(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌を培地に培養し、その培養物からソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法。但し、該ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の理化学的性質は以下の通りである。
（１）酵素作用
ＮＡＤの存在下にソルビトール−６−リン酸に作用して、フルクトース−６−リン      酸、ＮＡＤＨ及びＨ＋を生成する作用を有する。
（２）基質特異性
ソルビトール−６−リン酸に基質特異性を示す。
（３）分子量
７００００±５０００（ゲル濾過法により測定）
（４）至適ｐＨ
８〜８．５
（５）至適温度
５０℃付近
（６）ｐＨ安定性
ｐＨ８〜１１の範囲で最も良好な安定性を示す
【請求項２】
コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌がコマモナス・エスピーＳＹ−７７−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８１０）株である請求項１記載のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）生産菌を培養し、その培養物からソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を採取してなるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】
フルクトースは生化学上、または生理学的に重要な物質である。例えば、食品分野において、フルクトースは一般に多量のグルクコースと共存しており、果糖あるいは添加糖として大量に消費されている。また、健常人の血清には通常０．０６ｍＭのフルクトースが存在している。このフルクトースは人の健康状態を把握、例えば糖尿病のモニタリングの重要な因子の一つとされている。従って、フルクトースを正確に定量することが重要とされているが、通常グルコースがフルクトースの５０〜１００倍量存在しており、フルクトースを特異的に測定することは困難であった。
【０００３】
本発明者らはフルクトースを特異的に測定するためにフルクトキナーゼを発見し、ブランクの少ない、誤差を生じにくいフルクトース測定系を組み立てることが可能となった（特開平４−３２５０８９号公報）。しかし、本測定には共役の酵素としてホスホグルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）の２種が必要で、計３種もの酵素が必須であった。
【０００４】
一般に測定試薬の成分は多いほど、被検液中の共存物質の影響を受けやすいことは明白である。そこで、本ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素と組み合わせることにより２種の酵素でフルクトースを測定することを可能とする。
また、ソルビトールはポリオールのなかでも代表的なものであり、生体内ではグルコースからアルドース還元酵素により生成される。糖尿病において高血糖状態が続き細胞内におけるソルビトール産生が高進すると、ソルビトールは微量しか細胞外に拡散しないために細胞内に過剰蓄積し、蓄積されたソルビトールにより種々の障害をきたすことが明かとなってきた。従って、ソルビトールを正確に測定することは糖尿病患者の病体を把握するうえで重要である。
【０００５】
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４０，Ｄ−Ｓｏｒｂｉｔｏｌ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＡＤ＋  ２−ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の生産菌としてはエアロバクター・エアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｍ．Ｌｉｓｓ，Ｓ．Ｂ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｎ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２３７（４），１３４２−１３５０（１９６２））およびクロストリディウム・パスツリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（Ｐ．Ｊ．Ｄｕｔｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．Ｋｏｔｚｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０６，３３３−３４２（１９７０））などが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
エアロバクター・エアロゲネス由来の酵素は精製中に抗酸化剤としてのメルカプトエタノールが使用されていることから不安定であることが示唆される。また、クロストリディウム・パスツリディウムに関しては嫌気的培養を行っており、実用に供されるものではない。通常の通気撹拌培養により増殖し、精製中に抗酸化剤を必要とすることなく十分な安定性を有するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌株より、ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を効率よく生産できればより安定なフルクトース測定系を組み立てることが可能となる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは安定性に優れたソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を生産する微生物をスクリーニングしたところコマモナス・エスピーＳＹ−７７−１（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＹ−７７−１）が目的とする性質を有する当該酵素を生産していることを発見し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌を培養し、その培養物からソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法に関する。
以下に本発明について詳細に説明する。
【０００９】
まず、本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産菌について、コマモナス属に属するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素生産能を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはコマモナス属に属するＳＹ−７７−１株（コマモナス・エスピーＳＹ−７７−１；通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８１０として寄託されている；菌学的性状は米国特許第３９６０６６２号明細書参照のこと）が挙げられる。
【００１０】
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、コマモナス属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００１１】
炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、ソルビトール、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープリカー、ブレインハートインフュージョン、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤等の菌の生育やソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
【００１２】
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３５℃である。培養時間は条件により異なるがソルビトール−６−リン酸脱水素酵素が最も産生される時間まで培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素は主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種種の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液を得る。
【００１３】
粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を得る。例えば、粗製のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用してソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を沈澱させ、回収する。さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００１４】
次に本発明で得られるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。
ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の活性測定法
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２５ｍｌ、０．１Ｍのソルビトール−６−リン酸０．２ｍｌ、１０ｍＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロテトラゾニウムブルー）０．１ｍｌ、１０％のトリトンＸ−１００を０．０１ｍｌ、および蒸留水０．２９ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎの塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤを生成させる酵素量とし、計算式は下記のとうりである。
【００１５】
【数１】
0003602169.tif 000002
【００１６】
理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてソルビトール−６−リン酸を用いた酵素作用を以下に示す。
【００１７】
【化１】
0003602169.tif 000003
【００１８】
（２）基質特異性
ソルビトール−６−リン酸に基質特異性を示す。
各種基質に対する特異性は表１の通りである。
【００１９】
【表１】
0003602169.tif 000004
【００２０】
（３）Ｋｍ値
ソルビトール−６−リン酸に対して２．０±０．５（ｍＭ）、ＮＡＤに対して０．１３±０．０５ｍＭ、チオＮＡＤに対して０．１４±０．０５ｍＭであった。
（４）等電点
ｐＨ３．５〜１０．０のキャリアアンフォライトを用いた電気泳動法により本酵素の等電点は４．８±０．２であった。
（５）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（０．７５×６０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定した本酵素の分子量は７００００±５０００であった。
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求め、その結果を図１に示した。ｐＨ６．０〜６．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、〇）、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ９．０〜１０．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中、●）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは８〜８．５であった。
（７）ｐＨ安定性
１Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を各種緩衝液中、３７℃、６０分間、処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐＨ５．０〜６．５の範囲は１００ｍＭの酢酸緩衝液（図中、〇）、ｐＨ６．５〜８．０の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ７．５〜９．０の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（図中、△）、ｐＨ９．０〜１１．０の範囲はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中、●）を使用した。ｐＨ８〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を３７℃〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求め、その結果を図３に示した。至適温度は５０℃付近であった。
（９）熱安定製
１Ｕ／ｍｌのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で調製し、１０分間の加熱処理の後に残存活性を前記酵素活性測定法にしたがって測定した。その結果は図４に示される通りであって、酵素活性は少なくとも３７℃までは安定であった。
（１０）金属イオンの影響
１ｍＭの各種金属イオンのソルビトール−６−リン酸脱水素酵素活性への影響について調べた結果は表２に示す通りで、銅イオン、鉛イオンによる強い阻害がみられた。
【００２１】
【表２】
0003602169.tif 000005
【００２２】
【実施例】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
（コマモナス・エスピーＳＹ−７７−１株の培養）
ソルビトール２．０％、ブレインハートインフュージョン２．０％を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを、５００ｍｌ溶三角フラスコ２０本に分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後、これにコマモナス・エスピーＳＹ−７７−１の菌体１白金耳を接種し、２８℃で１２０ｒｐｍの振とう培養機で２０時間培養し、酵素活性２．７Ｕ／ｍｌの培養液１．９ｌを得た。
【００２４】
【実施例２】
（酵素の分離精製）
実施例１で得られた培養液１．９ｌを遠心分離して、得られた菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２ｌで１回洗浄した。洗浄菌体を同様の緩衝液に懸濁して５０ｍｌに調製し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して破砕液を得た。
【００２５】
この破砕液を１２０００ｒｐｍ２０分間遠心分離し、４２ｍｌ（酵素活性１０５Ｕ／ｍｌ、４２００Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｌに対して５℃で１夜透析し、５１ｍｌの粗酵素液（酵素活性８５Ｕ／ｍｌ、４３４０Ｕ）を得た。得られた酵素液を２０ｍＭのトリス塩酸−緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０．２ＭのＫＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｌを流し、次いで、０．３Ｍ  ＫＣｌを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、酵素液２５０ｍｌ（酵素活性１３Ｕ／ｍｌ、３２５０Ｕ）を得た。
【００２６】
得られた酵素液に３ＭになるようにＮａＣｌを溶解し、３ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（１．５×２８ｃｍ）カラムに通した。溶出は３Ｍ〜０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０ＭのＮａＣｌの溶出画分（酵素活性３５Ｕ／ｍｌ、２４５０Ｕ）を回収した。この酵素液に牛血清アルブミンを１００ｍｇ溶解し、凍結乾燥し、酵素粉末として６８ｍｇ（酵素活性３３Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、通常の通気撹拌培養により増殖し、精製中に抗酸化剤を必要とすることなく十分な安定性を有するソルビトール−６−リン酸脱水素酵素を効率よく生産できるコマモナス属に属する微生物によるソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の新規な製造法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素のｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明のソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の熱安定曲線を示す。
【図１】
0003602169.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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