【手続補正書】
【提出日】平成29年3月14日(2017.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により、１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程；および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法。
【請求項２】
酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、
および／または
グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含み、場合により、酵素による伸長工程が、それ自体同位体標識された糖単位を取り入れる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、１つまたはそれより多くの保護基で保護され、場合により、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、１つまたはそれより多くの、場合により置換されていてもよいベンジル基で保護されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、またはＮｅｕ
から選択され；
第二の単糖単位は、
Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｆｒｕ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、Ｎｅｕ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＦｒｕＮＡｃ、ＦｕｃＮＡｃ、ＭｕｒＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃ、シアル酸、またはイノシトール
から選択され；
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列：
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
Ｇａｌ−ＧａｌＮ
ＧａｌＮ−ＧｌｃＮ
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含み；
場合により、前記方法が、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ａｃ＊は、同位体標識されたアセチル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、式（Ｂ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ａ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化１】
2016521299.tif 000001
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値であり；
場合により、前記方法が、式（Ｄ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ｃ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化２】
2016521299.tif 000002
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である；
および／または
場合により、Ｒ２がＨであり；場合により、各Ｒ１がベンジルであり、Ｒ２がＨであり、各Ｒ３がＨである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
同位体標識されたアセチル化剤が、同位体標識された無水酢酸であり；場合により、同位体標識されたアセチル化剤が、
（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏまたは（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ
から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、
および／または
前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、同位体標識されたオリゴ糖を含む糖タンパク質を得ることをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって入手できる同位体標識されたオリゴ糖または複合糖質。
【請求項１２】
【化３】
2016521299.tif 000003
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
から選択されるモチーフを含むグリカンであり；場合により、モチーフが、
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
であり；
場合により、グリカンが、モチーフ：
【化４】
2016521299.tif 000004
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
を含む、グリカン。
【請求項１３】
各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３から選択され；場合により、グリカンが、１つまたはそれより多くのさらなる単糖単位を含む、請求項１２に記載のグリカン。
【請求項１４】
サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含み；場合により、分析物であるグリカンに関連するイオンのピークと、同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークとの相対的な強度を比較することによって、サンプル中のグリカンが定量化できるように、既知量の同位体標識されたグリカンがサンプルに添加される、上記方法。
【請求項１５】
前記方法が、（ｉ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；（ｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；（ｉｉｉ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；（ｉｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数のより高分子量の同位体標識されたアイソトポログを含み、ここで該方法の工程（ｉｖ）は、以下：
（ａ）より高分子量の同位体標識された各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、そのグリカンの標準中の既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｂ）場合により、関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｃ）場合により、工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
（ｄ）前記関数を使用して、分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの量を計算する工程；
（ｅ）場合により、分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
の工程を包含し；
場合により、前記方法が、ドープしたサンプルを分析する前に、グリカンを誘導体化することをさらに含む；
および／または
場合により、マススペクトロメトリーが、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、直接注入ＥＳＩ−ＴｏＦまたはＬＣ−ＭＳである；
および／または
場合により、前記方法が、マススペクトロメトリーを使用した分析中にタンデムマススペクトロメトリーによるフラグメンテーションをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、および／またはサンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、１種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含み；
場合により、医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
診断方法で使用するための請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の同位体標識されたグリカンであって、該方法は、
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること；
（ｉｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含み；
場合により、医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、上記グリカン。
【請求項２０】
サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、
（ａ）１種またはそれより多くの請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準；および
（ｂ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含み；
場合により、説明書が、タグ付けされた標準に関するマススペクトロメトリーデータを包含する、
および／または
場合により、説明書が、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークを、マススペクトル中の追加のイオンのピークと比較する工程を包含する、上記キット。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本発明の方法のいくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、ハロゲン化アシルまたは好適なカルボン酸の無水物であってもよい。いくつかの好ましい実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、同位体標識された無水酢酸、好ましくは（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。いくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
他の実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、カルボン酸の無水物、好ましくは酢酸の無水物である。いくつかの実施態様において、同位体標識されたアセチル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏから選択される。いくつかの好ましい実施態様において、同位体標識されたアセチル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】
J. A. Atwood III, L. Cheng, G. Alvarez-Manilla, N. L. Warren, W. S. York, R. Orlando, Journal of proteome research 2007, 7, 367-374.
O. Blixt, N. Razi, Method in Enzymology 2006, 415, 137-153.
J. C. Botelho, J. A. Atwood III, L. Cheng, G. Alvaez-Manilla, W. S. York, R. Orlando, International Journal of Mass Spectrometry 2008, 278, 137-142.
M. J. Bowman, J. Zaia, Analytical chemistry 2007, 79, 5777-5784.
M. J. Bowman, J. Zaia, Analytical chemistry 2010, 82, 3023-3031.
M. A. Breidenbach, K. K. Palaniappan, A. A. Pitcher, C. R. Bertozzi, Molecular & Cellular Proteomics 11.6, 2012.
A. M. Hitchcock, C. E. Costello, J Zaia, Biochemistry 2006, 45, 2350-2361.
J. Hsu, S. J. Chang, A. H. Franz, American Society for Mass Spectrometry 2006, 17, 194-204.
P. Kang, Y. Mechref, Z. Kyselova, J. A. Goetz, M. V. Novotny, Analytical chemistry2007, 79, 6064-6073.
R. Lawrence, S. K. Olson, R. E. Steele, L. Wang, R. Warrior, R. D. Cummings, J. D., Esko Journal of biological chemistry 2008, 283, 33674-33684.
