(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0003567174.tif 000003
（式中のｎは３〜６の整数である）
で表わされるメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを有効成分としてなる、正常細胞に対し低毒性のアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項２】
メチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートがブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｉｔａｌｉｃａ）由来のものである請求項１記載の正常細胞に対し低毒性のアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項３】
メチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートが沢わさび（Ｅｕｔｒｅｍａ  ｗａｓａｂｉ  Ｍａｘｉｍ．）由来のものである請求項１記載の正常細胞に対し低毒性のアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアナート、特に十字花科植物由来のメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを有効成分とした、正常細胞に対し低毒性の新規なアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
白血病は、骨髄の白血球細胞が自律増殖する疾患、いわゆる血液のがんであって、貧血、白血球増多症、血小板減少症などを起こし、しばしば肝、脾、リンパ節などの他の臓器に二次的浸潤病巣（転移）又は二次的造血病巣をつくることが知られている。
【０００３】
このような白血病の治療薬としては、これまで種々の合成物質、抗生物質、天然由来物質、あるいはインターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＣＳＦ（コロニー形成刺激因子）抑制物質などのバイオテクノロジー製品が開発されている。これらは、白血病細胞に作用して、その増殖を阻害したり、壊死すなわちネクローシスを起こさせて、疾病を治療するものである。しかしながら、上記ネクローシスによる細胞死は、往々にして病態細胞のみでなく、周囲の正常細胞にも及び新たな疾患を惹起するという重大な欠陥がある。
したがって、周囲の正常細胞に影響を与えずに、病態細胞のみに作用し、その増殖を阻害又は壊死させる治療薬が望ましい。
【０００４】
最近、このような要求を満たす治療薬として、アポトーシス誘導性の白血病細胞増殖阻害剤が見出され、これまで、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）の果肉から抽出されたレクチンタンパク質、トウアズキ（Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）の種子から分離されたレクチンタンパク質、ヒノキ科植物から抽出されるヒノキチオールなどが提案されている。
ここで、アポトーシスとは、修復することが困難な障害をもたらされた細胞がそのまま存続することが不利である場合、その細胞が一連のプログラムに沿って積極的に自己消化する生命現象のことであり、アポトーシス誘導性の白血病細胞増殖阻害剤を用いれば、血液中の白血病細胞が選択的に自己消化するため、正常細胞に対する影響が少ない状態で白血病治療を行うことができる。
【０００５】
ところで、十字花科植物の組織を摩砕するとその中に含まれているグルコシノレートから刺激性の強い香味成分として、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートが生成する。そして、この中のいくつかについては、実験的にニトロソアミンにより誘導されるラットの食道ガン、前胃ガンや７，１２‐ジメチルベンズ［ａ］アントラセン又はベンゾ［ａ］ピレンにより誘導されるヒト胃ガン、乳ガン、肺ガンなどを抑制する作用を有することが知られているが、白血病細胞に対してどのような作用を有するかは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、容易に入手可能な原料から製造しうる、正常細胞に対し低毒性の新規なアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、白血病細胞増殖阻害作用を有する物質について種々研究を重ねた結果、十字花科植物の組織中から抽出されるメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートが、白血病細胞に対し、優れたアポトーシス誘導性の増殖阻害作用を示すことを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、一般式
【化２】
0003567174.tif 000002
（式中のｎは３〜６の整数である）
で表わされるメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを有効成分としてなる、正常細胞に対し低毒性のアポトーシス誘導性ヒト白血病細胞増殖阻害剤を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において有効成分として用いる前記一般式（Ｉ）のメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートは、合成品を用いてもよいが、天然資源の有効利用及びコスト面から十字花科植物、例えば沢わさび（Ｅｕｔｒｅｍａ  ｗａｓａｂｉ  Ｍａｘｉｍ．）やブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｉｔａｌｉｃａ）の組織から抽出したものを用いるのが好ましい。これらの植物組織からメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを抽出するには、植物組織を摩砕し、エチルアルコールを加えて静置してエチルアルコール溶解分を除去したのち、残留分を乾燥し、水による抽出処理を行い、次にこの抽出液を必要に応じ加熱して酵素失活させ、遠心分離により沈殿物を除去し、上清液より限界濾過により分子量５，０００以下の画分を捕集し、凍結乾燥する。
【００１０】
次いで、このようにして得た乾燥物を蒸留水に溶かし、常法に従い、ゲル濾過し、必要に応じ高速液体クロマトグラフィーで活性成分を分画し、凍結乾燥する。このようにしてブロッコリーからは４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートを主体とするメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートが、また沢わさびからは、６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートを主体とするメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを得ることができる。
【００１１】
また、メチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートは、公知方法（例えば「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」，第８９巻，第２３９９ページ参照）により、一般式
ＣＨ３Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ  （ＩＩ）
（式中のｎは前記と同じ意味をもつ）
を酸化剤、例えば硝酸、過酸化水素などで処理することにより合成することができる。
【００１２】
このようにして得られたメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートがアポトーシス誘導による白血病細胞増殖阻害作用を示すことは、例えばこのメチルスルフィニルアルキルイソチオシアナートを蛍光標識したのち、蛍光標識の株化細胞との結合の形態及び細胞質内における挙動を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡により追跡し、かつアポトーシスに特徴的な細胞の形態変化を追跡することにより、確認することができる。また、顕微鏡観察では捉えることができない初期段階のアポトーシス発現は、白血病細胞膜構成成分の変化をフローサイトメトリー法で定量することにより、検出することができる。
