(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合によって連なった約８〜約３０個のヌクレオチドを含んでなるアンチセンス化合物であって、ヒトリンパ球機能関連抗原３をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、該ヒトリンパ球機能関連抗原３の発現を調節するアンチセンス化合物であり、その核酸塩基配列が配列番号２、４、５、７、８及び９からなる群より選択されるアンチセンス化合物。
【請求項２】
ヒトリンパ球機能関連抗原３をコードする核酸の領域と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、該領域が、終止コドン領域であり、かつ核酸塩基配列が配列番号１９に含まれる配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項３】
ヒトリンパ球機能関連抗原３の膜貫通イソ型の発現を調節するが、該ヒトリンパ球機能関連抗原３の可溶性又はホスファチジルイノシトール連結イソ型の発現は調節しない、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
１種類以上の修飾された連結、１種類以上の修飾された核酸塩基及び１種類以上の糖修飾からなる群より選択される１つ以上の化学修飾を含んでなる、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
リンパ球機能関連抗原３とＣＤ２との相互作用を遮断又は制限する方法であって、リンパ球機能関連抗原３を発現する細胞を１種類以上の請求項１に記載のアンチセンス化合物と接触させることを含んでなる方法。
【請求項６】
１種類以上の請求項１に記載のアンチセンス化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項７】
食事性送達用に配合されている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
コロイド分散系中に配合されている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物であって：
（ａ）共有結合によって連なった８〜３０個のヌクレオチドを含んでなり、ヒトリンパ球機能関連抗原３をコードする第１核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、該ヒトリンパ球機能関連抗原３の発現を調節する第１アンチセンス化合物であり、その核酸塩基配列が配列番号２、４、５、７、８及び９からなる群より選択されるアンチセンス化合物；及び
（ｂ）共有結合によって連なった８〜３０個のヌクレオチドを含んでなり、リンパ球機能関連抗原３より他のヒト遺伝子産物をコードする第２核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、かつ該リンパ球機能関連抗原３より他のヒト遺伝子産物の発現を調節する第２アンチセンス化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
リンパ球機能関連抗原３より他のヒト遺伝子産物が、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１及びＢ7 タンパク質からなる群より選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
医薬組成物であって：
（ａ）共有結合によって連なった８〜３０個のヌクレオチドを含んでなり、ヒトリンパ球機能関連抗原３をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、該ヒトリンパ球機能関連抗原３の発現を調節する１種類以上のアンチセンス化合物であり、その核酸塩基配列が配列番号２、４、５、７、８及び９からなる群より選択されるアンチセンス化合物；及び
（ｂ）１種類以上の非アンチセンスベースの化学療法剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物であって：
（ａ）共有結合によって連なった８〜３０個のヌクレオチドを含んでなり、ヒトリンパ球機能関連抗原３をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を含んでなり、該ヒトリンパ球機能関連抗原３の発現を調節する１種類以上のアンチセンス化合物であり、その核酸塩基配列が配列番号２、４、５、７、８及び９からなる群より選択されるアンチセンス化合物；及び
（ｂ）１種類以上の非アンチセンスベースの抗ウイルス剤又は抗生物質を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
ＬＦＡ−３を発現する細胞によるＴ細胞の刺激又は活性化を制限し、遮断し、又は防止する方法であって、ＬＦＡ−３を発現する単離された細胞を有効量の１種類以上の請求項１に記載のアンチセンス化合物と接触させることを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、ヒトＬＦＡ−３（別名ＣＤ５８抗原）を含むリンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）タンパク質を検出し、かつそのレベルを調節するための組成物及び方法を提供する。特には、本発明は、ＬＦＡ−３タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物に関する。
【０００２】
ＬＦＡ−３は特定の細胞−細胞相互作用に介在する。したがって、ＬＦＡ−３の発現を調節することで、そのような細胞−細胞相互作用及びその結果生じる、例えば、炎症のような効果の制御が見込まれる。したがって、本発明は、ＬＦＡ−３介在プロセスを検出するための診断方法、並びにそれぞれそれを防止し、又は阻害するための予防及び治療方法に向けられている。さらに、本発明は、ＬＦＡ−３タンパク質の異常発現に関連する状態の治療に向けられている。また、本発明は、ＬＦＡ−３タンパク質発現の調節に対応する、疾患状態又は障害の治療、診断、及び研究用試薬にも関する。細胞の過剰増殖の阻害、並びにそれに対応する予防、一時的緩和及び治療効果が本発明のアンチセンス化合物での治療から生じる。
【０００３】
【発明の背景】
細胞−細胞相互作用は様々な生物学的プロセスの特徴である。例えば、免疫応答の活性化において、通常の炎症応答で最も初期に検出し得る現象の１つは、血管内皮への白血球の接着とそれに続く脈管構造から感染又は損傷部位への白血球の移動である。血管内皮への白血球への接着は、脈管構造外部へのそれらの移動における必須工程である（再検討のためには、Ａｌｂｅｌｄａ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９９４， ８， ５０４を参照）。当該技術分野において公知のように、細胞−細胞相互作用は、それぞれ液性及び細胞性免疫応答の増強を生じるＢリンパ球及びＴリンパ球の両者の増殖にも重要である。
【０００４】
幾つかの場合には、ある細胞型の他のものへの接着に細胞表面の膜上に位置する“接着分子” と呼ばれる特定のタンパク質間の相互作用が介在する。接着分子間の相互作用は、リガンドが可溶性である代わりに細胞表面に固定されていることを除いて、古典的な受容体リガンド相互作用に類似する。細胞−細胞相互作用に介在する、（ペプチド配列によって）関連する生物学的に重要な分子の群の１つは当該技術分野においてＣＡＭ（細胞性接着分子）として公知である。ＣＡＭには、例えば、幾つかの細胞間接着分子（すなわち、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３）、内皮白血球接着分子１（ＥＬＡＭ−１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、及び血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）が含まれる。このＣＡＭファミリーそのものは遺伝子の免疫グロブリン・スーパーファミリーの一部である（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９０， ２４７， １２１９ ）。
細胞：細胞相互作用においては、第１の細胞上に存在する所定の細胞性接着分子が第２の細胞上に存在する１つ以上のリガンドと結合する。例えば、ＩＣＡ−１がＬＦＡ−１と結合し、ＬＦＡ−３がＣＤ２と結合し、等。このような相互作用は以下のように簡潔に表すことができる：
細胞．１−ＬＦＡ−３  ＋  ＣＤ−細胞．２  →
細胞．１−ＬＦＡ−３：ＣＤ２−細胞．２
【０００５】
所定の細胞性接着分子がそのリガンドに結合することで多くの結果がもたらされる可能性があり、これには（１）２個の細胞が特定の期間密着したままでいる能力を促進し、その間分子（例えば、抗原）を一方から他方に直接受け渡しできること、及び／又は（２）例えば、第２細胞において、第１細胞の接着分子とリガンドとの相互作用の結果生じる第２細胞のリガンドの立体配座の変化又は化学的変化による細胞性の応答（すなわち、シグナル伝達）の開始が含まれる。後者の場合、適切な接着分子のフリーの（すなわち、細胞と会合していない）可溶性形態が、第２細胞の表面リガンドに結合してそれにより同じであるか、又は類似の細胞性応答を誘発することが可能である。そのような接着分子の可溶性イソ型は、膜結合リガンドと競合的に結合させ、それによって細胞：細胞相互作用を低下させるか、もしくは阻害し、及び／又は細胞：細胞解離（ｄｅ−ａｄｈｅｓｉｏｎ ）を生じさせるため、イン・ビボで生成させることもできる。ＬＦＡ−３及びＣＤ２を例として用いると、そのような反応は以下のように簡潔に図示することができ、ここで“ｓＣＤ２” は過剰に存在する可溶性形態のＣＤ２を示す：
【０００６】
細胞．１−ＬＦＡ−３：ＣＤ２−細胞．２  ＋  ｓＣＤ２  →
細胞．１−ＬＦＡ−３：ｓＣＤ２  ＋  ＣＤ２−細胞．２
当該技術分野において公知のように、細胞：細胞相互作用は、様々な免疫応答における調節及び／エフェクター細胞である胸腺誘導リンパ球（Ｔ細胞）の活性化において重要な役割を果たす。すなわち、Ｔ細胞のあるもの（例えば、ヘルパー細胞）は、免疫系の他の細胞を、例えば、そのような他の細胞を刺激して分子性免疫反応活性を生じさせる因子を産生及び放出することによって調節するように作用する。他のＴ細胞［例えば、細胞毒性、細胞溶解性又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞］は、例えば、外来性又は異常抗原を有する標的細胞を溶解することにより、免疫反応活性を直接生じる。いずれの場合においても、免疫応答におけるＴ細胞の刺激及び抗原特異性には、Ｔ細胞と、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との細胞：細胞相互作用が介在する（Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９８８， ２， ２５８４）。分子レベルでは、これらの細胞：細胞相互作用にはＴ細胞及びＡＰＣ上に存在する接着分子が介在する  （Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９８８， ２， ２５８４；Ｍａｋｇｏｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １９８９， １０， ４１７ ）。
【０００７】
幾つかの型の接着分子がＴ細胞とＡＰＣとの相互作用の介在に関係する。これらには、少なくとも３種類のリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２及びＬＦＡ−３；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８２， ７９， ７４８９）及びＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３を含む）が含まれる。本発明はＬＦＡ−３の機能の修飾因子に迫るものであり、そのリガンド／受容体がＣＤ２である。ＣＤ２は、主として、ヘルパー細胞及びＮＫ細胞を含むＴ細胞上に発現し、これに対してＬＦＡ−３は胸腺細胞及び幾つかのＴ細胞を除く全てのヒト細胞上に発現する（Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９８８， ２， ２５８４）。
【０００８】
ＬＦＡ−３タンパク質は様々な細胞型の表面上に発現する糖タンパク質である（ＬＦＡ−３及び関連タンパク質の再検討のためには、Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９１， ９， ２７ を参照） 。ＬＦＡ−３は胸腺上皮細胞との胸腺細胞の相互作用並びに標的細胞及びＡＰＣとのＴリンパ球の抗原依存性及び抗原非依存性相互作用に介在する上で役割を果たす  （Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９８７， １６６， ９２３）。この相互作用は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のＴ細胞認識をも強化し得る（Ｓｅｌｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８７， ３２６， ４００ ）。また、ＬＦＡ−３は幾つかの過剰増殖性疾患、例えば、骨髄腫にも関連する（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．， １９９７， ９７， ８１ ；Ｔａｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９６， ８７， ８３７）。さらに、ＬＦＡ−３は、特定のウイルス、例えば、サイトメガロウイルスに感染した細胞において上方調節され、又はそれらの複製を強化する（Ｇｒｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９３， ７８， ４０５）。
【０００９】
ＬＦＡ−３が免疫応答、腫瘍形成及び他の疾患状態に関連する細胞プロセスに関与するため、ＬＦＡ−３の発現の阻害剤が、（１）自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、特には、甲状腺の自己免疫障害、例えば、バセドウ病、及び望ましくない免疫応答、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）；（２）様々な炎症性疾患又は炎症又はＴ細胞介在要素を伴う障害、例えば、様々な形態の関節炎；同種移植片拒絶；喘息；クローン病を含む腸の炎症性疾患；様々な皮膚科学的状態、例えば、感染；など、並びに癌、腫瘍、及びそれらの成長及び広がり（転移）を含むがこれらに限定されるものではない様々な過剰増殖性疾患又は障害に対する活性を有する新規治療クラスの免疫抑制剤及び／又は抗炎症剤及び／又は抗癌剤をもたらすことが期待される。
【００１０】
現在まで、ＬＦＡ−３の発現を効率的に防止する既知治療薬は存在しない。細胞性接着分子に影響を及ぼす現在の作用因子には接着分子のリガンドのモノクローナル抗体及びポリペプチド可溶性形態が含まれる。ＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体は、ＬＦＡ−３の発現による急性炎症性応答の治療に有用であるものと立証される可能性がある。しかしながら、膜結合ＬＦＡ−３への抗体の結合はリガンド（ＣＤ２）の結合を模倣し、したがって、ＣＤ２の結合がブロックされるにも関わらずシグナル伝達を刺激する可能性がある；ＬＦＡ−３の発現を低下させ、又は阻害する化合物、例えば、本発明のアンチセンス化合物は、リガンド及びシグナル伝達の両者をブロックするはずである。さらに、長期にわたる治療では、宿主動物がモノクローナル抗体に対する抗体を産生し、それによりそれらの有用性が制限される。加えて、モノクローナル抗体は巨大タンパク質であり、炎症部位に接近するのが困難である可能性がある。ポリペプチド形態の細胞接着分子は、それらの生成の経費及びそれらの低い結合親和性に加えて、モノクローナル抗体と同じ多くの制限を受ける。さらに、ＬＦＡ−３は膜貫通又は膜結合タンパク質であり、ＬＦＡ−３から誘導されるポリペプチドはしばしば水溶液に不溶性であり、これがそれらの治療上の潜在的可能性を制限する（Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９１， ９， ２７ ）。したがって、ＬＦＡ−３を有効に阻害する分子に対する長期間探られたきた要求が存在する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＦＡ−３の効果をブロックするのに用いられる現在の作用因子の多くの落とし穴を回避する。このようなアンチセンス化合物がＬＦＡ−３タンパク質の発現を調節し得ることは見出されている。
【００１１】
【関連技術】
公開ＰＣＴ特許出願 ＷＯ ９２／０４４６３及び ＷＯ ９２／１６５６３はＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体を開示し、そのような抗体が関節リューマチ、自己免疫疾患及び他の疾患の治療及び診断において有用なものであり得ることを示している。
公開ＰＣＴ特許出願 ＷＯ ９１／１３９８１、ＷＯ ９３／０６８５２ 及び ＷＯ ９６／３３２１７はＬＦＡ−３タンパク質及びそれらの断片を開示し、これらのポリペプチドを自己免疫疾患及び移植片拒絶の阻止に用いることができることを示している。
公開ＰＣＴ特許出願 ＷＯ ９３／０６８６６は、ＬＦＡ−３：ＣＤ２相互作用の非アンチセンスベースの阻害剤を用いる、皮膚状態の予防及び治療方法を開示する。
公開ＥＰＯ特許出願 ＥＰ ０ ７８６ ２５５ Ａ１は、ＣＤ２と結合するＬＦＡ−３又はＬＦＡ−３と結合するＣＤ２の可溶形態及び結合体を開示し、これらの化合物を同種移植片又は異種移植片寛容を改善するのに用いることができることを示している。
【００１２】
米国特許第 ４，９５６，２８１号、第 ５，１８５，４４１号及び第 ５，３５４，６６５号はＬＦＡ−３をコードするヌクレオチド配列及びＬＦＡ−３ポリペプチドの産生方法を開示する。
米国特許第 ５，５４７，８５３号は、診断及び治療目的に有用であることが示される、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインに対応するペプチドを開示する。
米国特許第 ５，５５６，９４３号はヒツジＬＦＡ−３タンパク質配列及びそれらの誘導体を開示し、そのようなポリペプチドが白血病の治療に有用であることを示している。
【００１３】
【発明の要旨】
本発明によると、ＬＦＡ−３タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物が提供される。本発明の特定のアンチセンス化合物はＬＦＡ−３タンパク質をコードする遺伝子から翻訳されるｍＲＮＡに直接結合するか、又はその選択されたＤＮＡ部分に結合し、それによりそれらの発現を調節するようにデザインされている。本発明の特別な態様においては、ＬＦＡ−３タンパク質、及びそれをコードする遺伝子はヒトを含む哺乳動物のものである。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物、及び本発明のアンチセンス化合物の様々な使用方法もここに提供される。
【００１４】
【発明の詳しい説明】
オリゴヌクレオチドは、同一性及び数が特定の核酸との特異的ハイブリダイゼーションを生じるのに十分なヌクレオチド配列を含み得る。このようなオリゴヌクレオチドは、一般に、“アンチセンス” と記述される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、研究用試薬、診断補助薬及び治療薬として用いられる。ヒトＬＦＡ−３を含むリンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３；別名ＣＤ５０抗原）をコードする遺伝子がこのアプローチに特に馴染むことが発見されている。より具体的には、本発明は、ＬＦＡ−３の発現を調節する、オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物に向けられている。
【００１５】
アンチセンス化合物でＬＦＡ−３タンパク質の発現を調節する方法がここで提供され、これらはＬＦＡ−３の発現と特定の過剰増殖性及び炎症性疾患との関連性の結果として治療的及び診断的に有用であるものと信じられる。また、これらの方法は、例えば、様々な細胞機能並びに生理学的プロセス及び状態におけるＬＦＡ−３の役割を検出及び決定する上でのツールとして、並びにそのような発現及び活性化に関連する状態の診断に有用でもある。
【００１６】
ＬＦＡ−３と正常及び異常細胞−細胞相互作用との関連性の結果として、ＬＦＡ−３タンパク質の発現を阻害することが、例えば、様々な望ましくない免疫応答性現象並びに腫瘍形成性及び／又は転移性現象の阻害につながり、したがって、そのような現象の望ましくない結果を調節することが期待される。このような調節は様々な炎症性及び過剰増殖性障害又は疾患の治療に（すなわち、予防的、一時的緩和及び／又は治療効果をもたらすのに）望ましい。このようなＬＦＡ−３、及び他のＣＡＭの阻害は、さらに、そのような疾患又は障害の傾向にあることが疑われ、又はその傾向にあることが知られる動物においてそのような疾患又は障害の発症を防止又は調節するのに望ましい。
【００１７】
また、本発明は、本発明のアンチセンス化合物を用いて様々なＬＦＡ−３介在炎症性並びに腫瘍形成性及び／又は転移性現象を阻害する方法も含む。異常又は過剰ＬＦＡ−３発現及び／又はＬＦＡ−３介在炎症が生じる状態を治療する方法も提供される。これらの方法は本発明のアンチセンス化合物を用いるもので、治療的に、並びに臨床研究用及び診断用ツールとして有用であるものと信じられる。本発明のオリゴヌクレオチドは研究の目的で用いることもできる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドが示す特異的ハイブリダイゼーションを検定、精製、細胞産生物の調製に用い、及び当業者に認められ得る他の方法論において用いることができる。
【００１８】
本発明は、タンパク質（ＬＦＡ−３）をコードするＤＮＡ又は伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能を調節し、その調節が望ましいので、最終的にそのタンパク質の発現を調節するアンチセンス化合物を用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとそのｍＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションはｍＲＮＡの正常な役割を妨害し、細胞におけるその機能の調節を引き起こす。妨害しようとするｍＲＮＡの機能には、全ての生命維持機能、例えば、そのＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転位置、そのＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、そのＲＮＡのスプライシングして１種類以上のｍＲＮＡ種を生じること、及び、おそらくは、そのＲＮＡによって関わり合い得る独立した触媒活性さえ含まれる。そのようなｍＲＮＡ機能の妨害の効果全体はタンパク質の発現の調節であり、ここで“調節” はそのタンパク質の発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の脈らにおいては、阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態である。
【００１９】
特定の遺伝子をアンチセンス攻撃の標的とすることが好ましい。オリゴヌクレオチドを関連核酸に“標的設定する” ことは、本発明の脈絡においては、多工程プロセスである。このプロセスは、通常、機能を調節しようとする核酸配列を同定することで開始される。これは、例えば、その発現が特定の障害又は疾患状態に関連する細胞性遺伝子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、又は感染性作用因子に由来する外来核酸であり得る。本発明においては、標的は過剰増殖性障害に関連する細胞性遺伝子である。この標的設定プロセスには、所望の効果、タンパク質の発現の検出もしくは調節のいずれか、が生じるようにオリゴヌクレオチド相互作用を起こすための、この遺伝子内の部位（１つもしくは複数）の決定も含まれる。ひとたび標的部位（１つもしくは複数）が決定されたら、その標的に対して十分相補的であり、すなわち、特異的にハイブリダイズし、かつ十分な特異性を有していて所望の効果をもたらすオリゴヌクレオチドを選択する。一般には、アンチセンス調節用に標的とすることができる遺伝子の幾つかの領域が存在する：５’ “キャップ” 、これはｍＲＮＡの最も５’ 側の残基にトリホスフェート連結によって結合するＮ７−メチル化グアノシンを含む（Ｂａｋｅｒ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３ Ｉｎ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９３， ｐａｇｅｓ ３７−５３ ）；５’ 非翻訳領域（以下、“５’ −ＵＴＲ” ）、翻訳開始コドン領域（以下、“ＡＵＧ” 領域）、読取り枠（以下、“ＯＲＦ” ）又は“コーディング領域” 、翻訳終結コドン領域（以下、“終止コドン” 領域又は略して単純に“終止” ）及び３’ 非翻訳領域（以下、“３’ −ＵＴＲ” ）。当該技術分野において公知のように、これらの領域は典型的な伝令ｍＲＮＡ分子において以下の順序で配置されている（左から右、５’ から３’ ）：キャップ、５’ −ＵＴＲ、ＡＵＧ、ＯＲＦ、終止コドン、３’ −ＵＴＲ。当該技術分野において公知のように、幾つかの真核生物転写体は直接翻訳されるが、多くのＯＲＦは“イントロン” として知られる１つ以上の配列を含み、これはそれが翻訳される前に転写体から切除される；ＯＲＦの発現（非切除）部分は“エキソン” と呼ばれる（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， １９８３， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４１１−４１５ ）。さらに、多くの真核生物ＯＲＦは長さが１０００ヌクレオチド以上であるため、ＯＲＦを、例えば、５’ ＯＲＦ領域、中央ＯＲＦ領域、及び３’ ＯＲＦ領域に細分することがしばしば好都合である。幾つかの場合には、ＯＲＦは、イン・ビボでの幾らかの機能的重要性のために標的とされ得る１つ以上の部位を含む。後者の型の部位の例には、遺伝子内ステム−ループ構造（例えば、米国特許第 ５，５１２，４３８号を参照）及び、未処理ｍＲＮＡ分子においては、イントロン／エキソン・スプライス部位が含まれる。
【００２０】
