【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非胚性組織から非胚性幹細胞を単離するための方法であって：
（１）（ａ）ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）アゴニスト；
（ｂ）ＲＯＣＫ（Ｒｈｏキナーゼ）阻害剤；
（ｃ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニスト；
（ｄ）Ｗｎｔアゴニスト；
（ｅ）マイトジェニック増殖因子；及び、
（ｆ）インスリン又はＩＧＦ；
を含む培地であって、
（ｇ）ＴＧＦβ受容体阻害剤；及び
（ｈ）ニコチンアミド又はその類似体；
の少なくとも１つを任意にさらに含んでもよい培地において、前記非胚性組織より解離した上皮細胞を、致死照射されたフィーダー細胞の第一集団および基底膜マトリックスと接触させて培養して、上皮細胞クローンを生成する工程と、
（２）前記上皮細胞クローンから単一細胞を単離する工程と、
（３）工程（２）からの単離された単一細胞を、前記培地において致死照射フィーダー細胞の第二集団および第二の基底膜マトリックスと接触させて個別に培養して、単一細胞クローンを生成する工程と、を含み、
ここで、前記単一細胞クローンのそれぞれは、前記非胚性幹細胞のクローン増殖物であり、それで前記非胚性幹細胞を単離する、前記方法。
【請求項２】
前記非胚性組織が立方又は円柱上皮組織（好ましくは、成体の立方又は円柱上皮組織）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非胚性幹細胞が成体幹細胞（ｐ６３を発現しない成体幹細胞のような）である、または、成体肺組織から単離された成体肺幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単一細胞クローンから単一の非胚性幹細胞を単離する工程をさらに含む、または、前記単一細胞クローンの１つを培養して、前記非胚性幹細胞の系統の細胞系を産生する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非胚性組織が、成体組織、胎児組織、もしくは哺乳動物組織（例、ヒト組織）である；または、肺、食道、胃、小腸、結腸、腸上皮化生、輸卵管、腎臓、膵臓、膀胱、又は肝臓、又はその一部／切片より入手されるか又はそれらに起源がある；請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非胚性組織が、疾患組織、障害組織、異常状態組織、又は前記疾患、障害、又は異常状態を有する患者からの組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（１）において、（上皮）細胞が前記非胚性組織から酵素での酵素消化により解離される、ここで当該酵素は所望によりコラゲナーゼ、プロテアーゼ、ディスパーゼ、プロナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、アキュターゼ（accutase）及び／又はトリプシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（１）において、（上皮）細胞が、前記非胚性組織から、前記（上皮）細胞の周囲にある細胞外マトリックスを溶かすことによって解離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記フィーダー細胞が（フィーダー細胞層を形成する）３Ｔ３−Ｊ２細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基底膜マトリックスがラミニン含有基底膜マトリックス（例、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ基底膜マトリックス（BD Biosciences））であり、好ましくは、増殖因子低下型である；所望により、前記基底膜マトリックスが、３次元成長を支持しないし、３次元成長を支持するのに必要な３次元マトリックスも形成しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（１）前記培地が、熱不活性化されない１０％  ＦＢＳをさらに含む；
（２）前記ノッチアゴニストがジャギド−１（Jagged-1）を含む； 
（３）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＶＩ（Ｙ−２７６３２、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド））、ファスジル（Fasudil）又はＨＡ１０７１（５−（１，４−ジアゼパン−１−イルスルホニル）イソキノリン）、又はＨ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン二塩酸塩）を含む；
