(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主が本来有しないSP6ファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識される、目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列と、外来因子による誘導によってコピー数を増加させる、lacプロモータの制御下にある複製起点とを有してなるプラスミドベクターであって、該目的遺伝子として、致死的タンパク質をコードする遺伝子を保持していることを特徴とするプラスミドベクター。
【請求項２】
目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列が配列表の配列番号30で示される塩基配列を含むものである請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を有する、請求項１又は２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
pACE601、pACE611、pACE701およびpACE702から選択されるプラスミドベクターであって、かつ致死的タンパク質をコードする遺伝子を保持している請求項３に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプラスミドベクターと、該プラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ遺伝子とを宿主に導入し、外来因子により該プラスミドベクターのコピー数の増加を誘導すると共に該RNAポリメラーゼの発現の誘導を行って致死的タンパク質をコードする遺伝子の転写、翻訳を行うことを特徴とする、致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項６】
プラスミドベクターのコピー数の増加とRNAポリメラーゼの発現とが異なる外来因子により誘導されることを特徴とする請求項５に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項７】
プラスミドベクターのコピー数の増加とRNAポリメラーゼの発現とが同一の外来因子により誘導されることを特徴とする請求項５に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項８】
プラスミドベクターのコピー数の増加を誘導する外来因子が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の添加および／またはラクトースの添加である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項９】
RNAポリメラーゼの発現を誘導する外来因子が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の添加、ラクトースの添加、ガラクトースの添加、アラビノースの添加、トリプトファン濃度の低減、及び形質転換体の培養温度の調整からなる群より選択されるものの１種以上である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項１０】
RNAポリメラーゼ遺伝子が他のプラスミドベクター又はファージベクターによって宿主に導入されていることを特徴とする請求項５に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項１１】
RNAポリメラーゼ遺伝子が宿主の染色体上に組み込まれていることを特徴とする請求項５に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項１２】
RNAポリメラーゼ遺伝子がSP6ファージ由来のものであることを特徴とする請求項10又は11に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項１３】
大腸菌を宿主に用いて行われることを特徴とする請求項５〜請求項12のいずれか１項に記載の致死的タンパク質をコードする遺伝子の発現方法。
【請求項１４】
致死的タンパク質をコードする遺伝子の単離方法において、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプラスミドベクターを用いることを特徴とする致死的タンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、遺伝子組換え技法において使用されるプラスミドベクター、及び該プラスミドベクターを用いた遺伝子の発現方法に関する。さらに本発明は、かかるプラスミドベクターを用いる目的遺伝子の単離方法に関する。また本発明は、遺伝子工学試薬として有用な制限酵素及びその遺伝子、更に詳細にはAcc III制限酵素及びそのDNAに関する。
背景技術
遺伝子組換え技法によって目的とする遺伝子の発現システムを構築する際には、用いる宿主のRNAポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下に目的遺伝子を配置することにより、該遺伝子の発現を制御することが行われる。しかし、宿主に対して有害なタンパク質をコードする遺伝子の場合には、用いるプロモーターの発現制御が厳密に行えないことに起因して該遺伝子産物の発現のためにプラスミドの構築自体が不可能になることがある。
そのような問題点を解決すべく開発された発現システムとしては大腸菌を宿主とし、大腸菌に感染するバクテリオファージ  T7のRNAポリメラーゼを利用したpET−システム（ノバジェン社製）がある［ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J.Mol.Biol.）第189巻、第113〜130頁（1986）、ジーン（Gene）、第56巻、第125〜135頁（1987）］。pET−システムは、プロモーター認識の特異性及び転写活性の高いT7RNAポリメラーゼを大腸菌内で発現させ、このT7RNAポリメラーゼが発現ベクター上のT7プロモーター下流に配置された目的遺伝子を転写し、高発現されるシステムである。目的の遺伝子の転写はT7RNAポリメラーゼによってのみ起こるため、該ポリメラーゼを生産しない宿主中では目的の遺伝子を発現させることなくプラスミドの構築をすることが可能であり、目的遺伝子を宿主の有するRNAポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下において発現システムを構築する場合とは異なりプラスミドの構築自体が不可能になることはない。
しかし、T7RNAポリメラーゼ遺伝子は、λ−ファージベクター上にクローニングされて発現用の宿主に溶原化されているために宿主を自由に選ぶことができず、宿主を変更しようとする場合には煩雑な操作が必要となる。さらに、宿主中のT7RNAポリメラーゼの発現があまり厳密に制御されていないため、非誘導状態の宿主内でもT7RNAポリメラーゼが発現されており、その結果、発現ベクター上のT7プロモーター下流に配置された目的遺伝子の発現が非誘導状態においても起こる。このような目的遺伝子の非誘導状態における発現を低下させるために、T7RNAポリメラーゼの阻害物質であるT7リゾチームを用いてT7RNAポリメラーゼの活性を阻害したり［ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J.Mol.Biol.）第219巻、第37〜44頁（1991）］、T7プロモーター下流にラクトースオペレーターを配置してT7RNAポリメラーゼのT7プロモーターへのアクセスを防いだりしている［ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第219巻、第45〜59頁（1991）］。
しかし、これらの措置も転写活性の高いT7RNAポリメラーゼに対しては十分でなく、非誘導状態のT7RNAポリメラーゼの活性を完全に阻止することはできない。そのため、目的の遺伝子産物が宿主に対して致死的な場合、プラスミドの構築はできてもその遺伝子を発現させるための形質転換体を作製できないことがある。つまり、pET−システムには宿主を自由に変更できないこと、およびT7RNAポリメラーゼの発現制御が正確でないこと、以上２つの解決すべき問題点がある。
一方、バクテリオファージ  T7に性質が類似したバクテリオファージとして、サルモネラ属細菌（Salmonella typhimurium）に感染するバクテリオファージSP6がある［サイエンス（Science）、第133巻、第2069〜2070頁（1961）］。バクテリオファージSP6が生産するRNAポリメラーゼは、分子量が約10万のシングルペプチドであり、プロモーター認識の特異性が強く転写活性も高いため試験管内RNA合成によく用いられている［ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J.Biol.Chem.）第257巻、第5772〜5778頁（1982）、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J.Biol.Chem.）、第257巻、第5779〜5788頁（1982）］。さらに、SP6RNAポリメラーゼ遺伝子はすでにクローニングされ、大腸菌内で大量発現されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第15巻、第2653〜2664頁（1987）］。
宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺伝子の例として、制限酵素（Restriction Endonuclease）遺伝子がある。本来制限酵素は、産生している微生物の体内に侵入したファージ等の外来DNAを切断することによる自己防御に利用される。一方、制限酵素を産生する微生物は、大抵の場合、制限酵素と同じ塩基配列を認識する修飾酵素を産生し、制限酵素による切断から自己のDNAを制御している。すなわち、修飾酵素は認識する塩基配列中の塩基の一つ以上にメチル基を添加してDNAを修飾し、同じ配列を認識する制限酵素の結合、或いは該酵素によるDNA切断を不可能にする。この機構を制限修飾系と呼び、構成する制限酵素及び修飾酵素の遺伝子対を制限修飾系遺伝子と呼ぶ。従って、制限修飾系遺伝子の修飾酵素遺伝子が欠損した微生物中で制限酵素遺伝子が発現すると、微生物自身のDNAが切断され細胞は死に到る。Mbo I制限修飾系遺伝子には二種類の修飾酵素遺伝子が存在しているが、このうちの一方の修飾酵素遺伝子のみを共存させることによる不完全なメチル化では宿主DNAの修飾が不完全となり、制限酵素遺伝子のクローニングが不可能であることが報告されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第21巻、第2309〜2313頁（1993）］。
また、制限修飾系遺伝子を保持する細胞より制限修飾系遺伝子の脱落が起こると、細胞内に存在する修飾活性が不足してゲノムDNAのメチル化が不完全になり、細胞内に残存するごく少量の制限酵素によって自分自身のゲノムDNAが切断されて致死的となることが明らかにされている［サイエンス（Science）第267巻、第897〜899頁（1995）］。このように制限修飾系を構成する修飾酵素非共存下では、制限酵素は細胞にとって極めて有害なタンパク質であり、その遺伝子を単独でクローニングし、さらに発現させることはこれまでの技術では不可能であった。
ここで制限酵素について触れると、その酵素学的性質により制限酵素はＩ型、II型、III型に分類する事ができる。その中でも、特定のDNA塩基配列を認識し、その配列の内部或いは近傍の特定の位置で切断するII型制限酵素は、遺伝子工学の分野で広く使用され、これまでに種々の特異性を有する制限酵素が様々な微生物から単離されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第24巻、第223〜235頁（1996）］。以下、本明細書ではII型制限酵素を「制限酵素」と記載する。しかし、微生物によっては、産生している制限酵素量が少なかったり、複数の制限酵素を産生している場合がある。例えば、制限酵素Acc IIIは通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３（郵便番号305）〕に、昭和60年11月９日（原寄託日）よりFERM  BP−935として寄託されているアチネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）（以下Acc菌と略する）により生産されるが、該酵素の発現量は低く、また本菌はAcc I及びAcc II制限酵素を同時に産生している。従って、高純度、安価な試薬として制限酵素Acc IIIを本菌を用い提供するには高度な製造技術を要した。高純度で安価な試薬として制限酵素を提供する場合、目的の制限酵素遺伝子を単離し、目的制限酵素のみを大量生産する遺伝子工学的生産は有効な手段である。この目的を達成するため、従来制限酵素遺伝子を単離する幾つかの方法が報告されている。
まず制限酵素を産生している微生物のゲノムDNAを適当な制限酵素により切断し、その断片を適当なプラスミドベクターに挿入し、制限酵素遺伝子が発現するクローンを選択する「ショットガン」方法が挙げられる。目的クローンのスクリーニング法として、例えば、宿主に制限修飾系遺伝子が導入されると、宿主が自己防衛機能を獲得することを利用し、ファージの感染に対する耐性を指標にし、制限修飾系遺伝子を単離する方法［Pst I:プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  USA（Proc.Ntal.Acad.Sci.）第78巻、第1503〜1507頁（1981）］がある。しかし、本方法では、制限修飾系遺伝子のサイズが単離可能な範囲に収まる必要があり、さらに単離された制限修飾系遺伝子の発現が、宿主を選択的に生存させうるに十分なファージ耐性を示す必要がある。一方、制限修飾系遺伝子の一般的な特徴として、制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子がゲノム上で近接していることが挙げられ、実際、これまでに得られた制限修飾系遺伝子の多くで確認されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第19巻、第2539〜2566頁（1991）］。そこで、上記特徴を利用し、修飾酵素遺伝子の発現を指標とし制限修飾系遺伝子をスクリーニングする方法［特開昭63−87982、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic.Acids Res.）第19巻、第1831〜1835頁（1991）］がある。しかし本法は、修飾酵素遺伝子に制限酵素遺伝子が近接していない場合、制限酵素遺伝子を得ることはできない。
