【手続補正書】
【提出日】平成29年6月28日(2017.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均直径が１０〜５００ｎｍであるマルチコンパートメント脂質ナノ粒子であって、リン脂質二重層によって区切られた第２の親水性コンパートメントによって部分的に囲まれた第１の親油性コンパートメントを含み、前記第１のコンパートメントが前記第２のコンパートメントに部分的に固定されていることを特徴とするマルチコンパートメント脂質ナノ粒子。
【請求項２】
多分散指数が５〜１５％である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記平均直径が１００〜２５０ｎｍである請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記親油性コンパートメントが、２５℃で液体状態又は半固体状態である脂質から成る請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記親油性コンパートメントが、グリセリドが混合されていてもよい脂肪酸エステルを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記脂肪酸エステルが、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物からなる群から選択される請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記グリセリドが、２５℃で液体又は固体であるグリセロールモノエステル、グリセロールジエステル、及びグリセロールトリエステルの混合物からなる群から選択される請求項５又は６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記リン脂質二重層が、少なくとも１つのリン脂質及び１つの親水性非イオン性界面活性剤を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記リン脂質が、双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記親水性非イオン性界面活性剤が、ポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される請求項８又は９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
少なくとも１つの対象となる分子をさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記対象となる分子が、核酸、タンパク質、多糖類、及び４０〜２０００Ｄａの分子から選択される請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
薬剤的に許容可能な賦形剤中に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子の懸濁液を含む医薬組成物。
【請求項１４】
以下の工程を含むマルチコンパートメント脂質ナノ粒子を調製する方法：
−  少なくとも１つの脂質、１つのリン脂質、１つの親水性非イオン性界面活性剤を含み、少なくとも１つの対象となる分子を含んでいてもよい、油／水エマルションを調製する工程；
−  高圧下で前記エマルションをホモジナイゼーションする工程。
【請求項１５】
前記エマルションをホモジナイゼーションする前に３０〜８０℃の温度に加熱する工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質が、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物からなる群から選択される請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン脂質が双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記親水性非イオン性界面活性剤が、ポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記油／水エマルションが
−  ５〜３０質量％の脂質；
−  ０．５〜５質量％のリン脂質；
−  ０．５〜５質量％のポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル又はポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂質が、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ又はＭ１９４４ＣＳである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リン脂質が、ホスフォリポン９０Ｇ（登録商標）である請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリオキシルグリセリド又は前記ポリオキシエチレン脂肪酸エステルが、ゲルシア
（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートである請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、対象となる分子を投与するための担体。
【請求項２４】
請求項１１又は１２に記載のナノ粒子を含む医薬品。
【請求項２５】
前記医薬品は、注射、経口、経皮又は経鼻で投与される医薬品である請求項２４に記載の医薬品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
さらに、暗くて電子で密な外層の厚さの測定は、リン脂質二重層（二重層）によって区切られた第２の親水性コンパートメントによって部分的に囲まれた第１の親油性コンパートメント（脂質マトリックス又はコア）を強く示唆する。そのうえ、本発明のセリソームの構造の研究によって、上記のものなどの好適な非イオン性界面活性剤の使用に起因して、前記第１のコンパートメントが前記第２のコンパートメントに部分的に固定されていることがわかった。この説明によって制限されないが、本発明のセリソームの構築上の要石は、「疎水性−親水性−疎水性」型の３つのセグメント（three-segment）誘導体を少な
