【手続補正書】
【提出日】平成29年10月27日(2017.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を含む、てんかんを有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を含む、発作の危険があるまたは発作を有する個体の発作の発症もしくは発生の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、発作の発症を特徴とする脳関連障害を有するものとする、前記医薬組成物。
【請求項３】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる薬剤の治療上有効量を含む、てんかんを発症する危険がある個体のてんかんの発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っているものとする、前記医薬組成物。
【請求項４】
前記個体が、Ｄｒａｖｅｔ症候群を有する疑いがあるまたはＤｒａｖｅｔ症候群と診断されている、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が、くも膜下腔内または鼻腔内投与される、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が、前記個体の中枢神経系に投与される、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物が、海馬または皮質に投与される、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記薬剤が、ｍｉＲ−１２８である、またはｍｉＲ−１２８と９０％以上の配列同一性を有する薬剤である、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる前記薬剤が、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８模倣物、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１２８が、ヌクレオチド配列：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵを有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性を増加させることができる前記薬剤が、脳由来神経栄養因子である、請求項１、２または３に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
発作の発症を特徴とする前記脳関連障害が、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記脳損傷が脳卒中によって引き起こされる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、ｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる薬剤を含む、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
ｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる前記薬剤が、化学的に安定化されたｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８模倣物、ｍｉＲ−１２８をコードする核酸およびｍｉＲ−１２８をコードするウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｍｉＲ−１２８が、ヌクレオチド配列：ＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＣＣＧＧＵＣＵＣＵＵＵを有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
発作の危険がある個体の発作の可能性の減少において、またはてんかんを誘発しそうな脳損傷を有する個体における抗てんかん発生薬として使用するためのｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させることができる薬剤であって、前記個体の脳に送達される薬剤。
【請求項１８】
ｍｉＲ−１２８発現細胞を候補化合物と接触させることと、前記細胞によって発現されている前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルを測定することとを含む、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法であって、ここで、前記候補化合物と接触していない細胞中のｍｉＲ−１２８の発現および／または活性の基準レベルに対する前記ｍｉＲ−１２８の発現および／または活性のレベルの増加が、前記候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示すものとする、前記方法。
【請求項１９】
発作を特徴とする前記病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
長さが６〜３０ヌクレオチドの間のオリゴマーを含む薬剤を投与することを含む、哺乳動物細胞中のｍｉＲ−１２８の発現または活性を増加させる方法であって、ここで、前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８の配列中に存在する少なくとも６個の隣接ヌクレオチドと同一である隣接ヌクレオチド配列を含むものとする、前記方法。
【請求項２１】
インビトロで行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インビボで行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域のヌクレオチド配列と同一である隣接ヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴマーが、ｍｉＲ−１２８のシード領域の配列と同一である隣接ヌクレオチド配列からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴマーの前記隣接ヌクレオチド配列が、ｍｉＲ−１２８の対応する領域の配列と同一である７〜２３個の間のヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
