【手続補正書】
【提出日】平成29年9月13日(2017.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【図１】図１Ａは、マウスにおける拡大した遺伝子ファミリーならびに同様の発現パターンおよびアゴニスト特異性に基づくそれらの同定されたヒトオルソログを例証する、マウスおよびヒトＭｒｇｐｒゲノム遺伝子座の図である。マウスＭｒｇｐｒ遺伝子（上部に名称を伴う縦棒として示されている）は、染色体７上でクラスタ化する。マウスＭｒｇｐｒＡ３（Ａ３）およびＭｒｇｐｒＣ１１（Ｃ１１）は、ヒトＭｒｇｐｒＸ１（Ｘ１）のオルソログであり、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいて特異的に発現され、クロロキン（ＣＱ）およびＢＡＭ８−２２（ＢＡＭ）に誘発されたかゆみを媒介するかゆみ受容体として機能する。マウスＭｒｇｐｒＢ２（Ｂ２）、ヒトＭｒｇｐｒＸ２（Ｘ２）のオルソログの発現およびアゴニスト特異性については、以下で記述する。図１Ｂは、マウス腹膜肥満細胞におけるＭｒｇｐｒＢ２転写産物（矢印）の同定された発現をスクリーニングする、ストリンジェンドな逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）からの結果を示す。Ｍｒｇｐｒ遺伝子名は、ゲル写真の上部に示されている。逆転写酵素がｃＤＮＡ合成反応から省かれた場合、バンドは見られなかった（陰性）。図１Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２またはＭｒｇｐｒＸ２のプラスミド駆動発現を一過性にトランスフェクトし、２０μＭ  ＰＡＭＰ（９〜２０）の浴適用（ｂａｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（上部に黒色線によって示された持続期間）に暴露したＨＥＫ２９３細胞からの、レシオメトリックＦｕｒａ−２イメージングによって測定した際の、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの例示的なトレースを示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１Ｄは、ＢＡＣトランスジェニックマウス組織からの代表的な共焦点画像を示す一連の顕微鏡写真である。ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームにおいてｅＧＦＰ−Ｃｒｅを発現しているＢＡＣマウスを、Ｒｏｓａ２６−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交尾させた。したがって、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現は、ＭｒｇｐｒＢ２プロモータの制御下にあるＣｒｅの発現パターンによって決定される。ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色）発現を、肥満細胞のマーカーであるアビジン染色（緑色）と比較した。２つのマーカー間のほぼ１００％の重複は、ＭｒｇｐｒＢ２が肥満細胞において特異的に含有されていることを示唆している。心臓を除くすべての組織について３匹のマウスを調査し、心臓については２匹のマウスを調査した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性でもあったアビジン陽性肥満細胞のパーセンテージ：無毛皮膚、９７．５％；有毛皮膚、９０．１％；気管、９７．２％；心臓、８７．１％。アビジン陽性でもあったｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージ：無毛皮膚、９９．２％；有毛皮膚、１００％；気管、９８．３％；心臓、９９％。各組織において計数された細胞の総数は、１００超であった心臓を除いて、３００超であった。心臓肥満細胞は、組織中の他の場所よりも密度がはるかに高いことから、体腔付近で調査し；ｔｄＴｏｍａｔｏについて陰性であったアビジン陽性細胞は、筋肉組織中にごく少数で包埋されていることが観察されたが、それらの同定は不明瞭であった。スケールバーは２０μｍ���ある。
