【手続補正書】
【提出日】平成29年1月4日(2017.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’および３’トランスポゾン特異的逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、
前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し且つプロモーターの制御下にある、導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列と、
前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する少なくとも１つのマトリックス結合領域（ＭＡＲ）エレメントと、
を含む組換え核酸分子であって、
前記ＴＥＰタンパク質は、
タンパク質分泌経路のタンパク質の以下のアミノ酸配列：配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸ、ならびに、特定された配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、
のうちの１つ以上であるか、または
以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質：ｈＵＣＰ４、ｈＣＭＰＳＡＴ、ｒＳＴ６Ｇａｌ１、ｈＣＯＭＳＣ、ｈＴ−シンターゼ、ｈＰ４ＨＡ１、ｈＰ４ＨＢ、ｈＧＩＬＺ、ｈＣｙＰＢ、ｈＮＲＦ２、ｈＨＫ１、ｈＰＤＩ、ｈＰＩＮ１、ｈＳＥＰＷ１、ｈＣＡＬＲ、ｈＤＤＯＳＴ、ｈＨＳＰ４０、ｈＡＴＰ５Ａ１、ｈＳＥＲ−ＣＡ２、ｈＰＤＩＡ４、ｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、ｈＨＹＯＵ１、ｈＣＭＰ−ＳＡＳ、ｈベクリン−１、ｈＥＲｄｊ３、ＣＨＯ−ＡＧＥ、ｈＷｉｐ１、ｈＲＴＰ４、ｈＲＥＥＰ２、ｈＤＰＭ１およびｈＤＲｉＰ７８、
のうちの１つ以上であるか、または
シャペロン、具体的には、ＢｉＰタンパク質、より具体的には、配列番号６０と８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する合成ＢＩＰタンパク質誘導体（ＤｒｏＢｉＰ）であり、または
前記ＴＥＰ機能性ＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、限定されるものではないがＲａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などの、少なくとも１つの組換え経路のタンパク質の発現を妨げ、
前記ＭＡＲエレメントは、配列番号１（ＭＡＲ  １−６８）、配列番号２（ＭＡＲ  １＿６）、配列番号３（ＭＡＲ  Ｘ＿Ｓ２９）、配列番号４（ＭＡＲ  Ｓ４）、配列番号５（ニワトリリゾチームＭＡＲ）から選択されるか、遺伝子操作された対応物、特に再構成された対応物であるか、および／または配列番号１〜５のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、
組換え核酸分子。
【請求項２】
前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する少なくとも１つの導入遺伝子をさらに含み、前記導入遺伝子が導入遺伝子プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記組換え核酸分子がベクターの一部である、請求項１または２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記ベクターが、単一ＭＡＲエレメント、または２つ以上のＭＡＲエレメントを含み、前記エレメント（複数可）が前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記ベクターが、２つのＭＡＲエレメントを含み、第１のＭＡＲエレメントがＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの上流側に位置し、第２のＭＡＲエレメントがＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流側に位置し、前記第１のＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ  １＿６エレメントおよび／または配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメント、具体的には、ＭＡＲ  １＿６に基づく再構成ＭＡＲ、より具体的には、配列番号８（ＭＡＲ  １＿６Ｒ２）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメントを含み、前記第２のＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ  １−６８エレメントおよび／または配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントを含む、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
前記ベクターが、前記単一ＭＡＲエレメントを含み、前記単一ＭＡＲエレメントが、ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流側に位置し、前記単一ＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ  １−６８もしくはＭＡＲ  Ｘ−２９エレメントおよび／または配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメント、具体的には、ＭＡＲ  １−６８もしくはＭＡＲ  Ｘ−２９に基づく再構成ＭＡＲ、具体的には、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号１０（ＭＡＲ  １＿６８Ｒ、ＭＡＲ  １＿６８Ｒ２もしくＭＡＲ  Ｘ＿２９Ｒ３）または配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり、好ましくは、ＭＡＲ  Ｘ＿２９エレメントおよび／または配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントである、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡを発現させるための方法であって、
導入遺伝子を含む組換え非ヒト哺乳類細胞をインビトロで提供することを含み、
前記ベクターがＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡを発現する請求項３〜６のいずれか一項に記載のベクターであり、任意選択で、前記ベクターによって発現した前記ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡが、前記非ヒト哺乳類細胞において導入遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させる、
方法。
【請求項８】
