(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ  １ａをコードする遺伝子が発現ベクターの形態で導入された、病原性糸状菌に抵抗性を有する双子葉植物であって、
該発現ベクターは、以下のａ）およびｂ）：
ａ）該Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ  １ａをコードする遺伝子を有する組換え遺伝子と、タバコＰＲ１ａ遺伝子のプロモーターとが、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して結合している、発現カセット；および
ｂ）カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに連結された薬剤耐性遺伝子；
を含み、
ここで、該タバコＰＲ１ａ遺伝子のプロモーターと、該カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとは、隣り合わせに配置されており、
該植物は、対応する非形質転換植物として比較して増強された病原性糸状菌耐性を有する、植物。
【請求項２】
前記組換え遺伝子が、前記Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ  １ａをコードする遺伝子と植物遺伝子とがタバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域を介して結合している組換え遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記発現カセットが、前記Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ  １ａをコードする遺伝子の下流に結合した、タバコＰＲ１ａ遺伝子由来のターミネーターを有する、請求項１〜２に記載の植物。
【請求項４】
前記発現ベクターが、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有する、請求項１〜３に記載の植物。
【請求項５】
前記シグナルペプチドが、ＰＲ１ａシグナルペプチドである、請求項１〜４に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子を有し、病原性糸状菌に抵抗性を有する植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物に抗細菌性ペプチドをコードする遺伝子を導入し、細菌に対して抵抗性を与える研究がなされている。特に、双翅目昆虫由来の抗細菌性ペプチドであるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ（特開平７−２５０６８５）が発現し、抗細菌性を有するようになったことが開示されている。しかし、抗病原性糸状菌に対して耐性を有する双翅目昆虫由来の抗細菌性ペプチドを有し、かつ、抗糸状菌耐性を有する植物はいまだかつて知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は上記の問題を解決するためのものであり、その目的とするところは、外来タンパク質として、病原細菌耐性のタンパク質を用いることにより、病原性糸状菌に対して抵抗性のある植物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明は抗細菌性ペプチドをコードする遺伝子を有し、病原性糸状菌に抵抗性を有する植物に関する。
【０００５】
好適な実施態様においては、前記病原性糸状菌は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ立ち枯れ病菌）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｒ（タバコ舞病菌）およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）である。
【０００６】
好適な実施態様においては、抗細菌性ペプチドが双翅目昆虫由来である。
【０００７】
好適な実施態様においては、前記双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドがＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａである。
【０００８】
好適な実施態様においては、前記双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子が、該遺伝子を有する組換え遺伝子、該組換え遺伝子と植物遺伝子プロモーターとが結合している発現カセット、および、該発現カセットと構成的に発現する植物プロモーターに連結された薬剤耐性遺伝子とから構成される発現ベクターからなる群から選択される形態で植物に導入されている。
【０００９】
好適な実施態様においては、前記組換え遺伝子が、前記双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子と植物遺伝子とがタバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域を介して結合している組換え遺伝子である。
【００１０】
好適な実施態様においては、前記Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａが植物タンパク質のシグナル配列と結合している。
【００１１】
好適な実施態様においては、前記植物遺伝子プロモーターが誘導性のタバコＰＲ１ａ遺伝子のプロモーターである。
【００１２】
好適な実施態様においては、前記発現カセットがタバコＰＲ１ａ遺伝子由来のターミネーターを有している。
【００１３】
好適な実施態様においては、前記発現ベクターが、さらにＴ−ＤＮＡ領域と薬剤耐性遺伝子とを有している。
【００１４】
好適な実施態様においては、前記薬剤耐性遺伝子がカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターで発現される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明を詳しく説明する。
【００１６】
本願明細書で使用する用語「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。特に好ましい植物として、タバコ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、イネ、ジャガイモ、トマト、オオムギ、コムギおよびリンゴが挙げられる。
【００１７】
