(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：23に記載のアミノ酸配列からなる、CTL誘発性ペプチドHBVc18。
【請求項２】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、少なくとも、配列番号：５に記載のアミノ酸配列、配列番号：６に記載のアミノ酸配列または配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含んでなるCTL誘発性ペプチド。
【請求項３】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のCTL誘発性ペプチド。
【請求項４】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のCTL誘発性ペプチド。
【請求項５】
配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のCTL誘発性ペプチド。
【請求項６】
配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のCTL誘発性ペプチド。
【請求項７】
配列番号：19に記載のアミノ酸配列からなる、ヘルパーＨ細胞誘発性ペプチド。
【請求項８】
Ｔヘルパーペプチドに連結された、請求項１〜７のいずれか１項に記載のCTL 誘発性ペプチドを含んで成るCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項９】
前記Ｔヘルパーペプチドが破傷風トキソイド（TT830-843)である、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチド。
【請求項１０】
担体に連結されている、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１１】
アセチル化されている、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１２】
パルミチル化されている、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
脂肪酸でアシル化されている、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１４】
前記CTL 誘発性ペプチドが、スペーサー分子を介して前記Ｔヘルパーペプチドに連結されている、請求項８に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１５】
前記スペーサーがAla-Ala-Ala である、請求項14に記載のCTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲート。
【請求項１６】
連結されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のCTL 誘発性ペプチド、Ｔヘルパーペプチド、及び脂質を含んで成るCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項１７】
前記CTL 誘発性ペプチドにカルボキシ末端において連結されている前記ＴヘルパーペプチドのＮ末端に前記脂質が連結されている、請求項16に記載のCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項１８】
スペーサー分子を介して、前記脂質が前記ＴヘルパーペプチドのＮ末端に連結されている、請求項16に記載のCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項１９】
前記スペーサー分子がLys-Ser-Ser である、請求項16に記載のCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項２０】
前記CTL 誘発性ペプチドがスペーサー分子を介して前記Ｔヘルパーペプチドに連結されている、請求項16に記載のCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項２１】
前記CTL 誘発性ペプチドと前記Ｔヘルパーペプチドとの間の前記スペーサー分子がAla-Ala-Ala である、請求項20に記載のCTL/Ｔヘルパー／脂質コンジュゲート。
【請求項２２】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症を発症し易い個体を同定するための方法であって：
課題の個体に由来するリンパ系単核細胞を、Ｂ型肝炎ウイルスに対するHLAクラスＩ−制限型CTL応答を誘発する、請求項１〜７のいずれか１項にに記載のＢ型肝炎ペプチド抗原とインキュベートし；次いで
その個体の、該抗原に対するCTL 応答の備わる能力、それ故慢性Ｂ型肝炎ウィルス感染症の発症のし易さをそれより決定すること；
を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記リンパ系単核細胞を末梢血液から獲得する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象の個体が急性Ｂ型肝炎感染症に苦しむ、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
転写プロモーター、前記ペプチドをコードするDNA 配列、及び転写ターミネーターを、それぞれが前記ペプチドの発現のために作動連結されて含んで成るDNA 構築体によって発現された、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２６】
CTL/Ｔヘルパーコンジュゲートであって、転写プロモーター、請求項１〜７のいずれか１項に記載のCTL 誘発性ペプチド及びＴヘルパーペプチドをコードするDNA 配列、並びに転写ターミネーターを、それぞれ前記CTL/Ｔヘルパーペプチドコンジュゲートの発現のために作動連結されて含んで成るDNA 構築体によって発現されたCTL/Ｔヘルパーコンジュゲート。
【請求項２７】
前記Ｔヘルパーペプチドが破傷風トキソイド（TT830-843)である、請求項26に記載のCTL/Ｔヘルパーコンジュゲート。
【請求項２８】
スペーサー分子を介して前記CTL 誘発性ペプチドが前記Ｔヘルパーペプチドに連結されている、請求項26に記載のCTL/Ｔヘルパーコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｂ型肝炎ウィルス（HBV)は肝細胞に感染するその性質にもかかわらず、肝細胞への損傷の直接的な原因ではないと信じられている。むしろ、非ウィルス宿主因子が肝炎の病原に包括される。HBV 感染に対する免疫応答における変化がHBV 感染にかかわる広範囲にわたる様々な症状の原因でありうると予測される。
【０００２】
急性HBV 感染の後、冒された成人の約90％が後遺症で伴うことなく回復し、そしてウィルスに対する免疫を発現せしめるか、しかし急性段階中の感染症の臨床経過自体はかなり様々でありうる。感染成人の５〜10％において、慢性HBV 感染症が樹立されてしまう。慢性HBV 感染症は無候症のキャリヤー状態から連鎖的な肝細胞懐死及び炎症に範囲することができ、そしてある状況においては肝細胞癌に到ることがある。HBV 感染に暴露された子供、特に１歳以下の者は通常慢性感染症を発症し、そして慢性感染症の主要原因を占める。世界中で約２億人がHBV で慢性的に感染されている。そして最後に、わずかなパーセンテージ（0.1〜0.5％）のHBV 感染症において、急性肝炎は、これらの患者の１／５〜１／３ぐらいしか生存できなくなるような肝臓における極度の細胞死をもたらしてしまう。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウィルスに対する免疫応答は疾患と同じように複雑である。様々な体液性及び細胞性応答がHBV のヌクレオカスピド  コアが表層抗原の様々な領域に対して同定されている。Ｔ細胞媒介免疫性、特にクラスＩ主要組織適合性複合体（MHC)−制限型細胞障害性Ｔリンパ球（CTL)にかかわるそれは、肝炎及びいくつかのその他のウィルス感染症に対する耐性に重要な役割を果たすと信じられている。CTL はクラスＩ組織適合性分子と一体化した小さなペプチドの形状にある。この抗原−特異性CTL は、刺激されたとき、ウィルス複製を阻害し、且つ感染細胞を排除する媒介体を分泌し、それ故個体の感染症からの回復に貢献する。
【０００４】
クラスＩ−制限型応答のＴ細胞レパートリーはウィルスタンパク質の一定の個々のイムノドミナントエピトープを焦点とすることを研究が示唆しているが（Bracialeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 277-281 (1989)) 、肝炎ウィルス、そして特にHBV を含む数多くのウィルスに関して、わずかなエピトープしか同定されていない。
【０００５】
また、Barnaba ら、Nature 345 : 258 (1990)はA11 制限型エピトープを同定し、一方Jin らJ. Exp. Med. 168 : 293 (1988) はA3制限型エピトープを同定している。Aichele はJ. Exp. Med. 171 : 1815-1820 (1990) はリンパ球の脈絡髄膜炎の核タンパク質に由来するペプチドによる、MHC クラスＩ依存型状態における抗ウィルスCTL 応答のインビボ誘発を示ている。最近になって、Kastら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 2283-2287 (1991)は、核タンパク質由来の遊離合成ペプチドを利用するインビボでのセンダイウィルス特異的CTL を刺激して、その後のウィルス攻撃に対する保護を授けることを述べている。
【０００６】
HBV 感染の際の肝細胞傷害はHBV 抗原に対するHLA クラスＩ−制限型CTL 応答により媒介されうることが示唆されている。HBV に対するCTL 応答を明らかにする試みにおいて、急性及び慢性HBV を有する患者由来の末梢血液リンパ球がインビトロで自己の肝細胞を殺傷できうることが示されているが、しかしその細胞溶解活性の特異性、そのHLA 制限要素、及び細胞表現型は樹立されていない。Mondelliら、J. Immunol. 129 : 2773 (1982) 及びMondelliら、Clin. Exp. Immunol. 6 : 311 (1987)を参照のこと。より近年になって、Moriyamaら、Science 248 : 361-364 (1990)は、HBV 主要エンベロープ抗原が、MHC クラスＩ−制限型の CD8+ 細胞障害性Ｔリンパ球により、及びエンベロープ特異性抗体により認識されることのできる形態において肝細胞表層にて発現されることを報告している。しかしながら、HBV 特異性CTL 活性の原因であるHBV エピトープ領域は同定されていない。
【０００７】
CD8 + CTL の発生におけるリンホカイン、例えばIL−２に関する必要性はよく樹立されているが、しかしこれらのリンホカインを供するための CD4 +Ｔヘルパー細胞の活性化についての必要性は幾分議論の余地がある。抗体生産のための結合化Ｔヘルパー−Ｂ細胞認識の概念はかなり明確にされているが、 CD8 + CTLのインビボ誘発にとっての結合化ＴヘルパーCTL 認識についての余儀のない証拠はない。例えば、Bullerら、Nature 328 : 77-79 (1987) ; Sarobeら、Eur. J. Immunol. 21 : 1555-1558 (1991) ;及びCassell とForman, Annals N. Y. Acad. Sci. : 51-60 (1991)を参照のこと。
【０００８】
HBV で慢性的に感染された個体は肝硬変及び／又は肝細胞癌を発症する危険にあり、そして疾患の伝染にとっての非常に大きなレザーバーを成してしまう。慢性的に感染した者の免疫系を刺激して適宜のHBV 抗体に応答させる及びその感染症を排除する、又は急性HBV 感染症から慢性段階への進行を防ぐことができることが望ましいであろう。更に、現存の承認されているHBV ワクチンは免疫された者の約90％しか予防しないため、より効率的な免疫性を誘引せしめるようにワクチンの免疫原性を強める又は多様化させることによって現存のワクチンを改良することが所望される。急性HBV 感染を有するどの患者が慢性HBV 感染症へと進行しがちであるかを予測し、これによって適切な処置及び注意を早期に準備せしめる手段も必要とされる。比較的驚くべきことに、本発明はこれら及びその他の関連の要望を満足せしめる。
【発明の開示】
【０００９】
本発明はHBV 抗原に対するMHC クラスＩ−制限型CTL 応答を誘発するペプチドを提供する。課題のペプチドはHBV 表層抗原又はヌクレオカプシドタンパク質の配列に由来する。一定の態様において、該ペプチドは６〜約30個のアミノ酸を含み、そしてHBV に対するMHCクラスＩ−制限型細胞障害性CTL 応答を誘発することのできる少なくとも１つのエピトープを含んでおり、ここでこのエピトープは799.10 (HBenv349-368) 〔Seq. ID No. 2 〕Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile-Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro-Ser-Leu又は799.09 (HBenv329-348) 〔Seq. ID No. 7 〕Ala-Ser-Ala Arg-Phe-Ser-Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Val-Gln-Trp-Phe-Val-Gly と称される（サブタイプayw 及びadw に関する）HBV エンベロープ抗原に属する。
【００１０】
その他のペプチド態様は６〜30個のアミノ酸を含んで成り、そしてHBenv 配列799.08 (HBenv309-328) 〔Seq. ID No. 1 〕Asn-Cys-Thr-Cys-Ile-Pro-Ile-Pro-Ser-Ser-Trp-Ala-Phe-Gly-Lys-Phe-Leu-Trp-Glu-Trp(サブタイプayw に関する）由来の少なくとも７個のアミノ酸を有している。更なる別の態様においては、ペプチドは配列Thr-Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe(サブタイプayw に関する）を有する802.03 (HBc91-110)〔Seq. ID No. 4 〕と称するHBV コア抗原配列領域に由来する。本発明のペプチドは、HBV CTL 活性を刺激する又は類似拮抗体として作用するペプチドの能力が実質的に損なわれない限り、Ｎ及びＣ末端の一方又は両方において任意的にフランクされている及び／又は改質されているか、このペプチドに置換、欠失及び付加がなされていてよい。
【００１１】
