(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞含有被検液にアルカリを添加して細胞をアルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオンを含有する中和液で処理した後、被検液中のＲＮＡの存在を検出することを特徴とするＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
検出がハイブリダイゼーション法によって行われる請求項１記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
金属イオンがマグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、コバルトイオン及び鉛イオンからなる群から選ばれる請求項１または２記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
ＲＮＡが細菌ＲＮＡである請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
ＲＮＡがリボゾームＲＮＡである請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
下記成分を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法に使用するための中和液。
（イ）バッファー；及び
（ロ）２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオン
【請求項８】
金属イオンがマグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、コバルトイオン及び鉛イオンからなる群から選ばれる請求項７記載の中和液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＲＮＡの検出方法に関し、さらに詳しくは、ＲＮＡ分解酵素の活性を抑制することによってＲＮＡをより安定な状態に保ち、被検ＲＮＡを高感度で検出する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の検出・同定による遺伝子発現の研究や、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の特異的検出による生物種の同定など、ハイブリダイゼーション法を利用するＲＮＡの検出方法はきわめて重要な技術である。しかしながら、ＲＮＡは非常に不安定な物質であり、その検出には高度な技術と細心の注意が必要である。
ＲＮＡが不安定になる原因として主にＲＮＡ分解酵素（以下、ＲＮａｓｅという）の存在がある。生物の細胞内には必ずＲＮａｓｅが存在し、遺伝子発現システムで働いている。
被検液を調製する工程やその後の検出の工程において、ＲＮａｓｅが混入していると一般に検出価が減少する。
本発明者らは先に、隣接するプローブを用いたＲＮＡの検出方法を開発し、その方法により、ハイブリダイゼーション及びその後の操作においてＲＮａｓｅの影響を減少させることが可能となった。しかしながら、ＲＮａｓｅ活性が非常に高い環境下では、上記の隣接するプローブを用いたハイブリダイゼーション法でもＲＮＡが不安定になることがあり、例えばハイブリダイゼーションする前にＲＮＡが部分的に分解してしまうことがある。
ＲＮＡの検出効率を高めるために、できる限りＲＮａｓｅの影響を除いて検出操作を行う必要がある。
ＲＮａｓｅ阻害剤として、ヒト胎盤由来ＲＮａｓｅインヒビターといったタンパク質性のＲＮａｓｅインヒビターや、バナジウム化したヌクレオチドなどが広く用いられているが、これらは非常に高価であり、かつ阻害活性を示す条件が限定されており、実用的ではない。また、ヘパリンもＲＮａｓｅ阻害活性を有することが知られているが、ハイブリダイゼーション法を利用するＲＮＡの検出方法においては有効でない。
また、多くの培養細胞や特殊な微生物の培地には血清が添加されているが、この中にも多量のＲＮａｓｅが存在している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＲＮａｓｅの活性を抑制しＲＮＡをより安定な状態で保ち、被検ＲＮＡを高感度で検出する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、上記方法に使用するための中和液を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために、安価で、かつ環境に左右されずにＲＮａｓｅ活性を阻害する物質を検索した。その結果、細胞をアルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する中和液で処理することにより、ＲＮａｓｅ活性が阻害され、よって被検液中のＲＮＡを高感度で検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
従って、本発明は、細胞含有被検液にアルカリを添加して細胞をアルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオンを含有する中和液で処理した後、被検液中のＲＮＡの存在を検出することを特徴とするＲＮＡの検出方法である。
本発明の好ましい実施態様によれば、検出がハイブリダイゼーション法によって行われる。
本発明はまた、ＲＮＡが細菌ＲＮＡである上記ＲＮＡの検出方法に関する。
本発明の方法で検出されるＲＮＡとして、具体的にリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）やメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。
本発明はさらに、下記の成分を含む上記ＲＮＡの検出方法に使用するための中和液を提供する。
（イ）バッファー；及び
（ロ）２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオン
本発明の好ましい実施態様によれば、２価以上の金属イオンはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、コバルトイオン及び鉛イオンからなる群から選ばれる。
【０００５】
本発明に使用される細胞含有被検液は特に限定されるものではなく、例えば細菌の培養液などが挙げられる。
本発明において、細胞のアルカリ変性は常法に従って行えばよく、また慣用的に用いられるアルカリを使用することができる。それらの例としてＮａＯＨ、ＫＯＨなどが挙げられる。アルカリのみでは変性しにくいときは、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳＡ）などの場合にはリソスタフィン（Lysostaphin)などの細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよい。
本発明で使用する中和液は、中和液に通常使用されるバッファー、例えばリン酸バッファーやトリス塩酸バッファーなどの中性バッファーを含む塩酸、硫酸、硝酸などに、２価以上の金属イオンと酸の陰イオン成分からなる塩及びポリリン酸塩を添加し溶解させることによって調製される。
上記酸は無機酸でも有機酸でもよく、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、炭酸や、酢酸、シュウ酸、酒石酸、安息香酸などのカルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸などが挙げられる。また、ポリリン酸塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などが挙げられる。
【０００６】
２価以上の金属イオンを含む塩の添加量は、金属イオンによって異なり一概に限定されないが、一般に被検液におけるその濃度が０．１〜５０ｍＭ程度になるのが適当であり、さらに好ましくは４〜３０ｍＭ程度が適当である。マグネシウムイオン及びカルシウムイオンについては、上記範囲でも比較的高い濃度で添加されることが好ましい。
またポリリン酸塩の添加量は、被検液におけるその濃度が０．０１〜０．３重量％程度が適当であり、さらに好ましくは０．０５〜０．２重量％が適当である。
２価以上の金属イオンは、アルカリ溶菌処理前に添加してもよいし、あるいはアルカリ溶菌処理時に添加してもよいが、一般に金属イオンの溶解性は酸性側で高いので、中和処理液に添加しておくのが最も効果的であると考えられる。しかしながら、中和液中で溶解していてもアルカリ処理液と混合した時に、沈殿が生じる場合がある。このような沈殿はハイブリダイゼーションを阻害することがあるので、生じた沈殿を除去することが必要となる。従って、ハイブリダイゼーションに影響を与えない限り、添加する２価以上の金属イオンの濃度は高いほど望ましいが、通常の操作において沈殿が生じない条件で添加するのが好ましい。
【０００７】
従来、細胞からＲＮＡを抽出しこれを検出する方法としては、チオシアン酸グアニジンや尿素、フェノールなどでタンパク質を変性させ、これを除去し、エタノール沈殿などで得られたものを用いることが一般的であるが、例えばｒＲＮＡなどの場合は、単純に細胞をアルカリ変性することによって抽出し、これをサンプルとして直接ハイブリダイゼーションを行う場合がある。
これらのＲＮＡサンプルは、直接もしくは電気泳動で分離したものをナイロンフィルターなどの担体に固定化し、ハイブリダイゼーションを行う場合が多い。この場合、ＲＮａｓｅの影響が少なくなるので、固定化した後はＲＮａｓｅの影響をあまり考える必要はない。しかしながらこのようなフィルターを用いるハイブリダイゼーション法は、手間がかかり、定量が困難であるという問題点を有する。
一方、本発明者らが先に開発した隣接プローブを用いるハイブリダイゼーション法は、溶液系で実施される簡便・迅速な方法であって、フィルターを用いる方法に比べてハイブリダイゼーションの効率が高いが、ＲＮａｓｅの影響を受けやすく、このＲＮａｓｅの影響を除外する工夫をする必要がある。
【０００８】
血清には高いＲＮａｓｅ活性があることが知られている。下記実施例１に示すような高濃度の血清を含む培地を利用して菌体を培養した場合、この培養液を従来のようにアルカリ溶菌、中和処理し、ハイブリダイゼーションに供すると、血清中のＲＮａｓｅ活性がアルカリ処理後も残存しており、特定ＲＮＡの検出値が減少してしまう。このような場合、本発明のＲＮＡの検出方法を採用することにより、サンプルの保存性も良好で、ハイブリダイゼーション法による検出値も安定し増加する。
また、ｍＲＮＡは、ｒＲＮＡよりもさらに分解されやすく、ｒＲＮＡでは問題にならないような微量のＲＮａｓｅの影響を受ける。従って、本発明の方法によりｍＲＮＡの検出感度を顕著に上昇させることができる。
本発明のＲＮＡの検出方法において、被検液中のＲＮＡの検出には慣用の方法を利用することができる。中でもハイブリダイゼーション法が好ましく、慣用の任意のハイブリダイゼーション法を使用することができる。
【０００９】
本発明に使用されるハイブリダイゼーション法の一具体例として、隣接する２種の核酸プローブを用いるＲＮＡの検出方法（以下、隣接ハイブリダイゼーション法という）を下記に説明する。
この方法は、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とする。
この検出方法では、２種の核酸プローブを用いることでＲＮＡ分子の切断の影響を極力防ぎ、またＲＮＡを迅速・簡便に検出することができる。
使用する第１の核酸プローブは、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。この第１の核酸プローブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
使用する第２の核酸プローブは、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００１０】
部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接していることが好ましい。
