(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）窒素源、及び第１の濃度レベルの粗製グリセリンを含む培地中で１種または複数種の微生物を培養することと、
（ｂ）グリセリンの第１の濃度が、０ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間の第１の閾値レベルまで低下した時点で、第１の濃度レベルに達するのに十分な濃度で、追加量の粗製グリセリンを前記培地に供給し、前記供給中に窒素源を前記培地に添加しないことと、
（ｃ）前記粗製グリセリンの第１の濃度レベルが第１の閾値レベルまで低下するまで、前記粗製グリセリン濃度を監視することと、
（ｄ）所望の微生物細胞密度に達するまで、ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことと
を含む、所望の細胞密度を有する微生物の集団を産生する方法。
【請求項２】
前記１種または複数種の微生物がＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種または複数種の微生物が受託番号ＰＴＡ−６２４５を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、１種または複数種の脂肪酸を産生する能力を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記脂肪酸が多価不飽和脂肪酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多価不飽和脂肪酸が、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪酸を単離することを更に含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の濃度レベルが１ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌとの間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記監視することが溶存酸素レベルを測定することを含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記監視することが、前記培地の試料を取得することと、該試料中の前記グリセリン濃度を測定することとを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記監視することが、熱量分析、化学反応に基づく熱量分析、蛍光分析、ＨＰＬＣ分析、酵素学的分析、またはそれらの組み合わせを用いて前記試料を分析することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞密度が５０ｇ／Ｌと２５０ｇ／Ｌとの間である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物がその全重量の５０重量％〜８０重量％の脂肪酸を含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸が１０〜４５％のＤＨＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物が全細胞重量の５〜３６％のＤＨＡを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が１種または複数種の更なる炭素源を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記粗製グリセリンが滅菌されていない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記粗製グリセリンが、メタノール、水、灰分、非グリセリン有機物、硫酸ナトリウム、牛脂脂肪酸メチル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記灰分が、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記粗製グリセリンがバイオディーゼルの副生成物である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１種または複数種の脂肪酸の製造方法であって、
（ａ）脂肪酸を産生する能力を有するＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ微生物を準備することと、
（ｂ）窒素源及び粗製グリセリンを含む培地を準備することと、
（ｃ）前記培地中の前記粗製グリセリンが０〜５ｇ／Ｌになった時点で、粗製グリセリンを窒素なしで繰り返し追加することによって、前記培地中で前記微生物を培養して、前記１種または複数種の脂肪酸を産生して、前記微生物の全細胞重量の少なくとも５０重量％である前記１種または複数種の不飽和脂肪酸の最終濃度を与えることと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記微生物がＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の微生物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が受託番号ＰＴＡ−６２４５を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記脂肪酸が多価不飽和脂肪酸を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記多価不飽和脂肪酸が、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂肪酸を単離することを更に含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が１種または複数種の更なる炭素源を含む、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記粗製グリセリンが滅菌されていない、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記粗製グリセリンが、メタノール、水、灰分、非グリセリン有機物、硫酸ナトリウム、牛脂脂肪酸メチル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記灰分が、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛またはそれらの組み合わせを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記粗製グリセリンがバイオディーゼルの副生成物である、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記粗製グリセリンが前処理されていない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記所望の微生物細胞密度が１５９．