(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液サンプル中のサイトカインを検出するための時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法であって：
（ａ）固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体、（ｂ）該サイトカイン、（ｃ）該サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２の抗体、（ｄ）ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体、および（ｅ）ランタノイド金属イオンが順次結合した複合体を該固相上に形成する工程；および、
該ランタノイド金属イオンと錯形成した該蛍光性構造部分の蛍光を測定する工程、を包含し、
ここで、該サイトカインは、ケモカイン・ファミリーに属するサイトカインであり、
該蛍光性構造部分は、一般式（Ｉ）で表される、方法：
【化１】
0003586243.tif 000015
（式中、Ｒはタンパク質と共有結合を形成し得る官能基の残基であり、Ａｒは共役二重結合系を有する炭化水素基であり、ｎは１以上の整数であり、Ｘはフッ素原子または一般式（ＩＩ）
【化２】
0003586243.tif 000016
で表される基である）。
【請求項２】
前記ランタノイド金属イオンがユウロピウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光性構造部分が一般式（ＩＩＩ）：
【化３】（式中、Ｒ、Ａｒ、およびｎは請求項１と同義である）
0003586243.tif 000017
で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光性構造部分が４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−スルホ−ｏ−テルフェニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記結合体において、ストレプトアビジンまたはアビジン１分子当たり、前記蛍光性構造部分１０〜６０単位が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光を測定する工程が、前記固相上に形成された複合体を解離させることなく行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光を測定する工程が、前記固相上に形成された複合体を解離させた後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サイトカインがＣＸＣケモカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サイトカインがストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体液サンプルが血漿または全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体を形成する工程に先だって、前記生体液サンプルをサンプル希釈用緩衝液で希釈する工程をさらに包含し、
該サンプル希釈用緩衝液が、０．１〜０．３％のウシ血清アルブミン、０．０５〜０．２％のアジ化ナトリウム、および０．５〜１．５％の塩化ナトリウムを含有する、ｐＨ７．３〜８．３の０．０１〜０．１Ｍトリス−塩酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体を形成する工程に先だって、前記生体液サンプルを、前記サイトカインの非変性温度条件下で加熱処理する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光を測定する工程に先だって、前記固相上に形成された複合体を洗浄用緩衝液で洗浄する工程をさらに包含し、
該複合体洗浄用緩衝液が、０．０１〜０．１％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含有する、ｐＨ８．５〜９．５の０．０１〜０．１Ｍトリス−塩酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固相が、５０〜２００ｎｇ／ｃｍ２のＩｇＧ吸着能を有するマイクロタイター・プレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生体液サンプル中のサイトカインを検出するための時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法のためのキットであって：
固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体；該サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２ の抗体；ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体；および、ランタノイド金属イオンを包含し、
ここで、該蛍光性構造部分は、一般式（Ｉ）で表される、キット：
【化４】
0003586243.tif 000018
（式中、Ｒはタンパク質と共有結合を形成し得る官能基の残基であり、Ａｒは共役二重結合系を有する炭化水素基であり、ｎは１以上の整数であり、Ｘはフッ素原子または一般式（ＩＩ）
【化５】
0003586243.tif 000019
で表される基である）
該サイトカインは、ケモカイン・ファミリーに属するサイトカインである、キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体液サンプル中のサイトカインを検出するための時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法に関し、特に、蛍光性ユウロピウム錯体を利用した、生体液サンプル中のサイトカインを高感度で検出するためのアッセイ法に関する。
背景技術
正常なヒト血漿などの生体液中に存在する遊離のサイトカインまたはケモカインの濃度は、従来のＥＬＩＳＡアッセイの検出限界付近であるか、またはそれ未満である。例えば、検出限界が約６ピコモル（ｐＭ）である従来のＥＬＩＳＡアッセイによっては、ＩＬ−８を、正常なヒト血漿から検出できないことが報告されている（Ｌｅｏｎａｒｄら（文献１））。生体液サンプル中のケモカイン濃度を正確に測定するためには、測定感度の増大と、生体液サンプル由来の非特異的バックグラウンドの低減とが、主要な課題となる。
近年、ユウロピウム錯体を利用した時間分解蛍光イムノアッセイ法が開発され、臨床への応用が進められている（Ｋｒｏｐｆら（文献２））。遊離の、錯形成したユウロピウムイオン（Ｅｕ3+）の放射波長（６１５ｎｍ）は、励起波長（３４０ｎｍ）にも、ある種のタンパク質による短寿命のバックグラウンド蛍光（３５０〜６００ｎｍ）にも影響されないので、好都合である。この原理に基づく分析法の１種が、ＤＥＬＦＩＡ（解離−増強型ランタノイド蛍光イムノアッセイ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）として商業化され、例えば、ＴＮＦαおよびＩＬ−６のアッセイに利用されている。しかし、ＤＥＬＦＩＡによっては、これらサイトカインの血漿中の濃度を正確に測定することには成功していない（Ｏｇａｔａら（文献３））。
松本らのグループは、最近、標識化合物として、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−スルホ−ｏ−テルフェニル（ＢＨＨＣＴ）−Ｅｕ3+錯体を開発した。この錯体は、タンパク質に直接結合させることができ、時間分解型の蛍光測定による高感度の分析を可能にする。（Ｙｕａｎら（’９７）（文献４）およびＹｕａｎら（’９８）（文献５））。ＢＨＨＣＴはβ−ジケトン構造を有し、Ｅｕ3+との結合の安定性定数は１０10Ｍ-1と高い。生じるＥｕ3+錯体の寿命は４００マイクロ秒（μｓ）を超え、吸収および発光波長の極大は３３０ｎｍおよび６１５ｎｍと、極めて良好な性質を示す。この錯体は、ヒト血漿中における、腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（Ｙｕａｎら（’９８）（文献５））、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）（Ｙｕａｎら（’９７）（文献４））の検出に利用し得ることが示されている。しかし、生体液サンプル中のサイトカインの検出に、上記のようなＥｕ3+錯体が応用された例は未だ知られていない。
ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、１９９３年に骨髄ストロマ細胞系から初めてクローニングされた（Ｔａｓｈｉｒｏら（文献６））、ケモカイン・ファミリーに属するサイトカインである。ＳＤＦ−１はＣＸＣＲ４レセプターの主要なリガンドであり（Ｂｌｕｅｌら（文献７）およびＯｂｅｒｌｉｎら（文献８））、このレセプターは、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のサブグループについて、ＣＤ４のコレセプターとして作用することが知られている。さらに、最近の研究によってＳＤＦ−１遺伝子の多型が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の進行の遅延に関与することが示されている。（例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒら（文献９）およびＭａｒｔｉｎら（文献１０））。しかし、その作用機序には複数の説があり、未だ確立されていない。
ＳＤＦ−１はまた、造血、心臓血管、および神経系の胚形成において必須の役割を果たすことが指摘されている。（例えば、Ｚｏｕら（文献１１）およびＴａｃｈｉｂａｎａら（文献１２））。他方、成人組織におけるＳＤＦ−１の生物学的機能については、未解明の部分が多く残っているのが現状である。
