(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置において、前記糖及び水溶性高分子化合物は、基質と混合して基質ゾーンに添加され、該基質ゾーンは展開液の輸液方向からみて酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けられる簡易型酵素免疫測定装置。
【請求項２】
酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置において、前記糖及び水溶性高分子化合物は、基質ゾーンの基質上又は基質の近傍に添加され、該基質ゾーンは展開液の輸液方向からみて酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けられる簡易型酵素免疫測定装置。
【請求項３】
糖が、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マンノース、グルコース、アラビノース、キシロース、マルトース、デキストラン又はアミロースデンプンである請求項１又は２記載の測定装置。
【請求項４】
水溶性高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸、ポリ乳酸、ポリエチレンイミン、カゼイン、アルカリ処理カゼイン、アルブミン、オボアルブミン又はゼラチンである請求項１又は２記載の測定装置。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定装置を用いる免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素標識試薬を充分に反応させた後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型酵素免疫測定装置、及び該装置を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
輸液可能なメンブレンを利用した簡易型ＥＩＡが知られている。この方法では基質を展開液に溶解しておくか又はメンブレン上に点着しておく。基質は、添加された検体を伴い展開液とともに移動し、陽性検体では、酵素との反応により検出ゾーンでの発色が観察される。基質を展開液に含む時には保存中に基質の分解を起こしやすい。そこで、メンブレン上に基質を点着する方法が基質を安定に保てるため、現在では主流となっている（例えば、特開平９−１３３６８１号参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、基質をメンブレン上に点着する方法では、陽性検体の場合に観察される発色が明瞭でなく、正確な判定が行いずらかった。従って、本発明は、検出ゾーンで生ずるシグナルを明瞭に観察し得る方法及び装置を提供することを課題とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、検体と反応した酵素標識試薬が充分に検出ゾーンで反応した後に基質が反応するように、糖又は水溶性高分子化合物にて基質を遅延展開させる手段をもつ簡易型ＥＩＡ及び装置を見出し本発明を完成した。
【０００５】
本発明のＥＩＡ装置は、展開器材の一端に展開液と接触する展開液供給ゾーン、他の一端に展開液吸収ゾーンを付設し、該展開器材には拡散的に添加した酵素標識試薬、展開器材に非拡散的に結合した抗原又は抗体からなる検出ゾーン、検体点着ゾーンを設け、更に糖又は水溶性高分子化合物からなる基質展開を遅延させる物質と基質とを拡散的に添加した基質ゾーンを設けることができる。この装置では、検体点着ゾーンに検体を添加し、各試薬が添加された展開器材に展開液を供給するだけで免疫測定を行うことができる。基質ゾーンには、基質に添加する糖又は水溶性高分子化合物は基質と混合して添加することができる。また、糖又は水溶性高分子化合物は、展開器材の基質上又は基質の近傍に添加することができる。本発明に用いる糖又は水溶性高分子化合物は、展開器材上の展開液による基質の展開を遅延させる物質であり、例えば糖、水溶性高分子化合物等を使用することができる。糖としては、単糖、オリゴ糖又は多糖であってよく、例えばショ糖、トレハロース、ラクトース、マンノース、グルコース、アラビノース、キシロース、マルトース、デキストラン、アミロースデンプン等を挙げることができる。水溶性高分子化合物としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアスパラギン酸、ポリ乳酸、ポリエチレンイミン、カゼイン、アルカリ処理カゼイン、アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン等を挙げることができる。本発明の糖又は水溶性高分子化合物は、以下に示す使用量の範囲において水に溶解する化合物であれば各種分子量のものを用いることができる。
