【手続補正書】
【提出日】平成28年11月21日(2016.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生成物の組換え生産のための単離された真核宿主細胞であって、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより低下するか、または消失するため、ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が真核細胞中で減弱されるように前記細胞のゲノムが変化し、ＦＡＭ６０Ａタンパク質は、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対する少なくとも７５％の同一性を有し、前記細胞がそのゲノム中に組み込まれた、発現カセット中に含まれる目的の生成物をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含み、目的の生成物がポリペプチドである、単離された真核宿主細胞。
【請求項２】
前記真核細胞が、
ａ）前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子が、遺伝子変異として、非機能的な、またはあまり機能的でない発現産物を提供する前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子中の１つまたは複数の変異を含む；
ｂ）ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の少なくとも１コピーが、前記真核細胞のゲノム中で欠失されるか、または機能的に不活化される；
ｃ）染色体の一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む、
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項１に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項３】
前記真核細胞が、
ａ）前記真核細胞が後生動物細胞である；
ｂ）前記真核細胞が脊椎動物細胞である；
ｃ）前記真核細胞が哺乳動物細胞である；
ｄ）前記真核細胞がげっ歯類細胞である；
ｅ）前記真核細胞がハムスター細胞である；
ｆ）前記真核細胞がＣＨＯ細胞である；
ｇ）前記真核細胞が細胞クローンもしくは細胞株として提供される；
ｈ）前記真核細胞が内因的にＤＨＦＲおよび葉酸受容体を発現する、
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項１または２に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項４】
ａ）前記真核細胞がハムスター細胞であり、第８染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む；または
ｂ）前記真核細胞がマウス細胞であり、第６染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含み、
場合により、前記単離された真核宿主細胞が、
ｉ）前記欠失したテロメア領域がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含み、Ｃａｐｒｉｎ２およびＩｐｏ８から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む；
ｉｉ）前記欠失が染色体切断により誘導され、切断点が前記Ｉｐｏ８遺伝子のセントロメアに位置する；
ｉｉｉ）前記欠失が染色体切断により誘導され、切断点が前記Ｔｍｔｃ１遺伝子内のＩｐｏ８遺伝子のセントロメアに位置する；
ｉｖ）前記テロメア領域の少なくとも一部がそれぞれの染色体対の両方の染色体において欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項２  ｃ）に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項５】
内因性ＦＡＭ６０Ａタンパク質が、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する、および／または
さらに、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が、前記細胞中で減弱され、前記Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子が、配列番号１０〜１６に示されるアミノ酸配列の１つもしくは複数または配列番号１７によりコードされるタンパク質に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜８の１つまたは複数に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項６】
前記真核細胞が、そのゲノム中に安定に組み込まれた、目的の生成物をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、選択可能マーカーもしくはリポーターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含み、前記異種ポリヌクレオチドが、同じか、もしくは異なる発現ベクター上に位置する、請求項１〜５の１つまたは複数に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項７】
ａ）前記真核細胞が前記目的のポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する；および／または
ｂ）前記目的の生成物が治療用ポリペプチドおよび診断用ポリペプチドから選択されるポリペプチドである
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項１〜６の１つまたは複数に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項８】
それぞれの細胞の集団を起源とする細胞の平均で少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％が、８週間、好ましくは１０週間の期間にわたって、より好ましくは１２週間の期間にわたって、その発現力価（容量）を３０％、好ましくは２５％を超えて失わない、それぞれの細胞の前記集団を起源とする、請求項１〜１２の１つまたは複数に記載の単離された真核宿主細胞。
【請求項９】
目的の生成物を組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
目的の生成物がポリペプチドであり、
（ａ）宿主細胞として請求項１〜８の１つまたは複数に記載の真核細胞を提供すること；および
（ｂ）前記目的の生成物を発現する１つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む、方法。
【請求項１０】
ａ）段階（ａ）で提供された前記宿主細胞が哺乳動物細胞である；
ｂ）段階（ａ）で提供された前記宿主細胞が、選択可能マーカーをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択可能マーカーにとって選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む；
ｃ）段階（ａ）で提供される前記宿主細胞が、選択可能マーカーをそれぞれコードする少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含み、第１の選択可能マーカーが葉酸受容体であり、第２の選択可能マーカーがＤＨＦＲであり、段階（ｂ）が、限定濃度の葉酸塩とＤＨＦＲ阻害剤とを含む選択培養培地中で前記複数の宿主細胞を培養することを含む；
