【手続補正書】
【提出日】平成29年2月22日(2017.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．プロモーター；
ｂ．前記プロモーターの下流に転写的に位置付けられた第１の核酸配列であって、前記第１の核酸配列はｄｓＲＮＡまたはタンパク質をコードする、前記第１の核酸配列；及び
ｃ．前記第１の核酸配列に対して３’に位置付けられた第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、前記第２の核酸配列；
を含み、
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列は、前記プロモーターに作動可能に連結される；
操作された発現構築物。
【請求項２】
前記第２の核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する、請求項１に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項３】
前記ヘアピンの各々は少なくとも５塩基対を含む、請求項１または２に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項４】
前記ヘアピンの各々は５乃至３０塩基対を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項５】
前記ヘアピンの各々は９乃至１８塩基対を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項６】
前記ヘアピンは、１０個またはそれ未満のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項７】
前記第２の核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１−２３からなる群から選択される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項８】
前記プロモーターはバクテリオファージプロモーターである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項９】
前記プロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、ＳＶ４０、ＳＰ６、Ｔ５、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトースオペロン（ｌａｃ）プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選択される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項１０】
前記第１の核酸配列は、配列番号２、４、１４、１５及び２０からなる群から選択される、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
【請求項１１】
宿主細胞に対して請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を提供することを含むＲＮＡ生成の改善方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞は大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞である、請求項１１に記載の前記ＲＮＡ生成の改善方法。
【請求項１３】
宿主細胞に対して請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を提供することを含むタンパク質生成の改善方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞はＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である、請求項１３に記載の前記ＲＮＡ生成の改善方法。
【請求項１５】
前記ベクターはプラスミドベクターである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記ベクターを含む細菌宿主細胞。
【請求項１７】
前記細菌宿主細胞はＲＮＡｓｅ  Ａを発現しない、請求項１６に記載の前記細菌宿主細胞。
【請求項１８】
前記細菌宿主細胞は大腸菌細胞である、請求項１６または１７に記載の前記細菌宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞及び成長培地を含むｄｓＲＮＡのインビボ合成のための細胞培養システム。
【請求項２０】
前記成長培地は、３．２％のトリプトン、２％の酵母エキス、０．５％のＮａＣｌ、１％のグリセロール、０．１％のグルコース、０．４％のアルファ乳糖、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む、請求項１８に記載の前記細胞培養システム。
【請求項２１】
前記細菌宿主細胞は死滅していて、かつ溶解されない、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞を含む有害無脊椎動物侵入を制御する組成物。
【請求項２２】
請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞の溶解物を含む有害無脊椎動物侵入を制御する組成物。
【請求項２３】
植物に対して請求項２１または２２に記載の前記組成物を適用することを含む有害無脊椎動物侵入の制御方法。
【請求項２４】
前記細菌宿主細胞は死滅していて、かつ溶解されない、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞を含む植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する組成物。
【請求項２５】
請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞の溶解物を含む植物群におけるウイルス疾患の前記蔓延を阻止する組成物。
【請求項２６】
植物に対して請求項２４または２５に記載の前記組成物を適用することを含む植物群におけるウイルス疾患の前記蔓延の阻止方法。
【請求項２７】
２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む転写ターミネーター。
【請求項２８】
前記核酸配列は少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する、請求項２７に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項２９】
前記ヘアピンの各々は５乃至３０塩基対を含む、請求項２７または２８に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項３０】
前記ヘアピンの各々は９乃至１８塩基対を含む、請求項２７乃至２９のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項３１】
前記ヘアピンは、１０個またはそれ未満のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される、請求項２７乃至３０のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項３２】
前記ヘアピンの各々は、３つ未満の不対ヌクレオチドを有するステム領域を含む、請求項２７乃至３１のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項３３】
前記ヘアピンの各々は、不対ヌクレオチドを有しないステム領域を含む、請求項３２に記載の前記転写ターミネーター。
【請求項３４】
前記核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１−２３からなる群から選択される、請求項２７に記載の前記転写ターミネーター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＲＮＡの生成及び送達のための組成物及び方法
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９３，５０６号明細書の利益を主張し、その全体を参照することにより本出願に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、サイズが１１，５１２バイト（Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰにおいて測定された）であり、２０１４年３月１０日に作成され、参照により全体が本明細書に組み込まれる、名称が「Ｐ３４１１８ＷＯ００＿５９６０９＿２０１４＿０３＿１０＿ｖ２ＳＴ２５．ｔｘｔ」であるファイルを含むＥＦＳ  ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡのインビトロ及びインビボ発現に有用であるベクター構築物が提供される。インビボにおいてＲＮＡ及びタンパク質を産生する細胞発現システムも提供される。インビボ転写ｄｓＲＮＡを対象生物に提供する方法及び組成物も提供される。
【０００４】
商業用作物はしばしば、ウイルス、または昆虫もしくは線虫などの有害生物による攻撃の標的となる。有害生物侵入及びウイルス感染は、作物の収量にかなりの悪影響を有し得る。化学的有害生物防除は、有害生物侵入を根絶する上でかなり効果的であったが、化学的有害生物防除を使用することには不利点がある。化学的有害生物防除剤は、選択的ではなく、有益な昆虫及び他の生物ならびに標的の有害生物に影響を及ぼし得る。化学的有害生物防除剤は環境に留まり、その場合、一般にゆっくり代謝されるようになる。それら化学的有害生物防除剤は、食物連鎖、特に、より高等な捕食種内に蓄積され、そこで、それら化学的有害生物防除剤は悪影響を示し得る。化学的有害生物防除剤の蓄積は、その防除剤に対する耐性の発現をももたらす。したがって、植物上へのまたは植物内への昆虫侵入を制御または根絶するための代替方法、及び、選択的な、環境的に不活性な、非持続的な、生物学的に分解可能な、及び有害生物耐性管理スキームに良好に適合する方法に対する要求が存在する。
【０００５】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている機構を介して、各種生物における特定の標的遺伝子の阻害を媒介することが示されてきた。ＲＮＡｉは、内因性細胞経路を使用し、それにより、標的配列のセンス及びアンチセンスに実質的に対応する相補的ヌクレオチド配列を含む二本鎖ＲＮＡは、対象のまたは、ｍＲＮＡテンプレートからのタンパク質の低減された翻訳のｍＲＮＡの破壊を媒介する。ＲＮＡｉ経路のエフェクタータンパク質は、対応するｍＲＮＡからの転写を認識及び破壊またはブロッキングするようにｓｉＲＮＡガイドを使用するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及び元のｄｓＲＮＡから小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生成するダイサータンパク質複合体を含む。ｓｉＲＮＡに対して相補的な転写のみが影響され、ゆえに、ｍＲＮＡ発現のノックダウンは、通常、配列特異的である。ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果は幾日も持続し、実験条件下で、対応するタンパク質のレベルの結果的な低下により、ある場合には、９０％またはそれ以上の大量の標的転写の低下に繋がり得る。タンパク質レベルはまた、ｍＲＮＡ転写レベルに実質的に影響することなく、翻訳をブロッキングすることにより乱され得る。
【０００６】
ｄｓＲＮＡ分子は、植物の有害生物侵入を制御または根絶するための化学的有害生物防除剤に対する、選択的な、環境的に不活性な代替物としての潜在性を示す一方、従来のインビトロ及びインビボ発現方法により産生され得るｄｓＲＮＡ量、ならびに、ｄｓＲＮＡの産生及び精製に関連するコストに対する制約は、作物における有害生物侵入及び疾病を制御するためのその使用に対する障害を与えている。したがって、効率的でコストパフォーマンスの高いｄｓＲＮＡを大量生産する手段に対する要求が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、ＲＮＡのインビトロ及びインビボ発現に有用であるベクター構築物に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは調節ＲＮＡである。生細胞内での効率的でコストパフォーマンスの高いＲＮＡの製造のための細胞発現システムについても記載されている。生細胞内での効率的でコストパフォーマンスの高いタンパク質の製造のための細胞発現系についても記載されている。生細胞内での効率的でコストパフォーマンスの高いｄｓＲＮＡの製造のための細胞発現系、ならびに対象生物に発現ｄｓＲＮＡを供給する方法及び組成物についても記載されている。記載されている組成物及び方法は、分析、スクリーニング及び他の用途のためにＲＮＡ配列を増幅するように、市販製剤のためのＲＮＡ分子を製造するのに用いられ得る。
【０００８】
いくつかの実施形態は、細胞培養によりＲＮＡ分子を効率的に大量生産する組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは調節ＲＮＡである。いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置決めされたＲＮＡコード領域と；２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む転写ターミネーターと；を含む操作された発現構築物であって、ＲＮＡコード領域及び転写ターミネーターはプロモーターに作動可能に連結される、発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、５乃至３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、９乃至１８塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、３つ未満不対ヌクレオチドを有するステム領域を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンのステム領域は不対ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１０個または９個以下のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、配列番号１３、１８及び２１乃至２３からなる群から選択された核酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態は、細胞培養によりタンパク質を効率的に大量生産する組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態は：プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置決めされたタンパク質コード領域と；２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む転写ターミネーターと；を含む操作された発現構築物であって、タンパク質コード領域及び転写ターミネーターがプロモーターに作動可能に連結される、発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、５乃至３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、９乃至１８塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、３つ未満の不対ヌクレオチドを有するステム領域を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンのステム領域は不対ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１０個または９個以下のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、配列番号１３、１８及び２１乃至２３からなる群から選択された核酸配列を含む。
【００１０】
本実施形態は、細胞培養によりｄｓＲＮＡ分子を効率的に大量生産し、対象生物に発現ｄｓＲＮＡ分子を送達する組成物及び方法にさらに関連する。いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する第１の転写ターミネーター配列と；第１の転写ターミネーターに対して３’に位置する第２の転写ターミネーター配列であって、ｄｓＲＮＡコード領域、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターがプロモーターに作動可能に連結される、第２の転写ターミネーター配列と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’にある。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’にある。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第２の転写ターミネーター配列に対して３’に位置する１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはメガヌクレアーゼ制限部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ制限部位は、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ  ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する１、２、３、４、５、６つまたは７つ以上の付加的な転写ターミネーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、ＰＴＨ−ターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔｌターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター及びＴＴａｄｃ転写ターミネーターからなる群から各々独立して選択される２つまたは３つ以上のＲｈо非依存性転写ターミネーター配列を含み、ゆえに、プロモーター及び転写ターミネーター配列は機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーター配列は酵母転写ターミネーター配列である。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は１つまたは複数のＲｈо依存性転写終結シグナルを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはｒｒｎ ＢＴ２であり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴであり、第３の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第４の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは大腸菌ターミネーターである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するＲＮＡコード領域と；ＲＮＡコード領域に対して３’に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位と；を含む操作された発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは調節ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコード領域はｄｓＲＮＡをコードし、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’にある。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’にある。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）制限部位、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）制限部位及びメガヌクレアーゼ制限部位からなる群から選択された部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位を含む。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ制限部位は、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ  ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、ＲＮＡコード領域の下流に転写的に１つまたは複数の転写ターミネーター配列を、及び部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位に対して５’を含む。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、配列番号２から本質的になるｄｓＲＮＡコード領域を含む。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物はバクテリオファージプロモーターを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するＲＮＡコード領域と；ＲＮＡコード領域に対して３’に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位と；を含む操作された発現構築物を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは調節ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコード領域はｄｓＲＮＡをコードし、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’である。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’である。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）制限部位、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）制限部位またはメガヌクレアーゼ制限部位からなる群から選択された部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位を含む。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ制限部位は、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ  ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、ＲＮＡコード領域の下流に転写的に１つまたは複数の転写ターミネーター配列を、及び部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位に対して５’を含む。いくつかの実施形態では、操作された発現構築物は、配列番号２から本質的になるｄｓＲＮＡコード領域を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物はバクテリオファージプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。
【００１３】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置する第１の核酸配列であって、第１の核酸配列はｄｓＲＮＡ、調節ＲＮＡまたはタンパク質をコードする、第１の核酸配列と；第１の核酸配列に対して３’に位置する第２の核酸配列であって、第２の核酸配列は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、第２の核酸配列と；を含む操作された発現構築物であって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される、発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、これらヘアピンの各々は少なくとも５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、これらヘアピンの各々は５乃至３０塩基対を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は９乃至１８塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１０または９個以下のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１乃至２３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターはバクテリオファージプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、ＳＶ４０、ＳＰ６、Ｔ５、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトースオペロン（ｌａｃ）プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列と、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列と、第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、１４、１５及び２０からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する第１の転写ターミネーター配列と；第１の転写ターミネーターに対して３’に位置する第２の転写ターミネーター配列であって、ｄｓＲＮＡコード領域、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターがプロモーターに作動可能に連結される、第２の転写ターミネーター配列と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’にある。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’にある。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、さらに、第２の転写ターミネーター配列に対して３’に位置する１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはメガヌクレアーゼ制限部位を含む。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ制限部位は、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ  ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、さらに、ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する１、２、３、４、５、６つまたは７つ以上の付加的な転写ターミネーター配列を含む。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、ＰＴＨ−ターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔlターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター及びＴＴａｄｃ転写ターミネーターからなる群から各々独立して選択される２つまたは３つ以上のＲｈо非依存性転写ターミネーター配列を含み、ゆえに、プロモーター及び転写ターミネーター配列は機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーター配列は酵母転写ターミネーター配列である。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。いくつかの実施形態では、第１転写ターミネーター及び第２転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１転写ターミネーター及び第２転写ターミネーターをコードするポ���ヌクレオチドは少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはｒｒｎ ＢＴ２であり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴであり、第３の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第４の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは大腸菌ターミネーターである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。
