(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２１および配列番号２２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３３および配列番号３４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１７、それぞれ配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１８、それぞれ配列番号３７および配列番号３８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１９、それぞれ配列番号３９および配列番号４０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２０、それぞれ配列番号４１および配列番号４２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２１、それぞれ配列番号４３および配列番号４４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２２、それぞれ配列番号４５および配列番号４６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２３、それぞれ配列番号４７および配列番号４８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２４、それぞれ配列番号４９および配列番号５０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２５、それぞれ配列番号５１および配列番号５２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２６からなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含む、ヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
【請求項２】
それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２１および配列番号２２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３３および配列番号３４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１７、それぞれ配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１８、それぞれ配列番号３７および配列番号３８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１９、それぞれ配列番号３９および配列番号４０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２０、それぞれ配列番号４１および配列番号４２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２１、それぞれ配列番号４３および配列番号４４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２２、それぞれ配列番号４５および配列番号４６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２３、それぞれ配列番号４７および配列番号４８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２４、それぞれ配列番号４９および配列番号５０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２５、それぞれ配列番号５１および配列番号５２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２６からなる群より選択される３またはそれ以上のプライマーセットを含む、ヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
【請求項３】
それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１８、それぞれ配列番号３７および配列番号３８で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１９、それぞれ配列番号４５および配列番号４６で表される塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２３、からなる群より選択される３またはそれ以上のプライマーセットを含む、ヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
【請求項４】
各々が配列番号５、６、９、１０、１７、１８、３１および３２に記載の塩基配列からなる８種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス１６、１８、３１および４５を検出するためのキット。
【請求項５】
各々が配列番号５、６、９、１０、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、３８、４５、４６、４７、４８、４９および５０に記載の塩基配列からなる２４種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８および５９を検出するためのキット。
【請求項６】
各々が配列番号１、２、３、４、５、６、９、１０、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０に記載の塩基配列からなる３６種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４２、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８および５９を検出するためのキット。
【請求項７】
各々が配列番号１−５２に記載の塩基配列からなる５２種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
【請求項８】
試料におけるヒトパピローマウイルスの存在または発現を検出する方法であって、前記試料から得られたＤＮＡまたは前記試料から得られたｍＲＮＡから逆転写により調製したｃＤＮＡをテンプレートとして、請求項１−７のいずれかに記載のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして、増幅されたヒトパピローマウイルス遺伝子を検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス遺伝子を検出するための特異的プライマーセット、およびこれを用いるヒトパピローマウイルス遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに５０種類以上の型のヒトパピローマウイルスが同定されおり、そのうち２０種類以上が生殖器に感染する。感染したヒトパピローマウイルスの型により、疾患の発生の確率および悪性の程度が異なることが知られている。例えば、良性のコンジロームには１１型が、比較的良性の子宮頸癌には６型や１１型が、悪性の子宮頸癌には１６型や１８型が多く検出される。したがって、感染したパピローマウイルスの型を調べることは、診断において非常に重要である。
【０００３】
パピローマウイルスの型を区別する診断方法としては、これまで、型特異的プライマーを用いて特定の型のヒトパピローマウイルス遺伝子のみを増幅させて検出する方法、およびランダムプライマーまたは型非特異的プライマーを用いてヒトパピローマウイルス遺伝子を非特異的に増幅させた後に、型特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出する方法が知られていた。
【０００４】
