(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリコカウロン属又はフーディア属の植物から得ることができる抽出物であって、式（１）：
【化１】
0003553086.tif 000089
を有する食欲抑制剤を含む抽出物。
【請求項２】
トリコカウロン属の植物がトリコカウロン・ピリフェルム及びトリコカウロン・オフィシナレ種から選択され、かつフーディア属の植物がフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイ又はフーディア・ルガルディイ種から選択される、請求項１に記載される抽出物。
【請求項３】
実質的に全ての非活性不純物が除去されている、請求項２に記載される抽出物。
【請求項４】
処理して自由流動粉末とされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載される抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載される抽出物を含む、食欲抑制活性を有する組成物。
【請求項６】
医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合されたときの請求項５に記載される組成物。
【請求項７】
単位剤形の形態で調製される、請求項５又は６に記載される組成物。
【請求項８】
食欲抑制活性を有する医薬の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載される抽出物の使用。
【請求項９】
食欲抑制活性を有する医薬として用いるための、請求項１〜４のいずれか１項に記載される抽出物。
【請求項１０】
ヒトでない動物に有効投与量の、請求項５、６又は７に記載される組成物を投与することによる、ヒトでない動物における食欲を抑制する方法。
【請求項１１】
トリコカウロン属又はフーディア属の植物から単離される式（１）：
【化２】
0003553086.tif 000090
の化合物の、食欲抑制活性を有する医薬の製造への使用。
【請求項１２】
化合物がトリコカウロン・ピリフェルムもしくはトリコカウロン・オフィシナレ種から、又はフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイもしくはフーディア・ルガルディイ種から単離される、請求項11による使用。
【請求項１３】
トリコカウロン属又はフーディア属の植物から単離される式（１）の化合物を含む、食欲抑制活性を有する組成物。
【請求項１４】
化合物がトリコカウロン・ピリフェルムもしくはトリコカウロン・オフィシナレ種の植物から、又はフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイもしくはフーディア・ルガルディイ種から単離及び／又は精製される、請求項13に記載される組成物。
【請求項１５】
化合物がトリコカウロン・ピリフェルム、トリコカウロン・オフィシナレ種の植物から、又はフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイもしくはフーディア・ルガルディイ種の植物から誘導される抽出物より単離及び／又は精製される、請求項13に記載される組成物。
【請求項１６】
医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合したときの、請求項13、14、又は15に記載される組成物。
【請求項１７】
単位剤形の形態で調製される、請求項16に記載される組成物。
【請求項１８】
食欲抑制活性を有する医薬として用いるための、トリコカウロン属又はフーディア属の植物から単離される、請求項１に定義される式（１）の化合物。
【請求項１９】
化合物がトリコカウロン・ピリフェルムもしくはトリコカウロン・オフィシナレ種の植物から、又はフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイもしくはフーディア・ルガルディイ種から単離される、請求項18に記載される化合物。
【請求項２０】
ヒトでない動物に有効投与量の、請求項13〜17のいずれか１項に記載される組成物を投与することによる、ヒトでない動物における食欲を抑制する方法。
【請求項２１】
ヒトでない動物において肥満と闘う方法であって、該ヒトでない動物に、肥満闘争量の請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載される抽出物を投与することを含む方法。
【請求項２２】
ヒトでない動物において肥満と闘う方法であって、該ヒトでない動物に、肥満闘争量の請求項５、６又は７のいずれか１項に記載される組成物を投与することを含む方法。
【請求項２３】
ヒトでない動物の食欲の抑制への抽出物の使用であって、該抽出物が、式（１）：
【化３】
0003553086.tif 000091
を有する食欲抑制剤を含んでなるトリコカウロン属又はフーディア属の植物から得ることができる抽出物である使用。
【発明の詳細な説明】
本発明はステロイド配糖体、そのようなステロイド配糖体を含む組成物並びにこれらのステロイド配糖体及びそれらを含む組成物の新規使用に関する。本発明は、さらに、これらのステロイド配糖体を植物材料から抽出及び単離する方法、これらのステロイド配糖体を合成により製造する方法、並びにそのような抽出及びそのような合成プロセスの生成物に関する。
特定の応用においては、本発明は食欲抑制剤、この食欲抑制剤を合成により製造するための方法、この食欲抑制剤を植物材料から抽出するための方法、この食欲抑制剤を含む食欲抑制組成物、及び食欲を抑制する方法に関する。
本発明によると、トリコカウロン（Trichocaulon）属又はフーディア（Hoodia）属の植物の抽出物を調製するための方法、食欲抑制剤を含む抽出物、集められた植物材料を溶媒で処理して食欲抑制活性を有する画分を抽出する工程、抽出溶液を植物材料の残部から分離する工程、この抽出溶液から溶媒を除去する工程及び抽出物を回収する工程を含む方法が提供される。このようにして回収された抽出物は、例えば適切な溶媒抽出手順により、さらに精製することができる。
また、本発明は、トリコカウロン属及びフーディア属を含む群の植物から製造され、かつ食欲抑制活性を有する植物抽出物も提供する。
この抽出物は植物材料、例えば、前記トリコカウロン属又はフーディア属の植物の茎及び根から調製することができる。トリコカウロン属及びフーディア属には、南アフリカに見出されるような乾燥地帯で成長する多肉植物が含まれる。本発明の応用の１つにおいては、活性食欲抑制抽出物がトリコカウロン・ピリフェルム（Trichocaulon piliferum）種から得られる。このトリコカウロン・ピリフェルム種は活性食欲抑制抽出物を提供するのに用いることもできる。本発明の別の応用においては、フーディア・キュロリイ（Hoodia currorii）、フーディア・ゴルドニイ（Hoodia gordonii）又はフーディア・ルガルディイ（Hoodia lugardii）から活性食欲抑制抽出物を得ることができる。出願人がラットに対して行った生物検定では、これらの抽出物のうちの幾つかが食欲抑制活性を有することが示されている。
植物材料を適切な溶媒、例えば、メタノール／塩化メチレン溶媒の存在下においてワーリング（Waring）ブレンダーのような装置によりホモジネートすることができる。次に、その抽出溶液を残りの植物材料から適切な分離手順、例えば、濾過又は遠心により分離することができる。溶媒は、ロータリーエバポレーターにより、好ましくは水浴中、60℃の温度で除去することができる。次いで、分離した組成抽出物を塩化メチレン及び水でさらに抽出した後、塩化メチレン抽出物及び水抽出物に分離することができる。この塩化メチレン抽出物から好ましくはロータリーエバポレーターでの蒸発により溶媒を除去し、得られた抽出物をメタノール／ヘキサン抽出によりさらに精製することができる。その後、このメタノール／ヘキサン抽出生成物を分離してメタノール抽出物及びヘキサン抽出物を得ることができる。このメタノール抽出物を、部分的に精製された活性抽出物を得るため、蒸発させて溶媒を除去することができる。
この部分的に精製された活性抽出物をメタノールに溶解し、シリカゲルを吸着媒体として、及びクロロホルム/30％メタノール混合液を溶出液として用いるカラムクロマトグラフィーによってさらに分画することができる。複数の異なる画分を得、各々を適切な生物検定手順により評価してそれらの食欲抑制活性を決定することができる。
食欲抑制活性を有する画分を、好ましくは、例えば、シリカゲルを吸着媒体として用い、かつ9:1クロロホルム：メタノール溶媒を用いるカラムクロマトグラフィーによりさらに分画し、得られたサブ画分をそれらの食欲抑制活性について生物検定することができる。食欲抑制活性を示すサブ画分を、所望であれば、シリカゲルを吸着媒体として用い、かつ9:1酢酸エチル：ヘキサン溶媒を用いるカラムクロマトグラフィー法を都合よく用いて、さらに分画及び精製することができる。得られた精製画分を、適切な生物検定手順により、再度それらの食欲抑制活性について評価することができる。
出願人は、そのような精製画分の少なくとも１つが良好な食欲抑制活性を有することを見出しており、その画分中の活性素は核磁気共鳴法を含む通常の化学技法により同定され、下記構造式を有する化合物であることが見出された。
0003553086.tif 000002
S.I.命名法によると、この活性素（１）は化合物３−Ｏ−［−β−Ｄ−テベトピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12β−Ｏ−チグロイルオキシ−14−ヒドロキシ−14β−プレグン−50−エン−20−オン（C47H74O15  M+878）である。
本発明の別の態様によると、トリコカウロン属又はフーディア属の植物の抽出物を調製するための方法が提供され、この抽出物は食欲抑制剤を含み、その方法は集められた植物材料を圧縮して樹液を固形植物材料から分離する工程及び固形植物材料を含まない樹液を回収して抽出物を形成する工程を含む。
この抽出物は、水分を除去するために、例えば噴霧乾燥、凍結乾燥又は真空乾燥により乾燥させ、自由流動粉末を形成することができる。
本発明は、上記抽出物を含む、食欲抑制活性を有する組成物に及ぶ。
この組成物は医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合することができ、単位剤形に調製することもできる。
また、本発明は、食欲抑制活性を有する医薬の製造における上記抽出物の使用、食欲抑制活性を有する医薬として用いるための上記抽出物、及びヒト又は動物に有効投与量の上記組成物を投与することにより食欲を抑制する方法にも及ぶ。
化合物（１）は新規化合物であり、本発明は化合物（１）及びこの食欲抑制特性を有するステロイド三糖体の特定の類似体又は誘導体に及ぶ。これらの類似体又は誘導体として選択される分子は、活性成分の活性を増加させる目的で、このステロイド三糖体の特性に影響を及ぼそうとするものである。類似体が選択されたとき、以下の効果が考慮された：
（ｉ）疎水性相互作用及び親油性
活性分子の官能基修飾は、その分子の疎水性及び親水性を変化させることを目的とするものである。親油性の増加は生物学的活性の増加、水溶性の劣化、界面活性／細胞溶解の増加、組織内での蓄積の増加、より迅速な代謝及び除去、血漿タンパク質結合の増加並びに作用の開始速度の高速化に関連することが示されている。
（ii）電子特性及び電離定数
官能基修飾はまた、酸性度及び塩基性度を変化させることをも目的とし、これは化合物のその作用部位への輸送の制御及びこの標的部位での結合で主要な役割を果たす。
（iii）水素結合
活性分子のカルボキシル及びカルボニル基の官能基修飾は、生物学的系におけるタンパク質とその化学的に修飾された官能基との相互作用を変化させることを目的とする。
（iv）立体的パラメータ
分子の立体的特徴の変更の目的は、その受容体への結合を増加させ、それによりその生物学的活性を増加させることである。
この分子に対する以下の化学的修飾は、その分子に関する疎水性及び親油性、電子的特性、水素結合並びに立体的パラメータに影響を及ぼすことを目的とするものである。
ａ）Ｃ−12基及びエステル官能性の化学的修飾；
ｂ）5,6−二重結合の化学的修飾、例えば、水素化及び転位；
ｃ）Ｃ−20カルボニル及びＣ−17アセチル基の化学的修飾；
ｄ）ステロイド又はアグリコン環の“D"環の化学的修飾；
ｅ）三糖部分の炭水化物の修飾。
したがって、本発明は下記一般構造式を有する化合物を提供する。
0003553086.tif 000003
（ここで、Ｒ＝アルキル；
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、又は他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5又はC5−C6の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
また、本発明は、C5−C6の間にさらに結合が存在し、Ｒ＝メチル、R1＝チグロイル、R2＝３−Ｏ−［−β−Ｄ−テベトピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル］であり、かつ下記構造式を有する上記化合物も提供する。
0003553086.tif 000004
本発明による食欲抑制化合物（１）のさらなる活性類似体又は誘導体は、下記構造式を有する化合物である：
0003553086.tif 000005
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、又はベンゾイル、又はチグロイル、又は他の有機エステル基）
0003553086.tif 000006
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、又はチグロイル、又はベンゾイル、又は他の有機エステル基）
0003553086.tif 000007
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、又はチグロイル、又はベンゾイル、又は有機エステル基）
0003553086.tif 000008
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、又はチグロイル、又はベンゾイル、又は他の有機エステル基）
0003553086.tif 000009
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、又はチグロイル、又はベンゾイル、又は他の有機エステル基）
0003553086.tif 000010
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、又は他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5又はC5−C6の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
0003553086.tif 000011
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、又は他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5又はC5−C6の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
