(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色剤を含有することを特徴とする生体試料中の特定成分を酸化酵素を用いて測定する試薬。
【請求項２】
ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルが、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルまたはポリオキシエチレンセチルエーテルまたはオクタエチレングコールモノ−ｎ−  ドデシルエーテルであり、フェロシアン化イオンがフェロシアン化カリウムまたはフェロシアン化ナトリウムである請求項１記載の試薬。
【請求項３】
ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルが、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（ＨＬＢ  １６．２）またはオクタエチレングリコールモノ−ｎ−ドデシルエーテル（ＨＬＢ  １３．１）である請求項１記載の試薬。
【請求項４】
ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度が、０．０５〜２．０重量％、であり、フェロシアン化イオンの濃度が、０．１〜３００μＭである請求項１記載の試薬。
【請求項５】
生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素がウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼまたはアシルＣｏＡオキシダーゼである請求項１記載の試薬。
【請求項６】
生体試料中の特定成分を酸化酵素を用いて測定する方法において、試料にＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色試薬を含有する試薬を反応させ、生成した過酸化水素から発生した発色強度を測定することを特徴とする生体成分の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清、尿、血漿、唾液、髄液等の生体試料中の特定成分、例えば尿酸、コレステロール、クレアチニン、クレアチンなどをそれぞれの酸化酵素を用いて測定する試薬および測定方法において、試料中の還元物質、特にビリルビンによる影響を回避することを特徴とする。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中の特定成分、例えばコレステロールをコレステロールオキシダーゼを用いて測定する方法において、試料中の還元物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどがコレステロールの測定に影響を及ぼすことはしばしば経験されることである。すなわち、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素をペルオキシーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体をカップリングさせ、発色させることによって、コレステロールを定量する。この際に、試料中の還元物質により過酸化水素が還元され、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体のカップリングが減少することになり、特定成分に比例した発色強度が得られない。
【０００３】
アスコルビン酸の影響を回避するために、アスコルビン酸オキシダーゼを添加して、アスコルビン酸を除去する方法（特公昭５６−３９１９８号公報）、あるいは鉄、コバルト、セレン、銅、水銀、ニッケル等の有機錯体などにより、アスコルビン酸を酸化させる方法（特公平１−４１２２３  号公報、特公昭６３−６７１３９号公報、特公昭６３−３９８７１号公報）が報告されている。さらにヨウ素酸塩などの過酸化物によるアスコルビン酸の除去も報告されている（特公平２−４８６１号公報）。アスコルビン酸オキシダーゼの添加は、効率的にアスコルビン酸を除去することが可能になるとともに、他の成分等の悪影響を及ぼすことがほとんどないため広く利用されている。
【０００４】
また、生体試料中のビリルビンの影響を回避するためには、ビリルビンオキシダーゼを添加する方法（特公昭５５−２５８４０号公報）、２価の銅イオン化合物と界面活性剤および／またはシアン化合物を添加する方法（特開昭５９−１５９７９８  号公報）  、陽イオン界面活性剤を添加する方法（特開平８−７８号公報）、両性界面活性剤を添加する方法（特開平７−１５５１９６号公報）が報告されている。
しかしながら、ビリルビンオキシダーゼは過酸化水素非存在下で色原体のカップリング反応を促進する作用を有しているため、実用されるに至っていない。
【０００５】
２価の銅イオン化合物と界面活性剤および／またはシアン化合物を添加する方法は、ビルルビンの除去には効果が認められるが、酸化酵素を用いて生じる過酸化水素を比色定量する場合、ビリルビンオキシダーゼを使用する場合と同様の問題が生じる。さらに、シアン化合物は猛毒であり、使用上、好ましくない。
陽イオン界面活性剤または両性界面活性剤を添加する方法は、酵素を用いて生体成分を比色定量する場合、酵素の保存安定性を低下させる。このように、試料中の還元物質の影響を回避する方法として、アスコルビン酸に関しては効果的、汎用的な方法がある一方、ビリルビンに関しては、そのような方法が確立されていない状況である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は生体試料中の特定成分を測定するに当たり、還元物質、特にビリルビンによる影響を回避することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記現状に鑑み、鋭意検討した結果、フェロシアン化イオンと非イオン界面活性剤の１種であるポリオキシエチレンアルキルエーテルを共存させることによって、還元物質による影響を軽減する効果を見出し、さらに詳細に検討を行った結果、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルに、特にその効果が顕著であることを見出し、本発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、本発明はＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色剤を含有することを特徴とする生体試料中の特定成分を酸化酵素を用いて測定する試薬である。
【０００９】
また、本発明は生体試料中の特定成分を酸化酵素を用いて測定する方法において、試料にＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色試薬を含有する試薬を反応させ、生成した過酸化水素から発生した発色強度を測定することを特徴とする生体成分の測定方法である。
【００１０】
【発明の実施態様】
