(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列からなるペプチド、その塩、又はアミノ酸残基の側鎖上もしくはＮ−あるいはＣ−末端上の官能基から調製されるその機能性誘導体。
0003554319.tif 000020
（式中、Ｘ１及びＸ２はＣｙｓ残基であり、Ｘ３はＬｙｓ残基である。）
【請求項２】
患者からの血液もしくは尿サンプル中の、インシュリン依存性糖尿病（以下、ＩＤＤＭという。）の存在もしくは開始を示す、ヒトｈｓｐ６０と免疫学的に反応する抗体もしくはＴ細胞の存在を検出するための請求項１記載のペプチドの使用。
【請求項３】
患者からの血液もしくは尿サンプル中の、ＩＤＤＭの存在又は開始を示す、ヒトｈｓｐ６０と免疫学的に反応する抗体もしくはＴ細胞の存在を検出する方法であって、前記患者からの血液又は尿サンプルについて前記抗体又はＴ細胞の存在を抗原としての請求項１記載のペプチドでテストする方法。
【請求項４】
前記サンプルについてｈｓｐ６０と免疫反応する抗−ｈｓｐ６０抗体又はＴ細胞の存在をテストして、これによってｈｓｐ６０と免疫的に反応する抗−ｈｓｐ６０抗体又はＴ細胞の存在が陽性を示す結果がＩＤＤＭの存在又は開始の可能性が高いことを示す請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは抗−ｈｓｐ６０抗体の存在がテストされる請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
テスト方法はラジオイムノアッセイを含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
テスト方法はＥＬＩＳＡテストを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項３から７のいずれか１項記載の方法に従って抗−ｈｓｐ６０抗体の存在をテストすることによりＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（i）請求項１のペプチドである抗原と、
（ii）検出される前記抗−ｈｓｐ６０抗体の不変領域を認識することができる標識された抗体とを含むキット。
【請求項９】
前記抗原は固相に固定されている請求項８記載のキット。
【請求項１０】
ＩＤＤＭの診断においてキットの使用のためのインストラクションを含む請求項８又は９記載のキット。
【請求項１１】
標識はラジオアイソトープ、酵素、発色団及び発蛍光団からなる群から選択される請求項８から１０のいずれか１項記載のキット。
【請求項１２】
前記サンプルはｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在がテストされる請求項３又は４記載の方法。
【請求項１３】
テスト方法はＴ細胞増殖テストを含む請求項１２記載の方法であって、このＴ細胞増殖テストは
（i）患者から得られた血液サンプルからＴ細胞を含む非核細胞フラクションを調製し、
（ii）前記非核細胞フラクションに請求項１記載のペプチドから選択された抗原を加え、
（iii）前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条件で前記細胞フラクションを培養し、
（iv）前記培養時間の終了前の適切な時点で（iii）の培養された細胞のカルチャーに対し標識されたヌクレオチドを加え、前記標識されたヌクレオチドを増殖しているＴ細胞のＤＮＡに取り込ませ、
（v）前記Ｔ細胞に取り込まれた標識されたヌクレオチドの量を分析することにより増殖しているＴ細胞の量を決定する
工程を含む方法。
【請求項１４】
テスト方法はＴ細胞サイトカイン応答テストを含む請求項１２記載の方法であって、このサイトカイン応答テストは、
（i）患者から得られた血液サンプルからＴ細胞を含む非核細胞フラクションを調製し、
（ii）前記非核細胞フラクションに請求項１記載のペプチドから選択された抗原を加え、
（iii）前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条件で前記抗原の存在の下で前記細胞フラクションを培養し、
（iv）応答しているリンパ細胞により倍地中に分泌されたサイトカインの存在を測定する
工程を含む方法。
【請求項１５】
サイトカインはＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α又はＴＧＦβである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項３、４又は１３項記載の方法によりｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在をテストすることによりＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（i）請求項１のペプチドの抗原と、
（ii）標識されたヌクレオチドと、
（iii）リンパ球の培養のために適した倍地
とを含むキット。
【請求項１７】
請求項３、４、１４又は１５項記載の方法によりｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在をテストすることによりＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（i）請求項１のペプチドの抗原と、
（ii）リンパ細胞の培養に適した倍地と、
（iii）応答しているリンパ細胞により倍地中に分泌されたサイトカインの存在を測定するためのキット
とを含むキット。
【請求項１８】
ＩＤＤＭの診断においてキットの使用のためのインストラクションを含む請求項１４から１７のいずれか１項記載のキット。
【請求項１９】
請求項１のペプチドと薬剤学的に許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項２０】
ＩＤＤＭの予防又は治療のための請求項１９記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
ＩＤＤＭを治療するための薬剤組成物を調製するための請求項１記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒト６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のエピトープの変形である新規ペプチド、これを含む薬剤組成物及びこのようなペプチドを用いたインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断及び治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｉ型糖尿病、即ちＩＤＤＭは膵臓の小島に存在するインシュリン生産性β−細胞を攻撃し、破壊するＴ細胞に起因する自己免疫疾患である（カスタノ及びアイゼンバース、１９９０年）。ＩＤＤＭにおいて完結する自己免疫過程は症状を発現することなく始まり、進行する。この疾患はβ−細胞の累積的損失量がインシュリンを供給する残余β−細胞の容量を越えた場合にのみ臨床的に表面化する。実際、グルコース恒常性の破壊及び臨床的なＩＤＤＭは８０−９０％のβ−細胞が免疫系により不活性化された後にのみ生じると考えられている。従って、ＩＤＤＭに罹患したと特定することができる患者はβ−細胞の自己免疫による破壊の進行した段階に至る。さらに、自己免疫マーカーによる初期の前臨床的な糖尿病の診断は自己免疫過程が開始した後にのみ行うことができる。従って、治療法を探索するということは、既に進行している自己免疫過程を停止する安全、明確且つ有効な方法を見出すことである。
【０００３】
以前、本発明者は、ヒトＩＤＤＭの忠実なモデルと考えられるＮＯＤ種のマウスに進行している自然発症性糖尿病の研究によりこの問題を検討した（カスタノ及びアイゼンバース、１９９０年）。ＮＯＤマウスは生後約４週でインシュリン炎を発症し、これは小島周辺部の穏やかな浸潤として開始し、重篤な小島内の炎症という過程をたどる。インシュリン不足を証明する高血糖症は本発明者のコロニーのメスでは生後約１４−１７週で始まる。生後約３５−４０週までに殆ど全てのメスＮＯＤマウスは重篤な糖尿病を発症し、インシュリン療法を行わなかった場合殆ど死亡する。オスＮＯＤマウスは低い罹患率を示すがその理由は明らかでない。ＮＯＤマウスの糖尿病は自己免疫Ｔ細胞に起因することが示されている（ベンデラックら、１９８７）年。
