【手続補正書】
【提出日】平成29年8月7日(2017.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
[本発明1001]
以下の段階を含む、筋肉関連疾患もしくは障害に罹患している患者、または筋肉関連疾患もしくは障害を発症するリスクを有する患者を処置する方法：
患者に治療的有効量の剤を投与する段階であって、該剤が、正常対照と比較して、標的細胞もしくは組織におけるBCL2関連アサノジーン3（BCL2-associated athanogene 3）（BAG3）分子、タンパク質、またはそれらのペプチドの発現または量を調節する、段階。
[本発明1002]
前記剤が、BAG3タンパク質もしくはそれらの活性断片、オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを発現する発現ベクターを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記発現ベクターが、プロモーターをさらに含み、該プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、2シストロン性プロモーター、または組織特異性プロモーターを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記発現ベクターが、ウイルスベクター、心臓作用性ベクター、プラスミド、または酵母ベクターを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記心臓作用性ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、コクサッキーウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、パルボウイルスベクター、または肝炎ウイルスベクターを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記発現ベクターが、心臓作用性偽型ウイルスベクターである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記剤が、タンパク質またはそれらのペプチド、ペプチド模倣体、小分子、有機または無機化合物、合成または天然化合物を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記筋肉関連疾患または障害が、心疾患または障害である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
以下の段階を含む、候補治療剤を同定する方法：
生物学的試料または細胞を候補治療剤と接触させる段階；
該候補治療剤の存在下または非存在下で、BCL2関連アサノジーン3（BAG3）タンパク質またはそれらのペプチドの発現または量を調節するためにアッセイする段階であって、該剤が、正常対照と比較して、BAG3タンパク質の発現を調節する、段階；
それによって、候補治療剤を同定する段階。
[本発明1010]
前記候補治療剤が、ベースライン対照と比較して、細胞におけるBAG3の発現または量を増加させる、本発明1009の方法。
[本発明1011]
BAG3を定量化またはBAG3の発現を測定するためのアッセイが、免疫アッセイ、リン酸化アッセイ、酵素アッセイ、生物アッセイ、バイオチップアッセイ、ブロット、ハイブリダイゼーションアッセイ、細胞ベースアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、クロマトグラフィー、化学アッセイ、ファージディスプレイアッセイ、ラブ-オン-チップ、マイクロ流体ベースアッセイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、ナノチューブベースアッセイ、比色分析アッセイ、分光光度アッセイ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
以下の段階を含む、心疾患または障害を有する患者を診断する方法：
患者から生物学的試料を得る段階；
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくはそれらのバリアントの発現を測定、またはBAG3ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくはそれらのバリアントを定量化する段階、および／またはBAG3分子における変異を同定する段階であって、健常対照と比較して、BAG3の低下した量もしくは発現の検出またはBAG3分子における変異の検出が、心疾患または障害の診断となる、段階。
[本発明1013]
前記変異が、BAG3ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの欠失またはバリアントを含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記生物学的試料が、体液、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1012の方法。
[本発明1015]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子の発現を測定もしくはBAG3分子を定量化するためのアッセイ、および／またはBAG3分子における変異を同定する段階が、免疫アッセイ、リン酸化アッセイ、酵素アッセイ、生物アッセイ、バイオチップアッセイ、ブロット、ハイブリダイゼーションアッセイ、細胞ベースアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、クロマトグラフィー、化学アッセイ、ファージディスプレイアッセイ、ラブ-オン-チップ、マイクロ流体ベースアッセイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、ナノチューブベースアッセイ、比色分析アッセイ、分光光度アッセイ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1012の方法。