0003553086.tif 000012
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、又は他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5又はC5−C6の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
0003553086.tif 000013
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、又は他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5、C5−C6又はC14−C15の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
0003553086.tif 000014
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5、C5−C6又はC14−C15の間に存在していてもよいさらなる結合を示す。）
0003553086.tif 000015
（ここで、Ｒ＝アルキル；及び
R1＝Ｈ、アルキル、チグロイル、ベンゾイル、他の有機エステル基；
R2＝Ｈ、又は１つ以上の６−デオキシ炭水化物、又は１つ以上の2,6−ジデオキシ炭水化物、又はグルコース分子、又はそれらの組み合わせ；
並びに、破線はC4−C5、C5−C6又はC14−C15の間に存在していてもよいさらなる結合を示し；並びに
R3＝Ｈ、アルキル、アリール、アシル、又はグルコキシである）
0003553086.tif 000016
（ここで、Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリール又はC14βヒドロキシ基、もしくはC12βヒドロキシ官能基、もしくはC17アシル基、もしくはC5−C6オレフィン、もしくはそれらの組み合わせを有するステロイドである）
本発明は、さらに、食欲抑制活性を有する化合物を合成により製造するための方法にも及ぶ。
この方法はステロイドを出発物質（又は中間体もしくは前駆体）として用い、このステロイドは下記化学式を有する。
0003553086.tif 000017
このステロイド（15）は式（22）を有する化合物から、以下の工程を含む方法によって調製することができる。
（ｉ）下記式を有するプロゲステロンを、
0003553086.tif 000018
微生物カロネクトリア・デコラ（Calonectria decora）で処理して下記式の化合物12β,15α−ジヒドロキシプロゲステロンを生成する工程、
0003553086.tif 000019
（ii）微生物（17）を塩化トシル及びピリジンで処理して下記式の化合物12β−ヒドロキシ−15α−（ｐ−トルエンスルホニル）−プロゲステロンを精製する工程、
0003553086.tif 000020
（iii）化合物（18）を150℃でコリジンで処理して下記式の化合物12β−ヒドロキシ−△14−プロゲステロンを生成する工程、
0003553086.tif 000021
（iv）化合物（19）を120℃で塩化アセチル及び無水酢酸で処理して下記式の化合物3,12β−ジアセトキシプレグナ−3,5,14−トリエン−20−オンを生成する工程、
0003553086.tif 000022
（ｖ）化合物（20）をエチレングリコール及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸で処理して下記式の化合物3,12β−ジアセトキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−3,5,14−トリエンを生成する工程、
0003553086.tif 000023
（vi）化合物（21）をNaBH4で処理して下記式の化合物３β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエン−12−アセテートを生成する工程。
0003553086.tif 000024
第１の代替手順においては、本発明によるステロイド（15）の調製方法は以下の工程を含む。
（ａ）化合物（22）を還元剤、例えば、LiAlH4で処理して下記式の化合物３β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエンを生成する工程、
0003553086.tif 000025
（ｂ）化合物（23）をＮ−ブロモアセトアミド（NBA）及び塩基、例えば、ピリジンで処理して下記式の化合物３β,12β−ジヒドロキシ−14,15−エポキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エンを生成する工程、
0003553086.tif 000026
（ｃ）化合物（24）を還元剤、例えばLiAlH4で、例えば還流しながら処理して下記式の化合物３β,12β,14β−トリヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エンを生成する工程、
0003553086.tif 000027
及び（ｄ）化合物（25）を酸、例えば酢酸、及び水で処理してステロイド中間体化合物３β,12β,14β−トリヒドロキシ−プレグン−５−エン（15）を生成する工程。
反応スキームＡは、本発明の“第１の代替手順”により化合物（22）からステロイド中間体（15）を調製するための手順を示す（及び、化合物（16）からの化合物（22）の調製を説明のために含む）。
0003553086.tif 000028
0003553086.tif 000029
第２の代替手順においては、本発明によるステロイド（15）の調製方法は以下の工程を含む。
（ａ）化合物（22）（３β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエン−12−アセテート）を塩化ｐ−トルエンスルホニル及び塩基、例えばピリジン、で処理して下記式の化合物３β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエン−３−トシル−12−アセテートを生成する工程、
0003553086.tif 000030
（ｂ）化合物（26）を溶媒、例えば、アセトン中において酢酸カリウムで処理して下記式の化合物６β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシ−3,5α−シクロプレグナン−14−エン−12−アセテートを生成する工程、
0003553086.tif 000031
（ｃ）化合物（27）を還元剤、例えばLiAlH4、及び、例えば、テトラヒドロフランで処理して下記式の化合物６β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシ−3,5α−シクロプレグナン−14−エンを生成する工程、
0003553086.tif 000032
（ｄ）化合物（28）をＮ−ブロモアセトアミド、場合によっては酢酸、及び塩基、例えばピリジン、で処理して下記式の化合物６β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシ−14,15−エポキシ−3,5α−シクロプレグナンを生成する工程、
0003553086.tif 000033
（ｅ）化合物（29）を還元剤、例えばLiAlH4、及び、例えば、テトラヒドロフランで処理して下記式の化合物６β,12β,14β−トリヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシ−3,5α−シクロプレグナンを生成する工程、
0003553086.tif 000034
及び（ｆ）化合物（30）を酸、例えば塩酸、及び溶媒、例えばアセトンで処理して化合物（15）を生成する工程。
反応スキームＢは、本発明の“第２の代替手順”による化合物（22）からステロイド中間体（15）の調製するための手順を示す。
0003553086.tif 000035
化合物（１）は活性化単糖シマロース部分の形態にある第１の炭水化物中間体から合成することができ、この第１の炭水化物中間体は式（36）を有する化合物から調製することができる。化合物（36）は下記工程を有する方法によって調製することができる。
（ｉ）下記式を有するメチル−α−Ｄ−グルコース
0003553086.tif 000036
をベンズアルデヒド及び塩化亜鉛で処理して下記式の化合物メチル−4,6−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000037
（ii）化合物（32）を０℃で塩化トシル及びピリジンで処理して下記式の化合物メチル−4,6−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−トシル−α−Ｄ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000038
（iii）化合物（33）を100℃でNaOMeで処理して下記式の化合物メチル4,6−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−アルトロピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000039
（iv）化合物（34）をＮ−ブロモスクシンアミド（NBS）で処理して下記式の化合物メチル６−ブロモ−４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｄ−アルトロピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000040
及び（ｖ）化合物（35）をNaBH4及びNiCl1で処理して下記式の化合物メチル４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｄ−アルトロピラノシドを生成する工程。
0003553086.tif 000041
本発明は活性化単糖シマロース部分の形態にある炭水化物中間体を調製するための方法に及び、これは以下の工程を含む。
（ｉ）化合物（36）をPhSSiMe3、ZnI2、及びBu4+I-で処理して下記式の化合物４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−αβ−Ｄ−フェニルチオアルトロシドを生成する工程、
0003553086.tif 000042
（ii）場合によっては、化合物（37）を三フッ化ジエチルアミノイオウ（DAST）で、例えば０℃で、処理して下記式を有する化合物４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−フェニルチオ−2,6−ジデオキシ−αβ−Ｄ−フルオロシマロピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000043
又は（iii）場合によっては、化合物（37）を溶媒、例えばピリジン、中において塩化ｔ−ブチルジメチルシリル及びイミダゾールで処理して下記式を有する４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−αβ−Ｄ−フェニルチオアルトロシドを生成する工程、
0003553086.tif 000044
（ここで、Ｚ＝TBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル）
及び（iv）化合物（39）を塩基、例えば、ナトリウムメトキシドで処理して下記式を有する３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−αβ−Ｄ−フェニルチオアルトロシドを生成する工程。
0003553086.tif 000045
（ここで、Ｚ＝TBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル）
反応スキームＣは、本発明により化合物（36）から活性化単糖シマロース部分（40）を調製するための手順を示す（及び、化合物（31）からの化合物（36）の調製を説明のために含む）。
0003553086.tif 000046
化合物（１）の合成には活性化単糖テベトース部分の形態にある第２の炭水化物中間体が関与することもあり、この第２の炭水化物中間体は式（47）を有する化合物から調製することができる。化合物（47）は下記工程を含む方法によって調製することができる。
（ｉ）下記式を有するα−Ｄ−グルコース
0003553086.tif 000047
をアセトン及び硫酸で処理して下記式の化合物1,2:5,6−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースを生成する工程、
0003553086.tif 000048
（ii）化合物（42）をNaH及びMeIで処理して下記式の化合物1,2:5,6−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコフラノースを生成する工程、
0003553086.tif 000049
（iii）化合物（43）を酢酸で処理して下記式の化合物３−Ｏ−メチル−αβ−Ｄ−グルコピラノースを生成する工程、
0003553086.tif 000050
（iv）化合物（44）をメタノール及び塩酸で処理して下記式を有する化合物メチル３−Ｏ−メチル−αβ−Ｄ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000051
（ｖ）化合物（45）をベンズアルデヒド及び塩化亜鉛で処理して下記式を有する化合物メチル4,6−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−メチル−αβ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000052
（vi）化合物（46）をＮ−ブロモスクシンアミド、塩化ニッケル及び水素化ホウ素ナトリウムで処理して下記式を有する化合物メチル４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−でオキシ−αβ−グルコピラノシドを生成する工程。
0003553086.tif 000053
本発明は活性化単糖テベトースを調製するための方法に及び、これは以下の工程を含む。
（ｉ）化合物（47）をフェニルチオトリメチルシラン及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートで処理して下記式を有する化合物４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−１−フェニルチオ−６−デオキシ−αβ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000054
（ii）化合物（48）を塩化ピバロイル及び溶媒、例えばピリジン、で処理して下記式を有する化合物４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ピバロイル−１−フェニルチオ−６−デオキシ−αβ−グルコピラノシドを生成する工程、
0003553086.tif 000055
