(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を含む水溶液中に還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン酸を共存させることを特徴とするフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質の安定化方法。
【請求項２】
発色基質がフェノチアジン系発色基質である請求項１の安定化方法。
【請求項３】
フェノチアジン系発色基質が１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン又はその塩である請求項２の安定化方法。
【請求項４】
水溶液が、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する際に使用する試薬である、請求項１、２又は３の安定化方法。
【請求項５】
酸化酵素の作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する際に使用する、フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を水溶液として含む試薬であって、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン酸を更に含有する試薬。
【請求項６】
発色基質がフェノチアジン系発色基質である請求項５の試薬。
【請求項７】
フェノチアジン系発色基質が１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン又はその塩である請求項６の試薬。
【請求項８】
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン酸の試薬中の濃度が０．０００１〜１重量％である請求項５、６又は７の試薬。
【請求項９】
請求項５、６、７又は８の試薬を凍結乾燥した試薬。
【請求項１０】
検体中の微量成分に酸化酵素を作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下にフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を用いて検出する際に、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドーリン酸を存在させることを特徴とする検体中の微量成分の定量法。
【請求項１１】
検出する際に、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドあるいは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン酸を補酵素とする酵素及びその基質を共存させる請求項１０記載の定量法。
【請求項１２】
微量成分が１，５−アンヒドログルシトールである請求項１０又は１１の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床検査試薬等の発色基質として用いられるフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質の変性を抑制し、長期にわたって着色を防止する方法、該発色基質を含有する安定性に優れた試薬及び１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５ＡＧと略す。）等の微量成分の定量法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
フェノチアジン系あるいはジフェニルアミン系の発色基質は公知の化合物で、例えば、特開昭５７−２９２９７号公報あるいは特開昭６３−２４６３５６号公報にその合成法が開示されており、その分子吸光係数が高いところから、臨床検査等における酵素反応を定量するための発色基質として使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、これら発色基質は、水溶液の状態では非常に不安定であり、水溶液中に溶け込んだ酸素あるいは光によって酸化されて着色し、測定ブランク値の上昇あるいは測定精度の低下を招く原因となっている。また、臨床検査用の酵素反応測定キットの場合凍結乾燥して長期の保存安定性を得ている商品が多いが、これら発色基質は凍結乾燥した状態であっても空気中の水分や光により自動酸化を受けて着色を起こす場合があり、長期の保存には難しい場合がある。さらには、凍結乾燥したものを再溶解したときに着色を起こす問題がある。
【０００４】
したがって、このような不安定な発色基質を有効に活用するため、水溶液状態での安定化技術、凍結乾燥品やその再溶解後の安定性を付与する技術が望まれている。
また、１，５ＡＧ等のように検体中に低濃度で存在する微量成分の測定をする場合に、感度、精度を向上させるためには、高感度の発色基質の使用が有利であるが、高感度発色基質は安定性に欠けるためその使用が難しいという問題点がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、フェノチアジン系あるいはジフェニルアミン系発色基質の安定性を向上させ酵素反応を妨害しない安定化剤を検討した結果、還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略す。）あるいは還元型βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン酸（以下ＮＡＤＰＨと略す。）が有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を含む水溶液中にＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを共存させることを特徴とするフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質の安定化方法。
（２）発色基質がフェノチアジン系発色基質である上記（１）の安定化方法。
（３）フェノチアジン系発色基質が１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン又はその塩である上記（２）の安定化方法。
（４）水溶液が、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する際に使用する試薬である、上記（１）、（２）又は（３）の安定化方法、
