(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノデキストランを含むコロイド粒子であって該アミノデキストランの外側被膜上に複数の側官能基を有するコロイド粒子であっても、各コロイド粒子は固体金属核物質と、該核物質を被覆する第１のゼラチン層とアミノデキストランの第２の層とからなり、第１のゼラチン層はブルーム数が60〜225のＢ型のアルカリ硬化ゼラチンからなり、該２つの層は（ａ）化学架橋剤の作用で架橋されているか、あるいは（ｂ）該ゼラチンと該アミノデキストランとの間の縮合反応によって結合されており、このような層構成を有する粒子の大部分の粒子は側官能基を有する個々の粒子として貯蔵可能となっている、コロイド粒子。
【請求項２】
上記核物質の表面が疎水性であることを特徴とする請求の範囲１記載の粒子。
【請求項３】
上記核物質が0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲１記載の粒子。
【請求項４】
上記核物質が0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲３記載の粒子。
【請求項５】
上記架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求の範囲１記載の粒子。
【請求項６】
上記アミノデキストランが1X,2X,3Xおよび5X−アミノデキストランから成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲１または２記載の粒子。
【請求項７】
上記アミノデキストランが5X−アミノデキストランであることを特徴とする請求の範囲６記載の粒子。
【請求項８】
上記側官能基が、アミノ基、マレイミジル基、スルフヒドリル基および生体物質から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲１または２記載の粒子。
【請求項９】
生体物質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および生物細胞から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲８記載の粒子。
【請求項１０】
アミノデキストランを含むコロイド粒子であって該アミノデキストランの外側被膜上に複数の側官能基を有するコロイド粒子の製造方法であって、該製造方法は、
（ａ）固体金属核物質を、ブルーム数が60〜225のＢ型のアルカリ硬化ゼラチンで被覆し、
（ｂ）（ａ）における生成物をアミノデキストランで被覆し、
（ｃ）該２つの層を、（ｃ−１）化学架橋剤の作用で架橋するか、あるいは（ｃ−２）該ゼラチンと該アミノデキストランとの間の縮合反応によって結合し、
（ｄ）段階（ｃ−２）の場合には、生成物の表面上に存在するすべての遊離、未反応架橋剤官能基を、上記基とポリアミンとの反応により、少なくとも１つのポリアミン−NH2基が未反応架橋剤官能基と反応し、少なくとも１つのポリアミン−NH2基が未反応のままであるように遮断し；
（ｅ）段階（ｄ）または段階（ｃ）（ｉ）の生成物を洗浄して、ゼラチンおよび／またはアミノデキストランで被覆されており、側官能基を有する固体疎水性、非ゼラチン、非アミノデキストラン核を有するコロイド粒子を得ることを特徴とするコロイド粒子の製造方法。
【請求項１１】
上記核物質が0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲10記載の方法。
【請求項１２】
上記核物質が0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲11記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｄ）の生成物を：
（ａ）側スルフヒドリル基を有する生成物を生成する試薬、
（ｂ）側マレイミジル基を有する生成物を生成する試薬、
（ｃ）側生体物質を有する生成物を生成する試薬
から成る群から選択された少なくとも１種の物質と反応させていることを特徴とする請求の範囲10記載の方法。
【請求項１４】
上記生体物質を、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および生物細胞から成る群から選択することを特徴とする請求の範囲13記載の方法。
【請求項１５】
上記アミノデキストランを1X,2X,3Xおよび5X−アミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求の範囲10または13記載の方法。
【請求項１６】
上記アミノデキストランが5X−アミノデキストランであることを特徴とする請求の範囲10または13記載の方法。
【請求項１７】
上記ポリアミンを、エチレンジアミン、1,3−ジアミノプロパン、1,4−シクロヘキサンジアミン、1,4−シクロヘキセンジアミン、1,4−フェニレンジアミン、ジエチレントリアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求の範囲10または13記載の方法。
【請求項１８】
複数の側官能基を有するコロイド粒子において、
各粒子がＢ型、ブルーム数60〜225のアルカリ硬化ゼラチンの第１ゼラチン層およびアミノデキストランの第２層を被覆した固体核を有し、上記層が、（ａ）化学架橋剤の作用により架橋されているかまたは（ｂ）上記ゼラチンと上記アミノデキストランとの間の縮合反応により結合されており、これにより上記のように層を有する粒子が、側官能基を有する、主に別個のコロイド粒子として貯蔵可能であることを特徴とするコロイド粒子。
【請求項１９】
上記固体核が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項２０】
上記固体核が0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項２１】
上記固体核が約0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項２２】
上記化学架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求の範囲18または19記載の粒子。
【請求項２３】
上記官能基がアミノ基であることを特徴とする請求の範囲18または19記載の粒子。
【請求項２４】
上記官能基が、マレイミジル基およびスルフヒドリル基から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲18または19記載の粒子。
【請求項２５】
生体物質が上記マレイミジル基およびスルフヒドリル基のいずれかに結合していることを特徴とする請求の範囲24記載の粒子。
【請求項２６】
上記生体物質が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲25記載の粒子。
【請求項２７】
上記生体物質が、スルフヒドリル置換基およびマレイミジル置換基から成る群から選択された反応性置換基を有し、さらに粒子官能基がマレイミジル基である際には生体置換基がスルフヒドリル基であり、粒子官能基がスルフヒドリル基である際には生体物質置換基がマレイミジル基であることを特徴とする請求の範囲25記載の粒子。
【請求項２８】
上記抗体が反応性スルフヒドリルまたはマレイミジル置換基を有することを特徴とする請求の範囲26記載の粒子。
【請求項２９】
上記官能基が、上記ゼラチン／アミノデキストランで被覆した核に結合した生体物質を有することを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項３０】
上記生体物質が、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲29記載の粒子。
【請求項３１】
上記官能基がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項３２】
上記官能基がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲18記載の粒子。
【請求項３３】
それぞれが架橋または縮合したＢ型、ブルーム数60〜225のアルカリ硬化ゼラチンの層およびアミノデキストランで被覆された固体核を有し、側官能基を有する別個のコロイド粒子を製造するにあたり、
（ａ）（ｉ）（１）上記ゼラチン中に金属核粒子を製造するかまたは（２）金属粒子を含む予備成形した粒子上に第１層として上記ゼラチンを吸着させ、ゼラチン被覆した粒子の表面上に第２層としてアミノデキストランを吸着させ；
（ii）段階（ａ）（ｉ）の被膜を化学架橋剤の作用により架橋させ；
（iii）段階（ａ）（ii）の生成物の表面上に存在する遊離、未反応架橋剤官能基を、上記基と十分なポリアミンとの反応により、１つのアミノ−NH2基が上記未反応架橋剤官能基と反応し、他の−NH2基が未反応のままであるように遮断するかまたは；
（ｂ）（１）上記ゼラチン中に金属核粒子を製造するかまたは（２）磁性粒子を含む予備成形した粒子上に第１層として上記ゼラチンを吸着させ、第２層としてアミノデキストランを縮合反応させることにより上記ゼラチンに結合させ；
（ｃ）段階（ａ）および（ｂ）の被覆した粒子を分離し、これを洗浄し、所要に応じて上記粒子を、二官能価架橋試薬との反応により誘導体化して、付加的な側官能基を有するコロイド粒子を得ることを特徴とするコロイド粒子の製造方法。
【請求項３４】
上記固体核が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求の範囲33記載の方法。
【請求項３５】
上記核粒子が約0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲33記載の方法。
【請求項３６】
上記核粒子が約0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲33記載の方法。
【請求項３７】
化学架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求の範囲33または34記載の方法。
【請求項３８】
上記ポリアミンを、エチレンジアミン、1,3−ジアミノプロパン、1,4−シクロヘキサンジアミン、1,4−シクロヘキセンジアミン、1,4−フェニレンジアミン、ジエチレントリアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求の範囲33または34記載の方法。
【請求項３９】
ポリアミンを、エチレンジアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求の範囲33または34記載の方法。
【請求項４０】
上記官能基を、マレイミジル基およびスルフヒドリル基から成る群から選択することを特徴とする請求の範囲33または34記載の方法。
【請求項４１】
上記官能基が、段階（ｃ）の生成物に結合した生体物質であり、反応性スルフヒドリルまたはマレイミジル置換基を有するかまたはこれらを有するように誘導体化された生体物質から成る群から選択することを特徴とする請求の範囲33または34記載の方法。
【請求項４２】
上記生体物質を、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から成る群から選択することを特徴とする請求の範囲41記載の方法。
【請求項４３】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が共有結合した粒子において、上記粒子のそれぞれが：
（ａ）コロイドの大きさの固体核物質；
（ｂ）（ｉ）上記核物質の表面上に化学架橋剤により架橋した第１ゼラチン被膜および第２アミノデキストラン被膜または
（ii）上記固体核の表面上に吸着した第１ゼラチン被膜および上記ゼラチン被膜上に縮合反応により結合した第２アミノデキストラン被膜（ここで上記ゼラチン被膜はＢ型、ブルーム数60〜225のアルカリ硬化ゼラチンから成る）；
（ｃ）抗体；および
（ｄ）一方の末端が上記アミノデキストランに共有結合し、他の末端が上記抗体に共有結合した架橋基を有することを特徴とする粒子。
【請求項４４】
上記固体核が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求の範囲43記載の粒子。
【請求項４５】
上記固体核材料が約0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲43記載の粒子。
【請求項４６】
上記固体核材料が0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲43記載の粒子。
【請求項４７】
化学架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求の範囲43または44記載の粒子。
【請求項４８】
上記架橋基が、上記架橋したゼラチンの表面に結合したアミノ基および反応性マレイミジルまたはスルフヒドリル基を有する部分に結合した他のアミノ基を有するポリアミンを有し、上記ポリアミンが、エチレンジアミン、1,3−ジアミノプロパン、1,4−シクロヘキサンジアミン、1,4−シクロヘキセンジアミン、1,4−フェニレンジアミンおよびジエチレントリアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲43または44記載の粒子。
【請求項４９】
上記ポリアミンがエチレンジアミンおよびアミノデキストランであることを特徴とする請求の範囲43または44記載の粒子。
【請求項５０】
上記抗体が、スルフヒドリル置換基およびマレイミジル置換基から成る群から選択された反応性置換基を有し、上記スルフヒドリル置換基が上記抗体上に本来的に存在するかあるいは上記抗体上に本来的に存在するアミノ基の２−イミノチオラン塩酸塩での変性により形成したものであり、上記マレイミジル置換基が、上記抗体上のアミノ基のマレイミジル含有試薬での変性により存在していることを特徴とする請求の範囲43または44記載の粒子。
【請求項５１】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が結合した粒子を製造するにあたり：
（Ｉ）（ａ）金属粒子を含む予備成形した固体核材料を、Ｂ型、ブルーム数60〜225のアルカリ硬化ゼラチンの１％w/v水溶液とを混合することにより被覆し、分離し、さらに上記粒子をアミノデキストラン溶液で洗浄し；
（ｂ）段階（ａ）の洗浄した粒子を、アミノデキストラン水溶液中に懸濁させて段階（ｃ）において用いるまで約６か月までの範囲で貯蔵するかまたは段階（ｃ）において段階（ａ）の粒子を直ちに用い；
（ｃ）段階（ａ）の粒子または段階（ｂ）の貯蔵しその後分離した粒子をアミノデキストラン被膜溶液中に懸濁させ；
（ｄ）段階（ｃ）の懸濁液をグルタルアルデヒド溶液と約１時間混合し、これにより表面に吸着したゼラチン／アミノデキストランを架橋させ；
（ｅ）エチレンジアミンを段階（ｄ）の懸濁液に加え、新たな懸濁液を１〜４時間混合し；
（ｆ）段階（ｅ）の懸濁液にNaBH4を加え、新たな懸濁液を混合し；
（ｇ）段階（ｆ）の粒子を懸濁溶液から分離し、粒子を0.2M  NaCl水溶液で洗浄し；
（ｈ）混合しながら、段階（ｆ）または（ｇ）で形成した粒子を周囲温度で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを含む0.2M  NaCl水溶液中のエチレンジアミンと反応させ；
（ｉ）段階（ｈ）の粒子を反応溶液から分離し、これをリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し；
（ｊ）段階（ｉ）の粒子を周囲温度でリン酸緩衝塩類溶液中の二官能価架橋剤と約0.50〜1.5時間反応させて、未反応末端マレイミジルまたはスルフヒドリル基が粒子の表面に結合した粒子を製造し；
（ｋ）段階（ｊ）の粒子を分離し、これをリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し；
（II）階（Ｉ）（ｋ）の粒子に結合させるための抗体を、上記抗体上のスルフヒドリル基またはマレイミジル基から成る反応性置換基を形成することにより個別に製造し；
（III）段階（Ｉ）（ｋ）の粒子と段階（II）の抗体とを混合しながら約１〜３時間反応させ、これにより上記抗体の上記反応性置換基を粒子の反応性基に結合させ、形成した抗体を含む粒子を反応媒体から分離し、これを緩衝塩類溶液で洗浄し；
（IV）段階（III）の生成物上に存在する未反応基を遮断し；
（Ｖ）段階（IV）の抗体を含む粒子を分離し、リン酸緩衝塩類溶液中の0.1％NaN3中の約１％ウシ血清アルブミンで洗浄し、洗浄した粒子を上記溶液中で約４刧で８〜16時間分類し、抗体を含む粒子を分離し、再び粒子をウシ血清アルブミン緩衝溶液で洗浄し、形成した抗体を含む粒子を用いる必要があるまでリン酸緩衝塩類溶液中の約１％ウシ血清アルブミン、0.1％  NaN3中に貯蔵することを特徴とする粒子の製造方法。
【請求項５２】
上記固体核材料が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求の範囲51記載の方法。
【請求項５３】
上記粒子が約0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲51記載の方法。
【請求項５４】
上記粒子が約0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲51記載の方法。
【請求項５５】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が結合した粒子を製造するにあたり：
（Ｉ）（ａ）金属粒子を含む予備成形した固体核材料をＢ型、ブルーム数60〜225のアルカリ硬化ゼラチンの１％w/v水溶液とを混合することにより被覆し；
（ｂ）段階（ａ）の粒子をアミノデキストランで、ゼラチンカルボン酸基とアミノデキストランアミノ基との間の縮合反応により被覆し；
（ｃ）段階（ｂ）の粒子を反応溶液から分離し、これをリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し；
（ｄ）段階（ｃ）の粒子を周囲温度でリン酸緩衝塩類溶液中の二官能価架橋剤と約0.50〜1.5時間反応させて、反応性末端マレイミジルまたはスルフヒドリル基が粒子の表面に結合した粒子を製造し；
（II）段階（Ｉ）（ｄ）の粒子に結合させるための抗体を、上記抗体上のスルフヒドリル基またはマレイミジル基から成る反応性置換基を形成することにより個別に製造し；
（III）段階（Ｉ）（ｄ）の粒子と段階（II）の抗体とを混合しながら約１〜３時間反応させ、これにより上記抗体の上記反応性置換基を粒子の反応性基に結合させ、形成した抗体を含む粒子を反応媒体から分離し、これを緩衝塩類溶液で洗浄し；
（IV）段階（III）の生成物上に存在する未反応基を遮断し；
（Ｖ）段階（IV）の抗体を含む粒子を分離し、リン酸緩衝塩類溶液中の0.1％NaN3中の約１％ウシ血清アルブミンで洗浄し、洗浄した粒子を上記溶液中で約４刧で８〜16時間貯蔵し、抗体を含む粒子を分離し、再び粒子をウシ血清アルブミン緩衝溶液で洗浄し、形成した抗体を含む粒子を用いる必要があるまでリン酸緩衝塩類溶液中の約１％ウシ血清アルブミン、0.1％  NaN3中に貯蔵することを特徴とする粒子の製造方法。
【請求項５６】
上記固体核材料が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求の範囲55記載の方法。
【請求項５７】
上記粒子が約0.1〜5.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲55記載の方法。
【請求項５８】
上記粒子が約0.1〜1.0ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求の範囲55記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は一般に、側官能基が結合した架橋ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜を有するコロイドの大きさの粒子に関する。特に本発明は、官能化されて側タンパク質、例えば抗体に結合する架橋ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜を有する重合体コロイド粒子、このような粒子を製造する方法およびこのような粒子のバイオアッセイにおける使用に関する。
背景技術
重合体粒子および磁性粒子を用いて化合物を結合させることは長く知られており、工業的および実験的方法において用いられている。例えば、メリフィールド（Merrifield）樹脂、架橋スチレン−ジビニルベンゼン回転楕円状ビーズは、最も早く、最も広く用いられる現代的な支持粒子（substrate particle）の一つである。これらは有機合成において均質な触媒を不均質化するために、および生物学的反応において用いられた。メリフィールド樹脂はかなり大きかったので、これらを濾過により容易に分離することができた。しかし、若干の分野において、コロイドの大きさの粒子を用いるのが望ましい。その理由は、結合する物質が少量であるか、高価であるかまたは比較的大きい粒子を用いるのが望ましくない方法において用いられるためである。これは特に、生化学分野においてあてはまる。
