【手続補正書】
【提出日】平成29年3月10日(2017.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、前記細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法。
【請求項２】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法。
【請求項３】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を強化する方法であって、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程を含み、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養することに比較して前記哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量が強化される方法。
【請求項４】
インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞から生成されたベバシズマブもしくはその断片の量がインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して強化される方法。
【請求項５】
細胞培養培地が銅及びインスリン；銅及びシスチン；インスリン及びシスチン；又は銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約５０．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約３５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約２５．０ｍｇ／Ｌ；又は約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養培地が約６９ｎＭ〜約１，０００ｎＭ；約３２５ｎＭ〜約３７５ｎＭ；約３２５ｎＭ〜約３５０ｎＭ；又は、約３３０ｎＭ、約３３５ｎＭ、約３３９ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３４５ｎＭもしくは約３５０ｎＭのうちの何れか１つの濃度で銅を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養培地が約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭ；約１．０ｍＭ〜約１．６ｍＭ；約１．２ｍＭ〜約１．４ｍＭ；又は、約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回；少なくとも３回；又は少なくとも６回前記細胞培養培地に加えられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約５０．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約３５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約２５．０ｍｇ／Ｌ；又は約１５ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
システインが、細胞培養培地中に約０．５〜約２．０ｍＭ、又は約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１〜約１．５ｍＭのシスチン、又は約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、約２８℃〜約３７℃、又は約３１℃〜約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ベバシズマブもしくはその断片を、細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞が、細胞の増殖期中に、又は細胞の産生期中に細胞培養培地と接触させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、成分（ｉ）から（ｉｉｉ）：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；（ｉｉ）約６９．０ｎＭ〜約１，０００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭのシスチンのうちの少なくとも２つを含む、細胞培養培地。
【請求項２３】
細胞培養培地が、
（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン及び（ｉｉ）約６９．０ｎＭ〜約１，０００．０ｎＭの銅を含むか；
（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭのシスチンを含むか；又は
（ｉｉ）約６９．０ｎＭ〜約１，０００．０ｎＭの銅及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭのシスチンを含む、請求項２２に記載の細胞培養培地。
【請求項２４】
細胞培養培地が、
約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約５０．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約３５．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約２５．０ｍｇ／Ｌ；及び
約１０．０ｍｇ／Ｌ
から成る群から選択される濃度にあるインスリンを含む、請求項２２又は２３に記載の細胞培養培地。
【請求項２５】
細胞培養培地が、
約６９ｎＭ〜約１，０００ｎＭ；
約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ；
約３２５ｎＭ〜約３７５ｎＭ；
約３２５ｎＭ〜約３５０ｎＭ；
約３３０ｎＭ、約３３５ｎＭ、約３３９ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３４５ｎＭもしくは約３５０ｎＭのうちの何れか１つ；及び
約３３９ｎＭから成る群から選択される濃度にある銅を含む、請求項２２から２４の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２６】
細胞培養培地が、
約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭ；
約１．０ｍＭ〜約２．０ｍＭ；
約１．０ｍＭ〜約１．６ｍＭ；
約１．２ｍＭ〜約１．４ｍＭ；及び
約１．３ｍＭ
から成る群から選択される濃度にあるシスチンを含む、請求項２２から２５の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７】
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）請求項２２から２６の何れか一項に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
【請求項２８】
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）請求項２２から２６の何れか一項に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
【請求項２９】
ベバシズマブもしくはその断片が、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞によって培地中に分泌される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地が約６９ｎＭ〜約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ〜約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する、方法。
【請求項３１】
初期細胞培養培地が（１）銅及びインスリン；（２）銅及びシスチン；（３）インスリン及びシスチン；又は（４）銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
初期細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約５０．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ〜約２０．０ｍｇ／Ｌ；又は、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１５ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ及び約２５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度でインスリンを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
初期細胞培養培地が約３２５ｎＭ〜約３７５ｎＭ；約３２５ｎＭ〜約３５０ｎＭ；又は約３３０ｎＭ、約３３５ｎＭ、約３３９ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３４５ｎＭ及び約３５０ｎＭのうちの何れか１つの濃度で銅を含む、請求項３０から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
初期細胞培養培地が約０．７ｍＭ〜約２．０ｍＭ；約１．０ｍＭ〜約１．６ｍＭ；又は約１．０ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ及び約１．６ｍＭのうちの何れか１つの濃度でシスチンを含む、請求項３０から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
初期細胞培養培地がインスリンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項３０から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
各時点に加えられるインスリンが、約５ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌ；又は約５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約１５ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ及び約２５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量が、約２０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ；又は、約２０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約３５ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ、約４５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約５５ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約６５ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ及び約８５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つである、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
初期細胞培養培地がシスチンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のシスチンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項３０から３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１〜約１．５ｍＭ；約０．４〜約０．７ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
シスチンが細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
方法が、細胞培養サイクル中に少なくとも１バッチフィードをさらに含む、請求項３０から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
方法が、細胞培養サイクル中に２、３もしくは４バッチフィードを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞培養サイクル中に、培地の温度が、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる、請求項３０から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
培地の温度が、細胞培養サイクル中に少なくとも１回又は少なくとも２回低下させられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
温度が、培養の開始後の第８日及び第１０日に低下させられる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞が、約３１℃〜約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項３０から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、約７．０〜約７．３のｐＨを有する培地中で培養される、請求項３０から４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
方法が、（ａ）約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約３２５ｎＭ〜約３５０ｎＭの銅及び約１．３ｍＭのシスチンを含む初期細胞培養培地中で細胞を培養する工程；（ｂ）培養の開始後の第３日に約１５ｍｇ／Ｌの濃度の追加のインスリンを提供するために細胞培養培地に第１バッチフィード及びインスリンフィードを提供する工程；及び（ｃ）培養の開始後の第６日に約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭの濃度の追加のシスチンを提供するために細胞培養培地にシスチンを含む第２バッチフィードを提供する工程を含み、このとき細胞は約３５℃の初期温度で培養され、温度は第８日に約３３℃へ低下させられ、培養の開始後の第１０日に約３１℃へさらに低下させられる、請求項３０から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項３０から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項３０から５１の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３０から５２の何れか一項に記載の方法。