(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチドと生体適合性物質が脂肪酸誘導体を介して連結された、タンパク質結合体であって、
前記脂肪酸誘導体が、前記結合体の形成前に少なくとも２つの反応基を有し、
少なくとも１つの反応基が、Ｃ1-3アルキルアミノ又は（Ｃ1-3アルコキシ）n（Ｃ1-3アルキルアミノ）鎖（ここで、ｎは１〜３の整数）を含むリンカーを介して、脂肪酸骨格に連結され、
前記脂肪酸誘導体が、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質のそれぞれに、前記反応基を介して連結され、
前記生体適合性物質が、免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチドであり、
前記脂肪酸誘導体が、前記結合体の形成前に以下の構造を有する、タンパク質結合体：
【化１】
0006989503.tif 000006
又は
【化２】
0006989503.tif 000007
。
【請求項２】
前記生理活性ポリペプチド及び前記生体適合性物質が脂肪酸誘導体とそれぞれ共有結合により連結された、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項３】
前記生体適合性物質に生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の連結体が少なくとも１つ連結された、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質もしくは受容体、細胞表面抗原又は受容体拮抗物質である、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項５】
前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン、ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）、オキシントモジュリン、キセニン（Xenin）、インスリン、ＣＣＫ（Cholecystokinin）、アミリン（amylin）、ガストリン（gastrin）、グレリン（ghrelin）、ＰＹＹ（peptide YY）などのように胃や腸で血糖と体重を調節するインクレチン類（incretins）；レプチン（Leptin）、アディポネクチン（adiponectin）、アディポリン（adipolin）、アペリン（apelin）、カルトネクチン（cartonectin）のように脂肪質（adipose）から分泌されるアディポカイン類（adipokines）；キスペプチン（Kisspeptin）、ネスファチン−１（Nesfatin-1）のように脳から分泌されるニューロペプチド類（neuropeptides）；イリシン（Irisin）、マイオネクチン（myonectin）、デコリン（decorin）、フォリスタチン（follistatin）、マスクリン（musclin）のように筋肉（muscle）から分泌されるペプチド又はタンパク質類；血管作動性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、ナトリウム利尿ペプチド類（natriuretic peptides）、好中球増加因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、Ｇタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体並びに抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項６】
前記生理活性ポリペプチドは、少なくとも２つの受容体を同時に活性化することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されている、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ（hinge）領域をさらに含む、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ（combination）及びそれらのハイブリッド（hybrid）からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質結合体を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの反応基を有する脂肪酸誘導体を介して生理活性ペプチドと生体適合性物質を連結するステップと、
（ｂ）前記（ａ）ステップの反応結果物であるタンパク質結合体を分離するステップとを含む、タンパク質結合体を製造する方法。
【請求項１２】
前記（ａ）ステップは、
（ａ１）脂肪酸誘導体の一方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方を連結するステップと、
（ａ２）前記（ａ１）ステップの反応混合物から脂肪酸に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方が連結された連結体を分離するステップと、
（ａ３）前記（ａ２）ステップで分離された連結体の脂肪酸誘導体の他方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドの他方を連結し、脂肪酸の反応基がそれぞれ生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質に連結されたタンパク質結合体を生成するステップとを含む、請求項１１に記載のタンパク質結合体を製造する方法。
【請求項１３】
前記（ａ１）ステップ及び前記（ａ３）ステップは、還元剤の存在下で行われる、請求項１２に記載のタンパク質結合体を製造する方法。
【請求項１４】
前記還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩、ピコリンボランコンプレックス又はピリジンホウ酸塩（borane pyridine）である、請求項１３に記載のタンパク質結合体を製造する方法。
【請求項１５】
前記（ａ１）ステップにおいて、生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の反応モル比は１：１〜１：２０であり、生体適合性物質と脂肪酸の反応モル比は１：１〜１：２０である、請求項１２に記載のタンパク質結合体を製造する方法。
【請求項１６】
前記（ａ３）ステップにおいて、（ａ２）ステップで分離された連結体と生体適合性物質又は生理活性ポリペプチドの反応モル比は１：０．５〜１：２０である、請求項１２に記載のタンパク質結合体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質が脂肪酸誘導体を介して連結されて生理活性持続期間が天然のものに比べて延長されたタンパク質結合体及びそれを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、生理活性ポリペプチドは、安定性が低いため変性しやすく、血液内のプロテアーゼにより分解されて腎臓や肝臓で容易に除去される。よって、薬理成分として生理活性ポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、主に注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品において、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射することは患者に多大な苦痛をもたらす。前記問題を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を向上させ、血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続して薬効を最大化するための多くの努力がなされてきた。このようなタンパク質薬物の持続性製剤は、タンパク質薬物の安定性を向上させるものであると共に、患者に免疫反応を誘発しないものでなければならない。
【０００３】
タンパク質を安定化させてプロテアーゼとの接触及び腎臓での除去を抑制する方法として、従来はポリエチレングリコール（polyethylene glycol，以下「ＰＥＧ」）のように溶解度が高い高分子をタンパク質薬物の表面に化学的に付加させるタンパク質のＰＥＧ化（Pegylation）が用いられてきた。ＰＥＧは、標的タンパク質の特定部位又は各種部位に非特異的に結合して溶解度を向上させることによりタンパク質を安定化させ、タンパク質の加水分解を防止する効果があり、特に副作用もないことが知られている（非特許文献１）。しかし、ＰＥＧの結合によりタンパク質の安定性は向上させることができるが、生理活性タンパク質の力価が著しく低下し、ＰＥＧの分子量が増加するにつれてタンパク質との反応性が低下して収率が減少するという問題があり、半減期の延長も十分でないことが知られている。
【０００４】
また、従来は、脂肪酸を生理活性ポリペプチドの薬物表面に化学的に付加させる方法も用いられてきた。このように脂肪酸を薬物表面に結合させる場合、長期持続性薬物としての効果を発揮することは困難であった。
【０００５】
よって、当該分野においては、生体内で生理活性ポリペプチドをより安定化させ、腎臓での除去を抑制し、生理活性ポリペプチドの血中半減期を長く維持する方法の開発が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献２】国際公開第９６／０３２４７８号
【特許文献３】米国特許第８１２９３４３号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１５／０６７７１５号
【特許文献５】国際公開第２０１５／０５５８０１号
【特許文献６】国際公開第２０１３／０４１６７８号
【特許文献７】国際公開第２０１４／１３３３２４号
【特許文献８】国際公開第２０１４／００９３１６号
【特許文献９】国際公開第２０１５／０５２０８８号
【特許文献１０】韓国登録特許第１０−０８２４５０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 71: pp 137-139, 1991
