(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物細胞におけるレセプター依存シグナル誘導経路に関する物質の調節効果を測定する方法であって、
ａ）レポーター遺伝子およびホスホリパーゼ活性の調節によってもたらされるイノシトール−1,4,5−トリホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）の濃度変化に応答する調節配列である、１以上のTREモチーフを含む配列を含む組換えDNAでトランスホームされ、その結果前記レポーター遺伝子の発現がIP3/DAG濃度の変化によって調節されている哺乳動物細胞であって、
さらに、
ｂ）ホスホリパーゼ・エフェクター系と共役しているレセプターをコードする配列を含む組換えDNAでトランスホームされ、その結果レセプターを発現している前記哺乳動物細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子産物の濃度を測定することによって、シグナル誘導経路に共役しているレセプターによって開始するシグナル誘導経路におけるホスホリパーゼの活性化またはホスホリパーゼの活性化に先立つ、あるいはそれに続くメカニズムに関する前記物質の調節効果を測定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記ａ）で定義される組換えDNAが、ホスホリパーゼＣの調節によってもたらされるIP3およびDAGの濃度変化に応答する調節配列である、１以上のTREモチーフを含む配列を含み、かつ、前記ｂ）で定義される組換えDNAがＧプロテイン共役レセプターをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、レポーター遺伝子、および、アデニレート・シクラーゼの調節によってもたらされるcAMPの濃度変化に応答する調節配列である、１以上のCREモチーフを含む配列を含む組換えDNAでトランスホームされ、その結果前記レポーター遺伝子の発現がcAMP濃度変化によって調節されている哺乳動物細胞をテスト物質とインキュベートし、レポーター遺伝子産物の濃度を測定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞を分解するのに適した界面活性剤、pHが６〜９のバッファー、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、ルシフェリン、穏やかな有機還元剤を含む試薬の存在下で、レポーター遺伝子生産物としてルシフェラーゼを測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞を分解するのに適した界面活性剤、pHが６〜９のバッファー、マグネシウム塩、アデノシン三リン酸、ルシフェリン、穏やかな有機還元剤を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法を行うための試薬。
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトまたは動物細胞におけるレセプター依存シグナル誘導経路に関する物質の調節効果を測定する方法に関する。
薬学的に活性を有する物質に関する従来のテスト法は、レセプターに結合した（ラベル化した）リガンドを置換しうる程度を評価する検定法が多い（ラジオリガンド・テスト法）。この種のテスト法は既知のレセプター結合部位の結合に影響する物質しか同定できない。従って、このようなテスト法は物質の結合をカバーするだけで細胞の機能的応答をカバーできず、結合する物質がアゴニスト的活性を有するのかアンチアゴニスト的活性を有するのか区別できない。ラジオリガンド・テスト法は比較的大量の物質を必要とし、しばしば動物組織から単離したレセプター含有膜画分が使用される。この組織には種々のレセプターを含む数種類の細胞が含まれている。このような物質の重要性にもかかわらず、組成の多様性、またはヒトに対する医薬効果を研究する場合のヒトと動物の種差およびヒト・レセプターと動物レセプターに対するリガンドの結合性の差は結果の説明する際に問題となる。
多くのトランスメンブレン・シグナル誘導システムは以下のメンブレン結合成分を含んでいる。ａ）細胞表面レセプター、ｂ）Ｇプロテインとして知られ、レセプターおよびエフェクターの両方に結合しうるグアニン・ヌクレオチド・結合およびGTP切断調節タンパク質、ｃ）いわゆる「エフェクター」、例えばイオンチャンネルまたはアデニレート・シクラーゼ、グアニレート・シクラーゼまたはホスホリパーゼ。
いわゆるＧプロテイン結合レセプターは光、匂い、（ペプチド）ホルモン、ニューロトランスミッター等の非常に多種に渡る細胞外シグナルの効果を受け渡す。これらは進化的にヒトと酵母ほど離れた生物の両方に同定される（ドールマン等、1991）。ほとんど全てのＧプロテイン結合レセプターは配列に類似性を有している。全ての類似性は脂質二重層を貫通する７つの疎水的（おそらくαヘリックス）領域からなる、全てのＧプロテイン結合レセプターに共通する同様のトポロジカル・モチーフに基づくものと考えられている。
細胞表面レセプターは種々の細胞外刺激から適したリガンドを認識する。レセプターへのリガンドの結合はヘテロトリメリックＧプロテインの活性化で開始するシグナル・カスケードを活性化する。長期間に渡るレセプターの活性化はレセプターの種々の修飾によって引き起こされる減感作を誘導する。Ｇプロテインの活性化レセプターとの相互作用はαサブユニットに結合したグアノシンジホスフェート（GDP）のグアノシントリホスフェート（GTP）による置換、β−γ−ヘテロダイマーからのα−GTP−複合体の解離およびGTPのGDPへの加水分解を引き起こす。単一のレセプターが多くのＧプロテイン分子を活性化し、それによってリガンド結合現象を強める。GTPが結合するαサブユニットおよび遊離型β−γサブユニットはエフェクターと相互作用し、いわゆる「第２メッセンジャー」を形成することによりシグナルを強める。アデニレート・シクラーゼの活性化によりトリガーされるcAMP（サイクリックAMP）、グアニレート・シクラーゼの活性化によりトリガーされるcGMP（サイクリックGMP）または場合によってはヒドロラーゼも関与するホスホリパーゼＣまたはホスホリパーゼＤ等のホスホリパーゼの活性化によりトリガーされるイノシトール−1,4,5−トリホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）等の低分子第２メッセンジャーは、細胞外変化をもたらす（ビラー（Billah）等、1989）。これらは特定の遺伝子の転写の調節、細胞骨格の再構築および膜の脱極性化に影響するプロテイン・キナーゼの活性化によるタンパク質の選択的リン酸化（例えばIP3/DAGによるPKC、cAMPによるPKA）を含んでいる。（アンタゴニスト効果を有する物質はアゴニスト効果を有する物質によって起こった相互作用およびそれに伴う全体的または部分的第２メッセンジャー濃度の変化を戻すことができ、さらに逆機能的効果を起こすことさえある。）このシグナル誘導システムにより細胞はお互いにコミュニケーションでき、発生またはそれに伴う現象を統一しうる。Ｇプロテインのαサブユニットに結合するGTPが加水分解してGDPが生成すると非活性型Ｇプロテインが再生される。
ホスホリパーゼの活性化、生産物がDAGである反応、またはアデニレート・シクラーゼに関連する特異的シグナル誘導経路を最終生産物がDAGである「ホスホリパーゼ・シグナル誘導経路」（または「ホスホリパーゼ・エフェクター・システム」）または「アデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路」（または「アデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システム」）と呼ぶ。
哺乳類では約100種のＧプロテイン結合レセプターが発見されている（その中のいくつかは同じリガンドに結合する）。例えば、現在まで５種類のムスカリン性レセプター・サブタイプ、８種類以上のアドレナリン性レセプター、少なくとも５種類のセロトニン・レセプターおよび４種類のオプシン・レセプターがそれぞれ同定されている。プリン、ボンベシン、ブラジキニン、トロンビン、ヒスタミン、ドーパミン、エコシノイド、バソプレシン、GHRH（「成長ホルモン放出ホルモン」）等のペプチドホルモンおよびソマトスタチンに応答するレセプターおよびレセプター・サブタイプがクローン化され、特性が明らかにされてきている（ドールマン（Dholman）等、1991、サイモン（Simon）等、1991、TIPSレセプター命名法、追補、1991、ドッヅ（Doods）およびヴォンミール（Von Meel）、1991）。同じリガンドに応答する種々のレセプターは、それらがトリガーする細胞内反応に基づいて互いに区別しうる。これらの特異的レセプター・サブタイプは種々のエフェクター・システムと共役しており種々のイオンチャンネルを調節しうる。単一のシグナル・レセプター（同細胞または異細胞）は１つ以上のエフェクターと共役し、いくつかのレセプター・サブタイプが同様のエフェクターを活性化して複雑なシグナル誘導ネットワークが生成する。さらに、Ｇプロテインおよびエフェクターの特徴は、これらも大きな遺伝子群により特定されていることを示している。多くのＧプロテイン、種々のアデニレート・シクラーゼおよびホスホリパーゼＣおよびA2等のホスホリパーゼが同定されている。Ｇプロテイン依存イオンチャンネルも種々のタンパク質群により分類しうる。現在、どの基準がＧプロテインおよびエフェクタータンパク質の不均一な集団の相互作用の特異性を決定するか、特異的レセプターがどのように特異的Ｇプロテインに結合するか、どのような経路でこれらのシグナル回路が互いに作用し合うか、およびこれらがどのように細胞分化の際に再生されるか等は明らかになっていない。
この様に活性化された転写因子（例えば、CREBタンパク質、AP1タンパク質）は、CREBおよびAP1と結合する調節DNA要素CRE（CRE要素、「cAMP応答要素」）またはTRE（TRE＝「TPA応答要素」:TPA＝フォーボル−12−ミリスタット−13−アセテート＝フォーボルエステル）と相互作用する。その転写がcAMPによって調節される多くの遺伝子（例えばラットのソマトスタチン、ヒト−α−ゴナドトロピン）は、5'隣接領域に調節要素として保存的配列を含む。この配列はパリンドローム構造のオクタマーTGACGTCAと同一かまたは類似している（モントミニー（Montminy）等、1990）。TRE要素は大変類似したペンタマーモチーフTGAGTCAを含んでおり、この配列はCRE要素コンセンサス配列と僅か１ヌクレオチドしか相違していない（デューシュ（Deutsch）等、1988）。TREモチーフ、またはこれに非常に類似したモチーフは、多くの遺伝子内に同定されており、その遺伝子の転写はフォルボエステルによって活性化される（エンジェル（Angel）等、1987aおよびｂ、リー（Lee）等、1987）。周囲のDNA配列または他の因子とのタンパク質・タンパク質相互作用が取り分け特異的遺伝子の固有の調節現象を決定する。
シグナル誘導経路のネットワークの複雑性のために、シグナル誘導経路間、例えば、アデニレート・シクラーゼおよびホスホリパーゼＣ−シグナル誘導経路間のいわゆる「クロストーク」が存在する。「クロストーク」とは１つのエフェクターシステムの影響が他のシステムに及ぶ現象である（セイソン・コルシ（Sassone−Corsi）等、1990、ホースレー（Houslay）、1991）。クロストークの現象は生理学的にも冗長するシグナルの生産または種々のシグナル誘導のコミュニケーションの確認のためのシグナルの統合または連結に使用されている。クロストークは種々の段階、取り分けＧプロテインの段階で起こる。例えば、あるレセプターまたはレセプター・サブタイプが１つ以上のＧプロテインと相互作用し、その結果cAMP−およびIP3/DAG−レベルの両方が影響を受ける。細胞における病理学的変化の原因にはこれらの相互作用の破壊、例えば、特異的レセプターが生理学的観点からエフェクターシステムと正しく相互作用しない場合等が考えられる。
特定のレセプターまたはレセプター・サブタイプに対して特異的で、さらに、唯一の特定のレセプター依存シグナル誘導経路に特異的に影響を及ぼす、病理学的状態の治療に関する医薬の発見を可能にする検定法が必要とされている。
レセプター依存シグナル誘導系に関する物質の調節活性が遺伝子の発現によって検出しうることを利用した検定法が既に開発されている。
キング（King）等、1990の検定システムは、酵母細胞にトランスフェクトされたレセプターに対するアゴニスト性化合物の結合反応が酵母細胞中でのカロリメトリーで測定される、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧプロテイン共役フェロモンレセプターによって使用されるシグナル誘導経路への影響に基づいている。この目的のために、ガラクトース誘導可能GAL1プロモーターのコントロール下の（高発現率を達成するため）修正β−アドレノレセプター遺伝子を、フェロモンに応答するFUS1−プロモーターのコントロール下のゲノムに安定して統合したレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を含む酵母に哺乳類Ｇプロテイン・サブユニットGsαと共にトランスフェクトした。このシステムはそのアゴニスト性がβ−ガラクトシダーゼを活性化し、この活性化は色変化に基づく簡単で自動化された検定法で測定しうる物質のスクリーニングの機会を提供する。しかし、このシステムは酵母細胞中の複雑なシステムから単離したヒトタンパク質の使用がヒト細胞における過程に関する直接的結論を誘導しえないという欠点を有している。さらに、酵母細胞におけるこのシステムは、ヒトのレセプターと相互作用しうる適当なＧプロテイン・サブユニットのコトランスフェクションを必要とする。このシステムは高等細胞固有のシグナル誘導システムを利用していないことから、このシステムのレセプター活性物質の機能的分析が問題となる。
モントメイヤー（Montmayeur）およびボレリ（Borelli）、1991は、Ｇプロテイン共役レセプターの活性化（D2レセプターおよびβ−アドレナリン性レセプターを使用）によるアデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路の影響に基づく検定法を報告した。このレセプターを利用してチミジン・キナーゼ（TK）プロモーターのコントロール下にレポーター遺伝子としてクロラムフェニコール・アセチルトランカフェラーゼ遺伝子（CAT）を含むヒト細胞をトランスホームした。このプロモーターに先行してcAMPに応答するプロモーター要素（「cAMP応答要素」CRE）を含む合成オリゴデオキシヌクレオチド配列がある。CAT活性によりアデニレート・シクラーゼを活性化することが知られているβ−アドレナリン性レセプターに対するアゴニスト的に活性な化合物がCAT活性の投与量依存的増加をもたらすことを示しうる。アデニレート・シクラーゼを阻害するドーパミン・レセプターによるコトランスフェクション後、この活性が再び減退した。この事はこのレポーター遺伝子のcAMP誘導型発現が投与量依存的に正にも負にも調節しうることを示している。
この検定法にはcAMP濃度によって調節されている遺伝子の発現を測定するという制限がある。これはIP3/DAG調節遺伝子の発現の測定を許容しない。クロストークによるアデニレート・シンラーゼおよびホスホリパーゼＣのシグナル誘導経路間の相互作用はこの検定法では部分的にしか、もしくは全く検出しえない。
本発明の目的はレセプターに依存してホスホリパーゼ・シグナル誘導経路、特にホスホリパーゼＣのシグナル誘導経路を調節する物質をスクリーニングするのに適した方法を提供することである。これらの物質にはレセプターのリガンド結合部位に結合する物質であって、アロステリック活性を有する物質並びに該リガンド結合部位に非競合的に作用する物質が含まれる。特に本発明は自動化が可能であり、効率よく物質をスクリーニングでき、また、生物からの抽出物などのような複雑な混合物から医薬的に活性を有する物質を探しうる方法を提供することを目的としている。
従って、本発明はヒトまたは動物細胞におけるレセプター依存シグナル誘導経路に関する物質の調節効果を測定する方法に関する。この方法は、場合によっては加水分解も含めてジアシルグリセロールを生ずるホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＣの活性、またはシグナル誘導経路におけるホスホリパーゼＣの活性化前後のメカニズム、望ましくはＧプロテイン共役レセプターによってトリガーされるシグナル誘導経路の調節に関する物質の調節効果が、
ａ）レポーター遺伝子およびホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＣの調節によっておこるイノシトール−1,4,5−トリホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）の濃度変化に応答する調節配列を含む組み換えDNAでトランスホームされ、その結果レポーター遺伝子の発現がIP3/DAGの濃度変化で調節されている、および、さらに、
ｂ）該細胞がレセプターを発現するようにホスホリパーゼ・エフェクターシステムと共役させたレセプターをコードする配列を含む組み換えDNAでトランスホームされている、
哺乳類細胞を物質とインキュベートし、該レポーター遺伝子産物の濃度を測定することにより検定することを特徴とする。
また、IP3/DAG濃度の変化、または後に述べるコントロール細胞の場合はcAMP濃度の変化に応答する組み換えDNAも本発明に関する。以後これを「センサーDNA」と呼ぶ。レポーター遺伝子は、その発現産物が検出可能であり、かつ濃度に比例したシグナルを測定することにより定量可能であるという制約を持つ。
センサーDNAに含まれ、IP3/DAG濃度の変化に応答する調節配列は１つ以上のヘプタマーTREモチーフ（以後TRE要素と呼ぶ）を含む。
センサーDNAに含まれ、cAMP濃度の変化に応答する調節配列は１つ以上のオクタマーCREモチーフ（以後CRE要素と呼ぶ）を含む。
これとは別に、センサーDNAはカルシウム濃度を増加することにより直接転写後に活性化されるタンパク質をコードする配列を含みうる。
レセプターをコードする配列を含む組み換えDNAを以後「レセプターDNA」と呼ぶ。
本発明の別の特徴はセンサーDNAによってのみトランスホームされた細胞に関する。この細胞を以後「プレ・テスト細胞」と呼ぶ。
センサーDNAおよびレセプターDNAでトランスホームした細胞を以後テスト細胞と呼ぶ。この細胞も本発明の目的物である。
ヒトの病気治療の医薬的効果に関して物質を検定する場合、レセプターDNAはヒト・レセプターをコードする配列を含むことが望ましい。（本発明の方法はヒトの病気を治療するの適した物質を発見することに使用されることが望ましい。しかし、動物の治療に使用する物質のスクリーニングにも使用しうる。この場合、対応する動物のレセプターが使用される。）
