(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性造血細胞をex  vivo増殖するための方法であって、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を含むサイトカイン類の組み合わせ体を用いて前記細胞を培養することを包含する方法。
【請求項２】
増殖させる細胞を、臍帯血、末梢血または骨髄から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性造血細胞が、CD34選択により得た前駆細胞および／または幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多能性造血細胞が、増殖細胞の除去により機能的に選択された幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性インターロイキン−６受容体を、少なくとも80ng/ml〜1280ng/mlの濃度で用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インターロイキン−６を、少なくとも50ng/ml〜100ng/mlの濃度で用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の多能性造血細胞の増殖に用いるための、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を含む物品。
【請求項８】
分化した血球コロニーをex  vivoで生成するための方法であって、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を多能性造血細胞と組み合わせる工程を含み、前記インターロイキン−６および幹細胞因子が異なるシグナル伝達経路により細胞応答を刺激する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、細胞増殖（cell expansion）におけるインターロイキン−６、可溶性インターロイキン−６受容体および幹細胞因子の組み合わせの使用に関する。特に、本発明は、造血系前駆／幹細胞のex  vivo増殖におけるこれらの因子の組み合わせの使用に関する。
産業上の利用分野
インターロイキン−６（IL−６）の受容体系は、２つの機能的に異なる鎖、すなわちリガンド結合鎖（IL−6R）および、リガンド非結合性のシグナル伝達鎖（gp130）から成る。gp130鎖はIL−6R/IL−６複合体と結合して、高親和性IL−６結合部位の形成およびシグナル伝達に導く（１−４）。インターロイキン−６受容体の細胞外可溶性型（sIL−6R）は、膜に固定されたgp130を介してIL−６シグナルを仲介することが示されている。sIL−6RとIL−６の複合体（sIL−6R/IL−６）は、IL−6R陰性細胞およびIL−6R陽性細胞の両方で発現するgp130と結合することができる。この結合により、gp130のホモ二量体化おびJAK−STAT経路の活性化を誘導し、細胞応答をもたらす（４−８）。
IL−６はIL−３および幹細胞因子（SCF）と相乗的に作用して、ヒト造血系前駆細胞の増殖を増大させ、又は休眠中のマウス造血系前駆細胞からのコロニー形成を助けることが示された（９−11）。しかしながら、ヒトの血液形成におけるgp130のシグナル伝達経路の役割についてはほとんど分かっていない。
最近、遺伝子治療、骨髄移植（BMT）の増大およびBMTの代用を含む種々の臨床応用のために造血前駆細胞のex  vivo増殖に多大の関心が寄せられている。種々の組み合わせのサイトカイン類または間質細胞を用いる細胞数の増大に関する既存の報告があるが、達成された前駆細胞、特に多能性前駆細胞、の増殖度は一般的に低い。このことは、原始細胞（primitivecells）の分化および枯渇化が増殖培養中に起こることを示唆している（12−15）。最近の研究により、IL−６およびsIL−6Rの組み合わせが、gp130シグナル伝達過程の活性化を介して分化可能な胚性幹（ES）細胞の自己再生を維持することが示された（16）。
IL−６の精製、クローニングおよび用途は公知である（1987年５月６日に公表されたEP220  574、Revelら;1988年１月14日に公表されたWO88/00206、Clarkら）。sIL−6Rの精製およびクローニング、また細菌感染、熱傷および損傷のような症状の治療におけるsIL−6RとIL−６の組み合わせ使用も報告されている（1991年２月27日に公表されたEP413  908、Novickら;JP89271865;Yamasakiら、Science、241:825−828、1988）。SCFは、初期に作用する造血因子である。SCFの精製、クローニングおよび用途が報告されている（゛幹細胞因子゛と題したPCT  WO  91/05795参照）。骨髄移植および骨髄回復の強化、並びに白血球減少症および血小板減少症の治療のためのSCFの使用が記載されてきた。IL−６と組み合わせたSCFの使用が記載されてきたが、造血系前駆細胞の増殖のためのSCF、IL−６およびsIL−6Rの組み合わせ使用に関する既存の報告はない。
発明の要約
本発明は、可溶性IL−６受容体（sIL−6R）およびIL−６と幹細胞因子（SCF）との組み合わせが、ヒト造血系多能性細胞のex  vivo増殖を助けることができることを立証する。sIL−6RまたはIL−６のいずれも、単一でSCFと組み合わせた場合、この効果を示さない。
多能性細胞は、臍帯血、末梢血または骨髄から得ることができる。多能性造血細胞としては、CD34選択により得られる前駆細胞および／または幹細胞、あるいは増殖している細胞の除去により機能的に選択された幹細胞、を挙げることができる。
サイトカイン類は、別々のサイトカインを入れた個々の容器を含むキットとして提供することもできるし、または１種以上のサイトカインを単一の容器の中の混合物として提供することもできる。
更に、本組み合わせのサイトカイン類は、エリトロポエチン（EPO）の非存在下、精製したヒト造血系幹細胞からの赤血球系細胞の増殖、分化および最終的成熟を助けることができる。sIL−6RまたはIL−６のいずれも、単一でSCFと組み合わせた場合、エリトロポエチンの非存在下ではこの効果を示さない。
この研究により、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせによる造血系幹細胞（例えば、CD34+細胞）からの赤血球系細胞の生成が立証された。サイトカイン類の有効性は、無血清培養でも確認された。多数の成熟赤血球細胞を含む、いくつかの赤血球系バースト（bursts）および混合赤血球系コロニーが、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせを含有するメチルセルロース培養中でCD34+細胞から発生した。抗gp130モノクローナル抗体を培養に添加すると、赤血球系細胞は全く産生されなかったが、一方、抗エリトロポエチン抗体の添加は、CD34+細胞からの赤血球系細胞の生成に影響を及ぼさなかった。
