(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の半定量的検出方法であって、
Ａ）特異的結合リガンドを結合して有している標的核酸を、多数の検出付着物を付着して有する水不溶性支持体と接触させる工程であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子が前記標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全ての高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであり、
それにより、各検出付着物における前記第一粒子の量に比例した前記検出付着物上の前記標的核酸鎖を捕捉する工程と、
Ｂ）前記検出付着物中の前記捕捉標的核酸鎖と前記特異的結合リガンドに対する受容体とを接触させる工程であって、前記受容体がリポーター分子で標識されており、
それにより、前記リポーター標識受容体を前記捕捉標的核酸鎖と複合させ、それにより前記検出付着物の各々における捕捉リガンド標識標的核酸鎖の量に比例した前記検出付着物上の各々の前記リポーター標識受容体を捕捉する工程と、そして
Ｃ）前記検出付着物上のリポーター分子を前記標的核酸の存在を半定量する手段として検出する工程とを含んでなることを特徴とする標的核酸の半定量的検出方法。
【請求項２】
前記特異的結合リガンドがビオチンであり、前記受容体が放射性同位元素、化学ルミネセンス試薬又は酵素で標識したストレプトアビジンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ストレプトアビジンがペルオキシダーゼで標識されている請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドを結合して有する前記標的核酸を、工程Ｂで、２〜１０個の検出付着物と、前記第一粒子の量が最も少ない検出付着物から前記第一粒子の量が最も多い検出付着物の順序で接触させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一及び第二粒子がほぼ同じ平均直径を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸と前記検出付着物との接触と同時に、前記標的核酸を、前記特異的結合リガンドと接合した検出プローブとハイブリダイゼーションする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸の増幅及び半定量的検出方法であって、
Ａ）標的核酸の対向する鎖を、ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰと、前記対向する鎖に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる二種からなる一組のプライマーで前記プライマーの一つが特異的結合リガンドで標識されているプライマーとを用いて増幅することにより、前記標的核酸の少なくとも一つの増幅リガンド標識鎖を得る工程と、
Ｂ）前記増幅リガンド標識標的核酸鎖を、多数の検出付着物を付着して有する水不溶性支持体と接触させる工程であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子が前記リガンド標識標的核酸鎖に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全ての高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであり、
それにより、各検出付着物における前記第一粒子の量に比例した前記検出付着物上の前記リガンド標識標的核酸鎖を捕捉する工程と、
Ｃ）前記検出付着物中の前記捕捉リガンド標識標的核酸鎖を前記特異的結合リガンドに対する受容体と接触させる工程であって、前記受容体がリポーター分子で標識されており、
それにより、前記リポーター標識受容体を前記捕捉リガンド標識標的核酸鎖と複合させ、それにより前記検出付着物の各々における捕捉リガンド標識標的核酸鎖の量に比例した前記各検出付着物上の前記リポーター標識受容体を捕捉する工程と、そして
Ｄ）前記標的核酸の存在を半定量する手段として前記検出付着物のリポーター分子を検出する工程とを含んでなることを特徴とする標的核酸の増幅及び半定量的検出方法。
【請求項８】
前記プライマーの前記特異的結合リガンド標識がビオチンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増幅を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々、並びにＤＮＡポリメラーゼ共同因子を用いて実施し、前記受容体がストレプトアビジンであり、そして前記リポーター分子がペルオキシダーゼであり、前記ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼと基質との反応に応答して比色信号を生じる一種以上の試薬と接触させることにより検出されるものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
増幅をポリメラーゼ連鎖反応２０〜５０サイクルにより実施する請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一及び第二粒子は平均直径がほぼ同じであり、前記リガンド標識標的核酸を、工程Ｂで、２〜１０個の検出付着物と、前記第一粒子の量が最も少ない検出付着物から前記第一粒子の量が最も多い検出付着物の順序で接触させる請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
多数の検出付着物を付着して有している水不溶性支持体を含んでなる試験要素であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子がリガンド標識標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全てが高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであることを特徴とする試験要素。
【請求項１３】
前記支持体が、高分子膜、濾紙、繊維マット、樹脂塗工フィルム若しくは紙又は未塗工フィルム若しくは紙である請求項１２に記載の試験要素。
【請求項１４】
前記支持体が、コロナ放電によるか樹脂系親水性下塗り層を適用することにより前処理したヒートシール又は超音波シール可能な樹脂塗工紙又は高分子フィルムである請求項１２に記載の試験要素。
【請求項１５】
前記検出付着物の各々が、高分子接着剤を前記検出付着物の総乾燥重量の約２０重量％以下の存在量で含んでなる請求項１２に記載の試験要素。
【請求項１６】
前記支持体上に形成された環状スポットである検出付着物２〜１０個を有する請求項１２に記載の試験要素。
【請求項１７】
特異的結合リガンドで標識した標的核酸の検出キットであって、
ａ）増幅試薬又は前記特異的結合リガンドに対するリポーター標識受容体と、そして
ｂ）多数の検出付着物を付着して有している水不溶性支持体を含んでなる試験要素であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子がリガンド標識標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全てが高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じである試験要素とを含んでなることを特徴とする試験キット。
【請求項１８】
一種以上の増幅試薬を含んでなり、前記試験要素が前記支持体上に形成された環状スポットである検出付着物２〜１０個を有し、前記第一及び第二粒子がほぼ同じ平均直径を有する請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、前記ＤＮＡポリメラーゼの共同因子と、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々と、ペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンと、前記標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションすることができそしてビオチンで標識されている少なくとも一種のプライマーとを含んでなる請求項１８に記載の試験キット。
【請求項２０】
前記支持体が、コロナ放電によるか親水性下塗り層を適用することにより前処理したヒートシール又は超音波シール可能な材料であり、そして
前記検出付着物の各々が、高分子接着剤を前記検出付着物の各々の総乾燥重量の約２０重量％以下の存在量で含んでなる請求項１７に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、標的核酸の半定量的検出に有用な診断方法、試験要素及び試験キットに関する。特に、本発明は、支持体上に付着させた捕捉プローブの複数の検出付着物を使用して、標的核酸を、増幅するかせずに、半定量的方法で検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
種々の感染性因子（ウイルス、細菌類、真菌類及び原生動物を含む）に関連した極めて低量の核酸を検出する技術が、ここ十年で急速に進歩した。このような技術には、プローブをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ増幅法等の増幅法と併用した非常に複雑なハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。研究者は、ヒト又は動物検体における疾病及び遺伝的特徴の検出でのこのような技術の価値に直ちに気がついた。このような技術にプローブやプライマーを使用することは、相補的ヌクレオチド（ヌクレオチド対としても知られている）間の水素結合による核酸の２本鎖の結合である相補性の概念に基づいている。
【０００３】
