【手続補正書】
【提出日】平成29年11月7日(2017.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性部分とミオスタチン遺伝子を標的とするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡ分子が親油性部分に連結されており、かつＲＮＡ干渉を媒介する、全身投与により対象におけるミオスタチン遺伝子の発現を調整するための、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項２】
前記親油性部分が、コレステロールである、請求項１に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項３】
前記親油性部分が、前記ｓｉＮＡ分子の３’末端または５’末端に付加される、請求項１または２に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項４】
前記ｓｉＮＡ分子が、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項５】
前記ｓｉＮＡ分子が、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖分子であり、前記アンチセンス鎖が、前記センス鎖に対して相補的である、請求項１から４のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖がそれぞれ独立して、１５〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項７】
前記ｓｉＮＡ分子が、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の鎖において１つまたは複数の３’オーバーハングヌクレオチドを含む、請求項５または６に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項８】
前記親油性部分が、前記ｓｉＮＡ分子の前記センス鎖の３’末端、前記ｓｉＮＡ分子の前記センス鎖の５’末端、または前記ｓｉＮＡ分子の前記アンチセンス鎖の３’末端のいずれかに付加される、請求項５から７のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項９】
前記ｓｉＮＡ分子が、前記分子の３’末端上にキャップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項１０】
前記対象が、ヒトである、請求項１から９のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項１１】
前記対象が、家畜である、請求項１から９のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含み、全身投与される、対象における筋肉量を増強するための組成物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含み、全身投与される、対象における筋肉の性能を増強するための組成物。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含み、全身投与される、ヒトまたは動物用医薬組成物。
【請求項１５】
対象における筋骨格系疾患もしくは障害、または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害の処置に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ミオスタチンの発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
（ａ）前記ｓｉＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
（ｂ）各鎖が、独立して、１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、および
（ｃ）前記アンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）、
５’−ＡＣＵＣＣＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＣＣＡＵ−３’（配列番号３）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも１５ヌクレオチドを含む、
二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１７】
ミオスタチンの発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
（ａ）前記ｓｉＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
（ｂ）各鎖が、独立して、１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、および
（ｃ）前記アンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）、
５’−ＡＵＧＧＣＵＵＣＵＡＵＵＣＵＧＧＡＧＵ−３’（配列番号２０）、または
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）
の少なくとも１５ヌクレオチド配列を含み、
前記ヌクレオチドの１つまたは複数が、化学的に修飾されていてよい、
二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
【請求項１８】
前記ｓｉＮＡ分子が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）および
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）および
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）、
５’−ＡＣＵＣＣＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＣＣＡＵ−３’（配列番号３）および
５’−ＡＵＧＧＣＵＵＣＵＡＵＵＣＵＧＧＡＧＵ−３’（配列番号２０）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）および
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）
のいずれかを含む、請求項１６または１７に記載の二本鎖ｓｉＮＡ分子。
【請求項１９】
前記ｓｉＮＡ分子が、親油性部分に連結される、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＮＡ分子。
【請求項２０】
前記親油性部分が、コレステロールである、請求項１９に記載の二本鎖ｓｉＮＡ分子。
【請求項２１】
前記親油性部分が、前記ｓｉＮＡ分子の３’末端または５’末端に付加される、請求項１９または２０に記載の二本鎖ｓｉＮＡ分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって前記対象にｓｉＮＡコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。本明細書において使用される句「ミオスタチンレベルを低減する」は、ミオスタチン遺伝子の発現を低減することまたはミオスタチンタンパク質レベルを低減することを指す。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象の筋肉量の増加をもたらす。「筋肉増強」および「筋肉を増強する」という用語は、本明細書において交換可能であることが意図され、過形成の誘導（筋線維数の増加）、肥大の誘導（筋線維直径の増加）、またはその両方を含むが、これらに限定されない。増加は、１型および／または２型筋線維におけるものとすることができる。本発明の本態様は、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を全身的に送達するによって、損傷した筋骨組織の再生を、それを必要とする対象において行う方法にさらに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、前記対象にｓｉＮＡコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象における筋肉の性能の増加をもたらす。「筋肉の性能の増強」は、萎縮の減少、筋肉耐久性の増加、および全体的な筋肉強度の増加（例えば収縮力の増加）のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。本発明のさらなる態様は、対象において筋肉の性能を増強するのに使用するためのミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の別の実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害（例えば筋力低下、筋萎縮症）の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害（例えば筋力低下、筋萎縮症）の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現における減少は、対象における筋肉量の増加および／または筋肉の性能の増強をもたらす。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