本願明細書で使用する用語「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現する公知のプロモーターを意味する。例えば、タバコの感染特異的タンパク質ＰＲ１ａのプロモーター（以下、タバコＰＲ１ａプロモーターという）などのある種のストレスにより発現が誘導されるプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターという）、ノパリン合成酵素のプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。高発現のためにはエンハンサーが用いられ得る。エンハンサーとしては、上記３５Ｓプロモーター上流の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは複数個用いられ得る。
【００１８】
本願明細書で使用する用語「植物遺伝子」は、植物が有する遺伝子を意味する。植物遺伝子としては、いずれの遺伝子も使用され得る。好適にはタバコの感染特異的タンパク質ＰＲ１ａ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
本願明細書で使用する用語「タバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域」とは、タバコのキチナーゼタンパク質中で異なる機能領域（キチン結合領域と触媒領域）を隔てている領域をいう。Ｈ．Ｓｈｉｎｓｈｉ  ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅ．  Ｂｉｏｌ．  １４巻、３５７−３６８（１９９０）を参照のこと。  植物遺伝子と外来遺伝子との連結部分にタバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域が存在することにより、各々のタンパク質の立体障害を避け得ることが期待される。
【００２０】
本願明細書で使用する用語「外来遺伝子」とは、宿主植物にとって異種のタンパク質をコードする遺伝子をいう。植物遺伝子、バクテリア、酵母などの微生物の遺伝子、昆虫の遺伝子、動物の遺伝子などが好適に用いられ得る。耐病性植物を育種する場合等には、抗菌性ペプチドが外来性遺伝子として用いられ得る。
【００２１】
例えば、双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドをコードする遺伝子をいうが、これに限定されない。双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドとしては、センチニクバエに由来するＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ、ザーペシン、または抗真菌タンパクが好ましいが、これらに限定されない。発現カセットに導入する外来遺伝子にはシグナル配列が付加され得、これにより生じる融合タンパク質は分泌され得る。
【００２２】
Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの遺伝子配列は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２３９巻  ７１７頁  （１９８６）に記載されている。
【００２３】
本願発明の、外来遺伝子と植物遺伝子とがタバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域を介して結合している組換え遺伝子の作成には、公知の遺伝子組換え技術が使用され得る。
【００２４】
本願明細書で使用する用語「発現カセット」とは、上記組換え遺伝子が発現し得るように、上記組換え遺伝子とその発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。発現カセットは常法に従って構築され得る。適切なプロモーター、例えば、タバコＰＲ１ａプロモーターを、上記組換え遺伝子に結合させる。タバコＰＲ１ａプロモーターは、誘導性でかつ発現量の高いプロモーターとして知られている。さらに好適には、ターミネーターを上記組換え遺伝子に結合させ得る。
【００２５】
本願明細書で使用する用語「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。タバコのＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターは遺伝子の発現効率を高めることが確認されている。
【００２６】
本願明細書で使用する用語「発現ベクター」とは、上記発現カセットを宿主細胞中に伝達する媒体をいう。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本願発明の発現ベクターはさらにＴ−ＤＮＡ領域と薬剤耐性遺伝子とを有し得る。
【００２７】
薬剤耐性遺伝子としては、形質転換植物の選抜が容易であることが望ましい。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシンフォスフォトランスフェレース（ＮＰＴ）遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェレース遺伝子等が好適に用いられ得る。
【００２８】
薬剤耐性遺伝子を発現させるプロモーターとしては、上記植物遺伝子プロモーター、例えばタバコＰＲ１ａプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成プロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。好適には、構成的に高発現するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが使用され得る。上記発現カセットに外来遺伝子を発現させるプロモーターとして誘導性のタバコＰＲ１ａプロモーターを用いると、このＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって、この誘導性のＰＲ１ａプロモーターが構成的に発現され、かつ、サリチル酸あるいは病原体感染に伴う壊死病斑形成によって、ＰＲ１ａプロモーター発現量が増大される。これは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＰＲ１ａプロモーターとが隣り合って存在するため、ＰＲ１ａプロモーターの性質が３５Ｓプロモーター上にあるシスエレメントの影響を受けるからと考えられる。
【００２９】