上記の結果から、成熟赤血球細胞は、エリトロポエチンの非存在下で造血系前駆細胞から産生可能であることが立証された。ヒト血清が検出可能なレベルのsIL−6R、IL−６およびSCFを含有するという既知の報告（26−28）と合わせると、通常の赤血球形成は、２つの異なる経路、すなわちエリトロポエチンが仲介するシグナル伝達、およびSCFシグナル伝達と組み合わさったgp130の関与する新規な作用機序、によって生理学的に調節されていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、指示した因子の組み合わせの存在下で培養した多能性細胞からのコロニー形成の結果を示す。
図２は、IL−６の存在下（○）または非存在下（●）における種々の濃度のsIL−6Rでの前駆細胞の増殖、並びにsIL−6Rの存在下（○）または非存在下（●）における種々の濃度のIL−６での前駆細胞の増殖を示す。
図３は、７日目（白い棒）、14日目（斜線棒）および21日目（黒塗りの棒）における、図に記載された因子またはそれらの組み合わせ体を補充した際の前駆細胞の増殖を示す。
図４は、７日目（白い棒）、14日目（斜線棒）および21日目（黒塗りの棒）における、SCFの存在下、種々の因子の組み合わせを補充した血清含有培養又は無血清培養での前駆細胞の増殖を示す。
図５は、総前駆細胞（○）およびCFU−Mix（●）の増大に対する種々の濃度の抗ヒトgp130モノクローナル抗体（Ａ）および抗ヒトIL−6Rモノクローナル抗体（Ｂ）の影響を示す。
図６は、IL−６およびSCFの存在下での種々の濃度のsIL−6Rの作用を示す。
図７は、sIL−6RおよびSCFの存在下での種々の濃度のIL−６の作用を示す。
図８は、無血清および血清含有培養に対するSCF、IL−6/SCFおよびsIL−6R/IL−6/SCFの作用を示す。
図９は、生成した赤血球系細胞の性質を示す。
図10は、培養の７、14および21日目における異なる組み合わせのサイトカイン類により産生した総細胞数、Ｅ−芽球（Ｅ−blasts）および赤血球を示す。IL−３はインターロイキン−３であり、Ｇ−CSFは顆粒球コロニー刺激因子であり、GM−CSFは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
図11は、sIL−6R/IL−6/SCFまたはEPO/SCFの組み合わせを体を添加した懸濁培養に対する抗gp130MAb（μg/ml）の作用を示す。
図12は、sIL−6R/IL−6/SCFまたはEPO/SCFの組み合わせ体を添加した懸濁培養に対する抗IL−6R  MAb（μg/ml）の作用を示す。
図13は、EPO、EPO/SCFまたはsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ体を添加した懸濁培養に対する抗EPO抗体（μg/ml）の作用を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト造血系幹／前駆細胞に対するsIL−6RおよびIL−６の複合体の活性により開始することのできるgp130シグナル伝達の潜在的役割の研究に基づく。本明細書中に示された結果は、SCFの存在下、sIL−6RおよびIL−６が関わるgp130シグナル伝達が、ヒト原始造血系前駆細胞のex  vivo増殖を劇的に刺激することを示す。
IL−６のシグナル伝達受容体成分であるgp130は、IL−６リガンドとIL−６受容体（IL−6R）との複合体と結合しシグナルを伝達する。ヒト造血系前駆細胞の増殖におけるgp130シグナル伝達の役割を調べるために、種々のサイトカイン類と組み合わせた組み換え可溶性ヒトIL−６受容体（sIL−6R）および／またはIL−６の、CD34+細胞に対する作用を試験した。
sIL−6RおよびIL−６の組み合わせ（sIL−6R/IL−６）が、幹細胞因子（SCF）の存在下、造血系前駆／幹細胞およびCD34+細胞の増殖を劇的に刺激することを見い出した。しかし、sIL−6RおよびSCFの組み合わせまたはIL−６およびSCFの組み合わせのいずれも同様の結果を与えなかった。sIL−6R/IL−6/SCFを添加した懸濁培養中で３週間にわたり多能性造血系前駆細胞の顕著な生成が起こった。コロニー、特に多系統および芽細胞コロニーの効率的形成が、組み合わせたサイトカイン類を補充した血清含有培養および無血清培養の両方で観察された。初めの造血系前駆／幹細胞は、胎児、胎盤、臍帯血、末梢血、または骨髄を含むいずれかの適切な細胞源から得ることができる。これらの多能性造血細胞としては、CD34選択により得られる前駆細胞および／または幹細胞を含むことができる。任意に、多能性造血細胞は、増殖している細胞の除去により機能的に選択または単離される幹細胞（Berardiら,Science,267:104−108,1995）であってもよい。
本発明により、それぞれsIL−6R/IL−６およびSCFにより開始される２つのシグナル経路、すなわちgp130シグナル伝達およびｃ−Kitシグナル伝達、がヒト造血系前駆細胞のex  vivo増殖を相乗的に促進することが立証された。sIL−6Rは、BAF−m130細胞、gp130cDNAでトランスフェクトした細胞、およびマウスの破骨細胞、のようなある種の細胞系に対してIL−６の存在下で作働的効果を高めることが報告されている（６−８、25）。しかしながら、本知見は、SCFの存在下でのsIL−6R/IL−６が、ヒト原始造血系前駆細胞の増殖にとって非常に強力な刺激剤であることを示した。ex  vivo増殖に関する既知の報告は、ヒト原始造血系細胞の刺激のためにsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせを用いて見出されたような顕著な相乗作用を示すことはできなかった。
造血系前駆細胞のin  vitro増殖は、遺伝子治療および細胞置換を含む可能な臨床応用に適した造血細胞を調製する魅力的な手段である。種々の組み合わせのサイトカイン類が、前駆細胞の増殖に有用であることが報告されてきた（12−15）。SCF、IL−３およびIL−６は、原始造血細胞に対し最も大きく作用するサイトカイン類として一般に認められており、これらの因子の組み合わせは、造血系前駆細胞の増殖のための基本的かつ最も効力あるサイトカインの組み合わせとして広く用いられてきた。しかしながら、本発明は、sIL−6RとIL−６およびSCFとの組み合わせ（sIL−6R/IL−6/SCF）が、CFU−MixまたはCFU−Blastを含む原始前駆細胞の増殖率に関して優れていることを示している。
