(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-6を恒常的に産生しうるKB細胞株（ATCC CCL 17）をIL-1α、IFN、TNF、およびリポポリサッカロイドからなる群より選ばれたものを含むASF301無血清培地で培養し、該培養液からIL-6を採取することを特徴とするIL-6の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、上皮腫（epithelioma）細胞であるKB細胞株（ATCC CCL 17）由来のIL-6の効率的な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−６は、Ｂ細胞に作用して抗体産生を誘導するＴ細胞由来のＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）として、Ｔ細胞培養上清から精製され、その部分アミノ酸配列の情報をもとに、ｃＤＮＡが単離された（Ｈｉｒａｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ．  ３２４：  ７３，  １９８６）。
【０００３】
組換えＩＬ−６や抗ＩＬ−６受容体抗体を用いた研究から、ＩＬ−６は、多彩な生物活性を示す多機能性サイトカインであることが明らかとなっている。個々の機能を作用形態から大まかに分類すると、ＩＬ−６は、骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）や形質細胞（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｓｉｓ）、Ｔ細胞、などに対しては増殖因子として働くが、逆に骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）細胞株や黒色種（ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞株に対しては、増殖抑制作用を示す。一方、肝細胞では、急性期タンパク質産生誘導など特異的遺伝子の発現に関わっているし、骨髄性白血病細胞株からマクロファージへの分化、褐色細胞種（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）細胞株の神経細胞への分化などにも関与する。
【０００４】
ヒトＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、などの免疫系細胞のほか、線維芽細胞、血管内皮細胞、ケラチノサイト、腎メサンギゥム細胞、などさまざまな細胞から分泌される。ＩＬ−６の産生は、Ｔ細胞株、白血病由来細胞株などで、ウイルス感染やリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＩＦＮ、ＴＮＦのほか、ＩＬ−１などの刺激で増加することが知られている。しかし、上皮性細胞については報告がない。ヒトＩＬ−６は、２１２アミノ酸として産生された後、Ｎ末端の２８アミノ酸のシグナルペプチドが切断され、最終的にＮ末端がＰｒｏから始まる１８４アミノ酸が分泌されるが、糖鎖が付加されるため、分子量は、２１〜２８ｋＤａとなる。
【０００５】
疾病とのかかわりとして、多発性骨髄腫の増殖因子としての作用のほか、リウマチのようなプラズマサイトーシスがみられる疾患、メサンギゥム細胞増殖性腎炎、腫瘍増殖に伴う悪液質、などで重要な働きをしていると考えられている。
【０００６】
ＩＬ−６の臨床応用としては、ＩＬ−６アンタゴニストを有効成分とする慢性関節リウマチの治療剤（特開平８−２０８５１４公報）のほか、抗腫瘍関連として、ヒト組換えＩＬ−６による、ヒト癌由来細胞系に対する増殖阻害に関する報告（Ｃｈｅｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：  ８０３７−８０４１，  １９８８；  Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：  ３５３８−３５４２，  １９８９；  Ｓｉｍｏｎ，  Ｃ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：  ２１６１２−２１６１６，  １９９２）がある。また、ヒト組換えＩＬ−６によるアポトーシス誘導が、マウスの造血幹細胞系（Ｏｒｉｔａｎｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｂｌｏｏｄ，  ８０：  ２２９８−２３０５，  １９９２）や骨髄細胞系（Ｍｉｎａｍｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９３：  ３９６３−３９６６，  １９９６）で報告されているが、ヒト由来の細胞株については、ヒト組換えＩＬ−６が、Ｕ９３７（組織球性リンパ腫患者由来単球芽球様細胞）に対して、細胞集団の僅かな部分（約  １０  ％）にアポトーシスを誘導する（Ｓｉｍｏｎ，  Ｃ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：  ２１６１２−２１６１６，  １９９２）というのが唯一の報告例である。
【０００７】
抗腫瘍関連特許出願として、癌化学療法剤、癌免疫療法剤、コロニー刺激因子、サイトカインからなる抗癌剤（特開平５−２７１０９５公報）、制癌作用および分化誘導能をもつカルボスチリル誘導体、サイトカイン、およびレチノイドからなる制癌剤（特開平７−６９８９３公報）、抗ＩＬ−６抗体や抗ＩＬ−６レセプター抗体とからなる抗腫瘍作用の増強された抗腫瘍剤（特開平８−２３１４３３公報）、などがある。また、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−γ、ａｎｔｉ−ＦａｓとＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α  とシクロヘキシイミド、ＴＮＦ−αとアクチノマイシンＤ、  などの組み合わせが、腫瘍細胞障害作用を増強することが知られている。しかし、ＩＬ−６単独の腫瘍細胞障害作用の増強の可能性、あるいはＩＬ−６  と抗腫瘍活性物質との組み合わせによる腫瘍細胞障害作用の増強の可能性については、未だ報告がなされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、動物細胞による天然型IL-6の効率的製造法を確立することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上皮腫（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）細胞に恒常的に発現しているＩＬ−６を得るために、上皮腫細胞の１種である類表皮癌から樹立されたＫＢ細胞株を、ＩＬ−１αを含む無血清培地で培養したところ、その培養上清中にＩＬ−６が大量に分泌産生されていることを見出し、該培養上清を各種カラムクロマトグラフィーを組み合わせて精製した結果、この精製ＩＬ−６が、単独で、腫瘍細胞に対する細胞障害作用を示し、また該ＩＬ−６と、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどの抗腫瘍活性を有するサイトカイン、シスプラチンなどの白金化合物、あるいはブレオマイシンなどの抗生物質とを組み合わせて用いると、これら抗腫瘍活性物質を単独で用いた場合に比較して、腫瘍細胞に対する細胞障害作用を著名に増強することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、IL-6を恒常的に産生しうるKB細胞株（ATCC CCL 17）をIL-1α、IFN、TNF、およびリポポリサッカロイドからなる群より選ばれたものを含むASF301無血清培地で培養し、該培養液からIL-6を採取することを特徴とするIL-6の製造法に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のIL-6を得るための細胞としては、上皮腫細胞であって類表皮癌由来の樹立細胞株であるKB細胞株（ATCC CCL 17）（Eagle, H.