本発明の目的に関する「物質」には純粋な物質および物質の混合物の両方が含まれる。
「調節」効果は、レセプター依存シグナル誘導経路に関するアゴニストまたはアンタゴニスト的効果を意味する。
本発明の望ましい態様では細胞をＧプロテイン共役レセプターをコードするDNAでトランスホームしている。
さらに、本発明の望ましい態様ではステップａ）に従った組み換えDNAのみでトランスホームしたコントロール細胞（TRE−プレ・テスト細胞）をテスト物質で処理し、レポーター遺伝子の発現をレセプター依存の調節に寄因させうるかどうかを探っている。もし、レポーター遺伝子の発現がホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムのレセプター非依存的調節に従うならば、または内在性レセプターが存在し、ホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムの調節がこれらのレセプターに依存するならば、この調節様式はTREプレ・テスト細胞で検出される。
ホスホリパーゼＣ・シグナル誘導経路に関するテスト物質の特異性を調べるには、センサーDNAがアデニレート・シクラーゼの調節によって起こるcAMP濃度の変化に応答する調節配列を含むプレ・テスト細胞（CREプレ・テスト細胞）を用いた平行テストで簡便に行うことができる。望ましい場合にはTREテスト細胞と同様のレセプターでトランスホームしたCREテスト細胞をコントロールとして使用する。
CREテスト細胞はコントロール細胞としてだけではなくアデニレート・シクラーゼ・シグナル誘導経路に関するレセプター依存調節鉱化に関して物質を検定するスクリーニングにおける一次基質細胞としても使用しうる。この場合、CREテスト細胞をアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと共役したレセプターをコードする配列を含むレセプターDNAでトランスホームする。CREテスト細胞はこの様なスクリーニングにおいてコントロール細胞として使用される。望ましい場合には、アデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと共役した同一のレセプターでトランスホームしたTREプレ・テスト細胞、場合によってはTREテスト細胞もコントロールとして使用される。
レポーター遺伝子の発現量の変化に基づいてレセプター自体の内在的発現が測定結果を妨害するシグナルを発生するので、問題のレセプターを内在的に発現しない細胞は（プレ・）テスト細胞の生産に適している。しかし、細胞が外来性レセプターを過剰生産し、その結果比較的に内在的発現が無視できるほど小さく、測定結果が影響を受けないならば、内在的にレセプターを発現する細胞を使用する事は排除されない。細胞が基本的に本発明の方法の（プレ・）テスト細胞として適しているかどうか、例えば、テスト物質によるホスホリパーゼＣ・エフェクターシステムへの調節的効果を測定する特定のレセプターを全く、または僅かしか発現しないことを知るために使用する操作は、例えば、TREセンサーDNAで哺乳類細胞をトランスホームし、問題のレセプターを活性化する事が知られている物質で処理することである。もし、細胞がこの処理に応答しないか、または限定された応答しかしないならば、基本的にこの細胞はテスト細胞として適していると考えられる。（CREテスト細胞としての適性をテストする為には、CREセンサーDNAを用いること以外は同様にテストする）細胞がそのレセプターを発現するかどうかを知る別の方法には例えば、PCR（ポリメレース・チェーン・リアクション）またはノーザン・ブロットによる分子生物学的方法を用いて直接発現を測定する方法がある。
出来るかぎり数多くのレセプターをトランスホームできるように問題となるレセプターを内在的に全く発現しないか、または出来る限り発現が少ないような、出来るかぎり多くのテスト細胞を生産するのに適するな（プレ・）テスト細胞生産用の原料細胞が選択されることが望ましい。
IP3/DAG濃度を増加させる物質による刺激後TRE調節レポーター遺伝子の強い発現を示す細胞、またはcAMPレベルを増加させる物質による刺激後CRE調節レポーター遺伝子の強い発現を示すプレ・テスト細胞を使用する事が望ましい。薬剤の作用後、問題のレセプターをホスホリパーゼＣシグナル誘導経路と効率的に共役させるテスト細胞を得るために、先ず１つ以上のTRE要素、またはカルシウムによって活性化されるタンパク質をコードする配列を含むセンサーDNA（プレ・テスト細胞）でトランスホームすることによりテスト細胞としての適性を哺乳類細胞について検討した。センサーDNAでトランスホームしたプレ・テスト細胞を一方ではcAMP濃度の増加をもたらす物質（例えばホルスコリン）で処理し、他方ではIP3/DAG濃度の増加をもたらす物質（例えばTPA）で処理した。もし、細胞がTPAで処理した時のみシグナルを発生し、ホルスコリンで処理した時シグナルを発生しないならば、これはIP3/DAG濃度の変化に特異的に応答するという基本的条件を満足しており、すなわち、細胞中での発現のクロストークはない（CREテスト細胞にも同様の操作が行われる。CREプレ・テスト細胞はホルスコリンに応答する）。さらに、導入されるレセプターに関して生理学的に「正しい」共役が起こるかどうか、およびシグナル誘導経路が開始するかどうかを見定める簡便なプレ・テスト細胞の検定を行った。この事に関する必要条件には、細胞がそのレセプターに対して特異的なＧプロテイン変異体（またはレセプター特異的な変異体と機能的に置換しうるＧプロテイン変異体）を含むことが挙げられる。この種の検討には、例えば、プレ・テスト細胞を問題のレセプターでトランスホームし、既知のリガンドで処理し、レポーター遺伝子発現の調節が起こっているかどうかをテストする。
さらに、本発明の範囲で使用する細胞の適性に関する条件は、プレ・テスト細胞として（センサーDNAのみでトランスホーム）およびテスト細胞（センサーDNAおよびレセプターDNAでトランスホーム）として有用な細胞の安定性である。細胞の安定性（生存率、ゲノムへの外来DNAの安定な組み込み）をテストするために、プレ・テスト細胞（第２メッセンジャーの濃度に影響を与える物質による処理）およびテスト細胞（レセプターリガンドによる処理）を用いた同一条件下の長期間に渡る実験を行い、その結果の再現性を確認した。
適当な細胞の例にはCHO（「チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞」系列）、COS（モンキー腎細胞系列）、A549（ヒト肺癌細胞系列）およびJEG−３（ヒトチョリオカルシノーマ細胞系列）がある。
本発明に従うプレ・テスト細胞は、一方ではレセプターDNAを含むテスト細胞調製用の原料として使用し、他方では本発明の方法においてシグナルをテスト物質によるシグナル誘導経路のレセプター依存調節に寄因させうるかどうかをチェックするためのコントロール細胞として使用しうる。もし、この物質がテスト細胞においてシグナルを発するが、コントロールとして使用したプレ・テスト細胞ではシグナルを発生しないならば、シグナルにより検出されるレポーター遺伝子の発現の調節は排他的にレセプター依存である。例えコントロール細胞がシグナルを発しても、その物質はレセプター非依存的シグナル誘導経路のプロセスに影響している。このシグナルに対応するコントロール測定値をテスト細胞で得られた測定値から差し引かなければならない。
センサーDNAは適当な宿主生物、望ましくは大腸菌中で高コピー数の複製が可能であり、哺乳類細胞へのトランスフェクションおよびヒトゲノムへの組み込み後、調節要素のコントロール下、レポーター遺伝子の発現を可能にするプラスミドに存在する事が望ましい。それはレポーター遺伝子（センサーDNA）に関する発現カセットおよび哺乳類細胞に対する選択可能マーカー、並びに少なくとも１つの複製開始点、および大腸菌における複製および選択マーカーを含むシャトルベクターであることが望ましい。
ゲノム中に安定に組み込まれたセンサーDNAを含む永続的細胞系列を生産するために、ベクターは優れた選択マーカーを含む。特定の選択マーカーの使用は本質的ではない。例えば、抗生物質ゼネチシン（Ｇ−418）に対する耐性を提供するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼの遺伝子（サザン（Southern）およびバーグ（Berg）、1982）、DHFR欠失細胞に対するDHFR遺伝子（ジハイドロホレート・リダクターゼ）、マイコフェノール酸に対する耐性を提供するキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（gpt）（ムリガン（Mulligan）およびバーグ（Berg）、1981）またはハイグロマイシレン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph、グリツ（Gritz）およびデービース（Davies）、1983）が使用しうる。選択マーカー遺伝子をプロモートするプロモーターの例にはSV40アーリー・プロモーター、サイトメガロウイルスのプロモーター（CMVプロモーター）、ヘルペス・シンプレックス・ウイルスのチミジン・キナーゼ遺伝子のプロモーター（TKプロモーター）、ラウス・ザルコーマ・ウイルス（RSV）のロング・ターミナル・リピート（LTR）がある。プラスミドは例えば種々の細胞系列を使用する結果として、特定の用途から生ずる種々の必要条件に対応しうるようにレポーター遺伝子、レポーター遺伝子のプロモーターおよび選択マーカーの調節配列などの個々の重要な要素が簡単に交換又は修正できように構築することが望ましい。このような内容には、例えば、プロモーターの前に、またはレポーター遺伝子の前にマルチクローニング部位を含ませ、プロモーターを調節する調節配列または種々のレポーター遺伝子のクローニングを可能にすることが含まれる。
適当なレポーター遺伝子を選択するための前提は、高感度で望ましくは非放射性、自動化可能な検定法が提供されることであった。
本発明の範囲では、理論的にこれらの条件を満足する全てのレポーター遺伝子を使用することが可能である。
化学発光基質を使用する場合アルカリホスファターゼを高感度で測定することが出来るが、多くの哺乳類細胞がこの酵素を比較的高いレベルで発現しているという欠点がある。従って、一般にこれを発現しないか、またはごく僅かしか発現しない細胞系列に対してのみレポーター遺伝子として使用することができる。
β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現産物は各々メチルウンベリフェリル−ガラクトシドまたは−グルクロニドを切断して蛍光発色団を生成しうる。これらの酵素反応は確立された蛍光検定法で測定しうる（ウィーランド（Wieland）等、1985、クリカ（Kricka）、1988）。
クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現は比較的高感度で明確に検出しうるが、取り分けこの検定法は放射能を使用し、かつ自動化しにくいという欠点を有している（ハートマン（Hartmann）、1991）。
本発明の範囲においては、ホチナス・ピラリス・ルシフェラーゼをコードする遺伝子（デ・ウェット（De Wet）等、1987）をレポーター遺伝子として使用することが望ましい。この酵素は、ATPの存在下、基質ルシフェリンにより高収率の生物化学発光を生成し、該生物化学発光は確立された指導下可能な方法で測定でき、かつ、この酵素は哺乳類細胞内で内在的に生産されていないという利点を有している。さらに、ルシフェラーゼは生体内での寿命が比較的短く、高濃度でさえ毒性が無い（ハートマン（Hartmann）、1991、ブレージア（Bradier）等、1989）。生物化学発光による蛍のルシフェラーゼの活性の測定は酵素の測定法のなかで最も感度の高いものの１つである。従って、ルシフェラーゼ活性が通常の哺乳類細胞には存在しないという観点から、この酵素は遺伝子調節の研究におけるレポーター遺伝子として特に適している（スブラマニ（Subramani）およびデルカ（DeLuca）、1987）。
ルシフェラーゼ活性を測定することに関する１つの欠点は最高値を達成させる理想的反応条件下での光シグナルの安定性が乏しいことである（デルカ（DeLuca）等、1979）。このことは、発光反応に必要な成分を基質溶液に添加した直後、生成する光を測定できる測定装置内でルシフェラーゼ活性を最もよく測定しうることを意味している。レポーター遺伝子を用いた研究でルシフェラーゼ活性を測定する上でのもう一つの問題は酵素を放出させるための細胞の分解であり、そのためのステップがさらに必要となる（ブレージア（Brasier）等、1989）。
また、本発明の別の特徴は、細胞培養物中で発現されたルシフェラーゼ活性を測定することを目的とする試薬に関する。
本発明の該試薬は単一ステップで直接細胞培養物中の発現されたルシフェラーゼ活性を測定することが可能である。この試薬は一方で界面活性剤により細胞を分解し、他方ではルシフェラーゼ反応に必要な基質を提供する。選択された基質を含む該試薬により、特に変化のない光シグナルが得られ、この事により試薬添加後２乃至20分の間でルシフェラーゼ活性を測定することが可能となった。さらに、この試薬はレディー・トゥー・ユースの状態で少なくとも１週間安定である。この試薬には、トリシン、HEPES、グリシルグリシン、リン酸、トリス等（望ましくはトリシン）の適当な緩衝物質を含む基本バッファが含まれる（リーチ（Leach）およびウェブスター（Webster）、1986）。このバッファのpHは６乃至９の範囲、望ましくは７乃至８の範囲にある。さらに、マグネシウム塩、望ましくは硫酸マグネシウム・７水塩（MgSO4・7H2O）が10乃至0.1g/l、望ましくは4g/lの濃度で添加される。ルシフェラーゼ反応に必要な基質は以下の濃度で存在することが望ましい：
アデノシン三リン酸（ATP）0.05乃至5g/l、望ましくは0.7g/l、ルシフェリン0.001乃至0.1g/l、望ましくは0.015g/l。さらに、バッファは約0.2g/lの量のエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA）等の複合体形成剤を含む。
望ましい基本バッファ（ルシフェラーゼ反応の基質を含む）には、25mmol/lのトリシン、0.5mmol/lのEDTA、16.3mmol/l MgSO4・7H2O、1.2mmol/l ATPおよび0.05mmol/lのルシフェリン・ナトリウム塩が含まれる。
ルシフェラーゼを安定化するために、ジチオスレイトール（DTT）またはβ−メルカプトエタノール等の温和な還元剤を単独または他の還元剤と組み合わせて使用する。この種の還元剤は酵素中のSH基の酸化およびそれに伴う発光反応中のルシフェラーゼの失活をを防止する。DTTは0.1乃至50g/l、望ましくは1g/lの濃度で使用する。BMEは0.1乃至50ml/l、望ましくは4ml/lの濃度で添加する。
発光を安定化および強化するために、さらにトリポリリン酸ナトリウム（NaTPP）を0.005乃至5g/l、望ましくは0.2g/lの濃度で使用する。トリポリリン酸ナトリウムの代わりにピロリン酸ナトリウムも使用しうる。
細胞はTriton X−100、Tween 20またはNP40、ブリッジ等の適当な界面活性剤を用いて分解する。Triton X−100は0.01乃至５％、望ましくは0.1％の濃度で使用する。
また、レポーター遺伝子としてアクオリア・ビクトリア由来の酵素アポアクオリンをコードする遺伝子を使用しうる（タナハシ（Tanahashi）等、1990）。この酵素はカルシウムイオンとの結合後、コファクターのコエレンテラジンの存在下で確立された自動化法によって測定しうる生物化学発光を高収率で生成する利点を有する。さらに、利点としてこの酵素は哺乳類細胞では内在的に発現されていないことが挙げられる。
センサーDNAを構築する際、レポーター遺伝子は、一つ以上の先行するTREまたはCRE調節要素によって調節しうる構成的な、望ましくは弱いプロモーター要素のコントロール下に置かれる。最も適したセンサーDNAの構築は、種々のセンサーDNAプラスミド構築物で細胞を一時的にトランスホームし、一方ではレポーター遺伝子、他方ではコントロール配列を変化させ、その感度に関してレポーター遺伝子産物の測定値を評価することで決定する。当業者は特に哺乳類細胞の於ける発現に適したコントロール配列に親しんでいる。選択は当初は関連文献に従ってもよいし（例えばランドシュルツ（Landschulz）等、1988、ターナー（Turner）およびジャン（tjian）、1989）、実行するのが容易である先に述べた一時的トランスフェクション実験で絞っていき、目的を達成していくことも出来る。適当なプロモーターの例にはβ−グロビンプロモーターおよびTKプロモーターがある。望ましい場合には、既知の天然の、もしくは合成したプロモーターを、例えば、プロモーター機能に必要な最小配列にまで短縮するなどして修正する。望ましい場合には、cAMPまたはIP3/DAGによって誘導しうる遺伝子であって、プロモーターおよび調節要素（モントミニ（Montminy）等、1990、デゥーシ（Deutsch）等、1988）、例えばICAM−１遺伝子の5'調節配列を含む遺伝子の調節配列を使用しうる。もし、アポアクオリン遺伝子をレポーター遺伝子として使用するなら、この遺伝子は強力な構造的プロモーターのコントロール下に置かれる。
一般に、センサーDNAに含まれる調節配列（隣接配列を含むCREまたはTRE要素）の選択は、所定の細胞系において感度良く検出可能なレポーター遺伝子の誘導を提供する適性を予備実験で検定した文献から知ることができる要素から始めて経験的に決定される。隣接配列を含む適当な調節要素の例には、ソマトスタチン「ヴァソアクティブ・インテスチナル・ペプチド」、サイトメガロウイルス・エンハンサー、子牛白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（BLV LTR）（CRE要素）およびICAM−１、コラゲナーゼ、パラチロイド・ホルモン（TRE要素）の配列が含まれる。もし、天然の配列中に含まれるTREまたはCREモチーフが完全なコンセンサス配列を有していないならば、これらを、または場合によってはこれらの隣接配列を１つ以上のヌクレオチドを交換することにより修正しうる。
調節要素（TREまたはCRE要素）およびこれらの隣接配列は合成したものでも、天然のものに由来するものでもよい。もの、細胞型に依存してcAMPおよび／またはIP3/DAGに応答することが知られている天然の配列を使用するなら、細胞を例えばTPAおよびホルスコリンで処理することにより、それが応答する第２メッセンジャーに関してプレ・テスト細胞で調べておく。
センサーDNAには１つ以上のTRE要素に加えて１つ以上のCRE要素を含ませる。この種のセンサーDNAを用いれば１つまたはもう１つののシグナル誘導経路の活性化または両シグナル誘導経路の平行した活性化の両方を検出しうる。
