(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチド。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ      （Ｉ）
【請求項２】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）を活性成分として含有するアンジオテンシン転換酵素阻害剤。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ      （Ｉ）
【請求項３】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）を活性成分として含有する血圧降下剤。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ      （Ｉ）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なペプチドに関する。また、本発明は、この新規なペプチドを活性成分として含有するアンジオテンシン転換酵素阻害剤に関する。さらに、本発明は、この新規なペプチドを活性成分として含有する血圧降下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）は、血圧の調節においてレニン−アンジオテンシン系に作用する酵素である。分子量約５７，０００のアンジオテンシノーゲンは、腎臓から血管中に移行するレニンによりアンジオテンシンＩに変換される。このアンジオテンシンＩは、殆ど血管収縮作用を示さない不活性型であるが、ＡＣＥにより活性型のアンジオテンシンＩＩに変換される。このアンジオテンシンＩＩについては、動脈末梢毛細血管の収縮作用［Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，  ｖｏｌ．１０８，  ｐ．１２９，  １９５３］、血管透過性増大［Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｒ．Ｗ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．１８９，  ｐ．２１９，  １９７５］  、交感神経におけるアドレナリン作動性の神経伝達促進［Ｂｅｌｌ，Ｃ．，  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．３１，  ｐ．３４８，  １９７２］  、副腎髄質からのカテコールアミンの放出促進作用及び副腎皮質からのアルドステロンの分泌促進［Ｂｉｒｏｎ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，  ｖｏｌ．４４，  ｐ．１１７１，  １９６５］などの作用が知られており、循環血流量の増加をもたらし、血圧が上昇する。また、血管拡張作用により血圧降下作用を示すブラジキニンは、ＡＣＥにより分解されるため、結果的に血圧が上昇する。一方、ＡＣＥ阻害物質は、上述したＡＣＥの作用を阻害するので、有効な血圧降下作用を有し、血圧降下剤の有効成分として有用であることが知られている。
【０００３】
近年、成人病の増加や高齢化による疾患の増加により、上述したような血圧降下作用を有する物質が脚光を浴びており、医薬として提供されるに至っているものもある。しかし、高血圧に関連する疾病は食事による影響が強いと言われており、高血圧の予防効果を有する物質としては、食品素材への利用性を有するものに対して大きな期待が持たれる。
【０００４】
そして、食品に含まれているＡＣＥ阻害物質としては、イワシ筋肉由来のたんぱく質分解ペプチド（日本水産製）  、オキアミからイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び逆層クロマトグラフィーにより単離したＡＣＥ阻害物質  ［河村幸雄ら，微量栄養素研究，  ｖｏｌ．７，  ｐ．３７，  １９９０］、トウモロコシたんぱく質由来のオリゴペプチド  ［特開平２−２４００２７号公報］  などが知られている。
【０００５】
さらに、乳たんぱく質カゼイン由来の分解物中にＡＣＥ阻害物質が多く存在することが知られている。すなわち、ヒトβカゼインのアミノ酸配列３９〜５２残基のペプチド［Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．５３，  ｐ．２１０７，  １９８９］  、ヒトκカゼインのアミノ酸配列４３〜５２残基のペプチド［Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．５４，  ｐ．８３５，  １９９０］、ウシαＳ１カゼインのアミノ酸配列２３〜３４残基及び  １９４〜１９９  残基のペプチド［Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．５１，  ｐ．