(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトEGFレセプターを発現し且つEGFによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者に対する有効量の抗腫瘍剤及び有効量のヒトEGFレセプターに対するモノクローナル抗体を有効成分として含み、該モノクローナル抗体がハイブリドーマセルラインATCC  HB9764によって産生された108であることを特徴とするヒト腫瘍細胞の成長阻害用治療剤。
【請求項２】
別々に存在する各有効成分を組み合わせてなる請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
製薬上許容し得る担体をさらに含む請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
ヒトEGFレセプターを発現し且つEGFによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞の成長を阻害するために有効な量の請求項１記載のモノクローナル抗体を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の治療剤。
【請求項５】
抗腫瘍剤がドキソルビシン又はシスプラチンである請求項１〜４のいずれか１項記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、新規なハイブリッドセルライン、特にヒトEGFレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の成長（増殖）を阻止することができる上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）（EGF）に対するヒトレセプターに特異性をもつモノクローナル抗体の産生のためのハイブリッドセルライン及びそのようにして産生された抗体及びその抗体を有効成分として含有する医薬、そして特にそのEGFレセプター抗体と抗腫瘍剤とを含有する医薬に関する。
（従来技術）
細胞の生育は可溶性の成長因子と細胞膜レセプターとの相互作用により制御されている。
上皮細胞の細胞分裂刺激（mitogenic stimulation）の最初のステップは上皮細胞成長因子レセプター（EGFレセプター）として知られる膜のグリコプロテインに上皮細胞成長因子（EGF）が特異的に結合することである。（Carpenter,et al.,Epidermal Growth Factor,Annual Review Biochem.,Vol.48,193−216（1979））。EGFレセプターは1,186個のアミノ酸からなつており、それは621個の残基からなる細胞外の部分と542個の残基からなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは23個の残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグメントによつて結合されている。（Ullrich,et al.,Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A−431  Epidermoid Carcinoma Cells,Nature,Vol.309,418−425（198））。EGFレセプターの細胞外の部分は４個のドメインに分けることができる。最近、２個のシステインのドメインによつてその側面を接した残基333から460のドメインIIIがレセプターのEGF結合部分を含んでいるらしいことが示された。（Lax,et al.,Localization of a Myjor Receptor−Binding Domain for Epidermal Growth Factor by Affinity Labelling,Mol.and Cell Biol.Vol.8,1831−1834（1988））。EGFのドメインIIIへの結合は多面的発現反応（pleiotropic responses）を引き起こし、DNA合成及び細胞増殖に導びく。
ヒト腫瘍細胞がEGFレセプターを過剰に発現していることが各種のヒト腫瘍細胞において見出されてきた。例えば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数のEGFレセプターを持つていることが示されている。（Neal,et al.,Epidermal Growth Factor Receptor in Human Bladder Cancer :Comparison of Invasive and Superficial Tumors,Lancet,Vol.1,366−367（1985））。乳癌細胞はEGFレセプター密度と腫瘍の大きさとの間に正の相互関係を持ち、分化の程度とは負の相互関係を持つことを示している。（Sainsbury,et al.,Epidermal Growth Factor Receptors and Ostrogen Receptors in Human Breast Cancer,Lancet,Vol.1,364−366（1985）;Presence of Epidermal Growth Factor Receptor as an Indicator of Poor Prognosis in Patients with Breast Cancer,J.Clin.Path.,Vol.38,1225−1228;Epidermal−Growth−Factor Receptor Status as Predictor of Early Recurrence and Death From Breast Cancer,Lancet,Vol.1,1398−1400（1987））。異なつたレベルのEGFレセプターを有する無胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（human vulval epidermoid carcinoma）（A431）のクローン化変異株を移植しての一連の腫瘍形成性の観察の結果、腫瘍形成性は直接にEGFレセプターの発現レベルに相互関係を持つことが見出された。（Santon,et al.,Effects of Epidermal Growth Factor Receptor Concentration on Tumorigenicity of A431 Cells in Nnde Mice,Cancer Res.,Vol.46,4701−4700（1986））。こうして、EGFレセプターの過剰な発現は、癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をはたしているとされてきている。
EGFレセプター密度の癌細胞の生物的なふるまいに及ぼす影響というものは、該レセプターとのリガンド−−すなわち、EGFまたはトランスホーミング成長因子（transforming growth factor）（TGF）との相互作用によつて仲介されうる。大部分の細胞において、EGFがEGFレセプターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂刺激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプターにモノクローナル抗体を結合させることによりヌードマウスに異種移植した腫瘍細胞A431のin vivoでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告している。Masui,et al．はEgG2a及びIgG1イソタイプの抗−EGFレセプターモノクローナル抗体による処置によつて、無胸腺マウスに皮下移植されたA431細胞の腫瘍形成を完全に阻止したことを、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始めて示めした。（Masui,et al.,Growth Inhibition of Human Tumor Cells in Athymic Mice by Anti−Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies,Concer Res.,Vol.44,1002−1007（1984）;Mechanism of Antitumor Activity in Mice for Anti−Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies With Different Isotypes,Cancer Res.,Vol.46,5592−5598（1986））。Rodeck,et alはMasuiのIgG2aイソタイプのものと異なるモノクローナル抗体を使用し、それはA431細胞のEGFレセプターに結合し、マウスに異種移植されたA431細胞の腫瘍の生育を完全に阻止した。（Rodeck,et al.,Tumor Growth Modulation by a Monoclonal Anとibody to the Epidermal Growth Factor Receptor:Immunologically Mediated and Effector Cell−Independent Effects,Cancer Res.,Vol.47,3692−3696（1987））。
しかしながら、現在までヒト口部類上皮癌（human oral epidermoid carcinoma）（KB）あるいはヒト乳房上皮細胞（human mammary epithelial）（184A1N4及び184A1N4−Ｔ−−併せて「184」という）のin vitroまたはin vivoでの生育を阻止することを誰一人としていない。KB及び184細胞は共にEGF−レセプターに関連した研究に用いられていた。
KB及び184細胞は実質的にA431細胞とは異なつている。特にそれらは上皮細胞成長因子に対する生育応答において異なつている。KB及び184細胞は高濃度の上皮細胞成長因子により生育刺激されるが、A431細胞は高濃度の上皮細胞成長因子によつては生育の阻害を受ける。