しかし、粒子がコロイドの大きさである場合には、濾過によりこれらを液体媒体から分離することは、長時間を要するかまたは困難になりうる。特に、コロイド粒子はフィルターの表面を被覆し、濾過工程を遅延させる傾向がある。磁性粒子、特に重合体被膜を有する磁性粒子を用いることは、大いに有用であることが見いだされた。その理由は、このような粒子は反応器の一方の側に磁気的に集まり、反応媒体の大部分を単にデカンテーションすることができるからである。ここで用いる「粒子」という用語は、球形、回転楕円状、ビーズおよび他の形状を同様に含み、他に特定しない限り、このような用語と交換可能に用いるものとする。
被覆した磁性粒子を用いることは、生物学的用途、特に抗体が粒子の表面被膜に結合する場合に特に有用であることが見いだされた。結合した抗体を用いて、多くの生体試料（biological sample）を含む試験試料から特定の生体物質（biological substance）を補集するかまたは所望の種を試料中に残して、不所望な種を試験試料から補集することができる。
また磁性球またはビーズとして知られている被覆した磁性粒子の種類を、４種の一般的な組に分けることができる。
1.磁性核および重合した単量体またはシラン処理剤の硬質殻被覆を有する核および殻ビーズ。Rembaumの米国特許第4,267,234号（強磁性流体核粒子の周辺のポリグルタルアルデヒド殻）;Czerlinskiの同第4,454,234号（サブミクロン磁性粒子の周辺の懸濁液または乳化重合被膜）;Whitehead等の同第4,554,088、4,695,392および4,695,393号（多分散の大きさおよび形状のシラン処理した磁性酸化物粒子）;Josephson）の同第4,672,040号（ポリシランで被覆した磁性粒子）;Margel等の同第4,783,336号（強磁性流体粒子の周辺の懸濁液重合ポリアクロレイン）;Owen等の同第4,795,698号（ウシ血清アルブミン被膜）；およびYudelsonの同第4,964,007号（ゼラチン−アラビアゴム−界面活性剤被膜）各明細書参照。
2.磁性核および架橋しているかまたは架橋していないランダムコイルまたは球形重合体のゆるい（loose）殻を有する核および殻ビーズ。Moldayの米国特許第4,452,773号（強磁性流体粒子の周辺のデキストラン被膜）；およびOwen等の同第4,795,698号（強磁性流体粒子の周辺のタンパク質例えばウシ血清アルブミン）各明細書参照。
3.ポリスチレンラテックス粒子中に均一に包埋された強磁性流体粒子により形成した磁性ラテックス材料。Daniel等の米国特許第4,358,388号明細書参照。
4.磁性材料、例えば重合体−フェライトまたは重合体磁赤鉄鉱複合系を充填した多孔質重合体粒子。K.Nustad等、「Monodisperse Polymer Particles In Immunoassays And Cell Separation」、Microspheres:Medical and Biological Applications,A.RembaumおよびZ.T6k s編（Boca Raton,Fla.:CRC Press,1988）第53〜75頁;C.D.Platsoucas等、「The Use Of Magnetic Monosized Polymer Particls For The Removal Of T Cells From Human Bone Marrow Cell Suspensions」、ibid.第89〜99頁；およびUghelstad等の国際特許出願公開第WO 83/03920号明細書（圧縮または多孔質粒子を鉄塩の溶液で処理することにより調製した重合体被覆磁性粒子およびこのような粒子の医学、診断または他の目的への使用）参照。
医学および生物学的用途におけるほどんどの重合体被覆磁性ビーズの有用性は、実際の考慮、例えば粒子の大きさおよび形状が均一であること、生体試薬が粒子に強力に結合することが必要であること、疎水性被膜より親水性重合体被膜が好ましいことおよび被膜が生物分解性であるか否かにより制限されていた。生体試薬がインビボで投与される場合には生物分解性は特に重要である一方、これはまた、種々の細胞の分類、分離およびアッセイ工程においても重要である。最も望ましい被覆した磁性粒子は以下の特徴を有する。
1.粒子は、生体試薬が被覆される表面積が最大になるように可能な限り小さくなければならないが、粒子はなお小さい磁石により容易に分離することができなければならない。大きさが小さく、表面積が大きいことは、可能な最小量の粒子を用いて目的とする物質を分離する；例えば、１つの段階において試料あたり106程度の細胞と相互作用し、これにより連続的添加および精密検査を回避するために望ましい。
2.抗体被覆粒子の細胞表面への非特異的結合が低くなければならない。粒子表面は親水性であるかまたは抗体が結合する親水性物質の被膜により覆われていなければならない。
3.粒子上の重合体および抗体層は互いに共有結合して解離およびコンホーメーションの変化を低減しなければならない。
4.磁性粒子上の被膜および抗体を重合体表面に結合させる任意の分子鎖は代謝可能でなければならない。
5.細胞の陽性選択において、生存可能な細胞を磁性粒子から迅速かつ容易に回収する機構を利用して、回収した細胞を培養することができるようにしなければならない。
6.細胞の陰性選択において、抗体被覆粒子は無菌であって、残りの細胞を培養することができるようにしなければならない。
7.細胞と他の生体物質とを磁気的に分離し、分離するために、好ましい磁性粒子は「柔軟な」磁性粒子である。即ち、硬質または永久磁性とは逆に、容易に磁化し、消磁することができる粒子である。粒子は強磁性、フェリ磁性または超常磁性（superparamagnetic）であることができる。強犠牲およびフェリ磁性粒子は大きさに制限はない一方、超常磁性粒子は、通常約40ナノメートルより小さい寸法を有する単一ドメイン構造（single domain structure）に限定される。（C.Kittel等、Solid State Physics 3:第437〜464頁（1956）。
それぞれの磁性複合粒子を上記の群のそれぞれから細胞分離工程において用いる際に問題が存在する。遭遇した問題のいくつかの例は、以下のものである：
1.強磁性流体核および通常の重合体の外殻粒子は磁気モーメントが小さすぎて、手で支えた永久磁石を用いて磁性粒子を採集し、分離する細胞分離に用いるのに実用的でない。このような粒子は、加工することができる物質の容量を激しく制限するハイフィールド（high−field）分離技術が必要であり、従ってスケールアップが制限される。
2.乳化重合により製造された強磁性流体−ポリスチレン粒子は、大きさを厳しく調整することができず、直径は約0.1〜４μｍの範囲内である。従って、このようなビーズに結合した抗体を用いて細胞を分離する際には、本質的に最も小さい磁気モーメントを有する極めて小さい、動的に可動である磁性粒子が、細胞表面上に抗原部位を優先的に占める傾向がある。この結果、形成した細胞−ビーズ結合体は分離を容易にするのに十分な非磁性モーメント（not magnetic moment）を有しない。
それぞれＢおよびＡ型のゼラチンの第１および第２層を有し、本明細書および係属中の優先権を伴う出願番号第07/607,253号明細書に教示されたように製造した磁性粒子を用いることにより、これらの問題が克服される。しかし、ゼラチンで被覆した粒子は、ある細胞、特に血小板および食細胞、例えば単球との非特異的相互作用に関する若干の問題を有することが見いだされた。ゼラチンのアミノ酸配列が（ラットおよび子牛皮膚コラーゲンのα−１鎖により例示されたように）、フィブロネクチンのRGD結合配列を複製するトリペプチド配列Arg−Gly−Asp（RGD）を含む３つの領域、細胞の付着を特異的に促進する細胞外マトリックスの成分を含むため、問題が発生した。これらの表面上に表された、フィブロネクチンを含むこれらの生物細胞は、架橋ゼラチンと同等であるコラーゲンに対して特異的な親和性を有する。例えば、白血球のサブセットの分離において用いられるゼラチンで被覆した磁性フェライト粒子を含む抗体もまた、血小板および単球の表面上のフィブロネクチンに結合する。この結果、単球および血小板が粒子および抗体特異性抗原を有するこれらの細胞と結合するため、非特異的な除去（depletion）が発生する。細胞の非特異的除去は、被覆した粒子上の最外被覆層としてアミノデキストランを用いることにより回避することができる。デキストラン誘導体を担体として用いることは、U.Manabe等、J.Lab.Clin.Med.104:第445〜454頁（1984）（抗体−ポリアルデヒドデキストラン−メトトレキセート）;L.B.Shin等、Intl.J.Cancer 41:第832〜839頁（1988）（抗体−アミノデキストラン−メトトレキセート）;A.R.Oseroff等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:第8744〜8748頁（1986）（抗体−アミノデキストラン−塩素  ６）;S.Rakestraw等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:第4217〜4221頁（1990）（抗体−デキストランヒドラジド−Sn（IV）塩素  ６）;R.J.Mrsnay等、Eur.J.Cell.Biol.45:第200〜208頁（1987）（ウアバイン−アミノデキストラン−金粒子）;J.W.M.Bulte等、Magnetic Res.25:第148〜157頁（1992）（抗粒子（anti particle））により討議されており；他のものはS.S.Wowg、「Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking」（CRC Press,Boca Raton,アメリカ合衆国フロリダ州、1991）に記載されている。
磁性粒子に加えて、親水性重合体被膜で被覆し、これにその後抗体が結合することができる、ポリスチレンラテックス（PSL）粒子が必要とされている。ここで、重合体を被覆したPSL粒子を、ビーズに基づく細胞集団分析およびイムノアッセイに用いることができる。しかし、製造された非磁性PSL粒子は通常、比較的低い密度の種々の官能基、例えばカルボキシルまたはアミノ基を有する。従って、被覆物質、例えばデキストランまたはゼラチンのPSL粒子の表面への共有結合は満足されない。
上記した種々の粒子は、生物学的技術において、種々の生体物質、特に抗体を固定するのに用いられている。このような粒子を用いるにあたり、共有結合による抗体の固定が、pHおよび用いられる各モノクローナル抗体に関する抗体濃度の注意深い個別の調整を必要とする抗体吸着による固定より好ましい。P.Bagchi等、J.Colloid Interface Sci.,83:第460〜478頁（1981）;J.Lyklema,Colloids and Surfaces,10:第33〜42頁（1984）;M.D.Bale等、J.Colloid Interface Sci.,125:第516〜525頁（1988）;C.C.Ho等、ibid.,121:第564〜570頁（1988）；「Proteins at Interfaces:Physecochemical and Biochemical Studies」、ACS Symposium Series,No.343,J.L.BrashおよびT.A.Horbett編（Washington:Amer.Chem.Soc.,1987）;W.Norde,Adv.Coll.Interface Sci.,25:第267〜340頁（1986）;A.V.Elgersma等、Abstracts of the 198th Amer.Chem.Soc.Meeting,アメリカ合衆国フロリダ州マイアミビーチ、1989年９月10〜15日、COLL 0131;およびD.E.Brooks,Annenberg Center for Health Sciences and H.B.Wallis Research Facility at Eisenhower Latex Conference,アメリカ合衆国フロリダ州オーランド、1989年12月４〜５日。しかし、pHおよび抗体を注意深く調整した際にも、吸着された抗体の配向が、活性な吸着された抗体が形成するようになることはほとんど確実でない。また、吸着された抗体は、抗体の粒子の表面からの脱着から生じる長期間貯蔵の問題を有する。さらに、タンパク質、例えば抗体は、タンパク質のp Iまたはこの付近において疎水性表面上の最大吸着を達成する傾向がある。しかし、帯電基間の静電気的相互作用が重要である場合には、吸着表面および吸着質は最終的に反対の電荷を有しなければならない。一方、共有結合方法は、これらの条件ほど感受性が高くない。
共有結合方法は、その後アミノデキストランで被覆され［R.S.Molday等、FEBS.Lett.,170:232〜238頁（1984）］、ここに参照として包含する係属中の出願番号第07/977,467号および07/255,743号明細書に記載されたように多くの抗体で誘導体化（derivatize）されるカルボキシ変性ラテックス中に包埋された磁鉄鉱の粒子に用いられている。抗体がIgGイソタイプである場合には、共有結合方法により、抗体と粒子との間の結合が抗体Fcまたはヒンジ部において発生し、抗体のFab部において発生しないことが確実になる。抗体が、Fab部のみが露出しているペンタメリック（pentameric）IgMイソタイプである場合には、１つのFab部の粒子への結合はなお露出している４つのFab部を残し、反応に有効である。
本発明は、側生体物質、例えばモノクローナル抗体が結合することができる、生物分解性を有する磁性および非磁性粒子の製造方法を提供する。本発明の粒子を種々の細胞分離およびアッセイ方法において用いることができる。磁性またはラテックス核材料上で用いられる被膜における生物分解性は、細胞分離技術において重要である。例えば、抗体は、ゼラチン／アミノデキストラン被覆磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子に結合することができる。従って、これらの粒子はタンパク質性被膜およびマンガン−鉄酸化物核を有し、これらのすべては生物分解性である。このような粒子を用いる陽性細胞選択工程において、所望の細胞が他の細胞から単離された後、粒子および被膜を放置して、細胞を生存可能に保持し、さらなる使用のために培養することができるような方法で分解させることができる。あるいはまた、酵素コラゲナーゼを第１に用いて、ゼラチン被膜の消化により核材料（磁性またはラテックス）を放出させることができる。次に、核材料を、細胞を培養する前に細胞懸濁液から除去することができる。このような生物分解性ビーズを用いる細胞の陰性選択において、ビーズを細胞懸濁液中に残し、ここから残りの細胞の生存可能性を損なうことなく目的の細胞を除去することができる。例えば、生物分解性磁性ビーズを用いる骨髄除去操作において、若干のビーズを患者に移植される除去した髄中に置き去りにする心配はほとんどない。現在、Ughelstad等、国際特許出願公開第WO 83/03920号明細書により製造され、抗体と結合したた合成重合体−磁鉄鉱粒子は骨髄除去に用いられている。重合体は生物分解性ではなく、これらのビーズに疎水性表面を与える。本発明のゼラチン被覆粒子には存在しないこの疎水性は、ビーズと細胞との間に非特異的相互作用を発生させることができる。この非特異的相互作用の結果、選択性は乏しく、所望のレベルの処理を達成するために一層多くのビーズを用いなければならない。本発明はこれらの問題を回避する。
ゼラチン被覆粒子は、ある細胞、特に血小板［Clinical Hematology,第８編、M.M.Wintrobe等編（Lea ＆ Febiger,アメリカ合衆国ペンシルバニア州フィラデルフィア、1981）、第16章］および食細胞、例えば単球［Basic ＆ Clinical Immunology,第６編、D.P.Stites等編（Appleton ＆ Lange,コネティカット、イースト  ノーウォーク、1987）、第９章］との非特異的相互作用に関して若干の問題があることが見いだされた。ゼラチンのアミノ酸配列が（ラットおよび子牛皮膚コラーゲンのα−１鎖により例示されたように）、フィブロネクチンのRGD結合配列を複製するトリペプチド配列Arg−Gly−Asp（RGD）［The theory of the Photogrophic Prosess,第４編、T.H.James編（Mac Millian,ニューヨーク、1977）第２章、第54頁］を含む３つの領域、細胞の付着を特異的に促進する細胞外マトリックスの成分［Biochem.Biophys.Res.Comm 170:第1236頁（1990）］を含むため、問題が発生した。これらの表面上に表された、フィブロネクチンを含むこれらの生物細胞は、架橋ゼラチンと同等であるコラーゲンに対して特異的な親和性を有する。例えば、結合した抗体、白血球のサブセットの分離において用いられるゼラチンで被覆した磁性フェライト粒子もまた、血小板および単球の表面上に存在するフィブロネクチンに結合する。この結果、単球および血小板並びに抗体特異性抗原を含む細胞がゼラチン被覆粒子と結合するため、細胞の試料からの非特異的な除去が発生する。細胞の非特異的除去は、最外被覆層としてアミノデキストランを用いることにより実質的に回避することができる。
本発明の開示
本発明は、水溶性ゼラチンまたはアミノデキストランで被覆した疎水性表面を有する重合体物質の核を有する別個のコロイド粒子を提供する。重合体核は、表面アミン反応性基が共有結合した重合体物質および表面アミン反応性基を有しない重合体物質から成る群から選択された非ゼラチン系、非アミノデキストラン系核である。複数の側官能基が被覆した粒子に結合している。側官能基は、末端アルデヒドまたはカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基またはマレイミジル基、並びにポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるかまたはこれらの構造内にこれらを含むことができる。
また、本発明は、任意の物質製の固体核を有し、水溶性ゼラチンの第１層およびアミノデキストランの第２層で被覆され、上記被膜が化学的架橋剤の作用により架橋されているかまたは固定されており、複数の側官能基を有する、別個のコロイド粒子を提供する。側官能基は、末端アルデヒドまたはカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基またはマレイミジル基、並びにポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるかまたはこれらを有することができる。核は、ゼラチン溶液中に形成した金属粒子であるかまたは次にゼラチンで被覆した予備形成した粒子とすることができる。
本発明は、側生物学的官能基、例えばポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被膜に、ヘテロ二官能価（heterobifunctional）剤、例えば短鎖ジアミンまたはポリアミン鎖により共有結合して、上記抗体官能化粒子を生物学的分離およびアッセイに好都合に用いることができるようにした、別個のコロイド粒子を提供する。ヘテロ二官能価剤は、生体物質または官能基と、架橋したゼラチンまたはアミノデキストランとの間の架橋基として作用する。
本発明はさらに、それぞれが複数の官能基を有する、水溶性ゼラチンまたはアミノデキストランで被覆した疎水性表面を有する重合体物質の固体核を有するコロイド粒子の製造方法を提供する。一般に、この方法は、疎水性表面を有する固体核重合体材料をゼラチンまたはアミノデキストランで、ゼラチンまたはアミノデキストランと重合体材料との間に共有結合を形成することなく被覆するかまたはアミノデキストランのアミノ基を重合体材料の表面上の反応性基（例えばアルデヒドまたはカルボン酸またはポリスチレン粒子上の酸エステル基）と結合させ、吸着されたゼラチンまたはアミノデキストランまたは結合したアミノデキストランを架橋させ、架橋したゼラチンまたはアミノデキストランを誘導体化して、所望の反応性種が上記架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン表面に共有結合した生成物を得ることを含む。重合体ビーズの表面に結合したアミノデキストランを架橋させることが好ましいが、このような架橋はすべての状態において必要であるとは限らない。例えばアッセイ中の生体物質またはアッセイに用いられる試薬は重合体物質と相互作用せず、架橋は必要でない。本発明はさらに、ゼラチンおよびアミノデキストランで被覆した粒子からポリクローナルおよびモノクローナル抗体が結合した粒子を製造する方法およびこのような粒子を生物学的アッセイ、特に免疫学的アッセイにおいて用いる方法を提供する。
