(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）フィブリノーゲンまたはフィブリン接着剤である組織シーラントと、
（ii）補充成長因子
とを含有する液体組成物であって、フィブリノーゲン濃度が４−135mg/mlであり、傷への適用後に該液体組成物の凝固物が形成された後、該組成物から該組成物の外側の部位へと成長因子を到達させることを特徴とする、傷の治癒を促進するための液体組成物。
【請求項２】
（ｉ）フィブリノーゲンを得ること、
（ii）トロンビンとフィブリノーゲンを混合すること、および
（iii）該トロンビンと該フィブリノーゲンとの凝固物形成の前に、補充成長因子を（ａ）該フィブリノーゲン、および／または（ｂ）該トロンビン、および／または（ｃ）該トロンビンとフィブリノーゲンとの混合物と混合すること、を含む方法で得られることを特徴とする、請求項１記載の液体組成物。
【請求項３】
フィブリノーゲンをフィブリノーゲン濃度４−135mg/mlで含有する＿、請求項２記載の液体組成物。
【請求項４】
フィブリノーゲン濃度が６−30mg/mlである＿、請求項３記載の液体組成物。
【請求項５】
フィブリノーゲン濃度が15−25mg/mlである＿、請求項４記載の液体組成物。
【請求項６】
（ｉ）フィブリノーゲンまたはフィブリン接着剤である組織シーラント（ここに、フィブリノーゲンの濃度は６−30mg/mlである）、
（ii）トロンビン、および
（iii）補充成長因子
を含有する液体組成物であって、該液体組成物の傷への適用後に該組成物の凝固物が形成された後、該組成物から該組成物の外側の部位へと補充成長因子を到達させることを特徴とする、傷の治癒を促進するための液体組成物。
【請求項７】
（ｉ）フィブリノーゲンを得ること、
（ii）トロンビンとフィブリノーゲンを混合すること、および
（iii）該トロンビンと該フィブリノーゲンとの凝固物形成の前に、補充成長因子を（ａ）該フィブリノーゲン、および／または（ｂ）該トロンビン、および／または（ｃ）該トロンビンとフィブリノーゲンとの混合物と混合すること、を含む方法で調製されることを特徴とする、請求項１記載の液体組成物。
【請求項８】
（ｉ）フィブリノーゲンを初期濃度４−135mg/mlで含有するフィブリノーゲン溶液、
（ii）トロンビン含有溶液、及び
（iii）補充成長因子
を含む組織シーラントを含有する液体組成物であって、該トロンビン溶液の容量は、適用後組織シーラントが凝固する量であり、かつ凝固した組織シーラント中のフィブリノーゲンの濃度が、凝固した組織シーラントの外側の部位へと補充成長因子を到達させるものである、傷の治癒を促進するための液体組成物。
【請求項９】
凝固した組織シーラント中のフィブリノーゲンの濃度が細胞を凝固した組織シーラント中に移動させる濃度である、請求項８記載の液体組成物。
【請求項１０】
（ｉ）フィブリノーゲン濃度４−135mg/mlで含有するフィブリノーゲン溶液を得ること、
（ii）トロンビン含有溶液とフィブリノーゲン含有溶液を混合すること、および
（iii）補充成長因子を得ること、
ここに、該成長因子は（ａ）フィブリノーゲン含有溶液中に、および／または（ｂ）トロンビン含有溶液中に、および／または（ｃ）組織シーラントが凝固する前に、フィブリノーゲン含有溶液とトロンビン含有溶液の混合物中に補充されるものであり、該トロンビン溶液の容量は、適用後組織シーラントが凝固する量であり、かつ凝固した組織シーラント中のフィブリノーゲンの濃度が、凝固した組織シーラントの外側の部位へと補充成長因子を到達させるものである、傷の治癒を促進するための液体組成物。
【請求項１１】
凝固した組織シーラント中のフィブリノーゲンの濃度が細胞を凝固した組織シーラント中に移動させる濃度である、請求項10記載の液体組成物。
【請求項１２】
組織シーラントの成分の好ましくない活性であって、組織シーラント中の成長因子の生物学的活性を干渉または阻害する活性を阻害、干渉または破壊する阻害性化合物、および組織シーラント中の成長因子の生物学的活性を仲介するか、さもなくば増加する強化性化合物、からなる群から選択される化合物を含有する、請求項１〜11のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１３】
該成長因子が血小板由来成長因子（PDGF）、インシュリン−結合成長因子−１（IGF−１）、インシュリン−結合成長因子−２（IGF−２）、上皮成長因子（EGF）、形質転換成長因子−α（TGF−α）、形質転換成長因子−β（TGF−β）、血小板因子４（PF−４）、オステオゲニンおよび他の骨成長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１（HBGF−１）、ヘパリン結合成長因子−２（HBGF−２）および任意の該成長因子類の生物学的に活性な誘導体からなる群から選択されるものである、請求項１〜12のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１４】
該成長因子が血小板抽出物の形である、請求項１〜13のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１５】
該阻害性または強化性化合物がヘパリンである、請求項12に記載の液体組成物。
【請求項１６】
該傷が内部の傷である、請求項１〜15のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項１７】
該内部の傷が骨折である、請求項16に記載の液体組成物。
【請求項１８】
オステオゲニンを含有する、請求項17に記載の液体組成物。
【請求項１９】
該傷が外部の傷である、請求項１〜15のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項２０】
該外部の傷が皮膚の傷である、請求項19に記載の液体組成物。
【請求項２１】
血管移植片の移植に際し、周辺組織に、および／または周辺組織の上に、および／または周辺組織の中に適用されたとき、血管移植片の内皮形成を促進することにより血管移植片の移植を促進し、もって傷の治癒を促進するものである、請求項１〜15のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項２２】
生物材料の移植に際し、周辺組織に、および／または周辺組織の上に、および／または周辺組織の中に適用されたとき、生物材料の内皮形成を促進することにより生物材料の移植を促進し、もって傷の治癒を促進するものである、請求項１〜15のいずれかに記載の液体組成物。
【請求項２３】
該生物材料が整形外科器具である請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
該血管移植片または生物材料がポリテトラフルオロエチレンを含むものである、請求項21〜23のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
該ポリテトラフルオロエチレン血管移植片または生物材料が節間距離60μｍの孔を有するものである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
該内皮形成における細胞が内皮細胞である、請求項21または22に記載の組成物。
【請求項２７】
該内皮形成における細胞が線維芽細胞である、請求項21または22に記載の組成物。
【請求項２８】
補充成長因子が骨形態発生タンパク質である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項２９】
ヒト以外の動物の傷の治癒を促進する方法であって、請求項１〜15のいずれかに記載の液体組成物を傷に適用することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の前後参照
本願はここに引用して編入されている、米国特許出願第07/618,419号（1990年11月27日出願）の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明は、皮膚や骨等の加速された傷の治癒；血管プロテーゼの内皮形成；およびインビトロでの内皮細胞や線維芽細胞等の動物細胞の増殖および／または分化を促進する、成長因子を補充したフィブリン接着剤のような組織シーラントに関する。本発明はさらに、成長因子（類）が補充されたフィブリン接着剤と傷、血管プロテーゼおよびインビトロで培養されている細胞との長期的な接触を維持する方法を提供する。
発明の背景
傷の治癒、即ち病巣の回復は、傷のほぼ直後から始まる。それには様々な細胞の連続的な協同機能および分解および再生工程の緊密な制御が必要である。それにはフィブリン血餅の形成、血餅の吸収、および上皮形成が含まれる。傷の治癒には、夥しい数の毛細血管、多くの活性な線維芽細胞、および豊富なコラーゲン原繊維の形成が含まれるが、特定の皮膚構造の形成は伴わない。
傷治癒の工程は傷細胞から流出するトロンボプラスチンによって開始される。トロンボプラスチンは血漿の因子VIIと接触し因子Ｘ活性化因子を形成し、該活性化因子と因子Ｖとがりん脂質およびカルシウムと複合体化し、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンの触媒作用でフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡおよびＢが放出されてフィブリンモノマーが形成され、それらが凝集してフィブリンフィラメントを形成する。トロンビンはまたトランスグルタミナーゼ（因子XIII a）を活性化し、それはフィブリンフィラメントを共有結合的にクロスリンクするためのイソペプチド形成を触媒する。アルファ２ー抗プラスミンが次いで因子XIIIによってフィブリンフィラメントと結合し、それにより、血漿によるフィラメントの分解を防御する。
