(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えタンパク質生産のための細菌の高細胞密度発酵プロセスにおいて沈澱を低減する方法であって、前記タンパク質生産の間栄養培地中にリン源としてリン酸塩ガラスを用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
リン酸塩ガラスを、約２〜約100の鎖長
0003592330.tif 000014
を有するリン酸ナトリウムガラスの中から選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リン酸ナトリウムガラスが約４〜約20の鎖長
0003592330.tif 000015
を有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リン酸ナトリウムガラスの鎖長
0003592330.tif 000016
が11であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
栄養培地中にオルトリン酸塩を含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
高細胞密度発酵がバッチ発酵、連続発酵または流加発酵であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組み換えタンパク質生産のための細菌の高細胞密度発酵プロセスにおいて細胞密度を高める方法であって、前記タンパク質生産の間栄養培地中にリン源としてリン酸塩ガラスを用いることを特徴とする方法。
【請求項８】
リン酸塩ガラスを、約２〜約100の鎖長
0003592330.tif 000017
を有するリン酸ナトリウムガラスの中から選択することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン酸ナトリウムガラスが約４〜約20の鎖長
0003592330.tif 000018
を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リン酸ナトリウムガラスの鎖長
0003592330.tif 000019
が11であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
栄養培地中にオルトリン酸塩を含まないことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
高細胞密度発酵がバッチ発酵、連続発酵または流加発酵であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
大腸菌において組み換えタンパク質を生産するための高細胞密度発酵プロセスにおいて沈澱を低減する方法であって、前記タンパク質生産の間栄養培地中にリン源として約４〜約20の鎖長
0003592330.tif 000020
を有するリン酸塩ガラスを用いることを含む方法。
【請求項１４】
リン酸塩ガラスの鎖長
0003592330.tif 000021
が約11であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、組み換えタンパク質生産のための細菌発酵プロセスに係わり、このプロセスでは或る種の供給培地栄養素を監視及び調節して培地中への金属リン酸塩の沈澱を制御する。本発明は特に、或る種のポリリン酸塩及び／またはメタリン酸塩を培地中に用いて栄養素の沈澱を排除し、かつ細胞密度を高める方法を含む高細胞密度発酵プロセスに係わる。
分子生物学の進歩及び組み換えDNA操作の開発により、或る種の宿主細胞系において多量の外来タンパク質を生産することが可能となった。組み換えタンパク質は宿主細胞系において、当該タンパク質をコードするDNAで宿主細胞をトランスフェクトし、その後トランスフェクトした宿主細胞を新規な組み換えタンパク質の発現を可能にする条件下に増殖させることにより生産できる。或る種の細菌宿主細胞系を用いれば、天然源からは通常限られた量でしか入手可能でないタンパク質に対応する組み換えタンパク質を大量に生産することができる。