【００１６】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置する第１の核酸配列であって、第１の核酸配列はｄｓＲＮＡ、調節ＲＮＡまたはタンパク質をコードする、第１の核酸配列と；第１の核酸配列に対して３’に位置する第２の核酸配列であって、第２の核酸配列は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、第２の核酸配列と；を含む操作された発現構築物であって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列はプロモーターに作動可能に連結される、発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、これらヘアピンの各々は少なくとも５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、これらヘアピンの各々は５乃至３０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は９乃至１８塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１０または９個以下のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１乃至２３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターはバクテリオファージプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、ＳＶ４０、ＳＰ６、Ｔ５、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトースオペロン（ｌａｃ）プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列と、標的配列に実質的に相補的な第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列と、第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、１４、１５及び２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞はＲＮＡｓｅ  Ａを発現しない。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は死滅し、かつ不溶解である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、有害無脊椎動物侵入を制御、または植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する組成物で使用されてもよい。いくつかの実施形態は、植物に対して死滅及び不溶解細胞を適用することを含む、有害無脊椎動物侵入を制御する方法に関する。いくつかの実施形態では、上記実施形態のいずれかの死滅及び不溶解細菌は、植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する方法において昆虫または線虫ウイルスベクターについての植物性食物源に適用される。
【００１７】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’である。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’である。いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する第１の転写ターミネーター配列と；第１の転写ターミネーター対して３’に位置する第２の転写ターミネーター配列であって、ｄｓＲＮＡコード領域、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターはプロモーターに作動可能に連結される、第２の転写ターミネーター配列と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して５’にある。いくつかの実施形態では、第１のセンス配向ヌクレオチド配列は、第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列に対して３’にある。いくつかの実施形態では、第１転写ターミネーター及び第２転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１転写ターミネーター及び第２転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはｒｒｎ ＢＴ２であり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴであり、第３の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第４の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネータ��及び第４の転写ターミネーターは大腸菌ターミネーターである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞はＲＮＡｓｅ  Ａを発現しない。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は死滅し、かつ不溶解である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、有害無脊椎動物侵入を制御、または植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する組成物で使用されてもよい。いくつかの実施形態は、植物に対して死滅及び不溶解細胞を適用することを含む有害無脊椎動物侵入を制御する方法に関する。いくつかの実施形態では、上記実施形態のいずれかの死滅及び不溶解細菌は、植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する方法において昆虫または線虫ウイルスベクターについての植物性食物源に適用される。
【００１８】
いくつかの実施形態は、細菌宿主細胞及び成長培地を含むＲＮＡのインビボ合成のための細胞培養システムであって、細菌宿主細胞は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置する第１の核酸配列であって、第１の核酸配列はｄｓＲＮＡ、調節ＲＮＡまたはタンパク質をコードする、第１の核酸配列と；第１の核酸配列に対して３’に位置する第２の核酸配列であって、第２の核酸配列は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、第２の核酸配列と；を含む操作された発現構築物を含むベクターを含む、細胞培養システムに関する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第２核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１乃至２３をからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成長培地は、３．２％のトリプトン、２％の酵母エキス、０．５％のＮａＣｌ、１％のグリセロール、０．１％のグルコース、０．４％のアルファ乳糖、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態は、細菌宿主細胞及び成長培地を含むタンパク質のインビボ合成のための細胞培養システムであって、細菌宿主細胞は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置する第１の核酸配列であって、第１の核酸配列は注目するタンパク質をコードする、第１の核酸配列と；第１の核酸配列に対して３’に位置する第２の核酸配列であって、第２の核酸配列は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、第２の核酸配列と；を含む操作された発現構築物を含むベクターを含む、細胞培養システムに関する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第２核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１乃至２３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、成長培地は、３．２％のトリプトン、２％の酵母エキス、０．５％のＮａＣｌ、１％のグリセロール、０．１％のグルコース、０．４％のアルファ乳糖、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域及び成長培地に対して３’に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞を含むｄｓＲＮＡのインビボ合成のための細胞培養システムが提供される。いくつかの実施形態では、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置するｄｓＲＮＡコード領域であって、ｄｓＲＮＡコード領域は、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列、ならびに第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する第１の転写ターミネーター配列と；第１の転写ターミネーターに対して３’に位置する第２の転写ターミネーター配列であって、ｄｓＲＮＡコード領域、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターがプロモーター及び成長培地に作動可能に連結される、第２の転写ターミネーター配列と；を含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞を含むｄｓＲＮＡのインビボ合成のための細胞培養システムが提供される。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはｒｒｎ ＢＴ２であり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴであり、第３の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第４の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは大腸菌ターミネーターである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、成長培地は、３．２％のトリプトン、２％の酵母エキ��、０．５％のＮａＣｌ、１％のグリセロール、０．１％のグルコース、０．４％のアルファ乳糖、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置決めされたＲＮＡコード領域であって、ＲＮＡコード領域はｄｓＲＮＡ、調節ｄｓＲＮＡまたはタンパク質をコードする、ＲＮＡコード領域と；有害無脊椎動物侵入を制御、または植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止するためのＲＮＡコード領域に対して３’に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位と；を含む操作された発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞の溶解物に関する。
【００２２】
いくつかの実施形態は、プロモーターと；プロモーターの下流に転写的に位置決めされたＲＮＡコード領域であって、ＲＮＡコード領域はｄｓＲＮＡ、調節ＲＮＡまたはタンパク質をコードする、ＲＮＡコード領域と；ｄｓＲＮＡコード領域に対して３’に位置する第１の転写ターミネーター配列と；第１の転写ターミネーターに対して３’に位置する第２の転写ターミネーター配列であって、ＲＮＡコード領域、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターは、有害無脊椎動物侵入を制御、または植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止するためのプロモーターに作動可能に連結される、第２の転写ターミネーター配列と；を含む操作されたＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む細菌宿主細胞の溶解物に関する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターをコードするポリヌクレオチドは少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物は、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーターはｒｒｎ ＢＴ２であり、第２の転写ターミネーターはＰＥＴであり、第３の転写ターミネーターはＰＴＨであり、第４の転写ターミネーターはＰＥＴである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは大腸菌ターミネーターである。いくつかの実施形態では、第１の転写ターミネーター、第２の転写ターミネーター、第３の転写ターミネーター及び第４の転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコード領域はｄｓＲＮＡをコードし、標的配列に実質的に対応する第１のセンス配向ヌクレオチド配列と、標的配列と実質的に相補的である第２のアンチセンス配向ヌクレオチド配列と、第１及び第２のヌクレオチド配列に隣接し、ＲＮＡ転写のループ領域の１つまたは複数のヌクレオチドをコードする第３のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態は、植物に溶菌液を付けることを含む有害無脊椎動物侵入を制御する方法に関する。いくつかの実施形態では、上記の実施形態のいずれかの溶菌液は、植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する方法において昆虫または線虫ウイルスベクターについての植物性食物源に適用される。
【００２３】
いくつかの実施形態は、２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む転写ターミネーターに関する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも３つのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は５乃至３０個の塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は９乃至１８個の塩基対を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１０または９個以下のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、３つ未満の不対ヌクレオチドを有するステム領域を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンの各々は、不対ヌクレオチドを有しないステム領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１３、１８及び２１乃至２３をからなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態は、プロモーター及びＲＮＡコード領域に作動可能に連結された転写ターミネーターを発現ベクターに提供することを含む、発現ベクターからのＲＮＡ製造の調節方法であって、転写ターミネーターが、選択された数の中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成し、それにより、ＲＮＡ生成が、増加した数の中サイズのヘアピンを有する二次構造を形成する転写ターミネーターを提供することにより増加される、方法に関する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、１つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、２つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、３つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、５つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。
【００２５】
いくつかの実施形態は、プロモーター及びタンパク質コード領域に作動可能に連結された転写ターミネーターを発現ベクターに提供することを含む、発現ベクターからのタンパク質産生の調節方法であって、転写ターミネーターは、選択された数の中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成し、それにより、タンパク質製造が、増加した数の中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する転写ターミネーターを提供することにより増加される、方法に関する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、１つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、２つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、３つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、４つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。いくつかの実施形態では、転写ターミネーターは、５つの中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、５’から３’への方向に、センスＤＮＡ断片に作動可能に連結されたプロモーター、ループコード領域、相補的アンチセンスＤＮＡ断片、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターを含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物の図式表現である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、５’から３’への方向に、アンチセンスＤＮＡ断片に作動可能に連結されたプロモーター、ループコード領域、相補的センスＤＮＡ断片、第１の転写ターミネーター及び第２の転写ターミネーターを含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物の図式表現である。
【図２Ａ】図２ＡはｐＣＰＢ−ｈｐベクターの図式表現である。
【図２Ｂ】図２ＢはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターの図式表現である。
【図２Ｃ】図２ＣはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターの部分地図である。
【図３Ａ】図３Ａは、３７℃（左側レーン）または２５℃（右側レーン）で一晩中成長された２０ｕＬの培養物から単離された総ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。「１」で印付けされたレーンはｐＵＣ１９／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「２」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「３」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「４」で印付けされたレーンはｐＵＣ１９／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「５」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「６」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３７℃（左側レーン）または２５℃（右側レーン）で一晩中成長された２０ｕＬの培養物から単離された総ＲＮＡが処理されたＲＮＡｓｅ  Ａを示すアガロースゲルの写真である。「１」で印付けされたレーンはｐＵＣ１９／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「２」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「３」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「４」で印付けされたレーンはｐＵＣ１９／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「５」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。「６」で印付けされたレーンはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ／ＨＴ１１５（ＤＥ３）＋ｐＬａｃ−Ｔ７細菌から単離された総ＲＮＡを示す。
【図４】図４は、レーン１における誘導を伴わない総細菌ＲＮＡ及びレーン２における誘導を伴う総細菌ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。Ｍはマーカーである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＲＮＡｓｅ  Ａ消化を伴わない細菌転写ＲＮＡ（レーン５乃至８）及びインビトロ転写ＲＮＡ（レーン９及び１０）を示すアガロースゲルの写真である。レーン４はサイズマーカーを示す。レーン５は、修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの１０倍希釈を示す。レーン６は、修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの５０倍希釈を示す。レーン７は、３０Ｋでスピンフィルタリングされた修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの１０倍希釈を示す。レーン８は、３０Ｋでスピンフィルタリングされた修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの５０倍希釈を示す。レーン９は、線状化ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターからインビトロで転写されたＲＮＡの１００倍希釈を示す。レーン１０は、線状化ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターからインビトロで転写されたＲＮＡの５００倍希釈を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、細菌転写ＲＮＡ（レーン５乃至８）及びインビトロ転写ＲＮＡ（レーン９及び１０）のＲＮＡｓｅ  Ａ消化の結果を示すアガロースゲルの写真である。レーン４はサイズマーカーを示す。レーン５は、修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの１０倍希釈を示す。レーン６は、修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの５０倍希釈を示す。レーン７は、３０Ｋでスピンフィルタリングされた修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの１０倍希釈を示す。レーン８は、３０Ｋでスピンフィルタリングされた修飾−ＳＮＡＰ精製ＲＮＡの５０倍希釈を示す。レーン９は、線状化ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターからインビトロで転写されたＲＮＡの１００倍希釈を示す。レーン１０は、線状化ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターからインビトロで転写されたＲＮＡの５００倍希釈を示す。
【図６】図６は、３７、５１、６２または７２℃で３０分間の培養後の大腸菌細胞の顕微鏡写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、自動誘導培地（ＡＩＭ）（レーン５）、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋ＡＩＭ培地（レーン６）またはプラスミド＋ＡＩＭ培地（レーン７）で成長したｐＤＶ４９細菌から単離された総ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。レーン４はサイズマーカーを示す。ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡバンドが矢印で示されている。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋培地（レーン５）で成長したｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ細菌から単離された総ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。レーン４はサイズマーカーを示す。ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡバンドが矢印で示されている。
【図８】図８はｐＤＶ４９＋２Ｔベクターの図式表現である。
【図９】図９は、プロモーターの３’端部とヌクレアーゼ認識部位との間に挿入されたセンスＤＮＡ断片及び相補的アンチセンスＤＮＡ断片を含むプラスミドベクターの図式表現である。ヌクレアーゼの発現はベクターを線状化する。
