【手続補正書】
【提出日】平成29年2月24日(2017.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的配列の変異体のライブラリーを作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は保護され、他方のオリゴヌクレオチドは保護されず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対して増幅反応を実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップ;
(d)dsDNA変異体の前記集団を、前記dsDNA変異体の保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる酵素とインキュベートし、それによってssDNA変異体の集団を作製するステップ;
(e)ssDNA変異体の前記集団をssDNA媒介体にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップであって、前記ssDNA媒介体は、前記目的配列又はその断片と実質的に同一の配列を含む、ステップ; 及び
(f)前記ヘテロ二本鎖DNAを細胞に形質転換し、それによって前記目的配列の変異体のライブラリーを作製するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記鋳型DNA分子が、
(i)直鎖状dsDNA分子であるか、
(ii)環状dsDNA分子であるか、又は
(iii)環状ssDNA分子であり、場合によりここで、前記鋳型DNA分子が、ウラシル化若しくはメチル化環状ssDNA分子であり、
場合によりここで、前記鋳型DNA分子の配列が、前記ssDNA媒介体の配列と実質的に同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的配列が、100塩基対を超え、
場合によりここで、前記目的配列が、
(i)100〜2000塩基対、
(ii)300〜1500塩基対、及び/又は
(iii)700〜1200塩基対
である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、3個以上の5'ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記保護されないオリゴヌクレオチドが、3個以上の5'ホスホロチオエートを含まないオリゴヌクレオチドであり、
場合によりここで、
(i)前記保護されたオリゴヌクレオチドが、3、4、又は5個の5'ホスホロチオエートを含み、
(ii)保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、T7エキソヌクレアーゼであり、及び/又は
(iii)保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、ラムダエキソヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、5'ホスフェートを含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記保護されないオリゴヌクレオチドが、5'ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチドであり、
場合によりここで、保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、ラムダエキソヌクレアーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅反応が、
(i)PCR反応であり、場合によりここで、前記増幅反応がエラープローンPCR反応であるか、
(ii)等温増幅反応であるか、又は
(iii)ローリングサイクル増幅反応である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
dsDNA変異体の前記集団のdsDNA変異体の50％が、前記目的配列と99.5％未満の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
(i)保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素とのインキュベーションの前に、dsDNA変異体の前記集団を精製するステップ、
(ii)前記ssDNA媒介体へのハイブリダイゼーションの前に、ssDNA変異体の前記集団を精製するステップ、及び/又は
(iii)前記細胞への形質転換の前に、前記ヘテロ二本鎖DNAを精製するステップ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ssDNA媒介体が、前記目的配列又はその断片と少なくとも50％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ssDNA媒介体が、ファージミド、又はファージミドの配列と実質的に同一である配列断片を含むベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ssDNA変異体の前記集団の、前記ssDNA媒介体への前記ハイブリダイゼーションが、ssDNA変異体の前記集団及び前記ssDNA媒介体の変性温度での共インキュベーションと、その後の、アニーリング温度までの徐冷却を含み、
場合によりここで、
(i)前記変性温度が約90℃であり、
(ii)前記アニーリング温度が約55℃であり、及び/又は
(iii)前記徐冷却が、1分あたり約-1℃の速度で生じる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞又は細菌細胞であり、及び/又は、前記細胞が、前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
(i)前記ssDNA媒介体が、修飾核酸塩基、又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミン以外の核酸塩基を含み、
