(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光標識物質で標識されたオリゴヌクレオチドの長さの変化を検出する方法であって、下記の工程を含む方法：
（ａ）  前記オリゴヌクレオチドの長さの変化をもたらす条件下で、反応混合物中で反応を行い；
（ｂ）  該標識物質の発光を変更するように該標識物質と相互作用することが可能なＤＮＡ  結合化合物の存在下で、前記反応混合物中の該標識物質の発光を測定し、ここでこの相互作用が前記オリゴヌクレオチドの長さに依存し、そして
（ｃ）  工程（ｂ）  で測定された発光によって、前記オリゴヌクレオチドの長さの変化を検出する；
ここで、前記ＤＮＡ  結合化合物は、ポリエチレンイミン及びその誘導体、スペルミン、及びスペルミジンから成る群から選択される；
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
下記の工程を含む方法：
（ａ１）  反応のための反応混合物を用意し、この反応混合物が、前記試料及び発光標識物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドを含有し、該オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸とハイブリッド形成することが可能な配列を含み、かつ前記反応は、該オリゴヌクレオチドが該標的核酸とハイブリッド形成する場合にのみ、該オリゴヌクレオチドの切断を触媒し；
（ａ２）    該オリゴヌクレオチドが該標的配列とハイブリッド形成しそして切断される条件下で、前記混合物を処理し；
（ｂ）  該標識物質の発光を変更することが可能なＤＮＡ  結合化合物の存在下で、前記反応混合物中の該標識物質の発光を測定し、ここでこの相互作用は前記オリゴヌクレオチドの長さに依存し；そして
（ｃ）  工程（ｂ）  で測定された発光によって、該標的配列が存在するかどうかを決定する；
ことを含んで成る、試料中の標的核酸を検出するための請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列が、工程（ｂ）  以前に増幅される、請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
（ａ１）  前記試料、オリゴヌクレオチドプライマー対、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、及び該標的核酸の領域とハイブリッド形成することが可能なオリゴヌクレオチドを含有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）  混合物を用意し、ここで前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドプライマーと結合した前記標的核酸配列内にハイブリッド形成し、かつ該オリゴヌクレオチドプローブは発光標識物質で標識されており；
（ａ２）  ＰＣＲ  条件下で、前記ＰＣＲ  混合物を処理し、ここで前記核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が前記標的配列とハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを切断し；
（ｂ）  該標識物質の発光を変更することが可能なＤＮＡ  結合化合物の存在下で、前記反応混合物中の該標識物質の発光を測定し、ここで前記相互作用は前記オリゴヌクレオチドの長さに依存し；そして
（ｃ）  工程（ｂ）  で測定された発光によって、該標的配列が存在するかどうかを決定する；
ことを含んで成る、請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ  結合化合物が、ポリエチレンイミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲第１〜４項記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、フルオレセイン、ローダミン及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求の範囲第１〜５項記載のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発光標識物質で標識されたオリゴヌクレオチド標識物質の長さの変化を検出する方法に関する。さらに、本発明は、プローブの機能を有する相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成による、核酸配列を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸の検出は、特定の標的を検出するための標準的手法となっている。多くのアッセイ様式が明らかになっている。一般に、核酸試料は、標識された標的に特異的なプローブとハイブリッド形成し、結合しないプローブはこのハイブリッド・リュプレックスから分離され、かつこのハイブリッド・リュプレックスの存在が該標識物質を用い検出される。このハイブリッド形成したプローブと形成しなかったプローブとの分離は、多くの方法で達成することができる。
【０００３】
例えば、その試料核酸を保持体上に固定化し、かつ非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除去するか、あるいはハイブリッドリュプレックス及び非結合プローブをゲル電気泳動によって分離するかのいずれかである。一般に、これらの方法は、ハイブリッド形成後に生じたシグナルを、非結合非標識プローブによって生じたバックグラウンドシグナルと区別するするための、分離工程を必要とする。
【０００４】
いくつかの核酸検出法は、プローブ−標的のハイブリッド・デュプレックスの形成後の、オリゴヌクレオチドプローブの選択的切断に関連して、説明されている。切断されたプローブの検出は、ハイブリッド形成の発生、及びこれによる標的配列の存在を示している。例えば、Ｓａｉｋｉ  らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：１００８−１０１２（１９８５）は、“オリゴマー制限”の方法を記載し、これは、標的に特異的なプローブのハイブリッド形成が、その後対応する制限酵素によって切断されるような制限部位を生じることを明らかにしている。
【０００５】
特許公報  ＷＯ  ８９／０９２８４号は、ＲＮＡ  プローブを用い、ＤＮＡ  標的配列を検出する方法を開示している。ＤＮＡ  標的とハイブリッド形成されたＲＮＡ  プローブを、選択的にＲＮＡ−ＤＮＡ  ハイブリッド・デュプレックス中のＲＮＡ  を切断するＲＮａｓｅＨを用いて切断する。米国特許第５，２１０，０１５  号は、核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を用い、標的配列とハイブリッド形成されたプローブを切断し、そしてこれにより検出のための標識されたオリゴヌクレオチド断片を放出する方法を開示している。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）  、核酸の増幅方法の発明は、感度及び特異性が顕著に増大した核酸の検出を可能にした。ＰＣＲ  を用い、単コピーゲノムＤＮＡ  のセグメントは、検出前に容易に検出可能なレベルにまで選択的に増幅される。ＰＣＲ  法は、米国特許第４，６８３，２０２  号において開示されている。ＰＣＲ  、及び増幅された標的核酸とハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いるＰＣＲ  生成物の検出法は、米国特許第４，６８３，１９５  号、並びに欧州特許公報第２３７，３６２  号に開示されている。
【０００７】
