【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞培養物において組換えポリペプチドを生産する方法であって、以下：
（ａ）抑制されたｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性を有する哺乳動物細胞を培養して、組換えポリペプチドを産生するステップ；及び
（ｂ）ポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤によって抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、ヌクレアーゼ耐性を改善し、ＲＩＳＣによるｍｉＲＮＡ特異的切断に対する耐性を高め、及び／又は結合親和性を増大するように、化学的に修飾される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤で安定的に又は一過的にトランスフェクトされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、以下：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ＨｅＬａ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、ＣＶ１サル腎細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞株、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、サル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株、及びＣ１２７からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ遺伝子ノックアウトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えポリペプチドが、抗体又はその結合断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体又はその結合断片が、多重特異性抗体、完全ヒト型抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドが、非抗体タンパク質を含み、前記組換えポリペプチドが、融合タンパク質、受容体、細胞表面タンパク質のリガンド、分泌タンパク質又は酵素を含んでもよい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、少なくとも約２５％増大した比生産性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、少なくとも約２５％増大した最大生産性を有し、これは、ピーク生存細胞密度（ＶＣＤ）で決定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、１％〜３０％の相対生存細胞密度を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞が、対照細胞培養物と比較して、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２１、及びそれらの組み合わせから選択される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡの増大した活性を有するか、又は前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４５、及びそれらの組み合わせから選択される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡの低減した活性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
組換えポリペプチドを発現するように設計された哺乳動物細胞株であって、抑制されたｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性を有する哺乳動物細胞株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
さらに、組換えポリペプチドを発現するように設計された哺乳動物細胞株であって、抑制されたｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性を有する哺乳動物細胞；ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤をコードする１つ又は複数のベクターと、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む発現系；ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンス阻害剤を含む細胞培地；並びにｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトした哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞培養物から産生される組換えポリペプチドも開示される。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
哺乳動物細胞培養物において組換えポリペプチドを生産する方法であって、以下：
（ａ）抑制されたｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性を有する哺乳動物細胞を得るステップ；
（ｂ）前記哺乳動物細胞を培養して、組換えポリペプチドを産生するステップ；及び
（ｃ）タンパク質を回収するステップ
を含む方法。
[項目２]
前記ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤によって抑制される、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を含む、項目２に記載の方法。
[項目４]
前記哺乳動物細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤でトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目３に記載の方法。
[項目５]
前記オリゴヌクレオチド阻害剤が、ヌクレアーゼ耐性を改善し、ＲＩＳＣによるｍｉＲＮＡ特異的切断に対する耐性を高め、及び／又は結合親和性を増大するように、化学的に修飾される、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記哺乳動物細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目１に記載の方法。
[項目７]
前記哺乳動物細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤で安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目１に記載の方法。
[項目８]
前記哺乳動物細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤で一過的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目１に記載の方法。
[項目９]
前記哺乳動物細胞培養物が、以下：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ＨｅＬａ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、ＣＶ１サル腎細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞株、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、サル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株、及びＣ１２７から選択される哺乳動物細胞を含む、項目１に記載の方法。
[項目１０]
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、項目１に記載の方法。
[項目１１]
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ遺伝子ノックアウトを含む、項目１に記載の方法。
[項目１２]
前記組換えポリペプチドが、抗体又はその結合断片を含む、項目１に記載の方法。
[項目１３]
前記抗体又はその結合断片が、多重特異性抗体、完全ヒト型抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体から選択される、項目１２に記載の方法。
[項目１４]
前記抗体又はその結合断片が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹから選択されるアイソタイプを含む、項目１３に記載の方法。
[項目１５]
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを含む、項目１３に記載の方法。
[項目１６]
前記組換えポリペプチドが、非抗体タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
[項目１７]
前記組換えポリペプチドが、融合タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
[項目１８]
前記組換えポリペプチドが、受容体を含む、項目１に記載の方法。
[項目１９]
前記組換えポリペプチドが、細胞表面タンパク質のリガンドを含む、項目１に記載の方法。
[項目２０]
前記細胞表面タンパク質が、受容体を含む、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記組換えポリペプチドが、分泌タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
[項目２２]
前記組換えポリペプチドが、酵素を含む、項目１に記載の方法。
[項目２３]
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、少なくとも約２５％増大した比生産性を有する、項目１に記載の方法。
[項目２４]
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、少なくとも約２５％増大した最大生産性を有し、これは、ピーク生存細胞密度（ＶＣＤ）で決定される、項目１に記載の方法。
[項目２５]
