(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質に対し分岐プローブを結合させる工程と、前記分岐プローブを備えた物質より増幅された情報を獲得する工程と、を具備した検出方法であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴とする検出方法。
【化１】
0003544830.tif 000006
【請求項２】
前記分岐プローブは、下記の式を満足することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
［１０3ｎ（Ｌ＋１）（１−Ｌm）］／（１−Ｌ）＜１．３×１０3ｎ3ｍ3
（式中、Ｌは分岐の数、ｎは核酸の長さ、ｍは試薬による反応回数である。）
【請求項３】
物質に対し分岐プローブを結合させる手段と、前記分岐プローブを備えた物質より増幅された情報を獲得する手段と、を具備した検出装置であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴とする検出装置。
【化２】
0003544830.tif 000007
【請求項４】
前記分岐プローブは、下記の式を満足することを特徴とする請求項３記載の検出装置。
［１０3ｎ（Ｌ＋１）（１−Ｌm）］／（１−Ｌ）＜１．３×１０3ｎ3ｍ3
（式中、Ｌは分岐の数、ｎは核酸の長さ、ｍは試薬による反応回数である。）
【請求項５】
物質に結合する分岐プローブを具備した検出試薬であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴とする検出試薬。
【化３】
0003544830.tif 000008
【請求項６】
前記分岐プローブは、下記の式を満足することを特徴とする請求項５記載の検出試薬。
［１０3ｎ（Ｌ＋１）（１−Ｌm）］／（１−Ｌ）＜１．３×１０3ｎ3ｍ3
（式中、Ｌは分岐の数、ｎは核酸の長さ、ｍは試薬による反応回数である。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸、蛋白質および有機塩素化合物等の物質を検出するための検出方法、検出装置および検出試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、遺伝子により規定された遺伝情報は、メッセンジャ−ＲＮＡを介して酵素やホルモン等の蛋白質に翻訳され、該蛋白質や酵素の作用により、生体が維持されている。ところで、ヒトの遺伝子の総数は５〜１０万といわれているが、それらの遺伝子中に何等かの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生じると、合成される蛋白質の特性、種類および量等が変化したり、あるいは蛋白質が合成されなくなるため、生体系における恒常性が保てなくなり、生体に各種の疾患等の障害をもたらすことになる。したがって、生体の備えた遺伝子を検出することにより疾患の同定や予防を行うことができる。また、生体内に存在するウイルスや細菌等の遺伝子を検出することにより、該ウイルスや細菌等に起因する疾患の発生を抑制したり、検出した遺伝子を定量することにより、該疾患の進行の程度を知ることができる。
【０００３】
近年、疾患の同定や予防を遺伝子に基づいて診断する方法（遺伝子診断）が、遺伝子工学の進歩に伴って可能になってきた。また、各種の抗原、例えば、癌マーカーとして用いられるＡＦＰ、ＣＥＡ等の抗原や、ホルモンの検出が免疫学的な手法を用いて行われており、癌等の疾患の診断に役立てられている。
【０００４】
ところで、遺伝子診断の分野では検出感度の高感度化が進行しており、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子診断では、治療あるいは疾病の進行状態の指標に用いる観点から、１０５  〜１０６  ｃｏｐｙ／ｍＬ程度までの核酸を検出可能な感度が要求されている。同様に、ＨＩＶおよびＨＢＶ等のウイルスや細菌の検査あるいは癌遺伝子の検出等においても高い検出感度が求められており、さらなる高感度化が求められている。さらに、患者への負担を軽減するために、採取するサンプルの微量化が進行しており、血液電解質測定等では既に数マイクロリットルのサンプルから検出が行われている。また、癌マーカーやホルモン等の蛋白質は生体内に微量しか存在しないことから、必然的にその検出には高感度化が要求されている。従来、上記物質は、例えば、化学発光物質、放射性同位元素および蛍光物質等により標識を行って該標識からの信号を獲得したり、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ法）のように酵素反応によって物質を増幅することにより検出されてきた。
【０００５】
しかしながら、化学発光物質、放射性同位元素および蛍光物質等により標識を行って該標識からの信号を獲得する方法は感度が不十分であり、要求される高感度化に対応することが困難であるという問題があった。また、ＰＣＲ法のように酵素反応によって物質を増幅する方法では、Ｔａｑポリメラーゼ等の高価な酵素を使用しなければならず、検出に要する経済的な負担が大きいという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来例に鑑みてなされたもので、物質を高感度に検出するとともに、経済性および操作性に優れた検出方法、検出装置および検出試薬を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る検出方法は、物質に対し分岐プローブを結合させる工程と、前記分岐プローブを備えた物質より増幅された情報を獲得する工程と、を具備した検出方法であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴としている。
【化４】
0003544830.tif 000002
【０００８】
本発明に係る検出方法によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【０００９】
また、本発明に係る検出装置は、物質に対し分岐プローブを結合させる手段と、前記分岐プローブを備えた物質より増幅された情報を獲得する手段と、を具備した検出装置であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴としている。
【化５】
0003544830.tif 000003
【００１０】
本発明に係る検出装置によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【００１１】
さらに、本発明に係る検出試薬は、物質に結合する分岐プローブを具備した検出試薬であって、前記分岐プローブは、核酸に下記一般式で示される試薬を反応させ、さらにこの反応部から側鎖用核酸を合成することにより作製されたものであることを特徴としている。
【化６】
0003544830.tif 000004
【００１２】