場合によってはレポーター遺伝子の発現に関するIP3/DAGおよび／またはcAMPの調節効果を強調するために、多くのCREおよび／またはTRE調節配列をタンデムに含む構築物も使用しうる。この調節配列には３乃至12個のTREおよび／またはCRE要素が含まれることが望ましい。この構築物の個々の要素を整列させる際には、転写因子がCREまたはTRE要素に結合しうるように互いのTREおよび／またはCRE要素の間隔を選択する。また、立体的配置の観点から決定されるTREまたはCRE要素の至適間隔は、例えばTATAボックス由来のもの等、転写に影響する他の調節DNA要素からの間隔と同様に予備テストで経験的に決定する。TREまたはCRE要素および／またはその隣接配列は同一か、もしくは少なくとも部分的に異なっていてもよいが、後者の態様はタンデム型になっていることが望ましい。
また、CREまたはTRE要素の調節能に影響を与えることが知られているCREまたはTRE要素に隣接する配列のように、天然において特定の調節要素を囲んでいる配列で特にその前後の配列を使用する事は望ましい（モントミニ（Montminy）等、1990、デゥーシ（Deutsch）等、1988）。その配列または配置は経験的に決定する。
センサーDNAの要素および選択に使用するマーカー遺伝子は、２つの別個のプラスミド上に存在して、一方がレポーター遺伝子構築物を含み（調節配列を含む発現コントロール配列を含む）、他方が選択マーカー遺伝子構築物を含んでもよい。
適当な選択マーカー遺伝子構築物の例には、その構築法が、例えば「クローニングベクター」等の関連マニュアルで見ることができるプラスミドpRSVneo、pSV2neo、pRSVgpt、pSV2gptがある。もし、別個のベクターを使用した場合は、細胞をその２つのベクターでコトランスホームし、そのマーカーで選択する。選択マーカーの存在で互いに物理的に結合していないDNAセグメント上に存在する２つの遺伝子のコトランスホーメーションはしばしばコトランスホーメーションされた両遺伝子の発現を誘導することが知られていることから、その細胞がレポーター遺伝子構築物も含むと結論づけさせる（ウィナッカー（Winnacker）、1985）。
テスト操作で使用する測定システムに関しては、望ましくは、例えばプロモーター配置の構造的変化等センサーDNAの構築法を変化させることにより、測定シグナルの最高値と通常値の比を完成させていくことが望ましい。バックグランド・シグナルは高感度でレポーター遺伝子発現の誘導を検出しうるのに十分なほど低く、同時にネガティブ・コントロールに関して検出限界を決定するのに十分なほど高いことが望ましい。
レセプターDNA構築物に関してはレセプター配列が強力で構成的なプロモーターのコントロール下にあることが望ましいこと以外は基本的にセンサーDNA構築物と同様の考え方が採用される。必要な場合は、レセプターをコードする配列および選択マーカーはレセプターDNAの場合も同様に細胞にコトランスホームされた２つの別個のプラスミドに存在してもよい。
センサーまたはレセプターDNAによる細胞のトランスフェクションは従来のトランスフェクション法、望ましくはエレクトロポレーション、カルシウム沈殿法、リポフェクションを用いて行う（例えば、ポッター（Potter）等、1984、フェルグナー（Felgner）等、1987）。
一般に、細胞を先ずセンサーDNAでトランスホームしてプレ・テスト細胞を作り、次いでレセプターDNAをトランスホームしてテスト細胞を作製する。
他のエフェクターシステムによる誘導が最小となることを目的とする事から望ましくはセンサーDNAの構築はプレ・テストまたはテスト細胞の単一の特定のエフェクターシステムにより最高の誘導性が達成されるように完成度を高めることが望ましい。従って、TREテスト細胞はレセプター依存的にホスホリパーゼＣシグナル誘導経路を調節する物質に特異的に応答する事が望ましい。
先に説明したようにテスト物質によるレセプター非依存的影響を除外するために、平行して対応するTREプレ・テスト細胞をこの物質で処理する。ホスホリパーゼＣ−エフェクターシステムに関するこの物質の特異性を明確にするために、場合によってはネガティブ・コントロールとしてプレ・テスト細胞をCRE−センサーDNAでトランスホームし、誘導されたテスト細胞をさらに検定している同じレセプターでトランスホームする測定を行う。
発見された物質により検定しているレセプターに関するホスホリパーゼＣ−シグナル誘導経路への影響をモニターするためには、さらにTREテスト細胞を別の種々のレセプターでトランスホームし、この物質で処理するコントロールテストを行うと便利である。もし、一般に薬剤の特異性に関してはそうであるようにある物質だけが特異的に１つのレセプターに影響するならば、この物質だけがそのレセプターを調節しうる。
TREテスト細胞を得るためのTREプレ・テスト細胞のトランスフェクションに適したレセプターは、ホスホリパーゼＣ・シグナル誘導経路と共役しうるすべてのレセプターである。これらには、α１型のα−アドレノセプター（アドレナリン）−レセプター、アンジオテンシンIIレセプター、アトリオナトリウレチック・ペプチドレセプター、ボンベンシン・レセプター、ブラジキニン・レセプター、コレシストキニンおよびガストリン・レセプター、エンドセリン・レセプター、メタボトロフィック・エクシタトリー・アミノ酸レセプター、ヒスタミン・レセプター（H1）、セロトニン・レセプター（５−HT1C、５−HT2）、リュウコトリエン・レセプター（LTB4、LTD4）、ムスカリニック・アセチルコリン・レセプター（M1、M3、M5）、ニュウロペプチド・Ｙ−レセプター（また、PYY、NPP）、ニュウロテンシン・レセプター、PAF（血小板活性化因子）レセプター、プロスタノイド・レセプター（EP1-3、FP、TP）、P2−プリオセプター（P2ガンマ）、タチキニン・レセプター（NK1,2,3）、バソプレシンおよびオキシトシン・レセプター（V1A、V1B、OT）、トロンビン・レセプター等が含まれる。また、これらの多くはアデニレート・シクラーゼ等の他のエフェクターと共役しうる。先に述べたレセプターおよび他の適当なレセプター並びにそれらのレセプターが共役するエフェクターは文献中に見られる。例えば、TiPSレセプター・ノーメンクレーチャー・サプルメント、1991に纏められている。
ホスホリパーゼＣを活性化し、従って基質細胞をトランスフェクションするのに本発明にしたがって使用しうる非−Ｇプロテイン共役レセプターの例には、FGF−レセプター、インシュリン・レセプター、PDGF−レセプター、BGF−レセプター群のメンバーが挙げられる（ウルリッヒ（Ullrich）およびシュリジンガー（Schlessinger）、1990）。
アデニレート・シクラーゼ・エフェクターに共役し、CREテスト細胞を得るためにCREプレ・テスト細胞をトランスフェクションするのに使用しうるレセプターもTiPSレセプター・ノーメンクレーチャー・サプルメント、1991に示されている。この例にはアデノシン（A1、A2）、アドネナリン（β−およびα２−型）、ドーパミン（D1、D21（＝D2A）、D2S（＝D2B）、ヒスチジン（H2−型）、セロトニン（５−HA1A−および５−HT1D−型、５−HT4）、アセチルコリン（M2−またはM4−型）およびエンセファリンに対するレセプターが含まれる。
（もし、またクローン化されていないレセプターまたはそのcDNAが適当なベクターに準備されていないレセプターを使用するなら、例えば、cDNAまたはゲノムバンクのスクリーニングによってレセプターDNAを入手し、クローン化することが出来る。
もし、レセプターがアデニレート・シクラーゼと負に共役している（例えば、M2−またはM4−型のアセチルコリン・レセプター、ニュウロペプチド・Ｙ−レセプター）、すなわち、レセプターの活性化がcAMP濃度の低下をもたらすならば、cAMP濃度の減少は以下のように測定する。細胞をテスト物質で処理する；もし、アゴニスト適に作用する物質ならばレセプターが活性化され、cAMPレベルが低下する。同時もしくはその後、細胞をcAMP濃度を増加することが知られている物質で処理する。また、逆に先ずcAMP濃度を増加し、次いで検定する物質とのインキュベーションを行うこともできる。（cAMPレベルの増加は、例えばホルスコリンを用いて直接的に、またはアデニレート・シクラーゼと正に共役しているレセプターに関してアゴニスト効果を有している物質で細胞を処理することにより間接的に行うことができる。このレセプターは内在性レセプターか、または細胞にコトランスフェクトしたレセプターである。）コントロールとして、cAMP濃度の増加のみが測定される同一のインキュベーション条件の平行テストを行う。シグナル値の差は物質の活性に寄因させうるcAMP濃度の低下に対応する。これはアデニレート・シクラーゼ活性のレセプター依存的低下の尺度となる。もし、細胞内に本来存在するcAMP濃度が非常に低く、従ってこの濃度の減少が測定器で検出しえない場合は、負のアデニレート・シクラーゼの共役によりレセプター活性化を間接的に測定することが必要となる。
取り分け、クロストークによりホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に加えて活性化がアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムを調節するレセプターも本発明の範囲内で使用しうる。もし、センサーDNAがIP3/DAG濃度の変化のみに応答するなら（TRE−センサーDNA）、TRE要素が結合するシグナルは転写因子が活性化したときに発生する。平行してアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムが活性化されているかどうかとは無関係にシグナルまたはシグナルの一部はクロストークによって発生する。
レセプターDNAによる細胞のトランスホーメーション後、例えば、既知の放射能標識したアゴニストおよびアンタゴニストを使用する結合検定法を用いて、ポジティブクローンをレセプター発現に関して検定する。
細胞当たりのレセプターの分子数はスキャッチャード・ブロットで決定しうる（Human Pharmacology,1991）。
生理学的レセプター濃度に出来るかぎり近いレセプター数を有するクローンをレセプターDNAを含む安定したトランスホーマントから選択することが望ましい。（もし、レセプター数が高すぎる場合は、不完全または非特異的結合が起こり、特異的結合に加えて非特異的結合が同時にたのエフェクターシステムを活性化してしまう。もし、レセプター数が少ない場合はシグナルが小さすぎて測定にかからなくなってしまう）
一方はIP3/DAG濃度に応答し、他方はcAMP濃度に応答する２つの異なるプレ・テスト細胞に１つのレセプター、またはレセプターサブタイプをトランスフェクトしうる。（平行して使用する細胞は他のエフェクターシステム、例えばアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムに特異的なセンサーDNAを用いた検定により、例えば、ホルスコリンおよびTPA等のcAMPまたはIP3/DAG濃度を増加させるか、またはそのような増加を誘導する物質で細胞を処理することでcAMPシグナル誘導経路による特異的活性化が起こるかどうかを調べておく。これらの予備テストで使用する細胞は安定したトランスホーメーションを必要としないセンサーDNAのみでトランスホーメーションした細胞、またはレセプターDNAとコトランスホームした細胞のいずれかである。後者の場合、培地にはレセプターを活性化する物質を含めるべきではない。細胞がホルスコリンにのみ応答することが確認されれば、TRE/レセプター・トランスホーム細胞を用いて行った検定をCREテスト細胞を用い、同条件下で繰り返す。）特異的TRE細胞および特異的CRE細胞およびIP3/DAGおよびcAMPに応答するテスト細胞における特定の物質および特定のレセプター（サブタイプ）を用いて得られたデータを比較することにより、そのシグナルをどの程度クロストークに寄因させうるか、どのようにシグナルを２つのエフェクターシステムの内の１つのみの影響に結び付けうるかを確認する事ができる。
本発明の方法に従い潜在的な医薬的活性を検定する物質は天然物でも合成物質でもよく、純物質でも混合物（例えば野菜抽出物、醗酵液等）でも使用しうる。特に純物質は低分子合成有機物でもよい。最も大きな濃度範囲を検出するために物質の段階的希釈物を細胞に作用させる。インキュベーション時間は、例えば、所定のテスト細胞を既知のレセプターアゴニストで処理し、レポーター遺伝子発現の誘導が再現的に測定される時間を計測する事などにより経験的に決定する。一般にこの時点でインキュベーションを止めるが、通常は少なくとも１時間はかかる。テスト細胞の絶対数は重要ではない。特に細胞数は測定シグナルの検出限界および細胞の生育段階に依存し、その下限はテストユニット上で細胞を均一に分布させる技術によって制限される。96穴のマイクロプレートを使用する場合、細胞数は例えばテストユニット当たり約20,000乃至200,000細胞となるが、測定シグナルが十分感度を持ち、細胞の分布が正確に行われるなら、より低い細胞数が用いられる。細胞の生育段階は開始細胞の細胞型特異的性質に依存する。さらに、これは基本的に特定のレセプターによって決定される（種々のレセプターに関して、同じエフェクターシステムでも生育段階に依存して活性化の程度が異なる）。細胞の生育段階および細胞数も種々の生育段階におけるプレ・テストおよびテスト細胞におけるレポーター遺伝子発現の速度を測定する予備実験で経験的に決定する。
本発明の範囲において、TRE−センサーDNAでトランスホームした種々の細胞（TREプレ・テスト細胞）がDAGを刺激することが知られている物質の添加に応答し、それによりレポーター遺伝子の発現を誘導する一方、それらはcAMP増加部室には応答しないことを示すことができる。（センサーDNAは調節要素としてTRE要素を含むヒトICAM−１遺伝子（細胞内粘着分子１）の1.3kb5'隣接領域、または多くのタンデムに配列したICAM−１遺伝子のTRE要素を含んでいる）。ホスホリパーゼＣシグナル誘導経路と特異的に共役するレセプター（ヒト５−HT2−レセプター、ニュウロキニン２−レセプターおよびヒトM3−レセプターが使用された）でTREプレ・テスト細胞をトランスホームする場合、レセプターアゴニストによる処理後ルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定した。このアゴニストにより仲介される誘導はアンタゴニストの添加で停止した。一方、この効果はcAMPに応答するプレ・テスト細胞にホスホリパーゼＣ共役レセプターがトランスホームされば場合は検出されなかった。
また、本発明の範囲において、CRE−センサーDNAでトランスホームした（CHO細胞（CREプレ・テスト細胞）におけるCRE調節レポーター遺伝子の発現は、cAMPの濃度を増加する物質によってのみ増加した。IP3/DAG濃度の増加をもたらすか、またはこれを刺激する物質によるCREプレ・テスト細胞の処理ではルシフェラーゼ発現は誘導されず、またはドーパミンおよびムスカリニック・アセチルコリン・レセプターに対するアゴニストである物質により処理でもその発現は誘導されなかった。後者の結果は、細胞が内在的にこれらのレセプターを発現していないことを示している。CREプレ・テスト細胞をアデニレート・シクラーゼ・エフェクター・システムと正に共役するレセプターでトランスフェクションした場合（ドーパミンD1−レセプターを使用した）、D1−レセプターに対するアゴニストでルシフェラーゼ発現を誘導でき、また、この誘導は再びアンタゴニストで停止する。
本発明をによりレセプター依存的に細胞内のシグナル誘導経路を特異的に調節しうる物質を提供する高感度で多機能な方法が提供される。本発明にしたがった方法で見つかった物質はシグナル誘導経路の機能不全と関連する病気を治療するための薬剤の開発を目的としたガイド物質として役立つし、また、さらに例えば一次細胞を用いた二次スクリーニングおよびその後の動物の臨床試験によるそれらの医薬的性質の検定に使用しうる。従って、必要とされる動物の数は本発明の方法を使用する事により有意に軽減される。
また、本発明の方法、例えば96穴マイクロプレート等の細胞培養容器の導入、テスト物質溶液の導入、インキュベーションおよび洗浄ステップおよび、例えば、レポーター遺伝子産物としてルシフェラーゼを使用した場合のリミノメーター等の装置はロボットで運転することが出来ることから自動化しうるという利点を有する。従って、本発明は例えば、１週間に2000種の物質または物質の混合物をテストしうる高効率のスクリーニング・プロモーターに適している。
また、本発明の方法を用いることにより、リガンド結合部位に関して非競合的に作用するアロステリックに作用する物質を検出しうる。
さらに、本システムの利点には、ある物質が特定の多段階レセプター依存細胞内シグナル誘導経路のいくつかの段階に介在する場合に、特定のシグナル誘導経路の調節に最も好ましいパラメーターを検出できる期待がより大きいという事がある。使用しうる多数のレセプターおよびレセプター・サブタイプに関する本システムの多様性は医薬的に活性な物質を発見するのに種々の指示タイプの使用を可能にしている。また、本発明のシステムは特異的レセプターおよびレセプター・サブタイプを注意深く選択することにより種々の細胞システム、例えば中枢神経系や末梢神経系における重要メカニズム間の優れた特異性を区別しうる。
また、本発明の方法により、リガンドに対する医薬的または生化学的特徴を明らかにされたレセプターをクローン化しうる。オペレーターは対応するプレ・テスト細胞系列をトランスホームするcDNAまたはゲノムバンクを取り扱うことから始める。レセプターの発現はレセプターがリガンドの結合により活性化された後のレポーター遺伝子の発現により示される。
（図面の説明）
第１図：プラスミドpADneoの構築
第２図：プラスミドpADneoTKの構築を目的としたPCR後のBgl II−BamH Iフラグメント
第３図：プラスミドpADneoTK
第４図A:プラスミドpADneoTKluciの構築
第４図B:プラスミドpADneoBGluciの構築
第５図：プラスミドpRc/RSVΔNae Iの構築
第６図：プラスミドpRc/RSVneoの構築
第７図：プラスミドpADneo2BGluciの構築
第８図:3個のCRE要素を含むオリゴヌクレオチド配列
第９図:6個のCRE要素を含むプラスミドpADneo2−6C−BGLの構築
第10図：プラスミドpHEBo
第11図：プラスミドp290
第12図：プラスミドpAHygCMV1
第13図：プラスミドpAHygCMV2
第14図：プラスミドpBHluc1.3
第15図:ICAM−１遺伝子の5'調節配列を含むプラスミドpADneo（1.3ICAM）luci
第16図:ICAM−１遺伝子の３個のTRE要素を含むプラスミドpADneo（3TRE）BGluci
第17図:5HT2レセプターをコードする配列を含むプラスミドpAD−CMV2−5HT2
第18図：ドーパミン−D1−レセプターをコードする配列を含むプラスミドpAD−CMV2:D1
