(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロポレーション（electroporation）による経組織分子デリバリーに適用するために使用される高圧パルス源及び電極を含むシステムであって、
組織表面を横切って配送される分子（被配送分子:trans  tissue molecular）を含有するマイクロキャリアーと、
該組織表面の選択部位にマイクロキャリアーを接触させるに際しこのマイクロキャリアーを支持する基剤（substrate）と、
前記組織の選択部位にエレクトロポレーション（electroporation）を誘導するとともに、前記マイクロキャリアーから当該組織内に分子（被配送分子）を配送させるに十分な強度の電界を与える手段と、
を含み構成されていることを特徴とする経組織分子デリバリーシステム。
【請求項２】
前記電界を与える手段が、10マイクロ秒から10ミリ秒範囲のパルス長であり、そして、約10kV/cmから約60kV/cmの強度（field  strength）であることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項３】
前記マイクロキャリアーがマイクロバブル（misrobabbles）であり、前記ポレーションによって誘導されたポアーの通過を阻害する（inhibite）サイズであることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項４】
前記マイクロキャリアーが、前記ポレーションによって誘導されたポアーを介して移動できるサイズであることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項５】
前記マイクロキャリアーがマトリックス構造を有し、該マトリックス内に分子が封入されることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項６】
前記マイクロキャリアーが、電気的に価電していることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項７】
前記マイクロキャリアーが、電気的に中和されていることを特徴とする請求項１に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項８】
前記マイクロキャリアーが膜を有してマイクロバブル（microbabbles）を形成し、該マイクロバブル中に前記分子が封入されていることを特徴とする請求項７に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項９】
前記電界を与える手段が、角質層表面に適用された多数の互いに近接する電極を手段を有し、100マイクロ秒から10ミリ秒の範囲のパルス長で、10Vから数百Ｖのパルスとして与えられることを特徴とする請求項８に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１０】
前記マイクロキャリアーが、電気的に中和されていることを特徴とする請求項２に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１１】
前記マイクロキャリアーが、角質層に形成されたポアーを介して移動できる程度に小さいことを特徴とする請求項２に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１２】
前記マイクロキャリアーが、電気的に価電していることを特徴とする請求項11に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１３】
前記マイクロキャリアーが、経時放出できるように構成されていることを特徴とする請求項12に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１４】
前記マイクロキャリアーが、電気的に価電していることを特徴とする請求項13に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【請求項１５】
前記マイクロキャリアーが、電気的に中和されていることを特徴とする請求項13に記載の経組織分子デリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はドラッグ  デリバリーに関するものであり、詳細には、薬物及び他の分子を経皮的に配送させるための方法、及びその装置に関するものである。
背景技術