さらに上記の「ショットガン」方法には、根本的な問題がある。それは、ゲノムDNA供給源となる生物と宿主との間の転写翻訳機構の違いである。例えば制限修飾系遺伝子に付随するプロモーター及びリボゾーム結合部位が宿主内でうまく機能せず、十分な遺伝子発現が起こらない場合には、たとえ目的の遺伝子を含有する形質転換体を得られていても、その形質転換体を選択する事に多大な労力を要する。この点を回避するには、例えば、制限酵素タンパク質のアミノ酸配列を解析し、そのデータを基にPCRによるDNA増幅法により、制限酵素産生菌のゲノムDNAより制限酵素遺伝子を得、既知のタンパク質発現システムを利用する方法がある［特開平６−277070］。しかし、従来のタンパク質発現システムでは、制限酵素の存在が宿主に対し致死的となるため、何らかの方法、例えば該酵素と制限修飾系を構成する修飾酵素を共存させ、宿主を保護する必要がある。
前述の制限酵素遺伝子の単離方法はいずれも、該遺伝子とともに制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子を同時に単離することが必要であるが、制限酵素遺伝子単独で単離する方法も報告されている［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic.Acids.Res.）第22巻、第2399〜2403頁（1994）］。しかし、この方法で例示されているのは、酵素活性至適温度が70℃付近の制限酵素をコードする遺伝子の単離であり、宿主培養温度近辺で比活性の高い制限酵素をコードする遺伝子を単離する場合には、やはり修飾酵素遺伝子を共存させている。
また例外的に、制限酵素Dpn Iの様にDNA認識配列中の特定の核酸塩基がメチル化による修飾を受けていないと、切断活性を示さない制限酵素が存在する。このような性質を有する制限酵素遺伝子は、宿主菌を選択することにより、例外的に、他の特定の遺伝子非共存下でも単離可能だと考えられる。実際、II型制限酵素ではないが、メチル化を受けた核酸塩基を含む特定のDNA塩基配列を認識し、DNA切断活性を有するMrrタンパク質をコードしたmrr遺伝子が単離されている［ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第173巻、第5207〜5219頁（1991）］。
上述したように、従来の技術により制限酵素遺伝子の単離を行うには、特殊な場合を除き、該遺伝子と制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子を同時に発現させる必要があった。
発明の開示
従って、本発明の第１の目的は、その遺伝子産物が宿主にとって致死的、あるいは有害であるため、従来技術では単離が困難であったり、発現システムの構築が困難であった遺伝子であっても単離することができ、さらに宿主に導入して効率よく該タンパク質を発現させることのできるプラスミドベクターを提供することにある。本発明の第２の目的は、このプラスミドベクターを用いた目的遺伝子の発現方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、このプラスミドベクターを利用することによる、目的遺伝子の単離方法、特に制限修飾系を構成する修飾酵素遺伝子の共存を必要としない、制限酵素遺伝子の単離方法を提供することにある。本発明の第４の目的は、Acc III制限酵素活性を有するポリペプチドを提供することにある。さらに本発明の第５の目的はAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供することにある。
本発明者らはpET−システムの問題点を解決するため、発現制御が正確な新しい発現システムとして、まずSP6RNAポリメラーゼを用いた発現システムの構築を行い、該システムの評価を試みた。
該発現システムは、SP6RNAポリメラーゼ遺伝子をminiFプラスミドに組み込んだシステムプラスミドを利用して構築されているため、目的の遺伝子をSP6プロモーター下流にクローニングした発現ベクターとこのシステムプラスミドを同時に宿主に導入することにより、様々な大腸菌で目的遺伝子の発現システムを構築することができる。さらに、lacプロモーターとアンチセンス技術を利用してシステムプラスミド上のSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の厳密な発現制御を可能にした。β−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子に用いて本発現システムを評価した結果、このシステムにおいてSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は正確に制御されており、非誘導状態でSP6RNAポリメラーゼがほとんど発現していないこと、および誘導後には目的遺伝子の高発現に必要十分なSP6RNAポリメラーゼが発現し、目的遺伝子が高発現することが明らかになった。
しかしながら大腸菌を宿主とした場合には、SP6プロモーターは大腸菌のRNAポリメラーゼによって非常に弱いながら認識されるために、その下流にある目的遺伝子は非誘導状態においてもごく少量発現することが明らかになった。このため、遺伝子産物が大腸菌に対して非常に有害で致死的に働く場合には発現システムの構築は不可能となり、本発明の目的を充分に達成することはできないことが判明した。
そこで、本発明者らはさらに鋭意研究した結果、目的遺伝子の発現を２種類の制御方法、すなわち該遺伝子のコピー数の制御、およびプロモーターを介した転写制御とを組み合わせてコントロールする新規なシステムを採用することにより、意外にも（ｉ）非誘導状態では目的遺伝子の発現を検出できないレベルに抑えることが可能であり、（ii）発現誘導を行った場合には目的遺伝子を含有するプラスミドのコピー数を上昇させると共にRNAポリメラーゼを発現させ、該RNAポリメラーゼの認識するプロモーター下流に配置された目的遺伝子が転写、翻訳されることを見いだした。即ち、本発明のプラスミドベクターは、上記課題を解決することができる、遺伝子工学的分野において画期的な性質を有するプラスミドベクターであり、本発明者らはさらに該ベクターを利用して目的遺伝子の発現方法を完成するに至った。
更に、上記プラスミドベクターを用いて、宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺伝子を単離する方法、特に、従来技術の欠点を克服した制限酵素遺伝子の単離方法を完成するに至った。
また上記の方法を利用することにより、従来得られていなかったAcc III制限酵素をコードするDNAをAcc III修飾酵素を共存させることなく単離することができ、更にAcc III制限酵素を大量発現させることが確認できた。
即ち、本発明の要旨は、
（１）  宿主が本来有しないSP6ファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識される、目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列と、外来因子による誘導によってコピー数を増加させる、lacプロモータの制御下にある複製起点とを有してなるプラスミドベクターであって、対応する修飾酵素遺伝子の共存なしに制限酵素遺伝子を宿主に保持させうることを特徴とするプラスミドベクター、
（２）  目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列が配列表の配列番号30で示される塩基配列を含むものである前記（１）に記載のプラスミドベクター、
（３）  選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を有する、前記（１）又は（２）に記載のプラスミドベクター、
（４）  pACE601、pACE611、pACE701、pACE702から選択される前記（３）に記載のプラスミドベクター、
（５）  前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプラスミドベクターに発現させようとする目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクター、
（６）  前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプラスミドベクターに発現させようとする目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターと、該プラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ遺伝子とを宿主に導入し、外来因子により該プラスミドベクターのコピー数の増加を誘導すると共に該RNAポリメラーゼの発現の誘導を行って目的遺伝子の転写、翻訳を行うことを特徴とする、目的遺伝子の発現方法、
（７）  プラスミドベクターのコピー数の増加とRNAポリメラーゼの発現とが異なる外来因子により誘導されることを特徴とする前記（６）に記載の目的遺伝子の発現方法、
（８）  プラスミドベクターのコピー数の増加とRNAポリメラーゼの発現とが同一の外来因子により誘導されることを特徴とする前記（６）に記載の目的遺伝子の発現方法、
（９）  プラスミドベクターのコピー数の増加を誘導する外来因子が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の添加および／またはラクトースの添加である、前記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の目的遺伝子の発現方法、
（10）  RNAポリメラーゼの発現を誘導する外来因子が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の添加、ラクトースの添加、ガラクトースの添加、アラビノースの添加、トリプトファン濃度の低減、及び形質転換体の培養温度の調整からなる群より選択されるものの１種以上である、前記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の目的遺伝子の発現方法、
（11）  RNAポリメラーゼ遺伝子が他のプラスミドベクター又はファージベクターによって宿主に導入されていることを特徴とする前記（６）に記載の目的遺伝子の発現方法、
（12）  RNAポリメラーゼ遺伝子が宿主の染色体上に組み込まれていることを特徴とする前記（６）に記載の目的遺伝子の発現方法、
（13）  RNAポリメラーゼ遺伝子がSP6ファージ由来のものであることを特徴とする前記（11）又は（12）に記載の目的遺伝子の発現方法、
（14）  目的遺伝子が宿主に対し致死的となる、あるいは有害なタンパク質をコードするものである、前記（６）〜（13）のいずれか１項に記載の目的遺伝子の発現方法、
（15）  大腸菌を宿主に用いて行われることを特徴とする前記（６）〜（14）のいずれか１項に記載の目的遺伝子の発現方法、
（16）  目的遺伝子の単離方法において、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプラスミドベクターを用いることを特徴とする目的遺伝子の単離方法、
（17）  目的遺伝子が宿主に対し致死的となる、あるいは有害なタンパク質をコードする遺伝子である前記（16）に記載の目的遺伝子の単離方法、
（18）  宿主に対し致死的となる、あるいは有害なタンパク質をコードする遺伝子が制限酵素遺伝子である、前記（17）に記載の目的遺伝子の単離方法、に関するものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、モデル発現プラスミドpMSP6LおよびpMSP6Fの構成を示す図である。
第２図は、モデル発現プラスミドpMSP60の構成を示す図である。
第３図（A,B）は、ランナウエイプラスミドpHS2870の構築の手順を示す図である。
第４図は、ランナウエイプラスミドpHS2870の構成を示す図である。
第５図（A,B）は、プラスミドpCRS04の構築の手順を示す図である。
第６図は、プラスミドpCRS04の構成を示す図である。
第７図は、プラスミドpCRA19の構成を示す図である。
第８図（A,B,C,D,E）は、システムプラスミドpFSP6の構築の手順を示す図である。
第９図（A,B）は、プラスミドpACE601の構築の手順を示す図である。
第10図は、プラスミドpACE611の構成を示す図である。
第11図（A,B）は、プラスミドpACE611の構築の手順を示す図である。
第12図（A,B）は、プラスミドpCRS70の構築の手順を示す図である。
第13図（A,B）は、プラスミドpACE701およびpACE702の構築の手順を示す図である。
第14図は、大腸菌HB101にpFSP6およびおACE601又はpFSP6およびpACE601−Nsp IIIを導入し、IPTGの誘導の有無によるNsp7524 III制限活性酵素の発現をλ−DNAの分解反応液のアガロースゲル電気泳動により調べた図である。図中のＭは、λ−EcoT141サイズマーカーを示し、１はAva I消化したλ−DNAを示し、２は誘導後のHB101/pFSP6/pACE601を示し、３は誘導前のHB101/pFSP6/pACE601を示し、４は誘導後のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、５は誘導前のHB101/pFSP6/pACE601/−Nsp IIIを示す。
第15図は、大腸菌HB101にpFSP6およびpACE601又はpFSP6およびpACE601−Nsp IIIを導入し、IPTG誘導の有無によるλ−DNAの分解反応を２時間および３時間まで延長した場合のアガロースゲル電気泳動を示す図である。図中のＭは、λ−EcoT141サイズマーカーを示し、１はAva I消化したλ−DNAを示し、２は１時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、３は２時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、４は３時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、５は１時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、６は２時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、７は３時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601を示し、８は１時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、９は２時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、10は３時間後（誘導あり）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、11は１時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、12は２時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示し、13は３時間後（誘導なし）のHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを示す。
第16図は、Acc III制限修飾系遺伝子構造を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の発明はプラスミドベクターに関する。すなわち、宿主が本来有しないRNAポリメラーゼによって認識される、目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列と、外来因子による誘導によってコピー数を増加させる複製起点とを有することを特徴とするプラスミドベクターに関する。該プラスミドベクターが有する目的遺伝子の発現を制御するプロモーター配列としては、特に限定されるものではないが、ある特定のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列、例えばT7、T3、SP6等のバクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列が使用でき、とりわけSP6ファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列が好ましい。SP6ファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター、すなわちSP6プロモーターの最小領域の塩基配列を配列表の配列番号30に示す。さらに、該プラスミドベクターは選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子を有することができる。
また、本発明のプラスミドベクターのコピー数の制御、すなわち該プラスミドベクターの複製起点の機能の制御を行う外来因子としては、特に限定されるものではないが、例えばラクトース又はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）のようなその構造類似物の添加、ガラクトース又はその構造類似物の添加、アラビノース又はその構造類似物の添加等の種々の化学物質の添加或いはトリプトファン濃度の低減、形質転換体の培養温度の調整等を挙げることができる。これらの因子により制御可能なプロモーターの支配下に複製起点をおくことによってコピー数の制御が可能となる。この目的に使用可能なプロモーターとしては上記の目的を達成できるものであれば特に制限はなく、たとえば宿主が大腸菌である場合にはlac、trp、tac、gal、ara、PL等のプロモーターを使用できる。またこれらのプロモーターはRNAポリメラーゼ遺伝子の発現誘導にも使用することが可能である。
本発明のプラスミドベクターの複製起点は、特に限定されるものではないが、例えばランナウエイプラスミドの複製起点であり、複製起点がlacプロモータの制御下にあるプラスミドベクターが例示される。この場合には、コピー数の制御はラクトース及びその構造類似物の添加、特に好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTC）の添加によって達成される。
本発明の第２の発明は、本発明のプラスミドベクターに発現させようとする目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターと、該プラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ遺伝子とを宿主に導入し、外来因子により該プラスミドベクターのコピー数の増加を誘導すると共に該RNAポリメラーゼの発現の誘導を行って目的遺伝子の転写、翻訳を行うことを特徴とする、目的遺伝子の発現方法に関する。プラスミドベクター上のプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼ遺伝子としては、特に限定されるものではないが、例えば前記のようなバクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼ遺伝子を挙げることができ、とりわけSP6ファージ由来のRNAポリメラーゼ遺伝子が好適である。また、かかるRNAポリメラーゼの発現の、又はプラスミドベクターのコピー数の増加の誘導を行う外来因子としては、特に限定されるものではないが、例えばラクトース又はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）のようなその構造類似物の添加、ガラクトース又はその構造類似物の添加、アラビノース又はその構造類似物の添加等の種々の化学物質の添加或いはトリプトファン濃度の低減、形質転換体の培養温度の調整等を挙げることができる。
プラスミドベクターのコピー数の増加の誘導とRNAポリメラーゼの発現の誘導とは、それぞれ別の外来因子の作用により行うことも、あるいは同一の外来因子の作用により行ってもよい。また、この場合RNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、宿主の染色体上に組み込まれていても、あるいは本発明のプラスミドベクターとは異なる別のプラスミドベクターやファージベクターによって宿主に導入されていてもかまわない。後者の場合には目的に応じて宿主を変更することが容易に行える。さらに、この場合にはRNAポリメラーゼ遺伝子を有するベクターの宿主への導入は、本発明のプラスミドベクターより先に行われても、あるいは後で行われてもかまわない。
本発明における目的遺伝子は、特に限定されるものではないが、宿主に対し致死的となる、あるいは有害なタンパク質をコードするものである場合にその意義が発揮される。このようなタンパク質としては、例えば前記のような制限酵素、その他の核酸分解酵素、核酸結合性のタンパク質、タンパク質分解酵素などが挙げられる。
本発明は、前記のように目的遺伝子の発現を２種類の制御方法、すなわち該遺伝子のコピー数の制御、およびプロモーターを介した転写制御とを組み合わせてコントロールするシステムを提供する。本発明におけるプラスミド上にクローニングされた目的遺伝子の発現の制御は、従来のものと異なり極めて厳密であり、非誘導状態ではその発現を検出できないレベルに抑えることが可能である。発現誘導を行いプラスミドのコピー数、すなわち目的遺伝子のコピー数を上昇させると共にRNAポリメラーゼを発現させると、該RNAポリメラーゼの作用によってプロモーターに制御されて目的遺伝子が転写、翻訳される。
従って、本発明のプラスミドベクターを用いることによって、従来技術では困難であった宿主に対して有害な、あるいは致死的な遺伝子を含有する形質転換体を作製し、さらに該遺伝子の発現を行うことが可能となる。
例えば、本発明のプラスミドベクターを使用し、Nsp7524 III制限酵素をコードする遺伝子のクローニングを試みたところ、対応する修飾酵素遺伝子を共存させることなく大腸菌に保持させることができた。さらに、得られた形質転換体にRNAポリメラーゼ遺伝子を含有するシステムプラスミドを導入して発現誘導を行うことによりその菌体内にNsp7524 III制限酵素を発現させることも可能であった。
また、本発明のプラスミドベクターを遺伝子ライブラリー作製のためのクローニングベクターとして用いることにより、従来の方法を用いた場合には取得できなかった遺伝子を単離し、さらにその発現産物の活性を確認することを１つの宿主で行うことが可能となる。もちろん本発明のプラスミドベクターの利用は宿主に対して有害な産物をコードする遺伝子のクローニングに限られるものではなく、一般的なプラスミドベクターとしても利用可能である。
本発明に係るRNAポリメラーゼ遺伝子を宿主に導入する方法として、例えば、プラスミドpFSP6、ファージM13sp6を用いることができる。プラスミドpFSP6の詳細な構築方法は参考例（２）に記載されている。該プラスミドで形質転換された大腸菌HB101はEscherichia coli HB101/pFSP6と命名、表示され、平成７年12月22日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕に受託番号FERM  BP−5742として寄託されている。ファージM13sp6の構築方法は実施例２（６）に記載されている。
以下に、プラスミドpFSP6を用いた場合を例に挙げて、本発明について更に詳しく説明する。
まず、上記のシステムプラスミドpFSP6を利用して目的遺伝子の発現を行うことができるプラスミドとして、SP6RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列と、レポーター遺伝子としてのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とを有するマルチコピーのモデル発現プラスミドであるプラスミドpMSP6L、pMSP6F（第１図）、pMSP6O（第２図）を構築し、これらのモデル発現プラスミドを用いて行った試験結果について説明する。
これらのモデル発現プラスミドの詳細な構築方法は参考例（３）に記載されている。これらのプラスミドにはSP6プロモーター配列としてSP6プロモーターの最小領域（pMSP6L）、ネイティブなSP6プロモーター領域（pMSP6F）、又はSP6プロモーターの最小領域とlacオペレーター領域（pMSP6O）がそれぞれ導入されている。
プラスミドpMSP6L又はpMSP6Fのみを表１に示す大腸菌に導入した場合には、表２に示されるように宿主大腸菌がSP6RNAポリメラーゼを発現しないにもかかわらずβ−ガラクトシダーゼ活性が認められ、その量はSP6プロモーターを有していないプラスミドpMS434を導入したものよりも高い。すなわち、SP6プロモーターが大腸菌由来のRNAポリメラーゼによって認識され、その下流のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が転写、翻訳されていると考えられる。また、大腸菌MRi80はpcnB遺伝子に変異を有し、上記のモデル発現プラスミドのようなColE1由来の複製起点を持つプラスミドのコピー数が親株であるMRi7に比べて1/6〜1/13に低下する株であるが、これを宿主に用いた場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性もMRi7の1/7〜1/14に減少している。このことから、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現のレベルと導入されたプラスミドのコピー数との間には相関があることが示される。
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次に、同じモデル発現プラスミドを上記のシステムプラスミドpFSP6とともに大腸菌に導入したうえ、SP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導しない条件下でβ−ガラクトシダーゼ活性を調べてみると、表３に示されるようにシステムプラスミドを有さない大腸菌の場合と同程度のβ−ガラクトシダーゼ活性しか認められない。このことは非誘導状態においてはプラスミドpFSP6上のSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現がほぼ完全に抑えられていることを示している。一方、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を添加してSP6RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導した場合にはβ−ガラクトシダーゼ活性は18〜32倍上昇しており、SP6プロモーターを介してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現可能であることを示している。特に大腸菌MRi80を宿主とした場合には、非誘導状態のβ−ガラクトシダーゼ活性は極めて低いレベルにおさえられているが、誘導４時間後には非誘導状態の25〜32倍に上昇している。
