(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体から第１および第２の粒子を分離するダイエレクトロホリティクによる分離装置装置であって、
チャンバと、
該チャンバ内に設置された一連の分離された電極と、
該電極の付近の各々の領域で異なる周波数のダイエレクトロホリティク・フィールドを発生するために、異なる周波数の電気的入力を個々の電極に供給する手段と、
を備える該ダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項２】
前記供給する手段が、異なる周波数を各々の電極に同時に供給し、異なるダイエレクトロホリティク・フィールドを同時に発生することを特徴とする請求項１に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項３】
前記一連の分離された電極が電極のサブグループからなり、前記供給する手段が異なる周波数を該電極の異なるグループ間に供給することを特徴とする請求項１または２に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項４】
流体から第１および第２の粒子を分離するダイエレクトロホリティクによる分離方法であって、
１）粒子を含む前記流体を、一連の分離した電極の表面上を通過させるステップと、
２）異なる周波数の電気的入力を各々の該電極に供給し、該電極の付近の各々の領域で異なる周波数のダイエレクトロホリティク・フィールドを発生させるステップと、
を備える該ダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項５】
前記異なる周波数の電気的入力が同時に供給され、異なるダイエレクトロホリティク・フィールドを同時に発生することを特徴とする請求項４に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項６】
前記一連の分離された電極が電極のサブグループからなり、前記異なる周波数の電気的入力が該電極の異なるグループの間に供給されることを特徴とする請求項４または５に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項７】
流体から第１および第２の粒子を分離するダイエレクトロホリティクによる分離装置であって、
チャンバを形成するハウジングであり、該ハウジングの上に入り口、第１の出口、第２の出口が形成され、該入り口、第１の出口、第２の出口は該チャンバと連絡している該ハウジングと、
該ハウジングによって形成された該チャンバの内部に設置された第１の電極配列と第２の電極配列と、
該入り口に該流体を供給し、かつ第１及び第２の出口から該流体を除去することによって、該チャンバの内部において流体の流動を起こさせる流体流動系と、
該第１と第２の電極配列に接続され、該第１と第２の電極配列の間にダイエレクトロホリティク・フィールドを形成することによって、該第１の粒子に第１の合力を加える周波数発生手段と、
該ダイエレクトロホリティク・フィールドを変えて該第２の粒子に第２の合力を加える手段を有し、該周波数発生手段と該流体流動系とを制御し、該第１の合力を該第１の粒子に加えながら、該第１の出口から該流体をとり除く制御手段と、
から成る該ダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項８】
前記流体流動系が、
流体搬送通路を形成する、前記入り口を介して前記ハウジングに接続された導管と、
該導管を介して該入り口に前記流体が供給されるように該導管に接続された圧力源と、
を有することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項９】
前記流体流動系が、
前記第１の出口を介して前記ハウジングに接続された導管と、
前記第２の出口を介して該ハウジングに接続された導管と、
これらの導管のいづれかに設置された少なくともひとつの弁と、
を更に有することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１０】
前記流体流動系が更に重力送りを含むことを特徴とする請求項７乃至９のいずれかに記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１１】
前記流体流動系が更にポンプを有することを特徴とする請求項７乃至９のいずれかに記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１２】
前記流体流動系が、
前記第１の出口を介して前記ハウジングに接続された第１の流体搬送通路を形成する導管と、
前記第２の出口を介して該ハウジングに接続された第２の流体搬送通路を形成する導管と、
これらの導管のいづれかに設置された少なくともひとつの弁と、を更に有し、
前記制御手段が、前記ダイエレクトロホリティク・フィールドと、該少なくともひとつの弁と、前記圧力源とを同期して作動させるマイクロプロセッサーとを有する、
ことを特徴とする請求項８に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１３】
前記第１電極配列と第２電極配列とのそれぞれが電極のサブグループから成り、
前記制御手段は、該第１電極配列の該サブグループと該第２電極配列の該サブグループとが周期的に作動されるよう前記周波数発生手段を制御することを特徴とする請求項８に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１４】
前記第１の電極配列と前記第２の電極配列の隣り合う電極間の電位差を可変させる手段を更に有することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１５】
前記第１の電極配列と前記第２の電極配列の隣り合う電極間に供給される電圧の周波数を可変させる手段を更に有することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１６】
前記第１の電極配列と前記第２の電極配列が、城壁状のインターディジタル構造の電極であることを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１７】
前記第１の粒子と前記第２の粒子の一方が生きた細胞で、他方が死んだ細胞であり、前記装置が該生きた細胞と該死んだ細胞とを分離することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１８】
前記第１の電極配列と前記第２の電極配列との少なくとも一方が、極性が変化するように制御される電気エネルギー源への接続用の電気接点と、
前記チャンバの内部において使用される表層と、
を有することを特徴とする請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項１９】
前記第１の電極配列と前記第２の電極配列との少なくとも一方が、化学反応の促進か抑制の少なくともいづれかを行う物質によって被覆されいることを特徴する請求項７に記載のダイエレクトロホリティクによる分離装置。
【請求項２０】
流体から第１および第２の粒子を分離するダイエレクトロホリティクによる分離方法において、該方法は、
ハウジングによって形成されるチャンバの中に、該第１の種類の粒子と該第２の種類の粒子とを含む流体を流し込むステップであって、該チャンバの内部には第１の電極配列と第２の電極配列とが設置され、該ハウジングは第１の入り口と、第２の入り口と、第三の入り口と、第１の出口と、第２の出口とが形成され、該流体は該第１の入り口を通って該チャンバの中に流れ込む該ステップと、
電源を始動させて、該第１の電極配列と該第２の電極配列との間にダイエレクトロホリティク・フィールドを形成し、それによって該第１の種類の粒子に第１の合力を加え、及び該第１の種類及び該第２の種類の粒子のいづれも含まない第２の流体を該第２の入り口を通して流し、該第２の種類の粒子を第１の方向に移動させ、該第２の流体が該第１の出口を通して該チャンバから流出するステップと、
該電源を制止し、該第２の流体を該第三の入り口を通して流し、該第１の種類の粒子と該第２の種類の粒子とを第２の方向に移動させるステップであって、該第２の方向は該第１の方向と反対の方向であって、該第２の流体が該第２の出口を通って該チャンバから流出するステップと、
該電源からの電力を再び加えて、該第１の電極配列と該第２の電極配列との間に該ダイエレクトロホリティク・フィールドを再形成し、及び該第２の流体と該第２の入り口を通して流し、該第２の種類の粒子を該第１の方向に移動させ、該第２の流体が該第１の出口を通って該チャンバから流出するステップと、
から成るダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項２１】
前記流体は第１のポンプの作用により前記第１の入り口から前記チャンバの中に流れ込み、該流体は第２のポンプの作用により前記第２の入り口から該チャンバの中に流れ込み、該流体は第三のポンプの作用により前記第三の入り口より該チャンバの中に流れ込むことを更に含むことを特徴とする請求項20に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項２２】
前記第１の電極配列及び前記第２の電極配列のそれぞれが電極のサブグループから成り、該第１電極配列の該サブグループと該第２電極配列の該サブグループを周期的に作動させることによって前記ダイエレクトロホリティク・フィールドを変えることを更に含むことを特徴とする請求項20または21に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項２３】
前記流体が前記チャンバを流れるとき、該流体を圧力源を使って該チャンバを通すことによって該流れが引き起こされることを更に含むことを特徴とする請求項21に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項２４】
前記第２の種類の粒子と前記第１の種類の粒子の分離を促進するため、該第１の種類の粒子と該第２の種類の粒子が前記チャンバの中に入ったとき、及び入る前のいづれかに、該第１の種類の粒子と該第２の種類の粒子の少なくとも一方に標識付けをするステップを更に含むことを特徴とする請求項20に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【請求項２５】
前記標識付けのステップでは、金を使って前記第１の種類の粒子と前記第２の種類の粒子の少なくとも一方に標識を付けることを特徴とする請求項24に記載のダイエレクトロホリティクによる分離方法。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、セパレータにおける改善に関し、特にダイエレクトロホリティク（dielectrophoretic）分離装置における改善に関する。
（背景技術）
ダイエレクトロホリティク分離装置は、不均等なDCまたはAC電界内の物質がダイエレクトロホリティク（DEP）力を受ける現象に依存している。この（DEP）力は、気体、液体、固体あるいは溶液に分解される物質を電場中に移動させる。
DEP電界は、異なる物質に異なる効果を持ち得る。この効果は、通常は懸濁状態の固体である物質を分析の目的のため液体から濾過あるいは分離するために用いられてきた。