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89: 362, 1955）が用いられる。上記KB細胞株（ATCC CCL 17）の増殖培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium: DMEM）に、10%ウシ胎児血清（または10%ウシ新生児血清）を加えたものがよく用いられるが、DMEMの代わりにイーグルの最小必須培地（MEM）を用いても、形態変化を伴わずに増殖する。生産培地としては、IL-1α、IFN、TNF、およびリポポリサッカライドからなる群より選ばれたものを含むASF301無血清培地（味の素）が用いられる。特に、IL-1αを添加したASF301無血清培地が、本発明のIL-6産生を飛躍的に増加させる。例えば、図１に示すように、ヒトIL-1α（2ng/ml）を含むASF301無血清培地を使用した場合は、5%FBSを含むDMEMに比較して、IL-6の産生量が、約20倍と飛躍的に増加している。細胞培養におけるサイトカインの産生において、IL-1α、IFN、TNF、リポポリサッカライドなどを含む無血清培地への変換で、このように飛躍的にIL-6の産生量が高まる例は、上皮細胞についてはこれまでに知られていない。
【００１２】
培養液は、遠心（１５００Ｇ、２０分、４℃）して細胞を除き、限外ろ過（分画分子量１０，０００）して、ほぼ１／１００まで濃縮する。その後、大量の純水、低濃度の緩衝液などに対して透析、あるいはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５などのゲルろ過を行い、塩のような低分子化合物を除く。さらに、０．２２μｍのフィルターなどにより、ろ過する。
【００１３】
ろ液からのＩＬ−６の精製は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、および抗ＩＬ−６抗体をリガンドとしたアフィニテイクロマトグラフィー、などを適宜組み合わせて用いることにより、可能である。精製の指標として、ＴＮＦ−α存在下、および非存在下における、ヒト乳癌由来の細胞株であるＳＫ−ＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３０）に対する細胞障害活性の測定、あるいはＭＨ６０細胞（マウスハイブリドーマ）、ＫＴ３（ヒトＴ細胞株）などの増殖誘導を、３Ｈ−ＴｄＲの取り込みやＭＴＴ法で測定して求めたＩＬ−６活性を用いる。
【００１４】
例えば、ＫＢ細胞の無血清培養による培養上清からＩＬ−６を、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（ＴＯＳＯＨ）、およびＴＳＫｇｅｌ  Ｂｌｕｅ−５ＰＷ  （ＴＯＳＯＨ）、の３段階のカラムクロマトグラフィーを組合わせて、精製した場合の、各精製段階での溶出図が、図２（Ａ〜Ｆ）に示されている。最終カラムのＴＳＫｇｅｌ  Ｂｌｕｅ−５ＰＷの溶出図の２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆから、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害活性とＥＬＩＳＡによるＩＬ−６測定結果とがよく一致するフラクション２０、２１、および２２番（図２Ｄ）、フラクション２３、２４、および２５番（図２Ｅ）、フラクション６０、６１、および６２番（図２Ｆ）、をそれぞれプールしたものを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電氣泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、ウエスタンブロッティング分析すると、図３Ａに示すように、フラクション２０、２１、２２番をプールしたものは２８ｋＤａ（レーン１）、フラクション６０、６１、６２をプールしたものは２４ｋＤａ（レーン２）、フラクション２３、２４、２５をプールしたものは約３１ｋＤａ（レーン３）、の分子量のＩＬ−６が主成分であることを示している。これらの結果は、このカラムクロマトグラフィーの組み合わせで、分子量の異なるＩＬ−６が相互に分離することを示している。ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  による純度検定をすると、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の純度は７０〜８０％であり（図３Ｂレーン１）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）の純度は９０  ％  以上である（図３Ｂレーン２）。
２４ｋＤａのＩＬ−６のＮ末端１５残基のアミノ酸を分析すると、配列番号：１に示すように、このＮ末端１５残基のアミノ酸配列は、既報の文献と一致する（特許第２６６４６９８号；Ｈｉｒａｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４：  ７３−７６，  １９８６；  Ｄａｍｍｅ，  Ｊ−Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４０：  １５３４−１５４１，  １９８８）。現在、ＩＬ−６の生理作用の研究は、組換えＩＬ−６を用いて行われている。この組換えＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸は全て、Ｐｒｏから始まるように設定されている。本発明のＫＢ細胞由来のＩＬ−６のＮ末端がＡｌａから始まる点で既存の組換えＩＬ−６とは異なる。
【００１５】
Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（図２Ａ）に示す活性Ｉと活性ＩＩのフラクションの一部をとり、分子量マーカーと混ぜ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００−ＨＲカラムで分析すると、活性Ｉの分子量は４３ｋＤａ、活性ＩＩのそれは２６ｋＤａである。活性Ｉの分子量は、ＩＬ−６分子の単量体と考えるには明かに大きすぎる。活性Ｉは、ｈｏｍｏ−  ないしは  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒと考えられる。この結果は、ウエスタンブロット分析の結果とは一致しない。また、これまでに報告のあったヒト細胞由来のＩＬ−６  分子の分子フルイによる分析結果とも一致しない。すでに報告されている  ＩＬ−６  単量体、二量体分子の分子フルイカラム、ゲル電気泳動による分析結果も一つの明確な結論を出しているわけではない。
