【手続補正書】
【提出日】平成29年5月1日(2017.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】肝性脳症の治療において使用するためのステロイド化合物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝性脳症の治療において使用するためのステロイド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝性脳症（ＨＥ）は、急性および慢性肝臓疾患における重篤な精神神経性および神経認知性合併症である。ＨＥは、慢性肝臓疾患の高い、ますます増大する有病率のために、重要な、ますます増大する医療問題である。ＨＥは、睡眠・覚醒サイクル、認知、記憶、学習、運動協調性、意識の障害、エネルギーレベルの低下および人格変化を特徴とし、ミニマルＨＥ（ＭＨＥ）から顕性ＨＥ（ＯＨＥ）にわたる。ＭＨＥは、認知障害を伴って現れ、健康に関連するクオリティ・オブ・ライフおよび運転などの複雑なタスクを実施する能力に対して有害な効果を有する。さらに、ＯＨＥは、精神および運動障害を伴って臨床的に表れ、症状は、見当識障害から鎮静および昏睡までさまざまである。
【０００３】
天然に存在するステロイドは、激しい代謝を受け、通常、経口投与には適していない。プレグナノロンとして知られている、内因性ステロイドホルモン、プレグネノロン、プロゲステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾンおよびコルチゾールの代謝物ならびにテストステロン、アンドロステンジオンおよびデヒドロエピアンドロステロンの代謝物はすべて、哺乳動物における神経学的シグナルシステムにおけるその役割を少なくとも部分的に解明する種々の研究の対象であった。ステロイド代謝物は、ＣＮＳ症状および障害を誘導し、ステロイドは、γ−アミノ酪酸受容体クロリドイオノフォア（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）複合体で正のモジュレーターとして働き、従って、ＧＡＢＡＡ受容体調節ステロイド（ＧＡＭＳ）と呼ばれる。
【０００４】
特定のステロイドは、特異的ＧＡＢＡＡ受容体エンハンサーであると示されている。これらのステロイドの例は、とりわけ、（特許文献１）に見出すことができる。これらのステロイドの一部は、強力であり、例えば、薬理学的用量で健忘、鎮静および麻酔を誘導する能力を有すると示されている。（特許文献２）および（特許文献３）には、ステロイドの拮抗効果が開示されている。（非特許文献１）および（非特許文献２）には、３β−ＯＨ−５α−プレグナン−２０−オンおよびその他の３β−ＯＨ−５α／βプレグナンステロイドの拮抗効果が開示されている。（特許文献４）および（特許文献５）には、肝臓代償不全、肝性脳症および門脈圧亢進症の治療のための化合物の使用が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０６３１２８号
【特許文献２】国際公開第９９／４５９３１号
【特許文献３】国際公開第０３／０５９３５７号
【特許文献４】国際公開第２００６／０５６７９４号
【特許文献５】国際公開第２０１０／１４４４９８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｎｇら２０００年（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  第１６９巻、３３３〜３４１頁）
【非特許文献２】Ｗａｎｇら２００２年（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ第２２巻（９）：３３６６〜７５頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
肝性脳症および関連障害のための、新規の、有効な治療的処置を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、肝性脳症の治療において使用するための、下記化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を提供する。
【０００９】
【化１】
2017507113.tif 000001
【００１０】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、ステロイドアンタゴニスト（ＧＡＭＳＡ）を調節するＧＡＢＡＡ受容体として知られる化合物のクラスに属する。
【００１１】
本発明者らは、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、アロプレグナノロンおよびテトラヒドロデオキシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）などの内因性ステロイドによるＧＡＢＡＡ受容体の正の調節を選択的に阻害できることを見出した。これらのステロイドは、鎮静、認知障害および運動障害を誘導すると知られており、脳におけるその濃度は、肝臓疾患誘導性高アンモニア血症およびＨＥの患者では増大される。
【００１２】
しかし、本発明者らはまた、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、ＧＡＢＡＡ受容体でγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の作用に向けた拮抗効果を有さないことを見出した。この驚くべき選択性は、ＧＡＢＡＡ受容体でのＧＡＢＡ結合の阻害が、けいれんを含めた副作用につながり得るので、安全性見込みから有利である。
【００１３】
さらに、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、α１およびα５ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプの両方に対して作用し、そのため、運動および認知障害の両方に対する正の効果ならびにＧＡＢＡＡ受容体の過剰活性化に起因する鎮静効果を発揮できる。運動および認知障害に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの正の効果は、ＨＥの２種の動物モデル（ラットにおける高アンモニア血症および門脈大静脈吻合、下記参照）において示されている。
【００１４】
ＨＥの既存の治療とは異なり、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、ｉｎ  ｖｉｖｏでアンモニアレベルに影響を及ぼさない。したがって、療法におけるその補完的使用の明確な可能性もある。
【００１５】
したがって、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、ＨＥおよび関連障害の治療に特に良好に適していると考える確かな根拠がある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、血液アンモニアレベルに影響を及ぼさないことを示す図である。値は、群あたり１２匹のラットの平均±ＳＥＭであり、対照と有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている；＊＊＊、ｐ＜０．００１。ＣＶ＝媒体を用いて治療された対照ラット；ＨＡＶ＝媒体を用いて治療された高アンモニア血症ラット；ＨＡ＋ＧＡＭ＝３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラット。
【図２】図２は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、放射状迷路において高アンモニア血症ラットの空間学習を回復させることを示す図である。図は、放射状試験における作業エラーを示す。ブロック１における作業エラー。値は、群あたり８匹のラットの平均±ＳＥＭである、＃  ＨＡＶに対してｐ＜０．０５。ＣＶ＝媒体を用いて治療された対照ラット；ＨＡＶ＝媒体を用いて治療された高アンモニア血症ラット；ＨＡ＋ＧＡＭ＝３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラット。
【図３】図３は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、モリスの水迷路試験において、高アンモニア血症ラットの空間記憶を回復させることを示す図である。図は、３日目の第１の試みでプラットフォームを見出す時間を示す。値は、群あたり８匹のラットの平均±ＳＥＭである。ＣＶに対するＨＡＶ  ｐ＝０．０５２。ＣＶ＝媒体を用いて治療された対照ラット；ＨＡＶ＝媒体を用いて治療された高アンモニア血症ラット；ＨＡ＋ＧＡＭ＝３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラット。
【図４】図４は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、高アンモニア血症ラットの運動協調性を回復させることを示す図である。値は、群あたり１５匹のラットの平均±ＳＥＭである。ＣＶと有意に異なる値は、＊、ｐ＜０．０５によって示され、ＨＡＶと有意に異なる値は、＃＃＃、ｐ＜０．００１によって示されている。ＣＶ＝媒体を用いて治療された対照ラット；ＨＡＶ＝媒体を用いて治療された高アンモニア血症ラット；ＨＡ＋ＧＡＭ＝３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラット。
【図５】図５は、総血漿３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度を示す図である。５日目および毎日の注射を用いる治療の最後の１週間の間の、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの皮下注射の４および２３時間後の、対照および高アンモニア血症ラットにおける総血漿３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度。ＨＡ＝高アンモニア（Ｈｙｐｅｒ  ａｍｍｏｎｉａ）動物。
【図６】図６は、２０ｍｇ／ｋｇの毎日注射を用いる７週間後の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムのｓ．ｃ．注射の１〜２時間後の、対照および高アンモニア血症ラットにおける未結合＊脳３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度を提供する図である。  ＊未結合脳濃度＝担体タンパク質または脳組織と結合していない脳中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの画分。
