【手続補正書】
【提出日】平成29年7月18日(2017.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】プロピオン酸の産生能を持つ微生物及びそれを含む粗飼料組成物
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロピオン酸の産生能を持つ微生物及びそれを含む粗飼料組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）は、反芻胃で炭水化物の分解によって生じる最も重要な最終産物である。揮発性脂肪酸は、反芻動物の重要なエネルギー源（７０％）であり、牛乳中のタンパク質と脂肪の含量にも影響を与える。反芻胃中の代謝から生じる主要な揮発性脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種で、給餌する飼料の種類及び消化の程度によって決まる。反芻動物では、揮発性脂肪酸の中でプロピオン酸だけがブドウ糖の合成に寄与し、量的にもブドウ糖は非常に重要な単一の前駆体である。総揮発性脂肪酸の１８％から２０％は、プロピオン酸が占める。プロピオン酸は、肝で血中の糖に転換されてエネルギーを提供して乳糖合成にも使用する。プロピオン酸の増加は、反芻上皮細胞で血の流れを増加して、血管生成を刺激したり上皮細胞を増やしたり、また牛を含む反芻動物の肥育を促進して肉の品質の改善に寄与する。
【０００３】
特許文献１は、キノコの副産物を主原料で用いた家畜用発酵飼料の製造方法に関するもので、キノコの廃培地にプロバイオティクスとして使う乳酸菌、枯草菌及び酵母菌を添加して発酵するのが特徴である。
【０００４】
特許文献２は、キノコの廃培地を使用して、豚の飼料を製造する方法に関するもので、プロピオン酸の産生能を持つ微生物を含まない複合微生物発酵剤を利用して発酵するのが特徴でする。
【０００５】
しかし、豊富な繊維素を活用しながら、抗生物質やホルモンなどの使用による副作用がなく、肥育の促進ができる効果的な飼料を求めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許第１１４４４７３号
【特許文献２】韓国特許第１１３８９３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これに、本発明者らは、反芻動物の肥育促進用飼料に関する研究を行い、反芻胃で粗飼料を発酵して、プロピオン酸の産生を増すことから、肥育の促進ができるプロピオン酸の産生能を持つ微生物を基にして本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、プロピオン酸の産生能を持つ反芻胃微生物の提供を目的とする。
【０００９】
本発明は、また優れた肥育促進の効果を持つ粗飼料組成物の提供を目的とする。
【００１０】
本発明は、また反芻胃微生物が入った粗飼料を用いて、反芻動物を肥育する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一例としては、反芻胃から分離したプロピオン酸の産生能を持つ微生物を提供する。
【００１２】
本発明の一例としては、前記微生物は、ラクトバチルス・ムコサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）ＫＣＣＭ１１４４０Ｐである。
【００１３】
ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐは、配列番号１の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を持ち、この配列に基づいて同定した。図１は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列に基づいて作成した系統図を示す。
【００１４】
プロピオン酸は、反芻胃の中で炭水化物分解の最も重要な産物であり、反芻動物の肝でブドウ糖に転換され、反芻動物の肥育を促進し、肉の品質の改善に寄与する。
【００１５】
反芻胃でプロピオン酸の産生能に基づいて分離したラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐは、ＭＲＳ培地で成長する。特に、ビタミンＢ１２や乳酸ナトリウムが入った培地で、高いプロピオン産生能を持つことが確認された。
【００１６】
本発明の別例としては、ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐを含む、粗飼料組成物を提供する。
【００１７】
本明細書で使った用語「粗飼料組成物」は、牧草、干し草、サイレージなどと同様に、繊維質の含量が高く、脂肪、タンパク質、澱粉などの含量が低い飼料組成物を意味する。
【００１８】
本発明の一例による粗飼料組成物は、プロピオン酸の産生能を持つラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐを含む、反芻胃で粗飼料の発酵時にプロピオン酸の産生を増やす。これによって、反芻動物の肥育を促進して肉の品質の改善ができる。プロピオン酸は、反芻胃で生じる揮発性脂肪酸の中で、唯一にブドウ糖に転換されてエネルギー代謝などに関与する為、牛を含む反芻動物の肥育の促進は、反芻胃で生じるプロピオン酸によって決まる。
