【手続補正書】
【提出日】平成29年6月12日(2017.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CYP153A ω-ヒドロキシラーゼドメインおよびP450RhFレダクターゼドメインを含むCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように操作された組換え微生物であって、
該ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、CYP153A ω-ヒドロキシラーゼドメインにまたは両ドメインに1つまたは複数の突然変異を有し、かつ
該ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが自給型（self-sufficient）であり、脂肪酸誘導体のω-OH脂肪酸誘導体への反応を触媒するω-ヒドロキシラーゼ酵素活性を包含する、組換え微生物。
【請求項２】
ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも80％、好ましくは90％の配列同一性を有する、請求項1記載の組換え微生物。
【請求項３】
SEQ ID NO：6の位置307に置換を含み、好ましくは、SEQ ID NO：6の位置307においてグリシン（G）がアラニン（A）に置換されている、請求項2記載の組換え微生物。
【請求項４】
ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも約90％の配列同一性を有し、かつ、位置27、82、141、178、231、309、407、415、516、666、および/または796を含むアミノ酸位置に1つまたは複数の突然変異を含む、請求項2または3記載の組換え微生物。
【請求項５】
V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、R27L、R82D、R178N、A231T、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A、P666Dおよび/またはA796Vからなる群より選択される1つまたは複数の突然変異を含む、請求項4記載の組換え微生物。
【請求項６】
ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントがアミノ酸位置141における突然変異を有し、好ましくは該突然変異がV141Iおよび/またはV141Tである、請求項2〜4のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項７】
ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、
(i) 突然変異V141IおよびA231T（SEQ ID NO: 32）；
(ii) 突然変異R27L、R82D、V141M、R178N、およびN407A（SEQ ID NO: 34）；
(iii) 突然変異P666A（SEQ ID NO: 36）；
(iv) 突然変異A796V（SEQ ID NO: 38）；
(v) 突然変異A796V、P666D、およびT516V（SEQ ID NO: 40）；
(vi) 突然変異V141I、A231T、およびA796V（SEQ ID NO: 42）；
(vii) 突然変異R27L、R82D、V141M、R178N、N407A、およびA796V（SEQ ID NO: 44）；または
(viii) 突然変異V141T、A231T、およびA796V（SEQ ID NO: 46）
を含む、請求項2〜4のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項８】
ω-ヒドロキシ脂肪酸およびω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項９】
EC 1.1.1.1/2のアルコールデヒドロゲナーゼまたはEC 1.1.3.13もしくはEC 1.1.3.20のアルコールオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項１０】
ω-オキソ脂肪酸およびω-オキソ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項9記載の組換え微生物。
【請求項１１】
EC 1.2.1.3/4/5のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはEC 1.2.3.1のアルデヒドオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項9記載の組換え微生物。
【請求項１２】
α,ω-二酸またはω-カルボキシ脂肪酸メチルエステルであるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項11記載の組換え微生物。
【請求項１３】
EC 6.2.1.3のアシル-CoAリガーゼまたはEC 2.8.3.6のアシル-CoAトランスフェラーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項11記載の組換え微生物。
【請求項１４】
α,ω-ジエステルであるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項13記載の組換え微生物。
【請求項１５】
EC 2.6.1のアミノトランスフェラーゼまたはEC 1.4.9、EC 1.4.98もしくはEC 1.4.99のアミンデヒドロゲナーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項9記載の組換え微生物。
【請求項１６】
ω-アミノ脂肪酸およびω-アミノ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項15記載の組換え微生物。
【請求項１７】
EC 1.1.-.-のアルコールデヒドロゲナーゼおよび1.2.99のカルボン酸レダクターゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項１８】
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-ジオールである、請求項17記載の組換え微生物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載の微生物を含む細胞培養物。
【請求項２０】
ω-ヒドロキシ遊離脂肪酸；ω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステル；ω-オキソ脂肪酸；ω-オキソ脂肪酸メチルエステル；α,ω-二酸；α,ω-ジオール；ω-アミノ脂肪酸；およびω-アミノ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、請求項19記載の細胞培養物。
【請求項２１】
（a）請求項1〜18のいずれか一項記載の組換え微生物を用意する段階；
（b）炭素源を含有する再生可能な原料を発酵ブロスに添加する段階；ならびに
（c）該発酵ブロスからω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を単離する段階
を含む、ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を生産する方法。
【請求項２２】
再生可能な原料が炭素系であり、好ましくは、炭素系の再生可能な原料が、トウモロコシ、サトウキビ、モロコシ、テンサイ、スイッチグラス、エンシレージ、わら、材木、パルプ、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、煙道ガス（flu-gas）、合成ガス、バイオマス加水分解物、および二酸化炭素からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