【図７】図７は、α１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体のテトラヒドロデオキシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）によって増強された活性化を示す代表的な電気生理学的測定値を提供する図である。ヒトα１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、３０μΜのＧＡＢＡまたは３０μΜのＧＡＢＡおよび１００ｎＭのＴＨＤＯＣに対して４０ｍｓの間曝露させた。ＴＨＤＯＣを用いた場合には、２０ｓのプレインキュベーションと、その後のＴＨＤＯＣ＋ＧＡＢＡの適用を行った。
【図８】図８は、α１β２γ２Ｌおよびα５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体のＴＨＤＯＣによって増強された活性化の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム（ＧＡＭＳＡ）拮抗作用およびＧＡＢＡの阻害がないことを示す代表的な電気生理学的測定値を提供する図である。Ａ）α１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体との、３０μΜのＧＡＢＡの１００ｎＭのＴＨＤＯＣによって増強された活性化の１μΜの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム拮抗作用、Ｂ）１μΜの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、α１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体の３０μΜのＧＡＢＡ活性化に拮抗しない、Ｃ）ＴＨＤＯＣの効果の拮抗作用を示す、α５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体との、０．３μΜのＧＡＢＡの２００ｎＭのＴＨＤＯＣによって増強された活性化の１μΜの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム拮抗作用、Ｄ）１μΜの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、α５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体の０．３μΜ  ＧＡＢＡ活性化を拮抗しない。
【図９】図９は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおいて運動協調性を回復させる能力を示す図である。運動協調性は、梁歩行試験を使用して評価した。（Ａ）は、媒体を用いて治療された対照（ＣＶ）または高アンモニア血症（ＨＡＶ）ラットの、および３（ＨＡ３）、１０（ＨＡ１０）または２０（ＨＡ２０）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラットのデータを示す。（Ｂ）は、媒体を用いて治療された偽手術された対照（ＳＭ）またはＰＣＳラットの、および０．７（ＰＣＳ０．７）または２．５（ＰＣＳ２．５）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットのデータを示す。値は、各バーの下に示されたラット数の平均±ＳＥＭである。対照または偽ラットと有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている。媒体を用いて治療された高アンモニア血症またはＰＣＳラットと有意に異なる値は、「ａ」によって示されている。＊ｐ＜０．０５；ａ  ｐ＜０．０５；ａａ  ｐ＜０．０１；ａａａ  ｐ＜０．００１。
【図１０】図１０は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおけるモリスの水迷路における空間記憶を回復させる能力を示す図である。モリスの水迷路における空間学習記憶は、媒体を用いて治療された対照（ＣＶ）または高アンモニア血症（ＨＡＶ）ラットにおいて、および３（ＨＡ３）、１０（ＨＡ１０）または２０（ＨＡ２０）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラットについて（Ａ、Ｂ）、および媒体を用いて治療された偽手術された対照（ＳＭ）またはＰＣＳラットにおいて、および０．７（ＰＣＳ０．７）または２．５（ＰＣＳ２．５）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットについて（Ｃ，Ｄ）評価した。（Ａ，Ｃ）異なるセッションの間の、プラットフォームに到達する逃避待ち時間（秒で）。（Ｂ、Ｄ）記憶試験の際に正しい四分円において過ごした時間（％）。値は、各バーの下に示されたラット数の平均±ＳＥＭである。対照または偽ラットと有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている。媒体を用いて治療された高アンモニア血症またはＰＣＳラットと有意に異なる値は、「ａ」によって示されている。＊ｐ＜０．０５；ａ  ｐ＜０．０５。
【図１１】図１１は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおいて放射状迷路において空間学習を回復させる能力を示す図である。  媒体を用いて治療された対照（ＣＶ）または高アンモニア血症（ＨＡＶ）ラットにおいて、および３（ＨＡ３）、１０（ＨＡ１０）または２０（ＨＡ２０）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラットについて（Ａ、Ｂ）、媒体を用いて治療された偽手術された対照（ＳＭ）またはＰＣＳラットにおいて、および０．７（ＰＣＳ０．７）または２．５（ＰＣＳ２．５）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットにおいて（Ｃ，Ｄ）、放射状迷路における空間学習を評価した。（Ａ，Ｃ）異なるセッションの間の作業エラー。（Ｂ，Ｄ）１〜２日目の間の作業エラー。値は、各バーの下に示されたラット数の平均±ＳＥＭである。対照または偽ラットと有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている。媒体を用いて治療された高アンモニア血症またはＰＣＳラットと有意に異なる値は、「ａ」によって示されている。＊  ｐ＜０．０５；ａ  ｐ＜０．０５；ａａ  ｐ＜０。０１。
【図１２】図１２は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、夜間の自発的運動活性を増大し、ＰＣＳラットの日内周期を部分的に回復させる能力を示す図である。運動活性を、媒体を用いて、または０．７（ＰＣＳ０．７）もしくは２．５（ＰＣＳ２．５）ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された、偽手術された対照（ＳＭ）またはＰＣＳラットにおいて評価した。Ａには、各時間の間の運動活性が；Ｂには夜間および日中の活性の比が、Ｃには、日中または夜間の総活性が示されている。光は、７：００ｐｍに消される。値は、群あたり８匹のラットの平均±ＳＥＭである。ＳＭラットと有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；  ＊＊＊ｐ＜  ０．００１。ＰＣＳラットと有意に異なる値は、「ａ」によって示されている；ａ  ｐ＜０．０５。
【図１３】図１３は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、日中の垂直活性を正常化する能力およびＰＣＳラットの日内周期を部分的に回復させる能力を示す図である。実験は、図１２について記載されたように実施したが、垂直カウントが示されている。値は、群あたり８匹のラットの平均±ＳＥＭである。ＳＭラットと有意に異なる値は、アスタリスクによって示されている；＊  ｐ＜０．０５；＊＊  ｐ＜０．０１；＊＊＊  ｐ＜０．００１。ＰＣＳラットと有意に異なる値は、ａによって示されている；ａ  ｐ＜０．０５；ａａ  ｐ＜０．０１。
【図１４】図１４は、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおける行動試験時の血漿における、および脳における３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム曝露を示す図である。Ａ）高アンモニア血症ラットおよびＢ）ＰＣＳラットには、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの総血漿中濃度が、μΜで示されている。Ｃ）高アンモニア血症ラットおよびＤ）ＰＣＳラットには、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの未結合脳濃度が、ｎｍｏｌ／ｋｇで示されている。高アンモニア血症ラットにおいて、使用される用量３、１０および２０ｍｇ／ｋｇ／日、およびＰＣＳのラットにおいて、０．７および２．５ｍｇ／ｋｇ／日を用いる、種々のラットモデルにおける同様の曝露に留意されたい。データは、研究の最後に、すなわち、９週間の、ｓ．ｃ．で１日１回与えられるゴマ油中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる毎日治療後に得たものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明が詳細に記載される前に、本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的で使用され、制限であるよう意図されないことは理解されなければならない。
【００１８】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」はまた、別に明確に記されない限り、複数形の言及も含むということは留意されたい。
【００１９】
用語「医薬組成物」は、少なくとも１種の活性物質および任意選択の担体、アジュバント、希釈剤、成分などを含有するすべての医薬上許容される組成物を包含する最も広い意味で使用される。
【００２０】
用語「投与」および「投与の様式」ならびに「投与の経路」もまた、その最も広い意味で使用される。
【００２１】
本発明に一致して使用されるような化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、治療されるべき肝性脳症状態にとって、局所（ｌｏｃａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）または全身様式の投与が最も適当であるか否かに大きく左右される、いくつかの方法で投与され得る。これらの種々の投与様式として、例えば、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）（例えば、皮膚上に）、局所（ｌｏｃａｌ）（眼および種々の粘膜、例えば、膣および直腸送達を含む）、経口、非経口または上気道および下気道を含む肺がある。このような組成物および製剤の調製は、医薬および製剤の技術分野の当業者に一般的に公知であり、本発明の組成物の製剤に適用され得る。
【００２２】
用語「アンタゴニスト」とは、別の物質、アゴニストを、その効果を誘導するために邪魔する物質を意味する。本願では、用語アンタゴニストおよび遮断薬は、同義的に使用される。