Gascoyne、Huang等によりなされ、「Meas.Sci.Technol.3（1992）」439乃至445ページに報告された研究は、哺乳動物の細胞の混合ポピュレーションの分離、特に正常な血液細胞から白血病細胞の分離を記載している。しかし、分離は電極上で局部的に行われたに過ぎない。
Pethig、Huang等の「J.Phys.D  Appl.Phys.24（1992）」881乃至888における別の研究は、インターディジタル城郭状の（interdigitated,castellated）微小電極を用いて、コロイド粒子の正および負の誘電伝達収集のための装置について記載している。記載されたこの装置は、コロイド懸濁液を局部的に分離することを可能にする。しかし、コロイドが懸濁された液体からのコロイドの恒久的分離は不可能であった。
米国特許第4,390,403号（Batchelder）は、核種（species）を濾過するための装置について記載し請求している。この特許は、DC不均等電界を用いて、化学物質の核種間の化学的反応を促進するため多重電極チャンバ内の１つ以上の化学物質を操作する方法について記載する。
ドイツ国公開特許出願第4127405号は、顕微鏡的粒子の連続的な分離のための装置について記載するとされる。この装置は、セパレータ内部の従来のドリフトの問題を克服したと記載される。この装置は、高周波の移動電磁波を、それ自体が前記の電極列から電気的に絶縁される２つの別の電極間に配置される電極列間に印加することによって、この問題を克服したとされる。この２つの別の電極（図１における５および６）は、相互に略々平行に配置される。前掲のドイツ国公開特許出願の記載は、粒子に対する電気泳動の故に存在する「別の力フィールド」に触れている。電気泳動（electrophoresis）は、荷電される粒子に依存する。本発明は、DEPのみを利用する。作用力の他の事例が記載されている。しかし、開示は、これらに関して有効であるとするほど充分に明瞭かつ完全ではないと見做される。
本発明は、液体でよい流体中の懸濁状態にある２つの物質の恒久的分離の問題の考察から生じた。
（発明の概要）
本発明の第１の特質によれば、流体から第１および第２の粒子を分離するための装置が提供され、その構成は
ｉ）流体が電極上に流れ、電極がフィルタ・チャンバ内に配置されるように、使用において第１および第２の粒子を保持する流体の経路内に配置される第１のグループおよび第２のグループの電極と、
ii）入口と、少なくとも１つの出口とを有するフィルタ・チャンバと、
iii）第１および第２のグループの電極間にダイエレクトロホリティク（dielectrophoretic）（DEP）フィールドを確立する手段と、
iv）第１の粒子が拘束されるように、結果として生じる力を粒子に働かせる電極間のDEPフィールド（field）と、
ｖ）第２の粒子を前記チャンバから選択的に除去する手段と
を含んでいる。
ダイエレクトロホリティク・フィールド（dielectrophoretic  field）を確立して第２の粒子をチャンバから選択的に除去する手段を付勢する制御手段が設けられることが望ましい。
この制御手段は、フィルタ・チャンバの各出口に配置され、各流体加圧手段によりこのチャンバカラ流体を排出させるように構成された１つ以上の弁を同期させる手段を含むことが望ましい。
前記フィールドの作用の変更は、電極に印加される信号の周波数を変化させることにより得られることが望ましい。異なる周波数は、異なる電極のグループまたはサブグループに同時に課すことができる。
ポンプまたは圧力供給源または重力でもよい流体加圧装置は、第２の粒子をチャンバの第２の出口に向けて押圧させる装置と関連して用いることができる。
流体加圧装置は、１つ以上のポンプを含むことが望ましい。望ましくは、ポンプは、チャンバの各出口に対して設けられる。更に望ましくは、各弁は、同期手段が第１の粒子を拘束するための第１のダイエレクトロホリティク・フィールドを確立すると同時に、チャンバの出口における弁を開いてチャンバ内の圧力をチャンバ外の圧力を越えさせるように、１つ以上のポンプと関連させられる。その結果、第２の粒子がチャンバから排出させられることになる。次に、制御手段は、弁を閉じて、チャンバ内の圧力をチャンバ外の圧力へ戻すことができる。その後、あるいは同時に、制御手段は第１の粒子を拘束するダイエレクトロホリティク・フィールドをオフにする。次いで、制御手段は、第２の弁および加圧手段を付勢して第１の粒子を出口に向けて押圧するが、この出口は第２の粒子が排出される出口と異なる出口であることが望ましい。次に、第１の粒子がチャンバから排出させられる。次いで、制御手段はこのシーケンスを周期的に反復する。制御手段は、チャンバ内の加圧を行うように弁を開き、あるいはポンプを付勢することができる。
本発明は、いわゆる移動波が生成されないという点においてドイツ国特許公開出願第4127405号に記載された装置とは異なっている。即ち、隣接する電極間または電極セット間で逐次あるいは周期的な切換えが存在しない。分離は、保持媒体の圧送が後に続くDEP電界による拘束の組合わせ作用によって達成される。
チャンバは、第２の粒子が重力の作用下でチャンバから除去されるように指向されている。第１の粒子は、全ての第２の粒子が除去された後にチャンバから除去される。これは、同じ出口を介して行われる。しかし、第１の粒子は、異なる出口を介して除去されることが望ましい。第１の粒子の除去を促すために別個の流体加圧装置を用いることもできる。
第１および第２の電極グループは、例えば、数対の別個の電極が存在するようにサブグループに細分割することもできる。これらの電極のサブグループの選択的な切換えは、電極のサブグループの隣接対の周期的な切換えを含む。これら対は、１つの切換えステップにおける１対の第２のメンバが以後の切換えステップにおける異なる対の第１のメンバとなるように重なってもよい。
第１の粒子は、これらが保持される流体により各電極に対して移動されることが望ましい。
用語「切換え」とは、隣接する電極および（または）電極のサブグループ間の電位差を変化させること、および（または）隣接する電極または電極サブグループ間で通常は液体である流体に流れる電流を変化させること、および（または）電圧および（または）電流の周波数を変化させることを含むことが理解される。
特に、電圧の周波数の変化が異なる物質に対する異なる誘電伝達力を生じることが発見されたので、電圧の周波数を変化させることが望ましい。即ち、液体中の懸濁に保持される２つの異なる物質ＡおよびＢが非常に異なって挙動し、粒子がおかれるDEPフィールド（電場）の印加の頻度に従って電気泳動の異なる大きさを受ける。
更にまた、隣接する電極のサブグループに接続される少なくとも１つの周波数発生器を直列に配置することにより、一方または両方の物質Ａ、Ｂを異なる時間間隔で異なる領域に選択的に吸引および（または）拘束するために、電極を周期的に切換えことが可能である。１つ以上のポンプをこの構成と組合わせて用いることができる。その結果は、「掃引」効果が得られることであり、これにより第１の粒子がチャンバの特定の出口に向けて押圧されるが第２の粒子はDEPフィールド内に保持される。このような構成は、１つの粒子または物質を２つ以上の粒子またはの混合物から分離するために用いることができる。
電極は、規則的な長手方向断面を持つことができ、形状は三角形、正弦波形、鋸歯形、あるいは方形でよい。隣接電極がインターディジタル形状で、方形の城郭状の断面を呈する。電極は、規則的な方形波の城郭形状プロフィールの形態である横方向周囲を持つように容易に形状とすることができる。対向（隣接）電極間のダイエレクトロホリティク・フィールドの選択的な切換えおよび変更は、異なる電極領域の周囲に物質の空間的な仕切りを生じる如きものである。電極はなるべくインターディジタル構造がよい。
ある形態の生細胞は、同じ種類の死細胞が受けるものとは異なるDEP力（DEP  force）を受ける。同様に、正常な細胞とガン細胞とは、同じDEPフィールドにおいて異なるDEP力を受ける。DEP力の大きさは、下記の如き細胞構造の物理的特性、即ち、イオン成分の濃度および移動度の如きに依存する。また、異なる形態のタンパク質および染色体が異なるDEP作用力を受けることも観察され、本発明はこれらを分離するために使用することができる。
事例としてのみ、また明瞭にする目的のため、本明細書の残部では、生細胞とは粒子ＢまたはタイプＢと呼ばれ、死細胞は粒子ＡまたはタイプＡと呼ばれる。タイプＡおよびＢとは、粒子が先のように言及されるならば、第１のタイプおよび第２のタイプと類似であることが理解されよう。
本発明の特定の一実施例における前記の空間的分離は、粒子タイプＡの細胞質を略々「樋部（trough）」内の城郭状のインターディジタル電極の表面の各部、即ち、同じ電極の突起部間と電極頂部に累積させ、粒子タイプＢの細胞質の場合は対向（隣接）する電極の「頂部」間に累積させる。これらの累積は、それぞれ「三角形」または「ひし形」および「真珠の鎖」と対比されてきた。１つの構成においては、電極の「樋部」の周囲および電極頂部に累積する「三角形」または「ひし形」を構成する細胞質タイプＡは、他の細胞質タイプＢが電極の各部分に吸引された場合より略々弱い電極表面の当該部分に対する吸引を受けた。この理由は、２つのタイプの粒子に生じる誘電伝達作用力の大きさがの空間的分布の故であり、また粒子が正と負の誘電伝達作用のどちらを受けるかの故である。このことは、更に詳細に以降において章「理論」に関して記載される。
電極周囲のDEP力の上記の空間的分布の理解を助ける有効な類推は、１つの電極の表面に跨がるDEP作用力の空間的分布の全体図を略図的に示す３次元グラフを考えることである。電極の表面は、ｘ−ｙ面に投影される。この面内におけるある点に生じるダイエレクトロホリティク（DEP）・フィールド（電場）は、ｚ軸上に示される。このような面は、粒子ＡおよびＢが持つ相対的電位エネルギを考える上で有効である。この面は、「山」と深浅の「谷」の領域を規定することが判る。これは、図面の幾つかに関して以下に記載する。
粒子ＡおよびＢが同じ体積の球とするならば、電極の各部分に対するその相対的な吸引／反発作用力は、面ｚ＝０からの「山」の高さと「谷」の深さに比例する。どんなシステムもその最小エネルギ状態にあろうとするため、タイプＢ細胞がタイプＡ細胞よりも大きなDEP作用力を受ける、即ち、より深いDEPの「谷」内で「より強く」保持されることが判る。ある球は、深い側面の「谷」内で容易かつ迅速に累積しようとし、そこから離れまいとする。例えば、電極面に流れる溶液の場合。しかし、他の球は、比較的浅い谷に累積し、そこから比較的容易に離れ得る。
本発明の第２の特質によれば、流体から第１および第２の粒子を分離するための装置において使用される電極が提供され、その構成は、極性に変化するように制御される電気エネルギ源に接続される電気的接点と、フィルタ・チャンバで使用されるための表面とを含む。
電極は、少なくとも金またはプラチナの如き伝導率物質で被覆されあるいはこの物質から形成されることが望ましい。しかし、貴金属の如き他の適当に不活性の金属、あるいは不活性の非金属でも使用することができる。
本発明の更に別の特質によれば、流体から第１および第２のタイプの粒子を選択的に分離するための方法が提供され、その構成は
ｉ）少なくとも２つの電極の表面上に粒子を含む流体を通すこと、