EC 3.1.2.-、3.1.1.5、または3.1.2.14のチオエステラーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え微生物。
【請求項２４】
チオエステラーゼがFatAである、請求項23記載の組換え微生物。
【請求項２５】
チオエステラーゼがFatA3である、請求項23記載の組換え微生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本開示は、C9〜C16飽和または不飽和マクロライドである、本明細書に記載の方法（前記）によって生産される芳香性化学組成物を、さらに意図する。本芳香性化学組成物は、アンブレトリド、ジヒドロアンブレトリド、15-ヒドロキシペンタデカン酸のマクロラクトン、および15-ヒドロキシペンタデセン酸のマクロラクトンおよび/または他のものから選択される化学的実体を含む。
[本発明1001]
（a）EC 3.1.2.-、3.1.1.5、もしくは3.1.2.14のチオエステラーゼ；またはEC 2.3.1.75もしくはEC 2.3.1.20のエステルシンターゼ；および
（b）EC 1.14.15.3の改変されたω-ヒドロキシラーゼ
を含むポリペプチドをコードする少なくとも2つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、再生可能な原料由来の炭素源の存在下において発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生させるための組換え微生物。
[本発明1002]
改変されたω-ヒドロキシラーゼが、改変されたシトクロムP450モノオキシゲナーゼ酵素活性を有し、かつインビボで炭化水素鎖のω位を効率的に触媒する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
改変されたω-ヒドロキシラーゼがCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドである、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1004]
CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドが、自給型（self-sufficient）CYP153A-RedRhFハイブリッド融合タンパク質である、本発明1003の組換え微生物。
[本発明1005]
改変されたω-ヒドロキシラーゼが、EC 1.14.15.3のω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1006]
ω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ、V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、R27L、R82D、R178N、A231T、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A、P666DおよびA796Vからなる群より選択される1つまたは複数の突然変異を有する、本発明1005の組換え微生物。
[本発明1007]
ω-ヒドロキシ脂肪酸およびω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1008]
EC 1.1.1.1/2のアルコールデヒドロゲナーゼまたはEC 1.1.3.13もしくはEC 1.1.3.20のアルコールオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1009]
ω-オキソ脂肪酸およびω-オキソ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1010]
EC 1.2.1.3/4/5のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはEC 1.2.3.1のアルデヒドオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1011]
α,ω-二酸またはω-カルボキシ脂肪酸メチルエステルであるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1010の組換え微生物。
[本発明1012]
EC 6.2.1.3のアシル-CoAリガーゼまたはEC 2.8.3.6のアシル-CoAトランスフェラーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1010の組換え微生物。
[本発明1013]
α,ω-ジエステルであるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1012の組換え微生物。
[本発明1014]
EC 2.6.1のアミノトランスフェラーゼまたはEC 1.4.9、EC 1.4.98もしくはEC 1.4.99のアミンデヒドロゲナーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1008の組換え微生物。
[本発明1015]
ω-アミノ脂肪酸およびω-アミノ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1014の組換え微生物。
[本発明1016]
EC 1.1.-.-のアルコールデヒドロゲナーゼおよび1.2.99のカルボン酸レダクターゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1017]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-ジオールである、本発明1016の組換え微生物。
[本発明1018]
本発明1001〜1017のいずれかの微生物を含む細胞培養物。
[本発明1019]
ω-ヒドロキシ遊離脂肪酸；ω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステル；ω-オキソ脂肪酸；ω-オキソ脂肪酸メチルエステル；α,ω-二酸；α,ω-ジオール；ω-アミノ脂肪酸；およびω-アミノ脂肪酸メチルエステルからなる群より選択されるω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する、本発明1018の細胞培養物。
[本発明1020]
（a）発酵ブロス中に組換え微生物を用意する段階であって、該微生物が、
EC 3.1.2.-、3.1.1.5、もしくは3.1.2.14のチオエステラーゼ；またはEC 2.3.1.75もしくはEC 2.3.1.20のエステルシンターゼ；および
EC 1.14.15.3の改変されたω-ヒドロキシラーゼ
を含むポリペプチドをコードする少なくとも2つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、段階；
（b）炭素源を含有する再生可能な原料を該発酵ブロスに添加する段階；ならびに
（c）該発酵ブロスからω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を単離する段階
を含む、ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を生産する方法。
[本発明1021]
改変されたω-ヒドロキシラーゼがCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドが、自給型CYP153A-RedRhFハイブリッド融合タンパク質である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
改変されたω-ヒドロキシラーゼが、EC 1.14.15.3のω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントである、本発明1020の方法。
[本発明1024]
