【手続補正書】
【提出日】平成29年6月16日(2017.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステップ（Ｉ）で、
共有結合によって生理活性表面（１）上に固定された、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される少なくとも１個の第１の分子（３）に、
少なくとも１個の特異的非共有結合の形態で、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択され、リガンド（６ａ）と化学的共有結合している、またはした少なくとも１個の第２の分子（４）を結合し、
少なくとも１個の第３の分子（５）と前記少なくとも１個の第２の分子（４）の結合が、少なくとも１個の特異的非共有結合を介して達成されるものであり、前記少なくとも１個の第３の分子（５）は一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択されるものであって、前記少なくとも１個の第３の分子（５）は第２のリガンド（６ｂ）と共有結合している、または共有結合したものであり、
分析物分子（９）を含む第１の緩衝液を前記表面（１）と接触させ、前記分析物分子（９）と前記リガンド（６ａ）及び前記第２のリガンドとの間の結合現象を分析的測定法によって検出し、
ステップ（ＩＩ）で、
前記第１の分子（３）と前記第２の分子（４）との間の前記特異的非共有結合を破壊し、前記表面上に非共有結合した分子を前記表面から除去するように、第２の緩衝液を前記表面（１）と接触させ、
その後、ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）を少なくとも１回繰り返す、生理活性表面上の分子の結合現象を検出する方法。
【請求項２】
前記リガンド（６ａ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のリガンド（６ｂ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンド（６ａ）と前記第２のリガンド（６ｂ）が同一である、または異なることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合現象を表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）および／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）によって検出することを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１個の分析物分子（９）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ＩＩ）で前記生理活性表面（１）と接触させる前記緩衝液は、ｐＨ値が３未満であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的非共有結合を破壊した後に、前記生理活性表面（１）を、ｐＨ値がｐＨ６〜ｐＨ８の範囲にある中和緩衝液と接触させることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される少なくとも１個の第１の分子（３）が共有結合によって生理活性表面（１）上に固定されており、
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択され、リガンド（６ａ）と化学的共有結合している少なくとも１個の第２の分子（４）が特異的非共有結合によって前記少なくとも１個の第１の分子（３）と結合されており、
少なくとも１個の第３の分子（５）が、少なくとも１個の特異的非共有結合を介して前記少なくとも１個の第２の分子（４）と結合しており、前記少なくとも１個の第３の分子（５）が、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択されるものであって、前記少なくとも１個の第３の分子（５）が、第２のリガンド（６ｂ）と共有結合しており、
前記第１の分子と第２の分子（３、４）の前記特異的非共有結合が、前記表面（１）を緩衝液と接触させることによって破壊可能である、分子の結合現象を検出する配置。
【請求項１０】
前記リガンド（６ａ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の配置。
【請求項１１】
前記第２のリガンド（６ｂ）が、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の配置。
【請求項１２】
前記リガンド（６ａ）と前記第２のリガンド（６ｂ）が同一である、または異なることを特徴とする、請求項９から１１のいずれか１項に記載の配置。
【請求項１３】
前記生理活性表面（１）が、結合現象の分析測定、好ましくは表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）および／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）による分析測定に適していることを特徴とする、請求項９から１２のいずれか１項に記載の配置。
【請求項１４】
少なくとも１個の分析物分子（９）が、好ましくは非共有結合を介して前記生理活性表面（１）と結合しており、前記分析物分子が好ましくはペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴ糖および分子質量が２００００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、特に好ましくは３０００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下である低分子化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９から１３のいずれか１項に記載の配置。