ii）電極間に確立されたダイエレクトロホリティク・フィールドが第１のタイプの粒子を第２のタイプの粒子よりも大きな程度拘束することができるように電極を配置すること、およびこれにより
iii）第２のタイプの粒子が第１のタイプの粒子から分離されるように、第２のタイプの粒子を第１のタイプの粒子に対して移動させること
を含む。
（内部に電極が配置される）フィルタ・チャンバに対して１つ以上の出口を提供することにより、第１の出口を介して流体を除去することができ、この流体は第１のタイプ（Ａ）の粒子を含まない。第２のタイプ（Ｂ）の粒子を含まない流体は、第２の出口から除去される。
流体からの第１および第２のタイプの粒子の除去は、隣接する電極間の誘電伝達電界を切換えて、第２のタイプの粒子の移動が異なる方向に生じるが、第１のタイプの粒子の移動が１つの方向で生じるように選択的に圧送することによって強化される。これらの方法は、各出口の方向と同じであるが反対方向であることが望ましい。各タイプの粒子の除去は、ポンプ、シリンジその他の加圧装置を用いて、所要の方向の一方または両方で保持流体を圧送することによって強化される。チャンバは、粒子が所要の方向に重力によって圧送されるように指向される。
本発明および本発明を実施する方法を、例示としてのみ図面に関して次に記述する。
【図面の簡単な説明】
図１は、10MHzの印加電圧周波数に対する正の誘電伝達作用下の電極に集まる伝導率40mS.m-1の280mMのマンニトール（＃訳者註：マンニット）中に懸濁された生イースト細胞を示し、
図２は、10KHzの印加電圧周波数に対する負の誘電伝達作用下の電極から反発される同じマンニトール溶液中に懸濁された生イースト細胞を示し、
図３は、水性媒体中に懸濁されて正の誘電伝達作用を受ける半径が３μｍの粒子に対する時間的に平均された電位エネルギ・プロフィールを示し、
図４は、負のダイエレクトロホリティクを受ける同じ粒子に対する電位エネルギ・プロフィールを示し、
図５は、表面電荷密度ρの計算のため12要素内に含まれる675個のサブ領域に分割される電極の全体図、
図６は、インターディジタル構造電極の全体図、
図７は、電極綿上で3.5μｍ面内に置された水性媒体中に懸濁された３μｍ半径粒子に対する時間的に平均された電位エネルギ・プロフィールを示し、
図８は、負の誘電伝達の場合の同じ粒子および電極に対する電位エネルギ・プロフィールを示し、
図９および図10は、大きさが1.5pNの余分な横方向作用力の付加によりそれぞれ変更される図７および図８の電位エネルギ・プロフィールを示し、
図11は、セパレータ装置の一部の簡単な概略図、
図12は、図11のセパレータの全体的概略図であり、コンピュータの制御下の周波数発生器を示し、
図13a乃至図13dは、図11のセパレータの一部であるインターディジタル電極の平面図を類似の方法で略図的に示し、これら電極が２つのタイプの粒子ＡおよびＢを分けるためどのように使用されるかを示し、
図13aは、DEP電界が付勢される分離サイクルの初めを示し、
図13bは、DEP電界がタイプＢの粒子を強く保持する間流体の流れにより左方へ移動されるタイプＡの粒子を示し、
図13cは、DEPフィールドがオフにされ、流体の流れにより右方へ全ての粒子が移動される状態を示し、
図13dは、ダイエレクトロホリティク・フィールドが再び確立されて、タイプＢの粒子が強く保持される間タイプＡの粒子が左方へ移動される状態を示し、
図14aは、インターディジタル構造電極の一部の拡大平面図、
図14bは、インターディジタル構造電極対の各部の拡大平面図であり、電極の異なる部分の周囲の第１および第２の細胞タイプ（ＡおよびＢ）のグループ化を示し、
図15aは、隣接電極間の正のダイエレクトロホリティク・フィールド電位を表わす３次元面のグラフ、
図15bは、正のダイエレクトロホリティク・フィールドを表わす３次元面のグラフ、
図16aは、負のダイエレクトロホリティク・フィールド電位を表わす３次元面のグラフ、
図15bは、負のダイエレクトロホリティク・フィールド電位を表わす３次元面のグラフ、
図17は、正のダイエレクトロホリティクの電極エッジに沿った生存細胞と負のダイエレクトロホリティク下の中心における非生存細胞との集合を示す多面電極の図、
図18aは、図17における装置に対応する隣接電極間の正のダイエレクトロホリティク・フィールド電位を表わす３次元面を示すグラフ、
図18bは、図17の装置における電極間の負のダイエレクトロホリティク・フィールド電位を表わす３次元面を示すグラフ、
図19は、5V（ピークツーピーク）の10KHz信号を与えた後、電極に集まる生存（生きた）および非生存（死んだ）の（メチレン・ブルーで染めた）イースト細胞の平面図、
図20は、城壁状のインターディジタル電極と5V（ピークツーピーク）10KHz信号を用いて、生存および非生存イースト細胞のダイエレクトロホリティクの分離を示し、
図21は、電極に適用された10MHzで非生存細胞をフラッシングした後にチャンバ内に残った生存細胞を示し、
図22は、スプリット・ビーム・ダイエレクトロホリティク分光計を用いて測定された如き生存および非生存イースト懸濁液のダイエレクトロホリティク・スペクトルを示し、
図23は、実験システムの概要を示し、
図24は、メチレン・ブルー染色、ダイエレクトロホリティク挙動により決定される混合細胞懸濁液の百分率生存度と作られた混合物から予期される生存度のグラフ、
図25は、第１の生存イースト細胞、次に非生存イースト細胞の選択的フラッシング（flushing）時のフィルタ・チャンバの流出流の吸収測定から得た生存度と、作られた混合物から予期される生存度（ｒ＝0.980）のグラフ、および
図26は、２つの流出流のそれぞれに弁を持つフィルタ・チャンバの概略図である。
理論の簡単な議論を図１乃至10に関して次に行うことにする。
理論
電極における生物粒子の選択的な固定化のためダイエレクトロホリシス（dielectrophoresis）を用いる基本理論および実際は、15年以上にわたりPohl  H.A.（1978）Dielectrophoresis  Cambridge  University  Press（Cambridge）で利用することができた。粒子が図１に示されるように電極表面で電界の最大領域に吸引される場合、正のダイエレクトロホリティクが用いられる。隔離電界最大値は電極から離れては生じ得ない:T.B.JonesおよびG.W.Bliss「（1977）J.Appl.Phys.」（48、1412〜17）が、重力とダイエレクトロホリティク力間の均衡を維持するように電子的フィードバックを用いて自由空間または液体中に粒子を浮遊させることが可能である:T.B.JonesおよびG.W.Bliss「（1977）J.Appl.Phys.」（48  1412〜17）、T.B.JonesおよびJ.P.Kraybill「（1986）J.Appl.Phys.」（60  1247〜52）、K.V.I.S.KalerおよびT.B.Jones「（1990）Biophys.J.」（57  173〜82）、K.V.I.S.Kaler、Ｊ−Ｐ  Xie、T.B.JonesおよびR.Paul「（1992）Biophys.J.」（63  58〜69）。
負のダイエレクトロホリティクは、電極構造から離れた安定位置に粒子を拘束するために用いることができる。この場合、粒子は図２に示されるように高い電場領域から離れるように誘導される。電極形状の適当な選択により、粒子が指向され最終的に拘束される電場最小値の場所を規定することが可能である:Y.HuangおよびR.Pethig「（1991）Meas.Sci.Technol.」（２  1142〜46）、R.Pethig、Y.Huang、Ｘ−Ｂ  WangおよびJ.P.H.Burt「（1992）J.Phys.D:Appl.Phys.」（25  881〜８）、P.R.C.Gascoyne、Y.Huang、R.Pethig、J.VykoukalおよびF.F.Becker「（1992）Meas.Sci.Technol.」（３  439〜45）。このため、ダイエレクトロホリティク力（２次元電気泳動）の両方の極性を用いることにより、電場の最大値と最小値の両方と関連する電位エネルギ・プロフィールに依存する程度に微小粒子を操作して捕捉することが可能である。
多面および城壁形状の微小電極により生じる正と負のダイエレクトロホリティク力を用いて粒子を指向することができる電位エネルギの「ウエル」即ち「谷」の深さとプロフィールを得るための製造装置について記載されている．得られる結果は、試験生物粒子（イースト、バクテリアおよび血液細胞）を用いて変化し、細胞のタイプ即ち生存度に従ってかかる生物粒子がどのように選択的に拘束されてエネルギ・ウエルから解放されるかが提示される。
実験の詳細
材料
Saccharomyces  cerevistae（株Ｒ  XII。Free  University  of  BerlinのInstitute  of  Biophysicsから得た）のイースト細胞は、５％スクロース（Sigma）、0.5％イースト抽出物（Oxoid）および0.5％微生物学的ペプトン（Oxoid）を含むpH5の媒体中で30℃において成長させられた。この細胞は、その成長相で約18時間で収穫され、280mMのマンニトール中で３回洗浄された。280mMのマンニトール中で懸濁が作られ、プラチナ・ブラック電極とHEWLETT  PACKARD（商標）4192Aインピーダンス・アナライザを用いて50KHzで決定される如き伝導率を40mS.m-1まで上昇するためこれに対して充分なNaClが添加された。生存細胞と同じ方法で10分間75℃で加熱して洗浄することにより、熱処理された細胞懸濁もまた調製された。メチレン・ブルーで染色した後:N.G.Stoicheva、C.L.Cavey,G.H.MarkxおよびD.B.Kell（1989）Biocatalysis  ３  245〜55、この熱処理は細胞の大部分が結果として非生存状態となることが発見された。280mMのマンニトール中の混合により略々等量の生存および非生存細胞を含む懸濁が形成され、このような懸濁の伝導率はNaClにより1mS.m-1に調製された。
羊血液が集められ、凝結防止剤としてリチウムヘパリンを含む無菌真空容器中（Becton  Dickinson、Oxford）に４℃で貯蔵された。血液を100gで五分間遠心分離により赤血球が得られ、320mMスクロースに3mg.m-1のグルコース溶液を加えたもので３回洗浄された。次に、細胞は同様なスクロースにグルコース溶液を加えたもので懸濁され、その伝導率はNaClを用いて10mS.m-1に調整された。
Micrococcus  luteus（syn.M.lysodeikticus）バクテリア、即ち、MoscowのBakh  Institute  of  Bichemistryから得たFleming株2665が、30℃の栄養スープ（Oxford）中で成長され、５分間100gで遠心分離により収穫された。この細胞は、次に３回洗浄され、最後に10mS.m-1のスクロースにグルコース溶液を加えたもので赤血球に対する如く再び懸濁された。
電極