原核生物である大腸菌は、既に詳細に研究されている細菌である。大腸菌は通常、高発現宿主細胞系に用いるべく選択されるが、その理由の一つとして、大腸菌細胞はきわめて大量の組み換えタンパク質を産生する傾向が比較的高いことが挙げられる。真核宿主細胞及び酵母宿主細胞が用いられる宿主細胞系は通常組み換えタンパク質を、大腸菌などの高発現宿主細胞系のようには大量に産生できない。そのうえ、高細胞密度発酵プロセスの開発によって、大腸菌における組み換え産物の容量生産性（volumetric  productivity）は向上した。Yee及びBlanch,Biotechnology  and  Bioengineering  41,pp.221−230,1993参照。
大腸菌系などの宿主細胞系において組み換えタンパク質を生産するのに用いられる発酵プロセスは、物理的に限られた容器（即ち発酵槽、反応容器）内で実施される。発酵槽の最も一般的な形態は攪拌タンクであるが、他の物理的形状を有する容器も多数開発されている。発酵槽の機能モードは、（１）不連続機能（バッチプロセス）、（２）連続機能、及び（３）流加（fed−batch）プロセスなど、様々な種類の半連続機能のうちのいずれかに該当し得る。
用いる機能モード及び宿主細胞系に応じて、細胞の増殖及び組み換えタンパク質の発現を可能にする特定の均衡（balanced）バッチ及び／または供給培地を案出しなければならない。このような特定培地が増殖に必須の栄養素のみを含有する場合は、当該培地を「最少培地」と呼称する。大腸菌系のための最少培地は、炭素、窒素、リン、マグネシウム、並びに微量の鉄及びカルシウムの供給源を含有しなければならない。Gunsalus及びStanter,“The  Bacteria,"Vol.1,Chapter  1,Academic  Press  Inc.,N.Y.,1960参照。ほとんどの最少培地において、炭素源としてはグルコース、窒素源としてはアンモニア、リン源としてはオルトリン酸塩（例えばPO4）が用いられる。理想的な細胞増殖用栄養培地は細胞増殖の間に消費される各栄養素を、当該栄養素が抑制レベルにまで蓄積されることも、細胞が当該栄養素に関して飢餓状態になることもないように適正量で含有する。Thompson等,Biotechnology  and  Bioengineering  27,pp.818−824,1985参照。低細胞密度振盪フラスコ（細胞乾燥重量1.5g/l以下の細胞密度）において用いるための、理論的に均衡させた大腸菌用最少栄養培地が以前に案出されている。Neidhardt等,Journal  of  Bacteriology  119,pp.736−747,1974参照。
培地の化学組成に加えて、pH、時間、培養温度、及び溶存酸素の分圧など、他の幾つかの環境パラメーターの影響を入念に考慮しなければならない。例えば、大腸菌の増殖に最適のpHは7.0である。発酵プロセスの間に培地のpHは、アンモニアの消費、または或る種の代謝産物、例えば酢酸及び乳酸の微生物合成に起因して変化し得る。変化したpHは最適の細胞増殖にとって好ましくないかもしれないので、培地を所定のpHに維持することは重要であり、この維持は酸及び塩基の添加によって可能である。pHその他のプロセスパラメーターは人手によって、または自動装置によって監視し得る。
高細胞密度発酵（即ち、細胞乾燥重量20g/lを上回る細胞密度を達成する発酵）では濃縮培地を用いなければならない。高細胞密度発酵を行なう操作者は、濃縮栄養培地を用いて作業した場合、リン酸塩含有溶液を他の栄養素成分が含有する溶液と混合すると沈澱物が生じることを発見した。栄養培地中に生じる沈澱物には、NH4MgPO4、Mg3（PO4）２、及び（Me）ｎ（PO4）ｍ（式中MeはFe、Ca、Zn、Cu、Co）の形態の金属リン酸塩を含めたオルトリン酸塩の沈澱が含まれる。上記のような化合物は水への溶解度が非常に低い。John  A.Dean,“Lange's  Handbook  of  Chemistry,"12th  edition,pp.7−12,McGraw−Hill,NewYork,1979参照。沈澱物量は、pH、グルコース濃度、及び培地成分の濃度に応じて様々となり得る。