既存の研究は、IL−３、IL−６およびSCFと、Ｇ−CSF、GM−CSF、IL−１またはEPOのようなある種の他のサイトカインとの組み合わせの存在下でのヒト末梢血由来のCD34+細胞の培養に基づいていた。このような研究は、これらの組み合わせが、血清含有懸濁液培養における前駆細胞の生成に有用であることを示している（12、13）。CFU−GMの約60倍の増加は、IL−３の組み合わせを用いて既に達成されたが、しかしながら、CFU−Mixは増大しておらず、CFU−MixまたはBFU−Ｅは、培養の14日目に全く検出されなかった。このような知見は、比較的後期の前駆細胞が、これらの培養で主として増大したことを示唆する。これに対して、本発明を用いた、懸濁培養中の多能性造血系前駆細胞の効率的な増大およびメチルセルロース培養中のMixおよびBlastコロニーの劇的形成は、sIL−6R/IL−６が、より初期の原始造血細胞または分化可能な幹細胞さえも刺激することを示す。
抗gp130モノクローナル抗体（mAb）または抗IL−6R mAbの上記培養への添加は、懸濁培養中の前駆細胞の増殖を用量依存的に阻害することが判明した。また、これらの抗体は、メチルセルロース培養中の多系統コロニーの形成も完全に遮断した。この知見は、sIL−6R/IL−６の観察された作用が、標的細胞上の膜固定されたgp130と、IL−６が結合したsIL−6R分子との相互作用を介して提供されたことを明示した。
最近の研究は、gp130が細胞上で遍在的に発現したこと、またES細胞の自己再生がin  vitroでLIFなしにsIL−6R/IL−６複合体により維持することができることを示した（６、16、18）。しかしながら、ヒトCD34+造血系幹／前駆細胞上でどのサイトカイン受容体が正常に発現するかという情報は、依然として不完全である。SCFのｃ−Kit受容体は確かに存在しており、本研究において、gp130は、全てのCD34+細胞中に存在しているようであるが、IL−6Rは、免疫染色により測定したようにCD34+細胞の小集団中にしか存在していないように思われる。sIL−6R/IL−６複合体は、IL−6R陽性細胞においてIL−６シグナルを増強することができ、更に重要なことには、通常IL−６に反応しないIL−6R陰性CD34+細胞中のgp130を介してシグナルを仲介することができる。sIL−6R/IL−６は、本研究で明らかにされたようにSCFの存在下でのみ機能することから、前駆細胞上のgp130およびｃ−Kitの同時発現およびこれらのシグナル経路の同時活性化は、潜在的な臨床応用のためのヒト造血系前駆細胞の劇的増殖をもたらす。
実施例
実施例１
メチルセルロース培養におけるCD34+細胞からのコロニー形成に対するsIL−6R、IL−６およびSCFの作用
材料および方法
細胞調製  ヒト臍帯血を、正常な満期分娩中に得、医療機関の指導により集めた。Silica（IBL,Fujioka,Japan）を用いた食細胞の枯渇後、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離により単核細胞（MNC）を分離した。CD34+細胞を結合させるための抗CD34抗体を有する磁気ビーズ（Dynabeads M−450 CD34;Dynal,Oslo,Norway）、MNCからCD34+細胞を分離するためのDynal Magnetic Particle Concentrator、および選択したCD34+細胞をビーズから分離するためのDETACHaBead CD34（Dynal）を用いてMNCからCD34+細胞を精製した。製造元の指示書に従って選択および分離操作を行った。分離した細胞の85〜95パーセントはCD34陽性であることが、FACS分析（Ortho Diagnostics Systems,Westwood,MA）により確認された。
受容体およびサイトカイン類  組換えヒトIL−６およびsIL−6Rのクローニング、発現および精製は、従来の開示の通りに十分特徴付けられる（17、18）。ヒトSCF（Amgen;Thousand Oaks,CA）、ヒトIL−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）およびエリトロポエチン（EPO）（Kirin Brewery Co.Ltd.;Tokyo,Japan）、およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）（Chugai Pharmaceutical CO.;Tokyo,Japan）を用いて細胞に対する種々のサイトカインの組み合わせの作用を評価した。サイトカイン類のすべてが、純粋な組換え分子であり、ヒト造血細胞のメチルセルロース培養に最適の応答を誘導する濃度で用いた。これらの濃度は、100ng/mlのSCF、200U/mlのIL−３、2U/mlのEPO、並びに10ng/mlのＧ−CSFおよびGM−CSFである。
懸濁培養  精製したCD34+細胞を、公知の技術（21、22）を用いて懸濁培養中でインキュベートした。培養混合物は、2000個のCD34+細胞、α−培地（ICN Flow;ICNBIOMEDICALS,Inc.,CostaMesa,CA）、20％牛胎児血清（FBS;HyClone,UT）、１％結晶化および脱イオン化画分Ｖ牛血清アルブミン（BSA,Sigma社）、および異なる組み合わせのサイトカイン類を含有した。24ウェルの組織プレート（Nunc,Kamstrup,Denmark）の各ウェル内の1mlの培養混合物を、５％CO2、５％O2および90％N2で満たした湿潤雰囲気下、37℃でインキュベートした。無血清懸濁培養は、２％の純粋なBSA（Sigma社）、10μg/mlのインスリン、200μg/mlのトランスフェリン（Sigma社）、10-5Mのメルカプトエタノール（Eastman社）、並びにFBSおよびBSAの代わりの40μg/mlの低濃度リポ蛋白（Sigma社）から構成された（22）。
１週間おきに、培養容量の半分を取り出すことにより培養物を減少させ、次いで、その分の容量を、同じ組み合わせのサイトカイン類を含有する新しく調製した培地で置き換えた。集めた培地中の細胞を洗浄し計数した（12−15）。培養の各時点で生成した造血系前駆細胞の総数を、クローナルメチルセルロースアッセイで、増殖した細胞の画分を更に培養することにより評価した。実施例３の遮断（blocking）実験のために、抗gp130mAbまたは抗IL−6R  mAbを培養の開始時に加えた。
