【手続補正書】
【提出日】平成29年1月10日(2017.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポリヌクレオチド中の１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させる方法であって、（ａ）前記１つまたは複数の停止されたヘリカーゼおよび前記ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させるステップ、ならびに（ｂ）前記ポア全体に電位を印加して、それにより前記１つまたは複数のヘリカーゼを前記ポリヌクレオチド上の前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させるステップを含む、方法。
【請求項２】
膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、
（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼが前記１個または複数のスペーサーで停止するように、前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップ、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび前記１つまたは複数の停止されたヘリカーゼを前記ポアと接触させるステップ、ならびに
（ｄ）前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動し、前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの前記移動を制御するように、前記ポア全体に電位を印加するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）請求項２に記載の方法を実行するステップ、および
（ｂ）ポアに関して前記ポリヌクレオチドが移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、前記測定値が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項４】
前記標的ポリヌクレオチドに前記１個または複数のスペーサーを設けるステップが、１個または複数のスペーサーを含むように前記標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の特性が、
（ａ）（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、および（ｖｉ）前記標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質でまたは１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否か、から選択され、
（ｂ）電気的測定および／または光学的測定によって測定され、あるいは
（ｃ）電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定により測定される、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のヘリカーゼが、前記印加された電位から生じる場に沿って前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの前記移動を制御する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記１個または複数のスペーサーが、前記ポリヌクレオチドとは異なる構造を有し、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり、前記１個または複数のスペーサーが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含み、
（ｃ）前記１個または複数のスペーサーが、１つもしくは複数のニトロインドール、１つもしくは複数のイノシン、１つもしくは複数のアクリジン、１つもしくは複数の２−アミノプリン、１つもしくは複数の２−６−ジアミノプリン、１つもしくは複数の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つもしくは複数の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つもしくは複数の逆位ジデオキシ−チミジン（ｄｄＴ）、１つもしくは複数のジデオキシ−シチジン（ｄｄＣ）、１つもしくは複数の５−メチルシチジン、１つもしくは複数の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つもしくは複数のイソ−デオキシシチジン（イソ−ｄＣ）、１つもしくは複数のイソ−デオキシグアノシン（イソ−ｄＧ）、１つもしくは複数のＣ３基、１つもしくは複数の光開裂（ＰＣ）基、１つもしくは複数のヘキサンジオール基、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基、１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つもしくは複数のチオール連結を含み、
（ｄ）前記１個または複数のスペーサーが、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
（ｅ)前記１個または複数のスペーサーが、塩基を持たない前記１つまたは複数のヌクレオチドを含み、
（ｆ）前記１個または複数のスペーサーが、前記１つまたは複数のヘリカーゼが停止する原因となる１つまたは複数の化学基を含み、
（ｇ）前記１個または複数のスペーサーが、前記１つまたは複数のヘリカーゼが停止する原因となる１つまたは複数の化学基を含み、前記１つまたは複数の化学基が、１つまたは複数のフルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／もしくはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／もしくは抗ジゴキシゲニンまたはジベンジルシクロオクチン基であり、
（ｈ）前記１個または複数のスペーサーが、遊離ヌクレオチドの存在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で前記１つまたは複数のヘリカーゼを停止でき、
（ｉ）前記１個または複数のスペーサーが、約１００ｍＭ以下の塩濃度において前記１つまたは複数のヘリカーゼを停止でき、あるいは、
（ｊ）前記１個または複数のスペーサーが、前記ポリヌクレオチドに含まれる、および／または前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた１つまたは複数のブロッキング分子の一部ではない、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）２つ以上の停止されたヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動し、（ｉｉ）互いに付着した前記２つ以上のヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動し、または（ｉｉｉ）互いに共有結合的に付着している前記２つ以上のヘリカーゼが、各スペーサーを過ぎて移動する、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記１個または複数のスペーサーが、前記ポリヌクレオチドの１本鎖領域または非ハイブリダイズ領域に含まれ、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記１個または複数のスペーサーが、前記ポアに優先的に挿入されるリーダー配列を含む前記１本鎖領域に含まれ、
