(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)ヒト血漿をマンナンに接触させ、０．１〜０．５Ｍマンノース溶液でマンノース結合蛋白質を溶出させた後、０．１〜０．５Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより得ることができる物質であり、
(2)還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が約３５ｋＤａであり、
(3)Ｎ末端に式（IV）に示されるアミノ酸配列を有し、
【化１】
0003571371.tif 000009
(4)オプソニン活性を有する蛋白質。
【請求項２】
式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列、または式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつオプソニン活性を有する請求項１記載の蛋白質。
【化２】
0003571371.tif 000010
【請求項３】
式（II）に示されるアミノ酸配列、または式（II）に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつオプソニン活性を有する請求項１記載の蛋白質。
【化３】
0003571371.tif 000011
【請求項４】
式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列、または式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列と、式（II）に示されるアミノ酸配列、または式（II）に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列とを有し、かつオプソニン活性を有する請求項１記載の蛋白質。
【化４】
0003571371.tif 000012
【請求項５】
式（III）に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または式（III）に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつオプソニン活性を有する蛋白質。
【化５】
0003571371.tif 000013
【請求項６】
請求項５記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
図２および図３に示される塩基配列の塩基番号８６〜９４９で示される塩基配列を含む請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
ヒト血漿をマンナンに接触させ、０．１〜０．５Ｍマンノース溶液でマンノース結合蛋白質を溶出させた後、０．１〜０．５Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。
【請求項１０】
請求項５記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はオプソニン活性を有する新規なヒト血漿由来蛋白質、それをコードするＤＮＡ、当該蛋白質の製造方法、および当該蛋白質を含有する感染症予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
細菌などの病原微生物に付着して、好中球、単球、マクロファージなどの貪食細胞による貪食作用を受けやすくする物質をオプソニンと呼び、このような貪食作用を増強する活性をオプソニン活性という。免疫グロブリンや補体成分であるＣ３ｂはオプソニン活性を有する。これは貪食細胞の表面にＦｃレセプターやＣ３ｂレセプターがあるためである。血清蛋白の一つであるＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）も肺炎球菌に対してオプソニン活性を有している。
【０００３】
オプソニン活性は感染防御機構として特に重要である。例えば、肺炎球菌の多糖体抗原、サルモネラのＯ抗原、Ｖｉ抗原、レンサ球菌のＭ蛋白に対する特異抗体は、オプソニン活性が強く、好中球、マクロファージによる貪食を高め、病原体の感染抑制に働くことから感染防御抗体と呼ばれている。菌体表層に貪食作用に抵抗する莢膜がある場合でも、これらの特異抗体が菌体に結合することによって貪食細胞による貪食が著しく容易になる。細菌などの病原微生物による感染症に対してはオプソニン活性が最も重要な生体防御反応である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、感染症の予防または治療に有用な、オプソニン活性を有する新規蛋白質、ならびにその製造方法を提供することにある。
また本発明の目的は、この新規蛋白質を遺伝子工学手法により製造するために、当該蛋白質のアミノ酸配列を明らかにし、当該蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。
さらに本発明の目的は、新規な感染症予防治療剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
糖鎖に結合する動物レクチンの中でマンノースとＮ−アセチルグルコサミンを認識するＣ型レクチンであるマンノース結合蛋白質（ＭＢＰ）とコングルチニンは、生体防御機構において重要な働きをしている。これらのレクチンはコラーゲン様構造を有し、コレクチンと呼ばれるファミリーを形成している。
【０００６】
本発明者らは、ＭＢＰの精製過程で、ヒト血漿中からマンナンに結合し、Ｎ−アセチルグルコサミンで溶出される新規な蛋白質を見出し、この蛋白質が、貪食細胞の貪食能を活性化するオプソニン活性を有することを見出した。
さらに本発明者らは、当該蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングを行い、そのｃＤＮＡの塩基配列から当該新規蛋白質のアミノ酸配列を明らかにした。
【０００７】
本発明は、実質的に式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【０００８】
【化６】
0003571371.tif 000002
【０００９】
当該蛋白質は、少なくとも式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列を含んでいればよい。式（Ｉ）はコラーゲン様ドメインを示す。このコラーゲン様ドメインは、Ｇｌｙ  −Ｘ−Ｙ（Ｇｌｙ  はグリシンを表し、ＸとＹはグリシン以外のアミノ酸を表す）で表される繰り返しパターンを含む。好ましくは当該蛋白質は、式（Ｖ）に示されるコラーゲン様ドメインを含む。
