【手続補正書】
【提出日】平成29年7月28日(2017.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）変異型葉酸受容体を選択可能マーカーとしてコードするポリヌクレオチドであって、前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下している、ポリヌクレオチドと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと
を含み、宿主細胞内へ導入された際に、前記目的のポリペプチドが前記宿主細胞から分泌される、発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項２】
前記コードされた変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて低下した葉酸結合親和性をもたらす少なくとも１つの変異を葉酸結合ポケットに含む、請求項１に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項３】
前記コードされた変異型葉酸受容体が、変異型葉酸受容体アルファである、請求項１または２に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項４】
以下の特徴の１または複数を有する、請求項３に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ：
ａ）  前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ（配列番号１）のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、前記変異型葉酸受容体のアミノ酸配列が、前記成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ（配列番号１）に比べて葉酸結合親和性を低下させる少なくとも１つの変異を含む；
ｂ）  前記変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体配列の４９位、１０４位および１６６位から選択されるアミノ酸位置に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応するアミノ酸位置に、少なくとも１つの置換を含む；および／または
ｃ）  前記変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応するアミノ酸位置に置換を含む。
【請求項５】
前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて、５−メチルテトラヒドロ葉酸の６Ｓジアステレオ異性体への結合親和性が低下している、および／または
前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて、葉酸への結合親和性が低下している、請求項１から４のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項６】
前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記野生型配列に存在するアラニンが、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されているか、または
前記野生型配列の４９位に存在するアラニンが、ロイシンによって置換されている、
請求項４のｃ）または請求項５に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項７】
前記コードされた変異型葉酸受容体が以下の特徴：
ａ）前記成熟型の変異型葉酸受容体が、以下の配列
【化２４】
2016525366.tif 000001
を含み、Ｘａａは、アラニンではなく、Ｘａａは、任意選択で、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸、またはロイシンであること、または
ｂ）前記成熟型の変異型葉酸受容体が、配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａは、前記変異型葉酸受容体ではアラニンではなく、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が低減しており、Ｘａａは、任意選択で、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸、またはロイシンであること
を有する、請求項１から６のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項８】
前記コードされた変異型葉酸受容体が以下の特徴：
ａ）以下の配列
【化２５】
2016525366.tif 000002
を含み、Ｘａａはロイシンであること、または
ｂ）配列番号１３として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａはロイシンであり、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、５−メチルテトラヒドロ葉酸の６Ｓジアステレオ異性体への前記変異型葉酸受容体の結合親和性が低減していること
を有する、請求項１から７のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項９】
葉酸類代謝に関与する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドを追加的に含み、
選択可能マーカーをコードする前記ポリヌクレオチドが、任意選択で、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする、請求項１から８のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項１０】
ａ）変異型葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記位置にて野生型配列に存在するアラニンがロイシンによって置換されている、発現カセットと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの発現カセットと、
ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドを選択可能マーカーとして含む、発現カセットと
を含む、請求項１から９のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
【請求項１１】
生存能が葉酸類の取込みに依存している宿主細胞であって、
ａ）野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下した変異型葉酸受容体をコードする、選択可能マーカーとして導入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入されたポリヌクレオチドと
を含み、前記目的のポリペプチドは、前記宿主細胞から分泌される、宿主細胞。
【請求項１２】
前記変異型葉酸受容体が、請求項２から８のいずれか１項に規定された１つまたは複数の特徴を有し、