【図２】図２Ａ（左）は、抗ＩｇＥ（５μｇ／ｍｌ）または化合物４８／８０（１０μｇ／ｍｌ）の浴適用によって誘発されたＦｌｕｏ−４イメージングによってアッセイした際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すマウス腹膜肥満細胞の代表的なヒートマップ画像を示す一連の顕微鏡写真である。図２Ａ（中）は、代表的なイメージングトレースを示す。各色の線は、個々の細胞を表す。「抗ＩｇＥ」パネルにおける黒色線は、各遺伝子型の平均トレースである。注記：［Ｃａ２＋］ｉトレースは、ＷＴおよびＭＵＴ群の間で同様である。図２Ａ（右）は、応答している細胞のパーセンテージの定量化を示す。細胞は、［Ｃａ２＋］ｉが少なくとも１０秒につき少なくとも５０％上昇したならば応答しているとして同定され、これは、リガンド誘発性応答を無作為なちらつき事象から明らかに区別するものである。これらおよびすべての他の実験についてのグループデータを、平均±標準誤差として表現する。片側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１で有意とみなした（各遺伝子型についてｎ＝３；各条件について１５０を上回る細胞が計数された）。抗ＩｇＥ応答は、有意に異なっていなかった。スケールバーは１０μｍである。図２Ｂは、４８／８０（３０μｇ／ｍｌ）に３７℃で３０分間の暴露後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウス由来の気管および腹部皮膚から上清中へのヒスタミン放出を示す棒グラフである。上清中に放出されたヒスタミンの量を定量化し、ｎｇ／ｍｇ組織（湿重量）で表現した。＊＊、ｐ＜０．０１（気管についてはｎ＝５、皮膚についてはｎ＝８）。図２Ｃは、一連のグラフである。図２Ｃ（上）は、４８／８０（３０μｇ／ｍｌ）または卵子（１０μｇ／ｍｌ；すなわちＩｇＥ依存性）に応答した、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスから単離された気管（事前にオボアルブミン（卵子）に感作されたもの）の収縮を示す代表的なトレースを示す。図２Ｃ（下）は、実験の終わりに添加された１０μＭのカルバミルコリンへの応答として決定された、最大総収縮の平均データを示す。４８／８０  ＷＴについてはｎ＝５、４８／８０  ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴについては３。図２Ｄは、一連の写真および４８／８０（右、矢印、１０μｇ／ｍｌ、生理食塩水中５μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後のエバンスブルー溢出の代表的な画像を示す棒チャート（左）である。図２Ｄ（右）は、足へのエバンスブルー漏出の定量化および１５分後の足の厚みの増大を示す。＊、ｐ＜０．０２（ｎ＝５／ＷＴ、ｎ＝６／ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ）。生理食塩水注射後の差異は有意ではなかった。図２Ｅは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、ＭｒｇｐｒＸ２リガンドおよび塩基性分泌促進物質に対するＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞応答性の定量化を示す棒チャートである。物質の濃度（単位μＭ）：ＰＡＭＰ（９〜２０）、２０；コルチスタチン−１４（ｃｏｒｔ．）、２０；物質Ｐ（ｓｕｂ  Ｐ）、２００；カリジン、２００；マストパラン（ｍａｓｔｏ．、スズメバチ毒の成分）、２０；スズメバチマストパラン、２０。ｎ＝３／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数さ��た／分泌促進物質。データを、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、注記のない限り、ｐ＜０．０５。＊、ｐ＜０．０５．＊＊、ｐ＜０．０１で有意とみなした。
【図３】図３Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２が肥満細胞応答性およびペプチド性治療薬の副作用を媒介することを示す棒チャートである。図３Ａは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、薬物適用後のＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：イカチバント、５０；セトロレリクス、２０；ロイプロリド、１００；オクトレオチド、１０；セルモレリン、６０；インスリン、８０。ｎ＝３／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質、インスリンについて計数された１００超の細胞を除く。インスリン応答性の間の差異は、有意ではなかった。