(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
0003569285.tif 000014
〔式（Ｉ）中、
R1は、Ｏ、またはＨおよびOR（式中、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルを示す。）を示し；
R2は、Ｈ、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR'、またはCOOX-X+（式中、Ｒは、アシル、アルキルまたはフェニルを示し、R'は、アルキルまたはフェニルを示し、Ｘは、Ｈ、Na、Ｋ、アミンまたは他の１価のカチオン性分子を示す。）を示す。〕で表される化合物（Ｉ）、およびそれらの塩よりなる群から選ばれるマクロライド化合物。
【請求項２】
下記式（II）
0003569285.tif 000015
〔式（II）中、
R1は、Ｈ、アルキル、CH2OR、CHO、COOR'、またはCOOX-X+（式中、Ｒは、Ｈ、アシル、アルキルまたはフェニルを示し、R'は、Ｈ、アルキルまたはフェニルを示し、Ｘは、Ｈ、Na、Ｋ、アミンまたは他の１価のカチオン性分子を示す。）を示す。〕で表される化合物（II）、およびそれらの塩よりなる群から選ばれるマクロライド化合物。
【請求項３】
下記式（III）
0003569285.tif 000016
〔式（III）中、R1は、Ｏ、またはＨおよびOR（式中、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルを示す。）を示し；
R2は、Ｈ、アルキル、CH2OR、CHO、COOR'、またはCOOX-X+（式中、Ｒは、Ｈ、アシル、アルキルまたはフェニルを示し、R'は、Ｈ、アルキルまたはフェニルを示し、Ｘは、Ｈ、Na、Ｋ、アミンまたは他の１価のカチオン性分子を示す。）を示す。〕で表される化合物（III）、およびそれらの塩よりなる群から選ばれるマクロライド化合物。
【請求項４】
下記式（IV）
0003569285.tif 000017
〔式（IV）中、Ｒは、Ｈ、アルキル、CH2OR'、CHO、COOR"、またはCOOX-X+（式中、R'は、Ｈ、アシル、アルキルまたはフェニルを示し、R"は、Ｈ、アルキルまたはフェニルを示し、Ｘは、Ｈ、Na、Ｋ、アミンまたは他の１価のカチオン性分子を示す。）を示す。〕で表される化合物（IV）、およびそれらの塩よりなる群から選ばれるマクロライド化合物。
【請求項５】
前記化合物が、下記式
0003569285.tif 000018
で表されるラソノライドＡである請求項１に記載のマクロライド化合物。
【請求項６】
癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、適切な薬剤学的担体、および請求項１に記載のマクロライド化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、適切な薬剤学的担体、および請求項２に記載のマクロライド化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項８】
癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、適切な薬剤学的担体、および請求項３に記載のマクロライド化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
癌細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、適切な薬剤学的担体、および請求項４に記載のマクロライド化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記マクロライド化合物が、請求項５に記載のラソノライドＡである請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
動物（ヒトを除く）を宿主とする癌細胞を治療する方法であって、該動物に、癌細胞阻害量のマクロライド化合物を投与することを含み、該マクロライド化合物が、請求項１に記載のマクロライド化合物である方法。
【請求項１２】
動物（ヒトを除く）を宿主とする癌細胞を治療する方法であって、該動物に、癌細胞阻害量のマクロライド化合物を投与することを含み、該マクロライド化合物が、請求項２に記載のマクロライド化合物である方法。
【請求項１３】
動物（ヒトを除く）を宿主とする癌細胞を治療する方法であって、該動物に、癌細胞阻害量のマクロライド化合物を投与することを含み、該マクロライド化合物が、請求項３に記載のマクロライド化合物である方法。
【請求項１４】