沈澱物の生成は供給培地において、また発酵槽において幾つかの問題を招きかねない。例えば、供給培地中に生じた沈澱物は（供給培地容器や供給管路の内部に沈澱することによって）培地の供給を不均一なものとし、かつ溶解性でなくなった重要な栄養素に関して細胞を飢餓状態にする恐れが有る。沈澱物には、供給ポンプ及び供給管を摩耗させ、また場合によっては供給管路を完全に閉塞する恐れも有る。
発酵槽内では、沈澱は培地が細胞増殖用に完全に均衡化されていない場合に生起する。発酵槽内での沈澱は、発酵槽に設けられた空気噴出部（air  sparger）の閉塞を惹起し、混合を不均一にし（即ち沈澱物が発酵槽内下方に溜まり）、かつ細胞が溶解性の栄養素を摂取する可能性を低下させる恐れが有る。細胞にとって摂取可能な栄養素の濃度は、細胞による栄養素摂取の速度に匹敵する、沈澱物生成に起因する栄養素損失の速度に依存するようになる。このような沈澱の影響は、pH制御のための酸及び塩基の自動添加によって倍加しかねない。上記のような状態はいずれも発酵プロセスの再現性を低下させる。更に、沈澱物の存在はタンパク質精製操作に甚だしく影響して、生産物から沈澱物を分離するべく特別の精製ステップを用いることを強要する恐れが有る。
市販セットにおいては、発酵プロセス用として実用的であるには沈澱の問題が軽減されなければならない。最少培地中への栄養素の沈澱を防止するために示唆された一方法では、栄養培地中の金属イオンをキレート化するべくEDTA及びクエン酸塩を添加する。S.J.Pirt,“Principles  of  Microbe  and  Cell  Cultivation,"p.134,1975参照。しかし、キレート化剤を添加しなければならないことは望ましいことでなく、なぜならキレート化剤は代謝されないからである。従ってキレート化剤は蓄積し、細胞環境のモル浸透圧濃度（osmolarity）を上昇させる。高いモル浸透圧濃度は細胞代謝に悪影響を及ぼす。Gouesbet等,Journal  of  Bacteriology  175,pp.214−221,1993参照。高濃度のキレート化剤はまた、細胞膜を損傷しかねない。Ryan等,Biotechnology  and  Bioengineering  37,pp.430−444,1991参照。
Riesenberg等のドイツ特許出願第290,212  A5号（1988年７月28日付出願）には、組み換えDNA生成物を得るための大腸菌の大量培養発酵に用いるグルコース最少培地を調製する操作が開示されている。Riesenberg等が開示している最少培地は、上記のような培地を用いて作業する場合に通常遭遇する重大な沈澱問題を克服するべく設計された。上記特許出願に開示された培地ではリン源としてオルトリン酸塩が用いられ、栄養素の沈澱は完全には排除されておらず、この培地はむしろ、沈澱物生成が軽微であるために低い乱流度（turbulence）しか示さないことが言われている。
ここまでに検討した事を除けば、栄養素沈澱問題を有効に排除する高細胞密度発酵用培地の調製に関して公知文献から引き出せる事は無い。全成分を混合（大腸菌の場合は中性pHで混合）した時に沈澱を生起させず、かつプロセス実施の間に発酵槽内で沈澱物が生じないことを保証する、バッチ及び／または供給培地中への沈澱を低減する方法がなお必要とされている。本発明は上記のような方法を、濃縮栄養培地中のリン源としてリン酸ナトリウムガラスを用いることによって提供する。先に引用した公知文献中に示唆されている方法とは異なり、本発明の方法は、（１）沈澱物を含有しない濃縮完全均衡バッチ及び／または供給培地の設計を可能にし、（２）大腸菌に代謝できない物質を用いず、かつ（３）細胞密度及び増殖速度を上昇させ得るという三重の利点を有する。実際的な本発明の方法は様々な細菌発酵、特に高細胞密度発酵プロセスに有用である。
発明の概要
本発明は、組み換えタンパク質生産のための細菌発酵プロセスに係わり、このプロセスでは或る種の供給培地栄養素を監視及び調節してプロセス進行中の金属リン酸塩沈澱を制御する。本発明は特に、濃縮栄養液中にリン源としてリン酸ナトリウムガラスを用いる方法を含む高細胞密度発酵プロセスに係わる。驚くべきことに、本発明の方法は培地中での沈澱物生成を排除し、かつ標準的な条件下に細胞密度を上昇させる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実験（run）Ｃ（●−●）及び実験Ｄ（○−○）から得られた細胞密度プロフィールを示すグラフである。このグラフは、培地中のリン源としてリン酸塩ガラスを用いることにより、前記リン源としてオルトリン酸塩を用いた場合を凌ぐ細胞密度上昇が得られたことを示している。細胞密度はPerkin−Elmer  M35分光光度計を用いて測定し、OD600を時間に対してプロットした。