[本発明1016]
以下の段階を含む、候補治療剤を同定するハイスループットスクリーニング方法：
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子を含む支持体表面を候補治療剤と接触させる段階；
該候補治療剤の存在下または非存在下で、ベースライン対照と比較して、BAG3の発現を調節するためにアッセイする段階であって、該候補治療剤が、BAG3の発現を増加させる、段階；
それによって、候補治療剤を同定する段階。
[本発明1017]
前記支持体表面が、プラスチック、ガラス、ビーズ、ファイバー、ゲル、電気化学的検出器、ナノチューブ、多孔性ストリップ、紙、マトリクス、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）の発現を測定するためのアッセイが、免疫アッセイ、酵素アッセイ、生物アッセイ、バイオチップアッセイ、ブロット、ハイブリダイゼーションアッセイ、細胞ベースアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、クロマトグラフィー、化学アッセイ、ファージディスプレイアッセイ、ラブ-オン-チップ、マイクロ流体ベースアッセイ、マイクロアレイ、マイクロチップ、ナノチューブベースアッセイ、比色分析アッセイ、分光光度アッセイ、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1016の方法。
[本発明1019]
本発明1009または1016の方法により同定された剤を治療的有効量で含む、薬学的組成物。
[本発明1020]
細胞内、インビボ、またはインビトロでBCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子の発現または量を調節する、治療剤。
[本発明1021]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子またはその相補性配列をコードする、発現ベクター。
[本発明1022]
前記ベクターが心臓作用性である、本発明1021の発現ベクター。
[本発明1023]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子またはその相補性配列をコードする発現ベクターを含む、薬学的組成物。
[本発明1024]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子またはその相補性配列をコードする発現ベクターを含む、細胞。
[本発明1025]
以下の段階を含む、心不全のリスクを有する対象または心不全に罹患している対象を処置する方法：
対象に、BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子の発現または量を調節する少なくとも1つの剤の治療的有効量を含む薬学的組成物を投与する段階であって、該剤が、BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子をコードする発現ベクターを含む、段階。
[本発明1026]
前記剤が、ベースライン対照と比較して、細胞または組織におけるBAG3の発現を増加させる、本発明1025の方法。
[本発明1027]
以下の段階を含む、特発性拡張型心筋症を発症するリスクを有する患者を診断または同定する方法：
患者から生物学的試料を得る段階；
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの発現を測定、またはBAG3ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを定量化する段階、および／またはBAG3分子における変異を同定する段階であって、健常対照と比較して、BAG3の低下した量もしくは発現の検出またはBAG3分子における変異の検出が、心疾患または障害の診断となる、段階。
[本発明1028]
前記変異が、BAG3ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの欠失またはバリアントを含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記生物学的試料が、体液、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1012の方法。
[本発明1030]
以下の段階を含む、特発性拡張型心筋症のリスクを有する対象または特発性拡張型心筋症に罹患している対象を処置する方法：
対象に、BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子の発現または量を調節する少なくとも1つの剤の治療的有効量を含む薬学的組成物を投与する段階。
[本発明1031]
