【手続補正書】
【提出日】平成29年6月23日(2017.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置から培地を除去するための装置であって、
気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに接続でき、前記フィルタを介して前記気体透過性細胞培養装置内に気体を送出することができ、細胞培養装置の内容積を加圧する働きを有する気体送出部と、
前記気体透過性細胞培養装置に接続している培地除去導管内へ移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出でき、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止できる第１流体流動制御部へ信号を送ることができる第１流体検出部とを含むもの。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記気体透過性細胞培養装置に接続された細胞除去導管内を移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出でき、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止可能な第２流体流動制御部へ信号を送ることができる第２流体検出部を含むもの。
【請求項３】
請求項１の装置を使用する方法であって、
細胞および培地を含み培地除去導管を備えた気体透過性細胞培養装置内の液体培地の容量を減らして培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させるため、気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに前記気体送出部を接続し、前記第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置に移動させ、その気体により細胞培養装置を加圧することで培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続された培地回収容器内へ移し、前記第１流体検出部により前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行った際に前記第１流体検出部から前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記第１流体流動制御部が前記信号を受け取った際に前記第１流動制御部で前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項４】
請求項２の装置を使用する方法であって、
液体培地および細胞を含み培地除去導管および細胞除去導管を備える気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに前記気体送出部を接続し、前記細胞の少なくとも一部が前記細胞培養装置内の培養面と接触するようにし、前記細胞培養装置が、第１流体検出部を前記培地除去導管に接続し、前記第１流体流動制御部を前記培地除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置に移動させ、その気体により細胞培養装置を加圧して前記細胞培養装置から前記培地除去導管に接続された培地回収容器内に培地を移し、前記第１流体検出部で前記培地除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行ったら前記第１流体検出部から前記第１流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取ったら前記第１流動制御部で前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させることにより気体透過性細胞培養装置内の培地１ミリリットル当たりの細胞数を増大させ、
前記第２流体検出部を前記細胞除去導管に接続し、前記第２流体流動制御部を前記細胞除去導管に接続し、前記気体送出部からの気体送出を開始することにより、気体を前記細胞培養装置内に移動させて細胞培養装置を加圧し、かつ、前記細胞除去導管によって前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内へと培地および細胞を移し、前記第２流体検出部により前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、検出した際に前記第２流体検出部から前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取った際に前記第２流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させることにより前記気体透過性細胞培養装置から細胞を除去する工程も含む方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、前記第２流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を大気に通気し、前記第１流動制御部を開放して前記培地除去導管を通る流体が流れられるようにし、培地を前記培地除去導管に通して前記細胞培養装置内へ移動させ、前記第１流動制御部を閉鎖し、前記培地を撹拌して細胞を前記培地内に移動させ、