種々の抗原に対するＴ細胞の反応性及び自己抗体は、ＮＯＤマウスの場合と同様に、ヒトＩＤＤＭ患者においても検出されており、可能な標的抗原に対する免疫がこの疾病の主たる原因であるかは明らかではない。治療の問題は因果関係の問題の背後にある。
ＮＯＤマウスにおける自己免疫過程の開始は、糖尿病の始まる前に、マウスを食事制限、ウイルス感染又は免疫系の不特定な刺激のような種々の操作の対象とすることにより防止することができることが示されている（ボウマンら、１９９４年）。ＮＯＤ糖尿病は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗原に対する免疫寛容を前糖尿病マウスに誘発することにより防止される（カウフマンら、１９９３年；ティッシュら、１９９３年）。
【０００４】
以前、本発明者はＮＯＤマウスの糖尿病は、ヒトｈｓｐ６０分子のｐ２７７ペプチド配列に特異的なＴ細胞を用いたＴ細胞のワクチン接種により防止されることを見出している（エリアスら、１９９１年）。このタンパク質は以前はｈｓｐ６５と称されていたが、現在は分子量に関するより正確な情報を参照してｈｓｐ６０と称されており、いずれの名称を用いてもタンパク質は同一である。
ＩＤＤＭに関与するヒトｈｓｐ６０のエピトープであり、ヒトｈｓｐ６０の配列の位置４３７−４６０に対応するｐ２７７ペプチドは本出願人のイスラエル特許出願第９４２４１号及びエリアス及びコーエン、１９９４年において最初に開示され、以下のような配列を有する。
0003554319.tif 000002
インシュリン炎の開始時にｐ２７７ペプチドを投与すると、おそらくＮＯＤ糖尿病に必須の抗−ｐ２７７免疫の抑制するように規制することにより、糖尿病の進行を防止することが示されている（エリアスら、１９９１年；イスラエル特許出願第９４２４１号）。最近の研究により、ｐ２７７ペプチドはβ−細胞自己免疫の段階の進行を逆転するために用いることもできることが示されている（エリアス及びコーエン、１９９４年）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
最近、本発明者の研究室は、かなり少量のβ−細胞毒素であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与により、自己免疫糖尿病の形態をマウスのＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ種に誘発することができることを報告した（エリアスら、１９９４年）。標準少量のＳＴＺの４０ｍｇ／ｋｇを５日間投与すると通常３週間以内に臨床的な糖尿病を誘発するが、３０ｍｇ／ｋｇを５日間投与すると約３ヶ月の遅滞期間後にのみ臨床的な糖尿病が誘発される。この誘発された糖尿病のモデルは、インシュリンに対する自己抗体、インシュリン自己抗体に対する抗−イディオタイプ抗体及びｈｓｐ６０に対する自己抗体の前兆期間内の外観により標識される。また、マウスもｈｓｐ６０及びそのｐ２７７ペプチドに対する自然的なＴ−細胞活性を明らかに示す（エリアスら、１９９４年）。従って、ＳＴＺの標準少量より少ない量の投与により、ＮＯＤマウスにおいて進行する自然発症的な糖尿病において観察されるものとは異なるものでなく、自己免疫過程の引き金を引くということは明らかである（エリアスら、１９９０年）。
本発明の目的は、ペプチドｐ２７７の変異体を提供するものであり、この変異体はＩＤＤＭの診断及び治療に有用である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ペプチドｐ２７７のフラグメント及び変異体の研究において、単一のスレオニン残基がリジン残基に置換され及び／又は１又は両方のシステイン残基がバリン残基により置換されたペプチドは糖尿病の治療においてｐ２７７としての活性を有するということが思いがけなく見出された。セリン残基によるシステイン残基の置換は不活性なペプチドをもたらすので、これらの結果は驚くべきことであった。
即ち、本発明は配列Ｉを有するペプチドに関するものである。
0003554319.tif 000003
（式中、Ｘ１及びＸ２は各々Ｃｙｓ又はＶａｌ残基であり、Ｘ３はＴｈｒ又はＬｙｓ残基であるが、Ｘ３がＴｈｒ残基である場合、Ｘ１及びＸ２の両方がＣｙｓであることはできない。）
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の具体的実施例は、配列Ｉを有し、Ｘ１及びＸ２の両方がＣｙｓであり、Ｘ３はＬｙｓであるｐ２７７（Ｌｙｓ１９）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３）、Ｘ１がＶａｌであり、Ｘ２がＣｙｓであり、Ｘ３がＴｈｒ又はＬｙｓであるｐ２７７（Ｖａ１６）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４）及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｌｙｓ１９）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５）、Ｘ１がＣｙｓであり、Ｘ２がＶａｌであり、Ｘ３がＴｈｒ又はＬｙｓであるｐ２７７（Ｖａｌ１１）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６）及びｐ２７７（Ｖａｌ１１−Ｌｙｓ１９）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：７）、Ｘ１とＸ２の両方がＶａｌであり、Ｘ３がＴｈｒ又はＬｙｓであるｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）（配列番号（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ）：８）及びｐ２７７（Ｖａｌ６，１１−Ｌｙｓ１９）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：９）のペプチドからなる。ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）はｐ２７７（Ｖ）と称する。
【０００８】
本発明の他の目的は本発明の配列Ｉのペプチドを用いたＩＤＤＭの早期の診断方法及びキットを提供することである。ＩＤＤＭが進行する過程において、動物はｈｓｐ６０分子又はこれと交差反応する分子を発現し、これは動物の血液又は尿にたどり着く。また、これらはこのような分子を特異的に対象とする抗体及びＴ細胞を発現する。従って、血液又は尿中のｈｓｐ６０（又はこれと交差反応する分子）又は抗体又はこれと特異的なＴ細胞は、β−細胞の破壊が完結し、個体が生涯糖尿病を運命づけられる前にＩＤＤＭの過程を検出するためのアッセイの目的にかなう。
患者中のＩＤＤＭの存在又は開始は、前記患者の血液又は尿についてヒトｈｓｐ６０と免疫学的に反応する抗−ｈｓｐ６０抗体又はＴ細胞の存在を抗原としての本発明の配列Ｉのペプチドでテストすることにより診断することができる。実際、ペプチドｐ２７７が使用可能であると従来より記述されているいかなる方法、例えば、ＷＯ９０／１０４４９で国際公開されているＰＣＴ国際出願に記載されている方法であって、引用により本明細書に一体化される方法は、本発明の配列Ｉのペプチドをｐ２７７の代用とする場合に使用することができる。
従って、本発明は患者におけるＩＤＤＭの存在及び開始を診断する方法であって、前記患者についてｈｓｐ６０と免疫反応する抗−ｈｓｐ６０抗体又はＴ細胞の存在をテストして、これによってｈｓｐ６０と免疫的に反応する抗−ｈｓｐ６０抗体又はＴ細胞の存在が陽性を示す結果がＩＤＤＭの存在又は開始の可能性が高いことを示す方法を提供する。
【０００９】
ＩＤＤＭの診断をするための方法においては、患者は抗−ｈｓｐ６０抗体の存在がテストされ、このテスト法はラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡテストを含むことができる。
患者はｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在をテストされることもできる。この形態の実施例においては、テスト方法はＴ細胞増殖テストを含み、このＴ細胞増殖テストは
（ｉ）患者から得られた血液サンプルからＴ細胞を含む非核細胞フラクションを調製し、