２９ｇ／Ｌと２５０ｇ／Ｌとの間である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記窒素源が硫酸アンモニウムである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地が２０ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物がその全重量の７０重量％〜８０重量％の脂肪酸を含有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
第２の炭素源がグルコースである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記粗製グリセリンのグルコース量に対する比が８０：２０または２０：８０である、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１５年３月２６日出願の米国仮出願第６２／１３８，６３１号の優先権を主張し、該出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
微生物の従属栄養発酵は、高価値の油分及びバイオマス製品を生み出す効率的な方法である。微生物は、特定の培養条件下で細胞内油を合成し、この細胞内油を抽出し、これを用いてバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル、バイオジェット燃料など）及び栄養脂質（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡ、及びＤＰＡなどの多価不飽和脂肪酸）を製造することができる。一部の微生物のバイオマスはまた、高い多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及びタンパク質含有量に起因して高い栄養価のバイオマスでもあり、動物飼料用の栄養補助剤として使用することができる。しかしながら、従属栄養発酵は、高コスト、且つ高エネルギー消費及び高原料消費の集約型プロセスである。炭素原料コストは一般に、微生物バイオマス及び油分の総生産コストの非常に大きな部分である。既存の微生物発酵は、炭素源としてグルコースなどの高価な炭水化物を主に使用する。生産プロセスを経済的に有利にするために、より安価な炭素代替物が検討されている。グルコースに加えて、フルクトース及びグリセリンなどのいくつかの他の形態の炭素が微生物用の天然炭素基質である。しかしながら、高度に精製されたグリセリンはグルコースよりも大きなコストがかかる。
【発明の概要】
【０００３】
１種または複数種の微生物の培養方法が提供される。上記方法は、粗製グリセリンを第１の濃度レベルで含む培地中で１種または複数種の微生物を培養することと、グリセリンの第１の濃度が第１の閾値レベルまで低下した時点で、第１の濃度レベルに達するのに十分な濃度で、追加量の粗製グリセリンを上記培地に供給することと、上記粗製グリセリンの第１の濃度レベルが第１の閾値レベルまで低下するまで、上記粗製グリセリン濃度を監視することとを含む。上記ステップは、所望の微生物細胞密度に達するまで、繰り返されてもよい。
【０００４】
１種または複数種の脂肪酸の製造方法も提供される。上記方法は、脂肪酸を産生する能力を有する微生物を準備することと、粗製グリセリンを含む培地を準備することと、上記培地中、上記１種または複数種の脂肪酸を産生するのに十分な条件下で上記微生物を培養して、上記微生物の少なくとも５０重量％である上記１種または複数種の不飽和脂肪酸の最終濃度を与えることとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】唯一の炭素源として異なるバイオディーゼル製造者由来の様々な粗製グリセリン原料を使用した発酵の間の、バイオマス濃度（ｇ／Ｌ）の経時的プロファイルを示すグラフである。
【図２】異なる容積比の粗製グリセリンとグルコースとの混合物を使用した発酵の間の、バイオマス濃度（ｇ／Ｌ）の経時的プロファイルを示すグラフである。グリセリンとはＲｏｔｈｓａｙ社の粗製グリセリンを意味し、グルコースは７５０ｇ／Ｌのグルコース溶液を意味する。上記比とは２種の溶液の容積比であった。
【図３】唯一の供給炭素源として粗製グリセリンを使用したＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＯＮＣ−Ｔ１８の大規模（２００，０００Ｌ）発酵の間の、バイオマス及び脂質濃度の経時的プロファイを示すグラフである。
【図４】メタノールを用いたバイオディーゼルのエステル交換反応の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
バイオ燃料に対する世界的な需要及び生産能力の増加の結果として、副生成物としての粗製グリセリンの巨大な余剰が生じている。粗製グリセリンの精製には過大な投資を必要とする一方、未精製粗製グリセリンは経済的価値がほとんどない。その結果、多くのバイオ燃料製造業者は粗製グリセリンを産業排水の一種と見なしている。したがって、かかる粗製グリセリンをより高付加価値の製品へと転化する効率的なプロセスは大いに注目されることとなる。バイオディーゼルの副生成物であるグリセリン（粗製グリセリンの一種）が炭素源として使用されてはいるが、粗製グリセリンの不純物に起因する毒性及びかかる毒性を回避するための適当な発酵の炭素供給方法がないことにより、高密度のバイオマス及び油分は得られていない。これに対して、本明細書では、粗製グリセリンを用いた微生物の培養方法及び油分の製造方法が提供される。該提供される方法により、発酵中に高いバイオマス及び油分の生産がもたらされ、６８％の油分を含有する１７２ｇ／Ｌの乾燥細胞重量を達成した。かかる生産性は、グルコースを用いる流加発酵によって達成することができる生産性に匹敵する。