しかし、前者の方法では、それぞれの型について別々のチューブで増幅反応を行わなければならないため、操作が煩雑であり、少量の試料では実施が困難であった。また、後者の方法では、増幅効率が低いために高い検出感度を得ることができなかった。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】特開２００１−１９７８９４
【特許文献２】特開２００１−２３１５８７
【特許文献３】特表２００１−５０２５４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、複数の型のヒトパピローマウイルス遺伝子を特異的かつ高感度で検出することができるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、２６種類のヒトパピローマウイルスを特異的に検出することができるＰＣＲプライマーセットを含むキットを提供する。該キットは、下記の表ＩＩに示されるプライマーセット１−２６からなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含む。より詳細には、本発明のキットは、それぞれ配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１、それぞれ配列番号３および配列番号４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号７および配列番号８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット４、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット６、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット７、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２１および配列番号２２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１１、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号２７および配列番号２８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１４、それぞれ配列番号２９および配列番号３０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１５、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３３および配列番号３４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１７、それぞれ配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１８、それぞれ配列番号３７および配列番号３８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１９、それぞれ配列番号３９および配列番号４０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２０、それぞれ配列番号４１および配列番号４２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２１、それぞれ配列番号４３および配列番号４４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２２、それぞれ配列番号４５および配列番号４６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２３、それぞれ配列番号４７および配列番号４８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２４、それぞれ配列番号４９および配列番号５０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２５、それぞれ配列番号５１および配列番号５２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２６からなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーセットを含む。
【０００７】
本発明にしたがえば、各プライマーセットを混合物として用いた場合でも、特定の型のヒトパピローマウイルスを特異的に検出することができる。後述の実施例に示されるように、本発明のプライマーセット１−２６は、それぞれの標的ヒトパピローマウイルスに対する特異性が高いため、これらを混合して１つの試験管内でマルチプレックスＰＣＲ反応を行った場合に、試料中に存在する特定の型のヒトパピローマウイルス遺伝子を特異的に増幅することが可能である。このことは、プライマーセット１−２６から任意の２つのプライマーセット、任意の３つのプライマーセット、任意の４つのプライマーセットなどを選択して混合物として用いた場合にも同様に、それぞれのプライマーセットに対応する標的のヒトパピローマウイルスが特異的に増幅されることを意味する。
【０００８】
好ましくは本発明のキットは、下記の表ＩＩに示されるプライマーセット１−２６からなる群より選択される３またはそれ以上のプライマーセット、より好ましくは４またはそれ以上のプライマーセットを含む。さらに好ましくは、本発明のキットは、それぞれ配列番号５および配列番号６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット３、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット５、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット８、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット９、それぞれ配列番号１９および配列番号２０で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１０、それぞれ配列番号２３および配列番号２４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１２、それぞれ配列番号２５および配列番号２６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１３、それぞれ配列番号３１および配列番号３２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１６、それぞれ配列番号３５および配列番号３６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１８、それぞれ配列番号３７および配列番号３８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット１９、それぞれ配列番号４５および配列番号４６で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット２３、からなる群より選択される３またはそれ以上のプライマーセット、より好ましくは３またはそれ以上のプライマーセットを含む。
【０００９】
また好ましくは、本発明は、各々が配列番号５、６、９、１０、１７、１８、３１および３２に記載の塩基配列を有する８種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス１６、１８、３１および４５を検出するためのキットを提供する。また好ましくは、本発明は、各々が配列番号５、６、９、１０、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、３１、３２、３５、３６、３７、３８、４５、４６、４７、４８、４９および５０に記載の塩基配列を有する２４種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８および５９を検出するためのキットを提供する。また好ましくは、本発明は、各々が配列番号１、２、３、４、５、６、９、１０、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０に記載の塩基配列を有する３６種類のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトパピローマウイルス６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４２、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８および５９を検出するためのキットを提供する。最も好ましくは、本発明のキットは、各々が配列番号１−５２に記載の塩基配列を有する５２種類のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１０】