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さらにSP6プロモーター下流にlacオペレーター配列を挿入されているプラスミドpMSP6Oでは、他のモデル発現プラスミドに比べて非誘導条件下でのβ−ガラクトシダーゼ活性が低下しているが、その発現を完全におさえることはできない。以上の結果は、マルチコピーのプラスミドを使用した発現システムでは目的遺伝子の発現を完全におさえることが難しく、また、この問題を解決するにはシステムプラスミド上のRNAポリメラーゼ遺伝子の発現制御よりも目的遺伝子を含むプラスミドのコピー数による制御の方が効果があることを示唆している。
そこで、本発明者らはこれらの結果をもとに新たな発現ベクターの開発を行い、本発明のプラスミドベクターを見出すに到った。
即ち、本発明者らは非誘導状態での発現レベルを下げ、誘導後の発現量を確保することができるランナウエイプラスミドベクターを構築した。まず、システムプラスミドではSP6RNAポリメラーゼの発現がIPTGによって誘導されることを考慮して、IPTGの誘導によりコピー数を増加させることのできるランナウエイ複製起点を有するプラスミドを第３図に示す操作に従って構築した。まず、プラスミドベクターpUC19（宝酒造社製）のNde Iサイトに配列表の配列番号:3および配列番号:4にその塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製される106Nde I DNA断片を導入して得られるプラスミドpUC106Aより、lacプロモーター、およびオペレーター領域を含むPvu II断片を除いたプラスミドpUC106AdPOを構築する。
次に該プラスミドを鋳型とし、該プラスミドの複製起点であるRNA II領域近傍に設定されたRNA II Aプライマー（配列表の配列番号:5にRNA II Aプライマーの塩基配列を示す）と106Nde I配列末端部分に設定された1870プライマー（配列表の配列番号:6に1870プライマーの塩基配列を示す）を用いたPCRによって得られるRNA1870断片をプラスミドpSTV28（宝酒造社製）のXba Iサイトに挿入したプラスミドpHS2870を得ることができる。構築されたプラスミドpHS2870を第４図に示す。通常、大腸菌１細胞あたりに該プラスミドは30コピー程度存在するが、IPTGの添加によりそのコピー数は数百に増加する。
次に該プラスミドよりプラスミドpSTV28由来のP15A複製起点を含むAcc I−Nsp I断片を除き（プラスミドpCRS01）、さらに不要の制限酵素サイトを含むEcoR I−Xba I断片を除去した後（プラスミドpCRS02）、プラスミドpMJR1560［ジーン（Gene）第51巻、第225〜267頁（1987）］由来のラクトース・レプレッサー（lac I q）遺伝子を含むDNA断片を導入したプラスミドpCRS04を構築することができる。第５図にプラスミドpHS2870からプラスミドpCRS04を構築する過程を示す。第６図にこうして構築されたプラスミドpCRS04を示す。該プラスミドはIPTGで誘導されるランナウエイプラスミドであり、通常は大腸菌１細胞あたりに１〜２コピー存在するが、IPTGの添加によりそのコピー数は数百に増加する。
該プラスミド上に挿入される目的遺伝子の発現を制御するために、該プラスミドのNhe IサイトにSP6プロモーター配列とlacオペレーター配列とを含む２本鎖オリゴヌクレオチド、PSP6−OlacEXリンカーを導入し、プラスミドpACE601を構築することができる。PSP6−OlacEXリンカーは配列表の配列番号:7および配列番号:8にその塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製される。該プラスミドpACE601は選択マーカーとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するランナウエイプラスミドベクターである。
また、上記のプラスミドpCRS04のNhe IサイトにプラスミドベクターpUC118（宝酒造社製）由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むBspH I断片を導入した後（プラスミドpCRS70）、さらにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むNco I−BsaA I断片を除いて上記のPSP6−OlacEXリンカーに置換することにより、該リンカーの挿入方向の異なるプラスミドpACE701およびpACE702を構築することができる。これらのプラスミドは選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を有するランナウエイプラスミドベクターである。
こうして得られたプラスミドpACE601、pACE701およびpACE702を使用した場合の目的遺伝子の発現制御の能力は上記同様にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として調べることができる。プラスミドpMS434［ジーン（Gene）第57巻、第88〜99頁（1987））］を鋳型とし、プライマーtrpA−Ｎ−Nco I、およびプライマーlacZ−Ｃ−Nco Iを用いたPCRによって増幅されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を、上記の３つのプラスミドそれぞれのSP6プロモーター下流に存在するNco Iサイトに導入したモデル発現プラスミドを構築することができる。プライマーtrapA−Ｎ−Ncol I、およびプライマーlacZ−Ｃ−Nco Iの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号:9および配列番号:10に示す。こうして得られたプラスミドはそれぞれプラスミドpACE601Z、pACE701ZおよびpACE702Zと命名されている。これらのモデル発現プラスミドで形質転換された大腸菌ではβ−ガラクトシダーゼ活性は全く検出されず、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が極めて厳格に制御されていることが示される。
本発明のプラスミドを用いで、宿主に対しその発現産物が致死的に働く遺伝子を単離し、さらに該遺伝子を発現させることが可能なことをNsp7524 III制限酵素遺伝子を用いて確かめることができる。プラスミドpBRN3はNsp7524 III制限修飾系遺伝子を含有しており、該プラスミドで形質転換された大腸菌MC1061はEscherichia coli MC1061/pBRN3と命名、表示され、平成７年９月28日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕に寄託番号FERM  BP−5741として寄託されている。該形質転換体より調製したプラスミドpBRN3を鋳型とし、プライマーＬ−ORF、およびプライマーNspR−ORF3を対としたPCRによるDNA増幅反応により、Nsp7524 III制限酵素遺伝子のみを含むDNA断片を取得することができる。配列表の配列番号:11および配列番号:12にプライマーＬ−ORF、およびプライマーNspR−ORF3の塩基配列を示す。得られたDNA断片を上記のプラスミドpACE601のSP6プロモーター下流のNco Iサイトに挿入して得られるプラスミドpACE601−Nsp IIIを大腸菌HB101に導入することにより形質転換体Escherichia coli HB101/pACE601−Nsp IIIを得ることができる。該形質転換体はNsp7524 III修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわらずNsp7524 III制限酵素遺伝子を、宿主に安定に保持させることが可能である。
さらに該形質転換体に上記のシステムプラスミドpFSP6を導入した形質転換体Escherichia coli HB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIを作製することができる。該形質転換体を培養し、その適当な時期にIPTGを添加して発現誘導を行うことにより培養物中でNsp7524 III制限酵素が産生可能なことを確認できる。
本発明の第３の発明は、上記プラスミドベクターを用いることを特徴とする、目的遺伝子の単離方法を提供する。本発明の単離方法は、宿主に対しその発現産物が致死的あるいは有害な遺伝子、特に制限酵素遺伝子の単離に好適に適用される。本法を用いることにより、これまで単離されていない制限酵素遺伝子、例えばAcc III制限酵素遺伝子を、Acc III修飾酵素遺伝子非存在下でも単離することが可能となる。制限酵素遺伝子の単離は、目的酵素産生菌のゲノムDNAを適当な制限酵素により断片化し、得られたDNA断片を直接、例えばプラスミドpACE611に組み込むことによる、いわゆる「ショットガン方法」のほか、例えば制限酵素産生菌のゲノムDNAのカセットライブラリーを利用し実施することも可能である。カセットライブラリーを鋳型とし、DNA増幅法により遺伝子を獲得することにより、宿主と転写機構の異なる微生物より調製した遺伝子も発現させることが可能になる。以下、カセットライブラリーを利用した制限酵素遺伝子の単離方法について、Acc III制限酵素を例として述べる。
Acc III制限酵素産生菌、すなわちAcc菌のゲノムDNAのカセットライブラリーは、以下のように作製できる。即ち、Acc菌を培養して得られる菌体よりゲノムDNAを抽出し、適当な制限酵素で消化した後、得られたDNA断片と相補的な突出末端を持つカセットとを連結する。ゲノムDNA切断に使用する制限酵素の種類を変え、同様のカセットライブラリーを数種作製する。これらを合わせてAccゲノムカセットライブラリーと呼ぶことにした。次に、Acc菌より目的制限酵素タンパク質を精製し、そのアミノ酸配列の一部を決定し、この配列に基づいてプライマーを合成する。このプライマーとカセットプライマーを用いて、個々のカセットライブラリーを鋳型としてPCRによるDNA増幅反応を行い、Acc III制限酵素遺伝子断片を含むDNA断片を取得する。得られたDNA断片の塩基配列を、例えば、PCR産物のダイレクトシークエンシングにより決定し、Acc III制限酵素遺伝子全長の塩基配列を決定する。
該塩基配列よりAcc III制限酵素遺伝子全長を増幅することが可能なプライマーを設計し、Acc菌のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによるDNA増幅反応によりAcc III制限酵素遺伝子全長を含むDNA断片を取得する。得られたDNA断片をプラスミドpACE611のSP6プロモーターの下流にコドンフレームが合うように挿入して得られる組み換えプラスミドを、例えば、大腸菌JM109に導入することにより形質転換体を得る。Acc III制限酵素遺伝子が発現可能な状態にある形質転換体の選択は、各形質転換体を培養し、更に本発明の遺伝子発現方法によって遺伝子発現誘導を行い、得られた各培養物中のAcc III制限酵素活性を確認するほか、例えば、各形質転換体に保持されているプラスミドDNAの制限酵素地図を作成することにより実施することができる。
実際、このようにして得られたAcc III制限酵素遺伝子をプラスミドpACE611に挿入し、得られたプラスミドはpCRA19と命名されている。第７図にその制限酵素地図を示す。図中、太い実線がAcc III制限酵素遺伝子を含むDNA断片である。プラスミドpCRA19を導入した大腸菌JM109はEscherichia coli JM109/pCRA19と命名され、平成８年５月28日（原寄託日）により通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）〕に寄託番号FERM  BP−5743として寄託されている。該形質転換体はAcc III修飾酵素遺伝子が共存しないにもかかわらず、制限酵素遺伝子を安定に保持している。上記の方法により、制限修飾系遺伝子を構成する修飾酵素遺伝子の共存を必要とせず、制限酵素遺伝子を単離することができる。
本発明の第４の発明はAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドを提供する。
本明細書において、Acc III制限酵素活性を有するポリペプチドの総称としてAcc III制限酵素なる用語を使用する場合がある。本発明のAcc III制限酵素は、例えば配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなる。
また、本発明のAcc III制限酵素は、前記のものに限定されることはなく、配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであって、Acc III制限酵素活性を有するポリペプチドをも含むものであり、さらに配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも一つがされており、かつAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドも本発明の範囲内である。
一般に天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパク質の生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があってもその機能や活性については大きな違いが認められないものは、本発明の範囲内である。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。たとえば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は多くの場合メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはその除去が完全には行われず、メチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしこのメチオニン残基の有無はタンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（IL−２）のアミノ酸配列中にあるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている［サイエンス（Science）、第224巻、1431頁（1984）］。
さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。たとえば目的タンパク質の発現量を増加させるためにＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。したがって本発明のAcc III制限酵素とは一部異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドであっても、それが本発明のAcc III制限酵素と本質的に同等の活性を示す限りにおいて、本発明の範囲内に属するものである。
Acc III制限酵素を得る方法としては、例えば、Acc III制限酵素遺伝子を含有する、上記形質転換体Escherishia coli JM109/pCRA19を培養し、その適当な時期に誘導剤のIPTGを添加しpCRA19コピー数を増加させた後、ファージM13sp6を感染させることにより、その目的を達成することができる。
形質転換体の培養物からAcc III制限酵素を採取するにあたっては、たとえば培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトフラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等を組み合わせて精製すればよい。この精製において出発原料となる上記培養物は、Acc I、Acc IIといった他の制限酵素を含まないため、従来の精製方法と比べて容易に必要な純度の酵素標品を得ることができる。
本発明の第５の発明はAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを提供する。
本発明のAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAは、配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列をコードするDNAからなるものであり、例えば配列表の配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。即ち、▲１▼配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであって、Acc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、▲２▼配列表の配列番号:2で示されるDNAの全部、又はその一部を含むDNAであって、該DNAの発現産物がAcc III制限酵素活性を示すDNA、▲３▼配列表の配列番号:1に記載のアミノ酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、１個もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも一つがされており、かつAcc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、▲４▼上記▲１▼〜▲３▼に記載のDNAにハイブリダイズ可能な、Acc III制限酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、等も本発明の範囲内である。
また、上記で得られたDNAをプローブとして厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、得られたDNA（配列表の配列番号:2）と配列は少し異なるが、同様な酵素活性を持つポリペプチドをコードする類似のDNAを得ることができ、これも本発明の範囲内のものである。
かかる厳密は条件下とは、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、６×SSC（１×SSCは塩化ナトリウム8.76g、クエン酸ナトリウム4.41gを１リットルの水に溶かしたもの）、１％  SDS、100μg/mlサケ精子DNA、0.1％  ウシ血清アルブミン、0.1％  ポリビニルピロリドン、0.1％  フィコールを含む溶液中で65℃にて20時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行うことをいう。
Acc III制限酵素活性をコードする類似のDNAをハイブリダイゼーションにより得る方法としては、たとえば以下の方法があげられる。
まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してDNAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNAを膜に固定する。この膜をあらかじめ32P等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号:1に記載したアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドであればよく、たとえば配列表の配列番号:2に記載の塩基配列の全部または一部からなるまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用することができる）を含む上記の組成の溶液中、上記の条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAが保持されている。
得られたDNAは、たとえば次のようにしてその塩基配列を決定し、それが目的の酵素タンパク質をコードするDNAであるかを確認する。
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作成された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア・コリであれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作成された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。
これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、ティ・マニアティス（T.Maniatis）らのモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、1982年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行）等に記載されている。
得られたDNAが目的のAcc III制限酵素活性をコードする類似のDNAであるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列表の配列番号:2に記載した塩基配列と比較して、あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号:1に記載したアミノ酸配列と比較して行うことができる。
得られたDNAが目的の制限酵素をコードする領域の全てを含まない場合には、得られたDNAの塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用いたPCRによって足りない領域を増幅したり、あるいは得られたDNAの断片をプローブとしてDNAライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード領域を得ることができる。
こうして得られたAcc III制限酵素をコードする類似のDNAを含有する形質転換体を作成して該DNAにコードされる酵素タンパク質を発現させ、さらに発現された酵素タンパク質を精製することができる。形質転換体の作成、酵素タンパク質の発現、精製はいずれも本発明のプラスミドを使用することにより、実施することができる。こうして得られた酵素タンパク質はAcc III制限酵素活性を保持している。
なお、従来得られていないAcc III修飾酵素及び該酵素をコードするDNAも、上記のAcc III制限酵素をコードするDNAを利用することにより得ることができる。例えば、多くの場合に制限酵素遺伝子と修飾酵素遺伝子とが接近して存在することを利用し、制限酵素遺伝子近傍のタンパク質をコードする遺伝子領域を、カセットライブラリーを鋳型としたDNA増幅反応により得、適当な発現ベクターに組み込み、遺伝子発現を行い、Acc III制限酵素活性を適当な方法で確認することにより実施できる。Acc III修飾酵素活性は、例えば該形質転換体により調製したDNAが、Acc III制限酵素の切断活性に対する耐性を示すことにより、確認することもできる。なお、上記遺伝子領域の塩基配列を決定し、既知の制限修飾系の修飾酵素遺伝子間の保存領域［ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J.Mol.Biol.）第206巻  第305〜321頁（1989）］とのホモロジーが確認できれば、遺伝子発現を行う前に、ある程度修飾酵素遺伝子であるとの予測を立てることができる。
このようにして、Acc菌のゲノムDNAのカセットライブラリーを利用することにより、Acc III修飾酵素及び該酵素をコードするDNAを得ることができる。配列表の配列番号:13にアミノ酸配列を、配列番号:14に塩基配列を示す。
また、本発明におけるAcc III修飾酵素は前記のものに限定されることはなく、Acc III制限酵素の項で述べたように、配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであって、Acc III修飾酵素活性を有するポリペプチドをも含むものであり、さらに配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換の少なくとも一つがされており、かつAcc III修飾酵素活性を有するポリペプチドも本発明の範囲内である。
本発明におけるAcc III修飾酵素をコードするDNAは、配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列をコードするDNAからなるものであり、例えば配列表の配列番号:14に記載の塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。すなわち、▲１▼配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドであって、Acc III修飾酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、▲２▼配列表の配列番号:14で示されるDNAの全部、又はその一部を含むDNAであって、該DNAの発現産物がAcc III修飾酵素活性を示すDNA、▲３▼配列表の配列番号:13に記載のアミノ酸配列又はその一部のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも一つがされており、かつAcc III修飾酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、▲４▼上記▲１▼〜▲３▼に記載のDNAにハイブリダイズ可能な、Acc III修飾酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA、なども本発明の範囲内である。
以下に参考例および実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については1989年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、T.マニアティス（T.Maniatis）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.）に記載の方法によった。
参考例
（１）培地及び培養条件
大腸菌はLB培地（トリプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、pH7.0）を用いて37℃で好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。pFSP6:25μg/mlのカナマイシン、pXX325:20μg/mlのアンピシリン、アンピシリン耐性ColE1タイププラスミド:50μg/mlのアンピシリン、アンピシリン耐性pUCタイププラスミド:100μg/mlのアンピシリン。発現誘導実験では、定常期まで培養した培養液を新鮮な培地に１％植菌した後、37℃で好気的に培養し、OD600＝0.6（６×108cell/ml）に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を最終濃度が0.2mMになるように添加し、さらに培養を続けた。
（２）システムプラスミドpFSP6の構築
システムプラスミドpFSP6は大腸菌JM109を宿主とし、第８図に示した手順で構築した。プラスミドpSP6−２［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第15巻、第2653〜2664頁（1987）］をHind III（宝酒造社製）で消化し、末端を平滑化した後、さらにBamH I（宝酒造社製）消化して得られるSP6RNAポリメラーゼ遺伝子を含む約2.8kbのDNA断片をBamH IおよびHinc II（宝酒造社製）で消化したプラスミドベクターpUC18（宝酒造社製）と混合してライゲーションを行い、プラスミドpUCSPを構築した。次にプラスミドpMJR1560［ジーン（Gene）第51巻、第225〜267頁（1987）］をKpn Iで消化し、末端を平滑化した後、更にPst I（宝酒造社製）消化して得られるlac I q遺伝子を含む約1.3kbのDNA断片を単離した。上記のプラスミドpUCSPをHind IIIで消化し、末端を平滑化した後、さらにPst Iで消化し、これと上記の約1.3kbのDNA断片とを混合してライゲーションを行い、プラスミドpUCSPlacを構築した。