多面の微小電極:Y.HuangおよびR.Pethig（1991）Meas.Sci.Technol.2  1142〜46、および城壁状インターディジタル電極:R.Pethig、Y.Huang、Ｘ−Ｂ  WangおよびJ.P.H.Burt（1992）J.Phys.D:Appl.Phys.25  881〜８、J.A.R.Price、J.P.H.BurtおよびＲ（1988）Biochim.Biophys.Acta  964  221〜30、どこかに記載されたフォトリトグラフ技術を用いて形状が生成され:J.A.R.Price、J.P.H.BurtおよびR.Pethig（1988）Biorhim,Biophys.Acta  964  221〜30。これらの電極タイプは、図３および図4;図５それぞれに示され、正と負のダイエレクトロホリティクの両作用を用いて生存および非生存イースト細胞、赤血球およびバクテリアの選択的捕捉および解放を示すため使用された。ピン・プレート形状の電極もまた構成され、これら電極を用いて、電場周波数および懸濁媒体伝導率の関数として細胞により示された誘電伝達効果の極性を明瞭に決定する（図１参照）。
電位エネルギ
J.C.Maxwell（1891）Ａ  Treatise  on  Electriciity  and  Magnetism,3rd  ed.  Vol.1,Ch.ix.Claredon  Press,Oxfordにより最初に記述される如く、外部電場が誘電媒体中に懸濁された粒子からなるシステムに印加される時、この偏波された粒子に電子ダイポールの特性を付与するように電荷が粒子−媒体の境界に現れるように誘導される。システムの対応する電位エネルギが、
Ｗ＝−ｍ・Ｅ                            式（１）
により与えられる。但し、ｍは誘導された実効ダイポール・モーメント、Ｅは印加電場である。この研究において、誘導多重極の作用が電場がゼロである領域においてのみ優勢になる:M.Washizu（1992）J.Electrostatics  29  177〜88、ため、誘導されたダイポール・モーメントと不均等な外部電場に限定することにする。
半径ｒの球状粒子の場合、絶対複合誘電率ε★ｐ（ε★ｐ＝εｐ−ｊσp/ω、但し、σは導電率、および
0003586279.tif 000002
が絶対複合誘電率ε★ｍの媒体中に懸濁され、ラジアン周波数ωのAC電場（x,y,z）cosωｔ  azを受け、誘導ダイポール・モーメントが下式により与えられる:Y.Huang、
0003586279.tif 000003
R.PethigおよびＸ−Ｂ  Wang（1992）Phys.Med.Biol.37  1499〜1517、即ち、
0003586279.tif 000004
但し、ReおよびImは、それぞれ、下式により定義されるクラウジウス−モソッティ因数ｆ（ε★p,ε★ｍ）の実数および仮数の成分を指す。即ち、
0003586279.tif 000005
印加電場の基間（２π／ω）よりはるかに長い時間にわたる積分式（２）、式（２）から偏光粒子の時間平均電位エネルギは、
0003586279.tif 000006
粒子に働くダイエレクトロホリティク力は、下式により与えらえる:Y.Huang、
0003586279.tif 000007
R.PethigおよびＸ−Ｂ  Wang（1992）Phys.Med.Biol.37  1499〜1517。即ち、
0003586279.tif 000008
その結果
0003586279.tif 000009
この式は、ダイエレクトロホリティク力が粒子をその電位エネルギが最小である領域へ指向させることを示す。このため、因数Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］に対する正の値に対応する粒子懸濁媒体より更に偏光可能である粒子の場合は、粒子は正のダイエレクトロホリティクを受けて、局所電場（E2）が最大である場所へ指向される。式（２）から、この状態もまた印加電場と誘導ダイポール・モーメントとお間の位相差φの大きさが90゜より小さい如き周波数で生じることを理解することができる。反対に、局所電場の最小値に指向される時に、Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］に対する負の値を持つに充分に低い（従って、｜φ｜＞90゜）偏光性の粒子が最小電位エネルギを持つことになる。
このため、粒子の選択的なダイエレクトロホリティク操作および拘束のためには、制御する重要なパラメータは電場の分布
0003586279.tif 000010
および因数Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］である。電場分布は電極の形状によって決定されるが、Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］は、それぞれ粒子の誘電特性（ε★ｐ）および（ε★ｍ）と周囲の媒体に従って周波数と共に変化する。異なる誘電特性の粒子の混合物の場合は、懸濁媒体の導電率または相対的誘電率の適当な修正により選択的な操作を得ることができるが、類似の誘電率特性の選択性の粒子の場合は、１つ以上の粒子タイプの誘電特性を変化させる非常に特有の化学的処理あるいは付随処理（例えば、抗体−抗原反応）を用いて達成可能である。
多面電極
基本的な多面電極形状は、図３に示され、電場の充分に規定された空間的変化を生じるように設計される:Y.HuangおよびR.Pethig（1991）Meas.Sci.Technol.2  1142〜46.電位を規定する多面性はLaplace式から得られ、下記の形態である。即ち、
ｆ（x,y）＝afna＋bfnb
但し、ｎは電極対の数を規定する。更なる詳細は、先に述べた如くHuangとPethigにより提供され、図３のｎ＝２なる多面設計では、電極間の空間における電場の空間的変化は下式により与えられる。即ち、
0003586279.tif 000011
但し、ｄは対称中心と電極先端部との間の半径方向距離であり、V1およびV2は対向電極に印加される電位である。このように、式（４）から、印加された正弦波電圧Ｖに対して、多面形状内に懸濁された粒子の時間平均電位エネルギは下式により与えられる。即ち、
0003586279.tif 000012
ｄ＝64μｍ、εｍ＝80ε０である水性媒体に懸濁された粒子半径ｒが３μｍの特定の場合、および5V（rms）の印加電圧に対する＜Ｗ＞の３次元プロットが図３および図４に示される。図３に示された電位エネルギ・プロフィールは、パラメータRe［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］が＋0.2の値を持つ場合に対応し、その結果粒子は正の誘電伝達の作用下で充分に電極縁部において急な勾配のエネルギで捕捉される。図４では、パラメータRe［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］は＋0.2の値を持ち、この時粒子は充分に電極間の空間の中心における電位エネルギへ指向される。電場が中心においてゼロである:Y.HuangおよびR.Pethig（1991）Meas.Sci.Technol.2  1142〜46であるため、＜Ｗ＞もまたゼロであり、基準点として取ることができる。
初めに電極縁部で水性媒体中に懸濁する、Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］が−0.2の値を持つ３μｍの半径の粒子の場合は、5V（rms）の印加と同時に、式（８）から、粒子が充分に相対的深さ918eVの電位エネルギへ指向されることが判る。換言すれば、この粒子は電極システムから逃れるために少なくとも918eVの電位エネルギ・バリアを克服しなければならない。式（６）から、粒子が電極縁部から移動する時この粒子に働く平均ダイエレクトロホリティク力は2.3pNであると計算できる。
インターディジタル構造電極
城壁状のインターディジタル電極の幾何学的形態が図５に示される。電極の寸法（縮尺通りでない）が示される。基本的な反復構造と反対の電位の同じ電極と隣接する電極のいずれかの側の６つの近傍電極との間の電荷の相互作用が勘案された。電極の詳細は、R.Pethig、Y.Huang、Ｘ−Ｂ  WangおよびJ.P.H.Burt（1992）J.Phys.D:Appl.Phys.25  881〜８によって記述されている。このような電極に対する電位エネルギ・プロフィールを得るため、電場分布の数値計算が、VAX（商標）コンピュータおよびFortran（VAX/VMSオペレーティング・システム）を用いて、電荷密度法:G.MartinezおよびM.Sancho（1973）Proc.IEEE  120  213〜220ページに従って行われた。
この電荷密度法は、電極面Ｓ上の電位Ｖ（ｒ）と電荷密度分布ρ（ｒ′）間の下記の関係を用いる。即ち、
0003586279.tif 000013
但し、εｍは周囲の媒体の絶対誘電率、ｒおよびｒ′は１つ以上の電極を含み得るＳ上の点である。電荷密度関数ρ（ｒ′）を見出す式（９）の解は、電極をその表面電荷密度が均一と仮定できる如き充分に小さなサイズのサブ領域へ分割することによって容易となる。Ｓを表面電荷密度ρｊのｎ個のサブ領域sj（ｊ＝1,2,...n）への分割は、下記のマトリックス形態を取る。即ち、
0003586279.tif 000014
ここで、rjはサブ領域sjの幾何学的中心、xijは下式により与えられる。即ち、
0003586279.tif 000015
サブ領域の分布を知ることから、サブ領域sjにおける単位電荷密度による点rjにおける電位Xijを決定することができる。従って、全電極面上の電荷密度ρｊは、次の関係から計算することができる。即ち、
ρ＝X-1V                                式（12）
但し、ρ＝［ρ1,ρ2...ρnl′,X＝（Xij,i＝1,...n;j＝1,...n）、およびＶ＝［V1  V2...Vnl′は電極に印加される既知の電位である。電荷密度ρｊ（ｊ＝1,...n）を得れば、どの点rkの電位も式（10）でXijを代入することにより見出されて下式を得る。即ち、
0003586279.tif 000016
インターディジタル構造電極設計は、図５および図６に示される周期的な「城壁状」構造からなっている。表面の電荷密度の計算のために、基本的な反復構造が図５に示される要素１〜12内に含まれる675個の規則的はサブ領域に分けられた。基本的な反復城壁状構造の12個の要素内の電荷分布は相互に異なることもあるが、類似の要素（即ち、同じ番号で識別される）における電荷密度は同じであると仮定された。要素の相対的サイズおよびそれらにおけるサブ領域数は、表面電荷分布の予めの計算に基いて選定された。最大の電荷密度変化の領域（例えば、要素７および10）は、最大数のサブ領域が割付けられた。電極表面の割当てられた細分割に基いて、電位係数（Xij）が式（11）とReitanおよびHiggins［17］により記載された手順とを用いて計算された。マトリックスＸの計算過程において、同じ電極の異なる部分ならびに隣接する電極の異なる部分に位置するサブ領域間の総合的電荷同士の相互作用が勘定に入れられた。例えば、図５において、要素７における全てのサブ領域siJにおける電位は、基本的城壁単位の675個のサブ領域において生じる電荷密度を勘定に入れるのみならず、左右の側における次の６個の城壁単位ならびに隣接する電極に位置する城壁単位に対する要素１〜12に生じる電荷密度をも勘定に入れて計算された。電荷密度分布（675個のサブ領域における電荷密度に対して675の値）が、（インターディジタル）電極対に印加られる＋1Vと−1Vの仮定された電極電位に対する式（12）を用いて得られた。
