(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第IX因子ファミリーからのプロテアーゼの次のドメイン：
ａ）触媒ドメイン、そのＮ末端に連結した
ｂ）チモーゲン活性化ドメイン、そのＮ末端に連結した
ｃ）EGF2ドメイン
から構成される、セリンプロテアーゼ活性を有する、グリコシル化されておらず、酵素として活性なタンパク質、又はそのチモーゲン。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質又はそのチモーゲンを生産するための方法であって、前記プロテアーゼをコードする組換え遺伝子を含む発現ベクターで原核宿主生物を形質転換し、該遺伝子を発現させ、そして生産されたプロテアーゼを単離することにより、前記生物内で、前記タンパク質をコードする核酸を異種発現させることによる方法。
【請求項３】
第IX因子ファミリーからのプロテアーゼのアクティベーター及び／又はインヒビターを同定するための請求項１に記載のタンパク質又はそのチモーゲンの使用。
【請求項４】
請求項１に記載のチモーゲン及び色原ペプチド基質とのインキュベーションにより、水溶液において第IX a因子を測定するための方法であって、前記ペプチド基質が、活性化されたチモーゲンにより特異的に開裂されることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記水溶液が体液であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、EFGマドメイン、活性化ペプチド（AP）及び触媒ドメイン（CD）から構成される第IX遺伝子ファミリー（F VII,F IX,F X及びプロテインＣ）のトランケートされた翻訳後非修飾性血漿プロテアーゼ変異体、並びに宿主細胞内、好ましくは微生物内での発現、試験管内での再生、及び次の適切なプロテアーゼでの活性化によりそれらを生産するための方法に関する。
本発明による血漿プロテアーゼは、インヒビターを見い出す（スクリーニングする）ため、Ｘ線構造解析及び薬剤モデリングの目的のためのプロテアーゼ変異体及びインヒビターから構成される共結晶の生産のため、並びにアクテイベーターテストにおける診断テストとして適する。
血漿プロテアーゼは、血液凝固、フィブリン形式による創傷治療及びフィブリン溶解、即ち創傷治療における血餅溶解において役割を果たす。創傷の後、創傷シグナルは、血液凝固を開始し、迅速に創傷が閉じるのを確実にするために不活性なプロ酵素の連続的な活性化（特定のタンパク質分解）により増幅される。血液凝固は２つの経路により開始され得る。それらは、全てのタンパク質成分が血液中に存在する内因性経路及び膜タンパク質、即ちいわゆる組織因子が重要な役割を果たす外因性経路である。
血液ホメオスタシス（血液凝固、フィブリン溶解及びこの平衡の制御）の分子メカニズム及びこれに関連する構成物は、いくつかの論文にわかりやすく記載されている（Furie,B.及びFurie,B.C.,Cell 53（1988）505−518;Davie,E.W.ら、Biochem.30（1991）10363−10379;Bergmeyer,H.U.（ed.）:Methods of Enzymatic Analysis,Vol.V,chapter 3,3rd ed.,Academic Press,New York（1983））。
血液凝固カスケードのプロテアーゼは極めて複雑なタンパク質である。概して、それらは、天然の生の材料源、血漿から、複雑な様式で、限られた量で、種々の質、均一性及び純度でのみ単離することができる（Van Dam−Mieras,M.C.E.ら.,In:Bergmeyer,H.U.（ed.）,Methods of Enzymatic Analysis,Vol.V,3rd ed.,page 365−394,Academic Press,New York（1983））。それらは、血液凝固、血餅形成及び溶解の間の平衡である血液ホメオスタンスの制御において重要な役割を演ずる。この十分に制御されたシステムは、遺伝子欠損、例えば血友病Ａ（第VIII因子欠損）及び血友病Ｂ（第IX因子欠損）により、並びに急性疾患、例えば心臓の梗塞、塞栓症及び脳卒中により不均衡になり得る。
それゆえ、医療的要求に従って血液凝固及びフィブリン溶解のシステムに影響を与えることができる物質について必要性がある。例えば、組換え生産された第VIII因子もしくは第IX因子又は現在は第VII因子は、血友病Ａ及びＢを治療するのに用いられる。tPA（組織型プラスミノーゲンアクティベーター）及びストレプトキナーゼ（バクテリアプロテアーゼ）は、例えば心臓の梗塞後に、例えば血餅溶解のために用いられる。複合タンパク質に加えて、ヒルジン（65アミノ酸からなるペプチド、特異的トロンビンインヒビター）、ヘパリン（ヘテログリカン、トロンビン阻害／補因子）及びビタミンＫアンタゴニスト（γ−カルボキシル化のインヒビター;GlaのドメインのGlu残基）のような物質も血液凝固を阻害するのに用いられる。しかしながら、それら利用できる物質は、しばしばまだ極めて高価であり（タンパク質因子）、それらの医療的適用に関して理想的でない（副作用）ので、血液凝固及び血餅溶解を特異的に調節するのに用いることができる薬剤についての必要性がある。
血液凝固、フィブリン溶解及びホメオスタシスの新しい調節物質（アクティベーター、インヒビター）についての調査は、例えば物質ライブラリーをスクリーニングし、そして次に薬剤モデリングにより同定された先導物質を改良することにより行うことができる。このためには、スクリーニングのため及び結晶化研究（例えば、タンパク質成分及び先導構造の3D構造に基づく変化の特定の予測による先導構造の改良）のために適切な量及び質で鍵になるタンパク質（標的）が利用できることが必要である。
活性化されたセリンプロテアーゼトロンビン、F VII a,F IX a,F X a,F XI a,F XII a、カリクレイン（血液凝固）、tPA、ウロキナーゼ、プラスミン（フィブリン溶解）及び活性化されたプロテインＣ（調節抗凝固物質）及びその不活性な前駆体（チモーゲン）が、例えば、ホメオスタシスにおいて注目される標的である。
血漿からの不活性なセリンプロテアーゼ（チモーゲン）の単離及び次のタンパク質分解による活性化は難しく、時間を浪費し、高価で、そしてしばしば例えば結晶化実験のために要求される量及び質を生産しない。例えば、不活性なプロテアーゼチモーゲンF X,F IX及びF VIIの血漿濃度は各々10.5及び0.5mg/ｌだけである（Furie,B.及びFurie B.C.,Cell 53（1988）505−518）。更に、血漿から単離され、試験管内で活性化されたプロテアーゼ調製物はしばしば不均一で不安定である。更に、不均一な翻訳後改変（例えば糖質基）は結晶化実験をじゃまする。
血漿プロテアーゼは、セリンプロテアーゼファミリーに属する複合糖タンパク質である。それらは、不活性なプロ酵素（チモーゲン）として肝臓において合成され、血液中に分泌され、そして特定のタンパク質分解により、即ち１又は２のペプチド結合の開裂により要求に応じて活性化される。それらは、それらのタンパク質ドメインの配置及びそれらの組成に関して構造的に極めて類似している（Furie,B.及びFurie,B.C.,Cell 53（1988）505−518）。
Furie B.及びFurie,B.C.によれば、第IX因子ファミリー（第VII,IX,X因子及びプロテインＣ）のプロテアーゼは、
−  プロペプチド、
−  GLAドメイン、
−  芳香族アミノ酸スタックドメイン、
−  ２つのEGFドメイン（EGF1及びEGF2）、
−  チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド、AP）及び
−  触媒プロテアーゼドメイン（CD）
から構成される。
更に、血漿プロテアーゼは分泌の間に翻訳後に修飾される：
−  11〜12のジスルフィド架橋
−  Ｎ−及び又はＯ−グルコシル化（GLAドメイン及び活性化ペプチド）
−  Bharadwaj,D.ら、J.Biol.Chem.270（1995）6537−6542
−  Medved,L.V.ら、J.Biol.Chem.270（1995）13652−13659
−  プロペプチドの開裂
−  Glu残基（GLAドメイン）のγ−カルボキシル化
−  Asp残基（EGFドメイン）のβ−ヒドロキシル化
−  チモーゲン領域の開裂（部分的）