２５５７，  １９８７］、ウシβカゼインのアミノ酸配列  １７７〜１８３  残基のペプチド［Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．，  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．５１，  ｐ．１５８１，  １９８７］  、カソキシンＣと称するウシκカゼインのアミノ酸配列２５〜３４残基のペプチド  ［戸塚護及び上野川修一，  日本畜産学会報，  ｖｏｌ．６３，  ｐ．８６７，  １９９２］などである。また、ウシカゼインをたんぱく質分解酵素で加水分解して得られるＡＣＥ阻害物質含有組成物として、ウシαカゼイン又はウシβカゼインの酵素分解物が高血圧の予防に有効であることが開示されている  ［特開平２−１６７０５２号公報］  。あるいは、ウシκカゼインのキモシン分解により生成するアミノ酸配列  １０６残基以後のペプチドであるウシκカゼイングリコマクロペプチドが血圧の上昇抑制効果を有することが開示されている  ［特開平６−３４５６６４号公報］  。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、食品素材として利用可能なＡＣＥ阻害活性を有する物質を見出すべく、鋭意研究を進めていたところ、チーズホエー中などに含まれているウシκカゼイングリコマクロペプチドのプロテアーゼ分解物中にＡＣＥ阻害活性を有する新規なペプチドを見出した。そして、動物実験を行ったところ、このペプチドが血圧を降下する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規なペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は、このペプチドを活性成分として含有するＡＣＥ阻害剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、このペプチドを活性成分として含有する血圧降下剤を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、食品素材として利用可能なＡＣＥ阻害活性を有する物質を見出すべく、甘性チーズホエーから得られるκカゼイングリコマクロペプチドについてもＡＣＥ阻害活性を調べたところ、κカゼイングリコマクロペプチドのたんぱく質分解酵素消化物中にＡＣＥ阻害活性を有する画分を見出した。そして、このＡＣＥ阻害活性を有する画分の活性本体を単離同定したところ、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドであることが判明した。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
【０００８】
このペプチドのアミノ酸配列は、κカゼイングリコマクロペプチドのアミノ酸配列２０〜２５残基に相当し、κカゼインのアミノ酸配列  １２５〜１３０  残基に相当するペプチドであった。
【０００９】
さらに、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドが、血圧降下作用を有することも確認した。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
【００１０】
本発明のペプチドを食品、化粧品、飼料あるいは医薬品に使用する場合には、精製品を用いても良いが、純度が低くても本発明のペプチドはＡＣＥ阻害活性が強いため、これらのペプチドを含む粗画分を用いても良いし、κカゼイングリコマクロペプチドのペプシン又はパパイン消化物をそのまま用いることもできる。また、化学合成により得られたものも用いることもできる。なお、ペプチドの化学合成法としては通常使用されている固相法などを用いることにより、例えば、アプライドバイオシステムズ社のペプチド合成機などで簡単にペプチドを合成することができる。さらに、本発明のペプチドのアミノ酸配列に相当する塩基配列を用いてＤＮＡを合成し、遺伝子操作により本発明のペプチドを製造することもできる。既に、ウシκカゼインの塩基配列は公知である［Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．１７８，  ｐ．３９５，  １９８８］  。したがって、遺伝子操作により本発明のペプチドを製造する際に使用する塩基配列としては、ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  が適当である。
【００１１】
次に、特に利用性の高い本発明のペプチドの製造法を説明する。
