(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）  NIH/3T3細胞を、HGF/SFhuおよびMethuをコードしているDNAでトランスフェクションし；
（ｂ）  ステップ（ａ）によりトランスフェクションされた細胞を非ヒト哺乳動物内に導入し、それにより、１次腫瘍を生じさせ；
（ｃ）  該１次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；
（ｄ）  ステップ（ｃ）により増殖した高レベルのHGF/SFhuおよび高レベルのMethuを発現する細胞を選択し；
（ｅ）  ステップ（ｄ）により選択した細胞を非ヒト哺乳動物内に導入し、それにより、２次腫瘍を生じさせ；
（ｆ）  該２次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；ついで
（ｇ）  ステップ（ｆ）の該細胞により産生されたHGF/SFhuを得る
からなるHGF/SFの製造法。
【請求項２】
作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・Metの全コーディングドメインをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第１のDNAベクター、および作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・HGF/SFをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第２のDNAベクターで同時トランスフェクションされた細胞系。
【請求項３】
NIH/3T3細胞細胞系である請求項２記載の細胞系。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
肝細胞増殖因子（HGF）は、ラット・肝細胞の有糸分裂生起を刺激する能力に基づいて、ヒトおよびウサギの血漿ならびにラットの血小板から最初に精製された（イー・ゴーダ（E.Gohda）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J.Clin.Invest）第81巻:414頁（1988年）；アール・ザーネガー（R.Zarnegar）およびジー・ミカロプーロス（G.Michalopoulos），キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）第19巻:3314頁（1989年）；ティー・ナカムラ（T.Nakamura）ら,FEBS・レターズ（FEBS Lett.）第224巻:311頁（1987年））。よって、HGFは、部分的肝切除または肝傷害後の肝臓の再生を促進する液体性因子として作用しうる（イー・エイチ・ゴーダ）（E.H.Gohda）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション第81巻:414頁（1988年）；ジー・ケイ・ミカロプーロス（G.K.Michalopoulos）,FASEB・ジャーナル（FASEB J.）第４巻:176頁（1990年））。同じ因子が、ヒト・繊維芽細胞培養液から精製され、メラノサイトならびに種々の上皮および皮内細胞に作用することが示された（ティー・イガワ）（T.Igawa）ら,BBRC第174巻:831〜838（1991年）；エム・カン（M.Kan）ら,BBRC第174巻:331〜337頁（1991年）およびジェイ・エス・ルビン（J.S.Lubin）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.）第88巻:415頁（1990年））。いくつかの器官におけるHGF発現に関する証拠（ジェイ・エス・ルビン，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第88巻:415頁（1990年）；ケイ・タシロ（K.Tashiro）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第87巻:3200頁（1990年）；アール・ザーネガーら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第87巻:1252頁（1990年）；ティー・キノシタ（T.Kinoshita）ら，バイオケミ・バイオフィジ・リサーチ・コミュニ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）第165巻:1229頁（1989年））とともに、HGFが、細胞形態に対する広いスペクトルを有する増殖についてのパラクリン伝達体として作用しうるということを、これらの知見は示している。HGFの分子クローニングにより、プラスミノーゲンおよび関連セリンプロテアーゼに対する著しい構造上の相同性が明らかとなった（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第88巻:415頁（1990年）；ティー・ナカムラ（T.Nakamura）ら，ネイチャー（Nature）第342巻:440頁（1989年）；ケイ・ミヤザワ（K.Miyazawa）ら，バイオフィジ・リサーチ・コミュニ（Biophys.Res.Comm.）第163巻:967頁（1989年））。HGFが、無処理の標的細胞において蛋白のチロシンのすみやかなリン酸化を誘導するという最近の証拠は、チロシンキナーゼ受容体がその分裂シグナルを伝達するということを示唆するものである（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第88巻:415頁（1990年））。
HGFは、プラスミノーゲン、プロトロンビン、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベータを包含するセリンプロテアーゼの族と構造的に関連している（ジェイ・エス・ルビンら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第88巻:415頁（1990年）；ティー・ナカムラら，ネイチャー第342巻:440頁（1989年））。例えば、HGFは、特徴的なクリングルドメイン（kringle domain）（パシー（Patthy）ら,FEBS・レターズ第171巻:131〜136頁（1984年））およびセリンプロテアーゼドメイン（ミヤザワら，バイオケミ・バイオフィジ・リサーチ・コミュニ（第163巻:697〜973頁（1989年）；ナカムラら，ネイチャー第342巻;440〜443頁（1989年））を有するということにおいて構造的にプラスミノーゲンに類似している。本発明において定義するように、HGFは、プラスミノーゲン様増殖因子（PLGF）と呼ばれる広スペクトルのマイトジェン（米国特許出願第07/582,063号の主題物質である）として以前特徴付けられた増殖因子を包含する。セリンプロテアーゼ族をはじめとするいくつかのプロテアーゼは、おそらく、インスリン受容体のトリプシン活性化と同様の蛋白分解機構により、DNA合成を刺激するであろう（エス・イー・シェールソン（S.E.Shoelson）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第263巻:4852（1988年））。ウロキナーゼのみが、それ自体いかなる既知チロシンキナーゼ受容体とも相同性を有しない特異的な細胞表面受容体と関連があることが見いだされている（エイ・エル・ロルダン（A.L.Roldan）ら，ジ・EMBO・ジャーナル第９巻:467頁（1990年）。
