(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜を有し膜両面に別個の液体が流通する分離機構を有し、該分離機構の膜の一方の面に被測定試料液を接触させる送液機構と、膜の別の面に接触して流通する液体を流す別個の送液機構を持ち、被測定試料液と膜の別面に流れる液体が膜をはさんで接する際に被測定試料液の一部もしくは被測定試料液に溶解した化学物質の一部を膜を介して転溶させ、この転溶した被測定試料液もしくは化学物質を検知する検出部を備えた濃度測定装置を用い、
被測定試料液を分離機構に導く配管の途中に流路を任意の時点で開閉できる開閉機構を設け、前記分離機構の膜面に接触する部分の流路体積に対して送液された被測定試料液の体積が流路体積の５倍以上になる任意の一定の時間間隔で被測定試料液流路を開放して膜と被測定試料液を接触させ、この間の検出部の出力から濃度を算出することを特徴とする濃度測定方法。
【請求項２】
標準溶液と被測定試料液を分離機構に導く配管を有し、この配管が膜を有する分離機構に入る前で１つの配管に統合されており、各々の配管の途中に流路を任意の時点で開閉できる開閉機構を設けた装置を用い、前記分離機構の膜面に接触する部分の流路体積に対して送液される標準溶液または被測定試料液の体積が流路体積の５倍以上になる任意の一定間隔で標準溶液および被測定試料液流路を開放し、最初に被測定試料液を一定時間接触せしめ、次に標準溶液を別途定めた一定時間接触せしめた時の検出値を記憶し、続いて標準溶液と同一時間被測定試料液を接触せしめた時の検出値と比較して濃度を算出するようにした請求項１記載の濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体試料、特に発酵液などを分析する場合に、検出器の汚染を防ぎ、濁りの影響を受けず試料消費量を少なくでき、高精度かつ保守が簡単な分析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来濃度測定装置において、被測定試料液を定量注入バルブに導き、該バルブに一定量の被測定試料液を貯留し、定量注入バルブの流路を切り替えて、別途送液系に一定量の試料を流入させて、なんらかの分離、反応後特定化合物を検出する方法が多く用いられている。この代表例は液体クロマトグラフ、フローインジェクション装置などである。
しかし、たとえば発酵液のような汚染が著しい試料場合、定量注入バルブがつまったり、検出器が汚染されて精度が低下するという問題点があった。それを防ぐために、発酵液などの被測定試料液に含まれる微生物や固形物が検出部に至らないように被測定試料液をフィルターでろ過し、ろ液を分析する形式の装置が従来多く用いられてきた。この方式では、フィルターが目詰まりし、頻繁にフィルターの交換が必要で保守が困難であり、またフィルターを使い捨てにする方式も存在するが分析コストの上昇をもたらす欠点があった。
このため膜両面に別個の液体が流通するようにし、被測定試料液と膜の別面に流れる液体が膜をはさんで接する際に被測定試料液の一部もしくは被測定試料液に溶解した化学物質の一部を膜を介して転溶させ、この転溶した被測定試料液もしくは化学物質を検知する形式の装置がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記の転溶方式はフィルターでのろ過方式に比べて目詰まりはしにくいが、膜の特性変動により測定値の変化が起きる可能性があり、従来高精度測定が困難であるとされてきた。また膜を介して溶液または物質が移動するのに時間がかかり、測定に長時間を要すると同時に試料消費量が多くなる欠点があった。また膜の特性により転溶される物質量がほぼ決定されており、測定濃度範囲が検出器のダイナミックレンジだけではなく、膜の特性によっても決定され、試料の適用範囲が限定され、或は試料の測定出来る濃度範囲が限定されてしまい、応用範囲がせまいものであった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記転溶式の濃度測定装置において、被測定試料液を分離機構に導く配管の途中に流路を任意の時点で開閉できる開閉機構を設け、前記分離機構の膜面に接触する部分の流路体積に対して送液された被測定試料液の体積が流路体積の５倍以上になる任意の一定間隔で被測定試料液流路を開放して膜と被測定試料液を接触させるようにした。