本発明は、任意の物質製の固体核を有し、架橋したゼラチンの生物分解性第１層および側官能基を有するアミノデキストランの生物分解性第２層で被覆された、別個のコロイド粒子の製造方法を提供する。この方法は、第１ゼラチン層および第２アミノデキストラン層を有する疎水性表面を有する固体核材料を被覆し、吸着した外部被膜を架橋させ、架橋した被膜を誘導体化して所望の反応性種が上記架橋した被膜表面に共有結合した生成物を得ることを含む。さらに、本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が結合した粒子を製造する方法を提供する。
本発明はまた、生体物質の陽性または陰性分離および分析方法を提供する。この方法は、生体物質を含む溶液を、架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被覆核粒子の表面に共有結合した抗体と接触させ、形成した混合物を、上記抗体と上記物質との間に複合体を形成するのに十分な温度および時間でインキュベーションし、溶液を含む形成した粒子を分析して、粒子によりシフトした光散乱または他の粒子によりシフトした特性を測定することを含む。所要に応じて、粒子を溶液から分離し、いずれかまたは両方を実施する分析により独立して分析する。
【図面の簡単な説明】
図１は、除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての好中球除去のプロットである。
図2A〜2Lは、一層高い滴定量の磁性ビーズを細胞試料に加えるに従って、正常の顆粒球領域において、一層後方への散乱（FS）または一層小さい大きさおよび一層側面方向への散乱（LSS）または一層大きい粒度へ明瞭に連続してシフトすることを例示する一連のヒストグラムである。
図３は、除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての真血細胞除去のプロットである。
図４は、除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての血小板除去のプロットである。
図５は、除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての白血球除去のプロットである。
図６は、実施例５において実施したT4抗体、アミノデキストラン被覆ポリスチレンビーズによるT4集団シフト分析を示す図である。
本発明を実施する最良の態様
以下の発明の詳細な説明および好適例において、本出願人は、反応性マレイミジル基を架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被覆粒子上に配置し、反応性スルフヒドリル基を抗体上に配置した。これらは、マレイミジル基が抗体に結合し、スルフヒドリル基が架橋ゼラチンに結合するように入れ換えることができる。本出願人はまた、スルフヒドリル試薬のモデルとして２−イミノチオラン塩酸塩を用い、マレイミジル試薬のモデルとしてスルホ−SMCC（以下に記載する）を用いることを選択した。列挙した他の試薬または類似した性質および結果を有する試薬もまた用いることができる。
ここで用いるアルデヒド／硫酸塩ポリスチレンラテックスおよび硫酸化ポリスチレンラテックス粒子は２種の異なるタイプの粒子を示す。前者は、物質、例えばアミノデキストランと結合することができる反応性アルデヒド基を有し、共有結合を形成する。後者は、このような反応性基を有しない。被膜物質は、硫酸化ポリスチレン粒子の表面上に、吸着された物質と粒子表面との間に共有結合を形成することなく吸着される。ポリスチレンラテックスに加えて、他の重合体物質を核粒子として用いることができる。例えば、特に、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエステルおよびポリフィレンオキシド（polyphylene oxide）粒子をゼラチンまたはアミノデキストランで被覆し、ここに記載したように誘導体化することができる。しかし、これらの他の重合体粒子の入手可能性および費用は、ポリスチレン粒子の使用を好ましくする。ポリスチレンを好ましくする他の考慮事項は、被覆される粒子の大きさおよび形状が均一であることである。重合体粒子の大きさは、約0.1〜約5.0ミクロンの範囲内である。好ましい粒子の大きさは、約0.1〜1.0ミクロンの範囲内である。
最後に、アミノデキストラン被膜を架橋させるか否かの選択は２つの要因に依存する。第１には、アミノデキストランが、例えばカルボン酸化ビーズ上に被覆されたかのように重合体粒子表面と結合するか否かである。アミノデキストランが結合していない場合には、被膜を架橋させなければならない。第２の要因は、従業者の選択である。アミノデキストランが結合している場合には、従業者は、被膜を架橋させるか否かは自由である。一般に、「比較的厚い」アミノデキストラン被膜が好ましい場合には、重合体表面に結合したアミノデキストラン層を架橋させ、付加的なアミノデキストランを用いて未反応架橋剤反応性基を遮断する。その後の反応を、ここに記載したように実施する。アミノデキストラン／架橋剤反応は、所要に応じて複数回実施することができる。１つのアミノデキストラン層のみが望ましい場合には、ここに記載したように、表面と結合した層をさらに架橋させることなく誘導体化するかまたは層を架橋させ、未反応架橋剤反応性基をポリアミン、例えば特にエチレンジアミンおよびトリエチレンジアミンとの反応により遮断することができる。次に、これらの粒子を、ここに記載したようにさらに誘導体化することができる。
生体試薬の用語解説
ここで用いるモノクローナル抗体（mAbまたはAb）に対するすべての参照は、アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター  コーポレーションにより、同社により製造されているモノクローナル抗体に関して用いられる識別表示による。以下の情報はさらに、ここで用いる抗体を同定する。これらのモノクローナル抗体の使用は例示のためのみであり、本発明を制限するものと考えるべきではない。「CD」という用語は、International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigensにより採用されている「クラスター表示」を示す。A.T.C.C.はAmerican Type Culture collection（アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル所在）である。
0003547437.tif 000002
ここで用いられ、クールター  コーポレーションから市場で入手できる他の試薬は以下のものである：
MsIgG1−RD1/MsIgG1−FITC:マウス  IgG1−フィコエリトリン［RD1］／マウス  IgG1−フルオレセインイソチオシアネート［FITC］
T11−RD1/B4−FITC:Ab T11−フィコエリトリン/Ab B4−FITC
T4−RD1/T8−FITC:Ab T4−フィコエリトリン/Ab T8−FITC
1X PBS:53.8gのK2HPO4を1.6リットルの蒸留水に溶解した。12.8gのKH2PO4を加え、溶解するまでかきまぜた。次に、340gのNaClを溶液に溶解した。すべての塩が溶解した後に、蒸留水を加えて容積を２リットルとし、0.2μｍフィルターで濾過した。生成した溶液は20X  PBSであった。１部の20X  PBSを19部の蒸留水で希釈することにより、1X  PBSを調製した。この1X  PBS溶液は7.1〜7.3の範囲内、代表的に7.2にpHを有し、NaCl濃度が0.15Mであった。
発明の詳細な説明
本発明の方法を用いるにあたり、大きさの範囲が0.1〜5.0ミクロンである均一な粒子（核材料）をゼラチンまたはゼラチンおよびアミノデキストランで被覆し、被膜を化学固定剤で固定するかまたは化学的に粒子表面に結合させる。被覆されていない粒子は疎水性または部分的に疎水性である表面を有する。粒子の好ましい大きさは0.1〜1.0ミクロンの範囲内である。
本発明において用いる磁性粒子は、ゼラチン溶液中に分散可能である予備成形された磁性粒子であるかまたは、上記磁性粒子の製造におけるゼラチンのその場での使用により製造される磁性粒子とすることができる。マンガン、亜鉛、混合マンガン−亜鉛、鉄、バリウム、コバルトおよびニッケルのフェライトの単分散コロイド粒子のその場での製造方法は、第１に第１鉄塩と他の金属塩を、水酸化カリウムまたはナトリウムおよび硝酸カリウムまたはナトリウム溶液を含む水性ゼラチン溶液中で混合し、すべての溶液に窒素ガスをパージすることにより形成した水性金属水酸化物ゲルを用いることを含む。ゲルの金属酸化物ゾルへの転化は、90℃（低い温度）において４〜72時間温和に熱処理し、この間第１鉄の硝酸酸化を実施することにより達成される。次にヒドロゾル中の磁性粒子を洗浄し、ここに記載したようにさらに処理する前に以下に記載したタイプのゼラチンの１％水溶液中に再懸濁させる。ここに記載したように、その場でのゼラチンを用いる磁性粒子を製造するにあたり、１種のタイプのゼラチンのみがこのような使用に最適であることが見いだされた。これは、p I範囲が4.75〜5.0であるＢ型またはアルカリ硬化ゼラチンである。その場でのゼラチンを用いて磁性粒子を製造する方法は、係属中の出願番号第07/532,432号、1990年６月４日出願、現在の米国特許第5,062,991号明細書に十分に記載し、この教示をここに参照として包含し、ここに記載する。本発明に従って架橋したゼラチンを以下に示す。
ゼラチンは、酸またはアルカリ硬化し、次に39℃またはこれより高い温度で熱分解した、繊維状組織、例えば皮膚または骨中の高度に架橋したコラーゲンから得られる。コラーゲン分子は、α型タンパク質のらせん構造と、β型タンパク質の鎖間水素結合との組み合わせである。それぞれか左巻きらせんである３つのコラーゲンペプチド鎖は、互いに関してねじれており、超らせんを形成する。処理する際には、超らせんの３つのペプチドストランドを、鎖巻水素結合を切断し、これらを水分子への水素結合で置き換えることにより分離する。分離されたペプチドはランダムコイル配置を有する。「The Theory of the Photographic Process」,T.H.James編、（ニューヨーク:MacMillian Press,1977）。α−１ペプチド鎖は配列され、1000以上の残基を有することが見いだされている。D.J.S.Hulmes等、J.Mol.Biol.,79:第137頁（1973）。これらは、主に非極性残基の長い部分を含み；存在する極性残基は、酸性または塩基性領域に局在していない。さらに、親水性残基を表面上に露出し、疎水性残基を構造中に埋める傾向がある球状タンパク質とは対照的に｛R.E.Dickerson等、「The Structure and Action of Proteins」、Menlo Park:Benjamin,1969）参照。｝、ランダムコイルゼラチンは、疎水性粒子、例えばポリスチレンラテックス粒子または磁鉄鉱およびフェライト粒子の表面に容易に吸着することができる疎水性残基が露出してる。水性ゼラチンが粒子の表面上に吸着される際には、この親水性側鎖（アスパルチル、グルタミルおよびリシル残基）は、水性媒体の外部を向く傾向がある。コラーゲンにおける分子内架橋点として作用するリシル基は、吸着したゼラチン中の架橋に近づきやすい。グルタルアルデヒドはしばしば架橋剤として用いられる。Van Der Merwe等、米国特許第4,478,946号明細書およびS.B.Sato等、J.Biochem.,100:第1481〜1492頁（1986）。
通常二官能価である、多くの異なる架橋剤、例えばビス［２−コハク酸イミドオキシカルボニルオキシ）−エチル］スルホン、酒石酸二コハク酸イミジル（disuccinimidyl tartarate）、エチレングリコールビス（コハク酸イミジルスクシネート（succinimidyl succinate））、スベリン酸二コハク酸イミジルおよびグルタルアルデヒトを本発明において用いることができる。好ましいゼラチンまたはアミノデキストラン架橋剤であり、市場で入手できるグルタルアルデヒドは、主に280nmにおいて単量体吸収を有する。しかし、市販の製品中には、235nmにおいて吸収を発生させる顕著な量の重合体物質が存在する。場合により三量体または直鎖状オリゴマーである重合体種は、吸着されたゼラチン上に存在するアミノ基の間の分子内または分子間架橋を形成するのに十分な長さである。吸着されたゼラチンまたはアミノデキストランとグルタルアルデヒドとの間の反応時間を賢明に選択することにより、ゼラチンを核粒子上に適切に固定することができ、従ってこれはその後の分離、反応および洗浄工程の間に除去されない。これにより、遊離ゼラチンの過剰の架橋により形成した大きな凝集塊を回避することができ、粒子間架橋が解消される。
若干のタイプのゼラチン、例えばＡ型、酸硬化、等電点pH8.3〜8.5およびＢ型、アルカリ硬化、等電点pH4.75〜5.0が、本発明において用いるのに有用である。各タイプが、ゲル強度を示す種々のブルーム数（Bloom Number）において有用である。本発明において用いるのに有用であるＡ型ゼラチンのブルーム数は、60〜300の範囲内である。本発明において用いるのに有用であるＢ型ゼラチンのブルーム数は、60〜225の範囲内である。本発明の好適例において用いられるＡ型のブルーム数175のゼラチンが好ましく、ゼラチン分子の間の分子間相互作用を最小にするために、比較的多数のリシル残基およびその一層低いブルーム数のために選択された。磁鉄鉱およびフェライト粒子への最適な吸着のために、これを、等電点の範囲の中心であるpH8.4に緩衝し、このpHではこれは最も水溶性が高く、最小粘度の溶液が得られる。グルタルアルデヒドを加えた際に発生する、フェライト粒子上に吸着したゼラチンの不安定さは、本発明により、一層希薄な粒子およびゼラチン濃度（0.1％重量／容量（w/v））を、ここでグルタルアルデヒドと反応しない不活性重合体安定剤、ポリビニルピロリドン（PVP）と共に他の反応に用いられた2.5％w/v固体懸濁液の代わりに用いることにより克服された。安定剤および25倍低いゼラチン濃度を用いることにより、グルタルアルデヒド固定反応中の粒子間架橋が回避される。重合体脱着が、グルタルアルデヒド固定反応の時間、約６分に対して極めて遅い工程であるため、核粒子の周辺の安定なゼラチン被膜が形成した。
生物学的および医学的技術において有用であるためには、固定された（架橋した）ゼラチンのみ（２層）またはゼラチン／アミノデキストラン被膜は、生物学的に活性な物質、例えば抗体と結合して、粒子表面に結合した固定された生物学的に活性な物質を生成することができる官能基を含んでいなければならない。生体物質の粒子表面への共有結合は、単なる吸着より好ましい。ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体の、架橋したゼラチン表面への結合は、「短鎖」ジアミンまたはポリアミンおよびヘテロ二官能価試薬を用いることにより達成される。（以下用語「ポリアミン」にはジアミンが含まれる。）ポリアミンは、本来的に存在するかまたは本発明の段階により存在し、架橋ゼラチン表面上に存在する残留アルデヒドまたはカルボキシル基と反応する。ポリアミンを用いることは、アルデヒド／カルボキシル基を遮断する役目を有するのみならず、架橋工程中に減少したゼラチンアミノ基、例えばリシルアミノ基を補充する役目を有する。この方法は一般に２段階で達成される。第１段階において、未反応末端アルデヒド基はポリアミンと反応し、続いて形成したシッフ塩基が水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）により還元されて、安定な飽和Ｃ−Ｎ結合が形成する。第２段階において、ゼラチンの露出したカルボン酸残基（グルタミン、アスパラギン）は、水溶性カルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDAC）の存在下でポリアミンに結合する。
ジアミンを含む短鎖ポリアミンは、同一粒子上の隣接するアルデヒドまたはカルボン酸基の架橋を回避するかまたは異なる粒子上のこのような基の結合を回避するために好ましい。１つのポリアミンのアミノ基はゼラチン表面と反応し、他のものは未反応のままであり、生体物質に直接または間接的に結合するのに有用である。「短鎖」ポリアミンの例には、エチレンジアミン、フェニレンジアミン、プロピレンジアミン、1,4−シクロヘキサンジアミン、シクロヘキセンジアミン、テトラメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、1,5−ジアミノ−３−（２−アミノエチル）ペンタン［（H2NCH2CH2）3C］および一般式H2NCH2−（CH2）ｘ−CHy（CH3）ｚ−NH2およびC6H4+a（NH2）21（ここでｘ＝０〜3,y＝１または２およびｙ＝１のときｚ＝１またはｙ＝２のときｚ＝０およびａ＝０または６である）で表される他のポリアミンが含まれる。エチレンジアミンが好ましい。
生体物質の粒子への結合は、被覆された架橋した粒子の遊離アミノ基の、水溶性ヘテロ二官能価試薬、例えば２−イミノチオラン塩酸塩（IT）、スルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−SMCC）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、サクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシニミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエートでの活性化を含み、上記に列挙した試薬はグルタルアルデヒド等の置換基である。２−イミノチオラン塩酸塩およびマレイミジル／サクシニミジル試薬が好ましい。E.Ishikawa,Immunoassay Supp.,1:第１〜16頁（1980）およびJ.Immunoassay,4:第209〜227頁（1983）;M.Imagawa等、J.Appl.Biochem.,4:第41〜57頁（1982）；およびM.D.Partis,J.Protein Chem.,2:第263〜277頁（1983）。スルホ−SMCCを用いる際には、スルホ−SMCCの活性スルホサクシニミジルエステル末端はpH7.0〜7.5においてアミンと反応してペプチド結合を形成する。形成したスルホ−SMCC/ジアミン架橋単位は長さが約16オングストロームである。
ポリアミンとスルホ−SMCCとの反応を実施する際には、粒子の凝集を顕微鏡試験（1000倍拡大）およびクールター  N4MDサブミクロン粒子サイズアナライザー（アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター  コーポレーション）または同様の装置を用いた光散乱分析により監視した。
スルホ−SMCCのマレイミジル基はpH6.5〜7.5で遊離スルフヒドリル基と反応して安定な共有チオエーテル結合を形成する。しかし、スルホ−SMCCと反応する被覆した粒子が、スルホ−SMCCのマレイミジル末端と反応しうる遊離スルフヒドリル基を含まないことが必須である。スルフヒドリル基は、ゼラチンがほとんど有しないシステインおよびシステインアミノ酸残基上に見いだされるかまたはこれから発生する。従って、本発明の架橋したゼラチン粒子は、スルホ−SMCCと反応する前に遊離スルフヒドリル基を遮断するタンパク質変性剤を必要としない。
生体物質、特にモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、スルホ−SMCC官能化粒子のマレイミジル末端に、本来的にまたは誘導体化により上記生体物質上に存在するスルフヒドリル基により共有結合することができる。システイン残基を有する生体物質は、本質的にスルフヒドリル基を含む。付加的なスルフヒドリル基を導入するために、生体物質のアミノ基を、トラウトの試薬（Traut's reagent）、２−イミノチオラン塩酸塩（IT）により、７〜10の範囲内のpHで活性化する。M.Erecinska,Biochem.Biophys.Res.Commun.,76:第495〜500頁（1977）;J.M.Lambert等、Biochemistry,17:第5406〜5416頁（1978）；およびM.E.Birnbaumer等、Biochem J.,181:第201〜213頁（1979）。生体物質が抗体である際には、抗体のリシルおよび末端アミノ基をITにより活性化する。本発明において、反応条件および反応体の濃度を変化させて最適な結合を決定し、従って、基材粒子と結合した際に、生体物質、特に抗体は最大官能活性を保持する。マレイミドはスルフヒドリル基と溶液中で極めて急速に反応するが、粒子上で固定された同一の基は、タンパク質と反応するための反応時間が長かった。特にIgM抗体を用いた際には、抗体結合中の粒子および抗体濃度を最適化して凝集を回避した。IgM抗体を最適化する手順を、等電点が約5.0〜約9.0の範囲内であるすべてのモノクローナル抗体に用いることができる。一般に、単なる吸着に必要であるより約30倍少ない抗体が、共有結合を達成するために必要であった；抗体を得るのが高価であるかまたは困難である際の重要性の結果が含まれる。