本発明の脈絡の中では、好ましい遺伝子内部位の１つは、その遺伝子の読取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンを包含する領域である。当該技術分野において公知のように翻訳開始  （ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）コドンは典型的には５’ −ＡＵＧ（翻訳されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’ −ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは“ＡＵＧコドン” 、“開始（ｓｔａｒｔ ）コドン” 又は“ＡＵＧ開始コドン” とも呼ばれる。少数の遺伝子はＲＮＡ配列５’ −ＧＵＧ、５’ −ＵＵＧ又は５’ −ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’ −ＡＵＡがイン・ビボで機能することが示されている。さらに、５’ −ＵＵＵがイン・ビトロで翻訳開始コドンとして機能する（Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， １９９０， ４， ４５ ；Ｇｅｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９０， １６， １７３ ；Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｓｔｏｒｍｏ， ｉｎ： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， １９８７， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐ． １３０３）。したがって、“翻訳開始コドン” 及び“開始コドン” という用語は、各々の場合における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物）ではあるが、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物及び原核生物の遺伝子は２つ以上の代替開始コドンを有することがあり、そのいずれもが、異なるアミノ末端配列を有する関連ポリペプチドを生成するため、特定の細胞型もしくは組織における、又は特定の条件の組の下での翻訳開始に優先的に利用され得ることも当該技術分野において公知である。本発明の脈絡においては、“開始コドン” 及び“翻訳開始コドン” は、そのようなコドンのヌクレオチド配列（１つ又は複数）に関係なく、イン・ビボにおいてＬＦＡ−３タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するのに用いられるコドン（１つ又は複数）を指す。遺伝子の翻訳終結コドン（すなわち“終止コドン” ）が３つの配列、すなわち、５’ −ＵＡＡ、５’ −ＵＡＧ及び５’ −ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’ −ＴＡＡ、５’ −ＴＡＧ及び５’ −ＴＧＡ）のうちの１つを有し得ることも当該技術分野において公知である。“開始コドン領域” 及び“翻訳開始領域” という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’ 又は３’ ）に約５０の近接（隣接）ヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を指す。同様に、“終止コドン領域” 及び“翻訳終結領域” という用語は、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’ 又は３’ ）に約５０の近接（隣接）ヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を指す。
この詳細な説明の残りは、（１）本発明のアンチセンス化合物、及び（２）生物学的均等物、及び（３）それらの例示的な有用性に加え、（４）本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物、及び（５）それらの投与方法により詳細に関する。
【００２１】
１．本発明のアンチセンス化合物：本発明はＬＦＡ−３タンパク質を調節するアンチセンス化合物を用いる。“アンチセンス化合物” という用語は、（ａ）具体的には、ＬＦＡ−３タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし得る核酸塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをペプチド核酸（ＰＮＡ）に加えて含み、かつ（ｂ）具体的には、生物学的起源のリボザイム及び核酸は排除する。本発明の脈絡において、“オリゴヌクレオチド” という用語はリボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらの模倣体のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語には、天然核酸塩基、糖及び共有糖間（主鎖）連結を含むオリゴヌクレオチドに加えて、同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば、細胞の取り込みの強化、核酸標的に対する親和性の強化及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加のため、しばしば天然形態よりも好ましい。本発明のアンチセンス化合物はイン・ビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス分子のイン・ビボ合成を指示するように設計された遺伝学的ベクター構築体は含まない。
【００２２】
本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０の核酸塩基、より好ましくは約１２〜約２８、最も好ましくは約２０〜約２６の核酸塩基を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び幾つかの望ましい修飾の考察は Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， １９９５， ２８， ３６６に見出すことが出きる。
オリゴヌクレオチドは一般にヌクレオチドとして知られる反復単位のポリマーである。非修飾（天然）ヌクレオチドは３つの成分を有する：（１）窒素含有複素環塩基であって、その窒素原子のうちの１つによって（２）５−ペントフラノシル糖に連結する塩基及び（３）その糖の５’ 又は３’ 炭素原子のうちの１つにエステル化されているリン酸。オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるとき、第１ヌクレオチドのリン酸も第２の隣接する分子の隣接糖に３’ −５’ リン酸連結によってエステル化される。
【００２３】
当該技術分野において公知のように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常複素環塩基である。そのような複素環塩基の２種類の最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドはそれ自体の糖部分に共有的に連結するリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに対しては、リン酸基はその糖の２’ 、３’ 又は５’ ヒドロキシル部分のいずれかに連結することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドを互いに共有的に連結して直鎖ポリマー化合物を形成する。この直鎖ポリマー構造のそれぞれの末端がさらに結合して環状構造を形成することができるが、本発明の脈絡のうちでは、開いた直鎖構造が一般に好ましい。
【００２４】
このオリゴヌクレオチド構造のうちでは、リン酸基はそのオリゴヌクレオチドの糖間“主鎖” を形成するものと言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結又は主鎖は３’ から５’ へのホスホジエステル連結である。オリゴヌクレオチド（又は他のアンチセンス化合物）の主鎖は一連の塩基を特定の順序に位置付ける；通常は、他に指示されない限り、５’ から３’ の順に記述される、この順序付けられた塩基の系列の記述表示はヌクレオチド又は核酸塩基配列として知られる。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは同一性及び数が特定の核酸との特異的ハイブリダイゼーションを生じるのに十分であるヌクレオチド配列を含むことができる。遺伝子のセンス鎖の一部に特異的にハイブリダイズするようなオリゴヌクレオチドは、一般に、“アンチセンス” と記述される。本発明の脈絡においては、“ハイブリダイゼーション” は相補的ヌクレオチド間の水素結合を意味し、これはワトソン・クリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型水素結合であり得る。例えば、アデニン及びチミンは水素結合の形成によって対を形成する相補的核酸塩基である。“相補的” は、ここで用いられる場合、２つのヌクレオチドの間で正確に対を形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができるのであれば、そのオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡはその位置で互いに相補的であるもの考えられる。オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡとは、各分子内で十分な数の対応する位置が互いに水素結合可能であるヌクレオチドで占められるとき、互いに相補的である。
【００２６】
したがって、“特異的にハイブリダイズ可能” 及び“相補的” は十分な程度の相補性、すなわち、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が生じるような正確な対形成を示すのに用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、核酸二重鎖内部における特定のパートナー核酸塩基の間での塩基対の形成により、その標的配列と特異的にハイブリダイズ可能である。天然核酸塩基のうち、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）に結合し、かつアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）に結合する。ＡのパートナーとしてのＵ（ＲＮＡ）及びＴ（ＤＮＡ）の等価性に加えて、他の天然核酸塩基等価物が公知であり、これには５−メチルシトシン及び５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）（Ｃ等価物）、並びに５−ヒドロキシメチルウラシル（Ｕ等価物）が含まれる。さらに、パートナー特異性を保持する合成核酸塩基が当該技術分野において公知であり、これには、例えば、Ｃに対するパートナー特異性を保持する７−デアザ−グアニンが含まれる。したがって、標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列中の核酸塩基に対する化学修飾によって変わることはなく、これは標的核酸中のパートナー核酸塩基に対するその特異性に衝撃を与えることがない。
【００２７】
オリゴヌクレオチド又は他のアンチセンス化合物の核酸塩基配列が、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸配列と１００％相補的である必要がないことは当該技術分野において理解されている。特異的結合が望ましい条件下、すなわち、イン・ビボ検定又は治療処置の場合には生理学的条件下、又はイン・ビトロ検定の場合には検定条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するとき、アンチセンス化合物はその標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般には、研究用試薬、診断補助薬、及び治療薬として用いられる。例えば、遺伝子の発現を優れた特異性で阻害することが可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、当業者によって、特定の遺伝子の機能を解明するのに、例えば、生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するのに用いられる。したがって、この特異的阻害効果は、当業者によって研究用途で利用されている。オリゴヌクレオチドの特異性及び感受性も当業者によって治療用途で利用される。本発明において有用である好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾主鎖又は非天然糖間連結を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義されるように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドには主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を持たないものが含まれる。本明細書の目的のため、及び当該技術分野において時折言及されるように、糖間主鎖にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドと考えることができる。
【００２９】
具体的なオリゴヌクレオチドの化学修飾を以下の小節において説明する。所定の化合物の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、以下の修飾の２つ以上を単一のアンチセンス化合物に組み込むことができ、又はそれらの単一の残基、例えば、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ組み込むことができる。
【００３０】
Ａ．修飾連結：好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロ−ジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’ −アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’ −アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’ −５’ 連結を有するボラノホスフェート、これらの２’ −５’ 連結類似体、並びに隣接ヌクレオチド単位対が３’ −５’ から５’ −３’ 又は２’ −５’ から５’ −２’ に連結する、極性が反転したものが含まれる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
【００３１】
上記リン原子含有連結の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ３，６８７，８０８  号；第 ４，４６９，８６３号；第 ４，４７６，３０１号；第 ５，０２３，２４３号； 第 ５，１７７，１９６号；第 ５，１８８，８９７号；第 ５，２６４，４２３号；第 ５，２７６，０１９号；第 ５，２７８，３０２号；第 ５，２８６，７１７号；第 ５，３２１，１３１号；第 ５，３９９，６７６号；第 ５，４０５，９３９号；第 ５，４５３，４９６号；第 ５，４５５，２３３号；第 ５，４６６，６７７号；第 ５，４７６，９２５号；第 ５，５１９，１２６号；第 ５，５３６，８２１号；第 ５，５４１，３０６号；第 ５，５５０，１１１号；第 ５，５６３，２５３号；第 ５，５７１，７９９号；第 ５，５８７，３６１号；第 ５，６２５，０５０号；及び第 ５，６９７，２４８号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖（すなわち、オリゴヌクレオシド）の好ましいものは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間連結で形成される主鎖を有する。これらには、（部分的にヌクレオシドの糖部分で形成される）モルホリノ連結；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルキレン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を含むもの；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２ 成分部を有する他のものが含まれる。
【００３３】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ５，０３４，５０６号；第 ５，１６６，３１５号；第 ５，１８５，４４４号；第 ５，２１４，１３４号；第 ５，２１６，１４１号；第 ５，２３５，０３３号；第 ５，２６４，５６２号；第 ５，２６４，５６４号；第 ５，４０５，９３８号；第 ５，４３４，２５７号；第 ５，４６６，６７７号；第 ５，４７０，９６７号；第 ５，４８９，６７７号；第 ５，５４１，３０７号；第 ５，５６１，２２５号；第 ５，５９６，０８６号；第 ５，６０２，２４０号；第 ５，６１０，２８９号；第 ５，６０２，２４０号；第 ５，６０８，０４６号；第 ５，６１０，２８９号；第 ５，６１８，７０４号；第 ５，６２３，０７０号；第 ５，６６３，３１２号；第 ５，６３３，３６０  号；第 ５，６７７，４３７号；及び第 ５，６７７，４３９号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体においては、ヌクレオチド単位の糖及び糖間連結の両者、すなわち、主鎖が新たな基で置き換えられている。これらの塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖がアミド含有主鎖、特にはアミノエチルグリシン主鎖で置き換えられている。これらの核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ５，５３９，０８２号；第 ５，７１４，３３１号；及び第 ５，７１９，２６２号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７ に見出すことができる。
【００３５】
本発明の最も好ましい態様はホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオチドであり、特には、上で参照される米国特許第 ５，４８９，６７７号の−ＣＨ２ −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２ −、−ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｏ−ＣＨ２ −［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ２ −Ｏ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −、−ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −ＣＨ２ −［ここで、本来のホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２ −と表される］、及び上で参照される米国特許第 ５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上で参照される米国特許第 ５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００３６】
Ｂ．修飾核酸塩基：本発明の化合物は、核酸塩基（しばしば、当該技術分野においては単に“塩基” と呼ばれる）の修飾又は置換をさらに、又は代わりに含んでいてもよい。ここで用いられる場合、“非修飾” 又は“天然” 核酸塩基にはプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第 ３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０ に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３によって開示されるもの、及び Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３ によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のあるものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（前著、２７６〜２７８頁）、現時点で、特に２’ −メトキシエチル糖修飾と組み合わせたときにはなおさら、好ましい塩基置換である。
【００３７】
他の修飾核酸塩基に加えて上記修飾核酸塩基の特定のものの調製を教示する代表的な米国特許には、上記米国特許第 ３，６８７，８０８号に加えて、米国特許第 ４，８４５，２０５号；第 ５，１３０，３０２号；第 ５，１３４，０６６号；第 ５，１７５，２７３号；第 ５，３６７，０６６号；第 ５，４３２，２７２号；第 ５，４５７，１８７号；第 ５，４５９，２５５号；第 ５，４８４，９０８号；第 ５，５０２，１７７号；第 ５，５２５，７１１号；第 ５，５５２，５４０号；第 ５，５８７，４６９号；第 ５，５９４，１２１号、第 ５，５９６，０９１号；第 ５，６１４，６１７号；及び第 ５，６８１，９４１号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）、並びに１９９６年１２月１０日出願の米国特許出願第 ０８／７６２，４８８ 号（これも参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
Ｃ．糖修飾：本発明のアンチセンス化合物は１つ以上の置換糖部分をさらに、又は代わりに含んでいてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは以下のもののうちの１つを２’ 位に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、又はＯ、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換もしくは非置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル又はＣ２ 〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２ ）ｎ Ｏ］ｍ ＣＨ３ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＯＣＨ３ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＮＨ２ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＣＨ３ 、Ｏ（ＣＨ２ ）ｎ ＯＮＨ２ 、及びＯ（ＣＨ２ ）ｎ ＯＮ［（ＣＨ２ ）ｎ ＣＨ３ ）］２ （ここで、ｎ及びｍは１〜約１０である）である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは以下のもののうちの１つを２’ 位に含む：Ｃ１ 〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３ 、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３ 、ＯＣＦ３ 、ＳＯＣＨ３ 、ＳＯ２ ＣＨ３ 、ＯＮＯ２ 、ＮＯ２ 、Ｎ３ 、ＮＨ２ 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’ −メトキシエトキシ［２’ −Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３ 、別名２’ −Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’ −ＭＯＥ］（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好ましい修飾には、１９９８年１月３０日出願の共同所有される米国特許出願第 ０９／０１６，５２０ 号（その内容は参照することによりここに組み込まれる）に記載されるような２’ −ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２ ）２ ＯＮ（ＣＨ）３ ２ 基、別名２’ −ＤＭＡＯＥが含まれる。
【００３９】
他の好ましい修飾には、２’ −メトキシ（２’ −Ｏ−ＣＨ３ ）、２’ −アミノプロポキシ（２’ −ＯＣＨ２ ＣＨ２ ＣＨ２ ＮＨ２ ）及び２’ −フルオロ（２’ −Ｆ）が含まれる。同様の修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置、特には、３’ 末端ヌクレオチド上もしくは２’ −５’ 連結ヌクレオチドにおける糖の３’ 位及び５’ 末端ヌクレオチド上の５’ 位になすこともできる。オリゴヌクレオチドはシクロブチル部分のような糖模倣体をペントフラノシル糖の代わりに有していてもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ４，９８１，９５７号；第 ５，１１８，８００号；第 ５，３１９，０８０号；第 ５，３５９，０４４号；第 ５，３９３，８７８号；第 ５，４４６，１３７号；第 ５，４６６，７８６号；第 ５，５１４，７８５号；第 ５，５１９，１３４号；第 ５，５６７，８１１号；第 ５，５７６，４２７号；第 ５，５９１，７２２号；第 ５，５９７，９０９号；第 ５，６１０，３００号；第 ５，６２７，０５３１ 号  第 ５，６３９，８７３号；第 ５，６４６，２６５号；第 ５，６５８，８７３号；第 ５，６７０，６３３号；及び第 ５，７００，９２０号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）、並びに１９９５年６月５日出願の米国特許出願第 ０８／４６８，０３７ 号（これも参照することによりここに組み込まれる）が含まれる。
【００４０】
Ｄ．他の修飾：さらなる修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置、特には、３’ 末端ヌクレオチドの糖の３’ 位及び５’ ヌクレオチドの５’ 位になすこともできる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる修飾の１つは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞の取り込みを強化する１つ以上の部分又は結合体をオリゴヌクレオチドに化学的に連結することに関与する。このような部分には、コレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９４， ４， １０５３ ）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０， １１１ ；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１ ；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７ ）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１ ）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９） 、又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３ ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
このようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ４，８２８，９７９号；第 ４，９４８，８８２号；第 ５，２１８，１０５号；第 ５，５２５，４６５号；第 ５，５４１，３１３  号；第 ５，５４５，７３０号；第 ５，５５２，５３８号；第 ５，５７８，７１７号、第 ５，５８０，７３１号；第 ５，５８０，７３１号；第 ５，５９１，５８４号；第 ５，１０９，１２４号；第 ５，１１８，８０２号；第 ５，１３８，０４５号；第 ５，４１４，０７７号；第 ５，４８６，６０３号；第 ５，５１２，４３９号；第 ５，５７８，７１８号；第 ５，６０８，０４６号；第 ４，５８７，０４４号；第 ４，６０５，７３５号；第 ４，６６７，０２５号；第 ４，７６２，７７９号；第 ４，７８９，７３７号；第 ４，８２４，９４１号；第 ４，８３５，２６３号；第 ４，８７６，３３５号；第 ４，９０４，５８２号；第 ４，９５８，０１３  号；第 ５，０８２，８３０号；第 ５，１１２，９６３号；第 ５，２１４，１３６号；第 ５，０８２，８３０号；第 ５，１１２，９６３号；第 ５，２１４，１３６号；第 ５，２４５，０２２号；第 ５，２５４，４６９号；第 ５，２５８，５０６号；第 ５，２６２，５３６号；第 ５，２７２，２５０号；第 ５，２９２，８７３号；第 ５，３１７，０９８号；第 ５，３７１，２４１号、第 ５，３９１，７２３号；第 ５．４１６，２０３号、第 ５，４５１，４６３号；第 ５，５１０，４７５号；第 ５，５１２，６６７号；第 ５，５１４，７８５号；第 ５，５６５，５５２号；第 ５，５６７，８１０号；第 ５，５７４，１４２号；第 ５，５８５，４８１  号；第 ５，５８７，３７１号；第 ５，５９５，７２６号；第 ５，５９７，６９６号；第 ５，５９９，９２３号；第 ５，５９９，９２８号及び第 ５，６８８，９４１号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