ＰＣＲは当該技術分野において顕著な進歩がなされ、極微量の標的核酸を検出が可能である。ＰＣＲの詳細は、例えば、ＵＳ−Ａ−４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓ等）、ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２（Ｍｕｌｌｉｓ）、ＵＳ−Ａ─４，９６５，１８８（Ｍｕｌｌｉｓ等）及びＭｕｌｌｉｓ等、Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５５、第３３５〜３５０頁、１９８７年に記載されているが、この分野での文献の量は急速に拡大している。
【０００４】
標的核酸を一度増幅すると、種々の手法を用いて検出できる。捕捉プローブを用いた検出の前に標的核酸を不溶化するハイブリダイゼーションアッセイ用に、種々の装置が設計された。例えば、ニトロセルロースフィルター及び他の平面固体支持体が、この目的で捕捉プローブを固定するのに使用された。プローブを支持体に固定するのに使用される一つの方法は、単にそれらを乾燥固定させることである。より最近では、プローブを、支持体に融着させた高分子粒子に固定している（Ｚａｎｄｅｒ等によるＵＳ−Ａ−５，１７３，２６０参照）。さらに、捕捉プローブを有するこのような高分子粒子は、例えば、ＥＰ−Ａ−０  ５３０  ３５７に記載されているようにして、高分子接着剤と支持体の種々の処理法を用いて支持体に接着できる。しかしながら、これらのいずれの文献にも、標的核酸の半定量的検出に上記捕捉プローブをどのように使用できるかが記載されていない。
【０００５】
増幅法とともに使用されるものを含む種々の分析アッセイは、小（μｍ以下の）粒子の表面上の色素、螢光物質又は放射性同位元素等の検出可能な種の検出に基づくものである。このようなアッセイの結果は、臨床化学試験装置（ＥＫＴＡＣＨＥＭ（登録商標）試験スライド等）で発生する信号の評価と同様に真に定量的な結果が得られる精巧な光学装置を用いて評価できる。また、アッセイの結果は、目視又はもっと単純な装置（光度計等）を用いて読み取り、単に陽性か陰性かの結果を提供することもできる。
【０００６】
光度計等の単純な装置を用いたアッセイで迅速な半定量的評価を得ることができることが非常に望ましい。「半定量的」とは、検出が、結果が絶対値のいくつかの特定の範囲内になることを推定できることを意味する。例えば、標的核酸が低、中若しくは高濃度で存在するか、又は単に全く存在しないかを測定することは望ましいであろう。現在のところ、これは、精巧で高価な分析装置と、患者の試料の複数の希釈物とを必要とする時間を浪費する方法を用いたときのみ可能である。しかしながら、ほとんどの研究室や診療所では、このような装置は入手できない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、以下の本発明により克服できる。即ち、本発明によれば、標的核酸の半定量的検出方法であって、
Ａ）特異的結合リガンドを結合して有している標的核酸を、多数の検出付着物を付着して有する水不溶性支持体と接触させる工程であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子が前記標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全ての高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであり、
それにより、各検出付着物における前記第一粒子の量に比例した前記検出付着物上の前記標的核酸鎖を捕捉する工程と、
Ｂ）前記検出付着物中の前記捕捉標的核酸鎖と前記特異的結合リガンドに対する受容体とを接触させる工程であって、前記受容体がリポーター分子で標識されており、
それにより、前記リポーター標識受容体を前記捕捉標的核酸鎖と複合させ、それにより前記検出付着物の各々における捕捉リガンド標識標的核酸鎖の量に比例した前記検出付着物上の各々の前記リポーター標識受容体を捕捉する工程と、そして
Ｃ）前記検出付着物上のリポーター分子を前記標的核酸の存在を半定量する手段として検出する工程とを含んでなることを特徴とする標的核酸の半定量的検出方法が提供される。
【０００８】
さらに、本発明によれば、標的核酸の増幅及び半定量的検出方法であって、
Ａ）標的核酸の対向する鎖を、ＤＮＡポリメラーゼと、複数種のｄＮＴＰと、前記対向する鎖に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる二種からなる一組のプライマーで前記プライマーの一つが特異的結合リガンドで標識されているプライマーとを用いて増幅することにより、前記標的核酸の少なくとも一つの増幅リガンド標識鎖を得る工程と、
Ｂ）前記増幅リガンド標識標的核酸鎖を、多数の検出付着物を付着して有する水不溶性支持体と接触させる工程であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子が前記リガンド標識標的核酸鎖に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全ての高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであり、
それにより、各検出付着物における前記第一粒子の量に比例した前記検出付着物上の前記リガンド標識標的核酸鎖を捕捉する工程と、
Ｃ）前記検出付着物中の前記捕捉リガンド標識標的核酸鎖を前記特異的結合リガンドに対する受容体と接触させる工程であって、前記受容体がリポーター分子で標識されており、
それにより、前記リポーター標識受容体を前記捕捉リガンド標識標的核酸鎖と複合させ、それにより前記検出付着物の各々における捕捉リガンド標識標的核酸鎖の量に比例した前記各検出付着物上の前記リポーター標識受容体を捕捉する工程と、そして
Ｄ）前記標的核酸の存在を半定量する手段として前記検出付着物上のリポーター分子を検出する工程とを含んでなることを特徴とする標的核酸の増幅及び半定量的検出方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、多数の検出付着物を付着して有している水不溶性支持体を含んでなる試験要素であって、
各検出付着物が水不溶性第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなり、
前記第一粒子がリガンド標識標的核酸に特異的であり且つそれとハイブリダイゼーションできる捕捉プローブを付着して有しており、そして
前記第二粒子が前記捕捉プローブを含まず、
前記多数の検出付着物が前記第一粒子と前記第二粒子とを異なる重量比で有するが、前記検出付着物の全てが高分子粒子の総重量及び形状がほぼ同じであることを特徴とする試験要素が提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、特異的結合リガンドで標識した標的核酸の検出キットであって、
ａ）増幅試薬又は前記特異的結合リガンドに対するリポーター標識受容体と、そして
ｂ）上記した試験要素とを含んでなることを特徴とする試験キットが提供される。
【００１１】
本発明は、増幅するか増幅することなく標的核酸を半定量的に検出するための、単純、効果的且つ効率的な手段を提供する。精巧な検出装置の使用は、回避できる。これらの利点は、支持体上で多数の検出付着物を使用することにより達成される。上記検出付着物は、異なる所定量の捕捉プローブを有している。検出付着物を調べる一つの方法は、捕捉プローブを付着物中に種々の「希釈状態」で存在させることにより、標的核酸を種々の量の一連の捕捉プローブと接触させることである。検出付着物は、付着物からの信号の強度、数又は位置を評価することにより、標的核酸の量について近似することができるように配置できる。捕捉プローブは、付着物中に２種類の粒子が異なる量で存在させるようにすることにより、検出付着物中で「希釈される」。一方の種類の粒子は、それに固定して捕捉プローブを有しているのに対して、第二の種類の粒子は、いずれの捕捉プローブも有していない。しかしながら、これらの種々の検出付着物は、粒子の総重量と形状がほぼ同じであり、配置した検出付着物からの信号により、半定量的に情報が得られる。
【００１２】
被分析物が存在しない場合には信号が観察されず、低濃度の被分析物が存在する場合には量の多い捕捉プローブを有する付着物のみが信号を示す。捕捉プローブの量がより少ない別の付着物では、被分析物の量が増加するにつれて信号が得られる。したがって、例えば、もし捕捉プローブの量が異なる１０個の付着物を使用するならば、被分析物濃度が低いときには、捕捉プローブ量が最大である１又は２個の付着物のみが信号を示す。検体中の被分析物の量が増加するほど、より多くの付着物が信号を示し、したがって、被分析物の半定量的量（又は相対量）を測定できる。
【００１３】
本発明は、検体試料を希釈して信号間の識別を行う必要がないので有利である。即ち、信号間の識別は、かなりの時間を必要とし且つ作業者誤差を生じ易い時間を浪費するアッセイ手順なしにより容易に達成できる。
【００１４】
【具体的な態様】
本発明の方法、要素及び試験キットは、標準的な核酸増幅及びハイブリダイゼーション技術並びに特異的結合リガンド（下記で定義する）と接合した適当な検出プローブを用いていずれの核酸の検出にも使用できる。核酸ハイブリダイゼーションアッセイについての試薬とプロトコールは当該技術分野において公知であるので、ここでは詳細には説明しない。このようなアッセイの代表的な記載は、以下の特許に見られる。これらの全ての特許は、そこで有用なアッセイ、試薬及び量、プロトコール並びにこのようなアッセイの種々の使用方法（診断、治療、配列決定、突然変異の検出及び当該技術分野で容易に明らかとなる他の使用方法を含む）の詳細に関して、引用することにより本明細書の開示の一部とされる：ＵＳ−Ａ−４，３５８，５３５（Ｆａｌｋｏｗ等）、ＵＳ−Ａ−４，４８６，５３９（Ｒａｎｋｉ等）、ＵＳ−Ａ−４，７２７，０１９（Ｖａｌｋｉｒｓ等）、ＵＳ−Ａ−４，９９４，３７３（Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ等）及びＵＳ−Ａ−４，７１１，９５５（Ｗａｒｄ等）。本明細書の以下の部分では、増幅法を適用した後本発明を使用する場合の好ましい実施態様について説明する。
【００１５】
