(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化２】
0003539978.tif 000030
を有する化合物の、オリゴヌクレオチド合成におけるヒドロキシル基を保護するための試薬としての使用方法。
【請求項２】
塩基の存在下にて、請求項１の式（Ｉ）  を有する化合物を式（ＩＶａ）  または（ＩＶｂ）
【化１３】
0003539978.tif 000031
（式中、Ｒ１は、水素または互いに独立に、式
【化５】
0003539978.tif 000032
の基であり、
Ｂは、
【化６】
0003539978.tif 000033
であり、
但し、Ｒ２は、それぞれの場合に互いに独立に、式
【化７】
0003539978.tif 000034
であるか、または
Ｂは、
【化８】
0003539978.tif 000035
であり、
但し、Ｒ３は、それぞれの場合に互いに独立に、水素または
【化９】
0003539978.tif 000036
であり、
Ｒ４は、それぞれの場合に互いに独立に、式
【化１０】
0003539978.tif 000037
であるか、または
Ｂは、
【化１１】
0003539978.tif 000038
であり、但しＹはＨ、ＣＨ３（またはＣ１〜Ｃ４−ｎ−アルキル）であり、Ｒ５は、それぞれの場合に互いに独立に、−ＯＨ、
【化１２】
0003539978.tif 000039
である）を有する適当な化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）
【化３】
0003539978.tif 000040
（式中、ＤａｎｓＥＯＣは、式
【化４】
0003539978.tif 000041
を有する基であり、Ｒ１およびＢは上記と同じ意味である）を有する化合物の製造法。
【請求項３】
ピリジン、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルおよび式
ＮＲ２０Ｒ２１Ｒ２２
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキル、好ましくはトリメチル、トリエチルまたはジイソプロピル基である）を有する化合物から成る混合物を塩基として用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド合成における、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物の使用方法。
【請求項５】
塩基の存在下にて、請求項２の式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を式（ＶＩ）
【化１６】
0003539978.tif 000042
（式中、Ｒ６及びＲ７は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピルまたはＣ５〜Ｃ１２−シクロアルキル基（好ましくはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と共に更にヘテロ原子および置換基を任意に含むことができる飽和または不飽和の複素環であり、Ｒ８は、式
【化１５】
0003539978.tif 000043
を有する基であるか、または未置換または１回以上環が置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であり、（１個以上の）置換基は互いに独立にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカルボキシル基であり、Ｚは塩素または臭素であるか、または式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であり、但し、Ｒ９およびＲ１０は同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピルまたはＣ５〜Ｃ１２−シクロアルキル基（好ましくはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基、好ましくは塩素である）を有する化合物と反応させることによる、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）
【化１４】
0003539978.tif 000044
［式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは請求項２に記載された意味を有し、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は上記した意味を有する］の化合物の製造法。
【請求項６】
ピリジン、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルのＣ１〜Ｃ４−トリアルキルアミン、好ましくはトリメチル−、トリエチル−またはジイソプロピルエチル−アミンとの混合物を、またはＺが式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であるときには、
式［ＨＮＲ１１Ｒ１２Ｒ１３］（＋）  Ｘ（−）  （但し、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル基であり、Ｘはハロゲン、特にＣｌである）を有する化合物またはテトラゾールの存在下、好ましくはテトラゾールの存在下で、塩基として用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチド合成における請求項５の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）を有する化合物の使用方法。
【請求項８】
請求項５の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物を、
１．  式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）
【化１７】
0003539978.tif 000045
（式中、ＢおよびＲ１は請求項２に記載された意味を有し、ＧはＲ１と同じ意味を有するかまたは式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物の２′−ヒドロキシルまたは３′−ヒドロキシル基によって結合されている重合支持体である）の化合物と反応させ、
２．  生成する化合物を酸化し、
３．  ダンシルエトキシカルボニル基を除去し、
４．  生成する化合物を請求項５の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物と反応させ、
５．  必要な鎖長になるまで反応工程２〜４を繰り返すことを特徴とする、式（Ｖａ）および／または（Ｖｂ）の化合物からオリゴヌクレオチドを製造する方法。
【請求項９】
請求項５の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）および請求項８の（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物を−２０〜＋１００℃の温度、好ましくは室温で反応させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
反応を弱酸の存在下にて行う、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
反応をテトラゾールまたはｐ−ニトロフェニルテトラゾールの存在下にて行う、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
酸化を、ヨウ素、硫黄またはアミンの存在下でのヨウ素を用いて行う、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
酸化を、−８０〜＋１００℃の温度、好ましくは−２０〜＋６０℃、特に室温で行う、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
塩基の存在下にて、請求項２の式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を式（ＩＸ）
ＰＲ１４Ｒ１５Ｒ１６                                    （ＩＸ）
（式中、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ１〜Ｃ８−フルオロアルキルまたはアリール基、好ましくは２，２，２−トリフルオロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル、エチルまたはフェニル基である）を有する化合物と反応させることを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）
【化１８】
0003539978.tif 000046
（式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を有し、Ｋ（＋）  はカチオン、特に［ＨＮ（Ｃ２Ｈ５）３］（＋）  である）を有する化合物の製造法。
【請求項１５】
塩基の存在下にて、請求項２の式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を式（Ｘ）