（ｉｉ）前記非核細胞フラクションに請求項１記載のペプチドから選択された抗原を加え、
（ｉｉｉ）前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条件で前記細胞フラクションを培養し、
（ｉｖ）前記培養時間の終了前の適切な時点で（ｉｉｉ）の培養された細胞のカルチャーに対し標識されたヌクレオチドを加え、前記標識されたヌクレオチドを増殖しているＴ細胞のＤＮＡに取り込ませ、
（ｖ）前記Ｔ細胞に取り込まれた標識されたヌクレオチドの量を分析することにより増殖しているＴ細胞の量を決定する工程を含む。
上記の工程（ｉｖ）においては、前記標識されたヌクレオチドは好ましくは３Ｈ−チミジンである。増殖しているＴ細胞の量の決定は標準的な方法でＴ細胞の刺激指数を計算することにより行われる。
【００１０】
本発明のこの形態の他の実施例においては、テスト方法はＴ−細胞サイトカイン応答テストを含み、これにおいてはステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）は上記Ｔ細胞増殖テストと同一であるが、ステップ（ｉｖ）において応答しているリンパ細胞により培地中に分泌されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα又はＴＧＦβのようなサイトカインが商業的に入手可能なキットで標準的な方法で検出される。
他の形態においては、本発明は配列Ｉのペプチドから選択される抗原が患者に皮下注射され、検出可能な皮膚反応（ＤＴＨ）の発生が観察されるインヴィヴォ系の方法を提供する。
【００１１】
また、本発明はこのようなアッセイを実行するためのキットとともに、このようなアッセイを実行する手段を提供する。キットは本発明を達成するために用いられる種々のアッセイのいずれかを実行するために調製することができる。このようなキットの各々は単一のアッセイ又は所定数のアッセイを実行するのに必要な全ての物質を含む。例えば、抗−ｈｓｐ６０抗体の存在を決定するキットは固相に固定された配列Ｉのペプチドと、標識された抗−ヒトＦａｂのような検出される抗−ｈｓｐ６０抗体の不変領域を認識することができる標識された抗体とを含む。また、キットはキットを使用するための説明書とキットの物質を保持するための容器を含んでもよい。ラジオアイソトープ、酵素、発色団又は発蛍光団のような従来からある標識を用いることができる。典型的なラジオアイソトープはヨウ素−１２５又はイオウ−３５である。本目的のための典型的な酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含む。
【００１２】
抗−ｈｓｐ６０抗体の存在をテストすることによりＩＤＤＭの存在を診断するキットは、
（ｉ）配列Ｉのペプチドから選択される抗原と、
（ｉｉ）検出される抗−ｈｓｐ６０抗体の不変領域を認識することができる標識された抗体とを含む。
ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在をテストすることによりＩＤＤＭの存在を診断するキットは、
（ｉ）配列Ｉのペプチドから選択される抗原と、
（ｉｉ）リンパ細胞（Ｔ細胞）の培養に適した培地と、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞増殖テストのための標識されたヌクレオチド又はサイトカインテストのためのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα又はＴＧＦβのようなサイトカインとアッセイキットのいずれかを含む。インヴィヴォ系のテストのためにはキットは注射に適した形態の配列Ｉのペプチドのみを含むことができる。
【００１３】
更に、本発明はＩＤＤＭの予防又は治療のための手段に関する。本発明の配列Ｉの抗原ペプチドのワクチン接種は抗原に対する自己免疫を下降調節し、ＩＤＤＭの自己免疫過程に対する抵抗性を有効に作り出す。このような抗原に特異的なＴ細胞によるワクチン接種が、希釈化又は弱毒化された形式による場合、抗原性を向上させるために処理された後である場合、又はそのフラグメント又は活性フラクションである場合でも同一である。患者が既にＩＤＤＭの前臨床的な開始段階にあると示されている場合、このような抗原又はＴ細胞（又はフラクション）はこの抗原に対する自己免疫を下降調節し、明確で恒久的な損失が生じる前に自己免疫過程を抑止することができる。また、ペプチドｐ２７７によるＮＯＤマウスの治療に関し本発明の発明者が最近示したように（エリアス及びコーエン、１９９４年）、ペプチドは自己免疫過程がはるかに進行した後であってもこれを停止するための治療剤として用いることができる。
【００１４】
従って、本発明はインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の予防又は治療のための調製物を提供するものであり、この調製物は（ａ）ヒトｈｓｐ６０のｐ２７７配列の特異性を明らかにし、配列Ｉのペプチドの存在下で培養されることにより活性化されるヒトＴ細胞、（ｂ）放射されさもなければ希釈された前記ヒトＴ細胞、（ｃ）水圧による圧力処理、化学架橋剤による処理及び／又は細胞骨格架橋剤による処理を受けた前記ヒトＴ細胞、（ｄ）上記（ａ）（ｂ）又は（ｃ）のＴ細胞のフラグメント又は（ａ）（ｂ）又は（ｃ）のＴ細胞から得られた表面タンパク質又は（ｅ）前記タンパク質、その塩、機能的誘導体、前駆体又は活性フラクションに特異的な（ａ）のリセプターの可変領域からなるペプチドから成る群から選択されるＴ細胞生産物を含む。
この発明の好ましい実施例においては、調製物は処置されるＩＤＤＭ患者から得られた同原Ｔ細胞であり、このＴ細胞は配列Ｉの前記ペプチドとインヴィトロ系で接触させることにより活性化される。このような特異的で活性化されたＴ細胞は、細胞を得た同一の患者に投与される。
【００１５】
また、本発明は薬剤学的に許容可能な担体と、有効量の主剤としての配列Ｉのペプチド、その塩又はその作用的誘導体とを含むＩＤＤＭを予防又は治療するための薬剤組成物を提供する。薬剤学的に許容可能な担体とは、好ましくは、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）として知られるミネラルオイルのエマルジョンのようなオイル担体である。しかしながら、ＩＦＡは、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ；マイコバクテリアの死滅した組織を含むミネラルオイルの調製物）と同様、ヒトに対する使用は認められない。その理由はミネラルオイルは代謝可能でなく、身体により分解されることができないからである。
本発明者は、ヒトの患者に対し静脈内栄養として永年使用されてきた特定の脂肪エマルジョンが本発明のペプチドを用いたペプチド療法の担体として機能することができることを見出した。このようなエマルジョンの例は、イントラリピッド及びリポフンディンとして知られている商業的に入手可能な脂肪エマルジョンである。”イントラリピッド”は静脈内栄養のための脂肪エマルジョンに対するスウェーデンのカビ・ファーマシアの登録商標であり、米国特許第３，１６９，０９４号に記載されている。リポフンディンはドイツのビー・ブラウン・メルシュンゲンの登録商標である。両方とも脂肪としてダイズ油（蒸留水１０００ｍｌ中各々１００又は２００ｇ、各々１０％又は２０％）を含む。卵黄リン脂質はイントラリピッド中で乳化剤として用いられており（１２ｇ／ｌ蒸留水）、卵黄レシチンはリポフンディン中で用いられている（１２ｇ／ｌ蒸留水）。イントラリピッド及びリポフンディンの両方において、等張性はグリセロール（２５ｇ／ｌ）の添加による。
更に、本発明はＩＤＤＭの予防又は治療方法に関し、この方法は配列Ｉのペプチドを含む薬剤組成物又は本発明の配列Ｉのペプチドに対し特異性を発現するＴ細胞を含む調製物をこれを必要とする患者に投与することを含む。
【００１６】
本発明において”配列Ｉのペピチド”という場合、ペプチドの糖尿病に対する生物活性が維持される限り、その塩及び作用的誘導体も意味する。
本発明で意味するペプチドＩの”塩”は生理学的に許容され得る有機及び無機塩である。