【図１０】図１０は、異なるターミネーターまたはターミネーターの組み合わせを有するＲＮＡ発現ベクターを含む大腸菌細胞から単離された総ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。サイズマーカーがレーン「Ｍ」に示されている。レーン１は、ｐＵＣ１９−ＰＥＴターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン２は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ１ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン３は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ２ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン４は、ｐＵＣ１９−ＢＴ１ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン５は、ｐＵＣ１９−ＢＴ２ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン６は、ｐＵＣ１９−ＣＪターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン７は、ｐＵＣ１９−Ｂ１００２ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン８は、ｐＵＣ１９−Ｂ１００６ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。レーン９は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離されたＲＮＡを示す。
【図１１】図１１は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（バージョン６．８．４）を使用して決定されるターミネーターＰＴＨ＋ＰＥＴ（配列番号１３）、ＣＪ（配列番号１０）、ｒｒｎ ＢＴ２（配列番号９）、ｒｒｎＢＴ１（配列番号８）、ＰＴＨ（配列番号７）、ＰＥＴ（配列番号１３）、Ｂ１００６（配列番号１２）及びＢ１００２（配列番号１１）により形成された二次構造を示す。二次構造の自由エネルギーは表５に見ることができる。
【図１２】図１２は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（バージョン６．８．４）を使用して決定される異なるサイズのＲＮＡヘアピン及びＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターにより形成された二次構造を示す。図１２Ａは、２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン及びＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターにより形成された二次構造を示す。図１２Ｂは、２４０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン及びＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターにより形成された二次構造を示す。図１２Ｃは、２８０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン及びＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターにより形成された二次構造を示す。ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターにより形成された構造は円で囲まれている。
【図１３】図１３は、２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター、２４０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター、及び２８０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター発現構築物の各々から得られたＲＮＡ収量を示すグラフである。
【図１４】図１４は、異なる数及び組み合わせのターミネーターを有するＲＮＡ発現ベクターを含む大腸菌細胞から単離された総ＲＮＡを示すアガロースゲルの写真である。レーン１は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴ  ２ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。レーン２は、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ  ４ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。レーン３は、ｐＵＣ１９−ＰＥＴ＋ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ  ４ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。レーン４は、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ  ３ターミネーター／ＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌から単離された総ＲＮＡを示す。
【図１５】図１５は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（バージョン６．８．４）を使用して決定される異なる数及び組み合わせのターミネーターにより形成された二次構造を示す。図１５Ａは、２つのターミネーター、すなわち、ＰＴＨ＋ＰＥＴにより形成された二次構造を示す。図１５Ｂは、４つのターミネーター、すなわち、ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴにより形成された二次構造を示す。図１５Ｃは、４つのターミネーター、すなわち、ＰＥＴ＋ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴにより形成された二次構造を示す。図１５Ｄは、３つのターミネーター、すなわち、ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴにより形成された二次構造を示す。ターミネーターの組み合わせにより形成された中サイズのヘアピンは円で囲まれている。
【図１６】図１６は、異なる数及び組み合わせのターミネーターを有する発現ベクターを含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から単離された総タンパク質を示すアＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。発現タンパク質、すなわち、タンパク質Ａは、２１ｋの分子量を有する。サイズマーカーがレーン「Ｍ」に示されている。レーン「Ａ」は、ｐＵＣ＋ＰＥＴターミネーター発現構築物を含む細胞から単離されたタンパク質を含む。レーン「Ｂ」は、ｐＵＣ＋ｒｒｎ ＢＴ２ターミネーター発現構築物を含む細胞から単離されたタンパク質を含む。レーン「Ｃ」は、ｐＵＣ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター発現構築物を含む細胞から単離されたタンパク質を含む。レーン「Ｄ」は、ｐＵＣ＋ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター発現構築物を含む細胞から単離されたタンパク質を含む。
【図１７】図１７は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（バージョン６．８．４）を使用して決定される操作されたターミネーターにより形成された二次構造を示す。図１７Ａは、４つのターミネーター、ｒｒｎ ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ（配列番号１８）により形成された二次構造を示す。図１７Ｂは、ＳＥＱ  ＩＤ２１により形成された二次構造を示す。図１７Ｃは、ＳＥＱ  ＩＤ２２により形成された二次構造を示す。図１７Ｄは、ＳＥＱ  ＩＤ２３により形成された二次構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下は、本発明を実施する上で当業者に提供される本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態において修正及び変更することが可能である。
【００２８】
Ａ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されているすべての技術的及び科学的用語は、当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、別段の定めがない限り、その用語の複数形も想定されている。別段の記載がない限り、本明細書の文中の核酸配列は、プロモーターに関して５’から３’への方向に与えられる。
【００２９】
以下の説明において、複数の用語が広範囲に亘って使用されている。以下の定義が、本実施形態の理解を容易にするように提供される。
【００３０】
本明細書で使用されているように、単数表現は１つまたは２つ以上のものを意味してもよい。
【００３１】
本明細書で使用されているように、用語「約」は、値または実験間に存在する変化を決定するのに用いられる方法についての誤差の固有のばらつきを含むことを意味する。
【００３２】
用語「第１」、「第２」などは、種々の要素を記載するのに本明細書で使用されてもよいが、これらの要素はそれらの用語により限定される必要はない。これらの用語は、一の要素を他の要素と区別するようにのみ使用される。
【００３３】
本明細書で使用されているように、用語「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）、天然に存在するヌクレオチドの類似物、またはそれら両方の組み合わせであるモノマーで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分における変化を有し得る。糖修飾は、たとえば、１つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基との置換を含み、または、糖はエーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに、全糖部分は、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体的及び電子的に類似する構造と置換され得る。塩基性部分における修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環置換体が挙げられる。核酸モノマーは、リン酸ジエステル結合またはそのような結合の類似結合により結合され得る。リン酸ジエステル結合の類似結合としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノエート、ホスホロジチオアート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどが挙げられる。
【００３４】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子である。たとえば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された受容体をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の他の非限定的な例は、生物のゲノムに組み込まれない化学合成核酸分子である。単離された核酸分子の他の非限定的な例は、特定の種からの染色体の完全なＤＮＡ分子より小さい特定の種から単離された核酸分子である。
【００３５】
用語「ベクター」は、宿主細胞に外来性遺伝物質を人為的に担持させる賦形剤として使用されるＤＮＡ分子であって、それは複製及び／または発現され得る、ＤＮＡ分子を意味する。ベクターのＤＮＡ配列は、一般に、インサート（導入遺伝子）、及び「バックボーン」としての役割を果たすより大きい配列を含む。ベクターバックボーンは、ベクターの必須の生物学的機能の損失なしに確定的に核酸分子の挿入を可能にする１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、ベクターが導入された細胞の特定及び選択で使用するのに適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列と、複製の起点とを含んでもよい。発現ベクター（発現構築物）は一般に、宿主細胞において導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本実施形態によって使用するのに好適なベクターの例としては、プラスミド、コスミド、プラストマー、人工染色体及びバクテリオファージが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、互換的に用いられてもよく、対象のヌクレオチド配列に連結されるときに、ＲＮＡに対象のヌクレオチド配列の転写を制御し得るＤＮＡ配列を意味する。用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、転写開始位置を特定する役割を果たす、または、生理学的条件に応じて転写開始の効果を制御するタンパク質因子の結合に関与するＴＡＴＡボックス及び他のＤＮＡ配列からなる短いＤＮＡ配列である最小プロモーターを含む。プロモーターは、宿主細胞の天然遺伝子からプロモーターの全部が由来する、同種のものであってもよく、または、他の生物から全体的にもしくは部分的に導出されるもので、異種のものであってもよく、または、自然の中で見出される異なるプロモーター由来の異なる要素からなってもよく、または、合成ＤＮＡセグメントからなってもよい。本明細書に記載されているように、プロモーターは、恒常的活性プロモーターまたは調節プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは抑制性であってもよい。他の実施形態では、プロモーターは誘導性であってもよい。
【００３７】
ヌクレオチド配列の発現が、プロモーターの制御下に置かれるとき、そのようなヌクレオチド配列は、プロモーターに「作動可能に連結される」といわれる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合には、「作動可能に連結されている」。
【００３８】
用語「宿主細胞」は、本実施形態により設計されたベクターを複製及び／または転写することができるいずれかの細胞を意味する。本実施形態で使用する宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、または、菌類、植物、昆虫、両生類、鳥、哺乳動物の細胞などの真核細胞であり得る。標的細胞へのベクターの挿入は、通常、細菌細胞に対する転換、真核細胞に対するトランスフェクションと称せられるが、ウイルスベクターの挿入は、しばしば、形質導入と称せられる。
【００３９】
用語「発現」または「遺伝子発現」は、遺伝子産物の生合成を意味する。たとえば、機能性ＲＮＡの場合、遺伝子発現は、ＲＮＡへの遺伝子の転写に関与する。
【００４０】
本明細書で使用されているように、表現「遺伝子発現の阻害」、「標的遺伝子の発現を阻害する」、「遺伝子抑制」または「標的遺伝子を抑制する」は、標的遺伝子からのタンパク質及び／またはｍＲＮＡ産物のレベルにおける非存在（または、観測可能な低減）を意味する。
【００４１】
本明細書で使用されているように、用語「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写から生じる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的複製であるとき、このＲＮＡ転写物は一次転写物と称せられ、または、このＲＮＡ転写物は、一次転写物の転写後処理由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称せられる。
【００４２】
本明細書で使用されているように、用語「センスＲＮＡ」は、対象生物により生成されるときに、対象生物によりタンパク質に翻訳され得るｍＲＮＡの形態にある、配列またはセグメントに対応するＲＮＡ転写物を意味する。いくつかの実施形態では、対象生物は有害生物である。
【００４３】
本明細書で使用されているように、用語「アンチセンスＲＮＡ」は、対象生物の細胞で通常生成されるｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるＲＮＡ転写物を意味する。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写のいずれかの一部を伴ってもよく、すなわち、５’非コード配列、３’非翻訳配列、イントロンまたはコード配列に存在してもよい。いくつかの実施形態では、対象生物は有害生物である。
【００４４】
用語「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される配列を意味し、参照配列は、たとえば、配列表に与えられた全長ｃＤＮＡ配列のセグメントとしてのより大きい配列のサブセットであってもよく、または、完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０個のヌクレオチドであり、しばしば長さが少なくとも２５個のヌクレオチドであり、及びたびたび長さが少なくとも５０個のヌクレオチドである。
【００４５】
本明細書で使用されているように、用語「標的配列」は、ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域に対応する、抑制のために標的にされた遺伝子のヌクレオチド配列を意味する。これに関連して、用語「遺伝子」は、調節領域、転写領域及び／または他の機能性配列領域を含む継承単位に対応するゲノム配列の配置可能領域を意味する。状況に応じて、用語「標的配列」は、抑制のために標的にされる遺伝子の全長ヌクレオチド配列または抑制のために標的にされる遺伝子の一部のヌクレオチド配列を意味する。
【００４６】
５’から３’への方向で観測されるときの第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチドの配列が参照ヌクレオチド配列の逆転写である場合に、３’から５’への方向で観測される第２のヌクレオチド配列「の捕捉物」またはそれ「に対する相補物」であるといわれる。例示として、ヌクレオチド配列「ＣＡＴＴＡＧ」は参照配列「ＣＡＴＴＡＧ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＡＴＣ」と相補的である。核酸配列分子は、５’から３’に読み取られる配列の一のすべてのヌクレオチドが、３’から５’に読み取られるときに他の配列のすべてのヌクレオチドと相補的であるときに、「完全な相補性」を示すといわれる。
【００４７】
本明細書で使用されているように、「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域と隣接する相補的領域が、相補的領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重体形成またはワトソン・クリック型塩基対から除外されるように、ハイブリダイズする核酸の一本鎖により形成された構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。
【００４８】
本明細書で使用されているように、用語「配列同一性」、「配列類似性」または「相同性」は、２つまたは３つ以上のヌクレオチド配列間の配列関係を表すのに用いられる。２つの配列間の「配列同一性」の割合は、比較ウィンドウ全体に亘って２つの最適に位置合わせされた配列を比較することにより決定され、ゆえに、比較ウィンドウにおける配列のその部分は、それら２つの配列の最適な位置合わせのための参照配列（付加または欠失を含まない）に比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が、マッチングした位置の数を得るのに両方の配列において存在する位置の数を決定し、マッチングした位置の数を比較ウィンドウにおける総位置数で除算し、その結果に、配列同一性の割合を得るのに、１００を乗算することにより演算される。参照配列と比較して、すべての位置で同一である配列は参照配列と同一であるといわれ、その逆もまた真である。
【００４９】
本明細書で使用されているように、用語「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個の連続的位置の、通常は約５０乃至約１００個の、より一般的には約１００乃至約１５０個の概念セグメントを意味し、このウィンドウにおいて、２つの配列が最適に位置合わせされた後に、配列は同じ数の連続的位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な位置合わせのための参照配列（付加または欠失を含まない）に比較して、約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。当業者は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）における配列位置合わせのために使用される詳細な方法を参照する必要があり、または、配列分析の詳細な議論については、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９８）を参照する必要がある。
【００５０】
本明細書で使用されているように、用語「から由来の」は、特に特定のソースまたは種から、その特定のソースまたは種から必ずしも直接でなくても、得られてもよい特定のヌクレオチド配列を意味する。
【００５１】
用語「エンドヌクレアーゼ」または「制限エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を開裂する酵素を意味する。
【００５２】
用語「メガヌクレアーゼ」は、大きい認識部位（１２乃至４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼを意味し、エンドデオキシリボヌクレアーゼは、その認識部位の大きさの結果として、所与のゲノムで、たとえ生じることがあったとしても、一般にはまれに生じる。メガヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−Ｍｓｏｌ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５３】
用語「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ヌクレアーゼドメインに融合されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼを意味する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬエフェクタードメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質由来であるように、所望の標的に結合するように操作され、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインなどのヌクレアーゼドメインに融合されてもよい。
【００５４】
用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）」は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインなどのヌクレアーゼドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼを意味する。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的にするよう操作され得、これは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内で一意の配列を標的にすることを可能にする。
【００５５】
用語「開裂」は、ＤＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子の共有結合バックボーンの切断を意味する。
【００５６】
本明細書で使用されているように、用語「有害生物」は、人的環境に蔓延し、有害生物宿主または共生生物により生成される１つまたは複数の細胞、組織または液体を摂取または接触する可能性がある昆虫、クモ、甲殻類、菌類、細菌、ウイルス、線虫、扁形動物、回虫、蟯虫、鉤虫、条虫、トリパノソーマ、住血吸虫、ウマバエ、ノミ、マダニ、ダニ、シラミなどを意味する。
【００５７】
本明細書で使用されているように、用語「有害生物耐性」は、有害生物宿主または共生生物に対して損傷または損失を典型的に与え得る、有害生物からの攻撃に反撃する、有害生物宿主または共生生物の能力を意味する。本明細書に記載されているように、そのような有害生物耐性は、有害生物宿主または共生生物を餌にすることを好む有害生物内のＤＮＡ配列からコードされる対応するＲＮＡセグメントと同一であるＲＮＡのセグメントの一部に含まれるｄｓＲＮＡ分子を有害生物宿主または共生生物の表面に供給することにより達成され得る。標的有害生物内の遺伝子発現はｄｓＲＮＡにより抑制され、標的有害生物における遺伝子発現の抑制は、有害生物宿主または共生生物が有害生物耐性を有するようにする。
【００５８】
Ｂ．ＲＮＡの生成
本開示は、高効率でコストパフォーマンスの高い転写ＲＮＡ分子の生成及び送達のための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子は調節ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子はｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子は、標的遺伝子を抑制し得る、安定化した少なくとも一部が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を形成するセンス配向セグメント及びアンチセンス配向セグメントの両方を含む。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、転写ＲＮＡ分子は調節ＲＮＡである。
【００５９】
ｄｓＲＮＡ
本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、第３のＲＮＡセグメントにより実質的に相補的な第２のＲＮＡセグメントに連結した第１のＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロ製造のためのベクター及びシステムに関する。第１及び第２のＲＮＡセグメントは、ＲＮＡ分子の長さ内にあり、互いの実質的に逆方向反復であり、ゆえに、第１及び第２のＲＮＡセグメント間の相補性は、一本鎖ループを形成する第３のＲＮＡセグメントにより第１及び第２のセグメントの各々の一端部で共に連結された二本鎖ＲＮＡステムを形成するように、インビボ及びインビトロでハイブリダイズする２つのセグメントの能力をもたらす。第１及び第２のセグメントは、抑制のために標的とされるヌクレオチド配列に対して実質的同一性を示す配列のセンス及びアンチセンスそれぞれに対応する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、少なくとも第２の標的配列を抑制する、少なくとも第２のステム−ループ形成領域をさらに含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の長さは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。同様に、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖の長さは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。ＲＮＡ二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、完全に相補的である必要はなく、二本鎖ＲＮＡは内部の非相補的領域を含んでもよい。センス鎖及びアンチセンス鎖のみが、生物学的条件下でアニールするように、二本鎖にするまたは実質的に相補的である必要がある。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補的塩基対から形成されるとき、その結果として得られる二本鎖は純端を有する。他の実施形態では、二本鎖ＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補的塩基対から形成されるとき、ｄｓＲＮＡは非対称構造を有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個または１６個以上のヌクレオチドの５’オーバーハングを有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個または１６個以上のヌクレオチドの５’オーバーハングを有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個または１６個以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個または１６個以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。
