【手続補正書】
【提出日】平成29年9月22日(2017.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアを通って移動するように接触させるステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取り、それにより前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの数または位置（１個もしくは複数）を決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの数または位置を決定するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１個、２個、３個または４個のアミノ酸によって分離されている、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの数または位置を決定するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１個または複数のＰＴＭが、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化、ビオチン化およびペグ化から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）疎水性基での前記修飾が、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化およびグリピエーションから選択され；
（ｂ）補因子での前記修飾が、リポイル化、フラビネーション、ヘムＣの付着、ホスホパンテテイニル化およびレチニリデンシッフ塩基形成から選択され；
（ｃ）化学基の前記付加が、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、アミド化、ブチル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ポリシアル酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ブロム化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、ＡＤＰリボシル化、酸化、リン酸化、アデニリル化、プロピノイル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、ＳＵＭＯ化；Ｓ−ニトロシル化、リジンへのサクシニル基のサクシニル化付加およびセレノイル化およびユビキニル化から選択される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１個もしくは複数のＰＴＭが１個もしくは複数のリン酸化である、または前記２個以上のＰＴＭが２個以上のリン酸化である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）における前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記膜にカップリングしている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、コレステロールを使用して前記膜にカップリングしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポア、固体ポアまたはハイブリッド膜固体ポアである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通タンパク質ポアが、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）、ＯＭＰおよびＷｚａ由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号２に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す４個の同一のサブユニットおよび配列番号６に示す４個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、または（ｂ）前記サブユニットの１個または複数が配列番号４に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、および／または前記サブユニットの１個または複数が配列番号６に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、前記ポアがポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記膜貫通タンパク質が（ａ）配列番号８に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号８に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数の異常なＰＴＭに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む前記生物由来の試料に対して請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭの数または位置（１個もしくは複数）を決定し、それにより前記生物が前記疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記生物が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するための、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ）症候群またはＸ連鎖筋細管ミオパチーである、請求項１５または１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
考察
ＤＮＡリーダー配列を伴ったモデルタンパク質がαＨＬポアを通って移行でき、同時にアンフォールドされ、特徴的なイオン電流サインを提供する３７という本発明者らの初期の発見に基づいて、本発明者らは、側鎖リン酸化、重要なＰＴＭを電流サインにおける変化を通じて単一分子レベルで検出できることをいまや見出している。注目すべきことに、タンパク質中の異なる場所でのリン酸化が異なるサインを生じ、修飾部位間の迅速な識別を可能にする。本発明者らは、２個の隣接部位（１残基によって分離されている）のリン酸化状態：すなわち、非リン酸化状態、２個の一リン酸化状態および二重リン酸化状態、を識別でき、定量できることも示している。２個の隣接部位の１個でのタンパク質一リン酸化は、ＭＳによって識別することが特に困難であり、本発明者らは、単一のポリペプチド鎖内のリン酸化部位の占有率および結合性は、ナノポア手法に理想的にふさわしい課題であることを示唆している。
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本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアを通って移動するように接触させるステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取り、それにより前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定するステップ
を含む方法。
［２］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの存在、非存在、数または位置を決定するためである、上記［１］に記載の方法。
［３］
１個、２個、３個または４個のアミノ酸によって分離されている、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの存在、非存在、数または位置を決定するためである、上記［１］に記載の方法。
［４］
前記１個または複数のＰＴＭが、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化、ビオチン化およびペグ化から選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［５］
（ａ）疎水性基での前記修飾が、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化およびグリピエーションから選択され；
（ｂ）補因子での前記修飾が、リポイル化、フラビネーション、ヘムＣの付着、ホスホパンテテイニル化およびレチニリデンシッフ塩基形成から選択され；
（ｃ）化学基の前記付加が、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、アミド化、ブチル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ポリシアル酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ブロム化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、ＡＤＰリボシル化、酸化、リン酸化、アデニリル化、プロピノイル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、ＳＵＭＯ化；Ｓ−ニトロシル化、リジンへのサクシニル基のサクシニル化付加およびセレノイル化およびユビキニル化から選択される、
上記［４］に記載の方法。
［６］
前記１個もしくは複数のＰＴＭが１個もしくは複数のリン酸化である、または前記２個以上のＰＴＭが２個以上のリン酸化である、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
ステップ（ａ）における前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記膜にカップリングしている、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、コレステロールを使用して前記膜にカップリングしている、上記［８］に記載の方法。
［１０］
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポア、固体ポアまたはハイブリッド膜固体ポアである、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記膜貫通タンパク質ポアが、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）、ＯＭＰおよびＷｚａ由来である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号２に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す４個の同一のサブユニットおよび配列番号６に示す４個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、または（ｂ）前記サブユニットの１個または複数が配列番号４に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、および／または前記サブユニットの１個または複数が配列番号６に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、前記ポアがポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１４］
前記膜貫通タンパク質が（ａ）配列番号８に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号８に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１５］
生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数の異常なＰＴＭに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む前記生物由来の試料に対して上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭが存在するかどうかを決定し、それにより前記生物が疾患、前記障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［１６］
前記生物が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するための、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
前記疾患または障害が、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ）症候群またはＸ連鎖筋細管ミオパチーである、上記［１５］または［１６］に記載の方法。