(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物の１種または２種以上を有効成分とすることを特徴とするメラニン産生抑制剤。
【化１】
0003557095.tif 000024
0003557095.tif 000025
ただし、上記式（１）中、Ｒ１は−ＣＯＯＲ６または−ＣＯＯＸを示し、Ｘは塩を形成しうる基を示し、Ｒ６は水素あるいは炭素数が１ないし３の低級アルキル基を示し、Ｒ２からＲ５はそれぞれ水素またはメチル基を示し、…Ａ…は  ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）＝、−Ｃ（＝ＣＨ２）−、−ＣＨ（ＣＨ３）−あるいは−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−を示す。
【請求項２】
一般式（１）に示す化合物がＣｉｓｔｕｓ  ｌａｄａｎｉｆｅｒｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｃｒｅｔｉｃｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｍｏｎｏｐｅｒｉｅｎｓｉｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｓａｌｖｉｆｏｌｉｕｓ（ハンニチバナ科）の植物体からの抽出物から調製された化合物である請求項１記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のメラニン産生抑制剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の化合物を有効成分とするメラニン産生抑制剤に関する。さらに、それら化合物を含有する皮膚外用剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
シミ、ソバカスおよび日焼け後の肌への色素沈着は、加齢に伴い、発生、増加、あるいは消失しにくくなり、特に中高年齢層にとっては悩みとなっている。
この様な後天的色素（メラニン）沈着の発生機序についてはまだ解明されていない点もあるが、ホルモンの異常、日光からの紫外線や酸素、化学物質などの外的刺激が原因となってメラニン色素が形成され、これが皮膚内に異常沈着するものと考えられている。
【０００３】
このメラニンの形成と沈着を防ぐ薬剤の開発が強く望まれており、これまでに多くの薬剤が開発されてきている。これら薬剤の中にはアスコルビン酸およびその誘導体、プラセンタエキス、ハイドロキノン、コウジ酸、アルブチンおよびエラグ酸などがあり、さらに植物より抽出されるメラニン産生抑制成分としては多くの報告例があるがその中で、カミツレの抽出物（特許文献１参照）、コガネバナ根エキス（特許文献２参照）、クミンの種子（特許文献３参照）、ウォロの抽出物（特許文献４参照）などがある。また、本発明者らも各種植物の溶媒等による抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製した画分がＢ１６メラノーマ細胞のメラニン産生を強く抑制することを見いだし特許を出願（特許文献５参照）している。またラブダン骨格を有する物質として  Ｄａｃｒｙｄｉｕｍ  ｂｉｆｏｒｍｅより抽出されるマヌール（特許文献６参照）のメラニン産生抑制効果が報告されており、さらにその誘導体のメラニン産生抑制効果も報告されている（特許文献７参照、特許文献８参照、特許文献９参照など）。しかしながらこれら従来のメラニン産生抑制剤は安定性、副作用、効果などの点で不十分なものが多く、新しいメラニン産生抑制剤が望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−９２０５６  号公報
【特許文献２】特開平８−１０４６１６号公報
【特許文献３】特開平８−１１９８４８号公報
【特許文献４】特開平１０−２９９２８号公報
【特許文献５】特開平１１−６０４６７号公報
【特許文献６】特開平６−７２８５５  号公報
【特許文献７】特開平７−２５７５４  号公報
【特許文献８】特開平７−６９８５８  号公報
