(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モデル実験小動物を用いる皮膚の免疫機能の評価方法であって、
（Ａ）免疫原を皮膚に塗布することにより前記動物を免疫感作する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）を経た前記動物を過密飼育しながらチャレンジする工程、
（Ｃ）チャレンジした動物の接触性過敏症反応を指標にして皮膚の免疫機能を評価する工程、
を含んでなる前記評価方法。
【請求項２】
皮膚異常の予防もしくは治療に効能を有するか否かを判断するために実施する請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
接触性過敏症反応の指標が皮膚のランゲルハンス細胞の形態変化である請求項１または２記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、殊に、皮膚異常の予防もしくは治療における効能を判断するための実験小動物を用いる皮膚の免疫機能の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性的なストレスは健康を害すると経験的に認識され、現に過去３０年間に発表されたストレス関連の研究論文では、高度の慢性的ストレスが多種多様な疾患を引き起こすことが示唆されている。より具体的には各種ストレスが中枢で認識され、神経系、内分泌系を介して末梢へ伝わり、生体は、免疫調節機構等を介して防御体制を敷くことが、例えば感染症モデルを用いた全身性の免疫反応等について明らかにされつつある。
【０００３】
一方、皮膚器官も例外でなく、解剖的、機能的に皮膚の免疫細胞と神経因子が関連することを、本発明者が明らかにした（例えば、土屋ら、Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０、２２１〜２３０（１９９５）、同２１、１１１〜１１７（１９９６）参照）。また、神永ら、フレグランス  ジャーナル（１１）１９９６、３５〜４０、「特集／ストレスと皮膚」において、過密ストレスの負荷によりモルモットの皮膚の色が変化し、皮膚の免疫担当細胞といわれるランゲルハンス細胞数の減少等が観察されることから、ストレスによる皮膚の免疫能が低下することを示唆している。さらに川口は、同誌、４１〜４５において、拘束ストレスを免疫感作の直前に負荷したマウスでは遅延型過敏反応が抑制されるが、免疫誘発させる直前にかかるストレスを負荷したマウスでは前記皮膚反応が観察されないことを示唆している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、ストレスと皮膚機能、特に免疫機能との間に関連性の存在することが示唆されている。しかし、外的刺激に対する免疫反応を、生体が本来的に有する恒常性維持機構による包括的な生体反応等から独立して選択的に評価するには、適切な免疫反応の評価時期を選定し、ヒトが実社会で受けるストレッサーにより近似したストレスによるモデル動物での免疫反応を客観的に評価しうることが必要であろう。したがって、本発明の目的は、皮膚の免疫機能を、モデル動物を用い客観的に評価する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の拘束ストレスによる実験結果とは対照的に、社会心理的ストレスに近似するといわれる過密ストレスによる接触性過敏症は、免疫感作時のストレスの有無によっては動物の過敏症反応に有意な差が観察されないものの、免疫惹起反応時（またはチャレンジ時）では、ストレスの有無が動物の過敏症反応を有意に識別できる結果をもたらすことを見い出した。
【０００６】
したがって、上記目的を達成するために、本発明に従う、モデル実験小動物を用いる皮膚の免疫機能の評価方法を提供する。この評価方法は、具体的には、
（Ａ）免疫原を皮膚に塗布することにより前記動物を免疫感作する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）を経た前記動物を過密飼育しながらチャレンジする（すなわち、過密ストレスを負荷しながら前記免疫原を、感作された動物に塗布する）工程、
（Ｃ）チャレンジした動物の接触性過敏症反応を指標にして皮膚の免疫機能を評価する工程、を包含する。
【０００７】
本発明の方法によれば、皮膚の免疫機能が安定かつ客観的に評価できる。かかる評価方法を応用すれば、例えば、ストレスによる免疫能の低下に起因する皮膚異常、例えば肌荒等を予防もしくは治療する手段のスクリーニングに用いることができる。従って、本発明のもう一つの態様としては、上記方法を皮膚異常の予防もしくは治療に効能を有するか否かを判断するために向けられる前記評価方法も提供される。
【０００８】
【発明の具体的な記述】
本発明で用いることのできるモデル実験小動物は、詳細には後述する過密ストレスを負荷したときと、負荷しないときに、接触過敏症反応が識別でき、かつそのような負荷を容易に行うことのできる小動物であればいかなる動物であってもよい。一般的には、マウス、ラット、モルモット、ウサギを都合よく使用することができる。
【０００９】
このような動物を免疫感作するのに用いることのできる免疫原は、アレルゲンとして作用しうる抗原物質であって、天然物、合成薬物のいずれであってもよい。所定の純度を有し、微量で動物を感作できる合成薬物、例えば、テトラニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）を都合よく使用することができる。
