【手続補正書】
【提出日】平成28年11月25日(2016.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的治療用融合タンパク質であって、
（ａ）ライソゾーム酵素、
（ｂ）成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、および
（ｃ）ライソゾーム酵素とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチド、を含み、
ここで前記スペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、標的治療用融合タンパク質。
【請求項２】
前記スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
【請求項３】
前記スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
【請求項４】
前記スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
【請求項５】
前記スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
【請求項６】
前記スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
【請求項７】
前記ライソゾーム酵素が、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
【請求項８】
前記ライソゾーム酵素が、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質である、請求項７の標的治療用融合タンパク質。
【請求項９】
ライソゾーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグがＡｒｇ３７の残基に変異を含む、請求項９の標的治療用融合タンパク質。
【請求項１１】
前記変異がアルギニンからアラニンへの置換である、請求項１０の標的治療用融合タンパク質。
【請求項１２】
薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３の核酸を含有している細胞。
【請求項１５】
前記標的治療用融合タンパク質の発現を許容する条件で請求項１４の細胞を培養する工程を含む、標的治療用融合タンパク質の生産方法。
【請求項１６】
対象におけるライソゾーム蓄積症の治療に使用するための医薬組成物であって、ライソゾーム酵素、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよび前記ライソゾーム酵素アミノ酸配列と前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記スペーサーペプチドはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）の治療に使用するための医薬組成物であって、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよびＮａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記スペーサーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）を患っている対象においてインビボでのグリコサミノグリカンレベルを低減させるための医薬組成物であって、ｉ）ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、ｉｉ）成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、およびｉｉｉ）Ｎａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含んでいる融合タンパク質の有効量を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ライソゾーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグがＡｒｇ３７の残基に変異を含む、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
前記変異がアルギニンのアラニンへの置換である、請求項２１の医薬組成物。
【請求項２３】
前記融合タンパク質がヒトＮａｇｌｕ（図１）の１〜７４３番目のアミノ酸または２４〜７４３番目のアミノ酸を含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
髄腔内に投与される、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記髄腔内投与が、前記融合タンパク質を脳室、腰部、または大槽に導入することを含む、請求項２４の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
このアッセイによりＮａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質がインビトロで酵素活性を有すること、人工の４ＭＵ−Ｎａｇｌｕ基質に対するＮａｇｌｕ融合タンパク質の特異的な活性はおよそ１７５，０００〜およそ２２０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇであることが示された。これらＮａｇｌｕ融合タンパク質の酵素活性は未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質の活性（およそ１９０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ）と同等であった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質に関する酵素活性データを表２に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
この競合ＩＧＦＩＩＲ結合アッセイから、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質が０．２３〜０．３６ｎＭのＩＣ５０値を有することが分かった。このアッセイでは、未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質の結合は検出できなかった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質のＩＧＦ２Ｒ競合結合データを表２に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
このアッセイにより、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質が、およそ２．３〜６．３ｎＭのＫ取り込み値でＭＰＳ  ＩＩＩＢ線維芽細胞に取り込まれることが分かった。対照的に未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質は、これらの実験条件では細胞には取り込まれなかった。さらに、観察されたＮａｇｌｕ融合タンパク質の取り込みはＩＧＦ−ＩＩによって阻害されたが、Ｍ６Ｐでは阻害されなかった。取り込まれた後の例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質は安定で、予測される半減期がおよそ９．５日であることが、細胞溶解物について測定した酵素活性（４−ＭＵ基質）から分かった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質の取り込みおよび半減期のデータを表２に示す。