【手続補正書】
【提出日】平成29年2月10日(2017.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大規模なウイルスベクター精製の方法であって、
ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
ｃ）工程ｂのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
ｄ）工程ｃのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記ウイルスベクターを単離する工程と、
ｅ）工程ｄで得られた前記ウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過により更に精製し、容積および緩衝液交換を減少させる工程と、
ｆ）工程ｅのろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程と、
ｇ）工程ｆのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
ｈ）工程ｇで得られたベクター溶液をフィルタでろ過する工程と、
ｉ）前記精製ウイルスベクターを回収する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
大規模なウィルスベクター精製の方法であって、
ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
ｃ）工程ｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積及び緩衝液交換を減少させる工程と、
ｄ）工程ｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
ｅ）工程ｄのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記ウイルスベクターを単離する工程と、
ｆ）工程ｅで得られたウイルスベクターをサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程と、
ｇ）工程ｆのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
ｈ）工程ｇで得られたベクター溶液をフィルタでろ過する工程と、
ｉ）前記精製ウイルスベクターを回収する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３】
大規模なウィルスベクター精製の方法であって、
ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
ｃ）工程ｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積を減少させ、緩衝液を交換する工程と、
ｄ）工程ｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
ｅ）工程ｄのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記ウイルスベクターを単離する工程と、
ｆ）工程ｅで得られたウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過により更に精製し、容積および緩衝液交換を減少させる工程と、
ｇ）工程ｆで得られたろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程と、
ｈ）工程ｇのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
ｉ）工程ｈで得られたベクター溶液をフィルタでろ過する工程と、
ｊ）前記精製ウイルスベクターを回収する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項４】
前記ウイルスベクターが組み換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ＨＩＶおよびその偽型から選択される組み換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）、または水疱性口内炎ウイルスＧ偽型レンチウィルス（ＶＳＶＧ偽型）ベクターを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法を用いて精製されたｒＬＶ粒子を、薬学的に許容される担体に含んでなるｒＬＶベクター製剤。
【請求項７】
前記導入遺伝子が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡを含んでなる群から選択される核酸をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記導入遺伝子が、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、アンギオスタチン、果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α  （ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、およびチロシンヒドロキシラーゼで構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記導入遺伝子が、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン類（ＩＬ１からＩＬ１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）、ＣＣＲ５、ならびにクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子で構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入遺伝子が、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンセターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列で構成される群から選択される、骨内の代謝エラーの修正に有用なタンパク質をコードする核酸を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入遺伝子が、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、ＥＧＦ−ＲＩＩＩ（上皮成長因子受容体変異型３）ＥＧＰ−２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｍＡｂ  ＩｇＥ標的ＴＡＡ、ＴＡＧ−７２、またはＶＥＧＦ−Ｒ２で構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換えウィルスベクターが哺乳類細胞により産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換えウィルスベクターが、ＨＥＫ  ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３Ｆ（ライフテクノロジーズ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）、２９３Ｓ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ）ｌ、またはＣＨＯ  Ｋ１（ＡＴＣＣ）の細胞により産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記無血清懸濁培養物が無血清細胞増殖培地を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記無血清増殖培地が、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅTM、サーモサイエンティフィック）、ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅTM、サーモサイエンティフィック）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４ＳＦＭ（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、２９３ＳＦＭ  ＩＩ（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、およびＣＤ２９３（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼが、ベンゾナーゼまたはＤＮａｓｅを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィーが陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィーが、強または弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィーが陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イオン交換カラムクロマトグラフィーが、強または弱陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記イオン交換カラムが、四級化ポリエチレンイミン系樹脂、または四級アミン系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記イオン交換カラムが、ポリエチレンイミン系樹脂、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）系樹脂、またはジエチルアミノプロピル系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アフィニティカラムがスルホプロピル系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アフィニティカラムがカルボキシメチル系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アフィニティカラムが多機能クロマトグラフィー樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アフィニティカラムまたは前記イオン交換カラムが、ヒドロキシアパタイト（（Ｃａ5（ＰＯ4）3ＯＨ）2）系樹脂、多モード弱陽イオン交換樹脂、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミン系樹脂、またはオクチルアミン系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アフィニティカラムが、金属キレートアフィニティ樹脂、ヘパリン系樹脂、または群特異的アフィニティ樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＥＧ変調アフィニティまたは前記イオン交換カラムクロマトグラフィーが、
ｉ）ステップｃのろ液を、ＰＥＧを随意に含んでなる結合溶液に調整し、前記ろ液を前記アフィニティカラムまたは前記イオン交換カラムに接触させることによってウイルスベクターをアフィニティカラムまたはイオン交換カラムに結合させる工程と、
ｉｉ）不純物を除去するために、ＰＥＧを含んでなる洗浄溶液、またはＰＥＧと塩を含んでなる溶液で、結合したウイルスベクターを洗浄する工程と、
ｉｉｉ）溶出溶液を用いて、アフィニティカラムまたはイオン交換カラムからウイルスベクターを溶出させる工程と、
を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合溶液が、０％から１０％重量／容積、または０％から５％重量／容積、または０％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記洗浄溶液が、１％から１０％重量／容積、または１％から５％重量／容積、または１％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記洗浄溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記溶出溶液が、０％から２０％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶出溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合溶液、洗浄溶液、または溶出溶液が塩をさらに含んでなる、請求項３２ないし３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶出溶液が、５００ｍＭから１，０００ｍＭの量の塩を含んでなる、請求項３２ないし３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記塩が、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含んでなる、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｈまたはｉのろ過が、０．２０から０．５μｍの孔径を有するフィルタを用いて行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
工程ｇのろ過が孔径０．２０μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
工程ｇのろ過が孔径０．２２μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
工程ｇのろ過が孔径０．４５μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターが１×１０5〜１×１０9感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターが６×１０6＋／−１０％感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターが３×１０8＋／−１０％感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１ないし４８のいずれか１項に記載の精製方法を実行する工程を含む、ウイルスベクターの生産方法。