(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示される塩基配列の５１５〜１８２８の塩基からなるプロモーター活性を示すＤＮＡ配列。
【請求項２】
該プロモーター活性が環境ストレスによって誘発される請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
該環境ストレスが損傷又は創傷、活性酸素種、熱、水分、温度、塩、大気汚染、紫外線、又は重金属によるストレスである請求項２記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
配列番号２で示される塩基配列の５１５〜１８２８の塩基からなるプロモーター活性を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結され得る有用物質をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構造体。
【請求項５】
該プロモーター活性を示すＤＮＡ配列が、ＡＢＡ（アブシジン酸）、メチルジャスモネート、損傷又は創傷、低酸素症、活性酸素症、熱、又は窒素に対するストレスを認識する因子を含む請求項４記載のＤＮＡ構造体。
【請求項６】
１）配列番号２で示される塩基配列の５１５〜１８２８の塩基からなるプロモーター活性を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結され得る有用物質をコードするＤＮＡ配列を挿入した発現ベクターを構築する工程；
２）宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程；及び
３）該発現ベクターを挿入した該形質転換体を選別する工程で起きるストレスによって有用物質の生産が誘発される形質転換体を製造する方法。
【請求項７】
該有用物質が薬理効果を奏する蛋白質又はペプチド、又はストレスに対する耐性を形質転換体に付与する物質である請求項６記載の方法。
【請求項８】
該工程２）の宿主細胞が、植物細胞、動物細胞及び微生物からなる群から選ばれる請求項６記載の方法。
【請求項９】
該形質転換体が、微生物、植物細胞、植物体及びこれらに由来したカルスからなる群から選ばれる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
請求項６記載の方法によって生産された形質転換煙草カルス（受託番号：ＫＣＴＣ ０８７５ＢＰ）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なプロモーター及びぺルオキシダーゼ遺伝子に関する。
【０００２】
植物を含めて大部分の生物は、病原菌、害虫、ビールスなどの生物学的ストレスだけでなく、地球環境悪化によって起こる各種の環境ストレスを受ける。これらのストレスにより、生命の維持に必要な必修要素であるが、反応性の高い酸素は、深刻な生理的障害などを誘発するスーパーオキシドアニオンラジカル（０２−）、過酸化水素（Ｈ２  Ｏ２  ）、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素種（ＲＯＳ）に変わる。従って、生体内では、このような活性酸素を除去するシステムとして、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ：ＥＣ１．１５．１１）、ぺルオキシダーゼ（以下「ＰＯＤ」とする）、カタラーゼ（ＣＡＴ）などの高分子抗酸化酵素及びビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオンなどの抗酸化物などが多く存在する。
【０００３】
ぺルオキシダーゼは、電子供与体の存在下で、過酸化水素を還元する酵素として植物細胞に広く分布するものとして知られている。ぺルオキシダーゼは酵素反応に敏感なために各種臨床試験用試薬として用いられるなど、商業的に重要な酵素としてだけでなく、植物体が各種の外部からのストレスに対応する場合の大切な役割を果たすので、高い関心がもたれている。一般に植物培養細胞は高い酸化的ストレス下で培養されるので、ペルオキシダーゼ活性が極めて高い。そのなかでも、さつまいも培養細胞はいままで報告されたどの植物体の培養細胞よりもぺルオキシダーゼを大量に生産することが報告されている。（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  ９８１−９８４（１９９５）  ）
【０００４】
【従来技術】
今までに西洋芥子大根、麦、小麦、油菜、煙草、菠薐草、稲など約２０種の植物に由来する一部の植物のぺルオキシダーゼ同位酵素をコードする遺伝子が知られていた。さつまいものぺルオキシダーゼ遺伝子については、本発明者によってはじめて分離され、報告された。さつまいも培養細胞から分離された酸性ぺルオキシダーゼｓｗｐａｌ及び中性ぺルオキシダーゼｓｗｐｎｌ遺伝子はさつまいもの培養細胞と植物体の幹で特異的に発現し、ゲノム内に複数で存在する特徴があり、この全体または一部を細胞植物体に形質転換させることによって、ぺルオキシダーゼを安定的に大量生産することができることを報告した。（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，  ２２５，  ３８２−３９１（１９９７）  ）
【０００５】
