(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染物質で汚染された汚染環境から取得した微生物に、前記汚染物質の分解活性を発現させるための外来遺伝子を導入して形質転換することを特徴とする環境汚染修復用形質転換体の製造方法。
【請求項２】
前記外来遺伝子がフェノール分解活性の発現のためのものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記外来遺伝子が有機塩素系化合物分解活性の発現のためのものである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記有機塩素系化合物が、トリクロロエチレンである請求項３に記載の環境修復方法。
【請求項５】
前記外来遺伝子が、シュードモナス・セパシア ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）から分離したものである請求項２〜４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記汚染環境が、土壌または水性環境である請求項１〜５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法で得られた形質転換体を、汚染環境に投与して、該汚染環境中の汚染物質を分解して修復することを特徴とする汚染環境の修復方法。
【請求項８】
修復対象の汚染環境が、土壌または水性環境である請求項７に記載の汚染環境の修復方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物を用いた汚染環境の修復方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
近年、様々な産業活動の進行に伴い、環境中に有害で難分解な化学物質が検出され、これらによる生態系に与える影響が懸念されている。したがってその汚染の拡大を防止していくと共に、汚染された環境を再生していく技術の確立が強く望まれている。
【０００３】
汚染は、湖沼・河川・海水・地下水・土壌など自然生態系そのもの、及びこれにつながる廃水・廃液の処理場、あるいは、ガス製造プラントサイト、製油所汚染土壌、石油精製所跡地、燃料基地跡地、パルプ工場跡地、半導体工場等の土壌など広範にわたっており、これらの汚染環境の修復に対するニーズは高く、なかでも、土壌の汚染は土地の再利用を妨げるばかりだけでなく、汚染物質が地下水に流れ込むことにより一層の汚染の拡大を引き起こす危険性があり、有効な汚染環境の修復のための技術の確立が求められている。
【０００４】
現在のところ広範囲に汚染が及ぶ環境の汚染修復の手段としてコスト、感度、操作性などを考慮すると微生物による分解に頼らざるを得ない状況である。例えば、汚染土壌の修復方法としては、土中より汚染物質を吸引する真空抽出法等があるが、コスト、感度、操作性、さらに土壌中ということを考慮すると微生物による分解が強く望まれている。
【０００５】
そこで、環境修復技術の一つとして、生態系中の微生物の機能を利用し汚染物質を分解・無公害化する技術が検討されており、これは生態系の自浄能力を強化することにより汚染物質の分解の促進を狙いとしている。さらに、この技術を一歩進め、汚染物質を分解する能力を保有する微生物を外部から汚染環境中に積極的に導入したり、微生物を分子生物学的に機能改変したりする試みがなされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現実に、環境汚染を引き起こしている難分解性化合物、例えば芳香族炭化水素や、有機塩素系化合物を微生物で分解し修復することは数多く行われている。より分解能力を高めるため、最近では汚染物質を分解する能力を保有する微生物を外部から積極的に導入したり、分解酵素系を組み込むなど分子生物学的処理を施した微生物の使用が試みられている。しかし、これらの方法は、外部から導入した微生物が理想的状況、もしくはその微生物の由来の環境では良く成育するものの新たな環境下では生残性が著しく劣るという点においてなお問題を有しており、実用的とはいえない。このように、せっかく微生物の汚染物質の分解能が高められても、環境に投与した微生物が生き延びることができなければその能力は発揮されない。
【０００７】
そこで、これら微生物の分解能力をより有効に使うため、新たな環境中において投与微生物の生存／増殖を促進する技術の開発が求められている。
【０００８】