本発明は、いずれかの公知の増幅法を適用した後に核酸を検出するのに使用できる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は最も一般的な増幅法であるが、本発明はこれには限定されない。例えば、本発明は、Ｋｗｏｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、８７、１９７４（１９８９）に記載されているような増幅法を基本とした転写、例えば、Ｗｕ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４、５６０（１９８９）及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ等、Ｇｅｎｅ、８９、１１７（１９９０）に記載されている核酸リガーゼ法、ＵＳ−Ａ−５，１１２，７３４（Ｋｒａｍｅｒ等）に記載されているようなＱ─ベータリプリカーゼ法、核酸標的にアニーリングしたＤＮＡ─ＲＮＡプローブのリボヌクレアーゼＨ開裂並びに鎖置換アッセイとともに使用できる。
【００１６】
ＰＣＲを用いた核酸の増幅及び検出の一般原理及び条件は、非常によく知られており、詳細はＵＳ−Ａ−４，６８３，１９５、ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２及びＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８をはじめとする数多くの文献に記載されている。これらに開示されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。増幅法は、「ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ」（即ち、「ネステッドプライマー」を順次用いる）又は非ネステッドＰＣＲ（プロセス全体を通じて同じプライマーを用いる）として知られている方法を含むことができる。
【００１７】
本発明は、試験検体における一種以上の核酸の一つ以上の特異的核酸配列の増幅及び半定量的検出（又は測定）に関する。このような検体として、検出できる核酸を含有する細菌性若しくはウイルス性物質、毛、体液又は細胞性物質を挙げることができる。特に、増幅及び検出されるべき核酸は、いずれかの源（細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物及びヒト等）からのプラスミド及び天然ＤＮＡ又はＲＮＡを含む種々の源から得ることができる。この核酸は、末梢血単核細胞及び他血液成分を含む種々の組織、組織物質（例えば、バイオプシー試料又は剥脱細胞）又は当該技術分野で公知な他の源から公知の手順を用いて抽出してもよい。
【００１８】
検出できる細菌には、ヒト血液に見られる細菌、サルモネラ種、連鎖球菌種、クラミジア種、淋菌種、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ホルタイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、トリ型結核菌複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、在郷軍人病菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボレリア・バルグトルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、赤痢菌種及びリステリア種が含まれるが、これらには限定されない。サイトメガロウイルス以外の検出可能なウイルスには、ヘルペス、ＥＢウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス、並びにＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩ等のレトロウイルスが挙げられるが、これらには限定されない。原生動物寄生菌、酵母及び糸状菌も検出可能である。他の検出可能な種は、当業者には容易に明らかであろう。
【００１９】
本出願で使用される「標的」ＤＮＡには、アッセイにおいて正の制御を行うために試験検体に添加される核酸も含まれる。
「ＰＣＲ試薬」は、ＰＣＲに必須と考えられる試薬、即ち、標的核酸のプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ共同因子及び二種以上（好ましくは４種）のデオキシリボヌクレオシド─５’─三リン酸を意味する。ＰＣＲにおいて必要に応じて使用される他の試薬及び材料を、以下に述べる。
【００２０】
用語「プライマー」は、核酸鎖（即ち、鋳型）に相補のプライマー延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ）生成物の合成を誘発する条件下に配置したときに合成開始点として作用することができる天然であるか合成物であるかとは無関係なオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件には、ヌクレオチド（４種の標準デオキシリボヌクレオシド─５’─三リン酸等）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ共同因子の存在、並びに適当な温度及びｐＨが含まれる。
【００２１】
プライマーは、最大の効率で増幅を行うには単一鎖であるのが好ましいが、必要に応じて二本鎖領域を含むことができる。このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で延長生成物の合成をプライミングするに十分な長さでなければならない。各プライマーの正確な長さは、意図する使用方法、標的配列の複雑さ、反応温度及びプライマー源により異なる。一般的に、本発明で使用されるプライマーは、ヌクレオチド１２〜６０個、好ましくはヌクレオチド２０〜４０個を有する。
【００２２】
本発明で使用されるプライマーは、プライミングされ増幅される特異的核酸配列に「実質的に相補」であるように選択される。このことは、プライマーは、それぞれの核酸配列とハイブリダイゼーションして所望のハイブリダイゼーション生成物を形成し、次いでＤＮＡポリメラーゼにより延長するのに十分な相補性を有しなければならない。好ましく且つ最も実用的な状況では、プライマーは、意図する核酸配列に完全に相補的である。
【００２３】
さらなる標的核酸の増幅及び検出に有用なプライマーは、この分野のかなりの文献を参考にして標的核酸の適当な核酸配列を決定することにより当業者により容易に決定できるであろう。これらの配列は、次に、公知技術を用いてプライマーを調製するための型として使用できる。例えば、プライマーを、公知の手法及びＡＢＩ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ８６００  Ｓｅｒｉｅｓ又は８８００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）等の装置を用いて調製できる。この装置を用いるための手順は周知であり、例えば、上記したＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８に記載されている。生物学的源から分離した天然プライマー（制限エンドヌクレアーゼ消化物等）も有用なことがある。
【００２４】
本明細書で使用される「プローブ」は、標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり、そして増幅標的核酸の捕捉に使用されるオリゴヌクレオチドである。このプローブは、一般的にヌクレオチド１０〜４０個を有するが、ある種のアッセイではこれよりも短いか長いプローブが有用なことがある。
さらなる標的核酸の捕捉に有用なプローブは、標的核酸配列が公知であれば、当業者には容易に明らかとなるであろう。数多くのこのような配列は、文献から公知である。したがって、本発明は、これらの配列を知り、実際に示されるプライマーやプローブに関して本明細書での代表的な教示に準じることにより十分実施可能である。現在未知の標的核酸も、この技術は同様の方法で使用できると予測できるので、同様に増幅し検出できる。このようなプローブは、上記でプライマーについて記載したのと同様の手順及び出発試薬を用いて調製できる。
【００２５】
ＰＣＲ試薬は、試験キットの一部分としてか、試験装置の試薬チャンバーにおいてか、反応組成物における混和状態において個々に準備できる。
数多くの有用なＤＮＡポリメラーゼが周知である。これらのＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド一リン酸分子を、プライマーと鋳型との複合体におけるプライマーの３’ヒドロキシ末端に付加する酵素である。但し、この付加は、鋳型に依存する（即ち、鋳型の特異的ヌクレオチドに依存する）。延長生成物の合成は、合成が終了するまで新規に合成される鎖の５’から３’方向に進行する。ＤＮＡポリメラーゼは、「熱安定性」であるのが好ましい。「熱安定性」とは、熱に対して安定であり且つより高温、とりわけプライミング及びＤＮＡ鎖の延長に使用される高温で優先的に活性となることを意味する。
【００２６】
ＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８及びＵＳ−Ａ−４，８８９，８１８（Ｇｅｌｆａｎｄ等）（両方とも、引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に詳細に述べられているものをはじめとして、多数の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野で報告されている。特に有用なポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）又はサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）等の種々の発熱（Ｔｈｅｒｍｕｓ）細菌種から得られるものである。他の有用な熱安定性ポリメラーゼが、ＷＯ−Ａ−８９／０６６９１（１９８９年７月２７日公開）に記載されている。有用なポリメラーゼのあるものは、市販されている。生体から天然ポリメラーゼを単離する方法及びこのパラグラフにおいて引用した当該技術分野で公知であり、ＥＰ−Ａ−０４８２７１４（１９９２年４月２９日公開）に記載されている遺伝子工学法を用いて組み換え型を製造する方法も、多数知られている。