【特許文献９】特開平７−２０６６２５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メラニン産生抑制作用を有する化合物であって、しかも安全且つ優しいメラニン産生抑制剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、ハンニチバナ科に属する  Ｃｉｓｔｕｓ  ｌａｄａｎｉｆｅｒｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｃｒｅｔｉｃｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｍｏｎｏｐｅｒｉｅｎｓｉｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｓａｌｖｉｆｏｌｉｕｓなどの茎、枝、葉などの熱水抽出物あるいはエタノール、ヘキサンなどの抽出物に強いメラニン産生抑制作用を見いだし、それがラブダノール酸に基づく活性である事を見いだし、さらにその抽出物またはラブダノール酸を分子蒸留して得られるラブド−７−エン−１５−オイックアシッド（ｌａｂｄ−７−ｅｎ−１５−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッド（ｌａｂｄ−８（１７）−ｅｎ−１５−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ラブド−８−エン−１５−オイックアシッド（ｌａｂｄ−８−ｅｎ−１５−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）に強いメラニン産生抑制作用を示すことを見いだした。さらにそれらの塩あるいはメチルおよびエチルエステル体、さらにはそれらの還元体にも同様の活性のあることを見いだし、検討を加え遂に本発明を完成させた。
【０００７】
本発明のメラニン産生抑制作用を示す化合物は下記一般式（１）
0003557095.tif 000002
0003557095.tif 000003
ただし、上記式（１）中、Ｒ１は−ＣＯＯＲ６または−ＣＯＯＸを示し、Ｘは塩を形成しうる基を示し、Ｒ６は水素あるいは炭素数が１ないし３の低級アルキル基を示し、Ｒ２からＲ５はそれぞれ水素またはメチル基を示し、…Ａ…は  ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）＝、−Ｃ（＝ＣＨ２）−、−ＣＨ（ＣＨ３）−あるいは−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）−を示す。
ここで、Ｘとしてはナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩を形成することができる基が、Ｒ６としては水素、メチル基、エチル基、プロピル基などが挙げられる。
【０００８】
上記化合物は既に知られているものであり、その製法も知られている。例えばラブダノール酸は  Ｃｉｓｔｕｓ  ｌａｄａｎｉｆｅｒｕｓより抽出されるラブダナムガムの成分（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９５６，  ４２５９−４２６２）であり、ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッド（エペルイン酸）とラブド−８−エン−１５−オイックアシッドはラブダノール酸を化学的に処理をすることにより得られる（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９５６，  ４２６２−４２７１）。さらにエペルイン酸はマメ科のワラバツリー（Ｅｐｅｒｕａ  ｆａｌｃａｔａ）の樹脂より（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９５５，  ６５８−６６２）、またラブド−７−エン−１５−オイックアシッド（カチビン酸）は同じくマメ科のカチボツリー（Ｐｒｉｏｒｉａ  ｃｏｐａｉｆｅｒａ  Ｇ．）の樹脂中の成分である（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｖｏｌ．７９，  １２０１−１２０５，  １９５７）ことが報告されている。しかし、これらの物質がメラニン産生抑制作用を有することは全く知られていなかった。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で規定する化合物を得るために用いられる植物は、該化合物を含む植物であるならば何ら限定されるものではないが、とくに  Ｃｉｓｔｕｓ  ｌａｄａｎｉｆｅｒｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｃｒｅｔｉｃｕｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｍｏｎｏｐｅｒｉｅｎｓｉｓ  Ｌ．、Ｃｉｓｔｕｓ  ｓａｌｖｉｆｏｌｉｕｓ（ハンニチバナ科）の植物体を使用することが有利である。これらを単独で、或いは２種以上を組み合わせて使用する。用いる植物体の部位は特に制限されるものではなく、葉、枝、幹、樹皮などを用いる。また、それらは採取直後でもよいし、乾燥させた後に用いてもよい。
【００１０】