上記のように、生体液サンプル中でＳＤＦ−１を正確に定量しモニタリングする手法を開発することは、ＳＤＦ−１についての理解を深めるうえで極めて重要である。他のケモカインおよびサイトカインについても同様に、生体液サンプル中での正確な測定方法が、学術的および臨床的な貢献をもたし得ることは、いうまでもない。このような観点から、より高感度でサイトカインを検出するアッセイ法が所望されている。
発明の開示
本発明は、上記課題の解決を意図するものであって、生体液サンプル中のサイトカインを高感度で、かつ簡便に検出するための方法を提供する。
本発明によれば、生体液サンプル中のサイトカインを検出するための時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法であって：
（ａ）固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体、（ｂ）該サイトカイン、（ｃ）該サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２の抗体、（ｄ）ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体、および（ｅ）ランタノイド金属イオンが順次結合した複合体を該固相上に形成する工程；および、
該ランタノイド金属イオンと錯形成した該蛍光性構造部分の蛍光を測定する工程、を包含し、
ここで、該蛍光性構造部分は、一般式（Ｉ）で表される、方法：
0003586243.tif 000002
（式中、Ｒはタンパク質と共有結合を形成し得る官能基の残基であり、Ａｒは共役二重結合系を有する炭化水素基であり、ｎは１以上の整数であり、Ｘはフッ素原子または一般式（II）
0003586243.tif 000003
で表される基である）が提供される。
本発明の一実施態様において、上記ランタノイド金属イオンは、ユウロピウムであり得る。
本発明の一実施態様において、上記蛍光性構造部分は一般式（III）：
0003586243.tif 000004
（式中、Ｒ、Ａｒ、およびｎは上記と同義である）
で表され得る。
本発明の一実施態様において、上記蛍光性構造部分は４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−スルホ−ｏ−テルフェニルあり得る。
本発明の一実施態様において、上記結合体において、ストレプトアビジンまたはアビジン１分子当たり、上記蛍光性構造部分１０〜６０単位が存在し得る。
本発明の一実施態様において、上記蛍光を測定する工程は、上記固相上に形成された複合体を解離させることなく行われ得る。
本発明の別の実施態様において、上記蛍光を測定する工程は、上記固相上に形成された複合体を解離させた後に行われ得る。
本発明の一実施態様において、上記サイトカインはケモカイン・ファミリーに属するサイトカインであり得る。
本発明の一実施態様において、上記サイトカインはＣＸＣケモカインであり得る。
本発明の一実施態様において、上記サイトカインはストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）であり得る。
あるいは、本発明の一実施態様において、上記サイトカインは、血液循環中に可溶性因子として存在し、微量で生物活性を持つサイトカインであり得る。
あるいは、本発明の一実施態様において、上記サイトカインは、
本発明の一実施態様において、上記サイトカインは、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはインターロイキン２（ＩＬ−２）であり得る。
本発明の一実施態様において、上記生体液サンプルは血漿または全血であり得る。
本発明の一実施態様において、上記複合体を形成する工程に先だって、上記生体液サンプルをサンプル希釈用緩衝液で希釈する工程がさらに包含され得、該サンプル希釈用緩衝液は、０．１〜０．３％のウシ血清アブルミン、０．０５〜０．２％のアジ化ナトリウム、および０．５〜１．５％の塩化ナトリウムを含有する、ｐＨ７．３〜８．３の０．０１〜０．１Ｍトリス−塩酸であり得る。
本発明の一実施態様において、上記複合体を形成する工程に先だって、上記生体液サンプルを、上記サイトカインの非変性温度条件下で加熱処理する工程がさらに包含され得る。
本発明の一実施態様において、上記蛍光を測定する工程に先だって、上記固相上に形成された複合体を洗浄用緩衝液で洗浄する工程がさらに包含され得、
該複合体洗浄用緩衝液は、０．０１〜０．１％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含有する、ｐＨ８．５〜９．５の０．０１〜０．１Ｍトリス−塩酸であり得る。
本発明の一実施態様において、上記固相は、５０〜２００ｎｇ／ｃｍ2のＩｇＧ吸着能を有するマイクロタイター・プレートであり得る。
また、本発明によれば、生体液サンプル中のサイトカインを検出するための時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法のためのキットであって：
固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体；該サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２の抗体；ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体；および、ランタノイド金属イオンを包含し、
ここで、該蛍光性構造部分は、一般式（Ｉ）で表される、キット：
0003586243.tif 000005
（式中、Ｒはタンパク質と共有結合を形成し得る官能基の残基であり、Ａｒは共役二重結合系を有する炭化水素基であり、ｎは１以上の整数であり、Ｘはフッ素原子または一般式（II）
0003586243.tif 000006
で表される基である）が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１ａは、ＳＤＦ−１についての較正曲線を示すグラフである。標準ＳＤＦ−１を、実施例２に記載のＴＲ−ＦＩＡ法を用いて測定した。データは、３連の測定の平均値を示す。
図１ｂは、図１ａと同様の較正曲線を、特に低濃度範囲での測定について示すグラフである。グラフ中の直線は；Ｙ＝１．３Ｘ＋１．２（×１００００ａ．ｕ．）、ｒ＝０．９９５である。データは、３連の測定の平均値を示す。
図１ｃは、ＳＤＦ−１の生物学的活性をモニタリングするために、ＥＬ−４細胞表面でのＣＸＣＲ４発現を、実施例３に記載のプロトコルに従って測定した結果を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の減少％を、ヒトＳＤＦ−１βなしでインキュベートしたコントロールと比較することにより計算した。データは、１連の実験を３回行い、中央値を選択したものである。
図１ｄは、ＳＤＦ−１についてのＴＲ−ＦＩＡの特異性を評価するために、各種のケモカインを測定した結果を示すグラフである。データは、３連の測定の平均値を示す。
図２は、ＳＤＦ−１についての、ＴＲ−ＦＩＡとＤＥＬＦＩＡとの比較を示すグラフである。図２の左側に、ヒトＳＤＦ−１βの標準溶液を、実施例２で使用したのと同じ組合せの捕捉抗体および検出抗体を用いて、ＤＥＬＦＩＡおよびＴＲ−ＦＩＡシステムで測定した結果を示す。図２の右側に、両システムで血漿サンプル中の内因性ＳＤＦ−１濃度を求めた結果を示す。なお、図２の右側に示されるサンプルには、標準ＳＤＦ−１を添加していない。また、図２の右側のデータと表１のデータとは、異なるサンプルについての測定結果を示すものである。データは、３連の測定の平均値を示す。
図３ａは、ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１測定への、抗凝固剤およびプロテアーゼ阻害剤の影響を示すグラフである。血漿サンプルを、ＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）；ヘパリン（３０ＩＵ／ｍｌ）；クエン酸塩（０．３８％クエン酸ナトリウム）；ならびにアプロチニン（１μｇ／ｍｌ）を有するＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて処理した。黒棒および斜線棒は、異なる２サンプルについての測定結果を示す。データは、３連の測定の平均値を示す。
図３ｂは、ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１測定への、血漿サンプルの予備加熱の影響を示すグラフである。血漿サンプルを、アッセイ前に５５℃にて３０分間予めインキュベートするか、または加熱することなく直接測定に用いた。２４個体分のサンプルは、健常な日本人ボランティア由来である。データは、２連の測定の平均値を示す。
図３ｃは、ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１測定への、血漿サンプルの希釈の影響を示すグラフである。各サンプルを緩衝液４で希釈した。５個体分のサンプルは、健常な日本人ボランティア由来である。データは、３連の測定の平均値を示す。
図４ａは、ＳＤＦ−１の対照としての、ＩＬ−８のＥＬＩＳＡでの定量における、血球の影響を示すグラフである。血漿サンプルにＩＬ−８を添加した後、細胞ペレットまたは血漿を混合した。３７℃、１５分間インキュベートした後、血漿中の可溶性ＩＬ−８を定量した。白四角は細胞ペレットまたは血漿と混合していない標準サンプル、黒丸は血漿と混合したサンプル、および、白丸は細胞ペレットと混合したサンプルを表す。データは、４連の測定の平均値を示す。
図４ｂは、ＳＤＦ−１の対照としての、ＭＣＰ−１のＥＬＩＳＡでの定量における、血球の影響を示すグラフである。血漿サンプルにＭＣＰ−１を添加した後、細胞ペレットまたは血漿を混合した。３７℃、１５分間インキュベートした後、血漿中の可溶性ＭＣＰ−１を定量した。記号は図４ａと同様。データは、４連の測定の平均値を示す。
図４ｃは、ＳＤＦ−１のＴＲ−ＦＩＡでの定量における、血球の影響を示すグラフである。血漿サンプルにＳＤＦ−１を添加した後、細胞ペレットまたは血漿を混合した。３７℃、１５分間インキュベートした後、血漿中の可溶性ＳＤＦ−１を定量した。記号は図４ａと同様。データは、４連の測定の平均値を示す。