発現ベクターの構築に用いるベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターあるいはｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられ得る。ｐＢＩ系のベクターはバイナリーベクター系あるいは中間ベクター系のようなアグロバクテリウムを介して植物に発現カセットを導入し得る。例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。ｐＵＣ系のベクターは、直接植物に発現カセットを導入し得る。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。本願では、ｐＴＲＡ系（Ｏｈｓｈｉｍａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２巻、９５−１０６頁（１９９０））のバイナリーベクターが好適に用いられ得る。この発現ベクターは、植物に導入され得る領域（Ｔ−領域）に融合遺伝子を含む発現カセットと、マーカー遺伝子としてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの支配下で発現されるＮＰＴ遺伝子を含んでいる。
【００３０】
本願発明の発現ベクターがＴ−領域を有する場合、そのＴ−領域構造に：
（１）アグロバクテリウムから植物に移行する際に、導入を意図する外来遺伝子が先に移行し、続いてマーカー遺伝子が移行する様にＴ−領域の右側に外来遺伝子を含む発現カセットが配置され得る。このため薬剤耐性によって選抜された形質転換植物は極めて高い確率で外来遺伝子を含み得る、および
（２）マーカー遺伝子の発現を支配するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと外来遺伝子の発現を支配するＰＲ１ａ遺伝子のプロモーターを隣り合わせに配置してある。このことにより、本来ＰＲ１ａプロモーターを用いて外来遺伝子を植物に発現させた場合非誘導条件下では発現が殆ど見られないが、おそらくＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの影響により非誘導状態でも構成的な発現を示し、なおかつ誘導により高いレベルの発現を示すようになる、という特徴を有する。
【００３１】
上記発現ベクターは、ＰＲ１ａプロモーターを用いると、サリチル酸あるいは病原体感染に伴う壊死病斑形成によって誘導的に発現量が増大する。
【００３２】
本願発明の発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作成され得る。
【００３３】
特開平７−２５０６８５で記載されている、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａを発現するプラスミドＰＳＴ１０も本願発明に使用し得る。
【００３４】
植物細胞への組換え遺伝子、発現カセット、あるいは発現ベクターの植物細胞への導入には、当業者に周知の方法が用いられ得る。
【００３５】
上記得られた発現カセット、あるいは発現ベクターを細胞に導入するには、上記のようにアグロバクテリウムを介する方法と直接細胞に導入する方法とがある。
【００３６】
アグロバクテリウムを介する方法は、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ６７，  ３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムに形質転換し、ついで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓ．  Ｂ．  Ｇｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）  に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。発現カセット、発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法がある。
【００３７】
発現カセット、発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性等の薬剤耐性で選択され、ついで、常法により、植物体に再生され得る。
【００３８】
形質転換された植物における外来遺伝子の発現の確認には、当業者に周知の方法が用いられ得る。例えば、形質転換された植物から可溶性のタンパク質を抽出し、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６６，  ３６８−３７９に記載のように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で抽出した蛋白質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、目的の蛋白質に対する抗体と反応させ、生じるバンドを免疫化学的に検出する事によって、発現が確認され得る。
【００３９】
本願発明の双翅目昆虫由来の抗細菌性ペプチドをコードする遺伝子を形質転換された植物が、病原糸状菌に耐性を有し得るか否かは、植物体に再生された形質転換植物およびコントロール植物を、それぞれ自家受粉させて得られる種子を薬剤耐性選抜の下で発芽させた幼植物を用いて決定され得る。この幼植物の生育する寒天培地上に病原菌を接種し、接種後適当な時間の経過後、緑色を示して生存している個体を抵抗性植物体と判定した。病原菌としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆ−３（ホウレンソウ萎凋菌）、  Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ苗立ち枯れ病菌）、  Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＡＧ−４  １２７２（ホウレンソウ株腐病菌）、およびＰｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｒ（タバコ舞病菌）などが挙げられる。
【００４０】
形質転換植物の病原糸状菌耐性の検定は、植物体に再生された形質転換植物およびコントロール植物の緑葉の表面に傷を付け、病原菌をすりつけることにより接種した後、一定期間後に淡褐色の病斑の大きさを評価することによっても行い得る。病原菌としては、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）、およびＢｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ（灰色カビ病菌）などが挙げられる。
【００４１】
試験管内でのＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗カビ実験は、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａを含む検定培地に、病原菌を前培養して得られる菌そうを接種し、一定時間毎に透過光のもとで伸長する菌糸のサイズを計測して、その面積を標準偏差と共に計算することにより行い得る。