組織が傷付くと、生物学的活性の配置を示すポリペプチド成長因子が、それらが傷の治癒に重要な役割をする傷内に放出される（例、Hormonal Proteins and Peptides,Li,G.H.ed.,Volume 7,Academic Press,Inc.New York,pp.251−277ブラントら（Brunt et al.）,Biotechnology 6:25−30（1988））。これらの活性化には、白血球や線維芽細胞のような細胞の傷領域への集合と、細胞増殖および分化の誘導が含まれる。傷の治癒に関与する成長因子には、以下のものが含まれる：血小板由来成長因子（PDGF）、インシュリンー結合成長因子−１（IGF−１）、インシュリンー結合成長因子−２（IGF−２）、上皮成長因子（EGF）、形質転換成長因子−α（TGF−α）、形質転換成長因子−β（TGF−β）、血小板因子４（PF−４）およびヘパリン結合成長因子１および２（HBGF−１およびHBGF−２）。
循環血小板のα顆粒に含まれるPDGF類は、傷の血液凝固の間に傷部位に放出される（例えば、リンチら（Lynch et al.）,J.Clin.Invest.84:640−646（1989））。PDGF類には以下のものが含まれる:PDGF、血小板由来脈管形成因子（PDAF）、TGF−βおよびPF−４、これは、好中球の化学誘因因子である（ナイトンら（Knighton et al.）,in Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing:Biological and Clinical Implications,Alan R.Liss,Inc.,pp.319−329（1988）参照）。PDGFはミトゲンであり、線維芽細胞および平滑筋細胞の化学的誘引物質であり、線維芽細胞および平滑筋細胞を含む、間葉起源の細胞におけるタンパク質合成の刺激因子である。PDGFはまた内皮細胞のための、非有糸分裂性化学的誘引物質である。
IGF−１は、PDGFと一緒になって間葉培養細胞における有糸分裂およびタンパク質合成を促進する。皮膚傷へのPDGFまたはIGF−１単独適用では治癒が促進されないが、両因子を一緒に適用すると、結合組織および上皮組織の成長が促進されるようである（リンチら（Lynch et al.）,Proc Natl.Acad.Sci.,76:1279−1283（1987））。
TGF−βはマクロファージおよび単球類の化学的誘引物質である。他の成長因子の存在または不在に依存して、TGF−βは多くの細胞型を刺激または阻害する。例えば、インビボで適用されると、TGF−βは治癒ー皮膚傷の張力強度を増す。TGF−βはまた、内皮細胞の有糸分裂を阻害し線維芽細胞によるコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの合成を刺激する。
成長因子、EGF、TGF−α、HBGF類およびオストゲニン等の他の成長因子も傷の治癒には重要である。胃分泌液および唾液に見いだされるEGFと、正常および形質転換細胞の両者で生成されるTGF−αは、構造上関連しており、同じ受容体（レセプター）を認識し、上皮細胞の細胞増殖を触媒するらしい。両因子は皮膚の傷の再上皮形成を促進する。脱ミネラル化骨から精製されたオストゲニンは骨形成を促進するらしい（ルイテンら（Luyten et al.）,J.Biol.Chem.264−13377（1989））。
HBGF類、これには酸性HBGF−１と塩基性のHBGF−２ポリペプチドが含まれるが、は、内皮細胞等の中胚葉および神経外胚葉リニアージ（lineage）の強力な有糸分裂誘発物質である（バーゲスら（Burgess et al.）,Ann.Rev.Biochem.58:575−606（1989））。加えて、HBGF−１は内皮細胞、線維芽細胞、および大グリア細胞のための走化性物質である。HBGF−１およびHBGF−２はいずれもヘパリンと結合し、その結果、タンパク質加水分解的な分解から保護される。HBGF類によって示される生物学的活性の配置はそれらが傷に治癒に重要な役割を果していることを示している。
成長因子は、従って、傷の治癒および組織の修復を特異的に促進するのに、潜在的に有用である。外因性成長因子を傷に与えることが、傷の閉鎖速度、傷領域の細胞の数、血管の成長、コラーゲン沈着の総速度、および瘢痕の強度を増大することが示された［例えば、カーターら（Carter  et al.）,in Growth Factoers and Other Aspects of Wound Healings:Biological and Clinical Implications,Alan R.Liss,Inc.,pp.303−317（1988）参照］。血小板由来傷治癒処方物（PDWHF）、血小板抽出物、それは通常、局所適用のための軟膏または軟膏剤の剤形である、が記載されている［例えば、ナイトン（Knighton et al.）,Ann.Surg.204:322−330（1986）参照］。
しかしながら、成長因子の局所適用の有効性を試験するための実験は矛盾する結果を与えた。別個に傷モデル系に適用されたPDGF、IGF−１、EGF、TGF−βおよび線維芽細胞成長因子（FGFまたはHBGF）は傷の結合組織や上皮の再生に殆ど効果を与えなかった［リンチら（Lynch et al.）,J.Clin.Invest.84:640−646（1989）］。試験された因子の内、TGF−βのみが大きい反応を示した。PDGF−２ホモ２量体（ダイマー）とIGF−１またはTGF−αとの併用は、しかしながら「結合組織の再生および上皮形成」を劇的に増大した。しかしながら、他の報告では、傷への個々の成長因子の適用によって傷治癒が刺激されたとされている［例えば、Tsuboi et al.,J.Exp.Med.,172:245−251（1990）］。
そのような矛盾する結果が得られた理由は分からないが、これは、それらの正常な生物学的活性の配置を示し得るような方法で成長因子を適用することが困難なことに起因するかもしれない。そのよな矛盾した結果の故に、外部から適用された成長因子が果す傷治癒刺激における役割は明確でない。さらに、成長因子を内部の傷に適用し、傷と成長因子（類）との長期間の接触を産む方法は現在では、知られていない。
血漿タンパク質を含有する外科的接着剤および組織シーラントが知られており、血液の損失を減少し、止血を維持するために、内部および外部の傷のシーリングに用いられている。そのようなシーラント類は通常血液凝固因子と他の血液タンパク質を含む。例えば、欧州特許0,068,047は、フィブリノーゲン、線維素溶解阻害物質、およびトロンビンまたはプロトロンビンを含有する豊富化血漿画分から導かれた無水粉末が記載されている。これは、水を加えるや否や、血餅が形成されるので、粉末状態でのみ適用可能である。オーストラリア特許AU−Ａ−75097/87には、フィブリノーゲン、因子XIII、抗トロンビンIII等のトロンビン阻害物質、プロトロンビン因子、カルシウムイオンおよび所望により、プラスミン阻害物質を含有する、１成分接着剤が記載されている。米国特許4,427,650および4,427,651（Stroetmann）には、フィブリノーゲン、トロンビンおよび／またはプラスミン、および線維素溶解阻害物質を含有する（さらに他の成分たとえば血小板抽出物をも含有していても良い）豊富化血漿誘導体が記載されている。米国特許4,627,879および4,928,603（Roseら）には、フィブリノーゲンと因子XIIIとを含有する低温沈澱懸濁液と、それのフィブリン（線維素）接着剤の製造における使用が記載されている。日本特許１−99565には、フィブリン接着剤の製造のためのキットが記載されている。アルターバウムら（Alterbaum,R.）（米国特許4,714,457）およびモースら（Morse）（米国特許5,030,215）は自己由来フィブリン接着剤の製造方法を記載している。さらに、改良されたフィブリン接着剤デリバリーシステムが記載された［ミラーら（Miller et al.）米国特許4,932,942およびモースら（Morse）らPCT出願WO 91/09641）。
フィブリン接着剤はフィブリンシーラントとも呼ばれるが、最初に、臨床用局所適用のために製剤化され出血の抑制および傷治癒の促進のために用いられた。最近フィブリン接着剤の臨床使用の総説が出された［ビッブルら（Gibble et al.）,Transfusion 30:741−747（1990）；ラーナーら（Lerner et al.）,J.Surg.Res.48:165−181（1990）］。フィブリン接着剤は市販されているものを入手可能である。例えば、IMMUNO  AG（オーストリア、ウィーン）およびBEHRINGWERKE  AG（ドイツ）は今日そのような生産物を市場に出している（例えば、米国特許4,377,572および4,298,598参照、いずれもIMMUNO  AG所有）。BAXTER  TRAVENOL（Waukegan,IL）は最近フィブリン接着剤を開発した。
フィブリン接着剤は血漿から生産される。各フィブリン接着剤の正確な成分は出発物質として用いられた、特定の血漿画分の関数である。一般に、フィブリン接着剤はトロンビンとの混合に際して血餅を形成するタンパク質の混合物を含有する。例えば、フィブリン接着剤は血漿から、低温沈澱の後、分画化して、トロンビンまたはトロンビン活性化物質と混合したとき、シーラントまたは血餅を精製する組成物を得ることで調製される。血漿成分の分画はエタノール、ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウムによる沈澱、およびイオン交換、およびゲルろ過クロマトグラフィー等の標準的なタンパク質精製法に従って行うことができる。