これらの違い並びに抗−EGF−レセプター抗体がin vivoでの腫瘍の生育を阻止するところのメカニズムの完全な理解がなされていないことは、A431細胞のEGFレセプターに結合し、そしてヌードマウスに異種移植されたA431細胞に抗腫瘍活性を示したモノクローナル抗体が同様にヌードマウスに異種移植されたKB細胞あるいは184細胞に対し抗腫瘍活性を示すのかどうか正確に決定することをさまたげている。
加えて、ヒトの腫瘍細胞はまた上皮細胞成長因子によつて生育刺激を受けることから、KB及び184細胞は、A431細胞よりもEGFに対する応答において代表的なパターンを提供するものであり、事実EGFレセプターを発現するヒト腫瘍細胞モデルとして使用されている。（Willington,et al．J.Cell Biol.,Vol.94,207−212（1982））。
腫瘍治療の第一目標は腫瘍細胞をすべて殺すことである。細菌を殺してしまう治療用剤は、細胞毒（cytotoxic）として定義されている。細胞を殺すというよりは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤は、細胞増殖抑制剤（cytostatic）として定義されている。
EGFレセプターに結合するモノクローナル抗体単独による処理は単に細胞が増えることを阻止しているだけで、これからモノクローナル抗体は細胞増殖抑制剤として作用している。モノクローナル抗体の細胞増殖抑制作用を持つのみということを克服するため、ヒト上皮細胞成長因子レセプターの細胞外のドメインに特異性を有するモノクローナル抗体をマクロフアージあるいはマウスの補体と組み合わせ、A431細胞に対する細胞毒反応を得ている。（Masui,et al.,Mechanism of Antitumor Activity in Mice for Anti−Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies with Diffevent Isotopes,Gancer Research,Vol.46,5592−5598（1986））。
それ自体投与して用いられる抗腫瘍剤あるいは化学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）及びシスプラチンのような抗腫瘍剤の利用は当該分野でよく知られている。しかしながらこれらのものは単独で用いた場合患者に対して毒性がある又は副作用があるような量でのみ効果がある。シスプラチンは４週間おきに１回100mg/m2の量を静脈内に投与されそしてアドリアマイシンは21日おきに１回60−75mg/m2の量を静脈内に投与される。
（発明の開示）
本発明は、ヒトEGFレセプターの発現及びヒトEGFによる細胞分裂刺激により特徴づけられたヒト腫瘍細胞の生育を阻止し、該腫瘍細胞のヒトEGFレセプターの細胞外のドメインに結合し、そして該細胞のヒトEGFレセプターの細胞外のドメインに結合して抗原抗体複合体となることによりヒト口部類表皮癌（KB）細胞またはヒト乳房上皮細胞（184）の生育を阻止することのできるモノクローナル抗体に関する。
特に、本発明は、ヒトEGFレセプターを発現し且つEGFによって細胞分裂促進を刺激されるヒト腫瘍細胞をもつヒト癌患者に対して有効量の抗腫瘍剤及び有効量のモノクローナル抗体を有効成分として含み、（ｉ）該抗体は該腫瘍細胞のヒトEGFレセプターの細胞外ドメインに結合し、（ii）該抗体は該抗腫瘍剤に結合せず、且つ（iii）該抗体はEGFのヒトEGFレセプターへの結合を阻害することを特徴とするヒト腫瘍細胞の成長阻害用治療剤。
本発明は、新規なハイブリドーマセルライン（hybridomacell lines）、ATCC HB9763及び9764に関し、それらはそれぞれの生育培地の上清液の成分として高い特異性を有するモノクローナル抗体、96及び108を与える。セルラインATCC HB9763及び9764は、1988年７月25日にAmerican Type Culture Collection,1230 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852に寄託された。この寄託はブタペスト条約に基づいてなされた。該カルチヤーは試料の分譲に係る最新の請求のあつた後すくなくとも５年間及びいかなる場合であつてもこの寄託の日の後30年間は継続して入手しうる。本発明は、ヒトEGFレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出されるEGFレセプターに特異的に結合することにより該腫瘍細胞の生育を阻止する新規なモノクローナル抗体を産生するセルラインを提供するものである。
更に、本発明は、
（ｉ）  マウスをヒトEGFレセプターを発現する細胞で免疫し；
（ii）  該マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞の懸濁物を作成し；
（iii）  融合促進剤の存在下該脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（mouse myeloma cells）とを融合せしめ；
（iv）  融合しなかつたミエローマ細胞が生育できない培地を含む分離ウエル中で融合細胞を希釈培養し；
（ｖ）  ハイブリドーマを含有する各ウエル中の上清液中のヒトEGFレセプターに対する抗体の存在を測定し；
（vi）  EGFレセプターの細胞外のドメインに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選別しクローン化し；そして
（vii）  該クローン上にある上清液から抗体を回収する
工程からなることを特徴とする
ヒトEGFレセプターの細胞外のドメインに結合し、そしてヒトEGFレセプターを発現すると共にEGFにより細胞分裂刺激を受けるヒト癌細胞の生育を阻止することのできるモノクローナル抗体の製造法に関する。
本発明は、また上記した工程（vii）を省き、さらなる工程
（viii）  該クローンをマウス腹腔内に移植し、
（ix）  該マウスから腫瘍化した腹水または血清を採取し、そして該腹水または血清は所望の抗体を含んでいる
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の製造法に関する。
本発明はまた、ヒトEGFレセプターを発現し且つヒトEGFによつて細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞の生育を阻止するのに有効な量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つと共に医薬担体を含んでなる治療用組成物にも関する。
また、驚くべきことにモノクローナル抗体のいずれか一つとドキソルビシン又はシスプラチンのような抗腫瘍剤とを併用すると、ヒトEGFレセプターを発現し且つヒトEGFにより細胞分裂促進の刺激を受けるヒト癌細胞の成長（増殖）を阻止するという点で、抗腫瘍剤又はモノクローナル抗体を単独で用いるよりも著しく有効であることを発見した。本発明者らによる新規なモノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法は、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞれは異なつたメカニズムによつて作用し、ヒトの腫瘍細胞に細胞毒性を発揮することから優れたものである。このような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大させるとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないようにするその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨床上生起する問題を解決することができる。さらにまた、驚くべきことにその抗腫瘍剤はそれが単独で投与された時に治療に必要な量であるが患者にとって有毒なあるいは副作用のある量よりも実質的に少ない量で投与しうることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプラチン以外のブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン（carmustine）、クロラムブシル（chlorambucil）及びシクロホスフアミドヒドロキシウレアのような抗腫瘍剤もまた新規モノクローナル抗体と一緒に使用することができる。上記であげたものは、単に例としてあげたものであつて、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
本発明は、また有効量の抗腫瘍剤及び有効量の新規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトEGFレセプターを発現し且つヒトEGFにより細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、そしてそこで該抗体は腫瘍細胞のヒトEGFレセプターの細胞外のドメインに結合して、抗原−抗体複合体を形成することからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供する。
次なるより詳細な説明を、添附された図面と一緒に参照して本発明をよりよく理解すれば本発明及び多くのそれに付随した利点のより完全な認識が容易に得られよう。
この記載は本発明を特定のものに限定するためと解すべきでなく、当業者がなしうるような変形も本発明の範囲内であると考えられるべきものである。
第１図はモノクローナル抗体108のＦ（ab）２´及びＦ（ab）調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下でゲル泳動はなされた。ａ）未処理モノクローナル抗体108、ｂ）未精製Ｆ（ab）２´、フラグメント調製物、ｃ）精製Ｆ（ab）２´、ｄ） Fabフラグメント、ｅ）分子量マーカー、KD.