（５）酸化酵素の作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する際に使用する、フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を水溶液として含む試薬であって、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを更に含有する試薬、
（６）発色基質がフェノチアジン系発色基質である上記（５）の試薬、
（７）フェノチアジン系発色基質が１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン又はその塩である上記（６）の試薬、
（８）ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの試薬中の濃度が０．０００１〜１重量％である請求項５、６又は７の試薬、
（９）上記（５）、（６）、（７）又は（８）の試薬を凍結乾燥した試薬、
（１０）検体中の微量成分に酸化酵素を作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下にフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を用いて検出する際に、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを存在させることを特徴とする検体中の微量成分の定量法、
（１１）検出する際に、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素及びその基質を共存させる上記（１０）記載の定量法、
（１２）微量成分が１，５−アンヒドログルシトールである上記（１）又は（１１）の定量法、
に関するものである。
【０００７】
本発明によれば、フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を水に溶解した水溶液の状態で安定に保つことができ、又、該発色基質を含む試薬の凍結乾燥品及びこれを再溶解したものも安定に保つことができる。
且つ定量反応の主要な反応である酵素反応を阻害することがない。
【０００８】
従って、酸化酵素によって測定物質あるいは測定物質から誘導される基質を酸化して過酸化水素を生成し、ペルオキシダーゼの存在下にフェノチアジン系発色基質を発色させてフェノチアジン系色素、あるいはジフェニルアミン系発色基質を発色させてジフェニルアミン系色素を生成し、この吸光度を測定して定量する際に、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを共存させることによって、過酸化水素に起因しない発色を抑制することができ、過酸化水素に起因しない吸光度の上昇が抑制され、測定精度を高くすることができる。
【０００９】
又、検体中の微量成分を高感度に測定する場合、発色反応のときにＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨが存在すると、過酸化水素あるいは発色した物質が還元されて、発色反応が抑えられ、本来の感度が得られない場合がある。この場合、フェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質とＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨが共存する系に、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素及びその基質を共存させ、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素反応系を組み込むことによって発色反応の抑制を防止し、微量成分を精度良く測定することができる。この場合、発色反応のときにＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨはβニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋  ）あるいはβニコチンアミドアデニンジヌクレオチド一リン酸（ＮＡＤＰ＋  ）に変換され、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨによる上記悪影響が回避される。
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。フェノチアジン系発色基質としては、フェノチアジン環を有するものならいずれでもよく、例えば、ロイコメチレンブルー（３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン）の１０位のアミノ基に置換基の結合した誘導体が挙げられる。
【００１１】
置換基としては、例えば、アシル（アセチル、プロピオニル、ブチリル等）、アルキルカルバモイル（メチルカルバモイル、エチルカルバモイル等）、カルボキシルメチルカルバモイル、フェニルカルボキシ、置換フェニルカルボキキシ、フェニルカルバモイル、置換フェニルカルバモイル等が挙げられる。
【００１２】
この発色基質の代表的なものには、例えば、１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン、１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジンあるいはその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、または１０Ｎ−メチルカルバモイル−３−ジメチルアミノ−７−ヒドロキシ−１０Ｈ−フェノチアジンなどがある。
【００１３】
ジフェニルアミン系発色基質としては、ジフェニルアミン構造を有するものならいずれでもよく、例えば、ロイコビンドシェドラーズグリーン（４，４′−ビスジメチルアミノージフェニルアミン）のアミノ基に置換基の結合した誘導体が挙げられる。
【００１４】
置換基としては、例えば、アシル（アセチル、プロピオニル、ブチリル等）、アルキルカルバモイル（メチルカルバモイル、エチルカルバモイル等）、カルボキシルメチルカルバモイル  、フェニルカルボキシ、置換フェニルカルボキキシ、フェニルカルバモイル、置換フェニルカルバモイル等が挙げられる。
【００１５】
この発色基質の代表的なものには、例えば、Ｎ−メチルカルバモイル−４，４’−ビス（ジメチルアミノフェニル）アミン、Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−４，４’−ビス（ジメチルアミノフェニル）アミンあるいはその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）などがある。また、ジフェニルアミン構造を有するロイコビンドシェドラーズグリーンのフェニル基に置換基の結合した誘導体が挙げられ、例えばビス（３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル）アミン、ビス（３−ジフェニルメチル−４−ジメチルアミノフェニル）アミンなどがある。