図５は、３６人の健常な日本人ボランティアからのヒト血漿中のＳＤＦ−１レベルを示すグラフである。アッセイの前に、全ての血漿サンプルについて５５℃にて３０分間の熱処理を行った。データは、異なる２回の測定、各々３連の平均値を示す。
図６は、ヒト血漿サンプルにおけるプロテインＧ−セファロースによるＩｇＧ枯渇の影響を示すグラフである。７人の健常日本人ボランティアからの血漿サンプルを、プロテインＧ−セファロースと共に氷上で３０分間インキュベートし、遠心分離し、そして上清中のＳＤＦ−１量を測定した。斜線棒および黒棒は、それぞれ、非加熱サンプルおよび加熱（５５℃にて３０分間）サンプルを示す。
図７は、ＧＭ−ＣＳＦについての較正曲線を示すグラフである。標準ＧＭ−ＣＳＦを、ＴＲ−ＦＩＡ法を用いて測定した。データは、３連の測定の平均値を示す。
図８は、ＩＬ−２についての較正曲線を示すグラフである。標準ＩＬ−２を、ＴＲ−ＦＩＡ法を用いて測定した。データは、３連の測定の平均値を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の方法は、時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法に基づく。「時間分解蛍光イムノアッセイ」とは、本発明におけるランタノイド金属イオン錯体のような長寿命の蛍光を放射し得る蛍光性化合物を用いて、測定対象物を免疫学的反応によって標識し、標識体からの蛍光シグナルを、より短寿命のバックグラウンド蛍光が消失した後に、時間分解型の測定に付するアッセイ法をいう。
本発明の方法は、特に生体液サンプル中のサイトカインを高感度で件検出するために適している。「生体液サンプル」とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトの生体から採取される液状物をいい、代表的な例として、血液（すなわち全血）およびその分画物である血漿および血清、ならびに、脳脊髄液、胆汁、羊水、胸水、腹水、気道内分泌液、骨髄液、乳汁、涙液、鼻汁、心内膜液、関節内包液、だ液、精液、尿などが挙げられる。さらに、動物由来の培養細胞の上清液なども、生体液サンプルに含まれ得る。本発明の方法では、全血、血漿、血清、または脳脊髄液を用いるとき、特に、全血または血漿を用いるときに、顕著な効果が奏され得る。なお、生体液サンプルというときは、便宜上、生体液自体と生体液に適切な担体で希釈するなどの処理を施した後の液状サンプルとの両方を含むものとする。
「サイトカイン」とは、生体において細胞間の情報の伝達を担うタンパク性の化学物質をいう。個々のサイトカインについて、標的細胞の表面上に特徴的なレセプターが発現され、このレセプターへの結合によって、細胞増殖、分化などの生理活性が示される。血球の分化と増殖を誘導する「造血因子」と総称されるサイトカインの一群には、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、幹細胞因子、エリスロポエチン、トロンボポエチンなどが含まれる。リンパ球を制御するインターロイキンには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８などが含まれる。「増殖因子」として総称されるサイトカインの一群には、ＴＧＦ−βファミリー、ＥＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＩＧＦファミリー、ＮＧＦファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などが含まれる。「腫瘍壊死因子」と総称されるサイトカインの一群には、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどが含まれる。「インターフェロン」と総称されるサイトカインの一群には、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γなどが含まれる。その他のサイトカインとして、エンドセリン、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などが知られている。サイトカインの中で、特に、機能的に成熟した血液細胞のいずれかに対して化学走性を与える一群をケモカインという。ケモカインは、そのＮ−末端領域における保存されたシステインの配置に従って、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、ＣＸＸＸＣの４つに分類される。
本発明の方法における検出対象は、上記のサイトカインのいずれでもあり得る。さらに、上記のサイトカインの一群に属する新たに発見されるメンバー、あるいは上記のサイトカインの一群に属さない新たに発見されるサイトカインもまた、本発明の方法における検出対象であり得る。特に、本発明の方法は、血液循環中に可溶性因子として存在し、微量で生物活性を持ち、種々の病態に関与するサイトカインに適用される。
本発明の方法における検出対象の例は、上記ケモカイン・ファミリーに属するサイトカインであり得、特にＣＸＣケモカインであり得るが、これらの分類に必ずしも限定はされない。本発明における最も好ましい検出対象の例はＳＤＦ−１である。
本発明の方法においては、生体液サンプル中の所望のサイトカインを選択的に捕捉し、標識するために、固相上に当該サイトカイン含む複合体を形成する。具体的には、サイトカイン含有複合体は、適切な固相上において、以下の成分から形成される：
（ａ）固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体；
（ｂ）サイトカイン；
（ｃ）サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２の抗体；
（ｄ）ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体；および
（ｅ）ランタノイド金属イオン。
以下、各成分について説明する。
まず、「固相」としては、抗体の結合が可能であり、かつ上記複合体の形成、ならびに後述する蛍光測定を妨げない限り、任意の形状、および材質の固体物質を用い得る。アッセイ法の実施の便宜から、代表的には、マルチウェルタイプのマイクロタイター・プレートが用いられるが、ビーズを充填したカラム（ビーズの材質はセファロース、アガロースなどであり得るが、これらに限定はされない）など他の形状であってもよい。本発明においては、特に中程度のタンパク質吸着能を示す、マイクロタイター・プレートが好適であり得る。ここで「中程度」の吸着能とは、標準タンパク質として免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を吸着させたときに、代表的には約５０〜約２００ｎｇ〜ｃｍ2、好ましくは約１５〜約１５０ｎｇ／ｃｍ2、より好ましくは約９０〜約１２０ｎｇ／ｃｍ2の吸着を示す性質をいう。マイクロタイター・プレートの材質は、好ましくはポリスチレンであり得るが、これに限定はされない。
成分（ａ）である「第１の抗体」は、上記固相に結合した状態で存在し、かつ所望のサイトカインと抗原−抗体反応により結合し得る抗体である。この意味で、第１の抗体は「捕捉抗体」とも呼ばれる。本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）2、キメラ抗体など、任意のタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）および免疫グロブリン由来分子を含んでいう。用語「抗体」は広義に用いられ、免疫グロブリンと同様にサイトカインと結合し得る限り、当該サイトカインをリガンドとするレセプターも含まれる。好ましい抗体の例は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。種々のサイトカインに対する抗体が市販されており、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（ミネソタ州、米国）、Ｄａｋｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ａ／ｓ（デンマーク）、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（アラバマ州、米国）などから入手可能である。あるいは、動物の免疫化、ハイブリドーマ技術などの常法を利用して、所望のサイトカインに対する抗体を作成することができる。
固相への結合は、常法に従って、例えば、マイクロタイター・プレートに第１の抗体を直接コーティングすることにより行われ得る。第１の抗体中の「固相に結合した部分」とは、代表的には、その一部分が固相上に吸着された、抗体のＦｃ領域をいうが、これに限定はされない。例えば、固相および抗体の一部とそれぞれ結合し得る二官能性のリンカー分子を用いることも可能である。
成分（ｂ）、すなわち、生体液サンプル中に存在する所望のサイトカインは、代表的には、上記第１の抗体と結合することにより、固相上に固定化される。サイトカインは必ずしも遊離の状態で第１の抗体と接触する必要はなく、例えば、後述する第２の抗体との結合の後で、第１の抗体と結合してもよい。このように、本発明における複合体の形成は、各成分の結合の順序について限定はされない。
本発明者らは、所望のサイトカインを含有する生体液サンプルを、当該サイトカインと結合し得る抗体にさらす際に、適切な緩衝液で適切な濃度に希釈しておくことが、高感度でのサイトカイン検出のために重要であることを見い出した。生体液サンプルの緩衝液による希釈倍率は、（生体液サンプル：緩衝液）の容量で表したとき、代表的には約１：１〜約１：３０、好ましくは約１：２．５〜約１：２０、より好ましくは約１：５〜約１：１５の範囲にあり得る。希釈倍率の最適値は、生体液サンプルの種類およびサイトカインの種類などによって変動し得、さらにサンプル希釈用緩衝液の組成にも依存し得る。
適切なサンプル希釈用緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」と略称する）および無機酸から構成される弱アルカリ性の緩衝液であり、代表的にはトリス−塩酸である。そのｐＨは、代表的には約７．０〜約８．０６、好ましくは約７．３〜約８．３であり、より好ましくは約７．５〜約８．１である。濃度は、代表的には約０．００５〜約０．２モル（Ｍ）、好ましくは約０．０１〜約０．１Ｍ、より好ましくは約０．０２５〜約０．０７５Ｍである。