フィブリン接着剤は通常、フィブロネクチン、因子XIII、von Willebrand因子を含むフィブリノーゲン濃縮物および乾燥ヒトまたはウシトロンビンを含有する。それは凍結乾燥した形で調製され、使用直前に塩化カルシウムと混合する。混合すると、成分が組織表面で凝集し、交差結合したフィブリンを含む血餅を形成する。因子XIIIはフィブリノーゲン濃縮物に含まれ、交差結合を触媒する。フィブリン接着剤は、組織の面と面とをシールし、空気または液体の漏れることを防ぎ、そのことにより止血を誘導する。止血と血液の流出を阻止する能力により、フィブリン接着剤は傷の治癒を促進する。しかしながら、それは真の意味での傷治癒特性をもっていない。フィブリン接着剤は、内部および外部の損傷の両方に使用でき、かつ止血の維持に有用なので、その傷治癒特性を向上することが望ましい。
約39g/lのフィブリノーゲン濃度を有しトロンビン濃度が200−600U/mlのフィブリン接着剤により傷のストレス、エネルギー吸収および弾力性値が有意に増大した［バイルンら（Byrne et al.）,Br.J.Surg.78:841−843（1991）］。加えて、フィブリン接着剤はマウスの骨形態発生タンパク質により誘導される異所性の骨ー軟骨形成に影響しなかった［ハットリ（Hattori,T.,Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi 64:824−834（1990）］。
しばしばポリテトラフルオロエチレン（PTFE）で製造される人工血管プロテーゼが、ヒトおよび他の動物で切除された血管の代わりに用いられる。これら血管プロテーゼの能力を最大にし、血栓の生成を最小にするために、非自己由来の内皮細胞をプロテーゼに蒔くことなど、様々な技術が用いられてきた。移植片と内皮細胞の両方に接着する様々な基質が、内皮細胞のシーディング（は種）を増大するために中間体基質として研究されている。これらの基質には、予め凝固された血液［ハーリングら（Hearing et al.）,Surgery 84:498−504（1978）］、フィブリン接着剤［ローゼンマンら（Rosenman et al.）,J.Vasc.Surg.2:778ー784（1985）；シレンクら（Schrenk,et al.）,Tharac.Cardiovasc.Surg.,35:6−10（1986）；ケブカーら（Koeveker et al.）,Tharac.Cardiovasc.Surgeon.,34:49−51（1986）；ジラら（Zilla et al.）,Surgery 105:515−522（1989）］、フィブロネクチン「ケスラーら（Kesler et al.）,J.Vasc.Surg.3:58−64（1986）；マカラクら（Macarak et al.）,J.Cell Physiol.116:76−86（1983）；ラマランゲオンら（Ramalangeons et al.）,J.Vasc.Surg.3:264−272（1986）］またはコラーゲン［ウイリアムスら（Williams et al.）,J.Surg.Res.38:618−629（1985）］。しかしながら、これらの技術における１つの一般的な問題は、非自己細胞がシーディングに用いられること（例えば、Schrenkら、前掲）、即ち、組織拒絶反応の可能性、さらにもしも樹立されるとしたら、融合性内皮を得るには、数カ月を要する。この遅延の結果、閉塞率が高い（Zillaら、前掲）。加えて、剪断ストレスによる内皮細胞の損傷および細胞損失がある（同上）。
骨の非結合性損傷においては、自然に新しい骨の形成が起きないという最小のギャップがある。これらの状態の臨床での治療は骨移植である。自己由来の骨の供給源は通常限られており、同種異系の骨の使用はウイルス混入の危険が高い。このような状況なので、脱ミネラル化したウイルス不活化骨粉末が魅力的な解決法である。骨脱ミネラル化マトリクス（DBM）は成長因子と、DBMがフィブリン接着剤（シバルツら（Schwarz et al.）Clin.Orthopaed.Related Res.238:282−287（1989）等の様々な物質と一緒に置かれる（im,ipまたはsc）とき、動物モデルで骨形成を誘導し得る、骨形態発生タンパク質（BMP's）とを含有する。免疫原的な観点から、DBMは種特異的であり、動物の進化程度が高等な程、その骨形成性が劣る。このような理由から、ヒトDBMの適用には限界がある。
天然の精製BMP類［マークら（Mark,et al.）,Plastic Reconstr,Surg.,86:623−630（1990）］または組換えBMP［ドアレサンドロら（D'Alessandro）et al.,J.Cell.Biochem.,15F:Q105,Abstract（1990）］が全血餅［ウオンら（Wang）,et al.,J.Cell.Biolchem.15F:Q20 Abstract（1990）］またはフィブリン接着剤［ハットリら（Hatori,et al.）,Nippon Seikkeigaku Gakkai Zasshi 64:824−834（1990）］を含む様々なデリバリー手段で動物モデルに与えられると、軟骨形成誘導効果を示した。
従って、本発明は、１つの目的として、成長因子が補充された、フィブリン接着剤のような組織シーラントであって、皮膚や骨等の傷の治癒；血管プロテーゼの内皮形成；およびインビトロでの、内皮細胞や線維芽細胞等、動物細胞の増殖および／または分化；を促進し得る組織シーラントを提供する。
また、本発明は成長因子（類）を傷ついた組織、血管プロテーゼ、およびインビトロで培養された動物細胞（内皮細胞や線維芽細胞等）に投与し、成長因子と傷ついた組織、血管プロテーゼおよび動物細胞と長時間接触させ、そのことにより傷の治癒、内皮形成または動物細胞の増殖および分化を促進する方法を提供するものである。
発明の要約
少なくとも１個の成長因子を有効濃度含有するフィブリン接着剤のような組織シーラントを提供する。この成長因子補充組織シーラントは傷の治癒、血管プロテーゼの内皮形成、およびインビトロでの動物細胞、とりわけ内皮細胞および線維芽細胞の増殖を促進する。傷の治癒の加速またはさもなくば促進、血管プロテーゼの内皮形成の生成、およびインビトロでの動物細胞、とりわけ上皮細胞および線維芽細胞の増殖および分化の生成のために、成長因子補充組織シーラントを用いる方法も提供する。
本発明の成長因子補充組織シーラントは、糖尿病患者の傷のように、容易に治癒しない傷の治癒促進、および成長因子を内部の傷部位に到達させ、内部傷部位と成長因子（類）とを長期間接触させるための媒体を提供するのに、特に有用である。例えば、成長因子補充組織シーラントは骨折部位または胃潰瘍その他の内部の傷の治癒を加速または促進するために適用し得る。
本発明の１つの目的は、フィブリン接着剤、ヒトDBMおよび精製DMP類の混合物を提供することにある。この混合物はヒト身体の細胞成分を移動させ、骨誘導の生起が必要な非結合性欠損のギャップを埋めるマトリックスを与える。タンパク質（フィブリノーゲンおよび因子XIII等）、酵素（トロンビンおよびプラスミン等）、骨形態発生タンパク質、成長因子、およびDBMを、この一時的な足場構造を最も長命にするのに適したように製剤化する。全混合物成分は生物分解的であるが骨形成の間は、該混合物は、新しく形成される骨の形を決定し得るよう、非破壊性の足場を提供する。骨の再構築手術における問題である、骨の非結合性欠損内への軟組織の崩壊は、かくして避けることができる。
好ましい態様では、傷治癒を加速および／または促進する能力を有する成長因子ー補充組織シーラントを得るために、有効濃度のHBGF−１をフィブリン接着剤に加える。他の好ましい態様では、フィブリン接着剤に有効量の血小板抽出物を加える。他の好ましい態様では、有効濃度の、少なくとも２個の成長因子の混合物をフィブリン接着剤に加え、成長因子（類）を含有する、有効量のフィブリン接着剤を傷組織に投与する。
成長因子に加えて、薬物、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、および他の化合物、例えば、傷の治癒を加速する化合物；組織シーラント内の成長因子の活性を仲介するか促進する化合物；および／または組織シーラント内の成長因子の活性を阻害する組織シーラント成分を阻害または干渉する化合物類、を組織シーラントに加えて良い。
本発明は１態様として、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する、ここに該濃度は傷の治癒を加速しまたはさもなくば促進するに有効な濃度である、傷の治癒、とりわけ皮膚および骨の傷の治癒を促進する組成物を提供する。
本発明は他の態様として、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する組成物を傷に適用することからなる、傷の治癒、とりわけ皮膚および骨の傷の治癒を促進する方法を提供する。
本発明は他の態様として、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する、ここに該濃度は血管プロテーゼの内皮形成を加速し、さもなくば促進するに有効な濃度である、血管プロテーゼの内皮形成を促進する組成物を提供する。
本発明は他の態様として、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する組成物を血管プロテーゼに適用することからなる、血管プロテーゼの内皮形成を促進する方法を提供する。
本発明は他の態様として、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する、ここに該濃度は動物細胞のインビトロでの増殖および／または分化を加速し、さもなくば促進するに有効な濃度である、動物細胞のインビトロでの増殖および／または分化を促進する組成物を提供する。