組換えＩＬ−６や天然型ＩＬ−６の分子量について明確に結論されていることは、（１）  大腸菌で産生される組換えＩＬ−６単量体分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で約２０ｋＤａを示す、（２）  ヒト細胞由来のＩＬ−６単量体分子は、主要なものとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約２４と２８ｋＤａの二つがあり、大腸菌由来の組換えＩＬ−６より分子量が大きいのは、糖鎖の結合による、である。これ以外のことは、個々の実験においては正しい結果であっても、ＩＬ−６分子一般としては結論できない。このように、ＩＬ−６  分子の多様性を説明するには、いくつかの仮定をおかないと説明できないことが多い。それらは、（１）  ＩＬ−６  分子は精製の程度によって見かけ上、異なる分子量を示したり、高次構造を変えたり、あるいは、異なる会合体分子を形成したりする、（２）  精製の段階でどのような樹脂や溶出液と接触したかによって、分子構造を変化させていく、（３）  産生される細胞の種類によって、最終的な成熟ＩＬ−６分子間で異なる修飾を受けていたり、高次構造を形成していたりする、などである。
【００１６】
ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、およびＩＬ−６（３１ｋＤａ）のそれぞれ単独での腫瘍細胞に対する細胞障害作用を調べると、図４に示すように、ほぼ、０．１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、濃度依存性に、細胞障害作用を増強する。
一方、一定量のＴＮＦ−α（２．５ｎｇ／ｍｌ）（以下、ＴＮＦと称する）との組み合わせでは、図４に示すように、ほぼ、０．１ｎｇ／ｍｌまでは、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）は、その濃度依存性に、ＴＮＦの腫瘍細胞に対する細胞障害作用を、増強する。０．０３〜０．０５ｎｇ／ｍｌ  以上では、アポトーシスによる細胞死が誘導されている。また、図７Ｃに示すように、ＴＮＦ単独では、０．１ｎｇ／ｍｌ以下では、腫瘍細胞障害作用が認められないが、一定量のＩＬ−６（２４ｋＤａ）（１．７ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせでは、ＴＮＦは、濃度依存性に腫瘍細胞障害作用を発揮する。ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、およびＴＮＦは、０．１ｎｇ／ｍｌ近辺以下では、細胞障害作用を示さないが、この濃度以下でも、両者を組み合わせると、細胞障害作用を濃度依存性に示すようになる（図４および図７Ｃ）。このように、ＩＬ−６とＴＮＦとの組み合わせが、腫瘍細胞に対する細胞障害作用を、濃度依存性に著名に増強することは、これまで知られてない。
【００１７】
また、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と、各種細胞由来の組換えＩＬ−６、それぞれ単独での、腫瘍細胞障害作用の比較をすると、図５に示すように、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、大腸菌由来ＩＬ−６、および昆虫細胞由来のＩＬ−６は、ほぼ、０．１ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ−６濃度で、濃度依存性に腫瘍細胞障害作用を示すが、酵母由来のＩＬ−６は、５０  ｎｇ／ｍｌ  まで濃度を上げても、全く細胞障害作用を示さない。ＣＨＯ細胞由来のＩＬ−６は、ほぼ、１ｎｇ／ｍｌ以上で、僅かに細胞障害作用が認められる。組換えＩＬ−６の中では、大腸菌由来、昆虫細胞由来のＩＬ−６が、最も腫瘍細胞障害作用が強いが、それでも、細胞生存率は５０％より低くはならない。
一方、一定量のＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせでは、図５の示すように、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、大腸菌由来ＩＬ−６、および昆虫細胞由来のＩＬ−６は、ほぼ、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６濃度までは、その濃度依存性に、ＴＮＦの、腫瘍細胞に対する細胞障害を増強する。そして、大腸菌由来ＩＬ−６および昆虫細胞由来のＩＬ−６は、ほぼ同じ強さのＴＮＦの細胞障害を増強するが、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度以上では、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）は、これらよりもより強くＴＮＦの細胞障害を増強する。酵母由来のＩＬ−６は、０．５ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ−６濃度で、僅かに増強作用が認められ、ＣＨＯ細胞由来のＩＬ−６の増強作用は、大腸菌由来、および昆虫細胞由来のＩＬ−６と、酵母由来のＩＬ−６との中間に位置している。すなわち、ＴＮＦの腫瘍細胞に対する細胞障害作用の増強の強さの順は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）＞大腸菌＝昆虫細胞＞ＣＨＯ  細胞＞酵母、である（図４も参照）。ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と  ＣＨＯ  細胞由来ＩＬ−６での増強作用は、１０  倍以上の差があることが認められる。ＩＬ−６（２４ｋＤａ）もほぼ同様の増強作用を有する。すなわち、本発明の上皮腫（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）細胞ＩＬ−６は、既存のＩＬ−６よりも優れて、抗腫瘍活性物質の腫瘍細胞障害作用を増強する。
【００１８】