本明細書中で用いられるペプチドＩの”作用的誘導体”は、残基又はＮ−又はＣ−末端の側鎖として現れる官能基から公知の手段により調製されることができる誘導体を含み、これは薬剤的に許容可能である、即ち、ｐ２７７の公知の活性の類似性に関する限りペプチドの活性を破壊せず、これを含む組成物に毒性を与えず、その抗原性に不利な影響を与えない限り、本発明に含まれる。このような”作用的誘導体”は１個のアミノ酸を他に有効に変換する変化を含むものと意図されない。
上記の資質を前提として、これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪酸エステル、アンモニア又は第１級又は第２級アミンとの反応により生産されるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイル又はカルボサイクリックアロイル基）との反応により形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又はアシル部分との反応により形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル又はスレオニル残基のそれ）のＯ−アシル誘導体を含む。
本発明の配列Ｉのペプチドは、ＩＤＤＭの診断のための診断用組成物における抗原と同様に、薬剤組成物における免疫原、特にＩＤＤＭの軽減又は治療のためのワクチンとして用いることができる。これらの薬剤及び診断用組成物は、本技術分野における公知の方法により調製することができるものであるが、本発明の一部をなす。
【００１７】
治療のための処置のため又は予防ワクチンとして用いられる場合、本発明のペプチドは自己免疫Ｔ細胞のＴＨ１→ＴＨ２のシフトを促進する生物活性を有する担体とともに投与されることが好ましい。ＣＤ４ヘルパー型のＴ細胞は活性化された場合に分泌するサイトカインにより２つのグループに分類される（モスマン及びコフマン、１９８９年）。ＴＨ１細胞はＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌し、ＴＨ２細胞はＩＬ−４及びＩＬ−１０を分泌する。このような担体は１０−２０％の植物及び／又は動物起源のトリグリセライド、１．２−２．４％の植物及び／又は動物起源のリン脂質、２．２５−４．５％の浸透圧調整剤、０−０．５％の抗酸化剤及び１００％までの蒸留水を含む脂肪エマルジョンであることが好ましい。このような担体はイントラリピッド又はリポフンディンであることが最も好ましい。このような担体の使用は、本発明についてのイスラエル特許出願（出願人の参照番号９４５１Ａにより特定される）と同日に本出願と同一の出願人により出願人されたイスラエル特許出願（出願人の参照番号９５２３により特定される）に記載されており、この内容は全体として本明細書中に一体化される。
本発明による治療用の組成物は経口的に又は皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内などのように非経口的に投与することができる。
本明細書中の実施例はヒトＩＤＤＭの科学的に受け入れられる動物モデルにおいて本発明の化合物及び組成物による治療上の処置の有効性を確立するものである。
【００１８】
【実施例】
物質及び方法
（ｉ）マウス  ＮＯＤ／Ｌｔ種のインブレットメスマウスは、イスラエル、レホヴォトのウィズマンインスティチュートオブサイエンスのアニマルブリーディングセンターより提供された。これらのマウスは生後１４から１７週でヒトのＩＤＤＭに類似する自己免疫性糖尿病を自然発症する。
（ｉｉ）ペプチド  ペプチドはＡＢＩＭＥＤ合成器（ＦＲＧ）を用いた標準フェモック化学により合成され、逆相クロマトグラフィーによりＨＰＬＣで精製された。配列はアミノ酸分析により確認された。以下のようなペプチドが合成された。ｐ２７７ペプチド；配列：Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０）のコントロールペプチドｐ２７８、ヒトｈｓｐ６０分子の４５８−４７４の位置に対応；ｐ２７７のフラグメント：ｐ２７７のアミノハーフ（ｐ２７７．Ｎ）、ｐ２７７のカルボキシハーフ（ｐ２７７．Ｃ）、及びｐ２７８と結合しているｐ２７７Ｃ（ｐ２７７．Ｃ−ｐ２７８）；ペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）；配列中の２つのシステイン残基が種々のアミノ酸で置換されたペプチドｐ２７７は以下の通りである：−ＳＨ基で架橋されたｐ２７７（ｐ２７７（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋））；両方のシステイン残基がバリンで置換されたｐ２７７（ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１））又はセリンで置換されたｐ２７７（ｐ２７７（Ｓｅｒ６−Ｓｅｒ１１））。
【００１９】
（ｉｉｉ）処置及び追跡  マウスは、ｐ２７７、他のペプチド又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ＵＳＡ，ＭＯ，セントルイスのシグマから購入）のエマルジョン０．１ｍｌを背中に皮下注射するにより処置された。抗原はＰＢＳ中で希釈され、同量のミネラルオイル（不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）；シグマ）又は１０％のイントラリピッド中で乳化された。マウスの血中グルコースレベルはエリアスら、１９９１年に記載されているように、１０Ａ．Ｍ．の非絶食状態、治療時（生後７、１２、１５又は１７週）及び生き残ったマウスについては生後４０週でテストされた。グルコース濃度が１１．１ｍＭ／Ｌ以上の場合に明確な高血糖症であるとされた。その理由は、この濃度の血中グルコースは１００匹の健康なマウスで測定された平均血中グルコース濃度より高い３つの標準偏差だからである（示さず）。膵臓の小島の組織学的検査はヘマトキシリン及びエオシンで着色された部分について行われた。この部分は群の特性を知らない２人の観察者により別個に評価された。種々の処置の統計的な差異を明らかにするためχ２テストが用いられた。
（ｉｖ）Ｔ−細胞増殖アッセイ  メスＮＯＤマウスから得られたクローンＣ９細胞及び脾臓細胞のサスペンションが前述のように（エリアスら、１９９１年）Ｔ−細胞増殖が試験された。簡単に言うと、１×１０５個クローン細胞／ｍｌ又は１×１０６個脾臓細胞／ｍｌが、５μｇ／ｍｌの種々の抗原の存在下又は不存在下で、マイクロタイターウェル中の０．２ｍｌの培養培地中で７２時間４組にわたって培養された。増殖は、培養の最後の１２時間の［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの取り込みにより測定された。結果は刺激指数、即ち抗原存在下における平均テストｃｐｍの抗原不存在下における平均バックグラウンドｃｐｍに対する比として計算された。４組のサンプル間における標準偏差は常に平均ｃｐｍの＜１０％であった。脾臓細胞の実験におけるバックグラウンドは＜１０００ｃｐｍであり、Ｃ９細胞については＜２００ｃｐｍであった。各々のマウスの脾臓は別々にテストされた。各々のグループのマウスの結果は平均±ＳＤとして示されている。
【００２０】
実施例１
ｐ２７７又はこのフラグメントによるＮＯＤマウスの治療
ｐ２７７ペプチドの２つの１２−アミノ酸ハーフのいずれかが、単独であるいは結合して、ｐ２７７のようにＮＯＤマウスにおいて有効であるかどうかをテストするため、メスＮＯＤマウスは生後７週の時点で、オイル中の種々のペプチド５０μｇを皮下接種することにより治療された。生後４０週までのマウスの状態が決定された。
結果を表１に示す。コントロールｈｓｐ６０ペプチドｐ２７８は糖尿病の進行に効果を有しなかったことが分かる。即ち、治療された４０匹のマウス中、全てが糖尿病であり、９０％が生後４０週までに死亡した。これに対して、ｐ２７７ペプチドは死亡を完全に防止し、２０匹の処置したマウスの６０％を治療した。ｐ２７７のフラグメントはそれほど有効ではなかった。即ち、ｐ２７７のアミノハーフ（ｐ２７７．Ｎ）、ｐ２７７のカルボキシハーフ（ｐ２７７．Ｃ）及びこれらの混合物（ｐ２７７．Ｎ，ｐ２７７．Ｃ）は、完全なｐ２７７の約半分の作用を果たした。ペプチドｐ２７７．Ｃはペプチドｐ２７８に結合して合成され、長いペプチドを生産する。しかしながら、ｐ２７７．Ｃ−ｐ２７８はｐ２７７．Ｃ単独よりも良い結果を示さなかった。従って、完全な治療上の効果を得るためには完全な、ｐ２７７ペプチドが必要であると結論することができる。
【００２１】
【表１】