動物（ヒトを除く）を宿主とする癌細胞を治療する方法であって、該動物に、癌細胞阻害量のマクロライド化合物を投与することを含み、該マクロライド化合物が、請求項４に記載のマクロライド化合物である方法。
【請求項１５】
前記マクロライド化合物が、請求項５に記載のラソノライドＡである請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のマクロライド化合物を得る方法であって、
（ａ）アカルヌス（Acarnus）、フォルセピア（Forcepia）、ヘミテダニア（Hemitedania）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）およびテダニア（Tedania）よりなる群から選ばれる海産生物を提供し、
（ｂ）マクロライドを有機溶媒へと分配し、
（ｃ）マクロライドをクロマトグラフィーによって単離すること
を含む方法。
【請求項１７】
請求項２に記載のマクロライド化合物を得る方法であって、
（ａ）アカルヌス（Acarnus）、フォルセピア（Forcepia）、ヘミテダニア（Hemitedania）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）およびテダニア（Tedania）よりなる群から選ばれる海産生物を提供し、
（ｂ）マクロライドを有機溶媒へと分配し、
（ｃ）マクロライドをクロマトグラフィーによって単離すること
を含む方法。
【請求項１８】
請求項３に記載のマクロライド化合物を得る方法であって、
（ａ）アカルヌス（Acarnus）、フォルセピア（Forcepia）、ヘミテダニア（Hemitedania）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）およびテダニア（Tedania）よりなる群から選ばれる海産生物を提供し、
（ｂ）マクロライドを有機溶媒へと分配し、
（ｃ）マクロライドをクロマトグラフィーによって単離すること
を含む方法。
【請求項１９】
請求項４に記載のマクロライド化合物を得る方法であって、
（ａ）アカルヌス（Acarnus）、フォルセピア（Forcepia）、ヘミテダニア（Hemitedania）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）およびテダニア（Tedania）よりなる群から選ばれる海産生物を提供し、
（ｂ）マクロライドを有機溶媒へと分配し、
（ｃ）マクロライドをクロマトグラフィーによって単離すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記マクロライド化合物が、請求項５に記載のラソノライドＡである請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記海産生物がフォルセピア（Forcepia）である請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
少なからぬ研究や資源が、腫瘍学と、化学療法を含む抗腫瘍手段とに傾注されている。腫瘍の増殖を阻害、緩和または制御するのを助けるある種の方法および化学組成物が開発されているが、新たな方法および抗腫瘍化学組成物も必要とされている。いくつかの天然の生成物や生物は、非常に多様な有用な生物学的活性を有する化学分子の潜在的な源泉であることが見出されている。海産生物は、様々な生物学的活性を有する化合物の発見の源泉であった。そのような発明について発行された米国特許のいくつかは、下記のとおりである：抗ウイルス活性を有するジデムニン類に対する米国特許第4,548,814号明細書は、海産被嚢類から単離され；米国特許第4,729,996号明細書は、海産海綿のテイカキシネラ・モルケラ（Teichaxinella morchella）およびプチロカウリス・ワルペルシ（Ptilocaulis walpersi）から単離された、抗腫瘍特性を有する化合物を開示し；米国特許第4,808,590号明細書は、海産海綿のテオネラ（Theonella）の一種から単離された、抗ウイルス、抗腫瘍および抗真菌特性を有する化合物を開示し：米国特許第4,737,510号明細書は、カリブ海海綿のアゲラス・コニフェリン（Agelas coniferin）から単離された、抗ウイルスおよび抗菌特性を有する化合物を開示している。明らかに、海産海綿は、生物学的化合物の源泉であることが証明され、海産海綿に由来する有機化合物を開示する、P.J.Scheuer（編）、「Marine Natural Products,Chemical and Biological Perspectives」、Academic Press社、米国、ニューヨーク、1978〜1983ページ、第１〜５巻;D.J.Faulkner、Natural Products Reports、第１巻、551〜598ページ（1984年）；同、Natural Products Reports、第３巻、１〜33ページ（1986年）；同、Natural Products Reports、第４巻、539〜576ページ（1987年）；同、J.Am.Chem.Soc.、第107巻、4796〜4798ページ（1985年）をはじめとする多くの出版物が発行されている。
