(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0003544549.tif 000021
［式中、
Ｘは−ＣＨ２−ＣＨ２−；
Ｙは−ＣＨ２−；
Ｚは−ＣＨ２−ＣＨ２−；
Ｒ１とＲ２の各々は式（ａ）：
【化２】
0003544549.tif 000022
{式中、Ｒ５は−ＮＨ２または−ＮＨＹ’ａ（式中、Ｙ’ａは保護基である。）、Ｒ６は−ＣＯＯＨまたはＣ２−７アルコキシカルボニルである。}で示される基；
Ｘ１はＨまたはＯＨ；
【化３】
0003544549.tif 000023
は陰イオン；
Ｒ３は式（ａ）：
【化４】
0003544549.tif 000024
{式中、Ｒ５は−ＮＨ２または−ＮＨＹ’ａ（式中、Ｙ’ａは保護基である。）、Ｒ６は−ＣＯＮＨ−Ｚａ−Ｙｂ（式中、Ｙｂは抗原性基、Ｚａはスペーサー基である。）である。}で示される基；
Ｒ４はヒドロキシ、Ｃ１−６ アルコキシまたはポリアルキレンオキシであるか、
または
Ｘは−ＣＨ２−ＣＨ２−；
Ｙは−ＣＨ２−；
Ｚは−ＣＨ２−ＣＨ２−；
Ｒ１とＲ３の各々は式（ａ）：
【化５】
0003544549.tif 000025
{式中、Ｒ５は−ＮＨ２または−ＮＨＹ’ａ（式中、Ｙ’ａは保護基である。）、Ｒ６は−ＣＯＯＨまたはＣ２−７アルコキシカルボニルである。}で示される基；
Ｘ１はＨまたはＯＨ；
【化６】
0003544549.tif 000026
は陰イオン；
Ｒ２は式（ａ）：
【化７】
0003544549.tif 000027
{式中、Ｒ５は−ＮＨ２または−ＮＨＹ’ａ（式中、Ｙ’ａは保護基である。）、Ｒ６は−ＣＯＮＨ−Ｚａ−Ｙｂ（式中、Ｙｂは抗原基、Ｚａはスペーサー基である。）である。}で示される基；
Ｒ４はヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはポリアルキレンオキシである。］
で示される化合物の製造方法であって、
式ＩＩ
【化８】
0003544549.tif 000028
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は上記で定義された通りである。］
で示される化合物を、式ＩＩＩ
Ｘ５−ＣＨ２−ＣＨＸ１−Ｚ−Ｒ３                  （ＩＩＩ）
［式中、
Ｘ１、ＺおよびＲ３は上記で定義された通りであり、Ｘ５は脱離基である。］
で示される化合物と反応させ、必要に応じて、ここに得られた上記式Ｉの化合物を別の上記式Ｉの化合物へ変換し、必要に応じて、ここに得られた化合物を遊離形または塩形で採取すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
製造される化合物が、式ＩＡ
【化９】
0003544549.tif 000029
［式中、Ｘ１はＨまたはＯＨ；
【化１０】
0003544549.tif 000030
は塩化物または酢酸イオンである。］
の化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式ＩＩ
【化１１】
0003544549.tif 000031
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は請求項１で定義された通りである。］で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明はピリジン誘導体、それらの製造方法およびヒトおよび動物における骨および他の結合組織の病変を検出する診断における使用に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
【０００２】
式ＩＡ
【化１５】
0003544549.tif 000002
［式中、Ｘ1はＨまたはＯＨであり、
【化１６】
0003544549.tif 000003
は塩化物イオンまたは酢酸イオンである。］
で示される化合物は、６モルのＨＣｌによる約１０８℃、約２４時間の加水分解による（オイレ（Ｅｙｒｅ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８４年、５３巻、７１７−７４８頁参照）かまたは溶離剤として酢酸を使用するクロマトグラフィー（Ｄ．Ｒ．オイレ（Ｅｙｒｅ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３７巻、３８０−３８８頁（１９８４年）参照）によって尿から抽出された。式ＩＡの化合物は、一定期間にわたる尿排泄物中のそれらの濃度の定量に基づいて代謝的骨および軟骨病におけるコラーゲンの分解の指標として開示されてきた（ウ（Ｗｕ）およびオイレ（Ｅｙｒｅ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８４年、２３巻、１８５０年、ロビンズ（Ｒｏｂｉｎｓ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８８年、１６９巻、１９７−２０３頁、Ｄ．イーベルハルト（Ｕｅｂｅｌｈａｒｔ）ら、ボーン・アンド・ミネラル（Ｂｏｎｅａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ）、１９９０年、８巻、８７−９６頁参照）。
【０００３】
例えばヒトにおける骨再吸収の測定のための結合組織代謝異常のマーカーとしてのこれらの化合物（文献ではピリジノリン［Ｘ1＝ＯＨ］およびデオキシピリジノリン［Ｘ1＝Ｈ］架橋と呼ばれる）への関心は高まりつつある。
【０００４】
しかし、式ＩＡの化合物は現在のところ抽出によって得られた天然の化合物であるので、標準化された再生産可能な、信頼すべき、時間を費やさない検定を行なうという要請には応えていない。
【０００５】
明確な標準ピリジノリン架橋に対する高い需要がある。
【０００６】
この発明の目的は、充分に基準化された条件の下で骨代謝回転測定ができるように実質的に純粋な形の式ＩＡの化合物の生産を含む、新規ピリジン誘導体および化学的合成によるそれらの生産を提供することである。
【０００７】
より具体的には、この発明は式Ｉ
【化１７】
0003544549.tif 000004
［式中、
Ｘ、ＹおよびＺは個別にＣ1-8アルキル、Ｏ、ＮおよびＳから選択された１個または２個のヘテロ原子によって中断されたＣ1-8アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−Ｃ1-4アルキル、（Ｃ1-4アルキル）−シクロアルキル、（Ｃ1-4アルキル）−シクロアルキレン−Ｃ1-4アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリール、（Ｃ1-4アルキル）−アリール、（Ｃ1-4アルキル）−ヘテロアリール、（Ｃ1-4アルキル）−アリーレン−Ｃ1-4アルキル、（Ｃ1-4アルキル）−ヘテロアリーレン−Ｃ1-4アルキル、アリル−Ｃ1-4アルキル、ヘテロアリール−Ｃ1-4アルキルであり、前記基中のアリールまたはヘテロアリール部分は所望により置換されていてもよい。Ｒ3はＣＯＯＨまたはその官能誘導体、ＣＨＯ、ＣＮ、Ｃ1-8アルコキシ、ＳＯ2、−ＰＯ3Ｈまたはその官能誘導体、第一、第二または第三級アミノ基、飽和または不飽和環状アミノ基、または式（ａ）、
