(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式：
【化１】
0003553691.tif 000008
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7は炭素数１〜６のアルキル、アルケニルまたはハロゲン化アルキルである］
からなる群から選ばれる少なくとも１つの色素を含む、網状赤血球と成熟赤血球を弁別可能に染色する網状赤血球測定用試薬。
【請求項２】
赤血球の非特異蛍光を抑制するための多価アニオンを含む請求項１記載の網状赤血球測定用試薬。
【請求項３】
浸透圧補償剤を含む請求項１または２記載の網状赤血球測定用試薬。
【請求項４】
ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含む請求項１〜３のいずれかに記載の網状赤血球測定用試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の試薬を用いて網状赤血球を測定する方法。
【請求項６】
フローサイトメータを用いて測定する請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の工程により測定する請求項６の方法：
（ａ）網状赤血球測定用試薬と血液学的試料とを混合して測定用試料を作製し、（ｂ）測定用試料をフローサイトメータに流し、
（ｃ）細胞からの蛍光と、大きさ情報を反映するパラメータを測定し、
（ｄ）大きさ情報あるいは、大きさ情報と蛍光強度で赤血球系細胞と血小板を弁別し、
（ｅ）蛍光強度で赤血球と網状赤血球と白血球を弁別し、網状赤血球数、網状赤血球比率を測定する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床検査分野において、血液中の網状赤血球を測定する試薬および測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
網状赤血球とは、骨髄中で造血幹細胞から分化成熟した赤芽球系細胞が脱核し、骨髄から末梢血液中に放出された直後の若い赤血球であり、１〜２日後に成熟赤血球となる。網状赤血球は、細胞成熟の名残として、成熟赤血球には含まれていない少量のＲＮＡあるいはリボソーム、ミトコンドリアなどの細胞内小器官を有している。
【０００３】
臨床検査分野において、網状赤血球を分類・計数することは、患者の骨髄内での造血状態を把握する上で極めて重要な検査である。正常人においては、網状赤血球は、全赤血球中の０．５〜２．０％を占めており、骨髄造血が抑制された状態では減少し、骨髄造血が亢進した状態では増加する。例えば、再生不良性貧血、悪性腫瘍の化学療法時では減少し、溶血性貧血等では増加する。
【０００４】
さて、網状赤血球を測定するためには、従来より血液とニューメチレンブルー（ＮＭＢ）、ブリリアントクレシルブルー（ＢＣＢ）などの塩基性色素を含有する染色液とを混合する（超生体染色）ことによって、網状赤血球中に含まれる上記残存物質を網状に析出させ、塗抹標本を作製し、１個１個の細胞を顕微鏡で観察することにより、成熟赤血球と網状赤血球とを弁別し計数する方法（用手法）が行われている。
【０００５】
しかしながら、用手法は操作が煩雑であり、検査技師間で細胞判別の個人差や細胞計数数の少なさに由来する統計学的誤差が大きいことが知られている。
【０００６】
これらの問題を解決するために、前述の塩基性色素のかわりに、蛍光性の塩基性色素で網状赤血球を蛍光染色し、フローサイトメータで細胞の前方散乱光強度、蛍光強度を測定し、主に蛍光強度の差で成熟赤血球と網状赤血球を弁別し、網状赤血球を計数する方法が行われている。さらに、網状赤血球の蛍光強度によって、網状赤血球を成熟度別に分類計数すること（成熟指数の計算）も可能である。例えば、蛍光強度の強い網状赤血球の比率、すなわち最も若い網状赤血球の比率は、骨髄造血能の回復の指標として有用であることが知られている。
【０００７】
この方法に用いられる色素としては、オーラミンＯが良く知られている。オーラミンＯは、実質的に３０秒以内で網状赤血球を染色でき、迅速かつ精度よく網状赤血球を分析することができる。オーラミンＯ以外にもアクリジンオレンジ、チアゾールオレンジなども使用できるが、５〜３０分の染色時間を要する。
【０００８】
一方、網状赤血球を特徴づける物質の１つであるＲＮＡを特異的に染色する色素が特公昭６３−６１６２２号、米国特許第４，９５７，８７０号に開示されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
