(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の真菌類株もしくはそれから単離される酵素調製物を用いる下記の一般式（Ｉ）で表される１８の環原子を有する乳酸含有性で光学活性な環式デプシペプチドの製造方法。
一般式（Ｉ）
【化１】
0003600300.tif 000014
上式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ4は各々独立に、水素、最高８までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、カルバモイルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、最高６までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルケニル、最高８までの炭素原子を有する環式アルキル、または場合により置換されていてもよいフェニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキルもしくはへテアリール（ｈｅｔａｒｙｌ）−Ｃ1−Ｃ4−アルキル（ここで、置換されている場合にとることのできる置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、ニトロ、もしくはアミノである）を表し、Ｒ3およびＲ5は各々独立に、水素、最高８までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、最高６までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルケニル、最高８までの炭素原子を有する環式アルキル、または場合により置換されていてもよいフェニル−Ｃ1−Ｃ4−アルキルもしくはへテアリール（ｈｅｔａｒｙｌ）−Ｃ1−Ｃ4−アルキル（ここで、置換されている場合にとることのできる置換基は、置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、ニトロ、もしくはアミノである）を表す。
【請求項２】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）
【化２】
0003600300.tif 000015
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ4は、一般式（Ｉ）について定義したのと同義である。］
の光学活性もしくはラセミアミノ酸、ならびに
式（Ｖ）および（ＶＩ）
【化３】
0003600300.tif 000016
［式中、
Ｒ3およびＲ5は、一般式（Ｉ）について定義したのと同義である。］
の光学活性もしくはラセミ２−ヒドロキシ−カルボン酸、ならびに
光学活性もしくはラセミ乳酸からの、請求項１における一般式（Ｉ）で表される１８の環原子を有する乳酸含有性で光学活性な環式デプシペプチドの製造方法であって、反応を適切な栄養溶液中フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の真菌株の存在下またはフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の真菌株から単離されたシンターゼの存在する緩衝剤系で実施することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、１８の環原子を有する乳酸含有性環式デプシペプチド（それらのデプシペプチドの内の幾つかのものは既に知られている）の新規製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１８の環原子を有する所定の乳酸含有性環式デプシペプチド（エンニアチン）および内寄生性生物駆除剤としてのそれらの利用は既に先行する特許出願（ドイツ特許出願公開第４  ３１７  ４５８号明細書）の主題となっている。
【０００３】
１８の環原子を有し、そしてＤ−２−ヒドロキシ−イソ吉草酸を含む環式デプシペプチドの製造法については、一連の化学的および微生物学的方法が存在する。（合成に関しては例えば、Ｐ．Ｑｕｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４６（１９６３）ｐｐ．１７１５−１７２０；Ｐ．  Ｑｕｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４７（１９６４）ｐｐ．１６６−１７３［エンニアチン  Ａ］；Ｐｌ．  Ａ．  Ｐｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４６（１９６３）ｐｐ．９２７−９３５［エンニアチン  Ｂ］；Ｙｕ．  Ａ．  Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２（１９７１）ｐｐ．１５９−１６２；Ｒ．Ｗ．Ｒｏｅｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５７（１９７４）ｐｐ．５５４−５６１［ボベリシン］を参照のこと、そして発酵については例えば、Ｒ．Ｚｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４５（１９９２）ｐｐ．１２７３−１２７７［エンニアチン  Ａ、Ｂ、およびＣ］；Ａ．  Ｖｉｓｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４０（１９９２）ｐｐ．１０７６−１０８２［エンニアチン  Ｂ４］；Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｔｏｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４５（１９９２）ｐｐ．１２０７−１２１５［エンニアチン  Ａ、Ａ１、Ｂ、Ｂ１、Ｄ、Ｅ、およびＦ］を参照されたし）。