【００２３】
用語「Ａ型肝性脳症」は、通常、急性肝不全を伴う、通常、脳浮腫を伴う肝性脳症を意味する。
【００２４】
用語「Ｂ型肝性脳症」は、通常、内因性肝臓疾患を伴わない門脈体循環シャントによって引き起こされる肝性脳症（バイパス）を意味する。
【００２５】
用語「Ｃ型肝性脳症」は、通常、硬変を有する患者で生じる肝性脳症を意味し、この型は、突発性、持続性およびミニマル脳症に細分される。
【００２６】
用語「ミニマル肝性脳症」は、通常、臨床的に顕性の認知障害につながらないが、神経心理学的研究を用いて実証され得る肝性脳症を意味する。
【００２７】
用語「顕性肝性脳症」は、通常、広範囲の精神および運動障害を伴う精神神経症候群として示される臨床的に明らかな肝性脳症を意味する。顕性肝性脳症は、これまで安定である患者において数時間または数日の期間にわたって偶発性に生じ得るか、または患者は、持続性精神神経異常を示し得る。
【００２８】
用語「高アンモニア血症」とは、通常、血液中の過剰のアンモニアを特徴とする代謝障害を意味する。
【００２９】
用語「肝臓移植」は、通常、例えば、急性肝不全または硬変の結果としての罹患肝臓を除去し、ドナーから得た健常肝臓と置き換える外科手術手技を意味する。ほとんどの肝臓移植手術は、死亡したドナーから得た肝臓を使用するが、肝臓はまた、生存ドナーから得る場合もある（健常なヒトの肝臓の一部）。例えば、硬変を有する患者は、肝性脳症をよく起こし、手術前肝性脳症は、移植後神経学的合併症の有意な予測因子である。
【００３０】
用語「慢性肝不全の急性増悪」は、通常、硬変、少なくとも１つの臓器不全の急性代償不全を意味するか、または高い短期の死亡率を有するサブグループに属する。
【００３１】
用語「代償性硬変」は、通常、臨床的証拠を全く伴わない肝硬変を意味するが、漸近食道または胃静脈瘤ならびに疲労およびエネルギーの喪失、食欲の喪失および体重減少、吐き気または腹痛などの初期症状を含み得る。
【００３２】
用語「非代償性硬変」とは、通常、黄疸、腹水、浮腫、肝性脳症、胃腸出血、門脈圧亢進症、細菌感染またはいずれかの組合せなどのさまざまな臨床的証拠を有する進行した肝硬変を意味する。
【００３３】
用語「門脈圧亢進症」とは、通常、経頸静脈的肝内門脈大循環シャント（ＴＩＰＳ）を伴うか、伴わない肝硬変後の肝静脈圧勾配を意味する。
【００３４】
本開示内において用語「予防」とは、通常、疾患または障害肝性脳症が生じるのを予防することを意味する。
【００３５】
本開示内において用語「軽減」とは、通常、疾患または障害肝性脳症の低減またはそれがないことを意味する。
【００３６】
肝性脳症を患っている患者は、それだけには限らないが、睡眠・覚醒サイクル、認知、記憶、学習、運動協調性、意識の障害、エネルギーレベルの低下ならびに人格変化、認知障害、見当識障害および昏睡を含めた症状を示し得る。
【００３７】
本発明者らは、驚くべきことに、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが、肝性脳症の治療にとって有用であり得ることを示した。
【００３８】
本発明の第１の態様において、肝性脳症の治療において使用するための、下記化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩が提供される。
【００３９】
【化２】
2017507113.tif 000002
【００４０】
本発明の一実施形態では、前記肝性脳症は、Ａ型肝性脳症である。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｂ型肝性脳症である。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｃ型肝性脳症である。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、ミニマル肝性脳症である。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、顕性肝性脳症である。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、前記化合物は、急性肝不全の患者において前記肝性脳症が治療される場合に使用するためのものである。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、前記化合物は、慢性肝不全の急性増悪を伴うか、または伴わない慢性肝臓疾患の患者において前記肝性脳症が治療される場合に使用するためのものである。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、前記化合物は、急性肝不全の患者において、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者において、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、顕性肝性脳症などの肝性脳症の予防または軽減のために使用するためのものである。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、肝臓移植前、肝臓移植中または肝臓移植後に使用するための前記化合物が提供される。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、肝性脳症の治療において使用するための３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、１種以上の医薬上許容される担体、賦形剤および／または希釈剤と一緒に含む医薬組成物が提供される。
【００５０】
本発明の別の態様では、医薬上有効な量の下記３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、肝性脳症を治療する方法が提供される。
【００５１】
【化３】
2017507113.tif 000003
【００５２】
本発明の一実施形態では、前記肝性脳症は、Ａ型肝性脳症である。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｂ型肝性脳症である。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｃ型肝性脳症である。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、ミニマル肝性脳症である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、顕性肝性脳症である。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、前記患者は、急性肝不全を患っている。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、前記患者は、慢性肝不全の急性増悪を伴うか、または伴わない慢性肝臓疾患を患っている。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、前記化合物は、肝臓移植の前、肝臓移植中または肝臓移植後に提供される。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、医薬上有効な量の下記３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、肝性脳症を予防または軽減する方法が提供される。
【００６１】
【化４】
2017507113.tif 000004
【００６２】
前記肝性脳症は、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症または顕性肝性脳症であり得る。さらに、前記予防は、急性肝不全の患者において、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者においてであり得る。
【００６３】
本発明の別の態様では、門脈圧亢進症の治療において使用するための、下記化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩が提供される。
【００６４】
【化５】
2017507113.tif 000005
【００６５】
前記使用はまた、門脈圧亢進症の予防または軽減であり得る。門脈圧亢進症の患者は、通常、慢性肝臓疾患、硬変または急性肝不全などの肝臓疾患を患っている。
【００６６】
本発明の別の態様では、医薬上有効な量の下記３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、門脈圧亢進症を治療する方法が提供される。
【００６７】
【化６】
2017507113.tif 000006
【００６８】
前記方法はまた、門脈圧亢進症の予防または軽減であり得る。門脈圧亢進症の患者は、通常、慢性肝臓疾患、硬変または急性肝不全などの肝臓疾患を患っている。
【００６９】
本発明の別の態様では、肝臓代償不全の治療において使用するための、下記化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩が提供される。
【００７０】
【化７】
2017507113.tif 000007
【００７１】
前記使用はまた、肝臓代償不全の予防または軽減であり得る。肝臓代償不全の患者は、通常、慢性肝臓疾患などの肝臓疾患を患っているか、または胃腸出血、感染、門脈血栓症または脱水症などの誘発事象を有すると疑われ得る。
【００７２】
本発明の別の態様では、医薬上有効な量の下記３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、肝臓代償不全を治療する方法が提供される。
【００７３】
【化８】
2017507113.tif 000008
【００７４】
前記方法はまた、肝臓代償不全の予防または軽減であり得る。肝臓代償不全の患者は、通常、慢性肝臓疾患などの肝臓疾患を患っているか、または胃腸出血、感染、門脈血栓症もしくは脱水症などの誘発事象を有すると疑われ得る。
【００７５】
本発明の別の態様では、肝性脳症を治療するための医薬の製造における、下記化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩の使用が提供される。
【００７６】
【化９】
2017507113.tif 000009
【００７７】
本発明の一実施形態では、前記肝性脳症は、Ａ型肝性脳症である。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｂ型肝性脳症である。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、Ｃ型肝性脳症である。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、ミニマル肝性脳症である。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、前記肝性脳症は、顕性肝性脳症である。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、前記使用は、急性肝不全の患者において前記肝性脳症が治療される場合である。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、前記使用は、慢性肝不全の急性増悪を伴うか、または伴わない慢性肝臓疾患の患者において前記肝性脳症が治療される場合である。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、前記使用は、肝臓移植前、肝臓移植中または肝臓移植後に提供される。