ＰＲ１７Ｒ１８Ｒ１９                                    （Ｘ）
（式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、塩素、臭素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルアミノまたは１，２，４−トリアゾリル基、好ましくは１，２，４−トリアゾリル基である）を有する化合物と反応させた後、加水分解することを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物の製造法。
【請求項１６】
Ｃ１〜Ｃ４−トリアルキルアミンまたはＮ−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルモルホリン、好ましくはＮ−メチルモルホリンを塩基として用いる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド合成における請求項１４の式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物の使用方法。
【請求項１８】
請求項１４の式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物を、
１．  請求項８の式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物と反応させ、
２．  ダンシルエトキシカルボニル基を除去し、
３．  生成する化合物を式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物と反応させ、
４．  必要な鎖長になるまで反応工程２および３を繰り返し、
５．  生成するオリゴヌクレオチドを酸化することを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  および／または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物からオリゴヌクレオチドを製造する方法。
【請求項１９】
請求項１４の式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  および請求項８の（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）を有する化合物を−２０〜＋１００℃の温度、好ましくは室温で反応させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
反応を酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物の存在下にて行う、請求項１８または２４に記載の方法。
【請求項２１】
反応をピバロイルクロリドまたはアダマンタンカルボニルクロリドの存在下にて行う、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
酸化を、トリフェニルホスフィン／ＣＣｌ４の存在下にてヨウ素、硫黄またはアミンを用いて行う、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
モノヌクレオチドの化学的重縮合は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の調製に重要な方法である。
【０００２】
ＤＮＡまたはＲＮＡの化学的合成における基本的な問題は、ヌクレオシド塩基および糖残基上におけるアミノおよびヒドロキシル基の好適な保護基を見出すことである。これらの保護基は、一方においては、重縮合反応の条件下で、すなわちホスホジエステル結合の形成の際に安定でなければならず、他方において、ホスホジエステル結合を開裂することなく反応の終了時に再度除去し得るほど十分に不安定でなければならない（エイチ・ジー・コーラナ（Ｈ．Ｇ．  Ｋｈｏｒａｎａ）、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １７  （１９６８），  ３４９）。
【０００３】
ＲＮＡの化学的合成は、リボース糖残基が２個のヒドロキシル基を有しておりこれを両方とも保護しなければならないので、特に難しい。更に、それぞれの重縮合工程の前には、５′−ヒドロキシル基を選択的に、すなわち２′−ヒドロキシル保護基を除去することなく、再度除去されねばならない。他方、２′−ヒドロキシル基上の保護基は、ＲＮＡ合成の終了時にのみ、特にホスホジエステル結合のいかなる開裂も異性化も起こさない条件下で、除去しなければならない（シー・ビー・リーズ（Ｃ．Ｂ．  Ｒｅｅｓｅ）、核酸および分子生物学（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  、３巻（エフ・エックシュタイン（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）  およびディー・エム・ジェイ・リレイ（Ｄ．Ｍ．Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ）  監修、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）  、ヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）  ）。
【０００４】
２′−ヒドロキシル保護基を除去することなく５′−ヒドロキシル保護基を選択的に除去する一つの可能性は、塩基に不安定な５′−ヒドロキシル保護基を酸に不安定な２′−ヒドロキシル保護基と結合させることによって行うことができる（クリスチャン・レーマン（Ｃｈｒ．  Ｌｅｈｍａｎｎ）ら、（１９８９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７，  ２３７９−２３９０，  ７号）。塩基に不安定な５′−ヒドロキシル保護基を用いることは、ＤＮＡの合成において既に形成されているホスホジ−および−トリエステル結合の温和な非酸加水分解条件下では通常は開裂しないので、ＤＮＡの合成においても有利である。更に、このような温和な非酸加水分解条件下では、ウー・ソンヴォー（Ｅ．  Ｓｏｎｖｅａｕｘ）  （ウー・ソンヴォー（Ｅ．  Ｓｏｎｖｅａｕｘ）  （１９８６），  ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １４，  ２８６  ）によって記載されているようなヌクレオチドの脱プリンが回避される。ＤＮＡおよびＲＮＡ合成において５′−ヒドロキシル保護基によって満たされなければならないもう一つの要件は、保護基が容易に検出可能であり且つ高感度であることである。この方法では、個々の反応工程の転換率が特に良好になり、できる限り完全に転換を行うことができる。これにより、特に長いオリゴヌクレオチドを高収率で調製することができる。また、これはナノモルからピコモルの範囲の少量の合成混合物をも可能にする。
【０００５】
ダンシルエトキシカルボニル基（Ｄａｎｓ−ＥＯＣ）を化学的オリゴヌクレオチドの合成において塩基に不安定な５′−ヒドロキシル保護基として用いることができることを、意外にも見出した。
【０００６】
したがって、本発明は、下記のことに関する。
１．  式（ＩＩ）
【化１９】
0003539978.tif 000002
を有する化合物をクロロカルボニル供与体と反応させることを特徴とする、式（Ｉ）
【化２０】
0003539978.tif 000003
を有する化合物の製造法；
２．  式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）
【化２１】
0003539978.tif 000004
（式中、ＤａｎｓＥＯＣは、式
【化２２】
0003539978.tif 000005
を有する基であり、
Ｒ１は、水素または互いに独立に、式
【化２３】
0003539978.tif 000006
の基であり、
Ｂは、
【化２４】
0003539978.tif 000007
であり、
但し、Ｒ２は、それぞれの場合に互いに独立に、式
【化２５】
0003539978.tif 000008
であるか、または
Ｂは、
【化２６】
0003539978.tif 000009
であり、
但し、Ｒ３は、それぞれの場合に互いに独立に、水素または
【化２７】
0003539978.tif 000010
であり、
Ｒ４は、それぞれの場合に互いに独立に、式
【化２８】
0003539978.tif 000011
であるか、または
Ｂは
【化２９】
0003539978.tif 000012
であり、但しＲ５は、それぞれの場合に互いに独立に、−ＯＨ、
【化３０】
0003539978.tif 000013
であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、特にＣＨ３である）を有する化合物；
３．  塩基、好ましくはピリジン、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルおよび式
ＮＲ２０Ｒ２１Ｒ２２
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキル基、好ましくはトリメチル、トリエチルまたはジイソプロピル基である）を有する化合物から成る混合物の存在下にて、式（Ｉ）  を有する化合物を、式（ＩＶａ）  または（ＩＶｂ）