プローブ−標的ハイブリッド・デュプレックスの形成後の、ハイブリッド形成プローブの選択的切断を含む前記の核酸検出法は、増幅された核酸の検出に適用されている。Ｓａｉｋｉ  らの  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：１３５０−１３５３（１９８５）は、ＰＣＲ  増幅された核酸を検出するために、“オリゴマー制限”を適用することを記載している。前記米国特許第５，２１０，０１５  号は、標的配列とハイブリッド形成された標識プローブを切断するために、核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を用いる、ＰＣＲ  増幅生成物の解析法を開示している（Ｈｏｌｌａｎｄらの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８  ８  ：７２７６−７２８０（１９９１））  も参照）  。
【０００８】
米国特許第５，２１０，０１５  号の方法において、増幅プライマーで結合された該標的核酸の領域とハイブリッド形成するプローブは、この増幅反応混合物に混合される。ハイブリッド形成されたプローブは、プライマー伸長の間に、該ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって切断される。標識された断片の検出は、プライマー伸長及びプローブハイブリッド形成の両方が生じ、その結果特定の標的配列の増幅が生じたことを示している。
【０００９】
多くの試薬が、標的核酸を容易に検出するための、プローブ又は標的のいずれかの核酸の標識に関して記載されている。標識物質類は、蛍光、放射線、比色、Ｘ−線回析又は吸収、磁気及び酵素活性によって検出可能なシグナルをもたらし、かつ例えば発蛍光団、発色団、放射性同位元素（  特に３２Ｐ  及び１２５  Ｉ）、高電子試薬、酵素、及び特異的結合パターンを有するリガンドである。標識は、標識物質を組み込むための、プライマー又はプローブの化学的修飾、もしくは修飾されたヌクレオチド三リン酸を、伸長生成物へと組み込むための重合剤の使用のような、多くの方法で達成することができる。
【００１０】
核酸ハイブリッド形成アッセイにおける、相互作用する蛍光標識物質によって標識されたオリゴヌクレオチドプローブの使用は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの論文（非同位体ＤＮＡ  プローブ技術、Ｋｒｉｃｋａ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ、ＣＡ、第１３章、（１９９２  ））；  並びにＨｅｌｌｅｒ及びＭｏｒｒｉｓｏｎの論文（汚染剤の迅速な検出及び同定、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ、ＣＡ、２４５−２５６（１９８５））に記載されている。これらの方法は、適した蛍光標識物質が近傍にもたらされた場合に生じる蛍光の変化によるものであり、前記文献中に、蛍光エネルギーの移動（ＦＥＴ）  、蛍光共鳴エネルギーの移動、無放射エネルギーの移動、長距離のエネルギーの移動、双極子組エネルギーの移動、又はフェルスターエネルギー移動として記載されている。
【００１１】
前述のＭｏｒｒｉｓｏｎの論文（１９９２）は、３種のアッセイ様式を記載している。これらのアッセイ様式のうちの２種において、相互作用する蛍光標識物質は、プローブハイブリッド形成によって、一緒に又は別々にされる個別のオリゴヌクレオチドを分離するように結合される。これらのアッセイ様式は、プローブ−プローブハイブリッド形成が、プローブ−標的ハイブリッド形成と競合するかどうかによって決まる、非競合的又は競合的なもののいずれかとして記載されている。
【００１２】
両方のアッセイ様式は、２種の配列に特異的な標識されたプローブを合成する必要がある。第三のアッセイ様式において、１個の蛍光標識物質はハイブリッド形成プローブと結合し、かつ第二の蛍光標識物質は、二本鎖ハイブリッド形成二重らせんの中に挿入されることによって、近傍にもたらされる。溶液中では、この挿入標識物質及び非ハイブリッド形成プローブ間には、重要な相互作用は生じない。該挿入標識物質は、いずれの二本鎖核酸の中にも挿入することができるので、この様式は、一本鎖の標的核酸の検出のためのみ、実用的である。
【００１３】
米国特許第５，２１０，０１５  号は、近傍で相互作用する蛍光標識物質類で標識されたハイブリッド形成プローブの使用を開示している。これらの標識は、増幅期のプローブの分解が該標識物質を分離し、その結果、蛍光の検出可能な変化を生じるように結合している。このような複合的に標識されたプローブは、合成が困難であり、かつ費用がかかる。
【００１４】
当該技術分野の範疇である分子生物学及び核酸化学の通常の技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの論文（  分子クローニング−実験操作法、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８５）  ）；  オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編集（１９８４））；核酸ハイブリッド形成（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集（１９８４  ））；並びに酵素的方法（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  社）  のような文献に十分に説明されている。
【００１５】
一般に本発明は、発光標識物質によって標識されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ  結合化合物によって、顕著な溶液内の消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）  が生じるような条件を提供する。この消光は、標識されたオリゴヌクレオチドの、その相補的配列へのハイブリッド形成を伴わない溶液中で生じる。本発明の方法は、標識されたオリゴヌクレオチドの長さによって左右されるこの消光を用いる。短い標識オリゴヌクレオチド（  ヌクレオチド約６個以下）  の消光は、より長い標識オリゴヌクレオチドの消光よりも、検出されにくい。発光標識物質によって標識されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ  結合化合物による溶液内消光の発生、並びに該オリゴヌクレオチドの長さによって決まる消光のいずれも、これまでは報告されていない。
【００１６】
本発明は、ＤＮＡ  結合化合物の存在下における蛍光の変化を基にした、標識オリゴヌクレオチドの長さの変化を検出する方法を提供する。特に本発明は、切断されていないオリゴヌクレオチドから切断されたオリゴヌクレオチド断片を分離する必要がない、反応混合物中でのオリゴヌクレオチドの分解（切断）  の検出方法を提供する。該オリゴヌクレオチドは、発光標識物質によって標識されている。該標識物質と相互作用し、該標識物質の発光を消光するような、ＤＮＡ  結合化合物が、この反応混合物に添加される。オリゴヌクレオチドの分解は、この反応後に、該標識物質の消光を測定することによって検出される。標識オリゴヌクレオチドの長さによって消光が左右されるので、オリゴヌクレオチド分解は、標識されたオリゴヌクレオチドの発光の検出可能な変化を生じる。
【００１７】
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成による、試料中の標的核酸の改善された検出法を提供する。本方法は、標的核酸とハイブリッド形成されたプローブの選択的切断によってもたらされる。本発明の方法において切断されたプローブが検出されることは、標的核酸が存在することを示している。