【００６１】
第３のＲＮＡセグメントは、第１のＲＮＡセグメント及び第２のＲＮＡセグメントがｄｓＲＮＡをハイブリダイズ及び形成することを容易にするまたは可能にするいずれかのヌクレオチドの配列を含んでもよい。第３のＲＮＡセグメントは、少なくとも長さが約１乃至５個のヌクレオチド、長さが５乃至１０個のヌクレオチド、長さが１０乃至１５個のヌクレオチド、長さが１５乃至２０個のヌクレオチド、長さが２０乃至２５個のヌクレオチド、長さが２５乃至３０個のヌクレオチド、長さが３０乃至３５個のヌクレオチド、長さが３５乃至４０個のヌクレオチド、長さが４０乃至４５個のヌクレオチド、長さが４５乃至５０個のヌクレオチド、長さが５０乃至５５個のヌクレオチド、長さが５５乃至６０個のヌクレオチド、長さが６０乃至６５個のヌクレオチド、長さが６５乃至７０個のヌクレオチド、長さが７０乃至７５個のヌクレオチド、長さが７５乃至８０個のヌクレオチド、長さが８０乃至８５個のヌクレオチド、長さが８５乃至９０個のヌクレオチド、長さが９０乃至９５個のヌクレオチド、長さが９５乃至１００個のヌクレオチド、長さが１００乃至１５０個のヌクレオチド、長さが１５０乃至２００個のヌクレオチド、長さが２００乃至２５０個のヌクレオチド、長さが２５０乃至４００個のヌクレオチド、または長さが４００乃至５００個のヌクレオチドの配列を含んでもよい。種々の異なる配列はループ配列としての役割を果たしてもよい。ｓｈＲＮＡにおいて機能することを示した特定のループ配列の例としては、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＴＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＣ及びＵＵＣＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、抑制のために標的になる遺伝子のセグメントのセンスまたはアンチセンス配列に実質的に対応する。たとえば、第３のＲＮＡセグメントは、自己相補的な第１及び第２のＲＮＡセグメントにより標的にされる遺伝子セグメントの先端に位置するヌクレオチドのセンスまたはアンチセンスに対応するヌクレオチドの配列を含んでもよい。他の実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、非標的遺伝子のセグメントのセンスまたはアンチセンス配列に実質的に対応する。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のループ領域のヌクレオチド配列から由来する。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列は、対象生物の天然ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のループ領域のヌクレオチド配列から由来する。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列は操作されたヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントの操作されたヌクレオチド配列は、ＧＣ含有量を変化させることにより天然遺伝子のヌクレオチド配列から由来する。いくつかの実施形態では、第３のＲＮＡセグメントのヌクレオチド配列はアプタマーをコードする。
【００６２】
いずれかの遺伝子が、本実施形態により製造されるｄｓＲＮＡ分子による抑制のために標的にされてもよい。本明細書に記載されているｄｓＲＮＡ分子を使用する標的遺伝子の阻害は、ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域に対応するヌクレオチド配列がＲＮＡｉ媒介阻害のために標的にされる点で、配列特異的である。ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域は、標的遺伝子の一次転写産物の全長ヌクレオチド配列もしくは完全に処理されたｍＲＮＡに対応してもよく、または、ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域は、標的遺伝子の一次転写生成物もしくは完全に処理されたｍＲＮＡの一部に対応してもよい。ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域に対応する、抑制のために標的にされた遺伝子のヌクレオチド配列は「標的配列」と称されてもよい。ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域は、長さが少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００または１,０００ヌクレオチドである標的遺伝子の一部に対応してもよい。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域は、標的遺伝子の大きさに依存する、標的遺伝子の約２０乃至２５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約２５乃至５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約５０乃至７５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約７５乃至１００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約１００乃至１２５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約１２５乃至１５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約１５０乃至１７５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約１７５乃至２００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約２００乃至２５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約２５０乃至２７５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約２７５乃至３００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約３００乃至３２５ヌクレオチド超、標的遺伝子の約３２５乃至３５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約３５０乃至４００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約４００乃至４５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約４５０乃至５００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約５００乃至５５０ヌクレオチド超、標的遺伝子の約５５０乃至６００ヌクレオチド超、標的遺伝子の約６００乃至７００ヌクレオチド超、または標的遺伝子の約７００乃至１,０００ヌクレオチド超に対応してもよい。二本鎖形成領域の長さは、対象生物、たとえば、昆虫により取り込まれ得るｄｓＲＮＡ分子の長さ、またはＲＮＡ干渉を狙いとするフラグメントに対して対象生物の細胞内で処理され得るｄｓＲＮＡの長さに依存してもよい。二本鎖形成領域の長さはまた、ｄｓＲＮＡ合成方法により影響を受けてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖形成領域は、標的配列に対する完全な相補性（１００％）を有する。しかしながら、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖形成領域と標的配列との間の絶対配列同一性は必要ではない。遺伝子変異、菌株多型または進化的分岐により予測され得る配列異変が容認され、挿入、欠失、及び標的配列に対する一転変異を伴う二本鎖形成ヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡが標的遺伝子を阻害するように使用されてもよい。本明細書に記載されているｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域のヌクレオチド配列及び標的遺伝子の対応する部分は実質的に相補的であってもよく、たとえば、これらの配列は、標的になっている配列に沿って、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性を共有してもよい。本明細書に記載されているように、ｄｓＲＮＡの二本鎖形成領域はまた、標的遺伝子転写の一部とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列として機能的に規定されてもよい。延ばされた長さは、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖形成領域とその標的配列との間のより小さい相同性を補償してもよい。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００塩基であってもよい。
【００６４】
ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖形成領域は、有害生物または病原菌由来の遺伝子から選択される１つまたは複数の標的配列を含むいずれかの標的配列に対して設計されてもよい。標的配列は、真核生物または非真核生物由来の遺伝子から選択されてもよい。標的配列は、細菌と、ウイルスと、菌類と、作物、観賞植物、非栽培または野生植物などの単子葉植物及び双子葉植物を含む植物と、節足動物、環形動物、線虫及び軟体動物などの無脊椎動物と、両生類、魚、鳥または哺乳動物などの脊椎動物とを含むいずれかの種からのいずれかの配列を含み得るが、それらに限定されない。
【００６５】
標的配列は、転写可能（コード）配列であり得、または、非コード配列（非コード調節配列など）であり得、またはそれらの両方であり得る。非転写配列（非コード）標的配列の非制限的例としては、５’非転写領域、プロモーター、エンハンサー、または他の非コード転写領域、３’非転写領域、ターミネーター及びイントロンが挙げられる。標的配列はまた、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、小さい干渉ＲＮＡ、リボソームまたはリボザイムのＲＮＡ組成物、小さい核小体ＲＮＡ、及び他の非コードＲＮＡを含んでもよい（たとえば、ｒｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；Ｅｒｄｍａｎｎら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１８９−１９３；Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，２１：３９９−４０４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３：１２１−１２４を参照されたく、それらは、参照により本明細書に組み込まれる）。転写可能（コード）標的配列の非制限的例としては、転写因子をコードする遺伝子、受容体をコードする遺伝子、ホルモンをコードする遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、及び対象分子の生合成または異化作用に関与する酵素をコードする遺伝子（アミノ酸、脂肪酸及び他の脂質と、糖及び他の糖質と、生物学的ポリマーと、アルカロイド、テルペノイド、ポリケチド、非リボソームペプチド及び混合生合成起源の二次代謝産物を含む二次代謝産物などであるが、それらに限定されない）を含む。さらに、標的ヌクレオチド配列は、機能が文献から確立された、いずれかの植物、昆虫、ウイルス、細菌または真菌遺伝子から決定されてもよい。いくつかの基準が標的遺伝子の選択で用いられてもよいと考えられる。たとえば、標的ヌクレオチド配列は、生存能力、成長、生育、生殖及び感染性において重要な役割を果たす遺伝子から決定されてもよい。これらの遺伝子は、ショウジョウバエ、シー・エレガンスまたは他の生物における致死ノックアウト変異体により特定されてもよい。遺伝子はまた、タンパク質生成物が急速な回転率を有する遺伝子であり、ゆえに、ｄｓＲＮＡ阻害は、タンパク質レベルにおける急速な減少をもたらす。特定の実施形態では、発現レベルにおける小さい低下が生物への悪影響をもたらす遺伝子を選択することは有利である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、標的配列は、昆虫由来の遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、作物への損傷及びその後の収量損失をもたらすいずれかの昆虫由来の遺伝子から選択され得る（有害昆虫）。有害昆虫の非制限的例としては、トウモロコシアブラムシ、ツマジロクサヨトウ、アフリカシロナヨトウ、アメリカタバコガ、ツマジロクサヨトウ、コーンリーフホッパー（ｃｏｒｎ  ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）、コーンブロッチリーフマイナー（ｃｏｒｎ  ｂｌｏｔｃｈ  ｌｅａｆ  ｍｉｎｅｒ）、ウェスターンコーンルートワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、メキシカンコーンルートワーム（Ｍｅｘｉｃａｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、サザーンコーンルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、ネキリムシ、タネバエ、ハリガネムシ、ムギアカタマバエ、ジュウイチホシウリハムシ、グリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ）、ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ）、ダイズアブラムシ及びソイビーンステムボーラー（ｓｏｙｂｅａｎ  ｓｔｅｍ  ｂｏｒｅｒ）が挙げられる。昆虫における遺伝子は、成熟（成虫）、未成熟（幼虫）または卵の段階で標的にされてもよい。いくつかの実施形態では、抑制のために標的になる遺伝子は、必須タンパク質をコードし得、その必須タンパク質の予測される機能は、筋肉形成、幼若ホルモン形成、幼若ホルモン調節、イオン調節及び輸送、消化酵素合成、細胞膜電位の維持、アミノ酸生合成、アミノ酸分解、精子形成、フェロモン合成、フェロモン感知、触角形成、羽形成、脚形成、生育及び分化、卵形成、幼虫成熟、消化酵素形成、血リンパ合成、血リンパ維持、神経伝達、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸及びアポトーシスからなる群から選択される。標的配列が、昆虫の生存能力または感染性に不可欠な遺伝子由来である場合、その下方制御は、その宿主を生き延びさせるまたは感染させる昆虫の能力低下をもたらす。ゆえに、そのような下方制御は、宿主細胞由来の栄養物を得て生き延びる昆虫の能力を防止または低減する点で、昆虫の生存能力または感染性の維持に関して“有害効果”をもたらす。昆虫の生存能力または感染性におけるこの低減によって、昆虫による感染性に対する耐性及び／または高許容性が促進される。いくつかの実施形態では、標的配列は、タンパク質生成物が急速な回転率を有する遺伝子から選択され、ゆえに、ｄｓＲＮＡ阻害は、タンパク質レベルにおける急速な減少をもたらすであろう。特定の実施形態では、発現レベルの小さい低下が昆虫に対する有害効果をもたらす遺伝子を選択することは有利である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、標的配列は、昆虫の腹で発現させた遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、原形質膜プロトンＶ−ＡＴＰａｓｅのタンパク質組成物をコードする既知の腹発現遺伝子のヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を共有する遺伝子から選択される（Ｄｏｗら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２００：２３７−２４５；Ｄｏｗ，Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉоｍｅｍｂ．，１９９９，３１：７５−８３）。このタンパク質複合体は、上皮イオン輸送の単一のエナージャイザーであり、中腸の管腔のアルカリ化に責任をもつ。Ｖ−ＡＴＰａｓｅは、マルピーギ管、体液平衡で機能する昆虫の後腸の副産物、及び哺乳動物の腎臓に類似する外因性化合物の解毒作用においても発現される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、標的配列は、昆虫の成長、生育及び生殖に関わる遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＣＨＤ３遺伝子をコードする遺伝子から選択される。キイロショウジョウバエのＣＨＤ３遺伝子は、タンパク質を、核のクロマチン会合／分解に関与するＡＴＰ−生育ＤＮＡヘリカーゼ活性でコードする。類似する配列は、シロイヌナズナ、シノラブディス・エレガンス及びサッカロマイセス・セレヴィシエなどの多様な生物で見出されてきた。いくつかの実施形態では、標的配列は、βチューブリン遺伝子をコードする遺伝子から選択される。βチューブリン遺伝子ファミリーは、細胞骨格の構成要素である微小管結合タンパク質をコードする。その関連配列は、シノラブディス・エレガンス及びたばこスズメガなどの多様な生物で見出されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、標的配列は、有害線虫由来の遺伝子から選択され得る。有害線虫の非制限的例としては、コロンビアネコブセンチュウ、ノーザンネコブセンチュウ、サザーンネコブセンチュウ、ネコブセンチュウ、ニセネコブセンチュウ、コーンシストセンチュウ、ダイズシストセンチュウ、イモシストセンチュウ、サトウダイコンシストセンチュウ、スティングセンチュウ、ワセンチュウ、スパイラルセンチュウ、ヤリセンチュウ、オオハリセンチュウ、ハリセンチュウ、ネグサレセンチュウ、ユミハリセンチュウ、スタントセンチュウ、ジャガイモシストセンチュウ及びイモグサレセンチュウが挙げられる。いくつかの実施形態では、抑制のために標的にされる遺伝子は、必須タンパク質をコードし得、その必須タンパク質の予測される機能は、筋肉形成、イオン調節及び輸送、消化酵素合成、細胞膜電位の維持、アミノ酸合成、アミノ酸分解、精子形成、生育及び分化、卵形成、消化酵素形成、神経伝達、細胞分裂、エネルギー代謝、呼吸及びアポトーシスからなる群から選択される。標的配列が、線虫の生存能力または感染性に不可欠な遺伝子由来である場合、その下方制御は、その宿主を生き延びさせるまたは感染させる線虫の能力低下をもたらす。ゆえに、そのような下方制御は、宿主細胞由来の栄養物を得て生き延びる線虫の能力を防止または低減する点で、線虫の生存能力または感染性の維持に関して“有害効果”をもたらす。線虫の生存能力または感染性におけるこの低減によって、線虫による感染性に対する耐性及び／または高許容性が促進される。いくつかの実施形態では、標的配列は、タンパク質生成物が急速な回転率を有する遺伝子から選択され、ゆえに、ｄｓＲＮＡ阻害は、タンパク質レベルにおける急速な減少をもたらすであろう。特定の実施形態では、発現レベルの小さい低下が線虫に対する有害効果をもたらす遺伝子を選択することは有利である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、標的配列は、菌類由来の遺伝子から選択される。菌類の非制限的例としては、多犯性土壌病原菌、パッシニアソルギ、トウモロコシ黒穂菌、エキセロヒラム・ペディセラータム、フザリウム・バーティシリオイデス、フザリウム・バーティシリオイデス及びスファセロセカ・レイリアナが挙げられる。いくつかの実施形態では、抑制のために標的にされる遺伝子は必須タンパク質をコードし得、それら必須タンパク質の予測される機能は、細胞分裂、エネルギー代謝、細胞壁形成、胞子形成、菌糸形成及び消化酵素合成からなる群から選択される。標的配列が菌類の生存能力または感染性に不可欠な遺伝子由来である場合、その下方制御は、その宿主を生き延びさせるまたは感染させる菌類の能力低下をもたらす。ゆえに、そのような下方制御は、宿主細胞由来の栄養物を得て生き延びる昆虫の能力を防止または低減する点で、菌類の生存能力または感染性の維持に関して“有害効果”をもたらす。菌類の生存能力または感染性におけるこの低減によって、菌類による感染性に対する耐性及び／または高許容性が促進される。いくつかの実施形態では、標的配列は、タンパク質生成物が急速な回転率を有する遺伝子から選択され、ゆえに、ｄｓＲＮＡ阻害は、タンパク質レベルにおける急速な減少をもたらすであろう。特定の実施形態では、発現レベルの小さい低下が菌類に対する有害効果をもたらす遺伝子を選択することは有利である。
【００７１】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡが２つ以上の種における標的遺伝子の発現を抑制することが好適であってもよい。いくつかの実施形態では、２つまたは３つ以上の昆虫種、たとえば、コーンルートワーム種において標的遺伝子の発現を抑制することが好適であってもよい。そのような実施形態では、標的配列は、選択された種において高度に保存された遺伝子または遺伝子の一部から選択されてもよい。たとえば、標的配列は、選択された種において、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性を有する遺伝子または遺伝子の一部から選択されてもよい。
【００７２】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡが種特異的活性を示すことは好適であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、他の種における対応する遺伝子との配列同一性の程度が低い標的種からの天然の遺伝子または天然の遺伝子の一部から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、他の種における対応する遺伝子との配列同一性の程度が約８０％未満である遺伝子または遺伝子の一部から選択されてもよい。他の実施形態では、標的配列は、他の種における対応する遺伝子との配列同一性の程度が約７０％未満である遺伝子または遺伝子の一部から選択されてもよい。他の実施形態では、標的配列は、他の種における対応する遺伝子との配列同一性の程度が約６０％未満である遺伝子または遺伝子の一部から選択されてもよい。特定の実施形態では、標的配列は、個別の昆虫種間に、または昆虫と他の生物との間に十分に保存されない遺伝子または遺伝子の一部から選択される。いくつかの実施形態では、標的配列は、他の生物において既知の相同性を有しない標的種の天然遺伝子から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、植物または脊椎動物において既知の相同性を有しない標的種の天然遺伝子から選択されてもよい。
【００７３】
ベクター及び発現
本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、ＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含むＲＮＡのインビボ及びインビトロ転写のための操作された発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであってもよい。他の実施形態では、ＲＮＡは、タンパク質をコードしてもよい、または調節ＲＮＡであってもよい。本明細書に記載されている操作された発現構築物は、有利に、複製可能なベクターの一部を形成してもよい。本明細書に記載されている実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物からのＲＮＡ生成の効率は、ベクターバックボーンからのＲＮＡの不所望の転写を防止または最小化することにより改善される。ベクターバックボーンの不所望の転写を防止または最小化するいくつかの方法が企図され、及び独立してまたは組み合わされて使用されてもよい。いくつかの実施形態では、２つまたは３つ以上の転写ターミネーター配列が、ＲＮＡコード要素の３’端のプロモーターの下流に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、２つまたは３つ以上の隣接する中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列は、ＲＮＡコード要素の３’端のプロモーターの下流に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムにおいて好適に見出されていない１つまたは複数の制限部位が、ＲＮＡコード要素に対して３’に提供される。この制限における開裂は、切断部位の下流で不所望の転写を防止する。いくつかの実施形態では、相補的塩基対を介して１つまたは複数のステムループ構造を形成し得るＲＮＡ転写をコードする合成ヌクレオチド配列は、ＲＮＡコード要素の３’端の下流でプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質のための１つまたは複数の結合部位をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡコード要素に対して３’に提供される。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物はＲｈｏ依存性終結シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ベクターバックボーンの大きさが低減されて、不所望の転写を最小化する。
【００７４】
