(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（5-S-GAD）、又は薬学的に許容されるその塩を有効成分として含む、破骨細胞形成阻害剤。
【請求項２】
破骨細胞関連疾患の治療及び／又は予防のために用いる、請求項１に記載の破骨細胞形成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス誘導剤並びに破骨細胞形成阻害剤に関し、より具体的にはＳａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ（ニクバエ）成虫から分離することができる、グルタチオンとβ−アラニル−ジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｏｐａ）との複合体である化合物を有効成分として含むアポトーシス誘導剤並びに破骨細胞形成阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
昆虫は、体の損傷又は微生物感染に対する応答として様々な防御分子、例えば、抗細菌タンパク質、抗菌タンパク質及びレクチンを生成することが知られている（Ｂｏｍａｎ，Ｈ．Ｇ．（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６５，  ２０５−２０７；  Ｎａｔｏｒｉ，Ｓ  （１９９４）  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｃｈｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  Ｖｏｌ．１８６，  ｐｐ．１２３−１３４，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；  Ｎａｔｏｒｉ，Ｓ．  （１９９８）ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔｓ  （Ｂｒｅｙ，Ｐ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｈｕｌｔｍａｒｋ，  Ｄ．，  Ｅｄｓ．），  ｐｐ．２４５−２６０，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ；  及びＨｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．（１９９５）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７，４−１０）。
【０００３】
ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）を用いた昆虫免疫の研究中に、本発明者らは免疫した成虫の溶解物中に新規な物質を単離し、これがＮ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）であることを同定した（Ｌｅｅｍ  Ｊ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６，  ２７１，  １３５７３−１３５７７；  Ｎａｔｏｒｉ  Ｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔｓ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，  １９９８，  ２４５−２６０；及び特開平８−３３７５９４号公報）。５−Ｓ−ＧＡＤは抗菌物質として最初に発見されたが、５−Ｓ−ＧＡＤの抗菌活性はＨ２Ｏ２を分解するカタラーゼで阻害されたことから、５−Ｓ−ＧＡＤの抗菌活性はそのカテコール成分由来のＨ２Ｏ２によるものであることが示唆された。
【０００４】
一方、本発明者らはｖ−ｓｒｃで形質転換したＮＩＨ３Ｔ３（マウス繊維芽）細胞の溶解物（Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７，  ４２３−４２６）及び組み換えｃ−Ｓｒｃ（Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４６，  １９５０−１９５１；及びＺｈｅｎｇ，Ｚ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４７，  １３６−１３７）をインビトロで用いることによって、５−Ｓ−ＧＡＤがタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の強力な阻害剤であることを実証した。ＰＴＫは細胞の増殖および分化の調節において重要な役割を担っていることが知られていることから、５−Ｓ−ＧＡＤはタンパク質チロシンチリン酸化を伴う様々な生物学的現象の解析のための有用なツールになると考えられた。