【化３１】
0003539978.tif 000014
（式中、Ｒ１およびＢは上記と同じ意味である）を有する適当な化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物の製造法；
４．  式（Ｖａ）または（Ｖｂ）
【化３２】
0003539978.tif 000015
［式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を有し、Ｒ６及びＲ７は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピルまたはＣ５〜Ｃ１２−シクロアルキル基（好ましくはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と共に更にヘテロ原子および置換基を任意に含むことができる飽和または不飽和の複素環であり、Ｒ８は、式
【化３３】
0003539978.tif 000016
を有する基であるか、または未置換または１回以上環が置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であり、（１個以上の）置換基は互いに独立にハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカルボキシル基である］を有する化合物；
５．  式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を、式（ＶＩ）
【化３４】
0003539978.tif 000017
（式中、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は前記の意味を有し、Ｚは塩素または臭素であるか、または式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であり、但し、Ｒ９およびＲ１０にはＲ６の場合と同じ基が好適であり、同一であるかまたは互いに異なるものである）を有する化合物と、Ｚが塩素であるときには、塩基、好ましくはピリジン、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルのＣ１〜Ｃ４−トリアルキルアミン、好ましくはトリメチル−、トリエチル−またはジイソプロピルエチルアミンとの混合物の存在下にて、またはＺが式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であるときには、式［ＨＮＲ１１Ｒ１２Ｒ１３］（＋）  Ｘ（−）  （但し、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル基であり、Ｘはハロゲン（特に塩素）、またはテトラゾールである）を有する化合物の存在下、好ましくはテトラゾールの存在下にて反応させることを特徴とする、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物の製造法；
６．  式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物を、
（１）  式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）
【化３５】
0003539978.tif 000018
（式中、ＢおよびＲ１は前記の意味を有し、ＧはＲ１と同じ意味を有するかまたは式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物の２′−ヒドロキシルまたは３′−ヒドロキシル基によって結合されている重合支持体である）の化合物と反応させ、
（２）  生成する化合物を酸化し、
（３）  ダンシルエトキシカルボニル基を除去し、
（４）  生成する化合物を式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物と反応させ、
（５）  必要な鎖長になるまで反応工程２〜４を繰り返すことを特徴とする、式（Ｖａ）および／または（Ｖｂ）の化合物からオリゴヌクレオチドを製造する方法；
７．  式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）
【化３６】
0003539978.tif 000019
（式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を有し、Ｋ（＋）  はカチオン、特に［ＨＮ（Ｃ２Ｈ５）３］（＋）  である）を有する化合物；
８．  塩基の存在下にて、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を、式（ＩＸ）
ＰＲ１４Ｒ１５Ｒ１６                                    （ＩＸ）
（式中、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ１〜Ｃ８−フルオロアルキルまたはアリール基、好ましくは２，２，２−トリフルオロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル、エチルまたはフェニル基である）を有する化合物と反応させることを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物の製造法；
９．  塩基の存在下にて、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有する化合物を、式（Ｘ）
ＰＲ１７Ｒ１８Ｒ１９                                    （Ｘ）
（式中、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、塩素、臭素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルアミノまたは１，２，４−トリアゾリル基、好ましくは１，２，４−トリアゾリル基である）を有する化合物と反応させた後、加水分解することを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物の製造法；
１０．  式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  を有する化合物を、
（１）  式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物と反応させ、
（２）  ダンシルエトキシカルボニル基を除去し、
（３）  生成する化合物を式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物と反応させ、
（４）  必要な鎖長になるまで反応工程２および３を繰り返し、
（５）  生成するオリゴヌクレオチドを酸化することを特徴とする、式（ＶＩＩＩａ）  および／または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物からオリゴヌクレオチドを製造する方法。
【０００７】
ダンシルエトキシカルボニル基をヌクレオシド中に導入するため、２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドをヌクレオシドと反応させるが、ヌクレオシドによっては、ヌクレオシド塩基のアミノおよびヒドロキシル基は好適な基によって保護される。アデニンの６−アミノ基に好適な保護基の例は、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基、特にベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基である。
【０００８】
グアニンの２−アミノ基に好適な例は、イソブチリル、４−（ｔ−ブチル）フェニルアセチルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基、特にイソブチリルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基である。グアニンの６−ヒドロキシル基およびウラシルの４−ヒドロキシル基は、いずれも通常は保護されないままであるかまたはパラ−ニトロフェニルエチル基によって保護される。シトシンの場合には、４−アミノ基は例えばベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基、特にベンゾイルまたはパラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニル基によって保護される。チミジンは一般的には保護されないままである。ウリジンの３−Ｎ基は、例えばＢｏｃまたはアミソイル基によって保護される。
【０００９】
