(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）穀類にα−アミラーゼ及びプロテアーゼを作用させて得た液化液及び／又はその濾液を用いて固定化麹菌を調製する工程、（２）穀類にα−アミラーゼを作用させて得た液化液に工程（１）の固定化麹菌を接触させて糖化酵素を含む抽出液を得る工程、（３）固定化酵母を工程（２）で得た抽出液に接種してアルコール発酵を行う工程の各工程を繰り返して並行複発酵を行うことを特徴とする酒類の製造法。
【請求項２】
固定化麹菌を調製する工程（１）を、液化液及び／又はその濾液にアスペルギルス・オリゼの胞子を懸濁させ、これをセルロースフォームに湿潤して３７℃で気相培養することにより行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
糖化酵素を含む抽出液を得る工程（２）を、液化液をプロテアーゼで処理し、この液化液を用いて４１℃で気相培養することにより行う請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（３）の固定化酵母の調製を、ガラスビーズを用いて協会７号酵母由来のアルコール耐性酵母を固定化することにより行う請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酒類の製造法に関し、詳しくは固定化麹菌と固定化酵母を用いて並行複発酵を行うことにより、清酒様高濃度エタノール含有酒類を効率よく製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酒類の醸造は、一般的に大規模な設備を必要とする上に、醸造期間も長い。このため、製造コストを低く抑え、かつ安定した品質の酒類を製造するために、さらなる設備の縮小化、醸造期間の短縮化及び杜氏に頼っていた発酵工程の自動化等による醸造工程の合理化が望まれている。
醸造工程を合理化するための技術に関しては、発酵液中に固形物を含まない酒類の連続醸造が提案されており、例えば酵母を含水ゲル中に包括させて固定化する技術が進歩し、このようにして得た固定化酵母を用いる麦汁の連続醸造法  ［Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．，  ８４，  ２２８  （１９７８）及び  ＥＢＣ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，  Ｐｒｏｃ．，  ５０５（１９８１）］等が提案されている。
しかし、清酒醪のような固液混合系である発酵形態においては、固定化菌体を用いて清酒と同様のアルコール濃度の酒類を醸造する方法は未だ報告がない。
【０００３】
また、清酒醸造にバイオリアクターを適用させるため、糖化とアルコール発酵の工程を分けた単行複発酵式の清酒醸造法に固定化酵母を利用して連続的に清酒を醸造する方法  ［醸造協会誌，  ８５，  １３  （１９９０）］が報告されているが、この方法では、糖化液のグルコース濃度が高いため、アルコール濃度は精々１２％（ｖ／ｖ）程度であり、従来の清酒と同様のアルコール濃度を得ることは困難であった。
一方、液化液に市販グルコアミラーゼを添加し、固定化酵母を用いて並行複発酵を行う技術（特開平１−１４８１７７号公報）もあるが、この方法は麹菌由来の香味成分や発酵促進物質  ［発酵工学会誌，  ４８，  ２９  （１９７０）  及び同誌，  ６０，  １９  （１９８２）］が存在しないため、得られる酒類は従来の清酒とは香味等の異なったタイプのものとなることが避けられない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、清酒様の高濃度アルコールを含む酒類を短期間で、かつ連続的に効率よく製造する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）穀類にα−アミラーゼ及びプロテアーゼを作用させて得た液化液及び／又はその濾液を用いて固定化麹菌を調製する工程、（２）穀類にα−アミラーゼを作用させて得た液化液に工程（１）の固定化麹菌を接触させて糖化酵素を含む抽出液を得る工程、（３）固定化酵母を工程（２）で得た抽出液に接種してアルコール発酵を行う工程の各工程を繰り返して並行複発酵を行うことを特徴とする酒類の製造法に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳しく説明する。
（１）麹菌の固定化
本発明に用いる麹菌は、糖化酵素を生産するものであればよく、具体的にはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）やアスペルギルス・ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）等があり、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ  ４０７５株、同ＩＦＯ  ４０７８株、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ  ４０６６株、同ＩＦＯ  ４３４３株等が好適である。液化液に添加する麹菌数は、胞子１０５  〜１０７  個／ｍｌ、好ましくは１０６  個／ｍｌである。
麹菌の培養方法としては、液体培養法や気相培養法が可能であるが、糖化酵素の活性を考慮すると、気相培養法が好適である。
【０００７】
麹菌を増殖させ、固定化するために用いる液化液は、穀類にα−アミラーゼとプロテアーゼを作用させることにより調製する。この液化液を単独で、もしくはその濾液と組み合わせて使用することができる。ここで、穀類としては、米，白糠等の米類、大麦，小麦，ライ麦，エン麦等の麦類、トウモロコシ，モロコシ，粟，稗，コウリャン，マイロ，蕎麦等の雑穀類が挙げられ、これらの穀類のうち１種若しくは２種以上を併用して用いることもできる。通常、これら穀類は粉状のものはそのまま、粒状のものは粉砕して用いる。
また、上記穀類を液化するために用いる酵素であるα−アミラーゼとしては、細菌起源のα−アミラーゼが好ましく、例えば「クライスターゼ」（大和化成社製），「スピターゼＨＳ」（長瀬産業社製），「ターマミル」（ノボ社製）などが挙げられる。
一方、プロテアーゼとしては、細菌もしくはカビ起源のものが好適であり、例えば「プロテアーゼＡ」（天野製薬社製），「プロテアーゼＭ」（天野製薬社製）などが挙げられる。
【０００８】
固定化麹菌の作成に用いる液化液は、α−アミラーゼとプロテアーゼを溶解した水に上記の穀類を混和することによって調製できる。この場合、α−アミラーゼとプロテアーゼの使用量は、穀類の重量に基づいて１／１００〜１／３０００に相当する量が適当であり、例えば穀類１００ｇあたりα−アミラーゼ０．０３〜１．０ｇ（１０〜３００００単位）、好ましくは０．１〜０．５ｇ（３０００〜１５０００単位）、プロテアーゼ０．０３〜１．０ｇ（３〜１００００単位）、好ましくは０．１〜０．５ｇ（１０００〜５０００単位）が適当である。これら酵素を穀類の８０〜１８０重量％、好ましくは１００〜１５０重量％に相当する量の水に溶解して酵素液を調製する。
次いで、この酵素液に穀類を加え、３０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃で０．５〜３時間、好ましくは１〜２時間攪拌して反応させる。その後さらに、６０〜１２０℃、好ましくは８０〜１００℃で１分〜３時間、好ましくは１０分〜２時間攪拌して目的とする液化液を作成する。なお、攪拌は処理容量によって異なるが、酵素液と穀類が均一に混和する程度に行えばよく、通常は１０〜７００ｒｐｍ、好ましくは３００〜５００ｒｐｍが適当である。
α−アミラーゼと同時にプロテアーゼを作用させることによって、糖化酵素の発現をさらに高めることができる。この効果は、プロテアーゼ自体による他、プロテアーゼに含まれている他の酵素による分解物が、固定化麹菌の糖化酵素生産に効果があると予想される。特に穀物由来のヘミセルロース等の構造多糖及びその分解物、さらに澱粉の分解物であるイソマルトオリゴ糖が効果があると予想される。
【０００９】