１又は２のペプチド結合の特異的開裂（活性化ペプチド）によるチモーゲン（タンパク質のチモーゲン形態）の活性化の後、その酵素で活性化されたプロテアーゼは、それらの分子量に従って重鎖及び軽鎖と呼ばれる２つの鎖から構成される。第IXプロテアーゼファミリーにおいては、EGF2ドメインとプロテアーゼドメインとの間の分子間ジスルフィド架橋により一緒に維持される。チモーゲン−酵素変換（活性化）は、プロテアーゼドメイン内のコンホメーション変化を導く。これは、プロテアーゼ活性のために必要な必須の塩橋がプロテアーゼドメインのＮ末端アミノ酸とプロテアーゼドメイン内のAsp残基との間に形成されるのを可能にする。そのＮ末端領域はセリンプロテアーゼのこのサブグループのために極めて重要であり、修飾されるべきでない。ただセリンプロテアーゼの典型的な活性部位がSer,Asp及びHisから構成される触媒トリアドを形成することが可能である（Blow,D.M.:Acc.Chem.Res.9（1976）145−152;Polgar,L.:In:Mechanisms of protease action.Boca Raton,Florida,CRC Press,chapter 3（1989））。
血漿プロテアーゼは、血液から不活性なチモーゲンを単離し、次にそれらを活性化することにより伝統的な様式で生産することができ、又はそれらは適切な哺乳動物細胞系又はイーストにおいて対応するcDNAを発現することにより組換えにより生産することができる。
真核生物宿主／ベクターシステムによるチモーゲン又は活性なプロテアーゼの発現／分泌による血漿プロテアーゼの生産
F VII:Hagen,F.S.ら、EPS 0200421;Pedersen,A.H.ら、Biochem.28（1989）9391−9336;F IX:Lin,S.−W.ら、J.Biol.Chem.265（1990）144−150;F X:Wolf,D.L.ら、J.Biol.Chem.266（1991）13726−13730;Protein C:Bang,N.U.ら、EPS 0191606。
概して、分泌過程において、ネイティブ酵素のように血漿プロテアーゼを翻訳後に修飾することができる宿主細胞が用いられる。次にチモーゲン−酵素変換は、例えばプロトロンビン又は第Ｘ因子の場合に蛇毒からのアクティベーターを用いることにより、下流のプロセッシングの間に行われる（Sheehan,J.P.ら、J.Biol.Chem.268（1993）3639−3645;Fujikawa,K.ら、Biochem.11（1972）4892−4898）。
（既に分泌の間に）生体内でのチモーゲン−酵素活性化の目的のため、天然のチモーゲン開裂部位又は完全な活性化ペプチドは、宿主細胞の分泌経路において自然に発生する特異的に開裂するプロテアーゼ、例えばKey2（イースト）又はPAした（哺乳動物細胞系）により開裂され得るプロテアーゼ開裂部位（いくつかの隣接する塩基性アミノ酸）により置換された（F X:Wolf,D.L.ら、J.Biol.Chem.266（1991）13726−13730;Prothrombin:Holly,R.D.及びFoster,D.C.,Wo 93/13208）。
真核生物宿主／ベクターシステムによる生産又はプロテアーゼ変異体（F X:Rezaie,A.R:ら、J.Biol.Chem.268（1993）8176−8180;F IX:Zhong,D.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91（1994）3574−3578）、突然変異体（F X:Rezaie,A.R.ら、J.Biol.Chem.269（1994）21495−21499;トロンビン:Yee,J.ら、J.Biol.Chem.269（1994）17965−17970）;F VII:Nicolaisen,E.M.ら、WO 88−10295）及びキメラ、例えばF IX及びF Xからなるもの（Lin,S.−W.ら、J.Biol.Chem.265（1990）144−150;Hertzberg,M.S.ら、J Biol.Chem.267（1992）14759−14766）も周知である。
真核生物哺乳動物細胞系における発現の欠点：
−  時間を浪費すること
−  発現生産量に関して制限されること
−  高価であること
−  翻訳後修飾であること
原核生物における発現による血漿プロテアーゼの生産及び後の発現産物の再生：
Thogersen,H.C.ら（WO 94/18227）は、不活性なF Xタンパク質が金属キレート複合体によりクロマトグラフィーカラム内に固定化される周期的再生過程によるF X変異体の再生（ポリ（His）−アフィニティ−ハンドル）を記載する。
このため、トランケートされたF X変異体（EGF1,EGF2及びプロテアーゼドメイン）、付加的なF X aプロテアーゼ認識配列及び６つのヒスチジン残基から構成される触媒ドメインのＣ末端における付着補助体から構成される融合タンパク質が用いられる。
欠点：
−  プロテアーゼ及びポリ−his付着補助体から構成される融合タンパク質を作製しなければならない。
−  再生過程が極めて複雑である。
−  多くの再生サイクルが必要である
−  複雑な装置である
−  収率が10％だけである
−  付着補助体は再生後に除去せざるをえない。
−  自己触媒はポリ−His尾を除去するだけであり、付加的に導入されたF X a開裂部位は除去しない。
DiBella,E.E.ら（J.Biol.Chem.270（1995）163−169）は、Ａ鎖（49アミノ酸）及びＢ鎖（295アミノ酸）から構成されるトランケートされたトロンビン変異体（プレトロンビン−２）の再生を記載する。
しかしながら、活性化ペプチド及びプロテアーゼドメインから構成される相同な第X a因子（実施例４を参照のこと）は再生することができない。F X a再生のためにはチモーゲン領域（約50アミノ酸か構成される活性化ペプチド）に加えて、EFG2ドメインが必要である。これはF IXタンパク質ファミリー（F VII,F IV,F X及びプロテインＣ）の全てのメンバーに適用される。
トロンビンはF IX遺伝子ファミリーのメンバーでなく、２つのEGFドメインのかわりに２つのクリングルドメインを有する。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素として活性なタンパク質は、それらがチモーゲン活性化ドメイン及びEGFドメイン（EGF1及び／又はEGF2）にＮ末端で連結したセリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）から構成されるなら、原核生物内での対応するDNAの発現、発現産物の再生及び酵素開裂により生産することができることが驚くことに見い出された。
第IX因子ファミリーの本発明による活性なトランケートされたセリンプロテアーゼの特異性は変わらず（同一である）、結果としてそれらは活性テストにおいて及び新しいモジュレーター（アクティベーター、インヒビター）についてスクリーニングするのに用いることができる。
触媒ドメインのみをコードするDNAの発現及び不活性な発現産物の再生により酵素的に活性なプロテアーゼを作ることは可能でなかった。
例えばF IX a及びF X aの要求される酵素的に活性なプロテアーゼドメインは、選択的なプロテアーゼ開裂部位（例えばエンテロキナーゼ開裂部位）を有するＮ末端プロテアーゼドメイン融合タンパク質によっても生産することはできなかった。先行技術により発現生産物を再生することは可能でなかった。
本発明は、第IX因子ファミリーからのプロテアーゼの次のドメイン：
ａ）触媒ドメイン、そのＮ末端に連結した
ｂ）チモーゲン活性化ドメイン（活性化ペプチド）、そのＮ末端に連結した
ｃ）EGF1及び／又はEGF2ドメイン（好ましくはEGF2又はEGF1及びEGF2）
から構成されるグリコシル化されていない酵素的に活性なセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質及びそのチモーゲン前駆体に関する。
チモーゲン活性化ドメインは、好ましくは50アミノ酸までのオリゴヌクレオチドから構成される。チモーゲン活性化ドメイン内の本発明のチモーゲンの（不活性な）一本鎖形態の開裂の後、２本鎖の活性プロテアーゼが形成される。２本鎖形態において、それら２本鎖に分子間ジスルフィド架橋により連結される（鎖間）（図１及び図２）
