(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
▲１▼下記プライマー１の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を有する第１のＤＮＡプライマーと
▲２▼下記プライマー２の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、
▲３▼ＤＮＡポリメラーゼと、
▲４▼被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液
とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とするカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出方法。
プライマー１：５’ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’
プライマー２：５’ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’
【請求項２】
被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製するに際し、被検試料に、カンジダアルビカンスの抗原因子５を共通して保有するカンジダトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）をキャリヤーとして加え、抗因子５抗体ＭＡｂ−５共存下に凝集塊（カンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスの凝集塊）を形成させ、この凝集塊からカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製する請求項１に記載するカンジダアルビカンスの検出方法。
【請求項３】
下記の２２５塩基から構成されることを特徴とするカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
ＡＴＡＣＧ  ＣＴＡＣＣ  ＴＧＡＣＣ  ＣＣＡＣＣ  ＴＧＡＡＡ
ＴＡＴＡＡ  ＴＡＣＣＣ  ＣＡＧＧＴ  ＧＧＧＣＣ  ＴＧＣＣＣ
ＣＡＣＣＣ  ＡＣＣＡＡ  ＣＴＣＧＡ  ＣＣＡＧＴ  ＡＧＧＣＣ
ＡＧＣＴＧ  ＣＴＴＣＣ  ＧＣＣＣＴ  ＴＴＡＴＴ  ＴＡＡＴＡ
ＴＴＴＡＴ  ＴＴＡＴＴ  ＡＧＧＡＡ  ＴＴＡＴＴ  ＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＣＴ  ＡＴＡＡＡ  ＡＡＴＡＡ  ＴＡＴＴＴ  ＴＡＴＡＴ
ＡＴＡＴＡ  ＡＧＡＴＡ  ＴＣＴＣＡ  ＡＴＡＴＡ  ＧＡＣＣＡ
ＣＣＣＧＡ  ＣＣＴＡＣ  ＣＧＣＡＴ  ＡＡＡＴＧ  ＴＧＧＴＧ
ＡＧＧＧＡ  ＴＡＡＡＣ  ＣＣＣＡＣ  ＡＴＴＧＴ  ＧＧＧＴＴ
【請求項４】
カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＯ１０９１で分解して得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片（ＥＯ３）に、更にＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩの２種類の制限酵素を作用させて得られる請求項３に記載するカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
【請求項５】
請求項３または、請求項４に記載するＤＮＡ断片を標識したカンジダアルビカンス検出用プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載するプローブを被検試料（被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液）と接触させ、プローブからの信号を検出することを特徴とするカンジダアルビカンスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出方法、カンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片、及びカンジダアルビカンス検出用プローブに関し、更に詳しくは、生体試料中に含まれる極めて微量のカンジダアルビカンスでも特異的に検出することができる検出方法、検出用ＤＮＡ断片、及び検出用プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンジダアルビカンスは、免疫不全の患者にとって重要な病原菌である。このカンジダ症の診断には、抗原又は抗体を検出する血清学的な方法が従来から使われていた。しかし、抗体検出法では、免疫機能の低下した患者に抗体産生能の低下が観察されることや、逆に健康人にも高い抗体価を示す場合があるので、診断法としては問題があった。一方、抗原検出法では、検体内に病原菌が少なくとも１０５  個存在しないと検出できないという感度上の問題があるので、菌の培養等の操作を必要とした。以上のように、従来、カンジダ症の良い診断法は存在しなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、カンジダアルビカンスを迅速かつ確実に検出するために、カンジダアルビカンスのＤＮＡを制限酵素を用いて分解し、得られたカンジダアルビカンスに特異的なＤＮＡ断片を得ていた。このＤＮＡ断片の塩基配列の中から、塩基配列を選択し、相補的なＤＮＡを合成したところ、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして良好に用いることが出来ることを見い出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は以上の見地からなされたもので、下記の（１）〜（６）の請求項に記載するカンジダアルビカンスの検出方法、カンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片、及びカンジダアルビカンス検出用プローブから構成されている。