Ｅ．キメラオリゴヌクレオチド：本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物をも含む。本発明の脈絡において、“キメラ” アンチセンス化合物又は“キメラ” は、各々少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチドの場合にはヌクレオチド、からなる２つ以上の化学的に異なる領域を含むアンチセンス化合物、特にはオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には少なくとも１つの領域を含み、ここではそのオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加が付与されるように修飾される。このオリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することが可能な酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨを活性化することでＲＮＡ標的の開裂が生じ、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が大きく高められる。したがって、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合には、しばしば、より短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の開裂はゲル電気泳動及び、必要であれば、当該技術分野において公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって定型的に検出することができる。ＲＮアーゼＨが介在する標的の開裂は核酸の開裂へのリボザイムの使用とは区別され、リボザイムは本発明には含まれない。
【００４３】
例として、このような“キメラ” は“ギャップマー” 、すなわち、オリゴヌクレオチドの中心部分（“ギャップ” ）が、例えば、ＲＮアーゼＨの基質の役割を果たし、かつ５’ 及び３’ 部分（“ウィング” ）が標的ＲＮＡ分子に対するより高い親和性を有し、又はそれと二重鎖を形成する場合にはより高い安定性を有するような方式で修飾されるが、ヌクレアーゼ活性を支持することが不可能である（例えば、２’ −フルオロ−又は２’ −メトキシエトキシ−置換）オリゴヌクレオチドであり得る。他のキメラには“ヘミマー” 、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’ 部分が、例えば、ＲＮアーゼＨの基質の役割を果たし、これに対して３’ 部分が標的ＲＮＡ分子に対するより高い親和性を有し、又はそれと二重鎖を形成する場合にはより高い安定性を有するような方式で修飾されるが、ヌクレアーゼ活性を支持することが不可能である（例えば、２’ −フルオロ−又は２’ −メトキシエトキシ−置換）、又はその逆のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４４】
より高いオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖安定性を付与する、幾つかのオリゴヌクレオチドに対する化学修飾が Ｆｒｅｉｅｒ ら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９）によって記述されている。このような修飾はキメラオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ耐性部分に好ましく、一般に標的ＲＮＡに対するアンチセンス化合物の親和性を高めるのに用いることができる。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上の上述のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成することができる。このような化合物も、当該技術分野において、ハイブリッド又はギャップマーと呼ばれる。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第 ５，０１３，８３０号；第 ５，１４９，７９７号；第 ５，２２０，００７号；第 ５，２５６，７７５号；第 ５，３６６，８７８号；第 ５，４０３，７１１号；第 ５，４９１，１３３号；第 ５，５６５，３５０号；第 ５，６２３，０６５  号；第 ５，６５２，３５５号；第 ５，６５２，３５６号；及び第 ５，７００，９２２号（これらの各々は参照することによりここに組み込まれる）、並びに１９９５年６月６日出願の米国特許出願第 ０８／４６５，８８０ 号（これも参照することによりここに組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
Ｆ．合成：本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは公知固相合成技術によって都合よく及び定型的に作製することができる。このような合成のための器機は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ 、ＣＡ）を含む幾つかのベンダーによって販売されている。当該技術分野において公知の、そのような合成用の他のあらゆる手段をさらに、又は代わりに用いることができる。同様の技術をホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの調製に用いることも公知である。
【００４６】
１．特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する技術は以下の米国特許又は継続特許出願に見出すことができる：ポリアミン結合オリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，１３８，０４５号及び第 ５，２１８，１０５号；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーに関しては米国特許第 ５，２１２，２９５号；修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，３７８，８２５号及び第 ５，５４１，３０７号；主鎖修飾オリゴヌクレオチド及び還元カップリングによるそれらの調製に関しては米国特許第 ５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基及びそれらの合成方法に関しては米国特許第 ５，４５７，１９１  号；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関しては米国特許第 ５，４５９，２５５号；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドの調製方法に関しては米国特許第 ５，５２１，３０２号；ペプチド核酸には米国特許第 ５，５３９，０８２号；β−ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドを合成するための方法及び材料に関しては米国特許第 ５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシド（このような基はヌクレオチドの様々の位置のいずれかに結合する他の部分に対するリンカーとして用いることができる）に関しては米国特許第 ５，５７８，７１８号；高キラル純度のホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，５８７，３６１号及び第 ５，５９９，７９７号；２’ −Ｏ−アルキルグアノシン、及び２，６−ジアミノプリン化合物を含む関連化合物の調製方法に関しては米国特許第 ５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関しては米国特許第 ５，５８７，４７０号；複合化４’ −デスメチルヌクレオシド類似体に関しては１９９３年６月２９日発行の米国特許第 ５，２２３，１６８号及び第 ５，６０８，０４６号の両者；主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体に関しては米国特許第 ５，６０２，２４０号、及び第 ５，６１０，２８９号；並びに、とりわけ、２’ −フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関しては１９９５年２月３日出願の米国特許出願第 ０８／３８３，６６６ 号、及び米国特許第 ５，４５９，２５５号。
【００４７】
２．生物学的等価物：本発明の化合物はあらゆる薬学的に許容し得る塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、又は、ヒトを含む動物に投与したとき、生物学的に活性の代謝物もしくはそれらの残基を（直接もしくは間接的に）もたらすことが可能であるあらゆる他の化合物を包含する。したがって、例えば、この開示も本発明のアンチセンス化合物の“プロドラッグ” 及び“薬学的に許容し得る塩” 、そのようなプロドラッグの薬学的に許容し得る塩、並びに他の生物学的等価物に関する。
【００４８】
Ａ．オリゴヌクレオチド・プロドラッグ：本発明のアンチセンス化合物は、さらに、又は代わりに、“プロドラッグ” 形態で送達されるように調製することができる。“プロドラッグ” は、不活性形態で調製され、それが身体又はそれらの細胞内で内在性の酵素又は他の化学物質及び／又は条件によって活性形態（すなわち、薬物）に変換される治療薬を示す。特には、本発明のアンチセンス化合物のプロドラッグ・バージョンは、１９９３年１２月９日に公開された Ｇｏｓｓｅｌｉｎ らの ＷＯ ９３／２４５１０に開示される方法に従ってＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【００４９】
Ｂ．薬学的に許容し得る塩：“薬学的に許容し得る塩” という用語は、本発明のアンチセンス化合物の生理学的及び薬学的に許容知る塩：すなわち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、かつそれらに望ましくない毒物学的効果を付与しない塩を指す。
【００５０】
薬学的に許容し得る塩基付加塩は金属又はアミン、例えば、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンを用いて形成する。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適切なアミンの例は、クロロプロカイン、コリン、Ｎ，Ｎ’ −ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．， １９７７， ６６：１ を参照）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、その遊離酸形態を十分な量の所望の塩基と接触させて通常の方法で塩を生成させることにより調製する。遊離酸形態はその塩形態を酸と接触させ、通常の方法で遊離酸を単離することにより再生することができる。遊離酸形態はそれらそれぞれの塩形態と極性溶媒中での溶解度のような特定の物理特性において幾らか異なるが、他の点ではそれらの塩は本発明の目的のためのそれらそれぞれの遊離酸と等しい。ここで用いられる場合、“医薬付加塩” には、本発明の組成物の成分のうちの１つの酸形態の薬学的に許容し得る塩が含まれる。これらにはアミンの有機もしくは無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容し得る塩は当業者に公知であり、これには様々な無機及び有機酸の塩基性塩、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸又はリン酸；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはホスホ酸又はＮ−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、エンボン酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、ニコチン酸、イソニコチン酸又は２−アセトキシ安息香酸；並びにアミノ酸、例えば、自然界でタンパク質の合成に関与する２０のアルファ−アミノ酸、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸、並びに、さらに、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、フェニル酢酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、メタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）、又は他の酸性有機化合物、例えば、アスコルビン酸が含まれる。化合物の薬学的に許容し得る塩は薬学的に許容し得るカチオンを用いて調製することもできる。適切な薬学的に許容し得るカチオンは当業者に公知であり、これには、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び四級アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩又は炭酸も可能である。
【００５１】
オリゴヌクレオチドについては、薬学的に許容し得る塩の好ましい例には、（ａ）カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えば、スペルミン及びスペルミジン等で形成される塩；（ｂ）有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等で形成される塩；並びに（ｄ）元素状態のアニオン、例えば、塩素、臭素、及びヨウ素で形成される塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
３．本発明の例示的有用性：本発明のオリゴヌクレオチドはＬＦＡ−３タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズする。本発明のアンチセンス化合物は、当業者には明らかなように、キットに加えて他の方法論に組み込むことができる治療用化合物、診断用ツール又は研究用試薬として利用することができる。
【００５３】
Ａ．検定及び診断用途：本発明のオリゴヌクレオチドは細胞又は組織試料中のＬＦＡ−３タンパク質特異的核酸の存在を検出するのに用いることができる。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’ 末端を３２Ｐ標識することによって放射標識オリゴヌクレオチドを調製することができる。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｇ． １０．５９ ）。次に、放射標識オリゴヌクレオチドをＬＦＡ−３タンパク質伝令ＲＮＡ（したがって、ＬＦＡ−３タンパク質）を含むことが疑われる細胞又は組織試料と接触させ、それらを洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去する。試料中に残留する放射能は結合オリゴヌクレオチドの存在を示し、それが次にそのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸の存在を示すものであり、これはシンチレーション・カウンター又は他の定型的な手段を用いて定量することができる。このようにして、これらのタンパク質をコードする核酸の発現が検出される。
【００５４】
本発明の放射標識オリゴヌクレオチドは、研究、診断又は治療の目的で組織のオートラジオグラフィーを実施してＬＦＡ−３タンパク質の局在化、分布及び定量化を決定することもできる。このような研究においては、組織の切片を放射標識オリゴヌクレオチドで処理して上述の通り洗浄した後、定型的なオートラジオグラフィーの手順に従って写真乳剤に露光する。この乳剤は、現像したとき、ＬＦＡ−３タンパク質遺伝子を発現する領域全体に銀粒子の画像を生じる。銀粒子を定量することで、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の発現の検出が可能となり、かつこれらの領域に向けてオリゴヌクレオチドを標的設定することが可能となる。
【００５５】
放射標識の代わりにフルオレセイン又は他の蛍光タグと結合している本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、ＬＦＡ−３タンパク質核酸の発現を蛍光検出するための同様の検定を開発することができる。このような結合体は、固相合成の間に、蛍光標識アミダイト又はコントロールド・ポア・グラス（ＣＰＧ）カラムを用いて定型的に達成される。フルオレセイン標識アミダイト及びＣＰＧは、例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、ＳｔｅｒｌｉｎｇＶＡから入手可能である。オリゴヌクレオチドを標識する他の手段は当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｕｔｈ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６ Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２６： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９４， ｐａｇｅｓ １６７−１８５ を参照）。
【００５６】
ＬＦＡ−３タンパク質の存在又は不在を検出するためのキットを調製することもできる。このようなキットは、適切な遺伝子、すなわち、ＬＦＡ−３タンパク質をコードする遺伝子に向けて標的設定されたオリゴヌクレオチドを含む。適切なキット及び検定形式、例えば、“サンドイッチ” 検定は当該技術分野において公知であり、本発明のアンチセンス化合物と共に用いるのに容易に適合させることができる。本発明のアンチセンス化合物とＬＦＡ−３タンパク質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは当該技術分野において公知の手段によって検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射標識又は他のあらゆる適切な検出システムが含まれ得る。
【００５７】
Ｂ．生物学的に活性のオリゴヌクレオチド：本発明は、生物学的活性を有するオリゴヌクレオチドの培養細胞、単離組織及び臓器並びに動物への投与にも関する。“生物学的活性を有する” が意味するところは、そのオリゴヌクレオチドが培養細胞、単離組織もしくは臓器及び／又は動物中の１つ以上の遺伝子の発現を調節するように機能することである。このような調節はアンチセンス・オリゴヌクレオチドにより当該技術分野において公知の様々な機構によって達成することができ、これには転写停止；ＲＮＡプロセシング（コピー、ポリアデニル化及びスプライシング）及び輸送に対する効果；標的核酸の細胞性分解の強化；並びに翻訳停止が含まれる（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｐａｔｅｎｔｓ， １９９６， ６：８５５）。
【００５８】
ヒト以外の動物においては、本発明の組成物及び方法をその動物における１つ以上の遺伝子の機能を研究するのに用いることができる。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ニューロンの死におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体の役割を研究するためにラットに、プロテインキナーゼＣ−αの生物学的役割を研究するためにマウスに、及び不安における神経ペプチドＹ１受容体の役割を調べるためにラットに全身投与されている（それぞれ、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９３， ３６３：２６０；Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９４， ９１：１１７６２；及び Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２５９：５２８）。関連タンパク質の複合ファミリーが研究されている場合、“アンチセンス・ノックアウト” （すなわち、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの全身性投与による遺伝子の阻害）がそのファミリーの特定のメンバーを調べるための最も正確な手段を代表する可能性がある（一般には、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， １９９４， １５：２５０ を参照）。
【００５９】
本発明の組成物及び方法には、１種類以上の核酸で全体的に、又は部分的に治療可能である疾患又は障害を有し（すなわち、それに罹患しており）、又はそれを有する傾向にあることが知られるか、もしくは疑われる、ヒトを含む動物における治療用途もある。“治療用途” という用語は、本発明のアンチセンス化合物をイン・ビボ又はエキソ・ビボのいずれかで動物の細胞と接触させる予防、一時的緩和及び治療用途を含むことが意図されている。エキソ・ビボで動物細胞と接触させたとき、治療用途は、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物で治療した後、そのような細胞を動物に組み込むことを含む。
【００６０】
治療用途には、ＬＦＡ−３の発現又は活性を調節することによって治療又は予防することができる疾患又は障害を有することが疑われる動物を、例えば、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを投与することによって治療する。本発明のアンチセンス化合物は、有効量のオリゴヌクレオチドを適切な薬学的に許容し得る担体、例えば、希釈剤に添加することによって、医薬組成物中で利用することができる。当業者は、ウイルス性、真菌性及び代謝性疾患に関与する遺伝子の発現を調節することが可能であるアンチセンス、三重鎖及び他のオリゴヌクレオチド組成物を識別している。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはヒトに安全に投与されており、幾つかの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織及び動物、特にはヒトを治療するための治療形態において有用であるように構成することができる有用な治療手段であり得ることが確立される。以下の米国特許はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを利用する一時的緩和、治療及び他の方法を示す。米国特許第 ５，１３５，９１７号はヒトインターロイキン−１受容体の発現を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第 ５，０９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ発癌遺伝子に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチド及び特定の癌性条件のアンチセンス・オリゴヌクレオチド治療に向けられている。米国特許第 ５，０８７，６１７号はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いる癌患者の治療方法を提供する。米国特許第 ５，１６６，１９５号はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国特許第 ５，００４，８１０号は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５  ｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつ複製を阻害することが可能なオリゴマーを提供する。米国特許第 ５，１９４，４２８号はインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第 ４，８０６，４６３号は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びそれらをＨＴＬＶ−ＩＩＩ の複製の阻害に用いる方法を提供する。米国特許第 ５，２８６，７１７号は、発癌遺伝子の一部に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第 ５，２７６，０１９号及び米国特許第 ５，２６４，４２３号は、細胞中で外来核酸の複製を妨げるのに用いられるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に向けられている。米国特許第 ４，６８９，３２０号は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドに向けられている。米国特許第 ５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写体の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第 ５，２４２，９０６号は、潜在性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染の治療において有用なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。
【００６１】
ここで用いられる場合、“疾患もしくは障害” という用語は、（１）生物体又は部分の、特には正常な生理学的機能を損なう感染、生来の弱さ、環境ストレスの結果としての、あらゆる異常な状態を含み；（２）妊娠に関連する自己免疫及び他の疾患を除いて妊娠それ自体は排除し；及び（３）癌及び腫瘍は含む。“疾患もしくは障害を有する傾向にあることが知られ、又はそれが疑われる” という用語は、被験動物が、そのような動物の一般的な集団に対して、高い危険性で、ここで定義される特定の疾患もしくは障害を発症していることが決定され、又はそれが疑われることを示す。例えば、“疾患もしくは障害を有する傾向にあることが知られ、又はそれが疑われる” 被験動物は、特定の疾患もしくは障害の頻繁な発生を含む個人的及び／又は家族の病歴を有する可能性がある。別の例として、“疾患もしくは障害を有する傾向にあることが知られ、又はそれが疑われる” 被験動物は、当該技術分野において公知の技術に従って遺伝子スクリーニングすることによって決定されるような感受性を有している可能性がある（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５ Ｉｎ； Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ， ＯＴＡ−ＢＡ−４５５， Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９０， ｐａｇｅｓ ７５−９９ を参照）。“１種類以上のアンチセンス化合物で全体的に、又は部分的に治療可能である疾患もしくは障害” という用語はここで定義される疾患もしくは障害を指し、（１）それらの管理、調節又は治療、及び／又は（２）それらからの治療的、治癒的、一時的緩和性及び／又は予防的な軽減が１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を含む組成物を投与することによってもたらされ得る。
【００６２】
