(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子座において同型接合するように真核細胞を改変せしめるための方法であって：
宿主細胞に前記標的遺伝子座に対し相同の領域が隣接するマーカー遺伝子を含んで成る単一の構築体を組込んで、前記構築体が一の標的部位において相同組換されている改変細胞を含んで成る細胞の混合物を作る、ここで前記マーカー遺伝子は非増幅性の遺伝子であり、当該改変細胞に選択培地の中で優先的に増殖する能力を授ける；
前記構築体を含んで成る細胞を、当該細胞を前記選択培地の中で、第一濃度の選択因子において増殖させることにより前記マーカー遺伝子を通じて選別し、そして相同性組換について生存細胞を分析して、１又は複数の標的遺伝子座において相同組換えした実質的に純粋な改変細胞の集団を供する；
前記改変細胞の集団を、前記第一濃度より高い濃度の同一の選択因子に委ね、これにより前記標的遺伝子座において同型接合した細胞が供されるように遺伝子変換を起こさせる；そして
前記同型接合細胞を単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗生物質耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子が前記標的遺伝子座と相同な少なくとも50bpの配列に隣接している、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記相同配列が前記標的遺伝子座配列から突然変異したものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が胎芽幹細胞であり、そして前記方法が前記細胞を非ヒト胚盤胞に注入し、それを非ヒト雌宿主に導入して、キメラ子孫を回収することを更に含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子座において同型接合するように哺乳動物細胞を改変せしめるための方法であって：
哺乳動物宿主細胞に前記標的遺伝子座に対し相同の領域が隣接するマーカー遺伝子を含んで成る単一の構築体を組込んで、前記構築体が一の標的部位において相同組換されている改変細胞を含んで成る細胞の混合物を作る、ここで前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、当該改変細胞に選択培地の中で優先的に増殖する能力を授ける；
前記構築体を含んで成る細胞を、当該細胞を選択培地の中で、第一濃度の抗生物質において増殖させることにより前記マーカー遺伝子を通じて選別し、そして相同性組換について生存細胞を分析して、１又は複数の標的遺伝子座において相同組換えした実質的に純粋な改変細胞の集団を供する；
前記の純粋な改変細胞を繁殖させる；
前記繁殖改変細胞の集団を、前記第一濃度より高い濃度の同一の抗生物質に委ね、これにより前記標的遺伝子座において同型接合した細胞が供されるように遺伝子変換を起こさせる；そして
前記同型接合細胞を単離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項８】
前記抗生物質耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーが前記標的遺伝子座と相同な少なくとも50bpの配列に隣接している、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が胎芽幹細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記標的遺伝子座が表層膜タンパク質の遺伝子座である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
序  論
技術分野
本発明の分野は生存細胞中の遺伝子の標的に向けられている。
背  景
細胞を改変せしめる技術は進歩し続けている。遺伝病の処置にとって最もエキサイティングな分野の一つは遺伝子治療である。比較的長期間生存しており、且つ培地の中で成育して繁殖できうる細胞が単離できうる状況においては、かかる細胞を、疾患宿主又は同種異系宿主のいづれかの宿主から単離する機会がある。次にそれらの細胞は培地の中で成育させ、繁殖させ、そして相同組換により改変させ、そしてその改変細胞は宿主にもどすことができうる。
別の状況においては、宿主に対して外因性である産物を生成させることが望まれている。この状況においては、胎芽幹細胞を改変せしめ、それらを未分化胚芽細胞に加え、それによってキメラ宿主を生成することができる。このキメラ宿主を次に交配させ、そしてその子孫を異型接合突然変異体として使用するか、又は同型接合突然変異体を生成するために更に交配せしめる。胎芽細胞における適当な変化を供することによリ、牛乳等の中に様々なヒトタンパク質を生成せしめることができうる。