図３Ｂ（左）は、イカチバント（右、矢印、１０ｍｇ／ｍｌ、生理食塩水中５μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後の、エバンスブルー溢出の代表的な画像を示す。図３Ｂ（右）は、１５分後の足へのエバンスブルー漏出の定量化を示す。＊＊、ｐ＜０．０１（各遺伝子型についてｎ＝６）。生理食塩水注射後の差異は、有意ではなかった。図３Ｃは、名前が挙げられた物質とともにインキュベーション後の、ＷＴ（赤色のひし形）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（黒色の正方形）マウスからの総ヒスタミン放出を示す一連のドットプロットである。ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ細胞の間には、抗ＩｇＥ抗体のいずれの用量においても有意差が見られなかった。実験を３回超繰り返した。データを、平均±ＳＥＭとして提示する。両側不対スチューデントｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図４】図４Ａは、化合物４８／８０およびより強力であると報告されている環化バリアントの一連の構造である。テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）モチーフは青色で強調表示されている。図４Ｂは、すべてのＮＭＢＤクラスの代表的なメンバーの一連の構造である。ＴＨＩＱモチーフは青色で強調表示されている。スクシニルコリンのみが大きい疎水性基を欠いていることに留意されたい。図４Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２が、小分子治療薬の肥満細胞応答性および副作用を媒介することを示す棒チャートである。図４Ｃは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、種々のＮＭＢＤの適用後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：アトラクリウム、５０；ミバクリウム、２０；ツボクラリン、３０；ロクロニウム、５００。ｎ＝３マウス／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質。図４Ｄは、シプロフロキサシンの構造の描写であり、すべてのフルオロキノロンに共通のモチーフは青色で強調表示されている。キノロンモチーフの近くの窒素に留意されたい。図４Ｅは、Ｆｌｕｏ−４イメージングを使用してアッセイした、フルオロキノロン適用後の、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞由来の応答している細胞のパーセンテージを示す棒チャートである。薬物の濃度（単位μｇ／ｍｌ）：シプロフロキサシン、２００；レポフロキサシン、５００；モキシフロキサシン、１６０；オフロキサシン、４００。ｎ＝３マウス／遺伝子型；１５０を上回る細胞が計数された／物質。図４Ｆは、時刻０におけるシプロフロキサシン（１２５μｌの生理食塩水中１．５ｍｇ）の静脈注射後の体温の変化を示す折れ線グラフである。ｎ＝４マウス／遺伝子型。データを、平均±ＳＥＭとして提示する。両側不対スチューデントｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａは、ＭｒｇｐｒＸ１オルソログが、ナイーブ条件下で肥満細胞において示差的レベルで発現されていないことを示すブロットの写真である。図５Ａは、ＭｒｇｐｒＸ１オルソログＭｒｇｐｒＡ３およびＭｒｇｐｒＣ１１の発現について、腹膜肥満細胞における低ストリンジェンシーＲＴ−ＰＣＲスクリーニングからの結果を示す。矢印は、予測されるバンドサイズを指し示す。図５Ｂは、ＭｒｇｐｒＸ１およびＭｒｇｐｒＣ１１アゴニストウシ副腎髄質由来ペプチド、断片８〜２２（ＢＡＭ８〜２２、５００ｎＭ）に応答する腹膜肥満細胞のパーセンテージを示す棒チャートである。Ｆｌｕｏ−４色素のイメージングを使用して、細胞内カルシウムの上昇を測定することにより、活性化をアッセイした。差異は有意ではなかった（ｐ＝０．３９）。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。図５Ｃは、ＭｒｇｐｒＸ２、ＭｒｇｐｒＢ２、およびＭｒｇｐｒＢ２と最も密接に関係している他のマウスＭｒｇｐｒ（すなわち、ＭｒｇｐｒＢ１、Ｂ１０、およびＢ１１）のプラスミド駆動発現を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞による、ＭｒｇｐｒＸ２リガンドおよびＭｒｇｐｒＸ１リガンドクロロキン（ＣＱ）に対する応答をまとめたチャートである。陽性および陰性応答は、それぞれ「チェック」および「バツ印」として示される。トランスフェクト細胞の少なくとも半分が［Ｃａ２＋］ｉの５０％増大を示した場合、応答は陽性とみなされた。ＭｒｇｐｒＢ１、Ｂ１０、およびＢ１１をトランスフェクトした細胞は、いかなる収載されている薬物に対しても応答しなかった。