クローン培養  懸濁培養中に接種したCD34+細胞およびその子孫を、メチルセルロース培養中でCD34+細胞は500細胞/ml、培養した細胞は２×103〜10×103細胞/mlの濃度で３つ組でインキュベートした（23）。培養混合物は、細胞、α−培地、0.9％メチルセルロース（Shinetsu Chemical Co.,Tokyo,Japan）、30％FBS、１％BSA、５×10-5Mのメルカプトエタノール、およびsIL−6R含有または非含有の種々の組み合わせのサイトカイン類を含有した。1mlの細胞含有培養混合物を、各35mmのLux標準非組織培養皿にプレーティングし、５％CO2を含む空気で満たした湿潤雰囲気下で37℃でインキュベートした。無血清メチルセルロース培養は、１％の純粋なBSA、300μg/mlのヒト  トランスフェリン、160μg/mlの大豆レシチン（Sigma社）、並びにBSAおよびFBSの代わりの96μg/mlのコレステロール（Nacalai Tesque Inc.,Kyoto,Japan）を除いては血清含有培養中のものと同じ成分を含有した（11）。
SCF、IL−３、IL−６、EPOおよびＧ−CSFの組み合わせを用いて各時点における懸濁培養中で生成した種々の前駆細胞を測定した。全ての培養は、３つ組で行い、公知の基準（10、11、23）により14日目に計数した。
結果
図１は、指示した因子の組み合わせの存在下で培養した多能性細胞から得た結果を示す。コロニーは、14日目に計数した。コロニー数は、３つ組の培養の平均±S.D.を示す。（コロニー型を示すのに用いた略号は、以下の通りである。GM、顆粒球−マクロファージコロニー;Meg、巨核球コロニー;B、赤血球系バースト;Blast、芽細胞コロニー;Mix、混合造血系コロニー；およびGEMM、顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー）。種々のサイトカイン類の各々を、1280ng/mlのsIL−6R、50ng/mlのIL−６および／または100ng/mlのSCFと組み合わせて用いた。
血清含有培養においては、sIL−6R、IL−６、sIL−6R/IL−６またはSCF単独では、わずかな数のコロニーしか誘導しなかった。IL−６およびSCFの組み合わせは、IL−６またはSCF単独の補充と比較して、GMおよびBlastコロニーの形成を増強した。最も顕著なコロニー生成は、sIL−6R、IL−６およびSCFを補充した培養中で50％を超える高いプレーティング効率として観察された。sIL−6RをIL−６およびSCFの組み合わせ体に添加すると、総コロニー数が4.2倍増加した。sIL−6R/IL−6/SCFにより誘導されたコロニー数は、IL−３を用いた場合の11.3倍、GM−CSFを用いた場合の5.2倍、Ｇ−CSFを用いた場合の5.4倍であった。sIL−6R/IL−6/SCFを補充した培養中で、いくつかのMegコロニーおよび赤血球系バーストの他に大きなサイズのかなりの数のBlastコロニーおよびMixコロニー、その大部分はGEMMである、が発生した。sIL−6R/IL−6/SCFにより誘導されたコロニーの60％以上がGEMMおよびBlastコロニーであり、一方、IL−３、GM−CSFおよびＧ−CSFにより誘導されたコロニーの大部分がGMコロニーであった。
FBS中の未知の因子の影響の可能性を排除するために、無血清培養も実施した。最も顕著なコロニー形成が、再度、sIL−6R/IL−6/SCFを補充した培養中で観察された。sIL−6RのIL−６およびSCFの組み合わせへの添加は、総コロニー数を17.5倍増加させた。また、この組み合わせは、Megコロニーおよび赤血球系バーストの他に、多数のMixおよびBlastコロニーの形成を刺激した。他の因子の組み合わせでは、コロニーが全く発生しないか又はわずかなGMコロニーしか発生しなかった。
図１に示すようにsIL−6R/IL−６を他の因子と組み合わせて試験した場合、sIL−6R/IL−６とIL−３、GM−CSFまたはＧ−CSFのいずれかとの間の僅かな相乗作用が、血清含有培養で観察された。しかしながら、無血清培養では、sIL−6R/IL−６と前記因子との間になんら相乗作用が見られなかった。この結果は、sIL−6R/IL−６がCD34+前駆細胞の増殖に特にSCFと相乗作用することを示している。
実施例２
懸濁培養における造血系多能性細胞の増大に対するsIL−6R、IL−６およびSCFの作用
SCF単独またはIL−6/SCF組み合わせ体と組み合わせた種々の濃度のsIL−6Rの存在下で、CD34+細胞の血清含有懸濁培養を用いて実験を行った。培養により誘導された前駆細胞を、14日のインキュベーション後にアッセイした。図２は、840個の前駆細胞を含有する2000個のヒトCD34+細胞に対するsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ（SCF100ng/ml）を用いた血清含有懸濁培養における14日後の前駆細胞増殖の結果を示している。図2Aは、IL−６（50ng/ml）の存在下（○）または非存在下（●）、種々の濃度のsIL−6Rにおける前駆細胞の増加を示す。図2Bは、sIL−6R（1280ng/ml）の存在下（○）または非存在下（●）、種々の濃度のIL−６における前駆細胞の増加を示す。図1Aに示すように、総前駆細胞は、sIL−6Rの濃度に従って劇的に増加した。この増加は、80ng/mlの低濃度でsIL−6Rを用いても検出可能である。増加は、1280ng/mlの濃度のsIL−6Rを用いると、前駆細胞は約70倍に増加したところでプラトーになる。
しかしながら、IL−６の非存在下では、sIL−6Rは、総前駆細胞を増大できなかった。また、前駆細胞の最適増大は、IL−６の濃度に依存すると考えられる。sIL−6Rの存在下、50ng/mlを超えるIL−６濃度を用いて前駆細胞の最大増加（63倍の増加）を得た（図2B）。対照的に、sIL−6Rの非存在下では、50ng/mlを超える濃度のIL−６を用いた場合でさえ、IL−６とSCFの組み合わせを用いても前駆細胞は約10倍の増加しか観察されなかった。これらの結果は、sIL−6Rが、機能的であり、IL−６との組み合わせでのみCD34+細胞において増殖シグナルを伝達することができることを示した。また、これらの結果は、1280μg/mlのsIL−6Rおよび50ng/mlのIL−６が、SCFを含有する懸濁培養中での前駆細胞の増大の最適濃度であることを示している。
造血系前駆細胞の増大に対するsIL−6R/IL−６の作用を更に詳細に検討調査するために、（他の因子と組み合わせてsIL−6RおよびIL−６を補充した）血清含有および無血清懸濁培養の両方を、３週間にわたって実施し、毎週、前駆細胞の増大を分析した。図３は、単一の因子または因子の組み合わせを補充した血清含有懸濁培養での７日目（白い棒）、14日目（斜線棒）および21日目（黒塗りの棒）における、684個の前駆細胞を含有する2000個のCD34+細胞からの総前駆細胞の生成結果を示す。データは、１回の実験から得ている。同様のデータが、更に４回の実験で得られた。