【非特許文献２】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＰＥＧ化によりタンパク質安定性を向上させるのではなく、脂肪酸誘導体をリンカーとして用いて、生理活性ポリペプチドとタンパク質の生体内安定性を向上させる生体適合性物質を共有結合させることにより、生理活性ポリペプチドをさらに安定化させ、腎臓での除去を抑制し、生理活性ポリペプチドの血中半減期を画期的に延長させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質が脂肪酸誘導体を介して連結されたタンパク質結合体を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、前記タンパク質結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、生理活性タンパク質の血中半減期を延長させるために、脂肪酸を介して生理活性ポリペプチドと生体適合性物質を連結させたタンパク質結合体を提供することを目的とする。具体的には、前記生理活性ポリペプチドと生体適合性物質は、リンカーである脂肪酸の反応基を介して連結されたものであってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体適合性物質、脂肪酸誘導体及び生理活性ポリペプチドが連結されたタンパク質結合体は、生理活性ポリペプチドの血中半減期を延長させることが確認されたので、タンパク質薬物分野において広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施例により製造された、免疫グロブリンＦｃ結合体、並びにＧＬＰ−１、グルカゴン及びＧＰＩ受容体を同時に活性化する三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。Ｍはマーカーを示し、１は非還元免疫グロブリンＦｃ結合体を示し、２及び３はそれぞれ非還元及び還元タンパク質結合体を示す。
【図２】本発明の一実施例により製造された、免疫グロブリンＦｃ結合体、及び三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体のインビボ薬物動態測定結果を示す図である。具体的には、比較群として従来の三重活性体を用いて、時間に応じた薬物の血中濃度変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一態様は、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質が脂肪酸誘導体を介して連結されたタンパク質結合体である。
【００１５】
一具体例として、本発明によるタンパク質結合体は、前記生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質が脂肪酸誘導体とそれぞれ共有結合により連結されたことを特徴とする。具体的には、前記脂肪酸誘導体は、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質を連結するリンカーとして作用する。
【００１６】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体は、脂肪酸骨格に直接又はリンカーを介して連結された少なくとも２つの反応基を有し、前記反応基を介して生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質とそれぞれ連結されたことを特徴とする。
【００１７】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体の反応基は、それぞれ独立して２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、アリールジスルフィド、ヘテロアリールジスルフィド、ハロアセトアミド（haloacetamide）又はＣ7-10アルキニル（alkynyl）であることを特徴とする。
【００１８】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体の反応基は、マレイミド、Ｎ−ヒドロスクシンイミド、スクシンイミド、Ｃ1-4アルキレンアルデヒド、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide; OPSS）、ヨードアセトアミド（iodoacetamide; IA）、前記ヨードの代わりに臭素、フッ素、塩素又はアスタチンを含むハロアセトアミド、ジフルオロシクロオクチン（difluorocyclooctyne; DIFO）、ジベンゾシクロオクチン（dibenzocyclooctyne; DIBO）、ジベンゾ−アザ−シクロオクチン（Dibenzo-aza-cyclooctyne; DIBACもしくはDBCO）、ビアリールアザシクロオクチノン（biarylazacyclooctynones; BARAC）、テトラメチルチアシクロヘプチン（tetramethylthiacycloheptyne; TMTH）、ビシクロノニン（bicyclononyne; BCN）ソンドハイマージイン（Sondheimer diyne）、シクロオクチン（cyclooctyne; OCT）、モノフッ素化シクロオクチン（monofluorinated cyclooctyne; MOFO）、ジメトキシアザシクロオクチン（dimethoxyazacyclooctyne; DIMAC）、２，３，６，７−テトラメトキシ−ジベンゾシクロオクチン（2, 3, 6, 7-tetramethoxy-DIBO, TMDIBO）、スルホン化ジベンゾシクロオクチン（sulfonylated DIBO; S-DIBO）、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン（carboxymethylmonobenzocyclooctyne; COMBO）、ピロロシクロオクチン（pyrrolocyclooctyne; PYRROC）又はアルキン（alkyne）であることを特徴とする。
【００１９】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体のリンカーは、Ｃ1-3アルキルアミノ、（Ｃ1-3アルコキシ）n（Ｃ1-3アルキルアミノ）鎖を含むことを特徴とする。
【００２０】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる生体適合性物質に生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の連結体が少なくとも１つ連結されたことを特徴とする。
【００２１】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質もしくは受容体、細胞表面抗原又は受容体拮抗物質であることを特徴とする。
【００２２】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる生理活性ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン、ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）、オキシントモジュリン、キセニン（Xenin）、インスリン、ＣＣＫ（Cholecystokinin）、アミリン（amylin）、ガストリン（gastrin）、グレリン（ghrelin）、ＰＹＹ（peptide YY）などのように胃や腸で血糖と体重を調節するインクレチン類（incretins）；レプチン（Leptin）、アディポネクチン（adiponectin）、アディポリン（adipolin）、アペリン（apelin）、カルトネクチン（cartonectin）のように脂肪質（adipose）から分泌されるアディポカイン類（adipokines）；キスペプチン（Kisspeptin）、ネスファチン−１（Nesfatin-1）のように脳から分泌されるニューロペプチド類（neuropeptides）；イリシン（Irisin）、マイオネクチン（myonectin）、デコリン（decorin）、フォリスタチン（follistatin）、マスクリン（musclin）のように筋肉（muscle）から分泌されるペプチド又はタンパク質類；血管作動性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、ナトリウム利尿ペプチド類（natriuretic peptides）、好中球増加因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、Ｇタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体並びに抗体フラグメントからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２３】
他の具体例として、本発明による生理活性ポリペプチドは、少なくとも２つの受容体を同時に活性化することを特徴とする。
【００２４】
他の具体例として、本発明による生理活性ポリペプチドは、天然に存在するものでない、天然生理活性ポリペプチドの誘導体から選択されることを特徴とする。生理活性ポリペプチドの誘導体とは、アミノ酸の置換、挿入、欠失、糖鎖付加、糖鎖欠失、非天然アミノ酸挿入、リング挿入、メチル残基のような化学的修飾などにより固有の受容体に対する結合力が変化したものや、物理化学的な性質、すなわち水溶性向上、免疫原性低下のように性質が変異したものを意味し、２つ以上の各種受容体に結合力を有するように操作された人工のペプチド類も含まれる。
【００２５】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる生体適合性物質は、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織又はその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、高分子重合体並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２６】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチドであることを特徴とする。