天然のヌクレオシド塩基の代わりに、アミノまたはヒドロキシル基を前記の保護基によって同様な方法で保護することができる修飾されたヌクレオシドを用いることも可能である。修飾された塩基を有するヌクレオシドの例は、イノシン、８−アザ−７−デアザアデノシン、ツベルシジン、ネブラリン、キサントシン、２−アミノアデノシンまたはピリドピリミジンヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは購入することができ、個々の保護基の導入は例えばシー・レーマン（Ｃ．  Ｌｅｈｍａｎｎ）ら、（１９８９）、シー・ビー・リーズ（Ｃ．Ｂ．  Ｒｅｅｓｅ（１９８９））［「オリゴおよびポリリボヌクレオチドの化学的合成（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏ  ａｎｄＰｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」核酸および分子生物学（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、３巻（エフ・エックシュタイン（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）  およびディー・エム・ジェイ・リレイ（Ｄ．Ｍ．Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ）  監修、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ベルリン、ハイデルベルク］、ウー・ソンヴォー（Ｅ．  Ｓｏｎｖｅａｕｘ）  （１９８６），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １４，  ２７４−３２５  、またはイー・ウールマン（Ｅ．  Ｕｈｌｍａｎｎ）およびエイ・ペイマン（Ａ．  Ｐｅｙｍａｎ）  （１９９０），  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０，  ５４３−５８４，  ４  号の方法によって行うことができる。
【００１０】
リボヌクレオチドを用いるときには、ヌクレオチド塩基のヒドロキシルおよびアミノ基に加えて、リボース残基の２′−ヒドロキシル基を保護することも必要である。前記のように、ＲＮＡ合成を可能にするには、５′−ヒドロキシルおよび２′−ヒドロキシル保護基の好適な組み合わせを選択して、選択的に、すなわち２′−ヒドロキシル保護基を脱離することなく５′−ヒドロキシル保護基を除去することが重要である。
【００１１】
非酸条件下では、酸に不安定な２′−ヒドロキシル保護基の存在下にて５′−ヒドロキシル保護基としてダンシルエトキシカルボニル基を選択的に脱離させることが可能である。用いることができる酸に不安定な２′−ヒドロキシル保護基の例は、４−メトキシ−４−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−ニトロベンジル、１−（２−クロロ−４−メチルフェニル）−４−メトキシ−４−ピペリジニルまたは１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシ−４−ピペリジニル基である。ダンシルエトキシカルボニル基は、非プロトン性極性溶媒、特にＤＢＵ（＝１，５−ジアザビシク［５．４．０］ウンデセ（ｕｎｄｅｃ）−５−エン）１〜３モル当量、好ましくは１．５〜２．５モル当量を有するアセトニトリルまたはピリジン中で好ましく脱離される。代わりに、ＴＭＧ（＝Ｎ１，Ｎ１，Ｎ２、Ｎ２−テトラメチルグアニジン）のような塩基、またはトリエチルアミンのようなＣ１〜Ｃ４−トリアルキルアミンを脱離に用いることも可能である。
【００１２】
２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドを、リボースまたはデオキシリボース残基の５′−ヒドロキシル保護基の出発化合物として、２−ダンシルエタノールを極性の非プロトン性溶媒の存在下にてクロロカルボニル供与体、例えばトリクロロメチルクロロホルメート、（ジホスゲン）および／またはホスゲン、好ましくはトリクロロメチルクロロホルメートと反応させることによって調製した。好ましい態様では、反応は単一の極性の非プロトン性溶媒の存在下にて、特にアセトニトリルの存在下にて行った。２−ダンシルエタノール対クロロカルボニル供与体のモル比は、０．５〜１対１〜２、好ましくは１対１〜２、特に１対１．５〜２であった。反応温度は、−２０℃から反応混合物の沸点までの範囲、好ましくは−５℃〜＋２０℃、特に０℃〜５℃であった。
【００１３】
本発明による方法は、２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドを純粋な生成物として生じ、この組成は元素分析によって確認した。エイ・タカダテ（Ａ．  Ｔａｋａｄａｔｅ）  ら、（エイ・タカダテ（Ａ．  Ｔａｋａｄａｔｅ）  ら、（１９８３）、薬学雑誌、１０３，  ９８２−９６６）は、２−ダンシルエタノールをトリクロロメチルクロロホルメートと反応させて、融点が前記の方法で合成した生成物の融点より約２０℃低い生成物を得たので、この結果は極めて驚くべきことである。２−ダンシルエタノールは、例えばエス・ゴヤ（Ｓ．  Ｇｏｙａ）  ら（エス・ゴヤ（Ｓ．  Ｇｏｙａ）  ら，  （１９８１）、薬学雑誌、１０１，  １１６４  ）の方法によって調製することができる。
【００１４】
２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドと保護ヌクレオシドの反応は、例えば塩基の存在下にてシー・レーマン（Ｃ．  Ｌｅｈｍａｎｎ）ら、（１９８９）の方法による９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリドとの反応と同様にして行うことができる。塩基として好適なものは、有機塩基、特にピリジンまたはテトラヒドロフラン、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルおよび式
ＮＲ２０Ｒ２１Ｒ２２
（式中、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキル、好ましくはトリメチル、トリエチルまたはジイソプロピル基である）を有する化合物から成る混合物である。それ故、用いられる基質が２′−保護リボヌクレオシドであるときには、ダンシルエチルオキシカルボニル−リボヌクレオシドと副生成物としてビス−ダンシルエチルオキシカルボニル−リボヌクレオシドとから成る生成物の混合物を生じる。この生成物の混合物は、次のホスホリル化反応に直接用いることができる。この混合物を、例えばフラッシュクロマトグラフィによって精製することも可能であり且つ好ましい。除去されたビス−ダンシルエチルオキシカルボニル−リボヌクレオシドを、続いて例えばＤＢＵによって開裂して、ダンシル不含リボヌクレオシドとして、これを次にダンシル反応の出発化合物として用いることができる。
【００１５】
２′，５′−結合オリゴリボヌクレオチドを合成するには、例えばトリ−またはテトラアデニレートがタンパク質の生合成を抑制するので（ケール，アイ・エム（Ｋｅｒｒ，  Ｉ．Ｍ．）およびブラウン・アール・イー（Ｂｒｏｗｎ，  Ｒ．Ｅ．）  （１９７８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５，  ２５６−２６０  ）、前記の説明にしたがって保護され且つ遊離の２′−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを同様な方法で２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドと反応させることが可能である。
【００１６】
糖残基上の２′−または３′−ヒドロキシル基が遊離のままであるダンシル化ヌクレオシドは、一般的にはホスフィチル化される。ホスフィチル化試薬としては、式（ＶＩ）
【化３７】
0003539978.tif 000020
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピル、またはＣ５〜Ｃ１２−シクロアルキル基（好ましくはＣ８以下）ベンジルまたフェニル基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と共に更にヘテロ原子および置換基を任意に含むことができる飽和または不飽和の複素環であり、
Ｒ８は、式
【化３８】
0003539978.tif 000021
を有する基であるか、または未置換または１回以上環が置換されたベンジル基であり、好ましくは未置換であり、（１個以上の）置換基は互いに独立に例えばハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、ニトロ、メトキシまたはカルボキシル基であり、
Ｚは、塩素または臭素であるか、または式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であり、但し、Ｒ９およびＲ１０は同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、好ましくはイソプロピルであるか、またはＣ５〜Ｃ１２−シクロアルキル基（好ましくはＣ８以下）、ベンジルまたはフェニル基である］を有する化合物を用いることが可能である。
【００１７】
ホスフィチル化試薬として好ましく用いられたものは、式（ＶＩＩ）  の化合物においてＺが塩素であり、Ｒ６およびＲ７はそれぞれイソプロピル基であり、Ｒ８は式
【化３９】
0003539978.tif 000022
の基であるものであった。
【００１８】
