(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を貫通する貫通孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第１基板と、透明な第２基板とからなり、前記第１基板の表面に前記第２基板を接合させることにより、前記第１基板と前記第２基板との接合部であって前記第１基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするマイクロチャネルアレイ装置。
【請求項２】
第１基板がシリコン基板であり、第２基板が透明なガラス基板である請求項１記載のマイクロチャネルアレイ装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とする粒子保持方法。
【請求項４】
吸引トラップされる粒子が、細胞である請求項３記載の粒子保持方法。
【請求項５】
第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子を吸引トラップすることを特徴とする請求項４記載の粒子保持方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とする細胞保持ならびに物質注入装置。
【請求項７】
請求項６記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とする細胞保持ならびに物質注入方法。
【請求項８】
第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入する請求項７記載の細胞保持ならびに物質注入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置に関し、詳しくは細胞に遺伝子等の物質を注入するのに最も好適なマイクロインジェクション法の効率化を図るためのマイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内に遺伝子を導入することのできる新技術の開発は、有用な特質を有する動植物種及び微生物種の育種効率を高める上で鍵となるものである。これまで種々の方法が開発されてきたが、確実性と効率性の両方を有する技術は未開発である。
【０００３】
例えば、細胞保持用ガラスマイクロピペットと細胞刺入用ガラスマイクロピペットとを、マイクロマニピュレータを用いて操作し、細胞１個１個に遺伝子を注入するマイクロインジェクション法は最も確実な方法であるが、その操作に熟練と時間を要し、そのため処理能力が低いことが大きな欠点になっている。
しかしながら、貴重な細胞と遺伝子を処理する場合、確実性がより重視されることから、マイクロインジェクション法は現在でも唯一の選択肢である。
【０００４】
そこで、このマイクロインジェクション法の効率化に関して、これまで多くの技術開発努力が行なわれてきた。
例えば、特開平１−１１２９７６号公報には、基板に貫通孔を規則的にあけ、そこに細胞をトラップして、基板の位置と注入針の位置をステップモーターとコンピューターにより自動的に制御することで注入を自動化する試みが記載されている。
本発明者も、多数の注入針を規則的に配列したマイクロキャピラリーアレイを作製する技術を開発し、これに対応した位置にチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイを用いて、マイクロチャンバーアレイに保持された全ての細胞へのＤＮＡの一括注入を可能とすることにより、さらに効率化を進めた（特開２０００−２３６５７号公報）。
【０００５】
しかしながら、上記のいずれの発明も、細胞の形状、大きさ、弾力性をほぼ均一と仮定して装置開発を行ったものである。実際には、それらがほぼ一定であることは極めて希であり、殆どの場合、細胞の形状、大きさ、弾力性はそれぞれに大きなバラツキがあるのが普通である。
そのため、各細胞に対する注入針の位置操作を同一に行ったのでは、多くの細胞に対して針が刺さらないか、或いは、多くの細胞を破壊する結果になる。
従って、殆どの場合、確実性の点から、トラップされた１個１個の細胞に対して、顕微鏡で観察しながら針を刺入していくことが求められている。
【０００６】
このように、現時点では、確実性の点から、トラップされた１個１個の細胞に対して、顕微鏡で観察しながら針を刺入していくことが求められていることから、顕微鏡で観察しながらの細胞のトラップや針の刺入などをより効率化する技術が要望されている。
【０００７】
ところで、上記いずれの発明も含めて、これまで開発されたマイクロインジェクション装置は、いずれも基板表面に規則的に貫通孔をあけて、その開口端に細胞を保持することを行っており、基板の表面に細胞を保持するように構成されている。
【０００８】
しかしながら、ガラス基板などの透明基板に微小な貫通孔をあけることは極めて難しいことから、実際には微小な貫通孔をあける基板としては、シリコン基板を用いざるを得ない。
その場合、シリコン基板は可視光を透過しないため、落射型反射照明方式で細胞を観察しなければならなくなる。
しかも、貫通孔部では光が反射されず、若しくは乱反射されて、その直上にある部分は暗部となって観察が困難になる。さらに、針の動く方向と顕微鏡観察方向がほぼ同じであるため、実際に顕微鏡観察を行うことは極めて難しく、特に、作業距離が短くなる高倍率での観察は実際上不可能である。