組織へ物理的に浸透させることなく薬物及び類似物を配送させるための手段として、過去数年間に亘り、経皮ドラッグ  デリバリー（transdermal drug delivery）なる概念がある。経皮ドラッグ  デリバリーは、注射針を使用しないため無侵入性（noninvasive）であるけれども、静脈点滴と同様、極めて正確かつ確実であると云う利点ももっている。コントロールされた薬物量を継続的に配送さ（deliver）せるスキンパッチ（skin patch）が、約10年前に最初に導入された。この方法は皮膚表面に薬物を含有させたパッチを貼付することを含み、該薬物を皮膚を介して吸収させるものである。薬物は血流中に配送されて治療レベルとなり、薬物を長時間に亘り投与するための慣用手段として提供された。従来のこの種の経皮ドラッグ  デリバリーは、受動的なシステムであり、多くの場合、その適用に満足できなかった。
皮膚には有意なバリアー特性があるため、上述した受動的な経皮ドラッグ  デリバリーは、極めて強力な作用をもち一日投与量が僅かであるとともに、容易に皮膚へ浸透される薬物にその適用は制限されていた。皮膚は、薬物を含む大部分の化合物の浸透に対して強い抵抗性を示す。最外層、すなわち角質層（SC）は、生理的には、大部分の化合物及び微生物の浸透に対して極めて強力な防御的バリアーとして機能する。
角質層（SC）は、死した細胞とある種の脂質とが結合してなる薄層を基本的に含んでいる。このことが、薬物類、免疫を与える薬品類、及び遺伝子の経皮投与に対する主たる障害となる。この層は、細胞のエレクトロポレーションに使用されるごとき短パルス電界を与えることによって穿孔することができる。しかしながら、角質層には強い電気抵抗性があり、そして、この穿孔は、「角質層の絶縁破壊」なるタームを引用して表示することがより適切である。
先行技術に係る方法及び装置は、強い電気抵抗を示す死細胞の薄層を含む角質層が、薬物類及び遺伝子の経皮投与によって主たる障害になる、という難しさがある。この層は、短パルス電界を与えることにより、角質層の絶縁破壊を惹起して分子を通過させ得るポアー（小孔）を形成できる。しかしながら、前記ポアー（小孔）を介してベース組織に向けて分子を移動させるためには、ある種の力が必ず必要である。
この分野に関係した広い先行技術としては、「エレクトローポレーション法による、組織を介する分子配送のコントロール」と題するウエバーらの米国特許第5,019,034号がある。ウエバーは、薬物治療剤をシリンジ注射する及びガン注射するという従来の手段に代わる手段として、エレクトロポレーション法を模索し、そして、提案している。彼は、組織表面に高電圧で短時間の電気パルスを用いることにより、薬物及び薬物治療剤を組織中に通過させ得る組織エレクトロポレーション法の提案を記述した。しかしながら、彼は、角質層の提供する障害に関する問題、及び分子を移動させるための力の必要性を認識若しくは言及していない。
興味ある他の特許は、「特定の解剖学的部位でエレクトフュージョンさせる装置及び方法」と題するグラソの米国特許第4,955,378号記載のものである。彼は、好適には角膜上で及び頸部域で、生物顆粒（biological particles）と生きている組織（living tissue）とを融合させる方法を開示した。この生きている組織は、生物顆粒と完全融合できる生きている細胞、又は生きている細胞類を含む。彼が、薬物類、免疫を与える薬品類、及び遺伝子の経皮投与に対する、角質層の抵抗によって起きる課題を認識しておらず又解決していないことを、繰り返して述べる。また、両特許権者は、薬物類、免疫を与える薬品類、又は遺伝子を、組織表面中に又は組織表面を横切って若しくは介して、導入するための力（force）を与える手段の必要性を認識しておらず、又示唆していない。
薬物類、免疫を与える薬品類、又は遺伝子の経皮ドラッグ  デリバリーに有効な改良方法及び装置が望まれている。
発明の開示
本発明の主目的は、マイクロキャリアーのエレクトロインコーポレーション法による経皮ドラッグ  デリバリーのための改良方法及び装置を提供することである。
本発明の主要な特徴によれば、薬物又は遺伝子はマイクロキャリアー内に封入され、該マイクロキャリアーを組織表面と物理的に接触させ、そして、電極を用いてマイクロキャリアーと組織との間に、パルス電界を与える。これにより、マイクロキャリアーと組織との接触面にポアーが形成され、該ポアーより大きなマイクロキャリアーは組織と融合してチャンネル（channl）を形成し、このチャンネルを介して、加圧された薬物及び遺伝子が組織内に入り込む。
本発明の他の特徴は、薬物、免疫を与える薬品若しくは遺伝子分子を搬送するマイクロキャリアーは、該マイクロキャリアーが角質層に形成されるポアーよりも小さい場合には、組織中に角質層を介して入り込み、前記分子は組織で拡散される。
【図面の簡単な説明】
本発明の目的、利点及び特徴は、添付された図面を参照に付した以下の詳細な説明からより明確となるであろう。