第19図A:NK2レセプターをコードする配列を含むプラスミドpAHyg−NK2
第19図B:5HT2レセプターをコードする配列を含むプラスミドpAHYG−5HT2
第20図：細胞系列A549、HeLaおよびCOS−７におけるTPAによるTRE−センサーDNA（pBHluc1.3）の誘導
第21図A:HeLa細胞においてTPAによって起こるがホルスコリンによっては起こらないTRE−センサーDNA（pBHluc1.3）の誘導
第21図B:COS細胞においてTPAによって起こるがホルスコリンによっては起こらないTRE−センサーDNA（pBHluc1.3）の誘導
第22図：細胞系列A549、HeLaおよびCOSにおいてTPAによって起こるがホルスコリンによっては起こらないTRE−センサーDNA（pADneo（3TRE）BGluci）の誘導
第23図A:COS−７細胞におけるTPAによる、３または６個のTRE要素が互いに異なる間隔で含まれているTRE−センサーDNAの誘導
第23図B:A549細胞におけるTPAによる、３または６個のTRE要素が互いに異なる間隔で含まれているTRE−センサーDNAの誘導
第24図:COS−７細胞においてムスカリン性M3レセプターにアゴニスト的に作用する物質を結合する事によるTRE−センサーDNA（pADneo（3TRE）BGluci）の誘導
第25図:A）5HT2レセプターDNAでトランスホームしたCOS−７細胞においてアゴニスト的に作用する物質を5HT2レセプターに結合することによるTRE−センサーDNA（pBHluc1.3）の誘導
Ｂ）5HT2レセプターDNAでトランスホームしたCOS−７細胞における5HT2レセプターに対してアゴニスト的に作用する物質によるCRE−センサーDNA（pADneo2−C6−BGL）の非誘導
第26図:A）ドーパミンD1レセプターDNAでトランスホームしたCOS−７細胞においてTPAによっては起こるが、ドーパミンD1レセプターに対してアゴニスト的に作用する物質によっては起こらないTRE−センサーDNA（pBHluc1.3）の誘導
Ｂ）COS 7細胞においてホルスコリンおよびドーパミン−D1−レセプターにアゴニスト的に作用する物質を結合する事によるCRE−センサーDNA（pADneo2−C6−BGL）の誘導
第27図:TREプレ・テスト細胞系列およびヒトのニュウロキニン２レセプターを発現するTREテスト細胞系列NK2−122のおけるルシフェラーゼ発現の誘導
第28図:NK2特異的アゴニストによるルシフェラーゼ誘導の速度論
第29図A:ニュウロキニンによるヒトのニュウロキニン２レセプターの活性化に依存するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線
第29図B:ニュウロキニンレセプターに対するアゴニストによるヒトのニュウロキニン２−レセプターの活性化に依存するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線
第30図:NK2特異的アンタゴニストによるニュウロキニンＡのアゴニスト的活性の阻害
第31図:5HT2レセプターを発現するテスト細胞系列におけるセロトニン誘導型ルシフェラーゼ発現の速度論
第32図：アゴニストによるヒトの5HT2レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線
第33図:cAMPまたはIP3/DAG濃度を修正するか、またはそれらの濃度変化を誘導する種々の物質またはレセプター特異的アゴニストによるCREプレ・テスト細胞（pADneo2−C6−BGLで安定にトランスホームしたCHO細胞）処理
第34図：ホルスコリンによるCREプレ・テスト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子の活性化の転写に関する投与量・活性曲線
第35図A:ホルスコリンの投与量に関するCHO細胞中でのルシフェラーゼ誘導の速度論
第35図B:ホルスコリンの投与量に対するCHO細胞におけるルシフェラーゼ誘導の速度論
第36図:CRE−センサーDNAおよびドーパミン−D1−レセプターDNAで安定にトランスホームしたCHOプレ・テスト細胞およびテスト細胞の種々の物質による処理
第37図Ａ、第37図Ｂ、第38図Ａ、第38図B:ドーパミン−D1−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線
第39図Ａ、第39図B:ドーパミン−D5−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線
第40図：ルシフェラーゼ活性を測定するための試薬の完成
本発明は、以下に示す実施例によってより良く説明される。
実施例で使用されている物質の活性は以下に示す表に示されている。
A23187  Ca2+−イオノフォア
アポモルフィン  ドーパミン・レセプターに対するアゴニスト
アトロピン  ムスカリン性レセプターに対するアンタゴニスト（非特異的）
ブロモクリプチン  ドーパミン・レセプターに対するアゴニスト
カルバコール  ムスカリン性レセプターに対するアゴニスト
クロザピン  ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（D4特異的）
ジブチリル−cAMP（dbcAMP）  膜透過性cAMP誘導体
ドーパミン  ドーパミン・レセプターに対するアゴニスト
フルペンチクソール  ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（D1特異的）
ホルスコリン  アデニレート・シクラーゼの刺激剤（cAMPの増加）
ハロペリドール  ドーパミン、レセプターに対するアンタゴニスト（D2特異的）
IBMX  ホスホジエステラーゼ阻害剤（cAMPの蓄積）
ケタンセリン  セロトニン・レセプターに対するアンタゴニスト（５−HT2特異的）
PMA（TPA）  プロテイン・キナーゼＣアクチベーター、IP3/DAGを刺激
SCH233390  ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（D1特異的）
セロトニン（５−HT）  セロトニン・レセプターに対するアゴニスト
セピロペリドール（＝スピペロン）  アンタゴニスト（５−HT1A−レセプター＞ドーパミン・レセプター）
SKF−38393  ドーパミン・レセプターに対するアンタゴニスト（D1特異的）
実施例１
哺乳類細胞におけるレポーター遺伝子の発現を目的とした基本ベクターの調製
ａ）プラスミドpADneoの構築
プラスミドpBluescript SK＋（ショート（Short）等、1988、ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA）およびpRc/CMV（インビトロゲン、サン・ディエゴ、CA:カタログ番号V750−20）の一部から、大腸菌における複製開始点（ori）およびアンピシリン耐性の選択マーカー（Amp、β−ラクタマーゼ）を含むプラスミドを調製した。M13のインタージェニック領域はヘルパーファージ（例えば、R408またはM13K07;ストラタジーン）によるトランスホームしたバクテリアのスーパーインフェクション後の一本鎖の調製を可能にし、該プラスミドのシーケンシングおよび突然変異誘発を容易にする。さらに、SV40のアーリー・プロモーター（SV40）の転写コントロール下にあるネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo）およびSV40のポリアデニレーション・シグナル（SV40 poly（Ａ））も存在する。
プラスミドpBluescdript SK＋をHind IIIで線状にし、DNA100ngを100μｌのPCR混合物（（サイキ（Saiki）等、1988）（反応液:50mM KCl、10mMトリス−HCl（pH8.3）、1.5mM MgCl2、0.01％（w/v）ゼラチン、0.2mM各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、100μｌ当たり2.5ユニットのTaqポリメラーゼ）に入れた。使用したプライマーは各50pmolの合成オリゴヌクレオチドEBI−1730（SEQ ID NO:3）（5'−ＧGAATTCGCGCCCTGTAGCGGCG−3'）およびEBI−2134（SEQ ID NO:4）（5'−CACTGAACTCGAGCAGCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCC−3'）である。94℃、５分間の変性後、10サイクルのPCRを行った（サイクル条件:94℃、40秒;55℃、45秒;72℃、５分、パーキン・エルマー・シータス、サーマル・サイクラー）。オリゴヌクレオチドは中間にβ−ラクタマーゼ遺伝子を有するM13のインタージェニック領域または複製開始点（ori）に隣接している。同時に、oriの一端にXho I部位、他端にEcoR I部位が生成する（オリゴヌクレオチド配列の下線部分）。フェノール・クロロホルム抽出でタンパク質を除き、DNAをエタノールで沈殿させる。得られたDNAをXho IおよびEcoR Iで切断し、アガロース・ゲル電気泳動で2.2kbのフラグメントを単離した。
プラスミドpRc/CMVをEcoR IおよびSal Iで二重切断した後、アガロース・ゲルを用いた電気泳動で分離して、SV40プロモーター、neo遺伝子およびSV40ポリ（Ａ）シグナルを含む1.5kbのフラグメントを単離した。2.2kbのベクターDNA100ngを２−３倍量の1.5kbの挿入DNAとT4DNAリガーゼの存在下、14℃で一晩インキュベーションし、次いで、DNA取り込みようにコンピテント細胞とした大腸菌JM101（チャン（Chung）およびミラー（Miller）、1988）にこのDNA試料をトランスホームした後アンピシリン耐性で選択した。生成したコロニーからプラスミドDNAを取り出し、種々の制限酵素による切断で特徴を調べた。望ましい構造のプラスミドをpADneoと命名した（第１図）。
ｂ）プラスミドpADneoTKの構築
プラスミドpADneoの中に２つのポリクローニング部位に隣接するヘルペス・シンプレックス・ウイルス・タイプＩ（HSV−Ｉ）のチミジン・キナーゼ（TK）遺伝子のプロモーター領域を挿入した。このDNAフラグメントはPCRによって生成した。TKプロモーターの前駆体として、プラスミドpX1を使用し（ワグナー（Wagner）等、1981）、ポリクローニング部位は5'末端での増幅プライマーの延長で生成させているので、5'末端はもはや前駆体に相補的ではなくなっている。100ngのプラスミドpX1を各々50pmolのオリゴヌクレオチドEBI−2983（SEQ ID NO:5（5'−GACTTCAGATCTGCGGCCGCCTCGAGGGTACCGTTAACGTCGACAAACCCCGCCCAGCGTCTTG−3'）およびEBI−2984（SEQ ID NO:6）（5'−GACTTCGGATCCGAGCTCACTAGTTCTAGAAAGCTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGC−3'）を用いた20サイクルのPCRにかけた（サイクル条件:94℃、40秒;55℃、45秒;72℃、１分）。フェノール／クロロホルムによるTaqポリメラーゼの除去およびDNAのエタノール沈殿後、末端をBamH IおよびBgl II（下線部分）で切断し、アガロース・ゲルによる電気泳動で0.2kbのフラグメントを単離した（第２図）。次いで、このDNAをBamH Iで線状化したプラスミドpADneoと連結し、大腸菌JM101にトランスホームした。neo遺伝子と同じ配向のTKプロモーターを有するプラスミドをpADneoTKと命名した（第３図）。これはTKプロモーターの5'側にプロモーターを調節する調節配列をクローニングするためのNot I、Xho I、Kpn I、Hpa IおよびSal I切断部位を含み、かつ、TKプロモーターの3'側にレポーター遺伝子の挿入に使用するHind III、Xba I、Spe I、Sac IおよびBamH I切断部位を含む。
ｃ）プラスミドpADneoTKluciの構築
SV40 poly（Ａ）領域を含むフォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）のルシフェラーゼ遺伝子を2.5kbのHind III−BamH IフラグメントとしてプラスミドpSV232 AL−ＡΔ5'（デ・ウェット（De Wet）等、1987）の誘導体pBHluc（ボラバーガー（Voraberger）等、1991）から単離した。pADneoTKをHind IIIおよびBamH Iで二重切断し、プラスミドpBHluc由来の2.5kbのHind III−BamH Iフラグメントに連結した。大腸菌JM101のトランスホーメーション後に得られた望ましい構造のプラスミドをpADneoTKluciと命名した（第４図Ａ）。このプラスミドで哺乳類細胞においてTKプロモーターのコントロール下、ルシフェラーゼの発現が可能となった。
ｄ）プラスミドpADneoBGluciの構築
レポーター遺伝子の誘導能を向上するために、TKプロモーターをウサギβ−グロビン遺伝子の最小プロモーター配列で置換した。プラスミドpADneoTKluciをSal IおよびHind IIIで二重切断し、アガロース・ゲルからベクター成分を単離した。Sal IおよびHind III適合末端に隣接するβ−グロビンプロモーターは、合成オリゴヌクレオチドEBI−3182（SAQ ID NO:7）（5'−GACTTCGGATCCGAGCTCACTAGTTCTAGAAAGCTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGC−3'）およびEBI−3184（SEQ ID NO:8）（5'−AGCTTGTAAGCAGCAGCTGCAGTGCTCTGCCTTTTATGCCCAAGG−3'）により調製した。これら２つのオリゴヌクレオチドはT4ポリヌクレオチド・キナーゼおよびATPとインキュベートすることにより5'末端をリン酸化し、次いで先に述べたベクターに連結した。大腸菌JM101へのトランスホーメーション後、正しい配列を含むプラスミドをpADneoBGluciと命名した（第４図Ｂ）。
ｅ）プラスミドpRc/RSVΔNae IおよびpRc/RSVneoの構築
SV40複製開始点を含むプラスミドの複製が可能な細胞系列（例えばcos−７（ATCC CRL1651）および293（ATCC CRL1573））においてセンサーDNAを使用するために、上述のプラスミド中のneo遺伝子をコントロールするSV40プロモーターを別のプロモーター（例えば、ラウス・ザルコーマ・ウイルス（RSV）ロング・ターミナル・リピート（LTR））で置換する別の細胞を用いた比較実験をすることが望ましい。
neo遺伝子のための新しいカセットを調製するために、以下に述べるプラスミドpRc/RSVΔNae IおよびpRc/RSVneoを調製した。
プラスミドpRc/RSV（インピトロゲン、サン・ディエゴ、CA;カタログ番号V780−20）をNae Iで切断し、アガロース・ゲルから3.8kbのベクター成分を単離し、再連結した。結果的にneo遺伝子を含む1.6kbのフラグメントが欠失した。このプラスミドをpRc/RSVΔNae Iと呼ぶ（第５図）。
pRc/RSVΔNae IをHind IIIおよびXba Iで二重切断し、次いで、４種のデオキシヌクレオチドの存在下、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント（クレノー酵素）による処理でDNA末端を平滑化した。
プラスミドpADneoをEcoRVおよびBstB Iで二重切断し、これも同様にクレノー酵素による処理でDNA末端を平滑化してneo遺伝子を含む0.86kbのDNAフラグメントを単離した。上述のベクターとのライゲーションおよびトランスホーメーション後、得られた望ましい構造のプラスミドをpRc/RSVneoと命名した（第６図）。このプラスミドはRSVプロモーターの転写コントロール下のneo遺伝子および子牛成長ホルモン（bGH）およびSV40のポリアデニレーション・シグナルを含む。
ｆ）プラスミドpADneo2BGluciの構築
pADneoBGluciの発現カセットSV40プロモーター−neo遺伝子−SV40 poly（Ａ）シグナルをプラスミドpRc/RSVneo由来の発現カセットRSVプロモーター−neo遺伝子−bGHpoly（Ａ）と交換した。
プラスミドpRc/RSVneoをXho Iで切断し、そのDNA末端をクレノー酵素で平滑化した。オリゴヌクレオチドEBI−3285（SEQ ID NO:9）（5'−TCGATGCGGCCGCGACTTCAG−3'）およびEBI−3286（SEQ ID NO:10）（5'−CTGAAGTCGCGGCCGCＡ−3'）から調製したXho I−Not Iアダプターを切断したpRC/RSVneoのDNAに連結した。このようにしてXho I切断部位を破壊し、Not I部位（下線）を挿入した。DNAリガーゼの熱失活後、DNAをNru IおよびNot Iで二重切断し、アガロース・ゲルから1.54kbのフラグメントを単離した。このDNAフラグメントはRSV−neo−bGH−poly（Ａ）カセットを含んでいる。
プラスミドpADneoBGluciをEcoR Iで部分分解し、末端をクレノー酵素で平滑化した後Not Iで再び切断した。アガロース・ゲルから4.9kb長のDNAフラグメントを単離し、上述の1.54kbのNru I−Not Iフラグメントと連結した。大腸菌へのトランスホーメーション後、望ましい構造のプラスミドをpADneo2BGluciと命名した（第７図）。
ｇ）cAMPによって調節可能な要素（CRE−センサーDNA）を含むレポータープラスミドの構築
IP3/DAGに対するセンサーDNA（TRE要素を含む）トランスバース感受性をコントロールするために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコントロール下に発現カセットを置いた。CRE配列の選択は特徴付けられたCRE要素の組成にしたがって行った（モントミニ（Montminy）等、1990）。選択したCRE配列は一方では完全な８塩基長のパリンドローム・コンセンサス配列TGACGTCAを有しており、他方では周囲の配列中にSp1転写因子の認識配列（CCGCCCまたはGGGCGG）に対する類似性を示すGC対のグループをもはや持っていないものである。cAMPの調節効果を強調するために多くのCRE配列をタンデムに配列してある。もし、いくつかの繰り返しの中で全体的に同一の配列が出現し、クローニングおよび大腸菌における安定性に関して不都合な効果が起こることを避けるために、種々のCRE配列の組み合わせを使用した。
プラスミドpADneo2BGluceのβ−グロビンプロモーターの5'側に合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより、３つの連続するCRE配列を有する２つのプラスミド（pADneo2−C3BVC−BGLおよびpADneo2−C3SVC−BGL）を作製し、これらのプラスミドを合わせることにより、６つのCRE配列を有するプラスミドpADneo2−C6−BGLを調製した。