本発明に係る検出試薬によれば、増幅された多量の情報を発信することが可能となる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能となる。
【００１３】
本発明において、物質としては、遺伝子（ゲノム上のある長さをもった特定の区画：構造遺伝子）等の核酸、生体を構成する各種の蛋白質、各種の抗原や抗体、脂質、糖、ダイオキシンやＰＣＢ等の催奇性物質、ベロ毒素、ハチ毒およびヘビ毒等の動物毒、ＬＳＤ等の薬物、各種の電解質およびこれらの複合体等を挙げることができ、上記物質は、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、微生物、細菌、ウイルス、植物体、動物体、食品、薬品、土壌、河川および海水等のいずれに由来するものであってもよい。また、上記物質の検出に当たり、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、微生物、細菌、ウイルス、植物体、動物体、食品、薬品、土壌、河川および海水等を直接用いることも可能であるが、例えば、遺伝子診断においては、血液や羊水等を試料として、該試料より核酸を抽出してこれを検出することになる。試料より核酸等の物質を抽出する方法は、物質の検出を妨げる結果を招く操作を行わない限り特に限定されるものではなく、例えば、試料より核酸を検出するにあたっては、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法、担体を用いる固液抽出法あるいはＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）やスマイテス卜（住友金属社製）等の市販のキットを利用することが可能である。
【００１４】
また、第１および第２の標識としては、核酸、蛋白質、各種の抗原、抗体、脂質および糖等の各種の物質を用いることができるが、第１および第２の標識は、相互認識しかつ結合する物質の組み合わせとなっていなければならない。相互認識し、かつ結合する標識の組み合わせとしては、アビジンとビオチン、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体等の種々の抗原と抗体、互いに相補的な塩基配列を備えた２つの核酸分子、適当な大きさの有機化合物とシクロデキストリン等のホスト−ゲスト分子、各種のレセプターとアンタゴニスト分子、金とジチオスレイトール、チオール化した核酸等の硫黄含有分子を挙げることができる。ここで、第１および第２の標識が結合する際の解離定数は、検出感度の低下を防止する観点から１０−３ｍｏｌ／Ｌ以下である事が望ましい。さらに、本発明においては、第２の標識を介して第３の標識が提示されるが、第３の標識に対し、第３の標識を認識する第４の標識を結合させ、第４の標識を介して第５の標識を提示させるようにして、標識を介した伸長反応をほぼ無限に実施することができる。このとき、物質に対しどの程度の数の標識を結合させるかは、物質の存在量、各標識を備えた物質より獲得される情報の質および量等により適宜設定すればよい。また、第３の標識以降の伸長反応の各段階において、相互認識しかつ結合する標識の組み合わせは上述した組み合わせを適用することができ、各物質が結合する際の結合定数は上述した値をとることが望ましい。また、各標識は、分子全体が標識として機能する構成であってもよいし、分子中の一部に標識を備えるような分子として構成されていてもよい。
【００１５】
ここで、各標識の組み合わせ方について、第１〜第３の標識を例として詳述する。前述したように、第１および第２の標識は、相互認識し、かつ結合する組み合わせでなければならないが、この条件を満たす各標識の組み合わせ方として、以下に示す組み合わせ方を挙げることができる。すなわち、１）第１および第３の標識を同一種の標識とする組み合わせ方、２）第１および第３の標識を異種の標識とする組み合わせ方、３）第２および第３の標識を同一種の標識とする組み合わせ方を挙げることができる。ここで、各組み合わせ方を適用した場合について検討する。はじめに、１）の組み合わせ方を適用した場合、第２および第３の標識は相互認識し結合することができるので、例えば、第２および第３の標識を同一の分子中に備えた分子を準備すれば、該分子を連続して結合し伸長させることにより、物質を多数の第２および第３の標識で修飾することができる。このとき、第２および第３の標識を同一の分子中に備えた分子において、第２および第３の標識間での分子内結合を防止するように該分子を構成しなければならない。この場合、該分子の第２および第３の標識の間にＰＢＬＧ（ｐｏｌｙ−  γ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）等の分子を介在させたり、該分子全体の構造を、第２および第３の標識間での分子内結合が生じないように設計すれば、第２および第３の標識間での分子内結合を防止することができる。また、２）の組み合わせ方を適用した場合、第３の標識は第１および第２の標識のいずれとも相互認識せず、また結合もしないので、第３の標識と相互認識し結合する第４の標識を第３の標識に結合させ、第４の標識を介して第５の標識を呈示させる工程を繰り返すことで、物質を多様かつ多数の標識で修飾することができる。このとき、各標識のすべてを異種の標識とすることができ、また、第４および第５の標識を結合させる段階以降に、相互認識しかつ結合する標識を備えた分子を用いるようにしてもよい。なお、各標識のすべてを異なる標識とした場合には、各標識を備えた分子において、相互認識する標識の結合による分子内結合が生じないことから、該分子の設計を自由度をもって行うことができる。さらに、３）の組み合わせ方を適用した場合、第３の標識は第１の標識と相互認識して結合するものの、第２の標識とは相互認識せず、また結合もしないので、第３の標識と相互認識し結合する第４の標識（第１の標識）を第３の標識に結合させるとともに該第４の標識を介して第５の標識（第１の標識）を呈示させ、次いで、第５の標識と相互認識し結合する第６の標識（第２の標識）を第５の標識に結合させるとともに第６の標識を介して第７の標識（第２の標識）を呈示させる工程を繰り返すことで、物質を多数の標識で修飾することができる。このとき、各標識のすべてを第１および第３（第２）の標識で統一することができ、また、第３および第４の標識を結合させる段階から、相互認識しかつ結合する２つの標識を備えた分子を用いるようにしてもよい。なお、第２および第３の標識が同一種で、第４および第５の標識が同一種（第２と第４の標識は異種）の場合には、第２および第３の標識を分子中に備えた分子と、第４および第５の標識を分子中に備えた分子��の間での分子間結合を防止するように伸長させなくてはならない。さらに、物質に対し標識を連続して伸長するように結合させる場合には、上述した各標識の組み合わせ方を必要に応じて適宜選択し、これを組み合わせることも可能である。さらに、物質と結合する第１の標識に第２および第３の標識を設けた分子を構築すれば、該分子種を用いるのみで、該分子を連続して結合し伸長させることができる。また、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示するようし、該操作を連続して繰り返していけば、さらに多数の各標識によって物質を修飾でき、物質の検出感度をさらに向上させることができる。なお、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示した場合には、分子の高次構造に基づく立体障害により標識を連続的に伸長することが困難となる可能性があるので、立体障害を防止する高次構造の予測に基づき、第２の標識を介して第３の標識を複数呈示する分子を設計する必要がある。