【０００４】
Ｄ−２−ヒドロキシ−第二級−カプロン酸を含むシクロヘキサデプシペプチドの発酵は、日本特許中に記載されている（ＭＫ  １６８８の合成：特開平２−２２９  １７７  号公報；引用、Ｃ．Ａ．１１４（２３）：２２７  ４８７ｋ参照）。
【０００５】
しかしながら、発酵による乳酸含有性シクロヘキサデプシペプチド（エンニアチン）の合成については何も開示されていない。
【０００６】
【発明の構成】
本発明は、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の真菌類株、もしくはそれから単離される酵素調製物を用いる１８の環原子を有する乳酸含有性で光学活性の環式デプシペプチド類の製造方法に関する。
【０００７】
本発明に従う方法においては、一般式（Ｉ）
【０００８】
【化４】
0003600300.tif 000002
【０００９】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は各々独立に、水素、最高８までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、カルバモイルアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、最高６までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルケニル、最高８までの炭素原子を有する環式アルキル、および場合によっては置換されるアリールアルキルもしくはへテアリールアルキル（挙げることができるこれらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、ニトロ、もしくはアミノである）を表し、
Ｒ３およびＲ５は各々独立に、水素、最高８までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキル、ヒドロキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、最高６までの炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルケニル、最高８までの炭素原子を有する環式アルキル、および場合によっては置換されるアリールアルキルもしくはへテアリールアルキル（挙げることができるこれらの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキル、ニトロ、もしくはアミノである）を表す］
の１８の環原子を有する乳酸含有性で光学活性の環式デプシペプチド（エンニアチン）を、
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）
【００１０】
【化５】
0003600300.tif 000003
【００１１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は、先に記載の意味を有する］
の光学活性もしくはラセミアミノ酸と、
式（Ｖ）および（ＶＩ）
【００１２】
【化６】
0003600300.tif 000004
【００１３】
［式中、
Ｒ３およびＲ５は、先に記載の意味を有する］
の光学活性もしくはラセミ２−ヒドロキシ−カルボン酸、
および光学活性もしくはラセミ乳酸とを、適切な栄養溶液中フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の真菌類株の存在下または微生物から単離されたシンターゼの存在下の緩衝剤系中で反応させ、次いで１８の環原子を有する所望の乳酸含有性環式デプシペプチド（エンニアチン）を単離する。
【００１４】
一般式（Ｉ）の１８の環原子を有する乳酸含有性環式デプシペプチド（エンニアチン）は、特に医療薬および獣医科学用の医療薬の分野において、内寄生性生物を駆除するのに非常に適している。
【００１５】
一般式（Ｉ）は、本発明に従う１８の環原子を有する乳酸含有性環式デプシペプチド（エンニアチン）の一般定義を提供する。
【００１６】
【化７】
0003600300.tif 000005
【００１７】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物は、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が各々独立に、水素、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、第三級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、ネオ−ペンチル、１−エチル−プロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、第三級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にヒドロキシメチル、１−および２−ヒドロキシエチル、メルカプト−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメルカプトメチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルチオメチル、メチルチオエチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルスルフィニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルスルフィニルメチル、メチルスルフィニルエチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルスルホニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルスルホニルメチル、メチルスルホニルエチル、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にメトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルエチル、カルバモイル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にカルバモイルメチル、カルバモイルエチル、アミノ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にアミノプロピル、アミノブチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にメチルアミノプロピル、メチルアミノブチル、Ｃ１−Ｃ４−ジアルキルアミノ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチル、グアニド−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、特にグアニドプロピル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、ヘキセニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチルメチル、ヘテロアリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にチエン−２−イル−メチル、チエン−３−イル−メチル、インドール−３−イル−メチル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にフェニルメチル（これは場合によっては、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、およびＣ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルを含む群からの基により置換されることがある）を表し、
Ｒ３およびＲ５が各々独立に、水素、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、第三級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、ネオ−ペンチル、１−エチル−プロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、第三級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にヒドロキシメチル、１−および２−ヒドロキシエチル、メルカプト−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメルカプトメチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルチオメチル、メチルチオエチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルスルフィニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルスルフィニルメチル、メチルスルフィニルエチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルスルホニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルスルホニルメチル、メチルスルホニルエチル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、ヘキセニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチルメチル、ヘテアリール−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にチエン−２−イル−メチル、チエン−３−イル−メチル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にフェニルメチル（これは場合によっては、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、およびＣ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルを含む群からの基により置換されることがある）を表す化合物である。
【００１８】
式（Ｉ）の特に好ましい化合物は、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が各々独立に、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチル−プロピル、ネオ−ペンチル、１−エチル−プロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にヒドロキシメチル、１−および２−ヒドロキシエチル、メルカプト−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメルカプトメチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルチオメチル、メチルチオエチル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、ヘキセニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、もしくはシクロヘプチルメチル、を表し、