発明の詳細な説明
或る種の供給培地栄養素を監視及び調節して発酵プロセスの間の金属リン酸塩沈澱を制御する本発明の方法を、以下の検討においてより詳細に説明し、かつ後出の実施例によって例証する。実施例には、高細胞密度発酵において代替リン源を用いることにより栄養素沈澱を排除し得ることが示してある。得られた結果は、濃縮バッチ及び／または供給培地中のリン源としてガラス質リン酸ナトリウムを用いた高細胞密度バッチ及び流加発酵が培地中への金属リン酸塩沈澱を排除し、かつ発酵物の細胞密度を上昇させたという点で驚くべきであった。
組み換えタンパク質の生産に関与する発酵プロセスでは、（１）不連続（バッチプロセス）操作、（２）連続操作、及び（３）半連続（流加）操作のうちのいずれかに該当する操作モードが用いられる。バッチプロセスは、微生物をプロセス開始時に滅菌培地（バッチ培地）に接種して所定の反応時間の間培養することを特徴とする。培養の間、細胞濃度、基質濃度（Ｃ源、栄養素塩、ビタミン等）、及び生産物濃度は変化する。十分に混合することによって、反応混合物の組成または温度に重大な局所的差異が生じないことが確実となる。反応は非定常的であり、細胞は増殖制限基質（通常は炭素源）が費消されるまで増殖する。
連続操作は、新しい培地（供給培地）を連続的に発酵槽に添加し、これと同じ速度で消費済みの培地及び細胞を連続的に発酵槽から抜き出すことを特徴とする。連続操作では、培地添加速度によって増殖速度を決定し、増殖制限基質（即ち炭素源）の濃度によって増殖収率を決定する。反応変数及び制御パラメーターはいずれも経時変化せず、従って発酵槽内では経時的無変化状態（time−constant  state）が確立され、その結果一定の生産性及び出力が得られる。
半連続操作は、バッチ操作と連続操作との組み合わせと看做すことができる。発酵をバッチプロセスとして開始し、増殖制限基質が費消されたら、グルコース及び無機質を含有する連続供給培地を所定の方法で添加する（流加）。即ち、この操作では、細胞の増殖及び所望タンパク質の効率的な生産を達成するのにバッチ培地と供給培地との両方が用いられる。細胞は培養の間添加も取り出しもされず、従って発酵槽は、微生物に関するかぎりはバッチ式に機能する。本発明は、上述のものを含めた様々なプロセスに適用可能であるが、好ましいのは流加プロセスに関連付けられる用途である。
上述のプロセスのいずれにおいても、代謝産物の生成と平均pH、光学密度、色及び滴定酸度など、他の幾つかの変数との相関関係を利用することによって細胞の増殖及び生産物の蓄積を間接的に監視できる。例えば、光学密度は不溶性細胞粒子の蓄積を指示し、表示装置または記録装置と結合したマイクロODユニツトを用いて作業継続下（on−stream）に、またはサンプリングによるオフラインで監視し得る。600nmにおける光学密度値（OD600）を、乾燥細胞重量確定手段として用いる。
高細胞密度発酵は通常、細胞乾燥重量20g/lを越える収率（OD600＞30）をもたらすプロセスであると説明される。いずれの高細胞密度発酵プロセスでも、「流加」プロセスにおいて段階的に発酵槽に計り入れられる濃縮栄養培地が用いられる。高細胞密度プロセスに濃縮栄養供給培地が必要であるのは、培地供給時に発酵槽の中味が稀釈されることを最小限に留めるためである。流加プロセスは操作者が炭素源の供給を制御することを可能にするので必要とされ、前記制御は、高細胞密度の実現に十分である高い濃度の炭素源に曝露された細胞は増殖を停止させる量の抑制性副産物即ち酢酸塩を生成させるので重要である。Majewski及びDomach,Biotechnology  and  Bioengineering  35,pp.732−738,1990参照。
組み換えタンパク質の生産に用いられる発酵プロセスのための標準的な反応条件には、大腸菌の場合で通常pHを約5.0〜8.0に、培養温度を20〜50℃に維持することが含まれる。宿主細胞系として大腸菌を用いる好ましい本発明の具体例では、最適pHは約7.0、最適培養温度は約37℃である。