【図６】図６Ａは、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたマウスＭｒｇｐｒＢ２およびヒトＭｒｇｐｒＸ２を活性化させる偽アレルギー反応を誘発する塩基性分泌促進物質および薬物を示す一連の折れ線グラフである。図６Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２およびＧα１５を発現しているＨＥＫ２９３細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。図６Ｂは、ＭｒｇｐｒＸ２およびＧα１５を発現しているＨＥＫ２９３細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例である。物質は、シプロフロキサシンを除いて３０から９０秒の間の期間にわたって灌流させ、シプロフロキサシンは、それが溶解する低ｐＨ溶液への暴露を最小化するために、３０から６０秒の間の期間にわたって灌流させた。インスリンを陰性対照として使用した。図６Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ２およびＭｒｇｐｒＸ２発現ＨＥＫ２９３細胞を活性化させる偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物のＥＣ５０の表である。ＥＣ５０は、３回繰り返した用量応答研究から決定した。データを、平均±ＳＥＭとして表現する。
【図７】図７は、ＢＡＣトランスジェニックマウスの複数の系統が肥満細胞特異的ＭｒｇｐｒＢ２発現を確認することを示す一連の顕微鏡写真である。図７は、２つの他のＢＡＣトランスジェニックマウス系統からの代表的な共焦点画像を示す。ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームにおいてｅＧＦＰ−Ｃｒｅを発現しているＢＡＣマウスを、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスと交尾させ、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色）発現を、肥満細胞のマーカーであるアビジン染色（緑色）と比較した。スケールバーは２０μｍである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ＭｒｇｐｒＢ２が、粘膜肥満細胞においても末梢白血球においても発現されないことを示す。図８Ａは、粘膜肥満細胞を標識するために抗ＭＣＰＴ１（β−キマーゼ）抗体で染色されたＭｒｇｐｒＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来の胃の切片の代表的な画像を示す。白色矢印は、陽性細胞を示す。二重標識された細胞はなかった（２９６のＭｃｐｔ１標識細胞および２７５のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞が計数された、ｎ＝３マウス）。スケールバーは４０μｍである。図８Ｂは、ＭｒｇｐｒＢ２発現細胞（赤色；左画像）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色（青色；右画像）についてｔｄＴｏｍａｔｏで二重標識されたＭｒｇｐｒＢ２−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来の末梢白血球のサイトスピン調製物の代表的な画像を示す。末梢白血球はＭｒｇｐｒＢ２を発現しなかった（ｎ＝３マウス；４０００超の細胞を調査した）。スケールバーは４０μｍである。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスが機能的ノックアウトであることを示す。図９Ａは、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座の中または周囲のゲノム領域の例証である。長い散在要素（ＬＩＮＥ）、短い散在要素（ＳＩＮＥ）および長いタンデム反復（ＬＴＲ）を包含する反復配列は、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子の３’側直後に開始し、加えて、５’側の２．５ｋｂ以内に存在することに留意されたい。