ＤＮＡポリメラーゼ共同因子は、活性に関して酵素が依存する非タンパク質化合物を意味する。多数のこのような物質は、二価の陽イオンとしてマンガン又はマグネシウムを含有するマンガン及びマグネシウム化合物を含む公知の共同因子である。有用な共同因子には塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩（例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸及びラウリン酸塩）等のマンガン及びマグネシウム塩を含むが、これらには限定されない。塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
【００２７】
また、ＰＣＲには、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰ等の２種以上のデオキシリボヌクレオシド─５’─三リン酸（ｄＮＴＰ）も必要である。ｄＩＴＰ及び７─ｄｅａｚａ─ｄＧＴＰ等の類似体も有用である。好ましい物質、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、集合的にアッセイに使用される。
【００２８】
ここで記載されるＰＣＲ試薬を準備し、一定のプロセスに適当な濃度でＰＣＲに使用される。増幅に必要なプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、共同因子及びデオキシリボヌクレオチド─５’─三リン酸の最小量及び各々の適当な範囲は、当該技術分野において公知である。好ましくは、反応混合物１００μＬ当たり熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ約０．１〜約５０単位をＰＣＲに使用する。本明細書では、「単位」は、総ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）１０ｎｍｏｌを延長核酸鎖に７４°Ｃ、３０分で取り込むのに必要とする酵素活性の量として定義される。プライマーの量は、少なくとも約０．０７５μＭ（μｍｏｌａｒ）であり、約０．１〜約２μＭが好ましいが、他の量は当該技術分野で周知である。共同因子は、一般的に約２〜約１５ｍＭの量で存在する。各ｄＮＴＰは、約０．２５〜約３．５ｍＭで存在する。
【００２９】
ＰＣＲ試薬は、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（又はその塩）を含むがこれには限定されない一種以上の適当な緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９に緩衝した水性組成物において混合状態で使用される。
特に有用な組成物は、本明細書に記載のプライマー、上記したマグネシウム共同因子、上記したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々、ゼラチン又は類似の親水性コロイド物質（少なくとも約５重量％の量）並びに約１０〜約１００ｍＭの量で存在するアルカリ金属塩（塩化ナトリウム又は塩化カリウム等）の緩衝混合物である。より好ましくは、この組成物は、適当量の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（上記したような）及びこのようなＤＮＡポリメラーゼに対するモノクローナル抗体も含む。上記抗体は約５０°Ｃ未満の温度でその酵素活性を阻害するが、それより高温では非活性化される。代表的なモノクローナル抗体は、最近許可されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９５８，１４４（Ｓｃａｌｉｃｅ等により１９９２年１０月７日出願）に記載されている。ここで記載されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。このような２種のモノクローナル抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州ロックビル）に寄託されているハイブリドーマ細胞系ＨＢ１１１２６及び１１１２７のいずれかを含む出発物質及び通常の手順を用いて当業者により容易に得られる。このモノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜５００：１の量で存在する。
【００３０】
標的核酸は、全血試料等の上記した種々の源のいずれかから得ることができる。一般的に、プライマー及び他のＰＣＲ試薬と接触するのを可能にするある種の方法で抽出される。このことは、通常望ましくないタンパク質及び細胞物質を適当な方法で検体から除去することを意味する。Ｌａｕｒｅ等、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、第５３８〜５４０頁（１９８８年９月３日）、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２８０〜２８１頁（１９８２年）、Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｎｄ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，３２（１９７３年）及びＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８に記載の方法を含む種々の方法が当該技術分野において公知である。全血又はその成分からＤＮＡを抽出することについては、例えば、ＥＰ−Ａ−０３９３７４４（１９９０年１０月２４日公開）、Ｂｅｌｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、７８（９）、第５７５９〜５７６３頁（１９８１年）及びＳａｉｋｉ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、第１００８〜１０１２頁（１９８５年）に記載されている。
【００３１】
増幅及び検出されるべき核酸は通常二本鎖の形態であるので、二本鎖は、プライミングが起きる前に分離（即ち、変性）しなければならない。これは、抽出工程中又はその後の別個の工程で生じさせることができる。変性は、熱処理単独又は当該技術分野において記載されているいずれかの適当な他の物理的、化学的又は酵素的手段と組み合わせて行われる。初期変性は、一般的に、標的核酸を含有していると推測される検体をまず約８５〜約１００°Ｃで適当な時間、例えば、約１秒〜３分加熱することにより実施される。
【００３２】
変性された鎖を、次に一般的に約５５〜約７０°Ｃの範囲である第二温度に冷却して鎖をプライミングする。変性鎖を冷却するのに必要とする時間は、ＰＣＲプロセスに使用される装置の型により異なる。
変性鎖を第二温度に冷却したらすぐ、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を適当な温度でインキュベーションしてプライマー延長生成物を生成させる。一般的に、この温度は、少なくとも約５０°Ｃ、好ましくは約６２〜約７５°Ｃの範囲である。インキュベーション時間は、インキュベーション温度及び所望の延長生成物の長さにより大きく異なることができるが、好ましい実施態様では、約１〜約１２０秒である。ＰＣＲの各サイクルは、２又は３種の異なる温度、一つの温度は変性、第二及び／又は第三温度はプライミング及び／又はプライマー延長生成物形成、を用いて実施できる。即ち、ある種のＰＣＲプロセスは、第二温度をプライミング及び第三温度をプライマー延長に利用する。
【００３３】
もしハイブリダイゼーションしたプライマー延長生成物を次に変性するならば、ＰＣＲを、さらにプライミング、延長及び変性の所望サイクル数で実施できる。一般的に、少なくとも２０サイクルを実施し、２０〜５０サイクルが好ましい。
本発明の増幅法は、連続自動化法で行い、反応混合物を、所望の設定時間制御された方法で温度サイクルに附するのが好ましい。当業者には公知のように、この目的に多数の機器が開発されている。
【００３４】
このための上記機器の一つは、ＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８及びＥＰ−Ａ−０２３６０６９に多少詳細に記載されている。一般的に、この機器は、反応混合物を入れた多数の反応管を保持すための熱伝導性容器、加熱、冷却及び温度保持用手段並びに信号を発生して増幅工程、温度変化及びタイミングを制御する演算手段を含んでなる。
【００３５】
使い捨て化学試験パックにおいて増幅反応するのに好ましい機器が、ＵＳ−Ａ−５，０８９，２３３（Ｄｅｖａｎｅｙ等）に多少詳細に記載されている。ここに開示されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。一般的に、この機器は、一個以上の化学試験パックを支持するための表面と、反応パックに作用して試験パックにおける隣接チャンバー間に流体を移動させるための、前記表面より上に支持されている圧力アプリケーターと、試験パックを介して延びる一連の運動により圧力アプリケーターを動作させるための手段とを含んでなる。
【００３６】
ＥＰ−Ａ−０４０２９９４は、上記したＵＳ−Ａ−５，０８９，２３３に記載の機器を用いて処理することができる有用な化学試験パックの詳細が記載されている。また、そこには、本発明の方法に適当な間隔で反復（即ち、サイクル）して試験パックを加熱及び冷却するための手段も記載されている。
有用なＰＣＲ処理装置に関するさらに詳細事項がこの分野におけるかなりの文献から得ることができ、当業者により容易に確認されることができる。
【００３７】
