【手続補正書】
【提出日】平成29年7月24日(2017.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上した性質を少なくとも１つ有し、前記少なくとも１つの有意に向上した性質は、有意に高い融解温度（Ｔｍ）、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおける有意に向上した性能、有意に向上したタンパク質産生性、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異体。
【請求項２】
前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に高い融解温度（Ｔｍ）を有し、かつＧ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイ及び希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有し、かつＫ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｐ３１６Ｆ、Ｓ２９７Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体は、希アンモニアトウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有し、かつＧ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｎ３１５Ｗ、Ｔ３０３Ｇ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体は、酸前処理トウモロコシ茎葉全加水分解産物（ｗｈＰＣＳ）アッセイにおいて、前記親ＧＨ６１酵素より有意に向上した性能を有し、かつＨ２００Ａ、Ｓ１８５Ｄ、Ｐ３１６Ａ、Ｎ５１Ｅ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体は、前記親ＧＨ６１酵素よりも有意に向上したタンパク質産生性を有し、かつＶ８０Ｔ、Ａ１６Ｎ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｔ１０８Ｋ及びこれらの組み合わせ（ここで、それぞれのアミノ酸置換の位置は、配列番号３に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体は、Ｇ３０１Ｓ、Ｄ１２４Ｎ、Ｓ１６４Ｍ、Ｙ３１８Ｗ、Ａ１２９Ｎ、Ａ１６８Ｋ、Ａ１６Ｎ、Ａ２０１Ｄ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｍ、Ｇ２３５Ｋ、Ｇ２３５Ｌ、Ｇ２３５Ｓ、Ｇ２９５Ｃ、Ｇ２９５Ｔ、Ｇ２９８Ｃ、Ｇ３０１Ｐ、Ｈ２００Ａ、Ｋ１０６Ｃ、Ｋ５８Ｖ、Ｋ６４Ｌ、Ｋ７０Ｅ、Ｋ７０Ｌ、Ｋ７０Ｎ、Ｋ７０Ｓ、Ｌ２９０Ａ、Ｌ２９０Ｍ、Ｎ１０Ｄ、Ｎ３１５Ｗ、Ｎ５１Ｅ、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５１Ｔ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｆ、Ｐ５２Ｆ、Ｑ１６７Ｋ、Ｑ３２０Ａ、Ｑ３２０Ｐ、Ｑ３２０Ｓ、Ｒ３０４Ｄ、Ｒ３０４Ｐ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１８５Ｄ、Ｓ１８７Ｄ、Ｓ２９７Ｃ、Ｓ２９７Ｅ、Ｓ３００Ｔ、Ｔ１０７Ｅ、Ｔ１０７Ｇ、Ｔ１０７Ｍ、Ｔ１０７Ｎ、Ｔ１０７Ｑ、Ｔ１０８Ａ、Ｔ１０８Ｋ、Ｔ１２７Ｉ、Ｔ２８７Ａ、Ｔ３０３Ｇ、Ｔ３０３Ｐ、Ｔ３１３Ｋ、Ｖ１０４Ａ、Ｖ８０Ｔ、Ｙ２９１Ｆ、Ｙ２９１Ｗ、Ｙ３１７Ｗ及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体は、１〜１０個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体は、組み合わせ変異体である、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
前記親ＧＨ６１ポリペプチドは、真菌グリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）であり、かつ前記真菌ＧＨ６１Ａは、ヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ  ｓｐ．）、及びシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の親ＧＨ６１ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターは発現ベクターである、ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、真菌細胞又は細菌細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記真菌細胞は、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハザリウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される糸状菌細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ＧＨ６１ポリペプチドの変異体を産生する方法であって、前記変異体を産生するのに好適な条件下において、好適な培地にて、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含み、任意的に前記産生した変異体を単離することを更に含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＧＨ６１変異体を含む組成物であって、前記組成物は、洗剤、飼料、飼料添加物、及び細胞培養上清からなる群から選択される、組成物。
【請求項２０】
セルロース基質を加水分解する方法であって、前記基質を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
エタノールを産生する方法であって、セルロース性基質を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。