反応は、通常は有機塩基、例えばピリジン、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび／またはアセトニトリルおよびＣ１〜Ｃ４−トリアルキルアミン、好ましくはトリメチル−、トリエチル−またはジイソプロピルエチル−アミン、特にジイソプロピルエチルアミンと混合物１〜８モル当量、好ましくは１〜６モル当量、特に１〜４モル当量の存在下にて、有機溶媒、例えばテトラヒドロフランまたは塩化メチレン、好ましくは塩化メチレン中で行った。Ｚが式−ＮＲ９Ｒ１０を有する基であるときには、反応は式［ＨＮＲ１１Ｒ１２Ｒ１３］（＋）  Ｘ（−）  （但し、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は同一であるかまたは互いに異なるものであり、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル基であり、Ｘ（−）  はハロゲン化物、特に塩化物である）を有する化合物またはテトラゾライトまたはテトラゾールの存在下、好ましくはテトラゾールの存在下で、好ましく行った。ダンシル化ヌクレオシド対ホスフィチル化試薬のモル比は、１対１〜４、好ましくは１対２〜４、特に１対２．５〜３．５であった。
【００１９】
この方法で得られた式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物は、引き続いてオリゴヌクレオチド合成に用いることができる。ここで、ヌクレオチドの糖残基はＤＮＡ合成ではデオキシリボースであり、ＲＮＡ合成ではリボースであるが、規則的にまたは不規則に配置されたデオキシリボースおよびリボース糖残基から成るオリゴヌクレオチドの合成にはデオキシリボースとリボースとの混合物も可能である。更に、オリゴヌクレオチドは式（Ｖａ）および（Ｖｂ）のモノヌクレオチドから成る規則的または不規則な構造を有することができる。オリゴ−およびポリヌクレオチド合成は、例えばクリスチャン・レーマン（Ｃｈｒ．  Ｌｅｈｍａｎｎ）ら  （１９８９）  によって記載されたホスホルアミダイト法と同様な方法で行うことができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドの合成には、原則として２つの可能性がある。一方では、例えばシー・ビー・リーズ（Ｃ．Ｂ．  Ｒｅｅｓｅ）［（Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ（１９８９）「オリゴおよびポリリボヌクレオチドの化学的合成（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏ−ａｎｄ  Ｐｏｌｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」核酸および分子生物学（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）（エフ・エックシュタイン（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）  およびディー・エム・ジェイ・リレイ（Ｄ．Ｍ．Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ）  監修）  ３，  １６４−１８１  ］によって記載された方法によって、溶液中で合成を行うことができる。
【００２１】
他方では、オリゴヌクレオチド合成は、固相、例えばヌクレオシド官能化ガラス（ケイ・ピー・ステンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  およびダブリュ・プランデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、（１９８９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，  ２１，  １０１；ケイ・ピー・ステンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  およびダブリュ・プランデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、（１９８９），    Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３１，  ２５４９；クリスチン・レーマン（Ｃｈｒ．  Ｌｅｈｍａｎｎ）ら、（１９８９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７，  ２３７９−２３９０，  ７号）上で行うことができる。一般的には、固相合成が好ましい方法である。
【００２２】
このために、下記の反応順序を好ましく選択した。
１．  式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物と式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）のヌクレオシド
【化４０】
0003539978.tif 000023
（式中、ＢおよびＲ１は前記の意味を有し、ＧはＲ１と同じ意味を有するかまたは弱酸、例えばテトラゾールまたはｐ−ニトロフェニルテトラゾールの存在下にて式（ＶＩＩａ）  または（ＶＩＩｂ）を有する化合物の２′−ヒドロキシルまたは３′−ヒドロキシル基によって結合されている重合支持体である）との反応。
２．  式（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の未反応化合物の無水酢酸等によるトラッピング。
３．  ヨウ素、硫黄またはヨウ素／アミンなどによるホスフェート、ホスホールアミデートまたはチオホスフェートへの酸化。
４．  例えばアセトニトリル中ＤＢＵによるダンシルエトキシカルボニル基の脱離。
５．  生成する支持体結合化合物の式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の化合物との反応。
６．  必要な鎖長のオリゴヌクレオチドを与えるための反応工程２〜６の繰り返し。
【００２３】
式（Ｖａ）または（Ｖｂ）および（ＶＩＩａ）または（ＶＩＩｂ）の化合物を、好ましくは、たとえば弱酸としてのテトラゾールまたはパラ−ニトロフェニルテトラゾールの存在下にて、−２０〜＋１００℃、特に室温で反応させた。酸化は、ヨウ素、硫黄またはアミンの存在下でのヨウ素の存在下にて、−８０〜１００℃、好ましくは−２０〜＋６０℃の温度で行った（エイ・イェーガー（Ａ．  Ｊａｅｇｅｒ）  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７，  ７２３７  （１９８８）  ）。ヨウ素、水および有機塩基、例えばルチジンまたはピリジンの混合物を用いたときには、酸化は好ましくは室温で行った。一方、元素状硫黄、トルエンおよび有機塩基の混合物を用いたときには、酸化は好ましくは６０℃で行った。
【００２４】
合成されたオリゴヌクレオチドは、一般的には２〜約２００、好ましくは２〜１００、特に２〜２０のモノヌクレオチドから成っていた。
【００２５】
ホスフィチル化の代わりに、糖残基上に２′−または３′−ヒドロキシル基を遊離のままで有するダンシルヌクレオシドも、式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）
【化４１】
0003539978.tif 000024
（式中、ＤａｎｓＥＯＣ、Ｒ１およびＢは前記の意味を有し、Ｋ（＋）  はカチオン、特に［ＮＨ（Ｃ２Ｈ５）３］（＋）  である）を有するＨ−ホスホネートに転換することができる（アール・シュトレンベルク（Ｒ．  Ｓｔｒｏｅｎｂｅｒｇ）  、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，  １；ビー・シー・フレーラー（Ｂ．Ｃ．  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）  、ピー・ジー・ヌグ（Ｐ．Ｇ．  Ｎｇ）  、エム・ディー・マテアッチ（Ｍ．Ｄ．  Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４  （１９８６），  ５３９９  ；エム・タハル（Ｍ．  Ｔａｈａｌｕ）  ら、Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９８８，  １６７５  ）。
【００２６】
これにより、一般的には式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の化合物を式（ＩＸ）または（Ｘ）
ＰＲ１４Ｒ１５Ｒ１６                                    （ＩＸ）
ＰＲ１７Ｒ１８Ｒ１９                                    （Ｘ）
（式中、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は同一であるかまたは互いに異なるものであり、水素またはＣ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ１〜Ｃ８−フルオロアルキルまたはアリール基であり、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、同一であるかまたは互いに異なるものであり、塩素、臭素またはＣ１〜Ｃ８−アルキルアミノまたは１，２，４−トリアゾリル基である）を有する化合物と反応される。
【００２７】