マレイミジルにより活性化された粒子との結合反応において用いられるイミノチオランにより活性化された抗体の最適濃度を、活性化抗体結合曲線（表面抗体対全抗体濃度）を用いることにより決定した。代表的な結合時間の後、試料を採取し、0.2μｍ低タンパク質結合フィルターで濾過した。濾液を分光光度分析し、表面抗体を、初期溶液中の全抗体と濾液中の抗体との間の差異（全抗体−濾液抗体）により決定した。抗体（Ab）濃度依存性実施例における結合データは、ラングミュア等温型特性を示す；即ち、全抗体対表面抗体濃度に関して線型低濃度領域であり、高濃度における粒子表面において飽和を示す平滑な変曲点および安定水準である。実際に用いられる抗体濃度は、変曲点におけるものまたは変曲点よりわずかに高い濃度におけるものであった。直線に関して双曲線の方程式を１つに計算し直すことにより、結合定数を図式的に得た。1/n2s対1/C2の２つの相互のプロットを作図し、ここでn2sは粒子のグラムあたり結合したIT−Abのモル数であり、C2は平衡における遊離IT−Abのモル濃度である。線型のプロットは、ラングミュア型結合の挙動を示す。IT−Abのスルホ−SMCCにより活性化されたフェライト粒子に対する結合定数K1＝nsKを、方程式1/n2s＝1/（nsKC2）＋1/ns（式中Ｋは固有結合定数であり、nsはフェライト粒子のグラムあたりの結合部位のモル数である）を用いて計算した。種々のモノクローナル抗体に関するプロットの線型回帰分析により、以下の結果が得られた：
Ab  T11:K＝1.3×106M-1  ns＝5.0×10-8モル/g
Ab  KC16:K＝6.4×106M-1  ns＝5.1×10-7モル/g
Ab  1D3:K＝2.7×106M-1  ns＝1.0×10-7モル/g
Ab  MO2:K＝1.8×107M-1  ns＝7.1×10-7モル/g
フェライト粒子に関する結果を、アミノデキストランで共有結合被覆し、モノクローナル抗体およびタンパク質と結合した市場で入手できるカルボキシ変性ラテックスビーズ（磁鉄鉱23％，直径0.980μｍ、Rh ne−Poulencから得られる）に関する類似するデータと好ましく比較した。結果は以下の通りである：
Ab  T11:K＝6.5×105M-1  ns＝1.1×10-7モル/g
Ab  KC16:K＝3.2×106M-1  ns＝6.9×10-8モル/g
Ab  1D3:K＝3.2×105M-1  ns＝1.7×10-7モル/g
Ab  MO2:K＝2.0×106M-1  ns＝1.6×10-7モル/g
Ab  KC48:K＝2.5×105M-1  ns＝7.6×10-8モル/g
Ab  PLT−1:K＝2.8×105M-1  ns＝2.2×10-7モル/g
ストレプタビジン:K＝1.3×106M-1  ns＝9.5×10-8モル/g
フェライト核ビーズに加えて、本発明を、架橋したゼラチンで被覆したポリスチレンビーズに結合したモノクローナル抗体を用いて評価した。これらの抗体に関する結合定数は、上記した両方の評価と好ましく比較し、以下の通りであった：
Ab  T8:K＝1.7×106M-1  ns＝9.5×10-8モル/g
Ab  T4:K＝2.5×107M-1  ns＝3.5×10-8モル/g
ポリスチレンビーズを用いた結果は、本発明の方法は磁性球に限定されず、疎水性表面を有する任意のコロイド粒子を用いて用いることができることを示す。
磁性ビーズを用いた好適例の記載
I.第１および第２ゼラチン層を有する磁性粒子の製造
磁鉄鉱および他の磁性粒子のゼラチン溶液中での製造
10ミリモル（５ミリリットル）の2M  KNO3溶液、12.5ミリモル（25ミリリットル）の5M  KOH溶液および11.25ミリリットルの二回蒸留水（DDW）を混合し、N2ガスを10分間パージした（溶液Ａ）。次に、6.25ミリモル（6.25ミリリットル）の1M  FeSO4溶液および25ミリリットルの新たに調製した、N2をパージした２％のＢ型、ブルーム数225のウシ皮膚ゼラチン溶液［有用なゼラチン溶液の範囲は約0.8〜約2.0％である］をパイレックス（登録商標）ビン中の溶液Ａに加え、混合し、N2ガスで掃引し、きつくふたをし、オーブン中に90℃で４時間平静に置いた。黒色磁鉄鉱粒子の懸濁液が室温に到達した後、これらを1/2時間超音波処理し、１％のＢ型、ブルーム数225のゼラチン溶液で洗浄し、次に次の段階のように大過剰量の１％w/vゼラチンと接触させた。
また、ゼラチンをこれらの調製物中でその場で用いて、金属フェライトを調製した。他の金属、即ちMn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+および（M2+）を用いた実施例において、M2+:Fe2+のモル比を1:2に保持したが、Co2+およびNi2+に関しては硝酸塩を硫酸塩の代わりに用いた。合計の金属対水酸化物のモル比を1:2に保持した；しかし、関連するKNO3対全金属およびKNO3対KOHのモル比を変化させた。混合Mn/Znフェライトを製造するにあたり、1:1のモル比の硫酸マンガン対硫酸亜鉛および同一の合計モル量の非鉄金属イオンを用いた。以下に例を示す。
10ミリモル（５ミリリットル）の2M  KNO3溶液、18.75ミリモル（3.75ミリリットル）の5M  KOH溶液および6.875ミリリットルのDDWを混合し、N2ガスを10分間パージした（溶液Ｃ）。次に、6.25ミリモル（6.25ミリリットル）の1M  FeSO4溶液、3.125ミリモル（3.125ミリリットル）の1M  Co（NO3）溶液および25ミリリットルのＢ型、ブルーム数225のウシ皮膚ゼラチン溶液を混合し、N2ガスを10分間パージした（溶液Ｄ）。溶液Ｄをパイレックス（登録商標）ビン中の溶液Ｃに加え、混合し、N2ガスで掃引し、きつくふたをし、オーブン中に90℃で５時間平静に置いた。茶色粒子の懸濁液が室温に到達した後、これらを1/2時間超音波処理し、１％のＢ型、ブルーム数225のゼラチン溶液で洗浄し、次に次の段階のように大過剰量の１％w/vゼラチンと接触させた。
上記の方法を用いて、直径が約0.1および0.2μｍであり、球形形状のコバルトおよびニッケルフェライト粒子を、大きい、ゆるく保持された茶色の凝集体に形成した。亜鉛は、72時間の熱処理の後にもなお低い収率の直径が約0.2μｍより小さい淡い茶色の磁性材料を生成した。均一な球形形状であり、直径が0.3μｍである濃い茶色のマンガンフェライト粒子が単一粒子として83〜88％の収率で得られた。同様の淡い茶色のマンガン−亜鉛フェライト粒子が90℃で72時間熱処理した後に49〜55％の収率で得られた。バリウムに関しては、BaSO4は水に不溶であるため、方法を変更した。（バリウムが存在する場合を除いて、２価の金属をこれらの塩化物または硫酸塩として硝酸塩と同様に用いることができる。）従って、6.25ミリモル（6.25ミリリットル）の1M  FeCl2溶液、0.5ミリモル（5.0ミリリットル）の0.1  Ba（NO3）２溶液および25ミリリットルの２％ゼラチンを混合し、N2ガスを10分間パージした（溶液Ｄ）。10ミリモルのKOH溶液（２ミリリットル）を用い、熱処理を20時間続けた以外は、溶液Ｃおよびフェライト製造工程の残りは不変とした。直径が0.2μｍであり、均一な非球形形状の黒色のバリウムフェライト粒子が形成した。
ゼラチン被覆した磁性粒子の製造
均一な大きさ（0.3μｍ）および球形形状を有し、上記の方法によりその場でゼラチンを用いて製造した若干量の磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子を、大過剰量の１％w/vのＢ型、ブルーム数225のゼラチン水溶液と接触させた。あるいはまた、均一な大きさ（0.3μｍ）および球形形状を有する、予備成形した（即ち、ゼラチンのその場での使用以外の方法により製造した）分散性磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子を、大過剰量の１％w/vのＢ型、ブルーム数225のゼラチン溶液と、周囲温度で約60分間接触させた。次に、粒子（上記のいずれか）を磁気的に分離し、0.2M塩化ナトリウム水溶液中の、２％w/vのＡ型、ブルーム数175のゼラチン溶液、pH8.4で５回洗浄した。洗浄後、粒子を、0.2M塩化ナトリウム、0.1％w/vアジ化ナトリウムを含む、２％w/vのＡ型、Ａ型ゼラチンの水溶液中の2.5％w/v（重量／容量）固体懸濁液としてpH8.4で周囲温度で数カ月以内貯蔵した。貯蔵溶液のアジ化物含有物が保持されている場合には、懸濁液は、約３か月まで貯蔵することができる。
吸着したゼラチンの架橋
62.5マイクロリットルの25％グルタルアルデヒド水溶液（0.156ミリモル）を、120ミリリットルの、0.2M塩化ナトリウム水溶液中の１％ポリビニルピロリドン（分子量＝40,000）、pH7.2に加えた。これに、上記で製造した５ミリリットルの2.5％固体懸濁液をグルタルアルデヒド溶液に加え、形成した懸濁液を周囲温度で３〜15分間、好ましくは約６分間混合した。
未反応アルデヒド基の遮断
0.105ミリリットルの99％エチレンジアミン（1.56ミリモル）を、１％PVP溶液、0.2M塩化ナトリウム、pH7.2中の125ミリリットルの固定した、ゼラチンで被覆した磁性粒子（0.1％w/v固体）に加えた。形成した懸濁液を、約１〜４時間、好ましくは約２時間、250ミリリットルの組織培養フラスコ中で混合した。混合時間の終了時に、1.25ミリリットルの0.1mM  KOH中の水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）の10mg/ミリリットル溶液を磁性粒子に加え、形成した懸濁液をさらに15分間混合した。次に、粒子を磁気的に分離し、複数回、好ましくは３回、0.2M塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。
安定剤としてポリビニルピロリドンを用いない吸着したゼラチンの架橋
上記のようにして製造した0.1M  リン酸緩衝液中の、２％w/vのＡ型、ブルーム数175のゼラチン、pH8.4に懸濁させた５ミリリットルの2.5％w/v固体マンガンフェライト粒子を磁気的に分離した。透明な上澄み液を廃棄し、磁性粒子の残留物を、56マイクロリットルの25％グルタルアルデヒド水溶液と1mM水酸化カリウム溶液、pH10.00とを混合することにより調製した５ミリリットルの3mg/ミリリットルのグルタルアルデヒド水溶液に再懸濁させた。形成した磁性粒子の懸濁液を約30分間混合し、好ましくはローラー混合した。グルタルアルデヒドの添加および混合が完了した後、約34マイクロリットルのエチレンジアミン（ジアミン対グルタルアルデヒドのモル比が10:1）を反応混合物に加え、次にこれをさらに２〜３時間かきまぜた。次に、1mM  KOH中の水素化ホウ素ナトリウムの40mg/ミリリットル溶液約0.313ミリリットルを反応混合物に加え、形成した混合物を約10〜30分間かきまぜた。次に、架橋した粒子を３回磁気的分離を用いて洗浄し、５ミリリットルの1mM水酸化カリウム水溶液中に再懸濁させた。
元素分析にあたり、マンガンフェライト粒子上の架橋したゼラチンの懸濁液５ミリリットルをさらに15回蒸留水で洗浄し、磁気的に分離した残留物をオーブン中で100℃で乾燥した。重量百分率分析は以下の通りであった:Mn,19.05％;Fe,49.49％;C,0.54％;H＜0.5％;O,30.92％（差分）。炭素のゼラチン中の重量百分率は、このアミノ酸含有から得られ、これは以下の通りであった:C,50.46％;H.6.765％;N,18.27％;O,24.29％およびS,0.21％。［「The Theory of the Photographic Process」，第４編、T.H.James編、（MacMillian、ニューヨーク,1977）、第２章、第52頁参照］。このようにして、1gのフェライト−ゼラチン粒子に関して、1g×0.0054/0.5056＝0.01070gのゼラチンおよび0.9893gのフェライトが存在する。球形であり、直径が0.29μｍであるマンガンフェライト粒子の粒子あたりの容積は、1.277×10-14cm3である。4.24g/cm3の粒子密度を用いて、粒子あたりの質量は、5.414×10-14gであり、0.9893gのフェライト中の粒子の数は1.827×1013である。従って、粒子あたりのゼラチンの質量は5.856×10-16gである。グルタルアルデヒドで架橋させる前の２％w/vのゼラチンから0.02g/cm3のゼラチン被膜の密度を仮定すると、粒子あたりのゼラチンの容量は、2.92×10-5cm3である。従って、粒子あたりの合計容積（フェライトおよびゼラチン）は、4.205×10-14cm3であり、フェライトおよびゼラチンから成る球の半径は、2.157×10-5cm、即ち0.2157μｍである。次に、ゼラチン被膜の厚さは、0.2157μｍ−0.145μｍ（フェライト粒子の平均半径）＝0.0707μｍ（即ち約71nm）である。ゼラチン被膜の厚さに関するこの値は、以下の刊行物から得られるようなゼラチンの種々の表面への以下の吸着データと良好に整合する。
1.A.T.Kudish等、Proteins at Intergaces,ASC Symposium Series 343,T.L.BrashおよびT.A.Horbett編（ワシントン、D.C.;American Chemical Society 1987）、第17章、第261〜277頁：ガラス上のＡ型ブタ皮膚ゼラチンは、750Å（0.075μｍ）の被膜の厚さを与え、ガラス上のＢ型子牛皮膚ゼラチンは、500Å（0.050μｍ）の被膜の厚さを与えた。
2.N.Kawaniski等、J.Phys.Chem.94:第4611〜4617頁（1970）：マイカ上のＢ型ゼラチン、ブルーム数259は、75nm（750Å）において、力対距離（マイカ表面間）の引力最小（attractive minimum）を与えた。
3.H.Meltger等、J.Colloid Intergace Sci.126:第292〜303頁（1988）：ガラス上の変性可溶性子牛皮膚コラーゲン（即ちゼラチン）は、600〜700Å（0.06000〜0.0700μｍ）の被膜の厚さを与えた。
粒子が分析にのみならず、さらに用いられる際には、グルタルアルデヒドからの残留アルデヒド基を、ジアミンとの反応により除去する。
固定したゼラチンのカルボン酸残基との反応
2.11ミリリットルの99％エチレンジアミンを、0.1M  NaCl水溶液中のアルデヒドで遮断したビーズの懸濁液、0.1％w/v固体118ミリリットルに加えた。形成した懸濁液を、約15分間物理的および超音波的に混合した。この混合の後、0.2M  NaCl中の10mg/ミリリットルのEDAC4.5ミリリットルを加え、懸濁液を第１に、約15分間物理的および超音波的に混合し、最後に物理的に約８〜16時間混合した。次に、フラスコの内容物を磁気的に分離し、1X  PBSで複数回洗浄し、1X  PBS中で約30分間超音波的に混合し、最後に５ミリリットルの1X  PBS中の2.5％w/v固体に濃縮した。大規模（100x）製造にあたり、前のアルデヒド遮断工程およびEDAC結合工程を組み合わせて、複数回の分離および洗浄を回避した。工程の組み合わせの結果、最終的な抗体結合ビーズの活性の損失はなかった。
ジアミンで処理した粒子のスルホ−SMCCによる活性化
一般に、新たに調製した1X  PBS中の10mg/ミリリットルのスルホ−SMCC27マイクロリットルを、2.5％w/v磁性粒子懸濁液１ミリリットルあたり用いた。代表的な調製において、135マイクロリットルのスルホ−SMCC溶液を、５ミリリットルの2.5％w/v粒子に加えた。次に、混合物を、15ミリリットルのプラスチック製遠心管中で約１時間ローラー混合し、約５分間超音波的に混合し、磁気的に分離し、1X  PBSで複数回洗浄した。
上記の一連の工程により形成した、官能化された架橋したゼラチン被覆粒子は側マレイミジル基を有し、種々の医学的および／または生物学的使用に適する。粒子に結合することが望ましい物質が十分な活性スルフヒドリル基を有する場合には、この物質の活性化は不必要であり、以下の段階を省略することができる。
２−イミノチオラン塩酸塩での抗体の活性化
0.1％のNaN3を含む1X  PBS中の51.24mg/ミリリットルの濃度のT11モノクローナル抗体を調製した。結合中の10mgのT11抗体および15mg/ミリリットルの抗体濃度に関して、合計の反応容積は0.667ミリリットルでなければならない。15:1::IT:T11の活性化比率を用いて、1X  PBS中の0.9375マイクロモル（0.129mg）のIT（65マイクロリットルの2mg/ミリリットルIT）が必要である。従って、0.407ミリリットルの1X  PBS溶液を0.195ミリリットルのT11濃縮物に加え、これにより形成した溶液に、さらに65マイクロリットルの2mg/ミリリットルIT溶液を加えた。最終的に形成した溶液を管反応器中で１時間ローラー混合した。次に、反応管の内容物を、20ミリリットルのＧ−50セファデックスカラムの最上部に加え、平衡にし、100ミリリットルの1X  PBSで洗浄した。誘導体化した抗体を、1X  PBSを用いて溶出し、複数の2.5ミリリットルフラクションをUVモニターで補助しながら採集した。280nmにおける帯吸収の中央のフラクションを保存し、A280値を用いてT11/IT抗体濃度を決定した。代表的に、T11/IT濃度は約3.0mg/ミリリットルであった。T11/IT溶液を、溶媒を除去することにより濃縮することができる。
T11/ITのスルホ−SMCC誘導体化粒子との結合
実験質規模結合において、合計溶液は５ミリリットルであり、粒子の濃度は2.5％w/v固体であり、T11/IT濃度は0.9mg/ミリリットルであった。１つの試料において、精製したT11/IT溶液の濃度が1.850mg/ミリリットルである際には、1X  PBS中のT11/IT抗体溶液2.392ミリリットルを、2.432ミリリットルの上澄み液を除去することにより予め濃縮した2.5％w/v固体のスルホ−SMCC活性化粒子５ミリリットルに加えた。T11/IT溶液を粒子に0.5ミリリットルずつ、添加の間に超音波的および物理的に混合しながら加えた。次に、形成した溶液を15ミリリットルの管中で約２時間ローラー混合した。次に１ミリリットルの試験試料を採取し、低タンパク質結合0.2μｍフィルターで濾過し、濾液をT11抗体に関して、280nmにおける吸収を測定することにより分光光度分析した;A280＝ｃ（上澄み液）＝0.3986mg/ミリリットル。［差分による測定、ｃ（表面）＝ｃ（合計）−ｃ（上澄み液）］。従って、ｃ（表面）＝0.9mg/ミリリットル−0.3986mg/ミリリットル＝0.501mg/ミリリットル。これは、粒子1gあたり20mgT11のT11表面負荷に言い換えられるかまたは、マンガンフェライト粒子に関しては、4.89m2/gの比表面積に関して、4.1mg  T11/m2粒子表面積であった。粒子濃度の２倍および３倍希釈を用いたが、結合中の同一の合計抗体濃度を用いた同様の方法により、一層高い表面抗体負荷が得られた。しかし、粒子濃度の４倍希釈が一層高い抗体の表面被覆を与えなかった際に、限界に到達した。
未反応マレイミジルおよびスルフヒドリル基の遮断
スルホ−SMCC活性化粒子上の未反応マレイミジル基を、抗体結合の後にＬ−システインで遮断した。代表的に、1X  PBS中の5mg/ミリリットルのＬ−システイン0.480ミリリットルを、前の工程の結合混合物の残りの４ミリリットルに加え、形成した溶液を15分間ローラー混合した。未反応スルフヒドリル基を、1X  PBS中の20mg/ミリリットルのヨードアセトアミド0.534ミリリットルを加え、続いて0.100ミリリットルの1M、pH9.8ホウ酸ナトリウム緩衝液を加えることにより遮断した。形成した溶液を30分間ローラー混合し、遮断した結合混合物を磁気的に分離し、粒子を１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、熱ショック）および0.1％NaN3（BSA緩衝液）を含む1X  PBSで３回洗浄した。洗浄後、４ミリリットルの前記のBSA溶液を粒子に加え、粒子を約１時間ローラー混合し、４℃に約８〜16時間貯蔵し、磁気的に分離し、BSA緩衝液でさらに３回洗浄した。
本明細書に記載した方法により製造した粒子を含む抗体は、種々の細胞分離アッセイにおいて有用であることが見いだされた。生体物質が、抗体に結合することができる抗原決定基を含む場合には、本発明を用いるアッセイにおいて用いられる生体物質は、正常または異常Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、ウィルス、赤血球、胸部、子宮、結腸、腎臓、肝臓、肺、精巣、腹部、甲状腺および上皮小体の細胞等から成る群から選択することができる。
上記の磁性粒子の例と同等の本発明の例において、マレイミジル基とスルフヒドリル基とを入替えることができる。即ち、架橋したゼラチンで被覆した粒子を、上記したマレイミジル基の代わりに反応性スルフヒドリル基で終了する側基を有するように誘導体化し、抗体を、上記したスルフヒドリル基の代わりに反応性マレイミジル基を有するように誘導体化する。この同等の例を製造するのに用いられる方法は，上記と同一である。両方の場合において、抗体をゼラチン表面に、上記のようにして製造した分子架橋により結合させる。
以下の実施例は、本発明の有用性を例示するために示すものであり、本発明を限定するものと解釈するべきではない。
実施例１
Ｔ細胞およびＢ細胞集団の磁性ビーズ除去に対するプロトコール。