ＭｒｇｐｒＢ２の３’端に隣接する５００塩基をクエリーとして使用した２０１４年３月のＢＬＡＳＴＮサーチはマウスゲノムにおいて２６９，０００超のヒットを発見した。図９Ｂは、突然変異体における４塩基対欠失の位置を示すＷＴ（配列番号６２）およびＭＵＴ（配列番号６３）ゲノム配列の比較である。数は、ＭｒｇｐｒＢ２オープン・リーディング・フレームに対応している。図９Ｃは、突然変異株が確立された後に生後１８か月のマウスから試料採取されたＷＴ（配列番号６４）およびＭＵＴ（配列番号６５）  ｃＤＮＡのシークエンシング結果である。突然変異体における欠落している塩基は赤色で強調表示されている。図９Ｄは、欠失が、第一の膜貫通領域の後まもなくフレームシフト突然変異および早期終止コドン（＊）を作成することを明らかにする、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴオープン・リーディング・フレームのアミノ酸翻訳である（それぞれ出現順に、配列番号６６及び配列番号６７）。Ｍｕｔ−フレームシフト欠失の部位。ＴＭ１−膜貫通領域１。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、肥満細胞数ならびに気管および皮膚組織のヒスタミン含有量が、野生型およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ動物の間で異なっていなかったことを示す、一連の顕微鏡写真および棒チャートである。図１０Ａ（上）は、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスにおけるアビジン染色の代表的な写真を示す。スケールバーは４０μｍである。図１０Ａ（下）は、種々の組織における肥満細胞数の定量化を示す。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、差異は有意ではなかった（各遺伝子型についてｎ＝３マウス；有毛および無毛皮膚では各遺伝子型についてそれぞれ３０００μｍ２および１０００μｍ２を上回って計数された；１０，０００を上回る腹腔細胞が計数された）。図１０Ｂは、気管ヒスタミン含有量がそれぞれ平均５．９±０．９および５．５±１．６ｎｇ／ｍｇ（各遺伝子型についてｎ＝５）であり、皮膚ヒスタミン含有量がそれぞれ平均３０．８±３．２および３０．２±４．０ｎｇ／ｍｇ（各遺伝子型についてｎ＝８）であったことを示す。差異は有意ではなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、それぞれ、一連の顕微鏡写真、折れ線グラフおよび棒チャートであり、これらは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴおよび野生型肥満細胞におけるＥＴＡ  ＧＰＣＲ１に誘発された同程度の活性化を介して作用するエンドセリンを示す。図１１Ａは、エンドセリン（１μＭ）の浴適用によって誘発されたＦｌｕｏ−４イメージングによってアッセイした際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すマウス腹膜肥満細胞の代表的なヒートマップ画像を示す。スケールバーは１０μｍである。図１１Ｂは、ＷＴ（赤色線）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（黒色線）について［Ｃａ２＋］ｉイメージングトレースの平均を示す。［Ｃａ２＋］ｉトレースは、ＷＴおよびＭＵＴ群間で同様である。トレースを、図２Ａについて記述されている通りに平均化した。図１１Ｃは、応答している細胞のパーセンテージの定量化を示す。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した（各遺伝子型についてｎ＝３；各遺伝子型について１８０を上回る細胞が計数された）。エンドセリン誘発性応答は、有意に異なっていなかった。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＩｇＥ媒介性炎症が、野生型およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴマウスの間で異なっていないことを示す。図１２Ａは、抗ＩｇＥ抗体（右、矢印、１００μｇ／ｍｌ、生理食塩水中７μｌ）または生理食塩水（左）の足底内注射の１５分後のエバンスブルー溢出の代表的な画像を示す。図１２Ｂは、１５分後の足へのエバンスブルー漏出の定量化を示す（ＷＴについてはｎ＝６、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴについてはｎ＝７）。抗ＩｇＥ抗体（ｐ＝０．４９）および生理食塩水（ｐ＝０．