散在因子（scatter factor）（SF）は、もともと、HGFと関連があるが、異なるものであると考えられていた。SFは、運動原性（運動性）と関連しており、さらにHGFは、細胞有糸分裂生起（増殖）に関連していると考えられていた。しかしながら、最近の研究により、実際には、SFおよびHGFは、同じアミノ酸配列、ｃ−met腫瘍原遺伝子によりコードされる蛋白である同じ受容体、および同じ生物学的作用を有する同一蛋白であることが示された（イー・ジェラルディー（E.Gherardi）およびエム・ストーカー（M.Stoker），ネイチャー第346巻:228頁（1990年）；ケイ・エム・ワイドナー（K.M.Weidner）ら,PNAS第88巻:7001〜7005頁（1991年）；エム・バルガヴァ（M.Bhargava）ら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション（Cell Growth ＆ Diff.）第３巻（１）:11〜20頁（1992年）；ナルディーニ（Naldini）ら,EMBO・ジャーナル第10巻（10）:2867〜2878頁（1991年）；イー・ジェラルディーおよびエム・ストーク（M.Stoke），キャンサー・セルズ（Cancer Cells）第３巻（６）:227〜232頁（1991年）およびグラジアーニ（Graziani）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（USA）第26巻）。
上記文献により取り込まれた米国特許出願第07/642,971号の主題物質は、HGF/SFおよびmet腫瘍原遺伝子蛋白（「Met］）よりなる複合体であることが記載されており、HGF/SFの受容体としてMetが同定されている。met腫瘍原遺伝子蛋白はチロシンキナーゼ増殖因子受容体族の１つである。この受容体／リガンドの関係に関する知識により、これらの分子の発現がが重要な役割を果している可能性のある増殖性疾患および腫瘍原性についての研究が容易になる。さらに、met腫瘍原遺伝子受容体HGF/SF複合体の同定により、因子の結合により影響を受ける肝臓組織以外の組織を同定するための手段が提供される。
細胞増殖に対する正の影響は、細胞内（モーゼス（Moses）ら，セル（Cell）第63巻:245〜247頁（1990年））および細胞表面（ハナム（Hannum）ら，ネイチャー第343巻:336〜340頁（1990年）；アイゼンベルク（Eisenberg）ら，ネイチャー第343巻:341〜346頁（1990年）；カーター（Carter）ら，ネイチャー第344巻:633〜637頁（1990年））の両方で、種々の濃度において妨げられることが、証拠によって示唆されている。
ヒト・HGFの種々の源が同定されており（ナカムラ，ティー，プログレス・イン・グロウス・ファクター・リサーチ（Progress in Growth Factor Research）第３巻:67〜86頁（1992年））、Cos細胞中またはバキュロウイルス宿主系中にトランスフェクションされた場合、遺伝子産物が過剰産生されることが示されている（ナカムラら，ネイチャー第342巻:440〜443頁（1989年）；クーパー（Cooper）ら，ジ・EMBO・ジャーナル（The EMBO J.）第５巻（10）:2623〜2628頁（1986年））。大量のヒト・HGF/SFを連続的に産生する哺乳動物細胞系は、まだ同定されていない。
発明の概容
したがって、本発明は、HGFおよびSFが同じ蛋白であって、その受容体へのHGF/SFの結合を阻害することにより腫瘍細胞転移を防止することができるという認識を基礎とした転移を阻害する方法を包含する。
より詳細には、HGF/SFがMetと結合するのを妨げるHGF/SF変種、HGF/SF模擬体、またはHGF/SFに対する抗体または抗体フラグメントである物質により、結合が阻害される。同様にHGF/SF−Met結合を妨げるMet変種、Met模擬体およびMetに対する抗体または抗体フラグメントによっても結合が阻害されうる。
そのうえ、大量のHGF/SF源を連続的に産生する必要性の観点において、出願人らは、意外にも、組み換え法により、高レベルのHGF/SFを発現しうるマウス・NIH/3T3細胞系を見いだし、本明細書に記載した。よって、本発明の１の具体例は、以下のステップ：
（ａ）  NIH/3T3細胞を、HGF/SFhu（huはヒト由来）およびMethuをコードしているDNAでトランスフェクションし；
（ｂ）  ステップ（ａ）によりトランスフェクションされた細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、１次腫瘍を生じさせ；
（ｃ）  １次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；
（ｄ）  ステップ（ｃ）により増殖した高レベルのHGF/SFhuおよび高レベルのMethuを発現する細胞を選択し；
（ｅ）  ステップ（ｄ）により選択した細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、２次腫瘍を生じさせ；
（ｆ）  ２次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；ついで
（ｇ）  ステップ（ｆ）の細胞により産生されたHGF/SFhuを得る
からなるHGF/SFの製造法を提供する：
さらにもう１つの本発明の具体例は、作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・Metの全コーディングドメインをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第１のDNAベクター、および作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・HGF/SFをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第２のDNAベクターで同時トランスフェクションされた細胞系に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、トランスフェクションされたNIH/3T3細胞におけるmet産物を示す。（Ａ）免疫沈降分析  細胞を［35S］メチオニンよび［35S］システイン（ICN社製、トランスラベル（Translabel））で、５分間、メチオニンおよびシステインを欠くDMEM（ギブコ（Gibco）社製）中で代謝的にラベルし、細胞溶解物をMethu−特異的モノクローナル抗体19S（ファレット，ディー・エル（Faletto,D.L.）ら，オンコジーン（Oncogene）第７巻:149〜1157頁（1991年））（レーン１および２）、またはMetmu（muはネズミ由来）−特異的ペプチド抗体SP260（アイヤー，エイ（Iyer,A.）ら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））（レーン３）のいずれかと免疫沈降させた。プロテインＧ−セファロース（ギブコ社製）で免疫沈降を完了させ、複合体を、５％β−メルカプトエタノールを含有するSDS試料用緩衝液に可溶化し、7.5％アクリルアミドゲル上で分離した。レーン１は、細胞をpSV2neoのみでトランスフェクションした場合；レーン２は、細胞をmethuでトランスフェクションした場合；レーン３は、細胞をmetmuでトランスフェクションした場合である。（Ｂ）パルス・チェイス分析  細胞を［35S］メチオニンよび［35S］システインで45分間代謝的にラベルし（レーン１および３）、ついで、チェイス時間を３時間間とした（レーン２および４）。Metを、Methuに対する19Sモノクローナル抗体（レーン１および３）またはMetmuに対するモノクローナル抗体（レーン２および４）と免疫沈降させ、パネルＡに示す電気泳動を行った。レーン１および２は、細胞をMethuでトランスフェクションした場合；レーン３および４は、細胞をMetmuでトランスフェクションした場合である。（Ｃ）細胞表面におけるmetのヨウ素化  集密的に近い細胞をペレット化し、ヨードゲン（Iodo−Gen（ピアス（Pierce）社製）の存在下においてNa125Iでラベルした。ラベルされた細胞をPBSで３回洗浄し、RIPA緩衝液で溶解し、19Sモノクローナル抗体（レーン１および２）またはSP260ペプチド抗体（レーン３および４）のいずれかと免疫沈降させた。Methuを発現するNIH/3T3細胞はレーン１および３である。Metmuを発現するNIH/3T3細胞はレーン２および４である。矢印は、p170metおよびp140metの位置を示す。