得られた電荷密度分布から、電位分布が式（13）を用いて得られた。次に、電場Ｅ（＝−grad  Ｖ）およびダイエレクトロホリティク力係数
0003586279.tif 000017
が電極上の3.5μｍに位置する面上に均等に分布された点に対して得られ、式（４）を用いて得た時間的に平均された電位エネルギ＜Ｗ＞の結果として得る３次元プロットが図７および図８に示される。
図７は正の誘電伝達（Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］＝＋0.2）に対する状態を示し、図８では、負の誘電伝達に対する電位エネルギ・プロフィールが（Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］＝−0.2であることが示される。これらのプロフィールを得るため用いられる他のパラメータについては以下に規定される。イースト懸濁の吸光度における相対的変化は、電極に対するAC電圧の印加後に測定される。同図から、正のダイエレクトロホリティク力の下では、粒子が電極構造内の初期位置とは無関係に電極縁部における電位エネルギ・トラップへ指向されることが判る。しかし、負のダイエレクトロホリティクでは、電極間の空間に初めに位置された粒子は電極の「ベイ（bay）」領域におけるエネルギ・ウエルへ指向されるが、電極表面上に初めに位置された粒子は電極の「チップ」の表面に指向される。
図７の結果から、負のダイエレクトロホリティク・エネルギ・ウエルに拘束された粒子と比較することにより、正の誘電伝達下で捕捉された粒子は、電極システムから逃れるために大きな電位エネルギ・バリアを克服しなければならないこともまた明らかである。粒子は、特性的な大きさ80μｍのインターディジタル電極により生じる正のダイエレクトロホリティク力（Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］＝＋0.2）を受ける。印加電圧は5Vrmsであり、Ｘ−Ｙ座標が図示された電極形状に関して規定される。このことは、電位エネルギ・プロフィールがどのようにダイエレクトロホリティク力に対して別の作用力場（例えば、重力または流体の流れ）を重ねる際に修正されるかを示す図８および図９に照してより正確に理解することができる。正のダイエレクトロホリティク力の作用下の粒子は、深いエネルギ・ウエル内に保持されるが、負のダイエレクトロホリティクを受ける粒子の場合は、電極システム上のこれら粒子の平行移動の自由度を制限するバリアは非常に大きくはない。
結果と論議
式（３）および（４）から、２つの粒子タイプからなる懸濁の場合、懸濁媒体の伝導率を慎重に選定することにより、ある周波数では各粒子に対するパラメータRe［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］が反対の極性である状態を得ることが可能であることになる。このことは、有効な用途、即ち、ダイエレクトロホリティク力を用いて不均一な懸濁の成分を分けることができることを示唆する。以降の実験は、このことの可能性を示すために行われた。
多面電極を用いる生存および非生存イースト細胞の分離
混合された生存および非生存（熱処理）イースト細胞の懸濁の50μｌサンプルが、対向数電極先端部間の寸法128μｍの多面電極構造に対して滴下（pipetted）された。10MHzの5V（rms）信号を電極に印加した10秒後に、図17に示される収集パターンが観察された。メチレン・ブルー染色テストと図１のピン電極システムを用いる生存および非生存細胞における別個のダイエレクトロホリティク測定から、図17に示された結果が、生存細胞が電極縁部に集められ非生存細胞は中心の電極間領域に拘束されることが結論された。
このため、10MHzの周波数および伝導率が1mS.m-1の懸濁媒体においては、生存および非生存イースト細胞がそれぞれ因数Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］に対する正と負の値を呈する。このことは更に、他の場所（Y.Huang、
0003586279.tif 000018
R.PethigおよびＸ−Ｂ  Wang（1992）Phys.Med.Biol.37  1499〜1517）で定量的に述べたように、生存および非生存イースト細胞の細胞壁、隔膜および細胞内部の誘電特性の相違を反映する。正のRe［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］値を呈する細胞は最大の電場強さの領域へ指向されるが、負のRe［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］の細胞は最小のE2値の領域へ拘束される。
インターディジタル構造電極を用いる赤血球およびミクロコックス・ルテウス（Micrococcus  luteus）の分離
赤血球およびM.ルテウス懸濁の試料が一緒に混合され、この混合物の50μｌの試料が特性的サイズ80μｍのインターディジタル構造電極アレイに対して滴下された。5V（rms）の10KHz信号がマイクロ電極へ印加された。赤血球およびバクテリアの結果として得る分布は、図14aおよび図14bに示されるものと類似する。これらの図面から判るように、血球（直径６μｍ）は電極の表面上の電極のベイ領域およびひし形のパターンにおける三角形状の集合として集まり、より小さなバクテリアは電極縁部に集まった。赤血球の小さな割合（５％より少）が、バクテリアのポピュレーション内の立体的な障害物により捕捉された。
図１のピン電極システムを用いる別個の赤血球とバクテリア懸濁の測定は、10KHzで10mS.m-1のスクロースとグルコースの媒体中で、ミクロコックスと赤血球はそれぞれ正と負のダイエレクトロホリティク力を受けた。このことは、インターディジタル電極を用いる時イースト細胞に対して得られる三角形状、ひし形状および真珠の鎖状の集合パターンの従前の指摘（R.Pethig、Y.Huang、Ｘ−Ｂ  WangおよびJ.P.H.Burt（1992）J.Phys.D:Appl.Phys.25  881〜８）と一致する。
血球とバクテリアの異なる挙動は、血球が脂質膜により包囲され、バクテリアはヘテロ多糖細胞壁により包囲されているという事実に主として関連している。10KHzの周波数では、血球膜は10mS.m-1の懸濁媒体（即ち、Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］）よりも大きな抵抗を持つように思われ、従ってこの血球膜は負の誘電伝達作用力を受ける。一方、バクテリアの細胞壁は、イオン交換樹脂と似た電気的特性を持ち、伝導率が比較的大きい（即ち、Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］は正である）。従って、ミクロコックスは、図７の電位エネルギ・プロフィールを有し、図８は負のダイエレクトロホリティク（Re［ｆ（ε★p,ε★ｍ）］＝−0.2）を受ける赤血球に対する状態に対応する。
このように、得られる集合パターンは、血球およびバクテリアがその電位エネルギを最小化するようにそれ自らを再配置する時に予期されるパターンとよく一致する。
最後に、図９および図10に示される結果は、負のダイエレクトロホリティク力により保持される粒子が正のダイエレクトロホリティク力により保持されるものより容易に解放されることを示す。このことは、電極アレイ上を液体洗浄することによって検証された。5Vrms（10KHz）信号を用いてミクロコックスおよび赤血球の分離後、およびこの信号を維持した状態で、血球は流れる液体により除去されたが、バクテリアは電極縁部で強く捕捉されたままであった。電圧信号を除去すると同時に、バクテリアは洗浄（flush）することができた。1mS.m-1のマンニトール溶液中の生存および非生存イースト細胞の混合物において同様な結果が得られた。5V（rms）の10MHz信号は、生存細胞が電極縁部で捕捉されてそこで液体の交差流に曝した状態で残る結果となったが、最初は赤血球と同様なひし形と三角形状の集合で集まった非生存細胞が洗い流された。
結論
先に述べた如き従前の研究において、多面のインターディジタル構造城壁形状の電極は正と負のダイエレクトロホリティクの両効果から生じる粒子の集合を容易にできることが示された。電極により生成される電場パターンに関して理論的説明がなされた。これをダイエレクトロホリティク力に曝された粒子が受ける電位エネルギ面の考察に拡張した。更に、懸濁媒体の伝導率の慎重な選定により、不均一な懸濁中の異なる粒子タイプが、これら粒子に働くダイエレクトロホリティク力の極性に従って、空間的に分離された電位エネルギ・ウエルに対して指向される周波数範囲を見出すことが可能であることを示した。多面およびインターディジタル構造電極を用いて観察される集合パターンと電位エネルギ表面の場所と幾何学的形状とに関して、理論と実験間の良好な一致が得られた。
城壁状インターディジタル構造電極の場合は、負のダイエレクトロホリティク下の電位エネルギ・ウエルに捕捉された粒子が正のダイエレクトロホリティク下で捕捉された粒子よりも更に容易に電極構造から（例えば、流体の流れまたは重力により）除去され得ることが判った。不均一懸濁における異なる粒子タイプのこのような選択的な拘束および解放が、生物医学的およびバイオテクノロジ的科学における交差する用途を持つと考えることができる。
本発明が実施される１つの方法について、特に図11乃至図18に関して次に記述することにする。
図11および図12を簡単に見て、全体的に10で示されるフィルタまたはセパレータは、貯溜部またはチャンバ14内部に収容された電極アレイ12（詳細には、図13に示される）を含む。チャンバ14は、入口16と、第１の出口18および第２の出口20とを有する。ポンプ22は、溶液（図示せず）をチャンバ14へ圧送する。この溶液は、細胞ＡとＢの混合物を含む。この混合物は、生きた細胞即ち生存細胞Ｂと死んだ細胞即ち非生存細胞Ａとを含む。これらの細胞ＡおよびＢは、同じ細胞種のものである。
溶液は電極アレイ12を流過し、細胞ＡおよびＢは、これが生きているか死んでいるかに従って異なる２次元電気泳動力を受ける。この作用力は、チャンバ14内部の細胞ＡおよびＢの結果運動に影響を及ぼす。結果として生じる効果は、Ａタイプ細胞は出口18に向けて押圧されＢタイプ細胞は出口20に向けて押圧されることである。しかし、分離過程には幾つかの段階が含まれ、これらについては図13a乃至図13dに関して以下に詳細に記述される。
ポンプ22および24を用いて、細胞ほ保持する液体をチャンバ14内部で前後方向に圧送する。ポンプ22、24はまた、細胞を更に濃縮するためＡタイプ細胞またはＢタイプ細胞に富んだ液体を更に別の濾過チャンバ（図示せず）へそれぞれ圧送する。フィルタまたはセパレータのカスケードが一緒に直列に接続されてDEPフィールド内でDEP力を受ける細胞、淡泊その他の物質の２つ以上の異なる核種の分離を可能にすることが理解されよう。
更に、別個の入口26、28が、異なる不活性媒体が濾過チャンバ14を通過してＡおよびＢタイプの細胞を集めるために任意に設けられる。しかし、これが要求されるのではなく任意であることが理解されよう。２つの種類の細胞を保持する液体は、ポンプ22の圧力下で入口16を介して進入する。
