【手続補正書】
【提出日】平成29年6月5日(2017.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィン遺伝子と結合する、Cas9及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含むDNAターゲティング系。
【請求項２】
前記少なくとも1つのgRNAがジストロフィン遺伝子のイントロン又はジストロフィン遺伝子のエクソンを標的とする、請求項１に記載のDNAターゲティング系。
【請求項３】
前記少なくとも1つのガイドRNAが、配列番号:5-40、65-144、492-515、540-563及び585-625の少なくとも1つを含む、請求項１又は２に記載のDNAターゲティング系。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の離ポリヌクレオチド又は請求項５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７】
その必要がある変異ジストロフィン遺伝子保有対象動物を治療するための組成物であって、請求項１から３のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項５に記載のベクターを含む、前記組成物。
【請求項８】
対象動物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを罹患する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
細胞で変異ジストロフィン遺伝子を修正するための組成物であって、請求項１から３のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、又は請求項６に記載の細胞を含む、前記組成物。
【請求項１０】
変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン、遺伝子欠損により破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、又は異常なスプライスドナー部位を含み、標的領域が、前記未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位又は異常なスプライスドナー部位の上流又は下流に存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
変異ジストロフィン遺伝子の修正が相同性指向修繕を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
さらにドナーDNAを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン及び切端遺伝子生成物を生じさせるフレームシフト変異を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
変異ジストロフィン遺伝子の修正がヌクレアーゼ媒介非相同性末端接合を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
変異ジストロフィン遺伝子の修正が、未成熟終止コドンの欠失、破壊されたリーディングフレームの修正、又はスプライスアクセプター部位の破壊若しくはスプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調整を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
変異ジストロフィン遺伝子の修正がエクソン45-55又はエクソン51の欠失を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
対象動物の筋肉でゲノム編集する組成物であって、改変されたアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター及び請求項１から３のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系をコードするヌクレオチド配列を含み、該筋肉が骨格筋又は心筋である、前記組成物。
【請求項１８】
改変AAVベクターが心筋及び骨格筋組織向性が強化されてある、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
対象動物の筋肉でゲノム編集する、対象動物を治療する、又は対象動物で変異遺伝子を修正するための、請求項１７に記載の組成物であって、前記筋肉が骨格筋又は心筋である、前記組成物。
【請求項２０】
対象動物が骨格筋の症状又は遺伝子疾患を罹患する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