（１）▲１▼下記プライマー１の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を有する第一のＤＮＡプライマーと
▲２▼下記プライマー２の塩基配列の少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わせと、
▲３▼ＤＮＡポリメラーゼと、
▲４▼被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液
とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、続いて、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とするカンジダアルビカンスの検出方法。
プライマー１：５’ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’
プライマー２：５’ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’
（２）被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製するに際し、被検試料に、カンジダアルビカンスの抗原因子５を共通して保有するカンジダトロピカリスをキャリヤーとして加え、抗因子５抗体ＭＡｂ−５共存下に凝集塊（カンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスの凝集塊）を形成させ、この凝集塊からカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を調製する前記（１）に記載するカンジダアルビカンスの検出方法。
（３）下記の２２５塩基から構成されることを特徴とするカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
ＡＴＡＣＧ  ＣＴＡＣＣ  ＴＧＡＣＣ  ＣＣＡＣＣ  ＴＧＡＡＡ
ＴＡＴＡＡ  ＴＡＣＣＣ  ＣＡＧＧＴ  ＧＧＧＣＣ  ＴＧＣＣＣ
ＣＡＣＣＣ  ＡＣＣＡＡ  ＣＴＣＧＡ  ＣＣＡＧＴ  ＡＧＧＣＣ
ＡＧＣＴＧ  ＣＴＴＣＣ  ＧＣＣＣＴ  ＴＴＡＴＴ  ＴＡＡＴＡ
ＴＴＴＡＴ  ＴＴＡＴＴ  ＡＧＧＡＡ  ＴＴＡＴＴ  ＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＣＴ  ＡＴＡＡＡ  ＡＡＴＡＡ  ＴＡＴＴＴ  ＴＡＴＡＴ
ＡＴＡＴＡ  ＡＧＡＴＡ  ＴＣＴＣＡ  ＡＴＡＴＡ  ＧＡＣＣＡ
ＣＣＣＧＡ  ＣＣＴＡＣ  ＣＧＣＡＴ  ＡＡＡＴＧ  ＴＧＧＴＧ
ＡＧＧＧＡ  ＴＡＡＡＣ  ＣＣＣＡＣ  ＡＴＴＧＴ  ＧＧＧＴＴ
（４）カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＯ１０９１で分解して得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片（ＥＯ３）に、更にＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩの２種類の制限酵素を作用させて得られる請求項３に記載するカンジダアルビカンス検出用ＤＮＡ断片。
（５）前記（３）または（４）に記載するＤＮＡ断片を標識したカンジダアルビカンス検出用プローブ。
（６）前記（５）に記載するプローブを被検試料（被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液）と接触させ、プローブからの信号を検出することを特徴とするカンジダアルビカンスの検出方法。
【０００５】
本明細書の塩基配列において、Ａはアデニン残基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基、そしてＴはチミン残基の意味である。
【０００６】
本発明方法で用いる被検試料とは、カンジダアルビカンスを含有している疑いのある試料であれば特に制限されない。例えば、血液、唾液、咽頭拭い液、組織切片等を用いることが出来る。
【０００７】
本発明による前記のカンジダアルビカンスを検出する第１の方法は、（ａ）ＤＮＡ増幅工程と、（ｂ）ＤＮＡ検査工程とからなる。
このＤＮＡ増幅工程（ａ）では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法を用いることが出来る。ＰＣＲ法を利用すると、微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域のみを自動的に約百万倍にまで増幅することが出来る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１参照）。ＰＣＲ法では、増幅させるＤＮＡ領域を挟んで＋鎖に対するプライマー（以下、第１プライマーと称する）及び−鎖に対するプライマー（以下、第２プライマーと称する）の２種類のＤＮＡプライマーを用いる。
【０００８】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、第１プライマーと第２プライマーの組み合わせを用いることにより、カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡに由来する下記の１２５塩基の領域のみを特異的に増幅することが出来る。
ＣＡＣＣＡ  ＡＣＴＣＧ  ＡＣＣＡＧ  ＴＡＧＧＣ  ＣＡＧＣＴ
ＧＣＴＴＣ  ＣＧＣＣＣ  ＴＴＴＡＴ  ＴＴＡＡＴ  ＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴ  ＴＡＧＧＡ  ＡＴＴＡＴ  ＴＴＴＣＣ  ＴＴＡＣＣ