次に、このようにして得た液化液及び／又はその濾液を用いて固定化麹菌を作成する。固定化は既知の方法により行えばよいが、担体保持法が好適である。担体としては、セルロースフォーム，ガラスリング，ガラスビーズ、ゼオライト等を用いることができるが、セルロースフォームやガラスリングが好適である。特に、デッドスペースの少ないセルロースフォームが好ましい。この担体はスポンジ状であり、そのサイズが１〜５０ｍｍ３  、好ましくは２０〜３０ｍｍ３  のものである。好ましくは、この担体を、例えば液化液２０ｍｌあたり４０ｍｌの割合で使用する。
液化液及び／又はその濾液に所定量の麹菌胞子を混ぜ、これを固定化担体を収容した容器（例えばメジウムボトルなど）に入れ、該担体に湿潤させて栓（商品名：シリコ栓）をした後、インキュベーター内で回転させながら気相培養する。培養は、容器を１〜１０ｒｐｍで回転させながら２０〜４５℃、好ましくは３０〜４２℃で２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間行う。このようにして担体に固定化された麹菌を得ることができる。気相培養によると、液体培養の場合に比べて糖化酵素活性が４〜１０倍も向上する。
【００１０】
（２）酒類製造用（発酵用）液化液の調製
酒類製造に用いる液化液は、上記した穀類、好ましくは粉砕物に、適量、通常は穀類の重量に基づいて１／１００〜１／３０００の量のα−アミラーゼを溶解した水を加えて混和し、液化することによって得ることができる。なお、この場合の反応は、反応温度６０〜１２０℃、好ましくは８０〜１００℃で１分〜３時間、好ましくは１０分〜２時間攪拌して行う。このときの攪拌は通常、１０〜７００ｒｐｍ、好ましくは３００〜５００ｒｐｍが適当である。
【００１１】
上記の液化液に前記固定化麹菌を接触させて糖化酵素を含む抽出液を得る。すなわち、麹菌が固定化されている担体に上記の液化液を加え、１０〜２０℃、好ましくは１３〜１７℃で、３０分〜２時間程度静置し、上清を得る。この上清には、麹菌に含まれている糖化酵素並びにその他の成分（例えば香味成分，発酵促進成分など）が含まれており、これを糖化酵素を含む抽出液として酒類の製造に用いる。
【００１２】
（３）酵母の固定化方法
本発明に用いられる酵母は、穀類から調製された発酵用の液化液を代謝してエチルアルコール，二酸化炭素等を生産するものであればよく、具体的には醸造用酵母として一般的に用いられるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やサッカロミセス・ウバルム（Ｓ． ｕｖａｒｕｍ）等を挙げることができ、具体的にはサッカロミセス・セレビシエＩＦＯ  ０３０５株、同ＩＦＯ  ０３０６株、サッカロミセス・ウバルムＩＦＯ  ０５７３株、同ＩＦＯ  ０６１５株等が好適である。特に、協会７号酵母由来のアルコール耐性酵母が好適である。
酵母の固定化は、一般的な酵母菌体の固定化方法を適用して行うことができるが、中でもアルギン酸カルシウムゲル法  ［バイオリアクターの応用技術−固定化生体触媒の製法と利用−，シーエムシー社発行、１９（１９８６）］  やガラスビーズ固定化法［ＩｏＢ（Ａ＆ＮＺ）  Ｐｒｏｃ．  ２３ｒｄ  Ｃｏｎｖ．  １０９  （１９９４）］  が好適である。
【００１３】
（４）並行複発酵による酒類の製造法
上記で得た固定化酵母を、前記の糖化酵素含有抽出液（酒類製造用液化液）と接触させ、並行複発酵を行う。並行複発酵は、バイオリアクターシステムを用いて実施する。すなわち、第１のリアクターに固定化麹菌を充填し、ここで糖化酵素を繰り返し連続的に生産させ、第２のリアクターには固定化酵母を充填し、糖化酵素含有抽出液と接触させて繰り返しアルコール発酵を行わせ、目的とする酒類を連続的に生産させる。したがって、酵母を充填したリアクターでアルコール発酵を行っている間、麹菌を充填したリアクターでは、再度麹菌増殖用液化液を浸潤させ、糖化酵素を連続的に生産させ、これに液化液を加えて抽出を行っている。本発明に用いることができるバイオリアクターシステムの一態様を図１に示す。図中、１は液化液リザーバー、２は固定化麹菌リアクター、３は固定化酵母リアクター、４はエタノール発酵液リザーバー、５はポンプである。