さらにpUCKm［ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第147巻、第217〜226頁（1981）］をPst I消化して得られる、カナマイシン耐性遺伝子を含む約1.5kbのDNA断片を上記のプラスミドpUCSPlacのPst Iサイトに導入してプラスミドpUCSPlacKmを構築した。該プラスミドをAat II（東洋紡社製）消化した後にNsp I（宝酒造社製）で部分消化を行って約6.5kbのDNA断片を単離し、さらにその両末端を平滑化した。
一方、プラスミドpXX325［プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻、第4784〜4788頁（1983）］をHind IIIで消化し、末端を平滑化した後、さらにSa1 I消化してminiFプラスミドの複製起点を含む約6.8kbのDNA断片を単離し、これを上記の約6.5kbのDNA断片と混合してライゲーションを行い、プラスミドpFSP6を構築した。また、該プラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、Escherichia coli HB101/pFSP6を作製した。
（３）マルチコピーのモデル発現プラスミドの構築
SP6プロモーターの最小領域を含む２本鎖オリゴヌクレオチドであるPSP6リンカーを配列表の配列番号:15および配列番号:16に塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製し、これとXho I（宝酒造社製）およびHind IIIで消化したプラスミドpMS434［ジーン（Gene）第57巻、第89〜99頁（1987）］を混合してライゲーションを行い、該プラスミド上のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子上流に上記のプロモーター配列が挿入されたモデル発現プラスミドpMSP6Lを構築した（第１図）。
一方、pSP64［ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucl.Acids Res.）第12巻、第7035〜7056頁（1984）］をAcc IIおよびHind III消化して得られるネイティブなSP6プロモーター配列を含むDNA断片を上記のプラスミドpMS434のXho I−Hind IIIサイト間に挿入することによりモデル発現プラスミドpMSP6Fを構築した（第１図）。さらにSP6プロモーターの最小領域とlacオペレーター領域とを含むPSP6−Olacリンカーを配列表の配列番号:17及び配列番号:18に塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製し、これを上記のプラスミドpMS434のXho I−Hind IIIサイト間に挿入することによりモデル発現プラスミドpMSP6Oを構築した（第２図）。
（４）SP6プロモーターの大腸菌のRNAポリメラーゼに対するプロモーター活性
参考例（３）で構築されたプラスミドpMSP6L、pMSP6F、および対照としてSP6プロモーター配列を含まないプラスミドpMS434を表１に示す大腸菌に導入し、得られた形質転換体を参考例（１）に示した方法で培養後、それぞれの菌体の培養液を対数増殖期に採取し、採取した培養液の一部でOD600を測定し、残りは予め冷やしておいた試験管に移して最終濃度が100mg/mlになるようにクロラムフェニコールを添加した。この培養液を試料として1972年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、J.H.ミラー（J.H.Miller）著、エクスペリメンツ  イン  モレキュラー  ジェネティクス（Experiments in Molecular Genetics）に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行った。
表２に示されるように、SP6プロモーターを含む配列が挿入されたモデル発現プラスミドpMSP6L、あるいはpMSP6Fを導入された大腸菌MC4100は、挿入されたプロモーター配列に関係なく、同レベルの低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。しかし、SP6プロモーターを含まないプラスミドpMS434を導入されたものではこれよりも低い酵素活性しか認められなかった。さらに大腸菌MRi70、MRi80を宿主として検討した結果、プラスミドのコピー数が減少するMRi80ではβ−ガラクトシダーゼ活性も低下した。
（５）システムプラスミドpFSP6の評価
参考例（４）で作製した各形質転換体にシステムプラスミドpFSP6を導入したうえ参考例（１）に示した方法で培養し、IPTG添加前後の非誘導状態と誘導状態のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してその結果を表３に示した。各形質転換体とも非誘導状態におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は表２に示されたプラスミドpFSP6を導入されていない場合と同程度の値であった。
一方、IPTG添加による誘導を行うと、プラスミドpMSP6L、およびpMSP6Fを導入されたものでは非誘導状態と比較して18〜32倍のβ−ガラクトシダーゼ活性が認められたのに対し、プラスミドpMS434を導入されたものでは活性の上昇は見られなかった。
（６）lacオペレーター配列の発現制御への効果
プラスミドpFSP6を導入された大腸菌MC4100にプラスミドpMSP6L、pMSP6F、pMSP6O、およびpMS434をそれぞれ導入して得られる形質転換体を参考例（１）に示した方法で培養し、非誘導状態におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果を表４に示す。lacオペレーター配列を含むプラスミドpMSP6Oを導入されたものではプラスミドpMSP6L、pMSP6Fに比べてβ−ガラクトシダーゼ活性が低くおさえられているが、なおわずかな活性の発現が見られた。つまり、lacオペレーター配列の導入だけでは完全に非誘導状態での発現を止めることはできなかった。
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実施例１
（１）培地及び培養条件
大腸菌はLB培地（トリプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、pH7.0）を用いて37℃で好気的に培養した。抗生物質は大腸菌が保持しているプラスミドに合わせて以下の濃度で培地に添加した。pFSP6:25μg/mlのカナマイシン、アンピシリン耐性ColE1タイププラスミド:50μg/mlのアンピシリン、アンピシリン耐性pUCタイププラスミド:100μg/mlのアンピシリン、クロラムフェニコール耐性ランナウエイプラスミド:30μg/mlのクロラムフェニコール、アンピシリン耐性ランナウエイプラスミド:30μg/mlのアンピシリン。発現誘導実験では、定常期まで培養した培養液を新鮮な培地に１％植菌した後37℃で好気的に培養し、OD600＝0.6（６×108cell/ml）に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を最終濃度が0.2mMになるように添加し、さらに培養を続けた。
（２）ランナウエイプラスミドpHS2870の構築
発現プラスミド構築の基になったランナウエイプラスミドpHS2870の構築を第３図に示す操作で行った。配列表の配列番号:3および配列番号:4に塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製された106Nde I DNA断片をNde I消化したプラスミドベクターpUC19と混合してライゲーションを行った。こうして得られたプラスミドpUC106AをPvu II消化し、セルフライゲーションを行ってプラスミドpUC106AdPOを得た。次いで、このプラスミドpUC106AdPOを鋳型とし、RNA II Aプライマー（配列表の配列番号:5にRNA II Aプライマーの塩基配列を示す）と1870プライマー（配列表の配列番号:6に1870プライマーの塩基配列を示す）を用いたPCRによって得られる増幅DNA断片をXba I消化した後、Xba I消化したプラスミドpSTV28と混合してライゲーションを行なってプラスミドpHS2870を得た。第４図にプラスミドpHS2870の構成を示す。
（３）ランナウエイプラスミドpCRS04の構築
上記のプラスミドpHS2870をAcc I（宝酒造社製）およびNsp Iで消化した後、末端を平滑化してセルフライゲーションしてP15A複製起点を除いたプラスミドpCRS01を得た。次に該プラスミドをEcoR I（宝酒造社製）およびXba Iで消化した後、上記同様に末端を平滑化してセルフライゲーションを行いプラスミドpCRS02を構築した。さらにプラスミドpMJR1560をKpn I（宝酒造社製）およびPst Iで消化して得られる約1.2kbのDNA断片の末端を平滑化した後、上記のプラスミドpCRS02をNsp VおよびVsp I（ともに宝酒造社製）で消化した後に末端を平滑化したものと混合してライゲーションを行ない、プラスミドpCRS04を得た。プラスミドpCRS04構築の過程を第５図に、またプラスミドpCRS04の構成を第６図に示す。
（４）ランナウエイ発現ベクターpACE601の構築
Nhe I（宝酒造社製）消化した後に末端を平滑化した上記のプラスミドpCRS04と、配列表の配列番号:7および配列番号:8に塩基配列を示した２つのDNA鎖から作製されたPSP6−OlacEXリンカーとを混合してライゲーションを行ない、プラスミドpACE601を構築した。第９図にプラスミドpACE601の構築の過程を示す。なお、これらのプラスミドの構築は大腸菌JM109を宿主として行った。
（５）ランナウエイ発現ベクターpACE611の構築
ランナウエイ発現ベクターpACE611をXho I−Hind IIIで消化し、そのサイトに配列番号:15、配列番号:16に記載の合成オリゴDNAからなるPsp6リンカーを挿入して、ランナウエイ発現ベクターpACE611の構築を行った。第10図にpACE611の構成を示す。また、第11図にプラスミドpACE611の構築の過程を示す。
（６）ランナウエイ発現ベクターpACE701およびpACE702の構築
プラスミドベクターpUC118（宝酒造社製）をBspH I（NEB社製）で消化して得られる約1kbのDNA断片の末端を平滑化し、Nhe I消化した後に末端を平滑化した上記のプラスミドpCRS04と混合してライゲーションを行ない、プラスミドpCRS70を構築した。第12図にプラスミドpCRS70の構築の過程を示す。次に該プラスミドをNco I（宝酒造社製）、およびBsaA I（NEB社製）で消化した後に末端を平滑化したうえ、上記のPSP6−OlacEXリンカーと混合してライゲーションを行ない、該リンカーの挿入方向の異なる２種のプラスミドpACE701、およびpACE702を構築した。第13図にプラスミドpACE701、およびpACE702の構築の過程を示す。なお、これらのプラスミドの構築は大腸菌JM109を宿主として行った。
（７）モデルランナウエイ発現プラスミドの構築
上記のプラスミドpMS434を鋳型とし、プライマーtrpA−Ｎ−Nco I、およびプライマーlacZ−Ｃ−Nco Iを用いたPCRを行い、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片を得た。プライマーtrpA−Ｎ−Nco I、およびプライマーlacZ−Ｃ−Nco Iの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号:9および配列番号:10に示す。該断片をNco Iで消化した後、上記のプラスミドpACE601、pACE701、およびpACE702をNco Iで消化したものそれぞれと混合してライゲーションを行ない、PSP6−Olac配列下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入されたモデルランナウエイ発現プラスミドpACE601Z、pACE701Z、およびpACE702Zを得た。なお、これらのプラスミドの構築は大腸菌JM109を宿主として行った。
（８）ランナウエイ発現プラスミドの非誘導状態での発現レベルの評価
上記のシステムプラスミドpFSP6を導入された大腸菌MC4100（以下MC4100/pFSP6と略す）に上記のモデルランナウエイ発現プラスミドpACE601Z、pACE701Z、およびpACE702Zを導入して得られる形質転換体MC4100/pFSP6/pACE601Z、MC4100/pFSP6/pACE701Z、およびMC4100/pFSP6/pACE702Zを実施例（１）に示した条件で培養し、対数増殖期に採取した培養液について参考例（４）に示した方法でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果、いずれの形質転換体においてもβ−ガラクトシダーゼ活性は検出限界以下であり、参考例（４）に示したマルチコピープラスミドを用いた場合に比べて顕著な発現抑制効果が見られた。
（９）Nsp7524 III制限酵素遺伝子発現プラスミドの構築