他方、宿主の産物、例えば肉、植物油、大きさ等の性質又は特徴を変えることが望まれうる。数多くのケースにおいて、宿主は二倍体であるため、両方の遺伝子に相同組換が必要とされるであろう。このことは、まず一方の遺伝子を改変するうえでかなりの段階数を行い、適切な改変が起きたかを確認し、次いでそのプロセスを反復させるために改変細胞を用い、そして第二遺伝子を改変せねばならない。たとえその改変がノックアウト、即ち、標的遺伝子座に対する妨害配列の導入及び／又は欠失であるにしても、そのプロセスは時間及び労力がかかる。従って、標的遺伝子座での遺伝改変を達せしめる効率における向上を可能とする技術が開発できうることに、かなりの感心がもたれている。
関連文献
ES細胞の改変及び改変細胞の検定のための手順はMortensen,らProc.Natl.Acad.Sci.（USA）88,7036−7040（1991）に見い出せうる。Paludan,ら、Gene85,421−426（1989）は、多重neo遺伝子を含んで成る細胞の高められた耐性を報告している。異型接合培養細胞からの同型接合細胞の自発生産がNelson,らMol.Cell.Biol.9,1284−1288（1989）;Potter,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84,1634−1637（1987）;Rajan,ら、J.Immunol.145,1598−1602（1990）及びCampbell,ら、Mol.Cell.Biol.1,336−346（1981）により報告されている。
発明の概要
遺伝子標的現象による同型遺伝子接合は、DNAを細胞の中に導入することによリ達せられ、ここでそのDNAは標的遺伝子座に対して相同性を有し、且つマーカー遺伝子を含む。相同性組換を受けた細胞を選び、そして高いレベルの選択因子に付する。次いで遺伝子変換を受けた細胞を選び、ここでその突然変異体はここでは改変のための同型接合体となっている。選択遺伝子は通常は薬剤耐性を授けるものであり、そして通常は増幅できない。
特定の態様の説明
標的遺伝子座において同型接合体となっている突然変異細胞は、細胞の中にDNAを導入することによって作られ、ここでそのDNAはその標的遺伝子座に対する相同性を有し、そして組込まれた構築体を含んで成る細胞の選別を可能とするマーカー遺伝子を含んでいる。次にこれらの細胞を相同組換についてスクリーンにかける。この相同組込体を高レベルのマーカー遺伝子に暴露せしめ、増幅以外により、選択因子の多重コピーを有する細胞について選別する。次にそれらの細胞を標的遺伝子座での同型接合について分析する。
標的遺伝子座での相同組換のための様々な構築体を製造できうる。通常、この構築体は標的遺伝子座に相同性な少なくとも50bp、そして500Kbp以下の配列を含むであろう。このマーカー遺伝子は通常、その両側上に相同性配列がフランクしているであろう。
様々なマーカー遺伝子が採用でき、それらは下記の特徴を有する。このマーカー遺伝子は増幅性でなく、即ち、選択因子の濃度が上昇するに従い、その遺伝子がタンデム複製を受けるような自発的な現象は検出されない。その選択因子は極端に毒性であるべきではなく、従って濃度のわずかな変更が細胞の生存性に顕著な影響を及ぼすべきではない。従って、この選択因子に対する高められた耐性を有する細胞についての特異的な選別のために、この選択因子の濃度の変化の簡単な勾配を供することができうる。勾配は、高濃度の選択因子において異型接合変異体をプレートすることに基づき、およそ10〜105のうちの１のコロニー形成効率となるようにするのが一般的であろう。
マーカー遺伝子にとっての転写開始領域は任意の好適な領域であってよく、誘発性でも構成的であってもよい。誘発性転写開始領域を供することによリ、このマーカー遺伝子は、宿主の中に細胞を導入せしめたときにサイレンとであるか（この場合誘発因子は存在していない）、又は宿主の中の導入せしめたときに基づき、もしくはその細胞の成熟及び分化に基づきオンとなりうる。誘発は温度、特定の化合物等の結果でありうる。構成的又は誘発性である広範囲にわたる様々なプロモーターが論文に挙げられており、ここでの誘発は温度、誘発因子、任意の特定の細胞タイプ又は特定のレベルの成熟の結果である。また、有用な数多くのウィルスプロモーターも知られる。対象のプロモーターにはβ−アクチンプロモーター、SV40初期及び後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（「PGK」）、イムノグロブリン遺伝子プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター及びフレンド（Friend）脾臓病巣形成ウィルスプロモーターが含まれる。これらのプロモーターはエンハンサーと会合していても、していなくてもよく、ここでこのエンハンサーは特定のプロモーターに天然会合しているか、又は別のプロモーターに会合していてよい。
末端領域が存在しており、ここでその末端領域はマーカー遺伝子と天然会合しているか、又は別の遺伝子により誘導されていてよい。ほとんどの場合、この末端領域は重要ではなく、そして広範囲にわたる様々な末端領域がマーカー遺伝子の発現性又は利用性に悪影響を及ぼすことなく使用できうる。