様々なペプチドの態様において、該ペプチドは大きめのホモポリマーを形成するようにそれ自体に対して、又はヘテロポリマーを形成するように別のペプチドに対して、それぞれ例えば重合又は共役を介して共有結合していることができる。ある状況において、ペプチドは混合物として組成物の中に組合わされ、従って結合していないことがある。CTL 誘発性ペプチドは例えばＴリンパ球応答を高めることのできる脂質含有分子に連結しているか、又はＴヘルパー細胞応答を誘発するＴヘルパーペプチドに連結しているか、又は脂質含有分子及びＴヘルパーペプチドの両者に連結していてよい。脂質又はＴヘルパーペプチドに対する連結はアミノ又はカルボキシ末端のいづれにおいてでよい。
【００１２】
本発明のペプチドを追加のペプチド、リポソーム、アジュバント及び／又は薬理学的に許容されている担体と一緒に配合されて含んで成る組成物を提供する。従って、薬理組成物を急性HBV 感染症の処置方法において、特にこの感染症が慢性又はキャリヤー状態へと進行することを予防する試みにおいて利用できる。慢性HBV 感染症及びHBV キャリヤー状態を処置するための方法も提供し、ここで該薬理組成物を感染個体に、HBs 及びHBc エピトープに対する免疫学的に有効なCTL 応答を刺激するのに十分な量で投与する。
【００１３】
これらの感染症を処置するには、HBV 抗原に対するMHC クラスＩ制限型CTL応答を誘発するペプチドを、その他のHBV 抗原に対する免疫応答を誘発するその他のペプチド又はタンパク質と組合せることが特に所望されうる。慢性又はキャリヤー状態の感染症を有する個体を処置するには、該組成物を初期用量で投与し、続いて一定期間にわたってそのブースティング用量を、感染症を治す又は実質的に緩和するのに必要なだけ投与してよい。
【００１４】
急性感染症からの慢性HBV 感染症に至る進行を防ぐことを含むHBV 感染症の予防のためのワクチン組成物も提供する。このワクチン組成物はMHC クラスＩ制限型CTL 応答を誘発する免疫学的に有効な量のHBV ペプチドを含んで成る。HLA-A2ハプロタイプ個体の場合、このプペプチドはペプチド799.08 (HBenv309-328) 〔Seq. ID No. 1 〕、799.09 (HBenv329-348) 〔Seq. ID No. 7 〕、799.10 (HBenv349-368)〔Seq. ID No. 2 〕及び／又は802.03 (HBc91-110)〔Seq. ID No. 4〕のいづれかに由来してよく、そして典型的には更にアジュバント、例えばフロインドアジュバント、水酸化アルミニウム等を含んで成るであろう。
【００１５】
HBV に対する強められた予防を得るため、このワクチンはHBV 抗原に対する防御性の細胞及び／又は抗体の応答を誘発せしめる追加の成分を含んで成ってよい。好ましい態様においては、CTL 誘発性ペプチドを、Ｔヘルパーエピトープを含む１又は複数のＴヘルパーペプチドと一緒に投与する。Ｔヘルパーペプチドの選択は、Ｔヘルパーペプチドを含むワクチン組成物を予防的に、又は治療的に投与するかどうかに依存する。予防的投与の場合、ＴヘルパーペプチドはHBV エンベロープもしくはコアに由来する１もしくは複数のHBV ペプチドであるか、又はその他の生物に由来するタンパク質、例えば破傷風トキソイド、インフレンザ、パラインフレンザ、マラリヤ、エプステインバーウィルス、単純ヘルペス及び当業者に公知のその他のものであろう。
【００１６】
治療的投与の場合、Ｔヘルパーエピトープは好ましくはHBV 以外の感染因子に由来するタンパク質か選ばれたペプチドであろう。Ｔヘルパーペプチドのいくつかの例はHBc 128-140, HBc 1-20, HBc 50-69及びHBc 111-125 破傷風トキソイド830-843 、並びにインフレンザ307-319 である。このＴヘルパーペプチドはCTL 誘発性ペプチドと一緒に、又は別々に投与してよいが、しかしCTL 及びＴヘルパーペプチドが連結していることが好ましい。ペプチドの連結はスペーサー分子、例えばアミノ酸残基、例えばアラニン、又はその他の比較的中性な残基で構成されうる。
【００１７】
更なる別の態様において、本発明は診断のための方法に関連し、この場合、本発明のペプチドは、個体におけるHBV 表層又はヌクレオカプシド抗原に対して細胞障害性Ｔ細胞応答が可能なリンパ球の存在を決定するために利用される。かかる細胞がないことは、対象の個体が慢性HBV 感染の発症に感受性であるかどうかを決定せしめる。典型的には、リンパ球は末梢血液リンパ球とし、そして対象の個体は急性HBV 感染症に苦しむ者である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明はHBV 感染症の処置、予防及び診断のための組成物及び方法において利用するための、HBV エンベロープ抗原（HBenv ; 表層抗原又はHBs とも呼ぶ）及びヌクレオシドコア（HBc)タンパク質の配列に由来するペプチドを提供する。該ペプチドはHBV 感染細胞に対するMHC HLA クラスＩ−制限型CTL 応答が可能である。リンホカイン（例えばガンマーインターフェロン）を分泌する、並びに細胞殺傷を伴うか伴わないで感染自己細胞又は移入細胞におけるウィルス複製を阻害する生成物（例えばタンパク質分解酵素、例えばセリンエステラーゼ）を遊離する刺激化CTL は、慢性HBV 感染症を妨害又は実質的に予防することができる。あらゆる状況において、効果的な細胞障害性Ｔ細胞応答と特定のHBV 抗原に対する保護的抗体応答との組合せは、HBV 感染症を予防又は終らせるのに最も効果的であろう。
【００１９】
好ましい態様において、本発明のペプチドはHBV 表層抗原又はヌクレオカプシドポリペプチド、コア及びプレコア内に由来する。本明細書記載のより好ましい態様において、CTL 誘発性ペプチドはHBenv 309-328(ペプチド799.08）、HBenv 329-348(ペプチド799.09)、HBenv 349-368(ペプチド799.10）の領域、又は領域HBc 91-110（ペプチド802.03）に由来し、ここでその番号は引用することで本明細書に組入れているGalibertら、Nature 281 : 646 (1979) に従っている。
【００２０】
本発明の「CTL 誘発性ペプチド」又は「オリゴペプチド」とは、HBenv もしくはHBc タンパク質の特定のエピトープ領域、又はその他の有効な標的抗原、例えば腫瘍関連抗原、例えば限定することなく、腎細胞癌、乳癌、癌胎児性抗原、黒色腫（MAGE-1）抗原及び前立腺癌特異的抗原、Ｃ型肝炎抗原、エプステインバーウィルス抗原、HIV-１及びHIV-２抗原、並びにパピロマウィルス抗原のようなその他のエピトープ領域に由来する、少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは８〜10個、時折り11〜14個の残基、そして通常は約30以下の残基、より通常には約25個以下、そして好ましくは15個以下、例えば８〜14個のアミノ酸残基の鎖を意味している。
【００２１】
下記により詳しく説明する通り、Ｂ型肝炎に関して、前記ペプチドの通常は少なくとも４個、時折り６個、しばしば７個以上の残基、又はこのペプチドの過半数のアミノ酸が、HBenv 309-328(ペプチド799.08）もしくはHBenv 329-348(ペプチド799.09）もしくはHBenv349-368(ペプチド799.10）として同定されている天然のHBenv 配列、又はHBc の領域HBc 91-110（ペプチド802.03）の対応部分と比較したときに、同一又は相同であろう。
【００２２】
該ペプチドは下記の通り「合成的」に、又は組換DNA 工学によって製造されうる。該ペプチドはその他の天然のHBV タンパク質及びそのフラグメントを実質的に含まないことが好ましいであろうが、ある態様においては、該ペプチドは天然のフラグメント又は粒子に合成的にコンジュゲートされていてよい。ペプチドなる語は本明細書においてポリペプチドと同義語として、一連のアミノ酸であって隣り同志のアミノ酸のアルファーアミノ基とアルファーカルボキシ基とのペプチド結合によって互いに接続されているものを称するように利用されている。このポリペプチド又はペプチドはあらゆる長さでよく、中性（無荷電）状態にあるか又は塩の形態であってよく、そして改質、例えばグリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化を含まないか、又は該ポリペプチドの本明細書に記載の生物学的活性をその改質が損わないことを条件としてそれらの改質を含んでいてよい。
【００２３】
該ペプチドは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持し続けながら、できるだけ小さいことが所望される。可能なら、細胞表層上のMHC クラスＩ分子に結合する内因性的にプロセスに付されたウィルスペプチドとサイズにおいてつり合う８〜12個のアミノ酸残基の長さへと本発明のペプチドを最適化することが所望されうる。一般的には本明細書に引用することで組入れるSchumacherら、Nature 350 : 703-706 (1991) ; Van Bleek ら、Nature 348 : 213-216 (1990) ; Rotzschke ら、Nature 348 : 252-254 (1990) ; 及びFalkら、Nature 351 : 290-296 (1991) を参照のこと。生物学的活性とは、適当なMHC 分子に結合する能力、CTL 応答を刺激するのに有用なペプチドの場合には、HBV 抗原又は抗原擬態物に対するCTL 応答を誘発せしめる能力を意味する。
【００２４】
ペプチド類似体拮抗剤の場合、この類似体はもしそれがMHC 分子に対する結合に関して該ペプチドと競合し、且つ天然ペプチドに比して実質的に低いCTL 応答刺激能力を有するとき、それは生物学的活性を有しているであろう。CTL 応答とは、課題のHBV 抗原に対する特異的な CD8+ Ｔリンパ球応答を意味し、この場合 CD8+ 、即ち、MHC クラスＩ−制限型Ｔリンパ球は活性化される。前述した通り、活性化Ｔリンパ球はウィルス複製を阻害せしめ、且つHBV 感染（又は移入）細胞を殺すもしくは殺さない様々な生成物を分泌するであろう。
【００２５】
本明細書で用いている「相同性」、「実質的に相同性」及び「実質的相同」なる語は、ある配列を対照のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。配列の同一性又は相同性のパーセンテージは一方を他方と、対照の配列の対応領域で並べたときの比較によって計算する。
【００２６】
本発明のCTL 誘発性HBenv ペプチドは６〜36個のアミノ酸を含んで成り、そして799.08ペプチド領域HBenv 309-328 に由来し、CTLエピトープ部位を含み、そして少なくとも７個のアミノ酸を有しており、ここで該ペプチドのアミノ酸の過半数は、天然のHBenv 309-328 配列の対応の領域を構成するアミノ酸と比較したとき、同一又は実質的に相同性であろう。この領域の代表的なペプチドはペプチドHBenv 309-328 であり、これは下記の配列（HBV サブタイプaywに関する）を有す：
【００２７】
799.08（HBenv309-328）〔Seq. ID No. 1 〕Asn-Cys-Thr-Cys-Ile-Pro-Ile-Pro-Ser-Ser-Trp-Ala-Phe-Gly-Lys-Phe-Leu-Trp-Glu-Trp(ここでこのペプチドは任意的に、本明細書で更に説明する通り、所望するならば、そのＮ−及びＣ−末端の一方又は両方において、HBV 配列、特にHBenv に由来するアミノ酸、担体等に連結されている別のＮ−及びＣ−末端改質体への連結を助長せしめるように付加するアミノ酸によってフランク及び／又は改質されていてよい）。HBV サブタイプadw に関しては、Gly 322 はAla 、そしてPhe 324 はTyr に置き代わられている。このペプチドHBenv 309-328 は少なくともMHC クラスＩ分子HLA-A2により媒介されるCTL 応答を誘発する。
【００２８】
本発明の他のHBenv CTL 誘発性ペプチドの態様は、799.10ペプチド領域HBenv 349-368 の６〜20個のアミノ酸を含んで成り、そして少なくとも７個又はそれより多くのアミノ酸のエピトープ部位を含むHBenv 349-368 に由来するペプチドを含み、ここで該ペプチドの過半数のアミノ酸はHBenv 349-368 として同定されている天然のHBenv 配列の対応領域と比較したときに同一又は相同性であり、ここでHBenv 349-368 は下記の通りである（HBV サブタイプayw 及びadw に関する）：
【００２９】
799.10（HBenv349-368）〔Seq. ID No. 2 〕Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile-Trp-Met-Met-Trp-Tyr-Trp-Gly-Pro-Ser-Leu(ここで前記領域から選ばれたペプチドは本明細書に記載の通り一方又は両方の末端においてフランク及び／又は改質されていてよい）。Ｂ型肝炎ウィルスに対するMHC クラスＩ−制限型細胞障害性Ｔ−リンパ球応答を誘発できる少なくとも１エピトープを含む799.10（HBenv 349-368)の領域由来の他のCTL 誘発性ペプチドの例は：
884.02（HBenv349-358）〔Seq. ID No. 3 〕Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val-Ile である。
【００３０】
本発明の更なる他のCTL 誘発性ペプチド態様はHBenv 領域のHBenv329-348 に由来する。ペプチド799.09（HBenv 329-348)に加えて、これらの態様には、HBV に対するMHC クラスＩ−制限型CRL 応答を誘発できるHBenv 329-348 の配列内のエピトープ部位を含むペプチドが挙げられる。HBV サブタイプayw に関するHBenv 329-348 は下記の配列を有する：
799.09（HBenv329-348）〔Seq. ID No. 7 〕Ala-Ser-Ala-Arg-Phe-Ser-Trp-Leu-Ser-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Val-Gln-Trp-Phe-Val-Gly。
【００３１】
更なる態様において、本発明のペプチドはHBc 領域のHBc 91-110に由来し、そして更に、ペプチド802.03（HBc 91-110）は、少なくとも７個、そして好ましくは９個のアミノ酸のエピトープ部位を含むペプチドを含んでおり、ここで該ペプチドの過半数のアミノ酸は天然のHBc 91-110のHBc 配列の対応領域のアミノ酸と比較したときに同一又は実質的に相同性であり、ここでHBV サブタイプayw に関するHBc 91-110の配列は下記の配列を有する：
802.03（HBc91-110)〔Seq. ID No. 4 〕Thr-Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe（ここで、前記領域から選ばれたペプチドは本明細書に記載の通り、一方又は両方の末端においてフランク及び／又は改質されていてよい）。
