【手続補正書】
【提出日】平成29年3月2日(2017.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大きな鎖とＦａｂ軽鎖の、２つのポリペプチド鎖を含有するタンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡ）であって、各鎖はＣ末端およびＮ末端を有し、前記ＴＦｃＢＡは、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖を含有するＦａｂ部分に含有される第一の結合部位を含有し、前記Ｆａｂ重鎖は、前記大きな鎖のＮ末端にあり、前記Ｆａｂ部分は、ｃＭＥＴに特異的に結合し、および、前記ＴＦｃＢＡはさらに、大きな鎖のＣ末端で一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）部分に含有される第二の結合部位を含有し、前記ｓｃＦｖ部分は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、ここで、
（ａ）前記Ｆａｂ重鎖および前記ｓｃＦｖ部分は、タンデムＦｃ（ＴＦｃ）を介して連結されており；
（ｂ）前記ＴＦｃは、大きな鎖により含有され、および、ＴＦｃリンカーを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成する第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域を有しており；および、
（ｃ）第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域が結合しＦｃ二量体を形成しており；ならびに、さらにここで、
（ｄ）前記Ｆａｂ軽鎖は、配列番号４００にある３つの軽鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有し；および、
（ｅ）前記Ｆａｂ重鎖は、配列番号４１０にある３つの重鎖ＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含有する、前記ＴＦｃＢＡ。
【請求項２】
前記ｓｃＦＶ部分が、配列番号４７２であるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項３】
前記ＴＦｃＢＡの大きな鎖が、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の順で含有する、請求項１または２に記載のＴＦｃＢＡ：
（ｉ）Ｆａｂ重鎖可変領域ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン；
（ｉｉ）ＩｇＧ１上部ヒンジならびにＩｇＧ４中部および下部ヒンジを含有するハイブリッドヒンジ；
（ｉｉｉ）Ｔ２９９Ｋ変異を含有する第一のＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン；
（ｉｖ）Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含有する第一のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン；
（ｖ）第一のジスルフィド架橋モチーフ（ＫＳＣＤＫＴ）；
（ｖｉ）任意選択的に、ａａ配列（Ｇ４Ｓ）８を含有するリンカーである、タンデムＦｃリンカー；
（ｖｉｉ）ＩｇＧ４中部ヒンジおよび下部ヒンジ；
（ｖｉｉｉ）Ｔ２９９Ｄ変異を含有する第二のＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン；
（ｉｘ）Ｔ３６６Ｗ変異を含有する第二のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン；
（ｘ）第二のジスルフィド架橋モチーフ（ＧＥＣ）；
（ｘｉ）連結リンカー；および、
（ｘｉｉ）ｓｃＦｖ。
【請求項４】
前記ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−８、１０ｅ−９、１０ｅ−１０、１０ｅ−１１、１０ｅ−１２、または１０ｅ−１３Ｍ未満のｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項５】
前記ＴＦｃＢＡが、３．０ｘ１０ｅ−８〜２．５ｘ１０ｅ−９ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項４に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項６】
前記ＴＦｃＢＡが、約１０ｅ−７もしくは１０ｅ−８Ｍ、または任意選択的に１０ｅ−９Ｍ未満のＥｐＣＡＭに対する結合のＫｄを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項７】
前記ＴＦｃＢＡが、１０ｅ−８〜１０ｅ−１１ＭのｃＭＥＴに対する結合のＫｄを示す、請求項６に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項８】
前記ＴＦｃリンカー配列が、配列番号１６９のアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項９】
前記ＴＦｃが、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、および、配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡ。
【請求項１０】
配列番号４１０であるアミノ酸配列を含有する大きな鎖を含有するＴＦｃＢＡ分子。
【請求項１１】
配列番号４１０の位置１〜１１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに、配列番号４００の位置１〜１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、ｃ−Ｍｅｔ結合部位を有する結合剤。
【請求項１２】
配列番号４１０の位置１〜１１８のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、配列番号４００の位置１〜１０８のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ｃ−Ｍｅｔ結合部位を有する結合剤。
【請求項１３】
配列番号４７２の位置１３５〜２５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに、配列番号４７２の位置１〜１１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、ＥｐＣＡＭ結合部位を有する結合剤。
【請求項１４】
癌治療剤を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤の使用であって、