宿主細胞が、任意選択で、請求項１から１０のうち１項または複数項に規定された発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せを含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
以下の特徴：
ａ）哺乳類細胞であること、
ｂ）齧歯類細胞であること、
ｃ）ＣＨＯ細胞であること、
ｄ）内因性の葉酸受容体を発現すること、
ｅ）葉酸類代謝に関与する選択可能マーカー、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする、導入されたポリヌクレオチドを含むこと、および／または
ｆ）前記導入されたポリヌクレオチドが、安定にゲノムへ組み込まれていること
のうち１つまたは複数を有する、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
生存能が葉酸類の取込みに依存している宿主細胞に、
ａ）野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下した変異型葉酸受容体を選択可能マーカーとしてコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）前記宿主細胞から分泌される目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと
を導入するステップを含み、
請求項１から１０のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せを任意選択で宿主細胞内へ導入する、請求項１１〜１３の少なくとも１項に記載の宿主細胞を作製するための方法。
【請求項１５】
目的のポリペプチドを所望の収量で発現することが可能な少なくとも１つの宿主細胞を選択するための方法であって、
ａ）請求項１１から１３のうち１項または複数項に記載の複数の宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）制限的な濃度で葉酸類を含む選択培養培地中で、前記複数の宿主細胞を培養するステップと、
ｃ）目的のポリペプチドを発現する少なくとも１つの宿主細胞を取得するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
以下の特徴：
ｉ）ステップｂ）およびｃ）を含む１回または複数回の選択サイクルを実施すること、
ｉｉ）ステップｃ）の後、前記細胞を、非制限的な濃度の葉酸類を含む培養培地で培養し、次いで、再度ステップｂ）に従って培養し、ステップｃ）に従って取得すること、
ｉｉｉ）ステップｂ）および／もしくはｃ）を実施する前および／もしくは後に、フローサイトメトリーに基づく選択および前記宿主細胞に導入された１つもしくは複数の追加的な選択可能マーカーについての選択から選択される１つもしくは複数の追加的な選択ステップを実施すること、
ｉｖ）宿主細胞を安定にトランスフェクトすること、ならびに／または
ｖ）選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換えによって発現して分泌すること
のうち１つまたは複数を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）請求項１１から１３の少なくとも１項に記載の宿主細胞、ならびに／または目的のポリペプチドの発現および分泌を可能にする条件下で請求項１５または１６に従って選択された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）細胞培養培地から目的のポリペプチドを単離するステップと、
ｃ）任意選択で、単離された目的のポリペプチドを処理するステップと
を含む、目的のポリペプチドを生産するためのプロセス。
【請求項１８】
ａ）以下の配列
【化２６】
2016525366.tif 000003
を含む変異型葉酸受容体であって、Ｘａａはアラニンではなく、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が、Ｘａａがアラニンである対応する野生型葉酸受容体（配列番号１）に比べて低減している、変異型葉酸受容体、または
ｂ）配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型葉酸受容体であって、Ｘａａは、前記変異型葉酸受容体ではアラニンではなく、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が低減している、変異型葉酸受容体であって、
ａ）およびｂ）において、Ｘａａが、任意選択で、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸である、変異型葉酸受容体
をコードするポリヌクレオチドの、生存能を葉酸類の取込みに依存している細胞を選択するための選択可能マーカーとしての使用。
【請求項１９】
ａ）以下の配列
【化２７】
2016525366.tif 000004
を含み、Ｘａａがロイシンである、変異型葉酸受容体、または
ｂ）配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａが、ｂ）による前記変異型葉酸受容体ではロイシンである、変異型葉酸受容体
をコードするポリヌクレオチドの、生存能を葉酸類の取込みに依存している細胞を選択するための選択可能マーカーとしての使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
【表１４】
2016525366.tif 000005
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ａ）変異型葉酸受容体を選択可能マーカーとしてコードするポリヌクレオチドであって、前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下している、ポリヌクレオチドと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと
を含み、宿主細胞内へ導入された際に、前記目的のポリペプチドが前記宿主細胞から分泌される、発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［２］
前記コードされた変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて低下した葉酸結合親和性をもたらす少なくとも１つの変異を葉酸結合ポケットに含む、請求項１に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［３］
前記コードされた変異型葉酸受容体が、低下した葉酸結合親和性をもたらすアミノ酸の置換、欠失または挿入から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１または２に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［４］
前記コードされた変異型葉酸受容体が、変異型葉酸受容体アルファである、請求項１から３のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［５］