【００１９】
本発明の一例としては、前記の粗飼料組成物は、キノコの廃培地を含む。
【００２０】
キノコの廃培地とは、主原料はのこくずで、副原料は農産副産物を含む、キノコの培養後に得られるものを意味する。キノコの廃培地ののこくずは、反芻胃でセルロース分解微生物の炭素源として利用する。ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐは、キノコの廃培地で培養され、プロピオン酸の産生を増やす。これによって、反芻動物の肥育の促進ができる。特に、キノコの廃培地は、キノコ類のセルロース分解菌による分解で得られた廃培地を原料とする為、優れた消化性の粗飼料で利用することができる。
【００２１】
本発明の一例としては、前記の粗飼料組成物は、ビタミンＢ１２及び乳酸塩の中で一つ以上を含む。
【００２２】
ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐは、培地の中にビタミンＢ１２あるいは乳酸塩、例えば、乳酸ナトリウムが補われる場合は、プロピオン酸の産生量は大幅に増える。したがって、粗飼料組成物の中にビタミンＢ１２及び乳酸塩のいずれかを含むと、プロピオ酸の産生が増え、これによって肥育の促進ができる。
【００２３】
本発明の一例としては、前記の粗飼料組成物は、反芻動物の肥育を促進する。通常の粗飼料組成物に比べて、プロピオン酸の産生能を持つラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐを含むと、反芻胃でプロピオン酸の産生が増え、これによって、反芻動物の肥育を促進し、肉の品質を改善する。
【００２４】
本発明の一例としては、前記の粗飼料組成物は、さらにプロバイオティクスを含むことができる。
【００２５】
家畜飼育の際、抗生物質の使用は避けられないが、誤乱用による問題が深刻になってから、プロバイオティクスが広く利用されている。プロバイオティクスは、家畜の腸内に有益な微生物を摂取させ、病原性微生物の増殖を抑えて病気の発生を予防し、家畜の生産性を高める。現在幅広く使っている微生物は、乳酸菌、枯草菌、酵母菌などである。乳酸菌は、有機酸を作ってｐＨを低くすることで、酸性に弱い有害菌を抑制し、また消化酵素の活性を促進する。特に、下痢の発生頻度を減らす。枯草菌は、活性の高い炭水化物、タンパク質、脂質などを分解する酵素を産生するので、腸内で飼料の消化と吸収を促進し、飼料の効率を向上する。また消化に伴うストレスを抑え、家畜の生育を促進する。整腸作用の効果もあり、家畜の腸を元気にして病気を予防する役割を持つ。また、酵母菌は家畜の消化管で容易に消化できる形で存在しており、アルコール、グルタミン酸などの天然香味成分を産生して、家畜飼料の嗜好性が増加する。
【００２６】
本発明の一例としては、前記の粗飼料組成物は、一般的な飼料と混合して提供するのができる。例えば、粗飼料組成物は、市販の配合飼料と１：１の割合で混合し、１日２回で反芻動物に給餌するのができる。適切な混合比率、給餌量及び給餌頻度は、当業者が対象となる反芻動物の年齢、体重、健康状態などを考えて、容易に決定するのができる。
【００２７】
本発明の他の例としては、反芻動物を肥育する方法として、ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐが入った粗飼料の給餌段階を含む方法を提供する。
【００２８】
本発明の一例では、前記の粗飼料は、キノコの廃培地を主成分として含むことができる。
【００２９】
本発明の一例としては、前記の粗飼料は、さらにプロバイオティクスを含むのができる。
【００３０】
本発明の一例では、前記の粗飼料は、ビタミンＢ１２及び乳酸ナトリウムの中で、一つ以上を含むのができる。
【００３１】
本発明の一例では、粗飼料は、通常の配合飼料と混合して給餌するのができる。
【００３２】
本発明の一例では、反芻動物とは、牛、羊、ヤギ、及びシカを称するが、これらに限らない。
【００３３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の例示であることで、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の詳しい一例によるラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐ及びこれを含む粗飼料組成物は、反芻動物の反芻胃でプロピオン酸の産生を増やし、これによって、優れた肥育促進や肉の品質を改善する効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明のラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づいて作成した系統図である。
【図２】培養時間による発酵飼料、麦くず、キノコの副産物及び醸造副産物の乾燥焼失量を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００３６】
プロピオン酸産生菌の分離と同定
１−１．菌株の分離