【化１８】
0003544549.tif 000005
［式中、
Ｒ5は第一、第二または第三級アミノ基または飽和または不飽和環状アミノ基であり、
Ｒ6は−ＣＯＯＨまたはその官能誘導体である。］
で示される基であり、
Ｒ1およびＲ2の各々は個別に、水素またはＲ3に与えられる意味の１つをもち、Ｒ4はヒドロキシ、Ｃ1-6 アルコキシ、またはポリアルキレンオキシであり、
Ｘ1はＨまたはＯＨであり、
【化１９】
0003544549.tif 000006
は陰イオンである。
但し、
ｉ）ＸおよびＹは両方ともアルキル部分を含み、−Ｙ−におけるアルキル部分の鎖長は−Ｘ−におけるアルキル部分より少なくとも１個の炭素原子分短く、
ｉｉ）
【化２０】
0003544549.tif 000007
は−Ｘ−Ｒ1および−Ｚ−Ｒ3が
【化２１】
0003544549.tif 000008
−Ｙ−Ｒ2が
【化２２】
0003544549.tif 000009
であり、Ｒ4がヒドロキシのとき、
【化２３】
0003544549.tif 000010
以外である。］
で示される化合物を提供する。
【０００８】
Ｃ1-8アルキルは好ましくはＣ1-6アルキル、より具体的にはＣ1-4アルキル、特にＣ1-2 アルキルである。
【０００９】
好ましくはアリールはフェニルまたは１−または２−ナフチル、具体的にはフェニルを意味する。アリールは、例えばヒドロキシ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシおよび／またはハロゲンによって１−、２−または３置換されるように、置換され得る。好ましくはアリールは非置換または１−置換フェニルである。
【００１０】
好ましくはヘテロアリールは、例えばイミダゾリル、チアゾリル、ピペリジニル、ピペラジニルまたはフタロイルなどの５−または６−員ヘテロ環状環を意味する。置換される場合、それはヒドロキシ、アルキル、アルコキシおよび／またはハロゲンによって１−、２−または３−置換され得る。好ましくはヘテロアリールは非置換である。
【００１１】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ5が第二級アミノ基であるとき、それは好ましくは−ＮＨＲa［式中、ＲaはＣ1-8アルキル、所望によりＣＯＯＨまたはその官能誘導体で置換されていてもよいＣ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキル−Ｃ1-8アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ1-8アルキル、またはＲaは基−Ｙaまたは−Ｚa−Ｙb（式中、Ｙaは保護基または共有結合的に抗原または保護基と反応することができる基であり、Ｚaはスペーサーであり、Ｙbは保護または抗原性基である。）、ビオチニルまたはビオチン−アビジンツールのような別の分子との複合体を形成することができる分子から誘導される基である。］である。
【００１２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ5が第３級アミノ基であるとき、それは好ましくは−ＮＲaＲa’［式中、Ｒaは前記で定義された通りであり、Ｒa’はＲaに与えられた意味の１つを個別にもつ。好ましくはＲaおよびＲa’はお互いを妨げない２つの置換基である。］である。
【００１３】
ＹaまたはＹbとしてのＮ−保護基は例えば、”プロテクティブ・グループ・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、Ｊ．ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＮＹ）（１９８１年）、２１９−２８７頁で開示されたような、例えばホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、メトキシスクシニル、ヒドロキシスクシニルなどのアシル、または所望によりフェニル環上で例えばｐ−メトキシカルボニル、ｐ−メトキシ、ｐ−ニトロ、ｐ−フェニルスルホンアミドカルボニルなどで置換されていてもよいベンゾイル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニルまたはメトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどのアリールメトキシカルボニルまたは所望によりフェニル環上でｐ−メトキシ、ｐ−ニトロ、ｏ−またはｐ−クロロ、ｍ−フェニルまたは３、４−ジメチルで置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、トリチル、所望によりｐ−メトキシ、ｐ−ニトロまたはｐ−クロロで環置換されていてもよいベンジルのようなアリールメチル、または所望によりｐ−メチルまたはｐ−メトキシで環置換されていてもよいフェニルスルホニル、または所望により例えばアミノまたはジ（Ｃ1-4アルキル）アミノで環置換されていてもよいナフチルスルホニルなどのアリールスルホニルなどの基を含む。
【００１４】
カルボン酸官能誘導体の例は、酸ハロゲン化物、酸無水物（混合酸無水物を含む）、活性エステル類、活性アミド類、などである。酸ハロゲン化物の中では、酸塩化物が最も頻繁に使用される。酸無水物の例は、環状無水物およびジアルキルリン酸混合無水物、ジアルキル亜リン酸混合無水物などの混合無水物を含む。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ6としての活性化エステル類の例は、例えばメチルエステルまたはエチルエステルなどのＣ1-8アルキルエステル、シアノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをもつエステル、所望により環置換されていてもよいフェニルまたはベンジルエステル、またはフルオレニルメチルエステルを含む。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ6としての活性カルボン酸アミド類の例は、イミダゾル、ジメチルイミダゾルまたはトリアゾルをもつアミド類を含む。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ6のようなカルボン酸アミド基はまた、例えば前記で定義されたような−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲaまたは−ＣＯＮＲa Ｒa’であり得る。