オーラミンＯ、アクリジンオレンジやチアゾールオレンジを用いた網状赤血球の分析方法では、極めて有用な方法であるにもかかわらず、蛍光色素を励起するための光源として非常に高価なアルゴンレーザを必要とするため、装置が非常に高価なものになってしまう。また、上記公報には、励起光源としてアルゴンレーザ以外の光源を用いた網状赤血球を測定する技術は開示されていない。
【００１０】
さらには色素の細胞膜透過性の問題が存在する。上記公報に開示されているＲＮＡを特異的に染色する色素は、ＲＮＡと溶液中で混合することによって、飛躍的に蛍光強度が増大する。従って、原理的には網状赤血球の検出のための優れた色素となるはずである。しかしながら、実際に網状赤血球を検出しようとした場合、ＲＮＡ水溶液と混合する場合とは異なり、まず色素は細胞膜を透過しなければならない。しかし、色素の細胞膜透過性は色素によって異なり、全ての色素が速やかに細胞膜を透過し、ＲＮＡと結合するわけではない。そのため、全ての色素が網状赤血球の検出に使用できるわけではない。
【００１１】
アルゴンレーザの波長４８８ｎｍで励起できる色素は、分子の大きさが比較的小さく、比較的容易に細胞膜を透過するため、細胞中のＲＮＡと容易に結合できる。そのため、染色のために特別な工夫をしなくても、例えば、通常良く用いられるＰＢＳ緩衝液に色素を溶解しただけの染色液で網状赤血球の測定が可能である。
【００１２】
青領域よりも長波長の励起光を発するレーザはアルゴンレーザよりも安価であるが、そのような励起光源を使用して網状赤血球の測定を行うためには、青領域よりも長波長で励起可能な色素を使用しなければならない。しかし、そのような色素は、青領域（例えば４８８ｎｍ）で励起できる色素に比べて、分子内各部の炭化水素鎖長が長い、あるいは大きな芳香環を有する等のために、大半の物質は極性が低い。このような色素で赤血球を染色した場合、多くの色素は細胞膜の脂質二重層あるいはヘモグロビンに結合し、非特異蛍光を発しやすい。あるいは、細胞膜に対して透過性が悪い。例えば、本明細書の参考例に記載するように、上述の色素の１種を用いて血液試料を染色し、赤半導体レーザを光源とするフローサイトメータで測定した場合、図１に示すように赤血球の非特異蛍光が強く、網状赤血球を正確に測定することはできない。さらに、細胞膜透過性が悪く、染色のために少なくとも３０分以上の時間が必要である。
【００１３】
なお、非特異蛍光の問題は、何も青領域よりも長波長で励起可能な色素に特有の問題ではなく、青領域で励起可能な色素についても起こりうる。
【００１４】
一般に疎水性分子は、親水性分子より速やかに赤血球細胞膜を透過し、小さな分子は大きな分子よりも速やかに膜を透過するとされているが、どのような色素が網状赤血球を迅速にかつ特異的に染色することができるかを予測するのは困難である（特開平６−１８０３１５号、４頁、カラム６、３８行目〜５頁、カラム７、６行目参照）。
【００１５】
本発明は、Ｈｅ／Ｎｅレーザや赤半導体レーザなどの安価な励起光源を用いたフローサイトメータを用いて、網状赤血球を正確かつ迅速に測定するための試薬ならびに測定方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述した目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明の色素が網状赤血球を正確かつ迅速に染色し、安価な励起光源を用いるフローサイトメータによっても網状赤血球を精度よく測定しうることを発見して本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下の構造式：
【化２】
0003553691.tif 000002
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は炭素数１〜６のアルキル、アル
ケニルまたはハロゲン化アルキルである］
からなる群から選ばれる少なくとも１つの色素を含有することを特徴とする網状赤血球測定用試薬を提供する。
【００１８】
本発明において使用可能な色素の例としては、以下のものが挙げられる。
【００１９】
（１）１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニン  アイオダイド（ＨＩＤＣＩ、ＬＡＭＢＤＡ  ＰＨＹＳＩＫ社）
（１，１’，３，３，３’，３’−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）
【化３】
0003553691.tif 000003
（２）１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシアニン  アイオダイド（ＮＫ−１３８、日本感光色素研究所）
