【手続補正書】
【提出日】平成29年1月23日(2017.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１に記載のグルコース酸化酵素であって、２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するグルコース酸化酵素、または
ｂ）ｂ）のグルコース酸化酵素が２つのアミノ酸置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、前記配列番号１におけるＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；Ｖ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を有するという条件で、ａ）のグルコース酸化酵素に少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高いアミノ酸配列同一性を示すグルコース酸化酵素、ただし、
ｂ）のグルコース酸化酵素は、ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素活性を示し、および、ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素特異性を示し、かつ
ｂ）のグルコース酸化酵素は、配列番号１のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より５倍低下された活性を示す、または配列番号１のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より１．５倍増大された活性を示すか、またはその両方であり、
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のグルコース酸化酵素の活性フラグメントであって、ただし、ｃ）の活性フラグメントにおいて、ａ）またはｂ）において記載されるようなアミノ酸置換が、ａ）またはｂ）に記載のグルコース酸化酵素と比較して保持されており、かつ
ｃ）のグルコース酸化酵素は、ａ）のグルコース酸化酵素の酵素活性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素活性を示し、および、ａ）のグルコース酸化酵素のグルコースに対する酵素特異性の少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、または９０％より高い酵素特異性を示し、かつ
ｃ）のグルコース酸化酵素は、配列番号１に記載のグルコース酸化酵素の、電子受容体としての酸素に対する活性より５倍低下された活性を示すか、または配列番号１に記載のグルコース酸化酵素の、酸素以外の電子受容体に対する活性より少なくとも１．５倍増大された活性を示すか、またはその両方である、
からなる群より選択される、配列番号１に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項２】
電子受容体としての酸素に対する前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸バッファー（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによって測定されており、
酸素以外の電子メディエーターの前記活性が、以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される請求項１記載のグルコース酸化酵素。
【請求項３】
前記酸素以外の電子メディエーターが、ニトロソアニリンおよびその誘導体、アゾ化合物、フェナジンおよびその誘導体、フェノチアジンおよびその誘導体、フェノキサジンおよびその誘導体、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化カリウム、Ｒｕ−およびＯＳ−錯体、キノンおよびその誘導体、インドールフェノール、ビオロゲン、テトラチアフルバレンおよびその誘導体、ならびに、フタロシアニンを含む群より選択される請求項１または２記載のグルコース酸化酵素。
【請求項４】
配列番号１に記載の２つの置換Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖに加えて、配列番号１に記載のＳ５３；Ａ１３７；Ａ１７３；Ａ３３２；Ｆ４１４；およびＶ５６０の群より選択される６つの位置のうちの任意の位置に、追加の、２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのアミノ酸置換を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項５】
前記追加の置換のためのアミノ酸は、置換アミノ酸が配列番号１の対応する位置に存在するものとは別のものである限り、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌの群より選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項６】
前記追加の置換のためのアミノ酸が、
Ｓ５３位におけるＰｈｅ；および／または
Ａ１３７位におけるＳｅｒ、Ｌｅｕ；および／または
Ａ１７３位におけるＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ；および／または
Ａ３３２位におけるＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ；および／または
Ｆ４１４位におけるＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ；および／または
Ｖ５６０位におけるＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ
の群より選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項７】
配列番号１に記載の前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、Ｆ４１４および／またはＶ５６０の位置における少なくとも１つの追加のアミノ酸置換が、Ａ１３７および／またはＡ１７３および／またはＡ３３２の位置における少なくとも１つのアミノ酸置換と組み合わせられている請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項８】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号４に記載のＡ１７３Ｉ；Ａ３３２Ｓ；およびＦ４１４Ｌの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項９】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号３に記載のＡ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｓ；Ｆ４１４Ｉ；およびＶ５６０Ｔの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１０】
前記Ｔ３０ＶおよびＩ９４Ｖの置換に加えて、配列番号６に記載のＡ１７３Ｖ；Ａ３３２Ｎ；Ｆ４１４Ｖ；およびＶ５６０Ｌの前記追加のアミノ酸置換を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１１】
以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのそれぞれの糖である基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによって測定される場合に、少なくとも９９．９％のグルコース特異性および／または４％未満のガラクトース特異性および／または０．３％未満のマルトース特異性および／または６％未満のキシロース特異性および／または０．１％未満のマルトトリオース特異性を示す請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１２】
以下の工程
ａ）７５μＬの酵素溶液が平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）１００μＬのメディエーター溶液（１９．０５ｍＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−４−ニトロソアニリン）；５％（ｗ／ｗ）ポリビニルピロリドン、ｐＨ７および２０μＬの２５ｍＭ  りんモリブデン酸が添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の１分間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）りんモリブデン酸還元の反応速度がマイクロプレートリーダーを用いて７００ｎｍでモニターされる工程
を含むメディエーターアッセイによる配列番号１のＧＯｘのニトロソアニリンメディエーター活性と比較して、４００％より大きい、または５００％より大きい、または６００％より大きい電子移動のためのニトロソアニリンメディエーターに対する活性を示し、かつ
以下の工程
ａ）７５μＬのサンプル酵素溶液が１００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含む平底９６ウェルマイクロプレートへと移される工程
ｂ）２０μＬの反応混合物が、以下の濃度、０．９１Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）；２．３ｍＭ  ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、をもたらすようにそれぞれのウェルへと添加される工程
ｃ）２５μＬのグルコース基質溶液を添加することおよびその後の３０秒間の１０００ｒｐｍでのプレートの振とうによって反応が開始される工程
ｄ）ＡＢＴＳの酸化がマイクロプレートリーダーを用いて４１４ｎｍで速度論的に測定される工程
を含むＡＢＴＳアッセイによる配列番号１のＧＯｘの酸素活性と比較して、３０％以下、または２５％未満、または２０％未満、特には１５％未満、または１０％以下の酸素活性を示す請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素またはその活性フラグメントをエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルコース酸化酵素またはその活性フラグメントによってエクスビボサンプルにおいてグルコースを検出する、決定する、または測定するための方法であって、前記検出、決定または測定が、エクスビボサンプルを前記グルコース酸化酵素またはその活性フラグメントに接触させることを含む方法。
【請求項１５】
グルコースの前記検出、決定または測定が、センサーまたはテストストリップ装置を使用して行われる請求項１４記載の方法。