標的遺伝子座への組込みのためのDNA構築体を製造する。この構築体はマーカー遺伝子を含んで成ることがあり、その適当な転写及び翻訳開始並びに終止調節領域は標的遺伝子座と相同性の領域によりフランクされている。標的遺伝子座での課題のマーカー遺伝子の組込みは、様々な方法、好適には標的遺伝子座のコード領域又はエキソンへの挿入により機能発現を妨害しうるが、しかしイントロンへの挿入によっても妨害することができ、この場合、その構築体はマーカー遺伝子の隣りにスプライス−アクセプター部位を有しており、従って標的遺伝子座が切断され、そして機能的なタンパク質の発現が妨げられる。もし望むなら、構築体の一部として独立転写開始領域を供するのではなく、マーカー遺伝子を標的遺伝子の転写開始領域の転写コントロール下に導く部位において標的遺伝子座の中に組込みを施す、例えばその構築体がこのマーカー遺伝子の５′末端においてスプライス−アクセプター部位を有しているイントロンの中に、又は標的及びマーカー遺伝子の解読フレームの融合体をもたらしめるエキソンの中に組込みを施してよい。重要な事項は、この標的遺伝子座でのマーカー遺伝子の組込みが標的遺伝子の不活性化をもたらしめることにある。
標的遺伝子座と相同性の領域は通常は少なくとも約50bp、より通常には少なくとも約150bpであり、そして500Kbpほど、通常には約20Kbp以下、好ましくは約10Kbp以下ほど大きくてよい。通常、このマーカー遺伝子と少なくとも約20、より通常には少なくとも50bpの相同性な５′及び３′があるであろう。様々な所見、例えば標的遺伝子座のサイズ、配列の入手性、標的遺伝子座での二重クロスオーバー現象の相対的な効率、他の配列との標的配列の類似性、等が相同性の度合いにかかわっているであろう。
相同性の領域は突然変異を含んでよく、ここで突然変異は更に標的遺伝子を不活性化せしめる、フレームシフトを供する、もしくはキーアミノ酸を変えるか、又はこの突然変異は機能不全対立遺伝子を修正すること等がある。通常、この突然変異は微妙な変化であり、相同性フランキング配列の約５％を超えず、従って通常50bpより少ない。遺伝子の突然変異が所望されるとき、マーカー遺伝子をイントロンに挿入して、転写に基づいてこの標的遺伝子を切ってよい。
この構築体は公知の方法に従って調製されることができ、それでは様々なフラグメントを一緒にし、適当なベクターの中に導入し、クローンし、分析し、そして所望の構築体ができるまで更に操作する。配列に様々な改変を、制限分析、切り出し、プローブの同定等を可能とするために行うことができうる。所望するならばサイレント突然変異を導入してよい。様々な段階において、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅、プライマー修復、インビトロ突然変異誘発、等を採用してよい。
この構築体は通常は原核複製系、例えば大腸菌（E.coli）により認識可能な起点を含む細菌性ベクターを用いて調製することができ、ここで段階毎に、構築体はクローン及び分析に付する。挿入のために用いるマーカーと同じ又は異なるマーカーを採用してよく、この場合、原核系マーカーは通常、標的細胞の中への導入の前に除去しておく。構築体を含むベクターが完成したら、細菌性配列の削除、線状化、相同性配列における短い欠失（一般には約500bpを超えず、一般に相同性配列の約20％未満、通常は約50〜300bpの範囲）の導入により更に操作にかけてよい。最終操作の後、その構築体は細胞の中への導入の用意がされた。
広範囲にわたる様々な真核標的宿主細胞、通常は脊椎動物、より詳しくは哺乳動物、所望するには家畜動物又は霊長類、特にヒトに由来する細胞を採用できうる。形質転換に委ねうる細胞は任意の課題の哺乳細胞であって、細胞療法、探索、インビトロでの他の細胞との相互作用、等において有用でありうるものであってよい。特に対象となる細胞には、数多くの一進化系統細胞の中で、幹細胞、例えば造血幹細胞、胎芽幹細胞、等、ランゲルハンス島、ドーパミンを分泌しうる副腎髄質、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球、例えばＢ−及びＴ−リンパ球、骨髄単球細胞等、ニューロン、グリアル細胞、神経節細胞、網膜細胞、肝細胞、例えば肝実質細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、毛包細胞及び筋芽（筋）細胞が挙げられる。
胎芽幹細胞に関しては、胎芽幹細胞系が採用できうるか、又は胎芽幹細胞は宿主から新鮮に獲得できうる。これらの細胞は適当な繊維芽細胞胎児層上で増殖させるか、又は白血病阻害因子（LIF）の存在下で増殖させてから使用できうる。この胎芽幹細胞はキメラ動物を供するように胚盤胞の中に注入してよい。
標的遺伝子構築体から上流及び／又は下流には、二重クロスオーバーが生じたかどうかの同定のための遺伝子が施されていてよい。この目的のために、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（「HSV−tk」）遺伝子が採用されてよく、なぜならチミジンキナーゼ遺伝子の存在はヌクレオシド類似体、例えばアシクロビル又はガンシクロビルの利用により、機能性HSV−tk遺伝子を含む細胞に対するその細胞障害作用について検出されうるからである。これらのヌクレオシド類似体に対するその耐性は、チミジンキナーゼ遺伝子がないことを示唆し、従ってそれは二重クロスオーバー現象が起こり、それ故相同組換が起こったことも示唆する。