３重CRE配列は互いに相補的なDNA末端を有する２対のオリゴヌクレオチドを連結することにより作製した（第８図）。各20pmolのオリゴヌクレオチドEBI−3489（SEQ ID NO:11）（5'−GGCAGCTGACGTCACTGTCTGGTGC−3'）およびEBI−3491（SEQ ID NO:12）（5'−CTCCTTGGCTGACGTCAGTAGAGAGATCCCATGGC−3'）を15μｌのキナーゼ・バッファ中（70mMトリス−HCl（pH7.6）;10mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、2mM ATP）、15ユニットのポリヌクレオチド・キナーゼと37℃で１時間インキュベーションし、次いでこの酵素を熱で失活させた（95℃、５分）。同様にして、オリゴヌクレオチドEBI−3490（SEQ ID NO:13）（5'−CTCTACTGACGTCAGCCAAGGAGGTAC−3'）およびEBI−3494（SEQ ID NO:14）（5'−CGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAG−3'）の5'末端をリン酸化した。
等モル量の5'リン酸基を持たない相補的オリゴヌクレオチドをリン酸化したオリゴヌクレオチドと混合し:EBI−3492（SEQ ID NO:15）（5'−GGCCGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGC−3'）とEBI−3489;EBI3491（SEQ ID NO:16）（5'−CTCCTTGGCTGACGTCAGTAGAGAGATCCCATGGC−3'）とEBI−3490;EBI−3493（SEQ ID NO:17）（5'−TCGACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGTCTGAAAGACGTCACAGTATGACGGCCATGGGATCT−3'）とEBI−3494、次いで56℃で５分間インキュベーションした。10pmolの二本鎖オリゴヌクレオチド対EBI3489/EBI3492およびEBI−3493/EBI−3494を30μｌのライゲーションバッファ（70mMトリス−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトール、1mM ATP）中、１ユニットのT4 DNAリガーゼと共に14℃で一晩インキュベーションし、次いで、酵素を70℃、10分間の熱処理で失活した。連結したオリゴヌクレオチドは、50μｌのキナーゼバッファ中、15ユニットのポリヌクレオチドキナーゼと37℃で１時間インキュベートする事により5'リン酸化した。
同様に、オリゴヌクレオチドEBI−3490/EBI−3491およびEBI−3493/EBI−3494のペアも連結し、リン酸化した。
Not IおよびSal Iで二重切断したプラスミド100ngを１ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μｌのライゲーションバッファ中、EBI−3489/3492/3493/3494を含む連結したオリゴヌクレオチド複合体0.2molと22℃で４時間インキュベートし、大腸菌JM101にトランスホームした。これから得られたプラスミドを配列分析し、望ましい構造のプラスミドをpADneo2−C3BVC−BGLと命名した（第９図）。このプラスミドは子牛の白血病ウイルスLTR（BLV）、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（VIP）およびサイトメガロウイルス・プロモーター（CMV）由来の３個のCRE配列を含んでいる。（プラスミド名は略号「BVC」により配列を示している。）
同様に、オリゴヌクレオチド複合体EBI−3490/3491/3493/3494をKpn IおよびSal Iで二重切断したプラスミドベクターpADneo2BGluciにクローン化し、プラスミドpADneo2−C3SVC−BGLを得た（第９図）。このプラスミドはソマトスタチン（Som）、VIPおよびCMV由来の３個のCRE配列を含んでいる。（プラスミド名は略号「SVC」により配列を示している。）
６個のCRE配列を有するプラスミドを調製するために、プラスミドpADmeo2−C3BVC−BGLをBamH IおよびSal Iで二重切断し、アガロース・ゲルから3.8kbのベクター成分を単離した。プラスミドpADneo2−C3SVC−BGLをBamH IおよびXho Iで二重切断し、2.7kbの挿入物を単離した。これら２つのDNAフラグメントを連結し大腸菌にトランスホームした。得られた望ましい構造のプラスミドをpADmeo2−C6−BGLと命名した（第９図）。
ｈ）ハイグロマイシンＢ耐性マーカーを含む哺乳類細胞における遺伝子の発現を目的とした基本ベクターの調製
発現プラスミドpAD−CMV1およびpAD−CMV2（EP−A 393 438）およびpHEBo（サグデン（Sugden）等、1985）から出発して、CMVプロモーター／エンハンサーの転写コントロール下にある遺伝子またはcDNAの発現およびハイグロマイシンＢ耐性による選択を目的としたプラスミドを作製した。
HSVチミジン・キナーゼ・プロモーターの転写コントロール下にある細菌性ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（グリッツ（Gritz）およびデービース（Davies）1980）を含むプラスミドpHEBo（スグデン（Sugden）等、1985;第10図）をCla Iで切断し、そのDNAの末端をクレノー酵素で充填してからBamH Iで切断した。このベクターにCMVプロモーター／エンハンサー配列を含む0.76kbのBamH I−Hind IIIフラグメント（BamH I末端はクレノー酵素で充填されている）（スチンスキー（Stinski）およびロアー（Roehr）1985）をクローン化し、プラスミドp290（第11図）を得た。
CMVプロモーターおよびEBV ori Pを含むプラスミドp290のSpe I−EcoR Vフラグメントを切りだした。プラスミドpAD−CMV1をBgl IIで切断し、DNAの末端をクレノー酵素で平滑化した後、Spe Iで切断した。CMVプロモーター、ポリクローニング部位、SV40スプライスシグナルおよびpoly（Ａ）シグナルを含むゲル精製した1.6kbのDNAフラグメントを先に述べたp290のベクター部分と連結した。得られたプラスミドをpAHygCMV1と命名した（第12図）。
同様に、プラスミドpAD−CMV2からSpe I−Bgl IIフラグメントを単離し、p290のSpe I−EcoR Vベクター部分にライゲーションした。pAHygCMV1とは配向が逆のポリクローニング部位を含む該プラスミドをpAHygCMV2と命名した（第13図）。
プラスミドpAHygCMV1の全ヌクレオチド配列をSEQ ID NO:36に示す。
プラスミドpAHygCMV1上の各領域（塩基番号で示されている）は以下の配列に対応している：
１−767  CMVプロモーター
768−785  T7プロモーター
794−854  ポリクローニング部位
854−1552  SV40 t  イントロンおよびポリアデニレーションシグナル
1553−1736  ハムスターDHFR遺伝子の5'非コード領域
1737−2261  EBV ori P部分配列
2262−2856  ポリアデニレーションシグナルを含むHSVチミジン・キナーゼ3'非コード領域
2857−3912  ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子
3913−4161  HSVチミジン・キナーゼ・プロモーター
4162−6531  pBR322ベクター成分
6532−6623  部分的にはplink322に由来する種々のクローニングプロセスから形成されたリンカー配列（マニアチス（Maniatis）等、1982）
プラスミドpAHygCMV2のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:37に示す。ポリクローニング部位の領域のみpAHygCMV1と異なる。pAHygCMV2の856番のシトシンはpAHygCMV1の849番のシトシンと対応する。
実施例２
ホルボルエステル（TPA）で誘導可能な要素（TRE−センサーDNA）を含むレポータープラスミドの構築
細胞内粘着分子ICAM−１のヒト遺伝子の1.3kb5'隣接領域のクローニングおよび欠失分析は、このフラグメントがｉ）肺のアデノカルシノーマ細胞系列A549（ATCCCCL 185）においてTPAで誘導されるが、ホルスコリンでは活性化されないず、またii）DNA配列TGATTCAを含むTPA応答要素（TRE）を含むことを示した（ボラバーガー（Voraberger）等、1991）。従って、1.3kbの長いICAM−１フラグメントまたはタンデム状の３個のTRE要素を含むヌクレオチドをルシフェラーゼ遺伝子がTPAで誘導しうるベクターの構築に使用した。
ａ）プラスミドpBHluc1.3の構築
プラスミドpBHluc1.3（第14図）は、ルシフェラーゼ遺伝子に先行するICAM−１遺伝子の1.3kb長の調節領域を含んでいる。この調製法はボラバーガー（Voraberger）等、1991に示されている。
ｂ）プラスミドpADneo（1.3ICAM）luci（TRE−センサーDNA）の調製
先ず、プラスミドpADneo2BGluci（実施例１参照）からこのプラスミドを制限酵素Sal IおよびHind IIIで切断し、DNA末端を四種のdNTPおよびクレノー酵素で平滑化し、最後にT4 DNAリガーゼを添加することにより再ライゲーションさせることでβ−グロビンプロモーターを切りだした。pADneo2luciと命名したβ−グロビンプロモーターを持たないプラスミドをNot IおよびKpn Iで切断し、再びプラスミドBluescript KS（ボラバーガー（Voraberger）等、1991）から1.3kbのICAM−１フラグメントを切りだしてpADneo2luciにライゲーションした。pADneo（1.3ICAM）luciと命名したこのプラスミド（第15図）は、ルシフェラーゼ遺伝子に先行してICAM−１の調節およびプロモーター領域を含んでいる。
ｃ）プラスミドpADneo（3TRE）BGluci（TRE−センサーDNA）の調製
プラスミドpADneo2BGluciのβ−グロビンプロモーターの5'側にKpn I、Bgl IIおよびXho Iの制限部位をコードする合成オリゴヌクレオチドと、それに続く３個のTRE配列を挿入することによりこのプラスミドを調製した。これを行うために、オリゴヌクレオチドEBI−3677（SEQ ID NO:18）（5'−GGCCGCAGGTACCAGATCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCTGTAGAC−3'）、EBI−3671（SEQ ID NO:19）（5'−GCTTGAATCACGGTCTACACTCGAGTAGATCTGGTACCTGC−3'）、EBI−3678（SEQ ID NO:20）（5'−TCGACTAAGCTTGAATCACGGTCTACAGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACAGCTAA−3'）およびEBI−33672（SEQ ID NO:21）（5'−CGTGATTCAAGCTTAGCTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAG−3'）をリン酸化して実施例１と同様に等モル量の相補的オリゴヌクレオチドEBI−3677およびEBI−3671、およびEBI−3678およびEBI−3672を互いに付加させた。ベクターpADneo2BGluciをNot IおよびSal Iで切断し、等モル量の切断したプラスミドpADneo2BGluci、オリゴヌクレオチド対EBI−3677/3671およびオリゴヌクレオチド対EBI−3672/3678を混合し、T4 DNAリガーゼを添加して互いに連結させた。生成したプラスミドの配列分析を行い、望ましい３個のTRE配列を含むプラスミドをpADneo（3TRE）BGluciと命名した（第16図）。
ｄ）プラスミドpADneo（nTREdx）BGluciの調製
これらのプラスミドは、高いにｘ塩基長の間隔でｎ個のTRE要素を含んでいる。ｃ）と同様の方法で以下に示すオリゴヌクレオチドを使用して、プラスミドpADneo（3xTREd16）BGluci、pADneo（3xTREd21）BGluci、pADneo（3xTREd24）BGluci、およびpADneo（3xTREd34）BGluciを調製した：
pADneo（3xTREd16）BGluciについては、EBI−3775（SEQ ID NO:22）（5'−GGCCGCAGGTACCAGATCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGTGTAGAC−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3671（上述）、EBI−3776（SEQ ID NO:23）（5'−TCGACCTTGAATCACGGTCTACACTAAGCTTGAATCACGGTCTACACTAA−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3777（SEQ ID NO:24）（5'−CGTGATTCAAGCTTAGTGTAGACCGTGATTCAAGG−3'）；
pADneo（3xTREd21）BGluciについては、EBI−3771（SEQ ID NO:25）（5'−GGCCGCAGGTACCAGATCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTG−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3671（上述）、EBI−3772（SEQ ID NO:26）（5'−TCGACTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCAGGCTAA−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3774（SEQ ID NO:27）（5'−GTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAG−3'）；
pADneo（3xTREd24）BGluciについては、EBI−3780（SEQ ID NO:28）（5'−GGCCGCAGGTACCAGATCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTGGCGGTGTAGAC−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3778（SEQ ID NO:29）（5'−CCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACTCGAGTAGATCTGGTACCTGC−3'）、EBI−3779（SEQ ID NO:30）（5'−CGTGATTCAAGCTTAGCCTGGCGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTG−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3781（SEQ ID NO:31）（5'−TCGACAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCGCCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCG−3'）；
pADneo（3xTREd34）BGluciについては、EBI−3786（SEQ ID NO:32）（5'−GGCCGCAGGTACCAGATCTACTCGAGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTGGCCGGTTAGCGCGGTGTAGAC−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3782（SEQ ID NO:33）（5'−CGCGCTAACCGGCCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACTCGAGTAGATCTGGTACCTGC−3'）、EBI−3790（SEQ ID NO:34）（5'−TCGACAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACACCGCGCTAACCGGCCAGGCTAAGCTTGAATCACGGTCTACAC−3'）および相補的オリゴヌクレオチドEBI−3791（SEQ ID NO:35）（5'−CGTGATTCAAGCTTAGCCTGGCCGGTTAGCGCGGTGTAGACCGTGATTCAAGCTTAGCCTG−3'）。
６個のTRE要素を含む対応するプラスミドを得るために、３個のTRE要素を含む関連するプラスミドをNot IおよびXho Iで切断し、もう一度対応するオリゴヌクレオチドをライゲーションした。オリゴヌクレオチドの構築により、対応する間隔を有するTRE要素の重複が起こる。生成したプラスミドをpADneo（6xTREd16）BGluci、pADneo（6xTREd21）BGluci、pADneo（6xTREd24）BGluci、およびpADneo（6xTREd34）BGluciと命名した。
実施例３
Ｇプロテイン共役レセプターのクローニングおよび発現プラスミド（レセプターDNA）の調製
問題のヒト５−HT2−レセプターのcDNAを、cDNAバンクのスクリーニングによって入手し、発現ベクターpAD−CMV1またはpAD−CMV2（EP−A 393 438）にクローニングした。
ａ）ヒト５−HT2−レセプターをコードする配列を含むクローンの単離
ラットの５−HT2−レセプター配列を含むクローンによる（ジュリアス（Julius）等、1990、プリチェット（Pritchett）等、1988）ラムダZAPベクター（ストラタジーン936205）中のヒトのヒポカンパスcDNAバンクのホモロジー・スクリーニングにより、１つのクローンを単離し、プラスミドpBuescript SKに含まれる挿入物をシーケンシングした。そのDNA配列およびそこから誘導されたアミノ酸の配列をSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示す。公表されているラットの５−HT2−レセプターの配列（ジュリアス（Julius）等、1990）とヒトの５−HT2−レセプターのアミノ酸の配列の比較は90％の一致を示した。