対象動物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを罹患する、請求項２０に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】RNAガイドiCas9-VP64によるヒトIL1RN遺伝子の活性化を示す。（a、b）不活化Cas9（iCas9, D10A/H840A）をVP64トランス活性化ドメインに融合させて、RNAガイド転写アクチベーターを作製した。iCas9-VP64は、ガイドRNA（gRNA）と20bpの標的配列とのハイブリダイゼーションを介してゲノムの標的部位を認識する。（c）IL1RNプロモーター中の配列を標的とする4つのgRNA又はcrRNA/tracrRNAのための発現プラスミドを、iCas9-VP64発現プラスミドとともにHEK293T細胞にコトランスフェクトした。IL1RN発現の活性化は、qRT-PCRによって判定した。（d）4つのgRNA発現プラスミドをiCas9-VP64と個々に又は一緒にしてコトランスフェクトした。旺盛な遺伝子活性化は、一緒にしたgRNAに対する応答でのみqRT-PCRで観察された。（e）IL1RN発現の活性化は、培養液へのIL-1ra遺伝子生成物の分泌をELISAで判定することによって確認された。IL-1raは、一緒にしたgRNAで処置した6つのサンプルの3つでのみ検出された。（c−e）については、データは平均±s.e.m.として示される（n＝3つの独立した実験）。一緒にしたgRNAによる処置は、チューキー（Tukey）検定によって他のすべての処置と統計的に相違した（*Pは0.02以下）。（f）RNA-seqを空発現ベクター処理サンプル（n＝2）又はIL1RNを標的とするiCas9-VP64及び4つのgRNAのための発現プラスミドでコトランスフェクトしたサンプル（n＝2）で実施した。これらの処置間における遺伝子発現の唯一の統計的に有意な変化は、4つのIL1RNアイソフォーム（偽発見率は3ｘ10-4以下）における増加及びIL32における減少（偽発見率＝0.03）であった。
【図２】細胞及び遺伝子療法、遺伝子再プログラミング、並びに再生医療と関連するヒト遺伝子のRNAガイド活性化を示す。HEK293T細胞にiCas9-VP64発現プラスミド及び4つのgRNAを個々に又は一緒にしてトランスフェクトした。標的遺伝子発現をqRT-PCRで測定し、GAPDH mRNAレベルで標準化した。データは平均±s.e.m.として示される（n＝3つの独立した実験）。一緒にしたgRNAによる処置は、チューキー検定によって他のすべての処置と統計的に相違した（*P＜0.05）。
【図３】iCas9-VP64の発現を示す。トランスフェクトされたHEK293細胞でのiCas9-VP64の発現は、N-末端Flagエピトープタグに対するウェスタンブロットによって確認した。wtCas9発現プラスミドはエピトープタグを含まない。
【図４−１】ヒト標的遺伝子のgRNA標的部位及びDNAse高感受性の位置を示す。各遺伝子座に対する4つのgRNA標的部位は上記各遺伝子のカスタムトラックとして示され、DNAse高感受性オープンクロマチン領域を示すDNase-seqデータは下記各遺伝子で示される。DNase-seqは、以前の記載のように（Song et al., Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5384, 2010；Song et al. Genome Res 21, 1757-1767, 2011）、HEK293T細胞で実施してDNase高感受性領域を同定した。結果は、オープンクロマチンはgRNAとiCas9-VP64との組み合わせによる遺伝子活性化のための要件ではないことを示している。
【図４−２】ヒト標的遺伝子のgRNA標的部位及びDNAse高感受性の位置を示す。各遺伝子座に対する4つのgRNA標的部位は上記各遺伝子のカスタムトラックとして示され、DNAse高感受性オープンクロマチン領域を示すDNase-seqデータは下記各遺伝子で示される。DNase-seqは、以前の記載のように（Song et al., Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5384, 2010；Song et al. Genome Res 21, 1757-1767, 2011）、HEK293T細胞で実施してDNase高感受性領域を同定した。結果は、オープンクロマチンはgRNAとiCas9-VP64との組み合わせによる遺伝子活性化のための要件ではないことを示している。
【図４−３】ヒト標的遺伝子のgRNA標的部位及びDNAse高感受性の位置を示す。各遺伝子座に対する4つのgRNA標的部位は上記各遺伝子のカスタムトラックとして示され、DNAse高感受性オープンクロマチン領域を示すDNase-seqデータは下記各遺伝子で示される。DNase-seqは、以前の記載のように（Song et al., Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5384, 2010；Song et al. Genome Res 21, 1757-1767, 2011）、HEK293T細胞で実施してDNase高感受性領域を同定した。結果は、オープンクロマチンはgRNAとiCas9-VP64との組み合わせによる遺伝子活性化のための要件ではないことを示している。