図２は、抗−Ｐ−Tyr抗体との精製物の反応性を示す。100mmディッシュ上の集密的に近い細胞を冷TBSで２回洗浄し、溶解用緩衝液（25mM  Tris−HCl,pH8.0、100mM  NaCl、50mM  NaF、１％トリトンＸ−100、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン、1.25mM  PMSF、1mMオルトバナジン酸ナトリウム）1ml中で溶解した。Methuに対する抗−C28ペプチド抗体（ゴンザッティ−ハセス，エム（Gonzatti−Haces,M.）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第85巻:21〜25頁（1988年））（パネルＡおよびＣ）またはMetmuに対するペプチド抗体SP260（アイヤーエイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））（パネルＢおよびＤ）でもって蛋白１ミリグラムが免疫沈降した。SDS緩衝液に溶解した後、試料を7.5％ゲル上のSDS−PAGEにより分離し、インモビロン−Ｐ（Immobilon−Ｐ）（ミリポア（Millipore）社製）に移し、ついで、抗−Ｐ−Tyr抗体、4G10（モリソン・ディー・ケイ（Morrison,D.K.）ら，セル第58巻:649〜657頁（1989年））（パネルＡおよびＢ）、19Sモノクローナル抗体（パネルＣ）、またはマウス・metペプチド抗体（パネルＤ）をプローブとして反応させた。ついで、インモビロンフィルターを125I−プロテインＡ（ICN社製）とインキュベーションし、オートラジオグラフィーを行った。パナルＡおよびＣのレーン１〜３には、methuでトランスフェクションした細胞の３本の異なる線があり；レーン４は対照細胞である。パネルＢおよびＤのレーン１は、metmuでトランスフェクションした細胞である。レーン２はNIH/3T3対照細胞である。
図３は、NIH/3T3細胞におけるMethuおよびHGF/SFhuの性質を示す。腫瘍細胞を外移植し、［35S］メチオニンおよび［35S］システインで６時間代謝的にラベルした。細胞溶解物を、19Sモノクローナル抗体（パネルＡ）、またはペプチド抗体SP260（パネルＢ）のいずれかと免疫沈降させた。ついで、「６時間」上清0.25mlを、セントリコン（Centricon）（アミコン（Amicon）社製  10Kカットオフ）で３倍に濃縮し、RIPA緩衝液で体積を0.3mlに調節し、試料を、抗−HGFモノクローナル抗体A3.1.2（パネルＣ）と免疫沈降させた。レーン１および３は、注入前に同時トランスフェクションされた２種の異なる細胞系からの試料である。レーン２は、レーン１で分析される細胞由来の腫瘍外移植物である。レーン４および５は、レーン３で分析される細胞由来の腫瘍外移植物である。レーン６は、対照NIH/3T3細胞から調製した試料である。矢印は、p170metおよびp140metの位置（パネルＡおよびＢ）ならびに87kDa（前駆体）、69kDa、および34kDaのHGFポリペプチドの位置（パネルＣ）を示す。
図４は、NIH/3T3細胞腫瘍中のMetキメラ蛋白の性質を示す。細胞を、［35S］メチオニンおよび［35S］システインで６時間代謝的にラベルし、細胞溶解物を、19Sモノクローナル抗体で免疫沈降させた（レーン１〜４）。レーン１は、マウス・Ｎ−末端／ヒト・Ｃ−末端キメラmetでトランスフェクションした注射していないG418（ギブコ社製）−耐性細胞であり、レーン２および３は、レーン１で分析される細胞由来の腫瘍であり、レーン４は、NIH/3T3対照細胞であり、レーン５は、抗−Ｐ−Tyr抗体（4G10）で分析し、ついで、ヒト・抗−C28ペプチド抗体とともに免疫沈降したレーン１〜４と同じ細胞のウエスタンブロットである。
図５は、Metmuの細胞外ドメインがMethuに形質転換能を付与すること（第２行と第３行を比較）、およびHGFhuとともに同時トランスフェクションした場合にMethu細胞外ドメインのみが形質転換能があること（第４行と第５行を比較）を示す。さらに、最後の２行は、Methuに形質転換能を付与する領域としてのNde I−Pbu II部位間のmetmu領域を示す（第６行と第４行を比較）。
図６は、ヒト・Metの保存されたNde I−Pbu II部位（上側）とマウス・Met配列（下側）とのコンピューターによる予測構造での比較を示す。ヒトおよびマウスのMet（Nde I−Pbu II部位の間）のアミノ酸配列をボックス内に示す。アミノ酸配列がより保存的でない領域が強調されている（保存性を、ヒトとマウスの配列の間の線で示す）。Metに形質転換能を付与するcDNAのNde I−Pbu IIセグメント内のより保存性の少ないドメインは、リガンド結合に直接用いられるドメインを反映しているか、あるいは構造的な特性によってリガンド結合またはリガンド結合後の受容体の活性化のいずれかを調節しているかである。それゆえ、出願人らは、これらの配列に対応する合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を作った。第１のドメインに対する抗体は、ヒト・配列（α1240）およびマウス・配列（α1241）に対してウサギ中で産生された。第２のドメインに対する抗体は、ヒト・配列（α1242）およびマウス・配列（α1243）に対して産生された。1242および1243のみが、ヒトおよびネズミのｃ−met蛋白それぞれに対して沈降を生じた。
図７は、ヒト（C28、19S、1242）およびマウス（260、1243）の特異的抗体に対するヒトおよびマウスのMetの反応性の対比を示す（パートＡ）。パートＢは、マウス・met  cDNAをNIH/3T3細胞中にトランスフェクションした場合（該細胞はHGF/SFmuを発現する）、該細胞は、ボイデン・チェンバー・アッセイ（Boyden chamber assay）において侵略的であることを示す（アルビーニ（Albini）ら，キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）第47巻:3239〜3245頁（1987年））。すなわち、細胞は、マトリゲル（matrigel）でコーティングしたフィルターを越えて移動するのである。metの腫瘍形態（tpr−met）でトランスフェクションした細胞もまた、このアッセイにおいて非常に侵略的である。フィルターを越えて移動する細胞に関しては、それらは、単に運動性があるだけでなく、基礎となる膜成分を分解しうるにちがいない（よって、コラゲナーゼまたはプラスミノゲナーゼのごとき酵素を分泌する）。Methuトランスフェクション体（第２行）は、ヒト・リガンドであるHGF/SFhuの不存在下では侵略的てはないが、HGF産生細胞を培養したならし培地を添加した場合は侵略的である。一方、methuおよびHGF/SFhuの同時トランスフェクション体（第５行）は、このアッセイにおいて侵略的である。この図の第２欄は、上記ドメイン中のヒト・Metに対する1242抗体が、HGF/SFhuを含有するならし培地で同時培養されたmethuトランスフェクション体のフィルター侵入を阻害することを示す。最終欄は、この阻害が、競争的なペプチドの存在下でブロックされることを示す。一方、MethuおよびHGFhuを産生する同時トランスフェクション体の侵略能（第４行）は、1242抗体によってはブロックされず、このことは、内部の、同時に産生されたHGF/SFリガンドによる受容体の細胞内オートクリン活性化を示唆するものである。結局、この図は、1243抗体は、metmuトランスフェクション体によるフィルターの侵略をブロックしなかったことを示す（第３行、第３欄）。
図８は、metmuおよびtpr−metトランスフェクション体が、インビボにおいて腫瘍原性であり（図５）、これらの細胞もまた、いくつかの形式のアッセイにおいては転移的であること（パネルＡおよびＢ）を示すインビボでの転移データを示す。さらに、Methu（パネルＡ）は、HGFhu  cDNAで同時トランスフェクションされないかぎり、インビボにおいて転移的でない。
図９は、実施例２において記載するように、HGF/SFの生産において、NIH/3T3細胞中に同時トランスフェクションされるプラスミドpRS2およびpRS24の構築を示すダイアグラムである。
好ましい具体例の詳細な説明
１の具体例において、本発明は、HGF/SFのMetとの結合を阻害することがらなる腫瘍細胞の転移を防止する方法を包含する。「防止」なる語は、腫瘍の転移を減少または阻止することを意味する。