被測定試料液の送液量が流路体積に対して５倍以上となるような一定時間間隔で被測定試料液流路を開放することにより、分離機構部において被測定試料液と別種の液体の相対速度は一定であり、かつ流路内が被測定試料液により完全に置きかえられる瞬間が存在することになる。この過渡的な過程での転溶量を検出することによって、試料量を最小にして正確な測定が可能となる。
さらに被測定試料液が膜と接触する時間を、送液量が流路体積の５倍以上になるように設定しておけば、その条件範囲内で時間を短くするほど、転溶される溶液量または化学物質量は少なくなり、感度は低下する。逆に長くすると感度が上昇し、膜面での感度調整が可能となる。
また本発明は、標準溶液と被測定試料液を交互に分離機構に導く配管を構成し、各々の配管の途中に流路を任意の時点で開閉できる開閉機構を設け、前記分離機構の膜面に接触する部分の流路体積に対して送液される標準溶液または被測定試料液の体積が流路体積の５倍以上になる任意の一定間隔で標準溶液および被測定試料液流路を開放し、最初に被測定試料液を一定時間接触せしめ、次に標準溶液を別途定めた一定時間接触せしめた時の検出値を記憶し、続いて標準溶液と同一時間被測定試料液を接触せしめた時の検出値と比較して濃度を算出する用にした。
このようにあらかじめ膜面に被測定試料液を接触させることにより、試料との接触による膜面の変動をあかじめ起こさせた後に標準溶液と、被測定試料液が順次一定条件で接触するようになって、より高精度の測定が可能となる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
図１を借りて本発明の実施の形態を説明する。９が前述した分離機構で１０が分離膜である。６は被測定試料液送液系の配管で、分離機構の膜１０の上側の流路に接続されており、途中に開閉弁が挿入され、その上流側に送液ポンプ１が設けてある。このポンプは図２に示すように開閉弁４の下流側に設けてもよい。まず図１で流路７は無いものとして、請求項１の発明について述べる。８は分離機構９の膜１０の下側の流路に接続された送液用配管でポンプ３によって被測定試料液とは別の液が分離機構の膜１０の下の流路を通って検出器１１に送られるようになっている。本発明はこのような装置を用いて次のようにして濃度測定を行う。即ちポンプ３を駆動して分離機構９の下側の流路に緩衝液のような液をながしながら、開閉弁４を被測定試料液が分離機構の上側の流路にその体積の５倍以上の一定量だけ流れる時間だけ開き、その間の検出器１１の出力を読み取るのである。この出力の読取りの方式は例えば、試料が膜と接触を開始した時点をスタ−ト点としてデータ収集を開始し、膜との接触を終了した後、出力が減少する点までのデータを記憶し、出力の最大点と最小点を求める。なお最大，最小の近傍で出力を平均化してＳ／Ｎを向上させることもできる。
請求項２の発明は図１に示すように、上述した装置に流路配管７を加えた装置により、配管６，７を通して被測定試料液と標準溶液とを交互に分離機構９の上側の流路に送れるようにし、まず被測定試料液を分離機構に一定時間流した後、標準溶液を別の一定時間分離機構の上側の流路に流し、そのときの検出器の出力を記憶し、その後被測定試料液を上記標準溶液と同じ時間だけ流して、そのときの検出器の出力と先の記憶させた検出器の出力とを比較するものである。
【０００６】