ＴＡＴＡＡ  ＡＡＡＴＡ  ＡＴＡＴＴ  ＴＴＡＴＡ  ＴＡＴＡＴ
ＡＡＧＡＴ  ＡＴＣＴＣ  ＡＡＴＡＴ  ＡＧＡＣＣ  ＡＣＣＣＧ
【０００９】
前記の第１プライマー及び第２プライマーは、それぞれ１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができるが、一般的には２０ｍｅｒから２５ｍｅｒであることが好ましい。第１プライマー及び第２プライマーは、各々［５’ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’］又は［５’ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’］で表される塩基のうちの、少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチドを含有していればよい。第１プライマー及び第２プライマーが１５ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の特異性が減少し、非特異的結合が増加する。又３０ｍｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での二重鎖を取り易くなるので好ましくない。
本発明方法で用いる第１プライマー及び第２プライマーの、それぞれを構成する各塩基は、公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。
【００１０】
本発明による前記のそれぞれの第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイト法）によって調製することが出来る。
【００１１】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、第１プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することのできるポリメラーゼを用いることができる。
【００１２】
本発明のＤＮＡ増幅工程（ａ）では、前記の第１プライマーと第２プライマーとの特定の組み合わせ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び被検試料中のカンジダアルビカンス由来のＤＮＡ抽出液を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は、場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム）を含有することができる。
【００１３】
本発明方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、
（ｉ）  ＤＮＡの変性工程（９０℃〜９５℃で、約１０秒〜約２分間）
（ｉｉ）  一本鎖ＤＮＡの第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約３０秒〜約３分間）、及び
（ｉｉｉ）    ＤＮＡボリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃で、約３０秒〜約５分間）とからなる。１サイクル毎にＤＮＡ量は約２倍に増幅され、ｎサイクル後には２ｎ  倍に増幅される。本発明においては、前記の増幅サイクルを１０〜６０回、好ましくは２０〜４０回繰り返す。最後のサイクルにおいては、工程（ｉｉｉ）での加熱時間を約５〜１０分間延長してＤＮＡ合成が完全に行われるようにするのが好ましい。
【００１４】
被検試料中にカンジダアルビカンスが存在する場合には、前記の増幅サイクル終了後には、１２５塩基対のＤＮＡ断片が大量に合成されている。このＤＮＡ断片を次のＤＮＡ検査工程によって検出する。
【００１５】
（ｂ）のＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動法及びエチジウムブロマイド染色を利用する方法、サザンブロットハイブリッド法、又はジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用することができる。
【００１６】
サザンブロットハイブリッド法、又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合には、非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は化学発光物質、蛍光物質でラベルしたプローブ）を用いることができる。更に、ジデオキシ法による塩基配列決定法を利用する場合には、蛍光ラベルを使用したＤＮＡオートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）等を用いることができる。
【００１７】
本発明は、更に、カンジダアルビカンス−ＤＮＡの特異的な検出に用いることのできるＤＮＡ断片、及びＤＮＡプローブを提供するものでもある。
カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡをＥｃｏＯ１０９１で分解して得られる、約２ｋｂのＤＮＡ断片であるＥＯ３を、制限酵素ＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで処理すると、前記プライマー１及び２を用いてＰＣＲ法により増幅された１２５塩基対の塩基配列を含む約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。これを標識してプローブとして用いることもできる。
【００１８】