【０００７】
このように、上記提供される方法は、工業的副生成物であるグリセリン（粗製）を一部のまたは唯一の炭素基質として他の栄養成分と共に用いて、微生物を高い細胞密度（＞１００ｇ／Ｌ）及び高い油分含有量（＞５０％）へと増殖させることを可能にする。工業起源由来の粗製グリセリンは前処理を殆どまたは全く必要としない。粗製グリセリン基質は、非常に高いバイオマス及び油分の収量を達成することができつつ、いずれの生物学的阻害効果も最小限に維持できるような、規定され且つ制御されたやり方によって発酵槽に供給される。本明細書では、無菌発酵プロセスに必要とされる一般的な滅菌操作をなくすことができることも実証される。また、上記粗製グリセリンの前処理を軽減または排除することもでき、上記グリセリンを製造者から受け入れた際にそのまま微生物培養に供給することができる。かかるプロセスが工業的規模で実施される場合、これにより相当なエネルギーコストが節約される。本明細書では、用語「前処理」とは、物理的または生物学的に上記培養増殖に影響を及ぼす場合がある非グリセリン不純物の除去をいう。前処理の例としては、不純物を沈殿させる及び除去するための化学的処理、培養環境のｐＨを適合させるためのｐＨ調整、懸濁した固体を除去するためのろ過または遠心分離が挙げられる。
【０００８】
本明細書では、１種または複数種の微生物の培養方法が提供される。上記方法は、粗製グリセリンを第１の濃度レベルで含む培地中で１種または複数種の微生物を培養することと、グリセリンの第１の濃度が第１の閾値レベルまで低下した時点で、第１の濃度レベルに達するのに十分な濃度で、追加量の粗製グリセリンを上記培地に供給することと、上記粗製グリセリンの第１の濃度レベルが第１の閾値レベルまで低下するまで、上記粗製グリセリン濃度を監視することとを含む。場合により、第１の濃度レベルは、１ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌとの間、または１ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌとの間の任意のレベル、但し両端値を含む、である。場合により、第１の濃度レベルは、５ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌとの間、１５ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌとの間、５ｇ／Ｌと２０ｇ／Ｌとの間、または１５ｇ／Ｌと２０ｇ／Ｌとの間である。場合により、第１の閾値レベルは、０ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間または０ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間の任意のレベル、但し両端値を含む、である。したがって、第１の閾値レベルは、例えば、０、１、２、３、４または５ｇ／Ｌであってよい。任意選択で、所望の微生物細胞密度に達するまで、上記ステップが繰り返される。場合により、上記所望の微生物細胞密度は１００ｇ／Ｌより大きい。場合により、上記所望の細胞密度は、５０〜２００ｇ／Ｌ、５０〜１５０ｇ／Ｌ、５０〜１００ｇ／Ｌ、１００〜２５０ｇ／Ｌ、１００〜１５０ｇ／Ｌ、または８０〜１００ｇ／Ｌである。場合により、上記細胞密度は５０ｇ／Ｌと２５０ｇ／Ｌとの間の任意の密度、但し両端値を含む、である。場合により、上記細胞密度は８０〜１００ｇ／Ｌである。場合により、上記細胞密度は１２０〜２３０ｇ／Ｌである。場合により、上記微生物細胞密度は、全脂肪酸の５０重量％〜８０重量％を含有する。任意選択で、上記全脂肪酸は１０〜４５％のＤＨＡを含む。任意選択で、上記微生物細胞密度は全細胞重量の５〜３６％のＤＨＡを含む。
【０００９】
上記微生物は、１種または複数種の脂肪酸を産生する能力を有する。したがって、１種または複数種の脂肪酸の製造方法が提供される。上記方法は、脂肪酸を産生する能力を有する微生物を準備することと、粗製グリセリンを含む培地を準備することと、上記培地中、上記１種または複数種の脂肪酸を産生するのに十分な条件下で上記微生物を培養して、上記微生物の少なくとも５０重量％である上記１種または複数種の不飽和脂肪酸の最終濃度を与えることとを含む。任意選択で、上記脂肪酸は多価不飽和脂肪酸である。上記多価不飽和脂肪酸は、例えば、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸、及びそれらの組み合わせであってよい。
【００１０】
上記提供される方法において、上記粗製グリセリン濃度を監視することは、当業者に公知の種々の方法を用いて実施することができる。任意選択で、上記監視することは溶存酸素レベルを測定することを含む。任意選択で、上記監視することは、上記培地の試料を取得することと、該試料中の上記グリセリン濃度を測定することとを含む。任意選択で、上記監視することは、熱量分析、化学反応に基づく熱量分析、蛍光分析、ＨＰＬＣ分析、酵素学的分析、またはそれらの組み合わせを用いて上記試料を分析することを含む。
【００１１】
上記提供される方法における使用に好適な種々の微生物が存在する。本明細書に記載される微生物は、藻類（例えば、微細藻類）、真菌（酵母を含む）、細菌、または原生生物であってよい。任意選択で、上記微生物は、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ目のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ、より詳細には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓを含む。任意選択で、上記微生物の集団は、米国特許第５，３４０，５９４号及び同第５，３４０，７４２号に記載されるＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓを含み、上記特許は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。上記微生物は、米国特許第８，１６３，５１５号に記載される、ＡＴＣＣ受入番号第ＰＴＡ−６２４５（すなわち、ＯＮＣ−Ｔ１８）として寄託されたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種などのＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種であってもよく、上記特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。したがって、上記微生物は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上（例えば、１００％を含む）配列番号１と同一である、１８ｓ  ｒＲＮＡ配列を有していてもよい。