サンプル希釈用緩衝液は、さらに適量の血漿タンパク質成分および塩類を含有する。血漿タンパク質成分は、代表的には、血清アルブミンであり、好ましくは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。その濃度は、代表的には約０．０５〜約０．５％、好ましくは約０．１〜約０．３％、より好ましくは約０．１５〜約０．２５％であり得る。塩類は、代表的には、アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）、および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。ＮａＮ3の濃度は、代表的には約０．０２〜約０．４％、好ましくは約０．０５〜約０．２％、より好ましくは約０．０５〜約０．１５％であり得る。ＮａＣｌの濃度は、代表的には約０．２〜約３％、好ましくは約０．５〜約１．５％、より好ましくは約０．６〜約０．１２％であり得る。
いうまでもなく、サンプル希釈用緩衝液の組成は、上記の条件に限定されることはなく、当業者に容易な種々の改変が許容される。例えば、上記のナトリウム塩の一部または全部を、他のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属の対応する塩で置換することは可能である。サンプル希釈用緩衝液のｐＨおよび各成分の濃度などの最適値は、検出対象であるサイトカインの種類によって異なる場合があり得、さらに生体液サンプルの希釈倍率にも依存し得る。このような最適化は、当業者による通常の条件設定プロセスの範囲内で行われ得る。
成分（ｃ）である「第２の抗体」は、サイトカインと結合し得る領域を有することにより、第１の抗体と共に、所望のサイトカインをサンドイッチ状に捕捉する。第１の抗体と、第２の抗体とは、互いに干渉することなく、同一のサイトカイン分子の異なる部位（すなわち、異なるエピトープ）を認識する抗ペプチド抗体であることが望ましい。従って、第１の抗体と第２の抗体とが、所望のサイトカインへの結合能に関して、好適な組み合わせをなすことが重要である。例えば、全長のサイトカイン、または複数のエピトープを含むことが知られているかまたは予測される当該サイトカインの断片で適切な動物を免疫して得られる複数のロットのポリクローナル抗体について、好適な組み合わせを選択することができる。あるいは、認識するエピトープが異なる複数のモノクローナル抗体から、好適な組み合わせを選択することができる。このような選択は、例えば、サイトカインの標準溶液を調製して、検討すべき抗体の組み合わせについて常法のＥＬＩＳＡを行う予備実験によって、格別の困難なく達成し得る。
第２の抗体はさらに、ビオチンが結合した部分を有することにより、蛍光測定によるサイトカインの検出を可能にする。この意味で、第２の抗体は「検出抗体」とも呼ばれる。ビオチンは、ビタミンＨまたは補酵素Ｒとも呼ばれるビタミンであって、ペプチドなどのアミノ基とアミド結合を形成し得る。第２の抗体は、検出対象であるサイトカインに対する抗体を、常法に従ってビオチン化し精製することによって調製し得る。第２の抗体中の「ビオチンが結合した部分」とは、ビオチン自体と、ビオチンが結合した抗体の一部（代表的には、Ｆｃ領域）とを併せていう。必要であれば、ビオチンと抗体の一部とを、それぞれと結合し得る二官能性のリンカー分子を用いて連結させることも可能である。
ここで、「第２の抗体」という表現は、必ずしも単一の分子を意図するものではなく、必要とする機能（すなわち、抗原−抗体反応またはリガンド−レセプター結合によりサイトカインと結合し得る機能、およびビオチンを担持する機能）を果たす限り、任意の構造単位を示し得る。上記の「第１の抗体」についても同様である。例えば、本発明において、所望のサイトカインに対する抗体と、この抗サイトカイン抗体に結合し得るビオチン化された抗ＩｇＧ抗体との組み合わせを用いることができる。この場合、抗サイトカイン抗体とビオチン化抗体ＩｇＧ抗体との組み合わせは、包括して、「第２の抗体」と称される。ビオチン化抗ＩｇＧ抗体は、汎用性がある点で便利である。また、所望のサイトカインに対する抗体が、何らかの理由でビオチン化反応に抵抗性である場合に、ビオチン化抗ＩｇＧ抗体との組み合わせを使用することが有効であり得る。他方、アッセイの手順を簡略化させ、かつサイトカインの検出感度を最大化させる観点からは、第２の抗体として単一の分子を用いることが好ましい。
成分（ｄ）である「結合体」は、ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する任意の構造単位であり、代表的には、ストレプトアビジンまたはアビジンと蛍光性構造部分とが直接または間接に共有結合で連結された分子である。ストレプトアビジンは、一般に放射菌のつくる分子量約６万のタンパク質として周知であり、ビオチンと強固に結合する性質を有する。ただし、本発明において「ストレプトアビジン」は、微生物の由来について必ずしも限定されず、ビオチンとの結合能が実質的に維持される限り、他の微生物由来の対応するタンパク質、ならびにそれらの改変物を含み得る。アビジンは、一般に、卵白に含まれる分子量約７万のタンパク質として周知であり、やはりビオチンと強固に結合する性質を有する。本発明において、「アビジン」は、天然の卵白タンパク質に必ずしも限定されず、ビオチンとの結合能が実質的に維持される限り、その改変物を含み得る。
なお、上述の理論から明らかなように、本発明の方法は、成分（ｃ）に代えて、サイトカインと結合し得る領域と、ストレプトアビジンまたはアビジンが結合した部分とを有する抗体を用い、そして成分（ｄ）に代えて、ビオチンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体を用いても、達成可能である。
成分（ｄ）の結合体における、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分は、対応する蛍光性化合物を、ストレプトアビジンまたはアビジンとの間で直接または間接に共有結合を形成するように反応させて得られる、部分構造をいう。蛍光性構造部分は、以下の一般式（Ｉ）で表される：
0003586243.tif 000007
（式中、Ｒはタンパク質と共有結合を形成し得る官能基の残基であり、Ａｒは共役二重結合系を有する炭化水素基であり、ｎは１以上の整数であり、Ｘはフッ素原子または一般式（II）
0003586243.tif 000008
で表される基である）。
上記一般式において、残基Ｒを規定する「タンパク質と共有結合を形成し得る官能基」は、タンパク質中のアミノ酸残基が有する任意の反応性基（代表的には、アミノ基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基）と反応して共有結合を形成し得る任意の有機官能基をいう。この官能基の例としては、以下に示す基が挙げられる。
0003586243.tif 000009
（ただし、Ｘはハライド原子、−ＯＳＯ2ＣＨ3、−ＯＳＯ2Ｆ、−ＯＳＯ2ＣＦ3、−ＯＳＯ2Ｃ4Ｆ9、または−ＯＳＯ2ＰｈＣＨ3-p（Ｐｈはフェニル基）から選択され、ＲAはアルキル基、アルケニル基、アリール基、またはアラルキル基から選択され、ＲBはアルキレン基、アルケニレン基、アリーレン基、またはアラルキレン基から選択され、ｐは０〜５であり、ｑは２〜１０である。）
上記一般式において、Ａｒを規定する「共役二重結合系を有する炭化水素基」は、少なくとも３個の共役した二重結合を有する炭化水素基であり、代表的には少なくとも１個のフェニル環を有する２価または３価の芳香族炭化水素基である。炭化水素基の炭素数の上限は特に限定されないが、代表的には約５０個以内、好ましくは約３０個以内である。ここで、１個以上の炭素がヘテロ原子（例えば、酸素またはイオウ原子）に置換されていてもよい。炭化水素基Ａｒの例としては、以下に示す基が挙げられる：
0003586243.tif 000010
好ましくは、炭化水素基Ａｒは３価であり、蛍光性構造部分は一般式（III）で表される：
0003586243.tif 000011
ここで、より好ましいＡｒの例は、４、４’位において２つのβ−ジケトン基と結合するｏ−テルフェニルである。同様に好ましいＡｒの他の例は、当該ｏ−テルフェニルによるβ−ジケトン基の配置と近似するか、または実質的に同一の空間的距離に、２つのβ−ジケトン基を配置させ得る３価の芳香族炭化水素基である。
上記一般式において、ｎは１以上の整数であり、代表的には１〜６であり、好ましくは２〜４である。
本発明において、特に好ましい蛍光性構造部分は、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−スルホ−ｏ−テルフェニルである。これは、対応する蛍光性化合物である、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−クロロスルホ−ｏ−テルフェニル（略して「ＢＨＨＣＴ」という）から得られる。ＢＨＨＣＴの構造式を下記に示す：
0003586243.tif 000012
上記蛍光性構造部分を与える所望の蛍光性化合物は、慣用的な有機合成反応を利用して合成され得る。代表的には、以下の２つの工程からなる手順に従って、合成される：
（第一工程）  アセチル化された芳香族化合物と、パーフルオロカルボキシレートエステルとのクライゼン縮合反応を、適切な溶媒中で塩基性触媒（例えば、ナトリウムメチラート）の存在下で行うことによって、アセチル基のＣＨ3−がパーフルオロカルボニル化されたβ−ジケトン化合物を生成する。
（第二工程）  β−ジケトン化合物に、タンパク質と共有結合を形成し得る官能基を導入する。例えば、クロロ硫酸を用いるクロロスルホニル化反応によって、芳香環の水素がクロロスルホニル基（ＣｌＳＯ2−）で置換される。各工程後に、必要に応じて、再結晶、沈殿などの精製を行い得る。
得られた蛍光性化合物は、上記第二工程で導入された官能基の種類に応じて、適切な条件下でタンパク質と反応させることで、目的とする蛍光性構造部分を与える。例えば、クロロスルホニル基はタンパク質中のアミノ基と、塩基性の反応条件下で容易にアミドを形成する。
