【手続補正書】
【提出日】平成29年3月13日(2017.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、
（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸、および
（ｃ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、請求項１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３】
前記グリセロール−１−ホスファターゼが、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項２に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項４】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項５】
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項６】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、請求項３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項７】
イソプレノイドを産生することができる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項８】
イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む、請求項７に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、
（ｂ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む、
（ｃ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、
（ｄ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む、
（ｅ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む、
（ｆ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、
（ｇ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、または
（ｈ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、
請求項８に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、請求項８に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１１】
（ａ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が単一の転写調節因子の制御下にある、
（ｂ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、
（ｃ）イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、
（ｄ）ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、または
（ｅ）ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、
請求項８から１０までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１２】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、あるいは
（ａ）前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、
（ｂ）前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、または
（ｃ）前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される、
請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１３】
細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１４】
酵母細胞である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１５】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１４に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１６】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１７】
イソプレノイドを産生するための方法であって、
（ａ）請求項７から１６までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリセロール−１−ホスファターゼがＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊される、
（ｂ）ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊される、
（ｃ）ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊される、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１８から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１８から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、請求項１８から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される。一部の実施形態では、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態では、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態では、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方を機能的に破壊する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態では、宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
（項目２）
ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸をさらに含む、項目１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３）
（ａ）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
（項目４）
ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸をさらに含む、項目３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目５）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、項目１から４までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目６）
前記グリセロール−１−ホスファターゼが、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、項目５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目７）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目８）
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目９）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１０）
イソプレノイドを産生することができる、項目１から９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１１）
イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１２）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１３）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１４）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１５）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１６）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１７）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１８）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１９）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２０）
前記ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２１）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が単一の転写調節因子の制御下にある、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２２）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２３）
イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２４）
ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２５）
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２６）
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、項目２５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２７）
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２８）
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２９）
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３０）
細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、項目１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３１）
酵母細胞である、項目１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３２）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３３）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、項目１から３２までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３４）
イソプレノイドを産生するための方法であって、
（ａ）項目１０から３３までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。
（項目３５）
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
（項目３６）
前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡの産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
（項目３８）
前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、項目３５から３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記グリセロール−１−ホスファターゼがＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、項目３５から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記宿主細胞が酵母細胞である、項目３５から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、項目３５から４６までのいずれか一項に記載の方法。