原料として有用であるκカゼイングリコマクロペプチドを得る方法としては、例えば、チーズホエーパウダーを溶解し、加熱した後、冷却し、エタノール沈澱して得られる上清を陰イオン交換樹脂により分画する方法［Ｓａｉｔｏ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．７４，  ｐ．２８３１，  １９９１］  、レンネットカゼインカードを調製する際に得られる排液を原料とし、この排液のｐＨを酸性領域に調製して生成する沈澱を除去し、次いで得られる上澄を脱塩する方法  ［特開昭  ６３−２８４１９９号公報］  、κカゼイングリコマクロペプチドを含有する乳質原料物質をｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を分画分子量５０，０００以下の膜を用いて濃縮する方法  ［特開平２−２７６５４２号公報］  、ホエー蛋白含有溶液を加熱した後、凍結して凍結物を得、更に該凍結物を解凍した後、ホエー蛋白と上清とを分離し、この上清を処理して上清を回収する方法  ［特開平３−２９４２９９号公報］  などにより、κカゼイングリコマクロペプチドを製造することが可能であるが、ここでは、いかなる方法で得られたκカゼイングリコマクロペプチドであっても良い。
【００１２】
このκカゼイングリコマクロペプチドをたんぱく質分解酵素で加水分解する。使用するたんぱく質分解酵素としては、ペプシンが好ましいが、パパインも使用可能である。また、酸加水分解により本発明のペプチドを調製することも可能である。なお、ペプシンを使用する場合、κカゼイングリコマクロペプチドに対しペプシンを重量比１／１０〜１／１００００  の割合で添加すれば良い。酵素反応は通常３０〜４０℃で行うが、酵素活性が認められる温度域であれば構わない。酵素反応に適したｐＨ領域は１〜５が好ましいが、ｐＨ４以上では反応にかなり時間を要するので、より好ましくはｐＨ１〜４である。酵素反応に使用する緩衝液としてはクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、塩化カリウム−塩酸緩衝液、（グリシン＋食塩）−塩酸緩衝液などを例示することができ、簡便的に塩酸溶液などの酸溶液でｐＨを調整して使用することもできる。反応時間は１０分間以上であり、好ましくは１〜４８時間である。反応時間が１０分間未満ではＡＣＥ阻害活性が２０％以下であり、４８時間を越えるとＡＣＥ阻害活性は６０％程度残存するが、反応時間が長くなると微生物汚染の問題やペプシン活性の低下などが起こり好ましくない。また、場合によっては反応途中でペプシンを再添加することもできる。酵素反応の停止は、  １００℃で５分間加熱して酵素を失活させることが簡便で良いが、冷アセトンを添加して濾別する処理や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質でｐＨを  ７．０に調整する処理を行っても良い。得られた溶液は必要に応じて濾過して沈澱を除去し、必要に応じてさらに減圧濃縮乾固、凍結乾燥又は噴霧乾燥を行う。また、逆浸透膜、電気透析膜、薄膜下降式濃縮などにより濃縮した後、乾燥粉末としても良い。このようにして得られた本発明のペプチドを含む粗画分は、１０〜  １００μｇ／ｍｌのオーダーでＡＣＥ阻害活性を示し、食品素材などとして充分に使用可能である。なお、急性毒性試験を行ったところ、本発明のペプチドは、経口で１ｇ／ｋｇ以上を示し、安全性の高いものであることが判明した。
【００１３】
本発明のペプチドの使用形態については特に制限がなく、溶液、粉、顆粒、錠剤などとして使用でき、各種飲食品、化粧品、飼料に添加でき、医薬品の原料として使用できる。本発明のペプチドは乳中より生成したものであるため、安全に使用することができる。また、本発明のペプチドの投与量は  １５０μｇ／ｋｇ／  日以上が好ましい。投与量が  １５０μｇ／ｋｇ／  日以下では血圧降下作用が弱くなる。
【００１４】
【参考例１】
チーズホエーパウダー１５０ｇに１２％（ｗ／ｖ）  濃度となるようトリクロロ酢酸溶液を加え、４℃で１時間振とう抽出した後、遠心分離（９，０００×ｇ、１５分間）  し、上清を回収して氷冷した。この上清を１Ｎ水酸化ナトリウムで中和し、透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｓａｌｅｓ  Ｃｏｒｐ．製）  で蒸留水に対して透析した後、遠心分離（９，０００×ｇ、１５分間）  し、上清を回収して凍結乾燥した。このようにして、純度８１％のκカゼイングリコマクロペプチド７ｇを得た。
【００１５】
【試験例１】
参考例１で調製したκカゼイングリコマクロペプチドについて、５種類のたんぱく質分解酵素を用い消化試験を行った。なお、酵素と緩衝液の組合せは以下の通りである。
（１）プロティナーゼＫ（シグマ製）と０．０１Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）
（２）アクチナーゼＥ（ナカライテスク製）と２０ｍＭ塩化カルシウム含有０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）
（３）ペプシン（シグマ製）と０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．０）