及び（iii）化合物（49）を臭化剤、例えばＮ−ブロモスクシンイミド、及び三フッ化ジエチルアミノイオウで処理して、下記式を有する立体異性体として生じる、化合物４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ピバロイル−１−フルオロ−６−デオキシ−β−グルコピラノシドを生成する工程。
0003553086.tif 000056
反応スキームＤは、本発明により化合物（48）から活性化単糖テベトース部分（50（Ａ）及び50（Ｂ））を合成するための手順を示す（及び、化合物（41）からの化合物（47）の調製を説明のために含む）。
0003553086.tif 000057
本発明のさらなる態様によると、式（１）の化合物並びにそれらの類似体及び誘導体を合成により生成する方法であって、適切なステロイド中間体又は前駆体を合成する工程及び必要とされる数の適切な単糖をこのステロイド中間体とカップリングさせる工程を含む方法が提供される。
本発明は単糖シマロースをステロイド中間体とカップリングさせる方法も提供し、これは以下の工程を含む。
（ｉ）シマロース部分（38）をステロイド中間体（15）と、例えば−15℃で、塩化スズの存在下、溶媒、例えば、エーテル中で反応させて下記式の化合物３−Ｏ−［４−Ｏ−ベンゾイル−２−フェニルチオ−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12,14−β−ジヒドロキシ−プレグン−５−エン−20−オンを生成する工程、
0003553086.tif 000058
及び（ii）化合物（51）をピリジン中でチグル酸塩化物と、次いで塩基、例えば、NaOMeで処理して下記式の化合物３−Ｏ−［−２−フェニルチオ−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12β−チグロイルオキシ−14−ヒドロキシ−14β−プレグン−５−エン−20−オンを生成する工程。
0003553086.tif 000059
本発明は、単糖シマロース部分を単糖テベトース部分にカップリングさせ、かつ得られた二糖を結合ステロイド生成物（52）にカップリングさせて化合物（１）を形成することを含む方法に及ぶ。
単糖シマロース部分を単糖テベトース部分にカップリングさせ、かつ得られた二糖を結合ステロイド生成物（52）にカップリングさせる方法は、以下の工程を含み得る。
（ｉ）選択的に保護されたシマロース部分（40）及び選択的に保護されたテベトース部分（50A）を、塩化スズ（ZnCl2）及びトリフルオロメタンスルホン酸銀を用いて、例えば、−15℃でカップリングさせて下記式の化合物を生成する工程、
0003553086.tif 000060
（ここで、Ｚ＝TBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル）
（ii）化合物（53）をフッ化テトラブチルアンモニウムで処理して下記式の化合物を生成する工程、
0003553086.tif 000061
（iii）化合物（54）を三フッ化ジエチルアミノイオウで、例えば、０℃で処理して下記式の化合物を生成する工程、
0003553086.tif 000062
（iv）化合物（55）を化合物（52）と反応させて下記式の化合物を生成させる工程、
0003553086.tif 000063
及び（ｖ）化合物（56）をラネー・ニッケル反応で、次いで塩基、例えば、NaOMeで処理して上記化合物（１）を生成する工程。
反応スキームＥは、中間体（52）及び（55）を合成し、それらをカップリングさせて化合物（56）を形成するための手順を示す。
0003553086.tif 000064
0003553086.tif 000065
本発明によると、シマロース及びテベトース部分をカップリングさせて三糖を形成し、かつその三糖をステロイド誘導体にカップリングさせて式（１）の化合物を形成することを含む代替法が提供される。
三糖を形成し、かつ得られた三糖をステロイド誘導体にカップリングする方法は以下の工程を含み得る。
（ｉ）選択的に保護されたシマロース部分（40）及び化合物（45）を、塩化スズ（II）、AgOTf、Cp2ZrCl2を用いてカップリングさせて下記式の化合物を生成する工程、
0003553086.tif 000066
（ここで、Ｚ＝TBDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル）
（ii）化合物（57）をフッ化テトラブチルアンモニウム及び三フッ化ジエチルアミノイオウで処理して下記式を有する三糖化合物を生成する工程、
0003553086.tif 000067
及び（iii）三糖（58）を下記式のステロイド中間体
0003553086.tif 000068
と、塩化スズ（II）、AgOTf、Cp2ZrCl2を用いてカップリングさせて化合物（１）を生成する工程。
ステロイド中間体（59）はステロイド（15）をチグル酸塩化物で処理することによって生成させることができる。
反応スキームＦは三糖（58）の合成及び三糖（58）をステロイド中間体（59）とカップリングさせることによる化合物（１）の合成の手順を示す。
0003553086.tif 000069
上記中間体（23）、（24）、（25）、（27）、（28）、（29）、（30）、（37）、（38）、（39）、（40）、（48）、（49）、（50）、（51）、（53）、（54）、（55）、（56）、（57）及び（58）は新規化合物であり、本発明はこれらの化合物そのものに及ぶ。
化合物（１）、３−Ｏ−［−β−Ｄ−テベトピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12β−Ｏ−チグロイルオキシ−14−ヒドロキシ−14β−プレグン−５−エン−20−オン、並びにそれらの様々な類似体及び誘導体は食欲抑制活性を有することが見出されている。
また、本発明は、活性成分がトリコカウロン属又はフーディア属の植物から得られる抽出物である、食欲抑制活性を有する組成物又は処方にも及ぶ。
この活性成分は、トリコカウロンもしくはフーディア属の植物から抽出される式（１）の化合物又はそれらの誘導体であってもよい。この植物は、トリコカウロン・オフィシナレ（Trichocaulon officinale）もしくはトリコカウロン・ピリフェルム種、又はフーディア・キュロリイ、フーディア・ゴルドニイもしくはフーディア・ルガルディイ種のものであり得る。
また、本発明は、活性成分が化合物（２）〜（14）に関して前に説明される合成により生成された式（１）の化合物又はそれらの誘導体もしくは類似体である、食欲抑制活性を有する組成物又は処方にも及ぶ。
本発明の別の態様によると、適切な投与量の、トリコカウロン又はフーディア属の植物の抽出物を含む食欲抑制剤をヒト又は動物に投与することによる、食欲を抑制する方法が提供される。この抽出物は、薬学的に許容し得る他の成分をも含む組成物又は処方に組み込むことができる。
食欲抑制剤は、前に説明されるように、下記式の単離天然化合物もしくは合成化合物又はそれらの誘導体もしくは類似体であり得る：
0003553086.tif 000070
食欲抑制組成物又は処方は、医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合した食欲抑制剤からなるものであり得る。安定化剤及び望ましいものであり得るような他の成分を含む他の適切な添加物を添加することができる。
本発明は、食欲抑制活性を有する医薬の製造における化合物（１）又はその誘導体もしくは類似体の使用に及ぶ。
さらに、本発明は、食欲抑制活性を有する医薬として用いられる、化合物（１）又は前に説明されるその誘導体もしくは類似体にも及ぶ。
ヒト又は動物に有効投与量の上記組成物を投与することによって食欲を抑制する方法も提供される。
トリコカウロン又はフーディア属の植物より得られる植物材料から食欲抑制活性を有するステロイド配糖体を抽出するための方法がここに記載されている。したがって、本発明は、トリコカウロン又はフーディア属の植物材料から得られ、かつ実質的に純粋な式（１）のステロイド配糖体を含む抽出物に及ぶ。
また、本発明は、摂取したときに食欲抑制効果を有するのに有効な量の、式（１）のステロイド配糖体又は前に説明されるその誘導体もしくは類似体を含む、食品又は飲料にも及ぶ。
分子遺伝学的研究は、食欲、満腹及び体重の調節の理解のかなりの増加につながっている。これらの研究により、多くの神経ペプチドが介在する多くの中枢調節経路が明らかになっている。正常体重の維持は、エネルギー摂取、食物の消費、及びエネルギー消費の複雑なバランスによって達成される。エネルギーの恒常性は広い範囲から影響を受け、最終的には脳によって制御される。それらの異なる信号には、嗅覚及び味覚のようなもの、並びに胃腸管の膨満のような胃腸の信号、脂肪酸及びグルコースのような胃粘膜及び血液由来の代謝に対する化学信号が含まれる。
中枢的には、レプチンによって負に調節される神経ペプチド“Y"（NPY）が摂食行動の正の調節因子の１つとして証明されている。メラノコルチン受容体に対する内在性アンタゴニストの発現も特定のモデル（ob/obマウス）における肥満の基礎であることが示されている。実際、MC4メラノコルチン受容体での欠乏により、肥満症候群が完全に複製される。エネルギーバランスにおいて役割を果たすことが示されている他の媒介物には、ボンベシン、ガロニン（galonin）及びグルカゴン様ペプチド−１が含まれる。
理論によって結び付けられるものではないが、出願人は、化合物（１）及び上述のその誘導体がメラノコルチン４受容体のアゴニストとして作用するものと信じる。これの効果はNPYを調節することであるが、コレシストキニンも増加させる。コレシストキニンの効果は、とりわけ、胃排出を阻害することである。
したがって、本発明は、メラノコルチン４受容体アゴニストを含む、食欲抑制活性を有する組成物に及ぶ。
このアゴニストは前述の抽出物又は化合物、特には式（１）の化合物であり得る。組成物は医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合することが可能であり、単位剤形として調製することができる。
さらにまた、本発明は、食欲抑制活性を有する医薬の製造におけるメラノコルチン４受容体アゴニストの使用、食欲抑制活性を有する医薬として用いられるメラノコルチン４受容体アゴニスト、有効投与量の、上記メラノコルチン４アゴニストを含む組成物をヒト又は動物に投与することによって食欲を抑制する方法、及びヒト又は動物における食欲の抑制及び／又は肥満との戦いへのメラノコルチン４受容体アゴニストの使用にも及ぶ。
本発明及びその有効性を、発明の範囲を限定することなく、以下の例及び図面を参照してさらに説明する。
これらの図面において、
図１は、トリコカウロン又はフーディア属の植物材料から第１の粗製食欲抑制抽出物及び精製食欲抑制抽出物を抽出する一般的な方法の流れ図を示し；
図２は、トリコカウロン・ピリフェルムの特に精製したメタノール抽出物を用いてラットに対して行った生物検定のグラフ表示を示し；
図３及び４は、共に、トリコカウロン又はフーディア属の植物材料の抽出物を生成するための本発明の好ましい態様の模式的表示を示し；並びに
図５及び６は、フーディア・ゴルドニイ種の植物材料の樹液抽出物及び噴霧乾燥樹脂抽出物を用いる反復投与研究における、それぞれ第−７日〜第７日及び第０日〜第７日の、異なる群についてのラットの体重の変化パーセンテージのグラフ表示を示す。
実施例１
トリコカウロン属又はフーディア属の植物材料から第１の粗製食欲抑制抽出物及び精製食欲抑制抽出物を抽出する一般的な方法が図１の流れ図として説明されている。
実施例２
実施例１に説明される方法で得られた、部分的に精製されたメタノール抽出物を用いてラットに対して行われた生物検定により、この抽出物が実際に食欲抑制活性を発揮することが示された。この活性抽出物の食欲抑制活性は、ラットに対するトリコカウロン・ピリフェルムのメタノール抽出物の典型的な効果の例として、図２のグラフ表示として示すことができる。
図２から、第５日に抽出物を投与した試験群のラットが次の２日にわたって実質的な食物摂取の減少を示し、これに対して対照群はそれに匹敵する食物摂取の減少を表さなかったことが立証される。試験群の食物摂取は、第８日以降は正常に戻り、実際には増加した。
実施例３
食欲抑制活性を有する抽出物を生成するための本発明による方法の好ましい態様が図３及び４に例として模式的に示されており、これらの２つの図は共に広範囲にわたるプロセスを示す。しかしながら、当業者によって理解されるように、他の様々な手順を用いることができる。
図３を参照して、トリコカウロン属又はフーディア属の植物材料を、供給ライン１を通して、供給ライン２を介して導入される塩化メチレン／メタノール溶液の形態の溶媒と共に、ブレンダー３、例えば、ワーリングブレンダーに供給する。均質化された生成物をライン４を介して、例えばフィルター又は遠心機の形態にある、分離段階５に供給し、残留植物材料をライン27を介して除去する。
この溶媒／抽出物混合物をライン６を介して蒸発段階７に供給し、そこで、例えばローターエバポレーターにより、溶媒を除去する。乾燥した粗製抽出物をライン８を介してさらなる抽出段階９に供給し、同時に塩化メチレン／水溶液をさらなる抽出のために供給ライン29を介して導入、添加した後、ライン11を通して分離段階13に供給し、そこで水画分をライン31を介して除去する。溶解した抽出物画分をライン15を介してドライヤー段階17に供給し、そこで、例えばローターエバポレーターにより、溶媒を蒸発させる。
図４を参照して、乾燥した抽出物をライン10を介して抽出段階12に供給する。同様に、乾燥した抽出物をさらに精製及び抽出するため、メタノール／ヘキサン溶液もライン14を介して抽出段階12に供給する。抽出／メタノール／ヘキサン混合物をライン16を介して分離段階18に供給し、ヘキサン画分をライン20を介して除去した後、メタノール／抽出物混合物をライン22を介して乾燥段階24に供給する。この乾燥段階24において、例えばローターエバポレーターでの蒸発により、溶媒を除去する。
この乾燥した、部分的に精製された活性抽出物を、ライン26を介して、メタノールをライン28を介して添加しながら、溶液段階30に供給し、溶解した画分をライン36を介してクロマトグラフィーカラム38に供給する。
このカラム38において、メタノール可溶性画分を、シリカゲル及びクロロホルム/30％メタノール溶媒を用いて、画分Ｉ〜Ｖと模式的に示される異なる画分にさらに分画する。出願人が行った実際の分画手順によると、この分画手順により以下の画分重量が得られた:I（3.9g）;II（2.6g）;III（2.1g）;IV（1.1g）及びＶ（2.0g）。これらの画分を（示されていない工程において）適切な生物検定手順により個別に評価し、顕著な食欲抑制活性を示す、画分Ｉ及びIIとして同定された画分をそれぞれ供給ライン40及び42によりカラム44及び46に供給し、そこで、再度シリカゲル及び9:1クロロホルム：メタノール系を用いるカラムクロマトグラフィーによりそれらを分画及び精製する。
カラム44から得られるサブ画分II（Ａ）〜（Ｃ）は、検定したとき、注目すべき食欲抑制活性は示さず、さらなるクロマトグラフィーに再利用することができる。
カラム46から得られるサブ画分Ｉ（Ａ）〜（Ｌ）も（示されていない検定工程により）評価し、サブ画分Ｉ（Ｃ）が顕著な食欲抑制活性を有することが見出される。
サブ画分Ｉ（Ｃ）を、シリカゲル及び9:1酢酸エチル：ヘキサン溶出液を用いてさらに分画及び精製するため、ライン48を介してカラム50に供給する。得られた精製画分のうち、画分Ｉ（Ｃ）（ii）が顕著な食欲抑制活性を有することが、検定の後に見出される。
この精製組成物は、（下記表１及び２に示されるように）核磁気共鳴法により、化合物（１）と同定される。