本発明によるタンパク質は、好ましくは第Ｘ因子及び／又は第IX因子のEGF2ドメイン、チモーゲン活性化ドメイン及び触媒ドメインから構成される。第Ｘ因子のEGF2ドメイン及び触媒ドメイン並びに第IX因子の活性化ペプチドから構成されるタンパク質も好ましい。第Ｘ因子EGFドメインのＮ末端部分（アミノ酸位置108−154、図３）、第IX因子EGF−２ドメインのＣ末端部分、第IX活性化ペプチド並びに第IX因子Ｎ末端側の半分（アミノ酸位置133−289、図４）及び第Ｘ因子Ｃ末端側半分（アミノ酸位置322−454、図３）から構成されるタンパク質が特に好ましい。
本発明による第IXファミリーのチモーゲン及び活性化プロテアーゼは、天然のチモーゲン及びプロテアーゼのかわりに用いることができる。有利な適用は、例えばバイオテクノロジーにおける制限プロテアーゼ（好ましくは第X a因子）として、特に血液凝固プロテアーゼ活性の間接的測定（好ましくは第IX a因子測定のための診断における測定の酵素的方法の構成物としての使用である。重なる適用は、血液凝固、フィブリン溶解又はホメオスタシスのモジュレーター（アクティベーター、インヒビター）について調査するためのスクリーニングアッセイにおける標的としてである。最後に、本発明によるタンパク質は、結晶化研究（好ましくはアクティベーター及びインヒビターとの共結晶）のために有利に用いることができる結晶化することができるセリンプロテアーゼを供する。
本発明による第IXファミリー（第IX a因子、第X a因子、第VII a因子及びプロテインＣ）の活性なプロテアーゼは、特に好ましくは、インヒビターを同定するのに用いられる。この場合、第IX a因子の直接の測定及び第IX aのインヒビターの同定が特に好ましい。更に、本発明によるチモーゲンは、診断テストにおける成分として用いることができる。この場合、本発明によるチモーゲン（例えば第Ｘ因子）は、測定されるべきプロテアーゼ（例えば第IX a因子）により活性化される。次に、その活性化されたチモーゲン（例えば第V a因子）は発色性ペプチド基質（例えばChromozym X）を開裂し、測定シグナル（例えばｐ−ニトロアニリン）を作りだす。生ずる色の変化は、サンプル中の第IX a因子の濃度の基準であり、測定されるべきプロテアーゼ活性に比例する。
50アミノ酸までのスペーサ−が、好ましくはチモーゲン活性化ドメインとEGFドメイン（又は複数のEGFドメイン）との間に挿入される。本発明によるチモーゲンの一本鎖形態がチモーゲン活性化ドメイン内で開裂される場合、活性なタンパク質は２本鎖形態で得られる。両方の鎖はその２本鎖形態における分子間ジスルフィド架橋により連結される（図１及び図２）
本発明によるタンパク質は、好ましくは第Ｘ因子及び／又は第IX因子のEGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒ドメインが構成される。第Ｘ因子のEGF2ドメイン及び触媒ドメイン並びに第IX因子の活性化ドメインから構成されるタンパク質も好ましい。
方法
組換えDNA技術
Sambrook,J.ら、（1989）（In:Molecular cloning:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York）に記載されるように標準的な技術を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明に従って用いた。
タンパク質測定
プロテアーゼ変異体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光度係数を用いて280nmにおける光学密度（OD）を測定することにより決定した。
発現ベクター
血液凝固プロテアーゼ変異体の発現のためのベクターは、コア−ストレプトアビジンのための発現ベクターpSAM−COREに基づく。プラスミドｐ−SAM−COREの調製及び記載は、Kopetzki E.ら（WO93/09144）により記載される。
コア−ストレプトアビジン遺伝子を、pSAM−COREベクター内の要求されるプロテアーゼ変異体遺伝子により置換した。
以下の例、出版物、配列プロトコル及び図面は、本発明を更に解明する。ここでその保護の範囲は特許請求の範囲から生ずる。記載される方法は、改良の後でさえ本発明の対象物をなお記載する例として理解されるべきである。
図面の記載
図１は、F IXプロテアーゼファミリーの血漿プロテアーゼの図である。
図２は、作製した、トランケートしたF IX,F X及びF IX/Xキメラ血漿−プロテアーゼの図である（rF IX/X−EGF2−AP−CDの場合、第Ｘ因子の部分は白で第IX因子部位は異である）。略語:AP＝活性化ペプチド;AA＝芳香族アミノ酸スタックドメイン;CD＝触媒ドメイン;EGFに上皮成長因子様ドメイン1;EGF2＝上皮成長因子様ドメインで;GLA＝γ−カルボキシグルタミン酸富化ドメイン。
図３は、Kaul.R.Kら（Gene 41（1986）311〜314）に供されるF Xについてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す（ヌクレオチド配列は配列番号:15に示す）。
図４は、McGraw,R.Aら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）2847〜2851）に供されるF IXについてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す（ヌクレオチド配列を配列番号:16に示す）。
実施例１
F Xプロテアーゼ遺伝子の触媒ドメインのクローニング（プラスミド:pF X−CD）
アミノ酸位置217〜454からのF Xプロテアーゼドメインをコードするbp位置649〜1362からのF X cDNA（Kaul,R.Kらの出版物（Gene 41（1986）311〜314;図３）に従うcDNA配列及びアミノ酸配列ナンバリング）を、Mullis,K.B.及びFaloona,F.A.（Methods Enzymol.155,（1987）350−355）に従って、PCRプライマーN1（配列番号:1）及びN2（配列番号:2）：
0003553970.tif 000002
並びにテンプレートDNAとしてのStratagene Company（La Jolla,CA,U.S.A）からの市販のヒト肝臓cDNAジーンバンク（ベクター：ラムダZAP▲R▼ II）を用いてポリメラーゼ鎖反応（PCR）で増幅した。それらPCRプライマーは、そのコーティング領域の５′末端に単独のBspH I開裂部位及びATG開始コドンを、コーティング領域の３′末端に単独のHind III開裂部位を導入した。
その約740bp長のPCR産物を制限エンドヌクレアーゼBspH I及びHind IIで消化し、その約720bp長のBspH I/Hind III−F Xフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による精製後に、約2.55kbb長のNco I/Hind III−pSAM−COREベクターフラグメントに消化した。その要求されるプラスミドpF X−CDを制限マッピングにより同定し、PCRにより単離したF X cDNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例２
Ｎ末端の（His）４尾、エンテロキナーゼ開裂部位及び触媒ドメイン（プラスミド:pF X−EK−CD）を伴うF Xプロテアーゼ遺伝子の作製
クローンしたF X−CD遺伝子の読み枠（実施例１を参照のこと）を、その５′端において、アミノ酸MHHHHDDDK（配列番号:17）をコードし、ATG開始コドン、ポリHis配列及びエンテロキナーゼ開裂部位を含むヌクレオチド配列に連結した。F X−CD遺伝子の５′端に位置した単独のBsm I開裂部位及びプロモーター内の上流にある隣接した単独のEcoR I開裂部位を用いてこのF X−EK−CD変異体遺伝子を作製した。
このため、プラスミドpF X−CDを制限エンドヌクレアーゼEcoR I及びBsm Iで消化し、そして約3.25kbp長のEcoR I/Bsm I−pF X−CDベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による単離の後に、F X−EK−CD DNAアダプターに連結した。F X−EK−CDアダプターは、相補性オリゴヌクレオチドN3（配列番号:3）及びN4（配列番号:4）からのハイブリダイーゼーション（反応緩衝液:12.5mmol/l  Tris−HCl,pH7.0及び12.5mmol/l  Mg（l2:N濃度：各々1pmol/60μl）により作製した。