ダンシル化ヌクレオシドは、好ましくはビス（２，２，２−トリフルオロエチル）Ｈ−ホスホネート、ビス（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル）Ｈ−ホスホネート、トリエチルホスファイト、トリフェニルホスファイト、またはＰＣｌ３、トリ（ジアルキルアミノ）ホスフィンまたはトリス（１，２，４−トリアゾリル）ホスファイト、好ましくはトリス（１，２，４−トリアゾリル）ホスファイトと、特に好ましくはイミダゾール／トリエチルアミンで活性化した後ＰＣｌ３と反応させて、加水分解してＨ−ホスホネートとした。
【００２８】
反応は、Ｃ１〜Ｃ４−トリアルキルアミンまたはＮ−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルモルホリン、好ましくはＮ−メチルモルホリンのような有機溶媒１〜５０モル当量、好ましくは１０〜５０モル当量、特に３０〜５０モル当量の存在下にて、テトラヒドロフランまたは塩化メチレン、好ましくは塩化メチレンのような有機溶媒中で行った。ダンシル化ヌクレオシド対ホスホニル化試薬のモル比は、１対１〜１０、好ましくは１対２〜８、特に１対５であった。
【００２９】
この方法で得た式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物は、引き続いてオリゴヌクレオチド合成に用いることができる。このためには、ヌクレオチドの糖残基はＤＮＡ合成ではデオキシリボースであり、ＲＮＡ合成ではリボースであるが、デオキシリボースとリボースとの混合物を用いて規則的または不規則に配置されたデオキシリボースおよびリボース糖残基から成るオリゴヌクレオチドを合成することもできる。更に、オリゴヌクレオチドは、式（ＶＩＩＩａ）  および（ＶＩＩＩｂ）  のモノヌクレオチドから成る規則的または不規則な構造を有することができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチド合成は、例えばビー・シー・フレーラー（Ｂ．Ｃ．  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）  （フレーラー・ビー・シー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，  Ｂ．Ｃ．）  （１９８６），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４，５３９９−５４０７，  Ｎｏ．  １３）によって記載されたＨ−ホスホネート法によって行うことができ、この場合には５′−ヒドロキシル保護基の酸脱離をダンシルエトキシカルボニル基の塩基性脱離に代える。
【００３１】
この合成は、原則として、たとえばシー・ビー・リーズ（Ｃ．Ｂ．  Ｒｅｅｓｅ）  （１９８９）  の方法と同様にして溶液中でまたはたとえばビー・シー・フレーラー（Ｂ．Ｃ．  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９８６））  の方法と同様にして固相上で行うことができる。固相合成が、通常は好ましい。
【００３２】
このために、下記の反応順序を好ましく選択した。
１．  酸塩化物、例えばピバロイルクロリドまたはアダマントイルクロリドの存在下での式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物とヌクレオシド結合の重合支持体との反応。
２．  例えばＤＢＵによるダンシルエトキシカルボニル基の脱離。
３．  生成する化合物と式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  の化合物との反応。
４．  必要な鎖長のオリゴヌクレオチドになるまで工程２および３の繰り返し。
５．  ヨウ素、硫黄、またはアミン／ＣＣｌ４／トリフェニルホスフィンによるホスフェート、ホスホールアミデートまたはチオホスフェートへの酸化（イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、前記を参照されたい）。
【００３３】
式（ＶＩＩＩａ）  または（ＶＩＩＩｂ）  および（ＶＩＩａ）および（ＶＩＩｂ）の化合物は、例えば酸としてのピバロイルクロリドの存在下にて、−２０℃〜＋１００℃の温度で、特に室温で好ましく反応させた。酸化は、例えば一般的にはピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、水、ＴＨＦから成る溶媒混合物中でヨウ素により室温で行った。
【００３４】
記載されたＨ−ホスホネート法によって合成されたオリゴヌクレオチドは、一般的には２〜約２００、好ましくは２〜１１０、特に２〜４０個のモノヌクレオチドから成っていた。
【００３５】
ホスホアミダイトまたはＨ−ホスホネート法によってダンシル化されたモノヌクレオチドからのオリゴヌクレオチド合成の利点は、下記の通りである。
ａ）  ダンシル基は、５５０ｎｍに強い螢光があるので検出が容易であり、
ｂ）  ポリ−およびオリゴヌクレオチドの合成をピコモルの範囲まで下げられ、
ｃ）  ヌクレオチド塩基上または糖残基上の他のヒドロキシル保護基を脱離することなく５′−ヒドロキシルダンシル保護基が除去され、
ｄ）  オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチド、特にオリゴリボヌクレオチドが合成され、
ｅ）  高収率および大鎖長でオリゴヌクレオチドが固相合成される。
【００３６】
ＲＮＡ合成における５′−ヒドロキシルダンシル保護基を用いることのもう一つの利点は、リボース残基の２′−ヒドロキシル基が合成の終了時に保護されたままにすることができることである。この方法で修飾されたオリゴリボヌクレオチドは、したがって一般的にはＲＮａｓｅによる加水分解だけでなく異性化反応から保護されるので、長期間安定に保存することができる。次いで、２′−ヒドロキシル保護基はＲＮＡの使用の直前にのみ脱離される。
【００３７】
合成されたオリゴヌクレオチド上のアミノおよびヒドロキシル保護基の支持体からの脱離および開裂は、公知の方法、例えばエム・ガイト（Ｍ．  Ｇａｉｔ）  監修：オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、実際的方法（ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ）；アイアールエル・プレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）  ；オックスフォード、１９８４年によって記載された方法によって行った。
【００３８】
下記の例により、本発明を更に説明する。下記の略号を用いた。
Ｂｚ：            ベンゾイル、
Ｍｔｈｐ：        メトキシテトラヒドロピラニル、
ＤａｎｓＥＯＣ：  ダンシルエトキシカルボニル、および
ＥＡ：            酢酸エチル。
【００３９】
【実施例】
例１
２−ダンシルエタノールとトリクロロメチルクロロホルメートとの反応
無水ＣＨ３ＣＮ１０ｍｌ中に、トリクロロメチルクロロホルメート０．８ｍｌ（１．３２ｇ＝６．６４ミリモル）を氷冷および撹拌しながらピペットで加える。次いで、氷冷および撹拌しながら、無水ＣＨ３ＣＮ５ｍｌに溶解した２−ダンシルエタノール１ｇ（３．５８ミリモル）を隔壁を通して注射器で少しずつ加える。混合物を氷浴で更に５時間撹拌する。沈澱した無色固形物を吸引濾別し、無水テトラヒドロフランで洗浄し、高真空で乾燥する。融点が１５４〜５５℃の無色固形物が１．１３５ｇ（３．００ミリモル＝８４％）が得られる。
元素分析は次の通りである：
0003539978.tif 000025
【００４０】
例２
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシンと２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリドとの反応
２′−Ｏ−Ｍｔｈｐ−Ｎ６−Ｂｚ−アデノシン２．４３ｇ（５ミリモル）を、無水ピリジン３０ｍｌずつで２回共蒸発させた後、無水ピリジン４０ｍｌに溶解する。次いで、氷冷および撹拌を行いながら、２−ダンシルエチルクロロホルメートヒドロクロリド２．４６ｇ（６．５ミリモル＝１．３当量）を固形物の形態で加える。混合物を氷浴で１時間撹拌すると、ヒドロクロリドは約０．５時間で溶解する。次いで、グリコール０．５ｍｌ（８．８ミリモル）を用いて反応を停止し、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２２００ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液２００ｍｌで洗浄し、水相をＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌずつで２回抽出し、纏めた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。これをトルエン１００ｍｌずつで２回、およびＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌずつで２回共蒸発させる。ＳｉＯ２カラム（１００ｇ、２３×３．５ｃｍ）上で精製する。フラッシュクロマトグラフィ溶出は、ＣＨ２Ｃｌ２０．５リットル、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１００：１）１リットルおよびＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１００：２）１．５リットルで行う。それぞれの生成物画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空で乾燥する。５′−置換体２．８６ｇ（３．６２ミリモル＝７２％）および３′，５′−二置換体生成物０．４７ｇ（０．４３ミリモル＝９％）が、それぞれの場合に黄色の螢光性の高い泡沫として得られる。元素分析のために、二置換体１００ｍｇをＳｉＯ２プレート（４０×２０ｃｍ）上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１００：２）を用いて再度精製する。