0003554319.tif 000004
【００２２】
実施例２
ｐ２７７置換ペプチドによるＮＯＤマウスの治療
以下のペプチドがＮＯＤマウスでテストされた。ｐ２７７、ｐ２７７（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋）、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）及びｐ２７７（Ｓｅｒ６−Ｓｅｒ１１）。
ＮＯＤメスマウスはミネラルオイルのエマルジョン（ＩＦＡ）０．２ｃｃ中の１００μｇのペプチドを皮下投与することにより治療された。マウスは生後１２週で処置され、糖尿病の罹病率が生後３０週の時点で決定された。
表２に示すように、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）は糖尿病の治療においてｐ２７７と同じように有効であり、未処置のマウスの糖尿病の罹病率は８０％であるが、ｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）で処置されたマウスは各々２２％及び２３％の罹病率を示した。一方、ｐ２７７（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋）またはｐ２７７（Ｓｅｒ６−Ｓｅｒ１１）のいずれも治療上の効果を奏しなかった。位置６及び１１におけるシステイン残基がアラニン又はγ−アミノブチル酸残基で置換された２つの追加のｐ２７７の変異体もまたクローンＣ９細胞及びＮＯＤ脾臓Ｔ−細胞の双方でインヴィトロでテストした場合有効でなかった。これらの２つのペプチドは抗−ｐ２７７特異的Ｔ細胞（示さず）により認識されなかったので、これらは治療効果のためのインヴヴィヴォテストには供されなかった。
【００２３】
【表２】
0003554319.tif 000005
【００２４】
実施例３
ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）の安定性
システインを置換する理由は、ｐ２７７ペプチドの安定性の問題であったので、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）の安定性が合成後のいくつかの時点でテストされた。ｐ２７７ペプチドは不安定であり、厳格な条件（真空中の凍結乾燥パウダー、−２０℃）においても悪化する。
ｐ２７７の安定性をそのｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）類似体と比較するため、両方のペプチドが同時に合成され、乾燥粉末として−２０℃で貯蔵された。合成日の１、９及び２０週後、アリクウォットが計量され、溶解され、テストされた。ペプチドの安定性はＴ細胞クローンＣ９を刺激する能力により評価された。図１は実験の結果を示す。元のｐ２７７は合成後９週間以内にほとんどの効果を失い、２０週までに全ての効果を失うが、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）は２０週間の貯蔵の後でも変化しないことが分かる。
ｐ２７７の不安定性はシステイン残基に起因すると考えられるので、ｐ２７７の生物活性を保持する本発明の全ての類似体は、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）の例で示されたのと同様の方法で、ｐ２７７よりも優れた安定性を有することが期待される。
【００２５】
実施例４
ｐ２７７又はｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）によるＮＯＤメスマウスの治療はインシュリン炎を逆転する
ＮＯＤメスマウスは、生後１２週で、ミネラルオイルのエマルジョン（不完全フロイントアジュバント）０．１ｃｃ中の改変されていないｐ２７７又はｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）を１００μｇ／マウスだけ皮下投与することにより治療された。コントロールマウスはＰＢＳ及びミネラルオイルのエマルジョンを投与された。生後６ヶ月で各々の群の５匹のマウスが犠牲にされ、膵臓が摘出され、ブワン固定液中で固定され、その部分がヘマトキシリン、エオシンで着色された。インシュリン炎はブラインド法で評価された。コントロールマウスでは重篤な糖尿病が進行したので、これらのマウスは生後５ヶ月で犠牲にされた。その時までに、コントロールマウスの血中グルコースレベルは２９−４８ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であった。結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
0003554319.tif 000006
【００２７】
生後１２週、即ち処置の時点において、未処置のマウスの小島の約６０％が小島内のインシュリン炎を示し、約２０％の小島が小島周辺部のインシュリン炎を有し、約２０％の小島はインシュリン炎を示さなかった。小島内の浸潤はβ細胞の作用の欠如に関連したインシュリン炎の重篤の形態であると考えられる。表３に示すように、小島部の外観の顕著な分岐は、オイル単独で処置されたコントロールマウスと比較して処置された２つの群において発達した。オイルで処置を受けたマウス（コントロール）では影響を受ヶなかった小島部の比率が斬新的に下降し、生後２２週、即ち全てのマウスが明らかな糖尿病となる時点までには、わずか１０％の正常な小島部を観察することができるだけであった。小島部の約６７％は２２週の時点で小島内のインシュリン炎を示し、残りの２３％の小島部は小島周辺部のインシュリン炎を示した。対照的に、ｐ２７７又はｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）で処置されたマウスは正常な小島の数の上昇（２５％から５２％の間）及び小島内にインシュリン炎を有する小島の数の下降（６％から１７％の間）を示した。小島周辺部のインシュリン炎を起こしている小島は約３１％−６９％にまで上昇した。従って、ｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）による治療は、治療後３ヶ月以上持続するインシュリン炎の程度の逆転と関連する組織学上の描写の改善に関連する。
【００２８】
メスＮＯＤマウスにおけるｐ２７７（Ｖ）の使用の他の結果
１５の他の実験が行われ、これにおいては１０匹のＮＯＤメスマウスの群の各々が生後１２−１５週でオイル中のｐ２７７（Ｖ）又はオイル単独で処置された。オイル単独で処置された１５０匹のマウスの総数の内、９０％で糖尿病が進行し、８５％が生後３２週までに死亡した。対照的に、ｐ２７７（Ｖで処置されたマウスはわずか５０％（ｐ＜０．０１）の罹病率を示しただけであり、わずか２０％が重篤な糖尿病で死亡しただけであった（ｐ＜０．０１）。従って、ｐ２７７（Ｖ）による後期の治療は致命的な糖尿病の進行を停止させるのに有効であった。
【００２９】
実施例５
油性エマルジョン中のｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）を用いたＩ型糖尿病のペプチド療法
膵臓のインシュリン生産性β−細胞の自己免疫による破壊はＴ−リンパ球により行われる。炎症性浸潤は生後５−８週で膵臓の小島周辺部で発達し、インシュリン欠乏症及び完全な糖尿病をもたらすβ細胞の破壊は生後１４−２０週で認められるようになり、生後３５−４０週までにはほとんど１００％のメスＮＯＤマウスは影響を与える。
ＮＯＤメスマウスは、ＰＢＳ、又は１０％の大豆オイル、１．２％の卵リン脂質及び２．２５％のグリセロールからなる１０％の油性エマルジョン（イントラリピッド、カビファーマシアＡＢ、スウェーデン）０．１ｍｌ中の１００μｇのペプチドｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）をマウスごとに皮下投与することにより処置された。