ω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ、V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、R27L、R82D、R178N、A231T、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A、P666DおよびA796Vからなる群より選択される1つまたは複数の突然変異を有する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体が、ω-ヒドロキシ遊離脂肪酸またはω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルである、本発明1020の方法。
[本発明1026]
組換え微生物が、EC 1.1.1.1/2のアルコールデヒドロゲナーゼまたはEC 1.1.3.13もしくはEC 1.1.3.20のアルコールオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1020の方法。
[本発明1027]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がω-オキソ脂肪酸またはω-オキソ脂肪酸メチルエステルである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
組換え微生物が、EC 1.2.1.3/4/5のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはEC 1.2.3.1のアルデヒドオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1026の方法。
[本発明1029]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-二酸またはα,ω-脂肪酸ジ-メチルエステルである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
組換え微生物が、EC 2.6.1のアミノトランスフェラーゼまたはEC 1.4.9、EC 1.4.98もしくはEC 1.4.99のアミンデヒドロゲナーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されている、本発明1026の方法。
[本発明1031]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がω-アミノ脂肪酸またはω-アミノ脂肪酸メチルエステルである、本発明1030の方法。
[本発明1032]
組換え微生物が、EC 1.2.99.6のカルボン酸レダクターゼまたはおよびEC 1.1.-.-のアルコールデヒドロゲナーゼを含むポリペプチドをコードする核酸をさらに発現するように操作されている、本発明1020の方法。
[本発明1033]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-ジオールである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
再生可能な原料が炭素系である、本発明1001〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
炭素系の再生可能な原料が、トウモロコシ、サトウキビ、モロコシ、テンサイ、スイッチグラス、エンシレージ、わら、材木、パルプ、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、煙道ガス（flu-gas）、合成ガス、バイオマス加水分解物、および二酸化炭素からなる群より選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
炭素源が、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、デンプン、セルロース、ペクチン、キシラン、スクロース、マルトース、セロビオース、ツラノース、ヘミセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コハク酸塩、乳酸塩、酢酸塩、エタノール、メタノール、グリセロール、廃脂肪酸およびそれらの混合物からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1037]
炭素源がグルコース、グリセロールまたはスクロースである、本発明1001の方法。
[本発明1038]
ポリウレタン、ポリエステルポリオール、ポリエステル樹脂、アルキルコート樹脂（alkyl coating resin）、ファイバーグラス樹脂、ゲルコート樹脂（gel coating resin）、およびポリエステル熱可塑性物質からなる群より選択される、本発明1020の方法によって生産されるポリマー組成物。
[本発明1039]
（a）EC 1.2.1.42のアシル-ACPレダクターゼ；
（b）EC 1.1.-.-のアルコールデヒドロゲナーゼ；および
（c）EC 1.14.15.3の改変されたω-ヒドロキシラーゼ
を含むポリペプチドをコードする少なくとも3種の核酸配列を発現するように操作された経路を含む、再生可能な原料由来の炭素源の存在下において発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生させるための組換え微生物。
[本発明1040]
改変されたω-ヒドロキシラーゼが、改変されたシトクロムP450酵素活性を有し、かつインビボで炭化水素鎖のω位を効率的に触媒する、本発明1039の組換え微生物。
[本発明1041]
改変されたω-ヒドロキシラーゼがCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドである、本発明1040の組換え微生物。
[本発明1042]
CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドが、自給型CYP153A-RedRhFハイブリッド融合タンパク質である、本発明1041の組換え微生物。
[本発明1043]
改変されたω-ヒドロキシラーゼが、EC 1.14.15.3のω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントである、本発明1039の組換え微生物。
[本発明1044]
ω-ヒドロキシラーゼハイブリッド融合タンパク質バリアントが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ、V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、R27L、R82D、R178N、A231T、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A、P666DおよびA796Vからなる群より選択される1つまたは複数の突然変異を有する、本発明1043の組換え微生物。
[本発明1045]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-ジオールである、本発明1039の組換え微生物。
[本発明1046]
本発明1039〜1045のいずれかの微生物を含む細胞培養物。
[本発明1047]
（a）発酵ブロス中に組換え微生物を用意する段階であって、該微生物が、EC 1.2.1.42のアシル-ACPレダクターゼ；EC 1.1.-.-のアルコールデヒドロゲナーゼ；およびEC 1.14.15.3の改変されたω-ヒドロキシラーゼを含むポリペプチドをコードする少なくとも3種の核酸配列を発現するように操作された経路を含む、段階；
（b）炭素源を含有する再生可能な原料を該発酵ブロスに添加する段階；ならびに
（c）該発酵ブロスからω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を単離する段階