分離機構部分での測定対象化合物の透過量をできる限り一定化し測定結果を高精度化するための方策を検討したところ、精度および感度は流速，流路形状に関係なく膜と接触する流路体積と、その内部を通過した被測定試料液量に関係することがわかり、さらに検討を進め流路体積の５倍以上の被測定試料液を通過させれば良いことが判明した。たとえば被測定試料がグルコースの場合、４０ｍｍ２  の面積で膜と試料が接触し、流路断面が１ｍｍの正方形であるとするとその流路体積は０．０４ｃｍ３  、つまり４０μｌとなる。この場合最低２００μｌの被測定試料液を通過させれば良い。被測定試料液を送液するチューブポンプの流速が２ｍｌ／分であるとすると、１０秒間送液することにより正確な結果が得られる。膜の逆面にたとえば緩衝液が２ｍｌ／分で流れていたとすると、転溶した測定対象化合物の濃度分布は液体クロマトグラフのピークのような形状となる。そしてこのときの測定値の変動率は３％である。ところが被測定試料液の体積が流路体積の３倍の場合は測定値の変動率は１０％にもなっているのである。
たとえば被測定試料液が酵母培養液であり、測定対象化合物がグルコースであり、検出部がグルコースオキシダーゼを固定化した酵素電極である場合で説明する。グルコース溶液を被測定試料液とし、膜面積４０ｍｍ２  、流路体積４０μｌの分離機構部を用い、２００μｌ〜１０００μｌの被測定試料液を接触させると、得られる検出値は接触した被測定試料液量に比例しほぼ直線的に増加する。つまり低濃度を高精度で測る場合は被測定試料液体積を増やせば良いことになり、被測定試料液の通過時間を制御することにより感度を制御できる。
また発酵液の場合、菌体、菌体由来の各種化合物、培地の不純物などが含まれており、長時間の膜面との接触により膜透過性が変化する場合があるが、本発明の方法では被測定試料液の接触時間を制限しているためこの変動量は比較的小さいが全く影響がないわけではない。
そこで、まず被測定試料液を短時間膜面と接触させ膜面状態を試料で変動した状態とし、その直後に標準溶液を測定し、その検出値と、その後に測定した被測定試料液での検出値を比較することにより最も精度良く測定できる。もちろん、被測定試料液と標準溶液との間に蒸留水などによる洗浄工程を入れても問題ないが、この場合も一定の間隔で実施することが必要である。また、あらかじめ被測定試料液を接触させる工程で、配管などに溜った古い被測定試料液を廃棄することが可能であり、装置の無駄な動作をなくせる利点もある。
【０００７】
本発明では、配管系６，７，８等を構成するチューブの素材と太さは特に問わないが、開閉手段４，５等として後述のピンチバルブを用いる場合には少なくとも配管系のピンチバルブで挟む部分は復元力のある弾性体、例えばシリコンチューブ、塩化ビニル樹脂チューブ、ポリオレフィン系チューブが望ましい。中でもポリオレフィン系チューブはガス透過性が低く、液が停止している際にチューブ外壁から空気が侵入し、気泡が発生することが少なく好ましい。またこれらのチューブを統合する際には２方向〜４方向ジョイントが用いられる。この部分の構成も特に問わないが金属またはプラスチックなどのチューブより硬い素材で構成されたジョイントにチューブを装着する方法が簡便であり好ましい。ジョイント素材がフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレンで構成されていると加工が容易で各種の形態のものを作成できる上、金属のように中を流れる液体による腐食が起きにくく好ましい。さらに、フッ素樹脂およびポリプロピレン製のジョイントは発酵液を送液する際に加圧蒸気滅菌が可能であり、より好ましい。
またバルブとしては、ピンチバルブ、電磁バルブ、モーター駆動の多方バルブなどの各種のものが用いられるが、被測定試料液の濁りによるつまりを防止するために内部配管径を選択する必要がある。ピンチバルブは用いる配管がそのまま流路を閉鎖するために用いられるのでつまりの点では最も有利である。
【０００８】