【００２７】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されていることを特徴とする。
【００２８】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ（hinge）領域をさらに含むことを特徴とする。
【００２９】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ（combination）及びそれらのハイブリッド（hybrid）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３０】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントであることを特徴とする。
【００３１】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体は、炭素数１〜４０の飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸の誘導体であることを特徴とする。
【００３２】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる前記脂肪酸は、ギ酸（ＨＣＯＯＨ，formic acid）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、プロピオン酸（Ｃ2Ｈ5ＣＯＯＨ）、酪酸（Ｃ3Ｈ7ＣＯＯＨ）、吉草酸（Ｃ4Ｈ9ＣＯＯＨ）、カプロン酸（Ｃ5Ｈ11ＣＯＯＨ）、エナント酸（Ｃ6Ｈ13ＣＯＯＨ）、カプリル酸（Ｃ7Ｈ15ＣＯＯＨ）、ペラルゴン酸（Ｃ8Ｈ17ＣＯＯＨ）、カプリン酸（Ｃ9Ｈ19ＣＯＯＨ）、ウンデシル酸（Ｃ10Ｈ21ＣＯＯＨ）、ラウリン酸（Ｃ11Ｈ23ＣＯＯＨ）、トリデシル酸（Ｃ12Ｈ25ＣＯＯＨ）、ミリスチン酸（Ｃ13Ｈ27ＣＯＯＨ）、ペンタデシル酸（Ｃ14Ｈ29ＣＯＯＨ）、パルミチン酸（Ｃ15Ｈ31ＣＯＯＨ）、マルガリン酸（Ｃ16Ｈ33ＣＯＯＨ）、ステアリン酸（Ｃ17Ｈ35ＣＯＯＨ）、ノナデシル酸（Ｃ18Ｈ37ＣＯＯＨ）、アラキジン酸（Ｃ19Ｈ39ＣＯＯＨ）、ベヘン酸（Ｃ21Ｈ43ＣＯＯＨ）、リグノセリン酸（Ｃ23Ｈ47ＣＯＯＨ）、セロチン酸（Ｃ25Ｈ51ＣＯＯＨ）、ヘプタコサン酸（Ｃ26Ｈ53ＣＯＯＨ）、モンタン酸（Ｃ28Ｈ57ＣＯＯＨ）、メリシン酸（Ｃ29Ｈ59ＣＯＯＨ）、ラッセル酸（Ｃ31Ｈ63ＣＯＯＨ）、アクリル酸（ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＨ）、クロトン酸（ＣＨ3ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ）、イソクロトン酸（ＣＨ3ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ）、ウンデシレン酸（ＣＨ2＝ＣＨ（ＣＨ2）8ＣＯＯＨ）、オレイン酸（Ｃ17Ｈ33ＣＯＯＨ）、エライジン酸（Ｃ17Ｈ33ＣＯＯＨ）、セトレイン酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、エルカ酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、ブラシジン酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、ソルビン酸（Ｃ5Ｈ7ＣＯＯＨ，Ｆ２）、リノール酸（Ｃ17Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ２）、リノレン酸（Ｃ17Ｈ29ＣＯＯＨ，Ｆ３）、アラキドン酸（Ｃ19Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ４）、プロピオール酸（ＣＨ≡ＣＣＯＯＨ）及びステアロール酸（Ｃ17Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ１）からなる群から選択される脂肪酸又はその誘導体であることを特徴とする。
【００３３】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる脂肪酸は、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸又はオレイン酸の脂肪酸又はその誘導体であることを特徴とする。
【００３４】
本発明の他の態様は、（ａ）少なくとも２つの反応基を有する脂肪酸誘導体を介して生理活性ペプチドと生体適合性物質を連結するステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップの反応結果物であるタンパク質結合体を分離するステップとを含む、タンパク質結合体を製造する方法である。
【００３５】
一具体例として、本発明による製造方法の前記（ａ）ステップは、（ａ１）脂肪酸誘導体の一方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方を連結するステップと、（ａ２）前記（ａ１）ステップの反応混合物から脂肪酸誘導体に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方が連結された連結体を分離するステップと、（ａ３）前記（ａ２）ステップで分離された連結体の脂肪酸誘導体の他方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドの他方を連結し、脂肪酸誘導体の反応基がそれぞれ生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質に連結されたタンパク質結合体を生成するステップとを含むことを特徴とする。
【００３６】
他の具体例として、本発明による製造方法の前記（ａ１）ステップ及び前記（ａ３）ステップは、還元剤の存在下で行われることを特徴とする。
【００３７】
他の具体例として、本発明による製造方法の前記還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩、ピコリンボランコンプレックス又はピリジンホウ酸塩（borane pyridine）であることを特徴とする。
【００３８】
他の具体例として、本発明による製造方法の前記（ａ１）ステップにおいて、生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の反応モル比は１：１〜１：２０であり、生体適合性物質と脂肪酸誘導体の反応モル比は１：１〜１：２０であることを特徴とする。
【００３９】
他の具体例として、本発明による製造方法の前記（ａ３）ステップにおいて、（ａ２）ステップで分離された連結体と生体適合性物質又は生理活性ポリペプチドの反応モル比は１：０．５〜１：２０であることを特徴とする。
【実施例】
【００４０】
本発明の一態様は、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質が脂肪酸誘導体を介して連結されたタンパク質結合体を提供する。特に、本発明のタンパク質結合体は、前記生理活性ポリペプチド及び前記生体適合性物質が脂肪酸誘導体とそれぞれ共有結合により連結されたものであってもよい。
【００４１】
本発明における「生理活性ポリペプチド」とは、前記結合体の一部（moiety）をなす一構成であり、生体内で何らかの生理作用を有するポリペプチドを総称する概念であり、ポリペプチド構造を有するという共通点を有し、様々な生理活性を有する。前記生理活性ポリペプチドには、遺伝表現と生理機能を調整することにより、生体内における機能調節に関与する物質の欠乏や過度な分泌により正常でない病態を示す場合にそれを正常にする役割を果たすものが含まれ、一般的なタンパク質治療剤も含まれる。また、前記生理活性ポリペプチドは、天然ポリペプチドだけでなく、その誘導体も全て含む概念である。
【００４２】
本発明の結合体において、生理活性ポリペプチドは、本発明の結合体構造により血中半減期延長を示す生理活性ポリペプチドであれば、特にその種類やサイズが限定されるものではない。
【００４３】
本発明の生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質又は受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質であることを特徴とする。
【００４４】
他の具体例として、本発明によるタンパク質結合体に含まれる生理活性ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン、ＧＩＰ、オキシントモジュリン、キセニン、インスリン、ＣＣＫ、アミリン、ガストリン、グレリン、ＰＹＹなどのように胃や腸で血糖と体重を調節するインクレチン類；レプチン、アディポネクチン、アディポリン、アペリン、カルトネクチンのように脂肪質から分泌されるアディポカイン類；キスペプチン、ネスファチン−１のように脳から分泌されるニューロペプチド類；イリシン、マイオネクチン、デコリン、フォリスタチン、マスクリンのように筋肉から分泌されるペプチド又はタンパク質類；血管作動性腸管ペプチド、ナトリウム利尿ペプチド類、好中球増加因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、Ｇタンパク質共役受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体並びに抗体フラグメントからなる群から選択されることを特徴とする。
【００４５】
他の具体例として、本発明による生理活性ポリペプチドは、天然に存在するものでない、天然生理活性ポリペプチドの誘導体から選択されることを特徴とする。生理活性ポリペプチドの誘導体とは、アミノ酸の置換、挿入、欠失、糖鎖付加、糖鎖欠失、非天然アミノ酸挿入、リング挿入、メチル残基のような化学的修飾などにより固有の受容体に対する結合力が変化したものや、物理化学的な性質、すなわち水溶性向上、免疫原性低下のように性質が変異したものを意味し、２つ以上の各種受容体に結合力を有するように操作された人工のペプチド類も含まれる。
【００４６】
本発明における「生理活性ポリペプチド」、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」又は「タンパク質薬物」とは、生体内で生理的現象に拮抗作用を示すポリペプチド又はタンパク質を意味するものであり、相互交換的に用いられる。
【００４７】