これ以降は前記細胞培養装置を大気に通気させないようにし、気体を前記気体送出部から前記細胞培養装置内に送出して細胞培養装置を加圧し、前記細胞培養装置から前記細胞除去導管に接続された細胞回収容器内に培地および細胞を移し、前記第２流体検出部により前記細胞除去導管を通って移動する流体がいつ液体から気体へと変化したのかを検出し、その検出を行った際に前記第２流体検出部から前記第２流体流動制御部に信号を送り、前記信号を受け取った際に前記第２流動制御部で前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項６】
細胞および培地を含む気体透過性細胞培養装置内の培地容量を減らす方法であって、
培地容量を減らして培地１ミリリットル当たりの細胞濃度を増大させるため、培地除去導管を備える細胞培養装置を加圧する働きを有する気体送出部を、第１容量の培地と培養面上にある細胞とを含む気体透過性細胞培養装置に接続されたフィルタに接続し、気体を前記気体送出部から送出することにより前記細胞培養装置内に移動させて細胞培養装置を加圧し、その気体により培地を前記細胞培養装置から前記培地除去導管を経由して培地回収容器内へ移し、前記培地除去導管を通って移動する流体が培地から気体へと変化したときに、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させ、前記第１容量未満の残量となった培地および細胞を前記細胞培養装置内に残す方法。
【請求項７】
細胞を回収する工程をさらに含む請求項６の方法であって、前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させた後、培地が前記培地除去導管の培地除去開口と接触した状態で、前記気体送出部から送出した気体を前記細胞培養装置内に移動させて前記細胞培養装置を加圧し、前記残量の培地および細胞を前記培地除去導管を通じて前記細胞回収容器内に移し、前記培地除去導管を通って移動する流体が培地から気体へと変化したときに前記培地除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項８】
請求項４の方法であって、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させた後、前記細胞培養装置を洗い流して前記細胞培養装置および／または前記細胞除去導管内に残っている可能性がある細胞を回収する更なる工程を含み、前記細胞培養装置を大気に通気する際に、前記培地除去導管を通る液体の流れを開始する工程をさらに備え、前記液体が前記培地除去導管を通って前記細胞培養装置内に移動し、液体を撹拌して前記細胞培養装置内の細胞を前記液体中に移動させ、
前記気体送出部から前記細胞培養装置内への気体送出を開始することにより気体で細胞培養装置を加圧し、液体および細胞を前記細胞培養装置から細胞回収容器内へと前記細胞除去導管を介して移し、前記細胞除去導管を通って移動する流体が液体から気体へと変化したときに、前記細胞除去導管を通る流体の流れを停止させる方法。
【請求項９】
請求項３または６の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜２５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３または６の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜２０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項３または６の方法であって、最初の培地の高さが１．０ｃｍ〜１５ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項３または６の方法であって、最初の培地の高さが２．０ｃｍ〜１０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項４または６の方法であって、培養面が疎水性であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項４または６の方法であって、培養面がシリコーンであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、シリコーンの厚さが０．０２５４ｍｍ（０．００１インチ）と０．６０９６ｍｍ（０．０２４インチ）の間の厚さであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項３、請求項４、請求項６のいずれか一項の方法であって、細胞が非接着性細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、細胞がＴ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、Ｔ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１の装置であって、気体送出部がダイアフラムポンプであることを特徴とする装置。
【請求項２０】
請求項３または４の方法であって、第１流体流動制御部により培地除去導管を通る流体の流れを停止したときに残る培地の高さが０．２０ｃｍ〜１．０ｃｍの範囲であることを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