くとも１つ含有する親水性非イオン性界面活性剤混合物の使用に基づいているようである。疎水性セグメントは、脂肪族アルコール、脂肪酸、グリセリド、コレステロール、又はリン脂質膜に親和性をもつ他の基から成ることができる。親水部は、ポリオキシエチレン、ポリプロピレン、多糖類型のポリマー、又は疎水性セグメントと併せて、ＨＬＢ値が１１を超える界面活性剤を生成できる任意の型のポリマーから成ることになる。ＨＬＢ値はグリフィンによって記載された尺度に従って本明細書で定義される。例えば、これらの界面活性剤は、ポリオキシルグリセリド若しくはマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルエーテルのファミリーに属することがあり、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートであることになる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、親水性ポリ（オキシエチレングリコール）鎖でエステル化された脂肪酸の混合物であり、脂肪酸−ＰＥＧ型（モノエステル）の２つのブロックが並んだ誘導体及び脂肪酸−ＰＥＧ−脂肪酸型（ジエステル）の３つのブロックが並んだ誘導体のさまざまな割合での混合物を含有する。また、マクロゴールグリセリドはグリセリドを含有する。特に、ゲルシア（登録商標）５０／１３は、グリセリドと１５００ｇ／ｍｏｌの親水性ポリ（オキシエチレングリコール）鎖でエステル化された脂肪酸の混合物であり、脂肪酸−ＰＥＧ−脂肪酸型（図４Ａ）の３つのブロックが並んだ誘導体を約４０％含む。提案された系では、ジエステル部分は、間違いなく二重層と脂質部の間の固定位置（anchor point）である（図４Ｂ）。実際に、リン脂質の脂質粒子型製剤への組み込みが、一般に２つのタイプの物体、ナノ粒子及びリポソームを含有する不均一な製剤を生じることは当該技術分野において公知である。グリフィンＨＬＢ値が１１を超える「疎水性−親水性−疎水性」型の非イオン性界面活性剤が非存在の場合に本発明の実験プロトコールを適用することによって同じ結果が得られた（データ示さず）。提案された系では、これらの界面活性剤部分は、間違いなく二重層と脂質部の間の固定位置である（図４Ｂ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
好ましくは、前記親水性非イオン性界面活性剤は、ポリオキシルグリセリド若しくはマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルエーテルのファミリー、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートからなる群から選択される。
好ましくは、本発明の方法の油／水エマルションは以下を含む：
−  ５〜３０％の脂質、好ましくは、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ又はＭ１９４４ＣＳ；
−  ０．５〜５％のリン脂質、好ましくはホスフォリポン９０Ｇ（登録商標）；
−  ０．５〜５％のマクロゴールグリセリド又はポリオキシエチレン脂肪酸エステル、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレート；
−  水、適量  １００ｇ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【図１】図１は、さまざまな操作条件下で得られた「ハンドバッグ」と呼ばれる構造の電子顕微鏡画像を示す。いずれの条件でも、「ハンドバッグ」は少ない割合にとどまる。
【図２】図２は、リポソーム（Ａ）及び脂質粒子（Ｂ）の模式的な説明並びにクライオ透過電子顕微鏡（クライオ−ＴＥＭ）画像を示す。
【図３】図３は、本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子のクライオ−ＴＥＭ画像を示す。
【図４Ａ】図４は、ゲルシア（登録商標）５０／１３の成分（Ａ）及び本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の膜超構造の模式図（Ｂ）を示す。
【図４Ｂ】図４は、ゲルシア（登録商標）５０／１３の成分（Ａ）及び本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の膜超構造の模式図（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製の模式図を示す。
【図６】図６は、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳについて、マルチコンパートメント脂質ナノ粒子のサイズ及びその多分散性の２０箇月にわたるモニターリングを示す。
【図７Ａ】図７は、水性媒体に溶かしたクェルセチンの安定性試験［室温Ｈ２Ｏ；室温、ｐＨ７．４の水性媒体；室温模擬胃液（ＳＧＦ）；３７℃模擬胃液（ＳＧＦ）；室温模擬腸液（ＳＩＦ）］（Ａ）並びに本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子封入クェルセチンのさまざまな濃度（１、２、３、４、及び５％）の化学的安定性試験（Ｂ、右）を示す。粒子の物理的安定性は図７Ｂの左に示される。
【図７Ｂ】図７は、水性媒体に溶かしたクェルセチンの安定性試験［室温Ｈ２Ｏ；室温、ｐＨ７．４の水性媒体；室温模擬胃液（ＳＧＦ）；３７℃模擬胃液（ＳＧＦ）；室温模擬腸液（ＳＩＦ）］（Ａ）並びに本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子封入クェルセチンのさまざまな濃度（１、２、３、４、及び５％）の化学的安定性試験（Ｂ、右）を示す。粒子の物理的安定性は図７Ｂの左に示される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は例えば以下を含む。
脂質（ラブラフィル（登録商標））                          ５〜２０％
リン脂質（ホスフォリポン９０Ｇ）                            １％
マクロゴールグリセリド（ゲルシア（登録商標）５０／１３）    ２％
水（適量）                                        １００ｇ
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
懸濁液中の有効成分の最大搭載量は約１％（又はその水への溶解度の５×１０３倍）であり、最適条件下での封入収率は約９６％である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は以下を含む（質量％）：
ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ      ２０％
ホスフォリポン９０Ｇ                          １％
ゲルシア（登録商標）５０／１３                ２％
水（適量）                            １０ｇ
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は以下を含む（質量％）：
ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ      ２０％
ホスフォリポン９０Ｇ                          １％
ゲルシア（登録商標）５０／１３                ２％
水（適量）                              １ｋｇ