前記癌治療剤は治療有効量投与されるものであり、ここで、任意選択的に、前記治療有効量は、１００ｎｇ／患者体重ｋｇ〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇであり、および、さらに任意選択的に、前記治療有効量は、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜２５ｍｇ／患者体重ｋｇである、使用。
【請求項１５】
前記癌が、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌、前立腺癌および膵臓癌から選ばれるいずれかであり、ここで任意選択的に、前記治療有効量は、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜１０ｍｇ／患者体重ｋｇである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
癌患者における腫瘍増殖の阻害剤を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤の使用であって、
前記阻害剤は治療有効量投与されるものであり、ここで、任意選択的に、前記治療有効量は、１００ｎｇ／患者体重ｋｇ〜１５ｍｇ／患者体重ｋｇ、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜１０ｍｇ／患者体重ｋｇ、または、１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜２５ｍｇ／患者体重ｋｇである、使用。
【請求項１７】
癌患者における腫瘍増殖の阻害剤を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤の使用であって、
前記阻害剤による癌患者における腫瘍増殖の阻害は、腫瘍細胞と、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡの濃縮物または結合剤を含有する液体とを接触させることを含み、前記ＴＦｃＢＡの濃縮物または結合剤は、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効である、使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤、および薬学的担体を含有する医薬組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、注射、静脈内注射、および／または、点滴に適した滅菌組成物である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、薬学的に受容可能な容器にパッケージされている、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸分子を含有するベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、前記コードされたタンパク質を発現する、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記ＴＦｃＢＡまたは結合剤が、細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現している細胞と接触した際に、接触後に細胞中で測定される総ｃ−Ｍｅｔの量が、接触前に同等の細胞で計測された総ｃ−Ｍｅｔの量よりも低い、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤。
【請求項２６】
前記ＴＦｃＢＡまたは結合剤が、細胞表面ｃ−Ｍｅｔおよび細胞表面ＥＰＣＡＭの両方を発現している細胞と接触した際に、細胞中で測定される総ＥＰＣＡＭの量が、本質的に変化しない、請求項２５に記載のＴＦｃＢＡまたは結合剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本明細書において、たとえば、タンデムＦｃ抗体（ＴＦｃＡｓ）等の改変抗体が開示される。例示的なＴＦｃＡｓは、たとえば、米国仮特許出願６１／５２７，８０２（２０１１年８月２６日に出願）；および同時係属されているＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５２４９０（２０１２年８月２７日に出願。国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０３３００８Ａ２を参照のこと）に開示されている、タンデムＦｃ二重特異性抗体（ＴＦｃＢＡｓ）である。ＴＦｃＢＡは、第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域（当該第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域の各々はＣ末端とＮ末端を有する）を含有するポリペプチド部分であるタンデムＦｃを含有し；第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、Ｃ末端およびＮ末端を有するＴＦｃリンカーを介して１つのポリペプチド鎖として連結されている（すなわち、第一のＦｃ領域のＣ末端は、ＴＦｃリンカーのＮ末端にペプチド結合により連結され、同様に、そのＴＦｃリンカーのＣ末端は、第二のＦｃ領域のＮ末端にペプチド結合により連結されている）。ＴＦｃＢＡは、少なくとも２つの結合部位（少なくとも第一の結合部位と第二の結合部位）を含有することができる。そのような結合部位の各々は、細胞表面受容体の特定の部分に特異的に結合する。例示的な細胞表面受容体は、癌細胞により発現、または過剰発現されているものである。例示的な結合部位としては、細胞表面受容体の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体由来の結合部位が挙げられる。ＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡの第一の結合部位または第二の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３（たとえば、米国特許第７，８４６，４４０号に開示されている結合部位）、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（αおよびβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒト受容体タンパク質に特異的に結合しても良い。通常、受容体は、受容体チロシンキナーゼである。一般的に、そのような結合は、受容体タンパク質の細胞外部分に特異的である。本明細書の有る実施態様において、ＴＦｃＢＡに包含される少なくとも２つの抗原結合部位のうちの１つは、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合部位である（たとえば、抗ｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂ、または抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦｖ）。