(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子化合物にビオチンを結合した後、該低分子化合物を抗低分子化合物抗体結合担体に結合し、洗浄した後、アビジン結合ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）断片を上記ビオチン・低分子化合物・抗低分子化合物抗体結合担体結合体のビオチン部分に結合し、ＤＮＡの増幅反応を行って該ＤＮＡの量から低分子化合物量を定量することを特徴とする低分子化合物の高感度測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低分子化合物の高感度測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
低分子化合物からなる薬物等の測定方法としては、従来から液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等による方法が知られているが、これらの方法では、ｎｇ／ｍｌオーダーまでの測定が限度であり、測定対象が薬物である場合、測定感度が低過ぎるという問題があった。
【０００３】
上記測定感度向上の試みとして、例えば、「酵素免疫測定法」第３版、第３６４頁〜第３８１頁、医学書院発行（１９８７年）や特開平２−３０７０５７号公報に、酵素免疫測定法が開示されている。
上記酵素免疫測定法は、低分子量の薬物及び低分子量の薬物に酵素が結合したコンジュゲートを第１抗体へ競合結合させ、次いで、得られた低分子量の薬物結合第１抗体及び上記コンジュゲート結合第１抗体を、第２抗体を介して第２抗体結合担体に結合させ、得られた上記コンジュゲート・第１抗体・第２抗体の担体結合複合体の量を酵素反応を利用して測定し、対象薬物を定量するものである。上記酵素免疫測定法では、ｐｇ／ｍｌオーダーまでの測定が可能である。しかし、上記酵素免疫測定法は、いずれも低分子量の薬物と低分子量の薬物に酵素が結合したコンジュゲートとの第１抗体に対する競合反応であるために、測定下限付近のバラツキが大きく測定感度に欠けるという問題点を有する。
【０００４】
又、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２３巻、第４４５頁〜第４５３頁（１９９０年）には、低分子化合物にビオチンを結合した後、該低分子化合物を抗低分子化合物抗体結合担体に結合し、洗浄した後、該抗低分子化合物抗体結合担体から低分子化合物を解離させ、該低分子化合物に酵素標識抗低分子化合物抗体を結合し、得られる低分子化合物・酵素標識抗低分子化合物抗体結合体に、更に、アビジン結合担体を結合し、得られた上記低分子化合物・酵素標識抗低分子化合物抗体・アビジン結合担体複合体の量を酵素反応を利用して測定し、対象低分子化合物を定量するものである。
【０００５】
しかし、低分子化合物を軟膏剤、ローション剤、貼付剤等の剤型で治療した患者の血中の薬物濃度の測定では、ｐｇ／ｍｌオーダー以下の濃度まで高感度に測定することが要求される。
このような場合、上記非競合酵素免疫測定法では測定困難もしくは測定不能となるおそれがある。更に、上記非競合酵素免疫測定法は、処理ステップが多く、操作が複雑である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、叙上の事実に鑑みなされたものであって、その目的とするところは、低分子化合物を、簡便な操作で、ｐｇ／ｍｌオーダー以下の濃度まで高感度に測定し得る低分子化合物の高感度測定法を提供するにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、低分子化合物にビオチンを結合した後、該低分子化合物を抗低分子化合物抗体結合担体に結合し、洗浄した後、アビジン結合ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）断片を上記ビオチン・低分子化合物・抗低分子化合物抗体結合担体結合体のビオチン部分に結合し、ＤＮＡの増幅反応を行って該ＤＮＡの量から低分子化合物量を定量することを特徴とする低分子化合物の高感度測定法をその要旨とするものである。
【０００８】
本発明において低分子化合物は、高分子化合物に対する語として使用したものであって、厳密に分子量を特定するものではないが、分子量１００００以下、就中、分子量１００００以下の生理活性を有する薬物が好ましい対象となる。
【０００９】
上記ビオチンは、分子式Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２  で表され、後述するアビジンとが選択的に結合するものである。
又、測定対象である低分子化合物にビオチンを結合する手段は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−メチルスクシンイミドビオチン等のビオチン誘導体を直接結合もしくは架橋試薬を介して結合する方法が挙げられる。
【００１０】
上記抗低分子化合物抗体は、上記低分子化合物もしくは上記低分子化合物に牛血清アルブミン等の高分子化合物を結合したものをウサギ等の動物に免疫して得られた抗体である。
上記担体は、免疫測定法で使用されるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、プラスチックプレート等が挙げられる。
【００１１】
上記洗浄に用いられる洗浄液は、未反応のビオチン及び他の基質に結合したビオチンを洗い流すことのできるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、リン酸バッファー、トリスバッファー等が挙げられる。
上記アビジンは、塩基性のアルブミン様の結晶性タンパク質であり、例えば、卵白のアビジン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ  由来のストレプトアビジン等が挙げられる。
【００１２】
上記アビジン結合ＤＮＡ断片は、アビジンにＤＮＡ断片が直接結合もしくは架橋試薬を介して結合したものが挙げられる。
上記ＤＮＡ断片は、どの様な種類のＤＮＡ断片でもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等のＤＮＡ断片が挙げられる。
上記アビジンとＤＮＡ断片の直接結合は、アビジンにＤＮＡ断片が、例えば、アビジンのアミノ基とＤＮＡ断片のリン酸基が結合したもの、アビジンと５’末端又は３’末端にＳ（硫黄）を結合しているＤＮＡ断片がＳを介して結合したもの等が挙げられる。