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照哺乳動物細胞培養物と比較して、増大した比生産性を有する、項目１に記載の方法。
[項目２６]
前記細胞培養物の比生産性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％増大している、項目１に記載の方法。
[項目２７]
前記細胞培養物が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して、約１％〜約３０％の相対生存細胞密度を有する、項目１に記載の方法。
[項目２８]
アポトーシス、タンパク質翻訳又は細胞代謝の少なくとも１つの媒介因子の発現が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して増大している、項目１に記載の方法。
[項目２９]
ＨＭＧＡ２、ＭＹＣ、ＮＦ２、ＮＩＲＦ、ＲＡＢ４０Ｃ、及びｅＩＦ４ａから選択されるｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａの少なくとも１つの標的の発現が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性が抑制されていない対照細胞培養物と比較して細胞培養物中で増大している、項目２４に記載の方法。
[項目３０]
前記哺乳動物細胞が、対照細胞培養物と比較して、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２１、及びそれらの組み合わせから選択される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡの増大した活性を有する、項目２に記載の方法。
[項目３１]
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２１、又はそれらの組み合わせを発現することができる第２の発現ベクターでトランスフェクトされる、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４５、及びそれらの組み合わせから選択される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡの低減した活性を有する、項目２に記載の方法。
[項目３３]
前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡの活性が、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤によって抑制される、項目３２に記載の方法。
[項目３４]
前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤が、第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を含む、項目３３に記載の方法。
[項目３５]
前記哺乳動物細胞培養物が、第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤でトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目３３に記載の方法。
[項目３６]
前記第２のオリゴヌクレオチド阻害剤が、ヌクレアーゼ耐性を改善し、ＲＩＳＣによるｍｉＲＮＡ特異的切断に対する耐性を高め、及び／又は結合親和性を増大するように化学的に修飾されている、項目３５に記載の方法。
[項目３７]
前記哺乳動物細胞培養物が、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤をコードする第２の発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞を含む、項目３４に記載の方法。
[項目３８]
組換えポリペプチドを発現するように設計された哺乳動物細胞株であって、抑制されたｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ活性を有する哺乳動物細胞株。
[項目３９]
ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａ遺伝子ノックアウトを含む、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４０]
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤でトランスフェクトされている、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４１]
前記哺乳動物細胞が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａの前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤をコードする発現ベクターでトランスフェクトされている、項目３９に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４２]
前記細胞株が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａの前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤で安定的にトランスフェクトされる、項目４０に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４３]
前記細胞株が、ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａの前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤で一過的にトランスフェクトされる、項目４０に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４４]
前記ベクターが、ウイルスベクターを含む、項目４１に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４５]
前記ベクターが、レトロウイルスベクターを含む、項目４４に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４６]
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターから選択される、項目４５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４７]
前記ベクターが、バキュロウイルスベクターを含む、項目４４に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４８]
前記ベクターが、アデノウイルスベクターを含む、項目４４に記載の哺乳動物細胞株。
[項目４９]
前記哺乳動物細胞が、以下：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ２９３）細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１サル腎細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞株、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞から選択される、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５０]
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５１]
前記組換えタンパク質が、抗体又はその結合断片を含む、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５２]
前記抗体又はその結合断片が、多重特異性抗体、完全ヒト型抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体から選択される、項目５１に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５３]
前記抗体又はその結合断片が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹから選択されるアイソタイプを含む、項目５１に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５４]
前記抗体又はその結合断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを含む、項目５１に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５５]
前記組換えポリペプチドが、非抗体タンパク質を含む、項目３８に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５６]
前記組換えタンパク質が、融合タンパク質を含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５７]
前記組換えタンパク質が、受容体を含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５８]
前記組換えタンパク質が、細胞表面タンパク質のリガンドを含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目５９]
前記細胞表面タンパク質が、受容体を含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目６０]
前記組換えタンパク質が、分泌タンパク質を含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目６１]
前記組換えタンパク質が、酵素を含む、項目５５に記載の哺乳動物細胞株。
[項目６２]
ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤をコードする１つ又は複数のベクターと、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む発現系。
[項目６３]
ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンス阻害剤を含む細胞培地。
[項目６４]
ｍｉＲＮＡ−ｌｅｔ−７ａのアンチセンスｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトした哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞培養物から産生される組換えポリペプチド。