「転移性」となる腫瘍細胞に関しては、多くの相関のある事柄が起こらなくてはならない。例えば、転移は、癌細胞が血管およびリンパ循環系の壁を透過し、循環系に侵入し、下流毛細血管床またはリンパ節に定着（「付着」）し、循環系を去り（「移動／運動性」）正常な支質組織中に透過していくプロセスを包含する。起こるべきこれらのプロセスのためには、腫瘍細胞が侵略的特性を獲得しなければならない。侵略的特性としては、（１）外部マトリックスに付着する細胞の能力（インテグリンのごとき細胞表面上の受容体による）；（２）コラゲナーゼ類およびプラスミノゲナーゼ類のごとき外部マトリックスを突き破る破壊酵素（「メタロプロテアーゼ類」）の誘導；および（３）酵素による破壊によってできた「穴」を通る細胞の移動が挙げられる。細胞により分泌されるメタロプロテアーゼ類のレベルの上昇、細胞の運動原性の増加、および受容体（付着体（インテグリン）に包含される）発現のパターンの変化は、すべて記載されており、いくつかの場合、ヒト・癌腫細胞の転移能と関連がある（エル・エイ・リオッタ（L.A.Liotta），サイエンティフィック・アメリカン（Scientific Ametican）54〜63頁（1992年２月））。
HGF/SFが、これらの事柄のうちの最後の２つ（すなわち、コラゲナーゼ類およびプラスミノゲナーゼ類の分泌ならびに運動原性）における活性レベルを増加させることが知られている。さらに、HGF/SFは、脈管形成性であることが知られており、血管形成は腫瘍細胞の生存にとり重要である（ジェイ・ベーレンス（J.Behrens）ら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell Biol.）第108巻:2435〜2447頁（1989年）；ケイ・エム・ウェイドナー（K.M.Weidner）ら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第111巻:2097〜2108頁（1990年））。「運動原性」なる語は、連続した細胞のシートが凝集せず、形態を変化させ、運動性となるプロセスをいう（イー・ジェラルディおよびエム・ストーカー、キャンサー・セルズ第３巻:227〜232頁（1991年））。この現象は「散在化」とも呼ばれる。出願人は、HGF/SFが運動原性を２通りの様式で誘導することを示した。下記実施例１参照。まず、表１に示すように、HGF/SFに対して古典的な散在化応答を示す細胞は、内在性met受容体のチロシンのすみやかなリン酸化を示し、このことは、met受容体を通して散在化が活性化されることを示唆する。
0003553936.tif 000002
次に、マウスおよびヒトのmet  cDNAがコードしているmet腫瘍原遺伝子産物でトランスフェクションしたマウス・乳癌「上皮」細胞系（C127細胞）について活発性の試験が行われ、外部から導入されたmet  cDNA由来のmet産物を発現する細胞においてのみ（トランスフェクションしていない細胞においてではない）、HGF/SFに応答した散在化を示した。これらの結果を表２に示す。
0003553936.tif 000003
HGF/SF−Met経路の不活性化により、本発明の治療的方法論に関する基礎が提供される。これらの方法論は、HGF/SFとMetとの結合を妨げる物質の製造を包含する。かかる物質としては、HGF/SFまたはMetの変種、HGF/SFまたはMetの模擬体、およびHGF/SFとMetとの結合を妨げるHGF/SFまたはMetに対する抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
「変種」としては、例えば、met結合ドメインを欠いているかまたは損傷を受けたmet結合ドメインを有するか、もしくは活性化ドメインを欠いているかまたは損傷を受けた活性化ドメインを有するHGF/SF種（しかしHGF/SFの構造的および生物学的特徴を保持している）が挙げられる（ロッカー（Lokker）ら，ジ・EMBO・ジャーナル第11巻（７）:2503〜2510頁（1992年）。
本発明の変種とされるHGF/SF種を、慣用的な遺伝子工学的方法により、本発明にしたがって製造することができる。例えば、部位特異的変異を含む方法により、変種を製造することができる。カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）,8.0.3中「ミュータジェネシス・オブ・クローンド・ディーエヌエイ（Mutagenesis of Cloned DNA）」およびその続きの部分；上記ロッカーらの文献参照。
本発明の変種としては、例えば、HGF/SFと結合する正常なMetに対するアンタゴニストとして作用する細胞外HGF/SF結合ドメインからなる可溶性系形態のMetも挙げられる。かかる変種を、本発明の分野においてよく知られた分子設計法により製造することができる。例えば、フー（Fuh）ら，サイエンス（Science）第256巻:1677〜1680頁（1982年）参照。
本発明の転移阻害性変種は、米国同時係属出願第07/655,502号に開示されたHGF/NK2またはHGF/NK1のごとき天然の変種であってもよい。該出願は文献により取り込まれる。HG/NK2は、Ｎ−末端および最初の２個のクリングルドメイン（kringle domain）を含む配列により特徴づけられる別のHGF転写物によりコードされるHGF/SFの切形形態である。HGF/NK1は、Ｎ−末端および最初の２個のクリングルドメイン（kringle domain）を含む配列により特徴づけられるHGF/SF転写物によりコードされるHGF/SFのもう１つの切形形態である。
本発明の転移阻害性物質は、HGF/SFまたはMetのためには模擬体であってもよい。模擬体の一例は、抗−イディオタイプ抗体、すなわち、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体で動物を免疫することにより産生される抗体である。抗−イディオタイプ抗体は、第１の抗体の結合部位を認識し、確認する。それゆえ、その結合部位の形態は、第１の抗体の結合部位中に適合するエピトープに非常によく似ている。抗−イディオタイプ抗体が、もとの抗原に似た結合部位を有しているので、それを、もとの抗原に対する受容体との結合のためのリガンドとして用いることができる。ファインバーグ（Fineberg）およびアートル（Ertl）,CRC・クリティカル・レビューズ・イン・イミュノロジー（CRC Critical Reviews in Immunology）第７巻:269〜284頁参照。HGF/SFの適当な模擬体を、HGF/SF抗体でスクリーニングしていずれの化合物がそれに結合するのか、あるいはいずれの化合物が分子設計により製造できるのかを調べることができる。モーガン（Morgan）ら，アニュアル・リポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー（Annual Reports in Medicinal Chemistry）（アカデミック・プレス（Academic Press）,1989年）中「アプローチズ・トゥ・ザ・ディスカバリー・オブ・ザ・ノン−ペプチド・リガンズ・フォー・ペプチド・リセプターズ・アンド・ペプチダーゼス（Approaches to the Discovery of the Non−Peptide LLigands for Peptide Receptors and Peptidases）」参照。
本発明の転移阻害性物質は、HGF/SFのMetとの結合を阻害するHGF/SFまたはMetに対する抗体または抗体フラグメントであってもよい。本発明にいう「抗体」は、抗体全体およびその一部、あるいはそれのみまたは他の部分を伴うものを包含する。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および単鎖抗体が挙げられる。抗体フラグメントは、HGF/SFまたはMetと結合するもの、とりわけ、FabおよびＦ（ab）２フラグメントが挙げられる。本発明の抗体を、動物中で生産することができ、また、当業者によく知られた組換えDNA法により生産することができる。