フィコール−ハイパーク（Ficoll−hypaque）勾配の密度単離により全血試料から単核細胞（MNC）を得て、PBSで洗浄した。試験する磁性粒子懸濁液（2.5％W/V）と結合した5,10,25,50および100マイクロリットルのモノクローナル抗体（mAb）を含む一連の管に１ミリリットルの１×PBS中の１×106MNCを添加した。２本の管を除去および非除去の各コントロール用にした。その後、得られた懸濁液を多重管渦巻器あるいは単一管回転器で３分間回転した。培養の終期に、細胞懸濁液を単一管磁性ラックにより供された磁界中に合計２分間置いた。磁性分離の終期に、非結合細胞をパストゥールピペットを用いて管の中央から透明な液体を全部抜き出すことによって抽出した。
Ｔ細胞あるいはＢ細胞（T11,T3,T4,T8,B1,B4）では、除去後集めた細胞懸濁液を元の細胞懸濁液と直接比較し、その後粒子除去した。元のおよび除去した試料を1200rpmで５分間遠心分離し、上澄みをデカントし、各管中に残っている約100マイクロリットルの１×PBSを残した。その後室温にて10分間除去管の各組の一方の管を10マイクロリットルのCYTO−STAT（商標）MsIgG1−RD1/MsIgG1−FITCコントロール試薬（MS）を用いて染色し（stain）、他の管を10マイクロリットルのCYTO−STAT（商標）T11−RD/B4−FITC試薬（T11,T3,B1あるいはB4除去に対して）あるいは10マイクロリットルのT4−RD1/T8−FITC試薬（T4あるいはT8除去に対して）を用いて染色した。培養の終期に、500マイクロリットルのPBSを各試薬に添加し、試料をフローサイトメトリーにより分析した。試料をＭビーズ２−カラープログラムを使用してEPICS（商標）プロフィルで分析した。（EPICS（商標）およびCYTO−STAT（商標）はクールター  コーポレーションの登録商標である）。Msコントロール試薬で染色した元の試料を操作し、検査してリンパ球集団がビットマップ１に完全に組み込まれたか否かを決定し、必要な場合は調整した。弁別器２の左側を＜１％の陽性染色を与えるチャンネルの各蛍光ヒストグラムに対してセットした。このことはMsコントロール試薬を用いて染色した各試料に対して行われ、その後特異的な抗体を用いて染色した対応する管を分析した。データを集め、赤および緑のヒストグラム（ＴおよびＢすなわちT4およびT8）の陽性染色細胞の、陽性のパーセントではなくて、絶対数として記録した。以下に試験結果をまとめる。
実施例２
赤血球（RBC）の磁性ビーズ除去に対するプロトコール。
100マイクロリットルのNa4EDTA抗凝固全血を一連の反応管中に置いた。各管に、磁性粒子懸濁液（2.5％W/V）と結合した25〜150マイクロリットルのKC−16を添加し、PBSを使用して合計体積を250マイクロリットルに調整した。懸濁液を３〜５分間多重管渦巻器あるいは単一管回転器で低混合速度にて回転した。回転完了後、1mlのPBSを各試料管に添加し、その後管を２〜５分間磁性ラックに置いた。パストゥールピペットを使用して各管から全上澄みを除去し、標識化管中に蓄えた。試料をクールター  Ｓ−plus（商標）IVあるいは類似のrbcカウンターで全rbc数/ml全血として分析した。陽性コントロールは100マイクロリットルの全血プラス1.150ミリリットルの１×PBSであり、100％rbcカウントを与え、陰性コントロールは100マイクロリットルの全血プラス1.150ミリリットルのバッチ溶解剤あるいは類似の溶解剤であり、０％rbcカウントを与えた。除去rbcの百分率は100％である〔（試料管中のrbcカウント）／（100％rbcカウント）〕。
実施例３
白血球の磁性ビーズ除去に対するプロトコール
100ミリリットルのNa4EDTA−抗凝固全血を集め、多数の遠心分離管に分離し、10分間500gにて遠心分離した。大部分の血漿を除去し、各管から細胞のバフ（buff）着色層を除去し、一緒に溜めて、更に10分間500gにて遠心分離した。バフ着色細胞および血漿は、rbcカウントが8.0×109/ml以下であり、白血球（wbc）が２〜４×107/mlである白血球リッチ全血を構成する。
100マイクロリットルの白血球リッチ全血を多数の反応管中にピペットで入れた。その後10〜160マイクロリットル量の磁性ビーズ懸濁液（2.5％W/V）を各管にピペットで入れ、その後200マイクロリットルの１×PBSを加えた。（10〜40マイクロリットルのビーズを用いたN.B.Lower滴定点を最初に操作すべきである。終点除去が40マイクロリットルで得られない場合のみ付加的なビーズを加えた）。各管を３〜５分間低速度で回転した。その後２ミリリットルの１×PBSを加え、管の内容物を混合し、その後２分間磁性的に分離した。全上澄み液を除去し、二重管中に置き、その後５分間400gにて遠心分離した。その後得られた上澄みをピペットで注意深く除去し、分析した。
白血球リッチあるいは白血球除去全血試料を細胞の混合物から特異的な細胞の除去に対して弁別するために設計した10マイクロリットルの単一のあるいは２つのカラー抗体調製物を添加することより分析した。例えば、T11結合磁性ビーズを除去に使用した場合、T11−B42つのカラーを使用して実際のT11細胞除去とT11細胞の非特異的除去（即ちＢ細胞）を弁別した。混合物を渦で混合し、暗中で室温にて10分間培養した。コントロールは非除去細胞を用いた抗体コントロールおよびアイソタイプコントロールであった。その後試験管をクールターEPICS（商標）Ｑ−プレップあるいは類似の装置に置き、35秒溶解モードで操作した。rbcを溶解し、試料を固定した（Ｑ−プレップ）後、全試料をクールターEPICS（商標）プロフィルフローサイトメーターあるいは類似の装置で分析した。この手順は試料の体積あたりの実際の細胞数としてデータを得るために必要である。プロフィルで利用できるプログラムをリンパ球および単球−骨髄集団の分析に使用した。
実施例１〜３のプロトコールを使用した試験結果の概要
1.T11/B4免疫細胞アッセイでは、非除去コントロールは97,209T11＋、18,240B4＋、19,717単球および25,381顆粒球カウントを与えた。T11抗体に結合した10マイクロリットルの2.5％W/V固体磁性ビーズを用いた除去の後、カウントはそれぞれ15,826、20,181、19,954および30,972であった。20マイクロリットルのT11抗体結合ビーズを用いた除去は2,256、20,989、20,874および31,965カウントを与えた;30マイクロリットルでは1,150、21,428、20,697および35,362カウントを与えた；および40マイクロリットルでは644、21,232、19,817および33,935カウントをそれぞれ与えた。
2.T4/T8免疫細胞アッセイでは、4.1×105T8および7.9×105T4細胞を含有する非除去コントロールは54,415T4および27,906T8カウントを与えた。T8抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの10、20および30マイクロリットルを用いた除去の後、カウントはそれぞれ57,030および12、59,538および６、および60,905および５であった。
3.赤血球／血小板アッセイでは、非除去コントロールは4.5×106wbc、4.4×108rbcおよび4.7×107血小板を含有した。除去実験はKC−16抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの20、40、60および80マイクロリットルを使用して行った。除去の後残留するwbc、rbcおよび血小板は、20マイクロリットルでは4.4×106のwbc、1.6×108のrbcおよび4.3×107の血小板であり;40マイクロリットルでは4.6×106のwbc、１×107のrbcおよび4.5×107の血小板であり;60マイクロリットルでは4.5×106のwbc、１×107のrbcおよび4.3×107の血小板であり;80マイクロリットルでは4.5×106のwbc、１×107のrbcおよび4.3×107の血小板であった。結果は1.85×1010粒子を含有する40マイクロリットルの2.5％固体ビーズは4.3×108rbcを除去し、こうして43の粒子対rbc比を与えた。
4.骨髄細胞アッセイでは、非除去コントロールは73,821のリンパ球、13,426の単球および55,661の顆粒球カウントを与えた。除去研究はKC−48抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの10、20、30および40マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ10マイクロリットルでは70,330、9,309および340カウント、20マイクロリットルでは68,414、2,006および1,332カウント、30マイクロリットルでは62,966、1,597および922カウント、および40マイクロリットルでは59,340、1,546および899カウントであった。
類似の除去研究は1D3抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの10、20、30および40マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ10マイクロリットルでは76,405、13,839および1,597カウント、20マイクロリットルでは73,198、8,653および1,216カウント、30マイクロリットルでは65,667、2,590および2,130カウント、および40マイクロリットルでは66,276、1,906および1,686カウントであった。
更なる除去研究はMO2抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの10、20、30および40マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ10マイクロリットルでは72,563、3,107および56,520カウント、20マイクロリットルでは72,905、3,616および34,533カウント、30マイクロリットルでは69,644、1,618および32,313カウント、および40マイクロリットルでは69,477、1,210および30,899カウントであった。
5.赤血球／血小板アッセイでは、非除去コントロールは７×106wbc、4.9×1010rbcおよび3.0×107血小板を含有した。除去研究はPLT−１抗体に結合した2.5％W/V固体磁性ビーズの20、40、60および80マイクロリットルを使用して行った。除去の後結果は20マイクロリットルでは10×106のwbc、5.4×1010のrbcおよび１×106の血小板であり;40マイクロリットルでは10×106のwbc、5.8×1010のrbcおよび１×106の血小板であり;60マイクロリットルでは７×106のwbc、5.1×1010のrbcおよび１×106の血小板であり;80マイクロリットルでは10×106のwbc、5.6×1010のrbcおよび０の血小板であった。
II.第１ゼラチン層および第２アミノデキストラン層を有する磁性粒子の調製アミノデキストランの調製
方法A.小規模なアミノデキストランの調製
デキストラン中でグリコピラノース環を部分的に分裂し、アルデヒド基に酸化し、アルデヒド基と1,3−ジアミノプロパンの結合によりシッフ塩基結合を形成し、シッフ塩基結合の還元により安定な炭素−窒素結合を形成することによってアミノデキストランを調製した。典型的な手順では、20gのデキストランを150ミリリットルの50mM酢酸カリウム緩衝液、pH6.5に溶解した。25ミリリットルの蒸留水中の2.14gの過ヨウ素酸ナトリウムの溶液を激しく磁性混合しつつ約10分にわたりデキストランに滴下した。得られた溶液を室温すなわち15〜27℃で約1.5時間攪拌し、その後蒸留水に対して透析した。20ミリリットルの1,3−ジアミノプロパンを20ミリリットルの蒸留水で混合し、氷浴中で冷却し、激しく攪拌し、氷酢酸の添加により約15分にわたり約11.5から約8.7にpHを調整した。典型的には15〜20ミリリットルの氷酢酸を使用した。透析したデキストラン溶液を冷却したジアミン溶液に約15〜20分にわたり滴下した。添加完了後、得られた溶液を室温で約2.25時間攪拌した。10ミリリットルの0.1mM水酸化ナトリウム中の0.8gの水素化ホウ素ナトリウムの還元溶液を約15分にわたり室温でデキストラン反応混合物に添加した。発泡のほとんどを排出するために水素化ホウ素添加の間反応混合物を攪拌した。流出液の電導率が３〜４μmho/cmになるまで粗アミノデキストラン溶液を蒸留水に対して徹底的に透析した。その後透析溶液を0.2μｍフィルターを通して濾過し、モデルTDS−00030−Ａ、Dura−Dryマイクロプロセッサー制御凍結乾燥器（FTSシステムインコーポレイテッド）中で24時間凍結乾燥し、21％の収率で4.25の薄片状の薄黄色の結晶を得た。
方法B.アミノデキストランの大規模な調製
方法Ａの手順をアミノデキストランの大規模調製のためおよびデキストランに導入されたアミノ基の数を増加するために改良した。より低分子量断片に糖ポリマーの更なる分裂を避けるために、中空繊維膜濾過が透析に置き代わり、より小さいジアミン−過ヨウ化物モル比を使用した。中空繊維カートリッジ（ポリスルホン、膜表面積3ft3、繊維直径1mm、5,000MWに切断）をリテンテイト（retentate）ラインで５〜10psiに相当する15〜20psiを分配するインプットパワーポンプ（２つのポンプヘッド、最大流速約4.56リットル／分、No.18Norprene（商標）食品用銘柄管材料使用）に縦に据えつけた。濾液を50〜100ミリリットル／分で集めた。約６〜８時間にわたって20〜30リットルの蒸留水を使用して洗浄を行った。導電率は約３〜４μmho/cmに減少し、pHは6.0〜6.5であった。脱塩中供給材料体積を２リットルに維持し、その後酸化デキストランの第１洗浄で800ミリリットルに濃縮し、アミノデキストランの第２洗浄で400ミリリットルに濃縮した。
標準規模の調製では、80gのデキストランを600ミリリットルの蒸留水を含有する１クォート（リットル）ガラスブレンダーボールに移した。固形物を約２〜５分間中速でブレンドし、全デキストランを溶解した。8.56gの過ヨウ素酸ナトリウムを100ミリリットルの蒸留水に溶解し、得られた溶液を激しく磁性攪拌して約10分にわたりデキストラン溶液に滴下した。添加完了後、得られた混合物を室温で更に３時間攪拌した。その後得られた粘性の反応混合物を蒸留水で２リットルに希釈し、中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は1.5mmho/cmあるいはこれより高く、初期pHは4.0であった。約18〜22リットルの蒸留水を使用して終期pH6.0〜6.5を有する溶液を得た。洗浄した酸化デキストラン溶液の終期体積は800ミリリットルであった。
洗浄した酸化デキストラン溶液に、80ミリリットルの無色の液体1,3−ジアミノプロパンをゆっくりと約10分にわたって室温で添加した。その後得られた混合物を室温で更に３時間攪拌した。攪拌終了後、40ミリリットルの1mM水酸化ナトリウム水溶液に溶解した3.2gの水素化ホウ素ナトリウムを室温でアミノデキストラン反応混合物に約５分にわたって磁性攪拌しつつ添加した。水素化ホウ素ナトリウムの添加終了後、得られた混合物を更に１時間攪拌し、その後中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は5.0mmho/cmあるいはそれより高く、初期pHは約12.0であった。導電率を約３〜４μmho/cmおよびpHを6.0〜6.5に減ずるために約20〜25リットルの蒸留水を必要とした。アミノデキストラン溶液の終期体積は400ミリリットルであった。この溶液を0.2μｍの無菌酢酸セルロースフィルターユニットに通し、その後48時間にわたって凍結乾燥して、収率52％で48gの薄片状の薄黄色の結晶を得た。
上記方法によりデキストランＴ−2Mから調製したアミノデキストランの２つの試料に対して元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ）を得た。分析は以下の通りであった。
試料1.  20gのデキストラン規模、透析による脱塩。
測定値:C  43.04
H   6.60
N   1.09
0  49.27（差より）
試料2.  80gのデキストラン規模、膜濾過による脱塩。
測定値:C  42.53
H   6.52
N   1.01
0  49.94（差より）
C46H79NO37・3H2Oに対する計算値：
C  42.76
H   6.63
N   1.08
0  49.53
２つの調製物におけるアミノデキストランに対する分析は非常に類似しており、こうして脱塩を透析あるいは膜濾過でしても同じ生成物を得たことを示した。試料１に対して得た実験式C46H84NO40は29単位のグルコース（C6H10O5）、１単位の完全にジアミン置換した糖環（C12H28N4O3）および12単位の水に基づく式C46H79NO37・3H2Oに非常に類似する。従って、デキストランにおけるジアミン置換の程度は100％過ヨウ素酸塩分裂およびジアミン置換に基づく1/12の理論値と比較して試料１では1/30であった。試料２に対して得た実験式C49H90NO43は31単位のグルコース、１単位の完全にジアミン置換した糖環および12単位の水に基づく式C49H84NO40・3H2Oに非常に類似する。デキストランにおけるジアミンによる置換の程度は試料２に対しては1/32であった。
アミノデキストラン被膜粒子の調製では、類似の結果を、１×（１×＝3.3％の糖残基の置換）、２×（6.6％）、３×（9.9％）および５×（16.5％）のアミノ基のモル量を有する平均分子量が10,000、40,000および2,000,000であるアミノデキストラン（Ｔ−10、Ｔ−40およびＴ−2M）を使用して得た。全アミノデキストランをデキストランの１×酸化において使用した過ヨウ素酸ナトリウムの２倍および３倍量を使用して方法ＡおよびＢに従って初期に調製した。シッフ塩基形成で使用した1,3−ジアミノプロパンの量を一定に維持した。
出願番号07/827,347において最初に開示したアミノデキストランを調製する方法ＡおよびＢに対して改良を行った。これらの改良は過ヨウ素酸アニオン、ジアミン添加およびシッフ塩基の水素化ホウ素ナトリウム還元を用いたデキストラングルコース環の酸化および分裂を含む。改良によりアミノデキストラン、特に５×アミノデキストランの収量が増加した。一般に、第１の改良は以前に開示した化学量論的な2:1ジアミン：過ヨウ素酸塩モル比に対してほんの10％過剰のジアミンを使用することであった。第２はジアミン添加反応を約５〜10℃の範囲の温度で行った。第３はジアミン添加反応をシッフ塩基形成に対して近紫外（UV）領域で分光器でモニターした。連続した分光分析が安定期に達したことを示したときシッフ塩基の形成は完了したと考える。その後反応を止めた。これらの改良によりより低分子量断片への重合性糖基のアミノリシスを減じ、こうして中空繊維膜濾過による精製および濃縮の後より高い収量の生成物を得た。中空繊維濾過は3ft2の膜表面積、1mmの繊維直径、5000分子量に切断したポリスルホンカートリッジを使用して行った。カートリッジをNo.18Norprene（商標）食品用銘柄管材料を使用した場合最大流速4.56リットル／分を有し15〜20psiを分配する２つのポンプヘッドを備えたインプットパワーポンプ中に縦に据えつけた。この形状では、リテネイト（retenate）ラインにおける圧力は約５〜10psiであった。濾液を50〜100ミリリットル／分で集めた。約６〜８時間にわたって20〜30リットルの蒸留水を使用して洗浄を行った。５×−アミノデキストランを調製するための以下の方法を全アミノデキストランの調製に応用できる改良した手順を説明するために示す。
方法C.5×−アミノデキストランの調製
Ｔ−2Mデキストラン（50g、0.308モル、シグマあるいはファルマシアから得た）を300ミリリットルの蒸留水を含有した１クォートあるいは１リットルのガラスブレンダーボールに添加した。混合物を全デキストランが溶解するまで、典型的には約３〜５分間、最大速度でブレンドした。300ミリリットルの蒸留水中の26.75g（0.125モル）のNaIO4の溶液を激しく磁性攪拌して約10分間にわたってデキストラン溶液に添加した。過ヨウ素酸塩の添加完了後、反応混合物を室温にて更に約３時間攪拌した。３時間後、600ミリリットルの反応体積は最初導電率9.7mmho/cmおよび初期pH2.5を有した。反応混合物を蒸留水で２リットルに希釈し、中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。15〜18リットルの蒸留水を使用して洗浄を行い、600ミリリットルの導電率10mmho/cmおよびpH6.7を有する洗浄した酸化デキストラン溶液を得た。
酸化デキストランの溶液を氷浴を使用して約８℃に冷却し、23.2ミリリットル（0.275モル）の1,3−ジアミノプロパンを約10分にわって酸化デキストラン溶液に添加した。得られた反応混合物を攪拌し、氷浴温度に維持した。黄色のシッフ塩基の形成を抽出試料の335nm近UV吸収を測定することにより10〜15分にわたってモニターした。典型的な実験では、1mmの通路長さのセルを使用した335nmでの測定値は以下の通りであった。
0003547437.tif 000003
