(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し、５５℃を超える温度で酵素反応可能な、スルフォロブス属に属する微生物から得ることのできる、ＳＤＳ−ゲル電気泳動法による分子量が約５４，０００乃至６４，０００ダルトンである耐熱性トレハロース遊離酵素。
【請求項２】
グリコシル部分が、重合度１以上のグルコース残基から構成されている請求項１記載の耐熱性トレハロース遊離酵素。
【請求項３】
耐熱性が、ｐＨ７．０、６０分間保持で８５℃付近まで安定であることを特徴とする請求項１又は２記載の耐熱性トレハロース遊離酵素。
【請求項４】
下記の理化学的性質を有し、スルフォロブス属に属する微生物から得ることのできる、耐熱性トレハロース遊離酵素；
（１）作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解してトレハロースを遊離する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５４，０００乃至６４，０００ダルトン。
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．６乃至６．６。
（４）  至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、７５℃付近。
（５）  至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応で、ｐＨ約５．５乃至６．０。
（６）  温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８５℃付近まで安定。
（７）  ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約４．５乃至９．５。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素産生能を有するスルフォロブス属に属する微生物を栄養培地中で培養し、得られる培養物から該耐熱性トレハロース遊離酵素を採取することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項６】
スルフォロブス属に属する微生物が、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）、スルフォロブス・アシドカルダリウス  （ＡＴＣＣ４９４２６）、スルフォロブス・ソルファタリカス（ＡＴＣＣ３５０９１）、又はスルフォロブス・ソルファタリカス（ＡＴＣＣ３５０９２）である、請求項５記載の耐熱性トレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質に作用させてトレハロースを生成させ、生成したトレハロース、又は、これを含む糖質を採取することを特徴とする、トレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項８】
還元性澱粉部分分解物に、下記に示す理化学的性質を有する非還元性糖質生成酵素と、請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素とを同時に作用させるか、これらの酵素をこの順序で作用させてトレハロースを生成させ、生成したトレハロース、又は、これを含む糖質を採取することを特徴とする、トレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法；
（１）  作用
グルコース重合度３以上の１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物から、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の１種又は２種以上の非還元性糖質を生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約６９，０００乃至７９，０００ダルトン。
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．４乃至６．４。
（４）  至適温度
ｐＨ５．５、６０分間反応で、７５℃付近。
（５）  至適ｐＨ
６０℃、６０分間反応で、ｐＨ５．０乃至５．５付近。
（６）  温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８５℃付近まで安定。
（７）  ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約４．０乃至９．５。
【請求項９】
還元性澱粉部分分解物が、澱粉質を酵素又は酸によって部分的に加水分解して得られる還元性澱粉部分分解物である請求項８記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１０】
酵素が、アミラーゼ及び／又は枝切酵素である請求項９記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１１】
還元性澱粉部分分解物が、グルコース重合度３以上の１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物、澱粉液化物、デキストリン又はマルトオリゴ糖である請求項８乃至１０のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１２】
更にグルコアミラーゼを作用させることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１３】
トレハロース、又は、これを含む糖質を採取するに際し、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項７乃至１２のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１４】
トレハロースが、含水結晶又は無水結晶である請求項７乃至１３のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法により得られるトレハロース、又は、これを含む糖質を含有せしめることを特徴とする飲食物の製造方法。
【請求項１６】
請求項７乃至１４のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法により得られるトレハロース、又は、これを含む糖質を含有せしめることを特徴とする化粧品の製造方法。
【請求項１７】
請求項７乃至１４のいずれかに記載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法により得られるトレハロース、又は、これを含む糖質を含有せしめることを特徴とする医薬品の製造方法。
【請求項１８】
請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素と、下記の理化学的性質を有する非還元性糖質生成酵素とを含んでなる酵素液；
（１）  作用
グルコース重合度３以上の１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物から、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の１種又は２種以上の非還元性糖質を生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約６９，０００乃至７９，０００ダルトン。
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．４乃至６．４。
（４）  至適温度
ｐＨ５．５、６０分間反応で、７５℃付近。
（５）  至適ｐＨ
６０℃、６０分間反応で、ｐＨ５．０乃至５．５付近。
（６）  温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８５℃付近まで安定。
（７）  ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約４．０乃至９．５。
【請求項１９】
請求項１乃至４のいずれかに記載の耐熱性トレハロース遊離酵素産生能と、下記に示す理化学的性質を有する非還元性糖質生成酵素産生能とを有するスルフォロブス属に属する微生物を栄養培地中で培養して、当該耐熱性トレハロース遊離酵素と当該非還元性糖質生成酵素とを生成させ、得られる培養物から当該耐熱性トレハロース遊離酵素及び当該非還元性糖質生成酵素を採取することを特徴とする、耐熱性トレハロース遊離酵素及び非還元性糖質生成酵素の製造方法；
（１）  作用
グルコース重合度３以上の１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物から、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の１種又は２種以上の非還元性糖質を生成する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約６９，０００乃至７９，０００ダルトン。
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．４乃至６．４。
（４）  至適温度
ｐＨ５．５、６０分間反応で、７５℃付近。
（５）  至適ｐＨ
６０℃、６０分間反応で、ｐＨ５．０乃至５．５付近。
（６）  温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８５℃付近まで安定。
（７）  ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約４．０乃至９．５。
【請求項２０】