【００１３】
本発明の白血病細胞増殖阻害剤は、非経口的に投与される。その投与量は、白血病の程度により増減されるが、通常１日当り０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で選ばれる。このものは、アポトーシス誘導による白血病細胞増殖阻害作用を示すため、他の細胞増殖阻害剤よりも少ない量の投与で十分な効果が得られる。このものは、０．１〜１０％濃度の水性溶液として製剤化されるが、所望に応じ溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤など注射液に慣用されている添加剤を併用することもできる。
【００１４】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００１５】
実施例１
急性リンパ性白血病由来のＴ細胞系ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）をＲＰＭ１−１６４０培地（１０％牛胎仔血清、１％グルタミン及び抗生物質としてストレプトマイシン及びペニシリンを含む）に接種し、５％ＣＯ２気相下、３７℃で培養し、株化細胞を調製した。
上記株化細胞を２．２２×１０５個／ｍｌの培養液とし、その９０μｌを９６穴マイクロウェルプレートに播種後、４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナート又は６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートの１５．６μｇ／ｍｌ溶液１０μｌを添加し、２０時間後に細胞を回収してＤＮＡを抽出した。次にこのＤＮＡを１．５重量％アガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロミドで染色し、紫外線を照射してその断片化を観察した。その結果を図１に示す。
図中の１はラダーマーカー、２はコントロール、３はキャスパーゼインヒビター（１００μＭ）を添加したコントロール、４は４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナート、５はキャスパーゼインヒビター（１００μＭ）を添加した４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナート、６は６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナート、７はキャスパーゼインヒビター（１００μＭ）を添加した６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートをそれぞれ示す。なお、キャスパーゼインヒビターとは、カルボベンゾキシ‐Ａｓｐ‐ＣＨ２‐ジクロロベンゾイルオキシメタンのことである。
【００１６】
実施例２
実施例１と同様にして得た株化細胞２．２２×１０５個／ｍｌを含む培養液９０μｌを同じ条件で２４時間培養後、濃度が１〜５０μｇ／ｍｌの範囲の所定の値になるように４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートのリン酸緩衝液に溶かして、各１０μｌずつを添加したのち、５％ＣＯ２気相下、３７℃でさらに２０時間培養した。
各濃度で培養した培養液１００μｌに含まれる細胞のミトコンドリア脱水素酵素の活性をテトラゾリウム塩を用いた毒性試験法に従って測定し、その値を指標にして細胞生存率を求めた。
このようにして得た４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率との関係を図２にグラフとして示す。
なお、４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートとしては、ブロッコリーから抽出し、精製したものを用いた。
【００１７】
次に、急性リンパ性白血病由来のジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）の代わりに、急性リンパ性白血病由来のＴ細胞系のモルト−４（ＭＯＬＴ−４）、急性リンパ性白血病由来のＢ細胞系のナルム−６（ＮＡＬＭ−６）及び同じＢ細胞系のバルム−１（ＢＡＬＭ−１）をそれぞれ用いて同様の操作を行った。４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナート濃度と細胞生存率との関係を図２にグラフとして示す。
【００１８】
実施例３
実施例２における４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートの代わりに、沢わさびから抽出した６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートを用い、実施例１と同様にしてジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、モルト−４（ＭＯＬＴ−４）、ナルム−６（ＮＡＬＭ−６）及びバルム−１（ＢＡＬＭ−１）に対する６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率の関係を調べ、その結果を図３にグラフとして示す。
【００１９】
参考例１
実施例２におけるジャーカット細胞の代わりに、３人の健常人由来の正常なリンパ球細胞ノーマル−Ｏ（ｎｏｒｍａｌ−Ｏ）、ノーマル−Ａ（ｎｏｒｍａｌ−Ａ）及びノーマル−Ｂ（ｎｏｒｍａｌ−Ｂ）を用いて実施例２と同様にして４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートの細胞生存率の濃度依存性を調べ、その結果を図４にグラフとして示す。なお、図４には比較のためにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）についてのグラフも示した。
【００２０】
参考例２
実施例３におけるジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）の代わりに、３人の健常人由来の正常なリンパ球細胞ノーマル−Ｏ（ｎｏｒｍａｌ−Ｏ）、ノーマル−Ａ（ｎｏｒｍａｌ−Ａ）及びノーマル−Ｂ（ｎｏｒｍａｌ−Ｂ）を用いて、実施例３と同様にして６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートの細胞生存率の濃度依存性を調べ、その結果を図５にグラフとして示す。なお、図５には比較のためにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）についてのグラフも示した。
【００２１】
以上の図２、図３と図４、図５とを対比すれば分かるように、本発明の白血病細胞増殖阻害剤は、正常なリンパ球細胞に対しては白血病細胞に対するよりも細胞毒性の効果が著しく低いことから、白血病の治療薬として好適である。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、白血病細胞に対しては強い毒性効果を示すが、正常細胞に対しては低い毒性効果を示す白血病の治療に好適に用いうる白血病細胞増殖阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートと６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートで処理したジャーカット細胞からのＤＮＡ断片化の状態を示す写真。
【図２】種々の白血病細胞に関する、４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフ。
【図３】種々の白血病細胞に関する、６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフ。
【図４】３人の健常人由来の正常なリンパ球細胞及びジャーカット細胞に関する、４‐メチルスルフィニルブチルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフ。
【図５】３人の健常人由来の正常なリンパ球細胞及びジャーカット細胞に関する、６‐メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアナートの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフ。
【図１】
0003567174.tif 000004
【図２】
0003567174.tif 000005
【図３】
0003567174.tif 000006
【図４】
0003567174.tif 000007
【図５】
0003567174.tif 000008