本発明における「生体適合性物質」とは、前記結合体の一部（moiety）をなす一構成であり、生理活性ポリペプチドに結合されて生体内半減期を延長させる物質を意味する。本発明における「生体適合性物質」とは、生体内半減期を延長させられる物質であるので「キャリア」ともいい、相互交換的に用いられる。前記生体適合性物質又は前記キャリアは、生理活性ポリペプチドに結合されてその半減期を延長させられる物質を全て含むものであり、例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織又はその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、高分子重合体並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであるが、これらに限定されるものではない。前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むポリペプチドであってもよく、例えばＩｇＧ Ｆｃであってもよい。前記生体適合性物質又はキャリアは、脂肪酸誘導体を介して生理活性ポリペプチドに結合されてもよい。
【００４８】
ポリエチレングリコールをキャリアとして用いる場合、位置特異的にポリエチレングリコールを付着することができるＡｍｂｒｘ社のＲｅｃｏｄｅ技術が用いられてもよく、糖鎖部位に特異的に付着することができるＮｅｏｓｅ社のグリコＰＥＧ化（glycopegylation）技術が用いられてもよい。また、生体内でポリエチレングリコールが徐々に除去されるｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＰＥＧ技術が用いられてもよいが、これに限定されるものではなく、ＰＥＧを用いて生体内利用率を向上させる技術が用いられてもよい。さらに、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸などの高分子重合体が前記技術により本発明の結合体に結合されてもよい。
【００４９】
本発明において、アルブミンをキャリアとして用いる場合、本発明のタンパク質結合体は、アルブミン又はアルブミンフラグメントが脂肪酸誘導体に直接共有結合された結合体であってもよく、アルブミンを直接結合しなくてもアルブミンに結合する物質、例えばアルブミン特異的結合抗体又は抗体フラグメントを脂肪酸誘導体に結合させてアルブミンに結合した結合体であってもよい。また、アルブミンに結合力を有する特定ペプチド／タンパク質／化合物などを脂肪酸誘導体に結合することにより結合されるタンパク質結合体であってもよく、アルブミンに結合力を有する脂肪酸自体が結合されたタンパク質結合体であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明において、抗体又は抗体フラグメントをキャリアとして用いることができ、それはＦｃＲｎ結合部位を有する抗体又は抗体フラグメントであってもよく、ＦａｂなどのＦｃＲｎ結合部位を含まない抗体フラグメントであってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域をキャリアとして用いることができる。
【００５１】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の作製、精製及び収率の面で有利であるだけでなく、アミノ酸配列が抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。
【００５２】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖定常領域を意味する。ただし、前記Ｆｃフラグメントは、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。
【００５３】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃフラグメントであってもよい。
【００５４】
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の作製、精製及び収率の面で有利であるだけでなく、アミノ酸配列が抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。
【００５５】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（mutant）も含まれる。アミノ酸配列変異体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。
【００５６】
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された変異体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去された変異体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された変異体など、様々な変異体が用いられてもよい。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃフラグメントの配列誘導体を作製する技術は、特許文献１、２などに開示されている。
【００５７】
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献２）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００５８】
場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００５９】
記述したＦｃ変異体は、本発明のＦｃフラグメントと同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃフラグメントの熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた変異体である。
【００６０】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法においては、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得ることができる。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペブシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。
【００６１】
ヒト由来のＦｃ領域、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
【００６２】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。
【００６３】
本発明における「糖鎖が除去（Deglycosylation）」されたＦｃ領域とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、「非グリコシル化（Aglycosylation）」されたＦｃ領域とは、原核生物、好ましくは大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃフラグメントを意味する。
【００６４】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
【００６５】
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃフラグメントをコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【００６６】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃフラグメント内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントに相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
【００６７】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けてもよく、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存的傷害（CDC, complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。特に、本発明のタンパク質結合体に含まれるキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃフラグメントであってもよい。ヒト由来のＦｃフラグメントは、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃフラグメントに比べて優れた効果を発揮することができる。
【００６８】
本発明においては、生体内半減期を延長させるために、ペプチド又はタンパク質フラグメントをキャリアとして用いることができる。用いられるペプチド又はタンパク質フラグメントは、特定アミノ酸の組み合わせの繰り返し単位で構成されるＥｌａｓｔｉｎ ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＥＬＰ）であってもよく、生体内安定性が高いことが知られているトランスフェリン（transferrin）、結合組織の構成成分であるフィブロネクチン（fibronectin）などとその誘導体などであってもよいが、これらに限定されるものではなく、生体内半減期を延長させるあらゆるペプチド又はタンパク質が本発明に含まれる。
【００６９】
本発明における「脂肪酸（fatty acid）」とは、前記結合体の一部（moiety）をなす一構成であり、１つのカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有する炭化水素鎖のカルボン酸を意味し、Ｒ−ＣＯＯＨの化学式を有する１価のカルボン酸を総称して脂肪酸という。本発明の脂肪酸は、炭化水素鎖を形成する炭素骨格の結合に応じて、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。前記不飽和脂肪酸とは、炭化水素鎖を形成する炭素骨格の結合に二重結合を少なくとも１つ含む脂肪酸を意味し、炭素骨格の結合が全て単結合だけで構成された脂肪酸は飽和脂肪酸である。