また、本発明者はさつまいもから酸性ぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１０９１２４  ）及びｓｗｐａ３  ｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１０９１２３  ）を分離し、その塩基配列を明らかにした。これらの塩基配列によると、ｓｗｐａ２は７１個のシグナルペプチドを含み、そしてｓｗｐａ３は、６６個のシグナルペプチドを含み、ｓｗｐａ２及びｓｗｐａ３は各々３５８個及び３４９個のアミノ酸をコードする１２４６ｂｐ及び１３１０ｂｐの大きさの塩基配列をもつ。ｓｗｐａ２及びｓｗｐａ３によって発現される成熟蛋白質の等電点は各々４．１及び４．３であり、このことは上記の遺伝子の全てが酸性ぺルオキシダーゼをコードすることを示す。この３’−末端非飜訳領域には、典型的なポリアデニル化シグナルのＡＡＵＡＡＡ及びポリ（Ａ）テールが存在し、特に、ｓｗｐａ２遺伝子のＮ−末端配列は、さつまいも培養細胞の主成分同位酵素（Ａ−２）と完全に一致した。また、本発明者はｓｗｐａ２遺伝子は、さつまいも植物体の葉に傷を負わせるかまたは低温処理またはオゾン処理を施した場合には強く発現が誘発されたこと、一方ではｓｗｐａ３遺伝子は植物体の葉に傷を負わせた場合には弱く発現されたが、低温処理またはオゾン処理を施した場合には強く発現が誘発されたことを明らかにした。（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２６１，  ９４１−９４７，  １９９９）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はさつまいも由来のぺルオキシダーゼのゲノムＤＮＡ及びその塩基配列を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は多様な環境ストレスによって遺伝子の発現が強く誘発されるプロモータを提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は多様な環境ストレスに対して耐性を有する形質転換体及びその製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は有用成分を大量に生産することができる形質転換体及びその製造方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本明細書に記載された用語、技術などは、特別な限定がない限り、本発明が属する技術分野で一般的に使用されている意味で使用する。また、本明細書に記載されている文献はすべて本発明を説明するためのものとして記載する。
【００１１】
本発明で用いる用語「塩基配列の変異体」は、生物学的活性を維持しながらｓｗｐａ２、ＳＷＰＡ２、またはＳＷＰＡ２プロモーターの塩基配列で一つ以上の塩基が置換、欠失または付加されて変更された塩基配列を意味する。
【００１２】
用語「塩基配列の変異体」はｓｗｐａ２によってコードされるぺルオキシダーゼ活性を有し、ｓｗｐａ２によってコードされるアミノ酸配列の中で一つ以上のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００１３】
用語「ＳＷＰＡ２プロモーター」は配列番号１の１〜１３１４の塩基配列を含み、作動可能に連結された遺伝子に適切な条件下で転写活性を付与する塩基配列を意味する。
【００１４】
用語「ＳＷＰＡ２プロモーターの活性断片」は、配列番号１の１〜１８２８番の位置の又はその一部を含み、作動可能に連結された遺伝子にＳＷＰＡ２プロモーター活性を付与する塩基配列を意味する。
【００１５】
用語「形質転換体」は、ＳＷＰＡ２プロモーターと、これと作動可能に連結され、有用物質をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構造体によって形質転換された細胞または植物体を意味する。本発明において形質転換体としては、形質転換された微生物、動物細胞、植物細胞、形質転換された動物または植物体及びこれらに由来した培養細胞などを含む。
【００１６】
用語「環境ストレス」は、対象生物にストレスとして作用する生物的または微生物的ストレスを意味し、例えば損傷又は創傷（怪我）、活性酸素種、熱、水分、温度、塩、大気汚染、紫外線、重金属などによるストレスを意味する。
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明はさつまいも由来のペルオキシダーゼ遺伝子をコードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ2及びその塩基配列を提供する。
【００１８】
本発明のＳＷＰＡ２は、配列番号１で示される塩基配列全体またはその一部からなる、さつまいもぺルオキシダーゼｓｗｐａ２をコードするエキソンを含むＤＮＡ配列である。
【００１９】
上記ＳＷＰＡ２は、さつまいもゲノムＤＮＡライブラリから３次スクリーニングによってｓｗｐａ２と読み取り枠（ＯＲＦ）が同一なゲノムクローンとして選別され、これを天然ＳＷＰＡ２と名付けた。  （図２参照）
【００２０】
天然ＳＷＰＡは３個のエキソンと２個のイントロン及びプロモータ領域からなり、上記エキソンの塩基配列はｓｗｐａ２  ｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１０９１２４）の塩基配列と完全に一致した。さつまいもぺルオキシダーゼゲノムクローンは２個のイントロンの中で特に一番目のイントロンが７３７ｂｐであり、ほかの植物種が１００〜３００であると比べて極めて長いイントロンを含んでおり、各々のイントロンは５’側がＧＴで始まり３’側がＡＧで終るＧＴ−ＡＧの法則にしたがっている。