【００８５】
本発明の別の実施形態では、医薬の製造における、化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩の前記使用は、急性肝不全の患者における、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者における、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、顕性肝性脳症などの肝性脳症の予防または軽減のためであり得る。
【００８６】
この態様の別の実施形態では、肝性脳症の治療において使用するための３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩を、医薬上許容される担体、賦形剤およびまたは希釈剤と一緒に含む医薬組成物が提供される。前記使用はまた、肝性脳症の予防または軽減においてであり得る。
【００８７】
本発明のさらなる態様では、高アンモニア血症によって引き起こされる症状の阻害または治療において使用するための、化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩である。
【００８８】
【化１０】
2017507113.tif 000010
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、急性肝不全の患者において、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者において、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、顕性肝性脳症などの肝性脳症の治療または予防において使用するための化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムであり、前記治療または予防は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩の、リファキシミン、ラクツロース、オルニチンフェニルアセテートおよびグリセロールフェニルブチレートなどのアンモニア低下性化合物との同時投与を含み、好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンまたはラクツロースであり、最も好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンである。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態は、急性肝不全の患者において、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者において、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、顕性肝性脳症などの肝性脳症の治療または予防の方法であり、前記治療または予防は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩の、リファキシミン、ラクツロース、オルニチンフェニルアセテートおよびグリセロールフェニルブチレートなどのアンモニア低下性化合物との同時投与を含み、好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンまたはラクツロースであり、最も好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンである。
【００９１】
本発明のさらなる実施形態は、急性肝不全の患者において、または慢性肝不全の急性増悪を伴うか、もしくは伴わない慢性肝臓疾患の患者において、Ａ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、顕性肝性脳症などの肝性脳症の治療または予防のための医薬の製造における、化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの使用であり、前記治療または予防は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムまたはその医薬上許容される塩の、リファキシミン、ラクツロース、オルニチンフェニルアセテートおよびグリセロールフェニルブチレートなどのアンモニア低下性化合物との同時投与を含み、好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンまたはラクツロースであり、最も好ましくは、アンモニア低下性化合物は、リファキシミンである。
【００９２】
本発明のさらなる態様は、ミニマル肝性脳症または顕性肝性脳症などの肝性脳症の治療において使用するための、各可能性ある置換基位置における１個以上の水素原子が、重水素またはトリチウムと置換され得る化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムである。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、組織または流体中の化合物の濃度を調べることを含むアッセイを使用するための、各可能性ある置換基位置における１個以上の水素原子が、重水素またはトリチウムと置換され得る化合物３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムである。
【００９４】
本発明によれば、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、以下の投与経路：静脈内に、経鼻的に、直腸によって、頬側に、膣内に、経皮的に、筋肉内におよび経口的にのうち１種によって投与され得る。一実施形態によれば、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、静脈内に投与される。別の実施形態によれば、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、経鼻的に投与される。クリーム、ゲルおよび軟膏として、または持続放出性粘着性医薬パッチの形態で製剤化された３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを使用する経皮的投与は、自己投薬に同様に適している、投与の別の可能性ある形態である。
【００９５】
選択された経路に適した化学形態の有効な医薬品を、従来使用され、当業者に周知である、適したアジュバント、担体、希釈剤および媒体と一緒に含む医薬組成物は、通常の薬理学的手順に従って適合または調整され得る。経口投与のための従来使用されるアジュバントおよび媒体は、例えば、二酸化チタン、無水ラクトース、シリカ、シリカコロイダリス（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｉｓ）、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微晶質セルロースなどのような充填剤または懸濁剤である。静脈内投与のために従来使用されるアジュバントおよび媒体は、例えば、滅菌注射水（ＷＦＩ）、滅菌バッファー（例えば、ｐＨ７．４に溶液を緩衝する）アルブミン溶液、脂質溶液、シクロデキストリンなどである。経皮投与のために従来使用されるアジュバントおよび媒体は、例えば、ワセリン、液体パラフィン、グリセロール、水、ＭＣＴオイル、ゴマ油、植物油などである。用量は、投与の様式、治療されるべき特定の状態または所望の効果、患者の性別、年齢、体重および健康ならびに治療医師によって評価される、可能性あるその他の因子に応じて自然に変わる。
【実施例】
【００９６】
本発明を、いくつかの例示的な、限定されない例によって以下に説明する。
【００９７】
［実施例１］
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの合成
ステップ１：３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンの合成
窒素下室温（ｒｔ）で、５０ｍＬの無水ＴＨＦに３，１７−アンドロスタンジオン（５．０ｍｍｏｌ）を溶解した。エチニルマグネシウムブロミド（１．１当量）を撹拌下室温で滴加し、溶液を窒素流下室温で一晩撹拌させた。次いで、溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）を用いてクエンチし、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）を用いて水相を抽出した。集めた有機相を、減圧下で蒸発させ、得られた黄色のオイルをジクロロメタンに溶解し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶液を真空下で還元し、残渣をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１：４ジエチルエーテル：ジクロロメタン）によって精製した（通常の収率６５％）。副生成物の最終的な痕跡は、ジエチルエーテルからのさらなる再結晶化によって排除され得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ６）：δ  ２．４３（ｓ，１Ｈ）；２．４２（ｍ，１Ｈ）；２．１０−２．０４（ｍ，２Ｈ）；１．０２（ｍ，１Ｈ）；０．８６（ｓ，３Ｈ）；０．８３（ｓ，３Ｈ）。
【００９８】
ステップ２：３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの合成
２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、室温および空気雰囲気において、ジクロロメタン５ｍＬおよびエタノール５０ｍＬ中に、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オン（１０ｍｍｏｌ）を溶解した。５ｍＬのＨ２Ｏに４当量の塩酸ＮＨ２ＯＨおよび４当量の酢酸ナトリウムを溶解し、次いで、ステロイド溶液に添加した。２０ｍＬのエタノールを添加し、混合物を還流に一晩置いた。次いで、混合物を冷却し、溶媒を減圧下で除去した。白色残渣を５０ｍＬのＨ２Ｏおよび５０ｍＬのジクロロメタンを用いて処理し、水相を３×３０ｍＬのジクロロメタンを用いて抽出した。次いで、集めた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。最終残渣を、シリカフラッシュカラムクロマトグラフィージクロロメタン：ジエチルエーテル４：１によって精製した（通常の収率９５〜１００％（定量的））。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ６）：δ  ２．５１−２．４７（ｍ，２Ｈ）；２．４３（ｓ，１Ｈ）；１．００（ｍ，１Ｈ）；０．８０（ｍ，１Ｈ）；０．９０（ｓ，３Ｈ）、０．８３（ｓ，３Ｈ）。
