(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダーマトファゴイデス・ファリネのDer F Iタンパク質アレルゲンをコードする単離DNAであって、下記アミノ酸配列：
0003592709.tif 000002
をコードすることを特徴とする単離DNA。
【請求項２】
下記アミノ酸配列：
0003592709.tif 000003
で示される成熟Der f Iタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離DNA。
【請求項３】
下記ヌクレオチド配列：
0003592709.tif 000004
を有する、請求項１または２に記載の単離DNA。
【発明の詳細な説明】
背景
最近の報告には、家塵ダニアレルギーにおけるＩ群およびII群アレルゲンに対する応答の重要性が記載されている。たとえば、患者の60％以上がこれらタンパク質に対して産生された抗ダニ抗体の少なくとも50％を保有していることが記載されている［リンド（Lind,P.）ら、Allergy、39:250〜274（1984）；ファン・デア・ゼー（van der Zee,J.S.）ら、J.Allergy Clin.Immunol.,81:884〜896（1988）］。子供が一層ひどい反応性を示すことはあり得る［トンプソン（Thompson,P.J.）ら、Immunology、64:311〜314（1988）］。ダーマトファゴイデス（Dermatophagoides;D.）属のダニに対するアレルギーは、喘息、鼻炎および異所性の皮膚炎を伴う。２つの種、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（D.pteronyssinus）およびダーマトファゴイデス・ファリネ（D.farinae）が殆どを占め、その結果、これら２つの種により産生されるアレルゲンを固定しようという相当の努力がなされてきた。ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスは、西ヨーロッパおよびオーストラリアの家塵中における最も一般的なダーマトファゴイデス種である。ダーマトファゴイデス・ファリネ種は、北アメリカや日本などの他の国に多くみられる［ウォートン（Wharton,G.W.）、J.Medical Entom.12:577〜621（1976）］。この属のダニに対するアレルギーには、喘息、鼻炎および異所性の皮膚炎などの疾患を伴うと長い間認識されてきた。これらダニにより産生されるいかなるアレルゲンが、アレルギー応答および関連する状態の原因でであるかについては未だ明らかではなかった。
発明の要約
本発明は、ダーマトファゴイデス（D.）（家塵ダニ）のタンパク質アレルゲンまたはダーマトファゴイデス属の家塵ダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードする単離DNAに関する。本発明は、特に、ダーマトファゴイデス・ファリネ種の主要なアレルゲン（Der f IおよびDer f IIと称する）またはこれら主要なアレルゲンの部分（すなわち、Der f IまたはDer f IIの少なくとも一つのエピトープを含むペプチド）をコードするDNAに関する。本発明はまた、特に、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスの主要なアレルゲン（Der p IおよびDer p IIと称する）またはこれら主要なアレルゲンの部分（すなわち、Der p IまたはDer p IIの少なくとも一つのエピトープを含むペプチド）をコードするDNAに関する。
本発明はさらに、単離ダーマトファゴイデス（たとえば、ダーマトファゴイデス・ファリネ、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス）DNAによりコードされるタンパク質またはペプチドに関する。本発明のペプチドは、ダーマトファゴイデス・ファリネアレルゲンの少なくとも一つのエピトープ（たとえば、Der f IまたはDer f IIの少なくとも一つのエピトープ）またはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲンの少なくとも一つのエピトープ（たとえば、Der p IまたはDer p IIの少なくとも一つのエピトープ）を含む。本発明はまた、ダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質またはペプチドに特異的な抗体およびダーマトファゴイデス・プテロニシヌスタンパク質またはペプチドに特異的な抗体に関する。
本発明のダーマトファゴイデスDNA、タンパク質およびペプチドは、診断および治療目的に有用である。たとえば、単離したダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質またはペプチドは、家塵ダニに対する個体の感受性を検出するのに用いることができ、個体の感受性を治療する（感受性を減少させるかまたは脱感作する）のに用いることができ、該患者に治療学的有効量のダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質またはペプチドを投与する。たとえば、個体を脱感作させるため、Der f IやDer f IIなどの単離したダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質アレルゲンを標準的な方法を用いて該個体に投与することができる。または、Der f IまたはDer f IIの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを同目的で投与することができる。Der p IやDer p IIなどの単離したダーマトファゴイデス・プテロニシヌスタンパク質アレルゲンも、Der f IやDer f IIについて記載したのと同様にして投与することができる。同様に、少なくとも一つのDer p Iエピトープや少なくとも一つのDer p IIエピトープを含むペプチドを同目的で投与することができる。これらタンパク質またはペプチドの組合せ（たとえば、Der f IとDer f II;Der p IとDer p II;またはDer fとDer pの両タンパク質の混合物）もまた投与することができる。そのような単離タンパク質またはペプチドを用いることにより、重要な家塵ダニアレルゲンに対して個体を脱感作する手段が得られる。
図面の簡単な記載
図１はクローンλgt11f1のcDNA挿入物の制限地図であり、DNAシークエンシングの方策の模式表示を含む。矢印は配列の読み取りを行った方向を示す。
図２は、cDNAλgt11f1のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。上に示す番号はヌクレオチドの位置であり、左に示す番号はアミノ酸の位置である。アミノ酸残基の正の番号は、スレオニンで始まる成熟排出Der f Iの配列に対応する。負の配列番号は、シグナルペプチドおよびDer f Iのプロエンザイム領域をさす。矢印は、それぞれ、プロエンザイム配列の開始部分および成熟Der f Iの開始部分を示す。下線を引いた残基−81〜−78はプロエンザイム生成のための提案された開裂部位を構成し、下線を引いた残基53〜55は可能なＮ−グリコシル化部位を示す。停止コドンTGAおよび隣接するポリアデニレーションシグナルもまた下線を引いてある。アミノ酸残基１〜28は、通常のアミノ酸配列分析により決定された公知のトリプシン分解ペプチド配列に対応する。
図３は、成熟Der p Iタンパク質およびDer f Iタンパク質のアミノ酸配列とを整合して並べたものである。この配列の上の番号は、Der p Iのものを表す。星印は、整合を最大とした場合に導入されるギャップを示す。記号（．）は、その位置におけるDer f Iのアミノ酸残基がDer p Iの対応アミノ酸残基と同一であることを示すために用いてある。矢印は、Der p IおよびDer f Iの活性部位を構成する残基を示す。