例示的なある実施態様において、ＴＦｃＢＡは、１つの抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位および、ｃ−Ｍｅｔに結合しない第二の結合部位（たとえば、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１−４、ＰＤＧＦＲ（αおよびβ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２に特異的な結合部位）を少なくとも１つ含有しており、ここで、当該抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位および第二の結合部位は、ＴＦｃを介して連結され、連続的なポリペプチドを形成している。ＴＦｃＢＡは、１つの受容体または２つの異なる細胞表面受容体上の２つのエピトープ（たとえば、細胞外エピトープ）に結合しており、そのような結合によって、ＴＦｃＢＡが結合する少なくとも１つの細胞表面受容体の同族リガンドにより通常であれば刺激されるシグナル伝達が強く阻害される。たとえば、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ  ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子、Ｃ−ｍｅｔの同族リガンド）およびＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、ＥＧＦＲの同族リガンド）のいずれかまたは両方により誘導されるシグナル伝達を阻害しうる。または、抗ｃ−Ｋｉｔ＋抗ＲＯＮ  ＴＦｃＢＡは、マクロファージ刺激タンパク質（ＲＯＮの同族リガンド）および幹細胞因子（ｃ−Ｋｉｔの同族リガンド）のいずれかまたは両方により誘導されるシグナル伝達を阻害しうる。または、抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＰＣＡＭ  ＴＦｃＢＡは、ＨＧＦにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、もしくは、ＨＧＦの非存在下でｃ−Ｍｅｔ受容体によるシグナル伝達を阻害しうる（たとえば、リガンド依存性ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達）。各阻害は、１０ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくは１ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０、または、少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の最大阻害割合（ＴＦｃＢＡにより阻害されるシグナル伝達である、リガンド誘導性（または、ＨＧＦ非存在下のｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の場合には、リガンド非依存性）の受容体（複数含む）のリン酸化の阻害により示される）である。多くの実施態様において、本明細書に開示されるＴＦｃＢＡを含有する抗ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔを発現している細胞に対し、本質的に何らの刺激作用も与えない。他の実施態様において、本明細書に開示されるＴＦｃＢＡを含有する抗ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔを発現している細胞に対し、ｃ−Ｍｅｔ受容体のダウンレギュレートまたは分解を誘導する。他の実施態様において、本明細書の抗ＥＰＣＡＭ  ＴＦｃＢＡは、低レベルのＥＰＣＡＭ（細胞当たり、わずか１００，０００±５％のＥＰＣＡＭ分子）、または非常に低レベルのＥＰＣＡＭ（細胞当たり、わずか２４，０００±５％のＥＰＣＡＭ分子）を発現している細胞に、最も強いシグナル伝達阻害効果（たとえば、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％超）を与える。ある実施態様において、細胞におけるＴＦｃＢＡの発現により、（ｉ）同じ受容体（複数含む）に結合するが、ＴＦｃを含有していない多価抗体の発現と比較し、より多くの（すなわち、より高い割合で）正しく形成されたＴＦｃＡＢ分子が産生されるか、または、（ｉｉ）正しく形成されたＴＦｃＡＢが８０％を超えて産生される（たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
たとえば、ＴＦｃＢＡ等のＴＦｃＡにより含有されるＴＦｃの第一のＦｃ領域および第二のＦｃ領域は、第一および第二のＣＨ３ドメインをそれぞれ含有しても良く、当該ＣＨ３ドメインの各々はＣ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃの第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、それぞれ、第一のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ２ドメインを含有してもよく、当該ＣＨ２ドメインの各々は、Ｃ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃの第一のＦｃ領域と第二のＦｃ領域は、それぞれ、第一のヒンジと第二のヒンジを含有しても良く、当該第一のヒンジと第二のヒンジの各々は、Ｃ末端とＮ末端を有している。ある実施態様において、第二のヒンジは、上部ヒンジサブドメインを含有していない。ＴＦｃＡに含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。ＴＦｃＡに含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ、第一のＣＨ２ドメイン、第一のＣＨ３ドメイン、ＴＦｃリンカー、第二のヒンジ、第二のＣＨ２ドメイン、および第二のＣＨ３ドメイン。第一のヒンジは、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン、および下部ヒンジサブドメインを含有しても良く、および、第二のヒンジは、コアヒンジサブドメインおよび下部ヒンジサブドメインを含有しても良いが、上部ヒンジサブドメインは含有しなくても良く、当該ヒンジサブドメインの各々はＣ末端とＮ末端を有している。