第２図はKB細胞への125Iモノクローナル抗体108及びそのフラグメントとEGFとの競合結合を示す。KB細胞は３×10-9Mの125Iモノクローナル抗体（１×106cpm/ml）の存在下、異なつた濃度のEGF（●）、非標識モノクローナル抗体108（○）、そのＦ（ab）２´、フラグメント（▲）あるいはFab´フラグメント（■）の存在下に培養した。（３個の独立した測定値の平均）。
第３図はモノクローナル抗体108のKB細胞への結合をセルソーター分析したものである。
第４図はヌードマウスに移植されたKB細胞に対する125Iモノクローナル抗体108の付着を示す。
第５図はKB細胞のコロニー形成におけるEGF及びモノクローナル抗体108の及ぼす効果を示す。コロニー形成のアツセイは実施例に記載されているようにして異なつた濃度のEGF（●）及びモノクローナル抗体108（■）の存在下に行われた。
第６図は、ヌードマウスに移植されたKB細胞に対するモノクローナル抗体108及びそのフラグメントの抗腫瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマウスからなつていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日目、第５日目、第12日目及び第18日目にその静脈内に、1mgのモノクローナル抗体108（■）、1mgのDNPに対するモノクローナル抗体（○）、0.66mgのモノクローナル抗体108のＦ（ab）２´、フラグメント（▲）、あるいはFab´フラグメント（◆）を投与して処理された。また、腫瘍細胞を注射した後１日して2mgのモノクローナル抗体108で１回処理した（●）。
第７図はヌードマウスの腹腔内に移植されたKB細胞に対する108mAbの抗腫瘍活性を示すものである。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目及び第７日目にその静脈内に0.5mgのモノクローナル抗体108（…）またはDNPに対する抗体（８匹のマウス）を投与して処理された。
第８図はヌードマウスの静脈内に注射されたKB細胞に対する108mAbの抗腫瘍活性を示すものである。
ａ）微小転移巣を示している1.5×106個のKB細胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：×250倍。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び第13日目に0.5mgのモノクローナル抗体108を静脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺を通して異なつた深さで採取された一連の部分の分析を示している。
第９図は、皮下に移植されたKB細胞に対する108mAbのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。0.45mgのモノクローナル抗体108と37.5μｇのドキソルビシンを４回すなわち、腫瘍の注入後24時間して及び３〜４日の間隔をおいて３回これを繰り返して投与した。
第10図及び第11図は皮下に移植されたKB細胞に対する108mAbのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。第10図においては1.8mgのモノクローナル抗体108及び100μｇのシスプラチンを含有するもので１回投与処置された。第11図では、マウスは腫瘍の移植後20時間して１回、静脈内に、19mgのモノクローナル抗体108及び0.1mgのシスプラチン（Abic,Ramat−Gan,Israelを投与処理された。各物質は別々に注射された。PBS（●）、モノクローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
第12図は細胞の生育に及ぼすEGFの効果を示している。Ａ）184A1N4細胞。Ｂ）MDA−468細胞。184A1N4細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、EGFを加えられた。MDA−468細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、１晩付着させておかれた。次の日にEGFを加えた。培地を48時間後に交換し、４日後に細胞を数えた。平均（±SD）細胞数を示した。
第13図は、付着依存性の細胞の生育の抗−EGFレセプター抗体（aEGPR）の阻害を示すものである。184A1N4細胞（Ａ及びＢ）及びMDA−468細胞（Ｃ及びＤ）は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、抗体を加える前に付着させておかれた。184A1N4の生育培地は1ng/mlのEGFを含有していた。48時間後生育培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平均±SD）のコトロールに対する％を示した。96IgM（●）、42IgM（○）、非特異的なIgM（△）、225IgG（■）、108IgG（□）、非特異的なIgG（▲）。
第14図は、EGFによる付着依存性の細胞の生育のaEGFR阻害の逆転を示すものである。細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルの中に入れられた（5,000個／ウエル）。184AlN4細胞（Ａ及びＢ）はEGF及び抗体を加える前にEGFを含まない培地中で４時間付着させておかれた。MDA−468細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を20nMの終濃度となるように加えた。培地を48時間後交換した。４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±SD）で示した。96IgM（●）、42IgM（○）、非特異的なIgM（△）、225IgG（■）、108IgG（□）、非特異的なIgG（△）。
第15図はモノクローナルaEGFRによる184A1N4−Ｔのコロニー形成の阻害を示すものである。細胞は実施例VIII（Ｂ）に記載したように軟寒天中で、20nMaEGFRまたは20nM非特異的な抗体の存在下EGF濃度を増大させながら生育させた。60μｍより大きいコロニーの数を平均（±SD）で示した。Ａ）IgG:225IgG（●）、108IgG（○）、非特異的なIgG（△）。Ｂ）IgM:96IgM（○）、42IgM（●）、非特異的なIgM（△）。
第16図はMDA−468コロニーの形成に及ぼすaEGFRの効果を示すものである。細胞は実施例VIII（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、20nMのaEGFRまたは非特異的な抗体の存在下EGF濃度を増大させながら生育させた。細胞はまたEGF単独下でも生育させた。60μｍより大きいコロニーの数を平均（±SD）で示した。Ａ）IgG:225IgG（●）、108IgG（△）、非特異的なIgG（▲）、EGF単独（○）。Ｂ）IgM:96IgM（△）、42IgM（●）、非特異的なIgM（▲）、EGF単独（○）。
第17図は、MDA−468細胞に結合する「125I」EGFに及ぼすaEGFRの効果を示すものである。24−ウエルプレート中の集密的（confluent）MDA−468細胞をヨウ素化したEGF（1nM）及び非標識抗体またはEGFの濃度を大きくしながら2.5時間４℃でインキユベートした。２または３つの別々の実験からの二つの測定の平均（±SD）を示した。Ａ）225IgG（△）、108IgG（◇）、非特異的なIgG（▽）、EGF標準（●）。Ｂ）IgM:96IgM（●）、42IgM（△）、非特異的なIgM（▼）、EGF標準（○）。
実施例1.