【００３２】
HBV サブタイプadw のペプチドに関しては、Phe 97はIle 、そしてLeu 101 はTrp により置き代わられている。このCTL 誘発ペプチド802.03は、少なくともMHC クラスＩ分子HLA-A2.1により媒介されるCTL 応答を誘発する。802.03（HBc 91-110）〔Seq. ID No. 4 〕の領域に由来し、且つＢ型肝炎ウィルスに対するMHC クラスＩ−制限型細胞障害性Ｔ−リンパ球応答を誘発できるエピトープを含むCTL 誘発性ペプチドの例には以下が含まれる：
883.02（HBc92-101)〔Seq. ID No. 5 〕Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu 、
（HBc92-100)〔Seq. ID No. 9 〕Asn-Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu 及び
883.03 (HBc93-102)〔Seq. ID No. 6 〕Met-Gly-Leu-Lys-Phe-Arg-Gln-Leu-Leu-Trp 。
【００３３】
前述した通り、オリゴペプチド又はペプチド末端に追加のアミノ酸を付加させて、本明細書に記載の理由のため、該ペプチド又はオリコペプチドの物理的又は化学的性質を改質するため、等のために、ペプチドを互いに連結し易くするようにすることができる。アミノ酸、例えばチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸等をこのペプチド又はオリゴペプチドのＣ−又はＮ−末端に導入してよい。更に、このペプチド又はオリゴペプチドは、末端NH2 アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ1 −Ｃ20）もしくはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシアミド化（例えばアンモニア、メチルアミン）等によって改質されることで、天然配列と相違してよい。ある状況において、これらの改質は支持体又はその他の分子への連結のための部位を担うことができる。
【００３４】
CTL 刺激活性を有する本発明のペプチド又はその類似体はその他の所望される特質、例えば向上した薬理学特性を供しながら、未改質ペプチドの生物学的活性を高める又は少なくともその実質的に全てを残すように改質されうる。例えば、該ペプチドは本明細書に開示している配列に由来するペプチドの例えばアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいづれかでのアミノ酸の付加もしくは削減による、伸長、削減又はペプチドアミノ酸配列における置換によって改質されうる。下記に更に説明する通り、課題のペプチドのCTL 活性は、破傷風トキソイド 830-843、インフレンザ 307-319、マラリアサーカムスポロゾイト 382-398及び378-389 、オバルブミン 323-336、並びにHBc 128-140 、HBc 1-20、HBc 50-69 及びHBc 111-125 内に含まれているようなＴヘルパー細胞を誘発できる少なくとも１エピトープを含む配列への結合によって高めることができる。
【００３５】
本発明において利用されるペプチドは、ペプチド799.08、799.09、799.10もしくは802.03、又は特定のHBV 表層抗原もしくはヌクレオカプシドタンパク質配列とは、課題の化合物が適当なMHC 分子に結合することができ、そして４種のHBV の主要サブタイプのうちの少なくとも１つに対する細胞障害性Ｔリンパ球活性を供することができる限り（ただしペプチド類似体拮抗体の場合、本明細書で更に説明する通り、MHC 分子に結合するが、実質的に低いCTL 活性刺激能力を有する）、同一である必要はない。
【００３６】
従って、該ペプチドは様々な変化、例えば挿入、欠失及び置換（保存的又は非保存的のいづれでもよい）に付されてよく、ここでかかる変化はその用途において一定の利点を供しうる。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／又は化学的に類似な別のものに交換すること、例えばある疎水性残基を別のものに、又はある極性残基を別のものに交換することを意味する。この置換には、Gly, Ala ; Val, Ile, Leu ; Asp, Glu ; Asn, Gln ; Ser, Thr ; Lys, Arg ;及びPhe, Tyrのような組合せが含まれる。
【００３７】
通常、HBV CTL 刺激性エピトープを実質的に擬態することを意図する配列の領域は、例えば連結又は複合化のし易さのためにペプチドの物理的又は化学的性質を改質せしめる目的のためにいづれかの末端において追加のアミノ酸が付加されている場合を除き、HBV の少なくとも１サブタイプの配列から約20％以上相違しないであろう。ペプチド配列の領域がHBV サブタイプにわたって多型性であることが見い出されている状況においては、種々のHBV株又はサブタイプの異なる細胞障害性Ｔリンパ球エピトープをより効果的に擬態するように１又は複数の特定のアミノ酸を変更することが所望されうる。
【００３８】
CTL エピトープ、例えばペプチド領域799.08（HBenv 309-328)、ペプチド領域799.09（HBenv 329-348)、ペプチド領域799.10（HBenv349-368)又はペプチド領域802.03（HBc 91-110）を含むものとして本発明により同定されたペプチド配列領域の中には、該ペプチドにその生物学的活性、即ち、HBV 表層及び／又はヌクレオカスピド抗原を発現するHBV 感染細胞に対するクラスＩ−制限型細胞障害性Ｔ−リンパ球応答を刺激する能力を保持させる残基（又は実質的に機能的に同等であるもの）がある。これらの残基は単一アミノ酸置換、欠失又は挿入によって同定できる。更に、残基の側鎖の機能は特定のアミノ酸（例えばAla)による系統学的なスキャンにより探り当てることができる。
【００３９】
多重置換に耐えるペプチドは一般に小さく、比較的中性な分子、例えばAla, Gly, Pro 又は類似の残基のような置換を含む。置換、付加又は削除できる残基の数及びタイプは、必須のエピトープ点と、追求される一定のコンホメーション的及び機能的特質（例えば疎水性、対、親水性）との間に必要とされる間隔に依存するであろう。所望するなら、CTL への供与のためのペプチド類似体のそのMHC 分子に対する高められた結合親和力も、かかる変更によって達成されうる。一般に、エピトープ的に及び／又はコンホメーション的に重要な残基間での任意のスペーサー置換、付加又は欠失は、結合性を損うことがある立体障害及び電荷干渉を避けるように選ばれるアミノ酸又はその他の成分を利用すべきである。
【００４０】
所望の生物学的活性を維持しながら置換に耐えるペプチドはＤアミノ酸含有ペプチドとしても合成されうる。かかるペプチドは「インバーソ（inverso)」又は「レトロ−インバーソ（retro-inverso)」形状として、即ち、配列のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置き換える、又はアミノ酸配列を反転させ、そしてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置き換えることによって合成されうる。Ｄ−ペプチドはペプチダーゼに対して実質的により耐性であり、それ故Ｌ−ペプチド対応物に比して血液及び組織の中でより安定であるため、生理学的条件のもとでのＤ−ペプチドの安定性は対応のＬ−ペプチドに比してのアフィニティーの相違を補うであろう。更に、置換を有する又は有さないＬアミノ酸含有ペプチドは抗原性ペプチドのエキソペプチダーゼ分解を阻止するＤ−アミノ酸でキャップされていてよい。
【００４１】
１又は複数種の患者又はHLA タイプにおいてHBV 特異性CTL 応答を刺激せしめるのに担う本発明の種々のペプチドを同定したら、ある状況において組成物の中で２種以上のペプチドを組合せることが所望されうる。この組成物中のペプチドは同一でも異なっていてもよく、そして一緒になってそれらはもとのペプチドと同等又はそれより高い生物学的活性を供するであろう。
【００４２】
例えば、本明細書に記載の方法を利用して、２種以上のペプチドは特定領域、例えばペプチド領域799.08（HBenv 309-328)、ペプチド領域799.09（HBenv 329-349)、799.10（HBenv 349-368)、又はペプチド領域（HBc 91-110)に由来する異なる又は重複するCTL エピトープを規定しうるものであってよく、これらのペプチドCTL 応答に対する強められた免疫原性を供する「カクテル」において組合せてよい。ある領域のペプチドを、別のMHC 制限要素を有するペプチドと組合せてもよい。この組成物は様々な集団にわたる本発明の治療的、ワクチン的、又は診断的方法及び組成物により供される免疫適用範囲を有効に広げるために利用できる。
【００４３】
本発明のペプチドはポリマー（多量体）を形成するよう連結を介して組合されうるか、又は連結抜きの混合物として組成物の中で配合されうる。同じペプチドを互いに連結させ合うとき、それ故ホモポリマーを作るとき、複数の反復エピトープ単位が供される。ペプチドが異なるとき、例えば種々のHBV サブタイプ、サブタイプ内での種々のエピトープ、種々のHLA 制限特異性、又はＴヘルパーエピトープを含むペプチドを供するカクテルのとき、反復単位を有するヘテロポリマーが供される。共有結合の他に、分子間又は構造内結合の形成の可能な非共有結合も考慮される。
【００４４】
ホモ−もしくはヘテロ−ポリマーのための、又は担体への複合化のための連結は様々な方法で供されうる。例えばシステイン残基をアミノ−及びカルボキシ末端の両方に加えてよく、この場合このペプチドはシステイン残基のコントロールされた酸化を通じて共有結合させる。更に有用なのは数多くのヘテロ二価試薬であり、これは一方の官能基末端でのジスルフィド連結及び他方でのペプチド連結を作りあげるものであり、それにはＮ−スクシジミジル−３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）が含まれる。この試薬はそれ自体と、あるタンパク質中のシステイン残基とのジスルフィド結合、及び他のものにおけるリジン上のアミノ又はその他の遊離アミノ基を通じてのアミド結合をもたらす。
【００４５】
様々なかかるジスルフィド／アミド形成試薬が知れている。例えば、Immun. Rev. 62 : 185 (1982) を参照のこと。その他の二価カップリング試薬はジスルフィド結合ではなく、チオエーテル結合を形成する。数多くのこのようなチオエーテル形成試薬が市販されており、そして６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等の反応性エステルが含まれる。
【００４６】
カルボキシル基はそれらをスクシニミド又は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と組合せることによって活性化できうる。特に好ましいカップリング剤はスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）である。むろん、この連結は、連結されたどの基もが、例えば前記したようにHBV 細胞障害性Ｔ細胞決定基として、ペプチド類似体CTL 拮抗体として、又はHBV Ｔヘルパー決定基として機能することを実質的に妨害してはならない。
【００４７】
別の観点において、本発明のペプチドを、HBV Ｔヘルパー細胞エピトープ、即ち、エンベロープ、コア又はその他の免疫原タンパク質又はそれらの誘導体に由来し、HBV に対する細胞障害性Ｔ細胞の誘発において協力するＴ細胞を刺激するＴヘルパーエピトープを含む６〜30個のアミノ酸を含んで成るＴヘルパーペプチドを供するその他のペプチドと組合せる又は複合させてよい。このＴ−ヘルパー細胞は例えばＴ−ヘルパー１又はＴ−ヘルパー２表現型のいづれかでもよい。
【００４８】
Ｔ−ヘルパーペプチド及びCTL ペプチドの組成物は従ってHBV に対する細胞媒介型免疫性及び保護抗体を供することによって個体の免疫性を高める。Ｔ−ヘルパーエピトープは配列Met-Asp-Ile-Asp-Pro-Tyr-Lys-Glu-Phe-Gly-Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro 〔Seq. ID No. 10〕を有するHBc 1-20として同定された。その他のＴ−ヘルパーエピトープは、配列Pro-His-His-Tyr-Ala-Leu-Arg-Gln-Ala-Ile-Leu-Cys-Trp-Gly-Glu-Leu-Met-Tyr-Leu-Ala 〔Seq. ID No. 11〕を有する領域HBc 50-69 、並びに配列Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu 〔Seq. ID No. 12〕（ここでIle 116 はHBV adwサブタイプにおいてはLeu である）を有するHBc 100-119 配列Glu-Tyr-Leu-Va-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala〔Seq. ID No. 13 〕を有するHBc 117-131 、及び配列Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile 〔Seq. ID No. 14〕を有するペプチドHBc 120-139 を含むHBc100-139 の領域に由来するペプチドにより供される。
【００４９】
Ferrari ら、J. Clin. Invest. 88 : 214-222 (1991)、及び米国特許第4,882,145号を参照のこと（それぞれ引用することで本明細書に組入れる）。その他のＴヘルパーエピトープは、例えば配列Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu (QYIKANSKFIGITE)〔Seq. ID No. 15〕を有する破傷風トキソイド 830-843；マラリヤサーカムスポロゾイト 382-398 Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser (KIAKMEKASSVFNVVNS)〔Seq. ID No. 16 〕；マラリヤサーカムスポロゾイト 378-398 Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser (DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS) 〔Seq. ID No. 17〕；オパルブミン 323-336 Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu〔Seq. ID No. 35〕及びインフレンザエピトープ307-319 Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr〔Seq. ID No. 18〕のようなペプチドにより供される。