【００４２】
【実施例】
以下実施例を挙げて本願発明を具体的に説明する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミド等は宝酒造株式会社、東洋紡績株式会社等から入手可能である。
【００４３】
（実施例１  組換え遺伝子および発現カセットの作成）
外来遺伝子と植物遺伝子とがタバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域を介して結合している組換え遺伝子を以下のように作成した。図１に基づいて説明する。
【００４４】
（１）  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片（ＰＲ１ａプロモーターの一部とＰＲ１ａ蛋白質のシグナルペプチドをコードする配列を有するＤＮＡ断片）の調製
図１に示すタバコＰＲ１ａ遺伝子のゲノミッククローンを有するプラスミドｐＰＲ−γ（Ｍ．Ｏｓｈｉｍａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５５巻、２４３ー２４６頁（１９８７））を鋳型として、ＰＲ１ａプロモーター領域にあるＸｈｏＩ部位からシグナルペプチドをコードしている領域までを増幅し、ＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片）を得た。Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片は、配列番号１の配列を有するプライマーＰＰＲ１ａ５１と配列番号２の配列を有するプライマーＳＰＲ１ａ３１とをプライマーとして、Ｐｆｕポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてＰＣＲで得られた断片である。このＰＣＲに用いたプライマーのうちＳＰＲ１ａ３１はＰＲ１ａ遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列と相補的な配列を有しているが、図２に示すように、塩基が一部置換されている。この塩基の置換により制限酵素部位Ｐｓｔ１が新たに導入されたが、コードするアミノ酸配列には変化がない。
【００４５】
（２）  ＴＰＲ１ａ断片（ＰＲ１ａ遺伝子のターミネーター領域を有するＤＮＡ断片）の調製
図１のタバコＰＲ１ａ遺伝子のゲノミッククローンを有するプラスミドｐＰＲ−γを鋳型として、ＰＲ１ａ遺伝子のターミネーター領域を有するＤＮＡ断片（ＴＰＲ１ａ断片）を得た。  ＴＰＲ１ａ断片は、配列番号３のプライマーＴＰＲ１ａ５１および配列番号４のプライマーＢＫＳＢＥを用いて、ＰＲ１ａのターミネーター領域をＰＣＲで増幅して得られたＤＮＡ断片である。このＰＣＲに用いたプライマーのうち、ＴＰＲ１ａ５１は５’端にＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ  １ａをコードするｃＤＮＡの３’端と相同な配列を有し、さらにその終止コドンの直後にＳａｃＩの認識配列を有する。また、終止コドン直前に、図３に示すように塩基が一部置換されている。この塩基の置換により制限酵素認識部位ＰｍａＣＩが新たに導入されたが、コードするアミノ酸配列には変化がない。他方、プライマーＢＫＳＢＥは、ｐＰＲ−γのベクター部分のＥｃｏｌＩ部位からＢａｍＨＩ部位までと相同な配列を持つ。この部位はｐＰＲ−γのＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターに相当する部分の３’端と隣接している。
【００４６】
（３）ＨＭＰＲ１ａ断片（タバコのキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域およびＰＲ１ａの成熟型タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡ断片）の調製
図１のタバコＰＲ１ａ遺伝子のゲノミッククローンを有するプラスミドｐＰＲ−γを鋳型として、ＰＲ１ａの成熟型タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡ断片（Ｈ  ＭＰＲ１ａ断片）を得た。  Ｈ  ＭＰＲ１ａ断片は、配列番号５のプライマーＨＭＰＰＲ１ａ５１および配列番号６のプライマーＭＰＲ１ａ３１を用いて、ＰＣＲにより増福された断片である。このＰＣＲに用いたプライマーのうち、ＨＭＰＲ１ａ５１は５’端にＴＰＲ１ａ５１のＰｍａＣＩ部位およびその周辺の１２塩基の配列と同一の配列を含み、さらにその３’側にタバコのキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域をコードする領域と同一の配列を有する。
【００４７】
また、ＭＰＲ１ａ３１は３’側の終止コドン直後に、制限酵素ＳａｃＩの認識部位が付加されている。
【００４８】
（４）ＭＳＡＲＣＯ断片（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎの成熟型ペプチドをコードする領域を有するＤＮＡ断片）の調製
Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａのｃＤＮＡを含む既知のプラスミドｐＴＯ１９（Ｎ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＣｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３９，  ７１７（１９８６））を鋳型として、  Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎの成熟型ペプチドをコードする領域を有するＤＮＡ断片（ＭＳＡＲＣＯ断片）を得た。このＭＳＡＲＣＯ断片は、配列番号７のプライマーＭＳＡＲＣＯ５１および配列番号８のプライマーＭＳＡＲＣＯ３１を用いてＳａｒｃｏｔｏｘｉｎの成熟型ペプヂドをコードする領域をＰＣＲにより増幅して得られたＤＮＡ断片である。プライマーＭＳＡＲＣＯ５１およびＭＳＡＲＣＯ３１の配列をそれぞれ図４および図５に示す。プライマーＭＳＡＲＣＯ５１は５’端付近にＳＰＲ１ａ３１のＰｓｔＩ部位およびその周辺の１４塩基と相補的な配列を持つ。ＭＳＡＲＣＯ３１は、図５に示すように終止コドンをコードする領域と相補的な配列周辺に制限酵素ＰｍａＣＩおよびＳａｃＩの認識部位が導入されている。この制限酵素部位の導入は、ＴＰＲ１ａ５１と同様にして行った。
【００４９】