当該植物からの抽出法は、水、低級アルコールおよび石油エーテル並びに炭化水素の中から選ばれる１種若しくは２種以上の溶媒を用いて行うことが望ましい。ここで低級アルコールとは、炭素数が１ないし４のアルコールが用いられ、とくにメタノール、エタノール等が好ましい。
石油エーテルとしては、本出願前公知のものを用いることができるが、市販されたものを用いることもできる。
炭化水素溶媒としては、常温で液状の脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素が挙げられるが、とくに常温で液状の脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、その中でもとくにヘキサン、トルエンなどの炭化水素が好ましい。
【００１１】
抽出操作は、上記植物や用いる溶媒により異なるが、通常、上記溶媒に裁断した植物を室温乃至５０℃の温度で浸漬または穏やかに撹拌して抽出する事により行う。
さらに本出願前周知のソックスレー抽出器などの装置を用いても良い。
抽出に要する時間は、通常３時間乃至４８時間程度である。
また本発明では、上記植物の葉、枝或いは幹等を破砕した後、水蒸気蒸留または熱水中で煮沸する方法を採用してもよい。この場合水蒸気蒸留あるいは熱水抽出で水の上に浮いてくるガム分をすくい取り、これを上記抽出に用いられる溶媒で不溶物と分離することにより得られる。
さらには、上記植物から上記方法のどれかを用いて得られた市販品のものを利用してもよい。
この様にして得られた粗抽出物には２５〜３５％のラブダノール酸が含まれる。この粗抽出物をそのままメラニン産生抑制剤として用いても良い。
【００１２】
上記粗抽出物、あるいは市販の抽出物から含有される酸あるいは酸混合物を得る代表的な方法について説明するが、本発明はこの例に何ら限定されるものではない。
上記粗抽出物、あるいは市販の抽出物を、１３．３  〜６６．５Ｐａの減圧下で分子蒸留を行い１６０℃から２３０℃までの、より望ましくは１８０℃から２２０℃までの留分を集めると、この留分にはラブド−７−エン−１５−オイックアシッド、ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッド、ラブド−８−エン−１５−オイックアシッドの混合物が含まれる。
メラニン産生抑制剤としてはこの酸の混合物のまま用いても良いし、また必要に応じて塩として、あるいはメチルまたはエチルのエステル体として用いることもできる。
【００１３】
次にこの酸の混合物から３種の酸を分離する。
具体的には、この酸の混合物をエタノールに溶解し、触媒量の硫酸の共存下反応させてエチルエステル体とし、硝酸銀処理したシリカゲルで作成したシリカゲルクロマトグラフィー処理する。カラムをヘキサンで洗い、次いで１％酢酸エチル−ヘキサンで溶出する。はじめにラブド−８−エン−１５−オイックアシッドエチルエステルが溶出し、次いでラブド−７−エン−１５−オイックアシッドエチルエステル、ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッドエチルエステルの順で溶出される。溶媒を留去し、それぞれのエチルエステル体の純品を得た。得られたエチルエステル体を加水分解して遊離の酸を、さらに遊離の酸をジアゾメタンと反応させてメチルエステル体とした。
【００１４】
かくして得られた酸、メチルエステル、エチルエステル、あるいはそれらの二種以上の混合物はメラニン産生抑制剤として有用である。さらに、これらを、例えば皮膚外用剤などに配合することにより、メラニン産生抑制能を有する皮膚外用剤などを得ることができる。また、本発明の化合物（１）を含有させて抗老化剤、抗しわ剤などを得ることもできる。
上記メラニン産生抑制剤の配合量は、皮膚外用剤では０．０１〜１０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％、である。
また、化粧水、乳液、クリーム等に配合する場合は、通常０．０５〜１０重量％、好ましくは０．０５〜２重量％である。
【００１５】
メラニン産生抑制剤の配合の仕方は、とくに限定されない。例えば、香料に用いられる通常の有機溶媒であるエチレングリコール、プロピレングリコールや低級アルコールの単独または混合液、その他の界面活性剤との混合液で希釈した後に配合するか、常用の香料素材と混合した後に配合してもよい。あるいは、他の物質を共存させることなく、そのまま配合してもよい。
【００１６】
また、本発明のメラニン産生抑制剤には、上記必須成分以外に、通常の化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、細胞賦活剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、界面活性剤、増粘剤、無機充填剤、着色剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、紫外線吸収剤、各種皮膚栄養剤等を目的または必要に応じて適宜配合することが出来る