本発明は、海綿を資源材料として利用して、当技術分野においてこれまで開示されていない一群の生物学的活性化合物を用いる技術、および抗腫瘍剤として役立つこれらの化合物を含む新規薬学的組成物を提供している。本発明のその他の利点、および適用可能性のそれ以上の範囲は、本明細書中に記載される詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、この詳細な説明は、本発明の好適な実施態様を示すが、そのような説明から、本発明の本旨および範囲内での様々な変化および変更が明らかになると思われることから、例示のためにのみ示されるにすぎないことを理解しなければならない。
発明の簡単な概要
本発明は、新規化合物であるマクロライド、およびこれらの化合物に対する利用方法に関する。本マクロライド、すなわち化合物（Ｉ）〜（VIII）についての構造を下記に示す。該マクロライド化合物は、生物学的活性を有し、細胞増殖を制御するのに効果的であり得る。本明細書中に具体例に例示したのは、ラソノライドＡであって、フォルセピア（Forcepia）属の海綿から単離された。ラソノライドＡは、本明細書中で下記に開示した化合物（Ｉ）［式中、R1はOHであり、R2はCH2OHである］の特定の誘導体である。ラソノライドＡの構造は、下記の化学式で示される：
0003569285.tif 000002
ラソノライドＡは腫瘍細胞の増殖を阻害することが見出された。したがって、この化合物ならびにその誘導体および類似体は、動物および人間の癌の治療に役立つ。
本発明の化合物は、癌および正常細胞など、細胞の細胞骨格上の変化の様々な面を決定する際の生化学的プローブとしても用いることができ、したがって、植物、動物および人間のある種の疾病の研究における重要な手段としても役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラソノライドＡを調製するための図式を示す。
発明の詳細な開示
本発明は、海産海綿から単離できる新規な化合物に関する。この化合物の類似体および誘導体も、記載かつ請求される。これらの化合物は、抗腫瘍活性を保有することが示された。したがって、本発明は、該化合物自体はもとより、これらの化合物を含有する薬学的組成物にも関する。該新規組成物を投与する方法もまた、開示され、請求の範囲に含まれる。これらの化合物の類似体および誘導体は、公知の手順によって製造できる。新化合物は、下記のとおり、海産海綿から単離できる。
天然の産物であるラソノライドＡの単離を、溶媒分配の手法を用いて実施し、その後クロマトグラフィーを用いて行った。該新規化合物の最終的精製は、析出によるか、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いることによって、達成できる。ラソノライドＡの構造は、主としてその1Hおよび13CNMRのデータに基づいて決定したが、これは、下記の化学式で表される：
0003569285.tif 000003
本発明の好適な実施態様は、ラソノライドＡであって、化合物（Ｉ）：
0003569285.tif 000004
［式中、特定のラソノライドＡ化合物についてのＲという基は、下記のように定義される:R1＝ＨおよびOH、そしてR2＝CH2OH］という構造を含む。
ラソノライドＡのその他の実施態様または類似体は、R1＝Ｏ、またはＨおよびOH、またはＨおよびOR（ここで、ＲはＨ、アシル、アルキルもしくはフェニルである）；そしてR2＝アルキル、Ｈ、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR'またはCOO−X+（ここで、Ｘ＝Ｈ、Na、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子、Ｒ＝アシル、アルキルまたはフェニル、そしてR'＝アルキルまたはフェニル）である構造を含む。
本発明の他の化合物は、化合物（II）〜（VIII）で表される。具体的には、化合物（II）は、構造：
0003569285.tif 000005