本発明の目的は、より効果的な環境修復方法、例えば分子生物学的処理を施した微生物が環境中に既に存在する菌に淘汰されることなく新たな環境中で生残できる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、汚染物質で汚染された汚染環境から取得した微生物に、前記汚染物質の分解活性の発現のための外来遺伝子を導入して形質転換して環境汚染修復用形質転換体を取得し、この形質転換体を汚染環境に投与することで汚染環境の修復が行われる。
【００１０】
一般に、自然界においては、既に環境にある微生物が一番その環境に適合しており、外部から導入して菌がその環境に適合し生き残る可能性は低い。また、逆に外部から導入する菌が非常に強い菌であったりすると、これが既にそこに存在した微生物などから構成される菌相（分布）を変えてしまったり、生態系をかき乱してしまう危険性がないわけではない。そこで、既にそこに存在する微生物（土着菌）を分子生物学的処理の宿主として用いるのが、環境に対する親和性、生残性、安全性の面からも優れている。
【００１１】
分子生物学的処理を施す微生物（宿主）は分解対象としての汚染物質で汚染されている環境、例えば河川、湖沼、地下水、海水等の水性環境や、土壌環境から採集すれば良く、採取した状態のものをそのまま用いても良いし、集積しても良く、場合によっては培養してから用いても良い。土壌や水から微生物を分離したり、単離せずに、環境中の物質（例えば、水、土壌粒子、微生物の死骸など）の物質と混在した状態で用いてもよい。また、複数種の微生物が混在したものをそのまま用いても良く、あるいは環境中で形成されている微生物共生系をそのまま維持した形で用いることもできる。
【００１２】
導入の仕方としては、外来遺伝子を宿主に入れ込む方法なら如何なる方法でも良いが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレション法など公知の方法が利用できる。
【００１３】
得られた形質転換体の環境への投与方法としては、そのまま微生物を環境中に放出しても良いが、担体と共に導入する、担体に固定化して投与するなど環境の状況に合わせて適宜選択すれば良い。用いる担体や固定化方法としては公知の方法が利用できる。土壌や地下水中への適用方法としては、例えば、上記の方法で得られた形質転換体を、必要に応じて適当な担体に担持させて、土壌に掘削した井戸孔より土壌内や土壌中の地下水中に拡散させる方法などが利用できる。
【００１４】
汚染物質の分解活性の発現のための外来遺伝子とは、宿主にとって外来のもので、汚染物質の分解に関与する酵素系を構成する酵素の遺伝子あるいは遺伝子群であり、該酵素系の発現を増幅する作用のある遺伝子あるいは該酵素系の活性を高める作用のある物質を発現するための遺伝子などがこれに含まれていても良い。このような外来遺伝子としては、例えばフェノール、及びトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素系化合物の分解に関与するシュードモナス属、アシネトバクター属、キサントバクター属に属する細菌で、特にシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・アルギノーザ等が有効であり、例えばシュードモナス・プチダＢＨ株、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）ＫＫ０１株等に由来する所望の機能を発現させるための遺伝子等を用いることができる。なお、上記のＫＫ０１株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｅｐａｃｉａ−ＫＫ０１として、平成４年３月１１日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在の生命工学工業技術研究所）に寄託（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１２８６９）され、平成５年３月９日付で国際寄託に変更（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）されたものである。  環境に投与する形質転換体の量の一例を示せば、土壌中では１０４〜１０７個（菌体）／ｇ（土壌）程度であるが、土壌中の環境、例えば栄養状態等によって投与量を選択すると良い。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００１６】
実施例１（組換えプラスミドの調製）
（１）ｐＵＣＫ０１等の調製