また、ｃ−ｓｒｃを標的化して破壊することにより、マウスでは大理石骨病が生じることが報告されている（Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４，  ６９３−７０２）。しかしながら、５−Ｓ−ＧＡＤが破骨細胞形成に及ぼす影響並びにアポトーシスに及ぼす影響については不明であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、５−Ｓ−ＧＡＤが破骨細胞形成に及ぼす影響、並びに細胞アポトーシスに及ぼす影響を解明することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、破骨細胞と初代骨髄細胞の同時培養系を用いてインビトロにおける破骨細胞の形成に及ぼす５−Ｓ−ＧＡＤの効果を調べた結果、５−Ｓ−ＧＡＤはこの系で破骨細胞の形成を有意に阻害することを見出した。さらに本発明者らは、ヒト前骨髄細胞株ＨＬ６０細胞を用いて５−Ｓ−ＧＡＤの効果を調べた結果、５−Ｓ−ＧＡＤは細胞のアポトーシスを誘導することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、アポトーシス誘導剤に関する。本発明のアポトーシス誘導剤は、例えば、アポトーシス減少に起因する疾患の治療及び／又は予防のために使用することができる。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、破骨細胞形成阻害剤が提供される。
本発明の破骨細胞形成阻害剤は、破骨細胞関連疾患の治療及び／又は予防のために使用することができる。
【０００９】
本発明の別の観点によれば、アポトーシスを誘導する方法であって、薬理学的に有効量の５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；並びに、破骨細胞の形成を阻害する方法であって、薬理学的に有効量の５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の観点によれば、アポトーシス誘導剤の製造における５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩の使用；並びに破骨細胞形成阻害剤の製造における５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩の使用が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤の有効成分は、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる化合物である。５−Ｓ−ＧＡＤの化学構造を以下に示す。
【００１２】
【化１】
0003586809.tif 000002
【００１３】
５−Ｓ−ＧＡＤには不斉炭素が存在するが、それらの不斉炭素の立体配置は特に限定されず、Ｓ−又はＲ−配置（α位又はβ位と呼ぶ場合もある）のいずれであってもよい。上記化合物が、１若しくは２個以上の不斉炭素に基づく異性体として存在可能な場合には、立体化学的に純粋な形態の任意の異性体（光学異性体、ジアステレオ異性体など）や、任意の異性体の混合物又はラセミ体などを用いることができる。
【００１４】
また、５−Ｓ−ＧＡＤ又はその機能性誘導体は、薬学的に許容される塩の形態で本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤に配合してもよい。さらに、遊離形態又は塩の形態の５−Ｓ−ＧＡＤの水和物又は溶媒和物を本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤に有効成分として配合して用いてもよい。
【００１５】
薬学的に許容される塩には酸付加塩、塩基付加塩、及びアミノ酸付加塩などが包含される。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、トリエチルアミン塩などのアミン塩を用いることができる。アミノ酸付加塩としては、例えば、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩を用いることができる。
【００１６】
本発明で有効成分として用いるＮ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）は、特開平８−３３７５９４号公報等に記載の公知の製造方法に準じて製造することができる。
具体的には、５−Ｓ−ＧＡＤは、センチニクバエの成虫に傷を与えて飼育した後に体液を採取するか、ホモジネート化して原料となし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣにより分離・分画処理して抗菌活性を有する画分を採取する方法により得ることができる。
【００１７】