本発明において、成分（ｄ）の結合体は、ストレプトアビジンまたはアビジンを蛍光性化合物で直接標識することによって調製され得る。または、ストレプトアビジンまたはアビジンと他のタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とをまず結合させた後、これをさらに標識することによって調製され得る。ストレプトアビジンまたはアビジンと他のタンパク質との結合は、常法に従って、例えばグルタルアルデヒドを用いる架橋反応によって行い得る。
蛍光性化合物によるタンパク質の標識反応は、代表的には、反応に適切なｐＨ（例えば、クロロスルホニル化の場合、ｐＨ約９程度）に調節された緩衝液にタンパク質を溶解し、これに、適切な溶媒（例えば、エタノールまたはジメチルホルムアミド）に溶解した蛍光性化合物を、所望のモル比となる量で、添加することによって行い得る。タンパク質に対する蛍光性化合物のモル比、および、蛍光性化合物を含有する溶液の濃度を調節させることによって、タンパク質１分子当たりに結合する蛍光性化合物の比（「結合比」ともいう）を制御することができる。この結合比は、本発明における結合体での、ストレプトアビジンまたはアビジン１分子当たりの蛍光性構造部分の単位数に該当する。結合比は、代表的には５〜１００単位、好ましくは１０〜６０単位であり得る。結合比が小さ過ぎると、十分に高いサイトカイン検出の感度が得られない場合がある。他方、結合比があまり大きくしても、検出感度の向上に役立たない場合がある。
成分（ｅ）であるランタノイド金属イオンが、上記の蛍光性構造部分と錯形成することによって、本発明の方法における、固相上での複合体形成が完成する。ランタノイド金属イオンの例としては、ユウロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、テルピウム（Ｔｂ）、およびジスプロシウム（Ｄｙ）が挙げられる。ユウロピウム（Ｅｕ）が好ましい。ランタノイド金属イオンは、通常、成分（ｄ）の結合体と予め錯形成させた状態で、複合体の形成に利用される。すなわち、通常、上記のストレプトアビジンまたはアビジンとビオチンとの結合が形成される時点で、蛍光性構造部分はすでにＥｕ3+を保持した錯体となっている。もっとも、これとは逆の手順が妨げられるわけではない。
本発明者らは、以上のように固相上に形成された複合体を、蛍光測定を行うに先だって適切な緩衝液で十分に洗浄しておくことが、高感度でのサイトカイン検出のために重要であることを見い出した。ここで、適切な複合体洗浄用緩衝液は、トリスおよび無機酸から構成されるアルカリ性の緩衝液であり、代表的にはトリス−塩酸である。そのｐＨは、代表的には約８．２〜約９．８、好ましくは約８．５〜約９．５、より好ましくは約８．７〜約９．４である。濃度は、代表的には約０．００５〜約０．２Ｍ、好ましくは約０．０１〜約０．１Ｍ、より好ましくは約０．０２５〜約０．０７５Ｍである。
複合体洗浄用緩衝液は、さらに適量の、タンパク質可溶化能を有するノニオン性界面活性剤を含有する。このノニオン性界面活性剤は、代表的には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートであり、好ましくは「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０」の商品名で市販されるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（分子量約１２００）である。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と、実質的に同一の性質（例えば、約９５〜約１１５のヒドロキシ価、約３５〜約５５のケン化価、および約１５〜１８のＨＬＢ（親水性−疎水性バランス））を有する他のノニオン性界面活性剤もまた好ましく使用され得る。ノニオン性界面活性剤の濃度は、代表的には約０．００５〜約０．２％、好ましくは約０．０１〜約０．１％、より好ましくは約０．０２５〜０．０７５％であり得る。
いうまでもなく、複合体洗浄用緩衝液の組成は、上記の条件に限定されることはなく、当業者に容易な種々の改変が許容される。ｐＨおよび各成分の濃度などの最適値は、検出対象であるサイトカインの種類によって異なる場合があり得る。このような最適化は、当業者による通常の条件設定プロセスの範囲内で行われ得る。
以下に、本発明の方法における、固相上での複合体形成に関する代表的な手順の例を概説する。
１）適切なコーティング用緩衝液で希釈した第１の抗体の溶液を、固相上（例えば９６ウェル・マイクロタイタープレートのウェル）に適用し、インキュベートすることによって、第１の抗体を固相に固定化する。コーティング用緩衝液としては、例えば、適量のＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液を用い得る。インキュベートの条件は、代表的には、約２〜６℃程度にて約２０時間以上である。
２）次いで、第１の抗体でコーティングされた固相の表面を、洗浄用緩衝液で数回洗浄する。洗浄用緩衝液としては、例えば、弱アルカリ性のトリス−塩酸を用い得、必要に応じて、適量のタンパク質可溶化能を有するノニオン性界面活性剤を添加させ得る。コーティングされた固相は、洗浄後、アッセイに使用する直前まで、−２０℃程度の低温で保存する。
３）上述のように、検出対象であるサイトカインを含む生体液サンプルは、好ましくは、予めサンプル希釈用緩衝液で適切に希釈しておく。この生体液サンプル、および必要に応じて当該サイトカインの標準溶液を、コーティングされた固相に適用してインキュベートする。インキュベートの条件は、代表的には、約３５〜３９℃程度にて約４０〜約２時間程度である。インキュベート後、上記と同様に、固相の表面を洗浄用緩衝液で数回洗浄する。
４）その後、適切な緩衝液で希釈した第２の抗体の溶液を固相に適用してインキュベートする。ここでは、上記のサンプル希釈用緩衝液と同じものを使用することが好ましい。インキュベートの条件は、生体液サンプルでの上記インキュベートと同程度である。インキュベート後、上記と同様に、固相の表面を洗浄用緩衝液で数回洗浄する。
５）結合体を、ランタノイド金属イオンの塩の溶液と混合して、蛍光性錯体部分を形成させる。錯形成した結合体を適切な溶媒で希釈した後に、固相に適用してインキュベートする。インキュベートの条件は、生体液サンプル、および第２の抗体での上記各インキュベートと同程度である。インキュベート後、上述のように、適切な複合体洗浄用緩衝液で固相上に形成された複合体を洗浄する。
このようにして得られた、ランタノイド錯体含有複合体は、次に、固相または液相での時間分解型蛍光測定に供される。この蛍光測定のための装置は、市販で入手可能である。測定条件は、代表的には、遅延時間約０．２〜約０．３ミリ秒（ｍｓ）、ウィンドウ時間約０．２〜約０．６ｍｓ、および、フラッシュ速度（ｆｌａｓｈ  ｒａｔｅ）約０．５〜約１．５ｍｓ、ならびに、励起波長３３７．１ｎｍ（窒素レーザの波長）、および測定波長６１５ｎｍである。
固相蛍光速度の場合は、上記複合体を有する固相を、そのまま蛍光測定条件に供すればよい。液相蛍光測定の場合は、複合体を適切な解離溶液で処理することによって蛍光性錯体部分を含む構造単位を溶液中に遊離させ、この溶液を蛍光測定条件に供する。解離溶液は、代表的には、トリアルキルフォスフィンオキシドとアニオン性界面活性剤とを含有する弱塩基性水溶液である。解離溶液の例として、トリ（ｎ−オクチル）フォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）とドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とを含有する炭酸水素ナトリウム（ＮａＣＨＯ3）水溶液を用い得る。このような解離溶液で、上記複合体を有する固相を、例えば約４５〜５５℃程度にて約４０分〜約２時間程度インキュベートすることによって、上記のストレプトアビジンまたはアビジンとビオチンとの結合が切断され、蛍光性錯体部分を含む結合体が溶液中に遊離される。
上記の液相蛍光測定によれば、固相が蛍光測定に関与しないため、固相の種類および材質の選択の範囲が広がる利点がある。他方、液相蛍光測定では、固相蛍光測定に比べて余分な工程を必要とするため、手順が煩雑になる。さらに、液相蛍光測定では、解離溶液での処理工程において不純物の影響などを受けやすいなどの理由から、固相蛍光測定に比べて感度が若干低下する場合がある。しかし、固相および液相それぞれの蛍光測定によって達成され得る最大の感度は、アッセイに関与する様々な条件の組み合わせによって変動し得ることが理解されるべきである。
本発明によれば、さらに、上述した時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法を実施するためのキットが提供される。このキットは、通常、少なくとも上記の成分（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を構成物品として含む。すなわち、固相に結合した部分と、サイトカインと結合し得る領域とを有する第１の抗体；サイトカインと結合し得る領域と、ビオチンが結合した部分とを有する第２の抗体；ストレプトアビジンまたはアビジンと、ランタノイド金属イオンと錯形成し得る蛍光性構造部分とを有する結合体；および、ランタノイド金属イオンを、一体として測定者に提供し、生体液サンプル中のサイトカインを検出するためのアッセイの実施を可能にする。必要に応じて、キットはさらに、測定対象であるサイトカインの標準品、上述した各種の緩衝液（特にサンプル希釈用緩衝液および複合体洗浄用緩衝液）などを含み得る。キットの構成物品は、通常、それぞれ適切な形態で容器に収容され、使用のための説明書または指示書とともに、一体として包装され得る。
本発明によって、生体液サンプル中のサイトカイン、特にＳＤＦ−１を含むケモカインを正確にかつ高感度で検出し得る新規な手法が利用可能となる。本発明の方法によるサイトカインの検出限界は、下記の実施例２と実質的に同一の条件で求めたとき、代表的には約１００ｐｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５０ｐｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約３０ｐｇ／ｍｌ以下であり得る。同様に、実施例２と実質的に同一の条件で求めたとき、サイトカイン測定の変動係数（ＣＶ）は、代表的には約１０％未満、好ましくは約８％未満、より好ましくは約７％未満であり得る。また、血漿サンプルからの当該サイトカインの回収率は、下記の実施例６と実質的に同一の条件で求めたとき、代表的には約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であり得る。さらに、同一個体由来の血漿サンプル中の当該サイトカインについて、４回以上の異なる日に、同一条件での測定を繰り返したときの測定値の変動は、好ましくは約１０〜約２０％の範囲にあり得る。