［式中、R1＝Ｈ、アルキル、CH2OR、CHO、COOR'またはCOO−X+、ここで、ＸはＨ、Na、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はＨ、アルキル、フェニルである］を有する。化合物（II）の構造による好適な化合物は、R1＝CH2OHのものである。
化合物（III）は構造：
0003569285.tif 000006
［式中、R1＝Ｏ、またはＨおよびOH、またはＨおよびOR;R2はＨ、アルキル、CH2OR、CHO、COOR'またはCOO−X+であり、ここで、ＸはＨ、Na、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はＨ、アルキルまたはフェニルである］を有する。化合物（III）の構造による好適な化合物は、R1＝ＨおよびOH、そしてR2＝CH2OHのものである。
化合物（IV）は、構造：
0003569285.tif 000007
［式中、ＲはＨ、アルキル、CH2OR'、CHO、COOR"またはCOO−X+であり、ここで、ＸはＨ、Na、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、R'はＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR"はＨ、アルキルまたはフェニルである］を有する。化合物（IV）の構造による好適な化合物は、Ｒ＝CH2OHのものである。
化合物（Ｖ）は、構造：
0003569285.tif 000008
［式中、R1＝Ｈ、ＲまたはＸ、ここで、ＸはNa、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり;R2＝Ｏ、またはＨおよびOH、またはＨおよびOR、ここでＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり；そしてR3＝Ｈ、アルキル、CH2OR、CHO、COOR'またはCOO−X+、ここで、ＸはＨ、Na、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、ＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はアルキルまたはフェニルである］を有する。
化合物（IV）は、構造：
0003569285.tif 000009
［式中、R1＝Ｈ、ＲまたはＸ、ここで、ＸはNa、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、そしてＲはアルキルまたはフェニルであり;R2＝Ｏ、またはＨおよびOH、またはＨおよびOR、ここでＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり;R3＝Ｈ、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR'またはCOO−X+、ここで、ＸはNa、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、Ｒはアシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はアルキルまたはフェニルである］を有する。
化合物（VII）は、構造：
0003569285.tif 000010
［式中、R1＝Ｈ、ＲまたはＸ、ここで、ＸはNa、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、そしてＲはアルキルまたはフェニルであり;R2＝Ｏ、またはＨおよびOH、またはOR、ここでＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり;R3＝Ｈ、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR'、COO−X+、ここで、ＸはNa、Ｋまたはアミンであり、Ｒはアシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はアルキルまたはフェニルである］を有する。
化合物（VIII）は、構造：
0003569285.tif 000011
［式中、R1＝Ｈ、ＲまたはＸ、ここで、ＸはNa、Ｋ、アミン、または他の１価のカチオン性分子であり、そしてＲはアルキルまたはフェニルであり;R2＝Ｏ、ＨおよびOH、ＨまたはOR、ここでＲはＨ、アシル、アルキルまたはフェニルであり；そしてR3＝Ｈ、アルキル、CH2OH、CH2OR、CHO、COOH、COOR'、COO−X+、ここで、ＸはNa、Ｋまたはアミンであり、Ｒはアシル、アルキルまたはフェニルであり、そしてR'はアルキルまたはフェニルである］を有する。
