【手続補正書】
【提出日】平成29年3月14日(2017.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
フリーラジカルは、ミトコンドリア機能不全（それは多数の中枢神経系（ＣＮＳ）障害を伴なう）、ならびにヘム−オキシゲナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびＮＡＤＰＨオキシダーゼの作用（それらは多様な炎症状態でフリーラジカルを発生する可能性がある）の結果として形成される。組織損傷に関与するフリーラジカルには、スーパーオキシドラジカル、酸化窒素、およびペルオキシナイトライト（スーパーオキシドラジカルおよび酸化窒素から形成され、それは酸化窒素シンターゼにより形成される−内皮性、神経性および誘導性）が含まれる。ペルオキシナイトライトは、それの比較的長い半減期および高い反応性のため、これらのフリーラジカルのうちおそらく最も損傷作用の大きいものであろう(1)。酸化的損傷の証拠は、これらのフリーラジカルが後に残す残留物により検出される：脂質の過酸化、およびタンパク質、特にチロシンの窒素化。脂質の過酸化およびタンパク質の窒素化の証拠は、多発性硬化症（ＭＳ）、多様な変性性脳疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アツルハイマー病、外傷性脳傷害など）、虚血性能損傷、および全身性疾患、たとえば心不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および糖尿病に広範に存在する(2-11)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
肺疾患
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気管支拡張症、嚢胞性線維症、および間質性肺疾患を含めた多くの肺疾患が、慢性炎症および酸化的ストレスを伴なう。ＣＯＰＤは米国で第４位の主要な死因であり、毎年の死亡全体の約４．５％を占める。有病推定値は１３，５００，０００人プラス“未診断”で最大１５，０００，０００人に及ぶ；２００万人は肺気腫を伴なう。ＣＯＰＤは炎症、水腫および分泌物により引き起こされる多様性疾患であり、結果として肺の全領域に形態変化が生じる。肺機能は年齢と共に低下し、進行性の不可逆的臓器不全として、特に肺気腫および慢性気管支炎において顕性になる。これらの障害は世界的に廃疾および死亡の主な負荷となっており、現在はそれらの自然経過を著しく変化させる全肺移植片の不足のため療法はない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
他の態様において、本発明は、下記により反応性酸素種に対する目的とするＣｅＮＰ作用を制御および指向する方法を提供する：近接接触のためにそれをカプセル化している生体適合層を脱落(shedding)させる（アンジッピング経路）、および／または、ＣｅＮＰ表面と脂質カプセルの間に挿入した炭化水素リンカーに由来する安定ラジカル表面部分を利用するＣｅＮＰラジカル相互作用の拡張した電子球(extended electronic sphere)。ＣｅＮＰのカプセル化は、ラジカル濃度が上昇していない血液および組織中でのＣｅＮＰと生体物質の相互作用を阻止する。カプセルはフリーラジカルの存在により‘アンジッピング’し、それにより、フリーラジカルが形成されている身体部位または多量に存在する身体部位で最も容易にＣｅＮＰのアンチオキシダント活性が利用できるようになる。アンジッピングは２つの態様により達成される。第１態様において、ＣｅＮＰをカプセル化する脂質は、クエン酸処理した表面、たとえばＣｅＮＰ表面に、特定の化学結合を用いて連結される。第２態様において、短い連結用の炭化水素が脂質コートとクエン酸処理ＣｅＮＰ表面の間に挿入される。脂質または炭化水素をクエン酸処理ＣｅＮＰ表面に連結する化学結合はフリーラジカル（たとえば、スーパーオキシドおよびペルオキシナイトライト）による化学的攻撃に対して少なからず感受性であり、脂質カプセルを炭化水素リンカーに連結する化学結合もフリーラジカルによる化学的攻撃に対して少なからず感受性である。さらに、炭化水素リンカーはＣｅＮＰ表面への電子シャトリングを可能にする化学構造をもつことができ、これによってより広範囲のフリーラジカルスカベンジングが促進され、炭化水素リンカーの遠位部分（ＣｅＮＰ表面から遠い）が安定なフリーラジカル自体を形成することもできる。