(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［Ｉ］
Ｘ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｙ    ［Ｉ］
（式中、Ｘはアミノ酸のＮ−末端保護基を表し、Ｔｈｒはスレオニン残基を表し、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ａｒｇはアルギニン残基を表し、Ｙはアルギニン残基のＣ−末端と共有結合を形成している発色性基又は蛍光性基を表す。）
で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩。
【請求項２】
アミノ酸のＮ−末端保護基がアセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、トシル基又はｔ−ブトキシカルボニル基等である請求項１に記載のペプチド誘導体又はその酸付加塩。
【請求項３】
アルギニン残基のＣ−末端と共有結合を形成している発色性基又は蛍光性基が、ｐ−ニトロアニリノ基、３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリノ基、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリノ基、４−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アミノアニリノ基又は７−アミノ−４−メチルクマリノ基である請求項１に記載のペプチド誘導体又はその酸付加塩。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチド誘導体又はその酸付加物を基質として使用することを特徴とする、エンドトキシンの定量方法。
【請求項５】
エンドトキシンを含む試料と、カブトガニ血球成分と、請求項１に記載のペプチド誘導体又はその酸付加物とを反応させ、その結果遊離する発色性化合物又は蛍光性化合物の増加量を測定し、その測定結果に基づいて試料中のエンドトキシン量を定量することを特徴とするエンドトキシンの測定方法。
【請求項６】
カブトガニ血球成分と、請求項１に記載のペプチド誘導体又はその酸付加物とを、構成成分として含んで成るエントドキシン定量用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の利用分野】
本発明は、プロテアーゼ、アミダーゼ、凝固酵素等の活性測定用基質として、特にエンドトキシンとカブトガニ血球成分（ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）との反応により活性化される凝固酵素の活性測定用基質として有用な新規なペプチド誘導体に関する。
【０００２】
【発明の背景】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙ−  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）であり、強い発熱性物質として知られている。このため、注射用医薬品等におけるエンドトキシンの検出は重要と考えられており、米国や日本の薬局方にもエンドトキシン試験法が収載されている。また、エンドトキシンはグラム陰性菌感染症におけるショックの主な原因と考えられており、臨床診断上では、血漿中エンドトキシンの測定がグラム陰性菌感染症の診断、グラム陰性菌感染症の治療効果及び予後の判定、エンドトキシンショックの早期診断等に用いられている。
【０００３】
カブトガニの血球成分は、エンドトキシンによって活性化されて、凝固酵素（プロテアーゼ等）等の活性化反応やゲル化反応を生じる性質を有しており、医学、薬学、微生物学の分野ではこれを利用した、簡便で、安価なエンドトキシン検出法が、広く用いられている。この代表的な方法としては、例えば米国薬局法［Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ＸＸ．８８８（１９８０）］に採用されたゲルの固さを肉眼で判定する方法、ゲル化に基づく濁度を測定する方法、クロット蛋白定量法等があるが、いずれもゲル化現象に基づいて判定を行う方法であるため測定精度の面で若干問題が生じる場合がある。
【０００４】
一方、カブトガニ血球成分とエンドトキシンとの反応により活性化される凝固酵素（プロテアーゼ）の作用により、例えばニトロフェノール、ニトロアニリン、メチルクマリン誘導体、インドキシル誘導体等の発色性化合物又は蛍光性化合物を遊離する合成ペプチド誘導体をエンドトキシン測定用の基質として使用する測定方法も報告されている（特公昭５９−１９５３２号公報、特公昭６１−５４４００号公報、特開昭５７−５０２２６６号公報等）。
【０００５】
このような方法に使用される合成基質に於いては、該凝固酵素による発色性基或は蛍光性基とペプチド残基との結合を開裂させるためには一般に２つのアミノ酸配列、即ちグリシルアルギニン残基（−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−）が必要であることが判明しており、その代表的なものとしては例えば以下のようなものが挙げられる。
（１）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（２）Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（３）Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（上記式中、「Ｂｏｃ」はｔ−ブトキシカルボニル基を、「Ｌｅｕ」はロイシン残基を、「ｐＮＡ」はｐ−ニトロアニリノ基を、「Ｓｅｒ」はセリン残基を、また「Ｂｎ」はセリン残基側鎖の水酸基と結合したベンジル基を夫々示す。）
【０００６】
しかしながら、これらペプチド誘導体はエンドトキシン定量の際の基質として用いるには問題が多い。
即ち、例えば上記（１）及び（２）で示されるペプチド誘導体には、該凝固酵素との反応性は高いものの水溶性が悪いため、該凝固酵素活性を効率よく測定するために必要な濃度の水溶液を得ることが困難であるという問題点が、また、上記（３）で示されるペプチド誘導体には、水溶性はよいものの該凝固酵素との反応性が低いため、これを基質として用いた場合には微量のエンドトキシンの測定が困難になるという問題点がある。
【０００７】
【発明の目的】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、プロテアーゼ、アミダーゼ、凝固酵素等の活性測定用基質として、特にエンドトキシンとカブトガニ血球成分（ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）との反応により活性化される凝固酵素の活性を簡便に且つ高感度に測定するための基質として好適なペプチド誘導体を提供することを目的とする。
【０００８】
【発明の構成】
本発明は、一般式［Ｉ］
Ｘ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｙ    ［Ｉ］
（式中、Ｘはアミノ酸のＮ−末端保護基を表し、Ｔｈｒはスレオニン残基を表し、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ａｒｇはアルギニン残基を表し、Ｙはアルギニン残基のＣ−末端と共有結合を形成している発色性基又は蛍光性基を表す。）
で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩、の発明である。