（５）ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ断片（ＭＳＡＲＣＯ断片とＴＰＲ１ａ断片とを連結したＤＮＡ断片）の調製上記（４）で得られたＭＳＡＲＣＯ  ＤＮＡ断片と（２）で得られたＴＰＲ１ａ断片とを鋳型としてプライマーＭＳＡＲＣＯ３１およびＢＫＳＢＥを用いる組換えＰＣＲ法により増幅し、ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ断片を得た。
【００５０】
（６）組換え遺伝子の調製（Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片、Ｈ  ＭＰＲ１ａ断片およびＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａ断片の接続）
上記（１）で得られたＰ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片、（３）で得られたＨ  ＭＰＲ１ａ断片および（５）で得られた（２）と（４）との結合断片であるＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａ断片を、それぞれ、プラスミドｐＵＣ１８にクローニングし、それぞれ、  ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ、ｐＵＣ  Ｈ  ＭＰＲ１ａおよびｐＵＣ  ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａと命名した（図６を参照）。これらのプラスミドに目的の配列が正しく挿入されていることを、アプライドバイオシステム社製の塩基配列決定ｋｉｔおよび塩基配列解析装置を用いて確認した。これらの、ｐＵＣ１８にクローニングされ塩基配列を確認したＤＮＡを以後の遺伝子組換えの材料として用いた。配列番号７に、配列決定されたＰＲ１ａのターミネーター部分の塩基配列を示す。
【００５１】
以下、図６を参照しながら本願発明の組換え遺伝子の作成を説明する。
【００５２】
まず、プラスミドｐＰＲ−γのＰＲ１ａ遺伝子のプロモーター領域のＸｈｏＩ部位より上流（５’側）部分を制限酵索ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、得られた約１．６ｋｂの断片をＢｉｏ  １０１社製のＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ｋｉｔで精製した。他方、Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ断片をクローニングしたプラスミドｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで切断し、その切断部位に、上記精製した約１．６ｋｂの断片を挿入した。得られたプラスミド（ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ（２．４））はインサートとして全長のＰＲ１ａ遺伝子プロモーターおよびＰＲ１ａ遺伝子のシグナル配列をコードするＤＮＡ領域を含む。このプラスミドはＥｃｏＲＩで切り出される、タバコＰＲ１ａプロモーターのカセットを有している。
【００５３】
ｐＵＣ  ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａに相当するＤＮＡ断片を精製した。この断片を、ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ（２．４）のＰｓｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドのうち挿入されたＤＮＡ配列が正しくＰ＋Ｓ  ＰＲ１ａ−  ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａの方向に挿入されているプラスミド（ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａ）を選択した。このプラスミドは、ＥｃｏＲＩで切り出される、タバコＰＲ１ａプロモーターによって支配される、発現可能な非融合Ｓａｒａｃｏｔｏｘｉｎをコードする遺伝子のカセット（カセットＰＳＳ）を有している。
【００５４】
ついで、プラスミドｐＵＣ  Ｈ  ＭＰＲ１ａからＨ  ＭＰＲ１ａ部分を制限酵素ＰｍａＣＩ，  ＳａｃＩにより切り出した。他方、ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ−ＴＰＲ１ａをＰｍａＣＩ−ＳａｃＩで切断し、その部位に切り出したＨ  ＭＰＲ１ａ部分を挿入した（ｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ  Ｈ  ＭＰＲ１ａ  ＴＰＲ）。このプラスミドは、外来遺伝子として双翅目昆虫由来の抗菌性ペプチドであるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの遺伝子と、植物遺伝子としてタバコＰＲ１ａタンパク質遺伝子とを、タバコキチナーゼのｈｉｎｇｅ領域を介して連結させた本願発明の組換え遺伝子を含有している。さらに、このプラスミドは、タバコＰＲ１ａプロモーターによって支配されるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ−ＰＲ１ａ融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を有しており、このプラスミドを、ＥｃｏＲＩで切断すると、タバコＰＲ１ａプロモーターによって支配される発現可能なＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ−ｈｉｎｇｅ−ＰＲ１ａ融合タンパク質をコードする組換え遺伝子、  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ  Ｈ  ＭＰＲ１ａ  ＴＰＲ、つまり、本願発明の組換え遺伝子を発現する発現カセット（カセットＰＳＰ）を有している。
【００５５】
（実施例２  発現ベクターの構築）
バイナリーベクターｐＴＲＡ４１５（図７）（Ｏｈｓｈｉｍａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２巻、９５−１０６頁（１９９０））は、ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片内に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流にＮＰＴ遺伝子が結合した配列を有する。特願平８−６８８０９に記載される方法に従って、このｐＴＲＡ４１５をＢｇｌＩＩで切断し、ライゲース（ｌｉｇａｓｅ）によって再連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、ｐＴＲＡ４１５のＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片が逆の方向に挿入されたプラスミド（ｐＴＲＡ４１５（Ｒ））を作製した。ｐＴＲＡ４１５（Ｒ）はＴ−領域内部にマーカー遺伝子としてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで支配されるＮＰＴ遺伝子を有し、その右側にｐＴＲＡ４１５（Ｒ）内で一箇所だけ切断する（ユニークな）制限酵素切断部位として、ＥｃｏＲＩ部位を持つ。このＥｃｏＲＩ部位に外来遺伝子を導入した場合、この外来遺伝子が植物に移行した後にマーカー遺伝子が移行される。