スルフォロブス属に属する微生物が、スルフォロブス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ３３９０９）、スルフォロブス・アシドカルダリウス  （ＡＴＣＣ４９４２６）、スルフォロブス・ソルファタリカス（ＡＴＣＣ３５０９１）、又はスルフォロブス・ソルファタリカス（ＡＴＣＣ３５０９２）である、請求項１９記載の耐熱性トレハロース遊離酵素及び非還元性糖質生成酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、耐熱性トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解しトレハロースを遊離する新規耐熱性トレハロース遊離酵素とその製造方法、加えて、この新規耐熱性トレハロース遊離酵素を用いて製造されるトレハロース、及び、このトレハロースを含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、古くからトレハロース（α，α−トレハロース）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６３年）アカデミック・プレス社（米国）及び『アプライド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載されているように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広範囲に及んでいる。トレハロースは、非還元性糖質ゆえにアミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起こさず、アミノ酸含有物質を損なわないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が望まれている。
【０００３】
トレハロースの製造方法としては、例えば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微生物を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公報で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロース・ホスホリラーゼとの組合せでマルトースを変換する方法などが知られている。しかしながら、微生物を用いる方法は、菌体を出発原料とし、これに含まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当り１５ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）未満と低く、その上、これを抽出・精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及びトレハロース・ホスホリラーゼを用いる方法は、いずれもグルコースリン酸を経由しており、その基質濃度を高めることが困難であり、また、両酵素の反応系が平衡反応で目的物の生成率が低く、更には、両酵素の反応系を安定に維持して反応をスムーズに進行させることが困難であって、未だ、工業的製造方法として実現するに至っていない。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者らが、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物がグルコース重合度３以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６など産生するトレハロース遊離酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これらの酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的に容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。
【０００５】
しかしながら、上記のリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の酵素は耐熱性に乏しく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を製造しようとすると、約５５℃以下の温度で酵素反応する必要がある。これに関して、『酵素応用の知識』、初版、第８０乃至１２９頁（１９８６年）、「糖質関連酵素とその応用」の「糖質関連酵素」の項において、「工業的な糖化条件では、５５℃以下では雑菌汚染の危険性が伴い、糖化反応中にｐＨが低下する。」と記載されているように、澱粉を原料とし、長時間にわたる酵素反応の場合、温度５５℃以下の反応条件では、雑菌汚染により反応液がｐＨ低下し、反応途中で酵素失活することが懸念され、リゾチーム等の添加による雑菌汚染防止や反応液のｐＨ調整を必要とする場合もある。また、澱粉部分分解物の加水分解率が低い場合、澱粉質の老化による不溶化物の生成も懸念される。
【０００６】
一方、耐熱性酵素は高い反応温度でも酵素反応が進行するため、耐熱性酵素を用いた反応では、微生物汚染の懸念が少なく、また、澱粉部分分解物の老化も起こりにくいと考えられる。耐熱性酵素の給源としては、一般的に、好熱菌を挙げることができる。好熱菌によるトレハロース生成に関して、『バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｒｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）』、第１２巻、第４３１乃至４３２頁（１９９０年）及び『バイオテック・フォーラム・ヨーロップ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｆｏｒｕｍ  Ｅｕｒｏｐｅ）』、第８巻、第２０１乃至２０３頁（１９９１年）に記載されているように、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ４９１５５の菌体及び菌体抽出物の部分精製酵素が、基質アミロースや可溶性澱粉からグルコース及びトレハロースを生成することが報告されている。しかしながら、酵素の精製がなされておらず、示されている理化学的性質も不充分であり、作用機作も不明であって、単にトレハロースが生成されることを示しているにすぎない。そこで、温度５５℃を越える条件で酵素反応可能な耐熱性酵素を用いることによるトレハロースの新規製造方法の確立が望まれる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、温度５５℃を越える条件で酵素反応可能な、且つ、作用機作も解明された耐熱性トレハロース遊離酵素を用いた還元性澱粉部分分解物からのトレハロース、又は、これを含む糖質の新規製造方法とそのトレハロース、又は、これを含む糖質並びにそれらの用途を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離するという作用機作を有する全く新しい耐熱性酵素の実現に期待を込めて、この酵素を産生する微生物を好熱菌を中心に広く検索してきた。
【０００９】
その結果、特願平６−１６６０１１号明細書（特開平８−６６１８８号公報）で開示したスルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属に属する耐熱性非還元性糖質生成酵素産生微生物スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ３３９０９及びＡＴＣＣ４９４２６、さらに、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３５０９１及びＡＴＣＣ３５０９２が、５５℃を越える温度で反応可能な耐熱性の新規トレハロース遊離酵素をも産生することを見い出した。還元性澱粉部分分解物に、耐熱性非還元性糖質生成酵素とこの新規耐熱性トレハロース遊離酵素とを作用させることにより、目指していた高い反応温度でのトレハロース生成反応を容易に行いうることを見い出し、また、還元性澱粉部分分解物に、耐熱性非還元性糖質生成酵素と新規耐熱性トレハロース遊離酵素とを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させることにより、更に高純度トレハロース含有反応液を得ることができ、容易にトレハロースを製造しうることを見い出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明では、上記菌のみならず、スルフォロブス属に属し、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解しトレハロースを遊離する耐熱性トレハロース遊離酵素を産生する他の菌株、更には、それらの菌株の変異株なども適宜用いられる。
【００１１】
本発明の微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜、澱粉部分分解物などの糖質、、又は、クエン酸、コハク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、澱粉部分分解物の場合には、通常、２０％以下が望ましく、菌の生育及び増殖からは５％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。
【００１２】
培養は、通常、温度４０乃至９５℃、好ましくは５０乃至９０℃、ｐＨ１乃至７、好ましくは２乃至６から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は本微生物が増殖しうる時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのため、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００１３】