吸収値が安定基に達した後、19.3ミリリットルの1mM水酸化カリウム水溶液中の19.3g（0.500モル）の水素化ホウ素ナトリウムを約10分にわたって周囲温度で磁性攪拌しつつ反応混合物に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの添加完了後、反応混合物を周囲温度で更に約２時間攪拌した。攪拌完了後、1cmの通路長さのセルを使用して335nmでの分光器による測定値はシッフ塩基化合物が本質的に消失したことを示す0.067単位の吸収値を示した。その後約1000ミリリットル体積の反応混合物を中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は43mmho/cmであり、初期pHは11.0であった。約18〜20リットルの蒸留水を洗浄の液体として使用し、導電率約４〜６μmho/cmおよびpH6.5〜7.0を有する約300ミリリットルの５×−アミノデキストラン溶液を得た。５×−アミノデキストラン溶液を0.2μｍの硝酸セルロース繊維を通して濾過し、モデルTDS−00030−Ａ、Dura−Dry（商標）マイクロプロセッサー制御凍結乾燥器（FTSシステムインコーポレイテッド）中で48時間凍結乾燥し、48％の収率で24gの薄片状の薄黄色の結晶を得た。元素分析によると、Ｃ＝45.83％、Ｈ＝7.00％、Ｎ＝4.49％、Ｏ（差より）＝42.68％であった。C12H22O8.25Ｎに対する計算分析では、Ｃ＝46.15％、Ｈ＝7.10％、Ｎ＝4.48％、Ｏ＝42.26％であった。
実際の分析に基づく実験式はC12H22O8.3Ｎであり、これは完全にジアミン置換した糖環（C12H28N4O3）の１単位あたり６単位のグルコースに基づく式C12H22O8.25Ｎに非常に類似している。従って、デキストラン中のジアミン置換の程度は100％過ヨウ素酸塩分裂およびジアミン置換に基づく1/2.5の理論値に比べて1/7であった。100gおよび300gのデキストラン規模での繰り返し実験では同程度の置換を有する生成物を得た。
ゼラチン溶液における磁鉄鉱および他の磁性粒子の調製
磁鉄鉱を含有する金属フェライト（MFe2O4、ここでＭ＝Fe2+,Mn2+,Zn2+,Co2+,Ni2+,およびBa2+である。）を上記Ｉで記載したようにタイプＢのゼラチンにおけるそのままの状態で（in situ）で調製した。更に、本発明を説明するために、マンガンフェライトを以下のように調製した。
62.5mmol（62.5ml）の1MのFe2SO4溶液、100mmol（50ml）の2MのKNO3溶液、31.25mmol（31.25ml）の1MのMnSO4溶液および72.92mlの蒸留水を１リットルのパイレックス（商標）ボトル中で一緒に混合し、10分間N2ガスでパージした（溶液Ａ）。その後166.6mmol（33.33ml）の5MのKOHを溶液Ａに添加し、N2ガスを吹き付け、約５〜10分の範囲の時間室温（18〜27℃）で音波処理して、滑らかな、暗い緑色のFe（OH）２ゲルのスラリーを得た。音波処理の後、250ミリリットルの２％のタイプＢ、アルカリ硬化した、225ブルーム（Bloom）ウシ皮膚ゼラチン溶液をFe（OH）２ゲルに添加し、混合し、N2ガスを吹き付け、固く蓋をし、約５〜10分音波処理し、約24時間90℃オーブン中に静置した。オーブン加熱の後、パイレックス（商標）ボトルおよび内容物をオーブンから除去し、室温に冷却するために放置した。冷却完了後、ボトル中の茶色の粒子の懸濁液を混合し、２つの250ミリリットルの組織培養フラスコにデカントした。洗浄の間磁性分離を使用して、各フラスコのフラクションを約５回１％W/VのタイプＢゼラチンあるいは１％１×アミノデキストラン溶液を用いて洗浄した。洗浄後、磁性粒子を再び一緒にして、十分な量の１％の１×アミノデキストラン溶液中に懸濁して500ミリリットルの合計体積にし、約0.5時間音波処理した。粒子を約５〜10℃の冷蔵温度で８時間から少なくとも６か月まで貯蔵した。0.1％W/Vのアジ化ナトリウムを含有する１×アミノデキストラン溶液中で2.5％W/V固体懸濁液として貯蔵した。また、タイプＢゼラチンにおける調製および１×アミノデキストランを用いた洗浄の後、直ちに粒子を使用してもよい。
５×−アミノデキストラン被膜磁性粒子の調製
方法1.  揃った寸法0.3μｍで球形の、上記手順により調製した多量の貯蔵マンガンフェライト粒子を蒸留水で多数回洗浄し、105℃で乾燥し、懸濁液中のW/V固体を決定した。0.56％W/V固体を有する分析した試料を使用した。
100ミリリットルの0.56％W/V固体のゼラチン調製したアミノデキストラン貯蔵マンガンフェライト粒子を磁性的に分離し、同体積の２％W/Vの５×−アミノデキストラン溶液中に再び懸濁した。100ミリリットルの茶色の粒子の懸濁液を約10分間音波処理し、その後夜中（約８〜16時間）250ミリリットル組織培養フラスコ中でオービタルシェーカーにより混合した。混合完了後、約20マイクロリットルの5M水酸化カリウム水溶液を用いてpHを10.0に調整した。吸着した５×−アミノデキストランを1.173ミリリットルの25％のグルタルアルデヒド水溶液（3.11mmol）をpH調整粒子懸濁液に添加することにより架橋し、得られた懸濁液を１〜４時間の範囲の時間、好ましくは１時間、オービタルシェーカーを使用して混合した。架橋粒子を磁性的に分離し、上澄みを測定して廃棄し、未反応アルデヒド基を遮断し安定化するために、廃棄した上澄みの体積と等しい１％の５×−アミノデキストラン溶液の体積中に粒子を再び懸濁した。また、エチレンジアミンあるいは1,3−ジアミノプロパン溶液のようなポリアミン溶液を未反応アルデヒド基を遮断するために使用してもよい。ポリアミンのモル量は使用したグルタルアルデヒドの量の約10倍である。再懸濁した粒子を振盪し、音波処理してそれらを分散し、得られた懸濁液をオービタルシェーカーを使用して夜中混合した。その後1mMの水酸化カリウム水溶液中の10mg/mlの水素化ホウ素ナトリウム（6.22mmolNaBH4）の23.5mlの試料を懸濁液に添加し、得られた混合物を更に0.5時間軌道的に混合した。その後粒子を磁性的に分離し、１×PBSで多数回（最低３回）洗浄し、22.4ml体積に濃縮し、2.5％W/V固体懸濁液を得た。
方法2.  0.1％アジ化ナトリウムを含有する１％W/V1×−アミノデキストラン溶液中に懸濁した0.83％W/V固体マンガンフェライト粒子の60.2ミリリットルの試料を磁性的に分離し、0.2Mの塩化ナトリウム水溶液の20ミリリットル部で多数回洗浄した。洗浄後、粒子を0.2M塩化ナトリウム溶液（約20ミリリットル）中の十分な量の3.75mg/mlの５×−アミノデキストラン中に再懸濁し、2.5％W/V固体懸濁液を得た。次に、2.5％W/V固体懸濁液のミリリットル毎に対して、0.2Mの塩化ナトリウム溶液中の９マイクロリットルの10mg/mlのEDAC・HClを懸濁液に添加した（合計180マイクロリットル）。得られた混合物を50ミリリットルの組織培養フラスコ中で約12〜16時間の範囲の時間軌道的に振盪した。粒子を磁性的に分離し、蒸留水で多数回洗浄し、１×PBS中に再懸濁して、ゼラチンとアミノデキストラン間の縮合反応により形成された被膜を有する磁性粒子の2.5％W/V固体懸濁液を20ミリリットル得た。この縮合反応はアミノデキストランのアミン基とゼラチン上に存在するカルボキシレート基間で起こる。EDACは尿素として縮合反応の間に形成した水を除去した。グルタルアルデヒドのような架橋剤を使用することは必要ない。得られた粒子は、第１ゼラチン層、第２アミノデキストラン層および化学架橋剤による架橋を有する粒子と等価であるとして規定する。
架橋したゼラチン層および５×−アミノデキストラン層の厚さの決定
A.ゼラチンの厚さ
グルタルアルデヒド架橋溶液を56マイクロリットルの25％グルタルアルデヒド水溶液と５ミリリットルの1mM水酸化カリウム水溶液を混合することにより調製した。上記のようにタイプＢにおいて調製した、および0.1Mリン酸塩緩衝液（pH8.4）中の２％W/VのタイプＡの175ブルームゼラチン中に懸濁した、マンガンフェライト粒子の2.5％W/V固体懸濁液の５ミリリットルから、粒子を磁性的に分離し、上澄み液を廃棄した。分離した粒子を５ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液に再懸濁し、約30分好ましくはローラーミキサーを使用して混合した。粒子を再び磁性的に分離し、５ミリリットルの1mM水酸化カリウム水溶液で３回洗浄し、５ミリリットルの1mM水酸化カリウム水溶液に再懸濁した。
蒸留水で15回洗浄し110℃で一定の重量になるまで乾燥した、５ミリリットルの架橋したゼラチン被膜マンガンフェライト粒子を使用して元素分析を行った。分析結果は、Mn＝19.05％、Fe＝49.49％、Ｃ＝0.54％、Ｈ＜0.5％、Ｎ＜0.5％およびＯ（差による）＝30.92％であった。ゼラチン中の重量による炭素の百分率はそのアミノ酸成分から得ることができる（「The  Theory  of  the  Photographic  Process」４編、ティー．エイチ．ジェイムズ、（マクミラン、ニューヨーク  19767）、２章、52頁）。ここで使用したタイプＡゼラチンはＣ＝50.46％、Ｈ＝6.765％、Ｎ＝18.27％、Ｏ＝24.29％およびＳ＝0.21％を与える。この情報を使用して、ゼラチン層の厚さを計算することができる。
1gのゼラチン被膜フェライト粒子を使用すると、1g×0.0054/0.5406＝0.01070gのゼラチンと0.9893gのフェライトがある。直径0.29μｍのマンガンフェライト球の粒子体積は1.277×10-14cm3であり、0.9893gのマンガンフェライト中の粒子数は1.827×1013である。従って、フェライト粒子あたりのゼラチン質量は5.856×10-16gである。
グルタルアルデヒドで架橋する前の２％W/Vゼラチンからゼラチン被膜の密度を0.02g/cm3と仮定すると、粒子あたりのゼラチン体積は2.92×10-14cm3である。結果として、粒子あたりの合計体積、すなわちゼラチンプラスフェライトは4.205×10-14cm3であり、ゼラチン−フェライト球の半径は2.157×10-5cm（0.2157μｍ）である。こうしてマンガンフェライト球上のゼラチン被膜の厚さは0.2157μｍ−0.145μｍ（フェライト球の平均半径）＝0.0707μｍ（71nm）である。これは、エイ．ティー．クディッシュ氏等による、「Proteins  at  Interfaces」、エイシーエスシンポジウムシリーズ343、ジェイ．エル．ブラッシュ氏等による、（American  Chem.Soc.ワシントン、ディー．シー.1987）出版、261〜277頁により与えられたガラス上の750オングストロームの値；エヌ．カワニシ氏等による、「J.Phys.Chem.」、94巻、4611〜4617頁（1990）により与えられた雲母上の75nmの値、およびエイチ．メッツァー氏等による、「J.Colloid  Inteface  Sci.」、126巻、292〜303頁（1988）により与えられたガラス上の600〜700オングストロームの値と良く一致する。
ポリビニルピロリドン（PVP）安定化剤を使用してゼラチン層を架橋したマンガンフェライト粒子に対してゼラチン層の厚さを同様にして計算した。元素分析によると、Mn＝18.84％、Fe＝47.82％、Ｃ＝1.67％、Ｈ＜0.5％、Ｎ＜0.5％およびＯ（差による）＝31.67％であった。ゼラチン被膜の計算した厚さは148nmであった。PVPを使用したより厚い被膜は手順の相違から生じたと考える。フェライト−ゼラチン溶液を元の手順において２％から0.08％に希釈し、１％PVPを添加した場合、より厚い被膜を得た。ゼラチン−フェライト粒子を２％ゼラチン溶液から分離し、架橋媒体中に再懸濁した場合、より薄い被膜を得た。結果として、過剰のポリマーがなく、ゼラチンあるいはPVPのいずれかが存在した。
B.アミノデキストランの厚さ
マンガンフェライト粒子を、順次、架橋され、遮断され、安定化される５×−アミノデキストラン（方法１）で被膜した。得られた粒子を蒸留水で多数回洗浄し、磁性的に分離し、110℃で乾燥した。元素分析の結果は、Mn＝14.04％、Fe＝44.36％、Ｃ＝2.97％およびＯ（差による）＝38.63％であった。45.83％のＣを含むとして分析された５×−アミノデキストランおよび２％W/Vの５×−アミノデキストラン被膜に対して、推定したアミノデキストラン層の厚さは218nmである。
スルホ−SMCCを用いたジアミン処理粒子の活性化
５倍の活性化量のスルホ−SMCCを使用した他は、スルホ−SMCCを用いてゼラチン被膜粒子を活性化するために説明した同じ手順を使用して５×−アミノデキストラン被覆粒子を活性化する。磁性粒子を１×−、２×−あるいは３×−アミノデキストランで被膜する場合、１、２あるいは３倍量のスルホ−SMCCをそれぞれ使用する。
２−イミノチオラン塩酸塩を用いた抗体活性化
前述した手順により２−イミノチオラン塩酸塩を用いて抗体を活性化した。活性化粒子に結合すべき抗体あるいは他の物質が反応性スルフィドリル基を十分に有する場合、２−イミノチオラン塩酸塩による活性化は必要ないかもしれない。また、当業者には、マレイミジル基を含むことによる粒子の活性化、および抗体あるいは他の物質の活性化がスイッチとなり得ることが認識できる。すなわち、反応性スルフィドリル基の導入により粒子を活性化でき、反応性マレイミジル基を含んで抗体あるいは他の物質を活性化できる。
本発明の利用性を説明するために以下の例を示すが、本発明を限定するものではない。別の方法が示されない限り、方法１を５×−アミノデキストランを用いて粒子を被膜するのに使用した。この例では、白血球リッチの全血試料中の好中球を数えるための２つの方法を説明する。５×−アミノデキストラン被膜ビーズに結合したモノクローナル抗体1D3およびフローサイトメトリーを両方法において使用する。
第１の方法では、磁性ビーズタイターを含有する一連の1D3を調製し、白血球リッチ血液試料と混合し、その後磁性的に試料から分離した。その後好中球を除去した上澄みをフローサイトメトリーで分析し、好中球除去が完了した点を決定した。試料を最低タイターから最高タイターのオーダーで分析し、除去を一定のサイトメーターカウントにより確認した。
第２の方法では、全血試料を同じタイターの1D3結合磁性ビーズと混合したが、磁性分離は行わなかった。好中球細胞の表面に磁性ビーズが付着したことにより細胞の寸法、形状あるいは屈折率が変化するので、この混合物を前方対側方（直交）散乱ヒストグラムにおける正常顆粒球領域から変化した好中球に対してフローサイトメトリーで分析した。変化した好中球集団あるいはカウントが安定な値に達した場合、光散乱ヒストグラムにおけるカウントあるいはビットマップ領域における蛍光発生カウントを好中球の相対数を得るために全白血球細胞（リンパ球、単球および顆粒球）に対するそれぞれのカウントと比較した。
均一な寸法、均一な球形および均一な屈折率性状を有する良好に規定されたフェライト粒子を使用することは、ここで説明した粒子のような粒子の表面に結合した生体細胞から光散乱において認識できる明確な変化を得るには本質的なことである。化学物質から生じる電気双極子散乱に加えて、フェライト粒子から生じる磁性双極子散乱が細胞粒子結合から生じる光分散の強度に実質的に寄与できる〔ジェイ．エイ．ストラトン、「Electromagnetic  Theory」（マグローヒル、ニューヨーク1941）、437頁およびシー．エフ．ボーレンおよびディー．アー．ホフマン、「Adsorption  and  Scattering  of  Light  by  Small  Particles」、（ウィリー、ニューヨーク1983）、141頁〕。ジェイ．ジェイ．マリー、「Optics」、４巻、1011頁（1965）では、磁鉄鉱のような磁性粒子により低角光散乱を測定する。
ここで使用したマンガンフェライト粒子の直径は0.29±0.08μｍであった。この直径は、国際特許出願公開WO90/13013（発明の名称:METHOD  AND  APPARATUS  FOR  SCREENING  CELLS  OR  FORMED  BODIES  WITH  POPULATIONS  EXPRESSING  SELECTED  CHARACTERISTICS  UTILIZING  AT  LEAST  ONE  SENSING  PARAMETER）およびPCT出願No.PCT/US/08590（出願人クールター  コーポレイション）（発明の名称:METHOD  AND  APPARATUS  FOR  SCREENING  MICROSCOPIC  CELLS  UTILIZING  LIGHT  SCATTER  TECHNIQUES）で使用されたポリスチレンラテックスおよび磁性ラテックス粒子に対する0.65〜3.0μｍの平均直径範囲から外れている。この研究で使用されたポリスチレンラテックス粒子は均一な寸法および形状であった。しかし、乳化重合の間にラテックスの内側に寸法および形状が変わるフェロ流体（ferrofluid）粒子を埋め込むことにより形成された磁性ラテックス粒子は球形であるが（米国特許4,358,388号明細書、ダニエル等）、寸法が広範に変わる。例えば、平均粒子直径は0.7μｍであったが、個々の粒子は0.2から1.0μｍに変わった。（ポリスチレンラテックスに埋め込んだフェロ流体粒子の構造が規定されないという事実から更なる問題が生じる）。重量％により測定した場合には低レベルであったが、直径の小さい粒子は非常に多かった。結果として、より大きい粒子の移動度に対してより小さい粒子の移動度がより高いために、より小さい粒子抗体結合は細胞表面の抗原部位を優先的に専有するであろう。しかし、これらの小さい粒子は細胞の光分散の変化への寄与が小さく、目的の変化した細胞集団の本当の数あるいはカウントを得るには、これらの磁性粒子を使用することは信頼性がない。合計においてラテックス粒子中に異なる空間的な方向を有する磁性粒子を多く有する場合に、このことは、幾分、得られる正味の磁性双極子が低レベルであるためかも知れない。
これらの均一な寸法および均一な球形に加えて、ここで説明したように形成され被膜された密集した微晶質のフェライト粒子の屈折率はポリスチレンラテックスおよび生体細胞の屈折率と十分に異なる。選択した細胞のセットあるいはサブセットをこれらの磁性粒子に結合する場合、非結合細胞のヒストグラムに比べて結合細胞の前方対側方分散ヒストグムに大きな変化が生じる。結果として、粒子に結合した細胞は粒子に結合しない細胞から区別できる。
実施例4.好中球の数え上げ
試料の調製
50ミリリットルのNa4EDTA抗凝固全血試料を多数の遠心管に分配し、約10分間500gで遠心分離した。血漿の大部分を除去し、各管中の細胞のバフ着色層を除去し、集めて、約10分間500gで再び遠心分離した。集合的に、バフ着色細胞および血漿は8.0×108/ml以下の赤血球（rbc）カウントおよび２〜４×107/mlの間の白血球（wbc）カウントを有する白血球リッチ全血を構成する。
100マイクロリットルの白血球リッチバフ着色細胞を多数の反応管にピペットで入れた。ここで説明したようにして調製した、５〜250マイクロリットル量の2.5％W/V懸濁固体である1D3結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を分離管にピペットで入れた。典型的に、フェライト粒子懸濁液のタイターは０、５、10、20、30、40、50、75、100、150、200および250マイクロリットルであった。その後各管の体積を１×PBSを添加して350マイクロリットルにした。各管を低速で６分間回転し、各管の内容物を磁性的に集め、60秒間分離した。白血球を除去した試料を構成する上澄み液を注意深くピペットで除去し、分析用の二重管に入れた。
白血球リッチ（白血球を除去しない）および白血球除去バフ着色細胞試料をフローサイトメーターで分析し、実際の好中球除去と非特異的好中球除去を弁別した。すなわち、好中球に加えて、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球の除去である。分析に供する各試料を10マイクロリットルの単色抗体試薬CYTO−STAT（商標）KC56−FITC（クールターコーポレーション、マイアミ、フロリダ）を加えて、渦流で混合し、室温で10分間培養して処理した。コントロール試料は非除去バフ着色細胞に結合した抗体コントロールおよびアイソタイプコントロールであった。その後管をクールターEPICS（商標）Ｑ−プレップあるいは類似の装置中に置き、35秒溶解モードで処理した。rbcを溶解し試料を固定した（Ｑ−プレップ）後、各試料の合計体積は1100マイクロリットルであった。その後全試料をクールターEPICS（商標）プロフィルIIフローサイトメーターあるいは類似の装置で分析した。プロフィルII装置で利用できるプログラムを蛍光発生としてリンパ球および単球骨髄集団を分析するのに使用した。試料体積あたりの細胞数を据低するために、100マイクロリットル試料の吸引である非除去試料のwbcカウントをクールターＳ−Plus（商標）カウンターで決定し（4.19×106wbc）、非除去試料および100マイクロリットル試料の吸引におけるリンパ球、単球および顆粒球に対して測定した合計蛍光発生（1.81×106）と比較した。これらの測定の結果として、実際の細胞カウントを得るために、除去試料に対して決定した蛍光発生を2.31〔（4.19×106）＋（1.81×106）〕のファクターおよび11の希釈ファクターによりスケールした。