モノクローナル抗体の産生
A.免疫及び体細胞のハイブリツド化
Balb/cマウスをCH71細胞またはCH71細胞膜調製物の腹腔内への注射により免疫した。CH71細胞はEGF−R cDNAの切断されたかたちのもの（EGF−Ｒの細胞内のドメインの大部分が欠失したもの）を有するプラスミドでトランスフエクトされたチヤイニーズハムスター卵巣細胞である。（Linvneh,et al.,J.Biol．Chem.,Vol.260,12490（1986））。このトランスフエクトされた細胞は、ほぼ106個の変異EGF−Ｒ分子／細胞を発現する。CH−71細胞を選ぶことにより、EGF−Ｒの細胞外のドメインに対する抗体を分泌するハイブリドーマのみを最初のスクリーニング試験で選択できそしてヒトEGF−Ｒ分子に結合しているヒトに特異的な糖類に対して向けられた抗体を選択することを避けることができる。
マウスを第０日目、第13日目及び第32日目の３回免疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそれぞれに３回CH71細胞を３日続けて融合前に腹腔内注射して免疫を促進増強した。次に65日目にマウスの脾臓細胞をNS1ミエローマ細胞（比率5/1）と、融合剤としてPEG4000（Merck）を用い、Kohler及びMilsteinの一般法に従つて融合せしめた。（Kohler and Milstein,Eur.J.Immun.,Vol.6,511−519（1976））。
B.ハイブリドーマの選別及び生育
融合生成物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HAT）選択培地の代わりにヒポキサンチン−アザセリン（HA）選択培地（G.Buttin,et al.,Current Topics in Microbiology and Immunology,Vol.81,27−36（1978））で希釈し、96ウエルプレートに分けて入れた。
最初にラジオイムノアツセイによつて生育しているハイブリドーマのウエル中の培地の中に特異抗体があるか否か分析した。EGFレセプターを発現している細胞あるいはEGFレセプターを発現していない細胞を96ウエルプレート中に入れた。集密状態下、それらを１回結合培地（DMEM、20mM Hepes,0.2％BSA）で洗滌し、異なつた生育ハイブリドーマから得られた100μｌのカルチヤーの上清と一緒にし室温で90分間インキユベートした。次に細胞を結合培地で３回洗滌し、100μｌのヨウ素化したヤギの抗マウス免疫グロブリン（250,000cpm/100μｌ）液と共にさらに室温で60分間インキユベートした。PBS（リン酸塩緩衝塩液、pH7.5）で３回洗つた後、細胞をウエルからこすり取り、それらの表面に結合した放射活性をガンマ線カウンターを用いて測定した。抗体のEGFレセプターを発現している細胞（ヒトEGF−Ｒ  DNA構築物でトランスフエクトされたA431、ヒト繊維芽胞細またはマウス3T3細胞）の表面への特異的な結合能をこの方法で測定し、さらにEGF−Ｒを発現していない細胞（マウス3T3細胞の特定のクローン）への結合能と比較した。陽性のハイブリドーマを限界希釈をしてクローン化し、さらに異なつた種（ヒト、マウス、ニワトリ）のセルラインのライゼートから得られた35Sメチオニンまたは32Pで標識されたEGF−Ｒを免疫沈殿させうるかどうかを測定して調べた。このために、ヤギ抗マウス免疫グロブリンを、プロテインＡ−セフアロースに、ヤギ抗マウス抗体溶液とプロテインＡ−セフアロースビーズとを室温で30分間インキユベートすることにより結合させた。次にこれを３回20mM Hepes,pH7.4で洗つた。次にさらにヤギマウスIgコートしたプロテインＡ−セフアロースビーズを30分間室温でハイブリドーマのカルチヤーの上清液と共にインキユベートし、HNTG緩衝液（20mM Hepes,150mM NaCl,0.1％  Triton X−100、10％グリセロール）で３回洗滌し、そして、可溶化緩衝液（１％  Triton X−100、150mM  NaCl、20mM  Hepes、1.5mMEGTA、1.5mM  MgCl2、10％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニン、ロイペプチン及びPMSF）でもつて細胞の単層を溶菌化し、ライゼートを遠心して核ペレツトを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと４℃で１時間インキユベートした。32Pで標識するため、免疫沈殿物をHNTGで３回洗い、次に15分間32P  ATP溶液（5mM  MnCl2及び３μCi/32P ATP試料を含むHNTG）と共にインキユベートした。次に電気泳動試料用緩衝液を加え、7.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲルにかける前に試料を10分間95℃で煮沸した。モノクローナル抗体108、96及び42はすべてヒトEGF−Ｒに対し特異性を持つことが見出された。これらの抗体はまたEGF−Ｒを発現している細胞の表面にヨウ素化されたEGFが結合するのを阻害する能力について調べられた。これら３種の抗体はEGFの該レセプターへの結合を阻害するが、その阻害の程度は96＞108＞42というものであつた。
実施例  II
セルラインの培養
A.ヒト口部類表皮癌細胞（KB細胞）の培養
口部類表皮癌から誘導されたKB腫瘍セルラインはAmerican Type Tissue Culture Collectionから入手された。その細胞は、56℃で30分間インキユベートすることにより補体活性をなくした10％ウシ胎児血清を補なつたDulbeccoの修飾Eagle培地中で生育させ、そしてグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びピルビン酸ナトリウム中37℃、５％ Co2;95％空気下に生育させた。
B.ヒト乳房上皮細胞（184細胞）及びヒト乳癌細胞（MDA−468細胞）の培養
184A1N4及び184A1N4−Ｔヒト乳房上皮細胞はMartha Stampfer,Lawrence Berkeley Laboratory,Berkeley,CA.により提供された。184A1N4細胞は、グルタミン（0.6mg/ml）、ウシ胎児血清（0.5％）、ヒドロコルチゾン（0.5μg/ml）、インシユリン（５μg/m）及びEGF（10ng/ml）を補なつた1MEM及び５％  CO2中で37℃で保持された。184A1N4−Ｔは、グルタミン（0.6mg/ml）、ゲンタマイシン（40mg/ml）及び10％ウシ胎児血清を補なつた1MEM（Biofluids,Rockrille,MD）及び５％  CO2中で37℃で保持された。MDA−468細胞は、184A1N4−Ｔ細胞と同じ条件及び培地中で培養された。
C.96IgM及び108IgG2aハイブリドーマセルラインの培養
108IgG2aハイブリドーマセルラインはEGFレセプターを発現しているCH71細胞でマウスを免疫して生成させ、KBセルラインと同じ条件下に培養した。
