【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年7月13日(2017.7.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】放出媒体
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は広くは、放出媒体に関し、具体的には、生物材料(例えば細胞、タンパク質、ペプチドなど)および薬物のような物質を保持するのに、かつその後に放出するのに適した組成物に関する。本発明による組成物は、生物材料および薬物のような物質の保持およびその後の放出で用いるのに特に適しており、それゆえ、そのような用途に重点を置きながら本発明を記述することが好都合であろう。しかしながら、他の物質を保持し、かつその後に放出するために組成物が用いられうることが理解されるべきである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
関心対象の物質を(内部におよび/または表面に)保持し、その後に放出しうる組成物を開発するために今日までに行われた研究は多数存在した。例えば、薬物放出組成物は医療産業において重要な役割を形成している。そのような組成物は、薬物が重合体と混ぜ合わされて、薬物/重合体の複合材料を形成しているものを含む。重合体/薬物の複合材料はその後、薬物放出媒体として用いられうる。例えば、レボノルゲストレルを含むシリコーンロッドが徐放避妊インプラントとして用いられている。
【０００３】
かなり効果的であるそのような媒体からの薬物の放出にもかかわらず、薬物が放出された後の所与の媒体の結末に関連した問題が存在しうる。例えば、レボノルゲストレル・インプラントの場合、薬物の放出後、「使用済みの」インプラントは対象から外科的に取り出されなければならない。取り出し中、いく度もの切開が必要とされることがあり、かつ/またはインプラントは回収時に断片化しうる。
【０００４】
細胞培養で用いるために他のタイプの媒体が開発されている。細胞培養は、典型的には、適当な媒体に、培養される細胞を播種することによって行われる。ヒト胚性幹細胞(hESC)および誘導多能性細胞(iPC)のようなある種の細胞型は、細胞が接着し増殖しうる表面を提供することによって、さらに効果的に培養される。接着および増殖の後、培養された細胞は、収集される必要があり、それゆえ、表面から放出される必要がある。細胞の放出は、典型的には、機械的剥離、超音波処理、化学的もしくは酵素的処理、またはその組み合わせのような技法によって促進される。
【０００５】
一般的な細胞放出技法は、いくつかの問題を呈しうる。例えば、機械的剥離は細胞に損傷を与えることがあり、それは小さな直径のウェルのような限定空間においてまたは三次元構造で用いるには適さないことが多い。所与の基材からの培養細胞の放出を容易とするように化学剤または生物剤を用いることも、細胞に損傷を与え、かつ/または培養細胞へ不純物を導入するリスクを与えうる。例えば、トリプシンなどの一般的な作用物質は、細胞機能の劣化を促進することが知られている。さらに、ある種の細胞は所与の基材に特に接着する可能性があり、その放出を促進するには強制条件に供される必要があり、その影響はある程度の細胞損傷を必然的に引き起こす。
【０００６】
細胞培養において用いられる従来の放出媒体はまた、細胞培養に適した基材のような所与の媒体は薬物放出のような他の用途で用いるのに適した媒体ではないことが多いという点で、汎用性に欠けることが多い。
【０００７】
それゆえ、種々の用途において使用でき、かつ/または媒体からの、細胞もしくは薬物などの、物質の放出に関連した問題の少なくともいくらかに対処できる、いっそう多用途の放出媒体を開発する機会が残されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を含む組成物を提供し;
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性である。
【０００９】
本発明による組成物は、放出媒体であって、その表面上におよび/または内部に、機能化された刺激応答性重合体が効果的、効率的かつ非侵襲的な方法で保持され、その後に放出されうる該放出媒体を好都合に提供することができる。機能化された刺激応答性重合体は、薬物、タンパク質または細胞のような部分で機能化されうる。
【００１０】
放出媒体として、組成物の成分は典型的には、液体中で提供される。言い換えれば、組成物は重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含みうる。
【００１１】
重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体は、特定の刺激に供されると、液体中で異なる溶解性を示すような移行を、好都合に生じることができる。例えば、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体は、所与の温度を上回る液体中で不溶性であり、かつその温度を下回る液体中で可溶性である熱応答性重合体でありうる。
【００１２】
重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が可溶性である温度を下回る液体内で、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体は、別個の実体として存在することができる(すなわちそれらは互いと物理的に結び付いていない)。重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が不溶性である温度にまたはその温度超に液体を加熱すると、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体は結び付いて凝集体構造を形成し、その表面上におよび/または内部に、機能化された刺激応答性重合体が保持される。重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体とのこの凝集体構造が、保持されている、機能化された刺激応答性重合体を放出しうる放出媒体に相当する。
【００１３】
凝集体構造からの、機能化された刺激応答性重合体の放出を促進するため、凝集体構造が位置している液体の温度は、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が再び、液体中で可溶性になる温度まで下げられれば十分である。その場合、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体の溶媒和は、凝集体構造の溶解および機能化された刺激応答性重合体のその後の放出のための推進力を与える。
【００１４】
本発明による組成物は、例えば、細胞培養および薬物送達の用途において放出媒体として機能するようにさまざまな方法で好都合に利用することができる。
【００１５】
細胞培養の場合、組成物は、細胞の凝集を促進するように機能し、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含みうる。その場合、機能化された刺激応答性重合体は、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体でありえ、ここでタンパク質は所望の細胞型と結合することができる。
【００１６】
液体の温度を特定の温度未満に、例えば37℃未満に維持することによって、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子は液体中で別個の分離性実体として存在することができ、液体の温度を37℃またはそれ以上に上昇させること(すなわち刺激を加えること)によって、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子は結び付いて、凝集体構造を形成する。
【００１７】
したがって、1つの態様において、液体の温度を37℃未満まで低下させることができる。次いで、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体によって提示されたタンパク質に複数の所望の細胞が結合して細胞で機能化された刺激応答性重合体を実質的に形成するように、該複数の所望の細胞を導入することができる。2種以上のタンパク質で機能化された刺激応答性重合体は、典型的には、各細胞と結合するであろう。
【００１８】
次いで、液体の温度を37℃またはそれ以上に上昇させることができ、これが今度は、細胞で機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子を結び付け、凝集体構造を形成させるであろう。凝集体構造の形成の際に、細胞で機能化された刺激応答性重合体の細胞は塊を本質的に形成し、重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との凝集体構造が、保持されている、細胞で機能化された刺激応答性重合体を放出しうる放出媒体に相当する。
【００１９】
そのように形成された細胞塊の内部の細胞はその後、増殖して、さらに大きな細胞塊を形成しうる。このような方法での細胞の増殖は、細胞多能性および生存性を好都合に持続できる条件を与えうる。
【００２０】
十分な増殖が行われた後に液体の温度を37℃未満まで低下させることで、重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体を、液体中で可溶性にする。この溶媒和プロセスは凝集体構造の解離を容易にし、これが次に、細胞で機能化された刺激応答性重合体の放出ならびに結果として、さらに小さな細胞塊および/または個々の細胞への細胞塊の分解を補助する。言い換えれば、本発明による組成物は好都合に、細胞が、後に個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊へ効果的かつ非侵襲的な方法でバラバラにされうる細胞塊の中で培養されることを可能にする。
【００２１】
細胞培養の代替的な形態として、組成物は重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含むことができ、ここで重合体粒子は基材に固定されている。固定された重合体粒子は、基材表面上の層として存在することができる。基材は、例えば、マウス胚性線維芽細胞(MEF)の層として存在しうる。その場合、機能化された刺激応答性重合体は、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体でありえ、ここでタンパク質は所望の細胞型と結合することができる。
【００２２】
液体の温度を特定の温度未満に、例えば37℃未満に維持することによって、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体および係留された重合体粒子は液体中で別個の分離性実体として存在することができ、液体の温度を37℃またはそれ以上に上昇させることによって、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体および係留された重合体粒子は結び付いて、タンパク質に富む表面を有する凝集体構造を形成することができる。
【００２３】
したがって、別の態様において、液体の温度を37℃またはそれ以上に上昇させることができる。これは、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体および係留された重合体粒子を結び付けて、タンパク質に富む表面を有する凝集体構造を形成させる。
【００２４】
次に、所望の細胞を液体に導入することができ、それによって細胞は、凝集体構造の表面に提示されたタンパク質に結合する。次いで細胞は、基材(MEFのような)に実質的に係留されている凝集体構造の、タンパク質に富む表面全体にわたって増殖することができ、新たに形成された細胞もまた、該凝集体構造の表面に提示されたタンパク質に結合する。このような方法での細胞の増殖は、細胞多能性および生存性を好都合に持続できる条件を与えうる。
【００２５】
十分な増殖が行われた後に液体の温度を37℃未満まで低下させることで、重合体粒子と今度の細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体を、液体中で可溶性にする。この溶媒和プロセスは凝集体構造の解離を容易にし、これが次に、基材表面からの、細胞で機能化された刺激応答性重合体の放出を補助する。言い換えれば、培養細胞は効果的かつ非侵襲的な方法で基材から好都合に放出されうる。
【００２６】
細胞培養の場合、本発明の組成物は約37℃超の温度に曝露されないことが望ましい。1つの態様において、液体を共通の刺激に供する段階はそれゆえ、液体を約37℃に加熱して、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進する段階を伴う。
【００２７】
同様に、機能化された刺激応答性重合体は、薬物で機能化された刺激応答性重合体でありえ、重合体粒子は適当な基材に固定される。その場合、薬物で機能化された刺激応答性重合体と重合体粒子との、そのように形成された凝集体構造は、特有の薬物放出システムを提供することができる。
【００２８】
したがって、1つの態様において、組成物は細胞培養または薬物送達用であり、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む。
【００２９】
別の態様において、組成物は細胞培養または薬物送達用であり、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含み、ここで重合体粒子は基材に固定される。
【００３０】
本発明による組成物は、ゲルの形態で存在することもでき、その内部におよび/または表面上に、機能化された刺激応答性重合体が保持される。ゲルは、温度の変化のような刺激に応答して特有の転換を生じ、液体組成物(すなわち液体状態の組成物)を形成することができ、ここで機能化された刺激重合体はもはや保持されず、液体組成物を構成する他の成分から容易に分離されうる。この態様によれば、組成物は液体をさらに含み、重合体粒子は、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在する。そのような態様において、重合体粒子は典型的には、自由に移動し、互いと凝集しうる(すなわちそれらは固定化基材または非移動基材に係留または固定されない)。
【００３１】
理論によって制限されることを望むわけではないが、本発明によって用いられる重合体粒子は、臨界ゲル濃度(CGC)を示すものと考えられる。CGCとは、粒子が温度の変化のような刺激に供された際に重合体粒子が互いと結び付いて凝集体構造を形成しこれが組成物の液体状態をゲルへ転換させることができる、液体中の粒子の濃度(液体および重合体粒子の合計質量に対するwt%)である。本発明との関連で、共通の刺激に供された際に、機能化された刺激応答性重合体は重合体粒子とも凝集し、したがって機能化された刺激応答性重合体は、そのように形成されたゲルの内部におよび/または表面上に保持されることが理解されよう。重合体粒子のCGCは、その形態、特に粒子のアスペクト比に依って変化するであろう。
【００３２】
本発明はそれゆえ、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む組成物を提供することもでき;
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり; かつ
重合体粒子は、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在する。
【００３３】
ゲルをもたらす本発明による組成物は、例えば、細胞培養および薬物送達の用途における放出媒体として機能するようにさまざまな方法で好都合に利用することもできる。
【００３４】
薬物放出媒体の場合、機能化された刺激応答性重合体は、薬物で機能化され、組成物は液体組成物の形態で最初に提供されうる。温度の上昇のような刺激に応答して、薬物で機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子は結び付いて凝集体構造を形成することができ、これが次に、ゲルへの液体の転換を促進する。ゲルの形態では、薬物で機能化された刺激応答性重合体は、ゲルの境界(confine)内部におよび/または表面上に実質的に保持される。薬物はその後、温度の低下のような刺激にゲルを供してゲルを液体組成物へ、つまり薬物を「放出される」状態で提示する類のものへ再び転換させることにより、ゲルから放出されうる。
【００３５】
細胞培養の場合、機能化された刺激応答性重合体は、細胞で機能化されうる(典型的には、細胞と結合しているタンパク質で機能化された刺激応答性重合体の該タンパク質によって形成されうる)。その場合、複数のタンパク質で機能化された刺激応答性重合体は、所与の細胞に結合することができる。組成物は、液体、重合体粒子、および細胞で機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物の形態で最初に提供され得、温度上昇のような刺激に応答して、細胞で機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子が結び付いて凝集体構造を形成することができ、これが次に、ゲルへの液体組成物の転換を促進する。ゲルの形態では、細胞で機能化された刺激応答性重合体は、ゲルの境界(confine)内部におよび/または表面上に実質的に保持される。
【００３６】
ゲル内部におよび/または表面上に保持されることにより、細胞で機能化された刺激応答性重合体は、「種細胞」として機能することができ、ゲルマトリックス内部でおよび/または表面上で増殖することができる。ゲルは、細胞の付着および増殖を促進する1種または複数種の部分(例えばタンパク質)で機能化されている、さらなる機能化された刺激応答性重合体を含みうる。増殖後、細胞は、温度の低下のような刺激にゲルを供してゲルを液体組成物へ再び転換させることにより、放出かつ収集されることができ、その効果によって、細胞は組成物の他の成分から放出され、それらは収集に向けて容易に利用可能とされる。
【００３７】
従来の放出媒体とは異なり、本発明による組成物は、ゲルから液体組成物へ好都合に移行することができ、そのプロセスによって、薬物または細胞のような関連物質の放出が促進される。特に、液体組成物へのゲルの移行では、放出が行われた後に固体または半固体の構造が残存することはない。薬物放出との関連では、このことは、薬物の放出の後で何らかの「使用済み」支持体構造を回収する必要がないことを意味する。細胞培養との関連では、このことは、ゲルの非侵襲的な液状化によって細胞がゲルから放出されうることを意味する。
【００３８】
組成物は、機能化された刺激応答性重合体に対して異なる機能的実体を選択するだけで、および/または液体中に存在する重合体粒子の濃度を調整するだけで、それらが異なる用途に容易に適合されうるという点で、特に多用途である。
【００３９】
1つの態様において、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体は液体中に存在し、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体は、液体内で可溶性である。その場合、重合体粒子を伴う非刺激応答性重合体は一般に、液体中で不溶性であろう。例えば、本発明による組成物は、親水性の液体(例えば水性液体)、重合体粒子、および機能化された刺激応答性重合体を含んでよく、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体は、親水性の液体内で可溶性である。その場合、重合体粒子を伴う非刺激応答性重合体は一般に、親水性の液体中で不溶性であろう。
【００４０】
別の態様において、組成物はゲルの形態であり、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体は、液体内で不溶性である。その場合、重合体粒子を伴う非刺激応答性重合体もまた、一般に、液体中で不溶性であろう。例えば、組成物は、親水性の液体(例えば水性液体)を含むゲルの形態であってよく、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体は、親水性の液体中で不溶性である。その場合、重合体粒子を伴う非刺激応答性重合体は一般に、親水性の液体中で不溶性であろう。この態様によれば、重合体粒子は、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在する。