【００１５】
−ＳＯ3Ｈまたは−ＰＯ3Ｈの官能誘導体の例は、例えばＣ1-6 アルキル、ベンジル、フェニル、アリルまたはトリメチルシリルエステル類、例えば酸塩化物などの酸ハロゲン化物、または例えばジエチルまたはジイソプロピルアミド類などの低級ジアルキルアミド類である。好ましくは、例えば、”アルコキシ”がメトキシ、ブトキシ、アリルオキシまたはベンゾキシであり、”ジアミノ”がジエチルアミノ、ジプロピルアミノまたはジイソプロピルアミノであるホスフィンなどの（アルコキシ）（ジアミノ）ホスフィン類である。
【００１６】
陰イオン
【化２４】
0003544549.tif 000011
は例えば
【化２５】
0003544549.tif 000012
などを含む。
【００１７】
好ましいＺaなどのスペーサーの基は、式（ｂ）
−Ｒ7−Ｘ3−          （ｂ）
［式中、
Ｘ3は、保護基または抗原と共有結合生成反応をすることができる官能部分から誘導される二価の基であり、
Ｒ7は、所望により一個以上のヘテロ原子または酸素、硫黄、ＣＯ、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1-4アルキル）−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｎ（Ｃ1-4アルキル）−、−ＮＨ−および−Ｎ（Ｃ1-4アルキル）から選択された基によって中断されていてもよいＣ1-6アルキレン、ヒドロキシ置換Ｃ1-6アルキレン、Ｃ2-6アルケニレン、
【化２６】
0003544549.tif 000013
または式（α1）
【化２７】
0003544549.tif 000014
（式中、ｓおよびｔの各々は個別に、０、１、２または３であり、環Ａは所望により置換されていてもよく、Ｒ8は、所望により保護されていてもよい天然または非天然のα−アミノ酸のＣα中に付着された残基である。）
で示される遊離基である。］
で示される遊離基を含む。
【００１８】
Ｚ1およびＸ3の各々は個別に、例えば、−ＣＯ−、−ＣＳ−または−ＮＨ−であり得る。
【００１９】
Ｒ8の例は、例えば、リシン中のＣα上に存在する、所望によりＮ−保護されていてもよい残基を含む。
【００２０】
式（ｂ）の遊離基の適当な例は、例えばスクシニル、β−Ａｌａまたは３−アミノ−プロパン酸、３−アミノイソブタン酸、４−アミノブタン酸、ＮＨ2−Ｃ（ＣＨ3）2−ＣＯＯＨ、６−アミノヘキサン酸、１，８−ジアミノオクタン、１，６−ジアミノヘキサンまたはＮＨ2−（ＣＨ2）1-4−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）1-6−ＮＨ2 から誘導された二価の残基である。
【００２１】
抗原またはＹaのような保護基と共有結合的に反応させることができる適当な基は、例えば、式（ｂ1）
−Ｒ7−Ｘ4                   （ｂ1）
［式中、
Ｒ7は前記で定義された通りであり、
Ｘ4は抗原または保護基と反応させることができる官能部分である。］
で示される基を含む。
Ｘ4の例は、例えば、抗原または保護基と反応させることができるカルボキシ、アミノ、またはその官能誘導体を含む。式（ｂ1）の基中、Ｒ7は好ましくはＣ1-6アルキレンまたはＣ2-6 アルケニレンである。
【００２２】
抗原基とは、例えばウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、チログロブリンまたはキーホールリンペット（スカシガイ）ヘモチアニン、などの抗体の製造に使用される担体分子から、または例えば、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）３７巻、１９９１年、４６−５７頁（これを引用して本明細書の記載に包含させる。）中でＧ．ユング（Ｊｕｎｇ）らにより開示されているような脂肪親和性部分がトリパルミトイルである化合物などの免疫刺激性リポアミノ酸またはリポペプチドから誘導された基を意味する。リポペプチド類の例は、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル］−［Ｒ］−システイン（Ｐａｍ3Ｃｙｓ−ＯＨと呼ばれる）、Ｐａｍ3Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、Ｐａｍ3Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）4およびＰａｍ3Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｕ）4である。
【００２３】
式Ｉの化合物中、下記の意味が単独でまたはいづれかの組合せまたは副組合せにおいて好ましい。
【００２４】
１．Ｘは−（ＣＨ2）n−［式中、ｎは２から８までの整数である。より好ましくはｎは２である。］
２．Ｙは−（ＣＨ2）m−［式中、ｍはｎ−１である。より好ましくはｍは１である。］
３．Ｚは−（ＣＨ2）p−［式中、ｐは１から８までの整数である。より好ましくはｐは２である。］
４．Ｒ4はＯＨ。
【００２５】
５．Ｒ1は水素、カルボキシまたはその官能誘導体、第一、第二または第三級アミノ基、または式（ａ）の基、好ましくは式（ａ）の基。
６．Ｒ2は水素、カルボキシまたはその官能誘導体、第一、第二または第三級アミノ基、または式（ａ）の基、好ましくは式（ａ）の基。
７．Ｒ3はカルボキシまたはその官能誘導体、第一、第二または第三級アミノ基、または式（ａ）の基。
【００２６】
８．式（ａ）の基は、
【化２８】
0003544549.tif 000015
［式中、Ｒ’5は−ＮＨ2または−ＮＨＲaである。］またはその官能誘導体例えば［式中、Ｒ’5は−ＮＨ2、−ＮＨＹaまたは−ＮＨＺa−Ｙbである。］で示される基であり、カルボキシは、例えばエステルまたはアミドなどのその官能誘導体によって置き換えられる。
【００２７】
９．式（ａ）の基において、Ｒ’5は−ＮＨＺa−Ｙbである。
１０．式（ａ）の基において、Ｒ’5が−ＮＨＺa−Ｙb であるとき、Ｙbは好ましくは抗原性基、より好ましくはウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペット（スカシガイ）ヘモシアニンから誘導された抗原性基である。
【００２８】
１１．式（ａ）の基は
【化２９】
0003544549.tif 000016
［式中、Ｒ’5はＮＨ2またはＮＨＹaである。Ｒaは好ましくはＺa−Ｙb である。］。Ｙbは好ましくは抗原基、より好ましくはウシ血清アルブミンまたはキーホール（リンペット（スカシガイ）ヘモシアニンから誘導された抗原性基である。
【００２９】
