(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株であって、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｖ２０２０４１であることを特徴とする耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【請求項２】
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株を母株として、そのＨＮタンパク質に、３番目のアルギニンからセリンへ、１９７番目のアルギニンからイソロイシンへ、２０３番目のヒスチジンからアスパラギンへ、４９５番目のリジンからバリンへ突然変異する４つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を得ることを特徴とする請求項１に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【請求項３】
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のＨＮタンパク質の遺伝子配列は配列番号１であることを特徴とする請求項１に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【請求項４】
ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドを構築するステップａと、
前記ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子の３番目、１９７番目、２０３番目及び４９５番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異するステップｂと、
突然変異した転写プラスミドを３つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップｃと、
を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の製造方法。
【請求項５】
ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造におけることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチンの遺伝子工学の分野であり、具体的には、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＮＵ４に関する。より具体的には、本発明は、逆遺伝子操作技術を用いて、点突然変異の方法で、ニューカッスル病ウイルスに耐熱性改変を行って得られた、耐熱性改変された新規突然変異ウイルス株、及びワクチン製造におけるこのウイルス株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病はニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ、ＮＤＶ）により引き起こした高度接触性伝染病であり、全世界の家禽業に巨大な脅威をもたらした。ＮＤＶはパラミクソウイルス科、禽の耳下腺炎ウイルス属のメンバーに属し、エンベロープを含む一本鎖、負鎖で、セグメント化されていないＲＮＡウイルスである。ＮＤＶゲノムは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、基質タンパク質（Ｍ）、ヘマグルチニンノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）、融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｆ）、及び依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）の６つの主要な構造タンパク質をコードする。一部の研究により、ＮＤＶのＨＮタンパク質がウイルス粒子の熱安定性を決定する重要な要素であることが明らかになった。
【０００３】
現在、ニューカッスル病の予防と制御は主にワクチン接種に依存しており、従来のワクチンは主に不活化ワクチンと弱毒生ワクチンであり、ニューカッスル病の流行による危害を大幅に低減した。現在臨床で使用されている不活化ワクチンは主にＬａＳｏｔａ株、Ｕｌｓｔｅｒ２Ｃ株、及びＣｌｏｎｅ３０株の３種類であり、油乳剤不活化ワクチンは高いレベルの抗体を産生でき、しかも免疫保護期間が長いが、筋肉内注射が必要で、手間と時間がかかり、免疫コストが高く、しかも家禽肉の品質に影響を与える。弱毒生ワクチンは主に遺伝子ＩＩ型ワクチン株ＬａＳｏｔａ株であり、その使いやすさ（飲水、点鼻／点眼、噴霧などの様々な方式でワクチンを投与する）のため、中国国内で最も広く利用されている。しかし、このような生ワクチンは耐熱性が悪く、冷蔵条件への要件が高いため、不適切な保存や使用が、免疫不完全、さらに免疫失敗を招くことがしばしばあり、これも非典型性ニューカッスル病が頻繁に発生する主要な理由の１つである。例えばＶ４、ＴＳ０９−Ｃ株など、一部のニューカッスル病ウイルス弱毒株は良い熱安定特性を持っており、このようなワクチンは気温が高い区域やコールドチェーンシステムが完備されていない農村で簡便に使用でき、ニューカッスル病の予防と制御において重要な役割を発揮している。そのため、ニューカッスル病ウイルスの耐熱性機序及び従来の弱毒株の熱安定性をどのように高めるかを検討することは極めて重要である。
【０００４】