（４）トリプシン（シグマ製）と２０ｍＭ塩化カルシウム含有０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）
（５）パパイン（シグマ製）と３．３ｍｇ  シアン化ナトリウム及び３．３ｍｇ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）
【００１６】
各緩衝液１０ｍｌにκカゼイングリコマクロペプチドを１ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう溶解し、５％（ｗ／ｗ）  濃度の酵素を添加して充分に撹拌した。各試料は少量のトルエン共存下、３７℃で２４時間静置して酵素消化した。その後、反応液に３倍量の冷アセトンを加え、−２０℃で１時間放置した後、溶液を濾過し、凍結乾燥して試験試料とした。そして、各試験試料１ｍｇを  ２００μｌ  の蒸留水に溶解した後、この試験試料溶液１５μｌ  を蒸留水で  １５０μｌ  に希釈してＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
0003567012.tif 000002
【００１８】
なお、ＡＣＥ阻害活性の測定は、以下のように行った。
まず、ＡＣＥ（うさぎ肺由来、和光純薬工業製）１ユニットを５０％グリセロール溶液２ｍｌに溶解してＡＣＥ酵素溶液（Ａ）を調製した。また、馬尿酸−ヒスチジルロイシン５３．６８８ｍｇを１Ｍ食塩含有ホウ酸緩衝液（ｐＨ  ７．８）１０ｍｌに溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ  ８．３に調整した基質溶液（Ｂ）を調製した。
【００１９】
中型のネジ付き試験管に被験液  １５０μｌ  、基質溶液（Ｂ）  １００μｌ  及びＡＣＥ酵素溶液（Ａ）１０μｌ  を添加し、３７℃で６０分間反応させた後、反応を停止させるために各試験管に酢酸エチル  １．５ｍｌをガラス製ピペットで加え、キャップをしてからボルテックスミキサーで１５秒振とうすることにより抽出した。抽出後、１，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して得られた上層（酢酸エチル）部を他の小型ネジ付き試験管に移し、８０℃、窒素ガス噴霧下で酢酸エチルを蒸発乾固させた。この蒸発乾固させた試料を８０℃、１０分間処理し、室温に戻した後、  ０．９％食塩溶液  ３．０ｍｌを加え、１５秒間ボルテックスミキサーで振とうして溶解し、直ちに  ２２８ｎｍの紫外部吸光度を測定した。そして、以下の式によりＡＣＥ阻害活性を算出した。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝｛（ＥＣ  −ＥＳ  ）／（ＥＣ  −ＥＢ  ）｝×１００
ＥＳ  ：  被験液  １５０μｌ  を添加した試料の吸光度
ＥＣ  ：  被験液の代わりに蒸留水  １５０μｌ  を添加したコントロールの吸光度
ＥＢ  ：  被験液の代わりに蒸留水  １５０μｌ  を添加し、反応開始直後に反応を停止させた試料の吸光度
【００２０】
表１に示したように、各種たんぱく質分解酵素消化物のＡＣＥ阻害活性は、ペプシンで最も強く、パパインでもわずかに認められた。そこで、ペプシン消化物中のＡＣＥ阻害活性を有する物質を探索した。
【００２１】
【参考例２】
１ｍｇ／ｍｌ濃度となるようκカゼイングリコマクロペプチドを０．１Ｎ塩酸に溶解した溶液１０ｍｌに５％（ｗ／ｗ）  濃度のペプシンを添加し、３７℃で２４時間静置して消化した後、  １００℃で正確に５分間加熱して酵素反応を停止した。そして、この反応液を濾過し、凍結乾燥してκカゼイングリコマクロペプチドのペプシン消化物を得、これを試料とした。
【００２２】
ブチルトヨパール（東ソー製）  １０ｍｌを９０％メタノールで洗浄した後、蒸留水で洗浄し、カラム（１．７×１２ｃｍ）  に充填した。次に、上述の試料を１０ｍｇ／５ｍｌ濃度となるよう蒸留水に溶解し、カラムに添加した。そして、カラムに蒸留水  ２００ｍｌを流した後、１０％刻みで調製した１０％〜  １００％濃度のメタノール溶液各  １００ｍｌで段階溶出した。この各溶出画分について、画分中のメタノールを減圧濃縮し、凍結乾燥した後、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したところ、非吸着画分に７０％のＡＣＥ阻害活性が認められた。そこで、この非吸着画分をさらに精製した。
【００２３】
【参考例３】
参考例２で得られた非吸着画分を９ｍｇ／５ｍｌ濃度となるよう蒸留水に溶解したものを試料とした。