４つの周波数発生器30、32、34および36が、チャンバ14内部でそれぞれ電極30A、32A、34A、36Aの選定されたサブグループにリンクされ、コンピュータ38によって制御される。１つの周波数発生器が４個の周波数発生器の代わりに用いられることが判るであろう。１つの周波数発生器は、増幅器（図示せず）に接続される。ポンプ22、23および24もまた、コンピュータ38によって制御される。周波数発生器30、32、34、36は、電極間のダイエレクトロホリティク・フィールド電界を変化させるように切換えられ、これにより異なるDEP力を細胞タイプＡと細胞タイプＢとへ印加させる。細胞Ａは三角形状領域に拘束されるが、細胞Ｂは強いDEP力により電極表面に吸引される。次にポンプ23、24を交互に用いて、以下に述べるように流体を１つの方向へあるいは反対方向へ圧送する。全体的な結果は、出口20から出てきた液体は出口18から出てきたものよりも細胞タイプＢを多く含み、出口18から出てきた液体は出口20から出てきた液体よりも細胞タイプＡを多く含むことである。これは、以下に図13乃至図18に関して一般的に説明される。
図13a乃至図13dは、時間間隔は必ずしも等しくなくてよいが、４つの逐次の時間インスタンスで電極アレイ12の一部の図を示している。細胞タイプＡおよびＢの混合物がチャンバ14へ導入される。細胞タイプＢを細胞タイプＡよりも大きな程度電極の特定の部分へ吸引するダイエレクトロホリティク・フィールドが印加される。図13aは、タイプＡおよびタイプＢの細胞が隣接する電極42、43間に別のパターンを形成する最初のインスタンスを示す。図13a乃至図13dの図面は、３対の電極40と41、42と43、44と45を示している。ダイエレクトロホリティク・フィールドは、細胞タイプＢがここでは真珠の鎖と呼ばれる鎖を対向する電極42、43の「頂部」即ち「先端部」間に形成するように、細胞タイプＡおよびＢを分離しようとする。細胞タイプＡは、電極42、43の表面の周囲および対向する電極の「樋部」即ち「ベイ（bay）」内で三角形またはひし形のパターンに形成しようとする。２つの異なる細胞タイプの分類については、エネルギの観点から現象について以下に図15乃至図18に関して簡単に触れるが、「理論」と題された章で先に述べられている。
図13bは、細胞ＡおよびＢを保持する液体がポンプ24によってチャンバ14内へ圧送される時、ダイエレクトロホリティク・フィールドが電極42、43間に維持される間に何が生じるかを示す。Ａタイプ細胞がより弱いDEP力により保持される時、この細胞は出口18の方向（左方）に強制される。Ｂタイプ細胞は、比較的強いDEP力により保持される時に、電極の表面に付着されたままである。このため、細胞タイプＡは電極41の方向に移動するが、とりわけ電極間では細胞タイプＢは「真珠の鎖」状に保持する。
図13cは、誘電伝達電界がオフにされる以降の瞬間を示す。入口19を介する液体では、ポンプ23によって圧力下で導入される。細胞タイプＡおよびＢは共に、出口20の方向に右方へ移動される。この時、DEPフィールドが再び確立される。
図13dは、スイッチ・オンされたDEPフィールドを示している。ＡタイプとＢタイプの細胞が（１つの電極対により）出口20に向けて（即ち、ページの右方に向けて）変位されたことが理解される。この時Ｂタイプ細胞は、DEP電界における電極43、44に付着される。これら電極は、Ｂタイプ細胞が前に付着されたものとは異なる電極である。一般に、該電極は電極の右側である。
この時、ポンプ23が流体を出口18に向けて圧送し、その際タイプＡ細胞もまた出口18に向けて移動される。全体的な結果は、２つの細胞タイプＡおよびＢが空間的に分けられることである。更なる空間分離ステップ毎に、細胞タイプＡおよびＢの濃度は、これら細胞がそれぞれの出口に近づくほど純度が高くなる。細胞タイプＡのクラスター（ふさ状）内に捕捉された細胞タイプＢは、不規則的に剥離された状態となり、関連する出口に向けて圧送され、またその逆も真である。これはまた、分離を改善する効果も有する。
細胞タイプＡおよびＢを含む溶液の新たな供給分が電極42、43間のセパレータに導入され、このプロセスは、以降の切換えサイクルが細胞タイプＡの出口18への連続的な結果として生じる変位を生じ、細胞タイプＢの出口20への変位を生じるように反復される。各細胞タイプの濃度は、各ステップ毎に純度が高くなる。
図14aは、電極42の表面の周囲に累積する細胞の拡大図で、Ａタイプの細胞の三角形が電極42の「樋部」に示されている。
図14bは、２つの電極42、43間の拡大図で、電極の「頂部」間の細胞タイプＢの「真珠の鎖」と、細胞タイプＡの三角形状とを示している。
図15a、図15b、図16aおよび図16bは、細胞タイプＢが集合させられる急な勾配の深い電位エネルギの「ウエル」即ち「谷」を略図的に示している。「ウエル」即ち「谷」の深さの類似点は先に述べたことである。細胞タイプＢは比較的深い「谷」へ「落込む」が、細胞タイプＡは、この細胞が容易に除去される堆積の頂部に累積しようとする。
１つの特定の実験については、図19乃至図25に関して以下において詳細に記載され、特定の細胞の種類の生細胞と死細胞の分離におけるフィルタ即ちセパレータの効率を示している。図23に示される如き実験ステーションが、２つのタイプの細胞を分けるために回分セパレータとして用いられた。分離の効率は、吸収技術、メチレン・ブルー染色法およびプレート・カウントによって測定された。
実験の概要
不均一な電界における粒子の運動であるダイエレクトロホリティク（２次元電気泳動）を用いて、良好な効率で生存および非生存イースト細胞を迅速に分離した。Saccharomyces  Cerevistaeの生存および非生存細胞の既知の混合物が、小さなチャンバ内でマイクロ電極により生成された正と負のダイエレクトロホリティク力を用いて分離されて選択的に単離された。メチレン・ブルー染色（ｒ＝0.992）から初期のダイエレクトロホリティク分離（ｒ＝0.995）後の電極における細胞の直接顕微鏡的カウントにより、またチャンバから生存および非生存細胞を選択的に洗浄した後の流出液の光学的吸収測定（ｒ＝0.980）によって、初期の既知の相対的組成との良好な相関が得られた。メチレン・ブルーによる染色とプレート・カウントによる細胞の生存度の測定により、60％の非生存細胞を含むca.1.4×107細胞ml-1の初期懸濁に対して、ダイエレクトロホリティクにより分離された非生存部分は３％の生存細胞を含み、生存部分は８％の非生存細胞を含んでいた。分離効率は、初期懸濁の希釈により、あるいは反復操作によって増加される。細胞の生存度は、この分離手順では影響を受けなかった。
細胞の生存度の決定は簡単ではなく、結果はしばしば使用された手法に非常に依存する。しかし、このような決定はかなり実用的かつ理論的に重要であり（Jones,1987;Higgins,1992;KaprelyantsおよびKell、1992）、細胞死の研究ならびに混合ポピュレーションにおける生存および非生存細胞の物理的分離のための新しい技術の開発は非常に有効である。ダイエレクトロホリティク現象は、このような技術に対する基礎を提供し得るものである。
ダイエレクトロホリティク現象（DEP）は、不均一なAC電界中での粒子（particle）の移動であり、理論および粒子は詳しく報告されている（Pohl,1978a＆b;Pethig,1979,1991）。外部的に電界が課せられる結果として、双極子モーメントが粒子（細胞、菌:cell）内で誘発され、該磁界が不均一であれば、粒子はそれが高磁界へ向かうか又は高磁界から遠ざかるネット並進力（net  translational  force）を経験する。この誘発された運動はDEP効果を構成し、細胞に対して個々の周波数−依存成分を含む（Burt等、1990;Pething  1991;Pethig等、1992）。
1KHZ以下では、該効果が表面電荷効果（surface  charge  effect）に関連した偏光（polarisation）により主として制御され、他方、1KHZと1MHZとの間では、膜間のイオン移動工程だけでなく、表面状態、薄膜または細胞壁面における二極性リラクセーション、薄膜流動性が優先的な影響である。1MHZ以上では、DEP応答上の制御での影響は薄膜キャパシタンス及び表面及び内部細胞構成に関連する界面偏光である。実験者の制御下における主な変数は、供給された電界の周波数と浮遊媒体の伝導率と誘電率である。従って、異なるDEP特性を有する粒子の混合が分離できるように該変数を選択することが可能であり、これはインターディジタル化され、スプライン加工された微小電極の使用が主に促進される（Price等。、1988;Burt等、1989、1990;Pethig等。、1992）。
イースト生菌及びイースト否生菌のDEP特性が著しく異なることは既に示されおり（Pohl,1978a＆b;Huang等、1992）、差異は誘電分光器に密接に関連した技術（Bouton等、1989;Stoicheva等、1989;Markx等、1991）及び電気−回転（electro−rotation）（HolzelおよびLamprecht,1992;Huang等、1992）を使用して既に報告されている。DEP方法は唯一の電極を用いて細胞（菌）を分離するためにPohl（Pohl及びHawk,1966;Crane及びPohl,1968,Pohl,1978a＆ｂ）及びMason及びTownsley（1971）により使用され、該使用は分離において良い効率を得られなかつた。以下に述べる方法は分離の高効率を達成するため２つの新しい特徴を用いる。これらは、インターディジタル・マイクロ電極アレイと、正と負の両方のダイエレクトロホリティク力との制御された使用である。また、この方法は、異なる臓器の細胞間でダイエレクトロホリティク特性が著しく変化し得、かつ実際に生存度以外の生理学的な状態にも依存するので、原理的に上位である（MasonおよびTownsley,1971;1978a＆b;Pethig,1991;Gascoyne等,1992）。
ここに述べたダイエレクトロホリティク分離法は、先に述べた如き（Huang等、1992）ことに基づいて動作する。即ち、次の場合に周波数範囲を見出すことができる。（ｉ）生存および非生存イースト細胞が正のDEPを呈し、（ii）生存細胞が正のDEPを呈し、非生存細胞が負のDEPを呈する場合。研究された他の現象は、城壁状のインターディジタル・マイクロ電極を用いる時、正のDEP下に集まる細胞は電極縁部の深い急な傾斜の電位エネルギ・ウエルに保持されるが、負のダイエレクトロホリティク力の影響下では、細胞が浅い電位エネルギ・ウエル内で三角形状の集合として保持される事実と関連している（Gascoyne等、1992;Pethig等、1992）。このため、正のDEPにより電極に付着した細胞は、電極上の洗浄流体では容易に剥離されないが、負のDEPにより保持される細胞はこのような作用により容易かつ選択的に除去される。
方法
イースト（yeast）：
使用されたイーストは、5gのl-1イースト抽出物（Oxoid）、5gのl-1バクテリア・ペプトン（Oxoid）および50gのl-1スルロースからなるpH5の媒体中に30℃で成長させたベーカリーのイースト（Saccharomyces  cerevisiae,株RXII。Free  University  of  Berlin,Institute  of  Biophysicsから入手）であった。イーストは、一晩成長され、収穫され、280mMのマンニトール中で４回洗浄された。細胞は、20分間水浴中で90゜まで加熱されることにより非生存状態にされ、その後前のように洗浄された。異なる相対量の生存および非生存細胞を含む懸濁が混合にょって作られた。