ｂ）発現ベクターpAD−CMV2への５−HT2−レセプター配列のサブクローニング
発現ベクターpAD−CMV2をEcoR Iで切断し、４種のdNTPおよびクレノーフラグメントによりDNA末端を平滑化し、次いで、このベクターをBamH Iで切断した。このベクターに、プラスミドpBluescriptからSma IおよびBamH Iで切りだした５−HT2−レセプター配列をライゲーションし、得られたクローンをpAD−CMV2−５−HT2と命名した（第17図）。
ｃ）発現ベクターpAD−CMV2へのドーパミン−D1−レセプター配列のクローニング
pGEMブルー・プラスミド・ベクター（プロメガ）（ゾー（Zhou）等、1990）中に3kbのヒトのドーパミン−D1−レセプター配列のEcoR I−Sac Iフラグメントを含むプラスミドpHD1−gemをEcoR IおよびBamH Iで二重切断し、3kbのDNA挿入物を単離した。発現ベクターpAD−CMV2（EP−A 393 438）をEcoR IおよびBamH Iで二重切断し、3kbのd1−レセプターフラグメントをドーパミンD1レセプターがサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサー要素のコントロール下にあるようにクローン化した。得られたプラスミドをpAD−CMV1:D1と命名した（第18図）。
ｄ）発現ベクターpAHygCMV1へのNK2−または5HT2−レセプター配列のサブクローニング
プラスミドベクターpBluescript SK＋（ストラタジーン）中にNK2−レセプターcDNAを含むプラスミドpBluescript0NKから制限酵素Sal IおよびNot Iを用いてヒトのNK2−レセプターのcDNAを切りだして、このcDNAを発現ベクターpAHygCMV1（実施例1h）にクローン化し、生成したプラスミドをpAHyg−NK2と命名した（第19図Ａ）。
5HT2レセプター配列を上述のベクターpAD−CMV2−5HT2からXba I−Cla Iフラグメントとして切りだし、ベクターpAHygCMV2（実施例1h）にクローン化した。この構築物をpAHyg−5HT2と命名した（第19図Ｂ）。
実施例４
３種のプレ・テスト細胞におけるTRE−センサーDNAの誘導
以下に示す細胞系列：ヒト肺ガン細胞系列A549（ATCC CCL 185）、ヒト子宮ガン細胞系列HeLa細胞（ATCC CCL 2）およびモンキーの腎細胞系列COS−７（ATCC CRL 1651）を、各々A549−およびCOS−７細胞はRPMI−1640培地（ギブコ）およびHeLa細胞は10％熱失活ウシ胎児血清（FCS）を含むEarle's BSS添加MEM培地（ギブコ）中、５％CO2雰囲気下、37℃でインキュベートすることによりTRE−センサーDNA（pBHlucl.3）でトランスフェクションした。トリプシンおよび室温、1200rpm、５分間の遠心（ヘラウス製ミニフゥージ）によりトランスフェクション当たり１×107個の細胞が培養皿の表面から回収され、これを5mlの無血清培地で１度洗浄し、1200rpm、５分間の遠心後、1mlの無血清培地に懸濁した。この細胞を250μg/mlのDEAE−デキストラン、５μｇのプラスミドDNAおよび50μg/mlのクロロキンと混合し、37℃で30分間インキュベートした後FCSを含まない培地で１度洗浄してから10mlの新鮮な血清培地と37℃で一晩インキュベートした。培地を交換し、４時間後、1ml当たり10ngのTPAまたは20μＭのホルスコリンで細胞を誘導した。さらに18時間後、細胞をPBSで洗浄し、ゴム製スクラッパーでシャーレから落として室温、1200rpmで５分間遠心した（ヘラウス製ミニフゥージ）。細胞で100μｌの分解バッファ（１％Triton X−100、25mMグリシルグリシンpH7.8、15mM MgSO4、4mM EDTAおよび1mM DTT）で分解し、その分解物を５分間遠心して上清を新しい試験管に移した。30μｌの上清を350μｌの検定バッファ（25MMグリシルグリシンpH7.8、5mM ATP、15mM MgSO4）に添加し、その試験管をルミノメーター・ルマット9501に入れ、インジェクション・バッファ（0.2mMルシフェリン、20mMグリシルグリシンpH7.8）300μｌ注入することにより反応を開始してルシフェラーゼ検定を行った（デ・ウェット（De Wet）等、1985）。発光の測定時間は10秒で行った。
ａ）TPAでは起こるがホルスコリンでは起こらないpBHluc1.3の誘導
先に示したように細胞系列A549、HeLaおよびCOS−７にプラスミドPBhluc1.3を添加することによりトランスフェクションし、TPAを添加して誘導を行った。トランスフェクションされたが誘導が起こらない細胞をネガティブ・コントロールとして使用した。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーゼ検定を行った。実験結果を第20図に示すが、これらはプラスミドpBHluc1.3がテストした細胞中で10倍以上にも誘導可能であることを示している。ボラバーガー（Voraberger）等、1991は、この構築物はA549中でホルスコリンによって誘導されないことを示した。同様にHeLa細胞およびCOS−７細胞に対してこの結果を確認するために、もう一度これらの細胞をpBHluc1.3でトランスフェクトし、再びコントロールとして非誘導細胞を使用してTPAまたはホルスコリンによる誘導を行った。これらの実験結果として第21図Ａおよび第21図Ｂから分かるように、HeLa細胞およびCOS−７細胞もTPAによって誘導されるがホルスコリンによっては誘導されなかった。
ｂ）TPAによっては起こるがホルスコリンでは起こらないpADneo（3TRE）BGluciの誘導
細胞系列A549、HeLaおよびCOS−７をプラスミドpADneo（3tre）bgluciでトランスフェクトし、TPAまたはホルスコリンで誘導した。再び、トランスフェクトしたが誘導を受けなかった細胞をネガティブ・コントロールとして使用した。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーゼ検定を行った。実験結果を第22図に示すが、これらはICAM−１遺伝子のTRE要素のみを含むベクターはテスト細胞中でTPAによっては誘導されるが、ホルスコリンでは誘導されないことを示している。
ｃ）TPAでは起こるがホルスコリンでは起こらないプラスミドpADneo（nTREdx）BGluciの誘導
細胞系列COS−７およびA549をプラスミドpADneo（3xTREd16）BGluci、pADneo（3xTREd21）BGluci、pADneo（3xTREd24）BGluci、pADneo（3xTREd34）BGluci、pADneo（6xTREd16）BGluci、pADneo（6xTREd21）BGluci、pADneo（6xTREd24）BGluci、またはpADneo（6xTREd34）BGluciでトランスフェクトし、TPAまたはホルスコリンを添加して誘導を行った。再び、トランスフェクトされるが誘導されない細胞をネガティブ・コントロールとして使用した。特定のインキュベーション時間後、細胞を分解し、ルシフェラーゼ検定を行った。実験結果を第23図Ａおよび第23図Ｂに示したが、これらはｉ）６個のTRE要素を含む構築物に関するTPAによる誘導は３個のTRE要素を含む構築物の時よりも大きいこと（ホルスコリンでは構築物は誘導されない）、ii）６個のTRE要素を含む構築物のTPAによる誘導は、TRE要素の間隔が大きいときよりも小さいときの方がより大きいことを示している。
実施例５
TRE−センサーDNAのレセプター仲介誘導
細胞系列がＧプロテインを介してホスホリパーゼＣ−リパーゼシステムに共役している表面上にレセプターを発現し、かつ適当な時間にレセプター特異的アゴニストを添加したならば、PAで誘導可能なセンサーDNAが誘導されることを示すために、COS−７細胞をTRE−センサーDNAとレセプター−DNAでコトランスフェクトした。COS−７細胞とSV40複製開始点を含むレセプター−DNAを使用することで高コピー数のレセプター−DNAの自動的複製が可能となり、細胞表面でのレセプターの発現の効率が高くなる。コトランスフェクションは、各々５μｇのTRE−センサーDNAおよびレセプター−DNAをトランスフェクトすること以外は、実施例４に述べたDEAE−デキストラン法で行った。この一連のテストにおいて、一晩のインキュベーションおよび培地交換後、平行してレセプター特異的アゴニスト、またはアゴニストおよび競合的アンタゴニスト、またはポジティブ・コントロールとしてのTPAを添加した。18時間のインキュベーション後、細胞を分解し、実施例４に示したようにルシフェラーゼ検定を行った。
ａ）ムスカリン性M3−レセプターにアゴニスト的作用物質を結合することによるpADneo（3TRE）BGluciの誘導
COS−７細胞をセンサーDNA pADneo（3TRE）BHluciおよびオカヤマ／バーグpCD発現ベクター（オカヤマ（Okayama）およびバーグ（Berg）、1983）中のヒトのムスカリン性M3−レセプターの配列を含むレセプターDNA pCD−M3（バックレー（Buckley）等、1989）でコトランスフェクトした。誘導は、ｉ）10ng/ml TPA（シグマ、P8139）、ii）1mMカルバコール（シグマ、C4382）、iii）1mMカルバコールおよび10μＭアトロピン（シグマ、A0132）およびiv）1mMカルバコールおよび20μＭアトロピンで行った。細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第24図に示すが、これらはルシフェラーゼの発現がTPAおよびケスカリン性レセプターに対するアゴニストであるカルパコールの両方で誘導されることを示している。アゴニストによって誘導される誘導は、選択的アンタゴニストであるアトロピンを同時に添加することで妨害される。
ｂ）セロトニン−５−HT2−レセプターにアゴニスト的に作用する物質が結合することによるpBHluc1.3の誘導およびpADnep2−C6−BGLの非誘導
COS−７細胞にセンサーDNA pBGluc1.3および発現ベクターpAD−CMV2中にヒト5HT2レセプターの配列を含むレセプターDNA pAD−CMV2−5HT2（実施例３参照）をコトランスフェクトした。誘導はｉ）10ng/mlのミディアムTPA（シグマP8139）、ii）10μＭ  α−メチルセロトニン−マレエート（RBIリサーチ・バイオケミカルス・インコーポレーティドＭ−110）、およびiii）10μＭ  α−メチルセロトニン−マレエートおよび10μＭケタンセリン−タルトレート（RBI S−006）で行った。細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は、第25図Ａに示したが、これらはルシフェラーゼの発現がTPAおよび５−HT2のアゴニストであるα−メチルセロトニン−マレエートの両方で誘導されることを示している。アゴニストによって仲介される誘導は、選択的アンタゴニストであるケタンセリン−タルトレートを同時に添加することで阻害される。平行した実験で、COS−７細胞を６個のCRE要素を含むセンサーDNA pADneo2−C6−BGLおよびレセプターDNA pAD−CMV2−5HT2でコトランスフェクトした。誘導はｉ）20μＭホルスコリン（シグマP8139）、ii）10μＭ  α−メチルセロトニン−マレエート（RBI M−110）、およびiii）α−メチルセロトニン−マレエートおよび10μＭケタンセリン−タルトレート（RBI S−006）で行った。インキュベーションおよび細胞分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第25図Ｂに示したが、これらはルシフェラーゼの発現が実際にホルスコリンによっては起こるが、５−HT2−レセプター−アゴニスト  α−メチルセロトニン−マレエートでは起こらないことを示している。以上の結果から５−HT2−レセプターに依存して、IP3/DAGに応答する調節要素では選択的活性化が起こるが、cAMP（CRE）に応答する調節要素では起こらないことが確認される。
ｃ）ドーパミン−D1−レセプターへのアゴニスト的に作用する物質の結合によるpADneo2−C6−BGLの誘導およびpBHluc1.3の非誘導
COS−７細胞にセンサーDNA pBHluc1.3および発現ベクターpAD−CMV2中にヒトドーパミン−D1−レセプターの配列を含むレセプターDNA pAD−CMV2−D1（実施例３参照）をコトランスフェクトした。誘導はｉ）10ng/mlのTPA（シグマP8139）、ii）20μＭホルスコリン（シグマP8139）、iii）１μＭアポモルフィン（RBI D−004）、およびiv）１μＭアポモルフィンおよび１μM SCH23390（RBI D−054）で行った。細胞のインキュベーションおよび分解後のルシフェラーゼ検定の結果は、第26図Ａに示したが、これらはルシフェラーゼ遺伝子の発現がTPA 2寄っては誘導されるがD1−レセプターに対するアゴニストであるアポモルフィンでは誘導されないことを示している。平行した実験で、COS−７細胞を６個のCRE要素を含むセンサーDNA pADneo2−C6−BGLおよびレセプターDNA pAD−CMV2−D1でコトランスフェクトした。インキュベーションおよび細胞分解後のルシフェラーゼ検定の結果は第26図Ｂに示したが、これらはルシフェラーゼの発現が実際にホルスコリンとアポモルフィンの両方で誘導されることを示している。アゴニストによって仲介される誘導は、同時に選択的アンタゴニストであるSCH23390を添加することで阻害される。以上の結果からドーパミン−D1−レセプターはアデニレート・シクラーゼのシグナル誘導経路に応答する調節要素（CRE）を選択的に活性化するがホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に応答する調節要素（TRE）は活性化しないことが確認された。
実施例６
ａ）細胞内IP3/DAG濃度に依存してルシフェラーゼを発現する組み換えA549細胞系列（TRE細胞系列）の開発
TRE−センサーDNA pBHluc1.3は細胞系列A549のトランスフェクション実験においてTPAの添加により10倍以上も誘導される（実施例4a）。直接的またはレセプターを仲介するIP3/DAGシグナル誘導経路の調節によりルシフェラーゼ遺伝子の発現に影響する物質に対する安定な（プレ・）テスト細胞を作製するために、以下に示すようにエレクトロポレーションによりA549をプラスミドpBHluc1.3および選択プラスミドpRSVneoで同時にトランスフェクトした。培地除去後、細胞をトリプシン/PBS溶液で表面から落とし、培地に懸濁してから250×ｇで５分間遠心した。この細胞を無血清RPMI−1640培地（ギブコ）で洗浄し、再び遠心してから1.25×107細胞/mlの密度となるように無血清RPMI−1640培地に懸濁した。細胞懸濁液0.8mlを20μｇのpBHluc1.3および２μｇのpRSVneoと混合した。両プラスミドは予めBamH Iで線状化しておく。トランスフェクションは270V、1080μＦ、1000msecの単一電流パルスを用いたPG200プロゲネターIIエレクトロポレーション装置（ホーファー・サイエンティフィック・インスツルメント）で行った。次いで、細胞を10％ウシ胎児血清を混合したRPMI−1640培地で希釈し、90mm培養皿当たり２−５×105細胞の密度となるようにプレーティングした。トランスフェクションした日から細胞を選択培地（10％透析処理ウシ胎児血清、ペニシリンNa塩（100ユニット/ml）、ストレプトマイシン（50ユニット/ml）および800μg/ml  ゲネチシン（Ｇ−418、ギブコ−BRL）を含むRPMI−1640）で生育させた。
トランスフェクションから15−20日後、各細胞クローンを96穴マイクロプレートに移し、さらに培養した。Ｇ−418耐性クローンについてTPAの添加によるルシフェラーゼ発現の誘導性を調べた。６回の反復操作のなかで各クローンにおいて約40,000個の細胞を組織培養物をコートした遮光96穴マイクロプレート（マイクロライトTM、ダイナテク・ラボラトリー）のウェル当たり200μｌ中にまき、37℃で一晩インキュベートした。３個の混合物を10ng/mlのTPAで処理し、さらに８時間インキュベートした。その後、培地を除去し細胞をPBSで２回洗浄した。細胞をバッチ当たり150μｌの分解バッファ（25mMトリシン、0.5mM EDTA、0.54mMトリポリリン酸ナトリウム、6.5mM DTT、16.3mM MgSO4・7H2O、0.1％Triton X−100、1.2mM ATP、0.05mMルシフェリン;pH7.8）に入れ、96穴ルミノメーター（ML−1000、ダイナテク）でルシフェラーゼ活性を測定した。細胞クローンA20は、TPAによって15−20倍に誘導されるルシフェラーゼ活性の測定可能な基本レベルを示したことから以後の実験にこのクローンを選択した。
ｂ）ヒトのニュウロキニン２−レセプターの活性化に対応してルシフェラーゼを発現する組み換えA549テスト細胞系列の開発
本実施例はホスホリパーゼＣシグナル誘導経路と共役するヒトのニュウロキニン２（NK2）−レセプターに関するテスト細胞系列の調製を説明している。このテスト細胞はルシフェラーゼ活性を測定することによりレセプターに依存して細胞内IP3/DAGを調節する物質を同定しうる。
ａ）で述べたように予めBal IIで線状化したプラスミドpAHyg−NK2のエレクトロポレーションによりプレ・テスト細胞系列A20をトランスフェクトした。トランスフェクションした日から、細胞を細胞系列A20に使用した選択培地にさらに150μg/mlのハイグロマイシンＢ（シグマ）を添加した培地で培養した。ａ）で述べたように個々のクローンのルシフェラーゼ活性の誘導性を調べた。しかし、個の場合、誘導財としてTPAの代わりにニュウロキニンＡ（１μＭ、シグマ）を使用した。反復実験において、クローンA20/NK2−122はニュウロキニン２−レセプターの活性化後、５−７倍のルシフェラーゼ活性の誘導を示した。
第27図に見られるように、プレ・テスト細胞系列A20およびNK2テスト細胞系列A20/NK2−122におけるルシフェラーゼ発現はIP3/DAGシグナル誘導経路によってのみ増加し、細胞内cAMP濃度の増加によるものではない。両細胞系列においてルシフェラーゼ活性はTPAにより投与量に依存して最高18倍まで誘導されたが、ホルスコリン（アデニレート・シクラーゼの刺激剤）はいかなるルシフェラーゼ活性の誘導も示さなかった。
テスト細胞系列A20/NK2−122におけるNK2特異的アゴニストであるNKA GR64349（１μＭ、ネオシステムS.A.）によるルシフェラーゼ誘導の速度論を第28図に示す。最高のルシフェラーゼ活性は７−８時間の誘導時間後に測定された。一方、細胞系列A20においてはNK2−アゴニストGR64349の添加によってルシフェラーゼ活性が誘導されなかった。このことは、プレ・テスト細胞系列A20は、内在性NK2−レセプター分子を含んでおらず、従ってNK2テスト細胞系列に関する適当なコントロール細胞系列であることを意味している。