これは、炭化水素リンカーが存在する場合に二重アンジッピングプロセスを作り出し、ＣｅＮＰコアからのアンチオキシダント活性の範囲を拡張する。炭化水素リンカーの各末端の二重アンジッピング結合の感受性が類似している必要はない。たとえば、脂質−炭化水素結合をフリーラジカル攻撃に対してきわめて感受性にし、内側の炭化水素−ＣｅＮＰ結合をフリーラジカル攻撃に対してより低い感受性にすることができる。変動するフリーラジカル攻撃に対する感受性をもつ異なる結合構造を有する多数の順列(permutation)が可能である。したがって、ラジカルとＣｅＮＰの相互作用の範囲を制御することにより（炭化水素リンカーの長さに応じて、短いものから長いものまで）本発明は多様な配合物を提供し、それらには、記載した組成物／配合物を低い毒性プロフィールおよび最大化した療法効力または診断効力で多様な慢性疾患に長期投与する用途が含まれる。本発明は、近接接触範囲と拡張接触範囲の両方により作用が得られるようにＣｅＮＰとラジカルを近づける配合物を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の以上および他の特徴、観点および利点を、添付の図面に示した以下の本発明の態様の記載に関連してより詳細に考察する。
【図１】図１は、酸化セリウムナノ粒子をリポソームカプセル化粒子として製造することによりそれらの多層薬物送達経路を作製する第１相を示す。ＣｅＮＰ粒子上に表面安定化のための配位子シェルを構築することにより、特異的な組織ターゲティング能をリポソーム配合物に付加することができる。（Ａ）ＣｅＮＰ上の表面反応基の模式図は、利用可能なカルボン酸基を示す。（Ｂ）直接表面修飾（親水性分子としてのクエン酸をこの例では示す）が、ＣｅＮＰをキレート化することによりターゲティング分子を付着させるためのＣｅＮＰ表面を調製する。ここではクエン酸配位子を一例として示すが、粒子表面化学の多数の順列をもたらす１８００種類を超えるカルボン酸成分がある。
【図２】図２は、ＣｅＮＰ周囲の配位子シェルがどのようにしてアンチオキシダントの生体適合性を最大化するかを示す。この例はＣｅＮＰをオレイン酸で囲む配位子シェルを示す。（Ａ）ＣｅＮＰ表面に脂質（長さ８〜２０炭素の範囲であってもよい）を配位子として結合させることにより、脂質の末端カルボン酸は表面と錯化し、一方で炭化水素テイルはＣｅＮＰコアの周囲に疎水性表面を形成する。（Ｂ）ＣｅＮＰのオレイン酸表面の全体図を示す。（Ｃ）オレイン酸の構造。オレイン酸およびそれのコンジェナーのカルボン酸結合特性が配位子シェルを形成するための鍵である。ＣｅＮＰと表面処理（この図ではクエン酸）の初期相互作用における不活性炭化水素（ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシル、デシル、ヘキシルデシルなど）または反応性末端基の選択は、目的とする機能結果に依存する。反応基または保護された基をもつカルボン酸配位子（アジド、アルキン、チオール、保護されたアミン、保護されたカルボン酸など）は、直接にＣｅＮＰの表面において、最大可能な修飾および表面化学フレキシビリティーを可能にする。
【図３】図３は、オレイン酸／脂質ハイブリッド層でコーティングされたＣｅＮＰ粒子を含有するテーラード(tailored)配合物の組成を示す。ＤＯＰＣおよびＰＥＧ３５０  ＰＥを示すが、ＣｅＮＰカプセル化の外面を特定の用途にテイラリングするために多様な脂質を導入することができる。リン脂質は細胞膜の主要な脂質成分であり、コリンヘッド基は細胞シグナル伝達に関与しないので、生体適合性を増強するための脂質カプセル化のための論理的な不活性選択肢となる。ただし、この例は、可能性のある組織ターゲティングのためにナノ粒子を広範な脂質でカプセル化する可能性に対する限定とみるべきではない。
【図４】図４は、ハイブリッド層の官能基化を示す。ターゲティング分子を付着させるために、反応性ヘッド基を備えた脂質を脂質ハイブリッド層に取り込ませる；幾つかの可能性のうち２つを示す。この戦略は、ターゲット細胞への透過を改善し、酸化セリウムナノ粒子の選択的な細胞取込みを増大させるであろう。
【図５】図５は、本発明のアンジッピング粒子合成方法からの一例を示す。本発明者らは、ＲＯＳおよび／またはＲＮＳに遭遇した時点でアンジッピングして粒子表面に結合している脂質を脱落させる酸化セリウムナノ粒子の合成方法の工程を立証した。この例では、配位子層を末端チオール（−ＳＨ）基に官能基化した後、ＣｅＮＰをチオール脂質またはアルカンチオール（末端チオール基を備えた炭化水素）に曝露して、ジスルフィド結合を形成する。粒子を次いで脂質、たとえばＤＯＰＣその他特定のＣｅＮＰ用途にテイラリングした脂質（たとえば、ＰＥＧ修飾した脂質）に曝露すると、二重層が生成する。好ましい連結を選択する論理がこの図の一部なのではなく、化学結合を構築する原理を示すにすぎない。