図１は、本発明の過程を実施するために用いる装置の斜視図である。
図２は、図１の装置のヘッド部を示す拡大図である。
図３は、薬物、免疫を与える薬品若しくは遺伝子分子を封乳したマイクロキャリアーを示したものである。
図４は、角質層の表面に適用した複数のマイクロキャリアーを示したものである。
図５は、電極を適用し、そして、マイクロキャリアーと皮膚若しくは角質層との間にパルス電界を適用するステップを示したものである。
図６は、マイクロキャリアーの表面と角質層とのポアー形成を示したものである。
図７は、マイクロキャリアーと角質層との融合、及び該角質層へのチャンネルを介する薬物又は遺伝子の透過を示したものである。
図８は、ポアーの形成、及びマイクロキャリアーの該ポアーを介する角質層への透過を示したものである。
図９は、角質層下のマイクロキャリアー、及び角質層下の皮膚内における、微粒子からの薬物、免疫を与える薬品若しくは遺伝子の透過を示したものである。
図10は、角質層表面における、電極周辺の、等電界線の分布（equipotential and field line distribution）を示したものである。
図11は、マイクロバブル（microbubbles）の周辺、及び角質層に形成されたポアーを介した電界線（field line）を示したものである。
図12は、図11に類似する、固体のマイクロキャリアー周辺の電界線（field line）を示したものである。
本発明の最適な実施の形態
本発明は、角質層を絶縁破壊することにより、小水包（vesicle）内に収容された薬物類と遺伝子類を角質層の表面を介してその下部の組織内に、そして、おそらく血流中に移動させ得る点に、その利点がある。所望する場合には、ついで、エレクトロポレーション法が適用され、これにより、ヒトの生きている組織の細胞、及び他の生きている器官の細胞内へ、薬物類、遺伝子類、DNA又はこれに類するものの取り込みを高めることができる。エレクトロポレーション法を含む様々な技術が、径が数μｍ未満であるマイクロキャリアー内に、薬物やDNAのごとき分子を封入するために使用される。ここで使用するマイクロキャリアーなる用語は、マイクロバブル（microbubbles）のような様々なキャリアーを指称するものであり、該マイクロバブルとしては、リポゾーム類、血球ゴースト若しくは他の小水包、及び固体のキャリアーがある。マイクロキャリアーは、角質層に適用され、ついで、電極がマイクロキャリアーを被うように適用される。次に、電界パルスが、角質層若しくは他の組織表面の絶縁破壊を起こさせて通路を形成するために使用され、この通路を介して、薬物類と他の分子類、又はマイクロキャリアーのいずれかが透過され、そして、前記薬物類と他の分子類は、その下部の組織内へと移動する。マイクロキャリアーがポアーよりも大きい時には、該マイクロキャリアーは皮膚表面と融合し、そして、電界によって角質層及びマイクロバブルの絶縁破壊を引き起こさせ、これにより、分子はマイクロバブルからポアーを介して移動する。マイクロキャリアー若しくはマイクロバブルがポアーよりも小さい時には、該マイクロキャリアー若しくはマイクロバブルは角質層を介して移動し、ついで絶縁破壊され、当該分子類は組織内に拡散される。
エレクトロポレーション法は、高電圧電界の短パルスを使用することにより、組織又は細胞膜に、遷移状態にあるポアーを形成させることを含むものである。一度、皮膚又は組織にこれらのポアーが形成されると、分子類は、組織内の所望部位に向けて皮膚又は組織を移動する。ポアーが細胞膜に形成された時には、DNA及び他の分子類は、細胞壁に形成されたポアーを介して細胞内に入り込める。そしてその後、細胞内に封入された状態で留まり、細胞壁自体は再び封じられる。そして、DNA若しくは他の遺伝子、又は薬物は、細胞内で作用してこの細胞の性質を変える。
図１において、本発明のプロセスを実施するために使用される装置の例示的な実施例が図示されている。この装置は、信号発生装置12、及び液媒体源14に連結され、付号10で示された手動式アプリケーターを含み構成されている。アプリケーター10にはヘッドアセンブリー16が備えられ、該ヘッドアセンブリー16により、患者さんの予め選ばれた組織領域の表面に、遺伝子、免疫を与える薬品類、又は薬物類を有するマイクロキャリアーが適用される。ヘッドアセンブリー16の細部は、図２に示されている。
ヘッドアセンブリー16には電極アレー18があり、該電極アレー18は、多孔質形状のエラストマー20のごときキャリアー若しくはアプリケターに装着されており、このキャリアー若しくはアプリケターは、柔軟で半剛性な若しくはフィルム形状の平板状絶縁支持部材22に装着されている。コンダクターに隣接する平行な部材は、組織表面に電界を与えるための電極として作用する。電極は、深さ約0.2mm、幅約0.2mmの如く、小さくそして近接して配置されていることが好ましい。アプリケーターはまた、その表面上に電極を有する小さな貼布片（patch）でもある。