本発明の１の具体例において、出願人らは、リガンド結合またはリガンド結合の調節に用いるMet細胞外ドメインに対応する合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を製造する。図６および図７およびその説明参照。
出願人らは、腫瘍の侵略または転移をブロックする能力を測定するMetに対して指向されたリガンド結合阻害剤についてのインビトロ試験に関するプロトコールを開発した。例えば、出願人らは、metmu（内因的にネズミ・HGF/SFを産生する）およびmetの腫瘍形態であるtpr−metでトランスフェクションした細胞が侵略的であるのと同様に、HGF/SFおよびmethuでトランスフェクションしたNIH/3T3細胞が、ボイデン−チェンバーアッセイにおいて侵略的であることを見いだした。同様に、「ならし培地」、すなわちHGF/SFhuを含有する培地中にある場合には、methuトランスフェクション体は侵略的である。さらに出願人らは、Metの細胞外ドメイン中のペプチド配列に対して産生された「1242」抗体が、腫瘍細胞の侵略能をブロックすることを見いだした。
実際に、実施例２に開示され、図５を参照して議論されるようなキメラなマウス／ヒトに関する実験により、リガンド／受容体結合に包含されるMet受容体およびHGF/SFに関するドメインを明らかにすることが可能になる。図６に示され記載された数学的かつコンピューターによる計算により、マウスおよびヒトにおいて異なっているドメイン中の領域を明らかにすることが可能である。これらの「相違」により、HGF/SFに対する対応における種特異性が調節されている可能性があり、かかる領域に対する抗体を、そのHGF/SF結合を阻害する能力に関して試験することができる。よって、出願人らは、インビボ用途の組成物の開発に適用可能な、腫瘍転移阻害についてのインビトロ試験法を提供した。
作用すべき選択部位への本発明腫瘍転移阻害物質の送達を、ドラッグデリバリー、遺伝子導入、またはそれらのすべての組み合わせといった慣用的方法を用いて行うことができる。ケイ・ジェー・バン・ゼー（K.J.Van Zee）ら,PNAS第89巻:4845〜4849頁（1992年）参照。送達手段としては、炭水化物またはキャリア蛋白と抱合体化；当該分野で認められているいかなる徐放複合体とともに行う投与；微小球またはリポソームのごとき他の送達システムとの組み合わせ；または発現ベクター系に導入しての投与が挙げられる。本発明に適用可能な送達方法の１つとしては、デイビス（Davis）ら，米国特許第4,479,337号の方法により、本発明の腫瘍転移阻害物質をポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールとカップリングさせて生理学的に活性な免疫原性のない水溶性組成物を製造することが挙げられる。
かかる組成物の投与を、当業者に知られたいかなる方法によっても行うことができる。例えば、組成物を水溶液中に入れ、哺乳動物の循環系内または筋肉内系に注射することができる。適正な用量の決定は、哺乳動物の年令および体重をはじめとするそれぞれのケースに特異的な変数の数に依存し、当業者の技術・知識範囲内の通常の実験を必要とする。
本発明のもう１つの具体例において、HGF/SF経路の人工的な活性化により、本来の生物学的活性を回復、置換、または増強するための治療的方法論に関する根拠が提供される。これらの方法論としては、MetとHGF/SFとの間の結合相互作用を増強するHGF/SFまたはMet変種あるいは模擬体を活性化すべき部位へ送達し、そのことにより、人工的に支持されたHGF/SF相互作用を作り出すことが挙げられる。例えば、MetのHGF/SF結合ドメイン、またはHGF/SFのMet結合ドメイン（あるいはその両方）の部位特異的変異を用いて、他のペアーのメンバーに対するより高い親和性を有するHGF/SF−Metペアーのメンバーを作り出すことができ、よって、損傷組織の成長または再生の加速に影響が及ぶ。同様に、構成的に活性化されたチロシンキナーゼを有するMetの変異をはじめとする慣用的な組換えDNA法を用いて、通常はHGF/SF結合により調節されるMet蛋白のキナーゼ活性を増強または支援することができる。外部から投与されたHGF/SFと組み合わせた組換えDNA法によりMetの自然発現を補う手段によってHGF/SF−Met経路を活性化することも、本発明の範囲内に包含される。
作用すべき選択部位への遺伝子操作されたHGF/SFまたはMet種の送達を、腫瘍転移を阻害する物質の送達に関して上で議論されたような、ドラッグデリバリー、遺伝子導入、またはそれらのすべての組み合わせといった慣用的方法を用いて行うことができる。
本発明の別の具体例において、出願人らは、ヒト・HGF/SFの製造法を提供する。詳細には、出願人らは、驚くべきことに、マウス・繊維芽細胞NIH/3T3細胞が、ヒト・HGF  cDNAを含むトランスフェクションされた末端反復配列（LTR）ベクター組み換え体から高レベルのHGF/SFを発現することを見いだした。出願人らは、LTRヒト・ｃ−met腫瘍原遺伝子（cDNAベクター）がヒト・LTR/HGF構築物とともに同時トランスフェクションされ、かつ細胞が２次腫瘍から由来する場合に、最高レベルのHGFがNIH/3T3中に検出されることを見いだした。下記実施例２参照。この細胞系の１の利点は、形質転換細胞が高密度にまで増殖することである。したがって、この細胞系は、非常に高レベルのHGF/SF、すなわちリットルあたりHGF/SF約1mg（mlあたり1250ユニット）を産生する。これに対し、ヒト・表皮ケラチン細胞由来の別の細胞系であるndk細胞は、48時間でリットルあたり約10μｇを産生する。ジェイ・シーアダムス（J.C.Adams）ら，サイエンス第98巻:385〜394頁（1991年）；イー・エム・ローゼン（E.M.Rosen）ら,BBRC第168巻（３）:1082〜1088頁（1990頁）参照。それゆえ、本発明の組換えベクター構築物で同時トランスフェクションしたNIH/3T3細胞から、1mg/mlの収量でHGF/SFを得ることは予期されないことである。
よって、本発明の１の具体例は、以下のステップ：
（ａ）  NIH/3T3細胞を、HGF/SFhuおよびMethuをコードしているDNAでトランスフェクションし；
（ｂ）  ステップ（ａ）によりトランスフェクションされた細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、１次腫瘍を生じさせ；
（ｃ）  １次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；
（ｄ）  ステップ（ｃ）により増殖した高レベルのHGF/SFhuおよび高レベルのMethuを発現する細胞を選択し；
（ｅ）  ステップ（ｄ）により選択した細胞を哺乳動物内に導入し、それにより、２次腫瘍を生じさせ；
（ｆ）  ２次腫瘍細胞を外移植し、インビトロで増殖させ；ついで
（ｇ）  ステップ（ｆ）の細胞により産生されたHGF/SFhuを得る
からなるHGF/SFの製造法に関する。
本発明DNAは、作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロモーター、ヒト・Metの全コーディングドメインをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第１のDNAベクター、および作動可能に連結されたレトロウイルスの末端反復配列由来のプロター、ヒト・HGF/SFをコードしているDNAおよびポリアデニレーションシグナルからなる第２のDNAベクターよりなる。
本発明DNAベクターの製造を、当業者に知られた種々の方法により行うことができるが、方法を実施例２のcDNAプラスミド構築物および細胞系の議論において例示する。本発明の好ましいDNAプラスミド構築物を図９に示す。