【図６】図６は、脂質もしくは短い炭化水素リンカーをＣｅＮＰに結合させ、または脂質外面とＣｅＮＰ表面に結合した短い炭化水素リンカーとの間に結合させるために用いた表面修飾化学および特定の化学結合により、アンジッピングプロセスによる有効成分のアンマスキング(unmasking)作用を作り出す方法を示す。ＣｅＮＰアンジッピング粒子がインビトロでＤＴＴ（ジチオトレイトール）に、またはインビボでグルタチオンに曝露されると、ジスルフィド結合が開裂して配位子表面が再生されるであろう。保護用の脂質／ＰＥＧ層が脱落した後、ＣｅＮＰは細胞環境でアンチオキシダント剤として作用できる状態になる。
【図７ａ】図７は、（Ａ）配位子シェル修飾の種々の順列および付着戦略へのルートを示す。ＣｅＮＰ表面の初期処理としてクエン酸を用いるこの例は、クエン酸配位子上の利用可能なカルボン酸を用いる他のアミン結合反応が可能であることを示す。５０００種類の可能なカップリング用アミンを、１つの業者、たとえばＡｌｄｒｉｃｈカタログから入手できる。したがって、フリーラジカルによる攻撃に対して少なからず感受性であってコアＣｅＮＰをアンジッピングする結合をＣｅＮＰ表面と外側カプセルとの間に形成するために、初期ＣｅＮＰ表面処理を変更することによって、脂質−ＣｅＮＰ結合のチューニングに際して大きなフレキシビリティーが得られる。（Ｂ）クエン酸配位子を用いるドーパミンの直接付着を示す。（Ｃ）ドーパミン受容体へのアクセス性を高めるためにＢＭＰＨをスペーサーとして含む、クエン酸配位子を用いるＬ−ＤＯＰＡ付着を示す。チオール末端表面は、他のチオール末端小分子またはシステイン末端ペプチドの直接結合をもたらす。（Ｄ）アミン末端ＣｅＮＰ表面を用いるＬ−ＤＯＰＡ直接結合を示す。Ｌ−ＤＯＰＡはこの図において概念説明のために用いる。
【図７ｂ】図７は、（Ａ）配位子シェル修飾の種々の順列および付着戦略へのルートを示す。ＣｅＮＰ表面の初期処理としてクエン酸を用いるこの例は、クエン酸配位子上の利用可能なカルボン酸を用いる他のアミン結合反応が可能であることを示す。５０００種類の可能なカップリング用アミンを、１つの業者、たとえばＡｌｄｒｉｃｈカタログから入手できる。したがって、フリーラジカルによる攻撃に対して少なからず感受性であってコアＣｅＮＰをアンジッピングする結合をＣｅＮＰ表面と外側カプセルとの間に形成するために、初期ＣｅＮＰ表面処理を変更することによって、脂質−ＣｅＮＰ結合のチューニングに際して大きなフレキシビリティーが得られる。（Ｂ）クエン酸配位子を用いるドーパミンの直接付着を示す。（Ｃ）ドーパミン受容体へのアクセス性を高めるためにＢＭＰＨをスペーサーとして含む、クエン酸配位子を用いるＬ−ＤＯＰＡ付着を示す。チオール末端表面は、他のチオール末端小分子またはシステイン末端ペプチドの直接結合をもたらす。（Ｄ）アミン末端ＣｅＮＰ表面を用いるＬ−ＤＯＰＡ直接結合を示す。Ｌ−ＤＯＰＡはこの図において概念説明のために用いる。
【図７ｃ】図７は、（Ａ）配位子シェル修飾の種々の順列および付着戦略へのルートを示す。ＣｅＮＰ表面の初期処理としてクエン酸を用いるこの例は、クエン酸配位子上の利用可能なカルボン酸を用いる他のアミン結合反応が可能であることを示す。５０００種類の可能なカップリング用アミンを、１つの業者、たとえばＡｌｄｒｉｃｈカタログから入手できる。したがって、フリーラジカルによる攻撃に対して少なからず感受性であってコアＣｅＮＰをアンジッピングする結合をＣｅＮＰ表面と外側カプセルとの間に形成するために、初期ＣｅＮＰ表面処理を変更することによって、脂質−ＣｅＮＰ結合のチューニングに際して大きなフレキシビリティーが得られる。（Ｂ）クエン酸配位子を用いるドーパミンの直接付着を示す。（Ｃ）ドーパミン受容体へのアクセス性を高めるためにＢＭＰＨをスペーサーとして含む、クエン酸配位子を用いるＬ−ＤＯＰＡ付着を示す。チオール末端表面は、他のチオール末端小分子またはシステイン末端ペプチドの直接結合をもたらす。（Ｄ）アミン末端ＣｅＮＰ表面を用いるＬ−ＤＯＰＡ直接結合を示す。Ｌ−ＤＯＰＡはこの図において概念説明のために用いる。