(ii)前記ssDNA媒介体が、ウラシル化ssDNA媒介体であり、場合によりここで、前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる前記細胞が、Ung+細菌細胞であり、好ましくは、前記細胞が、TG1大腸菌(E. coli)細胞であり、及び/又は、
(iii)前記ssDNA媒介体が、メチル化ssDNA媒介体であり、場合によりここで、前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる前記細胞が、Mcr+細菌細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼとのインキュベーションによって、前記ssDNA媒介体にハイブリダイズされた前記ssDNA変異体を伸長することをさらに含み、
場合によりここで、
(i)前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼとの前記インキュベーションが、前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼとのインキュベーションを含むか、
(ii)前記ssDNA媒介体がメチル化ssDNA媒介体であり、かつ、ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAを変性するステップ、及び変性した生成物を、メチル化DNAを選択的に分解する酵素とインキュベートするステップをさらに含み、好ましくは、前記メチル化ssDNA媒介体が、メチル化アデニン核酸塩基を含み、かつ、メチル化DNAを選択的に分解する前記酵素が、DpnIであるか、又は
(iii)前記ssDNA変異体がメチル化され、前記ssDNA媒介体がメチル化されず、かつ、ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAを変性するステップ、及び変性した生成物を、非メチル化DNAを選択的に分解する酵素とインキュベートするステップをさらに含み、好ましくは、前記メチル化ssDNA変異体が、メチル化されたシトシン又はグアニン核酸塩基を含み、かつ、非メチル化DNAを選択的に分解する前記酵素が、DNA配列5'-GATC-3'を認識する制限酵素である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヘテロ二本鎖DNAの前記細胞への前記形質転換が、前記細胞の2個以上、10個以上、20個以上、又は50個以上のアリコートの独立した形質転換を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的配列が、
(i)抗体又はそのドメイン若しくは断片、
(ii)ポリメラーゼ又はそのドメイン若しくは断片、又は
(iii)酵素又はそのドメイン若しくは断片
をコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ1(a)〜1(d)が、ssDNA変異体の2種以上の集団を作製するために、2種以上の異なる目的配列のそれぞれから並行して実施され、ここで、前記オリゴヌクレオチド、前記増幅反応、及び前記酵素は、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれに対するステップ1(a)〜1(d)のいずれか又は全ての適用において異なってよく、かつ、ssDNA変異体の前記集団は、ステップ1(e)の前又は最中に混合される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つが、
(i)単一の鋳型DNA分子から増幅され、好ましくは、前記2種以上の異なる目的配列の全てが、単一の鋳型DNA分子から増幅されるか、又は
(ii)異なる鋳型DNA分子から増幅され、好ましくは、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれが、異なる鋳型DNA分子から増幅される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
並行して実施される前記ステップの1つ以上が、
(i)前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つについて単一の反応において実施され、好ましくは、並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列の全てについて単一の反応において実施されるか、又は
(ii)前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つについて別々に実施され、好ましくは、並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれについて別々に実施される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ssDNA媒介体が、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれ、又はその断片、と実質的に同一の配列を含み、かつ、ステップ1(e)が、ssDNA変異体の前記2種以上の集団のそれぞれの、前記ssDNA媒介体へのハイブリダイゼーションを包含し、
場合によりここで、
(i)ssDNA変異体の前記2種以上の集団が、前記ssDNA媒介体に同時にハイブリダイズされるか、又は
(ii)ssDNA変異体の前記2種以上の集団が、前記ssDNA媒介体に連続的にハイブリダイズされる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
エラープローンPCRによってdsDNA変異体の集団を作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は3個以上の5'ホスホロチオエートを含み、他方のオリゴヌクレオチドは3個以上の5'ホスホロチオエートを含まず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ; 及び
