(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドアニオン発生系に、下記の式（１）で表されるテトラゾリウム化合物とスーパーオキシドジスムターゼ酵素とを添加してスーパーオキシドアニオンに対する該テトラゾリウム化合物および該酵素の反応を競合させ、該テトラゾリウム化合物がスーパーオキシドアニオンにより還元されて生成したホルマザンの吸光度を測定することにより該スーパーオキシドジスムターゼ酵素の活性を求めることを特徴とするスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性の測定法。
【化１】
0003602956.tif 000003
（式（１）中、Ｒ１  ，Ｒ２  ，Ｒ３  およびＲ４  は、それぞれ独立して、水素原子、ニトロ基、アルコキシル基またはハロゲン原子を示し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを示す。）
【請求項２】
活性酸素発生系に、下記の式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を添加して、該テトラゾリウム化合物が活性酸素により還元されて生成したホルマザンの吸光度を測定することにより該活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の測定法。
【化２】
0003602956.tif 000004
（式（１）中、Ｒ１  ，Ｒ２  ，Ｒ３  およびＲ４  は、それぞれ独立して、水素原子、ニトロ基、アルコキシル基またはハロゲン原子を示し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを示す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼの活性および活性酸素を測定するための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】
動植物のからだをつくる細胞はすべて酸素呼吸をしており、酸素なしでは細胞は窒息をしてしまい生きていくことができない。しかしながら、酸素は時として生体にとって極めて有害な形に変化することがある。例えば、有害酸素種の中で、活性酸素の１種であり三重項酸素が１電子還元を受け生成するスーパーオキシドアニオン（Ｏ２  −  ）  は、キサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）、ＮＡＤＨ酸化酵素などの酵素反応や還元性物質の自動酸化で生成し、動脈硬化症、肺気腫、Ｆａｎｃｏｎｉ  症などの発症に直接的に関わっていることが知られている。さらに、活性酸素は、白血球の殺菌作用など多くの生理現象に関与し、例えば、顆粒球やマクロファージなどの白血球の機能が正常であれば、刺激時に細胞外にスーパーオキシドアニオンやヒドロキシラジカル（・ＯＨ）などの活性酸素が放出されることも知られている。
【０００３】
一方、生体の側はＯ２  −  をはじめとする活性酸素種に対して種々の調節機構を備えている。例えば、我々は、有害な活性酸素の無毒化機構としてスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素を備えている。この酵素は２分子のＯ２  −  を不均化して酸素と過酸化水素に変換する反応を触媒し、結果的にＯ２  −  の反応性を低下させることで、その毒性を低減化する。これまでにＳＯＤの活性（肝臓のＳＯＤ活性を基礎代謝率で割った値）と動物種の最大寿命との間に高い直線的な関係が成立すること、遺伝的にＳＯＤを欠損したショウジョウバエの寿命が短く、逆に、高いＳＯＤ活性を有する突然変異体のセンチュウが長寿であることなどが明らかにされてきた。このことは酸素呼吸をする生物に対してＳＯＤの活性が寿命を決定する因子のひとつであることを強く示唆している。
【０００４】
したがって、活性酸素やその調節に関与する酵素の活性を測定することは、生体の機能や状態を調べる研究、疾病の診断および生体成分を分析する臨床検査などにおいてきわめて重要であり、これまでにも各種の方法が案出されている。特に、老化や寿命と深い関わりを有することが明らかにされつつあるＳＯＤについては、上記のごとき医療分野のみならず、老化予防や健康増進の観点からＳＯＤ様活性を有する成分が賦与された食品の開発が進められている点において食品分野においても、その活性の実用的な測定技術の確立が望まれている。