あるいは、５−Ｓ−ＧＡＤはアミノ酸の縮合合成法及び酵素処理法の両方を利用して合成することもできる。具体的には、ｔ−ブトキシカルボニル−β−アラニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＬ−β−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｏｐａ）とをジクロロメタン、トリエタノールアミン、シアン化メチル及びジメチルフルオリドの存在下に反応させ、反応混合物に１Ｎ塩酸を添加して酸性条件下で酢酸エチルを用いて抽出処理を行う。酢酸エチル層について減圧下で濃縮して析出する結晶を回収し、溶解後、ＨＰＬＣにより精製してβ−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（β−アラニル−ｄｏｐａ）を得る。なお、β−アラニル−ｄｏｐａは、液相ペプチド合成法により調製することもできる。次いで、β−アラニル−ｄｏｐａをグルタチオンと共にリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼにて処理し、塩酸などで反応液のｐＨを１とした後、ＨＰＬＣにより分離・精製することで５−Ｓ−ＧＡＤを得ることができる。
【００１８】
本発明では５−Ｓ−ＧＡＤの機能性誘導体を有効成分として使用することもできる。５−Ｓ−ＧＡＤの機能性誘導体とは、５−Ｓ−ＧＡＤに存在する１以上の官能基を適当な置換基で修飾した誘導体であって、５−Ｓ−ＧＡＤと同等以上のアポトーシス誘導活性又は破骨細胞形成阻害活性を有する誘導体を意味する。修飾される官能基としては、例えば、５−Ｓ−ＧＡＤにおける３つのカルボキシル基、２つのアミノ基または２つの水酸基の何れか１つ以上が挙げられる。カルボキシル基の修飾の例としては、アルコールと反応させてエステル体としたもの、又はアミン化合物と反応させてアミド体としたもの等が挙げられる。また、アミノ基の修飾の例としては、カルボン酸と反応させてアミド体としたもの、アミノ基中の片方又は両方の水素原子を置換基（好ましくは低級アルキル基など）で置換したもの等が挙げられる。また、水酸基の修飾の例としては、カルボン酸と反応させてエステル体としたもの、水酸基中の水素原子を置換基（好ましくは低級アルキル基など）で置換したもの等が挙げられる。これらの５−Ｓ−ＧＡＤの機能性誘導体は、上記した５−Ｓ−ＧＡＤの製造方法に準じて通常の有機化学合成法に従って入手することができる。
【００１９】
本発明の一つの態様によれば、５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、アポトーシス誘導剤が提供される。
アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は古典的細胞死である壊死（ネクローシス、ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とは形態学的に異なる細胞死として最初に発見され定義され（Ｋｅｒｒ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２６，  ２３９，  １９７２）、その後の研究からアポトーシスの誘導および抑制は遺伝子によって支配される、いわゆるプログラムされた細胞死であることが判ってきた。アポトーシスでは細胞の活性化に伴い、複雑な生化学反応が起こり、種々のタンパク質やＤＮＡの分解酵素が産生され、これが自身の細胞に作用して細胞死がもたらされる。アポトーシスは正常な発生・分化に不可欠な生理的細胞死であり、正常な生体組織の細胞回転などにおいて個々の細胞に起こっている。そのため、アポトーシスが過剰に減少すると多くの機能障害の原因になることが判明している。例えば、アポトーシスの減少に起因する疾患としては悪性腫瘍（癌）、白血病、自己免疫性疾患、ウイルス感染疾患（ＨＩＶ感染など）、増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、肝炎、腎疾患等を挙げることができる。従って、本発明のアポトーシス誘導剤は、これらのアポトーシスの減少に起因する疾患の治療及び／又は予防剤として使用できる可能性がある。
【００２０】
アポトーシスの形態学的特徴として、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及び核凝縮、核の分節化等を挙げることができ、更に、細胞表面の微絨毛の消失及び細胞表面の平滑化（細胞表面の水泡形成：ｍｅｍｂｒａｎｅｂｌｅｂｂｉｎｇ  ）等も観察される。また、エンドヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡが断片化する現象も観察され、細胞自体がアポトーシス小体とよばれる細胞断片を形成し、この形成されたアポトーシス小体が、迅速に周囲の細胞やマクロファージ等により貪食分解され、アポトーシスが起こるとされている。従って、アポトーシスの確認は、例えば、細胞から抽出したＤＮＡの断片化と細胞の形態的な観察などで行うことができる。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、５−Ｓ−ＧＡＤ、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、破骨細胞形成阻害剤が提供される。