また、本発明の方法を適当な容器中で実施するのも有用である。最も原始的な容器は試験管、キュベット、フラスコ又はビーカーであろうが、本方法の自動化を容易にするためのもっと精巧な容器が作製されている（例えば、ＷＯ−Ａ−９１／１２３４２参照）。例えば、本方法の実施中に一定の温度特性が得られるように構成されたキュベット及び化学試験パック（パウチとしても知られている）が、ＵＳ−Ａ−４，９０２，６２４（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ等）、ＵＳ−Ａ−５，１７３，２６０（Ｚａｎｄｅｒ等）及びＵＳ−Ａ−５，２２９，２９７（Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙ等）に記載されている。これら全てに開示されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。このような試験パックは、種々の試薬、緩衝液及び増幅又は検出法における種々の段階で有用である他の材料を含有する多数の試薬チャンバーを備えている。ＰＣＲ試薬を含有している水性組成物を、本発明の方法に使用するための反応チャンバーに入れることができる。パックを、適当且つ迅速に加熱及び冷却のサイクルに附して、増幅法の種々の工程を促進する。
【００３８】
増幅した標的核酸の検出は、特異的結合対を用いて行うことができる。増幅で使用されるプライマーの一つ又は両方は、特異的結合リガンドで標識される。したがって、増幅中に、標的核酸分子は、特異的結合リガンドで標識される。このような標識には、特異的結合リガンドと特異的に反応する受容体分子があるいずれの分子も含まれる。特異的結合対（そのうちの一方が標識であることができる）の具体例としては、例えば、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、糖／レクチン、抗体／ハプテン、抗体／抗原及び当業者とって容易に明らかな結合対が含まれるが、これらには限定されない。好ましい特異的結合リガンドはビオチンであり、対応の受容体はストレプトアビジンである。受容体を、公知の技術を用いて、酵素、放射性同位元素又は化学ルミネセンス試薬（例えば、ルミノール）等の検出可能な標識又はリポーター分子と接合する。
【００３９】
標識を受容体分子に連結するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ビオチン標識についてはＡｇｒａｗａｌ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＲｅｓ．、１４、第６２２７〜４５頁（１９８６）及びＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ等）に記載されており、酵素標識についてはＵＳ−Ａ−４，９６２，０２９（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ等）に記載されている。他の有用な標識には、放射性同位元素、高電子密度試薬、クロモーゲン、フルオロゲン、リン光性成分、フェリチン並びに「フェロフルード（ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄｓ）」と称せられることのある他の極微小磁気粒子（ＵＳ−Ａ−４，７９５，６９８（Ｏｗｅｎ等））及び化学ルミネセンス成分が含まれる。好ましい酵素標識には、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及び当該技術分野において公知の他の酵素標識が含まれる。特定の酵素標識の存在下で化学ルミネセンス又は比色信号を生じる基質試薬は、このような系は数十年にわたって臨床化学、免疫学又は核酸ハイブリダイゼーションアッセイに使用されてきたので、当業者には容易に明らかであろう。これらの試薬の多くは市販されている。
【００４０】
受容体に対する標識がペルオキシダーゼ等の好ましい酵素である場合には、アッセイのある時点で、過酸化水素と適当な色素形成組成物を添加して検出可能な色素（即ち、比色信号）を形成できる。例えば、有用な色素供与試薬には、テトラメチルベンジジン及びその誘導体並びにトリアリールイミダゾールロイコ色素等のロイコ色素（ＢｒｕｓｃｈｉによるＵＳ−Ａ−４，０８９，７４７に記載されているようなもの）、又はペルオキシダーゼの存在下で反応して色素を形成する他の化合物並びに過酸化水素等のオキシダントが含まれる。特に有用な色素供与組成物が、ＵＳ−Ａ−５，０２４，９３５（ＭｃＣｌｕｎｅ等）に記載されている。ここに開示されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。化学ルミネセンス信号は、アクリジニウム塩又はルミノール及び類似の化合物をペルオキシダーゼ及びオキシダントの存在下で増強剤と併用して発生できる。
【００４１】
最も好ましくは、一方又は両方のプライマーをビオチン（又はその等価誘導体）で標識し、増幅した標的核酸を、ストレプトアビジンと酵素との接合体を用いて検出する。このようにして特異的結合複合体に連結した酵素を、次に適当な基質試薬を用いて検出する。ペルオキシダーゼは、受容体分子の最も好ましい標識である。
【００４２】
増幅した標的核酸が検出されるためには、それを反応媒体中の他の物質から分離するのが有用なことがある（しかしながら、必須ではない）。これは、水不溶性粒子に共有結合した捕捉プローブを有する捕捉試薬を用いてなされる。捕捉プローブを増幅標的核酸とハイブリダイゼーションし、次に捕捉物質を、濾過、遠心分離、洗浄又は他の適当な分離法による等の適当な方法で未ハイブリダイゼーション物質から分離することができる。
【００４３】
本発明では、捕捉プローブを含有する多数の検出付着物を利用して標的核酸の半定量的検出を行う（これは、増幅するかしないかとは無関係である）。検出付着物を、試薬に対して不活性であるいずれかの適当な材料からなる水不溶性支持体上に配置する。このような支持体には、一般的に当該技術分野において公知の高分子膜、濾紙、ガラス、繊維マット、セラミックチップ、樹脂塗工又は未塗工高分子フィルム及び樹脂塗工又は未塗工紙等の平形材料が含まれる。特に有用な支持体は、例えば、ＥＰ−Ａ−０４０８７３８（１９９１年１月２３日公開）に記載されているようなヒート又は超音波シール手段によりそれ自体がシール可能な樹脂塗工紙又は高分子フィルム、並びにＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（登録商標）又はＢＩＯＤＹＮＥ（登録商標）としてＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているもの等の微孔質ポリアミド膜である。
【００４４】
検出付着物は、ＷＯ９２／１６６５９（１９９２年１０月１日公開）に記載されているような粒子及び捕捉プローブの水性懸濁液の試料を乾燥固定することを含む適当な方法で支持体に付着する。また、付着物を、例えば、ＵＳ−Ａ−５，１７３，２６０（Ｚａｎｄｅｒ等）に記載されているように熱で軟化することができる支持体に粒子を融着させることにより支持体に固定することもできる。
【００４５】
より好ましくは、捕捉プローブを、高分子接着剤（以下で詳細に説明する）と混和した粒状試薬として支持体上に付着させる。
シール可能な支持体は、熱又は超音波加圧シール法を用いて、互いにシール（又は融着）できるか別の材料シートにシール（又は融着）できる樹脂系材料（通常合成ポリマー）である。好ましくは、支持体は、適当な方法で適当な位置に互いにヒートシールして、シールされたシート、マット又は膜間に溝又は空隙を形成できるものである。
【００４６】
支持体は、例えば、ポリエステル類｛ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ〔４，４’─（ヘキサヒドロ─４，７─メタノインダン─５─イリデン）ジフェニレンテレフタレート〕及びポリ（４，４’─イソプロピリデンジフェニレン１，１，３─トリメチル─３─フェニル─５，４’─インダンジカルボキシレート）等｝、ポリカーボート類〔ビフェノールＡポリカーボネート（例えば、ＬＥＸＡＮ（登録商標）販売元Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社）等〕、ポリアミド類〔ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミド）等〕、ポリイミド類〔４，４’─ジアミノジフェニルエーテルとピロメリト酸二無水物とのポリイミド生成物等〕及びセルロース類〔酢酸セルロース及び酢酪酸セルロース等〕から構成できる。
【００４７】
一実施態様では、ポリエチレンシートを互いに周端部でシールして種々の試薬用の空隙を有する容器を形成する。別の実施態様では、ポリエチレンと、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポエステルとの積層体をヒートシールすることができる。積層体は、内部にシール可能層だけでなく接着剤や防湿層を含む種々の層を有することができる。
【００４８】
本明細書に記載の検出付着物を、シール可能な支持体表面の限定された領域に、通常ある種のパターンで付着させる。好ましくは、各検出付着物は、丸いスポット等の支持体表面の限定された領域内に付着させ、付着物は丸いスポットを特定の配置として含んでなることができる。
各検出付着物は、同種又は異種のポリマー、ガラス、セラミック、金属又は金属酸化物（磁気粒子等）から調製される水不溶性の第一及び第二粒子からなる混合物を含んでなる。このような粒子は一般的に形状が球状であるが、各付着物が同種の粒子、したがって、ジオメトリー、コンフィギュレーション及び多孔度が同じである粒子を有する限りは臨界的ではない。粒子が球状である場合、平均直径は、一般的に約０．００１〜約１０μｍ（好ましくは、約０．１〜約５μｍ）である。
【００４９】
好ましくは、粒子は、ガラス転移温度（Ｔｇ１）が少なくとも約７０°Ｃであるポリマー（又はポリマーの複合体）から調製したものである。好ましくは、Ｔｇ１は、約７０〜約１７５°Ｃであり、より好ましくは、約７５〜約１４０°Ｃの範囲内である。ガラス転移温度は、ポリマーがガラス状態からゴム状流動性又は粘着性ポリマーに変化する温度を意味する。ガラス転移温度の測定方法は、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、第１巻、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９６６年に記載されている。
【００５０】
また、ここで有用な粒子は、水性流体に不浸透性且つ非膨潤性でもある。これらの性質により、要素の支持体上に配置された組成物の構造的一体性が確保される。非膨潤性とは、粒子を水性流体中に３８°Ｃで約２．５分間浸漬した後に、Ｇｒｅｅｎ等、Ｊ．Ｐｈｏｔｏ．Ｓｃｉ．、２０、２０５（１９７２）に記載の型の膨潤計を用いて測定したとき水性流体中でほとんど膨潤しない（即ち、膨潤度が１０％未満）ことを意味する。