【０００９】
また、本発明は、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩を基質として使用することを特徴とする、エンドトキシンの定量方法、の発明である。
【００１０】
更に、本発明は、エンドトキシンを含む試料と、カブトガニ血球成分と、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体又はその酸付加物とを反応させ、その結果遊離する発色性化合物又は蛍光性化合物の増加量を測定し、その測定結果に基づいて試料中のエンドトキシン量を定量することを特徴とするエンドトキシンの測定方法、の発明である。
【００１１】
更にまた、本発明は、カブトガニ血球成分と、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体又はその酸付加物とを、構成成分として含んで成るエントドキシン定量用試薬キット、の発明である。
【００１２】
即ち、本発明者らは、エンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応の結果活性化される、例えばクロッティングエンザイム等の凝固酵素（プロテアーゼ）の活性を簡便に且つ高感度に測定することができる基質を求めて鋭意研究を重ねた結果、グリシルアルギニン残基（−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−）のＮ−末端に更にスレオニンが結合しているペプチドを基本骨格とする一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体は、水溶性に優れているため、酵素反応に用いる水溶液又は緩衝液等に目的の濃度に容易に溶解させることができ、しかも目的の凝固酵素との反応性が高いのでこれを基質として用いれば該酵素を高感度に測定することが可能となることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１３】
一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体に於いて、Ｘで表されるアミノ酸のＮ−末端保護基としては、アミノ酸やペプチドのＮ−末端保護基として通常この分野で用いられる基であれば特に限定されることなく挙げられるが、例えばアセチル基、ベンゾイル基等のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、トシル基、グルタリル基等が好ましく挙げられる。
【００１４】
また、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体に於いて、Ｙで示される発色性基又は蛍光性基としては、エンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応の結果活性化される凝固酵素によりペプチド残基との結合が切断されて、発色性或は蛍光性を示す化合物を生じさせ得る基（或は適当な化合物とカップリング等させることにより発色性或は蛍光性を示す物質となる化合物を生じさせ得る基）であれば特に限定されることなく挙げられるが、例えばｐ−ニトロアニリノ基、３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリノ基、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリノ基、４−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アミノアニリノ基等の発色性基、例えば７−アミノ−４−メチルクマリノ基等の蛍光性基等が好ましく挙げられる。
【００１５】
更に、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体は、無機酸又は有機酸と酸付加塩を形成していても良く、そのような酸付加塩の具体例としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、例えば酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等が好ましく挙げられる。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体は、ペプチド合成に慣用されている方法を用いれば容易に合成できるが、例えば以下のようにして合成すれば良い。
即ち、先ず、一般式［ＩＩ］
Ｈ−Ａｒｇ−Ｙ        ［ＩＩ］
（式中、Ｙは前記に同じ。）
で示されるペプチド誘導体又はその酸付加塩を、例えば以下のようにして合成する。
【００１７】
即ち、適当な保護基［例えばｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）等］によりアミノ基が保護されたアルギニン、又は、適当な保護基（例えばＢｏｃ基、Ｚ基、ニトロ基等）によりアミノ基及びグアニジノ基が保護されたアルギニンと、アルギニンに対して１〜２倍モル量の例えばｐ−ニトロアニリン、３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリン、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アミノアニリン等の発色性化合物或は例えば７−アミノ−４−メチルクマリン等の蛍光性化合物とを、ペプチド誘導体の合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、或はこれらの混合溶媒中、アルギニンに対して１〜２倍モル量の例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のペプチド合成に慣用される縮合剤の存在下、０〜２５℃で、１２〜２４時間反応させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、次いでこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用いられている方法、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製した後、脱保護の処理を行うことにより、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体が容易に得られる。尚、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体は、上記した方法以外のペプチド化学の分野で汎用される方法、例えば活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、ホスファゾ法等により合成してもよいことは言うまでもない。
【００１８】
