【手続補正書】
【提出日】平成29年4月21日(2017.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物に対するヒトおよび／または動物ワクチンとして適した組換え融合タンパク質であって、前記寄生生物の少なくとも２種の異なる生活環の主な段階において、前記寄生生物の表面に提示される少なくとも２種の異なるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する複数の単離された熱安定性断片を含み、各断片が少なくとも１つのフォールディングされたドメインを含む、組換え融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、少なくとも４種の異なる単離された熱安定性断片を含む、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
前記フォールディングされたドメインが、ＥＧＦ様ドメインまたはＴＳＲドメインである、請求項１から２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
前記組換え融合タンパク質が、アピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する少なくとも１種の非熱安定性の単離された断片をさらに含み、ここで融合タンパク質全体が熱安定性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、少なくとも５％、特に少なくとも７．５％の、より特には少なくとも１０％のシステイン含量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
前記異なるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）生活環段階が、前赤内期段階、血液段階および有性段階を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
前記アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物がプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物であり、特に、前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）および四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群から選択され、特に、前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
前記熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）表面タンパク質が、前赤内期段階および血液段階において前記寄生生物の表面に提示される、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
前記熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）表面タンパク質が、前赤内期段階、血液段階、および有性段階において前記寄生生物の表面に提示される、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
前記単離された熱安定性断片が、ＣｅｌＴｏｓ、ＣＳＰ、ＥＸＰ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ８、ＭＳＰ１０、ｍＴＲＡＰ、Ｐｆｓ２３０、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ４５／４８、Ｒｉｐｒ、Ｒｏｎ２、ＴＲＡＭＰおよびＴＲＡＰからなる群から選択されるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
前記単離された熱安定性断片が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１〜配列番号１９２またはこれらの配列の相同ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２】
前記組換え融合タンパク質が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１９６〜配列番号２０１またはこれらの配列の相同ポリペプチドからなる群から選択される配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３】
前記組換え融合タンパク質が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１９７の配列またはこれらの配列の相同ポリペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４】
前組換え融合タンパク質全体が熱安定性および／またはｐＨ安定性である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を生成する方法であって、
ａ）前記融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を提供するステップ、
ｂ）前記核酸構築物を宿主細胞中に導入するステップ、および
ｃ）前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を維持するステップ、
ｄ）前記細胞培養上清または抽出物の熱処理を含む、前記宿主細胞から前記融合タンパク質を精製するステップ、および
ｅ）任意選択で前記融合タンパク質をさらに処理するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が植物細胞であり、特に、前記植物が、アブラナ属（Brassica）、タバコ属（Nicotiana）、ペチュニア属（Petunia）、トマト属（Lycopersicon）、ナス属（Solarium）、トウガラシ属（Capsium）、ニンジン属（Daucus）、オランダミツバ属（Apium）、アキノノゲシ属（Lactuca）、シロガラシ属（Sinapis）またはシロイヌナズナ属（Arabidopsis）からなる群から選択される属に由来し、特に、前記植物が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata）、カラシナ（Brassica juncea）、アブラナ（Brassica napus）、クロガラシ（Brassica nigra）、ブラシカ・オレラセアエ（Brassica oleraceae）、ブラシカ・トウルムフォルチー（Brassica tourmfortii）、シロガラシ（Smapis alba）およびダイコン（Raphanus sativus）からなる群から選択される種に由来し、特に、前記植物がベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、および／または配列番号１９３〜配列番号１９５、配列番号２０２および配列番号２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
【表７】
2016523821.tif 000001
2016523821.tif 000002
2016523821.tif 000003
2016523821.tif 000004
2016523821.tif 000005
2016523821.tif 000006
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物に対するヒトおよび／または動物ワクチンとして適した組換え融合タンパク質であって、前記寄生生物の少なくとも２種の異なる生活環の主な段階において、前記寄生生物の表面に提示される少なくとも２種の異なるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する複数の単離された熱安定性断片を含み、各断片が少なくとも１つのフォールディングされたドメインを含む、組換え融合タンパク質。
［２］
前記融合タンパク質が、少なくとも４種の異なる単離された熱安定性断片を含む、上記［１］に記載の組換え融合タンパク質。
［３］
前記フォールディングされたドメインが、ＥＧＦ様ドメインまたはＴＳＲドメインである、上記［１］から［２］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［４］
前記組換え融合タンパク質が、アピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する少なくとも１種の非熱安定性の単離された断片をさらに含み、ここで融合タンパク質全体が熱安定性である、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［５］