本発明は他の態様として、動物細胞のインビトロでの増殖および／または分化を促進する方法であって、該細胞を、有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する、ここに該濃度は動物細胞のインビトロでの増殖および／または分化を加速し、さもなくば促進するに有効な濃度である、組織シーラントの上および／または内部に置くことを含む方法を提供する。
本発明は従来用いられていた組成物および方法を凌駕する幾つかの利点を有する。第１の利点は、本発明の成長因子補充組織シーラントは生物分解性であり体組織に再吸収され得ることである。
第２の利点は、体内の、傷または他の部位に成長因子を効率的に到達させる良い方法を与える点にある。今日、最大限の成長因子の生物学的効果のためには、成長因子受容体が少なくとも12時間占有されねばならないと考えられている。従来、体内部位では、これを行う方法は全く無かった。本発明は、成長因子とその受容体との長期間の接触が起きることを可能にし、強力な生物学的効果の生成を可能にする。
本発明の第３の利点は、全タンパク質およびフィブリノーゲン濃度が従来用いられていたものよりも薄いことである。これにより、市販品から入手可能なフィブリン接着剤の約1/5の濃度のフィブリン接着剤が製造される。この低濃度性により、動物細胞は本発明の成長因子補充フィブリン接着剤内に移動し、中を通り、中へ増殖することができる。このことは近隣の組織およびプロテーゼへの細胞強化を助ける。市販のフィブリン接着剤は、細胞がその中へ移動し、通過し、内部へ増殖するには、あまりに濃厚である。そして、動物細胞は市販のフィブリン接着剤の周囲を移動し、あるいはそれを消化しなければならない。
本発明の第４の利点はその液性により、従来利用可能なデリバリーシステムに比較して、表面をより十分かつ完全に覆うことができる点にある。これは、成長因子補充フィブリン接着剤は血管プロテーゼの内部、外部および孔を覆うので、本発明を血管プロテーゼの内皮形成に用いるためには特に重要である。この結果、自己由来の内皮細胞が血管プロテーゼ全長にわたって同時に生じ、その結果、その血栓形成性および抗原性の発達を減少する。従来用いていた組織シーラントでは、増強は血管プロテーゼの端で生じ、その内部に進行し、かくして血栓形成性および抗原性の発展時期が延長される。また、血管プロテーゼに従来使用されていた組織シーラントには、おもに非自己由来細胞が蒔かれており、これは体によって拒絶されプロテーゼを通過する血液の剥ぎ取り作用で容易に洗い流されてしまう。
【図面の簡単な説明】
図１はHBGF−１βと250U/mlトロンビンとを、増大量のヘパリンの存在下でインキュベートしたウエスタンブロットである。HBGF−１β（10μg/ml）、トロンビン（250μg/ml）および増大量のヘパリン（０、0.5、５、10、20および50U/ml）を37℃で72時間インキュベートした。各インキュベーション混合物から一部を定期的にとり、レムリ（Laemmli）（Nature 227:680（1970））の記載に従い調製した８％SDSポリアクリルアミドゲルに載せ、同じく該文献記載の方法で操作した。次いでゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、HBGF−１βに相当するバンドをアフィニティー精製したポリクローナルウサギ抗HBGF−１β血清を用いて同定した。
インキュベーション混合物中のヘパリン濃度は以下の通である：パネルＡ）、０単位/ml;パネルＢ）、0.5単位/ml;パネルＣ）、５単位/ml;パネルＤ）、10単位/ml;パネルＥ）、20単位/mlおよびパネルＦ）、50単位/ml。パネルＡ−Ｆの各々に記載したゲルにおいて、各レーンは以下のものを含む；レーン１はSDS−PAGE低分子量標準を含有する；レーン２はビオチン化標準を含む；レーン３は10μg/mlのHBGF−１βを含む；レーン４は250単位/mlのトロンビンを含む；レーン５−13は時間０、１、２、４、６、８、24、48および72時間目に採取した試料を含む。
図２はHBGF−１β濃度に比例した関数としての3Hチミジンの取り込みを示す。図１および実施例２に記載のごとくトロンビン250U/mlとヘパリン5U/mlの存在下でHBGF−１βの試料を０時間、24時間または72時間インキュベートした。これらの試料の希釈を次いでNIH3T3細胞に加え、それを実施例３記載のごとくプレートした。HBGF−１濃度に対してCPMをプロットした図である。
図３は活性な野生型FGF−１（100ng/ml）を補充したフィブリン接着剤上でヒト臍静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。多数の細胞とそれらの伸びた形が認められる。補充されていないフィブリン接着剤上で培養した細胞の少ないこと（図５）と対比されたい。
図４は活性な野生型FGF−１（10ng/ml）を補充したフィブリン接着剤上でヒト臍静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。多数の細胞とそれらの伸びた形が認められる。補充されていないフィブリン接着剤上で培養した細胞が少ないこと（図５）と対比されたい。
図５は補充されないフィブリン接着剤上でヒト臍静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。図３および図４に比較して細胞数が少ないことが注目され、これは増殖速度が遅いことを示す。
図６は不活性な、突然変異型FGF−１（100ng/ml）を補充したフィブリン接着剤上でヒト臍静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。図３および図４に比較して細胞数が少ないことが注目され、これは増殖速度が遅いことを示す。
図７は接着剤mlあたり105細胞の濃度でフィブリン接着剤中に24時間包理した後のヒト臍静脈内皮細胞の典型的なパターンである。接着剤のタンパク質濃度およびトロンビン濃度は、それぞれ、4mg/mlおよび0.6NIH単位/mlであった。それらの伸びた、多足（multipodial）形態、およびそれら細胞が相互に接触し得る場所でのネットワークの形成に注目されたい。フィブロネクチン中で同じ細胞を培養した場合の丸石形と比較して欲しい（図９）。
図８は接着剤mlあたり105細胞の濃度でフィブリン接着剤中に48時間包理した後のヒト臍静脈内皮細胞の典型的なパターンである。培養条件は図７と同様である。一層、伸びたかつ多足形態が強調されており、細胞ネットワークが増大していることに注目されたい。フィブロネクチン中で培養された細胞の丸石形と比較し（図10）、後者ではネットワークが無いことに注目されたい。
図９はヒト臍静脈内皮細胞をフィブロネクチンで被覆した表面で24時間培養した後の典型的なパターンである。細胞が丸石形をしており、ネットワークが無いことに注目されたい。図７と比較されたい。
図９はヒト臍静脈内皮細胞を、通常用いられるフィブロネクチンフィルム上で48時間培養した後の典型的なパターンである。細胞が丸石形をしており、ネットワークが無いことに注目されたい。図８と比較されたい。
図11は７日（パネルA,C,E）および28日（パネルB,D,F）の後に犬から体外移植されたPTFE血管移植片の断面のマイクログラフである。移植に先立ち、移植片を処理しない（ＡおよびＢ）、フィブリン接着剤のみで被覆する（ＣおよびＤ）あるいはヘパリンおよびHBGF−１を補充したフィブリン接着剤で被覆した（ＥおよびＦ）。
図12は図11の、移植28日目の、血管移植片の内面の走査電子マイクログラフである。移植片は処理しない（Ｇ）、フィブリン接着剤のみで被覆する（Ｈ）あるいはヘパリンおよびHBGF−１を補充したフィブリン接着剤で被覆した（Ｉ）。
好ましい態様の説明
定義
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は本発明の属する分野の当業者に通常理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の全特許および出版物を参考文献として本明細書に引用する。
本明細書中、傷とは、生きている生物におけるあらゆる損傷組織を包含する。組織は胃内面または骨折等の内部組織、あるいは皮膚のような外部組織であってよい。それは脾臓のように軟い組織、あるいは骨のように硬い組織であってよい。傷は外傷、感染または外科的処置など任意の原因によるものであってよい。
本明細書中、組織シーラントとは、血漿タンパク質から調製され、傷に適用されたとき、血餅を生成し、その結果、傷をシールし、血液の損失を減じ、止血を維持する組成物である。フィブリン接着剤（のり）のような組織シーラントは当業者に既知である。
本明細書中、そのようなシーラントは、実質的な改変なしに成長因子または成長因子混合物を傷部位に到達させるための担体ベヒクル（媒体）として作用し得、そして、その接着性または吸着特性の故に成長因子補充組織シーラントが傷の治癒を加速するのに十分な期間、該部位への接触を維持することができる、任意の組織シーラントまたは接着剤を包含する。
本明細書中、成長因子補充組織シーラントとは、少なくとも１個の成長因子、または傷の治癒を加速、促進または改善する他の成分が傷治癒の加速、促進または改善に有効な濃度になるよう添加されている組織シーラントである。成長因子補充組織シーラントはまた薬物、抗生物質、抗凝固剤および、１）組織シーラント内の成長因子の生物学的活性を強化、刺激または仲介する、または２）シーラント内の成長因子（類）の生物学的活性を阻害または破壊するかもしれない、成長因子補充組織シーラントの活性を減少する化合物等の他の成分をも含有していてよい。