ｄ）異種ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることにより前記真核細胞中に導入される、
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）段階（ｂ）が複数の選択ステップを含む；
ｂ）段階（ｂ）がフローサイトメトリーに基づく選択を実施することを含む；
ｃ）前記選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換え発現する、
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
目的の生成物を組換え生産するための方法であって、前記目的の生成物はポリペプチドであり、前記目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞として請求項１〜８の１つまたは複数に記載の真核宿主細胞を用いることを含み、
（ａ）前記目的の生成物の発現を可能にする条件下で、請求項１〜８の１つまたは複数に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｂ）細胞培養培地からおよび／または前記宿主細胞から、前記目的の生成物を単離すること；ならびに
（ｃ）場合により、前記単離された目的の生成物をプロセシングすること
を含む、方法。
【請求項１３】
真核細胞中でのＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果を減弱させるように前記細胞のゲノムを変化させること、および前記細胞中に、発現カセット中に含まれる目的の生成物をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターを安定にトランスフェクトすることを含み、前記目的の生成物がポリペプチドである、請求項１〜８の１つまたは複数に記載の真核宿主細胞を生産するための方法。
【請求項１４】
ＦＡＭ６０Ａの効果が真核細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的に分析することによって、目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞としてのその好適性について真核細胞を分析することを含む方法であって、前記ＦＡＭ６０Ａタンパク質は、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対する少なくとも７５％の同一性を有し、
前記方法は、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより低下するか、または消失するため、ＦＡＭ６０Ａの機能的発現が減弱されている少なくとも１つの細胞を、目的の生成物の組換え発現のために選択することをさらに含む、方法。
【請求項１５】
ａ）直接的に分析することが、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む；
ｂ）分析の前に、前記真核細胞が染色体切断を誘導する薬剤で処理され、前記分析が、前記薬剤を用いる処理がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む染色体の一部の欠失をもたらしたかどうかを分析することを含む；
ｃ）分析の前に、前記真核細胞に、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、分析の前に、少なくとも１つの選択ステップを実施して、うまくトランスフェクトされた宿主細胞を同定する；
ｄ）内因性Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的にさらに分析することを含み、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子は、配列番号１０〜１６に示されるアミノ酸配列の１つもしくは複数または配列番号１７によりコードされるタンパク質に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である；
ｅ）前記細胞がハムスター細胞であり、前記方法が、第８染色体のテロメア領域中に位置し、Ｔｍｔｃ１遺伝子およびＴｍｔｃ１遺伝子のテロメアに位置する遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が消失するか、または低下するかどうかを分析することを含み、それによって、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む；
ｆ）複数の細胞クローンが、安定な細胞クローンと不安定な細胞クローンを識別するために分析され、前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が低下するか、または消失する１つまたは複数の細胞クローンが、生産クローンとして選択される；
ｇ）複数の細胞クローンが、安定な生産細胞クローンと不安定な生産細胞クローン、および、高生産細胞クローンと低生産細胞クローンを識別するために分析され、前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が低下するか、または消失する１つまたは複数の細胞クローンが、生産クローンとして選択される、
という特徴の１つまたは複数を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
目的の生成物を組換え発現させるための単離された真核宿主細胞の使用であって、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより低下するか、または消失するため、真核細胞のゲノムが、ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が前記細胞中で減弱されるように変化しており、ＦＡＭ６０Ａタンパク質は、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対する少なくとも７５％の同一性を有し、前記目的の生成物はポリペプチドであり、前記使用が、前記真核細胞に、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを安定にトランスフェクトすることを含む、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
さらに、第８染色体のテロメア領域の一部を失った数百個のクローンを分析することにより、第８染色体のテロメア領域中に誘導することができるいくつかの切断点が存在すると考えられることが見出された。多くの分析された事例において、切断点はＩｐｏ８遺伝子のセントロメアに位置していた。ＦＡＭ６０ＡとＩｐｏ８の間にも切断点が検出された。欠失領域は、全ての事例において、容量生産性の増大と関連するＣ１２ｏｒｆ３５遺伝子を含んでいた（メチルトランスフェラーゼ様タンパク質２０をコードする遺伝子のテロメアに位置する）。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が真核細胞中で減弱されるように前記細胞のゲノムが変化し、前記細胞がそのゲノム中に組み込まれた、目的の生成物をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む、単離された真核細胞。
［２］
ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するため、前記ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が減弱される、上記［１］に記載の単離された真核細胞。