F X−EK−CDアダプター：
0003553970.tif 000003
実施例３
EGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒ドメイン（プラスミド:pF X−EGF2−AP−CD）を伴うF Xプロテアーゼ遺伝子のクローニング
アミノ酸位置108〜454からのEGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒プロテアーゼドメインをコードするbp位置322〜1362からのF X cDNAを、PCRプライマーN5（配列番号:5）及びN2（配列番号:2）：
0003553970.tif 000004
並びにテンプレートNDAとしてのStratagene Company（La Jolla,CA,U.S.A.）からの市販のヒト肝臓cDNA遺伝子バクンの（ベクター:Lambda ZAP▲R▼ II）を用いてPCRにより増幅した。それらPCRプライマーは、コーティング領域の５′末端にATG開始コドン及び単独のEcoR I開裂部位を、コーティング領域の３′端に単独のHind III開裂部位を導入した。
約1.09kbp長のPCR産物を制限エンドヌクレアーゼEcoR I及びBstE IIで消化し、その約1.02bp長のEcoR I/BstE II−F Xフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による精製の後、約2.58kbp長のEcoR I/BstE II−pF X−CDベクターフラグメントに連結した（実施例１）。その要求されるプラスミドpF X−EGF2−AP−CDを制限マッピングにより同定し、PCRにより単離されたF X cDNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例４
トランケートされたEGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒ドメインでのF Xプロテアーゼ遺伝子の作製（プラスミドpF X−ΔEGF2−AP−CD）
アミノ酸位置154〜454（図３に従うcDNA配列酸配列及びアミノ酸配列ナンバリング）からのトランケートされたEGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒プロテアーゼをコードするbp位置460〜1362からのF X cDNAを、PCRプライマーN6（配列番号:6）及びN2（配列番号:2）：
0003553970.tif 000005
並びにテンプレートDNAとしてプラスミドpF X−EGF2−AP−CDを用いてPCRにより増幅した。PCRにおいて、構造遺伝子の５′領域（アミノ酸位置２及び３）を、N6プライマーによりタンパク質配列を変えることなく大腸菌に好ましくは用いられるコドンに適合させた（N6プライマーにおいて小文字で書かれた塩基により示される最適化されたコドン用法でのATG環境）。
約960bp長のPCR産物を制限エンドスクレアーゼEcoR I及びHind IIIで消化し、そして約950bp長のEcoR I/Hind III−F Xフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製後に約2.53kbp長のEcoR I/Hind III−pSAM−COREベクターフラグメント（実施例１）に連結した。要求されるプラスミドpF X−ΔEFG2−AP−CDを制限マッピングにより同定し、そのPCRにより増幅したF X DNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例５
活性化ペプチド及び触媒ドメインでのF Xプロテアーゼの作製（プラスミド:pF X−AP−CD）
アミノ酸位置166〜454からの活性化ペプチド及び触媒プロテアーゼドメインをコードするbp位置496〜1362からのF X cDNA（図３に従うcDNA配列及びアミノ酸配列ナンバリング）を、PCRプライマーN7（配列番号:7）及びN2（配列番号:2）：
0003553970.tif 000006
並びにテンプレートDNAとしてプラスミドpF X−EGF2−AP−CD（実施例３）を用いてPCRにより増幅した。構造遺伝子の５′領域（アミノ酸位置２及び３）を、N7プライマーによりタンパク質配列を変えることなく大腸菌に好ましくは用いられるコドンに適合させた（N7プライマーにおいて小文字で書かれた塩基により示される最適化されたコドン用法でのATG環境）。
約890bp長のPCR産物を制限エンドスクレアーゼNco I及びHind IIIで消化し、そして約880bp長のNco I/Hind III−F Xフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による精製前に約2.55kbp長のNco I/Hind III−pSAM−COREベクターフラグメント（実施例１）に連結した。要求されるプラスミドpF X−AP−CDを制限マッピングにより同定し、そのPCRにより増幅したF X DNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例６
F IXプロテアーゼ遺伝子の触媒ドメインのクローニング（プラスミド:pF XX−CD）
アミノ酸位置181〜415からのF IXプロテアーゼドメインをコードするbp位置690〜1403からのF IX−DNA（McGrau,R.A.ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）2847−2851:図４）の出版物に従うcDNA配列及びアミノ酸配列ナンバリング）を、PCRプライマーN8（配列番号:8）及びN9（配列番号:9）：
0003553970.tif 000007
並びにテンプレートDNAとしてStratagene Company（La Jolla,CA,U.S.A.）からの市販のヒト肝臓cDNA遺伝子バンク（ベクター:Lambda ZAP▲R▼ II）を用いて増幅した。そのプライマーは、コーティング領域の５′端において単独のNco I開裂部位及びATG開始コドン並びにコーティング領域の３′端において単独のHind II開裂部位を導入した。
約730bp長のPCR産物を制限エンドヌクレアーゼNco I及びHind IIIで消化し、その約720bp長のNco I/Hind III−F IXフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による精製の後に約2.55kp長のNco I/Hind III−pSAM−COREベクターフラグメントに連結した。要求されるプラスミドpF IX−CDを、制限マッピングにより同定し、そのPCRにより単離されたF IX cDNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例７
EGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒ドメインを有するF IXプロテアーゼの作製（プラスミド:pF IX−EGF2−AP−CD）
アミノ酸位置85〜273からのEGF2ドメイン、活性化ペプチド及びF IX aプロテアーゼドメインのＮ末端領域をコードするbp位置402〜986からのF IX−DNA図４に従うcDNA配列及びアミノ酸配列ナンバリング）を、PCRプライマーN10（配列番号:10）及びN11（配列番号:11）：
0003553970.tif 000008
並びにテンプレートDNAとしてStratagene Company（La Jolla,CA,U.S.A.）からの市販のヒト肝臓cDNA遺伝子バンク（ベクター:Lambda ZAP▲R▼ II）を用いて増幅した。そのPCRプライマーN10は、コーティング領域の５′端においてATG開始コドン並びにNco I開裂部位を導入した。
約590bp長のPCR産物を制限エンドヌクレアーゼNco I及びBsm Iで消化し、その約360bp長のNco I/Bsm I−F IX−EGF2−APフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による精製の後に約3.2kp長のNco I/Bsm I−pF IX−CDベクターフラグメント（実施例６）に連結した。要求されるプラスミドpF IX−EGF2−AP−CDを、制限マッピングにより同定し、そのPCRにより増幅されたF IX cDNA配列をDNA配列決定によりチェックした。