ラソノライドＡのすべての態様および誘導体は、当業者には周知である標準的反応および手順を用いることによって、調製できる。例えば、Ｒをアセチル（Ac）基で置き換えることによって調製されるラソノライドＡの誘導体は、標準的なアセチル化反応を介して達成できる。具体的な反応を、より詳細に下記に説明する。実施例６−化合物の類似体および変化形を参照されたい。
化合物ラソノライドＡは、従来、天然資源から単離されたことがなかった。本化合物は、フォルセピア（Forcepia）属の海綿から単離することが可能である。フォルセピア（Forcepia）に加え、他の海綿も、本化合物（Ｉ）〜（VIII）の資源として用い得る。これらの他の海綿は、アカルヌス（Acarnus）、リソデンドリクス（Lissodendoryx）、ヘミテダニア（Hemitedania）、テダニア（Tedania）などを包含する。本発明の化合物は、その誘導体も含め、抗腫瘍特性を有する。したがって、それらは、癌をはじめとする多数の疾病の治療に用いることができる。その上、本化合物は、生化学的プローブとして用い得る、すなわち、植物、動物および人間の細胞の細胞骨格構造の研究における有用な手段であり得る。
以下は、本発明を実施するための、最良の形態を含む手順を例示する実施例である。これらの実施例は、本発明を限定するものとして解されてはならない。特に指示されない限り、百分率はすべて、重量％であり、溶媒の混合比率はすべて、体積による。
実施例１−海産海綿の同定および所在
目的とする海綿、すなわちフォルセピア（Forcepia）の一種（多骨海綿目、ミキシラ（Myxilla）科）は、英領バージン諸島、グアナ（Guana）島のイーストポイント（East point）北方、グランド・グット（Grand Ghut）、ノース・ショア（North Shore）の沖合い（北緯18度29.13分、西経64度37.65分）の19.2m（63フィート）の深さで採集できる。採集部位の地形は、滑らかな舗石状の岩および砂である。該海綿は、色彩が赤橙色で、形状が球形である。フォルセピア（Forcepia）のこの種は、？トリラビス（?trilabis）種として同定された。R.W.M.Van Soest、「Marine sponges from Curacao and other Caribbean localities,Part III.Poecilosclerida」、Stud.Fauna Curacao Caribb.Isl.、第66巻、第199号、１〜167ページ（1984年）を参照されたい。該海綿は、下記のように分類されている：
門：海綿動物
綱：普通海綿類
目：多骨海綿類
科：ミキシリデ（Myxillidae）
属：フォルセピア（Forcepia）
種:?トリラビス（?trilabis）
実施例２−ラソノライドＡの単離
本化合物、すなわちラソノライドＡを得るため、本化合物の原料海綿、すなわちフォルセピア・？トリラビス（Forcepia ?trilabis）をミキサー中で摩砕し、エタノール200mlで３回抽出した。抽出時間は、それぞれ約８、15および８時間であった。摩砕した海綿からエタノール抽出物をデカントし、重力濾過し、併合し、減圧下で濃縮して、未精製エタノール抽出物を得た。次いで、この抽出物を、等積の水と酢酸エチルとの間で溶媒分配した。酢酸エチル分配分を減圧下で濃縮し、ヘプタンと10％メタノール水溶液との間で、更に溶媒分配した。水性部分には、総含水量を40％にするのに充分な水を加えた。次いで40％メタノール水溶液分画を塩化メチレンで分配した。次いで、塩化メチレン分配を減圧下で濃縮し、メタノール／水1:1、メタノール／水80:20、および100％メタノールの溶媒勾配を用いて、逆相ODSゲルを充填した真空フラッシュカラム（VFC）を流下させることによって、更に精製した。次いで、メタノール／水80:20から得られた分画を、順相シリカゲルの半分取用カラム、および溶出溶媒として酢酸エチル／ヘプタン70:30を用いたHPLCによって精製した。これによって、純粋なラソノライドＡを得た。単離手順の略図による表示を図１に示す。本化合物の類似体および誘導体は、実質的に同様の抽出および精製手法を用いて得ることができる。
生物活性化合物であるラソノライドＡは、生物中に存在する主な細胞毒性化合物であり、海綿の湿潤重力に対して約0.05％の収率で、純粋形態で単離できる。大規模単離は、水抽出物（メタノール抽出物を水／酢酸エチルで分配した後に得ることができる）に対するRP−18真空液体クロマトグラフィーに続く、分取カラムでのRP−18のHPLCによって実施できる。この工程に必要な材料はすべて、当業者に容易に入手可能である。
実施例３−化合物の特性