次いで、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体をペプチド合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ或はこれらの混合溶媒中、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体に対して１〜２倍モルのＮ−末端が適当な保護基［例えばＢｏｃ基、Ｚ基、ベンゾイル基（Ｂｚ基）、アセチル基（Ａｃ基）等］により保護されたスレオニルグリシンと、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体に対して１〜２倍モルの例えばＤＣＣ等のペプチド合成に慣用される縮合剤の存在下に、０〜２５℃で１２〜２４時間反応させるか、或は、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体をペプチド合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、或はこれらの混合溶媒中、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体に対して１〜２倍モルのＮ−末端が適当な保護基（例えばＢｏｃ基、Ｚ基、Ｂｚ基、Ａｃ基等）により保護され且つＣ−末端に例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル等が結合したスレオニルグリシンの活性エステル体と０〜２５℃で１２〜２４時間反応させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、次いでこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用いられている方法、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製し、必要に応じて脱保護処理を行えば、本発明のペプチド誘導体が容易に得られる。尚、一般式［ＩＩ］で示されるアルギニン誘導体とスレオニルグリシンとを結合させるのは、上記した方法以外のペプチド化学の分野で汎用される方法、例えば混合酸無水物法、アジド法、ホスファゾ法等で行ってもよいことは言うまでもない。
【００１９】
かくして得られた本発明のペプチド誘導体は、特定酵素、例えばカブトガニ血球成分とエンドトキシンとの反応の結果活性化される凝固酵素（プロテアーゼ、アミダーゼ様酵素等）の基質として有用なものである。
【００２０】
本発明のペプチド誘導体を基質として用いてエンドトキシンを定量するには、例えば、本発明のペプチド誘導体を基質として用いる以外は、通常この分野で本発明のペプチド誘導体の如き合成基質を使用してエンドトキシンの定量を行う、所謂合成基質法に準じて操作を行えばよい。また、エンドトキシンとカブトガニ血球成分と本発明のペプチド誘導体とを混合して反応を開始させ、その結果遊離する発色性或は蛍光性を示す化合物に基づく吸光度変化量（或は蛍光強度変化量）が一定の値に到達するまでに要する時間（到達時間）を求め、この値を、到達時間とエンドトキシン濃度との関係を表す検量線に当てはめることにより行ってもよい。
【００２１】
この際に用いられるカブトガニの血球成分を含む溶液としては、通常のエンドトキシンの測定に使用できるものであれば特に限定されることなく用いることができるが、例えば、ＡＣＣ社、ヘマケム社、ウィタカーバイオプロダクト社、帝国臓器（株）、エンドセイフ社等によって製造された市販のカブトガニ血球成分の凍結乾燥品から調製されたものを用いてもよいし、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）属、タキプレウス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ）属或はカルシノスコルピウス（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ）属に属するカブトガニの血球から得られたもので、エンドトキシンとの反応により酵素（プロテアーゼ等）の活性化が生じるものであれば、特に限定されることなく挙げられる。
【００２２】
また、上記の如き本発明のペプチド誘導体を使用するエンドトキシン定量用試薬中には、例えば緩衝剤その他の適当な試薬類が含まれていても良く、これら試薬類は所謂合成基質法等で使用されるものの中から適宜選択して用いれば足りるし、その使用濃度も所謂合成基質法用試薬等を調製する際に選択される濃度範囲から適宜選択すれば足りる。尚、上記のエンドトキシン定量法に於ける本発明のペプチド誘導体の使用濃度としては、エンドトキシンの測定範囲をどの程度にするかによっても異なるが、反応時の濃度として通常０．５〜５ｍＭ、好ましくは１〜３ｍＭの範囲から適宜選択される。
【００２３】
本発明のペプチド誘導体を基質とするエンドトキシンの定量方法をより具体的に述べれば例えば以下の如くである。
【００２４】
ａ）合成基質法
エンドトキシンを含む試料とカブトガニ血球成分を含む溶液とを混合した後、２５〜４０℃保温下に所定時間反応させた後、該溶液に本発明のペプチド誘導体を加え、更に２５〜４０℃保温下に所定時間反応させるか、或はまた、エンドトキシンを含む試料とカブトガニ血球成分を含む溶液と本発明のペプチド誘導体とを混合し、２５〜４０℃保温下に所定時間反応させる。その後、反応液に反応停止液（例えば塩酸溶液、酢酸溶液等）を添加して反応を停止させ、得られた最終溶液の所定の吸光度（或は蛍光強度）を適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計等）を使用して測定する。
得られた測定値を、濃度既知のエンドトキシン溶液を使用して予め作成しておいたエンドトキシン濃度と該測定値との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のエンドトキシン濃度を求める。
【００２５】
ｂ）到達時間分析法
エンドトキシンを含む試料と、カブトガニ血球成分を含む溶液と、本発明のペプチド誘導体とを混合した後、２５〜４０℃保温下で該混合液の所定の吸光度変化（或は蛍光強度変化）を適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計等）を使用して測定し、混合直後からの吸光度変化量（或は蛍光強度変化量）が所定の値に到達する迄の時間（到達時間）を求める。
得られた到達時間を、濃度既知のエンドトキシン溶液を使用して予め作成しておいた到達時間とエンドトキシン濃度との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のエンドトキシン濃度を求める。
【００２６】
これらの定量法に於いて、本発明のペプチド誘導体から遊離する発色性（或は蛍光性）の化合物を測定するに当たっては、該化合物自身が発色性或は蛍光性を有する場合はその性質に基づいて測定を行えば良い。該化合物自身の発色性或は蛍光性がそれほど強くない場合（或は殆どない場合）には、適当な化合物とカップリング等させることにより発色性或は蛍光性を示す化合物を生じさせ、それに基づく発色或は蛍光を測定すれば良い。後者の場合についてより具体的に述べれば、本発明のペプチド誘導体から遊離する化合物が例えば４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリン、４−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）アミノアニリン等である場合には、これらを適当な酸化剤等の存在下、フェノール、ナフトール等と酸化縮合させ、生成する青色のインドフェノール型色素とした後に、生じた色素に基づく吸光度を測定すれば良い。また、本発明のペプチド誘導体から遊離する化合物が例えばｐ−ニトロアニリンである場合には、それ自身が発色性を有しているのでそのままで測定を行っても良いが、測定感度を上げるために適当な化合物とジアゾカップリング反応させ、その結果生じた化合物に基づく吸光度を測定しても良い。
【００２７】
本発明のエンドトキシン定量用試薬キットは、上記した如き方法によりエンドトキシンを定量する際に用いられるもので、カブトガニ血球成分と、一般式［Ｉ］で示されるペプチド誘導体又はその酸付加物とを、構成成分として含んで成るものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例については上で述べたとおりである。