前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ（配列番号１）のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、前記変異型葉酸受容体のアミノ酸配列が、前記成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ（配列番号１）に比べて葉酸結合親和性を低下させる少なくとも１つの変異を含む、請求項４に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［６］
前記変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体配列の４９位、１０４位および１６６位から選択されるアミノ酸位置に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応するアミノ酸位置に、少なくとも１つの置換を含む、請求項４または５に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［７］
前記変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応するアミノ酸位置に置換を含む、請求項１から６のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［８］
前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて、５−メチルテトラヒドロ葉酸の６Ｓジアステレオ異性体への結合親和性が低下している、請求項１から７のうち１項または複数項、具体的には請求項６または７に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［９］
前記変異型葉酸受容体が、野生型葉酸受容体に比べて、葉酸への結合親和性が低下している、請求項１から８のうち１項または複数項、具体的には請求項６または７に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１０］
前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記野生型配列に存在するアラニンが、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項７から９のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１１］
前記野生型配列の４９位に存在するアラニンが、ロイシンによって置換されている、請求項１０に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１２］
前記コードされた成熟型の変異型葉酸受容体が、ヒト葉酸受容体アルファの成熟型の野生型配列（配列番号１）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記成熟型の変異型葉酸受容体のアミノ酸配列が、前記野生型ヒト葉酸受容体アルファに比べて前記成熟型の変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性を低下させる少なくとも１つの変異を含む、請求項１から１１のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１３］
前記コードされた変異型葉酸受容体が以下の特徴：
ａ）前記成熟型の変異型葉酸受容体が、以下の配列
【化２４】
2016525366.tif 000006
を含み、Ｘａａは、アラニンではなく、好ましくはロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸であり、さらに好ましくは、Ｘａａはロイシンであること、または
ｂ）前記成熟型の変異型葉酸受容体が、配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａは、前記変異型葉酸受容体ではアラニンではなく、好ましくは、Ｘａａは、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸であり、さらに好ましくは、Ｘａａはロイシンであり、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が低減していること
を有する、請求項１から１２のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１４］
前記コードされた変異型葉酸受容体が以下の特徴：
ａ）以下の配列
【化２５】
2016525366.tif 000007
を含み、Ｘａａはロイシンであること、または
ｂ）配列番号１３として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａはロイシンであり、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、５−メチルテトラヒドロ葉酸の６Ｓジアステレオ異性体への前記変異型葉酸受容体の結合親和性が低減していること
を有する、請求項１から１３のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１５］
葉酸類代謝に関与する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドを追加的に含む、請求項１から１４のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１６］
選択可能マーカーをコードする前記ポリヌクレオチドが、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする、請求項１５に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１７］
ａ）変異型葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、前記コードされた変異型葉酸受容体が、成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１）のアミノ酸４９に構造的に対応するかまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記位置にて野生型配列に存在するアラニンがロイシンによって置換されている、発現カセットと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの発現カセットと、
ｃ）ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドを選択可能マーカーとして含む、発現カセットと
を含む、請求項１から１６のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せ。
［１８］
生存能が葉酸類の取込みに依存している宿主細胞であって、
ａ）野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下した変異型葉酸受容体をコードする、選択可能マーカーとして導入されたポリヌクレオチドと、
ｂ）目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入されたポリヌクレオチドと
を含み、前記目的のポリペプチドは、前記宿主細胞から分泌される、宿主細胞。
［１９］
前記変異型葉酸受容体が、請求項２から１４のいずれか１項に規定された１つまたは複数の特徴を有する、請求項１８に記載の宿主細胞。