本明細書に記載されている実施形態では、操作された発現構築物は：標的配列と実質的に同一であるセンス配向ヌクレオチド配列と；センス配向ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列と；ＲＮＡ転写において相補的領域の二本鎖形成から除外された１つまたは複数のヌクレオチドをコードする相補的センス及びアンチセンスヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列と；を含むｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は：標的配列と実質的に同一であるセンス配向ヌクレオチド配列と；ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列と；センス配向ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列と；を５’から３’への方向に含む、ｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は：標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列と；ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列と；アンチセンス配向ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるセンス配向ヌクレオチド配列と；を５’から３’への方向に含む、ｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列の配向はセンスまたはアンチセンスであり得る。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列は、ｄｓＲＮＡ分子による抑制のために標的にされる遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列の一部と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列は、ｄｓＲＮＡ分子による抑制のために標的にされる遺伝子以外の遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列の一部と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列は操作されたヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のループ領域をコードするヌクレオチド配列はアプタマーをコードする。
【００７５】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であるセンス配向ヌクレオチド配列と、センス配向ヌクレオチド配列より短く、センス配向ヌクレオチド配列の５’端に対して実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列とを、５’から３’への方向に含むｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、標的遺伝子の一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であるセンス配向ヌクレオチド配列と、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と実質的に相補的であり、センス配向ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌクレオチド配列をその３’端に含むより長いアンチセンス配向ヌクレオチド配列とを、５’から３’への方向に含むｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列と、アンチセンス配向ヌクレオチド配列より短く、アンチセンス配向ヌクレオチド配列の５’端と実質的に相補的であるセンス配向ヌクレオチド配列とを、５’から３’への方向に含むｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部と実質的に相補的であるアンチセンス配向ヌクレオチド配列と、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と実質的に同一であり、アンチセンス配向ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を３’端に含むより長いセンス配向ヌクレオチド配列とを、５’から３’への方向に含むｄｓＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、タンパク質コード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、調節ＲＮＡコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ、小さい干渉ＲＮＡ及びトランス作動性ＲＮＡからなる群から選択される。
【００７８】
操作されたＲＮＡ発現構築物で使用されるプロモーターは、操作されたＲＮＡ発現構築物が機能すること（たとえば、原核生物または真核の宿主細胞）予測される発現系の性質に基づいて選択されてもよい。このプロモーターは恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、バクテリオファージプロモーター、たとえば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＶ４０またはＳＰ６は、適切なＲＮＡポリメラーゼの結合のみに依存する高レベルの転写を提供するために、操作されたＲＮＡ発現構築物において使用されてもよい。宿主細胞が適切なＲＮＡポリメラーゼを発現しない場合、宿主細胞で認識されるプロモーターに作動可能に連結されるＴ７、Ｔ３、ＳＶ４０またはＳＰ６ポリメラーゼをコードする導入遺伝子が、操作されたＲＮＡ発現構築物と同じまたは異なるベクターに備えられてもよい。宿主細胞で認識されるプロモーターは、誘導性プロモーターまたは恒常的活性プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムにより発現されるポリメラーゼにより認識される同系プロモーターは、操作されたＲＮＡ発現構築物において使用されてもよい。細菌宿主と共に使用するのに好適なプロモーターの例としては、Ｔ５、βラクタマーゼプロモーター、大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物で使用されるプロモーターは、ＲＮＡ  ＰｏｌＩ、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩまたはＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーターであってもよい。特定の実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物で使用されるプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターであってもよい。ＰｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、５Ｓｒ  ＲＮＡプロモーター、７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ  ＲＮＡプロモーター及びＨ１  ＲＮＡプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、酵母で認識されるプロモーター、たとえば、ＡＤＲ１プロモーター、野生型α因子プロモーターまたはＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターは、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物で用いられてもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、ＲＮＡコード要素の転写及び／または得られた転写の安定性に有利に影響する付加的なヌクレオチド配列を任意にさらに含んでもよい。たとえば、操作されたＲＮＡ発現構築物は、１つもしくは複数のエンハンサーまたはポリアデニル化配列をさらに含んでもよい。
【００８０】
下記の転写終結配列などの大腸菌Ｒｈｏ非依存性終結シグナルなどの原核生物における転写終結を媒介する、Ｒｈｏ非依存性及びＲｈｏ依存性終結と称せられる２つの主要機構は、一連のウリジン（Ｕ）残基と共にこれらの配列から転写されたＲＮＡにおけるステムループ構造の形成が転写複合体からのＲＮＡ鎖の放出を促進するために、外因性転写終結因子を必要としない。他方で、Ｒｈｏ依存性終結は、ｍＲＮＡにおけるＲｈｏ及びシス作用エレメントと称せられる転写終結因子を必要とする。Ｒｈｏのための初期結合部位、すなわち、Ｒｈｏ利用（ｒｕｔ）部位は、実際の終結ターミネーター配列の上流で、高シチジン／低グアノシン含有量及び合成されるＲＮＡにおいて比較的小さい二次構造により特徴付けられる拡張した（〜７０ヌクレオチド、場合によっては、８０−１００ヌクレオチド）一本鎖領域である。ポリメラーゼ休止部位が生じたとき、終結が起こり、転写がＲｈｏのヘリカーゼ活性により解放される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、Ｒｈｏ依存性終結シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏ依存性終結シグナルは、ｄｓＲＮＡ転写のループ形成領域に位置する。他の実施形態では、Ｒｈｏ依存性終結シグナルは、ｄｓＲＮＡ転写の二本鎖形成領域のセンスまたはアンチセンス配列に位置する。Ｒｈｏ依存性終結シグナルをコードする核酸配列は、当該技術分野で公知であり、また、Ｒｈｏ依存性終結遺伝子において特定されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏ依存性終結シグナルは、Ｒｈｏ非依存性終結配列、ＲＮＡ転写を形成するステムループをコードする合成ヌクレオチド配列、ＤＮＡ結合タンパク質のための結合部位、及び下記のような部位特異的制限ヌクレアーゼ部位の１つまたは複数と関連させて提供されてもよい。Ｒｈｏ依存性終結シグナルを含む操作されたＲＮＡ発現構築物は、Ｒｈｏ処理因子（Ｒｈｏ＋細胞株）を発現する宿主細胞において発現され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、操作された発現構築物からのＲＮＡ転写の効率は、ＲＮＡコード要素の端に対して位置３’に２つまたは３つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を提供することにより、向上され得る。特定の理論により制約されることは望まれずに、二次構造は、転写伸長複合体を不安定化させて、ＤＮＡテンプレートから解離されるようになるポリメラーゼをもたらし、それにより、非機能性配列の非生産的転写を最小化して、所望のＲＮＡの転写を増強する。したがって、２つまたは３つ以上の隣接ヘアピンを含む二次構造を形成する終結配列が提供されてもよい。一般に、ヘアピンは、そのアームが一本鎖ループにより接続される対のステム領域を形成するようにそれ自身折り返し得る回帰性ヌクレオチド配列により形成され得る。いくつかの実施形態では、終結配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上の隣接ヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、隣接ヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の不対ヌクレオチドにより分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピンステムは、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１以上の塩基対を含む。特定の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが１２乃至３０塩基対である。特定の実施形態では、終結配列は、約９乃至２５塩基対を含むステム領域を有する２つまたは３つ以上の中サイズのヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのループ形成領域を含む。いくつかの実施形態では、ループ形成領域は４乃至８個のヌクレオチドを含む。特定の理論により制約されることは望まれずに、二次構造の安定性は終結効率性に関連付けられ得る。ヘアピンの安定性は、そのヘアピンの長さと、そのヘアピンが含む不整合または膨れの数と、対領域の塩基組成物とにより決定される。グアニンとシトシンとの間のペアリングは、３つの水素結合を有し、２つのみを有するアデニン−チミンのペアリングに比べて、より安定である。ヘアピン形成回帰性ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成回帰性ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、終結配列は、原核生物、真核またはファージ由来の１つまたは複数の転写終結配列由来である。いくつかの実施形態では、一連の４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアデニン（Ａ）をコードするヌクレオチド配列が、終結配列に対して３’に提供される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物からのＲＮＡ転写効率は、ＲＮＡコード要素の端に対して位置３’にタンデムに２つまたは３つ以上の転写終結配列を提供することにより向上され得る。図１を参照されたい。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物からのＲＮＡ転写効率は、ＲＮＡコード要素の端に対して位置３’にタンデムに３、４、５または６つ以上の転写終結配列を提供することにより向上され得る。転写終結配列は、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の下流に転写的に位置付けられるときに、オープンリーディングフレームの転写の端をもたらす、いずれかのヌクレオチド配列であってもよい。そのような配列は、当該技術分野では公知であり、原核生物、真核またはファージ由来であってもよい。終結配列の例としては、ＰＴＨターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口炎ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔｌターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター、及び、Ｍａｔα（α因子）転写ターミネーター、天然α因子転写終結配列、ＡＤＲ１転写終結配列、ＡＤＨ２転写終結配列及びＧＡＰＤ転写終結配列などの酵母認識終結配列が挙げられるが、それらに限定されない。ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇで利用可能なｉＧＥＭレジストリに、転写終結配列の非網羅的表が示されている。一連の２、３、４、５、６、７または８個以上の第１の転写終結配列が、ｄｓＲＮＡコード要素の最終ヌクレオチドに対して３’に直接、またはｄｓＲＮＡコード要素の最終ヌクレオチドに対して３’に少なくとも１乃至５、５乃至１０、１０乃至１５、１５乃至２０、２０乃至２５、２５乃至３０、３０乃至３５、３５乃至４０、４０乃至４５、４５乃至５０、５０乃至１００、１００乃至１５０、１５０乃至２００、２００乃至３００、３００乃至４００、４００乃至５００、５００乃至１,０００またはそれ以上のヌクレオチドの距離に位置付けられてもよい。タンデム転写終結配列間のヌクレオチドの数は変えられてもよく、たとえば、転写終結配列は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０乃至１５、１５乃至２０、２０乃至２５、２５乃至３０、３０乃至３５、３５乃至４０、４０乃至４５、４５乃至５０またはそれ以上のヌクレオチドにより分離されてもよい。いくつかの実施形態では、転写終結配列は、構造予測アルゴリズムにより決定されるように、それらの予測される二次構造に基づいて決定されてもよい。構造予測プログラムは、当該技術分野で公知であり、たとえば、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを含む。
【００８４】
転写終結配列は、ポリメラーゼ特異的または非特異的であってもよいが、本実施形態で使用するために選択される転写終結は、この終結配列がプロモーターを起点とするＲＮＡポリメラーゼの型により転写を終結することを可能にする必要があることを意味する、選択されたプロモーターとの‘機能的組み合わせ’を形成する必要がある。たとえば、真核ＲＮＡ  ｐоｌ  ＩＩプロモーター及び真核  ＲＮＡ  ｐоｌ  ＩＩターミネーター、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーター、Ｔ３プロモーター及びＴ３ターミネーター、酵母認識プロモーター及び酵母認識終結配列などは、一般に、機能的組み合わせを形成する。使用される配列終結配列の数及び同一性はまた、転写が所与のプロモーターから終結される効率に基づいて選択されてもよい。たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７または８個以上の同種または異種転写ターミネーター配列が、所与のプロモーターから、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の終結効率を達成するように、ＲＮＡコード要素の下流で転写的に供給されてもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態は、転写の効率的終結のための機能的組み合わせにおいてプロモーター及び２つまたは３つ以上の転写ターミネーターを含む操作された発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、ＰＴＨターミネーター及びｐＥＴ−Ｔ７ターミネーターは機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、ｒｒｎ  ＢＴ２ターミネーター、ＰＥＴターミネーター、ＰＴＨターミネーター及びｐＥＴ−Ｔ７ターミネーターは機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、ターミネーター配列は、非ヘアピン形成配列を除去するように改変される。いくつかの実施形態では、終結配列は、ヘアピンのステム領域における不整合を除去するように改変される。いくつかの実施形態では、終結配列は、ヘアピンのＧ−Ｃ含有量を増加させるように改変される。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ依存性終結シグナル及び１つまたは複数のＲｈｏ非依存性終結配列との機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ依存性終結シグナル及びＴｒｐＲリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ非依存性終結シグナル及びＴｒｐＲリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ依存性終結シグナル及びＴｙｒＲリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ非依存性終結シグナル及びＴｙｒＲリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ依存性終結シグナル及びＬａｃＩリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、１つまたは複数のＲｈｏ非依存性終結シグナル及びＬａｃＩリプレッサーとの機能的組み合わせを形成する。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターは、２つまたは３つ以上の隣接する中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する合成終結配列との機能的組み合わせを形成する。
【００８６】
固有終結として知られている転写終結を調節する一機構は、転写伸長複合体（テンプレート、転写及びＲＮＡポリメラーゼ間の相互作用に関与する）を不安定化させて、ＤＮＡテンプレートから解離されるようになるポリメラーゼをもたらす、転写中にＲＮＡ鎖におけるヘアピンループ構造の形成に関与する。したがって、合成ヌクレオチド配列は、転写終結を促進する１つまたは複数のヘアピンループ構造を形成するＲＮＡ転写をコードするように設計されてもよい。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写効率は、ＲＮＡコード要素の下流で転写的に１つまたは複数のヘアピンを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を提供することにより向上する。一般に、ヘアピンは、そのアームが一本鎖ループにより接続される対のステム領域を形成するようにそれ自身折り返し得る回帰性ヌクレオチド配列により形成され得る。いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のＲＮＡヘアピンをコードする。いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、ヘアピン形成回帰性ヌクレオチド配列に対してｐоｌｙ−Ｔ配列３‘をコードする。ヘアピンの安定性は終結効率性に関連付けられ得、ヘアピンの安定性は、そのヘアピンの長さと、そのヘアピンが含む不整合または膨れの数と、対領域の塩基組成物とにより決定される。グアニンとシトシンとの間のペアリングは、３つの水素結合を有し、２つのみを有するアデニン−チミンのペアリングに比べて、より安定である。いくつかの実施形態では、合成ヌクレオチド配列によりコードされたステムは、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１以上の塩基対である。特定の実施形態では、合成ヌクレオチド配列によりコードされたステムは、長さが１２乃至３０塩基対である。特定の実施形態では、ヘアピンは、約９乃至２５塩基対を含むステム領域を有する中サイズのヘアピンである。ループ形成領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ループ形成領域は４乃至８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ループ形成領域は４個のヌクレオチドを含む。ヘアピン形成回帰性ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成回帰性ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のＲＮＡヘアピンをコードする合成ヌクレオチド配列は、原核生物、真核またはファージ由来の１つまたは複数の転写終結配列に関連してｄｓＲＮＡコード要素の下流で転写的に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、一連の４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のウラシル（Ｕ）をコードするヌクレオチド配列が、ヘアピンコード配列に���して３’に提供される。
【００８７】
伸長中のポリメラーゼの休止は、Ｒｈｏ依存性及びＲｈｏ非依存性終結の重要な構成要素であると考えられる。ＤＮＡ結合タンパク質は、転写終結を促進する、転写伸長複合体を機能停止させる障害としての役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、効率的な転写終結が、ＲＮＡコード要素の端に対してＤＮＡ結合タンパク質３’のための１つまたは複数の結合部位を提供することにより促進される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質のための１つまたは複数の結合部位が、転写終結配列に近接して提供され、ゆえに、終結効率が改善される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質のための１つまたは複数の結合部位が、ヘアピンループを形成するヌクレオチドをコードする合成ヌクレオチド配列に近接して提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質のための１つまたは複数の結合部位が、Ｒｈｏ依存性終結部位に近接して提供される。ＤＮＡと複合化されるときに、転写伸長複合体の休止及び転写バブルの不安定化をもたらすいずれかのＤＮＡ結合タンパク質が使用されてもよい。たとえば、ＴｒｐＲリプレッサー、ＬａｃＩリプレッサーまたはＴｙｒＲリプレッサーのための１つまたは複数の結合部位が使用されてもよい。転写リプレッサーとして作用し得るＤＮＡ結合タンパク質の他の例としては、ＰＲＨ、Ｅｖｅ、Ｋｒｕｐｐｅｌ、ＴＧＩＦ、Ｍａｄ、ＩＲＦ−２、ＲＰ５８、Ｅ２Ｆ−６、ＭｅＣＰ２及びＭＢＤ２が挙げられる。宿主細胞が、内因性ＤＮＡ結合タンパク質を発現しない場合、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、操作されたＲＮＡ発現構築物を含むベクターに提供されてもよく、または、それは、異なるベクターに提供されてもよく、宿主細胞認識プロモーター、またはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６などのファージプロモーターの制御下で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、ＲＮＡコード要素に対して３’に、宿主細胞ゲノムで見出されない１つまたは複数の部位特異的エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、ゆえに、宿主細胞における部位特異的エンドヌクレアーゼの発現は、宿主細胞ゲノムを破壊することなく、操作されたＲＮＡ発現構築物を開裂することにより制限部位の下流の操作されたＲＮＡ発現構築物からの不所望の転写を防止する。図８を参照されたい。部位特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。メガヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられるが、それらに限定されない。部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＲＮＡ発現構築物を含むベクターに提供されてもよく、または、異なるベクターに提供されてもよい。いくつかの実施形態��は、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリメラーゼ、たとえば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＶ４０またはＳＰ６ポリメラーゼをコードするベクターに提供されてもよく、任意に、宿主細胞認識プロモーターに作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、１つまたは複数の終結配列に対して３’に、１つまたは複数の部位特異的エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＲＮＡ発現構築物は、１つまたは複数のＺＦＮ制限部位、ＴＡＬＥＮ制限部位またはメガヌクレアーゼ制限部位を含み、メガヌクレアーゼ制限部位は、ＰＴＨターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口炎ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔｌターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター、Ｍａｔα（α因子）転写ターミネーター、天然α因子転写終結配列、ＡＤＲ１転写終結配列、ＡＤＨ２転写終結配列及びＧＡＰＤ転写終結配列からなる群から選択された１つまたは複数の転写終結配列に対して３’に、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐоＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓоＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩからなる群から選択される。
【００８８】