親油性部分は、ｓｉＮＡ分子の末端（例えばｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’もしくは５’末端）への連結を通してまたはｓｉＮＡ分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンｓｉＮＡ分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、２つ以上の付加された親油性部分（例えば、パッセンジャー鎖の３’および５’末端の両方に付加された親油性部分；ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端に付加された親油性部分）を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子が、親油性部分に連結される。別の実施形態では、親油性部分が、コレステロールである。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の３’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の５’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の３’および５’末端のそれぞれに付加される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、アンチセンス鎖の５’末端でリン酸化される。リン酸基は、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートとすることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１】Ｍｓｔｎ−コレステロールコンジュゲートのインビボにおけるスクリーニングである。４つのＭｓｔｎ−コレステロールｓｉＲＮＡ（●）、ＰＢＳ（○）、およびプラセボ５非ターゲティングコントロール（●）を、ｉ．ｖ．注射によって１５ｍｐｋの用量でＣＤ−１マウス（ｎ＝５）においてスクリーニングした。（Ａ）Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｂ）Ｍｓｔｎタンパク質レベルは、投薬の３日後に血清において測定した。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【図２】Ｍｓｔｎ−コレステロールｓｉＲＮＡによるミオスタチンｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）のインビボにおける用量漸増法および持続時間である。Ｍｓｔｎ：１１６９コレステロール（「Ｍｓｔｎ−ｃｈｏｌ」）ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｖ．注射によって、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロール（５０ｍｐｋ）に加えて、５、１５、および５０ｍｐｋでＣＤ−１マウス（ｎ＝５）において試験した。Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡ発現は、注射後３、７、および２１日目に、腓腹筋（Ａ）、三頭筋（Ｂ）、およびＥＤＬ（Ｃ）において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｄ）血清Ｍｓｔｎタンパク質レベルは、示される時点で測定した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【図３】長期的なミオスタチンノックダウン（ＫＤ）が、筋肉のサイズの増加に至る。Ｍｓｔｎ：１１６９−コレステロールｓｉＲＮＡ（５０ｍｐｋ）を、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロールに加えて、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。（Ａ）Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡレベルは、注射後２１日目に、腓腹筋、ＥＤＬ、四頭筋、三頭筋、および脊柱僧帽筋（ｓｐｉｎｏｔｒａｐｅｚｉｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ）において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｂ）研究の期間に決定した血清Ｍｓｔｎタンパク質レベル。（Ｃ）研究の期間にモニターし、特注のＭＡＴＬＡＢおよびＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤのソフトウェアアルゴリズムを使用して一連の１０枚のマイクロＣＴ画像から定量化した脚の筋肉のサイズ（最大横断面積）。（Ｄ）２１日目の安静にした脚および運動させた脚（インサイツ筋肉機能アッセイにおいて使用）の腓腹筋重量。（Ｅ）腓腹筋の平均線維横断面積。（Ｆ）腓腹筋における筋線維の平均総数。（Ｇ）腓腹筋における筋線維のサイズ度数分布。（Ｈ）研究の期間に決定した体重測定値。（Ｉ）２０日目のｑＮＭＲ（ＥｃｈｏＭＲＩ）による体組成分析。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図４】筋疲労曲線の例である。疲労曲線は、筋疲労の３つの段階：初期疲労、後期疲労、および非疲労段階を示す。「初期疲労」は、Ｆｍａｘ−Ｆ０によって示され、典型的にＩＩｂ型線維を表し、ＩＩｂ型線維は、エネルギー源としてクレアチンリン酸を使用する。この段階に、「後期疲労」（Ｆ０−Ｆｍｉｎ）が続き、典型的にＩＩａ／ｘ型線維を表し、ＩＩａ／ｘ型線維は、エネルギー源としてグリコーゲンを使用する。疲労曲線の最終段階は、「非疲労」段階（Ｆｍｉｎ）であり、これは、Ｉ型線維を示し、Ｉ型線維は、エネルギー源として脂肪酸を使用する。
【図５】長期的なミオスタチンノックダウンが、筋肉の機能の変化に至る。Ｍｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートまたはプラセボ５０−コレステロール非ターゲティングｓｉＲＮＡコントロール（５０ｍｐｋ）を、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。筋疲労曲線、筋力（Ａ）、または比筋力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）（Ｂ）を、２１日目／２２日目に実行したインサイツ筋肉機能アッセイから作成した（合計ｎ＝９）。示される疲労曲線から計算した機能パラメーターを、（Ａ）および（Ｂ）においてそれぞれの曲線の下にプロットする。塗りつぶされたバーは、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートおよびプラセボ５−コレステロール治療の間の、特定のパラメーターにおける統計的に有意な変化を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図６】プラセボ５−ｃｈｏｌおよびＭｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡコンジュゲートについての様々なパラメーターに対して標準化した心臓重量測定値である。Ｍｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡコンジュゲート（５０ｍｐｋ）を、ＰＢＳおよびプラセボ５コレステロールコンジュゲート非ターゲティングコントロールに加えて、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。心肥大のサインについて評価するために、Ｍｓｔｎノックダウンの２１日後に、心臓を計量し、様々なパラメーター（すなわち脛骨の長さ、体重、除脂肪量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、および筋肉横断面積（ＣＳＡ））に対して標準化した。