配列（Ｂ）の３’末端配列と配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは配列（Ｂ）の５’末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複してもよいが、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズする際に、その重複部分で被検ＲＮＡに対して競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そのような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣接していることがより好ましい。
一方、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよいが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズした結果、被検ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくなり、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこと、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。
【００１１】
配列（Ａ）の逆相補鎖である特異配列ＤＮＡ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡである隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列はいずれを捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよい。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げられる。
この検出方法ではこの捕捉プローブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよい。
次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡを検出する。
【００１２】
被検ＲＮＡ液を、標識プローブとともに捕捉プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で３分〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合にはビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの混合物、また、Ｄｉｇで標識されている場合には抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合体を用いることができる。
適切な溶液（洗浄液２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いることもでき、この場合にはより高い検出感度を得ることができる。
洗浄液１、２は、特定されるものではないが、例えば０．０５％程度の界面活性剤を含む生理食塩水等を用いることができる。
【００１３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエのｒＲＮＡの検出
〔隣接プローブを用いるハリブリダイゼーション法に使用する捕捉プローブと標識プローブの調製〕
マイコプラズマ・ハイオニューモニエを検出するためのプローブセットを作成した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ＳＴ−１１株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列から２つの部分配列を選択し、それぞれ配列番号１、配列番号２で表される２本の逆相補鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と配列番号２のＤＮＡは、それぞれ隣接してマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ＳＴ−１１株の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする。
配列番号１：５’−ＴＡＴＴＣ  ＡＡＡＧＧ  ＡＧＣＣＴ  ＴＣＡＡＧ  ＣＴＴＣＡ  ＣＣＡＡＧ
配列番号２：５’−ＴＡＡＣＴ  ＡＡＴＧＴ  ＴＧＣＧＣ  ＡＣＣＣＣ  ＣＡＴＴＴ
標識プローブには配列番号１、捕捉プローブには配列番号２のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡはＤＮＡ合成装置（ＰＣＲ−ＭＡＴＥモデル３９１、ＡＢＩ社）を用いて合成した。
捕捉プローブを０．０２μｇ／μｌ  になるように５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０  に溶解した。これをマイクロタイタープレート（住友ベークライト製、ＭＳ−３６０８ＦＡ）の各ウェルに５０μｌ  加え、８０℃で乾燥させた。紫外線を１２０ｍＪ／ｃｍ２  照射した後、３０ｍＭクエン酸ナトリウム／３００ｍＭ塩化ナトリウム（２×ＳＳＣ）２００  μｌ  で３、４回洗浄し乾燥させた。
標識プローブは下記表１の組成の反応液でジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）  標識を行った。
【００１４】
【表１】
0003557239.tif 000002
【００１５】
標識反応後、１／１０容の０．２Ｍ  ＥＤＴＡ  、１／１０容の４Ｍ  ＬｉＣｌ  、３μｇのグリコーゲン及び２．５  倍容のエタノールを加え−８０℃で、一晩放置した。遠心分離により沈殿を集め、７０％  エタノールで洗浄し乾燥させた後、０．２ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８／１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解した。