【００９９】
［実施例２］
肝性脳症の動物モデルにおける３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
この研究では、肝性脳症において存在する認知および運動変容の多くを再現する慢性高アンモニア血症の動物モデルを使用した。ラットに、アンモニアをその食餌中で給餌し、アンモニアが豊富な食餌を用いて２週間の後、肝性脳症の症状を発症した。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム治療の３週間目および４週間目の間に梁歩行試験を行い、モリスの水迷路試験は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム治療の４週間目〜５週間目の間に行い、放射状迷路試験は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム治療の６週間目〜７週間目に行った。
【０１００】
研究を、動物（雄のウィスターラット）を用いる２つのシリーズに分け、各シリーズは、以下の群を含んでいた；媒体を用いて治療された対照（ＣＶ、シリーズあたりｎ＝８）、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された対照（Ｃ＋ＧＡＭ、シリーズあたりｎ＝８）、媒体を用いて治療された高アンモニア血症ラット（ＨＡＶ、シリーズあたりｎ＝８）、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラット（ＨＡ＋ＧＡＭ、シリーズあたりｎ＝８）。毎日１回の、２０ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる、または媒体を用いる治療を、１ｍｌ／ｋｇの皮下注射を用いておよそ午前９時に実施した。治療は、アンモニウム含有食を開始した１週間後に開始し、全実験期間の間、継続した。
【０１０１】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの試験品は、２０ｍｇ／ｋｇのゴマ油中の懸濁液として調製した。
【０１０２】
放射状迷路における空間学習
空間学習を評価する方法として放射状迷路を設計された。装置は、８つの等しい大きさのアームへ接近する中心領域から構成されている。アームは、７０ｃｍの長さおよび１０ｃｍの幅とし、中心領域は、直径３０ｃｍとした。迷路は、黒色パースペクスでできており、床面から８０ｃｍ高かった。各アームは、中心領域の遠位側（５ｃｍ）よりも近位側でより高い（３０ｃｍ）高さを有する外側壁を有していた。各アームの遠位端では、食物の褒美を置くための陥凹カップが設置されていた（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒａｂａｚａ  Ｖら２０１０年）。
【０１０３】
ラットを迷路に慣れさせるために、遠位合図（異なる大きさのポスターおよび物体）の存在下で２連続日で１０分間、ラットに迷路を探検させ、遠位合図は、訓練を通じて、所定の位置のままにした。
【０１０４】
放射状迷路における訓練は、１０連続日で実施される各３回の試みの５つのブロックから構成されていた。タスクは、ランダム配置に従って、各々異なるアームの末端に置かれる４個のペレットを設置することを含んでいた。配置は、各ラットに特異的であり、訓練を通じて変わらず維持された。空間参照エラーおよび作業記憶の数を算出し、ブロックあたりの参照および作業エラーの数として表した。さらに、学習指数を使用して、タスクの学習を評価し、正しい選択−参照エラーの数として定義した（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒａｂａｚａら２０１０年）。
【０１０５】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、放射状迷路において高アンモニア血症ラットの空間学習を回復させた。高アンモニア血症ラットは、空間学習の低下を示し、放射状迷路タスクにおいてより多い作業エラーをおかす。空間記憶は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムによって完全に回復された（図２）。
【０１０６】
［実施例３］
肝性脳症の動物モデルにおける３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例２に示される通りとした。
【０１０７】
モリスの水迷路における空間記憶
空間学習を評価する方法として迷路が設計された（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｒ．１９８４年）。試験は、任意に４つの四分円に分けられた、黒色円形プール（直径１６０ｃｍ、４０ｃｍの高さ）を使用して実施した。水の不透明性は、黒色塗料を添加することによって得た。訓練セッションの間、透明プレキシグラスプラットフォーム、直径１０ｃｍを、１つの四分円の中心で水面の２ｃｍ下に沈めた（Ｍｏｎｆｏｒｔら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、第２５巻、２１０３〜２１１頁）。
【０１０８】
試験は以下の通りに実施した；１日目は、プレ訓練日とし、単に水に適応するよう、ラットを２回、３０秒間水中に入れた。次いで、ラットを、見えないプラットフォームの固定された位置を学習するよう３日間訓練した。各訓練の試みは、ラットを、プラットフォームのない３つの四分円のうちの１つで、壁に面してプール中に入れることを含んでいた。各試みで、異なる出発点をランダムに使用した。訓練は、１日あたり５回の泳ぎからなっていた。各動物は、プラットフォームを見出すために最大１２０秒許可され、プラットフォーム上で１５秒間残され、ラットが１２０秒内にプラットフォームを探せなかった場合には、実験者によってプラットフォームに手作業で導かれた。この試験の目的は、ラットが見えないプラットフォームが置かれている場所を学習し、できる限り短い時間でそれに到達することである。Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ  ２．５、Ｃｈａｍｐａｇｎｅ  ａｕ  Ｍｏｎｔ  Ｄ’  Ｏｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されたビデオトラッキングシステムによって、隠されたプラットフォームを見出すために必要とされる時間、速度および進路を記録し、タスクの学習の尺度として使用した。１５回の訓練の試みの後、プラットフォームをプールから除去し、ラットをプール中で９０秒間泳がせ、訓練の間、プラットフォームが位置していた四分円において過ごした時間を記録した。
【０１０９】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、モリスの水迷路において高アンモニア血症ラットの空間記憶を完全に回復させた。高アンモニア血症ラットは、記憶の低下を示し、プラットフォームを見出すのに対照よりも長い時間を必要とした（図３）。
【０１１０】
［実施例４］
肝性脳症の動物モデルにおける３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例２に示される通りとした。
【０１１１】
梁歩行における運動協調性
梁歩行試験では、ラットは、上昇する狭い梁をわたって、閉鎖された避難プラットフォームに到達するよう訓練される。梁は、滑らかな丸い木（直径２０ｍｍ）でできている。梁は、床面から１ｍ上がっている。測定される運動協調性のパラメータは：足の滑り（または足の誤り）および梁をわたる待ち時間である（Ｊｏｖｅｒら、２００６年；Ｃａｒｔｅｒら、２０１０年）。ラットを慣らすために、実験者は、ラットを梁の始まりに置き、ラットが梁を渡るのを３回助ける。その後、試験は、３回の連続した試みからなる。各試みについて、左または右の後足が滑って梁から外れた回数を記録した。
【０１１２】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、梁歩行試験における高アンモニア血症ラットの運動失調を完全に逆転させた。高アンモニア血症ラットは、運動失調を示した（滑り数＝足の誤りの増大）（図４）。
【０１１３】
［実施例５］
外因性投与後の血漿および脳組織中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの濃度
血漿を得ること
血液は、アンモニア治療の第２週の最後および３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム治療の第１週にラットの尾から（実施例２から）、また、動物屠殺の際に首から得た。血漿を得るために、ＥＤＴＡ７．５ｎＭを添加し、１５００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離した。
【０１１４】
アンモニア判定
Ｐｏｃｋｅｔ  ｃｈｅｍ  ＢＡ（Ｗｏｏｄｌｅｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、アンモニア分析器を使用して血液サンプル中のアンモニア濃度を測定した。この装置は、即時試験を可能にし、結果を３分２０秒で送達する。また、遠心分離などの前処理の必要性も排除する。
【０１１５】
屠殺
ラットを断頭によって屠殺した。小脳を含む脳の２分の１を集め、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの判定のために−８０℃で保存した。種々の脳領域（小脳、皮質、海馬および線条体）を解剖し、ＧＡＭＳのあり得る判定のために−８０℃で保存した。
【０１１６】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度の分析
集めた脳および血漿サンプルを、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度について分析した。血漿および脳サンプルを室温で解凍した。血漿を、３倍容量のアセトニトリルを用いてタンパク質沈殿させ、脳組織を、１：４比の組織：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてホモジナイズし、次いで、２倍容量のメタノール：アセトニトリル（１：１）を用い、超音波処理の間、２０分間抽出した。その後、サンプルを振とうし、１００００×ｇ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｐｉｃｏ  １７遠心機）で１０分間遠心分離した。次いで、等容量のＰＢＳを用いて上清を希釈し、分析した。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの高すぎる濃度のために、いくつかのサンプルを１０倍希釈として再分析した。希釈は、ＰＢＳバッファー中の３７．５％アセトニトリルの溶液を用いて行った。