96IgMハイブリドーマセルラインは、108IgG2aハイブリドーマセルラインに対して記載したのと同じ方法で生成させた。
実施例  III
A.動物からのモノクローナル抗体108の精製
108IgG2aハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を４℃で10分間eppendorf centrifuqe中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウムをゆつくりと添加してpH 7.5で24時間かけて最後には45％（V/V）の濃度までにしモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を15分間10,000gで遠心して集め、50％V/Vの硫酸アンモニウム液、pH .,5、４℃で２回洗滌した。さらに0.14Mトリス緩衝液、pH 8.0中のセフアロースCLプロテインＡ（Pharmacia）のアフイニテイクロマトグラフイーによつて精製し、0.1Mクエン酸塩緩衝液、pH 3.0で溶出し、次にPBSに対して徹底的に透析してモノクローナル抗体108を得た。
B.動物からのモノクローナル抗体96の精製
96IgMハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹水を４℃で15分間3000RPMでlow speed centrifuge中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウム液をゆつくりと加え、pH 7.5で24時間かけて最後には45％（V/V）の濃度までにしてモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を10,000gで15分間遠心して集め、pH 7.5、４℃で50％V/Vの硫酸アンモニウム液で２回洗滌した。次に沈殿を溶解し、50mMトリスpH8、0.5M  NaClに対して徹底的に透析した。50mMトリス、pH 7.8、0.5M  NaCl中で平衡化したセフアクリルＳ−3000を使用してゲル
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によつてこのものを精製した。モノクローナル抗体mAb 96を含有するピークをプールして、PBSに対して透析した。
実施例  IV
モノクローナル抗体108のＦ（ab）２´及びＦ（ab）´フラグメントの精製、比活性及び免疫反応性
モノクローナル抗体108（5mg/ml）の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH 3.9の溶液を37℃で７時間４％W/Wペプシン（Worthington Biochemical Corporation,New Jersey）存在下消化した。2MトリスでpHを8.0にあわせて消化を止め、次に４℃でPBSに対して透析した。残りの未反応のIgG分子をプロテインＡアフイニテイクロマトグラフイーによつて除去した。Fc部及びより小さなフラグメントをセフアロースＧ−100のゲル
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により除去した。単価Fab´フラグメントを調製するため、Ｆ（ab）２´（2mg/ml）を37℃で１時間20mMトリス緩衝液、pH 8.2中で10mMジチオスレイトールで還元した。37℃で30分間40mMヨードアセトアミド液でアルキル化し、次に４℃でPBSに対して徹底的に透析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−RAGE、第１図参照）によつていろいろなフラグメントの純度及び消化が完結していることを分析した。モノクローナル抗体108の125I−標識化をクロラミンＴ法（Hunter and Greenwood,Preparation of 131Iodine Labelled Human Growth Hormond of High Specific Activity,Nature,Vol.196,465−6,（1962））によつて行つた。通常約３×106cpm/μg IgGの比活性のものが得られた。125I標識108のKB細胞上に現われたEGFレセプターへの結合と競合しうる点で天然のままのモノクローナル抗体108と比較してモノクローナル抗体108のＦ（ab）２´及びＦ（ab）フラグメントは充分に免疫反応性を有していた（第２図参照）。
実施例  Ｖ
モノクローナル抗体108の結合性
A.細胞表面EGFレセプターに対するモノクローナル抗体の結合活性
ハイブリドーマ108の上清液の抗体結合活性を間接螢光免疫分析法により測定した。KB細胞（試料当り２×106個）をアツセイ前に24時間トリプシン処理し、試料管（Falcon,ポリスチレン製丸底試験管）に入れた。アツセイ前に、KB細胞懸濁液を冷PBSで洗滌し、４℃で45分間108ハイブリドーマの上清と共にインキユベートした。１％ウシ血清アルブミンを含有するPBSで洗つた後、４℃で45分間フルオレツセイン標識したウサギ抗マウスIgGと共にその細胞をインキユベートした。細胞試料をPBSに懸濁し、螢光セルソーター（FACS II、Bectin Dickenson,Mountainview,Ca,USA）でもつて分析した（第３図参照）。レセプター発現の均一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイブリドーマ（7H01）の上清で観察された染色がないということと比較して少なくとも96％の細胞において陽性の染色があることによつて示した。４℃での抗体結合パラメーターのScatchard分析は平均２×105結合部位／細胞及び1.8×10-9M-1のKDを示した。
B.上皮細胞成長因子とモノクローナル抗体及びそのフラグメントとの競合ラジオイムノアツセイ
KB細胞（24ウエルプレート中の105個／ウエル;NUNC）を24時間生育させ、PBSで洗滌し、４℃、あるいは室温で１時間１％ウシ血清アルブミンを含有するDMEM中天然のままの抗体またはそのフラグメントの各種の濃度のものと、125Iモノクローナル抗体108（約１×106cpm/ml）存在下にインキユベートした。次に細胞を洗滌し、0.5N  NaOH液で可溶化し、その放射活性をカウンター（Konton,Switzerland）で測定した。非特異的な結合は、100倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を加えて測定した。結果を、非標識抗体と共にインキユベートした細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えることなしにインキユベートした細胞に結合した放射活性に対するパーセンテイジとして表わした。
EGFは、最大で約70％まで抗体のレセプターへの結合と競合している。（第２図参照）。
C.in vivoでの放射能標識されたモノクローナル抗体108の分布