プロピオン酸の産生能を持つ菌株を分離する為、体重４０±５ｋｇの在来黒ヤギ三頭から反芻胃液を採取した。嫌気状態を維持する為に嫌気チャンバー内で行い、ＨａｔｔｏｒｉとＭａｔｓｕｉ（Ａｎａｅｒｏｂｅ、Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．８７−９３、（２００８））の方法に従った。
【００３７】
反芻胃液から培養した菌を培地ｍｌ当り１０−３から１０−９に希釈した後、ＨｕｎｇａｔｅロールＡチューブに接種し、２４から４８時間培養した。培養液から単一のコロニーを分離し、液体培地（ＭＲＳ）に接種して１２０ｒｐｍで２４時間培養した。すべての培養は、３７℃、嫌気状態で行い（Ｌｅｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ。５８、ｐｐ。６６３−６６８、２００２）、培地とバッファ（Ｂｒｙａｎｔ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．８２、ｐｐ．７８０−７８７、１９５３）は、１２１℃で１５分間滅菌して使用した。
【００３８】
合計５１個の菌株を分離し、これらをＭＲＳ培地で培養しながら、揮発性脂肪酸の産生量を測定した。その中で一番高いプロピオン酸の産生量を示す菌株を選んだ。
【００３９】
１−２．菌株の同定
１−１で分離した菌株は、ＭＲＳ培地で培養した後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用し、染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型にして、１６Ｓ  ｒＲＮＡのコードする遺伝子を増幅する為、プライマー２７Ｆ（ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ）と１４９２ｒ（ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分の初期変性、９４℃で４５秒の変性、６５℃で４５秒のアニーリング、７２℃で１分の伸長となるサイクルの３２回反復及び７２℃で１０分の伸長である。
【００４０】
増幅したリボソームＤＮＡは、ＡＲＤＲＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）の方法によって類似性を分析した。ＰＣＲの産物は制限酵素（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）ＨａｅＩＩＩとＨｈａＩで３７℃で５時間処理した。制限酵素で処理したＤＮＡ試料は、ＭｅｔａＰｈｏｒ（登録商標）  アガロース（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）による電気泳動で１７０ｖ、８０分間分離した。電気泳動で分離したＤＮＡは、Ｋｏｄａｋ  Ｇｅｌ  Ｌｏｇｉｃ２００画像システム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）で確認した。ＡＲＤＲＡから得たバンドは、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【００４１】
精製した１６Ｓ  ｒＤＮＡは、ＰＣＲ産物の塩基配列の分析（  Ｍａｃｒｏｇｅｎ、韓国  ）により、配列番号１と確認した。分析した塩基配列の情報は、ＳｅｑＭａｎ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて組合し、塩基配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）とＥｚＴａｘｏｎ（ｈｔｔｐ：／／１４７．４７．２１２．３５：８０８０／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）のＧｅｎｅＢａｎｋのＢＬＡＳＴプログラムを使って比較した。  大体の系統学的分類は、ＣＬＵＳＴＲＡＬ  Ｗ  ｖｅｒｓｉｏｎ１．６を使用して、一番近い種と塩基配列の比較で決めた。ダブルスタンダード−ギャップ削除（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ｇａｐ  ｒｅｍｏｖａｌ）機能を持つＮＪ（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）の方法を用いて、Ｋｉｍｕｒａ（１９８０）の方法に従って、系統図を作成した。最終的に、ＰＨＹＬＩＰパッケージにあるｔｗｏ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ＮＪ方法を用いて、系統図の安定性を評価する為、１０００倍に及ぶデータを収集して、ブートストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）の分析方法を利用した。それから５０％以上のブートストラップ値を示すのを選択した。図１は、作成した系統図を示す。
【００４２】
分離した菌株は、ラクトバチルス・ムコサエＳ３２（Ｔ）と９６％の類似性を示した。これに基づいて、分離した菌株をラクトバチルス・ムコサエＢＲ−ＰＰと命名し、これを２０１３年７月２６日、韓国の微生物保存センターに寄託して、受託番号  ＫＣＣＭ１１４４０Ｐをもらった。