２３）注射後の差異は、有意ではなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定した。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄおよび図１３Ｅは、ＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ肥満細胞が、塩基性分泌促進物質および種々の治療薬に対して不応性であることを示す。図１３Ａは、図２Ｅからの塩基性分泌促進物質によって誘発されたＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定した際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１３Ｂは、イカチバント（５０μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す。図９Ｃは、選択されたＦＤＡ承認カチオン性ペプチド作動薬によって誘発された、ＷＴおよびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ腹膜肥満細胞から、Ｆｌｕｏ−４イメージングによって測定された際の、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示すトレース例を示す。各トレースは、独自の細胞からの応答である。図１３Ｄは、アトラクリウム（５０μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す一連の顕微鏡写真および折れ線グラフである。図１３Ｅは、シプロフロキサシン（２００μｇ／ｍｌ）の適用中のＷＴ（上）およびＭｒｇｐｒＢ２ＭＵＴ（下）培養腹膜肥満細胞からの代表的なＦｌｕｏ−４画像（左）および蛍光トレース（右）を示す一連の顕微鏡写真および折れ線グラフである。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ヒト肥満細胞が、ＭｒｇｐｒＸ２依存性様式で偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物によって活性化されることを示す一連の棒チャートである。図１４ＡのヒトＬＡＤ２肥満細胞を、異なる濃度の、化合物４８／８０、マストパラン、イカチバント、アトラクリウムおよびシプロフロキサシンで処理した。これらの物質に応答した肥満細胞の活性化は、β−ヘキソサミニダーゼ、ＴＮＦ、ＰＧＤ２およびヒスタミンの放出を特徴とする。加えて、ビオチンコンジュゲートヒトＩｇＥ感作ＬＡＤ２細胞の０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン刺激は、未処理細胞（４．１±０．３％放出）と比較して強固なβ−ヘキソサミニダーゼの放出（７１．３±１．８％放出）を引き起こした。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。図１４Ｂは、ヒトＭｒｇｐｒＸ２のノックダウンが、ＩｇＥによってではなく、偽アレルギー反応に関連する塩基性分泌促進物質および薬物によって引き起こされた肥満細胞活性化を、有意に低減させたことを示す。ヒトＬＡＤ２肥満細胞に、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡを最初にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、化合物４８／８０（０．１μｇ／ｍｌ）、マストパラン（５μｇ／ｍｌ）、イカチバント（１０μｇ／ｍｌ）、アトラクリウム（２５μｇ／ｍｌ）およびシプロフロキサシン（７５μｇ／ｍｌ）で処理した。β−ヘキソサミニダーゼの放出を特徴とするこれらの物質に応答した肥満細胞の活性化は、対照群における放出と比較して、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡ処理細胞において有意に低減された。ＩｇＥ媒介性肥満細胞脱顆粒は、ＭｒｇｐｒＸ２  ｓｉＲＮＡノックダウンによって影響を受けなかった。グループデータを、平均±標準誤差として表現する。両側不対スチューデントｔ検定を使用して、統計的比較における有意性を決定し、差異を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５で有意とみなした（実験を３回繰り返した）。