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシンの分析データー
ａ）  薄層クロマトグラフィ
薄層クロマトグラフィは、シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュール（Ｓｃｈｕｅｌｌ）  のシリカゲルＦ１５００／ＬＳ  ２５４上で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５：５）で行い、Ｒｆ０．４８を計算した。
ｂ）  メタノール中でのＵＶ分光分析
＋λｍａｘ      ２５７        ２７２        ３３９
ｌｏｇεｍａｘ      ４．４２      ４．３８      ３．６５
ｃ）  元素分析
0003539978.tif 000026
ｄ）  ＮＭＲ分光分析
ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ
９．０３  ｓ  ｂｒｏａｄ  （１）ＮＨ，  ８．８１  ｓ  （１）  Ｈ−８，  ８．６１  ｄ  （２）ダンシル−Ｈ−２，  ８．３５−８．３０  ｍ（２）ダンシルＨ−４，ダンシルＨ−８，  ８．２３  ｓ  （１）  Ｈ−２，  ８．０３  ｄ  （２）  Ｏ−Ｂｚの２Ｈ，７．６５−７．５０  ｍｍ  （５）  Ｂｚ  の３Ｈ，  ダンシルＨ−３，ダンシルＨ−７，  ７．２０  ｄ  （１）  ダンシルＨ−６，６．２０  ｄ  （１）  Ｈ−１´，  ５．１３  ｔ  （１）  Ｈ−２´，  ４．５２−４．３２  ｍ  （６）    ＣＨ２  ＯＣＯ，  Ｈ−３´，  Ｈ−４´，Ｈ−５´，  Ｈ−５”，  ３．７２  ｔ  （２）  ＳＯ２  ＣＨ２  ，  ３．７７−３．４３  ｍ  （４）  ＣＨ２  Ｏ  ＣＨ２  （Ｍｔｈｐ），  約２．９０  ｓ  ｂｒｏａｄ  （１）  ３´−ＯＨ，  ２．８９  ｓ  （６）  ＮＭｅ２  ，  ２．８７  ｓ  （３）  ＯＣＨ３  ，  １．９５−１．５５  ｍ  （４）  ＣＨ２  Ｃ  ＣＨ２    （Ｍｔｈｐ）  。
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−３′，５′−ビス−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシンの分析データー
ａ）  薄層クロマトグラフィ
薄層クロマトグラフィは、シリカゲルＦ１５００／ＬＳ  ２５４（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュール（Ｓｃｈｕｅｌｌ）  ）上で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１００：１）で行い、Ｒｆ０．３５を計算した。
ｂ）  メタノール中でのＵＶ分光分析
＋λｍａｘ      ２５４        ２７８        ３４３
ｌｏｇεｍａｘ      ４．５８      ４．３７      ３．９１
ｃ）  元素分析
0003539978.tif 000027
ｄ）  ＮＭＲ分光分析ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ
９．０５  ｓ  ｂｒｏａｄ  （１）ＮＨ，  ８．８３  ｓ  （１）  Ｈ−８，  ８．６９−８．６０  ２ｄ  （２）  ２ｘ  ダンシル−Ｈ−２，８．３５−８．２９  ｍ  （４）  ２ｘ  ダンシルＨ−４，  ２ｘ  ダンシルＨ−８，  ８．２２  ｓ  （１）  Ｈ−２，  ８．０３  ｄ  （２）  Ｏ−Ｂｚの２Ｈ，７．６８−７．５０  ｍ  （７）  Ｂｚの３Ｈ，  ２ｘダンシルＨ−３，  ２ｘ  ダンシルＨ−７，７．２４  −  ７．１８  ２ｄ  重複  ｔ（２）  ２ｘダンシルＨ−６，  ６．１３  ｄ  （１）  Ｈ−１´，  ５．３２  ｔ  （１）Ｈ−２´，５．１３−５．１１  ｍ  （１）  Ｈ−３´，  ４．６０−４．２２  ｍ  （７）    ２ｘ  ＣＨ２  ＯＣＯ，  Ｈ−４´，  Ｈ−５´，Ｈ−５”，  ３．７７−３．２６  ｍ  （８）  ２ｘ  ＳＯ２  ＣＨ２  ，  ＣＨ２  Ｏ  ＣＨ２  （Ｍｔｈｐ），  ２．８９  ｓ  （６）  ＮＭｅ２  ，２．８８  ｓ  （６）  ＮＭｅ２  ，  ２．６３  ｓ  （３）  ＯＣＨ３  ，  １．７８−１．２０  ｍ  （４）  ＣＨ２  Ｃ  ＣＨ２    （Ｍｔｈｐ）  。
【００４１】
例３
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシンと２−（４−ニトロフェニル）エチル＝ジイソプロピルホスホールアミドクロリダイトとの反応
２′−Ｏ−Ｍｔｈｐ−５′−Ｏ−ｄａｎｓＥＯＣ−Ｎ６−Ｂｚ−アデノシン１ｇ（１．２６４ミリモル）を無水ＣＨ２Ｃｌ２６ｍｌに溶解した後、ヒューニッヒ（Ｈｕｅｎｉｇ）  塩基０．８６ｍｌ（０．６５ｇ＝５．０３ミリモル＝４当量）と２−（４−ニトロフェニル）エチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト０．８４ｇ（２．５２８ミリモル＝２当量）を加える。混合物を室温で窒素雰囲気下にて撹拌し、アルミ箔に包んで遮光する。１．２５時間後に、ホスフィチル化試薬を、更に０．４２ｇ（１．２６４ミリモル＝１当量）を加える。全部で２．５時間室温撹拌した後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２７５ｍｌで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液７５ｍｌで洗浄し、水相をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍｌずつで４回逆抽出し、纏めた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。ＳｉＯ２カラム（３０ｇ、１２×３ｃｍ）上で、ＣＨ２Ｃｌ２２５０ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：１）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：２）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：３）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：５）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１００：７）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（９：１）１００ｍｌ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（４：１）３５０ｍｌ（試薬）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（２：１）１００ｍｌ（生成物）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１：１）１００ｍｌ（生成物）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥＡ（１：２）１００ｍｌ（生成物）およびＥＡ１００ｍｌ（生成物）で溶出するフラッシュクロマトグラフィによって精製する。
生成物画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、高真空で乾燥する。黄色の螢光性泡沫０．９５５ｇ（０．８７８ミリモル＝７０％）が得られる。
分析データー
ａ）  薄層クロマトグラフィ
薄層クロマトグラフィは、シリカゲルＦ１５００／ＬＳ  ２５４（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュール（Ｓｃｈｕｅｌｌ）  ）上で、トルエン／ＥＡ（１：６）で行い、Ｒｆ０．５０を計算した。
ｂ）  メタノール中でのＵＶ分光分析
＋λｍａｘ      ２６１        ３３０        ３３９
ｌｏｇεｍａｘ      ４．５４      ３．５５      ３．５１
ｃ）  元素分析
0003539978.tif 000028
ｄ）  ＮＭＲ分光分析
１．    ３１Ｐ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３中、１６１．７０ＭＨｚ
１５１．３４  ｐｐｍ  ｓ  （３１％）