このようにして、微生物を培養した後、本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、培養物の菌体に主に認められ、公知の方法によって精製して利用することができる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、東ソー株式会社製ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール』などを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、同社製ゲル『ブチルトヨパール』などを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、同社製ゲル『トヨパール  ＨＷ−５５』などを用いたゲル瀘過クロマトグラフィー、再度のブチルトヨパールを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、ファルマシア・バイオテク株式会社製ゲル『スーパーローズ  １２』などを用いたゲル瀘過クロマトグラフィー用いて精製することにより、電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００１４】
このようにして得られる本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素は、下記の理化学的性質を有する。
（１）    作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の
結合を特異的に加水分解する。
（２）    分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５４，０００乃至６４，０００
ダルトン。
（３）    等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約５．６乃至６．６。
（４）    至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、７５℃付近。
（５）    至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応で、ｐＨ約５．５乃至６．０。
（６）    温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、８５℃付近まで安定。
（７）    ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約４．５乃至９．５。
【００１５】
本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルトトリオシルトレハロース（別名、α−マルトテトラオシル  α−グルコシド）１．２５ｗ／ｖ％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）４ｍｌに酵素液を１ｍｌ加え６０℃で３０分間反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ１００℃で３０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。
【００１６】
本酵素の基質としては、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質であればよく、例えば、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどに非還元性糖質生成酵素を作用させ得られるグルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース、マルトペンタオシルトレハロースなどのグリコシルトレハロースが用いられる。また、澱粉、アミロペクチン、アミロースなどの澱粉質をアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解し得られる還元性澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素を作用させ得られる末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質を含む低還元性の澱粉部分分解物が用いられる。
【００１７】
澱粉を部分的に加水分解するアミラーゼとしては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ  Ａｍｙｌａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）』、（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーセなどが用いられる。これらアミラーゼとプルラナーゼ及びイソアミラーゼなどの枝切酵素を併用することも有利に実施できる。
【００１８】
還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素としては、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）で開示したリゾビウム・スピーシーズＭ−１１、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの非還元性糖質生成酵素を用いることができるが、反応温度が５５℃を越える場合は、本出願人が特願平６−１６６０１１号明細書（特開平８−６６１８８号公報）で開示したスルフォロブス属の耐熱性非還元性糖質生成酵素を有利に用いることができる。
【００１９】
基質濃度は特に限定されない。例えば、０．１％の基質溶液として用いた場合でも、５０％の基質溶液として用いた場合でも、本酵素の反応は進行し、トレハロースを生成する。また、基質溶液中に完全に溶けきれない過剰量の基質を含有するものであってもよい。反応温度は両酵素が失活しない温度、すなわち８５℃付近までで行えばよいが、好ましくは５５乃至７０℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至１０の範囲に調整すればよいが、好ましくはｐＨ約５乃至７の範囲に調整する。反応時間は酵素反応の進行により適宜選択する。
【００２０】
グルコース重合度が３以上の還元性澱粉部分分解物を基質として、本発明によるトレハロースの製造方法は、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）に記載の方法、即ち、非還元性糖質生成酵素とグルコアミラーゼの反応によって得られた反応液と比較して、顕著にトレハロース生成量は増加している。即ち、先願の非還元性糖質生成酵素とグルコアミラーゼの反応によって得られるトレハロース生成率は約３０％であるのに対して、本発明の非還元性糖質生成酵素とトレハロース遊離酵素とを共に作用させる反応では、トレハロース生成率が約６０％又はそれ以上である。
【００２１】
この作用の原理は、次の通りである。すなわち、まず、グルコース重合度が３以上の１分子の還元性澱粉部分分解物が非還元性糖質生成酵素により、末端にトレハロース構造を有する１分子の非還元性糖質に変換され、その非還元性糖質がトレハロース遊離酵素の加水分解反応により１分子のトレハロースとグルコース重合度で２を減少した１分子の還元性澱粉部分分解物とを生成する。新たに生成した還元性澱粉部分分解物のグルコース重合度が３以上であれば、この還元性澱粉部分分解物が、更に、非還元性糖質生成酵素により末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質に変換され、トレハロース遊離酵素により１分子のトレハロースと還元性澱粉部分分解物とを生成する。この非還元性糖質生成酵素の反応とトレハロース遊離酵素の反応とを繰り返すことにより、１分子の還元性澱粉部分分解物から複数分子のトレハロースを生成せしめることができる。
【００２２】
この作用の方法は、グルコース重合度が３以上の還元性澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素と本発明のトレハロース遊離酵素とを同時に作用させることも、また、該還元性澱粉部分分解物に、まず、非還元性糖質生成酵素を作用させ、次いで、トレハロース遊離酵素を作用させることもできる。必要に応じて、更にグルコアミラーゼを作用させてトレハロース含量を高めることも有利に実施できる。
【００２３】
反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。必要ならば、更に、高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、アルカリ処理による還元性糖質の分解除去などの方法で精製することにより、高純度のトレハロース製品を得ることも容易である。
【００２４】
このようにして得られた本発明のトレハロースを含む糖質を、必要により、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、トレハラーゼなどで加水分解したり、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで糖転移したりして、甘味性、還元力などを調整したり、粘性を低下させたりすることも、また、水素添加して還元性糖質を糖アルコールにして還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施すことも随意である。これを、前述の精製方法、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取する。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース含水結晶又は無水結晶トレハロースを得ることも有利に実施できる。
【００２５】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去してトレハロース高含有画分を採取する方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００２６】