【００４１】
本発明はまた、本発明による組成物を含む細胞培養システムを提供する。その場合、機能化された刺激応答性重合体は、細胞で機能化されうる。そのような細胞培養システムは好都合には、細胞培養を容易にするだけでなく、刺激主導での、酵素を含まない細胞収集を提供することもできる。
【００４２】
本発明はまた、本発明による組成物を含む薬物送達システムを提供する。その場合、機能化された刺激応答性重合体は、薬物で機能化されうる。
【００４３】
本発明はさらに、
(i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行がゲルの形成を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体を含むゲルを形成する方法を提供する。
【００４４】
この態様によれば、重合体粒子は当然ながら、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在し得る。
【００４５】
本発明はさらに、
(i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含むゲルを提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該ゲルを該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該ゲルを、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む液体組成物にして、それによって該ゲルからの該機能化された刺激応答性重合体の放出を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体をゲルから放出させる方法を提供する。
【００４６】
本発明の方法によれば、1つの態様において、液体は親水性の液体、例えば水性液体である。
【００４７】
機能化された刺激応答性重合体をゲルから放出させる方法によれば、1つの態様において、機能化された刺激応答性重合体は細胞で機能化される。さらなる態様において、機能化された刺激応答性重合体は薬物で機能化される。
【００４８】
本発明のさらなる局面および/または態様は、以下でさらに詳細に記述される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明の態様を以後、ほんの一例として添付の図面を参照して例証する。
【図１】重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む本発明による組成物を模式的に示す。図1A: ロッド様の形状を有する重合体粒子を示し、図1B: 球状を有する重合体粒子を示す。
【図２】ウォーム(またはロッド)および球の形態で本発明において用いられる重合体粒子のTEM顕微鏡写真を例証する。
【図３】タンパク質で機能化されたPNIPAM/ROD表面が濃度依存的にhESC細胞の付着を支持することを例証する。(A〜F) タンパク質で機能化されたポリ(NIPAM-b-STY)ジブロック共重合体表面に結合しているMEL1細胞。(A,C) hESCの結合は、点線によって示されるようにコーティングされていない表面には細胞が結合しなかったので、VNまたはFNで機能化されたポリ(NIPAM-b-STY)ジブロック共重合体表面に依存する。(EおよびF) 合成インテグリン結合ペプチド(RGD、最大で200 μg/ウェル)で機能化されたポリ(NIPAM-b-STY)ジブロック共重合体表面は、hESCの付着を支持しなかった。(B,D,F) RGDではなくFNおよびVN上での異なる細胞の拡散を示す、さらに高倍率の画像。全画像中のスケールバーは400 μmに相当する。G) 結合された細胞の数を、付着され、表面にわたる細胞の拡散を示した細胞の、手作業による細胞カウンティングによって、独立した2つのhESC細胞株MEL1およびMEL2について定量化した。傾向線は対数スケールである。データは、3回の独立した実験の平均である。
【図４】FNまたはVNで機能化されたポリ(NIPAM-b-STY)ジブロック共重合体表面に結合しているhESCに及ぼす温度の影響を例証する。37℃でGeltrex対照表面(A)、rVN-pNIPAM/PSTY (D)およびrFN-pNIPAM/PSTY (G)スライドガラス上に播種されたMEL1細胞の光学顕微鏡検査像。培養物をLCST未満、4℃でインキュベートし、30分(B,E,H)および60分(C,F,I)の時点で撮像した。各条件に対し、さらに高倍率の画像(差し込み図)はGeltrex(商標)対照上を除き、低下した温度でのインキュベーション後の細胞の円形化および剥離を示す(D, G)。スケールバーは400 μmに相当する。
【図５】hESCシートの剥離を例証する。MEL1細胞を臓器培養皿中、rFNで機能化されたポリ(NIPAM-b-STY)ジブロック共重合体表面に細胞1×106個/ウェルで播種し、24時間インキュベートした。温度を25℃に変化させると、細胞シートが穏やかな振盪で表面から剥離した。スケールバーは1000 μmである。(A) 細胞シート辺縁の剥離(暗斑点)を実証する拡大像。(B) 室温でのインキュベーション後の剥離を示す臓器培養皿中の、さらに低倍率の細胞シート。
【図６】本発明による細胞塊の形成の略図を例証する。
【図７】PNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMと混合された胚様体の解離を例証する。(A〜B) 手作業による解離前の対照および処理細胞塊。(C〜D) 手作業により細かく砕いた(titration)後の小塊への胚様体の解離は、PNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMとともにインキュベートされた条件においてのみ起こる(D)。
【図８】hESC胚様体の、酵素なしでの継代を容易にするように最適化できる2成分pNIPAMシステムに関するデータを例証する。
【図９】pNIPAM結合体によるヒト胚性幹細胞の多能性の、3D増殖に関するデータを例証する。
【００５０】
図のなかには、色表現または実体を含むものもある。図の着色版は、請求に応じて入手可能である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明による組成物は、重合体粒子を含む。重合体粒子は、本明細書において記述されるコアシェル構造を有する。重合体粒子が必要とされるコアシェル構造を有し、本明細書において記述されるように用いられうるなら、その形状またはサイズに関する特定の制限は存在しない。
【００５２】
重合体粒子は球、楕円、輪、円筒、ロッド、またはウォーム様の形状を有しうる。重合体粒子は異なる形状の重合体粒子の混合物を含みうる。
【００５３】
1つの態様において、重合体粒子の全ての寸法は約1ミクロン未満である。
【００５４】
さらなる態様において、重合体粒子の少なくとも1つの寸法は、約100 nm未満、または約70 nm未満、または約50 nm未満、または約30 nm未満、または約20 nm未満、または約15 nm未満、または約10 nm未満である。
【００５５】
別の態様において、重合体粒子は1超の、例えば少なくとも5、または少なくとも10、または少なくとも20、または少なくとも30、または少なくとも40、または少なくとも60、または少なくとも80、または少なくとも100、または少なくとも500のアスペクト比(平均長:平均直径)を有する。重合体粒子のアスペクト比は、約5から約1000または約25から約500、または約50から約200に及びうる。
【００５６】
重合体粒子のコアシェル構造は、ブロック共重合体を含む。「ブロック共重合体」とは、構成的に異なる隣接ブロックを有するブロック重合体である共重合体を意味する。「コアシェル」構造を有するとは、重合体粒子が、実質的に異なる外部組成(シェル)に囲まれている内部組成(コア)を有することを意味する。本発明との関連で、「シェル」は、ブロック共重合体の刺激重合体ブロックによって定義される。この刺激重合体ブロックは、重合体粒子が位置している液体に対して可溶性または不溶性でありうる。「コア」は、ブロック共重合体の非刺激重合体ブロックによって定義され、重合体粒子が位置している液体に対して典型的には不溶性であろう。
【００５７】
したがって、重合体粒子を形成するブロック共重合体は、非刺激応答性重合体ブロックが重合体粒子のコア構造の少なくとも一部を形成し、かつ刺激応答性重合体ブロックが重合体粒子のシェル構造の少なくとも一部を形成している、非刺激応答性重合体ブロックおよび刺激応答性ブロックを含む。重合体粒子はそれゆえ、コアからシェルへの移行が共重合体の非刺激応答性重合体ブロックから共重合体の刺激応答性重合体ブロックへの移行に相当するような、非刺激応答性重合体を含むコアおよび刺激応答性重合体を含むシェルを有すると記述されうる。
【００５８】
ブロック共重合体の重要な特徴は、刺激応答性重合体ブロックである。刺激応答性重合体(「スマート」重合体としても公知)は、温度、pH、イオン強度および/または光の波長の変化のような刺激に応答して物理的または化学的変化を生じる重合体である。
【００５９】
所与の刺激に応答して刺激応答性重合体によって示される物理的または化学的変化は、利用される重合体のタイプに依って変化しうる。例えば、物理的変化の1つの形態は、刺激に応答して、性質が疎水性である状態から性質が親水性である状態への可逆的移行を重合体が生じる場合である。
【００６０】
1つの態様において、ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、刺激に供された際に性質が疎水性である状態から性質が親水性である状態へまたはその逆への移行を生じるタイプのものである。
【００６１】
さらなる態様において、ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、温度の変化に応答して物理的または化学的な移行を生じる、温度応答性重合体ブロックである。
【００６２】
さらなる態様において、ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、温度の変化に応答して、性質が疎水性である状態から性質が親水性である状態へのまたはその逆への移行を生じる温度応答性重合体である。
【００６３】
「性質が疎水性」および「性質が親水性」のような表現は、別の物質と比べてある物質との間の好ましいまたは好ましくない相互作用(例えば引力相互作用または反発相互作用)を伝えるために、かつ特定の物質の絶対的な質を定義しないように当技術分野において一般に使われることを当業者は理解するであろう。例えば、親水性材料は、水性媒体によって湿潤または溶解される可能性がより高い(引力相互作用)が、疎水性材料は、水性媒体によって湿潤または溶解される可能性がより低い(反発相互作用)。特に指定のない限り、本発明との関連で、これらの表現は水性液体の極性に対しての刺激応答性重合体の極性への言及であるものと意図される。したがって、性質が親水性である状態により、刺激応答性重合体は水性液体によって湿潤または溶解されうる。性質が疎水性である状態により、刺激応答性重合体は水性液体によって湿潤または溶解されえない。
【００６４】
ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、ホモ重合体または共重合体の形態でありうる。
【００６５】
ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、天然重合体または合成重合体でありうる。
【００６６】
温度応答性重合体の例としては、N-イソプロピルアクリルアミドのホモ重合体および共重合体(NIPAAm、NIPAm、またはNIPAM)が挙げられる。
【００６７】
ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)ホモ重合体(P(NIPAAm)、PNIPAm、PNIPAMまたはpNIPAM)は、周知の温度応答性重合体であり、水性媒体中で約36℃の下限臨界溶液温度(LCST)を示す。これは、(i) 性質が親水性であり、かつ水性液体によって容易に湿潤または溶媒和されるLCST未満での拡張性ランダムコイル構造、および(ii) 性質が疎水性であり、かつ水性液体によって容易に湿潤または溶媒和されないLCST超での崩壊性球状構造を可逆的にとることができる。
【００６８】
NIPAAmが1種または複数種の親水性のエチレン性不飽和共単量体、例えばアクリルアミドと共重合される場合、得られる共重合体のLCSTは、P(NIPAAm)のそれと比べて上昇されうる。NIPAAmが1種または複数種の疎水性共単量体、例えばN-t-ブチルアクリルアミドと共重合される場合、その逆が起こりうる。アクリルアミドのような親水性単量体とのNIPAAmの共重合体は、より高いLCSTおよび一般的により広い沈殿温度範囲(P(NIPAAm)と比べて)を有するが、N-t-ブチルアクリルアミドのような疎水性単量体とのNIPAAmの共重合体は、より低いLCST (P(NIPAAm)と比べて)を有し、P(NIPAAm)に特徴的な急激な移行を保持している可能性が一般的により高い。
【００６９】
pH応答性重合体の例としてはアクリル酸、メタクリル酸、および他のアルキル置換アクリル酸、無水マレイン酸、マレイン酸、2-アクリルアミド(acryamido)-2-メチル-1-プロパンスルホン酸、N-ビニルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、メタクリル酸アミノエチル、ホスホリルエチルアクリレートまたはメタクリレートのようなpH応答性ビニル単量体に由来するものが挙げられる。pH応答性重合体は、全てがタンパク質(例えばリゾチーム、アルブミン、カゼイン)のような天然の重合体に由来するアミノ酸(例えばポリリジンまたはポリグルタミン酸(polyglutiamic acid))由来のポリペプチド、または多糖類(例えばアルギン酸、ヒアルロン酸、カラギナン、キトサン、カルボキシメチル、セルロース)またはDNAのような核酸として調製されうる。pH応答性重合体は通常、-OPO(OH)2、-COOHまたは-NH2のようなペンダントpH感受性官能基を含む。
【００７０】
NIPAAmのような温度応答性重合体をもたらす単量体を、少量(例えば約10モル%未満)の、アクリル酸のようなpH応答性重合体をもたらす共単量体と共重合させることにより、得られる共重合体は、温度応答性もpH応答性もともに示すことができる。そのような共重合体のLCSTは、共重合体がイオン化されないようなpHで、影響を受けないままであり、場合によっては2、3度低下さえされうるが、しかしpH感受性基がイオン化されればLCSTは劇的に上昇されうる。pH感受性基が高濃度で存在する場合、温度応答性作用のLCST応答は、実際上、排除されうる。
【００７１】
pHおよび温度に応答性の単量体に由来するブロック共重合体は、それらがpH転移および温度転移の両方を独立して保持するように調製することができる。例えば、pH応答性ブロック(ポリアクリル酸)および温度応答性ブロック(P(NIPAAm))を有するブロック共重合体は、独立したpH応答性および温度応答性を保持することができる。
【００７２】
ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックはそれゆえ、それ自体がブロック共重合体でありうる。
【００７３】
1つの態様において、ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックは、それ自体がブロック共重合体ではない。
【００７４】
光応答性重合体の例としては、重合体の主鎖につり下がったまたは沿った発色基を含有しかつ、適切な波長の光に曝露された場合に、トランス型から、双極性かつさらに親水性でありえ、可逆的な重合体立体構造変化を促進しうるシス型へ異性化されうるものが挙げられる。他の光感受性基も、光刺激により、相対的に無極性、疎水性の、非イオン化状態から親水性のイオン状態へ変換されうる。
【００７５】
光感受性色素(例えば芳香族アゾ化合物またはスチルベン誘導体)のようなペンダント光感受性基の場合、それらは反応性単量体に結合され(例外は、ビニル基を既に含む、クロロフィリンのような色素である)、その後、温度応答性単量体またはpH応答性単量体を含む、1つまたは複数の他の単量体と共重合またはホモ重合されうる。光感受性基はまた、刺激応答性重合体鎖を含む、重合体鎖の末端に結合されうる。そのような光感受性基を単量体または重合体鎖に結合させるための技法は、公知である。
【００７６】
一般に、光応答性重合体は、光感受性ペンダント基を含むビニル単量体から調製される。そのような単量体は、1つまたは複数の他のエチレン性不飽和単量体と共重合またはホモ重合されうる。
【００７７】
光感受性基は、それらがある波長の光を吸収する場合に、異性化するかまたはイオン化されるようになり、それらを疎水性の立体構造から親水性の立体構造にまたはその逆に変換する色素分子でありえ、あるいはそれらは、ある波長の光を吸収する場合に熱を出す色素分子でありえる。前者の場合は、異性化のみで鎖伸長または崩壊を引き起こしうるが、後者の場合は、重合体が温度応答性でもあれば沈降しうる。
【００７８】
光応答特性をもたらしうる発色基の例としては、芳香族ジアゾ色素が挙げられる。このタイプの色素が350〜410 nmのUV光に曝露される場合、性質が疎水性であるトランス型の色素は、双極性かつ性質がさらに親水性であるそのシス型に異性化されうるが、これが今度は、重合体立体構造変化を引き起こしうる。約750 nmの可視光への色素の曝露によって、この現象を反転させることができる。
【００７９】
特異的なイオン応答性重合体の例としては、その高次構造(confirmation)を、例えば、K+またはCa2+のようなイオンへの曝露に応じて、ランダムな高次構造から整然とした高次構造へ変化させるカラギナンのような多糖類が挙げられる。特異的なイオン応答性重合体の他の例としては、ヒスチジンまたはEDTAのようなペンダントイオンキレート基を有する重合体が挙げられる。
【００８０】
上記のように、刺激応答性重合体は複数の刺激に応答性でありうる。例えば、光応答性重合体が温度応答性でもあるなら、より疎水性または親水性の高次構造への、重合体骨格に沿って結合された発色団のUV光または可視光刺激変換は、重合体の組成および温度に依って、重合体の溶解/湿潤または沈降を刺激することもできる。あるいは、発色団が光を吸収し、それを、異性化を刺激するのではなく熱エネルギーに変換するなら、局部加熱も、システムの温度が相分離温度の近傍にある場合にP(NIPAAm)のような温度応答性重合体の相変化を刺激することができる。適切な単量体の共重合を通じた多重感度の組み入れは、本発明によって用いられる刺激応答性重合体に、さらに大きな多用途性を付与することができる。
【００８１】
ブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックが、本発明によって用いられる重合体粒子を提供するなら、刺激応答性重合体ブロックの数平均分子量に関する特定の制限は存在しない。刺激応答性重合体ブロックの数平均分子量は一般に、約1,500〜約40,000、例えば約2,000〜約20,000、または約2,000〜約10,000の範囲内に入るであろう。
【００８２】
本明細書において言及される重合体の数平均分子量への言及は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定されるもののことである。
【００８３】
ブロックを形成する重合された単量体残基という点で刺激応答性重合体ブロックのブロック長をいうことも、好都合でありうる。その場合、刺激応答性重合体ブロックは一般に、約20〜200、または約30〜約150、または約40〜約80の、重合された単量体単位を含むであろう。
【００８４】
重合体粒子を形成するブロック共重合体も、非刺激応答性重合体ブロックを含む。「非刺激応答性重合体ブロック」とは、当業者によって刺激応答性重合体ブロックであるものと考えられないような、したがって、温度、pH、イオン強度および/または光の波長の変化のような刺激に応答して物理的または化学的変化を生じないような、重合体ブロックを意味する。
【００８５】
非刺激応答性重合体ブロックは、ホモ重合体または共重合体の形態でありうる。
【００８６】
非刺激応答性重合体ブロックは、天然重合体または合成重合体でありうる。
【００８７】
非刺激応答性重合体ブロックは、刺激応答性重合体を提供するために必要される特性を有する単量体タイプの重合された残基を含みうる。しかしながら、その場合、そのような重合された単量体残基の量は、重合体ブロックに刺激応答特性を与えるには不十分であろう。
【００８８】