図４は、Der f Iのプレペプチド領域およびプロペプチド領域中のアミノ酸配列とラットカテプシンＨ、ラットカテプシンＬ、パパイン、アレウライン（aleurain）、CP1、CP2、ラットカテプシンＢ、CTLA−２、MCP、Der p Iおよびアクチニジンのアミノ酸配列との比較である。ダッシュで示されるギャップは、最大の整合のために加えたものである。二重の星印は、プロエンザイムの80％以上に共通する保存アミノ酸残基を示す。単一の星印は、55％以上の配列で保存された残基を示す。記号（．）は90％以上のプロエンザイム領域に共通する半保存等価アミノ酸を示すのに用いてある。
図５は、６残基ウィンドウ（window）を用いてマックベクターシークエンスアナリシスソフトウエア（Mac Vector Sequence Analysis Software）（IBI、ニューヘブン）により計算したホップ−ウッズ（Hopp−Woods）アルゴリズムを用いて作成したDer p I成熟タンパク質の親水性プロットおよびDer f I成熟タンパク質の親水性プロットである。正の値は相対的な親水性を示し、負の値は相対的な疎水性を示す。
図６は、Der f II cDNAのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。右側の番号はヌクレオチドの位置であり、上の番号はアミノ酸残基である。停止（TAA）シグナルは下線を引いてある。最初の８つのヌクレオチドは、Der p II配列に基づいてcDNAを生成するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーからのものである。
図７は、cDNAλgt11p1（13T）のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列である。右側の番号はヌクレオチドであり、上の番号はアミノ酸の位置である。正のアミノ酸は、スレオニンで始まる成熟排出Der p Iの配列に対応する。
図８は、配列データからコンピューターにより作成したDer f II cDNAの制限地図である。Der p IIの地図も同様にして比較のために示す。保存された共通の制限酵素部位はごくわずかしかない。星印でマークした部位はクローニング方法により導入した。
図９は、Der f II cDNA配列およびDer p II cDNA配列の整合を示す。右側の番号はヌクレオチドの位置であり、上の番号はアミノ酸残基である。一番上のラインはDer p IIヌクレオチド配列であり、第二のラインはDer p IIアミノ酸残基である。つぎの２つのラインは、これら配列とDer f IIとの差異を示す。
図10は、６残基ウインドウを用いたマックベクターシークエンスアナリシスソフトウエア（IBI、ニューヘブン）により計算したホップ−ウッズアルゴリズムを用いて作成したDer f IIおよびDer p IIの親水性プロットである。
図11は、５つのDer p Iクローン（ａ）〜（ｅ）（Der p Iタンパク質の多型を示す）のアミノ酸配列を整合して並べたものである。番号は、Der f I（ａ）クローンの配列のものである。記号（−）は、Der p Iクローンのアミノ酸残基がその位置におけるDer p I（ａ）の対応アミノ酸残基と同一であることを示すのに用いてある。これらクローンのアミノ酸配列は、Der p Iにおいて有意の変異が存在するかもしれず、これら５つの配列中に５つの多型アミノ酸残基が認められることを示している。
発明の詳細な記載
本発明は、家塵ダニダーマトファゴイデスからのアレルゲンをコードするヌクレオチド配列およびコードされたタンパク質またはペプチド（ダーマトファゴイデスアレルゲンの少なくとも一つのエピトープを含む）に関する。本発明は、特に、Der f IやDer f IIなどのダーマトファゴイデス・ファリネの主要なアレルゲンまたはDer f IまたはDer f IIの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で発現することのできるヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、Der p IやDer p IIなどのダーマトファゴイデス・プテロニシヌスの主要なアレルゲンまたはDer p IまたはDer p IIの少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを適当な宿主中で発現することのできるヌクレオチド配列に関する。ダーマトファゴイデスのヌクレオチド配列は、それにハイブリダイズし他のダニアレルゲン、とりわけダーマトファゴイデス・ファリネアレルゲンまたはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲンをコードする別のヌクレオチド配列を同定するためのプローブとして有用である。さらに、本発明は、ダーマトファゴイデス・ファリネタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはダーマトファゴイデス・プテロニシヌスタンパク質をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするがダーマトファゴイデス・ミクロセラス（D.microceras）などの家塵ダニの他の種またはタイプ（たとえば、Der m IおよびDer m II）からのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
コードされたダーマトファゴイデスダニアレルゲンまたは少なくとも一つのダーマトファゴイデス（Der f IまたはDer f II;Der p IまたはDer p II）エピトープを含むペプチドは、診断目的のため（たとえば、抗原として）および治療目的のため（たとえば、個体を脱感作するため）に用いることができる。または、コードされた家塵ダニアレルゲンは、ダーマトファゴイデス・ミクロセラスタンパク質またはペプチドなどの、Der fアレルゲンまたはDer pアレルゲンの抗原性を示すかまたは該アレルゲンと交差反応をするタンパク質またはペプチドであり得る；一般に、これらは高度のアミノ酸相同性を有する。
それゆえ、本発明はまた、ダーマトファゴイデスアレルゲン（たとえば、Der f IアレルゲンまたはDer f IIアレルゲン；Der p IまたはDer p IIアレルゲン、またはこれらと交差反応する他のダーマトファゴイデスアレルゲン）またはダーマトファゴイデスアレルゲン（Der f I、Der f II、Der p I、Der p II、またはこれらと交差反応する他のダーマトファゴイデスアレルゲン）の少なくとも一つのエピトープを含むペプチドを個々にまたは組合せて含有し治療目的（たとえば、脱感作）に用いることのできる組成物にも関する。下記に示すように、家塵ダニからの主要なアレルゲンをコードするDNAを単離しシークエンシングした。とりわけ、実施例で一層詳細に記載するように、それぞれDer f IアレルゲンおよびDer f IIアレルゲンをコードする２つのcDNAクローンを単離しシークエンシングした。Der p IおよびDer p IIのヌクレオチド配列も決定した。これら各クローンのヌクレオチド配列を、それぞれの予測させるアミノ酸配列を有する関連するダニであるダーマトファゴイデス・プテロニシヌスからの相同なアレルゲン（Der p IおよびDer p IIそれぞれについて）のヌクレオチド配列と比較した。
下記に記載するのは、Der f Iアレルゲンをコードする２つのcDNAクローンの単離およびシークエンシング並びに対応するダーマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲンとの比較、並びにヌクレオチド配列およびコードされた生成物の診断および治療目的の使用である。
Der f Iの単離および配列分析