【００５６】
上記プラスミドｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ  ＴＰＲ  （非融合Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎを発現するプラスミド）をＥｃｏＲＩで切断し、カセットＰＳＳを切り出し、ｐＴＲＡ４１５（Ｒ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたプラスミドから、挿入された発現カセットのＰＲ１ａプロモーターがマーカー遺伝子のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと隣接するように挿入されているものを選抜した（プラスミドＰＳＳ）。
【００５７】
同様に、プラスミドｐＵＣ  Ｐ＋Ｓ  ＰＲ１ａ（２．４）  ＭＳＡＲＣＯ  Ｈ  ＭＰＲ１ａ  ＴＰＲ（融合Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ−ＰＲ１ａタンパク質を発現するプラスミド）をＥｃｏＲＩで切断し、カセットＰＳＰを切り出し、ｐＴＲＡ４１５（Ｒ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。得られたプラスミドから、挿入された発現カセットのＰＲ１ａプロモーターがマーカー遺伝子のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと隣接するように挿入されているものを選抜した（プラスミドＰＳＰ）。  ＰＳＰおよびＰＳＳのプラスミドの模式図を図８に示す。
【００５８】
（実施例３  発現ベクターのタバコへの導入）
（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの形質転換
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを２５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを含む培地中、２８℃で培養しＮａｇｅｌら（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ６７，  ３２５（１９９０））の方法に従って、細胞培養液を調製し、発現ベクター（プラスミドＰＳＰ、およびプラスミドＰＳＳ）をエレクトロポレーションにより上記細菌に導入した。用いたＰＳＰおよびＰＳＳのプラスミドの模式図を図８に示す。
【００５９】
（２）タバコの形質転換
上記方法でプラスミドＰＳＰおよびプラスミドＰＳＳで形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを得、ＹＥＢ培地（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ第２巻７８頁）で振とう培養した後、減菌水で２０倍に希釈し、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ）の葉片を共存培養した。２〜３日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を除去し、２週間ごとに選択培地で継代し、形質転換したタバコ細胞を選抜し、定法により再分化した結果、独立した形質転換個体を得た。
【００６０】
同様にして、プラスミドＰＳＳで形質転換された形質転換個体を得た。
【００６１】
（実施例４  形質転換植物におけるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ発現のウェスタンブロッティングによる検出）
得られたＰＳＰおよびＰＳＳで形質転換されたタバコ形質転換植物からそれぞれ可溶性のタンパク質抽出液を調製した。タバコの葉から直径約７ｍｍの葉片４枚を切り取りサリチル酸０．５ｍＭ水溶液上に、および対象として純水上に、浮遊させた状態で２日間培養した後、２０μｌの５０ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ４（ｐＨ７．０），  １ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ，  １０μＭ  Ａ−ＰＭＳＦ，  ０．５μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，  ２ｍＭ  ＤＴＴ中ですりつぶし、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行い上清を回収しタンパク質抽出液とした。この抽出液のうち２．５μｌをＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６６，  ３６８−３７９で示されているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、抗Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ抗体と反応するバンドを免疫化学的に検出した。これにより形質転換植物においてＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ遺伝子が発現し、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎが合成されていることを確認した。
【００６２】
（実施例５  試験管内におけるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗糸状菌活性の測定）
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆ−３（ホウレンソウ萎凋菌）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ苗立ち枯れ病菌）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＡＧ−４  １２７２（ホウレンソウ株腐病菌）に対する、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗糸状菌活性の測定を行った。