【０１１７】
標準は、ブランク血漿／脳ホモジネートを濃度０．５〜５０００ｎｇ／ｍｌに添加し、その他の点ではサンプルと同様に処理することによって調製した。判定はＬＣ−ＭＳを用いて行った。
【０１１８】
結果
アンモニア判定：３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、血液アンモニアレベルに影響を及ぼさなかった。血液中のアンモニアレベルは、対照ラット（４７±３μΜ）と比較してアンモニウム食を給餌したラットでは増大される（１６７±１７μΜ）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、対照ラット（５５±７μΜ）における、または高アンモニア血症ラット（１３９±１５μΜ）における血液アンモニアレベルに影響を及ぼさなかった（図１）。肝性脳症症状に対して効果を示すすべての初期の研究は、アンモニアレベルを低下させたのでこれらの結果は、驚くべきことである。
【０１１９】
曝露後の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの判定  本研究では、血漿中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの総濃度を、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療の、５治療日に、および最後の１週間に、それぞれ注射の４時間および２３時間後に分析した。血漿中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの濃度は、図５に示されており、脳濃度は図６に示されている。５治療日に、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの濃度は、注射の４時間後よりも注射の２３時間後に低下し、治療の最後の１週間では、それぞれ、両群において４時間および２３時間の両方で、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの同様の濃度が見出された。脳では、最後の治療の１〜２時間後に、対照（９１±４．１ｎｍｏｌ／ｋｇ未結合＊３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム）において、およびＨＡラット（１０６±１５．４ｎｍｏｌ／ｋｇ未結合＊３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム）において、同様の濃度の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムが見出された（図６）。濃度は、驚くべき高レベルおよび２４時間を通じて安定な濃度を示した。
【０１２０】
＊未結合脳濃度＝担体タンパク質または脳組織と結合していない脳中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの画分。
【０１２１】
［実施例６］
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの、ＴＨＤＯＣの効果を拮抗するが、ＧＡＢＡＡ受容体ではＧＡＢＡと拮抗しない能力
α１β２γ２Ｌおよびα５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体を用いる全細胞電圧固定電気生理学
電気生理学測定のために、Ｒｅｓｏｌｖｅチップを有するＤｙｎａｆｌｏｗ（登録商標）システムを使用した（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ヒトα５、β３およびγ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット（α５β３γ２Ｌ）またはヒトα１、β２およびγ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット（α１β２γ２Ｌ）の構成的発現のために、ヒトＣＭＶプロモーターを含むベクターを用いてＨＥＫ−２９３細胞を永久にトランスフェクトした。使用した細胞株は、ＧＡＢＡとのおよびＴＨＤＯＣとの良好な反応性のために選択された。測定の前に、細胞を、９５％空気＋５％ＣＯ２中、以下：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭグルコース、０．１％  ＤＭＳＯ  ｐＨ７．４を含有する細胞外溶液（ＥＣ）中、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、Ｄｙｎａｆｌｏｗチップ浴中で、ＥＣ溶液に剥離した細胞を添加した。
【０１２２】
室温で全細胞電圧固定記録を行った（２１〜２３°Ｃ、Ｈａａｇｅら、２００２年；Ｎｅｈｅｒ、１９９２年におけるような液間電位差の代償を用いる−１７ｍＶ）。ＰＣＩａｍｐ  ９．０ソフトウェア、ＤｉｇｉＤａｔａ  １３２２ＡコンバータおよびＡｘｏｎＰａｔｃｈ  ２００Ｂ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって、指令パルスを作製し、データを集めた。パッチ電極（２〜６ΜΩ）を１４０ｍＭ  Ｃｓ−グルコン酸塩、３．０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．１％  ＤＭＳＯ、ｐＨ７．２を含む細胞内溶液（ＩＣ）で満たした。
【０１２３】
ＴＨＤＯＣおよび３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、その後、０．１％  ＤＭＳＯを含むようＥＣ溶液を用いて希釈した。
【０１２４】
異なる電気生理学測定のために異なるプロトコールを使用した。ｉｎ  ｖｉｖｏでα１β２ｙ２Ｌ−ＧＡＢＡＡ受容体が、シナプス内に存在するので、その状況に似ている条件、高ＧＡＢＡ濃度（３０μＭ）の短い適用（４０ｍｓ）を使用した。対照的に、α５β３γ２Ｌ−ＧＡＢＡＡ受容体は、シナプス外に存在するので、使用した条件は、低ＧＡＢＡ濃度（０．３μΜ）に対する長い曝露（６ｓ）であった。ＴＨＤＯＣのＥＣ７５濃度、すなわち、α１β２γ２Ｌの研究の場合には１００ｎＭおよびα５β３γ２Ｌ発現細胞が評価される場合には２００ｎＭを使用した。両細胞型を用いて、ＴＨＤＯＣまたはＴＨＤＯＣおよび３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる前曝露を使用し、その後、ＧＡＢＡを適用した。
【０１２５】
測定されたパラメータにおける細胞間および細胞内変動の効果を避けるために、ＧＡＢＡの存在下でのステロイド効果を対照に対して正規化し、各細胞をその自身の対照として使用し、曲線下面積（ＡＵＣ）を分析した。
【０１２６】
結果
ＧＡＢＡＡ受容体での３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの効果を、受容体のヒト変異体を発現する組換えＨＥＫ２９３細胞で電気生理学的測定を用いて研究した。ＧＡＢＡの存在下でのα１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体の１００ｎＭのＴＨＤＯＣによって増強された活性化が、図７に示されている。
【０１２７】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム（１μΜ）は、ＧＡＢＡＡ受容体のα１β２γ２Ｌおよびα５β３γ２Ｌサブユニット変異体の両方でＴＨＤＯＣの効果を部分的に拮抗する（図８ＡおよびＣ）。α１β２γ２Ｌ受容体を用いた場合は、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、ＧＡＢＡのＴＨＤＯＣ増強の２９±４．７％を阻害し（Ｐ＜０．００１）、α５β３γ２Ｌ受容体を用いた場合は、阻害は、４９±４．７％（Ｐ＜０．００１、表１）である。
【０１２８】
対照的に、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム（１μΜ）は、ＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＡ活性化を拮抗しない（図８ＢおよびＤ）。ＧＡＢＡが、受容体の唯一のアクチベーターである場合には、α１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体（−３．１±１．７％、ＮＳ）またはα５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体（−３．８±１．５％、ＮＳ）のいずれかで、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの有意な効果がない（表１）。
【０１２９】
【表１】
2017507113.tif 000011
【０１３０】
［実施例７］
その他の標的および受容体を上回る３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの選択性
神経伝達物質受容体のすべての主要なクラスを含む、受容体、イオンチャンネルおよび酵素について、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの結合を調べた。合計、１１３種の標的を、１０μΜの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ｓｃｒｅｅｎ）を用いて２連で試験した。結合活性は、リガンド結合の５０％以上の阻害として定義した。
【０１３１】
結果
１０μΜでは、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、研究された神経伝達物質関連受容体、ステロイド受容体またはペプチド受容体のいずれにも結合活性を示さなかった。
【０１３２】
［実施例８］
ＨＥおよび門脈大静脈吻合を有するラットの運動協調性に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
ラットにおける慢性高アンモニア血症。雄のウィスターラット（１４０〜１６０ｇ）を、酢酸アンモニウム含有食（３０重量％）を給餌することによって高アンモニア血症にした（Ｆｅｌｉｐｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８８年、第１７６巻、５６７〜５７１頁）。
【０１３３】
門脈大静脈吻合。雄のウィスターラット（２２０〜２４０ｇ）にイソフランを用いて麻酔をかけ、端側門脈大静脈吻合を、ＬｅｅおよびＦｉｓｈｅｒ（Ｓｕｒｇｅｒｙ、１９６１年、第５０巻、６６８〜６７２頁）によって記載されるように実施した。対照ラットを偽手術し；それらはクランプされた門脈および下大静脈を１０分間有していた。
【０１３４】
門脈大静脈吻合手術を受けたラットは、本明細書において「ＰＣＳラット」と呼ばれる。
【０１３５】
