【手続補正書】
【提出日】平成29年2月9日(2017.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を検出する方法であって、
ａ）試料を、それぞれが少なくとも１つの標的捕捉配列を含む１つまたは複数の捕捉用プローブと、前記１つまたは複数の捕捉用プローブが前記試料中の１つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ；
ｂ）前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ；
ｃ）増幅産物を複数の再捕捉用プローブとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ；
ｄ）前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体によって生じるシグナルを検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在および／または存在量により、前記試料中の前記１つまたは複数の標的核酸の存在および／または存在量が示される、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記捕捉用プローブのそれぞれが、１つの標的捕捉配列を含み、かつ１つの別個の標的核酸に特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記再捕捉用プローブのそれぞれが、１つの標的捕捉配列を含み、かつ１つの別個の標的核酸に特異的に結合する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記再捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉用プローブが同一のものであり、前記再捕捉用プローブが同一のものである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉用プローブおよび／または前記再捕捉用プローブが担体に結びついている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記担体が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、ＰＬＧＡ、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記材料がヒドロゲルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記担体がパターン化平面担体、マイクロチップ、プラスチック、ビーズ、バイオフィルム、粒子である、請求項７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記担体が粒子である、請求項７から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが前記粒子の１つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子が、１つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記１つまたは複数のエンコーディング領域が前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の標的核酸がマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コード転写物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数のアダプターを前記捕捉された標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のアダプターを、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のアダプターがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記捕捉された標的核酸を、前記１つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖５’領域および／または３’領域を除去する、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、請求項１７から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、請求項１７から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライゲーションをＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ酵素によって実施する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のＤＮＡ修飾酵素またはＲＮＡ修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、請求項１７から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲ反応でＴａｑ、Ｂｓｔ、および／またはＰｈｉ２９から選択されるポリメラーゼ酵素を使用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
逆転写が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素によって触媒される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリメラーゼ酵素がＰｙｒｏｐｈａｇｅまたはＴｔＨである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
逆転写が１つの酵素によって触媒され、ＰＣＲ増幅が第２の酵素によって行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的核酸および／または前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＣＲを、単一のプライマーセットを用いて実施する、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＣＲを、１種のプライマーを用いて実施する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＣＲを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、請求項２７から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＣＲを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ（Ａ）プライマーの組合せを使用して実施する、請求項２７から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたｄＮＴＰおよび／または挿入色素として提供される、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記担体が増幅時間中存在する、請求項１から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、請求項１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、５つ未満のプライマー対を使用して実施する、請求項１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＣＲに、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、請求項２７から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フォワードプライマーを前記ＰＣＲ反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が１：２未満である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、請求項１から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ステップの間に前記担体をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および／またはアダプターを除去する、請求項１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を１つまたは複数含有する、請求項１から５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、ｄＮＴＰ濃度、または、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、２−ピロリドン、もしくはＤＮＡ二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、請求項１から５２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料が生体試料である、請求項１から５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記生体試料が、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、請求項１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナルを定量化する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、請求項１から５７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記各粒子が、スペクトル特性が既知である１つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記増幅された１つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、請求項１から６２までのいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、請求項１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、請求項１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、請求項１から６５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１％未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の０．１％未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の１未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１千万分の１未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
標的核酸を検出する方法であって、
