【手続補正書】
【提出日】平成29年10月20日(2017.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセットであって、
前記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインが、ジンクフィンガー結合タンパク質、メガヌクレアーゼ結合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質、またはＴＡＬＥＮ結合タンパク質に結合する部位特異的ヌクレアーゼ結合配列を含み、
前記解析ドメインが、配列番号１４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号１４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、
ポリヌクレオチドドナーカセット。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項３】
トランスジェニック植物細胞である、請求項２に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項４】
請求項２に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物であって、以下の要件：
ｉ）前記植物が単子葉植物であり、前記単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択されるものであることが好ましい、
ｉｉ）前記植物が双子葉植物であり、前記双子葉植物は、ダイズ植物、ワタ植物およびキャノーラ植物からなる群から選択されるものであることが好ましい、
のうちの少なくとも１つを満たす、トランスジェニック植物。
【請求項５】
請求項３に記載のトランスジェニック植物から得られるトランスジェニック種子。
【請求項６】
配列番号１３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１４０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号１４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドドナーカセットであって、前記解析ドメインが、９塩基対長よりも長い一連の同一の塩基対配列を含まないポリヌクレオチドを含むことが好ましい、ポリヌクレオチドドナーカセット。
【請求項７】
１つ以上の相同性アーム配列を含み、前記１つ以上の相同性アーム配列が、最適遺伝子座＿２０４６３７（配列番号２１０）、最適＿遺伝子座＿２０４７２６（配列番号２１１）、最適＿遺伝子座＿１５６３９３（配列番号２１２）、最適＿遺伝子座＿１９８３８７（配列番号２１３）、最適＿遺伝子座＿３１７１０（配列番号２１４）、最適＿遺伝子座＿６４５４２（配列番号２１５）、最適＿遺伝子座＿１９７３７２（配列番号２１６）、最適＿遺伝子座＿２３２２２８（配列番号２１７）、最適＿遺伝子座＿２８５６２１（配列番号２１８）および最適＿遺伝子座＿１５７３１５（配列番号２１９）からなる群から選択される最適ゲノム遺伝子座と少なくとも８０％の配列同一性を有していてもよい、請求項１に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
【請求項８】
植物細胞のゲノム内のポリヌクレオチドドナーカセットのターゲッティングされた組込みのための方法であって、
ａ．少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ＤＮＡ結合ヌクレアーゼを発現させるステップであって、前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが植物細胞のゲノム内の標的部位と結合する、ステップと、
ｂ．前記植物細胞を、請求項１に記載のポリヌクレオチドドナーカセットと接触させるステップと、
ｃ．前記植物細胞のゲノム内の標的部位を前記部位特異的ＤＮＡ結合ヌクレアーゼで切断するステップと、
ｄ．請求項１に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを前記植物細胞のゲノム内の標的部位中に組み込むステップと
を含む、方法。
【請求項９】
以下の少なくとも１つを含む、請求項８に記載の方法：
ｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー結合ドメイン、メガヌクレアーゼ結合ドメイン、ＴＡＬＥＮ結合ドメイン、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ結合ドメインからなる群から選択される、
ｉｉ）前記ヌクレアーゼドメインが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに由来し、前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩおよびＳｔｓＩからなる群から選択されることが好ましい、
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、ポリペプチドを発現する、
ｉｖ）前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、非コーディング核酸配列を含む、
ｖ）前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、１つまたは複数のジンクフィンガー結合配列を含む、
ｖｉ）前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、１つまたは複数のプライマー結合配列を含む、
ｖｉｉ）前記組み込むステップが、相同性によって指示される修復機序（homology directed repair mechanism）を含む、
ｖｉｉｉ）前記組み込むステップが、非相同性末端結合によって指示される修復機序（non-homologous end joining directed repair mechanism）を含む、
ｉｘ）前記植物細胞が、単子葉植物細胞であり、前記単子葉植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、コムギ植物細胞およびイネ植物細胞からなる群から選択されることが好ましい、
ｘ）前記植物細胞が、双子葉植物であり、前記双子葉植物細胞が、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞およびキャノーラ植物細胞からなる群から選択されることが好ましい、