ＴＦｃＡにより含有されているＴＦｃは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有してもよい：第一のヒンジ（そのＣ末端は、第一のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第一のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端はＴＦｃリンカーのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のヒンジのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されており、次いで、そのＣ末端は第二のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結されている）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ＴＦｃＡ、たとえばＴＦｃＢＡ、たとえば抗ｃ−Ｍｅｔ＋抗ＥＧＦＲ  ＴＦｃＢＡまたは抗ｃ−Ｋｉｔ＋抗ＲＯＮ  ＴＦｃＢＡまたは抗ＦＧＦＲ２＋抗ＥＰＣＡＭ  ＴＦｃＢＡは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する重鎖を含有しても良い：第一の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、および第二のＶＨドメイン。重鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有しても良い：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカーおよび第二のＶＨドメイン。重鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有しても良い：第一のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＴＦｃ、連結リンカー、第二のＶＨドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第二の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン。ここで、当該第二のＶＨおよびＶＬドメインは、結合し、第二の結合部位を形成している。ＴＦｃＡは、第一のＶＨドメインと二量体化し第一の結合部位を形成する第一のＶＬドメインを含有する軽鎖を含有しても良い。軽鎖は、ＶＬドメインのカルボキシル末端に連結されている軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含有しても良い。第一の結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、または、抗ＥｐｈＡ２の結合部位であっても良く、および、第二の結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗  ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位であっても良い。ＴＦｃＡが一価のＴＦｃＡである場合、結合部位は、抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗  ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位であっても良い。例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位としては、ａ）配列番号２２３または２８７のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＶＨＣＤＲ３）のａａ配列、および、ｂ）配列番号２３１または２８９のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれか、または両方を含有するＶＨドメインを含有するものが挙げられる。他の例示的な抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位としては、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨ  ＣＤＲのセットを含有するＶＨドメイン（ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、および、ＶＨＣＤＲ３は、配列番号２２３または２３１のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有する）；ならびに、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、および、ＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有するＶＬドメイン（ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２８７または２８９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する）、を含有するものが挙げられる。例示的な抗ＥＧＦＲ結合部位としては、ａ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＨＣＤＲ３、および、ｂ）配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有するＶＬＣＤＲ３、のいずれか、または両方を含有するものが挙げられる。例示的な抗ＥＧＦＲ結合部位としては、ＶＨＣＤＲ１、ＶＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含有する３つのＶＨＣＤＲのセットを含有するＶＨドメイン（ここで、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７または２７９のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のａａ配列を含有する）；ならびに、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含有する３つのＶＬＣＤＲのセットを含有するＶＬドメイン（ここで、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、配列番号２３３、２３７、２５８、２７５、２７７、または２７９のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のａａ配列を含有する）、を含有するものが挙げられる。抗ｃ−Ｍｅｔ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または、抗ＥＧＦＲの結合部位は、重鎖のＮ末端部分および軽鎖のＮ末端部分を含有しても良い。抗ＥＧＦＲ、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、抗ＥｒｂＢ４、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＩＧＦ２Ｒ、抗インスリン受容体、抗ＲＯＮ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＴＮＦＲ、抗ＦＧＦＲ１、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、抗ＦＧＦＲ４、抗ＰＤＧＦＲα、抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＥｐｈＡ２、または抗ｃ−Ｍｅｔ結合部位は、重鎖により全体的に包含され、連続的なポリペプチドを形成するＣ末端ｓｃＦｖにより包含されても良い。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
