(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在する物質のレセプターであって、同一のレセプターにつき２種類以上のサイズのものが存在するレセプターのアミノ酸配列を調べ、長いレセプターのどの領域が短いレセプターにおいて欠失しているかを調べることにより生理活性物質を探索することを含む生理活性物質の探索方法。
【請求項２】
前記レセプターは７回膜貫通型のレセプターである請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な各種生理活性物質の探索方法及び製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、未知の生理活性物質の探索は、体液や組織中に存在する成分を分析し、新規な物質を同定及び単離し、発見された新規な物質の生理活性を調べることにより行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記した従来の方法は、何の予測もなくただ生体中の成分を分析し、新たな物質を見つけ出してその生理活性を調べるだけである。しかしながら、生体中には極めて多くの成分が存在するし、生理活性物質はしばしば低濃度でしか存在しないから新規な物質を見つけることは困難な仕事である。しかも、生体は非常に多くの生理反応を行なっているので、新たに見つかった物質がどのような生理活性を有しているかを見つけることも困難である。このように、従来の方法では、新規な生理活性物質を見つけだすのは困難な作業である。
【０００４】
従って、本発明の目的は、一定の予測性をもってより効率的に新規な生理活性物質を探索する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、拮抗作用を有する物質若しくは細胞が生体中に存在する物質のレセプター、又はある物質Ａが作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在する該物質Ａのレセプターであって、同一のレセプターにつき２種類以上のサイズのものが存在する場合があり、その欠失部分、つまりスプライスされた部分のアミノ酸配列が生理的意義を持つことを見出した。例えば、カルシトニンは破骨細胞上のカルシトニンレセプターと結合して破骨細胞による骨吸収を抑制し、一方、破骨細胞の作用と拮抗作用を有する骨芽細胞が存在する。カルシトニンレセプターは既にアミノ酸配列が報告されているが、サイズの異なる２種類以上のものが報告されている。本願発明者は、この２種類以上のサイズのカルシトニンレセプターのうち、より長い方のレセプターの１領域が切断されてより短い方のレセプターになること、及びこの切断された領域が、カルシトニンが作用する破骨細胞の作用と拮抗する作用を有する骨芽細胞に対して作用するであろうことを洞察した。そして、この切断領域を化学合成して調べたところ、この新規なペプチドは骨芽細胞上のレセプターに結合して骨形成を促進することが確認された。これにより、本願発明者の上記の洞察が正しかったことが明らかになり、本発明が完成された。
【０００６】
すなわち、本発明は、物質が作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在する物質のレセプターであって、同一のレセプターにつき２種類以上のサイズのものが存在するレセプターのアミノ酸配列を調べ、長いレセプターのどの領域が短いレセプターにおいて欠失しているかを調べることにより生理活性物質を探索することを含む生理活性物質の探索方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、ある物質Ａが作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在する該物質Ａのレセプターに着目する。拮抗作用は生体の恒常性を保つ上で基本的なものであり、生体内には互いに拮抗作用を有する物質又は細胞が非常に多く存在する。ある物質Ａが作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在する該物質Ａのレセプターの例としては、カルシトニン（これが作用する破骨細胞が骨芽細胞と拮抗）レセプター、グルカゴン（インシュリンと拮抗）レセプター、ソマトスタチン（成長ホルモンと拮抗）レセプター、副甲状腺ホルモン（カルシトニン等と拮抗）レセプター等多数のレセプターがある。レセプターとしては、カルシトニンレセプターのような７回膜貫通型のレセプターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０００８】