【００２１】
また、本発明は多様な環境ストレスによって遺伝子の発現が誘発されるプロモーターを提供する。
【００２２】
本発明において特に限定しない限りＳＷＰＡ２プロモータはＳＷＰＡ２プロモーター及びその活性断片を含む意味で用いられる。
【００２３】
本発明において、ＳＷＰＡ２プロモーターは配列番号２で示される塩基配列全体またはその一部からなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列からなる。例えば、本発明では、ＳＷＰＡ２プロモーターは望ましくは配列番号２の塩基配列の中で１〜１３１４の塩基配列またはその一部からなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列からなる。
【００２４】
本発明によるプロモーターは、環境ストレスによって強く発現し、さつまいも由来のぺルオキシダーゼゲノム遺伝子の天然ＳＷＰＡ２に由来する。
【００２５】
天然ＳＷＰＡ２は、翻訳開始点の上流にプロモーター領域を有しているが、これをＳＷＰＡ２プロモーターと名付けた。ＳＷＰＡ２プロモーター領域はコンピューターバイオロジカル  エンド  インホーマティックス  ラボラトリー（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ）のトランスクリプション  エレメント  サーチ  ソフトウエアー（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて塩基配列上の特性を分析した結果、上記の配列番号２で示された塩基配列からなっており、転写開始のためのＴＡＴＡボックスと−８９５部位にＣＡＡＴボックスを有する。（図３参照）
【００２６】
転写調節蛋白質の付着部位として、ＡＢＡ（ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ：  アブシジン酸）、メチルジャスモネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ）、紫外線、損傷又は創傷、低酸素症などによって調節されることが知られてる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）Ｇボックスは、ＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと記載されたアミノ酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモーター領域の−４４５及び−４５５部位にこれと類似な領域（モティーフ）が存在する（図３参照）天然ＳＷＰＡ２プロモーター領域内のＧボックスと転写開始点との間には、組織特異的に発現されストレスによって発現が誘発される転写因子であることが明らかにされた（Ｇｉｄｏｎｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）ＳＰ−１が存在していて、それ以外にもＡＡＡＡＴＡＡの反復配列が６個存在する。
【００２７】
また、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域は、配列番号２の塩基配列内−１１７０と−１１８８との間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する熱衝撃に反応する転写因子のＨＳＥ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を有している。（図３参照）  ＧＣＮ−４及びＡＰ−１は活性酸素種などに反応するものと知られ、特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホルデニンプロモーターで窒素に反応する重要要素として知られている。（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ  ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  ）さらに、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域にはＧＮ−４が３部位にそしてＡＰ−１が２部位に存在する。特に、−１１７５０と−１１６３との間にはＧＣＮ−４及びＡＰ−１が逆方向反復塩基配列で存在する。（図３参照）
【００２８】
本発明のＳＷＰＡ２プロモーターは酸化的ストレスを含む多様な外部的要因によって発現が強く誘発され、特に培養細胞において強く発現されるので、環境ストレス抵抗性植物体の開発に及び形質転換植物細胞を用いる有用物質の生産に有用に利用することができる。
【００２９】
本発明のＳＷＰＡ２プロモーターはストレスによって遺伝子の発現を効果的に誘発することができる。このために、本発明のプロモーターはＡＢＡ、メチルジャスモネート、損傷又は創傷、低酸素症、活性酸素症、熱又は窒素によるストレスを認識する因子を含む。ＳＷＰＡ２プロモーターは、このような特性を用いて配列番号２で示される塩基配列中の１〜１８２８又はこの一部からなり、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結された構造遺伝子からなる融合遺伝子構造体の製造に利用することができる。上記融合遺伝子構造体は、ＳＷＰＡ２プロモーター遺伝子に有用物質の生産に係る構造遺伝子を連結し、多様な環境ストレス下でＳＷＰＡ２プロモーターの調節によって有用物質を発現するので有用物質を生産するための形質転換体の製造に有用に利用することができる。また、上記融合遺伝子構造体に多様な環境ストレスに対して耐性を示す遺伝子を構造遺伝子として使用することにより、外部的なストレスが加わった場合に、これに対して耐性を有する形質転換体の製造にも利用することができる。