配列番号２、４、１４、１５及び２０で示されているような、本明細書に記載されている操作されたＲＮＡ発現構築物は、組成物配列要素から構築されて、当該技術分野で公知である標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、好適なベクターに組み込まれてもよい。多くのベクターが、この目的のために利用可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びこのベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。本実施形態により使用するために好適なベクターの例としては、プラスミド、コスミド、プラストマー、細菌人工染色体、酵母人工染色体及びバクテリオファージが挙げられるが、それらに限定されない。ベクターバックボーンは、ベクターの機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）及び互換的である特定の宿主細胞に依存して種々の構成要素を含んでもよい。たとえば、ベクターバックボーンは、ベクターの重要な生物学的機能の損失なしに決定可能に核酸分子の挿入を可能にする１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、抗生物質耐性遺伝子などの、すなわち、ベクターで形質転換される細胞の識別及び選択で使用するために好適である選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞において導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列と、複製のオリジンとを含んでもよい。利用可能な細菌ベクターの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＤＥＳＴ、ｐＢＡＤ、ｐＧＥＭ、ｐＧＥＸ、ｐＡＣＹＣ１８４及びｐＢＲ３２２ベクターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ベクターバックボーンの大きさは、不所望の転写のために利用可能な鋳型の量を低減するように、最小化される。いくつかの実施形態では、本実施形態により使用するために好適な最小のベクターは、抗生物質耐性マーカーなどのタンパク質ベースの選択可能なマーカーの１つまたは複数と、非必須のスペーサーと、規定された機能をコードしないジャンク配列とを含まない。いくつかの実施形態では、本実施形態により使用するために好適な最小のベクターは、複数のクローニング部位、選択可能なマーカー遺伝子及び複製の起点から本質的になる。本実施形態により使用するために好適な最小のベクターは３ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．７ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．６ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．５ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．４ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．３ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．２ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．１ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは２．０ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは１．９ｋｂ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の操作されたＲＮＡ発現構築物及び／または１つまたは複数のＲＮＡコード要素は、少なくとも３ｋｂの最小サイズを達成するように、最小ベクターにクローン化される。
【００９０】
本明細書に記載されている操作された発現構築物によりコードされるＲＮＡ分子は、宿主細胞においてインビトロまたはインビボで合成されてもよい。宿主細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはインビボで転写を媒介してもよく、または、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＶ４０、ＳＰ６）などのクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、インビボまたはインビトロでの転写のために使用されてもよい。
【００９１】
上記のような操作された発現構築物を含む１つまたは複数のベクターは、ＲＮＡ分子を生成するように、広範囲の原核生物及び真核微生物宿主に導入されてもよい。本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、非機能性配列の非生産的転写を最小化するように設計された操作された発現構築物からＲＮＡを発現する宿主細胞に関する。好適な宿主細胞としては、菌類、糸状菌、酵母、藻類及び細菌が挙げられるが、それらに限定されない。宿主細胞において転写されるｄｓＲＮＡ分子の分解を防止するために、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ欠乏宿主が使用されてもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。好適な真核宿主細胞としては、真菌細胞、藻細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、それらに限定されない。好適な真菌宿主細胞としては、酵母細胞及び糸状菌細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９３】
一実施形態では、真菌宿主細胞は酵母である。一実施形態では、酵母は、次の属、すなわち、カンジダ、ハンゼヌラ、サッカロミケス、シゾサッカロミケス、ピキア、クルイベロミセス、ヤロウィアの一つからのものである。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、ピキアパストリス、ピキアフィンランディカ、ピキアトレハロフィラ、ピキアコダマ、ピキアメンブラナエファシエンス、ピキアオパンティエ、ピキアサーモトレランス、ピキアサリクタリア、ピキアクエルカム、ピキアピジュペリ、ピキアスティピチス、ピキアメタノリカ、ピキアアングスタ、クルイベロミセスラクチス、カンジダアルビカンスまたはヤロウィアリポリティカである。
【００９４】
他の実施形態では、宿主細胞は原核生物細胞である。好適な原核生物細胞は、グラム陽性、グラム陰性、グラム可変細菌細胞を含む。好適な原核生物宿主細胞としては、アグロバクテリウム、アリサイクロバチルス、アナベナ、アナシスティス、アシネトバクター、アルスロバクター、アゾバクター、バチルス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、ブチリビブリオ、ブフネラ、カムペストリス、カンピロバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、クロマチウム、コプロコッカス、エシェリキア、エンテロコッカス、エンテロバクター、エルウィニア、フソバクテリウム、フィーカリバクテリウム、フランシセラ、フラボハクテリウム、ゲオバチルス、ヘモフィラス、ヘリコバクター、クレブシエラ、ラクトバシラス、ラクトコッカス、イリオバクター、ミクロバクテリウム、メソリゾビウム、メチロバクテリウム、メチロバクテリウム、マイコバクテリウム、ナイセリア、パントエア、シュードモナス、プロクロロコッカス、ロドバクター、ロドシュードモナス、ロドシュードモナス、ロゼブリア、ロドスピリラム、ロドコッカス、セネデスムス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、セラチア、サルモネラ、シゲラ、サーモアナエロバクテリウム、トロフェリマ、ツラレンシス、テメキュラ、サーモシネココッカス、サーモコッカス、ウレアプラズマ、ザントモナス、クシレラ、エルシニア及びザイモモナスの種が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、ヒトに対して非病原性である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、バチルス種、たとえば、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス、バチルス・レンテュス、バチルス・シルクランス、バチルス・プミルス、バチルス・ロータス、バチルス・コアギュランス、バチルス・ブレビ、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・クラウジイ、バチルス・ステアロサーモフィラス及びバチルス・アミロリケファシエンスがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、クロストリジウム種、たとえば、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・テタニーＥ８８、クロストリジウム・リツセブレンセ、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス及びクロストリジウム・ベイジェリンキがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、コリネバクテリウム種、たとえば、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、エシェリキア種、たとえば、大腸菌がある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ欠乏大腸菌株、たとえば、大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、エルウィニア種、たとえば、エルウィニア・ウレドバラ、エルウィニア・カロトバラ、エルウィニア・アナナス、エルウィニア・ハビコラ、エルウィニア・プンクタタ及びエルウィニア・テレウスがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、パントエア種、たとえば、パントエア・シトレア及びパントエア・ アグロメランスがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、シュードモナス種、たとえば、シュードモナス・プジタ、シュードモナス・メバロニイ及びシュードモナス・ｓｐ．Ｄ−０１１０がある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、ストレプトコッカス種、たとえば、ストレプトコッカス・エクイシミリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカス・ウベリスがある。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、ストレプトマイセス種、たとえば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・エバミチリス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトマイセス・フンジシディカス、ストレプトマイセス・グリセウス及びストレプトマイセス・リビダンスである。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞には、ザイモモナス種、たとえば、ザイモモナス・モビリス及びザイモモナス・リポリチカがある。
【００９６】
いくつかの実施形態では、幅広い種類の重要な作物葉面（植物の葉の表面）及び／または根圏（植物の根の周囲の土）に生息するとして知られている微生物、たとえば、細菌、藻類及び菌類は、ｄｓＲＮＡの生成及び送達のための所望の宿主細胞であってもよい。宿主微生物において転写されるｄｓＲＮＡ分子の破壊を防止するように、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ欠乏宿主が使用されてもよい。細菌、たとえば、属として、バチルス（バチルス・チューリンゲンシス・クルスターキＨＤ−１、バチルス・チューリンゲンシス・クルスターキＨＤ−７３、バチルス・チューリンゲンシス・ソット、バチルス・チューリンゲンシス・ベルリナー、バチルス・チューリンゲンシス・チューリンゲンシス、バチルス・チューリンゲンシス・ｔｏｗｏｒｔｈｉ、バチルス・チューリンゲンシス・デンドロリムス、バチルス・チューリンゲンシス・アレスチ、バチルス・チューリンゲンシス・ガレリア、バチルス・チューリンゲンシス・アイザワイ、バチルス・チューリンゲンシス・スブトキシクス、バチルス・チューリンゲンシス・エントモシダス、バチルス・チューリンゲンシス・テネブリオニス及びバチルス・チューリンゲンシス・サンディエゴの種及び亜種を含む）；シュードモナス、エルウィニア、セラチア、クレブシエラ、ザントモナス、ストレプトマイセス、リゾビウム、ロドシュードモナス、メチロフィルス、アグロバクテリウム、アセトバクター、ラクトバシラス、アルスロバクター、アゾトバクター、リューコノストック及びアルカリゲネス；菌類、特に、酵母、たとえば、属として、サッカロミケス、クリプトコッカス、クルイウェロマイセス、赤色酵母、ロドトルラ及びアウレオバシジウム；などの微生物に特に関心がもたれている。シュードモナス・シリンガエ、シュードモナス・フルオレッセンス、セラチア・マルセセンス、アセトバクター・キシリナム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、ロドバクター・スフェロイデス、ザントモナス・カンペストリス、リゾビウム・メリロティ、アルカリゲネス・ユートロフス及びアゾトバクター・ビネランジイなど葉面細菌種と、ロドトルラ・ルブラ、ロドトルラ・グラティニス、ロドトルラ・マリナ、ロドトルラ・アウランティアカ、クリプトコッカス・アルビダス、クリプトコッカス・ジフルエンス、クリプトコッカス・ローレンティ、サッカロミセス・ロゼイ、サッカロミセス・プレトリエンシス、出芽酵母、スポロボロマイセス・ロセウス、スポロボロマイセス・オドラス、クルイベロミセス・ ヴェローナエ及びアウレオバシジウム・プルランスなどのフィトスフェア酵母種と、に特に関心がもたれている。
【００９７】
いくつかの実施形態は、非機能性配列の非生産的な転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から改善された転写効率を有するｄｓＲＮＡを製造する細胞発現システムに関する。一態様では、本明細書に記載されているように、操作された発現構築物を含む宿主細胞を培養することによりｄｓＲＮＡを製造する方法が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２を含む操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現する。他の実施形態では、宿主細胞は、配列番号４を含む操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現する。他の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１４を含む操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現する。他の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１５を含む操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現する。他の実施形態では、宿主細胞は、配列番号２０を含む操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ欠乏である細菌細胞、たとえば、大腸菌細胞である。
【００９８】
組換えＤＮＡ構築物及び対象のＲＮＡ分子をコードするベクターを調製し、ＲＮＡ分子を転写する宿主細胞を形質転換して生成する組換えＤＮＡ技術を用いる方法が、当該技術分野で容易に利用可能である。
【００９９】
Ｃ．ｄｓＲＮＡの適用
いくつかの実施形態は、対象生物に上記のような非機能性配列の非生産的転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から転写されたｄｓＲＮＡを送達する組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、操作された発現構築物からインビトロで合成されて、対象生物に提供される。他の実施形態では、対象生物に提供されるｄｓＲＮＡは、操作された発現構築物から宿主細胞（インビボ）において転写される。
【０１００】
特定の実施形態は、宿主細胞において上記のような操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを発現することを含む対象生物にｄｓＲＮＡを送達し、対象生物に宿主細胞で転写されたｄｓＲＮＡを提供する方法に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞で転写されたｄｓＲＮＡは、対象生物に提供される前に、宿主細胞から単離されて精製される。たとえば、ｄｓＲＮＡは、溶媒または樹脂を用いた抽出、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせにより宿主細胞溶解物から精製され得る。代替として、ｄｓＲＮＡには、最小の精製が使用されてもよい、または精製が使用されなくてもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ発現宿主細胞から調製された操作された発現構築物または溶解物から転写されたｄｓＲＮＡを含む宿主細胞が対象生物に提供される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、対象生物の必須遺伝子を抑制する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、対象生物の有害生物または病原体の必須遺伝子を抑制する。たとえば、ｄｓＲＮＡはウイルス遺伝子を抑制し得る。
【０１０１】
上記のように、細菌または酵母などの宿主細胞は、本明細書に記載されているような操作された発現構築物からｄｓＲＮＡを製造するように操作され得る。これらの宿主細胞は、害虫または対象生物により食われ得る。取り込まれるときに、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉ応答を開始し得、標的ｍＲＮＡの分解に繋がり、標的ｍＲＮＡが必須タンパク質をコードし、摂食生物を衰弱または死亡させる。実施例３に示されているように、コロラドハムシ（ＣＰＢ）ＲＮＡ配列を含むインビトロ転写ｄｓＲＮＡ分子、ＣＢＰ  ＲＮＡ配列を含む細菌で転写されたｄｓＲＮＡ分子、または、操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物からＣＰＢの幼虫に転写されたＣＰＢ  ＲＮＡ配列を含むｄｓＲＮＡを発現する細菌のすべてが、ｄｓＲＮＡ組成物を摂取する幼虫の死または生育及び分化の阻害をもたらす。すべてのＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ調製が、ＣＰＢの成長の８７．５％を阻害するＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ発現細菌調製の最小濃度（０．００００２ｍｇ／ｍＬ）で、ＣＰＢの幼虫に対してかなりの活性を示した。対象生物の成長及び生育の阻害におけるｄｓＲＮＡ発現細菌の活性は、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡを効率的に発現するように操作された宿主細胞が、たとえば、付加的なＲＮＡ精製ステップを必要とせずに、標的遺伝子の活性を抑制するように給餌することにより、対象生物に直接提供されてもよい。
【０１０２】
多くのアプリケーションでは、細菌、酵母または藻類細胞である宿主細胞は、好適には、対象生物に対して、または対象生物の食物源に対して提供される前に、死滅される必要がある。たとえば、ｄｓＲＮＡ発現細菌は、生物農薬として、または、ヒトまたは他の哺乳動物との接触がありそうな環境で、操作されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞が使用される他のアプリケーションとして使用される。ｄｓＲＮＡ発現宿主細胞は、ｄｓＲＮＡのかなりの分解をもたらさないいずれかの手段により死滅されてもよい。たとえば、宿主細胞は、熱処理により、化学的処理であって、たとえば、フェノールもしくはホルムアルデヒド処理により、または、機械的破壊により、死滅されてもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、かなりの溶解を用いることなく、死滅される。いくつかの実施形態では、宿主細胞、たとえば、細菌細胞は、溶解をもたらすことなく、この細胞を死滅させるのに十分な温度に加熱される。たとえば、宿主細胞は、少なくとも５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃または少なくとも７５℃の温度に加熱され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、操作されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞は溶解され、細胞溶解物が、対象生物または対象生物の食物源に提供される。ｄｓＲＮＡ発現宿主細胞は、ｄｓＲＮＡのかなりの破壊をもたらさないいずれかの手段により溶解されてもよい。たとえば、宿主細胞は、凍結融解により、化学物質、たとえば、洗浄剤、トルエンまたは水酸化ナトリウムによる処理により、酵素処理により、または、機械的破壊であって、たとえば、均一化により、溶解されてもよい。いくつかの実施形態では、粗溶解物が、対象生物または対象生物の食物源に提供される。他の実施形態では、一部精製された溶解物または単離された宿主細胞発現ｄｓＲＮＡが、対象生物または対象生物の食物源に提供される。
【０１０４】
他の実施形態は、対象の生物、たとえば、哺乳動物、鳥、節足動物または魚においてウイルス疾患を防止または阻害する方法及び組成物に関する。対象生物の特定の例としては、ブタ、ウシ、バイソン、ウマ、ヤギ、ニワトリ、ウズラ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、エビ、クルマエビ、ロブスター、カニ、ミツバチ、サケ、テラピア、シーバス、コイ及びナマズが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、ウイルス遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡが対象生物に投与され、ゆえに、標的ウイルス遺伝子の発現がサイレンシングされる。一実施形態では、対象生物が摂取するように、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物が食物源に組み込まれ、または、食物源、たとえば、作物の表面に塗られる。一態様では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、上記の非機能性配列の非生産的転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から転写されたｄｓＲＮＡを含む。他の態様では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、上記の死滅されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞またはその溶解物を含む。いくつかの実施形態では、上記の非機能性配列の非生産的な転写を最小化するように設計された操作された発現構築物を含む溶解された加熱死細菌細胞が、哺乳動物、鳥、節足動物または魚からなる群から選択された対象生物に給餌される。一実施形態では、対象生物は、エビまたはクルマエビであり、操作された発現構築物は、ホワイトスポット病ウイルス、モノドン型バキュロウイルス、バキュロウイルス中腸腺壊死ウイルス、造血器壊死症ウイルス、イエローヘッドウイルス、タウラ症候群ウイルス、伝染性筋壊死ウイルス、オニテナガエビノダウイルス、Ｌａｅｍ‐Ｓｉｎｇｈウイルスまたはモーリリアンウイルスの遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡをコードする。一実施形態では、対象生物は魚であり、操作された発現構築物は、流行性造血器壊死症ウイルス、マダイイリドウイルス、コイヘルペスウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、伝染性サケ貧血ウイルスまたはウイルス性神経壊死症ウイルスの遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡをコードする。
【０１０５】
いくつかの実施形態は、有害無脊椎動物侵入を制御する組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物を含む食事へのそれらの暴露を介する有害無脊椎動物へのｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物の送達のための送達システムが提供される。一実施形態では、有害無脊椎動物による摂取のために、ｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物は、有害生物の食物源に組み込まれ、または、有害生物食物源、たとえば、作物の表面に塗られる。一態様では、ｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物は、上記のような非機能性配列の非生産的な転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から転写された精製済みｄｓＲＮＡ分子を含む。他の態様では、ｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物は、上記のような溶解され、死滅されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞を含む。他の態様では、ｄｓＲＮＡ有害生物防除組成物は、上記のような非精製のまたは最小限精製されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞の溶解物を含む。この組成物は、ｄｓＲＮＡ、宿主細胞または溶解物に加えて、さらなる賦形剤、希釈剤または担体を含んでもよい。
【０１０６】