本発明による前記のカンジダアルビカンスの検出する第２の方法は、このＤＮＡプローブ（前記約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片）を使用するものである。このＤＮＡプローブは、被検試料がＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を経たものであっても、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド法であっても、カンジダアルビカンスＤＮＡを特異的に認識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることが出来る。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００１９】
本発明方法においては、被件試料中にカンジダアルビカンスが存在する場合にのみ、前記の第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせにより、ＰＣＲ法によりそれぞれ下記の１２５塩基のＤＮＡ断片が短時間のうちに特異的に大量に増幅合成される。
ＣＡＣＣＡ  ＡＣＴＣＧ  ＡＣＣＡＧ  ＴＡＧＧＣ  ＣＡＧＣＴ
ＧＣＴＴＣ  ＣＧＣＣＣ  ＴＴＴＡＴ  ＴＴＡＡＴ  ＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴ  ＴＡＧＧＡ  ＡＴＴＡＴ  ＴＴＴＣＣ  ＴＴＡＣＣ
ＴＡＴＡＡ  ＡＡＡＴＡ  ＡＴＡＴＴ  ＴＴＡＴＡ  ＴＡＴＡＴ
ＡＡＧＡＴ  ＡＴＣＴＣ  ＡＡＴＡＴ  ＡＧＡＣＣ  ＡＣＣＣＧ
従って、被検試料中におけるカンジダアルビカンスの存在を極めて特異的に検出することが出来る。更に、被検試料中のカンジダアルビカンス量が微量であっても１２５塩基のＤＮＡ断片が増幅合成されるので高感度である。
又、本発明方法においては、カンジダアルビカンス−ＤＮＡに特異的な標識ＤＮＡプローブを用いるので、極めて正確にカンジダアルビカンスを検出することができる。
【００２０】
更に、前記の第１プライマー及び第２プライマーを用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査工程を併用すると、検査の所用時間はエチジウム染色の場合は４〜５時間程度ですみ、サザンブロットハイブリッド法で行う場合でも４８〜５０時間程度でよく、迅速に結果を得ることが出来る。
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例において使用した標準株（１４株）は、以下の通りである。
カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清型
カンジダアルビカンスＭ１４４５血清型
カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１０１７
カンジダギラモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３
カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）Ｍ１００５
カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５
カンジダケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）Ｍ１００４
カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）Ｍ４００２
サッカロミセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＬ２０
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３
クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）ＮＩＨ−６８
ヒト口腔扁平上皮癌ＨＳＣ−２細胞株
【００２２】
又、以下の実施例において用いた各種の供試カンジダ菌株は、明治薬科大学、株式会社ヤトロン、及び財団法人理化学研究所（ＪＣＭ：Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ    ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の保存株である。カンジダ菌株の同定は、通常の生物学的方法、及びポリクローナル因子血清（カンジダチェツク：  ヤトロン）によって行った。酵母の培養はサブロー培地（Ｄｉｆｃｏ社）中で２７℃にて行い、細菌の培養は普通栄養液体培地（栄研）中で３７℃にて行った。
【００２３】
【実施例】
＜実施例１＞
前記１４株を培養した菌体からのＤＮＡの調製は、下記のように行なった。    カンジダアルビカンスＡ血清型Ｍ１０１２株（明治薬科大学から入手）をザイモリエース（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）によりスフェロプラストとした後（Ｔｏｒｒｅｓ−Ｂａｕｚａ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，１９８０，Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  ｍｙｃｅｌｉａｌｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １１９：３４１−３４９  参照）、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｃｒｙｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，１９７５，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ，  ＩＮ  Ｄ．Ｍ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（ｅｄ．），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）に従い、全ＤＮＡを調製した。