【００１８】
本発明のある具体的な実施態様において、試料中の標的核酸の検出方法が提供され、かつこの方法は：
（ａ）  該試料及び発光標識物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する反応混合物を用意し、ここで該プローブは該標的核酸とハイブリッド形成することができる配列を含み、そして該ＤＮＡ  結合化合物が、該標識物質の発光を変更し；
（ｂ）  工程（ａ）  の反応混合物のアリコートに、ＤＮＡ  結合化合物を添加し、そしてその標識物質の発光を測定し；
（ｃ）  前記混合物を、該オリゴヌクレオチドプローブが該標的配列にハイブリッド形成しかつ切断されるような条件下で処理し；
（ｄ）  工程（ｃ）  の反応混合物のアリコートに、ＤＮＡ  結合化合物を添加し、そしてその標識物質の発光を測定し；そして
（ｅ）  工程（ｂ）  及び工程（ｅ）  において測定された発光の差によって、該標識配列が存在するかどうかを判定する；
工程を含む。
【００１９】
標的核酸とハイブリッド形成したプローブの選択的切断は、多くの公知の反応のいずれかによって達成することができる。標的配列とハイブリッド形成したプローブを選択的に切断するのに適した反応の例は、前述のＳａｉｋｉ  らの論文（１９８５  ）；前記特許公報  ＷＯ  ８９／０９２８４号；  及び前記米国特許第５，２１０，０１５  号に、記載されている。
【００２０】
本発明の核酸を検出する方法は、特に増幅工程と組み合わせて使用することが適している。従って、本発明のある実施態様において、該標的配列は、工程（ｃ）  の以前に、もしくはこれと組み合わせて増幅される。
好ましい実施態様において、本発明は、米国特許第５，１２０，０１５  号に開示された、プライマー伸長のため、並びにハイブリッド形成された標識プローブの切断の両方ために１種の核酸ポリメラーゼを使用するような、均質ＰＣＲ  増幅及びＰＣＲ  生成物検出アッセイの改善を提供する。本発明によってもたらされたこの改善は、切断及び非切断プローブを分離するための反応後の操作を必要とせず、１種の発光標識物質で標識されたプローブを使用することが許される。
【００２１】
従って、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）  を用い、試料中の標的核酸配列を検出する方法を提供し、この方法は：
（ａ）  前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、該オリゴヌクレオチドプライマーによって結合された標的核酸の領域にハイブリッド形成することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを含有するＰＣＲ  混合物を用意し、ここで該プローブは発光標識物質で標識され、そして該ＤＮＡ  結合化合物が該標識物質の発光を変化させることが可能であり；
（ｂ）  ＤＮＡ  結合化合物の存在下で、前記反応混合物中の標識物質の発光を測定し；
（ｃ）  前記ＰＣＲ  混合物を、該核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が該標的配列にハイブリッド形成されたプローブを切断するようなＰＣＲ  条件下で処理し；
（ｄ）  ＤＮＡ  結合化合物存在下で、該標識物質の発光を測定し；そして
（ｅ）  工程（ｂ）  及び工程（ｄ）  間の発光の差によって、該標識配列が存在するかどうかを判定する；
工程を含む。
【００２２】
図１は、実施例１に記載された、標識オリゴヌクレオチドの長さ、発光標識物質、及びＤＮＡ  結合化合物の濃度への消光の依存性を示すグラフである。
図２は、実施例２に記載された、使用されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）  の分子量及び濃度に対する消光の依存性を示すグラフである。
図３は、実施例３に記載された、内部定量標準存在下での標的核酸配列の増幅による、核酸の定量に関する。
【００２３】
本発明の理解を助けるために、幾つかの用語の定義を下記に示す。
用語“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”は、検出されるべきプローブ及びオリゴマー断片を意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−  リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、並びにプリンもしくはピリミジン塩基、又は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ  グリコシドであるいずれかの型について一般的でなければならない。“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”という用語の間には、長さに関する意図的な相違点は存在せず、かつこれらの用語は互いに交換して使用されるであろう。これらの用語は該分子の１次構造のみを意味する。従って、これらの用語は、二本鎖−及び一本鎖−ＤＮＡ  に加え、二本鎖−及び一本鎖−ＲＮＡ  を含む。
【００２４】
用語“標的領域”、“標的配列”及び“標的核酸配列”は、検出されるべき核酸の領域を意味する。
用語“プローブ”は、相補的塩基対のために標的核酸の配列とデュプレックスを形成するオリゴヌクレオチドで、典型的には標識されたオリゴヌクレオチドを意味する。このプローブは、該標的配列の領域に対応する、好ましくは１０〜５０のヌクレオチドから成る、さらに好ましくは２０〜３０のヌクレオチドから成るような“ハイブリッド形成領域”を含むであろう。“対応する”とは、指示された核酸と同一であるか、又は相補的であることを意味する。本発明において、プローブオリゴヌクレオチド類は、検出を可能にするために、蛍光標識物質で標識され、すなわちそれに結合している。
【００２５】
用語“ハイブリッド形成”は、相補的塩基対のために、２個の一本鎖核酸による、デュプレックス形成を意味する。ハイブリッド形成は、完全に相補的核酸鎖間で、又は組み合わせが不適合な小領域を含むような核酸鎖間で生じることができる。完全に相補的核酸鎖のみがハイブリッド形成するような条件は、“緊縮ハイブリッド形成条件”と呼ばれる。不適合な小領域以外は相補的である２個の一本鎖核酸は、“実質的に相補的”と呼ばれる。実質的に相補的な配列の安定なデュプレックスは、より緊縮性の少ないハイブリッド形成条件下で達成することができる。核酸技術分野における当業者は、例えば該オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度及び不適合の塩基対の存在率を含む多くの変数を経験的に考慮し、デュプレックスの安定性を決定することができる。
【００２６】
用語“配列に特異的なオリゴヌクレオチド”及び“ＳＳＯ  ”は、ハイブリッド形成領域が、検出されるべき配列と完全に相補的であるようなオリゴヌクレオチドプローブを意味する。該プローブが完全に相補的な標的配列のみとハイブリッド形成するような、緊縮ハイブリッド形成条件の採用は、その特定の標的配列の検出をもたらす。緊縮ハイブリッド形成条件は、当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの論文（分子クローニング−実験操作法、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８５））参照。緊縮条件は、配列によって決まり、かつ別の環境では異なるものとなるであろう。一般に、緊縮条件は、所定のイオン強度及びｐＨでの、特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度及びｐＨ下での）その塩基対の５０％が解離する温度である。ハイブリッド形成条件の厳密性の緩和は、配列の組み合わせの不適合を忍用性があるものとし；この忍用性がある不適合を、そのハイブリッド形成条件の適当な調整によって、制御することができる。