前記ベクターが、単一ＭＡＲ  Ｘ＿２９エレメントおよび／または配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含み、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４週を超える培養後に、前記ベクターによって発現した前記ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡが、目的の遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
好ましくは、単一コピーとして細胞のゲノムに組込まれた２０、１５、１０または５以下の請求項１または２に記載の組換え核酸分子を含む組換え非ヒト哺乳類細胞。
【請求項１０】
ａ）少なくとも１つの導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）機能性ＲＮＡ、および／または、ＴＥＰタンパク質もしくはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの組換え核酸配列、ならびに、
ｂ）（ｉ）少なくとも１つの目的の導入遺伝子と、（ｉｉ）ＭＡＲエレメントと、を含む組換え核酸分子、
を含む組換え非ヒト哺乳類細胞であって、
前記ＴＥＰタンパク質は、
タンパク質分泌経路のタンパク質の以下のアミノ酸配列：配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸ、ならびに、特定された配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、
のうちの１つ以上であるか、または
以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質：ｈＵＣＰ４、ｈＣＭＰＳＡＴ、ｒＳＴ６Ｇａｌ１、ｈＣＯＭＳＣ、ｈＴ−シンターゼ、ｈＰ４ＨＡ１、ｈＰ４ＨＢ、ｈＧＩＬＺ、ｈＣｙＰＢ、ｈＮＲＦ２、ｈＨＫ１、ｈＰＤＩ、ｈＰＩＮ１、ｈＳＥＰＷ１、ｈＣＡＬＲ、ｈＤＤＯＳＴ、ｈＨＳＰ４０、ｈＡＴＰ５Ａ１、ｈＳＥＲ−ＣＡ２、ｈＰＤＩＡ４、ｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、ｈＨＹＯＵ１、ｈＣＭＰ−ＳＡＳ、ｈベクリン−１、ｈＥＲｄｊ３、ＣＨＯ−ＡＧＥ、ｈＷｉｐ１、ｈＲＴＰ４、ｈＲＥＥＰ２、ｈＤＰＭ１およびｈＤＲｉＰ７８、
のうちの１つ以上であるか、または
シャペロン、具体的には、ＢｉＰタンパク質、より具体的には、配列番号６０と８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する合成ＢＩＰタンパク質誘導体（ＤｒｏＢｉＰ）であり、または
前記ＴＥＰ機能性ＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、限定されるものではないがＲａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などの、少なくとも１つの組換え経路のタンパク質の発現を妨げ、
前記ＭＡＲエレメントは、配列番号１（ＭＡＲ  １−６８）、配列番号２（ＭＡＲ  １＿６）、配列番号３（ＭＡＲ  Ｘ＿Ｓ２９）、配列番号４（ＭＡＲ  Ｓ４）、配列番号５（ニワトリリゾチームＭＡＲ）から選択されるか、遺伝子操作された対応物、特に再構成された対応物であるか、および／または配列番号１〜５のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、
組換え非ヒト哺乳類細胞。
【請求項１１】
非ヒト哺乳類細胞、具体的には、ハムスター細胞をインビトロでトランスフェクトするための方法であって、任意選択で第１のトランスフェクションにおいて、
少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの請求項１または２に記載の組換え核酸分子、および／または、
少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの単離された導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）機能性ＲＮＡおよび少なくとも１つの導入遺伝子（ここで、任意選択で該導入遺伝子は組換え核酸分子の一部であり、任意選択で該組換え核酸分子は、任意選択で単離核酸またはｍＲＮＡと共に、その後の第２のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされ、該単離核酸または該ｍＲＮＡは、上記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを認識するトランスポゼースを発現する）
で前記非ヒト哺乳類細胞をトランスフェクトすることを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の組換え核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを１つの容器内に含み、互換性のあるトランスポゼースをコードするベクターを第２の任意の容器内に含み、前記ベクター（複数可）の使用法についての説明書をさらに別の容器内に含むキット。
【請求項１３】
好ましくは、導入遺伝子の組換えおよび／または発現を増加させるための、請求項１または２に記載の組換え核酸および／または請求項９または１０に記載の組換え非ヒト哺乳類細胞の使用。
【請求項１４】
（ａ）上流側でプロモーターと、下流側でポリアデニル化シグナルと隣接する導入遺伝子、
（ｂ）ポリアデニル化シグナルの下流側の単一ＭＡＲエレメント、または
（ｃ）目的の導入遺伝子の上流側の第１のＭＡＲエレメントおよび前記導入遺伝子の組込み部位の下流側の第２のＭＡＲエレメント、
を含む発現ベクターであって、
単一または第１および第２のＭＡＲエレメントが、ＭＡＲエレメント１＿６８、１＿６、１＿６Ｒ２、１＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２、Ｘ＿２９Ｒ３もしくはＸ＿２９または配列番号１、２、３、６、７、８、９もしくは１０と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメントから選択されるか；または再構成したＭＡＲエレメント１＿６Ｒ２、１＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２もしくはＸ＿２９Ｒ３または配列番号６、７、８、もしくは１０と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントから選択され、
任意選択で、ＭＡＲエレメント（複数可）が、それらの再構成していない対応物と比較して、目的の導入遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させる、発現ベクター。
【請求項１５】
導入遺伝子を発現させるための方法であって、
前記導入遺伝子を含む請求項１４に記載のベクターのうちの１つを含む組換え非ヒト哺乳類細胞をインビトロで提供することと、導入遺伝子を発現させることと、を含み、
前記ＭＡＲエレメント（複数可）が、前記導入遺伝子の発現を好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させる、方法。