ａ）１つまたは複数の標的核酸を含む試料を、それぞれが少なくとも１つの標的捕捉配列を含む複数の捕捉用プローブを担持する粒子の第１のセットと、前記複数の捕捉用プローブが前記試料中の１つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ；
ｂ）前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ；
ｃ）増幅産物を、複数の再捕捉用プローブを担持する粒子の第２のセットとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ
を含み、ここで、
各粒子が前記複数の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブを担持する１つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する１つまたは複数のエンコーディング領域を有し、
前記粒子の第２のセット上の前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体により生じる検出可能なシグナルの存在および／または存在量により、前記試料中の前記１つまたは複数の標的核酸の存在および／または存在量が示される、
方法。
【請求項７２】
前記粒子の第２のセットをフロースルーデバイスによって走査して、前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸に結びついた前記検出可能なシグナルの存在および／または存在量ならびに前記粒子の１つまたは複数のエンコーディング領域に結びついた前記検出可能な部分を検出するステップを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記粒子の第１のセットが、別個の捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
各粒子が、複数の同一の捕捉用プローブを担持する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記粒子の第２のセットが、別個の再捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、請求項７１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
各粒子が、複数の同一の再捕捉用プローブを担持する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記粒子の第１のセットと第２のセットが同一である、請求項７１から７６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記粒子の第１のセットと第２のセットが同じセットである、請求項７１から７７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記粒子が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、ＰＬＧＡ、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、請求項７１から７８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記粒子がヒドロゲル粒子である、請求項７１から７８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記粒子の少なくとも１つの寸法が約１μｍ超から約４５０μｍまでである、請求項７１から８０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、前記粒子の１つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、請求項７１から８１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記粒子が、１つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記１つまたは複数のエンコーディング領域が、前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記１つまたは複数の標的核酸がマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コード転写物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項７１から８３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項７１から８４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、請求項７１から８５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
１つまたは複数のアダプターを前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、請求項７１から８６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つまたは複数のアダプターを、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つまたは複数のアダプターがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、請求項８７から８９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記捕捉された標的核酸を、前記１つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖５’領域および／または３’領域を除去する、請求項７１から９０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、請求項７１から９１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、請求項８７から９３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ライゲーションをＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ酵素によって実施する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記１つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のＤＮＡ修飾酵素またはＲＮＡ修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、請求項８７から９４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を前記粒子の存在下で増幅する、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前にまず前記粒子から分離する、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ポリメラーゼ酵素がＰｙｒｏｐｈａｇｅまたはＴｔＨである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素および別々のポリメラーゼ酵素を含む、請求項７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ポリメラーゼ酵素がＴａｑ、Ｂｓｔ、および／またはＰｈｉ２９から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、請求項７１から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記標的核酸および／または前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、請求項７１から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＣＲを、単一のプライマーセットを用いて実施する、請求項９７から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＰＣＲを、１種のプライマーを用いて実施する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＰＣＲを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、請求項９７から１０８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＰＣＲを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ（Ａ）プライマーの組合せを使用して実施する、請求項９７から１０９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、請求項７１から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたｄＮＴＰおよび／または挿入色素として提供される、請求項７１から１１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、請求項７１から１１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記担体が増幅時間中存在する、請求項７１から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、請求項７１から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、５つ未満のプライマー対を使用して実施する、請求項７１から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＰＣＲに、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、請求項９７から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記フォワードプライマーを前記ＰＣＲ反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が１：２未満である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、請求項７１から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