４．本発明の化合物を含む医薬組成物：本発明は、１種類以上のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を含む治療用及び医薬組成物に対する備えを有する。本発明のアンチセンス化合物を投与するための組成物には、バッファ、希釈剤及び他の適切な添加物をも含有することができる無菌の水溶液が含まれる。
【００６３】
Ａ．食事性送達用の組成物：本発明の好ましい態様においては、１種類以上のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を食事性送達により、好ましくは経口投与によって投与する。経口投与用の医薬組成物には粉末又は顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、サシェイ、トローチ、錠剤又はＳＥＣ（軟弾性カプセル又は“カプレット” ）が含まれる。濃厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、担体物質又は結合剤をこのような組成物に添加することができる。このような医薬組成物はアンチセンス化合物（１種類もしくは複数種類）を消化管に、それらの粘膜に晒すために送達する効果を有する。したがって、この医薬組成物は、オリゴヌクレオチドを胃のｐＨ流から保護し、又は全時間にわたってオリゴヌクレオチドを放出して特定の粘膜部位へのそれらの送達を最適化する上で有効な物質を含むことができる。酸耐性錠剤、カプセル及びカプレット用の腸溶コーティングが当該技術分野において公知であり、これには、典型的には、アセテートフタレート、ポリプロピレングリコール及びソルビタンモノリエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）が含まれる。食事性送達用の医薬組成物を製造するための様々な方法が当該技術分野において公知である。一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０の Ｎａｉｒｎ、８３章；Ｂｌｏｃｋ 、８７章；Ｒｕｄｎｉｃら、８９章；Ｐｏｒｔｅｒ、９０章；及び Ｌｏｎｇｅｒ ら、９１章を参照。
【００６４】
本発明のアンチセンス化合物は公知の方法で通例の医薬組成物、例えば、錠剤、コート錠、ピル、顆粒、エアロゾル、シロップ、エマルジョン、懸濁液及び溶液に不活性で非毒性の薬学的に許容し得る担体（賦形剤）を用いて組み込むことができる。治療上活性の化合物は、各々の場合において、混合物全体の約０．５重量％〜約９５重量％の濃度、すなわち、明記されている投与量範囲を達成するのに十分な量存在するべきである。この医薬組成物は、例えば、活性化合物を薬学的に許容し得る担体で希釈し、かつ、適切であるならば、乳化剤及び／又は分散剤を用いることによって調製され、水が希釈剤として用いられるときには、適切であるならば、有機溶媒を助剤として用いることができる。この医薬組成物は、適切であるならば、通常の方法で、さらなる薬学的に許容し得る担体を用いて配合することができる。このように、これらの組成物は、通常の手段によって、さらなる賦形剤、例えば、結合剤（例えば、予め糊化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプンもしくはナトリウムデンプングリコラート）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製することができる。錠剤は当該技術分野において公知の方法によってコートし、かつ香味料、着色料及び／又は甘味料を含有することもできる。
【００６５】
１種類以上のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を含む組成物は直腸モードで投与することができる。特には、直腸投与用の治療用又は医薬組成物には、泡状物質、溶液（浣腸）及び座剤が含まれる。成人用の直腸座在は、通常、一端もしくは両端が先細りの形状であり、通常の基剤、カカオ脂が用いられる場合、典型的には約２ｇの重量であって、幼児用直腸座剤は典型的にはほぼ半分の重量である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０の Ｂｌｏｃｋ、８７章）。
【００６６】
製剤形態で都合よく提示することができる医薬組成物は製薬業界において公知の通常の技術に従って調製することができる。このような技術には、活性成分（１種類もしくは複数種類）を薬学的に許容し得る担体（１種類もしくは複数種類）と会合させる工程を含む。一般には、医薬組成物は、活性成分（１種類もしくは複数種類）を液体賦形剤もしくは細かく砕いた固体賦形剤又はそれらの両者と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、その生成物を成形することによって調製する。
【００６７】
経口投与に適する本発明の医薬組成物は個別の単位、例えば、カプセル、カシュー又は錠剤として提示することができ、これらは各々予め決定された量の活性成分を；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；又は水中油エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして含む。錠剤は、場合によっては１種類以上の副成分と共に、圧縮又は成形によって作製することができる。圧縮錠は、適切な装置内で、場合によっては結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤もしくは分散剤と混合した、自由流動形態の活性成分、例えば、粉末もしくは顆粒を圧縮することによって調製することができる。成形錠は、適切な装置内で、不活性液体希釈剤で湿潤した粉末化化合物の混合物を成形することによって作製することができる。錠剤はコートするか、又は刻み目を入れることができ、かつ活性成分の徐放もしくは制御放出がもたらされるように配合することができる。徐放性経口送達系及び／又は経口投与製剤用の腸溶コーティングは米国特許第 ４，７０４，２９５号；第 ４，５５６，５５２号；第 ４，３０９，４０６号；及び第 ４，３０９，４０４号に記載されている。
【００６８】
Ｂ．添加物：１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を含む医薬及び治療用組成物には、さらに、バッファ、希釈剤及び他の適切な添加物を含むこともできる無菌の水溶液が含まれる。アンチセンス化合物と害をなすように反応することのない、非腸管外投与に適する薬学的に許容し得る有機又は無機担体物質を用いることができる。この医薬組成物は滅菌し、かつ、必要であれば、その医薬組成物のオリゴヌクレオチド（１種類もしくは複数種類）と害をなすように反応することのない助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色、香味及び／又は芳香物質等と混合することができる。水性懸濁液の形態にある医薬組成物はその懸濁液の粘性を増加させる物質を含むことができ、これには、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランが含まれる。場合によっては、このような組成物は１種類以上の安定化剤、浸透賦活剤、担体化合物又は薬学的に許容し得る担体を含んでいてもよい。
【００６９】
（１）浸透賦活剤：本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、それらのオリゴヌクレオチドの食事性送達を強化するため、浸透賦活剤を含んでいてもよい。浸透賦活剤は５つの広い範疇、すなわち、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、表面活性剤及び非表面活性剤のうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ８：９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７：１）。
【００７０】
脂肪酸：浸透賦活剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンリエート（ｒｅｃｉｎｌｅａｔｅ）、モノオレイン（ａ．ｋ．ａ．  １−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アリキドン酸（ａｒｉｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グリセリル１−モノカプレート、アシルカルニチン、アシルコリン、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、モノ−及びジ−グリセリン並びにそれらの生理学的に許容し得る塩（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノリエート等）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２ ；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７：１ ；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４：６５１）。
【００７１】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９６， ｐａｇｅｓ ９３４−９３５ の Ｂｒｕｎｔｏｎ、３８章）。様々な天然胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が浸透賦形剤として作用する。したがって、“胆汁塩” には胆汁の天然成分のいずれも、及びそれらの合成誘導体のいずれもが含まれる。
【００７２】
キレート剤：キレート剤はＤＮアーゼ阻害剤の役割も果たすというさらなる利点を有し、これにはクエン酸、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸、５−メトキシサリチル酸及びホモバニリン酸ナトリウム）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９（ｌａｕｒｅｔｈ−９ ）並びにベータ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ． ９２； Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １； Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．， １９９０， １４， ４３）。
【００７３】
界面活性剤：界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２ ）；並びにＦＣ−４３のようなパーフルオロケミカル・エマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｍａｃｏｌ．， １９８８， ４０：２５２ ）が含まれる。
【００７４】
非界面活性剤：非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２ ）；並びに非ステロイド抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、ヨードメタシン及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９：６２１）が含まれる。
【００７５】
（２）担体化合物：ここで用いられる場合、“担体化合物” は、核酸もしくはそれらの類似体であって、不活性（すなわち、生物学的活性それ自体は持たない）ではあるが、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を、例えば、その生物学的に活性の核酸を分解するか、又は循環からのその除去を促進することによって低下させるイン・ビボ・プロセスにより核酸として認識されるものを指す。核酸及び担体化合物を、典型的には後者の物質を過剰に用いて、同時投与することで、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合のため、肝臓、腎臓又は他の循環外貯留所において回収される核酸の量の実質的な減少が生じ得る。例えば、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの肝臓組織における回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’ −イソチオシアノ−スチルベン−２，２’ −ジスルホン酸と共に同時投与されたとき、減少する（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５：１１５； Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６：１７７）。
【００７６】
（３）薬学的に許容し得る担体：担体化合物とは対照的に、“薬学的に許容し得る担体” （賦形剤）は、１種類以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容し得る溶媒、懸濁剤又は他のあらゆる薬理学的に不活性のビヒクルである。この薬学的に許容し得る担体は液体であっても固体であってもよく、核酸及び所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせたとき、望ましいバルク、コンテンシー等が賄えるよう心に思い描いた投与方法に従って選択される。典型的な薬学的に許容し得る担体には、結合剤（例えば、予め糊化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートもしくはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアレート、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、ナトリウムデンプングリコラート等）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な薬学的に許容し得る担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン粘稠性パラフィン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
（４）種々のさらなる成分：本発明の組成物は、医薬組成物に従来見出される他の補助成分をそれらの技術分野で確立されている使用レベルでさらに含むことができる。したがって、例えば、これらの組成物はさらなる適合性の薬学的に活性の物質、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤を含むことができ、又は本発明の組成物の様々な剤形を物理的に配合する上で有用であるさらなる物質、例えば、色素、香味料、保存料、酸化防止剤、乳白剤、濃厚化剤及び安定化剤を含むことができる。しかしながら、このような物質は、添加されたとき、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害するべきではない。
【００７８】
Ｃ．コロイド分散系：本発明のアンチセンス化合物を患者に導入する方法に関わらず、コロイド分散系を送達ビヒクルとして用いてそれらの化合物のイン・ビボ安定性を強化し、及び／又はそれらの化合物を特定の臓器、組織又は細胞型に向けて標的設定することができる。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、構造が特徴付けられていない脂質：オリゴヌクレオチド複合体及びリポソームを含む脂質ベースの系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
好ましいコロイド分散系は複数のリポソームである。リポソームは、二重層の構成に配置された脂質からなる１つ以上の外層（１つもしくは複数）に取り囲まれた水性の核を有する微視的な球である（一般には、Ｃｈｏｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９９５， ６， ６９８を参照）。リポソームの薬物送達剤としての治療上の潜在能力はほぼ３０年前に認識された（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， １９６８， ９， ３１０）。リポソームは、幾つかの場合においては、生物活性剤の細胞性送達ビヒクルとして、イン・ビトロ及びイン・ビボで用いることができる（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９８８， ６， ６８２ ；Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１ ；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， １９９４， ２３， １１９ ）。例えば、サイズが０．２〜０．４ミクロンの範囲にある巨大単層ビヒクル（ＬＵＶ）が、大きな巨大分子を含む水性バッファのかなりのパーセンテージを封入できることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び未変性ビリオンを水性内部に封入し、生物学的に活性の形態で脳細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １９８１， ６， ７７ ）。
【００８０】
リポソームを含むコロイド分散系の標的指向性は受動的又は能動的のいずれかであり得る。受動的標的指向性は、洞様毛細血管を含む臓器の細網内皮系の細胞に分布しようとするリポソーム生来の傾向を利用する。対照的に、能動標的指向性はリポソームの修飾に関与し、これは、ウイルスタンパク質外被（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）， １９９３， ９０， ８４７４ ）、モノクローナル抗体（もしくはそれらの適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（もしくはそれらの適切なオリゴペプチド断片）のような特異的リガンドを結合させることにより、又は天然の局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成及び／又はサイズを変更することにより行う。標的指向されるコロイド分散系の表面は様々な方法で修飾することができる。リポソーム標的指向送達系の場合、標的指向性リガンドを脂質二重層と密接に会合した状態に維持するため、脂質基をそのリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖を標的指向性リガンドに結合させるのに様々な連結基を用いることができる。本発明の化合物を送達することが望まれる細胞上に広く見出される特定の細胞表面分子に結合するこの標的指向性リガンドは、例えば、（１）送達が望まれる細胞が主に発現する特定の細胞受容体によって結合される、ホルモン、成長因子もしくはそれらの適切なオリゴペプチド断片、又は（２）標的細胞上に広く見出される抗原性エピトープに特異的に結合する、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、又はそれらの適切な断片（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’ ）２ ）であり得る。２種類以上の生理活性作用物質（例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド及び従来の薬物；２種類のオリゴヌクレオチド）を単一のリポソーム内で組み合わせ、かつそれによって送達することができる。コロイド分散系に、それらの内容物の細胞内安定性及び／又は標的指向性を強化する作用物質を添加することもできる。
【００８１】
本発明のリポソームは、一般には１種類以上の中性もしくは負に荷電したリン脂質、好ましくは１種類以上の中性リン脂質を、通常は１種類以上のステロール、好ましくはコレステロールと組み合わせて含む小胞形成性脂質から形成される。リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドが含まれる。典型的には、リポソームの腫瘍脂質成分はホスファチジルコリン（ＰＣ）又はＰＣ誘導体である。鎖長及び飽和の程度が様々である様々なアシル鎖基を有するＰＣ誘導体が市販されており、又は公知の技術によって合成することができる。濾過無菌化のためには、より飽和度の少ないＰＣが、特にリポソームが約０．３ミクロン未満のサイズでなければならない場合、一般にはより容易にサイズがそろえられる。Ｃ１４〜Ｃ２２、特にはＣ１６〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含むＰＣが好ましく、特にはジアシルホスファチジルグリセロールである。説明に役立つリン脂質には、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン及びジステロイルホスファチジルコリンが含まれる。一及び二不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルコリンも用いることができる。他の適切なリン脂質には、コリン以外の先頭基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐｓ ）、例えば、エタノールアミン、セリン、グリセロール及びイノシトールを有するものが含まれる。他の適切な脂質には、脂肪酸がエステル連結ではなくエーテル連結でグリセロールに連結するホスホノリピドが含まれる。好ましいリポソームはステロール、例えば、コレステロールを約０．１〜１．０のモル比（ステロール：リン脂質）で含む。
【００８２】
典型的には、本発明のリポソームは、それらの水性内部に、１種類以上のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを約０．００５ｎｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０１ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量含み、ここで“約” は望ましい濃度の±５％を示す。
【００８３】
本発明の組成物は、立体的に安定したリポソーム内に取り込まれた１種類以上のアンチセンス化合物及び／又は他の治療薬を含むことができる。ここで用いられる場合、“立体的に安定したリポソーム” という用語は、１種類以上の特殊化した脂質を含むリポソームであって、この特殊化した脂質が、リポソームに組み込まれたとき、そのような特殊化した脂質を欠くリポソームに対して循環寿命の強化を生じるものを指す。立体的に安定化したリポソームの例は、そのリポソームの小胞形成性脂質部分が（Ａ）１種類以上の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１を含むか、又は（Ｂ）１種類以上の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されるものである。特定の理論で結び付けることを望むものではないが、当該技術分野においては、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ誘導脂質を含む立体的に安定したリポソームについては、これらの立体的に安定したリポソームの循環半減期の強化が細網内皮系の細胞内への取り込みの減少に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．， １９８７， ２２３， ４２； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９３， ５３， ３７６５）。
【００８４】
１種類以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当該技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ら（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７， ５０７， ６４ ）は、リポソームの血液半減期を改善するモノシラノガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの知見は Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９ ）によって説明された。Ａｌｌｅｎ らの米国特許第 ４，８３７，０２８号及び ＷＯ ８８／０４９２４には、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第 ５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）にはスフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが ＷＯ ９７／１３４９９（Ｌｉｍ ら）に開示されている。
【００８５】
１種類以上の親水性ポリマーで誘導体化した脂質を含む多くのリポソーム及びそれらの調製方法が当該技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８ ）には、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗浄剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームが記述されている。Ｉｌｌｕｍ ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８４， １６７， ７９ ）には、ポリスチレン粒子をポリマー性グリコールで親水性コートすることで血液半減期の大幅な強化が生じることを注記している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾されている合成リン脂質は Ｓｅａｒｓによって記述されている（米国特許第 ４，４２６，３３０号及び第 ４，５３４，８９９号）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．， １９９０， ２６８， ２３５ ）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が大幅に増加していることを示す実験を記述している。Ｂｌｕｍｅ ら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１ ）は、このような観察を他のＰＥＧ誘導リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大した。外表面にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームは Ｆｉｓｈｅｒ の欧州特許 ０，４４５，１３１ Ｂ１ 及び ＷＯ ９０／０４３８４に記述されている。１〜２０モルパーセントの、ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含むリポソーム組成物、及びそれらの使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第 ５，０１３，５５６号及び第 ５，３５６，６３３号）並びに Ｍａｒｔｉｎ ら（米国特許第 ５，２１３，８０４号及び欧州特許 ＥＰ ０，４９６，８１３ Ｂ１）によって記述されている。幾つかの他の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームは、 ＷＯ ９１／０５５４５及び米国特許第 ５，２２５，２１２号（両者とも Ｍａｒｔｉｎ ら）並びに ＷＯ ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは ＷＯ ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記述されている。米国特許第 ５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び第 ５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）には、官能性表面部分によってさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームが記述されている。