1つの態様において、非刺激応答性重合体ブロックは、刺激応答性重合体を提供しうるタイプの、重合された単量体残基を含まない。
【００８９】
ブロック共重合体の非刺激応答性重合体ブロックが、本発明によって用いられる重合体粒子を提供するなら、非刺激応答性重合体ブロックの数平均分子量に関する特定の制限は存在しない。非刺激応答性重合体ブロックの数平均分子量は一般に、約500〜約40,000、例えば約2,000〜約20,000、または約4,000〜約10,000の範囲内に入るであろう。
【００９０】
ブロック共重合体の非刺激応答性重合体ブロックおよび刺激応答性重合体ブロックは一般に、適当なエチレン性不飽和単量体の重合を介して調製されるであろう。ブロック共重合体を調製するために用いられる単量体は当然ながら、非刺激応答性重合体ブロックおよび刺激応答性重合体ブロックを、それぞれ、提供するために適切に選択されるであろう。また、そのような単量体は一般に、他の単量体と重合されることができよう。さまざまな単量体の共重合可能性を決定する要因は、当技術分野において十分に裏付けられている。例えば、Greenlee, R.Z., Polymer Handbook 3rd Edition (Brandup, J., and Immergut. E.H. Eds) Wiley中: New York, 1989 p II/53を参照されたい。
【００９１】
ブロック共重合体を調製するために重合されうる適当なエチレン性不飽和単量体は、式(I)のものを含む:
2015519902.tif 000001
式中、UおよびWはCO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR12、水素、ハロゲンおよび置換されてもよいC1〜C4アルキルより独立して選択され、またはUおよびWは、それ自体が置換されてもよいラクトン環、無水物環またはイミド環をともに形成し、ここで任意選択の置換基がヒドロキシ、-CO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CN、-CONH2、-CONHR1、-CONR12、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1、および-OCSR1より独立して選択され;
Vは水素、R1、-CO2H、-CO2R1、-COR1、-CSR1、-CSOR1、-COSR1、-CONH2、-CONHR1、-CONR12、-OR1、-SR1、-O2CR1、-SCOR1、および-OCSR1から選択され;
式中、R1または各R1は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいカルボシクリル、置換されてもよいヘテロシクリル、置換されてもよいアリールアルキル、置換されてもよいヘテロアリールアルキル、置換されてもよいアルキルアリール、置換されてもよいアルキルヘテロアリール、および置換されてもよい重合体鎖より独立して選択される。
【００９２】
R1または各R1はまた、置換されてもよいC1〜C22アルキル、置換されてもよいC2〜C22アルケニル、置換されてもよいC2〜C22アルキニル、置換されてもよいC6〜C18アリール、置換されてもよいC3〜C18ヘテロアリール、置換されてもよいC3〜C18カルボシクリル、置換されてもよいC2〜C18ヘテロシクリル、置換されてもよいC7〜C24アリールアルキル、置換されてもよいC4〜C18ヘテロアリールアルキル、置換されてもよいC7〜C24アルキルアリール、置換されてもよいC4〜C18アルキルヘテロアリール、および置換されてもよい重合体鎖より独立して選択されうる。
【００９３】
R1はまた、置換されてもよいC1〜C18アルキル、置換されてもよいC2〜C18アルケニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいカルボシクリル、置換されてもよいヘテロシクリル、置換されてもよいアラルキル、置換されてもよいヘテロアリールアルキル、置換されてもよいアルカリル、置換されてもよいアルキルヘテロアリールおよび重合体鎖から選択されうる。
【００９４】
1つの態様において、R1は、置換されてもよいC1〜C6アルキルより独立して選択されうる。
【００９５】
R1の任意選択の置換基の例としては、アルキレンオキシジル(エポキシ)、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、ホルミル、アルキルカルボニル、カルボキシ、スルホン酸、アルコキシ-またはアリールオキシ-カルボニル、イソシアナト、シアノ、シリル、ハロ、アミノから選択されるものが、その塩および誘導体を含めて、挙げられる。重合体鎖の例としては、ポリアルキレンオキシド、ポリアリーレンエーテルおよびポリアルキレンエーテルから選択されるものが挙げられる。
【００９６】
式(I)の単量体の例としては、無水マレイン酸、N-アルキルマレイミド、N-アリールマレイミド、フマル酸ジアルキルおよびシクロ重合性単量体、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステル、アクリル酸およびメタクリル酸、スチレン、N-アルキルアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、およびメタクリロニトリル、これらの単量体の混合物、ならびにこれらの単量体と他の単量体との混合物が挙げられる。
【００９７】
式(I)の単量体のさらなる例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル(全ての異性体)、メタクリル酸ブチル(全ての異性体)、メタクリル酸2-エチルヘキシル、メタクリル酸イソボルニル、メタクリル酸、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸フェニル、メタクリロニトリル、α-メチルスチレン、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル(全ての異性体)、アクリル酸ブチル(全ての異性体)、アクリル酸2-エチルヘキシル、アクリル酸イソボルニル、アクリル酸、アクリル酸ベンジル、アクリル酸フェニル、アクリロニトリル、スチレン、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸2-ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル(全ての異性体)、メタクリル酸ヒドロキシブチル(全ての異性体)、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリル酸、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリル酸、メタクリル酸トリエチレングリコールから選択される官能性メタクリレート、アクリレートおよびスチレン、無水イタコン酸、イタコン酸、アクリル酸グリシジル、アクリル酸2-ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル(全ての異性体)、アクリル酸ヒドロキシブチル(全ての異性体)、アクリル酸N,N-ジメチルアミノエチル、アクリル酸N,N-ジエチルアミノエチル、アクリル酸トリエチレングリコール、メタクリルアミド、N-メチルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-tert-ブチルメタクリルアミド、N-n-ブチルメタクリルアミド、N-メチロールメタクリルアミド、N-エチロールメタクリルアミド、N-tert-ブチルアクリルアミド、N-n-ブチルアクリルアミド、N-メチロールアクリルアミド、N-エチロールアクリルアミド、ビニル安息香酸(全ての異性体)、ジエチルアミノスチレン(全ての異性体)、α-メチルビニル安息香酸(全ての異性体)、ジエチルアミノα-メチルスチレン(全ての異性体)、p-ビニルベンゼンスルホン酸、p-ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、メタクリル酸トリメトキシシリルプロピル、メタクリル酸トリエトキシシリルプロピル、メタクリル酸トリブトキシシリルプロピル、メタクリル酸ジメトキシメチルシリルプロピル、メタクリル酸ジエトキシメチルシリルプロピル、メタクリル酸ジブトキシメチルシリルプロピル、メタクリル酸ジイソプロポキシメチルシリルプロピル、メタクリル酸ジメトキシシリルプロピル、メタクリル酸ジエトキシシリルプロピル、メタクリル酸ジブトキシシリルプロピル、メタクリル酸ジイソプロポキシシリルプロピル、アクリル酸トリメトキシシリルプロピル、アクリル酸トリエトキシシリルプロピル、アクリル酸トリブトキシシリルプロピル、アクリル酸ジメトキシメチルシリルプロピル、アクリル酸ジエトキシメチルシリルプロピル、アクリル酸ジブトキシメチルシリルプロピル、アクリル酸ジイソプロポキシメチルシリルプロピル、アクリル酸ジメトキシシリルプロピル、アクリル酸ジエトキシシリルプロピル、アクリル酸ジブトキシシリルプロピル、アクリル酸ジイソプロポキシシリルプロピル、酢酸ビニル、酪酸ビニル、安息香酸ビニル、塩化ビニル、フッ化ビニル、臭化ビニル、無水マレイン酸、N-フェニルマレイミド、N-ブチルマレイミド、N-ビニルピロリドン、N-ビニルカルバゾール、ブタジエン、エ���レンならびにクロロプレンが挙げられる。このリストは網羅的でない。
【００９８】
1つの態様において、ブロック共重合体は、スチレン、4-メチルスチレンおよびアクリル酸n-ブチルから選択される1つまたは複数の単量体に由来する非刺激応答性重合体ブロックを含む。
【００９９】
さらなる態様において、ブロック共重合体は、N-イソプロピルアクリルアミドおよびモノメトキシルエーテルポリ(エチレンオキシド)アクリレートから選択される1つまたは複数の単量体に由来する刺激応答性重合体ブロックを含む。
【０１００】
さらなる態様において、ブロック共重合体は、ポリスチレン非刺激重合体ブロックおよびポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)刺激応答性重合体ブロックを含む。
【０１０１】
重合体粒子が、必須のブロック共重合体組成を有するなら、それらが調製されうる方法に関する特定の制限は存在しない。
【０１０２】
重合体粒子は、例えば、WO 2010/091465に概説されている方法論によって調製されうるが、その内容全体が相互参照により本明細書に組み入れられる。その場合、重合体粒子は、従来の分散重合の技法(例えば従来の乳化重合、ミニ乳化重合および懸濁重合)ならびに機器を用いて調製されうる。
【０１０３】
例えば、重合体粒子は、連続水相、1種または複数種のエチレン性不飽和単量体を含む分散有機相、制御ラジカル重合部分が共有結合されている刺激応答性重合体、および有機相用の安定剤を有する分散液を提供する段階を含む方法によって調製されうる。分散液を調製すると、1種または複数種のエチレン性不飽和単量体が制御ラジカル重合部分の制御下で重合される。
【０１０４】
用いられる1種または複数種のエチレン性不飽和単量体は、非刺激応答性重合体ブロックを供与するように選択される。したがって、重合は、非刺激応答性重合体ブロックおよび刺激応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体を供与する。
【０１０５】
制御ラジカル重合部分の「制御下で」重合されるとは、単量体の重合が適切な制御ラジカル重合機構によって進行し、重合体を形成することを意味する。制御ラジカル重合部分はそれゆえ、重合体鎖を形成させるための、特定タイプの制御ラジカル重合による1種または複数種のエチレン性不飽和単量体のラジカル重合の制御または媒介に関与しうる部分である。
【０１０６】
制御ラジカル重合の例としては、イニファータ重合、安定遊離ラジカル媒介重合(SFRP)、原子移動ラジカル重合(ATRP)、および可逆的付加・脱離連鎖移動(RAFT)重合が挙げられる。例えば、制御ラジカル重合部分がRAFT部分である場合、単量体の重合はRAFT機構によって進行し、重合体を形成する。
【０１０７】
そのような重合は、刺激応答性重合体ブロックおよび非刺激応答性重合体ブロックを有するブロック共重合体鎖を含む重合体粒子の分散液を提供する。そのように形成された重合体粒子を適切な刺激(すなわちブロック共重合体の刺激応答性重合体ブロックが化学的または物理的な移行を生じる刺激)に供することによって、重合体粒子は形態形成の転換を生じ、異なる形態を有する種々の重合体粒子を形成しうる。例えば、重合において用いられる刺激応答性重合体が温度応答性刺激重合体ブロックを含む場合、刺激応答性重合体ブロックのLCSTを上回るおよび下回る加熱/冷却サイクルに重合体粒子の分散液を供することにより、得られる重合体粒子には、ロッドまたはウォーム様の形状が供与されうる。
【０１０８】
形成されたさまざまな形状の重合体粒子の確認は、透過電子顕微鏡法(TEM)のような従来の分析技法を用いて達成されうる。
【０１０９】
重合体粒子に加えて、本発明による組成物はまた、機能化された刺激応答性重合体を含む。表現「機能化された刺激応答性重合体」とは、物理的または化学的結合(例えば共有結合)によって、本発明による放出媒体から放出されることになる機能的実体が付着されている刺激応答性重合体を意味する。機能的実体、またはその修飾型もしくは派生型が放出媒体から放出されうるなら、そのような機能的実体の性質に関する特定の制限は存在しない。
【０１１０】
例えば、機能化された刺激応答性重合体は、生物材料、薬物、および細胞受容体リガンドから選択される機能的実体で機能化されうる。
【０１１１】
生物材料の例としては、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質および糖質が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１２】
細胞受容体リガンドの例としては、タンパク質、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、薬物、アゴニストおよびアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１３】
細胞の具体例としては、胚性幹細胞(hESC)、間充織幹細胞(MSC)、造血幹細胞(HSC)、神経幹細胞(NSC)、がん幹細胞(CSC)、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、胎性幹細胞、組織特異的幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤由来幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、ヒト羊膜細胞、NS0細胞、PER.C6細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞(MDCK)、ハイブリドーマ細胞、ヒト胎児腎臓細胞(HEK)、ノバリケン(Muscovy Duck) (AGE1.CR(登録商標))、Vero細胞(アフリカミドリザル)、NIH-3T3、MRC-5、WI-38、FRhl-2、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)、ニワトリ胚腎臓(CEK)および胚盤葉由来胚性幹細胞(例えば、EB14、Vivalis)、昆虫細胞(例えばSf9およびHigh Five)、HeLa細胞、COS細胞、ならびに初代または不死化ヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１４】
タンパク質の具体的としては、細胞外マトリックス成分およびプロテオグリカン、例えばビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびエラスチンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１５】
ペプチドの具体例としては、RGD、YIGSR、REDVおよびポリ-アラニンを含む細胞接着モチーフ、ならびにトロンボポエチン(TPO)由来ペプチドが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１６】
薬物の具体例としては、アフィジコリン、ブレビスタチン、コルヒチン、サイトカラシン、ラトランクリン、レプトマイシン、ROCK阻害剤(Y-27632)、グリカンシンターゼキナーゼ3阻害剤(例えばBIO (6-ブロモインジルビン-3'-オキシム)およびCHIR99021)、RA (レチノイン酸)、プルリポチン(Pluripotin)/SC1、PD0325901、A83-01、IDE1、(-)インドラクタムV、スタウプリミド、SB431542、BIX-01294、RG108、(+)Bayk 8644、パルネート(Parnate)、ケンパウロン(Kenpaullone)、バルプロ酸(Valproic Acid)、リバーシン(Reversine)ならびにホルボールミリスチン酸酢酸が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１１７】
機能化された刺激応答性重合体の刺激応答性重合体成分は、本明細書において記述される刺激応答性重合体でありうる。機能的実体および刺激応答性重合体は、当技術分野において公知の技法を用いて互いと化学的にまたは物理的に結び付けられうる。例えば、機能的実体および刺激応答性重合体にはそれぞれ、化学反応を起こして、機能的実体と刺激応答性重合体との間の共有結合を供与する相補的な反応性官能基が供与されうる。
【０１１８】
本発明による組成物は、液体を含みうる。組成物が液体組成物である場合、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体は、液体内で可溶性である。重合体粒子が液体中で完全に溶解するのを防ぐため、重合体粒子コアを形成する共重合体の非刺激応答性重合体ブロックは当然ながら、液体内で不溶性であろう。
【０１１９】
1つの態様において、液体は水性液体のような親水性の液体である。
【０１２０】
液体中で所望の溶解性を有するように重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を伴う刺激応答性重合体を選択することに加え、各刺激応答性重合体はまた、少なくとも1つの共通の刺激に応答するように選択される。言い換えれば、各刺激応答性重合体は同じ刺激に応答して物理的または化学的変化を生じることができる。例えば、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体は、温度応答性重合体でありうる。
【０１２１】
一般に、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体だけが、少なくとも1つの共通の刺激に応答するのではなく、両方の刺激応答性重合体が、同一のまたは類似の方法でその共通の刺激に応答する。例えば、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が温度応答性重合体である場合、それらはともに、同一のまたは類似のLSCTを有するであろう。
【０１２２】
1つの態様において、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体は、(a)温度応答性重合体であり、(b) わずか5℃、または4℃、または3℃、または2℃、または1℃しか異ならないLSCTを有する。
【０１２３】
重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う刺激応答性重合体が液体中で可溶性である場合、機能化された刺激応答性重合体および重合体粒子は、別個の分離性実体として液体組成物内に存在する(すなわちそれらは凝集しない)。
【０１２４】
組成物が意図されたように機能しうるなら、使用できる液体に関する特定の制限は存在しない。1つの態様において、液体は親水性の液体、例えば水性液体、水溶性アルコールまたはポリエーテル、例えばポリエチレンオキシドである。水性液体として、水は1種または複数種の水溶性の液体または固体を含みうる。
【０１２５】
図1に関連して、図1Aおよび1Bは、重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含む本発明による組成物を模式的に示す。図1Aは、ロッド様の形状を有する重合体粒子を示し、図1Bは、球状を有する重合体粒子を示す。組成物はLCSTを下回る温度(左側に)およびLCSTを上回る温度(右側に)を基準にして示されている。
【０１２６】