ｘｉ）前記標的部位が、最適ゲノム遺伝子座を含み、前記最適ゲノム遺伝子座が、以下の特徴：
ａ．前記非遺伝子配列のメチル化のレベルが１％以下であること、
ｂ．前記非遺伝子配列が、前記ゲノム中に含有される任意のその他の配列と４０％未満の配列同一性を共有すること、
ｃ．前記非遺伝子配列が、既知または予測された発現コード配列の４０Ｋｂの領域内に位置すること、
ｄ．前記非遺伝子配列が、０．０００４１ｃＭ／Ｍｂより大きいゲノム内の組換え頻度を示すこと
を含む低メチル化非遺伝子配列であることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
関連技術分野の前記の例およびそれに関連する制限は、例示であって、排他的なものではない。関連技術分野のその他の制限は、本明細書を読めば当業者に明らかとなろう。
本発明は以下を提供する。
［１］部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセット。
［２］３Ｋｂｐ未満の長さを含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３］上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを含むトランスジェニック細胞。
［４］トランスジェニック植物細胞である、上記［３］に記載のトランスジェニック細胞。
［５］上記［４］に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
［６］単子葉植物である、上記［５］に記載のトランスジェニック植物。
［７］上記単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される、上記［６］に記載のトランスジェニック植物。
［８］双子葉植物である、上記［５］に記載のトランスジェニック植物。
［９］上記双子葉植物が、ダイズ植物、ワタ植物およびキャノーラ植物からなる群から選択される、上記［８］に記載のトランスジェニック植物。
［１０］上記［５］に記載のトランスジェニック植物から得られるトランスジェニック種子。
［１１］配列番号１３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１３９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号１４０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号１４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１２］上記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインが、２つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ結合配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１３］上記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインに、ジンクフィンガー結合タンパク質、メガヌクレアーゼ結合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質またはＴＡＬＥＮ結合タンパク質が結合している、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１４］上記解析ドメインが、配列番号１４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号１４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１５］上記解析ドメインが、１つまたは複数の制限酵素配列を含む、上記［１］または［１４］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１６］上記解析ドメインが、約４０％〜約６０％のグアニンおよびシトシン塩基対パーセンテージを含む、上記［１］または［１４］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１７］上記解析ドメインが、９塩基対より長い長さを有する繰り返し配列を含有しないポリヌクレオチドを含む、上記［１］または［１４］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１８］上記解析ドメインが、９Ｂｐより長い長さの一連の同一塩基対配列を含有しないポリヌクレオチドを含む、上記［１１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［１９］上記解析ドメインが、−１９ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える自由エネルギー（ΔＧ）の二次構造を有するポリヌクレオチドを含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２０］上記解析ドメインが、１つまたは複数のプライマー結合配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２１］１つまたは複数の相同性アーム配列を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２２］上記１つまたは複数の相同性アーム配列が、５０から１００塩基対の間の長さである、上記［２１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２３］上記１つまたは複数の相同性アーム配列が、最適ゲノム遺伝子座と少なくとも８０％の配列同一性を共有する、上記［２１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２４］上記最適ゲノム遺伝子座が、最適遺伝子座＿２０４６３７、最適＿遺伝子座＿２０４７２６、最適＿遺伝子座＿１５６３９３、最適＿遺伝子座＿１９８３８７、最適＿遺伝子座＿３１７１０、最適＿遺伝子座＿６４５４２、最適＿遺伝子座＿１９７３７２、最適＿遺伝子座＿２３２２２８、最適＿遺伝子座＿２８５６２１および最適＿遺伝子座＿１５７３１５からなる群から選択される、上記［２３］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２５］上記解析ドメインが、ペプチドをコードしない、