（１，１’−ｄｉｅｔｈｙｌ−２，４’−ｑｕｉｎｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ
ｉｏｄｉｄｅ）
【化４】
0003553691.tif 000004
（３）ピナシアノール  クロライド
（Ｐｉｎａｃｙａｎｏｌｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【化５】
0003553691.tif 000005
（４）１，３’−ジエチル−２，２’−キノチアカルボシアニン  アイオダイド（１，３’−ｄｉｅｔｈｙｌ−２，２’−ｑｕｉｎｏｔｈｉａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）
【化６】
0003553691.tif 000006
網状赤血球を染色するのに十分な色素の量は、色素によって異なるが、０．３〜１００ｍｇ／ｌ  程度の量が好適な濃度である。
【００２０】
色素濃度がこの範囲を越えた場合、色素にもよるが、一般的には、赤血球の非特異蛍光が増加し、成熟赤血球と網状赤血球との弁別が困難になる。
【００２１】
色素濃度がこの範囲以下の場合、使用不可能ではないが、使用の容器壁面への吸着、分解等により色素濃度の減少が発生しやすくなる。
【００２２】
本発明の試薬中には、赤血球の非特異蛍光を抑制するための多価アニオンを含有することができる。一般に、赤血球系細胞を超生体染色する場合、溶血を防ぐために、染色液の浸透圧は、生理的浸透圧付近（２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ程度）に調整される。この目的には、塩化ナトリウムを主成分（通常１００ｍＭ以上）とするＰＢＳが汎用されている。
【００２３】
ところが染色液中に塩化ナトリウム、とくに塩化物イオンが多量に存在する場合、赤血球の非特異蛍光が強く、成熟赤血球と網状赤血球の弁別が困難になる。しかし、塩化物イオンを多価アニオンで置換した場合、赤血球の非特異蛍光が著しく抑制され、成熟赤血球と網状赤血球の弁別が容易になることを本発明者らは見いだした。使用できる多価アニオンとしては、クエン酸、シュウ酸、フタル酸、琥珀酸等の多価カルボン酸イオン、燐酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン等が好適である。濃度は、試薬中の全アニオン成分に占める割合がモル比で５０％以上が使用可能であり、好ましくは７０％以上が好適である。
【００２４】
ハロゲン等の単価アニオンは速やかに細胞膜を通過して、ヘモグロビン分子と結合してヘモグロビンの立体構造を変化させ、色素に対する親和性を増加させ、結果として、赤血球の非特異蛍光が増加すると考えられる。単価アニオンの大部分を多価アニオンに置換することにより赤血球の非特異蛍光は抑制される。
【００２５】
なお、多価アニオンの対イオンはアルカリ金属イオンが好適である。
【００２６】
さらに本発明において、多価アニオンを組み合わせて用いるとさらに好適である。例えば、燐酸イオンを主成分とし（８０〜２００ｍＭ）、多価カルボン酸を組み合わせる（５〜８０ｍＭ）。燐酸とシュウ酸との組合せは特に好適であり、赤血球の非特異蛍光を抑制するだけでなく網状赤血球の蛍光強度を増加させる効果がある。
【００２７】
本発明においては、浸透圧補償剤を添加することもできる。浸透圧補償剤は赤血球の低張溶血を防ぐために添加するものであり、通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧があればよい。浸透圧が高すぎることの弊害は特に認めないが、通常６００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度までで使用される。上述の多価アニオンで十分な浸透圧が得られる場合は必須の成分ではない。浸透圧補償剤として特に制限されるものはない。例えば、プロピオン酸などのアルカリ金属塩、グルコース、マンノースなどの糖類が好適に使用される。なお、全アニオン成分に占める割合が５０％未満であれば、ハロゲン化物も使用できる。
【００２８】
さらに本発明においては、緩衝剤を含有させることもできる。緩衝剤は、安定した染色結果を得られるように、ｐＨを一定に保つために加えられるものである。通常使用される緩衝剤、例えば、カルボン酸類、燐酸、グッド緩衝剤等が使用でき、数ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度で使用される。ｐＨは染色に好適なｐＨが選ばれる。好適なｐＨは、色素によって異なるが、４．０〜１１．０の範囲から選ばれる。ｐＨがこの範囲よりも低すぎる場合、あるいは高すぎる場合、赤血球が溶血しやすくなり、正確な測定ができなくなる。さらに、ｐＨが高すぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離してマイナスチャージを持ち、カチオン性である色素と結合することにより、赤血球の非特異蛍光が増加して、成熟赤血球と網状赤血球の弁別が困難になる傾向がある。