宿主細胞の中への構築体の導入のための様々な技術が採用されうる。使用できうる技術には、リン酸カルシウム/DNA共沈殿、細胞の中へのDNAのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、インタクト細胞との細菌性プロトプラスト融合、トランスフェクション等が含まれる。DNAは一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、緩和又はスーパーコイルDNAであるうる。哺乳動物細胞の形質転換のための様々な技術についてはKeownら、Meth.in Immun.185,527−537（1990）を参照のこと。これらの細胞を次に適当な選択培地の中で成育させて適当な組込みを供する細胞を同定する。所望の表現型を示すこれらの細胞を次に制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応等によって更に分析してよい。標的遺伝子部位において適切な挿入を示すフラグメントを同定することにより、標的遺伝子の２つのコピーのうちの一方を不活性化する又はそうでなければ改変する相同組換が生じた細胞を同定することができうる。
組込まれたマーカー遺伝子を含む異型接合細胞を次に適当な培養培地の中で長期間、通常は１週間、そして６週間まで、又はそれ以上にわたって増殖させてよい。次にこの細胞をプレートし、そして個々のコロニーを様々な濃度の薬剤（マーカー遺伝子はそれに対する耐性を授ける）の中で選別する。例えば、ネオマイシン耐性では、細胞の種類に応じ、G418の濃度は約0.5〜4mg/ml、より通常には約0.5〜2.5mg/mlに変えてよい。生存コロニーを次にスクリーンにかけて機能的な内因性遺伝子がないか、又は適切に変異したことを確立する。前記した通り、突然変異体の同型接合体の存在を分析するために様々な技術が利用できうる。得られる同型接合体は、通常マーカー遺伝子を含んでいる、別々の染色体上に同一の遺伝子の２つのコピーを有するであろう。この細胞は通常、構築体を有さないであろう。
本発明は特定の遺伝子を不活性化せしめる又は標的遺伝子座にある遺伝子の中に変異を導入せしめることを望むときに幅広い用途が見い出されうる。対象の遺伝子には様々は表層膜タンパク質遺伝子が含まれる。ある対象の分野は、主要組織適合性複合抗原クラスＩ及び／もしくはII、又はあらゆる個々のグループ、例えばA,B,C,DP,DQ及びDRの発現性の低下である。クラスＩをノックアウトするため、β２−マイクログロブリン遺伝子の中に組込みを供することができうる。クラスII抗原に関しては、DR遺伝子をノックアウトするだけで十分でありうる。従って、外来MHC抗原の存在にかかわる免疫応答を、かかる抗原が宿主の中に導入されたときに下げることができうる。他方、外因性イムノグロブリン遺伝子を導入するときに宿主遺伝子の発現を阻害することを、例えば外因性遺伝子座を導入するときに宿主イムノグロブリン遺伝子座をノックアウトすることを望むことがある。その他の対象の遺伝子には、MHC発現に影響を及ぼすもの、又は免疫原性に究極的に影響を及ぼす細胞の抗原表示機構のような他の成分が含まれる。
様々な代謝プロセスを研究するため、特定の遺伝能力のなさの影響を同定するため、等のために本方法を利用することもできうる。この場合、特定の癌遺伝子の役割、調節タンパク質の作用、酵素の役割、他の経路の存在、等を同定することができうる。
課題の方法論を機能不全対立遺伝子の中に突然変異を導入して、遺伝欠陥、特に微妙な変化がかかわっているもの、例えば約50bpより少ない、しばしば約10bpより少ないものがかかわってるものの治療に利用できうる。従って、幹細胞、例えば造血幹細胞を改変せしめて、鎌状赤血球貧血、β−サラセミア、血友病、等を治療するために、遺伝子治療のための遺伝子、例えばβ−グロブリン、赤血球代謝酵素、補体系、凝血因子、ジストロフィン；炭水化物、脂質、アミノ酸、ステロイド並びにプリン及びピリミジン代謝用酵素；輸送タンパク質、例えば嚢胞性線維症トランスメンブラン調節因子等の遺伝子を標的とすることができうる。
改変胎芽幹細胞は、同型遺伝子接合化胎芽幹細胞を胚盤胞の中に注入し、次いで慣用の技術に従って雌の宿主哺乳類の中に委ねることによってキメラ非ヒト哺乳動物を作るのに利用できうる。次に異型接合子孫はPCR、サザンブロッティング等を用い、標的遺伝子座の部位での変異の存在をスクリーンできうる。同種の野生型宿主と交配させた後、得られるキメラ子孫を次に交雑させて同型接合宿主を得ることができうる。この同型接合宿主は様々な変異を有し、ここでその遺伝子は標的遺伝子座において非機能的であることがあり、変異はしているが機能的であり続けていることがあり、又は保持され、そして追加の遺伝能力が供されていることがあり、この場合、この追加の能力は、標的遺伝子座にある遺伝子との同時転写により同時制御されうる。
哺乳動物宿主は対立遺伝子を含んで成る標的遺伝子座を有し、この対立遺伝子は両方の対立遺伝子において同じ位置にて組込まれたマーカー遺伝子を有する点で少なくとも実質的に同一であるべきである。更に、第一段階における相同組換の結果としての任意の変異が両対立遺伝子の中に存在しているべきでもある。これにより、標的遺伝子座において１又は複数の変異を含みうる「ダブルノックアウト」対称組込み等が達せられうる。