【００２７】
用語“サブ配列”は、本願明細書中では、別の配列内に含まれたヌクレオチド配列を意味する。
本願明細書中で使用される用語“標識物質”は、核酸に付着することができ、かつ検出可能なシグナルを提供する、もしくは第二標識物質によってもたらされた検出可能な信号を変化させるために第二の標識物質と相互作用するような、いずれかの原子又は分子を意味する。好ましい標識物質は、蛍光、化学発光又は生物発光による検出可能なシグナルを発生する発光化合物を意味する。
【００２８】
用語“発蛍光団”は、発蛍光が可能な化合物、すなわちある周波数の光を吸収し、かつ別の、一般にはより低い周波数の光を発光する化合物を意味する。
用語“生物発光”は、発光化合物が生体内に見つかるようなものである化学発光の型を意味する。生物発光化合物の例は、細菌のルシフェラーゼ及びホタルのルシフェラーゼである。
【００２９】
用語“消光”は、その機能にかかわらず、第二の化合物によって引き起こされた第一の化合物の蛍光の減少を意味する。通常消光は、これらの化合物が近傍にあることが要求される。本願明細書においては、該化合物又は該化合物の蛍光のいずれかが、消光されることを意味し、かつ双方の使用は、同じ現象を意味すると理解される。
【００３０】
用語“反応混合物”は、所定の反応を遂行するために必要な試薬類を含有する溶液を意味する。増幅反応を遂行するために必要な試薬類を含有する溶液を意味する、“増幅反応混合物”は、典型的には、適当なバッファー中に、オリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡ  ポリメラーゼを含む。特定の反応のための反応混合物は、前述の文献において周知である。
【００３１】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチド類の合成又は切断のいずれかの検出に適用される。切断されたオリゴヌクレオチドの検出は、該標識物質の発光を減少するために該標識物質と相互作用することができるようなＤＮＡ  結合化合物を含有する溶液中で行われる。合成又は切断によるこの標識されたオリゴヌクレオチドの長さの変化は、付着した標識物質の発光の検出可能な変化をもたらす。適した発光標識物質、及び該標識物質の発光を変化させるように相互作用することができるＤＮＡ  結合化合物は、下記のものである。
【００３２】
本発明の例示された方法において、一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した蛍光標識物質の発光が検出される。ＤＮＡ  結合化合物は、該標識物質の蛍光を、付着したオリゴヌクレオチドの長さに依存する程度で消光する。一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した蛍光標識物質のＤＮＡ  結合化合物による溶液内消光の発生、及び該オリゴヌクレオチドの長さへの消光の依存の双方が、先行技術の検討においては予期されていない。
【００３３】
好ましい実施態様において、前記ＤＮＡ  結合剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）  であり、これは様々な分子量のエチレンイミンの分枝したもしくは分枝していないポリマー類を意味する。ヒドロキシエチル化されたＰＥＩ  のような、ＰＥＩ  誘導体が、本発明の方法に適している。本発明の方法における作業に示されている他の化合物類は、スペルミン及びスペルミジンを含む。
【００３４】
分枝したＰＥＩ  は、粘度から推定される分子量が６００  から少なくとも６０，０００〜８０，  ０００  までの範囲のものが、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ワーリントン、ＰＡ）から市販されている。ＰＥＩ  分子量が、６００  、１２００、１８００、１０，０００、及び６０，０００〜８０，０００であるものを試験し、長さ２の蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを、長さ３３のものから区別する本発明の方法における機能が示されている。当業者のあるものは、いずれの大きさのＰＥＩ  が、所定の適用に最も適しているかということを経験的に決定することができるであろう。
【００３５】
前述のＤＮＡ  結合化合物の適した濃度は、経験的に決定される。典型的には、ＤＮＡ  結合化合物の至適濃度は、使用される発光標識物質の種類及び反応試薬類の濃度によって影響を受ける。具体的には、塩濃度が、ＰＥＩ  の至適濃度に影響することが認められている。いくつかの反応においては、該反応混合物へのキレート剤の添加（例えば約１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）  は、ＰＥＩ  の範囲を、それに対するウインドウ  （ｗｉｎｄｏｗ）  が最大値付近となるように広げることが認められている。長い及び短い標識オリゴヌクレオチド類の蛍光に最大差をもたらす、ＤＮＡ  結合化合物濃度の通常の最適化は、下記の実施例１及び２に本質的に記載されたように、行うことができる。
【００３６】
当該技術分野において記載されている多くの発光化合物が、本発明の方法において、オリゴヌクレオチド標識物質として使用するのに適している。理論上、発蛍光団は、散乱した励起光による干渉を最少にするために、高度のストークスシフト（すなわち、最大吸収波長及び最大発光波長の間の大きな差）を有さなければならない。
【００３７】
当該技術分野において周知である適当な化合物は、フルオレセイン（ＦＡＭ）  、ヘキサクロロフルオロセイン（ＨＥＸ）  、テトラクロロフルオロセイン（ＴＥ  Ｔ）、及びジクロロジメチルフルオロセイン（ＪＯＥ）  などのフルオレセイン及び誘導体；テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）  、ローダミン（ＲＯＸ）  、及びテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）  のようなローダミン及び誘導体；ルシフェルイエロー、並びに７−Ｍｅ２Ｎ−  クマリン−４−  アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−  クマリン−３−  アセテート、及び７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−  アセテート（ＡＭＣＡ）のようなクマリン誘導体であるが、これらに限定されるものではない。ＦＡＭ  、ＨＥＸ  、ＴＥＴ  、ＪＯＥ  、ＲＯＸ  及びＴＡＭＲＡ  は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社の応用生合成部門（フォスター市、ＣＡ）によって販売されている。
【００３８】
テキサスレッド及び多くの他の適当な化合物類は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユージン、ＯＲ）によって販売されている。エネルギー供給体としての使用に適している化学発光及び生物発光化合物の例は、ルミノール（アミノフタルヒドラジド）及び誘導体、並びにルシフェラーゼが含まれる。