【０００６】
また、本発明の基質ゾーンには、発色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。発色基質は、標識酵素のアルカリ性ホスファーゼの測定には５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸等、β−ガラクトシダーゼの測定には、５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−インドリル−β−ガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等、パーオキシダーゼの測定には、例えば１，２−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を用いることができる。蛍光基質は、アルカリ性ホスファターゼの測定には４−メチルウムベリフェリル・ホスフェート、β−ガラクトシダーゼの測定には、４−メチルウムベリフェリル・β−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。発光基質は、アルカリ性ホスファーゼの測定には３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン  二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、３−（４−クロロ−２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン  二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ）等、β−ガラクトシダーゼの測定には、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン等を挙げることができる。
【０００７】
展開器材に添加する基質量は、特に限定されず、各測定物質によっても異なるが、通常水又は緩衝液に５〜４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を展開器材に２〜１０μｌ添加される。本発明の糖又は水溶性高分子化合物は、基質溶液に対し、１〜１５％、好ましくは３〜１０％添加することができる。また、展開器材に添加した基質は、０℃〜５０℃又は凍結乾燥によって乾燥することが好ましい。
【０００８】
本発明の展開器材は、展開液を輸液可能な矩形のメンブレン等であり、この材質は免疫測定に用いられるセルロース、ニトロセルロース等のセルロース又はセルロース誘導体、ガラス繊維等から構成された多孔質膜であることが好ましい。この展開器材の一端部には、展開液供給ゾーン、他の一端には展開液吸収ゾーンを設けることができる。
【０００９】
本発明の展開器材に拡散的に添加される標識試薬は、測定物質と免疫反応する抗原又は抗体を酵素で標識して製造され、ＥＩＡで用いられる周知の酵素標識抗体又は酵素標識抗原を使用することができる。また、展開器材の設けられる検出ゾーンには、測定物質の抗体又は抗原と反応する抗原又は抗体が展開器材に物理吸着又は化学結合により非拡散的に結合される。さらに、検出ゾーンは、ゼラチン粒子等の粒子に抗原又は抗体を結合させた感作粒子を展開器材に添加して形成することもできる。
【００１０】
本発明のＥＩＡ装置の断面図を図１に例示する。本発明のＥＩＡ装置１では、メンブレン２に前記糖又は水溶性高分子化合物と基質との混合物を含有した基質ゾーン３、メンブレンの一方の端部に設けた展開液供給ゾーン４、酵素標識試薬ゾーン５、検体点着ゾーン６、検出ゾーン７及びメンブレンの他方の端部に展開液吸収ゾーン８を設けることができる。基質ゾーン３は、メンブレンの展開液供給ゾーンから輸液方向の下流側、且つ酵素標識試薬ゾーンの上流側に設けることが好ましい。酵素標識試薬ゾーン５には、酵素で標識された抗体又は抗原が展開液よって移動可能な状態で前記メンブレン上に設けたパッドに含有される。また、検出ゾーン７では、前記メンブレンには検体中の測定対象物質と免疫反応する抗原又は抗体がメンブレンにライン状に結合している。展開液１１は破壊可能なシール部材１２によって密封され、ＥＩＡ装置の端部に付設された展開液槽１０から展開液供給ゾーン４を通ってメンブレン２に展開液１１を供給することができる。展開液吸収ゾーン８は吸水性の不織布で構成される。展開液吸収ゾーンは通常メンブレンよりも厚く形成されるが、このことは必須ではない。展開液供給ゾーン４は、前記展開液吸収ゾーン８の吸水性の不織布と同じ不織布をメンブレンに重ね合わせて構成することもできる。
【００１１】