HGF/SFhuおよびMethuLTR−cDNAでトランスフェクションされた細胞を、当該分野でよく知られた方法により、好ましくは、注射により哺乳動物中に導入する。ブレイアー，ディー・ジー（Brair,D.G.）ら，サイエンス第218巻:1122〜1125頁（1982年）参照。本発明の好ましい哺乳動物はヌードマウスである。これらの動物中で５〜10週間増殖した後の１次腫瘍を外移植し、実施例２のヌードマウスアッセイ記載のごとくインビトロ培養で増殖させる。ついで、インビトロ増殖した１次腫瘍細胞を、免疫沈降分析に付してどの細胞が高レベルのHGF/SFhuおよび高レベルのMethuを発現しているのかを確認する。図３およびその説明参照。例えば、外移植された細胞を代謝的にラベルし、ついで、Methuモノクローナル抗体（モノクローナル19S）とともに免疫沈降させ、濃縮し、ついで、HGF/SFhuモノクローナル抗体A3.1.2.とともに免疫沈降させる。高レベルのHGF/SFhuおよびMethuを、出発物質における発現レベルと比較して測定する。したがって、出発物質において観察されるよりも高い発現レベルのものすべてを、この方法の目的に照らし合わせて、「高い」とみなす。ついで、高レベルのHGF/SFhuおよびMethuを発現する細胞を哺乳動物に導入し、増殖する２次腫瘍を外移植し、当該分野でよく知られた方法によりインビトロ増殖させる。ブレイアー・ディー・ジーら，サイエンス第218巻:1122〜1125頁（1982年）参照。
ついで、外移植された２次腫瘍細胞により発現されるHGF/SFhuを、ウェイドナーら，ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第111巻:2097〜2108（1990年）記載のごとく精製する（本発明の適用可能な他の方法は当業者によく知られている）。
さらにもう１つの具体例において、本発明は、met  cDNAでトランスフェクションされたNIH/3T3細胞由来のマウスおよびヒトのMetのＣ−末端イソ体（isoform）に関する。これらのイソ体は翻訳後のプロセッシングにより生じる可能性がもっと高いが、出願人らは、トランスフェクションされたDNAの可能な再配列を排除することはできない。Ｃ−末端において切形されたいくつかのmet産物が報告されている（プラト，エム（Prat,M.）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）第11巻:5954〜5962頁（1991年））が、これらの産物は本発明イソ体（isoform）とは異なる。その理由は、それらがＣ−末端抗体と反応しないからである。そのうえ、これらのイソ体は、高レベルのmetを発現している細胞においてのみ検出され、そのことは、それらの存在量が少ないことを示すものである。
実施例1.c−met腫瘍原遺伝子は運動原性に関連した受容体である
ｃ−met受容体を発現する多くのヒト・癌細胞系において転移および／または散在化（運動原性）を誘導するHGF/SFの能力を調べた。上記表１に示す細胞系を、1X104〜5X104個/mlとなるよう96ウェル組織培養プレートに撒き、集密的に近くなるまで増殖させた。ウェルを洗浄して血清を除去し、無血清培地にて２日間細胞を飢餓状態とした。その翌日、細胞を、無血清、血清、またはHGF/SF10ng/mlで16〜18時間処理し、ついで、ウェルあたり3H−チミジン１μCi（５μCi/ml）を添加して、さらに６時間置いた。氷冷PBSでウェルから標識を洗い落とすことによりアッセイを終了し、細胞を５％TCAで固定し、ついで、0.25M  NaOHでDNAを可溶化した。運動原性インデックスは、血清不存在下におけるチミジンの取り込みとHGFによるチミジンの取り込みとの比である。運動原性アッセイ用に、細胞を、2X103個/mlとなるように16−ウェルチェンバースライド（ラブテック（LabTek）社製）に撒き、60％集密的になるまで増殖させた。ついで、細胞を洗浄して血清を除去し、HGF/SF添加／無添加無血清培地にて一晩インキュベーションした。スライドを氷冷アセトンで10分間固定し、クリスタルバイオレット染色した（５分間）。「散在化した表現形」における質的な変化が記録された。
ｃ−metの上皮細胞系への導入により「散在化」活性が該細胞に付与されることを示すために、ヒト・met  cDNAまたはネズミ・met  cDNAのいずれかでリポフェクション（BRL）することにより、C127細胞をトランスフェクションした。表１のように分裂原性および／または動物原性を測定した。この研究結果を上記表２に示す。
実施例2.NIH/3T3細胞系におけるHGF/SF産生
cDNAプラスミド構築物および細胞系  met  cDNAプラスミドを、pMEX（オスカム，アール（Pskam,R.）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第85巻:2964〜2968頁（1988年））の誘導体（ポリリンカー配列なし）であるpMB1中で構築した。該プラスミドは、モロニー・ミュリン・サルコーマ・ウイルス（Molony murine sarcoma virus）（MSV）由来のLTRRプロモーターおよびシミアン・ウイルス40（simian virus 40）のポリアデニレーションシグナルを含んでいる。オーオプンリーディングフレームを含む4.6kbのmethu配列中において、内部の300bpのEcoR IフラグメントをpOKの250bpのEcoR Iフラグメントと置換することによりmethuプラスミドを構築した。パーク，エム（Park,M）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第84巻:6379〜6383頁（1987年）；ロドリゲス（Rodriguez）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー第11巻:2962〜2970頁（1991年）参照。metmuプラスミドは、4.6Kbのマウス・metオープンリーディングフレーム全体を含んでいる。アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年）参照。キメラなヒト／マウスmet構築物を、保存的なPvu II部位（アミノ酸807）を用いて構築した。pMEXのBamH I−Kpn I部位中にヒト・HGF配列の2.3KbのBamH I−Kpn Iフラグメントを挿入することによりHGFhuプラスミドを構築した。ナカムラ，ティーら，ネイチャー第342巻:440〜443頁（1989年）；オスカム，アールら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第85巻:2964〜2968頁（1988年）参照。NIH/3T3  490細胞を、８％子ウシ血清（ギブコ社製）含有DMEM培地（ギブコ社製）中で増殖させた。
DNAトランスフェクション  プラスミドDNA（子ウシ胸腺キャリアDNA8μｇを含む水75μｌ中２μｇ）を0.67M  CaCl275μｌと混合することにより、DNAトランスフェクションに関するリン酸カルシウム法（クーパー，シー・エス（Cooper,C.S.）ら，ネイチャー第311巻:29〜33頁（1984年））を行った。連続的に攪拌しながらこの混合物を、0.15mlの溶液Ｈ（0.27M  NaCl、0.01M  KCl、0.0014M  Na2HPO4・7H2O、0.012M  デキストロース）に滴下した。室温に30分間置いた後、0.01M  Hepesバッファーを含む培地1mlを入れた35mmディッシュ上で約70％の集密性を有する細胞に、該混合物を添加した。細胞を37℃で４時間インキュベーションし、ついで、溶液Ｈ中の15％グリセロール（v/v）で２分間処理した。G418により選択のために、細胞を再度DMEMおよび８％子ウシ血清中に一晩フィードし、ついで、３個の60mmディッシュに移した。24時間インキュベーションした後、細胞を、400μg/mlのG418（ギブコ社製）を含有する培地に、１週間に２度フィードした。
ノーザン分析  RNAsol（CINNA/BIOTECX社製）を用いてRNAを単離した。RNA20μｇを、１％変性的ホルムアミドアガロースゲル上の電気泳動に供し、ついで、ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー・アンド・シュール（Schleicher and Schuell）社製）に移した。30％ホルムアミド、6xセイラインクエン酸ナトリウム（SSC）、5xデンハート溶液（Denhardt's  solution）、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）および超音波処理したサケ・精子DNA（250μg/ml）中で、ブロットを、32P−標識ランダムプライマーDNAプローブと42℃で15時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダーゼーション後、フィルターを、1xSSC（0.1％SDS含有）中、室温で２回洗浄し、ついで、1xSSC（0.1％SDS含有）中、50℃で洗浄した。フィルターを乾燥させて−70℃で１〜３日間、Ｘ線フィルムに暴露した。