前記融合タンパク質が、少なくとも５％、特に少なくとも７．５％の、より特には少なくとも１０％のシステイン含量を有する、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［６］
前記単離されたタンパク質ドメインが互いに直接的に連結される、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［７］
前記単離されたタンパク質ドメインがリンカーを介して互いに間接的に連結される、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［８］
前記リンカーが２０個以下のアミノ酸、特に２〜６個のアミノ酸の大きさを有するポリペプチドである、上記［７］に記載の組換え融合タンパク質。
［９］
前記異なるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）生活環段階が、前赤内期段階、血液段階および有性段階を含む、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１０］
前記アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物がプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物である、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１１］
前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）および四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群から選択される、上記［１０］に記載の組換え融合タンパク質。
［１２］
前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）である、上記［１０］に記載の組換え融合タンパク質。
［１３］
前記熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）表面タンパク質が、前赤内期段階および血液段階において前記寄生生物の表面に提示される、上記［１２］に記載の組換え融合タンパク質。
［１４］
前記熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）表面タンパク質が、前赤内期段階、血液段階、および有性段階において前記寄生生物の表面に提示される、上記［１２］に記載の組換え融合タンパク質。
［１５］
前記単離された熱安定性断片が、ＣｅｌＴｏｓ、ＣＳＰ、ＥＸＰ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ８、ＭＳＰ１０、ｍＴＲＡＰ、Ｐｆｓ２３０、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ４５／４８、Ｒｉｐｒ、Ｒｏｎ２、ＴＲＡＭＰおよびＴＲＡＰからなる群から選択されるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する、上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１６］
前記単離された熱安定性断片が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１〜配列番号１９２またはこれらの配列の相同ポリペプチドからなる群から選択される、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１７］
前記組換え融合タンパク質が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１９６〜配列番号２０１またはこれらの配列の相同ポリペプチドからなる群から選択される配列を含む、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１８］
前記組換え融合タンパク質が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１９７の配列またはこれらの配列の相同ポリペプチドを含む、上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［１９］
前組換え融合タンパク質全体が熱安定性および／またはｐＨ安定性である、上記［１］から［１８］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
［２０］
単離された核酸分子であって、
ａ）上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子、
ｂ）好ましくは１個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の融合タンパク質の改変された形態をコードする核酸分子、
ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｂ）の核酸分子のいずれかとハイブリダイズできる核酸分子、
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｃ）の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズできる核酸分子、
ｅ）ａ）〜ｄ）の核酸分子のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ、アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の１種もしくは複数の寄生生物に対する、特に熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）に対するヒトおよび／もしくは動物ワクチンとして適した熱安定性融合タンパク質をコードする核酸分子、または
ｆ）ａ）〜ｅ）の核酸分子のいずれかの相補体
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
［２１］
上記［２０］に記載のヌクレオチド分子を含むベクター。
［２２］
上記［２１］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［２３］
前記細胞が、酵母または植物細胞である、上記［２２］に記載の宿主細胞。
［２４］
前記酵母がピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、上記［２３］に記載の宿主細胞。
［２５］
前記植物がベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）である、上記［２３］に記載の宿主細胞。
［２６］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を生成する方法であって、
ａ）前記融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を提供するステップ、
ｂ）前記核酸構築物を宿主細胞中に導入するステップ、および
ｃ）前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を維持するステップ、
ｄ）前記細胞培養上清または抽出物の熱処理を含む、前記宿主細胞から前記融合タンパク質を精製するステップ、および
ｅ）任意選択で前記融合タンパク質をさらに処理するステップ
を含む、方法。
［２７］
活性ウイルスを実質的に含まない、生物学的に活性な治療薬を調製する方法であって、上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の所与の融合タンパク質の供給源が、特に熱処理および／または酸性処理によって、存在する任意のウイルスを不活性化するのに十分な条件下でウイルス不活性化ステップに付される、方法。
［２８］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）ｐＨ＜８で前記融合タンパク質を発現する宿主細胞を懸濁し、５５〜７０℃の間の温度で前記懸濁液をインキュベートするステップ、
ｂ）分離するステップ、
ｃ）前記組換え融合タンパク質を含有する前記懸濁液の可溶性画分を集めるステップ、
および
ｄ）前記組換え融合タンパク質を精製するステップ、および任意選択でそれをさらに処理するステップ
を含む、方法。
［２９］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質を精製する方法であって、
ａ）前記融合タンパク質を発現する宿主細胞の細胞培養物を回収するステップ、
ｂ）ｐＨ＜８で前記宿主細胞を再懸濁し、５５〜７０℃の間の温度で前記懸濁液をインキュベートするステップ、