【００３０】
本発明のプロモータは、植物体だけでなく、微生物でも作用可能であり、従って形質転換植物細胞、形質転換植物体及びこれらかに由来した形質転換カルス、形質転換微生物、形質転換動物細胞を生産することに利用できる。
【００３１】
さらに、本発明は上記ＳＷＰＡ２プロモーターを用いて多様な環境ストレスによって有用物質の生産を誘発することができる形質転換体の製造方法を提供する。
【００３２】
上記形質転換体の製造方法は、
１）配列番号２で示される塩基配列の１〜１８２８の塩基又はこの一部からなるプロモーター活性を示すＤＮＡ配列及びこれと作動可能に連結され得る有用物質をコードするＤＮＡ配列を挿入した発現ベクターを構築する工程；
２）宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程；及び
３）該発現ベクターを挿入した該形質転換体を選別する工程からなる。
【００３３】
本発明の方法において有用物質としては薬理効果を奏する多様な蛋白質またはペプチド、形質転換体にストレスに対する耐性を付与する物質などを含む。従って、本発明の方法によって有用物質を生産することができる形質転換体及び多様な環境ストレスに耐性を有する形質転換体を作ることができる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
〈実施例１〉ぺルオキシダーゼゲノムＤＮＡの分離
ぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２のゲノム遺伝子を探すために、まずｓｗｐａ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１０９１２４  ）がさつまいものゲノム内に存在する遺伝子であることを確認するために、サザンブロット分析を実施した。
【００３６】
さつまいも培養細胞からゲノムＤＮＡをデラポルタ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ，  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，  ５７，  ２６−２９（１９８３）  ）によって抽出したゲノムＤＮＡ１５μｇを制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。上記ゲル上のゲノムＤＮＡをナイロン膜に転写した後、ｓｗｐａ２遺伝子各々の特異的な３’−末端非飜訳領域を３２Ｐで標識した遺伝子断片を探針として用いて混成化反応を行った。その結果を図１に示す。
【００３７】
図１に示したように、ｓｗｐａ２遺伝子は、２個以上のバンドを示し、お互いに違うゲノム内に複数存在する遺伝子であることがわかる。
【００３８】
〈実施例２〉ぺルオキシダーゼゲノムＤＮＡ  ＳＷＰＡ２の分離及び塩基配列の分析
本発明のぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２をゲノム内に含むゲノムＤＮＡを分離するために下記の実験を行った。
【００３９】
さつまいもゲノムＤＮＡライブラリーは、λ  Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＲＴＭ  ＢａｍｈＩ  Ａｒｍｓ  ベクターキット（Ｎｏｖａｇｅｎ  社製）を用いて製造した。ｓｗｐａ２の塩基配列を特異的に認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った。これから合成された０．５ｋｂの大きさのＤＮＡ産物を３２Ｐで標識してさつまいもＰＯＤゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。ライブラリスクリーニングは、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  １９８９  ）によって実施し。３次スクリーニングによってｓｗｐａ２とＯＲＦとが同一なゲノムクローンを得て、これを天然ＳＷＰＡ２と名付けた。
【００４０】
天然ＳＷＰＡ２は、全体長さが約４ｋｂの配列番号１で示される塩基配列をもち、３個のエキソンと２個のイントロンとプロモーター領域で構成されていた。（図２）上記エキソンの塩基配列は、ｓｗｐａ２ｃＤＮＡの塩基配列と完全に一致するゲノムクローンであることを確認した。さつまいもＰＯＤゲノムクローンは２個のイントロン中、特に一番目のイントロンが７３７ｂｐであり、ほかの植物種が１００〜３００ｂｐであることに比べると、極めて長いイントロンを含んでいる。各々のイントロンは５’の側がＧＴで始まり、３’の側がＡＧで終るＧＴ−ＡＧ法則にしたがっている。
【００４１】
〈実施例３〉ペルオキシダーゼゲノムＤＮＡＳＷＰＡ２のプロモーターの分離
天然ＳＷＰＡ２のプロモーターは、翻訳開始点の上流から−１８２８ｂｐまでの領域に該当する配列番号２として記載される塩基配列を構成する。（図３）上記ＳＷＰＡ２のプロモーターの塩基配列上の特性をコンピューターバイオロジカル  エンド  インホーマティックス  ラボラトリーのトランスクリプションエレメント  リサーチ  ソフトウエアー（ＴＥＳＳ）を用いて分析した。
【００４２】