家塵ダニダーマトファゴイデス・ファリネの主要なアレルゲンであるDer f IをコードするcDNAを単離し配列決定した。該クローンのcDNA挿入物の制限地図を図１にDNAシークエンシングの方策として示す。このDer f I cDNAクローンは、典型的なシグナルペプチド、プロエンザイム領域および成熟Der f Iタンパク質をコードする1.1kb cDNAを含有する。生成物は321アミノ酸残基：推定18残基のシグナルペプチド、80残基のプロエンザイム（プロペプチド）領域、および223残基の成熟酵素領域である。得られた分子量は25,191である。Der f I cDNAのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を図２に示す。導かれたアミノ酸配列は、プロ領域並びに成熟タンパク質において他のシステインプロテアーゼに有意の相同性を示す。関連するダニのダーマトファゴイデス・プテロニシヌスからの相同なアレルゲンDer p Iとの成熟Der f Iタンパク質の配列整合（図３）により、タンパク質レベルでの以前のシークエンシングにより予測されるように、これら２つのタンパク質の間に高度の相同性（81％）が明らかになった。特に、これら酵素の活性部位を含む残基は保存されており、可能なＮ−グリコシル化部位は両方のダニアレルゲンにおいて等価な位置に存在していた。
保存されたシステイン残基対（31,71）および（65,103）（番号はDer p Iについてのもの）は、パパインおよびアクチニジン（さらにジスルフィド橋を有する）に対するDer p IおよびDer f Iの３次元構造の仮定された類似性に基づいてジスルフィド結合生成に関与しているように思われる。パパインおよびアクチニジンに相同なシステイン残基が存在する第５および最後のシステイン残基は、活性部位のシステイン（Der f I中の残基35）である。Der p IおよびDer f I中に存在する２つの余分のシステイン残基が第三のジスルフィド橋の形成に関与していると考えられないこともない。
Der p I中の可能なＮ−グリコシル化部位はまたDer f I中の等価の位置にも存在し、トリペプチド部位の重要な第一の残基および最後の残基が保存されている。Der f IおよびDer p Iのグリコシル化の程度は、なお決定する必要がある。マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含む炭水化物が、これらダニアレルゲンの精製調製物中に報告されている（チャップマン（Chapman,M.D.）、J.Immunol.,125:587〜592（1980）；ウオルデン（Wolden,S.）ら、Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,68:144〜151（1982））。
通常のアミノ酸シークエンシングによって決定されたDer m Iを用い（プラッツ−ミルズ（Platts−Mills TAE）ら、マイト・アラジー、ア・ワールド−ワイド・プロブレム（Mite Allergy,a World−wide Problem）、27〜29（1988）；リンド（Lind,P.）およびホーン（N.Horn）：マイト・アラジー、ア・ワールド−ワイド・プロブレム、30〜34（1988））、成熟Der p IとDer m Iの間（70％）および成熟Der f IとDer m Iとの間（97％）の最初の30のＮ−末端アミノ酸残基の相同性の程度が得られると、完全な成熟Der m I配列はＩ群ダニアレルゲンとの間に全体で70〜80％の相同性が確認されるであろう。Der m Iはダーマトファゴイデス・ミクロセラスからのアレルゲンである。残基−23〜−１におけるDer p IとDer f Iのプロエンザイム領域間での高い相同性（91％）およびDer f Iの構造分析により、相同な構造および少なくともプロペプチドに関して相同な組成の成熟タンパク質のＮ−末端伸長ペプチド（extension peptides）を有すると思われる。
シグナル配列の設計の微細構造に関する研究により、これまでに３つの構造的に非類似の領域が同定された：正に荷電したＮ−末端（ｎ）領域、中央の疎水性（ｈ）領域および一層極性の大きいＣ−末端（ｃ）領域（開裂部位を定めているように思われる）（フォン・ヘイジン（Von Heijne,G.）、EMBO J.,３:2315〜2323（1984）;Eur.J.Biochem.,133:17〜21（1983）;J.Mol.Biol.,184:99〜105（1985））。Der f Iのシグナルペプチドを分析したところ、該ペプチドもまたこれら領域を含有していることがわかった（図４）。ｎ−領域は長さおよび組成に関しては極めて変化に富むが、その正味の電荷に関しては全長にわたって認め得るほどに変化せず、約＋1.7の平均値を有する。長さが２残基のDer f Iシグナルペプチドのｎ−領域は、最初のメチオニン（ホルミル化されておらず、それゆえ真核生物中で正に荷電している）および隣接するリジン（Lys）残基により＋２の正味電荷を有する。Der f Iのｈ−領域は疎水性残基に富み（この領域の特徴である）、ただ一つの親水性残基（Ser）が許容され得るものとして存在している。Der f I c−領域の全体のアミノ酸組成は、h/c境界が残基−６および−５の間に位置する（真核生物における平均の位置である）シグナル配列において認められるように、ｈ−領域よりも極性が大きい。それゆえ、Der f Iプレペプチド配列は、機能性のシグナル配列が従わなければならない条件を満たしているように思われる。
Der f Iと他のシステインプロテアーゼとはシグナル配列が構造的相同性を有するが（すべてｎ、ｈおよびｃ−領域からなる）、図４から明らかなように、全体にわたる長さおよびアミノ酸配列に関しては非常に変化する。しかしながら、システインプロテアーゼ前駆体のプロ領域の間には有意の配列相同性が示されている（イシドー（Ishidoh,K.）ら、FEBS Letters、226:33〜37（1987））。Der f Iと幾つかの他のシステインプロテアーゼとのプロエンザイム領域の整合（図４）によれば、これらプロ領域は幾つかの非常に保存された残基並びに半保存残基（これら配列の半分以上にわたって存在する）を共有していることが示された。この相同性は、バリン（Val）、イソロイシン（Ile）およびロイシン（Leu）（小さな疎水性の残基）またはアルギニン（Arg）およびLys（正に荷電した残基）を同一とみなすならば一層増加した。Der f Iプロ領域は、７つの高度に保存されたアミノ酸のうち６つのアミノ酸および保存変化の部位におけるすべての残基を有していた。保存性の低い部位での相同性は一層低かった。プロペプチド、とりわけ高度に保存された残基における相同性は、これら酵素のプロセシングにおけるプロペプチドの機能を考慮した場合に重要である。というのは、これら配列は構造的および機能的類似性を有しているように思われることが示されているからである。
マウス、ウサギおよびヒト血清中に存在する抗体を用い、高度に交差反応性のＢ細胞エピトープがDer f IおよびDer p I上に示された（ヘイマン（Heymann,P.W.）ら、J.Immunol.137:2841〜2847（1986）；プラッツ−ミルズら、J.Allergy Clin.Immunol.,78:398〜407（1986））。しかしながら、種特異的エピトープもまた、これら系において規定されている。マウスモノクローナル抗体は、種特異的な抗原決定基に優先的に結合する（プラッツ−ミルズら、J.Immunol.,139:1479〜1484（1987））。約40％のウサギ抗Der p I反応性は、Der p Iに独特のエピトープによって説明され（プラッツ−ミルズら、J.Allergy Clin.Immunol.,78:398〜407（1986））、大部分は交差反応性のエピトープと結合するが、ヒトアレルゲンからの抗体の幾つかの種特異的結合が観察された（プラッツ−ミルズら、J.Immunol.,139:1479〜1484（1987））。
