【手続補正書】
【提出日】平成29年10月24日(2017.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる方法であって、
1種類または複数種の細胞外マトリックス(ECM)分子、骨形成タンパク質2(BMP2)、および骨形成タンパク質7(BMP7)の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
iPSCがヒトiPSCである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
1種類または複数種のECM分子が増殖因子低減型マトリゲルマトリックスを含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
腎上皮細胞培養培地が腎上皮細胞増殖培地を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
iPSCが最初に約5000〜約10000生細胞/cm2の密度で播種される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
iPSCが最初に約8000生細胞/cm2の密度で播種される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
培養する工程の前に、iPSCが最初に、ROCK阻害剤の存在下かつBMP2およびBMP7の非存在下で播種される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
培養する工程中に、BMP2が約1ng/ml〜約25ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
培養する工程中に、BMP7が約0.25ng/ml〜約10ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
iPSCを最初に播種して約12〜約24時間後に、BMP2およびBMP7が腎上皮細胞培養培地に添加される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
増殖因子低減型マトリゲルマトリックスでコーティングされた培養支持体に未分化iPSCが付着できるように、BMP2およびBMP7を含まずかつ約5μM〜約15μMのROCK阻害剤を含む腎上皮細胞増殖培地中に、未分化iPSCを約8000生細胞/cm2の密度で約12時間〜約24時間、播種する工程;
腎上皮細胞増殖培地を、ROCK阻害剤を含まずかつ約2.5ng/ml〜約15ng/mlのBMP2および約1ng/ml〜約5ng/mlのBMP7を含む新鮮な腎上皮細胞増殖培地と交換する工程;
BMP2およびBMP7を含む腎上皮細胞増殖培地中で、iPSCを約8〜約10日の期間にわたって約37℃の温度および約5％CO2の下で、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含み、iPSCがヒトiPSCである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
約7〜約10日の期間にわたって1種類または複数種の細胞外マトリックス分子、骨形成タンパク質2、および骨形成タンパク質7の存在下で腎上皮細胞培養培地に約5000〜約10000生細胞/cm2の密度で播種した人工多能性幹細胞(iPSC)の集団から分化した、PTC様細胞集団。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法によって調製された、請求項12記載の細胞集団。
【請求項１４】
細胞の約90％以上がAQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する、請求項12または13記載の細胞集団。
【請求項１５】
バイオ人工腎臓装置の中空繊維バイオリアクターの中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項１６】
ヒドロゲルの中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項１７】
生物工学的に作製された組織の中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項１８】
請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団が播種されたマトリックスを含む、生物工学的に作製された組織移植片。
【請求項１９】
マトリックスが脱細胞化マトリックスである、請求項18記載の組織移植片。
【請求項２０】
マトリックスが生物工学的に作製された3D腎臓マトリックスである、請求項18記載の組織移植片。
【請求項２１】
化合物の腎毒性をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、以下の工程を含む、方法:
試験化合物を、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞試験集団と接触させる工程;および
試験化合物と接触していない細胞対照集団と比較して、試験化合物の効果を確かめる工程。
【請求項２２】
細胞生存率、細胞数、マーカー遺伝子の発現、細胞形態、細胞骨格成分の配置、細胞因子の移行、ATP枯渇、ミトコンドリア損傷、グルタチオン(GSH)枯渇、膜損傷、活性酸素種の発生、またはDNA損傷に対する試験化合物の効果について試験集団が評価される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
細胞試験集団が、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法に従って調製され、接触させる工程の前に収集することなく、分化させて約8〜約10日後に、接触させる工程が該試験集団に対して行われる、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
バイオ人工腎臓装置を調製する方法であって、装置に、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団を播種する工程を含む、方法。
【請求項２５】
対象において腎臓関連障害を治療するためのバイオ人工腎臓装置の製造における、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団の使用。
【請求項２６】
腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療するための生物工学的に作製された組織移植片の製造における、有効量の請求項12〜14、16、および17のいずれか一項記載の細胞集団の使用。
【請求項２７】
腎臓関連障害が、急性腎傷害、慢性腎臓病、末期腎臓病、腎症、糖尿病性腎症、ネフローゼ、ブライト病、腎機能不全、糸球体炎、糸球体硬化症、または腎炎を含む、請求項25または26記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
[本発明1001]
