【手続補正書】
【提出日】平成29年2月15日(2017.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みのための組み合わせ物であって、
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチドと、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣと
を含む組み合わせ物。
【請求項２】
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みのための、
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチド
を含む、組成物であって、
前記組成物が、外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣと組み合わせて投与される、組成物。
【請求項３】
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みのための、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣ
を含む組成物であって、
前記組成物が、少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチドと組み合わせて投与される、組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列に隣接する、前記選択された遺伝子に対して相同性の領域をさらに含む、請求項１に記載の組み合わせ物あるいは請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種のヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系からなる群から選択される、請求項１または請求項４に記載の組み合わせ物あるいは請求項２〜４いずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記外因性配列が、タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列またはｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１、４および５のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質コード配列が、抗体、抗原、酵素、増殖因子、細胞表面受容体、核受容体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターまたはそれらの組合せをコードする、請求項６に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項８】
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列の発現を駆動するプロモーターを含む、請求項１および４〜７のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ  ＭＣ、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、請求項１および４〜８のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記選択された遺伝子がセーフハーバー遺伝子である、請求項１および４〜９のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項１および４〜１０のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞が幹細胞である、請求項１１に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項１３】
請求項１および４〜１２のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜１２のいずれかに記載の組成物によって作製された細胞または細胞株。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞から作製された遺伝子導入生物。
【請求項１５】
外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の組込みを介した改変を受けている細胞において、毒性効果を低下させるための組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は、
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチドと、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣと
を含み、それによって、前記毒性効果が、前記外因性配列がプラスミドまたはウイルスベクターを使用して送達される細胞と比較して低下される、組み合わせ物。
【請求項１６】
外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の組込みを介した改変を受けている細胞において、毒性効果を低下させるための、
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチド
を含む組成物であって、
前記組成物が、外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣと組み合わせて投与され、それによって、前記毒性効果が、前記外因性配列がプラスミドまたはウイルスベクターを使用して送達される細胞と比較して低下される、組成物。
【請求項１７】
外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の組込みを介した改変を受けている細胞において、毒性効果を低下させるための、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、選択された遺伝子中に組み込まれる、ＤＮＡ  ＭＣ
を含む組成物であって、
前記組成物が、少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ポリヌクレオチドと組み合わせて投与され、それによって、前記毒性効果が、前記外因性配列がプラスミドまたはウイルスベクターを使用して送達される細胞と比較して低下される、組成物。
【請求項１８】
対象において外因性配列を発現させるための請求項１および４〜１２のいずれかに記載の組み合わせ物または請求項２〜１２のいずれかに記載の組成物であって、
外因性配列が細胞中に組み込まれ、
前記細胞が前記対象において前記外因性配列を発現するように、前記対象に前記細胞が投与されることを特徴とする、組み合わせ物または組成物。
【請求項１９】
前記細胞が幹細胞である、請求項１８に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、前記細胞が骨髄移植において投与される、請求項１９に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項２１】
前記対象が、前記細胞を投与する前に、骨髄破壊的前処理を受ける、請求項２０に記載の組み合わせ物または組成物。
【請求項２２】
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みを実施するためのキットであって、請求項３に記載の組成物、または請求項３に従属する場合の請求項４〜１２のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項２３】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチド、細胞、試薬およびそれらの組合せをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列およびｍｉＲＮＡ配列からなる群から選択される配列を含む、ＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記配列には、内因性遺伝子に対して相同性の領域が隣接する、ＤＮＡミニサークル。
【請求項２５】
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする配列を含むＤＮＡ  ＭＣ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明のＤＮＡ  ＭＣを含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ  ＭＣ（例えば、ＲＮＡ分子、または適切な発現ベクター中に含有されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。これらのＤＮＡ  ＭＣは、キット中での使用のための目的のドナー分子もまた含み得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞のゲノム中の選択された遺伝子中への導入遺伝子の標的化された組込みのための方法であって、
前記細胞に少なくとも１種のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを投与するステップであって、前記ヌクレアーゼが前記細胞中で発現される場合、前記選択された遺伝子が開裂される、ステップと、
外因性配列を含むＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）を前記細胞に投与するステップであって、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記外因性配列が、前記選択された遺伝子中に組み込まれる、ステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列に隣接する、前記選択された遺伝子に対して相同性の領域をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１種のヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系からなる群から選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記外因性配列が、タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列またはｍｉＲＮＡ配列を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記タンパク質コード配列が、抗体、抗原、酵素、増殖因子、細胞表面受容体、核受容体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターまたはそれらの組合せをコードする、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＤＮＡ  ＭＣが、前記外因性配列の発現を駆動するプロモーターを含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ  ＭＣ、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記選択された遺伝子がセーフハーバー遺伝子である、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞である、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が幹細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれかに記載の方法によって作製された細胞または細胞株。
（項目１２）
項目１１に記載の細胞から作製された遺伝子導入生物。
（項目１３）
外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の組込みを介した改変を受けている細胞において、毒性効果を低下させるための方法であって、項目１に記載の方法に従って前記外因性配列を組み込むステップを含み、それによって、前記毒性効果が、前記外因性配列がプラスミドまたはウイルスベクターを使用して送達される細胞と比較して低下される、方法。
（項目１４）
対象において外因性配列を発現させる方法であって、
外因性配列を、項目１〜１０のいずれかに記載の方法に従って細胞中に組み込むステップと、
前記細胞が前記対象において前記外因性配列を発現するように、前記対象に前記細胞を投与するステップと
を含む方法。
（項目１５）
前記細胞が幹細胞である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、前記細胞が骨髄移植において投与される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対象が、前記細胞を投与する前に、骨髄破壊的前処理を受ける、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１〜１０のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、前記外因性配列を含む前記ＤＮＡ  ＭＣを含むキット。
（項目１９）
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチド、細胞、試薬およびそれらの組合せをさらに含む、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
タンパク質コード配列、ｓｈＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ配列およびｍｉＲＮＡ配列からなる群から選択される配列を含む、ＤＮＡミニサークル（ＤＮＡ  ＭＣ）であって、前記配列には、内因性遺伝子に対して相同性の領域が隣接する、ＤＮＡミニサークル。
（項目２１）
少なくとも１種のヌクレアーゼをコードする配列を含むＤＮＡ  ＭＣ。