１４９．４７  ｐｐｍ  ｓ  （６９％）。
２．    １Ｈ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３中、２５０ＭＨｚ
９．０７  ｓ  ｂｒｏａｄ  （１）ＮＨ，  ８．８３    および８．８２  ２ｓ  （１）  Ｈ−８，  ８．６１  ｄ  （１）  ダンシル−Ｈ−２，  ８．３５−８．２９  ｍ  （２）    ダンシルＨ−４，ダンシルＨ−８，  ８．２４  および８．２２  ２ｓ  （１）  Ｈ−２，８．１８−８．１３  ２ｄ  （２）  フェニル−ＮＯ２  の２ＨＯ  ，８．０３  ｄ  （２）  Ｏ−Ｂｚ  からの２Ｈ，  ７．６４−７．４９  ｍ  （５）  Ｂｚの３Ｈ，  ダンシルＨ−３，    ダンシルＨ−７，  ７．４５−７．３８  ２ｄ  （２）  ２Ｈ  ｍフェニル−ＮＯ２  ，  ７．１９  ｄ  （１）    ダンシルＨ−６，  ６．２３  および６．１５  ２ｄ  （１）  Ｈ−１´，  ５．２０および５．１１  ２ｔ  （１）  Ｈ−２´，  ４．４８  ｔ  （２）    ＣＨ２  ＯＣＯ，  ４．４４−４．１８  ｍ  （４）  Ｈ−３´，  Ｈ−４´，  Ｈ−５´，  Ｈ−５”，  ４．１０−３．８８  ｍ  （２）    ＣＨ２  ＯＰ，  ３．８４−３．２５  ｍ  （６）  ２ｘＣＨ（ｉ−Ｐｒ）．    ＣＨ２  Ｏ  ＣＨ２  （Ｍｔｈｐ），  ３．７１  ｔ  （２）  ＳＯ  ２  ＣＨ２  ，  ３．０６  ｔ  （２）    ＣＨ２  −フェニルＮＯ２  ，  ２．８８  ｓ  （６）  ＮＭｅ２  ，  ２．６６および２．６１  ２ｓ  （３）  Ｏ  ＣＨ３  ，  ２．００−１．４５  ｍ  （４）  ＣＨ２  Ｃ  ＣＨ２    （Ｍｔｈｐ重複ｄ  （１２）  ２ｘ  Ｃ（ＣＨ３  ）  ２  （ｉ−Ｐｒ）。
【００４２】
例４
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルホスホルアミダイトを用いる自動オリゴリボヌクレオチドの合成。デカヌクレオチド（ｒＡｐ）９Ｔの調製
合成は３８０  Ｂ  ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて行った。
使用カラム：  ＡＢＩ標準カラム、
使用支持材料：３′−ヒドロキシル基によってヌクレオチドに結合しているＬＣＡＭＡ−ＣＰＧ支持体。
（文献：ケイ・ピー・シュテンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  、ダヴリュ・プライデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，  ２１，  １０１，  （１９８９）；  ケイ・ピー・シュテンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  、ダヴリュ・プライデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３１，  ２５４９  （１９９０））。
３′−ヒドロキシル基を介して支持体に結合しているチミジンを装填：１９マイクロモル／ｇ、
バッチサイズ：約０．６マイクロモル（トリチル脱離によって決定）。
合成サイクル：
１．  下記のパルス順序による無水アセトニトリル中での０．５Ｍテトラゾールおよび０．１Ｍ  ２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３′−Ｏ−ホスホルアミダイトの縮合
0003539978.tif 000029
２．  無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：３）および６．５％ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）／ＴＨＦ中による未反応ヌクレオチドのキャッピング
流動                              ２０秒間
待機工程                          ３０秒間。
３．  Ｉ２溶液（１．２６９ｇＩ２／２０ｍｌＨ２Ｏ／１０ｍｌピリジン／１００ｍｌＴＨＦ）
流動                              ３０秒間
待機工程                          ３０秒間。
４．  １秒間の逆フラッシュを挿入した２×３０秒間および８×１０秒間のパルス流での０．１Ｍ  ＤＢＵ／アセトニトリルによるダンシルエトキシカルボニルの脱離
第４工程からの溶出液を集めて、縮合収率を螢光分光分析法（励起：３６８ｎｍ；  発光：５２６ｎｍ）によって形成された５−ジメチルアミノ−１−ナフチルビニルスルホンに基づいて測定した。
平均の工程ごとの収率は約９８％であった。
それぞれの工程１〜４の間に、アセトニトリルによる通常の洗浄工程およびブロックおよび逆フラッシュを行った。
【００４３】
例５
５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルで保護されたＨ−ホスホネート
イミダゾール１０．７５当量を無水塩化メチレン５ｍｌに溶解し、次いで氷／塩化ナトリウムで冷却した後、冷却溶液にＰＣｌ３３．５当量およびトリエチルアミン１１．２５当量を加える。混合物を冷却しながら１５分間撹拌した後、２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン０．２５ミリモル（１等量）または２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル−Ｎ６−パラ−ニトロフェニルエチルオキシカルボニルアデノシン（アセトニトリルで１回共蒸発）０．２５ミリモルを無水塩化メチレン５ｍｌに溶解したものを撹拌しながら１０分間を要して滴下して加える。
次いで氷浴を取り除き、混合物を室温で更に１５分間撹拌する。次いで、反応溶液を１Ｍトリエチルアンモニウムビカーボネート１０ｍｌで振盪することによって抽出する。相を分離し、水相をＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｌで抽出し、纏めた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮したところ、黄色の螢光性泡沫を生成する。これを、短いシリカゲルカラム（フラッシュクロマトグラフィ）上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨグラディエントを用いて精製する。
【００４４】
例６
２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニルリボヌクレオチド  ３′−Ｏ−Ｈ−ホスホネートを用いる自動オリゴリボヌクレオチド合成。（ｒＡｐ）９Ｔの調製。
合成は３８０  Ｂ  ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて行った。
使用カラム：  ＡＢＩ標準カラム、
使用支持材料：ＬＣＡＭＡ−ＣＰＧ支持体。
（文献：ケイ・ピー・シュテンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  、ダヴリュ・プライデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．，  ２１，  １０１，  （１９８９）；  ケイ・ピー・シュテンゲル（Ｋ．Ｐ．  Ｓｔｅｎｇｅｌｅ）  、ダヴリュ・プライデラー（Ｗ．  Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ）  、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３１，  ２５４９  （１９９０））。
３′−ヒドロキシル基を介して支持体に結合しているチミジンを装填：１９マイクロモル／ｇ、
バッチサイズ：約０．６マイクロモル（トリチル脱離によって決定）。
合成サイクル：
１．  無水ピリジン／アセトニトリル（１：１）で洗浄、
２．  無水ピリジン／アセトニトリル（１：１）中での２′−Ｏ−（４−メトキシテトラヒドロピラニル）−５′−Ｏ−ダンシルエトキシカルボニル＝Ｈ−ホスホネート（１０ｍＭ）およびピバロイルクロリド（５０ｍＭ）の反応、
３．  無水アセトニトリルで洗浄（４５秒間）、
４．  アセトニトリル中０．１ＭＤＢＵによるダンシルエトキシカルボニル脱離（２分間）、
５．  必要な鎖長に達するまで工程１〜４を反復、
６．  アセトニトリル中０．１Ｍ  ＤＢＵによるダンシルエトキシカルボニル脱離（２分間）および溶出物の収集、
７．  ピリジン／Ｎ−メチルイミダゾール／水／ＴＨＦ（５／１／５／９０）中Ｉ２（０．１Ｍ）（２．５分間）またはトリエチルアミン／水／ＴＨＦ（５／５／９０）中Ｉ２（０．１Ｍ）（２．５分間）による酸化。
チオホスフェートまたはホスホルアミデートへの酸化も、ウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）  およびペイマン（Ｐｅｙｍａｎ）  （１９９０）  に記載の方法で行った。
第６工程からの溶出液を集めて、縮合収率を螢光分光分析法（励起：３６８ｎｍ；  発光：５２６ｎｍ）によって形成される５−ジメチルアミノ−１−ナフチルビニルスルホンに基づいて測定する。
平均の工程ごとの収率は約９８％である。