【００１６】
これらの発色基質は単独で、あるいは２種以上を組み合わせて使用できる。
これらの発色基質の水溶液あるいは水溶液試薬中の濃度は特に限定されないが、実用上から、通常、０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１７】
ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの水溶液中あるいは水溶液試薬中の濃度は特に限定されないが、通常０．０００１〜１重量％、好ましくは０．０００５〜０．５重量％、特に好ましくは０．００１〜０．１重量％である。
【００１８】
水溶液あるいは水溶液試薬は、上記発色基質及びＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ以外に、その他の成分例えば緩衝剤、界面活性剤、酵素、基質等、発色基質を発色させその吸光度を測定することにより検体中の微量成分を定量する際に使用する発色基質含有試薬の成分として使用されているもの等を含有することができる。
水溶液試薬は、常法に従って凍結乾燥することにより、凍結乾燥試薬とすることができる。
【００１９】
検体としては、種々のものが使用でき特に限定されず、例えば、血清、血漿、血液、髄液などの体液や尿などの排泄物、便などの希釈物から固形分を除去したもの、各種組織の抽出液、又は、これらの体液、排泄物、抽出液等から干渉物質（定量対照物質以外の成分で目的とする微量成分の定量に悪影響を及ぼす糖や蛋白質等）を除去したもの等が挙げられる。
【００２０】
検体中の定量する微量成分としては、例えば１，５ＡＧ、グルコース、尿酸、コレステロール、ポリアミン、ピルビン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
酸化酵素とは酸素の存在下、基質を酸化して過酸化水素を発生する酵素であり、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、Ｌ−ソルボースオキセダーゼ（ＥＣ１．１．３．１１）、ウリカーゼ（ＥＣ１．７．３．３）は、プトレシンオキシーダーゼ（ＥＣ１．４．３．１０）等が挙げられるが、これに限定されるものでなく、過酸化水素を発生する酸化酵素であれば該当する。
【００２２】
酸化酵素は、測定すべき検体中の微量成分の種類に応じて適宜選択される。又、測定する微量成分の種類によっては、酸化酵素を該微量成分に作用させる前に、常法により検体を他の酵素等で処理して、酸化酵素の基質となるように変換処理してもよい。
【００２３】
ペルオキシダーゼとしては、その起源、由来は特に限定されず、植物、動物、微生物由来のペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）およびペルオキシダーゼ様活性物質等が挙げられる。
【００２４】
酸化酵素、ペルオキシダーゼ及び発色基質の使用量は、測定すべき検体中の微量成分の種類、量、酵素の種類、測定条件により適宜決定される。
【００２５】
検出系に存在させるＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの量は、使用する発色基質の種類及び量、測定条件により異なるが、検出系の液体中のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの濃度は、０．００００５〜０．５重量％であることが好ましく、特に０．０００５〜０．０５重量％であることか好ましい。
【００２６】
微量成分の定量にあたって、酵素反応は常法に従って行なうことができる。酵素反応を行なう際のｐＨは５〜９であることが好ましく、又、酵素反応は２０〜４０℃で行なうのが好ましい。
【００２７】
ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素とその基質の組合わせとしては、例えば、乳酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２７、ＥＣ１．１．１．２８）とピルビン酸の組合せ、リンゴ酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．３７、ＥＣ１．１．１．８２）とオキサロ酢酸の組合せ、アラニン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．１）とピルビン酸とアンモニウム塩の組合せ、グルタミン酸脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．２、ＥＣ１．４．１．３、ＥＣ１．４．１．４）とケトグルタル酸とアンモニウム塩の組合せ、ロイシン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．９）とケトイソカプロン酸とアンモニウム塩の組合せ等が使用できる。この他にも種々の組合せが考えられるが、安定性及び測定する物質の酸化酵素との組合わせから最適なものを選択すれば良い。
ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素する酵素は、検出系の液体中に０．００１〜１ｕ／ｍｌ特に０．００５〜０．５ｕ／ｍｌの濃度で存在させるのが好ましく、又、その基質類は検出系の液体中に０．００１〜１重量％特に０．０１〜０．５重量％の濃度で存在せさるのが好ましい。
【００２８】
本発明の定量法において、発色基質、酵素、その他の基質、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨは、別々に又は前もって混合した後に測定系に添加することかできる。例えば、第一試薬としてフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質とＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ、およびＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の基質を含む試薬を作成し、第二試薬として酸化酵素とペルオキシダーゼ及びＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素を含む試薬を作成し、これらを用いることにより発色反応を妨害することのない測定精度が高く、且つ安定性の良好な試薬とすることが出来る。尚、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の基質は第二試薬に組み込んでも良い。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、％は、特に断りのない限り重量％を示す。