【００２９】
さらに好適には４．５〜９．０のｐＨ範囲、より好適には４．５〜７．０の範囲が選ばれる。なお、前述の多価アニオンの塩類によって、ｐＨを染色に適した値に安定に保つことができるのであれば必須の成分ではない。
【００３０】
また、本発明の試薬には、赤血球球状化剤として界面活性剤を赤血球が溶血しない濃度でかつ網状赤血球の染色を阻害しない濃度で含有させることもできる。
【００３１】
さらに、色素が水溶液中で不安定な場合、色素を適当な水溶性の非水溶媒、例えば、エタノール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール等に溶解して保存し、使用時に希釈液と混合して使用することができる。希釈液の成分としては、前述の多価アニオンの塩類、浸透圧補償剤、緩衝剤あるいは赤血球球状化剤を含有させることができる。
【００３２】
本発明の試薬を用い、フローサイトメータで網状赤血球を測定するには、
（ａ）網状赤血球測定用試薬と血液学的試料とを混合して測定用試料を作製し、
（ｂ）測定用試料をフローサイトメータに流し、
（ｃ）細胞からの蛍光と、大きさ情報を反映するパラメータを測定し、
（ｄ）大きさ情報あるいは、大きさ情報と蛍光強度で赤血球系細胞と血小板を弁別し、
（ｅ）蛍光強度で赤血球と網状赤血球と白血球を弁別し、網状赤血球数、網状赤血球比率を測定する。
【００３３】
測定用試料の作製にあたっては、網状赤血球測定用試薬と血液学的試料との混合比は、１００：１〜１０００：１、反応時間は１０〜１２０秒、反応温度は２５〜５０℃の範囲で作製することができる。
【００３４】
大きさ情報を反映するパラメータとしては、前方散乱光強度、電気抵抗信号が挙げられる。また、蛍光は、前方蛍光または側方蛍光のいずれを測定してもよい。
【００３５】
本発明の方法で使用するフローサイトメータの光源は、色素によって異なるが、Ｈｅ／Ｎｅレーザ、赤半導体レーザ等安価なものが好適である。
【００３６】
【実施例】
参考例
次の構造式を有する色素（米国特許第４，９５７，８７０号に開示された範囲に含まれる）：
【化７】
0003553691.tif 000007
１ｍｇ／ｍｌジメチルスルホキシドの溶液を調製し、その色素溶液１２５μｌをＰＢＳ（ＮａＨ２ＰＯ４  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１ｌ  に加え染色液とした。
【００３７】
上記の染色液２ｍｌに抗凝固処理血液１０μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした後、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで、前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した。
【００３８】
図１に示したように、赤血球の非特異蛍光が強く、網状赤血球と成熟赤血球の弁別が困難である。
【００３９】
本参考例の試薬で処理した検体の網状赤血球比率は、０．７８％であった。一方、同じ検体を対照としてアルゴンレーザを光源とするＲ−２０００システム（東亜医用電子株式会社製、染色液はオーラミンＯを使用）で測定した場合、１．５％であり、本参考例の試薬では、網状赤血球を正確に測定できないことが判明した。
【００４０】
実施例１
ＨＩＤＣＩ  １ｍｇをＰＢＳ（ＮａＨ２ＰＯ４  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１ｌ  に溶解し染色液とした。
【００４１】
上記の染色液２ｍｌに抗凝固処理血液１０μｌを加え、３５℃で２０秒間インキュベートした後、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで、前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した。
【００４２】
図２に示したように、網状赤血球と成熟赤血球との間に十分な蛍光強度の差があり、網状赤血球を測定できる。
【００４３】
本実施例の試薬で処理した検体の網状赤血球比率は、１．７６％であった。一方、同じ検体を参考例と同様にＲ−２０００システムで測定した場合、１．６５％であり、本実施例の試薬を用いると、網状赤血球を正確に測定できることが判明した。