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してエラープローンPCRを実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップ
を含む、方法。
【請求項２２】
非組み換え核酸を選択的に分解する方法であって、以下:
(a)制限部位を有する少なくとも1つのセグメントを含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)前記制限部位を含まない少なくとも1つのセグメントを含む第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第一の核酸及び前記第二の核酸を、前記第一の核酸の前記セグメントが前記第二の核酸の前記セグメントに置き換えられるように前記第一の核酸及び前記第二の核酸を組み換えるための反応に供し、それによって前記制限部位を含まない組み換え生成物を作製するステップ;
(d)前記反応の生成物を、前記制限部位を切断することができる制限酵素を発現する細胞に形質転換するステップ; 及び
(e)前記細胞を、前記細胞によって発現される前記制限酵素による切断を可能にするのに十分な様式でインキュベートするステップ
を含み、
場合によりここで、前記細胞が、前記制限酵素によって切断される制限部位を含まない組み換え生成物を含むかどうかを決定するステップ、又は前記細胞から前記組み換え生成物を単離するステップをさらに含む、方法。
【請求項２３】
前記制限酵素がEco29kIであり、及び/又は、前記組み換え生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異されていない核酸を選択的に分解する方法であって、以下:
(a)制限部位を有する少なくとも1つのセグメントを含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)前記制限部位を含まず、かつ前記制限部位を有する前記第一の核酸の少なくともセグメントにハイブリダイズすることができる、少なくとも1つのセグメントを有する、第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第二の核酸を前記第一の核酸にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップ;
(d)前記ヘテロ二本鎖DNAを回復させ、それによって前記制限部位を含まない生成物を作製するステップ;
(e)前記反応の生成物を、前記制限部位を切断することができる制限酵素を発現する細胞に形質転換するステップ; 及び
(f)前記細胞を、前記細胞によって発現される前記制限酵素による切断を可能にするのに十分な様式でインキュベートするステップ
を含み、
場合によりここで、(i)前記細胞が、前記制限酵素によって切断される制限部位を含まない生成物を含むかどうかを決定するステップ、又は(ii)前記細胞から前記生成物を単離するステップをさらに含む、方法。
【請求項２５】
(i)前記制限酵素がEco29kIであり、
(ii)前記生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第二の核酸の少なくとも一部又はその配列によってコードされ、及び/又は
(iii)前記第一の核酸がssDNA媒介体であり、前記第二の核酸がssDNA変異体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
目的配列の変異体のライブラリーを作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は保護され、他方のオリゴヌクレオチドは保護されず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してエラープローンポリメラーゼの取り込みを用いて増幅反応を実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップであって、前記dsDNA変異体はそれぞれ、Eco29kI制限部位を含まない、ステップ;
(d)dsDNA変異体の前記集団を、前記dsDNA変異体の保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる酵素とインキュベートし、それによってssDNA変異体の集団を作製するステップ;
(e)ssDNA変異体の前記集団をssDNA媒介体にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップであって、前記ssDNA媒介体は、前記目的配列又はその断片と実質的に同一の配列を含み、前記ssDNA媒介体は、ウラシル化ssDNA媒介体又はメチル化ssDNA媒介体であり、前記ssDNA媒介体はそれぞれ、1つ以上のEco29kI制限部位を含む、ステップ; 及び
(f)前記ヘテロ二本鎖DNAを細胞に形質転換し、それによって前記目的配列の変異体のライブラリーを作製するステップであって、前記細胞は、前記1つ以上のEco29kI制限部位を選択的に分解することができる酵素を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
非組み換え核酸を選択的に分解する方法であって、以下:
(a)制限部位を有する少なくとも1つのセグメントを含む第一の核酸を提供するステップであって、少なくとも1つのセグメントは、ベクターをコードする配列を含む、ステップ;
(b)前記制限部位を含まない少なくとも1つのセグメントを含む少なくとも1つの第二の核酸を提供するステップであって、前記少なくとも1つのセグメントは、scFv軽鎖可変領域、scFv重鎖可変領域、scFvリンカー領域、IgG重鎖定常領域、IgG軽鎖定常領域、Gp3タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つをコードする配列を含む、ステップ;
(c)前記第一の核酸及び前記少なくとも1つの第二の核酸を、前記第一の核酸の前記セグメントが前記第二の核酸の前記セグメントに置き換えられるように組み換え反応に供し、それによって前記制限部位を含まない組み換え生成物及び前記制限部位を含む組み換え生成物を作製するステップ;