下記の実施例に示すように、本発明に従って、蛍光性化合物ＢＨＨＣＴ由来のＥｕ3+錯体を利用することにより、特にＳＤＦ−１について、ＥＬＩＳＡおよびＤＥＬＦＩＡなどの従来の方法と比べたとき、血漿サンプル中での検出感度は２桁から３桁のオーダーで改善された。ＳＤＦ−１の生体での挙動を正確に把握し、その生理的機能を解明することは、ＨＩＶ−１感染についての理解を深め、ＡＩＤＳ治療への新しい展望を開くうえで極めて重要である。本発明がサイトカインの分子生物学の発展および応用に、格別の有意義な貢献を果たし得ることは明らかである。
さらに、下記の実施例に示すように、本発明に従って、蛍光性化合物ＢＨＨＣＴ由来のＥｕ3+錯体を利用することにより、ケモカイン・ファミリー以外のサイトカイン、例えば、血液循環中に可溶性因子として存在し、微量で生物活性を持ち種々の病態に関与するばかりでなく、すでに治療応用されているサイトカインについても、ＳＤＦ−１同様の高感度で、かつ再現性良く測定できることが示された。
実施例
以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
以下、本願発明を、実施例によって具体的に説明する。これら実施例は、本願発明を限定するものではない。
実施例で使用した材料、装置および測定条件を以下に挙げる。
抗体：ヒトＳＤＦ−１βの残基３３〜４５（ＲＦＦＥＳＨＩＡＲＡＮＶＫ）を含む多抗原ペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、アラバマ州、米国）でウサギを免疫することにより、抗ＳＤＦ−１抗血清を惹起した。抗血清をアフィニティーカラムで精製し、そして用いた。ヒトＳＤＦ−１βに対するヤギポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（ミネソタ州、米国）から購入した。ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に対するヒトモノクローナル抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）から購入した。ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に対するモノクローナル抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）から購入した。
ケモカイン：ヒトランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ヒトＭＩＰ−１αおよびβ、ヒトＭＤＣ、ならびにヒトフラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）を、ＤＩＡＣＬＯＮＥ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（フランス）から購入した。ヒトＩＬ−８を、ＥＮＤＯＧＥＮ（マサチューセッツ州、米国）から購入した。市販のＥＬＩＳＡキットを、血漿中に添加したマウスＩＬ−８およびマウスＭＣＰ−１の決定のために用いた。マウスＩＬ−８を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（スウェーデン）から、マウスＭＣＰ−１を、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）から、それぞれ購入した。マウスＳＤＦ−１α、マウスＳＤＦ−１β、ヒトＳＤＦ−１α、およびヒトＳＤＦ−１βは、それぞれ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マサチューセッツ州、米国）から贈与されたものである。ヒトＧＭ−ＣＳＦは、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）から購入した。ヒトＩＬ−２は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州、米国）から購入した。
装置および測定条件：時間分解型蛍光測定のために、Ｗａｌｌａｃ（フィンランド）およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈからの１４２０型ＡＲＶＯ多標識カウンターを用いた。測定条件は、次の通り：遅延時間０．２０ミリ秒（ｍｓ）、ウィンドウ時間０．４０ｍｓ、およびフラッシュ速度１．００ｍｓ。最も鋭敏なＴＲ−ＦＩＡアッセイシステムを得るために、Ｎｕｎｃ（デンマーク）から購入した５種類のマイクロタイタープレートを調べた。このうち、ポリソープ（ｐｏｌｙｓｏｒｐ）プレートが、標準ヒトＳＤＦ−１βの測定において最も鋭敏な蛍光シグナルを生じた。感度の順序は次の通り：Ｗｈｉｔｅ  Ｃ９６ポリソープ＞Ｗｈｉｔｅ  Ｃ９６マキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）＞Ｗｈｉｔｅ  Ｃ８マキシソープ＞Ｂｌａｃｋ  Ｆ１６マキシソープ。以下の実験では、Ｗｈｉｔｅ  Ｃ９６ポリソープ・マイクロタイタープレートを常用した。
（実施例１；ＴＲ−ＦＩＡのための予備的検討）
最初に、ＳＤＦ−１測定のためのＥＬＩＳＡに基く免疫アッセイ系に適切な、固相結合捕捉抗体と検出抗体との良好な組合せを見出すことを試みた。この目的のために、ポリクローナルウサギ抗ＳＤＦ−１抗体およびポリクローナルヤギ抗ＳＤＦ−１抗体の合計５種類について、種々の組み合わせを検討した。標準ＳＤＦ−１の特異的検出が、３種の組合せで見出された。しかし、ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＳＤＦ−１の検出限界は、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌを越えることはなかった。通常、血漿中に存在するＳＤＦ−１レベルは、この検出限界よりもはるかに低い。従って、ＥＬＩＳＡアッセイでは、血漿サンプル中のＳＤＦ−１の検出は事実上不可能であることが確認された。
以上で見出された最も好適なポリクローナル抗体の組合せを用い、通常のＴＲ−ＦＩＡの条件に下記のような変更を加えて、ＳＤＦ−１の検出を行った。
（実施例２：標準ＳＤＦ−１についてのＴＲ−ＦＩＡ）
ＴＲ−ＦＩＡのために、４種類のアッセイ緩衝液を調製した；９６ウェル・マイクロタイタープレートをコーティングするための緩衝液１（０．１４Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ））；プレートを洗浄するための緩衝液２（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）；洗浄のための緩衝液３（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）；タンパク質溶液の希釈のための緩衝液４（０．２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3、および０．９％ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）。
ＢＨＨＣＴの合成は、Ｙｕａｎら（’９８）（文献５）に記載の方法に従って、そして、ストレプトアビジン−ウシ血清アルブミン（ＳＡ−ＢＳＡ）結合体の調製、および結合体のＢＨＨＣＴでの標識は、Ｙｕａｎら（’９７）（文献４）に記載された方法に従って実施した。標識した結合体の溶液を、−２０℃で保存し、使用直前に、下記の緩衝液（緩衝液４）を用いて１００倍に希釈した。
ウサギポリクローナル抗ヒトＳＤＦ−１β抗体またはヤギポリクローナル抗ヒトＳＤＦ−１β抗体を捕捉抗体として用いた。これらは各々、類似の結果を生じた。緩衝液１で１０μｇ／ｍｌに希釈した捕捉抗体の溶液（各々６０μｌ）を、９６ウェル・マイクロタイタープレートのウェルにおいて、４℃にて２４時間インキュベートした。次いで、このウェルを、緩衝液２で２回、そして緩衝液３で１回洗浄した。このようにして抗ＳＤＦ−１抗体でコーティングされたプレートは、−２０℃にて少なくとも１ヶ月間は保存し得る。
ＳＤＦ−１の標準溶液（５０μｌ）を、コーティングされた上記のプレートにピペッティングし、そして３７℃にて１時間インキュベートした。緩衝液２および緩衝液３でプレートを洗浄した後、緩衝液４で１０００倍に希釈したビオチン化ヤギポリクローナル抗ヒトＳＤＦ−１β抗体（上記Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍのヤギ抗体を常法に従ってビオチン化したもの）の溶液５０μｌをウェルにおいて、３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを緩衝液２で２回、そして緩衝液３で１回洗浄し、そして５０μｌのＢＨＨＣＴ−Ｅｕ3+で標識したＢＳＡ−ＳＡ溶液（５０μｌ）を、ウェル中で３７℃にて１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１でプレートを４回洗浄した。このプレートを、１４２０型ＡＲＶＯ多標識カウンターを用いて、固相蛍光測定に供した。
上記のＴＲ−ＦＩＡによって得られた、水性溶液中の標準ＳＤＦ−１についての較正曲線を、図１ａおよび図１ｂに示す。ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１の検出限界は、以下の計算式（Ｋｒｏｐｆら（文献２）による）から算出される：
３ｘ［Ｓ0］ｘｓB／（Ｓ0−Ｂ）
ここで、
［Ｓ0］は、標準溶液の最適濃度
ｓBは、ブランクの標準偏差
Ｓ0は、最低濃度の標準溶液の蛍光シグナル強度、そして
Ｂは、ブランクの蛍光シグナル強度、である。