【００５１】
粒子は、一般的に少なくともその表面が、オリゴヌクレオチドが共有結合（以下で説明する）して捕捉プローブとして作用することができる天然又は合成物質で構成されている。このような物質は、一般的にオリゴヌクレオチド又はその誘導体が反応して共有結合を形成できる反応性基を有している。
一般的に、アミノ又はスルフヒドリル基が反応する反応性基がこのために有用である。特に有用な反応性基には、活性ハロゲン、カルボキシ、アミジン、活性２─置換エチルスルホニル、活性２─置換エチルカルボニル、ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、エポキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、アミノ（活性化後のもの）、ヒドラジン及びスクシンイミドキシカルボニル等の活性エステル類が含まれるが、これらには限定されない。好ましい粒子は、活性ハロゲン、活性２─置換エチルスルホニル又はビニルスルホニル基を有する一種以上のエチレン性不飽和重合性モノマーから調製されたＥＰ−Ａ−０３２３６９２（１９８９年７月１２日公開）に記載されているもの等の有機高分子ビーズである。最も好ましい粒子は、ＵＳ−Ａ−５，１４７，７７７（Ｓｕｔｔｏｎ等）に記載のような反応性カルボキシ基を有している。この特許に開示されている内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００５２】
Ｓｕｔｔｏｎ等による特許のモノマーはホモポリマーとして重合できるが、一種以上の他のエチレン性不飽和重合性モノマーと共重合するのが好ましい。
より詳細には、本発明で有用な粒子は、少なくともその表面が、
（ａ）上記で定義した反応性基を有する一種以上のエチレン性不飽和重合性モノマー由来の反復単位約０．１〜約６０重量％と、
（ｂ）単独重合したときに水不溶性ホモポリマーを形成する一種以上のエチレン性不飽和重合性モノマー由来の反復単位約４０〜約９９．９重量％と、
（ｃ）共重合体に対してコロイド安定性を付与する親水性モノマーを含むがそれらには限定されない、成分（ａ）及び（ｂ）に関して上記で定義した以外の一種以上のエチレン性不飽和重合性モノマー由来の反復単位０〜約１５重量％とを含んでなるポリマーから構成されている。
【００５３】
各成分に関して有用なモノマーは、上記したＳｕｔｔｏｎ等特許に記載されている。
成分（ｃ）に関してさらに他の有用なモノマーには、例えば、ＵＳ−Ａ−５，０８６，１４３（Ｓｕｔｔｏｎ等）に記載されているようなポリオキシアルキレン側鎖を有するものが含まれる。代表的なモノマーには、ペンタエチレングリコールモノメタクリレート、デカエチレングリコールモノメタクリレート、エイコサエチレングリコールモノメタクリレート、ペンタエチレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタ─クリレート及びポリプロピレングリコールモノメタクリレートが含まれるが、これらには限定されない。
【００５４】
各成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）についての種々のモノマーの混合物を、モノマーが互いに混和し且つ得られた粒子の表面上に十分な反応性基が存在する限りは、共重合することができる。
ここで粒子を製造するのに有用な共重合体は、例えば、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ等、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２版、（１９６８）、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク及びＳｔｅｖｅｎｓ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ロンドン（１９７５）に記載されているような標準乳化又は懸濁重合法を用いて調製される。
【００５５】
また、粒子は、上記したポリマーをシェルとして反応性基が表面で使用できるようにしたコア／シェル粒子でもよい。コア／シェル粒子とそれらの製造方法は周知であり、例えば、ＵＳ−Ａ−４，４０１，７６５（Ｃｒａｉｇ等）及びＵＳ−Ａ−４，９９７，７７２（Ｓｕｔｔｏｎ等）に記載されている。このような粒子のコアは、必要とする物理的一体性とガラス転移温度に寄与し且つ一般的にシェルポリマーとは異なるいずれかの適当なポリマーから構成できる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの分子は、標的核酸用捕捉プローブとして粒子に共有結合される。好ましくは、捕捉プローブは、標的二本鎖核酸の鎖の一つの核酸配列に相補的且つそれに対して特異的である。
オリゴヌクレオチドは、適当な手法を用いて高分子粒子に共有結合される。この際、粒子の表面上の反応性基をオリゴヌクレオチドの対応スルフヒドリル、カルボキシ又はアミノ基と反応させることにより直接結合させることができる。また、オリゴヌクレオチドをビオチニル化するか修飾して特異的結合種を付加した後、それを粒子に結合できる対応の受容体と特異的に結合してもよい。アビジン─ビオチン複合体は、例えば、ＥＰ−Ａ−０１３９４８９（１９８５年５月２日公開）、ＥＰ−Ａ−０１９２１６８（１９８６年８月２７日公開）及びＥＰ−Ａ−０３７０６９４（１９９１年７月２４日公開）に記載されているようにこの目的に使用されることが公知である。オリゴヌクレオチドへのビオチンの取り込みは、ＥＰ−Ａ−００９７３７３（１９８４年１月４日公開）に記載されているものを含む公知の技術を用いて達成できる。
【００５７】
好ましくは、しかしながら、オリゴヌクレオチドを化学修飾してそこに反応性基を形成するか「スペーサ」基又は「リンカー」基を形成して、粒子表面から離れた位置までオリゴヌクレオチドを延長するのが望ましい。このための手法は周知であり、例えば、ＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ等）及びＷＯ８９／１１５４８（１９８９年１１月３０日公開）に記載されている。
【００５８】
粒子表面上のオリゴヌクレオチドの被覆量は、粒子のサイズ、結合の化学的手段、オリゴヌクレオチドの長さ及びスペーサ分子の長さにより異なることができる。
捕捉プローブを含有する粒子は、支持体上に乾燥付着することができる。また、高分子接着剤を使用して、支持体に粒子を付着することもできる。また、高分子接着剤も、粒子を互いに結合する役割を果たす。この接着剤は、ガラス転移温度（Ｔｇ２）が、粒子を構成しているポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ１）  より少なくとも約３０°Ｃ低いポリマーを含んでなる。好ましくは、Ｔｇ２は、Ｔｇ１より約３０〜約１２０°Ｃ低い。また、Ｔｇ２は、約９０°Ｃ未満である。より好ましくは、Ｔｇ２は、約−５０〜約＋４０°Ｃの範囲である。
【００５９】
接着剤は、診断及び分析法で一般的に遭遇する水性流体に不溶のものである。また、必須ではないが、接着剤が水性流体中で非膨潤性であることも好ましい。
より詳細には、接着剤ポリマーは、
（ｄ）上記した第一ポリマーの成分（ｂ）に使用される一種以上のエチレン性不飽和重合性モノマー由来の反復単位約５５〜１００重量％と、
（ｅ）水溶性ホモポリマーを形成するか、極性基〔第一、第二及び第三アミン、ヒドロキシ及びポリ（アルキレンオキシ）基等〕、アニオン基〔カルボキシレート、スルホネート、スルフェート、ホスフェート及びホスホネート等〕、カチオン基〔トリアルキルアンモニウム及びトリアルキルホスホニウム等〕及び当業者に容易に明らかなその他の基から親水性を付与する、一種以上のエチレン性不飽和モノマー由来の反復単位０〜約４５重量％と、そして
（ｆ）ポリマー接着剤に架橋を形成することができる一種以上のエチレン性不飽和モノマー由来の反復単位０〜約１５重量％とから構成される。
【００６０】
第一ポリマーの成分（ｂ）に関して上記したモノマーは成分（ｄ）も有用であるが、成分（ｄ）の好ましいモノマーはアルキルアクリレート及びメタクリレート〔但し、アルキル基は炭素数１〜８（メチル、エチル、ｎ─プロピル、ｎ─ブチル、イソブチル、２─エチルヘキシル、ヘキシル及びオクチル等）であり、そしてアルキル基が１つ以上のチオ、オキシ又は炭素数１〜６のイミノアルキル基で遮断されていてもよい〕である。より好ましいモノマーには、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ｎ─ブチルアクリレート及びｎ─ブチルメタクリレートが含まれるが、これらには限定されない。メチルアクリレートが最も好ましい。
【００６１】
成分（ｅ）に関して有用なモノマーには、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２─アクリルアミド─２─メチルプロパンスルホン酸、３─メタクリロイルオキシプロパン─１─スルホン酸及びそれらの塩、Ｎ─（２─アクリロイルオキシエチル─Ｎ，Ｎ，Ｎ─トリメチルアンモニウムメトスルフェート、３─ヒドロキシエチル─１─ビニルイミダゾリウムクロリド、アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド、Ｎ─（２─アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド、２─カルボキシエチルアクリレート、ｐ─スチレンスルホン酸及びそれらの塩、ｍ及びｐ─カルボキシメチルスチレン及びその塩、並びに他のエチレン性不飽和重合性スルホネート、カルボキシレート、スルフェート、ホスホネート、第四アンモニウム塩、ピリジニウム塩、イミダゾリウム塩、キノキサリニウム塩及び当業者に容易に明らかな他の塩を含むがこれらには限定されない、酸類及びそれらの塩類等の帯電モノマー（カチオン又はアニオン）が含まれるが、これらには限定されない。また、粒子ポリマーの成分（ａ）に関して上記したカルボキシ含有モノマー（及びそれらの塩）が有用である。
【００６２】