免疫沈降  集密的に近い細胞を、メチオニンおよびシステイン不含DMEM中で、0.25mCiのトランスラベル（Translabel（ICN社製））（1ml/35mmディッシュ）で４ないし６時間ラベルした。ラベルした細胞を、0.5mlのRIPA緩衝液［１％トリトンＸ−100、１％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）,0.15M  NaCl、0.02M  NaPO4,pH7.2、1mM  フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）,2mM  EDTA、50mM  NaF、30mM  ピロリン酸ナトリウム］中で溶解させた。等量の放射線カウントを有する清澄化した溶解物を、19Sモノクローナル抗−メチオニン抗体（ファテット，ディー・エル（Faletto,D.L.）ら，オンコジーン（Oncogene）第７巻:1149〜1157頁（1991年））と４℃で一晩免疫沈降させた。免疫沈降物を、プロテインＧ−セファロース（ギブコ社製）に複合体化させ、ついで、RIPA緩衝液で２回洗浄し、ハイサルト緩衝液（high−salt buffer）（1M  NaCl、10mM  Tris−HCl,pH7.2、0.5％トリトン）で洗浄した。５％β−メルカプトエタノール含有SDS試料用緩衝液中で煮沸することにより、免疫沈降物を可溶化させた。試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ついで、フルオログラフィックエンハンサー（fluorographic enhancer）（アンプリファイ（Amplify）TM,アマシャム（Amersham）社製）で処理し、−70℃において増強スクリーンでフルオログラフィーを得た。
SP260は、ウサギ・抗血清から作られたペプチド抗体であり、metmuのＣ−末端の21個のアミノ酸に対して指向されている（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））。A.3.1.2は、抗−ヒト組み替え型HGFモノクローナル抗体（IgG,サブクラスG2a）である。
パルスチェイス分析  集密的に近い細胞を、メチオニンおよびシステイン不含DMEM1ml中（各35mmディッシュ）、0.25mCiのトランスラベルで45分間ラベルした。細胞を２回洗浄し、完全培地で３時間チェイスし、ついで、溶解し、免疫沈降分析に供した。
表面ヨウ素化  集密的に近い細胞を、ヨード−ジェン（Iodo−Gen（ピアス（Pierce）社製）の存在下でNa125Iでラベルした。ヨードージェン試薬20μｌ（クロロホルム中10mg/ml）をＩ−ドラムバイアル（Ｉ−dram vial）の底に入れ、窒素の流れにより乾燥させた。ついで、ヨード−ジェンを10mM  EDTAを含有する1M  Tris（pH7.5）に溶解し、細胞ペレットに添加した。Na125I（0.5mCi）を添加した10分間反応した。ラベルした細胞をPBSで３回洗浄し、ついで、RIPA緩衝液で溶解し、免疫沈降分析に付した。
ウエスタン分析  100mmディッシュ上の集密的に近い細胞を、冷TBS（10mM  Tris,pH8.0、150mM  NaCl）で２回洗浄し、1mlの溶解用緩衝液（25mM  Tris−HCl,pH8.0、100mM  NaCl、50mM  NaF、１％トリトンＸ−100、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチン、1.25mM  PMSF、1mMバナジン酸塩）中で溶解させた。蛋白1mgを、抗−C28抗−Methuポリクローナル抗体（ゴンザッティ−ヘイセス，エム（Gonzatti−Haces,M.），プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第85巻:21〜25頁（1988年））とともに免疫沈降させ、抗−ホスホチロシン（抗−Ｐ−Tyr）抗体4G10（モリソン、ディー・ケイ（Morrison,D.K.）ら，セル第58巻:649〜657頁（1989年））、またはヒトもしくはマウスのmet特異的抗体である19Sモノクローナル（ファレット，ディー・エルら，オンコジーン第７巻:1149〜1157頁（1991年））あるいはSP260（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））のいずれかとウエスタン分析を行った。製造者の指示に従い、125I−プロテインＡ（アマシャム社製）を用いて陽性バンドを検出した。
ヌードマウス腫瘍アッセイ  すでに記載されているようにして（ブレイアー，ディー・ジーら，サイエンス第218巻:1122〜1125頁（1982年））、アッセイを行った。トランスフェクションされG418で選択されたNIH/3T3細胞（106個）を２回洗浄し、無血清培地0.1ml中に再懸濁した。細胞を、離乳した胸腺除去ヌードマウス（ハーラン・スプラグ・ダウリー，インク（Harlan Sprague Dawley,Inc.）の背中に注射した。腫瘍形成を、毎週10週目までモニターした。腫瘍が15mmのサイズになった時、腫瘍を外移植し、腫瘍細胞を免疫沈降分析に供した。
軟寒天アッセイ  軟寒天増殖アッセイを、ブレイアら、ウイロロジー（Virology）第95巻:303〜316頁（1979年）の変法により行った。簡単に説明すると、トリプシン処理細胞を、10％子ウシ血清および0.24％精製寒天（DIFCO社製）を含有する8mlのDMEM中、2x105および2x104個となるように懸濁し、10％子ウシ血清および0.27％寒天を含有するDMEMの硬化下層を入れた２系の60mmディッシュに移した。１週間間隔で、10％子ウシ血清および0.27％寒天を含有するDMEM2mlをプレートにフィードした。37℃で３週間インキュベーションした後、顕微鏡でコロニーを数えた。
NIH/3T3細胞におけるMethuおよびMetmuの発現  methu腫瘍原遺伝子cDNAを含んでいるプラスミドを、pSV2neoとともにNIH/3T3細胞に同時トランスフェクションし、免疫沈降分析により、ヒトまたはマウスのMet発現に関してG418耐性細胞をスクリーニングした。これらの分析により、トランスフェクションされたNIH/3T3細胞において、ヒトおよびマウスのp170metおよびp140metが発現されることが示されている（図1Aのそれぞれレーン２および３）。NIH/3T3細胞における同等のレベルのmetmu発現が報告されている（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））。出願人らは、Methuを発現するG418耐性細胞において、外来性のMetmuの発現が見られないかまたは殆ど起こらないことを見いだした。MethuおよびMetmuの適当なプロセッシングについて、パルスチェイスラベリング実験により試験し、これらの研究により、45分のパルスの間に合成されるp170met（図1B,レーン１および３）が、３時間後に、効果的に成熟p410metへとプロセッシングされる（レーン２および４）ことが示された。そのうえ、ヒトおよびマウスのMetは、細胞表面に局在化していた。出願人らは、無処理の細胞をNa125Iでラベルし、その溶解物を免疫沈降して、p140metおよびp170met両形態ともがヨウ素化されたことを示した（図1C）。よって、NIH/3T3細胞において発現されるヒトまたはマウスのMetは、正確にプロセッシングされ、細胞表面に局在化するのである。これらの分析は、p170metが細胞表面に到達することも示す。p170metのヨウ素化物は、溶解細胞からは生じなかった。なぜならば、同じヨウ素化条件において、細胞質性tpr−met腫瘍蛋白が検出されなかったからである（ゴンザッティ−ヘイセス，エム（Gonzatti−Haces,M.），プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第85巻:21〜25頁（1988年））。さらに、methuを過剰産生するヒト・胃癌細胞系であるオカジマ細胞（Okajima cells）において発現されるp170metもまた、表面ヨウ素化によりラベルされるが（データ示さず）、NIH/3T3細胞と比較した場合、ラベルされたp140metに対するp170metの割合は小さかった。