【００１３】
又、上記架橋試薬としては、タンパク質の架橋試薬として使用されるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、グルタールアルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリジルジスルフィド基を有する化合物等が挙げられる。
【００１４】
上記ＤＮＡの増幅反応は、上記ＤＮＡ断片にプライマーをアニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うものであり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
本発明の低分子化合物の高感度測定法は、複数種の既知濃度の試料の測定データに基づき、予め作成された検量線を用いて、常法に従い、未知試料の測定が行われる。
【００１５】
【発明の実施の態様】
以下に、実施例を挙げて本発明の実施の態様を説明する。
【００１６】
（１）ストレプトアビジン−ラムダファージＤＮＡの調製
ＤＮＡとしてラムダファージＤＮＡを使用して以下のようにＴａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）中にあるラムダファージＤＮＡ１０μｌ（１０μｇ）に、１μｌのＡＴＰαＳ（アデノシン３リン酸のα位のＰをＳに置換したもの）、１μｌのＧＴＰαＳ（グアノシン３リン酸のα位のＰをＳに置換したもの）、１μｌのＣＴＰαＳ（シトシン３リン酸のα位のＰをＳに置換したもの）、１μｌのＴＴＰαＳ（チミン３リン酸のα位のＰをＳに置換したもの）（いずれも第一化学薬品社製）及び１μｌの末端デオキシヌクレオチジルキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃×１０分間反応を行い、３’末端にＳが付加されたラムダファージＤＮＡを得た。
【００１７】
次に、ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）５．４ｍｇ（１５．１μｍｏｌ）を２００μｍｏｌの無水ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬工業社製）２．０ｍｇを含む５０μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（和光純薬工業社製）３．２ｍｇを含む１００μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液を加え、遮光して、室温にて７０分間攪拌することにより、活性化ストレプトアビジンを得た。
【００１８】
上記活性化ストレプトアビジンを上記３’末端にＳが付加されたラムダファージＤＮＡに滴下し、遮光室温にて２時間反応した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ含有）にて４℃で２日間透析した。
得られたストレプトアビジンとラムダファージＤＮＡの結合体を結晶化し、これにグリセロールを添加し、グリセロール溶液として−２０℃で保存した。
【００１９】
（２）インドメタシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲートの調製
インドメタシン（和光純薬工業社製）５．４ｍｇ（１５．１μｍｏｌ）を２００μｍｏｌの無水ジメチルホルムアミド（前出）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（前出）２．０ｍｇを含む５０μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（前出）３．２ｍｇを含む１００μｌの無水ジメチルホルムアミド溶液を加え、遮光して、室温にて７０分間攪拌することにより、活性化インドメタシンを得た。
【００２０】
上記活性化インドメタシンを、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（和光純薬工業社製）２００μｇを含む１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴下し、遮光して、室温にて２時間反応した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ含有）にて４℃で２日間透析してインドメタシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲートを結晶化し、これにグリセロールを添加し、グリセロール溶液として−２０℃で保存した。
【００２１】
（３）第一抗体（抗血清）の調製
上記（２）項と同様にして得られた活性化インドメタシンを、窒素ガス下で乾固し、次いで、再度１００μｌの無水ジメチルホルムアミド（前出）に溶解した後、この溶液を２０ｍｇの牛血清アルブミン（シグマ社製）を含む１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に滴下し、遮光して、室温にて７０分間攪拌することにより、インドメタシン−牛血清アルブミン複合体を得た。
上記複合体溶液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ含有）にて４℃で２日間透析した。
上記透析によって精製されたインドメタシン−牛血清アルブミン複合体０．２ｍｇを含む溶液０．５ｍｌとフロイントコンプリートアジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）０．５ｍｌとを混合し、該混合物を雄のウサギに注射し、更に、４週間後、同様に同量注射し、その１週間後に、ウサギより採血し、血清を分離し、該血清を５６℃で３０分間加熱した後、−２０℃で保存した。
【００２２】
（４）ＤＮＡの増幅反応
ＤＮＡの増幅反応には、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（前出）を用い、反応の温度制御には、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＭ  （宝酒造社製）を用いた。