また、同様に、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と、一定量のタキソール（６．２５ｎｇ／ｍｌ）、シスプラチン（０．２５μｇ／ｍｌ）、あるいはブレオマイシン（８３．３μｇ／ｍｌ）との組み合わせによる腫瘍細胞障害作用を調べると、図６Ａに示すように、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）とタキソール（６．２５ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせの場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）は、その濃度依存性にタキソールの腫瘍細胞に対する傷害作用を増強し、最大障害作用の５０％に対応するＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度は、約０．０４６ｎｇ／ｍｌである。シスプラチンとの組み合わせの場合、図６Ｂに示すように、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度が、０．０１８ｎｇ／ｍｌ以上で濃度依存性に、シスプラチンの腫瘍細胞に対する傷害作用を増強し、５０％に対応するＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度は、約０．６５ｎｇ／ｍｌである。ブレオマイシンとの組み合わせの場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度が、０．０９３ｎｇ／ｍｌ以上で濃度依存性にブレオマイシンの腫瘍細胞に対する傷害作用を増強し、５０％に対応するＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度は、約０．７ｎｇ／ｍｌである。ＩＬ−６（２４ｋＤａ）を用いても結果は本質的に同じである。
【００１９】
さらにまた、一定量（１．７ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−６（２４ｋＤａ）と、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、あるいはＴＮＦとの組み合わせによる  腫瘍細胞障害作用を調べると、図７Ａ、および図７Ｂに示すように、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ単独では、濃度を上げても、ほとんど細胞障害作用を示さないが、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）と組み合わせると、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γは、その濃度依存性に細胞障害作用を増強する。また、ＴＮＦは、上記したように、ＴＮＦ単独では、０．１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、初めて、腫瘍細胞障害作用が認められるが、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）と組み合わせると、ＴＮＦの濃度依存性に腫瘍細胞障害を増強する。すなわち、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）とこれらのサイトカインを組み合わせると、腫瘍細胞障害に対する相乗的増強作用が認められる。ＩＬ−６（２８ｋＤａ）を用いても結果は本質的に同じである。
【００２０】
ＩＬ−６  分子は、動物細胞中で産生された場合、糖鎖の結合により修飾され、多くの場合、少なくとも２４ｋＤａ  分子と２８ｋＤａ分子が産生される。さらには、これらの分子が会合した  ４２ｋＤａ  以上  ８０ｋＤａ  位までの大きさの数種類の分子が確認されている。また細胞の種類によっても、その分子種は異なる場合が多い。しかし、これらの個々の分子を精製し、その生物活性を解析することは、まだなされていない。
【００２１】
一方、ＩＬ−６  分子は、分子科学的に見てたいへん多様生を示す。これは、ある一つの細胞から産生される  ＩＬ−６  分子を見た場合に多様性があるというだけではなく、細胞の種類によっても異なる分子種、性質の  ＩＬ−６  が産生される。ＩＬ−６は多くの場合、細胞（Ｔ細胞株、ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  等）をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）や、ＩＬ−１  、ＴＮＦ、などのサイトカインで刺激すると産生されてくる。また人体への  ＴＮＦ  やエンドトキシンの投与で、血中の  ＩＬ−６  濃度は著しく上昇する。また、ヒトＩＬ−６ｃＤＮＡを細胞に導入し、いわゆる組換えＩＬ−６も産生されている。この場合、使用される細胞は、ＣＨＯ細胞、酵母、大腸菌、ｓｆ９細胞（昆虫由来）、などである。これらの異なる細胞、異なる方法（天然型と組み換え型）で産生されたＩＬ−６分子を詳細に検討していくと、それぞれでその分子的性質を異にしていることが分かる。現時点では、分子的差異により、作用、機能の差が生ずるのかは結論されてない。しかし、分子的性質が異なる以上、ＩＬ−６はその由来によって区別する必要がある。
【００２２】
ＩＬ−６  は、細胞内シグナル伝達物質を介して転写調節因子を活性化することが明らかとなってきた。それによって細胞のある特定の遺伝子発現が促される。しかし、そのことと、ＩＬ−６が示す種々の生理作用の関係を示す説明は、これまで何一つ明かにされてはいない（Ｔ  Ｔａｇａ  ＆  Ｔ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｌ．  １５，  ７９７−８１９  （１９９７））。ＩＬ−６が細胞死を誘導する過程で、何が細胞内で誘導されてくるのか、どのような細胞内シグナルが関係しているか、を明かにすることは、腫瘍細胞の死の誘導の原理を明かにし、そのスイッチを手にいれることとなる。
【００２３】
ｃＤＮＡクローンの単離や改変といった組換えＤＮＡの操作が、基本的に大腸菌で行われていることもあり、タンパク質の発現系の第一の選択肢として最も頻繁に用いれれているのが、大腸菌の系である。その手軽さと大量発現と精製の容易にできる点において、この系の右にでる系はない。しかし、多くのタンパク質は、特有の翻訳後修飾を受けた状態で機能することがわかっており、それが問題となる場合も多い。このような場合には、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などを用いることとなる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］  培養
２×１０７個のＫＢ細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−５％ＦＢＳ）１００ｍｌに浮遊させ、底面積３００ｃｍ２のフラスコに播種した。２日間培養した後、ＤＭＥＭ−５％ＦＢＳ、該培地を、ＡＳＦ３０１培地（無血清；味の素）、あるいは、ヒトＩＬ−１α（２ｎｇ／ｍｌ）を含むＡＳＦ３０１培地にそれぞれ交換（１２５ｍｌ／３００ｃｍ２）し、さらに２日間培養した。培養上清を集め遠心（４℃、１５００Ｇ、２０分）した。遠心後の培養上清中のＩＬ−６量を、ＥＬＩＳＡ  キット（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｒｅｍｓ社）で測定した。結果を図１に示す。ＩＬ−６の産生量は、ＡＳＦ３０１培地を使用した場合、ＤＭＥＭ−５％ＦＢＳに比較して、約４倍に増加しており、さらに  ＡＳＦ３０１培地＋ヒトＩＬ−１α（２ｎｇ／ｍｌ）を使用した場合は、約２０倍と飛躍的に増加している。
【００３０】
［実施例２］精製