【００１２】
本明細書に記載の方法において用いるための微生物は種々の脂質化合物を産生してもよい。本明細書では、用語脂質とは、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸のエステル、トリアシルグリセリン、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド）、炭化水素、ならびに当業者に公知の他の脂質を包含する。任意選択で、上記脂質化合物は不飽和脂質を含む。上記不飽和脂質としては、多価不飽和脂質（すなわち、少なくとも２の不飽和炭素−炭素結合、例えば二重結合を含有する脂質）または高度に不飽和の脂質（すなわち、４以上の不飽和炭素−炭素結合を含有する脂質）を挙げることができる。不飽和脂質の例としては、ドコサヘキサエン酸（すなわち、ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（すなわち、ＥＰＡ）などのオメガ−３及び／またはオメガ−６多価不飽和脂肪酸、及び他の天然起源の不飽和、多価不飽和及び高度に不飽和の化合物が挙げられる  １０％のシード容積を接種すると、この長い誘導期が劇的に短縮される。
【００１３】
上記提供される方法は、当技術分野で公知の方法に従って微生物を培養するための追加のステップを含むか、またはそれらと共に用いてもよい。例えば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ、例えばＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．は、米国特許公開２００９／０１１７１９４または２０１２／０２４４５８４に記載の方法に従って培養することができ、これらの特許文献は、該特許文献中で用いられる方法または組成物の各ステップに関して、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００１４】
微生物は増殖培地（「培養培地」としても知られる）中で増殖させる。種々の培地のいずれかが、本明細書に記載の微生物の培養における使用に適し得る。任意選択で、上記培地は、炭素源及び窒素源を含む上記微生物のための種々の栄養成分を供給する。Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ培養のための培地は、種々の炭素源のいずれを含んでいてもよい。炭素源の例としては、脂肪酸、脂質、グリセリン、トリグリセリン、炭水化物、ポリオール、アミノ糖、及び任意の種類のバイオマスまたは廃棄物流が挙げられる。脂肪酸としては、例えばオレイン酸が挙げられる。炭水化物としては、グルコース、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（トウモロコシまたは小麦）、アセテート、ｍ−イノシトール（例えば、コーンスティープリカー由来）、ガラクツロン酸（例えば、ペクチン由来）、Ｌ−フコース（例えば、ガラクトース由来）、ゲンチオビオース、グルコサミン、アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（例えば、グルコース由来）、セロビオース、デキストリン、アルファ−シクロデキストリン（例えば、デンプンに由来）、及びスクロース（例えば、糖蜜由来）が挙げられるが、これらに限定はされない。ポリオールとしては、マルチトール、エリトリトール、及びアドニトールが挙げられるが、これらに限定はされない。アミノ糖としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−マンノサミンが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１５】
上記提供される方法において用いられる培地または複数の培地は粗製グリセリンを含む。本明細書では、用語「粗製グリセリン」とは、製造プロセス、例えばバイオディーゼル製造の副生成物をいう。用語「粗製グリセリン」は、用語「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）」または「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）」と区別される。というのも、これらの製品は、単独でまたは本質的に純粋な形態での「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）」または「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）」を含むからである。用語「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）」及び「グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）」は、本明細書を通して同義で用いられる。したがって、粗製グリセリンは、純粋なグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）またはグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）に加えて更なる薬剤及び／または成分を含有する。任意選択で、上記粗製グリセリンはバイオディーゼル製造の副生成物である。粗製グリセリンは、トリグリセリドのエステル交換によるバイオディーゼル製造の主要な副生成物、またはトリグリセリドの加水分解（ケン化）による石ケン製造の副生成物である。