【００３０】
実施例１
１０Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン    ５μｍｏｌを１０％トリトンＸ−１００（ノニオン界面活性剤）水溶液１０ｍｌに溶解し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）９０ｍｌを加えて溶解した。これを１０ｍｌずつに分け、これにＮＡＤＨとＮＡＤＰＨをそれぞれ０．０００１％〜０．１％の濃度になるように添加したものと無添加のものを用意した。これらを４℃にて１週間保存し、６６６ｎｍセル長１０ｍｍの吸光度の変化を比較した。その結果、以下のように無添加の場合１週間の保存で大きく着色し、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを共存させることで保存中の着色を抑えることができた。
【００３１】
0003604198.tif 000002
【００３２】
実施例２
１０Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビスジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジンナトリウム塩    ５μｍｏｌを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００ｍｌを加えて溶解した。これを１０ｍｌずつに分け、これにＮＡＤＨとＮＡＤＰＨをそれぞれ０．  ００１％〜０．  １％の濃度になるように添加したものと無添加のものを用意した。これらを４℃にて１週間保存し、６６６ｎｍセル長１０ｍｍの吸光度の変化を比較した。その結果、以下のように無添加の場合１週間の保存で大きく着色し、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを共存させることで保存中の着色を抑えることができた。
【００３３】
0003604198.tif 000003
【００３４】
実施例３
ビス（３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル）アミン    ５μｍｏｌを１ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、更に１０％トリトンＸ−１００（ノニオン界面活性剤）水溶液２０ｍｌに溶解し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）７９ｍｌを加えて溶解した。これを１０ｍｌずつに分け、これにＮＡＤＨとＮＡＤＰＨをそれぞれ０．  ０１％〜０．  １％の濃度になるように添加したものと無添加のもの用意した。これらを４℃にて１週間保存し、７５５ｎｍセル長１０ｍｍの吸光度の変化を比較した。その結果、以下のように無添加の場合１週間の保存で大きく着色し、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを共存させることで保存中の着色を抑えることができた。
【００３５】
0003604198.tif 000004
【００３６】
次に自動分析装置を用いた例を示す。
実施例４
グルコースオキシダーゼを用いたグルコースの測定試薬として以下の組成の試薬を調製した。
【００３７】
0003604198.tif 000005
【００３８】
上記試薬を用いて以下のパラメーターにて日立７１５０型自動分析機を用いて血清試料中のグルコース濃度を測定し、更に試薬を１週間冷蔵庫保存し、再測定した。
尚、試料は凍結保存した。
試料（検体）        ３μｌ
試薬            ３５０μｌ
温度              ３７℃
反応時間          １０分
検量線          ０、２００ｍｇ／ｄｌ
測定波長        ６６０／７５０ｎｍ
この結果は以下のとおりであり、１週間保存後でも試薬自身の着色はなく、測定値に大きな変動はなかった。
【００３９】
0003604198.tif 000006
【００４０】
実施例５
ピラノースオキシダーゼを用いたアスコルビン酸の影響を受けないグルコースの微量測定試薬として以下の組成の試薬を調製した。
【００４１】
0003604198.tif 000007
【００４２】
上記試薬を用いて以下のパラメーターにて日立７１５０型自動分析機を用いて尿試料中のグルコース濃度を測定し、更に試薬を１週間冷蔵庫保存し、再測定した。尚、試料は凍結保存した。
試料（検体）        ３μｌ
試薬１          ２００μｌ
試薬２          ２００μｌ
温度              ３７℃
反応時間            ５分×２
検量線          ０、２００ｍｇ／ｄｌ
測定波長        ６６０／７５０ｎｍ
この結果は以下のとおりであり、１週間保存後でも試薬自身の着色はなく、測定値に大きな変動はなかった。
【００４３】
0003604198.tif 000008
【００４４】
実施例６
ピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定試薬として以下の組成の試薬を調製し、日立７１５０型自動分析機を用いて測定した。
【００４５】
0003604198.tif 000009
【００４６】
上記試薬を用いて以下のパラメーターにて日立７１５０型自動分析機を用いて血清試料中の１，５ＡＧ濃度を測定し、更に試薬を１週間冷蔵庫保存し、再測定した。尚、試料は凍結保存した。
試料（検体）      １０μｌ
試薬１          ２６０μｌ
試薬２          １３０μｌ
温度              ３７℃
反応時間            ５分×２
検量線          ０、５０μｇ／ｍｌ
測定波長        ６６０／７５０ｎｍ
この結果は以下のとおりであり、１週間保存後でも試薬自身の着色はなく、測定値に大きな変動はなかった。
【００４７】
0003604198.tif 000010
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを共存させることによりフェノチアジン系発色基質あるいはジフェニルアミン系発色基質を安定に保つことができ、そのため、これらの発色基質を用いて検体中の微量成分を定量する際、優れた測定精度を得ることができる。