リクロプレップＲＰ１８  （メルク製）１０ｇを９０％メタノールで洗浄した後、蒸留水で洗浄し、カラム（１．７×１２ｃｍ）  に充填した。次に、上述の試料をカラムに添加し、蒸留水  ２００ｍｌを流した後、１０％刻みで調製した１０％〜  １００％濃度のメタノール溶液各  １００ｍｌで段階溶出した。この各溶出画分について、画分中のメタノールを減圧濃縮し、凍結乾燥した後、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したところ、１０％〜２０％濃度のメタノール溶出画分に９０％以上の強いＡＣＥ阻害活性が認められた。また、３０％〜６０％濃度のメタノール溶出画分にも５０％〜１５％のＡＣＥ阻害活性が認められた。そこで、１０％〜６０％濃度のメタノール溶出画分を回収し、ＡＣＥ阻害活性粗画分とした。
【００２４】
【参考例４】
参考例３で得られたＡＣＥ活性粗画分を７ｍｇ／５ｍｌ濃度となるよう蒸留水に溶解し、リクロプレップＲＰ１８  （メルク製）  によるリクロマトグラフィーを行った。そして、５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、３０％及び９０％濃度のメタノール溶液で段階溶出した。この各溶出画分について、画分中のメタノールを減圧濃縮し、凍結乾燥した後、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したところ、５％濃度のメタノール溶出画分、１０％濃度のメタノール溶出画分及び１２％濃度のメタノール溶出画分に強いＡＣＥ阻害活性が認められた。そこで、これらの画分についてさらに精製した。
【００２５】
【参考例５】
参考例４で得られた活性画分について、ＯＤＰ−５０  （アサヒパック製、  ７．６×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。カラムは、０．０５％トリフルオロ酢酸含有１０％アセトニトリル水溶液（Ａ）で平衡化し、溶離液（Ｂ）として、０．０５％トリフルオロ酢酸含有６０％アセトニトリル水溶液を用い、３０分間で溶離液（Ｂ）のアセトニトリルが５０％となるようにグラジュエント溶出した。なお、流速は  ０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。その結果、リテンションタイムで１０分〜１８分までの画分に強いＡＣＥ阻害活性が認められたので、この画分を回収し、さらに精製した。
【００２６】
【参考例６】
参考例５で得られた活性画分について、スペリオレックスＯＤＳ（資生堂製、  ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。カラムは、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ）でカラムを平衡化し、溶離液（Ｂ）として、０．０５％トリフルオロ酢酸含有６０％アセトニトリル水溶液を用い、溶離液（Ｂ）のアセトニトリルが５０％となるようにグラジュエント溶出した。なお、流速は  ０．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。その結果、図１に示すように単一ピークが認められ、これを分取してアミノ酸配列を決定した。
【００２７】
【参考例７】
参考例６で得られた単一ピークについて、アミノ酸配列を決定するために、アミノ酸シークエンサー（４７３Ａ型、アプライドバイオシステムズ製）を使用し、試料１μｇ  をＰＶＤＦ膜にドットブロットして分析した。その結果、ＡＣＥ阻害活性を有する物質の本体は、下記のアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明した。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
【００２８】
【参考例８】
参考例７でアミノ酸配列を確認したペプチドのＡＣＥ阻害活性を確認するために、ペプチドを合成した。ペプチドの化学合成は、ペプチドシンセサイザー  （４３０Ａ型、アプライドバイオシステムズ製）  を用い、ｔ−Ｍｏｃ法で行った。すなわち、  ０．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ｌ−Ｃｌｎ−Ｏ−ＣＨ２  −ＰＡＭ樹脂及び２ｍｍｏｌの構成アミノ酸をペプチドシンセサイザーに充填して合成を行い、目的のペプチドを結合した樹脂を得た。この樹脂１．５ｇに結合しているペプチドをチオアニソール及びエタンジチオール存在下、トリフルオロメタンスルホン酸により切り出し、ジエチルエーテルで沈澱させた後、１０％酢酸で溶解し、同じく１０％酢酸で置換した強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒｅｘ  ＭＳＺ  １−Ｘ８）に通して精製し、ペプチド  １４０ｍｇを得た。このペプチドをさらにＡｑｕａｐａｃ  ＲＰ−３００  （アプライドバイオシステムズ製）  による逆相ＨＰＬＣで、溶出液として  ０．１％トリフルオロ酢酸／水及び  ０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルを用い精製し、ペプチド白色粉末３０ｍｇを得た。そして、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を表２に示す。なお、参考例６で精製したペプチドについてもＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００２９】