実施例１で得られた遠心後のＡＳＦ３０１培養上清５Ｌは、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（アミコンＹＭ１０）で、約５０ｍｌにまで濃縮した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ７．０）に対して透析した後、０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ液は、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファーマシア）、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、およびＴＳＫｇｅｌ  Ｂｌｕｅ−５ＰＷ  （ＴＯＳＯＨ）、の３段階のカラムクロマトグラフィーを組合わせて精製した。精製の指標として、ＴＮＦ−α存在下、および非存在下における、ヒト乳癌由来の細胞株であるＳＫ−ＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３０）に対する細胞障害活性単位を用いた。
すなわち、ヒト乳癌由来ＳＫ−ＢＲ３細胞を、９６ウエルマイクロプレートに３×１０４  ｃｅｌｌ／１００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで約１５時間静置培養し細胞をプレートに接着させた。その後、培地のみを５０μｌ／ウエル添加（対照群）、２０〜１００倍、あるいは４倍段階希釈した試料を５０μｌ／ウエル添加した。５時間培養した後、培地のみを５０μｌ／ウエル添加（対照群）、あるいはＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；ＴＮＦと略す）を５０μｌ／ウエル添加（ＴＮＦの最終濃度を２．５ｎｇ／ｍｌとする）して９０時間培養した。ＴＮＦ−αのタンパク量は、そのメーカーの表示にしたがった。細胞の生存率測定は、ＳＨ  Ｌｅｅらの方法（ＳＨ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：  １０８３−１０８６，１９８４）に準じて行った。生細胞をクリスタルバイオレットで染色し、６２０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し細胞の生存率を求めた。なお、予め６２０ｎｍの吸光度と生細胞数との相関を調べ、直線性のある範囲で生細胞数を求めた。ＴＮＦ−α２．５ｎｇ／ｍｌ存在下での、３×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞の最大致死率の５０％を示すのに必要なＩＬ−６量を、活性の１単位（Ｕ／ｍｌ）と定義した。
【００３１】
１）Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
培養上清は、１００倍に濃縮して、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファーマシア  ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ、カラムサイズ  １．５ｘ３．０ｃｍ）に添加した。吸着しないタンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  ５０ｍｌで洗出した。吸着したタンパクは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）５０ｍｌと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）−０．３Ｍ  ＮａＣｌ  ５０ｍｌの溶出液によるリニアグラディエントにより溶出した（流速約１０ｍｌ／ｈｒ）。フラクションは５ｍｌ／ｔｕｂｅで集めた。結果、図２Ａに示すように、ＴＮＦ−α存在下でのＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用の最大のピークＩとＩＩの二つに分かれた。
【００３２】
２）ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
ＩとＩＩのフラクションをそれぞれプールし、約１ｍｌまで濃縮し、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（ＴＯＳＯＨ、カラムサイズ  ０．７５ｘ７．５ｃｍ）に添加した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）の溶出液で未吸着物質を洗い出した後、同じ溶出液によるＮａＣｌリニアグラジエントにより、吸着物質を溶出（流速０．５ｍｌ／分）した。フラクションは、０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで集めた。それぞれの溶出図を図２Ｂ、および図２Ｃに示す。図２Ｂでは、活性とＥＬＩＳＡによるＩＬ−６の測定結果とがよく一致する、フラクション３７、３８、３９番に溶出されるピーク（Ｉ）と、フラクション４２、４３番付近に溶出されるピーク（ＩＩＩ）とに分かれた。図２Ｃでは、同様に、活性とＥＬＩＳＡによるＩＬ−６の測定結果とがよく一致するピークＩＩが得られた。これらの結果から、ピークＩ、ＩＩＩ、およびＩＩの活性がＩＬ−６によるものであることが明らかとなった。
【００３３】
３）ＴＳＫｇｅｌＢｌｕｅ−５ＰＷカラム
ピークＩ、ＩＩＩ、およびＩＩのフラクションをそれぞれプールし、ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｌｕｅ−５ＰＷカラム（カラムサイズ  ０．７５ｘ７．５ｃｍ）に添加した。未吸着タンパクを２０ｍＭリン酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．９）で洗い出し、吸着タンパクは同じｂｕｆｆｅｒでＮａＣｌのグラディエントをかけて溶出（流速は０．５ｍｌ／分）した。フラクションは、０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで集めた。ピークＩとＩＩＩの溶出図を図２Ｄと図２Ｅに、ＩＩの溶出図を図２Ｆにそれぞれ示す。いずれも、活性と、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６測定結果とが、よく一致している。図２Ｄのフラクション２０、２１、２２番、図２Ｅのフラクション２３、２４、２５番、および図２Ｆのフラクション６０、６１、６２番、をそれぞれプールした。
【００３４】
［実施例３］  活性画分のウエスタンブロット法による分析