塗りつぶされたバーは、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートおよびプラセボ５−コレステロール治療の間の、特定のパラメーターにおける統計的に有意な変化を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図７】Ｃｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートである。（Ａ）ＷＴ、ＬＤＬＲ−／−、およびＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートの効能についてのインビボにおける比較。Ｃｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌ  ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｖ．注射によって１４ｍｐｋの用量でＣＤ−１マウス（ｎ＝３または４）においてスクリーニングした。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）（Ｂ）パッセンジャー鎖の３’または５’末端に単一のコレステロールを付加したＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌ  ｓｉＲＮＡを、ｉ．ｖ．注射によって、１５ｍｐｋの用量で、ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）においてスクリーニングした。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡ発現を、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロール（３’ｃｈｏｌ）と比較した。ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
親油性部分は、ｓｉＮＡ分子の末端（例えばｓｉＮＡ分子のオリゴヌクレオチド鎖の３’もしくは５’末端）への付加を通してまたはｓｉＮＡ分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンｓｉＮＡ分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、２つ以上の付加された親油性部分（例えば、パッセンジャー鎖の３’および５’末端の両方に付加された親油性部分；ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端に付加された親油性部分）を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡおよび非ターゲティングコントロールｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を表３に示す。表３の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖としても知られている）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖としても知られている）を含有し、各鎖は２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２１位（３’））で構成され、内部および末端化学修飾ヌクレオチドの両方を含有する。それぞれのｓｉＲＮＡ分子の名称は、第１列に提供され、分子が標的にされるマウスＭｓｔｎ  ｍＲＮＡ領域に対応する。表３の第２列の「鎖」は、示される行の特定の配列が二本鎖のセンス（Ｓ）であるかアンチセンス（Ａ／Ｓ）鎖であるかを示す。表３の第３列の「５’−第１位ヌクレオチド」は、示されるｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の第１位を記述し、それぞれ、５’キャップ成分の付いたヌクレオチドで構成される。５’−第１位ヌクレオチドのそれぞれの化学構造は以下の表６ａに提供される。ｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表３の第４列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第４列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表６ｂに提供される。表３の第５列の「ヌクレオチド位置２１−３’」はｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖の最３’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｏｍｅＵ−ｉＢ」または「ｏｍｅＵＳｕｐ」によって表される（構造については以下の表６ｃを参照）。表３のｓｉＲＮＡ分子の各鎖（第１〜２１位）の配列番号は第６列に提供される。表３の各ｓｉＲＮＡ分子は、分子の両末端に２つのヌクレオチドから構成される３’オーバーハングを有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
実施例２：Ｍｔｓｎ  ｓｉＲＮＡコレステロールコンジュゲート
コレステロールコンジュゲーション  −  単一のコレステロール要素を、表３に記載されるそれぞれのｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に付加した。３’末端上にコレステロール単位を有するオリゴヌクレオチドの調製のために、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護第一級アルコールも含有するあらかじめ負荷されたコハク酸コレステロールを有するデオキシシチジリル（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌｙｌ）−デオキシグアノシン（ＣｐＧ）（構造については以下表６ｄを参照）は、対応するオリゴヌクレオチド配列の合成のために使用した（実施例１を参照）。典型的に、最後の５’−ＤＭＴ保護基は、オリゴ合成の間に除去した。次いで、オリゴヌクレオチドは、メチルアミン水などの塩基性溶液による処理によってＣｐＧから切断し、Ｃ１８などの逆相樹脂を有するクロマトグラフィによって精製した。この精製オリゴは、所望のオリゴヌクレオチド二重鎖を調製するために、その対応する相補鎖にアニールさせた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
結果  −  筋肉におけるコレステロールコンジュゲートの取込みの潜在的なメカニズムおよびリポタンパク質粒子とのコンジュゲートの関連が取込みに必要とされるかどうかを検査するために、パッセンジャー鎖の３’または５’末端に付加された単一のコレステロール要素を有するＣｔｎｎｂ１  ｓｉＲＮＡ分子の効能を、野生型、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）−／−、およびＡｐｏＥ−／−マウスにおいて検査した。マウスは、１４ｍｐｋでのＣｔｎｎｂ１：１７９７［３’Ｃｈｏｌ］ｓｉＲＮＡの単回ｉ．ｖ．注射により治療し、Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡを、７２時間後に腓腹筋において測定した（図７Ａ）。最大６０％のｍＲＮＡノックダウンが、ｗｔマウスにおいて観察された。ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてｍＲＮＡ  ＫＤの低下があり（５０％のＫＤ）、ＬＤＬＲ−／−マウスにおいてＫＤの低減の傾向がある。データは、Ｃｔｎｎｂ１コレステロールコンジュゲートの取込みが、筋肉においてＬＤＬ受容体を通してまたは任意のＡｐｏＥ含有リポタンパク質を介して部分的にだけ媒介されることを示唆する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
パッセンジャー鎖上のコレステロールの位置がコレステロールコンジュゲートの効能にとって本質的かどうかを決定するために、パッセンジャー鎖の３’または５’末端上にコレステロールを有するＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートをインビボにおいて検査した（図７Ｂ）。ＣＤ−１マウスを、１５ｍｐｋの一方のバージョンのＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌにより治療し、３’位にコレステロールを有するＰＢＳコントロールおよびプラセボ５−ｃｈｏｌと比較した。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡレベルは、注射の７２時間後に腓腹筋において検査した。データは、筋肉において非常に効果的なコレステロールコンジュゲートを作成するために両方の位置を使用することができることを示唆する。