を含む、ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を生産する方法。
[本発明1048]
ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体がα,ω-ジオールである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
再生可能な原料が炭素系である、本発明1047〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
炭素系の再生可能な原料が、トウモロコシ、サトウキビ、スイッチグラス、エンシレージ、わら、材木、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、煙道ガス、合成ガス、および二酸化炭素からなる群より選択される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
炭素源が、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、デンプン、セルロース、ペクチン、キシラン、スクロース、マルトース、セロビオース、ツラノース、ヘミセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コハク酸塩、乳酸塩、酢酸塩、エタノール、メタノール、グリセロールおよびそれらの混合物からなる群より選択される、本発明1047の方法。
[本発明1052]
炭素源がグルコース、グリセロールまたはスクロースである、本発明1047の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本開示は、好ましい態様を例示する役割を果たす添付の図面と併せて読むと、最も良く理解される。しかし、本開示が、図面中に開示された具体的な態様に限定されないことは理解されよう。
【図１】ω-ヒドロキシ-カルボン酸、ω-オキソ-カルボン酸、ω-アミノ-カルボン酸およびα,ω-二酸を製造するための経路を描写している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図２Ａ】メチルエステル中間体を介して、ω-ヒドロキシ-カルボン酸、ω-アミノ-カルボン酸およびα,ω-二酸を製造するための経路を描写している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図２Ｂ】ジメチルエステル中間体を介して、α,ω-二酸を製造するための経路を描写している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図３】チオエステラーゼおよびカルボキシル酸レダクターゼを用いて、α,ω-ジオールを製造するための経路を描写している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図４】アシル-ACPレダクターゼを用いて、α,ω-ジオールを製造するための経路を描写している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図５】ω-アミノカルボン酸をラクタムに変換する経路を図示している。炭素原子12個を有する脂肪酸誘導体が、一例として描写されている。
【図６】ドデカン酸を与えた場合に12-ヒドロキシドデカン酸形成をもたらす、cyp153Aオペロンを発現する組換え大腸菌（E. coli）株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。対照菌株（MG1655 ΔfadD）からの抽出物のGC/MSクロマトグラフも示されている。
【図７Ａ】誘導体化された12-ヒドロキシドデカン酸（12.297分でのピーク）の質量スペクトルを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。質量スペクトルは、大腸菌株sAS.321の抽出物によるものである。
【図７Ｂ】誘導体化された12-ヒドロキシドデカン酸の基準標準物質の質量スペクトルを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図７Ｃ】誘導体化されていない12-ヒドロキシドデカン酸（11.393分でのピーク）の質量スペクトルを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。質量スペクトルは、大腸菌株sAS.321の抽出物によるものである。
【図８Ａ】誘導体化された12-ヒドロキシドデカン酸（12-トリメチルシリルオキシドデカン酸トリメチルシリルエステル）のイオン断片化パターンを図示している。
【図８Ｂ】誘導体化されていない12-ヒドロキシドデカン酸のイオン断片化パターンを図示している。
【図９】ドデカン酸を与えた場合に12-ヒドロキシドデカン酸形成をもたらす、CYP153Aオペロンを発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。菌株sAS.335は、改良されたCYP153Aオペロンを発現する。
【図１０Ａ】ドデカン酸からの12-ヒドロキシドデカン酸の形成をもたらす、CYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。対照菌株MG1655 ΔfadDの抽出物も示されている。
【図１０Ｂ】ドデカン酸メチルエステルからの12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルの形成をもたらす、CYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。対照菌株MG1655 ΔfadDの抽出物も示されている。
【図１０Ｃ】ドデカノールからの1,12-ドデカンジオールの形成をもたらす、CYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。対照菌株MG1655 ΔfadDの抽出物も示されている。
【図１１Ａ】菌株sAS.336の抽出物からの誘導体化された1,12-ドデカンジオール（11.948分でのピーク）の質量スペクトルを描写している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１１Ｂ】誘導体化された1,12-ドデカンジオール基準標準物質の質量スペクトルを描写している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１２Ａ】菌株sAS.336の抽出物からの12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルの質量スペクトルを描写している。誘導体化されていない試料（11.662分でのピーク）が示されている。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１２Ｂ】菌株sAS.336の抽出物からの12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルの質量スペクトルを描写している。誘導体化された試料が示されている（11.107分でのピーク）。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１３Ａ】誘導体化を伴わない、1,12-ドデカンジオールのイオン断片化パターンを図示している。
【図１３Ｂ】誘導体化を伴わない、12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステルのイオン断片化パターンを図示している。