【００１０】
本発明では、まず最初に、免疫原を適当濃度の溶液にして、動物の皮膚に塗布することにより動物を感作する。具体的な塗布操作は、使用動物に応じて、それ自体既知の方法から選ぶことができる。
【００１１】
次いで、感作された動物は過密飼育することにより、所謂、過密ストレスを負荷する。一般的に、マウス（例えば、ｃ５７ＢＬ／６マウス）は、１ケージ（１７×２８ｃｍ２）当り５匹で飼育しているが、これを１０匹に（過密飼育）することで、適度な過密ストレスを負荷することができる。この際、飼育は２日程度でよい。上記マウスの場合、通常、動物は感作後数日（１〜５日）目に過密飼育に移し、さらに１ないし２日後にチャレンジ（前記免疫原溶液を動物の皮膚に塗布する。この塗布箇所は、感作時の塗布箇所と同一または異なっていてもよい）する。
【００１２】
本発明によれば、このようなチャレンジにより免疫反応（接触性過敏症反応）が惹起される。この過敏症反応は、チャレンジ時に薬物を塗布した部位の腫張や、皮膚から表皮シートを剥離し、蛍光免疫染色を行った後の共焦点レーザー走査顕微鏡によるランゲルハンス細胞の形態の観察や、場合により血漿中のコルチコステロン濃度により評価できる。この評価は、通常、動物の飼育密度を代えて、上記操作を繰り返すか、好ましくは並行して実施した対照試験の結果と比較して行うことができる。
【００１３】
本発明の方法によれば、上記操作に従い、過密ストレスを負荷した場合、対照（ストレス未負荷）に比べ上記腫張は小さくなり、ランゲルハンス細胞の陽性細胞数の減少または突起数の減少もしくは表面の平滑化し、そしてコルチコステロン濃度は増大する。これらの有意な変化が認められるので、本発明の方法に従うストレスの負荷により、接触性過敏症反応の抑制（皮膚免疫機能の低下）の程度を数量的に評価することができる。
【００１４】
本発明によれば、ストレスによる皮膚免疫能の低下により肌（または皮膚）に異常が生じている場合（潜在的な症状も含む）のモデル実験動物系が提供できるので、例えば、ある一定の手段（例えば、医薬品または医薬部外品）等を前記動物系に適用すれば、それらの手段がストレスに起因する肌荒れ等の予防もしくは治療に有効であるか否かを評価することもできる。
【００１５】
【実施例】
以下、実験小動物として、ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用する例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１６】
例１：  飼育密度の接触性過敏反応（耳の腫張）の血漿コルチコステロン濃度の影響
１ケージ（１７×２８ｃｍ２）当り５匹ずつ飼育している８週齢の雌のｃ５７ＢＬ／６マウスの背部に３％テトラニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）のアセトン溶液２５μｌを塗布して免疫した。４日後に、１ケージ当り動物の飼育数を１匹、５匹、１０匹に変え、翌日、１％ＴＮＣＢ溶液１０μｌを耳に塗布し、さらに２４時間後に耳の腫張を測定すると同時に採血した。血漿中の総テストステロン濃度を、市販のＲＩＡキット（ＴＫＴＴ１、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ、製）で測定した。結果を図１に示す。図中の黒丸はコルチコステロン濃度を表し、棒グラフは耳の腫張の厚さを表す。
【００１７】
図１は、ストレスの負荷がマウスの接触性過敏症反応にどのような影響を及ぼすかを示すグラフである。
【００１８】
ストレスの指標となるコルチコステロンはケージ当りの飼育匹数の増加に依存して統計的に有意に（ＰＦ＜１％）増加したのに対し、アレルギー反応の指標である耳の腫張は有意に低下した。（ＰＦ＜１％）
例２：表皮ランゲルハンス細胞の評価
異なる飼育密度で２日間飼育した後皮膚を採取し、３．８％イソチアン酸アンモニウム水溶液中で１５分間インキュベートすることにより表皮シートを剥離した。この表皮シートを抗Ｉ−Ａ抗体（Ｍ５、１１４細胞培養上清）およびＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  ＵＳＡ製）で間接蛍光免疫染色を行った後、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用い観察し解析した。
【００１９】
計測した蛍光強度および細胞の突起数を下記表Ｉにて示す。
【００２０】
【表１】
0003553312.tif 000002
【００２１】
抗原提示反応に関わる分子の発現に対応する蛍光強度が飼育匹数の増加に伴って有意に（ＰＦ＝０．０００４）減少し、また細胞１個あたりの突起数が減少している。これらはストレスによるランゲルハンス細胞の不活性化を示している。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、ストレスによる皮膚の免疫機能を客観的に評価できる方法が提供される。かかる方法を、例えば皮膚異常の予防もしくは治療用製剤に適用すれば、かかる製剤がストレスによる皮膚免疫能の低下に起因する皮膚異常に効能を有するか否かを評価できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ストレスの負荷がマウスの接触性過敏反応にどのような影響を及ぼすかを示すグラフである。
【図１】
0003553312.tif 000003