【００１０】
【化７】
0003571371.tif 000003
【００１１】
上記式（Ｖ）のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ  −Ｘ−Ｙ（Ｇｌｙ，ＸおよびＹは前記の通り）で表される繰り返しパターンの間に１つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が挿入されていてもよい。具体的には当該蛋白質は、式（ＶＩ）に示されるコラーゲン様ドメインを含む。
【００１２】
【化８】
0003571371.tif 000004
【００１３】
上記式（ＶＩ）のアミノ酸配列には、６アミノ酸（式（ＶＩ）  中の下線部分）をはさんで２回と１５回のＧｌｙ  −Ｘ−Ｙの繰り返しパターンが存在する。
【００１４】
本発明は、実質的に式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【００１５】
【化９】
0003571371.tif 000005
【００１６】
当該蛋白質は、少なくとも式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を含んでいればよい。式（ＩＩ）はフィブリノーゲン様ドメインを示す。このフィブリノーゲン様ドメイン中には、Ｃａ結合に関与するＥＦｈａｎｄに類似した配列（式（ＩＩ）中の破線部分）が含まれている。これは本発明蛋白質がＣａイオンと結合する可能性を示唆する。
【００１７】
本発明は、実質的に上記式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列および実質的に上記式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。（Ｉ）と（ＩＩ）の配列の順序は限定されないが、好ましくはＮ末端側に（Ｉ）の配列を、Ｃ末端側に（ＩＩ）の配列を含む蛋白質である。当該蛋白質は（Ｉ）の配列と（ＩＩ）の配列の間に１つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明は、実質的に式（ＩＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【００１９】
【化１０】
0003571371.tif 000006
【００２０】
ここで「実質的に」とは、本発明の蛋白質は式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）  の各式に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に限定されず、当該アミノ酸配列を有する蛋白質と同様な生物学的性質（オプソニン活性）を有する限り、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかについて欠失、置換、もしくは付加があってもよいことを意味する。
【００２１】
本発明の蛋白質は、上記アミノ酸配列を有してなるポリペプチドにさらに糖が結合したものであってもよい。
上記式中で用いた略号は次の意味を有する。
Ａ  Ａｌａ  アラニン
Ｒ  Ａｒｇ  アルギニン
Ｎ  Ａｓｎ  アスパラギン
Ｄ  Ａｓｐ  アスパラギン酸
Ｃ  Ｃｙｓ  システイン
Ｑ  Ｇｌｎ  グルタミン
Ｅ  Ｇｌｕ  グルタミン酸
Ｇ  Ｇｌｙ  グリシン
Ｈ  Ｈｉｓ  ヒスチジン
Ｉ  Ｉｌｅ  イソロイシン
Ｌ  Ｌｅｕ  ロイシン
Ｍ  Ｍｅｔ  メチオニン
Ｋ  Ｌｙｓ  リジン
Ｆ  Ｐｈｅ  フェニルアラニン
Ｐ  Ｐｒｏ  プロリン
Ｓ  Ｓｅｒ  セリン
Ｔ  Ｔｈｒ  スレオニン
Ｗ  Ｔｒｐ  トリプトファン
Ｙ  Ｔｙｒ  チロシン
Ｖ  Ｖａｌ  バリン
【００２２】
本発明の蛋白質の好適な例として、次の性質を有するヒト血漿由来の蛋白質Ｐ３５が挙げられる。
▲１▼ヒト血漿をマンナンに接触させ、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより得ることができる。
▲２▼還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が約３５ｋＤａである。
▲３▼Ｎ末端に式（ＩＶ）に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
【化１１】
0003571371.tif 000007
【００２４】
▲４▼等電点：６．３
蛋白質Ｐ３５は、Ｎ−アセチルグルコサミンと特異的に結合する。Ｐ３５は、Ｎ−アセチルグルコサミンを介して糖と結合すると考えられる。即ち、Ｎ−グリコシド型糖鎖の高マンノース型には結合せず、複合型、混合型には結合する。
【００２５】
本発明の新規蛋白質は、ヒト血漿から精製することにより、あるいは組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成法などの常法によって調製することができる。
【００２６】
本発明の蛋白質をヒト血漿から調製する場合は、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、吸着剤処理、塩析、等電点沈澱法、ポリエチレングリコール分画法などの公知の血漿蛋白質の精製法を適宜組合せることに得ることができる。好ましくは、ヒト血漿をマンナンに接触させ、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより調製することができる。
【００２７】
以下に本発明の蛋白質の好適な調製方法を示す。
マンナンに接触させるヒト血漿画分は、ヒト血清をポリエチレングリコール分画処理した沈澱画分が好ましい。詳細には、常法に従ってヒト血漿からフィブリンを除去して調製したヒト血清に、分子量４０００のポリエチレングリコールを終濃度７％になるように添加し、沈澱画分を回収する。このポリエチレングリコール分画処理は２〜８℃好ましくは４℃付近で行う。
【００２８】
得られた沈澱画分を緩衝液に溶解してマンナンに接触させる。緩衝液は塩濃度０．１〜２Ｍ、ｐＨ６〜８が好ましく、具体的には１〜１．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸またはリン酸緩衝液（ｐＨ７〜８）が例示される。マンナンは、不溶性担体にマンナンを結合したものが好適に使用され、例えばマンナン−セファロース、マンナンアフィゲルなどのカラムが用いられる。次いで、マンノース溶液でマンノース結合蛋白質を溶出させた後、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより、本発明蛋白質を含有する画分が得られる。マンノース溶液は、好ましくは０．１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．３Ｍのマンノースを含有する緩衝液であり、緩衝液としては前記のものが好適に使用される。Ｎ−アセチルグルコサミン溶液は、好ましくは０．１〜０．５Ｍ、より好ましくは０．３ＭのＮ−アセチルグルコサミンを含有する緩衝液であり、緩衝液としては前記のものが好適に使用される。
