(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）  ：
【化１】
0003547834.tif 000004
で表される化合物４６０Ａ。
【請求項２】
アスペルギルス属に属する、下記式（１）  ：
【化２】
0003547834.tif 000005
で表される化合物４６０Ａ生産能を有する微生物を培地に培養し、該培養物から化合物４６０Ａを採取することを特徴とする、化合物４６０Ａの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規な化合物４６０Ａ及び該化合物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、アスペルギルス・ヤポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２（３），  ｐｐ．５２３〜５２８  （１９７８）参照）、マイセリオフトラ・サーモフィーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、特公平５−８８７１０  号公報参照）、ペニシリウム・シトリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｕｍ  、日本農芸化学会誌，１９９４  年度大会講演要旨，  ｐ．５３４  参照）、クロムロスポリウム・ファルバム（Ｃｈｒｏｍｅｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４７（９），  ｐｐ．１０６５〜１０６８  （１９９４）  参照）などがそれぞれ異なるチオールプロテアーゼ阻害物質を生産することが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来知られていない、優れたチオールプロテアーゼ阻害活性を有する物質及び該物質の製造法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため種々検討を重ねた結果、アスペルギルス属に属する微生物が、従来公知のチオールプロテアーゼ阻害物質とは全く異なる新規な物質（以下化合物４６０Ａと称する）を生産することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記式（１）  ：
【０００５】
【化３】
0003547834.tif 000002
【０００６】
で表される化合物４６０Ａを提供する。
また、本発明は、アスペルギルス属に属する、上記式（１）  で表される化合物４６０Ａ生産能を有する微生物を培地に培養し、該培養物から化合物４６０Ａを採取することを特徴とする、化合物４６０Ａの製造法を提供する。
【０００７】
化合物４６０Ａ
以下、本発明による化合物４６０Ａの理化学的性質について説明する。
【０００８】
１．外観
白色粉末
【０００９】
２．質量分析値
陽イオンＦＡＢＭＳスペクトル：  ｍ／ｚ  ３７３（Ｍ＋Ｈ）＋  
陽イオンＦＡＢＭＳスペクトル：  ｍ／ｚ  ３９５（Ｍ＋Ｎａ）＋  
陰イオンＦＡＢＭＳスペクトル：  ｍ／ｚ  ３７１（Ｍ−Ｈ）−  
陽イオン高分解能ＳＩＭＳスペクトル：ｍ／ｚ  ３７３．２４５６（Ｍ＋Ｈ）＋  
【００１０】
３．分子量
３７２
【００１１】
４．ＵＶ吸収スペクトル
水溶液で測定した結果、末端吸収を示す。
【００１２】
５．ＩＲ吸収スペクトル
ＫＢｒ錠中で測定したＩＲスペクトルを図１に示す。
【００１３】
６．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
重水中５００ＭＨｚで測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。
【００１４】
７．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル
重水中１２５ＭＨｚで測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
【００１５】
８．溶解性
水、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、アセトン及びアセトニトリルに易溶；
酢酸エチル及びクロロホルムに不溶。
【００１６】
９．呈色反応
陽性：ライドン−スミス、ニンヒドリン
陰性：坂口、アンスロン
【００１７】
１０．構成アミノ酸
常法により６Ｎ塩酸を用いて加水分解を行い、アミノ酸自動分析計にてアミノ酸分析を行うことにより、イソロイシンを検出した。
【００１８】
１１．薄層クロマトグラフィー
Ｍｅｒｃｋ社  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０使用
展開溶剤；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：１：１
Ｒｆ＝０．１０
【００１９】
次に化合物４６０Ａ並びに、これに類似していると思われる公知のチオールプロテアーゼ阻害物質の化学構造式（対照１〜４）を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0003547834.tif 000003
【００２１】