また、成分（ｅ）に有用な非イオンモノマーには、ジメチルアミノプロピルアクリレート及びジエチルアミノエチルメタクリレート等のアミン含有モノマー、並びに２─ヒドロキシエチルアクリレート、２─ヒドロキシエチルメタクリレート、２，３─ジヒドロキシプロピルアクリレート、ペンタエチレングリコールモノアクリレート及び当業者に容易に明らかな他のモノマー等のヒドロキシ含有モノマーが含まれるが、これらには限定されない。
【００６３】
成分（ｅ）において好ましいモノマーには、２─アクリルアミド─２─メチルプロパンスルホン酸及びその塩、２─アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド及びＮ─（２─アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリドが含まれる。
架橋を形成することのできる成分（ｆ）に関するモノマーは、重合中に架橋してもよいし、その後の相互間の化学反応又は追加の架橋剤との化学反応後に架橋を形成してもよい。このようなモノマーには、ジ─及びトリアクリレート及びメタクリレート（エチレンジアクリレート及びエチレンジメタクリレート等）等の多官能ビニルモノマー、ジビニルベンゼン並びに公知の化学反応を用いて架橋することができる活性メチレン基含有モノマーが含まれる。後者の例としては、２─アセトアセトキシエチルメタクリレート、Ｎ─（２─アセトアセトキシエチル）アクリルアミド、Ｎ─（２─アセトアセタミドエチル）メタクリルアミド、６─（ｍ及びｐ─ビニルフェニル）─２，４─ヘキサンジオン、エチルアクリロイルアセテート並びにＵＳ−Ａ−３，５５４，９８７（Ｓｍｉｔｈ）、ＵＳ−Ａ−３，４５９，７９０（Ｓｍｉｔｈ）及びＵＳ−Ａ−４，２４７，６７３（Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｏ等）に記載されているもの等の当該技術分野において公知の他の類似のモノマーが挙げられる。
【００６４】
成分（ｆ）に関する好ましいモノマーには、２─アセトアセトキシエチルメタクリレート、Ｎ─（２─アセトアセトキシエチル）アクリルアミド及びＮ─（２─アセトアセタミドエチル）メタクリルアミドが含まれる。
好ましくは、接着剤を調製するのに有用な共重合体は、成分（ｄ）約７０〜約９８重量％、成分（ｅ）約２〜約３０重量％及び成分（ｆ）０〜約１０重量％由来の反復単位から構成される。より好ましくは、上記共重合体は、成分（ｄ）約８５〜約９５重量％、成分（ｅ）約２〜約１５重量％及び成分（ｆ）０〜約８重量％由来の反復単位から構成される。
【００６５】
接着剤用の好ましい付加重合体は、ポリ〔メチルアクリレート─コ─２─アクリルアミド─２─メチルプロパンスルホン酸，ナトリウム塩─コ─２─アセトアセトキシエチルメタクリレート〕である。
接着剤として有用なポリマーは、例えば、粒子ポリマーの調製に関して上記した文献に記載されているような通常の乳化重合を用いて調製できる。
【００６６】
また、検出付着物は、「第二」粒子として同定されるものを含有する。この第二粒子は、捕捉プローブを担持している粒子と組成が同じかまたは異なるが、第二粒子は捕捉プローブを含有していない。一般的に、上記粒子は、平均直径及び形状が第一粒子と同じである。また、上記第二粒子は、第一粒子と組成及びサイズが同じであり、したがって、表面に捕捉プローブが存在しないことのみが異なることが好ましい。
【００６７】
このように、好ましくは、各検出付着物は、第一及び第二粒子からなる混合物及びポリマー接着剤を有している。支持体上の一つの検出付着物と別の検出付着物とでは第一粒子と第二粒子との重量比が異なる。一般的に、検出付着物は、粒子試料０．５〜４μＬと固形分約０．１〜約１０％の接着剤とから調製する。第一粒子の捕捉プローブ飽和度は、約０．１〜１００％でよい。
【００６８】
ポリマー接着剤は、各検出付着物中に約２０重量％以下の量（粒子及び捕捉プローブの乾燥重量基準）で存在できる。好ましくは、接着剤は、約０．１〜約２０重量％の量で存在し、約０．２〜約１０重量％の量がより好ましい。用語「約」は、記載の値の＋２０％又は−２０％を意味する。
検出付着物は、必要に応じて緩衝液、界面活性剤又はバインダー等の他の添加物を少量、即ち、一般的に付着物の総重量の約５％未満の量で含有することができる。
検出付着物は、いずれかの適当な方法で支持体に適用できる。例えば、標準的な塗工装置及び手法を用いて検出付着物を支持体上に塗工するか、手で適用するか、支持体上に印刷するか、ピペットの先端でスポットを形成するか、ミクロシリンジの先端で適用するか、ミクロディスペンシングポンプで適用した後乾燥する。好ましくは、しかしながら、検出付着物を、水性懸濁液形態でミクロシリンジの先端で支持体上に配置し、乾燥固定する。乾燥は、水性懸濁液を、粒子を調製するのに使用される上記のポリマーのガラス転移温度よりも約１０〜約８０°Ｃ低い温度範囲で加熱することにより行うことができる。
【００６９】
一般的に親水性である支持体に対する検出付着物の接着性を高めるために、支持体を予備処理してより親水性を高めることが望ましいことがある。この前処理は、化学的、電気的若しくは機械的又は異なる種類の処理の組み合わせであることができる。例えば、化学的処理には、クロム酸を使用して行う方法があり、この方法では、重クロム酸ナトリウムの硫酸溶液で数分間表面をエッチングすることを含む。
【００７０】
また、支持体は、例えば、ＵＳ−Ａ−３，５２６，５８３（Ｈａｙｗａｒｄ）及びＨａｎｓｏｎ等、Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、４４、第５８〜５９頁、１９６６年９月２６日に記載されているような希ガス等のガス状活性種で処理することもできる。さらに別の公知の方法として、高温で亜酸化窒素を使用することがある。
【００７１】
電気処理には、例えば、Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｂｏｎｄｉｎｇ、Ｌｅｅ（編集者）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第２６５〜２６７頁に記載されているような、当該技術分野において周知でもあるコロナ放電、フレーミング及び電極放電法が含まれる。
別の予備処理には、反応性ガスの存在下で高周波電磁界を用いる等の化学的・電気的同時処理が含まれる。このような方法は、例えば、ＵＳ−Ａ−３，７６１，２２９（Ｌｉｄｅｌ）及びＵＳ−Ａ−４，０７２，７６９（Ｌｉｄｅｌ）に詳細に記載されている。
【００７２】
他の化学的、電気的及び機械的予備処理は当業者には容易に明らかであろうが、好ましい予備処理には、コロナ放電処理、クロム酸処理及び反応性ガスの存在下での高周波電磁界による処理が含まれる。コロナ放電処理が最も好ましい。
上記した予備処理に対する代替法又は補充法として、親水性ポリマーを支持体に適用して親水性下塗り層としての役割を果たすようにさせることもできる。下塗り層ポリマー及びそれらの製造方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＵＳ−Ａ−３，１４３，４２１（Ｎａｄｅａｕ等）及びＵＳ−Ａ−３，２０１，２４９（Ｐｉｅｒｃｅ等）に記載されている。一般的に、このようなポリマーは、カルボキシ、スルホニル、ホスホノ、ホスフィニル、カルボニル及びヒドロキシ等のアニオン性基又は親水性基を一個以上側基として有する反復単位から構成されている。このようなポリマーの他の一般的な特性には、塩化ビニル、二塩化ビニリデン及び当業者に容易に明らかである他のもの等のモノマーに由来するある種のハロゲン分が存在することが含まれるが、これには限定されない。
【００７３】
特に有用な下塗り層材料には、ポリ（アクリロニトリル─コ─ビニリデンクロリド─コ─アクリル酸）、ポリ（メチルアクリレート─コ─ビニリデンクロリド─コ─イタコン酸）、ポリ（モノメチルイタコネート─コ─ビニリデンクロリド）、ポリ（モノエチルイタコネート─コ─ビニリデンクロリド）及びポリ（モノブチルイタコネート─コ─ビニリデンクロリド）が挙げられる。
【００７４】
本発明の試験要素は、粒子と、捕捉プローブと、ポリマー接着剤とからなる懸濁液を本明細書で定義されている適当な支持体上に配置し、配置した組成物を懸濁液を乾燥し検出付着物を形成するに十分な温度及び時間で加熱することにより作製される。適当な接着時間と温度は、反比例して変化でき、一般的に温度は第一ポリマーのガラス転移温度より約１０〜約８０°Ｃ低い範囲が使用される。加熱時間は、一般的に約１０〜約４０秒間である。種々のこのような検出付着物を上記のようにして形成して一連の検出付着物を適当に配置する。一般的に、各検出付着物は、支持体上に環状スポットとして設ける。
【００７５】
好ましい試験要素では、検出付着物２〜１０個を、捕捉プローブを有する第一粒子の量が最小から最大となる順序又は捕捉プローブの第一粒子量が最大から最小となる順序で配置する。最も好ましくは、標的核酸を、まず捕捉プローブを有する第一粒子の量が最小である付着物と接触させる。
例えば、第一粒子量が増加するか減少する一列以上の付着物を、例えば、上記したＵＳ−Ａ−５，１７３，２６０又はＵＳ−Ａ−５，２２９，２９７に記載されているような試験装置の流路である支持体上に配置できる。流体を、流路の付着物上に通じて標的核酸を捕捉することができる。
【００７６】
本発明の試験キットは、本明細書に記載の試験要素及び一種以上のハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅試薬を含んでなることができる。このような試薬は当該技術分野において周知であり、これらのいくつかは、上記した教示に具体的に記載されている。また、上記キットは、アッセイに使用される特異的結合リガンド用標識リポーター分子も含むことができる。また、種々のアッセイ装置、試験パック及び取扱説明書も、当業者が容易に予想できるように、キットに入れることができる。
【００７７】
【実施例】
以下、実施例により本発明の実施について説明するが、本発明はこれらのみには限定されない。全ての％は、特記のない限りは重量基準である。
実施例に用いる材料及び方法
サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から組み換えＤＮＡポリメラーゼを、上記したＵＳ−Ａ−４，８８９，８１８に記載されているような公知の方法を用いて調製した。
【００７８】