IL−６またはsIL−6Rを単独に補充した培養で見られた前駆細胞の数は、徐々に減少し、14日又は21日目では観察される前駆細胞は、ほとんど残存していなかった。sIL−6R/IL−６またはSCF単独のいずれも前駆細胞の増大に対し顕著な効果がなかった。SCFおよびIL−６を補充した細胞は、７、14および21日目までにそれぞれ8.5倍、14倍および21倍まで総前駆細胞数が増加した。対照的に、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせは、前駆細胞の増殖を劇的に増加させた。経時的観察は、14日目まで総前駆細胞の継続的増加、その後21日目まで下降を示した。増殖前の値と比較すると、前駆細胞の全体の増加は、７、14および21日目でそれぞれ44倍、61倍および33倍であった。培養14日目で総CD34+細胞が約80倍に増加したことがFACS分析により観察された。
増殖した前駆細胞の種々のサブタイプを毎週メチルセルロースアッセイで分析すると、Mixコロニーが、他の因子の組み合わせにおいてはかろうじて検出可能であるが、GMコロニー形成単位（CFU−GM）、赤血球系バースト形成単位（BFU−Ｅ）、CFU−BlastおよびCFU−Mixを含む全タイプの前駆細胞が、sIL−6R、IL−６およびSCFの存在下、３週間の培養を通じて生成し続けたことが判明した。CFU−Mixの数は、７および14日目までにそれぞれ約60倍および80倍増加した。また、無血清懸濁培養を用いて同様の結果が得られた。興味深いことには、sIL−6R、IL−６およびSCFの存在下、21日目の無血清懸濁培養でさえも、40倍の増加でかなりの数のCFU−Mixが得られた。
これらの結果は、造血系前駆細胞の増殖においてsIL−6R/IL−６がSCFと相乗的に作用することを示した。その後の実験で、sIL−6R/IL−６を、SCFの存在下、IL−３およびＧ−CSFを含む初期に作用するサイトカイン類と組み合わせて試験した。
また、この研究では、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせと、増大実験に用いた前述の標準であるIL−３、IL−６およびSCFの組み合わせとを比較した。sIL−6R/IL−6/SCFを用いた総前駆細胞の増大は、IL−３、IL−６およびSCFの組み合わせを用いて得られたものの1.5倍であった。
血清含有および無血清培養の両方において異なるサイトカインの組み合わせを用いたCFU Mixの生成を図４に示す。初めの培養混合物は、786個の前駆細胞および188個のCFU−Mixを含む2000個のCD34+細胞を含有した。７日目（白い棒）、14日目（斜線棒）および21日目（黒塗りの棒）にSCFの存在下で種々の因子の組み合わせ体を培養に補充した。データは、１回の実験から提供されている。同様のデータが、更に２回の実験で得られた。
sIL−６、IL−６およびSCFの組み合わせは、血清含有培養において７および14日目にそれぞれ約60倍および80倍、無血清培養において７および14日目にそれぞれ約49倍および68倍、CFU−Mixを増大させた。IL−３、IL−６およびSCFの組み合わせにより生成した前駆細胞は、主として顆粒球および／またはマクロファージ系統であり、CFU−Mixは、培養14日目までに血清含有で約30倍および無血清培養で10倍増大したにすぎなかった。sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせへのIL−３の添加は、CFU−Mixの増殖を増加させなかった。興味深いことには、この組み合わせへのＧ−CSFの添加は、増殖に対しマイナスの影響がありそうであった。これらの結果は、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせが、特に原始前駆細胞の増殖にとってより効力ある組み合わせであることを示した。
実施例３
多能性細胞の増殖に対する抗gp130 mAbおよび抗IL−6R mAbの影響
sIL−6R/IL−６複合体が仲介する造血系前駆細胞増殖におけるgp130の関与を証明するために、前駆細胞の増殖に対するマウス抗ヒトgp130 mAbおよび抗ヒトIL−6R mAbの影響を評価した。
抗体の調製  抗−ヒトgp130モノクローナル抗体（例えば、GPX7、GPX22およびGPZ35）の調製は、公知である（２、19）。これらの３種のmAbは、gp130受容体上の異なるエピトープを認識し、IL−６が誘導するgp130およびIL−６受容体結合の阻害を介してIL−６が仲介する生物学的反応を阻害することが知られている。抗ヒトIL−6R mAb（PM1）も調製した（20）。PM1は、IL−6RのIL−６への結合の阻害を通じてIL−６が仲介する生物学的反応を阻害することが知られている。
抗gp130 mAbの添加は、血清含有懸濁培養における総前駆細胞の増大を用量依存的に阻害することが分かった。図５は、種々の濃度の抗ヒトgp130 mAb（Ａ）および抗ヒトIL−6R mAb（Ｂ）を培養に加えたときの、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせを含有する培養中の総前駆細胞（○）およびCFU−Mix（●）、並びにIL−３およびSCFの組み合わせを含有する培養中の総前駆細胞（△）の各増大を示す。mAbを含まない培養を対照実験として評価した。データは、mAbで処理した各培養中で生成した前駆細胞と、対照を用いて得られた前駆細胞との比率を対照のパーセント（％）として表す。
CFU−Mixの増殖は、１μg/mlの抗gp130 mAb濃度で完全に遮断されたが、一方、mAbは、IL−３およびSCFの組み合わせにより誘導される増殖にほとんど又は全く影響しないようであった。抗IL−6R mAbの培養への添加は、効率がわずかに低いことを除いては類似の阻害を示し、10μg/mlの濃度でCFU−Mixが完全に増殖しなくなることが観察された（図5B）。また、抗IL−6R抗体もIL−３およびSCFの組み合わせにより刺激される増殖に影響を与えなかった。これに対して、抗EPO抗体は、SCFおよびEPOにより誘導される増殖を阻害したが、sIL−6R、IL−６およびSCFにより誘導される増殖には全く影響を与えなかった（データは示さず）。同じ結果が、無血清懸濁培養およびメチルセルロース培養の両方において得られた。
赤血球系細胞産生