オリゴヌクレオチドは、いずれかの適した方法によって調製することができ、これは例えば制限酵素を用いる適切な配列のクローニング及び単離、並びにＮａｒａｎｇらの論文（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ６８：９０−９９（１９７９））  のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  らの論文（Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ６８：１０９−１５１（１９７９））  のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅらの論文（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１８５９−１８６２（１９８１））  のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６  号の保持体法などの方法による直接的化学合成を含む。
【００３９】
標識オリゴヌクレオチド類の合成法は、Ａｇｒａｗａｌ  及びＺａｍｅｃｎｉｋの論文（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  １８（１８）：５４１９−５４２３（１９９０））  ；ＭａｃＭｉｌｌａｎ  及びＶｅｒｄｉｎｅ  の論文（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５９３１−５９３３（１９９０））；Ｐｉｅｌｅｓらの論文（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  １７（２２）：８９６７−８９７８（１９８９））  ；Ｒｏｇｅｔ  らの論文（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  １７（１９）：７６４３−７６５１（１９８９））  ；並びにＴｅｓｌｅｒらの論文（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：６９６６−６９７６（１９８  ９  ））に記載されている。合成方法の論評は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  （Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １（３）：１６５−１８７（１９９０））によって提供されている。
【００４０】
本発明の方法は、ＤＮＡ  又はＲＮＡ  のいずれかの、増幅された核酸の検出に特に適している。増幅に適した方法は、前述のＰＣＲ  （米国特許第４，６８３，１９５  号、第４，６８３，２０２  号、及び第４，９６５，１８８  号）に加え、下記のものを含むが、これらに限定されるものではない：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ  の論文、（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０−５６９  （１９８９））  及びＢａｒａｎｙの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３（１９９１）））；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  の論文（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．，  １：５−１６  （１９９１）））；ギャップ−ＬＣＲ（特許公報  ＷＯ  ９０／０１０６９号）；修復連鎖反応（欧州特許公報第４３９，１８２  号）；３ＳＲ（Ｋｏｗｈらの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８  ６  ：１１７３−１１７７（１９８９））  ；Ｇｕａｔｅｌｌｉらの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４−１８７８（１９９０）  ）；特許公報  ＷＯ  ９２／０８８００号；並びにＮＡＳＢＡ  （米国特許第５，１３０，２３８  号）である。
【００４１】
本発明は、いずれかの具体的な増幅システムを限定するものではない。別のシステムが開発された場合には、これらのシステムは本発明の実施により利益をもたらすことができる。増幅システムの最新の調査は、Ａｂｒａｍｓｏｎ及びＭｙｅｒｓ  の論文（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：４１−４７（１９９３））に発表された。
本発明の好ましい実施態様は、前述の米国特許第５，２１０，０１５  号に開示された方法、及びＨｏｌｌａｎｄ  らの論文（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８８：７２７６−７２８０（１９９１））の方法の改善をもたらす。この方法は、耐熱性のＤＮＡ  ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を使用し、ハイブリッド二重らせんからアニールされた標識オリゴヌクレオチドプローブを切断し、かつ検出用の標識断片を放出する。
【００４２】
本発明の標識されたプローブのＤＮＡ  ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断は、この反応混合物へ標識物質を遊離する。ＤＮＡ  結合化合物による溶液内シグナルの消光は、該発蛍光団が完全な長さの非切断オリゴヌクレオチドプローブに結合した場合のほうが、短く切断された断片に結合した場合よりも、顕著に大きい。観察された蛍光の結果的増加は、プローブの切断を示し、標的配列の存在及びプローブ／標的ハイブリッド形成の発生の両方を必然的に示す。
【００４３】
一般に、該試料中の核酸は、ＤＮＡ  配列であり、最も一般的にはゲノムＤＮＡ  であろう。しかし本発明は、メッセンジャーＲＮＡ  、リボソームＲＮＡ  、ウィルスのＲＮＡ  、又はクローン化されたＤＮＡ  などの、その他の核酸で実施することもできる。本発明での使用に適した核酸試料は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ  又はＲＮＡ  を含む。当業者は、標識オリゴヌクレオチドプローブの切断にいずれの反応を用いるかによって、いかなる核酸の性質であっても、単に使用される方法にとって妥当かつ周知の改変を行うだけで、核酸が検出できることを理解するであろう。
【００４４】
試料の調製は、その試料の原料、検出されるべき標的、及び該アッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチド−分解反応によって異なるであろう。各アッセイは、そのアッセイ試薬類に適合したバッファー中に標的試料を必要とする。標的が、プローブの切断の検出の以前もしくは同時のいずれかに増幅された場合には、この標的核酸は、該標的を増幅するために使用された酵素類に適合したバッファー中に存在しなければならない。この標的核酸は、組織、体液、糞便、痰、唾液、移植細胞、細菌培養などを含む、様々な生物材料から分離することができる。
【００４５】
各アッセイに適している試料調製法は、当該技術分野において明らかにされていて、例えば前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの論文を参照のこと。標的配列のＰＣＲ  増幅のための簡便かつ迅速な試料調製法は、Ｈｉｇｕｃｈｉ  によって、１９８９年に、ＰＣＲ  技術（Ｅｒｌｉｃｈ  編集、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社、ＮＹ）  、並びにＰＣＲ  プロトコール（Ｉｎｎｉｓらの編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年）の第１８〜２０章に、記載されている。一部当業者は、適当なプロトコールを選択し、かつ経験的に最適化することができる。
【００４６】