他の実施形態は、植物、たとえば、作物の集合体におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する方法及び組成物に関する。植物ウイルスは、節足動物または線虫ベクターによって植物に一般に媒伝される。したがって、ウイルスによる植物の感染は、節足動物または線虫ベクターにおけるウイルス遺伝子発現を阻害することにより阻害され得る。したがって、節足動物または線虫ベクターにおけるウイルス遺伝子発現を阻害する組成物及び方法が提供される。一実施形態は、ｄｓＲＮＡを投与することを含む方法であって、ｄｓＲＮＡは、節足動物または線虫ベクターに対して、植物ウイルスからの遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、ゆえに、標的ウイルス遺伝子の発現はサイレンシングされる、方法に関する。標的ＲＮＡ転写は、アブチロンモザイクウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、アラビスモザイクウイルス、オオムギマイルドモザイクウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、オオムギ黄化モザイクウイルス、テンサイカーリートップウイルス、ビート西部萎黄ウイルス、ビーンゴールデンモザイクウイルス、テンサイ葉巻ウイルス、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス、ビート土壌伝染性ウイルス、ビート西部萎黄ウイルス、ブロムモザイクウイルス、キャッサバモザイクベゴモウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、キュウリ壊死ウイルス、カボチャアブラムシ伝搬黄萎ウイルス、カカオ腫れてシュートウイルス、ブドウファンリーフウイルス、ブドウ葉巻随伴ウイルス、ブドウウイルスＡ、ブドウウイルスＢ、落花生輪紋ウイルス、アイリスイエロースポットウイルス、ジョンソングラスモザイクウイルス、レタス伝染性黄斑ウイルス、レタスモザイクウイルス、エンドウマメアーリーブロウニングウイルス、ペッパー赤色輪点ウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、イネ萎縮病ウイルス、イネラギッドスタントウイルス、土壌感染性ムギ類萎縮ウイルス、インゲンマメ南部モザイクウイルス、イチゴ潜在赤色輪点ウイルス、サツマイモ斑紋モザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、タバコ茎えそウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、トマト退緑黄化ウイルス、タバコゴールデンモザイクウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス、トマト黄化えそウイルス、ベルベットタバコモザイクウイルスまたは小麦ストリークモザイクウイルスからのものであってもよい。一実施形態では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、ウイルスベクターによる摂取のために、食物源内に組み込まれ、または、食物源、たとえば、作物の表面に塗られる。一態様では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、上記のような非機能性配列の非生産的な転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から転写された精製されたｄｓＲＮＡ分子を含む。他の態様では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、上記のような溶解されていない、死滅されたｄｓＲＮＡ発現宿主細胞を含む。他の態様では、抗ウイルスｄｓＲＮＡ組成物は、上記のようなｄｓＲＮＡ発現宿主細胞の精製されていないまたは最小限精製された溶解物を含む。節足動物ベクターは、昆虫ベクター、たとえば、アブラムシ、カブトムシ、ウンカ、ヨコバイ、コナカイガラムシ、カメムシ、ダニ、アザミウマ及びコナジラミであってもよい。この組成物は、ｄｓＲＮＡ、宿主細胞または溶解物に加えて、さらなる賦形剤、希釈剤または担体を含んでもよい。ｄｓＲＮＡ発現加熱死滅微生物またはその溶解物を含む組成物は、ｄｓＲＮＡが、数日または数週間の期間であってもよい時間の長さの間に外部環境条件に暴露されるときでさえ、非破壊的なかつ媒介可能なＲＮＡｉのままであるよう十分に安定的である必要がある。
【０１０７】
本明細書に記載されている実施形態では、ｄｓＲＮＡは、上記のような非機能性配列の非生産的な転写を最小化するように設計された操作された発現構築物を含む微生物により発現されてもよく、または、微生物またはそれらの溶解物は、植物もしくは種の表面に塗られてもよく、または、注入などの物理的手段により、もしくは吸水による種の場合に、種、根、茎または葉に取り込まれてもよい。たとえば、植物の表面への、本明細書に記載されているような操作された発現構築物を含む微生物の送達は、スプレーによる塗布を介してもよい。一実施形態では、ｄｓＲＮＡを生成及び蓄積するように操作される細菌または酵母が培養されてもよく、加熱死滅細菌もしくは酵母またはそれらの溶解物などの、この培養の生成物は、一般的な農作業と整合する組成物として配合されてもよい。いずれかの賦形剤の性質及び組成物の物理的形態は、処理される基体の性質に依存して変わってもよい。たとえば、組成物は、処理される基体にこすり込まれ、噴霧され、もしくは刷り込まれる液体であってもよく、または、処理される基体に塗布されるコーティングもしくは粉末であってもよい。したがって、一実施形態では、組成物は、付着する好適な表面上のコーティングの形態にあり、このコーティングと接触する昆虫または線虫などの対象生物により最終的には摂取される。
【０１０８】
作物に対する噴霧製剤は、効率的に葉を覆うための適切な粘着剤及び湿潤剤、ならびにｄｓＲＮＡがＵＶ損傷しないようにするＵＶ防止剤を含んでもよい。たとえば、葉の表面上のフィルム内に微生物を分散させるのに役立つ加熱死滅微生物の製剤を有すること、または、加熱死滅微生物を葉の細胞間隙に移動させること、及び／または、湿った環境条件下（耐雨性）で微生物が葉に付着する何らかの能力を提供することが、好適であってもよい。そのような添加剤は、バイオ殺虫剤産業において一般的に使用され、当業者によく知られている。同様に、土壌施用の製剤は、コーンルートワームなどの土壌害虫の幼虫に対する餌としての役割を果たす顆粒製剤を含んでもよい。そのようなアプリケーションは、昆虫給餌損傷からの植物の保護を強化するように、生物学的に基づくまたは基づかないにかからず、他の殺虫剤アプリケーションと組み合わされ得る。たとえば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）タンパク質が、害虫を制御するための作用モードを害虫の餌において提供されるときである。したがって、いくつかの実施形態は、本明細書に記載されているｄｓＲＮＡ組成物及び方法の、昆虫侵入を制御するための局所製剤及びトランスジェニック・アプローチを含むＢｔ方法及び組成物との相乗的な組み合わせに関する。
【０１０９】
本明細書に記載されている方法及び組成物が塗布される植物の例としては、アルファルファ、アネット、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、ルッコラ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、豆、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、チェリー、コリアンダー、シトラス、クレメンタイン、コーヒー、トウモロコシ、綿花、キューリ、アメリカトガサワラ、ナス、エンダイブ、エスカロール、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ウリ、ブドウ、グレープフルーツ、ハニーデュー、ヒカマ、キウイフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴ、メロン、マッシュルーム、ナッツ、エンバク、オクラ、タマネギ、オレンジ、花き、パパイヤ、パセリ、エンドウ豆、モモ、ピーナッツ、ナシ、ペッパー、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアータマツ、ラディッキオ、ダイコン、ラズベリー、コメ、ライムギ、トウモロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートガム、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、芝、つる植物、スイカ、コムギ、ヤマノイモ及びズッキーニが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１０】
本明細書に記載されている方法及び組成物は、標的遺伝子発現のある低減のレベルを提供するように、いずれかの単子葉植物または双子葉植物に適用されてもよく、または、薬学的に許容される製剤を介して脊椎動物または無脊椎動物に適用されてもよい。標的遺伝子発現の阻害は、標的ＲＮＡの転写により生成される内因性標的ＲＮＡまたはタンパク質を計測することにより定量化されてもよく、阻害の結果は、標的細胞または生物の外向き表現型の検査により確認され得る。ＲＮＡ及びタンパク質を定量化する技術は当業者によく知られている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％または少なくとも８０％だけ阻害される。いくつかの実施形態では、かなりの阻害が起こるように、標的遺伝子発現は、対象生物の細胞内で、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％だけ阻害される。対象生物へのｄｓＲＮＡの投与が、標的遺伝子に対応する内因性ＲＮＡ及び／またはタンパク質における検出可能な表現型（たとえば、幼虫の成長の停止、まひまたは死亡）または検出可能な減少をもたらす場合に、かなりの阻害が起こるといわれ得る。いくつかの実施形態では、阻止が、対象生物の実質的にすべての細胞で起こっている一方で、いくつかの実施形態では、阻止は、遺伝子を発現する細胞のサブセットのみにおいて起こる。たとえば、標的遺伝子が、昆虫消化管の細胞において必須の役割を果たす場合、これらの細胞内の標的遺伝子の阻害は、昆虫に所望の悪影響を及ぼすのに十分である。
【０１１１】
以下の実施例は、例示目的で提供され、限定として意図されるものではない。
【０１１２】
実施例１
ｄｓＲＮＡ生成ベクターの設計
標的配列、すなわち、配列番号１のヌクレオチド３０−３０９は、ＣＯＰＩコートマーの推定コロラドハムシ（ＣＰＢ）オルソログから選択された。
【０１１３】
配列番号１：
2016517274.tif 000001
2016517274.tif 000002
【０１１４】
ｄｓＲＮＡコード要素は、ＣＰＢ  ＣＯＰＩコートマー標的配列に対応するセンス配列（配列番号２のヌクレオチド４−２８３）と、１５０ヌクレオチドループコード配列（配列番号２のヌクレオチド２８４−４３３）と、ＣＰＢ  ＣＯＰＩコートマー標的配列のリバース相補体であるアンチセンス配列（配列番号２のヌクレオチド４３４−７１３）とを含んで設計された。
【０１１５】
配列番号２：
2016517274.tif 000003
【０１１６】
ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡを生成するプラスミドベクターが、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌ｌａｃ  Ｚ遺伝子のＮ−終端フラグメント、複数のクローニング部位及び複製の起点を含むｐＵＣ１９クローニングベクターを用いて構築された。ＣＰＢ−ｈｐベクターは、Ｔ７プロモーターが配列番号２のｄｓＲＮＡコード領域に作動可能に連結されるように、構築された。ｐＣＰＢ−ｈｐベクターの模式地図を示す図２Ａを参照されたい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる非ｄｓＲＮＡコード領域の読み過ごし、及びプラスミドバックボーンからの役に立たないｓｓＲＮＡの生成を防止または最小化するように、ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターが、ｄｓＲＮＡコード領域の３’端に２つのＴ７ターミネーター配列（ＰＴＨターミネーター及びｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター）を位置付けることにより構築された。ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔベクターの模式地図を示す図２Ｂ及び２Ｃを参照されたい。
【０１１７】
大腸菌株ＨＴ１１５（ＤＥ３）は、ミネソタ大学のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒから購入された（ＨＴ１１５（ＤＥ３）の遺伝子型は、Ｆ−、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢ、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１、ｒｎｃ１４：：Ｔｎ１０（ＤＥ３溶原菌：ｌａｖＵＶ５プロモーター−Ｔ７ポリメラーゼ）（ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩマイナス）である）。大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞は、ｐＵＣ１９（制御）、ｐＣＰＢ−ｈｐまたはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔにより形質転換され、３７℃または２５℃で一晩成長された。総ＲＮＡは、培養物の２０ｕｌから単離され、アガロースゲル（図３Ａ、１（ｐＵＣ１９）、２（ｐＣＰＢ−ｈｐ）及び３（ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ）で印付けされたレーン）上に直接乗せられ、または、アガロースゲル（図３Ｂ、１（ｐＵＣ１９）、２（ｐＣＰＢ−ｈｐ）及び３（ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ）で印付けされたレーン）上に乗せられる前に、ＲＮＡｓｅで処理された。
【０１１８】
大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞は、２つのプラスミドであって、ｄｓＲＮＡテンプレート（ｐＵＣ１９（制御）、ｐＣＰＢ−ｈｐまたはｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ）を担持する一のプラスミドと、誘導要素（ＩＰＴＧ誘導Ｔ７ポリメラーゼ）の制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを担持する他のプラスミドとによっても形質転換された。形質転換された細胞は、３７℃または２５℃で一晩成長された。総ＲＮＡは、培養物の２０ｕｌから単離され、アガロースゲル（図３Ａ、４（ｐＵＣ１９及びｐＬａｃ−Ｔ７）、５（ｐＣＰＢ−ｈｐ及びｐＬａｃ−Ｔ７）、ならびに６（ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ及びｐＬａｃ−Ｔ７）で印付けされたレーン）上に直接乗せられ、または、アガロースゲル（図３Ｂ、４（ｐＵＣ１９及びｐＬａｃ−Ｔ７）、５（ｐＣＰＢ−ｈｐ及びｐＬａｃ−Ｔ７）、ならびに６（ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ及びｐＬａｃ−Ｔ７）で印付けされたレーン）上に乗せられる前に、ＲＮＡｓｅで処理された。
【０１１９】
図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、３７℃で成長された形質転換細胞は、２５℃で成長された細胞よりより多くのＲＮＡを生成し、ｄｓＲＮＡの収量は、宿主細胞におけるＴ７ポリメラーゼの発現により改善され、ｄｓＲＮＡテンプレートに対して３’に２つのターミネーター配列を含めることは、ｄｓＲＮＡ収量におけるさらなる増加をもたらした。３０−５０ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡの収量が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌細胞及びｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ  ｄｓＲＮＡ構築物から観察された（データは示されていない）。
【０１２０】
実施例２
コロラドハムシ（ＣＰＢ）ｄｓＲＮＡのインビボ生成
１．形質転換
ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ及びｐＬａｃ−Ｔ７プラスミドは、実施例１で説明したように、大腸菌株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換された。形質転換に続いて、大腸菌細胞は塗布され、単一のコロニーが選択された。
【０１２１】
２．培養条件
単一のコロニーが、種培養物を生成するように、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む３ｍｌのＬＢ培地において３７℃で６−８時間成長された。ｄｓＲＮＡの発現を誘導するように、２００ｕｌの種培養物が、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む５０ｍｌの自己誘導培地（ＡＩＭ）（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）を用いて２５０ｍｌのフラスト内に植菌され、次いで、培養された。４℃で１０分間６０００ｇの遠心分離により細胞が回収された。
【０１２２】
３．ＲＮＡ精製
細菌のＲＮＡが、下記のようなＲＮＡ抽出バッファーに対する改変によりＳｔｅａｄのＳＮＡＰプロトコル（Ｓｔｅａｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｎｏｖ  １；４０（２０）：ｅ１５６）から適合された方法を用いて単離された。細菌培養物の１ｍｌ（〜１０８細胞）が１６,０００ｇで３０秒間遠心分離して、上澄み液が除去された。細胞ペレットが、抽出の準備ができるまでに、ドライアイス中に保存された。細胞ペレットは、次いで、激しくボルテックスすることにより１００μｌの改変されたＲＮＡ抽出溶液（１８ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＳＤＳ、５ｍＭのＴＣＥＰ、９５％のホルムアミド（ＲＮＡグレード））中に再懸濁された。ＳｔｅａｄのＳＮＡＰプロトコルのＲＮＡ抽出溶液中に用いられる１％の２−メルカプトエタノールは、ＴＣＥＰが２−メルカプトエタノールに比べてかなり低い毒性及び２−メルカプトエタノールと同等の有効性を有するために、５ｍＭのＴＣＥＰと置き換えられた（データは示されていない）。
【０１２３】
改変されたＲＮＡ抽出溶液における再懸濁に続いて、細胞は、恒温槽において９５℃で７分間サンプルを培養することにより溶解された。細胞破片は、１６,０００ｇで温かいサンプルを室温で５分間遠心分離することによりペレット化された。上澄み液は、ペレットを乱すことなく、清浄なチューブに注意深く移された。
【０１２４】
非誘導の（図４、レーン１）及び誘導の（図４、レーン２）ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌細胞から単離された総ＲＮＡはＨ２Ｏで希釈され、アガロースゲル上に乗せられた。図４に示すように、ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡに対応するバンドが、非誘導ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌細胞ではなく、誘導ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌細胞において観測された。
【０１２５】
実施例３
インビボ及びインビトロ転写ＲＮＡの比較
ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔプラスミドは、線状化され、ＲＮＡのインビトロ転写のためのテンプレートとして使用された。インビトロ転写ＲＮＡ（図５Ａ、レーン９及び１０）は、実施例１において説明された改変されたＳＮＡＰプロトコルにより精製された細菌転写ＲＮＡと共にアガロースゲル上に乗せられ、直接Ｈ２Ｏで希釈されて（図５Ａ、レーン５及び６）、または、３０Ｋで分子を分画する濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）でフィルタリングされて、ＲＮＡ転写の大きさを決定するようにＨ２Ｏで希釈する（図５Ａ、レーン５及び６）前に、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ＴＣＥＰ及びホルマリンなどの試薬を除去した。インビトロ転写ＲＮＡは、細菌転写ＲＮＡ（図５Ａを参照されたい）より大きいことが観測された。
【０１２６】
インビトロ及びインビボ（細菌）転写ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡではなく、一本鎖ＲＮＡを消化するＲＮＡｓｅ  Ａにより培養される。図５Ｂに示すように、ＲＮＡｓｅ  Ａ消化にしたがって、インビボ（レーン５−８）及びインビトロ（レーン９及び１０）ＲＮＡ転写生成物の大きさは同一である。これは、インビトロ転写ＲＮＡの大きさの増加がＲＮＡ処理により細菌細胞において除去される一本鎖ヘアピンループの存在によることを示した。
【０１２７】
実施例４
大腸菌の加熱死滅
細胞溶解を伴わずに大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞を加熱死滅させる温度範囲が実験的に決定された。大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞は、３７℃乃至７２℃の異なる温度で３０分間培養された。加熱処理された細胞は、続いて、溶解が生じて、ＬＢプレート上に広がり、加熱処理後の生存率を決定するよう一晩中培養されたかどうかを判定するように、顕微鏡で検査された。表１に示すように、５９℃及びそれ以上の温度への加熱はすべての細胞を死滅させるが、まだ、細胞溶解は、７２℃までの試験される温度のいずれにおいても観測されなかった（図６を参照されたい）。
2016517274.tif 000004
すべての細胞は異なる温度で３０分間処理された。低ＯＤはＯＤ６００’’０．２及び高ＯＤはＯＤ６００’’２である。
【０１２８】
実施例５
細菌ｄｓＲＮＡ収率−成長培地の最適化
３つの豊富な培地、すなわち、自己誘導培地（ＡＩＭ）（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（Ａｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ．１９９７．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）＋培地及びプラスミド＋ＡＩＭ培地が、細菌ＲＮＡ生成収率が培地選択により改善され得るかどうかを判定するために試験された。
【０１２９】
自己誘導培地（ＡＩＭ）は、１％のＮ−Ｚ−アミンＡＳと、０．５％の酵母エキスと、０．５％のグリセロールと、０．０５％のグルコースと、０．２％のアルファラクトースと、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、１ｍＭのＭｇＳＯ４と、を含む。
【０１３０】
Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋ＡＩＭ培地は、３．２％のトリプトンと、２％の酵母エキスと、０．５％のＮａＣｌと、１％のグリセロールと、０．１％のグルコースと、０．４％のアルファラクトースと、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、２ｍＭのＭｇＳＯ４と、を含む。
【０１３１】
プラスミド＋ＡＩＭ培地は、自己誘導のための、プラスミド＋培地（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４と、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、１ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．５％のグリセロールと、０．０５％のグルコースと、０．２％のアルファラクトースと、を含む。
【０１３２】
ＤＶ４９大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞の種培養物は、実施例２に記載された培養条件にしたがって調製された。３つの異なる生成培地が同じ量の種培養物で植菌され、実施例２に記載された条件にしたがって培養された。フラスコ培養の１６時間後に、細胞は、産出試験のために回収された。
【０１３３】
ＡＩＭにおいて成長したＤＶ４９細胞は４０ｍｇ／ＬのＲＮＡを産出した。Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋培地において成長したＤＶ４９細胞は２０７ｍｇ／ＬのＲＮＡを産出した。プラスミド＋ＡＩＭ培地において成長したＤＶ４９細胞は９６ｍｇ／ＬのＲＮＡを産出した。３つの培地からの細菌ＤＶ４９ＲＮＡの産出に基づいて、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋が最も高い収量の標的生成物を与えた。図７Ａを参照されたい。
【０１３４】
ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ生成に対するＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋培地の効果が、上記のように試験された。Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋培地において培養されたｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞は６６ｍｇ／ＬのＲＮＡを産出した。図７Ｂを参照されたい。Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ＋培地における産出は、試験された他の培地に亘る改善である。
【０１３５】
実施例６
コロラドハムシにおけるｄｓＲＮＡの生物有効性
３つのｄｓＲＮＡサンプル、すなわち、非溶解の加熱死滅ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）、精製された細菌転写ＣＢＰ  ｄｓＲＮＡ及びインビトロ転写ＣＢＰ  ｄｓＲＮＡが、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、すなわちＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａに対してｄｓＲＮＡ調製の生物有効性を試験するために、上記のように生成された。
【０１３６】
ＣＰＢ幼虫を用いたバイオアッセイが、１３．２ｇ／Ｌの寒天（Ｓｅｒｖａ  １１３９３）、１４０．３ｇ／ＬのＢｉｏ−Ｓｅｒｖｅ  ｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｆ９３８０Ｂ）、５ｍｌ／ＬのＫＯＨ（１８．３％ｗ／ｗ）及び１．２５ｍｌ／Ｌのホルマリン（３７％）の人工飼料を用いて行われた。この飼料は、２００ｕＬアリコートで９６ウェルプレートに分散され、サンプル適用の前に少し乾燥された。試験サンプル（非溶解の加熱死滅ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）、精製された細菌転写ＣＢＰ  ｄｓＲＮＡ、またはインビトロ転写ＣＢＰ  ｄｓＲＮＡ）の２０ｕＬアリコートが、未処理対照（ＵＴＣ）としての役割を果たす滅菌水を用いて、ウェル毎に適用された。プレートは、幼虫が加えられる前に乾燥された。一匹の新生ＣＰＢ幼虫が細かい絵筆を用いてウェル毎に加えられた。続いて、これらのプレートはマイラーで密閉され、虫ピンを用いて換気された。３２匹の幼虫（３２）が処理毎に試験された。
【０１３７】
バイオアッセイプレートは、完全に暗くして１０−１２日間、２７℃、６０％の相対湿度（ＲＨ）で培養された。これらのプレートは、続いて、幼虫の死亡（表２）及び成長阻害（表３）がスコア付けされた。データは、ＪＭＰ（著作権）４統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９９５）を用いて解析され、全因子ＡＮＯＶＡが、未処理対照に対して比較される処理効果を求めるＤｕｎｎｅｔ試験により行われた（Ｐ＜０．０５）。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃテストが、すべての対の処理を比較するように実行された（Ｐ＜０．０５）。
【０１３８】
表２及び３に示すように、すべてのＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ調製が、コロラドハムシに対するかなりの活性を示した。たとえば、コロラドハムシ成長の８７．５％が、試験された非溶解の加熱死滅大腸菌の最も低い濃度で阻止された（０．００００２ｍｇ／ｍｌ）。
表２：ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ死亡バイオアッセイ
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表３：ＣＰＢ  ｄｓＲＮＡ成長阻害バイオアッセイ