フェノール及び有機塩素系化合物を分解する菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）の全ＤＮＡを常法に従って調製し、制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＰｓｔ  Ｉ  での部分消化を行った。得られた種々の長さのＤＮＡ断片の混合物と、Ｂａｍ  ＨＩとＰｓｔ  ＩでプラスミドｐＵＣ１９を消化して得たＤＮＡ断片とをリガーゼの存在下で常法により反応させた。得られた反応混合物をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入し、フェノール２００ｐｐｍ及び１．２％寒天を含む下記組成のＭ９からなる寒天培地に均等に塗布し３７℃で７２時間培養した。寒天培地上に現れたコロニーのうち、フェノールの分解により周辺が黄変したコロニーから釣菌し、３７℃で酵母エキス液体培地（Ｍ９＋０．０５％酵母エキス）で培養した。
Ｍ９組成（１リットル中）；
Ｎａ２ＨＰＯ４      ６．２ｇ
ＫＨ２ＰＯ４        ３．０ｇ
ＮａＣｌ          ０．５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ          １．０ｇ
水                残部
（ｐＨ７．０）
このフェノール分解活性を獲得した形質転換体（トランスフォーマント）をＪＭＫ０１とし、そのフェノール分解能をフェノールを含む培地（１００ｐｐｍフェノール、０．０５％酵母エキス、Ｍ９）で培養して培地中のフェノールの残存量を分光光度計で測定することで確かめた後、その培養菌体からプラスミドを常法により調製し、ｐＵＣＫＯ１とした。
【００１７】
さらに、ｐＵＣＫ０１を制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで部分消化して得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＹＥ  ｕｒａ及びλＹＥＳ（いずれもＴＯＹＯＢＯ）のＥｃｏ  ＲＩサイトにそれぞれ挿入し、得られた組換えプラスミドを、それぞれｐＨＹＫ０１、ｐＹＥＫ０１及びλＹＥＳＫ０１とした。
【００１８】
この３種のプラスミドを個々に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を常法により形質転換し、形質転換体ＪＴＨＹＫ０１（ｐＨＹＫ０１を有する）、ＪＴＹＥＫ０１（ｐＹＥＫ０１を有する）及びＪＴλＫ０１（λＹＥＳＫ０１を有する）の３種を得た。
【００１９】
また、バイアル瓶に１５ｍｌの培地（１５ｐｐｍ  ＴＣＥ、０．０５％酵母エキス、Ｍ９、１００ｐｐｍフェノール）を入れ、これに先の形質転換体ＪＭＫ０１の培養液の０．１ｍｌを接種した後ブチルゴム栓で完全に密封し、３０℃で更に培養を行った。ＴＣＥ量をガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により定量し、形質転換体ＪＭＫ０１がＴＣＥ分解能をも獲得したものであることを確かめた。
（２）ｐＵＣＫ０１’等の調製
ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）の全ＤＮＡを常法にしたがい調製し、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで部分消化を行った。得られた種々の長さのＤＮＡ断片の混合物と、Ｅｃｏ  ＲＩでプラスミドｐＵＣ１９を消化して得たＤＮＡ断片とを、ＢＡＰ処理後にリガーゼの存在下で常法により反応させ、得られた反応混合液をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に導入した。
【００２０】
次に、これを２００ｐｐｍフェノールを含む１．２％寒天からなるＬＢ寒天培地に均等に塗布し３７℃で７２時間培養した。現れたコロニーのうち、周辺が黄変したコロニー（フェノールが分解）から釣菌し３７℃で（１）で用いた酵母エキス液体培地で培養し、フェノール分解の酵素系を持つ形質転換体ＪＭ２Ｋ０１とした。この形質転換体を増殖させ、得られた菌体からプラスミドを調製し、ｐＵＣＫ０１’とした。このプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで部分消化し得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＹＥ  ｕｒａ及びλＹＥＳ（いずれもＴＯＹＯＢＯ）のＥｃｏ  ＲＩサイトにそれぞれ挿入し、得られた組換えプラスミドを、それぞれｐＨＹＫ０１’、ｐＹＥＫ０１’及びλＹＥＳＫ０１’とした。
【００２１】
実施例２（土壌）
（１）土壌菌への遺伝子の導入（塩化カルシウム法）