ステップの間に前記粒子をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および／またはアダプターを除去する、請求項７１から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を１つまたは複数含有する、請求項７１から１２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、ｄＮＴＰ濃度、または、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、２−ピロリドン、もしくはＤＮＡ二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、請求項７１から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記試料が生体試料である、請求項７１から１２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記生体試料が、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、請求項７１から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記フロースルーデバイスがフローサイトメーターまたはアレイスキャナーである、請求項７２から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記シグナルを定量化する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記１つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、請求項７１から１３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記各粒子が、スペクトル特性が既知である１つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記増幅された１つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、請求項７１から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、請求項７１から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、請求項７１から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、請求項７１から１３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１％未満である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の０．１％未満である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の１未満である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１千万分の１未満である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４４】
請求項１から１４３までのいずれか一項に記載の１つまたは複数の標的核酸を検出するステップを含む、診断を支援するための方法。
【請求項１４５】
標的核酸を検出するためのキットであって、
粒子であって、標的捕捉配列を含むプローブを担持する１つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上のプローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する１つまたは複数のエンコーディング領域を含む、粒子；
所定のイオン強度、緩衝化されたｐＨ、および変性試薬を伴うハイブリダイゼーション緩衝液；
ポリメラーゼ連鎖反応プライミングおよび／または逆転写のための部位として働くように設計されたアダプターを含む標識化緩衝液；
プライマー、ｄＮＴＰ、および捕捉された標的を増幅するための試薬を含有するＰＣＲ緩衝液
を含む、キット。
【請求項１４６】
リガーゼを含む、請求項１４５に記載のキット。
【請求項１４７】
逆転写酵素およびポリメラーゼをさらに含む、請求項１４５または１４６に記載のキット。
【請求項１４８】
逆転写酵素活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項１４５または１４６に記載のキット。
【請求項１４９】
前記変性試薬がホルムアミドおよび／または２−ピロリドンである、請求項１４５から１４８までのいずれか一項に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
標的核酸を検出する方法であって、
ａ）試料を、それぞれが少なくとも１つの標的捕捉配列を含む１つまたは複数の捕捉用プローブと、前記１つまたは複数の捕捉用プローブが前記試料中の１つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ；
ｂ）前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ；
ｃ）増幅産物を複数の再捕捉用プローブとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ；
ｄ）前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体によって生じるシグナルを検出するステップであって、前記検出可能なシグナルの存在および／または存在量により、前記試料中の前記１つまたは複数の標的核酸の存在および／または存在量が示される、ステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記捕捉用プローブのそれぞれが、１つの標的捕捉配列を含み、かつ１つの別個の標的核酸に特異的に結合する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記再捕捉用プローブのそれぞれが、１つの標的捕捉配列を含み、かつ１つの別個の標的核酸に特異的に結合する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記再捕捉用プローブのそれぞれが、複数の別個の標的捕捉配列を含み、かつ複数の別個の標的核酸に結合する、項目１から３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記捕捉用プローブが同一のものであり、前記再捕捉用プローブが同一のものである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記捕捉用プローブおよび／または前記再捕捉用プローブが担体に結びついている、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記担体が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、ＰＬＧＡ、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記材料がヒドロゲルである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記担体がパターン化平面担体、マイクロチップ、プラスチック、ビーズ、バイオフィルム、粒子である、項目７または８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記担体が粒子である、項目７から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが前記粒子の１つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記粒子が、１つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記１つまたは複数のエンコーディング領域が前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記１つまたは複数の標的核酸がマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コード転写物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
１つまたは複数のアダプターを前記捕捉された標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記１つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記１つまたは複数のアダプターを、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１つまたは複数のアダプターがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、項目１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記捕捉された標的核酸を、前記１つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖５’領域および／または３’領域を除去する、項目１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、項目１７から２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、項目１７から２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ライゲーションをＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ酵素によって実施する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記１つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のＤＮＡ修飾酵素またはＲＮＡ修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、項目１７から２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＰＣＲ反応でＴａｑ、Ｂｓｔ、および／またはＰｈｉ２９から選択されるポリメラーゼ酵素を使用する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
逆転写が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素によって触媒される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ポリメラーゼ酵素がＰｙｒｏｐｈａｇｅまたはＴｔＨである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
