(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
犬もしくは兎由来の血漿またはそのＶ因子含有フラクションおよびヒト血漿を含有することを特徴とする欠損凝固Ｖ因子検出のための試験法で使用するキャリブレータ。
【請求項２】
正常なヒト血漿で得られるのとは異なった結果を、Ｆ.Ｖ−依存またはＦ.Ｖａ−依存試験法で生じる種からの血漿を使用する請求項１記載のキャリブレータ。
【請求項３】
ＡＰＣ依存検定法で、犬もしくは兎由来の血漿が凝血時間の短縮または凝血時間と同等のパラメータの低減を生じる請求項１記載のキャリブレータ。
【請求項４】
犬もしくは兎由来のＶ因子を含むクエン酸添加血漿または血漿フラクションを使用する請求項１記載のキャリブレータ。
【請求項５】
ヒト血漿がヒトクエン酸添加血漿である請求項１〜４記載のキャリブレータ。
【請求項６】
ヒトクエン酸添加血漿に対する犬または兎のＶ因子含有添加物の濃度をキャリブレータの反応性が添加物なしのものと明確に異なるように選択する請求項１〜５記載のキャリブレータ。
【請求項７】
添加物を凝血時間が未反応ヒトクエン酸添加血漿で得られる凝血時間とは少なくとも２０％異なっているように選択される請求項６記載のキャリブレータ。
【請求項８】
添加物を凝血時間が未反応ヒトクエン酸添加血漿で得られる凝血時間とは少なくとも５０％異なっているように選択される請求項６記載のキャリブレータ。
【請求項９】
タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ系の機能効率を検査する凝固試験のための請求項１〜８記載のキャリブレータの使用。
【請求項１０】
Ｖａ因子を分解する活性化タンパク質Ｃの能力を検査する凝固試験のための請求項１〜８記載のキャリブレータの使用。
【請求項１１】
活性化タンパク質Ｃを外因により添加する請求項９記載の使用。
【請求項１２】
試料のタンパク質Ｃが活性化される請求項９記載の使用。
【請求項１３】
フィブリンクロットの形成により、そして（または）合成トロンビン基質の変換による色素形成により生成されるトロンビンの量を測定する凝固試験での請求項１〜８記載のキャリブレータの使用。
【請求項１４】
犬もしくは兎由来の血漿または犬もしくは兎由来の血漿からのＶ因子含有フラクションを添加することにより、ヒト血漿を補完する凝固検定法で使用する請求項１〜８記載のキャリブレータの製法。
【請求項１５】
犬もしくは兎由来の血漿が兎由来の血漿である請求項１〜８記載のキャリブレータ。
【請求項１６】
ヒト血漿またはある種の変異を示すヒトＶ因子の代替品としての犬もしくは兎由来の血漿または犬もしくは兎由来の血漿からのＶ因子含有フラクションの欠損凝固Ｖ因子検出のための試験法における使用。
【請求項１７】
変異ヒトＶ因子が、ヒト活性化タンパク質Ｃにより、開裂されていないか、またはゆるやかにのみ開裂されている請求項１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、活性化タンパク質ＣによるＶ因子の分解を検知する凝固試験でキャリブレータとして使用し得る血漿、かかる血漿の調製およびその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
第一に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組織に持続させることを確保するものであり；第二に、この系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによって生体の完全な状態を維持することを確保するものである。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロテアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビンの形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開裂により補因子Ｖ因子およびＶＩＩＩ因子をトロンビンが活性化するので、この形成はトロンビン自体により促進される。それぞれ、プロテアーゼＸａ因子およびＩＸａ因子と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵素／補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活性は個々のプロテアーゼの活性よりも約１０００の係数で高いものである。この正のフィードバック機序はほぼ爆発的に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には創傷閉鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固の拡大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症の誘起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、またプロテアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プロテアーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ阻害剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止はトロンビン自体で開始される。このためには、トロンビンは膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前駆体タンパク質Ｃを活性プロテアーゼタンパク質Ｃａ（ＡＰＣ）に変換する。ＡＰＣはその一部では補因子タンパク質Ｓと共に複合体を形成し、この複合体は活性補因子ＶＩＩＩａ因子およびＶａ因子をタンパク質分解で開裂し、それによって不活性化する。このようにしてＡＰＣはこれらの補因子がもたらす強力な促進効果を阻止する。
【０００３】
