【手続補正書】
【提出日】平成29年3月10日(2017.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、ｐＣＰＮ１２４に、誤りが生じやすい突然変異誘発を行わせる。得たプラスミドを菌株ＢＢ２６−３６（Ｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１１７：１０６５−１０７６（１９７４））に入れて形質転換する。菌株ＢＢ２６−３６はｐｌｓＢ遺伝子に変異を含む。さらに、菌株は、親株ＢＢ２６のグリセロール−３−ホスフェート栄養素要求性を有していない。これは、フルクトース−１，６−ジホスフェート（ｆｒｕ−１，６−ｄｉＰ）によるグリセロールキナーゼ（ＧｌｐＫ）の抑制を失っているからであり、そのため、ＢＢ２６−３６はグリセロール−３−ホスフェートを産生することができ、最少培地Ｍ９にグリセロール（３ｇ／Ｌ）およびグルコース（３ｇ／Ｌ）を加えたもので成長する（Ｍ９は、１リットル当たり、１２．８ｇのりん酸水素ナトリウム７水和物、３ｇの第一りん酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）、０．５ｇの塩化ナトリウム、１ｇの塩化アンモニウム、０．２４ｇの硫酸マグネシウム、および１１．１ｍｇの塩化カルシウムを含む）。
形質転換反応物（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、５ｇ／Ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／Ｌのカーベニシリンを含んでいるＭ９培地で平板培養した。こうしたプレート上で成長するコロニーからプラスミドを抽出し、ｇｐｓ遺伝子の配列を決定する。突然変異タンパク質のＧｐｓＡ活性を測定した。またグリセロール−３−ホスフェートのＫｉを測定する。その後、野生型タンパク質と比べてＫｉの大きいタンパク質を用いて酵母菌染色体のＧＰＤ１と置き換え、イソブタノールおよびグリセロールの産生量を測定する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
２．前記ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、上記１に記載の組換え微生物。
３．前記１−ブタノール生合成経路が、
（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒される）、
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（クロトナーゼによって触媒される）、
（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される）、および
（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、上記２に記載の組換え微生物。
４．前記２−ブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アルファ−アセト乳酸からアセトイン（アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、
（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒される）、および
（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、上記２に記載の組換え微生物。
５．前記イソブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される）、
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）、
（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、および
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１の基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、上記２に記載の組換え微生物。
６．前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、上記１〜５のいずれかに記載の組換え微生物。
７．前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、上記６に記載の組換え微生物。
８．前記異種性ＧＰＤが自然界に存在するＧＰＤである、上記１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
９．前記異種性ＧＰＤが、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ドナリエラ・ヴィリディス（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、オオミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アーキオグロブス・フルジダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ
ａｌｂａ）、カンジエラ・コレニス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｉｓ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびアナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕ）からなる群から選択される生物からのＧＰＤの配列を含む、上記８に記載の組換え微生物。
１０．前記異種性ＧＰＤが改変ＧＰＤである、上記１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
１１．前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、上記１０に記載の組換え微生物。
１２．前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、上記１１に記載の組換え微生物。
１３．前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、上記１１に記載の組換え微生物。
１４．前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に置換を含み、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に置換を含む、上記１１に記載の組換え微生物。１５．前記微生物が、ＮＡＤＨを利用するケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）を含む、上記５〜１４のいずれかに記載の組換え微生物。
１６．配列番号１９５との少なくとも８５％の同一性を有する改変グリセロール−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素。
１７．前記酵素が、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、上記１５に記載の改変ＧＰＤ酵素。
１８．前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する少なくとも１つの置換を含む、上記１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
１９．前記酵素が、配列番号１９５の位置１２９に対応する少なくとも１つの置換を含む、上記１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
２０．前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する置換および配列番号１９５の位置１２９に対応する置換を含む、上記１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
２１．ＮＡＤＨの場合の前記ＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、上記１６〜２０のいずれかに記載の改変ＧＰＤ酵素。
２２．上記１６〜２１のいずれかに記載の改変ＧＰＤ酵素を含む組換え微生物。
２３．前記微生物が、前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種の遺伝子を含むブタノール生合成経路を含み、前記微生物が、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含み、前記組換え微生物が、前記改変ＧＰＤ酵素のない微生物と比べてブタノール産生が向上する、上記２２に記載の組換え微生物。
２４．前記ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、上記２３に記載の組換え微生物。
２５．前記１−ブタノール生合成経路が、
（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒される）、
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（クロトナーゼによって触媒される）、
（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される）、および
（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、上記２４に記載の組換え微生物。
２６．前記２−ブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アルファ−アセト乳酸からアセトイン（アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、
（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒される）、および
（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少な
くとも１種の遺伝子を含む、上記２４に記載の組換え微生物。
２７．前記イソブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される）、