【００６３】
Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａに抗糸状菌活性があること、およびその測定方法は知られていないので、まず前培養培地および検定用培地を種々検討した。前培養培地としては短期間で菌そうが均一に拡大するものを選択し、および検定用培地としてはできるだけ菌糸の伸長を抑え、確認しやすいものを選んだ。
【００６４】
（１）検定用プレートの調製
検定用培地とした、以下の３種類の培地を用意した。
【００６５】
（ｉ）Ｃｚａｐｅｋ改変培地（１リットル当たり：１０ｇ  ショ糖、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．０ｇ  ＮａＮＯ３、０．０１ｇ  Ｆｅ２（ＳＯ４）３、１．０ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ  ＫＣｌ、１５ｇ  アガロース、ｐＨ６．８〜７．０；Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＡＧ−４  １２７２（ホウレンソウ株腐病菌）で使用）、（ｉｉ）５倍希釈ＰＤＡ培地（１リットル当たり：７．８ｇ  Ｂａｃｔｏ（登録商標）Ｐｏｔｅｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、１２ｇ  アガロース；Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆ−３（ホウレンソウ萎凋菌）で使用）、（ｉｉｉ）Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（１５ｇ／ｌ  アガロース、ｐＨ５．８；Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ苗立ち枯れ病菌で使用））。
【００６６】
検定用培地をオートクレーブして、５０℃以下に下がったところでＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ（ペプチド合成により合成し、ＨＰＬＣにより、９９％以上に精製した標品）を添加し、１２ウェルマイクロプレートにウェル当たり４００μｌを注入して固化させた。最終のＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの濃度は、図９〜１１に記載の通りである。
【００６７】
（２）病原性糸状菌の接種
（ａ）前培養
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆ−３（ホウレンソウ萎凋菌）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ苗立ち枯れ病菌）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＡＧ−４  １２７２（ホウレンソウ株腐病菌）をＰＤＡ培地（３９ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ（登録商標）Ｐｏｔｅｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ）で２日間、２２℃で前培養した。
【００６８】
（ｂ）病原糸状菌の接種
９ｃｍシャーレの培地表面にほぼ全面に拡がった各菌糸の最も外側の菌そうを、直径４ｍｍのコルクボーラで打ち抜き、検定用プレートのウェルの中央に、菌そうの表面を下にしておいた。この検定用プレートを暗黒下、２２℃で保温した。
【００６９】
（ｃ）抗糸状菌の検定
上記の病原糸状菌を接種した検定用プレートを、一定時間毎に、透過光のもとで伸長する菌糸のサイズを計測して、その面積を標準偏差と共に計算した（図９、図１０、図１１）。これらの図に示されるように、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗カビ性は濃度依存性を示した。従って、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａが糸状菌に有効であると推察された。
【００７０】
（実施例６  Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ遺伝子導入タバコにおけるＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ立ち枯れ病菌抵抗性））
ＰＳＰまたはＰＳＳを有するアグロバクテリウムで形質転換した形質転換タバコ、および対照実験として３５Ｓ−ＧＵＳを形質転換したタバコを自家受粉することにより得られた種子をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む培地に播種し、２０日経過した草丈約８ｍｍの幼植物を使用した。ＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．およびＳｋｏｏｇ，Ｆ．  （１９６２）  Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｕｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５巻  ４７３−４９７頁を参照）を含む直径９ｃｍのシャーレにこの幼植物３０本を均一に植えて、３日間置いた。次いでＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ立ち枯れ病菌）を前培養して得られる菌そうを３ｍｍ角に切り取り、シャーレ当たり７片を均等に寒天上に置くことにより菌を接種し、２２℃に保温した。接種後６日目に緑色を示して生存している個体を抵抗性植物体とした。結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
0003590832.tif 000002
【００７２】
ＰＳＰまたはＰＳＳで形質転換された形質転換植物は、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（キュウリ立ち枯れ病菌）に対して抵抗性を示した。表中の括弧内の数字は、抵抗性個体の中でも正常な緑色を示し、特に旺盛な生育を続けている個体数を示す。
【００７３】
（実施例７  Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ遺伝子導入タバコにおけるＰｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ（タバコ舞病菌）抵抗性）