【図１５】図１５は、５０未満のアミノ酸のすべてのＦＤＡ承認治療薬の表である。電荷はケムアクソンによって算出した。セトロレリクス、ガニレリクスおよびオクトレオチドについてのＩＳＲデータは、下記の参考文献からである：参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ９０，５５２−５５９（２００３）；Ｆｌｕｋｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ７５，３８−４５（２００１）；およびＴｕｖｉａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ９７，２３６２−２３６９，（２０１２）。すべての他の情報は、ＦＤＡによって供給された。
【図１６】図１６は、すべてのクラスのＦＤＡ承認神経筋遮断薬（ＮＭＢＤ）および代表的なメンバーを収載するチャートである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
プライマーは次の通りであった。ＭｒｇｐｒＡ１（ａｔｃｃａｇｃａａｇａｇｇａａｔｇｇｇｇ（配列番号：９）については、ｒｅｖ  ｔｇｔｇａｃｃｔａｇｇａｇｇａａｇａａｇａａｇ（配列番号：１０））；ＭｒｇｐｒＡ２（ｃｃｔｃｃｔａｃａｃａａｇｃｃａｇｃａａ（配列番号：１１）については、ｒｅｖ  ａａｇｃａｃａａｇｔｇａａａｇａｔｇａｔｇｃｔ（配列番号：１２））；ＭｒｇｐｒＡ３（ｇｃｔａｃａｔｃｃａｇｃａａｇａｇｇａａｔｇ（配列番号：１３）については、ｒｅｖ  ｇｃａａａａａｔｔｃｃｔｔｔｇｇｇｔａｇｇｇｔ（配列番号：１４））；ＭｒｇｐｒＡ４（ｃｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｔｇａｔｃｔｇｇｔ（配列番号：１５）については、ｒｅｖ  ｔｃａｃｇｇｔｔａａｔｃｃａｇｇｇｃａｃ（配列番号：１６））；ＭｒｇｐｒＡ６（ｃａｔｔｔｔｃｃｔｃｃｃｃｃａａｃａｇｔ（配列番号：１７）については、ｒｅｖ  ａｔｇｃｃｔｇａａｔｇａｇｃｃｃａｃａａ（配列番号：１８））；ＭｒｇｐｒＡ９（ｃａｇｔｇａｔｃｔａｃａｔｃｃａｇｃａａａａｇｇ（配列番号：１９）については、ｒｅｖ  ｇｃｇｔｇｇａａｇｃｔａｔｇａｔｇｃｇａ（配列番号：２０））；ＭｒｇｐｒＡ１０（ｃａｇｔｇｇｔｃｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａ（配列番号：２１）については、ｒｅｖ  ａｃａｇｇｃａａｇａｇａｇｔｃａｔｇｇｔｔ（配列番号：２２））；ＭｒｇｐｒＡ１２（ｔｃａｇｇｇａｔｃｇｇｇｔｇａａｇｃａｃ（配列番号：２３）については、ｒｅｖ  ｇａｇｃａｔｔｔｇａａｇｇｔｇｔｔｇｔｔｇｇａ（配列番号：２４））；ＭｒｇｐｒＡ１４（ｇｇｔｔｇｃｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ（配列番号：２５）については、ｒｅｖ  ｔａｔｔｇｃｃａｇｔｃａｇｔａａｇｃｔｇａｇ（配列番号：２６））；ＭｒｇｐｒＡ１６（ｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃｃａｔｔａｃｔ（配列番号：２７）については、ｒｅｖ  ｇｔｔｔｔｔｇｇａｃｃａｃｔｇａｇｇｃａｔｔ（配列番号：２８））；ＭｒｇｐｒＡ１８（ｔｇｃｔｃｔｇｇｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔｔｇｃ（配列番号：２９）については、ｒｅｖ  ｔｇａｇｇｃａｔｇｔｃａａｇｔｃａｇｔｃａ（配列番号：３０））；ＭｒｇｐｒＡ１９（ｃａｇｇａｃｃｃａｇａｔｃａｃｇａｃａｃ（配列番号：３１）については、ｔｃｃｔｇｇｇｃｔｔｃｃｇａｔｔｔｃａｃ（配列番号：３２））；ＭｒｇｐｒＢ１（ａｔｔａｇｃｃｔｔｃａｔｃａｇｇｃａｃｃａ（配列番号：３３）については、ｃｃａｇｃｃｃａａｃｔａａｇｇｃａａｔｇ（配列番号：３４））；ＭｒｇｐｒＢ２（ｇｔｃａｃａｇａｃｃａｇｔｔｔａａｃａｃｔｔｃｃ（配列番号：３５）については、ｃａｇｃｃａｔａｇｃｃａｇｇｔｔｇａｇａａ（配列番号：３６））；ＭｒｇｐｒＢ３（ａｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｔ（配列番号：３７）については、ｒｅｖ  ｇｃｔｇａａｃｃｃａｃａｇａｇａａｃｃａ（配列番号：５８））；ＭｒｇｐｒＢ４（ｔｃｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｔ（配列番号：３８）については、ｒｅｖ  ａｃｃａｃｇａｇｇｃｔｃａａｃａａｔａｇａ（配列番号：３９））；ＭｒｇｐｒＢ５（ｃｔｇｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｃｃａ（配列番号：４０）については、ｒｅｖ  