動物への疼痛および不快感を最小にするために、適当な尺度をとった。実験は、本発明者らのセンターの実験と動物の幸福の委員会（Ｃｏｍｉｔｅ  ｄｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｃｉｏｎ  ｙ  Ｂｉｅｎｅｓｔａｒ  Ａｎｉｍａｌ）（ＣＥＢＡ）によって承認され、欧州委員会の指令（Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）（２０１０／６３／ＥＵ）のガイドラインおよび実験動物の飼育および管理のためのスペイン立法（Ｒ．Ｄ．  １２０１／２００５）に従って実施された。
【０１３６】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療。ゴマ油中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを、１日１回ラットの背中に皮下注射によって投与した。高アンモニア血症ラットにおいて２つの異なるセットの実験を実施した。第１のセットでは、４群のラットを使用した：１）媒体を注射した対照ラット、２）媒体を注射した高アンモニア血症ラット、３）２０ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを注射した対照ラットおよび４）２０ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを注射した高アンモニア血症ラット。
【０１３７】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを注射した対照ラットは、これらのラットでは関連効果が見られなかったのでその後含まれなかった。
【０１３８】
実験の第２のセットでは、５群のラットを使用した：１）媒体を注射した対照ラット；２）媒体を注射した高アンモニア血症ラットおよび３〜５）３、１０または２０ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを注射した高アンモニア血症ラット。各実験では、群あたり６〜８匹のラットを使用した。
【０１３９】
ＰＣＳラットを使用する実験について、以下のラットの群を使用した：１）媒体を注射した偽ラット；２）媒体を注射したＰＣＳラット；３〜４）０．７または２．５ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを注射したＰＣＳラット。各実験において使用したラットの数は、対応する図に示されているか、または対応する図の説明に与えられている。
【０１４０】
統計分析
示されるデータは、各図において示されるラットの数の平均±ＳＥＭである。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニポストテストを用いて、および１パラメータのみが比較された場合にはスチューデントのｔ検定を用いて推定した。分析は、ＷｉｎｄｏｗｓのＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
【０１４１】
運動協調性。梁歩行試験。
運動協調性は、木の梁（直径２０ｍｍ）を使用することによってＧｏｎｚａｌｅｚ−Ｕｓａｎｏら（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、第１９巻、５（２）、１００〜１０５頁）によって記載されたように試験した。ラットは、地面のおよそ１メートル上に位置する１メートル長の木の梁をわたるようにされ、２人の観察者が足の誤り（滑り）の数を記録した。ラットを、最大５回梁をわたるようにすることによって試験のために訓練し、その後、測定値を記録した。足の誤り（滑り）の数は、運動失調の尺度である。
【０１４２】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、高アンモニア血症およびＰＣＳラットの両方について運動協調性を回復させると示された。
【０１４３】
高アンモニア血症ラットは、梁歩行試験において運動失調を示し、対照ラット（１．０±０．１）よりも高い滑り数（１．４±０．１）を有していた（ｐ＜０．０５）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、高アンモニア血症ラットにおいて運動協調性を回復させる（図９Ａ）。効果は、３ｍｇ／ｋｇ（０．８±０．１滑り、ｐ＜０．０５）および２０ｍｇ／ｋｇ（０．７８±０．０７滑り、ｐ＜０．０５）の用量について統計的に有意であった。
【０１４４】
ＰＣＳラットもまた、梁歩行試験において運動失調を示し、偽手術された対照ラット（０．７１±０．０７）よりも高い滑り数（１．２±０．１）を有していた（ｐ＜０．０１）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療はまた、ＰＣＳラットにおいても運動協調性を回復させる（図９Ｂ）。０．７ｍｇ／ｋｇの用量の滑り数は、０．７５±０．１０であった（ＰＣＳラットに対してｐ＜０．０５）。２．５ｍｇ／Ｋｇで、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは同様に、運動協調性を改善し、偽ラットと同様の値に戻した（０．８±０．１滑り；ＰＣＳラットに対するｐ＝０．０５８）（図９Ｂ）。
【０１４５】
［実施例９］
ＨＥおよび門脈大静脈吻合を有するラットの空間記憶および空間学習に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例８に示される通りとした。
【０１４６】
モリスの水迷路試験における空間記憶および学習
試験は、任意に４つの四分円に分けられた、円形プール（直径１６０ｃｍ、４０ｃｍの高さ）を使用して、Ｍｏｎｆｏｒｔら（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、第２５巻、２１０３〜２１１１頁）によって記載されるように実施した。プレ訓練後、ラットを、見えないプラットフォームの固定された位置を学習するよう３日かけて訓練した。訓練は、ラットを、プラットフォームのない３つの四分円のうちの１つにおいて、壁に面してプール中に入れることを含んでいた。各試みで、異なる出発点をランダムに使用した。訓練は、１日あたり３回の泳ぎからなっていた。各動物は、プラットフォームを見出すために最大１２０秒許可され、プラットフォーム上で２０秒間残された。ラットが１２０秒内にプラットフォームを探せなかった場合には、実験者によってプラットフォームに手作業で導かれた。隠されたプラットフォームを見出すのに必要であった時間を手作業で記録し、タスクの学習の尺度として使用した。
【０１４７】
プラットフォームを除去し、プラットフォームがあった四分円においてラットが過ごした時間を測定することによって、２４時間後に空間記憶を評価した。
【０１４８】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおいてモリスの水迷路試験において空間記憶を回復させると示された。
【０１４９】
高アンモニア血症ラットは、モリスの水迷路において空間記憶の低下を示した。すべてのラットの群が、プラットフォームを見出すよう学習し、それに到達する待ち時間は、３日の訓練日に沿って減った（図１０Ａ）。学習能力は、高アンモニア血症ラットにおいてわずかに低下し、プラットフォームに到達するのに対照よりも長い時間を必要とした。
【０１５０】
高アンモニア血症ラットにおいて、空間記憶は、有意に低下した（ｐ＜０．０５）。記憶試験では、高アンモニア血症ラットは、対照ラット（時間の３９±２％）よりも、正しい四分円中により少ない時間しか留まらなかった（時間の３０±２％）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、高アンモニア血症ラットにおいてモリスの水迷路において空間記憶を回復させた。正しい四分円中で過ごした時間のパーセンテージは、それぞれ、３、１０および２０ｍｇ／ｋｇの用量について４１±４、４２±５および３８±３であった（図１０Ｂ）。
【０１５１】
ＰＣＳラットもまた、モリスの水迷路において空間記憶の低下を示した。すべてのラットの群は、プラットフォームを見出すよう学習し、それに到達する待ち時間は、３日の訓練日に沿って減った（図１０Ｃ）。空間記憶は、ＰＣＳラットにおいて有意に低下した（ｐ＜０．０５）。記憶試験では、ＰＣＳラットは、対照ラット（時間の４１±２％）よりも、正しい四分円中により少ない時間しか留まらなかった（時間の３１±３％）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、ＰＣＳラットにおいてモリスの水迷路において空間記憶を回復させた。正しい四分円中で過ごした時間のパーセンテージは、それぞれ、０．７および２．５ｍｇ／ｋｇの用量について３４±４および３９±３であった（図１０Ｄ）。
【０１５２】
［実施例１０］
ＨＥおよび門脈大静脈吻合を有するラットの空間学習に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例８に示される通りとした。
【０１５３】
放射状迷路試験における空間学習
装置は、８つの等しい大きさのアームへ接近する中心領域から構成されていた。アームは、７０ｃｍの長さおよび１０ｃｍの幅とし、中心領域は、直径３０ｃｍとした。各アームの遠位端は、食物の褒美を含有するカップを有していた。迷路に適応させるために、遠位合図の存在下で２連続日１０分間ラットに迷路を探検させた。放射状迷路における訓練は、６連続日の１日あたり３回の試みから構成されていた。Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒａｂａｚａら（Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、第１５巻、４１３〜４２３頁）によって記載されたように、タスクは、ランダム配置に従って、各々異なるアームの末端に置かれる４個のペレットを設置することを含んでいた。作業記憶エラー数（同一の試みにおける既に訪れたアームへの訪問）を記録し、作業エラーとして表した。
【０１５４】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、放射状迷路試験において空間学習を回復させるとわかった。
【０１５５】
高アンモニア血症ラットは、放射状迷路において空間学習の低下を示した。図１１Ａに示されるように、作業エラー数は、１〜３日目で対照ラットにおいてよりも高アンモニア血症において高かった。すべてのラットの群が、訓練日に沿って学習し、３日目の後、対照と高アンモニア血症ラット間の差は有意ではなかった（図１１Ａ）。１〜２日目の作業エラー数は、対照ラットにおいて（１１±１．５エラー）よりも高アンモニア血症において（１８±３エラー）高かった（ｐ＜０．０５）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療された高アンモニア血症ラットは、対照と同様に挙動した。エラー数（対照と有意に異ならない）は、それぞれ、３、１０および２０ｍｇ／ｋｇ用量について６．５±２．８、８．８±１．９および１２±２であった（図１１Ｂ〜Ｃ）。