Nsp7524 III制限修飾系遺伝子を含有するプラスミドpBRN3をEscherichia coli MC1061/pBRN3（FERM  BP−5741）より調製し、これを鋳型としてプライマーＬ−ORF、およびプライマーNspR−ORF3を用いたPCRを行い、Nsp7524 III制限酵素遺伝子のみを含む約1kbのDNA断片を得た。配列表の配列番号:11および配列番号:12にプライマーＬ−ORF、およびプライマーNspR−ORF3の塩基配列を示す。該断片をNco Iで消化した後、上記のプラスミドpACE601をNco Iで消化したものと混合してライゲーションを行ない、PSP6−Olac配列下流にNsp7524 III制限酵素遺伝子のみを導入されたプラスミドpACE601−Nsp IIIを構築した。該プラスミドは、Nsp7524 III修飾酵素遺伝子を共存させていない大腸菌JM109に安定に保持された。
（10）Nsp7524 III制限酵素遺伝子の発現システムの構築
上記のシステムプラスミドpFSP6を導入された大腸菌HB101（以下HB101/pFSP6と略す）にNsp7524 III制限酵素遺伝子を含む上記のプラスミドpACE601−Nsp III、及び対照として用いるプラスミドpACE601をそれぞれ導入して得られる形質転換体HB101/pFSP6/pACE601−Nsp III、およびHB101/pFSP6/pACE601をLB培地で定常期まで培養し、この培養液を新鮮な培地２本に１％ずつ植菌して37℃で好気的に培養し、生育がOD600＝0.6に達した時点でその一方にIPTGを最終濃度が0.2mMになるように添加し、さらに培養終了後、集菌した菌体を破砕用緩衝液Ａ（20mM トリス−塩酸、pH7.5、10mM 2−メルカプトエタノール）に懸濁して超音波破砕した後、遠心分離して粗抽出液を得た。
この粗抽出液１μｌを30μｌの反応液（10mM トリス−塩酸、pH7.5、10mMのMgCl2、1mMのDTT、50mMのNaCl、１μｇλ−DNA）に加え、37℃、１時間反応させた後、反応液をアガロースゲル電気泳動に付してλ−DNAの分解を調べ、制限酵素活性を確認した。第14図に示されるようにIPTGを添加して発現誘導を行ったHB101/pFSP6/pACE601−Nsp IIIのみに制限酵素活性が認められ、そのλ−DNA切断のパターンはNsp7524 IIIのアイソシゾマーであるAva Iのものと一致した。
また、上記のλ−DNA消化反応の反応時間を２時間、３時間まで延長した場合の結果を第15図に示す。この場合、本実験に使用した粗抽出液には宿主大腸菌由来のヌクレアーゼが含まれているため、レーン８〜10ではNsp7524 III活性によって生じたDNA断片が大腸菌のヌクレアーゼによってさらに分解を受け、反応時間を延長するにつれてバンドが薄くなり、レーン10ではバンドが確認できなくなっている。レーン11〜13ではNsp7524 IIIが誘導されないため、反応時間を延長してもNsp7524 III分解断片が生成せず、λ−DNAが直接大腸菌のヌクレアーゼの作用を受けて低分子化されていることが分かる。なお、HB101/pFSP6/pACE601の粗抽出液では制限酵素活性は検出されなかった。
実施例２
Acc III制限酵素遺伝子の単離及び発現
（１）Acc III制限酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の決定及び該アミノ酸配列対応プライマーDNAの合成
市販のAcc III制限酵素（宝酒造社製）約2kuをSephacryl S300（ファルマシア社製）カラムを用いたゲルろ過に供し、Acc III制限酵素の分子量を測定した。活性の溶出位置より、Acc III制限酵素の分子量は約７万であることを確認した。制限酵素タンパク質はダイマーであることが多く、従ってSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でAcc III制限酵素タンパク質は分子量約３万５千の位置に泳動されることが推定された。
次に、Acc III制限酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析用のサンプルを得るため、市販のAcc III制限酵素約2kuをタンパク質分子量マーカーとともにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、ゲルからPVDF膜にタンパク質を移し、タンパク質位置の確認のために、ブロモフェノールブルーによるタンパク質染色をおこなった。10％酢酸−50％メタノールで脱色後、分子量約３万５千のタンパク質がブロッティングされたPVDF膜の部分を切り取り、プロテイン  シークエンサー  G1000A（ヒューレット  パッカード社製）を用いた自動エドマン分解により、配列表の配列番号:19で示すＮ末端アミノ酸配列を決定した。次にこの配列に基づき、カセットプライマーの対として用いる、配列表の配列番号:20で表されるAcc IIIプライマー１と配列番号:21で表されるAcc IIIプライマー２を合成した
（２）Acc菌ゲノムDNAの調製
ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleric Acids Research）第13巻、第8685〜8694頁（1985）に記載されている喜多らの方法に従いAcc菌を培養し、湿菌体を得た。得られた湿菌体2gを10mlの緩衝液Ｂ［25mM  トリス−HCl（pH8.0）、50mM  グルコース、10mM  EDTA］に懸濁し、緩衝液Ｂで2mg/mlに調製した1mlのリゾチーム溶液を加えて撹拌し、37℃で20分静置した。つぎに、当該溶液に28mlの緩衝液Ｃ［100mM  NaCl、100mM  トリス−HCl（pH8.0）］を加え、撹拌し、さらにTE［10mM  トリス−HCl  1mM  EDTA（pH8.0）］で20mg/mlになるように調製した1mlのプロテイナーゼＫ溶液と4mlの10％SDS溶液を加え、撹拌し、37℃で１時間静置した。
当該溶液に6mlの5M  NaCl水溶液と6mlの緩衝液Ｄ［10％  CTAB（セチル  トリメチル  アンモニウム  ブロマイド）、0.7M  NaCl］を加えて撹拌し、60℃で20分静置した。当該溶液をフェノール処理、続いてクロロホルム処理を行い水層を分取した。これに、TEで10mg/mlになるように調製したRNaseA（シグマ社製）溶液50μｌを加えて攪拌し、37℃で40分静置した。当該溶液を静置後、フェノール処理、クロロホルム処理を行い水層を分取後、これに等量の冷エタノールを加え、析出したDNAをガラスキャピラリーで巻き取って回収した。DNAを70％エタノールで洗浄し3mlのTEに溶解させ、約200μｇのゲノムDNAを得た。
（３）Accゲノムカセットライブラリーの作製
以後の操作は、基本的に、宝酒造社の遺伝子工学ガイド（1995〜1996年版）F16〜F17頁記載の方法に従い、実施した。
（２）で得られたゲノムDNAを、EcoR I（宝酒造社製）で完全消化し、得られたDNA断片と相補的な突出末端を有するEcoR Iカセット（宝酒造社製）を連結しEcoR Iカセットライブラリーを作製した。同様にゲノムDNAを制限酵素Bgl II、EcoT14 I、EcoT22 I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I（以上宝酒造社製）で個別に完全消化し得られたゲノムDNA断片と、相補的な突出末端を有する数種のカセット（宝酒造社製）とを個別に結合することによりBgl II、EcoT14 I、EcoT22 I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I各カセットライブラリーを作製した。各カセットライブラリーを総称しAccゲノムカセットライブラリーとした。
（４）Acc III制限酵素遺伝子の解析
（３）で得られたEcoR Iカセットライブラリーを鋳型とし、Acc IIIプライマー１とカセットプライマーC1（宝酒造社製）をプライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行った。目的領域を効率よく特異的に増幅させるために、該反応液の一部を用い、Acc IIIプライマー２とカセットプライマーC2（宝酒造社製）をプライマー対として、２度目のPCRによるDNA増幅反応を行い、増幅DNA断片を得た。同様に、Bgl II、EcoT14 I、EcoT22 I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I各カセットライブラリーを鋳型として、個別に上記２段階PCRによるDNA増幅反応を行い、増幅DNA断片を得た。各増幅DNAをアガロースゲル電気泳動により解析したところ、Xba Iカセットライブラリー由来の増幅DNA断片が、特に高い増幅効率を示した。
そこで、Xba Iカセットライブラリーを鋳型とし、Acc IIIプライマー１とカセットプライマーC1をプライマー対として、再度、PCRによるDNA増幅反応を行った。この反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約0.5kbの増幅DNA断片をゲルから回収した。得られたDNA断片を鋳型とし、Acc IIIプライマー２とカセットプライマーC2をプライマー対として、２度目のPCRによるDNA増幅反応を行った。得られた約0.5kbの増幅DNA断片の塩基配列を決定したところ、（１）でＮ末端のアミノ酸配列を決定したタンパク質の一部をコードしていることが明らかとなった。一方、Acc III制限酵素タンパク質の推定分子量は約３万５千であり、該タンパク質をコードしている遺伝子は、約1kbの長さと推定される。従って、今回塩基配列を一部決定した遺伝子領域において、上記約0.5kbの塩基配列情報に加え、Acc IIIプライマー１及びAcc IIIプライマー２がアニーリングした5'端領域の正確な塩基配列情報及び3'側領域の残り約0.5kbの塩基配列情報が得られれば、Acc III制限酵素遺伝子の塩基配列を決定できると考えられた。
そこで、Acc III制限酵素遺伝子領域の正確な5'端領域の塩基配列を確認するために、配列表の配列番号:22で表されるAcc IIIプライマー３、配列番号:23で表されるAcc IIIプライマー４を合成した。次に、（３）で得られたEcoR Iカセットライブラリーを鋳型とし、Acc IIIプライマー４とカセットプライマーC1をプライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行った。この反応液の一部を用い、Acc IIIプライマー３とカセットプライマーC2をプライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行った。同様に、Bgl II、EcoT14 I、EcoT22 I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I各カセットライブラリーを鋳型として、個別に上記２段階PCRによるDNA増幅反応を行った。増幅したDNA断片のうち最短の、EcoT14 Iカセットライブラリーを鋳型として得られた、約1kbのDNA断片の塩基配列を決定した。
さらにAcc III制限酵素タンパク質をコードすると推定される遺伝子領域の3'側、約0.5kbを決定するために、配列番号:24で表されるAcc IIIプライマー５と、配列番号:25で表されるAcc IIIプライマー６を合成した。（３）で得られたEcoR Iカセットライブラリーを鋳型とし、Acc IIIプライマー５とカセットプライマーC1をプライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行った。この反応液の一部を用い、Acc IIIプライマー６とカセットプライマーC2をプライマー対として、PCRによるDNA増幅反応を行った。同様に、Bgl II、EcoT14 I、EcoT22 I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I各カセットライブラリーを鋳型として、個別に上記２段階PCRによるDNA増幅反応を行った。
増幅したDNA断片のうち、EcoT22 I、Hind III各カセットライブラリーを鋳型として得られた、約0.5kb、約0.8kbのDNA断片の塩基配列を決定した。得られた３つの塩基配列の結果を総合し、約1.6kbのDNA断片の塩基配列情報を得た。その塩基配列を配列表の配列番号:26に示す。さらに、タンパク質をコードしうるオープンリーディングフレーム（ORF）を検索した結果、塩基番号558〜1442にORF1が、塩基番号1588〜1434にORF2と考えられる一部、および塩基番号１〜535にORF3と考えられる一部が存在した。ORF1は、（１）でＮ末端アミノ酸配列を決めたタンパク質をコードしており、ORF1がAcc III制限酵素遺伝子であると推定された。Acc III制限酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号:2に示す。但し、この場合5'端より４番目の塩基はＣである。また、該塩基配列より推定されるアミノ酸配列を、配列表の配列番号:1に示す。但し、この場合Ｎ末端より２番目のアミノ酸はLeuである。なお、ORFの翻訳方向は、ORF1及びORF3とは逆方向である。
（５）プラスミドpCRA19の構築
次に、Acc III制限酵素遺伝子を発現させるためのプラスミドの構築を行った。まず、該遺伝子を得るため、配列表の配列番号:27で表されるAcc−RLプライマーと配列番号:28で表されるAcc−RRをプライマーを合成した。なお、両プライマーに制限酵素Nco I認識配列部位を導入した。上記プライマー対を用いると、Acc菌のゲノムDNAを鋳型としたPCRにより得られるDNA増幅断片より、Acc III制限酵素遺伝子を制限酵素Nco Iで切り出すことが可能となり、またpACE611ベクターのNco I部位に挿入した際、SP6プロモーター支配下、翻訳時のコドンフレームが合うようになる。一方、このプライマー対の使用により、Acc III制限酵素遺伝子の5'末端より４番目の塩基がＣからＧに、該遺伝子にコードされるタンパク質のＮ末端より２番目のアミノ酸が、LeuからValに置換される。上記プライマー対を用い、（２）で得られたAcc菌のゲノムDNAを鋳型として、PCRによるDNA増幅反応を行った。このDNA断片を制限酵素Nco I（宝酒造社製）で完全消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約900bpの大きさのDNA断片を回収した。次に、このDNA断片がSP6プロモーターの下流に配置されるように、pACE611ベクターのNco I部位に挿入した。