本発明の方法では、これらのレセプターのアミノ酸配列又はサイズを調べ、同じレセプターでありながら、サイズが異なるものを見つけ出す。この作業は、当該レセプターのアミノ酸配列又はサイズを複数回決定することにより行なってもよいし、文献に報告されている場合にはその報告を利用してもよい。同一のレセプターでありながらサイズの異なる２種類以上のものが存在するレセプターの例として、カルシトニンレセプター、グルカゴンレセプター、ソマトスタチンレセプター等を挙げることができる。
【０００９】
同一のレセプターについてサイズの異なる２種類以上のレセプターが存在することを見つけ出した後、それら２種類以上のレセプターのアミノ酸配列を比較し、長いレセプターのどの領域が欠失して短いレセプターとなっているかを調べる。短いレセプターにおいて欠失している領域が、当該拮抗作用に対して何らかの作用を有する生理活性物質である。つまり、スプライスされた構造のうちあるものが生理活性物質である。すなわち、生理活性物質がレセプターに結合することにより、そのレセプターの一部が切断され、この切断されたレセプター断片が当該拮抗作用に対して調節的な作用等の生理活性を示すものと考えられる。例えば、下記実施例に具体的に示されるように、カルシトニンレセプターにおけるこの欠失領域が骨芽細胞上のレセプターに結合し、骨形成を促進することが確かめられた。
【００１０】
上記方法により見出される欠失領域は生理活性を有するから、これを製造することにより生理活性物質が得られる。多くの場合、欠失領域は比較的短いペプチドから成るので、このような場合には市販のペプチド合成機を用いて、化学合成により容易に当該生理活性物質を作製することができる。あるいは、常法により遺伝子工学的手法を用いて作製することもできる。
【００１１】
得られた生理活性物質の生理活性は、上記拮抗作用に関与するものであるから、それぞれの拮抗作用に応じた適宜の方法により容易に確認することができる。
【００１２】
なお、一般に生理活性を有するペプチドにおいて、その少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、少数のアミノ酸が付加され、又は少数のアミノ酸が欠失した場合でも、その生理活性が維持される場合があることは当業者に周知の事実である。従って、上記の欠失領域を構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、少数のアミノ酸が付加され、又は少数のアミノ酸が欠失したものであって、上記欠失領域から成る生理活性物質が持つ生理活性を有する物質（本願発明においてこのような物質を上記欠失領域の「誘導体」という）を製造することも本発明の範囲に含まれる。このような誘導体は上記欠失領域に対し、７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有することが好ましい。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１４】
実施例１  カルシトニンレセプターの欠失領域の決定
カルシトニンレセプターのアミノ酸配列はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，第９０巻、第５号（１９９２）に記載されている。ここに記載されたカルシトニンレセプターのアミノ酸配列を比較すると、短い方のアミノ酸配列では、長い方のアミノ酸配列の第１７５番目〜第１９０番目のアミノ酸配列が欠失している。この欠失領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１５】
実施例２  ペプチドの製造
市販のペプチド合成機を用い、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。
【００１６】
実施例３  骨芽細胞増殖促進作用
骨芽細胞であるラット由来ＲＯＳ細胞（入手先：ＡＴＣＣ）を１０％牛胎児血清を含むＦ１０培地（入手先：大日本製薬）にて培養し、５％炭酸ガス加湿３７℃恒温器内にて育成した。トリプシン処理により２４穴培養プレートに１ｘ１０５  個／穴（ｗｅｌｌ）蒔種し、コンフルーエントになったところで培地を１％牛胎児血清Ｆ１０培地に交換し、２４時間培養した。その後、実施例２で製造した本発明のペプチドを１％牛胎児血清Ｆ１０培地に溶解し、容量を変化させながらｗｅｌｌに加えてさらに２４時間培養を継続した。培養後、本ペプチドによる細胞の増殖促進効果をＭＴＴアッセイにより測定し、非処理群に対する増殖促進効果を求めた。なお、ＭＴＴアッセイ及び増殖促進率の算出は具体的には次のように行った。フナコシ（株）より市販されているＭＴＦ−Ｃｅｌｌ−Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔの手順に従い、本物質を用量を変化させながらウェルに加え一昼夜放置後、生細胞のミトコンドリア中に存在する酵素によりＭＴＴ（３−４，５Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２ＹＬ）−２，５Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  が暗青色のホルマザンに開裂する現象を利用し比色法にて生細胞を計数した。本物質を加えない対照群を１００％とし用量を変化させて加えた群の比色度を求めると次のようになった。結果を下記表１に示す。