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２６］上記解析ドメインが、ペプチドをコードする、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２７］上記解析ドメインが、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記［２６］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２８］上記遺伝子発現カセットが、プロモーターを含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［２９］上記導入遺伝子が、リポーター遺伝子を含む、上記［２７］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３０］上記リポーター遺伝子が、ｙｆｐ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｒｆｐ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ａａｄ−１遺伝子、ａａｄ−１２遺伝子、ｐａｔ遺伝子およびグリホサート耐性遺伝子からなる群から選択される、上記［２９］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３１］上記プラスミドドメインが、ｐＵＣ１９プラスミドを含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３２］上記プラスミドドメインが、高コピー数複製起点を含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３３］上記高コピー数複製起点が、ｃｏｌｅ１複製起点を含む、上記［３２］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３４］上記プラスミドドメインが、選択マーカーを含む、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３５］上記選択マーカーが、カナマイシン選択マーカー、アンピシリン選択マーカー、スペクチノマイシン選択マーカー、クロラムフェニコール選択マーカーおよびリファンピシン選択マーカーからなる群から選択される、上記［３０］に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
［３６］植物細胞のゲノム内のポリヌクレオチドドナーカセットのターゲッティングされた組込みのための方法であって、
ａ．少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ＤＮＡ結合ヌクレアーゼを発現させるステップであって、上記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが植物細胞のゲノム内の標的部位と結合する、ステップと、
ｂ．上記植物細胞を、上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセットと接触させるステップと、
ｃ．上記植物細胞のゲノム内の標的部位を上記部位特異的ＤＮＡ結合ヌクレアーゼで切断するステップと、
ｄ．上記［１］に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを上記植物細胞のゲノム内の標的部位中に組み込むステップと
を含む、方法。
［３７］上記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガー結合ドメイン、メガヌクレアーゼ結合ドメイン、ＴＡＬＥＮ結合ドメイン、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ結合ドメインからなる群から選択される、上記［３６］に記載の方法。
［３８］上記ヌクレアーゼドメインが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに由来する、上記［３６］に記載の方法。
［３９］上記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩおよびＳｔｓＩからなる群から選択される、上記［３８］に記載の方法。
［４０］上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、ポリペプチドを発現する、上記［３６］に記載の方法。
［４１］上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、非コーディング核酸配列を含む、上記［３６］に記載の方法。
［４２］上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、１つまたは複数のジンクフィンガー結合配列を含む、上記［３６］に記載の方法。
［４３］上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、１つまたは複数のプライマー結合配列を含む、上記［３６］に記載の方法。
［４４］上記組み込むステップが、相同性によって指示される修復機序を含む、上記［３６］に記載の方法。
［４５］上記組み込むステップが、非相同性末端結合によって指示される修復機序を含む、上記［３６］に記載の方法。
［４６］上記植物細胞が、単子葉植物細胞である、上記［３６］に記載の方法。
［４７］上記単子葉植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、コムギ植物細胞およびイネ植物細胞からなる群から選択される、上記［４６］に記載の方法。
［４８］上記植物細胞が、双子葉植物である、上記［３６］に記載の方法。
［４９］上記双子葉植物細胞が、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞およびキャノーラ植物細胞からなる群から選択される、上記［４８］に記載の方法。
［５０］上記標的部位が、最適ゲノム遺伝子座を含む、上記［３６］に記載の方法。
［５１］上記最適ゲノム遺伝子座が、以下の特徴：
ａ．上記非遺伝子配列のメチル化のレベルが１％以下であること、
ｂ．上記非遺伝子配列が、上記ゲノム中に含有される任意のその他の配列と４０％未満の配列同一性を共有すること、
ｃ．上記非遺伝子配列が、既知または予測された発現コード配列の４０Ｋｂの領域内に位置すること、
ｄ．上記非遺伝子配列が、０．０００４１ｃＭ／Ｍｂより大きいゲノム内の組換え頻度を示すこと
を含む低メチル化非遺伝子配列である、上記［５０］に記載の方法。