ヒト造血系前駆細胞からの赤血球系細胞の生成に対するgp130シグナル伝達の影響を更に調べるために、さらに実験を行った。正常なヒト造血系前駆／幹細胞を、臍帯血単核細胞から単離し、種々の濃度のsIL−6Rと共にIL−６およびSCFの存在下で培養した。総細胞数は、用量依存的に増加することが分かった。この増加は、80ng/mlの低い濃度でもsIL−6Rで検出可能であり、1280ng/mlでプラトーになるようであった。図６は、IL−６およびSCFの存在下、種々量のsIL−6Rを用いた１回の実験の結果を示す。
総細胞数の分析は、1280ng/mlを超えるsIL−6R濃度で、インキュベーションの７、14および21日目にそれぞれ30倍以上、650倍以上および900倍以上の培養中の総細胞の増大を示した。しかしながら、IL−６の非存在下では、sIL−6Rは、総細胞数を増加させなかった。これらの結果は、sIL−6Rが機能的であり、IL−６と組み合わせてのみCD34+細胞における増殖シグナルを伝達することができることを明白に示している。
また、IL−６の用量−応答実験は、総細胞数の用量依存的な増加を示した。1280ng/mlのsIL−6Rの存在下、50〜100ng/mlの濃度のIL−６を用いて最大細胞数が得られた（図７）。sIL−6Rの非存在下では、しかしながら、IL−６は、50ng/mlを超える量を用いた場合でさえ、総細胞数のわずかな増加しか得られなかった。これらの結果は、1280ng/mlのsIL−6Rおよび50ng/mlのIL−６が、SCFを含む血清含有培養中での精製幹細胞からの総細胞の増大に有効な組み合わせでありうることを示している。sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせによる総細胞の増大は、ヒト骨髄から精製したCD34+細胞を用いた場合にも観察された（データは示さず）。
血清含有培養中の組み合わせたsIL−6R/IL−６の観察された効果は、sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ単独によるよりむしろ牛胎児血清（FBS）に混入する未知の因子と連関した上記因子の作用による可能性があった。この可能性を排除するために、CD34+臍帯血細胞の無血清懸濁培養を検討した。驚くべきことに、血清含有培養と比較したところ、無血清培養でsIL−6R、IL−６およびSCF間により大きい相乗作用が観察された（図８）。sIL−6R、IL−６およびCSFの組み合わせを用いた細胞の無血清培養は、培養の７、14および21日目に総細胞数の増大をそれぞれ38倍、530倍および2200倍促進した。SCF単独またはIL−６と組み合わせて培養した細胞は、21日目でさえわずかに2.2または7.5倍の増大しか示さなかった。これらの結果は、未知の因子の影響の可能性を明白に排除し、SCFの存在下でsIL−6Rが造血系幹細胞の増大を誘導することを示した。
増大した細胞の細胞遠心分離調製物を、種々の細胞化学的および免疫学的染色で染色した。これらの細胞の示差的細胞数は、CD34+臍帯血細胞培養の７日目に存在したもののような主として芽細胞の存在を示した（図9a）。興味あることには、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせを用いた場合、血清含有および無血清懸濁培養の両方で培養の14日目に多数の赤芽球が観察された。赤血球系細胞の性質を、グリコホリンＡ（図9b）およびヘモグロビン−ａ（図9c）に対するモノクローナル抗体を用いベンジジン染色および免疫染色により確認した。いくつかの赤血球系細胞は、正赤芽球および除核した赤血球期に分化した（図9d）。培養の21日目に、ほとんどの赤血球系細胞が正赤芽球期に分化し、多数の除核赤血球が観察された。
赤血球系細胞の絶対数は、総細胞数およびサイトスピンスライド上のグリコホリンＡ陽性細胞の発生により算定した。サイトカイン類およびsIL−6Rの種々の組み合わせを添加した無血清培養中の赤血球系細胞の絶対数を毎週分析した結果を図10に示す。
sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせは、他の組み合わせと比較し総細胞数のみならず総赤血球系細胞の生成もより顕著に刺激した。培養の２週間目に、この組み合わせにより生成した細胞の約79％は赤血球系細胞（即ち、Ｅ−芽球および赤血球）であった。培養の３週間目に、この組み合わせにより生成した細胞の約69％は赤血球系細胞であった。また、IL−３またはGM−CSFのいずれかと組み合わせてsIL−6RおよびIL−６を含有する培養中に少数の赤血球系細胞が観察されたが、これは、in  vitroでの赤血球系細胞の生成にgp130シグナル伝達が役割を果たすことを示唆している。
エリトロポエチンを含む組み合わせを除いては、他のサイトカインの組み合わせ体を添加した培養中に赤血球系細胞は検出できなかった。エリトロポエチン単独との比較では、sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせにより産生した赤血球系細胞の総数は、培養14日目で約５倍、培養21日目で約115倍であった（図10）。エリトロポエチン、sIL−6RおよびIL−６の組み合わせとの比較では、sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせにより産生した赤血球系細胞の総数は、培養14日目で約4.1倍、培養21日目で約38.3倍であった。赤血球系細胞の生成に対するsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせの効果は、CD34+骨髄細胞の血清含有および無血清培養の両方で観察された（データは示さず）。
sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ体を添加した懸濁培養において、多数の赤血球系細胞の生成は、CD34+細胞集団中での未成熟な赤血球系前駆細胞の増殖、分化および成熟によるものと考えられた。この可能性を確認するために、CD34+細胞のメチルセルロースクローン培養を検討した。培養には、エリトロポエチン単独、組み合わせたエリトロポエチン/IL−６、またはエリトロポエチン/sIL−6R/IL−６の組み合わせ体のいずれかが添加された。表１は、14日間培養した500個のCD34+臍帯血細胞から得た結果を示す。