ラソノライドＡの特性は、NMR分光分析によって決定した。これらのデータの結果を下記の表１に示す。
0003569285.tif 000012
実施例４−抗腫瘍活性
P388マウス白血病細胞およびA549ヒト肺癌細胞に対する毒性について、ならびにプロテインキナーゼＣ（PKC）およびEL−４細胞接着の活性化に付随するシグナル導入経路を攪乱できる能力について、ラソノライドＡを試験した。
A.細胞株の維持:P388マウス白血病細胞は、米国メリーランド州ベセスダ（Bethesda）、米国国立癌研究所のJ.メイオ（J.Mayo）博士から入手した。A549細胞およびEL−4.IL−２細胞（TIB）は、米国メリーランド州ロックビル（Rockville）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手した。P388細胞は、10％ウマ血清を補充したロスウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート（Roswell Park Memorial Institute）培地1640号（RPMI−1640）中で維持し、プラスチック組織培養フラスコ中で培養し、恒温器内で、５％CO2を含む湿潤な空気中で37℃に保った。A549細胞は、RPMI−1640中で同様に維持したが、10％ウシ胎児血清を補充した。P388およびA549細胞の無抗生物質保存株を、新鮮な増殖培地への希釈によって、２〜５日間隔で105細胞/mlに継代培養した。EL−４細胞も同様に維持したが、10体積％の加熱不活化ウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、６μg/mlのＬ−グルタミンおよび5x10-3モルの２−メルカプトエタノールを補充した（TCM）（Grand Island Biologicals社、米国ニューヨーク州Grand Island）。
細胞は、３〜４日ごとに植え継いだ。トリパンブルー除去によって生存率を決定し、常に80％を上回った。接着検定には、凍結保存株の15継代以内の細胞を用いた。ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート（PMA）および４α−ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート（４α−PMA）は、LC Services Corporation社（米国マサチューセッツ州Woburn）から入手した。PMAおよび４α−PMAの原液は、DMSO中で調製し、使用の前に−70℃で貯蔵した。
B.手順:P388細胞に対する薬剤の増殖阻害効果を評価するために、薬物を含まぬ培地、あるいは未精製抽出物を1:500の最終希釈で、または中間体ならびに純粋な化合物を10.0、1.0、0.10および0.010μg/mlで含有する培地に、1x105細胞/mlの培養株200μｌを確立した（96穴組織培養プレート、デンマーク国Nunc社）。すべての希釈に用いた溶媒は、エタノールであって、これはすべてのプレートから減圧下で除去した。48時間接触させた後、下記のとおり、臭化３−［4,5−ジメチルチアゾール−２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾリウム（MTT）を用いて、P388細胞を計数した。
A549細胞に対するラソノライドＡまたはその類似体の増殖阻害効果を評価するために、微量滴定プレートのウエル中に、培地に対して1.5x105細胞/mlの最終濃度で細胞を単層培養株として確立してから24時間後に、化合物と接触させた。100μｌの体積の培地を各培養ウエルから除去し、100μｌの体積の、薬物を含まぬ培地、または未精製抽出物を1:500の最終希釈で、もしくは中間体および純粋な化合物を10.0、1.0、0.10および0.010μg/mlで含有する培地で置き換えた。プレートを37℃で72時間インキュベートし、下記のとおり、MTTを用いて細胞を計数した。
細胞増殖に対するラソノライドＡまたはその類似体の効果を定量するために、5mg/mlのMTTを含有する暖めた増殖培地75μｌを各ウエルに加えた。培養物を恒温器に戻し、90分間静置した。還元されたホルマザンの形成を分光測光によって定量するため、プレートを遠心分離し）900xg、５分間）、培養液を吸引によって除去し、各ウエルごとに200μｌの酸性化イソプロパノール（イソプロパノール1Lあたり2mlの濃塩酸）を加えた。得られた溶液の吸光度を、プレートリーダー（MR700Microplate Reader、Dynatech Laboratories社、米国バージニア州Chantilly）で570nmで測定した。試験ウエルの吸光度を、薬物を含まぬウエルの吸光度で除し、未処理培養物の吸光度の50％を与える化合物の濃度（IC50）を、ロジット変換したデータの線形回帰によって決定した。P388やA549の細胞数とホルマザン生産との間の線形関係が、この研究で観察された細胞密度の範囲にわたって見出された。