【００７０】
また、本発明の脂肪酸は、直鎖構造を有する脂肪酸であってもよく、アルキル基に分枝鎖を有する脂肪酸であってもよい。脂肪酸は、炭化水素鎖を形成する炭素数によって短鎖／中鎖／長鎖脂肪酸に分類され、一般に炭素数１〜６のものは短鎖脂肪酸、炭素数６〜１２のものは中鎖脂肪酸、炭素数１４以上のものは長鎖脂肪酸に分類される。また、不飽和脂肪酸の場合、二重結合の位置によって特性が異なることがある。
【００７１】
さらに、本発明の「脂肪酸誘導体」は、前述した脂肪酸の骨格に少なくとも２つの反応基が直接又はリンカーを介して結合された物質であってもよい。例えば、前記反応基としては、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、アリールジスルフィド、ヘテロアリールジスルフィド、ハロアセトアミド又はＣ7-10アルキニルが挙げられる。具体的には、前記反応基は、マレイミド、Ｎ−ヒドロスクシンイミド、スクシンイミド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide; OPSS）、ヨードアセトアミド、前記ヨードの代わりに臭素、フッ素、塩素又はアスタチンを含むハロアセトアミド、ジフルオロシクロオクチン（difluorocyclooctyne; DIFO）、ジベンゾシクロオクチン（dibenzocyclooctyne; DIBO）、ジベンゾ−アザ−シクロオクチン（Dibenzo-aza-cyclooctyne; DIBACもしくはDBCO）、ビアリールアザシクロオクチノン（biarylazacyclooctynones; BARAC）、テトラメチルチアシクロヘプチン（tetramethylthiacycloheptyne; TMTH）、ビシクロノニン（bicyclononyne; BCN）ソンドハイマージイン（Sondheimer diyne）、シクロオクチン（cyclooctyne; OCT）、モノフッ素化シクロオクチン（monofluorinated cyclooctyne; MOFO）、ジメトキシアザシクロオクチン（dimethoxyazacyclooctyne; DIMAC）、２，３，６，７−テトラメトキシ−ジベンゾシクロオクチン（2, 3, 6, 7-tetramethoxy-DIBO, TMDIBO）、スルホン化ジベンゾシクロオクチン（sulfonylated DIBO; S-DIBO）、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン（carboxymethylmonobenzocyclooctyne; COMBO）、ピロロシクロオクチン（pyrrolocyclooctyne; PYRROC）又はアルキン（alkyne）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
また、前記反応基は、Ｃ1-3アルキルアミノ、（Ｃ1-3アルコキシ）n（Ｃ1-3アルキルアミノ）鎖（ここで、ｎは１〜３の整数）を含むリンカーを介して脂肪酸骨格に結合されてもよいが、リンカーの種類はこれらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の脂肪酸は、Ｒ−ＣＯＯＨの化学式を有するカルボン酸であって当該Ｒ基が直鎖状又は分枝状飽和炭化水素基を含むものであってもよく、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸であってもよく、短鎖、中鎖又は長鎖脂肪酸であってもよく、具体的には炭化水素鎖を形成する炭素数１〜４０のものであってもよく、より具体的には炭素数４〜３０のものであってもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、本発明の脂肪酸は、ギ酸（ＨＣＯＯＨ，formic acid）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、プロピオン酸（Ｃ2Ｈ5ＣＯＯＨ）、酪酸（Ｃ3Ｈ7ＣＯＯＨ）、吉草酸（Ｃ4Ｈ9ＣＯＯＨ）、カプロン酸（Ｃ5Ｈ11ＣＯＯＨ）、エナント酸（Ｃ6Ｈ13ＣＯＯＨ）、カプリル酸（Ｃ7Ｈ15ＣＯＯＨ）、ペラルゴン酸（Ｃ8Ｈ17ＣＯＯＨ）、カプリン酸（Ｃ9Ｈ19ＣＯＯＨ）、ウンデシル酸（Ｃ10Ｈ21ＣＯＯＨ）、ラウリン酸（Ｃ11Ｈ23ＣＯＯＨ）、トリデシル酸（Ｃ12Ｈ25ＣＯＯＨ）、ミリスチン酸（Ｃ13Ｈ27ＣＯＯＨ）、ペンタデシル酸（Ｃ14Ｈ29ＣＯＯＨ）、パルミチン酸（Ｃ15Ｈ31ＣＯＯＨ）、マルガリン酸（Ｃ16Ｈ33ＣＯＯＨ）、ステアリン酸（Ｃ17Ｈ35ＣＯＯＨ）、ノナデシル酸（Ｃ18Ｈ37ＣＯＯＨ）、アラキジン酸（Ｃ19Ｈ39ＣＯＯＨ）、ベヘン酸（Ｃ21Ｈ43ＣＯＯＨ）、リグノセリン酸（Ｃ23Ｈ47ＣＯＯＨ）、セロチン酸（Ｃ25Ｈ51ＣＯＯＨ）、ヘプタコサン酸（Ｃ26Ｈ53ＣＯＯＨ）、モンタン酸（Ｃ28Ｈ57ＣＯＯＨ）、メリシン酸（Ｃ29Ｈ59ＣＯＯＨ）、ラッセル酸（Ｃ31Ｈ63ＣＯＯＨ）、アクリル酸（ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＨ）、クロトン酸（ＣＨ3ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ）、イソクロトン酸（ＣＨ3ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ）、ウンデシレン酸（ＣＨ2＝ＣＨ（ＣＨ2）8ＣＯＯＨ）、オレイン酸（Ｃ17Ｈ33ＣＯＯＨ）、エライジン酸（Ｃ17Ｈ33ＣＯＯＨ）、セトレイン酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、エルカ酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、ブラシジン酸（Ｃ21Ｈ41ＣＯＯＨ）、ソルビン酸（Ｃ5Ｈ7ＣＯＯＨ，Ｆ２）、リノール酸（Ｃ17Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ２）、リノレン酸（Ｃ17Ｈ29ＣＯＯＨ，Ｆ３）、アラキドン酸（Ｃ19Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ４）、プロピオール酸（ＣＨ≡ＣＣＯＯＨ）及びステアロール酸（Ｃ17Ｈ31ＣＯＯＨ，Ｆ１）からなる群から選択されたものであってもよく、より具体的にはパルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸又はオレイン酸であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
また、本発明の脂肪酸は、前述した脂肪酸の誘導体、類似体などであってもよく、特に脂肪酸を形成する炭化水素が直鎖状、分枝状ではなく、環基を含む変異体であってもよい。前記炭化水素に含まれる環基は、飽和単環又は複素環、芳香族縮合又は非縮合単環又は複素環であってもよく、エーテル結合、不飽和結合及び置換基を有してもよい。
【００７５】
また、本発明の脂肪酸として特許文献３、４、５、６、７、８及び９に記載されている脂肪酸誘導体が用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、少なくとも２つのカルボキシ基を含む多価脂肪酸、脂肪酸のカルボキシ基の代わりにカルボン酸同配体（carboxylic acid (bio)isostere）、リン酸基又はスルホン酸基を含む物質、脂肪酸エステルなどが制限なく用いられてもよい。
【００７６】
それ以外にも、本発明の脂肪酸には、当該分野で公知の前記脂肪酸の誘導体、類似体、及び当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体、類似体も含まれる。本発明の脂肪酸は、分子量が０．１〜１００ｋＤａの範囲、具体的には０．１〜３０ｋＤａの範囲のものであってもよく、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明のタンパク質結合体に含まれる脂肪酸誘導体の少なくとも２つの反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一方の反応基にはマレイミド基、他方の反応基にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒドなどのアルキルアルデヒド基を有してもよい。２つの反応基にヒドロキシ反応基を有する脂肪酸を用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、商業的に入手可能な修飾された反応基を有する脂肪酸を用いることにより、本発明の結合体を製造することができる。
【００７８】
本発明のタンパク質結合体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端や、ポリペプチドの末端でない中間アミノ酸残基に脂肪酸が連結され、生理活性ポリペプチドに連結された脂肪酸部分に生体適合性物質が連結されたものであってもよい。前記Ｎ末端又はＣ末端には、末端自体でないＮ末端又はＣ末端側の１〜２５個のアミノ酸からなる領域が含まれる。
【００７９】
本発明のタンパク質結合体は［生理活性ポリペプチド−脂肪酸誘導体−生体適合性物質］の構造を１つ以上含んでもよく、これを構成する要素は共有結合により直鎖状又は分枝状に連結されてもよく、本発明のタンパク質結合体は各構成要素を１つ以上含んでもよい。本発明の脂肪酸は、少なくとも２つの反応基を含んでいるので、生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質とそれぞれ共有結合により連結されてもよい。また、１つの生体適合性物質に、生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体が結合された連結体を共有結合により少なくとも１つ連結することにより、生体適合性物質を媒体として生理活性ポリペプチド単量体、二量体又は多量体を形成することができ、それにより生理活性ポリペプチドの生体内活性及び安定性の向上をより効果的に達成することができる。
【００８０】
本発明のタンパク質結合体において、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質は様々なモル比で結合されてもよい。