塩基配列分析結果：ＳＷＰＡ２プロモーターは真核生物プロモーターの調節要素部位を有していることが確認されたが、転写開始のためのＴＡＴＡボックスが存在し、−８９５部位にＣＡＡＴボックスが存在した。転写調節蛋白質の付着部位はＡＢＡ、メチル  ジャスモネート、紫外線、損傷又は創傷、低酸素症などによって調節されることが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）。ＧボックスはＮＮＮＳＡＣＧＴＧＮＣＭと記載されたアミノ酸配列を有するが、ＳＷＰＡ２プロモーター領域の−４４５と−４５５部位にこれと類似な領域（モティーフ）が存在する。（図３）ＳＷＰＡ２プロモーター内のＧボックスと転写開始点との間には組織特異的に発現し、ストレスによって発現が誘導される転写因子であることが明らかにされた（Ｇｉｄｏｎｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４  ）ＳＰ−１が存在していて、ほかにもＡＡＡＡＴＡの反復配列が６個存在した。
【００４３】
また、ＳＷＰＡ２プロモーターは−１１７０と−１１８８との間にＡＧＡＡＮの共通配列を有する熱衝撃に反応する転写因子のＨＳＥ（熱ショックエレメント）を有している。（図３）ＧＣＮ−４及びＡＰ−１は活性酸素種などに反応するものとして知られており、特にＡＰ−１は麦Ｃ−ホルデニンプロモータで窒素に反応する重要要素として知られている。（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  ）同時に、天然ＳＷＰＡ２のプロモーター領域には、ＧＣＮ−４が３部位に、ＡＰ−１が２部位に存在する。特に、−１１７５と−１１６３との間にはＧＣＮ−４及びＡＰ−１が逆方向反復塩基配列で存在する。（図３）
【００４４】
上記のように、本発明のＳＡＰ２プロモーターは、ＲＯＳをはじめ多様なストレスを認識する因子を多く含んでいて環境ストレスに対して耐性を有する耐性植物体開発にとても有用に使用できる。
【００４５】
〈実施例４〉ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体の製造
本発明のＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を製造するために、ＳＷＰＡのプロモーター領域をＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ社製）と配列特異的プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。この時、プライマーは配列番号３〜７として示される上流側のプライマーと配列番号８として示される下流側のプライマーを用いて、上記上流側プライマーはすべてＳａｌＩ制限酵素部位を含み、下流側プライマーはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含むように製造した。上記のプライマーのＰＣＲ反応による欠失大きさは、各々３５４、６０２、９６８、１３１４、１８２４ｂｐで増幅された。（図４）
【００４６】
これから得たＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した後、バイナリベクターとしてＧＵＳコード部分とＮＯＳターミネーターを含むｐＢＩ１０１プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）  に上記ＤＮＡ断片をサブクローニングした。これから−１８２４、−１３１４、−９６８、−６０２、−３５４欠失構造を含むＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異プラスミドベクターｐＢＳ１８１４、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ９６８、ｐＢＳ６０２、ｐＢＳ３５４を製造し、これを用いてトランシット  アッセイ（Ｔｒａｎｓｉｔ  ａｓｓａｙ  ）を実施した。
【００４７】
〈実施例５〉煙草原形質体を用いたＳＷＰＡ２プロモーターのトランシットアッセイ
ＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異体を用いたトランシット  アッセイを下記のように行った。まず、煙草懸濁培養細胞ＢＹ−２（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｂｒｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ  ２  ）を用いて継代培養し、３日経過後に細胞を２％セルラーゼＲ−１０と０．５％マセロザイム（ｍｙｃｅｒｏｚｙｍｅ）を含有する酵素液で３時間処理し、原形質体を分離した。これに上記の実施例４で製造した欠失突然変異体プラスミドベクターを加えて、ポリエチレングリコール方法を用いてプラスミドベクターを細胞内に導入させた後、２５℃で暗状態下で１６時間培養した。欠失突然変異体プラスミドベクターを含む原形質体の蛍光をジェファソン他の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｆ．，  ５，  ３８７−４０５，  １９８７  ）で測定することによって、プロモーターの活性をＧＵＳ蛋白質が生産された量として計算した。
【００４８】
トランシット  アッセイの結果、ＳＷＰＡ２プロモータ中に、特に−１３１４の欠失構造が導入された場合ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを用いた場合より、約３０倍以上の高いＧＵＳ活性を示した。（図５）