図1A (左手側)に特に関連して、重合体粒子は、ブロック共重合体の重合体ブロックからそれぞれ形成されているコア(10)およびシェル(20)を有する。非刺激応答性重合体ブロック(10)は、コア(10)の少なくとも一部を形成し、液体(30)中で不溶性である。刺激応答性重合体ブロック(20)は、シェル(20)の少なくとも一部を形成する。示されている刺激応答性重合体ブロック(20)の数は、明確にするために制限されている。この例において、重合体粒子の刺激応答性重合体ブロック(20)は、熱応答性重合体ブロックであり、液体(30)中で可溶性であるようにそのLCSTを下回る温度で存在する。重合体粒子は液体中で分離性実体として存在する。組成物はまた、機能化された刺激応答性重合体(40)を含む。この例において、機能化された刺激応答性重合体の刺激応答性重合体は、熱応答性重合体であり、そのLCSTを下回る温度で、同様に液体(30)中で可溶性である。機能化された刺激応答性重合体はまた、液体中で分離性実体として存在する。
【０１２７】
図1A (右手側)に特に関連して、液体(30a)の温度はLCSTを上回るまでに上昇された。与えられたこの刺激は、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との熱応答性重合体を液体(30a)中で不溶性にして、これが今度は、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体に凝集体構造(50)を形成させる。凝集体構造において、重合体粒子は、(i) 液体(30a)中で不溶性であるコア(10)の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック(10)、および(ii) 液体(30a)中で今度も不溶性であるシェル(20a)の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロック(20a)を含む。凝集体構造において、機能化された刺激応答性重合体の熱応答性重合体はまた、液体(30a)中で不溶性であり、重合体粒子と結び付いて凝集体構造(50)を形成する。機能化された刺激応答性重合体は、単に液体(30a)の温度をLCST未満まで冷却することによって、凝集体構造(50)から放出されうる。
【０１２８】
同様の考慮が図1Bにも当てはまるが、ただしこの場合、重合体粒子は球状を有する。
【０１２９】
本発明の組成物において用いられうる、重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体の量、または重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との比率に関する特定の制限は存在しない。用いられる量および比率は、典型的には、意図された用途により左右されるものと考えられ、当業者によって容易に決定されうる。
【０１３０】
組成物がゲルの形態で用いられる場合、それらは液体を含むものと考えられ、重合体粒子は、重合体粒子の少なくとも刺激応答性重合体が少なくとも1つの共通の刺激に供された際に液体をゲルへ転換させるのに十分な濃度で、液体内に存在する。ゲルを形成させるため、重合体粒子は互いと容易に結び付き、凝集体構造を構築(すなわち、互いと物理的に連絡している粒子の一群を形成)しうるように供与される。
【０１３１】
所与のタイプの重合体粒子のCGCは、主に粒子のアスペクト比に依って変化するであろう。ゲルを形成させるため、重合体粒子はそのCGCでまたはそのCGC超で供与されよう。低いアスペクト比を有する重合体粒子は、典型的には、高いアスペクト比を有するそれらの粒子よりも高いCGCを有するであろう。例えば、10のアスペクト比を有する重合体粒子は、5〜10 wt%前後のCGCを有しうるが、100のアスペクト比を有する重合体粒子は、0.1〜0.5 wt%前後のCGCを有しうる。当業者は、所与の重合体粒子または重合体粒子の混合物に対するCGCを容易に判定することができよう。
【０１３２】
用語「ゲル」とは、固体様の塊が、典型的な液流特性を示さないゼリー状の稠度(consistency)を有することを意味する。「ゲル」の形態で存在している本発明による組成物は、重合体粒子、刺激応答性重合体、および液体を含むであろう。
【０１３３】
理論によって制限されることを望むわけではないが、重合体粒子の刺激応答性重合体を、(刺激を加えることによって)例えば液体中で可溶性である状態から液体中で不溶性である状態へと物理的または化学的な移行を生じさせることで、該粒子の三次元凝集構造の形成をもたらすことができると考えられる。重合体粒子がそのCGCでまたはそのCGC超で存在する場合、この凝集は浸出された粒子のネットワークをもたらすものと考えられ、これが今度は、液体状態からゲル状態へと組成物を移行させる。
【０１３４】
同じく理論によって制限されることを望むわけではないが、機能化された刺激応答性重合体の刺激応答性重合体を、(刺激を加えることによって)例えば液体中で可溶性である状態から液体中で不溶性である状態へと物理的または化学的な移行を生じさせることで、(同じく同様の移行を生じた)重合体粒子とともに凝集された構造を形成する機能化された刺激応答性重合体が得られるものと考えられる。これが今度は、機能化された刺激応答性重合体を凝集体構造に実質的に結合させ(すなわち放出媒体を形成させ)、該凝集体構造は、重合体粒子の濃度に依存してゲルの一部を形成してもしなくてもよい。
【０１３５】
例えば、本発明による組成物は、水性液体内に重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を含みうる。重合体粒子のブロック共重合体は、(a) コア構造の少なくとも一部を形成し、かつ水性液体内で不溶性である疎水性の非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成し、かつそのLCST未満で、水性液体内で可溶性である熱応答性重合体ブロックを含みうる。機能化された刺激応答性重合体は、(a) シェル構造の少なくとも一部を形成する熱応答性重合体ブロックと同じLCSTを有し、かつ(b) 該LCST未満で、水性液体内で可溶性である熱応答性重合体により、機能化された熱応答性重合体でありうる。LCSTを下回る温度で、重合体粒子および機能化された熱応答性重合体は、別個かつ分離性の実体として存在する。
【０１３６】
液体を、重合体粒子と機能化された熱応答性重合体との熱応答性重合体のLCSTを上回る温度上昇に供することで、熱応答性重合体の親水性の性質を、水性液体中で可溶性である状態から水性液体中で疎水性かつ不溶性である状態へと移行させる。この移行は、重合体粒子および機能化された熱応答性重合体を結び付け、凝集体構造を形成させる。
【０１３７】
凝集体構造の形成は、機能化された熱応答性重合体またはその修飾型が後に放出されうる放出媒体をもたらす。
【０１３８】
hESCの、再現性のある大規模産生のための十分に定義された条件の開発は、広範囲にわたる医療適用に向けた重大な課題のままである。生物医薬品の生産のような他の細胞に基づく製造業において、用いられる細胞は、撹拌タンク生物反応器の中で大規模(10,000〜20,000 L)に単分散された浮遊培養物として成長させることができる。しかしながら、hESCは、浮遊培養にまだ容易には適合されておらず、その未分化状態を維持しながらの、高い生存性、長期成長および増殖のためには生物学的に活性な基材への接着を要し、臨床用途および商業用途を制限している。
【０１３９】
hESCは、典型的には、受精した胚の5〜6日齢の胚盤胞の内細胞塊に由来する。それらは、次の2つの重要な特徴を保有する: (1) 安定な核型を維持しながら無制限に増殖する能力、ならびに(2) 全4種の成体細胞系統(外胚葉、中胚葉、内胚葉および生殖細胞)から体細胞へ分化する能力。しかしながら、これらの有用性が現実となるには、当初は、分化していないhESCの増殖、その後に関心対象の系統への極めて効率的な分化をもたらすための強固で、拡張可能な、かつ標準化されたシステムを開発することが重要である。系統特異的な分化に十分な量での未分化hESCまたは誘導多能性幹細胞(iPSC、一緒にまとめて多能性幹細胞PSCと呼ばれる)の、再現性のある増殖は、細胞療法または創薬で後に用いるための強力なシステムを与えるものと期待される。
【０１４０】
培養条件に対する任意の所与のPSC細胞株の応答は、媒体成分のロット間のバラツキ、遺伝的変異性、株がhESCまたはiPSC、特にiPSCに関するものであるかどうか、およびiPSCが、実際に、そのhESCの近縁のものと同等の発生段階へ脱分化したかどうかを含めて、いくつかの要因により影響されうる。
【０１４１】
全てのPSCが等しく生み出されるわけではない。実際に、PSCを構成するものは、1998年のhESCの最初の導出から2006年のiPSCの作出および乳腺における多能性細胞Oct4+の最近の発見へと一貫して進展している。さらに、hESCは常に、マウス胚性幹細胞(mESC)と比較されてきたが、この二つの間には、ひところ、それらが異なる種由来の細胞株であるという事実から生じるものと考えられた多くの重要な差異がある。しかしながら、最近の研究により、hESCはマウス胚盤葉上層幹細胞に類似している可能性があり、mESCとhESCとの間の差異は、hESCが発達経路に若干ながらさらに沿うものであったことによるものと示唆されている。そのような可変性を念頭に置き、主要な問題は、複数の細胞株の細胞増殖が可能な再現性のある培養システムを作出することになっている。
【０１４２】
再現性の問題も、媒体組成および細胞外マトリックス(ECM)との関連で考慮することができる。ロット間のバラツキおよび動物由来成分の内部でまたは表面上で成長させた細胞に対する潜在的な免疫応答に関する懸念事項が、文献において知られている。したがって、PSCの培養プロセスは、ウシ胎仔血清(FBS)を含有する媒体、hESCの導出のためにもともとは使われたマウス支持層共培養システムから、ますます定義された媒体処方を利用するシステムへと前進した。定義された媒体の効率および利用は、マウス由来のECM混合物MatrigelまたはGeltrexに通常は基づく付着マトリックスの効果的選択に依存している。最近、これらの動物由来の成分を、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチンおよびE-カドヘリンのような組み換えタンパク質または小さなペプチドが施された単純な重合体からなる十分に定義された基材と置き換えることで進展がなされている。
【０１４３】
報告から、ラミニン-511が、ラミニン-332、ラミニン-411およびラミニン-111を含む他のラミニンと比べてmTeSR1媒体中にて安定な核型でhESCの長期の多能性増殖を維持できることが示されている。多能性hESC増殖の、その支持でよく研究され、かつ特徴付けられている別のECMタンパク質は、ビトロネクチン(VN)である。他の研究から、hESCの維持が、VNソマトメジンBドメインの、短い、組み換えにより産生された断片と、それに続く、細胞表面インテグリンとの会合および細胞結合に関与するアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフとで可能であることが示されている。さらなる研究により、異なるVNドメインから構成されたVN断片を組み換えにより産生することによってECMの構成に対するhESCの応答のバラツキのいくつかが浮き彫りにされており、その特異的な成長条件の下で、RGDモチーフおよびヘパリン結合ドメインが付着および成長に関してhESCからの最良の応答を与えたことが示されている。
【０１４４】
細胞-細胞および細胞-ECM間の接触の重要性がまた、最近の一連の研究において実証されており、そのなかでは、1) 胚細胞間のシグナル伝達におけるRhoキナーゼおよびミオシンの役割、2) hESCの酵素的解離が細胞表面E-カドヘリンおよびインテグリンシグナル伝達の致命的な混乱につながったこと、ならびに3) 酵素的解離後のアクチン-ミオシン収縮が組織崩壊による細胞死(アノイキス)の増大に関与していることが示された。酵素的消化は、重要な生存および多能性維持のシグナル伝達経路に関与する細胞表面インテグリンおよび成長因子受容体を破壊しうる。非酵素的な方法および表面基材の適切な選択によってhESCを培養できることは、治療用途における幹細胞の将来を大きく左右する。
【０１４５】
しかしながら、ECMの構成におけるそのようなシステム/進歩は、2D培養の制約によってその拡張可能性が限られている。
【０１４６】
これを克服するため、3D浮遊システムは、高品質な細胞の大量産生のための再現性のある、制御可能な自動化を可能にし、同時に接着性の培養容器に関連して大きな労働力を要し、かつ多大な時間を要した方法を退けるので、適当な選択肢でありうる。
【０１４７】
しかしながら、3DシステムにおけるPSCの増殖は、第一に、PSCを、もともとはPSCの分化のために利用された胚様体(EB)と呼ばれる細胞塊の中で成長させるという点で問題でありうる。第二に、上記のようにPSC培養における細胞-細胞間の接触の要件は、アクチン-ミオシン誘導性アノイキスの阻害剤の存在下でさえも、単個細胞または小塊増殖のPSCに、50%またはそれ以上の、高い比率の細胞死を起こしやすくさせる。第三に、EBまたはPSC凝集体が3D増殖に必要とされるなら、凝集体のサイズは、これが成長および多能性状態という点で細胞の挙動に影響を及ぼすので、厳密に制御される必要がある。最後に、PSCの増殖には、関心対象の細胞型への効率的な分化のために臨床的に意義のある細胞数が得られるような再現性が必要とされる。例えば、心筋梗塞を有する患者を処置するための、心筋細胞では、必要とされる仮定上の心筋細胞数は、およそ1〜2×109個の細胞と推定されている。分化培養のために小型生物反応器または浮遊胚様体を現在用いることでは、1 mlあたり心筋細胞3.1×104〜1.1×105個の、低収率の心筋細胞の作出が報告されている。
【０１４８】
これらの要因を念頭に置くと、従来のPSC、3D増殖技法では、1種もしくは複数種の未定義の成分を含有する媒体を利用するか、細胞死阻害剤を後に必要とする酵素法もしくは他の継代法を使用するか、または2D等価物も同然の低い増殖率を維持するにすぎず、スケールアップの可能性が狭められる。
【０１４９】
本発明は、hPSC培養に関連する問題の少なくともいくつかに対しての特有の解決策を提供する。本発明による組成物は、優れた生体適合性を付与し、細胞成長と、非侵襲性の刺激の適用によってその後の、細胞の非酵素的な放出を可能にしうる。
【０１５０】
本発明による特有の組成物は、1) 要求に応じて調整されうる異なる成長因子またはECM断片の包含、2) 細胞に対していっそう穏やかな、非侵襲性の刺激を用いて、細胞の放出を促進し、それによって酵素またはROCKiの必要性を取り除くことができること、ならびに3) 組成物は2Dおよび3D環境の間で容易に移行可能であり、かくしてそれを治療用途に適用可能にすることを含め、従来の細胞培養組成物/技法に比べて利点を供与することができる。
【０１５１】
細胞培養の1つの態様において、本発明による組成物は、水性液体内に重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を含みうる。重合体粒子のブロック共重合体は、(a) コア構造の少なくとも一部を形成し、かつ水性液体内で不溶性である疎水性の非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成し、かつそのLCST未満で、水性液体内で可溶性である熱応答性重合体ブロックを含みうる。機能化された刺激応答性重合体は、(a) シェル構造の少なくとも一部を形成する熱応答性重合体ブロックと同じLCSTを有し、かつ(b) 該LCST未満で、水性液体内で可溶性である熱応答性重合体により、機能化された熱応答性重合体でありうる。LCSTを下回る温度で、重合体粒子および機能化された熱応答性重合体は、別個かつ分離性の実体として存在する。
【０１５２】
重合体粒子と機能化された熱応答性重合体との熱応答性重合体のLCSTを上回る温度の上昇に液体を供することで、熱応答性重合体の親水性の性質を、水性液体中で可溶性である状態から水性液体中で性質が疎水性かつ不溶性である状態へと移行させる。この移行は、重合体粒子および機能化された熱応答性重合体を結び付け、凝集体構造を形成させる。
【０１５３】
凝集体構造の形成は、機能化された熱応答性重合体またはその修飾型が後に放出されうる放出媒体をもたらす。
【０１５４】
重合体粒子が基材に固定される場合、そのように形成された放出媒体は、その基材の表面に存在することができる。例えば、重合体粒子は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)の層のような基材に固定されうる。その場合、機能化された熱応答性重合体は、タンパク質で機能化された熱応答性重合体でありえ、ここでタンパク質は所望の細胞型と結合することができる。液体がLCST未満である場合、重合体粒子およびタンパク質で機能化された熱応答性重合体は、別個の分離性実体として存在するであろう。
【０１５５】
液体をLCSTにまたはLCST超まで加熱すると、タンパク質で機能化された熱応答性重合体は、放出媒体として働く凝集体構造を形成するように係留された重合体粒子上へ凝集し、それによって保持されよう。その状態で、重合体粒子の表面は、タンパク質で機能化された熱応答性重合体由来のタンパク質で満ちうる。次いで、タンパク質で機能化された刺激応答性重合体のタンパク質成分と結合できる1種または複数種の細胞を、液体に導入することができる。1種または複数種の細胞はその後、タンパク質と結合し、このタンパク質に富む表面の全体で増殖し、新たな細胞もタンパク質と結合しうる。このような方法での細胞の増殖は、細胞多能性および生存性を好都合に持続できる条件を与えうる。
【０１５６】
十分な増殖が行われた後に液体の温度をLCST未満まで低下させることで、凝集体構造の解離を促進することができ、これが次に、今度の、細胞で機能化された熱応答性重合体の放出を容易にすることができる。言い換えれば、培養細胞は効果的かつ非侵襲的な方法で基材から収集のため好都合に放出されうる。
【０１５７】
そのような基材の例としては、ガラス、金属、セラミック、プラスチック、支持細胞(例えばマウス胚性線維芽細胞のような線維芽細胞、およびその組み合わせが挙げられる。
【０１５８】
1つの態様において、本発明はそれゆえ、
(i) 液体、基材に固定された重合体粒子および細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞受容体リガンドを含む表面と凝集体構造を形成させる、段階;
(iii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞を該液体に導入する段階; ならびに
(iv) 該細胞受容体リガンドを含む該表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
【０１５９】
この方法は、
(v)重合体粒子と細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む液体組成物を共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
【０１６０】
この方法はまた、
(vi) 段階(v)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
【０１６１】
この方法はまた、
(vii) 細胞受容体リガンドを含む該表面上でさらなる細胞を培養するために段階(vi)の後に段階(i)〜(v)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
【０１６２】
さらなる態様において、本発明はまた、
(i) 液体、重合体粒子、および細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体を含むゲル組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階;
(ii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞をゲルに導入する段階; ならびに
(iii) 細胞をゲル表面上でおよび/またはゲル内部で培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
【０１６３】
この方法は、
(iv)重合体粒子と細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含むゲルを共通の刺激に供する段階であり、該移行が該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