【請求項１５】
前記特異的非共有結合が、ｐＨ値がｐＨ３未満である緩衝液と接触させることによって破壊可能であることを特徴とする、請求項９から１４のいずれか１項に記載の配置。
【請求項１６】
前記表面（１）が本質的に乾燥していることを特徴とする、請求項９から１５のいずれか１項に記載の配置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明において、上記目的は、請求項１に記載の方法および請求項９に記載の配置によって達成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本方法は、請求項１に記載の特徴を備える。生理活性表面上の分子の結合現象を検出する本発明に係る方法の場合、第１のステップ（Ｉ）において、共有結合によって生理活性表面上に固定された少なくとも１個の第１の分子に、少なくとも１個の特異的非共有結合の形態で、少なくとも１個の第２の分子を結合する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
上記の如く、下相と結合した固定相の結合安定性に影響を与えることなく、例えば、好ましくは表面プラズモン共鳴分光（ＳＰＲ）、光干渉測定（ＬＩＭ）および／または水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いて、リガンド−分析物結合現象を検出するために、ステップ（Ｉ）とステップ（ＩＩ）の間でさらなるステップ（Ｉｉ）を実施することができる。生理活性表面は、好ましくは少なくとも１個の特異的、より好ましくはただ１個の特異的分析物分子（例えば、分析物分子としてのタンパク質）を含む溶液と接触させられる。その後、分析物分子と生理活性表面の結合現象を分析測定によって測定する。ここで、少なくとも１個の第２の分子と結合したリガンドを、溶液の分子にとっての結合パートナーとみなす。また、第３の分子が（いわゆる第２の）リガンドを含む場合、このリガンドも結合パートナーとみなし、両リガンドが分析物分子との結合に参加する場合、結合が特に強くなる。第１、第２および／または第３の分子は、単にリガンド（複数可）のプラットホームとして働き、分析物との結合に参加することを意図していない。したがって、具体的には本発明に係る方法により、潜在的なリガンドを既知の分析物に提供することができ、分析物分子とリガンドとの間の結合現象を測定することができる。特に粒子またはビーズを用いるおよび粒子またはビーズ上での適用中に、ＡＬＰＨＡ（増幅発光近接均質アッセイ）に基づく方法（PerkinElmer）を使用することにより、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる。さらに、蛍光を利用した粒子ソーティングシステム、例えば、分子結合または分子−分子相互作用を蛍光／化学発光によって検出することができるフロースルー細胞数測定またはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）などへの利用が考えられる。かかる場合、蛍光色素によるターゲットへのマーキングなどを行うためのさらなるステップ／インキュベーションが必要となり得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本配置は、請求項９に記載の特徴を備える。分子の結合現象を検出する本発明に係る配置は、共有結合によって生理活性表面上に固定された少なくとも１個の第１の分子を有する。さらに、本発明に係る配置は、特異的非共有結合によって少なくとも１個の第１の分子に結合した少なくとも１個の第２の分子を有し、該特異的非共有結合は破壊可能である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【図１】バイオセンサチップの投入および再生を示す図である。
【図２ａ】ＱＣＭシグナル図を参照してＤＮＡ一本鎖の可逆的ハイブリダイゼーション（Ａ’；Ａ）の例を示す図である。
【図２ｂ】ＱＣＭシグナル図を参照して固定化分子と可動性分子との間の結合現象（会合および解離）を検出する実験例を示す図である。
【図２ｃ】ＱＣＭシグナル図を参照して固定化分子と可動性分子との間の結合現象（会合および解離）を検出する実験例を示す図である。
【図２ｄ】ＱＣＭシグナル図を参照して固定化分子と可動性分子との間の結合現象（会合および解離）を検出する実験例を示す図である。
【図３】さらなる実施形態を参照した本発明による方法原理の概略図である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
図１は、バイオセンサチップの投入および再生を示し、初期状態Ａのバイオセンサチップは、第１の分子として共有結合したＤＮＡ一本鎖３の固定化を有する。生理活性表面１上のＤＮＡ一本鎖３は、共有結合した複合体２に共有結合的に固定される。少なくともＤＮＡ一本鎖３と共有結合した複合体２から形成された下相を符号８で示す。本方法のステップ（Ｉ）では、下相８を、第２のＤＮＡ一本鎖４を第２の分子として含む緩衝液と接触させる。第２のＤＮＡ一本鎖４は共有結合的にカップリングしたリガンド６を有する。緩衝液との接触中、第２のＤＮＡ一本鎖４は、ＤＮＡ二本鎖の形成によって、固定されたＤＮＡ一本鎖３と相補的に、すなわち特異的に非共有結合的にハイブリダイズする。ここで、上側固定相を形成する領域を符号７で表す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