【０００５】
従来よりＳＯＤの活性測定法としては、酵素反応（ＸＯＤの反応）や化学反応を用いて発生させたＯ２  −  の捕捉能力をテトラゾリウム化合物（テトラゾリウム塩）と競合させて測定する方法が一般的に利用されている。しかしながら、一般に利用されているテトラゾリウム化合物であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）は還元を受けると水に不溶のホルマザンになり、分光光度計のセルをはじめ様々な器具に吸着してしまい、非常に取扱いにくい。そのため臨床検査で汎用されている連続流れ分析システムには不向きであった。また、この方法はＯ２  −  発生系のＸＯＤの還元型と直接的な酸化還元反応を生じることから、高濃度のＳＯＤを反応系に添加しても、ＮＢＴホルマザンの生成を完全に阻害することができないという現象が認められ、活性測定の解釈が非常に複雑になるという欠点を抱えている。
【０００６】
本発明者らは、先に、還元型ホルマザンが水可溶性である新しいテトラゾリウム化合物ＸＴＴ（３´−｛１−［  （フェニルアミノ）−カルボニル  ］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ハイドレート）を用いるＳＯＤ活性測定法を提案した（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５１，  ２０６−２０９  （１９９７））。この方法においては、ＸＴＴの還元型ホルマザンが水に溶け易い性質を有していることから、測定器具への吸着という現象は改善された。さらに、ＸＴＴはＸＯＤとの直接的な相互作用を示さず、反応系へのＳＯＤの添加により、ＸＴＴに対する１００  ％の阻害が得られることもわかった。しかしながら、ＸＴＴを用いるこの方法は、ＮＢＴを用いる方法と比較すると、低いｐＨにおいて極度にＳＯＤ活性の検出感度が低下する難点が見出された。また、測定に最適な濃度のＸＴＴ溶液を調製するためには、加熱によりＸＴＴを溶解させなければならない。したがって、ＸＴＴを用いる方法も、未だＳＯＤ活性を測定する理想的なものとは言えない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、簡便で迅速に活性酸素やＳＯＤを測定することのできる新しい技術を開発することにある。本発明者は、このたび、特定のテトラゾリウム化合物を用いることによって、上述したような従来のＳＯＤ活性測定法の欠点を解消し得ることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、スーパーオキシドアニオン発生系に、下記の式（１）で表されるテトラゾリウム化合物とスーパーオキシドジスムターゼ酵素とを添加してスーパーオキシドアニオンに対する該テトラゾリウム化合物および該酵素の反応を競合させ、該テトラゾリウム化合物がスーパーオキシドアニオンにより還元されて生成したホルマザンの吸光度を測定することにより該スーパーオキシドジスムターゼ酵素の活性を求めることを特徴とするスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性の測定法を提供するものである。
【０００９】
【化３】
0003602956.tif 000002
但し、式（１）中、Ｒ１  ，Ｒ２  ，Ｒ３  およびＲ４  は、それぞれ独立して、水素原子、ニトロ基、アルコキシル基またはハロゲン原子を示し、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムを示す。
【００１０】