トレハロース含水結晶を製造するには、例えば、純度６０％以上、濃度６５乃至９０％のトレハロース含有液を助晶缶にとり、必要により、０．１乃至２０％の種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは、１０乃至９０℃の範囲で、撹拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。また、減圧濃縮しながら、晶析させる連続晶析法を採用することも有利に実施できる。マスキットからトレハロース含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００２７】
分蜜方法の場合には、通常、マスキットをバスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度６０乃至８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃至２０％晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを数時間乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。また、無水結晶トレハロースを製造するには、トレハロース含水結晶を乾燥して変換させることもできるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度トレハロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で撹拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【００２８】
このようにして製造される本発明のトレハロースは、還元力がなく、安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸又はアミノ基を含有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、それ自身が良質で上品な甘味を有している。更に、トレハロースはトレハラーゼにより容易にグルコースにまで分解することから、経口摂取により、消化吸収され、カロリー源として利用される。虫歯誘発菌などによって、発酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００２９】
また、本発明のトレハロースは、経管栄養剤、輸液剤などとして非経口的に使用され、毒性、副作用の懸念もなく、よく代謝、利用され、生体へのエネルギー補給に有利に利用することができる。また、安定な甘味料であることにより、トレハロース含水結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性などの性質を具備している。
【００３０】
従って、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００３１】
本発明のトレハロース及びこれを含む糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００３２】
また、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することも随意である。また、本発明のトレハロース及びこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００３３】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調理料として有利に使用できる。
【００３４】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物への甘味付けに呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００３５】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤として有利に利用できる。
【００３６】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００３７】
以上述べたような各種組成物にトレハロースを含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、０．１％以上、望ましくは、１％以上含有せしめるのが好適である。
【００３８】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００３９】
【実験１  酵素の生産】
ペプトン０．１ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム０．２ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム七水塩０．０２ｗ／ｖ、塩化カリウム０．０２ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を５００ｍｌ容三角フラスコに約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌し、冷却した後、硫酸にてｐＨ３．０に調整した。この液体培地にスルフォロブス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ３３９０９を接種し、７５℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを第１次種培養液とした。容量１０ｌのファーメンターに第１次種培養の場合と同組成の培地約５ｌを入れて殺菌、冷却してｐＨ３．０、温度７５℃とした後、第１次種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度７５℃、通気量５００ｍｌ／分で約４８時間通気培養したものを第２次種培養液とした。容量３００ｌのファーメンターに第１次種培養の場合と同組成の培地約２５０ｌを入れて殺菌、冷却してｐＨ３．０、温度７５℃とした後、第２次種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度７５℃、通気量１００ｌ／分で約４２時間通気培養した。培養液の耐熱性トレハロース遊離酵素の酵素活性は約０．０３単位／ｍｌであった。
【００４０】
【実験２  酵素の精製】
実験１の方法で得られた培養液約１７０ｌを遠心分離し、含まれる菌体を湿重量として２５８ｇ回収した。この菌体に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３００ｍｌ加え、懸濁した後、日本精機製作所製超音波破砕機モデル『ＵＳ３００』で菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、約３００ｍｌの遠心上清液を得た。その液に飽和度０．７になるように硫酸アンモニウムを加え溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離して塩析物を回収した。得られた塩析物を１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離し不溶物を除いた。その透析液（約６００ｍｌ）を２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパールを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量約３５０ｍｌ）を行った。
【００４１】
本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素、耐熱性非還元性糖質生成酵素ともＤＥＡＥ−トヨパールに吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから０．１Ｍ食塩濃度付近で両酵素とも溶出し、両酵素活性画分として回収した。
【００４２】
両酵素活性画分を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離し不溶物を除き、得られる上清を東ソー株式会社製ゲル『ブチルトヨパール  ６５０』を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を１Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウム濃度のリニアグラジエントでカラムより溶出させたところ、耐熱性トレハロース遊離酵素と耐熱性非還元性糖質生成酵素酵素とは異なる硫酸アンモニウム濃度においてそれぞれ溶出した。ブチルトヨパールからの溶出パターンを図１に示す。耐熱性非還元性糖質生成酵素は硫酸アンモニウム濃度約０．８Ｍで、耐熱性トレハロース遊離酵素は硫酸アンモニウム濃度約０．２Ｍで溶出し、それぞれの酵素活性画分を回収し、以下、両酵素を別々に精製した。
【００４３】
耐熱性非還元性糖質生成酵素画分を０．２Ｍ食塩を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離し不溶物を除き、得られる上清をセプラコル社製ゲル『ウルトロゲル  ＡｃＡ  ４４』を用いたゲル瀘過クロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）を行い、酵素活性画分を回収した。続いて、同緩衝液に対して透析し後、ファルマシア・エルケイビー社製ゲル『Ｍｏｎｏ  Ｑ』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量１０ｍｌ）に供し、吸着した本酵素を０Ｍから０．２Ｍ食塩濃度のリニアグラジエントでカラムより溶出させ、０．１Ｍ食塩濃度付近で溶出した耐熱性非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。