同型遺伝子接合体は更なる遺伝子改変にかけてよい。例えば、宿主に置換、交換又は異なる遺伝能力を供するよう、同型遺伝子接合宿主の中に追加の遺伝能力を導入することが望まれる（この場合、内因性対立遺伝子は非機能的となっている）。例えば、ヒトイムノグロブリンを小さな宿主、例えばマウス又はウサギの中で産生することが望まれうる。まずイムノグロブリンの軽及び重鎖についてコードする内因性遺伝子をノックアウトすることにより、ヒトの軽及び重鎖をコードする遺伝子であり、且つ再配列してこの宿主の感作に応答してヒトイムノグロブリンタンパク質を産生できるヒト遺伝子座由来の遺伝子を導入することができうる。例えば、Ｊ領域をノックアウトしてよく、このことはイムノグロブリンのサブユニットの発現を妨げる。
同型遺伝子接合の後にマーカー遺伝子を除去することが望まれることがある。もとの構築体のマーカー遺伝子領域が欠失している実質的に相同性のDNA（可能としては伸ばされた配列）を含んで成る構築体を導入することによリ、その標的遺伝子座との相同組換を得ることができうる。除去段階において、一方が陽性選別、そして他方が陰性選別を供する組込み用マーカー遺伝子の組合せを利用することにより、マーカー遺伝子を保持する細胞に対する選別ができうる。陰性選別のための慣用のマーカー遺伝子にはヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子が含まれ、その存在はヌクレオシド類似体、例えばアシクロビル及びガンシクロビルに対する感受性をもたらしめる。
ウシ又はヒツジ宿主において、ウシ又はヒツジタンパク質をヒトタンパク質に交換することが望まれうる。家畜動物において、宿主の向上した産品又は成育をもたらしめる改変の導入が望まれうる。家畜動物が特定の対立遺伝子の結果として病気にかかり易いとき、この病気に対する感受性を下げるためにその対立遺伝子を改変することができうる。
対象の宿主にはヒトを除く霊長類、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ネズミ等が含まれる。
下記の実施例は例示であって限定ではない。
実  験
実施例Ｉ
４つの異なる遺伝子、Ｇ−タンパク質サブユニットαi2及びαi3、Ｔ−細胞レセプター（TCR）−α、β−心臟ミオシン重鎖（MYHC−Ｂ）を、陽性／陰性選別を用いて標的化した（Mansourら、Nature 336,348−352（1988））。各ケースにおいて、標的構築体はホスホグリセレートキナーゼ（PGK）遺伝子のプロモーター領域により作動されるネオマイシン耐性遺伝子（neo）を含むように作った。このPGK−neo配列は遺伝子の制限酵素消化パターンの検出可能な変化をもたらすエキソンに割り込んでいる。
各ケースにおいて、PGK−TKホスホグリセレートキナーゼプロモーターチミジンキナーゼ遺伝子を相同性領域の外側に挿入した。Ａ）αi2標的構築体の製造はMortensen,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）88,7036−7040（1991）に既に述べられている。Ｂ）αi3クローンはαi2遺伝子について述べられている通りに単離した。Hind III−Sal IフラグメントをBluescript SK（＋）（Stratagene）の中にサブクローンした。この構築体はエキソン１に、翻訳開始ATGにあるNco I部位において割り込むPGK−neo遺伝子を含む。Ｃ）４本の定常領域エキソンの全てを含むネズミTCR−α遺伝子の5.6Kbpのフラグメントをゲノムクローンλ★1.2からBluescript SK II（＋）の中にサブクローンした（Ausubel,ら、Curr.Proto.in Mol.Biol.〔John Wiley and Sons,New York,1988〕）。このフラグメントは、人工EcoR I部位、Xba I部位の５′からXho I部位まで広がる。エキソン３と４との間のEcoR I部位をEcoR Iにより消化し、クレノウでブラント末端化し、そしてリゲーションに付した。第一定常領域エキソンは、PGK−neoの挿入により固有EcoR V部位において割り込まれている。Ｄ）ほぼエキソン10からほぼエキソン24にまで広がるMyhc−Ｂ遺伝子の7.5Kbp（Sal I−EcoR V）領域をBalb/cゲノムライブラリー（Clontech）からクローンし、配列決定により同一性を確認した。標的構築体はエキソン14における固有Nde I部位において遺伝子を割り込ませることにより作った。
ES細胞（E.Robertson,Columbia Universityより獲得した系CCE、又はA.Bradley,Baylor Universityより獲得したCC1.2）を培養し、トランスフェクトに付し、そして既に述べられている通り（Mortensen,前掲（1991））に相同組換についてスクリーンした。相同組換に関して異型接合体として同定されたいくつかの細胞系を14〜28日間繁殖させた。次いで細胞系をプレートし、24時間培養し、そして様々な濃度のG418で選別した。生存クローン由来のDNAを内因性遺伝子のなさについてサザンブロットにより分析した。
0003571337.tif 000002