フェノールで２０年間にわたって汚染された日本の関東の汚染土壌から１０ｇ土壌をサンプリングし、これに１００ｐｐｍフェノール溶液を１０ｃｃ加え３０℃で２４時間培養した後、１５ｃｃの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１００ｍＭＣａＣｌ２含有）溶液を加え、氷浴中で１０分間冷却した。これに実施例１の（１）で得たプラスミドｐＵＣＫ０１（１ｍｇ）を加え、さらに３０分間氷浴中に放置した。その後、この混合物に４２℃で２分間のヒートショックを与え、その全量を１００ｐｐｍフェノール溶液１００ｃｃに加え、３０℃で２４時間培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地での培養（３０℃）によるスケールアップ（培養液（菌体を含む）のＯ．Ｄ．６６０が０．４程度になるまで培養したところで培養液の量を１０倍に増量し、更に培養液のＯ．Ｄ．６６０が０．４になるなで培養を行うステップを所望の回数行い、所望の培溶液量までスケールアップする。以下の各例においても同様）を行い、以下に示すモデル土壌槽に導入した。
（３）モデル土壌槽での実施
フェノールで２０年間にわたって汚染された日本の関東の土壌を、攪乱を最小限に抑えるようにサンプリングし、２ｍ四方、深さ１ｍのモデル土壌槽に充填し密封状態にして１ケ月放置した。
【００２２】
この土壌槽の土壌表面領域に、先にスケールアップした微生物溶液（菌体濃度Ｏ．Ｄ．６６０＝０．８）を５リットル／日の割合でまんべんなく散布・攪拌した。微生物溶液接種の第１日目から１０日毎に土壌を掘削して、５ケ所からそれぞれ１０ｇの土壌サンプルを取り出し、この試験土壌中のフェノール濃度をＨＰＬＣで定量し、フェノールの除去率を求めた。この結果を図１に示す。
【００２３】
比較例１
微生物溶液を接種せずに、１日１回攪拌のみを行なう以外は実施例２と同様にして、フェノールの濃度変化（除去率）を求めた。結果を図１に示す。
【００２４】
比較例２
実施例１で得た形質転換体ＪＭＫＯ１の微生物溶液を用いる以外は、実施例２と同様にしてフェノールの濃度変化（除去率）を求めた。結果を図１に示す。
【００２５】
実施例３（土壌）
（１）土壌菌への遺伝子の導入（エレクトロポーレション法）
フェノールで２０年間にわたって汚染された日本の関東の汚染土壌から５ｇ土壌をサンプリングし、これにＰＢＳ（１Ｌ中、８．０ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、２．９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４）１０ｃｃを加えてから、エレクトロポレーション用のジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）のキュベットチャンバー内に、実施例１の（２）で調製した３種の組換えプラスミドｐＨＹＫ０１’、ｐＹＥＫ０１’及びλＹＥＳＫ０１’の混合物（合計量０．０５ｍｇ；混合比１：１：１）と共に入れた。ピーク電圧５ｋＶ／ｃｍ、時定数３ｍｓｅｃでパルスを加えた。１０分間放置後、１００ｐｐｍフェノールを含むＰＢＳの５０ｃｃに加え、３０℃で２４時間培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地での培養（３０℃）で順次スケールアップを行い以下に示すモデル土壌槽に導入した。
（２）モデル土壌槽での実施
フェノールで２０年間にわたって汚染された日本の関東の土壌を、攪乱を最小限に抑えるようサンプリングし、２ｍ四方、深さ１ｍのモデル土壌槽に充填し密封状態にして１ケ月放置した。
【００２６】
この土壌槽の土壌表面領域に、先にスケールアップした微生物溶液（菌体濃度Ｏ．Ｄ．６６０＝０．８）を５リットル／日の割合でまんべんなく散布・攪拌した。微生物溶液接種第１日目から１０日毎に土壌を掘削して、５ケ所からそれぞれ１０ｇの土壌サンプルを取り出し、この試験土壌中のフェノール濃度をＨＰＬＣで定量し、土壌中のフェノールの除去率を求めた。この結果を図２に示す。
【００２７】
比較例３
微生物溶液を接種しない以外は実施例３と同様に土壌の処理を行い、フェノールの濃度変化（除去率）を求めた。結果を図２に示す。
【００２８】
実施例４（土壌）
（１）土壌菌への遺伝子の導入（塩化カルシウム法）
ＴＣＥで２０年間にわたって汚染された日本の関東の汚染土壌から１０ｇ土壌をサンプリングし、これに蒸留水を１０ｃｃを加え３０℃で２４時間培養した後、１５ｃｃの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１００ｍＭ  ＣａＣｌ２  を含む）溶液を加え、氷浴中で１０分間冷却した。これに先に実施例１の（１）で調製したプラスミドｐＵＣＫ０１（１ｍｇ）を加え、さらに３０分間氷浴中に放置した。その後、この土壌含有混合物に４２℃で２分間ヒートショックを行った後、その全量を０．０５％酵母エキスを含むＭ９培地１００ｃｃに加え  ３０℃で２４時間培養した後、同様の培養条件でのスケールアップを順次行い、以下に示すモデル土壌槽に導入した。
