(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘミセルロースを基質として、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６６３のエンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２）由来の、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が約３０，０００程度と計算され、至適温度が約４０℃、至適ｐＨが約６．８、酵素の安定温度域が３０−４０℃、安定ｐＨ領域が６．５−８．０であるキシラナーゼを反応させることを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
ヘミセルロースを基質として、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６６３のエンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２）由来の、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が約３０，０００程度と計算され、至適温度が約４０℃、至適ｐＨが約６．８、酵素の安定温度域が３０−４０℃、安定ｐＨ領域が６．５−８．０であるキシラナーゼを反応させてキシロオリゴ糖を調製し、これを更に、水素化触媒の存在下で還元することを特徴とするキシロオリゴ糖還元物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
【０００２】
本発明は、キシロオリゴ糖及びその還元物の製造方法に関する。
【０００３】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
【０００４】
キシロオリゴ糖とは２つ以上のキシロースが主にβ−１，４結合した少糖類を云うが、最近の研究の結果、オリゴ糖やその還元物は腸内の有用微生物の活性化や抗腫瘍性等の点から注目されている。
【０００５】
また、キシロースは遊離の形では自然界にほとんど存在せず、ヘミセルロースとして、キシロースが長く連なったキシランの形で存在するが、そのキシランは、ほとんど全ての陸上植物中及びある種の海藻類中に存在する。
【０００６】
自然界に存在するヘミセルロースに酵素を作用させてキシロオリゴ糖を製造しようとした場合、キシロテトラオース（Ｘ−４）やキシロペンタオース（Ｘ−５）を生成する酵素は極めて少なく、例えば、特公昭４９−２０５０４号公報にはストレプトミセス属の放線菌が紹介されているが、その菌が生産する酵素を用いたキシランとの反応に於ける主生成物はキシロースおよびキシロビオースであり、Ｘ−４やＸ−５の生成量はわずかなので、Ｘ−４やＸ−５を製造する酵素としては適切でないと云う課題があった。
【０００７】
また、Ｄ．Ｎ．Ｖｉｅｔ等は、アエロモナス・キャビエ・Ｗ−６１株の酵素を紹介している［Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，４４５−４４９（１９９１）］が、この酵素にはキシロース転移酵素活性があり、反応生成物中にキシロビオースを含み、結果的にＸ−４、Ｘ−５等のキシロオリゴ糖割合が減少してしまう、つまり、効率良くキシロオリゴ糖を製造できないと云う課題や、キシロース転移酵素活性のために、生成物の構造や量から、もとのキシランの構造を推定することができないと云う構造解析上の課題があった。
【０００８】
更に、Ａ．オオコシ等も、アエロモナス・エスピー・Ｎｏ．２１２株の酵素を紹介している［Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，４９，３０３７−３０３８（１９８５）  ］が、この酵素にもキシロース転移酵素活性があり、前記アエロモナス・キャビエ・Ｗ−６１由来の酵素と同様の課題があったのである。
【０００９】
以上のように、キシロース転移酵素活性を持っていない酵素を用いて、Ｘ−４やＸ−５を主成分とし、キシロースやキシロビオースを含まないキシロオリゴ糖を効率良く製造できる方法は未だ存在せず、その方法の開発が要望されていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、キシロオリゴ糖を製造する微生物及びその酵素を鋭意研究した結果、草食昆虫の腸管内から見出したアエロモナス・キャビエ・ＭＥ−１（以下、ＭＥ−１と云うことがある。）株及び／又はエンテロバクター・アグロメランスＭＥ−２株（以下、ＭＥ−２と云うことがある。）由来のキシラナーゼを採用することにより、キシランから直接キシロビオースを含まないキシロオリゴ糖を製造することに成功し、更に、それを還元することによりキシロオリゴ糖の還元物を得ることに成功して本発明を完成するに到った。
【００１２】