(d)前記反応の組み換え生成物を、前記制限部位を切断することができる制限酵素を発現する細胞に形質転換するステップ; 及び
(e)前記細胞を、前記細胞によって発現される前記制限酵素による切断を可能にするのに十分な様式でインキュベートするステップであって、前記制限部位を含まない組み換え生成物は維持され、前記制限部位を含む組み換え生成物は選択的に分解される、ステップ
を含む、方法。
【請求項２８】
(i)前記細胞が、前記制限酵素によって切断される制限部位を含まない組み換え生成物を含むかどうかを決定するステップ、又は
(ii)前記細胞から、前記制限部位を含まない前記組み換え生成物を単離するステップ
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記制限酵素がEco29kIであり、及び/又は、前記組み換え生成物が、
(i)免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされるか、
(ii)免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン重鎖が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされるか、又は
(iii)免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記制限部位がSacII制限部位を含み、場合によりここで、前記制限部位がヌクレオチド配列CCGCGGを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、
(i)細菌細胞であり、場合によりここで、前記細菌細胞が大腸菌細胞であるか、
(ii)昆虫細胞であるか、又は
(iii)哺乳動物細胞であり、場合によりここで、前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
具体的な実施形態に関連して発明を記載したが、さらなる改変が可能であることが理解される。したがって、本明細書は、当分野内の公知の又は慣習的な実施の範囲にある本開示からの発展を含めて、概して本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用、又は応用をカバーすることが意図される。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
目的配列の変異体のライブラリーを作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は保護され、他方のオリゴヌクレオチドは保護されず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対して増幅反応を実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップ;
(d)dsDNA変異体の前記集団を、前記dsDNA変異体の保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる酵素とインキュベートし、それによってssDNA変異体の集団を作製するステップ;
(e)ssDNA変異体の前記集団をssDNA媒介体にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップであって、前記ssDNA媒介体は、前記目的配列又はその断片と実質的に同一の配列を含む、ステップ; 及び
(f)前記ヘテロ二本鎖DNAを細胞に形質転換し、それによって前記目的配列の変異体のライブラリーを作製するステップ
を含む、方法。
[項目２]
前記鋳型DNA分子が、直鎖状dsDNA分子である、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記鋳型DNA分子が、環状dsDNA分子である、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記鋳型DNA分子が、環状ssDNA分子である、項目１に記載の方法。
[項目５]
前記鋳型DNA分子が、ウラシル化又はメチル化環状ssDNA分子である、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記鋳型DNA分子の配列が、前記ssDNA媒介体の配列と実質的に同一である、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
[項目７]
前記目的配列が、100塩基対を超える、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
[項目８]
前記目的配列が、300塩基対を超えるか、500塩基対を超えるか、又は700塩基対を超える、項目７に記載の方法。
[項目９]
前記目的配列が、100〜2000塩基対である、項目７に記載の方法。
[項目１０]
前記目的配列が、300〜1500塩基対である、項目９に記載の方法。
[項目１１]
前記目的配列が、700〜1200塩基対である、項目１０に記載の方法。
[項目１２]
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、3個以上の5'ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記保護されないオリゴヌクレオチドが、3個以上の5'ホスホロチオエートを含まないオリゴヌクレオチドである、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、3、4、又は5個の5'ホスホロチオエートを含む、項目１２に記載の方法。
[項目１４]
保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、T7エキソヌクレアーゼである、項目１２又は１３に記載の方法。
[項目１５]
保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、ラムダエキソヌクレアーゼである、項目１２又は１３に記載の方法。