【０１６４】
この方法はまた、
(v) 段階(iv)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
【０１６５】
この方法はまた、
(vi) ゲル表面上でおよび/またはゲル内部でさらなる細胞を培養するために段階(v)の後に段階(i)〜(iv)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
【０１６６】
重合体粒子が自由に移動できる(すなわちそれらが固定化基材または非移動基材に固定されない)場合、液体の温度をLCST未満に維持することによって、機能化された熱応答性重合体および重合体粒子は液体中で別個の分離性実体として存在し、液体の温度をLCST超まで上昇させることによって、機能化された熱応答性重合体および重合体粒子は結び付いて、三次元凝集体構造を形成する。また、機能化された熱応答性重合体はその場合、タンパク質で機能化された熱応答性重合体でありえ、ここでタンパク質は所望の細胞型と結合することができる。
【０１６７】
その場合、液体の温度がLCST未満であるとき、タンパク質で機能化された熱応答性重合体により提示されたタンパク質に複数の所望の細胞が結合して細胞で機能化された熱応答性重合体を実質的に形成するように、該複数の所望の細胞を導入することができる。2種以上のタンパク質で機能化された熱応答性重合体は、典型的には、各細胞と結合するであろう。
【０１６８】
次いで、液体の温度をLCST超まで上昇させることができ、これが今度は、細胞で機能化された熱応答性重合体および重合体粒子を結び付け、凝集体構造を形成させるであろう。凝集体構造の形成の際に、細胞で機能化された熱応答性重合体の細胞は塊を本質的に形成し、重合体粒子と細胞で機能化された熱応答性重合体との凝集体構造が、保持されている、細胞で機能化された熱応答性重合体を放出しうる放出媒体に相当する。
【０１６９】
そのように形成された細胞塊の内部の細胞はその後、増殖して、さらに大きな細胞塊を形成しうる。このような方法での細胞の増殖は、細胞多能性および生存性を好都合に持続できる条件を与えうる。
【０１７０】
十分な増殖が行われた後に液体の温度をLCST未満まで低下させることで、凝集体構造の解離を促進することができ、これが次に、細胞で機能化された熱応答性重合体の放出および結果として起こる、細胞塊の分解を容易にすることができる。言い換えれば、本発明による組成物は好都合に、培養細胞塊が後に、個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊へ効果的かつ非侵襲的な方法で分解されうる液体内で分散された細胞塊の中で細胞が培養されることを可能にする。
【０１７１】
本発明のこの形態によれば、培養細胞塊が個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊へ分解されたら、さらなるタンパク質で機能化された熱応答性重合体をLCST未満の温度で導入することができ、細胞培養プロセスを繰り返すことができる。このようにして、細胞を連続サイクルのプロセスで好都合に培養および収集することができる。
【０１７２】
1つの態様において、本発明はそれゆえ、
(i) 液体、重合体粒子、および細胞で機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞で機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞塊を形成させる、段階; ならびに
(iii) 該細胞塊の内部でおよび/または表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
【０１７３】
この方法は、
(iv)重合体粒子と細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む液体組成物を共通の刺激に供する段階であり、ここで該移行が、細胞塊からの個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊の放出を容易にする、段階
をさらに含みうる。
【０１７４】
この方法はまた、
(v) 段階(iv)においてそのように形成された個々の細胞および/または形成されたさらに小さな細胞塊の少なくともいくつかを、液体組成物から取り出す段階
をさらに含みうる。
【０１７５】
この方法はまた、
(vi) そのように形成された細胞塊の内部でおよび/または表面上でさらなる細胞を培養するために段階(v)の後に段階(i)〜(iv)の1つまたは複数を繰り返す段階
をさらに含みうる。
【０１７６】
本発明による細胞を培養する方法は好都合に、細胞が繰り返し培養され、その後に収集されうるように継続的に行うことができる。
【０１７７】
重合体粒子が粒子のCGCと同等以上の濃度で液体内に存在する場合、液体をLCST超まで加熱すると、液体は代わりに、ゲルへ転換され、細胞培養はあるいは、本明細書において記述されるように行われうる。
【０１７８】
かくして、ゲル組成物の形態で、本発明は、機能化された刺激応答性重合体の機能的実体として存在する薬物および/または生物材料のような物質を保持するために好都合に用いることができる。
【０１７９】
機能化された刺激応答性重合体の機能的実体が薬物である場合、ゲルの形態の組成物を、その薬物の放出媒体として好都合に用いることができる。そのような薬物放出媒体は、任意の所望の形状で提供されてもよく、例えばゲルは、内部にゲルが形成された容器の形状をとっている。
【０１８０】
本発明の組成物を用いて形成されたゲルは、優れた安定性を有し、数日間、数ヶ月間、場合によって数年間、ゲルの状態で維持することができる。
【０１８１】
所与の薬物も十分な安定性を有するなら、薬物を含むゲルの形態の本発明による組成物も、数日間、数ヶ月間、場合によって数年間、安定なゲルの状態で好都合に残存することができる。
【０１８２】
本発明による組成物が細胞培養に用いられる場合、用いられる機能化された刺激応答性重合体の機能的実体は一般に、関心対象の細胞と結合できるタンパク質のような細胞受容体リガンドであろう。異なる受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の組み合わせが用いられうる。例えば、特定の機能を供与するように1種または複数種の受容体リガンドが選択されうる。一般に、選択された受容体リガンドは、最低限でも、細胞に結合することができよう。しかしながら、所与の受容体リガンドはまた、細胞の生存および/または増殖を促進するように選択されうる(例えば増殖因子タンパク質)。
【０１８３】
1つの態様において、本発明によって用いられる機能化された刺激応答性重合体は、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体である。
【０１８４】
ゲルの形態の本発明による組成物は、所望の細胞と結合しうるように選択される細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体を用いて調製されうる。種細胞を次に、それらが移動して、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の細胞受容体リガンドと結合するように、形成されたゲルに導入することができる。得られたゲルを次に、細胞を培養するために用いることができる。
【０１８５】
あるいは、そのような細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の少なくともいくらかを最初に、ゲルを形成させる前に細胞に結合させてもよく、得られた、細胞で機能化された刺激応答性重合体を、任意により、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体と併せて、ゲルを形成させるのに用いてもよい。その場合、細胞で機能化された刺激応答性重合体(種細胞として機能するように)は、任意により、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体と併せて、ゲル内にその形成時に含有され、その後に保持される。得られたゲルを次に、細胞培養に用いることができる。
【０１８６】
組成物が細胞培養用のゲルの形成において用いられる場合、そのゲルを、(本明細書において記述されるように)基材上に形成させ、細胞をゲル内部でおよび/または表面上で増殖させてもよい。本発明によりゲルを形成させると、ゲルは、ゲルが形成される表面に好都合に接着することができる。例えば、ゲルはプラスチック容器内に形成されうる。その場合、そのように形成されたゲルは、その容器の表面に好都合に接着することができる。
【０１８７】
本発明によって用いられる細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体は、当技術分野において公知の技法を用いて調製されうる。例えば、細胞受容体リガンドはタンパク質でありえ、S-Sカップリング反応を用いて刺激応答性重合体-タンパク質結合体を調製することができる。
【０１８８】
所与の細胞は、2種以上の細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体鎖と結合しうる。同様に、所与の細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体鎖は、2種以上の細胞と結合しうる。
【０１８９】
細胞は、従来の細胞培養の方法論を用い本発明によって培養されうる。例えば、細胞は2Dおよび3Dの両方の形式で培養されうる。
【０１９０】
本発明による組成物は、細胞成長および増殖中、細胞に多能性を好都合に維持させることができる。本組成物は、少なくとも部分的に、静置培養または浮遊培養のいずれかで細胞が凝集するための支持体を提供することによってこれを達成する。本組成物はまた、例えばインテグリンシグナル伝達およびインテグリン結合分子との相互作用を通じて、多能性状態を維持するために必要とされる細胞の合図を組み入れるようにしてデザインすることができる。
【０１９１】
本発明の重要な特徴は、重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との凝集体構造を形成させると、機能化された刺激応答性重合体が、温度の変化のような刺激に構造を供することによってその構造から放出されうることである。凝集体構造を形成させるために最初に用いられる機能化された刺激応答性重合体の機能的実体は、凝集体構造からの放出時に同じ形態で存在してもまたはしなくてもよいことが理解されよう。
【０１９２】
例えば、機能化された刺激応答性重合体の機能的実体は、薬物でありえ、それは、凝集体構造から最終的に放出されるこの薬物で機能化された刺激応答性重合体である。
【０１９３】
さらなる例として、機能化された刺激応答性重合体の機能的実体は、細胞受容体リガンドでありうる。組成物が細胞培養に用いられる場合、その細胞受容体リガンドは細胞培養中に細胞と結合することができ、機能化された刺激応答性重合体はひいては、細胞で機能化された刺激応答性重合体と言い表すのが一番合っているかもしれない。その場合、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体は、細胞が付着されている修飾型ではあるが、凝集体構造から依然として放出される。
【０１９４】
1つの態様において、機能化された刺激応答性重合体は、放出媒体からの放出の際に生分解性カップリングが分解し、機能的実体が刺激応答性重合体から切断されるような、機能的実体(例えば薬物または細胞受容体リガンド)と刺激応答性重合体との間の生分解性カップリングを備えている。
【０１９５】
本発明による組成物が細胞培養に用いられる場合、凝集体構造からの、細胞で機能化された刺激応答性重合体の放出は、例えばその温度を低下させることなどの刺激（それによって凝集体構造が含有される液体中で重合体粒子と機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体を可溶性にする）に凝集体構造を供することによって、促進することができる。細胞で機能化された刺激応答性重合体の放出は、機械的せん断応力の適用によって容易にすることもできる。
【０１９６】
本明細書において「置換されてもよい」は、基が、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アラルキル、アルカリル、アルクヘテロシクリル、アルクヘテロアリール、アルクカルボシクリル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ハロカルボシクリル、ハロヘテロシクリル、ハロヘテロアリール、ハロアシル、ハロアリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシカルボシクリル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシヘテロシクリル、ヒドロキシヘテロアリール、ヒドロキシアシル、ヒドロキシアラルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルケニル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボシクリル、アルコキシアリール、アルコキシヘテロシクリル、アルコキシヘテロアリール、アルコキシアシル、アルコキシアラルキル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、カルボシクリルオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アシルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアルキニルオキシ、ハロアリールオキシ、ハロカルボシクリルオキシ、ハロアラルキルオキシ、ハロヘテロアリールオキシ、ハロヘテロシクリルオキシ、ハロアシルオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール(nitroheteroayl)、ニトロカルボシクリル、ニトロアシル、ニトロアラルキル、アミノ(NH2)、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アラルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、アシルアミノ、ジアシルアミノ、ヘテロシクロアミノ(heterocyclamino)、ヘテロアリールアミノ、カルボキシ、カルボキシエステル、アミド、アルキルスルフォニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アシルチオ、スルホキシド,スルホニル、スルホンアミド、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノカルボシクリル、アミノアリール、アミノヘテロシクリル、アミノヘテロアリール、アミノアシル、アミノアラルキル、チオアルキル、チオアルケニル、チオアルキニル、チオカルボシクリル、チオアリール、チオヘテロシクリル、チオヘテロアリール、チオアシル、チオアラルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、カルボキシアルキニル、カルボキシカルボシクリル、カルボキシアリール、カルボキシヘテロシクリル、カルボキシヘテロアリール、カルボキシアシル、カルボキシアラルキル、カルボキシエステルアルキル、カルボキシエステルアルケニル、カルボキシエステルアルキニル、カルボキシエステルカルボシクリル、カルボキシエステルアリール、カルボキシエステルヘテロシクリル、カルボキシエステルヘテロアリール、カルボキシエステルアシル、カルボキシエステルアラルキル、アミドアルキル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、アミドカルボシクリル、アミドアリール、アミドヘテロシクリル、アミドヘテロアリール、アミドアシル、アミドアラルキル、ホルミルアルキル、ホルミルアルケニル、ホルミルアルキニル、ホルミルカルボシクリル、ホルミルアリール、ホルミルヘテロシクリル、ホルミルヘテロアリール、ホルミルアシル、ホルミルアラルキル、アシルアルキル、アシルアルケニル、アシルアルキニル、アシルカルボシクリル、アシルアリール、アシルヘテロシクリル、アシルヘテロアリール、アシルアシル、アシルアラルキル、スルホキシドアルキル、スルホキシドアルケニル、スルホキシドアルキニル、スルホキシドカルボシクリル、スルホキシドアリール、スルホキシドヘテロシクリル、スルホキシドヘテロアリール、スルホキシドアシル、スルホキシドアラルキル、スルホニルアルキル、スルホニルアルケニル、スルホニルアルキニル、スルホニルカルボシクリル、スルホニルアリール、スルホニルヘテロシクリル、スルホニルヘテロアリール、スルホニルアシル、スルホニルアラルキル、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアルケニル、スルホンアミドアルキニル、スルホンアミドカルボシクリル、スルホンアミドアリール、スルホンアミドヘテロシクリル、スルホンアミドヘテロアリール、スルホンアミドアシル、スルホンアミドアラルキル、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロカルボシクリル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロアシル、ニトロアラルキル、シアノ、スルフェート、ホスフェート、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、およびカルバゾール基から選択されるものを含めて、1つ、2つ、3つまたはそれ以上の有機基および無機基と置換または融合(縮合多環式基を形成するように)されてもまたはされなくてもよいことを意味するものと解釈される。任意選択の置換は、鎖または環中の-CH2-基が、-O-、-S-、-NRa-、-C(O)-(すなわちカルボニル)、-C(O)O-(すなわちエステル)、および-C(O)NRa-(すなわちアミド)から選択される基によって置き換えられる場合をいうものと解釈されてもよく、式中、Raは本明細書において定義される通りである。
【０１９７】