実施例８
F IX及びF Xから構成されるキメラプロテアーゼ遺伝子の作製（プラスミド:pF IX/X−EGF2−AP−CD）
キメラF IX/F Xプロテアーゼ遺伝子を、F X EGF2ドメインのＮ末端部分（bp位置:322−462;アミノ酸位置108〜154、図３）,F IX EGF2のＣ末端部分、F IX活性化ペプチド、並びにF IX N末端半分（bp位置:397〜867;アミノ酸位置:133−289;図４）及びF X  Ｃ末端半分（bp位置:964−1362;アミノ酸位置:322−454、図３）から作った。
このため、bp位置397〜867（アミノ酸位置:133−289;図４）からのF IX EGF2のＣ末端部分、F IX活性化ペプチド及びF IX N末端半分をコードするDNAを、PCRプライマーN12（配列番号:12）及びN13（配列番号:13）：
0003553970.tif 000009
並びにテンプレートDNAとしてのプラスミドpF IX−EGF2−AP−CD（実施例７）を用いて第１のPCR反応において増幅した。そのF X−EGF2 DNA配列を、CPRプライマーN12の５′オーバーハングヌクレオチド配列によりF IX−EGF2 DNA配列に連結した。それは、５′端に単独のStu I開裂部位を有するbp位置430〜462（図３）からのF X DNA配列から構成される。そのF IX DNAを、N13プライマーの５′オーバーハンギングヌクレオチド配列を用いてF X DNAに連結した。それは、bp位置:964〜970（図３）からのF X DNA配列で構成される。この配列において、タンパク質配列を変えることなく（N13プライマー内に小文字で記載される塩基により示される）２塩基対置換により単独のMro I開裂部位を作った。bp位置:964−1362（アミノ酸位置:322−454;図３）からのF X  Ｃ末端半分を、PCRプライマーN14（配列番号:14）及びN2（配列番号:2）：
0003553970.tif 000010
並びにテンプレートDNAとしてプラスミドpF X−EGF2−AP−CD（実施例３）を用いて第２のPCR反応において増幅した。アミノ酸配列を変えることなく、（N14プライマーにおいて小文字で記載される塩基により示される）2bp置換により、コーディングF X−CD領域内の５′端においてN14プライマーにより単独のMro I開裂部位を導入した。
第１のPCR産物をStu I及びMro Iで消化し、第２のPCR産物をMro I及びHind IIIで消化した。次に、約510bp長のStu I/Mro Iフラグメントを、約400bp長Mro I/Hind IIIフラグメント及び約2640bp長Stu I/Hind III−pF X−EGF2−AP−CDベクターフラグメント（実施例13）に、３フラグメント連結において連結した。要求されるプラスミドpF IX/X−EGF2−AP−CDを制限マッピングにより同定し、PCRにより増幅されたF IX/X DNA配列を、DNA配列決定によりチェックした。
実施例９
ａ）大腸菌内でのプロテアーゼ遺伝子の発現
プロテアーゼ遺伝子を発現させるために、大腸菌株UT5600（Grodberg,J.及びDunn.J.J;J.Bacteriol.170（1988）1245−1253）を各々の場合、実施例１〜８に記載される発現プラスミドpF X−CD,pF X−EK−CD,pF X−EGF2−AP−CD,pF X−ΔEGF2−AP−CD,pF X−AP−CD,pF IX−CD,pF IX−EGF2−AP−CD及びpF IX/X−EGF2−AP−CD（アンピシリン耐性）のうちの１つで、並びにlac IqリプレッサープラスミドpUB5520（カナマイシン耐性、調製及び記載について、Brinkmann,V.ら、Gene 85（1989）109−114を参照のこと）で形質転換した。
発現プラスミドpF X−CD,pF X−EK−CD,pF X−EGF2−AP−CD,pF X−ΔEGF2−AP−CD,pF X−AP−CD,pF IX−CD,pF IX−EGF2−AP−CD及びpF IX/X−EGF2−AP−CDで形質転換したUT5600/pUB5520/細胞を、37℃で50〜100mg/lアンピシリン及び50mg/lカナマイシンを含むDYT培地（１％（w/v）イーストエキス、１％（w/v）バクトトリプトン、Ditco及び50％NaCl）中で振とう培養で、0.6〜0.9の550nmの光学密度（OD550）まで培養して、次にIPTG（最終濃度１〜5mmol/l）で誘導した。37℃で４〜８時間（ｈ）の誘導の後、それら細胞を遠心（Sorvall RC−5B centrifuge,GG53ローター、6000rpm,15分）により収集し、50mmol/l Tris−HCl緩衝液pH7.2で洗浄し、更なる処理まで−20℃に保存した。１lの振とう培養物からの細胞収量は４〜5g（浸潤重量）であった。
ｂ）発現分析
プラスミドpF X−CD,pF X−EK−CD,pF X−EGF2−AP−CD,pF X−ΔEGF2−AP−CD,pF X−AP−CD,pF IX−CD,pF IX−EGF2−AP−CD及びpF IX/X−EGF2−AP−CDで形質転換したUT5600/pUB5520/細胞の発現を分析した。この目的のために、各々の場合に1mlの遠心した培養培地からの細胞ペレットを、0.25mlの10mmol/lのTris−HCl,pH7.2に再度懸濁し、そしてその細胞を、Branson Company（Heusenstamm,Germany）からのSonifier▲R▼Cell Disruptor  B15を用いて超音波処理（50％強度で30秒の２パルス）により溶解した。その不溶性の細胞成分を沈澱させ（Eppendorf 5415 centrifuge,14000rpm,5分）、1/5容量（vol）の５×SDSサンプル緩衝液（１×SDSサンプル緩衝液:50mmol/l Tris−HCl,pH6.8,1％SDS,1％メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.001％プロモフエノールブルナを、その上清に加えた。その不溶性細胞デブリス画分（ペレット）を、６〜8M尿素を含む0.3mlの１×SDSサンプル緩衝液に再度懸濁し、そのサンプルを95℃で５分、インキュベートし、そして再び遠心した。次に、そのタンパク質を、SDSポリアクリル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.K.,Nature.227（1990）680−685）により分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ染料で染色した。
大腸菌内で合成されたプロテアーゼ変異体は均一であり、不溶性細胞デブリス内で排他的に見い出された（封入体、IBs）。その発現収量は全大腸菌タンパク質に対して10〜50％であった。
実施例10
細胞溶解プロテアーゼ変異体の可溶化及び再生
ａ）細胞溶解及び封入体（IBs）の調製
３lの振とう培養物（約15g湿潤重量）からの細胞ペレットを75mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2に再度懸濁した。その懸濁液を0.25mg/mlのリゾチームと混合し、それを０℃で30分、インキュベートした。2mmol/lのMgCl2及び10μg/mlのDNase I（Boehringer Mennheim GmbH,catalogue No.164159）を加えた後、その細胞をSLM Amico Company（Urbana,IL,USA）からのFrench▲R▼Pressでの高圧破砕により機械的に破壊した。次に、そのDNAを室温（RT）で30分、消化した。その調製物に37.5mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2,60mmol/l EDTA,1.5mol/l NaCl,6％ Triton X−100を加え、それを更に30分、RTでインキュベートし、Sorvall RC−5B遠心機（GSA Rotor,12000rpm,15分）で遠心した。その上清を捨てて、そのペレットに100μlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2,20mmol/l EDTAを加え、それを４℃で撹拌しながら30分、インキュベートし、再び沈澱させた。その最後の洗浄ステップをくり返した。その精製したIBs（1.5〜2.0g湿潤重量、25〜30％乾燥量、100〜150mgプロテアーゼ）を更なる処理まで、−20℃で保存した。
