(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合した配位子をもつ担体材料を包含し、生物重合体の分離および固定化に供される耐アルカリ水溶液性吸着剤において、担体材料が重合体網状組織で完全にあるいは部分的に浸透されているかまたは表面被覆されている固体相からなり、そして配位子は構造：
Ｘ−Ｓ−（CH2）ｎ−Ｒ
式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２であり、Ｒは環構造中に少なくとも１個の窒素原子をもつπ電子に富んだ環系である、を有する、上記吸着剤。
【請求項２】
生物重合体がタンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
固体相は1mm未満の直径をもつ粒子あるいは1mmを越えない厚さをもつ隔膜からなる、請求項１又は２に記載の吸着剤。
【請求項４】
重合体網状組織はポリヒドロキシ重合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項５】
ポリヒドロキシ重合体は、ポリガラクタンである、請求項４に記載の吸着剤。
【請求項６】
ポリガラクタンが寒天又はアガロースである、請求項５に記載の吸着剤。
【請求項７】
重合体網状組織は、ポリアミドからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項８】
ポリアミドが橋かけ結合したポリアクリルアミド又はその誘導体である、請求項７に記載の吸着剤。
【請求項９】
固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するか、あるいは表面被覆した無機重合体からなる、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１０】
無機重合体がシリカ又はその誘導体である、請求項９に記載の吸着剤。
【請求項１１】
固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するか、あるいは表面被覆した疎水性有機重合体からなる、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１２】
疎水性有機重合体がポリスチレンである、請求項11に記載の吸着剤。
【請求項１３】
Ｒは
0003553962.tif 000007
式中、ＺはＮまたはCHである、
からなる、請求項１から請求項12のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１４】
配位子は、ピコリルチオエーテル基を含む、あるいは該基からなる、請求項１から請求項13のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１５】
スペーサーアームは、構造−CH2−CHOH−CH2−を含む、請求項１から請求項14のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１６】
吸着剤は、40℃の1M  NaOHに対して少なくとも13日間耐える、請求項１から請求項15のいずれか１項に記載の吸着剤。
【請求項１７】
最初に重合体網状組織中にチオール基を導入し、次に求電子性の側鎖をもつ複素芳香族基を導入する、前記請求項１から16に記載の吸着剤の製造方法。
【請求項１８】
複素芳香族基は、構造−（CH2）ｎ−Ｙ、
式中、Ｙはハロゲンであり、ｎは１または２である、をもつ側鎖置換基を有する、請求項17記載の吸着剤の製造方法。
【請求項１９】
ハロゲンが塩素である、請求項18に記載の吸着剤の製造法。
【請求項２０】
複素芳香族基に付く求電子性側鎖は、ビニル置換基からなる、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から請求項16に記載の吸着剤を生物重合体の分別に使用する方法。
【請求項２２】
生物重合体がタンパク質、ペプチド又は核酸である、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、共有結合した配位子をもつ担体材料を包含する、タンパク質の分離および固定化に供するための吸着剤、該吸着剤の製造法、および使用法に関する。更に詳しく言えば、本発明吸着剤は耐アルカリ性であるため、ある処理工程の間にアルカリ性溶液に曝露されることがありうるタンパク質との使用法に適している。
クロマトグラフ法においては、異なる塩濃度で種々な型の塩を添加することによりタンパク質の吸着を増大させ、溶離用緩衝液から塩を除去した後でタンパク質を吸着剤から脱着させる方法でタンパク質を精製することができ、あるいは種種な画分に分割することができる。
先行技術