上記プールしたものについて、ＩＬ−６タンパクの純度検定とウエスタンブロット分析のために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。なお比較のため、ＣＨＯ細胞、酵母、大腸菌、および昆虫細胞由来の精製組換えヒトＩＬ−６についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、イワキの泳動装置を使い、１ｍｍ厚で濃度１６％のゲル（ＴＥＦＣＯ社）で１８ｍＡ／ｇｅｌ、泳動時間１００分とした。各レーンに対する注入量は、レーン１：フラクション２０、２１、２２番をプールしたもの１ｎｇ、レーン２：フラクション６０、６１、６２番をプールしたもの２．５ｎｇ、レーン３：２３、２４、２５番をプールしたもの３．５ｎｇ、レーン４：ＣＨＯ細胞由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１００ｎｇ、レーン５：酵母由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１００ｎｇ、レーン６：大腸菌由来ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）２０ｎｇ、レーン７：昆虫細胞ＩＬ−６（ｓｆ９細胞）由来２０ｎｇ、であった（図３Ａ）。分子量マーカーとして、フォスフォリラーゼｂ（分子量９４０００）、血清アルブミン（同６７０００）、オボアルブミン（同４３０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（同３００００）、トリプシンインヒビター（ｓｏｙｂｅａｎ，同２０１００）、α−ラクトアルブミン（同１４４００）の６種のタンパク（ファーマシア社）を同時に泳動した。
ブロッティングはトランスブロットＳＤセルセミドライ装置（バイオラッド社）で１５Ｖ定電圧下、２５分間ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写ｂｕｆｆｅｒはＢｊｅｒｒｕｍ，Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎのｂｕｆｆｅｒを用いた。１％ＢＳＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキング後、ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  ＡＰ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）で免疫染色した。一次抗体は、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  社）を、二次抗体はＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｆｃ）ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。
【００３５】
図３Ａに、ウエスタンブロッティング分析結果を示す。フラクション２０、２１、２２番（図２Ａ）をプールしたものは２８ｋＤａ（レーン１）、フラクション６０、６１、６２番（図２Ｆ）をプールしたものは２４ｋＤａ（レーン２）、フラクション２３、２４、２５番（図２Ｅ）をプールしたものは３１ｋＤａ（レーン３）、のＩＬ−６が主成分であることが明らかとなった。以後、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）と称する。これらの結果は、このカラムクロマトグラフィーの組み合わせで、分子量の異なるＩＬ−６が相互に分離することを示している。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  による分析の結果、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の純度は７０〜８０％であり、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）の純度は９０  ％  以上であった（図３Ｂレーン１、および２）。
ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）に相当する  ＩＬ−６  分子は  ＣＨＯ  細胞でも産生しているのが明らかである（レーン４）。酵母で産生された  ＩＬ−６  分子はこの抗体ではまったく認識されない（レーン５）。これは、酵母由来のＩＬ−６  分子は修飾、あるいは高次構造が、ＣＨＯ細胞由来、大腸菌由来、あるいは昆虫細胞由来のＩＬ−６分子とはまったく異なるため、少なくともこの抗体では認識されないと考えられる。大腸菌（レーン６）、昆虫細胞（レーン７）で産生された  ＩＬ−６  分子は糖鎖による修飾を受けてないとされる２０．３ｋＤａのＩＬ−６が主要である。ただ、昆虫細胞由来のＩＬ−６には、２４、１８ｋＤａ  ＩＬ−６も観察された。これらの結果は、ＩＬ−６分子は産生される細胞によって、糖鎖修飾による不均一性だけでなく、さらに、他の原因による分子構造の変化も生ずる可能性を示している。ＩＬ−６（２４ｋＤａ）のＮ末端１５アミノ酸配列を分析した結果、配列番号：１に示すように、報告されているＩＬ−６のアミノ酸配列（特許第２６６４６９８号）と一致する。
【００３６】
［実施例４］一定濃度の抗腫瘍活性物質の腫瘍細胞障害増強作用
方法は、実施例２の１）に記載の方法にに準じた。
４−１．  ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、あるいはＩＬ−６（３１ｋＤａ）の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、それぞれ、単独で、あるいは一定量のＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで調べた。結果を図４に示す。図中、実線はＩＬ−６単独の場合を、点線はＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせの場合を示す。
ＩＬ−６単独の場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）は、ほぼ０．１ｎｇ／ｍｌ近辺から、その濃度依存性に、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を示しており、その強さにも差は、ほとんど認められない。しかし、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）は、１ｎｇ／ｍｌより高濃度のところでは、細胞障害作用が減少し、生存細胞率は５０％より低くならない。ここでは示さないが、他の実験結果から、生存細胞率が５０  ％より低くなったところでは、細胞数の減少を伴うことが明かとなっている。したがって、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）ともに約１ｎｇ／ｍｌ  以上のＩＬ−６濃度では、細胞死の誘導を伴っていると考えられる。生存細胞数の５０％に対応するＩＬ−６（２８ｋＤａ）、およびＩＬ−６（２４ｋＤａ）のＩＬ−６量は、図４から、０．０３〜０．０５ｎｇ／ｍｌである。
一方、ＩＬ−６と一定量（２．５ｎｇ／ｍｌ）のＴＮＦとの組み合わせの場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）は、ほぼ、０．１ｎｇ／ｍｌ付近の濃度までは、その濃度依存性に、ＴＮＦのＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を何れも同程度に増強しているが、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）の場合は、この濃度を越えると、増強活性は認められなくなる。また、図７Ｃに示すように、ＴＮＦ単独の場合、ＴＮＦ濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ以下では、ＴＮＦはＳＫ−ＢＲ３細胞に対して細胞障害作用を発揮しないが、一定量（１．７ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−６（２４ｋＤａ）とＴＮＦとを組み合わせた場合は、ＴＮＦは、その濃度依存性にＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を発揮する。このように、ＩＬ−６とＴＮＦとの組み合わせが、ＴＮＦの腫瘍細胞に対する細胞障害作用を、相乗的または相加的に増強させることは、これまで知られてない。