例えば、一般的なバイオディーゼルプロセスは、脂肪または油分（トリグリセリド）のメタノールなどのアルコールとの、脂肪酸のエステル（バイオディーゼル）及びグリセリンを形成する反応である。メタノールを用いた反応の例を図４に示す。脂肪／油分中の不純物ならびに、多くの場合ナトリウムメチラートなどの化学的触媒によって促進される当該反応自体に起因して、最終的なグリセリン画分は比較的に高い含有量の不純物を含む。一般的な粗製グリセリンの組成及び物性を表１に示す（出典：ＲＥＧ  Ｒａｌｓｔｏｎ社の粗製グリセリンの分析証明書）。同一の粗製グリセリンの灰分組成を表２に示す。粗製グリセリンのキャラクタリゼーションの更なる例が引用文献、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．  ２２（２）：  ２６１−２６５  （２００６），及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２０１２，  ６０（２３）：５９１５−５９２１  （２０１２）に記載されており、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【表１】
0006988031.tif 000002
【表２】
0006988031.tif 000003
【００１６】
任意選択で、上記粗製グリセリンは培地または複数の培地中の唯一の炭素源である。任意選択で、上記培地は１種または複数種の更なる炭素源を含む。任意選択で、上記粗製グリセリンは滅菌または前処理がなされない。任意選択で、上記粗製グリセリンは、メタノール、水、灰分、非グリセリン有機物、硫酸ナトリウム、牛脂脂肪酸メチル、またはそれらの組み合わせを含む。任意選択で、上記灰分は、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛またはそれらの組み合わせを含む。
【００１７】
任意選択で、本明細書において提供される微生物は、バイオマス及び／または目的の化合物の産生（例えば、油分または全脂肪酸（ＴＦＡ）の含有量）を増加させる条件下で培養される。Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは、例えば、一般的には生理食塩水培地中で培養される。場合により、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは約０．５ｇ／Ｌ〜約５０．０ｇ／Ｌの塩濃度の培地中で培養してもよい。場合により、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは約０．５ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ（例えば、約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ）の塩濃度の培地中で培養される。任意選択で、本明細書に記載のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは低塩条件で培養してもよい。例えば、上記Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄは約０．５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば、約０．５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ）の塩濃度の培地中で培養してもよい。上記培養培地は、任意選択で、ＮａＣｌを含む。任意選択で、上記培地は天然または人工の海塩及び／または人工海水を含む。
【００１８】
上記培養培地は、ナトリウム源として非塩化物含有ナトリウム塩を含んでいてもよい。本方法に従った使用に好適な非塩化物ナトリウム塩の例としては、ソーダ灰（炭酸ナトリウムと酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。例えば、米国特許第５，３４０，７４２号及び第６，６０７，９００号を参照されたく、これらの特許のそれぞれの全体の内容は参照により本明細書に援用される。例えば、培養培地中の全ナトリウムの約１００％未満、７５％未満、５０％未満、または２５％未満しか塩化ナトリウムによって供給されないような、全ナトリウムの相当の部分が非塩化物塩によって供給されてもよい。
【００１９】
場合により、上記培養培地の塩化物濃度は、約３ｇ／Ｌ未満、５００ｍｇ／Ｌ未満、２５０ｍｇ／Ｌ未満、または１２０ｍｇ／Ｌ未満である。例えば、上記提供される方法において使用するための培養培地の塩化物濃度は、約６０ｍｇ／Ｌと１２０ｍｇ／Ｌとの間、但し両端値を含む、であってよい。
【００２０】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ培養用の培地は、種々の窒素源のいずれかを含んでいてもよい。例示的な窒素源としては、アンモニウム溶液（例えば、Ｈ２Ｏ中のＮＨ４）、アンモニウム塩またはアミン塩（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、（ＮＨ４）３ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＯＯＣＨ２ＣＨ３（ＮＨ４Ａｃ））、ペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、大豆エキス、カザミノ酸及び醸造かすが挙げられる。好適な培地中の窒素源の濃度は、一般には約１ｇ／Ｌと約２５ｇ／Ｌとの間、但し両端値を含む、の範囲である。
【００２１】
上記培地は、任意選択で、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムなどのリン酸塩を含む。培地中の無機塩及び微量栄養素としては、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン塩化カルシウム、及びＥＤＴＡが挙げられる。ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、パントテン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸及びビタミンＢ１２などのビタミンが含まれていてもよい。