逆転写が１つの酵素によって触媒され、ＰＣＲ増幅が第２の酵素によって行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記標的核酸および／または前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＰＣＲを、単一のプライマーセットを用いて実施する、項目２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ＰＣＲを、１種のプライマーを用いて実施する、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記ＰＣＲを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、項目２７から３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＰＣＲを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ（Ａ）プライマーの組合せを使用して実施する、項目２７から３７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたｄＮＴＰおよび／または挿入色素として提供される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記担体が増幅時間中存在する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、５つ未満のプライマー対を使用して実施する、項目１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ＰＣＲに、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、項目２７から４５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記フォワードプライマーを前記ＰＣＲ反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が１：２未満である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
ステップの間に前記担体をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および／またはアダプターを除去する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を１つまたは複数含有する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、ｄＮＴＰ濃度、または、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、２−ピロリドン、もしくはＤＮＡ二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記試料が生体試料である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記生体試料が、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記シグナルを定量化する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記１つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記各粒子が、スペクトル特性が既知である１つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記増幅された１つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、項目１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１％未満である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の０．１％未満である、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の１未満である、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１千万分の１未満である、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
標的核酸を検出する方法であって、
ａ）１つまたは複数の標的核酸を含む試料を、それぞれが少なくとも１つの標的捕捉配列を含む複数の捕捉用プローブを担持する粒子の第１のセットと、前記複数の捕捉用プローブが前記試料中の１つまたは複数の標的核酸を捕捉することを可能にする条件下で接触させるステップ；
ｂ）前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、検出可能な実体を含む反応混合物中で増幅するステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が、前記検出可能な実体で標識化される、ステップ；
ｃ）増幅産物を、複数の再捕捉用プローブを担持する粒子の第２のセットとともにインキュベートするステップであって、前記ステップにより、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸が前記複数の再捕捉用プローブによって再捕捉される、ステップ
を含み、ここで、
各粒子が前記複数の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブを担持する１つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上の捕捉用プローブまたは再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する１つまたは複数のエンコーディング領域を有し、
前記粒子の第２のセット上の前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸と結びついた検出可能な実体により生じる検出可能なシグナルの存在および／または存在量により、前記試料中の前記１つまたは複数の標的核酸の存在および／または存在量が示される、
方法。
（項目７２）
前記粒子の第２のセットをフロースルーデバイスによって走査して、前記再捕捉された増幅された１つまたは複数の標的核酸に結びついた前記検出可能なシグナルの存在および／または存在量ならびに前記粒子の１つまたは複数のエンコーディング領域に結びついた前記検出可能な部分を検出するステップを含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記粒子の第１のセットが、別個の捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、項目７１または７２に記載の方法。
（項目７４）
各粒子が、複数の同一の捕捉用プローブを担持する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記粒子の第２のセットが、別個の再捕捉用プローブを担持する別個の粒子を含む、項目７１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
各粒子が、複数の同一の再捕捉用プローブを担持する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記粒子の第１のセットと第２のセットが同一である、項目７１から７６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記粒子の第１のセットと第２のセットが同じセットである、項目７１から７７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記粒子が、ヒドロゲル、ガラス、フォトレジスト、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、アガロース、キトサン、アルギナート、ＰＬＧＡ、光ファイバー、セルロース、およびその組合せからなる群より選択される材料から作製されている、項目７１から７８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記粒子がヒドロゲル粒子である、項目７１から７８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記粒子の少なくとも１つの寸法が約１μｍ超から約４５０μｍまでである、項目７１から８０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、前記粒子の１つまたは複数のプローブ領域全体にわたって包埋されている、項目７１から８１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記粒子が、１つまたは複数のエンコーディング領域をさらに含み、前記１つまたは複数のエンコーディング領域が、前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記１つまたは複数の標的核酸がマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コード転写物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、項目７１から８３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、項目７１から８４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記標的核酸に特異的なプローブが、前記標的核酸と実質的に相補的な標的捕捉配列を含む、項目７１から８５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
１つまたは複数のアダプターを前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸とカップリングするステップをさらに含む、項目７１から８６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記１つまたは複数のアダプターが普遍的アダプターである、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記１つまたは複数のアダプターを、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方で前記標的核酸とカップリングする、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記１つまたは複数のアダプターがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはその組合せである、項目８７から８９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記捕捉された標的核酸を、前記１つまたは複数のアダプターのカップリングの前に、まずヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化して一本鎖５’領域および／または３’領域を除去する、項目７１から９０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記捕捉用プローブのそれぞれが、前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列をさらに含む、項目７１から９１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記１つまたは複数のアダプターと相補的な配列が前記標的捕捉配列に隣接している、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションによって前記標的核酸とカップリングする、項目８７から９３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記ライゲーションをＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ酵素によって実施する、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記１つまたは複数のアダプターが、ポリメラーゼ連鎖反応プライミング、逆転写、または他のＤＮＡ修飾酵素またはＲＮＡ修飾酵素による修飾のための部位として働くように特異的に設計された配列を含む、項目８７から９４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を前記粒子の存在下で増幅する、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前にまず前記粒子から分離する、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記捕捉された標的を増幅する前に逆転写する、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記ポリメラーゼ酵素がＰｙｒｏｐｈａｇｅまたはＴｔＨである、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