第29図Ａは、ニュウロキニンによるヒトのニュウロキニン２レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性化曲線を示している。細胞系列A20/NK2−122におけるニュウロキニン（シグマ）の相対的効果、NKA〉ニュウロメジンＫ（NMK）〉物質Ｐ（SP）は、レセプター結合実験から得られた、すでに報告されているデータと一致している。細胞系列A20は、３種のタキキニンのいずれによっても誘導しえず、このことはこの細胞がいかなるニュウロキニン・レセプターを含んでいないことを意味している。３種のニュウロキニン・レセプターのうちの１つに特異的な一連のアゴニスト:NK1:GR73632（ネオシステム、S.A.）、BIIC 1230（［β−Ala4、Sar9、Met（O2）11］SP（４−11））;NK2:G64349（ネオシステム、S.A.）、BIIC 1219（［β−Ala8］NKA（４−10））;NK3:［MePhe7］NMK（バッケム・フェインケミカリエンAG）の投与量依存的活性は第29図Ｂに示す。
細胞系列A20/NK2−122におけるニュウロキニンのアゴニスト効果はNK2−特異的アンタゴニスト（GR83074、GR87389、GR94800、ネオシステムS.A.）（第30図）により阻害された。この目的のために細胞を同時に一定量のニュウロキニンＡ（50nM）および種々の量のアンタゴニストで処理した。一方、NK1−特異的アンタゴニスト（すなわち、BIBO 2020（±cis−３−（２−メトキシベンジルアミノ）−２−ベンズヒドリルキヌリジン）、P7492（ペニンスラ・ラボ））またはNK3−特異的アンタゴニスト（Ｈ−9290、バッケム・フェインケミカリエンAG）は高濃度で効果があった（P7492＞BIBO 2020＞Ｈ−9290）。
ｃ）ヒト5HT2−レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現するA549細胞系列の開発
ヒトの5HT2−レセプターは、ホスホリパーゼＣシグナル誘導経路に共役するレセプターの別の例である。従って、TRE細胞系列A20も5HT2−レセプターの活性を調節する物質を発見することを目的としたテスト細胞系列の確立のための開始細胞に適している。
この目的のためにBgl IIで線状化したプラスミドpAHyg−5HT2をａ）で述べたようにエレクトロポレーションにより細胞系列A20にトランスフェクトし、選択培地で生育させた。ハイグロマイシンＢ耐性細胞クローンに関して5HT2−特異的アゴニストα−メチルセロトニン・マレエート（10μＭ、リサーチ・バイオケミカル社）の添加後のルシフェラーゼ活性の誘導性を調べ、以後の実験で使用するために４−５倍の誘導が測定されたクローンA20/5HT2−11を選択した。
テスト細胞系列A20/5HT2−11におけるセロトニン（１μＭ）によるルシフェラーゼ誘導の速度を第31図に示した。第28図に見られるように、６時間の誘導時間までルシフェラーゼ活性は連続的に増加した。従って、アゴニスト的またはアンタゴニスト的に作用する物質をテストするには６−８時間の誘導時間で十分である。細胞系列A20において、セロトニンの添加はルシフェラーゼ活性を誘導しえなかった。このことは、プレ・テスト細胞系列A20が内在的に5HT2−レセプター分子を含んでおらず、従って、5HT2−テスト細胞系列に対する適当なコントロール細胞系列であることを示している。
第32図Ａは、アゴニストによるヒトの5HT2−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性化曲線を示している。期待されるように、投与量・活性曲線は、5HT1A−レセプターのアゴニスト80H−DPAT（リサーチ・バイオケミカルス社）およびバスピロンとは異なり、セロトニンおよび5HT2−レセプターのアゴニスト、セロトニン・マレエートに対して選択的である。
細胞系列A20/5HT2−11におけるセロトニンのアゴニスト活性は5HT2−特異的アンタゴニスト、スピペロンおよびミアンセリン（リサーチ・バイオケミカルス社）の添加で阻害しうる（第32図Ｂ）。この目的のために細胞を同時に一定量のセロトニン（１μＭ）および種々の量のアンタゴニストで処理した。
実施例７
ａ）細胞内cAMP濃度に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞系列（CRE細胞系列）の開発
レセプター分子と相互作用することにより直接的または間接的に細胞内cAMPレベルに影響を与える物質を検定するための（プレ・）テスト細胞を調製するために、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系列CHO−DXB11（ウルロウブ（Urlaub）およびチャシン（Chasin）、1980）をセンサーDNA pADneo2−C6−BGLでトランスフェクトした。親細胞系列CHO−DXB11を10％ウシ胎児血清（セバク）、ヒポキサンチン（100μＭ）、チミジン（16μＭ）、ペニシリンＧナトリウム塩（100ユニット/ml）およびストレプトマイシン（50ユニット/ml）を含むメスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（RPMI）培地1640（ギブコ）で培養した。トランスフェクションの前日に細胞を新鮮な培地に移した。
エレクトロポレーションによるトランスフェクションは以下のように行った。培地の除去後、細胞をトリプシン/PBS溶液により表面から落とし、培地に懸濁後250×ｇ、５分間の遠心でペレット状とした。細胞をHBS（10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl）で洗浄し、遠心でペレットにした。細胞を１×107細胞/mlの密度となるようHBSに懸濁した。この細胞懸濁液0.8mlをSca Iで線状にしたプラスミドpADneo2−C6−BGLのDNA 20μｇと混合し、エレクトロポレーション・セルに移した。トランスフェクションは320V、1080μＦ、1000msecの単一電流パルスを使用するPG200プロゲネターIIエレクトロポレーション装置（ホーファー・サイエンティフィック・インスツルメント、サン・フランシスコ、CA）で行った。エレクトロポレーション後、細胞を上述の培地に希釈し、90mm培養皿当たり20,000個の細胞となるようにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。トランスフェクションの次の日から、細胞を選択培地（10％ウシ胎児血清、ヒポキサンチン（100μＭ）、チミジン（16μＭ）、ペニシリンＧナトリウム塩（100ユニット/ml）およびストレプトマイシン（50ユニット/ml）、ゲネチシン（Ｇ−418、ギブコ−BRL）（700μg/ml）を含むRPMI−1640）で培養し、以後、細胞増殖を観察した。
トランスフェクションから７−10日後、生成した個々の細胞クローンを24穴の細胞培養皿に移し、培養を続けた。アデニレート・シクラーゼの活性化によるルシフェラーゼ発現の誘導性について25個の単離したＧ−418耐性細胞クローンを調べた。
各クローン約300,000個の細胞を６穴細胞培養皿の各ウェルに合計４箇所植種し、37℃で24時間インキュベートした。各々のクローンの２バッチを20μＭのホルスコリンで処理し、さらに37℃で５時間インキュベートした。次に全ての細胞から培地を除き、細胞をPBSで洗浄した。細胞をTriton X−100で分解し、ベルソルド・ルマットLB9501ルミノメーター中でルシフェラーゼ活性を測定した（ブレーザー（Brasier）等、1989）。最も高いレベルのルシフェラーゼ活性を有しており、同時にホルスコリンによる最も高い誘導性を示したことから以下の実験のために細胞クローンC6−13を選択した。
細胞系列CHO C6−13の細胞をcAMPまたはIP3/DAGの細胞内濃度を変えるか、または濃度変化を刺激する種々の物質で３時間処理し、さらに上述のシグナル誘導メカニズムに影響するレセプター特異的アゴニストで処理した。第33図に示されているように、細胞系列CHO C6−13におけるルシフェラーゼの発現はホスルコリン（アデニレート・シクラーゼのスチムレーター）、ジブチリル−cAMP（膜透過性cAMP誘導体）およびイソブチルメチルキサンチン（IBMX、ホスホジエステラーゼ・インヒビター）等のcAMP増加物質によってのみ増加した。ホルボルエステルPMA、Ca2+イオノフォアA23187およびドーパミン・レセプターに対するアゴニスト化合物（アポモルフィン、ブロモクリプチン）、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターに対するアゴニスト化合物（カルバコール）およびセロトニンはルシフェラーゼ活性の有意な変化をもたらさなかった。このことは細胞系列CHOC6−13におけるルシフェラーゼ発現がcAMP濃度の変化によってのみ調節され、IP3/DAG濃度変化では調節されず、さらに、この細胞はドーパミン性、ムスカリン性またはセロトニン型の生物学的に検出可能なcAMP刺激性レセプターを含まないことを示している。
第34図に示したように、ホルスコリンによって誘導されたcAMP濃度の増加によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写型活性化の投与量・活性曲線は20μＭのホルスコリンで最高の誘導を示した。十分高いホルスコリン濃度でのルシフェラーゼ誘導の低下はホルスコリン自信の毒性効果またはcAMPの過剰レベルに寄因すると考えられる。IBMXによるホスホジエステラーゼの阻害は形成されたcAMPの分解を減少させ、結果的にアデニレート・シクラーゼの活性化を伴ってcAMPレベルを増加させる。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の最高の誘導値はIBMX処理によって有意な影響を受けず、このことは転写の最高の活性化が20μＭのホルスコリンで得られるcAMP濃度で達成されることを意味している。IBMXによる投与量・活性曲線の１オーダー低いホルスコリン濃度へのシフトは、cAMPの分解を担っている酵素を阻害することによるcAMPの蓄積を明確に示している。
第35図Ａに示されているように、ホルスコリンの投与量に対するルシフェラーゼ誘導の速度は、ホルスコリンによる刺激から60分後にルシフェラーゼ活性の増加を検出しうることを示している。ルシフェラーゼ発現の全誘導は2.5時間後に達成され、ホルスコリン刺激後４時間までは変化しない。ルシフェラーゼ誘導の絶対レベルは2.5時間まで増加するが、ホルスコリン処理の間、ED50レベルは実質的な影響を受けない（第35図Ｂ）。
ｂ）ヒトのドーパミン−D1−レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えCHOテスト細胞系列の開発
以下に示す実施例8と同様に本実施例は特異的な、望ましくはヒトのアデニレート・シクラーゼ共役レセプターを調節する物質の細胞性スクリーニング・システムにも適している（コントロール）CREテスト細胞の調製を説明している。ヒトのドーパミン−D1−レセプター配列を使用してレセプターDNAを生成した。
上述の特徴を有する細胞系列CHO C6−13をａ）で述べた方法にしたがい、予めFsp Iで線状化したプラスミドpAD−CMV2:D1を用いたエレクトロポレーションでトランスフェクトした。トランスフェクションした日から細胞をジハイドロフォレート・リダクターゼ（DHFR）による選択に適した選択培地（無ヌクレオチド培地α−MEM（ギブコ））、10％透析ウシ胎児血清（セバク）、ペニシリンＧナトリウム塩（100ユニット/ml）、およびストレプトマイシン（50ユニット/ml）、700μg/ml  ゲネチシン（Ｇ−418、ギブコ−BRL）中で培養し、細胞増殖を観察した。先に述べたように６穴の細胞培養皿で24個の単離細胞クローンを増殖し、10μＭのアポモノフィン（ドーパミンレセプターに対するアゴニスト）による処理後４時間に未処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性の増加を検定した。反復実験において、クローンCHO 13D1−38は、ドーパミンD1レセプターの活性化後ルシフェラーゼ活性の最も高い増加を示した。
高効率の自動スクリーニングシステムでテスト細胞系列を使用するためにはプレート当たり96個のウェルを有するマイクロプレートを使用すると便利である。このために、組織培養物でコートした非透過性マイクロプレート（マイクロライトTM、ダイナテク・ラボラトリーズ）中ウェル当たり200μｌの培地に60,000個の細胞（CHO C6−13またはCHO 13D1−36）を植種し、37℃で一晩インキュベートした。この細胞に種々の薬剤を添加し、特定の時間（通常３時間）インキュベートした。培地の除去後、細胞をPBSで洗浄し、１％Triton X−100で分解してから96穴ルミノメーター（ML−1000、ダイナテク）によってルシフェラーゼ活性を測定した（第36図）。
第37図Ａおよび第37図Ｂ、および第38図Ａおよび第38図Ｂに示されているようにヒトのドーパミンD1−レセプターの活性化に対するルシフェラーゼ活性の投与量・活性曲線は、マイクロプレート様式でプロットしたが、曲線上の各ドットは４回の実験の平均値を表しており、標準偏差は約15％であった。
プレ・テスト細胞系列CHO C6−13におけるホルスコリンによるルシフェラーゼ誘導の速度と同様に（実施例7a））、アポモルフィンによるD1−レセプターの刺激後１時間にドーパミンD1−レセプターテスト細胞系列CHO 13D1−38におけるルシフェラーゼ活性の増加が測定された（第37図Ａ）。最高のルシフェラーゼ活性化は刺激後2.5時間に達成され、４時間まで定常的に維持された。ホルスコリンを用いたアデニレート・シクラーゼの直接的活性化後の速度と比較することにより（第35図Ａ）速度を決定する段階はルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の転写および翻訳であり、活性化されたレセプターによるアデニレート・シクラーゼの刺激の段階ではないと結論付けられる。
第37図ＢにおけるアポモルフィンのED50値を決定するための測定値の修正によってED50値がアゴニストによるレセプター刺激時間に有意に依存しないことが示された。
第38図Ａは、アゴニスト（アポモルフィン）でのD1−レセプターの活性化によるレポーター遺伝子の誘導はアンタゴニストにより投与量依存的に阻害しうることを示している。この目的のために、テスト細胞をマイクロプレートに植種してから24時間後に一定量のアポモルフィン（最終濃度１μＭ）添加して直ちにアンタゴニストと混合すると、第37図Ａに示したようにルシフェラーゼ遺伝子の最高の誘導をもたらす。テスト物質が均一な溶液として供給されるスクリーニング法を模倣して、この実験では最終濃度１％のDMSOを使用した。
このテストで使用した物質の効果はレセプター結合実験を行った文献に報告されているデータと良く一致した。
第38図Ｂは別の形で記録された同じ値（コントロールとしての同一の未処理細胞と比較したルシフェラーゼのＸ−倍の誘導）、さらにアゴニストであるブロモクリプチンの投与量依存活性を示している。最も高いブロモクリプチン濃度（100μＭ）におけるルシフェラーゼ誘導の逆転はブロモクリプチン自身の細胞毒性、またはブロモクリプチンを溶解するのに必要な低pHに帰することが出来る。
実施例８
ａ）細胞内cAMP濃度に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えチャイニーズ・ハムスター・卵巣（CHO）細胞系列（CRE細胞系列）の開発
レセプター分子と直接的または間接的に相互作用することにより細胞内cAMPレベルに影響する物質をテストするための（プレ・）テスト細胞の調製を目的として、チャイニーズ・ハムスター・卵巣細胞系列CHO−DXB11（ウルローブ（Urlaub）およびチャシン（Chasin）、1980）をセンサーDNA pADneo2−C12−TKLでトランスフェクトした。（このプラスミドは、６個のCRE要素を含む領域が倍加しており、β−グロビン・プロモーターがTKプロモーターに置換している点で（実施例1b参照）実施例１で示したpADneo2−C6−BGLとは異なる）。これを行うためには、Sal I−Hind III−β−グロビン−プロモーター−フラグメントをTKプロモーターを同様の切断フラグメントで置換した（マクナイト（McKnight）、1980）。
親細胞系列CHO−DXB11を10％ウシ胎児血清（セバク）、ヒポキサンチン（100μＭ）、チミジン（16μＭ）、ペニシリン記Ｇナトリウム塩（100ユニット/ml）、およびストレプトマイシン（50ユニット/ml）を含むロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート（RPMI）培地1640（ギブコ）で培養した。トランスフェクション１日前、細胞を新鮮な培地に移した。
細胞クローンのトランスフェクションおよびテストは実施例7a）と同様に行った。以後の実験用に、最も高いルシフェラーゼ活性を示し、同時にホルスコリンによる高い誘導性を示す細胞クローンC12−32を選択した。
ｂ）ヒトのドーパミンD5レセプターの活性化に応じてルシフェラーゼを発現する組み換えCHOテスト細胞系列の開発
（先の実施例７と同様に）本実施例は特異的な、望ましくはヒトのアデニレート・シクラーゼ共役レセプターに適した（コントロール）CREテスト細胞の調製を示している。レセプターDNAの調製にはヒトのドーパミン−D5−レセプター配列を使用した。
先に特徴を明らかにされた細胞系列CHO C12−32を、ａ）と同様にトランスポレーションによって20μｇのStu Iで線状化したプラスミドpAD−CMV1:D5でトランスフェクションした。（プラスミドpAD−CMV1:D5は、ヒトのD5レセプター遺伝子のコード領域を含むphD5−gemの1.6kbのSal I−Xba Iフラグメント（グランディ（Grndy）等、1991）を切断したヒト・ベクターpAD−CMV1に連結することにより調製した。）トランスフェクションした日から細胞をジハイドロホレート・リダクターゼ（DNFR）による選択に適した選択培地（10％ウシ胎児血清（セバク）、ペニシリンＧナトリウム塩（100ユニット/ml）、およびストレプトマイシン（50ユニット/ml）、700μg/mlのゲネチシン（Ｇ−418、ギブコ−BRL）を含む無ヌクレオチド培地α−MEM（ギブコ））中で培養し、細胞増殖を観察した。先に述べたように単離した24個の細胞クローンを６穴細胞培養皿で培養し、10μＭアポモルフィン（ドーパミンレセプターに対するアゴニスト）による処理から４時間後、未処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性の増加を見た。反復実験の結果、クローンCHO 32D5−39はドーパミンD5レセプターの活性化後ルシフェラーゼ活性の高い増加を示した。