生後６ヶ月での糖尿病の罹病率及び抗−ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）抗体の生産は以下の通りであった。糖尿病は持続的な高血糖症、即ちベックマングルコースアナライザーＩＩで１週間の間隔をおいて少なくとも２回１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上の血中グルコースレベルが測定された場合に診断された。ペプチド療法は、正常な血中グルコース濃度（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下）が維持された場合、膵臓の小島内の炎症（インシュリン炎）が軽減された場合及びＴＨ２型の免疫応答のインディケーターとして治療に用いるペプチドに対する抗体が誘発された場合に成功したと判断された。結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
0003554319.tif 000007
【００３１】
表４から明らかなように、イントラリピッド中で投与された本発明のペプチドによる処置は糖尿病の罹病率及び死亡率を低下するのに有効であった。一方、ＰＢＳ中で投与された処置は無効であった。
【００３２】
実施例６
ペプチドｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）は免疫学的に交差反応性である
前糖尿病のＮＯＤマウスから単離されたＴ−細胞クローンＣ９の細胞はペプチドｐ２７７（黒塗りの円）、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）（白抜きの円）、ｐ２７７（Ｓｅｒ６−Ｓｅｒ１１）（黒塗りの四角形）及びｐ２７７（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋）（白抜きの菱形）と共に培養された。結果を図２に示す。クローンＣ９はペプチドｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対してのみ陽性の増殖応答を示すことが見出された。これはｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）が交差反応性であり、ペプチドｐ２７７（Ｓｅｒ６−Ｓｅｒ１１）及びｐ２７７（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋）は治療上は有効でなく、免疫学的に交差反応性でないことを示す。
【００３３】
実施例７
新しくＩＤＤＭと診断された患者はｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）の両方に対してＴ−細胞増殖応答を示す
新しくＩＤＤＭと診断された患者（２−４週）が増殖アッセイでテストされた。末梢血のリンパ球がヘパリンを加えた全血からフィコール−ハイパーク法で単離され、インヴィトロ系で増殖がスクリーニングされ、これは３Ｈ−チミジンの取り込みとして測定され、ｈｓｐ６０ペプチドｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）及びコントロールペプチドｐ２７８により誘発された。Ｔ細胞増殖応答は刺激指数（ＳＩ）、即ち、ペプチドで刺激されたチミジン取り込みの量とＴ細胞によるチミジンのバックグラウンド（抗原が加えられていない）の取り込み量との割合として表される。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
表５に示されるように、新しくＩＤＤＭと診断された患者は、ｐ２７７ペプチドと同様に、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対して応答する。従って、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）は免疫学的にｐ２７７と均等である。ｐ２７７の治療上の効果は、免疫学上の認識により達成されるので、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）がｐ２７７と免疫学的に交差反応性であるという事実は、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）は糖尿病の治療においてｐ２７７の代りに用いることができるということを示している。
【００３６】
実施例８
ｈｓｐ６０及びＩＤＤＭ及び健康な個体中のペプチドに対するＴ細胞の応答
２１人のＩＤＤＭ患者及び１４人の健康な血液ドナーが実施例７の増殖アッセイにより抗−ｈｓｐ６０及びｐ２７７（Ｖ）のスクリーニングを受けた。表６及び表７はコントロール抗原（コントロールＡｇ）、即ち破傷風毒素及びテキサス株のインフルエンザウイルス及び全体の遺伝子組み替え型ｈｓｐ６０及びｐ２７７（Ｖ）に対する各々の個体のＴ細胞の増殖応答（刺激指数；ＳＩ）を示す。３又はそれ以上のＳＩ値は陽性と考えられた。
【００３７】
【表６】
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【００３８】
【表７】
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【００３９】
表８は、８６％及び５２％の患者がｈｓｐ６０及びｐ２７７（Ｖ）に対し応答したのに対し、２１％及び１４％がコントロールに応答したこと（ｐ＜０．０５）を示す表である。従って、ＩＤＤＭ群はｈｓｐ６０及びｐ２７７（Ｖ）に対する応答が明らかに陽性であった。これによって、ＩＤＤＭ患者ではｈｓｐ６０及びｐ２７７（Ｖ）に反応する個体の割合は健康人よりも高いという結論が導かれる。
【００４０】
【表８】
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【００４１】
実施例９
ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）に対するＮＯＤのＴ−細胞増殖
ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）ペプチドは１個のアミノ酸がｐ２７７と異なる。ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）がＮＯＤのＩＤＤＭにおける自己抗原であることを確認するため、ペプチドｐ２７７及びペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）に対するＴ−細胞の増殖を比較した。図３はメスＮＯＤ脾臓のＴ細胞がｐ２７７と同一の程度ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）に対して増殖したことを示す。コントロールペプチドｐ２７８に対する応答は存在しなかった。
上記の結果は、クローンＣ９、即ちヒトペプチドｐ２７７に対して応答することが知られている糖尿病誘発性のＮＯＤのＴ−細胞クローンを使用することで確認された（エリアスら、１９９１年）。Ｃ９細胞はｐ２７７ペプチドと同程度ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）ペプチドに対して増殖することが見出された（図４）。
【００４２】
実施例１０
ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）によるＮＯＤメスマウスの治療
以前、本発明者は、生後３ヶ月のメスＮＯＤマウスに現れる進行したインシュリン炎はヒトｐ２７７の単一注射で処置することで停止することができ、処置されたマウスでは臨床的に完全な糖尿病の罹病率及び重篤な高血糖症による死亡率が低下することを報告した。ペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）、即ちマウスの自己ｐ２７７ペプチドが有効であるかどうかテストするため、本発明者は生後３ヶ月のメスＮＯＤマウスをＩＦＡ中のヒトｐ２７７又はｐ２７７（Ｌｙｓ１９）１００μｇで処置した。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチドｐ２７７又はｐ２７７（Ｌｙｓ１９）は同量の不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）で乳化された。１０匹の生後３ヶ月のメスＮＯＤマウスの群はいずれかのペプチドを含むエマルジョン０．１ｍｌ（ペプチド１００μｇ）が皮下注射された。コントロールマウスはＰＢＳ及びＩＦＡのエマルジョンが注射された。マウスは４週毎に採血され、血中グルコースレベルがベックマングルコースアナライザーＩＩで求められた。高血糖症の罹病率及び糖尿病による死亡率は、生後６ヶ月で評価された。マウスは血中グルコースが１１ｍｍｏｌ／Ｌより大きい場合に糖尿病と診断された。