【図７ｄ】図７は、（Ａ）配位子シェル修飾の種々の順列および付着戦略へのルートを示す。ＣｅＮＰ表面の初期処理としてクエン酸を用いるこの例は、クエン酸配位子上の利用可能なカルボン酸を用いる他のアミン結合反応が可能であることを示す。５０００種類の可能なカップリング用アミンを、１つの業者、たとえばＡｌｄｒｉｃｈカタログから入手できる。したがって、フリーラジカルによる攻撃に対して少なからず感受性であってコアＣｅＮＰをアンジッピングする結合をＣｅＮＰ表面と外側カプセルとの間に形成するために、初期ＣｅＮＰ表面処理を変更することによって、脂質−ＣｅＮＰ結合のチューニングに際して大きなフレキシビリティーが得られる。（Ｂ）クエン酸配位子を用いるドーパミンの直接付着を示す。（Ｃ）ドーパミン受容体へのアクセス性を高めるためにＢＭＰＨをスペーサーとして含む、クエン酸配位子を用いるＬ−ＤＯＰＡ付着を示す。チオール末端表面は、他のチオール末端小分子またはシステイン末端ペプチドの直接結合をもたらす。（Ｄ）アミン末端ＣｅＮＰ表面を用いるＬ−ＤＯＰＡ直接結合を示す。Ｌ−ＤＯＰＡはこの図において概念説明のために用いる。
【図８ａ】図８は、脂質／ハイブリッド二重層上のチオール脂質ヘッド基への（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡおよび（ｂ）一般的ペプチドの結合を示す。同じ戦略を用いて、その後の粒子テイラリングのために、遊離システインを含むペプチドが容易に脂質層に付加される。脂質ヘッド基中の第一級アミンは脂質層の修飾のための別の可能性をもたらす。
【図８ｂ】図８は、脂質／ハイブリッド二重層上のチオール脂質ヘッド基への（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡおよび（ｂ）一般的ペプチドの結合を示す。同じ戦略を用いて、その後の粒子テイラリングのために、遊離システインを含むペプチドが容易に脂質層に付加される。脂質ヘッド基中の第一級アミンは脂質層の修飾のための別の可能性をもたらす。
【図９】図９は、療法、診断および研究の用途のためにＣｅＮＰを蛍光色素で修飾する２つの異なる付着戦略を示す。色素は脂質に取り込ませてもよい（図３〜６）。これらの色素は、Ｃｅ＋３の固有の蛍光特性とカップリングして、粒子、それのシェル、それらの互いの相互作用、ならびに細胞、組織および動物における相互作用のトラッキングを可能にする。
【図１０】図１０は、多様な化学官能基のフリーラジカルを形成するエンタルピー（△Ｈ°）を挙げる。結合解離エネルギー（△Ｈ°（ＢＤＥ））と結合形成エネルギー（△Ｈ°（ＢＦＥ））を合わせると、エネルギーサイクルの推定が可能になる(44)(45-47)。フリーラジカルの存在下で、これらの化学リンカーは安定なラジカルを形成し、結合解離および形成エネルギーは結合開裂および再形成が熱力学的に好都合であることを示す。この分析から、多数の可能なアンジッピング例が同定される。これにより、フリーラジカルアンジッピングに対する脂質−ＣｅＮＰ層の感受性をフリーラジカル形成速度にテイラリングすることができ、あるいはいずれか特定の組織におけるフリーラジカル炎症の重症度に比例してＣｅＮＰを制御および放出し、または利用できるようにすることができる。
【図１１】図１１は、アミン末端炭化水素へのＣｅＮＰカップリングの模式図を示す。ＥＤＣおよびＮＨＳを用いると、ＣｅＮＰ表面のポリアクリレート配位子のカルボン酸が反応性になり、目的アミンの添加に伴なって容易にアミド結合を形成する。ここに挙げるデシルアミンおよびアセタールアミンの例は、完成した２つの成功した修飾である。
【図１２Ａ】図１２は、ＣｅＮＰ上でのアミドカップリング反応を赤外（ＩＲ）分光分析により追跡する。（Ａ）ポリアクリレート配位子シェルを含むＣｅＮＰ（‘裸’またはストックＣｅＮＰ）のＩＲスペクトルおよびＣｅＮＰ−デシルアミン（粗抽出物）のスペクトルを示す。（Ｂ）デシルアミンのＣ−Ｈ伸縮、Ｎ−Ｈ伸縮、ならびに一連の他の伸縮および縦ゆれ(wag)を示し、ＣｅＮＰ−デシルアミド（粗抽出物）と比較する。（Ｃ）粗抽出物へのクエン酸添加が未反応アミンに及ぼす影響を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ＣｅＮＰ上でのアミドカップリング反応を赤外（ＩＲ）分光分析により追跡する。（Ａ）ポリアクリレート配位子シェルを含むＣｅＮＰ（‘裸’またはストックＣｅＮＰ）のＩＲスペクトルおよびＣｅＮＰ−デシルアミン（粗抽出物）のスペクトルを示す。（Ｂ）デシルアミンのＣ−Ｈ伸縮、Ｎ−Ｈ伸縮、ならびに一連の他の伸縮および縦ゆれ(wag)を示し、ＣｅＮＰ−デシルアミド（粗抽出物）と比較する。（Ｃ）粗抽出物へのクエン酸添加が未反応アミンに及ぼす影響を示す。