Ｒ３およびＲ５が各々独立に、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、第三級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチル−プロピル、ネオ−ペンチル、１−エチル−プロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、第三級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にヒドロキシメチル、１−および２−ヒドロキシエチル、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にメチルチオメチル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、ヘキセニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、もしくはシクロヘプチルメチル、を表す化合物である。
【００１９】
式（Ｉ）の極めて特に好ましい化合物は、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が各々独立に、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチル−プロピル、ネオ−ペンチル、１−エチルプロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロヘキシルメチルを表し、
Ｒ３およびＲ５が各々独立に、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ８−アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級−ブチル、第三級−ブチル、ペンチル、第二級−ペンチル、１，２−ジメチル−プロピル、ネオ−ペンチル、１−エチル−プロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、イソヘキシル、第二級−ヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、第二級−ヘプチル、第三級−ヘプチル、オクチル、イソオクチル、第二級−オクチル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、特にビニル、アリル、ブテニル、ヘキセニル、Ｃ３−Ｃ７−シクロ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、特にシクロヘキシルメチルを表す化合物である。
【００２０】
以下に示す式（Ｉ）の光学活性な化合物を個々に挙げることができ、それらは、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ノルバリル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−ノルロイシル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アロイソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アロイソロイシル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アロイソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−２−アミノ−ブチリル−Ｄ−ラクチル−）、
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−アロイソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−２−アミノ−ブチリル−Ｄ−ラクチル−）、
である。
【００２１】
一般式（Ｉ）の化合物の内の幾つかのものは既知であり（例えば、Ｖ．Ｚ．Ｐｌｅｔｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｋｈｉｍ．  １（２）（１９７５）  ｐｐ．１６０−１６５；引用Ｃ．Ａ．  ８３（１３）：１１４  ８７２ｅ；ドイツ特許出願公開第４  ３１７  ４５８号明細書を参照のこと）、そしてそれらにおいて記載される化学合成的方法により取得することもできる。
【００２２】
乳酸含有性環式デプシペプチド（エンニアチン）（Ｉ）の製造のための本発明に従う方法においては、Ｌ−バリン（Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４：−イソプロピル）を式（ＩＩ）から（ＩＶ）までの化合物として使用し、そしてＤ−乳酸（Ｒ３およびＲ５；−メチル）を式（Ｖ）および（ＶＩ）の化合物として使用する場合には、本方法は、例えば以下に示す化学式
【００２３】
【化８】
0003600300.tif 000006
【００２４】
［ＳＡＭ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
金属塩：例えばアルカリ土類金属塩（Ｍｇ２＋塩）もしくはＭｎ２＋塩］により表すことができる。
【００２５】