【００４３】
１−３．対照群菌株の選択  
１−１と１−２で分離し、同定したラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐのプロピオン酸の産生能を比較する為の対照群を選ぶ為、プロピオン酸の産生能を持つと知られた、セレノモナスボビース（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｂｏｖｉｓ）１５１５４（ＳＢ）、ベイロネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）５０１９（ＶＰ）、プロピオニバクテリウムエシディプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）５０２０（ＰＡｃｉ）と  プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）１１９４６（ＰＡｃｎ）をそれぞれＫＣＴＣ及びＫＡＣＣから分譲して使用した。
【００４４】
それぞれの菌株は、３７℃で４８、７２、９６、１２０及び１４４時間培養しながら、ＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）値とｐＨを測定した。各実験は３回反復して行った。また、培養液から時間毎に採取した試料は、ＵＶ検出器の付いた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００  ｓｅｒｉｅｓ）でＭｅｔａＣａｒｂ  ８７Ｈ（Ｖａｒｉａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）カラムを用い、流動速度０．６ｍｌ／ｍｉｎ、０．００８５Ｎ・Ｈ２ＳＯ４緩衝液で溶出して分離した。試料は２１０ｎｍ及び２２０ｎｍで検出して、揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の産生量を測定した（Ｔａｂａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．５０、ｐｐ。１１２４−１１２６（１９８８）とのＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．４０、ｐｐ．２８９７−２９０５（２００５））。
【００４５】
プロピオニバクテリウムエシディプロピオニシは、培養１４４時間後に、高いプロピオン酸の産生量を示した。また、プロピオニバクテリウムエシディプロピオニシは、偏性嫌気性である他のプロピオン酸の産生菌株とは異なり、通性嫌気性を示した。高いプロピオン酸の産生量と通性嫌気性であるプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシをプロピオン酸産生の標準微生物とし、対照群として利用した。
【実施例２】
【００４６】
ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４０Ｐのプロピオン酸の産生能
実施例１で分離して同定したラクトバチルス・ムコサエのプロピオン酸の産生能を評価した。ＭＲＳ培地を含むアガロースで、嫌気状態で４８時間培養した。培地をＨｕｎｇａｔｅチューブに入れ、ｐＨ６．５、Ｏ２−ｆｒｅｅ、２０％ＣＯ２、８０％Ｎ２ガスで充填後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。プロピオン酸の産生能に及ぼす影響を確認するため、ＭＲＳ培地を含むアガロースに、それぞれビオチン（０．５ｍｇ／Ｌ）、乳酸（２％）、ビタミンＢ１２（５０μｇ／Ｌ）またはグリセロール（２％）を添加した。プロピオン酸の産生能を評価する為の対照群は、実施例１で選択したプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシであった。
【００４７】
２４時間、４８時間および７２時間培養の試料を採取して、ＯＤ、ｐＨ及びプロピオン酸を含む揮発性脂肪酸の産生量を測定した。
【００４８】
ｐＨは、インキュベーター内で測定しないで、培地を常温にしてからＭ５０３Ｐメター（ｗｒｋｓ、Ｍｅｄｉｆｉｆｉｅｌｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で測定した。
【００４９】
揮発性脂肪酸の産生量は、培養の時間毎に培養物を１０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離し、上等液を採取して、０．２μｍのマイクロフィルターで精製して分析した。  ＭＥＴＡＣＡＲＢ８７Ｈ（Ｖａｒｉａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）カラムの付いたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ１２００  ｓｅｒｉｅｓ）を用いて、３５℃で分析した。検出器のＵＶ波長は、２１０ｎｍと２２０ｎｍであった。移動相の溶媒は０．００８５ＮＨ２ＳＯ４で、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎであった。