すなわち、プロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）の存在下でスフェロプラストを１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで溶解し、その溶解物をクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）で処理してタンパク質を除去した後、膵ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：５０μｇ／ｍｌ）処理し、エタノールで沈澱させ、得られた粗ＤＮＡをＰＣＲ法に用いた。
他の前記カンジダ菌株については、前記と同様のスフェロプラスト溶解物をクロロホルム−フェノール（１：１）で抽出処理してタンパク質を除いた後、膵ＲＮａｓｅで処理し、エタノール沈澱により粗ＤＮＡを調製し、これらを後述のハイブリダイゼーション及びＰＣＲ法に用いた。
又、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒト由来細胞株、及び各種細菌の粗ＤＮＡは、Ｒｅｓｔｒｅｐｏらの方法（Ｒｅｓｔｒｅｐｏ，Ｂ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  １８Ｓ  ｒＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：５５９６−５６００）、及びＭａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）により調製した。
【００２４】
＜実施例２＞
血液検体中の菌体からのＤＮＡの調製
血液検体からのカンジダアルビカンスのＤＮＡの調製は、人の血液０．１ｍｌに０．４５％−Ｎｏｎｉｄｅｔ    Ｐ−４０と６０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ    を含むトリトン−トリス緩衝液［１％トリトン    Ｘ−１００、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］０．９ｍｌを加え、５５℃で１０分間保持した後、カンジダトロピカリスの生菌又は加熱死菌１０５  細胞をキャリヤーとして加え、１２，５００×ｇ、７秒間遠心し、得られた沈澱をカンジダアルビカンスの因子５に対する抗体ＭＡｂ−５を含有している無菌のマウス腹水（抗体価    １：３２０）１２５μｌに懸濁する。
５分間氷冷後、生じたカンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスの凝集塊を、トリトン−トリス緩衝液１ｍｌに懸濁し、遠心する。得られた沈澱を、同じ緩衝液を用いて更に２回、洗浄し、最後に、蒸留水で洗浄する。菌体に、ザイモリエース    ６００００（生化学工業、０．５ｍｇ／ｍｌ）と２％メルカプトエタノールを含んでいるＳＥ緩衝液［１Ｍソルビトール−０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）］０．１ｍｌを加え、３７℃、１５分の処理により、スフェロプラストを得る。ＳＥ緩衝液で２回洗浄後、０．４５％−Ｎｏｎｉｄｅｔ    Ｐ−４０と６０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ    Ｋを含有するＰＣＲ緩衝液［８０ｍＭ    ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０ｍＭ    トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）］に懸濁して５５℃、２０分保持した後、９５℃、１０分の熱処理を行い、遠心して、その上清をＤＮＡ抽出液として用いた。
【００２５】
＜実施例３＞
ＤＮＡプローブの調製（カンジダアルビカンス−ＤＮＡの特異的な検出に用いることのできるＤＮＡ断片の調製）
プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位で連結した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９に移入して作製したカンジダアルビカンスの遺伝子ライブラリー（Ｍｉｙａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：８９４−９００  ）から、カンジダアルビカンスの特異的ＤＮＡ断片ＥＯ３（約２ｋｂ）を得た（図１参照）。
次に、ＥＯ３を制限酵素ＡｃｃＩとＨｉｎｃＩＩで処理した後、反応産物をアガロースゲル電気泳動して２２５ｂｐのバンドを切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（フナコシ）を用いて抽出した。得られた２２５塩基のＤＮＡ断片（ＡｃｃＩ−ＨｉｎｃＩＩ）をプローブとして用いた。このＤＮＡ断片（以下、ＡＨ２２と称する）は、前記プライマー１及びプライマー２を使用してＰＣＲ法により増幅される１２５塩基の領域をカバーしている。
【００２６】
＜実施例４＞
ＤＮＡプローブの標識
カンジダアルビカンス由来のＥＯ３から調製したＡＨ２２をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ：３，０００Ｃｉ／ミリモル）で標識し、ニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）で精製した。
【００２７】
＜実施例５＞
プライマーの合成