【００１６】
また、物質に対し第１の標識を結合させる手段は、物質と第１の標識とが結合する条件を提供できるものであれば、物質および第１の標識の種類等に基づいて適宜選択することができる。例えば、物質が遺伝子であり、第１の標識が特定の塩基配列を備えた核酸分子である場合には、第１の標識に物質と特異的に結合する塩基配列を備えた核酸分子を設けておき、物質と第１の標識を備えた核酸分子との間でハイブリダイゼーションを行うことによって、第１の標識を核酸分子に結合させることができるので、この場合にはハイブリダイゼーションを実施できる手段を選択すればよい。また、抗原抗体反応に基づいて第１の標識を物質に結合させる場合にも、抗原抗体反応を実施できる手段を選択すればよい。また、第１の標識に対し該第１の標識を認識する第２の標識を結合させ、かつ第２の標識を介して第３の標識を呈示させる手段としては、第１の標識と第２の標識とが相互認識し、かつ結合する条件を提供できるものであれば、第１および第２の標識の種類等に基づいて適宜選択することができる。例えば、第１の標識が特定の塩基配列を備えた核酸分子である場合には、第１の標識を認識し特異的に結合する塩基配列を備えた第２の標識と第１の標識との間でハイブリダイゼーションを行うことによって、第２の標識を第１の標識に結合させることができるので、この場合には、例えば、ハイブリダイゼーションの実施可能な環境が実現できる手段を選択すればよい。また、抗原抗体反応に基づいて第２の標識を第１の標識に結合させる場合にも、例えば、抗原抗体反応の実施可能な環境が実現できる手段を選択すればよい。なお、第３の標識は、第２の標識と同一分子内に存在していてもよいし、第２の標識とは分離されて存在していてもよいが、第１および第２の標識が結合する際に第２の標識を通じて呈示されなくてはならない。
【００１７】
また、標識を備えた物質より獲得される情報としては、標識より生じる信号や、標識あるいは標識の設けられた分子に予め固定化された標識剤より生じる信号等を挙げることができ、これらの情報を獲得するにあたっては、例えば、各標識を備えた物質に電圧を印加し、該印加した電圧によって生じた信号を測定する方法や、各標識を備えた物質に紫外線等を照射し、該紫外線の照射により生じた光学的な信号を測定する方法等を挙げることができる。電圧の印加によって生じた信号を測定する手段としては、例えば、電流値、電気伝導度、電位、抵抗値、電気容量、インダクタンスおよびインピーダンス等の電気的な信号を検出する手段や、蛍光、化学発光および電気化学発光を検出する手段を挙げることができる。また、紫外線の照射により生じた信号を測定する手段としては、例えば、蛍光を検出する手段を挙げることができる。
【００１８】
また、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長するにあたっては、該物質を予め担体に固定化しておくことが望ましい。これは、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーションを行う場合のように、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長する際に洗浄操作が必要なとき、該洗浄操作を容易に実施できるようにするためであるが、物質を担体に固定化するに際し、例えば、金、銀、銅、チタン、ニッケル、白金、炭素、水銀、パラジウム等の電極、光ファイバー、水晶振動子、ＩＳＦＥＴおよび各種の半導体素子等を担体とし、物質を該担体に固定化すれば、各標識を備えた物質からの情報を獲得するに際し電気的な測定を行う場合、容易に該情報を検出することが可能となる。また、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等、一般的に遺伝子操作に用いる担体であってもよく、ポリプロピレン等からなるマイクロタイタープレート、ポリスチレン、ラテックス等のビーズ、磁気微粒子、金コロイド等を担体として用いることも可能である。また、固定化の方法も特に限定されるものではなく、共有結合、物理吸着および化学吸着等により固定化することが可能てある。さらに、固定化に際しては、物質に特異的に結合する、例えば、抗体、抗原または核酸等の物質をあらかじめ担体に結合しておき、該物質を介して担体に対し物質を結合してもよい。
【００１９】
さらに、本発明に係る検出試薬は、上記第１および第２の標識を備えていればよいが、例えば、抗体、抗原または核酸等の物質と特異的に結合する物質を担体に結合しておき、上記標識とともに該担体を備えるように構成することも可能である。さらに、標識を介した伸長反応を実施する際に用いる緩衝液や酵素等を備えるように構成することも可能である。なお、検出試薬は、ＤＮａｓｅ  、ＲＮａｓｅ  あるいは各種のプロテアーゼ等により汚染されないよう密閉して保存できるように構成する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２１】
はじめに、第２および第３の標識としてアビジンおよびビオチンを適用し、一分子中にアビジンおよびビオチンを備えた物質を用いた検出方法について説明する。この場合、分子中のアビジンおよびビオチンにより分子内結合が生じないよう、分子中のアビジン−ビオチン間にスペーサを配置したり、剛直な分子構造をとらせたり、またはアビジン−ビオチン間で結合が生じない分子構造をとらせる必要があることから、例えば、α−ヘリックス構造を備えたポリアミド、ポリイミド、アラミド繊維、ステロイド、カリックスアレン、アルケン等の分子を介して、その末端にアビジンおよびビオチンをそれぞれ導入する。なお、アビジンおよびビオチンを導入するにあたっては、これを複数導入してもよく、また必ずしも同数である必要はない。また、上述したように、アビジンおよびビオチンをそれぞれ異なる分子にのみ備えるように構成することもでき、このとき、物質に対し各標識を連続的に結合させて伸長させる場合には、同一分子中にアビジンあるいはビオチンが２つ以上存在するように構成することが望ましい。なお、必要に応じて、アビジンおよび／またはビオチンを導入した分子を、例えば、ルミノ一ルおよびアクリジニュウムエステル誘導体等の発光物質、ＦＩＴＣおよびローダミン等の蛍光物質、ルテニウム錯体、ルシゲニンおよびユウロピウム等の電気化学発光物質、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ等の酵素、トリニトロベンゼンスルホン酸およびジニトロベンゼンスルホン酸等のハプテン、ビオチン、アビジン、スピンラベル剤および放射性同位元素等の標識剤により予め標識しておくことも可能である。