先ず、ラムダファージＤＮＡを９２℃で一本鎖にし、次に上記  Ｋｉｔ中のコントロールプライマー１、２を４５℃でアニーリングした後、７２℃で上記  Ｋｉｔ中にデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混合物を加え、上記  Ｋｉｔ中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行った。このサイクルを１サイクルとして６０サイクルの反応を行った。
【００２３】
（実施例１）
表１に示す濃度のインドメタシン含有ヒト血漿１００μｌに０．１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．５、０．３Ｍ−ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕９００μｌを加え、攪拌後、１００℃で加熱処理し、１４０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離して除タンパクした。
この上清１００μｌに、Ｎ−メチルスクシンイミドビオチン（シグマ社製）の４０ｍｍｏｌ／ｌジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）溶液５μｌを加え、３０℃で３０分間反応し、更に、２Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を加え、３０℃で３０分間反応して、インドメタシン−ビオチン結合体を得た。
【００２４】
上記インドメタシン−ビオチン結合体反応液に０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３  含有〕を６３５μｌ加えて反応を停止した後、予め上記第一抗体（抗血清）溶液５０μｌを１００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３  含有〕に溶解した溶液で４８時間浸漬後、更に、０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕で１８時間浸漬し、ブロッキングしたポリスチレンビーズを加え、１５℃で４時間反応を行ってインドメタシン−ビオチン結合ポリスチレンビーズを得た。
【００２５】
上記反応で得られたインドメタシン−ビオチン結合ポリスチレンビーズを、０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕で３回洗浄することにより、未反応のビオチン及びインドメタシン以外と反応したビオチンを除去した。
上記インドメタシン−ビオチン結合ポリスチレンビーズ及びアビジン結合ラムダファージＤＮＡを、０．０１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン塩酸酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ・Ｎａ２  含有）５００μｌに加えた後、３０℃で２時間、ビオチン−アビジンの結合反応を行った。
上記ビオチン−アビジンの結合反応後、前記ＤＮＡの増幅反応を行い、吸光度測定装置でＤＮＡの定量を行った。測定結果は表１に示す。
【００２６】
（比較例１）
表１に示す濃度のインドメタシン含有ヒト血漿１００μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  含有）９００μｌを加え、攪拌後、１００℃で加熱処理し、１４０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離して除タンパクした。
この上清１００μｌに、４℃下でインドメタシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲート５０μｌ及び抗血清５０μｌを加え、攪拌後、４℃で１８時間静置した。上記溶液に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  含有）２００μｌを加え、攪拌後、予めヤギ抗ウサギＩｇＧ（カッペル社製）１５ｍｇを１００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  含有）に溶解した溶液で４８時間浸漬後、更に、０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕で１８時間浸漬し、ブロッキングしたポリスチレンビーズを加え、１５℃で４時間反応を行った。
然る後、上記反応によって得られたポリスチレンビーズを、０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕で３回洗浄することにより、上記ポリスチレンビーズに結合していないインドメタシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲートを除去した（Ｂ／Ｆ分離）。
【００２７】
上記Ｂ／Ｆ分離したインドメタシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲート結合ポリスチレンビーズを、０．０１Ｍリン酸緩衝液〔ｐＨ７．０、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含有〕に加えた後、０．３ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−  β−ｇａｒａｃｔｏｓｉｄｅ、シグマ社製）を２００ｍｌ加え、３７℃で２時間酵素反応を行った。
上記反応液に０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を２ｍｌ加えて反応を停止させた後、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドから生成した４−メチルウンベリフェリルの蛍光強度（励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ）を測定した。
測定結果は表１に示す。
【００２８】
【表１】
0003553215.tif 000002
【００２９】
【発明の効果】
本発明の低分子化合物の高感度測定法は、叙上の如く構成され、測定対象低分子化合物をビオチンとコンジュゲートし、アジビン結合ＤＮＡ断片を非競合的に結合させ、ＰＣＲ反応（ＤＮＡの増幅反応）を行った後、ＤＮＡの量を測定することによって、低分子化合物の定量を行うものであるので、従来の定量法では測定不能であったｐｇ／ｍｌレベル以下の濃度まで測定可能となった。