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sIL−6R、IL−６およびSCFの組み合わせは、エリトロポエチンの非存在下で、赤血球系バーストを刺激するのみならず多数の大きい混合赤血球系コロニーも生成させた。全ての混合赤血球系コロニーは、赤血球を含む多数の成熟赤血球系細胞を含有した（図9fおよび図9g）。sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせは、500個のCD34+臍帯血細胞から27.2±5.8個の赤血球系バーストおよび122.3±21.8個の混合赤血球系コロニーを産生した。対照的に、SCF単独またはIL−６と組み合わせたSCFを添加した培養中には、赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーのいずれも観察されなかった。また、sIL−6R/IL−6/SCFを用い臍帯血および骨髄幹細胞のいずれからも、赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーの生成が無血清培養で確認された（データは示さず）。成熟赤血球系前駆細胞（即ち、コロニー形成単位−赤血球系）を含む骨髄単核細胞をsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせを用いて培養した場合、多数の赤血球系コロニーを観察した。これらの結果は、sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせが、CD34+細胞集団中での未成熟赤血球系前駆細胞、および骨髄単核細胞中での成熟赤血球系前駆細胞、の増殖、分化および最終的成熟を助けることができることを強く示した。
赤血球形成の調節のための代替経路の可能性を更に調べるために、細胞の発生に対する種々の抗体の作用を調査した。次の抗体の作用を調べた:sIL−6R/IL−６複合体と細胞表面のgp130との間の相互作用を遮断する抗gp130MAb（GPX7、GPX22およびGPZ35）（19、29）;IL−６およびIL−6R間の相互作用を遮断する抗IL−6R MAb（20）；およびCD34+細胞からの赤血球系細胞の発生を遮断する抗エリトロポエチン中和抗体。sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ体を添加した懸濁培養への抗gp130 MAbの添加は、赤血球系細胞の産生を完全に阻害した（図11）。抗gp130抗体は、しかしながら、エリトロポエチンに依存する赤血球系細胞の産生に対しては何ら影響しなかった。
sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ体を添加した培養への10μg/mlの濃度の抗IL−6R MAbの添加は、赤血球系細胞の産生をほぼ完全に阻害した（図12）。抗IL−6R MAbのより低い効率は、IL−６および細胞表面IL−6R間の相互作用の抗体中和を妨げることのできる過剰のsIL−6Rにより説明することができる。対照的に、抗エリトロポエチン抗体は、赤血球系細胞のエリトロポエチンに依存する産生をほぼ完全に阻害するが、sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせによる赤血球系細胞の生成には影響を与えなかった（図13）。
さらに、造血系幹細胞のメチルセルロースクローン培養も、抗エリトロポエチン抗体ではなく抗gp130 MAbが、さもなければsIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせにより誘導される赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニー形成の両方の発生を完全に遮断することを示した。これらの結果は、インターロイキン−６リガンドおよび可溶性受容体の観察された作用が、IL−６およびsIL−6Rの相互作用並びにその結果生じたIL−6/sIL−6R複合体と標的前駆細胞上の膜固定gp130との結合に起因することを明白に示している。また、これらの結果は、SCFと組み合わせたgp130シグナル伝達による未成熟赤血球系前駆細胞からの赤血球系細胞の生成が、エリトロポエチンの存在と独立して起こることを示した。
赤血球系細胞の増殖および最終的成熟は、エリトロポエチン受容体シグナル伝達により生理学的に調節されると考えられてきた。本発明は、SCFと組み合わせたgp130シグナル伝達が、エリトロポエチンの非存在下で赤芽球および赤血球のもとになる未成熟赤血球系前駆細胞を刺激することを示している。これは、そして、エリトロポエチン受容体シグナル伝達が、正常なヒト赤血球系細胞の増殖、分化および最終的成熟に必須ではないことを示唆する。sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせによる赤血球系細胞の顕著な産生および、sIL−6Rの添加を受けていない幹細胞によるこのような産生の欠如は、sIL−6Rが、膜貫通IL−6Rを欠いてはいるがgp130を発現する細胞にIL−６反応性を付与するという従来の報告を思い出させる。この理論は、全CD34+細胞および増殖細胞がgp130を発現したが、sIL−6R/IL−6/SCFの組み合わせ体の添加を受けたCD34+細胞の約90％がIL−6R染色に陰性であったことを示す免疫細胞学的染色実験により支持された。
sIL−6Rの生理学的有意性が、ヒト血清におけるその検出により示されることが報告されてきた（26）。血清中に存在するsIL−6Rは、IL−６に結合し終局的にgp130を刺激するその能力の点で生物学的に活性である（30）。in  vitroでCD34+細胞からの赤血球系細胞の生成に対するsIL−6RおよびIL−６の組み合わせの半最大効果が、320ng/mlのsIL−6Rおよび25ng/mlのIL−６の濃度で観察された。これは、生理的濃度範囲内に入いりそうだと考えられる。IL−６およびSCFもヒト血清中で検出可能である。IL−６と同様に、可溶性および膜結合の両方の型のSCFは、造血系幹細胞および未成熟前駆細胞を固定し骨髄中で増殖を助けることのできる骨髄間質細胞により産生される（27、28、31、32）。合わせて考えると、今回の結果は、gp130シグナル伝達と組み合わせたSCFが、in  vivoでの正常な赤血球形成に重要な役割を果たすことを示している。
実施例４
ヒト造血系幹細胞に対するsIL−6RおよびIL−６の増殖活性
方法  医療機関のガイドラインにより得たヒト臍帯血を、正常な満期分娩中に集めた。Silica（IBL,Fujioka,Japan）を用いた食細胞の枯渇後、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離により単核細胞を分離した。洗浄後、単核細胞を、抗CD34抗体を有する磁気粒子（Dynabeads M−450 CD34;Dynal,Oslo,Norway）と、ビーズ対細胞比1:1で混合した。細胞−ビーズ懸濁液を懸濁し４℃で30分間インキュベートして細胞をビーズに結合させた。得られたビーズ／ロゼット形成細胞をDynal Magnetic Particle Concentrator内に集めた。製造元の指示書に従って、DETACHaBead CD34（Dynal）により陽性選択された細胞からビーズを脱着し、選択したCD34+細胞を回収した。分離したCD34+細胞の純度は、FACS分析（Ortho,USA）により85〜95％であった。