ｔｔｔｃｃａｇｔｔｃｃｃｃａｇａｃｃｔｔｔ（配列番号：４１））；��ｒｇｐｒＢ６（ｔｃｔｇｔｃｔａｃａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇ（配列番号：４２））については、ｒｅｖ  ａｔｔａｔｃｔｃａｔｇａｇｇａａｇｇｃｔｃａａ（配列番号：４３））；ＭｒｇｐｒＢ８（ａｇａｇａａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃｇａ（配列番号：４４）については、ｒｅｖ  ｇａｇｇａａｇｔｔｔｇｃｃｃｃａｇａｃａ（配列番号：４５））；ＭｒｇｐｒＢ１０（ｃａｃｔｇｇｔｃａｃａｔｔｇｃｃａａｃｃ（配列番号：４６については、ｒｅｖ  ｇｇｇｇａｔｇｇａａｔｃａａｔｇｔｃｃａａｇａ（配列番号：４７）；ＭｒｇｐｒＢ１１（ａｃｃｔｔｃｔｔｇｃｔａｔｔｔｔｔｃｃｃｔｃｃａ（配列番号：４８）については、ｒｅｖ  ａｇｇａｔｇａｇａｃｔｇｇａｃｃｃａｃａ（配列番号：４９））；ＭｒｇｐｒＣ１１（ｃａｇｃａｃａａｇｔｃａｇｃｔｃｃｔｃａａ（配列番号：５０）については、ｒｅｖ  ａｔｇｃｃｃａｔｇａｇａａａｇｇａｃａｇａａｃｃ（配列番号：５１））。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
発現構築物
Ｍｒｇｐｒ遺伝子をクローン化し、標準的な技術を使用してｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現プラスミドに挿入した。すべてのマウス遺伝子は、それらのＮ末端にコザック配列を有しており、また、アミノ酸リンカーＤＩＩＬによって遺伝子から分離されたＣ末端ＦＬＡＧタグをコードしていた（配列番号５９）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
ＢＡＣトランスジェニックマウス生成
ＢＡＣクローンＲＰ２３−６５Ｉ２３は、小児病院オークランド研究所から購入した。このクローンは、ＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座、約６０ｋｂの５’ゲノム配列および１００ｋｂを上回る３’ゲノム配列を含有する。細菌における組換え工学（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して、ＭｒｇｐｒＢ２開始コドンの直後にｅＧＦＰ−ＣｒｅおよびポリＡシグナルを導入した（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｂａｒａｍ，Ｄ．＆  Ｍｅｋｏｒｉ，Ｙ．Ａ．Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７７，１０３３−１０７９（１９９７））。ＢＡＣをＮｏｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ）で線状化し、単細胞受精Ｃ５７Ｂｌ／６卵から前核に注射した。卵を偽妊娠の雌に移植した。３つのＢＡＣマウス系統が確立された。マウスは既にＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドであったが、少なくとも４世代にわたって交配して、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＷＴおよびｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスとした後、実験に使用した。ＢＡＣマウスを、イメージング研究のためにジャクソン研究所から購入したＲＯＳＡ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏマウスと交尾させた。図１の実験では、ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが、多くの場合、異種であり、ヘテロ接合マウスにおいては弱いことから、ＲＯＳＡ２６Ｔｄｔｏｍａｔｏについてホモ接合のマウスを使用した。ＢＡＣマウスについての遺伝子型判定反応は、６１℃アニーリングで実行し、プライマーは、フォワード、ｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａ（配列番号６０）；リバース、ｃａｇａｃｃｇｃｇｃｇｃｃｔｇａａｇａ（配列番号６１）であった。いずれのプライマーもｅＧＦＰ−Ｃｒｅリーディングフレーム内にあるが、遺伝子全体およびＭｒｇｐｒＢ２遺伝子座における正しい配置を、事前のシークエンシングによって検証した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017524382000001.app