図１において、アプリケーター10は、さらに、ハンドル部24と、前記ヘッドアセンブリー16上に載置されるアーム部26を含んでいる。ヘッドアセンブリー16は１対のピン28によってＹ形状の末端部26aに連結されている。これらのピンは、ヘッド部の曲げを可能とし、そして、皮膚表面湾曲部への当接を可能とする。
前記コンダクター18の末端部は、電動ケーブル30により信号発生装置12に連結されている。分子類若しくは薬物を含有する小水包類の液状媒体は、液状媒体源14に収容されており、この液状媒体源14は、適当な自動ポンプ若しくは加圧源（図示しない）を含み構成されている。液状媒体源14は、アプリケーター10に延びる柔軟な管32によって、フォームエラストマー（foam elastomer）20と連結されている。前記アプリケーターのハンドル24上の作動ボタン30は、図示しないバルブの活性化を抑制し、液状媒体の適宜量をフォームエラストマー20に配送させる（deliver）。前記エラストマー20は、予め決定された量の液状媒体を保持するためにスポンジ様の物質として提供される。前記アプリケーター及び信号発生装置は、後述する特許出願においてより完全に記載されているように機能する。ここに、完全記載された引例として援用する。
本発明は、米国特許第5,318,514号にて掲示されたカテーテル（catheter）方式の装置及び方法によって実施可能であり、ここに、完全記載された引例として援用する。これは、例えば体腔のごとき組織の表面及び膜を介して薬物及び遺伝子を配送させるためのより慣用的な装置を提供するものである。本発明は、角質層の抵抗に起因する課題を解消するために考案された。しかしながら、体腔及び傷口内の他の組織表面を介して、薬物や遺伝子類のごとき分子の挿入に適用し得る。これら他の適用には、図示した装置に対してある種の改良を加える必要があるかもしれない。
図３において、本発明のプロセスは、まず、経皮的に配送される薬物類若しくは遺伝子類36を、担体としてのマイクロバブル（microbubbles）のようなのマイクロキャリアー38内に封入することにより実施される。これらマイクロキャリアーには、リポゾーム、血球ゴースト、又は他の小水包（vesicles）がある。マイクロキャリアーはマトリックス型のものであり、薬物類又は他の分子はこのマトリックスの内部に封入される。これにより、経時的な放出機能が提供できる。分子の封入は、エレクトロポレーション法を含む様々な公知プロセスのいずれかを用いて行うことができる。
この封入済みマイクロバブルは、図４に示すように、ついで、適用な手段により皮膚層42の皮膚層の表面組織若しくは角質層に接触させ、近接する１対の電極44、46の間に位置させる。これは、図１に示す装置を使用して行うことができ、スポンジ20によりマイクロバブルを搬送してきた液体を適用し、アプリケーター表面の電極間に位置させる。図２に示すような、パッドと類似した構造を持つ貼布片（patch）と電極によっても実施できる。
次に、短パルス電圧が電極間に与えられ、十分な強度を持つ電界が作り出され、角質層及びマイクロバブルに絶縁破壊を誘発（induce）してポアーが形成され、そして、該ポアーを介して、マイクロバブル内の分子類は、下方の組織内に移動させられる。分子をポアーを介して移動させるため、マイクロバブルに若干の圧力を与えることができる。図５に示すように、有効な電子線（electric lines）が、組織表面又は角質層に対して垂直方向となるように、電界が与えられる。角質層に対する特定のパラメーターは、20kV/cmから約60kV/cmの電界強度（field strength）であり、これは、パルス長が10マイクロ秒（μsec）から10ミリ秒（msec）、電圧が20Vから120Vで作り出すことができる。この電界により、角質層、及び小水包若しくはマイクロバブルの壁の両方に、それぞれ絶縁破壊が誘発される。他の組織の組織表面は、一般に、これよりもより弱い電界を要求するであろう。
角質層及びマイクロバブルの両方における絶縁破壊によって、図６に示すように、ポアー50、52が産生又はオープンする。これらのポアーは、図７に示すように、さらに拡大し、１つのルーメン（lumen）へと結合してチャンネル54を造ることができ、該チャンネルを介して前記マイクロバブルの内容物は、角質層の下方に位置する皮膚へと取り出される。マイクロバブルの内圧は、１以上のチャンネルを介して分子類を通過させるための移動力として作用できる。角質層は本質的には死した物質（細胞）からなるため、チャンネルは、生きている組織内と同様、急速に閉鎖されることはない。これにより、下方に位置する皮膚組織内に、薬物類若しくは遺伝子類を、表層を介して分散できる。