SCF、IL−３、IL−６、エリトロポエチンおよびＧ−CSFを補充したメチルセルロース培養におけるコロニー形成は、45〜55％であった。精製CD34+細胞を、以下の改変を加えた従来法（21、22）を用いて懸濁培養液中で培養した。培養培地は、2000個のCD34+細胞、α−培地、20％牛胎児血清（FBS;HyClone,UT）、１％結晶化脱イオン化牛血清アルブミン（BSA,Sigma）を含有した。５％CO2および５％O2を用い37℃で24−ウェルの組織プレート（Nunc,Kamstrup,Denmark）中で1mlの培養混合物並びに組換えヒトsIL−6R、IL−６、およびSCF（100ng/ml）の種々の組み合わせ体をインキュベートした。組換えsIL−6R、IL−６、およびSCFは、従来の通りに作製して用いた。無血清懸濁培養は、２％の純粋なBSA（Sigma）、10μg/mlのインスリン、200mg/mlのトランスフェリン、10-5Mのメルカプトエタノール（Eastman）、およびFBSの代わりの40μg/mlの低濃度リポ蛋白（Nakarai Tesque Inc.,Tokyo）から構成された（10）。１週間おきに、培地の半分を、同じサイトカインセットを含有する新鮮な培地と交換した。細胞の画分を、次いで、回収し、洗浄し、血球計数器で計数し、細胞遠心分離し、染色した。
結果  本実験の結果を、上記したように図10〜図12に示す。図10は、インキュベーション14日目のIL−６（50ng/ml）の存在下（○）または非存在下（●）でSCFと共に種々の濃度のsIL−6Rを用いた血清含有懸濁培養中の幹細胞の成長を示す。図11は、インキュベーション14日目のsIL−6R（1280ng/ml）の存在下（○）または非存在下（●）でSCFと共に種々の濃度のIL−６を用いた血清含有懸濁培養中の幹細胞の成長を示す。図12は、７日目（白い棒）、14日目（斜線棒）および21日目（黒塗りの棒）におけるSCF単独、SCFおよびIL−６（50ng/ml）の組み合わせ体、またはSCF/IL−６およびsIL−6R（1280ng/ml）の組み合わせ体のいずれかを含有する血清含有および無血清培養中での幹細胞の成長を示す。結果は、３回の別々の実験から得たものである。標準偏差を誤差棒で表す。
実施例５
組み合わせたサイトカイン類を有する培養中での造血系幹細胞からの赤血球系細胞の発生
方法  懸濁培養の細胞遠心分離調製物を、従来法により７日目および14日目にMay−Grunwald−Giemsaで染色した。また14日目に、調製物を、従来方法（23）により抗グリコホリンＡに対するMAb（Immunotech Co,Marseilles,France）および抗ヘモグロビンα鎖（COSMO Bio Co.,TOKYO,Japan）を用いアルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（APAAP）法で免疫染色した。陽性の細胞を赤みがかった粒子で染色した。既に報告された（23、24）通りにメチルセルロース培養を行った。培養混合物は、500個のCD34+臍帯血細胞、α−培地、0.9％、30％FBS、１％BSA、5x10-5Mのメルカプトエタノール、1280ng/mlのsIL−6R、80ng/mlのIL−６および100ng/mlのSCFを含有した。1mlの培養混合物を、各35mm Lux標準非組織培養皿にプレーティングした。細胞を、５％CO2含有空気の湿潤雰囲気下で37℃でインキュベートした。
結果  本実験の結果を図９に示す。７日目（図9a）および14日目（図8d）にMay−Grunwald−Giemsaで染色した懸濁培養の細胞遠心分離調製物を示す。14日目に抗グリコホリン−A MAbまたは抗ヘモグロビン−α MAbで免疫染色した培養の細胞遠心分離調製物を、それぞれ図9bおよび9cに示す。14日目におけるsIL−6R、IL−６およびSCF含有メチルセルロース培養物中の赤血球系前駆細胞から生成した代表的赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーを、それぞれ図9eおよび9fに示す。
実施例６
赤血球系細胞の産生に対する抗体の影響
方法  以下の実験は、赤血球系細胞の生成に対する抗ヒトgp130 MAb、抗ヒトIL−6R MAbおよび抗ヒト  エリトロポエチン抗体の影響を調べた。抗ヒトgp130 MAb（GPX7、GPX22およびGPZ35）の調製法は、既に記載されている（２）。要するに、マウスを組換えヒト可溶性gp130で免疫し、抗ヒトgp130 MAb GPX7、GPX22およびGPZ35を産生するハイブリドーマを作製した。３種の抗体は、gp130上の異なるエピトープを認識し、gp130とIL−６受容体とのIL−６が誘導する結合の阻害を介してIL−６が仲介する生物学的反応を阻害する（２、19）。抗ヒトIL−6R（PM1）MAbを調製した（20）。PM1は、IL−６のIL−６受容体への結合の阻害を介してIL−６が仲介する生物学的反応を阻害する。ウサギ抗ヒトエリトロポエチン抗体（IgG K−５）は、Kirin Co.,Japanにより提供された。抗エリトロポエチン抗体（24mg/ml）は、2U/mlのエリトロポエチンを中和する（34）。
図11に示されるように、ヒト臍帯血幹細胞（2000個のCD34+細胞）には、予め決定した最適濃度のsIL−6R/IL−6/SCF（○）、またはエリトロポエチン（2U/ml）およびSCF（100ng/ml）の組み合わせ体（●）のいずれかを添加した。実施例４で述べた通りに調製した血清含有懸濁培養中にマウス抗ヒトgp130 MAb（図11）、マウス抗ヒトIL−6R MAb（PM1）（図12）またはウサギ抗ヒト  エリトロポエチン抗体（図13）を添加した又は添加しない培養を観察した。培養の初めに濃度を変えた抗体を加えた。抗体を全く加えないウェルを対照として用いた。14日間培養後、細胞を回収し、計数し、細胞遠心分離した。総赤血球系細胞（赤芽球、正赤芽球および赤血球を含む）は、総細胞数およびサイトスピンスライド上で測定した赤血球系細胞の割合に基づいて算定した。その結果得たデータを、各対照のウェル内の赤血球系細胞に対する、抗体で処理した各ウェル内の赤血球系細胞の比率で表し、対照のパーセント（％）として表した。
以下に、本明細書で引用した参考文献を記す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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