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
実施例１．ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
１）ベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩の合成
ｐ−ニトロアニリン（２６ｇ，１８８ｍｍｏｌ）をピリジン（４００ｍｌ）に溶解し、−２０〜−１０℃に冷却下、三塩化リン（８．２ｍｌ，９４ｍｍｏｌ）を含むピリジン溶液（１００ｍｌ）を３０分間を要して滴下した後、同温度で３０分間攪拌反応させた。反応液を室温に戻し、更に２時間攪拌反応させた後、ベンジルオキシカルボニルアルギニン（５８ｇ，１８８ｍｍｏｌ。和光純薬工業（株）製。）を加え、４０〜５０℃で３時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝７：３の混合溶媒で抽出し、抽出液を１規定塩酸、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をアセトンで結晶化して、５６．５ｇのベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（収率６４．６％）を得た。
２）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシンエチルエステルの合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（８．４ｇ，６０ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製。）とｔ−ブトキシカルボニルスレオニン（１１．０ｇ，５０ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製。）とを塩化メチレン（３００ｍｌ）に懸濁し、これに氷冷下トリエチルアミン（８．４ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（１２．４ｇ，６０ｍｍｏｌ）とを加えた後、室温で２０時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで抽出処理した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣は、特に精製を行わず、次反応に供した。
３）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシンの合成
上記２）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシンエチルエステル（１５．０ｇ，４９ｍｍｏｌ）をメタノール（６００ｍｌ）に溶解し、これに１規定水酸化ナトリウム水溶液（７５ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を１規定塩酸（７５ｍｌ）で中和し、これを減圧濃縮した。得られた残渣を飽和重曹水に溶解し、酢酸エチルで洗浄した。飽和重曹水層を、１規定塩酸で酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、酢酸エチルを留去する事により、１０．０ｇのｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン（収率７２％）を油状物として得た。
４）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
上記１）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（１６．３ｇ，３５ｍｍｏｌ）を２５％臭化水素−酢酸溶液（５０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で４時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液にエーテルを注ぎ、析出した沈澱物を濾取し、更にエーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（５００ｍｌ）に溶解し、氷浴中トリエチルアミン（４．９ｍｌ，３５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（７．２ｇ，３５ｍｍｏｌ）、１−オキシベンゾトリアゾール（５．４ｇ，３５ｍｍｏｌ）、及び上記３）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン（９．７ｇ，３５ｍｍｏｌ）を順次添加し、氷冷下で２時間、更に室温下で２０時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノ−ル＝８：２の混合溶媒で抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００；和光純薬工業（株）商品名、７５０ｇ，溶出液；酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝６０：２０：６：１１の混合溶媒）にて精製し、目的物の溶出画分を減圧濃縮して得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝８：２の混合溶媒で抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣をイオン交換カラムクロマトグラフィー（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４１０  酢酸型；アンバーライト社製、  ５００ｃｍ３，溶出液；水）にて酢酸塩型へと変換した。目的物の溶出画分を凍結乾燥して得られた粉末をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ファルマシア社商品名。溶出液；メタノール）にて精製した。更に、目的物の溶出画分を減圧濃縮して得られた残渣を、注射用蒸留水（大塚製薬（株）製，７００ｍｌ）に溶解し、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製；Ｕｌｔｒａｚａｒｔ  Ｄ−２０、及びそのユニット）にて発熱性物質を除去し、濾液を凍結乾燥することにより、１１．５ｇのｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩（収率５３．７％）を得た。
元素分析値（Ｃ２５Ｈ４０Ｎ８Ｏ１０として）
計算値（％）：Ｃ  ４９．０１，  Ｈ  ６．５８，  Ｎ  １８．２９
測定値（％）：Ｃ  ４７．３１，  Ｈ  ６．４３，  Ｎ  １７．６８
【００２９】
実施例２．ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド酢酸塩の合成
１）ベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−アセトキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩の合成