上述のような発酵プロセスにおいて標準的な栄養培地成分には通常、エネルギー、炭素、窒素、リン、マグネシウム、並びに微量の鉄及びカルシウムの供給源が含まれる。加えて、培地は増殖因子（ビタミン及びアミノ酸など）、無機塩、及び生産物の生成に必須である他の任意の前駆体を含有し得る。所期の微生物の元素組成を用いて、細胞増殖の支援に必要な各成分の比率を計算し得る。成分濃度は、プロセスが低細胞密度プロセスと高細胞密度プロセスとのいずれであるかに応じて変更する。例えば、低細胞密度バッチ発酵プロセスではグルコース濃度は１〜5g/lとし、一方高細胞密度バッチプロセスでは45〜75g/lのグルコース濃度を用いる。
本発明の実施において培地中のリン酸塩源として用いるべく企図されているのは、様々なリン酸塩ガラスである。リン酸塩ガラスは、比較的特化された用途を有する直鎖状ポリリン酸塩である。リン酸塩ガラスを含めた直鎖状ポリリン酸塩全般についての検討は、D.E.C.Corbridge,“Phosphorus:An  Outline  of  its  Chemistry,Biochemistry  and  Technology,"4th  edition,Chapter  3,pp.210−302,1990を参照されたい。リン酸塩ガラスは広範な組成で製造可能であり、主としてカチオンと個々のポリリン酸鎖との混合物から成り得る。Na+カオチンとの結合によって生成したガラスが最も徹底的に調べられており、このガラスはP2O5から5Na2O・100P2O5まで、通常の温度で安定な一連の組成で存在する。リン酸塩ガラスはオルトリン酸アニオンの縮合によって、即ちNaH2PO4を650℃まで加熱し、かつ急冷（quenching）することによって製造する。温度650℃及び水蒸気圧55Torrにおいて急冷メルトから得られる典型的なガラスの平均鎖長
0003592330.tif 000002
は、PO4四面体60個である。
0003592330.tif 000003
ガラス質のポリリン酸ナトリウムは様々なものが市販されている。それらは様々な平均鎖長
0003592330.tif 000004
を有して製造される。
通常、本発明の方法に有用なポリリン酸塩はリン酸ナトリウムガラスである。特に、
0003592330.tif 000005
が約２〜約100、好ましくは約４〜約20のリン酸ナトリウムガラスの使用が考えられる。上記のようなリン酸塩ガラスが本発明に有用であるのは、（１）混合時に沈澱を惹起しないで濃縮栄養培地を調製できるような溶解特性を有し、（２）大腸菌系などの宿主細胞系が該リン酸塩ガラスの代謝に必要な経路を有し、かつ（３）沈澱が生起しないためにあらゆる栄養素が完全に消費可能であり、その結果細胞密度及び増殖速度が上昇するからである。好ましい一具体例では、鎖長
0003592330.tif 000006
が11であるガラス質ポリリン酸ナトリウムをリン源として用いる。
本発明は、様々な組み換えタンパク質を生産するプロセスにおいて有用である。その生産を企図されるタンパク質の例に、Ｇ−CSF、SCF、EPO、GM−CSF、CSF−１、IL−１〜IL−12などのインターロイキン、IGF類、Ｍ−CSF、TNFまたはLIFといった様々な造血因子を含めたサイトカインが有る。インターフェロン（α、β、γまたはコンセンサスインターフェロン）、並びにヒトまたは他の動物の成長ホルモン（例えばブタまたはニワトリ成長ホルモン）、FGF、KGF、EGF及びPDGFなどの成長因子もしくはホルモンなど、他の治療タンパク質も有用である。メタロプロテイナーゼ阻害剤（TIMP−１、TIMP−２、または他のプロテイナーゼ阻害剤）などのプロテアーゼ阻害剤も考えられる。BDNF及びNT−３などの神経成長因子も考えられる。親タンパク質の一次構造の全部または一部を有し、かつ親タンパク質の生物学的特性を少なくとも一つ有するタンパク質のペプチド部分も、その生産を企図されるものである。
通常、本発明に有用なKGFはヒトKGFか、またはその密接に関連する類似体の配列を有する。国際特許出願公開第90/08771号には、ヒト胚性線維芽細胞系の馴らし培地からのKGFの精製、単離したポリペプチドの部分的アミノ酸配列決定、遺伝子のクローニング、及び細菌細胞（大腸菌）での発現による生物活性な組み換えKGFの取得が開示されている。