ｃ）分離するステップ、および
ｄ）前記組換えタンパク質を含有する前記懸濁液の可溶性画分を集めるステップ、
ｅ）前記組換え融合タンパク質を精製するステップ、および任意選択でそれをさらに処理するステップ
を含む、方法。
［３０］
前記宿主細胞が植物細胞である、上記［２６］から［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
前記植物が、アブラナ属（Brassica）、タバコ属（Nicotiana）、ペチュニア属（Petunia）、トマト属（Lycopersicon）、ナス属（Solarium）、トウガラシ属（Capsium）、ニンジン属（Daucus）、オランダミツバ属（Apium）、アキノノゲシ属（Lactuca）、シロガラシ属（Sinapis）またはシロイヌナズナ属（Arabidopsis）からなる群から選択される属に由来する、上記［３０］に記載の方法。
［３２］
前記植物が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata）、カラシナ（Brassica juncea）、アブラナ（Brassica napus）、クロガラシ（Brassica nigra）、ブラシカ・オレラセアエ（Brassica oleraceae）、ブラシカ・トウルムフォルチー（Brassica tourmfortii）、シロガラシ（Smapis alba）およびダイコン（Raphanus sativus）からなる群から選択される種に由来する、上記［３１］に記載の方法。
［３３］
前記植物がベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana tabacum）である、上記［３２］に記載の方法。
［３４］
生理学的に許容される培地中に、有効成分として上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、および／または配列番号１９３〜配列番号１９５、配列番号２０２および配列番号２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列もしくはそれらの相同ポリペプチドと、担体とを含む、アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物に対して感受性哺乳動物を免疫処置するためのワクチン組成物。
［３５］
前記融合タンパク質が前記担体に吸着される、または共有結合によって結合される、上記［３４］に記載のワクチン組成物。
［３６］
前記担体が担体タンパク質である、上記［３５］に記載のワクチン組成物。
［３７］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質と結合する単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物。
［３８］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、および／または配列番号１９３〜配列番号１９５、配列番号２０２および配列番号２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列もしくはそれらの相同ポリペプチドを含み、前記組成物は、好ましくは医薬および／または診断用組成物である、組成物。
［３９］
上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質、および／または配列番号１９３〜配列番号１９５、配列番号２０２および配列番号２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列もしくはそれらの相同ポリペプチドと、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
［４０］
さらなる薬剤をさらに含む、上記［３９］に記載の医薬組成物。
［４１］
前記さらなる薬剤が治療薬である、上記［４０］に記載の医薬組成物。
［４２］
アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物に対するヒトおよび／または動物ワクチンとして適したワクチン組成物であって、少なくとも２種の異なるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する複数の単離された熱安定性断片を含み、各断片が少なくとも１つのフォールディングされたドメインを含有し、前記単離された熱安定性断片が、前記寄生生物の生活環における少なくとも２種の異なる段階において、前記寄生生物の表面に提示されるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する、ワクチン組成物。
［４３］
前記ワクチン組成物が、少なくとも４種の異なる単離された熱安定性断片を含む、上記［４２］に記載のワクチン組成物。
［４４］
前記単離された熱安定性断片が、ＣｅｌＴｏｓ、ＣＳＰ、ＥＸＰ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ８、ＭＳＰ１０、ｍＴＲＡＰ、Ｐｆｓ２３０、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ４５／４８、Ｒｉｐｒ、Ｒｏｎ２、ＴＲＡＭＰおよびＴＲＡＰからなる群から選択されるアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する、上記［４２］から［４３］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［４５］
前記単離された熱安定性断片が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１〜配列番号１９２からなる群またはこれらの配列の相同ポリペプチドから選択される、上記［４２］から［４４］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［４６］
前記熱安定性断片が、少なくとも２種の異なる組換え融合タンパク質中に含まれ、前記組換え融合タンパク質の一方が、前記寄生生物の生活環の単一の段階において前記寄生生物の表面に提示される少なくとも１種のアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する２種以上の熱安定性断片を含み、他方の組換え融合タンパク質が、生活環の異なる段階において前記寄生生物の表面に提示される少なくとも１種のアピコンプレクサ門（Apicomplexa）表面タンパク質に由来する２種以上の熱安定性断片を含む、上記［４２］から［４５］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［４７］
前記組換え融合タンパク質が熱安定性および／またはｐＨ安定性である、上記［４６］に記載のワクチン組成物。
［４８］
前記組換え融合タンパク質が、１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって組換えまたは合成法によって生成される、配列番号１９３〜配列番号１９５、配列番号２０２および配列番号２０５からなる群から選択される配列またはこれらの配列の相同ポリペプチドを含む、上記［４６］から［４７］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［４９］
前記アピコンプレクサ（Apicomplexa）門の寄生生物がプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物である、上記［４２］から［４８］のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
［５０］
前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）および四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群から選択される、上記［４９］に記載のワクチン組成物。
［５１］
前記プラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物が熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）である、上記［４９］に記載のワクチン組成物。
［５２］
前記熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）生活環の生活環中の異なる段階が、前赤内期段階および血液段階である、上記［５１］に記載のワクチン組成物。
［５３］
前記熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）生活環の異なる段階が、前赤内期段階、血液段階および有性段階である、上記［５１］に記載の組換え融合タンパク質。