0003553086.tif 000071
0003553086.tif 000072
化合物（１）
IRデータ:3440cm-1（OH）、2910cm-1（CH）、1700cm-1（Ｃ＝０）
［αＤ］20589＝12.67゜（Ｃ＝3;CHCl3）
m.p.  147℃−152℃
実施例４〜13では、中間化合物及びステロイド（15）を“第１の代替手順”に従って調製することができる合成手順が説明される。
実施例４
12β、15α−ジヒドロキシプロゲステロン（17）
カロネクトリア・デコラ（ATCC14767）の培養物を、ショ糖（900g）、K2HPO4（30g）、チャペク（Czapek）濃縮物（300ml）、コーンスティープリカー（300ml）及び蒸留水（30l）を含んでなる培養培地の接種により調製する（150×500mlフラスコ）。26℃で５日間振盪した後、ツィーン80の懸濁液中のプロゲステロン（16）（150g）（0.1％溶液、1.5l）をフラスコに添加する。これらの培養物をさらに５日間インキュベートした後、遠心により後処理し、デカントし、その培地をクロロホルムで抽出し、次いで蒸発させてジヒドロキシプロゲステロン（17）を得る（75g、45％）。
1H  NMR（CDCl3）:5.71（1H、ｓ、Ｈ−４）;4.12−4.22（1H、ｍ、Ｈ−15）4.43（1H、br、ｓ、OH）;3.46−3.53（1H、dd、Ｊ＝4.6Hz、Ｈ−12）;2.16Hz（3H、ｓ、Ｈ−21）;1.18（3H、ｓ、Ｈ−19）;0.74（3H、ｓ、Ｈ−18）
実施例５
12β−ヒドロキシ−15α−（ｐ−トルエンスルホニル）−プロゲステロン（18）
ジヒドロキシプロゲステロン（17）（75g、0.22モル）をピリジン（300ml）に溶解し、０℃に冷却する。乾燥ピリジン（200ml）中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（46g、0.24モル）を滴下によりこの反応混合物に０℃で添加する。反応物を０℃で一晩攪拌し、H2O（500ml）を添加することにより反応を停止させる。水層を酢酸エチル（11）で抽出し、有機抽出物を塩酸（6M、３×11）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（500ml）、飽和塩化ナトリウム水溶液（500ml）、及び水（500ml）で洗浄する。有機相を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、ｐ−トルエンスルホン化プロゲステロン（18）（98g、92％）を粘性暗黄色油として得る。
1H  NMR（CDCl3）:7.7（2H、ｄ、Ｊ＝14Hz、Ｈ−２、６）;7.34（2H、ｄ、Ｊ＝８、4Hz、Ｈ−３、５）;5.67（1H、ｓ、Ｈ−４）;4.86−4.93（1H、ｍ、Ｈ−15）;3.45−3.50（1H、dd、Ｊ＝４、6Hz、Ｈ−12）;2.44（3H、ｓ、Ｈ−4Me）;2.15（3H、ｓ、Ｈ−21）1.13（3H、ｓ、Ｈ−19）;0.74（3H、ｓ、Ｈ−18）。
実施例６
12β−ヒドロキシ−Δ14−プロゲステロン（19）
2,4,6−トリメチルコリジン（500ml）中のトシル化プロゲステロン（18）（98g、0.19モル）の溶液を150℃で３時間還流する。この反応混合物を冷却し、水（500ml）に注ぎ入れる。水層を酢酸エチル（11）で抽出した後、有機相を塩酸（6M、３×11）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（500ml）、飽和塩化ナトリウム水溶液（500ml）、及び水（500ml）で洗浄する。乾燥（MgSO4）及び濾過した後、酢酸エチルを蒸発させ、粗製混合物をアセトン：クロロホルム（1:10）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、Δ14−プロゲステロン（19）（50g、78％）を暗赤色油として得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.73（1H、ｓ、Ｈ−４）、5.28（1H、dd、Ｊ＝２、2Hz、Ｈ−15）、4.41（1H、br、ｓ、OH）、3.49−3.52（1H、dd、Ｊ＝４、3Hz、Ｈ−12）、2.80−2.84（1H、dd、Ｊ＝９、2Hz、Ｈ−17）、2.14（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.19（3H、ｓ、Ｈ−19）、0.89（3H、ｓ、Ｈ−18）。
実施例７
3,12β−ジアセトキシプレグナ−3,5,14−トリエン−20−オン（20）
塩化アセチル（1.5l）及び無水酢酸（750ml）中のΔ14−プロゲステロン（19）（50g、0.15モル）の溶液を２時間還流する。この反応混合物を冷酢酸エチル（11）に注ぎ入れ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液を、攪拌しながら、泡立ちが収まるまで添加する。酢酸エチル層を重炭酸ナトリウム層から分離し、さらなる重炭酸ナトリウム水溶液（３×700ml）、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液（700ml）及び最後に水（700ml）で洗浄する。有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、3,12β−ジアセトキシプレグナ−3,5,14−トリエン−20−オン（20）（60g、93％）をオレンジ色の油として得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.68（1H、ｓ、Ｈ−４）、5.44（1H、ｍ、Ｈ−６）、5.31（1H、dd、Ｊ＝２、2Hz、Ｈ−15）、4.82−4.86（1H、dd、Ｊ＝４、5Hz、Ｈ−12）、3.10−3.18（1H、ｔ、Ｊ＝９、5Hz、Ｈ−17）、2.18（3H、ｓ、３−Ac）、2.11（3H、ｓ、12−Ac）、2.08（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.02（3H、ｓ、Ｈ−19）、1.01（3H、ｓ、Ｈ−18）
実施例８
3,12β−ジアセトキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−3,5,14−トリエン（21）
ジアセトキシ化合物（20）（60g、0.14モル）をベンゼン（11）に溶解し、エチレングリコール（60ml）及びｐ−トルエンスルホン酸（1g）を添加する。（このベンゼンは予めディーン・スタークトラップで還流する）。この混合物を攪拌しながら還流し、水を16時間共沸除去する。冷却した溶液に飽和重炭酸ナトリウム水溶液（500ml）を添加する。その後、これを食塩水（500ml）及び水（500ml）で洗浄し、乾燥させる（MgSO4）。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を酢酸エチル：ヘキサン（2:8）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、エチレンジオキシプレグナ−3,5,14−トリエン（21）（35g、53％）を得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.68（1H、ｓ、Ｈ−４）、5.45（1H、ｍ、Ｈ−６）、5.31（1H、dd、Ｊ＝２、2Hz、Ｈ−15）、4.73−4.85（1H、dd、Ｊ＝４、4Hz、Ｈ−12）、3.78−3.98（4H、ｍ、エチレンジオキシ）、2.16（3H、ｓ、３−Ac）、2.04（3H、ｓ、12−Ac）、1.29（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.12（3H、ｓ、Ｈ−19）、1.02（3H、ｓ、Ｈ−18）。
実施例９
３β−12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエン−12−アセテート（22）
ジエノールアセテート（21）（35g、0.077モル）をエタノール（500ml）に懸濁させ、水素化ホウ素ナトリウム（2.8g、0.074モル）を０℃で添加する。この混合物を室温に暖め、一晩攪拌する。大部分の溶媒を真空中で除去し、その混合物を水（500ml）で希釈して酢酸エチル（500ml）で抽出する。後処理し、次いでアセトン／クロロホルム（1:10）を用いるシリカゲルでのクロマトグラフィーにより、３β−アルコール（22）（25g、80％）を得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.41（1H、ｍ、Ｈ−６）、5.28（1H、dd、Ｊ＝２、2Hz、Ｈ−15）、4.72−4.81（1H、dd、Ｊ＝４、4Hz、Ｈ−12）、3.82−4.02（4H、ｍ、エチレンジオキシ）、3.45−3.59（1H、ｍ、Ｈ−３）、2.03（3H、ｓ、12−Ac）、1.28（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.10（3H、ｓ、Ｈ−19）、1.01（3H、ｓ、Ｈ−18）。
実施例10
３β,12β−ジヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−5,14−ジエン（23）
乾燥テトラヒドロフラン（300ml）中の３β−アルコール（22）（25g、60.2ミリモル）を乾燥テトラヒドロフラン（500ml）中の水素化アルミニウムリチウム（2.7g、72.2ミリモル）の懸濁液に滴下により添加する。この反応混合物を室温で24時間攪拌した後、水（2.7ml）を注意深く添加し、さらに10分間攪拌する。次に、水酸化ナトリウム（15％溶液、2.7ml）を添加し、その懸濁液を攪拌する。10分後、水（8.1ml）を添加し、その懸濁液を10分間攪拌し、濾過させ、乾燥させ（MgSO4）、溶媒を蒸発させて、３β,12βジヒドロキシプレグナ−ジエン（23）（20g、90％）を得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.36（1H、ｍ、Ｈ−６）、5.23（1H、dd、Ｊ＝2.2Hz、Ｈ−15）、3.94−4.06（4H、ｍ、エチレンジオキシ）、3.41−3.52（1H、ｍ、Ｈ−３）、3.32−3.36（1H、dd、Ｊ＝４、3Hz、Ｈ−12）、1.31（3H、ｓ、Ｈ）、1.01（3H、ｓ、Ｈ−19）、0.96（3H、ｓ、Ｈ−18）。
13C  NMR（CDCl3）:152.4（ｃ−14）、140.2（ｃ−５）、121.1（ｃ−15）、119.7（ｃ−６）、111.1（Ｃ−20）、79.8（Ｃ−12）、71.6（Ｃ−３）、63.7及び63.6（エチレンジオキシ）、58.8（Ｃ−17）、19.0（Ｃ−19）、11.9（Ｃ−18）。
３β,12β−ジヒドロキシ−14,15−エポキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エン；
３β,12β−ジヒドロキシ−5,6−エポキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−14−エン
Ｎ−ブロモアセトアミド（211mg、1.5ミリモル）を、アセトン（100ml）、酢酸（2.5ml）、及び水（5ml）中の5,14−ジエン（23）（500mg、1.34ミリモル）の攪拌溶液に０℃で添加する。15分後、亜硫酸ナトリウム（５％溶液、50ml）を反応混合物に添加する。アセトンを蒸発させ、水層をジクロロメタン（３×50ml）で抽出する。有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。ピリジン（1ml）をこの生成物に添加し、0.5時間攪拌する。その後、ジクロロメタン（100ml）を反応混合物に添加し、そのジクロロメタンをクエン酸（５％溶液、３×100ml）、飽和重炭酸ナトリウム（50ml）、及び水（50ml）で洗浄する。有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて14,15−及び5,6−エポキシドの混合物（360mg、69％）を白色泡状物質として得る。このエポキシドの混合物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーによっては分離することができなかった。
実施例11
３β,12β−ジヒドロキシ−14,15−エポキシド−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エン（24）
乾燥テトラヒドロフラン（200ml）中の14,15−及び5,6−エポキシド（14.4g、37.0ミリモル）を乾燥テトラヒドロフラン（300ml）中の水素化アルミニウムリチウム（1.69g、44.4ミリモル）の懸濁液に添加する。この反応混合物を室温で24時間攪拌した後、水（1.69ml）及び水酸化ナトリウム（15％溶液、1.69ml）を添加することにより前述の通りに後処理する。濾過及び溶解を蒸発させた後、その粗製生成物を、メタノール／クロロホルム（1:9）を溶媒として用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、未反応14,15エポキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エン（24）（300mg、2.1％）を得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.31（1H、ｍ、Ｈ−６）、3.82−3.98（4H、ｍ、エチレンジオキシ）、3.43−3.52（1H、ｍ、Ｈ−３）、3.41（1H、ｓ、Ｈ−15）、3.31−3.35（1H、dd、Ｊ＝４、3Hz、Ｈ−12）、1.29（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.17（3H、ｓ、Ｈ−19）、1.02（3H、ｓ、Ｈ−18）。
13C  NMR（CDCl3）:139.8（Ｃ−５）、120.8（Ｃ−６）、112.1（Ｃ−20）、77.2（Ｃ−12）、75.4（Ｃ−14）、61.0（Ｃ−15）、22.3（Ｃ−21）、19.2（Ｃ−19）、9.5（Ｃ−18）。
実施例12
３β,12β,14β−トリヒドロキシ−20,20−エチレンジオキシプレグン−５−エン（25）
乾燥テトラヒドロフラン（10ml）中の14,15−エポキシド（24）（300mg、0.77ミリモル）をテトラヒドロフラン中の水素化アルミニウムリチウム（300mg、7.89ミリモル）の懸濁液に添加し、その反応物を48時間還流する。前述の通りに水（0.3ml）、水酸化ナトリウム（15％溶液、0.3ml）を添加して濾過した後、その混合物を、メタノール：クロロホルム（1:9）を溶媒として用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、トリヒドロキシプレグネン（25）（250mg、83％）を得る。
1H  NMR（CDCl3）:5.38（1H、ｍ、Ｈ−６）、3.98（4H、ｍ、エチレンジオキシ）、3.43−3.53（1H、ｍ、Ｈ−３）、3.25−3.32（1H、dd、Ｊ＝４、1Hz、Ｈ−12）、1.32（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.01（3H、ｓ、Ｈ−19）、0.98（3H、ｓ、Ｈ−18）