[項目１６]
前記保護されたオリゴヌクレオチドが、5'ホスフェートを含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記保護されないオリゴヌクレオチドが、5'ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチドである、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素が、ラムダエキソヌクレアーゼである、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記増幅反応が、PCR反応である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１９]
前記増幅反応が、エラープローンPCR反応である、項目１８に記載の方法。
[項目２０]
前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２１]
前記増幅反応が、ローリングサイクル増幅反応である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
dsDNA変異体の前記集団のdsDNA変異体の50％が、前記目的配列と99.5％未満の同一性を有する、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２３]
dsDNA変異体の前記集団のdsDNA変異体の50％が、前記目的配列と98％未満の同一性を有する、項目２２に記載の方法。
[項目２４]
保護されない鎖を保護された鎖より優先して選択的に分解することができる前記酵素とのインキュベーションの前に、dsDNA変異体の前記集団を精製するステップをさらに含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記ssDNA媒介体へのハイブリダイゼーションの前に、ssDNA変異体の前記集団を精製するステップをさらに含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
前記ssDNA媒介体が、前記目的配列又はその断片と少なくとも50％の同一性を有する配列を含む、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
[項目２７]
前記ssDNA媒介体が、前記目的配列又はその断片と少なくとも70％の同一性を有する配列を含む、項目２６に記載の方法。
[項目２８]
前記ssDNA媒介体が、前記目的配列又はその断片と少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、項目２７に記載の方法。
[項目２９]
前記ssDNA媒介体が、前記目的配列又はその断片と100％の同一性を有する配列を含む、項目２８に記載の方法。
[項目３０]
前記ssDNA媒介体が、ファージミド、又はファージミドの配列と実質的に同一である配列断片を含むベクターである、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
ssDNA変異体の前記集団の、前記ssDNA媒介体への前記ハイブリダイゼーションが、ssDNA変異体の前記集団及び前記ssDNA媒介体の変性温度での共インキュベーションと、その後の、アニーリング温度までの徐冷却を含む、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
[項目３２]
前記変性温度が約90℃である、項目３１に記載の方法。
[項目３３]
前記アニーリング温度が約55℃である、項目３１又は３２に記載の方法。
[項目３４]
前記徐冷却が、1分あたり約-1℃の速度で生じる、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
前記細胞が、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞又は細菌細胞である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
[項目３６]
前記ssDNA媒介体が、修飾核酸塩基、又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミン以外の核酸塩基を含む、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
[項目３７]
前記細胞が、前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる細胞である、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
[項目３８]
前記ssDNA媒介体が、ウラシル化ssDNA媒介体である、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目３９]
前記ssDNA媒介体が、メチル化ssDNA媒介体である、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる前記細胞が、Ung+細菌細胞である、項目３８に記載の方法。
[項目４１]
前記細胞が、TG1大腸菌(E. coli)細胞である、項目４０に記載の方法。
[項目４２]
前記ssDNA媒介体を選択的に分解することができる前記細胞が、Mcr+細菌細胞である、項目３９に記載の方法。
[項目４３]
ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼとのインキュベーションによって、前記ssDNA媒介体にハイブリダイズされた前記ssDNA変異体を伸長することをさらに含む、項目１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼとの前記インキュベーションが、前記ヘテロ二本鎖DNAのDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼとのインキュベーションを含む、項目４３に記載の方法。