【００２２】
上記培地のｐＨを、適当である場合には、酸もしくは塩基を用いて、及び／または窒素源を用いて、３．０と１０．０との間、但し両端値を含む、に調節してもよい。任意選択で、上記培地を滅菌してもよい。
【００２３】
一般に、微生物の培養に用いられる培地は液体培地である。但し、微生物の培養に用いられる上記培地は固体培地であってもよい。固体培地は、本明細書で論じられる炭素源及び窒素源に加えて、構造的支持を与える及び／または当該の培地を固体形態とする１種または複数種の成分（例えば、寒天またはアガロース）を含有していてもよい。
【００２４】
任意選択で、得られたバイオマスを低温殺菌し、該バイオマス中に存在する望ましからざる物体を不活性化する。例えば、上記バイオマスを低温殺菌し、化合物を分解する物体を不活性化してもよい。上記バイオマスは、低温殺菌ステップに対して、発酵培地中に存在していてもよいし、または発酵培地から単離されていてもよい。上記低温殺菌ステップは、上記バイオマス及び／または発酵培地を昇温状態に加熱することによって行うことができる。例えば、上記バイオマス及び／または発酵培地を、約５０℃〜約９５℃（例えば、約５５℃〜約９０℃または約６５℃〜約８０℃）の温度に加熱してもよい。場合により、上記バイオマス及び／または発酵培地を約３０分〜約１２０分間（例えば、約４５分〜約９０分間、または約５５分〜約７５分間）加熱してもよい。上記低温殺菌は、例えば蒸気の直接注入などの適宜の加熱手段を用いて行うことができる。
【００２５】
任意選択で、低温殺菌ステップは実施されない。換言すれば、本明細書で教示される方法は、任意選択で低温殺菌ステップを含まない。
【００２６】
場合により、上記バイオマスを、当業者に現在公知のものを含む種々の方法に従って採取することができる。例えば、上記バイオマスは、例えば遠心分離（例えば、固体排出遠心分離機を用いて）またはろ過（例えば、十字流ろ過）を用いて、発酵培地から収集することができる。任意選択で、上記採取ステップは、細胞バイオマスの収集を加速するための沈殿剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは塩化カルシウム）の使用を含む。
【００２７】
任意選択で、上記バイオマスは水洗される。場合により、上記バイオマスを最大約２０％の固形分に濃縮してもよい。例えば、上記バイオマスを、約５％〜約２０％の固形分、約７．５％〜約１５％の固形分、または約固形分〜約２０％の固形分、または上記列挙した範囲内の任意の割合まで濃縮してもよい。場合により、上記バイオマスを、約２０％以下の固形分、約１９％以下の固形分、約１８％以下の固形分、約１７％以下の固形分、約１６％以下の固形分、約１５％以下の固形分、約１４％以下の固形分、約１３％以下の固形分、約１２％以下の固形分、約１１％以下の固形分、約１０％以下の固形分、約９％以下の固形分、約８％以下の固形分、約７％以下の固形分、約６％以下の固形分、約５％以下の固形分、約４％以下の固形分、約３％以下の固形分、約２％以下の固形分または約１％の固形分まで濃縮してもよい。
【００２８】
上記提供される方法は、任意選択で、上記バイオマスまたは微生物から上記多価不飽和脂肪酸を単離することを含む。上記多価不飽和脂肪酸の単離は、当業者に現在公知の方法を含む、種々の方法の１種または複数種を用いて行うことができる。例えば、多価不飽和脂肪酸の単離方法は米国特許第８，１６３，５１５号に記載され、該特許はその全体が参照により本明細書に援用される。任意選択で、上記培地は、上記多価不飽和脂肪酸の単離に先立って滅菌されない。任意選択で、滅菌は温度の上昇を含む。任意選択で、上記微生物によって産生され、上記提供される方法から単離される多価不飽和脂肪酸は中鎖脂肪酸である。場合により、上記１種または複数種の多価不飽和脂肪酸は、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２９】
本明細書に記載の方法に従って製造される多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及び他の脂質を含む油分は、その生物学的、栄養学的または化学的特性を活用する様々な用途のいずれかにおいて利用することができる。したがって、上記提供される方法は、任意選択で、採取された閾値容積の部分から油分を単離することを含む。任意選択で、上記油分は燃料、例えばバイオ燃料を製造するために用いられる。任意選択で、上記油分は医薬品、食品補助剤、動物飼料添加剤、化粧品などに用いてもよい。本明細書に記載の方法に従って製造される脂質はまた、他の化合物の製造における中間体として用いてもよい。
【００３０】
例として、上記提供される方法を用いて培養された微生物によって産生される油分は脂肪酸を含んでいてもよい。場合により、上記脂肪酸は、アルファリノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、ガンマ−リノレン酸、リノール酸、リノレン酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。場合により、上記油分はトリグリセリドを含む。場合により、上記油分は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１（ｎ−７））、シス−ワクセン酸（Ｃ１８：ｌ（ｎ−７））、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５（ｎ−６））、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６（ｎ−３））、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３１】
任意選択で、本明細書に記載の方法に従って製造される脂質は、最終製品（例えば、食品または飼料補助剤、乳児用調合乳、医薬品、燃料など）に組み入れられてもよい。上記脂質が組み入れられてもよい好適な食品または栄養補助剤としては、牛乳、水、スポーツ飲料、エネルギー飲料、茶及びジュースなどの飲料；キャンデー、ゼリー、及びビスケットなどの菓子；乳製品などの脂肪含有食品及び飲料；炊いた米（または粥）などの加工食品製品；乳児用調合乳；朝食用シリアル等が挙げられる。任意選択で、１種または複数種の製造される脂質は、例えばビタミンまたはマルチビタミンなどの栄養補助食品に組み入れられてもよい。任意選択で、本明細書に記載の方法に従って製造される脂質は、栄養補助食品中に含まれていてもよく、任意選択で、食品または飼料の成分（例えば、食品補助剤）中に直接組み入れられてもよい。
