【手続補正書】
【提出日】平成29年6月15日(2017.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症に対する被験体のリスクを評価する方法であって、
１種または複数種の低分子代謝物に関して前記被験体のバイオサンプルをアッセイする工程と、
表６に列挙された１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の量を定量する工程と、
を含み、
表６に列挙された前記１７９種の低分子代謝物のうちの１種以上の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となる、方法。
【請求項２】
前記バイオサンプルが、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される１つ以上の手法によりアッセイされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
表６に列挙された前記代謝物のうちの少なくとも４０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり、
表６に列挙された前記代謝物のうちの約８０〜約１６０種の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり；
２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となり；または
ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパルテート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物の、非自閉症対照と比較して統計的に有意な存在量差が、自閉症のリスク増加の指標となる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
非自閉症対照と比較して統計的に有意なホモシトルリンの存在量差が自閉症のリスク増加の指標となる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
２種以上の低分子代謝物の比を決定する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオサンプルが、脳脊髄液、脳組織、羊水、血液、血清、血漿、羊水、または尿である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオサンプルが血漿である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が２歳未満である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
代謝シグネチャーが自閉症被験体の表現型サブ集団の指標となる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
代謝シグネチャーが高機能自閉症（ＨＦＡ）および／または低機能自閉症（ＬＦＡ）の指標となる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
自閉症のメタボロミックシグネチャーであって、ホモシトルリン、２−ヒドロキシ吉草酸、シスチン、アスパラギン酸、イソロイシン、クレアチニン、セリン、４−ヒドロキシフェニル乳酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸、ＤＨＥＡ硫酸、グルタル酸、５−ヒドロキシノルバリン、ヘプタデカン酸、５−アミノ吉草酸ラクタム、コハク酸、ミリスチン酸、２−ヒドロキシ吉草酸、メチルヘキサデカン酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１個以上の特徴、２個以上の特徴、３個以上の特徴、４個以上の特徴、５個以上の特徴、６個以上の特徴、７個以上の特徴、８個以上の特徴、９個以上の特徴、１０個以上の特徴、１１個以上の特徴、１２個以上の特徴、１３個以上の特徴、１４個以上の特徴、１５個以上の特徴、１６個以上の特徴、１７個以上の特徴、１８個以上の特徴、１９個以上の特徴、２０個以上の特徴または２１個の特徴；
２−アミノオクタン酸、アセスルファム、ＡＤＭＡ、コリン、ＣＭＰＦ、システイン、シスチン、ＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡＳ）、グリシン、グリココール酸、ヒポキサンチン、インドールアクリル酸、インドキシル硫酸、ＬｙｓｏＰＣ（１６：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（０：０／１８：１（９Ｚ））、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、ＬｙｓｏＰＥ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／０：０）、メチオニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェニルアラニン、フェニル乳酸、プロリン、セロトニン、トリプトファン、尿酸、および／またはバリンのうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、および／または２６種の代謝物；または
ホモシトルリン、グルタル酸、サッカロピン、５−アミノ吉草酸、ラクテート、スクシネート、イソシトレート、ＤＨＥＡＳ、ＤＨＡ、アンドロステロン硫酸、２７−ノルコレステロール、ＬｙｓｏＰＥ、ＰＥ、長鎖状Ｆａｓ、ＬｙｓｏＰＣ、アスパルテート、グルタメート、アセチルオルニチン、バリン、イソロイシン、ケトロイシン、セリン、ホモシステイン酸、バリン、シスチン、ヒドロキシアセトン、ホスホヒドロキシピルビン酸、インドール−３−乳酸、および／または３−アミノイソ酪酸のうちの、任意の１種以上の代謝物、任意の２種以上の代謝物、任意の３種以上の代謝物、任意の４種以上の代謝物、任意の５種以上の代謝物、任意の６種以上の代謝物、任意の７種以上の代謝物、任意の８種以上の代謝物、任意の９種以上の代謝物、任意の１０種以上の代謝物、任意の１１種以上の代謝物、任意の１２種以上の代謝物、任意の１３種以上の代謝物、任意の１４種以上の代謝物、任意の１５種以上の代謝物、任意の１６種以上の代謝物、任意の１７種以上の代謝物、任意の１８種以上の代謝物、任意の１９種以上の代謝物、任意の２０種以上の代謝物、または２１種以上の代謝物、任意の２２種以上の代謝物、任意の２３種以上の代謝物、任意の２４種以上の代謝物、任意の２５種以上の代謝物、任意の２６種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２７種の代謝物またはそれを超える代謝物、任意の２８種の代謝物またはそれを超える代謝物、および／または２９種の代謝物
を含む、自閉症のメタボロミックシグネチャー。
【請求項１４】
自閉症のメタボロミックシグネチャーであって、
表６に示される特徴のうちの１個以上；
表６に列挙された代謝物のうちの少なくとも４０種；または