人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる方法であって、
1種類または複数種の細胞外マトリックス(ECM)分子、骨形成タンパク質2(BMP2)、および骨形成タンパク質7(BMP7)の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
iPSCがヒトiPSCである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1種類または複数種のECM分子が増殖因子低減型マトリゲルマトリックスを含む、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
腎上皮細胞培養培地が腎上皮細胞増殖培地を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
iPSCが最初に約5000〜約10000生細胞/cm2の密度で播種される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
iPSCが最初に約8000生細胞/cm2の密度で播種される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
培養する工程の前に、iPSCが最初に、ROCK阻害剤の存在下かつBMP2およびBMP7の非存在下で播種される、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
培養する工程中に、BMP2が約1ng/ml〜約25ng/mlの濃度で存在する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
培養する工程中に、BMP7が約0.25ng/ml〜約10ng/mlの濃度で存在する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
iPSCを最初に播種して約12〜約24時間後に、BMP2およびBMP7が腎上皮細胞培養培地に添加される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
増殖因子低減型マトリゲルマトリックスでコーティングされた培養支持体に未分化iPSCが付着できるように、BMP2およびBMP7を含まずかつ約5μM〜約15μMのROCK阻害剤を含む腎上皮細胞増殖培地中に、未分化iPSCを約8000生細胞/cm2の密度で約12時間〜約24時間、播種する工程;
腎上皮細胞増殖培地を、ROCK阻害剤を含まずかつ約2.5ng/ml〜約15ng/mlのBMP2および約1ng/ml〜約5ng/mlのBMP7を含む新鮮な腎上皮細胞増殖培地と交換する工程;
BMP2およびBMP7を含む腎上皮細胞増殖培地中で、iPSCを約8〜約10日の期間にわたって約37℃の温度および約5％CO2の下で、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含み、iPSCがヒトiPSCである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
約7〜約10日の期間にわたって1種類または複数種の細胞外マトリックス分子、骨形成タンパク質2、および骨形成タンパク質7の存在下で腎上皮細胞培養培地に約5000〜約10000生細胞/cm2の密度で播種した人工多能性幹細胞(iPSC)の集団から分化した、PTC様細胞集団。
[本発明1013]
本発明1001〜1011のいずれかの方法によって調製された、本発明1012の細胞集団。
[本発明1014]
細胞の約90％以上がAQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する、本発明1012または1013の細胞集団。
[本発明1015]
バイオ人工腎臓装置の中空繊維バイオリアクターの中に含まれる、本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団。
[本発明1016]
ヒドロゲルの中に含まれる、本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団。
[本発明1017]
生物工学的に作製された組織の中に含まれる、本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団。
[本発明1018]
本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団が播種されたマトリックスを含む、生物工学的に作製された組織移植片。
[本発明1019]
マトリックスが脱細胞化マトリックスである、本発明1018の組織移植片。
[本発明1020]
マトリックスが生物工学的に作製された3D腎臓マトリックスである、本発明1018の組織移植片。
[本発明1021]
化合物の腎毒性をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、以下の工程を含む、方法:
試験化合物を、本発明1012〜1014のいずれかの細胞試験集団と接触させる工程;および
試験化合物と接触していない細胞対照集団と比較して、試験化合物の効果を確かめる工程。
[本発明1022]
細胞生存率、細胞数、マーカー遺伝子の発現、細胞形態、細胞骨格成分の配置、細胞因子の移行、ATP枯渇、ミトコンドリア損傷、グルタチオン(GSH)枯渇、膜損傷、活性酸素種の発生、またはDNA損傷に対する試験化合物の効果について試験集団が評価される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
細胞試験集団が、本発明1001〜1011のいずれかの方法に従って調製され、接触させる工程の前に収集することなく、分化させて約8〜約10日後に、接触させる工程が該試験集団に対して行われる、本発明1021または1022の方法。
[本発明1024]
バイオ人工腎臓装置を調製する方法であって、装置に、本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団を播種する工程を含む、方法。
[本発明1025]
対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、本発明1012〜1014のいずれかの細胞集団を含むバイオ人工腎臓装置を外部接続する工程を含む、方法。
[本発明1026]
腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、有効量の本発明1012〜1014、1016、および1017のいずれかの細胞集団または本発明1018〜1020のいずれかの生物工学的に作製された組織移植片を、対象の、PTC様細胞が必要とされる部位に移植する工程を含む、方法。
[本発明1027]
腎臓関連障害が、急性腎傷害、慢性腎臓病、末期腎臓病、腎症、糖尿病性腎症、ネフローゼ、ブライト病、腎機能不全、糸球体炎、糸球体硬化症、または腎炎を含む、本発明1025または1026の方法。
本発明の他の局面および特徴は、本発明の特定の態様の以下の説明と添付の図面を見れば当業者に明らかになるだろう。