【００８６】
限られた数の、核酸を含むリポソームが当該技術分野において公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙ らの公開ＰＣＴ出願 ＷＯ ９６／４００６２には、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法が開示されている。Ｔａｇａｗａらの米国特許第 ５，２６４，２２１号にはタンパク質結合リポソームが開示され、このようなリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを含み得ることが主張されている。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第 ５，６６５，７１０号には、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する方法が記述されている。Ｌｏｖｅらの ＷＯ ９７／０４７８７には、ｒａｆ遺伝子に向けて標的設定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むリポソームが開示されている。Ｋｌｉｍｕｋらの ＷＯ ９７／４６６７１には、ＩＣＡＭ−１をコードする遺伝子に向けて標的設定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むリポソームが開示されている。１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を、Ｂａｌｌｙ らの米国特許第 ５，７０５，３８５号及び Ｗｈｅｅｌｅｒらの ＷＯ ９６／４０９６４に開示されるように１種類以上のカチオン性脂質を含む［脂質：（アンチセンス化合物）］複合体に、又は Ｋｉｍらの ＷＯ ９８／００５５６に記述されるようにリポタンパク質含有複合体に、配合することができる。
【００８７】
本発明のリポソームは様々な公知技術のいずれによっても調製することができる。例えば、リポソームは、多層脂質小胞（ＭＬＶ）を調製するためのあらゆる通常の技術により、すなわち、１種類以上の選択された脂質を適切な容器の内壁上に、その脂質をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを蒸発させた後、封入しようとする薬剤（１種類もしくは複数種類）を含む水溶液をその容器に添加し、その水溶液を脂質と水和させ、かつ得られた脂質懸濁液を旋回もしくは渦攪拌することによって堆積させることで形成することができる。このプロセスにより所望のリポソームを含む混合物が得られる。
【００８８】
別の例として、大きな単層小胞（ＬＵＶ）の生成に用いられる技術、例えば、逆相蒸発、注入法及び界面活性剤希釈をリポソームの生成に用いることができる。脂質小胞を生成するためのこれらの、及びその他の方法が Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８４ ）に記述されている。これらのリポソームは、米国特許第 ４，５８８，５７８号及び第 ４，６１０，８６８号（両者とも Ｆｏｕｎｔａｉｎ ら）、第 ４，５２２，８０３号（Ｌｅｎｋら）並びに第 ５，００８，０５０号（Ｃｕｌｌｉｓら）に開示される型のステロイド脂質小胞、安定な多層小胞（ＳＰＬＶ）、単相小胞（ＭＰＶ）又は脂質マトリックス担体（ＬＭＣ）の形態であり得る。ＭＬＶの場合、所望であれば、リポソームを複数回（５回以上の）凍結−解凍サイクルに処してそれらの捕捉される容積及び捕捉効率を高め、かつ溶質のより均一な相内分布を得ることができる（Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８５， ２６０， ８０２）。特定のオリゴデオキシヌクレオチド：リポソーム組成物を製造するための具体的な方法は Ｒａｈｍａｎ らの米国特許第 ５，６６５，７１０号に記述されている。
【００８９】
それらの調製に続いて、リポソームをサイズ分けして所望のサイズ範囲及びサイズ分けした粒子の比較的狭い分布を達成することができる。好ましい態様においては、リポソームは約５０〜約７５ｎＭ、最も好ましくは約６０ｎＭの直径の下方範囲及び約７５〜約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１２５ｎＭの直径の上方範囲を有し、ここで“約” は±１０ｎＭを示す。
【００９０】
リポソームを所望のサイズ範囲にサイズ分けするのに幾つかの技術を用いることができる。バスもしくはプローブ超音波処理法のいずれかによりリポソーム懸濁液を超音波処理することで、サイズが約０．０５ミクロン未満の小単層小胞（ＳＵＶ）まで低下する進行性のサイズ減少が生じる。大リポソームをより小さいものに断片化する剪断エネルギーに依存する均質化が別の公知サイズ分け技術であり、ここではＭＬＶを、選択されたリポソームのサイズ範囲、典型的には約０．１〜約０．５ミクロンが達成されるまで、標準エマルジョン・ホモジナイザーを通して再循環させる。フィルターもしくはメンブランを通すリポソームの押し出しが所望のサイズ範囲を有するリポソームを生成するための別の方法である（例えば、Ｍａｒｔｉｎらの米国特許第 ４，７３７，３２３号及び Ｃｕｌｌｉｓ らの第 ５，００８，０５０号を参照）。他の有用なサイズ分け法が当業者に公知である。そのような方法のほとんどにおいて、通常のレーザー・ビームサイズ決定又は当該技術分野において公知の他の手段によって粒子サイズ分布を監視することができる。
【００９１】
リポソームは、保存期間を延長させるため、好ましくは減圧下において、標準的な凍結乾燥器機を用いて脱水することができる。脱水をしようとしまいと、最初に、リポソーム及びそれらを取り巻く媒体を液体窒素中で凍結させ、減圧下に置くことができる。この後者の凍結工程の追加は脱水プロセス全体の長期化を助長するが、脱水に先立ってリポソームを凍結したときには脂質小胞の損傷が少なく、かつそれら内部の内容物の損失が少ない。
【００９２】
リポソームのかなりの部分がこの脱水プロセスを無傷のままで耐えることを確実にするため、１種類以上の保護糖を脂質小胞膜との相互作用に利用可能とし、水が除去されるときにそれらを無傷のままに保たせることができる。適切な糖には、トレハロース、マルトース、スクロース、ラクトース、グルコース、デキストラン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般には、二糖が単糖よりも良好に作用し、トレハロース及びスクロースがほとんどの場合において特に有効であるが、他のより複雑な糖を代わりに用いることもできる。当業者は、特定の脂質小胞の調製についてどのような条件が最良に作用するのかを決定するため、様々な糖及び濃度を容易に試験することができる（一般には、Ｈａｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐｉｄｓ， １９９０， ５２， １３９、及び Ｊａｎｏｆｆ らの米国特許第 ４，８８０，６３５号を参照）。一般には、約１００ｍＭ以上の糖濃度が望ましい程度の保護を生じることが見出されている。ひとたびリポソームが脱水されると、それらが使用されるまで長期間保存することができる。適切な保存条件はその脂質小胞の化学組成及びそれらが封入する活性薬剤（１種類もしくは複数種類）に依存する。例えば、熱不安定性薬剤を含むリポソームは、活性薬剤の効力が失われないように冷蔵条件下で保存するべきである。
【００９３】
２種類以上の生理活性薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド及び通常の薬物、又は２種類以上のオリゴヌクレオチド；以下参照）を単一のリポソーム内で組み合わせ、かつそれによって送達することができる。コロイド分散系に、それらの内容物の細胞内安定及び／又は標的指向性を強化する薬剤を添加することもできる。
【００９４】
５．本発明の化合物の投与方法：本発明のアンチセンス化合物を含む治療用又は医薬組成物の投与は当業者の技術の範囲内にあるものと信じられる。一般には、治療又は予防を必要とする患者に、１種類以上の本発明によるアンチセンス化合物を通常は薬学的に許容し得る担体中に含む組成物を、患者の年齢及び治療する障害もしくは疾患状態の重篤性に応じて体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの用量範囲で投与する。投薬は、数日〜数ヶ月続く治療過程で、又は治癒が達成されるか、疾患状態の減退もしくは防止が達成されるまで治療しようとする疾患状態の重篤性及び応答性に依存する。最適の投薬スケジュールは、患者の体内の薬物滞留の測定から算出することができる。当業者は最適投与量、投薬方法及び繰り返し率を容易に決定することができる。最適投与量は個々のアンチセンス化合物の相対効力に応じて変化することがあり、一般にはイン・ビトロ及びイン・ビボモデルにおいて有効であることが見出されるＥＣ５０に基づいて見積もることができる。
【００９５】
Ａ．治療計画：本発明の脈絡において、“治療計画” という用語は、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を含む１種類以上の組成物の治療的、一時緩和的及び予防的な投与用式を包含しようとするものである。特定の治療計画は、特定の疾患もしくは障害の性質、その重篤性及び患者の全体的な状態に依存して変化する期間にわたって持続し得るものであり、かつ１日１回から２０年毎に１回にまで広がりうるものである。治療に続いて、患者を彼／彼女の状態の変化について、及び障害もしくは疾患状態の症状の軽減について監視する。オリゴヌクレオチドの投与量は、患者が現在の投与量レベルに対して有意に応答しない場合には増加することができ、あるいは障害もしくは疾患状態の症状の軽減が観察される場合、又は障害もしくは疾患状態が取り除かれている場合には用量を減少することができる。
【００９６】
最適投薬スケジュールは、特定の投与用式で投与されるオリゴヌクレオチドの治療上有効な量を送達するのに用いられる。“治療上有効な量” という用語は、本発明の目的上は、意図する目的を望ましくない副作用（例えば、毒性、刺激もしくはアレルギー応答）なしに達成するのに有効である、オリゴヌクレオチド含有医薬組成物の量を指す。個別の必要量は変化することがあるが、医薬組成物の有効量に関する最適範囲の決定は当該技術分野における技術の範囲内にある。ヒトの用量は動物研究から外挿することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０の Ｋａｔｏｃｓ ら、２７章）。一般には、医薬組成物の有効量を得るのに要する投与量は、これは当業者が調整することができるが、レシピエントの年齢、健康、身体条件、体重、その疾患もしくは障害の型及び程度、治療の頻度、（あるのであれば）現在の治療の性質並びに所望の効果（１つもしくは複数）の性質及び範囲に依存して変化する（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９６の Ｎｉｅｓ ら、３ 章）。
【００９７】
治療が成功した後、患者にその治療状態の再発を防止するための維持療法を施すことが望ましいものであり得、そこでは核酸を、体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回以上、２０年毎に１回投与する。例えば、自己免疫又は炎症状態の傾向にあることが知られ、又はそれが疑われる個体における場合には、体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の予防的用量を、１日１回以上、２０年毎に１回投与することによって予防効果を達成することができる。同様の方式で、ある医学的処置の結果として生じることが予想される炎症状態、例えば、細胞、組織もしくは臓器を個体に移植することから生じる移植片対宿主病に対して個体の感受性を低下させることができる。
【００９８】
本発明の別の方法においては、第１のＬＦＡ−３タンパク質に向けて標的設定された第１のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを第２のＬＦＡ−３タンパク質に向けて標的設定された第２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いるが、これはそのようなＬＦＡ−３タンパク質をいずれかのオリゴヌクレオチドを個別に用いたときに達成され得るものよりも高い程度まで調節するためである。本発明の様々な態様において、このようなオリゴヌクレオチドが標的とする第１及び第２ＬＦＡ−３タンパク質は同一であるか、異なるＬＦＡ−３タンパク質であるか、又は同じＬＦＡ−３タンパク質の異なるイソ型である。
【００９９】
幾つかの場合においては、治療計画の効率を高めるため、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を含む組成物を他の伝統的な治療様式と共に用いて患者を治療することがより効果的であり得る。本発明の脈絡において、“治療計画” という用語は治療、一時緩和及び予防様式を包含しようとするものである。治療に続いて、患者を彼／彼女の状態の変化について、及び障害もしくは疾患状態の症状の軽減について監視する。治療用又は医薬組成物の投与量は、患者が現在の投与量レベルに対して有意に応答しない場合には増加することができ、あるいは障害もしくは疾患状態の症状の軽減が観察される場合、又は障害もしくは疾患状態が取り除かれている場合には用量を減少することができる。
【０１００】
高リスクの個体に対する予防様式も本発明に包含される。ここで用いられる場合、“高リスクの個体” という用語は、例えば個体もしくは家族の履歴又は遺伝子試験により、疾患もしくは障害の発症もしくは再発に対して感受性である可能性が正常のものよりも高いことが決定されている個体を指すことが意図されている。高リスクの個体に対する治療計画の一部として、その個体を予防的に治療して疾患もしくは障害の発症もしくは再発を防止することができる。“予防上有効な量” という用語は、疾患もしくは障害の発症もしくは再発の防止として観察される効果を生じる、医薬組成物の量を指すことが意図されている。医薬組成物の予防上有効な量は、典型的には、活性薬剤を欠く第２の医薬組成物を同様の状況にある個体に投与したときに観察される効果と比較した、それらが有する効果によって決定される。
本発明の治療用及び医薬組成物は、局所又は全身性治療のいずれが望ましいのかに応じて、及び治療しようとする領域に応じて、幾つかの方法で投与することができる。典型的には、経口又は非経口投与のいずれかが用いられる。
【０１０１】
Ｂ．非経口送達：“非経口送達” は、消化管を通す以外の方法での、動物への１種類以上の本発明のアンチセンス化合物の投与を指す。非経口投与には、静脈内（ｉ．ｖ．）点滴、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）もしくは筋肉内注射、又はくも膜下内もしくは脳室内投与が含まれる。非経口、くも膜下内又は脳室内投与のための組成物には無菌水溶液が含まれ、これはまた、緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加物を含むことができる。非経口医薬組成物を調製及び投与する手段は当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ １５４５−１５６９ の Ａｖｉｓ 、８４章を参照）。非経口送達手段には以下の説明的な例が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
硝子体内注射（哺乳動物の目の硝子体液に薬物を直接送達するためのもの）が、米国特許第 ５，５９１，７２０号に記載されており、その内容は参照することによりここに組み込まれる。眼用製剤を調製及び投与する手段は当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ １５８１−１５９５ の Ｍｕｌｌｉｎｓら、８６章を参照）。
【０１０３】
静脈内投与（様々な非ヒト哺乳動物へのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの投与）が、Ｉｖｅｒｓｅｎ によって記述されている（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９９３， ｐａｇｅｓ ４６１−４６９の ２６ 章）。腹腔内手段による非ヒト哺乳動物へのオリゴヌクレオチドの全身性送達も記述されている（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９４， ９１， １１７６６ ）。
【０１０４】
腔内薬物投与（管状臓器又は組織（例えば、動脈、静脈、尿管もしくは尿道）の隔離部分に薬物を直接投与するためのもの）が、そのような臓器又は組織の管腔を冒す疾患又は状態の患者の治療に望ましいものであり得る。この様式のオリゴヌクレオチド投与を達成するため、適切な手段によってカテーテル又はカニューレを外科的に導入する。例えば、左総頸動脈を治療するため、カニューレを外頸動脈からその内部に挿入する。管状臓器又は組織の治療が求められる部分を隔離した後、本発明のアンチセンス化合物を含む組成物をカニューレもしくはカテーテルを通して隔離区画に注入する。約１〜約１２０分間インキュベートし、その間にオリゴヌクレオチドが血管内腔の細胞によって取り込まれ、その後、注入カニューレ又はカテーテルを取り除き、それらの区画の隔離を行っていた結紮糸を除去することによってその管状臓器又は組織内部の流れを回復させる（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９３， ９０， ８４７４ ）。アンチセンス化合物を生体適合性マトリックス、例えば、ヒドロゲル材料と組み合わせ、イン・ビボで血管組織に直接適用することもできる  （Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ら、米国特許第 ５，５９３，９７４号、１９９７年１月１４日発行）。
【０１０５】
脳室内薬物投与（患者の脳に薬物を直接送達するためのもの）が、脳を冒す疾患又は状態の患者の治療に望ましいものであり得る。この様式のオリゴヌクレオチド投与を達成するため、シリコーン・カテーテルをヒト患者の脳の脳室に外科的に導入し、それを腹部領域に外科的に移植されている皮下注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ 、ＭＮ）に接続する（Ｚｉｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８４， ４４， １６９８；Ｓｈａｗ， Ｃａｎｃｅｒ， １９９３， ７２（１１ Ｓｕｐｐｌ．， ３４１６）。このポンプはオリゴヌクレオチドの注入に用いられ、外部プログラミング装置の助けで正確な投与量の調整及び投与スケジュールの変更を可能にする。このポンプのリザーバ容量は１８〜２０ｍＬであり、注入速度は０．１ｍＬ／時〜１ｍＬ／時の範囲をとり得る。日毎から月毎までの範囲をとる投与の頻度、及び体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲をとる、投与しようとする薬物の用量に依存して、ポンプのリザーバを３〜１０週間隔で再充填することができる。ポンプの再充填は、ポンプの自己シーリング隔壁を経皮穿刺することによって達成することができる。
【０１０６】
くも膜下腔内薬物投与（患者の脊柱に薬物を導入するためのもの）が、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の患者を治療するのに望ましいものであり得る。この経路のオリゴヌクレオチド投与を達成するため、シリコーンカテーテルをヒト患者のＬ３−４腰髄間空間に外科的に移植し、それを上部腹部領域に外科的に移植されている皮下注入ポンプに接続する（Ｌｕｅｒ ａｎｄ Ｈａｔｔｏｎ， Ｔｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ， １９９３， ２７， ９１２， １９９３ ；Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ， １９７８， ４１， １２７０；Ｙａｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ．， １９８５， ５９， １９３ ）。このポンプはオリゴヌクレオチドの注入に用いられ、外部プログラミング装置の助けで正確な投与量の調整及び投与スケジュールの変更を可能にする。このポンプのリザーバ容量は１８〜２０ｍＬであり、注入速度は０．１ｍＬ／時〜１ｍＬ／時で変化し得る。日毎から月毎までの範囲をとる薬物投与の頻度、及び体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲をとる、投与しようとする薬物の投与量に依存して、ポンプのリザーバを３〜１０週間隔で再充填することができる。ポンプの再充填は、ポンプの自己シーリング隔壁まで１回経皮穿刺することによって達成される。ＣＮＳ内部でのオリゴヌクレオチドの分布、安定性及び薬物動態は公知の方法に従って追跡する（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９３， ９０， ４６６５ ）。
【０１０７】
この方法によって脳又は脊柱以外の領域へのオリゴヌクレオチドの送達を達成するには、皮下注入ポンプを、例えば、肝臓に送達するには肝動脈に接続するようにシリコーンカテーテルの構成を変える（Ｋｅｍｅｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ， １９９３， ７１， １９６４ ）。注入ポンプはオリゴヌクレオチドの全身性送達を達成するのに用いることもできる（Ｅｗｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９２， ５２， ３００５；Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ．， １９９６， ６２， １９４ ）。
【０１０８】
上皮及び経皮送達（薬物を含む医薬組成物が局所的に適用される）は、局所真皮に吸収させようとする薬物の投与に、又は下層組織にさらに浸透及び吸収させるためにそれぞれ用いることができる。調製及び医薬の局所投与の手段は当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ １５９６−１６０９ の Ｂｌｏｃｋ、８７章を参照）。
【０１０９】
膣送達は、局所治療をもたらし、初回通過代謝、消化酵素による分解、及び潜在的な全身性副作用を回避する。この様式の投与は膣が通常の生息地である病原性生物、例えば、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ）に向けて標的設定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドに好ましいものであり得る。別の態様においては、受胎及び続く妊娠の可能性を高めるため、精子特異的抗体をコードする遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドをこの投与様式によって送達することができる。膣座剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ １６０９−１６１４ の Ｂｌｏｃｋ、８７章）又は局所軟膏をこの様式の送達を達成するのに用いることができる。
【０１１０】
膀胱内送達は、局所治療をもたらし、初回通過代謝、消化酵素による分解、及び潜在的な全身性副作用を回避する。しかしながら、この方法は患者の尿道カテーテル処置及び熟練したスタッフを必要とする。それにも関わらず、この様式の投与は、泌尿生殖器管に侵入する病原性生物、例えば、膣トリコモナスに向けて標的設定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドに好ましいものであり得る。
【０１１１】
Ｃ．食事性送達：“食事性送達” という用語は、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を含む組成物を動物の消化管の一部に直接もしくは他の方法で投与することを指す。“消化管” という用語は、食物の消化及び吸収並びに食物残滓の排除において機能する、口から肛門までを走る動物体内の管状通路、並びにその部分又はセグメントのいずれか及び全て、例えば、口腔、食道、胃、小腸及び大腸、並びに結腸はもちろん、それらの複合部分、例えば、胃腸管を指す。したがって、“食事性送達” という用語は、経口、直腸、内視鏡及び舌下／頬投与を含むがこれらに限定されるものではない幾つかの投与経路を包含する。食事性送達用の組成物には無菌の水溶液が含まれ、これは緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加剤も含み得る。経口医薬組成物を調製及び投与する手段は当該技術分野において公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ １５９６−１６１４， １６３３−１６６５， １６６６−１６７５ ａｎｄ １６７６−１６９３ のそれぞれ Ｂｌｏｃｋ、８７章；Ｒｕｄｎｉｃ、８９章；Ｐｏｒｔｅｒ、９０章；及び Ｌｏｎｇｅｒ 、９１章を参照）。本発明のアンチセンス化合物を食事性送達するための好ましい組成物は１９９７年７月１日出願の、Ｔｅｎｇらの同時係属米国特許出願第 ０８／８８６，８２９ 号に記載されており、その開示全体は参照することによりここに組み込まれる。
【０１１２】
頬／舌下投与：口腔粘膜を介する薬物の送達には幾つかの望ましい特徴があり、これには、多くの場合、経口送達よりも迅速な薬物血漿濃度の上昇が含まれる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅ ７１１の Ｈａｒｖｅｙ 、３５章）。さらに、口からの静脈の流れは上大静脈に向かうため、この経路も肝臓による迅速な初回通過代謝を迂回する。両者の特徴はニトログリセリン用の選り抜きの様式である舌下経路に貢献する（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９６， ｐａｇｅ ７の Ｂｅｎｅｔら、１ 章）。
【０１１３】
内視鏡投与：内視鏡を、薬物を消化管の内部部分に直接送達するのに用いることができる。例えば、内視鏡逆行型胆嚢管膵臓撮影（ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｃｙｓｔｏｐａｎｃｒｅａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＥＲＣＰ）は延長された胃内視鏡を利用し、胆管及び膵管への選択的な接近を可能にする（Ｈｉｒａｈａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｎ Ｔｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ， １９９２， １９（１０ Ｓｕｐｐｌ．）， １５９１ ）。リポソーム製剤を含む医薬組成物は、内視鏡手段により、消化管の部分、例えば、十二指腸（Ｓｏｍｏｇｙｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， １９９５， １２， １４９）又は胃の粘膜下組織（Ａｋａｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９４， ８５， ６５２）に直接送達することができる。胃洗浄装置（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｉｆ． Ｏｒｇａｎｓ， １９９７， ２１， ２８ ）及び経皮内視鏡供給装置（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，  Ａｌｉｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， １９９５， ９， ４７１ ）も医薬組成物の直接食事性送達に用いることができる。
【０１１４】