また、標識剤として、ビオローゲン、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ピスベンズイミダゾール、エチジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシンマイトマイシン、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ピピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体、フェロセンカルポン酸、フェロセンアルデヒド等のフェロセン誘導体、フェリ／フェロシアン化カリウム、ハイドロキノン、カフェイン酸等のキノン誘導体等の電気化学的に活性な物質を適用することもできる。こうして、物質の備えた多数の標識剤より得られる情報を獲得すれば、高感度な物質の検出を実施することが可能となる。なお、電気化学的に可逆的な酸化還元を示す挿入剤を適用した場合、電位走査を数回〜数百回繰り返すことで酸化還元電流を繰り返して測定できることから検出信号の効果的な増幅を行うことが可能になり、さらに高感度な物質の検出を実施することが可能となる。例えば、アビ���ンおよびビオチンを同一分子内に備えた物質により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタに対しＨＢＶの遺伝子に対して特異的に結合するプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）を固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含まれると思われるサンプルおよびＨＢＶに対して特異的に結合し、かつプローブＡとは異なる塩基配列を備えたプロ一ブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行う。なお、プローブＢはあらかじめアビジンで標識してある。ハイブリダイゼーション反応後、蛍光色素フルオレセインで標識され、同一分子内に分子量１０００のポリエチレンを介してアビジンおよびビオチンが導入された分子を添加する。ここで、該分子を同時にあるいは交互に添加すると、該分子はアビジンおよびビオチンの結合により次々と結合してゆくので、アビジンおよびビオチンによる多量の情報（信号）を得ることが可能となる。最後に、フィルタを洗浄し、該フィルタより生じる蛍光強度を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。
【００２２】
また、第２および第３の標識としてアビジンおよびビオチンを適用した場合、アビジンおよびビオチンは異種の分子内にそれぞれ存在していてもよいが、この場合には、それぞれの分子内にアビジンおよびビオチン分子の少なくとも一方が複数存在する必要がある。この条件は、アビジンおよびビオチンを第２および第３の標識として用いた場合に限定されず、相互認識し結合しうる全ての標識に共通である。例えば、同一分子内にアビジン２つ備えた分子Ａと、同一分子内にビオチンを２つ備えた分子Ｂを合成し、該分子Ａおよび分子Ｂを用いてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタにＨＢＶに対するプローブＡを固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含むと思われるサンプルおよびＨＢＶに対するプローブＢを添加してハイブリダイゼーションを行う。なお、分子Ａおよび分子Ｂはあらかじめ蛍光色素（フルオレセイン）で標識され、プローブＢはあらかじめアビジンで標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、蛍光色素で標識した分子Ａおよび分子Ｂを交互あるいは同時に添加する。最後に、フィルタを洗浄し、該フィルタより生じる蛍光強度を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。
【００２３】
さらに、第２および第３の標識として核酸分子を用いた場合には、検出感度を向上させる目的から、例えば、図１および図２に示した分岐プローブを適用できる。このとき、ＤＮＡ合成装置を用いてフォスフォアミダイト法で３′−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成した後に、例えば、下記一般式で示される試薬を２回作用させ、その後、３′−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成する。すると、５つに枝別れした分岐プローブ（図１）を得ることができる。また、上記試薬を３回作用させ、その後、３′−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＣ−５′からなる塩基配列を備えた核酸を合成すると、９つに枝別れした分岐プローブ（図２）を得ることができる。なお、上記試薬を作用させる回数は、分岐プローブに要求される枝別れ数（側鎖の数）に応じて適宜設定すればよい。
【００２４】
【化７】
0003544830.tif 000005
一方で、分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸分子５′−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３′を同様に合成しておく。そして、分岐プローブと該核酸分子とを交互に添加してハイブリダイゼーションを実施すれば、分岐プローブの備えた枝（側鎖）の数に応じて更に側鎖が広がるように伸長することになる。したがって、分岐プローブおよび／または分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸に標識剤により標識をしたり、あるいは最後のハイブリダイゼーションが実施された段階で標識剤により核酸を標識して増幅された信号を獲得すれば、簡単に高感度な物質の検出が可能になる。もちろん、核酸に基づく情報（信号）を獲得する場合も全く同様にして簡単に高感度な物質の検出が可能になる。なお、分岐直後の核酸には、側鎖に起因する立体障害のため分岐プローブ間を結合させる直鎖の核酸が結合しにくくなる傾向があるので、５塩基以上からなるスペーサを導入することが望ましい。また、上記分岐プローブの作製に際しては、上記立体障害を防止する観点から、以下に示した式（１）を満足するように作製することが望ましい。すなわち、分岐プローブ中の分岐（側鎖）の数をＬ、核酸の長さ（塩基の数）をｎ、試薬による反応回数をｍとすると、
１０3ｎ（Ｌ＋１）（１−Ｌm）／（１−Ｌ）＜１．３×１０3ｎ3ｍ3 （１）