KB細胞（４×106個）をヌードマウス（５−６週令）の背部に皮下接種した。14日後腫瘍が約1.2cmの直径に達した時125Iモノクローナル抗体108を静脈内あるいは腹腔内に注射した（５×106cpm:3×106cpm/μｇ）。コントロールとしてヒトＢ型肝炎ウイルスに対する125I−モノクローナル抗体7H01  IgG2を用いた。抗体を投与して４日たつてから動物を殺して、各種組織中の放射活性を測定した。少なくとも各群あたり４匹の動物の平均を示した。（第４図参照）。
標識化したモノクローナル抗体108の静脈及び腹腔内への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まつていた。コントロールIgGの投与の場合静脈内投与では腫瘍部では何らの濃度もなかつたが、腹腔内投与の方では腫瘍の縁部に少し存在していた。静脈内投与後96時間での腫瘍部に蓄積した投与物のパーセンテージはそれぞれモノクローナル抗体108で7.8±1.1、モノクローナル抗体7H01（コントロール抗体）で0.8±0.1であり、腹腔内投与ではそれぞれモノクローナル抗体108で7.5＋0.4、モノクローナル抗体7H01で1.8±0.2であつた。
実施例  VI
モノクローナル抗体96の結合性
A.上皮細胞生長因子とモノクローナル抗体96との競合ラジオイムノアツセイ
24−ウエルプレート中の洗滌され集密的MDA−468細胞単層を４℃で2.5時間各種濃度の結合緩衝液（IMEM、0.1％  BSA、50mM  Hepes）中の抗体または非標識EGFと共にあるいはそれらなしにインキユベートした。〔125I〕EGF（S.A.80−160μCi/μｇ、ICN Radiochemicals,CA）を終濃度1nMとなるよう加えた。インキュベーション後、単層細胞を洗滌し、溶菌用緩衝液（10mM  トリス、1mM EDTA、0.5％ SDS、pH 7.4）でもつて可溶化し、放射活性をガンマ線カウンター（LKB−Pharmacia）を用いて測定した。
４種の抗体すべて標識化したEGFの結合を阻害することができたが、非特異的なIgGまたはIgMは無効であつた。細胞の生長を阻害するのに最も有効であつた２種の抗体（125 IgM及び225 IgG）もまた〔125I〕EGFの結合を阻害するのに最も効果があつた。これらの抗体は非標識EGFよりも多くの程度まで125I〕EGFの結合を阻害することができた。（第17図参照）
実施例  VII
モノクローナル抗体108の有用性
A.KB細胞のコロニー阻止アツセイ
KB細胞を２×102細胞／皿の濃度でペトリ皿（50×15nM2、NUNC）中にまいた。16〜24時間後、培地を、EGFを含むあるいは含まないモノクローナル抗体108の天然のものあるいはフラグメント化したものの各種濃度のものを含有する新鮮なもので置きかえた。６日目にカルチヤーを上記の成分を含有する新鮮な培地に再び植えた。15日目にPBSで洗滌し、４％V/VホルムアルデヒドのPBS液で15分間固定し、ヘマトキシリンで染色した。次に形成されたコロニー数（25細胞）を測定した。
第４図はKB細胞に及ぼす増加する濃度のEGF及びモノクローナル抗体108の効果を示している。KB細胞をEGF（160nM）にさらすと、その成長因子なしでインキユベートされた細胞に比較して植えた後15日して（処理を開始してから14日後）測定したコロニー数は150％まで増加していた。加えてEGFはKB細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様の実験をモノクローナル抗体108（1.6μＭ）の存在下行なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の30％にまで減少させた。さらに、コロニー数を50％増大させるような濃度のEGFと共に100倍過剰量のモノクローナル抗体108ではそのコロニー数をコントロール値の20％にまで減少させた。同じ条件下では、モノクローナル抗体108のＦ（ab）２´フラグメントではKBのコロニー数に何の影響も与えなかつた。しかし、EGFに対して100倍過剰な量を用いた時、Ｆ（ab）２´フラグメントは形成されたコロニーの数に及ぼすEGFの効果を打ち消すことができた（150％〜103％）。同じ濃度のジニトロフエニル（DNP）に対するモノクローナル抗体とのインキユベートでは形成されたコロニー数に何らの影響もなかつた。（第５図参照）。
B.ヌードマウスにおけるモノクローナル抗体108及びそのフラグメントの抗腫瘍活性
KB細胞（２×106）をヌードマウスに皮下注射し、次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回または数回間隔をおいたモノクローナル抗体108の投与を行なつた。腫瘍パラメーターを週に２回カリパスでもつて測定し、その容積を次式に従つて計測した：
腫瘍容積（nM3）＝長さ×幅×高さ。
測定値を確認するため、動物を殺した時に腫瘍の容積と腫瘍の重量との相互関係を評価した。
ヌードマウスにおけるKB細胞の生育の阻止能をその抗体について測定した。（第６図参照）。腫瘍接種後第１日目、第５日目、第12日目及び第18日目に動物は1mgのモノクローナル抗体108あるいはコントロールのジニトロフエニルに対するモノクローナル抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（ab）２´及びFab′は抗体と等価の量投与された。コントロールのモノクローナル抗体で処理された群と比較してモノクローナル抗体108で処理された群は顕著に腫瘍の拡大及び生育を阻害した（Ｐ＜0.017、スチユーデントテスト）。Ｆ（ab）２´は腫瘍の生育に影響を及ぼすことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣つていた（Ｐ＜0.05、第12日目、第17日目、第22日目及び第25日目のスチユーデントテスト）。Fab´フラグメントは腫瘍の生育に何の影響も与えなかつた。腫瘍細胞の注射後第１日目に天然のままのモノクローナル抗体108の2mgの１回の投与は、腫瘍の接種後第１日目、第５日目、第12日目及び第18日目にそれぞれ1mgづつ計４回処理されたものと同じ効果を有していることが見出された。別の実験において、動物を0.66mgのＦ（ab）２´フラグメントで１回投与処理した時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロール群と処理群との間には顕著な差異がMann Whitney分析法（第９日目、第12日目、第14日目、第17日目でＰ＜0.03）及びスチユーデントテスト（student test）（第９日目、第12日目でＰ＜0.05）を用いて見出された。動物を殺した時に腫瘍は測定され、次に重量測定のため取り出された。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は0.95（Ｐ＜0.0001）であつた。
C.腹腔内での腫瘍の成長
