(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するＦＯ−２０３０物質またはその薬学的に許容し得る塩。
（１）元素分析値：Ｃ７２．０１％、Ｈ８．８２％
（２）分子式    ：Ｃ15Ｈ22Ｏ3 （高分解能マススペクトルによる）
（３）分子量    ：２５０
（４）融点      ：３００℃以上で分解
（５）比旋光度  ：〔α〕D 28＋４．４°（Ｃ＝０．１、メタノール中）
（６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、２０３、２２８ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（７）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外部吸収スペクトルは、３４１２、２９０２、２８９１、１７００、１６７４、１４７３、１３８０、１２７７、１０７５、１０１０ｃｍ-1付近に吸収帯を有する
（８）呈色反応  ：５０％Ｈ2 ＳＯ4 で発色する。ニンヒドリンに陰性
（９）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、酢酸エチルエステル、クロロホルムに可溶、水に不溶
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：中性
（１１）物質性状  ：無色粉末
【請求項２】
ペニシリウム属に属する請求項１に記載されたＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＦＯ−２０３０物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−２０３０物質を採取することを特徴とするＦＯ−２０３０物質の製造法。
【請求項３】
ペニシリウム属に属する請求項１に記載されたＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する微生物が、ペニシリウム  エスピー・ＦＯ−２０３０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０００）である請求項２記載の製造法。
【請求項４】
ペニシリウム属に属し請求項１に記載されたＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する微生物が、ペニシリウム  エスピー・ＦＯ−２０３０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０００）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、養鶏産業上重要な疾病であるコクシジウム症に対する治療薬および予防薬として有用なＦＯ−２０３０物質及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗コクシジウム剤としては、サルファ剤、キノリン剤、抗チアミン剤、抗生物質等が実用化されており、最近ではポリエーテル系抗生物質、例えばモネンシン、サリノマイシン、ラサロシド等が広く使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの薬剤に耐性のコクシジウムが出現し、その効果が弱まっており、これらに代わる抗コクシジウム剤が要望されている。
従って、本発明の目的は、上記の観点から、薬剤非耐性のコクシジウムは勿論のこと、特にポリエーテル系化合物に対して耐性を獲得したコクシジウムに対して有効な薬剤を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
一般に薬剤の交差耐性は、作用する物質の構造の類似あるいは作用機序の類似する場合に成立し、従来の抗コクシジウム剤と構造的に、あるいは、作用機序が相違する化合物はコクシジウム症の治療剤あるいは予防剤として有用である。本発明者らは、従来の薬剤に耐性を獲得したコクシジウム原虫に対しても有効な新規薬剤を自然界から見出すべく種々の研究を続け、モネンシン耐性のコクシジウム原虫を試験生物として、微生物の生産する代謝産物の中から探索した結果、新たに土壌から分離したＦＯ−２０３０菌株の培養液中にコクシジウムに有効な物質が産生されることを見出した。
【０００５】
次いで、培養物から抗コクシジウム活性物質を分離、精製した結果、後記の理化学的性質を有するＦＯ−２０３０物質は、従来全く知られていない物質であることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって、後記の物理化学的性状を有するＦＯ−２０３０物質またはその薬学的に許容し得る塩を提供するものである。更に、本発明は、ペニシリウム属に属し、ＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中にＦＯ−２０３０物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＯ−２０３０物質を採取することを特徴とするＦＯ−２０３０物質またはそれらの薬学的に許容し得る塩の製造法を提供するものである。
【０００６】
本発明のＦＯ−２０３０物質の物理化学的性状を述べると次の通りである。
（１）元素分析値：Ｃ７２．０１％、Ｈ８．８２％
（２）分子式：Ｃ１５Ｈ２２Ｏ３  （高分解能マススペクトルによる）
（３）分子量：２５０（高分解能ＥＩマススペクトルによる測定値は次の通りである）
計算値：２５０．１５７０
実測値：２５０．１５７２
（４）融点：３００℃以上で分解
【０００７】
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示す通りであり、２０３、２２８ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外部吸収スペクトルは図２に示す通りであり、３４１２、２９０２、２８９１、１７００、１６７４、１４７３、１３８０、１２７７、１０７５、１０１０ｃｍ−１付近に吸収帯を有する
（７）呈色反応：５０％Ｈ２  ＳＯ４  で発色する。ニンヒドリンに陰性
（８）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、酢酸エチルエステル、クロロホルムに可溶、水に不溶
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性
【０００８】
（１０）物質性状：無色粉末
（１１）核磁気共鳴スペクトル：バリアンＸＬ−４００、４００ＭＨｚ、ＮＭＲスペクトロメータを用いて重クロロホルム溶液中で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、それぞれ図３及び図４に示す通りである。また、水素および炭素の化学シフトは下記表１に示す通りである。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