直腸投与：経口経路で投与される薬物は、しばしば代わりに、下部腸経路で、すなわち、肛門を通して直腸又は下部腸に投与することができる。直腸座剤、滞留浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａｓ）又は直腸カテーテルをこの目的で用いることができ、他の方法では患者のコンプライアンスを達成することが困難である場合（例えば、小児及び老人用途、又は患者が嘔吐していたり意識不明である場合）に好ましいものであり得る。直腸投与は経口経路よりも迅速に高い血中濃度を生じることがあるが、逆もまた真であり得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅ ７１１の Ｈａｒｖｅｙ 、３５章）。直腸から吸収された薬物の約５０％が肝臓を迂回するため、この経路による投与は初回通過代謝の可能性を大きく低下させる（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９６の Ｂｅｎｅｔら、１ 章）。
【０１１５】
経口投与：好ましい投与方法は経口送達であり、これは典型的には全身性循環に接近するのに最も都合のよい経路である。消化管からの吸収は一般に適用可能である要素、例えば、吸収のための表面積、吸収部位への血流、薬物の物理的状態及び吸収部位でのその濃度によって支配される（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９６， ｐａｇｅｓ ５−７ の Ｂｅｎｅｔ、１ 章）。特定のオリゴヌクレオチドを含む経口投与された組成物は当該技術分野において公知である（例えば、Ａｇｒａｗａｌ らの米国特許第 ５，５９１，７２１号を参照）。本発明のアンチセンス化合物を経口送達するための好ましい組成物は、１９９７年７月１日出願の、Ｔｅｎｇ  らの同時係属米国特許出願第 ０８／８８６，８２９ 号（参照することによりここに組み込まれる）に記載されている。
本発明のアンチセンス化合物を経口送達するための好ましい組成物は、１９９７年７月１日出願の、Ｔｅｎｇらの同時係属米国特許出願第 ０８／８８６，８２９ 号（参照することによりここに組み込まれる）に記載されている。
【０１１６】
【実施例】
以下の例は本発明を説明するものであり、それを限定しようとするものではない。当業者は、ここに記載される特定の物質及び手順の多くの等価物を認識し、又は定型的な実験によって確認することができるであろう。このような等価物は本発明の範囲内にあるものとみなされる。
【０１１７】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
Ａ．一般的な合成技術：オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡシンセサイザで、酸化にヨウ素を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を用いて合成した。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ 、ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、標準酸化瓶をホスファイト連結の段階的チア化のためにアセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液で置き換えた。
２’ −Ｏ−メチル（ａ．ｋ．ａ．  ２’ −メトキシ−）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、標準ホスホロアミダイトの代わりに２’ −Ｏ−メチルβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ 、Ｎｅｅｄｈａｍ 、ＭＡ）を用い、テトラゾール及び塩基のパルス送達後の待機サイクルを３６０秒に増加させる上述の手順に従う。
【０１１８】
同様に、２’ −Ｏ−プロピル（ａ．ｋ．ａ．  ２’ −プロポキシ−）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはこの手順を僅かに修正することによって、及び本質的には１９９５年２月３日出願の米国特許出願第 ０８／３８３，６６６ 号に開示される手順に従って調製する。
本発明の２’ −フルオロ−ホスホロチオエートアンチセンス化合物は、５’ −ジメトキシトリチル−３’ −ホスホロアミダイトを用いて合成し、１９９５年２月３日出願の米国特許出願第 ０８／３８３，６６６ 号及び１９９６年１０月８日発行の米国特許第 ５，４５９，２５５号に開示される通りに調製する。２’ −フルオロ−オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト化学及び標準ＤＮＡ合成プロトコルの僅かな修正（すなわち、脱保護をメタノール性アンモニアを用いて室温で行う）を用いて調製した。
２’ −メトキシエチルオリゴヌクレオチドは本質的に Ｍａｒｔｉｎ らの方法（Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔｓ， １９９５， ７８， ４８６ ）に従って合成した。合成を容易にするため、２’ −メトキシエチルオリゴヌクレオチドの３’ ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであり、２’ −Ｏ−ＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３−シトシンは以下に記載される手順に従って合成した５−メチルシトシンであった。
ＰＮＡアンチセンス類似体は、本質的に、米国特許第 ５，５３９，０８２号及び第 ５，５３９，０８３号（両者とも１９９６年７月２３日発行）に記述の通りに調製した。
【０１１９】
Ｂ．５−メチル−２’ −メトキシエトキシ−シトシン：５−メチル−２’ −メトキシエトキシ−シトシン残基を有するオリゴヌクレオチドを以下のように調製する。
（ｉ）２，２’ −アンヒドロ［２−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］：５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ、銚子、日本から商業的に入手可能）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に添加した。この混合物を攪拌しながら還流温度に加熱し、放出される二酸化炭素ガスを制御された様式で放出させた。１時間後、僅かに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）に攪拌しながら注ぎ入れた。生成物がゴム状物質を形成した。エーテルをデカントし、その残滓を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。その溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ入れ、固いゴム状物質を得た。エーテルをデカントし、そのゴム状物質を真空オーブン内で乾燥させて（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固体を得、それを破砕して明黄褐色の粉末とした（５７ｇ、粗収率８５％）。この物質をそのままさらなる反応に用いた。
【０１２０】
（ｉｉ）２’ −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン：２，２’ −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、ホウ酸トリス（２−メトキシエチル）（２３１ｇ、０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧力容器に加え、１６０℃で予熱した油浴に入れた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開き、溶液を乾燥するまで蒸発させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共に摩砕した。その残滓を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁させた。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄して濾液を蒸発させた。その残滓（２８０ｇ）をＣＨ３ ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含むＣＨ２ Ｃｌ２ ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中で充填した。残滓をＣＨ２ Ｃｌ２ （２５０ｍＬ）に溶解してシリカ（１５０ｇ）に吸着させた後、カラムに載せた。生成物を充填溶媒で溶出し、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。
【０１２１】
（ｉｉｉ ）２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：２’ −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共に同時蒸発させ、乾燥した残滓をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの第１アリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その混合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチルの第２アリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その反応物をさらに１時間攪拌した。次に、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して反応を停止させた。ＨＰＬＣにより約７０％の生成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、ＣＨ３ ＣＮ（２００ｍＬ）と共に摩砕した。その残滓をＣＨＣｌ３ （１．５Ｌ）に溶解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３ 及び２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ ＳＯ４ で乾燥させ、濾過して蒸発させた。２７５ｇの残滓が得られた。その残滓を、０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填及び溶出する３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。純水画分を蒸発させて１６４ｇの生成物を得た。約２０ｇのさらなる生成物が不純画分から得られ、１８３ｇ（５７％）の合計収量が得られた。
【０１２２】
（ｉｖ）３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦ及び１８８ｍＬのピリジンから調製した３：１混合物７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を組み合わせ、室温で２４時間攪拌した。ＭｅＯＨを添加することでｔｌｃ試料の初回失活を行うことによってｔｌｃで反応を監視した。ｔｌｃによる判定で反応が完了したとき、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、その混合物を３５℃で蒸発させた。残滓をＣＨＣｌ３ （８００ｍＬ）に溶解し、２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を戻し、２００ｍＬのＣＨＣｌ３ で抽出した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて１２２ｇの残滓を得た（約９０％の生成物）。その残滓を３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  （４：１）を用いて溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させ、９６ｇ（８４％）を得た。
【０１２３】
（ｖ）３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン：３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ３ ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することにより第１溶液を調製し、脇に置いた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）をＣＨ３ ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に添加して−５℃に冷却し、オーバーヘッド・スターラーを用いて０．５時間攪拌した。ＰＯＣｌ３ を、３０分間にわたって、０〜１０℃に維持されたこの攪拌溶液に滴下により添加し、得られた混合物をさらに２時間攪拌した。第１溶液を、４５分間にわたって、後者の溶液に滴下により添加した。得られた反応混合物を低温室に一晩保存した。塩を反応混合物から濾過し、溶液を蒸発させた。その残滓をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体を濾過によって除去した。濾液を１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ３ 及び２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて蒸発させた。その残滓をＥｔＯＡｃと共に摩砕して表題の化合物を得た。
【０１２４】
（ｖｉ）２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：ジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ４ ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’ −Ｏ−アセチル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を室温で２時間攪拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残滓をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）と共沸した。その残滓をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ３ ガスを飽和させたメタノール（４００ｍＬ）を添加し、容器を１００℃に２時間加熱した（薄層クロマトグラフィー、ｔｌｃが完全な変換を示した）。容器の内容物を乾燥するまで蒸発させ、その残滓をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解して飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて表題の化合物８５ｇ（９５％）を得た。
【０１２５】
（ｖｉｉ ）Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残滓をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸した。その残滓をＣＨＣｌ３ （７００ｍＬ）に溶解して飽和ＮａＨＣＯ３ （２×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４ で乾燥させ、蒸発させて残滓を得た（９６ｇ）。その残滓を、１．５ｋｇのシリカカラムで、０．５％Ｅｔ３ ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として用いてクロマトグラフィー処理した。純水生成物画分を蒸発させ、表題の化合物９０ｇ（９０％）を得た。
【０１２６】
（ｖｉｉｉ）Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’ −アミダイト：Ｎ４ −ベンゾイル−２’ −Ｏ−メトキシエチル−５’ −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ２ Ｃｌ２ （１Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を攪拌しながら、窒素雰囲気下で添加した。得られた混合物を室温で２０時間攪拌した（ｔｌｃは反応が９５％完了していることを示した）。この反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３ （１×３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。洗浄水溶液を戻してＣＨ２ Ｃｌ２ （３００ｍＬ）で抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４ で乾燥させて濃縮した。得られた残滓を、１．５ｋｇのシリカカラムで、ＥｔＯＡｃ＼ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として用いてクロマトグラフィー処理した。純粋生成物画分を合わせ、表題の化合物９０．６ｇ（８７％）を得た。
【０１２７】
Ｃ．精製：コントロールド・ポア・グラス・カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から開裂し、濃水酸化アンモニウム中５５℃で１８時間脱ブロック処理した後、２．５容積のエタノールを含む０．５Ｍ  ＮａＣｌから２回沈殿させることによってオリゴヌクレオチドを精製した。分析用ゲル電気泳動を２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸バッファ、ｐＨ７．０で行った。オリゴヌクレオチド及びそれらのホスホロチオエート類似体は、電気泳動から、８０％を上回る完全長物質であるものと判定された。
【０１２８】
実施例２：ＬＦＡ−３に向けて標的設定されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
Ａ．ヒトＬＦＡ−３をコードする核酸に向けて標的設定されたオリゴヌクレオチド：表１には、ヒトＬＦＡ−３  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように設計された一組のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列及びそれらの対応するＩＳＩＳ及び配列番号が列挙されている。標的遺伝子のヌクレオチド等位部分（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｓ） 及び遺伝子の標的領域も含まれている。ヌクレオチド等位部分は ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ００６３６、ローカス名“ＨＳＬＦＡ３” から導き出される（Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９８７， １６６， ９２３の図２も参照）。遺伝指標的領域の略語は以下の通りである：５’ −ＵＴＲ、５’ 非翻訳領域；ＡＵＧ、翻訳開始領域；ＯＲＥ、読み取り枠；ｓｔｏｐ、翻訳終結領域；３’ −ＵＴＲ、３’ 非翻訳領域。オリゴヌクレオチドに相補的な標的配列の位置は図１に示されている。
その配列が表１に提示されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホロチオエート及びホスホジエステル連結の両者を含むＩＳＩＳ１７１５９を除いて、ホスホロチオエートによって連なる。これらのオリゴヌクレオチドは、２’ 位で修飾された（２’ −メトキシエトキシ）５つの連続するヌクレオチドを５’ 及び３’ 末端の両者に有するギャップマーである。これらの“ギャップマー” 内の内部ヌクレオチドは２’ 位で修飾されてはいない（２’ −デオキシ）。
【０１２９】
【表１】
0003590585.tif 000002
【０１３０】
実施例３：ＨＵＶＥＣ細胞におけるＬＦＡ−３発現のアンチセンス介在阻害の検定
Ａ．一般的な技術：潜在的なヒトＬＦＡ−３調節性オリゴヌクレオチドの活性を評価するため、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）からのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（その代わりに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、ＭＤからのＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３０を用いることができる）を成長させ、オリゴヌクレオチド又は対照溶液で下記のように処理した。回収後、培養抽出物を調製し、ＬＦＡ−３  ＲＮＡ及びタンパク質濃度について調べた（例えば、それぞれ、ノーザン又はフローサイトメトリー検定）。全ての場合において、“発現％” は非処理細胞（又はオリゴヌクレオチドを欠く対照溶液で処理した細胞）に対するオリゴヌクレオチド処理細胞におけるＬＦＡ−３特異的シグナルの量を指し、“阻害％” は以下のように算出する：
１００％  −  発現％  ＝  阻害％
【０１３１】
Ｂ．ＲＮＡ検定：各ＬＦＡ−３タンパク質のｍＲＮＡの発現を、それらに特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを用いて“ノーザン” 検定で決定した。ＬＦＡ−３に特異的な核酸プローブはこれらの例に記載されている。これらのプローブは当該技術分野において公知の手段で放射標識した（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， ｐａｇｅｓ ３−１１〜２−３−４４及び ４−１７ 〜 ４−１８ ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２６： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９４， ｐａｇｅｓ １６７−１８５ の Ｒｕｔｈ 、６ 章；及び Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ １０．１−１０．７０ の １０ 章を参照）。ＲＮＡのロードが等しいことを確認し、かつＬＦＡ−３転写体の濃度をＧ３ＰＤＨシグナルに関して標準化するため、ブロットを細片にし、３２Ｐ標識グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． 、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ 、ＣＡ）を用いて再検索した。
【０１３２】
ＨＵＶＥＣ（ヒト）細胞を、Ｔ−７５フラスコ内で、８０〜９０％集密まで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ 、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地中で成長させた。この時点で、細胞を１０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ）で３回洗浄した。次に、１０μ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（すなわち、１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ここで、ＤＯＴＭＡ＝Ｎ−［１−（２，３−ジオレイオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物であり、かつＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ）を含む５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地及び適量のオリゴヌクレオチドを細胞に添加した（ここに記載される実験においてオリゴヌクレオチドの添加時間はｔ＝０ｈである）。対照として、細胞を、オリゴヌクレオチド処理試料と同じ条件下で、同じ時間、オリゴヌクレオチドを含まないＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で処理した。３７℃で４時間後（ｔ＝４ｈ）、培地を、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＥＧＭ培地で置き換えた。細胞を典型的には２時間回復させた。次に、当該技術分野において公知の技術に従い、全細胞性ＲＮＡをグアニジニウム中で抽出し、ゲル電気泳動にかけてフィルターに移した（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ ７．１−７．８７の ７章、及び Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， ｐａｇｅｓ ２−２４ ｔｏ ２−３０ ａｎｄ ４−１４ ｔｏ ４−２９を参照）。
【０１３３】
ＲＮＡ転移に続いて、フィルターを、関心のある特定のＬＦＡ−３コード化遺伝子に対して特異的なプローブと、ハイブリダイゼーションバッファ（ＱＵＩＫＨＹＢ（商標）ハイブリダイゼーション溶液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中で、典型的には一晩ハイブリダイズさせる。これに続いて、室温（〜２４℃）で１５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回、及び６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。ハイブリダイズするバンドをＸ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに露光することによって可視化し、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）を用いて、本質的には製造者の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ 、ＣＡ）に従って定量した。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）又は匹敵する器機による定量化がＲＮＡ濃度測定の好ましい手段ではあるが、これらの“ノーザン” 検定の結果は当該技術分野において公知の他の手段によって決定することができる。
【０１３４】
Ｃ．タンパク質検定：ＨＵＶＥＣ細胞を、１２ウェルプレートフラスコ内で、８０〜９０％集密まで、１０％ＦＢＳを含むＥＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ 、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地中で成長させた。この時点で、細胞を１０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ）で３回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）［すなわち、１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ここで、ＤＯＴＭＡ＝Ｎ−［１−（２，３−ジオレイオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物であり、ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ）を含む５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地及び適量のオリゴヌクレオチドを細胞に添加した（ここに記載される実験においてオリゴヌクレオチドの添加時間はｔ＝０ｈである）。対照として、オリゴヌクレオチド処理試料と同じ条件下で同じ時間、オリゴヌクレオチドを含まないＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で処理した。３７℃で４時間後（ｔ＝４ｈ）、培地を、１０％ＦＢＳを含む新鮮なＥＧＭ培地で置き換えた。タンパク質抽出物の調製に先立ち、細胞を典型的には４８時間回復させた。細胞を洗浄し、トリプシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ）で処理することによって放出させた。細胞を、検査中のＬＦＡ−３タンパク質を特異的に認識する、適切に蛍光標識した一次抗体で染色し、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ（登録商標））技術（例えば、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ の米国特許第 ４，７２７，０２０号、Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔ らの第 ５，２２３，３９８号及び Ｓｉｚｔｏらの第 ５，５５６，７６４号を参照）を用いて各ＬＦＡ−３タンパク質の量を決定した。各ＬＦＡ−３タンパク質に特異的な蛍光標識一次抗体は適切な実施例に記載されている。その代わりに、ＬＦＡ−３に対する非標識一次抗体（幾つかがこれらの実施例に記載されている）を用い、蛍光標識二次  （すなわち、一次抗体に特異的な）抗体を用いることによって検出することができる。