転移形態のKB腫瘍を細胞を静脈内（i.v.）に注射することによつて得ることができた。1.5×106個のKB細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６週間で肺に腫瘍結節を作つた。この腫瘍モデルは、腫瘍細胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似たものである。このことは癌治療の上での主要の問題点である。KB細胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後第６日目、第９日目及び第13日目に.5mgのモノクローナル抗体108を計３回静脈内注射した。実験の終りに、肺を取り出し、４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフインに埋め込んだ。４−５μｍの厚さに連続してスライスし、ヘマトキシリンで染色した。肺を通るいろいろな深さの転移性の結節の数が光顕微鏡検査分析法により得られた。動物が有していた肺の腫瘍から３種の転移性細胞クローンを単離し、そのレセプターレベルをアツセイし、レセプターの発現があることがわかつた。抗体による処理は肺の腫瘍の結節の数を、それぞれのコントロールの15％にまで減少させた。（Ｐ＜0.05  Mann−Whitney分析法）。（第８図参照）
実施例  VIII
モノクローナル抗体96の有用性
A.184A1N4及びMDA−468細胞の生育の96による阻止
184A1N4及びMDA−468細胞を３本の24−ウエルプレートのウエルの中に入れ（5,000/ウエル）、抗体を加える前に付着させておいた。184A1N4の生育培地は1ng/ml  EGF及びEGFと共に同時に生育培地中に加えられたいろいろな量のEGFR抗体を含んでいた。MDA−468の生育培地はどんなEGFも含んでいなかつた。生育培地を48時間後に交換し、４日後に細胞を測定した。生育実験の最後に細胞をトリプシン−EDTAでもつて収穫し、Particle Dataセルカウンター（Particle Data,Inc.,Elmhurst,IL）を用いて測定した。コントロール細胞数％（平均±SD）で示した。9   IgM（●）、42IgM（○）、非特異的なIgM（△）、225IgG（■）、108IgG（□）、非特異的なIgG（▲）。（第13図参照）。
B.184A1N4細胞に対する96のコロニー阻止アツセイ
184A1N4−Ｔ細胞を0.4％ Bacto−Agar（Difco,Detroit,MI）、IMEM、10％ FBS及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁した。細胞を３本の1ml  IMEM、0.6％寒天及び10％FBSを含有する35mm培養皿に入れた（10,000個／皿）。10−14日間37℃で５％  CO2中で20nM aEGFRまたは20nM非特異的な抗体の存在下そしてEGFの濃度を大きくしながらその皿をインキユベートした。60μｍより大きなコロニーの数を平均（±SD）で示した。Ａ）IgG:225 IgG（●）、108 IgG（○）、非特異的なIgG（△）。Ｂ）IgM:96IgM（○）、421gM（●）、非特異的なIgM（△）。直径が60μｍより大きな細胞のコロニーはBausch ＆ Lombコロニーカウンターを用いて測定した。（第15図参照）
C.MDA−468細胞に対する96のコロニー阻止アツセイ
MDA−468細胞を0.4％  Bacto−Agar（Difco,Detroit,MI）、IMEM、10％   FBS及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁した。細胞を３本の1ml  IMEM、0.6％寒天及び10％FBSを含有する35mm培養皿中に入れた（10,000個／皿）。10−14日間37℃で５％  CO2中で20nM  aEGFRまたは20nM非特異的な抗体の存在下そしてEGFの濃度を大きくしながらその皿をインキユベートした。60μｍより大きなコロニーの数を平均（±SD）で示した。
Ａ）IgG:225 IgG（●）、108  IgG（△）、非特異的なIgG（▲）、EGF単独（○）。Ｂ）IgM:96IgM（△）、42IgM（●）、非特異的なIgM（▲）、EGF単独（○）。直径が60μｍより大きな細胞のコロニーはBausch ＆ Lombコロニーカウンターを用いて測定した。（第16図参照）。
実施例  IX
モノクローナル抗体108のドキソルビシンと共に投与した場合の有用性
KB細胞を注射して皮下に腫瘍をつくつた。腫瘍を注射した後24時間目及び３−４日の間隔を置いて３回、0.45mgのモノクローナル抗体108と37.5μｇのドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与した。腫瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩緩衝液、抗体単独あるいは薬剤単独。（第９図参照）
モノクローナル抗体108のシスプラチンと共に投与した場合の有用性
ａ）1.8mgのモノクローナル抗体108及び100μｇシスプラチンでもつて皮下に２×106個のKB細胞を接種後24時間して１回投与処理した。結果を第10図に示す。ｂ）腫瘍の移植後20時間目に1.9mgのモノクローナル抗体108と0.1μｇのシスプラチンを別々の注射器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場合にはそれぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れていた（Ｐ＜0.02、スチユーデントテスト、Ｐ＜0.007 Mann−Whitney分析法）。（第11図参照）
【図面の簡単な説明】
第１図はモノクローナル抗体108のＦ（ab）２´及びＦ（ab）調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。非還元条件下でゲル泳動はなされた。ａ）未処理モノクローナル抗体108、ｂ）未精製Ｆ（ab）２´フラグメント調製物、ｃ）精製Ｆ（ab）２´、ｄ）Fabフラグメント、ｅ）分子量マーカー、KD。
第２図はKB細胞への125Iモノクローナル抗体108及びそのフラグメントとEGFとの競合結合を示す。KB細胞は３×10-9Mの125Iモノクローナル抗体（１×106cpm/ml）の存在下、異なつた濃度のEGF（●）、非標識モノクローナル抗体108（○）、そのＦ（ab）２´、フラグメント（▲）あるいはFab´フラグメント（■）の存在下に培養した。（３個の独立した測定値の平均）。
第３図はモノクローナル抗体108のKB細胞への結合をセルソーター分析したものである。
第４図はヌードマウスに移植されたKB細胞に対する125Iモノクローナル抗体108の付着を示す。
第５図はKB細胞のコロニー形成におけるEGF及びモノクローナル抗体108の及ぼす効果を示す。コロニー形成のアツセイは実施例に記載されているようにして異なつた濃度のEGF（●）及びモノクローナル抗体108（■）の存在下に行われた。