ここで使用したオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ、標準ホスホルアミダイトケミストリー及びＡＢＩ  １μＭスケール、迅速サイクルプロトコールを用いた３塔ＤＮＡ合成装置を使用し公知の出発物質及び方法を用いて調製した。ヌクレオシド─３’─ホスホルアミダイト及びヌクレオシド誘導制御細孔ガラス支持体を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。捕捉プローブの３’端末を、ＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ等）及びＵＳ−Ａ−４，９６２，０１９（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ等）に準じて、２個のテトラエチレングリコールスペーサ及びその後単一アミノジオール結合基を用いて官能化した。全ての精製は、核酸精製カラムを用いその後逆相ＨＰＬＣ法により実施した。
【００７９】
実施例１に使用した捕捉プローブの配列は、以下の通りであった：
配列番号：１：    ５′−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧ  ＣＣＧＧＣＴＣＡＣＣ  ＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧ−Ｘ−３  ′
（但し、Ｘは上記した官能化末端基である）。
配列番号１に相補的であるオリゴヌクレオチドを、実施例１で標的核酸として使用した。このオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りであった：
配列番号：２：    ５′−ＣＣＡＡＣＡＴＡＧＡ  ＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧ  ＣＣＣＴＣＧＧＴＴＣ−Ｙ−３  ′
（但し、Ｙは上記したＬｅｖｅｎｓｏｎ等による特許に記載の方法を用いて単一ビオチンホスホルアミダイトに結合させたテトラエチレングリコールを２単位を含んでなる。このように、標的核酸をビオチン誘導体で標識し、捕捉後検出できるようにした。
【００８０】
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。
ストレプトアビジン─ペルオキシダーゼ接合体溶液は、アビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼ（１２６μＬ／リットル）との市販（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の接合体と、カゼイン（０．５％）と、メルチオレート（０．５％）とを含んでなるものであった。
【００８１】
色素供与組成物（ｐＨ６．８）は、４，５─ビス（４─ジメチルアミノフェニル）─２─（４─ヒドロキシ─３─メトキシフェニル）イミダゾール（０．００５％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、ジエチレントリアミン五酢酸（１０μＭ）及びリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍＭ）を含有していた。
粒状捕捉プローブを、以下の方法でオリゴヌクレオチド捕捉プローブをポリ〔スチレン─コ─３─（ｐ─ビニルベンジルチオ）─プロピオン酸〕（重量比９５：５、平均直径１μｍ）粒子に結合させることにより調製した。粒子を水に添加して調製した懸濁液を、２─（Ｎ─モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６）で２回洗浄し、固形分約１０％となるように懸濁させた。緩衝液（０．１Ｍ）に固形分３．３３％まで希釈した洗浄粒子試料（３．３ｍＬ）を、１─（３─ジメチルアミノプロピル）─３─エチルカルボジイミドヒドロクロリド（８４ｍｇ／ｍＬ水を２．１ｍＬ）及び適当なプローブ（４４．４４ＯＤ／ｍＬナノピュア水を９８３μＬ）と混合した。得られた懸濁液を、水浴中５０°Ｃで約２時間断続的に混合しながら加熱し、遠心分離した。粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．０００１Ｍ）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ８）で３回洗浄し、そこに固形分４％で再懸濁した。
【００８２】
実施例１では、粒状捕捉プローブを、ＳＵＲＥＣＥＬＬ（登録商標）試験装置（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の試験ウエルにおける未塗工ＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（登録商標）ポリアミド微孔性膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、平均細孔サイズ５μｍ）に取りつけた。
他の試薬及び材料は、市販品を用いるか、容易に入手できる出発物質及び通常の方法を用いて調製した。
実施例１試験要素の調整及び標的核酸の検出
本実施例では、本発明の試験要素の作製及びその試験要素を標的核酸の半定量的検出に使用する方法について説明する。本実施例で使用した粒子は、ポリ〔スチレン─コ─３─（ｐ─ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５）から調製した上記に記載のものである。
【００８３】
得られた高分子粒子（「第一」粒子）上に捕捉プローブを分散したものを、捕捉プローブを有さない同種の粒子（「第二」粒子）と混合して、総固形分０．２５％の水性分散体を形成した。但し、この際、捕捉プローブを有する粒子と捕捉プローブを有さない粒子との重量比を変化させた。懸濁液において、総粒子の０．０００１、０．０００２、０．０００９、０．００３９又は０．０６２５％は、捕捉プローブを有する第一粒子であった。第二粒子のみ（捕捉プローブなし）の懸濁液一種を使用して、対照検出付着物を準備した。
【００８４】
各懸濁液の試料（２μＬ）を、ＳＵＲＥＣＥＬＬ（登録商標）試験装置の試験ウエル内の未塗工ＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（登録商標）ポリアミド微孔質膜の表面に適用し乾燥して、試験装置内に第一粒子と第二粒子の濃度が異なる乾燥検出付着物を形成した。捕捉プローブを含有しない対照付着物も、同様にして形成した。種々の濃度（０．０８、０．３１、１．２５、５及び１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）の標的核酸と、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド緩衝液（ｐＨ８、１０ｍＭ）と、塩化カリウム（５０ｍＭ）と、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）と、ゼラチン（１ｍｇ／ｍＬ）とを含有する試験溶液を調製した。
【００８５】
各試験溶液の試料（９５μＬ）を、検出付着物（一試料／ウエル）の入ったＳＵＲＥＣＥＬＬ（登録商標）試験装置の試験ウエルに添加し、４２°Ｃで５分間インキュベーションして、捕捉プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションを行った。付着物を、次に上記した緩衝液２５０μＬを用いて５５°Ｃで洗浄した。
【００８６】
次に、この接合体溶液（５０μＬ）を、各試験ウエルに添加した。室温でインキュベーションを２分間行うと、接合体がビオチニル化標的核酸と複合するであろう。次に、未結合物質を、上記と同様の緩衝液（２５０μＬ）を用いて５５°Ｃで洗い流した。
次に、上記した色素供与組成物（１００μＬ）を試験ウエルに添加した後、室温で２分間インキュベーションした。アジ化ナトリウム（０．１％）溶液（１００μＬ）を添加することにより色素形成を停止させた。得られた色素信号を、１０を最高色素濃度とした０〜１０の値を有するカラーチャートを用いて目視評価した。結果を、標的核酸の最低濃度３種類についての図１の棒グラフに示す。グラフにおける各一連の３本の棒において、それぞれ最初の棒は１．２５ｐｍｏｌ／ｍＬについての信号（棒Ａ、Ｄ及びＧ）であり、第二の棒は０．３１ｐｍｏｌ／ｍＬについての信号（棒Ｂ、Ｅ及びＨ）であり、第三の棒は標的核酸０．０８ｐｍｏｌ／ｍＬについての信号（棒Ｃ、Ｆ及びＩ）であった。
【００８７】
信号発生と捕捉プローブ希釈との組み合わせにより３種の濃度での標的核酸の半定量的検出が達成された。信号強度差は、試験検体における標的核酸の相対量に比例して容易に測定できた。
本実施例は、試験検体に添加した合成的に調製した標的核酸の検出における本発明の実施を示している。本発明は、本明細書に記載したように、標的核酸が天然源からのものであるならば、増幅の有無とは無関係に、同様に有用であろう。標的核酸源は、本発明の検出方法には無関係である。
【００８８】
以上、本発明を特定の好ましい実施態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲内で変更及び修正できることは理解されるところであろう。
【００８９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、増幅の有無とは無関係に、簡単、効果的且つ効率的手段で標的核酸を検出できる。このため、精巧で複雑な検出装置を使用する必要がない。また、検体試料を希釈して信号間の識別を行う必要がない。本発明では、かなりの時間を必要とし且つ作業者誤差を生じやすいアッセイ手順を行うことなく、容易に信号間の識別を行うことができる。また、本発明の方法、要素及び試験キットによれば、標準的な核酸増幅及びハイブリダイゼーション技術及び特異的結合リガンドと複合した適当な検出プローブを用いて、いずれの核酸も検出できる。
【００９０】
【配列表】
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【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で詳細に説明した本発明の要素を用いて異なる量の被分析物で観察される色素信号の量を示す棒ブラフである。
【図１】
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