本明細書中、強化化合物は組織シーラント内の成長因子の生物学的活性を仲介するか、さもなくば増加する化合物である。ヘパリンはHBGF−１の生物学的活性を強化する化合物の例である。
本明細書中、阻害性化合物とは、組織シーラントの成分の好ましくない活性であって、組織シーラント中の成長因子または因子類の生物学的活性を干渉または阻害する活性を阻害、干渉または破壊する化合物である。阻害化合物はその効果を、成長因子を破壊から保護することで表すであろう。しかしながら、阻害性化合物は成長因子補充フィブリン接着剤の傷治癒特性にとって必須のいかなる活性をも阻害しない。
本明細書中、成長因子は細胞増殖、細胞分化、組織再生、傷の治癒および／またはあらゆる発展または増殖工程を制御または仲介するあらゆる可溶性因子を包含する。成長因子は天然起源からの抽出、合成化学による製造、組換えDNA技術またはウイルス不活化した成長因子（類）豊富化血小板放出物（releasate）等、当業者既知の任意の他の技術を用いる方法によって製造することができる。
本明細書中、内皮細胞成長因子（ECGF）や酸性FGFという他の名称でも知られているHBGF−１は、HBGF−１αの前駆体であるHBGF−１β、およびFGFのような頭が切断された形を含め、HBGF−１のあらゆる生物学的活性形を指す。本明細書に引用する米国特許第4,868,113（Jaye et al.）は各形のHBGFのアミノ酸配列を記載した。このようにHBGF−１は、前駆体、頭部切断形またはHBGF−１の生物学的活性を示す他の改良形またはHBGF−１のサブセットを包含する。
他の成長因子もまた、他の名称で当業者に知られている。従って、特定の成長因子を１つの名称で引用するときは、当業者に他の名称で知られているそのような因子、その生物学的に活性な前駆体、頭部切断形または改良形であって生物学的に活性なものをも包含する。
本明細書中、生物学的活性とは、インビボまたはインビトロで特定の成長因子に伴う活性の１つまたは全部を指す。一般に、成長因子は、有糸分裂誘発活性（増殖誘発または維持の能力）並びに、分化および／または発展の維持を誘発する能力を含む非有糸分裂誘発活性等、幾つかの活性を示す。加えて、成長因子は、それから増殖性および発展性工程が進む特定の細胞を送り込むか誘因することができる。例えば、適当な条件下、HBGF−１は内皮細胞を送り込み、それからの血管の形成を指令することができる。この活性により、成長因子補充組織シーラントは、それにより特定の部位での血流と栄養供給を増大する手段を与える。
成長因子−補充組織シーラントの製造
本明細書に開示した、本発明の実施態様の実施に際しては、第一段階として、成長因子および組織シーラントを選択しなければならない。それぞれは当業者既知の方法で調製し得るか、その供給者から購入することができる。好ましい態様では、成長因子を補充したフィブリン接着剤を調製する。
組織シーラントの調製
フィブリン接着剤のような、あらゆる組織シーラントを本発明に用いることができる。例えば、当業者に周知のフィブリン接着剤（米国特許No.4,627,879、4,377,572および4,298,598、これらを本明細書に引用して導入する）は、IMMUNO  AG（オーストリア、ウイーン）およびBEHRINGWERKE  AG（ドイツ）のような、それの供給者または製造業者から購入できる。あるいは、フィブリン接着剤は血漿または血漿成分から容易に調製できる。選択した組織シーラントの特定の組成は、それがインビボで組織シーラントとして機能し成長因子（類）と傷を負った組織または血管移植片との接触のための媒体として作用することができ、それにより傷の治癒または内皮形成が促進または加速される限り、臨界的なものではない。
本明細書に例示した実験のために、新鮮な凍結血漿からの低温沈澱物からフィブリン接着剤を調製した。成長因子のためのビヒクルとして用いたフィブリン接着剤の成分には、以下の物が含まれる；フィブリノーゲン；フィブロネクチン；因子XIII;およびvon Willebrand因子。
本発明の好ましい実施態様では、フィブリン接着剤の製造に用いる溶液の全タンパク質濃度は約５−150mg/mlである。さらに好ましい実施態様では、この調製溶液の全タンパク質濃度は約７−35mg/mlである。最も好ましい実施態様では、この調製溶液の全タンパク質濃度は約17−28mg/mlである。
本発明の好ましい実施態様では、フィブリン接着剤の製造に用いる溶液のフィブリノーゲン濃度は約４−135mg/mlである。さらに好ましい実施態様では、この調製溶液のフィブリノーゲン濃度は約６−30mg/mlである。最も好ましい実施態様では、この調製溶液のフィブリノーゲン濃度は約15−25mg/mlである。
成長因子の濃度は用いる成長因子によって変化するが、本発明の好ましい実施態様では、成長因子の濃度はフィブリン接着剤の約1ng/ml−1mg/mlである。さらに好ましい実施態様では、成長因子の濃度はフィブリン接着剤の約１μg/ml−100μg/mlである。最も好ましい実施態様では、成長因子濃度はフィブリン接着剤の約５μg/ml−20μg/mlである。加える成長因子（類）の量は様々な濃度を試験し、どれが意図する目的、および適用部位に有効であるものを選択することにより、実験的に決定することができる。
成長因子の調製
成長因子（類）またはその混合物は当業者既知の任意の方法で調製するか、市販品を購入することができる。例えば、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞、およびケラチノサイトのようなある種の細胞型の増殖を刺激する成長因子、および／または同じ細胞型の増殖、および平滑筋細胞の増殖をも阻害する成長因子を含む成長因子から選択される。そのような選択は成長因子を補充した組織シーラントを適用すべき特定の組織部位に依存する。例えば、EGFを補充した組織シーラントは目の傷への適用、および胃潰瘍の治癒の加速および促進のための適用に好ましく、オステオゲニンを補充した組織シーラントは骨折および骨の破損の治癒の加速および促進のための適用に好ましい。
他の好ましい実施態様では、HBGF−１βを調製し、フィブリン接着剤に加える。HBGF−１βまたはHBGF−１αあるいはHBGF−１の他の任意の活性形は天然起源、遺伝子工学的に得られるHBGF−１を発現する細胞またはその誘導体から精製するか、他の当業者既知の任意の方法で得ることができる。
HBGF−１βは組換えDNA法で調製された［ジャイら（Jaye et al.），米国特許No.4,868,113;ジャイら（Jaye et al.）,J.Biol.Chem.262:16612−16617（1987）］。簡単に述べると、HBGF−１βをコードするDNAを原核性発現ベクター（pUC9の誘導体）にクローンし、大腸菌の細胞内で発現させた。発現したペプチドを次いで高圧縮ー脱圧縮サイクルによる細胞崩壊装置（ディスラプター）を用いて、圧力により細胞から放出させた。崩壊の後、細胞屑をろ過して除き、ヘパリンセファロースTM、次いでCMセファロースTMによるイオン交換クロマトグラフィーを用いる標準的なタンパク質精製法で、上清からHBGF−１βを精製した。
上記のHBGF−１以外の、フィブリン接着剤に加えることができる他の成長因子には、HBGF−２、IGF−１、EGF、TGF−β、TGF−α、任意の血小板誘導成長因子または抽出物、および任意の成長因子の混合物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、血小板抽出物は成長因子に富む供給源であるが、これをHBGF−１のような他の成長因子と一緒に、あるいはその代わりに組織シーラントに加えてもよい。
好ましい実施態様では、当業者既知の任意の方法で調製された血小板抽出物を組織シーラントに加える。そのような抽出物はフィブリン接着剤と一緒に用いるために血漿減少血小板から調製された。
PDWHFを調製し、フィブリン接着剤に加えてもよい［ナイトンら（Knighton et al.）,Ann.Surg.204:322−330（1986）］。簡単に述べると、PDWHGを調製するためには、血液を抗凝固剤溶液にとり、血小板に富む血漿を冷蔵遠心で調製する。血小板を単離し、トロンビンで刺激すると、アルファ顆粒含有物が放出される。血小板を除去し、有効濃度の残存抽出物を組織シーラントに加える。
成長因子−補充組織シーラントの他の成分
それらは本質的に血漿画分なので、組織シーラントは夥しい数の成分を含有する成長因子と一緒に用いることが予期されており、そのあるものは、選択した成長因子（類）の活性を阻害するかもしれない。例えば、トロンビンはフィブリン接着剤の基本的な成分であるが、タンパク質加水分解酵素としても作用し得、特異的にHBGF−１βを開裂する。従って、組織シーラント中の選択した成長因子の生物学的活性を阻害、干渉または破壊するような他の成分の作用から成長因子（類）を保護する、プロテアーゼまたは阻害物質のような追加の成分を含有させることが必要である。
特定の阻害性成分（類）の選択は、以下に述べるように、組織シーラント中の成長因子（類）の生物学的活性を評価する方法を用いて実験的に決定されるであろう。生物学的の評価の方法は当業者に既知である。
加えて、成長因子がその活性を確実に発揮するために、所望の活性を強化または仲介する成分を包含させる必要があるであろう。例えば、ヘパリンはインビボでHBGF−１の生物学的活性を強化する［例えば、バーゲスら（Burgess,et al.）,Annu.Rev.Biochem.58:575−606（1989）参照］。