【０１３５】
ＬＦＡ−３濃度を測定するための代替法においては、細胞溶解物及びタンパク質抽出物を電気泳動し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ニトロセルロースフィルターに移して当該技術分野において公知の手段によって検出する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ １８．３４， １８．４７−１８．５４ ａｎｄ １８．６０−１８．７５の １８ 章を参照）。ＬＦＡ−３に対する非標識一次抗体を用い、例えば、その一次抗体に結合する二次抗体による一次抗体の検出を含む、当該技術分野において公知の手段によって検出し（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， ｐａｇｅｓ １０−３３ ｔｏ １０−３５；及び Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ １８．１−１８．７５ ａｎｄ １８．８６−１８．８８ の １８ 章を参照）、かつ当該技術分野において公知の他の抗体ベースの検定を用いて定量することができる。このような抗体ベースの検定には、ＥＬＩＳＡ検定、ウェスタン検定等が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｗａｎｄｓ らの米国特許第 ４，８７９，２１９号及び Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ らの第 ４，８３７，１６７号並びに Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， ｐａｇｅｓ １１−５ ｔｏ １１−１７を参照）。ＬＦＡ−３の活性は当該技術分野において公知の適切な細胞接着検定及びモデル系において測定することができる（Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９１， ９， ２７ ）。
【０１３６】
実施例４：オリゴヌクレオチドによるヒトＬＦＡ−３の発現のアンチセンス介在阻害
Ａ．ＬＦＡ−３オリゴヌクレオチドの活性：ＬＦＡ−３の発現を調節することができる活性化合物の初期スクリーニングにおいて、ＨＵＶＥＣ細胞を１０ｎＭの一連のＬＦＡ−３特異的“ギャップマー” オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ番号１６３７１〜１６３８１、１６９０９〜１６９１２、１７０９２及び１７１５９；配列番号２〜１５）で処理し、ＬＦＡ−３タンパク質の濃度を、ＦＡＣＳ（登録商標）により、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ 、ＣＡ）からのフィコエリスリン（ＰＥ）に結合した、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）に対するモノクローナル抗体を用いて決定した。アイソタイプ（マウスＩｇＧ−２ａカッパ）対照抗体（同様に Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ から）は、典型的には、基本シグナルの≦５％のシグナルをもたらした。ＬＦＡ−３に対するＰＥ−及びＦＩＴＣ−標識抗体は、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ 、ＭＥ）、Ｓｅｒｏｔｅｃ （Ｏｘｆｏｒｄ、英国）、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ 、ＭＥ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（ＲＤＩ 、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）から入手可能である。標識二次抗体との組み合わせでＦＡＣＳ（登録商標）分析に適する、他のＬＦＡ−３に対する一次抗体は、上記ベンダー及び、例えば、Ｅｎｄｏｇｅｎ （かつては Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）及び Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ 、ＮＹ）から入手可能である。
【０１３７】
スクリーニングからのデータ（表２）は以下の結果を示す。この検定において、阻害レベル≧ＬＦＡ−３タンパク質濃度の約３０％（ここで、“約” は±５％を示す）に反映される活性を示すオリゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ番号１６３７１、１６３７３、１６３７４、１６３７６、１６３７７、１６３７８、１６９０９、１６９１０及び１７１５９（それぞれ、配列番号２、４、５、７、８、９、５、２、及び５）が含まれる。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは、ＬＦＡ−３の発現を調節するための本発明の好ましい態様である。この検定において阻害レベル≧ＬＦＡ−３の約５０％（ここで、“約” は±５％を示す）を示すオリゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ番号１６３７１、１６３７４、１６９１０及び１７１５９（それぞれ、配列番号２、５、２及び５）が含まれる。したがって、これらのオリゴヌクレオチドはＬＦＡ−３の発現を調節するための本発明の最も好ましい態様である。
【０１３８】
【表２】
0003590585.tif 000003
【０１３９】
Ｂ．用量応答及び配列特異性：様々な濃度のＩＳＩＳ番号１６３７１、１６３７４、１６３７５及び１３３１５での処理の４時間後の、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＬＦＡ−３タンパク質の発現の用量応答が表３に示されている。ＩＳＩＳ１３３１５（配列番号１６）はマウスＩＣＡＭ−１を標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチドであり、無関連配列対照として用いた。ＬＦＡ−３タンパク質の濃度は上述の通りＦＡＣＳ（登録商標）によって決定した。これらの条件下で、活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１６３７１及びＩＳＩＳ１６３７４は、１０ｎＭの濃度で適用したとき、それぞれ、ＬＦＡ−３タンパク質濃度の約４５％及び７０％阻害をもたらし、ここで“約” は±５％を示す。対照的に、不活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１６３７５では最小阻害、すなわち、≦約１５％阻害がもたらされた。ＩＳＩＳ１６３７１については、阻害の程度は３０ｎＭで約６５％に増加した。ＩＳＩＳ１６３７４については、阻害の程度は３０ｎＭで約８０％に増加した。
【０１４０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるＬＦＡ−３の調節の特異性を、ＩＳＩＳ番号１３３１５を対照として用いて確認した。それらの結果は、対照オリゴヌクレオチドでの細胞の処理がＬＦＡ−３タンパク質の発現に対してほとんど効果がないことを示す。これらの結果は、スクランブルされた対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ番号１６９１１、１６９１２、１７０９２について表２に示される結果と一致する。これらのスクランブルされた対照オリゴヌクレオチドはＬＦＡ−３の最小阻害、すなわち、≦約１０％（ここで、“約” は±５％を示す）をももたらした。これらの結果は、活性アンチセンス化合物のＬＦＡ−３調節活性が配列特異的であることを示す。
【０１４１】
【表３】
0003590585.tif 000004
【０１４２】
Ｃ．アンチセンス機構の確認：活性と同定されたオリゴヌクレオチドがアンチセンス機構で作用することを確認するため、以下の実験を行ってＬＦＡ−３ｍＲＮＡの濃度を検定した。ＬＦＡ−３特異的核酸プローブを調製するため、ＰＲＩＭＥ−Ａ−ＧＥＮＥ（登録商標）標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ 、Ｍａｄｉｓｏｎ 、ＷＩ）を用いるＰＣＲ反応において、ＨＵＶＥＣ細胞に由来するＲＮＡ及び一対のホスホジエステルオリゴヌクレオチド、
５’−ＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣ         （配列番号１７）；及び
５’−ＧＴＴＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣ         （配列番号１８）、
をプライマーとして用いて、放射標識ＬＦＡ−３特異的ＰＣＲ産物を調製した。得られた３２Ｐ−シトシン放射標識７４３ｂｐ産物はヒトＬＦＡ−３の読み取り枠（配列番号１）にハイブリダイズする。しかしながら、その代わりに、他のＰＣＲプローブを調製することができ、又は当該技術分野において公知の方法を用いて表１のオリゴヌクレオチドの１つ以上を検出可能に標識してＬＦＡ−３特異的プローブとして用いることができる。
【０１４３】
ノーザン検定は、上記プローブを用いて、実施例３に記述される通りに行った。ＨＵＶＥＣ細胞を５ｎＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理し、ｔ＝ｈにＲＮＡを回収した。この実験を３回行い、それらの結果をＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）を用いて定量し、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）をコードするｍＲＮＡに対して標準化した。これらの結果（表４）は、ＩＳＩＳ１６３７４がＬＦＡ−３  ｍＲＮＡの濃度をほぼ８５％減少させ、これに対して対照（スクランブルされた）オリゴヌクレオチドはＬＦＡ−３  ｍＲＮＡの濃度に対する効果がほとんどないことを示す。したがって、本発明の化合物はそれらの効果を紛うことなくアンチセンス機構で発揮する。
【０１４４】
【表４】
0003590585.tif 000005
【０１４５】
Ｄ．ヒトＬＦＡ−３をコードする核酸のアンチセンス調節に好ましい領域：本発明のアンチセンス化合物はＬＦＡ−３をコードする核酸のいかなる部分にも特異的にハイブリダイズする（標的設定される）ように設計することができる。しかしながら、上述の結果は、ヒトＬＦＡ−３をコードする核酸の幾つかの領域及びそのような領域内の配列がヒトＬＦＡ−３のアンチセンス調節に特に好ましく、したがって、それを調節するように設計されるアンチセンス化合物の好ましい標的領域であることを示す。
【０１４６】
１．ヒトＬＦＡ−３のＡＵＧ（開始）コドン領域は、本発明の好ましい態様である、ＩＳＩＳ１６３７１及び１６９１０（配列番号２）の標的領域である。
２．ヒトＬＦＡ−３のＯＲＦ（読み取り枠）はＩＳＩＳ１６３７３、１６３７４、１６９０９及び１７１５９（配列番号４及び５）の標的領域であり、これらは全て本発明の好ましい態様である。
３．ヒトＬＦＡ−３の終止コドン領域はＩＳＩＳ１６３７６及び１６３７７（配列番号７及び８）の標的領域であり、これらは全て本発明の好ましい態様である。図１に示されるように、これらのアンチセンス化合物はヒトＬＦＡ−３配列の塩基対７６０〜８００（配列番号１）を含み、したがって、この領域（配列番号１９）はヒトＬＦＡ−３を調節するように設計されるアンチセンス化合物の好ましい標的領域である。
４．ヒトＬＦＡ−３の３’ −ＵＴＲ（非翻訳領域）は、本発明の好ましい態様であるＩＳＩＳ１６３７８（配列番号９）の標的領域である。
【０１４７】
Ｅ．ＬＦＡ−３の異なるイソ型への標的指向性：配列番号１（Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９８７， １６６， ９２３）によってコードされるＬＦＡ−３の膜貫通形態に加えて、ＬＦＡ−３の２つのイソ型が公知である。本発明のアンチセンス化合物のあるものは、特定の効果を達成するために特定のイソ型を指向させることができる。
“ＰＩ連結ＬＦＡ−３” （ａ．ｋ．ａ．  ＰＩ連結ＣＤ５８）は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）への共有結合によって細胞膜に固定されるＬＦＡ−３のイソ型である。ＰＩ連結ＬＦＡ−３は細胞表面上に提示され、したがって細胞：細胞会合に寄与し得るが、細胞膜を横切ることがなく、したがって、おそらくはシグナル伝達を行うことはない。ＰＩ連結ＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｓｅｅｄ， Ｎａｔｕｒｅ， １９８７， ３２９， ８４０）は、７１９〜１０４０位で膜貫通イソ型をコードするもの（配列番号１）から分かれる。したがって、ＩＳＩＳ１６３７６、１６３７７及び１６３７８（配列番号７、８及び９）を含むがこれらに限定されるものではない、この領域に向けて標的設定されるアンチセンス化合物は、ＰＩ連結ＬＦＡ−３の発現に大きな衝撃を与えることなく膜貫通形態の発現を減少又は阻害することが予想される。
【０１４８】
“可溶性ＬＦＡ−３” （ａ．ｋ．ａ．  ｓＬＦＡ−３又はｓＣＤ５８）はヒトの血清及び尿並びに幾つかのヒト細胞系の培養上清において同定されている（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９３， ２３， ３００３）。ｓＬＦＡ−３が産生されるイン・ビボ機構は未だ特徴付けられていないが、同様の生物学的な系に基づくと、（１）膜貫通ドメインを欠くイソ型をコードするｍＲＮＡを産生する、ＬＦＡ−３をコードするＲＮＡの代替スプライシング又は  （２）膜結合ＬＦＡ−３タンパク質のタンパク分解性開裂のいずれかから生じる可能性がある。いかなる特定の理論によっても結び付けることを望むものではないが、ｓＬＦＡ−３が代替スプライシングによって産生される場合、ＬＦＡ−３の膜貫通ドメインをコードするＲＮＡの部分に向けて標的設定されているアンチセンス化合物は、ｓＬＦＡ−３の発現に大きな衝撃を与えることなくＬＦＡ−３の膜貫通形態の発現を減少又は阻害することが予想される。膜貫通ドメインは配列番号１の塩基６５５〜１０４０によってコードされ（Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９８７， １６６， ９２３）、この領域に向けて特異的に標的設定されるアンチセンス化合物にはＩＳＩＳ１６３７６、１６３７７及び１６３７８（配列番号７、８及び９）が含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなアンチセンス化合物は、可溶性ＬＦＡ−３の発現に大きな衝撃を与えることなく、代替ＲＮＡスプライシングによって産生されるＬＦＡ−３の膜貫通形態の発現を減少又は阻害することが予想される。
【０１４９】
実施例５：Ｔ細胞刺激のアンチセンス介在阻害
研究から、ヒト内皮細胞（ＥＣ）が、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって活性化されたＴ細胞からのインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生を有効に同時刺激することが示されている。ＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体を用いる遮断実験により、ＬＦＡ−３：ＣＤ−２介在シグナル伝達がＥＣによる同時刺激の約５０％に寄与することが示唆されている（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９９０， １７１， １４５３）。サイトカインの産生及びＴ細胞の増殖によって測定される、Ｔ細胞を活性化する細胞の能力を調節する本発明のアンチセンス化合物の能力を評価するため、以下の実験を行った。
【０１５０】
Ａ．ＰＨＡ同時刺激検定：連続的に培養したＨＵＶＥＣ細胞を、６ウェル組織ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）において、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を用いて、前に実施例に記載されるように、２５ｎＭのＩＳＩＳ１６３７４（活性ＬＦＡ−３オリゴヌクレオチド）又は１７０９２（１６３７４のスクランブル化対照）で処理した。７０時間後、処理細胞の試料をＬＦＡ−３の表面発現について、ＦＡＣＳ（登録商標）分析により、前の実施例のように、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５８（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ 、ＭＥ）を用いて分析した。ＩＳＩＳ１６３７４処理ＨＵＶＥＣ細胞上でのＬＦＡ−３の表面発現は、スクランブル化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１７０９２で処理した細胞の表面上に発現するものの２０〜２５％に減少した。残りの細胞は、以下の同時刺激検定のため、組織培養丸底９６ウェルプレートに再塗布した。
【０１５１】
ＣＤ４＋   Ｔ細胞を成人ボランティア・ドナーに由来する末梢血単球（ＰＢＭＣ）からネガティブ選択により単離したところ、得られた細胞は約９０％のＣＤ４＋ であった。約２，０００の精製ＣＤ４＋   Ｔ細胞を、各ウェルの、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２．５ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（全て Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を最終容積２００μＬで含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に添加した。Ｔ細胞分裂促進因子フィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ 、ＭＯからのＰＨＡ−Ｌ）も３μｇ／ｍＬで培地に添加した。
【０１５２】
比較の目的で、遮断剤ＩＥ６（抗ＣＤ５８、アイソタイプＩｇＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 、ＭＡからの贈り物）を５０μｇ／ｍＬで添加した；対照として、Ｋ１６／１６（非結合性ＩｇＧ１、腹水）を１：１０００希釈で添加した。他の抗ＣＤ５８遮断抗体、例えば、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 、ＭＡからのカタログ番号８−４７５８Ｎ、又は Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ 、Ｕ．Ｋ．の寄託番号９１０６０５５８を用いることができる。２４時間後に培地を集め、ヒトＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ． 、Ｍｉａｍｉ 、ＦＬ）を用いて様々なＴ細胞産生サイトカインについて検定した。
【０１５３】
これらの結果が図２に示されており、ここで各データ点は２つのウェルの平均を表す。スクランブル化対照（ＳＣ）オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１７０９２は３種類のサイトカインの産生に対して効果がなく（“ＳＣ／ＥＣ” 、白抜きの四角）、かつサイトカインの産生を減少させる、ＬＦＡ−３もしくはＣＤ２に対するモノクローナル抗体の能力を阻害することがない（“ＳＣ／ＥＣ” 、それぞれ斜線付き及び塗りつぶした四角）。対照的に、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＩＳＩＳ１６３７４は、サイトカイン産生の阻害において、ＬＦＡ−３もしくはＣＤ２に対する抗体とほぼ同様に有効であった（“ＡＳＯ／ＥＣ” 、白塗りの四角）。ＩＳＩＳ１６３７４を抗体と組み合わせたとき、サイトカイン産生のさらなる減少は見られなかった（“ＡＳＯ／ＥＣ” 、斜線付き及び塗りつぶした四角）。
【０１５４】
Ｂ．アロ反応：従来の研究により、ＩＦＮ−γ処理培養ＥＣが同種ＣＤ４＋ 細胞を活性化してサイトカインを分泌させ、かつ増殖させることが可能であり、及びＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体がこのアロ反応を阻害することが示されている（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９３， ５６， １２８ ）。同時刺激を平底プレートで行い、かつＰＨＡを添加しなかったことを除いて、ＰＨＡ同時刺激検定と同様の方法でアロ反応を開始した。ＣＤ４＋   Ｔ細胞の添加の４日前［ｄ（−４）］にＥＣを低集密で塗布し、直ちに５００Ｕ／ｍＬヒトＩＦＮ−γで処理してクラスＩＩ  ＭＨＣの発現を誘導した。ｄ（−３）にＥＣをオリゴヌクレオチドで処理し、ｄ（−１）に再塗布し、ｄ０に１０μｇ／ｍＬのミトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ ）で１時間処理して洗浄した後、３×１０５ 個の精製ＣＤ４＋   Ｔ細胞を添加した。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡキットを用いるサイトカイン検定のため、ｄ１、ｄ２又はｄ３にこれらの同時培養物から培地を集めた。ＩＬ−２を測定する実験においては、培地からの細胞のＩＬ−２の取り込みを防止するため、抗ＴＡＣを１０ｍｇ／ｍＬで添加した。抗ＴＡＣは、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖に結合してそれがＩＬ−２と相互作用するのを遮断するモノクローナル抗体である（Ｔｏｍ Ｗａｌｄｍａｎｎからの贈り物であり、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ 、ＣＡから商業的に入手可能である）。加えて、ｄ４、ｄ５、ｄ６又はｄ７の同時培養の最後の１８〜２４時間の間に、１μＣｉの［３ Ｈ］チミジンを各ウェルに添加し、Ｔ細胞の増殖を［３ Ｈ］の取り込みによって評価した。これらのプレートを９６ウェル収穫器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｃｏ． Ｌｔｄ． 、東京、日本）で収穫し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ シンチレーション・カウンター（ＥＣ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ 、Ｔｕｒｋｕ 、フィンランド）でカウントした。これらの結果が図３及び４に示されており、ここで各データ点は３つの複製ウェルの平均を表す。
【０１５６】
図３に示されるように、活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１６３７４でＥＣを前処理する（閉じた四角）ことで、スクランブルした対照オリゴヌクレオチド１７０９２（開いた四角）と比較してＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生が阻害された。ＩＦＮ−γに対する効果は著しいものではなかったが、ＩＬ−２に対するＩＳＩＳ１６３７４は約５０％阻害のレベルを少なくとも３日間維持した。
【０１５７】
３つの独立した増殖検定からの結果が図４に示されている。アロ応答は幾らか変動する；ピーク増殖応答の阻害の程度は約２０％〜約５０％の範囲であった。しかしながら、全ての場合において、ピーク増殖応答はＩＳＩＳ１６３７４でのＥＣの前処理によって阻害される。
これらの結果は、本発明のアンチセンス化合物がヒト内皮細胞上でのＬＦＡ−３の発現を特異的に阻害し、かつそのような処理がＴ細胞を活性化するそのような細胞の能力を少なくともＬＦＡ−３もしくはＣＤ２に対するモノクローナル抗体と同じ程度まで低下させることを示す。
【０１５８】
実施例６：治療方法
本発明のアンチセンス化合物はイン・ビボで免疫抑制性及び抗炎症性効果を生じ、当業者がそのような効果を必要とする、ヒトを含む動物に予防的、一時緩和的及び治療上の利益をもたらすのに用いることができる。また、本発明のアンチセンス化合物は癌細胞の転移を阻害するそれらの能力についても評価され、過剰増殖性疾患からの予防的、一時緩和的又は治療的軽減をもたらすのに用いられる。本発明のアンチセンス化合物を用いる治療方法には以下の例が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
Ａ．望ましくない免疫応答性現象の調節：本発明は、動物において直接もしくは間接的にＬＦＡ−３が介在し、又はそれによって影響を受ける免疫応答性現象を調節する方法を提供する。このような免疫応答性現象は望ましくない効果、例えば、炎症につながり得る。ＬＦＡ−３が介在し、又はそれによって影響を受ける免疫応答性現象の調節方法は、必要であれば医薬製剤中の、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物（又はそれらと１種類以上の抗炎症剤もしくは免疫抑制性非アンチセンスベースの薬剤、すなわちＮＡＢＡの組み合わせ；下記参照）を動物に投与することを含む。本発明のアンチセンス化合物の幾つかの特定の治療様式が例として以下に続くが、これらは本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１６０】
１．ＬＦＡ−３及びＣＤ２が介在する現象：本発明はＬＦＡ−３の発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。引き続く分子及び／又は細胞の現象を誘発するにはＬＦＡ−３のＣＤ２への結合が必要であるため、ＬＦＡ−３発現の阻害はそのような現象の減少又は阻害を生じるものと予想される。様々なイン・ビトロ及びイン・ビボ法が、本発明のアンチセンス化合物のＬＦＡ−３：ＣＤ２相互作用を阻害する能力の検定に利用可能である  （例えば、Ｄｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １９９６， １３２， ４６５；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９６， １５７， １８６３ を参照）。
【０１６１】