［２０］
請求項１から１７のうち１項または複数項に規定された発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せを含む、請求項１９に記載の宿主細胞。
［２１］
以下の特徴：
ａ）哺乳類細胞であること、
ｂ）齧歯類細胞であること、
ｃ）ＣＨＯ細胞であること、
ｄ）内因性の葉酸受容体を発現すること、
ｅ）葉酸類代謝に関与する選択可能マーカー、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする、導入されたポリヌクレオチドを含むこと、および／または
ｆ）前記導入されたポリヌクレオチドが、安定にゲノムへ組み込まれていること
のうち１つまたは複数を有する、請求項１８から２０のうち１項または複数項に記載の宿主細胞。
［２２］
生存能が葉酸類の取込みに依存している宿主細胞に、
ａ）野生型葉酸受容体に比べて葉酸結合親和性が低下した変異型葉酸受容体を選択可能マーカーとしてコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）前記宿主細胞から分泌される目的のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと
を導入するステップを含む、請求項１８から２１のうち少なくとも１項に記載の宿主細胞を作製するための方法。
［２３］
請求項１から１７のうち１項または複数項に記載の発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せを宿主細胞内へ導入する、請求項２２に記載の方法。
［２４］
目的のポリペプチドを所望の収量で発現することが可能な少なくとも１つの宿主細胞を選択するための方法であって、
ａ）請求項１８から２１のうち１項または複数項に記載の複数の宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）制限的な濃度で葉酸類を含む選択培養培地中で、前記複数の宿主細胞を培養するステップと、
ｃ）目的のポリペプチドを発現する少なくとも１つの宿主細胞を取得するステップと
を含む方法。
［２５］
ステップｂ）で使用される前記選択培養培地が、約２０００ｎＭ以下、約１７５０ｎＭ以下、約１５００ｎＭ以下、約１２５０ｎＭ以下、約１０００ｎＭ以下、約７５０ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３５ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約７．５以下、約５ｎＭ以下、および約２．５ｎＭ以下から選択される濃度で、制限的な濃度の葉酸類を含み、前記葉酸類が、好ましくは葉酸である、請求項２４に記載の方法。
［２６］
前記宿主細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼである選択可能マーカーをコードする導入されたポリヌクレオチドを含み、ステップｂ）で使用される前記選択培養培地が、１５００ｎＭ以下、１２５０ｎＭ以下、１０００ｎＭ以下、７５０ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１２５ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、および１０ｎＭ以下から選択される濃度で葉酸代謝拮抗剤を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
［２７］
以下の特徴：
ｉ）ステップｂ）およびｃ）を含む１回または複数回の選択サイクルを実施すること、
ｉｉ）ステップｃ）の後、前記細胞を、非制限的な濃度の葉酸類を含む培養培地で培養し、次いで、再度ステップｂ）に従って培養し、ステップｃ）に従って取得すること、
ｉｉｉ）ステップｂ）および／もしくはｃ）を実施する前および／もしくは後に、フローサイトメトリーに基づく選択および前記宿主細胞に導入された１つもしくは複数の追加的な選択可能マーカーについての選択から選択される１つもしくは複数の追加的な選択ステップを実施すること、
ｉｖ）宿主細胞を安定にトランスフェクトすること、ならびに／または
ｖ）選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換えによって発現して分泌すること
のうち１つまたは複数を有する、請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法。
［２８］
ａ）請求項１８から２１のうち少なくとも１項に記載の宿主細胞、ならびに／または目的のポリペプチドの発現および分泌を可能にする条件下で請求項２４から２７のうち少なくとも１項に従って選択された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）細胞培養培地から目的のポリペプチドを単離するステップと、
ｃ）任意選択で、単離された目的のポリペプチドを処理するステップと
を含む、目的のポリペプチドを生産するためのプロセス。
［２９］
ａ）以下の配列
【化２６】
2016525366.tif 000008
を含む変異型葉酸受容体であって、Ｘａａはアラニンではなく、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が、Ｘａａがアラニンである対応する野生型葉酸受容体（配列番号１）に比べて低減している、変異型葉酸受容体、または
ｂ）配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型葉酸受容体であって、Ｘａａは、前記変異型葉酸受容体ではアラニンではなく、Ｘａａがアラニンである成熟型の野生型ヒト葉酸受容体アルファ配列（配列番号１を参照）に比べて、前記変異型葉酸受容体の葉酸結合親和性が低減している、変異型葉酸受容体をコードするポリヌクレオチドの、生存能を葉酸類の取込みに依存している細胞を選択するための選択可能マーカーとしての使用。
［３０］
Ｘａａが、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸であり、好ましくはＸａａがロイシンである、請求項２９に記載の使用。
［３１］
ａ）以下の配列
【化２７】
2016525366.tif 000009
を含み、Ｘａａがロイシンである、変異型葉酸受容体、または
ｂ）配列番号９として示される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘａａが、ｂ）による前記変異型葉酸受容体ではロイシンである、変異型葉酸受容体
をコードするポリヌクレオチドの、生存能を葉酸類の取込みに依存している細胞を選択するための選択可能マーカーとしての使用。
［３２］
前記変異型葉酸受容体が、請求項８、９または１４のうち１項または複数項に規定された特徴を有する、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の使用。
［３３］
ポリヌクレオチドによってコードされている前記変異型葉酸受容体が、ＧＰＩで繋留されている、請求項２９から３２のいずれか１項に記載の使用。
［３４］
前記変異型葉酸受容体が、選択可能マーカーとしてのジヒドロ葉酸レダクターゼと組み合わせた選択可能マーカーとして使用される、請求項２９から３３のうち１項または複数項に記載の使用。
［３５］
請求項２４から２８に記載の方法における、請求項２９から３４のうち１項または複数項に記載の使用。