この組換えDNAを大腸菌JM109に導入し形質転換体を得た。適当に30個の形質転換体を選択し、30μg/mlのクロラムフェニコール含む5mlのLB培地に個別に接種し、37℃で培養した。菌体培養液のOD600が0.6になった時に、プラスミドコピー数増加のために、最終濃度が2mMになるようにIPTGを添加し、さらに37℃で２時間培養後、各培養物より、個別にプラスミドDNAを調整した。得られた各プラスミドDNAを制限酵素Hind IIIとXba Iで同時に切断し、アガロースゲル電気泳動により生じたDNA断片長を確認したところ、挿入した遺伝子領域が正方向に挿入されたと考えられるプラスミドが、１個存在した。本プラスミドDNAをpCRA19と命名し、pCRA19を大腸菌JM109に導入し、得られた形質転換体をEscherichia coli JM109/pCRA19と命名した。
（６）Acc III制限酵素遺伝子の発現システムの構築
まず、大腸菌JM109にSP6RNAポリメラーゼ遺伝子を導入し、さらに発現させることが可能なファージベクターを構築した。すなわち、市販のファージベクターM13mp18（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト内のBamH I−Hind IIIサイトに、pSP6−２をBamH I−Hind III消化することにより得たSP6RNAポリメラーゼ遺伝子断片を挿入することにより、SP6RNAポリメラーゼ発現ファージM13sp6を構築した。
次に、形質転換体（Escherichia coli JM109/pCRA19）をクロラムフェニコール30μg/mlを含む5mlのLB培地に接種し、37℃で培養した。菌体培養液のOD600が0.6になった時に、プラスミドコピー数増加のために、IPTGを最終濃度が2mMになるように添加し、更に37℃で２時間培養した。その後、Acc III制限酵素遺伝子にコードされたタンパク質を発現させるため、ファージM13sp6を感染させ、更に、37℃で16時間培養した。得られた湿菌体11mgを、180μｌの菌体破砕用緩衝液Ｅ［20mM  トリス−HCl（pH7.5）10mM  ２−メルカプトエタノール］に懸濁し、超音波処理により菌を破砕し、遠心分離（18000g、10分間）により固液分離を行った。
上清の活性を、宝酒造社製のAcc III制限酵素に添付されたデータシートに記載の活性測定条件で測定したところ、湿菌体1g当り約8000ユニットのAcc III制限酵素が産生されていた。これはAcc菌の産生量と比較して、湿菌体重量あたり約16倍の産生量であった。また、得られた上清にはAcc III以外の制限酵素活性、及びAcc III修飾酵素活性は認められなかった。プラスミドpCRA19に挿入されたAcc III制限酵素遺伝子は、PCRによるDNA増幅を行った際、翻訳開始塩基より４番目の塩基がＣからＧに置換され、この結果、翻訳タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸が、LeuからValに置換されているが、該タンパク質はAcc III制限酵素活性を有することが明らかとなった。
以上、Acc III修飾酵素非共存下でのAcc III制限酵素遺伝子の単離及び大量生産系が完成した。
（７）Acc III修飾酵素遺伝子の単離
修飾酵素遺伝子と制限酵素遺伝子は近傍に存在することが多い。そこで（４）で推定されたORF2領域の決定のために、（４）においてAcc III制限酵素遺伝子3'側領域を決定するために調製した増幅DNA断片のうち、EcoR Iカセットライブラリーを鋳型として得られた、約1.4kbのDNA断片の塩基配列を決定した。さらに、（４）で推定されたORF3領域の決定のために、（４）においてAcc III制限酵素遺伝子5'端領域の塩基配列を決定するために調製した増幅DNA断片のうち、Bgl IIカセットライブラリーを鋳型として得られた約2.2kbのDNA断片の塩基配列を決定した。これらと、（４）で決定したAcc III制限酵素遺伝子領域を含む約1.6kbのDNA断片の塩基配列を総合して、配列表の配列番号:29に示す約4.2kbの塩基配列情報が得られた。塩基番号1913〜2797にAcc III制限酵素遺伝子が、塩基番号3712〜2789にORF2が、塩基番号691〜1890にORF3が存在した。各ORFのうち、既知の制限修飾系における修飾酵素間の保存領域とホモロジーの高い部分が、ORF2に存在することが判明した。
次に、ORF2領域を得るため、EcoR Iカセットライブラリーを鋳型とし、Accプライマー６、カセットプライマーC1及びAccプライマー５、カセットプライマーC2を各々対とした二段階PCRにより得られた増幅DNA断片より、EcoT22 I、Hpa I（宝酒造社製）を用いORF2を含む約1.1kbの部分を切り出し、pUC118ベクターlacプロモーター下流のSma I部位に挿入した。本組換えプラスミドがAcc III修飾酵素遺伝子を含んでおり、大腸菌内でAcc III修飾酵素が発現可能であれば、本組み換えプラスミドを大腸菌JM109に導入し、得られた形質転換体の培養物中のDNAはAcc III修飾酵素によりメチル化を受け、Acc III制限酵素による切断に耐性を示すようになる。
しかし本組換えプラスミドの構築に用いられたpUC118ベクターにはAcc III制限酵素認識配列が存在しないため、本組換えプラスミド自体をAcc III修飾酵素活性の確認に使用するのは不適当である。一方、大腸菌JM109内で本組み換えプラスミドと共存可能なプラスミドpSTV29にはAcc III制限酵素認識配列が存在する。そこでpSTV29をAcc III修飾酵素発現の指標とするため、先の組み換えプラスミドをpSTV29と共に大腸菌JM109に導入し形質転換体を得た。３個の形質転換体を100μg/mlのアンピシリン、30μg/mlのクロラムフェニコール及び2mM  IPTGを含む2mlのLB培地で個別に37℃、16時間培養し、各培養物よりプラスミドDNAを調製した。
調製したDNAはpSTV29と上記の組換えプラスミドの混合物として得られる。各DNAサンプルをAcc III制限酵素による切断反応に供したところ、全てのサンプル中のpSTV29がAcc III制限酵素切断に対する耐性を示し、該DNAサンプルに含まれる組換えプラスミドに、Acc III修飾酵素遺伝子が挿入されていることが確認された。更に、該DNAサンプルを、制限酵素Hind IIIとXba Iで同時に切断し、アガロースゲル電気泳動にて生じたDNA断片長を解析したところ、組換えプラスミド中にORF2が存在することが確認された。従って、ORF2がAcc III修飾酵素遺伝子であることが判明した。得られたAcc III修飾酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号:14に、また該配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号:13にそれぞれ示す。
本発明により明らかとなったAcc III制限修飾系遺伝子構造を第16図に示す。図中、Ｍは修飾酵素遺伝子、Ｒは制限酵素遺伝子、矢印はORFの方向を示す。
産業上の利用可能性
本発明により、宿主に対し致死的となる、あるいは有害なタンパク質をコードする外来性の目的遺伝子を該宿主に導入しうるプラスミドベクター、および該プラスミドベクターを用いて該タンパク質を発現させうる方法が初めて提供される。また、従来技術では困難であった制限修飾系を構成する制限酵素遺伝子を、修飾酵素遺伝子の非共存下で単離方法が提供される。さらに、本発明によりAcc III制限酵素遺伝子及びAcc III修飾酵素遺伝子が単離され、該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、遺伝子工学において有用なAcc III制限酵素あるいは修飾酵素を、従来の精製方法と比べ、容易に必要な純度の酵素標品を得ることが可能となる。
配列番号:1
配列の長さ:295
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴:2（ValあるいはLeu）
配列：
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0003549210.tif 000007
配列番号:2
配列の長さ:885
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列：
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配列番号:3
配列の長さ:215
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:4
配列の長さ:215
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:5
配列の長さ:28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:6
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:7
配列の長さ:100
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:8
配列の長さ:100
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:9
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:10
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:11
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:12
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:13
配列の長さ:308
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号:14
配列の長さ:924
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列：
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配列番号:15
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:16
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:17
配列の長さ:54
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:18
配列の長さ:54
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:19
配列の長さ:20
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
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配列番号:20
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列の特徴:6、９、12（イノシン）
配列：
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配列番号:21
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列の特徴:9（イノシン）
配列：
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配列番号:22
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:23
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:24
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:25
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:26
配列の長さ:1588
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列：
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配列番号:27
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:28
配列の長さ:26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列：
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配列番号:29
配列の長さ:4146
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列：
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配列番号:30
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列：
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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