上述したタンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系は重要な抗凝血機序を表している。このことは、遺伝性または後天性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの欠乏または欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症に極めて罹りやすいと言う事実によって確認された（Ｅｓｍｏｎ，  Ｃ．Ｔ．  ＴＣＭ  ２：  ２１４−２１９，  １９９２年）。
タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓに加えて、その他の因子も系の活性に対して影響を及ぼすことができる。これらの因子にはフォン・ヴィレブランド因子および因子ＩＸａ（Ｒｉｃｋ，  Ｍ．Ｅ．  等，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １１５：  ４１５−４２１，  １９９０年）が含まれ、これらの因子は因子ＶＩＩＩａをタンパク質分解による分解から防護することができる。
【０００４】
後天性欠損はまたルプス抗凝血剤（Ｌｕｐｕｓ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）の形成に因ることもある。これらは、りん脂質に対向し、かつプロテアーゼ／補因子複合体のりん脂質表面への結合（適切な機能のために必要である）を阻害する抗体である（Ａｍｅｒ，  Ｌ．  等，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  ５７巻，  ２４７−２５８頁，  １９９０年）。
最後に、Ｖ因子の変異体はごく最近に報告され、このものは最早ＡＰＣで不活性化され得ないか、または少なくともごく低い程度で不活性化され得るだけである（Ｂｅｒｔｉｎａ，  Ｒ．Ｍ．  等，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９巻，  ６４−６７頁，  １９９４年）。
【０００５】
タンパク質Ｃ自体を除いて、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系に対するこのような阻害は通常のスクリーニング法（Ａｍｅｒ，  Ｌ．  等，  １９９０年）の変法、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の変法（この変法を以下ＡＰＣ時間（ＡＰＣＴ）と称する）を用いて診断学上比較的容易に検出することができる。ＡＰＴＴを測定するためには、血漿試料を例えばシリカ、カオリンまたはガラスのような界面活性剤を含む試薬およびりん脂質の等容量と接触させる。この混合物を２、３分間＋３７℃でインキュベートする。この間に、カルシウム依存ではない凝固系の因子（ＸＩＩ因子、  ＸＩ因子およびＩＸ因子）が活性化される。カルシウムイオンを加えた後、凝固カスケードの残りが活性化され、トロンビンが形成される。生成するトロンビン量を、天然基質フィブリノーゲンがクロットに変換されることによるか、または色素形成基質からの発色団の遊離により、測定する。このＡＰＴＴからＡＰＣＴへの変更は、カルシウムイオンと同時に活性化タンパク質Ｃを添加することを伴っている。上述の如く、ＡＰＣはＶＩＩＩａおよびＶａ補因子を破壊するので、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ系の機能効率に依存しているトロンビンの形成に減速が生じてくる。
【０００６】
凝固診断薬において、結果を標準の百分率によって対照標準曲線から評価するのが通例である。この関係で、健康な血液供給者からの血漿のプールを１００％の値とし、一方追加の較正点は通常生理食塩水でこのプールを希釈したものを用いてプロットする。しかし、このようなアプローチはＡＰＣＴの較正には適当ではない。その理由は、血漿の希釈は凝血時間を延長させるからである（実施例１参照）；しかしながら、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の機能効率を測定する試験では、病理試料の凝血時間が延長される程度は、試料の凝固活性が不十分に抑制されているために、左程に大きいものではない。
【０００７】
較正を実施するためには、正常な血漿（１００％値）を検討すべき因子を除いておいた血漿と混合するのが凝固診断薬で通常のことでもある。この方法はまた実施例１で実証するようにＡＰＣＴの較正には適していない。Ｂｅｒｔｉｎａ等の研究（１９９４年）が明らかにしているように、Ｖ因子の変異は不適切に長いＡＰＣＴの重要な原因である。Ｖ因子欠損血漿は使用し得ない。その理由はこの血漿は該因子の欠損のためにＡＰＴＴまたはＡＰＣＴで事実上凝固し得ないからである。
理論上は、罹患患者の血液からキャリブレータが得られることも考えられる。しかし、このアプローチは倫理上および技術上の理由から実行可能ではない。
変異凝固因子によるその他の凝固障害についても同じような考え方が適用できる。
【０００８】
【課題解決のための手段】
従って、本発明の基本的な目的は、罹患患者からの血液供給とは無関係に調製することができるキャリブレータを見い出すところにある。
この目的は特許請求の範囲に記載の態様を提供することにより達成される。
意外にも、ヒト血漿にある種の動物血漿を添加すると濃度依存様式でＡＰＣＴでの凝血時間が短縮されることが見い出された（実施例２参照）。この知見は、多くの動物血漿はヒト血漿よりも著しく高い含量でＶ因子を有していることが知られている（Ｋａｒｇｅｓ  等，  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  ４４巻，  ７９３−７９７頁，  １９９４年）ので、なお一層意外なことである。従って、変異Ｖ因子を含む血漿にヒト以外の血漿を添加すると、変異Ｖ因子は添加Ｖ因子で遮蔽されているので、短縮ＡＰＣＴを無効としてしまうと予想されていた。しかしながら、正確には反対の効果が認められた（実施例３参照）。得られることがわかった効果は、おそらくは試験に用いたヒト活性化タンパク質Ｃはヒト以外の凝固因子をタンパク質分解での開裂をなし得ないことによるものである。
【０００９】