誘電伝達分光計
生存および非生存細胞が正または負のDEPを呈した周波数範囲を確認するため生存および非生存イースト細胞の懸濁のDEPスペクトルが測定された。1cmの経路長さ（1.4×107細胞ml-1と対応）のクベット中で655nmで0.6の吸収を有する生存および非生存（熱処理）イースト細胞の懸濁が調製され、従前の設計（Price等、1988;Burt等、1989,1990）に基くスプリット・ビーム分光システムを用いてそのDEPスペクトルが得られた。スプリット・ビームの１つの成分が、細胞分離チャンバにおいて用いたものと同じ形状の２つのインターディジタル構造電極アレイ間に配置された細胞懸濁の光学的密度をモニターした。スプリット・ビームの他の成分がビーム強さのランダム変化について補正し、また測定の増強感度を提供するため基準信号を提供した。細胞懸濁の光学的密度における減少として正のDEPがそれ自体を精査し、負のDEPの効果は、電極からバルク懸濁駅へ排斥される細胞の結果として光学的密度を増加することであった。どこか（Price等、1988;Burt等、1989）に述べられたように、AC電圧信号を電極に印加する際の吸光度の変化の初期率は、細胞のDEP集合率に比例する。
誘電伝達分離
細胞分離チャンバは、コロイド粒子、バクテリア、イーストおよび哺乳類の細胞のDEP研究において用いたものと同じ基本設計および構造（Burt等、1989,1990;Price等、1988;Pethig等、1992）の城壁状インターディジタル・マイクロ電極を組込んだ。この電極は、顕微鏡のスライド上に作られ、城壁形状を規定する特徴的寸法は80μｍであった。体積が50μｌのチャンバが、ポリアセテート・スペーサと顕微鏡カバー・スリップを電極頂部に配置し、システムをエポキシ樹脂で封止することにより構成された。細胞および懸濁液（suspending  fluid）がチャンバへ注入されこれから２つの小さな直径のチュープを経て洗浄される。分離プロセスの最初の段階は、生存および非生存の両細胞が電極に対して正のダイエレクトロホリティク力の結果電極先端部に集まった如き周波数の正弦波電圧を印加することからなっていた。この電圧信号が依然として印加された状態で、細胞屑および電極により捕捉されなかった細胞を除去するためチャンバは清潔な懸濁液で洗浄された。印加電圧の周波数は、生存細胞は正のダイエレクトロホリティク力の下で電極先端部に残るが、負のダイエレクトロホリティク力の作用下で電極ベイ領域における三角形の集合で集まるよう、非生存細胞がそれ自体を再び分布させるように調整された。この電圧信号が印加された状態で、チャンバは、これから非生存細胞を選択的に除去するため洗浄された。最終段階は、電極に対する印加電圧を遮断することと、生存細胞を除去するためのチャンバの洗浄とを含んでいた。
異なる生存度の細胞の分離の測定は、２つの方法で行われた。第１の方法では、細胞が注入によってチャンバ内へ供給され、５ボルト（ピークツーピーク）10MHzの電圧が電極に印加され、三角形の集合と電極頂部に生じる細胞と電極縁部に集まる細胞の数は、直接的な顕微鏡の観察により、また電極アレイに対して典型的である領域の写真からカウントされた。ある細胞が前の実験からチャンバ内に存在したことを補償するため、細胞カウントもまた新しい試料を導入する前に行われた。
第２の方法では、細胞は注入により細胞内に入れられ、かつ10V（ピークツーピーク）の10KHzの信号を印加することにより電極縁部に集まった。捕捉されなかった細胞および細胞屑は、280mMのマンニトールにより洗浄された。次に、信号は、生存細胞は電極縁部に位置したまま非生存細胞を三角形集合および電極の頂部に移動させる効果をもつ10V（ピークツーピーク）の10MHzに変更された。10MHzの信号を印加してDEPチャンバ内に流体媒体の緩やかな流れを通すことにより、非生存細胞がチャンバから選択的に除去された。これらの細胞の通過は、1cmの流過細胞およびPye−Unicam  SP6−400（商標）分光計を用いて、500nmにおける吸光度の増加として監視された。非生存細胞の除去と同時に、電圧は遮断され、生存細胞の電極縁部からの以後の洗浄もまた吸光度の増加として記録された。吸光度信号は、時間的に追従され、２つの吸収ピーク下方の面積が測定された。チャンバ内の流量は30ml  hr-1であり、同じ濃度の生存および非生存イースト細胞の懸濁が500nmにおける同じ吸光度を呈した。
生存度の推定
細胞の生存度を推定するため、細胞はメチレン・ブルーで染色され（Stoicheva等、1989）、また1.2％agarの成長媒体を含むプレート上に置かれた。
結果と論議
スプリット・ビーム分光計を用いて測定された生存および非生存イースト細胞の懸濁のDEPスペクトルが図22に示される。これらのスペクトルは、細胞分離が確立されるための条件、即ち、2MHzより高ければ非生存細胞は負のDEP効果を呈し生存細胞は正の効果を呈するが、生存および非生存の両細胞が10KHzにおける類似の大きさの正のDEPを呈することをを可能にするため必要な情報を提供した。
5V（ピークツーピーク）の10KHzの電圧信号を生存および非生存の両細胞を含む懸濁に対する電極に印加する結果は、図19に示される。両方の細胞タイプが電極に（10秒以内に）集まる。図20は、印加電圧の周波数を10MHzに変更する結果を示す。生存細胞は電極の縁部と、電極の「頂部」間に「真珠の鎖」状に集まったままであるが、非生存細胞は自らを電極の「ベイ」または「樋部」の領域に三角形状の集合に再配置した。非生存細胞はまた、電極縁部から離れた電極表面上へ集められ、完全には理解されていないが、これは、主として負のダイエレクトロホリティク効果の作用下で生じるものと見做される（Pethig等、1992）。細胞のこの再配置は、30乃至60秒以内で完了する。細胞の２つのタイプはこのように、10MHzの信号の印加によって局所的スケールで容易に認識でき物理的に分離された。メチレン・ブルー処理された細胞懸濁を用いる観察は、染色された細胞が三角形の形状で電極の頂部に集まったが、染色されない（従って、生存状態の）細胞は電極縁部に真珠の鎖状に集まったことを確認した。
生存および非生存細胞の相対数は、図20に示される如く電極における細胞の集合の直接的な顕微鏡検査により、ならびに写真記録から得られた。図23は、細胞がマイクロ電極を含むDEP分離チャンバ内へどのように注入されたか、またDEP分離後にその洗浄が光の吸収によって監視されたかを略図的に示している。細胞の生存度は、メチレン・ブルー染色を用いて決定された。図24は、測定された細胞の生存度と細胞混合物の既知の組成から予期される生存度の関係を示す。良好な相関が判る（それぞれ、メチレン・ブルー染色およびダイエレクトロホリティクに対する相関係数ｒ＝0.992および0.995）。
また、先に述べたように、細胞は、最初に非生存細胞を選択的に除去し（図21）、次いで生存細胞を除去するように、DEPチャンバを洗浄することにより分離された。集合した負のDEP（非生存）細胞と集合した正のDEP（生存）細胞が、吸光度の測定により決定された。以前の研究（Burt等、1989）は、約1.4×107細胞m1-1までのイースト濃度について1cmの経路長さのクベットにおける吸光度が濃度と共に直線的に変化することを示した（即ち、Beerの法則に従う）。細胞濃度間の直線的関係はさて置き（生存および非生存細胞懸濁について検査）、Beerの法則内で動作する利点は、多重の光散乱と関連するエラーが避けられることである。この研究では、1.4×107ml-1以上の細胞濃度は用いられなかった。得られた結果は図25に示され、初期の周知の懸濁の相対的組成に妥当な相関が見出される（ｒ＝0.980）。
40％の生存イースト細胞と60％の非生存（熱処理）イースト細胞とを用いて調製された懸濁のDEP分離後に、２つの分離された成分がメチレン・ブルー（methylene  blue）で染色され、1.2％寒天の成長培地に延ばされた。生存細胞（３％）が非生存細胞を含むと思われた部分に依然として存在し、主として生存細胞を含む部分も死細胞（８％）を含んでいた。このことは、これらの実験で用いた比較的高い濃度（ca  107ml-1）でも、懸濁が100％良好ではなかったことを示す。これらの濃度では、非生存（染色）細胞が、電極縁部において生存細胞により時に捕捉され、あるいは立体的に阻害された。この効果は、より低い密度の細胞の懸濁が用いられたならば低減された。延展と同時に、良好な成長（実験的エラー以内で細胞回収率100％）が生存細胞を含む部分から得られたが、非常に少ない（３％）コロニーが非生存細胞を含む部分から得られた。イーストの生存度が、更に損傷を受けやすいイースト原形質体の生存度がダイエレクトロホリティクにより影響を受けないことを示した
0003586279.tif 000019
およびEmels（1985）の早期の研究による印加電界によっては影響を受けないことが判った。
図25は、両方の方法に対する良好な相関を示すグラフを示す（メチレン・ブルーおよびDEPに対する相関係数は、それぞれｒ＝0.992および0.995）。
結論
イースト細胞のダイエレクトロホリティクおよびエレクトロローテーションの挙動の分析から、Huang等（1992）は、細胞の細胞質膜の伝導率が、0.2Sm-1乃至７×10-3Sm-1の内部細胞の伝導率の減少と並行して、2.5×10-7Sm-1乃至1.6×10-4Sm-1の熱処理で増加したことを示した。細胞の電気的特性におけるこのような変化が、ここで述べたダイエレクトロホリティク挙動における相違を生じ、分離技術の基礎を形成する。
細胞を分離チャンバへ注入し、10KHz信号を用いて細胞を捕捉し、10MHz信号を用いて電極における非生存細胞から生存細胞を局部的に分離するプロセスを２分以内に達成することができる。生存細胞と非生存細胞の数がダイエレクトロホリティク分離のこの段階でカウントされた測定が、ここでは１つのカウント手順により行われたが、これはイメージ分析技術（Gascoyne等、1992）を用いて自動化することができる。従って、この手順は細胞の化学的処理を必要とせずに細胞の生存度を確認して、細胞を後で選択的に集合させる迅速な方法を提供する。
40％の生存度の1.4×107細胞ml-1のためには、選択的に洗浄された生存細胞のみを含む部分であるはずのところに著しい数（８％）の死細胞が現れた。メチレン・ブルーで処理された懸濁に対するDEP効果の直接的な顕微鏡的観察から、非生存細胞が立体的に阻害され更に生存細胞により捕捉された故に、この「汚染」が起ることが発見された。この効果は、初期懸濁の10倍の希釈で著しく低減された。改善された分離効率もまた、細胞をダイエレクトロホリティク分離の２段階以上に通すことにより達成することができる。
最後に、静置培養（stationary  culture）による予備データ（データは示さない）が、異なる生理学的状態における細胞がダイエレクトロホリティク挙動により識別することができ、また死にかけた細胞の挙動が生存および非生存細胞のそれとは異なることを示す。選択的細胞分離技術の可能性はさて置き、細胞の生存度および生理的状態を決定するための染色法とのダイエレクトロホニック技術の比較がこのように化学的に価値のあることを証明できる。
本発明の別の実施例について図26に関して記載する。