上記式より、ＴＲ−ＦＩＡの検出限界は３０ｐｇ／ｍｌと計算された。これは、上記参考例のＥＬＩＳＡによる検出限界（約１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）より３桁低い値である。１ウェル当り溶液５０μｌを用いるので、ＴＲ−ＦＩＡにより検出されるＳＤＦ−１タンパク質の最小量は１．５ｐｇ／ウェルである。
ＴＲ−ＦＩＡは、測定の再現性という点でも改善されていた。ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１検出の変動係数（ＣＶ）は、標準サンプルについて、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０２４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で７％未満であった。これは、上記参考例のＥＬＩＳＡによるＣＶ値が、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で１０％を越え、ＤＥＬＦＩＡ（下記比較例を参照）によるＣＶ値が、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０２４ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でやはり１０％を越えたことと対照的である。
なお、上記の固相蛍光測定に加えて、液相での蛍光測定も検討した。すなわち、上記の手順により固相上に形成された蛍光性複合体（ポリクローナル抗ＳＤＦ−１抗体−ＳＤＦ−１−ビオチン化ポリクローナル抗ＳＤＦ−１抗体−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ3+標識化ＢＳＡ−ＳＡ）を、酸性キレート化界面活性剤溶液（１０μＭのＴＯＰＯと０．０５％のＳＤＳとを含有する０．１ＭのＮａＨＣＯ3水溶液）で処理することにより、標識されたＢＳＡ−ＳＡ結合体を固相から遊離させた。溶液中の結合体の蛍光強度を１４２０型ＡＲＶＯ多標識カウンターを用いて測定した。この場合のＳＤＦ−１検出感度は約１００ｐｇ／ｍｌであり、上記の固相測定ほど高くなかった。
（実施例３：ヒトＳＤＦ−１βによるＣＸＣＲ４のダウンモデュレーション）
実施例２のＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１の測定値と、標準ＳＤＦ−１タンパク質の生物活性との相関を確認するために、ＳＤＦ−１の結合によりＥＬ−４細胞で誘導される、ＳＤＦ−１レセプター（ＣＸＣＲ４）のインビトロでのダウンモデュレーションを測定した。
ＥＬ−４細胞を、ヒトＳＤＦ−１β（１、１０、２０、４０、１００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ’ＭＥＭ）中で培養した。３７℃で６時間のインキュベーションの後、細胞の表面上のＣＸＣＲ４を、Ｆｃ−ヒトＳＤＦ−１αキメラタンパク質およびＦＩＴＣ結合ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、アラバマ州、米国）を用いて染色した。蛍光強度測定を、フルオロサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ、カリフォルニア州、米国）により実施した。ＣＸＣＲ４のダウンモデュレーションを、ＣＸＣ４染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の減少％を計算することにより評価した。結果を図１ｃに示す。
図１ｃにより、ヒトＳＤＦ−１βと共に培養したＥＬ−４細胞が、用量依存的に、ＣＸＣＲ４の発現についてダウンモデュレーションされることが示される。得られた結果は、ＳＤＦ−１αおよびβがＣＸＣＲ４に、それぞれ５〜１０ｎＭおよび２．２〜３．６ｎＭのＫｄ値で結合するという、以前の報告（Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒら（文献１３）およびＡｍａｒａら（文献１４））と良く整合している。
（実施例４：ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１測定の特異性）
ＳＤＦ−１についてのＴＲ−ＦＩＡの特異性を確認するために、実施例２の記載と同様のＴＲ−ＦＩＡ測定を、次の各種ケモカインについて行った：ＣＣケモカイン（マウスＭＣＰ−１、ヒトＭＩＰ−１αおよびβ、ヒトランテス、ヒトＭＤＣ）、ＣＸＣケモカイン（ヒトＩＬ−８、マウスＳＤＦ−１αおよびマウスＳＤＦ−１β、ヒトＳＤＦ−１αおよびヒトＳＤＦ−１β）、ならびにＣＸＸＸＣケモカイン（ヒトフラクタルカイン）。結果を図１ｄに示す。蛍光強度の有意な上昇は、ＳＤＦ−１以外のいずれのケモカインでも認められなかった。従って、上記ＴＲ−ＦＩＡが、ＳＤＦ−１を高い特異性で検出し得ることが確認された。ヒトとマウスとのＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１β間では交差反応性が示された。
（実施例５：血漿サンプルの調製）
以下の各実施例で使用した血漿サンプルは、１８〜３０歳の健康なボランティア（日本人）の３６個体の血液から、抗凝固剤としてＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ血液）を用いて調製した。具体的には、０．１Ｍ  ＥＤＴＡでコーティングされたシリンジに、採取血液１ｍｌ当たり７μｌとなるように、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを充填した。このシリンジ中に血液を採取し、室温にて５分間インキュベートし、続いて３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、血漿を得た。血漿サンプルは、−８０℃にて保存し、他に示さない限り、分析直前に、緩衝液４で１０倍に希釈した。アッセイの前に、凍結／融解を反復することのないようにした。
（実施例６：血漿サンプルでのＴＲ−ＦＩＡ）
実施例２に記載のＴＲ−ＦＩＡを、ＳＤＦ−１の標準溶液および上記の血漿サンプル（５個体分）を用いて行った。標準溶液での測定から求めた較正曲線（図２の左側に示す黒丸の線グラフ）との対比により、血漿サンプル中のＳＤＦ−１濃度を算出した。さらに、測定の正確さを確認するために、各血漿サンプルに０．４または０．８ｎｇ／ｍｌの標準ＳＤＦ−１を添加して測定し、回収率を算出した。
標準ＳＤＦ−１添加後の血漿サンプルについて測定された蛍光強度を、図２の右側（「ＴＲ−ＦＩＡ」の欄）に示す。標準ＳＤＦ−１添加前および添加後の血漿サンプルのＳＤＦ−１濃度、および回収率を下記の表１に示す。ＴＲ−ＦＩＡにより、血漿サンプルからも、標準溶液の場合と同様にＳＤＦ−１が検出され得、その回収率は極めて高いことが示された。
（比較例；ＳＤＦ−１についてのＤＥＬＦＩＡ）
以下、ＤＥＬＦＩＡの測定操作は、他に記載のない限り、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；以下「ＡＰＢ社」）の指示に従った。洗浄には、全てＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌまで希釈したウサギ抗ヒトＳＤＦ−１β抗体またはヤギ抗ヒトＳＤＦ−１β抗体の溶液（各々６０μｌ）を、透明なマキシソープ・プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に吸着させ、４℃にて２４時間インキュベートした後、１回洗浄した。続いて、非特異的結合をブロックするために、１８０μｌのＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＡＰＢ社）を、室温にて少なくとも３０分間、適用した。
プレートを３回洗浄した後、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液で希釈した標準ＳＤＦ−１、または１０倍希釈した血漿サンプルを、ウェルあたり５０μｌづつ添加し、そして４℃にて、少なくとも６時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、アッセイ緩衝液中に２０ｎｇ／ｍｌまで希釈したＥｕ標識ストレプトアビジン（ＡＰＢ社）１００μｌを添加し、そして室温にて３０分間インキュベートした。プレートを６回洗浄した後、ＤＥＬＦＩＡ増感溶液（ＡＰＢ社）を添加して、固相に結合したＥｕ標識抗体からＥｕ3+を解離させた。マイクロプレートをゆっくりと５分間振盪させた後、時間分離型フルオロメーター（ＡＲＶＯ  １４２０）で蛍光を測定した。
標準溶液での測定から求めた較正曲線を、図２の左側に示す（黒四角の線グラフ）。実施例２に記載の計算式に従って算出した検出限界は、１３０ｐｇ／ｍｌであった。ＤＥＬＦＩＡにより、標準溶液中のＳＤＦ−１は、ＴＲ−ＦＩＡよりも低感度ながら検出し得た。しかし、血漿サンプル（４個体分）の測定では、いずれも内因性ＳＤＦ−１を検出できなかった。さらに、各血漿サンプルに１．０ｎｇ／ｍｌの標準ＳＤＦ−１を添加して測定した場合の回収率も、約２０％以下と、ＴＲ−ＦＩＡよりも著しく低かった。
標準ＳＤＦ−１添加後の血漿サンプルについて測定された蛍光強度を、図２の右側（「ＤＥＬＦＩＡ」の欄）に示す。標準ＳＤＦ−１添加前および添加後の血漿サンプルのＳＤＦ−１濃度、および回収率を表１に示す。（なお、図２および表１のデータに示される血漿サンプルは、何れも、５５℃、３０分の予備加熱をしたものである。）
0003586243.tif 000013
（実施例７：抗凝固剤およびプロテアーゼ阻害剤の影響）
抗凝固剤およびプロテアーゼ阻害剤はヒト血漿サンプル中でのサイトカインの測定に影響することが報告されている（Ｔｈａｖａｓｕら（文献１５））。ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１の測定が、これらの要因に影響されるか否かを検討するために、以下の実験を行った。