（２）モデル土壌槽での実施
ＴＣＥで２０年間にわたって汚染された日本の関東の土壌を、攪乱を最小限に抑えるようにサンプリングし、２ｍ四方、深さ１ｍのモデル土壌槽に充填し密封状態にして１ケ月放置した。
【００２９】
この土壌槽に、深さ２．５ｍ、直径５ｃｍの給水用ホールを槽の４隅にそれぞれ降ろし、それぞれのホールに、外径５ｃｍで先端１ｍの間に、直径０．５ｃｍの給水用ピットを多数設けた塩化ビニルパイプ４本を挿入し、土壌表面の挿入部のパイプ外周を粘土で密封して給水用ラインとした。さらに、直径５ｃｍの同様のパイプを土壌槽の中央部に給水用ラインと同様にして設置し吸引用ラインとした。給水用ラインを給水ポンプに接続し約０．５リットル／ｈｒで給水し、吸引用ラインをポンプに接続し約１リットル／ｈｒで吸引した。
【００３０】
先のスケールアップした微生物溶液（菌体濃度Ｏ．Ｄ．６６０＝０．８）を給水用ラインから土壌中に接種し、接種開始から１０日毎に給水ライン近傍の土壌を掘削して、５ケ所からそれぞれ１０ｇの土壌サンプルを取り出し、ＴＣＥ濃度をヘキサン抽出法とＥＣＤガスクロマトグラフィーによって測定し、ＴＣＥの除去率を求めた。この結果を図３に示す。
【００３１】
比較例４
実施例４で用いたのと同様の汚染土壌を充填した土壌槽をそのまま放置し、実施例４と同様にしてＴＣＥの濃度変化（除去率）を求めた。結果を図３に示す。
実施例５（水系）
（１）環境中の微生物への遺伝子の導入（エレクトロポーレション法）
フェノールを含む工場廃水の処理槽にある汚泥から１５ｇサンプリングを行い、これにＰＢＳ（１Ｌ中、８．０ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、２．９ｇＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４）１０ｃｃを加えから、エレクトロポレーション用のジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のキュペットチャンバー内に、実施例１の（１）で調製したｐＨＹＫ０１、ｐＹＥＫ０１及びλＹＥＳＫ０１の混合物（合計量０．０５ｍｇ；混合比１：１：１）と共に入れた。ピーク電圧５ｋＶ／ｃｍ、時定数３ｍｓｅｃでパルスを加えた。１０分間放置後、その全量を１００ｐｐｍフェノールを含むＰＢＳ５０ｃｃに加え、２４時間３０℃で培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地を用いた培養（３０℃）で順次スケールアップを行い、以下に示す分解実験に供した。
（２）分解実験
フェノールを含む工場廃水を５リットルとり、これに先にスケールアップした微生物溶液（菌体濃度Ｏ．Ｄ．６６０＝０．８）を１００ｍｌ加え２０℃で培養した。この溶液中のフェノール除去率を吸光度（２７０ｎｍ）から求めた。この結果を図４に示す。
【００３２】
比較例５
微生物溶液を添加しない以外は実施例５と同様にして工場廃水を２０℃で放置し、フェノール除去率を求めた。結果を図４に示す。
【００３３】
実施例６（水系）
（１）環境中の微生物への遺伝子の導入（エレクトロポーレション法）
ＴＥＣで２０年間にわたって汚染された日本の関東の汚染土壌の地下水を１００ｃｃサンプリングを行い、濾過により、１０ｃｃの微生物を含む液を得た。これにＰＢＳ（１Ｌ中、８．０ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、２．９ｇＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４）１０ｃｃ加えてから、エレクトロポレーション用のジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のキュペットチャンバー内に、実施例１の（１）で調製したプラスミドｐＵＣＫ０１、ｐＨＹＫ０１、ｐＹＥＫ０１及びλＹＥＳＫ０１の混合物（合計量０．０５ｍｇ；混合比１：１：１：１）と共に入れた。ピーク電圧５ｋＶ／ｃｍ、時定数３ｍｓｅｃでパルスを加た。１０分間放置後、１００ｐｐｍフェノールを含むＰＢＳ５０ｃｃに加え２４時間３０℃で培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地を用いた培養（３０℃）で順次スケールアップを行い５００ｃｃとし以下に示す分解実験に供した。
（２）分解実験