得られた標識プローブの４μｌ  を下記表２に示すハイブリダイゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液）。なお、標識プローブ液は４℃で１ヵ月以上の保存が可能である。
【００１６】
【表２】
0003557239.tif 000003
＊  ０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム
＊＊    あらかじめ１００  ℃、１０分の変性処理を行った。
【００１７】
〔被検液の調製〕
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ＳＴ−１１株を表３に示す組成の培地で３日間、３７℃で培養した。培養液を０．８ｍｌとり、０．１ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、３７℃、１０分放置後、表４に示す濃度で各種物質を含む中和液０．１ｍｌ（１Ｎ  ＨＣｌ／０．２Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２）を加えて、被検液を得た。
【００１８】
【表３】
0003557239.tif 000004
【００１９】
上記で得た各種被検液を放置せずに、または室温（約２０℃）で３時間放置した後、下記の隣接ハイブリダイゼーション法に供し、検出を行った。その結果を表４に併せて示す。
被検液５０μｌ  と標識プローブ液５０μｌ  を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープレートに入れ、３７℃、１時間振盪する。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、１％ブロッキング剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で１００００  倍希釈した抗Ｄｉｇ  ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガーマンハイム社製）を加え３０分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：０．１２％  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／０．１Ｍ  酢酸ナトリウム，ｐＨ５／３０％ジメチルホルムアミド、Ｂ液：０．０３％  過酸化水素／０．２％  リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混合）１００  μｌ  を加え５〜１５分放置する。得られた青色液の吸光度を６６０ｎｍ  の波長で測定した。
【００２０】
【表４】
0003557239.tif 000005
*)  最終濃度（被検液における濃度）は、これらの1/10となる。
【００２１】
表４の結果から、種々の２価以上の金属イオンにより、検出値が向上しＲＮＡの安定化効果が発揮されていることがわかる。中でも亜鉛イオン、銅イオンの効果が顕著である。
一方、ポリ陰イオンでも、ヘパリンやポリアクリル酸ナトリウムなどはほとんど効果を示さないが、ポリリン酸イオンは顕著な効果を示す。さらに、ポリリン酸イオンと亜鉛イオンあるいは銅イオンを併用することによって、検体液を３時間室温に放置しても検出値はほとんど変化せず、相乗効果が示されることがわかる。
【００２２】
【実施例２】
〔大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の検出〕
大腸菌菌株は、ＪＭ１０９  株及び本株をプラスミドｐＵＣ１１８で形質転換したものを用いた。検出する遺伝子は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、その一部がｐＵＣ１１８に含まれているが、この領域から配列番号３で表されるＤＮＡをマイクロタイタープレートに固定し、配列番号４で表されるＤＮＡをジゴキシゲニンで標識し、ハイブリダイゼーションに供した。ＬＢ培地で一晩培養した培養液を、新しいＬＢ培地に１／１００  容加え、３７℃、１時間培養した。これにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終２ｍＭになるように加えβ−ガラクトシダーゼを誘導、さらに３７℃、１時間培養を続けた。
培養液に１Ｎ  ＮａＯＨを１／８  容加え、３７℃、１０分処理後、中和液（１Ｎ  ＨＣｌ／０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）  あるいはこのバッファーに２０ｍＭ  ＺｎＣｌ２及び１％ポリリン酸ナトリウムを含むもの）を加え、実施例１に示した方法に従って検出を行った。結果を表５に示す。
配列番号３：５’−ＧＧＧＡＴ  ＧＴＧＣＴ  ＧＣＡＡＧ  ＧＣＧＡＴ
配列番号４：５’−ＴＡＡＧＴ  ＴＧＧＧＴ  ＡＡＣＧＣ  ＣＡＧＧＧ  Ｔ
【００２３】
【表５】
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の検出
0003557239.tif 000006
【００２４】
ｐＵＣ１１８は細胞内のコピー数が１，０００  以上と非常に多コピーであり、転写産物も単一遺伝子の場合に比べ、大量に生産されているものと思われる、また、転写誘導をかけない状態では検出値がバックグラウンドレベルであることから、これらの検出試験ではプラスミドＤＮＡは検出されていないことがわかる。従って、誘導をかけた形質転換株で得られた検出値は細胞内のｍＲＮＡレベルを反映しているものと考えられる。
【００２５】
【発明の効果】
被検液のＲＮＡ保存安定性がよく、またＲＮＡを高感度で検出することができる。
【００２６】
【配列表】
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【００２７】
0003557239.tif 000008
【００２８】
0003557239.tif 000009
【００２９】
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