別の観点においては、本発明は、試料におけるヒトパピローマウイルスの存在を検出する方法を提供する。該方法は、前記試料から得られたＤＮＡをテンプレートとして、上述の本発明のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして、増幅されたヒトパピローマウイルス遺伝子を検出することを含む。試料におけるヒトパピローマウイルスの発現を検出するためには、前記試料からｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した後、上述と同様にしてヒトパピローマウイルス遺伝子を増幅し、これを検出することができる。
【００１１】
さらに別の観点においては、本発明は、表ＩＩＩに示されるＤＮＡフラグメント１−２６からなる群より選択される２またはそれ以上のＤＮＡフラグメントが固定化されている、ヒトパピローマウイルスを検出するためのＤＮＡアレイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製  Model 394）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【００１３】
本発明のプライマーセットを用いて試料におけるヒトパピローマウイルス遺伝子の存在を検出するためには、試料からＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ヒトパピローマウイルス遺伝子を増幅させる。試料としては、ヒトパピローマウイルスに感染していると疑われる被験者から得られた組織試料、生検、スメア等を用いることができる。あるいは、培養細胞、例えばＨｅＬａ細胞等を用いてもよい。
【００１４】
試料からＤＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出を用いることができる。あるいは市販のＤＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００１５】
さらに、本発明のプライマーセットは、ヒトパピローマウイルス遺伝子のコーディング領域中の配列が増幅されるよう選択されているため、試料におけるヒトパピローマウイルス遺伝子の発現を検出するために用いることができる。ヒトパピローマウイルス遺伝子の発現を検出するためには、試料からＲＮＡを抽出して鋳型ｃＤＮＡを調製し、これをテンプレートとして本発明のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、試料中で発現されているヒトパピローマウイルス遺伝子を増幅させる。
【００１６】
試料からＲＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、グアニジン−イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出を用いることができる。あるいは市販のＲＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００１７】
ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法も当該技術分野においてよく知られている。プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することができる。逆転写酵素としては、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いることができる。
【００１８】
次に、このようにして調製したＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとして、本発明のプライマーセットの混合物をプライマーとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ポリメラーゼとしては例えばＥｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ）を用いることができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、９４℃で５分間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を２５サイクル、次に７２℃で５分間で実施する。次に、増幅産物を各ヒトパピローマウイルスに特異的な遺伝子がスポットされている検出用アレイとハイブリダイズさせることにより、試料中における各ヒトパピローマウイルスの存在または非存在を検出することができる。
【００１９】
検出用のＤＮＡアレイは、検出すべきヒトパピローマウイルス遺伝子の配列とハイブリダイズしうる配列を有するＤＮＡ断片が固定化されている支持体である。支持体としては、限定されないが、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコンチップなどを用いることができる。好ましくは、検出用アレイに固定化するＤＮＡ断片は、それぞれ対応する型のヒトパピローマウイルス遺伝子とのみハイブリダイズし、他の型のヒトパピローマウイルス遺伝子とはハイブリダイズしないよう選択する。最も好ましくは、本発明において用いる検出用アレイは、表ＩＩＩに示されるＤＮＡフラグメントの２またはそれ以上が固定化されているものである。
【００２０】
すなわち、本発明の別の観点においては、本発明は、表ＩＩＩに示されるＤＮＡフラグメント１−２６からなる群より選択される２またはそれ以上のＤＮＡフラグメントが固定化されている、ヒトパピローマウイルスを検出するためのＤＮＡアレイを提供する。
【００２１】
本発明のキットは、２６種類のヒトパピローマウイルスに対応するプライマーセットを混合して用いた場合にも、各ヒトパピローマウイルス遺伝子を特異的に増幅させることができることを特徴とする。したがって、１つの試験管内で２６種類のヒトパピローマウイルスについて同時にその存在または非存在を調べることができるため、型特異的プライマーを用いて別々の試験管内でＰＣＲを行う従来技術の方法と比較して、アッセイが簡単であり、アッセイに要する時間、費用および試料が少なくてよいという利点を有する。また、本発明のプライマーセットの混合物を用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のＤＮＡアレイで検出することにより、試料中に複数種類のヒトパピローマウイルスが存在する場合でも、これらを同時に検出することが可能である。
【００２２】
さらに、本発明のプライマーセットおよびＤＮＡアレイを用いることにより、プライマーの特異性に基づくＰＣＲ増幅の特異性と、ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションの特異性との相乗効果が得られる。このため、ランダムプライマーまたは型非特異的プライマー（共通プライマー）を用いて各種のヒトパピローマウイルス遺伝子を非特異的に増幅させた後に、型特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出する従来技術の方法と比較して、より特異性の高い検出が可能となる。
【００２３】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
実施例１  プライマーの設計
ヒトパピローマウイルスの遺伝子配列は公共データベースから入手した。表Ｉに、本発明において用いた遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を示す。