即ち、第一の本発明は、ヘミセルロースを基質として、アエロモナス・キャビエ・ＭＥ−１株（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ  ＭＥ−１）及び／又はエンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２  ）由来のキシラナーゼを反応させることを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法である。
【００１３】
また、第二の本発明は、ヘミセルロースを基質として、アエロモナス・キャビエ・ＭＥ−１株（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ  ＭＥ−１）及び／又はエンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２  ）由来のキシラナーゼを反応させてキシロオリゴ糖を調製し、これを更に、水素化触媒の存在下で還元することを特徴とするキシロオリゴ糖還元物の製造方法である。
【００１４】
なお、アエロモナス・キャビエ・ＭＥ−１株（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ  ＭＥ−１）は、日本国茨城県にある工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年（１９９３年）５月３１日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６６４として寄託されている。
【００１５】
また、エンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２  ）は、日本国茨城県にある工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年（１９９３年）５月３１日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６６３として寄託されている。
【００１６】
以下に本発明の内容を詳細に説明する。
【００１７】
本発明を実施するに際して、ＭＥ−１及び／又はＭＥ−２由来のキシラナーゼを用いるが、これらの菌株は、草食昆虫の一種であるシンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）の幼虫の腸管内やイナゴ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）  の成虫の腸管内に生息しているので、例えば、シンジユサンの幼虫やイナゴの成虫の腸を採取し、カラスムギ等由来のキシラン０．５％、ポリペプトン０．５％、及び各種栄養塩類を含有する培地で、ｐＨを６．０〜９．０程度とし、３０℃前後の温度で好気的に培養することによって得ることができる。
【００１８】
このようにして得られた菌、ＭＥ−１及びＭＥ−２の菌学的性質は表１の通りである。
【００１９】
【表１】
0003590642.tif 000002
【００２０】
また、それらの菌株が生産するキシラナーゼを得るには、菌を前記と同様の培地にて、好気的に１時間〜７２時間程度培養し、その遠心分離後の上澄液を採取することにより、粗酵素とすることができる。
【００２１】
また、この粗酵素は、そのまま本発明に用いるキシラナーゼとして採用することもできるが、必要に応じて、硫安塩析、クロマト分画等の通常の酵素精製操作を適用することにより、高度に精製されたキシラナーゼとして本発明に用いることもできる。
【００２２】
このようにして、得られたＭＥ−１由来のキシラナーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が、２０，１８６と計算され、至適温度が５０℃、至適ｐＨが７．０、酵素の安定温度域が３０−４０℃、安定ｐＨ領域が６．５−８．０、最終生成物はキシロース、キシロビオースを含まず、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、及びＤＰ≧６のキシロオリゴ糖である。
【００２３】
また、ＭＥ−２由来のキシラナーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量が、約３０，０００程度と計算され、至適温度が約４０℃、至適ｐＨが約６．８、酵素の安定温度域が３０−４０℃、安定ｐＨ領域が６．５−８．０、最終生成物はキシロース、キシロビオースを含まず、キシロテトラオース及びＤＰ≧６のキシロオリゴ糖を主成分とするものである。
【００２４】
本発明に用いるヘミセルロースは、キシロースの多糖であるキシランを含有するものであれば、その由来、製法、品質を問われないが、木材や各種植物、特に、棉実殻、トウモロコシの芯や茎、イネやカラスムギなどのムギのモミ、ワラ等由来のキシランが有利に採用することができる。
【００２５】