【００５０】
好ましい態様において、本発明のCTL 誘発性ペプチドはＴヘルパーペプチドに共有結合している。特に好ましくは、CTL 誘発性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートはスペーサー分子によって連結されている。他方、CTL ペプチドはスペーサー抜きでＴヘルパーペプチドに連結されていてよい。このスペーサーは典型的には比較的小さい中性分子、例えばアミノ酸又はアミノ酸擬態物であって、生理学的な条件のもとでは実質的に無電荷であり、そして線形又は枝分れ側鎖を有しうるものを含んで成る。これらのスペーサーは典型的には例えばAla, Gly、又はその他の非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の中性スペーサーより選ばれる。
【００５１】
本明細書の一定の好ましい態様において、中性スペーサーはAla である。任意的に存在するスペーサーは同じ残基より構成されている必要はなく、従ってヘテロ−又はホモ−オリゴマーであってよいことが理解されるであろう。好ましい典型的なスペーサーはAla のホモ−オリゴマーである。存在しているなら、このスペーサーは通常は少なくとも１又は２個の残基数、より通常には３〜６個の残基数であろう。
【００５２】
別の態様において、該ヘルパーペプチドはCTL ペプチドにコンジュゲートされており、好ましくはそのＴヘルパーペプチドはアミノ末端に位置している。このペプチドは中性リンカー、例えばAla-Ala-Ala 等によって連結されていてよく、そして好ましくは脂質残基、例えばパルミチン酸等を更に含んでおり（下記に更に詳しく説明する）、それらはLys 残基のアルファー及びエプシロンアミノ基に付加されており（（PAM)2 Lys)、ここでこのLys 残基は典型的にはSer-Ser 結合等を通じてペプチドコンジュゲートのアミノ末端に付加されている。
【００５３】
CTL 誘発性ペプチドはCTL ペプチドのアミノ又はカルボキシ末端のいづれかに、直接的又はスペーサーを介してのいづれかでＴヘルパーペプチドに連結されていてよい、CTL 誘発性ペプチド又はＴヘルパーペプチドのいづれかのアミノ末端はアシル化されていてよい。更に、CTL ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは下記に説明する通り、１又は複数の連結残基、例えばGly, Gly-Gly, Ser, Ser-Serを介して一定のアルカノイル（Ｃ1 −Ｃ20）脂質に連結されていてよい。
【００５４】
下記の典型的な態様において、実質的にHBc 128-140 (Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile-Leu)〔Seq. ID No. 19〕内に由来するＴヘルパーペプチドは、CTL ペプチド（HBc 18-27)に連結しているとき、試験した全ての動物における動物の特異的なCTL 感作を誘発し、そしてそのレベルは、投与したCTL ペプチドとＴヘルパーペプチドとが連結されていないときよりも高かった。Ｔヘルパー及びCTL HBV ペプチドがAla-Ala-Ala スペーサーにより連結されているとき、その特異的なCTL 活性はスペーサー抜きで連結させたペプチドによる特異的なCTL 活性の誘発より高い。これらの結果は、免疫原として、HBV Ｔヘルパーエピトープを含むペプチドにスペーサーを介して連結されているCTL エピトープを含むペプチドを用いたときの、HBV 抗原を表示する細胞に対する強いCTL 応答を示唆している。
【００５５】
本発明のペプチドは様々な方法で調製できる。その比較的短い長さのため、これらのペプチドは常用の技術に従って溶液中又は固相支持体上で合成されうる。様々な自動合成装置が市販されており、そして公知のプロトコールに従って利用されうる。例えば、引用することで本明細書に組入れる、Stewart とYoung, Solid Phase Peptide Synthesis,第２版., Pierce Chemical Co. (1984) ; Tamら、J. Am. Chem. Soc. 105 : 6442 (1983) ; Merrifield, Science 232 : 341-347 (1986) ;  及びBaranyとMerrifield, The Peptides, Gross とMeienhofer, 編., Academic Press, New York,  頁 1-284(1979)を参照のこと。
【００５６】
他方、組換DNA 技術を利用することができ、この場合、課題のCTL ペプチド及び／又はＴヘルパーペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主細胞の中に形質転換又はトランスフェクトし、そして発現にとって適切な条件のもとで培養する。これらの手順は当業界に一般的に知られており、開示内容を引用することで本明細書に組入れている、例えばSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982) 及びAusubelら、（編) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York (1987),並びに米国特許第4,237,224 、4,273,875 、4,431,739 、4,363,877 及び4,428,941 号に記載されている。
【００５７】
従って、本発明の１又は複数のペプチド配列を含んで成る融合タンパク質はHBV 細胞障害性Ｔ細胞決定基を供するように利用できる。例えば、組換HBV 表層抗原であって、そのHBenv アミノ酸配列が、CTL 応答を刺激する本明細書に記載のペプチド領域のエピトープをより効率的に提供するように変更されているものを調製する。このことは、複数のＴ細胞エピトープを含むポリペプチドを利用することを意味する。
【００５８】
本明細書で考慮している長さのペプチドに関するコード配列は化学的技法、例えばMatteucci ら、J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185(1981)のホスホトリエステル法により合成できるので、天然ペプチド配列をコードするものについての適当な塩基の置換によって改質は簡単に行うことができる。従って、コード配列に適当なリンカーを施し、そして当業界において一般に入手できる発現ベクターへとリゲートせしめ、次いで所望の融合タンパク質を生成するように適当な宿主を形質転換させるためにこのベクターを利用する。
【００５９】
数多くのかかるベクター及び適当な宿主系は現在入手できる。融合タンパク質の発現のためには、コード配列に作動連結型開始及び停止コドン、プロモーター及びターミネーター領域、並びに通常は所望の細胞宿主の中での発現のための発現ベクターを供する複製系が施されるであろう。むろん、適当なベクター及びコントロール配列を利用して、酵母又は哺乳動物細胞宿主を利用してもよい。
【００６０】
本発明のペプチド並びにその薬理学的及びワクチン的組成物はHBV 感染症を処置及び／又は予防するための哺乳動物、特にヒトへの投与にとって有用である。このペプチドはHBV 感染細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球応答を刺激するように利用されるため、この組成物は急性及び／又は慢性HBV 感染症を処置又は予防するのに利用できうる。
【００６１】
薬理組成物に関しては、該ペプチド、即ち上記した本発明のCTLペプチド又はCTL/ＬヘルパーペプチドはHBV で既に感染されている個体に投与されるであろう。感染のインキュベーション段階又は急性段階にある者は、適宜、他の処置と独立して、又は一緒にこの免疫原ペプチドによって処置してよい。治療的用途においては、組成物をHBV に対する効果的なCTL 応答を誘発する、且つその症状及び／又は合併症を治す又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で患者に投与する。これを成し遂げるのに適切な量を「治療的に有効な量」と定義する。
【００６２】
この使用にとって有効な量は、例えばペプチド組成、投与方法、処置すべき疾患の段階及び重症度、患者の体重及び一般的な健康状態、かかり付けの医師の判断に依存するであろうが、しかし一般的には初期免疫（即ち、治療的又は予防的投与）に関する範囲は70kgの患者に関して約1.0μｇ〜約500 μｇのペプチドに範囲し、患者の血液における特異的なCTL 活性の測定による患者の応答及び状態に応じて、数週間から数ヶ月にわたるブースティング療法に従う約1.0μｇ〜約100 μｇのペプチドのブースティング投与がそれに続く。
【００６３】
本発明のペプチド及び組成物は重症な疾患状態、即ち生命の脅かされている又は潜在的に生命の脅かされている状況において一般に利用されうることを念願におかなくてはならない。かかるケースにおいて、最少限の外生物質及びペプチドの比較的無毒な性質の見地において、処置する医師がかなり大量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、且つ所望されうると思われる。
【００６４】
該組成物の一回又は数回の投与が、処置する医師により選ばれる投与レベル及びパターンに従って実施されうる。あらゆる状況において、この薬理製剤は本発明の細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドは患者を有効に処置するのに十分な量で供するべきである。
治療的用途のため、投与はHBV 感染症の一次徴候で始めるか、又は急性感染症の場合は診断されたすぐ後に始めるべきであり、少なくとも症状が実質的に緩和するまで、更にはその後一定期間にわたるブースティング投与を続ける。慢性感染症においては、負荷投与、それに続くブースティング投与が必要とされうる。急性肝炎の処置の際のHBV に対する効果的なCTL 応答の誘発は、慢性肝炎、HBV キャリヤー段階、及び続発性肝細胞癌へのその後の進行の可能性を低くするであろう。
【００６５】
本発明の組成物による感染個体の処置は、急性感染個体における感染症の治癒を早めることができる。慢性感染症に進行し易い（又は予測される）個体にとって、該組成物は急性から慢性感染症に至る進行を防ぐのための方法において特に有用である。例えば本明細書に記載の通り、感受性個体が感染前又は中に同定されたとき、該組成物をその者を標的とすることができ、大量の人々への投与の必要性を小さくする。
【００６６】
該ペプチド組成物は慢性肝炎の処置のため、及びウィルス感染細胞を排除するようにキャリヤーの免疫系を刺激するためにも利用できる。慢性肝炎を有する者は感染後約３〜６ヶ月経て、ウィルスについての陽性を試験することにより同定できる。個体はその感染症の急性段階の際の不適切なCTL 応答（又はそれがないこと）によって慢性HBV 感染症に進行しうるため、細胞障害性Ｔ細胞応答を有効に刺激するのに十分なる、製剤中での免疫可能ペプチドの量及び投与態様を施すことが重要である。
【００６７】
従って、慢性肝炎の処置のためには、代表的な投与量は一回の投与当り、70kgの患者にとって約1.0μｇ〜約500 μｇ、好ましくは約５μｇ〜100 μｇの範囲にある。投与は少なくとも臨床症状又は実験室指標が、HBV 感染症が排除又は実質的に緩和するまで、そしてその後もしばらく続けるべきである。免疫投与、それに続く確立された間隔、例えば１〜４週間の間隔でのブースティング投与が、感染症を治癒せしめるのに必要なだけ、可能としては長期にわたって必要とされる。慢性及びキャリヤーHBV 感染症の処置のためには、CTL ペプチドを、その他のHBV 抗原、例えばHBs Agに対する免疫応答を誘発するその他のペプチド又はタンパク質と組合せることも所望されうる。
【００６８】
本発明の別の態様において、慢性活性型肝炎は拮抗剤としての抗原性エピトープ類似体を利用して処置する。この類似体は適当なMHC クラスＩ抗原に結合するが、しかしCTL 活性化及び増殖を阻止し、従ってHBV 感染化肝細胞及びＴ細胞媒介型肝炎に対するダメージを下げる。このペプチド拮抗剤はCTL エピトープペプチドであって、例えばアミノ酸置換により、そのペプチドがクラスＩMHC 分子に有効に結合するが、そのエピトープ特異的Ｔ細胞を刺激する能力が実質的に低められているように改質されているものを含んで成る。
【００６９】
類似体拮抗剤は少なくとも１個のHLA クラスＩエピトープを含むようにペプチドを改質することによって同定される。好ましい態様において、改質すべきペプチドはクラスＩ−制限型CTL エピトープを含んで成るであろう。置換又はその他の特定の改質をペプチドに導入し、このペプチド類似体を次に無関係の抗原エピトープ、例えばインフレンザペプチドの同じクラスＩ分子により制限されたインフレンザ−特異的Ｔ細胞クローンへの提供を阻止する能力についてスクリーンする。
【００７０】
例えば本明細書に記載のHLA-A2制限型CTL ペプチドを、例えば１又は数箇所の置換により改質し、次いでHLA-A2により制限されたインフレンザ−特異的Ｔ細胞クローンへのHLA-A2−制限型インフレンザCTL マトリックスペプチド（例えば56-58)の提供を阻止する能力について試験する。拮抗類似体は、抗原提供細胞／標的細胞を、刺激用量の抗原性ペプチドに暴露せしめた後に拮抗ペプチドに暴露したときに、Ｔ細胞増殖及び／又は細胞障害活性を阻害するであろう。本発明の拮抗類似体は例えば米国特許第4,882,145号及びFerrari ら、J. Clin. Invenst、前掲、に記載されているものを含む様々なHBV クラスＩエピトープに対して同定されうる。
【００７１】
治療的処置のための該薬理組成物は非経口、塗布、経口又は局所投与を意図している。好ましくは、該薬理組成物は非経口的に、例えば静脈内的、皮下的、経皮的又は筋肉内的に投与される。従って、本発明は、許容されている担体、好ましくは水性担体の中に溶かされている、又は懸濁されているCTL 刺激性ペプチドの溶液を含んで成る非経口投与用組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、0.4％の食塩水、0.3％のグリシン、ヒアルロン酸等が利用されうる。
【００７２】
これらの組成物は常用の公知の滅菌技術で滅菌されうるか、又は滅菌濾過されてよい。得られる水性溶液はそのまま利用されるように包装されうるか、又は凍結乾燥され、凍結乾燥調製品は投与前に滅菌溶液と組合せる。この組成物は適当な生理学的条件にするのに必要な薬理学的に許容されている補助剤、例えばpH調整及び緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含んでよい。
【００７３】