（４）前記ＢＭＰアンタゴニストが、ノギン（Noggin）、ＤＡＮ、ＤＡＮシスチンノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質（例、ケルベロス（Cerberus）及びグレムリン（Gremlin））、コーディン（Chordin）、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン（Follistatin）、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、デコリン、又はα−２マクログロブリンを含む；
（５）前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、Ｒ−スポンジン模倣体、Ｗｎｔファミリータンパク質（例、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ５、Ｗｎｔ−６ａ）、ノルリン（Norrin）、又はＧＳＫ阻害剤（例、ＣＨＩＲ９９０２１）を含む；
（６）前記マイトジェニック増殖因子がＥＧＦ（及び／又は角化細胞増殖因子、ＴＧＦα、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ）を含む；
（７）前記ＴＧＦβ受容体阻害剤が、ＳＢ４３１５４２（４−（４−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−５−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド）、Ａ８３−０１、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、又はＳＪＮ２５１１を含む；または
（８）前記培地が、以下：Ｗｎｔ３ａ、ｐ３８阻害剤（例えば、ＳＢ−２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２、ＶＸ−７４５、ＰＤ−１６９３１６、ＲＯ−４４０２２５７およびＢＩＲＢ−７９６）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ガストリン、ＨＧＦ、テストステロン（例えば、（ジヒドロ）テストステロン）、Ｎ２、Ｂ２７、およびＰＧＥ２、の少なくとも１つを欠く；
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＧＦβ（シグナル伝達）阻害剤が、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４、ＴＧＦ−β受容体キナーゼ１、及びＡＬＫ７からなる群より選択される１又はそれ以上のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼへ結合してその活性を低下させる；所望により、前記ＴＧＦβ（シグナル伝達）阻害剤が、１ｎＭと１００μΜの間、１０ｎＭと１００μΜの間、１００ｎＭと１０μΜの間、又は概ね１μΜの濃度で加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が、ＤＭＥＭ：Ｆ１２が３：１の培地中、５μｇ／ｍＬ  インスリン；２ｎＭの（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン）；４００ｎｇ／ｍＬ  ヒドロコーチゾン；２４．３μｇ／ｍＬ  アデニン；１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ；１０％ウシ胎仔血清（熱不活性化無し）；１μＭ  ジャギド−１；１００ｎｇ／ｍＬ  ノギン；１２５ｎｇ／ｍＬ  Ｒ−スポンジン１；２．５μＭ  Ｙ−２７６３２；及び１．３５ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含み、所望により０．１ｎＭ  コレラ腸管毒素をさらに含み；所望により、前記培地は（１）２μＭ  ＳＢ４３１５４２、（２）１０ｍＭ  ニコチンアミド、または（３）２μＭ  ＳＢ４３１５４２と１０ｍＭニコチンアミドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（１）前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が１０ｍＭ  ニコチンアミドをさらに含む；
（２）前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が２μＭ  ＳＢ４３１５４２と１０ｍＭニコチンアミドをさらに含む；
（３）前記非胚性組織が成体小腸であって、前記培地が（１）２μＭ  ＳＢ４３１５４２と、ガストリン（Gastrin）、ＰＧＥ２、Ｗｎｔ３ａの１つ；又は（２）１０ｍＭ  ニコチンアミドとＧＳＫ３阻害剤；をさらに含む；
（４）前記非胚性組織が胎児小腸であって、前記培地が１０ｍＭニコチンアミドをさらに含む；または
（５）前記非胚性組織が胎児小腸であって、前記培地が、ＦＧＦ受容体阻害剤；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；ｐ３８阻害剤（例、ＳＢ−２０２１９０、ＳＢ−２０３５８０、ＶＸ−７０２、ＶＸ−７４５、ＰＤ−１６９３１６、ＲＯ−４４０２２５７、及びＢＩＲＢ−７９６）；ガストリン；ＰＧＥ２；ＦＧＦ受容体阻害剤；Ｓｈｈ；ＴＧＦβ；１０ｍＭニコチンアミドとＴＧＦβ；１０ｍＭニコチンアミドとＷｎｔ３ａ；１０ｍＭニコチンアミドとＧＳＫ３阻害剤；又は１０ｍＭニコチンアミドと２μＭ  ＳＢ４３１５４２；をさらに含む；