好ましい具体例に従って、この発明は式Ｉ、［式中、Ｘは−ＣＨ2−ＣＨ2−、Ｙは−ＣＨ2−、Ｒ1およびＲ2の各々は式（ａ）、（式中、Ｒ5は−ＮＨ2またはＮＨＹ’a（式中、Ｙ’aは保護基である。）Ｒ6は−ＣＯＯＨまたはＣ2-7アルコキシカルボニルである。）の残基であり、Ｘ1はＨまたはＯＨ、好ましくはＨ、Ｚは−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、Ｒ3は式（ａ）（式中、Ｒ5は−ＮＨ2またはＮＨＹ’aであり、Ｒ6は−ＣＯＮＨ−Ｚa−Ｙbまたは−ＣＯＮＨＹa である。）の残基である。］で示される化合物を提供する。
【００３０】
別の好ましい具体例に従って、この発明は式Ｉ、［式中、Ｘは−ＣＨ2−ＣＨ2−、Ｚは−ＣＨ2−ＣＨ2−、Ｒ1およびＲ3の各々はは式（ａ）、（式中Ｒ5は−ＮＨ2またはＮＨＹ’aであり、Ｒ6は−ＣＯＯＨまたはＣ2-7アルコキシカルボニルである。）の残基であり、Ｘ1はＨまたはＯＨ、好ましくはＨ、Ｙは−ＣＨ2−であり、Ｒ2は式（ａ）、（式中、Ｒ5はＮＨ2または−ＮＨＹ’aであり、Ｒ6は−ＣＯＮＨ−Ｚa−Ｙbまたは−ＣＯＮＨＹaである。）の残基である。］で示される化合物を提供する。
【００３１】
さらに好ましい具体例に従って、この発明は、式Ｉ、［式中、Ｚは−ＣＨ2−ＣＨ2−、Ｙは−ＣＨ2−、Ｒ2およびＲ3の各々が式（ａ）（式中、Ｒ5は−ＮＨ2またはＮＨＹ’aであり、Ｒ6が−ＣＯＯＨまたはＣ2-7アルコキシカルボニルである。）の残基であり、Ｘ1がＨまたはＯＨ、好ましくはＨ、Ｘは−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、Ｒ1は式（ａ）（式中、Ｒ5は−ＮＨ2または−ＮＨＹ’aであり、Ｒ6は−ＣＯＮＨ−Ｚa−Ｙbまたは−ＣＯＮＨＹaである。）で示される残基である。］で示される化合物を提供する。
【００３２】
式ＩおよびＩＡの化合物は、例えば塩形で存在し得る。塩は、例えば塩酸塩および酢酸塩のような有機酸、高分子酸または無機酸との酸付加塩、例えばアルカリ金属塩または置換または非置換アンモニウム塩および分子が少なくとも１個の式（ａ）の遊離基を含む場合のいわゆる内部塩のような、分子中に存在するカルボン酸、スルホン酸またはリン酸基で得られる塩形を含む。
【００３３】
式（ａ）の基は不斉炭素原子を含み、ＤまたはＬ配置で存在し得る。式ＩおよびＩＡの化合物はまた、Ｘ1がＯＨの場合に不斉炭素を含む。この発明は式ＩＡの化合物および式Ｉ、［式中、Ｘ1はＯＨであり、式（ａ）の３個の基までが分子中に存在する。］で示される化合物の光学的異性体およびジアステレオ異性体を含むと理解され得る。同様な事が、式（ａ）で示される基を含むか、またはＸ1がＯＨである出発物質に関して適用される。
【００３４】
この発明はまた、
ａ）式ＩＩ、
【化３０】
0003544549.tif 000017
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は前記で定義された通りである。］
で示される化合物を式ＩＩＩ、
Ｘ5−ＣＨ2−ＣＨＸ1−Ｚ−Ｒ3          （ＩＩＩ）
［式中、
Ｘ1、ＺおよびＲ3は前記で定義された通りであり、
Ｘ5は脱離基である。］
で示される化合物と反応させるかまたは、
ｂ）式ＩまたはＩＡの化合物を別の式ＩまたはＩＡの化合物へと転換すること、およびこうして得た式ＩまたはＩＡの化合物を遊離形または塩形で採取することを含む、式ＩまたはＩＡの化合物の製造方法を提供する。
【００３５】
式ＩＩＩの化合物において、Ｘ5は、例えばハロゲン化物、所望により置換され得るアンモニウム、メタン−またはエタンスルホン酸塩、トシル化物などであり得る。Ｘ5がハロゲン化物であるとき、それはＸ2-として陰イオンに転換され得る。
【００３６】
段階（ａ）は中性溶媒中で便宜的に行なわれ得、室温から反応混合物の沸点以下の温度で好便に行なわれ得る。
【００３７】
段階（ｂ）は、例えば保護形の式Ｉの化合物から少なくとも１個の保護基を除去することまたは、式ＩまたはＩＡの化合物中に所望によりスペーサー基を通ってもよい、少なくとも１個の保護基または抗原性基を導入することであり得る。
【００３８】
少なくとも１個の抗原性基を含む式Ｉの化合物の製造のために、式ＩＡの化合物または式Ｉ［式中、Ｒ3および／またはＲ1および／またはＲ2はカルボキシ、−ＳＯ3Ｈまたは−ＰＯ3Ｈまたはその官能誘導体、第一、第二または第三級アミノ基または抗原性基をもたない式（ａ）の基である。］で示される化合物を所望によりスペーサー基を通っていて抗原と反応させる。
【００３９】
保護基または抗原性基がスペーサー基を通して付着されている場合、反応は、別法として式ＩまたはＩＡの化合物、または保護基を生じる化合物または抗原に既に付着されているスペーサー基によって行なわれ得る。別法として、置換基Ｙaを含む式Ｉの化合物を、目的のスペーサー基Ｚaを得るために、Ｙaに相補的なスペーサー基を含む、保護基を生じる化合物または抗原と反応させ得る。
同じことを式Ｉ、［式中、Ｙbはビオチニルまたは同様なマーク機能を持つ基である。］で示される化合物の製造に適用できる。
【００４０】
出発物質として使用される式ＩＩの化合物はまた、新規であり、この発明の部分を形成する。
式ＩＩの化合物を、
ｉ）所望によりスペーサー基を通ってもよい、式ＩＩの化合物のアミノ基またはカルボキシ基から少なくとも１個の保護基を除去するかまたは少なくとも１個の保護基を添加する、かまたは
ｉｉ）式ＩＶ、
【化３１】
0003544549.tif 000018
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ1およびＲ2は前記で定義された通りであり、Ｚ2は脱離基である。］
で示される化合物を閉環し、
必要ならば、生成した式ＩＩ、［式中、Ｒ4はＯＨである。］で示される化合物を、式ＩＩ、［式中、Ｒ4 はアルコキシまたはポリアルキレンオキシである。］で示される化合物へとエーテル化し、
生成した遊離形または塩形の化合物を採取する、
ことを含む方法によって製造し得る。
【００４１】
段階（ｉ）を既知の技術に従って行い得る。
段階（ｉｉ）を不活性溶媒中で、好ましくは室温で便宜的に実施し得る。閉環を、例えば、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）または、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）のような塩基の存在下で好便に行い得る。
【００４２】
出発物質の製造が具体的に開示されていない場合、それらは実施例４と同様にして製造され得る。
下記の実施例は、この発明を説明するものである。温度は全て、℃である。ＢＯＣはｔ−ブトキシカルボニルを示す。
【００４３】
実施例１
