【手続補正書】
【提出日】平成29年5月26日(2017.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
具体的には、生理活性ポリペプチドとしては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロンα、β及びγ、可溶性Ｉ型インターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０など）とインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、αガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、β、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（platelet-activating factor acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）など）、インターロイキン結合タンパク質及びサイトカイン結合タンパク質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類（angiopoietin）、ヘモグロビン、トロンビン（thrombin）、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン（thrombomodulin）、血液凝固第ＶII因子、血液凝固第ＶIIａ因子 、血液凝固第ＶIII因子、血液凝固第ＩＸ因子、血液凝固第ＸIII因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（hirudin）、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（angiostatin）、アンジオテンシン（angiotensin）、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン及びインスリン誘導体、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（elcatonin）、結合組織活性化因子、組織因子経路阻害剤（tissue factor pathway inhibitor）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、ニュールツリン（neuturin）など）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−１）又はエキセンジン−４（Exendin-4）などのインスリン分泌ペプチド、腸から分泌されるインクレチン（incretin）類、メタボリックシンドローム（metabolic syndrome）に効果があることが知られているレプチンなどの脂肪細胞（adipocyte）類及びｎｅｕｒｏ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ類、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（autotaxin）、ラクトフェリン（lactoferrin）、ミオスタチン（myostatin）、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いられる生理活性ポリペプチドは、天然のものであってもよく、大腸菌などの原核細胞や、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞などの真核細胞から遺伝子組換えにより生産されたものであってもよく、また天然のものと同等の活性を有し、１つ以上のアミノ酸位置で突然変異が起こった誘導体であってもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例１：ヒト顆粒球コロニー刺激因子−ＰＥＧ−免疫グロブリン結合体の作製
＜１−１＞ＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現ベクターの作製
ＩｇＧ４のヒンジ領域を含む重鎖Ｆｃ領域をクローニングするために、ヒトの血液から得られた血球細胞のＲＮＡを鋳型とし、次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、Ｑｉａｍｐ ＲＮＡ血液キット（Qiagen社）を用いて約６ｍＬの血液から全ＲＮＡを分離し、その後このＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen社）を用いて遺伝子を増幅した。ここで、プライマーとしては、配列番号４（ｇｇｇｃａｔａｔｇｃ ｃａｔｃａｔｇｃｃｃ ａｇｃａｃｃｔｇａｇ ｔｔｃｃｔｇｇｇｇ）と５（ｇｇｇｇｇａｔｃｃｃ ｔａｔｔｔａｃｃｃａ ｇａｇａｃａｇｇｇａ ｇａ）の対を用いた。その後のクローニング過程を容易にするために、プライマーにはＮｄｅＩ制限酵素認識部位とタンパク質発現のために必要な開始コドンであるＡＴＧを挿入し、配列番号５の３−プライマーには終止コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入した。こうして増幅されたＦｃ領域産物をそれぞれＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、その後同じ制限酵素で処理したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen社）に挿入してプラスミドを作製した。プラスミドは、ＩｇＧ４ ＦｃフラグメントがＩｇＧ４ Ｆｃヒンジの全アミノ酸配列であるＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏのうち１〜８番目のアミノ酸残基が欠失したヒンジ配列を含むように設計されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
まず、ＬＢ培地１００で前記形質転換体をそれぞれ一晩中振盪培養し、その後発酵槽に接種して本培養を行った。発酵槽の温度は３５℃又は２８℃を維持し、嫌気性状態になることを防止するために、空気を２０ｖｖｍで投入しながら５００ｒｐｍで攪拌した。発酵が進むにつれて微生物の成長のために不足なエネルギー源であるブドウ糖（glucose）と酵母抽出液（yeast extract）を微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００でのＯＤ値が８０になる時期に誘導物質（inducer）であるＩＰＴＧを投与して発現を誘導した。これを４０〜４５時間培養することにより、吸光度６００でのＯＤ値が１００〜１２０となるように高濃度に培養した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して１つのシステイン残基のみを有するように変異したヒンジ領域を含む、変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
【請求項２】
生体内鎖交換及び単量体形成が起こらないものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項３】
前記ヒンジ領域が、８番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜８つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項４】
前記ヒンジ領域が、１１番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜８つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項５】
前記ヒンジ領域が、８番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜５つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項６】
前記ヒンジ領域が、１１番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜５つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項７】
前記ヒンジ領域が、８番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜３つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項８】
前記ヒンジ領域が、１１番目の位置のＣｙｓ残基を含む１〜３つの連続的又は不連続的なアミノ酸が欠失して変異したものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項９】
非グリコシル化されたものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項１０】
非ペプチド性重合体により改質されたものである、請求項１に記載の変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント。
【請求項１１】
請求項１のＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２のベクターが導入された微生物。
【請求項１４】
請求項１３の微生物を培養する段階を含む、請求項１〜１０のいずれかのＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントを製造する方法。
【請求項１５】
薬物及び請求項１〜１０のいずれかの変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントがリンカーを介して結合された薬物結合体。
【請求項１６】
薬物は、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類とインターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質及びサイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類（angiopoietin）、ヘモグロビン、トロンビン（thrombin）、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン（thrombomodulin）、血液凝固第ＶII因子、血液凝固第ＶIIａ因子 、血液凝固第ＶIII因子、血液凝固ＩＸ因子、血液凝固第ＸIII因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（hirudin）、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（angiostatin）、アンジオテンシン（angiotensin）、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン及びインスリン誘導体、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（elcatonin）、結合組織活性化因子、組織因子経路阻害剤（tissue factor pathway inhibitor）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、ニュールツリン（neuturin）など）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−１）又はエキセンジン−４（Exendin-4）などのインスリン分泌ペプチド、腸から分泌されるインクレチン（ｉｎｃｒｅｔｉｎ）類、メタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に効果があることが知られているレプチンなどの脂肪細胞（adipocyte）類及びニューロ−サイトカイン類、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（autotaxin）、ラクトフェリン（lactoferrin）、ミオスタチン（myostatin）、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント類、ウイルス由来ワクチン抗原からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１７】
薬物が顆粒球コロニー刺激因子である、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１８】
リンカーが非ペプチド性重合体である、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１９】
非ペプチド性重合体が両末端又は三末端を有する、請求項１８に記載の結合体。
【請求項２０】
請求項１５の結合体を含む薬学組成物。
【請求項２１】
下記のアミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失して１つのシステイン残基のみを有するように変異したヒンジ領域を含む、変異したＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントを含み、生体内鎖交換及び単量体形成が起こらないことを特徴とする薬物キャリア。
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