【００４４】
耐熱性トレハロース遊離酵素の精製は、ブチルトヨパールから溶出した耐熱性トレハロース遊離酵素活性画分を用いて、トヨパール  ＨＷ−５５を用いたゲル瀘過クロマトグラフィーを行い、酵素活性画分を回収した。続いて、再度、ブチルトヨパール  ６５０を用いた疎水カラムクロマトグラフィーを同様に行った。更に、ファルマシア製カラム『スーパーローズ  １２ＨＲ  １０／３０』を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、耐熱性トレハロース遊離酵素活性画分を回収した。
【００４５】
なお、この発明を通じて、非還元性糖質生成酵素の活性は、特にことわらない限り、次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、６０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を１００℃で１００分間加熱して反応を停止させる。反応液を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。非還元性糖質生成酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定義する。
【００４６】
精製の各工程における酵素活性量、比活性、収率を、耐熱性非還元性糖質生成酵素の場合は表１に、本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の場合は表２に示す。
【００４７】
【表１】
0003557277.tif 000002
【００４８】
【表２】
0003557277.tif 000003
【００４９】
表１及び表２の工程でそれぞれゲル瀘過溶出液として得られた、精製耐熱性非還元性糖質生成酵素及び精製耐熱性トレハロース遊離酵素をポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度７．５％）を用いる電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で、純度の高い標品であった。
【００５０】
【実験３  理化学的性質】
【実験３−１  耐熱性トレハロース遊離酵素の性質】
実験２の方法で得られた精製耐熱性トレハロース遊離酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約５４，０００乃至６４，０００ダルトンであった。
【００５１】
本精製酵素をポリアクリルアミドゲル（２％アンフォライン含有、ファルマシア・エルケービー社製）を用いる等電点電気泳動法に供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は約５．６乃至６．６であった。
【００５２】
本酵素活性に対するの温度の影響、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図２（温度の影響）、図３（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応で約７５℃、至適ｐＨは６０℃、３０分間反応で約５．５乃至６．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを７に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図４（温度安定性）、図５（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約８５℃までであり、ｐＨ安定性は５．５乃至９．５であった。
【００５３】
本精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を、アプライド・バイオシステムズ・ジャパン販売プロテインシーケンサー  モデル『４７３Ａ』を用いて、Ｎ末端から１０残基まで分析したところ、本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、メチオニン−フェニルアラニン−セリン−フェニルアラニン−グリシン−グリシン−アスパラギン−イソロイシン−グルタミン酸−リジンであった。
【００５４】
【実験３−２  耐熱性非還元性糖質生成酵素の理化学的性質】
実験２の方法で得られた精製耐熱性非還元性糖質生成酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカーと比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約６９，０００乃至７９，０００ダルトンであった。本精製酵素をポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は約５．４乃至６．４であった。
【００５５】
本酵素活性に対するの温度の影響、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。酵素の至適温度は約７５℃、至適ｐＨは約５．０乃至５．５であった。本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を実験３−１の方法と同様に調べたところ、本酵素の温度安定性は約８５℃までであり、ｐＨ安定性は４．０乃至９．５であった。
【００５６】
本精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を実験３−１の方法と同様に調べたところ、本酵素のＮ末端アミノ酸配列は、メチオニン−イソロイシン−セリン−アラニン−スレオニン−チロシン−アルギニン−ロイシン−グルタミン−ロイシンであった。
【００５７】
【実験４  耐熱性トレハロース遊離酵素によるトレハロースの生成】
【実験４−１  非還元性糖質生成酵素の調製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二ナトリウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．１％を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１３０）を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ファーメンターに同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１ｖ／ｖ％接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で７２時間通気撹拌培養した。培養物を大日本製薬株式会社製超高圧菌体破砕装置『ミニラボ』で処理し、含まれる菌体を破砕した。遠心分離により不溶物を除去後、硫安分画、ＤＥＡＥ−トヨパールを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパールを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、トヨパールＨＷ−５５を用いたゲル瀘過カラムクロマトグラフィーを行って精製したところ、比活性１９５単位／ｍｇ蛋白質の非還元性糖質生成酵素が、培養１ｌ当たりに換算して、約２２０単位の収量で得られた。
【００５８】
なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来非還元性糖質生成酵素の活性測定は、実験２の測定条件のうち、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、反応温度を６０℃を４０℃に代えて行った。
【００５９】
【実験４−２  末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質の調製】
マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースから選ばれる還元性澱粉部分分解物の２０％水溶液に実験４−１の方法で得られた非還元性糖質生成酵素を基質固形物グラム当たりそれぞれ２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた後、常法に従って、加熱失活、瀘過、脱色、脱塩、濃縮し、東京有機化学工業株式会社製ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』（架橋度４％）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャッケト付ステンレス製カラム３本に充填し、直列につなぎ、カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質の純度９５％以上の画分を回収した。回収した画分に水酸化ナトリウムを０．１Ｎになるように加え、１００℃で２時間加熱して残存する還元性糖質を分解した。この溶液を活性炭にて脱色し、Ｈ型、ＯＨ型、イオン交換樹脂で脱塩し、純度９９．０％以上のα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースの非還元性糖質標品を調製した。
【００６０】
【実験４−３  耐熱性トレハロース遊離酵素による非還元性糖質からのトレハロースの生成】
実験４−２の方法で得られた５種の非還元性糖質の５％水溶液を調製し、それぞれに実験２で得られた耐熱性トレハロース遊離酵素を基質固形物グラム当たり２単位の割合で加え、６０℃、ｐＨ５．５で４８時間作用させた後、脱塩し、和光純薬工業株式会社製カラム『ワコービーズ  ＷＢ−Ｔ−３３０』を用いた高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。対照として、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースに耐熱性トレハロース遊離酵素を同様に作用させ、高速液体クロマトグラフィーで分析した。それらの結果を表３示す。