[項目４５]
前記ssDNA媒介体がメチル化ssDNA媒介体であり、かつ、ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAを変性するステップ、及び変性した生成物を、メチル化DNAを選択的に分解する酵素とインキュベートするステップをさらに含む、項目４３又は４４に記載の方法。
[項目４６]
前記メチル化ssDNA媒介体が、メチル化アデニン核酸塩基を含み、かつ、メチル化DNAを選択的に分解する前記酵素が、DpnIである、項目４５に記載の方法。
[項目４７]
前記ssDNA変異体がメチル化され、前記ssDNA媒介体がメチル化されず、かつ、ステップ(e)が、前記ヘテロ二本鎖DNAを変性するステップ、及び変性した生成物を、非メチル化DNAを選択的に分解する酵素とインキュベートするステップをさらに含む、項目４３又は４４に記載の方法。
[項目４８]
前記メチル化ssDNA変異体が、メチル化されたシトシン又はグアニン核酸塩基を含み、かつ、非メチル化DNAを選択的に分解する前記酵素が、DNA配列5'-GATC-3'を認識する制限酵素である、項目４７に記載の方法。
[項目４９]
前記細胞への形質転換の前に、前記ヘテロ二本鎖DNAを精製するステップをさらに含む、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
[項目５０]
前記ヘテロ二本鎖DNAの前記細胞への前記形質転換が、前記細胞の2個以上、10個以上、20個以上、又は50個以上のアリコートの独立した形質転換を含む、項目１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
[項目５１]
前記目的配列が、抗体又はそのドメイン若しくは断片をコードする、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
[項目５２]
前記目的配列が、ポリメラーゼ又はそのドメイン若しくは断片をコードする、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
[項目５３]
前記目的配列が、酵素又はそのドメイン若しくは断片をコードする、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
[項目５４]
ステップ1(a)〜1(d)が、ssDNA変異体の2種以上の集団を作製するために、2種以上の異なる目的配列のそれぞれから並行して実施され、ここで、前記オリゴヌクレオチド、前記増幅反応、及び前記酵素は、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれに対するステップ1(a)〜1(d)のいずれか又は全ての適用において異なってよく、かつ、ssDNA変異体の前記集団は、ステップ1(e)の前又は最中に混合される、項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
[項目５５]
前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つが、単一の鋳型DNA分子から増幅される、項目５４に記載の方法。
[項目５６]
前記2種以上の異なる目的配列の全てが、単一の鋳型DNA分子から増幅される、項目５５に記載の方法。
[項目５７]
前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つが、異なる鋳型DNA分子から増幅される、項目５４に記載の方法。
[項目５８]
前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれが、異なる鋳型DNA分子から増幅される、項目５７に記載の方法。
[項目５９]
並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つについて単一の反応において実施される、項目５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
[項目６０]
並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列の全てについて単一の反応において実施される、項目５９に記載の方法。
[項目６１]
並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列の少なくとも2つについて別々に実施される、項目５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
[項目６２]
並行して実施される前記ステップの1つ以上が、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれについて別々に実施される、項目６１に記載の方法。
[項目６３]
前記ssDNA媒介体が、前記2種以上の異なる目的配列のそれぞれ、又はその断片、と実質的に同一の配列を含み、かつ、ステップ1(e)が、ssDNA変異体の前記2種以上の集団のそれぞれの、前記ssDNA媒介体へのハイブリダイゼーションを包含する、項目５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
[項目６４]
ssDNA変異体の前記2種以上の集団が、前記ssDNA媒介体に同時にハイブリダイズされる、項目６３に記載の方法。
[項目６５]
ssDNA変異体の前記2種以上の集団が、前記ssDNA媒介体に連続的にハイブリダイズされる、項目６３に記載の方法。
[項目６６]
エラープローンPCRによってdsDNA変異体の集団を作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は3個以上の5'ホスホロチオエートを含み、他方のオリゴヌクレオチドは3個以上の5'ホスホロチオエートを含まず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ; 及び