第39図Ａはアゴニスト（アポモルフィン）でのD5レセプターの活性化によるレポーター遺伝子の誘導は投与量依存的にアンタゴニストによって阻害しうることを示している。これを行うためには、テスト細胞をマイクロプレートへの植種から24時間後であって一定量のアポモルティン（最終濃度0.1μＭ）添加後直ちにアンタゴニストと混合したが、この事で第39図Ａに示されているようにルシフェラーゼレポーター遺伝子の最高の誘導がもたらされた。これらの実験結果を第39図Ｂに示す。
このテスト操作に使用した物質の能力は、レセプター結合実験を行った文献のデータと良く一致した。
実施例９
ルシフェラーゼ活性を測定するための試薬の開発
ATP、ルシフェリン、MgSO4−7H2O、ジチオスレイトール（DTT）、β−メルカプトエタノール（BME）、トリポリリン酸ナトリウム（NaTPP）、Triton X−100の濃度およびpHを変化させることによるルシフェラーゼ測定シグナルへの影響を調べた（表２）。その他の成分は表１に示した望ましい基本バッファに対応する濃度を使用した。試薬添加から３分後に得られた測定値を比較のために使用した（得られた最高測定シグナルに対するパーセンテージで表される）。
第40図は基本バッファにβ−メルカプトエタノールおよび／またはトリポリリン酸ナトリウムを添加することのルシフェラーゼ測定シグナルへの影響を示している（黒四角：基本バッファ；白四角:4μl/mlのβ−メルカプトエタノールの添加；黒丸:0.2mg/mlのトリポリリン酸ナトリウムの添加；白丸:4μl/mlのβ−メルカプトエタノールおよび0.2mg/mlのトリポリリン酸ナトリウムの添加）。全ての測定にダイナテク社製マイクロライトML1000を搭載するルミノメーターを使用した。
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配列データ
（１）発明の名称：レセプター依存細胞性シグナル誘導経路に関する調節効果を有する物質のスクリーニング法
配列数:37
（２）SEQ  ID  NO:1の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1630塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型:cDNA
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（２）SEQ  ID  NO:2の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:471アミノ酸
（Ｂ）配列タイプ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：タンパク質
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（２）SEQ  ID  NO:3の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:23塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:3:
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（２）SEQ  ID  NO:4の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:37塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
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（２）SEQ  ID  NO:5の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:64塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
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（２）SEQ  ID  NO:6の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:56塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:6:
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（２）SEQ  ID  NO:7の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:56塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:7:
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（２）SEQ  ID  NO:8の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:45塩基対
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクリオチド
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（２）SEQ  ID  NO:9の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:21塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
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（２）SEQ  ID  NO:10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:17塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:10:
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（２）SEQ  ID  NO:11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:25塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:11:
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（２）SEQ  ID  NO:12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:35塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:12:
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（２）SEQ  ID  NO:13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:27塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:13:
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（２）SEQ  ID  NO:14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:47塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:14:
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（２）SEQ  ID  NO:15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:41塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:15:
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（２）SEQ  ID  NO:16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:35塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:16:
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（２）SEQ  ID  NO:17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:63塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
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（２）SEQ  ID  NO:18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:57塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:18:
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（２）SEQ  ID  NO:19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:41塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:19:
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（２）SEQ  ID  NO:20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:56塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:20:
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（２）SEQ  ID  NO:21の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:40塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:21:
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（２）SEQ  ID  NO:22の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:56塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:22:
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（２）SEQ  ID  NO:23の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:50塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:23:
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（２）SEQ  ID  NO:24の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:35塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:24:
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（２）SEQ  ID  NO:25の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:53塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:25:
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（２）SEQ  ID  NO:26の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:64塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:26:
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（２）SEQ  ID  NO:27の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:52塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:27:
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（２）SEQ  ID  NO:28の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:64塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:28:
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（２）SEQ  ID  NO:29の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:50塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:29:
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（２）SEQ  ID  NO:30の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:51塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:30:
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（２）SEQ  ID  NO:31の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:65塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:31:
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（２）SEQ  ID  NO:32の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:74塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:32:
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（２）SEQ  ID  NO:33の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:62塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:33:
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（２）SEQ  ID  NO:34の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:73塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:34:
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（２）SEQ  ID  NO:35の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:61塩基
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子型：合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:35:
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（２）SEQ  ID  NO:36の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:6623塩基対
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）分子型：プラスミドDNA
（xi）配列:SEQ  ID  NO:36:
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（２）SEQ  ID  NO:37の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:6630塩基対
（Ｂ）配列タイプ：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）分子型：プラスミドDNA
（xi）配列:SEQ  ID  NO:37:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003571718.tif 000056
【図９】
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【図１０】
0003571718.tif 000058
【図１１】
0003571718.tif 000059
【図１２】
0003571718.tif 000060
【図１３】
0003571718.tif 000061
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
0003571718.tif 000065
【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
0003571718.tif 000083
【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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