【図１２Ｃ】図１２は、ＣｅＮＰ上でのアミドカップリング反応を赤外（ＩＲ）分光分析により追跡する。（Ａ）ポリアクリレート配位子シェルを含むＣｅＮＰ（‘裸’またはストックＣｅＮＰ）のＩＲスペクトルおよびＣｅＮＰ−デシルアミン（粗抽出物）のスペクトルを示す。（Ｂ）デシルアミンのＣ−Ｈ伸縮、Ｎ−Ｈ伸縮、ならびに一連の他の伸縮および縦ゆれ(wag)を示し、ＣｅＮＰ−デシルアミド（粗抽出物）と比較する。（Ｃ）粗抽出物へのクエン酸添加が未反応アミンに及ぼす影響を示す。
【図１３】図１３は、ＣｅＮＰ生成物と比較した未反応デシルアミンのＮＭＲスペクトルを示す。反応後に、α−メチレンプロトン（アミド結合に隣接するもの）は２．６８から２．２１ｐｐｍへシフトする。弱いピークが７．８５ｐｐｍに出現し、それはアミドプロトンピークに配属された。
【図１４Ａ】図１４は、ＣｅＮＰ出発物質のＤＬＳスキャンをポリアクリレート配位子単独（‘裸’）および脂質カプセル化ＣｅＮＰと比較する。（Ａ）裸ＣｅＮＰは、０．７７±１．０ｎｍを中心とする単一の粒子分布ピーク（９９％の質量）をもつ。（Ｂ）脂質カプセル化ＣｅＮＰは４つのピークを示す。集団のうた約１／３が目的サイズ範囲（４〜８ｎｍ）のベシクルを形成した。この集団は単一ナノ粒子コアを含有するベシクルのみを含む。形成された、より大きなリポソームも、修飾ナノ粒子を含有する可能性がある。
【図１４Ｂ】図１４は、ＣｅＮＰ出発物質のＤＬＳスキャンをポリアクリレート配位子単独（‘裸’）および脂質カプセル化ＣｅＮＰと比較する。（Ａ）裸ＣｅＮＰは、０．７７±１．０ｎｍを中心とする単一の粒子分布ピーク（９９％の質量）をもつ。（Ｂ）脂質カプセル化ＣｅＮＰは４つのピークを示す。集団のうた約１／３が目的サイズ範囲（４〜８ｎｍ）のベシクルを形成した。この集団は単一ナノ粒子コアを含有するベシクルのみを含む。形成された、より大きなリポソームも、修飾ナノ粒子を含有する可能性がある。
【図１５】図１５は、ＣｅＮＰが脂質色素に近接している場合の蛍光の変化を示す。Ｃｅ＋３／Ｃｅ＋４の固有蛍光は、励起ピークを３５０ｎｍに、発光ピークを４６５ｎｍ（非修飾ＣｅＮＰスペクトルに示すように）に示す。適宜な脂質色素が１０ｎｍ以内にあれば、蛍光は脂質色素の方へシフトするであろう。この図の脂質色素の例は、発光ピークが５２０ｎｍへシフトし、脂質がＣｅＮＰの１０ｎｍ以内にあることの指標となる。
【図１６Ａ】図１６（ＡおよびＢ）は、Ｆｅ＋２と１，１０−フェナントリンの錯体形成、およびそれの吸光スペクトルを示す。
【図１６Ｂ】図１６（ＡおよびＢ）は、Ｆｅ＋２と１，１０−フェナントリンの錯体形成、およびそれの吸光スペクトルを示す。
【図１７Ａ】図１７は、Ｆｅ＋２／Ｆｅ＋３および１，１０−フェナントリン（ＰＡ）の存在下での過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）分解を用いて、ＣｅＮＰの存在下でのＦｅ＋２／Ｆｅ＋３サイクリングを測定する。Ｆｅ＋２からＦｅ＋３への変換は高活性の指標となり、５２０ｎｍで吸光するＦｅ＋２＋ＰＡ錯体の数が少なくなる。（Ａ）すべてのアッセイを比較した場合、非修飾ＣｅＮＰが最高活性をもつが、それらは生体適合性が最小である。（Ｂ）Ｈ２Ｏ２を用いないと、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合に最大吸光が起きる。ＣｅＮＰを含むアッセイ（Ｃ）では、Ｆｅ＋３に認識可能な上昇があり、これはＣｅＮＰ活性の指標となる。２種類の修飾ＣｅＮＰを比較すると（Ｄ）、デシルアミドＣｅＮＰより、アセタール、すなわちアンジッピングするナノ粒子が最高活性を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、Ｆｅ＋２／Ｆｅ＋３および１，１０−フェナントリン（ＰＡ）の存在下での過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）分解を用いて、ＣｅＮＰの存在下でのＦｅ＋２／Ｆｅ＋３サイクリングを測定する。Ｆｅ＋２からＦｅ＋３への変換は高活性の指標となり、５２０ｎｍで吸光するＦｅ＋２＋ＰＡ錯体の数が少なくなる。（Ａ）すべてのアッセイを比較した場合、非修飾ＣｅＮＰが最高活性をもつが、それらは生体適合性が最小である。（Ｂ）Ｈ２Ｏ２を用いないと、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合に最大吸光が起きる。ＣｅＮＰを含むアッセイ（Ｃ）では、Ｆｅ＋３に認識可能な上昇があり、これはＣｅＮＰ活性の指標となる。２種類の修飾ＣｅＮＰを比較すると（Ｄ）、デシルアミドＣｅＮＰより、アセタール、すなわちアンジッピングするナノ粒子が最高活性を示す。