【表２】
0003567012.tif 000003
【００３０】
【試験例２】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドの血圧改善効果について、確認した。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
４週令の高血圧を自然発症するＳＨＲ／ＮＣｒｉラット（日本チャールズリバーより購入）を下記に示したような群に分け、動物実験を行った。
Ａ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを  ３００μｇ／日投与
Ｂ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを３０μｇ／日投与
Ｃ群：アミノ酸配列（Ｉ）ペプチドを３μｇ／日投与
Ｄ群：ペプチド未投与
【００３１】
１群５匹とし、カゼインを含まないＣＥ−２（クレア製）を飼料として６週間飼育した。各試験試料は１日２回、強制投与し、飲料水は自由摂取とした。そして、６週間後の血圧を測定した。その結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
0003567012.tif 000004
数値は、平均値±標準偏差で示した。Ａ群及びＢ群において、有意に血圧低下作用が認められた。
【００３３】
【実施例１】
特開平２−２７６５４２号公報に記載された方法に従い、ホエーたんぱく質濃縮物（ＷＰＣ）１ｋｇからκカゼイングリコマクロペプチド  ５０ｇを得た。このκカゼイングリコマクロペプチド５０ｇ  を水１，２５０ｇに溶解し、塩酸でｐＨを  １．５に調整した後、ペプシン  （シグマ製）  ０．５ｇを添加し、３７℃で１５時間酵素反応を行った。酵素反応の停止は  １００℃で５分間の加熱処理により行い、濾紙（アドバンテック製）  で濾過した後、凍結乾燥してκカゼイングリコマクロペプチドのペプシン消化物  ３７ｇを得た。次に、この消化物３７ｇ  を蒸留水１，８５０ｇに溶解し、蒸留水で平衡化したバイオシルＣ１８ＨＬ（バイオラッド製）５ｋｇを充填したカラム  （２０ｃｍ×２０ｃｍ）  に添加し、蒸留水でカラムを洗浄した後、６０％メタノール水溶液で溶出した。そして、この溶出画分を減圧濃縮し、凍結乾燥して活性画分  １２ｇを得た。さらに、この活性画分  ３００ｍｇを０．１  ％トリフルオロ酢酸含有２％アセトニトリル水溶液１ｍｌに溶解し、  ０．１％トリフルオロ酢酸含有２％アセトニトリル水溶液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔ  カラム  （５５ｍｍ×６０ｃｍ、東ソー製）  に添加し、  ０．１％トリフルオロ酢酸含有５０％アセトニトリル水溶液でグラジュエント溶出した。そして、ＡＣＥ阻害活性が認められたアセトニトリル濃度１０％付近の単一ピークを分取した。この操作を繰り返して分取した画分を遠心乾燥機で濃縮し、凍結乾燥してペプチド１．８ｇを得た。
【００３４】
そして、スーペリオレックスＯＤＳ  （４．６ｍｍ×１５０ｍｍ  、資生堂製）  で確認したところ、このペプチドの純度は９３％であった。また、アミノ酸シークエンサーでアミノ酸分析を行ったところ、このペプチドは下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドであった。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
本発明者らは、上記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドをκカゼイノシンと命名した。
【００３５】
【実施例２】
０．５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ｌ−Ｃｌｎ−Ｏ−ＣＨ２  −ＰＡＭ樹脂及び２ｍｍｏｌの構成アミノ酸をペプチドシンセサイザー  （４３０Ａ型、アプライドバイオシステムズ製）  に充填して合成を行い、目的のペプチドを結合した樹脂を得た。この樹脂１．５ｇに結合しているペプチドをチオアニソール及びエタンジチオール存在下、トリフルオロメタンスルホン酸により切り出し、ジエチルエーテルで沈澱させた後、１０％酢酸で溶解し、同じく１０％酢酸で置換した強塩基性陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒｅｘ  ＭＳＺ  １−Ｘ８）に通して精製し、ペプチド  １４０ｍｇを得た。このペプチドをさらにＡｑｕａｐａｃ  ＲＰ−３００  （アプライドバイオシステムズ製）  による逆相ＨＰＬＣで、溶出液として  ０．１％トリフルオロ酢酸／水及び  ０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルを用い精製し、２０％アセトニトリルで溶出した画分からペプチドの白色粉末３０ｍｇを得た。このペプチドについて、アミノ酸シークエンサーでアミノ酸分析を行ったところ、下記のアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドであった。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
