(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号1及び2に示されるアミノ酸配列を有し、下記の特性を有するヒト大腸癌由来培養細胞Caco2（ATCC HTB-37）の細胞質由来ヒト型酵素。
(1) 活性1：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸6残基以上17残基以下のペプチドを特異的に加水分解する。
(2) 活性2：キレート剤の存在下で失活する。
(3) 分子量:76±5ｋDa（SDS-PAGE;還元条件下）
(4) PAS染色：陰性
(5) 等電点：4.6〜5.2
(6)至適pH：7.4〜7.7
【請求項２】
ヒト大腸癌由来培養細胞Caco2（ATCC HTB-37）の細胞質溶液を、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、請求項1記載の酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な酵素及びその製造方法に関する。詳しくは、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2 の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、該酵素の製造方法に関する。本発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
種々の生理活性ペプチドは、細胞間のシグナル伝達物質として作用していることが明らかにされつつあり、ペプチドホルモンとして、内分泌型のシグナル伝達に関与するものや、局所的なケミカルメディエーターとして機能するもの、そして神経伝達物質として神経細胞間の伝達物質として機能するものもある。いずれのタイプのペプチドも、ターゲットとする細胞の機能発現と密接に関わっていることから、ペプチドの代謝回転も厳密に制御されていると考えられている。特に神経系など局所での伝達の場合、伝達物質の代謝回転は迅速で、それに関わる分解酵素の機能を整理することは重要な課題である。ペプチドホルモンや脳腸ペプチドの分解酵素として、プロリルオリゴペプチダーゼ (EC 3.4.21.26) 、ネプリリシン（neprilysin：EC 3.4.24.11）、サイメットオリゴペプチダーゼ（thimetoligopeptidase ：EC 3.4.24.15）、ニューロリシン（neurolysin：EC 3.4.24.16）などが知られているが、体内に広く分布するものや、細胞内に局在するものもあり、それらの機能についての明確な結論は出ていない。
【０００３】
高齢人口の増加に伴い、神経系の疾患として痴呆症に関心が寄せられている。中でもアルツハイマー症は最も解析の進んだ疾患の一つで、この疾患を誘引する物質と考えられているβ−アミロイド蛋白質の産生に、ペプチダーゼが関与している可能性が示唆されている。サイメットオリゴペプチダーゼはその候補の一つでもあり、広く体内に分布していて、主に細胞質に存在するメタロエンドペプチダーゼとして発見されたものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上述の酵素と同様の活性を有する新規な酵素を求めて鋭意探索した結果、ヒト大腸癌由来培養細胞であるCaco2 の細胞質に、同様の活性を有する新規な酵素を見出した。従って本発明は、新規なヒト型酵素及びその製造方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、新規な酵素及びその製造方法に関する。本発明の新規酵素は、ヒト大腸癌由来培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得ることができる。即ち、培養したCaco2 を培養フラスコから常法により剥離、回収し、ホモジナイズしたものを遠心分離する。さらに得られた上清を超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液とする。この細胞質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画分を得、これを透析する。透析後の粗画分を陰イオン交換樹脂で分画し、活性画分を得る。さらに、得られた活性画分について、ハイドロキシアパタイトカラム、セファクリルカラム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラムを組み合わせて精製することにより、精製された本発明の酵素を得ることができる。このようにして得られた本発明の酵素はヒト型であり、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有するものである。
本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の酵素は、ヒト大腸癌由来培養細胞Caco2 (ATCC HTB-37) の細胞質から得ることができる。即ち、サブコンフルエント状態まで培養したCaco2 を培養フラスコから常法により剥離、回収し、ホモジナイズしたものを遠心分離する。得られた上清を、さらに超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液とする。細胞質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５〜６０％の沈殿画分を得、これを透析する。透析後の粗画分を陰イオン交換樹脂で分画し、活性画分を得る。この時用いる陰イオン交換樹脂としては特に限定されないが、好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂であるDEAE-Sephadex 、DEAE-Toyopearl、DEAE- セルロファインなど、特に好ましくはDEAE- セルロースが用いられる。さらに、得られた活性画分について、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動など通常用いられる手法を適宜組み合わせて精製することにより、精製された本発明酵素を得ることができる。この時、特にハイドロキシアパタイトカラム、セファクリルカラム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラムを組み合わせて精製することが好ましい。このようにして精製された画分を回収することにより、精製された本発明の酵素を得ることができる。本発明の酵素は、以下の物理化学的性質により特定される。
(1)活性１：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解する。
(2)活性２：キレート剤の存在下で失活する。
(3)分子量：７６±５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元条件下）
(4)ＰＡＳ染色：陰性