３−ヒドロキシ−１−（５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−ｔ−ブトキシカルボニル−ペンチル）−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−エチル）−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヨージド
２５ｍｌのジオキサン中の２．０ｇの３−ヒドロキシ−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−エチル）−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）ピリジンおよび１．９ｇの６−ヨード−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘキサン酸ｔ−ブチルを、１１０℃で１時間加熱する。蒸発の後、標題の化合物をシリカゲル（メチレンクロリド／メタノール／アンモニア  ９５：５：０．５）上のカラムクロマトグラフィーによって単離する。ＭＳ（ＦＡＢ）：  Ｍ+  ８８１
【００４４】
実施例２
３−ヒドロキシ−１−（５−アミノ−５−カルボキシ−ペンチル）−４−（１−アミノ−１−カルボキシ−２−エチル）−５−（３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ピリジニウムヒドロクロリド
２０６ｍｇの実施例１の標題の化合物を２０ｍｌのトリフルオロ酢酸／水９５：５中で９０分間攪拌する。ジエチルエーテルの添加によって、標題の粗化合物を沈澱させ濾過する。この混合物を２ｍｌのメタノール中に溶解し、ジエチルエーテル中の２ＮのＨＣｌ溶液でｐＨ＝１に酸性化する。蒸発の後、残留物を分離用高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
カラム：  マチェリー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ）／ナーゲル（Ｎａｇｅｌ）  ＳＡ５／ＳＣＸ  ５ｍ  ４．６ｘ２００ｍｍ
溶媒：  Ａ：  ０．０２モル  ＬｉＣｌ
Ｂ：  ０．２モル  ＬｉＣｌ
勾配：  ５０分でＡ  ＋  Ｏ  −  １００％Ｂ
検出：  ＵＶ  ２９０ｎｍ
標題の化合物を含む画分を、バイオ−ゲル  Ｐ２カラム（５０−１００メッシュ）を通し、水で溶出することによって脱塩する。凍結乾燥後、純粋な標題の化合物を単離する。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  Ｍ+  ４１３
【００４５】
実施例３
２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノアミノ−４−［３−ヒドロキシ−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニル−１−アミノ−２−エチル）−５−ピリジニル］ブタン酸ｔ−ブチルエステル
２１２ｍｇの７−ｔ−ブトキシカルボニルアザ−２，１２−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５，９−ジオキソ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔブチルを１０ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解し、０．２６ｍｌの１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−ウンデカ−７−エンを添加する。この溶液を室温で１５時間攪拌し、次に蒸発する。混合物をシリカゲル上のカラム・クロマトグラフィーによって分離し（メチレンクロリド／メタノール  ９６：４）、標題の化合物を得る。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ５９６
【００４６】
実施例４
実施例３で出発物質として使用された、７−ｔブトキシカルボニルアザ−２，１２−ジ−ｔ．ブトキシカルボニルアミノ−５，９−ジオキソ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔブチルを下記のように製造し得る。
【００４７】
ａ）２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５，６−エポキシ−ヘキサン酸ｔ−ブチル
１３．１ｇのｍ−クロロペルオキシ安息香酸（９０％）を、４００ｍｌのメチレンクロリド中に溶解した１３．８ｇの２−ｔブトキシカルボニルアミノ−５−ヘキサン酸ｔ−ブチルに添加する。室温で１８時間の攪拌の後、混合物を氷／飽和ＮａＨＣＯ3溶液で処理する。水部分をメチレンクロリドで２度抽出する。有機溶媒を結合し、乾燥し、蒸発する。酢酸エチル／ヘキサン１：２．５を使ったシリカゲル上のクロマトグラフィーにより標題の化合物４ａ）を得る。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ２８６
【００４８】
ｂ）７−Ｎ−ベンジルアザ−５，９−ジヒドロキシ−２，１２−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔ−ブチル
１ｇの４ａ）標題化合物および０．１８ｍｌのベンジルアミンの混合物を７０℃で１８時間加熱する。この混合物をシリカゲル（アセトン／ヘキサン  １：２）上のカラム・クロマトグラフィーによって分離し、標題の化合物４ｂ）を得る。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ７１０
【００４９】
ｃ）７−アザ−５，９−ジヒドロキシ−２，１２−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔ−ブチル
９．４８ｇの４ｂ）標題化合物を３５０ｍｌのエタノール中に溶解し、１．４ｇの１０％パラジウム炭素の存在下室温常圧で水素添加する。次にこの混合物を濾過し、蒸発する。標題の化合物４ｃ）を、シリカゲル（メチレンクロリド／メタノール９：１）上のカラム・クロマトグラフィーによって精製する。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ６２０
【００５０】
ｄ）７−ｔ−ブトキシカルボニルアザ−５，９−ジヒドロキシ−２，１２−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔ−ブチル
４．１ｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを３１０ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解した７．７ｇの４ｃ）標題化合物に迅速に添加する。生成溶液を室温で３時間攪拌する。蒸発の後、標題の化合物４ｄ）をシリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル  ６：４）上のカラム・クロマトグラフィーによって精製する。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ７２０