高濃度のG418において単離されたクローン由来のDNAのサザンブロット分析を実施した。DNAを１％のアガロースゲルで分画し、Genescreenに移し、そして既に述べられている通り（Ausubel,前掲〔1988〕）にハイブリダイズさせた。各ケースにおいて、相同組換生成物についてのバンドが観察され、αi2については13.6Kbバンド、αi3については6.5のバンド、TCR−αについては2.0のバンド、そしてMyhc−Ｂについては7.1のバンドであった。β−心臟ミオシンプローブはMyhc−Ａ（α−心臟ミオシン重鎖）と交差反応し、各レーンにおいて２本のバンドをもたらす遺伝子が存在していた。
高G418で生存する同型接合突然変異ESの頻度を決定するため、個々の異型接合サブクローンを、トリプシン−分散化17E10細胞を高希釈率でプレートすることにより単離した。これらのクローンそれぞれ及びもとの17E10クローンを５×105細胞/100mmプレートでプレートし、高G418レベルで選別し、そして生存クローンを表１の通りに分析した。G418抜きのプレート効率は42％であった。
0003571337.tif 000003
実施例II
ES細胞中のマウスIg重鎖Ｊ遺伝子の不活性化不活性化ベクターの構築
マウスイムノグロブリン重鎖Ｊ領域遺伝子及びフランキング配列を含む、Balb/cマウス胎芽グノムライブラリーよりクローンし、そしてpUC18の中に挿入した（pJH）、6.1−KbのEcoR IフラグメントをXho I及びNac Iで消化して、４つのＪ遺伝子を含む約2.3Kbpのフラグメントを排除した（チャート2Aを参照のこと）。BamH I部位でブラント末端化し、ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼが遺伝子（HSV−tk）プロモーター及びポリオーマエンハンサーにより作動するネオマイシン耐性遺伝子を含む約1.1KbpのXho I−BamH IフラグメントをpMClNeoより単離した（Thomas and Capecchi,Cell，51,503−512,1987）。このフラグメントをXho I−Nac I欠失pJHに挿入して不活性ベクター（pmHSJ、チャート2Bを参照のこと）を作った。その中のネオマイシン及び重鎖遺伝子の転写方向は同じである。このプラスミドをES細胞にトランスフェクトする前にNde I消化により線状化した。相同組換現象をもたらす配列は約2.8Kbp及び約1Kbpのフラグメントであり、ネオマイシン遺伝子に対してそれぞれ５′及び３′に位置する。
ES細胞の培養、エレクトロポレーション及び選別
ES細胞系E14TG2a（Koller and Smithies,1989,PNAS,USA,86,8932−8935）をミトマインシＣ処理剤胎芽繊維芽細胞支持細胞層上で記載の通り（Koller and Smithies,1989,PNAS,USA,86,8932−8935）に培養した。ES細胞をトリプシン処理し、HBSバッファー（pH7.05;137mMのNaCl,5mMのKCl,2mMのCall2,0.7mMのNa2HPO4,21mMのHEPES,pH7.1）の中に２×107/mlの濃度で、再懸濁し、そして50μg/mlの線状化不活性化ベクターの存在下でエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは240ボルト及び500μＦキャパシタンスを利用してBioRad Gene Pulserで行った。５×106のエレクトロポレート細胞を100mmのディッシュの中で、15％の胎児牛血清及び0.1mMの２−メルカプトエタノールの付加したDulbecco改良イーグル培地（DMEM）の存在下でミトマイシンＣ−処理繊維芽細胞上でプレートした。この培地をエレクトロポレーションの24hr後に200μg/mlのG418を含む培地と交換した。エレクトロポレーションして12−14日後に得られるG418耐性ESコロニーをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる分析のために延伸キャピラリーピペットで採取した。採取したコロニーのそれぞれの半分を24ウェルプレートの、ミトマイシンＣ処理済支持細胞が既にまかれている個々のウェルに移した。４つのプールに組合せた残り半分を0.3mlのPBSを含むエッペンドルフチューブに移し、そして細胞リゼートをJoynerら（Nature,338:153−155,1989）に記載の通りにPCR分析のために準備した。PCR反応は５〜20μｌの細胞リゼート、１μＭづつのプライマー、1.5μのTagポリメラーゼ及び200μＭのdNTPを含んだ。PCR増幅はサーマルサイクラー（Perking−Elmer Cetus）を用い、94℃での融解を１分、55℃でのアニーリングを２分、そして72℃で伸長を３分の45サイクルを採取した。２つのプライミングオリゴヌクレオチドはACGGTATCGCCGCTCCCGAT（SEQ ID NO:1）及びAGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA（SEQ ID NO:2）とし、それぞれネオマイシン遺伝子のBamH I部位の５′の約120塩基、及びマウス重鎖遺伝子に位置する。挿入部位の３′の約160塩基の配列に相当する。有用な相同組換は約1.4Kbpのフラグメントもたらした。20mlの反応混合物を１％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロミドで染め、そしてナイロン膜（Gene Screen）に移した。フィルターを32P−ラベルEcoR I−Pst I、挿入部位の３′のマウス重鎖に位置する約1.4Kbpのフラグメントでプローブした（チャート２を参照のこと）。更なる分析のため、ゲノムDNAをES細胞から調製し、制限酵素によりその製造者の推奨通りに消化し、そしてそのフラグメントを１％のアガロースゲル上で分けた。DNAをナイロン膜に（Gene Screen）に移し、そして前記の返りに32P−ラベルフラグメントでプローブした。