【００１７】
【表１】
0003590045.tif 000002
【００１８】
表１から明らかなように、本発明の方法により探索された上記ペプチドは、骨芽細胞に対し増殖促進的に作用することが確認された。従って、本ペプチドは骨量の増加に結びつくものと考えられ、骨粗鬆症等の骨疾患の治療に対し有用である。
【００１９】
実施例３  本ペプチドに対する骨芽細胞上の受容体の存在
本ペプチドが骨芽細胞に対し増殖促進作用があることが判明したことにより、骨芽細胞が本ペプチドに対する受容体を持っていることが推察される。もし受容体が存在するならば本ペプチドは生命にとり根源的な物質であることが考えられ、次に骨芽細胞に受容体が存在するか否かを調査した。
【００２０】
実施例２で得られたペプチドをビオチンで標識し、実施例３と同様に培養したＲＯＳ細胞に一定量に標識した本ペプチドを加え、さらに競合反応をさせるために非標識の本ペプチドを１０％牛胎児血清Ｆ１０培地に溶解し、容量を変化させながら加えて競合反応を見た。この実験操作は具体的には次のように行った。ＳＵＭＩＬＯＮ社製の蛋白ビオチン化標識キットの手順に従い本ペプチドをビオチン化し、ウェルに播種された一定数の細胞に対し一定量のビオチン化ペプチドを加え非標識ペプチド０〜０．５１２μｇ／ｗｅｌｌを各々加え競合反応を６時間行い、その後、細胞をＰＢＳにて洗浄しストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼで細胞表面にある受容体に結合したビオチン化ペプチドに反応して発色反応を見る。細胞表面に本ペプチドの受容体が存在すれば非標識のペプチドと競合反応が起こり発色強度は低下する。結果を下記表２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２に示されるように、非標識体の添加量に依存して加えた標識体に対する割合が変化しているので、骨芽細胞が本ペプチドに対する受容体を持っていることは明らかであり、本物質が根源的な役割を担っていることが推察される。
【００２３】
急性毒性試験
実施例２で作製したペプチドについて、ｄｄｙ雄性マウス（体重４０〜４５ｇ）を用い、その急性毒性を試験した。本ペプチドを生理食塩水（ｐＨ６．０）に溶解し、これをマウスの尾静脈より投与し、１４日間観察した。投与量は１、１０、１００μｇ／ｋｇとした。この結果を下記表３に示す。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
実施例４  グルカゴンレセプターの欠失領域の決定
実施例１と同じ方法により、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５１  （１９９４）  ２７１−２７５  に記載されたグルカゴンレセプターのアミノ酸配列を比較することにより、長い方のレセプターに存在するが短い方のレセプターにおいて欠失している領域のアミノ酸配列を決定した。決定された欠失領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２６】
実施例５  ソマトスタチンレセプターの欠失領域の決定
実施例１と同じ方法により、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４４：１００８−１０１５（１９９３）  に記載されたソマトスタチンレセプターのアミノ酸配列を比較することにより、長い方のレセプターに存在するが短い方のレセプターにおいて欠失している領域のアミノ酸配列を決定した。決定された欠失領域のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、一定の予測性をもって効率的に新規な生理活性物質を探索する方法が初めて提供された。本発明の方法では、拮抗作用に関与する物質のレセプターを調べることにより新規な生理活性物質を見つけることができるので、従来のように極めて多様な成分を含む生体試料中に微量含まれる生理活性物質を単離する必要がない。また、探索された生理活性物質の生理活性は、上記拮抗作用に関与するものであるから、その生理活性を探索することも従来に比べてはるかに容易である。よって、本発明の方法によれば、従来よりもはるかに高効率に新規な生理活性物質を探索することができる。
【００２８】
【配列表】
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【００２９】
0003590045.tif 000006
【００３０】
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