溶液中での標識物質の発光は、蛍光分光光度計、例えばＨｉｔａｃｈｉ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒモデル６５０−４０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  社、ノーウォーク、ＣＴ）  、もしくはＰＴＩＬＳ−１００  発光蛍光分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ロンドン、オンタリオ州、カナダ）を用いて測定される。蛍光分光光度計は、使用された特定の機械の性質によって、バンド幅に加え、励起及び発光波長の調節の自由度がある。
【００４７】
一部の通常の当業者には、特定の標識物質からの発光の検出にあわせてセットされる波長及びバンド幅の決定法は周知であろう。一般的手引きは、例えばメルクインデックス（Ｂｕｄａｖａｒｉ  らの編集、Ｍｅｒｃｋ  社（１９８９）、ローウェイ、ＮＪ）  及びＨａｕｇｌａｎｄによる１９９０年のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  社カタログ（ユージーン、ＯＲ）  に見られる。各標識物質が個別の発光スペクトルを有する場合であっても、広い幅の検出波長が、本発明の実施には適している。
【００４８】
プローブ切断の結果生じる発光の変化は、プローブ切断の前後に測定された発光を比較することによって測定されるのが好ましい。代わりに、該ＤＮＡ  結合試薬を該反応混合物中に混合し、かつ該プローブの蛍光を反応が継続している間は、連続的又は断続的にモニタリングすることによって、発光の変化を、プローブ−切断と同時に測定することができる。この場合、さらに発光測定での使用に適していて、この反応容器を開けずに直接発光の測定ができるような反応容器の使用が、好ましい。
【００４９】
しかし、特定のＤＮＡ  結合試薬は、特定のプローブ−切断反応を阻害するので、該反応混合物からこのＤＮＡ  結合試薬を除去することが必要であることがある。この場合、反応前測定は、デュプリケート反応混合物を用いて行うことができる。通常は、この反応混合物は反応前に分割され、かつこの反応条件に晒されない該反応混合物の一部は、反応前発光の測定に使用される。典型的には、反応前発光、及び該反応が完了後の反応後発光の両方を測定することが、最も都合がよい。
【００５０】
前述の該核酸検出法をＰＣＲ  増幅と組み合わせるような好ましい方法において、増幅反応は自動化された工程として実行される。４８又は９６本の反応管まで収容可能なヒートブロックを使用する、熱サイクラーが、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社（  ノーウォーク、ＣＴ）  から現在入手可能である。その結果、９６種までの増幅反応を、同時に行うことができる。
ＰＣＲ  増幅において、すべての試験管からの発光を測定に適した光学システムは、前述のＨｉｇｕｃｈｉ  らの論文（１９９２）、前述のＨｉｇｕｃｈｉ  らの論文（１９９３）、及び欧州特許公報第５１２，３３４  号に記載されている。このような光学システムのひとつは、複数の光ファイバーの線が、光源から反応管へ励起光を伝達し、かつ各管からその発光を測定するために使用される。これらの反応管からの蛍光を読み取る際に、各光ファイバーは同時に迅速に読み取ることができるので、一台の蛍光分光光度計のみが必要となる。複数の反応管の蛍光を同時に測定するための別の光学システムは、ビデオカメラを使用する。当業者にとって、この別の検出装置も、本発明に使用できることは明らかであろう。
【００５１】
別の適当な検出方法は、９６−  ウェルマイクロタイター様式を使用する。この様式型は、臨床検査室における大量の試料のスクリーニング、例えば血液銀行のスクリーニングにおける鎌状赤血球貧血又はＡＩＤＳウイルスのような遺伝子診断において好まれている。本発明は、この種の分析に適し、ＥＬＩＳＡ  型様式又は他の光学密度を基にした方法のような、公知の“ウェル中”アッセイ操作で必要とされる多くの洗浄及び抽出操作の必要性を除去する（Ｋｏｌｂｅｒらの論文（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，１０  ８  ：２５５−２６４（１９８８））  、Ｈｕｓｃｈｔｓｃｈａらの論文（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，２５（  １  ）：１０５−１０８（１９８９））、及び１９７９年のＶｏｌｌｅｒらの論文（免疫吸着剤に結合した酵素アッセイ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，アレキサンドリア、ＶＡ）を参照。
【００５２】
本検出法も、ＥＬＩＳＡ  プレート読み取り装置に類似しているが、蛍光を励起しかつ測定するように設計された装置を用い、直接発光を測定することができる。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  社（ベッドフォード、ＭＡ）  によって製造されたＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  （登録商標）２３００が、このような方法に適している。
本発明の方法は、具体的な検出法、熱サイクラー又はシグナル測定機器、もしくは反応容器の数に限定されないことは、当業者には明らかである。
【００５３】
本発明の方法は、複数の標的配列を同時に検出するために使用することができる。各標的に対し特異的なプローブ類が、該反応混合物中に存在する。該試料中に存在する各標的核酸に対応しているプローブは、ハイブリッド形成され、かつ切断される。これらの切断されたプローブを検出するために、各種のプローブを、検出可能な個別の波長で発光する標識物質で標識される。その後、各種のプローブは、測定波長を適当に選択することで、個別に検出される。
【００５４】
従って、本発明の方法は、１個の試料中の複数の標的を検出する、ＰＣＲ  同時増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法における増幅生成物の検出に有用である。本発明は、同一の試料中の２種の異なる核酸標的の定量的比較に、特に有用である。核酸を定量する方法は、米国特許第５，２１９，７２７  号に開示されている。この開示された定量法は、それぞれ、標的の相対量、又は増幅前に存在する標的の量の正確な定量のいずれかを決定するために、内部基準を使用する、ＰＣＲ  を基にした方法である。
【００５５】
短い又は長い標識オリゴヌクレオチドの特徴的な消光も、同じく合成されたオリゴヌクレオチドへのヌクレオチドの取り込みを測定するために使用される。例えば、ＤＮＡ  ポリメラーゼ活性アッセイは、ヌクレオチドの取り込み速度を測定する。ヌクレオチドの取り込みを測定するために、反応混合物は、適当なバッファー中に、ＤＮＡ  ポリメラーゼのようなオリゴヌクレオチドの合成に必要な他の試薬の他に、標識されたｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）類を含むようにする。合成前のこの反応混合物の蛍光は、ＤＮＡ  結合化合物の存在下でタイトレーションされる。
【００５６】
合成前に、すべての標識物質は、単ヌクレオチドと結合し、かつ消光は最少である。合成後には、この反応混合物の蛍光は、ＤＮＡ  結合化合物の存在下で測定される。オリゴヌクレオチドの合成は、標識ヌクレオチドの数の減少をもたらす。より長い、新たに合成されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ  結合化合物によってより効果的に消光されるので、オリゴヌクレオチドへのｄＮＴＰの取り込みは、蛍光の減少をもたらす。
【００５７】
本発明の実施態様を、詳細に説明することのみを目的として下記に示すが、これは、本発明の範囲を限定するものではない。これらの実施例の後に記された発明の範囲内の本発明の多くの実施態様は、通常の当業者にとっては、前述の本文及び下記の実施例を読むことで明らかになるであろう。