表１に示すように、これらのチオールプロテアーゼ阻害物質はいずれも、中央がアミノ酸成分からなり、その両端に異なる２つの化合物が結合した、３つの構成成分からなることがわかる。また、表１から明らかなように、本発明の化合物４６０Ａは、クロムロスポリウム・ファルバムから産生する物質（対照１、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４７（９），  ｐｐ．１０６５〜１０６８  （１９９４）  参照）、マイセリオフトラ・サーモフィラから産生する物質（対照２、特公平５−８８７１０  号公報参照）、ペニシリウム・シトリウムから産生する物質（対照３、日本農芸化学会誌，１９９４  年度大会講演要旨，  ｐ．５３４  参照）、及びアスペルギルス・ヤポニカスから産生する物質（対照４、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２（３），  ｐｐ．５２３〜５２８  （１９７８）参照）と比較すると、それぞれ３つの構成成分のうち左端の構成成分は同一であるが、中央のアミノ酸及び右端の構成成分が異なる。
【００２２】
このように、本発明の化合物４６０Ａは、従来から知られているアスペルギルス属及びその他の属に属する微生物より得られた物質とは構造上全く異なる新規な化合物である。
【００２３】
製造方法
次に本発明による化合物４６０Ａの製造法について具体的に説明する。
本発明において使用する微生物は、アスペルギルス属に属し、化合物４６０Ａ生産能を有する菌株であればいずれのものでもよく、その具体例としては、アスペルギスル・オリゼー  （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０３８６、アスペルギスル・オリゼーＡＴＣＣ２２７８８  、アスペルギスル・オリゼーＩＡＭ２７２０  、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ４２２４９  、アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ２０２４５  、アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ１１９０６  等の公知の菌株を挙げることができ、その変種あるいは変異株も用いることができる。
【００２４】
培養方法は原則的には糸状菌の培養法に準じ、固体培養法（製麹法）、液体培養法により行われる。
【００２５】
培養に用いられる培地としてはアスペルギルス属に属する菌株が化合物４６０Ａを生産し得るものであればいずれを用いてもよく、合成培地、半合成培地又は天然培地が用いられる。
【００２６】
合成培地の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトース、グリセリン、スターチ、デキストリンなどが用いられ、合成培地の窒素源としては、硫安、硝安などが用いられる。また天然培地の組成としては、炭素源として米、ふすま、小麦などが挙げられ、窒素源としてスキムミルク、大豆粉、脱脂大豆粉、グルテン、ペプトン、肉エキス、カゼイン、大豆ミール、コーンステープリカーなどが挙げられる。
【００２７】
また、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の適当な無機塩類、ビタミンＢ、パントテン酸カルシウム等のビタミン類を適宜使用することができ、さらに必要に応じて菌の生育に必要な各種の有機物、無機物などを培地に添加使用することができる。
これらの原料は、必要により２種以上を併用しても良い。
培養は、好気的に行われ、静置、振盪、通気培養などいずれを用いてもよい。
【００２８】
上記適当な天然培地を用いて固体培養を行う場合は、例えば、通常のふすま麹、米麹、醤油麹などの麹の製造法に従って、ふすま、米、脱脂大豆もしくは割砕小麦又はこれらの２種以上を適宜組合わせたものに、必要に応じて適当な栄養源を添加し、次いで加水して適当な吸水を行った後、蒸煮等の加熱変性を行い、放冷することにより得られた固体培地に、種菌を接種して培養を行う。培養温度は、通常、２５〜３７℃であり、２〜６日間で培養を終了する。
【００２９】
こうして得られた固体培養物から化合物４６０Ａを得るには、該培養物に、水を３〜８容量倍添加して撹拌し、１時間〜２日間抽出を行った後、圧搾、濾過又は遠心分離などにより固液を分離して、化合物４６０Ａを含有する液体を分離する。なお、固液分離に際して、セライト等の濾過助剤を添加使用することが好ましい。
【００３０】
また適当な天然培地を用いて液体培養を行う場合は、例えば、水に対し米粉、又はふすまを２〜２０重量％、好ましくは５〜１０重量％添加し加熱変性を行うことにより得られた液体培地に、種菌を接種して培養を行う。培養温度は、通常、２５〜３７℃であり、２〜６日間で培養を終了する。
【００３１】
こうして得られた液体培養物から、化合物４６０Ａを得るには、化合物４６０Ａは主としてその液状部分に存在するので、該培養物を圧搾、濾過、又は遠心分離などにより固液を分離して、化合物４６０Ａを含有する液体を分離し、該液体から目的とする物質を採取する。
【００３２】
上記の如き方法により得られた化合物４６０Ａ含有液から化合物４６０Ａを精製するには、化合物４６０Ａの化学的特性に基づき種々の方法を適当に組合わせて、又は反復することによって容易に行い得る。
【００３３】