【００３６】
【実施例３】
斉藤らの方法［Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．７４，  ｐ．２８３１，  １９９１］に従い、チーズホエー粉１ｋｇからκカゼイングリコマクロペプチド  １３ｇを得た。このκカゼイングリコマクロペプチド１３ｇ  をクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）  ０．３３リットルに溶解し、ペプシン  （シグマ製）０．０１ｇを添加し、３２℃で４８時間酵素反応を行った。酵素反応の停止は冷アセトン１．９５リットルを添加することにより行った後、エバポレータで  ０．５リットルとなるまで濃縮し、凍結乾燥して活性画分１１ｇ  を得た。この活性画分について、試験例１に示した方法と同様の方法によりＡＣＥ阻害活性を測定したところ、  １００μｇ／ｍｌにＡＣＥ阻害活性が  １００％存在した。
【００３７】
【実施例４】
特開平２−２７６５４２号公報に記載された方法に従い、チーズホエー粉１ｋｇからκカゼイングリコマクロペプチド１７ｇ  を得た。このκカゼイングリコマクロペプチド１７ｇ  を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）６５リットルに溶解した後、パパイン  （シグマ製）０．１７ｇを添加し、３７℃で２０時間酵素反応を行った。酵素反応の停止は、冷アセトン１．９５リットルを添加することにより行った。そして、この反応液をエバポレーターで  ０．５リットルとなるまで濃縮し、凍結乾燥してκカゼイングリコマクロペプチドのパパイン消化物１５ｇ  を得た。なお、このパパイン消化物について、試験例２に示した方法でＡＣＥ阻害活性を測定したところ、  １００μｇ／ｍｌにＡＣＥ阻害活性が９％存在していた。
【００３８】
【実施例５】
実施例１で得られたペプチドを配合したドリンク剤を試作した。
本発明のペプチド１５０ｍｇ  、ショ糖３．２ｇ、クエン酸５３ｇ  、クエン酸ナトリウム５３ｇ  、ビタミンＢ２  ０．０６ｇ  、ビタミンＣ  ０．３７ｇ、葉酸０．０３ｇ  、香料６．７ｇ、５倍濃縮アップル果汁１３４ｇ及び水３．５Ｋｇ  を混合した組成物を９０℃、１０秒保持して加熱殺菌した後、５〜１０℃に冷却して殺菌済容器中に貯蔵した。次いで、この混合液を殺菌済の  ３５０ｍｌ容器に無菌充填し、高血圧予防用ドリンク剤を製造した。
【００３９】
【実施例６】
実施例２で得られたペプチドを配合した錠剤を試作した。本発明のペプチド２０ｍｇ、乳糖３３．３ｍｇ、トウモロコシデンプン１６．４ｍｇ、カルボキシメチルセルロースカルシウム１２．８ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム１．５ｍｇ  を配合し、常法に従って高血圧抑制用錠剤を製造した。
【００４０】
【実施例７】
実施例３で得られた本発明のペプチドを含む活性画分を配合した動物用飼料を試作した。本発明のペプチドを含む活性画分１ｇ、脱脂粉乳６０ｇ  、ホエーたんぱく質濃縮物（ＷＰＣ）１４．３ｇ  、脂肪１７．２ｇ  、グルコース５．０ｇ、ビタミン２．５ｇ及びミネラル２．５ｇを配合して動物用飼料を製造した。
【００４１】
【実施例８】
実施例１で得られたペプチドを配合した高血圧予防用ミルクを試作した。本発明のペプチド７５０ｍｇ  、脱脂乳１，１９５ｇ、ホエー粉２６３ｇ、植物油脂１１９ｇ及びビタミン・ミネラル類５ｇを配合した高血圧予防用粉ミルクを製造した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のペプチドは乳由来の安全性の高いペプチドであり、注射剤、糖衣錠、タブレット、カプセルなどとして、あるいは、清涼飲料水、果汁飲料、発酵飲料、ゼリー、アイスクリームなどの各種飲食品に添加して、高血圧症治療及び予防の目的で使用できる。また、化粧品に添加して、血管拡張作用を付与することもできる。さらには、動物飼料に添加して、家畜や動物の高血圧治療及び予防の目的で使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例６におけるＨＰＬＣの結果を示す。
【図１】
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