ダイエレクトロホリティク観察のためには高い電場強さが必要であるため、この効果は、このような電場強さが容易に生成できる調査される粒子と同じ程度の電極を用いて一般に小さなスケールでのみ観察される。しかし、電極間の距離が非常に小さいという事実の結果として、粒子は通常は短い距離を移動するだけで、結果的に目的とされる多くの隣接電極を用いなければ（Burt＆Pethig,1990;Washizu等、1993）、流動する液体または重力により生じる如き他の作用力が大きな距離だけ細胞を移動させるのに必要である。LinおよびBenguigui（1982）は、流れる液体から無機粒子を分離するのに城壁部のないインターディジタル構造電極を使用した。彼らは、異なる電気的特性を持つ粒子を分離しようとも、あるいはシステムを連続的にしようとも試みなかった。Markx等（1993）は、城壁状インターディジタル構造電極を用いて生存および非生存イースト細胞の分離を提示しているが、連続的分離を達成する試みはなされなかった。ダイエレクトロホリティク力を生じるため、同心シリンダ（Mason＆Townsley,1971）またはいわゆるアイソモーティブ（isomoive）電極（Pohl,1978a  ＆  ｂ）の使用前に連続的ダイエレクトロホリティク分離が試みられたが、結果は満足できるものではなく、歩留まりは非常に低いものであった。有効な連続的分離が達成可能である城壁状インターディジタル構造電極のアレイ40を含むチャンバにおける周期的な向流方式を、図26に関して以下に記述する。モデル・システムとして、生存および非生存イースト細胞が用いられた。
材料と方法
細胞
使用されたイースト細胞は、BerlinのFree  Universityから入手されたSaccharomyces  cerevisiae株RXIIであった。このイーストは、先に述べたように成長され（Markx等、1990）、収穫されて脱イオン水中で４回洗浄された。非生存イースト細胞は、熱処理（90℃で20分）により得られ、先に述べたように洗浄された。非生存細胞および生存細胞（Non−viable  and  viable  cell）は次に50％対50％の比で混合された。イースト細胞の生存度は、メチレン・ブルー染色法（Stoicheva等、1989）を用いて試験された。使用された懸濁の光学的密度は0.288で、７つのE6細胞ml-1の細胞濃度に対応する。
装置
ダイエレクトロホリティク分離チャンバが図26に示される。城壁状のインターディジタル構造電極（クローム基盤上の金から作られ、20mmの長さ、城壁部の特徴寸法は70μｍ）が、フォトリトグラフ手法を用いて12枚の26mmの幅および76mmの長さの顕微鏡スライドの頂部に作られた。顕微鏡スライドは、頂面にガラス板が接着された。顕微鏡スライド上の電極に対する接続はハンダ付けにより行われた。チャンバは、200ミクロンのPTFEスペーサと別の顕微鏡スライドを用いて電極上方に構成された。液体がチャンバから1mm内径のPVCおよびシリコーン・チュービング（silicone  tubing）を介して流入流出された。細胞は、チャンバの中心のチューブ（tube）を介して圧送され、細胞を含まない新鮮な液体はチャンバの２端部におけるチューブを介して圧送され、分離された細胞を含む液体はチャンバの遠端部における２本の異なるチューブを介して搬出された。システム全体は、流動シリコーン・ゴム（RS）を用いて封止され、滅菌可能である。
分離の全段階の概要が図13a乃至図13dに示された。13a.細胞が装入され、電圧が印加される。生存細胞は、電極間の高い電界領域へ吸引されるが、非生存細胞は排斥される。13b.緩やかな流体の流れが非生存細胞を剥離させて１つの方向に運ぶ。生存細胞は依然として保持される。13c.印加電圧はゼロに設定される。生存および非生存細胞の両者は反対方向に移動される。13d.電圧が再び印加され、非生存細胞が再びｂにおけると同じ方向に移動される。
流体の流れを制御するため、ペリスタリスティック（peristaltic）ポンプ（Gilson  Minipuls  ３（商標））およびソレノイド（RS）から作られた弁が用いられた。ポンプの流量は、5.5ml  min-1程度であり、AC電圧がFarnell  LFM3（商標）とKrohn−Hiteモデル2000（商標）周波数発生器とによりリレーを介して印加された。全システムはコンピュータ制御された。
表１に示される弁制御方式を用いて連続的な分離が達成された。
0003586279.tif 000020
ポンプの遮断後に、システムへ細胞を圧送した後を除いて（周期１）細胞を養生させるため10秒の周期（period）が用いられ、これには45秒の養生時間が用いられた。しかし、これらの周期は変更することができる。
結果および結論
チャンバの左側では全ての細胞が生存状態にあるが、右側の細胞は全て非生存状態であることが明らかである。これは、全ての細胞が混合されるチャンバの中間で明瞭に異なる。予測されるように、チャンバの中心から遠去かるほど分離が改善され、チャンバの出口で生存および非生存細胞の略々完全な（約100％）分離が達成された。これは、従前に実施されて（Marks等、1993）90〜95％の分離が達成されたバッチ分離（batch  separation）とは対照的である。
流入点から3cmの距離で略々完全な分離が達成されたものと推定される。このことは、チャンバが30cmの長さであるから、理想的な推定最小計の５分離ステップを有することを示唆する。実際に、このことは、流入点付近の流れが充分に規定されないためおそらくはそれ以上であり、それから更に離れるほど良好に規定されよう。0.55ml/分の流体流量の場合、流入点から流出点まで推定２時間の移動を要する。
他の細胞タイプ、特に植物の原形質体の分離のためのこのシステムの使用。Friend  Murine赤白血病細胞および異なる種のバクテリアが現在研究中である。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の実施例および方法に対して変更が可能であることが理解されよう。例えば、DEP効果を受ける粒子に対するDEP作用力の効果を変更するように、懸濁媒体（溶媒または液体の如き）の導電率または相対的誘電率に対する変更が可能であることが理解される。同様に、高い電界勾配を許容し、これにより全体的に小さな系統内で２つ（以上）の粒子タイプの局部的な拘束を容易にするために電極形態の大きさおよび形状に対する変更が可能である。
このように、上記の特性を変化させることにより、またDEP電場を確立するため印加される周波数の慎重な選択によって、異なる核種の高度の選択が可能である。
特定の実施例において比較的小さな面積を持つと記載したが、（0.1−1m2）の合計面積を有する大型の電極アレイを組立てられると考えられる。このような電極アレイは、液体媒体の比較的大きな処理能力、例えば毎分数リットルあるいは数十リットル程度の処理能力を可能にするしよう。一方を他方に重ねることにより３次元アレイを形成する如き類似の電極アレイを作ることもできる。
分離される粒子の混合物を保持する液体をチャンバを通るように圧力が押圧するチャンバについて触れたが、本発明はまた、ダイエレクトロホリティク特性が類似する幾つかの異なる核種を分離するダイエレクトロホリティク・コラムとしても使用することができる。このように作用するよう構成された本発明は、ガス・クロマトグラフの如き化学的分離装置として同じようにダイエレクトロホリティクにより分離を行うように考えることもできる。制御手段は、電界が付勢される時、保持媒体をチャンバを通るように脈動させるため動作するように構成される。
micrococcus  lysodelkticus（Gram＋ve）と、Escherichia  coli（Gram−ve）と、伝導率が50ms/分の280mMのマンニトール（1M  NaClを用いて調整された）中に懸濁されたSaccharomyces  cerevisiaeとの0.25mlの混合物を用いる実験は、0.25mlのコラムのチャンバの片側を形成する２組の城壁状のインターディジタル・マイクロ電極を含む（最初に「装填」された）コラムを通過するようにされた。４〜8Vの（ピークツーピーク）電圧信号が、50KHz（または、10〜100KHz）で印加された。イースト細胞が、前記コラムから最初に集合させられた（〜0.3mlのフラクション）。次に、Ｅ−coliが集合させられた（組織中のGram染色の欠如により識別される）が、M.lysodeikticusはそのままで、後でボルトが除去されたチャンバ内を洗浄することにより集められた。このように、３つの異なる核種の連続的な分離が可能であった。
また、細胞質が標識（label）を付される時に、細胞質の分離に用いられる時本発明が特に有効であることも理解されよう。例えば、Fluorescein  isothiocyanate（FITC）、金その他の化学的標識の如き蛍光標識は、細胞質のコンダクタンスおよび（または）誘電率の変化を生じる。標識；保持流体の電気的特性；および印加電界の周波数の慎重な選択が、強化された分離を起生する。
本発明は、特に細胞質に関して記述した。しかし、非細胞質の分離もまた本発明を用いることによって達成可能である。
同様に、電極上のコーティングは化学的反応を強化／禁止し得る。コーティングは、疎水性または親水性の化学物質、酸性または塩基性の化学物質または抗体を含むことができる。粒子がDEP作用力により拘束されるという事実が反応速度を高めるのである。
【図１】
0003586279.tif 000021
【図２】
0003586279.tif 000022
【図３】
0003586279.tif 000023
【図４】
0003586279.tif 000024
【図６】
0003586279.tif 000025
【図５】
0003586279.tif 000026
【図７】
0003586279.tif 000027
【図８】
0003586279.tif 000028
【図９】
0003586279.tif 000029
【図１０】
0003586279.tif 000030
【図１１】
0003586279.tif 000031
【図１２】
0003586279.tif 000032
【図１３ａ】
0003586279.tif 000033
【図１３ｂ】
0003586279.tif 000034
【図１３ｃ】
0003586279.tif 000035
【図１３ｄ】
0003586279.tif 000036
【図１４ａ】
0003586279.tif 000037
【図１４ｂ】
0003586279.tif 000038
【図１５ａ】
0003586279.tif 000039
【図１５ｂ】
0003586279.tif 000040
【図１６ａ】
0003586279.tif 000041
【図１６ｂ】
0003586279.tif 000042
【図１７】
0003586279.tif 000043
【図１８ａ】
0003586279.tif 000044
【図１８ｂ】
0003586279.tif 000045
【図１９】
0003586279.tif 000046
【図２０】
0003586279.tif 000047
【図２１】
0003586279.tif 000048
【図２２】
0003586279.tif 000049
【図２３】
0003586279.tif 000050
【図２４】
0003586279.tif 000051
【図２５】
0003586279.tif 000052
【図２６】
0003586279.tif 000053