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記２本鎖部分の２本の鎖が、架橋成分を使用して連結されており、あるいは、
（ｅ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、前記２本鎖部分の２本の鎖が、架橋成分を使用して連結されており、前記１個または複数のスペーサーが、架橋成分に含まれる、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のヘリカーゼが、（ａ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ、１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼまたは１つもしくは複数のＤｄａヘリカーゼ、（ｂ）（ａ）におけるヘリカーゼのいずれかに由来の１つもしくは複数のヘリカーゼ、あるいは（ｃ）（ａ）および／もしくは（ｂ）におけるいずれかのヘリカーゼの組合せである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであり、
（ｂ）前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、ライセニン（lysenin）、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来であり、
（ｃ）配列番号２に示す８つの同一のサブユニットから形成されている、または前記８つのサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種であり、あるいは、
（ｄ）配列番号４に示す７つの同一サブユニットから形成されている、または前記７つのサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１つまたは複数の停止されたヘリカーゼをポリヌクレオチド上の１個または複数のスペーサーを過ぎて移動させるための膜貫通ポアおよび印加された電位の使用。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが膜貫通ポアと接触する前に、前記ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるための１個または複数のスペーサーの使用。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチド上の１つまたは複数のヘリカーゼのローディングを制御する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに１個または複数のスペーサーを設けるステップ、および
（ｂ）前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドが１個または複数のスペーサーを含むように標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含み、および/または前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ）ｎを設ける（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、１つのヘリカーゼが各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ１−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ１）ｎを設けるステップを含む（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは、１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、前記１つまたは複数のヘリカーゼが前記標的ポリヌクレオチドに結合し、２つのヘリカーゼが各スペーサーで停止するように、（ａ）において提供された前記標的ポリヌクレオチドを前記１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを設けるステップを含む（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは、２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
各スペーサーに停止された前記２つのヘリカーゼが互いに異なっており、または各スペーサーに停止された前記２つのヘリカーゼが互いに付着しているまたは互いに共有結合的に付着している、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドに５’から３’方向で（Ｌ２−Ｓ）ｎまたは（Ｓ−Ｌ２）ｎを設けるステップ（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは、２つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけである非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、ｎは整数である）、
（ｂ）各領域Ｌ２の残りの部分が１つのヘリカーゼが結合するために十分な長さだけであるように、ブロッキングポリヌクレオチドを各領域Ｌ２の一部にハイブリダイズさせるステップ、
（ｃ）１つのヘリカーゼが各領域Ｌ２の残りの部分に結合するように、（ｂ）において生成された前記標的ポリヌクレオチドを１つまたは複数のヘリカーゼに接触させるステップ、
（ｄ）それらが各ブロッキングポリヌクレオチドを除去し、各スペーサーＳで停止するように、遊離ヌクレオチドおよびヘリカーゼ補因子を（ｃ）における前記１つまたは複数の結合したヘリカーゼに提供するステップ、ならびに
（ｅ）１つの異なるヘリカーゼが各領域Ｌ２に結合し、各スペーサーおよび（ｄ）において停止された各ヘリカーゼによって停止されるように、（ｄ）において生成された前記標的ポリヌクレオチドを（ｃ）において使用されたものとは異なる１つまたは複数のヘリカーゼと接触させるステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ポリヌクレオチドに、２つ以上スペーサーが設けられ、および／または前記１つまたは複数の停止されたヘリカーゼが、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を使用して前記１個または複数のスペーサーを過ぎて移動される、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための複合体であって、（ａ）５’から３’方向の（Ｌ−Ｓ−Ｄ）ｎまたは（Ｄ−Ｓ−Ｌ）ｎ（式中、Ｌは１本鎖ポリヌクレオチドまたは非ハイブリダイズポリヌクレオチドであり、Ｓはスペーサーであり、Ｄは２本鎖ポリヌクレオチドであり、式中ｎは整数である）を含むアダプターと、（ｂ）各アダプターに停止された１つまたは複数のヘリカーゼとを含む、複合体。
【請求項２４】
（ａ）Ｌが、１つのヘリカーゼだけに結合できる（Ｌ１）または２つのヘリカーゼだけに結合できるものであり（Ｌ２）、あるいは
（ｂ）１つのヘリカーゼだけに結合できる（Ｌ１）または２つのヘリカーゼだけに結合できるものであって（Ｌ２）、ｎが１であり、１つまたは２つのヘリカーゼが前記アダプターで停止されている、
請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのキットであって、（ａ）１個または複数のスペーサー、請求項７に定義される１もしくは複数のスペーサー、または請求項２３もしくは２４に定義される１もしくは複数のアダプター、（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび（ｃ）膜貫通ポアを含む、キット。