13C  NMR  CDCl3:139.1（Ｃ−５）、122.1（Ｃ−６）、112.2（Ｃ−20）、85.1（Ｃ−14）、75.1（Ｃ−12）、71.6（Ｃ−３）、23.4（Ｃ−21）、19.4（Ｃ−19）、8.9（Ｃ−18）
実施例13
３β,12β,14β−トリヒドロキシ−プレグン−５−エン（15）
エチレンジオキシプレグネン（25）（250mg、0.64ミリモル）を酢酸（13.4ml）及び水に溶解し、凍結乾燥の後、トリヒドロキシステロイド（15）（200mg、89％）を得る、m.p.:228゜−235℃（lit  225゜−235℃）、Ｍ＋348、［αＤ］20＋35゜（lit［αＤ］20＋29゜）。
1H  NMR（CDCl3）:5.39（1H、ｍ、Ｈ−６）、3.56−3.62（1H、ｔ、Ｊ＝８、1Hz、Ｈ−17）、3.42−3.51（1H、ｍ、Ｈ−３）、3.28−3.39（1H、dd、Ｊ＝４、3Hz、Ｈ−12）、2.23（3H、ｓ、Ｈ−21）、1.01（3H、ｓ、Ｈ−19）、0.09（3H、ｓ、Ｈ−1B）
13C  NMR（CDCl3）:217.7（Ｃ−20、138.9（Ｃ−５）、122.2（Ｃ−６）、85.5（Ｃ−14）、73.6（Ｃ−12）、71.6（Ｃ−３）、57.0（Ｃ−17）、55.1（Ｃ−13）、43.6（Ｃ−９）、42.1（Ｃ−４）、37.3（Ｃ−１）、36.8（Ｃ−10）、35.9（Ｃ−８）、34.5（Ｃ−15）、32.9（Ｃ−21）、31.5（Ｃ−16）、30.1（Ｃ−２）、27.4（Ｃ−７）、24.4（Ｃ−11）、19.4（Ｃ−19）、8.3（Ｃ−18）。
実施例14〜19では、中間体化合物及びステロイド（15）を“第２の代替手順”に従って調製することができる合成手順が説明される。
実施例14
20,20−エチレンジオキシ−３β−トルエン−ｐ−スルホニルオキシ−プレグン−5,14−ジエン−12β−オールアセテート（26）−ピリジン（10ml）中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（650mg、3.4ミリモル）をピリジン（15ml）中の20,20−エチレンジオキシプレグナ−5,14−ジエン−３β,12β−ジオール12−アセテート（22）（1.3g、3.1ミリモル）の混合物に０℃で滴下により添加した。この反応混合物を室温で24時間攪拌したままにした後、その反応混合物に水を添加した。その溶液を酢酸エチル（２×50ml）で抽出し、酢酸エチル層をクエン酸（５×50ml）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（100ml）、飽和塩化ナトリウム溶液（100ml）及び水（100ml）で洗浄した。酢酸エチル層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させ、ヘキサン−酢酸エチル（8:2v/v）を溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、β−Ｏ−トシルステロイド（26）、（1.5g、84％）、を黄色油として得た、（実測Ｍ  570.271、C32H42O7SはＭ  570.273を必要とする）。
δＨ  1.021（3H、ｓ、19−Ｈ）、1.131（3H、ｓ、18−Ｈ）、1.282（3H、ｓ、21−Ｈ）、2.021（アセテートOCH3）、2.431（3H、ｓ、Ar−CH3）、3.883（4H、ｍ、OCH2CH2O）、4.750（1H、dd、3J  10.8Hz、5.2Hz、12−Ｈ）、4.890（1H、ｍ、30H）、5.281（1H、dd、3J  4.2Hz、2.1Hz、15−Ｈ）、5.388（1H、ｍ、６−Ｈ）、7.341（2H、ｄ、3J  8.2Hz、ArH）、7.746（2H、ｄ、3J  8.2Hz、ArH）。
δＣ  13.493Q（Ｃ−18）、19.002Q（Ｃ−19）、21.612Q（Ar−メチル）＊、21.671Q（Ｃ−21）＊、24.175Q（アセテートメチル）、63.401T（エチレンジオキシ）、63.498T（エチレンジオキシ）、71.531S（Ｃ−13）、80.912D（Ｃ−12）、82.531D（Ｃ−３）、111.363S（Ｃ−20）、120.881D（Ｃ−15）、121.461D（Ｃ−６）、123.715−133.917（芳香族）、139.903S（Ｃ−14）、151.722S（Ｃ−５）、170.819S（エステルカルボニル）。
＊は交換可能である。
実施例15
20,20−エチレンジオキシ−３α,5−シクロ−５α−−プレグン−14−エン−６β,12β−ジオール−12−アセテート（27）−水（250ml）及びアセトン（500ml）中の３β−トルエン−ｐ−スルホニルオキシ−プレグン−5,14−ジエン（26）（1.2g、2.1ミリモル）及び酢酸カリウム（2.2g、22.4ミリモル）の溶液を60℃で16時間還流した。アセトンを蒸発させ、水を酢酸エチル（200ml）で抽出した。この酢酸エチルを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させた。この混合物をクロロホルム−アセトン（9:1v/v）を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィー分離することで、３α,5−シクロ誘導体（27）（530mg、61％）を黄色油として得た、（実測Ｍ  416.262、C25H36O5はＭ  416.263を必要とする）。
δＨ  0.288（1H、dd、3J  8.1Hz、4.9Hz、４−Ha）、0.477（1H、dd、3J  4.4Hz、4.4Hz、4Hb）、1.025（3H、ｓ、19−Ｈ）、1.121（3H、ｓ、18−Ｈ）、1.256（3H、ｓ、21−Ｈ）、1.989（3H、ｓ、アセテート−CH3）、3.302（1H、dd、3J  2.8Hz  2.8Hz、６−Ｈ）、3.784−3.947（4H、ｍ、OCH2CH2O）、4.721（1H、dd、3J  8.5Hz、5.6Hz、12−Ｈ）、5.232（1H、dd、3J  3.9Hz、1.9Hz、15−Ｈ）。
δＣ  11.678T（Ｃ−18）、12.298Q（Ｃ−18）、19.971Q（Ｃ−19）、23.623Q（Ｃ−21）、24.153Q（アセテートメチル）、63.700T（エチレンジオキシ）、63.788T（エチレンジオキシ）、73.591D（Ｃ−６）、80.551D（Ｃ−12）、111.126S（Ｃ−20）、118.778D（Ｃ−15）、152.959S（Ｃ−14）、170.991S（エステルカルボニル）。
実施例16
20,20−エチレンジオキシ−３α,5−シクロ−５α−プレグン−14−エン−６β,12β−ジオール（28）−テトラヒドロフラン（20ml）中の３α,5−シクロ誘導体（27）、（500mg、1.2ミリモル）の溶液をテトラヒドロフラン（10ml）中の水素化アルミニウムリチウム（50mg、1.3ミリモル）の懸濁液に滴下により添加した。この反応混合物を４時間攪拌し、水（50μｌ）を添加することにより反応を停止させた。30分後、水酸化ナトリウムを添加し（15％溶液、50μｌ）、攪拌をさらに30分間継続した。水（150μｌ）を添加し、その反応混合物を濾過した。テトラヒドロフランを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させ、クロロホルム−アセトン（8:2v/v）を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィー精製し、ジオール（28）、（370mg、83％）を油として得た、（実測Ｍ  374.250、C23H34O4はＭ  374.252を必要とする）。
δＨ  0.298（1H、dd、3J  8.1Hz、4.9Hz、４−H2）、0.510（1H、dd、3J  4.4Hz、4.4Hz、４−Hb）、0.985（3H、ｓ、19−Ｈ）、1.055（3H、ｓ、18−Ｈ）、1.325（3H、ｓ、21−Ｈ）、3.318（1H、dd、3J  3.0Hz、3.0Hz、６−Ｈ）、3.363（1H、dd、3J  11.4Hz、4.2Hz、12−Ｈ）、4.019（4H、ｍ、OCH2Ch2O）、4.622（1H、ｓ、OH）、5.255（1H、dd、3J  3.9Hz、1.9Hz、15−Ｈ）。
δＣ  11.681T（Ｃ−４）、12.243Q（Ｃ−18）、19.844Q（Ｃ−19）、23.604Q（Ｃ−21）、63.620T（エチレンジオキシ）、63.733T（エチレンジオキシ）、73.569D（Ｃ−６）、77.478D（Ｃ−12）、111.125S（Ｃ−20）、118.702D（Ｃ−15）、152.912S（Ｃ−14）。
実施例17
20,20−エチレンジオキシ−14,I5β−エポキシ−３α,5−シクロ−５α,14β−プレグナン−６β,12β−ジオール（29）−Ｎ−ブロモアセトアミド（150mg、1.1ミリモル）をアセトン（20ml）、水（0.25ml）及び酢酸（0.25ml）中の20,20−エチレンジオキシ−３α,5−シクロ−５α−プレグン−14−エン−６β,12β−ジオール（28）（340mg、0.91ミリモル）の溶液に０℃で添加した。15分後、亜硫酸ナトリウム（５％溶液、20ml）をこの反応混合物に添加した。アセトンを減圧下で蒸発させ、残留する溶液をジクロロメタン（３×30ml）で抽出した。ジクロロメタン層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて濃縮体積（50ml）とした。ピリジン（0.5ml）をこの混合物に添加してさらに１時間攪拌した後、ジクロロメタン層をクエン酸溶液（５％、３×30ml）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（30ml）及び水（30ml）で洗浄した。このジクロロメタン層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させ、クロロホルム−メタノール（9.5:0.5v/v）を溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、エポキシド（29）（180mg、51％）を泡状物質として得た、（実測Ｍ  390.245、C23H34O2はＭ  390.247を必要とする）。
δＨ  0.287（1H、dd、3J  8.1Hz、4.9Hz、４−Ha）、0.501（1H、dd、3J  4.4Hz、4.4Hz、４−Hb）、0.978（3H、ｓ、19−Ｈ）、1.048（3H、ｓ、18−Ｈ）、1.321（3H、ｓ、21−Ｈ）、3.318（1H、dd、3J  3.1Hz、3.1Hz、６−Ｈ）、3.355（1H、dd、3J  11.2Hz、4.1Hz、12−Ｈ）、3.491（1H、ｓ、15−Ｈ）、4.001（4H、ｍ、OCH2Ch2O）、4.901（1H、ｓ、OH）。
δＣ  11.668T（Ｃ−４）、11.973Q（Ｃ−18）、19.515Q（Ｃ−19）、23.519Q（Ｃ−21）、59.910D（Ｃ−15）、63.601T（エチレンジオキシ）、63.713T（エチレンジオキシ）、72.501S（Ｃ−14）、73.571D（Ｃ−６）、77.471D（Ｃ−12）、111.085S（Ｃ−20）。
実施例18
20,20−エチレンジオキシ−６β,12β,14−トリヒドロキシ−３α,5−シクロ−５α,14β−プレグナン（30）−テトラヒドロフラン（10ml）中のエポキシド（29）（170mg、0.44ミリモル）の溶液をテトラヒドロフラン（5ml）中の水素化アルミニウムリチウム（20mg、0.53ミリモル）の懸濁液に添加した。この反応混合物を２時間還流した後、水（20μｌ）を添加し、05時間攪拌を継続した。水酸化ナトリウム溶液（15％、20μｌ）を添加し、さらに0.5時間攪拌を継続した。さらなる量の水を添加し（60μｌ）、その懸濁液を１時間攪拌した。濾過した後、その懸濁液を乾燥させ（MgSO4）、濾過してテトラヒドロフランを蒸発させた。クロロホルム−メタノール（9:1v/v）で溶出する、得られた混合物のフラッシュクロマトグラフィー分離により、必要とされるトリオール（30）、（90mg、53％）を透明油として得た、（実測Ｍ  392.261、C23H38O5はＭ  392.263を必要とする）。
δＨ  0.287（1H、dd、3J  8.1Hz、4.9Hz、４−H2）、0.510（1H、dd、3J  4.4Hz、4.4Hz、４−Hb）、0.971（3H、ｓ、19−Ｈ）、1.042（3H、ｓ、18−Ｈ）、1.319（3H、ｓ、21−Ｈ）、3.321（1H、dd、3J  3.0Hz、3.0Hz、６−Ｈ）、3.321（1H、dd、3J  11.1Hz、3.9Hz、12−Ｈ）、3.561（1H、ｓ、OH）、4.084（4h、ｍ、OCH2Ch2O）、4.671（1H、ｓ、OH）。
δＣ  11.668T（Ｃ−４）、11.971Q（Ｃ−18）、19.511Q（Ｃ−19）、23.520Q（Ｃ−21）、63.612T（エチレンジオキシ）、63.711T（エチレンジオキシ）、73.483D（Ｃ−６）、76.051D（Ｃ−12）、84.307S（Ｃ−14）、111.099S（Ｃ−20）。
実施例19
３β,12β,14−トリヒドロキシ−14β−プレグン−５−エン−20−オン（15）−アセトン（20ml）及び塩酸（1M、10ml）中のトリオール（30）（80mg、0.20ミリモル）の混合物を60℃で２時間還流した。この反応混合物を冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（20ml）を添加した。アセトンを蒸発させ、水層をクロロホルム（３×20ml）で抽出し、そのクロロホルム層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、エピマー性トリヒドロキシステロイド（15a、15b）（42mg、61％）を得た。このエピマー混合物（15a、15b）（15mg）の分離を、クロロホルム：メタノール（9:1v/v）を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィー分離により達成し、純粋な17β−エピマー（15a）、（10mg）、m.p.224−229℃（アセトン）、（lit.226−223゜）、（実測Ｍ  348.234、C;72.32、Ｈ  9.21％C21H32O4はＣ、72.38;H  9.26％、Ｍ  348.236を必要とする）、及び17α−エピマー（15B）（3mg）、m.p,183−191℃（アセトン）、（lit  184−196゜）を得た。
３β,12β,14−トリヒドロキシ−14β−プレグン−５−エン−20−オン（15a）：
δＨ  0.963（1H、ｓ、19−Ｈ）、1.192（3H、ｓ、18−Ｈ）、2.236（3H、ｓ  21−Ｈ）、3.325（1H、dd、3J  11.2Hz、3.9Hz、12−Ｈ）、3.464（1H、ｓ、OH）、3.5140（1H、ｍ、３−Ｈ）、3.598（1H、dd、3J  9.6Hz、9.6Hz、17−Ｈ）、4.255（1H、ｓ、OH）、5.383（1H、ｍ、５−Ｈ）。
δＣ  8.275Q（Ｃ−18）、19.414Q（Ｃ−19）、24.400T（Ｃ−11）、24.581T（Ｃ−16）、27.443T（Ｃ−７）、30.062T（Ｃ−２）、32.972Q（Ｃ−21）、34.543T（Ｃ−15）、35.864D（Ｃ−８）、36.975S（Ｃ−10）、37.337T（Ｃ−１）、42.144T（Ｃ−４）、43.565D（Ｃ−９）、55.101S（Ｃ−13）、57.038D（Ｃ−17）、71.597D（Ｃ−３）、73.558D（Ｃ−12）、85.566S（Ｃ−14）、122.223D（Ｃ−６）、138.932S（Ｃ−５）、217.011S（Ｃ−20）。