手順1.試料の磁性ビーズ除去後の好中球に対するフローサイトメーター分析
非除去コントロール試料の骨髄細胞アッセイの結果は、蛍光発生として29,131のリンパ球、19,282の単球および116,479の顆粒球カウントとなった。従って、合計wbc集団の顆粒球百分率は70.6％である。クールターＳ−Plus（商標）カウンターを使用して得た結果は、71.7％の顆粒球合計であった。除去分析を５、10、20、30、40、50、75、100、150、200および250マイクロリットルの、1D3モノクローナル抗体と結合した0.25％W/V固体磁性ビーズを使用して行った。結果は表２に示す。
0003547437.tif 000004
好中球および単球の両方は1D3結合磁性ビーズを用いて完全にタイターを除去された。単球の除去は、バフ細胞および磁性ビーズ混合物に対する回転時間を６分から30秒に短縮することによりおよび磁性分離時間を60秒から15秒に減じることにより避けるかあるいは実質的に減少させることができる。顆粒球に対する非除去および除去試料蛍光発生と非除去試料における合計wbc蛍光発生の間の相違に基づいて、合計wbcにおける好中球の百分率は66.8％であった。
蛍光発生を顆粒球細胞カウントに転化するために、0.25％W/V固体懸濁液のミリリットルあたり4.18×1010のマンガンフェライト粒子の値およびファクター25.41（蛍光発生スケールファクター2.31×希釈ファクター11、共に上記より得た）を使用して好中球除去データをビーズおよび細胞の値に変換した。結果を表３に示す。
0003547437.tif 000005
図１は、除去した好中球数対磁性ビーズ／細胞の比を図的に示したものであるが、約2000:1のビーズ対細胞の比を使用して2.8×106の好中球を完全に除去した場合、好中球除去における安定期は0.25％W/V磁性ビーズタイターの100マイクロリットルと150マイクロリットルの間に到達したことを示す。このことは、クールターＳ−Plus（商標）カウンターにより決定されこ4.19×106の合計wbcカウントの66.8％を示す。
手順2.磁性ビーズにより変化した好中球に対するフローサイトメーター分析
クールタープロフィルIIサイトメーターを使用した分析のための試料の調製において説明したようにして白血球リッチバフ細胞−磁性ビーズ混合物を調製したが、磁性分離はなされなかった。前方対側方分散ヒストグラムにおけるリンパ球および単球骨髄集団を分析するためにプログラムをプロフィルに導入した。特に、好中球を磁性フェライト粒子に結合することにより、寸法、粒度あるいは屈折率における変化が現れるために、これらの好中球は正常顆粒球領域から変化した。図２における一連のヒストグラムは、より高いタイターの磁性ビーズを細胞試料に添加した場合、正常顆粒球領域において、より少ない前方分散（FS）あるいはより小さい寸法およびより多い側方分散（LSS）あるいはより大きい粒度の方向に明確な連続的な変化を示す。
しかし、フェライト粒子の屈折率および磁性性状は、粒子が目的細胞に付着する場合に示される、より大きい寸法（より多いFS）およびより大きい粒度（より多いLSS）に通常の傾向を変える。最終結果として、最高の磁性ビーズタイターにて顆粒球により正常に占有される領域を占有する顆粒球と同じ方向に単球は変化した。100μＬの0.25％固体磁性ビーズ以上のタイターを使用するまでリンパ球は変化しなかった。これらのより高いタイターでは、前方対側方散乱ヒストグラムのリンパ球囲み領域から変化するので、リンパ球は明らかに除去された。単球あるいは好中球のいずれかに非結合の過剰の磁性ビーズが存在する場合、この変化が明白となる。過剰のビーズは、結合によるのではなく、過剰の磁性フェライト粒子からの戻り散乱（back−scatter）によりリンパ球の粒状化を妨害することが明らかである。以下の表４は異なるタイターの0.25％W/V固体の1D3結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を使用して、元の顆粒球カウント、変化した顆粒球カウントおよび変化した顆粒球の百分率を示す。
0003547437.tif 000006
100μＬタイターに対して、合計分析結果は、リンパ球カウント26,604、単球カウント1,045、変化しない顆粒球カウント17,449および変化した顆粒球カウント88,145であった。結果として、合計wbcカウントにおける好中球百分率は66.2％として計算された。集団変化方法により得た好中球百分率は、手順１を使用して得た磁性除去データから計算した66.8％に良く一致する。
更に本発明の有用性を説明するために、（ａ）赤血球および血小板、並びに（ｂ）白血球において付加的な研究除去を行った。
実施例5.赤血球および血小板の磁性ビーズ除去
100μＬのNa4EDTA−抗凝固全血を多数の反応管に入れた。20〜160μＬタイターの2.5％W/V固体のKC−16結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を反応管に添加し、各管の合計体積を１×PBSを用いて260μＬに調整した。得られた混合物を６分間多重管渦巻き器あるいは単管回転器において低混合速度にて回転した。回転が完了した後、各管のビーズを磁性的に60秒分離した。上澄み液をパストゥールピペットを使用して除去し、標識化管に貯蔵した。試料をクールターＳ−Plus（商標）あるいは類似のrbcカウンターを使用して100μＬの試料（全血プラスビーズプラス１×PBS）あたりの合計rbcカウントとして分析した。陽性コントロールは100μＬの全血プラス160μＬの１×PBSであり、100％のrbcカウントを示した。除去されたrbc百分率＝100％−〔（試験管中のrbcカウント）÷（100％rbcカウント）〕。
以下の表５は赤血球／血小板アッセイの結果をまとめたものである。０μＬのデータは除去しないコントロール試料である。除去は1.25％W/V固体のKC−16結合５×アミノデキストラン被膜ビーズを使用して行った。KC−16モノクローナル抗体は赤血球にのみ結合し、白血球あるいは血小板には結合しない。
0003547437.tif 000007
2.5％W/V固体懸濁液に対する磁性ビーズ/mlの数は4.18×1011である。除去rbc数対ビーズ／細胞の比のプロットである図３を使用し、160μＬの1.25％W/V固体ビーズは3.36×1010の磁性粒子を含み、4.37×108rbcを除去して、粒子／結合rbcの比は77を与える。
アッセイは方法２により５×アミノデキストランを用いて被覆した磁性ビーズに対して繰り返された。アッセイは５、10、20、40、60、80、100、150、200および250μＬタイターの2.5％W/V固体のKC−16結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を使用して行った。陽性コントロールは実質的に1.000mlに１×PBSで希釈される、250μＬの１×PBS中の100μＬの全血であった。非除去コントロール用のwbc、rbcおよび血小板カウントは０μＬビーズとして以下の除去表６に示される。
0003547437.tif 000008
除去rbcの数対粒子／細胞の比のプロットは図２において示したのと同様に安定期を有する。安定期における150μＬの2.5W/V固体磁性粒子は6.3×1010の粒子を含み、粒子/rbcの比147に対して4.3×108rbcを除去した。
血小板に対する除去アッセイは、10、20、30、40、50、100、150および200μＬの0.83％W/V固体のPLT−１モノクローナル抗体（クールターコーポレイション、ハイアレア、フロリダ）結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子について行った。合計体積は必要に応じて１×PBSを添加して350μＬに調整した。陽性コントロールは250μＬの１×PBSを用いて希釈した100μＬの全血であった。非除去コントロール用のwbc、rbcおよび血小板は以下の除去表７に０μＬビーズとして示される。
0003547437.tif 000009
図４にプロットし結果は、100μＬの0.83％W/V固体ビーズは1.39×1010粒子を含み、1.79×107血小板を除去し、粒子／血小板の比779を与える。
実施例6.白血球の磁性ビーズ除去
白血球リッチ試料の調製、KC−56モノクローナル抗体（クールターコーポレイション）結合５×アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を用いた除去および手順１による磁性除去の後の上澄み液の分析は、1D3抗体結合磁性ビーズを使用した好中球除去に対して説明したものと類似である。除去アッセイは５、10、20、40、60、80、100、150、200および250μＬの0.833％W/V固体のKC−56結合５×−アミノデキストラン被膜マンガンフェライト粒子を使用して行われた。蛍光発生として与えられる非除去コントロール試料用のリンパ球、単球および顆粒球カウントは、以下の除去表８に０μＬビーズとして示される。
0003547437.tif 000010
試料体積あたりの細胞数を決定するために、非除去試料のwbcカウント（2.86×106）をクールターＳ−Plus（商標）カウンターにおける100μＬの吸引に対して決定し、このカウントを非結合試料におけるリンパ球、単球および顆粒球に対する合計蛍光発生（8.56×105）と比較し、およびクールターEPICS（商標）プロフィルIIフローサイトメーターにおける100μＬの吸引に対して決定した。結果として、蛍光発生を3.34〔すなわち、（2.86×106）÷（8.57×105）〕のファクターによりおよび11の希釈ファクターによりスケールし、細胞数を得た。ビーズ数を0.833％W/V固体懸濁液に対する1.39×1011粒子/mlを使用して計算した。以下の除去表９に、除去wbc数（×105）、除去において使用した磁性ビーズ数（×108）およびビーズ／細胞比（×103）として結果を示す。
0003547437.tif 000011
図５は除去したWBC数対磁性ビーズ／細胞の比のプロットである。図５は2.15×103および4.13×103のビーズ／細胞の値に対して急勾配で上がり、100μＬの0.833％W/Vビーズタイターにて安定期が始まり、ここでは2.85×106wbcを約4900:1のビーズ／細胞比にて除去した。ほとんどすべてのリンパ球および単球を除去した後、より大きい顆粒球細胞の除去を始める。このことは、磁性的に細胞を除去するために顆粒球に付着したより多くの磁性ビーズ数が必要であることと矛盾しない。すなわち、顆粒球の磁性分離には、磁界に向けて溶液から細胞を物理的に引く十分な磁性モーメントを持つために、より大きい顆粒球細胞のおのおのに付着したより多くの磁性粒子を有することが必要である。顆粒球除去に対して図５では分離屈曲点はない。しかし、幾つかの顆粒球は前方対側方散乱ヒストグラムにおいてより高いタイターに対して変化し、その後除去が完了した。このことは、磁性分離により除去されず、細胞に付着した磁性ビーズの数が十分にある懸濁液中に残っている幾つかの顆粒球の存在を示す。
III.生物分解性の被膜を有する重合性粒子の調製
A.ゼラチン被膜重合性粒子
ゼラチン被膜ポリスチレンラテックス粒子の調製
均一な寸法（2.17μＬ±3.0％）および球形の硫酸ポリスチレンラテックス粒子（IDCコーポレイション、ポートランド、オレゴン）を本発明を例証するのに使用し、これを蒸留水中に分散し、3000rpmで10分間遠心分離した。上澄み液を廃棄して、粒子を2.5％W/V固体にて１％のタイプＡ、175ブルームゼラチン水溶液中に再懸濁し、再分散を助けるために１分間音波処理して混合し、８〜16時間ローラー混合した。硫酸ポリスチレンラテックス粒子はポリスチレンに付着したアミン反応性基を有していない。しかし、ゼラチンがアミン基を有しているとして、ほとんど含んでいない状態でも、基を同じ方法で使用できる。更に、ポリスチレンラテックス粒子は磁性粒子を埋め込んでもよく、あるいは粒子はポリマー被膜を有する磁性核（この場合、ポリスチレンラテックスの被膜である）からなっていてもよい。このような磁性粒子を使用する場合、分離は遠心分離による代わりに磁性的にすることができる。
吸着ゼラチンの架橋および未反応アルデヒド基の遮断
25％のグルタルアルデヒド水溶液（0.749mmol）の0.300mlアリコートを１％のポリビニルピロリドン（40,000MW）を含む575mlのリン酸緩衝液（１×PBS）に添加した。その後１％のタイプＡ、175ブルームゼラチン溶液中の2.5％W/V固体硫酸ポリエチレンラテックス粒子の25mlをグルタルアルデヒド溶液に添加した。得られた懸濁液を1Lのポリプロピレン遠心分離ボトル中に入れ、６分間ローラー混合した。混合後、0.505mlの99％エチレンジアミン（7.49mmol）を600mlの１×PBS中の粒子に添加し、得られた懸濁液を約２〜３時間ローラー混合した。0.1mMKOH水溶液中の10mg/mlNaBH4の6.0mlを添加し、懸濁液を15分間再びローラー混合した。粒子を３回0.2MのNaCl水溶液でを遠心分離およびデカンテーションにより洗浄した。洗浄後、粒子を0.2MNaCl中に再懸濁し、24mlの2.5％W/V固体懸濁液を得た。
ポリビニルピロリドン安定化剤を含まない吸着ゼラチンの架橋
56μＬの25％グルタルアルデヒド水溶液を5mlの1mM水酸化カリウム水溶液と混合した。0.1Mのリン酸緩衝液（pH8.4）中の２％W/V、タイプａゼラチンに懸濁した2.5％W/V固体硫酸ポリスチレンラテックス粒子の5mlを遠心分離により分離して、上澄み液を廃棄した。分離ゼラチン被膜ポリスチレンラテックス粒子を本明細書中に説明したようにして調製した5mlの3mg/mlグルタルアルデヒド溶液に懸濁した。得られた懸濁液を約30分間混合し、好ましくはローラー混合した。グルタルアルデヒドの添加および混合が完了した後、20μＬのエチレンジアミン（2:1＝ジアミン：グルタルアルデヒドモル比）を反応混合物に添加し、その後、更に２〜３時間攪拌した。続いて、1mMKOH中の40mg/mlの水素化ホウ素ナトリウム溶液の0.313ml（ビーズ１グラムあたり100mg）を反応物に添加し、得られた混合物を約10〜30分攪拌した。その後、架橋粒子を遠心分離により分離し、３回洗浄し、5mlの0.2M塩化ナトリウム水溶液中に再懸濁した。
ポリスチレンラテックス粒子を被膜したゼラチンのカルボキシレート残基へのエチレンジアミンの結合
99％エチレンジアミンの0.404mlアリコート（6.00mmol）をポリビニルピロリドン安定化剤を使用してあるいは使用しないで調製した24mlの、固定した、アルデヒド遮断した、ゼラチン被膜の、ポリスチレン粒子、2.5％W/V固体に混合した。0.2MNaCl溶液中の10mg/mlEDTA（0.50mmol）の試料0.960mlを粒子に添加し、８〜16時間50ml遠心管中でローラー混合した。3000rpmで10分間遠心分離し、デカンテーションした後、１×PBSで５回、管の内容物を洗浄した。その後、粒子を十分な量の１×PBSに再懸濁し、24mlの合計体積を与えた。
スルホ−SMCCによる粒子活性化およびゼラチン被膜ポリスチレンラテックス粒子への抗体結合
粒子の活性化およびゼラチン被膜ポリスチレン粒子へのモノクローナル抗体の結合を、粒子の分離を3000rpmにて10分間遠心分離およびその後の上澄みのデカンテーションにて完了したことを除いて、磁性ビーズに対してしたのと同じ手順を使用して実行した。
実施例7.ゼラチン被膜ポリスチレンラテックス粒子へのモノクローナル抗体共有結合を使用したT4およびT8細胞集団アッセイ
15μＬのKC−48結合磁性ビーズ懸濁液（2.5％W/V）を50μＬの全血に添加した。混合物を15秒間緩やかに渦巻き混合し、磁性的に分離した。28μＬの上澄み液を新しい試験管に移動し、15μＬのT4−あるいはT8−結合ゼラチン被膜ポリスチレンラテックスビーズ（2.5％W/V）をその管に添加した。その後、管の内容物を15秒間渦巻き混合した。300μＬの、赤血球に対するバッチ溶解剤を添加し、混合物を４秒間渦巻き混合し、120μＬの溶解失活剤を添加し、再び混合物を４秒間渦巻き混合した。得られた試料をクールターVCSあるいは類似の装置で変化したＴ細胞の集団に対して分析した。コントロールは全血あるいは顆粒球をKC−48結合磁性ビーズにより除去した全血であった。試料中のT4あるいはT8細胞の百分率はDC対不透明部（opacity）のKC−48除去領域に変化した細胞集団に等しい。T4あるいはT8細胞の百分率（％）＝〔（変化したT4あるいはT8細胞集団）÷（合計オリジナルリンパ球集団）〕×100。この百分率を得たプロットはDC対〔（RF−85）÷DC〕であり、ここで、RFは高周波散乱であり、DCは直流抵抗であり、−85は一定である
上記のラテックス粒子の例に等価な本発明の例では、マレイミジル基およびスルフィドリル基を置き換える。すなわち、上記マレイミジル基の代わりに、架橋ゼラチン被膜粒子を誘導し、側基を反応性スルフィドリル基末端にし、上記スルフィドリル基の代わりに、抗体を誘導し、反応性マレイミジル基を持たせる。この等価例を実施するのに使用した方法は、上記と同じである。
B.アミノデキストラン被膜粒子
アミノデキストランの調製
重合性粒子を被膜するのに使用するアミノデキストランを上記のようして調製した。
アミノデキストラン被膜した官能化ポリスチレンラテックス粒子の調製
２タイプの官能化ポリスチレンラテックス粒子あるいはビーズを模範的な被膜材料として５×アミノデキストランを用いて本発明に従って被膜した。第１のタイプは、ワシントン、ペンシルベニア、ポリサイエンス  インコーポレイテッドからの直径2.01μｍ（標準偏差0.046）のポリビーズカルボキシレートミクロスフェアであり、第２のタイプはポートランド、オレゴン、IDC  コーポレイションからの直径2.15μｍ±5.5％のアルデヒドあるいはアルデヒド／硫酸ポリスチレンラテックス粒子である。これらの粒子のどちらも磁性ではない。しかし、磁性ビーズは同じ方法で被膜され、遠心分離の代わりに使用される磁性分離により懸濁媒体からビーズを分離する。５×−アミノデキストランを用いたビーズの被膜の第１段階は、表面カルボキシレートあるいはアルデヒド基と５×−アミノデキストランのアミン基間の縮合反応により粒子表面官能基へ５×−アミノデキストランを結合することであった。
手順1.カルボキシレートポリスチレンラテックス粒子への結合
5mlの10mg/ml5×−アミノデキストラン水溶液および1mlの2MNaCl水溶液を4mlの2.5％W/V固体カルボキシレル化ポリスチレンラテックス粒子の懸濁水溶液に添加した。その後230μＬの水溶性カルボジイミドの10mg/ml水溶液、例えばEDAC  HClをラテックス粒子のコロイド分散に添加し、全混合物を約８〜16時間の範囲内の時間混合し、好ましくはローラー混合器を用いて混合した。
手順2.アルデヒド／硫酸ポリスチレンラテックス粒子の結合
5mlの10mg/ml5×−アミノデキストラン水溶液および2.619mlの蒸留水を2.381mlの4.2％W/V固体アルデヒド／硫酸ポリスチレンラテックス粒子の懸濁水溶液に添加した。その後分散物のpHを２μＬの5M水酸化カリウム水溶液の添加により10.0に調製した。その後得られた混合物を約８〜16時間の範囲内の時間で、好ましくは、ローラー混合器を用いて混合した。
ポリスチレンラテックス粒子における５×−アミノデキストランスの架橋
手順１あるいは２のいずれかにより調製されたアミノデキストラン被膜ビーズを蒸留水中に懸濁し、3000rpmにて10分間遠心分離して、３〜４回洗浄した。その後ビーズを10mlの２％W/V5×−アミノデキストラン水溶液に再懸濁し、３時間、好ましくはローラー混合器を用いて混合した。混合完了後、２μＬの5M水酸化カリウム水溶液を添加してpHを約10.0に調製した。pH調製の後直ちに、0.117mlの25％グルタルアルデヒド溶液（５×−アミノデキストラン中のアミノ基１モルあたり１モルあるいは0.311モル）をビーズ含有溶液に添加し、約１時間、好ましくはローラー混合器により混合した。15分の混合の後、シッフ塩基形成の黄色の指示に注意した。その後ビーズを遊離グルタルアルデヒドおよびアミノデキストランから遠心分離により分離し、上澄み液を廃棄した。未反応アルデヒド基遮断するために、ビーズを10mlの１％W/V5×−アミノデキストランに再懸濁し、約８〜16時間の範囲内の時間、好ましくはローラー混合により混合した。選択的に、エチレンジアミン（グルタルアルデヒド１モルあたり10モル）を遮断試薬として使用できる。これらの反応により形成されたシッフ塩基を2.35mlの10mg/mlの水素化ホウ素ナトリウムをビーズ混合物に添加することにより還元し、更に約30分間混合した。続いて、ビーズを４回遠心分離および１×PBSを使用して洗浄した。洗浄上澄み液を廃棄し、洗浄したビーズを十分な量の×PBSに懸濁し、10mlの、５×−アミノデキストラン被膜カルボキシレートビーズあるいは５×−アミノデキストラン被膜アルデヒド／硫酸ビーズのいずれかの合計体積懸濁液を与えた。１×−、２×−および３×−アミノデキストランを用いて被膜したビーズは同様にして生成できる。
硫酸ポリスチレンラテックス粒子における３×−アミノデキストランの架橋