ＮＤＶ逆遺伝学の急速な発展はＮＤＶに対する点突然変異修飾、外来遺伝子の挿入、遺伝子断片の交換などの遺伝子操作を可能にした。ニューカッスル病耐熱性ワクチンと逆遺伝子操作方法に関する文献は多いが、ニューカッスル病ウイルスに対して点突然変異による耐熱性改変を行う方法に関する報告はなかった。例えば、出願番号２０１１１０１６３１０９．３の特許文献「ベビーハムスター腎継代細胞に適したニューカッスル病ウイルスの耐熱性弱毒株、その製造方法及び使用」には、継代細胞株に適したニューカッスル病ウイルスの耐熱性株、及び耐熱性ワクチンの製造分野におけるその使用が開示されている。出願番号２０１２１００９００９９．４の特許文献「ニューカッスル病ウイルスの耐熱性又はワクチンベクター系及びその使用」には、ニューカッスル病ウイルスの耐熱性生ワクチンベクター系及びＨＮ遺伝子交換によるウイルス熱安定性の改変方法が開示されている。ＨＮ遺伝子交換の方法で非耐熱性ウイルスの熱安定性をある程度高めることができるが、どのように既存の耐熱性ウイルス株の熱安定性を高めるかについては、交換対象となる、より耐熱性のウイルス株のＨＮ遺伝子がないため、ＨＮ遺伝子交換方法は既存の耐熱性ウイルス株の熱安定性をさらに高めることができない。そのため、既存の耐熱性株に対してその熱安定性をさらに高める方法の開発が急務となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記技術的課題を解決するために、より熱安定性の高いニューカッスル病ウイルスの耐熱性突然変異株、その製造方法及び使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記発明の目的を達成するために、本発明の技術案は以下の通りである。
【０００７】
耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４であって、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｖ２０２０４１、保蔵時間は２０２０年７月３１日である。
【０００８】
好ましくは、前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株を母株として、そのＨＮタンパク質に、３番目のアルギニンからセリンへ、１９７番目のアルギニンからイソロイシンへ、２０３番目のヒスチジンからアスパラギンへ、４９５番目のリジンからバリンへ突然変異する４つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を得る。前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のＨＮタンパク質の遺伝子配列は配列番号１である。本発明に使用されるＴＳ０９−Ｃ株は既に２０１１年５月９日に中国典型微生物保蔵センターに保蔵され、保蔵番号はＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１１１３である。
【０００９】
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の製造方法は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドを構築するステップａと、前記ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子の３番目、１９７番目、２０３番目及び４９５番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異させるステップｂと、突然変異した転写プラスミドを３つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップｃとを含む。
【００１０】
ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造における、前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の使用である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の有益な効果は次の通りである。
【００１２】
１）本発明は、ニューカッスル病ウイルスの耐熱性ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドに基づき、ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子の３番目、１９７番目、２０３番目、及び４９５番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸、及びバリンに突然変異させ、点突然変異した転写プラスミドを構築するものであり、ウイルスレスキューの方法により、新しいウイルス突然変異株を得る。耐熱性試験の結果から明らかなように、ウイルス突然変異株の耐熱特性は母株より明らかに高く、さらに常用のワクチン株よりはるかに高く、それは、本発明が既存の耐熱性株の熱安定性をさらに高めることを示した。
【００１３】
２）他のニューカッスル病ウイルス弱毒株と比較して、耐熱性改変された弱毒株は熱安定性がより高く、これにより製造された生ワクチンは、保存や輸送過程において低温やコールドチェーン輸送設備に過度に依存することがなく、耐熱性保護剤を添加することなく、ワクチンの有効期限を延長することができ、コストを削減することができるとともに、高温地域や冷蔵設備が完備していない地域におけるワクチンの大規模な普及・応用に有利である。熱安定性に優れた生ワクチンは、噴霧や飲水などの簡便な免疫方法で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ニューカッスル病ウイルス突然変異株のゲノムの構造模式図である。
【図２】ニューカッスル病ウイルス突然変異株の細胞増殖曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面及び実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明の内容は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
本発明は耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を提供する。耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４は、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｖ２０２０４１、保蔵時間は２０２０年７月３１日である。
【００１７】
該耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株を母株として、そのＨＮタンパク質に、３番目のアルギニンからセリンへ、１９７番目のアルギニンからイソロイシンへ、２０３番目のヒスチジンからアスパラギンへ、４９５番目のリジンからバリンへ突然変異する４つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を得る。前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のＨＮタンパク質の遺伝子配列は配列番号１である。
【００１８】
本発明はさらに耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の製造方法を提供する。製造方法は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドを構築するステップａと、前記ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子の３番目、１９７番目、２０３番目及び４９５番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異するステップｂと、突然変異した転写プラスミドを３つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップｃとを含む。
【００１９】
本発明はさらにニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造における、前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の使用を提供する。
【００２０】
以下、実施例を参照して本発明を説明する。
【００２１】
（実施例１）
ニューカッスル病ウイルス突然変異株の転写プラスミドの構築及びウイルスレスキュー
突然変異スキームに従って、遺伝子合成方法で４種類の突然変異ＨＮ遺伝子配列（ＨＮ−Ｐ４、ＨＮ−ＰＵ４、ＨＮ−ＮＵ４、及びＨＮ−ＵＰ４）を得た。ＨＮ−Ｐ４の突然変異スキームは、６２番目のＡがＲ、９８番目のＮがＫ、２９３番目のＥがＫ、４９４番目のＤがＧに突然変異することである。ＨＮ−ＰＵ４の突然変異スキームは、３番目のＲがＳ、１９７番目のＲがＩ、２０３番目のＨがＮ、４９５番目のＫがＶに突然変異することである。ＨＮ−ＵＰ４の突然変異スキームは、６２番目のＡがＲ、２８０番目のＱがＲ、３５３番目のＱがＲ、５７０番目のＧがＲに突然変異することである。ＨＮ−ＮＵ４の突然変異スキームは、１４７番目のＤがＧ、２９３番目のＥがＧ、３０９番目のＤがＮ、４９４番目のＤがＧに突然変異することである。それらをそれぞれＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子に置換し、図１に示すように、４種類の改変された転写プラスミド（ｐＴＳ−ＨＮ−Ｐ４、ｐＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４、ｐＴＳ−ＨＮ−ＮＵ４、及びｐＴＳ−ＨＮ−ＵＰ４）を得た。改変された転写プラスミドと補助プラスミドをＢＨＫ−２１細胞に共トランスフェクションし、それぞれｒＴＳ−ＨＮ−Ｐ４（対照例）、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４（本発明）、ｒＴＳ−ＨＮ−ＮＵ４（対照例）、及びｒＴＳ−ＨＮ−ＵＰ４（対照例）の４株の耐熱性改変されたニューカッスル病ウイルス突然変異株を得た。上記の４種類の突然変異ウイルスの構築とレスキュースキームでは、会社に送って合成する配列に違いがある以外、残りの操作はほぼ一致している。
【００２２】
１．１  突然変異ＨＮ遺伝子配列
突然変異ＨＮ遺伝子配列を会社に送って合成し、突然変異ＨＮ配列を含むＴベクターをテンプレートとして、突然変異ＨＮ遺伝子を増幅する上流プライマー配列を配列番号２とし、突然変異ＨＮ遺伝子を増幅する下流プライマー配列を配列番号３（１番目から１５番目の塩基はＩｎｆｕｓｉｏｎクローニング連結のための相同配列である）とする特異的プライマーを設計した。高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて改変ＨＮ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡゲル回収キットを用いて、特異的目的バンドを回収して、突然変異ＨＮ遺伝子断片を得た。
【００２３】
１．２  ＴＳ０９−Ｃ転写プラスミドの線形化
ＴＳ０９−Ｃ転写プラスミド中のＨＮ遺伝子以外のすべての配列を増幅するための一対のＰＣＲプライマーを設計して合成し（プライマーの５’末端に相同配列を導入し、改変されたＨＮ遺伝子増幅産物と線形化クローニングベクターとの間に、互いに相同組換え可能な完全に一致する配列を持たせる）、このＰＣＲプライマーは、ＴＳ０９−Ｃ転写プラスミドを増幅する上流プライマー配列を配列番号４、ＴＳ０９−Ｃ転写プラスミドを増幅する下流プライマー配列を配列番号５（１番目から１５番目の塩基はＩｎｆｕｓｉｏｎクローニング連結のための相同配列である）とし、これらはすべて人工配列であった。ＰＣＲ反応系は、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、上下流Ｐｒｉｍｅｒ（０．２〜０．３μＭ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｈ２Ｏ及びテンプレートからなる。ＰＣＲ増幅条件は９８℃１０秒間、６０℃１５秒間、６８℃１分間／ｋｂ、３５サイクルであった。アガロースゲル電気泳動により目的バンドを検出し、ＰＣＲ増幅バンドをＤＮＡ精製キットで精製して回収し、ＴＳ０９−Ｃ株転写プラスミド（ＨＮ遺伝子を除く）の線形化産物を得た。
【００２４】
１．３  突然変異株の転写プラスミドの連結及び同定
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔの取扱書に従って、突然変異したＨＮ遺伝子断片とＴＳ０９−Ｃ株転写プラスミドの線形化断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ連結し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ耐性プレートに塗布し、１６時間反転培養後、単コロニーを選んでＰＣＲ同定を行い、陽性コロニーに対して拡大培養とプラスミドの抽出を行った。
【００２５】
１．４  突然変異株の転写プラスミドの酵素切断同定
