【手続補正書】
【提出日】平成29年11月13日(2017.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体の富化方法であって、前記核酸は単一のヌクレオチド位置で異なる、２種の変異体配列の形で存在し：
前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体中に低存在量でサンプルに存在し；
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、
そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し；そして、
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し、そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を回収すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示されるような、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらの類似体（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
【請求項２】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、前記他の変体が野生型対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異対立遺伝子を増幅し、そして検出する工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異対立遺伝子の検出方法であって、前記変異対立遺伝子が単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そし大過剰の野生型対立遺伝子中に低存在量でサンプルに存在し：
前記サンプル中の変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化が、
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、変異対立遺伝子と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして野生型対立遺伝子とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して結合することができるミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に給し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記野生型対立遺伝子の変性された一本鎖を除去し；
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し；そして標的核酸の富化された変異対立遺伝子の一本鎖を含む緩衝液を回収すること
により実施され；そして、
富化された変異対立遺伝子の生成物、又はその増幅された富化変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示されるような、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらの類似体（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
【請求項６】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程が、対立遺伝子特異的プライマーにより実施される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するための反応混合物であって、
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる２種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示されるような、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらの類似体（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、反応混合物。
【請求項９】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するためのキットであって、
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる２種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示されるような、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらの類似体（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、キット。