【００１７】
これらの配合成分について、それらの一部を以下に例示する。美白剤としてはアルブチン、コウジ酸、エラグ酸、アスコルビン酸等とそれらの各種誘導体、プラセンタエキス等、各種植物や動物由来の抽出物などが例示できる。細胞賦活剤としてはグリコール酸などのα−ヒドロキシ酸、ホルモン類、ビタミン類、各種動物、植物の抽出物などがあげられる。保湿剤としてはソルビトール、キシリトール、グリセリン、プロピレングリコール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、ヒアルロン酸、コラーゲンなど、酸化防止剤としてはビタミンＥ、ブチルオキシトルエン、ブチルオキシアニソールなど、油性成分としては流動パラフィン、パラフィン、オリーブ油、やし油などの植物性油脂、牛脂、豚脂、ミンク油、スクワランなどの動物性油脂、メチルポリシロキサン、シリコーンオイル、トリイソパルミチン酸グリセリンなどの合成油脂などが例示できる。
【００１８】
界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリン酸トリエタノールアミンなどの陰イオン性の界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウムなどの陽イオン性界面活性剤、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖エステルなどの非イオン性界面活性剤が例示され、増粘剤としてはカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カラギーナンなどが、無機充填剤としてはタルク、セリサイト、マイカ、カオリン、亜鉛華、雲母、酸化チタン、酸化マグネシウムなど、ｐＨ調整剤としてはクエン酸、クエン酸ナトリウムなどの有機酸およびその塩類、防腐剤としては尿素、メチルパラベン、エチルパラベンなどのパラベン類、安息香酸ナトリウム、エチルアルコールなどが例示できる。また種々の紫外線吸収物質を添加することにより、日焼け防止効果を向上させることもできる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２０】
【実施例１】
市販のラブダナムアブソリュート（ジボーダン社製）を分子蒸留にかけた。ラブダナムアブソリュート（１０ｇ）を減圧下（１３．３Ｐａ）で分子蒸留を行い１８０℃から２２０℃までの留分（４．３ｇ）を集めた。この留分にはラブド−８−エン−１５−オイックアシッド（化合物１）、ラブド−７−エン−１５−オイックアシッド（化合物４）、ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッド（化合物７）の混合物が含まれていた（この混合物を以下酸混合物という）。
酸混合物（１ｇ）をエーテル（２ｍｌ）に溶解し、ジアゾメタンを滴下しメチルエステル体（０．９６ｇ）を得た（このメチルエステル体を以下メチルエステル混合物という）。
同様にこの酸混合物（１０ｇ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解し、硫酸触媒存在下にてエステル化を行いエチルエステル体（９．５ｇ）を得た（このエチルエステル体を以下エチルエステル混合物という）。
【００２１】
【実施例２】
次にこれら３種の酸を分離するために上記エチルエステル混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにかける。エチルエステル混合物（１０ｇ）をヘキサン（１００ｍｌ）に溶解し、硝酸銀処理したシリカゲルで作成したカラムに注ぎ込み、ついで溶媒を注ぎ込み、溶出する。注ぎ込む溶媒は、最初はヘキサンとし、ついでヘキサンに酢酸エチルを１容量％加えた混合溶媒とする。はじめにラブド−８−エン−１５−オイックアシッドエチルエステルが溶出し、次いでカチビン酸エチルエステル、エペルイン酸エチルエステルの順で溶出される。それぞれの成分のみを含む溶出液を集めて溶媒を留去し、それぞれのエチルエステル体の純品（溶出順に０．８３ｇ、０．１６ｇおよび０．６３ｇ）を得た。得られたエチルエステル体を常法により加水分解して遊離の酸を得た。
さらに遊離の酸にジアゾメタンを滴下し、溶媒を留去してメチルエステル体とした。
【００２２】
【化３】
0003557095.tif 000004
化合物（１）：Ｒ＝Ｈ（ラブド−８−エン−１５−オイックアシッド）
化合物（２）：Ｒ＝ＣＨ３
化合物（３）：Ｒ＝Ｃ２Ｈ５
【化４】
0003557095.tif 000005
化合物（４）：Ｒ＝Ｈ（ラブド−７−エン−１５−オイックアシッド）
化合物（５）：Ｒ＝ＣＨ３