【００６１】
【表３】
0003557277.tif 000004
【００６２】
表３の結果から明らかなように、
（１）    耐熱性トレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し、トレハロースとグルコース重合度が１以上の還元性糖質とを生成する。（２）    マルトオリゴ糖は、耐熱性トレハロース遊離酵素によって全く作用をうけない。
【００６３】
これらの結果から、本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とその他のグリコシル部分との間の結合を極めて特異的に加水分解し、トレハロースを遊離する全く新しい作用機構の酵素であると判断される。
【００６４】
【実験５  還元性澱粉部分分解物からのトレハロースの調製】
５％ワキシーコーンスターチ懸濁液を加熱糊化させた後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり４０００単位の割合になるように加え、２０時間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃、１０分間）し、次いで６０℃に冷却し、これを東ソー株式会社製カラム『トヨパールカラムＨＷ５０』を用いたゲル瀘過クロマトグラフィー（ゲル量７５０ｍｌ）でグルコース重合度３７乃至１１の還元性澱粉部分分解物を分離した。
【００６５】
得られた還元性澱粉部分分解物、又はグルコース重合度３のマルトトリオースを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１％濃度に調整し、これに実験２の方法で調製した精製耐熱性非還元性糖質生成酵素標品及び精製耐熱性トレハロース遊離酵素標品をそれぞれ基質固形物当たり４単位の割合で加え、６０℃で２４時間作用させた後、一部を採り、脱塩し、高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。残りの反応液は、更に、５０℃、ｐＨ４．５に調整した後、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を基質固形物当たり５０単位の割合で加え、１０時間作用させ、同様に脱塩し、高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。それらの結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】
0003557277.tif 000005
【００６７】
表４に示すように、耐熱性非還元性糖質生成酵素及び耐熱性トレハロース遊離酵素を作用させた後のトレハロース生成率は、グルコース重合度３のマルトトリオースでは２．２％と低い値であったが、グルコース重合度１０．８乃至３６．８の澱粉部分分解物では６３．３乃至８１．２％の高い値が得られた。また、グルコース重合度が高い程、得られるトレハロース純度が高いことも判明した。更に、グルコアミラーゼで残存する末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質をトレハロースとグルコースとに分解することにより、生成するトレハロース純度がより高まることも判明した。
【００６８】
【実験６  他のスルフォロブス属微生物由来の耐熱性トレハロース遊離酵素の生産とその性質】
スルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ３３９０９に代えて、スルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ４９４２６、スルフォロブス・ソルファタリカス  ＡＴＣＣ３５０９１、スルフォロブス・ソルファタリカス  ＡＴＣＣ３５０９２を用いた以外は、実験１と同様にファーメンターで４２時間培養した。それぞれの培養液約１７０ｌから菌体を回収し、実験２の方法に準じて、超音波処理し、その上清を硫安塩析、透析し、イオン交換カラムクロマトグラフィーと疎水カラムクロマトグラフィーし、得られた部分精製酵素標品の性質を調べた。これらの結果を、前述のスルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ３３９０９の場合とともに表５にまとめた。
【００６９】
【表５】
0003557277.tif 000006
【００７０】
また、これらの部分精製酵素を用いて、実験４−３の方法に従って、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレハロース調製の実験を行ったところ、スルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ３３９０９由来の耐熱性トレハロース遊離酵素の場合と同様に、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレハロースを遊離することが判明した。
【００７１】
以下、本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の製造方法とそれを利用したトレハロース及びそれを含む糖質の製造方法を実施例Ａで、トレハロース及びそれを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【００７２】
【実施例Ａ−１】
スルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ３３９０９を実験１の方法に準じて、ファーメンターで約４２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮し、約５ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その懸濁液をミニラボで処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離し、約４．８ｌの遠心上清を得た。この上清に飽和度約０．７になるように硫安を加え、酵素を塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。続いて、同緩衝液で平衡化した三菱化成工業株式会社製ゲル『セパビーズ  ＦＰ−ＤＡ１３』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量約２ｌ）を５回行った。吸着した酵素を０Ｍから０．５Ｍ食塩濃度のリニアグラジエントで溶出させ、０．１５Ｍ食塩濃度付近で溶出した酵素活性画分を回収した後、ＵＦ膜で濃縮し、耐熱性非還元性糖質生成酵素（３２．６単位／ｍｌ）と耐熱性トレハロース遊離酵素（５８．５単位／ｍｌ）を含む濃縮酵素液約３００ｍｌを回収した。次いで、両酵素活性画分を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離し、不溶物を除去し、得られる上清をブチルトヨパール  ６５０を用いた疎水性カラムクロマトグラフィー（ゲル量３５０ｍｌ）を５回行い、耐熱性非還元性糖質生成酵素と耐熱性トレハロース遊離酵素を分離した。１５％とうもろこし澱粉乳に最終濃度０．１重量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に調整し、これにノボ社製α−アミラーゼ『ターマミール６０Ｌ』を澱粉グラム当たり０．２重量％になるよう加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液をオートクレーブ（２ｋｇ／ｃｍ２）を３０分間行った後、５８℃に冷却し、ｐＨを５．５に調製し、こ  れにイソアミラーゼを澱粉グラム当たり２，０００単位、上記調製の耐熱性非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり０．５単位、耐熱性トレハロース遊離酵素を澱粉グラム当たり０．５単位加え、９６時間反応させた。その反応液を９７℃で３０分間保った後、冷却し、瀘過して得られる瀘液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度６０％のシラップを固形物当たり約９３％で得た。本品は固形物当たりトレハロースを７１．２％、グルコシルトレハロースを３．０％、マルトシルトレハロースを１．３％、グルコースを２．９％、マルトースを１１．１％、マルトトリオースを８．５％及びマルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖を２．０％を含有しており、まろやかで上品な甘味、低い還元性、低い粘度、適度の保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７３】
【実施例Ａ−２】
実施例Ａ−１の方法で得られた糖液を原糖液とし、トレハロースの含量を高めるため、東京有機化学工業株式会社製ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を用いたカラム分画を行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、グルコース、マルトース及びマルトトリオースなどの夾雑糖類を除去し、トレハロース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース高含有粉末を固形物当たり約５７％で得た。本品はトレハロースを９７％含有しており、極めて低い還元性、まろやかで上品な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７４】
【実施例Ａ−３】