【００８１】
本発明の他の態様は、（ａ）脂肪酸誘導体を介して生理活性ペプチドと生体適合性物質を連結するステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップの反応結果物であるタンパク質結合体を分離するステップとを含む、タンパク質結合体を製造する方法を提供する。
【００８２】
前記生理活性ペプチド、前記生体適合性物質及び前記脂肪酸誘導体については前述した通りである。
【００８３】
前記（ａ）ステップにおいて、三構成要素の連結は共有結合であってもよく、当該共有結合は順次又は同時に行われてもよい。例えば、少なくとも２つの反応基を有する脂肪酸誘導体の反応基にそれぞれ生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質を結合させる場合、生理活性ポリペプチドと生体適合性物質のいずれかを先に脂肪酸誘導体の一方の反応基に結合させ、その後残りの成分を脂肪酸誘導体の他方の反応基に結合させる方式で反応を順次行うことが、目的とするタンパク質結合体以外の副産物の生成を最小限に抑えるのに有利である。
【００８４】
よって、前記（ａ）ステップは、（ａ１）脂肪酸誘導体の一方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方を連結するステップと、（ａ２）前記（ａ１）ステップの反応混合物から脂肪酸誘導体に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドのいずれか一方が連結された連結体を分離するステップと、（ａ３）前記（ａ２）ステップで分離された連結体の脂肪酸誘導体の他方の反応基に生体適合性物質と生理活性ポリペプチドの他方を連結し、脂肪酸の反応基がそれぞれ生理活性ポリペプチド及び生体適合性物質に連結されたタンパク質結合体を生成するステップとを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００８５】
前記（ａ１）ステップ及び前記（ａ３）ステップの反応は、反応に関与する脂肪酸誘導体の反応基の種類を考慮して、必要に応じて還元剤の存在下で行ってもよい。具体的な還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩、ピコリンボランコンプレックス、ピリジンホウ酸塩（borane pyridine）などが用いられてもよい。
【００８６】
前記（ａ２）ステップ及び前記（ｂ）ステップは、要求される純度及び生成される産物の分子量、電荷量などの特性を考慮して、タンパク質の分離に用いられる通常の方法を必要に応じて適宜選択して行ってもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする様々な公知の方法を用いることができ、必要に応じて、より高い純度に精製するために複数の各種方法を組み合わせて用いることができる。
【００８７】
前記（ａ１）ステップにおいて、生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の反応モル比及び生体適合性物質と脂肪酸誘導体の反応モル比は、それぞれ独立して１：１〜１：２０の範囲から選択される比率であってもよい。具体的には、生理活性ポリペプチドと脂肪酸誘導体の反応モル比は１：２〜１：１０であってもよく、生体適合性物質と脂肪酸誘導体の反応モル比は１：４〜１：２０であってもよい。一方、前記（ａ３）ステップにおいて、（ａ２）ステップで分離された連結体と生体適合性物質又は生理活性ポリペプチドの反応モル比は１：０．５〜１：２０の範囲であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
本発明のさらに他の態様は、本発明のタンパク質結合体を製造する方法により製造したタンパク質結合体と、前記製造したタンパク質結合体を含む薬剤学的組成物を提供する。本発明の薬剤学的組成物は、生体内持続性及び安定性が天然生理活性ポリペプチドより向上した持続性製剤であってもよい。
【００８９】
本発明の結合体を含む薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、前述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、単位投薬アンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【００９０】
なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。
【００９１】
また、本発明の薬剤学的組成物は、充填剤、抗凝集剤、滑滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００９２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００９３】
作製例１：少なくとも２つの反応基を有する脂肪酸誘導体の作製のための中間体１−２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（２−（２−（２，２−ジメトキシエトキシ）エトキシ）エチル）アセトアミドの合成
【００９４】
［反応式１］
【化１】
0006989503.tif 000002
【００９５】
工程１．ベンジル２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルカルバメートの作製
テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran; THF, ５Ｌ）に溶解した２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１５０ｍＬ，１．４５９ｍｏｌ）にトリエチルアミン（２２９ｍＬ，１．６４５ｍｏｌ）、クロロギ酸ベンジル（２１１ｍＬ，１．４９５ｍｏｌ）を加え、その後１２時間攪拌した。固体を濾過して酢酸エチルで洗浄し、その後濾液を濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して標題化合物（２０２ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.29(m, 5H), 5.25(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.13-4.11(m, 2H), 3.57-3.54(m, 4H), 3.43-3.38(m, 2H), 2.24(br, 1H).
【００９６】
工程２．ｔ−ブチル３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オエートの作製
前記工程１で得たベンジル２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルカルバメート（１２９ｇ，０．５３９ｍｏｌ）をＴＨＦ（２Ｌ）に溶解し、その後カリウムｔ−ブトキシド（６０．５ｇ，０．５９３ｍｏｌ）を０℃で滴下した。３０分後にｔ−ブチルブロモアセテートを加えて０℃で３時間攪拌し、常温で１５時間さらに攪拌した。この反応溶液に水を入れて反応を終結させ、その後濃縮して酢酸エチルを入れて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濾過して濾液を濃縮し、その後カラムクロマトグラフィーで精製して標題化合物（８７．５ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.30(m, 5H), 5.38(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.00(s, 2H), 3.70-3.64(m, 4H), 3.60-3.56(m, 2H), 3.43-3.40(m, 2H), 1.46(s, 9H).
【００９７】
工程３．３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オイック酸の作製
前記工程２で得たｔ−ブチル３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オエート（２２．０ｇ，６２．２４９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１３８ｍＬ）に溶解し、その後トリフルオロ酢酸（１３８ｍＬ）を加えて常温で５時間攪拌した。この反応溶液を濾過し、濾液を濃縮して標題化合物（１３．０ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.31(m, 5H), 5.11(s, 2H), 4.15(s, 2H), 3.74-3.58(m, 6H), 3.42-3.40(m, 2H).
【００９８】
工程４．エチル３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オエートの作製
前記工程１で得たベンジル２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルカルバメート（１５．０ｇ，６２．６９１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２４０ｍＬ）に溶解し、その後カリウムｔ−ブトキシド（７．０ｇ，６２．６９１ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。３０分後にエチルブロモアセテートを加えて０℃で３時間攪拌し、常温で１５時間さらに攪拌した。この反応溶液に水を入れて反応を終結させ、その後濃縮して酢酸エチルを入れて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濾過して濾液を濃縮し、その後カラムクロマトグラフィーで精製して標題化合物（８．６ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.30(m, 5H), 5.32(br, 1H), 5.10(s, 2H), 4.19(q, 2H), 4.12(s, 2H), 3.72-3.65(m, 4H), 3.59-3.56(m, 2H), 3.41-3.38(m, 2H), 1.26(t, 3H).