【図１４Ａ】グルコースからω-OH脂肪酸を産生するCYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はすべてBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図１４Ｂ】グルコースからω-OH脂肪酸メチルエステルを産生するCYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はすべてBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図１４Ｃ】グルコースからα,ω-ジオールを産生するCYP153A-RedRhF融合タンパク質を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はすべてBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図１５】ω-ヒドロキシ脂肪酸が産生細胞から効率的に分泌されることを実証している。
【図１６】グルコースを加えて増殖させた場合に2種の大腸菌株から産生されたω-ヒドロキシ脂肪酸の組成を示している。
【図１７】α,ω-二酸を産生させるCYP153A-RedRhF融合タンパク質、アルコールオキシダーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はすべてBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図１８Ａ】菌株sEP.690の抽出物からの誘導体化された1,14-テトラデカン二酸（13.367分でのピーク）の質量スペクトルを描写している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１８Ｂ】誘導体化された1,14-テトラデカン二酸の基準標準物質の質量スペクトルを描写している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図１９】図19Aは、誘導体化された1,14-テトラデカン二酸のイオン断片化パターンを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。
【図２０】末端近傍（例えば、ω-1、ω-2および/またはω-3）ヒドロキシル化脂肪酸を少量産生する、cyp102A1（F87A）を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。対照菌株AlcV334の抽出物のGC/MSクロマトグラフも示されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２１Ａ】11-ヒドロキシドデカン酸と同定された、RT 7.195から7.510までのピーク（図20から）の質量スペクトルを描写している。診断用イオン断片は、ヒドロキシル化位置について描写されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２１Ｂ】10-ヒドロキシドデカン酸と同定された、RT 7.195から7.510までのピーク（図20から）の質量スペクトルを描写している。診断用イオン断片は、ヒドロキシル化位置について描写されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２１Ｃ】9-ヒドロキシドデカン酸と同定された、RT 7.195から7.510までのピーク（図20から）の質量スペクトルを描写している。診断用イオン断片は、ヒドロキシル化位置について描写されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２１Ｄ】8-ヒドロキシドデカン酸と同定された、RT 7.195から7.510までのピーク（図20から）の質量スペクトルを描写している。診断用イオン断片は、ヒドロキシル化位置について描写されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２１Ｅ】7-ヒドロキシドデカン酸と同定された、RT 7.195から7.510までのピーク（図20から）の質量スペクトルを描写している。診断用イオン断片は、ヒドロキシル化位置について描写されている。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２２Ａ】グルコースからω-1、ω-2およびω-3ヒドロキシ脂肪酸を産生するcyp102A7タンパク質を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２２Ｂ】グルコースからω-1、ω-2およびω-3ヒドロキシ脂肪アルコールを産生するcyp102A7タンパク質を発現する組換え大腸菌株からの抽出物のGC/MSクロマトグラフを示している。試料はBSTFA＋1％TMCSによって誘導体化した。
【図２３Ａ】誘導体化された9-ヒドロキシドデカノール（9.653分でのピーク）の質量スペクトルおよびイオン断片化パターンを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。試料は大腸菌株XL963の抽出物由来である。
【図２３Ｂ】誘導体化された10-ヒドロキシドデカノール（9.808分でのピーク）の質量スペクトルおよびイオン断片化パターンを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。試料は大腸菌株XL963の抽出物由来である。
【図２３Ｃ】誘導体化された11-ヒドロキシドデカノール（9.905分でのピーク）の質量スペクトルおよびイオン断片化パターンを図示している。誘導体化剤はBSTFA＋1％TMCSとした。試料は大腸菌株XL963の抽出物由来である。
【図２４Ａ】cyp102A7を発現する組換え大腸菌株によってグルコースから産生された末端近傍（例えば、ω-1、ω-2および/またはω-3）ヒドロキシル化脂肪酸の量を示している。
【図２４Ｂ】cyp102A7を発現する組換え大腸菌株によってグルコースから産生された末端近傍ヒドロキシル化脂肪アルコールの量を示している。
【図２５】大腸菌株stEP.798によって産生されたω-ヒドロキシル化脂肪酸を示している。
【図２６】大腸菌株L1017によって産生されたα,ω-二酸を示している。
【図２７】CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合タンパク質バリアントを発現する微生物の培養の結果を示している。示されているように、V141Tを有するバリアント（SEQ ID：46）は、ω-ヒドロキシヘキサデセン酸を最も高い力価で産生し、ヘキサデセン酸からの変換も最も高度であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本明細書において言及される「ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体組成物」とは、組換え宿主細胞によって産生され、典型的には、さまざまな鎖長および/または飽和および/または分枝特性を有する、ある特定の種類のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体（例えば、さまざまな鎖長および/もしくは飽和および/もしくは分枝特性を持つα,ω-二酸；またはさまざまな鎖長および/もしくは飽和および/もしくは分枝特性を持つα,ω-ジエステル；またはさまざまな鎖長および/もしくは飽和および/もしくは分枝特性を持つα,ω-ジオール；など）の混合物を含む。場合によっては、ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体組成物は、ほとんど1種類のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体、例えば、1,12-ドデセンジオールまたは1,14-テトラデカンジオールまたは16-ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステルまたは16-ヒドロキシ-ヘキサデセン酸または15-ヒドロキシ-ペンタデカン酸または15-ヒドロキシペンタデセン酸または18-ヒドロキシオクタデセン酸、またはこれらの脂肪酸誘導体のメチルエステルなどを含む。さらに別の場合には、ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体組成物は、特別に設計された組成物を得る目的で、複数の種類のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体の混合物を含む（例えば、同一の組成物中で約20％が1,12-ドデセンジオール、約80％が1,16-ヘキサンデカンジオールであるものは、そのような一例を与えると考えられる）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