実施例Ａ−２方法で得られたトレハロース高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色しイオン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約７０％に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ２の高圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥塔の上部  より送風し、底部に設けた移送金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥塔外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成塔に充填して温風を送りつつ、１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結晶粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物当たり約９０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７５】
【実施例Ａ−４】
実施例Ａ−２の方法で得られたトレハロース高含有画分を、実施例Ａ−３と同様に精製し、次いで蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約３．０％のシラップとした。次いで助晶機に移し、これに種晶として無水結晶トレハロースをシラップ固形物当たり１％加え、１２０℃で５分間撹拌助晶し、次いで、アルミ製バットに取り出し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、流動乾燥して、水分０．３％の無水結晶トレハロース粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して約８５％の収率で得た。本品は、食品、化粧品、医薬品、その原材料、又は加工中間物などの含水物の脱水剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉末甘味料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７６】
【実施例Ａ−５】
スルフォロブス・アシドカルダリウス  ＡＴＣＣ３３９０９の変異株を実施例Ａ−１の方法に準じて、ファーメンターで約４２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮し、約５ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その懸濁液をミニラボで処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離し、約４．８ｌの遠心上清を得た。この上清に飽和度約０．７になるように硫安を加え、酵素を塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、耐熱性非還元性糖質生成酵素（約１５単位／ｍｌ）と耐熱性トレハロース遊離酵素（約１２単位／ｍｌ）を含む酵素液約６００ｍｌを回収した。次いで、疎水性カラムクロマトグラフィーを行い耐熱性非還元性糖質生成酵素を５８５０単位、耐熱性トレハロース遊離酵素を３９６０単位回収した。馬鈴薯澱粉１重量部に水６重量部とナガセ生化学工業株式会社製α−アミラーゼ『ネオスピターゼ』０．０１重量部とを加え、撹拌混合し、この懸濁液のｐＨを６．２に調整した後、８５乃至９０℃に保ち、澱粉の糊化・液化を行い、その液化液を１２０℃で１０分間加熱してα−アミラーゼを失活させた後、６０℃に冷却し、ｐＨを５．５に調整し、これに、あらかじめ透析し添加されていたスクロースを除き、ＵＦ膜濃縮したノボ・ノルデイスク・バイオインダストリー株式会社販売プルラナーゼ『プロモザイム  ２００Ｌ』を澱粉グラム当たり５００単位、及び上記の方法で調製した耐熱性非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり１単位、耐熱性トレハロース遊離酵素を澱粉グラム当たり１単位加え７２時間反応させた。その反応液を９７℃で３０分間して酵素を失活させた後、５０℃、ｐＨ５．０に調整し、ナガセ生化学工業株式会社製グルコアミラーゼ『グルコチーム』を澱粉グラム当たり１０単位加えて２４時間反応させ、次いで加熱して酵素を失活させた。本溶液を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約６０％に濃縮した。本糖液中には固形物当たり７９．５％のトレハロースを含有していた。イオン交換樹脂として、オルガノ株式会社販売ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『Ｃ６０００』を用いた以外は、実施例Ａ−２の方法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、トレハロース高含有画分を採取した。本高含有液は、固形物当たり約９５％のトレハロースを含有していた。本溶液を濃度７５％に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％を加えて撹拌助晶し、次いで、プラスチック製バットに取り出し、室温で３日間放置し晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕してトレハロース含水結晶粉末を、原料澱粉に対して固形物当たり約７０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７７】
【実施例Ａ−６】
スルフォロブス・ソルファタリカス  ＡＴＣＣ３５０９１を実験１の方法に準じて、ファーメンターで約４２時間培養した。培養後、実施例Ａ−１の方法に準じて、ＳＦ膜濃縮し、菌体破砕し、その遠心上清を硫安塩析し、塩析物を透析後、イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、酵素活性画分を回収した後、ＵＦ膜で濃縮し、耐熱性非還元性糖質生成酵素（２６．４単位／ｍｌ）と耐熱性トレハロース遊離酵素（５７．５単位／ｍｌ）を含む濃縮酵素液約１５０ｍｌを回収した。次いで、疎水性カラムクロマトグラフィーを行い、耐熱性非還元性糖質生成酵素２６５０単位と耐熱性トレハロース遊離酵素を５９５０単位回収した。濃度６％の馬鈴薯澱粉乳を加熱糊化させた後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソアミラーゼを澱粉グラム当たり５００単位の割合になるように加え、２０時間反応させた。その反応液をｐＨ６．５に調整し、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行い、次いで９５℃に冷却し、これにノボ社製α−アミラーゼ『ターマミール６０Ｌ』を澱粉グラム当たり０．１％重量部の割合になるよう加え、１５分間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１３０℃）を３０分間行った後、６５℃に冷却し、これに上記調製の非還元性糖質生成酵素酵素を澱粉グラム当たり１単位、トレハロース遊離酵素を含む濃縮液を澱粉グラム当たり１単位加え、７２時間反応させた。その反応液を９７℃で３０分間保った後、５０℃、ｐＨ５．０に調整し、グルコチームを澱粉グラム当たり１０単位加えて２４時間反応させ、次いで加熱して酵素を失活させた。本溶液を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約６０％に濃縮した。本糖液中には固形物当たり８０．９％のトレハロースを含有していた。本溶液を濃度約８４％に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％を加えて撹拌助晶し、次いで、プラスチック製バットに取り出し、室温で３日間放置し晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕してトレハロース含水結晶粉末を、原料澱粉に対して固形物当たり約９０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７８】
【実施例Ｂ−１  甘味料】
実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末１重量部に、東洋精糖株式会社販売α−グリコシルステビオシド『αＧスイート』０．０１重量部及び味の素株式会社製Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル『アスパルテーム』０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２．５倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリーは、蔗糖の約１／２．５に低下している。本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好適である。
【００７９】
【実施例Ｂ−２  ハードキャンディー】
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャンデーである。
【００８０】
【実施例Ｂ−３  チューインガム】
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部及び実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。
【００８１】
【実施例Ｂ−４  加糖練乳】
原乳１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ３重量部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【００８２】
【実施例Ｂ−５  乳酸菌飲料】
脱脂粉乳１７５重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ１３０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【００８３】