EL−４細胞に対する本化合物の効果を評価するために、96穴の平底の微量滴定試験プレートで37℃で、EL−４細胞（2.5x105/ウエル）を三重の濃度の海綿代謝生成物とともに、PMA（16ナノモルの最終濃度）の存在下（プレート１）または非存在下（プレート２）で培養した。試験化合物をTCMで、EtOHの最終濃度が1.25％を超えないようにして希釈した。対照は、単独でインキュベートした細胞（負の対照）と、PMAとともにインキュベートした細胞（正の対照）とで構成した。PMAの不在下でEL−4.IL−２細胞および同一希釈の化合物からなる追加の対照プレート（プレート３）は、細胞毒性のプレートとして役立て、下記のような接着には処理しなかったが、EL−4.IL−２細胞に対する化合物の細胞毒性効果の可能性を監視するのに用いた。インキュベートの時間は37℃で１時間であった。インキュベートの期間後に、プレート１および２を下記のとおり処理した：プレートをキャッチトレーに振り入れ、プレートをペーパータオル上に反転して置いて、残留する排水ウエルを排水かつ吸い取ることによって、各ウエルの内容物を除去した。各ウエルに、100μｌという体積のTCMを室温で加え、５にセットした回転プラットホーム攪拌器（Mini−Orbital Shaker、BELLCO Biotechnology社、米国ニュージャージー州Vineland）にプレートを４分間載せた。次いで、プレートを180゜回転させ、更に４分間の攪拌に付した。プレートを取り出し、その内容物を、記載したとおりに再度除去し、吸い取り、各ウエルにTCMを加え、回転攪拌器にプレートを載せた。この工程を、更に２回の洗浄周期について繰り返した。
ウエルの内容物を除去した後、200μｌという体積のTCMおよびMTT溶液（TCM中に2mg/ml）75μｌを全プレートの各ウエルに加えた。プレートを37℃で更に４時間インキュベートした。インキュベートした後、プレート１および２の内容物を、プレートをシンクに振り入れ、ペーパータオルに吸い取ることによって、再度除去した。プレート３は、遠心分離し、同様に吸い取った。次いで、全プレートの各ウエルに、体積200μｌのiPrOHを加えて、形成されたホルマザンの結晶を溶解した。プレートリーダー（Microplate Autoreader,Model EL−311、BIO−TEK Instruments,Inc.社、米国バーモント州Winooski）を用いて、570nmでプレートを読み取った。三重のウエルの各セットについての吸光度を平均化し、標準誤差を決定した。各試験ウエルの平均吸光度および標準誤差をプロットすることによって、結果をグラフで表した。結果を下記のように解釈した：
PKCのアゴニスト（接着の誘発剤）：、単独でインキュベートした細胞（負の対照）の吸光度より高い、接着した細胞によって代謝されたMTTの吸光度によって証拠付けられるとおり、化合物は、PMAの不在下（プレート２）でEL−4.IL−２細胞の接着を誘発する。
PKCのアンタゴニスト（接着の阻害剤）:MTTの吸光度が皆無であることによって証拠付けられるとおり、化合物は、PMAの不在下（プレート２）でEL−4.IL−２細胞の接着を誘発しない。MTTの吸光度が皆無であることによって証拠付けられるとおり、化合物は、PMAの存在下（プレート１）でEL−4.IL−２細胞の接着を阻害する。化合物は、プレート３によって測定されたとおり、細胞毒性をもたない。
C.結果:A549、P388およびEL−４の接着検定の結果を、下記の表２に示す。精製されたラソノライドＡ（バイアル10319番）は、マウス白血病細胞に対して強い阻害特性を有し、0.01μg/ml未満のIC50を有することが判明した。ラソノライドＡは、培養されたヒト肺癌細胞（A549）に対して0.04μg/mlのIC50を有することも判明した。EL−４接着検定を用いても、阻害はラソノライドＡについて強力であった。精製された化合物は、EL−４の接着によって、0.019のIC50を有することが示された。化合物ラソノライドＡ、またはそれに由来する組成物は、人間または動物において、腫瘍を阻害するのに用いることができる。
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実施例６−化合物の類似体および変化形
新規化合物、すなわちラソノライドＡの修飾は、当業者によって容易に実施できる。