遺伝子断片化および発現の組換えDNA法を用い（グリーン（Green,W.K.）ら、Immunol.（1990））、ウサギ抗Der p I抗血清により認識されるＢ細胞エピトープを含む組換えDer p Iの５つの抗原性領域を定めた。免疫吸着（immunoabsorption）の方法を用い、これら推定エピトープのうち、２つはDer p Iに特異的であったが（領域82〜99および112〜140）、３つはDer f Iと共通していることが示された（アミノ酸残基34〜47、60〜72および166〜194を含む領域に位置する）。ウサギ抗ダーマトファゴイデス・ファリネに対するこれらペプチドの反応性の違いは、上記交差反応性のエピトープおよび種特異的エピトープという区分を支持していた。Der p IおよびDer f Iタンパク質の間で示される配列の相違は，パパインおよびアクチニジンの二次構造および三次構造から予測されるように（ベイカー（Baker,E.N.）およびドレンス（J.Drenth）、バイオロジカル・マクロモレキュールズ・アンド・アセンブリーズ（Biological Macromolecules and Assemblies）、Vol.3、314〜368頁、ジョンウイリーアンドサンズ、ニューヨーク（1987））、Ｎ末端領域およびＣ末端領域中、並びにヘリックスＤ（残基127〜136）を含む酵素の２つのドメインを連結する伸長表面ループ（残基85〜136）中に主として位置する。これら残基が表面に位置することは、図５におけるDer p IおよびDer f Iの親水性プロットにより支持されており、この領域が親水性の性質を優勢に示すことから表面に暴露されていることを示している。この領域はまた、ウサギ抗Der p I血清により認識される２つの種特異的Ｂ細胞エピトープを含んでいる（上記）。交差反応性エピトープを含有する領域における配列の分析により、交差反応性エピトープのうち２つ（領域34〜47および60〜72に位置する）はDer p IおよびDer f I間で完全に保存されているが、第三の交差反応性エピトープ含有領域（残基領域166〜194）では残基の大部分が保存されていることが示された。
大腸菌中での発現の結果、組換えDer p Iのものに比べて大きな溶解性、安定性および抗原性を有する組換えタンパク質であるプレ−プロ−Der f Iタンパク質が得られた。Der f I cDNAによりコードされるタンパク質はpGEXベクターを用いて発現され、ラジオイムノアッセイによりウサギ抗ダーマトファゴイデス・ファリネ抗体と反応することが示された。可溶性のDer f Iアレルゲンおよび抗原性誘導体を高収量で得ることが可能になったことにより、診断および治療剤の開発およびＢ細胞およびＴ細胞抗原決定基のマッピングが容易になることであろう。
組換えDer f Iの完全なアミノ酸配列が利用できることにより、Ｂ細胞およびＴ細胞の両区画により認識されるエピトープのマッピングを行うことができる。重複合成ペプチドのスクリーニングなどの方法の使用、モノクローナル抗体および遺伝子断片化および発現の使用により、Der f Iの連続および局所的（topographical）な両エピトープを同定することができるはずである。アレルゲン性（IgE−結合性）抗原決定基が共通の性質を有するかどうか、および抗原性（IgG−結合性）抗原決定基とは生来的に異なるのかどうか、およびＢ細胞により認識されるものとは異なる独特のエピトープをＴ細胞が認識するのかどうかを決定することは特に有用であろう。ダニアレルギーヒトIgE抗体と反応性のDer f Iエピトープを同定するための研究、およびこれらをDer p Iと交差反応性の抗原決定基とDer f Iに独特の抗原決定基に分けることも行うことができる。いずれかの種に特異的なＢ細胞（またはＴ細胞）エピトープは、異なるダニ種に対する反応性を決定するのに有用な診断試薬を提供するのに用いることができ、一方、交差反応性のエピトープは共通の免疫治療剤の候補である。
本願とともに出願中の米国出願第458,643号（参照のために本明細書中に引用する）に記載されているように、ダニアレルゲンのモレキュラークローニングの結果、0.8kb cDNA挿入物を含有するDer p IをコードするcDNAクローンが単離された。配列分析により、222アミノ酸残基の成熟組換えDer p Iタンパク質が、アクチニジン、パパイン、カテプシンＨおよびカテプシンＢを含む一群のシステインプロテアーゼと有意の相同性を示すことがわかった。
Der f IIの単離および配列分析
実施例２に記載するように、家塵ダニダーマトファゴイデス・ファリネの主要なアレルゲンであるDer f IIをコードするcDNAクローンを単離し、シークエンシングした。Der f II cDNAのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を図６に示す。Der f IIをコードするクローンのcDNA挿入物の制限地図を図８に示す。
図９はDer f IIおよびDer p II cDNA配列の整合を示す。
Der f IIの配列とDer p IIの配列との相同性（88％）は、Der p IとDer f Iとの間に認められた相同性（81％）よりも高く、これはカイ２乗分布を用いて有意に異なっている（ｐ＜0.05）。この理由は、単純にＩ群のアレルゲンの方が大きく、分子の構造および機能にとって各残基が一層重要ではないためであるかもしれない。たとえば、これらが他のシステインプロテアーゼと類似のコンホメーションを取るとした場合に、Der p IおよびDer f I中のアミノ酸の違いの多くが該分子の２つのドメイン構造を連結する残基中に存在することが知られている。６つのシステイン分子がII群アレルゲンの間で保存されていて、類似のジスルフィド結合を示唆している（このことは高い全体の相同性を仮定した場合に期待されることではあるが）。これらタンパク質の保存を示す他のものとして、コード配列のヌクレオチド変化の34/55がコドンの第三の塩基で起こることであり、このような変化は通常アミノ酸を変化させない。該分子の機能において重要な残基はSer57であり、これは３つのすべての塩基が変化しているのにアミノ酸は保存されている。同様の現象は残基88においても存在し、完全なコドン変化が小さな脂肪族残基を保存させている。さらに、Der p IIと同様に、Der f II cDNAクローンは、3'非コード領域がアデノシンに富み２つの可能なポリアデニル化シグナルATAAを有しているが、ポリＡテールを有していない。最初の４つの残基をコードするヌクレオチドは、Ｎ−末端アミノ酸シークエンシングからDer p IIとDer f IIとの知られた相同性により設計されたPCRプライマーからのものである。これら塩基並びにシグナル配列を決定するため、いまやＣ−末端配列に基づいたプライマーを用いることができる。
本件アレルゲン性タンパク質／ペプチドおよびそれをコードするDNAの使用
本明細書に記載する手順により得られる物質並びにこれら物質を含有する組成物は、ダニアレルゲン、とりわけダーマトファゴイデス・ファリネや他の種（たとえば、ダーマトファゴイデス・プテロニシヌスおよびダーマトファゴイデス・ミクロセラス）などのダーマトファゴイデス属のダニに対するアレルギー応答の診断、治療および予防方法において用いることができる。加えて、上記cDNA（または該cDNAが転写されたmRNA）は他の類似の配列を同定するのに用いることができる。このことは、たとえば、低い厳格さの条件下で行うことができ、本明細書に記載した方法を用いてさらに評価するために充分な相同性（一般に40％以上）を有する配列を選択することができる。別法として、高い厳格さの条件を用いることもできる。この方法では、Der f I、Der f II、Der p IまたはDer p IIと類似のアミノ酸配列を有するダニアレルゲンをコードする配列を同定するために本発明のDNAを用いることができる。それゆえ、本発明は、Der fおよびDer p IIのみならず他のダニアレルゲン（たとえば、本発明のDNAとハイブリダイズするDNAによりコードされる他のダニアレルゲン）をも包含するものである。