実施例１
ＰＥＩ  による長さに依存した消光
本実施例は、溶液中の標識オリゴヌクレオチドの長さに左右される消光について記している。長さ３３及び長さ２のオリゴヌクレオチドを、様々な蛍光標識物質の中の１種で標識し、かつ各オリゴヌクレオチドの蛍光を、ＰＥＩ  含有溶液中で測定した。この測定は、長さ３３及び２のオリゴヌクレオチド間のシグナルの差を最大にするような至適ＰＥＩ  濃度を決定するために、様々な濃度のＰＥＩ  を含有する溶液を用いて繰り返した。
【００５８】
プローブは、ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ  合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＤ  社、フォスター市、Ｃ  Ａ）で、１μＭ  のスケールで合成した。蛍光標識物質アミダイトを、オリゴヌクレオチド合成時に使用し、５’−  標識オリゴヌクレオチドを直接調製した。長さ３３のプローブは、３’末端にＰＯ４  基で合成し、実施例２に記載された方法において使用した。各長さ３３の標識プローブの核酸配列は、ＳＫ５３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）５’−ＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴであった。長さ２のプローブの核酸配列は、５’−ＡＧ  であり、これは前述の長さ３３のプローブの分解生成物に相当した。
【００５９】
使用した蛍光標識物質は、それらの各標識物質の励起及び発光波長とともに下記に示した。下記に述べるような、各標識物質の検出に使用したフィルターのスリット幅も記載した。
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下記に列記した各プローブ類用の、複製アッセイ溶液は、バッファー５０μＬ  （５０ｍＭ  ビシン、１００  ｍＭ  ＫＯＡｃ（ｐＨ８．３）、３．６ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２）中に、プローブ１μＭ  を含有し、これをマイクロタイタープレートのウェルに加えた。ＰＥＩ  （分子量１２００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ウェーリントン、ＰＡ）より入手）  を、濃度０．０１６  ％、０．００８  ％、０．００４  ％、０．００２  ％、及び０．００１  ％含有する一連の溶液を調製した。水５０μＬ  を、１個のウェルに加え、最大シグナル対照とした。ＰＥＩ  溶液５０μｌ  を、残りのウェルに加えた。前記表に示した、励起及び発光波長を用い、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ２３００微量滴定プレート読み取り装置で、蛍光測定を行った。
【００６０】
本発明の方法は、短い及び長い標識オリゴヌクレオチドの消光の差に依存する。“ウインドウ”と称される、消光のこの差の測定は、下記の個々の蛍光測定値から算出した。まず、バッファー単独によってもたらされる消光のバックグラウンドレベルを測定し、各プローブの蛍光測定値から引き算した。次に、残りの蛍光を、ＰＥＩ  非存在下の同一プローブの蛍光に対するＰＥＩ  の存在下でのプローブの蛍光の比として算出し、未消光の蛍光のパーセンテージとして表した。最後に、このウインドウを長さ２の標識オリゴヌクレオチドの残留蛍光及び長さ３３のオリゴヌクレオチドの残留蛍光の間の差として算出した。このウインドウは、長さ３３の標識プローブの、長さ２の標識プローブへの分解の結果生じたシグナルの変化の測定値である。最大ウインドウを引き起こすＰＥＩ  濃度は、本発明の検出方法で最大の感度をもたらした。
【００６１】
この結果を、図１に示しているが、これは様々なプローブ標識物質を用いて得られたウインドウを、ＰＥＩ  濃度に対し作図したものである。標識オリゴヌクレオチドを表わす線分の意味は、下記に示す：
ｈｅｘｘ２：  ＨＥＸ−  標識オリゴヌクレオチドで、標識物質は、スペーサーを介し、該オリゴヌクレオチドの５’−  末端に結合している。
ｆａｍ２：  ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチド。
ｈｅｘ２：  ＨＥＸ−標識プローブで、標識物質は、該オリゴヌクレオチドの  ５’  末端に直接結合している。
ｊｏｅ：  ＪＯＥ−  標識オリゴヌクレオチド。
ｒｏｘ：  ＲＯＸ−  標識オリゴヌクレオチド。
ｔａｍ：  ＴＡＭＲＡ−  標識オリゴヌクレオチド。
【００６２】
図１に示されたように、いくつかのＰＥＩ  濃度では各標識物質で、顕著なウインドウが認められた。得られたウインドウの大きさは、標識物質及びＰＥＩ  濃度の両方に依存した。スペーサーを介したオリゴヌクレオチドへのＨＥＸ  標識物質の結合は、試験された範囲のＰＥＩ  濃度で得られたウインドウの大きさを減少した。
実施例２
ＰＥＩ  分子量の効果
本実施例において、蛍光標識されたプローブの消光に対するＰＥＩ  分子量及び濃度の影響を記載する。実質的に実施例１に記載された実験を、ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチドを用い、様々な大きさかつ実施例１よりも高濃度のＰＥＩ  を用いて行った。
【００６３】
分子量６００  、１２００、１８００、及び１０，０００キロダルトンのＰＥＩ  は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ウェーリントン、ＰＡ）  から入手した。発光測定は、５０ｍＭ  ビシン、１１５ｍＭ  ＫＯＡｃ、酢酸カリウム（ｐＨ８．３）  、及び８％グリセロールから成るバッファーを含有するアッセイ溶液中で行った。各大きさのＰＥＩ  のために、ＰＥＩ  を、前記アッセイ溶液中に、濃度０．００００１３％〜  ０．０２  ％（ｗ／ｖ）  で混合した。各ＰＥＩ  の大きさ及び濃度について、ウインドウを実施例１のように計算した。
【００６４】
この結果を図２に示した。異なるＰＥＩ  の大きさを用い、ウインドウの大きさにはわずかな差が認められたが、本発明の方法において各ＰＥＩ  の大きさが作用するとみなされた。各ＰＥＩ  の大きさに関し、至適ＰＥＩ  濃度は、最大ウインドウをもたらすようなＰＥＩ  濃度として、図２から決定することができる。前述の実験は、当業者が各検出アッセイを行う際の、ＰＥＩ  の大きさ及び濃度の通常の最適化を例証している。
【００６５】
実施例３
ＰＣＲ  増幅による定量
本実施例は、本発明の方法を用いる核酸の定量を記載する。本実施例において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）  ＲＮＡ  から成る標的を、蛍光標識したプローブ存在下で、逆転写反応−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。該ＤＮＡ  ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、増幅プライマーの下流の標的配列とハイブリッド形成された、標識プローブを切断し、これにより該プローブの小さい標識オリゴヌクレオチド断片を、該反応混合物中に放出した。
【００６６】
増幅後に、ＰＥＩ  を該反応混合物に添加し、かつ標識プローブの蛍光を測定した。短い標識オリゴヌクレオチド分解生成物の産生は、この分解生成物がＰＥＩ  によって、完全な長さの非分解プローブが消光される程度には消光されないので、測定された蛍光の増加をもたらした。プローブの分解は、標的の増幅と共に生じるので、この蛍光の増加は該標的配列の増幅を示している。
【００６７】