本発明における生体試料としては、血清、尿、血漿、唾液、髄液等が挙げられる。また、これらの生体試料中の特定成分としては、尿酸、コレステロール、中性脂肪、無機リン、グルコース、クレアチニン、クレアチン、遊離脂肪酸、リン脂質などが例示される。
【００１１】
生体試料中の上記特定成分を酸化酵素を用いて測定する試薬とは、それぞれの特定成分に直接的に、または間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素を使用する。
【００１２】
試料中の特定成分と酸化酵素の組み合わせとしては、尿酸とウリカーゼ、グルコースとグルコースオキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオキシダーゼ、中性脂肪とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、無機リンとキサンチンオキシダーゼ、クレアチン、クレアチニンとザルコシンオキシダーゼ、遊離脂肪酸とアシルＣｏＡオキシダーゼ、リン脂質とコリンオキシダーゼなどが挙げられる。
【００１３】
本発明において用いるＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルとは、アルキル基が炭素原子数１２〜２２のアルキル基であり、オキシエチレン基の繰り返し単位数が４〜５０，０００の化合物である。このような化合物としては、例えば、ポリオキシエチレンドデシルエーテル（ＨＬＢ１３．１）  、ポリオキシエチレンセチルエーテル（ＨＬＢ１４．２）  、ポリオキシエチレンオクチルエーテル（ＨＬＢ１３．１）  、ポリオキシエチレンステアリルエーテル（ＨＬＢ１３．９）  、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（ＨＬＢ１６．２）  、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＨＬＢ１５．３）  、オクタエチレングリコールモノ−ｎ−  ドデシルエーテル（ＨＬＢ１３．１）  などが例示される。ＨＬＢが１３よりも低いと、生体試料中の濁り成分の影響を受けるために、正確な測定が困難となる。
【００１４】
フェロシアン化イオンとしては、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウムなどが例示される。
【００１５】
本発明の試薬中のＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度は特に限定されるものではないが、好適には０．０５〜２．０重量％で用いられる。また、フェロシアン化イオンの濃度は、０．１〜３００μＭである。
これらの濃度より少ないと、ビリルビンの影響を回避することが困難である。また、これらの濃度より多いと、試薬ブランクの上昇を引き起こし、正確な測定が困難である。
【００１６】
本発明の尿酸測定試薬としては、ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素発色試薬、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの試薬は一液でも、または二液であってもよい。また、液状試薬であっても、固形試薬であってもよい。
【００１７】
本発明のグルコース測定試薬としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素発色試薬、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの試薬は一液でも、または二液であってもよい。また、液状試薬であっても、固形試薬であってもよい。
【００１８】
本発明のクレアチニン測定試薬は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素発色試薬、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの試薬は一液でも、または二液であってもよい。また、液状試薬であっても、固形試薬であってもよい。
【００１９】
上記特定成分以外の成分においても同様に酸化酵素、ペルオシダーゼ、過酸化水素発色試薬、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの試薬は、必要によりアスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、アジ化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において使用するペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色試薬は何ら制限されるものではない。過酸化水素発色試薬としては、例えば４−アミノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とフェノールまたその誘導体またはアニリンまたはその誘導体を組み合わせて使用する。フェノール誘導体としては、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、１，２−ジクロロフェノール等が挙げられる。アニリン誘導体としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−Ｎ−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン等が挙げられる。
また、１０−Ｘ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、ビス〔８−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン、１，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル−（２，７−ジヒドロキシ−４−ナフチル）メタン等のロイコ色素を使用してもよい。
【００２１】
従来から、非イオン界面活性剤は試料に由来する混濁の除去（特公平２−２４５２０号公報）、脂質加水分解酵素の反応促進剤（特公昭６０−１２０４０号公報）、試薬保存中の自然発色防止（特開平７−５１０９５  号公報）、ヘムタンパクの安定化（特表平８−５０２４１１号公報）などの報告がなされている。一方、フェロシアン化イオンはビリルビンの影響を回避するために使用されている。しかし、ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルをフェロシアン化イオンと共存させることによって、ビリルビンなどの還元物質の影響を回避した例は知られていない。
【００２２】
ＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびフェロシアン化イオンのいずれか一方を添加しただけでは、ビリルビン影響を回避する効果が不十分であるか、または、本発明と同レベルの効果が得られる濃度では、試薬の粘性が高くなる。あるいは試薬ブランクの上昇を引き起こすなどの測定の正確性において悪影響を及ぼす。