また、癌を有する対象を治療する方法が開示され、当該方法には、ＴＦｃＡもしくはＴＦｃＢＡ、核酸分子、またはベクターの治療有効量を対象に投与することが含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
１０．当該第一のヒンジが、上部ヒンジサブドメイン、コアヒンジサブドメイン、および下部ヒンジサブドメインを含有し、ならびに、第二のヒンジが、コアヒンジサブドメインおよび下部ヒンジサブドメインを含有するが、上部ヒンジドメインは含有せず、当該各ヒンジサブドメインはＣ末端およびＮ末端を有している、実施態様９のＴＦｃＢＡ。
１１．当該ＴＦｃＢＡに含有されているＴＦｃが、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順で含有する、実施態様１〜１０のいずれか１つのＴＦｃＢＡ：第一のヒンジがあり、そのＣ末端で第一のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第一のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端でＴＦｃリンカーのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のヒンジのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され、次いで、そのＣ末端で第二のＣＨ３ドメインのＮ末端に連結される。
１２．当該ＴＦｃリンカーが２０〜５０ａａを含有する、実施態様１〜１１のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
１３．当該ＴＦｃリンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである、実施態様１２のＴＦｃＢＡ。
１４．当該ＴＦｃリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含有し、ここで、ｎは、４、５、６、７または８である、実施態様１３のＴＦｃＢＡ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
２６．当該ＤｉＳ修飾は、ＤｉＳモジュール１またはＤｉＳモジュール２により含有される、実施態様２３〜２５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２７．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインの各々が、１以上のＡＥＭおよび１以上のＤｉＳ修飾を含有する、実施態様１〜２６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２８．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列に少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０ａａの付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜２７のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
２９．当該第一のＣＨ３ドメインまたは第二のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様２８のＴＦｃＢＡ。
３０．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインが共に、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、ＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各当該対の各配列と少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で各当該対の各配列から異なっており、ここで、当該第一のＣＨ３ドメインは、第二のＣＨ３ドメインにより含有される対とは異なるメンバーを含有する、実施態様１〜２８のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
８６．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインのいずれか、または両方が、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列に少なくとも７０％同一であるａａ配列か、または、最大で３０ａａの付加、欠失または置換という点でそれらから異なっているａａ配列を含有する、実施態様１〜８５のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
８７．当該第一のＣＨ３ドメインまたは第二のＣＨ３ドメインが、配列番号２７〜９８からなる群から選択されるａａ配列を含有する、実施態様２８のＴＦｃＢＡ。
８８．当該第一のＣＨ３ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインが共に、２つの異なるメンバーの対を含有し、各メンバーは、ＣＨ３のａａ配列であり、各対は、配列番号３１および３５、配列番号３３および３７、配列番号３９および４３、配列番号４１および４５、配列番号４７および５１、配列番号４９および５３、配列番号５５および５９、配列番号５７および６１、配列番号６３および６７、配列番号６５および６９、配列番号７１および７３、配列番号７２および７４、配列番号７５および７９、配列番号７７および８１、配列番号８３および８５、配列番号８４および８６、配列番号８７および８９、配列番号８８および９０、配列番号９１および９３、配列番号９２および９４、配列番号９５および９７、ならびに配列番号９６および９８からなる対の群から選択され、各メンバーのａａ配列は、各当該対の各配列と少なくとも７０％同一であるか、または、最大で３０のａａ付加、欠失または置換という点で各当該対の各配列から異なっており、ここで、当該第一のＣＨ３ドメインは、第二のＣＨ３ドメインにより含有されるものとは異なる対のメンバーを含有する、実施態様１〜８６のいずれか１つのＴＦｃＢＡ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