また、仮に顕微鏡観察できたとしても、針が顕微鏡の焦点深度の方向で動くため、動きと共に像がぼけて、その位置操作は極めて難しくなる。
【０００９】
従って、基板の表面に細胞を保持するように構成されているこれまでのマイクロインジェクション装置では、確実性の点から求められている顕微鏡で細胞を観察しながらの針刺入を行うことは、殆ど不可能である。
【００１０】
以上のような数々の問題点があったため、上記のマイクロインジェクション法において、顕微鏡で観察しながら細胞のトラップや針の刺入などをより効率化する技術は、その実用化が進んでいないのが現状である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マイクロインジェクション法の実際の使用における種々の問題を解決し、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子（例えば、細胞）に物質を注入することのできる方法ならびにこの方法の実施に好適な装置の提供を目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、マイクロインジェクション法の実施にあたり、基板表面に多数の貫通孔をあけてその開口端に細胞をトラップする方法、即ち、基板の表面に細胞をトラップするこれまでの方法に替えて、基板の端面（側面）に粒子トラップ用開口端を有するマイクロチャネルアレイ装置を用いて該開口端に細胞を吸入トラップすることにより、顕微鏡観察の方向とその焦点深度内でのマイクロピペット先端の移動を可能にし、それにより実際上効率良く物質の注入を行えることを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに到った。
【００１３】
本発明者は、これまでシリコン基板に加工した微細な溝のアレイをガラス基板で覆うことによりマイクロチャネルアレイを作成する方法を考案し、その血液成分測定への応用（特開平２−１３０４７１号公報、特許第２５３２７０７号公報）、粒子の濾過，分級への応用（特開平１１−１６５０６２号公報）等を開発してきたが、マイクロチャネルアレイのマイクロインジェクション法への利用、第１基板と第２基板の密着部のマイクロチャネル開口端を利用して第１基板端面に粒子を保持するマイクロチャネルアレイ装置等は、本発明者が今回初めて発明したものである。
【００１４】
即ち、請求項１に係る本発明は、基板を貫通する貫通孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第１基板と、透明な第２基板とからなり、前記第１基板の表面に前記第２基板を接合させることにより、前記第１基板と前記第２基板との接合部であって前記第１基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするマイクロチャネルアレイ装置を提供するものである。
【００１５】
請求項２に係る本発明は、第１基板がシリコン基板であり、第２基板が透明なガラス基板である請求項１記載のマイクロチャネルアレイ装置を提供するものである。
【００１６】
請求項３に係る本発明は、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とする粒子保持方法を提供するものである。
【００１７】
請求項４に係る本発明は、吸引トラップされる粒子が、細胞である請求項３記載の粒子保持方法を提供するものである。
【００１８】
請求項５に係る本発明は、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子を吸引トラップすることを特徴とする請求項４記載の粒子保持方法を提供するものである。
【００１９】
請求項６に係る本発明は、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とする細胞保持ならびに物質注入装置を提供するものである。
【００２０】
請求項７に係る本発明は、請求項６記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とする細胞保持ならびに物質注入方法を提供するものである。
【００２１】
請求項８に係る本発明は、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入する請求項７記載の細胞保持ならびに物質注入方法を提供するものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を示す。
まず請求項１に係る本発明は、マイクロチャネルアレイ装置に関し、基板を貫通する孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第１基板と、透明な第２基板とからなり、前記第１基板の表面に前記第２基板を接合させることにより、前記第１基板と前記第２基板との接合部であって前記第１基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするものである。
このような請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置について、図面を参照しつつ説明する。図１は、第１基板１１の１例を示す正面図であり、第１基板１１上に存在する窪みと溝のデザインの１例が示されている。図２は、図１のＡ部を拡大した説明図である。図３は、第１基板１１と、透明な第２基板１５とからなる、請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置の側面を一部拡大した図であって、細胞をトラップしている状態を示す説明図である。