式（ＩＩ）から（ＩＶ）までは、本発明に従う方法を実施するための出発化合物として必要なアミノ酸の一般定義を提供する。これらの式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４が、本発明に従う式（Ｉ）の物質の記載に関してこれらの置換基について好ましいとして既に記載されている基を表すことが好ましい。
【００２６】
出発物質として用いる天然もしくは合成アミノ酸がキラルである場合には、それらはＤもしくはＬ体で存在することができる。しかしながら、Ｌ立体配置をとるアルファーアミノ酸が好ましい。
【００２７】
挙げることができる例は、
Ａａｄ、Ａｂｕ、ｊＡｂｕ、ＡＢｚ、２ＡＢｚ、εＡｃａ、Ａｃｈ、Ａｃｐ、
Ａｄｐｄ、Ａｈｂ、Ａｉｂ、βＡｉｂ、Ａｌａ、βＡｌａ、ΔＡｌａ、
Ａｌｇ、Ａｌｌ、Ａｍａ、Ａｍｔ、Ａｐｅ、Ａｐｍ、Ａｐｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、
Ａｓｐ、Ａｓｕ、Ａｚｅ、Ａｚｉ、Ｂａｉ、Ｂｐｈ、Ｃａｎ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、
（Ｃｙｓ）２、Ｃｙｔａ、Ｄａａｄ、Ｄａｂ、Ｄａｄｄ、Ｄａｐ、Ｄａｐｍ、
Ｄａｓｕ、Ｄｊｅｎ、Ｄｐａ、Ｄｔｃ、Ｆｅｌ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、
Ｇｕｖ、ｈＡｌａ、ｈＡｒｇ、ｈＣｙｓ、ｈＧｌｎ、ｈＧｌｕ、Ｈｉｓ、
ｈＩｌｅ、ｈＬｅｕ、ｈＬｙｓ、ｈＭｅｔ、ｈＰｈｅ、ｈＰｒｏ、ｈＳｅｒ、
ｈＴｈｒ、ｈＴｒｐ、ｈＴＹｒ、ＨｙＩ、Ｈｙｐ、３Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｉｓｅ、
Ｉｖａ、Ｋｙｎ、Ｌａｎｔ、Ｌｃｎ、Ｌｅｕ、Ｌｓｇ、Ｌｙｓ、βＬｙｓ、
ΔＬｙｓ、Ｍｅｔ、Ｍｉｍ、Ｍｉｎ、ｎＡｒｇ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｌｙ、
Ｏｒｎ、Ｐａｎ、Ｐｅｃ、Ｐｅｎ、Ｐｈｅ、Ｐｈｇ、Ｐｉｃ、Ｐｒｏ、ΔＰｒｏ、
Ｐｓｅ、Ｐｙａ、Ｐｙｒ、Ｐｚａ、Ｑｉｎ、Ｒｏｓ、Ｓａｒ、Ｓｅｃ、Ｓｅｍ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｉ、βＴｈｉ、Ｔｈｒ、Ｔｈｙ、Ｔｈｘ、Ｔｉａ、Ｔｌｅ、Ｔｌｙ、
Ｔｒｐ、Ｔｒｔａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｎａｌ、Ｔｂｇ、Ｎｐｇ、Ｃｈｇ、Ｔｈｉａ、
（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＸＶ／１および２、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９７４、を参照のこと）。
【００２８】
式（Ｖ）から（ＶＩ）までは、本発明に従う方法を実施するための出発物質として必要な２−ヒドロキシ−カルボン酸の一般定義を提供する。
【００２９】
これらの式中、Ｒ３およびＲ５が、本発明に従う式（Ｉ）の物質の記載に関してこれらの置換基について好ましいとして既に記載されている基を表すことが好ましい。
【００３０】
出発物質として用いる２−ヒドロキシ−カルボン酸がキラルである場合には、それらはＤもしくはＬ体で存在することができる。しかしながら、Ｄ立体配置をとる２−ヒドロキシ−カルボン酸が好ましい。
【００３１】
挙げることができる例は、
Ｈｙａｃ、Ｈｙｂａ、Ｈｙｄｄ、Ｈｙｄｅ、Ｈｙｉｃ、Ｈｙｉｖ、Ｈｙｍｂ、
Ｈｙｐｐ、Ｈｙｐｒ（Ｌａｃ）、Ｈｙｔｄ、Ｈｙｕｄ、Ｈｙｖａ、
（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＸＶ／１および２、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９７４、を参照のこと）。
【００３２】
本発明に従う方法を実施するのに適するフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株は、以下に示すフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株である。
【００３３】
0003600300.tif 000007
0003600300.tif 000008
0003600300.tif 000009
ミントライト  フサリウム（Ｍｉｎｔｏｌｙｔｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株ＤＳＭ  ８９３８およびＤＳＭ  ８９３９は特に挙げる必要があり、これらはブダペスト条約に従って、ブルンスウィック（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）にあるＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）；（ドイツ微生物収集局）に、１９９４年１月３１日に寄託した。
【００３４】
この方法は、微生物から単離されるシンセターゼを使用して実施することもできる。この目的に必要なエンニアチンシンセターゼは、刊行物から知られる方法を使用して、先に詳細を記載したフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株から単離することができる（例えば、Ｒ．Ｐｉｅｐｅｒ、Ｈ．  Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ、Ｒ．Ｚｏｃｈｅｒ、Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．  ４５（１９９３）ｐｐ．１２７３−１２７７、を参照せよ）。
【００３５】
フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）という種の真菌類株は、適切な栄養溶液の存在下において、それ自体既に知られている方法により発酵させる。これらの栄養溶液は、真菌類の生育に必要な塩、ならびに炭素および窒素源を含む。
【００３６】
本発明に従う方法を実施するのに適する無機塩は、すべてのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および周期表の第ＩＩ族から第ＶＩＩＩ族までの元素を用いる金属塩である。
【００３７】
挙げることができる例は、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、カドミウム、スカンジウム、チタン、ジルコニウム、バナジウム、ニオブ、クロム、モリブデン、マンガン、鉄、コバルト、もしくはニッケルの、酢酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、亜リン酸塩、亜リン酸水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、炭酸塩、もしくは炭酸水素塩である。
【００３８】
使用することが好ましい物質は、アルカリ金属類、特にナトリウムおよびカリウムの、酢酸塩、ハロゲン化物、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、硝酸塩、アルカリ土類金属、特にマグネシウム、ならびに亜鉛、マンガンおよび鉄を例とする周期表の第ＩＩ族、第ＶＩＩ族、および第ＶＩＩＩ族の金属類の硫酸塩である。
【００３９】
本発明に従う方法を実施するための炭素源は、炭水化物および炭水化物含有生産物である。
【００４０】
挙げることができる例は、ペントース類、特にリボース、ヘキソース類、特にグルコースおよびフルクトースのような単糖類、二糖類、特にスクロース、マルトース、およびラクトース、三糖類、特にフラフィノース、ならびに四糖類、五糖類、および六糖類のようなオリゴ糖類である。
【００４１】
ヘキソースを一例とするもののような、特にグルコースである単糖類、二糖類を一例とするもののような、特にショ糖であるオリゴ糖類を使用することが好ましい。
【００４２】
本発明に従う方法を実施するのに適する窒素源は、アミノ酸および窒素含有性塩である。
【００４３】
挙げることができる例は、先に詳細を記載した天然および合成アミノ酸、あるいは硝酸アンモニウム、亜硝酸アンモニウム、もしくは先に詳細を記載した金属類の硝酸塩および亜硝酸塩である。
【００４４】
先に詳細を記載した天然のアミノ酸、ならびに硝酸アンモニウムのような窒素含有性塩を使用することが好ましい。
【００４５】
発酵法のために用いるフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株はまず第一に、例えばモラッセス／コーンスティープリカーからなる培地中において、それ自体既に知られている方法により生育させる。それらが生育した後、形成される胞子を胞子用フィルターにより単離する。予備培養物を生産するためには、炭素源および無機塩からなるフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）用規定培地（ＦＤＭ）に約１０９の胞子を接種し、そして再発酵させる。数日後、ＦＤＭ主培養物を１ｍｌの予備培養物の接種により調製することができ、そして発酵を類似する方法において実施することができる。
【００４６】
その後実際の発酵は、式（ＩＩ）から（ＩＶ）まで、もしくは（Ｖ）および（ＶＩ）の化合物の存在下、および光学活性もしくはラセミ乳酸の存在下において実施する。
【００４７】
発酵期間は１から３０日までである。発酵は、＋５℃と＋４０℃との間、好ましくは＋１５℃と＋３５℃との間、特に好ましくは＋２５℃と＋３０℃との間の温度において実施する。本方法は、滅菌条件下、および大気圧下において実施する。
【００４８】
本方法を実施するためには、式（Ｖ）および（ＶＩ）の化合物を、一般的には５ｍＭから５０ｍＭまで、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭまでの濃度において使用する。
【００４９】
発酵終了後には、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）培養物の菌糸体を吸引濾過し、ホモジネートし、有機溶媒を用いて繰り返し抽出し、そしてその後濾過する。得られる培養物濾液を通常の方法において抽出し、脱水し、そして減圧下において濃縮する。
【００５０】
得られる粗エンニアチンを、カラムクロマトグラフィーもしくは向流分配による通常の方法において精製することができる。至適な処理法は個々の各事例において決定すべきである（製造法実施例も参照せよ）。
【００５１】
本発明に従う方法を単離シンセターゼの存在下において実施する場合には、この方法を、金属塩、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下において水性緩衝系を使用して実施する。
【００５２】
挙げることができる金属塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、マグネシウム、カルシウム、もしくはバリウムの、酢酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、亜リン酸塩、亜リン酸水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、炭酸塩、および炭酸水素塩である。
【００５３】
使用することが好ましい塩は、例えば塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、もしくは酢酸マグネシウムのようなアルカリ土類金属塩である。