陽性と同定された転写プラスミドをＢａｍ  ＨＩ制限エンドヌクレアーゼで酵素切断同定を行ったところ、アガロースゲル電気泳動により検出されたバンドはすべて期待通りであった。転写プラスミドを会社に送ってシークエンシング分析を行ったところ、突然変異ＨＮ遺伝子を含む転写プラスミドの構築に成功したことを示した。
【００２６】
１．５  突然変異株ウイルスのレスキュー
トランスフェクションの前日に生育状態の良好なＢＨＫ−２１細胞を６ウェルプレートに移し、トランスフェクションの当日の細胞密度が８０％程度に達することを確保し、ＨＢＳＳで細胞を３回洗浄した後、２％血清を含むＤＭＥＭ培地を交換し、同時に０．０１ＭＯＩのポックスウイルスを加え、３７℃で１時間インキュベートした。突然変異した転写プラスミドとＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質をそれぞれ発現する３つの補助プラスミドとを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬を用いてＢＨＫ−２１細胞にそれぞれ１．２５μｇ、０．３１３μｇ、０．３１３μｇ、０．６２５μｇのプラスミドの量で共トランスフェクションした。６時間のトランスフェクション後、ＨＢＳＳで細胞を３回洗浄し、０．４μｇ／ｍＬ  ＴＰＣＫパンクレアチン、２％ペニスロマイシンの二重抗体を含むＤＭＥＭを交換し、細胞の病変状況を観察し、細胞が明らかな病変を示して脱落したときに、凍結融解を３回繰り返し、０．２２μｍ孔径のフィルターを用いてポックスウイルスを除去し、９〜１１日齢のＳＰＦニワトリ胚において３回継代し、ＨＡ力価測定とＲＴ−ｑＰＣＲ方法を用いてニューカッスル病ウイルスを同定した。正確であると同定されたニューカッスル病ウイルス突然変異株は、後続の研究に用いることができる。
【００２７】
（実施例２）
ニューカッスル病ウイルス突然変異株の熱安定性試験
それぞれ４株のニューカッスル病ウイルス突然変異株に感染した尿膜液を、１００μＬ／本、５６℃の水浴で熱処理し、３回繰り返し、それぞれ０、２、５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間でウイルス尿膜液を取り出し、速やかに氷上に置き、ウイルスの血液凝固（ＨＡ）力価を測定し、力価の変化を統計して、表１を得た。表１に示すように、母株ＴＳ０９−Ｃ株に比べて、ｒＴＳ−ＨＮ−Ｐ４、ｒＴＳ−ＨＮ−ＮＵ４及びｒＴＳ−ＨＮ−ＵＰ４株は、いずれもＨＡ熱安定性が著しく低下しており、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のみはＨＡ熱安定性が大幅に向上した。このウイルス株は５６℃で１８０分間熱処理した後、ＨＡ力価が３ｌｏｇ２だけ低下したが、母株ＴＳ０９−Ｃ株は０に低下した。対照ＬａＳｏｔａ株は５分間熱処理した後、１ｌｏｇ２まで低下した。そのため、４株のニューカッスル病ウイルス突然変異株のうち、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のみはＨＡ熱安定性が著しく向上した。さらに４つの突然変異株の感染力耐熱性を測定し、５６℃で対応する時間処理した後、勾配希釈してＢＨＫ−２１細胞に接種し、そのＴＣＩＤ５０力価の変化状況を測定し、感染力−耐熱性曲線をプロットし、感染力が１ｌｏｇ１０（９０％）低下するのに要する時間Ｔ９０を算出した。その結果、ｒＴＳ−ＨＮ−Ｐ４、ｒＴＳ−ＨＮ−ＮＵ４、ｒＴＳ−ＨＮ−ＵＰ４、及びｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のＴ９０は、それぞれ４．３、４．０、４．５、及び２５．５分間であり、対照ＴＳ０９−ＣとＬａＳｏｔａ株のＴ９０は、それぞれ１２．７と１．５分間であった。このため、４株の突然変異株のうち、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株のみは、熱安定性が著しく向上し、母株ＴＳ０９−Ｃ株に比べて２．７倍（２５．２／１２．７））上昇し、一般的なＬａＳｏｔａ株より１７倍（２５．２／１．５）上昇した。
【００２８】
【表１】
0006988015.tif 000002
【００２９】
（実施例３）
ニューカッスル病ウイルスｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の細胞増殖試験
点突然変異がｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の細胞増殖力価に影響を与えるか否かを解析するために、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株と母株ＴＳ０９−Ｃ株の細胞上での増殖状況を比較した。希釈した２株のウイルスを緻密な単層に成長したＢＨＫ−２１細胞に接種し、接種してから０、２４、４８、７２、９６時間後、細胞上清をそれぞれ採取した。採取した上清を１０倍勾配希釈し、希釈度ごとに１００μＬを単層ＢＨＫ−２１細胞を含む９６ウェルプレートに接種し、希釈度ごとに３回繰り返して、細胞病変状況からＴＣＩＤ５０を計算して、ウイルスの成長動態曲線をプロットした。その結果、図２に示すように、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株は細胞感染７２時間後、基本的にプラットフォーム期に達し、力価が１０６．８６ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、母株ＴＳ０９−Ｃ株の成長曲線と類似していた。したがって、点突然変異はｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の細胞増殖力価に影響を与えなかった。
【００３０】
（実施例４）
ニューカッスル病ウイルスｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の病原性解析
ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の病原性をウイルスのニワトリ胚の最小致死量の平均死亡時間（ＭＤＴ／ＭＬＤ）と脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）で評価した。ＭＤＴ／ＭＬＤの検出方法：ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株のウイルス尿膜液を１０倍勾配希釈し、ＳＰＦニワトリ胚に１００μＬ／枚で接種し、７日間連続観察し、ニワトリ胚の死亡時間を記録し、ＭＤＴ／ＭＬＤ値を算出した。ＩＣＰＩ検出方法：１０倍勾配希釈したｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株のウイルス尿膜液を１日齢のＳＰＦ雛に１０羽／群、接種量５０μＬ／羽で接種し、１日１回観察し、ニワトリについて採点し、正常ニワトリは０、発病ニワトリは１、死亡ニワトリは２とした。合計８日間観察し、ＩＣＰＩ値を算出した。その結果、各希釈度のウィルスをニワトリ胚に１２０時間接種した場合、死亡せず、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株のＭＤＴ／ＭＬＤ値は１２０時間よりも大きく、ＩＣＰＩ値は０．００であった。母株ＴＳ０９−Ｃ株のＭＤＴも１２０時間よりも大きく、ＩＣＰＩ値は０．００であった。したがって、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株は母株ＴＳ０９−Ｃ株の弱毒性を保持した。
【００３１】
（実施例５）
ニューカッスル病ウイルスｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の免疫原性解析
点突然変異がｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株の免疫原性に影響を与えるか否かを解析するために、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株のニワトリ免疫試験を実施した。２週齢のＳＰＦ雛を点鼻や点眼により１０６．０ＥＩＤ５０／羽の用量で接種し、同時に、それぞれ母株ＴＳ０９−Ｃ株と未免疫群の２つの対照群を設定した。免疫してから２週間後、翅静脈を介して採血し、血清を分離し、その血液凝固抑制抗体レベルを測定した。その結果、空白対照群を除いて、残りの２群はすべてＨＩ抗体陽性であることを示した。これらのうち、ＴＳ０９−Ｃ株免疫群の平均抗体レベルは２３．６、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４群の平均抗体レベルは２４．８であった。したがって、ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４株は、母株ＴＳ０９−Ｃ株よりもニワトリに対する免疫原性が高く、ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの候補株とすることができる。
【００３２】
（付記）
（付記１）
耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株であって、中国典型培養物保蔵センターに保蔵され、保蔵アドレスは中国、武漢、武漢大学、保蔵番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｖ２０２０４１であることを特徴とする耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【００３３】
（付記２）
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４は、ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株を母株として、そのＨＮタンパク質に、３番目のアルギニンからセリンへ、１９７番目のアルギニンからイソロイシンへ、２０３番目のヒスチジンからアスパラギンへ、４９５番目のリジンからバリンへ突然変異する４つのアミノ酸突然変異を導入し、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を得ることを特徴とする付記１に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【００３４】
（付記３）
前記耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４のＨＮタンパク質の遺伝子配列は配列番号１であることを特徴とする付記１に記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４。
【００３５】
（付記４）
ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドを構築するステップａと、
前記ＴＳ０９−Ｃ株の転写プラスミドにおけるＨＮ遺伝子の３番目、１９７番目、２０３番目及び４９５番目のアミノ酸を、それぞれセリン、イソロイシン、アスパラギン酸及びバリンに突然変異するステップｂと、
突然変異した転写プラスミドを３つの補助プラスミドとともに宿主細胞にトランスフェクションし、前記耐熱性突然変異株を得るステップｃと、
を備えることを特徴とする付記１から３のいずれか１つに記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の製造方法。
【００３６】
（付記５）
ニューカッスル病の耐熱性生ワクチンの製造におけることを特徴とする付記１から３のいずれか１つに記載の耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４の使用。
【要約】      （修正有）【課題】常用のワクチン株よりはるかに高い耐熱特性を有するニューカッスル病ウイルス突然変異株、その製造方法、及び使用を提供する。【解決手段】ニューカッスル病ウイルスＴＳ０９−Ｃ株を母株として、そのＨＮタンパク質に、３番目のアルギニンからセリンへ、１９７番目のアルギニンからイソロイシンへ、２０３番目のヒスチジンからアスパラギンへ、４９５番目のリジンからバリンへ突然変異する４つのアミノ酸突然変異を導入した、耐熱性ニューカッスル病ウイルス突然変異株ｒＴＳ−ＨＮ−ＰＵ４を提供する。【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【配列表】
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