NIH/3T3細胞におけるmetの構造的なチロシンのリン酸化  ノーザンハイブリダイゼーション分析により、出願人らは、NIH/3T3細胞およびmethuまたはmetmuのいずれかでトランスフェクションされた細胞におけるHGF/SF  mRNA発現を検出した。出願人らは、同レベルのHGF/SF  mRNA発現を観察した。そのことは、G418選択細胞系におけるmethuまたはmetmuの過剰産生は外来性HGF/SF発現に影響しないことを示すものであった。これらの結果もまた、Metがオートクリン様式で活性化されうることを示すものであった。それゆえ、出願人らは、これらの細胞において発現したMethuおよびMetmuが抗−Ｐ−Tyr抗体と反応するかどうかを調べた。MethuおよびMetmuを発現する細胞系からの抽出物を、ヒトまたはマウスに特異的なペプチド抗体との免疫沈降に供し、ついで、抗−Ｐ−Tyr抗体（図2Aおよび2B）、またはヒト（図2C）あるいはマウス（図2D）に特異的なMet抗体を用いたウエスタン分析を行った。これらの分析は、Methuのp170metおよびp140metならびにMethuが抗−Ｐ−Tyr抗体と強く反応したことを示すものである。これは、p170metのチロシンリン酸化物が抗−Ｐ−Tyr抗体と反応することを示した最初の例である。１つの細胞系はMethuを非常に高レベルで発現した（図2AおよびＣのレーン１）。これは例外である。なぜならば、他のすべてのMethu細胞系が、図2AおよびＣのレーン２および３で分析された細胞系に匹敵するレベルの発現を示したからである。さらに、Ｃ−末端Met蛋白産物（p85、p75、およびp65）がマウスまたはヒトいずれかのmetを発現する細胞におけるＣ−末端抗体でもって検出された（図2A〜Ｄのレーン１）。
NIH/3T3細胞におけるmetの腫瘍原性  出願人らは、図５に示すように、Metmuを発現するがMethuを発現しないNIH/3T3細胞培養物が形質転換されたこと（アイヤー，エイら，セル・グロウス・アンド・ディファレンシエイション第１巻:87〜95頁（1990年））を観察した。このことは、ヌードマウスにおける培養物の腫瘍原性について試験し、ついで、トランスフェクションし、G418選択を行うことによって確認された。metmuを発現するNIH/3T3細胞は、下表３に示すように非常に腫瘍原性があるが、methuを発現する細胞は腫瘍原性が低く、試験した８系のうち１系のみが腫瘍を生成したにすぎなかった。
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注射する前は、これらの腫瘍原性細胞系（図2AおよびＣのレーン１）は、腫瘍原性でない細胞系（図2AおよびＣのレーン２および３）と比較すると、高レベルのMethuを産生していた。この系の腫瘍外移植物も同様に高レベルのMethuを示した。比較のため、注射する前のMetmu系のレベルをに示す（図2BおよびＤのレーン１）。より低いレベルのMetmuを発現する細胞系もまた、このアッセイにおいて腫瘍原性であった。細胞系123−１により生じた２個の腫瘍（表３）は、外来性Metmuの発現レベルの増加およびMethuレベルの減少を示すものであった。このことは、すでに記載されたように（クーパー，シー・エス（Cooper,C.S.）ら，ジ・EMBO・ジャーナル第５巻:2623〜2628頁（1986年）；ヘルデン，シー・エイチ（Helden,C.H.）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）第184巻:487〜496頁（1989年））、マウス・metの増幅により２個の腫瘍が生じたことを示唆するものである。出願人らは、Methuは、NIH/3T3細胞においては殆ど腫瘍原性がないと結論する。
methuおよびHGF/SFhuで同時トランスフェクションされたNIH/3T3細胞の腫瘍原性  methuでトランスフェクションされたNIH/3T3細胞の低い腫瘍原性に関する１の説明は、外来性のHGF/SFmuによってはmethu受容体活性化により十分なシグナルを得ることができないということである。それゆえ、出願人らは、methuおよびHGF/SFhu両方のcDNAでのトランスフェクションが、オートクリン機構を通して腫瘍原性を増加させるかどうかを調べた。これらの分析により、methuおよびHGF/SFhuで同時トランスフェクションされたNIH/3T3細胞が高い腫瘍原性となることが示されている（表４）。
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そのうえ、腫瘍細胞は、MethuおよびHGF/SFhu両方のレベルの増加を示した（それぞれ図3AおよびＣのレーン２、４および５）。レーン４および５に示される腫瘍外移植物において、MethuおよびHGF/SFhuが両方とも高レベルで発現された。外来性のmetmuの増幅を示した細胞系はなかった（図3B）。出願人らは、HGF/SFhuでトランスフェクションされたNIH/3T3細胞もまた、いくつかの腫瘍を生じさせたが、外移植物由来の腫瘍細胞において発現したHGF/SFhu産物のレベルは、methu−HGF/SFhu同時トランスフェクション実験（図3C）による腫瘍において発現したレベルほど高くなかった。５個のHGF/SFhu腫瘍のうち１個において、外来性のmethuのレベル上昇が検出された。
NIH/3T3細胞におけるキメラなヒト／マウス・metの腫瘍原性  リガンド結合ドメインが腫瘍原性に影響するかどうかを調べるために、出願人らは、キメラなヒト／マウス・met受容体分子を得、ヌードマウスにおけるそれらの腫瘍原性を試験した（図５）。出願人らは、トランスメンブレンをコードしている部位に隣接した外部ドメイン中の保存されたPvu II部位を用いてこれらの組換体を作った。マウス・外部リガンド結合ドメインをヒト・トランスメンブランおよびチロシンキナーゼドメインに連結した場合、該キメラな受容体は、Metmuと同等の腫瘍原活性を示した（図５）。これらの腫瘍の外移植物は、ヒト・チロシンキナーゼドメインに対して指向されたヒト・抗体でもって認識されるキメラなMet蛋白のレベルの増加を示した（図４のレーン２および３）。これらの腫瘍において、metmuの増幅に関する証拠は得られず、キメラな産物は、抗−Ｐ−Tyr抗体を用いたエウスタン分析によって認められた（図４のレーン５）。
マウス・Met外部リガンド結合ドメインを伴ったキメラの高い腫瘍原性とは対照的に、ヒト・Ｎ−末端／マウス・Ｃ−末端キメラは殆ど腫瘍原性がなかった。しかしながら、Methuの場合と同様に、HGF/SFhucDNAでこのキメラを同時トランスフェクションした場合、効果的な腫瘍形成が観察された（図５）。さらに出願人らは、metmu−methuキメラを発現する細胞が、ヌードマウスに注射する前に、形成転換され、metmuでトランスフェクションされた細胞と同様に軟寒天中にコロニーを形成することを示す。methu−metmu細胞は、HGF/SFで同時発現されないかぎり、形質転換された表現形を示さない。出願人らは、Metmu外部リガンド結合ドメインが、腫瘍原性を調べる主要因子であると結論した。
上記発明を、明確および理解の目的で、いくらか詳細に記載したが、本発明は、この開示を読んだ当業者により理解されるであろう。また、本発明の真の範囲から離れることなく、形態および詳細において種々の変更がなされうる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図９Ａ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ｂ】
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