【００２３】
請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、下記に示すような第１基板１１と第２基板１５とを接合、密着させることにより得られる。
第１基板１１は、平面形状が略長方形状をなす、薄板状のものであって、特に請求項２に記載したように、シリコン基板からなるものである。この第１基板１１の表面には、該基板を貫通する孔１４を有する窪み１２と、該窪み１２と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝１３とが設けられている。図１、図２中、窪み１２の端とそれに平行する第１基板１１の端をつなぐ多数の短い線分のそれぞれが溝１３を示している。
ここで窪み１２の平面形状は、図１では略「エ」字状とされているが、これに限定されるものではなく、例えば第１基板１１の略全体をカバーする略長方形状をなすものとしてもよい。また、図１に示す第１基板１１は、図２、図３では、周縁部にテーパー（勾配）を付けたものとされているが、このテーパーはなくとも差し支えない。
【００２４】
第１基板１１には、さらに基板の表裏面を貫通する貫通孔１４が窪み１２の中に設けられている。図１では、貫通孔１４として、平面形状が円形のものが示されているが、これに限定されるものではなく、該貫通孔１４を通して引圧をかけられるものであれば、平面形状が角形のものなどであっても差し支えない。また、図１では、貫通孔１４は、第１基板１１の中央部に設けられているが、１例を示したものであって、これに限定されるものでないことは、言うまでもない。
【００２５】
さらに、第１基板１１には、窪み１２と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝１３が設けられている。
即ち、第１基板１１には、図１、図２に示すように、窪み１２の周囲の基板表面に、窪み１２の端とそれに平行する第１基板１１の端面の間を連通する（つなぐ）微細な溝１３が、基板の端面に沿って（図１では上下の端面に沿って）多数設けられている。このように、窪み１２の端とそれに平行する基板の端面の間を、多数の微細な溝１３が連通するようになっている。
【００２６】
このような第１基板１１は、例えばフォトリソグラフィーとエッチングの技法を用いて、以下のようにウェーハー（シリコン単結晶からなる基板用薄板）を加工することにより得ることができる。
まず、１回目のフォトリソグラフィーとエッチングで、溝１３を加工し、次に２回目のフォトリソグラフィーとエッチングで窪み１２を加工する。さらに、貫通孔１４をサンドブラスト法等で加工し、最後にウェーハーをカットすることにより、第１基板（チップ）１１を作製することができる。
【００２７】
ウェーハーのカットには、端面がきれいに仕上がることから、高密度プラズマによる異方性エッチングを用いることが望ましい。
ここで高密度プラズマによる異方性エッチングとは、基板表面に塗布したフォトレジストにフォトリソグラフィ工程によってカット部分を形成し、そのフォトレジストをマスクとして反応性イオンの高密度プラズマによるエッチングでカットする技術である。
この他に、ダイシングカットでも、端の欠けが最小限になるように注意して行うことで、実用に耐える端面を得ることができる。また、ある深さまでエッチングで彫り、それから残りをダイシングカットしても良い。
【００２８】
このような第１基板１１の大きさは特に限定されないが、粒子、特に細胞のトラップに用いられることから、通常、縦８〜１２ｍｍ、横１６〜２４ｍｍ、厚さ０．４〜０．６ｍｍ程度のものであって、溝１３の幅が０．００２〜０．０２ｍｍ、長さが０．０５〜０．２ｍｍ程度のものである。
【００２９】
次に、上記第１基板１１と接合、密着させられる第２基板１５は、透明な基板であって、請求項２に記載したように、通常は、透明なガラス基板からなるものである。
従って、第１基板と第２基板とは、請求項２に記載したように、それぞれシリコン単結晶からなるシリコン基板と、透明なガラスからなる透明なガラス基板とであることが好ましい。
この第２基板１５は、通常、上記第１基板１１と略同様の平面形状を有するものであって、第１基板１１より大きいものとすると、図３に示されるように、第１基板１１の端面と第２基板１５の表面とで形成されるコーナー部に、粒子（細胞）１６を確実に保持することができる。第１基板１１より大きければ、第２基板１５は勿論円盤形状であってもよい。
【００３０】
請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、上記第１基板１１の表面に、即ち窪み１２や溝１３などが設けられている側に、上記第２基板１５を接合、密着させたものである。
上記第１基板１１の表面に上記第２基板１５を接合、密着させることにより、第１基板１１と第２基板１５との接合部であって第１基板１１の端面に、溝１３によって形成される粒子トラップ用開口端Ｂがいわば自動的に形成される。この粒子トラップ用開口端Ｂに粒子（細胞）１６をトラップ（捕捉）する。
【００３１】
上記したように、平面形状が第１基板１１より大きい第２基板１５を用いると、図３に示されるように、粒子トラップ用開口端Ｂ付近に、第１基板１１の端面と第２基板１５の表面とでコーナー部が形成され、このコーナー部に、粒子（細胞）１６を確実に保持することができる。