特公平６−２７１１１号公報に記載された合成方法に準じて３−アミノベンジルアルコールを原料としてアセチル化、ニトロ化等を行うことにより合成された３−アセトキシメチル−４−ニトロアニリン（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）をピリジン（５０ｍｌ）に溶解したものを−２０〜−１０℃に冷却し、三塩化リン（０．４４ｍｌ，５ｍｍｏｌ）を含むピリジン溶液（５ｍｌ）を５分間で滴下し、−２０〜−１０℃で３０分間攪拌反応させた。反応後、室温に戻し、更に１時間攪拌反応させた後、ベンジルオキシカルボニルアルギニン（３．１ｇ，１０ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製。）を加え、４０〜５０℃で３時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００；和光純薬工業（株）商品名、２５０ｇ，溶出液；酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝６０：２０：６：１１の混合溶媒）にて精製した。目的物の溶出画分を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去して、３．８ｇのベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−アセトキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩（収率７６．１％）を油状物として得た。
２）ベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩の合成
上記１）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−アセトキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩（３．６ｇ，６．７ｍｍｏｌ）をメタノ−ル（１５０ｍｌ）に溶解し、氷冷下、これにナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液（０．１５ｍｌ）を添加して、氷冷下で３時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を１規定塩酸で中和し、これを減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝６：４の混合溶媒で抽出し、抽出液を１規定塩酸、蒸留水で順次洗浄した後、溶媒を留去した。得られた残渣をエタノール／エーテルの混合溶媒で結晶化し、３．０ｇのベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩（収率９１．０％）を得た。  ３）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド酢酸塩の合成
上記２）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド塩酸塩（２．５ｇ，５ｍｍｏｌ）を２５％臭化水素−酢酸溶液（５ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で４時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液にエーテルを注ぎ、析出した沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解し、氷冷下トリエチルアミン（０．７ｍｌ，５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．０ｇ，５ｍｍｏｌ）、１−オキシベンゾトリアゾール（０．８ｇ，５ｍｍｏｌ）、及び上記実施例１の３）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン（１．４ｇ，５ｍｍｏｌ）を順次添加し、氷冷下で２時間、更に室温に戻し２０時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝７：３の混合溶媒で抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００；和光純薬工業（株）商品名、３００ｇ，溶出液；酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝６０：２０：６：１１の混合溶媒）にて精製した。目的物の溶出画分を減圧濃縮し、得られた残渣を、酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝７：３の混合溶媒で抽出した。抽出液を１規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣を、イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４１０  酢酸型；アンバーライト社製、５０ｃｍ３，溶出液；水）にて酢酸塩型へと変換した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、得られた粉末を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ファルマシア社商品名。溶出液；メタノール）にて精製した。更に、目的物の溶出画分を減圧濃縮して得られた残渣を、注射用蒸留水（大塚製薬（株）製、５０ｍｌ）に溶解し、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製；Ｕｌｔｒａｚａｒｔ  Ｄ−２０、及びそのユニット）にて発熱性物質を除去し、濾液を凍結乾燥することにより、２．１ｇのｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−３−ヒドロキシメチル−４−ニトロアニリド酢酸塩（収率６５．１％）を得た。
元素分析値（Ｃ２６Ｈ４２Ｎ８Ｏ１１として）
計算値（％）：Ｃ  ４８．５９，  Ｈ  ６．５９，  Ｎ  １７．４４
測定値（％）：Ｃ  ４７．３１，  Ｈ  ６．４３，  Ｎ  １７．６８
【００３０】
実施例３．ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド酢酸塩の合成
１）ｔ−ブトキシカルボニル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリドの合成
ｔ−ブトキシカルボニル−ＮＧ−ニトロアルギニン（２０．２ｇ，６３ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製）をＤＭＦ（１３０ｍｌ）に溶解し、ピリジン（５．０ｍｌ，６３ｍｍｏｌ）とＮ−エチルピペリジン（８．７ｍｌ，６３ｍｍｏｌ）とを加え、−２０〜−１５℃に冷却した後、塩化ピバロイル（７．７ｍｌ，６３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液（３０ｍｌ）を１０分間で滴下し、０〜５℃で１０分間攪拌した。これを再び−２０〜−１５℃に冷却した後、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリン（１１．４ｇ，６３ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製。）を含むＤＭＦ溶液（３０ｍｌ）を添加し、−１０〜５℃で２時間、更に室温に戻し１２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解し、酢酸エチルで洗浄した。水層を、飽和重曹水でアルカリ性とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００；和光純薬工業（株）商品名、１０００ｇ，溶出液；クロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒）にて精製した。目的物の溶出分画を減圧濃縮し、得られた残渣をヘキサンにて粉末化することにより、２３．８ｇのｔ−ブトキシカルボニル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド（収率７８．２％）を得た。