結果を表９に示す。生後６ヶ月で、９０％のコントロールマウスが完全な高血糖症となり、６０％が糖尿病により死亡した。これに対して、ｐ２７７又はｐ２７７（Ｌｙｓ１９）による処置により糖尿病（各々４０％及び５０％の罹病率）及び死亡（各々１０及び２０％の死亡率）が防止された。従って、マウスの自己ペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）は進行したインシュリン炎の治療に異種ｐ２７７として有効であると思われる。
【００４３】
【表９】
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【００４４】
これらの結果は、ヒトｈｓｐ６０分子及びそのｐ２７７ペプチドを用いて検出されたＮＯＤのＴ細胞の増殖応答は、マウスｈｓｐ６０及びマウスｐ２７７（Ｌｙｓ１９）配列に対する自己免疫応答と均等であることを示す。これは前糖尿病マウスの脾臓において進行している自然応答と同様、糖尿病誘発性Ｃ９Ｔ細胞クローンについても示された。さらに、ｐ２７７（Ｌｙｓ１９）はＮＯＤマウスの糖尿病の治療にｐ２７７と同程度有効であった。月齢及び性別が一致する他の種類のマウスの脾臓Ｔ細胞はｐ２７７に対する自然的なＴ−細胞の増殖応答を示さなかった（示さず）。
糖尿病誘発性Ｔ細胞により標的されるマウスｈｓｐ６０配列に対する自己免疫性の発見は、ＩＤＤＭが自己免疫過程に起因するという一般的な考え方を支持するものである。
【００４５】
実施例１１
ｐ２７７（Ｖ）によるＳＴＺ誘発性糖尿病の治療
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、２００ｍｇ／ｋｇの容量が注射されると、２４−４８時間以内にβ−細胞を破壊することにより中毒性糖尿病を引き起こすことができるβ−細胞特異性毒素である。これを少量投与すると糖尿病に結びつく遺伝的なマウスのインシュリン炎を誘発する。炎症過程はＳＴＺの容量により、２０−３０日かかる。ＳＴＺ誘発性糖尿病のための通常のプロトコールは体重１ｋｇに対し２００ｍｇのＳＴＺを連日４０ｍｇ／ｋｇの容量を５回投与することであり（ライク及びロジニ、１９７６年）、このモデルは低量ＳＴＺと呼ばれている。全量が１５０ｍｇ／ｋｇ（３０ｍｇ／ｋｇ×５）に減量されると、糖尿病は８０−１００日以内に発現するということが見出されている。このＳＴＺ誘発性糖尿病の穏やかな進行形態はおそらくヒトにおける自己免疫性糖尿病と類似し、ＮＯＤマウスの自然発症的な糖尿病の前臨床的段階と同一の期間持続する（カスタノ及びアイゼンバース、１９９０年）。さらに、急性の毒素効果は容量が減少すると減少する。
６０ｋＤａ熱ショック蛋白質（ｈｓｐ６０）はＮＯＤ（エリアスら、１９９０年）及びＳＴＺ誘発性（エリアスら、１９９４年）糖尿病の両方において役割を果たしている。完全な糖尿病が始まる前に、ｈｓｐ６０に対する抗体及びＴ細胞増殖応答が生じていることが示されている。ｈｓｐ６０に特異的なＴ細胞クローンは前糖尿病ＮＯＤマウスに由来し、若いＮＯＤ（エリアスら、１９９１年）又はτγιδＮＯＤマウスにインシュリン炎及び高血糖症を養子免疫伝達することができる。ＮＯＤ糖尿病誘発性Ｔ細胞クローンはｐ２７７と呼ばれるｈｓｐ６０配列４３７−４６０の２４個のアミノ酸からなる長いペプチドを認識する。誘発性糖尿病は前臨床段階で抗−ｐ２７７Ｔ細胞応答を伴う。
上記実施例はｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）ペプチドはＮＯＤマウスを保護することを示した。本実験は低量ＳＴＺモデルにおけるｐ２７７（Ｖ）療法の有効性をテストするものである。
【００４６】
１０匹のオスマウスからなる群は１日あたり３０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺで５日間治療された。１週間後、マウスはオイル中の１００μｇのｐ２７７（Ｖ）、カウフマンらが１９９３年にＮＯＤマウスの糖尿病に関連すると記載したグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤｐ３４）のペプチド又はオイル単独で処置された。この処置は、８５日間繰り返された。１００日目にマウスは採血され、その血液が高血糖症かどうかテストされた（１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上のグルコース濃度）。結果を図５に示す。ＧＡＤｐ３４で処置されたマウス又は処置されなかったマウスの平均血中グルコースは高血糖症の範囲にあることが分かる。反対に、ｐ２７７（Ｖ）で処置されたマウスの平均血中グルコースは正常の範囲内であった。従って、ｐ２７７（Ｖ）は遺伝的に異なるメスＮＯＤマウスで自然的に進行した糖尿病と同様ＳＴＺにオスＣ５７ＢＬ／ｋｓｊマウスに誘発された糖尿病の治療においても有効である。ｐ２７７（Ｖ）療法の適用性は、１の原因又は１の遺伝子型又は性別の糖尿病に限定されない。
本明細書中に引用された参照文献は雑誌、記事若しくは要約、又は公開された若しくは対応する米国若しくは外国出願、発行された米国又は外国出願、更には他の参照文献を含むものであるが、全体として本明細書に一体化され、これは、引用された文献中の全てのデータ、表、数値及びテキストを含む。更に、ここに引用した参照文献中で引用されている参照文献の全体の内容もまた本明細書に一体化される。
【００４７】
公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法又は従来の方法への参照は、本発明の観点、説明及び実施例が関連技術において開示、教示又は示唆されていることを認めるものではない。
上述の実施例の説明は本発明の一般的性質を明らかにしているので、本技術の属する分野の通常の知識を適用することにより（ここに引用した参照文献の内容を含む）、不必要な実験を行うことなく、本発明の一般的概念から離れることなく、容易に実施例の変更及び／又は応用を行うことができる。従って、このような変更及び応用は、本明細書中における教示及び指導に基づき、実施例と均等の意味及び範囲内であると意図される。本明細書中で用いられた用語は発明の説明のためのものであり、発明を限定するものではないので、本明細書の用語は本明細書の開示及び教示を参照して、発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者の知識と組み合わせることにより、通常の知識を有する者により解釈されなければならない。
【００４８】
参考文献
ベンデラック（Ｂｅｎｄｅｌａｃ  Ａ）、カルナウド（Ｃａｒｎａｕｄ  Ｃ）、バッハ（Ｂａｃｈ  ＪＦ）、（１９８７）、糖尿病ＮＯＤマウスから健康な新生児への自己免疫糖尿病の親縁移転：Ｌ３Ｔ４＋及びＬＹ＋−２＋Ｔ細胞の要件（Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｎｅｏｎａｔｅｓ．  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  Ｌ３Ｔ４＋  ａｎｄ  Ｌｙ＋−２＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １６６：８２３−８３２
ボウマン（Ｂｏｗｍａｎ  ＭＡ）、レイター（Ｌｅｉｔｅｒ  ＥＨ）及びアトキンソン（ＡｔｋｉｎｓｏｎＭＡ）、（１９９４）、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の予防：ヒト疾病の治療的な介入の関係（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＯＤ  ｍｏｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｔｏｄａｙ，  １５：１１５−１２０
カスタノ（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ）、アイセンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ）、（１９９０）、Ｉ型糖尿病：ヒト、マウス及びラットの慢性自己免疫疾患（Ｔｙｐｅ−Ｉ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：  ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ，  ｍｏｕｓｅ，  ａｎｄ  ｒａｔ）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：６４７−６７９