本発明のDNAによりコードされるタンパク質およびペプチドは、たとえば、「精製」アレルゲンとして用いることができる。そのような精製アレルゲンは、家塵ダニに対するアレルギーの診断および治療のための試薬として用いることのできるアレルゲン抽出物または調製物の標準化に有用である。本発明のペプチドを使用することにより、一定の充分に定められた組成および生物学的活性を有するアレルゲン調製物を調製し、治療目的で（たとえば、家塵ダニ感受性の個体のアレルギー応答を変えるために）投与することができる。Der f IまたはDer f IIペプチドまたはタンパク質（または下記に記載するような、それらの修飾形）は、たとえば、Der f IまたはDer f IIに対するＢ−細胞の応答、Der f IおよびDer f IIに対するＴ−細胞の応答、または両方の応答を変えることができる。同様に、Der p IまたはDer p IIタンパク質またはペプチドは、Der p IまたはDer p IIに対するＢ−細胞および／またはＴ−細胞の応答を変えるのに用いることができる。精製アレルゲンはまた、家塵ダニ、とりわけDer f I、Der f II、Der p IおよびDer p IIに対するアレルギーの免疫治療のメカニズムを研究するために、および非修飾（「天然に存在する」）ペプチドよりも免疫治療において一層有用な修飾された誘導体または類似体を設計するために用いることもできる。
Der f IおよびDer p Iに共通し本明細書中に記載した３つのエピトープなどの交差反応性のエピトープが存在する場合においては、交差反応性のエピトープを含む分子の領域は、共通のエピトープを有する２つの（またはそれ以上の）ダニ種に対するアレルギーを治療するに際して投与すべき共通の免疫治療ペプチドとして使用することができる。たとえば、これら交差反応性のエピトープは、両方のアレルゲン（たとえば、Der f IおよびDer p Iアレルゲン）に対するIgGブロッキング抗体を誘発するのに用いることができる。全分子よりも１価抗体エピトープを含有するペプチドの方を用いることができ、このような１価抗体エピトープは、肥満細胞と交差反応することができず脱感作治療に際して有害な副作用を起こすことができないので有利であることがわかった。また、Ｂ細胞エピトープを担体分子に付着させて、アレルギー応答に対するＴ細胞制御を指令させるようにすることもできる。
または、選択されたダーマトファゴイデスアレルゲンに特異的なペプチドを調製することも望ましいかまたは必要である。本明細書に記載するように、みかけ上Der p I−特異的な２つのエピトープを同定した。同様の試みは、他の種−特異的なエピトープ（たとえば、Der p IまたはII、Der f IまたはII）を同定するために用いることができる。個体中の種−特異的なエピトープに対する抗体の存在は、どのダニ種がアレルギー応答を引き起こしているかを決定するための迅速な血清学的試験として用いることができる。このことは、個体に提供される治療を原因種に対して特別に標的化することを可能にするものであり、それゆえ、治療効果を高めることを可能にするものである。
他の研究者による仕事によると、一般に高投与量のアレルゲンが最良の結果（すなわち、最良の徴候緩解）を引き起こすことが示されている。しかしながら、多くの人は、これらアレルゲンに対するアレルギー応答のために大量のアレルゲン投与に耐えることができない。天然に存在するアレルゲンの修飾は、修飾されたペプチドまたは修飾されたアレルゲンが、対応する天然に存在するアレルゲンと同じかまたはより高い治療性能を有するが副作用（とりわけ、アナフィラキシー反応）は減少しているような仕方で設計することができる。これらは、たとえば、本発明のペプチド（たとえば、Der f IまたはDer f II、Der p IまたはDer p IIのアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチド）であってよい。または、ペプチドの組合せを投与することができる。修飾したペプチドまたはペプチド類似体（たとえば、免疫原性を修飾し、および／またはアレルギー誘発性を減少させるようにアミノ酸配列を変化させたまたは同目的のために成分を付加したペプチド）は、脱感作治療のために用いることができる。
脱感作しようとする個体への本発明のペプチドの投与は、公知方法を用いて行うことができる。単一のペプチドまたは異なるペプチドの組合せの個体への投与は、たとえば、適当な緩衝液、担体および／またはアジュバントを含有する組成物中にて行うことができる。そのような組成物は、一般に注射、吸入、経皮適用または直腸投与により投与されるであろう。現在利用できる情報を用い、充分な量で感受性個体に投与した場合に該個体のDer f Iおよび／またはDer f IIに対するアレルギー応答を変えるであろうDer f IまたはDer f IIペプチドを設計することができる。このことは、たとえば、Der f IまたはDer f IIの構造を調べ、家塵ダニ感受性個体におけるＢ−細胞および／またはＴ−細胞応答に影響を与える能力について調べようとするペプチドを産生させ、ついでこれら細胞により認識される適当なエピトープを選択することにより行うことができる。上記エピトープのアミノ酸配列を模倣しDer f IまたはDer f IIアレルゲンに対するアレルギー応答を下方制御することのできる合成アミノ酸配列を調製することができる。本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体は、公知方法においてDer f IまたはDer f IIに対するアレルギー応答を検出および診断するために用いることができる。このことは、たとえば、これらアレルゲンの一つに対する感受性について評価しようとする個体から得た血液を、該血液中の成分（たとえば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ペプチドとの結合および刺激のために適当な条件下で家塵ダニの単離アレルゲン性ペプチドと接触させ、ついでそのような結合が起こる程度を決定することにより行うことができる。Der p IおよびDer p IIタンパク質またはペプチドもまた、脱感作および感受性の診断のために同様に用いることができる。Der fおよびDer pタンパク質またはペプチドは、両アレルゲンタイプに感受性の個体を治療するために一緒に投与することができる。
また、家塵ダニ感受性個体においてアレルギー反応を引き起こすDer f IまたはDer f IIの能力をブロックまたは抑制し得る剤または薬を設計することも今や可能である。そのような剤の設計は、たとえば、それらアレルゲンは関連する抗Der f Iまたは抗Der f II IgEに結合するので、IgE−アレルゲン結合およびそれに続く肥満細胞の脱顆粒を防ぐような仕方で行うことができる。また、そのような剤は免疫系の細胞成分と結合することができ、その結果、これらアレルゲンに対するアレルギー応答の抑制または脱感作となる。このことの非制限的例示は、適当なＢ−細胞およびＴ−細胞エピトープペプチドの使用、またはDer f IまたはDer f IIアレルゲンに対するアレルギー応答を抑制する本発明のcDNA/タンパク質構造に基づいた、その修飾形の使用である。このことは、Der f IまたはDer f II−感受性個体からの血球を用いたインビトロの研究においてＢ−細胞およびＴ−細胞の機能に影響を与えるＢ−細胞およびＴ−細胞エピトープペプチドの構造を決定することにより行うことができる。このことはまた、Der p IまたはDer p IIに対するアレルギー応答をブロックするために、これらアレルゲンに対しても適用することができる。
Der f IまたはDer f IIまたは少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするcDNAを用い、遺伝子クローニングなどの公知方法を用いてさらに別のペプチドを調製することもできる。本発明のタンパク質またはペプチドの製造法は、たとえば、発現ベクター（選択されたアレルゲン性タンパク質またはペプチド（たとえば、Der f I、Der f IIまたは少なくとも一つのエピトープを含むペプチド）の全部または一部をコードするDNAを含有する）を含む宿主細胞を培養することを包含する。該DNA挿入物の発現（コードされたタンパク質またはペプチドの製造）に適した条件下で細胞を培養する。ついで、公知方法を用い、発現された生成物を回収する。別法としては、アレルゲンまたはその部分を公知の機械的または化学的方法を用いて合成することもできる。本明細書において使用するタンパク質またはペプチドなる語は、これら方法により製造されるあらゆるタンパク質またはペプチドをさす。得られたペプチドを、今度は上記のようにして用いることができる。