２）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステルの合成
上記実施例１の３）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン（３．３ｇ，１２ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（２．２ｇ，１２ｍｍｏｌ）と  をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、氷冷下ＤＣＣ（２．５ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪  拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾去し、濾液を減圧濃縮して、ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステルを油状物として得た。得られた油状物は、特に精製を行わず、次反応に供した。
３）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリドの合成
上記１）で得たｔ−ブトキシカルボニル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド（４．８ｇ，１０ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）に懸濁し、アニソール（１ｍｌ）を加えた後、室温で１時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣にエーテルを注入した。析出した沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、氷冷下トリエチルアミン（２．８ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、及び上記２）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシン−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル（１２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液（２０ｍｌ）を添加し、氷冷下で２時間、更に室温に戻し２０時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝８：２の混合溶媒で抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００；和光純薬工業（株）商品名、６００ｇ，溶出液；クロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒）にて精製した。目的物の溶出画分を減圧濃縮し、得られた残渣をエーテルにて結晶化し、４．４ｇのｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド（収率６８．１％）を得た。
４）ｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド酢酸塩の合成
上記３）で得たｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシル−ＮＧ−ニトロアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド（３．２ｇ，５ｍｍｏｌ）をメタノール（３５０ｍｌ）に溶解し、パラジウムカーボン触媒（５００ｍｇ）を加えて、室温で４昼夜水添反応を行った。反応終了後、不溶物を濾去し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をイオン交換カラムクロマトグラフィー（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４１０酢酸型；アンバーライト社製、５０ｃｍ３，溶出液；水）にて酢酸塩型へと変換した。目的物の溶出画分を、更にイオン交換カラムクロマトグラフィー（ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ；東ソー（株）製、４０ｃｍ３，溶出液；蒸留水〜０．２Ｍ  酢酸アンモニウム、リニアグラジエント）で精製を行った。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、得られた粉末を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，ファルマシア社商品名、溶出液；メタノール）にて精製した。目的物の溶出画分を減圧濃縮し、得られた残渣を注射用蒸留水（大塚製薬（株）製、３０ｍｌ）に溶解し、限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製；Ｕｌｔｒａｚａｒｔ  Ｄ−２０、及びそのユニット）にて発熱性物質を除去し、濾液を凍結乾燥することにより、３．３ｇのｔ−ブトキシカルボニルスレオニルグリシルアルギニン−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド酢酸塩（収率４８．８％）を得た。
元素分析値（Ｃ２９Ｈ５０Ｎ８Ｏ９として）
計算値（％）：Ｃ  ５３．２０，  Ｈ  ７．７０，  Ｎ  １７．１１
測定値（％）：Ｃ  ５１．３７，  Ｈ  ７．５６，  Ｎ  １６．４９
【００３１】
参考例１．ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
１）ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシンエチルエステルの合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（６．７ｇ，４８ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製）とｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリン（１１．８ｇ，４０ｍｍｏｌ、ペプチド研究所製）とをＴＨＦ（１５０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下トリエチルアミン（６．７ｍｌ，４８ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（９．９ｇ，４８ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の２）に準じて後処理を行った。得られた残渣は、特に精製を行わず、次反応に供した。
２）ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシンの合成