本発明の成長因子を補充したシーラントはまた、薬物、他の化学物質、およびタンパク質等の他の成分を含有していてもよい。これらには、抗生物質；活性化プロテインＣ、ヘパリン、プロストラサイクリン（PGI2）、抗トロンビンIII、ADPase、およびプラスミノーゲン活性化因子のような抗凝固剤；デキサメタゾンのような抗炎症性ステロイド類；カルシウムチャンネルブロッカーのような心臓血管製剤；化学誘引物質；およびブピバカイン（bupivacaine）のような局所麻酔剤が含まれるがこららに限定されない。これらの補充成分には、またポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体、またはその機能的な誘導体またはフラグメントが含まれる。それらは、例えば、PDGF、および／またはTGF−βに対する抗体のような平滑筋の増殖、または組織シーラントによる処置の領域内またはその付近の、他の望ましくない細胞型の増殖、を阻害する抗体であってもよい。これらの抗体はまた抗がん、抗血小板、または抗炎症性活性が必要な状況下でも有用である。一般に、その効果または経済性が、部位特異的ナデリバリーにより改善されるような抗体であれば、どれでも、このフィブリン接着剤デリバリーシステムの利益を享受する。
成長因子補充組織シーラントの傷治癒特性を分析するための分析法
特定の成長因子補充組織シーラントが傷の治癒を加速または高めるか否かを確かめるために、そしてそうするために最適な成長因子（類）濃度を選択するために、当業者既知の、傷の治癒を加速または促進する能力に関して組成物を試験する方法で、組成物を試験する［例えば、ツボイら（Tsuboi et al.）,J.Exp.Med.172:245−251（1990）；サンダーら（Ksander et al.）,J.Am.Acad.Dermatol.22:781−791（1990）およびグリーンハーグら（Greenhalgh et al.）,Am.J.Path.136:1235（1990）参照］。組織シーラント中の選択した成長因子（類）の活性を評価し得る任意のインビボおよびインビトロの両者の方法が使用できる。例えば、HBGF−１βの活性は２つの独立したインビトロ分析法で評価されてきた。第１では、成長因子を補充したフィブリン接着剤をプラスチック表面に充満し、その浅い液層に懸濁した内皮細胞の内皮細胞の増殖を測定した。第２の方法では、HBGF−１の存在下で培養した線維芽細胞への3Hチミジンの取り込みを測定した。
インビボ分析では、モデル系としてマウスを用い、HBGF−１βを補充したフィブリン接着剤のインビボでの傷治癒促進の能力に関して試験した。この方法ではマウスの背領域で同じパンチバイオプシーを行い、それを、試験、処置対照群および非処置対照群に分けた。試験群のマウスの傷は成長因子を補充した組織シーラントで処置した。処置対照群の傷は補充しないシーラントで処置した。非処置群の傷は処置しなかった。検出可能な傷治癒が進行するに十分な期間の後、一般に１週間から10日後、マウスを殺し、各群の傷修復程度を組織学的に評価するために、傷を負った組織を顕微鏡で調べた。
成長因子補充組織シーラントの細胞増殖の誘導能力、および細胞送り込み能力は当業者既知のインビトロの方法でも評価することができる。例えば、上に記載し、実施例で詳細に述べる成長因子の生物学的活性のインビトロ測定法を組織シーラント組成物中の成長因子の活性の試験に用いることができる。さらに、候補の阻害および／または強化因子の添加の効果も評価することができる。
一般に、阻害および／または強化化合物の添加の必要性は実験的に決定することができる。例えば、下記の実験例で記載したように、HBGF−１補充フィブリン接着剤中のHBGF−１βは確率的な方法で開裂され、このことはフィブリン接着剤製品の成分、多分トロンビン、がその原因であることを示している。HBGF−１と結合し、ある種のタンパク質加水分解からそれを保護することが知られているヘパリンを、HBGF−１補充フィブリン接着剤に加えた。かなり低濃度のヘパリンを加えると、フィブリン接着剤に含まれる生物学的活性により破壊されるはずのHBGF−１βが開裂から保護された。従って、HBGF−１を含む組織シーラント組成物はヘパリンまたはHBGF−１のトロンビンまたはフィブリン接着剤中の他のタンパク質加水分解性成分によるHBGF−１の開裂を阻害する物質を加えなければならない。
同様に、選択した阻害物質の成長因子を組織シーラント組成物による分解からの保護能力は当業者既知の任意の方法で評価することができる。例えば、ヘパリンの、フィブリン接着剤の必須成分であるHBGF−１のトロンビンによる開裂を阻害する能力を試験した。そのために、様々な濃度のヘパリンとHBGF−１補充フィブリン接着剤とを用意し、様々な時間インキュベートした。混合物中のHBGF−１の生物学的活性を試験し、そのようなHBGF−１の全体性をSDSゲルのウエスタンブロットで確かめた。比較的低濃度、ヘパリン:HBGF−１のモル比が約1:1で、HBGF−１のフィブリン接着剤中での分解の阻止に十分であった。
特定の化合物を組織シーラント中の成長因子または成長因子類の生物学的活性の強化、仲介または促進に用い得るか否かも、実験的に決定することができる。成長因子で修飾した組織シーラントの内部の、または外部の傷への局所または内部適用
臨床使用に先立ち、成長因子および組織シーラント、または成長因子を補充した組織シーラントを滅菌するか、あるいは、ウイルス等のあらゆる病原性混在物を不活化するために処置する。混在物を不活化する方法は当業者に周知であり、例えば、溶媒−洗剤処理および熱処理［例えば、タボーら（Tabor et al.）,Thrombosis Res.22:233−238（1981）；ピツキビッツら（Piszkiewicz et al.）,Transfusion 28:198−199（1988）参照］があるが、これらに限定されない。
成長因子で修飾した組織シーラントは傷組織に直接適用される。典型的には、外部の傷には、それを、傷の上からスプレーすることを含め、任意の手段で直接適用することができる。それはまた、手術中に、内部へ適用することもできる。それを骨等に、内部に適用した場合、血餅は時間と共に徐々に溶解する。
以下の実施例は例示のみを目的としており、本発明を制限する意図ではない。
実施例１
HBGF−１を補充したフィブリン接着剤の調製
血漿の低温沈澱画分から調製したフィブリン接着剤を用いた。血漿はヒト血液を遠心して赤血球をペレット化し、血小板を除去することで調製した。血漿を遠心し、低温沈澱物を集め、分画してフィブリン接着剤を製造した。
HBGF−１をコードするDNAを含有させたプラスミドを含む組換え大腸菌の800ml培養を調製した。誘導および37℃で24時間の培養の後、細胞を遠心し上清を捨てた。細胞ペレットを0.15M  NaClを含有する20mMりん酸バッファーpH7.3（25ml）に再懸濁した。懸濁した細胞を細胞ディスラプターで破壊し、細胞屑を5000gで20分間遠心して溶液から分離した。
ペレットを捨て、可溶化HBGF−１βおよび他の細菌性タンパク質を含有する上清ヘパリン−セファロースTM（Pharmacia Fine Chemicals,Upsala,Sweden）の直径2.6cm、高さ10cmのカラムに詰めた。カラムを５容量の20mMりん酸バッファー、pH7.3中の0.15M  NaClで洗浄し、次いで20mMりん酸バッファー中の0.15M  NaClから2.0M  NaClのグラディエントで溶離した。
溶出液を280nmのUV吸光度により監視した。UV吸収物質の３ピークが溶出し、それらをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。約17,400ダルトンでシングルバンドとして溶離した第３ピークは実質上純粋なHBGF−１βを含有していた。
HBGF−１βが混在する細菌性タンパク質を含まないことをさらに保障するために、成長因子活性を有する第３ピークを20mMヒスチジン、0.15M  NaCl、pH7.5に対して１夜透析した。タンパク質2mgをCM−セファロースTM（Pharmacia,Upasala,Sweden）1mlのイオン交換カラムに詰めた。カラムを20mMヒスチジン、0.15M  NaCl、pH7.5（10カラム床容量）で洗浄し、20mMヒスチジン、pH7.5中、0.15M  NaClから20mMヒスチジン、pH7.5中、1.0M  NaClのグラディエントで溶離した。溶出液を280nmでのUV吸収で監視し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でHBGF−１βを同定した。
精製HBGF−１βの１−10μｇをフィブリン接着剤に加えた。
実施例２
HBGF−１のフィブリン接着剤中での安定性
HBGF−１βがフィブリン接着剤の成分であるトロンビンによって消化されることを防止するためにフィブリン接着剤にある種の物質を加えることが必要であった。HBGF−１に吸着されるヘパリンを選択し、それがHBGF−１を、トロンビンおよびフィブリン接着剤の他のタンパク質加水分解的成分による消化から保護するか否かを決定するために試験した。増大濃度のヘパリンの存在下でのHBGF−１の安定性を求めた。
HBGF−１β（10μg/ml）、トロンビン（250μg/ml）および増大濃度のヘパリン（０、0.5、５、10、20および50U/ml）を37℃でインキュベートした。インキュベーション溶液の一部を周期的にとり、凍結し、−70℃で以後の試験まで保存した。
インキュベーションが完了した後、試料を解凍し、レムリ（Laemmli）（Nature 227:680（1970））の方法に従い15％SDSポリアクリルアミドゲルで還元条件下、分離した。次いでゲルをニトロセルロースに電気ブロットし、HBGF−１βに相当するバンドをアフィニティー精製したポリクローナルウサギ抗HBGF−１血清を用いて同定した。ウエスタンブロットは図１に示されており、それには、17,400nwにHBGF−１βが認められる。結果は、ヘパリン濃度、僅か５単位/mlで、HBGF−１βはトロンビンによる消化から防御されたことを示している。さらに、実施例３に記載するように、その生物学的活性は変化しなかった。