【００３２】
第１基板１１の表面に上記第２基板１５を接合、密着させる方法としては、例えば陽極接合法を用いることもできるが、好ましくは必要に応じて取り外し可能とするため、ホルダー等を用いて機械的に両者を圧着させるとよい。
【００３３】
図４、図５に、第１基板１１の表面に上記第２基板１５を、ホルダーを用いて機械的に接合、密着させた状態を示す。図４は、その正面図であり、図５はその平面図である。この図４、図５は、第２基板１５として、円盤状のガラス基板を用いた例である。
図中、符号１７はホルダーを示しており、押しネジ１８、樹脂ブロック１９、Ｏリング２０、載置台２１などから構成されている。このようなホルダー１７の押しネジ１８で樹脂ブロック１９を押すことにより、Ｏリング２０を介して、第１基板１１が第２基板１５に押しつけられ、接合、密着させられる。
通常、第２基板１５上にセンターガイド用基板１５ａを載せ、該センターガイド用基板１５ａの中央に第１基板１１が丁度入る大きさの円形の孔を開けておく。そうすることで、第１基板１１を第２基板１５の中央に容易に置くことができる。該センターガイド用基板１５ａは、プラスチック基板でよい。
この場合、第１基板１１の元の表面（溝１３、窪み１２以外の部分であって、第２基板１５と密着する部分）を光学研磨しておくと共に、第２基板１５の表面も光学研磨されたものを用いることにより、両者の密着度を十分に高くし、漏れを防ぐことができる。
【００３４】
一般に、細胞試料を調製するとき、一部の細胞が壊れ、その断片等が混在することが一般的である。また、その混在物を取り除けない場合が多い。
そのため、第１基板１１端面の開口部Ｂに粒子（細胞）１６を吸引トラップするときにも、混在物が吸引されることがあり、しばしばマイクロチャネルを構成している一部の溝１３が詰まる結果になる。
上記の如く、図４、図５に示すように、第１基板１１と第２基板１５とを機械的に圧着させた場合には、使用後、これら基板を取り外して洗浄し、再度両者を圧着させることにより、容易に詰まりを取り除くことができ、従って再使用が可能となる。一方、溶着により接着させた場合には、詰まりを取り除くことは困難であり、再使用が難しくなる。
【００３５】
請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、このように第１基板１１の表面に第２基板１５を接合、密着させることにより、第１基板１１と第２基板１５との接合部であって第１基板１１の端面に、溝１３によって形成される粒子トラップ用開口端Ｂが形成されており、この粒子トラップ用開口端Ｂに粒子（細胞など）１６をトラップ（捕捉）する。
図５に示したように、粒子トラップ用開口端Ｂが形成されている第１基板１１の端面２２は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、また、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明での顕微鏡観察が可能となっている。
【００３６】
このような請求項１又は２に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置を用いた粒子保持方法を提供するのが、請求項３に係る本発明である。
請求項３に係る本発明は粒子保持方法に関し、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とするものである。
なお、後述する図６は、請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の１例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図であるが、粒子１６を吸引トラップするところまでの装置は、この請求項３に係る本発明の方法でも利用されるものであるので、適宜、これを参照して説明することとする。
【００３７】
請求項３に係る本発明では、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を用いる。これについては、上記した通りである。
請求項３に係る本発明では、このような請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第１基板１１の貫通孔１４を通して引圧をかけ、それによって第１基板１１端面に形成されている粒子トラップ用開口端Ｂに粒子１６を吸引トラップする。
【００３８】
例えば、まず初めに、粒子トラップ用開口端Ｂ付近であって、第１基板１１の端面と第２基板１５の表面とで形成されるコーナー部近傍に、粒子（細胞など）１６を置いて、粒子１６を粒子トラップ用開口端Ｂに吸引トラップする準備をする。
なお、粒子１６をコーナー部近傍に置く手段は、特に限定されないが、先端径が大きいマイクロピペットとそれを操作するためのマイクロマニピュレータを別に用意し、そのマイクロピペット内に粒子浮遊液を予め入れておき、マイクロマニピュレータでマイクロピペット先端位置をコーナー部近傍に持っていき、粒子浮遊液をマイクロピペットより押出せばよい。粒子を粒子トラップ用開口端Ｂにさらに近付けるには、請求項６に係る本発明において示すような粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７をマイクロマニピュレータ２８を用いてマイクロピペット先端で粒子を押す等の操作をすればよい。しかし、吸引すれば周りの液体と共に粒子が動いて開口端に来るので、一般にその操作は不要である。その際、センターガイド用基板１５ａの中央に開けられている孔は液溜め１５ｂになる。次に、第１基板１１に設けられている貫通孔１４を通じて、例えば別途設置した細胞などの粒子１６を吸引トラップするための引圧を発生させる、吸引トラップ用引圧発生器３０などを用いて、引圧をかける。