下記の表１及び２は、その結果を表す。
【００５０】
【表１】
2016533755.tif 000001
【００５１】
【表２】
2016533755.tif 000002
【００５２】
その結果、ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐは、ビタミンＢ１２あるいは乳酸ナトリウム入りのＭＲＳ培地で培養した場合、最も多い量のプロピオン酸を産生することが確認された。
【実施例３】
【００５３】
粗飼料の製造
反芻胃液及び緩衝液を利用して、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で反芻胃で発酵効果を評価した。
【００５４】
反芻胃液の採取及び緩衝液の製造  
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験での試験を行う為、順天大学校の付設農場で飼育中の６００±４７ｋｇ程のホルスタイン牛から、管を用いて胃液を採取した。公試動物である韓牛は、イタリアンライグラス（Ｉｔａｌｉａｎｒｙｅｇｒａｓｓ）と濃厚飼料｛重量基準で、トウモロコシ５５％、小麦１５％、脱脂米ぬか８％、コーングルテン飼料５％、大豆粕１０％、糖蜜０．２％、炭酸カルシウム（ｌｉｍｅｓｔｏｎｅ）２．０％、塩０．５％、リン酸カルシウム１．３％、ビタミン−ミネラル混合物（ビタミンＡ  ３０００ＩＵ、ビタミンＤ  ６０００ＩＵ、ビタミンＥ  ３０ＩＵ、Ｃｕ  ２５ｍｇ、Ｆｅ  １５０ｍｇ、Ｚｎ  ２００ｍｇ、Ｍｎ  １００ｍｇ、Ｃｏ  ０．５ｍｇ及びＩ  １．５ｍｇ）１．０％｝を２：８の割合で混合し、体重に対して２％程度を１日２回に分けて給餌した。それから水は自由に取るようにした。飼料給餌の２時間後に、チーズ布（ｃｈｅｅｓｅ  ｃｌｏｔｈ）を利用して、胃液を採取して使用した。緩衝液（Ｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）は、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．４５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．９ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１９ｇ／Ｌ、トリップティカ剤（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）１．０ｇ／Ｌ、酵母エキス１．０ｇ／Ｌ、システイン・ＨＣｌ  ０．６ｇ／Ｌ（ｐＨ６．９）を含む基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ）で製造した。
【００５５】
反芻胃液と緩衝液を１：３（反芻胃液：緩衝液）の割合で混合し、窒素ガス（Ｎ２  ｇａｓ）で充填した。それぞれの乾物２％の発酵飼料を１６０ｍｌ  ｓｅｒｕｍ  ｂｏｔｔｌｅに入れ、緩衝液１００ｍｌを加えた。Ｏ２  ｆｒｅｅ−Ｎ２で嫌気状態を維持しながら、ゴムキャップとアルミキャップで密封した。３９℃で、嫌気性状態で、水平を持ちながら１００ｒｐｍで、混ぜながら培養した（Ｈａｔｔｏｒｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ、Ａｎａｅｒｏｂｅ、Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．８７−９３、（２００８））。インビトロでの培養は、０、１２、２４及び４８時間で、３回反復で試験を行った。反芻胃発酵の特性に、ｐＨ、総ガスの発生量、メタン、アンモニア及びＶＦＡを測定した。
【００５６】
ｐＨの変化
ｐＨは、インキュベーターから直接測定しないで、常温に安定化した後、Ｍ５０３Ｐメートル（ｗｒｋｓ、Ｍｅｄｉｆｉｆｉｅｌｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【００５７】
総ガスの発生量
総ガスの発生量は、試料を安定化した後、ＥＡ−６（Ｉｎｃ、Ｓｕｎ  Ｂｅｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）圧力センサ測定器を使用した。総ガスの発生量を測定した後、メタンと二酸化炭素の発生量を測定する為、真空管を用いて発生するガスを捕集した。各培養の時間毎に得られた総ガスの発生量に基づき、ＱｒｓｋｏｖとＭｃＤｏｎａｌｄ（１９７９）の公式により、ガスの発生量を推定した。
【００５８】
揮発性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ）の含量
ＶＦＡ測定は、培養の時間毎に培養物を１０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心分離し、上等液を採取して、０．２μｍマイクロフィルターで精製して分析した。ＭＥＴＡＣＡＲＢ８７Ｈ（Ｖａｒｉａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）カラムの付いたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ１２００  ｓｅｒｉｅｓ）を利用して、３５℃で分析した。検出器のＵＶ波長は、２１０ｎｍと２２０ｎｍであった。移動相の溶媒は、０．００８５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４であり、流速は０．６ｍｌ／  ｍｉｎであった。