【００５１】
ｅ）７−ｔブトキシカルボニルアザ−２，１２−ジ−ｔ−ブトキシ−カルボニルアミノ−５，９−ジオキソ−トリデカン二酸１，１３−ジ−ｔ−ブチル
４２ｍｌのメチレンクロリド中の４．０ｍｌのジメチルスルホキシドの溶液を１４０ｍｌのメチレンクロリドおよび２．４ｍｌのオキサリルクロリドの溶液に−７０℃で滴下して加える。１５分後、８０ｍｌのメチレンクロリド中の８．０ｇの４ｄ）標題化合物の混合物を溶液中に−７０℃で徐々に添加する。−７０℃で３時間の攪拌後、１５．７ｍｌのトリエチルアミンを−５０℃で添加する。この混合物を氷／水上に注ぐ。画分を分離し、水部分をジエチルエーテルで２度抽出する。全ての有機画分を結合し、乾燥し、蒸発する。残留物をシリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル６：４）上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、標題の化合物４ｅ）を得る。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ７１６
【００５２】
実施例５
３−ヒドロキシ−１−（２−ヒドロキシ−５−アミノ−５−カルボキシ−ペンチル）−４−（１−アミノ−１−カルボキシ−２−エチル）−５−（３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ピリジニウムヒドロクロリド
実施例１および２の方法を、５−ヒドロキシ−６−ヨード−２−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘキサン酸ｔ−ブチルを使って繰り返す。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  Ｍ+  ４２９
３−ヒドロキシ−１−（２−ヒドロキシ−５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−ｔ−ブトキシカルボニル−ペンチル）−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−エチル）−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ．−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヨージド
ＭＳ（ＦＡＢ）：  Ｍ+  ８９７
【００５３】
実施例６
３−ヒドロキシ−１−［５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−Ｎ−（１−メトキシカルボニル−２−エチル）カルボキシアミド−ペンチル］−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−エチル）−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヨージド
１ｍｌのジオキサン中の２３５ｍｇの実施例３の化合物および２３０ｍｇのε−ヨード−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−（メチル−β−アラニル）リシンを１２０℃で３０分間加熱する。蒸発の後、標題の化合物をシリカゲル（酢酸エチル／メタノール  ７：３）上のクロマトグラフィーによって精製する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  ９１０
【００５４】
実施例７
３−ヒドロキシ−１−［５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−Ｎ−（１−カルボキシ−２−エチル）カルボキシアミド−ペンチル］−４−（１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−エチル）−５−（３−ｔブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヒドロキシド
５０ｍｇの実施例６の標題の化合物を、５ｍｌのメタノールおよび２ｍｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム中に溶解し、室温で５時間攪拌する。次に、１０ｍｌの水および１０ｍｌのメチレンクロリドを添加し、強く攪拌しながら、０．２Ｎの塩酸をｐＨが２−３になるまで添加する。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発する。シリカゲル（メチレンクロリド／メタノール  ６：４）上のクロマトグラフィーで標題の化合物を得る。
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  ８９６
【００５５】
実施例８
【化３２】
0003544549.tif 000019
４５ｍｇの実施例７の化合物を、１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミドおよび１２ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール中に溶解した後、１３μｌのジイソプロピル−エチルアミン（ヒューニッヒ（Ｈｕｅｎｉｇ）ベース）、２ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド中の３２ｍｇのＮ−ビオチニル−１，４−ジアミノブタン、１５ｍｇのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加する。この混合物を室温で２３時間攪拌する。蒸発およびシリカゲル（メチレンクロリド／メタノール／アンモニア  ９０／１０／１）上のクロマトグラフィーの後、標題の化合物を分離する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  １１９２
【００５６】
実施例９
【化３３】
0003544549.tif 000020
１２８ｍｇの実施例８の化合物を２５ｍｌのトリフルオロ酢酸／水  ９５：５中に溶解し、室温で１時間攪拌する。溶媒を蒸発し、残留物をＨＰＬＣで精製する。カラム：  ハイパーシル  ＯＤＳ  ４．６ｘ２５０ｍｍ
溶媒：    Ａ：  １００％  Ｈ2０、  １％  ＣＦ3ＣＯＯＨ
Ｂ：    ８０％  ＣＨ3０Ｈ、２０％  Ｈ2０、１％  ＣＦ3ＣＯＯＨ勾配：  ２０分間でＡ＋２０％Ｂ