化合物（６）：Ｒ＝Ｃ２Ｈ５
【００２３】
【化５】
0003557095.tif 000006
化合物（７）：Ｒ＝Ｈ（ラブド−８（１７）−エン−１５−オイックアシッド）
化合物（８）：Ｒ＝ＣＨ３
化合物（９）：Ｒ＝Ｃ２Ｈ５
【化６】
0003557095.tif 000007
化合物（１０）：Ｒ＝Ｈ（ラブダン−１５−オイックアシッド）
化合物（１１）：Ｒ＝Ｃ２Ｈ５
【００２４】
【実施例３】
実施例１で得られたエチルエステル混合物（４．３ｇ）をエタノール（１０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウムカーボン触媒（０．２ｇ）を加えて水素添加反応を行い、化合物１１（４．１ｇ）を得た。さらに加水分解して化合物１０を得た。
【００２５】
【試験例１】
メラニン産生抑制試験
Ｂ１６メラノーマ細胞を底面積２５平方ｃｍの細胞培養ボトルに１ボトル当たり８万個となるように８ｍｌの１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で調製して加え、３７℃で５％二酸化炭素存在下にて３日間培養した。培養３日目に古い培地を捨てて、新しい培地８ｍｌと交換した。更にそこに表に示す最終濃度になるようにエタノールに溶解したサンプル４０μｌを添加した。コントロールとしてはエタノールのみを加えたものを用いた。培地交換後さらに３日間同条件で培養した。培養終了後、培地を除去、トリプシン処理で細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水  （ＰＢＳ）で懸濁液とし、その一定量を用いコールターカウンターで細胞数の計測を行い、細胞増殖率を求めた。
【００２６】
細胞増殖率は下記の式により求める。
0003557095.tif 000008
【００２７】
残りの細胞懸濁液は、遠沈後５％トリクロロ酢酸、エタノール／エチルエーテル（３：１容量比）、エチルエーテルを用いて細胞を洗い、さらに細胞を乾燥後２Ｎ−ＮａＯＨを加え７０℃に加温しながら細胞（中のメラニン）を溶解し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。測定値は合成メラニンの検量線より換算して、細胞百万個あたりのメラニン量を算出しメラニン産生抑制率を下記の式により求めた。
【００２８】
0003557095.tif 000009
【００２９】
【表１】メラニン産生抑制率
0003557095.tif 000010
【００３０】
【試験例２】
既存チロシナーゼ阻害剤との併用試験
試験例１の方法でチロシナーゼ阻害活性を示すアルブチン、コウジ酸、エラグ酸と本発明化合物とを混合してＢ１６メラノーマ細胞のメラニン産生抑制率と増殖率を調べその併用効果を見た。
【００３１】
【表２】アルブチンとの併用効果
0003557095.tif 000011
【００３２】
【表３】コウジ酸との併用効果
0003557095.tif 000012
【００３３】
【表４】エラグ酸との併用効果
0003557095.tif 000013
表２、３、４に見られる通り本発明物質とこれらのチロシナーゼ阻害物質とを併用して用いると、それぞれを単独で用いたときより高いメラニン産生抑制効果を示し、細胞増殖率もこれらチロシナーゼ阻害物質単独で用いたよりも高くなっていることが判る。このことよりこれらの物質と本発明化合物とを混合して用いることにより、より強い併用美白効果を示すことが示される。
【００３４】
【試験例３】
モルモット紫外線誘導色素斑に対する消退効果
５匹の褐色モルモットの背部毛を丁寧に剃毛した後、剃毛部に２．５ｃｍ平方の開口部４個を設けた遮光板を当て、そこにＵＶＢ領域の紫外線を４５０ｍｊ／ｃｍ２の強度で隔日に３回照射した。紫外線の照射終了直後より、照射部位に１日１回、３５日間サンプル７０μｌずつを連続塗布することによる色素斑消退量を表５記載の日にちに調べた。試料としては本発明化合物の内、実施例４で得られた酸混合物を１％含むエタノール溶液を用い、コントロールとしてはエタノールのみを塗布した。
【００３５】
活性の評価はそれぞれの塗布部位を色差計（ミノルタカメラ株式会社、ＣＲ２００ｂ）で測定を行い、得られた試料塗布部のＬ値（経時変化値）から試料塗布開始直前の試料塗布部のＬ値を差し引いたΔＬｓ  値を求め、同様にして得られたエタノール塗布部のΔＬｃ  を差し引いたΔΔＬ値により行った。
なお、ΔΔＬ値は以下の式により求められる。
ΔΔＬ＝（Ｌｘ  −Ｌｏ  ）−（Ｌ’ｘ  −Ｌ’ｏ  ）
Ｌｏ  ：試料塗布前の被験部位（試料塗布部位）のＬ値
Ｌｘ  ：試料塗布ｘ日後の被験部位（試料塗布部位）のＬ値
Ｌ’ｏ  ：エタノール塗布前の被験部位（エタノール塗布部位）のＬ値
Ｌ’ｘ  ：エタノール塗布ｘ日後の被験部位（エタノール塗布部位）のＬ値