ある態様においては、この薬理組成物の中にCTL を感作せしめる少なくとも一成分を含ませることが所望されうる。脂質はインビボでウィルス抗原に対してCTL を感作せしめることの可能な試薬として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をLys 残基のアルファー及びエプシロン残基に付加し、次いで例えば典型的には１又は複数の連結残基、例えばGly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 等を介して、クラスＩ−制限型CTL エピトープを含んで成る合成ペプチドに連結させてよい。
【００７４】
本明細書で更に説明する通り、この脂質化ペプチドは次にアジュバント、例えば不完全フロインドアジュバントの中に乳濁しておいたリポソームの中に一体化させることができる。好ましい態様において、特に有効な免疫原は、Ｔ細胞決定基、例えば本明細書に記載のようなペプチド、及びかかる決定基を有するものとして同定されたその他のペプチドを有するクラスＩ制限型ペプチドのアミノ末端に、連結基、例えばSer-Ser を介して付加されているLys のアルファー及びエプシロンアミノ基に付加されているパルミチン酸を含んで成る。
【００７５】
CTL 応答を感作する脂質の他の例としてのＥ．コリ（E. coli)リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（P3CSS)が、適当なペプチドと共有結合させときに、特異的CTL を感作せしめるのに利用できる。引用することで本明細書に組入れるDeres ら、Nature 342 : 561-564 (1989) を参照のこと。本発明のペプチドは例えばP3CSS にカップルさせてよく、そしてHBV に対するCTL 応答を特異的に感作せしめるように個体にこのリポペプチドを投与する。
【００７６】
更に、中和抗体の誘発も、適当なエピトープ、例えばHBs Agエピトープを表示するペプチドにコンジュゲートされたP3CSS で感作されるため、HBV 感染症、に対する体液性及び細胞媒介型応答を共により有効的に誘発せしめるようにこの二つの組成物を組合せてよい。CTL 応答を感作する脂質の更なる例は、CTL/Ｔヘルパー−ペプチド−コンジュゲートを、適当なカルボン酸無水物を介して酢酸からステアリン酸に至る範囲の種々の鎖長及び不飽和度の無荷電脂肪酸残基、並びに陰荷電スクシニル残基にコンジュゲートすることによって成し遂げられる。
【００７７】
様々なその他の抗原に対するCTL 応答は、CTL 誘発性ペプチド／Ｔヘルパー誘発性ペプチドコンジュゲートを脂質と組合せることによって高めることができる。このCTL 誘発性ペプチドは、標的タンパク質、例えばとりわけ腎細胞癌、乳癌、癌胎児性抗原、黒色腫（MAGE-1）抗原、前立腺癌特異的抗原（PSA)、Ｃ型肝炎抗原、エプステインバーウィルス抗原、HIV-１及びHIV-２抗原、並びにパピロマウィルス抗原から選ばれうる。脂質は、Ｔヘルパーエピトープを供し、脂質と組合されるその他のペプチドに連結されていてよい。CTL 誘発性ペプチド／Ｔヘルパーペプチド／脂質を含んで成るコンジュゲートの成分の配列は変えてよい。
【００７８】
ある場合、脂質成分をCTL誘発性ペプチドのアミノ末端に連結させ、次にそのカルボキシ末端においてＴヘルパーペプチドに連結させてよい。別の場合、脂質をＴヘルパーペプチドのアミノ末端に連結させ、このＴヘルパーペプチドをそのカルボキシ末端においてCTL 誘発性ペプチドに連結させてよい。どちらのケースでも、脂質成分とCTL 又はＴヘルパーペプチドとの間に、及びＴヘルパーとCTL 誘発性ペプチドとの間にスペーサー分子を選択的に挿入してよい。
【００７９】
脂質とＴヘルパー又はCTL 誘発性ペプチドとの間のスペーサーの場合、好ましい例はLys-Ser-Ser を含んで成るが、他のスペーサーも本明細書に記載してある。ＴヘルパーとCTL 誘発性ペプチドとの間のスペーサーの例はAla-Ala-Ala であり、本明細書に更に詳しく述べてある。CTL 誘発性ペプチドはHBc もしくはHBs 領域、又は前記した他のCTL 誘発性抗原に由来しうる。
【００８０】
薬理製剤中の本発明のCTL 刺激ペプチドの濃度は広範囲、即ち約１重量％以下、通常は少なくとも約10重量％から、20〜50重量％以上にわたることができ、そしてそれは主として流体容量、粘度に応じて、選ばれた投与の特定の態様に従って選択されるであろう。
静脈内点滴のための典型的な薬理組成物は250 mlまでの滅菌リンガー溶液及び100 mgのペプチドを含むように作られていることができる。非経口投与用化合物を調製するための実際の方法は当業者に公知又は明らかであり、そして例えば引用することで本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Science, 第17版、Mack Publishing Campany, Easton, PA (1985) により詳しく説明してある。
【００８１】
本発明のペプチドはリポソームを介して投与してもよく、これは該ペプチドを特定の組織、例えばリンパ系組織を標的とするように働かさせるか、又はHBV 感染化肝細胞を特異的に標的化させ、更には該ペプチド組成物の半減期を長期化する。リポソームには、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、層板の層、等が含まれる、このような調製物の中に、導入すべきペプチドはリポソームの一部として、単独で、あるいは例えばリンパ系細胞にわたって広がっているレセプターに結合する分子、例えばCD45抗原に結合する抗体と一緒に、又はその他の治療用もしくは免疫原組成物と一緒に含まれている。
【００８２】
これによって、本発明の所望のペプチドの詰まっているリポソームはリンパ系細胞の部位に導かれることができ、そこでこのリポソームは特定の治療用／免疫原ペプチド組成物を導入せしめる。本発明において利用するためのリポソームは標準の小胞形成用脂質から作られ、これらには一般に中性及び陰性荷電リン脂質、並びにステロール、例えばコレステロールが含まれる。脂質の選別は一般に、例えばリポソームのサイズ及び血流中でのリポソームの安定性を考慮して決められる。リポソームを調製するための様々な方法が有用であり、例えば引用することで本明細書に組入れるSzoka ら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467(1980)、米国特許第4,235,871 、4,501,728 、4,837,028 及び5,019,369 号に記載されている。
【００８３】
免疫細胞を標的とするためのリポソームの中に含ませるべきリガンドには例えば所望の免疫系細胞の細胞表層決定基に特異的な抗体又はそのフラグメントが含まれる。ペプチドを含んでいるリポソーム懸濁物は、静脈内的に、局所的に、塗布的に、等により、とりわけ投与方法、導入すべきペプチド、及び処置すべき疾患の段階に従って変わる投与量において投与できる。
【００８４】
固形組成物に関しては、常用の無毒固形担体を利用することができ、これには例えば薬理学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。経口投与のためには、薬理学的に許容されている無毒な組成物を、任意の通常利用されている賦形剤、例えば前述した担体と、一般に10〜95％、そしてより好ましくは25％〜75％の濃度の活性成分、即ち本発明の１又は複数種のペプチドとを一体化させることによって形成する。
【００８５】
エアゾール投与のためには、該CTL 刺激性ペプチドを界面活性剤及び噴射剤に、細く分割した状態で供給することが好ましい。ペプチドの典型的なパーセンテージは0.01〜20重量％、好ましくは１〜10重量％とする。この界面活性剤は当然無毒でなくてはならず、そしてこの噴射剤中で可溶性であることが好ましい。かかる試薬の代表例は６〜22個の炭素原子を含む脂肪酸のエステル又は部分エステル、例えば脂肪族多価アルコール又はその環状無水物を有するカプロン酸、オクタノン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸及びオレイン酸である。複合エステル、例えば複合させた、又は天然のグリセリドも利用できうる。この界面活性剤は該組成物の0.1〜20重量％、好ましくは0.25〜５重量％を占める。該組成物の残りは通常噴射剤とする。必要ならば担体も、例えば経鼻導入のためのレシチンと一緒に含ませてよい。
【００８６】
別の観点において、本発明はワクチンに向けられ、これは免疫学的に有効な量の本明細書に記載のCTL 刺激性ペプチドを活性成分として含んでいる。このペプチドはその担体に結合した状態で、又は活性ペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとしてヒトを含む宿主に導入してよい。かかるポリマーは強い免疫反応の長所を有し、そしてポリマーを作るために異なるペプチドを利用したとき、HBV の様々な抗原決定部位と反応する抗体及び／又は細胞障害性Ｔ細胞を誘発せしめる追加の能力を有する。
【００８７】
有用な担体は当業界に公知であり、そして例えばサイログロブリン、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ、例えばポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）、インフレンザ、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換ワクチン等が含まれる。このワクチンは生理学的に寛容（許容）されている希釈剤、例えば水、リン酸緩衝食塩水、又は食塩水をも含んでよく、そして更に典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はみようばんが当業界に公知な材料である。
【００８８】
更に、前述した通り、CTL 応答は本発明のペプチドを脂質、例えばP3CSS にコンジュゲートせしめることによって感作されうる。本明細書に記載のペプチド組成物による注射、エアゾール、経口、経皮又はその他のルートを介する免疫化により、宿主の免疫系はHBV 表層及び／又はヌクレオカスピド抗原に特異的な大量のCTL を生成せしめることによってこのワクチンに応答し、そしてこの宿主はHBV 感染症に対して少なくともある程度免疫化されるか、又は慢性HBV 感染症の進行に対して耐性となる。
【００８９】
本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、HBV 感染症に感受性であるか又はそうでなければその危険性にある患者に、その患者自身の免疫応答能力を高めるように投与する。その量は「免疫学的に有効な投与量」と定義する。この利用において、その正確な量も、患者の健康状態及び体重、投与方法、製剤の種類、等に依存し、しかしながら一般には70kgの患者当り約1.0μｇ〜約500 μｇ、より一般的には70kgの体重当り約50μｇ〜約100 μｇ  mgに範囲する。該ペプチドは適宜のHLA 型の個体に投与され、例えばペプチドHBenv309-328 、HBenv 349-368 及びHBc 91-110のワクチン組成物については、HLA-A2個体に投与されるであろう。
【００９０】
ある状況において、本発明のペプチドワクチンを、HBV 、特にHBV エンベロープ抗原、例えば組換HBV env −コード化抗原に応答する中和抗体を誘発するワクチンと、又はHBV-感染化個体より獲得した精製血漿調製品から調製したワクチンと組合せることが所望されうる。様々なHBV ワクチン調製品が述べられており、そしてそれらはHBs Ag及びそのポリペプチドフラグメントを主として基礎とする。本発明のペプチドと一緒に配合できるワクチンの例については、それぞれ引用することで本明細書に組入れるヨーロッパ特許公開EP 154,902 及びEP 291,586、並びに米国特許第4,565,697 、4,624,918、4,599,230 、4,599,231 、4,803,164 、4,882,145 、4,977,092 、5,017,558 及び5,019,386 号を参照のこと。これらのワクチンは組合せて一緒に投与するか、又は別の調製品として投与してよい。
【００９１】
治療的又は免疫的目的のため、本発明のペプチドは弱毒化ウィルス宿主、例えば痘疹又は鶏痘によって発現されることもできる。このアプローチは痘疹ウィルスを、本発明のペプチド又はコンジュゲートをコードするヌクレオチド配列を発現せしめるベクターとして利用することを包括する。急性又は慢性HBV 感染宿主への、又は非感染宿主への導入により、この組換痘疹ウィルスはHBs 及び／又はHBc ペプチドを発現し、そしてこれによりHBV に対する宿主CTL 応答が誘発される。
【００９２】
免疫プロトコールにおいて有用な痘疹ベクター及び方法は例えば引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,722,848 号に記載されている。他のベクターはBCG(カルメット  ゲラン桿菌）である。BCG ベクターは引用することで本明細書に組入れるStoverら（Nature 351 : 456-460 (1991))に記載されている。本発明のペプチドの治療用投与又は免疫化にとって広範囲にわたる様々な他のベクター、例えばサルモネラ チフィ（Salmonella typhi)ベクター等が有用であることが、本明細書より当業者にとって明らかとなるであろう。
【００９３】
該ペプチドは診断試薬としての有用性も見い出された。例えば、本発明のペプチドは該ペプチド又は関連のペプチドを利用する処置療法に対する特定の個体の感受性を決定するために利用でき、従って現存の処置プロトコールを改良するうえで、又は冒された個体にとっての予後を決定するうえで役立ちうる。更に、該ペプチドは慢性HBV 感染に進行する実質的な危険性にある個体を予測するのにも利用できうる。
【実施例】
【００９４】
下記の実施例は例示のために提供し、限定するものではない。
実施例１．CTL-特異的HBV エピトープの同定
マウス−ヒト  キメラクラスＩ分子を発現する遺伝子導入マウス系列を、HBV コア、及びCTL 特異的エピトープを表わす表層抗原配列を決定するために用いた。
【００９５】
Scripps Clinic and Research Foundationより獲得した遺伝子導入マウス系列66は、ヒトHLA-A2.1抗原のα１及びα２ドメインと、H-2Kb のα３トランスメンブラン及び細胞質ドメインとより成るキメラクラスＩ分子を発現する。遺伝子導入マウスは、引用することで本明細書に組入れるVitielloら、J. Exp. Med. 173 : 1007-1015(1991)に一般に記載の通りに調製した。これらのマウスをインビボでインフレンザウィルスで感作せしめたとき、それらはヒトインフレンザ−特異的CTL により認識されるものと事実上同じエピトープに特異的なCTL 応答を発生せしめた。従って、これらの遺伝子導入マウスはヒトＴ細胞により認識されるHBV エピトープを決定するのに利用することができた。
【００９６】