この発酵は、１０〜２０℃、好ましくは１３〜１７℃で１〜５日間行う。この場合、３日間の培養によってエタノール濃度が約１５％の酒類を得ることができ、５日間の培養ではエタノール濃度は約１９％に上昇する。これに対して、液化液として市販のグルコアミラーゼを含有するものを使用した場合は、同様の条件で実施しても７日間の培養でエタノール濃度は精々８〜９％にしか到達しない。なお、このとき用いられる発酵槽としては、攪拌槽型，流動槽型及びカラム型リアクター  ［バイオリアクターの応用技術−固定化生体触媒の製法と利用−，シーエムシー発行，３９  （１９８６）］等がある。
【００１４】
【実施例】
以下に、本発明を実施例等により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１
（１）麹菌増殖用液化液の調製
α−アミラーゼ（クライスターゼ、大和化成社製）０．２ｇとプロテアーゼ（プロテアーゼＡ、天野製薬社製）０．２ｇを１５０ｍｌの滅菌水に溶解した酵素液を、米の粉砕物１００ｇに混和し、攪拌機（ＨＥＩＤＯＮ社製）を用いて回転数５００ｒｐｍ、温度５０℃で２時間攪拌した。さらに、回転数５００ｒｐｍ、温度８５℃の条件で２時間攪拌し、固定化麹菌増殖用の液化液を調製した。
【００１５】
（２）麹菌の固定化
続いて、上記の固定化麹菌増殖用の液化液２０ｍｌに、アスペルギルス・オリゼの胞子を１０６  個／ｍｌの濃度となるように懸濁した。この懸濁液を１００ｍｌ容メディウムボトルに入れた、大きさ３０ｍｍ３  のセルロースフォーム（東京理科社製）４０ｍｌに湿潤させ、３７℃に保たれた恒温槽内で回転数１０ｒｐｍで回転させながら、３日間気相培養し、セルロースフォームにアスペルギルス・オリゼを固定化、増殖させた。
【００１６】
（３）糖化酵素連続生産実験
前記麹菌増殖用液化液に固定化麹菌を温度４１℃にて接触させ、糖化酵素を連続的に生産させた。なお、糖化酵素活性は、糖化酵素活性測定用キット（キッコーマン社製）にて測定し、活性が著しく低下するまで実験を続けた。結果を図２に示す。
図から明らかなように、プロテアーゼ処理した液化液を用い、かつ麹菌を４１℃で接触させて糖化酵素を生産させた場合において、３０日間にわたり連続１０回生産することができた。しかも、糖化酵素生産能は繰り返すごとに上昇し、１０回目では１回目の１６５％にまで上昇した。
【００１７】
試験例２
試験例１において液化液を固定化麹菌に温度３７℃で接触させたこと以外は、すべて試験例１と同様に行った。結果を図３に示す。
この場合は、４回の連続生産を行うことができたが、酵素の生産能は徐々に低下し、４回目では１回目の４７％にまで低下した。
【００１８】
試験例３
１回目の液化液のみα−アミラーゼと共にプロテアーゼを用いて処理し、２回目以降はプロテアーゼ処理をしない液化液を固定化麹菌に温度３７℃で接触させたこと以外は、すべて試験例１と同様に行った。結果を図４に示す。
この場合も、２回目以降から活性が低下し、３回目では活性の上昇が殆ど見られなかった。
【００１９】
実施例１
（１）麹菌増殖用液化液の調製
α−アミラーゼ（ＴＣ−３、大和化成社製）０．２ｇとプロテアーゼ（プロテアーゼＡ、天野製薬社製）０．２ｇを１５０ｍｌの滅菌水に溶解した酵素液を、搗減り７０％に精白した精白米の粉砕物１００ｇに混和し、攪拌機（ＨＥＩＤＯＮ社製）を用いて、回転数５００ｒｐｍ、温度５０℃で１時間攪拌した。
さらに、回転数５００ｒｐｍ、温度８５℃で２時間攪拌し、固定化麹菌増殖用の液化液を調製した。
【００２０】
（２）麹菌の固定化
続いて、上記の固定化麹菌増殖用の液化液２０ｍｌに、アスペルギルス・オリゼの胞子を１０６  個／ｍｌの濃度となるように懸濁した。これを１００ｍｌ容メディウムボトルに入れた、大きさ３０ｍｍ３  のセルロースフォーム（東京理科社製）４０ｍｌに湿潤させ、３７℃に保たれた恒温槽内で回転数１０ｒｐｍで回転させながら、３日間気相培養し、セルロースフォームにアスペルギルス・オリゼを固定化、増殖させた。
【００２１】
（３）酵母の固定化
酵母の固定化には、ガラスビーズ固定化法を採用し、酵母は協会７号酵母由来のアルコール耐性酵母を用いた。すなわち、酵母の固定化は、５００ｍｌ三角フラスコにガラスビーズ８０ｍｌとＹＰＤ液体培地を２００ｍｌ入れ、１２１℃で１５分間殺菌を行った後、室温まで冷却してから、酵母を１白金耳植菌し、８０ｒｐｍで回転させながら２５℃で２日間培養することにより行った。