３β,12β,14−トリヒドロキシ−14β−プレグン−５−エン−20−オン（15b）：
δＨ  0.996（1H、ｓ、19−Ｈ）、1.144（3H、ｓ、18−Ｈ）、2.221（3H、ｓ、21−Ｈ）、3.339（1H、dd、3J  9.4Hz、9.4Hz、17−Ｈ）、3.492（1H、ｍ、３−Ｈ）、3.629（1H、dd、3J  11.1Hz、3.9Hz、12−Ｈ）、3.712（1H、ｓ、OH）、4.325（1H、ｓ、OH）、5.383（1H、ｍ、５−Ｈ）。
実施例20〜28では、第１の単糖（40）を形成するための中間体化合物を調製することができる手順が説明される。
実施例20
メチル−4,6−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコースピラノシド（32）
メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（30g、0.15モル）、ベンズアルデヒド（70ml）及び塩化亜鉛（20g）の混合物を室温で24時間攪拌する。その反応生成物を氷水に注ぎ入れ、15分間攪拌を継続する。白色沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。この固形物質をメタ重亜硫酸ナトリウム（10％溶液）と共に15分間攪拌し、濾過して水で洗浄する。固形物質をクロロホルム及びエーテルから結晶化し、ベンジリデン生成物（32）（31g、72％）を得る。
実施例21
メチル−4,6−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−トシル−α−Ｄ−グルコピラノシド（33）
ピリジン（100ml）中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（25g、1.2当量）をピリジン（100ml）中のベンジリデングルコース（32）（31g、0.12モル）の溶液に０℃で滴下により添加する。この反応物を室温で48時間攪拌する。この反応混合物に氷を添加する。得られた白色固形物質を水で洗浄し、熱エタノールから再結晶してトシル化グルコース（33）（28g、60％）を得る。
実施例22
メチル−4,6−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−アルトロピラノシド（34）
メタノール（150ml）中のナトリウム（7g）の溶液中のトシレート（33）（28g、64ミリモル）を、オートクレーブ内で、110℃で48時間加熱する。反応容器を冷却し、反応混合物に固形二酸化炭素を添加する。濾過した後、メタノールを蒸発させ、次に固形物質を水に取る。水層をクロロホルムで抽出する（×３）。クロロホルムを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。その粗製混合物を、クロロホルム：アセトン（9:1）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アルトロシド（34）（10g、52％）を得る。
実施例23
メチル−６−ブロモ−４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｄ−アルトロピラノシド（35）
ベンジリデンアルトロシド（34）（10g、33ミリモル）を四塩化炭素中のＮ−ブロモスクシンイミド（7.6g）及び炭酸バリウム（20g）の溶液に添加し、その反応混合物を75℃で３時間還流する。この反応混合物を濾過し、四塩化炭素層を水で洗浄する。有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させ、６−ブロモ−アルトロシド（35）、（9g、69％）を得る。
実施例24
メチル−４−Ｏ−benzovl−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−α−Ｄ−アルトロピラノシド（36）
水（30ml）中の水素化ホウ素ナトリウム（18g）をエタノール（300ml）中のブロモアルトロシド（35）（9g、23ミリモル）及び塩化ニッケル（18g）の溶液に０℃で滴下により添加する。この反応混合物を75℃で１時間還流した後、濾過する。エタノールを蒸発させ、残留する水層をクロロホルムで抽出する（×３）。このクロロホルムを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させて、６−デオキシ−アルトロシド（36）（5g、72％）を得る。
実施例25
４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−αβ−Ｄ−フェニルチオアルトロピラノシド（37）
フェニルチオトリメチルシラン（5ml）及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（2ml）をジクロロメタン（200ml）中の６−デオキシ−アルトロシド（36）（5g、17ミリモル）の溶液に０℃で添加する。この反応混合物を室温で６時間攪拌する。この反応混合物に飽和重炭酸ナトリウムを添加する。ジクロロメタン層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。その粗製混合物を、クロロホルム：アセトン（9:1）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、αβ−フェニルチオアルトロシド（37）（4g、63％）を得る。
実施例26
４−Ｏ−ベンゾイル−3O−メチル−２−フェニルチオ−2,6−ジデオキシ−αβ−Ｄ−フルオロシマロピラノシド（38）
三フッ化ジエチルアミノイオウ（0.65g）をジクロロメタン中のαβ−フェニルチオアルトロシド（37）（0.5g、1.33ミリモル）の溶液に０℃で迅速に添加する。この反応物を０℃で0.5時間攪拌した後、飽和重炭酸ナトリウムを添加する。ジクロロメタンを水層から分離し、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、αβ−フルオロシマロース（38）（450mg、90％）を得る。
実施例27
４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−αβ−Ｄ−フェニルチオ−アルトロシド（39）
６−デオキシアルトロシド（37）（5g）をピリジン（50ml）中の塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（3g）及びイミダゾール（3g）を用いてシリル化する。この反応物を、酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチルを塩酸（6N）、次いで重炭酸ナトリウム、最後に水で洗浄することにより後処理する。酢酸エチル層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、シリル化ベンゾイルフェニルチオアルトロシド（39）（80％）を得る。
実施例28
３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−αβ−Ｄ−フェニルチオアルトロシド（40）
シリル化ベンゾイルフェニルチオアルトロシド（39）（6g）をナトリウムメトキシド（100ml）で４時間処理する。メタノールを蒸発させ、反応物に水を添加する。水層を酸性化し（pH5、ACOH）、酢酸エチルで抽出する。この酢酸エチルを水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させてシリル化メチルフェニルチオアルトロシド（40）（75％）を得る。
実施例29〜37では、第２の単糖（50）を形成するための中間体化合物を調製することができる合成手順が説明される。
実施例29
1,2:5,6−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（42）
硫酸（40ml）をアセトン（11）中のα−Ｄ−グルコース（41）（50g、0.28モル）の溶液に０℃で滴下により添加する。この反応混合物を24時間攪拌した後、水酸化ナトリウム（6M）を用いて中和する。アセトンを蒸発させ、水層をクロロホルム（×２）で抽出する。このクロロホルムを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。シクロヘキサンから結晶化することでジ−イソプロピリデングルコース（42）（41g、57％）を得る。
実施例30
1,2:5,6−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−３−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコフラノース（43）
テトラヒドロフラン（300ml）中のα−Ｄ−グルコフラノース（42）（41g、0.16モル）をテトラヒドロフラン（200ml）中の水素化ナトリウム（5g）の懸濁液に滴下により添加する。0.5時間後、テトラヒドロフラン中（100ml）中のヨウ化メチル（25g）をこの反応混合物に滴下により添加し、次にそれを24時間攪拌する。この反応混合物に水を添加した後、エーテルで抽出する（×３）。エーテル層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、メチル保護グルコース（43）（38g、83％）を得る。
実施例31
３−Ｏ−メチル−αβ−Ｄ−グルコピラノシド（44）
メチルジイソプロピリデン化合物（43）（38g、0.14モル）を酢酸（50％、700ml）に溶解し、その溶液を18時間還流する。冷却後、酢酸を蒸発させる。その粗製生成物を、クロロホルム：メタノール：アセトン：水（70:27:2:1）で溶出するカラムクロマトグラフィーによって精製し、３−Ｏ−メチル−αβ−グルコピラノシド（44）（13g、50％）を得る。
実施例32
メチル３−Ｏ−メチル−αβ−Ｄ−グルコピラノシド（45）
３−Ｏ−メチル−αβ−グルコピラノシド（44）（10g）をメタノール（50ml）及びHCl（濃）（1ml）に溶解し、一晩還流する。固体NaHCO3を添加し、反応物を濾過する。メタノールを蒸発させて1,3−ジ−Ｏ−メチル−αβ−Ｄ−グルコピラノシド（45）、（95％）を得る。
実施例33
メチル4,6−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−メチル−αβ−グルコピラノシド（46）
グルコピラノシド（45）（8g）をベンザルアルデヒド（20ml）及び塩化亜鉛（5g）の溶液中において、室温で攪拌する。24時間後、氷を添加し、水層をクロロホルムで抽出する。クロロホルム層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。ベンザルアルデヒドを真空蒸留により除去し、その生成物を、アセトン：クロロホルム（0.5:9.5）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ベンジリデン−αβ−グルコピラノシド（46）（60％）を得る。
実施例34
メチル４−Ｏ−ベンゾイル−Ｏ−メチル−６−デオキシ−αβ−グルコピラノシド（47）
ベンジリデン化合物（46）（5g）を、四塩化炭素中のＮ−ブロモスクシンイミド（3.7g）及び炭酸バリウム（4g）の混合物中において、80℃で還流する。４時間後、この反応物を濾過し、四塩化炭素を水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させてブロモ化合物（70％）を得る。
このブロモ化合物（4.3g）をエタノール（300ml）及び塩化ニッケル（8.6g）の溶液に０℃で溶解する。この溶液に、水（50ml）中の水素化ホウ素ナトリウム（8.6g）を15分にわたって滴下により添加する。この反応混合物を100℃で45分間還流し、冷却し、濾過して蒸発させた。クロロホルムを添加し、クロロホルム層を水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させて、６−デオキシ糖（47）（70％）を得る。
実施例35
４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−１−フェニルチオ−６−デオキシ−αβ−グルコピラノシド（48）
６−デオキシグルコピラノシド（47）（3g）をジクロロメタン（50ml）に溶解する。この溶液に、フェニルチオトリメチルシラン（2g）及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（0.2ml）を添加する。この溶液を室温で一晩攪拌した後、飽和重炭酸ナトリウムを添加する。ジクロロメタン層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。その生成物を、酢酸エチル：ヘキサン（2:8）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物（48）（60％）を得る。
実施例36
４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ピバロイル−１−フェニルチオ−６−デオキシ−αβ−グルコピラノシド（49）
ピリジン（20ml）中のグルコピラノシド（48）（2g）の溶液に塩化ピバロイル（2ml）を添加する。この溶液を室温で一晩攪拌した後、水を添加する。水層を酢酸エチルで抽出し、有機層をHCl（6N）で洗浄する。その有機層を乾燥させ（MgSO4）、濾過し、蒸発させてピバロイルエステル（49）（80％）を得る。
実施例37
４−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−ピバロイル−１−フルオロ−６−デオキシ−β−グルコピラノシド（50）
Ｎ−ブロモスクシンイミド（1.2g）及び三フッ化ジエチルアミノイオウ（1.2g）をジクロロメタン（100ml）中のピバロイルエステル（49）（2g）の溶液に０℃で添加する。１時間後、飽和重炭酸ナトリウムを添加する。ジクロロメタン層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。このβ−フルオロピラノシド（50）を、酢酸エチル：ヘキサン（2:8）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製する、（収率45％）。
実施例38では、化合物３−Ｏ−［４−Ｏ−ベンゾイル−２−フェニルチオ−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12,14β−ジヒドロキシ−プレグナン−５−エン−20−オン（51）を調製することができる合成手順が説明される。
実施例38
３−Ｏ−［４−Ｏ−ベンゾイル−２−フェニルチオ−β−Ｄ−シマロピラノシル］−12,14β−ジヒドロキシ−プレグン−５−エン−20−オン（51）
塩化スズ（190mg、１ミリモル）を乾燥ジエチルエーテル及び4Aモレキュラーシーブ中の3,12,14β−トリヒドロキシプレグナン−５−エン−20−オン（15）（100mg、0.28ミリモル）及びフルオロシマロピラノシド（38）（210mg、0.56ミリモル）の溶液に−15℃で添加する。この反応混合物を−15℃で３時間維持する。この反応混合物に飽和重炭酸ナトリウムを添加する。エーテル層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。その生成物を、クロロホルム：メタノール（9.5:0.5）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、グリコシド（51）（30mg、15％）を得る。