すると、第１基板１１に設けられている窪み１２を経由して、粒子トラップ用開口端Ｂにも引圧がかかり、粒子１６は前記コーナー部近傍から粒子トラップ用開口端Ｂに吸引トラップされ、そのまま保持される。
【００３９】
なお、吸引トラップの対象となる粒子としては、例えば請求項４に記載したように、マイクロインジェクション法において、ＤＮＡ等の物質が注入される対象となる細胞などが挙げられる。
【００４０】
ここで、請求項５に記載したように、第１基板１１の端面に形成されている粒子トラップ用開口端Ｂの近傍を、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子１６を吸引トラップすると、粒子１６に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となり、同時に、落射型反射照明を用いて、窪み１２や溝１３が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も同時に顕微鏡観察することができる。従って、より確実に細胞などの粒子１６を保持することができる。
【００４１】
次に、請求項６に係る本発明は細胞保持ならびに物質注入装置に関し、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とするものである。
【００４２】
図６は、請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の１例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図である。
請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置を有している。このようなマイクロチャネルアレイ装置は、前記したように、基板を貫通する貫通孔１４を有する窪み１２と、該窪み１２と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝１３とを該基板表面に有する第１基板と、この第１基板の表面に接合される透明な第２基板１５とからなり、前記第１基板１１の表面に前記第２基板１５を接合させることにより、第１基板１１と第２基板１５との接合部であって第１基板１１の端面に、溝１３によって形成される粒子トラップ用開口端Ｂが形成されているものである。この粒子トラップ用開口端Ｂに粒子（細胞）１６をトラップ（捕捉）する。
【００４３】
請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、請求項１又は２記載のマイクロチャネルアレイ装置の他に、まず前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ２３を有している。このマイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ２３としては、マイクロチャネルアレイ装置を搭載しうるものであればよく、特に制限されない。
【００４４】
請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、次に透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡２４を有している。図６中、符号２５は透過照明用の光源を示しており、符号２６は落射型照明用の光源を示している。これらは、既知のものを用いることができる。
【００４５】
請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、さらに粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ２８、前記マイクロピペット２７から物質を押し出すための圧発生器２９、及び、吸引トラップ用引圧発生器３０とを有している。これらについても、既知のものを用いることができる。さらに、図４、図５に示すようなホルダー１７を用いて、第１基板１１と第２基板１５とを機械的に密着させることがより好ましい。
【００４６】
このような請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置によれば、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子（例えば、細胞）に物質を注入することができる。
請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いた、そのような効率のよい細胞保持ならびに物質注入方法を提供するのが、請求項７と請求項８に係る本発明である。
【００４７】
即ち、請求項７に係る本発明は細胞保持ならびに物質注入方法に関し、請求項６記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第１基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とするものである。
【００４８】