本発明蛋白質を含有する溶出画分は、好ましくは抗ＩｇＭ、抗ＩｇＧを不溶性担体に結合させたカラムを通して不純物成分のＩｇＭ、ＩｇＧを除去する。
【００２９】
組換えＤＮＡ技術により本発明の蛋白質を調製する場合には、常法に従って、本発明蛋白質をコードするＤＮＡ（後述）を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地中で培養し、該培養物から本発明蛋白質を採取することによって調製することができる。
【００３０】
宿主細胞としては、微生物〔細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセス属）〕、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓ．ｆ．細胞）などが使用できる。
【００３１】
ベクターとしては、ｐＢＲ３２２，  ｐＢＲ３２５，  ｐＵＣ１２，  ｐＵＣ１３などの大腸菌由来のプラスミド、ｐＵＢ１１０，  ｐＴＰ５，  ｐＣ１９４  などの枯草菌由来のプラスミド、ｐＳＨ１９，  ｐＳＨ１５などの酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、バキュロウイルス（核多角体ウイルス）などの昆虫ウイルスなど、公知の入手可能なベクターを使用することができる。
【００３２】
本発明はまた、式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡに関する。
当該ＤＮＡは、上記塩基配列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なくとも式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。
式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図２、３に示される塩基配列中５’末端から数えて塩基番号１６１〜２９５で示される塩基配列が例示される。
【００３３】
本発明は、式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡに関する。
当該ＤＮＡは、上記塩基配列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なくとも式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。
式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図２、３に示される塩基配列中５’末端から数えて塩基番号２９６〜９４９で示される塩基配列が例示される。
【００３４】
更にまた本発明は、式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列および式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡに関する。
当該ＤＮＡは、上記塩基配列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なくとも式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。
式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列または式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、上述した塩基配列が例示される。
【００３５】
また、本発明は、式（ＩＩＩ）に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡに関する。
当該ＤＮＡは、上記塩基配列を含んでいればいかなるＤＮＡであってもよいが、少なくとも式（ＩＩＩ）  に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。
式（ＩＩＩ）  に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式（ＩＩＩ）  に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図２、３に示される塩基配列中５’末端から数えて塩基番号８６〜９４９で示される塩基配列が例示される。
また、当該ＤＮＡは、その５’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含有していてもよい。シグナルペプチドの由来は特に限定されず、マンノース結合蛋白等が例示されるが、好ましくはヒト血漿のオプソニン活性を有する蛋白質に由来するものである。具体的には、図２中の下線で示されるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜２５で示される配列）をコードするＤＮＡであり、より具体的には図２、３に示される塩基配列中５’末端から数えて塩基番号１１〜８５で示される塩基配列が例示される。
【００３６】
一般に、遺伝子組換えの技術分野では、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡは図２、３に示される塩基配列に特定されず、当該図２、３で示される塩基配列を遺伝暗号に基づく置換によって変化させた塩基配列を有するものをも包含する。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
【００３８】
従って、本発明のＤＮＡは、常法に従って本発明の蛋白質のｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
【００３９】
（１）  例えば、本発明蛋白質のｍＲＮＡからのｃＤＮＡクローニングは、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）  に従って行うことができる。具体的には、以下の方法が例示される。