HBV 表層及びコアタンパク質のうちのどの配列領域がCTL エピトープを示しているかを決定するため、これらの２つのタンパク質に由来する合成ペプチドを作り、そしてヒトHLA-A2.1に結合するその能力について試験した。結合は、インフレンザマトリックスペプチド57-68 の存在下でのCTL 系列219 によるA2.1標的細胞の認識を阻害する様々なペプチド濃度の相対能力により決定し、それは細胞からのセリンエステラーゼの放出の阻害によって決定した。この219系列はA2.1遺伝子マウスに由来し、そしてHLA-A2.1内のマトリックスペプチド57-68 に特異的である。
【００９７】
簡単に述べると、CTL エピトープについてアッセイするペプチドをDMSOの中に20mg／mlの濃度で溶かす。アッセイの直前に、ペプチドを25μＭのHepes で緩衝され、そして0.05％のBSA を含むRPMI 1640（アッセイ培地）の中に希釈する。200 μｇ／ml，66μｇ／ml又は22μｇ／mlのペプチド溶液50μｌを、50μｌの容量アッセイ培地中に４×105 のジャーカットA2.1/Kb 細胞を含んでいる96穴丸底プレートのウェルに加える。このプレートを37℃で30min.インキュベートする。
【００９８】
次に指標ペプチド（PR8 インフレンザウィルス由来のマトリックスペプチド57-68)の2.5μｇ／mlの溶液50μｌをこの細胞に加え、続いて５×104 の系列219 CTL を含むもの50μｌを加え、ここで利用した指標ペプチドの濃度は、このペプチドの力価により決定される、CTL 219 からの75％のセリンエステラーゼの放出を誘発するような濃度とする。37℃で４時間のインキュベーションの後、プレートを1000 RPMで５分遠心し、そして20μｌの上清液を平底96穴プレートに移した。上清液中のエステラーゼ活性を、0.2ＭのトリスHCl pH8.1，2.0×10-4のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  チオベンジルエステル（BLT)及び2.2×10-4Ｍのジチオビス（ニトロ安息香酸）より成る反応混合物180 μｌを加えて測定する。プレートを37℃で１時間インキュベートし、そして412 nmの吸光値を測定する。パーセント阻害は下記の式より計算する：
【００９９】
【数１】
0003586278.tif 000002
【０１００】
A2.1に結合し、且つ細胞による24％より多くのセリンエステラーゼ放出を起こさせるペプチドを、インビトロで、HBV 感作A2.1遺伝子導入マウスに由来する脾細胞からのCTL 応答を再刺激せしめる能力についてアッセイ化した。（Sette, A. ら、J. Immunol. 147 : 3893 (1991))。HBV 感作は、Carbone とBevan, J. Exp. Med. 171 : 377-387 (1990)に記載の通りにHBV ウィルスの「負荷」されているA2.1脾臓細胞を注射することによって実施した。
【０１０１】
簡潔すると、赤血球除去脾細胞を、200 μｌのHBV 精製ウィルス及び200 μｌの2Xの高張溶液（0.5Ｍのスクロース、10％ｗ／ｖのポリエチレングリコール1000，10mMのHepes, pH 7.2，RPMI 1640培地中）より成る溶液0.4mlの中に、37℃で10分懸濁した。この細胞懸濁物を次に予め温めておいた高張培地（60％のHBSS及び40％の水）の中にす早く希釈し、37℃で２分インキュベートし、ペレット化し、HBSSで２回洗い、そして照射せしめた（1,000 rad)。次にマウスに200 μｌの容量中の5.0×106 の負荷細胞を注射した。10日後、マウスをHBV-負荷脾臓細胞でブーストに付した。
【０１０２】
約２週間後、感作マウス由来の脾臓細胞（24穴プレートにおいて５×106 細胞／ウェル）を13種の異なるペプチドで個別にコートされている同系照射化（3000rad) LPS芽細胞（２×106 細胞／ウェル）の４種の異なる混合物と一緒に培養した。コーティングは、チューブの中の25×106 のLPS 芽細胞のアリコートを、１ml中の13種のHBP 合成ペプチドのうちのいづれか100 μｇと共に、37℃で１〜２hrインキュベートとすることによって行った。次にそれぞれのチューブの中身をプールして４種の混合物を得た。
【０１０３】
【表１】
0003586278.tif 000003
【０１０４】
細胞の混合物を一回洗い、所望の濃度に希釈し、そしてプレートに付した。培養のために用いた培地は、10％のFCS 、50μｇ／mlのゲンタマイシン、２mMのグルタミン及び５×10-5Ｍの２−メルカプトエタノールの添加したRPMI 1640 (R10) である。９日後、エフェクター細胞を、培養物中において用いたものに対応する種々のペプチド混合物の存在下において、ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する細胞障害性についてアッセイした。得られた結果を図１、パネルＡ〜Ｄに示した。
【０１０５】
これらの培養物から得たエフェクター細胞（0.2×106 細胞／ウェル）を、照射に付した（20,000rad)ペプチドコート化ジャーカットA2/Kb 細胞（0.2×106 細胞／ウェル）によって、５％のラットConA上清液の添加されたR10 中で、３×106 フィーダー細胞／ウェル（C57 BL/6照射化脾臓細胞）の存在下で再刺激せしめた。６日後、これらのエフェクター細胞を13種の個々のペプチドの存在下で51Crラベル化ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する細胞障害性についてアッセイした。
【０１０６】
バックグランドより高いジャーカットA2/Kb 標的細胞のCTL 溶解を誘発せしめたペプチド（図１のＥ〜Ｈ）、即ち、HBenv 47-63 、HBc 11-27(パネルＥ）、HBenv 141-157 、HBenv 194-213 、HBc 91-110（パネルＦ）、HBenv 329-348及び349-368(パネルＧ）、並びにHBenv 309-328(パネルＨ）をそれぞれ、ペプチド混合物により発生するエフェクター細胞を再刺激するために用いた。
【０１０７】
培養物中で６日後、これらのエフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドの存在下で、51CrジャーカットA2/Kb 細胞に対する細胞障害性について試験した（図１）。本実施例で概略した一連の実験は、HBV ペプチドHBc 11-27(図１パネルＡ，Ｅ；図２パネルＪ）HBc 91-110 (図１パネルＢ，Ｆ；図２パネルＭ）、HBenv 329-348(図１パネルＣ，Ｇ；図２パネルＮ）HBenv 349-368（図１パネルＣ，Ｇ；図２パネルＯ）及びHBenv 309-328(図１パネルＤ，Ｈ；図２パネルＰ）がはっきりとCTL エピトープを提供していることを我々に決定させた。
【０１０８】
実施例２．不完全フロインドアジュバント（IFA)中の精製HBV による皮下感作によるA2.1−制限型CTL の誘発
皮下的なIFA 中のオバルミン（OVA)の注射は、マウスにおけるオバルミン−特異的CTL 応答を誘発し、一方、i. v. 又はi. p. のいづれかによるOVA の注射はCTL の発生を一般的にもたらさない。この技術を、A2.1遺伝子導入マウス中でのHBV 特異的CTL の誘発に利用した。
【０１０９】
感作及びインビトロ再刺激：A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、不完全フロインドアジュバント（IFA)中の精製HBV ウィルスのエマルション100 μｌを注射した。このエマルションはHBSSの中で１：５に希釈した精製HBV(１mgのタンパク質／ml）を、等容量のIFA と混合することによって調製した。感作の７日後、これらの動物から獲得した脾細胞（24穴プレート中、５×106 細胞／ウェル）を下記のペプチドそれぞれでコートされた同系照射化LPS 芽細胞（２×106 ／ウェル）で再刺激した：
【０１１０】
【表２】
0003586278.tif 000004
【０１１１】
これらのペプチドを選んだ理由は：１）それらが実施例１におけるCTL エピトープを含むと決定されたから（ペプチド799.10、799.09、802.03）；２）それらが大きめのエピトープにより認識される実施例１において決定したペプチドの短縮体を代表するから（即ち、ペプチド875.15、844.02、883.02、883.03）；又は３）それらがFalkら（Nature 351 : 290-296 (1991))に記載のA2.1結合性モチーフ、即ち、位置２におけるロイシンもしくはメチオニン、及び位置９におけるロイシンもしくはバリン、又は位置10におけるバリンのいづれかを含むから（即ち、ペプチド884.01、875.20、875.21及び875.19）；である。
【０１１２】
コーティングは各ペプチド50μｇを、12×106 のLPS 芽細胞と、10％のFCS の添加された容量の0.4mlのRPMI培地の中で37℃で1hインキュベートすることにより行った。これらの細胞を一回洗った。６日後、エフェクター細胞を適宜のペプチドの存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 細胞に対する細胞障害毒性についてアッセイした。その結果を図３に示す。
【０１１３】
これらのエフェクター細胞（0.2×106 細胞／ウェル）を週の間隔で再刺激した。最初の再刺激に関しては、ペプチドコート化LPS芽細胞を使用し、続いてペプチドコート化ジャーカットA2.1/Kb 細胞を使用した。再刺激の６日後、エフェクター細胞を適宜のペプチドの存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害性についてアッセイした。得られた結果を図４に示す。
【０１１４】
HBV 感作マウスの脾細胞からインビトロCTL を明らかに誘発可能なペプチドは図３及び４、パネルＡ：HBc 18-27 ; 図３及び４、パネルＢ：HBenv 349-368 ; 図３及び４、パネルＤ：HBenv 349-358; 図３及び４、パネルＦ：HBenv 329-348 ; 図３及び４、パネルＩ：HBc 91-110；図３及び４、パネルＪ：HBc 92-102；並びに図３及び４、パネルＫ：HBc 93-102である。大きめのペプチドに対して発生せしめたCTL により認識され、そしてCTL エピトープの少なくとも一部を含むであろう短縮ペプチドは：図3F，4F：HBenv 335-343及びHBenv 338-347 である。
【０１１５】
実施例３．ペプチドの合成
ペプチドをApplied Biosystems (Foster City, CA)の430Aペプチド合成装置で、Fmoc保護化アミノ酸、及びアミノ酸の活性化のための２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（HBTU) エステルを用いて合成した。各アミノ酸を通常通りに三重カップル化させた。Fmoc保護化アミノ酸及びヒドロキシベンゾトリアゾールはBurdick and Johnson より購入した。HBTUはRichelieu Biotechnologies (St-Hyacinthe, Canada)より購入した。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸、無水酢酸、及びエタンジチオールはSigma Chemical Corporationより購入した。
【０１１６】
ａ．ペプチドPhe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH〔Seq. ID No. 23〕
Sasrin (商標）樹脂（Bachem Biosciences) にカップルさせたＬ−バリンをペプチド合成反応槽に入れ、そしてＮ−メチルピロリドン（NMP)で一回洗った。次に下記の操作を順に行った：
【０１１７】
１．Fmoc保護基をNMP 中の25％のピペリジンによる樹脂結合アミノ酸の処理によって除去した。
２．この樹脂をNMP で５回洗った。
３．Fmoc−セリン、ジイソプロピルエチルアミン、HBTU及びNMP を含む混合物を反応槽に加え、そしてボルテックス撹拌のもとで30分間反応させた。
４．溶媒を排出させ、そして樹脂をNMP で３回洗った。
５．段階（３）と（４）を更に２回繰り返した。
６．この樹脂をNMP で更に４回洗った。
段階１−６をペプチドの各アミノ酸に関して繰り返した。
最後のカップリングサイクルに続き、樹脂結合ペプチドをNMP 中の25％のピペリジンとの反応により脱保護し、NMP で７回洗い、次いでジクロロメタンで２回洗った。
【０１１８】
この樹脂を真空で24時間乾かした。このペプチドをSasrin（商標）樹脂から、2.5％のエタンジチオール及び５％の水を含むトリフルオロ酢酸による処理によって切断した。このポリスチレン樹脂を濾過によってこのトリフルオロ酢酸溶液から除去した。トリフルオロ酢酸は真空エバポレーションにより除去した。粗ペプチドをジエチルエーテルで粉砕し、そして水に溶かした。この水を凍結乾燥により除去した。次にこのペプチドをＣ8 カラム（VYDAC)での逆相HPLCにより、それぞれ0.1％のTFA を改質剤として含むアセトニトリルと水の勾配を利用して精製した。
【０１１９】
ｂ．ペプチド（Pal)2-Lys-Ser-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH〔Seq. ID No. 24〕
段落ａに記載の樹脂結合ペプチドを、上記の手順に従って２個のセリン残基の付加により伸長せしめた。次に下記の操作を作った：
【０１２０】
１．Fmoc保護基をNMP 中の25％のピペリジンによる樹脂結合アミノ酸の処理によって除去した。
２．この樹脂をNMP で５回洗った。
３．ビス−Fmoc−リジンをNMP 中のジイソプロピルカルボジイミドによる処理によって対応の対称性無水物に変換させた。この樹脂結合ペプチドを、得られる無水物と反応させた。
４．この樹脂をNMP で５回洗った。
５．Fmoc保護基をNMP 中の25％のピペリジンによる樹脂結合アミノ酸の処理によって除去した。
６．パルミチン酸をNMP 中のヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルカルボジイミドと反応させた。
７．この樹脂をNMP で５回洗った。
最後に、このペプチドを上記の通りに樹脂から切断せしめた。
【０１２１】
ｃ．ペプチドGln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH〔Seq. ID No. 25〕。
段落ａに記載の樹脂結合化ペプチドは、段落ａに記載の手順に従う、Glu, Thr, Ile, Gly, Ile, Phe, Lys, Ser, Asn, Ala, Lys, Ile, Tyr及びGln 残基の付加により伸長させた鎖である。切断及び精製は上記の通りに実施した。
【０１２２】
ｄ．ペプチドGln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH〔Seq. ID No. 26〕。
段落ａに記載の樹脂結合化ペプチドは、段落ａに記載の手順に従う、Ala, Ala, Glu, Thr, Ile, Gly, Ile, Phe, Lys, Ser, Asn, Ala, Lys, Ile, Tyr及びGln 残基の付加により伸長させた鎖である。切断及び精製は上記の通りに実施した。