式（１）のテトラゾリウム化合物は、ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）活性を測定するのに特に適しているが、活性酸素そのものを測定するのにも適用することができる。すなわち、本発明は、別の態様として、活性酸素発生系に、下記の式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を添加して、該テトラゾリウム化合物が活性酸素により還元されて生成したホルマザンの吸光度を測定することにより該活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の測定法も提出する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＳＯＤ活性測定法および活性酸素測定法は、上記式（１）で表されるテトラゾリウム化合物の特性を利用することによって実施される。式（１）で表される化合物のうち、特に好ましいものは、Ｒ１  〜Ｒ４  のうち少なくとも１つがニトロ基であるものであり、例えば、Ｒ１  およびＲ４  が水素、Ｒ２  がニトロ基、Ｒ３  がヨウ素であるテトラゾリウム化合物（以下、本明細書においてはＷＳＴ−１と略称する）、または、Ｒ１  が水素、Ｒ２  およびＲ３  がニトロ基、Ｒ４  がメトキシ基であるテトラゾリウム化合物（以下、ＷＳＴ−８と略称する）等がある。
【００１２】
本発明に従いＳＯＤ活性を測定するには、適当な緩衝液中でスーパーオキシドアニオン発生系に、式（１）で表されるテトラゾリウム化合物とスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素を添加する。スーパーオキシドジスムターゼ発生系としては、キサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）を用いるキサンチン（またはヒポキサンチン）−キサンチン酸化酵素系が一般的であるが、その他の化学反応によるスーパーオキシドアニオン発生系も適用可能である。
【００１３】
後述するように式（１）の化合物の特性の１つは、スーパーオキシドアニオンのような活性酸素により還元されて吸光光度分析の可能な還元型ホルマザンを生成することにある。したがって、スーパーオキシドアニオン発生系において、スーパーオキシドアニオンに対するテトラゾリウム化合物の反応（スーパーオキシドアニオンによる還元型ホルマザンの生成反応）と、スーパーオキシドアニオンに対するＳＯＤの反応（ＳＯＤによるスーパーオキシドアニオンの不均化反応）とが競合し、ＳＯＤの活性が高い程、前者の反応が阻害されホルマザンの吸光度変化は小さくなる。かくして、還元型ホルマザンの吸光度を測定することによりＳＯＤの活性を求めることができる。
【００１４】
活性酸素によって還元されて水溶性ホルマザンを生成する式（１）のテトラゾリウム化合物を使用すれば、ＳＯＤ活性を測定できるのみならず、活性酸素そのものを測定することもできる。この場合には、活性酸素発生系（インビトロ系のみならずインビボ系も含む）に、式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を添加して、該テトラゾリウム化合物が活性酸素により還元されて生成した還元型ホルマザンの吸光度を測定することにより活性酸素を定量することができる。なお、ここで、活性酸素とは、スーパーオキシドアニオンを意味する。
【００１５】
本発明者らは、先に、式（１）に重複する一連のテトラゾリウム化合物の創製に成功し、そして、該化合物が乳酸脱水素酵素等の脱水素酵素の定量に使用し得ることを見出している（特許第２５９２４３６  号および特願平８−１２１１３４）。本発明者は、この種のテトラゾリウム化合物について更に研究を重ねた結果、式（１）で表される化合物が、スーパーオキシドアニオンのような活性酸素によって還元される性質を有し、しかも、以下に記すように、ＳＯＤ活性測定に従来より採用されているＮＢＴおよびＸＴＴのそれぞれの欠点を解消して両化合物の長所を兼備し、ＳＯＤ活性測定、さらには活性酸素測定における理想的な試薬となり得ることを見出し、本発明の測定法を案出した。
【００１６】
１．先ず、式（１）の化合物は、スーパーオキシドアニオンにより還元されて、ＸＴＴと同様に水溶性のホルマザンを生成する。したがって、該化合物を用いる測定系においては測定器具への固形分の吸着という問題は生じない。
【００１７】
２．また、式（１）の化合物は、常温で溶解するので、ＳＯＤ活性や活性酸素の測定における測定液の調製が容易である。例えば、ＳＯＤ活性測定においては、テトラゾリウム化合物を０．７５ｍＭ程度の濃度に設定するのが一般的であるが、ＸＴＴは加熱しなければその濃度に調製できないのに対して、式（１）の化合物は常温でも簡単に該濃度に調製できる。