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（１）単一細胞として単離される時に、各々の前記単一細胞クローンの内の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、又は約８０％の細胞が単一細胞クローンとして増殖可能である；
（２）前記非胚性幹細胞が、単一細胞として単離される場合に、約５０世代より多く、約７０世代より多く、約１００世代より多く、約１５０世代より多く、約２００世代より多く、約２５０世代より多く、約３００世代より多く、約３５０世代より多く、又は約４００又はこれ以上の世代の自己複製が可能である；
（３）前記非胚性幹細胞が前記非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能である；
（４）前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、（１）ＭＵＣ又はＰＡＳ（杯細胞マーカー）、ＣＨＧＡ（神経内分泌細胞マーカー）、ＬＹＺ（パネート（Paneth）細胞マーカー）、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１３、及びＫＲＴ２０より選択されるマーカーを発現する；及び／又は（２）水と栄養素を吸収する（分化腸細胞によるなど）、粘液を分泌する（分化杯細胞によるなど）、腸管ホルモンを分泌する（分化腸内分泌細胞によるなど）、又は抗菌物質を分泌する（分化パネート細胞によるなど）分化小腸細胞へ分化することが可能である；
（５）前記非胚性幹細胞が、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａより選択される１又はそれ以上の幹細胞マーカーを発現する；
（６）前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、ＯＬＦＭ４、ＳＯＸ９、ＬＧＲ５、ＣＬＤＮ１８、ＣＡ９、ＢＰＩＦＢ１、ＫＲＴ１９、ＣＤＨ１７、及びＴＳＰＡＮ８より選択される１以上のマーカーを発現する；
（７）前記非胚性幹細胞が前記非胚性組織における分化細胞種に関連したマーカー（複数）の発現を実質的に欠いている；
（８）前記非胚性幹細胞が小腸幹細胞であって、ＭＵＣ又はＰＡＳ（杯細胞マーカー）、ＣＨＧＡ（神経内分泌細胞マーカー）、ＬＹＺ（パネート細胞マーカー）、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１３、及びＫＲＴ２０より選択される、分化小腸細胞に関連したマーカーの発現を欠いている；または
（９）前記非胚性幹細胞が、核細胞質比が高い小円形細胞形状を特徴とする未熟な未分化形態を有する；
請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１の方法に従って単離される非胚性幹細胞であって、
（ａ）ここで当該非胚性幹細胞は所望により、立方又は円柱上皮組織（好ましくは、成体立方又は円柱上皮組織）から単離される；
（ｂ）ここで当該非胚性幹細胞は所望により、ｐ６３を発現しない成体幹細胞である；または
（ｃ）ここで当該非胚性幹細胞は所望により、肺、食道、胃、小腸、結腸、腸上皮化生、輸卵管、腎臓、膵臓、膀胱、又は肝臓、又はその一部／切片から単離される；
前記非胚性幹細胞。
【請求項１７】
非胚性幹細胞の単一細胞クローンであって、
（ａ)ここで前記単一細胞クローン内の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、又は約８０％の細胞は、単一細胞として単離された場合に、増殖して単一細胞クローンを産生可能である；
（ｂ）ここで前記非胚性幹細胞は、単一細胞として単離された場合に、約５０世代より多く、約７０世代より多く、約１００世代より多く、約１５０世代より多く、約２００世代より多く、約２５０世代より多く、約３００世代より多く、約３５０世代より多く、又は約４００以上の世代の自己複製が可能である;
（ｃ）ここで前記非胚性幹細胞は、前記非胚性幹細胞を単離する非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能であるか又は前記非胚性幹細胞が存在する非胚性組織の分化細胞種へ分化することが可能である；
（ｄ）ここで前記非胚性幹細胞は、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａより選択される１以上の幹細胞マーカーを発現する；
（ｅ）ＯＬＦＭ４、ＳＯＸ９、ＬＧＲ５、ＣＬＤＮ１８、ＣＡ９、ＢＰＩＦＢ１、ＫＲＴ１９、ＣＤＨ１７、及びＴＳＰＡＮ８より選択される１以上のマーカーを発現する；
（ｆ）ここで前記非胚性幹細胞は、前記非胚性組織における分化細胞種に関連したマーカー（複数）の発現を実質的に欠いている；
（ｇ）ここで前記非胚性幹細胞は、ｐ６３の発現を実質的に欠いている（又はｐ６３を発現しない）；または
（ｈ）ここで前記非胚性幹細胞は、核細胞質比が高い小円形細胞形状を特徴とする未熟な未分化形態を有する；
前記単一細胞クローン。