プローブに用いるＡＨ２２の部分塩基配列に基づき、ＰＣＲに用いる一対のプライマー（２０ｍｅｒ）をＤＮＡ合成装置で作製した。３８１Ａ型自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に、シトシンＣＰＧカラムを装着してプライマー１［５’−ＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＧＣ−３’］、及びチミンＣＰＧカラムを装着してプライマー２［５’−ＣＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴ−３’］を合成した。
【００２８】
アンモニア水（約３０％）２．５ｍｌを入れたディスポシリンジ（２．５ｍｌ）を、合成工程が完了したＣＰＧカラムに接続し、アンモニア水をカラム内に押し出して、合成したＤＮＡフラグメントを溶出した。回収したＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイアル瓶を密栓し、５５℃で６時間加温した後、室温まで冷やしてから濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａと称す）（ｐＨ７．４）に溶解し、沈澱を除いてから、Ｌ−６２００型高速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所）（以下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装着し、５％アセトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−Ａとアセトニトリルとによる濃度勾配を用いて精製し、メインピークを集めた。得られた沈渣に８０％酢酸（アセトニトリルで調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分間保持してから減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥＡ−Ａに溶解し、ジエチルエーテルで抽出してから、２回目のＨＰＬＣによる精製を行い、メインピークを集めた。こうして得られた精製ＤＮＡプライマーを減圧乾燥して保存し、後記の実施例で用いた。
【００２９】
＜実施例６＞
プライマーペアーの特異性
Ｔｈｅｒｍｕｓ    ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが産生する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）１．２５Ｕを反応液２５μｌ［８０ｍＭ−ＫＣｌ、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．９）、０．０５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、０．１％コール酸ナトリウム、０．１％トリトンＸ−１００（東洋紡）、５０μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、特に記載しない限り標的ＤＮＡ２５０μｇ及び各プライマー０．１μＭを含む］に加えた。ＤＮＡをＰＣＲプロセッサー（Ｚｙｍｏｒｅａｃｔｏｒ：Ａｔｔｏ  Ｃｏｒｐ．）中で、
熱変性：９４℃で１分間
アニーリング（二重鎖形成反応）：５６℃で２．５分間
プライマー延伸反応：７２℃で３分間
のサイクルを３５回繰り返し行って増幅させた。最終サイクルでは、ＰＣＲの残存産物を完全な二重鎖とするため更に７２℃で７分間反応させた。
【００３０】
実施例１で得た粗ＤＮＡを用い、３５サイクルのＰＣＲ処理の後、そのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動により分析した。結果を図２及び表１に示す。
なお、図２中（Ａ）はエチジウムブロマイド染色、（Ｂ）はプローブＡｃｃＩ−ＨｉｎｃＩＩによるサザンブロットハイブリダイゼイションの結果を示す。
ブロッティングしたＤＮＡは以下の通りである。
カンジダアルビカンスＭ１０１２Ａ血清型
カンジダアルビカンスＭ１４４５Ｂ血清型
カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）Ｍ１０１７
カンジダギラモンディー（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｍ１０２３
カンジダクルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）Ｍ１００５
カンジダパラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）Ｍ１０１５
カンジダケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）Ｍ１００４
カンジダグラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）Ｍ４００２
サッカロミセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＬ２０
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３
カンジダアルビカンスＡ血清型  ５株
カンジダアルビカンスＢ血清型  ５株
【００３１】
図２から明かな通り、カンジダ属の７菌種を初めとする１２標準菌株のうち、カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のＤＮＡにのみ１２５塩基断片が検出され、その他の株では増幅されたバンドは認められなかった。