【００１８】
３．さらに、式（１）のテトラゾリウム化合物（酸化型）は高濃度の溶液でも殆ど無色に近く、吸光度がきわめて低い。例えば、同じ０．２ｍＭ  の終濃度で比較したとき、ＸＴＴは約０．０４ＡＵを示したのに対して、ＷＳＴ−１やＷＳＴ−８のような式（１）の化合物は殆ど無視し得る程度の吸光度しか示さない。したがって、式（１）のテトラゾリウム化合物の被還元性を利用してＳＯＤ活性や活性酸素を測定すると、ローブランクで測定を行うことができるという利点がある。
【００１９】
４．式（１）のテトラゾリウム化合物を用いるＳＯＤ活性測定は、従来のテトラゾリウム化合物と同等以上の感度を示し、しかも感度のｐＨ依存性がきわめて小さい。例えば、ＳＯＤに対する検量線を作成し、５０％の阻害を示す濃度の比較から感度の比較を行ったところ、ｐＨ１０．２において式（１）に属するＷＳＴ−１は、ＸＴＴとほぼ同じ感度、またＮＢＴの約２倍の感度を示した。しかも、ＸＴＴはｐＨの低下とともに感度が大きく減少するが、式（１）の化合物ではこのようなｐＨ依存性は見られず、ｐＨ８ではＷＳＴ−１の方がＸＴＴよりも３倍程度、感度が高くなることも見出された。
【００２０】
５．式（１）の化合物は測定系に含まれる酵素類と直接的な相互作用を示さないので、測定結果の解釈が容易になる。例えば、式（１）に属するＷＳＴ−１やＷＳＴ−８を用いたＳＯＤ活性測定においても、ＸＴＴを用いる場合と同様に反応系へのＳＯＤの添加により１００  ％の阻害または１００  ％に近い阻害が認められ、ＮＢＴを用いる場合の問題点であったＸＯＤとの直接的な相互作用は存しないことが明らかにされている。
【００２１】
本発明のＳＯＤ活性測定法および活性酸素測定法において用いられる式（１）のテトラゾリウム化合物は、特許第２５９２４３６  号および特願平８−１２１１３４に記載しているように常法に従って合成することができる。すなわち、例えば、官能基Ｒ１  およびＲ２  を有するフェニルヒドラジンにアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させることにより、対応するヒドラゾンを合成する。次いで、このヒドラゾンに、官能基Ｒ３  およびＲ４  を有するフェニルジアゾニウム塩を水溶媒中塩基性条件下で反応させて、式（１）に対応するホルマザンを得る。ここで、塩基性化剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。次に、得られたホルマザンを亜硝酸ブチルまたは次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いてアルコール溶媒中で酸化することにより式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。
【００２２】
【実施例】
本発明の特徴を更に明らかにするため、式（１）で表されるテトラゾリウム化合物をＳＯＤ活性測定に適用した実施例を以下に示す。
式（１）に属するテトラゾリウム化合物としてＷＳＴ−１（Ｒ１  ＝Ｒ４  ＝Ｈ；Ｒ２  ＝ＮＯ２  ；Ｒ３  ＝Ｉ）およびＷＳＴ−８（Ｒ１  ＝Ｈ；Ｒ２  ＝Ｒ３  ＝ＮＯ２  ；Ｒ４  ＝ＯＣＨ３  ）を合成して、その特性を評価し、必要に応じてＸＴＴおよびＮＢＴとの比較を行った。活性酸素（スーパーオキシドアニオン）発生系として、キサンチン酸化酵素（ＸＯＤ）によるキサンチン−キサンチン酸化酵素系を採用した。なお、実験に用いた試薬の入手源は次のとおりである：ＳＯＤ（ウシ赤血球由来；ＥＣ  １．  １５．  １．  １．  ；４０００Ｕ／ｍｇタンパク質；Ｓｉｇｍａ  社製）、ＸＯＤ（バターミルク由来；ＥＣ  １．  ２．  ３．  ２  ；０．３Ｕ／ｍｇ  ；オリエンタル酵母（株）製）、ＮＢＴ（和光純薬（株）製）、ＸＴＴ（米国Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  社製）、ＧＯ（グルコースオキシダーゼ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ    ｎｉｇｅｒ由来；ＥＣ  １．  １．  ３．  ４  ；１１０Ｕ／ｍｇ  ；天野製薬（株）製）。
【００２３】