実施例３
ヘパリンおよびトロンビンの存在下でHBGF−１βをインキュベーションした後の生物学的活性
実施例２に記載したように、ヘパリン５単位/mlを含有するインキュベーション混合物中のHBGF−１βの生物学的活性を、NIH3T3細胞への3Hチミジンの取り込み分析で測定した。
NIH3T3細胞を96ウエルプレートに入れ、0.5％ウシ血清（BCS;GIBCO、グランドアイランド、ニューヨーク）を加えたダルベッコの改良培地（DMEM;GIBCO,グランドアイランド、ニューヨーク）中で、37℃、飢餓条件下、細胞が30−50％全面成長するまで培養した。２日後、実施例２で調製した試料から得た様々な希釈度のHBGF−１を、培地を変えずに各ウエルに加えた。負対照には成長因子の代わりに希釈液（インキュベーション緩衝液）を加え、正対照には、HBGF−１試料の代わりに増殖に必要な成長因子を含有する、10％BCS含有DMEMを加えた。
37℃で18時間インキュベーションした後、3Hチミジン（0.25μCi;比活性6.7μCi/ml）を各ウエルに加え、37℃でさらに４時間インキュベーションした。プレートをりん酸緩衝化食塩水（PBS）で洗浄し、10％冷トリクロロ酢酸（TCA）0.5mlで、４℃で15分間固定化した。TCAを除去し、プレートをPBSで洗浄し、酸で沈澱可能な物質を室温で１時間、0.1N水酸化ナトリウムを0.5ml/ウエル用いて可溶化した。試料をシンチレーションバイアルに移し、バイアルあたり、10mlのシンチレーション液（New England Nuclear,AquasureTM）を加えた。
結果を図２に示すが、これはトロンビンおよびヘパリンの存在下でインキュベートされたHBGF−１が、その生物学的活性を保っていることを示している。観察されたチミジン取り込みの濃度依存性はインキュベーション時間に無関係であり、成長因子の濃度の関数としての細胞増殖の依存性に関する予測の典型であった。成長因子は、典型的に、細胞増殖が最大になる至適濃度を表している。
内皮細胞の増殖の観察により、トロンビンおよびヘパリンの存在下でのHBGF−１の生物学的活性も測定した。ペトリ皿の表面をHBGF−１補充フィブリン接着剤で満たした。内皮細胞を浅い層で加え細胞の数を数えた。時間と共に細胞の数は増えた。加えて、細胞は容器内に結集するように見えた。
従って、HBGF−１は、トロンビンの分解作用からHBGF−１を保護し、また、成長因子を補充したフィブリン接着剤中のHBGF−１の生物学的活性を増強し得るヘパリンを含有するフィブリン接着剤中でその生物学的活性を維持している。
実施例４
HBGF−１は、フィブリン接着剤凝固物から、濃度および時間の関数として拡散する
5mlのプラスティック製試験管中で10U/mlヘパリンおよびトロンビンを含有するフィブリノーゲンコンプレックス0.3mlと40mM CaCl2とを混合することにより、フィブリン接着剤凝固物が形成された。４本の試験管に下記のものを入れた。
A:0.5U/mlトロンビンおよび10μg/mlHBGF−１
B:0.5U/mlトロンビンおよび50μg/mlHBGF−１
C:5U/mlトロンビンおよび10μg/mlHBGF−１
D:5U/mlトロンビンおよび50μg/mlHBGF−１
凝固物を0.2Mヒスチジン緩衝液、pH7.3で覆った。２時間毎に重層した緩衝液試料30μｌを採取し、ウエスタンブロットにかけた。
実験結果は、凝固物からのHBGF−１の拡散は、時間およびその凝固物中の濃度の関数であり、凝固物中のトロンビンの濃度は凝固物からのHBGF−１の放出速度に影響しないことを示した。
実施例５
成長因子を補充したフィブリン接着剤中でのヒト臍静脈内皮細胞の挙動
酸性線維芽細胞成長因子（FGF−１）を補充したフィブリン接着剤のヒト内皮細胞へのインビトロでの効果を研究するために、これら細胞の浮遊液を、フィブリノーゲン約9mg/mlおよび0.25NIH単位/mlのトロンビンを含有するフィブリン接着剤2.5mlが均等に噴霧されている直径10cmのペトリ皿に加えた。フィブリン接着剤は下記のように補充されていた。
A:成長因子不添加
B:100ng/mlの活性な、野生型FGF−１を添加；
C:100ng/mlの不活性な、突然変位型FGF−１を添加；あるいは
D:10ng/mlの活性な、野生型FGF−１を添加。
細胞をフィブリン接着剤層に蒔き、10％ウシ胎児血清を含有するDMEM中で７日間維持した。
生物学的に活性なFGF−１（図３および４）を補充したフィブリン接着剤と接触した場合、細胞は長くなり、効率良く増殖した。補充されていないフィブリン接着剤（図５）または生物学的に不活性なFGF−１（図６）と接触した場合には、細胞は長くなったが、増殖速度は比較的遅かった。
実施例６
ヒト臍静脈内皮細胞のフィブリン接着剤中での挙動
ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を研究するために、1mlあたり105またはそれ以上の細胞をタンパク質濃度4mg/mlのフィブリン接着剤中に包理した。フィブリン接着剤中のトロンビン濃度は、0.6NIH単位/mlに調節した。全実験で用いた培養培地は10％ウシ胎児血清、10ug/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン、1ng/ml酸性線維芽細胞成長因子および10U/mlヘパリンを含有するM199（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M0）であった。
24時間以内に、フィブリン接着剤中の細胞は長くなり、多足（multipodial）となり、それらが相互に接触すると細胞ネットワークを形成した（図７）。この成長は少なくとも５日間持続した。図８は48時間後のその状態を示す。
対照として、フィブロネクチン10μg/cm2で被覆した表面で同じ細胞浮遊液を培養した。対照細胞は丸石形となりこの形態を少なくとも５日間維持した。図９および10は、それぞれ、24時間および48時間後のその状況を示す。
実施例７
フィブリン接着剤中でのPMEXNEO−3T3−2.2細胞の挙動
PMEXNEO−3T3−2.2細胞は遺伝子操作されたタンパク質を発現し得る、改変されたゲノムを有する線維芽細胞である。これらの細胞のフィブリン接着剤中での挙動を調べるために、105細胞／ウエルを以下の３条件下で培養した：（１）フィブリン接着剤に包理；（２）フィブリン接着剤の表面；および（３）フィブリン接着剤不在下（対照）。実験は24ウエルプレート中、10％ウシ胎児血清（FCS）を補充したDMEM培地（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M0）中で２回ずつ行った。フィブリン接着剤のタンパク質濃度は4mg/mlであった。1.5％FCSを補充して同じ実験を行い負対照とた。
10％FCSを補充した培地で３群の細胞を培養し全面成長に達した。培地に1.5％FCSを補充した負対照実験では、細胞はフィブリン接着剤の存在下で成長し、少なくとも５日間は生存したが、それがないと成長、生存しなかった。しかしながら、それらの成長は10％FCS補充フィブリン接着剤中での方が、1.5％FCS補充フィブリン接着剤中でのそれよりも早かった。フィブリン接着剤が存在しない場合には、1.5％FCS補充培地では、細胞は48時間以内に死滅した。生存の基準は被検細胞を新鮮な10％FCS補充培地に移したとき、増殖する能力とした。
実施例８
ヘパリン結合１型成長因子（HBGF−１）の予備処理による、膨張した（expanded）ポリテトラフルオロエチレン移植片の促進された内皮形成
２つの研究により、血液−接触生物材料を内皮細胞（EC）ミトゲンで予備処理すると内皮形成が促進されることが証明された。最初の研究は既知の脈管形成因子であるHBGF−１を補充したフィブリン接着剤懸濁液を、膨張したポリテトラフルオロエチレン（PTFE）移植片に適用し、次いでウサギの大動脈に移植し、そのインビボでの流失（崩壊）特性を調べた。
一般に、改良フィブリン接着剤は、移植片の内面および外面に、約1ng/cm2のヒト組換え125I−HBGF−１、20ng/cm2ブタ腸粘膜ヘパリン、および2.86mg/cm2フィブリノーゲンを、2.86x10-2U/cm2の再構成された、市販のヒトトロンビン（1000U/ml）に加え、重合を誘導することで製造した。
125HBGF−１は特に下記のようにして調製した。
フィブリノーゲンは、フィブリノーゲン500mgをPBS25mlに再構成し、PBS中、フィブリノーゲン濃度を20mg/mlにすることで調製した。この溶液3ml（フィブリノーゲン60mg含有）を12のプラスチック製エッペンドルフ管に入れ−70℃で維持した。これら各部分を個別に用いた。
トロンビンは市販の濃度1000U/mlのトロンビン（Amour Pharmaceutical Co.,Kankakee,IL）を滅菌溶液で1:10に希釈して濃度100U/mlに再構成した。このトロンビン溶液をさらに1:10希釈して10U/ml溶液を得た。
ウシヘパリン（Upjohn,Kalamarco,MI）は、1000U/mlの製品を通常の食塩水で1:1000希釈して再構成した。
再構成したフィブリノーゲン１および48/100（1.48）mlプラス再構成ヘパリン63μｌプラス125I−HBGF−１  15.66μｌをガラス製シンチレーション管中で混合した。混合物を次いで3mlのプラスチック製注射器（シリンジ）で吸引した。再構成トロンビン5mlをガラスシンチレーション管に入れた。
膨張したPTFE組織移植片の１端をプラスチック製３方コック付きノズルの上に置き、２−０絹タイ（tie）でその位置に確保した。次いでPTFEを、3x3cm四方のパラフィイルムTMで強化し、次いで垂直な血管鉗子でそれをその位置に止め、防水シールした。第２の２−０絹タイをコックの隣りのパラフィルムの上に位置させさらにシールした。次いで、垂直な血管鉗子を用いて2mm離れたPTFE/パラフィルムを縛り、この端をシールした。