又、下記表１には、標準株以外に多数の株についてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物をアガロースゲルで分析した結果を示す。カンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型の３５株全てにおいて１２５塩基断片が観察された。一方、カンジダアルビカンスに属していない菌株及びヒト細胞株においては、増幅されたＤＮＡ断片は全く検出されなかった。
なお、現在分類学上カンジダアルビカンスに帰属しているカンジダステライトイデア１３株についてもテストした１３株すべてについてＰＣＲ陽性であった（表１参照）。
【００３２】
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前記表中のａ，ｂ，ｃはの表す内容は次の通りである。
ａ：エチジウムブロマイド染色
ｂ：プローブＡＨ２２とのサザンブロットハイブリダイゼーション
ｃ：現在Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに属すると考えられている（Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｄ．Ｇ．      Ａｈｅａｒｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ．１９８４．Ｇｅｎｕｓ  ４．Ｃａｎｄｉｄａ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，ｐ．５８５−８４４．      Ｉｎ  Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ（ｅｄ．），  Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ：ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，３ｒｄ      ｅｄ．Ｅｒｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｒｄａｍ．）
【００３３】
＜実施例７＞
ＰＣＲの感度
カンジダアルビカンスを検出する感度を調べるために、実施例２に記載した方法で、１０４  、１０３  、１０２  、１０及び３個のカンジダアルビカンスの細胞を含んだ検体から調製したＤＮＡを、ＰＣＲ反応液２５μｌに加え、各増幅産物をアガロース電気泳動及び実施例４で調製したプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼイションで解析した（実施例６参照）。その結果を図３に示す。
図３によれば、エチジウムブロマイド染色による検出限界はカンジダアルビカンス１０細胞であるのに対し、サザンブロットハイブリダイゼイションでは３細胞まで可能である。血液検体中の菌体からＤＮＡを調製する際にカンジダトロピカリスだけを加えた場合には、エチジウムブロマイド染色においては、カンジダアルビカンス１００細胞が検出限界であったが、カンジダトロピカリスと因子抗体ＭＡｂ−５の両方を加えてＤＮＡを調製した場合には、感度がほぼ１０倍上昇した。
【００３４】
【発明の効果】
（１）本発明によるプライマー１とプライマー２との組み合わせを用いるＰＣＲ法により、カンジダアルビカンスのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）由来の約２ｋｂのＤＮＡ領域（ＥＯ３）の内の１２５塩基の領域を特異的に増幅することが出来る。このＤＮＡ領域はカンジダアルビカンスＡ血清型及びＢ血清型のいずれにおいても特異的に存在するのに対し、他のカンジダ属に属する菌には存在しない。従って、本発明のプライマーによって其の領域の塩基配列を増幅し、ＤＮＡ検査工程として好ましくは本発明のプローブを使用すると、試料中に少量のＤＮＡしか存在しなくても、カンジダアルビカンスを特異的に検出することができる。
【００３５】
（２）カンジダアルビカンスｍｔＤＮＡ由来の約２ｋｂのＤＮＡ断片ＥＯ３を制限酵素ＡｃｃＩ及びＨｉｎｃＩＩで処理して得られる２２５塩基のＡＨ２２をプローブとすることにより、カンジダアルビカンスを特異的に検出することができる。
【００３６】
（３）カンジダアルビカンスを少量しか含んでいない検体からのカンジダアルビカンスのＤＮＡの調製法として、検体にカンジダトロピカリスをキャリヤーとして加え、遠心して得られる沈渣にカンジダアルビカンスとカンジダトロピカリスに共通のマンナンの抗原因子５に対する抗体ＭＡｂ−５を加えて懸濁することにより検体中のカンジダアルビカンスの細胞を失わないように注意することによりＰＣＲ法による検出感度を上げることができる。
【００３７】
（４）上記の方法で実検体から調製したカンジダアルビカンスのＤＮＡ標品を用いて、ＰＣＲ法とＡＨ２２基を組み合わせると、検体中にカンジダアルビカンスが３細胞あれば検出できる。以上のように、本発明は特異性と感度の優れた新しいカンジダアルビカンスの迅速検出及びカンジダ症の迅速診断手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カンジダアルビカンスＤＮＡ由来のＤＮＡ断片ＥＯ３の中でのプローブ設定位置、プライマーで増幅される部分を示した図である。
【図２】（Ａ）プライマーの特異性を、エチジウムブロマイド染色によって分析した結果を示す図（写真）である。
（Ｂ）プライマーの特異性を、サザンブロットハイブリダイゼイションによって分析した結果を示す図（写真）である。
【図３】（Ａ）カンジダアルビカンスを検出する感度を、エチジウムブロマイド染色によって分析し、その結果を示す図（写真）である。
（Ｂ）カンジダアルビカンスを検出する感度を、サザンブロットハイブリダイゼイションによって分析し、その結果を示す図（写真）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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