本発明で使用される上記のＦＯ−２０３０物質を生産する微生物（以下、ＦＯ−２０３０物質生産菌と称する）は、ペニシリウム属に属するが、その中で例えば本発明者らが分離したペニシリウム属に属するペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−２０３０菌株は、本発明の最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。
【００１１】
Ｉ．形態的性質
本菌株はバレイショ・ブドウ糖寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地、麦芽汁寒天培地等で比較的良好に生育し、分生子の着生は中程度である。バレイショ・ブドウ糖寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると菌糸は透明で隔壁を有しており、分生子柄は基底菌糸より直生している。ペニシラスは単輪生で、分生子柄はまれに分岐し、分生子柄が隔壁を有し長くなるものと、短いものが混在する。梗子はペン先型〜とっくり型で２〜４個群生し、大きさは７．５〜１０．０×２〜３μｍである。はじめはフィアロ型分生子が、梗子の頂端に一個着生し、培養時間の経過と共に連鎖状となり、最終的にはこの連鎖は１００μｍ前後に達する。分生子は球形〜亜球形で、大きさは２．５〜３．０μｍであり、その表面は平滑である。
【００１２】
ＩＩ．各種培地上での諸性状
各種培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的に観察した結果を表２に示した。各培地において、菌の生育に伴う分泌液および菌核の形成は観察されなかった。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
ＩＩＩ．生理的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件はＹｐＳｓ培地においてｐＨ４〜８であり、生育温度は１５〜３０℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲はＹｐＳｓ培地においてｐＨ２〜１０、生育温度は８〜３７℃である。
３）好気性、嫌気性の区別：好気性
【００１５】
以上の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する菌種であると考えられ、ペニシリウム  エスピー・ＦＯ−２０３０と命名した。本菌株はペニシリウム  エスピー・ＦＯ−２０３０（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ・ＦＯ−２０３０）として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１４０００であり、受託日は平成５年１２月６日である。
【００１６】
以上、ＦＯ−２０３０物質生産菌について説明したが、菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射またはＸ線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ペニシリウム属に属し、ＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。又、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株もＦＯ−２０３０物質生産菌として包含される。
【００１７】
本発明においては、先ずペニシリウム属に属するＦＯ−２０３０物質を生産する能力を有する生産菌が培地に培養される。本菌の培養においては、通常真菌類の培養法が一般に用いられる。培地としては、微生物が同化し得る炭素源、資化し得る窒素源および無機物、更に必要に応じてその他の栄養物をほどよく含有する合成培地または天然培地を使用することができる。培地に使用される炭素源および窒素源としては、使用菌株の利用可能なものならばいずれの種類でもよい。
【００１８】
同化し得る炭素源としては、例えばグルコース、シュークロース、グリセロール、フラクトース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、リボース、デキストリン、糖密、澱粉またはその加水分解物等の種々の炭水化物が利用できる。その濃度は通常、培地に対して０．１〜５％が好ましい。又、グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン酸等の各種アミノ酸、さらにはメタノール、エタノール等のアルコール類やノルマルパラフィン等の非芳香属炭化水素、あるいは植物もしくは動物性の各種油脂等も使用可能である。
【００１９】
資化し得る窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の各種無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩類、尿素、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・ステイープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉あるいはその消化物、カゼインあるいはその水分解物などの含窒素有機物質、さらには、グリシン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能である。
【００２０】
無機物としては、例えば各種リン酸塩、硫酸塩、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム等を使用できる。さらには必要に応じて微量の重金属塩、消泡剤としての動物、植物、鉱物油等を添加することもできる。また、栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然その栄養要求性を満足させる物質を培地に加えなければならないが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合は、とくに添加を必要としない場合がある。
【００２１】
培養は通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培養のｐＨはたとえば５．０〜８．０であるが、ｐＨ６．５付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は例えば２０〜３７℃で行い得るが、通常は２６〜３２℃（好ましくは２７℃付近）に保つのがよい。培養時間は液体の場合、通常２〜５日間培養を行うと、本発明のＦＯ−２０３０物質が蓄積されるので、培養中の蓄積量が最大に達した時に、培養を終了すればよい。