【００４４】
実施例２
ＨＩＤＣＩ  １ｍｇを１５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）１ｌ  に溶解し、  染色液とした。測定は実施例１と同様に行った。
【００４５】
図３に示したように、成熟赤血球の非特異蛍光が抑制され、さらに良好に網状赤血球を測定できる。
【００４６】
本実施例の試薬で処理した検体の網状赤血球比率は、１．３０％であった。一方、同じ検体を参考例と同様にＲ−２０００システムで測定した場合、１．３３％であり、本実施例の試薬を用いても、網状赤血球を正確に測定できることが判明した。
【００４７】
実施例３
シュウ酸                      ３０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４                １２０ｍＭ
ＮａＯＨでｐＨ５．０に調整
上記の水溶液に色素を溶解し、染色液を調製した。
【００４８】
色素として、ＨＩＤＣＩ  １ｍｇ／ｌ用いた場合を図４に、１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシアニン  アイオダイド３ｍｇ／ｌを用いた場合を図５に、ピナシアノール  クロライド１ｍｇ／ｌを用いた場合を図６に示す。いずれの場合でも、網状赤血球と成熟赤血球との間に十分な蛍光強度の差があり、網状赤血球を測定できる。
【００４９】
本実施例で用いた検体を参考例と同様にＲ−２０００システムで測定したとき、その網状赤血球比率は、２，０１％であった。同じ検体を本実施例の色素で染色し、赤半導体レーザを光源とするフローサイトメータを用いて測定したとき、
色素ＨＩＤＣＩ：１．９８％
色素１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシアニン  アイオダイド：
２．０５％
色素ピナシアノール  クロライド：１．８９％
であり、本実施例のいずれの色素で染色して赤半導体レーザで測定する場合にもアルゴンレーザと同様に網状赤血球を正確に測定できることが判明した。
【００５０】
実施例４
実施例３でＨＩＤＣＩ  １ｍｇ／ｌを用いた場合と、対照法としてＲ−２０００システム（東亜医用電子株式会社製、染色液はオーラミンＯを使用）を用いた場合との相関図を図７に示す。
【００５１】
直線回帰式Ｙ＝０．９３＋０．１８、相関係数ｒ＝０．９１５１（ｎ＝３７）であり、Ｒ−２０００システムと比較して、良好な相関が得られた。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、安価な光源を用いたフローサイトメータで、網状赤血球を測定することができる。また、色素と多価アニオンを組み合わせることによって、さらに精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。本図ならびに以下の図において、ＲＢＣは赤血球を、Ｒｅｔは網状赤血球を、ＰＬＴは血小板を表す。なお、白血球は蛍光強度が非常に強く、信号がオーバーフローしている。
【図２】実施例１に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。
【図３】実施例２に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。
【図４】色素としてＨＩＤＣＩを用いる実施例３に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。
【図５】色素として１，１’−ジエチル−２，４’−キノカルボシアニン  アイオダイドを用いる実施例３に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。
【図６】色素としてピナシアノール  クロライドを用いる実施例３に記載の染色液で染色した血液を、赤半導体レーザ（波長６３３ｎｍ）を光源とするフローサイトメータで前方散乱光および６６０ｎｍ以上の側方蛍光を測定した結果を示す。
【図７】実施例３でＨＩＤＣＩを用いた場合と、Ｒ−２０００システム（染色液はオーラミンＯ）を用いた場合の相関図を示す。
【図１】
0003553691.tif 000009
【図２】
0003553691.tif 000010
【図３】
0003553691.tif 000011
【図４】
0003553691.tif 000012
【図５】
0003553691.tif 000013
【図６】
0003553691.tif 000014
【図７】
0003553691.tif 000015