【手続補正書】
【提出日】平成29年2月7日(2017.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約1,000個のビーズを含むライブラリーであって、前記少なくとも約1,000個のビーズの各ビーズが異なるバーコード配列を含む、ライブラリー。
【請求項２】
前記異なるバーコード配列が、固定化配列及び/又は配列決定プライマーのためのアニーリング配列を含むポリヌクレオチド中に含まれる、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記異なるバーコード配列が少なくとも約5ヌクレオチド長または少なくとも約10ヌクレオチド長である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記異なるバーコード配列が無作為ポリヌクレオチド配列である、または前記異なるバーコード配列が組合せによって生成される、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記1,000個のビーズの各々が、複数コピーの前記異なるバーコード配列を含む、または前記1,000個のビーズの各々が、少なくとも約100,000コピーの前記異なるバーコード配列を含む、または前記1,000個のビーズの各々が、少なくとも約1,000,000コピーの前記異なるバーコード配列を含む、または前記1,000個のビーズの各々が、少なくとも約10,000,000コピーの前記異なるバーコード配列を含む、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項６】
同じバーコード配列を含む2個以上のビーズを更に含む、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記1,000個のビーズの少なくとも2個のビーズが同じバーコード配列を含む、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記少なくとも約1,000個のビーズが少なくとも約10,000個のビーズを含む、または前記少なくとも約1,000個のビーズが少なくとも約100,000個のビーズを含む、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項９】
少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約10,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または  少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含む、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記少なくとも約1,000個のビーズが複数のパーティションにわたって分配される、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記パーティションが乳濁液の液滴である、請求項10に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記1,000個のビーズの各ビーズが異なるパーティション中に含まれる、または前記1,000個のビーズの2個以上のビーズが異なるパーティション中に含まれる、請求項1又は5に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記異なるパーティションが乳濁液の液滴である、請求項12に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記1,000個のビーズがヒドロゲルビーズである、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項１５】
バーコード配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを合成する方法であって、
a.バーコード配列を含む複数のポリヌクレオチドを合成する工程;
b.前記ポリヌクレオチドを複数のパーティションに分離することによって、区分化されたポリヌクレオチドを生成する工程;
c.前記区分化されたポリヌクレオチドを増幅することによって、増幅されたポリヌクレオチドを生成する工程;及び
d.増幅されたポリヌクレオチドを含むパーティションを単離する工程
を含む方法。
【請求項１６】
前記合成工程が、アデニン、チミン、グアニン、及びシトシンの混合物をカップリング反応中に含有させる工程を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離工程が、限界希釈を実施することによって、希釈されたポリヌクレオチドを生成する工程を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離工程が、前記希釈されたポリヌクレオチドを区分化する工程を更に含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記パーティションの各々が、平均で、バーコード配列を含む約1個のポリヌクレオチドを含む、または平均で、バーコード配列を含む約0.5個のポリヌクレオチドを含む、または平均で、バーコード配列を含む約0.1個のポリヌクレオチドを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅工程が、
a.      ポリメラーゼ連鎖反応、非対称性ポリメラーゼ連鎖反応、エマルジョンPCR(ePCR)、ビーズの使用を含むePCR、ヒドロゲルの使用を含むePCR、複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅サイクル(MALBAC)、単一プライマー等温増幅、並びにその組合せからなる群から選択される方法により；または
b.      任意選択で、前記増幅されたポリヌクレオチドをRNase Hに曝露する工程を更に含む、RNAプライマーを用いて
実施される、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離工程がフロー支援選別により実施される、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチド、前記区分化されたポリヌクレオチド、及び前記増幅されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドがビーズに結合している、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅されたポリヌクレオチドを部分相補配列とアニーリングさせる工程を更に含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
前記部分相補配列がバーコード配列を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも1つを標的配列に結合させる工程を更に含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的配列が断片化される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的配列が機械的剪断及び酵素による処理からなる群から選択される方法によって断片化される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記機械的剪断が超音波により誘導される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵素が制限酵素、フラグメンターゼ、及びトランスポザーゼからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合工程が、ライゲーション及び増幅からなる群から選択される方法により実施される、請求項25に記載の方法。
【請求項３１】
前記パーティションが液滴、カプセル、及びウェルからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項３２】
前記ライブラリーが少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約500,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列を含む、または前記ライブラリーが少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項３３】
前記パーティションが、バーコード配列を含む複数コピーの同じポリヌクレオチドを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項３４】
バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチドが、固定化配列、配列決定プライマーのためのアニーリング配列、及び標的ポリヌクレオチドとのライゲーションに適合する配列からなる群から選択される配列を更に含む、請求項15に記載の方法。
【請求項３５】
種の区分化における、オリゴヌクレオチドの区分化における、パーティションからの種の刺激選択的放出における、パーティション中での反応(例えば、ライゲーション及び増幅反応)の実施における、核酸合成反応の実施における、核酸のバーコード化における、配列決定のためのポリヌクレオチドの調製における、ポリヌクレオチドの配列決定における、突然変異検出における、神経障害診断における、糖尿病診断における、胎児異数性診断における、がん突然変異検出及び法医学における、疾患検出における、医学的診断における、低入力核酸適用における、循環腫瘍細胞(CTC)配列決定における、ポリヌクレオチド位相化における、少数の細胞からのポリヌクレオチドの配列決定における、遺伝子発現の分析における、細胞からのポリヌクレオチドの区分化における、又はその組合せにおける、請求項1から14のいずれか一項に記載のライブラリー又は請求項15から34のいずれか一項に記載の方法の使用。