を満たすｎ、ｍおよびＬの組み合わせから選択して分岐プローブを作製することが望ましい。さらに、この条件で、Ｌmが最大になる組み合わせから選択して分岐プローブを作製することが望ましい。上記分岐プローブおよび分岐プローブ間を結合する核酸により、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出する場合には、ニトロセルロースフィルタに対しＨＢＶの遺伝子に対して特異的に結合するプローブＡを固定化する。ここに、ＨＢＶを含む、あるいは含まれると思われるサンプル、ＨＢＶと分岐プローブとに対して特異的に結合し、かつプローブＡとは異なる塩基配列を備えたプロ一ブＣ、分岐プローブおよび分岐プローブ間を結合する核酸を添加してハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション反応後、図３に示したように、フェロセン３１で分岐プローブ３２間を結合する核酸３３を標識すると、フェロセン３１による多量の情報（信号）を得ることが可能となる。最後に、ニトロセルロースフィルタを洗浄し、該フィルタを通じて電圧を印可してフェロセンより生じる電流値を測定すれば、ＨＢＶ遺伝子の検出を行うことができる。なお、上記ハイブリダイゼーションは、通常、イオン強度０．０１〜５、ｐΗ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。緩衝液中にはハイブリダイゼーションの促進剤である硫酸デキストラン、サケ精子ＤＮＡやウシ胸腺ＤＮＡ等のキャリア核酸、核酸の分解を防止するためにＥＤΤΑおよび界面活性剤等を添加することが可能である。ハイブリダイゼーションを行う際にキャリア核酸が混在する場合にはハイブリダイゼーションを阻害する可能性があるのでキャリア核酸の添加には慎重を期し、必要に応じて既知の塩基配列からなるキャリア核酸を添加するとよい。一方、試料より抽出した核酸がＤＮＡの場合には、９０℃以上で熱変性させ緩衝液中に混合する。なお、試料より抽出した核酸を９０℃以上で熱変性させた後、０℃で急冷して緩衝液中に混合することもできる。また、試料より抽出した核酸がＲＮＡの場合には、特に熱変性を実施する必要はない。ハイブリダイゼーション中は、攪拌又は震盪等の操作を行って反応速度を高めることも可能である。そして、１０〜９０℃の下、１分以上１晩程度の反応時間でハイブリダイゼーションを行えばよい。
【００２５】
また、図４は、電極を用いた検出装置の一実施形態を示した図である。図４において、４１は物質と特異的に結合するプローブ４２を固定化した電極、４３は反応槽であり、電源４４が電極４１および反応槽４３を介して回路を形成するように接続されている。また、回路の内部には、電流計４５、電圧計４６および可変抵抗４７が配置されており、反応槽４３内でハイブリダイゼーション等の反応を行った後に電圧を印加して回路に流れる電流等を測定するように構成されている。なお、反応槽４３の内部に保持される溶液は容易に置換することができ、測定時には反応槽４３の内部を新鮮なハイブリダイゼーション溶液等で置換することが可能である。図４における検出装置によれば、反応槽４３の内部に緩衝液（例えば、ハイブリダイゼーション溶液）、物質あるいは該物質を備えたサンプルおよび第１〜第３の標識を保持させ、それぞれの間でハイブリダイゼーション等の反応を行ってそれぞれを結合させる。このとき、ハイブリダイゼーションを行った場合には、該ハイブリダイゼーションの温度および時間は上述したように設定されることが望ましい。また、抗原抗体反応やゲスト−ホスト等の間の反応の場合にも、適宜反応条件を設定すればよい。次いで、好ましくは、反応槽４３および電極４１を洗浄し、反応槽４３の内部に新鮮な溶液（例えばハイブリダイゼーション溶液）を満たして電源４４を動作させ、電流値あるいは電圧値等を電流計４５や電圧計４６を用いて測定する。そして、測定結果より、サンプル中に含まれる物質の存在および量（濃度）が算出される。なお、上述したように、各種の標識剤を用いて検出感度をより向上させることが可能である。ここで、上記電極は、例えば、図５および図６に示した構成をとることができる。図５および図６は、上記電極の構成例を示す上面図（図５（ａ）および図６（ａ））およびＡ−Ｂ線で切断した場合の断面図（図６（ｂ）および図６（ｂ））である。図５においては、電極の基礎をなす基板５２上に導電体５１を形成している。そして、導電体５１および基板５２の一部に絶縁体５４を形成させた後、フォトリソグラフィーにより開口して露出した導電体からなる開口部５３を形成している。また、図６においては、電極の基礎をなす基板５２上に、まず接着層５５を形成している。そして、接着層５５の上に導電体５１を形成させた後、フォトリソグラフィーにより開口して露出した導電体からなる開口部５３を形成させている。
【００２６】
また、図７および図８は、上記電極を用いて完全に自動化された検出装置の一実施態様の構成を示す図である。
【００２７】
図７および図８において、検出装置は、上記の電極を具備した電極ホルダーと、上記電極および試料（物質）を反応させるための、温度可変の反応槽を具備した反応部と、反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）後に電極を洗浄するための、温度可変の洗浄槽を具備した第一洗浄部と、反応後の洗浄済み電極を挿入剤等の標識剤と反応させるための、温度可変の標識剤溶液槽を具備した標識剤反応部と、標識剤による反応後に電極を洗浄するための、温度可変洗浄槽を具備した第二洗浄部と、標識剤による反応後の洗浄済み電極の電気化学測定を行うための電気化学的測定部と、前記の電気化学的測定により得たデータを分析するための分析ユニットと、上記の一連の反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）、洗浄、標識剤による反応、洗浄、電気化学的測定を制御するための操作ユニットと、前記の反応部、第一洗浄部、標識剤反応部、第二洗浄部、電気化学的測定部を隣接してのせた移動装置とを備えている。なお、上記検出装置には、さらに、検出用の試料（検体）を搬入する搬入口と、試料から核酸等を抽出するための試料調整ユニットと、該搬入口と該試料調製ユニットとの間および該試料調製ユニットと前記反応部との間の、試料の移動を行う搬送ユニットと、前記の反応（ハイブリダイゼーションや抗原抗体反応等による標識の連続的な伸長反応）、洗浄、挿入剤反応時に生じる廃液を保管する気ための廃棄物保管ユニットとを備えていることが好ましい。
【００２８】