破骨細胞は、直径２０〜１００μｍの大きさを有し、約５０個ほどの核を含む大型多核細胞で、骨細胞を吸収及び除去する作用を有する。健常な生体においては、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収はバランスよく保たれ、その結果、骨組織は基本的形状を変えることなく常に新生骨と置換されて健常な状態が保たれている。また、このバランスは、血中のカルシウム濃度を一定に保つなど生体の恒常性維持のためにも重要な役割を果たしている。一方、このバランスが崩れた場合、特に骨吸収量が骨形成量を上回るような場合には、骨関連の疾患のみならずその他の種々の疾患が惹き起こされることとなる。
【００２２】
破骨細胞の形成の機構は、例えば、促進因子としてインターロイキン−１や阻害因子としてインターロイキン−４等が確認されているにも拘わらず、未だ完全に解明されたと言えない。これは、生体における破骨細胞の形成も、他の生体内での種々の現象と同様に、数多くの促進因子や阻害因子が複雑に且つ密接に関わり合って制御されているためであると考えられている。
【００２３】
本発明の破骨細胞形成阻害剤は、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含有するものであり、インビトロ、インビボを問わず、破骨細胞の形成を阻害するために用いられるすべての形態を包含する。本発明の破骨細胞形成阻害剤は、例えば、（１）破骨細胞の形成を阻害して、所望の細胞の維持、増殖及び／又は分化を良好にするための動物細胞等の細胞培養用の培地成分として、（２）骨関連の疾患剤のスクリーニング用キットの構成物として、（３）骨吸収調節剤として、また、（４）破骨細胞関連疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。ここでいう骨吸収調節剤とは、生体内での破骨細胞の形成を阻害することにより骨吸収を正常な域に調節して、比較的軽微な関節痛などの体調不良を改善する薬剤及び健康食品等を包含する。また、ここでいう破骨細胞関連疾患とは、生体内での破骨細胞の過剰な形成及び／又は機能に伴うすべての疾患を意味し、例えば、高カルシウム血症、破骨細胞腫、ペーチェット病、骨肉腫、関節症、慢性関節リウマチ、変形性骨炎、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨粗鬆症等を挙げることができる。
【００２４】
上記の破骨細胞関連疾患の一例として挙げた骨粗鬆症は、骨の量的減少により骨折しやすくなる疾患である。骨の量は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収という一連の過程により維持されているが、骨形成と骨吸収は、通常、量的に平衡が保たれるように厳密にコントロールされている。しかしながら、内分泌異常および栄養障害等の原因により骨吸収が骨形成を上回ると骨粗鬆症となる。本発明の破骨細胞形成阻害剤は骨粗鬆症の治療及び／又は予防のために用いることも可能である。
【００２５】
本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤としては、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、その機能性誘導体、又は薬学的に許容されるそれらの塩から選択される少なくとも１種をそのまま単独で用いてもよいが、通常は製剤学的に許容される製剤用添加物を用いて医薬組成物の形態で供給することが好ましい。本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤は経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤はこれらに限定されることはない。
【００２６】
本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたり１μｇ／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤は、毎日投与してもよいしあるいは数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与される。
【００２７】
本発明のアポトーシス誘導剤及び破骨細胞形成阻害剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されることはない。
