同様である。例えば、２１日おきに細胞を移植している場合には７〜１６日目がジャスモン酸類の添加又は内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の適期にあたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャスモン酸類の生産量を高める処理は、一度に行ってもよいし、複数回に分けて行ってもよい。
【００６３】
また本発明は、特願平６−１４６８２６号明細書に開示されている、培養器内の気相中の酸素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培養する方法とも併用することができる。
【００６４】
ここで、培養初期とは、培養開始時ないし培養開始後７日目をいい、培養器内の気相中の酸素濃度、又は組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好ましい。また、制御の期間としては、培養全期間を通して該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間のみを制御してもよく、特に限定するものではないが、全培養期間中の、少なくとも３日間制御することが好ましい。
【００６５】
培養器内の気相中の酸素濃度は、４ないし１５％に制御することが必要であり、特に６ないし１２％に制御することが好ましい。また、流動性の培地中の溶存酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の１ないし７５％に制御することが必要であり、特に１０ないし７５％に制御することが好ましい。
【００６６】
また、本発明は、特願平５−２８４８９３号、同６−１０４２１３号明細書に開示されている、細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも１つの層に含まれる細胞を培養する方法と併用することもできる。
細胞を比重によって分離する方法としては、一般に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重層した後、遠心分離する方法が知られている。
【００６７】
遠心分離用媒体としては、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ  （共にＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）、ショ糖、塩化セシウム等が用いられる。
密度勾配を形成する層の数に特に制限はない。各層の比重差は、特に限定されるものではなく、また各比重差は同じであっても異なっていてもよい。
従って、この密度勾配の定義には勾配が連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数が無限大、各層の比重差が０に近い状態）も含む。
【００６８】
このようにして密度勾配を形成し、細胞を重層、遠心分離することにより細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。
作成する層の比重は、通常１．００〜１．２０ｇ／ｍｌ、好ましくは１．０３〜１．１１ｇ／ｍｌの範囲である。培養の対象となる層としては、少なくとも１つの層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよい。
【００６９】
複数の層を選択して培養する場合、これらの複数の層は、それぞれ個別に培養することもできるが、選択した複数の層のうちの２層以上の層を混合して培養することもできる。
タキサン型ジテルペン産生能の高い培養細胞は、通常、比重が１．０７以下の層に含まれる細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。また、単に比重の違いによって分画しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジテルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、より確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得するためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産生細胞を含む層を選択することが望ましい。
【００７０】
また、例えば１．０７ｇ／ｍｌのように、ある１つの特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠心分離することによっても、培養細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。
【００７１】
また、本発明は、特願平６−２０１１５０号明細書に記載されている、重金属を含む化合物類、重金属イオンを含む錯イオン類、及び重金属イオンから選ばれた少なくとも一つの存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ここで、重金属としては、銀に代表される銅族、コバルトに代表的される鉄族を使用することが好ましく、当該重金属を含む化合物、当該重金属を含む錯イオン類、又は当該金属イオンの形で使用することが好ましい。
また、本発明は、特願平６−２０１１５１号明細書に記載されている、アミン類の存在下に培養する方法との併用が挙げられる。
ここでアミン類としては、ポリアミン類、具体的にはプトレッシン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−  プロパンジアミン、ジエチレントリアミン、及びこれらの化合物の塩より成る群から選ばれる少なくとも一種以上を使用することが好ましい。
【００７２】
また、本発明にかかる方法と、上述の先願特許に記載の方法のいくつか又はすべてを組み合わせることも可能である。
【００７３】
以上のようにして得られた培養組織又は培養細胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。
本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。
【００７４】
先ずイチイ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。
【００７５】
この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを構成する細胞は、環状多糖類を含有する固体培地又は液体培地で培養される。環状多糖類は、培養初期から培地に添加しても良いし、培養途中に培地に添加しても良く、添加時期については特に限定しない。
【００７６】
本発明の組織培養における培養温度としては、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、１４〜４２日間が好適である。
【００７７】
本発明の培養方法において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーションまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞および／または培地から目的とするタキサン型ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
【００７８】
【実施例】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
〔実施例１〕
ナフタレン酢酸を１０−５Ｍの濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液または７０％エタノール溶液等で滅菌処理したセイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ  ＬＩＮＮ）の茎の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してセイヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス０．１ｇ（新鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディー・プラント・メディウム１ｍｌ入りのφ１８ｍｍウェルに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１２０ｒｐｍ）し、２８日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。
【００８０】
このようにして得られた培養細胞１ｇ（新鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加した液体ウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移して２５℃で１４日間振盪培養した。培養１４日目にβ−サイクロデキストリンの終濃度が０．０１ｍＭになるように添加し、さらに７日間培養した。
【００８１】
培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカチンＩＩＩと比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表１に示す。
【００８２】
〔比較例１〕
実施例１において、β−サイクロデキストリンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８３】
〔実施例２〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が０．１ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８４】
〔実施例３〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が１ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８５】
〔実施例４〕
実施例１において、添加したβ−サイクロデキストリンの終濃度が１０ｍＭである以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８６】
〔実施例５〕
実施例１において、β−サイクロデキストリンの代わりに６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−サイクロデキストリンをその終濃度が５０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８７】
〔実施例６〜１０〕
実施例１〜５において、さらにジャスモン酸メチルエステルをその終濃度が１００μＭになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００８８】
〔比較例２〕
比較例１において、さらにジャスモン酸メチルエステルをその終濃度が１００μＭになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００８９】
〔実施例１１〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにα−サイクロデキストリンをその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９０】
〔実施例１２〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにγ−サイクロデキストリンをその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９１】
〔実施例１３〕
実施例９において、β−サイクロデキストリンのかわりにサイクロフラクタン（フルクトース７個が結合した化合物）をその終濃度が１０ｍＭとなるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００９２】
【表１】
0003549594.tif 000017
【００９３】
【表２】
0003549594.tif 000018
【００９４】
【表３】
0003549594.tif 000019
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、環状多糖類を含む組織培養培地を用いたタキサン型ジテルペン産生植物の組織培養によって、大量のタキサン型ジテルペンを簡便に得ることが可能になった。