前記剤が、正常対照と比較して、細胞または組織におけるBAG3の発現を増加させる、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記剤が、BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、BAG3タンパク質、BAG3タンパク質もしくはその活性断片、またはそれらの組み合わせをコードする発現ベクターを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記発現ベクターが、プロモーターをさらに含み、該プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、2シストロン性プロモーター、または組織特異性プロモーターを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記発現ベクターが、ウイルスベクター、心臓作用性ベクター、プラスミド、または酵母ベクターを含む、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記心臓作用性ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、コクサッキーウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、パルボウイルスベクター、または肝炎ウイルスベクターを含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記発現ベクターが、心臓作用性偽型ウイルスベクターである、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記剤が、タンパク質またはそれらのペプチド、ペプチド模倣体、小分子、有機または無機化合物、合成または天然化合物を含む、本発明1030の方法。
[本発明1038]
以下の段階を含む、インビトロまたはインビボでBCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子の発現を調節する方法：
インビトロで細胞を接触させる段階、または患者に治療的有効量の剤を投与する段階であって、該剤が、正常対照と比較して、インビトロまたはインビボで、標的細胞または組織におけるBCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子、タンパク質、またはそれらのペプチドの発現または量を調節する、段階。
[本発明1039]
前記剤が、BAG3タンパク質またはそれらの活性断片を発現する発現ベクターを含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記発現ベクターが、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記発現ベクターが、プロモーターをさらに含み、該プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、2シストロン性プロモーター、または組織特異性プロモーターを含む、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記発現ベクターが、ウイルスベクター、心臓作用性ベクター、プラスミド、または酵母ベクターを含む、本発明1039の方法。
[本発明1043]
前記心臓作用性ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、コクサッキーウイルスベクター、サイトメガロウイルスベクター、エプスタイン-バーウイルスベクター、パルボウイルスベクター、または肝炎ウイルスベクターを含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記発現ベクターが、心臓作用性偽型ウイルスベクターである、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記剤が、タンパク質またはそれらのペプチド、ペプチド模倣体、小分子、有機または無機化合物、合成または天然化合物を含む、本発明1030の方法。
[本発明1046]
BCL2関連アサノジーン3（BAG3）分子をコードするアデノ随伴ウイルスベクター血清型9（AAV9）を含む、発現ベクター。
[本発明1047]
前記ベクターが、心臓作用性であり、心臓組織においてBAG3を発現する、本発明1046の発現ベクター。
[本発明1048]
心臓組織におけるBAG3分子の発現を調節する、本発明1046の発現ベクター。
[本発明1049]
BAG3タンパク質が、正常対照と比較して、心臓組織において過剰発現される、本発明1048の発現ベクター。
他の局面は、以下に記載される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】BAG3関連性の拡張型心筋症の系図を示す略図である。男性は四角で示される。円は女性を示す。白抜きの記号は、罹患していない個体を示し、黒塗りの記号は、罹患した個体を示す。BAG3における10ヌクレオチド欠失の存在または欠如は、それぞれ(+)または(-)で示される。矢印は発端者を意味する。星印は、DNAを全エキソーム配列決定のために使用した個体を意味するために使用される。斜線は、死亡した個体を意味するために使用される。
【図２】図2Aは、BAG3の10ヌクレオチド欠失に対する配列決定アライメントを示す略図である。図2Aは、記載順にそれぞれSEQ ID NO:9〜49を開示する。図2Bは、罹患した個体のBAG3遺伝子における欠失の代表的なサンガー配列決定を示す略図である。図2Bは、記載順にそれぞれSEQ ID NO:50および51を開示する。
【図３】図3Aおよび図3Bは、心不全を有する患者における低レベルのBAG3発現を示す。非不全（NF）および不全（F）のヒト心臓におけるBAG3およびGAPDHレベルの代表的なウエスタンブロットを示す。グラフは、非不全および不全のヒト心臓におけるBAG3タンパク質レベルの定量化を示す。値は、タンパク質負荷における変動を説明するため、GAPDHのレベルに対して正規化される。横線は、平均および平均の標準誤差を示す。統計解析は、不等分散に対するウェルチの補正を有する独立t検定を用いて行われた。