【００２８】
【実施例】
（Ａ）材料および方法
（Ａ−１）インビトロでの破骨細胞形成
破骨細胞培養物は、Ｔａｋａｈａｓｈ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２３，  ２６００−２６０２に記載された通りに、逐次的コラーゲナーゼ消化により新生ｄｄｙマウスの頭蓋冠から調製し、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む最少基本培地α−改良（α−ＭＥＭ）で維持した。初代骨髄細胞はα−ＭＥＭにより脛骨の骨髄腔を洗い流すことによって得、その後、ナイロン細胞濾過器（１００μｍ孔、ファルコン）を通して濾過した。分散した細胞は、２４穴プレート上の１×１０４の骨芽細胞の上に２．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度になるように重層した。この培養物を、１０ー８Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）の存在下、１０％のＦＣＳを含むα−ＭＥＭ中で８日間３７℃で維持し、その間に培地を１、２回交換した。破骨細胞を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡｃＰ）染色により同定し、核の数により分類した（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，  ４０８４−４０９１）。必要な場合、３５０μｇ／ｍｌ  （６１０μＭ）の５−Ｓ−ＧＡＤを添加した。
【００２９】
（Ａ−２）ＨＬ６０細胞の培養及び形態学的観察
ヒト前骨髄細胞株ＨＬ６０は、Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ００８５）から入手した。細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）は、１０％  ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。細胞は、それぞれ必要に応じて１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（シグマ）、５０μｇ／ｍｌ（１０５０  Ｕ／ｍｌ）のカタラーゼ（シグマ）、及び／又は５７．３  μｇ／ｍｌ（１００  μＭ）の５−Ｓ−ＧＡＤによって５％  ＣＯ２下３７℃で６時間処理した。アポトーシス細胞は、アポトーシス小体の形成に基づいて同定した。
【００３０】
（Ａ−３）ＤＮＡフラグメント化アッセイ
ＤＮＡフラグメント化アッセイは、基本的にＨｉｒｔ，Ｂ．（１９６７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，  ３６５−３６９に記載されている通りに行った。ＨＬ６０細胞を洗浄し、５０  μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａを含む細胞溶解緩衝液（５０  ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％  ナトリウム−Ｎ−ラウリルサルコシネート）に再懸濁し、５０℃で３０分間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを細胞ライセートに添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。フェノール、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）、及びクロロホルム：イロアミルアルコール（２４：１）を用いてＤＮＡを培養細胞から抽出し、５０％の２−プロパノールで室温で１５分間沈殿させた。遠心した後、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、１５  μｌの水に溶解し、２％アガローズゲル上で電気泳動した。ＤＮＡフラグメントはエチジウムブロミド染色により可視化した。
【００３１】
（Ａ−４）ＦＡＣＳ分析によるＨＬ６０細胞の細胞内Ｈ２Ｏ２の測定
ＨＬ６０細胞を収集し、洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁した。細胞を５  μＭの  ２’７’−ジクロロフルオレセインジアセト（ＤＣＦＨ−ＤＡ：イーストマン−コダック（株）、ローチェスター、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて３７℃で１５分間処理した。次いで細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。１００  μｌの細胞懸濁液に１００  μｌの試料溶液を添加し、インキュベーションを１０分間続けた。Ｈ２Ｏ２の細胞内生成はＦＡＣスキャンフロー血球測定器を用いて５３０  ｎｍにおける蛍光放射として検出し、データはコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＥＬＩＴＥソフトウェアを用いて分析した。