デリバリー  システムは、前記アーム部若しくは本体に結び付られているか、又は簡単に連結されている貼布片（patch）を含むシステムのごとき、他の形態として使用できる。前記貼布片は、薬物封入されたマイクロバブルの懸濁液を収納した槽を有する、再蓄電可能なバッテリー式パルス供給装置を含み構成されている。アプリケターは、図１に示した装置のような基本構成であり、ボタンを押すことにより、予め選択されたマイクロバブル量が、皮膚の電極間に配送される。このマイクロバブルは、物理的に良好な接触を得るため、皮膚に対して押圧される。他のボタン若しくはスイッチで印加することにより、マイクロバブルを角質層に融合させる電極に、電気パルスを配送する。そして、マイクロバブルの大多数が皮膚に融合され、角質層を介する薬物類の汲み上げ（pumpimg）若しくは押し付け（forcing）が開始される。
パッド20の基本構造を持つ特定の貼布片もまた、組織の表面に適用し得る。マイクロバブルを貼布片に含ませることができ、該貼布片には電界を作り出すための電極もまた含まれている。電極の構造は図２と同様に構成でき、貼布片の内側に設けられる。電極構造は、貼布片外側の２つの電極に連結されているがゆえに、電圧パルスを提供するためのこれら外側の電極に、パルス発生装置を絶えず連結させておくことができる。貼布片の端部に、皮膚若しくは組織にくっつけるための粘着端を形成した状態で提供されることが好ましい。また、皮膚若しくは組織へ貼布される前に剥離する保護カバーを設けることが好ましい。
仮に薬物類が細胞内に搬送されたとすると、適宜時間融合させた後に、細胞のポアーを拡大するために、適宜電圧で適宜時間、持続的に第２番目のパルスが与えられる。これにより、エレクトロポレーション法と同様、細胞内に薬物若しくは分子が取り込まれる。体内の細胞ポレーション（cell poration）のパラメーターは、溶液中のパラメーターと実質的には同一であり、当業者により知られているか、又は当業者に利用されている。係るパラメーターは、また、カリフォルニア州、サン  ディエゴの、ジェネトロニクス  インク．から刊行された刊行物が利用できる。
ドラッグ  デリバリーのタイム  プロフィールは、径の異なるマイクロバブルを混和することにより創り出すことができる。ついで、その流れ（flux）は、ポアーの大きさと配送されるマイクロバブル量によってコントロールできる。また、本発明のプロセスは、イオントフォレシス法を追加起動力（additional  driving force）として組み合せすることもできる。イオントフォレシスは、イオンチャージができ、組織中に存在する経路若しくはポアーを介したイオン類又は分子類の移動を引き起こすことができるという利点がある。この組み合せは、エレクトロポレーションを、チャンネル及びポアーを拡大させるために利用でき、そして、イオントフォレシスを、選択された組織内に向けた更なる薬物類若しくは遺伝子の移動を引き起こすために利用できる。
本発明の実施例は、次に述べる実験により証明されている。
1.ラベルされたカルセイン（labelled calcein）をヌードマウスの皮膚上に配置した。
2.ラベルされたカルセイン（labelled calcein）を前記マウスの皮膚上に配置し、ついで、エレクトロポレーション法で処理した。
3.ラベルされたカルセイン（labelled calcein）をリポゾーム内に封入し、ついで、前記マウスの皮膚上に配置した。
4.ラベルされたカルセイン（labelled calcein）をリポゾーム内に封入しついで、マウスの皮膚上に配置してエレクトロポレーション法で処理した。
この限られた実験結果から、下方の皮膚若しくは組織内への皮膚浸透性は、実験４が最も優れていることがわかり、実験４は、皮膚に電気融合せしめるリポゾーム内に封入されたカルセインを使用したものである。
図８及び図９に他の実施例が示されており、類似の構造は、プライム（’）を付した類似の付番で確認される。この実施例において、マイクロキャリアー38'は、ポアー50'を介して移動できる程度に小さなものから選択されている。現時点において、私は、約９μｍ若しくはこれより若干大きいものが、その最小径であると信じている。角質層における絶縁破壊は、図８に示すように、オープンポアー50'を介して移動中のキャリアーで発生する。これらのポアーは拡大し、そして、図９に示すように、キャリアーは、ポアーを介して移動すとともに、角質層の下に位置する皮膚内に移動し得る。内部に入り込み開口52'が形成されると直ちに、皮膚内酵素がキャリアーの壁を破壊するように作用し、キャリアー内の分子類を皮膚内に放出させる原因となる。角質層は本質的には死した物質からなるものであるから、チャンネルは、生きている組織のように極めて急速に閉じることはない。これは、薬物類若しくは遺伝子を含有するキャリアーを、表層を介して、下方の皮膚組織内に向けて移動させ得ることであり、該下方の皮膚組織において分子類は組織内に分散される。