１１１．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補対および２９９位の電荷相補対の両方を含有し、ここで、２９７位の電荷相補対の当該第一および第二のアミノ酸残基は、２９９位の電荷相補対の当該第一および第二のアミノ酸残基と同一、または異なっている、実施態様１１０の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１２．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９７位の電荷相補対を含有し、および、ここで、当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡよりも安定であるが、第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は両方とも、同じ荷電アミノ酸からなる残基であることを除き、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であり、当該同じ荷電アミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９７位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである、実施態様１１０または１１１の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１３．当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、２９９位の電荷相補対を含有し、および、ここで、当該電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡは、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡではないＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡよりも安定であるが、第一および第二のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は両方とも、同じ荷電アミノ酸からなる残基であることを除き、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡと同一であり、当該同じ荷電アミノ酸は、電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡの２９９位の電荷相補対のアミノ酸のうちの１つである、実施態様１１０、１１１または１１２の電荷相補的に対形成されたＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
１１４．当該第一または第二の結合部位は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン受容体、Ｒｏｎ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦＲ、ＦＧＦＲ１  ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、  ＦＧＦＲ４、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｋｉｔ、ＥＰＣＡＭおよびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるヒトタンパク質に特異的に結合する、実施態様５９〜１１３のいずれか１つのＴＦｃＡまたはＴＦｃＢＡ。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
また、ＣＨ２ドメインは、例えば、ａａ欠失、付加、または置換のような１以上のａａ修飾において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のそれと異なるａａ配列を含むこととしてもよい。所定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然由来の（または野生型）ＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号２６１および２６２）または多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０ａａにおいて配列番号２５または２６のそれとは異なるａａ配列を含む。所定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、天然由来のＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号２６１および２６２）のそれまたは配列番号２５もしくは２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一性または類似であるａａ配列を含む。代表的な変更は、ａａ２９７でのグリコシル化を低減または除去するための他の変更を含む。概して、変更は、哺乳類の細胞において発現される場合に、変異体が実質的にアグリコシル化されるように、ＥＵ位置２９７〜２９９（ａａモチーフＮＸＴ）のいずれかにおけるアミノ酸置換を含むこととしてもよい。Ｔ２９９Ｋに加えて、ａａ２９７でグリコシル化を低減するためにａａ２９９でなされる他の置換は、例えば、ＷＯ／２００５／０１８５７２に記載されるように、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｃ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｗ、およびＴ２９９Ｖを含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
ＴＦｃＡにおいて使用されるＦｃ領域は、また、例えば、ａａ欠失、付加、または置換のような１以上のａａ修飾における、例えば、配列番号９９〜１６６のような本明細書に記載されるものとは異なるａａ配列を含むこととしてもよい。所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、多くて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ａａにおいて、例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択される配列のような、本明細書で述べられる配列とは異なるａａ配列を含む。所定の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択される配列のような、本明細書で述べられる配列のそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるａａ配列を含む。例えば、配列番号９９〜１６６からなる群から選択されるａａ配列からなるＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、Ｃ末端リジンおよび／またはＥ３５６Ｄおよび／またはＭ３５８Ｌの欠失を含むこととしてもよい。例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣのような、いくつかの抗体エフェクタ機能は、Ｆｃ領域により媒介され、Ｆｃ領域をなし得るａａ変化は、Ｆｃ領域のエフェクタ機能（複数を含む）に影響を及ぼす変化を含む。これらのドメインに対する代表的な突然変異が本明細書で述べられる。これらのａａ修飾のいくつかは、Ｆｃ領域が、例えば、生物学的活性、安定性、および低免疫原性のような所望の特性を保持することを提供することを可能にする。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