図２ａで、上記の２本のＤＮＡ一本鎖のハイブリダイゼーション（Ａ’；Ａ）を、ＱＣＭシグナル図から理解できるように、移動相（ハイブリダイゼーション緩衝液）中に存在し、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と抱合しているＤＮＡ一本鎖Ａは、固定されたＤＮＡ一本鎖Ａ’とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションによって固定された第２の分子、すなわち、ＣｓＡ抱合ＤＮＡ  Ａを切り離すために、２．５ｍＭ  ＨＣｌを用いてセンサチップの表面を１２０秒間洗い流すまたはインキュベートすることができる。さらに、図２ａから推論することができるように、ハイブリダイゼーションサイクル、すなわち、固定されたＤＮＡ一本鎖Ａ’ ５１、５２、５３とＤＮＡカップリングとの繰り返しが、対応するＱＣＭシグナルを示している。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
図２ｂ〜図２ｄで、図２ａに記載される、固定されたＣｓＡ分子と、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、変異型シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）、シクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）、との間の結合工程（会合および解離）を測定するための運動実験を、ＱＣＭシグナル図を参照しながら示す。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
先ず、図２ａに記載される、ＤＮＡ  ＡとカップリングしたＣｓＡ分子が固定されているＱＣＭチップを、タンパク質結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１μｍ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ｐＨ７．４）で洗浄し、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）およびシクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）を種々の濃度でタンパク質結合緩衝液にそれぞれ添加する。対応するシクロフィリン分子濃度は、図２ｂ〜図２ｄの図から推論され得るように、より強いＱＣＭシグナルとして表れる。種々の分子濃度のシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ、図２ｂ）、シクロフィリンＡ変異体（ＣｙｐＡ変異体、図２ｃ）およびシクロフィリン４０（Ｃｙｐ４０、図２ｄ）の注入（接触）を、それぞれ２５μｌ／分の流量、２２℃で８４秒の注入期間行った。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
図２ｂは、９番目のハイブリダイゼーションまたは脱ハイブリダイゼーション（dehybridization）サイクルにおけるＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐＡの結合および解離を示している。ここで、ＣｙｐＡは以下の濃度のものを使用した：６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭ。ＱＣＭシグナルの測定後には、それぞれセンサチップを１％ラウリル硫酸ナトリウム緩衝液（ＳＤＳ）で１２０秒間洗い流して洗浄した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
図２ｃは、ＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐＡ変異体の結合および解離を示しており、ＣｙｐＡ変異体を３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度で供給した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
図２ｄは、ＱＣＭセンサチップ上のＣｙｐ４０の結合および解離を示しており、Ｃｙｐ４０を３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度で供給した。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
図２ｂ〜図２ｄに使用されている本発明に係るＱＣＭセンサチップのいずれにおいても、結合実験（２ｂ〜２ｄ）の実施中に、１％ＳＤＳ緩衝液による洗浄工程の結果としてのＤＮＡ二重螺旋（Ａ’；Ａ）の脱ハイブリダイゼーションが確立されなかった。ＣｓＡカップリングＤＮＡ鎖Ａの切り離しまたは脱ハイブリダイゼーションは、ｐＨ低下によってのみ達成することができる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
図３は、バイオセンサチップの生理活性表面上への分子の結合現象を検出する本発明に係る方法原理の概略図であり、方法の進行を矢印で示す。初期状態Ａにおいて、バイオセンサチップの生理活性表面１は、結合緩衝液によって完全に覆われており、チップ１と化学的共有結合している一本鎖ＤＮＡに関する少なくとも第１の分子３の固定化を有する。この化学的共有結合固定化は、例えば、チップを、ＥＤＣ／ｓＮＨＳの存在下で遊離アミノ基（ＮＨ２−ｓｓＤＮＡ）を有する一本鎖ＤＮＡと遊離カルボキシル基を反応させることによって達成することができる。同様に、遊離カルボキシル基を有するいずれのリガンド６ａ、６ｂも、ＮＨ２−ｓｓＤＮＡ４、５およびＥＤＣ／ｓＮＨＳと反応するよう作成される。結果として、リガンド６ａ、６ｂと化学的共有結合した本発明に係る第２の分子４および／または第３の分子５を作成することができる。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2016523372.tif 000001
【図２ａ】
2016523372.tif 000002
【図２ｂ】
2016523372.tif 000003
【図２ｃ】
2016523372.tif 000004
【図２ｄ】
2016523372.tif 000005
【図３】
2016523372.tif 000006