ｂ）IBsの可溶化及び誘導化
精製されたIBsを１〜３時間、室温で撹拌しながら、6mol/lグアニシニウム−HCl,100mmol/l Tris−HCl,20mmol/l EDTA,150mmol/l GSSG及び15mmol/l GSH,pH8.0中５〜10mg/mlのタンパク質に相当する100mgのIBペレット（湿潤重量）/mlの濃度に溶かした。次に、そのpHをpH5.0に調節し、その不溶性成分を遠心（Sorvall RC−5Bセントリフュージ、5534ローター、16000rpm,10分）により分離した。その上清を４℃で24時間、100容量の４〜6mol/lグアニジウム−HCl pH5.0に対して透析した。
ｃ）再生
6mol/lのグアニジウム−HCl中に可溶化し、及びGSSG/GSHで誘導化したプロテアーゼ変異体の再生を、24時間の間隔で各々の場合、50mlの50mmol/lのTris−HCl,0.5mol/lのアルギニル、20mmol/lのCaCl2,1mmol/lのEDTA及び0.5mmol/lシスティン、pH8.5への0.5mlのIB可溶化物／誘導体のくり返し（例えば３回の）添加により４℃で行った。再生反応を終えた後、不溶性成分を、Seitz Company（Bad Kreuznach,Germany）からの深床フィルターK250を備えた
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からのろ過装置でのろ過により分離した。
ｄ）再生調製物の濃縮及び透析
プロテアーゼを含む透明な上清を、Filtron Company（Karlstein,Germany）からのMinisette（膜タイプ:Omega 10K）におけるクロス・フローろ過により10〜15倍に濃縮し、グアニジウム−HCl及びアルギニンを除去するために100容量の20mmol/l Tris−HCl及び50mmol/l NaCl,pH7.2に対して４℃で24時間、透析した。沈澱したタンパク質を遠心（Sorvall RC−5B  Centrifuge,5534ローター、16000rpm,20分）し、その透明な上清をNalge Company（Rochester,NY,USA）からのNalgene▲R▼使い捨てろ過ユニット（孔径:0.2μｍ）でろ過した。
ｅ）再生効率の測定
再生し、濃縮し、そしてろ過した再生調製物のタンパク質濃度を、rF X−CD,rF X−EK−CD,rF X−EGF2−AP−CD,rF X−ΔEGF2−AP−CD,rF X−AP−CD,rF IX−CD,rF IX−EGF2−AP−CD及びrF IX/X−EGF2−AP−CDについてのアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光度係数を用いて280nmにおいて光学密度を測定することにより決定した。
ネイティブと同様に折りたたまれたプロテアーゼ及び誤ってジスルフィド架橋されたプロテアーゼオリゴマーから構成される再生調製物のサンプルを、非還元性SDS PAGE（実施例13b）により分離した。要求される可溶性モノマープロテアーゼチモーゲンを、見掛け分子量及びそのバンドの強度により同定した。残存するバンド（タンパク質スミア）に対するモノマーのプロテアーゼチモーゲンのバンド強度の比較（比率）から再生効率を評価した。
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結果：
EGF2ドメイン、活性化ペプチド（AP）及び触媒ドメイン（CD）を有するプロテアーゼ変異体のみが再生可能である。
実施例11
再生された不活性化プロテアーゼ変異体の精製
再生調製物からの不活性プロテアーゼ変異体は、必要に応じて、当業者に周知であるクロマトグラフィー法で更に精製することができる。
ａ）Ｑ−Sepharose−ffでのイオン変換クロマトグラフィーによるプロテアーゼ変異体の精製
20mmol/lのTris−HCl及び50mmol/lのNaCl,pH8.0に対して透析した濃縮した再生調製物を、同じ緩衝液で平衡化したPharmacia Biotech Company（Freiburg,Germany）からのＱ−Sepharose offカラム（1.5×11cm,V＝20ml；ローディング能;10mgタンパク質/mlゲル）に適用し（２カラム容量／時間、2CV/h）、そしてそれを溶出液の280nmにおける吸光度が緩衝液のブランク値に達するまで、平衡緩衝液で洗った。その結合した材料を、20mmol/l Tris−HCl,pH8.0（2CV/h）中50〜500mmol/l NaClの勾配により溶出した。プロテアーゼを、100〜150mmol/lのNaCl濃度で溶出した。プロテアーゼを含む画分を、非還元性及び還元性SDS PAGEにより溶出し、その溶出ピークをプールした。
ｂ）ヘパリン−Sepharose CL−6Bでのイオン変換クロマトグラフィーによる不活性なプロテアーゼ変異体の最終精製
Ｑ−Sepharose ffカラムでのクロマトグラフィーの後、その組み合わせたプロテアーゼを含む画分を、20mmol/l Tris−HCl及び200mmol/l NaCl,pH8.0で平衡化したPharmacia Biotech Company（Freiburg,GFR）からのヘパリン−Sepharose CL−6Bカラム（1.5×11cm,V＝20ml、ローディング能:1mgタンパク質/mlゲル）に直接適用した。次に、それを、280nmにおける溶出液の吸光度がその緩衝液についてのブランク値に達するまで、平衡緩衝液で洗った。その結合した材料を、20mmol/lのTris−HCl,pH8.0（2CV/h）中の0.2〜1.0mol/lのNaClの勾配により溶出した。そのプロテアーゼを500〜600mmol/lのNaCl濃度で溶出した。プロテアーゼを含む画分を、非還元性及び還元性SDS PAGEにより同定し、その溶出ピークを組み合わせ、20mmol/l Tris−HCl,50〜200mmol/l NaCl,5mmol/l CaCl2,pH7.8に対して透析した。
実施例12
活性化プロテアーゼ変異体の活性化及び精製
再生された精製されたrF IX及びrF Xプロテアーゼ変異体を、精製されたラッセルクサリヘビ毒（RVV−Ｘ）プロテアーゼで活性化した。RVV−Ｘプロテアーゼは、Esmon,C.T.（プロトロンビン活性化、博士論文、Washington University,St.Louis,MO（1973））による出版物に記載されるように、Sigma Aldrich Chemie GmbH Co（Deisenhofen）からの市販の蛇毒凍結物から、ゲルろ過及び次のＱ−Sepharose ffでのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
ａ）RVV−ＸでのrF IX−EGF2−AP−CDプロテアーゼの活性化及び精製
プロテアーゼ変異体rF IX−EGF2−AP−CDを25℃で20mmol/l Tris−HCl,50mmol/l NaCl,10mmol/l CaCl2,pH7.8中0.5〜2.0mg/mlの濃度及び1:10〜1:20のプロテアーゼ／基質化で消化した。酵素的F IX活性化の時間経過を、消化が完了するまで（安定水準最大活性化）、色源基質（実施例13aを参照のこと）を測定することによりモニターした。この目的のために、24時間までの期間にわたって３〜４時間の間隔で反応調製物からサンプル（10〜100μl）をとり、そして生成されたrF IX a活性を測定した。活性安定期に達した後、RVV−Ｘ消化物を、Ｑ−Sepharose−ffでのネガティブクロマトグラフィーにより精製した。
RVV−Ｘ及び非活性化rF IX−EGF2−AP−CDプロテアーゼは所定の条件下でＱ−Sepharose−ffに結合したが、rF IX a−EGF2−AP−CDプロテアーゼは結合しなかった。
