【手続補正書】
【提出日】平成29年7月3日(2017.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相カラムの試料注入容量が増大された分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の精製方法であって、サロゲート固定相／追加固定相をＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相と併せて使用し、前記サロゲート固定相／追加固定相が、中性界面活性剤又はＰＥＧ化界面活性剤である、精製方法。
【請求項２】
逆相カラムの前記分取注入容量が、前記逆相カラムにサロゲート固定相／追加固定相を被覆および／または結合することにより増大されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サロゲート固定相／追加固定相である界面活性剤が、アルキルグリコシド、胆汁酸、グルカミド及びポリオキシエチレン類から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリオキシエチレン類がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アルキルグリコシドが、式：
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨ３
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｒ＝グルコースの場合、
ｘ＝８であるｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝７であるｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｘ＝６であるｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはｘ＝５であるｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、あるいは
Ｒ＝マルトースの場合、
ｘ＝１１であるドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｘ＝９であるドデシル−β−Ｄ−マルトシド、またはｘ＝９であるデシル−β−Ｄ−マルトシドである、
請求項３に記載の方法。
【請求項７】
胆汁酸が、式：
【化１】
2016536612.tif 000001
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＯＮａであるデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａであるタウロデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝Ｈ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａであるグリコデオキシコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＯＮａであるコール酸ナトリウム、
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｎａであるタウロコール酸ナトリウム、または
Ｘ＝ＯＨ、Ｒ＝ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａであるグリココール酸ナトリウムである、
請求項３に記載の方法。
【請求項８】
グルカミドが、式：
【化２】
2016536612.tif 000002
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝８であるＭＥＧＡ−１０、
Ｘ＝７であるＭＥＧＡ−９、または
Ｘ＝６であるＭＥＧＡ−８、
あるいは、式：
【化３】
2016536612.tif 000003
で表される化合物から選択され、
式中、
Ｘ＝ＨであるデオキシＢｉｇ  ＣＨＡＰ、または
Ｘ＝ＯＨであるＢｉｇ  ＣＨＡＰである、
請求項３に記載の方法。
【請求項９】
分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の多成分試料の精製方法であって：
（ａ）疎水性固定相を有するクロマトグラフィーシステムを構成するステップと、
（ｂ）前記クロマトグラフィー固定相を、アルキルグリコシド、胆汁酸、グルカミド及びポリ−オキシエチレンから選択されるサロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で飽和させるステップと、
（ｃ）有機溶媒と水との混合物を使用して前記カラムを洗浄して、過剰量の未結合界面活性剤を除去するステップと、
（ｄ）前記カラムを出発移動相で平衡化させるステップと、
（ｅ）前記サロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤で被覆された固定相を含む前記クロマトグラフィーベッドの一端に多成分試料を注入するステップと、
以下（ｆ）から（ｉ）：
（ｆ）緩衝液Ａが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１ｍＭ臭化セチルトリメチルアンモニウム及び０．１ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｇ）緩衝液Ａが０．１％リン酸の水溶液であり、緩衝液Ｂが０．１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、
（ｈ）緩衝液Ａが１％リン酸の水溶液であり、緩衝液Ｂが１％リン酸を含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ、及び
（ｉ）緩衝液Ａが２５ｍＭ〜１５０ｍＭのリン酸トリエチルアンモニウムの水溶液であり、緩衝液Ｂが２５ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウムを含む５０％アセトニトリル水溶液であり、前記緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの直線濃度勾配を用いて前記多成分試料を溶出するステップ
から選ばれるステップと、
（ｊ）前記多成分試料中の所望の成分を回収するステップと、を含む、方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の前記疎水性固定相が、Ｃ−８又はＣ−１８アルキル鎖誘導体化シリカである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の前記サロゲート固定相／追加固定相用界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）における、前記未結合界面活性剤を除去するための前記カラムの洗浄が、前記カラムをアセトニトリル水溶液で洗浄することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）における、前記未結合界面活性剤を除去するための前記カラムの洗浄が、０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液で洗浄することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記平衡化が、前記出発移動相で前記カラムを平衡化させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記平衡化が、０．１％〜１％のリン酸水溶液、０．１％ＴＦＡの水溶液、及び２５〜１５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウムの水溶液で前記カラムを平衡化させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
逆相カラムの試料注入容量が増大された分取逆相高速液体クロマトグラフィー（分取ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、ペプチドを含む有機化合物の精製方法であって、下記構造を有するＰＥＧ系洗浄剤／界面活性剤を追加固定相／サロゲート固定相として、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相となるＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相又は他の担体と併用する方法：
【化４】
2016536612.tif 000004
（式中、
「アルキル／アリール」は、直鎖又は分岐のアルキル、環式炭化水素、芳香族基、アルキル置換芳香族基、アリール置換アルキル基を含む群から独立に選択され、
「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、１〜２０である。）
【請求項１７】
前記式中の「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、６〜１２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記式中の「ｎ」はエチレン−オキシド残基の数であり、９〜１０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料注入容量の増大が、Ｃ−１８誘導体化シリカに結合した前記サロゲート固定相／追加固定相が可動状態である場合、または前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相に強くまたは恒久的に結合した場合に生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記可動状態が、低級炭素系界面活性剤を用いた観察において、Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相への結合及びＣ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相からの浸出が同時に見られる状態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ−３５及びＴｗｅｅｎ−８０から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
残存シラノール基と水素結合可能であり、かつ十分な濃度の有機修飾剤を有する緩衝液で前記カラムを洗浄して、前記Ｃ−１８／Ｃ−８誘導体化シリカ固定相用担体から前記サロゲート固定相／追加固定相によるコーティングを除去することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記有機修飾剤が、０．２５Ｍ〜０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む５０％〜９０％アセトニトリル水溶液である、請求項２２に記載の方法。