デリバリー  システムは、他の形態として使用できる。たとえば、アーム部若しくは本体に結び付けられているか又は簡単に連結されている貼布片（patch）を含む小システムのごときものであり、該小システムは、薬物を封入したマイクロバブルの懸濁液が収納された槽を有する再蓄電可能なバーツテリー式のパルス供給装置を含んでいる。アプリケターは、図１に示した装置のごとき基本部品をもっており、ボタンの押圧によって、小水包の予め選択された量が、皮膚の電極間に配送される。このマイクロキャリアーは、物理的に良好な接触を得るため、皮膚に対して押圧される。他のボタン若しくはスイッチにより印加することにより、マイクロバブルを角質層に融合させる電極に、電気パルスが、配送される。
特定の貼布片がまた組織表面に適用される。マイクロキャリアーは、この貼布片に含ませることができ、該貼布片はまた電界を作り出すための電極も含んでいる。電極の構造は、図２と類似で、貼布片の内側若しくは表面に備えられている。電極構造は、貼布片外側にのつの電極に連結されており、電圧パルスを提供するため、これら外側の電極にパルス発生装置を絶えず連結させておくことができる。この貼布片は、皮膚若しくは組織にくっつけるための粘着端を有するものとして提供されることが好ましい。また、貼布片は、皮膚若しくは組織に貼布する前に剥離される保護カバーを有することが好ましい。
仮に薬物類が細胞内に搬送されたとすると、適宜時間融合させた後に、細胞のポアーを拡大するために、適宜電圧で適宜時間、持続的に第２番目のパルスが与えられる。これにより、細胞は、エレクトロポレション法によると同様、薬物若しくは分子の取り込みができるようになる。
ドラッグ  デリバリーのタイム  プロフィールは、径の異なるマイクロキャリアーを混和することにより創り出すことができる。その流れ（flux）は、ついで、ポアーの大きさと配送される小水包量によってコントロールできる。また、本発明のプロセスは、イオントフォレシス法を追加起動力（additional  drivinng force）として組み合せすることもできる。イオントフォレシス法は、イオンチャージができ、組織中に存在する経路若しくはポアーを介したイオン類又は分子類の移動を引き起こすことができるという利点を有する。この組み合せは、エレクトロポレーション法を、チャンネル及びポアーを拡大させるために利用でき、そして、イオントフォレシス法を、選択された組織内に向けた更なる薬物類若しくは遺伝子の移動を引き起こすために利用できる。
本発明の実施例は、次に述べる実験により証明されている。
1.ラベルしたカルセイン（labelled calcein）を、径が約300nmである小さなリポゾーム内に、径が約９μｍである大きなリポゾームと同様に封入した。これらを無毛マウスの皮膚上に配置し、そして、皮膚に対して垂直方向となる電界を構成体（components）に作り出すため、電極を前記リポゾームの上端に配置した。約60Vでパルス長が1.2ミリ秒のパルスを負荷した。
2.蛍光顕微鏡による実験から、パルス負荷後のカルシウムは、毛包中ではなく毛包間、すなわち、上皮と真皮に存在することがわかった。さらに、透過型電子顕微鏡"TEM"での実験から、パルス負荷後のリポゾーム全体は、角質層（SC）の下方に存在することがわかった。このことは、径が300nm乃至９μｍの範囲内であるリポゾームは、パルス負荷する間に、角質層を横断したことを示している。
3.TEMによる研究と実験から、リポゾームは崩壊して内容物を真皮中の組織内に放出することが明らかになった。さらなるテストから、カルセインは、パルス負荷後の数分間の間に、血中に入ることがわかった。分析から、皮膚上にカルセイン25μｇを適用した場合、血中で検出される量は、ml当り約300ngであることが示された。血液量のトータルが約5mlであるとすると、血中のカルセインの総量は約1.5μｇとなる。これは、25（μｇ）あたり1.5（μｇ）の効率と算定され、これは約６％と等しい。
これを時間に対してプロットすると、血中カルセイン濃度は、最初の５分間で急激に上昇し、15分後に最大となり、そして、90分後までほぼ同一の傾斜で徐々に低下することが示された。
図10において、約0.2mmの電極周辺における、幅0.2mmの等電界線の分布（equipotential and electric field line distribution）が、図示されている。電極44、46、48は、角質層の表面に図示されている。角質層は損なわれておらず、高い抵抗活性を有している。等電界線は、角質層内に集中しており、電界力が高くなっている。角質層40は、下方の上皮をフィールドから遮断する。
