(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗非胎児型シトクロムＰ４５０抗体と非胎児型シトクロムＰ４５０との抗原抗体反応を用いた免疫測定により、血清中の非胎児型シトクロムＰ４５０を測定することから成る、非胎児型シトクロムＰ４５０の測定方法。
【請求項２】
測定される前記非胎児型シトクロムＰ４５０は、３Ａファミリーに属するヒト型のシトクロムＰ４５０である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗非胎児型シトクロムＰ４５０抗体は、抗ラットシトクロムＰ４５０  ３Ａ２抗体である請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰとも言う。以下、単に「Ｐ４５０」と略記）の測定方法に関する。本発明は、肝疾患の診断等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｐ４５０は種々の酸素添加反応を触媒する酵素であり、近年薬物代謝酵素として注目され始めているものである。Ｐ４５０は、肝細胞のミクロソーム中に局在するものであり、これを肝機能マーカーとして用いることが知られている。Ｐ４５０は肝細胞のミクロソーム中に局在するので、これを測定するためには肝細胞を採取する必要があり、患者の負担が大きく、また、採取にもかなりの手間がかかる。
【０００３】
一方、妊婦の血清中のＰ４５０を測定し、これを腫瘍マーカーとして利用することが知られている（特開平２−２３４０６２号公報）。しかしながら、ここで測定されるＰ４５０は、妊婦が出産を終えれば元に戻ることから、胎児由来のＰ４５０が母親の体内に漏れ出したものであり、母親自身のＰ４５０を測定しているわけではないと考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、肝細胞を採取することなく非胎児型のＰ４５０を測定する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、肝細胞のミクロソーム中に局在し、血液中に漏れ出ることがないと考えられていたＰ４５０が、血液中に測定可能な濃度に存在する場合があることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、抗非胎児型シトクロムＰ４５０抗体と非胎児型シトクロムＰ４５０との抗原抗体反応を用いた免疫測定により、血清中の非胎児型シトクロムＰ４５０を測定することから成る、非胎児型シトクロムＰ４５０の測定方法を提供する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
上記のように、本願発明者らは、肝細胞のミクロソーム中に局在している非胎児型Ｐ４５０が血清中に検出可能な濃度に存在することがあるという驚くべき事実を見出し、本発明に至ったものである。従って、血清中の非胎児型Ｐ４５０を免疫測定により測定する方法は全て本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
本発明の方法により測定される非胎児型Ｐ４５０としては、特に限定されず、全ての非胎児型Ｐ４５０が測定可能であると考えられるが、好ましくは、ヒト型の３Ａファミリーに属するＰ４５０、すなわち、Ｐ４５０  ３Ａ３、３Ａ４、３Ａ５及び３Ａ５ｐが測定される。
【００１０】
本発明の方法に用いられる抗非胎児型Ｐ４５０抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗体の調製方法はこの分野において周知である。抗非胎児型Ｐ４５０ポリクローナル抗体は、種々のものが市販されているので、これらの市販の抗体を用いることができる。
【００１１】
３ＡファミリーのＰ４５０を測定するためには、３ＡファミリーのＰ４５０を対応抗原とする抗体を用いることが好ましい。３Ａファミリーに対する抗体は、３Ａファミリーに属する各種Ｐ４５０と交差反応するので、３Ａファミリーに属するいずれかのＰ４５０を免疫原として用いて作製した抗体を用いて３Ａファミリーに属するＰ４５０を測定することができる。また、抗非胎児型Ｐ４５０抗体は、種を越えて交差反応性を示すので、ヒト血清中のＰ４５０を測定するのにヒト以外の動物由来の非胎児型Ｐ４５０を免疫原として得られる抗体を用いることができる。例えば、下記実施例では、ラットのＰ４５０  ３Ａ２を免疫原として用いて得たポリクローナル抗体を用いて、ヒトにはＰ４５０  ３Ａ２が存在しないにもかかわらず、ヒト血清中のＰ４５０を測定することができた。
【００１２】
免疫測定の方法自体は周知である。本発明の方法は、特定の免疫測定方法に限定されるものではなく、公知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、反応形式で分類すれば、例えばサンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれであってもよく、また、標識で分類すれば、例えば酵素標識法、放射標識法、蛍光標識法、ビオチン標識法等のいずれであってもよい。これらの免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、酵素標識サンドイッチ法の詳細な一例が下記実施例に記載されている。