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）、
（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、および
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、上記２４に記載の組換え微生物。
２８．前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、上記２２〜２７のいずれかに記載の組換え微生物。
２９．前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、上記２８に記載の組換え微生物。
３０．前記微生物が、ＮＡＤＨを利用するケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）を含む、上記２７〜２９のいずれかに記載の組換え微生物。
３１．（ａ）
ｉ．改変イソブタノール生合成経路と、
ｉｉ．ＧＰＤ１をコードする内在性遺伝子の欠失または破損と、
ｉｉｉ．
ａ．上記１６〜２２のいずれかに記載の前記改変ＧＰＤ酵素；または
ｂ．異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤの少なくとも１種と
を含む組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）イソブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、イソブタノールを製造するための方法。
３２．前記組換え微生物が嫌気条件下で成長する、上記３１に記載の方法。
３３．前記改変ＧＰＤが、配列番号１９５の４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、上記３１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．前記ＧＰＤのＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、上記３１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫｍと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
３６．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
３７．組換え微生物であって、
（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
３８．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
３９．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール
産生が減少する、組換え微生物。
４０．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
４１．前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、上記３８〜４０のいずれかに記載の組換え微生物。
４２．前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、上記３８〜４１のいずれかに記載の組換え微生物。
４３．前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、上記４２に記載の組換え微生物。
４４．前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、上記３８〜４３のいずれかに記載の組換え微生物。
４５．前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、上記４４に記載の組換え微生物。
４６．（ａ）上記３８〜４０のいずれかに記載の組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）ブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、ブタノールを製造するための方法。
４７．前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、上記９に記載の方法。
４８．前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、上記４６または４７に記載の方法。
４９．前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、上記４８に記載の方法。
５０．前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、上記４６〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、上記５０に記載の方法。５２．（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
５３．異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物であって、前記異種性ＧＰＤがＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有し、かつ前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
５４．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
５５．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
５６．組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
５７．前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、上記５４〜５６のいずれかに記載の組換え微生物。
５８．前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、上記５４〜５７のいずれかに記載の組換え微生物。
５９．前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、上記５４〜５８のいずれかに記載の組換え微生物。
６０．前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、上記５９に記載の組換え微生物。
６１．（ａ）上記５４〜６０のいずれかに記載の組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）ブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、ブタノールを製造するための方法。
６２．（ａ）グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）と、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
６３．異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物であって、前記異種性ＧＰＤがグリセロール−３−ホスフェートによって抑制され、前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素であって、前記酵素が、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、改変グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素。
【請求項２】
前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項３】
前記酵素が、配列番号１９５の位置１２９に対応する少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項４】
前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する置換および配列番号１９５の位置１２９に対応する置換を含む、請求項１に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項５】
ＮＡＤＨの場合の前記ＫMが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変ＧＰＤ酵素を含む組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物がアルコール生合成経路を含み、前記微生物がＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含み、さらに前記組換え微生物では、改変ＧＰＤ酵素のない微生物と比べてアルコール産生が向上する、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
組換え微生物であって、
（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫMと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫMを有する異種性ＧＰＤと、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項９】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤ
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項１４】
（ａ）グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）と、
（ｂ）
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項１５】
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の破損の欠失をさらに含む、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の組換え微生物。