【００９９】
工程５．２−（２−（２，２−ジメトキシエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミンの作製
前記工程４で得たエチル３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オエート（５．０ｇ，１５．３６８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、−７８℃で水素化ジイソブチルアルミニウム（diisobutylaluminium hydride; DIBAL-H，２３．０ｍＬ，２３．０５１ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、その後０℃で１時間攪拌した。この反応溶液に１０％塩酸を加えて０℃で３０分間攪拌し、その後酢酸エチルを入れて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濾過して濾液を濃縮した。生成物をアルゴン雰囲気下でメタノール（１８ｍＬ）に溶解し、オルトギ酸トリメチル（１３．４ｍＬ，１２２．９４１ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（１４６ｍｇ，０．７６８ｍｍｏｌ）を入れて常温で２時間攪拌した。酢酸エチルを入れて抽出し、次いで有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、その後濾過して濾液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を再びメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（７６ｍｇ，０．４ｗｔ％）を入れて水素雰囲気下、常温で３時間攪拌した。反応溶液を濾過して濾液を濃縮し、その後減圧乾燥して標題化合物（６７３ｍｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.53(t, 1H), 3.68-3.62(m, 6H), 3.56-3.50(m, 2H), 3.40(s, 6H), 2.87(t, 2H).
【０１００】
工程６．２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（２−（２−（２，２−ジメトキシエトキシ）エトキシ）エチル）アセトアミドの作製
前記工程３で得た３−オキソ−１−フェニル−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−オイック酸（９５２ｍｇ，３．２０４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、ＢＯＰ（(benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, １．６ｇ，３．５２２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（N,N-diisopropylethylamine; DIPEA, １．７ｍＬ，９．６０６ｍｍｏｌ）を入れ、その後常温で３０分間攪拌した。この反応溶液に工程５で得た２−（２−（２，２−ジメトキシエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（６５０ｍｇ，３．３６４ｍｍｏｌ）を入れて常温で３時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを添加して重曹（炭酸水素ナトリウム）で洗浄した。その後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濾液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を再びメタノール（８ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（１０４ｍｇ，０．４ｗｔ％）を入れて水素雰囲気下、常温で３時間攪拌した。反応溶液を濾過して濾液を濃縮し、その後減圧乾燥して中間体１（１７３ｍｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, MeOD) δ 4.52(t, 1H), 4.03(s, 2H), 3.71-3.32(m, 22H), 2.97(t, 2H).
【０１０１】
作製例２：少なくとも２つの反応基を有する脂肪酸誘導体の作製のための中間体２−（Ｓ）−２４−（ｔ−ブトキシカルボニル）−３−メトキシ−１２，２１，２６−トリオキソ−２，５，８，１４，１７−ペンタオキサ−１１，２０，２５−トリアザトリテトラコンタン−４３−オイック酸の合成
【０１０２】
［反応式２］
【化２】
0006989503.tif 000003
【０１０３】
工程１．１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカン酸の作製
トルエン（３．７Ｌ）にオクタデカン二酸（octadecandioic acid, １００ｇ，３１８ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（７５６ｍｇ，３．９７５ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（２６．４ｍＬ，２５４．４ｍｏｌ）を加えて蒸留した。この反応溶液にセライトを入れ、４０℃に冷却して１時間攪拌し、その後シリカゲルで濾過した。濾液を減圧濃縮し、５０℃でヘプタンを加えた。固体を濾過してヘプタンで洗浄し、その後乾燥して標題化合物（６７．９ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.34(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.35(t, 4H), 1.64(t, 4H), 1.25(s, 24H).
【０１０４】
工程２．１−ベンジル１８−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オクタデカノエートの作製
前記工程１で得た１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカン酸（２０．０ｇ，４９．４３ｍｍｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．８ｇ，５９．３１９ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（N,N’-diisopropylcarbodiimide, １２．２４ｇ，５９．３１２ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（N-methyl-2-pyrrolidone, ２００ｍＬ）に溶解し、その後６０℃で２．５時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を常温に冷却して固体を濾過した。濾液に水を加え、生成された固体を濾過して水で洗浄した。固体をイソプロピルアルコールで再結晶して標題化合物（２１．６ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.31(m, 5H), 5.11(s, 2H), 2.83(s, 2H), 2.60(t, 2H), 2.35(t, 2H), 1.77-1.53(m, 6H), 1.25(s, 24H).
【０１０５】
工程３．（Ｓ）−１−ｔ−ブチル５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−（１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカンアミド）ペンタンジオエートの作製
前記工程２で得た１−ベンジル１８−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オクタデカノエート（１０．０ｇ，１９．９３４ｍｍｏｌ）、Ｌ−グルタミン酸５−ｔ−ブチルエステル（４．３ｇ，２０．９３１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（８０ｍＬ）に入れて５０℃で４時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を常温に冷却し、水（２３０ｍＬ）、０．５Ｍ硫酸水素カリウム（３４ｍＬ）、酢酸エチルを添加して抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濾液を濃縮した。生成物をＮＭＰ（７５ｍＬ）に溶解し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．７ｇ，３１．８９４ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（N,N’-dicyclohexylcarbodiimide, ５．４ｇ，２５．９１４ｍｍｏｌ）を加え、その後常温で１６時間攪拌した。固体を濾過して濾液を水で洗浄し、その後有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して濾液を濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して標題化合物（７．１ｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.36-7.31(m, 5H), 6.19(d, 1H), 5.11(s, 2H), 4.64-4.57(m, 1H), 2.83(s, 4H), 2.73-2.62(m, 2H), 2.35(t, 2H), 2.24-2.17(m, 2H), 1.66-1.55(m, 4H), 1.48(s, 9H), 1.24(s, 26H).
【０１０６】
工程４．（Ｓ）−２４−（ｔ−ブトキシカルボニル）−３−メトキシ−１２，２１，２６−トリオキソ−２，５，８，１４，１７−ペンタオキサ−１１，２０，２５−トリアザトリテトラコンタン−４３−オイック酸の作製
前記工程３で得た（Ｓ）−１−ｔ−ブチル５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）２−（１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカンアミド）ペンタンジオエート（３２９ｍｇ，０．４７８ｍｍｏｌ）、作製例１で準備した中間体１（１７０ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２ｍＬ，１．４３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍＬ）に入れて常温で１６時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を濃縮してカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（１４０ｍｇ，０．４ｗｔ％）を入れて水素雰囲気下、常温で３時間攪拌した。反応溶液を濾過し、その後濾液を濃縮し、減圧乾燥して中間体２（３００ｍｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.87(br, 1H), 6.63(d, 1H), 4.52(t, 1H), 4.41(m, 1H), 4.04(s, 2H), 3.70-3.47(m, 18H), 3.41(s, 6H), 2.35-2.2.20(m, 7H), 1.93-1.86(m, 1H), 1.63-1.53(m, 4H), 1.46(s, 9H), 1.26(s, 24H).
【０１０７】
作製例３：生体適合性物質としての免疫グロブリンＦｃフラグメントの作製
タンパク質結合体の生体適合性物質として免疫グロブリンＦｃフラグメントを用いた。免疫グロブリンＦｃフラグメントは、本発明者らが出願した特許文献１０「開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域の大量生産方法」により製造した。
【実施例１】
【０１０８】
リンカーとして２つの反応基を含む脂肪酸誘導体１−（Ｓ）−２２−（１８−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−１８−オキソオクタデカンアミド）−１，１０，１９−トリオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン−２３−オイック酸の作製
作製例２で準備した中間体２（１５０ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、ＨＡＴＵ（1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1, 2, 3-triazolo[4, 5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate, ７７ｍｇ，０．２０１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．１ｍＬ，０．５４９ｍｍｏｌ）を入れ、その後常温で２０分間攪拌した。この反応溶液にＮ−（２−アミノエチル）マレイミド（３２ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ）を入れて常温で１２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを添加して重曹で洗浄し、その後無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して濾液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をジクロロメタンに溶解し、その後トリフルオロ酢酸（０．１６ｍＬ，２．１２３ｍｍｏｌ）を入れて常温で１６時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、その後ジエチルエーテルで再結晶して標題化合物（１５ｍｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.71(s, 1H), 7.20(br, 1H), 6.97(br, 1H), 6.73(s, 2H), 5.84(br, 1H), 4.48-4.44(m, 1H), 4.05(s, 2H), 3.72-3.45(m, 22H), 2.26-2.07(m, 8H), 1.62-1.57(m, 4H), 1.25(s, 24H);
MS (ESI+): [M+H]+ m/z 840.5.