本発明を実施してキシロオリゴ糖を製造する際には、例えば、前記粗酵素又は精製酵素を用い、１％程度のキシランを含む水溶液を基質として温度２０〜４５℃程度、ｐＨ６〜９程度の条件で１〜７２時間程度反応させることが好ましく、このようにして得られたキシロビオースを全く含まないかまたはほとんど含まないキシロオリゴ糖を更に水素雰囲気下で水素化触媒の存在のもとに還元することによってキシロオリゴ糖還元物を調製することができる。
【００２６】
本発明者の研究により確認したところでは、キシラン加水分解活性はＭＥ−２由来の酵素よりもＭＥ−１由来の酵素のほうが若干高く、ＭＥ−２由来の酵素はＸ−４を選択的に生成する性質を有しているので、本発明を実施するに際し、ＭＥ−１由来のキシラナーゼとＭＥ−２由来のキシラナーゼとを併用することによって、各々の酵素の性質を相乗的に利用することが可能になり、極めて有利にキシロオリゴ糖及びその還元物を製造することができる。
【００２７】
本発明を実施することにより、Ｘ−３、Ｘ−４、Ｘ−５及びＤＰ≧６のキシロオリゴ糖を主成分とし、キシロースやキシロビオースを全く含まないかまたはほとんど含まないキシロオリゴ糖やその還元物をキシランから効率良く製造することができ、また、この酵素を採用してキシランを加水分解することによって生成した各成分の生成比率と量から、もとのキシランの構造を推定することもできる。
【００２８】
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明の内容を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
また、％は、特に断らない限り重量％を表すものとする。
【００３１】
［酵素調製例−１］
【００３２】
本発明者がシンジュサンの幼虫の腸管から分離同定したアエロモナス・キャビエ・ＭＥ−１株（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ  ＭＥ−１）を、０．１％ＮａＮＯ３  、０．１６％Ｎａ２  ＨＰＯ４  ・１２Ｈ２  Ｏ、０．０９％ＫＨ２  ＰＯ４  、０．０５％ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、０．５％カラスムギキシラン、０．５％ペプトンから成り、ｐＨ９．０に調整した培養液５，０００ｍｌに入れ、３０℃にて７２時間通気培養した後、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離して、得られた上澄液を粗酵素−１とした。
【００３３】
［酵素調製例−２］
【００３４】
本発明者がイナゴ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）の成虫の腸管から分離同定したエンテロバクター・アグロメランス・ＭＥ−２株（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＭＥ−２）を、０．１％ＮａＮＯ３  、０．１６％Ｎａ２  ＨＰＯ４  ・１２Ｈ２  Ｏ、０．０９％ＫＨ２  ＰＯ４  、０．０５％ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、０．５％カラスムギキシラン、０．５％酵母エキスから成り、ｐＨ６．８に調整した培養液１，０００ｍｌに入れ、３０℃にて一夜振盪培養し、それに同じ培養液４，０００ｍｌを加えて更に同条件で６０時間振盪培養し、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離して、得られた上澄液を粗酵素−２とした。
【００３５】
［酵素精製例−１］
【００３６】
酵素調製例−１で得られた粗酵素２，０００ｍｌを、硫安塩析（０−９５％飽和）し、析出した沈殿を５０ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１ｍＭ硫安を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したセファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）に吸着させた後、０．２Ｍ硫安を含むリン酸緩衝液により毎分１１ｍｌの速度でキシラナーゼを溶出させ、各５ｍｌの画分に分けた。
【００３７】
次いで、キシラナーゼ活性を有する画分を集め、予め１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化したＨＰＬＣ（（株）島津製作所製、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−３００）にてキシラナーゼを溶出させ、溶出液を平均ポア径２４オングストロームの市販の透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  社製、ダイアライシスメンブラン）のチューブに入れて１０時間透析した後、凍結乾燥して、１８ｍｇの精製酵素−１を得た。