1つの態様において、グルコースなどの再生可能な原料を用いてω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体を生成する経路は、図1から4までに描写されている。グルコースは生来の生物によってアシル-ACPに変換される（図1から4までにおける段階1を参照）。脂肪酸分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意で、所望の産物に応じて減弱させることができる（実施例、下記を参照）。そのようなポリペプチドの非限定的な例には、アシル-CoAシンテターゼ（FadD）およびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ（FadE）がある。表1は、当技術分野において公知の方法に従って任意で減弱させることができる、さまざまな脂肪酸分解酵素を含む代謝経路内にある酵素活性（下記）の包括的リストを提示している（例えば、前記の米国特許第8,283,143号を参照）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
もう1つの態様において、図2Aおよび2Bは、中間体としてのメチルエステルを介する、α,ω-二酸およびω-アミノ脂肪酸を含むさまざまな化合物の生成を示している。図2Bの段階6は、（アシル-CoAリガーゼ/トランスフェラーゼを用いる）α,ω-ジエステルの生成を示している。図2Aおよび2Bの段階2では、エステルシンターゼを使用して、アシル-ACPを脂肪酸メチルエステル（FAME）に変換させる。ある態様において、エステルシンターゼをコードする遺伝子は、酵素分類EC 2.3.1.75またはEC 2.3.1.20の酵素をコードするもの、ホホバ、アシネトバクター属種ADP1、アルカニボラックス・ボルクメンシス、緑膿菌、ファンジバクター・ジャデンシス（Fundibacter jadensis）、シロイヌナズナもしくはアルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）由来の二官能性エステルシンターゼ/アシル-CoA：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるwax/dgatをコードするもの、またはAtfA1、AtfA2、ES9もしくはES8をコードするもの、またはそれらのバリアントである（この段階を触媒させるために用いうるエステルシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドを示している、前記の表9も参照）。段階3では、ω-ヒドロキシラーゼ（またはω-オキシゲナーゼ）を用いて、ω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルを生成させている（例えば、前記の表2Aは、この段階を触媒させるために用いうる酵素活性を有するポリペプチドを示している）。図2Aに見てとれるように、脂肪酸メチルエステルのω位はヒドロキシ基である。図2Aの段階3では、アルコールデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼが、ω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルをω-オキソ脂肪酸メチルエステルにさらに変換させることができる（例えば、前記の表3Aは、この段階を触媒させることができるアルコールデヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼの酵素活性を有するポリペプチドを示している）。同様に、経路はここから二通りの択一的な経路をとることができ、すなわち、一方の経路は、アルデヒドデヒドロゲナーゼもしくはオキシダーゼを介して（前記の表3Bを参照）、かつ最後にエステラーゼもしくはリパーゼ（前記の表5を参照）を介するか、または化学変換によって、ω-オキソ脂肪酸メチルエステルをα,ω-二酸に変換させる；一方、もう1つの経路は、アミノトランスフェラーゼまたはトランスアミナーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼを介して（前記の表4を参照）かつ最後にエステラーゼまたはリパーゼ（前記の表5を参照）を介して、ω-オキソ脂肪酸メチルエステルをω-アミノ脂肪酸に変換させる。最後の段階（すなわち、エステラーゼまたはリパーゼが、α,ω-脂肪酸メチルエステルまたはω-アミノ脂肪酸メチルエステルの、示されている最終産物への変換を触媒する）は、酵素的ならびに化学的な変換段階の結果であってよい。例えば、この段階を加水分解しうる適した酵素は、表5に列記されている。選択されるリパーゼ（EC 3.1.1.3）またはエステラーゼ（EC 3.1.1.1）は、周辺質に位置するか、または上清中に分離される。適した分泌シグナルまたはアンカー配列は、当技術分野において公知の方法に従って操作することができる。もう1つの態様において、図2Bは、α,ω-脂肪酸ジメチルエステルを介したα,ω-二酸の生成を示している。この経路は図2Aの左側の分枝に類似しているが、これは別のアシ���-CoAシンターゼ/アシル-CoAリガーゼまたはトランスフェラーゼを用いる（適した候補については前記の表7を参照）。第1の段階を触媒するエステルシンターゼ/アシルトランスフェラーゼは、最後から2つ目の段階も触媒する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
1つの態様において、本開示の実施に用いるためのCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28またはSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、およびSEQ ID NO：46に対して少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、グリシン（G）がアラニン（A）で置換されている、マリノバクター・アクアエオレイ由来のCYP153A（G307A）ポリペプチドに由来し、ロドコッカス属種NCIMB9784由来のP450RhFのレダクターゼドメインに融合している。シトクロムP450RhFは自給型であり、高度な基質非特異性（substrate promiscuity）を示し、広範な官能基を触媒する。他の態様において、本開示の実施に用いるためのCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、またはSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44またはSEQ ID NO：46に対して、少なくとも約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％の配列同一性を有し、さらに、本明細書に記載されたような有用な特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換を含んでもよい。他の態様において、本開示の実施に用いるためのCYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28またはSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、またはSEQ ID NO：46に対して、100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、または90％の配列同一性を有する。