まず、ヒト肝臓などヒト由来オプソニン活性を有する蛋白質を培養し、その培養液から該蛋白質をコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８，  ５２９４  （１９７９）  〕、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばＯｋａｙａｍａ，Ｈ．らの方法｛Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２，  １６１  （１９８２）  及び同誌  ３，  ２８０  （１９８３）｝やＧｕｂｌｅｒ，Ｕ．  とＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．の方法｛Ｇｕｂｌｅｒ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｇｅｎｅ，  ２５，  ２６３  （１９８３）｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１０，λｇｔ１１，λＺＡＰ等が例示される。
ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で本発明蛋白質の遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
【００４０】
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えば  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  ら，  モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．２３９  （１９８２）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Ｈｙｕｎｈ，Ｔ．  Ｖ．  らの方法〔Ｈｙｕｎｈ，Ｔ．Ｖ．，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）｝などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
【００４１】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．らのモレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．２３９  （１９８２）  に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
【００４２】
上記の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、別個に本発明蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを３２Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法〔Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，  Ｄ．Ｓ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７２，  ３９６１  （１９７５）  〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．２３９  （１９８２）  〕により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製し、本発明の蛋白質の特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、本発明蛋白質に対する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
【００４３】
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Ｍａｘａｍ，  Ａ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｗ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ７４，  ５６０  （１９７７）〕あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法〔Ｓａｎｇｅｒ，  ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ７４，  ５４６３−５４６７  （１９７７）  〕によって決定することができる。本発明のＤＮＡは、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【００４４】
（２）  また、ヒト肝臓のゲノムＤＮＡから本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
ヒト肝臓を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから本発明の蛋白質のＤＮＡの全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【００４５】
（３）  また、化学的合成による本発明のＤＮＡの製造は、図２、３に示される塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【００４６】
本発明の蛋白質は、オプソニン活性を有し病原微生物を不活化する作用を有するので、細菌、ウイルス、真菌などの病原微生物による感染症の予防又は治療に有効である。細菌としては、サルモネラ、大腸菌、緑膿菌などのグラム陰性菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌などのグラム陽性菌、ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、ＨＩＶなど、真菌としては、カンジダ、アスペルギルスなどが挙げられる。これらの病原微生物による感染症としては、急性胃腸炎、食中毒、尿路感染症、膀胱炎、腎盂炎、肺炎、敗血症、ブドウ球菌症、皮膚疾患、ヘルペスウイルス感染症、帯状ほう疹、白癬、カンジダ症などが挙げられる。
【００４７】
本発明において、オプソニン活性は貪食細胞（単球、マクロファージ、好中球など）による病原微生物の貪食を増加させる作用を意味する。オプソニン活性は、例えば、貪食細胞により貪食される微生物の数を測定することにより測定することができる。貪食細胞としてはヒト由来の単球、マクロファージ、好中球などが使用できる。