【００３２】
本明細書に記載の方法によって製造される脂質を組み入れてもよい飼料の例としては、猫用飼料などのペットフード；犬用飼料など；水槽魚、養殖魚または養殖甲殻類などの飼料；農場、養殖で飼育される動物（家畜及び養殖で飼育される魚または甲殻類を含む）の飼料が挙げられる。本明細書に記載の方法に従って製造される脂質を組み入れてもよい食品または飼料の材料は、意図される受容者である生物の嗜好に合うことが好ましい。この食品または飼料の材料は、食品材料に関する現在知られている任意の物理的特性（例えば、固体、液体、軟質）を有していてもよい。
【００３３】
任意選択で、１種または複数種の上記製造される化合物（例えば、ＰＵＦＡ）は、栄養補助食品または医薬品中に組み入れられてもよい。かかる栄養補助食品または医薬品の例としては、様々な種類の錠剤、カプセル剤、飲用可能な薬剤などが挙げられる。任意選択で、上記栄養補助食品または医薬品は局所適用に好適である。剤形としては、例えば、カプセル剤、油剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、丸剤、トローチ剤などを挙げることができる。
【００３４】
本明細書に記載の方法に従って製造される油分または脂質は、種々の他の薬剤のいずれかと組み合わせて、本明細書に記載の製品中に組み入れられてもよい。例えば、かかる化合物は、１種もしくは複数種の、結合剤または充填剤、キレート剤、顔料、塩、界面活性剤、湿潤剤、粘度調整剤、増粘剤、皮膚軟化剤、香料、防腐剤など、あるいはそれらの任意の組み合わせと組み合わせてもよい。
【００３５】
上記開示される方法及び組成物の製品に用いてもよい、上記製品と共に用いてもよい、上記製品の調製に用いてもよい、または上記製品である、物質、組成物、及び成分が開示される。これらの及び他の物質は本明細書に開示され、これらの物質の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などが開示される場合、種々の個々の及び集団としての組み合わせ、並びにこれらの化合物の置換のそれぞれの明確な言及が明示的に開示されないとしても、それぞれが本明細書に明確に企図され、記載されると解釈されるべきものである。例えば、方法が開示及び議論され、その方法を含む多くの分子に対してなされ得る多くの改変が議論される場合、そうでない旨が明確に示されない限り、上記方法のそれぞれの及び全ての組み合わせ及び置換、ならびに可能な改変が明確に企図される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせも明確に企図され開示される。この概念は、開示される組成物を用いる方法におけるステップを始めとする、但しこれに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、種々の実施可能な更なるステップがある場合、これらの更なるステップのそれぞれは、開示される方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせを用いて実行することができること、及び、かかる組み合わせまたは組み合わせの部分集合のそれぞれが明確に企図されており、開示されているとみなされる必要があることが理解されるべきものである。
【００３６】
全体を通して、範囲（例えば、１〜１０）及び約所与の値（例えば、約１または約１０）に対する言及は、記載された値または複数の値（例えば、１及び／または１０）を包含する。
【００３７】
本明細書に引用される刊行物及び該刊行物の引用の対象となる内容は、参照によりその全体が本明細書に明確に援用される。
【００３８】
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の態様を更に例証することを意図しており、特許請求の範囲の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１  粗製グリセリン発酵
４種の粗製グリセリン流を、３社の異なるバイオディーゼル製造者（Ｒｏｔｈｓａｙ社（カナダ、ウィニペグ）、ＢＩＯＸ社（カナダ、ハミルトン）及びＲＥＧ  Ｎｅｗｔｏｎ  ＬＬＣ（アイオワ州、ニュートン）から得た。これらの組成を対応する製造者によって提供された情報に基づいて表３に列挙する。異なる粗製グリセリンの間で大きなばらつきが示されることは明らかであった。
【表３】
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【００４０】
実験室規模の発酵実験を行うために、水酸化ナトリウム溶液を用いて、Ｒｏｔｈｓａｙ及びＢＩＯＸ  ６５粗製グリセリンのｐＨを５．５に調整した。ＢＩＯＸ  ９８及びＲＥＧ  Ｎｅｗｔｏｎ粗製グリセリンはｐＨ調整を行わなかった。次いで、全ての粗製グリセリン流をオートクレーブ滅菌し、これらを供給炭素の唯一の供給源として用いて、２Ｌ発酵槽中で、別個の粗製グリセリンを用いたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＯＮＣ−Ｔ１８の流加発酵を実施した。全ての初期発酵培地は、（リットル当たり）グリセリン６０ｇ、大豆ペプトン２ｇ、塩化ナトリウム１．６５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物４ｇ、リン酸二水素カリウム２．２ｇ、リン酸水素二カリウム２．４ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、塩化カルシウム二水和物０．１ｇ、塩化鉄０．００３ｇ、硫酸銅五水和物０．００３ｇ、モリブデン酸ナトリウム無水物０．００１５ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．００３ｇ、塩化コバルト六水和物０．００１５ｇ、塩化マンガン四水和物０．００１５ｇ、硫酸ニッケル六水和物０．００１５ｇ、ビタミンＢ１２  ０．００００３ｇ、ビオチン０．００００３ｇ、チアミン塩酸塩０．００６ｇを含有していた。上記２Ｌ発酵槽をＲｏｔｈｓａｙ、ＢＩＯＸ  ６５及びＢＩＯＸ  ９８の発酵に用い、５Ｌ発酵槽をＲＥＧ  Ｎｅｗｔｏｎの発酵に用いた。全ての発酵のｐＨを水酸化ナトリウム及びリン酸溶液によって４．５±０．２に制御した。全ての発酵の温度を２８℃に制御した。全ての発酵を、対応する粗製グリセリンを唯一の炭素原料として用いて、流加法で運転した。適当な時間に、ある量の粗製グリセリンを自動的に発酵槽にポンプ注入して、培地中グリセリン濃度を６０ｇ／Ｌ（２Ｌ運転）、または２０ｇ／Ｌ（５Ｌ運転）とした。