Ｄｒｄ１ａ−ｃｒｅ；ｍｉＲ−１２８−２ｆｌ／ｆｌマウスの線条体切片における電気生理学的研究によって、Ｄ１−ニューロン興奮性の増加が明らかになった。ｍｉＲ−１２８欠損Ｄ１−ニューロンは細胞体で正常な膜興奮性を示した（図８Ａ）が、樹状突起興奮性増強（図３Ａ）ならびに機能的樹状突起棘の約２０％増加（図３Ｂ、８Ｂ）を示した。さらに、ＥＲＫ２ネットワークは神経興奮性およびシナプス可塑性に関与するようである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
成熟ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの相対発現レベルを、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にしたがって、脳試料からの全抽出ＲＮＡを用いてＴａｑＭａｎアッセイによって測定した。精製ＲＮＡ試料を、製造業者によって推奨されるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）からの事前設計ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いて、相対遺伝子発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）からの以下の事前設計ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用した：ｍｉＲ−１２８（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００２２１６）、ｓｎｏ１３５（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００１２３０）、ｍｉＲ−１２４ａ（Ａｓｓａｙ  ＩＤ００１１８２）、Ｆｏｓｂ  Ｍｍ００５００４０１＿ｍ１、ＦｏｓＩ２  Ｍｍ００４８４４４２＿ｍ１、Ａｒｃ  Ｍｍ００４７９６１９＿ｇ１、ＪｕｎＢ  Ｍｍ０４２４３５４６＿ｓ１、Ｄａｒｐｐ−３２  Ｍｍ００４５４８９２＿ｍ１、Ｂｔｇ２  Ｍｍ００４７６１６２＿ｍ１、Ｇａｄｄ４５ｇ  Ｍｍ０１３５２５５０＿ｇ１、Ｄｕｓｐ１  Ｍｍ００４５７２７４＿ｇ１、Ｎｒ４ａ１  Ｍｍ０１３００４０１＿ｍ１、Ｊｕｎ  Ｍｍ００４９５０６２＿ｓ１、Ａｃｔｂ  Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１、Ａｒｐｐ−２１  Ｍｍ００４７３６３０＿ｍ１（エクソンにまたがっているプローブが、全てのＡｒｐｐ−２１アイソフォームに共通のエクソンを検出する）、Ａｒｐｐ２１  Ｍｍ００４７３６４５＿ｍ１（Ａｒｐｐ−２１の長いＴＡＲＰＰアイソフォームを特異的に検出するエクソンにまたがっているプローブ）。ｍｉＲＮＡ定量化のサイクルカウントを、示されるｓｎｏＲＮＡ１３５またはｍｉＲ−１２４ａに正規化し、ｍＲＮＡ定量化のサイクルカウントをＡｃｔｂまたはＧａｐｄｈに正規化した。各ｍＲＮＡについての相対発現（ΔＣｔ）および定量化（ＲＱ＝２−ΔΔＣ）を、示唆されるＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびΔΔＣｔ法を用いて計算した。標準偏差（ＳＤΔＣｔ＝（ＳＤ標的２＋ＳＤｒｅｆ２）１／２）およびエラーバー（ＲＱ１＝２＾（−（ΔΔＣｔ＋ＳＤΔΔＣｔ））およびＲＱ２＝２＾（−（ΔΔＣｔ＋ＳＤΔΔＣｔ））の計算を、ＡＢＩ技術文献部番４３７１０９５Ｒｅｖ  Ｂによって計算した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
パッチピペットを、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−９７プラーで厚壁ホウケイ酸ガラスから引き出した。ピペット抵抗は、記録液で満たした場合、典型的には３〜５Ｍｏｈｍであった。ｂＡＰ伝播を伴う試験のために、内部記録液は、１３５ＫＭｅＳＯ４、５ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、２ＡＴＰ−Ｍｇ２＋、０．５ＧＴＰ−Ｎａ＋、５ホスホクレアチン−トリス；５ホスホクレアチン−Ｎａ＋および０．１スペルミンを含有していた（ｍＭ）。ｐＨをＮａＯＨで７．２５に調整し、モル浸透圧濃度を２７０〜２８０ｍＯｓｍｌ−１に調整した。Ｃａ２＋イメージング実験のために、記録液は２００μＭ  Ｆｌｕｏ−４ペンタカリウム塩および５０μＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヒドラジドＮａ＋塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含有していた。電圧固定試験のために、記録溶液は、１２０ＣｓＭｅＳＯ３、５ＮａＣｌ、１０ＴＥＡ−Ｃｌ（テトラエチルアンモニウムＣｌ）、１０ＨＥＰＥＳ、５Ｑｘ−３１４、４ＡＴＰ−Ｍｇ２、０．３ＧＴＰ−Ｎａ、０．２Ｆｌｕｏ  ４ペンタカリウム塩および０．０５Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヒドラジドＮａ＋塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．２５、２７０〜２８０ｍＯｓｍ−１を含有していた（ｍＭ）。切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１直立固定ステージ顕微鏡にマウントした沈没型記録チャンバーに移し、カルボゲン−起泡ＡＣＳＦで連続的に灌流した。電気生理学的記録をＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器により得た。二光子イメージングおよび電気生理学的プロトコルを自動化および同期化するカスタムシェアウェアパッケージＷｉｎＦｌｕｏｒ（Ｊｏｈｎ  Ｄｅｍｐｓｔｅｒ、Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国）を用いて、刺激およびディスプレイを前記のように（Ｄａｙら、２００８）得た。増幅器ブリッジ回路を調整して直列抵抗を補填し、記録中絶えず監視した。