【００２２】
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用できる。このようにして得られた培養物に蓄積される本発明のＦＯ−２０３０物質は菌体内および培養濾液中に含有されるので、培養物を遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、各々から本発明のＦＯ−２０３０物質を採取するのが有利である。
【００２３】
培養濾液からＦＯ−２０３０物質を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝物を採取するのに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、または反復して用いられる。すなわち、例えば抽出濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する例えば沈澱、結晶化、再結晶、転溶、向流分配法、クロマトグラフイー等の手段が用いられる。
【００２４】
培養液からＦＯ−２０３０物質を採取するには、菌体を除去した培養濾液から採取すればよい。例えば、培養濾液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非親水性有機溶媒で抽出するか、あるいは培養濾液あるいは菌体抽出液を活性炭、アルミナ、多孔性合成高分子樹脂、イオン交換樹脂等に吸着させ、メタノール等の溶出溶媒で溶出し、得られた抽出液を減圧濃縮後、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。
【００２５】
得られた粗物質は、さらに脂溶性物質の精製において通常用いられている公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナ等の担体を用いるカラムクロマトグラフイーあるいはＯＤＳ担体を用いる逆相クロマトグラフイーにより精製することができる。また、本発明のＦＯ−２０３０物質の薬学的に許容し得る塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を常法により製造することができる。
【００２６】
【発明の効果】
次に、本発明のＦＯ−２０３０物質の鶏に対する抗コクシジウム活性について述べる。
鶏コクシジウム生育阻害活性：
モネンシンに耐性の鶏コクシジウム、エイメリア・テネラのオーシストを用い、宿主であるハムスター腎由来細胞（ＢＨＫ−２１細胞）上での生育阻害活性を田畠らの方法（ジャーナル・オブ・アンチバイオテックス、４６、７４９−７５５（１９９３））に準じて測定した。その測定結果を表３に示した。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
本発明のＦＯ−２０３０物質の鶏コクシジウムに対する生育阻害作用濃度は、４．０μｇ／ｍｌであった。なお、ＦＯ−２０３０物質４０μｇ／ｍｌ濃度で細胞毒性が認められたが、本物質は宿主であるハムスター腎由来細胞（ＢＨＫ−２１細胞）に対してエイメリア・テネラの生育阻害活性を示す濃度において細胞毒性は認められなかった。一方、既知鶏コクシジウム生育阻害活性モネンシンについても同様の生育阻害実験を行った。その結果、モネンシンでは、コクシジウム生育阻害活性は認められず、０．０２μｇ／ｍｌ投与で宿主細胞に対する細胞毒性が認められた。
【００２９】
以上のように、本発明のＦＯ−２０３０物質は、ポリエーテル系抗生物質モネンシンに耐性のコクシジウム原虫の生育阻害活性を有することから、コクシジウム病の寛解に導くことが可能となる。また、公知の抗コクシジウム剤の薬物の効果を著しく持続せしめる併用剤として用いることもできる。
【００３０】
【実施例】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はけっしてこれのみに限定されるものではない。
実施例１
５００ｍｌ容三角フラスコに、グルコース２．０％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業（株）製）０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、リン酸２水素カリウム０．１％、寒天０．１％からなる液体培地（ｐＨ６．０）を１００ｍｌを分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、これに寒天斜面培地に生育させたペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＯ−２０３０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０００）の菌体を白金耳にて無菌的に接種し、２７℃、３日間培養して種培養液を得た。
【００３１】
次いで３０Ｌ容ジャー培養槽に可溶性澱粉３％、グリセロール１％、大豆粉２％、ドライイースト（ｆｅｒｍｉｐａｎ、旭化成工業（株）販売）０．３％、塩化カリウム０．３％、リン酸２水素カリウム０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地（ｐＨ６．５）を２０Ｌを仕込み、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。これに上記の種培養液２００ｍｌを接種し、攪拌速度２５０ｒｐｍ、通気量１０Ｌ／分で２７℃で２日間培養した。
【００３２】
この培養液１８Ｌに１８Ｌの酢酸エチルを加えてよく攪拌した後、遠心分離して酢酸エチル層を分離した。この酢酸エチル抽出液を減圧濃縮乾固して粗抽出物２３．４ｇを得た。この粗抽出物をシリカゲルクロマトグラフイー（クロロホルム６Ｌで洗浄後クロロホルム：メタノール（９９：１）６Ｌで活性物質を溶出させ粗精製物２．６ｇを得た。次いでメタノールに溶解させ、よくソニック後、遠心分離の操作で不溶物を除去し、粗精製物６４６ｍｇを得た。更に逆相（ＯＤＳ）系の高速液体クロマトグラフイー（展開溶媒：０．０５％リン酸含有４０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリル）により、ＦＯ−２０３０物質３．９ｍｇを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＯ−２０３０物質の紫外部吸収スペクトルである。
【図２】ＦＯ−２０３０物質の赤外部吸収スペクトルである。
【図３】ＦＯ−２０３０物質のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】ＦＯ−２０３０物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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