【実施例Ｂ−６  粉末ジュース】
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉末５０重量部、蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃、風量１５０ｍ３とし、これに、実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラッ  プをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定であった。
【００８４】
【実施例Ｂ−７  カスタードクリーム】
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【００８５】
【実施例Ｂ−８  ういろうの素】
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末８０重量部及びプルラン４重量部を均一に混合してういろの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【００８６】
【実施例Ｂ−９  あん】
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース含有シラップ５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として好適である。
【００８７】
【実施例Ｂ−１０  パン】
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース含有粉末１重量部及び無機フード０．１重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【００８８】
【実施例Ｂ−１１  ハム】
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０重量部及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従って、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【００８９】
【実施例Ｂ−１２  粉末ペプチド】
不二製油株式会社製４０％食品用大豆ペプチド溶液『ハイニュートＳ』１重量部に、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース含水結晶粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。
【００９０】
【実施例Ｂ−１３  粉末味噌】
赤味噌１重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末３重量部を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、これを室温下で一夜静置して固化し、雛形して１個当たり約４グラムの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調味料としてだけでなく味噌菓子などとして利用できる。
【００９１】
【実施例Ｂ−１４  粉末卵黄】
生卵から調製した卵黄をプレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得られる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末４重量部の割合で混合した後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。また、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用できる。
【００９２】
【実施例Ｂ−１５  化粧用クリーム】
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉末２重量部、α−グリコシル  ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部及び防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【００９３】
【実施例Ｂ−１６  粉末薬用人参エキス】
薬用人参エキス０．５重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末１．５重量部を混捏した後、バットに移し、２日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量のビタミンＢ１及びビタミンＢ２粉末とともに顆粒成型機にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用できる。また、育毛剤などとしても利用できる。
【００９４】
【実施例Ｂ−１７  固体製剤】
ヒト天然型インターフェロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、安定剤である牛血清アルブミンを素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量の株式会社林原商事販売無水結晶マルトース粉末『ファイントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型インターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用できる。本品は、トレハロースと共にマルトースが安定剤として作用し、室温でも放置してもその活性を長期間よく維持する。
【００９５】
【実施例Ｂ−１８  糖衣錠】
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハロース含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【００９６】
【実施例Ｂ−１９  練歯磨】
配合
第２リン酸カルシウム                                  ４５．０％
プルラン                                              ２．９５％
ラウリル硫酸ナトリウム                                  １．５％
グリセリン                                            ２０．０％
ポリオキシエチレンソルビタンラウレート                  ０．５％
防腐剤                                                ０．０５％
実施例Ｂ−３に方法で得たトレハロース含水結晶粉末      １２．０％
マルチトール                                            ５．０％
水                                                    １３．０％
上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として好適である。
【００９７】
【実施例Ｂ−２０  流動食用固体製剤】
実施例Ａ−３の方法で製造したトレハロース含水結晶粉末５００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【００９８】
【実施例Ｂ−２３  外傷治療用膏薬】
実施例Ａ−３の方法で製造したトレハロース含水結晶粉末２００重量部及びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから、治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【００９９】
【発明の効果】
上記から明らかなように、本発明の新規耐熱性トレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離し、熱安定性も優れており、また、還元性澱粉部分分解物に耐熱性非還元性糖質生成酵素とともに作用させることによって、雑菌汚染の少ない５５℃を越える高温で、高収率でトレハロースを生成する。そのトレハロースの分離、精製も容易であり、このようにして得られるトレハロース及びそれを含む糖質は安定性に優れ、良質で上品な甘味を有している。また、経口摂取により消化吸収され、カロリー源となる。トレハロース及びそれを含む糖質は甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１００】
従って、本発明の確立は、安価で無限の資源である澱粉に由来する澱粉部分分解物から、従来、望むべくして容易に得られなかったトレハロース及びそれを含む糖質を工業的に大量かつ安価に供給できる全く新しい道を拓くこととなり、それが与える影響の大きさは、澱粉科学、酵素科学、生化学などの学問分野は言うに及ばず、産業界、とりわけ食品、化粧品、医薬品分野は勿論のこと、農水畜産業、化学工業にも及び、これら産業界に与える工業的意義は計り知れないものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＥＡＥ−トヨパールからの本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素と非還元性糖質生成酵素の溶出パターンを示す図である。
【図２】本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図４】本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図５】本発明の耐熱性トレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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