さらに他の態様において、CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのP450触媒ドメインは、マリノバクター・アクアエオレイ以外の種に由来する。そのような他の種は、以下を非限定的に含む：アシネトバクター属種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属種、アルカニボラックス・ボルクメンシス、バークホルデリア・フンゴラム（Burkholderia fungorum）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、ハイフォモナス・ネプチュニウム（Hyphomonas neptunium）、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属種、マイコバクテリウム属種。さらに他の態様において、CYP153A-レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのレダクターゼドメインは、ロドコッカス属種以外の種に由来する。そのような他の種は、以下を非限定的に含む：ロドコッカス・エクイ、アシネトバクター・レイディオレジステンス、鼻疽菌、鼻疽菌、ラルストニア・ユートロファ、カプリアビダス・メタリデュランス。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
いくつかの態様において、組換え宿主細胞によって産生される1種または複数種のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体の産生能は、少なくとも100mg/L/時、少なくとも200mg/L/時、少なくとも300mg/L/時、少なくとも400mg/L/時、少なくとも500mg/L/時、少なくとも600mg/L/時、少なくとも700mg/L/時、少なくとも800mg/L/時、少なくとも900mg/L/時、少なくとも1000mg/L/時、少なくとも1100mg/L/時、少なくとも1200mg/L/時、少なくとも1300mg/L/時、少なくとも1400mg/L/時、少なくとも1500mg/L/時、少なくとも1600mg/L/時、少なくとも1700mg/L/時、少なくとも1800mg/L/時、少なくとも1900mg/L/時、少なくとも2000mg/L/時、少なくとも2100mg/L/時、少なくとも2200mg/L/時、少なくとも2300mg/L/時、少なくとも2400mg/L/時または少なくとも2500mg/L/時である。例えば、本開示の方法による組換え宿主細胞によって産生される1種または複数種のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体の産生能は、500mg/L/時〜2500mg/L/時、または700mg/L/時〜2000mg/L/時であり得る。1つの特定の態様において、産生能は、約0.7g/L/h〜約3g/L/hである。産生能は、所与の組換え宿主細胞培養物により産生される特定のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体に関するものでも、複数種のω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体の組合せに関するものでもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
ω-ヒドロキシ脂肪酸の例には、8-ヒドロキシオクタン酸、10-ヒドロキシデセン酸、10-ヒドロキシデカン酸、12-ヒドロキシドデセン酸、12-ヒドロキシドデカン酸、14-ヒドロキシテトラデセン酸、14-ヒドロキシテトラデカン酸、16-ヒドロキシヘキサデセン酸、16-ヒドロキシヘキサデカン酸、18-ヒドロキシオクタデセン酸、および18-ヒドロキシオクタデカン酸が非限定的に含まれる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
ω-ヒドロキシ-脂肪酸メチルエステルの例には、8-ヒドロキシオクタン酸メチルエステル、10-ヒドロキシデセン酸メチルエステル、10-ヒドロキシデカン酸メチルエステル、12-ヒドロキシドデセン酸メチルエステル、12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、14-ヒドロキシテトラデセン酸メチルエステル、14-ヒドロキシテトラデカン酸メチルエステル、16-ヒドロキシヘキサデセン酸メチルエステル、16-ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル、18-ヒドロキシオクタデセン酸メチルエステル、および18-ヒドロキシオクタデカン酸メチルエステルが非限定的に含まれる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
ω-アミノ脂肪酸の例には、8-アミノオクタン酸、10-アミノデセン酸、10-アミノデカン酸、12-アミノドデセン酸、12-アミノドデカン酸、14-アミノテトラデセン酸、14-アミノテトラデカン酸、16-アミノヘキサデセン酸、16-アミノヘキサデカン酸、18-アミノオクタデセン酸、および18-アミノオクタデカン酸が非限定的に含まれる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
ω-アミノ脂肪酸メチルエステルの例には、8-アミノオクタン酸メチルエステル、10-アミノデセン酸メチルエステル、10-アミノデカン酸メチルエステル、12-アミノドデセン酸メチルエステル、12-アミノドデカン酸メチルエステル、14-アミノテトラデセン酸メチルエステル、14-アミノテトラデカン酸メチルエステル、16-アミノヘキサデセン酸メチルエステル、16-アミノヘキサデカン酸メチルエステル、18-アミノオクタデセン酸メチルエステル、および18-アミノオクタデカン酸メチルエステルが非限定的に含まれる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
ω-オキソ脂肪酸の例には、8-オキソオクタン酸、10-オキソデセン酸、10-オキソデカン酸、12-オキソドデセン酸、12-オキソドデカン酸、14-オキソテトラデセン酸、14-オキソテトラデカン酸、16-オキソヘキサデセン酸、16-オキソヘキサデカン酸、18-オキソオクタデセン酸、および18-オキソオクタデカン酸が非限定的に含まれる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
ω-オキソ脂肪酸メチルエステルの例には、8-オキソオクタン酸メチルエステル、10-オキソデセン酸メチルエステル、10-オキソデカン酸メチルエステル、12-オキソドデセン酸メチルエステル、12-オキソドデカン酸メチルエステル、14-オキソテトラデセン酸メチルエステル、14-オキソテトラデカン酸メチルエステル、16-オキソヘキサデセン酸メチルエステル、16-オキソヘキサデカン酸メチルエステル、18-オキソオクタデセン酸メチルエステル、および18-オキソオクタデカン酸メチルエステルが非限定的に含まれる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
α,ω-二酸の例には、1,8-オクタン二酸、1,10-デセン二酸、1,10-デカン二酸、1,12-ドデセン二酸、1,12-ドデカン二酸、1,14-テトラデセン二酸、1,14-テトラデカン二酸、1,16-ヘキサデセン二酸、1,16-ヘキサデカン二酸、1,18-オクタデセン二酸、1,18-オクタオクタデカン二酸が非限定的に含まれる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
実施例1：ω-ヒドロキシ脂肪酸誘導体の生産のための組換え大腸菌株の培養