実施例39〜41では、シマロース及びテベトース部分をカップリングさせることができる合成手順が説明される。
実施例39
テベトース−シマロース二糖（53）
ジクロロメタン中のテベトース（50A）（1.5g）、シマロース（40）（1.3g）、及びモレキュラーシーブ4Aの溶液を室温で１時間攪拌する。この反応混合物を−15℃に冷却し、塩化スズ（II）（0.8g）及びトリフルオロメタンスルホン酸銀（1.1g）を添加する。この混合物を−15℃で16時間攪拌した後、トリエチルアミン（0.5ml）を添加する。この反応生成物を濾過し、ジクロロメタンを蒸発させる。その二糖（53）を、酢酸エチル：ヘキサン（2:8）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製する、収率15％。
実施例40
テベトース−シマロース二糖（54）
テトラヒドロフラン（20ml）中の二糖（53）（200mg）の溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.4ml）を添加する。この混合物を室温で１時間攪拌した後、飽和重炭酸ナトリウムを添加する。その反応混合物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。その二糖（54）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトン：クロロホルム、0.5:9.5）によって精製する、収率60％。
実施例41
テベトース−シマロース二糖（55）
ジクロロメタン（10ml）中の二糖（54）（80mg）の溶液に三フッ化ジエチルアミノイオウ（80μｌ）を０℃で添加する。０℃で0.5時間攪拌した後、飽和重炭酸ナトリウム及びさらなるジクロロメタンを添加する。ジクロロメタンを乾燥させ（MgSO4）、濾過して蒸発させる。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン  1:9）によって精製することで二糖（55）を65％の収率で得る。
実施例42
この食欲抑制剤に関する以下の３つの生物検定の結果を以下に記載する、すなわち、
ａ）アーウィン（Irwin）試験
ｂ）急性毒性試験；及び
ｃ）経口投与摂食障害試験。
ａ）アーウィン試験
この試験の目的は、前述のように植物抽出物から生成される本発明の食欲抑制剤を、動物を減らしたアーウィン試験に従って、静穏化及び鎮静化作用について評価することであった。
実験手順
出願人が前述の方法により植物材料から食欲抑制剤を抽出し、それを各々３匹の動物を含む４つの群のうちの２つに投与した:1つの群には処置を施さず、１つの群には溶媒ジメチルスルホキシド（DMSO）を投与し、１つの群には試験試料を50mg/kgで投与し、かつ１つの群には試験試料を300mg/kgで投与した。処置は腹腔内注射により行い、処置後５時間までの特定の間隔で観察を行った。DMSO処置動物において観察されたもの以外の症状のみを結果の解釈に用いた。
結果
溶媒DMSOが動物、特には心臓調節機構に対する顕著な効果を有することが明らかであった。この溶媒単独で、又は試験試料と共に処置した全ての動物の体温は、顕著な低下を示した。
低用量群の動物は、対照群を含む他の全ての群におけるものと同様に、ケージ内の離散の減少及び運動活動の減少を示した。無気力がDMSO処置群と同程度に見られた。処置の15〜60分後に呼吸の減少が観察された。眼瞼下垂（眼瞼の閉鎖）もDMSO群よりも高い程度に観察された。耳翼（耳）応答が正の指応答に加えてみられ、これは怯えを示す。処置後に体温が32.7℃に低下した。
高用量群の動物は、他の群と同様に、ケージ内での離散の初期の低下及び運動活動の低下を示したが、死ぬ前に離散及び運動活動の増加を示し、これは処置の約１時間後に生じた。重度の間代性非対称痙攣が処置の30分後に生じた。呼吸は最初は減少したが、死ぬ前には増加した。耳翼（耳）応答は遅延し、かつ正の指応答が観察され、これは怯えを示すものであり、両者とも低用量群の動物において観察されるものと同様であった。体温は処置後に30.7℃に低下した。位置的な受動性の増加が身体の緊張の低下に加えて観察された。異常な肢の回転が観察され、握力が低下し、痛みの応答が存在せず、正向反射の喪失が生じた。
考察
対照及びDMSO処置動物と比較したとき、低用量（50mg/kg）を投与した動物は呼吸の減少及び眼瞼下垂の程度の増加を示すのみであった。高用量（300mg/kg）の試験試料を投与した動物は、痙攣及び死亡を示すことにより非常に強く反応した。これらの動物においてなされた他の全ての観察は、痙攣及び瀕死の状態にある動物のものであると見なすことができる。試験試料に帰することができる、試験群における静穏化及び鎮静化作用を示唆する徴候、例えば、ケージ内での離散の顕著な減少、運動活動の減少及び無気力は見られなかった。
したがって、この試験試料は、DMSOを溶媒として腹腔内に投与した場合、300mg/kgでマウスにとって致死的であり、50mg/kgでマウスに対する呼吸抑制効果を有するものと結論付けることができる。
ｂ）急性毒性試験
この試験の目的は、試験試料の毒性に関する情報を得ることにあった。
実験手順
前述の通りに本発明に従って調製され、かつ食欲抑制作用を有する植物抽出物を精製し、１つの試験試料をマウスにおける経口処置により用量を増加させて試験した。１匹の動物のみを処置した最高投与群を除いて、投与群当たり２匹の動物を用いた。動物の健康状態が良好であることを調べ、それらの体重を処置当日に測定した。
用量の範囲は100mg/kgから3028.5mg/kgまでであった。用量を計算し、各々の動物が0.2mlの総用量を摂取するように調製ポテトスターチに混合した。動物13には0.25mlを投与した。ポテトスターチは、20gのスターチを小容量の冷水と混合し、それを沸騰水に添加して１リットルの容量とすることにより調製した。その懸濁液を、投与に先立って室温に冷却した。
群１及び２の動物は同じ日に処置した。それらを24時間観察し、毒性の徴候が現れない場合には次の群を処置した。全ての動物を処置するまで同じアプローチを続けた。それ以前の群で急性毒性用量に到達している場合に動物を不必要に処置しないことを保証するため、このスケジュールに従った。
動物を、毒性の臨床的徴候について、処置の直後（１〜２時間）及びその後毎日観察した。体重を週に１回測定し、各々の動物の総食物及び水摂取量を測定した。
生存動物を、この実験の第14日に、ペントバルビツールナトリウム（Euthanaze、CentaurRの商品名で商業的に入手可能）を腹腔内注射することにより安楽死させた。これらの動物に加えて、実験の間に死亡した１匹の動物に対して死後検査を行った。組織病理用の試料を集めた。
結果
群１（対照群）
14日の観察期間の間、毒性の臨床的徴候は観察されなかった。食物及び水の摂取量は正常パラメータ内であった。体重の変化も正常パラメータ内であった。肝臓試料における組織病理学的変化は記録されなかった。
群２（100mg/kg）
観察期間の間、毒性の臨床的徴候は観察されなかった。食物及び水の摂取量は正常であり、観察期間を通しての体重の変化も正常であった。巨視的病理は観察されず、肝臓試料における組織病理学的及び形態学的変化は記録されなかった。
群３（200mg/kg）
この群の動物は、実験の間、毒性の臨床的徴候は示さなかった。食物及び水の摂取量は正常であり、体重の変化も同様であった。巨視的病理は観察されなかったが、肝臓が検査時に組織病理学的変化を示した。肝細胞の混濁腫脹が動物６においては軽かったが、動物５においては中程度であった。動物５の肝細胞においては中程度の水症性変性も生じた。
群４（400mg/kg）
観察期間の間毒性の臨床的徴候は観察されず、死後検査の間巨視的病理は観察されなかった。肝細胞の混濁腫脹及び軽い水症性変化が組織学で観察された。
動物７における水及び食物の摂取量並びに体重の増加は正常であった。動物８は動物７の総食物摂取量のほぼ２倍を消費した（それぞれ、144.6g及び73.9g）が、体重の増加は2.7gと比較して僅かに0.81gであった。
群５（800mg/kg）
１匹の動物（動物10）が投与の３時間後にいかなる特定の徴候をも示すことなく死亡した。他の動物（動物９）は、いかなる毒性の徴候を示すこともなく全観察期間生存した。生存動物の水摂取量は正常であった（42.42ml）が、食物の摂取量は多かった（134.2g）。体重は2.85g増加し、これはこの実験における全ての動物のうちで最高であった。
経口投与の後短期間で死亡した動物10の死後検査時に、肺が充血していた。試験物質の吸引を示す異質の身体反応は存在しなかった。巨視的病理は動物９には観察されなかった。軽い細胞質空胞化（水症性変性）が動物10に存在していたが、動物９においては中程度であった。肝臓の腺性の細胞質の外観は両者の動物において中程度と分類された。
群６（1600mg/kg）
実験の持続期間に毒性の臨床的徴候を提示する動物はいなかった。死後検査時に巨視的病理は観察されなかったが、動物11の肝臓において中程度の変性変化が組織病理学的検査時に観察された。動物12は肝細胞の中程度の混濁腫脹及び軽い水症性変化を示した。食物及び水の摂取量は正常であり、実験期間を通しての体重の増加も同様であった。
群７（3028.5mg/kg）
この用量では１匹の動物のみを試験した。この動物は観察期間に毒性の徴候は示さず、巨視的病理は観察されなかった。組織病理学的検査時に、肝細胞の中程度の混濁腫脹及び水症性変性が観察された。この動物は観察期間を通しての体重の喪失（−0.82g）を示したが、食物及び水の摂取量は正常であった。
考察
各投与群において用いた動物の数が非常に小数であったため、結論を出すことは困難である。僅かに１匹の動物が低用量率でいかなる症状をも示すことなく死亡したという事実は、その死が試験試料に関連するものではなく、処置の間及び／又はその後のストレスによるものであることを示すものであろう。より多量の投与群において死亡、又は毒性の徴候を示す動物はおらず、それがこの仮説をさらに支持する。
動物８において観察された食物摂取量の増加は、おそらく、体重の増加の低さに反映されるように、食物の過剰の取りこぼしに帰することができる。この実験における全ての動物は僅かに１回処置しただけであり、この実験における場合のように、食欲抑制剤が14日間にわたる食物もしくは水の摂取量、又は体重のいずれかに顕著な影響を及ぼすことはありそうもないことを心に留めるべきである。
肝臓試料の組織病理学的検査からは、病理学的変化が用量に関連し、より高い用量を投与された動物が広範な変化を示すことが明らかであった。観察された病理は自然に生じる代謝的なものではなく、おそらくは試験試料が誘発したものであった。この変化は変性的なもののみであり、したがって、可逆的であった。不可逆的な肝細胞の変化の徴候は観察されなかった。
したがって、１匹の動物のみが低用量（800mg/kg）で死亡したが、その死はおそらくは試験試料に関連するものではなかったものと結論付けることができる。いずれの投与群においても、処置後の14日の観察期間に毒性の徴候を示し、又は処置の結果として死亡した動物は他にはいなかった。試験試料の１回の経口投与で、可逆的な用量関連肝細胞変化が誘発された。
ｃ）経口投与摂食障害試験
この試験の目的は、本発明に従って調製される植物抽出物の活性、及び最少有効用量を決定し、同時に、アーウィン試験において見られた呼吸の抑制のような可能性のある副作用を研究することにあった。
実験手順
乱数表を用いて動物を処置群に割り当てた。各処置群は３匹の動物からなり、対照群は６匹であった。試験試料を、順化時に体重100〜150gの若い雌ラットに３日連続して投与した。動物は、簡単に識別するため、金属耳標及びKMnO4皮膚マーキングによって識別した。動物を標準的な齧歯類用ポリカーボネートケージに個別に収容し、水及び粉末化市販齧歯類用ペレットを自由に摂取させた。水及び食物摂取量を毎日測定して、計算した。試験試料の最少有効用量を見出すため、５種類の用量を試験した。処置は、ポテトスターチに懸濁させた試験試料を用いて、経口強制給餌により行った。
試験物質は化合物（１）、本発明に従って植物材料由来の抽出物から調製した白色顆粒状粉末であり、量を測定した試験試料を調製ポテトスターチと混合して投与した。ポテトスターチとの混合は毎日投与直前に行った。各動物用の投与体積を引き出す前に、それらの懸濁液をVortexを用いて完全に混合した。
５種類の用量の範囲を試験し、対照群には担体物質のみを投与した。用量は前述のアーウィン試験において観察された効果に基づいて選択し、以下のようなものであった。
群1:0.00mg/kg（対照群）
群2:6.25mg/kg
群3:12.50mg/kg
群4:25.00mg/kg
群5:37.50mg/kg
群6:50.00mg/kg
結果
処置は、この研究期間には、動物の健康に影響を及ぼさなかった。全ての投与群における試験試料で処置した動物は、全研究期間を通しての平均体重増加の有意の低下を示し、５つの処置群のうちの３つの動物は実際に体重が減少した。
全ての処置群の平均食物摂取量は研究期間を通して減少した。高用量投与群の動物は、水の消費の増加を示した。
いずれの投与群においても、呼吸数が有意に影響を受けた動物はいなかった。
全ての投与群の動物は死後検査時に脆い肝臓を提示したが、巨視的病理は観察されなかった。
考察
順化期間に集められたデータにより、この実験に含まれる全ての動物が健康であり、体重の増加はこれらの動物の間で同等であることが確かめられた。
体重増加の減少、及び何匹かの動物においてはその喪失さえもが、食物摂取量の減少との組み合わせで、食欲中枢の抑制を示す。
食物摂取量の減少及び体重増加の減少は最少投与群（6.25mg/kg）でさえ見られた。体重の実際の減少は12.50mg/kg群においてみられた。
治療群の全てで餌の消費が減少したときに水の消費が増加した（図２）ことに注意することが重要である。これは、試験試料の利尿効果、又は脳の渇き中枢（thirst centre）の刺激によるものである可能性がある。
上で言及される、腹腔内径路での急性毒性試験において観察されているような、呼吸抑制が生じないという事実が肯定的な面として見られる。これは、胃腸管からの吸収が低下し、結果としてバイオアベイラビリティが低下しているためである可能性がある。しかしながら、この経口投与試験でのバイオアベイラビリティは、試験試料が有効である上では十分なものである。ほとんどの群における処置の１時間後の呼吸数の僅かな減少は、投与容積での胃の充満とその結果としての動物の受動性に帰することができる。
処置群において観察された脆い肝臓は、脂肪代謝の増加及び肝臓の過負荷を生じる、食物摂取量の減少に続くエネルギー代謝の変化によるものである可能性がある。これが実際にこの場合であったならば、これらの変化は、定常状態に到達した後に、又は試験試料を除去した後に時間と共に回復し得る一過性のものと見なすことができる。肝臓に対する可能性のある効果もさらに研究する必要がある。
この研究は主としてスクリーニング試験を目的としていたため、小さな群の試験動物を用いた。これは、特に個々の動物が全体として異なるように反応するときに、データの統計的解釈を困難にする。しかしながら、このデータは、試験試料が試験した最低の用量（6.25mg/kg）でさえ食欲抑制作用を有することを示す。試験した用量では呼吸抑制の臨床的徴候は生じなかった。
