【手続補正書】
【提出日】平成29年7月4日(2017.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドラターゼ又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼと、ワックスエステルシンターゼとをコードする異種核酸配列を含む、遺伝子組み換え微生物であって、Ｃ４以上の炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、前記微生物。
【請求項２】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、ＮｐｈＴ７を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項３】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、配列番号１から１２０のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項４】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、アミノ酸８６〜８９におけるＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｆ２１７Ｗ、Ｇ２８８Ｓ、Ｇ３０９Ｓ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｃ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｙ、Ｖ１５７Ｆ、Ｖ１９６Ｇ、及びＹ１４４Ｌからなる群から選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項５】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、Ｉ１４７Ｔ及びＨＦＬＱ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｗ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｋ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｅ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｇ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ａ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｌ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｉ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｍ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｐ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｓ、Ｉ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｅ、並びにＩ１４７Ｍ及びＦ２１７Ｋからなる群から選択される２つのアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項６】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、Ｙ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ；Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ及びＨＦＬＱ；Ｉ１４７Ｔ、Ｖ１４７Ｆ及びＦ２１７Ｖ；並びにＹ１４４Ｌ、Ｉ１４７Ｔ及びＶ１５７Ｆからなる群から選択される３つのアミノ酸置換を含む、修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項７】
前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、Ｓｅｒ８４、Ｖａｌ１１４、Ｇｌｙ２８８、Ｉｌｅ１９４、Ｇｌｙ３１８、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｎ９０、Ｖａｌ１９６、Ｔｙｒ１４４、Ｐｈｅ１５９、Ｉｌｅ１４７、及びＰｈｅ２１７からなる群から選択される位置における１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＮｐｈＴ７ポリペプチドを含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項８】
脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルケン、脂肪族アミド、脂肪族アルカン、及び脂肪族二塩基酸を含む群から選択される脂肪酸誘導体の産生を触媒する終結酵素をコードする異種核酸配列を更に含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項９】
前記ワックスエステルシンターゼが、Ｍａｑ１、Ｐｃｒｙ１、Ｒｊｏｓ１、及びＡｂｏｒｋ１を含む群から選択され、前記微生物が脂肪エステルを産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１０】
前記ワックスエステルシンターゼが、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、及び配列番号２９２のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記微生物が脂肪エステルを産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１１】
微生物がチオエステラーゼをコードする異種核酸配列をさらに含み、
ａ）１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７  Ｆ２１７Ｖ、及びＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖからなる群から選択され；
ｂ）前記ケトＣｏＡレダクターゼが、ｆａｄＢであり；
ｃ）前記３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドラターゼが、ｆａｄＢであり；
ｄ）前記エノイル−ＣｏＡ−レダクターゼが、ｔｅｒであり；及び
ｅ）前記チオエステラーゼが、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、
並びに前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記タンパク質が、炭素数６又は７の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１２】
前記微生物がチオエステラーゼをコードする異種核酸配列をさらに含み、
ａ）１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７  Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｓ、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、並びにシンターゼＩＩＩからなる群から選択され；
ｂ）前記ケトＣｏＡレダクターゼが、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され；
ｃ）前記３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドラターゼが、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され；
ｄ）前記エノイル−ＣｏＡ−レダクターゼが、ｔｅｒであり；及び
ｅ）前記チオエステラーゼが、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ＣｐｅｒｆＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され；
並びに前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記タンパク質が、炭素数８又は９の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１３】
前記微生物がチオエステラーゼをコードする異種核酸配列をさらに含み、
ａ）１つ又は２つ以上の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼが、ＮｐｈＴ７、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｔ、ＮｐｈＴ７  Ｆ２１７Ｖ、ＮｐｈＴ７  Ｉ１４７Ｔ及びＦ２１７Ｖ、Ｎｐｔｈ７  Ｉ１４７Ｓ、Ｎｐｔｈ７  Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ、シンターゼＩＩＩ、シンターゼＩＶ、並びにシンターゼＶからなる群から選択され；
ｂ）前記ケトＣｏＡレダクターゼが、ｆａｄＢ及びｆａｂＧからなる群から選択され；
ｃ）前記３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドラターゼが、ｆａｄＢ、ｅｃｈ及びｅｃｈ２からなる群から選択され；
ｄ）前記エノイル−ＣｏＡ−レダクターゼが、ｔｅｒであり；及び
ｅ）前記チオエステラーゼが、ＡｔＴＥ、ＣｐＴＥ、ｆａｄＭ、ＰＡ２８０１ＴＥ、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｙｂｆＦ、ｙｂｇＣ、及びｙｃｉＡからなる群から選択され、
並びに前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記タンパク質が、炭素数１０又は１１の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、アセチル−ＣｏＡをプライマーとして、及びマロニル−ＣｏＡを伸長分子として使用して、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０から選択される炭素鎖長の脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１５】
ｆａｂＨをコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１６】
所望の鎖長特異性を有するｆａｂＨをコードする異種核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１７】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ又はエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え微生物であって、Ｃ８以上の炭素鎖長を有する脂肪酸又は脂肪酸誘導体を産生できる、前記微生物。
【請求項１８】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼがさらにＮｐｈＴ７を含む、請求項１７に記載の遺伝子組み換え微生物。
【請求項１９】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼがさらにＮｐｈＴ７変異体を含む、請求項１７に記載の遺伝子組み換え微生物。