この方法のいずれかの態様において使用するDNAは、本明細書に記載する方法により得られたcDNAであってよく、また図２および図６に示す配列の全部または一部を有するあらゆるオリゴデオキシヌクレオチド配列、またはその機能的等価物であってよい。そのようなオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知方法を用いて化学的または機械的に製造することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的等価物とは、図２および図６の配列（または、その対応配列部分）がハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、および／またはこれら図に示す配列（または、その対応配列部分）によりコードされる生成物と同じ機能的特性を有する生成物（たとえば、ポリペプチドまたはペプチド）をコードするものである。機能的等価性がこれら一方または両方の基準に適合する必要があるかどうかは、その使用に依存する（たとえば、オリゴプローブとしてのみ使用するのであれば第一の基準さえ適合すればよく、家塵ダニアレルゲンを製造するために用いるのであれば第二の基準に適合する必要がある）。
いまや利用できる構造に関する情報（たとえば、DNA、タンパク質／ペプチド配列）はまた、ダーマトファゴイデス・ファリネアレルゲンに対するアレルギー反応において重要なＴ細胞エピトープペプチドおよび／またはＢ細胞エピトープペプチドを同定または規定するために、およびこれら反応が起こるメディエーターまたはメカニズム（たとえば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、γインターフェロン）を解明するために用いることもできる。この知識により、ペプチドに基づく家塵ダニ治療剤またはこれら応答を調節するために用いることのできる薬を設計することが可能になる。
本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。
実施例
実施例１
Der f IをコードするcDNAの単離および特徴付け
材料および方法
ダーマトファゴイデス・ファリネ培養
コモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ（Commonwealth Serum Laboratories）（パークビル、オーストラリア）からダニを購入した。
ダーマトファゴイデス・ファリネcDNAλgt11ライブラリーの構築
生きたダーマトファゴイデス・ファリネからポリアデニル化mRNAを単離し、キット（アマーシャム・インターナショナル（Amersham International）、バックス）を用いたRNaseH法（ガブラー（Gubler,V.）およびホフマン（B.J.Hoffman）、Gene、25:263〜269（1983））によりcDNAを合成した。EcoR Iリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）、ベバリー、マサチューセッツ州）を加えた後、上記cDNAをアルカリホスファターゼ処理λgt11アーム（プロメガ（Promega）、マジソン、ウイスコンシン州）にライゲートした。ライゲートしたDNAをパッケージングし、大腸菌Y1090（ｒ−）中にプレーティングして２×104組換え体のライブラリーを得た。
ダーマトファゴイデス・ファリネcDNAλgt11ライブラリーからのDer f I cDNAクローンの単離
ライブラリーのスクリーニングは、位置指定突然変異誘発（チュア（Chua,K.Y.）ら、J.Exp.Med.,167:175〜182（1988））によりアミノ酸残基−１と１との間および残基116と117との間に２つのBamH I制限部位を挿入したDer p I cDNAの誘導体をBamH Iで消化することにより得られた２つのDer p I cDNA BamH I断片１−348および349−857からなる２つのプローブとハイブリダイズさせることにより行った。これらプローブをニックトランスレーションにより32Pで放射性標識した。ファージを150mmペトリ皿当たり20,000pfuにてプレーティングし、プラークをニトロセルロースに移し（シュライヒャー・アンド・シュル（Schleicher and Schull）、ダッセル、FRG）、変性し、焼き付けた（マニアチスら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1982））。50％ホルムアミド/5×SSCE/1×デンハルト／ポリＣ（0.1mg/ml）／ポリＵ（0.1mg/ml）中、42℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行い、42℃、106cpm/mlにて一夜ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２×塩化ナトリウムクエン酸塩（SSC）/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5×SSC/0.1％SDS、0.1×SSC/0.1％SDSで順番に室温にて15分間行い、最後に0.1×SSC/1％SDS中、50℃にて30分間行った。
λgt11 f1 cDNAクローンからのDNAの単離
λgt11 f1クローンからのファージDNAの調製を迅速な単離法により行った。清澄化したファージプレート溶解液（1ml）を2.5M NaCl中の25％wt/volポリエチレングリコール（PEG6000）（270μＬ）と混合し、室温にて15分間インキュベートした。ついで、この混合物をミクロ遠心管（エッペンドルフ、FRG）中で５分間回転させ、上澄み液を除去した。得られたペレットを、1mM EDTAおよび100mM NaClを含有する10mMトリス/HCl、pH8.0（100μＬ）（TE）中に溶解した。このDNA調製物をフェノール/TEで抽出し、フェノール相を100μl TEで洗浄し、ついでプールした水性相をフェノール/TEでさらに２回、リーダー（Leder）フェノール（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール;25:24:1）で２回、クロロホルムで１回抽出し、DNAをエタノールにより沈澱させた。
DNAシークエンシング
DNA配列分析のためのクローンを得るため、上記λgt11 f1ファージDNAをEcoR I制限酵素（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）で消化し、得られたDNA挿入物をEcoR I消化M13−由来シークエンシングベクターmp18およびmp19（マニアチスら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル・コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1982））にライゲートした。形質転換は大腸菌TG−１を用いて行い、シークエンシングはシークエナーゼバージョン2.0DNAシークエンシングキット（U.S.B.、クリーブランド、オハイオ州）を用い、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（サンガーら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74:5463〜5467（1977））により行った。
複製連鎖反応（PCR）
PCRは、TaqPaqキット（バイオテック・インターナショナル（Biotech International）、ベントレイ、ワシントン州）および供給者により推薦される条件を用いたTaq DNAポリメラーゼ法（サイキ（Saiki,R.K.）ら、Science、239:487〜491（1988））により、10ngの標的DNAおよび10ピコモルのλgt11プライマー（ニュー・イングランド・バイオラブズ・ベバリー・マサチューセッツ州）を用いて行った。
結果
Der f I cDNAクローンの単離