(5)等電点：４．６〜５．２
(6)至適ｐＨ：７．４〜７．７
(7)内部アミノ酸配列：配列表配列番号１及び２に示す配列を有する。
本発明の酵素は、その活性より脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはペプチダーゼが関与していると考えられている疾患、例えばアルツハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用である。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説明する。
【０００８】
【実施例１】
本発明酵素の製造
(1）酵素活性測定
目的酵素の加水分解活性は、 Barrett等の方法 (Methods in Enzymol., Vol. 248, p529, 1995 ）に準じて測定した。即ち、0.01mMの7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババイオケム社）を基質として分解、生成される7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-OHの時間変化を測定した。生成物を１分当たりに１μmol 産生させうる酵素量を１Ｕと定義した。
【０００９】
(2) 細胞培養
Caco2 細胞をT-120 フラスコに、10%FCSを含むコスメディウム（コスモバイオ社）で37℃、5% CO 2 下、コンフルエント状態に達するまで培養し、1010個の細胞を出発材料とした。
(3) 細胞分画と硫安分画
コンフルエントに達した細胞表面をPBS(-)ですすいだ後、セルスクレイパーでかき取って，少量の生理食塩水を加え剥離細胞を集めた。次いで、細胞懸濁液に対して４倍量の20mM Tris/HCl(pH7.8)、 250mMショ糖、 5mM  ２−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF（Phenyl methyl sulfonyl fluoride ；和光純薬社）を加え、ポッター型ホモジナイザーでホモジナイズした。次いで、10,000×ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収した上清を更に100,000 ×ｇ、１時間の超遠心分離を行い、その上清を回収して細胞質溶液とした。細胞質溶液を硫安分画に付し、硫安飽和度３５〜６０％沈殿画分を回収した。次に、少量の 10mM Tris-HCl(pH 7.8)、 0.1mM ZnCl2、 5mM  ２−メルカプトエタノール、 0.1mM
PMSF に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。
【００１０】
(4）DEAE- セルロースクロマトグラフィー
透析後の粗画分を、予め10mM Tris-HCl(pH7.8)、 5mM  ２−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0. 05% Brij-35 （和光純薬社）で平衡化したDEAE- セルロース (ワットマン社) カラム（内径16mm、高さ35cm) にロードし、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した後、流量0.4ml/min 、NaCl濃度０〜０．３Ｍ／７００mlのグラディエント溶出で分画し、活性画分を回収してＤＥプールとした。ＤＥプールは、10mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、 5mM  ２−メルカプトエタノール、 0. 05% Brij-35 、0.1mM ZnCl2 に対してダイアフィルトレーションし、最終的に１０ｍｌに濃縮して次の精製ステップに供した。
【００１１】
(5) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
ＤＥプールをハイドロキシアパタイトカラム（内径10mm、高さ40mm、バイオラッド社）にロードして、流量0.1ml/min 、分画量0.5ml で、リン酸濃度０．０１〜０．３Ｍ／８０mlのグラディエント溶出で分画した。得られた画分の加水分解活性を測定し、活性画分をまとめてＨＡプールとした。
【００１２】
(6) セファクリルＳ−２００ゲルフィルトレーション
ＨＡプールを限外濾過で２mlまで濃縮し、予め10mM Tris-HCl(pH7.8)、 5mM 2−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0.15M NaCl 、0.05% Brij-35 で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム (ファルマシア社) にアプライして、流量0.2ml/min、分画量２mlで分離、分取した。各画分の分解活性を測定し、活性画分を合わせてＧＦプールとした。
【００１３】
(7) ブルーセファロースクロマトグラフィー
ＧＦプールを、 10mM Tris-HCl(pH7. 8)、 5mM  ２−メルカプトエタノール、0.1mM ZnCl2 、0.05% Brij-35 、0.1M NaCl で平衡化した HiTrap Blueカラム (５ml、ファルマシア社) にアプライして、非吸着画分を回収した。
【００１４】
(8) ＭｏｎｏＱ  ＦＰＬＣ
ブルーカラムの非吸着画分をＭｏｎｏＱカラム (ファルマシア社) でさらに分画した。分離条件は、流量0.5ml/min 、NaCl濃度０．１〜０．２Ｍ／３０分のグラディエント溶出で、分画量0.5ml とした。活性画分をあわせ、精製酵素とした。精製過程の収率を表１に示す。この結果、最終的に比活性5.6U/mg の精製酵素が39μg 回収された。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【実施例２】
本発明酵素の特性
(1) 分子量と等電点
本発明酵素の最終精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）の結果を、図１に示す。最終的にＭｏｎｏＱで分画して回収した画分は単一バンドを示し、実施例１記載の方法により、本発明酵素を単離出来ることが確認された。単離した酵素の分子量は、７６±５ｋＤａであった。又、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、精製酵素はほぼ同一の移動度で単一バンドを示したことから、本酵素は単一のペプチド鎖であることが確認された。さらに、等電点をファーストシステム（ファルマシア社）を用いて分析した結果、本酵素の等電点は４．６〜５．２であった。
【００１７】
(2) 至適ｐＨ
10mM Tris-HCl 緩衝液及び10mMリン酸緩衝液を、ｐＨ７．０〜８．２まで適宜調整し、本発明酵素の各ｐＨにおける活性を測定した。結果を図２に示す。この結果、両緩衝液中とも至適ｐＨは７．４〜７．７を示した。