【図１７Ｃ】図１７は、Ｆｅ＋２／Ｆｅ＋３および１，１０−フェナントリン（ＰＡ）の存在下での過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）分解を用いて、ＣｅＮＰの存在下でのＦｅ＋２／Ｆｅ＋３サイクリングを測定する。Ｆｅ＋２からＦｅ＋３への変換は高活性の指標となり、５２０ｎｍで吸光するＦｅ＋２＋ＰＡ錯体の数が少なくなる。（Ａ）すべてのアッセイを比較した場合、非修飾ＣｅＮＰが最高活性をもつが、それらは生体適合性が最小である。（Ｂ）Ｈ２Ｏ２を用いないと、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合に最大吸光が起きる。ＣｅＮＰを含むアッセイ（Ｃ）では、Ｆｅ＋３に認識可能な上昇があり、これはＣｅＮＰ活性の指標となる。２種類の修飾ＣｅＮＰを比較すると（Ｄ）、デシルアミドＣｅＮＰより、アセタール、すなわちアンジッピングするナノ粒子が最高活性を示す。
【図１７Ｄ】図１７は、Ｆｅ＋２／Ｆｅ＋３および１，１０−フェナントリン（ＰＡ）の存在下での過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）分解を用いて、ＣｅＮＰの存在下でのＦｅ＋２／Ｆｅ＋３サイクリングを測定する。Ｆｅ＋２からＦｅ＋３への変換は高活性の指標となり、５２０ｎｍで吸光するＦｅ＋２＋ＰＡ錯体の数が少なくなる。（Ａ）すべてのアッセイを比較した場合、非修飾ＣｅＮＰが最高活性をもつが、それらは生体適合性が最小である。（Ｂ）Ｈ２Ｏ２を用いないと、Ｈ２Ｏ２が存在しない場合に最大吸光が起きる。ＣｅＮＰを含むアッセイ（Ｃ）では、Ｆｅ＋３に認識可能な上昇があり、これはＣｅＮＰ活性の指標となる。２種類の修飾ＣｅＮＰを比較すると（Ｄ）、デシルアミドＣｅＮＰより、アセタール、すなわちアンジッピングするナノ粒子が最高活性を示す。
【図１８】図１８は、５２０ｎｍにおけるＦｅ＋２＋ＰＡ錯体の吸光と比較した場合のＦｅ＋２濃度間の直線関係を示す。この検量曲線から、活性アッセイデータを定量できる。
【図１９】図１９は、活性アッセイの定量を示す。最初に２９９μＭのＦｅ＋２が溶液中にある。検量曲線から、彎曲点におけるＦｅ＋２の濃度を計算する。Ｈ２Ｏ２を含まないアッセイからの最大吸光は、最初に存在した２９９μＭのＦｅ＋２から２１９μＭの錯体が生成することを示す。Ｈ２Ｏ２をＦｅ＋２溶液に添加すると、約８８μＭのＦｅ＋３が変換される。これと対照的に、デシルＣｅＮＰはＦｅ＋３の量を１２６μＭに増加させ、アセタールＣｅＮＰは１５０μＭを変換する。非修飾ＣｅＮＰはこのアッセイで最高量の約２００μＭのＦｅ＋３を生成する。§  すべての彎曲点データが１５ｓにおける吸光値であると推定される。＊  Ｆｅ＋２／ＰＡ対照実験からのデータを用いて、得られる最大吸光および最大遊離Ｆｅ＋２を推定する。それらの吸光値はｔ＝∞で取得されたものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
この反応経路は炭化水素付加（単数または複数）を含む：カルボン酸系キレート化剤、たとえばクエン酸は、ＣｅＮＰの表面に効率的に結合する。一例としてクエン酸に注目する；それは３つのカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基をもち、それらのうち少なくとも１つをターゲティング分子の付着のために利用できる。露出したカルボン酸基は、カルボジイミドおよびスクシンイミド化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を利用して、クエン酸を適切なアミン（−ＮＨ２）末端小分子にカップリングさせるのを可能にする。この戦略はペプチド結合形成をシミュレートしており、カルボン酸部分をアミンに結合させるために広く用いられている(54-56)。本発明者らの研究で、図１２（Ａ−Ｃ）においてデシルアミンへのＣｅＮＰカップリングを赤外（ＩＲ）分光分析により追跡する。図１２（Ａ）において、ポリアクリレート配位子シェルを含むＣｅＮＰ（‘裸’またはストックＣｅＮＰ）のＩＲスペクトルは、顕著なＣ＝Ｏ（１６３２ｃｍ−１）およびＣ−Ｏ（１５６２ｃｍ−１）、ならびに３５００ｃｍ−１における幅広いＯ−Ｈ伸縮を示す。