G. Ridlova, J. C. Mortimer, S. L. Maslen, P. Dupree, e. Stephens, Rapid Communications in Mass Spectrometry 2008, 22, 2723-2730. 
T. W. D. F. Rising, C. D. Heidecke, J. W. B. Moir, Z. Ling, A. J. Fairbanks, Chemistry - A European Journal 2008, 14, 6444-6464.
N. Ruiz, S. S. Ferreira, D. Padro, N.-C. Reichardt, M. Martin-Lomas, Carbohydrate Research 2011, 246, 1581-1591.
S. Serna, J. Etxebarria, N. Ruiz, M. Martin-Lomas, N.-C. Reichardt, Chemistry - A European Journal 2010, 16, 13163-13175.
B. Xia, C. L. Feasley, G. P. Sachdev, D. F. Smith, R. D. Cummings, Analytical biochemistry 2009, 387, 162-170.
J. Yuan, N. Hashii, N. Kawasaki, S. Itoh, T. Kawanishi, T. Hayakawa, journla of chrmoatography A 2005, 1067, 145-152.
H. Zhang, X.-J. Li, D. B. Martin, R. Aebersold, Nature biotechnology2003, 21, 660-6.
G. Zou, H. Ochiai, W. Huang, Q. Yang, C. Li, L.-X. Wang, Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 18975-18991。
本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程；および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法。
［２］酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］酵素による誘導体化が、グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含み、場合により酵素による伸長工程が、それ自体同位体標識された糖単位を取り入れる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、１つまたはそれより多くの保護基で保護される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、１つまたはそれより多くの場合により置換されていてもよいベンジル基で保護されている、［４］に記載の方法。
［６］オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、またはＮｅｕ
から選択され；
第二の単糖単位は、
Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｆｒｕ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、Ｎｅｕ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＦｒｕＮＡｃ、ＦｕｃＮＡｃ、ＭｕｒＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃ、シアル酸、またはイノシトール
から選択され；
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列：
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記方法が、
ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
Ｇａｌ−ＧａｌＮ
ＧａｌＮ−ＧｌｃＮ
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記方法が、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ａｃ＊は、同位体標識されたアセチル基である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記方法が、式（Ｂ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ａ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化１２】
2016521299.tif 000005
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記方法が、式（Ｄ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ｃ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化１３】
2016521299.tif 000006
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］Ｒ２がＨである、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］各Ｒ１がベンジルであり、Ｒ２がＨであり、各Ｒ３がＨである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］同位体標識されたアシル化剤が、同位体標識された無水酢酸である、［１３］に記載の方法。
［１５］同位体標識されたアセチル化剤が、
（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２
から選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、同位体標識されたオリゴ糖を含む糖タンパク質を得ることをさらに含む、［１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］［１］〜［１８］のいずれかに記載の方法によって入手できる同位体標識されたオリゴ糖または複合糖質。
［２０］
【化１４】
2016521299.tif 000007
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
から選択されるモチーフを含むグリカン。
［２１］モチーフが、
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
であり、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている、［２０］に記載のグリカン。
［２２］グリカンが、モチーフ：
【化１５】
2016521299.tif 000008
を含み、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている、［２１］に記載のグリカン。
［２３］各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３から選択される、［２０］〜［２２］のいずれかに記載のグリカン。
［２４］グリカンが、１つまたはそれより多くのさらなる単糖単位を含む、［２０］〜［２３］のいずれかに記載のグリカン。
［２５］サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、上記方法。
［２６］分析物であるグリカンに関連するイオンのピークと、同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークとの相対的な強度を比較することによって、サンプル中のグリカンが定量化できるように、既知量の同位体標識されたグリカンがサンプルに添加される、［２５］に記載の方法。
［２７］前記方法が、（ｉ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；（ｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；（ｉｉｉ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；（ｉｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、［２５］または［２６］に記載の方法。
［２８］タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数の同位体標識された「重い」アイソトポログを含み、ここで該方法の工程（ｉｖ）は、以下：
（ａ）重い各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、そのグリカンの標準中の既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｂ）場合により、関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｃ）場合により、工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
（ｄ）前記関数を使用して、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの量を計算する工程；
（ｅ）場合により、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
の工程を包含する、［２７］に記載の方法。
［２９］前記方法が、ドープしたサンプルを分析する前に、グリカンを誘導体化することをさらに含む、［２８］に記載の方法。
［３０］マススペクトロメトリーが、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、直接注入ＥＳＩ−ＴｏＦまたはＬＣ−ＭＳである、［２５］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記方法が、マススペクトロメトリーを使用した分析中にタンデムマススペクトロメトリーによるフラグメンテーションをさらに含む、［２５］〜［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、［２５］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］サンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、［２５］〜［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、１種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む、［２５］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、［３４］に記載の方法。
［３６］診断方法で使用するための［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンであって、該方法は、
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること；
（ｉｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカン。
［３７］医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、［３６］に記載の方法で使用するためのグリカン。
［３８］サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、（ａ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準；（ｂ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含む、上記キット。
［３９］説明書が、タグ付けされた標準に関するマススペクトロメトリーデータを包含する、［３８］に記載のキット。
［４０］説明書が、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークを、マススペクトル中の追加のイオンのピークと比較する工程を包含する、［３８］または［３９］に記載のキット。
［４１］［３８］、［３９］または［４０］のいずれかに記載のキットにおける、［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンの使用。