請求項７に係る本発明において、粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップするところまでは、請求項３、４に係る本発明と同様である。
即ち、まず初めに、粒子トラップ用開口端Ｂ付近であって、第１基板１１の端面と第２基板１５の表面とで形成されるコーナー部近傍に、細胞などの粒子１６を置いて、細胞などの粒子１６を粒子トラップ用開口端Ｂに吸引トラップする準備をする。なお、この操作は、細胞などの粒子浮遊液をコーナー部近傍に注げば充分である。
次に、第１基板１１に設けられている貫通孔１４を通じて、吸引トラップ用引圧発生器３０から引圧をかける。
すると、第１基板１１に設けられている窪み１２を経由して、粒子トラップ用開口端Ｂにも引圧がかかり、細胞などの粒子１６は前記コーナー部近傍から粒子トラップ用開口端Ｂに吸引トラップされ、そのまま保持される。
【００４９】
このように吸引トラップされた細胞などの粒子１６に対して、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７を刺入することにより、細胞内に物質を注入する。
【００５０】
細胞内に物質を注入するにあたっては、透過照明用の光源２５などを用いることにより、細胞などの粒子１６に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となる。このため、透過照明により第１基板１１の端面に形成されている粒子トラップ用開口端Ｂの近傍を顕微鏡２４で観察しながら、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７により容易にＤＮＡ等の物質を刺入することが可能である。
【００５１】
さらに、請求項８に記載したように、透過照明用の光源２５と共に、落射型反射照明用の光源２６を用いることにより、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いての顕微鏡観察ができ、細胞などの粒子１６に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となると同時に、落射型反射照明を用いて、窪み１２や溝１３が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も顕微鏡観察することができる。従って、より確実、かつより容易にＤＮＡ等の物質を刺入することが可能である。
【００５２】
なお、図６では、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７は、第２基板１５に対し約４５度の傾きで描かれているが、これに限定されるものではなく、本発明では、細胞等の粒子が第１基板１１と第２基板１５との接合部であって第１基板１１の端面に形成された粒子トラップ用開口端Ｂにトラップされるため、水平に近い角度まで持ってきた状態での操作も可能である。このようにすることにより、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７を動かす方向（水平方向）と顕微鏡２４の観察方向（垂直方向）とがほぼ直交することとなる。従って、高倍率で観察することができ、かつ、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット２７の先端をほぼ顕微鏡２４の焦点深度内で動かすことができ、位置操作をより容易に行うことができる。
【００５３】
なお、上記した如き請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いてポプラプラストを吸引トラップし、細胞刺入用のマイクロピペット（針）を刺したところの顕微鏡画像からの参考図を図７に示す。
ポプラプラスト３１の大きさ、形状、弾力性等は極めて不均一であり、またプロトプラスト浮遊液調製試料は膜破片や葉緑体等の不純物をも含む。
このような不揃いな粒子を対象としてマイクロインジェクションを行う場合には、顕微鏡で観察しながら注入操作を効率良く行うことができる本発明が不可欠である。
【００５４】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されるので、以下に記載するような効果を有する。
（１）請求項１、２に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、従来のように基板の表面に細胞を保持するのではなく、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子トラップ用開口端Ｂが形成されている第１基板１１の端面２２は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、しかも、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明での顕微鏡観察が可能である。
請求項３、４、５に係る本発明の粒子保持方法によれば、透過照明で顕微鏡観察しながら粒子をトラップするすることが可能である。
【００５５】