【００３２】
（Ｂ）結果
（Ｂ−１）インビトロでの５−Ｓ−ＧＡＤによる破骨細胞形成の阻害
頭蓋冠由来のマウス破骨細胞及び初代骨髄細胞の同時培養系を用いて、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の存在下で破骨細胞形成における５−Ｓ−ＧＡＤの効果を調べた。上記した培養条件下では、ＴＲＡｃＰ−陽性多核性細胞［ＴＲＡｃＰ（＋）ＭＮＣ］の数として評価した場合、破骨細胞の出現は８日目にプラトーに達した。実験結果は図１に示す。各実験において、培地は矢印で示した日に交換した。黒の矢印は５−Ｓ−ＧＡＤを含む培地を添加した時間、白の矢印は５−Ｓ−ＧＡＤを含まない培地を添加した時間を示す。コントロールとして５−Ｓ−ＧＡＤなしで同一の実験を行い、コントロールレベルに対する破骨細胞形成阻害の百分率を計算した。５−Ｓ−ＧＡＤは明らかに破骨細胞形成を阻害していた。しかし、細胞を５−Ｓ−ＧＡＤで最後の４，５日間だけ処理した場合の方が全８日間処理した場合よりも、破骨細胞形成の阻害がより大きくなる傾向があった（レーン１及び３、４及び６、及び８及び９を参照）。反対に、最後の２日間だけ処理した細胞では、５−Ｓ−ＧＡＤの阻害効果は更に弱かった（レーン１０）。細胞が最初の４、５日間だけ処理した場合も５−Ｓ−ＧＡＤの阻害効果は弱かった（レーン２及び５）。これらの結果から、３〜６日目の細胞は他の段階の細胞よりも５−Ｓ−ＧＡＤの感受性が高いことが分かった。
【００３３】
（Ｂ−２）５−Ｓ−ＧＡＤによるアポトーシスの誘導
破骨細胞の初代培養は扱いが困難であるため、破骨細胞の代わりにヒト前骨髄細胞株のＨＬ６０細胞を使用して５−Ｓ−ＧＡＤの効果を更に調べたが、その理由は、破骨細胞前駆細胞は単球−マクロファージ系の細胞の元となる細胞と類似した前駆細胞に由来するからである。ＨＬ６０細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）及び１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を用いて処理した場合、単球／マクロファージ様細胞に分化した。しかし、５７．３  μｇ／ｍｌの５−Ｓ−ＧＡＤが存在する場合、多くのアポトーシス小体が検出されたため、細胞はＰＭＡ及び１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３に関わりなく３−６時間以内にアポトーシスで死滅する傾向が見られた。図２Ａに示すように、アポトーシス小体は５−Ｓ−ＧＡＤで処理した細胞の６０％  近くで検出され、その形成は５０  μｇ／ｍｌの生（ｎａｔｉｖｅ）カタラーゼの添加で阻害されたが、熱不活性化形態のカタラーゼでは阻害されなかった。これらの細胞から採取したＤＮＡを電気泳動すると、図２Ｂに示すように、アポトーシス小体の形成と一致してＤＮＡのフラグメント化が検出された。従って、５−Ｓ−ＧＡＤにより引き起こされる細胞死は、Ｈ２Ｏ２により発生するアポトーシスによると考えられる。これは、インビトロでの破骨細胞形成の間に起こると予想される。
【００３４】
（Ｂ−３）５−Ｓ−ＧＡＤで処理したＨＬ６０細胞の細胞内Ｈ２Ｏ２測定
Ｈ２Ｏ２の生成を確認するために、５−Ｓ−ＧＡＤで処理したＨＬ６０細胞においてＨ２Ｏ２を測定した。ＨＬ６０細胞を先ずＤＣＦＨ−ＤＡで処理し、次いで５−Ｓ−ＧＡＤで処理した。細胞内にＨ２Ｏ２を含む細胞は、ＦＡＣスキャンフロー血球測定器により調べた。図３に示すように、細胞内Ｈ２Ｏ２を含む細胞は、外部に添加された５−Ｓ−ＧＡＤ濃度の増加に伴い増加した（図３のＡ）。しかし、カタラーゼが存在した場合、Ｈ２Ｏ２陽性細胞はほとんど増加しなかった（図３のＢ）。同様に、培地にＨ２Ｏ２を直接添加した場合、Ｈ２Ｏ２陽性細胞は増加した（図３のＣ）。これらの結果は、５−Ｓ−ＧＡＤを添加した場合、Ｈ２Ｏ２は細胞外で生成してから細胞内に浸透してその細胞のアポトーシスを引き起こしたことを示唆している。細胞を氷上で、血清を含まない培地中で５−Ｓ−ＧＡＤで処理した場合、Ｈ２Ｏ２の生成が抑制されたことは注目すべきある（図３のＤ及びＥ）。これらの条件下では、Ｈ２Ｏ２が生成されないか、又はＨ２Ｏ２が細胞内に浸透しないことが考えられる。
【００３５】
（Ｃ）考察