上記１）で得たｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシンエチルエステル（１５．２ｇ，４０ｍｍｏｌ）をメタノール（４００ｍｌ）に溶解し、これに１規定水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の３）に準じて後処理を行い、５．７ｇのｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシン（収率４０％）を得た。
３）ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
実施例１の１）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（４．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を２５％臭化水素−酢酸溶液（１５ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で４時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液にエーテルを注入し、析出した沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、氷浴中トリエチルアミン（１．４ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）、１−オキシベンゾトリアゾール（１．５ｇ，１０ｍｍｏｌ）、及び上記２）で得たｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシン（３．５ｇ，１０ｍｍｏｌ）を順次添加し、氷冷下で２時間、更に室温に戻し２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の４）に準じて後処理、及び精製を行い、５．８ｇのｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩（収率８５％）を凍乾粉末として得た。
元素分析値（Ｃ３１Ｈ４４Ｎ８Ｏ１０として）
計算値（％）：Ｃ  ５４．０６，  Ｈ  ６．４４，  Ｎ  １６．２７
測定値（％）：Ｃ  ５３．８０，  Ｈ  ６．３３，  Ｎ  １６．１３
【００３２】
参考例２．ｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
１）ｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシンエチルエステルの合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（６．７ｇ，４８ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製）とｔ−ブトキシカルボニルロイシン１水和物（１０．０ｇ，４０ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製）とを塩化メチレン（１５０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下トリエチルアミン（６．７ｍｌ，４８ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（９．９ｇ，４８ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の２）に準じて後処理を行った。得られた残渣は、特に精製を行わず、次反応に供した。
２）ｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシンの合成
上記１）で得たｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシンエチルエステル（１２．５ｇ，４０ｍｍｏｌ）をメタノール（４００ｍｌ）に溶解し、これに１規定水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の３）に準じて後処理を行い、９．０ｇのｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシン（収率７８％）を得た。
３）ｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
実施例１の１）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（４．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を２５％臭化水素−酢酸溶液（１５ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で４時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液にエーテルを注入し、析出した沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、氷浴中トリエチルアミン（１．４ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）、１−オキシベンゾトリアゾール（１．５ｇ，１０ｍｍｏｌ）、及び上記２）で得たｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシン（２．９ｇ，１０ｍｍｏｌ）を順次添加し、氷冷下で２時間、更に室温に戻し２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の４）に準じて後処理、及び精製を行い、５．５ｇのｔ−ブトキシカルボニルロイシルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩（収率８８％）を凍乾粉末として得た。
元素分析値（Ｃ２７Ｈ４４Ｎ８Ｏ９として）
計算値（％）：Ｃ  ５１．９１，  Ｈ  ７．１０，  Ｎ  １７．９４
測定値（％）：Ｃ  ５１．１８，  Ｈ  ７．０２，  Ｎ  １７．１８
【００３３】
参考例３．ｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
１）ｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシンエチルエステルの合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（６．７ｇ，４８ｍｍｏｌ、和光純薬工業（株）製）とｔ−ブトキシカルボニルセリン（８．２ｇ，４０ｍｍｏｌ、ペプチド研究所製）とをＴＨＦ（１５０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下トリエチルアミン（６．７ｍｌ，４８ｍｍｏｌ）とＤＣＣ（９．９ｇ，４８ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の２）に準じて後処理を行った。得られた残渣は、特に精製を行わず、次反応に供した。
２）ｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシンの合成
上記１）で得たｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシンエチルエステル（１１．６ｇ，４０ｍｍｏｌ）をメタノール（４００ｍｌ）に溶解し、これに１規定水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の３）に準じて後処理を行い、７．０ｇのｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシン（収率６７％）を得た。