現在、タンパク質の精製に対しては、タンパク質の溶離時に大きいタンパク質損失を起こす配位子をもつタンパク質吸着剤が使われている。
1M苛性アルカリ溶液で吸着剤を洗浄した後でも、タンパク質が吸着剤上に残留し、その特性を変化させてしまう。従って、吸着剤を再使用すると、吸着剤上に残留するタンパク質によって他の試料混合物が汚染される危険が起こりうる。これら吸着剤の代替品として、IgGなどの単離に対し一層特異的な吸着剤が開発された。これら吸着剤の特徴は、タンパク質が吸着剤に共有結合されていてIgGに特異的に結びつくことである。その欠点は共有結合されたタンパク質が遊離しかつ漏出し、そのため医学的な問題を起こしうることである。
このような生物特異的吸着剤（それぞれタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇ）の代替品として、いわゆるチオフィリック（tiophilic）な吸着剤が開発された（Porath,Belew−SE−PS  8405431−１号）。しかし、これまでに開発された種類のチオフィリックな吸着剤はアルカリに安定でなく、そのため吸着剤を大規模処理工程で再使用する場合、細菌およびウィルス感染を防止しまた発熱物質による危険を防止する条件としての1M苛性アルカリ溶液による精製および洗浄を行なうと必ず望ましくない影響を受ける危険を伴う。
構造：
0003553962.tif 000002
を有する吸着剤が以前にEP−Ａ−Ｏ  180  563号及びSE−Ｂ−462  165号（PorathおよびOscarsson）明細書に記載されている。この吸着剤のもつ欠点は、これが硫黄および窒素の位置により決まる分子内の不都合な電子密度分布のためアルカリに対して安定でないことである。
式Ｉ中のピリジルスルフィド分子内の電子密度分布を下記の式IIに示す：
0003553962.tif 000003
分子内の電子密度分布を計算すると、炭素原子C1がその位置に電子欠乏を有することが示され、このことは求核的ヒドロキシル基がC1位のところで反応し、ヒドロキシピリジンの脱離を起こすことを意味する。硫黄とピリジン環との間にメチレン基を導入することによって上記分子内のピリジン環から硫黄を移動させる場合には、C1に及ぼす電子欠乏の望ましくない影響が起こらない。このことは実験的にも証明された。それによって吸着剤はアルカリに対して安定となり、吸着剤と接触したタンパク質に対して高い吸着効力をもち、更にタンパク質残渣が非常に低くなる。
本発明の目的は、1Mアルカリに長時間さらしても破壊されず、従って細菌、ウイルスおよび発熱物質を効果的に除去できる吸着剤を提供することにある。
本発明の更に一つの目的は、顕著な損失を伴なわずに溶離することのできる吸着剤を提供することである。
更に本発明は感染を見過ごす危険を起こすことなく1M苛性アルカリ溶液による溶離後に再使用できる吸着剤の提供を目的とする。
本発明に係る吸着剤は、1mm未満の直径をもつ微粉砕粒子あるいは1mmを越えない厚さをもつ隔膜の形をした重合体網状組織を包含する。
本重合体網状構造は多糖類のような親水性重合体、例えば橋かけ結合したセルロースまたはアガロース、橋かけ結合した多価（polyhydric）重合体、例えばポリビニルアルコール、からなり、あるいは橋かけ結合したポリアクリルアミドのこともありうる。この重合体網状構造へ、一般構造：
−Ｘ−Ｓ−（CH2）ｎ−Ｒ
式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２の整数であり、Ｒは環構造中に少なくとも１個の窒素原子（例えば、ニトロ基またはシアノ基）を有するπ原子に富む環系である、
をもつ配位子を共有結合させる。
本発明に係る吸着剤は特別な吸着特性を示す。これは特にタンパク質溶液との接触で、とりわけ高濃度のリオトロピックな塩類、例えばアルカリ金属、マグネシウムおよびアンモニウムの硫酸塩およびリン酸塩の存在下で示され、この場合タンパク質は吸着剤に対するそれらの優先的な親和性の比率によって異なる吸着力をもつ種類に分類される。本発明に係る吸着剤はまた幾つかの軟金属イオン、例えばAg+,Hg2+,Pd2+およびPt2+の吸着にも使用できる。
ここで本発明を吸着剤製造の例と共に更に詳細に説明することにする。
例  １
ピリジル−２−メチル  チオエーテル  アガロース
0003553962.tif 000004
最初に、50gの洗浄６％アガロースゲル（Sepharose 6B）を蒸留水で更に洗浄し、その後NaBH4  0.34gと2M  NaOH  35mlを加え、またエピクロロヒドリン25mlを１滴ずつ加えることによりエポキシ活性ゲルを製造する。次に反応を室温で約20時間続ける。
このゲル50gへ2M  Na2S2O3  10mlを加え、反応を室温で10時間続ける。