【０１２３】
ｅ．ペプチドAc-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Ala-Ala-Ala-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH〔Seq. ID No. 27〕。
段落ｄに記載の樹脂結合ペプチドを、NMP 中の無水酢酸との反応によりアセチル化させた。切断及び精製は上記の通りに実施した。
【０１２４】
実施例４．CTL とＴヘルパーエピトープとの組合せによるCTL 誘発
本実施例は、HBV CTL エピトープのみ、Ｔヘルパーエピトープを含むペプチドと複合したCTL エピトープ、又はＴヘルパーエピトープに物理的に連結されているCTL エピトープを発現するペプチドの相対的なインビボHBV 特異的CTL 感作効率を決定する実験を記す。
【０１２５】
遺伝子導入マウス（HLA-A2.1/Kb ) を完全フロインドアジュバント（CFA)中のペプチド875.23（Iab −制限型ヘルパーエピトープHBc 128-140 TPPAYRRPNAPIL) 100μｇで皮下的に（尾の根元）感作せしめた。９日後、下記のペプチドそれぞれを不完全フロインドアジュバント（IFA)中で100 μｇ／マウスで、２匹の未感作及び２匹のヘルパー感作マウスに皮下注射した。
【０１２６】
【表３】
0003586278.tif 000005
【０１２７】
CTL エピトープで感作して３週間後、脾細胞をHBc 18-27 でコートしたLPS 芽細胞（コーティングは、30×106 のLPS 芽細胞を、１mlの培地中のHBc 18-27 100 μｇとインキュベートすることにより行い、37℃で１〜２hr後、その細胞を洗浄した）でインビトロ再刺激した。６日後、エフェクター細胞をHBc 18-27 の存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【０１２８】
結果が示すには、ＴヘルパーとCTL エピトープペプチドとを単純に混合し（即ち、連結させていない）、そして免疫用量で投与した場合に試験した動物の50％において、バックグランド殺傷のレベルより若干高い検出可能な抗原−特異的CTL 活性の誘発が認められた。検出された応答の例を図７に示す。驚くべきことに、動物をCTL エピトープに連結してあるＴヘルパーエピトープで感作すると、100％が特異的感作の証拠を示し（図８）、その度合いは未連結で投与したエピトープの場合に検出されたもの（図７）より高かった。
【０１２９】
かなり驚くべきことに、図９に示する通り、アラニン−アラニン−アラニンスペーサーを介するＴヘルパーとCTL エピトープとの連結（即ち、ＴヘルパーAAA-CTL)は、ＴヘルパーとCTL 決定基をそれのみで連結させたことにより検出されるものより高い特異的なCTL 活性の誘発をもたらした。Ｔヘルパーペプチド又はCTL ペプチド単独での感作はHBc 特異的CTL を誘発しなかった（図５及び６）。また、Ｔヘルパー特異的免疫性の誘発のための動物の事前免疫は、ＴヘルパーとCTL との混合物、又はＴヘルパーCTL コンジュゲートのいづれかを利用するCTL についての感作のために必須でないと認められ、なぜなら無垢の動物を適宜のコンジュゲートで感作せしめたときに免疫が検出されたからである（図10Ａ及びＢ）。
【０１３０】
実施例５．HBenv 360-368 に特異的なA2.1制限型CTL の誘発
A2/Kb 遺伝子導入マウスに、不完全フロインドアジュバント（IFA)中の100 μｇのHBenv 360-368 及び100 μｇのHBc 128-140 ヘルパーエピトープのエマルション100 μｌを注射した。（このエマルションは、PBS 中の両ペプチド500 μｇを等容量のIFA と混合することによって調製した）。感作の21日後、これらの動物から獲得した脾細胞（24穴プレート中、５×106 細胞／ウェル）を、ペプチドHBenv 360-368 でコートした同系LPS 芽細胞（２×106/ウェル）で再刺激した。
【０１３１】
これらのエフェクター細胞（0.2×106 ／ウェル）を週の間隔で再刺激した。第１及び第２回目の再刺激に関しては、HBenv 360-368 コート化LPS 芽細胞を利用し、続いてHBenv 360-368 コート化ジャーカットA2.1/Kb 細胞を利用した。再刺激の６日後、エフェクター細胞をHBenv 360-368 の存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する細胞障害性についてアッセイした（図11参照のこと）。
【０１３２】
実施例６．インビボ感作に関する連結された破傷風トキソイドとHBc 細胞障害性Ｔ細胞エピトープの試験
遺伝子導入マウス（HLA-A2.1/Kb ）を200 mg（0.07mM）のペプチド934.02によって皮下的に（尾の根元）感作した。
【０１３３】
【表４】
0003586278.tif 000006
【０１３４】
感作して３週間後、脾細胞をHBc 18-27 でコートしたLPS 芽細胞でインビトロ再刺激した（実施例１に記載の通り）。７日後、細胞をHBc 18-27 でコートしたジャーカットA2/Kb 細胞で再刺激した（実施例１に記載の通り）−６日後、これらのエフェクター細胞をHBc 18-27 の存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する、HBc 18-27 の存在下又は非存在下でのJy標的細胞に対する、及びHBV コアでトランスフェクトされたJy細胞に対する細胞障害性についてアッセイした。図12に示す結果は、ペプチド934.02がHBc 18-27 に特異的なCTL を効果的に誘発することを示唆している。更に、これらのCTL は内因的に提供される抗原（Jyコア）を認識及び殺傷する。
【０１３５】
実施例７．ペプチド免疫により誘発されるCTL 免疫性の比較
抗原性CTL ペプチドの様々な改質体及び配合体を、その免疫原性を強める効果において試験した。BALB／ｃマウスを尾の根元において下記のペプチド又はペプチド混合物のいづれかを皮下的に感作した。
【０１３６】
【表５】
0003586278.tif 000007
【０１３７】
免疫の３週間後、脾細胞を取出し、そしてflu 147-155 ペプチドでインビトロ刺激した。１週間後、標的として51Cr−ラベル化B10.D2繊維芽細胞を利用してCTL 活性をアッセイした。標的細胞を抗原の非存在下で、Flu 147-155 ペプチドの存在下で、又はインフレンザPR8 ウィルスの感染の後に試験した。４回の個別に実施した実験のうちの１つより獲得した代表的な結果を表６にまとめている。
【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
構築体（PAM2KSS-ＴヘルパーCTL と（PAM)2KSS- ＴヘルパーAAA-CTL)は他の組合せ全てに比して、食塩水又はみょうばんの中で注射したときに優れていた。ペプチドＴヘルパーCTL とＴヘルパーAAA-CTL は、Ｔヘルパー＋CTL の混合（即ち未連結）に対して優れ、そしてIFA 中でよく働いたが、食塩水又はみょうばんの中ではよく働かなった。従って、ワクチンの開発のためには、（PAM)2KSSを、CTL ペプチドに連結してあるＴヘルパーペプチドに連結するのがCTL 免疫性を誘発するのに有利であることが明らかである。
【０１４０】
実施例８．CTL ペプチドエピトープ799.09による最小の最適配列の決定
遺伝子導入マウス（A2-1/Kb ）を実施例IIに実質的に記載してある通りにIFA 中のHBV ウィルスで感作せしめた。感作の７日後、これらの動物から獲得した脾細胞をペプチド799.09でコートされた同系照射LPS 芽細胞で再刺激した（実施例１に記載の通り）。６サイクルの799.09コート化細胞による再刺激の後（実施例２に記載の通り）、エフェクター細胞をペプチド799.09でコートされた同系照射LPS 芽細胞と10％のラットCon A 上清液の添加された培地とを利用して限界希釈によってクローンした。２つのCTL 系、系110 及び系113 が得られ、それらはペプチド799.09でコートされたJA2Kb 標的細胞を殺した。これらの系は、799.09Ｎ末端短縮ペプチド、並びに799.09配列全体をカバーする重複の量体及び10量体のパネルで試験した。
【０１４１】
図13のパネルＡに示す通り、系113 及び110 により認識される最小Ｎ末端短縮ペプチドはそれぞれHBV env. 333-348 (923.09)及び335-348 (923.07)であった。図13のパネルＢは、この９量体及び10量体のいづれも、系113 により認識されないことを示しており、このCTL 系による認識のためにはもっと長いペプチドが最小配列として必要とされることを意味している。系110 により認識される最小配列はペプチドHBV env. 333-341 (923.26) 及びHBV env 335-343 (923.22)により表わされ、可能として２つの異なる、しかしながら重複しているペプチドが799.09特異的CTL のための抗原決定基として働きうることが示唆される。
【０１４２】
以上より、本発明の特定の態様を例示したが、その様々な改良が本発明の範囲を逸脱することなくなされることが明らかであろう。従って、本発明は請求の範囲を除き、限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１−ａ】図１−ａは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。HBV-感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、13種のペプチドのうちの１つでそれぞれコートされた同系LPS 芽細胞の４通りの混合物で再刺激せしめている。９日後、エフェクター細胞を、誘発のために用いた４通りの異なるペプチド混合物の存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカット（Jurkat) A2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図１−ｂ】図１−ｂは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。HBV-感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、13種のペプチドのうちの１つでそれぞれコートされた同系LPS 芽細胞の４通りの混合物で再刺激せしめている。９日後、エフェクター細胞を、誘発のために用いた４通りの異なるペプチド混合物の存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカット（Jurkat) A2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図１−ｃ】図１−ｃは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。HBV-感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、13種のペプチドのうちの１つでそれぞれコートされた同系LPS 芽細胞の４通りの混合物で再刺激せしめている。９日後、エフェクター細胞を、誘発のために用いた４通りの異なるペプチド混合物の存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカット（Jurkat) A2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図１−ｄ】図１−ｄは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。HBV-感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、13種のペプチドのうちの１つでそれぞれコートされた同系LPS 芽細胞の４通りの混合物で再刺激せしめている。９日後、エフェクター細胞を、誘発のために用いた４通りの異なるペプチド混合物の存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカット（Jurkat) A2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図１−ｅ】図１−ｅは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。４通りの異なるペプチド混合物に対して発生せしめたエフェクター細胞を同じペプチド混合物に対してインビトロで再刺激し、そして個々のペプチドの存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性をアッセイした。
【図１−ｆ】図１−ｆは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。４通りの異なるペプチド混合物に対して発生せしめたエフェクター細胞を同じペプチド混合物に対してインビトロで再刺激し、そして個々のペプチドの存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性をアッセイした。
【図１−ｇ】図１−ｇは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。４通りの異なるペプチド混合物に対して発生せしめたエフェクター細胞を同じペプチド混合物に対してインビトロで再刺激し、そして個々のペプチドの存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性をアッセイした。
【図１−ｈ】図１−ｈは、A2.1/Kb 遺伝子導入マウスに、HBV の「負荷された」同系脾臓細胞を感作せしめることによる、HBV ペプチド−特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示している。４通りの異なるペプチド混合物に対して発生せしめたエフェクター細胞を同じペプチド混合物に対してインビトロで再刺激し、そして個々のペプチドの存在下又は非存在下で、51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性をアッセイした。
