【手続補正書】
【提出日】平成28年12月9日(2016.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の複数の標的をプローブする方法であって、
（ａ）１以上のプローブを、複数の標的を含む生体試料中に存在する１以上の標的に結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で結合した１以上のプローブからの信号を検出する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の結合プローブを含む試料を、電子移動試薬及び以下の工程（ｄ）での標的改質を防ぐ添加剤と接触させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の試料を照射する工程と、
（ｅ）１以上のプローブを、工程（ｄ）の試料中に存在する１以上の標的に結合させる工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で結合したプローブからの信号を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）のプローブが光信号発生剤を含み、工程（ｂ）で検出される信号が光信号である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）のプローブが蛍光信号発生剤を含み、工程（ｂ）で検出される信号が蛍光信号である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）における試料の照射がｐＨ５〜９の緩衝液の存在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）における試料の照射が、３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に試料を露光することによって達成される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｄ）における試料の照射が、４００〜７００ｎｍの波長の光に試料を露光することによって達成される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
電子移動試薬が、以下の構造式で表されるボレート塩である、請求項１記載の方法。
【化１】
2016508213.tif 000001
式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり、これらのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ4は、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらのアルキル、アルケニル又はアルキニルは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｍ+は、有機カチオン及び無機カチオンからなる群から選択される。
【請求項８】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が各々アリール又は置換アリールであり、Ｒ4がアルキル又は置換アルキルである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が各々非置換フェニルであり、Ｒ4が非置換ブチルであり、ボレート塩がトリフェニルブチルボレート塩である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
プローブが形態染色剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
電子移動試薬が高水溶性ボレート塩である、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
高水溶性ボレート塩が、テトラ−ｎ−ブチルボレート塩、フェニル−トリス−２−（４−メトキシＰＥＧ（１０）メチルフェニル）エチルボレート塩又はジフェニル−ビス−２−（４−（メトキシＰＥＧ（１０）メチル）フェニル）エチルボレート塩である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）〜（ｆ）が１回以上繰り返される、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）及び（ｄ）が約１００ミリ秒〜約１５分間実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）の後に、試料から残留電子移動試薬を有効に除去する洗浄溶液で試料を洗浄することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
洗浄溶液が助剤を含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）のプローブ及び工程（ｅ）のプローブが各々信号発生剤を含み、工程（ａ）の信号発生剤が工程（ｅ）の信号発生剤とは異なる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）における試料の照射が、光活性化型ケミカルブリーチングによって信号発生剤を実質的に不活性化する光反応を開始する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
工程ｄ）の後に、検出可能な信号が検出されない、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
標的改質を防止する添加剤がラジカルスカベンジャーである、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
ラジカルスカベンジャーが、アスコルビン酸、ｎ−プロピルガレート、メルカプトエタノール、システインヒドロクロリド、ｔ−ブチルヒドロキシトルエン、シクロヘプタトリエン、ジオクチルフタレート、１，４−ジヒドロ−ｏ−トルアミド、ａ−トコフェロール及びトロロクスからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
標的改質を防止する添加剤が一重項酸素用クエンチャーである、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
一重項酸素用クエンチャーが、アスコルビン酸、ａ−トコフェロール、クルクミン及びＤＡＢＣＯからなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生体試料中の複数の標的をプローブする方法であって、
（ａ）第１のプローブセット及び第２のプローブセットを含む複数のプローブを、複数の標的を含む生体試料中に存在する複数の標的に結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で結合した第１のプローブセットからの第１の信号セットを検出する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の結合プローブを含む試料を、電子移動試薬及び以下の工程（ｄ）での標的改質を防ぐ添加剤と接触させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の試料を照射する工程と、
（ｅ）工程（ａ）で結合した第２のプローブセットからの第２の信号セットを発生させる工程と、
（ｆ）第２の信号セットを検出する工程と
を含む、方法。
【請求項２５】
ハイスループット多重化生体試料分析方法であって、
各サイクルにおいて、染色及びイメージングし、続いて、電子移動試薬及び標的改質を防止する添加剤を適用し、生体試料を照射するシグナルサイクリングプロセスを含む、方法。
【請求項２６】
プローブと異なる生体試料成分を有意に改質せずに迅速なシグナルサイクリングを可能にする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
光標識生体標的を示す一連の２以上の画像であって、画像が、生体試料中の複数の標的をプローブするプロセスで得られるものであり、プロセスが、
（ａ）１以上の光プローブを、複数の標的を含む生体試料中に存在する１以上の標的に結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で結合した光プローブからの信号を検出する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の結合光プローブを含む試料を、電子移動試薬及び以下の工程（ｄ）での標的改質を防ぐ添加剤と接触させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の試料を照射する工程と、
（ｅ）１以上の光プローブを、工程（ｄ）の試料中に存在する１以上の標的に結合させる工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で結合した光プローブからの信号を検出する工程と
を含む、画像。
【請求項２８】
結合剤及び信号発生剤が単体において統合されている、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
単体が小分子プローブである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
小分子プローブが有機色素である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
有機色素が、試料中の特定の構造又はタンパク質に結合する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
生体試料中の複数の標的を調べるための信号をブリーチングするためのキットであって、
信号発生剤と接触すると、照射により信号発生剤をブリーチングすることができる電子移動試薬と、
信号発生剤の光活性化型ケミカルブリーチング中の標的改質を防止する添加剤と
を含む、キット。
【請求項３３】
生体試料中の複数の標的を調べるためのシグナルサイクリングプロセスが可能となるように請求項３２記載のキットを使用して信号をブリーチングする方法であって、生体試料中に存在する１以上の標的に結合した１以上のプローブからの信号を検出した後に、試料を電子移動試薬及び標的改質を防止する添加剤と接触させる工程と、試料を照射する工程とを含む、方法。
【請求項３４】
フローセルデバイス内にロード／捕捉された生体試料の光活性化型ケミカルブリーチング用自動化プロセスであって、以下の自動化工程
ａ）１以上のプローブを、生体試料中に存在する１以上の標的に結合させる工程と、
ｂ）工程（ａ）で結合した１以上のプローブからの信号を検出する工程と、
ｃ）電子移動試薬及び場合により後続の試料照射中の標的改質を防止する添加剤をフローセルに充填する工程と、
ｄ）露光により試料を照射してプローブからの信号を不活性化する工程と、
ｅ）場合により、電子移動試薬及び添加剤を洗い流す工程と、
ｆ）別のラウンドのイメージング用の１以上の他のプローブを用いて、工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程と
を含む、光活性化型ケミカルブリーチング用自動化プロセス。
【請求項３５】
光学フィルタ、顕微鏡対物レンズ及び移動台を使用して試料の特定領域を光に曝露することによって、試料の照射を達成する、請求項３４記載の光活性化型ケミカルブリーチング用自動化プロセス。
【請求項３６】
試料全体を同時に露光することによって、試料の照射を達成する、請求項３４記載の光活性化型ケミカルブリーチング用自動化プロセス。