【００５４】
本発明に従う方法は、緩衝水溶液中において実施する。
【００５５】
挙げることができる例は市販品として入手可能な緩衝溶液であり、その一例は、ｐＨ１．０に関しては特にグリシン／塩酸、ｐＨ２．０から４．０に関しては特にクエン酸／塩酸、ｐＨ５．０から６．０に関しては特にクエン酸／水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０に関しては特にリン酸、ｐＨ８．０に関しては特にホウ酸／塩酸、そしてｐＨ９．０から１０．０までに関しては特にホウ酸／塩化カリウム／水酸化ナトリウム溶液である。
【００５６】
「生理学的範囲」内において操作を行うことが好ましく、それはつまり、６．０から９．０までのｐＨであり、このためにはリン酸緩衝溶液、特にリン酸水素カリウム／リン酸水素二ナトリウム、もしくはリン酸水素カリウム／リン酸水素二カリウムを使用することが好ましい。
【００５７】
本方法を実施するためには、２ｍＭから８ｍＭまで、好ましくは３ｍＭから５ｍＭまでの式（ＩＩ）から（ＶＩ）までの化合物、光学活性もしくはラセミ乳酸、およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、３ｍＭから９ｍＭまで、好ましくは４ｍＭから６ｍＭまでのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２ｍＭから２５ｍＭまで、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭまでのアルカリ土類金属塩、１０ｍＭから１００ｍＭまで、好ましくは４０ｍＭから６０ｍＭまでの緩衝液を、一般的にはインビトロにおいて１００μｇから１０００μｇ、好ましくは２００μｇから６００μｇの単離エンニアチンシンセターゼと共に利用する。
【００５８】
インビトロでの酵素合成の反応時間は２分から２４時間までである。インビトロでの酵素合成は、０℃から＋５０℃まで、好ましくは＋１０℃から＋３０℃まで、特に好ましくは＋２０℃と＋３０℃との間の温度範囲おいて実施する。
【００５９】
本方法は、６．５から８．５まで、好ましくは７．０から８．０までの範囲のｐＨにおいて実施し、ｐＨは緩衝液を添加することにより全反応の間定常的に７．３に保持する。
【００６０】
本方法は、滅菌反応条件下および大気圧下において実施することが好ましい。
【００６１】
インビトロでの酵素合成は、水での希釈により停止することができる。
【００６２】
さらに収率を上げるためには、水相を有機溶媒で繰り返し抽出し、そしてこの抽出物を脱水し、そして減圧下において濃縮する。
【００６３】
得られる粗エンニアチンを、カラムクロマトグラフィーもしくは向流分配による通常の方法において精製することができる。繰り返し述べるが、理想的な処理法は個々の各事例において決定すべきであろう（製造法実施例も参照せよ）。
【００６４】
【実施例】
製造法実施例
実施例１
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）の製造法
【００６５】
【化９】
0003600300.tif 000010
【００６６】
Ｄ−乳酸のインビボでの組み込み
１０ｍＭの濃度のＤ−乳酸を滅菌条件下においてフサリウム  スキルピ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｃｉｒｐｉ）の２日目の主培養物に添加し、そして発酵をさらに３日間継続する。その後フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）培養物の菌糸体を吸引濾去により漉し、そしてこの濾液を酢酸エチルを用いて３回抽出する。菌糸体はアセトンを用いながら乳鉢内で２度ホモジナイズし、そしてホモジネートを次に吸引濾過に供する。培養物の濾液を各回１００ｍｌの酢酸エチルでの３回の振盪により抽出し、そして合わせた有機相をアセトン抽出物と一緒にして蒸発乾固させる。
【００６７】
別法では、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の全培養物をその容積の約２倍の酢酸エチル中において一晩抽出することができる。
【００６８】
カラムクロマトグラフィーによりエンニアチンを濃縮するには、少量のクロロホルム中に溶かした粗エンニアチンをＡｌ２Ｏ３カラム（３０×２ｃｍｍ）にかけ、そして段階的に溶出する。
【００６９】
インビトロでの酵素合成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の３００−５００μｇの精製済みエンニアチンシンセターゼを、４ｍＭのＬ−バリン、４ｍＭのＤ−乳酸、４ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、５ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下において、１．５ｍｌの総容積中２８℃下で１０分間インキュベートする。
【００７０】
２ｍｌの水を添加した後、この混合物を各回２ｍｌ分の酢酸エチルを使用して繰り返し抽出する。有機相を硫酸ナトリウムを使用して脱水し、そしてその後減圧下において濃縮する。
【００７１】
ａ）もしくはｂ）により得られる生成物を、精製用ＨＰＬＣ（ＲＰ  １８／７５−８０％メタノール）により精製する。
【００７２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：０．８３；１．０３（ｄ，１８Ｈ，３×−ＣＨ（ＣＨ３）２）；１．４５（ｄ，９Ｈ，３×−Ｏ−ＣＨ−ＣＨ３）；２．２７（ｍ，３Ｈ，３×−ＣＨ（ＣＨ３）２）；３．０６（ｓ，９Ｈ，３×−Ｎ−ＣＨ３）；４．４３（ｄ，３Ｈ，３×−Ｎ−ＣＨ−ＣＯ−）；５．６２（ｑ，３Ｈ，３×−Ｏ−ＣＨ−ＣＯ−）ｐｐｍ