（２）請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、従来のように基板の表面に細胞を保持するのではなく、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子トラップ用開口端Ｂが形成されている第１基板１１の端面２２は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、しかも、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いての顕微鏡観察ができ、細胞などの粒子に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となると同時に、落射型反射照明を用いて、窪みや溝が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も顕微鏡観察することができる。従って、より確実、かつより容易にＤＮＡ等の物質を刺入することが可能である。
【００５６】
（３）また、請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子にＤＮＡ等の物質を注入する際、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペットの動く方向を水平に近くすることができることから、高倍率での観察と焦点深度内でのマイクロピペット先端の操作が可能である。従って、細胞へのＤＮＡ等の物質の注入を、粒子（細胞）刺入用のマイクロピペットを顕微鏡で観察しながら行うことが可能である。
即ち、細胞に粒子（細胞）刺入用のマイクロピペットでＤＮＡ等の物質を注入するにあたり、マイクロピペットを動かす方向（ほぼ水平方向）と顕微鏡の観察方向（垂直方向）とがほぼ直交するので、細胞を高倍率で観察することができ、また、マイクロピペット先端を顕微鏡の焦点深度の中で動かすことができる。
【００５７】
（４）さらに、請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置によれば、形状、大きさ、弾力性に大きなバラツキのある複数の細胞であっても、顕微鏡で観察しながら物質の注入を行えるので、確実に物質を注入することができる。
【００５８】
（５）また、請求項１、２に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置と、請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置とにおいて、第１基板と第２基板とを機械的に取り外し自在に接合、密着させた場合には、細胞試料に混在する細胞断片等の混在物が吸引されてたとしても、使用後、基板同士を取り外して洗浄し、再度接合、密着させることにより、容易に詰まりを取り除き、再使用に供することができる。
【００５９】
以上のように、本発明によれば、マイクロインジェクション法の実際の使用において、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子（例えば、細胞）に物質を注入することが可能であり、マイクロインジェクション法の効率を著しく高めることができる。
従って、本発明は、マイクロインジェクション法の効率を大幅に高めることができるので、医学、生化学、遺伝子工学等の各分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１基板の１例を示す正面図である。
【図２】図１のＡ部を拡大した説明図である。
【図３】第１基板と、透明な第２基板とからなる、請求項１に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置の側面を一部拡大した図であって、細胞をトラップしている状態を示す説明図である。
【図４】第１基板の表面に第２基板を、ホルダーを用いて機械的に接合、密着させた状態を示す正面図である。
【図５】図４の平面図である。
【図６】請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の１例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図である。
【図７】請求項６に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いてポプラプラストを吸引トラップし、細胞刺入用のマイクロピペット（針）を刺したところの顕微鏡画像からの参考図である。
【符号の説明】
１１  第１基板（シリコン基板）
１２  窪み
１３  溝
１４  貫通孔
１５  第２基板（ガラス基板）
１５ａ  センターガイド用基板
１５ｂ  液溜め
１６  粒子（細胞）
１７  ホルダー
１８  押しネジ
１９  樹脂ブロック
２０  Ｏリング
２１  載置台
２２  粒子トラップ用開口端Ｂが形成されている第１基板の端面
２３  マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ
２４  顕微鏡
２５  透過照明用の光源
２６  落射型照明用の光源
２７  粒子（細胞）刺入用のマイクロピペット
２８  マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ
２９  マイクロマニピュレータから物質を押し出すための圧発生器
３０  吸引トラップ用引圧発生器
３１  ポプラプロトプラスト
Ａ  拡大されて図２として示されている部分
Ｂ  粒子トラップ用開口端
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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