更に、本発明のＥＩＡ装置は、試薬類が添加された前記展開器材を例えば特開平１０−１０４２３６号に記載されたプラスチック製のカセットに載置し、測定に用いることが好ましい。
【００１２】
本発明では、測定物質の抗原又は抗体を含むを思われる検体を前記ＥＩＡ装置の検体点着ゾーンに点着した後、水又は緩衝液からなる展開液を展開液供給ゾーンに供給することにより測定を開始することができる。検体点着ゾーンに添加された検体は、酵素標識試薬と反応をした後、展開液により展開して検出ゾーンで充分に反応が行われて結合する。次いで糖又は水溶性高分子化合物によって基質が遅延して展開し、検出ゾーンに到達して酵素との反応が起こる。検体中に測定物質が含まれない場合には、酵素標識試薬は検出ゾーン留まらずに展開液吸収ゾーンに吸収されてしまい、検出ゾーンの発色、蛍光、発光等のシグナルは観察されない。検体中の測定物質の測定は、展開液を前記ＥＩＡ試薬の展開液供給ゾーンに供給後、通常１０〜２０分後にカセットに開けられた窓から検出ゾーンのシグナルを測定することにより行うことができる。また、前記展開液には、所望により更に発色、蛍光又は発光の増幅物質、安定化剤、防腐剤などを添加することもできる。
【００１３】
【実施例】
以下実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１  ＨＢｓ抗原の測定
５ｍｍ×５０ｍｍのニトロセルロース（ミリポア社製）からなるメンブレンの両端に、吸水性の不織布からなる展開液供給ゾーン及び展開液吸水ゾーンを設けた。メンブレンに付設した展開液吸収ゾーンから展開液の展開方向の上流側の部分に、抗ＨＢｓ抗体を塗布乾燥して検出ゾーンとした。次いで、メンブレンの検出ゾーンの上流側にアルカリ性ホスファターゼ標識抗ＨＢｓ抗体を含む吸水性不織布からなるパッドを重ね酵素標識試薬ゾーンとし、該ゾーン上を検体点着ゾーンとした。また、酵素標識試薬ゾーンの上流側には、下記表１に示す糖又は水溶性高分子化合物を５％含む２０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリン酸二ナトリウム（ＢＣＩＰ）溶液５μｌを添加し、３７℃で風乾し基質ゾーンとした。このメンブレンを、特開平１０−１０４２３６号に記載の展開液槽と展開液供給手段を持つ反応カセット内に納めて免疫測定装置とした。
【００１４】
前記免疫測定装置の検体点着ゾーンに検体液として、濃度７．５ｎｇ／ｍｌのＨＢｓ抗原を含む陽性血清２５μｌ加え、反応カセットの展開液槽から展開液をメンブレンに供給し、測定を開始した。展開液供給後、１５分経過後の検出ゾーンの発色強度を目視で測定した。同一の陽性検体で３回ずつ測定した結果を表１に示す。また、陰性検体を用いて１５分後、３０分後の測定結果を表１に示す。更に、ＢＣＩＰ溶液に糖又は水溶性高分子化合物を含有しない基質ゾーンを設けた装置による測定結果（無添加；比較例）を表１に示す。
【００１５】
尚、表１中の記号は、検出ゾーンにおいて、−：ラインが認められない、±：青色が認められるがラインとして認められない、＋：青色のラインが認められる、＋＋：濃く鮮明な青色ラインが認めれることを示す。
【００１６】
【表１】
0003539277.tif 000002
【００１７】
実施例２  抗ＨＢｓ抗体の測定
実施例１記載の免疫測定装置において、抗ＨＢｓ抗体とアルカリ性ホスファターゼ標識抗ＨＢｓ抗体の代わりにそれぞれＨＢｓ抗原とアルカリ性ホスファターゼ標識ＨＢｓ抗原を用いて抗ＨＢｓ抗体測定用の装置を製造した。
【００１８】
前記免疫測定装置の検体点着ゾーンに検体液として、濃度１６ｍＩＵ／ｍｌの抗ＨＢｓ抗体を含む陽性血清２５μｌ加え、反応カセットの展開液槽から展開液をメンブレンに供給し、測定を開始した。展開液供給後１５分後の検出ゾーンの発色強度を目視で測定した。同一の陽性検体で３回ずつ測定した結果を表２に示す。また、陰性検体を用いて１５分後、３０分後の測定結果を表２に示す。更に、ＢＣＩＰ溶液に糖又は水溶性高分子化合物を含有しない基質ゾーンを設けた装置による測定結果（無添加；比較例）を表２に示す。
【００１９】
尚、表２中の記号は、前記表１と同じである。
【００２０】
【表２】
0003539277.tif 000003
【００２１】
【発明の効果】
本発明の測定装置では、陽性の検体であれば検出ゾーンに明瞭なシグナルが認められる。従って、この装置で測定すると、検出ゾーンのシグナルから極めて容易に判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置例を模式的に示す断面図である。
【符号の説明】
１  ＥＩＡ装置
２  メンブレン
３  基質ゾーン
４  展開液供給ゾーン
５  酵素標識試薬ゾーン
６  検体点着ゾーン
７  検出ゾーン
８  展開液吸収ゾーン
１０  展開液槽
１１  展開液
１２  シール部材
【図１】
0003539277.tif 000004