［３］
前記細胞が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前記のいずれかの組合せにより、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させるように変化している、上記［２］に記載の単離された真核細胞。
［４］
前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子が、遺伝子変異として、非機能的な、またはあまり機能的でない発現産物を提供する前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子中の１つまたは複数の変異を含む、上記［３］に記載の単離された真核細胞。
［５］
ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の少なくとも１コピーが、前記真核細胞のゲノム中で欠失されるか、または機能的に不活化される、上記［３］または［４］に記載の単離された真核細胞。
［６］
前記真核細胞が、後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である、上記［１］〜［５］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［７］
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、上記［６］に記載の単離された真核細胞。
［８］
染色体の一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む、上記［１］〜［７］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［９］
ａ）前記真核細胞がハムスター細胞であり、第８染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む；または
ｂ）前記真核細胞がマウス細胞であり、第６染色体のテロメア領域の少なくとも一部が欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む、
上記［８］に記載の単離された真核細胞。
［１０］
ａ）前記欠失したテロメア領域がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含み、Ｃａｐｒｉｎ２およびＩｐｏ８から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む；
ｂ）前記欠失が染色体切断により誘導され、切断点が前記Ｉｐｏ８遺伝子のセントロメア、好ましくは、前記Ｔｍｔｃ１遺伝子内に位置する；
ｃ）前記テロメア領域の少なくとも一部がそれぞれの染色体対の両方の染色体において欠失し、前記欠失した部分がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［９］に記載の単離された真核細胞。
［１１］
ａ）前記真核細胞がげっ歯類細胞である、
ｂ）前記真核細胞がハムスター細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞である、
ｃ）前記真核細胞が内因的にＤＨＦＲおよび葉酸受容体を発現する、ならびに／または
ｄ）前記真核細胞が細胞クローンもしくは細胞株として提供される
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［１］〜［１０］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１２］
内因性ＦＡＭ６０Ａタンパク質が、配列番号１〜８に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を有する、上記［１］〜［１１］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１３］
さらに、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が、好ましくは、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、前記細胞中で減弱される、上記［１］〜［１２］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１４］
前記Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子が、配列番号１０〜１６に示されるアミノ酸配列の１つもしくは複数または配列番号１７によりコードされるタンパク質に対する少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、上記［１３］に記載の単離された真核細胞。
［１５］
前記真核細胞が、そのゲノム中に安定に組み込まれた、目的の生成物をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、選択可能マーカーもしくはリポーターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含み、前記異種ポリヌクレオチドが、同じか、もしくは異なる発現ベクター上に位置する、上記［１］〜［１４］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１６］
ａ）前記目的の生成物がポリペプチドである；
ｂ）前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記真核細胞が前記目的のポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する；および／または
ｃ）前記目的の生成物が治療用ポリペプチドおよび診断用ポリペプチドから選択されるポリペプチドである
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［１］〜［１５］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１７］
それぞれの細胞の集団を起源とする細胞の平均で少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％が、８週間、好ましくは１０週間の期間にわたって、より好ましくは１２週間の期間にわたって、その発現力価（容量）を３０％、好ましくは２５％を超えて失わない、それぞれの細胞の前記集団を起源とする、上記［１］〜［１６］の１つまたは複数に記載の単離された真核細胞。
［１８］
目的の生成物を組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として上記［１］〜［１７］の１つまたは複数に記載の真核細胞を提供すること；および
（ｂ）前記目的の生成物を発現する１つまたは複数の宿主細胞を選択すること
を含む、方法。
［１９］
段階（ａ）が、ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が真核細胞中で減弱されるように前記細胞のゲノムが変化している前記細胞に、前記目的の生成物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを安定にトランスフェクトして、ゲノム中に安定に組み込まれた、前記目的の生成物をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む真核宿主細胞を提供することを含む、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