アミノデキストランが結合する化学的に反応性の官能基がないポリスチレンラテックス粒子には改良した被膜および架橋手順の使用が必要となる。この手順で使用された硫酸ポリスチレンラテックス粒子はアルデヒド／硫酸粒子上に存在するアルデヒド基を持たない。
16.7mlの30mg/ml13×−アミノデキストラン水溶液および77.2mlの蒸留水を6.1mlの8.2％W/V固体硫酸ポリスチレンラテックス粒子懸濁液に添加した。250mlの組織培養フラスコ中の（2.13μｍ平均粒子直径IDC）。その後得られた懸濁液のpHを0.1M水酸化ナトリウム水溶液の滴下により10.0に調整した（約20滴使用）。フラスコを軌道振盪器に置き、その内容物を約８〜16時間混合した。混合後、1.130mlの25％グルタルアルデヒド溶液（１ミリリットル反応体積あたり3mgのグルタルアルデヒド）をビーズ懸濁液に添加し、その後更に30分間軌道振盪器にかけた。その後未反応アルデヒド基を2mlのエチレンジアミン（グルタルアルデヒド１モルあたり10モル）の添加により遮断し、その後更に約３時間振盪した。結局、1mlの10mg/ml水素化ホウ素ナトリウム水溶液および1mM水酸化カリウム溶液をラテックス粒子懸濁液に添加し、その後更に約30分間軌道振盪して、シッフ塩基結合を還元して安定化する。その後ラテックス粒子を分離して、遠心分離および１×PBSをそれぞれ使用して４回洗浄した。ビーズを１×PBS中に再懸濁して次の反応に使用できる2.5％W/V固体懸濁液となるように体積を調整した（最終体積約20ml）。
スルホ−SMCCによる粒子活性化および５×−アミノデキストラン被膜ポリスチレンへの抗体結合
2.5％W/V固体ビーズ懸濁液１ミリリットルあたり33.75μＬの10mg/mlスルホ−SMCC溶液を使用したことを除いて、アミノデキストラン被膜ポリスチレンラテックス粒子へのモノクローナル抗体の結合をゼラチン被膜ラテックス粒子に対して説明したようにして行った。本発明により調製した抗体結合、アミノデキストラン被膜ポリスチレンラテックス粒子をフローサイトメトリーおよび他の方法体系により種々の細胞集団分析において使用できる。例えば、国際特許出願公開WO90/10313および同時係属の米国特許出願番号587,646（1990年９月29日出願）、285,856（1988年12月16日出願）、339,156（1989年４月14日出願）および07/525,231（1990年５月17日出願）参照のこと。
特別な別の方法がなければ、ビーズに結合したモノクローナル抗体の量はビーズ表面積１平方メートルあたり３〜5mgの抗体の範囲内である。ビーズは例えば活性化ビーズを用いたイミノチオラン活性化抗体のような活性化抗体の反応より調製される。典型的に、反応は、１％W/Vビーズ懸濁液の１ミリリットルあたり0.625mgの活性化抗体を使用する。
実施例8.アミノデキストラン被膜ポリスチレンラテックスビーズを使用したフローサイトメトリーによるポリスチレンビーズＴ細胞集団変化分析
50mlのNa4EDTA−抗凝固血液の試料を得て、多数の遠心管に分配し、10分間500gで遠心分離した。血漿の大部分を除去し、各管中の細胞の残分バフ着色層を溜めて、更に10分間500gで遠心分離した。残分血漿およびバフ着色細胞を分離した。集合的に、バフ着色細胞および血漿は白血球リッチ全血を構成する。
バフ着色細胞を１×PBSで希釈して、クールターＳ−Plus（商標）カウンターで決定したように、4,6,8,10および12×105白血球（wbc）を含む多数の試料をそれぞれ得た。その後4,6,8,10および12×105wbcの各試料の100μＬアリコートを多数の5mlの試験管にピペットで入れた。続いて、３×−アミノデキストラン被膜硫酸ポリスチレンラテックスビーズに結合したT4モノクローナル抗体の懸濁液の5,10,15,20,30および40μＬアリコート（１％W/V固体、ビーズ表面積１平方メートルあたり３〜5mg抗体およびミリリットルあたり1.786×109粒子）を各wbc濃度に対して分離管にピペットで入れた。その後各管を２分間回転した。回転に続いて、10μＬのCYTO−STAT（商標）T4−RD1/T8−FITCの２つの着色抗体試薬を各試料に添加して、実際のt4＋細胞のラベリングとＴ細胞すなわちT8細胞の非特異的ラベリングを弁別可能にした。試料を渦巻き回転し、室温（18〜27℃）に10分間温置した。その後試料管をクールターEPICS  Ｑ−プレップ（フロリダ、マイアミ、クールター  コーポレイション）あるいは類似の装置に置き、赤血球（rbc）を溶解するために35秒溶解モードで処理した。rbcを溶解し試料を固定（Ｑ−プレップ）した後、全試料をクールターEPICS（商標）プロフィルIIフローサイトメーターあるいは類似の装置で分析した。プロフィルに導入した標準プログラムを使用し、蛍光発生としてリンパ球および単球−骨髄集団を決定した。特に、ポリスチレンラテックス粒子の結合による寸法および／または顆粒度における変化のために、これらのリンパ球は変化した前方対側方散乱領域にある。
プロフイルIIをアラインメントに対するDNAチェック（フロリダ、マイアミ、クールター  コーポレイション）ビーズを用いておよび蛍光強度に対する標準ブライトビーズ（クールター  コーポレイション）を用いてキャリブレイトした。ポリスチレンビーズおよび蛍光マーカーを含まないバフ細胞試料をリンパ球、単球および顆粒球の集団（量）を確立するために使用した。リンパ球集団を蛍光分析のためビットマップ化し、３つの細胞タイプ集団全部を蛍光発生として細胞カウントのためボックス化した。ポリスチレンビーズなしのバフ細胞試料をCYTO−STAT（商標）MsIgG1−RD1/MsIgG1−FITC制御試薬を用いて染色し、クワッドスタット（quad stat）およびカーソルをセットするために使用した。２つの蛍光試薬T4−RD1/T8−FITCを含み、ポリスチレンビーズを含まないバフ細胞試料を使用して着色補正をセットした。40μＬのT4結合ポリスチレンラテックス粒子を含むバフ細胞試料をビットマップ化しおよびボックス化した変化した細胞集団の位置を決定するのに使用した。T4結合ポリスチレンラテックス粒子のバフ細胞試料をMsIgG1−RD1/MsIgG1−FITC制御試薬を用いて染色し、クワッドおよびカーソルをセットするために使用した。バフ細胞がないかあるいは蛍光試薬が存在するT4結合ポリスチレンラテックスビーズの試料を使用して、ビーズが散乱図で細胞に干渉しないことを証明した。上記段階が完了した後、種々のwbc濃度および２つの着色マーカー（RD1およびFITC）を含むバフ細胞試料を使用して、オリジナルT4細胞蛍光発生カウントを決定した。最後に、２つの色マーカーを有するバフ細胞試料および種々の量（5,10,15,20,30および40μＬ）の、濃度３〜5mgT4/m2ビーズ表面積のビーズ含有T4を使用して、より大きい寸法および／または顆粒度の方向に残るリンパ球集団から離れて変化した前方分散対側分散プロット領域におけるT4細胞蛍光発生細胞カウントを決定した。
検定おびコントロール試料の調製では、より小さいおよびより移動性の分子染料−抗体結合物によりＴ細胞上の抗原部位の飽和を避けるために、蛍光マーカーの添加前に、抗体−ビーズ結合物をバフ細胞試料に混合することが重要である。T4細胞カウントをT4蛍光発生およびＳ−Plus（商標）カウンター対プロフィルIIデータから推定した〔T4発生（ビーズなし）−T4発生（40μＬビーズ）〕×〔Ｑ−プレップ希釈ファクター（11）〕×〔（Ｓ−Plusリンパ球カウント）÷（合計リンパ球発生）＝1.24〕。結果を以下の表10および図１に変化したT4細胞数対ビーズ/R4細胞の比としてまとめる。
0003547437.tif 000012
Ｓ−Plus（商標）カウンターにより決定したwbc試料中のリンパ球の百分率は38.9％であった。リンパ球の中のT4細胞の百分率を方程式により決定した。
T4細胞（％）＝100％×
〔（プロットの安定期における変化した集団中の
T4細胞の数）÷wbcカウント〕÷0.389〕
12,10,8,6および４×105の濃度のwbcに対するT4百分率はそれぞれ39.3％、39.3％、38.3％、37.8％および38.6％であった。前方分散対側方分散プロットにおける変化したおよび変化しないリンパ球集団の相対的な蛍光発生に基づくT4百分率、すなわち〔（T4発生（ビーズなし）−T4発生（40μＬビーズ）〕÷（合計リンパ球発生）〕は、それぞれ39.2、39.5、38.4、38.0および39.0であった。タイプＡゼラチンで被膜された硫酸ポリスチレンラテックスビーズに結合したT4モノクローナル抗体を用いた類似の実施例では、架橋ゼラチンとの非特異的相互作用のために、変化した単球からの干渉を示した。このようにして、このような干渉が観測された場合、アミノデキストラン被膜ポリスチレンラテックスビーズを使用することにより実行可能な選択肢を提供できる。
実施例９
5X−アミノデキストランで被覆したポリスチレンラテックス粒子を用いたT4およびT8細胞集団分析
T4およびT8モノクローナル抗体を5X−アミノデキストランで被覆したカルボン酸ポリスチレンラテックス粒子および5X−アミノデキストランで被覆したアルデヒド／硫酸塩ポリスチレンラテックス粒子に結合させた。粒子を1X  PBS中に懸濁させて１％w/v混合物を得た。十分量のT4またはT8に結合した粒子を200マイクロリットルの全血に加えた。1X  PBSを加えることにより試料容量を300マイクロリットルとし、次に２分間かきまぜた。次に、100マイクロリットルのアリコートをクールター  VCS（登録商標）（アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター  コーポレーション）またはシフトしたＴ細胞の集団の分析に用いる同様の装置に、T.Russell等により国際特許出願公開第WO90/18013号明細書に記載された方法を用いて吸引した。赤血球のバッチ溶解剤および溶解クエンチ剤の添加を装置により自動的に制御した。T4またはT8細胞の試料中の百分率は、DC対不透明度の未散乱領域中にシフトしたＴ細胞集団に等しい。T8細胞のT4の百分率＝［（シフトしたT4またはT8細胞集団）÷（初期のリンパ球集団の合計）］×100％。この百分率を得るプロットはDC対［（RF−85）÷DC］であり、ここでRFは無線周波散乱に等しく、DCは直流細胞抵抗に等しく、−85は定数である。用いたモノクローナル抗体が結合した被覆した粒子（１％w/v固体）および測定されたT4細胞の百分率を表11に示す。
0003547437.tif 000013
いずれかのタイプの粒子を用いて、すべてのT4細胞が、T4抗体で被覆した過剰量のポリスチレンビーズによりシフトした際に、約44.1〜44.4％T4細胞における安定水準が観察された。この終点容量は、分析した全血試料のリンパ球集団中のT4細胞の真の百分率と考えることができる。終点におけるビーズ対T4細胞の比率はそれぞれ1210および928であった。
1X−アミノデキストランとトシル活性化ポリスチレン磁鉄鉱含有粒子との結合（架橋なし）
磁性材料を包埋した30mg/ミリリットルの均一な多孔質ポリスチレン粒子（Ｍ−450ダイナビーズ（登録商標）、トシル活性化、4.5μｍ±５％；ダイナル、インコーポレテッド（Dynal,Incorporated））２ミリリットルを３回0.25Mホウ酸塩緩衝液、pH9.8で洗浄した。0.198ミリリットルの45.4mg/ミリリットルの1X−アミノデキストランを、洗浄したビーズに加え、ホウ酸塩緩衝液で合計容量を2.4ミリリットルに調整して、3.75mg/ミリリットルの1X−アミノデキストラン濃度を有する2.5％w/v固体懸濁液を得た。次に懸濁液を約８〜16時間混合した。次に、粒子を磁気的に分離し、2.4ミリリットルの1X  PBSで４回洗浄し、1X  PBS中に再懸濁させて、合計容量が2.4ミリリットルである粒子懸濁液を得た。
T11モノクローナル抗体を1X−アミノデキストランで被覆したＭ−450ビーズに、ここに記載した、モノクローナル抗体をゼラチン被覆フェライト粒子に結合させる方法を用いて結合させた。次に、抗体が結合した粒子を、実施例１の方法を用いて実施したT11/B4リンパ球アッセイにおいて用いた。０、25、50および100マイクロリットルのT11抗体が結合したＭ−450粒子で処理した試料に関する結果を表12に示す。結果は、Ｂ細胞の有意な非特異的除去はなかったことを示す。ビーズ対細胞の比率は、100マイクロリットルの粒子を用いた際には48:1であった。
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5X−アミノデキストランとポリスチレン−磁鉄鉱粒子との結合
50ミリリットルのポリスチレン−磁鉄鉱粒子（0.5％  SDS中で10％w/v固体、平均直径0.980μｍ、−COOH官能基、磁鉄鉱23.1％）を、150ミリリットルの１％アジ化ナトリウム、10mMの重炭酸ナトリウム溶液を含む反応フラスコに加えた。内容物を約８〜16時間振盪機を用いて混合し、次に、粒子を２回磁気的に分離し、200ミリリットルの10mM重炭酸ナトリウム水溶液を用いて洗浄した。次に、洗浄した粒子を0.2M塩化ナトリウム水溶液に懸濁させ、懸濁液容積を約150ミリリットルに調整した。750mgの5X−アミノデキストランを約10ミリリットルの0.2M塩化ナトリウム水溶液に溶解した溶液を調製し、粒子懸濁液に加えた。次に、0.2M塩化ナトリウム水溶液で合計容積を200ミリリットルに調整して、3.75mg/ミリリットルの5X−アミノデキストラン濃度を有する2.5％w/v固体懸濁液を得た。次に、0.2M塩化ナトリウム水溶液中の10mg/ミリリットルのEDACの試料1.80ミリリットルを粒子懸濁液に加えて、アミノデキストランアミノ基と、粒子表面上に存在する−COOH基との結合を促進した。EDACを含む懸濁液をオービタル振盪機（orbital shaker）上で約８〜16時間混合し、磁気的に分離し、蒸留水で３回洗浄した。次に、洗浄した5X−アミノデキストランで被覆したビーズを十分量の1X  PBS中に再懸濁させて、200ミリリットルの2.5％w/v固体懸濁液を得た。
5X−アミノデキストランで被覆したポリスチレン−磁性粒子のスルホ−SMCCでの活性化
以下のことを変えた以外は、モノクローナル抗体を5X−アミノデキストランで被覆したポリスチレン−磁鉄鉱粒子に、ここに記載した、モノクローナル抗体をゼラチン被覆粒子に結合させる方法を用いて結合させた。
１  5X−アミノデキストランで被覆した粒子の活性化を、2.5％w/v固体懸濁液１ミリリットルあたりスルホ−SMCCの10mg/ミリリットル溶液33.75マイクロリットルを用いて行った。
２  抗体−粒子結合を、活性化粒子の1.25％w/v固体懸濁液１ミリリットルあたり約0.313mgのイミノチオラン活性化モノクローナル抗体を用いて行った。
ビーズのイミノチオランによる活性化および抗体のスルホ−SMCCによる活性化を逆にするかまたは他の試薬を本明細書の他の場合において特定した活性化剤として用いることができる。
実施例10
5X−アミノデキストランで被覆した粒子に結合した抗体に関する試験結果の要約
実施例１〜３に記載したプロトコルを用いて、以下のアッセイ結果を得た。
A.  赤血球／胸腺リンパ球アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.8333％w/v固体、KC−16結合磁性ビーズを用いて赤血球／胸腺リンパ球アッセイを実施した。結果を表13に示す。結果は、100マイクロリットルの0.833％w/vビーズが、4.9×107個の赤血球をアッセイ試料から除去する1.32×109個のビーズを含み、従って27のビーズ対細胞比率が得られることを示す。
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B.  T4/T8リンパ球アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.025％w/v固体、T4モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、T4/T8リンパ球除去アッセイを実施した。結果を表14に示す。クールター  エス−プラス（Ｓ−Plus）（登録商標）カウンターにおいて測定したリンパ球の数に対する合計のリンパ球蛍光結果を評価した後、各除去後に残存するT4細胞の数を評価し、これらのデータを用いて、150マイクロリットルの0.25％w/v固体ビーズが、6.0×105個のT4細胞をアッセイ試料から除去する6.0×107個の粒子を含み、従って100のビーズ対細胞比率が得られることが示される。
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C.  赤血球／血小板アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.25％w/v固体、PLT−１モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、赤血球／血小板アッセイを実施した。結果を表15に示す。結果は、200マイクロリットルの0.25％w/v固体ビーズが、9.2×106個の血小板を除去する7.92×108個の粒子を含み、従って8.6のビーズ対血小板比率が得られることを示す。
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D.  骨髄細胞アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.125％w/v、M02モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、骨髄細胞アッセイを実施した。結果を表16に示す。結果は、200マイクロリットルの0.125％w/v固体ビーズが、4.8×104個の単球を除去すると評価された4.0×108個の粒子を含み、従って8.3×103のビーズ対単球比率が得られることを示す。
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E.  骨髄細胞アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.1％w/v固体、KC−48モノクローナル抗体結合ビーズを用いて、骨髄細胞アッセイを実施した。結果を表17に示す。結果は、150マイクロリットルの0.1％w/v固体ビーズが、1.6×106個の顆粒球を除去すると評価された2.4×108個の粒子を含み、従って149のビーズ対顆粒球比率が得られることを示す。
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同様の除去試験を、表17と同一の対照試料および０〜250マイクロリットルの0.5％w/v固体、1D3モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて実施した。これらの結果を表18に示す。結果は、50マイクロリットルの0.5％w/v固体ビーズが、1.54×106個の好中球を除去すると評価された4.0×108個の粒子を含み、従って260のビーズ対好中球比率が得られることを示す。
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F.  T11/B4リンパ球アッセイ
０〜60マイクロリットルの0.25％w/v固体、T11モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、T11/B4リンパ球アッセイを実施した。結果を表19に示す。結果は、20マイクロリットルの0.25％w/v固体ビーズが、6.46×105個のT11＋細胞を除去すると評価された8.0×107個の粒子を含み、従って124のビーズ対T11＋細胞比率が得られることを示す。
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第２の除去試験を、表19で用いたものと同一の対照試料および５〜60マイクロリットルの0.25％w/v固体、B4モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて実施した。これらの結果を表20に示す。結果は、40マイクロリットルの0.25％w/v固体ビーズが、1.23×105個のB4＋細胞を除去すると評価された1.6×108個の粒子を含み、従って1300のビーズ対B4＋細胞比率が得られることを示す。
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G.  磁性ビーズを用いた骨髄細胞アッセイ
０〜250マイクロリットルの0.5％w/v固体、KC−56モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、赤血球の骨髄細胞除去アッセイを実施した。結果を表21に示す。結果は、250マイクロリットルのビーズが、1.35×106個の赤血球を除去すると評価された1.98×109個の粒子を含み、従って1470のビーズ対赤血球比率が得られることを示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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