【００４９】
〈実施例６〉ＳＷＰＡ２プロモーターの酵母での発現
ＳＷＰＡ２プロモーターが酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でも発現されるかどうかを試験するために、酵母／大腸菌シャトルベクターのＹＥｐ３５２（Ｈｉｌ  ｌ  他  １９８６  ）及びＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ  Ｌ３２６２を宿主として用いた。実施例４で製造されたＧＵＳ遺伝子及びターミネーター（ＮＯＳ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）に結合された形態でＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異を含んでいるプラスミドベクターの各々をＹＥｐ３５２ベクターに導入した後、ＰＥＧ及酢酸リチュームを用いた酵母形質転換方法を用いて酵母を形質転換させた。形質転換された酵母をＳＤ  ｂａｓｅ−Ｕｒａ  ＤＯ  （ｄｒｏｐ  ｏｕｔ）  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で培養し、実施例５と同一方法で形質転換された酵母から発生される蛍光を測定してプロモーターの活性を検定した。
【００５０】
その結果、−１３１４の欠失構造、−１６２０の欠失構造及び−１８２４の欠失構造が導入された形質転換酵母ではＣａＭＶ  ３５Ｖプロモーターよりも各々１．６倍、１．４倍及び８．４倍高いＧＵＳ活性を示した。（図６）
【００５１】
〈実施例７〉形質転換植物体及び培養細胞でＳＷＰＡ２プロモーターを用いるＧＵＳ発現
【００５２】
〈７−１〉植物材料及び形質転換植物体の製造
形質転換植物体の材料は、煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ）を用い、上記実施例４で製造されたＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異を含むプラスミドベクターのｐＢＳ１８２４（−１８２４欠失構造）及びｐＢＳ１３１４（−１３１４欠失構造）及びＣａＭＶプロモーターにＧＵＳ遺伝子が結合されたｐＢ１１２１を導入した癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ）ＬＢＡ４４０４を各々上記煙草に感染させた。感染された煙草を２００ｍｇ／Ｌカナマイシン及び３００ｍｌ／Ｌクラホラン（ｃｌａｆｏｒａｎ）を含有したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ．  他、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ，  １５，  ４７３−４９７，  １９６２  ）で培養して形質転換植物体を選別し、ルーティグ（ｒｏｏｔｉｎｇ）及びシューティング（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）過程を経た後、純化させ、小さい花盆へ移して栽培しながら実験材料として用いた。
【００５３】
上記形質転換植物体内にＳＷＰＡ２プロモーターの欠失突然変異が導入されたかどうかを確認するために、配列番号９及び１０で示されるＮＰＴＩＩプライマーと配列番号１１及び１２で示されるプロモータープライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＮＰＴＩＩプライマーを用いた場合には、９５℃で１分、６５℃で１分、７２℃で１分によって３０回、プロモータープライマーを用いる場合には、９５℃で１分、６２℃で１分、７２℃で１分によって３０回行った。この結果、形質転換植物体ではＮＰＴＩＩプライマーによる０．７ｋｂのＤＮＡ切片とプロモータープライマーによる１．０ｋｂのＤＮＡ切片が検出され、これによって上記形質転換植物体内に外来遺伝子が挿入されたことを確認した。
【００５４】
本発明で選別された、ｐＢＳ１３１４（−１３１４欠失構造）で形質転換カルスを生命工学研究所附設遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ）に２０００年１０月１６日付けで寄託した。  （受託番号：  ＫＣＴＣ  ０８７５ＢＰ）
【００５５】
〈７−２〉形質転換培養細胞の製造
形質転換培養細胞を製造するために、実施例〈７−１〉で遺伝子導入が確認された形質転換煙草植物体の葉をＭＳ基本培地に０．１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、２ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、３０ｇ／Ｌスクロースを含むカルス誘導培地で培養してカルスを誘導し、これから誘導された形質転換煙草細胞主から懸濁培養を確立した。
【００５６】
〈７−３〉ストレスによる形質転換植物体でのＧＵＳ発現の測定
外部的環境ストレスによる形質転換植物体内でＳＷＰＡ２プロモータの発現様相を検査するために、上記形質転換植物体に損傷を負わせ、又はＨ２  Ｏ２  で処理してこれらから誘導されるＧＵＳ活性を測定した。
【００５７】