主要なダニアレルゲンであるDer f Iを発現する２つのクローンを、Der p I cDNAプローブ（ヌクレオチド１−348および349−857）の両方にハイブリダイズする能力によりダーマトファゴイデス・ファリネcDNAλgt11ライブラリーから単離した。この方法を採用したのは、アミノ酸シークエンシングによりこれら２つのアレルゲン間に高い相同性（80％）が示されたからである（トーマス（Thomas,W.R.）ら、Advances in the Biosciences、14:139〜147（1989））。このλgt11 f1クローンDNAをEcoR I制限酵素で消化してcDNA挿入物を放出することにより、３つのDer f I cDNA EcoR I断片：一つの約800塩基長のもの、および１対の約150塩基長のものが得られた。Der f I cDNA挿入物はまた複製連鎖反応（PCR）によりファージDNAから増幅させて約1.1kbのPCR生成物とすることもできた。各Der f I cDNA断片をM13−由来シークエンシングベクターmp18およびmp19中に別々にクローニングし、シークエンシングした。
DNA配列分析
図１に示すシークエンシング法を用いてDer f I cDNAのヌクレオチド配列を決定した。完全な配列は長さが1084塩基であることが示され、335−塩基長の5'近位端配列、導かれた分子量が25,191で223アミノ酸の全天然Der f Iをコードする領域、および80−塩基長の3'非コード領域を含んでいた（図２）。Der f IのNH2−末端アミノ酸としてスレオニン残基を１位として配したのは、該天然タンパク質のNH2−末端アミノ酸シークエンシングによって得られたデータおよび組換えDer p Iの予測されたアミノ酸配列に基づいていた（チュアら、J.Exp.Med.,167:175〜182（1988））。NH2−末端領域中のDer f I cDNAの予測されたアミノ酸配列は、タンパク質レベルで決定されたものと完全に一致していた（図２）。
完全な成熟タンパク質は、ヌクレオチド位1007〜1009のTGA停止コドンで終わる単一のオープンリーディングフレームによりコードされている。ヌクレオチド位42〜44の最初のATGコドンは、それに続く配列が典型的なシグナルペプチド配列をコードするので翻訳開始部位であると思われる。
アミノ酸配列分析
ヌクレオチド分析により予測されるアミノ酸配列を図２に示す。成熟Der p IおよびDer f Iのアミノ酸配列を整合して並べたものに示すように（図３）、これら２つのタンパク質の間に高い相同性が観察された。配列相同性分析によると、以前の通常のアミノ酸シークエンシングにより予測されたように、Der f Iタンパク質はDer p Iタンパク質と81％の相同性を示すことが明らかになった。特に、Der p Iの活性部位を構成する残基は、パパイン、アクチニジン、カテプシンＨおよびカテプシンＢについて決定した残基に基づいて、Der f Iタンパク質においても保存されていた。その残基は、グルタミン（残基29）、グリシン、セリンおよびシステイン（残基33〜35）、ヒスチジン（残基171）およびアスパラギン、セリンおよびトリプトファン（残基191〜193）（番号はDer f Iのものである）である。予測される成熟Der f Iアミノ酸配列は、53〜55位に可能なＮ−グリコシル化部位（Asn−Thr−Ser）を含んでおり、該部位はまたDer p I中の対応位置にAsn−Gln−Serとして存在する。
全Der f I cDNA挿入物の予測されるアミノ酸配列の分析により、他のシステインプロテアーゼについてそうであるように（図４）、Der f Iタンパク質がプレ形およびプロ形の中間体を有していることが示された。すでに記載したように、位置−98のメチオニン残基は開始メチオニンであると思われる。この仮定は、まず第一に、残基−98〜−81からの5'近位端配列が主として疎水性アミノ酸残基からなり（72％）、これはシグナルペプチドの特徴であることに基づいている（フォン・ヘイジン、EMBO J.,３:2315〜2323（1984））。第二に、仮定されたプレペプチド（18アミノ酸残基）およびプロペプチド（80残基）の長さが他のシステインプロテアーゼのプレペプチドおよびプロペプチドの長さと類似している（図４）。調べたたいていのシステインプロテアーゼは約120のプレプロエンザイム残基を有し（そのうち、平均19残基がシグナルペプチドを形成する）、カテプシンＢは最も小さくて80である（イシドー（Ishidoh,K.）ら、FEBS Letters、226:32〜37（1987））。Der f Iは、全部で98のプレプロエンザイム残基にてこの範囲に含まれる。
フォン・ヘイジンにより概略が示されたシグナル配列開裂部位の予測法に従うことにより、プロエンザイム形成のためのプレDer f I配列からの開裂がAla（−81）とArg（−80）との間にあるシグナルペプチダーゼ開裂部位にて起こることが提唱される（フォン・ヘイジン、Eur.J.Biochem.,133:17〜21（1988）およびJ.Mol.Biochem.,184:99〜105（1985））。それゆえ、残基−98から−81の配列はリーダーペプチドをコードし、Der f Iのプロエンザイム部分は残基Arg（−80）から始まり残基Glu（−１）で終わる。
実施例２
Der f IIをコードするcDNAの単離および特徴付け
材料および方法
アミノ酸配列分析
λgt11ダーマトファゴイデス・ファリネcDNAライゲーションの調製
ダーマトファゴイデス・ファリネをコモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ（パークビル、オーストラリア）から購入し、記載に従ってmRNA（ポリアデニル化RNA）を調製するのに用いた（スチュアート（Stewart,G.A.）およびトーマス（W.R.Thomas）、Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,83:384〜389（1987））。このmRNAを約0.5μg/μｌにて懸濁し、５μｇを用いてRNaseH法（ガブラーおよびホフマン、Gene、25:263〜269（1983））によりキット（アマーシャム・インターナショナル、バックス）を用いてcDNAを調製した。ヒューン（Huynh）らにより記載された方法（Constructing and screening cDNA libraries in gt10 and gt11,In;Glover,DNA Cloning vol.A practical approach47〜78頁、IRLプレス、オックスフォード（1985））に従ってEcoR Iリンカー（アマーシャム、GGAATTCC）を結合させた。ついで、溶出に0.5Mアルギニン塩基を用いた他はサンブルックらのプロトコール6.24（サンブルックら、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1989））に従い、DNAをEcoR Iで消化し、電気泳動によるアガロースゲル精製からDEAE膜（シュライヒャー・アンド・シュエル、ダッセル、FRG,NA−45）中に回収した。ついで、このcDNAをλgt10およびλgt11中に2:1のアーム／挿入比にてライゲートした。幾つかをプラークライブラリーのためにパッケージングし、アリコートを下記複製連鎖反応により配列を単離するために保持した。
複製連鎖反応によるDer f II cDNAの単離
Der f II cDNAを単離するため、Der p IIのＮ−末端配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。というのは、これら領域においてそれらのアミノ酸配列が同一であるからである（ヘイマンら、J.Allergy Clin.Immunol.,83:1055〜1087（1989））。プライマーGGATCCGATCAACTCGATGC−3'を用いた。最初のGGATCCはBamH I部位をコードし、以下の配列GAT...はDer p IIの最初の４残基をコードする。他のプライマーとして、EcoR Iクローニング部位の両側にあるλgt11 TTGACACCAGACCAACTGGTAATG−3'逆プライマーに用いた（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベバリー、マサチューセッツ州）。Der p IIプライマーの設計は、約50〜60％Ｇ−Ｃを有するように、およびコドンの第三の塩基ではなく、第一または第二の塩基で終わるようにして行った（グールド（Gould,S.J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.86:1934〜1938（1989））；サマー（Summer,R.）およびタウツ（D.Tautz）、Nucleic Acid Res.,17:6749（1989））。