【００２３】
また、生体試料中の特定成分を酸化酵素により測定する法において、銅イオン、陽イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤を添加すると、しばしば酸化酵素タンパクへ影響を及ぼし、その結果、酸化酵素の保存安定性を低下させることが知られている。しかし、ポリオキシエチレンアルキルエーテルをフェロシアン化イオンと共存させる場合、酸化酵素の保存安定性を低下させない。
【００２４】
本発明のポリオキシエチレンアルキルエーテルに代えて、他の非イオン界面活性剤、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル群に属する界面活性剤あるいはエステル結合を有する界面活性剤を使用しても、同様の効果を得ることはできない。
【００２５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例および比較例を用いて説明する。
実施例１  血清中尿酸の測定
0003601648.tif 000002
【００２６】
0003601648.tif 000003
【００２７】
【表１】
0003601648.tif 000004
【００２８】
測定方法
試料６μｌに第一試薬２６０μｌを添加、３７℃で５分間加温後、第二試薬１３０μｌを添加し、さらに５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量線を用いて、測定値を算出した。その結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
0003601648.tif 000005
【００３０】
表２から、本発明の試薬組成１は、他の非イオン界面活性剤を使用した試薬組成２に比べて、試料中のビリルビンの影響を低減していることが確認された。
【００３１】
実施例２  血清中のグルコースの測定
0003601648.tif 000006
【００３２】
0003601648.tif 000007
【００３３】
試料
実施例１と同様にして試料の調製を実施した。
測定方法
試料３μｌに第一試薬２６０μｌを添加した後、３７℃で５分間加温し、第二試薬１３０μｌを添加し、混和し、５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量線を用いて、測定値を算出した。その結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
0003601648.tif 000008
【００３５】
表３から、本発明の試薬組成１は、他の非イオン界面活性剤を使用する試薬組成２に比べて、ビリルビンの影響を低減していることが確認された。
【００３６】
実施例３  血清中クレアチニンの測定
0003601648.tif 000009
【００３７】
0003601648.tif 000010
【００３８】
試料
実施例１と同様にして試料の調製を実施した。
測定方法
試料６μｌに第一試薬２７０μｌ添加、３７℃で５分加温後、第二試薬を９０μｌ添加し、さらに５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量線を用いて測定値を算出した。その結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
0003601648.tif 000011
【００４０】
表４から、本発明の試薬組成１は、他の非イオン界面活性剤を使用する試薬組成２に比べて、ビリルビンの影響を低減していることが確認された。
【００４１】
実施例４  血清中尿酸の測定
0003601648.tif 000012
【００４３】
試料
実施例１と同様に試料の調製を実施した。また実施例１のビリルビン４０ｍｇ／ｄｌに代えて、イントラリポス１０％を用いた以外は実施例１と同様にして試料の調製を実施した。
測定方法
試料８μｌに第一試薬２６０μｌを添加、３７℃で５分間加温後、第二試薬１３０μｌを添加し、さらに５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量線を用いて、測定値を算出した。実施例１と同様に試料を調製した結果を表５に示し、ビリルビンをイントラリポスに代えた結果を表６に示す。
【００４４】
【表５】
0003601648.tif 000013
【００４５】
【表６】
0003601648.tif 000014
【００４６】
表５，６から、本発明の試薬組成１は、他の非イオン界面活性剤を使用する試薬組成２に比べて、ビリルビンの影響を低減し、さらに乳びの影響を受けないことが確認された。
【００４７】
実施例５  血清中クレアチニンの測定
0003601648.tif 000015
【００４８】
0003601648.tif 000016
【００４９】
試料
実施例１と同様にして試料の調製を実施した。
測定方法
試料６μｌに第一試薬を２７０μｌ添加、３７℃で５分加温後、第二試薬を９０μｌ添加し、さらに５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量線を用いて測定値を算出した。その結果を表７に示す。
【００５０】
【表７】
0003601648.tif 000017
【００５１】
表７から、フェロシアン化カリウム濃度が０．１ｍＭである試薬組成１の方が、０．０５μＭである試薬組成２に比べて、ビリルビンの影響が軽減されていることが確認された。
【００５２】
実施例６  試薬ブランク吸光度の測定
0003601648.tif 000018
【００５３】
0003601648.tif 000019
【００５４】
試料
実施例１と同様に試料の調製を実施した。
測定方法
試料６μｌに第一試薬２７０μｌを添加、３７℃で５分加温後、第二試薬９０μｌを添加し、さらに５分間加温後、５４６ｎｍの吸光度を、精製水を対照に測定した。また３７℃にて一週間保存した試薬についても同様の検討を行った。その結果を表８に示す。
【００５５】
【表８】
0003601648.tif 000020
【００５６】
表８から、フェロシアン化カリウム濃度が０．１ｍＭである試薬組成１の方が、１ｍＭである試薬組成２に比べて、試薬ブランクの上昇が少ないことが確認された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明ではＨＬＢ１３以上のポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびフェロシアン化イオンを使用することにより、生体試料中の還元物質、特にビリルビンの影響を回避して特定成分を正確に測定することができる。また、これらの添加物は試薬中に添加される酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色試薬を安定に保ち、長期保存が可能である液状試薬としても正確な測定が可能である。