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してエラープローンPCRを実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップ
を含む、方法。
[項目６７]
エラープローンPCRによってssDNA変異体の集団を作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は3個以上の5'ホスホロチオエートを含み、他方のオリゴヌクレオチドは3個以上の5'ホスホロチオエートを含まず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してエラープローンPCRを実施し、それによってdsDNA変異体の集団を作製するステップ; 及び
(d)dsDNA変異体の前記集団を、前記dsDNA変異体の非ホスホロチオエート鎖を加水分解することができるが、ホスホロチオエート鎖を加水分解することができない酵素とインキュベートし、それによってssDNA変異体の集団を作製するステップ
を含む、方法。
[項目６８]
PCRによってdsDNA分子の集団を作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は3個以上の5'ホスホロチオエートを含み、他方のオリゴヌクレオチドは3個以上の5'ホスホロチオエートを含まず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ; 及び
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してPCRを実施し、それによってdsDNA分子の集団を作製するステップ
を含む、方法。
[項目６９]
PCRによってssDNA分子の集団を作製する方法であって、以下:
(a)前記目的配列を含む鋳型DNA分子を提供するステップ;
(b)オリゴヌクレオチドのペアを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列の逆鎖にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドの一方は3個以上の5'ホスホロチオエートを含み、他方のオリゴヌクレオチドは3個以上の5'ホスホロチオエートを含まず、かつ、前記オリゴヌクレオチドは前記目的配列に隣接する、ステップ;
(c)前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記鋳型DNA分子に対してPCRを実施し、それによってdsDNA分子の集団を作製するステップ; 及び
(d)dsDNA分子の前記集団を、前記dsDNA分子の非ホスホロチオエート鎖を加水分解することができるが、ホスホロチオエート鎖を加水分解することができない酵素とインキュベートし、それによってssDNA分子の集団を作製するステップ
を含む、方法。
[項目７０]
ファージディスプレイの方法であって、以下:
(a)項目１〜６５のいずれか一項に記載の変異体のライブラリーを提供するステップ;  (b)変異体の前記ライブラリーの1つ以上のアリコートを培養して、変異体の培養ライブラリーを作製するステップ;
(c)変異体の前記培養ライブラリーの1つ以上のアリコートを、ヘルパーファージとインキュベートし、ファージディスプレイライブラリーを作製するステップであって、前記ファージディスプレイライブラリーの細胞が、前記目的配列によってコードされるタンパク質の変異体を提示する、ステップ;
(d)前記ファージディスプレイライブラリーの前記細胞を、標的分子と接触させるステップであって、前記目的配列によってコードされるタンパク質の前記変異体の1つ以上が、前記標的分子と相互作用し得る、ステップ; 及び
(e)前記ファージディスプレイライブラリーの前記細胞の中から、前記標的分子と相互作用する変異体タンパク質を提示する細胞を単離するステップ
を含む、方法。
[項目７１]
非組み換え核酸を選択的に分解する方法であって、以下:
(a)制限部位を有する少なくとも1つのセグメントを含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)前記制限部位を含まない少なくとも1つのセグメントを含む第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第一の核酸及び前記第二の核酸を、前記第一の核酸の前記セグメントが前記第二の核酸の前記セグメントに置き換えられるように前記第一の核酸及び前記第二の核酸を組み換えるための反応に供し、それによって前記制限部位を含まない組み換え生成物を作製するステップ;
(d)前記反応の生成物を、前記制限部位を切断することができる制限酵素を発現する細胞に形質転換するステップ; 及び
(e)前記細胞を、前記細胞によって発現される前記制限酵素による切断を可能にするのに十分な様式でインキュベートするステップ
を含む、方法。
[項目７２]
前記細胞が、前記制限酵素によって切断される制限部位を含まない組み換え生成物を含むかどうかを決定するステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
[項目７３]
前記細胞から前記組み換え生成物を単離するステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
[項目７４]
前記制限酵素がEco29kIである、項目７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
[項目７５]
前記組み換え生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされる、項目７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
[項目７６]
突然変異されていない核酸を選択的に分解する方法であって、以下:
(a)制限部位を有する少なくとも1つのセグメントを含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)前記制限部位を含まず、かつ前記制限部位を有する前記第一の核酸の少なくともセグメントにハイブリダイズすることができる、少なくとも1つのセグメントを有する、第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第二の核酸を前記第一の核酸にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップ;