即ち、例えばエタノール、アセトンなどを使用する有機溶媒沈殿法、硫酸アンモニウムなどの塩類を用いる塩析法、熱処理法などによる高分子物質画分除去法、活性炭、セパビーズＳＰ８２５（三菱化成社製）などの非イオン性吸着樹脂による吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過担体によるゲル濾過クロマトグラフィー、セルロース等による分配クロマトグラフィー、アルキル基結合シリカゲルによる逆相分配クロマトグラフィー等通常の有機物質を分離精製する手段を適宜組合わせて又は反復して精製し、化合物４６０Ａを得ることができる。これら以外にも化合物４６０Ａの特性に基づいた精製手段がすべて適宜に使用できることは言う迄もない。
【００３４】
本発明の化合物４６０Ａは、パパイン、カテプシンＢなどのチオールプロテアーゼに対して優れた阻害活性を示す。従って、この化合物４６０Ａは、水産練製品工業において有用である。例えば、従来食品加工原料としては全く利用価値のなかった胞子虫寄生魚肉、いわゆるジェリーミートを有する魚肉でも、本発明の化合物４６０Ａを利用することにより、チオールプロテアーゼに由来する肉軟化作用を防止し、胞子虫の寄生のない通常の魚肉を用いたのと同様の生又は冷凍魚肉すり身を製造することが可能となる。また、化合物４６０Ａは、一般に医薬品工業においても有用である。即ち、チオプロテアーゼ阻害剤は、特にカルシウム依存性中性プロテアーゼ活性を抑制すると言われていることから、本発明の化合物４６０Ａは、筋ジストロフィー、或いは白内障の治療薬としても期待される。
【００３５】
【実施例】
実施例１
化合物４６０Ａの製造
固体培養による製造
（１）微生物
アスペルギルス・オリゼーＡＴＣＣ２０３８６
（２）固体栄養培地の組成
小麦ふすま      ４０キログラム
ｐＨ                無調整
（３）培養
小麦ふすま４０キログラムに、水道水７０％（重量）を均一に撒水して１２１℃で６０分間蒸煮したものに、アスペルギルス・オリゼーＡＴＣＣ２０３８６  を接種し、３０℃で４日間培養し、ふすま麹を得た。
【００３６】
（４）水抽出液の調製
上記ふすま麹に５容量倍の水道水を加えて室温で１２時間攪拌した。得られた処理物について、濾過助剤としてセライトを使用して濾過により固液分離した。
得られた濾液を非イオン性吸着樹脂セパビーズ  ＳＰ８２５（三菱化成社製）３０リットルを充填したカラムに吸着させ、水洗後３０％エタノール水溶液１７０リットルにて溶出した。
【００３７】
得られた溶出液を２３３０ｍｌに減圧濃縮し、この濃縮液のｐＨを塩酸で３．０に調整した後、９３２０ｍｌのエタノールを加えて撹拌し、３０分間放置した。次いで、不溶物を遠心分離で除去し、得られた上澄み液を１２３０ｍｌに減圧濃縮し、濃縮液のｐＨを水酸化ナトリウムで７．０に調整した。これをアルキル基結合シリカゲル  ＹＭＣ  ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０（ワイエムシー社製）２．３リットルを充填したカラムに７回に分けて吸着させ、水洗後アセトニトリル濃度０〜２０％の間で直線的に濃度を変えて溶出する逆相分配クロマトグラフィーを繰り返し、得られた活性画分を集めて１７２ｍｌに減圧濃縮した。
【００３８】
これを、ゲル濾過担体バイオゲル  Ｐ−２（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ製）２リットルを０．１ＭのＮａＣｌ水溶液に懸濁して充填したカラムに５回に分けて注ぎ、０．１ＭのＮａＣｌ水溶液で展開するゲル濾過クロマトグラフィーを繰り返し、得られた活性画分を集めて３２ｍｌに減圧濃縮した。これを１０回に分けて高速液体クロマトグラフィー用分取逆相カラムＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＳＧ１２０  ２０×２５０  ｍｍ（資生堂社製）に付し、水洗後アセトニトリル濃度０〜１５％の間で直線的に濃度を変えて溶出することを繰り返し、得られた活性画分を集めて１５ｍｌに減圧濃縮した。
【００３９】
これに等量のアセトニトリルを加えた溶液を６回に分けて高速液体クロマトグラフィー用分取順相カラム  ＴＳＫ  ＧＥＬ  Ａｍｉｄｅ８０    ２１．５×３００ｍｍ  （東ソー社製）に付し、水：アセトニトリル＝１：１で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）：アセトニトリル＝１：１で溶出することを繰り返し、得られた活性画分を集めて２８．５ｍｌに減圧濃縮した。
【００４０】
これを２回に分けて高速液体クロマトグラフィー用分取逆相カラムＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＳＧ１２０  ２０×２５０ｍｍ  （資生堂社製）に付し、水洗後アセトニトリル濃度０〜５％の間で直線的に濃度を変えて溶出することを繰り返し、得られた活性画分を集めて減圧乾固し、精製された目的化合物を１０６．６ｍｇ得た。
【００４１】
実施例２
チオールプロテアーゼ（パパイン）に対する阻害活性試験