【００５９】
アンモニア態窒素（ＮＨ３−Ｎ）濃度
アンモニアの濃度測定は、採取した試料を１３０００ｒｐｍで遠心分離し、ＣｈａｎｙとＭａｒｂａｃｈ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ。８、ｐｐ。１３０−１３２、（１９６２））の方法で行った。フェノール溶液で試料中のアンモニアを発色し、６３０ｎｍで吸光度（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２１Ｄ）を測定して表した。
【００６０】
３−１．副産物の発酵
ほとんどの副産物は、主な生産物を生産した後では、一般的に廃棄する。これらの副産物の中で、繊維素の成分の高い醸造副産物とキノコの副産物（キノコの廃培地）を収集して、反芻動物の飼料として使用できるかを評価した。すなわち、これらを発酵飼料に利用して、前述のように、反芻胃液と緩衝液の混合物中でインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で発酵を行った。
【００６１】
図２は、培養時間による発酵飼料の乾物消失量を示す。ふすまと醸造副産物またはキノコの副産物の組み合わせで、発酵飼料として利用した。ふすまの場合、醸造副産物よりキノコの副産物で消失量がより高かった。結果的に、キノコの副産物は、反芻胃内で醸造副産物より消化しやすいことを示す。
【００６２】
３−２．プロピオン酸の産生能を持つ微生物を添加した飼料の発酵。
サイレージは、飼料の質と最大の乾物を提供する。また、飼料中の微生物は、発酵の速度を向上させ、サイレージの結果を増進させる。そのため、プロピオン酸の産生能を持つ微生物を添加して、インビトロで発酵の効果を測定した。
【００６３】
ふすまと醸造副産物あるいはキノコの副産物の組み合わせで、ラクトバチルス・ムコサエＫＣＣＭ１１４４０Ｐあるいはプロピオンバクテリウムアクランドプロピオンオニシを添加した後、インビトロで培養しながら乾物消失量、水分含量、ｐＨ、揮発性脂肪酸の産生量、総ガス発生量及びアンモニアの産生量を測定した。
【００６４】
ふすまと醸造副産物またはキノコの副産物（廃培地）をそれぞれ１：１の割合で混合し、１％糖蜜を添加した後、ラクトバチルス・ムコサエまたはプロピオニバクテリウムエシディプロピオニシ（陽性対照群）培養液の１０％を接種した。すべての試料は、真空包装した後、３７℃で７２時間培養した。
【００６５】
サイレージの製造後、醸造副産物は、キノコの副産物より水分含量は高かったが（Ｐ＜０．０５）、ｐＨ値は低かった（Ｐ＜０．０５）。表３は、測定した水分含量とｐＨを示す。
【００６６】
【表３】
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【００６７】
下記の表４は、発酵時間による乾燥物質（乾物）の消失を表す。キノコの副産物の乾物の消失は、醸造副産物より低かった（Ｐ＜０．０５）。その結果、サイレージの醸造副産物の乾物の消失の増加は、ラクトバチルス・ムコサエ添加に起因することを示す。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
表５は、発酵によるＶＦＡ生産量を表す。乾物の消失は、キノコの副産物で低く見えたが、総ＶＦＡとプロピオン酸は、醸造副産物の方が高かった。また、処理中に副産物へラクトバチルス・ムコサエを添加した発酵では、プロピオン酸の産生量と総揮発性脂肪酸（ＴＶＦＡ）が高いことを示した。これは、栄養学的に醸造副産物よりキノコの副産物の酸の変化がより高くなったことを示す。サイレージが作られる時に生じる多量の酸は、飼料給餌の反芻動物には、より高いエネルギー源になることを意味する。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
表６は、醸造副産物とキノコの副産物のインビトロでの発酵による、総ガス生産量、ｐＨ及びアンモニア性窒素量を示す。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
統計的方法
本研究で得たすべての結果は、ランダムにデザインした一般的な線形モデル（ＧＬＭ）を用い、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。すべての処理は、ＤＭＲＴ（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒａｎｇｅ  Ｔｅｓｔ）方法により、３回反復で、処理区間の特異性を確認した。統計的な有意性は、Ｐ＜０．０５で表し、すべての分析は、ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）バージョン９．１（ＳＡＳ、２００２）で行った。
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