好ましい任意選択の置換基には、アルキル(例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルのようなC1〜6アルキル)、ヒドロキシアルキル(例えばヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル)、アルコキシアルキル(例えばメトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシメチル、エトキシエチル、エトキシプロピルなど) アルコキシ(例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシのようなC1〜6アルコキシ)、ハロ、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、ヒドロキシ、フェニル(これはそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、ベンジル(ここでベンジルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O) C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、フェノキシ(ここでフェニルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、ベンジルオキシ(ここでベンジルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、アミノ、アルキルアミノ(例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノなどのようなC1〜6アルキル)、ジアルキルアミノ(例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノのようなC1〜6アルキル)、アシルアミノ(例えばNHC(O)CH3)、フェニルアミノ(ここでフェニルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、ニトロ、ホルミル、-C(O)-アルキル(例えばアセチルのようなC1〜6アルキル)、O-C(O)-アルキル(例えばアセチルオキシのようなC1〜6アルキル)、ベンゾイル(ここでフェニル基それ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ ヒドロキシC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、C=OとのCH2の置き換え、CO2H、CO2アルキル(例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステルのようなC1〜6アルキル)、CO2フェニル(ここでフェニルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシルC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロ OC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、CONH2、CONHフェニル(ここでフェニルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシルC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、CONH���ンジル(ここでベンジルそれ自体が、例えば、C1〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ ヒドロキルC1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、シアノ、ニトロOC(O)C1〜6アルキル、およびアミノによってさらに置換されてもよい)、CONHアルキル(例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルアミドのようなC1〜6アルキル) CONHジアルキル(例えばC1〜6アルキル) アミノアルキル(例えば、HN C1〜6アルキル-、C1〜6アルキルHN-C1〜6アルキル-および(C1〜6アルキル)2N-C1〜6アルキル-)、チオアルキル(例えば、HS C1〜6アルキル-)、カルボキシアルキル(例えば、HO2CC1〜6アルキル-)、カルボキシエステルアルキル(例えば、C1〜6アルキルO2CC1〜6アルキル-)、アミドアルキル(例えば、H2N(O)CC1〜6アルキル-、H(C1〜6アルキル)N(O)CC1〜6アルキル-)、ホルミルアルキル(例えば、OHCC1〜6アルキル-)、アシルアルキル(例えば、C1〜6アルキル(O)CC1〜6アルキル-)、ニトロアルキル(例えば、O2NC1〜6アルキル-)、スルホキシドアルキル(例えば、C1〜6アルキル(O)SC1〜6アルキル-のようなR(O)SC1〜6アルキル)、スルホニルアルキル(例えば、C1〜6アルキル(O)2SC1〜6アルキル-のようなR(O)2SC1〜6アルキル-)、スルホンアミドアルキル(例えば、2HRN(O)SC1〜6アルキル、H(C1〜6アルキル)N(O)SC1〜6アルキル-)、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、ならびにカルバゾールが含まれる。
【０１９８】
本明細書において用いられる場合、単独でまたは複合語で用いられる「アルキル」という用語は、直鎖、分枝または環状アルキル、好ましくはC1〜20アルキル、例えばC1〜10またはC1〜6を意味する。直鎖および分枝アルキルの例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、1,2-ジメチルプロピル、1,1-ジメチル-プロピル、ヘキシル、4-メチルペンチル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、1,2,2-トリメチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、ヘプチル、5-メチルヘキシル、1-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、4,4-ジメチルペンチル、1,2-ジメチルペンチル、1,3-ジメチルペンチル、1,4-ジメチル-ペンチル、1,2,3-トリメチルブチル、1,1,2-トリメチルブチル、1,1,3-トリメチルブチル、オクチル、6-メチルヘプチル、1-メチルヘプチル、1,1,3,3-テトラメチルブチル、ノニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-メチルオクチル、1-、2-、3-、4-または5-エチルヘプチル、1-、2-または3-プロピルヘキシル、デシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-および8-メチルノニル、1-、2-、3-、4-、5-または6-エチルオクチル、1-、2-、3-または4-プロピルヘプチル、ウンデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-または9-メチルデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-エチルノニル、1-、2-、3-、4-または5-プロピルオクチル、1-、2-または3-ブチルヘプチル、1-ペンチルヘキシル、ドデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-または10-メチルウンデシル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-または8-エチルデシル、1-、2-、3-、4-、5-または6-プロピルノニル、1-、2-、3-または4-ブチルオクチル、1-2-ペンチルヘプチルなどが挙げられる。環状アルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルなどのような単環式または多環式アルキル基が挙げられる。アルキル基が一般的に「プロピル」、「ブチル」などといわれる場合、これは適切な場合、直鎖、分枝および環状異性体のいずれかをいうことができるものと理解されよう。アルキル基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。
【０１９９】
本明細書において用いられる「アルケニル」という用語は、すでに定義されているエチレン性一、二もしくは多不飽和アルキルまたはシクロアルキル基を含む少なくとも1つの炭素・炭素二重結合を含んだ直鎖、分枝または環状炭化水素残基から形成された基、好ましくはC2〜20アルケニル(例えばC2〜10またはC2〜6)を意味する。アルケニルの例としては、ビニル、アリル、1-メチルビニル、ブテニル、イソ-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-ペンテニル、シクロペンテニル、1-メチル-シクロペンテニル、1-ヘキセニル、3-ヘキセニル、シクロヘキセニル、1-ヘプテニル、3-ヘプテニル、1-オクテニル、シクロオクテニル、1-ノネニル、2-ノネニル、3-ノネニル、1-デセニル、3-デセニル、1,3-ブタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1,3-シクロペンタジエニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニル、1,3-シクロヘキサジエニル、1,4-シクロヘキサジエニル、1,3-シクロヘプタジエニル、1,3,5-シクロヘプタジエニルおよび1,3,5,7-シクロオクタテトラエニルが挙げられる。アルケニル基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。
【０２００】
本明細書において用いられる場合、「アルキニル」という用語は、すでに定義されているエチレン性一、二もしくは多不飽和アルキルまたはシクロアルキル基を含む少なくとも1つの炭素・炭素三重結合を含んだ直鎖、分枝または環状炭化水素残基から形成された基を意味する。炭素原子の数が指定されていなければ、この用語は好ましくは、C2〜20アルキニル(例えばC2〜10またはC2〜6)をいう。例としては、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、ならびにブチニル異性体、およびペンチニル異性体が挙げられる。アルキニル基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。
【０２０１】
「ハロゲン」(「ハロ」)という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素(フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード)を意味する。
【０２０２】
「アリール」(または「カルボアリール」)という用語は、芳香族炭化水素環系の単核、多核、共役および縮合残基のいずれか(例えばC6〜24またはC6〜18)を意味する。アリールの例としては、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、クアテルフェニル、ナフチル、ヘトラヒドロナフチル、アントラセニル、ジヒドロアントラセニル、ベンズアントラセニル、ジベンズアントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、ピレニル、イデニル、アズレニル、クリセニルが挙げられる。好ましいアリールには、フェニルおよびナフチルが含まれる。アリール基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもまたはされなくてもよい。「アリーレン」という用語は、二価の形態のアリールを意味するものと意図される。
【０２０３】
「カルボシクリル」という用語には、非芳香族の単環式、多環式、縮合または共役炭化水素残基のいずれか、好ましくはC3〜20(例えばC3〜10またはC3〜8)が含まれる。環は飽和していてもよく、例えばシクロアルキルであってよく、または1つもしくは複数の二重結合を保有してもよく(シクロアルケニル)、かつ/または1つもしくは複数の三重結合を保有してもよい(シクロアルキニル)。特に好ましいカルボシクリル部分は、5〜6員または9〜10員環系である。適当な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロオクタテトラエニル、インダニル、デカリニルおよびインデニルが挙げられる。カルボシクリル基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。「カルボシクリレン」という用語は、二価の形態のカルボシクリルを意味するものと意図される。
【０２０４】
「ヘテロ原子」または「ヘテロ」という用語は、本明細書においてその最も広範な意味で用いられる場合、環状有機基の一員でありうる炭素原子以外の任意の原子をいう。ヘテロ原子の具体例としては、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素、ケイ素、セレンおよびテルル、より具体的には窒素、酸素および硫黄が挙げられる。
【０２０５】
「ヘテロシクリル」という用語には、単独でまたは複合語で用いられる場合、1つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられて非芳香族残基を提供する、単環式、多環式、縮合または共役炭化水素残基のいずれか、好ましくはC3〜20(例えばC3〜10またはC3〜8)が含まれる。適当なヘテロ原子にはO、N、S、PおよびSe、特にO、NおよびSが含まれる。2つまたはそれ以上の炭素原子が置き換えられる場合、これは同じヘテロ原子の2つもしくはそれ以上によって、または異なるヘテロ原子によって置き換えられてもよい。ヘテロシクリル基は、飽和または部分的に不飽和であってよく、すなわち1つまたは複数の二重結合を保有する。特に好ましいヘテロシクリルは5〜6員および9〜10員のヘテロシクリルである。ヘテロシクリル基の適当な例には、アズリジニル(azridinyl)、オキシラニル、チイラニル(thiiranyl)、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、2H-ピロリル、ピロリジニル、ピロリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、チオモルホリニル、ジオキサニル、ヘトラヒドロフラニル、ヘトラヒドロピラニル、ヘトラヒドロピロリル、ヘトラヒドロチオフェニル、ピラゾリニル、ジオキサラニル、チアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、ジヒドロピラニル、オキサジニル、チアジニル、チオモルホリニル、オキサチアニル、ジチアニル、トリオキサニル、チアジアジニル、ジチアジニル、トリチアニル、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、インデニル、インダニル、3H-インドリル、イソインドリニル、4H-キノラジニル、クロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ピラニルおよびジヒドロピラニルが挙げられうる。ヘテロシクリル基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。「ヘテロシクリレン」という用語は、二価の形態のヘテロシクリルを意味するものと意図される。
【０２０６】
「ヘテロアリール」という用語には、1つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子により置き換えられて芳香族残基を提供する、単環式、多環式、縮合または共役炭化水素残基のいずれかが含まれる。好ましいヘテロアリールは、3〜20個、例えば3〜10個の環原子を有する。特に好ましいヘテロアリールは、5〜6員および9〜10員の二環系である。適当なヘテロ原子にはO、N、S、PおよびSe、特にO、NおよびSが含まれる。2つまたはそれ以上の炭素原子が置き換えられる場合、これは同じヘテロ原子の2つもしくはそれ以上によって、または異なるヘテロ原子によって置き換えられてもよい。ヘテロアリール基の適当な例としては、ピリジル、ピロリル、チエニル、イミダゾリル、フラニル、ベンゾチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、1,5-ナフチリジニル、キノザリニル、キナゾリニル、キノリニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、オキサジアルゾリル(oxadialzolyl)、オキサトリアゾリル、トリアジニル、およびフラザニルが挙げられうる。ヘテロアリール基は、本明細書において定義される1つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されてもよい。「ヘテロアリーレン」という用語は、二価の形態のヘテロアリールを意味するものと意図される。
【０２０７】
単独のまたは複合語のいずれかの「アシル」という用語は、部分C=Oを含んだ(かつカルボン酸、エステルまたはアミドではない)基を意味する。好ましいアシルにはC(O)-Reが含まれ、式中、Reは、水素またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリル残基である。アシルの例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、2-メチルプロパノイル、ペンタノイル、2,2-ジメチルプロパノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、ノナデカノイルおよびイコサノイルのような直鎖または分枝アルカノイル(例えばC1〜20); シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニルおよびシクロヘキシルカルボニルのようなシクロアルキルカルボニル; ベンゾイル、トルオイルおよびナフトイルのようなアロイル; フェニルアルカノイル(例えば、フェニルアセチル、フェニルプロパノイル、フェニルブタノイル、フェニルイソブチリル、フェニルペンタノイルおよびフェニルヘキサノイル)およびナフチルアルカノイル(例えば、ナフチルアセチル、ナフチルプロパノイルおよびナフチルブタノイル)のようなアラルカノイル; フェニルアルケノイル(例えば、フェニルプロペノイル、フェニルブテノイル、フェニルメタクリロイル、フェニルペンテノイルおよびフェニルヘキセノイル)およびナフチルアルケノイル(例えば、ナフチルプロペノイル、ナフチルブテノイルおよびナフチルペンテノイル)のようなアラルケノイル(aralkenoyl); フェノキシアセチルおよびフェノキシプロピオニルのようなアリールオキシアルカノイル; フェニルチオカルバモイルのようなアリールチオカルバモイル; フェニルグリオキシロイルおよびナフチルグリオキシロイルのようなアリールグリオキシロイル; フェニルスルホニルおよびナフチルスルホニルのようなアリールスルホニル; 複素環式カルボニル; チエニルアセチル、チエニルプロパノイル、チエニルブタノイル、チエニルペンタノイル、チエニルヘキサノイル、チアゾリルアセチル、チアジアゾリルアセチルおよびテトラゾリルアセチルのような複素環式アルカノイル; 複素環式プロペノイル、複素環式ブテノイル、複素環式ペンテノイルおよび複素環式ヘキセノイルのような複素環式アルケノイル; ならびにチアゾリグリオキシロイル(thiazolyglyoxyloyl)およびチエニルグリオキシロイルのような複素環式グリオキシロイルが挙げられる。Re残基は、本明細書において記述されるように置換されてもよい。
【０２０８】
単独のまたは複合語のいずれかの「スルホキシド」という用語は、基-S(O)Rfをいい、式中、Rfは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、およびアラルキルから選択される。好ましいRfの例としてはC1〜20アルキル、フェニルおよびベンジルが挙げられる。
【０２０９】
単独のまたは複合語のいずれかの「スルホニル」という用語は、基S(O)2-Rfをいい、式中、Rfは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリルおよびアラルキルから選択される。好ましいRfの例としてはC1〜20アルキル、フェニルおよびベンジルが挙げられる。
【０２１０】
単独のまたは複合語のいずれかの「スルホンアミド」という用語は、基S(O)NRfRfをいい、式中、各Rfは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、およびアラルキルから独立して選択される。好ましいRfの例としては、C1〜20アルキル、フェニルおよびベンジルが挙げられる。1つの態様において、少なくとも1つのRfは水素である。別の態様において、両方のRfが水素である。
【０２１１】
「アミノ」という用語は、本明細書で当技術分野において理解されているその最も広範な意味で用いられ、式NRaRbの基を含み、式中、RaおよびRbは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、およびアシルから独立して選択されるいずれかであってよい。RaおよびRbは、それらが付着される窒素と一緒になって、単環式または多環式環系、例えば3〜10員環、特に5〜6員および9〜10員の系を形成してもよい。「アミノ」の例としては、NH2、NHアルキル(例えばC1〜20アルキル)、NHアリール(例えばNHフェニル)、NHアラルキル(例えばNHベンジル)、NHアシル(例えばNHC(O)C1〜20アルキル、NHC(O)フェニル)、Nアルキルアルキル(ここで各アルキル、例えばC1〜20は、同じでもまたは異なっていてもよい)および1つまたは複数の同じまたは異なるヘテロ原子(例えばO、NおよびS)を任意で含んでもよい、5員または6員環が挙げられる。
【０２１２】
「アミド」という用語は、本明細書で当技術分野において理解されているその最も広範な意味で用いられ、式C(O)NRaRbを有する基を含み、式中、RaおよびRbは上記に定義される通りである。アミドの例としては、C(O)NH2、C(O)NHアルキル(例えばC1〜20アルキル)、C(O)NHアリール(例えばC(O)NHフェニル)、C(O)NHアラルキル(例えばC(O)NHベンジル)、C(O)NHアシル(例えばC(O)NHC(O)C1〜20アルキル、C(O)NHC(O)フェニル)、C(O)Nアルキルアルキル(ここで各アルキル、例えばC1〜20は、同じでもまたは異なっていてもよい)および1つまたは複数の同じまたは異なるヘテロ原子(例えばO、NおよびS)を任意で含んでもよい、5員または6員環が挙げられる。