同じ実験をコウジ酸７％を含むエタノール溶液についても行った。結果を表５に示す。
【００３６】
【表５】ΔΔＬ値の変化
0003557095.tif 000014
表５に見られる通り、本発明化合物の一つである酸混合物にはコントロールに比して明らかな色素斑の消退作用が認められた。その作用は２８日目以降ではコウジ酸よりも強く、また経時変化で見るとコウジ酸の方が１４日目までの早い時期に活性を示すことが認められた。
【００３７】
【試験例４】
マッシュルームチロシナーゼ阻害試験
市販のマッシュルーム由来チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてチロシナーゼ阻害活性を調べた。リン酸塩緩衝液２．３ｍｌに表６に示す最終濃度になるようにサンプル溶液０．２ｍｌを加え、これに市販チロシナーゼ溶液（１０００単位／ｍｌ）０．１ｍｌを加え、さらに基質としてＬ−チロシン溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍｌを加え、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、波長４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し次式によりチロシナーゼ反応の阻害率を求めた。比較としてチロシナーゼ阻害剤として知られているアルブチン、コウジ酸についてもテストした。
【００３８】
0003557095.tif 000015
0003557095.tif 000016
【００３９】
【表６】マッシュルームチロシナーゼ阻害率
0003557095.tif 000017
表６に見られる通り、チロシナーゼ阻害剤として知られているアルブチンおよびコウジ酸はマッシュルームチロシナーゼを阻害するが本発明のメラニン産生抑制剤である化合物は阻害活性を示さず、従ってその作用はチロシナーゼの阻害でない可能性が示された。
【００４０】
【試験例５】
Ｂ１６メラノーマ細胞のチロシナーゼ阻害試験
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３７℃、５％２二酸化炭素存在下に３日間培養した。培養後増殖した細胞をトリプシン処理して回収し、トリトンＸ１００を０．１％含むＰＢＳに千万細胞／ｍｌの割で懸濁して超音波処理を行って細胞を破砕した。これを１１０００Ｇで２０分間遠心し、得られた上清を粗酵素液として使用した。リン酸塩緩衝液で表７に示す最終濃度になるように調製したサンプル溶液０．２ｍｌを加え、これに粗酵素液０．２ｍｌを加えて、５分間３７℃で予熱した後、基質としてＬ−ＤＯＰＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを加え、３７℃で３時間反応させた。反応終了後、波長４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し、試験例４に示す式によりチロシナーゼ反応の阻害率を求めた。比較としてチロシナーゼ阻害剤として知られているアルブチンおよびコウジ酸についてもテストした。
【００４１】
【表７】Ｂ１６メラノーマ細胞のチロシナーゼ阻害率
0003557095.tif 000018
表７に見られる通りチロシナーゼ阻害剤として知られているアルブチンおよびコウジ酸はＢ１６メラノーマ細胞のチロシナーゼを阻害したが本発明のメラニン産生抑制剤である化合物は阻害活性を示さなかった。
【００４２】
【実施例５】
本発明のメラニン産生抑制剤を用いて、以下の処方により化粧水、乳液、クリーム、パック、クリームファンデーションを調製した。
【００４３】
（１）化粧水
【表８】
0003557095.tif 000019
【００４４】
（２）乳液
【表９】
0003557095.tif 000020
【００４５】
（３）クリーム
【表１０】
0003557095.tif 000021
【００４６】
（４）パック
【表１１】
0003557095.tif 000022
【００４７】
（５）クリームファンデーション
【表１２】
0003557095.tif 000023
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、特定植物の抽出物の精製物が優れたメラニン産生抑制活性していることが明らかとなった。この精製物からなるメラニン抑制剤は、シミ、ソバカスおよび日焼け後の肌への色素沈着を改善または防止する効果、所謂美白作用が優れているだけでなく安全性、安定性に優れるものである。これらのメラニン産生抑制剤はクリーム、ローション、乳液、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメイクアップ化粧料、皮膚外用剤などへ配合する事ができ、極めて実用的なものである。