血漿サンプルに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（１．０ｍｇ／ｍｌ）、ヘパリン（３０ＩＵ／ｍｌ）、クエン酸ナトリウム（０．３８％）、ならびに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（１．０ｍｇ／ｍｌ）およびプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン（１μｇ／ｍｌ）を添加した。各添加サンプルについて、実施例２と同様にしてＴＲ−ＦＩＡによりＳＤＦ−１を測定した。結果を図３ａに示す。抗凝固剤およびプロテアーゼ阻害剤は、ＴＲ−ＦＩＡによる血漿ＳＤＦ−１の測定に有意な影響を与えないことが確認された。
（実施例８：血漿サンプルの予備加熱の影響）
ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１測定の臨床への適用においては、安全性確保のために、血液由来サンプル中に存在し得るＨＩＶウイルスを不活性化することが必要となる。そこで、血漿サンプルの予備加熱がＴＲ−ＦＩＡに及ぼす影響を検討した。
まず、ＳＤＦ−１タンパク質の熱安定性を試験するために、ＳＤＦ−１の標準溶液を：０℃、３０分間；３７℃、３０分間；５５℃、３０分間；７０℃、３０分間；および１００℃、１分間でそれぞれ保持した後、アッセイに付した。７０℃、３０分間、および１００℃、１分間の条件では、ＳＤＦ−１の熱変性によると考えられる検出量の低下が観察された。他方、３７℃または５５℃、３０分間の加熱は、非加熱サンプルとほぼ同一の較正曲線を与え、ＳＤＦ−１の検出量に影響しなかった。
以上の結果を基に、２４個体分の血漿サンプル（実施例５参照）を、アッセイ前に５５℃で３０分間予めインキュベートするか、または加熱することなく用いて、実施例２と同様にしてＴＲ−ＦＩＡによりＳＤＦ−１を測定した。（予備加熱は、血漿サンプルを緩衝液４で希釈する前に行った。）結果を図３ｂに示す。５５℃、３０分間の予備加熱により、平均約２０％の蛍光強度の増大が得られた。
この結果は、血漿サンプル中のＳＤＦ−１の少なくとも一部が、多量体として、および／または、熱により解離または分解等される結合因子と結合した形態で存在する可能性を示唆する。このような多量体および／または結合形態において、ＳＤＦ−１のエピトープへの抗体の結合が阻害されているのかもしれない。
（実施例９：血漿サンプルの希釈の影響）
血漿サンプル中でのＩＬ−８およびＭＣＰ−１の測定に関する以前の研究（Ｔｈａｖａｓｕら（文献１５）およびＫａｊｉｋａｗａら（文献１６））により、非希釈サンプルでの測定ではケモカインの存在量が過小評価されることが示されている。そこで、ＴＲ−ＦＩＡによるＳＤＦ−１の測定への、血漿サンプルの希釈の影響を検討した。
５個体分の血漿サンプルを、１：１〜１：２０までの各種比率で、緩衝液４で希釈したものを用いて、実施例２と同様にしてＴＲ−ＦＩＡによりＳＤＦ−１を測定した。結果を図３ｃに示す。希釈倍率を１倍から１０倍まで増加させる間、ほぼ一貫して検出感度の向上が認められた。他方、希釈倍率を１０倍から２０倍にしても、検出感度は向上しなかった。従って、１０倍の希釈（すなわち、血漿  サンプル１部に対して緩衝液４を１０部）が最も有効な条件であると評価された。
（実施例１０：血漿サンプルへの血球の添加の影響）
ＩＬ−８およびＭＣＰ−１を全血に添加すると、血球によって、これらのケモカインが吸収されることが報告されている（Ａｍａｒａら（文献１４）、Ｄａｒｂｏｎｎｅら（文献１７）、およびＮｅｏｔｅら（文献１８））。ＳＤＦ−１について、血球による同様な吸収が観察されるか否かを検討した。
全血２５０μｌをミクロ遠心分離機にかけて、細胞を沈殿させ、１２５μｌの上清画分として血漿を取り出した。この１２５μｌの血漿に、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１またはＳＤＦ−１を、所定の最終濃度を与えるように添加した。次に、これらのケモカイン添加血漿を、１２５μｌ容量の細胞ペレット、または１２５μｌの血漿と混合した後、３７℃において１５分間インキュベートした。次いで、細胞ペレットを混合したサンプルでは、遠心分離により細胞を沈殿させ、分離した。サンプル中の可溶性ＩＬ−８、およびＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡにより、そしてＳＤＦ−１を、ＴＲ−ＦＩＡにより定量した。結果を図４ａ〜図４ｃに示す。
ＩＬ−８およびＭＣＰ−１は、添加量の大部分が血球に吸収された（図４ａおよび図４ｂ）。他方、ＳＤＦ−１の場合、血球とインキュベーションした後の減少量は１０％未満であった（図４ｃ）。さらに、別の実験において、ＳＤＦ−１を全血に直接添加し、インキュベーション後に血球を分離してからＴＲ−ＦＩＡにより定量したところ、ＳＤＦ−１を血漿に添加したコントロールとの間に有意な差は認められなかった（データは示さず）。以上より、ＳＤＦ−１は、ほとんど血球に吸収されないことが確認された。
（実施例１１：血漿サンプルでのＴＲ−ＦＩＡ−多数検定）
３６個体分の血漿サンプルについて、５５℃、３０分間の予備加熱（実施例７参照）の後に、実施例２と同様にしてＴＲ−ＦＩＡによりＳＤＦ−１を測定した。結果を図５ｃに示す。ヒト血漿中のＳＤＦ−１レベルの平均値および標準偏差は、０．８５±０．２６ｎｇ／ｍｌであった。
同一個体（３名）由来の血漿サンプルについて、４回以上の異なる日に、同一条件での測定を繰り返したところ、測定値の変動は１０〜２０％の範囲にあった。ＴＲ−ＦＩＡによる血漿ＳＤＦ−１測定の信頼性が十分に高いことが示された。
（実施例１２：血漿サンプルでのＳＤＦ−１のＩｇＧとの会合）
ＩＬ−８およびＭＣＰ−１に関して、血漿サンプルでの免疫アッセイを阻害し得る別の要因として、循環系における自己抗体との結合または会合の可能性が指摘されている（Ｌｅｏｎａｒｄら（文献１）およびＴｈａｖａｓｕら（文献１５））。ＳＤＦ−１について、血漿中でのＩｇＧとの会合を、以下のように評価した。
７個体分の血漿サンプルを、非加熱のまま、または加熱処理（５５℃、３０分間）の後に、プロテインＧ−セファロースと共に氷上で３０分間インキュベートして、ＩｇＧを枯渇させた。サンプルを、遠心分離し、そして上清画分を取り出した。この上清中のＳＤＦ−１を、ＴＲ−ＦＩＡにより測定した。プロテインＧ−セファロース処理前の血漿サンプルでの測定値と比較して、蛍光強度の減少度を求めた。結果を図６に示す。
図６において、斜線棒および黒棒は、それぞれ、非加熱サンプルおよび加熱処理サンプルを示す。非加熱サンプルは、加熱サンプルと比較して、プロテインＧ−セファロース処理による影響を受けやすいことが分かる。非加熱サンプルについては、ＩｇＧ枯渇による、ＴＲ−ＦＩＡ測定可能なＳＤＦ−１のレベルは２３〜３７％（平均３０％）減少した。他方、加熱処理サンプルの場合は、対応する減少度は６〜２２％（平均１５％）であった。従って、実施例８において示された予備加熱の効果（図３ｂ）は、血漿サンプル中でＳＤＦ−１の一部がＩｇＧと会合して存在し、これが加熱により解離して、ＴＲ−ＦＩＡ測定可能な可溶性形態に変換されるとの仮説により説明され得る。
別の実験において、血漿サンプルに添加した標準ＳＤＦ−１については、プロテインＧ−セファロース処理の後で、有意な減少は観察されなかった（データは示さず）。従って、ＳＤＦ−１自体がプロテインＧ−セファロースに吸着される可能性、ならびに、血漿サンプル中の抗ＳＤＦ−１ＩｇＧ以外の抗体またはタンパク質がプロテインＧ−セファロースに吸着され、これにＳＤＦ−１が吸着される可能性は否定された。
以上の結果から、ＴＲ−ＦＩＡによる測定される、ヒト血漿中のＳＤＦ−１レベルは、血液中に実際に存在する生理的ＳＤＦ−１レベルに極めて近いことが理解される。
（実施例１３：ＧＭ−ＣＳＦについてのＴＲ−ＦＩＡ）
捕捉抗体として抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用いたこと、およびビオチン化抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（上記ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎヒト抗体を定法に従ってビオチン化したもの）を用いたことを除いて、実施例２と同様にＧＭ−ＣＳＦの標準溶液（５０μｌ）を固相蛍光測定に供し、標準ＧＭ−ＣＳＦについて較正曲線を作成した。結果を図７に示す。さらに、実施例５と同様の方法により健常日本人ボランティアから血漿サンプルを調製し、実施例９に記載のように緩衝液４で希釈して標準溶液と同様にＴＲ−ＦＩＡによりＧＭ−ＣＳＦを測定した。その結果、ＧＭ−ＣＳＦについても、高感度の測定が可能であり、再現性において優れた結果が確認された。
（実施例１４：ＩＬ−２についてのＴＲ−ＦＩＡ）
捕捉抗体として抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体を用いたこと、およびビオチン化抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体（上記ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎヒト抗体を定法に従ってビオチン化したもの）を用いたことを除いて、実施例２と同様にＩＬ−２の標準溶液（５０μｌ）を固相蛍光測定に供し、標準ＩＬ−２について較正曲線を作成した。結果を図８に示す。さらに、実施例５と同様の方法により健常者日本人ボランティアから血漿サンプルを調製し、実施例９に記載のように緩衝液４で希釈し標準溶液と同様にＴＲ−ＦＩＡによりＩＬ−２を測定した。その結果、ＩＬ−２についても、高感度の測定が可能であり、再現性において優れた結果が確認された。
産業上の利用可能性
生体液サンプル中のサイトカイン、特にＳＤＦ−１を含むケモカインを極めて高感度で、かつ簡便に検出し得る、時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）法、ならびに、当該方法のためのキットが提供される。この方法およびキットは、血液循環中に可溶性因子として存在し、微量で生物活性を持ち種々の病態に関与するサイトカインに適用される。
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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