【００３７】
４−２．  ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＣＨＯ細胞、酵母、大腸菌、および昆虫細胞由来の精製組換えヒトＩＬ−６（実施例３と同じもの）の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、それぞれ単独で、あるいは一定量のＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで調べた。結果を図５に示す。図中、実線はＩＬ−６単独の場合を、点線はＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせの場合を示す。▲１▼：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、▲２▼：ＣＨＯ由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）、▲３▼：酵母由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）、▲４▼：大腸菌由来ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、▲５▼：昆虫細胞（ｓｆ９細胞）由来ＩＬ−６（ＡＵＳＴＲＡＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、である。
ＩＬ−６単独の場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、大腸菌由来ＩＬ−６、および昆虫由来のＩＬ−６は、０．１〜０．２ｎｇ／ｍｌ以上のタンパク濃度で、濃度依存性にＳＫ−ＲＢ３細胞に対する細胞障害作用が認められるが、酵母由来のＩＬ−６は、５０  ｎｇ／ｍｌ  まで濃度を上げても、全く細胞障害作用が認められない。ＣＨＯ細胞由来のＩＬ−６は、１ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ−６濃度で僅かに細胞障害作用が認められる。ＩＬ−６（３１ｋＤａ）、大腸菌由来、昆虫細胞由来のＩＬ−６も細胞障害作用を示すが、これらは、何れも、生存細胞率５０％よりは大きな細胞障害を示さない特徴がある。
一方、これら各種のＩＬ−６と、一定量のＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせの場合、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、大腸菌由来ＩＬ−６、および昆虫由来のＩＬ−６は、ほぼ、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６濃度までは、濃度依存性に、ＴＮＦの細胞障害作用を増強するが、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）とＴＮＦとの組み合わせが、最も強い細胞障害増強作用を示し、大腸菌由来および昆虫細胞由来のＩＬ−６とＴＮＦの組み合わせは、ほぼ同じ強さの細胞障害増強作用を示す。酵母由来のＩＬ−６とＴＮＦの組み合わせは、０．５〜１ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ−６濃度で、僅かに細胞障害増強作用が認められる。ＣＨＯ細胞由来のＩＬ−６は、細胞障害増強作用が、大腸菌由来、および昆虫由来のＩＬ−６と、酵母由来のＩＬ−６との中間に位置している。  すなわち、ＴＮＦのＳＫ−ＲＢ３細胞に対する細胞障害増強作用の強さの順は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）  ＞大腸菌＝昆虫細胞＞ＣＨＯ  細胞＞酵母、である（図４も参照）。ＩＬ−６（２８ｋＤａ）とＴＮＦとの組み合わせの場合と、ＣＨＯ  細胞由来ＩＬ−６とＴＮＦとの組み合わせの場合との細胞障害増強作用の強さには、１０  倍以上の差が認められる。
【００３８】
４−３．  ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と、一定量のタキソール（６．２５ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）、シスプラチン（０．２５μｇ／ｍｌ）（日本化薬）、あるいはブレオマイシン（８３．３μｇ／ｍｌ）（日本化薬）との組み合わせによる、ＳＫ−ＢＲ３  細胞に対する細胞障害作用を調べた。結果を図６Ａ、Ｂ、およびＣに示す。タキソールとＩＬ−６（２８ｋＤａ）との組み合わせの場合、ＩＬ−６の濃度が少なくとも１．５ｎｇ／ｍｌまでは、ＩＬ−６の濃度依存性に、タキソールは、ＳＫ−ＢＲ３  細胞に対する細胞障害を増強する。シスプラチンの場合は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度が０．０１８ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、ＩＬ−６の濃度依存性に、シスプラチンは、細胞障害を増強する。ブレオマイシンの場合は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の濃度が０．０９３以上で、その濃度依存性に相加的な障害増強作用を示す。
【００３９】
［実施例５］各種濃度の抗腫瘍活性物質の腫瘍細胞障害増強作用
天然型ＩＮＦ−α（林原生化学研究所）、組換えＩＦＮ−γ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、あるいは組換えＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、それぞれ、単独で、あるいは一定量（１．７ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−６（２４ｋＤａ）との組み合わせで調べた。方法は、実施例２の１）に記載の方法にしたがった。結果を図７Ａ、Ｂ、およびＣに示す。ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γ単独では、細胞障害作用をほとんど示さないが、一定量のＩＬ−６（２４ｋＤａ）と組み合わせると、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γは、その濃度依存性に、細胞障害作用を発揮する。また、ＴＮＦ単独の場合、０．１ｎｇ／ｍｌ以上で細胞障害作用を発揮するが、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）と組み合わせると、ＴＮＦは、０．１ｎｇ／ｍｌ以下でも、その濃度依存性に、細胞障害作用を示す。ＩＬ−６（２８ｋＤａ）を用いても同様な結果が得られた。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、上皮腫（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）細胞由来のＩＬ−６の大量培養法が確立された。また、該ＩＬ−６単独、あるいは該ＩＬ−６と、少なくとも１種、または２種以上の抗腫瘍活性物質とを組み合わせることにより、腫瘍細胞障害作用が、増強されることが初めて明らかにされた。その結果、本発明のＩＬ−６と、１種、または２種以上の抗腫瘍活性物質とを含む抗腫瘍剤は、１）抗腫瘍効果を高める、２）抗腫瘍スペクトラムを広げる、３）抗腫瘍剤耐性を防止または遅延する、ことが期待される。