【００１３】
免疫測定に供する血清は、希釈してもよいが、希釈することなく免疫測定に供することができる。
【００１４】
血清中の非胎児型Ｐ４５０は、下記実施例に記載するように、健常人ではほとんど検出されないが、原発性肝細胞癌、肝硬変、慢性肝炎、自己免疫性肝炎等では有意な割合で検出される。従って、血清中の非胎児型Ｐ４５０を測定することは、肝疾患の診断の一助となる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１６】
（１）  検量線の作成
抗Ｐ４５０抗体としては、常法により、ラットのＰ４５０  ３Ａ２を免疫原としてウサギに免疫し、回収された抗ラットＰ４５０  ３Ａ２ウサギポリクローナル抗体を用いた。
【００１７】
上記ポリクローナル抗体をＰＢＳ（ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２  ＨＰＯ４  ・１２Ｈ２  Ｏ  １．４４ｇ、ＫＨ２  ＰＯ４    ０．２ｇ／Ｈ２  Ｏ  １リットル）中に、５μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。この溶液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルの量分注し、４℃で一夜放置して抗体をウェルに固相化した。ウェルを洗浄後、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を２００μｌ／ウェルの量で各ウェルに分注し、室温下、１時間放置した。ウェルを洗浄後、標準抗原としてのラットＰ４５０  ３Ａ２を、２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、２０、０  ｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌの８点に調製し、１５０μｌ／ウェルの量で分注し、室温下、２時間放置した。ウェルを洗浄後、上記ポリクローナル抗体を常法によりビオチン化して得られたビオチン化ポリクローナル抗体を、上記ブロッキング緩衝液中に５μｇ／ｍｌの濃度になるように調製し、１００μｌ／ウェルの量で分注し、室温下、１時間放置した。ウェルを洗浄後、１５００倍希釈したペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製）をＴＢＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５））にて調製後、１００μｌ／ウェルの量で分注し、室温下、０．５時間放置した。ウェルを洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の添附文書に従って基質を調製後、１００μｌ／ウェルの量で分注し、室温下、１時間放置した。次いで４Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルの量で分注し反応を停止した。各ウェルの吸光度（吸収波長４５０／６５０ｎｍ）を測定した。なお、上記の操作において、ウェルの洗浄は、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  ２４ｇ、ＫＣｌ  ０．６ｇ、Ｎａ２  ＨＰＯ４  ・１２Ｈ２  Ｏ  ８．７ｇ、ＫＨ２  ＰＯ４    ０．６ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）１．５ｍｌ／Ｈ２  Ｏ  ３リットル）にて４回（最終洗浄は５回）、ソークタイム１５秒で行った。
【００１８】
結果を図１に示す。図１に示されるように、測定された吸光度は抗原の濃度に依存して変化しており、２０〜２０００  ｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌの範囲で精度良く免疫測定が可能であることがわかった。
【００１９】
（２）  ヒト血清中のＰ４５０  ３Ａの測定
（１）  で記載したＥＩＡ系を用い、健常人、ゾニサミド投与患者及び各種間疾患患者の血清中のＰ４５０  ３Ａファミリーを測定した。結果を下記表１に示す。
【００２０】
【表１】
表１
0003544413.tif 000002
【００２１】
表１から明らかなように、陽性の検体が得られ、ヒト血清中にＰ４５０が存在する場合があること、及びヒトにはＰ４５０  ３Ａ２は存在しないにもかかわらず、交差反応により、ラットのＰ４５０  ３Ａ２に対する抗体を用いてヒト血清中のＰ４５０  ３Ａファミリーを測定することが可能であることが確認された。さらに、表１に示されるように、肝疾患患者の血清中にＰ４５０が検出される確率は健常人に比べてはるかに高いので、血清中のＰ４５０を測定することは、肝疾患診断の一助となることがわかった。
【００２２】
（３）  ヒト血清中Ｐ４５０  ３Ａの精製及びウェスタンブロッティング
（１）  で用いた抗ラットＰ４５０  ３Ａ２ポリクローナル抗体を担体（ホルミルセルロファイン（生化学工業社製）に常法により結合し、カラム（φ０．７ｃｍｘ５．５ｃｍ）に充填した。これを用いて、（２）  で陽性となった血清をプールしたものをアフィニティクロマトグラフィーにかけた。平衡緩衝液は０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、溶出緩衝液は２Ｍ