最初の標的配列のコピー数の定量的概算は、標的配列の増幅の結果得られる蛍光の増加を、第二の核酸配列の増幅の結果得られる蛍光の増加と比較することによって得られた。第二の核酸配列を、既知のコピー数で反応に加え、これにより未知の試料の増幅と比較される、内部定量基準（ＩＱＳ）  が得られた。第二核酸配列の検出は、固有の波長で発光する第二の蛍光標識物質を用いて行った。
【００６８】
増幅
２種の標的ＲＮＡ  配列を各反応中で増幅した。両方の標的核酸配列を、単プライマー対、ＫＹ７８及びＫＹ８０を用い、同時に増幅した。本実施例において、該標的ＲＮＡ  配列は転写プラスミドから生じた。ＨＣＶ  配列を含む転写プラスミドの構造及び使用、増幅プライマー、並びにＲＴ−ＰＣＲ増幅は、欧州特許公報第５２９，４９３  号、及びＹｏｕｎｇ  らの論文（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，    ３１（４）：８８２−８８６（１９９３））  に記載されている。第一の標的配列は、ＨＣＶ  の５’−  非  −コード領域の中の領域から成る。
【００６９】
ＩＱＳ  として使用される第二の標的核酸配列は、別のプローブ結合サイトを含む核酸配列をフランキングする、同じ２種のプライマー結合サイトを含有する。その結果、両方の標的配列は、同じプライマー対を用いて増幅されたが、これらの２種の標的配列は、異なる配列に特異的なプローブを用い、それぞれ独立に検出することができた。ＩＱＳ  の構造及び使用は、Ｍｕｌｄｅｒらの論文（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，３４（  ２  ）：２９２−３００  （１９９４））  に記載されている。
【００７０】
増幅は、ＨＣＶ  標的配列に特異的なＦＡＭ−標識プローブ及びＩＱＳ  に特異的なＨＥＸ−標識プローブの両方の存在する中で行った。ＦＡＭ  及びＨＥＸ  の最大発光は、異なる波長であり、これは、適した測定周波数を選択することによって、これらのプローブを別々に検出することができる。これらのプローブの核酸配列は、５’から３’への配向を示した。これらのプローブは、前述のように、５’末端に標識物質を合成した。
【００７１】
各プローブは、３’−ＯＨ  の代わりに３’−ＰＯ４を有するように合成し、増幅反応時のＴａｑ  ポリメラーゼによるあらゆる伸長を防止した。ＨＣＶ  標的配列の検出のためのＦＡＭ−標識プローブの配列は、ＫＹ８８として、前述のＹｏｕｎｇ  らの論文（１９９３）に記載されている。ＩＱＳ  検出のためのＨＥＸ−標識プローブは、前述の実施例１において、提供された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）。
【００７２】
増幅は下記の試薬を含む１００  μｌ  反応物中で行った：
ＨＣＶ  標的配列（下記に記されたコピー数）
ＩＱＳ  （１０００コピー）
５０ｍＭ  ビシン
１００ｍＭ  ＫＯＡｃ，  ｐＨ８．３
３．６ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２
０．４  μＭ  の各プライマー
１μＭ  の各プローブ
０．２ｍＭ  の各ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
２０単位のｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ＊
２単位のアムペラーゼ  ウラシル−Ｎ−  グリコソラーゼ＊
８％グリセロール
＊  は、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  社によって開発製造され、かつＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社（ノーウォーク、ＣＴ）によって販売されている。
【００７３】
増幅は、ＨＣＶ  標的の０から１０７  のコピーを用いて行った。ＰＣＲ  熱サイクル条件に晒した該反応混合物の他に、測定対照として使用するために、２種の追加の反応混合物を生成し、かつ保存した（熱サイクルなし）。反応混合物は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９６００  熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ノーウォーク、ＣＴ）中で、下記の増幅方式を行った：
５０℃で２分間
６０℃で３０分間
９５℃で１分間
２サイクル：
９５℃で１５秒間
６０℃で２０秒間
４６サイクル：
９０℃で１５秒間
６０℃で２０秒間
７２℃で短くとも５分〜１０分、最長１時間。
【００７４】
増幅後は、反応物を、分析時まで４℃で保存した。
解析法
ＥＤＴＡ  ０．８ｍＭを含む０．００４  ％ＰＥＩ  （分子量１２００）５０μｌ  を、増幅後に各反応混合物５０μｌ  、及び同じく増幅条件に晒さなかった２個の対照反応混合物の一方に添加した。蛍光は、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  （登録商標）２３００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ロケーション）微量滴定プレート読み取り装置を用いて測定した。ＦＡＭ−標識プローブの蛍光は、室温で、４８５ｎｍ  励起フィルター（通過バンド幅２０ｎｍ）及び５３０ｎｍ  発光フィルター  （通過バンド幅２５ｎｍ）を用い測定した。ＨＥＸ−標識プローブの蛍光は、室温で、５３０ｎｍ  励起フィルター（通過バンド幅２５ｎｍ）及び５９０ｎｍ  発光フィルター（通過バンド幅３５ｎ  ｍ  ）を用い測定した。
【００７５】
各プローブ標識物質の測定された蛍光は、プローブを含まない非サイクル反応混合物の蛍光を引き算することによって補正し、これらはいずれも該標識物質に適した波長で測定した。この結果は、図３に示しているが、ＨＣＶ  標的コピー数の対数に対する、蛍光比（ＨＣＶ／ＩＱＳ）  の対数として作図した。“標準曲線”は、データの最少二乗法で直線を概挿して作成した。
【００７６】
前述の実験から作成された標準曲線で、未知のＨＣＶ  試料を定量することができる。未知のＨＣＶ  試料を定量するために、前述のようにＨＣＶ  核酸を、既知量のＩＱＳ  で増幅する。蛍光の測定された変化の比の対数を、計算し、かつ対応するＨＣＶ  コピー数を、前述の標準曲線の式から決定する。
【００７７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：線形
分子の型：ＤＮＡ  （ゲノム）
配列番号：１
ＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧ  ＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧ  ＧＡＣＴＧＡＧＴＣＣ  ＡＡＴ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１に記載された、標識オリゴヌクレオチドの長さ、発光標識物質、及びＤＮＡ  結合化合物の濃度への消光の依存性を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２に記載された、使用されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）  の分子量及び濃度に対する消光の依存性を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３に記載された、内部定量標準存在下での標的核酸配列の増幅による、核酸の定量に関するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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