【０１０９】
【化３】
0006989503.tif 000004
【実施例２】
【０１１０】
リンカーとして２つの反応基を含む脂肪酸誘導体２−（Ｓ）−２２−（１８−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−１８−オキソオクタデカンアミド）−１，１０，１９−トリオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン−２３−オイック酸の作製
作製例２で準備した中間体２（１５０ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２３ｍｇ，０．２０１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, ４２ｍｇ，０．２１９ｍｍｏｌ）を入れ、その後常温で１６時間攪拌した。反応終了後、重曹で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過して濾液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製した。生成物をジクロロメタンに溶解し、その後トリフルオロ酢酸（０．１７ｍＬ，２．１８１ｍｍｏｌ）を入れて常温で１６時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、その後ジエチルエーテルで再結晶して標題化合物（２５ｍｇ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.70(s, 1H), 7.21(d, 1H), 7.06(br, 1H), 4.53-4.46(m, 1H), 4.05(s, 2H), 3.76-3.49(m, 16H), 2.84(s, 4H), 2.60(t, 4H), 2.48-2.2.41(m, 2H), 2.23(t, 2H), 2.12-2.04(m, 2H), 1.78-1.72(m, 2H), 1.65-1.62(m,2H), 1.25(s, 24H);
MS (ESI+): [M+H]+ m/z 815.5.
【０１１１】
【化４】
0006989503.tif 000005
【実施例３】
【０１１２】
生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体リンカーで結合された結合体の製造
実施例１又は２で作製した、反応基としてマレイミド基とアルデヒド基とを含む脂肪酸誘導体リンカーを生理活性ポリペプチドの一種であるＧＬＰ−１、ＧＩＰ及びグルカゴン受容体の全てに活性を示す三重活性体（配列番号１）のシステイン残基に結合させるために、前記三重活性体と脂肪酸誘導体リンカーを１：１〜２のモル比で混合し、４〜８℃で約１〜２時間反応させた。ここで、三重活性体の濃度は３〜５ｍｇ／ｍＬであり、反応は２０ｍＭトリス（Tris）、ｐＨ７．０〜８．０、イソプロパノール下で行った。反応液は、クエン酸塩（ｐＨ３．０）、エタノールを含む緩衝液と塩化カリウム濃度勾配を用いたＳＰ−ＨＰ（ＧＥ，米国）カラムを用いて、脂肪酸誘導体リンカーと１：１で結合された三重活性体を精製した。
【０１１３】
次に、前記精製された脂肪酸誘導体リンカーと三重活性体が結合された結合体と免疫グロブリンＦｃフラグメントを１：２〜５のモル比で、全タンパク質濃度を２０〜３５ｍｇ／ｍＬにして４〜８℃で１２〜１８時間反応させた。ここで、反応液はリン酸カリウムｐＨ６．０〜６．５であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride, SCB）を添加した。反応終了後、この反応液をビス−トリス（ｐＨ６．５）緩衝液と塩化カルシウム濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ，米国）カラムと、硫酸アンモニウムと２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｓｅ ＩＳＯ（ＧＥ，米国）に適用し、三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体リンカーを介して共有結合により連結された結合体を精製した。製造したタンパク質結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。その結果を図１に示す。
【実施例４】
【０１１４】
脂肪酸の種類に応じたタンパク質結合体の製造
脂肪酸骨格の炭化水素鎖を形成する炭素数１〜１００の脂肪酸誘導体を用いてタンパク質結合体を製造した。具体的には、炭素数４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１の脂肪酸誘導体を用いてタンパク質結合体を製造した。
【０１１５】
具体的には、実施例１〜３の方法を用いて、様々な脂肪酸誘導体及びそれを用いたタンパク質結合体を製造した。
【０１１６】
実験例１：タンパク質結合体のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態（pharmacokinetics）の確認
実施例３で製造したタンパク質結合体、具体的にはＧＬＰ−１、ＧＩＰ及びグルカゴン受容体の全てに活性を示す三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体のインビボ（in vivo）薬物動態を確認し、従来の三重活性体に比べて生体内持続性が向上したかを比較した。具体的には、正常動物モデルとして広く用いられるＩＣＲマウスを薬物動態の確認に用いた。３日間の馴化期間を経た非絶食の８週齢ＩＣＲマウスを次の２つの群に分けて試験物質を投与した。
群１；三重活性体を４９．２ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回皮下注射
群２；実施例３の三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体を５．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で単回皮下注射
【０１１７】
三重活性体を投与した群１は１５匹の個体で構成し、それぞれ０．２５、０．５、１、２及び４時間後にそれらの眼窩静脈から０．３ｍＬの血液を交互に採血した。一方、実施例３の三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体を投与した群２は１２匹の個体で構成し、それらの個体からはそれぞれ１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に群１と同様に交互に採血した。採取した血液は遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０分，Eppendorf）して血清を分離し、その後−２０℃の冷凍庫に保管した。
【０１１８】
血清内の三重活性体又は三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体の濃度は、三重活性体に特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着検査法（Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA）で定量した。薬物動態パラメータは、Ａ、Ｂ及びＣの各時間の血清濃度に基づいて、ＰｈｏｅｎｉｘTM ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）７．０（Pharsight, USA）プログラムを用いて非区画法（non-compartment method）で算出した。最高血中濃度（Ｃｍａｘ）及び到達時間（Ｔｍａｘ）は基礎資料により確認し、各時間の血中薬物濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は対数−線形台形加算（log-linear trapezoidal summation）により算出した。半減期ｔ1/2、分布容積Ｖｄ、クリアランスＣＬなどの他の薬物動態パラメータも前記プログラムを用いて算出した。図２に時間に応じた薬物の血中濃度変化を示す。
【０１１９】
図２に示すように、従来の三重活性体の結果と比較して、本発明の実施例２による三重活性体と免疫グロブリンＦｃが脂肪酸誘導体を介して連結された結合体は、血中半減期が大幅に延長された持続性を示す。
【０１２０】
この結果は、本発明において新たに提案する生理活性ポリペプチドと生体適合性物質を連結する脂肪酸リンカーが、結合された生理活性ポリペプチドの持続性を画期的に向上させ、投与用量及び回数を減らすことのできる新たな薬物プラットフォームとしての地位を確立できることを示唆するものである。
【０１２１】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
0006989503.tif 000008
【図２】
0006989503.tif 000009
【配列表】
0006989503000001.app