２．Ｔ細胞の活性化：本発明は、動物においてＬＦＡ−３介在Ｔ細胞活性化を調節する方法であって、必要であれば医薬製剤中の、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物、又はそれらと１種類以上の抗炎症剤もしくは免疫抑制剤との組み合わせを動物に投与することを含む方法を提供する。膜結合ＣＤ２について細胞表面ＬＦＡ−３と競合する可溶性形態のＬＦＡ−３は、Ｔ細胞の活性化を妨害する（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， ９２， ３９）。望ましくないＬＦＡ−３介在又は関連Ｔ細胞活性化は、多くの傷害性免疫応答における重要な成分であるものと考えられ、この傷害性免疫応答には炎症、喘息、アルコール性肝硬変を含む慢性肝疾患等が含まれる（Ｍｅｎｇｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．， １９９４， １４９， ３４５；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ．， １９９６， ２５， ４６５；Ｓａｎｔｏｓ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９６， ５０， １７９）。必要であれば適切な医薬組成物の一部として、本発明のアンチセンス化合物を動物に投与することで、Ｔ細胞の活性化及びそれに続く望ましくない免疫応答性現象、例えば、炎症及び炎症性損傷の阻害が期待される。このような治療は、１種類以上の抗炎症剤及び／又は免疫抑制性ＮＡＢＡ及び、それに加えて、又はその代わりに、例えばＣＡＭタンパク質、Ｂ７ タンパク質、もしくはプロテインキナーゼＣに向けて標的設定された１種類以上のさらなるアンチセンス化合物との組み合わせであり得る（下記参照）。このような投与は全身性のものであっても、又は直接炎症及び／又は炎症性損傷の部位（１ヶ所もしくは複数箇所）に対するものであってもよい。本発明のアンチセンス化合物は、Ｔ細胞の活性化及び引き続く望ましくない炎症及び／又は炎症性損傷を調節するそれらの能力について、例えば、実施例５に記載される検定及び／又は他の適切なものを用いて、イン・ビトロ又はイン・ビボモデルにおいて評価される。
【０１６２】
３．同種移植片拒絶及びＧＶＨＤ：本発明は、動物における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療又は防止を含む同種移植片拒絶を回避する方法であって、必要であれば医薬製剤中の、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物、又はそれらと１種類以上の抗炎症剤もしくは免疫抑制剤との組み合わせを動物に投与することを含む方法も提供する。可溶性ＬＦＡ−３−ＩｇＧ１融合タンパク質によるＬＦＡ−３：ＣＤ２相互作用の阻害は、霊長類の心臓同種移植の生存期間を長期化し、免疫不全マウス／ヒトキメラにおいて異種移植された皮膚組織を保護することが示されている（Ｋａｐｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９６， ６１， ３５６ ；Ｓｕｌｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９９７， １５， ７５９ ）。したがって、１種類以上の本発明のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を（必要であれば、他の薬剤と組み合わせて、及び適切な医薬組成物の一部として）動物に投与することで、異種移植片もしくは同種移植片拒絶及びＧＶＨＤの調節が期待される。
【０１６３】
この方法における本発明のアンチセンス化合物の投与は全身性のものであっても、直接移植した組織（１つもしくは複数）もしくは臓器（１つもしくは複数）の領域（１ヶ所もしくは複数箇所）に対するものであってもよく、又はエキソ・ビボで移植以前に組織（１つもしくは複数）もしくは臓器（１つもしくは複数）に投与される。このような治療は、１種類以上の抗炎症剤及び／又は免疫抑制性ＮＡＢＡ及び、それに加えて、又はその代わりに、ＣＡＭタンパク質、Ｂ７ タンパク質、もしくはプロテインキナーゼＣに向けて標的設定された１種類以上のさらなるアンチセンス化合物との組み合わせであり得る（下記参照）。本発明のアンチセンス化合物は、同種移植片拒絶を調節するそれらの能力について、１種類以上の当該技術分野において公知の検定及び／又は１種類以上の適切な動物モデルを用いて評価される（例えば、Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９４， １５３， ５３３６ 、及び Ｂｅｎｎｅｔｔらの米国特許第 ５，５１４，７８８号の実施例２１を参照、これらは参照することによりここに組み込まれる）。
【０１６４】
５．関節炎：本発明は、動物における様々な形態の関節炎を治療する方法であって、必要であれば医薬製剤中の、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物、又はそれらと１種類以上の抗炎症剤もしくは免疫抑制剤との組み合わせを動物に投与することを含む方法も提供する。このような投与は全身性のものであっても、直接関与する組織、例えば、滑液に対するものであってもよい。可溶性形態のＬＦＡ−３（ＣＤ５８）は関節リューマチ（ＲＡ）の患者の滑液中で同定されており、かつＲＡではないヒトにおいて見出される濃度と比較してＲＡ患者においては低い濃度で見出される（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９６， １０４， ４６０ ；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， １９９６， １４， ２３ ）。したがって、１種類以上の本発明のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を（必要であれば、他の薬剤と組み合わせて、及び適切な医薬組成物の一部として）動物に投与することで、ＲＡの調節が期待される。
【０１６５】
ＲＡを治療するための本発明のアンチセンス化合物の投与は、１種類以上のさらなるアンチセンス化合物又は抗炎症剤／免疫抑制性ＮＡＢＡとの組み合わせであってもよい（下記参照）。本発明のアンチセンス化合物は、関節炎及びそれらから生じる炎症性損傷を調節するそれらの能力について、当該技術分野において公知の１種類以上の検定及び／又は１種類以上の適切な動物モデルを用いて評価される（例えば、Ｂｅｎｏｉｓｔ らの公開ＰＣＴ出願 ＷＯ ９５／３２２８５を参照）。
【０１６６】
６．腸の炎症性障害：本発明は、動物における様々な腸の炎症性障害を治療する方法であって、必要であれば医薬製剤中の、１種類本発明のアンチセンス化合物、又はそれらと１種類以上の抗炎症剤もしくは免疫抑制剤との組み合わせを動物に投与することを含む方法も提供する。このような障害には、例えば、クローン病（ＣＤ）及び他の形態の局所的腸炎；並びに潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及び肉芽腫性、虚血性及び放射線大腸炎を含む様々な形態の大腸炎が含まれる（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， ｐｐ． ７９７−８０６， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｈａｙ， Ｎ．Ｊ．， １９８７を参照）。クローン病に見出される組織肉芽腫に類似する細胞性の凝集体が形成されるクローン病のイン・ビトロモデルが記述されている。ＬＦＡ−３に対する抗体を遮断することで、このモデルにおけるイン・ビトロ凝集体形成が阻害される（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １９９３， １０４， ７７２ ）。さらに、ＲＡの場合と同様に、炎症性腸疾患の患者においては可溶性ＬＦＡ−３の濃度が低下する（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｚ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １９９６， ３４， ５２２）。これらの知見は、１種類以上の本発明のＬＦＡ−３調節性アンチセンス化合物を（必要であれば、他の薬剤と組み合わせて、及び適切な医薬組成物の一部として）動物に投与することで、クローン病及び他の腸の炎症性障害の調節が期待できることを示す。
【０１６７】
このような障害を治療するための本発明のアンチセンス化合物の投与は、１種類以上のさらなるアンチセンス化合物又は抗炎症剤及び／又は免疫抑制性ＮＡＢＡとの組み合わせであってもよい（下記参照）。本発明のアンチセンス化合物は、腸の炎症性障害を調節するそれらの能力について、１種類以上の当該技術分野において公知の検定及び／又は１種類以上の適切な動物モデルを用いて評価される（例えば、Ｏｋａｙａｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １９９０， ９８， ６９４ ；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， １９９３， １０４， ７７２ ；及び Ｂｅｎｎｅｔｔらの米国特許第 ５，５１４，７８８号の実施例２０を参照、これらは参照することによりここに組み込まれる）。
【０１６８】
７．自己免疫疾患及び障害：本発明は、自己免疫甲状腺障害；関節炎の自己免疫形態；多発性硬化症（ＭＳ）；若年性糖尿病の幾つかの形態；重症筋無力症；尋常性天疱瘡；及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥもしくはループス）を含むがこれらに限定されるものではない様々な自己免疫疾患及び障害の治療方法も提供する（自己免疫障害の再検討のためには、Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｓｃｉ． Ａｍｅｒ．， １９９３， ２６９， １０７を参照）。本発明の好ましい態様は、自己免疫甲状腺障害、例えば、グレーブス病（甲状腺中毒症）、橋本病及びド・ケルヴァン甲状腺炎の治療又は防止に関与し、これはＬＦＡ−３がこのような状態において発現することが観察されているためである（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．， １９９０， ３， ７２７ ）。必要であれば適切な医薬組成物の一部として、本発明のアンチセンス化合物を動物に投与することで、自己免疫疾患の発症及び引き続く望ましくない現象の防止又は阻害が期待される。このような治療は、１種類以上の抗炎症剤／免疫抑制性ＮＡＢＡ並びに、それに加えて、又はその代わりに、例えばＣＡＭタンパク質、Ｂ７ タンパク質、もしくはプロテインキナーゼＣに向けて標的設定されている、１種類以上のさらなるアンチセンス化合物との組み合わせであってもよい。このような投与は、障害の性質に応じて、全身性のものであっても直接特定の組織に対するものであってもよい。例えば、全身性投与はＳＬＥに対してより適切であり、これに対してグレーブス病の場合には甲状腺又は隣接組織への直接投与がより有効であろう。本発明のアンチセンス化合物は、自己免疫疾患を防止又は阻害するそれらの能力について、当業者に公知の適切な検定及び動物モデルを用いて評価される（例えば、Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． Ｉｎｔ．， １９９７， １７， ９１ を参照）。
【０１６９】
Ｂ．過剰増殖性障害の治療：良性腫瘍、及び発達過程の早期に検出されている原発性悪性腫瘍を有する患者は、しばしば、その良性もしくは原発性腫瘍を外科的に除去することによってうまく治療することができる。しかしながら、検査をしないと、悪性腫瘍に由来する細胞が浸潤及び転移のプロセスにより患者の身体中に広がる。浸潤は、最初の付着部位から脱着し、例えば、下層をなす基底膜に侵入する癌細胞の能力を指す。転移は、（１）癌細胞がその細胞外マトリックスから脱着し、（２）脱着した癌細胞が、しばしば循環系を介して、患者の身体の別の部分に移動し、かつ（３）遠位の不適切な細胞外マトリックスに付着し、それにより二次腫瘍が生じ得る病巣を作製する、という現象の系列を示す。正常細胞は浸潤もしくは転移する能力を持たず、及び／又はそのような現象が生じたとしてもアポトーシス（プログラムされた細胞死）を受ける（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｓｃｉ． Ａｍｅｒ．， １９９６， ２７５， ７２）。
【０１７０】
播種性の前癌性又は癌性細胞は、しばしば、上記転移プロセスの工程（３）を促進し得る接着分子の異所的発現を示す。このような接着分子の例にはＩＣＡＭ−１及び他のＣＡＭが含まれる（再検討のためには、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， １９９４， １４， １０９ を参照）。ＬＦＡ−３も幾つかの過剰増殖性疾患、例えば、様々な骨髄腫（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．， １９９７， ９７， ８１ ；Ｔａｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９６， ８７， ８３７）、膀胱腫瘍（Ｎｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｕｒｏｌ． Ｉｎｔ． ５６， ６）及び成人Ｔ細胞白血球（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １９９３， ５５， ８１１）に関連する。したがって、本発明のアンチセンス化合物を用いて１種類以上のＣＡＭを調節することで、遠位の及び／又は不適切なマトリックスに付着する播種性癌細胞の能力を低下させ、それにより原発性腫瘍の転移を調節することができる。
【０１７１】
したがって、本発明は、動物における転移を調節又は防止する方法であって、必要であれば医薬製剤中の、１種類以上の本発明のアンチセンス化合物を動物に投与することを含む方法も提供する。このような治療は、１種類以上のさらなるアンチセンス化合物又は抗癌化学療法用ＮＡＢＡとの組み合わせであってもよい（下記参照）。本発明のアンチセンス化合物は、転移を調節するそれらの能力について、１種類以上の当該技術分野において公知の検定及び／又は１種類以上の適切な動物モデルを用いて評価される（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ らの米国特許第 ５，５１４，７８８号の実施例１６〜１８を参照、これは参照することによりここに組み込まれる）。
【０１７２】
Ｃ．病原体によって引き起こされる疾患の治療：幾つかの研究により、ＬＦＡ−３の発現及び／又は機能がヒトウイルスの病原性の強化と関連付けられている。例えば、ＬＦＡ−３はサイトメガロウイルスに感染した線維芽細胞において上方調節され（Ｇｒｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９３， ７８， ４０５）、この効果は抗ウイルス性ＮＡＢＡガンシクロビア及びフォスカーネットでの治療によっては遮断されない（Ｃｒａｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９６， ６２， １１０２ ）。したがって、移植レシピエントにおける従来の抗ウイルス治療にもかかわらず、ＣＭＶ感染ドナー細胞がＬＦＡ−３を過剰発現し、そのためそれが事実上炎症誘発性であることがあり、その特徴は免疫病理又はＧＶＨＤもしくは同種移植片拒絶の悪化に寄与する可能性がある。イン・ビボでレシピエント動物を、及び／又はエキソ・ビボでドナー細胞もしくは組織を、必要であれば抗ウイルス性ＮＡＢＡと組み合わせて、本発明のアンチセンス化合物で治療することで、そのような望ましくない効果の防止又は制限が期待される。
【０１７３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の場合、ＬＦＡ−３に対する可溶性抗体によるＬＦＡ−３（ＣＤ５８）の固定がＨＩＶの複製を強化することが研究によって示されている（Ｓｈａｔｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １９９６， １７４， ５４ ）。この効果は、Ｔ細胞においてＬＦＡ−３リガンド、ＣＤ２に対する抗体がＨＩＶの末端反復配列からの転写を活性化することから、シグナル伝達機構によるものである可能性がある（Ｂｒｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９１， １４７， ２２９０ ）。したがって、本発明のアンチセンス化合物で個体を治療することでＨＩＶの成長及び伝播の制限が期待される。
ＬＦＡ−３の発現は口腔扁平苔癬（ＯＬＰ）を有する患者の頬粘膜に存在する病変において増加し、したがって、ＯＬＰの病因に関連付けられている（Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒａｌ Ｄｉｓ．， １９９５， １， １９３ ）。したがって、本発明のアンチセンス化合物で個体を治療することでＯＬＰの成長及び伝播の制限が期待される。
【０１７４】
Ｄ．組み合わせ治療及び組成物
１．アンチセンス化合物の組み合わせ：上述のように２種類以上のアンチセンス化合物を同時に投与することができる。また、組み合わせ治療は、まず（１）１種類以上のＣＡＭに向けて標的設定された１種類以上のアンチセンス化合物（又は、それらと１種類以上の抗炎症剤／免疫抑制剤もしくは化学療法剤との組み合わせ）を含む第１組成物を第１の期間投与し、次に（２）１種類以上のＣＡＭに向けて標的設定された１種類以上のアンチセンス化合物（又は、それらと１種類以上の抗炎症剤もしくは化学療法剤との組み合わせ）を含む第２組成物の投与に第２の期間“切り替える” ことにより行うこともできる。同時に投与しようと連続的に投与しようと、アンチセンス化合物の好ましい組み合わせには、細胞の接着を介在する分子、例えば：（１）ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１；（２）ＬＦＡ−３及びＶＣＡＭ−１；（３）ＬＦＡ−３及びＥＬＡＭ−１；並びに（４）ＬＦＡ−３及びＢ７タンパク質、例えば、Ｂ７−１もしくはＢ７−２に向けて標的設定されているものが含まれる。Ｂ７−１及びＬＦＡ−３は同時刺激的な様式でＴ細胞を活性化するように作用する（Ｐａｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， １５８， ６３７ ；Ｐａｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， １３１４）、組み合わせ（４）がＴ細胞活性化の調節に特に好ましい。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１及びＢ７タンパク質に向けて標的設定されているアンチセンス化合物は、全て Ｂｅｎｎｅｔｔらの米国特許第 ５，５１４，７８８号及び第 ５，５９１，６２３号並びに１９９６年１２月３１日出願の同時係属米国特許出願第 ０８／７７７，２６６ 号に記載されている。
【０１７５】
所望であれば、望ましくない障害又は疾患の妨害又は防止に必要とされるレベルを達成するため、ＬＦＡ−３（又は他のＣＡＭ）の発現の治療的アンチセンス調節をさらなる治療と組み合わせることができる。このような組み合わせは、例えば、（ａ）２種類以上のＣＡＭに向けて標的設定されている２種類以上のアンチセンス化合物、（ｂ）あるものがＣＡＭに、及び他のものが遺伝子標的に向けて標的設定されている２種類以上のアンチセンス化合物、又は（ｃ）炎症を患う動物を治療する場合、非アンチセンスベースの抗炎症剤もしくは免疫抑制剤と組み合わせた、ＣＡＭに向けて標的設定されているアンチセンス化合物を同時投与することにより行うことができる。過剰増殖性疾患もしくは障害を患う動物を治療しようとする場合、ＣＡＭに向けて標的設定されているアンチセンス化合物を非アンチセンスベースの化学療法剤と組み合わせることができる。本発明のアンチセンス化合物と共に用いる場合、そのような非アンチセンスベースの薬剤（ＮＡＢＡ）は単純な組み合わせで（例えば、ＮＡＢＡ及びアンチセンス化合物の投与）、連続的に（例えば、第１のＮＡＢＡ及びアンチセンス化合物を特定の期間投与した後、第２のＮＡＢＡ及びアンチセンス化合物を投与する）、又は１種類以上の他のそのような非アンチセンスベースの薬剤もしくは物理的処置との組み合わせで（例えば、ＮＡＢＡ及びアンチセンス化合物の投与、又は、例えば過剰増殖性障害の治療においては、放射線療法と組み合わせた１種類以上のＮＡＢＡ及びアンチセンス化合物の投与）用いることができる。治療計画において２種類（もしくはそれ以上）のアンチセンス化合物、又は１種類以上のアンチセンス化合物及び１種類以上のＮＡＢＡの組み合わせを同時に投与しようとする場合、好ましい組成物の１つは、両者の（もしくは全ての）成分を含有する脂質小胞、特には無菌的に安定化された脂質小胞を含むものである。本発明の脈絡において、“治療計画” という用語は治療、一時的緩和及び予防様式を包含しようとするものである。
【０１７６】
抗ウイルス用途については、本発明のアンチセンス化合物は関心のある特定のウイルスを指向するアンチセンス化合物と組み合わせることができる。例えば、ＣＭＶ感染細胞のイン・ビボ又はエキソ・ビボ治療に対しては、アンチセンス化合物を、ＣＭＶに向けて標的設定されている１種類以上のアンチセンス化合物と組み合わせることができる。ＣＭＶに向けて標的設定されている特に好ましいアンチセンス化合物、及びそれらを使用する治療方法は、米国特許第 ５，４４２，０４９号及び第 ５，５９５，９７８号（参照することによりここに組み込まれる）に記載されている。ＨＩＶに対する特に好ましいアンチセンス化合物は米国特許第 ５，１６６，１９５号及び第 ５，５９１，６２３号（これらも参照することによりここに組み込まれる）に記載されている。１種類以上の非アンチセンスベースの抗ウイルス剤、例えば、ガンシクロビル及びフォスカーネットも１種類以上の本発明のアンチセンス化合物と組み合わせることができる。本発明のアンチセンス化合物と好ましく組み合わせられる他の非アンチセンスベースの抗ウイルス剤には、米国特許第 ５，５２３，３８９号及び第 ５，６２７，１８５号（参照することによりここに組み込まれる）並びに公開ＰＣＴ特許第 ＷＯ ９６／４０１６４号に記載されるものが含まれる。
【０１７７】
２．化学療法剤との組み合わせ：過剰増殖性障害を治療する目的で、本発明のアンチセンス化合物を、さらに、又は代わりに、非アンチセンスベースの化学療法剤と組み合わせて用いることができる。本発明のアンチセンス化合物との組み合わせで用いることができるような薬剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホロアミド、５−フルオロデオキシシウリジン５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキセート、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれるが、これらに限定されるものではない（一般には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， ｐｐ． １２０６−１２２８， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｈａｙ， Ｎ．Ｊ．， １９８７を参照）。
【０１７８】
３．抗炎症剤／免疫抑制剤との組み合わせ：本発明のアンチセンス化合物と組み合わせて用いることができる非アンチセンスベースの抗炎症剤又は免疫抑制剤には、サリチル酸塩；インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｏｆｅｎ ）、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、スリンダク及びメクロフェナメートを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；金化合物、例えば、オーラノフィン（ａｕｒａｎｏｆｉｎ ）；Ｄ−ペニシラミン；シクロホスファミド；メトトレキセート；アザチオプリン；コルヒチン；ヒドロキシクロロキン；コルチコトロピン；ステロイド及び副腎皮質ステロイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デオキシヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン及びパラメタゾンが含まれるが、これらに限定されるものではない。一般には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， ｐｐ． １２３９−１２６７ ａｎｄ ２４９７−２５０６， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｈａｙ， Ｎ．Ｊ．， １９８７を参照。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ヒトＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡの配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ００６３６、ローカス名“ＨＳＬＦＡ３” ）及び実施例に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置及び配列を示す。このｃＤＮＡ配列は５’ から３’ に記載されており、１０塩基毎を示す縦のマークを有する；この配列における塩基の累積番号は各ラインの右にボールド体で示されている。開始（ＡＴＧ）及び終止（ＴＧＡ）コドンはボールド体表記され、かつ二重下線が付されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列はそれらの相補性を示すため３’ から５’ に記載され、それらのＩＳＩＳ番号は各ラインの右の括弧内に示されている。
【図２】ヒト内皮細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理することでＰＨＡ活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞からのサイトカイン産生の同時刺激が阻害されることを示す。記号及び略語：“ＳＣ” 、スクランブルした対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１７０９２）；“ＡＳＯ” 、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１６３７４）；白抜きの四角、モノクローナル抗体の添加なし；斜線付きの四角、ＬＦＡ−３に対するモノクローナル抗体を添加；塗りつぶした四角、ＣＤ２に対するモノクローナル抗体を添加。
【図３】ヒト内皮細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理することでアロジェネイックＣＤ４＋ Ｔ細胞によるサイトカイン産生が阻害されることを示す。指示されるように、ＩＬ−２の利用を防止するため、上のパネルの実験においてはＩＬ−２受容体のアルファ鎖に対する抗体（すなわち、“抗ＴＡＣ” ）を添加した。記号：白抜きの四角、スクランブルした対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１７０９２）；塗りつぶした四角、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１６３７４）。
【図４】ヒト内皮細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理することでアロジェネイックＣＤ４＋ 細胞の増殖が阻害されることを示す。記号：白抜きの四角、スクランブルした対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１７０９２）；塗りつぶした四角、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１６３７４）。
【配列表】
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0003590585.tif 000009
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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