実施例43
自然環境から、又は栽培計画を通して収穫したフーディア植物を、まず、４℃で最大48時間保存する。これらの植物を水道水で洗浄した後、±1cmの切片にスライスする。これらのスライス片を全て合わせた後、水圧プレスにより、300バールの圧力で、圧縮当たり最低で0.5時間圧縮する。この圧縮の過程で、植物の樹液を別々に集める。この樹液を、さらなる処理が必要となるまで−18℃で保存する。
この樹液を、自由流動粉末を得るのに適する条件下で噴霧乾燥する。粉末中の水分含量は好ましくは噴霧乾燥後に５％未満であり、必要であれば、真空オーブン内で、又は流動床ドライヤーを用いてさらに乾燥させる。
この樹液及び噴霧乾燥物質の両者は、ラットでの生物学的検定において、食欲抑制剤として有効であることが示されている。
実験
50kgのフーディア・ゴルドニイ植物を水道水で洗浄した後、1cmの切片にスライスした。次に、これらのスライスした植物を、水圧プレスにより、300バールの圧力で、バッチ当たり最低で0.5時間圧縮した。樹液を集めたところ、その質量は、環境からのフーディア・ゴルドニイ植物を用いた場合には10kgであり、栽培計画からのフーディア・ゴルドニイ植物を用いた場合には20kgであることが見出された。樹液（500g）を、以下の条件を用いて噴霧乾燥した：
流速            :2.85ml/分
導入口温度      :110℃
排出口温度      :70℃
チャンバー温度  :78℃
得られた噴霧乾燥粉末は、水分含量が6.9％の自由流動粉末（22g）であった。
この噴霧乾燥粉末を、HPLC技法を用いて、活性成分濃度について分析した。活性体の濃度は13g/噴霧乾燥粉末kgと決定された。
HPLC分析法
溶出液   :アセトニトリル：水（7:3）、アイソクラチック
カラム   :逆相Ｃ−18
UV吸収   :225nm
流速     :1ml/分
注入容積 :10μｌ
方法
噴霧乾燥粉末（10mg）を水（0.5ml）及びアセトニトリル（0.5ml）に溶解してこの溶液10μｌをHPLCに注入し、活性化合物（１）の濃度を、純粋な化合物（１）から作成した標準曲線を用いて決定した。
実施例44
ラットにおいて化合物（１）の可能性のある摂食障害効果を評価するように設計された研究の結果を以下に示す。以下において、試験した化合物は純粋樹液（試料１）、噴霧乾燥樹液（試料２）及び活性部分（試料３）である。試料１及び２は、それぞれ、上記実施例43に記載されるものと同様の樹液及び噴霧乾燥樹液である。試料３は純度≧95％の溶媒抽出化合物（１）である。
試料１〜３を、各々、１回経口用量として雄ウィスターラットに投与した。２つのさらなる対照群にはビヒクル（蒸留水又はDMSO）を投与した。経口投与したフェンフルラミン（7.5mg/kg）を参照標準として含めた。
経口投与した試料１（純粋樹液）では食物消費の用量依存性の減少が生じ、これは、ビヒクル処置対照と比較したとき、1600mg/kg以上の用量で統計的に有意であった。同時に体重（又は成長速度）の減少も記録された。投与当日に、投与後３時間（6400及び1000mg/kg）並びに投与後６時間（10000mg/kg）で水の消費の統計的に有意の増加が記録された。投与後24〜48時間に、3200mg/kg以上の用量で水の消費の統計的に有意の減少が記録された。
76mg/kgで経口投与した試料２（噴霧乾燥樹液）でも、ビヒクル処置動物と比較したとき、食物消費及び体重の統計的に有意の減少が生じた。水の消費に対する統計的に有意の効果は記録されなかった。
試料３（活性部分）では、5.0mg/kgの経口用量で、食物消費の統計的に有意の減少が生じた。この活性部分によっては、ビヒクル処置対照動物と比較したとき、データの検査で成長の僅かな遅れが明らかになったものの、体重に対する統計的に有意の効果は生じなかった。水の消費対する統計的に有意の効果は記録されなかった。
参照標準、フェンフルラミン（7.5mg/kg）では、関連ビヒクル処置対照群と比較したとき、投与後６及び24時間に食物消費の統計的に有意の減少が生じた。水の消費又は体重に対する統計的に有意の効果は記録されなかった。
肝臓に対する処置関連の効果は記録されなかった。
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実験手順
55匹の雄ウィスターラットをこの研究に用いた。
体重、食物消費（フードホッパー重量）及び水消費（ボトル重量）を、到着の日から研究が終了するまで、毎日同じ時間に記録した。
第１日に、以下の表に従い、ラットに１回経口（強制給餌）用量を投与した：
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群１〜８には10mg/kgの一定投与容積を用いて投与し、群９〜12には1ml/kgの投与容積を用いて投与した。
食物及び水の消費は、第１日の投与後１、３及び６時間にも測定した。
第８日の測定の後、二酸化炭素窒素により動物を殺し、組織学的検査の前に肝臓を切除して10％緩衝ホルマリンに入れた。各々の肝臓のパラフィンワックス切片を４〜５μｍで取り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。さらなる切片をクリオスタットを用いて12μｍで切断し、オイルレッドＯ（Oil Red O）（ORO）で脂肪を染色した。
データ分析
P57処置動物についての各時点での投与後の食物及び水消費の測定及び体重を、関連する同様に処置されたビヒクル対照群と、分散の分析、次いで対照と比較するためのウィリアムズ検定（Williams' test）を用いて比較した。
フェンフルラミン処置動物のデータはビヒクル処置対照群のものとスチューデントｔ検定を用いて比較した。
結果
これらの結果を表にまとめる。
経口投与した試料１（純粋樹液）では、毎日の食物消費に顕著な用量に関連する減少が生じた。これらの食物消費における減少の持続期間及び広がりは用量依存性であった。投与後24時間で、試料１（純粋樹液）は、ビヒクル処置対照と比較したとき、1600mg/kg以上の用量で食物消費に統計的に有意の減少を生じた。試料１（樹液）の最高用量（10000mg/kg）では、投与後５日まで毎日、食物消費に統計的に有意の減少が生じた。
試料２（噴霧乾燥樹液）及び試料３（活性部分）では、それぞれ76及び5.6mg/kgの経口用量で、食物消費に顕著な、及び統計的に有意の減少が生じた。両者の場合において、これらの効果は投与後48時間持続した。
参照標準、フェンフルラミン（7.5mg/kg、p.o.）では、関連ビヒクル処置対照群（群12）と比較したとき、投与後６及び24時間で食物消費の統計的に有意の減少が生じた。
試料２（噴霧乾燥樹液）及び試料３（活性部分）では、水消費に対する顕著な用量関連効果は生じなかった。投与当日、純粋樹液では、投与後３時間（6400及び10000mg/kg）及び投与後６時間（10000mg/kg）で水消費の統計的に有意の増加が生じた。しかしながら、投与の２日後に、試料１（樹液）を3200、6400及び10000mg/kg投与した動物において水消費の統計的に有意の減少が記録された。しかしながら、これらの減少は明らかな用量関連のものではなく、投与後１〜２日にのみ生じた。したがって、これらの効果の生物学的意義は不明のままである。
試料１（純粋樹液）では、ビヒクル処置対照群（群１）と比較したとき、体重に対する用量関連の、統計的に有意の効果が生じた。3200mg/kg以上の用量を経口で投与した場合、試料１（純粋樹液）では、ビヒクル処置動物と比較したとき、統計的に有意の体重の減少又は成長速度の低下が生じた。これらの効果は投与後48時間からこの研究の最後まで統計的に有意であった。
76mg/kgで経口投与した試料２（噴霧乾燥樹液）でも、ビヒクル処置対照群（群１）と比較したとき、動物の成長の統計的に有意の低下が生じた。これらの効果は、第３日（投与後48時間）〜第５日で包括的に、統計的に有意であった。
試料３（活性部分）では、関連ビヒクル処置対照群（群12）と比較したとき、最高用量（5.0mg/kg）で動物の成長を遅延させるように思われたが、この効果は統計的に有意ではなかった。
フェンフルラミン（7.5mg/kg）では、ビヒクル処置対照群（群12）と比較したとき、水消費又は体重に対する顕著な、又は統計的に有意の効果は生じなかった。
肝臓に対する処置関連の効果は記録されなかった。
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組織病理報告
組織病理学的検査は肝臓に限定した。試料１（液体）、試料２（噴霧乾燥樹液）、試料３（活性部分）、フェンフルラミン又はDMSO対照群について、処置関連の変化は検出されなかった。
記録された所見は対照群及び処置群において同様の発生率のものであった。
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実施例45
実施例44に記載されるものと同じ試験試料を用いる、さらなる生物検定を以下に記載する。この研究においては、動物に与える食餌を制限し、すなわち動物には毎日12:00〜3:00pmにのみ食餌を与えた。これは、食物がラットにとって自由に摂取可能であった、これまでに実施された他の全ての生物学的検定とは異なる。動物を７日間（第−７日〜第−１日）にわたって順化し、投与を第０日〜第６日の9:00amに経口強制給餌によって行った。回復期間は第７日〜第13日であった。投与群を下記表１に記載する。実際の対照群は群09と表示されていることに注意すべきである。群５は群４と等しい食餌を受けた制御群である。この群の目的は、動物の肝臓に対する、食餌の制限が有する効果を評価することであった。
結果
この研究の間に生じた結果は順化期間が短すぎたことを示した。主として夜間に給餌されていたラットを、餌の摂取を日中の３時間に制限するように突然変更した結果、１日摂取量が減少した。餌の１日摂取量は、ほとんどの群において、試験物品の投与を開始した順化期間の最後でも依然として増加していた。この結果、試験物質の効果は投与期間にラットの食物摂取量に有意に影響を及ぼすことがなかった。
異なる群についての第−７日〜第−１日及び第０日〜第６日の平均体重を表D1及び表D2に示す。樹液及び噴霧乾燥樹液の異なる投与量の効果は、添付のグラフに、第０日〜第７日の体重の変化％（図５）及び第−７日〜第７日の体重の変化％（図６）として示す。体重の減少は、特に高投与量で、明らかに用量に関連する。
肝臓の組織病理学的検査では、試験物品を投与した群でいかなる有意の病理も示されなかった。
食物
順化の間及びこの研究の間、食物の消費を毎日測定した。食物は、１日に、12:00から始まって15:00に終了する３時間の給餌期間に摂取可能であった。残りの時間にはこれらの動物を絶食させた。群５の動物には、群４の第０日の平均食物消費に等しい、測定された量の食物を第１日に給餌した。群５に対する、前日の群４の平均食物消費から決定されるこの制御給餌パターンは、第１日〜第７日まで続けた。
水
水は標準容器で与えた。水（Magalies Water Board Tap Water、ヒトの消費に適する）は自由に摂取可能であった。水の消費は１日１回、毎日同じ時間に、食物消費の測定後に測定した。
順化
この研究を開始する前にこれらの動物を７日間順化し、この間の食物及び水の消費を上述の通りに測定した。この間、体重を毎日測定した。
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投与径路
試験物品は、７日間毎日、胃内針を用いて投与した。（09:00から始まる）この物品投与の前18時間は動物を絶食させた。
処置の持続期間
動物を連続する７日間（第０日〜第６日）処置した。各群のうちの３匹の動物を最後の投与の24時間後（第７日）に犠牲にした。残りの３匹の動物は最後の処置の７日後（第13日）に犠牲にした。群５を除く全ての群でこの手順に従い、群５では３匹の動物を最後の制御給餌の24時間後（第８日）に犠牲にし、残りの３匹の動物は最後の処置の７日後（第13日）に犠牲にした。
体重
体重は毎日、各々の日でほぼ同じ時間に、順化期間を含めて研究が持続する間測定した。
安楽死
各群のうちの３匹は最後の投与の24時間後（第７日）に犠牲にした。
残りの３匹の動物は最後の処置の７日後に犠牲にした。群５を除く全ての群でこの手順に従い、群５では３匹の動物を最後の制御給餌の24時間後（第８日）に犠牲にし、残りの３匹の動物は最後の処置の７日後（第13日）に犠牲にした。研究期間の最後に動物をCO2ガスで安楽死させた。
検眼鏡検査
検眼鏡を用いる検眼鏡検査を、試験物品の最初の投与の前及び終了時に、全ての群の全ての動物で行った。
巨視的病理
研究期間の最後に安楽死させた全ての動物に対して完全な死後検査を行った。
組織病理
各々の動物の肝臓に対して組織病理学的検査を行った。
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噴霧乾燥樹液に加えて凍結樹液を給餌された実験ラットからの肝臓切片においては特別な病変は記録されず、これは上記化学物質を経口投与したためであると考えることができた。対照及び実験ラットの両者において記録された水症性細胞膨潤は、正常代謝細胞の膨潤及び無酸素変化を示すものであり得る。リンパ性血管周囲カフィングの微細病変が幾らかの動物において見出されたが、これはおそらくは偶発的な観察である。数匹のラットにおいて、軽度の鬱血が肝類洞に存在しているが、これは偶発的な観察と見なすべきである。
この研究の結果によって示される本発明の重要な特徴は、いかなる試料に対する寛容も試験期間を通して出現しなかったことである。これは、特に、肥満の治療における本発明の化合物及び組成物の使用に関して、多大な利益を提供し得る。
本発明の化合物及び組成物を、主として、それらの食欲抑制剤としての特性に関連して記載してきたが、この表現−“食欲抑制剤”−は、ここでは、食欲を制限し、及び／又は満腹感を増進させる傾向にあり、したがって、総カロリー摂取量を減少させる傾向にある（これが、次に、肥満を相殺する傾向にある）活性を示すのに用いられることに注意すべきである。したがって、本発明は、ヒト又は非ヒト動物において肥満を治療し、予防し、又はそれと闘う方法であって、該ヒト又は非ヒト動物に、肥満治療、予防又は闘争量の式（２）の化合物を投与することを含む方法に及ぶ。本発明のこの面での好ましい態様では、式（１）の化合物を含む組成物又は抽出物が用いられる。
“動物”という用語は、ここで用いられる場合、コンパニオン・アニマル、例えば、家庭用ペット及び家畜に及ぶが、これらに限定されるものではない；このような動物の非限定的な例には、ウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ラクダ、ウマ、家禽、魚、ウサギ、ヤギ、イヌ及びネコが含まれる。
食欲抑制剤として、又はヒトにおける肥満の治療もしくは予防においては、式（２）の化合物、好ましくは式（１）の化合物、又は以下の請求項９及び25〜31のいずれか１項に定義される組成物を、そのヒトに、約0.01mg/kg/日〜約10mg/kg/日の投与量で投与することが有利である。好ましい投与量範囲は0.05mg/kg/日〜0.5mg/kg/日である。本発明の抽出物の噴霧乾燥粉末形態を用いる場合には、好ましい投与用範囲は0.1mg/kg/日〜20mg/kg/日であり；特に好ましいのは0.5mg/kg/日〜5mg/kg/日である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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