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６．５（３×−ＣＨ３，Ｄ−Ｌａｃ）；１８．５；２０．１（６×−ＣＨ３，ＭｅＶａｌ）；２７．８（３×−ＣＨ（ＣＨ３）２，Ｌ−ＭｅＶａｌ）；３２．９（３×−Ｎ−ＣＨ３，Ｌ−ＭｅＶａｌ）；６３．１（３×−Ｎ−ＣＨ−ＣＯ−，Ｌ−ＭｅＶａｌ）；６６．３（３×−Ｏ−ＣＨ−ＣＯ−，Ｄ−Ｌａｃ）；１６９．２（３×−Ｃ＝Ｏ，アミド；１６９．８（３×−Ｃ＝Ｏ，エステル）ｐｐｍ
ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ（％）：５５５（Ｍ＋，３２）；４８２（２０）；３５３（１）；２６８（３４）；１６８（１００）；８６（５３）
実施例２
シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシル−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−）の製造法
【００７３】
【化１０】
0003600300.tif 000011
【００７４】
Ｄ−乳酸のインビボでの組み込み
１０ｍＭの濃度のＤ−乳酸を滅菌条件下においてフサリウム  サムブキヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）の２日目の主培養物に添加し、そして発酵をさらに３日間継続する。その後フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）培養物の菌糸体を吸引濾去し、そしてこの濾液を酢酸エチルを用いて３回抽出する。この菌糸体はアセトンを用いながら乳鉢内で２度ホモジナイズし、そしてホモジネートを次に吸引濾過に供する。培養物の濾液を各回１００ｍｌの酢酸エチルでの３回の振盪により抽出し、そして合わせた有機相をアセトン抽出物と一緒にして蒸発乾固させる。
【００７５】
エンニアチンの濃縮および精製は実施例１において記載されるように実施する。
【００７６】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１８．４；１８．０（２×−ＣＨ３，Ｄ−ＨｙＩｖ）；１６．８；１５．８（２×−ＣＨ３，Ｄ−Ｌａｃ）；１６．７；１５．３；１１．４；１０．６；１０．３；１０．０（６×−ＣＨ３，Ｌ−Ｍｅｌｌｅ）；２５．０；２４．９；２４．４（３×−ＣＨ２，Ｌ−Ｍｅｌｌｅ）；３４．７；３４．１；３２．３（３×−ＣＨ（ＣＨ３）−，Ｌ−Ｍｅｌｌｅ）；３５．６；３１．６；３１．２（３×−Ｎ−ＣＨ３，Ｌ−Ｍｅｌｌｅ）；２９．９（−ＣＨ（ＣＨ３）２，Ｄ−ＨｙＩｖ）；７４．０；６７．５；６６．１（３×−Ｏ−ＣＨ−ＣＯ−，Ｄ−ＨｙＩｖ）；６５．１；６０．５；５９．５（３×−Ｎ−ＣＨ−ＣＯ−，Ｌ−Ｍｅｌｌｅ）；１６９．２；１６９．１；１６９．０（３×−Ｃ＝Ｏ，アミド）；１７０．６；１７０．１；１６９．８（３×−Ｃ＝Ｏ，エステル）ｐｐｍ
ＥＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ（％）：６２５（Ｍ＋，２３）；５５２（１４）；４０９（５）；２９６（２０）；１８２（４３）；１００（１００）
類似する方法により、以下に示す表Ｉに列挙される一般式（Ｉ）の化合物を、ＬＤＬＤＬＤ立体異性体の形態において製造することができる。
【００７７】
表１
一般式（Ｉ）の化合物の実施例
【００７８】
【化１１】
0003600300.tif 000012
【００７９】
【表１】
0003600300.tif 000013
【００８０】
目的のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株を、モラッセス／コーンスティープリカー（各々３０ｇおよび１０ｇ／ｌ）からなる培地中において生育させる。
【００８１】
培養物は、１００ｒｐｍ（２６から２８℃）において５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ（１００ｍｌの培地）中で生育させる。４−５日後に、形成される胞子を胞子用フィルターにより単離する。これらの胞子は数週間４℃において保持することができる。
【００８２】
予備培養物を調製するには、２００ｍｌのＦＤＭ（リットル当たり、７５．０ｇのスクロース、１２．７５ｇのＮａＮＯ３、１５．０ｇのＮａＣｌ、７．５ｇのＭｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、４．０ｇのＫＨ２ＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ４）を含むフラスコを１０９の胞子で接種し、そして先のように発酵させる。
【００８３】
２−３日後に、ＦＤＭ主培養物を、接種物として各回１ｍｌの予備培養物を使用することにより調製し、そして先のように発酵させる。
【００８４】
エンニアチンを製造することを目的とするインビトロでの合成のための製造法
２−もしくは３−日目の主培養物をまず最初にそれらのエンニアチン力価について調査して、その細胞が合成活性を有することを確認する。この目的のためには、３−５ｍｌの培養物を滅菌条件下においてサンプリングし、そして各回２ｍｌの酢酸エチルを用いて繰り返し抽出を行う。有機相を蒸発させた後、エンニアチンをＨＰＬＣ（ＲＰ  １８．８０％メタノール）により直接調査する。
【００８５】
目的の主培養物を、１０ｍＭの最終濃度まで、対応する前駆体であるヒドロキシ酸もしくはアミノ酸を用いて滅菌条件下において処理し、そして発酵を実施例１において記載されるように継続する（総発酵期間は約１週間である）。