まず、損傷によるＳＷＰＡ２プロモーターの発現様相を探るために形質転換植物体に損傷を負わせてＧＵＳ活性を測定した。その結果、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター遺伝子を含むｐＢＩ１２１ベクターが導入された形質転換植物体では、損傷によるＧＵＳ発現量の変化は現れなかったが、一方ｐＢＳ１８２４ベクター及びｐＢＳ１３１４ベクターが各々導入された形質転換植物体では、損傷処理３日経過後にＧＵＳの発現量が増加した。（図７）ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植物体の場合には、損傷処理によりＤＵＳの発現量が無処理群よりも約３．６倍増加した。ｐＢＳ１８２４が導入された形質転換植物の場合には、損傷処理によるＧＵＳ発現量の増加はｐＢＳ１３１４よりも低かったが、損傷によりＧＵＳの発現が誘発されたものはｐＢＳ１３１４と類似な傾向を示した。
【００５８】
また、本発明者はＨ２Ｏ２によるＳＷＰＡ２プロモーターの発現様相を確認するために、成熟した葉から直径７ｍｍの葉切れ（ｌｅａｆ  ｄｉｓｋ）を取って１ｍＭＨ２Ｏ２溶液に浮かべて連続光の状態下で培養した。培養後ＧＵＳ活性を測定してＨ２Ｏ２によるＳＷＰＡ２プロモーターの発現様相を検査した。その結果、培養４８時間経過後ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植物体の場合には、非処理群に比べて約５８倍ＧＵＳの発現量が増加し、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターより約１．７倍高いＧＵＳ活性が測定された。〈図８〉ｐＢＳ１８２４が導入された形質転換植物体の場合には、Ｈ２Ｏ２によってＧＵＳの発現量が３．２倍増加し、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターより１．２倍高くＧＵＳの活性が測定された。
【００５９】
さらに、ぺルオキシダーゼゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２のプロモータ欠失突然変異体が導入された煙草の形質転換植物体に紫外線を照射した後、誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果、培養２４時間経過後ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換植物体の場合には、非処理群に比べて約５．６倍ＧＵＳの発現量が増加し、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターより約１．２倍高いＧＵＳ活性が測定された。
【００６０】
〈７−４〉ケルロース及び懸濁培養におけるＧＵＳの発現
本発明のペルオキシダーゼ遺伝子ＳＷＰＡ２プロモーターが培養細胞の生長と関連して、その発現が調節されるかどうか検査するために、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ１８２４、及びｐＢＳＩ１２１を各々導入した形質転換植物体から誘導された形質転換カルスからＧＵＳ活性を測定した。その結果、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換カルスは、ｐｂＩ１２１が導入された形質転換カルスより約４倍高いＧＵＳ活性を示した（図１０ａ及び図１０ｂ）。
【００６１】
また、形質転換カルスから誘導された懸濁細胞でＧＵＳの活性変化を検査した結果、ｐＢＳ１３１４、ｐＢＳ１８２４、及びｐＢＩ１２１を導入した形質転換細胞は、同一の生長を見せ、培養１５日経過後に停滞期に到達した（図１１ａ及び図１１ｂ）
【００６２】
ｐＢＩ１２１が導入された形質転換細胞のＧＵＳ活性は、細胞の生長時期に関係なく比較的低い水準に維持された。ｐＢＳ１８２４が導入された形質転換細胞においても、細胞生長に関係なく一定水準のＧＵＳを発現しているが、ｐＢＩ１２１より高い発現量を維持した。一方、ｐＢＳ１３１４が導入された形質転換細胞においては、細胞培養５日〜７日の間には低い水準でＧＵＳを発現したが７日経過後からＧＵＳ発現量が急激に増加した。培養１５日経過後には、最高の発現量を示し、培養後期まで維持した。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、さつまいもの培養細胞から環境ストレス条件で強く発現する新規なペルオキシダーゼ遺伝子ＳＷＰＡ２及び上記遺伝子のプロモーターを提供する。本発明のペルオキシダーゼゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２プロモーターは、各種環境ストレスを認識する領域を複数部位に含んでおり、形質転換植物体から目的とする遺伝子を発現させるために一般的に多く使われているＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーターに比べて、トランシット  アッセイで約３０高い活性を示すことが明らかにされた。従って、上記のプロモーターの全体又はその一部を使って、細胞、植物体、微生物及びバクテリアなどの形質転換体の開発に利用すれば、環境ストレスに対して耐性を持った耐性植物体の開発と有用な成分を大量生産できる形質転換生物体の開発とに有用に利用できる。
【００６４】
【配列表】
0003571639.tif 000002
0003571639.tif 000003
0003571639.tif 000004
0003571639.tif 000005
0003571639.tif 000006
0003571639.tif 000007