本発明の濃度測定方法で用いる基本的な動作および配管系の説明を補足する。ピンチバルブを備えた配管系６，７をピンチバルブ設置部の液体の流れ方向に対して下流側に設置した合流用のジョイント１２を用いて合流させ、膜を備えた分離機構の膜の片面流路内に被測定試料液を導く。なおポンプ１，２は図１のようにジョイント１２の前でも図２のようにジョイント１２の後でもよく、あるいは分離機構９の後に入れてもよい。一般的に分離機構内部の流路が細く、通過時の背圧が上昇する可能性がある場合は、分離機構の前に入れて加圧導入する方が良い。ここで用いるポンプは、ギアポンプ、プランジャーポンプ、チューブポンプなど各種のものを用いることができるが、安価でかつ濁りを含む定被測定試料液を送液する目的ではチューブをしごいて送液を行なうチューブポンプが好ましい。チューブポンプに用いるチューブは前記の配管に用いたのと同様に各種のものを用いることができるが、長期の送液速度安定性が得られるポリオレフィン系チューブが好ましく用いられる。
【０００９】
一般的に膜を有する分離機構で用いる膜は、限外ろか膜、透析膜、メンブレンフィルターなどが例示できる。限外ろか膜としては、分離し測定する対象物質により各種の膜材が利用できるが、ポリスルフォン膜、セルロースアセテート膜などが例示できる。透析膜としては再生セルロース膜などが用いられる。メンブレンフィルターとしてはフッ素樹脂製、ポリカーボネート製、再生セルロース製、ニトロセルロース製などのものが用いられる。水溶性低分子を測定対象とする際には、加圧の必要性がなく丈夫な透析膜が好んで用いられる。また水中に溶けたアンモニアやアルコールを気化、転溶させる際にはフィルター孔径０．１〜１．０μｍ程度のフッ素樹脂製メンブレンフィルターを利用すると、一種のガス透過膜となり目的物質のみを転溶させ、不要な成分が検出器に到達することをより有効に防げる。
分離機構部自体は金属、プラスチックなどどのような素材でも構成できるが、液による腐食を防ぐため、ステンレス、チタン材、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなどで製作しておくことが好ましい。特にプラスチックで製作すると透析膜を挟んだ場合、膜を傷めることが少なく望ましい。
【００１０】
測定対象物質の検知に用いる検出器としては、吸光光度計、蛍光光度計、ｐＨメータ、イオン電極、半導体イオンセンサ、電気化学検出器、原子吸光分析器、誘導プラズマ発光分析器、酵素電極、熱測定器などの公知の検出器が用いられる。また流路内部で化学反応を起こさせ、その結果変化する物理量を検知することも可能であるし、発酵液の菌体などを除去した後に、分離カラムに導入し、いわゆる液体クロマトグラフと接続することも可能である。この中で特定成分を特異的に検出できる酵素電極の利用は、装置を簡単に構成でき、容易に高精度化が可能である点で望ましい。
酵素電極の種類としては過酸化水素電極、酸素電極、ｐＨ電極などの表面に膜上に酵素を固定化する形式のものでも、担体に固定化した酵素をカラムに充填しその下流に各種電極を設置してもよい。酵素の固定化方法としては化学結合法、包括法、イオン結合法など公知の各種方法を用いることができる。また電極上に膜状に酵素を固定化する際は電極面に直接酵素あるいは酵素およびアルブミンなどの酵素と架橋する化合物などが接触していてもよいし、アセチルセルロース膜上に酵素を固定化し膜を電極面に押し当てる形で保持してもよい。担体に固定化する場合には、活性炭、シリカゲル、ケイソウ土などの公知の担体を利用できる。担体をカラムとして用いる方法は酵素活性が低い場合にタンパク質量を多く固定化できるため有利である。
【００１１】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
図１に示すように、外径４ｍｍで、内径２ｍｍのシリコンチューブとピンチバルブ４および５、さらに第１の被測定試料液送液用ポンプ１により構成される第１の被測定試料液送液系６と、同様に構成される第２の被測定試料液系７をポリプロピレン製３方ジョイントで接続した。
被測定試料液は送液用チューブポンプ１および２を用いてどちらも流速２ｍｌ／分の速度で吸引送液される。
ピンチバルブ４または５のどちらかが開放されて被測定試料液を切り替えるようになっている。ピンチバルブを開放した時点でその配管系に配置されたチューブポンプを駆動して、被測定試料液を切り替えるようにした。  分離機構９には膜厚さ２０μｍの再生セルロース製透析膜１０が装着されており、膜の反対側には、第３の送液用チューブポンプ３でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液が流されている。なお分離機構９の膜に面する流路体積は１２０μｌであった。