【００１８】
(3) 阻害剤
本酵素に対する各種プロテアーゼ阻害剤の影響を調べた。即ち、実施例１−(1) に記載の方法に従って１mUの酵素量で阻害剤無添加時の比活性を測定し、次いで同一酵素量に対し、表２に記載の濃度で各々の阻害剤を添加し、阻害剤添加時の比活性を測定して、阻害率[%] ＝（阻害剤無添加時比活性[mU/ml] ／阻害剤添加後比活性[mU/ml] ）×100 を求めた。尚、プロテアーゼ阻害剤としてＥ−64（ペプチド研究所社）、ＰＭＳＦ、ペプスタチン（Pepstatin ）、Ｏ−フェナントロリン（O-Phenanthrolin ）、ＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミド（N-ethylmaleimid ）（全て和光純薬社）を用いた。ＥＤＴＡのみ添加後１時間インキュベートした後、測定した。結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
この結果、単離した本発明酵素はＰＭＳＦ、ペプスタチンには全く阻害されなかったことから、セリンプロテアーゼやアスパラギン酸プロテアーゼではないことが確認された。一方、ＥＤＴＡやＯ−フェナントロリン等のキレート試薬で阻害されたことから、本発明酵素は金属プロテアーゼであることが確認された。但し、Ｅ−６４に阻害されず、Ｎ−エチルマレイミドに阻害されたことから、本酵素に含まれるシステイン残基が活性発現に何らかの関与をしていることが示唆された。
【００２１】
(4) 合成ペプチドに対するKm値とKi値
単離した本発明酵素の特性として、合成基質である 7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2（ノババイオケム社）に対するKm値を、Serizawaらの方法（J.Biol.Chem., Vol.270, p2092 (1995) ）により測定した。その結果、Km値は22.2μＭを示した。又、同じ合成ペプチドを、ダイノルフィンＡ (1-13) 及び N-[1-(RS)-carboxyl-3-phenylpropyl]-Ala-Ala-Phe-pAb に対するKi値を測定した。その結果、Ki値はそれぞれ 0.419μＭ及び 3.85 μＭを示した。
【００２２】
(5) 基質特異性
本酵素の合成あるいは天然ペプチドに対する基質特異性を測定した。即ち、合成あるいは天然ペプチドを基質とし、その分解物をＨＰＬＣで分析した。尚、基質としてDnp-Pro-Leu-Gly-Pro-Trp-D-Lys （ＱＦ０１；ノババイオケム社）、7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ＱＦ０２；ノババイオケム社）、ブラジキニン、ニューロテンシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、ダイノルフィンＡ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン（全てシグマ社）を用いた。分離、分取後、アミノ酸分析により切断位置を同定した。結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
この結果、本発明酵素はコラーゲン、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ヒツジＩｇＧ、ミオグロビン、トランスフェリン、オボアルブミン等の高分子タンパク質を、全く分解しなかった。これに対し、合成の低分子ペプチド類や脳腸ペプチドは、本発明酵素により分解された。これを解析した結果、基質と成り得るペプチド鎖は６残基から１７残基であったことから、本酵素はオリゴエンドペプチダーゼ活性を有することが確認された。
【００２５】
(6) アミノ酸配列
単離した本発明酵素のＮ末端アミノ酸配列分析を、自動アミノ酸配列分析装置(４７６Ａ型、アプライドバイオシステムズ社）を用いて実施したが、シグナルは検出されず、Ｎ末端がブロックされている可能性が示された。次に、精製した酵素の内部アミノ酸配列の分析を行った。精製酵素約40μg(約500pmol 相当）を還元ピリジルエチル化し、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）で加水分解し、ついで逆相クロマトグラフィーで分解されたペプチドを分離し、２ピークを分取し、自動アミノ酸配列分析装置を用いて、目的酵素の内部アミノ酸配列を解析した。得られた配列を、配列表配列番号１及び２に示す。 各アミノ酸配列について、GeneBank、EMBL、及びSwiss-Protデータベースに対して同一配列の検索を行った結果、完全に一致するものは認められず、本発明で得たヒト由来メタロエンドペプチダーゼが新規な物質であることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、新規な酵素及びその製造方法が提供される。詳しくは、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６±５ｋＤａ、等電点４．６〜５．２、至適ｐＨ７．４〜７．７であり、高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解する活性を有する新規なヒト型酵素、及びヒト大腸癌由来培養細胞Caco2 の細胞質溶液を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、該酵素の製造方法が提供される。本発明の酵素は、脳腸ペプチドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、あるいはアルツハイマー病などの神経系疾患の治療薬として有用である。
【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素の還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動パターンを示す。
【符号の説明】
レーン１：分子量マーカー蛋白質
９７ｋＤａ：ホスホリラーゼ
７８ｋＤａ：トランスフェリン
６８ｋＤａ：ウシ血清アルブミン
５５ｋＤａ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
３５ｋＤａ：グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ
２９ｋＤａ：カルボニックアンヒドラーゼ
２２ｋＤａ：大豆トリプシンインヒビター
１２．５ｋＤａ：シトクロムＣ
レーン２：本発明酵素
【図２】本発明酵素の各緩衝液における至適ｐＨを示す。
【符号の説明】
●：10mM  リン酸緩衝液
○：10mM  Tris-HCl緩衝液
【図１】
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【図２】
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