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【０１３９】
実施例７
ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡの生物有効性
アンチセンスＤＶ４９＋ループ＋センスＤＶ４９＋ＰＴＨ−ターミネーター＋ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーターの発現を駆動するＴ７プロモーターを有するｐＵＣバックボーンプラスミドが構築された。図８を参照されたい。ＤＶ４９発現構築物のヌクレオチド配列が配列番号４において提供される。
配列番号４：
2016517274.tif 000008
【０１４０】
ヌクレオチド１−１７はＴ７プロモーターをコードし、ヌクレオチド２１−２６０は、コーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス配列をコードし、ヌクレオチド２６１−４１０はルート形成領域をコードし、ヌクレオチド４１１−６５０は、コーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して実質的に同一であるセンス配列をコードし、ヌクレオチド６５９−６６８はＰＴＨ−ターミネーターをコードし、ヌクレオチド６８１−７６４はｐＥＴ−Ｔ７ターミネーターをコードする。
【０１４１】
大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞は、２つのプラスミド、すなわち、ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現構築物を担持する一のプラスミド、及び、誘導要素の制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＩＰＴＧ誘導Ｔ７ポリメラーゼ）を担持する他のプラスミドにより形質転換される。これらの細胞は、所望の細胞密度に対して生育され、ｄｓＲＮＡの収量が決定される。ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現細胞は、これらの細胞を死滅するように、少なくとも５９℃の温度に３０分間加熱される。ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現細胞は、ｄｓＲＮＡの濃度の増加、たとえば、０．００００２、０．００１及び０．００５ｍｇ／ｍｌを有する組成物を提供ように滴定され、加熱死滅ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現細胞または加熱死滅大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）制御細胞を含む組成物が、コーンルートワームの幼虫の飼料中に提供される。幼虫の死亡率または疾病率が評価され、幼虫の生存量が決定される。制御細胞に比べて、加熱死滅ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現細胞の摂取に続くコーンルートワームの幼虫の死滅、成長阻害または他の阻害は、加熱死滅ＤＶ４９  ｄｓＲＮＡ発現細胞の摂取が、コーンルートワームの侵入を制御するのに有効であることを示す。
【０１４２】
実施例８
溶解細菌対非溶解細菌の生物有効性
ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）の培養が調製され、細胞は、実施例４に記載されているように加熱死滅される。加熱死滅ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞のアリコートは、続いて、細胞溶解物を生成するように、化学、酵素、凍結融解または機械的手段により溶解される。細胞溶解物のアリコートは、続いて、細胞破片を除去するように、遠心分離により部分的に精製される。３つのサンプル、非溶解の加熱死滅ｐＣＰＢ−ｈｐ＋２Ｔ大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞、非精製細胞溶解物及び部分的精製細胞溶解物が、続いて、上記の実施例６に記載されているように、コロラドハムシ（ＣＰＢ）、すなわちＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａに対して生物有効性が試験される。これら３つのサンプルのアリコートは、期間を長くするために、凍結乾燥もしくは凍結、室温、４℃及び０℃などの温度などの異なる調製をさらに受け、種々の調製及び保存条件の下に置かれるサンプルの生物有効性が、上記の実施例６に記載されているようなバイオアッセイを実行することにより決定される。異なるサンプル調製のバイオアッセイが比較され、高度の生物有効性及び安定性を示す調製が選択される。
【０１４３】
実施例９
ｄｓＲＮＡ収量の最適化−ターミネーターの数及び組み合わせ
有効なｄｓＲＮＡ生成のためのプラスミドベクターが、転写ターミネーター配列がプロモーターとの機能的組み合わせを形成するように、ＰＴＨターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔｌターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーターからなる群から独立して各々選択される、ｄｓＲＮＡコード配列、すなわち、２、３、４、５または６個の転写終結配列に対して位置３’で挿入されることによって構築される。
【０１４４】
宿主細胞は操作されたベクターにより形質転換され、プロモーターからのｄｓＲＮＡコード配列の転写が誘導される。転写終結配列の各数及び組み合わせの終結効率が決定される。最も高い終結効率を示す最小数及び組み合わせの終結配列は、高い終結効率がベクター配列の非生産的読み過ごしを最小化し、低い終結効率に比べて、ｄｓＲＮＡの収率を改善するように、選択される。
【０１４５】
実施例１０
ｄｓＲＮＡ収量の最適化−プラスミドの大きさ
効率的なｄｓＲＮＡ生成に対するプラスミドベクターが、プロモーターと、ｄｓＲＮＡコード要素と、２つまたは３つ以上の終結配列とを含む操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を、タンパク質ベースの選択可能マーカー及び／または非必須スペーサー配列を含まない最小のプラスミドベクターに挿入することにより、構築される。操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物を含むベクターの予測される大きさが、効率的なプラスミド複製の最小の大きさを下回る場合、１つまたは複数の付加的な操作されたｄｓＲＮＡ発現構築物またはｄｓＲＮＡコード要素はベクターに挿入されて、結果として得られる発現ベクターの効率的な複製のための最小の大きさを達成する。宿主細胞は、ｄｓＲＮＡ発現ベクターにより形質転換される。必要に応じて、ｄｓＲＮＡ発現ベクターからのｄｓＲＮＡ転写を駆動するＲＮＡポリメラーゼをコードするベクターは共形質転換される。最小のベクターバックボーンは、ベクターバックボーンのより大きい割合を有するプラスミドに比較してｄｓＲＮＡの収量を改善して、非ｄｓＲＮＡコード配列の非生産的読み過ごしのための縮小テンプレートを提供する。
【０１４６】
実施例１１
ｄｓＲＮＡ収量の最適化−線状化テンプレート
効率的なｄｓＲＮＡ生成のためのプラスミドベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたｄｓＲＮＡコード配列に対して３’である位置において、宿主細胞ゲノム（たとえば、大腸菌ゲノム、ＺＦＮ制限部位またはＴＡＬＥＮ制限部位におけるいずれかの部位を有しないＩ−Ｓｃｅｌ）を切断しないエンドヌクレアーゼのための制限部位を挿入することにより構築される。たとえば、図９を参照されたい。宿主細胞は、ｄｓＲＮＡ＋エンドヌクレアーゼ生成ベクター及び制限部位を認識するエンドヌクレアーゼをコードするベクターにより共形質転換される。いくつかの例では、エンドヌクレアーゼの発現は誘導的であり、このエンドヌクレアーゼは、ｄｓＲＮＡ生成を駆動するＲＮＡポリメラーゼをさらにコードするベクター上にコードされてもよい。エンドヌクレアーゼの発現は、ｄｓＲＮＡ生成ベクターを線状化し、それにより、ベクター配列の非生産的読み過ごしが排除され、最小化非線状化プラスミドに比較してｄｓＲＮＡの収量が改善される。
【０１４７】
実施例１２
ＲＮＡ収量の最適化−ターミネーター組み合わせの比較
ＲＮＡ生成収量の比較が、同じ発現プラスミドにクローニングされた異なるターミネーターを用いて行われる。
【０１４８】
１．ＲＮＡ生成ベクターの設計
異なるターミネーターまたはターミネーターの組み合わせを有する９個のプラスミドベクターが、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌ｌａｃ  Ｚ遺伝子のＮターミナルフラグメント、複数のクローニング部位及び複製の起点を含むｐＵＣ１９クローニングベクターを用いて構築された。下記の表４に示しているターミネーター配列は、異なるターミネーターまたはターミネーターの組み合わせを有する９個の異なるベクターを生成するように、Ｔ７プロモーターの下流のｐＵＣ１９ベクターにクローニングされる。ＣＰＢ−ｈｐをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）は、Ｔ７プロモーターの下流及びターミネーター配列の上流でベクターに挿入された。
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【０１４９】
２．培養条件
プラスミドベクターは、大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞に形質転換された。各プラスミドベクターに対する単一のコロニーが選択され、種培養物を生成するように、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む３ｍｌのＬＢ培地において３７℃で６−８時間生育された。ｄｓＲＮＡの発現を誘導するように、種培養物の２００μｌが、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む自己誘導媒体（ＡＩＭ）（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１（２００５）２０７−２３４）を有する２５０ｍｌのフラスコ内に植菌され、続いて、培養された。４℃で１０分間６０００ｇで遠心分離することにより、細胞が回収された。
【０１５０】
３．ＲＮＡ精製及び測定
総ＲＮＡが、実施例２に記載されているプロトコルにしたがって、細菌細胞から精製され、生成されるＲＮＡ量を測定するように、アガロースゲル上に乗せられた。図１０に示すように、高レベルのＲＮＡ生成が、タンデムに２つのターミネーター（ＰＴＨ及びＰＥＴ）を含むＲＮＡ生成ベクターから得られた。単一のターミネーターを含む殆どのＲＮＡ生成ベクターは、検出可能なレベルのＲＮＡを生成しなかった。特定の理論により制約されることは望まれずに、Ｔ７転写を停止させる単一のターミネーターによる障害は、乏しいＲＮＡ生成をもたらす。ＰＥＴまたはｒｒｎ  ＢＴ２単一ターミネーターを含むＲＮＡ生成ベクターは検出可能な量のＲＮＡを生成したが、ＰＥＴ及びｒｒｎ  ＢＴ２生成ベクターからの収量は、２つのターミネーターを含むＲＮＡ生成ベクター（それぞれ、１６％及び４０％）に比べて、かなり低かった。図１０を参照されたい。
【０１５１】
４．構造比較
これらのターミネーターにより形成された二次構造は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）を使用して解析された。この二次構造の自由エネルギーも決定された。表５を参照されたい。図１１に示すように、最も高いＲＮＡ生成の収量（ＰＥＴ、ｒｒｎ ＢＴ２及びＰＴＨ；ＰＥＴ）を提供したターミネーターは、約１０乃至２０塩基対のステムを有するヘアピン構造である類似した二次構造を有する。ＲＮＡ生成ベクターからの検出可能なＲＮＡ生成が殆どないまたは全くないＲＮＡ生成に関連するターミネーターは、転写を停止させるのに短過ぎるまたは長過ぎるヘアピンを有していた。他の単一のターミネーター構築物と比較して、最も高い収量を与えた２ターミネーター構築物ＰＴＨ；ＰＥＴは隣接する小及び中サイズのヘアピンを有することが、判明した。図１１を参照されたい。
表５：二次構造の自由エネルギー
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【０１５２】
実施例１３
ＲＮＡ収量に対する二次構造の効果の評価
ＲＮＡ生成収量の比較が、同じＲＮＡ生成ベクターにクローニングされた異なる長さのヘアピンコード配列により行われた。
【０１５３】
２７ｍｅｒ（２７ｂｐステム足す８ｂｐループ）（配列番号１４）、２４０ｍｅｒ（２４０ｂｐステム足す１５０ｂｐループ）（配列番号１５）、または２８０ｍｅｒ（２８０ｂｐステム足す１５０ｂｐループ）（配列番号２）ヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベクターにおけるＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターの上流及びＴ７プロモーターの下流に挿入された。ＲＮＡヘアピン及びターミネーターにより形成された二次構造は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）を使用して決定された。図１２を参照されたい。図１２Ａにおいて理解できるように、２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピンは、ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター（円で囲まれている）により形成されたものと類似する二次構造を示す。２４０ｍｅｒ及び２８０ｍｅｒヘアピンは、ターミネーターのような二次構造を示さない、図１２Ｂ及び１２Ｃを参照されたい。
【０１５４】
２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター、２４０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター、及び２８０ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター発現構築物は、大腸菌ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞に転写され、ＲＮＡ生成は、実施例２に記載されているように誘導された。図１３において理解できるように、ｄｓＲＮＡ収量は、より長いＲＮＡヘアピン構築物に比べて、２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター構築物において特に高かった。この結果は、２７ｍｅｒ  ＲＮＡヘアピン／ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター構築物における付加的な中サイズのヘアピン構造の存在が、より高いＲＮＡ生成収量をもたらすＴ７転写の終結を支援してもよいことを示唆している。
【０１５５】
実施例１４
ＲＮＡ収量に対するターミネーター数及び二次構造の効果
ＲＮＡ生成収量の比較が、同じＲＮＡ生成ベクターにクローニングされた複数の異なるターミネーターにより行われた。
【０１５６】
上記の実施例１２に記載されているように、改善されたＲＮＡ発現が、２つのターミネーターの組み合わせＰＴＨ＋ＰＥＴを含むＲＮＡ生成ベクターから観察された。ＲＮＡ収量がターミネーター配列の数の増加に伴って改善されるかどうかを決定するように、付加的なターミネーター配列がｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベクターにクローニングされた。ＰＥＴ及びｒｒｎ  ＢＴ２ターミネーター配列は、単一のターミネーターＲＮＡ生成ベクターに対して最も高いＲＮＡ収量を生成するように観察されるために、これらの配列は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベクターにクローニングするために選択された。これらの付加的なＲＮＡ生成ベクター、すなわち、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＨＴ＋ＰＥＴ、ｐＵＣ１９−ＰＥＴ＋ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＨＴ＋ＰＥＴ、及びｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＨＴ＋ＰＥＴが作られた。プラスミドは、ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞に配列、確認及び形質転換された。細胞は培養され、総ＲＮＡは、実施例１２に記載されているように、単離された。総ＲＮＡは、生成されたＲＮＡ量を測定するように、アガロースゲル上に乗せられた。図１４を参照されたい。
【０１５７】
ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベクターから生成された総ＲＮＡ（図１４、ライン１）が、ベースラインＲＮＡ収量（１００％）として使用され、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＨＴ＋ＰＥＴ、ｐＵＣ１９−ＰＥＴ＋ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＨＴ＋ＰＥＴ、及びｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＨＴ＋ＰＥＴ発現ベクターからの総ＲＮＡ収量が、このベースラインと比較された。驚いたことに、ＲＮＡ収量の増加は、ターミネーターの数と厳密には相関してはいず、３ターミネーター発現ベクター、すなわち、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴのときには、２ターミネーターベースラインにより生成された総ＲＮＡの５２％が生成され、４ターミネーター発現ベクター、すなわち、ｐＵＣ１９−ＰＥＴ＋ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＴＨ＋ＰＥＴのときには、その４０％が生成された。図１４及び表６を参照されたい。しかしながら、４ターミネーター発現ベクター、すなわちｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ）の総ＲＮＡ収量は、２ターミネーターベースラインのそれより３５％高かった。図１４及び表６を参照されたい。
【０１５８】
ターミネーターにより形成された二次構造は、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）を使用して決定された。図１５を参照されたい。図１５Ａにおいて理解できるように、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベースラインＲＮＡ生成ベクターの２ターミネーターは、２つの隣接する中サイズのヘアピン（円で囲まれている）を有する二次構造を有する。最も高いＲＮＡ収量を生成した４ターミネーター発現ベクター、すなわち、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ）は、３つの隣接する中サイズのヘアピンを有する二次構造を示す。図１５Ｂを参照されたい。図１５Ｃ及び図１５Ｄに示すように、最も低い総ＲＮＡ収量を有するＲＮＡ生成ベクターは、隣接する中サイズのヘアピンを伴わずに二次構造を示す。
表６：複数のターミネーター
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【０１５９】
実施例１５
増加したＲＮＡ収量を提供する隣接するｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター
ＰＴＨ＋ＰＥＴ及びＰＥＴ＋ｒｒｎ  ＢＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターに対するＲＮＡ生成収量の比較が付加的な遺伝子について行われた。
【０１６０】
コロラドハムシから導出された３９７ｍｅｒヘアピンをコードするＤＮＡ配列（配列番号２０）は、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴベクター及びｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴベクターにおけるターミネーターの上流及びＴ７プロモーターの下流に挿入された。プラスミド配列は、ＨＴ１１５（ＤＥ３）細胞に配列し、かつ形質転換されることにより確認された。細胞培養及び総ＲＮＡ抽出は、実施例１２に記載されているように実行された。１８時間の培養後、ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターを含む発現ベクターを有する株はＯＤ６００５．７８に到達し、４４ｍｇ／ＬのＲＮＡ収量を生成した一方、ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターを含む発現ベクターを有する株はＯＤ６００５．５５に到達し、１３２ｍｇ／ＬのＲＮＡ収量を生成した。この結果は、付加的な中サイズのヘアピン構造ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター構築物の存在が、より高いＲＮＡ生成収量をもたらすＴ７転写の終結を支援してもよいことを示唆する。
【０１６１】
実施例１６
増加したタンパク質収量を提供する隣接するｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター
タンパク質Ａ（ＭＷ  ２１ｋ）をコードするＤＮＡ配列は、ｐＵＣ１９−ＰＥＴターミネーター、ｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２ターミネーター、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーター及びｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターベクターにクローニングされた。プラスミドは、確認され、かつＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された配列である。発現プラスミドを含む細胞が選択され、続いて、カルベニシリンを有するＬＢ培地において培養された。ＯＤ６００が０．５に達したとき、１ｍＭ  ＩＰＴＧが各培養体に加えられた。細胞は、誘導の４時間後に回収された。総タンパク質は、２Ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷バッファー中で５分間、細胞を煮沸させることにより、細胞から単離された。５ｕｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。図１６に示すように、ｐＵＣ１９−ＰＴＨ＋ＰＥＴ及びｐＵＣ１９−ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ発現プラスミドを含む細胞は、最も高い標的タンパク質の収量を生成した。
【０１６２】
実施例１７
増加したＲＮＡ及びタンパク発現のための合成ターミネーター設計
ｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ終結配列（配列番号１８）は、非ヘアピン形成配列及びヘアピン形成領域内の塩基対のミスマッチを除去するように改変され、その結果として得られる合成配列、すなわち、配列番号２１が、ヘアピン形成領域においてミスマッチがない３つの隣接する中サイズのヘアピンを有する二次構造を形成するように、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）により予測された。図１７Ｂを参照されたい。配列番号２１を含むＤＮＡポリヌクレオチドが合成された。配列番号２１を含むＤＮＡポリヌクレオチドが、Ｔ７プロモーターの下流でｐＵＣ１９ベクターにクローニングされた。
【０１６３】
４つの異なる推定ターミネーター配列が、大腸菌から特定され、タンデムに配列され、合成配列、すなわち、配列番号２２をもたらした。配列番号２２が、ヘアピン形成領域内にあるいくつかのミスマッチ（泡）を伴う４つの隣接する中サイズのヘアピンを有する二次構造を形成するように、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）により予測された。図１７Ｃを参照されたい。配列番号２２を含むＤＮＡポリヌクレオチドが合成され、Ｔ７プロモーターの下流でｐＵＣ１９ベクターにクローニングされた。
【０１６４】
配列番号２２が、非ヘアピン形成配列及びヘアピン形成領域内の塩基対のミスマッチを除去するように改変され、その結果として得られる合成配列、すなわち、配列番号２３が、ヘアピン形成領域においてミスマッチがない４つの隣接する中サイズのヘアピンを有する二次構造を形成するように、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．８．４）により予測された。配列番号２３を含むＤＮＡポリヌクレオチドを化学的に合成する試みがなされたが、生成物は得られなかった。特定の理論により制約されることは望まれずに、配列番号２３の二次構造は合成の妨げになっていてもよい。
表７：合成ターミネーター
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【０１６５】
実施形態１８
ＲＮＡ収量の最適化−合成ターミネーター
宿主細胞は、対象のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターとの機能的組み合わせにおいて、配列番号２１、２２または２３に記載されているような操作されたターミネーター配列を含む操作されたベクターにより形質転換される。プロモーターからの配列をコードするＲＮＡの転写が誘導される。各操作されたターミネーター配列の終結効率が決定される。最も高い終結効率を示す操作された終結配列が選択される。隣接する中サイズのヘアピンが転写の速度を落とすまたは転写を停止して、ベクター配列の非生産的読み過ごしを最小化し、ＲＮＡ収率を改善するように、操作されたターミネーター配列により形成された中サイズのヘアピンの数が増加するにつれて、ＲＮＡ生成収量は増加する。
【０１６６】
実施形態１９
Ｔ３、ＳＶ４０、ＳＰ６、Ｔ５、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌プロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトースオペロン（ｌａｃ）プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｔａｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターとの機能的組み合わせを転写ターミネーター配列が形成するように、ＲＮＡ生成のためのプラスミドベクターは、ＲＮＡコード配列、ＰＥＴ、ＰＴＨ＋ＰＥＴ、またはｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ終結配列に対して位置３’に挿入することにより構築される。
【０１６７】
宿主細胞は、操作されたベクターにより形質転換され、プロモーターからのＲＮＡコード配列の転写が誘導される。転写終結配列の各数及び組み合わせの終結効率が決定される。ＲＮＡ生成収量は、ＰＥＴ終結ベクターに比べて、ＰＴＨ＋ＰＥＴ終結ベクターにおいて増加し、ＲＮＡ生成収量は、転写の速度を落とすまたは転写を停止して、ベクター配列の非生産的読み過ごしを最小化し、ＲＮＡ収率を改善する隣接する中サイズのヘアピンを、ＰＴＨ＋ＰＥＴ及びｒｒｎ  ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴターミネーターが有するように、操作されたターミネーター配列により形成された中サイズのヘアピンの数が増加するにつれて、ＰＨＴ＋ＰＥＴ（２つのターミネーター）及びＰＥＴ（１つのターミネーター）終結ベクターに比べて、ＢＴ２＋ＰＥＴ＋ＰＴＨ＋ＰＥＴ終結ベクターにおいて増加される。