実施例１で製造した化合物４６０Ａを用いてチオールプロテアーゼ（パパイン）に対する阻害活性を調べた。各種濃度に調製した化合物４６０Ａ、パパイン（チオールプロテアーゼ力価２０００ｕｎｉｔｓ）、システイン（０．２４２ｍｇ）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ  （０．３７２ｍｇ）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０  １ｍｌを３７℃で１０分間プレインキュベートし、次に２％アゾカゼイン（基質）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを加えて反応を開始した。
【００４２】
３７℃で１５分間反応させた後、０．４Ｍトリクロロ酢酸２ｍｌを加えて反応を停止させ、パパインにより加水分解されたアゾカゼイン量を調べるために、トリクロロ酢酸可溶画分の４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、対照液との比較により、阻害活性の指標となるＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値を求めた。その結果、本発明の化合物４６０ＡのＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値は０．１１６  であった。
尚、ＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値は、上記の測定法において、酵素活性を５０％阻害し得る酵素阻害物質の重量を意味する。したがって、この数値が低い程阻害活性が強いものとなる。
【００４３】
比較例１
チオールプロテアーゼ活性阻害物質として知られ、市販されている「Ｅ６４」（ペプチド研究所社販売）について、実施例２と同様の方法でＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値を測定したところ、０．１４３  であった。尚、この「Ｅ６４」は、アスペルギルス・ヤポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ）を利用して得られることが記載されている（表１の対照４、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２（３），  ｐｐ．５２３−５２８  （１９７８）  参照）。
【００４４】
以上の結果から、本発明の化合物４６０Ａは、チオールプロテアーゼ（パパイン）に対し、従来公知のチオールプロテアーゼ活性阻害物質と比べて優れた阻害活性を有するということが確認された。
【００４５】
実施例３
チオールプロテアーゼ（カテプシンＢ）に対する阻害活性試験
実施例１で製造した化合物４６０Ａを用いてチオールプロテアーゼ（カテプシンＢ）に対する阻害活性を調べた。各種濃度に調製した化合物４６０Ａ、８ｍＭのシステインと、４ｍＭのＥＤＴＡを含む０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．２５ｍｌにカテプシンＢ（チオールプロテアーゼ力価０．０６ｕｎｉｔ）を含む０．１％ブリジ３５水溶液０．５ｍｌを加え、４０℃で２分間プレインキュベートし、次にＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＮｅｃ（基質）を加え、４０℃で９０秒間反応させた後、１ｍｌの０．１Ｍモノクロロ酢酸ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）を加えて反応を停止させた。
その後、遊離のアミノメチルクマリン量を蛍光光度計にて測定し、阻害活性の指標となるＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値を求めた。
その結果、本発明の化合物４６０ＡのＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値は０．３９７  であった。
【００４６】
比較例２
比較例１で使用した「Ｅ６４」について、実施例３と同様の方法でＩＤ５０（μｇ／ｔｕｂｅ）値を測定したところ、０．５６８  であった。
【００４７】
以上の結果から、本発明の化合物４６０Ａは、チオールプロテアーゼ（カテプシンＢ）に対し、従来公知のチオールプロテアーゼ活性阻害物質と比べて優れた阻害活性を有するということが確認された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の新規化合物４６０Ａは、パパイン、カテプシンＢなどのチオールプロテアーゼに対し優れた阻害活性を示す。従って、該化合物は、例えば、水産練製品工業や、医薬品工業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により得られる化合物４６０ＡのＩＲ吸収スペクトル（ＫＢｒ錠中で測定）を示す。
【図２】同化合物４６０Ａの  １Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重水中５００ＭＨｚで測定）を示す。
【図３】同化合物４６０Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重水中１２５ＭＨｚで測定）を示す。
【図１】
0003547834.tif 000006
【図２】
0003547834.tif 000007
【図３】
0003547834.tif 000008