不運にも、標準の閉鎖系流体処理方法を使用して、同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および’７６８にて開示したもののような装置において培地容量を減らす新規な能力の強みを十分に利用すると、細胞損失に繋がり、かつ、培養装置を損傷するかもしれず、そのために、Ｔ細胞療法、養子免疫療法および／または養子細胞療法用途は高額の医療費がかかるかもしれないことを見つけた。図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄをまとめると、Ｇ−Ｒｅｘ（商標）装置および同時係属‘８１４、‘８４８、‘５９７、‘７００および’７６８に開示するもののような他の気体透過性装置から細胞を回収する前に、従来の培地処理ツールや方法を用いて培地容量を減らそうとする際に発見した問題の例を示している。図１Ｂは、廃液容器１３２を培地除去導管１１０に装着した後の、図１Ａに記載した装置を示す。細胞１１６を回収しなければならない初期培地容量１２０Ａの量を減らす際の第１工程として、培地除去導管１１０を介して廃液容器１３２にそれを圧送することによって、初期培地容量１２０Ａの一部を細胞培養／細胞回収装置１００から引き出す。培地を圧送する一般的な方法は、蠕動ポンプ１３４を用いて培養装置から培地を引き出すことである。図１Ｃに示すように、初期培地容量の一部を細胞培養／細胞回収装置１００から除去すると、滅菌通気口フィルタ１２８全体で圧力が降下し、内容物１１４が大気圧よりも低くなり、通常は装置の内容物１１４内がすばやく真空になる。培養面１０６は、ほとんどの場合で、材料を薄くかつ脆くさせる気体を透過する性質を有する気体透過性材料を含むのが好ましいため、真空が形成されると、培養面１０６はあっという間にその望ましい水平平面状態から引っ張られて、図に示すように新らしく非平面の配置になる。更に、蠕動ポンプのローラー１３６が回転すると、ローラー間の間隙により装置内に真空が発生してパルスし、それにより拡張した培養面１０６をパルスし、細胞１１６を取り除き、培地全体に取り除いた細胞を分散させる。その後、図１Ｄに示すように、培地を廃液容器１３２内へ引き抜き続けると、細胞１１６も廃液容器１３２内へ引き抜かれる。この一連の事象により、相当数の細胞が廃液容器内に分配される可能性が高い。患者の病気の経過は治療用量における細胞数に相関しているので、これら貴重な細胞の損失のために高額の医療費がかかることもある。また、細胞が失われないとしても、培養面は、培地除去導管に引き込まれて損傷を受ける可能性がある。例えば、培養面に穴が開くと、細胞培養設備内のものをバイオハザードに曝す可能性があることに加えて、培養物を汚染し、患者への使用に適合しなくなる可能性がある。培養面が培地除去導管によって損傷しないとしても、培地除去導管に引き込まれる場合は、培地および細胞をこれ以上除去できない可能性がある。要約すると、その平らで望ましい水平な状態から培養面を引っ張ることは、細胞損失、細胞の除去ができないこと、その膨張に起因する培養面の損傷、培地除去導管との物理的接触に起因する培養面への損傷、培養物の汚染、製造労働者のバイオハザードへの暴露、のいずれか、或いはすべてを引き起こすかもしれない。したがって、これらの危険を回避する細胞回収方法が必要となる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
一般に、細胞培養を行った後に、細胞は気体透過性材料を含む装置の底部に引き寄せられていて装置が依然として培地を保持しているとき、装置の内容物を加圧する方法で細胞培養／細胞回収装置内へある容量の気体を移動させる場合に有利である。好ましくは、第１容量の気体を装置内へ移動させて、第１容量の培地を装置から廃液容器内へ移動させる。当該工程は、細胞が存在する培養面が水平面を向くように置いた装置で行われることが好ましい。この工程が完了すると、培地の残留量が装置内に残り、細胞も装置内に残る。第２容量の気体を装置内へ移動させ、それにより、装置から培地の残留量および細胞を移し、培地の残留量および細胞を細胞回収容器内へ移動させる。このようにして、培地容量の細胞数に対する比が減少する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
図２Ａから図２Ｅは本発明の実施例の実例を提供し、これは、図１Ｂ〜図１Ｄに示す課題を、真空下で装置から培地を引き出すのとは異なり、圧力下で装置から培地或いは培地と細胞を追いやる細胞培養／細胞回収装置に気体を押し込むことによって解決する。この手法は、真空の形成を防止し、培養面の上方への歪みを防止し、迅速に細胞を取り除くことができる平面状態になるならないを繰り返す培養面のパルスを防止することのいずれか或いはすべてにより、細胞損失の可能性、装置への損傷のいずれか或いは両方を最小限に抑える。図２Ａでは、細胞培養／細胞回収装置１０００の細胞培養の向きおよびその装置の静止細胞培養状態での断面図を示している。細胞培養／細胞回収装置１０００は、上端１０１２およびそれより低い位置にある培養面１００６により区切られた内容物１０１４と、通気口１０２８と、培地除去開口部１００８を備えた培地除去導管１０１０とを含む。培地除去導管クランプ１００９は、内容物１０１４内に培地を保持するべく閉鎖位置にある。上端１０１２は、側壁１０５４によって培養面１００６に隣接するのが好ましく、側壁１０５４は培養面１００６に垂直であり、かつ、剛性であるので、接種した細胞は培養面１００６上に均一に広がることができる。初期培地容量１０２０Ａは装置内に存在する。初期培地容量１０２０Ａの高さは、細胞培養／細胞回収装置１０００の境界内にて初期培地高さ１０２１Ａとし、この高さは最も高い培地面から最も低い培地面までの距離に等しい。細胞１０１６も存在しており、培養面１００６上に引き寄せられている。培養面１００６は、平面状とするのが好ましく、培養作業中は水平方向に置かれ、無孔性で気体透過性かつ液体不透過性の材料を含み、非接着性細胞を培養する場合には疎水性とする。培地除去開口部１００８は、培養面１００６から少し離れており、図で分かるように、離れていることで残留培地高さ１０２１Ｂが決まる。細胞培養作業のある時点では、初期培地容量１０２０Ａをより少量の残留培地容量まで減らす培地除去作業を行って、新鮮な培地を追加するか細胞を残留培地容量まで濃縮することが望ましい。