好ましい一具体例において、プロセスにおいて用いる組み換え宿主細胞は大腸菌である。大腸菌は好ましい系であり、なぜなら大腸菌はその遺伝現象が十分に解明されており、高い細胞密度を可能にし、かつ通常の条件（例えばpH及び温度）下に効率的に増殖し得るからである。
本発明の好ましい具体例をもたらす付加的な要素に、酵母抽出物、及びカゼイン大豆粗粉、肉、血液または綿実の化学消化物などの複合窒素源が含まれる。当分野の技術を知る者には理解されようが、本発明は、上記付加的要素の様々な組み合わせを有する金属リン酸塩沈澱を制御する方法を包含する。
実施例１
大腸菌の高細胞密度発酵において組み換えタンパク質を生産するのに用いられる培地の典型である均衡最少栄養供給培地を、代替リン酸塩源を用いて調製した。リン源としてオルトリン酸塩を用いる「標準的な」バッチ最少培地（培地Ａと呼称）を、FMC  Corp.から供給されている鎖長
0003592330.tif 000007
のガラス質ポリリン酸ナトリウムであるHexaphosTMをリン源として用いた培地（培地Ｂと呼称）と比較した。
培地Ａには、45g/lのグルコース、3g/lの酵母抽出物、1g/lの（NH4）2SO4、4g/lのK2HPO4、4.56g/lのKH2PO4、0.71g/lのMgSO4・7H2O、0.74g/lのKCl、4.0ml/lの微量金属溶液Ａ（27g/lのFeCl3・6H2O、2.0g/lのZnCl2・4H2O、2.0g/lのCoCl2・6H2O、2.0g/lのMnMoO4・2H2O、1.0g/lのCaCl2・2H2O、1.9g/lのCuSO4・5H2O、0.5g/lのH3BO3、1.6g/lのMnCl2・4H2O、73.5g/lのクエン酸ナトリウム・H2O）、及び4ml/lのビタミン溶液Ａ（0.06g/lのビオチン、0.04g/lの葉酸、1.4g/lのピリドキシン・HCl、0.42g/lのリボフラビン、5.4g/lのパントテン酸、6.1g/lのナイアシン）を含有させた。培地Ｂは、リン源としてK2HPO4及びKH2PO4の替わりに3.3g/lのHexaphosTMを用いた以外は培地Ａと同じとした。
各培地の滅菌の際、グルコース及び硫酸マグネシウムは一緒に滅菌し、微量金属溶液Ａは分離して滅菌し、（オルトリン酸塩を含めた）その他の培地成分は分離して滅菌する。この措置は望ましくない副反応を防止するために取るものである。培地Ｂの場合、HexaphosTMも分離して滅菌する。培地Ａでは、総ての滅菌済み培地成分を互いに混合して得られた溶液は混濁した。この混濁は沈澱反応の生起に帰因した。しかし、培地Ｂは混合しても透明なままであった。
培地の10ml試料を採取し、これをフィルターホルダー（Nalgene;300−4100）に設置した孔径0.2μｍのナイロンフィルター（Nalgene;215−4020）２個で濾過することによって、生じた沈澱物の重量を測定した。相前後して位置するフィルターのうちで２番目のものは、膜中に捕捉される可溶性固体に起因する質量増大の推定に用いた。フィルターを数時間風乾し、その後重量計を具備したLabware  9000マイクロ波乾燥オーブンで完全に乾燥した。Labware  9000を用いて、フィルターの乾燥重量を試料の適用前及び適用後に測定した。結果を下記表１にまとめる。
0003592330.tif 000008
実施例２
大腸菌における組み換えKGF生産のために設計した高細胞密度流加発酵を行なって、バッチ培地及び濃縮栄養供給培地中のリン源としてリン酸塩ガラスを用いた場合をオルトリン酸塩を用いた場合と比較した。培地中への金属リン酸塩沈澱のレベル及び総細胞密度への影響を測定した。リン源としてオルトリン酸塩を用いた「標準的」流加最少培地実験（実験Ｃと呼称）を、リン酸としてHexaphosTMを用いた実験（実験Ｄと呼称）と比較した。