【００２２】
（４）酒類製造用（発酵用）液化液の調製
酒類製造用（発酵用）の液化液の原材料として米の粉砕物を１００ｇ用い、これをα−アミラーゼ（ＴＣ−３，大和化成社製）０．２ｇを滅菌水１５０ｍｌに溶解した酵素液と混和し、８５℃で２時間攪拌した。なお、攪拌には攪拌装置（ＨＥＩＤＯＮ社製）を用いた。このとき回転数は５００ｒｐｍとした。
得られた液化液は、グルコースが３個以上結合したもの（Ｇ３＞）の割合が７５％以上であり、酵母への影響が少ないものであった。
この液化液１００ｍｌを、セルロースフォームに固定化した麹菌に接触させ、１５℃で１時間静置することにより糖化酵素を含む抽出液（酒類製造用液化液）を１００ｍｌ得た。
【００２３】
（５）アルコール発酵
次に、該抽出液１００ｍｌと上記アルコール耐性酵母を固定化したガラスビーズ８０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０ｒｐｍで回転させながら１５℃で５日間アルコール発酵を行った。この間、糖化酵素を抽出した固定化麹菌には、再度麹菌増殖用液化液を浸潤させて培養することによって連続して糖化酵素を生産させた。
この発酵期間中、糖濃度はフェノール−硫酸法、グルコース濃度はグルコースＢ−テストワコー（和光純薬社製）、エタノール濃度は酵素法を利用したＦ−キットエタノール（ベーリンガー・マンハイム社製）、糖化酵素活性は糖化酵素活性用キット（キッコーマン社製）を用いて測定した。得られた結果を図５に示す。図中、○は糖濃度（ｗ／ｖ）％を、●はエタノール濃度（ｖ／ｖ）％を、▲はグルコース濃度（ｗ／ｖ）％を、■は糖化酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を表している。
【００２４】
図から明らかなように、発酵開始から３日目でエタノール濃度１５（ｖ／ｖ）％に達し、５日目で１９（ｖ／ｖ）％を示した。  なお、糖濃度とグルコース濃度は共に減少していた。また、糖化酵素活性は、０．６Ｕ／ｍｌと安定していた。
【００２５】
比較例１
酒類製造用の液化液にリゾープス属由来のグルコアミラーゼ（グルクザイムＮＬ４．２、天野製薬社製）を０．１％を用い、発酵期間を７日間にしたこと以外は、すべて実施例１と同様に行った。この結果を図６に示した。
【００２６】
図から明らかなように、グルコアミラーゼを作用させた場合、発酵が停滞し、エタノール濃度は７日目においても８．６（ｖ／ｖ）％までしか上昇しなかった。これに伴い、糖は１９（ｗ／ｖ）％と実施例１に比べて４倍近く残存した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、固定化された麹菌と酵母をバイオリアクターとして用いることによって、高濃度のアルコールを短期間で効率よく、かつ連続して生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるバイオリアクターシステムの一態様を示す。
【図２】プロテアーゼ処理をした麹菌増殖用液化液を用い、４１℃で糖化酵素を連続生産させた場合の糖化酵素活性を示す。
【図３】プロテアーゼ処理をした麹菌増殖用液化液を用い、３７℃で糖化酵素を連続生産させた場合の糖化酵素活性を示す。
【図４】プロテアーゼ処理をしない通常の酒類製造用（発酵用）液化液を用い、３７℃で糖化酵素を連続生産させた場合の糖化酵素活性を示す。
【図５】酒類製造用の液化液にて固定化麹菌から糖化酵素を抽出して得た液化液を用いてアルコール発酵させた場合の糖濃度，グルコース濃度，エタノール濃度，糖化酵素活性測定結果を示す。
【図６】酒類製造用の液化液にグルコアミラーゼを作用させて得た液化液を用いてアルコール発酵させたた場合の糖濃度，エタノール濃度，糖化酵素活性測定結果を示す。
【符号の説明】
１  液化液リザーバー
２  固定化麹菌リアクター
３  固定化酵母リアクター
４  エタノール発酵液リザーバー
５  ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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