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  ７８０
【００５７】
実施例１０
デソキシピリジノリン−１−β−アラニル−ＢＳＡ−コンジュゲート
１４ｍｇの実施例７の化合物を０．４ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド中に溶解し、次に３．３ｍｇのＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリドに続いて２．３ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加する。この溶液を室温で２時間攪拌し、次に２ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ＝８）中の６５ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、攪拌を６時間続ける。つぎに溶媒を蒸発し、残留物を１０ｍｌのトリフルオロ酢酸／水９５：５中に溶解し、室温で９０分間攪拌する。蒸発の後、残留物をバイオ−ゲルＰ６（１００−２００メッシュ）水／酢酸９８：２上のクロマトグラフィーによって精製する。”高”分子部分を収集し、免疫感作に使用する。
【００５８】
実施例１１
デソキシピリジノリン−１−β−アラニル−ＫＬＨ−コンジュゲート
２．５ｍｇの実施例７の化合物を２．５ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド中に溶解し、次に０．７ｍｇのＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリドにつづいて０．５ｍｇのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドを添加する。この混合物を室温で９０分間攪拌する。次に０．５ｍｌの５０％グリセロール中の、キーホールリンペット（スカシガイ）からの３４．２ｍｇのヘモシアニンを添加し、室温で３６時間攪拌を続ける。次に、５ｍｌのトリフルオロ酢酸／水９５：５を添加し、溶液を７５分間室温で攪拌する。トリフルオロ酢酸および水を蒸発によって除去する。残留物を水で数回洗浄（遠心）し、免疫感作に使用する。
【００５９】
実施例１２
３−ヒドロキシ−４−（２−ｔブトキシカルボニルアミノ−２−カルボキシ−エチル）−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジン
０．５ｇの実施例３の化合物を１０ｍｌの水および１０ｍｌのメタノール中に溶解し、１ｇの水酸化ナトリウムを添加する。生成溶液を室温で３時間攪拌し、次に実施例８で開示されたように後処理する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  ＭＨ+  ５４０
【００６０】
実施例１３
３−ヒドロキシ−４−［１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−Ｎ−（１−エチル−メトキシカルボニル）カルボキシアミド−２−エチル］−５−（３−ｔブトキシカルボニルアミノ−３−ｔブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジン
３２０ｍｇの実施例１２の化合物、２００ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３００ｍｇのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、２００ｍｇのβ−アラニンメチルエステルを１０ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解し、室温で１晩攪拌する。溶媒の蒸発後、残留物をシリカゲル（メチレンクロリド／メタノール９５：５）上で精製する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  ＭＨ+  ６２５
【００６１】
実施例１４
３−ヒドロキシ−１−（５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−ｔ−ブトキシカルボニル−ペンチル）−４−［１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−Ｎ−（１−メトキシカルボニル−２−エチル）−カルボキシアミド−２−エチル］−５−（３−ｔブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヨーシド
この化合物を実施例１に記載したようにして製造する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  ９１０
【００６２】
実施例１５
３−ヒドロキシ−１−（５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−ｔ−ブトキシカルボニル−ペンチル）−４−［１−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−Ｎ−（１−カルボキシ−２−エチル）−カルボキシアミド−２−エチル］−５−（３−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ピリジニウムヒドロキシド
この化合物を実施例７の方法に従って製造する。
ＭＳ−ＦＡＢ：  Ｍ+  ８９６
【００６３】
実施例１６
実施例１５の標題の化合物を、実施例１０および１１中に記載されたのと同じ方法でＢＳＡまたはＫＬＨに結合する。生成化合物は、ピリジニウム環の４位の側鎖のカルボキシ基にそれぞれ付着されたＢＳＡまたはＫＬＨをもつ。
【００６４】
実施例１７
２−アミノ−４−［３−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−１−アミノ−２−エチル）−５−ピリジニル］ブタン酸
２００ｍｇの実施例３の化合物を２０ｍｌのトリフルオロ酢酸／水  ９５：５で９０分間処理してから蒸発する。
ＭＳ（ＦＡＢ）：  ＭＨ+  ２８４
式ＩおよびＩＡの化合物は、例えば尿または血清のような生物体液中に存在するコラーゲン分解から誘導されるピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の水準を評価するのに有用である。高度の骨再吸収または骨形成と骨再吸収間の平衡異常を特徴とするヒトおよび動物の症状は、例えば、骨多孔症、ページェット病、ベグニンの進行または骨の悪性腫瘍および転移腫瘍、骨軟化症、原発性副甲状腺機能こう進症、骨再吸収を増大する化合物での治療（例えばグルココルチコイド）、骨関節炎およびリューマチ性関節炎などである。