先にスケールアップした微生物溶液を軽く遠心し、集積した菌体を２０ｍｌ（Ｍ９、２０μｇ／ｍｌロイシン）に懸濁（菌体濃度Ｏ．Ｄ．６６０＝０．７）し、この懸濁液にアクリルアミドモノマー７．５ｇと架橋剤のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド４００ｍｇを水２４ｍｌに溶かした液に加えて混合した。この混液に８℃で重合促進剤として２５％β−ジメチルアミノプロピオニトリル１ｍｌ、重合開始剤として１％Ｋ２Ｓ２Ｏ８を５ｍｌ加え、よく混合して２０℃に保ち微生物固定化担体を得た。
【００３４】
こうして得られた固定化担体を粉砕し、ＴＣＥで汚染された地下水のサンプル１リットルに拡散させ、２５℃で静置培養し、ＴＣＥの除去率の変化をヘキサン抽出法とＥＣＤガスクロによって測定した。この結果を図５に示す。  比較例６実施例６で用いたＴＣＥで汚染された地下水を、微生物固定化担体を添加せずにそのまま２５℃で放置した際のＴＣＥ残存量（除去率）の変化を実施例５で記した方法で測定した。この結果を図５に示す。
【００３５】
実施例７（水系）
（１）環境中の微生物への遺伝子の導入（エレクトロポーレション法）
ＴＥＣで２０年間にわたって汚染された日本の関東の汚染土壌の地下水を１００ｃｃサンプリングを行い、濾過により微生物を集積して１０ｃｃの微生物含有溶液を得た。これにＰＢＳ（１Ｌ中、８．０ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、２．９ｇＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４）１０ｃｃを加えてから、エレクトロポレーション用のジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）のキュペットチャンバーに、実施例１の（１）で調製したプラスミドｐＵＣＫ０１、ｐＨＹＫＯ１、ｐＹＥＫＯ１及びλＹＥＳＫＯ１の混合物（合計量０．０５ｍｇ；混合比１：１：１：１）と共に入れた。ピーク電圧５ｋＶ／ｃｍ、時定数３ｍｓｅｃでパルスを加えた。１０分間放置後、１００ｐｐｍフェノールを含むＰＢＳの５０ｃｃに加え、２４時間３０℃で培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地での培養（３０℃）で順次スケールアップを行い５００ｃｃとし以下に示す分解実験に供した。このとき、微生物の成育を良くするため、３ｍｍ片角ポリウレタン約５０ｇを加えた。
（２）分解実験
先にスケールアップした微生物溶液の全量をポリウレタンごと、ＴＣＥで汚染された地下水のサンプル１リットルに拡散させ、２５℃で静置培養し、ＴＣＥの除去率の変化をヘキサン抽出法とＥＣＤガスクロによって測定した。この結果を図６に示す。
【００３６】
比較例７
実施例７で用いたＴＣＥで汚染された地下水を、微生物を添加せずにそのまま２５℃で放置した際のＴＣＥ除去率の変化を実施例７で記した方法で測定した。この結果を図５に示す。
【００３７】
比較例８
実施例１の（１）で得た形質転換体ＪＴＫ０１、ＪＹＫ０１、ＪＴＹＥＫ０１及びＪＴλＫ０１を１００ｐｐｍフェノールを含むＰＢＳの５０ｃｃに同量接種し、２４時間３０℃で培養した後、実施例１の（１）で用いた酵母エキス液体培地での培養（３０℃）で順次スケールアップを行い５００ｃｃとした。培養にあたっては、実施例７と同様に微生物の成育を良くするため、３ｍｍ片角ポリウレタン約５０ｇを培地に加えた。得られた混合微生物培養液の全量（ポリウレタンを含む）を実施例７で用いた汚染地下水１リットルに加え、実施例７と同様にＴＣＥ除去率の変化を求めた。結果を図６に示す。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、汚染物質分解活性を有する微生物（形質転換体）の遺伝子組換えによる形成のための宿主として汚染環境から取得した微生物を用いたので、得られた形質転換体は、安定的に環境中に存在でき、汚染物質の分解活性を有効に発揮でき、効果的な環境修復が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２、比較例１及び比較例２で得られた土壌中のフェノール除去率の変化を示す図である。
【図２】実施例３、比較例３で得られた土壌中のフェノール除去率の変化を示す図である。
【図３】実施例４、比較例４で得られた土壌中のＴＣＥ除去率の変化を示す図である。
【図４】実施例５、比較例５で得られた土壌中のフェノール除去率の変化を示す図である。
【図５】実施例６、比較例６で得られた土壌中のＴＣＥ除去率の変化を示す図である。
【図６】実施例７、比較例７及び比較例８で得られた土壌中のＴＣＥ除去率の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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