本願で用いられるように、「類似体」、「変化形」および「誘導体」という用語は、もう一つの化合物と実質的に同じであるが、例えば、追加のアミノ酸または側鎖基を加えることによって、修飾されていた可能性がある化合物を意味する。本願で用いられるように、「類似体」、「変化形」および「誘導体」という用語は、もう一つの化合物と実質的に同じであるが、該化合物中の一定の個所での原子または分子の置換を有する化合物を意味してもよい。
記載のとおり、該化合物の好適な実施態様は、ラソノライドＡであって、R1＝OHであり、R2＝CH2OHである上記の構造を有する。しかし、この好適な実施態様の類似体または誘導体は、一般的に公知である標準的反応を用いて、容易に調製できる。これらの標準的反応は、メチル化、アセチル化および酸性化反応を包含するが、これらに限られない。ここに具体的に例示した誘導体および類似体は、下記のとおりに調製できる。
1.メチル化：標準的なメチル化の手順を用いて、ラソノライドＡをメチル化できる。例えば、ラソノライドＡのメタノール溶液と反応させたメチル化試薬、例えば硫酸ジメチルは、R1＝CH3である上記の構造を生じる。
2.アセチル化：標準的なアセチル化反応を用いて、アセチル（Ac）基をラソノライドＡに付加できる。アセチル化は、遊離ヒドロキシル基が分子上に存在する位置で生じ得る。例えば、ラソノライドＡのアセチル化は、過剰な無水酢酸およびピリジン（1:2）を用いて実施でき、R1およびR2＝CH2COO−である化合物（Ｉ）として上記に示した構造を生じることになる。この構造は、上記のとおり、標準的なメチル化の手順によって更にメチル化でき、R1およびR2＝CH2COOCH3である上記の構造を生じることになる。
本発明は、具体的に例示した化合物および他の組成物について示した、具体的な構造を包含する。本発明は、更に、該構造の類似体、変化形および誘導体はもとより、該誘導体の類似体および変化形も包含する。これらの類似体、変化形および誘導体は、該類似体、変化形または誘導体が、最初に例示した化合物と実質的に同じ適切な生物学的活性を保持する限り、本発明内に包含される。例えば、原子または分子的置換を行なうことは、充分に当業者の技量の範囲内にある。これらの置換が適切な生物学的または化学的活性を実質的に変更しない程度にまでであるならば、得られる化合物は、本発明の範囲内に属する。「適切な生物学的または化学的活性」という用語は、ある化合物の特定の適用のための問題の活性を意味する。例えば、ラソノライドＡの一つより多くの用途を本明細暑中で考察する。これらの用途は、細胞骨格の構造の研究における生化学的プローブとしてのその適用を包含する。ラソノライドＡをこれらの方面に用いようとするならば、「類似体」とは、生化学的プローブとして用い得る化合物の可能性を実質的に変えることなく、（例えば分子的置換によって）ラソノライドＡが修飾された化合物を意味することになるであろう。分子的置換は、本発明の主題の範囲内にある変更の形式の一例にすぎない。
実施例７−配合および投与
本発明の化合物は、様々な非治療的および治療的目的に役立つ。試験から、本発明の化合物は、生化学的プローブに、および腫瘍増殖の制御に効果的であるのが明らかである。この新規化合物、およびそれらを含有する組成物の治療への適用は、当業者には現在および将来的に公知である、適切ないかなる治療方法および手法によっても達成されるものと想定できる。更に、本発明の化合物は、他の有用な化合物および組成物の製造のための出発材料または中間体としての用途を有する。
上記の指示での宿主への投与用量は、感染の正体、関係する宿主の類型、その年齢、体重、健康、存在するならば、併用する処理の種類、処理の頻度、および治療比率に左右されることになる。
本発明の化合物は、薬剤学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って配合できる。配合物は、当業者には周知であって、容易に入手できる、多数の資料に詳細に記載されている。例えば、E.W.マーチン（E.W.Martin）による「レミントンの薬剤学（Remington's Pharmaceutical Science）」は、本発明と関連して用い得る配合物を記載している。一般に、本発明の組成物は、有効量の生物活性化合物を、該組成物の効果的な投与を促すのに適した担体と組合せるように配合されることになる。
本明細書に開示された実施例および態様は、例示目的のためであるにすぎず、それらを勘案しての様々な変更または変化が当業者には示唆されると思われ、かつ本願の本旨および範囲、ならびに添付された請求の範囲内に包含されるべきであることが理解されなければならない。
【図１】
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