図７に示した検出装置７０は、上記電極を保持するための電極固定ホルダ７１、反応槽７２、第１洗浄槽７３、標識剤反応槽７４、第２洗浄槽７５および電気化学測定槽７６、並びに反応槽７２、洗浄槽７３、標識剤反応槽７４、洗浄槽７５および電気化学測定槽７６をのせた移動装置７７、並びに分析ユニット７８および操作ユニット７９を具備している。これらの槽の間での電極の移動は、移動装置７７を使って反応槽７２等を動かすことにより達成される。反応槽７２に、試料あるいは予め試料から抽出しておいた核酸等の物質を含有した溶液を入れておき、電極固定ホルダ７１に固定された上記電極を反応槽７２に浸す。次いで、反応槽７２中で、物質とプローブを固定化した電極との結合および物質に標識を連続的に結合させて伸長反応を行う工程と、洗浄工程と、標識剤反応工程と、洗浄工程と、電気化学工程とを順次行う。次の第１洗浄槽７３では、通常、電極を２５℃から８０℃の間で温度制御しながら洗浄する。この工程により、非特異的に電極に結合した核酸や蛋白質等を取り除くことができる。次に、標識剤溶液槽７４で、洗浄済み電極を２５℃から８０℃の間の温度で制御して、標識剤と電極上に形成された物質−標識複合体との反応を行わせる。次の第２洗浄槽７５では、電極を２５℃から８０℃の間で温度制御しながら洗浄する。更に、電気化学測定槽７６で、電気的な測定を行う。測定終了後、分析ユニット７８に予め記録されている検量線を参考にして試料中の検出対象の物質（例えば、遺伝子等）の濃度がアウトプットされる。以上の操作を、それぞれの槽及びユニットと電気的につながれた操作ユニット７９を通じて行う。また、図８に示した検出装置８０は、図７に示した検出装置に加えて、試料搬入口８１と、試料調製ユニット８３と、該試料搬入口８１と該試料調製ユニット８３との間、および該試料調製ユニット８３と上記検出装置７０との間を結ぶ試料搬送ユニット８２、並びに廃棄物保管ユニット８５とを備えている。この態様においては、試料を試料搬入口８１に入れた後、該試料は、試料搬送ユニット８２を通って試料調製ユニット８３に運ばれ、該試料調製ユニット８３で核酸等の物質の抽出や菌体の洗浄等が行われる。抽出された物質は該試料搬送ユニッ卜８２を通って上記検出装置７０に運ばれて上述した検出が行われる。また、廃棄物保管ユニット８５に、洗浄工程等において生じた廃棄物を一時的に保存する。なお、上記実施の形態においては、電極固定ホルダに電極を保持し、電気的な測定を電気化学測定槽で行っているが、電極の代わりにマイクロタイタープレートを適用することもできるし、電気化学測定槽の代わりに光学的な測定を行う光学機器を搭載するように構成することもでき、検出装置の各構成は、検出に用いる物質や検出する情報の量および質に鑑みて適宜設定すればよい。
【００２９】
また、図９、図１０および図１１は、検出試薬の一実施態様の構成を示す図である。図９に示したように、検出試薬９０は、直径０．３ｍｍの開口部５３を備えた金電極５０、チューブ９１および９２を備えており、金電極５０、チューブ９１および９２は、例えば、以下に示す構成を備えている。すなわち、ＨＢＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）を固定化し、チューブ９１にはＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えアビジンで標識されたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２には分子量１０００のＰＢＬＧ分子の末端にアビジンとビオチンが導入され、さらにへキスト３３２５８で標識された分子Ｃが収納された構成である。また、他のＨＢＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡを固定化し、チューブ９１にはＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えアビジンで標識されたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２には同一分子内にビオチンを複数備えフェロセンで標識した分子Ｄおよびフェロセンで標識したアビジンからなる分子Ｅが収納された構成である。なお、分子ＥはポリエチレンイミンとＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｄ−ｂｉｏｔｉｎ  とカルボキシフェロセンを反応させて得ることができる。さらに、ＨＣＶ遺伝子検出試薬として、開口部５３にＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）を固定化し、チューブ９１にはＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）が収納されるとともに、チューブ９２にはプローブＥと結合する分岐プローブおよびフェロセンで標識され分岐プローブ同士を結合させるプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）が収納された構成である。
【００３０】
また、図１０に示したように、検出試薬１００は、抗血清抗体を固定化したラテックスビーズを収納したチューブ１０１、アビジン標識した抗ＡＦＰ抗体を収納したチューブ１０２、分子量１００００のＰＢＬＧを介してアビジンおよびビオチンを備えＨＲＰ酵素で標識された物質Ｆを収納したチューブ１０３およびＨＲＰ酵素の基質としてＡＢＴＳを収納したチューブから構成されている。  さらに、図１１に示したように、検出試薬１１０は、各ウェル１１１にＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＧ（５’−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’：ＳＫ３８）を固定化したマイクロタイタープレート１１２、５’末端にチオール基を導入しＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＨ（５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’：ＳＫ３９）を収納したチューブ１１３、金のコロイド粒子を収納したチューブ１１４およびジチオスレイトールを収納したチューブから構成されている。なお、本発明に係る検出試薬は、上記実施の形態に何ら限定されるものではなく、標識の種類および保存形態等は検出対象となる物質や標識の特性等にあわせて適宜設定されることはいうまでもない。
【００３１】
（実施例１）
実施の形態に記載した検出装置を用いて血清中よりＨＢＶの検出を行った。はじめに、ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）は、５’末端にチオール基が導入され、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化されている。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、分子量１０００のＰＢＬＧ分子の末端にアビジンとビオチンが導入されヘキスト３３２５８で標識された分子を添加し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのヘキスト３３２５８に由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３２】