ＫＳＣＮ、１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用い、流速は５〜１０ｍｌ／時間で行った。溶出画分を１ｍｌずつ集め、２８０ｎｍ及び４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００２３】
図２に示されるように、高い吸光度を有する画分が得られた。これらの画分中にＰ４５０  ３Ａが含まれることは（１）  に記載したＥＩＡにより確認した。
【００２４】
このようにして得られたＰ４５０画分を１つにまとめ、ウェスタンブロットを行った。また、比較のため、ヒト肝細胞ミクロソーム中のＰ４５０についても同様にウェスタンブロットを行った。ウェスタンブロットは具体的に次のようにして行った。
【００２５】
１０％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルを調製し、このゲルを用いて常法により試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。泳動後、一組（７ｘ９ｃｍ）のニトロセルロース転写膜へ１００ｍＡ、１時間通電しながら転写した。得られた転写膜を５％スキムミルク含有ＰＢＳ（ＮａＣｌ  ８．０ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２  ＨＰＯ４  ・２Ｈ２  Ｏ  １．４４ｇ、ＫＨ２  ＰＯ４    ０．２ｇ／Ｈ２  Ｏ  １リットル）に浸して、室温下１時間攪拌することによりブロッキングした。膜を洗浄後、０．５％スキムミルク含有ＰＢＳにて（１）  で用いた抗ラットＰ４５０  ３Ａ２ポリクローナル抗体を５０μｇ／１０ｍｌに調製し、転写膜を浸して室温下、１時間攪拌することにより一次反応を行った。次いで膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。０．５％スキムミルク含有ＰＢＳにてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清（ＴＡＧＯ社製）を２５０００倍希釈に調製し、転写膜を浸して室温下、１時間攪拌することにより二次反応を行った。上記と同様に洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ法により染色した。すなわち、ニトロブルーテトラゾリウム２０ｍｇ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．７）をＮＢＴ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート２０ｍｇ／ジメチルスルホキシド１ｍｌをＢＣＩＰとして、ＮＢＴ：ＢＣＩＰ＝１００：１に混合したもの１０ｍｌを発色剤として用いた。発色剤に転写膜を浸して酵素反応を室温下に行った。適当な染色像が得られたら、十分に水で洗浄して遮光下、風乾した。結果を図３に示す。なお、図３には、比較のため、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色して得られた電気泳動パターンも併せて示す。
【００２６】
図３中、レーン１はヒト血清Ｐ４５０  ３Ａ粗分画のＣＢＢ染色、レーン２はレーン１のウェスタンブロット解析、レーン３はレーン４のウェスタンブロット解析、レーン４はヒト肝ミクロソーム分画のＣＢＢ染色の結果を示す。図３に示されるように、ヒト血清Ｐ４５０  ３Ａ粗分画とヒト肝ミクロソーム分画のウェスタンブロット解析において、全く同じ位置に抗ラットＰ４５０  ３Ａ２と反応するバンドが検出された。このことから、ヒト血清中に肝細胞ミクロソーム中と同じ抗原性を有するＰ４５０  ３Ａが存在すること、及び該Ｐ４５０  ３Ａが、ヒトには存在しないラットのＰ４５０  ３Ａ２に対する抗体を用いて検出可能であることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、血清中に非胎児型のＰ４５０が検出可能に存在することが初めて明らかにされ、血清中の非胎児型のＰ４５０の測定が可能になった。従って、本発明により、肝細胞を採取することなくＰ４５０を測定することが可能になったので、患者の負担や医療機関の手間が減少する。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素免疫分析によりラットＰ４５０  ３Ａ２を測定して得られた検量線を示す図である。
【図２】抗ラットＰ４５０  ３Ａ２ポリクローナル抗体を結合したアフィニティクロマトカラムにヒト血清をかけて得られたアフィニティクロマトグラムを示す図である。
【図３】図２に示すアフィニティクロマトグラフィーにより得られたＰ４５０含有画分及びヒト肝細胞ミクロソーム画分のウェスタンブロットの結果をＣＢＢ染色の結果と併せて示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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