第６図は、ヌードマウスに移植されたKB細胞に対するモノクローナル抗体108及びそのフラグメントの抗腫瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマウスからなつていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日目、第５日目、第12日目及び第18日目にその静脈内に、1mgのモノクローナル抗体108（■）、1mgのDNPに対するモノクローナル抗体（○）、0.66mgのモノクローナル抗体108のＦ（ab）２´、フラグメント（▲）、あるいはFab´フラグメント（◆）を投与して処理された。また、腫瘍細胞を注射した後１日に2mgのモノクローナル抗体108で１回処理した（●）。
第７図はヌードマウスの腹腔内に移植されたKB細胞に対する108mAbの抗腫瘍活性を示すものである。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目及び第７日目にその静脈内に0.5mgのモノクローナル抗体108（・・・）またはDNPに対する抗体（８匹のマウス）を投与して処理された。
第８図はヌードマウスの静脈内に注射されたKB細胞に対する108mAbの抗腫瘍活性を示すものである。ａ）微小転移巣を示している1.5×106個のKB細胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織の写真（第８図ａ）：×250倍。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び第13日目に0.5mgのモノクローナル抗体108を静脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺を通して異なつた深さで採取された一連の部分の分析を示している（第８図ｂ）。
第９図は、皮下に移植されたKB細胞に対する108mAbのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。0.45mgのモノクローナル抗体108と37.5μｇのドキソルビシンを４回すなわち、腫瘍の注入後24時間して及び３〜４日の間隔をおいて３回これを繰り返して投与した。
第10図及び第11図は皮下に移植されたKB細胞に対する108mAbのシスプラチンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性を示している。第10図においては1.8mgのモノクローナル抗体108及び100μｇのシスプラチンを含有するもので１回投与処置された。第11図では、マウスは腫瘍の移植後20時間して１回、静脈内に、19mgのモノクローナル抗体108及び0.1mgのシスプラチン（Abic,Ramat−Gan,Israel）を投与処理された。各物質は別々に注射された。PBS（●）、モノクローナル抗体（▲）、シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプラチン（◆）。
第12図は細胞の生育に及ぼすEGFの効果を示している。Ａ）184A1N4細胞。Ｂ）MDA−468細胞。184A1N4細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、EGFを加えられた。MDA−468細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、１晩付着させておかれた。次の日にEGFを加えた。培地を48時間後に交換し、４日後に細胞を数えた。平均（±SD）細胞数を示した。
第13図は、付着依存性の細胞の生育の抗−EGFレセプター抗体（aEGPR）の阻害を示すものである。184A1N4細胞（Ａ及びＢ）及びMDA−468細胞（Ｃ及びＤ）は３本の24−ウエルプレートのウエルに入れられ（5,000個／ウエル）、抗体を加える前に付着させておかれた。184A1N4の生育培地は1ng/mlのEGFを含有していた。48時間後生育培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平均±SD）のコントロールに対する％を示した。96IgM（●）、42IgM（○）、非特異的なIgM（△）、225IgG（■）、108IgG（□）、非特異的なIgG（▲）。
第14図は、EGFによる付着依存性の細胞の生育のaEGFR阻害の逆転を示すものである。細胞は３本の24−ウエルプレートのウエルの中に入れられた（5,000個／ウエル）。184A1N4細胞（Ａ及びＢ）はEGF及び抗体を加える前にEGFを含まない培地中で４時間付着させておかれた。MDA−468細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を20nMの終濃度となるように加えた。培地を48時間後交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±SD）で示した。96IgM（●）、42IgM（○）、非特異的なIgM（△）、225IgG（■）、108IgG（□）、非特異的なIgG（△）。
第15図はモノクローナルaEGFRによる184A1N4−Ｔのコロニー形成の阻害を示すものである。細胞は実施例VIII（Ｂ）に記載したように軟寒天中で、20nM  aEGFRまたは20nM非特異的な抗体の存在下EGF濃度を増大させながら生育させた。60μｍより大きいコロニーの数を平均（±SD）で示した。Ａ）IgG:225 IGg（●）、108IgG（○）、非特異的なIgG（△）。Ｂ）IgM:96IgM（○）、42IgM（●）、非特異的なIgM（△）。
第16図はMDA−468コロニーの形成に及ぼすaEGFRの効果を示すものである。細胞は実施例VIII（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、20nMのaEGFRまたは非特異的な抗体の存在下EGF濃度を増大させながら生育させた。細胞またはEGF単独下でも生育させた。60μｍより大きいコロニーの数を平均（±SD）で示した。Ａ）IgG:225IgG（●）、108IgG（△）、非特異的なIgG（▲）、EGF単独（○）。Ｂ）IgM:96IgM（△）、42IgM（●）、非特異的なIgM（▲）、EGF単独（○）。
第17図は、MDA−468細胞に結合する〔125I〕EGFに及ぼすaEGFRの効果を示すものである。24−ウエルプレート中の集密的MDA−468細胞をヨウ素化したEGF（1nM）及び非標識抗体またはEGFの濃度を大きくしながら2.5時間４℃でインキユベートした。２または３つの別々の実験からの二つの測定の平均（±SD）を示した。Ａ）225IgG（△）、108IgG（◇）、非特異的なIgG（▽）、EGF標準（●）。Ｂ）IgM:96IgM（●）、42IgM（△）、非特異的なIgM（▼）、EGF標準（○）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図８】
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【図１５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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