【００４８】
本発明の蛋白質は薬理的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤など）などの製薬上必要な成分と適宜混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、注射剤などの形態で医薬組成物として、経口的又は非経口的（静脈内、筋肉内または局所的）に投与することができる。好ましくは、生理食塩水、注射用蒸留水、滅菌精製水などの希釈剤に溶解した、またはそれを凍結乾燥した注射剤の形態である。投与経路は静脈内投与が好ましい。
【００４９】
当該製剤には、安定化剤を配合してもよい。安定化剤は、血漿蛋白製剤の安定化剤として通常使用されるものであれば特に限定されない。例えばショ糖、マルトース、グルコース等の糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸塩等の塩、リン脂質、アルブミン、ゼラチン、クエン酸、リンゴ酸などを用いることができる。
【００５０】
上記製剤中には、本発明の蛋白質の有効量が配合される。投与量は投与経路、患者の症状、体重あるいは年齢などによっても異なるが、例えば成人患者に静脈内投与する場合は１０μｇ〜１０ｍｇを１日１〜数回に分けて投与するのが望ましい。
本発明の蛋白質はヒト血漿由来の成分であるため毒性は極めて低く、医薬として安全に投与することができる。
【００５１】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００５２】
実施例１：Ｐ３５の精製
ヒトクエン酸加血漿に最終濃度１０ｍＭになるように塩化カルシウムを加えて３７℃、１時間反応させて凝固させた。これを濾過してフィブリンを除き、９，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心により得た上清（血清）にポリエチレングリコール４，０００  を終濃度７％となるように加え、４℃で１時間、反応させた。９，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心操作で沈澱画分を得た。これを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１Ｍ塩化ナトリウム，  ５０ｍＭ塩化カルシウム含有緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解後、酵母マンナンセファロースカラムにアプライした。前記緩衝液でカラムを洗浄後、０．３Ｍマンノースを含有する前記緩衝液でマンノース結合タンパクを溶出させた。その後、０．１５Ｍ  Ｎ−アセチルグルコサミンを含む前記緩衝液で本発明の蛋白質Ｐ３５を溶出させた。Ｐ３５含有画分には、不純物成分としてＩｇＭとＩｇＧが含まれていたので、抗ＩｇＭ−セファロースカラムと抗ＩｇＧセファロースカラムを用いてそれらを除いてＰ３５を精製した。得られたＰ３５は、還元下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で３５ｋＤａのバンドとして認められた。Ｐ３５はＮ末端に次式（ＩＶ）  で示されるアミノ酸配列を有していた。
【００５３】
【化１２】
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【００５４】
実施例２：Ｐ３５のｃＤＮＡクローニング
Ｐ３５のｃＤＮＡクローニングは、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）  に従って行なった。λＺＡＰおよびλｇｔ１０をベクターとして、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを構築した。実施例１で精製したＰ３５タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に基づいて、ライブラリースクリーニングのための２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドをプローブとして、まずλＺＡＰｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。プラークを転写したナイロンメンブレンとプローブとのハイブリダイゼーションは、５×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）  ，４×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１００μｇ／ｍｌサケＤＮＡおよび３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドを含む溶液中で３７〜４２℃、一昼夜行なった。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、１×ＳＳＣ中室温で５０分間、さらに４０〜４３℃で１〜２時間行なった。２種類のオリゴヌクレオチドプローブの両方に陽性のクローンを選択した結果、１クローンのＰ３５ｃＤＮＡの断片が得られた。
【００５５】
このＰ３５ｃＤＮＡ断片（９７０ｂｐ）をプローブとして、λＺＡＰおよびλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーを再びスクリーニングした。この時のハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドプローブの場合と同様の溶液中で６０℃、一昼夜行なった。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、１×ＳＳＣ中室温で３０分間、さらに０．１×ＳＳＣ中６５℃で１〜２時間行なった。この結果、約２０万のλＺＡＰおよび約２０万のλｇｔ１０から、それぞれ４クローンと２クローンのＰ３５ｃＤＮＡが得られた。これらを制限酵素で切断してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ  ＋  にサブクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，    ７４，  ５４６３，  １９７７）  に従って塩基配列を決定した。
【００５６】
塩基配列の共通部分を重複させた結果、図２、３に示すようなＰ３５ｃＤＮＡ配列が得られた。図１にＰ３５の制限酵素地図を示す。このｃＤＮＡは９３９ｂｐの長さのＯＲＦ（転写解読枠）を持ち、２５アミノ酸からなるシグナルペプチド（図２中の下線部分）とこれに続く２８８アミノ酸の成熟Ｐ３５蛋白質をコードしていた。成熟Ｐ３５（シグナルペプチドを除く）の分子量は実施例１で単離されたＰ３５の分子量とほぼ一致した。