【図４】偽手術された（sham operated）野生型マウス、AAV9-BAG3構築物を注入された野生型マウス、大動脈結紮を行い（および心不全を発症させた）マウス、および結紮されて心不全であるがAAV9-BAG3構築物を注入されたマウスにおける駆出率の測定を示す。示されるように、BAG3注入は、BAG3タンパク質の発現に時間的に関連して（注入後、約5〜6週）、LV機能を正常化した。
【図５】患者におけるBAG3レベルを示すウエスタンブロットである。「対照」の3レーンおよび「患者」の3レーンを示す。これは、罹患した患者IV-1である。「対照」レーンは、非不全のヒト心臓、すなわち正常ヒト心臓に由来し、これは、利用可能なレシピエントとサイズおよび組織型が不適合性であるために移植に使用することができなかった組織採取時に得られた。レーンに表示された「患者」の全ては、同一患者であるIV-1に由来した。これらは、彼が心臓移植を行った時点で外移植された彼の心臓片から得られた。結果は、BAG3レベルの低下が、非家族性心不全を有する患者において見られる低下に匹敵することを示す。
【図６】図6A〜図6Dは、不全のマウス心臓におけるBAG3レベルを示す。図6Aは、心臓重量対体重の割合を示すグラフである；図6Bは、収縮性を示すグラフである；図6Cは、BAG3タンパク質レベルを示すグラフである；図6Dは、BAG3タンパク質レベルのイムノブロット解析である。
【図７−１】図7A〜図7Fは、バルーン閉塞後のブタ心臓における血流力学的インデックスおよびBAG3レベルを示す。図7Aは、駆出率を示すグラフであり：図7Bは、短縮率を示すグラフであり；図7Cは、拡張終期容積を示すグラフであり；図7Dは、収縮終期容積を示すグラフである。
【図７Ｅ】BAG3タンパク質レベルを示すグラフである。
【図７Ｆ】BAG3タンパク質レベルのイムノブロット解析である。
【図８】BAG3に関するNCBIリファレンスアミノ酸配列を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
「Fv」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体断片である。この領域は、堅いコンコバレント（con-covalent）結合での、1つの重鎖および1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体構造において、各可変ドメインの3つの超可変領域は、相互作用して、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定する。6つの超可変領域は、抗原結合特異性を与えるが、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な3つのみの超可変領域を含むFvの半分）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。安定性を向上するために、VH-VLドメインは、1本鎖FvまたはscFV抗体断片を形成するために(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:7)などのフレキシブルペプチドリンカーによって結合されてもよく、またはジスルフィド安定化Fv（dsFv）を産生するためにフレームワーク領域内に2つのシステイン残基を導入することによってジスルフィド結合を形成するように操作されてもよい。抗体の断片は、完全長抗体の所望の特異性、および／またはBAG3ポリペプチドに特異的に結合するために十分な特異性を保持する限り、提供される方法において使用するために適している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
遺伝学的解析：  図1に見られるように、系図および臨床データは、常染色体優性の成人発症性家族性IDCと適合する。5名の罹患した家族メンバー（III-5、7：IV-1、4、5）および1名の罹患していない家族メンバー（III-9）に由来するDNAのエクソーム配列決定は、1試料当たり平均11.8±0.96 Gbのパスフィルター配列読み取りデータを有した。バイオインフォマティクスフィルタリングの後、BAG3のエクソン4のコード領域における10ヌクレオチド欠失（Ch10:del 121436332_12143641:del. 1266_1275[NM 004281]）が、全ての試験された罹患対象に存在し、発端者の健常な妹（III-9）には存在しないことが示された（図2）。さらなる家族メンバーが、サンガー配列決定によって、BAG3欠失に対して試験され、罹患した個体（III-1、5、7およびIV-1、4、5、6）および罹患していない個体（III-9およびIV-8、9、10、11、12）の表現型とこの欠失との適切な共分離が確認された。この欠失は、存在するデータベース中には見出されず、フレームシフトおよび13アミノ酸の後に未成熟停止コドンを導入し、カルボキシル末端で140アミノ酸分のBAG3の切断が予想される。したがって、異常なBAG3タンパク質は、575アミノ酸の代わりに、435アミノ酸を有すると予測される。加えて、欠失の遠位のアミノ酸配列：
2017506623.tif 000001
は、正常タンパク質に見出されるものとは異なることが予測される。1つの追加のバリアントのみが、エクソーム配列決定により、およびバイオインフォマティクスフィルタリングの後に、見出された。IKZF5遺伝子において見出されたバリアント（rs8192669）は、他の家族メンバーにおけるIDC表現型どおりには分離しなかった。稀なバリアント（≦1％）に対する一遺伝子性IDCに関連する52遺伝子の以前の解析は、TTN、GATAD1、MYPN、ANKRD1、およびRBM20における非同義変異のみを同定した：これらのバリアントのいずれも、疾患表現型と共に分離しなかった。