グルコースオキシダーゼを固定化した酵素電極を装着した検出器１１を分離機構９の下流に設けた。
被測定試料液としては、１．８（ＷＴ／Ｖ）％グルコース濃度および３．６（ＷＴ／Ｖ）％グルコース濃度であるそれぞれ１％の酵母菌体を含む発酵モデル液を用いた。
ピンチバルブが開放される時を３０秒とし、各被測定試料液の送液される量を流路体積に対して約８．３倍の１０００μｌを送液した。
この試料を交互に各５回送液し、その時の検出器１１での値から発酵モデル液のグルコース濃度を算出した。結果を表１に示す。
【表１】
0003582188.tif 000002
【００１２】
【実施例２】
図２に示すように、外径４ｍｍで、内径２ｍｍのシリコンチューブとピンチバルブ４および５、さらに第１の被測定試料液送液用ポンプ１により構成される第１の被測定試料液送液系６と、同様に構成される第２の被測定試料液系７をポリプロピレン製３方ジョイントで接続した。被測定試料液は送液用チューブポンプ１を用いて流速２ｍｌ／分の速度で吸引送液される。
ピンチバルブ４または５のどちらかが開放されて被測定試料液を切り替えるようになっている。ピンチバルブが開放される時間は４５秒として実験を行なった。
分離機構９には膜厚さ２０μｍの再生セルロース製透析膜１０が装着されており、膜の反対側には、第３の送液用チューブポンプ３でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液が流されている。なお分離機構９の膜に面する流路体積は２００μｌであった。
グルコースオキシダーゼを固定化した酵素電極を装着した検出器１１を分離機構９の下流に設けた。
被測定試料液としては０．９（ＷＴ／Ｖ）％グルコース濃度であり１％の酵母菌体を含む発酵モデル液を用い、また標準液としては１．８（ＷＴ／Ｖ）％グルコース水溶液を用いた。
あらかじめ被測定試料液を２０秒間送液した後、標準液および被測定試料液順次４５秒ずつ分離機構９に送液し、その時の検出器１１で得られる標準液の値とその後に流れる被測定試料液の値から、校正された被測定試料液のグルコース濃度を算出する。この工程を５回繰り返した。
なお、標準液および被測定試料液の送液される量は流路体積に対して約７．５倍の１５００μｌを送液した。
この試料を交互に各５回送液し、その時の検出器１１での値から標準液発酵モデル液のグルコース濃度を算出した。
【００１３】
【比較例１】
実施例２において、標準液を送液する前段で被測定試料液を２０秒間、分離機構９に送液していたのを省略した以外は同様に実験を行った。
これらの結果を実施例２の結果と合わせて表２に示す。
実施例２では、被測定試料液と接触することによる膜面の変動をあらかじめ起こさせた後に標準溶液と、被測定試料液が順次一定条件で接触するため、より定量精度が良くまた再現性も良好となることが判明した。
【表２】
0003582188.tif 000003
【００１４】
【発明の効果】
本発明の濃度測定装置を用いることにより、簡単な構成で発酵液などの汚染しやすい試料を小容量利用して高精度で測定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１で用いた濃度測定装置の概略図である。
【図２】本発明の実施例２で用いた濃度測定装置の概略図である。
【記号の説明】
１・・・第１の被測定試料液送液用ポンプ
２・・・第２の被測定試料液送液用ポンプ
３・・・緩衝液送液用ポンプ
４・・・第１のピンチバルブ
５・・・第２のピンチバルブ
６・・・第１の試料送液用配管
７・・・第２の試料送液用配管
８・・・緩衝液送液用配管
９・・・分離機構
１０・・・分離膜
１１・・・酵素電極を有する検出器
【図１】
0003582188.tif 000004
【図２】
0003582188.tif 000005