【００５７】
図４にＰ３５のドメイン構造を示す。成熟Ｐ３５のＮ端側にはコラーゲン様構造があり、６個のアミノ酸をはさんで２回と１５回のＧｌｙ  −Ｘ−Ｙの繰り返しが存在する。この構造はＭＢＰのコラーゲン様構造に類似しており、この部分でオリゴマーを形成していると推定される。Ｐ３５のＣ端側には、ＭＢＰと異なり、２１８個のアミノ酸からなるフィブリノーゲン様構造が存在する。データバンクとのホモロジイ検索の結果、Ｐ３５はブタ子宮の細胞膜から単離されたＦｉｃｏｌｉｎ  αおよびβと高いホモロジイをもつことがわかった（参考文献：Ｉｃｈｉｊｏ，  Ｈ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  １４５０５−１４５１３  （１９９３））。フィブリノーゲン様構造をもつ蛋白質はこれまで数種類知られている。これらの蛋白質のフィブリノーゲン様配列から得られたコンセンサス配列とＰ３５を比較してみると、システインの位置ならびに幾つかのアミノ酸が完全に保存されていることがわかった。フィブリノーゲン様構造の中にＣａ結合に関与するＥＦｈａｎｄ（Ｔｕｆｔｙ  ＆  Ｋｒｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８７，  １６７，  １９７５）  に類似した配列が２カ所認められ（図２、３中の破線部分）、Ｐ３５がＣａイオンと結合する可能性を示唆する。Ｐ３５はその精製過程からレクチンの一種と考えられるが、Ｐ３５のアミノ酸配列の中にＭＢＰなどのコレクチンに認められる糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）と相同の配列は認められなかった。
【００５８】
実施例３：オプソニン活性試験
本発明蛋白質のオプソニン活性を示すために、単球の貪食能に対する活性化作用を調べた。
（１）  単球の分離
健康成人から単球を分離した。ヘパリン採血後、Ｆｉｃｏｌｌ  ｈｙｐａｑｕｅにて単核球の層を取り出し、さらに低張溶菌（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｌｙｓｉｓ）  にて赤血球を除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に浮遊させ、１×１０７  個／ｍｌに調整する。
上記のように調製した単球浮遊液を８−ｃｈａｍｂｅｒ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｓｌｉｄｅに５００μｌずつ分け、３７℃のＣＯ２  インキュベーターで培養した。２４時間後、付着細胞を０．１％ゼラチンと１０ｍＭ  ＣａＣｌ  ２を含むＨＢＳＳ（以下、ＧＨＢＳＳという）にて３回洗浄し、これを単球として使用した。
（２）  単球によるサルモネラの貪食
サルモネラは、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ  ２に浮遊させ、４×１０８  個／ｍｌに調整する。５０μｌずつ１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。ＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ  ２にて２０μｇ／ｍｌに調整したＰ３５を５０μｌ加え、４℃で３０分振盪しながら放置する（Ｐ３５によりサルモネラが凝集するのを防ぐため）。サルモネラはＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ  ２で、１３００ｇで５分、３回洗浄した。２００μｌのＧＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ  ２を加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、凝集したサルモネラをほぐした。上記のように調製した単球にサルモネラを加えた。３７℃で５分、１０分、２０分、４０分培養し、氷冷ＰＢＳを追加して貪食を終了させ、さらにＰＢＳで３回洗浄した。Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色し、単球４００個に貪食されているサルモネラを数えた。
（３）  結果
結果を図５に示す。─■─はコントロール、─□─はＰ３５の結果を示す。本発明蛋白質Ｐ３５の添加により単球の貪食能の活性化が認められた。
【００５９】
製剤例１（注射剤）
実施例１で得たＰ３５  １ｍｇを滅菌精製水１ｍｌに溶解し、安定化剤としてヒトアルブミンを加え、ｐＨを７．５に調整した。除菌濾過後、バイアル瓶に充填し凍結乾燥して注射剤を調製した。
【００６０】
【発明の効果】
本発明の新規蛋白質は、貪食細胞による病原微生物の貪食を活性化するオプソニン活性を有し、細菌、ウイルス、真菌などの病原微生物による感染症の予防又は治療に有用である。
また本発明によれば、当該新規蛋白質をヒト血漿から簡便に、効率よく調製する方法が提供される。
【００６１】
さらに本発明は、当該新規蛋白質のアミノ酸配列、および当該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を初めて明らかにするものである。かかるアミノ酸配列および塩基配列の解明により、遺伝子工学的手法による本発明蛋白質の製造、それに基づく構造活性相関の研究が可能となる。すなわち、本発明のアミノ酸配列および塩基配列は、当該蛋白質の分子あるいは遺伝子レベルでの物理化学的性状、および生物学的性状の解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛋白質Ｐ３５のｃＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。
【図２】蛋白質Ｐ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびＰ３５のアミノ酸配列を示す図である（図３に続く）。
【図３】蛋白質Ｐ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびＰ３５のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】蛋白質Ｐ３５のドメイン構造を示す図である。
【図５】単球によるサルモネラの貪食に及ぼす蛋白質Ｐ３５の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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