【００３８】
精製酵素−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを形成し、粗酵素に較べて、酵素活性が５１倍であった。
【００３９】
［酵素精製例−２］
【００４０】
酵素調製例−２で得られた粗酵素２，３００ｍｌを、硫安塩析（７５−１００％飽和）し、析出した沈殿を５０ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、１ｍＭ硫安を含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−６５０Ｍ［東ソー（株）製］に吸着させた後、０．２Ｍ硫安を含むリン酸緩衝液により毎分１１ｍｌの速度でキシラナーゼを溶出させ、各５ｍｌの画分に分けた。
【００４１】
次いで、キシラナーゼ活性を有する画分を集め、予め１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化した１３×２ｃｍのＣＭ３２（ワットマン社製）カラムにキシラナーゼを吸着させ、ＮａＣｌ水溶液を毎分２８ｍｌの速度で流し、０−１Ｍの濃度勾配でキシラナーゼを溶出させ、酵素精製例−１と同様に透析、凍結乾燥して、２１ｍｇの精製酵素−２を得た。
【００４２】
精製酵素−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを形成し、粗酵素に較べて、酵素活性が４６倍であった。
【００４３】
【実施例−１】
【００４４】
１％カラスムギキシラン［試薬、生化学工業（株）製］を含む５０ｍＭのｐＨ５．０酢酸緩衝液１０ｍｌに、酵素調製例−１で得られた粗酵素−１を１ｍｌ加え、４０℃で３０分間反応させた。
【００４５】
このときの生成物は、アルミナ薄層クロマトグラフ上にブタノール：酢酸：水＝２：１：１で展開し、エタノール：硫酸＝１：１を噴霧して１４０℃に５分間加熱して発色させることにより分析した結果、キシロトリオース（Ｘ−３）、キシロテトラオース（Ｘ−４）、キシロペンタオース（Ｘ−５）（Ｘ−３＋Ｘ−４＋Ｘ−５の合計を１０としたときの生成比は、Ｘ−３：Ｘ−４：Ｘ−５＝６：１：３であった）並びにそれ以上の分子量の糖類であり、キシロビオースは検出されなかった。
【００４６】
また、ミハエリス・メンテン定数（Ｋｍ）は９．４ｍｇ／ｍｌ、生成最大速度（Ｖｍａｘ）は４．３３０μＭ生成キシロース相当量／分／ｍｇ蛋白質であった。
【００４７】
【実施例−２】
【００４８】
１％カラスムギキシラン［試薬、生化学工業（株）製］を含む２５ｍＭのｐＨ６．８リン酸緩衝液１００ｍｌに、酵素調製例−２で得られた粗酵素−２を２０ｍｌ加え、４０℃で４８時間反応させた。
【００４９】
このときの生成物は、実施例−１と同様に薄層クロマトグラフにより分析した結果、Ｘ−４を主成分とし、その他はＸ−３、Ｘ−５並びにそれ以上の分子量の糖類であり、キシロース及びキシロビオースは検出されなかった。
【００５０】
【実施例−３】
【００５１】
１％カラスムギキシラン［試薬、生化学工業（株）製］を含む５０ｍＭのｐＨ５．０酢酸緩衝液１００ｍｌに、酵素精製例−１で得られた精製酵素−１の希釈液（濃度１％）を２ｍｌ加え、４０℃で４８時間反応させた。
【００５２】
このときの生成物は、実施例−１と同様に薄層クロマトグラフにより分析した結果、Ｘ−３、Ｘ−４、Ｘ−５並びにそれ以上の分子量の糖類であり、キシロビオースは検出されなかった。
【００５３】
生成物Ｘ−３、Ｘ−４、Ｘ−５の合計を１０としたときの生成比はＸ−３：Ｘ−４：Ｘ−５＝５：２：３であった。
【００５４】
【実施例−４】
【００５５】
１％カラスムギキシラン［試薬、生化学工業（株）製］を含む２５ｍＭのｐＨ６．８リン酸緩衝液１００ｍｌに、酵素精製例−２で得られた精製酵素−２の希釈液（濃度２％）を２ｍｌ加え、４０℃で４８時間反応させた。
【００５６】
このときの生成物は、実施例−１と同様に薄層クロマトグラフにより分析した結果、Ｘ−４、及びそれ以上の分子量の糖類であり、キシロース及びキシロビオースは検出されなかった。
【００５７】
【実施例−５】
【００５８】
実施例−３の方法を繰り返して得られた酵素反応生成物をイオン交換樹脂にて脱イオンした後、固形分濃度３０％に調整した水溶液２５０ｍｌを電磁攪拌式ステンレス製オートクレーブに入れ、市販のラネーニッケル触媒４ｇを加えて水素圧１２０ｋｇ／ｃｍ２  加圧下、１２０℃で２時間還元し、キシロビイトールを含まず、ＤＰ＝３〜５の糖アルコールを主成分とするキシロオリゴ糖還元物を得た。
【００５９】
【発明の効果】
【００６０】
本発明を実施することにより、Ｘ−３、Ｘ−４、Ｘ−５及びＤＰ≧６のキシロオリゴ糖を主成分とし、キシロースやキシロビオースを全く含まないかまたはほとんど含まないキシロオリゴ糖やその還元物をキシランから効率良く製造することができ、また、この酵素を採用してキシランを加水分解することによって生成した各成分の生成比率と量から、もとのキシランの構造を推定することもできる。