【００６５】
これらの架橋水準の定量を、例えば免疫学的方法、電気化学滴定、天然蛍光分光法または紫外線吸収などを使って行い得る。これらの方法は、さらに精製せずに、または、例えば過剰な分量の汚染物質が存在する場合は精製後、直接体液上で行い得る。生物体液中に存在する遊離架橋またはコラーゲン分解ペプチドからの加水分解によって放出され、体液中に存在する架橋をこの発明に従って定量し得る。全架橋は、遊離架橋および体液中に存在する加水分解された架橋の全量または濃度を意味する。
【００６６】
好ましくは、生体液中のピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の定量を免疫学的方法を使って行なう。従って、特異的抗体を、これ以後本明細書中で免疫原と呼ぶ、少なくとも１個の抗原基をもつ式Ｉの化合物に対して製造する。少なくとも１個の抗原性基をもち、Ｘ1がヒドロキシである式Ｉの化合物および／またはＸ1がヒドロキシであるこのような置換化合物に免疫反応性のあるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造し得る。この発明の好ましい具体例に従って、少なくとも１個の抗原基をもち、式中、Ｘ1がＨである式Ｉの化合物と免疫反応性のある特異的抗体を製造する。
【００６７】
前記のように、式Ｉの化合物において、抗原性基は定義された位置に直接または間接に付着させ得る。例えば、抗原性基はＲ1、Ｒ2またはＲ3、特にＲ3またはＲ2に存在し得る。好ましくは、抗原性基はスペーサー基を通って付着する。この発明の方法に従って製造された式ＩＡの化合物はまた、前記で開示された１、２または３個の抗原性基をもつ式Ｉの対応する化合物を製造するのに有用である。
【００６８】
抗体製造は、当技術で既知の免疫学的技法（ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モルキュラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、Ａ．Ｍ．、１９８６年、１３巻、エルセビアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ））に従って少なくとも１個の抗原基をもつ式Ｉの化合物をネズミ、ウサギまたはヒツジに注射することを含む従来の技術によって実施することができる。血清を免疫原についての抗体形成を測定するために滴下する。脾臓細胞または末梢血液リンパ球を収穫し、均質化し、その後、この発明の式Ｉの目的の架橋化合物に免疫反応性のあるモノクローナル抗体を生成する融合細胞ハイブリッドを生成するために、例えば癌細胞などと融合し得る。モノクローナル抗体製造は、Ｇ．ガルファー（Ｇａｌｆｒｅ）およびＣ．ミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、１９８１年、メソズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）７３巻、１章で開示された技術に従って行い得る。
【００６９】
前記の方法またはそれと均等な方法によって生成されたポリクローナルまたは特にモノクローナル抗体またはそのフラグメントを生物体液中のコラーゲン分解から誘導されたピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量するための様々な免疫検定において使用し得る。これらの免疫検定は、検出可能マーカーと結合したモノクローナル抗体または抗体フラグメントを含む。適当な検出可能マーカーの例は、例えば、酵素、補酵素、酵素阻害剤、発色団、発蛍光団、化学発光物質、常磁性金属、スピン標識および放射性核種を含む。骨再吸収を指標するのに適する標準免疫法の例は、例えば酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定（ＲＩＡ）およびサンドイッチ免疫放射線検定（ＩＲＭＡ）を含む。
【００７０】
抗原性基をもたない式Ｉの化合物またはこの発明に従った式ＩＡ、［式中、Ｘ1はＨまたはＯＨである。］で示される化合物を、生物体液におけるコラーゲン分解から誘導されるピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量するための標準レファレンスとして、例えば前記の定量方法またはこのような定量方法に基づく用具などに使用し得る。
【００７１】
前記に従って、この発明は、以下のものを提供する
１．式Ｉの化合物を使用することを含む、例えば骨または軟骨再吸収などの結合組織代謝異常を、生物液におけるコラーゲン分解から誘導された全または遊離ピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量することによって測定する方法。
２．この発明の方法によって生成された式ＩＡの化合物を使うことを含む、生物液中のコラーゲン分解から誘導された全または遊離ピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量することによる、例えば骨または軟骨再吸収などの結合組織代謝異常測定方法。
３．生物体液を、少なくとも１個の抗原性基を含み、式Ｉ［式中、Ｘ1はＨまたはＯＨである。］で示される化合物に免疫反応性のある特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させることを含む、生物液中のコラーゲン分解から誘導される全または遊離ピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量する方法。
４．生物体液中のコラーゲン分解から誘導される全または遊離ピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の濃度を定量するための基準としての、この発明の方法によって生成された式ＩＡの化合物または抗原性基をもたない式Ｉの化合物の使用。
５．前記で開示されたようなポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
６．前記モノクローナル抗体を分泌するセルライン。
７．前記モノクローナル抗体を生成する方法。
８．前記で開示されたような、抗体または免疫学的反応性のあるそれのフラグメントを含む組成物および前記免疫検定の実施のための別の試薬が前記検定を行なうための指示書とともに含まれ、標準として、この発明の方法に従って製造された式ＩＡの化合物または抗原性基をもたない式Ｉ、［式中、Ｘ1はＨまたはＯＨ、特にＨである。］で示される化合物を使った、生物体液中のコラーゲン分解から誘導される全または遊離ピリジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の量または濃度の免疫検定測定のためのキット。