３）ｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩の合成
実施例１の１）で得たベンジルオキシカルボニルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（４．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を２５％臭化水素−酢酸溶液（１５ｍｌ）に懸濁し、氷冷下で４時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液にエーテルを注入し、析出した沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄した。これを、減圧下で１０時間乾燥させた後、ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、氷冷下、トリエチルアミン（１．４ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）、１−オキシベンゾトリアゾール（１．５ｇ，１０ｍｍｏｌ）、及び上記２）で得たｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシン（２．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を順次添加し、氷冷下で２時間、更に室温に戻し２０時間攪拌反応させた。反応終了後、実施例１の４）に準じて後処理及び精製を行い、４．３ｇのｔ−ブトキシカルボニルセリルグリシルアルギニン−ｐ−ニトロアニリド酢酸塩（収率７３％）を凍乾粉末として得た。
元素分析値（Ｃ２４Ｈ３８Ｎ８Ｏ１０として）
計算値（％）：Ｃ  ４８．１６，  Ｈ  ６．４０，  Ｎ  １８．７２
測定値（％）：Ｃ  ４７．６１，  Ｈ  ６．３１，  Ｎ  １８．７０
【００３４】
実施例４．基質の反応性の検討
エンドトキシンテストワコー（和光純薬工業（株）製）中のカブトガニ血球成分試薬（リムルス属由来、凍結乾燥品、２ｍｌ用。）を４．０ｍｌの０．２Ｍ−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０、エンドトキシンフリー）に溶解した（使用時迄氷冷下で保存。）。これに、１ＥＵ／ｍｌのエンドトキシン水溶液（４．０ｍｌ）を添加して、３７℃で１０分間加温下に反応させたものを酵素液とした。
所定の基質の所定濃度の水溶液（１００μｌ）と、酵素液（１００μｌ）とを混合し、３７℃で２分間反応させた後、３０％酢酸水溶液（８００μｌ）で反応を停止させた。この溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した結果に基づいて求めた各基質のＫｍ値、Ｖｍａｘ値、Ｖｍａｘ値／Ｋｍ値を表１に示す。尚、表１には各基質の水溶性（水にどの程度溶解するか）のデータも併せて示す。
【００３５】
【表１】
0003569966.tif 000002
【００３６】
表１の結果から、参考例１及び２で得られた基質は水溶性が極めて低いことが、また、参考例３で得られた基質は水溶性は良好ではあるが、エンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応の結果活性化される凝固酵素（プロテアーゼ）との反応性が他の基質に比較して悪い（Ｋｍ値が大きく、且つＶｍａｘ／Ｋｍ値が小さい。）ことが判る。
これに対し、本発明のペプチド誘導体は、これら参考例で得られた基質にはない性質、即ちエンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応の結果活性化される凝固酵素（プロテアーゼ）との反応性が良好で且つ良好な水溶性を有しており、該凝固酵素の基質として最も適したものであることが判る。
【００３７】
実施例５．本発明のペプチド誘導体を基質として用いたエンドトキシンの定量
（１）カブトガニ血球成分溶液の調製
エンドトキシンテストワコー（和光純薬工業（株）製）中のカブトガニ血球成分試薬（リムルス属由来、凍結乾燥品、２ｍｌ用。）を１２．０ｍｌの０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０、エンドトキシンフリー、また、基質として実施例１又は２で得られた本発明のペプチド誘導体を１ｍＭ含有。）に溶解したものをカブトガニ血球成分溶液とした（使用時迄氷冷下で保存。）。
（２）操作法
所定濃度のエンドトキシン（ＵＳＰ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＥＣ−５）を含む水溶液（１００μｌ）と、上記のカブトガニ血球成分溶液（１００μｌ）とを、９６穴マイクロプレートの所定の試料ウェルに分注、混合した後、マイクロプレートリーダーＴ−ＭＡＸ（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃加温下で４０５ｎｍの吸光度を１５秒毎に測定した。
測定結果に基づいて到達時間（エンドトキシン溶液と上記カブトガニ血球成分溶液とを混合後から４０５ｎｍの吸光度が０．１００に到達するまでに必要な時間）を求めた。
（３）結果
実施例１で得られた本発明のペプチド誘導体を基質として用いた場合の到達時間とエンドトキシン濃度との関係を示す検量線を図１に示す（縦軸、横軸共に対数目盛り）。
また、実施例２で得られた本発明のペプチド誘導体を基質として用いた場合の到達時間とエンドトキシン濃度との関係を示す検量線を図２に示す（縦軸、横軸共に対数目盛り）。
図１及び図２から明かな如く、本発明のペプチド誘導体を基質として用いることにより、到達時間とエンドトキシン濃度との良好な検量関係が得られること、言い換えれば、エンドトキシンを低濃度から高濃度まで精度よく測定し得ることが判る。
【００３８】
【発明の効果】
以上に述べた如く、本発明は、プロテアーゼ、アミダーゼ、凝固酵素等の活性測定用基質として、特にエンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応により活性化される凝固酵素の活性測定用基質として有用な新規なペプチド誘導体を提供するものであり、本発明のペプチド誘導体は、エンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応の結果活性化される凝固酵素との反応性が高いのでこれをエンドトキシン定量用の基質として用いれば低濃度のエンドトキシンを検出することが可能であり、しかも水溶性も高いので、エンドトキシン定量用試薬用の凍結乾燥品を調製するための原液を容易に調製することができるという、従来の基質では得られなかった効果を奏するので、斯業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５で得られた、実施例１で得られた本発明のペプチド誘導体を基質として用いた場合の到達時間とエンドトキシン濃度との関係を示す検量線である（縦軸、横軸共に対数目盛り）。
【図２】実施例５で得られた、実施例２で得られた本発明のペプチド誘導体を基質として用いた場合の到達時間とエンドトキシン濃度との関係を示す検量線である（縦軸、横軸共に対数目盛り）。
【図１】
0003569966.tif 000003
【図２】
0003569966.tif 000004