図11において、角質層に形成されたホール60入り口における、径が約300μｍのリポゾーム58の周辺の等電界線が示されている。価電したリポゾームは、コロンブ力（電界による価電粒子類上の力）を体験することとなり、角質層の崩壊後、角質層及び上皮内に引き込ませることができる。私の実験で使用した小さなリポゾームのような価電していない（uncharged）リポゾームは、均質は電界内で、コロンブ力を体験しない。これらは電界内で極性化され、角質層ポアー内の不均質な電界によって生じる力を受ける。この”ジエレクトロホレティック（dielectrophoretic）”な力は、作り出される電界強度（field strength）と、電界の勾配（gradient）とに、比例する。
図12において、角質層に形成されたホール若しくはポアー64の入口における、固状粒子62周辺の同様な電界プロットが、図示されている。角質層に形成されたポアーに近接した位置でのリポゾーム及び固状粒子の周辺の電界の分布は、実質的に同一である。
エレクトロホレティクな力（electrophoretic force）によって移動する、価電していないリポゾームのポアーを介する動きが、次の簡単なモデルとして記載されている。
1.  角質層の絶縁崩壊：
Ｅ≧20KV/cm
2.  中性粒子上のジエレクトロホレティックな力FD:
0003554935.tif 000002
ここで、
ａ＝極性（Polarizability）
Ｖ＝容積（Volume）
Ｅ＝電界強度（Field Strength）
3.速度（velocity）ｖは、ストークス力（Stokes force）Fsにより決定される。
Fs＝６πrvη
ここで、
0003554935.tif 000003
4.浸透深度（penetration depth）ｄはパルス負荷時間（pulse duration）により決定される。
ｄ＝VTN
ここで、
Ｔ＝パルスの長さ（pulse length）
Ｎ＝パルス数（number of pulses）
5.例:2rが９μｍ、Ｅが36kV/cm、１ミリ秒毎に３パルスであると、
浸透深度（penetration depth）ｄ＝129μｍ
より正確な算定には、角質層に形成されるポアー内の電界形状についての知識が要求される。エレクトロインコーポレーション法は、膜を有する小水包と同様、固体の粒子類に有効であると期待される。
角質層をとおす起動力を用いるジエレクトロホレシス（dielectrophoresis）法は、電気泳動法と同様、膜をもつ小水包であることを要求しない。この方法は、膜を必須とする電気融合法（electrofusion）の機序とは相違する。マトリックス内に薬物を含有する多種類の小水包類若しくはマイクロ球に、エレクトロインコーポレーション法が適用可能であると期待される。小水包類が十分に小さく、角質層及び皮膚内に形成されたポアー若しくは開口を介して移動できるものであると、そのよさが理解されるであろう。現時点において、私は、これが約９μｍ若しくは若干大きめと確信している。
次の研究を実施した。
配送された化合物（Chemical delivered）：カルセイン（分子量  623）
実験動物：毛を剃ったマウス
分析    ：蛍光顕微鏡による鏡検
最上部の角質層、深度が約1500μｍまでの組織標本の観察
実験条件：
1.  カルセインの局部適用
2.  カルセインの局部適用と、エレクトロッポレーション法の適用
3.  リポゾーム内封入カルセインの適用（24時間のインキュベーション処理）
4.  リポゾーム内封入カルセインの適用と、電気融合法の適用（エレクトロポレーション後、５分間のインキュベーション処理）
結論：
1.仮にあったとしても、殆ど浸透しなかった。
2.表面付近に僅かな浸透が認められた。
3.毛幹内によく浸透した。血中の取り込みは認められなかった。
4.毛幹の間の組織内によく浸透した。15分以内に、血中で検出できた。
この限られた実験の結果から、下方の皮膚若しくは組織に向け最も良好な皮膚浸透を示すものは、リポゾーム内封入カルセインと電気パルスとを適用した実験４であることがわかった。
特定の実施例を手段として、私の発明を説明しそして記述したが、添付したクレームで定義される本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更（changes）及び修辞（modifications）を行ない得ることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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