G418−耐性ESコロニーの分析
第１の実験において、プールしたコロニーのPCR分析は、136のG418耐性コロニーを示す34プールのうちで１の予測サイズ（約1.4Kbp）に陽性PCRシグナルを検出せしめた。この陽性プールに寄与した４つの個々のコロニーをPCRによりそれぞれ分析し、そして陽性クローンES33D5が同定された。第２実験で得られた540のG418耐性コロニーの同様の分析は４つの更なる陽性クローンをもたらしめた（ES41−1,ES61−1,ES65−1,ES110−１）。
Ｊ遺伝子の１コピーの標的崩壊を確認するため（この遺伝子は常染色体であり、それ故２つのコピーの中に存在している）、PCR陽性クローンを繁殖させ、そしてゲノムDNAを調製し、Hind III又はSaCIで消化し、そしてEcoR I−Pst Iプローブを用いて前記の通りにサザン分析により分析した。
相同組換現象によるネオマイシン遺伝子の挿入によるＪ遺伝子の交換は、EcoR I−Pst Iプローブにより検出可能であり、欠失Ｊ遺伝子領域中にある２つのHind III部位のなさにより（チャート2Cを参照のこと）天然の遺伝子座における同等のフラグメントより約1.9Kbp長いHind IIIフラグメントをもたらした。Hind III消化による５つの陽性クローンそれぞれのサザン分析は、重鎖Ｊ遺伝子の２コピーのうちの一方が崩壊されていることを示すパターンを供した。３つのラベル化フラグメントが検出された：未処理細胞の中に同程度で存在している、サイズにおいて同一の１フラグメント（約760bp）、未処理細胞の中に存在しているが、PCR陽性クローンの中で低い程度で存在している、サイズにおいて同一の１フラグメント（約2.3Kbp）、そして相同組換現象について予測されるサイズであり、PCR−陽性クローンにのみ存在している約4.2Kbpの更なるフラグメント。同様に、相同組換現象によるネオマイシン遺伝子によるＪ遺伝子の交換はSac I部位の欠失及び、天然遺伝子座における同等のフラグメントよりも約570bp小さいEcoR I−Pst Iプローブにより検出可能なフラグメントの出現（チャート2Cを参照のこと）をもたらした。Sac I消化によるクローンのサザン分析は一の天然及び一の標的対立遺伝子の予測パターンを供した：未処理細胞の中で検出されるものとサイズにおいて同一であるが、５つの陽性クローンにおいて低い強度の約4.0Kbpのフラグメント、及び標的相同組換現象について予測されるサイズの、同定クローンの中にのみ存在している約3.4Kbpの更なるフラグメント。ネオマイシン遺伝子に対するプローブによるサザン分析の再ハイブリダイゼーションは、Hind III及びSac I消化にそれぞれ由来する4.2Kbp及び3.4Kbpのフラグメントのみが標的現象により予測される通りにプローブにすることを示した。
マウスにおけるマウスイムノグロブリン重鎖Ｊ遺伝子の不活性化マウス胚盤胞への標的ES細胞の注入及びキメラ子孫の作製
マウスをJackson Laboratoriesより購入した（Bar Harbor,ME）。生後3.5日後のC57BL/6胚盤胞を、Kollerら、1989前掲に記載の通りに生後４〜５週間の過排卵雌から獲得した。ES細胞をトリプシン処理し、新鮮なDMEM培地で１回洗い、そしてM2培地の中に約１×106/mlに希釈した。約５μｌの細胞をパラフィン油下にある胚盤胞を含む150μｌのM2培地の液滴に加えた。10〜15の細胞を各胚盤胞の胞胚腔に注入した。６〜９のES含有胚盤胞を、2.5日前に精管除去した雄と交配させたC57BL/6×DBA F1偽子孫の雌の子宮角それぞれに戻した。注入せしめた胚盤胞に由来する子供が一般に16〜18日後に生まれた。子孫に対応するES細胞に寄与を子供の毛皮の色の検査により目視で判定した。胚盤胞をC57BL/6マウス（これは一様に異色で売られている）から獲得した。ES細胞系E14TG2a（標的細胞がその親株系に由来する）を129/olaマウスから単離した。このマウス株はクリーム色であり、３色の遺伝子、アグーチ（agouti）遺伝子座にある優性AW対立遺伝子、Ｐ遺伝子座にある劣性ピンク色の眼の希釈対立遺伝子、及びＣ遺伝子座にある劣性Cch対立遺伝子の組合せ効果である。動物の形成にES細胞がかかっている子孫は茶及びクリーム色の毛を含む毛皮を有していた。不活性化マウスイムノグロブリン重鎖を保有するES細胞系ES41−１を前記の通りC57BL/6マウス胚盤胞に注入した。18の生存している子供のうちの６が高い度合いの毛皮色調キメラ（70〜90℃）を有していた。不活性化ESを注入した胚盤胞を移植した雌由来のキメラ新生子供より単離したDNAのPCR分析は、突然変異イムノグロブリン重鎖遺伝子座が様々な器官、例えば脾臓、甲状腺、腎臓、肝臓、脳及び皮膚にあることを示唆した。