表６に列挙された代謝物のうちの約８０〜約１６０種
を含む、自閉症のメタボロミックシグネチャー。
【請求項１５】
ホモシトルリンを含む、請求項１３または１４に記載の自閉症のメタボロミックシグネチャー。
【請求項１６】
ホモシトルリンの減少、グルタル酸の増加、サッカロピンの増加、５−アミノ吉草酸の増加、ラクテートの増加、スクシネートの増加、イソシトレートの減少、ＤＨＥＡＳの増加、ＤＨＡの増加、アンドロステロン硫酸の増加、２７−ノルコレステロールの増加、ＬｙｓｏＰＥの減少、ＰＥの減少、長鎖状Ｆａｓの減少、ＬｙｓｏＰＣの減少、アスパレートの増加、グルタメートの増加、アセチルオルニチンの増加、バリンの減少、イソロイシンの減少、ケトロイシンの増加、セリンの増加、ホモシステイン酸の減少、バリンの減少、シスチンの減少、ヒドロキシアセトンの増加、ホスホヒドロキシピルビン酸の増加、インドール−３−乳酸の減少、および／または３−アミノイソ酪酸の増加を含む自閉症のメタボロミックシグネチャー。
【請求項１７】
ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法であって、
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ＧＣ−ＭＳ、Ｃ８ｐｏｓ、Ｃ８ｎｅｇ、ＨＩＬＩＣｐｏｓ、および／またはＨＩＬＩＣｎｅｇから選択される同一の２つ以上の手法により１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
前記２つ以上の手法のそれぞれについて非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
前記２つ以上の手法のそれぞれにより同定された非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生される前記複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
対照の非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットを前記トレーニングセットから選択する工程と、
を含み、
対照の非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプルと比較して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプルで統計的に有意な存在量差を有する低分子の前記サブセットが、自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む、方法。
【請求項１８】
バイオサンプルが、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）、負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）、正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）、および／または負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）から選択される３つ以上の手法によりアッセイされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトにおいて自閉症に特有のメタボロミックシグネチャーを同定する方法であって、
ａ）ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣＭＳ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｂ）ＧＣＭＳにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離されたバイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｃ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＧＣＭＳによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｄ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｅ）Ｃ８ｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｆ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｇ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせたＣ８液体クロマトグラフィー（Ｃ８ｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｈ）Ｃ８ｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｉ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＣ８ｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｊ）正イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｐｏｓ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｋ）ＨＩＬＩＣｐｏｓにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｌ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｐｏｓによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｍ）負イオン極性のエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣｎｅｇ）により１種または複数種の低分子代謝物に関して自閉症被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｎ）ＨＩＬＩＣｎｅｇにより１種または複数種の低分子代謝物に関して非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプル群をアッセイする工程と、
ｏ）非自閉症対照被験体と比較して自閉症被験体で示差的に産生されるＨＩＬＩＣｎｅｇによりアッセイされた１種または複数種の低分子代謝物を同定する工程と、
ｐ）工程ｃ）、工程ｆ）、工程Ｉ）、工程ｌ）、および工程ｏ）により同定された前記複数種の低分子代謝物を組み合わせて低分子代謝物のトレーニングセットを形成する工程と、
ｑ）対照の非自閉症対照被験体から単離された前記バイオサンプル群と比較して自閉症患者から単離された前記バイオサンプル群で統計的に有意な存在量差を有する低分子代謝物のサブセットを前記トレーニングセットから選択する工程と、
を含み、
工程ｑ）の低分子の前記サブセットが、ヒトにおいて自閉症のメタボロミックシグネチャーを含む、方法。