ＣｅＮＰ−デシルアミン（粗抽出物）のスペクトルには、Ｃ−Ｈ（２８５０〜２９５０ｃｍ−１）、Ｃ−Ｏ、Ｃ＝ＯおよびＣ−Ｎバンド（１３００〜１７００ｃｍ−１）が追加された。Ｎ−Ｈ伸縮（３３５０ｃｍ−１）は未反応デシルアミンの指標であり、それは後に除去されるであろう。粗抽出物を図１２（Ｂ）のデシルアミンと比較すると、デシルアミンは２８５０〜２９５０ｃｍ−１にＣ−Ｈ伸縮、３３３３および３１８５ｃｍ−１にＮ−Ｈ伸縮、ならびに１６５０から１３８５ｃｍ−１までに一連の伸縮および縦ゆれを示す；Ｃ−Ｈ、Ｎ−ＨおよびＣ−Ｎバンドを示すＣｅＮＰ−デシルアミン（粗抽出物）と比較する。粗抽出物中にＮ−Ｈ伸縮は依然として存在する（３５００ｃｍ−１）が、それはデシルアミンＮ−Ｈ伸縮よりかなり小さい。同様に、Ｃ−Ｏ、Ｃ＝ＯおよびＣ−Ｎはすべて１３００〜１７００ｃｍ−１領域にシフトした。図１２（Ｃ）に示すように粗抽出物にクエン酸を添加した後、未反応アミンは次いでクエン酸とアミド結合を形成して水相中へ分配され、その結果、分離した生成物が残る。粗抽出物と比較して３３３３ｃｍ−１のアミンＮ−Ｈ伸縮は消失している。同様に、アミンカルボニル（１７００ｃｍ−１）およびＣ−Ｎ（１６５０ｃｍ−１）伸縮はより顕著である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
カプセル化ＣｅＮＰ配合物に埋め込まれた（不安定）結合（単数または複数）のアンジッピング：有効性を確実にするために、フリーラジカル攻撃に対して感受性であって脂質シェルから開裂しやすい不安定結合（単数または複数）を取り込むようにＣｅＮＰの表面を修飾する。酸化的損傷を受けている環境（高濃度のフリーラジカル）は不安定結合を開裂させ、その結果、脂質／ＰＥＧ表面がアンジッピングしてＣｅＮＰが露出し、それのアンチオキシダント活性が最大になる（トロイ戦略(Trojan strategy)）。アンチオキシダントの診断および療法用途にそのような戦略を用いることは知られていない。このゲートキーピング法は、ＣｅＮＰをそのターゲットにおいて脂質ハイブリッド層からアンジッピングして有効成分を放出させ、それの療法または診断作用が最適になる細胞位置でＣｅＮＰの最大有効活性が得られるようにする様式で、本発明のデザインに組み込まれている。これは、一部は安定なラジカルを形成する官能基（たとえば、アセタール、エポキシド、アミド、ペルオキシドまたはエーテル（図１０および(47)を参照）を備えた炭化水素を選択することにより達成される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
（３）図５は、そのような粒子をトロイの馬戦略による送達で調製する方法を示し、図６は細胞内でのアンジッピングおよび作用の機序を示す。これまでに探査されていない粒子表面修飾化学により、ターゲット細胞内で開裂する開裂性結合を埋め込むことが可能になり、配合物はＣｅＮＰの療法作用に関与しない層を脱落させて療法／診断用ＣｅＯ２粒子を露出させることができる。これらの配合物を工学作製するために提唱された方法により、ある範囲の表面被覆度（１／１０未満の被覆度から完全被覆度まで）を含む多重順列が可能になり、フリーラジカル開裂性結合へのアクセス性を変更できる。これらの順列はすべて、多様な慢性疾病状況において有効となるようにテーラリングされた疾患および組織特異的配合物をもたらす。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
（４）本発明の粒子をさらにテーラリングする。脂質とＰＥＧ修飾脂質を組み合わせると、その結果、水性環境でハイブリッド二重層が生成する。本発明の配合物の官能基化を添付の図３に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
他の態様において、ターゲット組織に至る途中での生体適合性を最大化し、次いで罹患組織へ送達されてアンジッピングした時点で細胞内において有効な成分、ＣｅＯ２ナノ粒子を開放するように、配合物を工学作製する。このハイブリッド二重層は、脂質およびＰＥＧの特性を利用して、インビボでの生体適合性および循環時間を最大化する。しかし、そのような層は、反応性無機表面を不動態化するためにも用いられている(59-63)。有効性を確実にするために、ハイブリッド二重層の付着前に不安定結合を取り込むように表面を修飾する。酸化的豊富な環境は、この結合を開裂させ、その結果、脂質／ＰＥＧ表面がアンジッピングされて酸化セリウム粒子が露出し、それの活性が最大になるであろう（トロイの馬戦略）。