表Ｉ
【表１】
0003600616.tif 000002
【００２５】
各ヒトパピローマウイルス遺伝子の配列に基づいて、以下の基準を満たすプライマーセットを設計した：増幅産物の配列がコーディング領域内に含まれる；融解温度が５８−６３℃の範囲内である；増幅産物の長さが３００−５５０ｂｐの範囲内である；他の種類のヒトパピローマウイルスと有意なホモロジーを有しない；分子内に二次構造を形成しない；プライマーどうしがハイブリダイズしない。このようにして、各ヒトパピローマウイルスに特異的なプライマーセットを設計した。
【００２６】
表ＩＩ
【表２】
0003600616.tif 000003
【００２７】
【表３】
0003600616.tif 000004
【００２８】
表ＩＩに示されるプライマーセットの配列に基づいて、ＤＮＡ合成機によりオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成し、その配列を確認した。
【実施例２】
【００２９】
実施例２  プライマーの特異性の確認
HPV06、HPV11、HPV16、HPV17、HPV18、HPV20、HPV21、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV45、HPV47、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59およびHPV61をコードするＤＮＡをそれぞれプラスミドｐＵＣ１８内に導入して、テンプレート用のプラスミドを作成した。
【００３０】
ＨＰＶ１８の配列を含むことが知られているＨｅＬａ細胞培養物から総ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。また、ＳＷ４８０細胞培養物からも同様にｃＤＮＡを合成した。さらに、ヒト組織よりＤＮＡを抽出することによりゲノムＤＮＡを調製した。これらの各テンプレートプラスミドと、それぞれ１００倍量のＨｅＬａ／ｃＤＮＡ、ＳＷ４８０／ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを混合して、試験テンプレート混合物を調製した。
【００３１】
この試験テンプレート混合物をテンプレートとして、実施例１で作成した各々のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。反応液の組成は以下のとおりであった：
【表４】
0003600616.tif 000005
用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりであった：９４℃で５分間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で５分間の後に４℃で保存。得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動により分離した。図１に示されるように、いずれのプライマーセットについても、予測される長さの増幅産物が得られ、非特異的ハイブリダイズに起因する夾雑増幅物がないことが確認された。
【実施例３】
【００３２】
実施例３  検出用アレイの作成
実施例２で作成した各々のテンプレート用のプラスミドをテンプレートとして、それぞれ対応するＦプライマーおよびＲプライマー（配列は上記表ＩＩに示される）を用いてＰＣＲ反応を行い、スポット用ＤＮＡフラグメントを増幅した。反応液の組成は以下のとおりであった：
【表５】
0003600616.tif 000006
用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりであった：９４℃で５分間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次に７２℃で５分間の後に４℃で保存。増幅産物を水で１００倍に希釈し、同じ条件で２回目のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物の量および純度はゲル電気泳動により確認した。次に、ナイロンフィルタに図２に示す配置で各ＰＣＲ産物を４ｎｇずつスポットして、検出用アレイを作成した。表ＩＩＩにスポットしたフラグメントを示す。
【００３３】
表ＩＩＩ
【表６】
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【実施例４】
【００３４】
実施例４  プライマー混合物を用いるヒトパピローマウイルスの検出
実施例２に記載されるＨｅＬａ／ｃＤＮＡ、ＳＷ４８０／ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、またはこれらの混合物をテンプレートとして、本発明のプライマーセットの混合物をプライマーとして、以下の反応条件下でＰＣＲ反応を行った。
（ａ）  テンプレート：ＨｅＬａ／ｃＤＮＡ、ＳＷ４８０／ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの混合物
プライマー：プライマーセット混合物
反応液の組成は以下のとおりであった：
【表７】
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用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりであった：９４℃で５分間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を２５サイクル、次に７２℃で５分間の後に４℃で保存。
（ｂ）  テンプレート：ＨｅＬａ／ｃＤＮＡ、ＳＷ４８０／ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの混合物
プライマー：プライマーセット混合物
反応条件は、ＰＣＲのサイクル数を３０サイクルにしたことを除き、上述の（ａ）と同じ。
（ｃ）  テンプレート：ＨｅＬａ／ｃＤＮＡ、ＳＷ４８０／ｃＤＮＡの混合物；
プライマー：ランダムプライマー
反応液の組成は以下のとおりであった：
【表８】
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用いたＰＣＲの反応条件は次のとおりであった：９８℃で３分間、次に９８℃で２０秒間、５５℃で１０秒間、７４℃で６分間を２５サイクル、次に４℃で保存。
（ｄ）  テンプレート：ゲノムＤＮＡ
プライマー：ランダムプライマー
反応条件は上述の（ｃ）と同じ。
【００３５】
次に、これらのＰＣＲ産物を実施例３で作成したアレイにより分析した。ハイブリダイゼーションは、１０．０μｌのプローブを使用し、７２℃で行った。結果を図３に示す。図３（ａ）に示されるように、試料としてｃＤＮＡ・ゲノムＤＮＡの混合物を、プライマーとして本発明のプライマーセットの混合物を用いたとき、試料中のＨＰＶ１８の配列が特異的に検出された。（ｂ）は、サイクル数を増やすと非特異的な増幅が生ずることを示す。（ｃ）は、ランダムプライマーを用いた場合には、ＨＰＶ１８について検出可能なシグナルが得られなかったことを示す。（ｄ）は対照反応である。なお、すべてのフィルターにＨＰＶ５５のシグナルが見られるが、これはＤＮＡアレイにスポットされているＤＮＡ断片の非特異的ハイブリダイゼーションに起因するシグナルが強いためであり、このバックグラウンド・シグナルのレベルはＨＰＶ５５の遺伝子の存在下におけるポジティブ・シグナルのレベルとは明らかに区別しうるものである。
【００３６】
これらの結果から、本発明のプライマーセットは、混合して用いた場合であっても、試料中のヒトパピローマウイルスを特異的に検出することができることが示される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明のプライマーの特異性を示す、増幅産物の電気泳動写真である。
【図２】図２は、本発明の方法において用いるアレイ上の各配列のスポットの配置を示す。
【図３】図３は、本発明のプライマー混合物を用いて増幅したＰＣＲ産物のアレイハイブリダイゼーション分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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