ＳＯＤ活性測定は次のように行った：５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４  および１０．２の場合）またはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０  、７．５  および８．０  の場合）の２．５ｍｌ  に、３ｍＭのキサンチン、３ｍＭのＥＤＴＡ、ＷＳＴ溶液、およびＳＯＤ含有溶液または水を、各０．１ｍｌ  ずつ添加した。ＸＯＤ溶液（０．１ｍｌ）を添加することにより反応を開始させた。分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００）を用い２５℃で、ＷＳＴ−１については４３８ｎｍ  、ＷＳＴ−８については４６０ｎｍ  における吸光度変化を測定することによりＳＯＤ活性を求めた。ＸＴＴおよびＮＢＴを用いる場合も同様であるが、吸光度変化の測定は、それぞれ、４７０ｎｍ  および５６０ｎｍ  において行った。
【００２４】
ＳＯＤ活性測定への適用性の検討：
図１に、ｐＨ１０．２、キサンチン濃度３ｍＭおよびＷＳＴ−１またはＷＳＴ−８の濃度０．７５ｍＭにおけるＸＯＤ濃度の変化に対する吸光度変化を示す。ＸＯＤ濃度（ＸＯＤ活性）が約１５５ｍＵ／ｍｌに達するまで、ＸＯＤ濃度の上昇に従って、吸光度変化がほぼ直線的に上昇していることが認められる。また、図２に、ｐＨ１０．２、ＸＯＤ濃度５８ｍＵ／ｍｌ  、ＷＳＴ−１またはＷＳＴ−８の濃度０．７５ｍＭにおけるキサンチン濃度に対する吸光度変化を示すが、キサンチン濃度の上昇に伴い吸光度変化がほぼ直線的に上昇している。
【００２５】
さらに、図３に、ｐＨ１０．２、キサンチン濃度３ｍＭおよびＸＯＤ濃度５８ｍＵ／ｍｌ  におけるＷＳＴ−１またはＷＳＴ−８の濃度変化に対する吸光度変化を示している。図に示されるように、ＷＳＴ−１または−８の濃度が一定値に到達するまでＷＳＴ−１または−８の濃度の上昇に伴い吸光度変化がほぼ直線的に上昇している。
【００２６】
以上の結果から示されるように、ＷＳＴ−１やＷＳＴ−８のようなテトラゾリウム化合物は、スーパーオキシドアニオン発生系においてその生成量に比例する吸光度変化を発現し、ＳＯＤ活性の測定に適用できることが明らかである。
【００２７】
ｐＨの影響および酵素との相互作用の検討：
図４に、キサンチン濃度３ｍＭ、ＸＯＤ濃度５８ｍＵ／ｍｌ  、ＷＳＴ−１またはＷＳＴ−８の濃度０．７５ｍＭにおける吸光度変化に対するｐＨの影響を示す。ＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８のいずれについても、ｐＨ９．４  において最大の吸光度変化が認められる。
【００２８】
さらに、上述の最適測定条件、すなわち、キサンチン濃度３ｍＭ、ＸＯＤ濃度５８ｍＵ／ｍｌ  、およびＷＳＴ−１またはＷＳＴ−８の濃度０．７５ｍＭにおけるＳＯＤの阻害を測定した。ＷＳＴ−１によるＳＯＤ阻害曲線を図５に、ＷＳＴ−８によるＳＯＤ阻害曲線を図６にそれぞれ示す。ＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８のいずれを用いる系においてもＳＯＤ濃度が高くなると１００  ％または１００  ％に近い阻害が得られ、これらのテトラゾリウム化合物がスーパーオキシドアニオン発生に用いられる酵素（ＸＯＤ）と相互作用しないことが示唆される。
【００２９】
特に注目すべきは、ＷＳＴ−１を用いる場合であり、図５に示されるように、ｐＨ８．０  、９．４  および１０．２のいずれにおいてもＳＯＤ添加による１００  ％の阻害が認められ、しかも、ほぼ同一のＳＯＤ阻害曲線が得られており、ＷＳＴ−１を用いる系の感度がｐＨに依存していないことを示している。ちなみに図７はｐＨ１０．２における阻害をＸＴＴおよびＮＢＴと比較して示すものであり（キサンチン濃度３ｍＭ；ＸＯＤ濃度５７ｍＵ／ｍｌ）、ＷＳＴ−１はＸＴＴを用いる測定系と同様に１００  ％阻害が認められる。但し、前述したように、ＸＴＴはｐＨの低下とともに感度が大きく減少しｐＨ８ではＷＳＴ−１の方が感度が高くなった。
【００３０】