上記実施例により、５−Ｓ−ＧＡＤがインビトロでマウス破骨細胞の形成を阻害すること、並びに５−Ｓ−ＧＡＤがＨＬ６０細胞のアポトーシスを誘導することが示された。Ｈ２Ｏ２がＨＬ６０細胞のアポトーシスを誘導することは既知である（Ｇｏｒｍａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０４，２７−３３）。また、ドーパミン関連化合物に由来するＨ２Ｏ２がカテコールアミン性細胞のアポトーシスを誘導することも知られている（Ｍａｓｓｅｒａｎｏ，Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０，１３０９−１３１５）。即ち、５−Ｓ−ＧＡＤを用いて得た上記実施例の結果は、これらの結果と矛盾しない。カタラーゼは５−Ｓ−ＧＡＤ  のアポトーシス誘導作用をほぼ完全に阻害したことから、５−Ｓ−ＧＡＤによるＰＴＫの阻害が５−Ｓ−ＧＡＤにより誘導されるＨＬ６０細胞のアポトーシスに直接は関与していないことは明白である。ＨＬ６０細胞は多核マクロファージ様細胞に分化することができるので、ある意味では破骨細胞前駆細胞と類似している。従って、５−Ｓ−ＧＡＤは破骨細胞前駆細胞のアポトーシスを誘導して破骨細胞の形成を阻害している可能性がある。
【００３６】
また、破骨細胞の形成に対する５−Ｓ−ＧＡＤの阻害効果は、培養期間の全体に渡って５−Ｓ−ＧＡＤが存在する場合よりも培養の中間時点で５−Ｓ−ＧＡＤを添加した場合の方が顕著であったことから、破骨細胞前駆細胞が５−Ｓ−ＧＡＤに感受性になり易い特定の時機が存在するようである。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３によるマウス骨髄細胞培養物における破骨細胞形成の進行は、前駆細胞の増殖期（１日目〜４日目）、ＴＲＡｃＰ−陽性細胞の分化期（４日目〜６日目）、及びＴＲＡｃＰ（＋）ＭＮＣを形成する融合期（６日目〜８日目）の３つの時期に分類されている（Ｂｉｓｋｏｂｉｎ，Ｄ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．  １０，１０２５−１０３２）。多分、未成熟のＴＲＡｃＰ陽性細胞は５−Ｓ−ＧＡＤ  に対して感受性が高いと考えられる。
【００３７】
上記実施例では、Ｈ２Ｏ２はＦＣＳが存在する場合にのみ５−Ｓ−ＧＡＤで処理した場合に生成した。５−Ｓ−ＧＡＤから放出される水素は細胞の表面でＨ２Ｏ２に転換され、またＦＣＳは５−Ｓ−ＧＡＤからの水素の産生を触媒する一定の物質を含んでいるようである。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の薬剤は、アポトーシス誘導剤並びに破骨細胞形成阻害剤として有用であり、アポトーシス減少に起因する疾患、並びに破骨細胞関連疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、５−Ｓ−ＧＡＤによる破骨細胞形成の阻害を示す。３つの独立した実験を異なる培養スケジュールを用いて行った。細胞は、３５０  μｇ／ｍｌ  （６１０  μＭ）の５−Ｓ−ＧＡＤで処理した。培地は矢印で示した日に交換した。黒の矢印と白の矢印は各々、５−Ｓ−ＧＡＤを含む培地と含まない培地を示す。ＴＲＡｃＰ（＋）ＭＮＣは８日目に計測し、その後にコントロール（５−Ｓ−ＧＡＤなし）に対する骨細胞の分化の阻害を計算した。
【図２】図２は、５−Ｓ−ＧＡＤによるＨＬ６０細胞のアポトーシスの誘導を示す。
Ａ：ＨＬ６０細胞を様々な条件下で５−Ｓ−ＧＡＤで処理した。アポトーシス小体の形成を計測し、コントロール培養物中（添加なし）の正常細胞に対するアポトーシス細胞の数を計算した。
Ｂ：ＤＮＡを培養細胞から抽出し、電気泳動プロフィールを調べた。細胞を以下のものと一緒に培養した；Ａ、コントロール（添加なし）；Ｂ、１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（アポトーシス陽性コントロール）；Ｃ、５７．３μｇ／ｍｌ（１００μＭ）の５−Ｓ−ＧＡＤ；Ｄ、５−Ｓ−ＧＡＤ及び５０μｇ／ｍｌのカタラーゼ；Ｅ、５−Ｓ−ＧＡＤ及び熱により不活性化したカタラーゼ。Ｍは分子量マーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）を示す。
【図３】図３は、５−Ｓ−ＧＡＤで処理したＨＬ６０細胞の細胞内Ｈ２Ｏ２の検出を示す。ＨＬ６０細胞を表に示した量の５−Ｓ−ＧＡＤで１０分間処理し、その後、細胞内Ｈ２Ｏ２陽性細胞の比率をＦＡＣＳ分析により分析した。細胞は、細胞内Ｈ２Ｏ２を検出可能にするため、５−Ｓ−ＧＡＤ処理に先立ってＤＣＦＨ−ＤＡにより予め処理した。陽性コントロールとして、細胞をＨ２Ｏ２により処理した。添加及び培養条件は以下の通りである：Ａ、５−Ｓ−ＧＡＤ；Ｂ、５−Ｓ−ＧＡＤ及びカタラーゼ；Ｃ、Ｈ２Ｏ２；Ｄ、５−Ｓ−ＧＡＤ、細胞は氷上に保持；Ｅ、５−Ｓ−ＧＡＤ、ＦＣＳを培地から除去。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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