ａ）前記真核細胞が哺乳動物細胞である；
ｂ）段階（ａ）で提供された前記宿主細胞が、選択可能マーカーをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択可能マーカーにとって選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む；
ｃ）異種ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることにより前記真核細胞中に導入される；
ｄ）目的の組換え生成物がポリペプチドである；
ｅ）段階（ｂ）が複数の選択ステップを含む；
ｆ）段階（ｂ）がフローサイトメトリーに基づく選択を実施することを含む；
ｇ）前記選択された宿主細胞が免疫グロブリン分子を組換え発現する；
ｈ）段階（ａ）で提供される前記宿主細胞が、選択可能マーカーをそれぞれコードする少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含み、第１の選択可能マーカーが葉酸受容体であり、第２の選択可能マーカーがＤＨＦＲであり、段階（ｂ）が、限定濃度の葉酸塩とＤＨＦＲ阻害剤とを含む選択培養培地中で前記複数の宿主細胞を培養することを含む
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
目的の生成物を組換え生産するための方法であって、前記目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞として上記［１］〜［１７］の１つまたは複数に記載の真核細胞を用いることを含む、方法。
［２２］
（ａ）前記目的の生成物の発現を可能にする条件下で、上記［１］〜［１７］の１つまたは複数に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｂ）細胞培養培地からおよび／または前記宿主細胞から、前記目的の生成物を単離すること；ならびに
（ｃ）場合により、前記単離された目的の生成物をプロセシングすること
を含む、上記［２１］に記載の方法。
［２３］
生産のために、さらに、好ましくはＣ１２ｏｒｆ３５遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることにより、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が減弱されている真核細胞を用いる、上記［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］
ａ）前記真核細胞が後生動物細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞である；
ｂ）前記真核細胞が哺乳動物細胞、好ましくは、げっ歯類細胞である；
ｃ）前記目的の生成物がポリペプチドである；
ｄ）前記目的の生成物がポリペプチドであり、前記宿主細胞が前記目的のポリペプチドを前記細胞培養培地中に分泌する
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［２１］〜［２３］の１つまたは複数に記載の方法。
［２５］
真核細胞中でのＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果を減弱させるように前記細胞のゲノムを変化させること、および前記細胞中に、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターを安定にトランスフェクトすることを含む、上記［１］〜［１７］の１つまたは複数に記載の真核細胞を生産するための方法。
［２６］
ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現を低下させるか、または消失させることによって、前記真核細胞中での前記ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果を減弱させることを含む、上記［２５］に記載の方法。
［２７］
目的の生成物の組換え発現のための宿主細胞としてのその好適性について真核細胞を分析するための方法であって、ＦＡＭ６０Ａの効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的に分析することを含む、方法。
［２８］
直接的に分析することが、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、上記［２７］に記載の方法。
［２９］
分析の前に、前記真核細胞が染色体切断を誘導する薬剤で処理され、前記分析が、前記薬剤を用いる処理がＦＡＭ６０Ａ遺伝子を含む染色体の一部の欠失をもたらしたかどうかを分析することを含む、上記［２７］または［２８］に記載の方法。
［３０］
前記細胞がハムスター細胞であり、前記方法が、第８染色体のテロメア領域中に位置し、Ｔｍｔｃ１遺伝子およびＴｍｔｃ１遺伝子のテロメアに位置する遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現が消失するか、または低下するかどうかを分析することを含み、それによって、ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が前記細胞中で低下するか、または消失するかどうかを分析することを含む、上記［２７］〜［２９］の１つまたは複数に記載の方法。
［３１］
内因性Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が前記細胞中で減弱されるかどうかを直接的または間接的にさらに分析することを含む、上記［２７］〜［３０］の１つまたは複数に記載の方法。
［３２］
分析の前に、前記真核細胞に、目的の生成物をコードする異種ポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、分析の前に、少なくとも１つの選択ステップを実施して、うまくトランスフェクトされた宿主細胞を同定する、上記［２７］〜［３１］の１つまたは複数に記載の方法。
［３３］
複数の細胞クローンが、安定な生産細胞クローンと不安定な生産細胞クローン、および場合により、高生産細胞クローンと低生産細胞クローンを識別するために分析され、前記ＦＡＭ６０Ａ遺伝子の機能的発現が低下するか、または消失する１つまたは複数の細胞クローンが、生産クローンとして選択される、上記［２７］〜［３２］の１つまたは複数に記載の方法。
［３４］
目的の生成物を組換え発現させるための単離された真核細胞の使用であって、真核細胞のゲノムが、ＦＡＭ６０Ａタンパク質の効果が前記細胞中で減弱されるように変化している、使用。
［３５］
ａ）前記真核細胞が後生動物、脊椎動物または哺乳動物細胞である；
ｂ）前記真核細胞が哺乳動物細胞である；
ｃ）前記真核細胞のゲノムが上記［２］〜［５］および［８］の１つまたは複数に記載のように変化している；
ｄ）さらに、Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の発現産物の効果が、好ましくは、内因性Ｃ１２ｏｒｆ３５遺伝子の機能的発現を低下させるか、もしくは消失させることにより、前記真核細胞中で減弱される；
ｅ）前記目的の生成物がポリペプチドである；
ｆ）前記目的の生成物が、前記真核細胞中での発現の際に、細胞培養培地中に分泌されるポリペプチドである；
ｇ）使用が、前記真核細胞に、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを安定にトランスフェクトすることを含む、および／または
ｈ）前記真核細胞が上記［１］〜［１７］の１つまたは複数に記載の細胞である
という特徴の１つまたは複数を有する、上記［３４］に記載の使用。