【００４１】
かかる炭素供給を、特定のバイオマス濃度及び細胞内油含有量に達するまで、発酵全体を通じて実施した。１４０ｇ／Ｌ〜１６５ｇ／Ｌの範囲の最終バイオマス濃度（図１）が達成され、６５％〜７８％の範囲の細胞内脂質を含有した（表４）。被験粗製グリセリン原料間の品質のばらつき及び該原料に適用した最小限の前処理を考慮すると、これらの結果によって、粗製グリセリン副生成物を使用した、工業的に実施可能なバイオマス及び脂質の製造を実施するために開発された上記高細胞／脂質密度流加発酵プロセスが、不安定な状況に左右されないものであることが良好に実証された。
【表４】
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【００４２】
実施例２  混合炭素源発酵
発酵による製造プラントの運転にとって、十分な且つ途切れることのない量で炭素原料が供給されることが決定的に重要である。主たる炭素原料の供給が不足する状況下においては、補助的な炭素原料の利用が可能であることが、当該プラントの持続的な運転にとって重要となり得る。そこで、グルコースと粗製グリセリンとの混合物を用いたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＯＮＣ−Ｔ１８の発酵を実施した。グルコースは、脂質製造のためのＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄの高密度発酵用の周知の炭素源ではあるが、同一の発酵でグルコースを第２の炭素源と共に用いると、炭素の異化代謝産物抑制を生じるかどうかが不明確であった。実施例１に示したものと同様の初期培地処方を用いて、２台の２Ｌ発酵槽を準備した。実施例１に示した規格のＲｏｔｈｗａｙの粗製グリセリンを入手し、７５０ｇ／Ｌのグルコース溶液も調製した。次いで、第１の発酵槽用の炭素原料として、粗製グリセリンとグルコース溶液とを８０：２０の容積比で物理的に混合し、また第２の発酵槽用の炭素原料として２０：８０の容積比で混合した。実施例１に記載したものと同様の炭素供給方法によって発酵を実施した。図２及び表５に示すデータによって実証されるとおり、粗製グリセリン及びグルコースを混合炭素原料として使用することにより、粗製グリセリンを唯一の炭素原料として用いた場合に匹敵するバイオマス及び脂質の結果を生じた。より好ましい炭素源と第２の炭素源の両方の炭素が増殖培地中に存在する場合に、前者の存在によって後者の代謝が阻害される現象である炭素の異化代謝産物抑制が、この実施例には該当しないことが見出された。発酵に際して、グリセリンとグルコースの両方が、該培養プロセスを通して同時に消費された。この実施例は、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄの工業的培養に際して、粗製グリセリンを主たる炭素源、または従たる炭素源として用いてもよく、且つ第２の炭素原料を同じ発酵で用いてもよいことを実証している。かかる炭素使用の柔軟性により、大規模な発酵プロセスの運転の安定性が確保される。
【表５】
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【００４３】
実施例３  混合粗製グリセリン発酵
実施例２と同様に、持続的な大規模プラントの運転にとって、異なるバイオディーゼル製造プロセスに由来する粗製グリセリンの混合物を使用することが可能であることも有利となるであろう。この目的のために、４種の粗製グリセリン流を等容量比で混合して、粗製グリセリン混合物を形成した。各粗製グリセリン流の規格を表６に列挙する。混合後に、この粗製グリセリン混合物を、如何なる更なる処理（例えば、ｐＨ調整、ろ過）または滅菌も行うことなく、炭素原料として使用した。この実験のために、滅菌操作の前に、初期培地のバッチにグリセリンを加えなかった以外は、実施例１に示したものと同様の処方の初期培養培地を用いて、３０Ｌの発酵槽を準備した。接種直後に、上記粗製グリセリン混合物を実施例１に記載した供給方法に従って供給し、各供給により培地中のグリセリン濃度を２０ｇ／Ｌとした。７０時間までに、バイオマスは１７１．５４ｇ／Ｌに達し、脂質は６８．００％であった。上記粗製グリセリン混合物を滅菌せずに使用したにもかかわらず、発酵には汚染がなかった。
【表６】
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【００４４】
実施例４  工業的なバイオマス及び脂質の製造のための粗製グリセリン
上記開発された工業的なバイオマス及び脂質の製造のための粗製グリセリンを用いた発酵プロセスの実施可能性を証明するために、２種の大規模な（２００，０００Ｌ）発酵を実施した。ＲＥＧ  Ｒａｌｓｔｏｎ社の粗製グリセリンを唯一の供給炭素源として、いずれの前処理または滅菌も行わずに使用した。培地処方は、初期培地のバッチに３０ｇ／Ｌのグルコースのみを加え、第１バッチにおいては１ｇ／Ｌの大豆ペプトンを用い、第２バッチにおいては１ｇ／Ｌの（大豆ペプトンに代えて）コーンスティープソリッドを用いた以外は、実施例１に記載したものと同様であった。発酵は、ｐＨ４．５±０．３で、温度を２９±１℃に制御して実施した。２回の発酵のうちの１回のバイオマス及び脂質の経時プロファイルを図３に示す一方、両方の大規模運転の全てのプロセス指標を表７に列挙する。いずれの前処理操作または滅菌操作も行わずに、バイオディーゼル粗製グリセリン副生成物を唯一の供給炭素源として用いて、２００，０００Ｌの発酵槽によって、平均で１８０．７６ｇ／Ｌのバイオマス、１２６．５３ｇ／Ｌの脂質を製造することができる。これらの結果は、バイオマス及び脂質の大規模な工業的製造のための炭素原料として、粗製グリセリンを使用することができることを実証している。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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