エリアス、ダナ（Ｅｌｉａｓ，  Ｄａｎａ）、（１９９４）、ＮＯＤマウス：自己免疫インシュリン依存性糖尿病のモデル（Ｔｈｅ  ＮＯＤ  ｍｏｕｓｅ：  Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．）、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，  ｐｐ１４７−１６１
【００４９】
エリアス（Ｅｌｉａｓ，  Ｄ）、マルコヴィッツ（Ｍａｒｋｏｖｉｔｓ  Ｄ）、レシェフ（Ｒｅｓｈｅｆ  Ｔ）、ファン−デル・ジー（ｖａｎ−Ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ  ＩＲ）、（１９９０）、６５−ｋＤａ熱ショックタンパク質による非肥満性糖尿病（ＮＯＤ／Ｌｔ）における自己免疫性糖尿病の誘発と治療（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ／Ｌｔ）ｍｏｕｓｅ  ｂｙ  ａ  ６５−ｋＤａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８７：１５７６−１５８０
エリアス（Ｅｌｉａｓ  Ｄ）、プリゴジン（Ｐｒｉｇｏｚｉｎ  Ｈ）、ポラック（Ｐｏｌａｋ  Ｎ）、ラポポート（Ｒａｐｏｐｏｒｔ  Ｍ）、ローゼン（Ｌｏｈｓｅ  ＡＷ）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ  ＩＲ）、（１９９４）、β−細胞毒素であるストレプトゾトシンにより誘発される自己免疫糖尿病（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂ−ｃｅｌｌ  ｔｏｘｉｎ  ｓｔｒｅｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４３：９９２−９９８
エリアス（Ｅｌｉａｓ  Ｄ．）、レシェフ（Ｒｅｓｈｅｆ  Ｔ）、ビルク（Ｂｉｒｋ  ＯＳ）、ファンデルジー（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ  ＭＤ）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ  ＩＲ）、（１９９１）、ヒト６５ｋＤａ熱ショックタンパク質のＴ細胞エピトープによるマウス自己免疫糖尿病のワクチン（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｕｓｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ６５ｋＤａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８８：３０８８−３０９１
エリアス（Ｅｌｉａｓ  Ｄ．）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ  ＩＲ）、（１９９４）、ＮＯＤマウスにおける糖尿病のペプチド療法（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ）、Ｔｎｅ  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４３：７０４−７０６．
カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＬ）、クラーレ−サルズラー（Ｃｌａｒｅ−Ｓａｌｚｌｅｒ  Ｍ）、タイアン（Ｔｉａｎ  Ｊ）、ホルストフーバー（Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒ  Ｔ）、ティング（Ｔｉｎｇ  ＧＳＰ）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｐ）、アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＡ）、セルカルツ（Ｓｅｒｃａｒｚ  ＥＥ）、トビン（Ｔｏｂｉｎ  ＡＪ）、レーマン（Ｌｅｈｍａｎｎ  ＰＶ）、（１９９３）、ムリンインシュリン依存性糖尿病におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼに対するＴ−細胞寛容の自然損失（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、Ｎａｔｕｒｅ，  ３６６：６９−７２
【００５０】
ライク（Ｌｉｋｅ  ＡＡ）、ロジニ（Ｒｏｓｓｉｎｉ  ＡＡ）、（１９７６）、ストレプトゾトシン誘発性膵臓インシュリン炎：糖尿病の新規モデル（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ：  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９３：４１５−４１７
モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．Ｒ．）及びコフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ  Ｒ．Ｉ．）、（１９８９）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ７：１４５−１７３
ティッシュ（Ｔｉｓｃｈ  Ｒ）、ヤング（Ｙａｎｇ  ＸＤ）、シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ  ＳＭ）、リブラヴ（Ｌｉｂｌａｖ  ＲＳ）、フガー（Ｆｕｇｇａｒ  Ｌ）、マクデヴィット（ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ）、（１９９３）、グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫応答は非肥満性糖尿病マウスにおいてインシュリンと相互関連する（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙ  ｌａｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ，  ３６６：７２−７５
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐ２７７及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）の安定性を示すグラフである。黒塗りの円はｐ２７７を用いた結果を示し、白抜きの円はｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）を用いた結果を示す。大きい円は１週間の貯蔵後の結果を示し、中間の大きさの円は９週後を示し、最も小さい円は２０週後を示す。
【図２】図２は糖尿病誘発性クローンＣ９のＮＯＤのＴ細胞がペプチドｐ２７７（黒塗りの円）及びｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）（白抜きの円）に応答して増殖することを示す。
【図３】図３はＮＯＤ脾臓細胞がペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）存在下で増殖することを示す。５匹のメスマウスの脾臓が各々の月齢のグループでペプチドｐ２７７（Ｌｙｓ１９）（黒塗りの円）、ｐ２７７（白抜きの円）及びコントロールペプチドｐ２７８（黒塗りの四角形）に応答したＴ細胞の増殖がテストされた。
【図４】図４は糖尿病誘発性クローンＣ９のＮＯＤのＴ細胞がペプチドｐ２７７に応答して増殖することを示す。
【図５】図５はＳＴＺ誘発性糖尿病の予防においてコントロールの処置又はＧＡＤｐ３４による処置と比較してＩＦＡ中のｐ２７７（Ｖ）による前処置の有効性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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