PCR反応は、67mMトリス−HCL（pH8.8、25℃）、16,6mM（NH4）2SO4、４μM dNTPs、5mM 2−メルカプトエタノール、６μmM EDTA、0.2mg/mlゼラチン、2mM MgCl2、10ピコモルの各プライマーおよび２単位のTaqポリメラーゼを含有する25μｌの最終反応容量で行った。約0.001μｇの標的DNAを加え、管の中身を混合し、パラフィン油を重層した。管を最初95℃で６分間変性し、ついで55℃で１分間アニールし、72℃で２分間伸長させた。その後は38サイクルを、変性を30秒間行い、アニーリングおよび伸長を上記と同様にして行った。最後の（40回目）サイクルにおいては、伸長反応を10分間に伸ばして、増幅したすべての生成物が完全長であることを確実にした。Ｎ−末端プライマーにおけるずれ（mismatches）を容認するために、アニーリング温度をオリゴヌクレオチドプライマーのTm（式:Tm＝69.3＋0.41（Ｇ＋Ｃ％）−650/オリゴ長  により決定）よりも意図的にわずかに低く設定した。
ついで、５μｌの反応液を１％アガロースゲル上での増幅バンドについて調べた。反応混合物の残りをクロロホルムで抽出してパラフィン油をすべて除去し、低融点アガロースゲル（バイオ−ラド、リッチモンド、カリフォルニア州）上での増幅生成物の精製の前にエタノール沈澱させた。
PCR生成物のサブクローニング
10mMトリスHCl、10mM MgCl2、50mM NaCl、0.025mM dNTPおよび１μｌのクレノウ酵素を最終容量100μｌで含有する反応液中で、精製PCR生成物の末端を充填した。37℃で15分間反応を行い、70℃で10分間熱不活化した。この混合物をエタノール沈澱する前にリーダーフェノール抽出した。得られた平滑末端DNAを、0.5M ATP、１×リガーゼ緩衝液および１単位のT4リガーゼを含有する反応液中、15℃で24時間、Sma Iで消化したM13mp18中にライゲートし、CaCl2法によりコンピテントにした大腸菌TG1中に形質転換した。形質転換した細胞をＬ＋Ｇプレート上にローン（lawn）としてプレーティングし、37℃にて一夜増殖させた。
シークエンシングのための一本鎖DNA鋳型の調製
単離した白色プラークをオレンジスティック（orange stick）を用い、２×TYブロス中に1/100に希釈したTG1細胞の一夜培養液（2.5ml）中に取り出し、37℃で６時間増殖させた。培養液をペレット化し、上澄み液を新たな管中に除いた。この上澄み液の1mlアリコートに270μｌの20％ポリエチレングリコール、2.5M NaClを加え、管を室温にて15分間静置させる前に回転撹拌した。ついで、これを再び回転させ、上澄み液をすべて痕跡なく管から除いた。ついで、ペレットを100μｌの１×TE緩衝液中に再懸濁した。少なくとも２回のフェノール:TE抽出を行い、ついでリーダーフェノール抽出を１回行い、CHCL3抽出した。DNAをエタノール中で沈澱させ、最終容量20μｌのTE緩衝液中に再懸濁した。
DNA分析
DNAシークエンシングは、大腸菌TG1中でM13由来ベクターmp18およびmp19から産生させたDNAおよびT4DNAポリメラーゼ（シークエナーゼバージョン2.0、USBコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州；制限エンドヌクレアーゼは東洋紡（大阪、日本）からのものであった）を用い、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（サンガーら、Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463〜5467（1977））により行った。一般的な手順はすべて標準的な方法によった（サンブルックら、ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（1989））。配列分析はマックベクターソフトウエア（Mac Vector Software）（IBI、ニューヘブン、コネチカット州）を用いて行った。
結果
Der p IIの４個のＮ末端残基をコードするヌクレオチドに対して相同性を有するオリゴヌクレオチドプライマー、およびコード部位の両側のλgt11配列のための逆プライマーを用い、λgt11中にライゲートしたダーマトファゴイデス・ファリネcDNAを用いて配列を増幅した。生成物をゲル電気泳動にかけたときに、約500bpおよび300bpの２つの主要なバンドが得られた。これらをM13 mp18中にライゲートし、上記500bp断片を含有する幾つかのクローンをDNAシークエンシングにより分析した。３つのクローンからはＮ−末端プライマー端からの配列データが得られ、一つのクローンからは他の方向からの配列データが得られた。これら２つの方向からの配列データが重複する部分では、完全な一致が認められた。これらクローンの一つはＮ−末端プライマーから読み始め、一つの塩基の欠失を含んでいて読み取り枠がシフトしていた。これはコピー上のエラーであると考えられた。というのは、他の２つのクローンではアレルゲンの最初の20のアミノ酸残基のタンパク質配列と一致していたからである。
正しい読み取り枠を有し一致したクローンの配列を、推定されるアミノ酸配列とともに図６に示す。それは、Ｎ−グリコシル化部位を有さず計算された分子量が14,021kDの129残基タンパク質をコードしていた。GenBankデータベース（61.0リリース）上で他のタンパク質と比較した場合、相同性は認められなかった。しかしながら、図９の整合に示すDer p IIとは88％のアミノ酸残基相同性を示した。16の変化のうち７は保存性であった。保存された残基にはまた、８、21、27、73および119位に存在するすべてのシステインが含まれていた。一般に用いられる酵素のための配列データから得られる制限酵素地図はDer p IIと異なっているが（図８）、かなりのヌクレオチド相同性も認められた。図10に示すDer f IIおよびDer p IIの翻訳配列の疎水性プロットはほとんど同一である。
Der p I、Der p II、Der f IおよびDer f IIをコードする核酸配列において配列多型が存在することが期待され、Der p I、Der p II、Der f IおよびDer f IIをコードする核酸配列中の１または２以上のヌクレオチドが自然の対立遺伝子変異のために個々のダニで変化するかもしれないことは当業者により評価されるであろう。そのようなヌクレオチド変化およびその結果としてのアミノ酸多型のすべてが本発明の範囲に含まれる。アミノ酸多型は、異なるDer p Iクローンのシークエンシングの際に発見された。これら多型は、図11に示してある。
均等物
当業者は、通常の実験により本明細書に記載した特定の態様と均等な多くの物を認識しかつ得ることができるであろう。そのような均等物は、下記請求の範囲により包含される。
【図１】
0003592709.tif 000005
【図２】
0003592709.tif 000006
【図３】
0003592709.tif 000007
【図４】
0003592709.tif 000008
【図５】
0003592709.tif 000009
【図６】
0003592709.tif 000010
【図７】
0003592709.tif 000011
【図８】
0003592709.tif 000012
【図９】
0003592709.tif 000013
0003592709.tif 000014
【図１０】
0003592709.tif 000015
【図１１】
0003592709.tif 000016