ES細胞中の不活性化Ig重鎖Ｊ遺伝子の同型遺伝子接合
重鎖Ｊ遺伝子標的化ES細胞110−１細胞系を支持細胞の上に、1400μg/mlのG418の存在下で100mmのプレート当り５×103の細胞数の密度でまいた。生存コロニーのうちの７を繁殖させ、ゲノムDNAを調製し、そして内因性Ig重鎖Ｊ遺伝子のなさについてサザン分析により分析した。Sac I消化によるサザン分析は、クローンのうちの一つ、ES DK207が天然Ig重鎖Ｊ遺伝子座を失っていることを示した。同一のブロットとＪ遺伝子領域全体に広がるXho I−Nac Iプローブとのハイブリダイゼーションは、ES DK207ゲノムの中にフラグメントを全く検出せしめず、天然Ig重鎖Ｊ遺伝子の欠失を更に示唆する。
同型遺伝子接合した重鎖Ｊ標的化Ｂ細胞を保有するキメラマウスの作製
ES DK207細胞をマウスの胚盤胞に注入し、そしてキメラマウスを前記の通りに作製した。これによりキメラマウスを得、その７は40〜70％の毛皮色調キメラを有し、ES細胞のこれらのマウスへの寄与を示唆する。
このマウスを、Ｂ細胞の分化及び抗体発現の能力に及ぼす両重鎖対立遺伝子からのＪ遺伝子の欠失の効果を決定するために用いた。これらのキメラのうちの一つ、DK334−１に由来する末梢血液リンパ球の分析は、リンパ球の約10％が、ES細胞が起源とするマウス株、即ち129SV/Ola株に由来することを示唆した。これは、株129に由来する細胞には結合するが、株C57B/6に由来する細胞には結合しないLy9aの抗体で決定した。株129を起源とする成熟Ｂ細胞のなさは、蛍光活性化細胞選別により、株129由来のリンパ球が表層抗原CD45Rbright及びIgMaを欠くことで実証することによって確立した。これらの結果は、Ig重鎖の両方の対立遺伝子の中でのＪ領域の欠失に基づき、Ｂ細胞の発育がES DK207由来のリンパ球において阻止されていることの所見を裏付けする。
以上の結果から、対象の方法論、１又は複数の対立遺伝子の性質を変えることを望むときに、宿主の中の２種以上の対立遺伝子における同型接合体を作る有効で効率的な方法を提供する。これにより、二培体の中にある２つの対立遺伝子をノックアウトする、２つの対立遺伝子を突然変異させて、同じ配列を獲得し、しかし所望の同型接合体の単離を可能とするように十分に高い頻度を保つことができうる。対象の方法は様々な用途、即ち遺伝子導入動物において、宿主細胞上にある表層タンパク質を改変させ、免疫原性を下げる又は高める等に利用できうる。
本明細書に記載の全ての出版物及び特許出願は全て引用することで本明細書に組入れる。
本発明を理解のし易さのために例示してきたが、当業者は本発明の教示により様々な変更及び改良を本発明の範囲を逸脱することなくできることが理解されるであろう。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：セル  ジェネシス  インコーポレイティド，ザ  プレジデント  アンド  フェロウズ  オブ  ハーバード  カレッジ
（ii）発明の名称：遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
（iii）配列の数:2
（iv）連絡先
（Ａ）宛先：ベルトラム  I.ローランド
（Ｂ）通り:4エンバーカデロ  センター，スーテ  3400
（Ｃ）市：サン  フランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号:94111
（ｖ）コンピューター読み取り方式：
（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PCコンパチブル
（Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン  リリース＃1.0、
バージョン＃1.25
（vi）現出願人のデーター：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日:1993年２月２日
（Ｃ）分類：
（viii）代理人／代理店情報：
（Ａ）名称：ローランド、ベルトラム
（Ｂ）登録番号:201015
（Ｃ）参照／処理番号:FP−55841/BIR
（iv）通信情報：
（Ａ）電話：（415）781−1989
（Ｂ）テレファックス：（415）398−3249
（２）SEQ ID NO:1についての情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型:cDNA
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1:
0003571337.tif 000004
（２）SEQ ID NO:2についての情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子の型:cDNA
（xi）配列の詳細:SEQ ID NO:2:
0003571337.tif 000005