【０２１３】
「カルボキシエステル」という用語は、本明細書で当技術分野において理解されているその最も広範な意味で用いられ、式CO2Rgを有する基を含み、式中、Rgは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、およびアシルを含む基から選択されうる。カルボキシエステルの例としては、CO2C1〜20アルキル、CO2アリール(例えばCO2フェニル)、CO2アラルキル(例えばCO2ベンジル)が挙げられる。
【０２１４】
本明細書において用いられる場合、「アリールオキシ」という用語は、酸素橋を通じて付着された「アリール」基をいう。アリールオキシ置換基の例としては、フェノキシ、ビフェニルオキシ、ナフチルオキシなどが挙げられる。
【０２１５】
本明細書において用いられる場合、「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を通じて付着されている「アシル」基をいう。「アシルオキシ」の例としては、ヘキシルカルボニルオキシ(ヘプタノイルオキシ)、シクロペンチルカルボニルオキシ、ベンゾイルオキシ、4-クロロベンゾイルオキシ、デシルカルボニルオキシ(ウンデカノイルオキシ)、プロピルカルボニルオキシ(ブタノイルオキシ)、オクチルカルボニルオキシ(ノナノイルオキシ)、ビフェニルカルボニルオキシ(例えば4-フェニルベンゾイルオキシ)、ナフチルカルボニルオキシ(例えば1-ナフトイルオキシ)などが挙げられる。
【０２１６】
本明細書において用いられる場合、「アルキルオキシカルボニル」という用語は、カルボニル基を通じて付着された「アルキルオキシ」基をいう。「アルキルオキシカルボニル」基の例としては、ギ酸ブチル、ギ酸sec-ブチル、ギ酸ヘキシル、ギ酸オクチル、ギ酸デシル、ギ酸シクロペンチルなどが挙げられる。
【０２１７】
本明細書において用いられる場合、「アリールアルキル」という用語は、芳香環で置換された直鎖または分枝鎖アルカンから形成される基をいう。アリールアルキルの例としては、フェニルメチル(ベンジル)、フェニルエチルおよびフェニルプロピルが挙げられる。
【０２１８】
本明細書において用いられる場合、「アルキルアリール」という用語は、直鎖または分枝アルカンで置換されたアリール基から形成される基をいう。アルキルアリールの例としては、メチルフェニルおよびイソプロピルフェニルが挙げられる。
【０２１９】
本発明を、以下の非限定的な例を参照して以下にさらに記述する。
【実施例】
【０２２０】
材料:
用いた溶媒はHPLCまたはAR等級であった。活性化塩基性アルミナ(Aldrich: Brockmann I, 標準等級, およそ150メッシュ, 58Å)、MilliQ水、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS: Aldrich, 99%)は、受け取ったまま用いた。スチレン(STY: Aldrich, >99%)は塩基性アルミナカラムを通過させて、阻害因子を除去した。使用の前に、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM: Aldrich, 97%)はヘキサンから再結晶化され、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN: Riedel-de Haen)はメタノールから再結晶化された。二硫化炭素(99%)、1-ブタンチオール(99%)、ブロモプロピオン酸メチル(98%)、ジメチルスルホキシド(DMSO, >99.9%)、Aldrithil(商標)-2 (98%)、ヘキシルアミン(99%)は、Aldrichから受け取ったまま用いた。トリエチレンアミン(>99%)はMERCKから受け取ったまま用いた。hESC株MEL1 (雄性)およびMEL2 (雌性)は、Stem Core Queensland (Formerly Australian Stem Cell Centre)から提供され、オーストラリア国立保健医療研究審議会の承認(許可番号309709)の下、マウス胚性線維芽細胞支持層上にて手作業で継代された培養物として日常的に維持された。全ての実験において用いた媒体は、hESC用のStemPro(登録商標)無血清媒体(Life Technologies Carlsbad, CA, USA)であった。対照は、200分の1のGeltrex(商標)中で1時間コーティングされた組織培養プラスチック皿(BD Falcon)上に播種した。
【０２２１】
分析技法
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
オートサンプラを備えたWaters Alliance 2690 Separations Module、示差屈折率(Differential Refractive Index) (RI)検出器および直列につながれたフォトダイオードアレイ(PDA)検出器を用いてSEC測定を行った。HPLC等級のテトラヒドロフランを流速1 mL/分で溶出液として用いた。カラムは、直列につながれた2つの7.8×300 mm Waters線形Ultrastyragel SECカラムからなった。ポリスチレン標準物質を較正に用いた。
【０２２２】
透過電子顕微鏡法(TEM)
周囲温度にてスポットサイズ6で100 kVの加速電圧を利用しJEOL-1010透過型電子顕微鏡を使って重合体ラテックスのナノ構造の外観を分析した。典型的なTEMグリッドの調製は次の通りであった: 重合混合物をMilliQ水でおよそ0.05 wt%に希釈した。次いで、ホルムバール・プレコート銅TEMグリッドを希釈されたラテックス溶液に浸し、ろ紙上25℃で乾燥させた。
【０２２３】
1H核磁気共鳴(NMR)分光学
全てのNMRスペクトルは、Bruker DRX 500 MHz分光計に記録された。
【０２２４】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-ToF)質量分析
窒素レーザー(337 nm, 200 Hzの最高射程率)を備えたBruker MALDI-ToF autoflex IIIスマートビームを用いてMALDI-ToF MSスペクトルを600〜400,000 Daの質量範囲で得た。スペクトルをリフレクトロンモード(2,000〜5,000 Da)および線形モード(5,000〜20,000 Da)の両方で記録した。トランス-2-[3-(4-tert-ブチルフェニル)-2-メチル-プロペニリデン]マロノニトリル(DCTB; THF中20 mg/mL)をマトリックスとして用い、Na(CF3COO) (THF中1 mg/mL)を陽イオン源として用いた。サンプルは、標的プレート上にマトリックス(20 μL)、Na(CF3COO) (1 μL)、および重合体(20 μL, THF中1 mg/mL)溶液を同時にスポットすることによって調製された。
【０２２５】
TrypLE (Life Technologies)酵素消化を用いて、細胞を単個細胞の継代に適合させた。細胞を、TrypLE (Life Technologies)を用いて組織培養表面から剥がし、StemPro(登録商標) (Life Technologies)中ビトロネクチン、フィブロネクチンまたはRGDペプチド(表1)のいずれかで機能化されたpNIPAM/PSTYジブロック共重合体でコーティングされた組織培養皿またはカバーガラス(24ウェルプレートの中に挿入された)上にプレーティングした。細胞を付着アッセイ法の場合には細胞5×104個/カバーガラスまたは臓器培養皿および細胞シート形成の場合には1×106個で播種した。結合対照の場合、臓器培養皿およびカバーガラスを、DMEM-F12中で200分の1希釈されたGeltrex(商標) (Life Technologies)でコーティングした。倍率20×でEVOSfl倒立顕微鏡(Advanced Microscopy Group, Bothell WA)にて撮像し、標準的な血球計を用いて細胞を手作業でカウントした。温度依存的な剥離の場合、穏やかに撹拌しながら4℃または室温でのインキュベーションによって表面から細胞を放出させた。播種から24時間後にpNIPAM/PSTYジブロック共重合体ECM機能化表面から細胞シートを放出させた。
【０２２６】
（表１）組み換えタンパク質断片の配列
2015519902.tif 000002
【０２２７】
実施例1 部分(a): 2-(ブチルチオカルボノチオイルチオ)プロパン酸メチルの合成
2015519902.tif 000003
窒素雰囲気下の1-ブタンチオール(10 mL, 0.093 mol)およびTEA (14.3 mL, 0.103 mol)のDCM (100 mL)撹拌溶液に、0℃で30分間にわたりDCM (50 mL)中の二硫化炭素(6.18 mL, 0.103 mol)を滴下した。溶液は添加中に徐々に黄色くなった。添加を完了した後に、溶液を1時間室温で撹拌した。次いで、DCM (50 mL)中のMBP (11.5 mL, 0.103 mol)を30分間にわたり溶液に滴下し、2時間撹拌した。DCMを窒素下で除去し、残留物をジエチルエーテルに溶解した。この溶液を10%冷HCl溶液(3×50 mL)およびMilliQ水(3×50 mL)で洗浄し、その後、無水MgSO4で乾燥した。溶媒を真空下で除去し、残留する黄色の油状物をカラムクロマトグラフィー(シリカ上、9:1の石油エーテル/酢酸エチル、第2のバンド)によって精製した。
2015519902.tif 000004
【０２２８】
部分(b): RAFT重合によるPNIPAM43-SC(=S)SC4H9の合成
NIPAM (15 g, 0.133 mol)、RAFT剤(0.75 g 3.0×10-3 mol)およびAIBN (50 mg, 3.0×10-4 mol)を50 ml Schlenkフラスコ中、DMSO 30 mlに溶解した。溶液を30分間Arによってパージした。反応溶液を次に、16時間、60℃で予熱された油浴中に浸した。氷浴中で冷却し、溶液を空気に曝すことにより反応を停止させた。重合混合物を次に、DCM 500 mlによって希釈し、MilliQ水によって3回洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮し、ジエチルエーテル中で沈降させた。ろ過後、黄色の粉末を48時間室温にて真空下で乾燥した(Mn,GPC = 4800)。
1H NMR (CDCl3, 298K, 500 MHz); 6.47 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-C=O-)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、4.62 (b, 1H, -CH-SC(=S)S- C4H9)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、3.66 (b, 3H, CH3O- RAFT残存基) 3.34 (b, 2H, -SC(=S)S-CH2C3H7)、1.06〜2.45 (b, ポリ(NIPAM)骨格のメチレンおよびメチンプロトン)、1.12 (b, ポリ(NIPAM)反復単位のメチルプロトン)、0.90 (b, 6H, RAFT残存基のメチルプロトン)。
2015519902.tif 000005
【０２２９】
部分(c): ピリジンジスルフィド機能化ポリ(NIPAM)-PDSの合成
PNIPAM43-SC(=S)SC4H9 (Mn,GPC = 4800, 0.29 g, 6.0×10-5 mol)、Aldrithiol(商標)-2 (40 mg, 1.8×10-4 mol)およびTEA (40 mg, 1.8×10-4 mol)をDMF 5 mlに溶解した。溶液を20分間Arによってパージし、ヘキシルアミン(40 mg, 1.8×10-4 mol)を気密注射器によって加えた。室温で終夜撹拌した後に、反応混合物に送気管で風を吹きつけて、いくらかのDMFを除去した。残留物を次に、ジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテル中で沈降させた。溶解/沈降操作を3回繰り返し、ろ過を行った。重合体を次に、48時間室温にて真空下で乾燥して、収率75.8%として白色の粉末状生成物0.22 gを得た。
1H NMR (CDCl3, 298K, 500 MHz); δ 8.45 (b, 1H, ピリジンプロトン)、7.63 (b, 2H, ピリジンプロトン)、7.13 (b, 1H; ピリジンプロトン)、6.47 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-C=O-)、3.97 (b, ポリ(NIPAM)反復単位の-NH-CH(CH3)2)、3.66 (b, 3H, CH3O- RAFT残存基) 3.46 (b, 1H, ジスルフィド架橋に近いメチンプロトン)、1.36〜2.10 (b, ポリ(NIPAM)骨格のメチレンおよびメチンプロトン)、1.12 (b, ポリ(NIPAM)反復単位のメチルプロトン)、0.88 (b, 3H, RAFT残存基のメチルプロトン)。
2015519902.tif 000006
【０２３０】
部分(d): (NIPAM)-タンパク質(GFP、Cheery、フィブロネクチンおよびビトロネクチン)結合の合成
組み換えタンパク質(GFPおよびmCherry)またはECMペプチド(フィブロネクチンおよびビトロネクチン)を文献に記述されているように産生したが、配列を表1に示す。PNIPAM-PDSを10 mg/mLの濃度でMilli-Q水に溶解した。タンパク質は既に(異なる濃度で)溶解していた。PNIPAM-PDS溶液をタンパク質溶液に加え、その結果、3:1のモル比が達成された。反応混合物を室温で6時間ゆっくり振盪した。結合効率をUV-Vis分光分析によって測定した。タンパク質と結合させた後にPNIPAM-PDSから放出されたピリジンチオンのものとみなした340 nmでの吸光度を用いて、結合効率を定量化した。GFP、Cherry、フィブロネクチンおよびビトロネクチンの場合に、結合効率は、それぞれ100%、97.7%、89.6%および28.0%であった。次いで、溶液を1日間、水に対して透析し(水交換3回)、凍結乾燥した。
2015519902.tif 000007
【０２３１】
部分(e): ウォームおよびナノスフィアを作出する水中でのPNIPAM43-SC(=S)SC4H9マクロCTAおよびSDSとのスチレンのRAFT媒介重合
典型的な重合は次のように行われた: PNIPAM43-SC(=S)SC4H9 (0.350 g, 7.4×l0-5 mol, 5 wt%)、SDS (0.0145 g, 5.0×10-5 mol)およびMilli-Q水(6.25 g)を、磁気撹拌棒を備えた10 mL Schlenk管に加えた。重合体を溶解するため、フラスコを氷浴中に入れることによって溶液をPNIPAMのLCST未満まで冷却した。重合体溶液を40分間アルゴンでパージした。スチレン(0.350 g, 3.4×10-3 mol, 5 wt%)およびAIBN (0.0012 g, 7.3×10-6 mol)の混合物を、冷却した重合体溶液に加えた。反応混合物をさらに10分間アルゴンでパージし、重合混合物を3時間70℃の油浴中で加熱した(SEC: Mn=8300, PDI=1.10)。
2015519902.tif 000008
【０２３２】
ウォームを作出するため、ラテックス溶液3 mLを、可塑剤としてトルエン60 μLを有する予熱されたガラスバイアルに加えた。混合物を10秒間振盪し、その後、25℃に冷却した。水中の重合体ウォームを次に、凍結乾燥して、粉末状ウォームを回収した。ナノスフィアを作出するため、重合後、反応容器を空気にさらして反応を停止させ、4時間70℃での加熱を続けて、重合されていない、いずれのSTY単量体も除去した。水中の重合体ナノスフィアを次に、凍結乾燥して、粉末状ウォームを回収した。その後、ウォームもナノスフィアもともにTEMによって特徴付けた(図2)。ウォーム状の構造は、実施例3では「pWorm」といわれる。
【０２３３】
部分(f): PNIPAM-タンパク質とウォームまたはナノスフィアとの間の熱応答性マトリックスの形成
凍結乾燥したウォーム(またはナノスフィア)を4℃にてMilli-Q水で再水和した。PNIPAM-タンパク質溶液(4℃)を次に、ウォーム(またはナノスフィア)懸濁液に加え、振盪によって混合した。溶液を次に、LCST (29℃)超に加熱して、ウォーム(またはナノスフィア)のマトリックス表面上でのPNIPAM-タンパク質の結合を可能にした。
【０２３４】
実施例2 ヒト胚性幹細胞培養
本明細書で記述される全ての哺乳動物組織培養試薬は、特に指定のない限りLife Technologies (Carlsbad, CA, USA)からのものであった。用いたhESC株は、NKX2-5 (eGFP/w) (hES3のバックグラウンド、Andrew Elefanty and Ed Stanley1からの物品寄付)、H9 (WiCell, Wisconsin, MI, USA)、MEL1およびMEL2 (2に言及されている)であった。NKX2-5、MEL1およびMEL2は、Stem Core Queenslandにより維持され、既述3のようにMEF支持層上にて手作業で継代された培養物として日常的に支持された。実験の前に、細胞を、4 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および0.1 mM 3-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich, Grand Island, NY, USA)を含有するKnockout血清代替媒体中で既述4, 5のように単個細胞の継代に適合させた。
【０２３５】
部分(a): 機能化PNIPAM/RODジブロック共重合体へのヒト胚性幹細胞の付着
PBS中pWorms (30% w/v) 35 μLの混合物をPBS中pVNまたはpFN 35 μL (各ECM重合体結合体0〜50 μgに及ぶ)と混ぜ合わせた。これらの溶液を臓器培養皿(直径15 mmの組織培養表面, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)の上に30秒間4000 rpmでスピンコートした。MEL1またはMEL2細胞の単個細胞懸濁液を皿1枚あたり細胞5×104個にてStemPro(登録商標)媒体中でプレーティングした。2時間の結合後、未結合の細胞を37℃で加温PBSにより表面から洗浄した。倍率20×でEVOSfl倒立顕微鏡(Advanced Microscopy Group, Bothell WA)にて撮像し、細胞を手作業でカウントした6。
【０２３６】
2成分のシステムにおいて(図1に示すように)、水中のウォームをポリ(NIPAM)-タンパク質と混合したが、ここでタンパク質はフィブロネクチン、ビトロネクチンまたはインテグリン結合トリペプチドRGDのいずれかであった。フィブロネクチンまたはビトロネクチン機能化重合体のいずれかでコーティングされた表面は、hESC細胞の良好な付着を示したが(図3A〜D)、この場合にRGDを有する表面はそうでなかった(図3E〜F)。さらに、機能化重合体に付着された細胞の数は、ポリ(NIPAM)-タンパク質の濃度(図3G)を最大50 μg/ウェルまで変化させることにより調整することができた。ポリ(NIPAM)-タンパク質濃度の増加により、付着された細胞の数の、対応する増加が認められた。ウォームおよびポリ(NIPAM)-タンパク質の組み合わせは、細胞の結合に不可欠であった(図3AおよびC)。
【０２３７】
部分(b): ヒト胚性幹細胞の温度依存性の、酵素なしでの解離
PNIPAMのLCST未満まで温度を低下させることにより、hESCは酵素の補助なしに、表面から剥離した。本発明者らは、1時間4℃にてポリ(NIPAM)-タンパク質と混合されたウォームでコーティングされたスライドガラス上でまたはGeltrexコーティング組織培養プレート上で37℃にて24時間細胞を培養した。本発明者らは、ウォーム/ポリ(NIPAM)-タンパク質(すなわちタンパク質はフィブロネクチンまたはビトロネクチンのいずれかであった)でコーティングされたスライドガラス上でまたはGeltrexコーティング組織培養プレート上で37℃にて24時間細胞を培養した。培養物を1時間4℃に冷却した。4℃にてGeltrex対照表面での細胞のインキュベーションは、細胞剥離に顕著な特徴である細胞円形化を伴うことなく、細胞形態に大きな影響を及ぼさなかった(図4A〜C)。対照的に、ウォーム/ポリ(NIPAM)-タンパク質表面に付着された細胞をLCST未満でインキュベートした場合、顕著な細胞円形化を観察することができ、多くの細胞が表面から自発的に剥離した(図4D〜I)。残存している細胞を次に、媒体の穏やかな吸引により表面から取り除くことができた。