本発明において用いるＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８が酵素と相互作用しないことを確認するため、ＧＯによるグルコース酸化反応系にＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８を添加して還元型ホルマザンが生成するか否かを試験した。ｐＨ９．５  における結果を図８に示すが、吸光度の変化は見られずＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８はＧＯとも相互作用しないことが明らかである。
【００３１】
生体サンプルのＳＯＤ活性の実測
上述の最適条件下にＷＳＴ−１およびＷＳＴ−８、さらに、比較のためにＸＴＴおよびＮＢＴを用いてラットの血液サンプル中のＳＯＤ活性を測定した。なお、ラットの血液サンプルは次のように調製した：ラット（体重約５００ｇ）の血液に冷却した０．９％ＮａＣｌ溶液を加え攪拌、遠沈を繰り返して得た赤血球に冷却蒸留水を加えて溶血赤血球を得た。これにエタノール／クロロホルムを加えて遠沈して得た上清を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて４℃で透析し、これを遠心分離により沈殿を除去した上清をサンプルとした。
【００３２】
ＳＯＤ活性測定の結果を、各テトラゾリウム化合物を用いる方法について対比させて図９のＡ〜Ｃに示す。これらの図から理解されるように、ＷＳＴ−１を用いる方法は従来のＮＢＴを用いる方法よりも高感度であり（図９のＡ）、ＸＴＴとほぼ同等の感度を有し（図９のＢ）、さらに、ＷＳＴ−１の方がＷＳＴ−８よりも高い感度を有する（図９のＣ）。
【００３３】
また、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８、ＮＢＴ、ＸＴＴのそれぞれを用いるＳＯＤ活性の値には良好な直線関係があり（図９のＡ、ＢおよびＣにおけるｒ＝０．９９９  、０．９６８  および０．９５０）、本発明に従うＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８のような化合物は、従来よりＳＯＤ測定に一般に使用されているＮＢＴのような化合物に代わるＳＯＤ測定用試薬として適していることが明らかである。
【００３４】
【発明の効果】
式（１）のテトラゾリウム化合物を利用する本発明のＳＯＤ活性測定法および活性酸素測定法は、測定液の調製が容易であり、分光光度計のセルなど器具類に固形分が吸着することもないので、簡便で迅速性を要求される連続流れ分析システムに適している。
特に、本発明のＳＯＤ活性測定法は、広範囲のｐＨ領域にわたってデータ解析が容易で高感度の分析を行うことができるので、医療、臨床検査、機能性食品開発などにおいてＳＯＤまたは活性酸素と健康との関わりを探究する研究分野の発展に資するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるＸＯＤ濃度と吸光度変化の関係の１例を示す。
【図２】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるキサンチン濃度と吸光度変化の関係の１例を示す。
【図３】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるテトラゾリウム化合物の濃度と吸光度変化の関係の１例を示す。
【図４】本発明に従うＳＯＤ活性測定法における吸光度変化に対するｐＨの影響の１例を示す。
【図５】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるＳＯＤ阻害曲線の１例を示す。
【図６】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるＳＯＤ阻害曲線の別の例を示す。
【図７】本発明に従うＳＯＤ活性測定法におけるＳＯＤ阻害曲線を従来より使用されていたテトラゾリウム化合物と比較して示す。
【図８】本発明において用いられるテトラゾリウム化合物のグルコース酸化反応系における吸光度変化の１例を示す。
【図９】本発明に従うテトラゾリウム化合物を用いて測定したラットの血液サンプルのＳＯＤ活性を従来の化合物を用いた場合と対比して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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