いくつかの実施形態において、ＴＦｃＡは、例えば、野生型Ｆｃ領域と比較してポリペプチドの抗原依存性エフェクタ機能、特にＡＤＣＣまたは補体活性を変化させるａａ変化を含むＦｃ変異体を含む。代表的な実施形態では、前記抗体は、Ｆｃガンマレセプター（例えば、ＣＤ１６）に対する変化した結合を示す。このような抗体は、野生型ポリペプチドと比較した場合に、ＦｃγＲｎ対する増加したまたは減少した結合を示し、よって、増強されたまたは低減されたエフェクタ機能をそれぞれ媒介する。ＦｃγＲについての改善された親和性を有するＦｃ変異体は、エフェクタ機能を増強することが予想され、このようなタンパク質が、例えば、腫瘍治療のような、標的分子の破壊が所望される哺乳類を治療する方法における有用なアプリケーションを有することとしてもよい。これに対して、減少したＦｃγＲ結合親和性を有するＦｃ変異体は、エフェクタ機能を低減することが期待される。一実施形態では、ＴＦｃＡが、野生型Ｆｃ領域を含むＴＦｃＡと比較して、最適化、食作用、補体依存性細胞障害、抗原依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)、またはエフェクタ細胞調整からなる群から選択される、少なくとも１つの変更された抗原依存性エフェクタ機能を含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
所定の実施形態では、ＴＦｃＡ組成物は、１以上の、以下の特徴、１）少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多いタンパク質が、タンパク質での精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥで目に見える、２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察される種の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多くが正しい分子量である、３）示差走査蛍光測定により測定される熱安定性プロファイルが溶解した球状の挙動を示さない、４）ＳＥＣにより可視化される５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはそれより多い単量体を含まない、および５）ｐＥＧＦＲ抑制により測定される外因性のＥＧＦリガンドの付加により活性化されたＥＧＦレセプターシグナルの９５％より多くを阻害する、を含む。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
異なる核酸（配列番号２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、または、３２８を有する）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと一過性にトランスフェクトし、原則的に以下の通りに、ワンステップのプロテインＡ精製を用いて精製した。タンパク質をコードする核酸を、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドへとクローニングした。用いた発現プラスミドは、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。発現プラスミドを、ポリエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）およびＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で６日間インキュベートして回収した。すべてのタンパク質を、メーカーの説明書に従いプロテインＡアフィニティプロトコールを用いて精製した。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的に、効率的に結合させた。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。この工程の後、融合タンパク質として所望される分子形態の分画は、６０〜９８パーセントの範囲にあった。ＧＥのＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡアフィニティ樹脂として用いる。精製した物質を濃縮し、ＰＢＳへと透析した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
一過性のトランスフェクション：核酸を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと一過性にトランスフェクトし、原則的に以下の通りに、ワンステップのプロテインＡ精製を用いて精製する。タンパク質をコードする核酸を、１つのタンパク質として、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現プラスミドへとクローニングする。用いた例示的な発現プラスミドは、ｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ  ＃  Ｒ７９０−０７）である。発現プラスミドを、ポリエチレンイミン（２．５μｇ／ｍｌ培養物）およびＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ細胞培養物）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で６日間インキュベートして回収する。すべてのタンパク質を、メーカーの説明書に従いプロテインＡアフィニティプロトコールを用いて精製する。プロテインＡアフィニティ工程を用いて、培養した細胞培養液（ＨＣＣＦ）から融合タンパク質を選択的に、効率的に結合させた。これにより、９５％を超える不純物を一回の工程で除去し、高い収率と高いスループットを得ることができる。ＧＥのＭＡＢＳＥＬＥＣＴを、プロテインＡアフィニティ樹脂として用いる。精製した物質を濃縮し、ＰＢＳへと透析する。