その消化調製物を、20mmol/l Tris−HCl,50mmol/l NaCl,pH7.8で平衡化したPharmacia Biotech Company（Freiburg,GFR）からのＱ−Sepharose−ffカラム（1.0×10cm,V＝8ml）に適用し（2CV/h）、そのカラムを、分画しながら平衡化緩衝液で展開した。rF IX a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを含む画分を、非還元性及び還元性SDS PAGE並びに活性測定により同定した。
ｂ）RVV−ＸでのrF X−EGF2−AP−CDプロテアーゼの活性化及び精製
プロテアーゼ変異体rF X−EGF2−AP−CDを、25℃で、20mmol/l Tris−HCl,50mmol/l NaCl,10mmol/l CaCl2,pH7.8中0.5〜2.0mg/mlの濃度及び1:100〜1:200のプロテアーゼ／基質比で消化した。酵素的rF X−EGF2−AP−CD活性化の時間経過を、消化が完了するまで（安定状態、最大活性化）、色源基質（実施例13aを参照のこと）でその活性を測定することによりモニターした。この目的のため、サンプル（10〜100μl）を、４時間までの期間にわたり、15〜30分の間隔で、その反応調製物からとり、形成されたF X a活性を測定した。活性安定期に達した後、その活性rF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを、ベンズアミジン−Sepharose−CL−6Bでのクロマトグラフィーにより精製した。
活性化されたrF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異体のみが特定の条件下でベンズアミジン−Sepharose−CL−6Bに結合する。
その消化調製物を、20mmol/l Tris−HCl,200mmol/l NaCl,pH8.0で平衡化したPharmacia Biotech Company（Freiburg,GFR）からのベンズアミジン−Sepharose−CL−6Bカラム（1.0×10cm,V＝8ml；ローディング能:2〜3mgタンパク質/mlゲル）に適用し（2CV/h）、280nmにおける溶出液の吸光度がその緩衝液のブランク値に達するもので、平衡化緩衝液で洗った。その結合した材料を、20mmol/l Tris−HCl,200mmol/l NaCl,pH8.0中10mmol/lのベンズアミジンで溶出した（2CV/h）。rF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを含む画分を非還元性及び還元性SDS PAGE並びに活性測定により同定した。
ｃ）RVV−Ｘでの活性化及びキメラrF IX/X−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異体の精製
プロテアーゼ変異体rF IX/X−EGF2−AP−CDを、25℃で、20mmol/l Tris−HCl,50mmol/l NaCl,10mmol/l CaCl2,pH7.8中0.5〜2.0mg/mlの濃度及び1:10〜1:20のプロテアーゼ基質比で消化した。酵素的rF IX/X−EGF2−AP−CD活性化の時間経過を、その消化が完了する（安定状態、最大活性化）まで色源基質（実施例13aを参照のこと）でその活性を測定することによりモニターした。この目的のため、サンプル（10〜100μl）を、24時間までの期間にわたって３〜４時間の間隔で反応調製物からとり、形成されたrF IX/X a−EGF2−AP−CD活性を測定した。活性化安定状態に達した後、RVV−Ｘ消化物をＱ−Sepharose−offでのネガティブクロマトグラフィーにより精製した。
FVV−Ｘ及び非活性化rF IX/X−EGF2−AP−CDプロテアーゼは所定の条件下で、Ｑ−Sepharose−ffに結合するが、活性化rF IX/X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異体はそうでない。
その消化調製物を、20mmol/l Tris−HCl,50mmol/l NaCl,pH7.8で平衡化したPharmacia Bioctech Company（Freiburg,GFR）からのＱ−SephaRose−ffカラム（1.0×10cm,V＝8ml）に適用（3CV/h）、そしてそのカラムを分画しながら平衡緩衝液で展開した。rF IX/X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを含む画分を、非還元性及び還元性SDS PAGE並びに活性測定により同定した。
実施例13
精製されたプロテアーゼ変異体のキセラクチリゼーション
ａ）活性化テスト
再生された活性化rF IX a−EGF2−AP−CD,rF X a−EGF2−AP−CD及びrF IX a/X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異体の活性を、色源基質Chromozym X（Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,GFR,cat.No.789763）を用いて測定した。10〜100μlのサンプルを、190〜100μlの50mmol/l Tris−HCl,150mmol/l NaCl,5mmol/l CaCl2,0.1％ポリエチレングリコール8K（PEG8000）,pH8.0で200μlにし、20μlのChromozym X（0.5〜40mmol）と混合し、405nmの波長及びRTにおいて、ELISAリーダーにおいて試薬ブランク値に対して測定した。活性及び速度定数を、ミカエリス・メンテン等式に従って、直線の最初の傾きから決定した。
ｂ）SDS PAGE
分子間ジスルフィド架橋形成によるオリゴマー及び凝集物形成並びに再生され活性化された及び精製されたプロテアーゼ変異体の均一性及び純度を、非還元（−メルカプトエタノール）及び還元（＋メルカプトエタノール）SDS PAGE（Laemml,UV,Nature 227（1970）680−685）により検査した。
実施例14
F Xアクティベーターテスト
組換えにより作られた高純度の不活性なrF X−EGF2−AP−CDチモーゲン（いずれの干渉する副活性もない）は、例えば水溶液中、好ましくは体液、例えば血液又は血漿中で低F IX a濃度を測定するのに極めて適する。F IX aは、開裂により不活性なrF X−EGF2−AP−CDチモーゲンを活性化する。そのチモーゲン活性化は、色源性F X aペプチド基質、例えばChromozym Xを用いて、共役したインジケーター領域により測定される。決定されるべきF IX a活性は、チモーゲン活性化の増幅システムにより増幅される。このようなF IV aテストは、例えばVan Dam−Mieras,M.C.E.ら、（Bergmeyer,H.U.（ed.）,Methods of Enzymatic Analysis,Vol.V,page 365−394,3rd ed.,Academic Press,New York（1983））により記載される。
0003553970.tif 000013
0003553970.tif 000014
測定シグナル1:pNA（ｐ−ニトロアニリン）
F X a基質:MOC−Ｄ−NleGlyArg−pNA（Chromozym X）
テスト混合物:200μl緩衝液
＋20μl rF X−EGF2−AP−CD（0.13mg/ml;4μmol/1）
＋25μl基質（Chromozym X,8mmol/l）
＋20μl F IX aサンプル
緩衝液:50mmol/l Tris−HCl,pH8.0,150mmol/l
NaCl;5mmol/l CaCl2;0.1％ PEG 8000
テスト混合物をRTでマイクロタイタープレート内でインキュベートし、その吸光度を、試薬ブランク値に対して405nmにおいて、時間に対して測定した。F IX aによるChromozym Xの直接の変換は所定のテスト条件下でごくわずかである。
チモーゲンrF X−EGF2−AP−CDの第IX a因子触媒活性化は、色源ペプチド基質（Chromozym Xを用いて測定される。ｐ−ニトロアニリン（測定シグナル）の形成は、存在する（測定されるべき）第IX因子活性の基準（比例）である。
実施例15
rF X a−EGF2−AP−CDの結晶化