増幅のための前記反応混合物が、逆転写酵素および別々のポリメラーゼ酵素を含む、項目７１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記ポリメラーゼ酵素がＴａｑ、Ｂｓｔ、および／またはＰｈｉ２９から選択される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記捕捉された標的核酸を増幅するステップを等温で実施する、項目７１から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記標的核酸および／または前記１つまたは複数のアダプターをライゲーションまたは酵素的重合によって環状化する、項目７１から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記ＰＣＲを、単一のプライマーセットを用いて実施する、項目９７から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記ＰＣＲを、１種のプライマーを用いて実施する、項目１０６に記載の方法。
（項目１０９）
前記ＰＣＲを、前記担体に付着させたプライマーを用いて実施する、項目９７から１０８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＰＣＲを、普遍的プライマー、特異的プライマー、またはポリ（Ａ）プライマーの組合せを使用して実施する、項目９７から１０９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記検出可能な実体が、フルオロフォア、色素、ビオチン、放射性同位元素、抗体、アプタマー、ポリペプチド、量子ドット、発色団からなる群より選択される、項目７１から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記検出可能な実体が、前記反応混合物中に、標識化されたプライマー、標識化されたｄＮＴＰおよび／または挿入色素として提供される、項目７１から１１１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、増幅する前に前記捕捉用プローブから分離する、項目７１から１１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を、熱、化学的変性剤、またはヘリカーゼ酵素を使用した変性によって前記捕捉用プローブから分離する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記担体が増幅時間中存在する、項目７１から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、単一のプライマーを使用して実施する、項目７１から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記捕捉された１つまたは複数の標的核酸を増幅するステップを、５つ未満のプライマー対を使用して実施する、項目７１から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記ＰＣＲに、前記増幅された１つまたは複数の標的核酸の相当な割合が一本鎖になるようにバイアスをかける、項目９７から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
アニーリング温度がリバースプライマーよりも有意に低いフォワードプライマーを設計することによって、前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記フォワードプライマーを前記ＰＣＲ反応の間に使い尽くされるような濃度で添加することによって前記ＰＣＲに一本鎖の増幅された標的核酸の方向にバイアスをかける、項目１１８に記載の方法。
（項目１２１）
前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーの比が１：２未満である、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記増幅産物および前記複数の再捕捉用プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、項目７１から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
ステップの間に前記粒子をすすいで、結合していないプローブ、標的核酸および／またはアダプターを除去する、項目７１から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記捕捉用プローブまたは前記再捕捉用プローブが、標的核酸に対するミスマッチ塩基を１つまたは複数含有する、項目７１から１２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記条件を、ストリンジェントな捕捉をもたらすために、温度、時間、一価塩濃度、二価塩濃度、ｄＮＴＰ濃度、または、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ポリエチレングリコール、２−ピロリドン、もしくはＤＮＡ二重鎖形成の動態を変更する他の作用剤の添加を制御することによって調整する、項目７１から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記試料が生体試料である、項目７１から１２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記生体試料が、単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの調製物、プロテアーゼ組織消化物、細胞溶解物、血清、血漿、全血、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物、経頸管洗浄液、およびその組合せである、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記検出可能な実体によって生じるシグナルをフローサイトメーターまたはアレイスキャナーによって検出する、項目７１から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記フロースルーデバイスがフローサイトメーターまたはアレイスキャナーである、項目７２から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記シグナルを定量化する、項目１２８に記載の方法。
（項目１３１）
前記１つまたは複数の捕捉用プローブが、複数の標的核酸に特異的な複数の捕捉用プローブを含む、項目７１から１３０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記複数のプローブが複数の粒子と結びついており、各粒子が同じ標的核酸に特異的なプローブを含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記各粒子が、前記粒子上の特異的なプローブの同一性をもたらすようにエンコーディングされている、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記各粒子が、スペクトル特性が既知である１つまたは複数のフルオロフォアを組み入れることによってエンコーディングされている、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記複数の捕捉用プローブが、平面担体の複数の別個の領域上に位置する、項目１３２に記載の方法。
（項目１３６）
前記増幅された１つまたは複数の標的核酸を再捕捉するステップを、前記捕捉ステップよりも実質的にストリンジェントな条件下で実施する、項目７１から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される単一のプライマーセットを含む、項目７１から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記反応混合物が、複数の別個の標的核酸を増幅するために使用される複数のプライマーセットを含む、項目７１から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
各標的核酸が前記試料において低存在量で存在する、項目７１から１３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１％未満である、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の０．１％未満である、項目１３９に記載の方法。
（項目１４２）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の百万分の１未満である、項目１３９に記載の方法。
（項目１４３）
各標的核酸が前記生体試料中の全核酸の１千万分の１未満である、項目１３９に記載の方法。
（項目１４４）
前記項目のいずれか一項に記載の１つまたは複数の標的核酸を検出するステップを含む診断方法。
（項目１４５）
標的核酸を検出するためのキットであって、
粒子であって、標的捕捉配列を含むプローブを担持する１つまたは複数のプローブ領域、および前記粒子上のプローブの同一性をもたらす検出可能な部分を担持する１つまたは複数のエンコーディング領域を含む、粒子；
所定のイオン強度、緩衝化されたｐＨ、および変性試薬を伴うハイブリダイゼーション緩衝液；
ポリメラーゼ連鎖反応プライミングおよび／または逆転写のための部位として働くように設計されたアダプターを含む標識化緩衝液；
プライマー、ｄＮＴＰ、および捕捉された標的を増幅するための試薬を含有するＰＣＲ緩衝液
を含む、キット。
（項目１４６）
リガーゼを含む、項目１４５に記載のキット。
（項目１４７）
逆転写酵素およびポリメラーゼをさらに含む、項目１４５または１４６に記載のキット。
（項目１４８）
逆転写酵素活性を有するポリメラーゼをさらに含む、項目１４５または１４６に記載のキット。
（項目１４９）
前記変性試薬がホルムアミドおよび／または２−ピロリドンである、項目１４５から１４８までのいずれか一項に記載のキット。
図面は、例示するためだけのものであり、限定するものではない。