実験Ｃの場合、バッチ培地には5g/lのグルコース、1.68g/lの（NH4）2SO4、0.05g/lのK2SO4、0.36g/lのNaH2PO4・H2O、0.136g/lのMgSO4・7H2O、0.008g/lのKCl、0.78ml/lの微量金属溶液Ａ（27g/lのFeCl3・6H2O、2.0g/lのZnCl2・4H2O、2.0g/lのCoCl2・6H2O、2.0g/lのMnMoO4・2H2O、1.0g/lのCaCl2・2H2O、1.9g/lのCuSO4・5H2O、0.5g/lのH3BO3、1.6g/lのMnCl2・4H2O、73.5g/lのクエン酸ナトリウム・H2O）を含有させた。実験Ｄのバッチ培地は、NaH2PO4・H2Oに替えて0.28g/lのHexaphosTMを用いた以外は実験Ｃのものと同じとした。
実験Ｃの供給培地には、651.5g/lのグルコース、6.52g/lのK2SO4、46.91g/lのNaH2PO4・H2O、17.69g/lのMgSO4・7H2O、1.08g/lのKCl及び102ml/lの微量金属溶液Ａを含有させた。実験Ｄの供給培地は、NaH2PO4・H2Oに替わりに37.2g/lのHexaphosTMを用いた以外は実験Ｃのものと同じとした。いずれの実験でも、供給培地のpHは36ml/lの40％  v/v  NaOH溶液の添加によって7.0に調節した。
実施例１の均衡最少栄養供給培地の場合同様、リン源としてオルトリン酸塩を用いると滅菌済みの培地成分同士を混合した時に沈澱が起こった。他方、HexaphosTMを用いた場合は上記のような沈澱は起こらなかった。生じた沈澱物の重量を実施例１に述べた操作を用いて測定した。結果を下記表２にまとめる。
0003592330.tif 000009
実験Ｃ及びＤでは細胞密度も監視した。いずれの実験でも、最初は細胞をバッチ培地中でバッチ式に増殖させる。グルコース費消後、供給培地を用いて培地の連続供給を開始する。発酵の培地供給段階では、供給速度を２時間間隔で細胞密度に従い上昇させる。実験Ｃでは、最初0.08/時であった増殖速度が培地供給開始の42時間後に0.04/時に低下し、この時細胞密度はOD  65に達した。その後、ODは低下した。実験Ｄでは、発酵物は0.09/時の一定速度で43時間増殖し、その結果細胞密度はOD  92に達した。その後、ODは低下した（第１図参照）。実験Ｃの結果としての最終細胞密度が細胞乾燥重量43g/lでしかなかったのに対し、実験Ｄの結果としての最終細胞密度は細胞乾燥重量61g/lであった。その結果、実験Ｄでは180mg/lのKGFを生産し、一方実験Ｃでは120mg/lのKGFしか生産しなかった。
実施例３
大腸菌の高細胞密度発酵に用いる培地の典型である培地調製物中に、リン源としてHexaphosTM以外の数種のポリリン酸塩
0003592330.tif 000010
を用いた。高細胞密度発酵に必要な比の典型であるグルコース対リン比及びグルコース対マグネシウム比を有する数種の培地を、グルコース／硫酸マグネシウムの濃縮ストック溶液（グルコース888g/l含有）を異なるリン含有化合物の濃縮水溶液と混合することによって調製した。得られた各溶液のpHを、40％  NaOHまたは30％  HClを用いて7.0に調節した。
各溶液を５日間毎日、沈澱物生成に関して目視により調べた。結果を下記表３にまとめる。表に示した結果からは、培地中のリン源としてHexaphosTMを用いれば800g/lもの高いグルコース濃度を沈澱を生起させずに用い得ることが明らかである。
0003592330.tif 000011
のガラス質ポリリン酸ナトリウムであるGlass  HTM、及び
0003592330.tif 000012
のガラス質ポリリン酸ナトリウムであるSodaphosTMを用いると600g/lもの高いグルコース濃度を用いることができる。他方、オルトリン酸塩を用いた場合は最高でも462g/lのグルコース濃度しか可能とならない。
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上記結果から、高細胞密度発酵における組み換えタンパク質生産に用いる濃縮培地中への栄養素の沈澱を排除する上で様々なガラス質ポリリン酸ナトリウムが有効であることは明らかである。
ここに示した結果は高細胞密度細菌発酵プロセスに用いる培地中への金属リン酸塩沈澱反応を制御する実際的な方法を明示しており、様々な高細胞密度細菌発酵プロセスにおいて優れた細胞増殖及びタンパク質生産を実現するものである。
【図１】
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