0.1M  NaHCO3  100ml中ジチオ−トレイトール（DTT）1.5gをゲル25gへ加え、室温で30分反応させることにより活性化を行なう。
活性化されたゲルをガラスフィルター上で蒸留水で洗浄してから、0.1M  NaHCO3中ピコリルクロリド（２−クロロメチル−ピリジン）2.5gを加え、pHを8.0に調節する。反応を室温で３時間行なう。ゲルを1M  NaOH中に40℃で13日間保つ前と後で窒素含量を元素分析することによりゲルの安定度試験を行なう。
0003553962.tif 000005
このように本発明に係るゲルは1M苛性アルカリで洗浄しても何等質低下の危険は無いが、例えばIgGの精製に以前から使われているゲルは、室温で1M苛性アルカリによる洗浄時に既に破壊される。
洗浄の前後で本発明に係るゲルを用いるIgGの精製（分別（fractionation））は、精製能力および特異性に関して何等有意な変化を示さなかった。
IgGの分別にゲルを再使用した際、差が認められなかった。
とりわけ下記の配位子：
0003553962.tif 000006
を有するゲルについても相応して好結果が得られた。
例  ２
ピリジル−４−メチル  チオエーテル  アガロース
例１と同じ方法でピリジル−４−メチル  チオエーテル  アガロースを製造するが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに同量の４−ピコリルクロリド（４−クロロメチルピリジン）を使用する。
例  ３
キノリン−２−メチル  チオエーテル  シリカ
丸底フラスコに100mlの乾燥トルエンと24gのシリカとを加え、次に乾燥トリエチルアミン3mlを加え、続いてｇ−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン30mlを加えた。混合物を３時間還流した後、ガラスフィルター上でトルエンにより洗浄し、10mlの2M  Na2S2O3で室温において10時間活性化する。この洗浄したゲルへ、0.1M  NaHCO3に溶解したジチオエリトリトール1gを加え、pHを7.5に調節する。30分反応後、ゲルをガラスフィルター上蒸留水で、続いてトルエンで洗浄する。トルエン洗浄したこのシリケートゲルへトルエンの溶解した2gのキノリン−２−メチルクロリドを加え、60℃で６時間反応させた後、ゲルをガラスフィルター上でトルエンにより洗浄する。
例  ４
イミダゾリルエチル  チオエーテル  アガロース
例１と同じ方法で調製するが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに同量のビニルイミダゾールを使用する。
例  ５
ウラシリル−６−メチル  チオエーテル  アガロース
例１と同じ方法で調製するが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに６−クロロメチルウラシルを使用する。
本発明に係るゲルの使用法
クロマトグラフ法においては、種々なタイプの塩を異なる塩濃度で添加することにより、タンパク質の吸着が増強される。溶離緩衝液から塩を除くとタンパク質が脱着される。
最適条件下で本発明吸着剤は、塩を含まない緩衝液による脱着後に、適用された全タンパク質の2.7％の残留を示した。
相当するコマーシャル製剤、オクチル−セファロースおよびフェニル−セファロースは、塩を含まない緩衝液による脱着後で、最適条件下で、適用された全タンパク質のそれぞれ29.3および8.1重量％の残留を示した。残留タンパク質の全パーセントが相応に大きい損失となるので、残留量を全く減少させることが経済的に非常に重要である。
上記のように、残留タンパク質および吸着剤の両者共、感染源、例えばウィルス、細菌、発熱物質、をもつことがあるが、それらは1M苛性アルカリでの洗浄により効果的に無害化される。1M苛性ソーダを用いた洗浄後に吸着剤上に残留するタンパク質の全量をアミノ酸分析により定量し、相当に温和な処理、即ち安全な再使用には不十分な処理、の後の現在使用されている吸着剤の値と比較した。前記の表から明白なように、40℃で13昼夜処理したとき、本発明に係る吸着剤についての窒素値が1.4重量％に保たれたのに対し、硫黄がピリジン核に直接結合したピリジンチオエーテル型吸着剤においては、冷苛性アルカリによる短時間の洗浄後で既に窒素値が1.4重量％から0.5重量％に減少した。
本発明に係るゲルの特性の高揚した理由は、配位子内の電子分布に及ぼす窒素原子および硫黄の効果によるものと想定される。配位子内のこれら原子の配置が不都合であると、とりわけ炭素原子上の電子欠乏が、電子の欠乏した炭素原子に対するヒドロキシル基（アルカリ溶液からの）の求核攻撃を可能ならしめる。このことは配位子の不安定性を意味する。本発明に係る吸着剤について、また現在使用されている相応のコマーシャル製剤についての電子分布の研究を行なってこの想定を確証した。