（実施例２）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、同一分子内にアビジン４つ備えフェロセンで標識された分子Ｆと、同一分子内にビオチンを４つ備えフェロセンで標識された分子Ｇとを添加し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として１０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを１００００コピー含む試料の場合１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１００００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３３】
（実施例３）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＡ（５’−ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＢＶの核酸を含むサンプルおよびＨＢＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＢ（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブＢはあらかじめアビジンにて標識されている。ハイブリダイゼーション反応後、同一分子内にアビジンを２つ備えフェロセンで標識された分子Ｈを添加して洗浄し、同一分子内にビオチンを２つ備えフェロセンで標識された分子Ｉを添加した。上記分子Ｈおよび分子Ｉによる伸長反応を３０回繰り返し、洗浄後、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＢＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として１０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＢＶを５０００コピー含む試料の場合５０ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、５０００コピー以上のＨＢＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３４】
（実施例４）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離し、あらかじめ抗血清抗体を固定化したラテックスビーズと反応させた。次に、該ラテックスビーズとアビジンにより標識した抗ＡＦＰ抗体とを反応させ、洗浄後、分子量１００００のＰＢＬＧを介してアビジンおよびビオチンを備えた分子Ｊを添加した。なお、分子ＪはあらかじめＨＲＰ酵素で標識されている。上記反応後、洗浄を行って基質ＡＢＴＳを添加し吸光度を測定した。また、ＨＢＶの検出は得られた吸光度から評価した。その結果、ＡＦＰを０．１ｐｇ含む試料の場合、ＡＦＰを含まない試料を用いた場合と比較して吸光度の変化が有為に観察された。したがって、０．１ｐｇ以上のＡＦＰを検出できることが確認された。
【００３５】
（実施例５）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５′−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＣＶの核酸を含むサンプルおよびＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、図１に示した構成の分岐プローブと、フェロセンで標識され該分岐プローブを連続的に伸長させるためプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）とを交互に添加して１０回にわたりハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行い、燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）を行って電流値を測定した。また、ＨＣＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＣＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＣＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＣＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３６】
（実施例６）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＤ（５′−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３’）の５’末端にチオール基を導入して、図５に示す金電極の開口部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＣＶの核酸を含むサンプルおよびＨＣＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えたプローブＥ（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、図２に示した構成の分岐プローブと、フェロセンで標識され該分岐プローブを連続的に伸長させるためプローブＦ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’）とを交互に添加して１０回にわたりハイブリダイゼーションを行った。さらに、フェロセンにて標識されたプローブＧ（５’−ＧＧＴＴＣＡＴＴＧＧ−３’）を添加してハイブリダイゼーション行い、ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行って燐酸緩衝液中で電気化学的な測定（サイクリックボルタンメトリー）により電流値を測定した。また、ＨＣＶの検出は得られた電流値から評価した。なお、ＨＣＶを含まない試料を用いた場合には、バックグラウンド電流として５０ｎＡの電流値が観察された。これに対し、ＨＣＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、１００ｎＡのフェロセンに由来の電流値が得られた。したがって、１０００コピー以上のＨＣＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３７】
（実施例７）
ヒトの抹消静脈血から血清成分を分離して核酸の抽出を行った。一方、ＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備えた２０−ｍｅｒのプローブＨ（５′−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３’：ＳＫ３８）をマイクロタイタープレートのウェルの底部に化学吸着で固定化した。次に、ＨＩＶの核酸を含むサンプルおよびＨＩＶの塩基配列に対し相補的な塩基配列を備え、５’末端にチオール基が導入されたプローブＩ（５’−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’：ＳＫ３９）を添加してハイブリダイゼーションを行った。次に、金コロイド粒子を添加して洗浄しジチオスレイトールを反応させた。金コロイド粒子の添加とジチオスレイトールによる反応を１０回繰り返した後、金コロイドの凝集の程度を確認した。なお、ＨＩＶを含まない試料を用いた場合には、金コロイドの凝集塊はほとんど観察されなかった。これに対し、ＨＩＶを１０００コピー含むサンプルを用いた場合には、金コロイドの凝集塊が大きく成長していた。したがって、１０００コピー以上のＨＩＶに由来する核酸を検出できることが確認された。