従来から、当業者にとって、動物血漿Ｖ因子は既知の前凝固試験法でヒトＶ因子の如く挙動することが知られていた。従って、動物Ｖ因子もまたＡＰＣＴ試験でヒトＶ因子に相当する様式で挙動すると予測されていた筈である。意外にも、更に研究の結果、検討した様々の動物種の血漿は、本発明のキャリブレータでの使用適合性が異なっていることが明らかとなった。本発明の教示により、凝血時間の短縮を示すＡＰＣＴ測定に使用するのに適当な血漿との適合性は簡単な実験によって定めることができる。兎および犬からの血漿またはＶ因子が特に適当であることがわかったが、一方例えば馬の血漿は左程適切ではない。
【００１０】
動物Ｖ因子製剤は、動物血漿の形態、強化または精製Ｖ因子フラクションの形態または遺伝子操作で製造した純粋なＶ因子の形態で好適に使用される。兎および犬の血漿が特に適当である。
それで、Ｖ因子および（または）タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の機能効率を検討するための機能試験でＶ因子の欠損に擬せられているキャリブレータは、ヒト血漿に前述のヒト以外の血漿またはヒト以外の起源のＶ因子を含むフラクションを添加することによって調製することができる。
【００１１】
【実施例】
次の実施例は本発明を具体的に説明するためのものである。
以下の略称を使用する。
ＡＰＣＴ      活性化タンパク質Ｃ時間
ＡＰＴＴ      活性化部分トロンボプラスチン時間
ＤＢＡ        ジエチルバルビツール酸アセテート
Ｆ．Ｖ．−Ｄｅｆ．    Ｖ因子変異を有するヒト血漿
ＳＨＰ        標準ヒト血漿
【００１２】
実施例１
健康血液供給者からの血漿プールの希釈によるキャリブレータの調製
凝固時間をＳｃｈｎｉｔｇｅｒ  ＆  Ｇｒｏｓｓ機械コアグロメータ（Ａｍｅｌｕｎｇｅｎから入手）を用いて測定した。試薬はすべてＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  Ａ．Ｇ．から入手した。標準ヒト血漿を健康血液供給者からの血漿プールとして用いた。
ＡＰＴＴは次のプロトコールに従って測定した。ヒト胎盤から得られたりん脂質５ｍｌについて、Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）  １バイアルを界面活性剤としてカオリンの懸濁液５ｍｌに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５ｍＭ）を使用前＋３７℃に加温した。
【００１３】
次のものを測定管に連続して注入した。
Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）  １００μｌ
血漿試料          １００μｌ
混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、塩化カルシウム溶液１００μｌを加えて凝固時間が開始した。同時に、内蔵ストップウオッチのスイッチを入れ、凝固が検出されるまでの経過時間を記録した。
ＡＰＣＴは、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅから入手したＡＰＣ感作試薬を用いて測定した。ＡＰＴＴについての活性化試薬を調製した。出発試薬は塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Ｃからなり、これを蒸留水５ｍｌに溶解し、使用前に＋３７℃に加温した。
【００１４】
次のものを測定管に連続して注入した。
Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）  １００μｌ
血漿試料        １００μｌ
混合物を３分間＋３７℃で培養し、出発試薬１００μｌを加えて凝固時間が開始した。同時に、内蔵ストップウオッチのスイッチを入れ、凝固が検出されるまでの経過時間を記録した。
生理食塩水またはＤＢＡ緩衝液（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅから入手）を用いて、ＳＨＰを種々の濃度に希釈し、ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴを測定した。表１から、ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴ共に使用した培地とは関係なく血漿の希釈を増大するにつれて増大していることがわかる。従って、この方法は正常な血漿よりも短いＡＰＣＴを有するキャリブレータの調製には適当ではない。
【００１５】
【表１】
0003600667.tif 000002
【００１６】
実施例２
ヒト血漿にヒト以外の血漿を添加することによるキャリブレータの調製
凝固時間を実施例１に記載の如く測定した。
表２に、正常ヒトクエン酸添加血漿（ＳＨＰ）を兎クエン酸添加血漿または犬クエン酸添加血漿と混合したときに得られる凝固時間（二回測定の平均値）をまとめた。混合物のＡＰＣＴはヒト以外の血漿の比率が増大するにつれて短くなることがわかる。兎血漿の効果は、犬の血漿よりも明らかに顕著なものである。それで、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の欠陥は、ヒト血漿に小量のヒト以外の血漿を加えることにより、ＡＰＣＴに擬することができる。従って、この方法は、適切に定められたキャリブレータを調製するのに適切である。
【００１７】
【表２】
0003600667.tif 000003
【００１８】
実施例３
Ｖ因子遺伝子に欠陥を有するヒト血漿に対してヒトおよびヒト以外の血漿を加えることによる効果
凝固時間は実施例１に記載の如く測定した。
正常血漿（ＳＨＰ：実施例１参照）および兎クエン酸添加血漿を、ＡＰＣがかろうじて不活性化することができるＶ因子を含むヒト血漿と様々の濃度で混和し、ＡＰＣＴに対する効果をモニターした（表３）。予想通り、過剰の正常ヒト血漿は非分解性Ｖ因子の作用中性化をもたらし、それによりＡＰＣＴで一層長い凝固時間が観察される。対照的に、小量の兎血漿の添加でも、ＡＰＣＴの更に顕著な短縮が得られ、これはまた正常ヒト血漿でも実証されたとおりである。
【００１９】
【表３】
0003600667.tif 000004