ＰＳＰまたはＰＳＳを有するアグロバクテリウムで形質転換した形質転換タバコ、および対照実験として３５Ｓ−ＧＵＳを形質転換したタバコを自家受粉することにより得られた種子を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む培地に播種し、２０日経過した草丈約８ｍｍの幼植物を使用した。ＭＳ寒天培地を含む直径９ｃｍのシャーレにこの幼植物３０本を均一に植えて、１日間置いた。次いでＰｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ（タバコ舞病菌）を前培養して得られる菌そうを３ｍｍ角に切り取り、シャーレ当たり７片を均等に寒天上に置くことにより菌を接種し、２２℃に保温した。接種後１４日目に緑色を示して生存している個体を抵抗性植物体とした。結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
0003590832.tif 000003
【００７５】
ＰＳＰまたはＰＳＳで形質転換された形質転換植物は、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ（タバコ舞病菌）に対して抵抗性を示した。表中の括弧内の数字は、抵抗性個体の中でも正常な緑色を示し、特に旺盛な生育を続けている個体数を示す。
【００７６】
（実施例８  Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ遺伝子導入タバコにおけるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）抵抗性）
ＰＳＰまたはＰＳＳを有する形質転換当代の植物およびコントロール植物の葉の表面の６箇所に、それぞれ小薬匙の背（幅６ｍｍ程度のステンレス板状）でこすることにより傷を付けた。前培養したＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）の菌そうが広がった平板培地を約３ｍｍ角の大きさに切ったものを傷を付けた部位に置き、これを小薬匙でこすりつけることによって菌を接種した。一定期間後にそれぞれの接種部位の病徴（褐色病斑の大きさ）の程度を調査し、６箇所の合計をもってその植物の病徴指数とした。
【００７７】
病斑の評価を以下の数字で表した。
【００７８】
０  病斑は見られない。
【００７９】
１  直径が５ｍｍ以下の褐色の病斑あり。
【００８０】
２  直径が５ｍｍ−１０ｍｍの褐色の病斑あり。
【００８１】
３  直径が１０ｍｍ−２０ｍｍの褐色の病斑あり。
【００８２】
４  直径が２０ｍｍ以上の褐色の病斑あり。
【００８３】
このとき高い抵抗性を示した形質転換タバコ６個体、およびコントロール植物の結果をそれぞれ図１２に示す。  Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａ遺伝子が導入された植物の中からＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）による感染に高い抵抗性を示すものが得られた。特に、ＰＳＳ植物においては全く病徴を示さないものが２個体見られた。
【００８４】
【発明の効果】
植物に抗細菌性ペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、抗細菌性のみならず、病原性糸状菌に対しても耐性を有する植物の提供が可能となった。
【００８５】
【配列表】
【００８６】
【配列番号：１】
0003590832.tif 000004
【００８７】
【配列番号：２】
0003590832.tif 000005
【００８８】
【配列番号：３】
0003590832.tif 000006
【００８９】
【配列番号：４】
0003590832.tif 000007
【００９０】
【配列番号：５】
0003590832.tif 000008
【００９１】
【配列番号：６】
0003590832.tif 000009
【００９２】
【配列番号：７】
0003590832.tif 000010
【００９３】
【配列番号：８】
0003590832.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】タバコＰＲ１ａ遺伝子のゲノミッククローンを有するプラスミドｐＰＲ−γを示す図である。
【図２】プライマーＳＰＲ１ａ３１の置換された配列を示す図である。
【図３】プライマーＴＰＲ１ａ５１の置換された配列を示す図である。
【図４】プライマーＭＳＡＲＣＯ５１の配列を示す図である。
【図５】プライマーＭＳＡＲＣＯ３１の置換された配列を示す図である。
【図６】本願発明の組換え遺伝子の作成を説明する図である。
【図７】バイナリーベクターｐＴＲＡ４１５およびｐＴＲＡ４１５（Ｒ）を示す図である。
【図８】本願発明に用いた各プラスミドＰＳＰ、ＰＳＳを示す図である。
【図９】試験管内におけるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗−Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｆ−３（抗ホウレンソウ萎凋菌）試験の結果を示す。
【図１０】試験管内におけるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗−Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ  ＡＧ−４  １２７２（抗ホウレンソウ株腐病菌）試験の結果を示す。
【図１１】試験管内におけるＳａｒｃｏｔｏｘｉｎ１ａの抗−Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（抗キュウリ苗立ち枯れ病菌）試験の結果を示す。
【図１２】形質転換された植物のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（疫病菌）抵抗性を示す図である。
【図１】
0003590832.tif 000012
【図２】
0003590832.tif 000013
【図３】
0003590832.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
0003590832.tif 000017
【図７】
0003590832.tif 000018
【図８】
0003590832.tif 000019
【図９】
0003590832.tif 000020
【図１０】
0003590832.tif 000021
【図１１】
0003590832.tif 000022
【図１２】
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