【００３８】
（実施例８）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗ダイオキシン抗体を結合させた。次に、ビオチン標識したダイオキシンとダイオキシンが含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。なお、物質Ｋは、ポリエチレンイミンと５−（ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｅｎｔｙｌ  Ｄ−ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ  とを反応させて得た。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、ダイオキシンを０．１ｐｇ含む試料を用いた場合には、ダイオキシンを含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、０．１ｐｇ以上のダイオキシンを検出できることが確認された。
【００３９】
（実施例９）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗ベロ毒素抗体を結合させた。次に、ビオチン標識したベロ毒素とベロ毒素が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、ベロ毒素を０．１ｐｇ含む試料を用いた場合には、ベロ毒素を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、０．１ｐｇ以上のベロ毒素を検出できることが確認された。
【００４０】
（実施例１０）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗大腸菌抗体を結合させた。次に、ビオチン標識した抗Ｏ−１５７抗体と大腸菌が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジンおよび同一分子内にビオチンを複数備えた物質Ｋを交互に１０回にわたり添加した。最後に、ビオチン標識したＨＲＰ酵素を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、大腸菌Ｏ−１５７を１００個含む試料を用いた場合には、大腸菌Ｏ−１５７を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、１００個以上の大腸菌Ｏ−１５７を検出できることが確認された。
【００４１】
（実施例１１）
マイクロタイタープレートのウェルの底部に抗大腸菌抗体を結合させた。次に、ビオチン標識した抗Ｏ−１５７抗体と大腸菌が含まれると推測されるサンプルとを上記マイクロタイタープレートのウェルに添加し３７℃で１時間反応させた。洗浄後、Ｏ−１５７血清およびＯ−１５７抗体を交互に１０回にわたり添加した。最後に、ＨＲＰ酵素を結合した抗Ｏ−１５７抗体を反応させ、ＨＲＰ酵素と基質ＡＢＴＳとの酵素反応に基づく発色を検出した。検出の結果、大腸菌Ｏ−１５７を１００個含む試料を用いた場合には、大腸菌Ｏ−１５７を含有しない試料を用いた場合と比較して有為な吸光度の変化を確認することができた。したがって、１００個以上の大腸菌Ｏ−１５７を検出できることが確認された。
【００４２】
【発明の効果】
以上、詳述したように、本発明に係る検出方法によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出方法を提供することができる。
【００４３】
また、本発明に係る検出装置によれば、増幅された多量の情報を得ることができるので、物質を高感度に検出することが可能な検出装置を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出装置を提供することができる。
【００４４】
さらに、本発明に係る検出試薬によれば、増幅された多量の情報を発信することが可能な検出試薬を提供することができる。また、優れた経済性および操作性を発揮することが可能な検出試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】分岐プローブの構成を示した図である。
【図２】分岐プローブの構成を示した図である。
【図３】分岐プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った場合の模式図である。
【図４】検出装置の実施形態を示した図である。
【図５】電極の構成例を示した図である。
【図６】電極の構成例を示した図である。
【図７】電極を備えた検出装置の一実施態様を示した図である。
【図８】電極を備えた検出装置の一実施態様を示した図である。
【図９】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【図１０】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【図１１】検出試薬の一実施態様を示した図である。
【符号の説明】
１０、２０……分岐プローブ    ３１……フェロセン
３２……分岐プローブ    ３３……核酸
３４……ニトロセルロースフィルタ    ３５……プローブＡ
３６……プローブＣ    ４１……電極    ４２……プローブ
４３……反応槽    ４４……電源    ４５……電流計    ４６……電圧計
５１……導電体    ５２……基板    ５３……開口部    ５４……絶縁体
５５……接着層    ７０、８０……検出装置  ７１……電極固定ホルダ
７２……反応槽    ７３……第１洗浄槽    ７４……標識剤溶液槽
７５……第２洗浄槽    ７６……電気化学測定槽    ７７……移動装置
７８……分析ユニット    ７９……操作ユニット    ８１……試料搬入口
８２……試料搬送ユニット    ８３……試料調製ユニット
８４……制御ユニット    ８５……廃棄物保管ユニット
８６……廃液保管ユニット    ８７……試薬供給ユニット
８８……分析ユニット    ９０、１００、１１０……検出試薬
９１、９２、１０１〜１０３、１１３〜１１４……チューブ
１１１……ウェル    １１２……マイクロタイタープレート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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