(d)前記ヘテロ二本鎖DNAを回復させ、それによって前記制限部位を含まない生成物を作製するステップ;
(e)前記反応の生成物を、前記制限部位を切断することができる制限酵素を発現する細胞に形質転換するステップ; 及び
(f)前記細胞を、前記細胞によって発現される前記制限酵素による切断を可能にするのに十分な様式でインキュベートするステップ
を含む、方法。
[項目７７]
前記細胞が、前記制限酵素によって切断される制限部位を含まない生成物を含むかどうかを決定するステップをさらに含む、項目７６に記載の方法。
[項目７８]
前記細胞から前記生成物を単離するステップをさらに含む、項目７６に記載の方法。
[項目７９]
前記制限酵素がEco29kIである、項目７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
[項目８０]
前記生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第二の核酸の少なくとも一部又はその配列によってコードされる、項目７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
[項目８１]
前記第一の核酸がssDNA媒介体であり、前記第二の核酸がssDNA変異体である、項目７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
[項目８２]
突然変異されたオープンリーディングフレームからタンパク質を選択的に発現する方法であって、以下:
(a)1つ以上の終止コドンを、もしそれがなければ発現可能なオープンリーディングフレームの少なくとも1つのセグメント中に含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)終止コドンを含まない少なくとも1つのセグメントを含む第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第一の核酸及び前記第二の核酸を、前記第一の核酸の前記セグメントが前記第二の核酸の前記セグメントに置き換えられるように前記第一の核酸及び前記第二の核酸を組み換えるための反応に供し、それによって前記オープンリーディングフレーム中に終止コドンを含まない組み換え生成物を作製するステップ;
(d)前記反応の生成物を細胞に形質転換するステップ; 及び
(e)前記細胞を、前記オープンリーディングフレームの発現を可能にするのに十分な期間インキュベートするステップ
を含む、方法。
[項目８３]
前記細胞が、前記第一の核酸の一部の配列及び前記第二の核酸の少なくとも一部の配列を含むオープンリーディングフレームから発現されるタンパク質又はその一部を含むかどうかを決定するステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
[項目８４]
前記第一の核酸の一部の配列及び前記第二の核酸の少なくとも一部の配列を含むオープンリーディングフレームから発現されるタンパク質又はその断片を前記細胞から単離するステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
[項目８５]
前記組み換え生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第一の核酸の少なくとも一部及び前記第二の核酸の少なくとも一部によってコードされる、項目８２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
[項目８６]
前記組換え反応が、第一の核酸がssDNA媒介体であり、第二の核酸がssDNA変異体である、突然変異誘発反応である、項目８２〜８５のいずれか一項の記載の方法。
[項目８７]
突然変異されたオープンリーディングフレームからタンパク質を選択的に発現する方法であって、以下:
(a)1つ以上の終止コドンを、もしそれがなければ発現可能なオープンリーディングフレームの少なくとも1つのセグメント中に含む第一の核酸を提供するステップ;
(b)終止コドンを含まず、かつ前記終止コドンの1つ以上を有する前記第一の核酸の少なくともセグメントにハイブリダイズすることができる、少なくとも1つのセグメントを含む、第二の核酸を提供するステップ;
(c)前記第二の核酸を前記第一の核酸にハイブリダイズさせ、ヘテロ二本鎖DNAを作製するステップ;
(d)前記ヘテロ二本鎖DNAを回復させ、それによって前記オープンリーディングフレーム中に終止コドンを含まない生成物を作製するステップ;
(e)前記反応の生成物を細胞に形質転換するステップ; 及び
(f)前記細胞を、前記オープンリーディングフレームの発現を可能にするのに十分な期間インキュベートするステップ
を含む、方法。
[項目８８]
前記細胞が、前記第一の核酸の一部の配列及び前記第二の核酸の少なくとも一部の配列を含むオープンリーディングフレームから発現されるタンパク質又はその一部を含むかどうかを決定するステップをさらに含む、項目８７に記載の方法。
[項目８９]
前記第一の核酸の一部の配列及び前記第二の核酸の少なくとも一部の配列を含むオープンリーディングフレームから発現されるタンパク質又はその断片を前記細胞から単離するステップをさらに含む、項目８７に記載の方法。
[項目９０]
前記生成物が、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖をコードし、前記免疫グロブリン軽鎖及び前記免疫グロブリン重鎖の1つ以上が、前記第二の核酸の少なくとも一部又はその配列によってコードされる、項目８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
[項目９１]
前記組換え反応が、第一の核酸がssDNA媒介体であり、第二の核酸がssDNA変異体である、突然変異誘発反応である、項目８７〜９０のいずれか一項に記載の方法。