【図２−ｉ】図２−ｉはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｊ】図２−ｊはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｋ】図２−ｋはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｌ】図２−ｌはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｍ】図２−ｍはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｎ】図２−ｎはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｏ】図２−ｏはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図２−ｐ】図２−ｐはA2.1遺伝子導入CTL のHBV ペプチド特異性を示している。HBV 感作遺伝子導入マウスより高揚させ、そして４通りの異なるペプチド混合物のうちのどれかで２回インビトロで再刺激せしめた遺伝子導入CTL を個々のHBV ペプチドで再刺激し、そして再刺激のために用いたHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカット標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。
【図３−ａ】図３−ａはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｂ】図３−ｂはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｃ】図３−ｃはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｄ】図３−ｄはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｅ】図３−ｅはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｆ】図３−ｆはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｇ】図３−ｇはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｈ】図３−ｈはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｉ】図３−ｉはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｊ】図３−ｊはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｋ】図３−ｋはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図３−ｌ】図３−ｌはIFA 中のHBV でA2.1/Kb 遺伝子導入マウスを感作せしめることによるHBV ペプチド特異的A2.1−制限型CTL の誘発の結果を示す。HBV感作遺伝子導入マウス由来の脾細胞をインビトロで、HBV ペプチドでコートされた同系LPS 芽細胞によって再刺激せしめた。６日後、エフェクター細胞を適当なHBV ペプチドの存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する溶解活性についてアッセイした。表示の標的ペプチドによって誘発されたCTL 活性を示している。
【図４−ａ】図４−ａは、図３−ａのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ａに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｂ】図４−ｂは、図３−ｂのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｂに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｃ】図４−ｃは、図３−ｃのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｃに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｄ】図４−ｄは、図３−ｄのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｄに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｅ】図４−ｅは、図３−ｅのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｅに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｆ】図４−ｆは、図３−ｆのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｆに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｇ】図４−ｇは、図３−ｇのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｇに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｈ】図４−ｈは、図３−ｈのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｈに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｉ】図４−ｉは、図３−ｉのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｉに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｊ】図４−ｊは、図３−ｊのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｊに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｋ】図４−ｋは、図３−ｋのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｋに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図４−ｌ】図４−ｌは、図３−ｌのエフェクターCTL をペプチドコート型LPS 芽細胞で再刺激し、続いて一週間の間隔をおいて、ペプチドコート型ジャーカットA2.1/Kb 細胞で再刺激した。最後の再刺激の６日後、エフェクター細胞を再刺激のために用いたペプチドと関連ペプチドの非存在下又は存在下で51Crラベル化ジャーカットA2.1/Kb 標的細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。図３−ｌに示しているペプチドにより誘発せしめたCTL 活性を示している。標的ペプチドが表示してある。
【図５】図５は、HBc 875.23  Ｔヘルパーエピトープ単独で感作せしめたマウスにおいてHBc 18-27-特異的CTL 応答が全く検出されなかったことを示している。動物を完全フロインド  アジュバント（CFA)中の100 μｇの875.23 (Ｔヘルパーエピトープ）で皮下的に感作せしめ、続いて９日後、IFA のみで（皮下的に）感作せしめた。脾細胞を３週間後に取出し、CTL エピトープ（875.15）100 μｇと洗浄前に２時間インキュベートしておいたLPS-芽細胞の存在下で６日間培養し、次いで抗原表示細胞の起源として培養物に加えた。HBc 18-27(875.15 ）特異的CTL の存在を標的としてのジャーカットA2.1/Kb 細胞による標準の６hr 51Cr 放出アッセイを利用して決定した。
【図６】図６はマウスをIFA 中のHBc 18-27 (875.15)で感作したときにHBc 18-27-特異的CTL 応答が全く検出されなかったことを示す。実験のプロトコールは図５に記載のものと類似しているが、ただしマウスに、インビボCTL 感作のためにIFA 単独ではなく、IFA 中の100 μｇの875.15を皮下的に受容せしめてある。
【図７】図７は１：１の比でHBc CTL 誘発性ペプチド（875.15）と混合せしめたHBc Ｔヘルパーペプチド（875.23）で感作せしめたマウスの50％においてHBc 18-27-特異的CTL 応答が検出されたことを示している。この実験プロトコールは図５及び６に記載のものと類似である。
【図８】図８は、HBc ＴヘルパーとCTL 誘発性ペプチドとがペプチド結合を介して連結しているペプチド902.01で感作せしめたマウスにおいて、HBc 特異的（875.15）CTL 活性が検出されたことを示している。
【図９】図９は、HBc ＴヘルパーとCTL 誘発性ペプチドとが、典型的なスペーサー、例えばアラニン−アラニン−アラニンを利用するペプチド結合を介して連結しているペプチド902.02で感作せしめたマウスにおいて、最大のHBc 18-27 (875.15)特異的CTL 活性が検出されたことを示している。
【図１０−ａ】図10−ａはヘルパーＴ細胞の事前感作が、ペプチド902.01及び902.02を利用するHBc 18-27-特異的CTL 応答のインビボ感作にとって必要でないことを示している。CTL 応答はCFA 中でのペプチド875.23による事前感作抜きで、ペプチド902.01（図10A)又は902.02（図10B)単独によって皮下的に感作された動物から示された。
【図１０−ｂ】図10−ｂはヘルパーＴ細胞の事前感作が、ペプチド902.01及び902.02を利用するHBc 18-27-特異的CTL 応答のインビボ感作にとって必要でないことを示している。CTL 応答はCFA 中でのペプチド875.23による事前感作抜きで、ペプチド902.01（図10A)又は902.02（図10B)単独によって皮下的に感作された動物から示された。
【図１１】図11はHBenv360-368特異的CTL 応答の誘発を示している。A2.Kb 遺伝子導入マウスに100 mgのHBenv 360-368 及び100 mgのHBc 128-148 のエマルション（IFA)100 μｌを注射した。３週間後、脾細胞をペプチドHBenv 360-368 でコートされた同系LPS 芽細胞で再刺激せしめた。エフェクター細胞をHBenv 360-368 の存在下又は非存在下で51Crラベル化ジャーカットA2/Kb 標的細胞に対する細胞障害性についてアッセイした。
【図１２】図12は破傷風トキソイド830-843(ヒトヘルパーＴ細胞エピトープ）に連結しているHBc 18-27 を含むペプチドでの感作によるHBc 18-27に特異的なCTL 応答の誘発を示している。エフェクター細胞を、HBc18-27 の存在下又は非存在で51Crラベル化ジャーカットA2-1/Kb 標的細胞に対して；HBc 18-27 の存在下又は非存在下でJy標的細胞に対して、及びHBV コアのトランスフェクトされたJy細胞に対してアッセイした。
【図１３−ａ】図13−ａはHBV env 329-348 ペプチド（799.09）内でのCTL 認識のための最小配列を示している。CTL 細胞系110 及び113 は、IFA 中のHBV ウィルスにより皮下的に感作され、そして799.09コート型刺激細胞でインビトロ活性化されたA2Kb遺伝子導入マウスより獲得した脾細胞に由来する。799.09特異的CTL 細胞系110 及び113 を、799.09ペプチド短縮体（トランケーション）の存在下で標的としてJA2Kb 細胞を用いる６hr 51Cr 放出アッセイにおいて溶解活性についてアッセイした（799.09Ｎ末端短縮体）。
【図１３−ｂ】図13−ａの続きである（799.09の重複９量体及び10量体）。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図１−ｃ】
0003586278.tif 000011
【図１−ｄ】
0003586278.tif 000012
【図１−ｅ】
0003586278.tif 000013
【図１−ｆ】
0003586278.tif 000014
【図１−ｇ】
0003586278.tif 000015
【図１−ｈ】
0003586278.tif 000016
【図２−ｉ】
0003586278.tif 000017
【図２−ｊ】
0003586278.tif 000018
【図２−ｋ】
0003586278.tif 000019
【図２−ｌ】
0003586278.tif 000020
【図２−ｍ】
0003586278.tif 000021
【図２−ｎ】
0003586278.tif 000022
【図２−ｏ】
0003586278.tif 000023
【図２−ｐ】
0003586278.tif 000024
【図３−ａ】
0003586278.tif 000025
【図３−ｂ】
0003586278.tif 000026
【図３−ｃ】
0003586278.tif 000027
【図３−ｄ】
0003586278.tif 000028
【図３−ｅ】
0003586278.tif 000029
【図３−ｆ】
0003586278.tif 000030
【図３−ｇ】
0003586278.tif 000031
【図３−ｈ】
0003586278.tif 000032
【図３−ｉ】
0003586278.tif 000033
【図３−ｊ】
0003586278.tif 000034
【図３−ｋ】
0003586278.tif 000035
【図３−ｌ】
0003586278.tif 000036
【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
0003586278.tif 000038
【図４−ｃ】
0003586278.tif 000039
【図４−ｄ】
0003586278.tif 000040
【図４−ｅ】
0003586278.tif 000041
【図４−ｆ】
0003586278.tif 000042
【図４−ｇ】
0003586278.tif 000043
【図４−ｈ】
0003586278.tif 000044
【図４−ｉ】
0003586278.tif 000045
【図４−ｊ】
0003586278.tif 000046
【図４−ｋ】
0003586278.tif 000047
【図４−ｌ】
0003586278.tif 000048
【図５】
0003586278.tif 000049
【図６】
0003586278.tif 000050
【図７】
0003586278.tif 000051
【図８】
0003586278.tif 000052
【図９】
0003586278.tif 000053
【図１０−ａ】
0003586278.tif 000054
【図１０−ｂ】
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【図１１】
0003586278.tif 000056
【図１２】
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【図１３−ａ】
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【図１３−ｂ】
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【配列表】
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