菌株を、ルリア-ベルターニ（LB）培地中で一晩かけて増殖させた。培養物を新鮮なLB培地中に1：10に希釈し、32℃で2〜3時間（h）増殖させた上で、規定FA2培地（下記の表10を参照）中に再び1：10に希釈した。いくつかの実験では、培地に0.5mM δ-アミノレブリン酸および微量ビタミン溶液を加えた。スペクチノマイシン（100μg/ml）またはカナマイシン（50μg/ml）などの抗生物質を、菌株が各々の抗生物質耐性マーカーを有するプラスミドを含む場合には添加した。32℃での4〜5時間の増殖後に、培養物を1mM IPTGによって誘導し、同じ温度でさらに16〜18時間培養した。いくつかの実験では、誘導時にドデカン酸、ドデカノールまたはドデカン酸メチルエステルを最終濃度1g/Lで添加した。脂肪酸メチルエステルの誘導体を産生させることを目的とする培養物には、誘導時にメタノール（2％、v/v）を加えた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
この実験では、マリノバクター・アクアエオレイ由来のcyp153A（G307A）P450触媒タンパク質、ならびにロドコッカス属種NCIMB9784由来のP450RhFのc末端FMNおよびFe/Sを含有するレダクターゼドメインで構成されるハイブリッド-融合タンパク質をコードする遺伝子を、以下の通りに作り出した：cyp165A（G307A）_Maqu遺伝子をpAS.022から増幅させて、コドンが最適化された合成P450RhFレダクターゼドメインと、クロスオーバーPCRによって融合させた。その結果得られた融合遺伝子（SEQ ID NO：5）を、その転写がIPTG誘導性Ptrcプロモーターによって制御されるように、pCL1920派生物（すなわち、SC101レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）中にクローニングした。このプラスミドをpAS.023と命名し（前記の表11を参照）、大腸菌MG1655 ΔfadDに形質転換導入して菌株sAS.336を得た（前記の表12を参照）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
全体として、菌株stEP675は以下のω-ヒドロキシ脂肪酸を産生した：12-ヒドロキシドデセン酸、12-ヒドロキシドデカン酸、14-ヒドロキシテトラデセン酸、14-ヒドロキシテトラデカン酸、16-ヒドロキシヘキサデセン酸、16-ヒドロキシヘキサデカン酸、および18-ヒドロキシオクタデセン酸（図14A参照）。菌株stEP682は、以下のω-ヒドロキシ脂肪酸を産生した：12-ヒドロキシドデセン酸、12-ヒドロキシドデカン酸、14-ヒドロキシテトラデセン酸、14-ヒドロキシテトラデカン酸、16-ヒドロキシヘキサデセン酸、および16-ヒドロキシヘキサデカン酸。菌株stEP677は、ω-ヒドロキシ脂肪酸に加えて、以下のω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルも産生した：12-ヒドロキシドデカン酸メチルエステル、14-ヒドロキシテトラデカン酸メチルエステル、および16-ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル（図14Bを参照）。菌株stEP684は、ω-ヒドロキシ脂肪酸に加えて、以下のω-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルも産生した：14-ヒドロキシテトラデカン酸メチルエステル、16-ヒドロキシヘキサデセン酸メチルエステル、および16-ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル。菌株stEP676は、以下のα,ω-ジオールを産生した：1,12-ドデセンジオール、1,12-ドデカンジオール、1,14-テトラデカンジオール、1,16-ヘキサデセンジオール、および1,16-ヘキサンデカンジオール（図14C）。菌株stEP685は以下のα,ω-ジオールを産生した：1,14-テトラデカンジオール、1,16-ヘキサデセンジオール、および1,16-ヘキサンデカンジオール。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
35℃  Nlim培養プロトコール：
（96ウェルプレート中で増殖させたLB培養物からの）40μLのLB培養物を用いて360μLのLB培地（表21、後述）に接種し、続いてそれを32℃で振盪しながらおよそ4時間インキュベートした。LB播種物（seed）の40μLを用いて、360μLのNlim培地に接種した。2時間32℃で増殖させた後に、培養物をIPTG（最終濃度1mM）によって誘導した（表21、後述）。特記されない限り、培養物を続いて35℃で振盪しながら20時間インキュベートし、その後にそれらを、以下に詳述する標準的な抽出プロトコールに従って抽出した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
実施例15：cyp153A（G307A）-Red450RhF融合タンパク質のP450触媒ドメインの飽和ライブラリー
CYP153A-Red450RhF融合タンパク質のP450触媒ドメインの完全飽和ライブラリーを構築し、CYP153A（G307A）-Red450RhF（すなわち、鋳型ポリペプチド）を上回る改善を示すバリアントに関してスクリーニングした。G307A（位置307におけるグリシン残基がアラニンで置き換えられている）は、CYP153Aのω-ヒドロキシラーゼ活性を向上させる有益な突然変異である（Honda Malca et al. (2012) Chem. Commun. 48:5115を参照）。ヒットに関する選択基準は、（1）ω-ヒドロキシ脂肪酸の量（ωOHFFA力価）の増大；および/または（2）脂肪酸のω-ヒドロキシ脂肪酸への変換の増加とした。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
図25は、30.5℃で72時間のうちに菌株stEP.798によって産生されたω-ヒドロキシル化脂肪酸の量を示しており、それは72時間後に16.0g/Lという高い力価に達した。産生されたω-ヒドロキシル化脂肪酸は、ω-ヒドロキシヘキサデセン酸（C16：1）が63.1％、ω-ヒドロキシヘキサデカン酸（C16：0）が26.4％、ω-ヒドロキシテトラデカン酸（C14：0）が7.6％、ω-ヒドロキシテトラデセン酸（C14：1）が1.9％、ならびに少量のω-ヒドロキシドデセン酸（C12：0）およびω-ヒドロキシドデセン酸（C12：1）（C12が1％未満）からなっていた。加えて、stEP.798は、72時間の時点で3.0g/Lの脂肪酸も産生した。結論として、脂肪酸を過剰産生する大腸菌株における改良されたハイブリッドCYP153A-Red450RhF融合タンパク質の発現により、再生可能な糖質原料からの高力価でのω-ヒドロキシル化脂肪酸産生が可能になった。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
図26は、30.5℃で48時間のうちに菌株L1017によって産生されたα,ω-二酸の量を示している。この菌株は、31時間の時点で21.2g/Lのα,ω-二酸を産生し、それは48時間後には23.9g/Lという高い力価に達した。産生されたα,ω-二酸は、α,ω-ドデカン酸（C12：0）が85.9％、α,ω-ドデセン酸（C12：1）が4.7％、α,ω-テトラデカン酸（C14：0）が5.7％、α,ω-テトラデセン酸（C14：1）が2.9％、および少量のα,ω-ヘキサデセン酸（C16：1）（C16が1％未満）からなっていた。加えて、L1017は、48時間の時点で9.3g/Lの脂肪酸も産生した。ω-ヒドロキシ脂肪酸は微量でしか検出されなかった。結論として、脂肪酸を過剰産生し、アルコールオキシダーゼ（alkJ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（alkH）の共発現を伴う大腸菌株における、改良されたハイブリッドCYP153A-Red450RhF融合タンパク質の発現により、再生可能な糖質原料からの高力価でのα,ω-二酸産生が可能になった。