【０２３８】
部分(c): ヒト胚性幹細胞シートの作出
pVNまたはpFNのいずれか50 μgにより上記で調製された臓器培養皿に細胞1×106個/皿でMEL1またはMEL2細胞を播種し、これを24時間培養して、細胞間結合を形成させた。この皿を37℃のインキュベータから取り出し、30分間RTで(すなわちPNIPAMのLCST未満で)放置して、細胞シートの放出を可能にした。細胞をまた、低密度(細胞1×105個/皿)で播種して、酵素なしでの剥離をさらに実証し、およそ4℃でのインキュベーション後にLCST未満で放出させた。臓器培養皿上にコーティングされたGeltrex(商標) (DMEM-F12中0.5% v/v)を対照として用いた。室温でのこれらの培養物のインキュベーションによって、細胞シートが容易に遊離され、これは穏やかな振盪で完全に取り去ることができた(図5)。この方法は、分化プロトコルにおいて用いられることが多い小さなhESC塊の迅速な作出を可能にしうる。この方法を用いることで、トリプシン(typsin)およびコラゲナーゼのような酵素を使わなくても規定のサイズのインタクトな細胞塊の作出が可能とされうる。
【０２３９】
実施例3 部分(a): ヒト胚性幹細胞塊(胚様体)の形成および解離
pVNおよびpWormでのhESC 3D胚様体形成
いくつかの修正を加えつつ既述7のようにスピンEBプロセスを用いて、APEL媒体中で胚様体(EB)を形成させるためにMEL1、MEL2およびNKX2-5を用いた。手短に言えば、RTで丸底96ウェルプレートの1ウェルあたりに、細胞3500個を含有する細胞懸濁液50 μLを播種した。pWorm (156 μg/mL)、pVN (14 μg/mL)およびbFGF (100 ng/mL)の濃度のものを細胞懸濁液に加えた。プレートを次に、5分間480 gで37℃にて遠心分離した。細胞を5% CO2および5% O2雰囲気下、37℃でインキュベートした。3日目に、EBを30分間室温でインキュベートした後に、穏やかにピペッティングしてEBを分解した。図7A〜Bおよび図8B〜Cは、対照細胞もPNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMとともにインキュベートされた細胞もともに、胚様体を形成させることが可能であったことを実証する。しかしながら、温度降下後、PNIPAM/RODジブロック共重合体/ビトロネクチン-PNIPAMの存在下で培養された胚様体しか、室温で小塊に手作業で解離させることができなかった(図7C〜D)。EBの解離を、図8Aに表された4つの分類に基づきスコア化した。
【０２４０】
ポリビニルアルコールの非存在下でのスピンEB形成および解離
ポリビニルアルコール(PVA)を除去し、等容量をF-12栄養素ミックスと置き換えたことを除いて、既述のようにAPEL媒体を作出した。PVAを含まない媒体をAELと名付けた。pWorm (0〜1560 μg/mL)およびpVN (0〜50 μg/mL)を100 ng/mLのbFGFとともにAEL媒体に加えた。EBを、密度の均一性、球状のEB構造およびEB境界のなめらかさに基づき1日目に効率的な形成についてスコア化した。pVNおよびpWormの希釈系列に基づき(図8D)、それぞれ、50 μg/mLおよび1.56 ng/mLの最適濃度をPVAの非存在下でのEBの形成のために選択した。
【０２４１】
pVNおよびpWormでの3D hESC増殖
pVNおよびpWormの希釈系列に基づき(図8DおよびE)、それぞれ、50 μg/mLおよび1.56 ng/mLの最適濃度をPVAの非存在下でのEB形成のために選択した。NKX2-5、MEL2およびH9を18日にわたる3D多能性増殖に用いた。スピンEB形成に用いた媒体は、BSA有りおよび無しのAELまたはStemPRO(登録商標) hESC SFM 8であった。AELおよびStemPRO(登録商標) hESC SFMに、それぞれ100および10 ng/mlのbFGFを補充した。プレートおよび細胞を5分間480 gで37℃にて遠心分離した。細胞を5% CO2および5% O2雰囲気下、37℃でインキュベートした。3および10日目に継代するために手作業によるピペッティングを用い室温でEBを穏やかに再懸濁した。qPCRおよびフローサイトメトリーの陽性対照は、記述2のようにKSR媒体中でのMEF支持層または20 μg/cm2のVN上のStemPRO(登録商標)媒体中での支持細胞なしのいずれかでの2D培養であった。
【０２４２】
胚様体(EB)形態および細胞増殖動態
10、11および18日目にEVOSfl倒立顕微鏡(Advanced Microscopy Group)を用いてEBの明視野写真を撮った。Image J (v1.41)を用いてμm単位でEBの直径を測定した。1条件につき複製ごと60のEBのサイズを決定し、合算で1条件につき180となった。細胞カウントのため、選択のEBを、TrypLEを用いて解離させ、血球計にてカウントする前に死細胞の排除についてトリパンブルー(Trypan Blue)で染色した。代表的な倍増殖は図9Aに概略されており、継代前後の平均EBサイズ分布は図9BおよびCに概略されている。
【０２４３】
定量的PCR
用いた全プロトコルは、qPCRの結果の実施および報告に関する最近のガイドラインを厳密に順守している9。RNA抽出およびDNA除去は、Qiagen RNeasy RNA抽出キット(Qiagen)およびオンカラムDNASEセットを用いて行った。手短に言えば、増殖後18日目にhESCからまたは図に示されているようにさまざまな時点で分化細胞からRNAを抽出した。Life TechnologiesのSuperscript III First Strand Sythesis Supermixを用いて、DNAを含まないRNA 1マイクログラムをcDNAに変換した。qPCRの前にcDNAを10分の1希釈した。qPCRに用いたプライマー配列は、表2において見出すことができる。記述10のようにApplied Biosystems 7500 Fast ThermoCyclerおよびSYBR Green Master Mixを用いてqPCRを行った。段階的な融解曲線分析での1本のピークの存在により、プライマー産物の特異性が確認された。倍数変化の表現は、MEF上で増殖されたhESCに対して判定したものであった。関心対象の全ての遺伝子は、Pfaffl法12を用いて3種のハウスキーピング遺伝子: ヒト0-アクチン、HPRTおよびGAPDH11を基準にした。全ての実験およびqPCRの実行は、三つ組で行われた。結果は、図9Dに表示されている。
【０２４４】
（表２）qPCRプライマー配列
2015519902.tif 000009
【０２４５】
フローサイトメトリー
細胞を解離時に4%ホルマリン中で固定し、一次抗体マウスIgG1、抗Oct-4 (2 μg/mL) (Merck Millipore)により4℃で終夜染色した。Alexa fluor 488に結合されたアイソタイプ特異的な二次抗体を1 μg/mLで用いた。Samplerアーム(BD Biosciences)を有するC6 Accuriフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーにより、多能性マーカーOct-4の発現を判定した。CFlow Samplerソフトウェア(v1.0.264.15, BD Biosciences)を用いてデータを分析し、結果を図9Eに表示した。
【０２４６】
図8および9に関するさらなる考察は、以下に続く。
【０２４７】
図8 - A2成分PNIPAMシステムは、hESC胚様体の、酵素なしでの継代を容易にするように最適化することができる:
(A) RTで手作業により穏やかに細かく砕いた(titration)後のEB塊分類の例。pWORM (156 μg/mL)およびpVN (14 μg/mL)を含有するAPEL媒体中でSpin EBプロトコルを用いてEBを形成させた。3日目に、EBをRTで20分間インキュベートした後に、200 μLのピペットチップを通過させて、解離させた。スケールバーは1000 μmである。(B) 手作業による解離後の分離したEBの割合。EBはAに定義されるようにpWORMs/pVN有りまたは無しのAPEL媒体中で形成された。3日目に、EBを37℃でまたはRTで手作業により解離させ、分離したまたは分離なかったと分類した。(C) RTで解離後のEB塊のサイズの分布。RTでの解離の後、EBをAに概説されているようにサイズにしたがって4つの部類に分類した。(D) PVAの非存在下でのpWORMおよびpVNの滴定中に形成されたEBの明視野像。EBは示したようにpWORMおよびpVN濃度の滴定中、PVAの非存在下でスピンコート法を用いて形成された。EBは、EBの形成(1)、部分的形成(2)、さまざまな塊の形成(3)および形成なし(4)に基づき、形成について1日目に1〜4にスコア化された。形成のスコアを3回の独立した実験および各実験内での技術的反復、n=18にわたって平均化した。(E) pWORMおよびpVNを有しPVA無しの媒体中RTでのEBの解離。pWORM (1.56 ng/mL)およびpVN (50 μg/mL)を有するAEL媒体中で形成されたEBを3日目に解離させ、(A)に概説されているようにEB塊のサイズにしたがって分類した。APEL; アルブミンポリビニルアルコール必須脂質(Albumin Polyvinylalcohol Essential Lipid)、pVN; PNIPAM-ビトロネクチン(Vitronectin)、AEL; アルブミン必須脂質(Albumin Essential Lipid)。
【０２４８】
図9 - pNIPAM結合体によるヒト胚性幹細胞の多能性の、3D増殖:
(A) 胚様体としてのNkx2-5 hESCの倍増殖。EBは、BSAおよびPNIPAM (pVN 50 μg/mLおよびpWorm 1.56 ng/mL)有りおよび無しのSP媒体中にて細胞3,500個/凝集体でスピンEB法を用いて形成された。EBは3日目および10日目に、20分間RTでインキュベートし、引き続いて穏やかにピペッティングすることによって継代された。倍数変化は0日目の投入細胞数と比べて18日目の総細胞数に基づいていた。(B) 平均のEB直径。EBを10、11および18日目に写真に撮った。EBの直径はImage J画像解析ソフトウェアを用いて判定された。1複製につき1サンプルあたり60個のEBをサイズ分類した、n= 180。(C) 継代前後のEBサイズの分布。(D) NanogおよびOct4遺伝子発現のqPCR分析。18日目に、mRNAをEBから抽出し、Oct4およびNanog発現のqPCR測定の前にcDNAに変換した。倍数変化は、MEF支持層上で成長させたhESCに対するものであり、3種のハウスキーピング遺伝子(3-アクチン、GAPDHおよびHPRTを用いて平均化されている。エラーバーは3回の独立した実験の標準偏差を表す。(E) フローサイトメトリーによって測定されたOct4タンパク質の発現。SP; StemPro、BSA; ウシ血清アルブミン、PNIPAM; pVN 50 μg/mLおよび1.56 ng/mLのpWORMでの培養、APEL; アルブミンポリビニルアルコール必須脂質、2D VN; ビトロネクチンでコーティングされた組織培養プラスチック上のhESC、2D MEF; マウス胚性線維芽細胞支持層上で成長させたhESC。
【０２４９】
参考文献:
2015519902.tif 000010
2015519902.tif 000011
【０２５０】
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈がそうでないことを必要とする場合を除いて、単語「含む」ならびに「含み」および「含んで」のような変化形は、指定の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を含むが、任意の他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を排除しないことを示唆することが理解されよう。
【０２５１】
本明細書における先行文献(もしくはそれから導かれる情報)または既知の事項の言及は、先行文献(もしくはそれから導かれる情報)または既知の事項が、本明細書に関連する活動の分野における常識の一部を形成することを認めるもの、承認するもの、または示唆するものと捉えられず、かつ捉えられるべきでない。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重合体粒子および機能化された刺激応答性重合体を含む組成物であって;
該重合体粒子が、(i) ブロック共重合体を含み、かつ(ii) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、少なくとも1つの共通の刺激に応答性である、
該組成物。
【請求項２】
液体をさらに含み、前記重合体粒子および前記機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う前記刺激応答性重合体が該液体内で可溶性である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
液体をさらに含み、かつゲルの形態であり、前記重合体粒子および前記機能化された刺激応答性重合体の両方を伴う前記刺激応答性重合体が該液体内で不溶性である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物を含む、細胞培養システム。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物を含む、薬物送達システム。
【請求項６】
(i) 重合体粒子および細胞で機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞で機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞で機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、細胞塊を形成させる、段階; ならびに
(iii) 該細胞塊の内部でおよび/または表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法。
【請求項７】
(iv)前記重合体粒子と前記細胞で機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、前記液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、培養された細胞を含む前記液体組成物を前記共通の刺激に供する段階であり、該移行が、前記細胞塊からの個々の細胞および/またはさらに小さな細胞塊の放出を容易にする、段階
をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
(v) 段階(iv)においてそのように形成された個々の細胞および/または形成されたさらに小さな細胞塊の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記液体が水性液体であり、かつ前記重合体粒子と前記細胞で機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、共通のLCSTを有する熱応答性重合体である、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
段階(ii)において加えられる共通の刺激が、前記液体の温度をLCST超まで上昇させることである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
37℃がLCSTであるかまたはLCST超である、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
(i) 液体、細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体、および基材に固定された重合体粒子を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階;
(ii)該重合体粒子と該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該重合体粒子および該細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体の凝集を促進して、該細胞受容体リガンドを含む表面を有する凝集体構造を形成させる、段階;
(iii) 細胞受容体リガンドと結合するように培養される1種または複数種の細胞を該液体に導入する段階; ならびに
(iv) 該細胞受容体リガンドを含む該表面上で細胞を培養する段階
を含む、細胞を培養する方法。
【請求項１３】
(v)前記重合体粒子と前記細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、前記液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、培養された前記細胞を含む前記液体組成物を前記共通の刺激に供する段階であり、該移行が該培養細胞の放出を容易にする、段階
をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
(vi) 段階(v)において形成された培養細胞の少なくともいくつかを、前記液体組成物から取り出す段階
をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記液体が水性液体であり、かつ前記重合体粒子と前記細胞受容体リガンドで機能化された刺激応答性重合体との前記刺激応答性重合体が、共通のLCSTを有する熱応答性重合体である、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
段階(ii)において加えられる共通の刺激が、液体組成物の温度をLCST超まで上昇させることである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項13に従属する場合、段階(v)において加えられる共通の刺激が、液体組成物の温度をLCST未満まで低下させることである、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
37℃がLCSTであるかまたはLCST超である、請求項15、16、または17記載の方法。
【請求項１９】
(i) 液体、重合体粒子、および機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物を提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で可溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で可溶性である状態から該液体中で不溶性である状態への移行を生じるように、該液体組成物を該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、ゲルの形成を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体を含むゲルを形成する方法。
【請求項２０】
(i) 重合体粒子、機能化された刺激応答性重合体、および液体を含むゲルを提供する段階であり;
該重合体粒子が、(a) ブロック共重合体を含み、かつ(b) コアシェル構造を有し、該ブロック共重合体が、(a) コア構造の少なくとも一部を形成する非刺激応答性重合体ブロック、および(b) シェル構造の少なくとも一部を形成する刺激応答性重合体ブロックを含み;
該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との刺激応答性重合体が、(a) 少なくとも1つの共通の刺激に応答性であり、かつ(b) 該液体中で不溶性である、段階; ならびに
(ii)該重合体粒子と該機能化された刺激応答性重合体との該刺激応答性重合体が、該液体中で不溶性である状態から該液体中で可溶性である状態への移行を生じるように、該ゲルを該共通の刺激に供する段階であり、該移行が、該ゲルを、該重合体粒子および該機能化された刺激応答性重合体を含む液体組成物にして、それによって該ゲルからの該機能化された刺激応答性重合体の放出を促進する、段階
を含む、機能化された刺激応答性重合体をゲルから放出させる方法。