アンチオキシダントの診断および療法用途にそのような戦略を用いることは知られていない。このゲートキーピング法は本発明の粒子表面デザインに固有であり、それによりそれのターゲットにおいて薬物または脂質ハイブリッド層が除去されてＣｅＯ２がそれの療法または診断作用を発揮する最大の機会を与える。これは、一部は安定なラジカルを形成する官能基（たとえば、アセタール、エポキシド、アミド、ペルオキシドまたはエーテル（図１０および(47)を参照）を備えた炭化水素を選択することにより達成される。いったんアンジッピングすると、酸化セリウム表面は、診断および／または処置される疾患に応じて多様な由来の酸化的損傷及び酸化的ストレスをうけた組織またはターゲット組織にアクセスできる状態になる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（２）アミン末端色素誘導体を用いて色素をＣｅＮＰのカルボン酸表面に付着させることもできる。あるいは、色素の他の末端反応基を適切なＣｅＮＰ表面化学で使用できる。ＦＲＥＴ事象から、表面への色素装填の検出および特性解析ツールとしてのそのような化学の使用が期待される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
１態様において、二重にアンジッピングした時点でＣｅＯ２ナノ粒子表面は酸化的損傷組織にアクセスできる状態になる。細胞への透過、沈着および細胞内反応性の改善により、インビボで用いた際のＣｅＮＰの薬物動態特性が著しく改善されるであろう。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
・ラットにおける予備毒性試験により、静脈内送達したセリアナノ粒子は、酸化的に活性な臓器（脳、心臓、および肺）に主に蓄積し、注射後少なくとも６か月間は顕性毒性なしに保持されることが認められた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
方法
１．卓越した療法特性を備えた有効な生物学的利用能のある酸化セリウムナノ粒子プラットホームを作製する。セリアナノ粒子（直径５〜１０ｎｍ）は生物活性をもち、ペルオキシナイトライトおよびスーパーオキシドのレベルを低下させ、その結果、炎症の傷害性細胞作用を低減する。新規コーティングおよびキャリヤーまたは多官能性炭化水素を用いて修飾したナノ粒子を合成することができ、レドックス活性を増強するための内部修飾を開発し、粒子を特定の組織ヘターゲティングさせ、隔離環境への粒子透過を増大させることができる（肺の上皮層を通した吸収、血液脳関門の透過増大）。選択的取込みのために肺への吸入により投与できまたは静脈内に投与できる組成物および表面特性、パッケージングならびに送達ビヒクルの工学作製は、特異的にフリーラジカル発生部位における蓄積を最大化し、生物学的利用能を増大させ、有効性を最適化するであろう。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
２．肺気腫の動物モデルにおける吸入ナノ粒子の有効性、タバコの煙に曝露した後の肺損傷の軽減および改善を立証する。吸入した化学修飾された酸化セリウムナノ粒子の効果について、２パック／日の喫煙と同等のタバコの煙に２０週間曝露した２系統のラットにおいて試験を実施することができる；吸入ナノ粒子の投与がペルオキシナイトライトの濃度を低下させるかどうか（タンパク質のニトロシル化に反映される）、またタバコの煙に曝露した後に測定した肺損傷の重症度を軽減するかどうかを試験する。ラット系統は、タバコの煙により誘発される肺疾患に対するそれらの感受性が異なる。この曝露の期間および程度は、約７５％の動物に肺気腫を発症させるのに十分なものである。両方ともこの研究分野で既に受け入れられている２つのラット系統について試験することができる。肺疾患の重症度は、タバコ曝露動物と対照動物、および薬物曝露動物と対照動物において、肺の体積変化および一酸化炭素の拡散度を測定することにより判定できる（２×２実験デザイン）。安全性、副作用および毒性を査定することができる。肺気腫は、立体解析法を用いて種々の動物グループにおいて肺胞のサイズを測定することにより病理学的に判定できる。最後に、サイトカインおよびチロシン化タンパク質についての肺洗浄液分析と肺組織の細胞内セリアレベルを測定するための肺組織分析との組合わせを用いて、セリア粒子について作用機序および組織特異的な装填を確認することができる。この作業は＃１と同時に実施できる。