【０１５６】
ＰＣＳラットもまた、放射状迷路において空間学習の低下を示した。図１１Ｃに示されるように、作業エラー数は、１および２日目に偽ラットにおいてよりもＰＣＳラットにおいて高かった。すべてのラットの群が、訓練日に沿って学習し、３日目の後、偽とＰＣＳラット間の差は有意ではなかった（図１１Ｃ）。１〜２日目の作業エラー数（図１１Ｄ）は、偽ラットにおいて（１０±２エラー）よりもＰＣＳラットにおいて（２２±２エラー）高かった（ｐ＜０．０１）。ＰＣＳラットの０．７ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、放射状迷路における成績を改善するのに十分ではなかった（２３±２エラー）。２．５ｍｇ／Ｋｇを用いる治療は、放射状迷路におけるＰＣＳラットの成績を完全に正常化した（１１±１エラー、ＰＣＳに対してｐ＜０．０５）。
【０１５７】
［実施例１１］
ＰＣＳラットにおける日内周期および夜間運動活性に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの治療効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例８に示される通りとした。
【０１５８】
自発的歩行運動活性の日内周期
アクチメーター（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓ  ｔ．  Ａｌｂａｎｓ、ＶＴ）を使用して運動活性を測定した。ラットをオープンフィールド活性チャンバー（４３×４３×３１ｃｍ）に個別に入れ、明暗（Ｌ：Ｄ）、１２時間：１２時間の条件で、運動活性を１４日間連続して記録した。データは、５分間隔で記録した。運動活性は、３次元、ｘ、ｙおよびｚに置かれた赤外運動検出器のアレイによって検出された。ラットが、ｘまたはｙ位置の３の連続する赤外検出器を遮った場合に、１歩行カウントが、装置によって記録される。垂直カウントは、ラットがｚ位置の赤外検出器を遮った場合に記録される。ソフトウェアによって、歩行カウントまたは垂直カウントなどの運動活性の種々のパラメータを測定することが可能となる（Ａｈａｂｒａｃｈら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１０年、第８８巻、１６０５〜１４頁）。
【０１５９】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、夜間の自発的運動活性を増大し、ＰＣＳラットの日内周期を部分的に回復させるとわかった。
【０１６０】
ＰＣＳラットは、夜間（ラットの活動期）の運動活性（歩行カウント）の低下を示し、対照ラット（４５４６±５８４カウント）よりも有意に（ｐ＜０．０５）低い１８４９±１７６カウントを示す。０．７ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、ＰＣＳラットにおける活性を、２６５２±２７５カウントにわずかに増大させた（ｐ＜０．０５）。２．５ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、歩行カウント（２２３５±１７０カウント３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム）に影響を及ぼさなかった（図１２Ａおよび１２Ｃ）。
【０１６１】
ＰＣＳラットでは、日中の活性に対する夜間の歩行活性の比が低下し、日内周期の変更を示す（図１２Ｂ）。対照ラットについては、この比は、３．３±０．４であり、ＰＣＳラットでは、０．８±０．１６に低下した（ｐ＜０．００１）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットは、活性の夜／昼比において、部分的ではあるが有意な改善を示し（ｐ＜０．０５）、それぞれ、０．７および２．５ｍｇ／ｋｇについて、１．７±０．２および１．６±０．３に達した（図１２Ｂ）。これは、活性の日内周期の部分的回復を示す。
【０１６２】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムはまた、日中の垂直活性を正常化し、ＰＣＳラットの日内周期を部分的に回復させるとわかった。
【０１６３】
ＰＣＳラットは、夜間（ラットの活動期）の垂直活性の低下を示し、対照ラットにおいて（１２２８±１３８カウント）よりも有意に低い（ｐ＜０．０５）、５６１±１０８カウントを示した。０．７ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、夜間の垂直活性に影響を及ぼさなかった（それぞれ、６６４±１２１および６９５±１８５カウント）（図１２Ａおよび１２Ｃ）。
【０１６４】
対照的に、ＰＣＳラットは、日中の垂直活性の増大を示し、対照ラットにおいて（３９１±６４カウント）よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）、６８２±１１４カウントを示した。０．７ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、日中の垂直活性を完全に正常化し、それぞれ、３３９±４７および４２４±４４カウントに達した（図１２Ａおよび１２Ｃ）。
【０１６５】
ＰＣＳラットでは、日中の活性に対する夜間の垂直活性の比もまた低下し、日内周期の変更を示した（図１２Ｂ）。対照については、この比は、３．７±０．６であり、ＰＣＳラットでは、０．８±０．０１に低下した（ｐ＜０．００１）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットは、活性の夜／日中比の部分的であるが有意な改善を示し（ｐ＜０．０１）、それぞれ、０．７および２．５ｍｇ／ｋｇについて、２．１±０．４および１．９±０．６に達した（図１２Ｂ）。これは、垂直活性の日内周期の部分的回復を示す。
【０１６６】
［実施例１２］
高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおける血液アンモニア濃度に対する３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム治療の効果
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例８に示される通りとした。
【０１６７】
アンモニアの判定
血液アンモニアは、２０μＬの新鮮血液を使用してキットＩＩアンモニアＡｒｋｒａｙ試験（ＰｏｃｋｅｔＣｈｅｍ  ＢＡ、Ａｒｋｒａｙ）を、製造業者の説明書に従って使用して測定した。
【０１６８】
結果
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムは、高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおけるアンモニアレベルに影響を及ぼさないとわかった。
【０１６９】
血液アンモニアレベルは、対照（４７±３μΜ）と比較して高アンモニア血症ラットにおいて１６７±１６μΜに増大された（ｐ＜０．００１）。２０ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、高アンモニア血症ラット（１３９±１４μΜ）におけるアンモニアレベルに影響を及ぼさなかった。
【０１７０】
ＰＣＳラットにおいて同様の結果が得られた。血液アンモニアレベルは、偽ラット（１２５±３１μΜ）と比較してＰＣＳラットにおいて（３４８±２７μΜ）増大された（ｐ＜０．００１）。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いる治療は、血液アンモニアに影響を及ぼさず、それぞれ、０．７および２．５ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムを用いて治療されたＰＣＳラットにおいて、３０２±３０および２９４±３７μΜのままであった。
【０１７１】
［実施例１３］
治療期間の後の高アンモニア血症およびＰＣＳラットにおける血漿および脳組織における３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム濃度
治療および試験スケジュール
治療および試験スケジュールは、実施例８に示される通りとした。
【０１７２】
３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム曝露の分析
治療期間の最後に、尾静脈から血漿を採取し、断頭によって屠殺した後に、脳を採取し、ドライアイス上で即時凍結した。３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム曝露の分析のために、１：４比の組織：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて脳組織をホモジナイズし、次いで、２倍容量のメタノール：アセトニトリル（１：１）を用いて抽出し、一方で、血漿を、３倍容量のアセトニトリルを用いてタンパク質沈殿させた。分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ＋Ｗａｔｅｒｓ  ＸＥＶＯ−ＴＱＳトリプル四重極質量分析器（Ａｄｍｅｓｃｏｐｅ  Ｏｙ、Ｏｕｌｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によって実施した。脳中の遊離３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシム曝露の量の算出のために、脳ホモジネート中の未結合の画分（Ｆｕｂ）を透析によって決定した。ＨＡにおけるＦｕｂ＝０．７０およびＰＣＳにおけるＦｕｂ＝１．４３％（Ａｄｍｅｓｃｏｐｅ  Ｏｙ、Ｏｕｌｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）。
【０１７３】
結果
高アンモニア血症ラットでは、３、１０および２０ｍｇ／Ｋｇの３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの１日１回の投与が、血漿および脳組織の両方において用量依存性曝露をもたらした。行動試験時に、血漿中の３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの総濃度は、それぞれ、０．３４±０．０３、１．０８±０．１１、１．９５±０．６１μΜであり、脳組織では、３α−エチニル−３β−ヒドロキシアンドロスタン−１７−オンオキシムの未結合濃度は、それぞれ、６．１±１．４、１１．６±１．４、２３±５ｎｍｏｌ／ｋｇであった（図１４Ａ）。
【０１７４】
また、ＰＣＳラットでは、曝露は、用量依存性であり、これらのラットではより低い用量、０．７および２．５ｍｇ／Ｋｇが使用され、曝露は、高アンモニア血症ラットにおけるものと極めて類似していた。血漿中の総濃度は、それぞれ、０．７および２．５ｍｇ／ｋｇ／日で０．４８±０．０９および１．６４±０．３０μΜであり、脳における未結合濃度は、行動試験時に、それぞれ、６．１８±０．９７および１７±２ｎｍｏｌ／ｋｇであった。