0003571639.tif 000008
0003571639.tif 000009
0003571639.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のさつまいもぺルオキシダーゼ遺伝子ｓｗｐａ２を含むゲノムＤＮＡを分離するために、サザンブロット法で分析した結果を示す図である。
【図２ａ】本発明のさつまいものペルオキシダーゼをコードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを翻訳したアミノ酸配列を示す図である。
【図２ｂ】図２ａに示したぺルオキシダーゼをコードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２の塩基配列及びこれを翻訳したアミノ酸配列に連続する塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図３】さつまいもぺルオキシダーゼをコードするゲノム遺伝子ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の塩基配列を示す図である。
【図４】本発明のぺルオキシダーゼをコードするゲノム遺伝ＳＷＰＡ２のプロモーター領域の欠失突然変異体を作成する過程を示す図である。
【図５】本発明のプロモータ領域の欠失突然変異体を用いるトランシット  アッセイの結果を示す図である。
【図６】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した形質転換酵母でのＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図７ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体での損傷処理なしに誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図７ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体での損傷処理後に誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図８ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体でのＨ２  Ｏ２  処理なしに誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図８ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体でのＨ２  Ｏ２  処理後に誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図９ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体での紫外線照射なしに誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図９ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体での紫外線照射後に誘発されたＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図１０ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスをＧＵＳで染色した結果を示す図である。
Ａ：ｐＢＳ１３１４            Ｂ：ｐＢＳ１８２４
Ｃ：対照群                    Ｄ：ｐＢＩ１２１
【図１０ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体の葉から誘導したカルスのＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
Ａ：ｐＢＳ１３１４            Ｂ：ｐＢＳ１８２４
Ｃ：対照群                    Ｄ：ｐＢＩ１２１
【図１１ａ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを懸濁培養して、その細胞の細胞成長曲線を示す図である。
【図１１ｂ】本発明のプロモーター欠失突然変異体を挿入した煙草の形質転換植物体の葉から誘発したカルスを懸濁培養して、その細胞のＧＵＳ活性を測定した結果を示す図である。
【図１】
0003571639.tif 000011
【図２ａ】
0003571639.tif 000012
【図２ｂ】
0003571639.tif 000013
【図３】
0003571639.tif 000014
【図４】
0003571639.tif 000015
【図５】
0003571639.tif 000016
【図６】
0003571639.tif 000017
【図７ａ】
0003571639.tif 000018
【図７ｂ】
0003571639.tif 000019
【図８ａ】
0003571639.tif 000020
【図８ｂ】
0003571639.tif 000021
【図９ａ】
0003571639.tif 000022
【図９ｂ】
0003571639.tif 000023
【図１０ａ】
0003571639.tif 000024
【図１０ｂ】
0003571639.tif 000025
【図１１ａ】
0003571639.tif 000026
【図１１ｂ】
0003571639.tif 000027