活性化され、精製され、組換え生産されたrF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを６時間、４℃で、２×100容量の5mmol/l HEPES緩衝液、pH6.5に対して透析し、次にAmicon Company（Witten,GFR）からのCentrikon▲R▼10マイクロコンセントレーターにおいて10mg/mlの濃度に濃縮した。それを、シッティングドロップにおいて蒸気拡散法により結晶化する。（インヒビターＨ−Glu−Gly−Arg−クロロメチルケトン（Bacher Biochemica,GmbH,Heidelberg,GFR）と等モル濃度の）4mlに濃縮したrF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼを４℃で、４μlの100mmol/l Tris−HCl,5mmol/l CaCl2,22％ポリエチレングリコール6K（PEG6K）,pH8.2と混合し、４℃で、シッティングドロップにおける蒸気拡散法により500μｌの100mmol/l Fris−HCl,5mmol/l CaCl2,22％ PEG6K,pH8.2のリザーバーに対して平衡化した。
実施例16
F X aインヒビターを見い出すためのテスト
F X aプロテアーゼインヒビターを、F X a活性の阻害により同定した。このため、組換え生産されたrF X a−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異体のF X a活性を、テストされるべき基質の、又は基質混合物の欠如又は存在下で測定し、そして阻害割合を、その比率を計算することにより計算した。阻害定数Kiは、阻害速度から決定した。
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測定シグナル:pNA（ｐ−ニトロアニリン）
F X a基質:MOC−Ｄ−NleGlyArg−pNA（Chromozym X）
テスト混合物:200μl緩衝液
＋20μl rF X a−EGF2−AP−CD（0.13mg/ml;4μmol/1）
＋25μl基質（Chromozym X,8mmol/l）
＋20μlインヒビター
緩衝液:50mmol/l Tris−HCl,pH7.4,150mmol/l
NaCl;5mmol/l CaCl2;0.1％ PEP
テスト混合物を、マイクロタイタープレート内でRTでインキュベートし、その直線の最初の勾配（ΔA/分）を、405nmにおける吸光度測定により決定した。
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配列表
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:1:
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（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:2:
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（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:77  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:3:
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（２）配列番号:4の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:71  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:4:
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（２）配列番号:5の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:59  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:5:
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（２）配列番号:6の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:58  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:6:
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（２）配列番号:7の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:7:
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（２）配列番号:8の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:8:
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（２）配列番号:9の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:9:
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（２）配列番号:10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:39  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:10:
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（２）配列番号:11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:11:
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（２）配列番号:12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:61  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:12:
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（２）配列番号:13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:13:
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（２）配列番号:14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:14:
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（２）配列番号:15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1404  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：他の核酸
（xi）配列の記載：配列番号:15:
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（２）配列番号:16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1389  塩基対
（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ゲノムDNA
（xi）配列の記載：配列番号:16:
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（２）配列番号:17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:10  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:17:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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