上記のようにして調製した等量のフィブリノーゲン溶液およびトロンビン溶液を混合し約30秒間反応させると、その時点で重合が起こった。トロンビン−重合フィブリノーゲンは不透明であった。（この時間因子はおよそであり、トロンビンのロットにより変化する。適当な重合時間の長さは混合物の不透明さを観察することで決定できる。）トロンビン／フィブリノーゲン混合物を1ccシリンジに吸引した。（注意：この移植片の容量は0.42mlである。これ以上の容量の移植片には、より大きいシリンジが必要である。）シリンジをコックに付け、PTFEの狭い隙間から「水滴」が見えるまで、手で５秒間かけて混合物を注入し、PTFEとパラフィルムTMの間の空間を満たした。PTFEに向けて３方コックを３分間閉じ、コックの上のPTFEの端の結紮糸をスケープル（scapel）剃刀で切断した。コックからPTFE移植片／パラフィルムを除去し、止血鉗子を用いてパラフィルムエンベロープからPTFEを除去した。残存する成長因子を補充したフィブリン接着剤を移植片の管腔から清掃するために、移植片の腔が完全にきれいになるまで、No.3塞栓切除カテーテルを５回、移植片を通って通過させた。成長因子補充フィブリン接着剤で処理したPTFE移植片を約12時間、層状流動フード（laminar flow hood）の下で一夜乾燥させた。処理した移植片を次いで移植のために準備した。
HBGF−１を補充したフィブリン接着剤を内径34mm（各端は24mm＋5mm）x3mmの薄い壁の膨張PITF移植片に加圧潅流し、移植片の内腔を被覆し節を通って移植片の外側表面に至らしめた。上記のごとく、移植片の腔を清掃した。次いで移植片を24頭のニュージランドホワイトラッビト（24、３ー5Kg）の腎臓下方（infrarenal）腹部大動脈に移植した。最初の研究では、０時（手術による損失を補正するため）、および５、30および60分、および１、７、14および30日後に動物を殺し、標本を体外移植（explant）した。ガンマ計測で残存放射能を測定した。突発的な遅延を補正した、残存125I−HBGF−１をゼロ時の値の％ととして表した。
125I−HBGF−１の流出は古典的な動力学に従い、最初は循環のリエスタブリッシュメント（再構成）（％／分＝−24.1、５−60分の間）を伴う急速な損失、次いで１時間後（％／分−0.03）遅い損失があり、１週間後の残存が13.4％±6.9％、30日後の残存は3.8％±1.1％であった。
第２の研究では、適用したHBGF−１補充フィブリン接着剤の、犬の大動脈−腸骨位置に移植した、広範囲に膨張した節間距離60μｍの膨張PTFE移植片の内皮形成速度；これら内皮細胞の時間の関数としての増殖速度；および観察した内皮細胞増殖への、HBGF−１とフィブリン接着剤の相対的寄与の影響を評価した。３群の、強化されていない50x4mmの膨張PTFE移植片を12匹の犬の大動脈腸骨部位に移植した。１群（ｎ＝６）はヘパリン20μg/cm2、フィブリノーゲン2.86mg/cm2およびヒトトロンビン2.86x10-2U/cm2プラスHBF−１  1ng/cm2を含有する。２群（ｎ＝３）はHBGF−１を含有しない、同じフィブリン接着剤を含有する。３群（ｎ＝３）の組成は同じであるが、非処理対照移植片を用いる。トリチル化チミジン（3H−Td R;0.5Ci/kg）を体外移植の10時間前に注入した。光学および電子顕微鏡、因子VIII免疫組織化学、およびランダムハイパワーフィールド（高出力電界）での内皮細胞増殖のオンファス（en face）オートラジオグラフィーのために、７および28日目に移植片を体外移植した。各移植片はその移植片がどの処置群からのものであるかを知らない３人の「盲目（ブラインド）」観察者により観察された。内皮細胞増殖における違いを２方向ANOVAおよび独立ｔ−試験で統計学的に解析した。
７日目に、フィブリン接着剤およびHBGF−１補充フィブリン接着剤の両方の33％が内皮細胞の非接触焦点を示した（図11）。対照移植片の表面にはフィブリン凝固が残っていた。28日目には、各HBGF−１補充フィブリン接着剤が、広範な毛細管の内部成長（ingrowth）と融合した内皮細胞が形成された血液接触表面を示し、それは、他の２群には決して見られなかった（図11および12）。図12は、28日目の非処理移植片が表面に認め得る内皮細胞を殆ど有していなことを示している（パネルＧ）。フィブリン接着剤のみで処理した移植片の表面約33％が内皮細胞で覆われ、このことはフィブリン接着剤単独処理でも幾分、内皮細胞の再形成が促されることを示している（パネルＨ）。しかしながら、HBGF−１で補充したフィブリン接着剤で処理した移植片（パネルＩ）は完全（＞95％）に円石形の特性を示す内皮細胞に覆われているようである。このように、フィブリン接着剤による成長因子到達の組み合わせによって、基本的に、血管移植片を非トロンボゲン性内皮細胞による裏打ちで完全に覆うことができた。オンファスオートラジオグラフィーにより、他のすべての群と比較して、時間および移植処理の関数として、28日目のHBGF−１補充フィブリン接着剤移植片におけるEC類のDNAへの３−TdRの取り込みの統計的な増大（ｐ＜.05）が明らかになった。
これらのデータは、節間距離60μの膨張PTFE移植片へのHBGF−１補充フィブリン接着剤の加圧潅流が、毛細血管の内部成長とEC増殖の増大を介して内皮形成を促進することを示すものである。
これらの研究は、直径の小さい血管移植片のヒトでの自発的な内皮形成の促進の可能性、および移植内皮細胞のより迅速な融合の誘発の可能性をも示している。
実施例９
フィブリン接着剤と一緒に用いる血小板抽出物の調製
血漿を減少した血小板を調製し、ペレット化した。上清血漿を除去した。ペレット血小板を洗浄し、50mMヒスチジンと0.15M塩化ナトリウムを含有する緩衝液、pH6.5に懸濁し、ウシトロンビンで処理した。処理後、上清を遠心して集め、一部をー80℃で凍結した。抽出物を解凍し、フィブリン接着剤または他の組織シーラントと混合した。
実施例10
成長因子補充フィブリン接着剤のインビボでの傷の治癒への効果
糖尿病マウスの傷の回復への成長因子補充フィブリン接着剤の効果を評価した。６匹の各試験マウスの背部分から得た２個の全厚み6mmの生検（バイオプシー）を、HBGF−１β５μｇを加えたフィブリン接着剤で満たした。６匹のマウスの同じ生検は無処置のままで置き、６匹の対照マウスの場合には、補充されていないフィブリン接着剤を満たした。９日後、マウス全部を殺し、各傷部位および周囲の皮膚から厚さ５ミクロンの切片の病理学的標本を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
各試料の傷修復の程度を３人の訓練された分析者による「盲目」試験（それがどの処置群から得られたかが分からない）により評価し、彼らはコラーゲン沈着、上皮細胞再形成、粒状組織の厚みおよび炎症細胞の密度、線維芽細胞および毛細血管等を評定した。各試料は否から完全な修復に至る０から15までの評価を課された。補充されないフィブリン接着剤で処理した傷由来の試料は一貫して最も評点が低く、処理されない傷または成長因子で補充したフィブリン接着剤で処理した傷から得た試料は最高の評点を与えた。
実施例11
骨誘導物質のデリバリービヒクルとしてのフィブリン接着剤
フィブリン接着剤のDBMを含有する能力および細胞をフィブリン接着剤−DBMマトリックスに移動させる能力を研究するために、フィブリン接着剤とDBMの混合物から作成したペレットを筋肉内（胸筋）およびロングエバンスラットの頭蓋冠の直径8mmの欠損に移植した。フィブリン接着剤−DBMペレットは、直径7mm、高さ0.7mmのギャップのある円筒状プレスを用いて調製した。ヒト骨から得たDBM25mgをFG60ugと混合し、円盤状ペレットに打錠した。フィブリン接着剤は1mlあたりフィブリノーゲン約45mgとトロンビン15単位を含有していた。ペレットの移植から５日後、動物を殺し、ペレットを周囲の筋肉および骨組織と一緒に収穫した。試料を円盤の真ん中で切断し組織学的に分析した。これら標本の組織学的解析は、移植したペレットがあらかじめ決めた形のマトリックスを与えていることを示した。マトリックスには孔サイズの大きいチャンネルがあり、それを通して骨誘導細胞が移植内に侵入していた。フィブリン接着剤−DBMを、フィブリン接着剤とBMP類を補充したヒトDBMを用いて作成すれば、体の骨形成細胞が多孔性マトリックス内に浸透し新しい骨を形成するであろう。
一般に、フィブリノーゲンは、最終濃度として３−60mg/ml、最適濃度30mg/ml、で存在しなければならない。DBMは、およその濃度として約50−500ml/ml存在しなければならない。骨誘導性成長因子、またはBMP類は、約１−100ug/mlの濃度で存在しなければならない。材料を注意深く、非結合のギャップに到達させねばならない。新しい骨はほぼ４−６週間で再生するはずである。フィブリン接着剤ーDBMマトリックスの形は新しく形成された骨の形態学の決定のために示されたものである。従って、可能なら、フィブリン接着剤−DBMマトリックスは予め決定した形に形成されるべきである。液体形のフィブリン接着剤−DBMマトリックスを、不規則な形の欠損に到達させるか注入し、それが満たされた領域で重合し、骨の形成を促進させることができる。
修飾は当業者にとって自明のことなので、本発明は添付の請求項の範囲にのみ限定される意図ではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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