【００４１】
【配列表】
0003600741.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＢ細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＡＳＦ３０１無血清培地（味の素）、及びＡＳＦ３０１無血清培地＋ヒトＩＬ−１α（２ｎｇ／ｍｌ）で培養した場合の、各培地上清中のＩＬ−６量（ｎｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
【図２】ＫＢ細胞のＡＳＦ３０１無血清培地による培養上清を、３段階のカラムクロマトグラフィーにより精製した際の各カラムの溶出図を示す。Ａ：Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂ、およびＣ：ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、Ｄ、Ｅ、およびＦ：ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｌｕｅ−５ＰＷである。
【図３】Ａ：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）（レーン１）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）（レーン２）、ＩＬ−６（３１ｋＤａ）（レーン３）、ＣＨＯ細胞由来ＩＬ−６（レーン４）、酵母由来ＩＬ−６（レーン５）、大腸菌由来ＩＬ−６（レーン６）、および昆虫細胞（ｓｆ９細胞）ＩＬ−６（レーン７）、のウエスタンブロッティング分析結果を示す。一次抗体は、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  社）を、二次抗体は、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｆｃ）ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用した。分子量のマーカーとして、フォスフォリラーゼｂ（９４０００）、血清アルブミン（６７０００）、オボアルブミン（４３０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３００００）、トリプシンインヒビター（２０１００）、α−ラクトアルブミン（１４４００）の６種のタンパク（ファーマシア社）を同時に泳動した。Ｂ：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と（２４ｋＤａ）を直接ＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、銀染色でタンパクを確認した結果を示す。
【図４】ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、あるいはＩＬ−６（３１ｋＤａ）の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、単独で、あるいは一定量のＴＮＦ−α（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで調べた結果を示す。図中、実線は、ＩＬ−６単独を、点線はＩＬ−６とＴＮＦとの組み合わせを、をそれぞれ示す。図中○：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、△：ＩＬ−６（２４ｋＤａ）、□：ＩＬ−６（３１ｋＤａ）を示す。
【図５】ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、ＣＨＯ細胞由来ＩＬ−６、酵母由来ＩＬ−６、大腸菌由来ＩＬ−６、および昆虫細胞由来のヒトＩＬ−６の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、それぞれ単独で、あるいは一定量のＴＮＦ（２．５  ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで調べた結果を示す。図中、実線は、ＩＬ−６単独を、点線はＩＬ−６とＴＮＦとの組み合わせを、をそれぞれ示す。図中×：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）、○：ＣＨＯ細胞由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）、▽：酵母由来ＩＬ−６（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）、□：大腸菌由来ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、△：昆虫細胞（ｓｆ９細胞）由来ＩＬ−６（ＡＵＳＴＲＡＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を示す。
【図６】Ａ：ＩＬ−６（２８ｋＤａ）の、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、単独で、あるいは一定量のタキソール（６．２５ｎｇ／ｍｌ）、シスプラチン（０．２５μｇ／ｍｌ）、およびブレオマイシン（８３．３μｇ／ｍｌ）、との組み合わせで調べた結果を示す。図中、実線は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）単独を、点線は、ＩＬ−６（２８ｋＤａ）と、タキソール、シスプラチン、あるいはブレオマイシンとの組み合わせを、それぞれ示す。
【図７】Ａ：天然型ＩＮＦ−α、組換えＩＦＮ−γ、あるいは組換えＴＮＦ−αの、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する細胞障害作用を、単独で、あるいは一定量のＩＬ−６（２４ｋＤａ）（１．７ｎｇ／ｍｌ）との組み合っせで調べた結果を示す。図中、実線は、天然型ＩＮＦ−α、組換えＩＦＮ−γ、組換えＴＮＦ−α単独を、点線は、ＩＬ−６（２４ｋＤａ）と、天然型ＩＮＦ−α、組換えＩＦＮ−γ、組換えＴＮＦ−αとの組み合わを、それぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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