【図４−４】ヒト標的遺伝子のgRNA標的部位及びDNAse高感受性の位置を示す。各遺伝子座に対する4つのgRNA標的部位は上記各遺伝子のカスタムトラックとして示され、DNAse高感受性オープンクロマチン領域を示すDNase-seqデータは下記各遺伝子で示される。DNase-seqは、以前の記載のように（Song et al., Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5384, 2010；Song et al. Genome Res 21, 1757-1767, 2011）、HEK293T細胞で実施してDNase高感受性領域を同定した。結果は、オープンクロマチンはgRNAとiCas9-VP64との組み合わせによる遺伝子活性化のための要件ではないことを示している。
【図５】iCas9-VP64によるヌクレアーゼ活性は存在しないことを示す。野生型Cas9又は不活化(D10A、H840A)iCas9-VP64発現プラスミドを、IL1RNプロモーターを標的とする4つの異なるガイドRNAのための発現プラスミドとともにコトランスフェクトした。ヌクレアーゼ活性はサーベイヤーアッセイによって決定した（Guschin et al., Methods Mol Biol 649, 247-256, 2010）。ヌクレアーゼ活性の指標である低分子量バンド及び非相同性末端接合によるDNA修繕は野生型Cas9による処置後でのみ存在し、iCas9-VP64によるヌクレアーゼ活性の停止を支持した。
【図６】HBG1及びHBG2を標的とするgRNAで処置されたサンプルについてのRNA-seqを示す。RNA-seqは、コントロール空発現ベクターで処置したサンプル（n＝3）、又はiCas9-VP64及びHBG1を標的とする4つのgRNAのための発現プラスミドをコトランスフェクトしたサンプル（n＝2）で実施した。これらgRNAの3つはまたHBG2を標的とした。コントロールに対してHBG1及びHBG2の両方で増加が観察されたが、低い発現レベルのために統計的には有意ではなかった。これら処置間における遺伝子発現の唯一の統計的に有意な変化は、IL32（偽発見率＝0.0007）及びTNFRS9（偽発見率＝0.002）における減少であった。
【図７】iCas9-VP64によるAscl1及びγ-グロビンのアップレギュレーションを示す。HEK293T細胞にiCas9-VP64及びASCL1又はHBG1プロモーターを標的とする4つのgRNAをトランスフェクトした。対応するAscl1及びγ-グロビンタンパク質レベルをウェスタンブロットで判定した。これらのタンパク質の低レベルがHEK293T細胞で検出でき、発現増加は2つの別個の実験でiCas9-VP64処置後に検出できた。
【図８−１】iCas9-VP64で処置したネズミ胚線維芽細胞におけるAscl1の下流標的の活性化を示す。マウス胚線維芽細胞（MEF）にコントロールGFP発現プラスミド又はiCas9-VP64発現プラスミド及びASCL1を標的とする4つのgRNA発現プラスミドを50：50又は75：25の比率でトランスフェクトした。（a）ヒトASCL1プロモーター（配列番号:3）のgRNA標的部位はマウスASCL1プロモーター（配列番号:4）で保存されている。標的部位は実線で示され、転写領域は点線で示される。
【図８−２】iCas9-VP64で処置したネズミ胚線維芽細胞におけるAscl1の下流標的の活性化を示す。マウス胚線維芽細胞（MEF）にコントロールGFP発現プラスミド又はiCas9-VP64発現プラスミド及びASCL1を標的とする4つのgRNA発現プラスミドを50：50又は75：25の比率でトランスフェクトした。（b）MEFにおけるASCL1発現は、qRT-PCRで決定したときiCas9-VP64/gRNA処置後2日で増加した。（c−h）神経誘導培地で10日後に、細胞をAscl1及びTuj1（ニューロン分化の初期マーカー）のために（c−d）、又はTuj1及びMAP２（より成熟したニューロン分化のマーカー）のために（d−f）染色した。いくつかのTuj1陽性細胞はニューロンの形態をとり（f−g）、単独細胞はTuj1及びMAP2陽性であることが見出された（g）。（h）Tuj1陽性細胞はiCas9-VP64/gRNA処置培養で容易に特定されたが（〜0.05％）、コントロールには存在しなかった。n＝3つの独立実験でデータは平均±平均の標準誤差として示される。gRNA 75/25は、gRNA 50/50及びコントロールと有意に相違した（*P＜0.01、チューキー検定）。
【図９Ａ】（a）iCas9-VP64タンパク質配列（配列番号:1）を示す。
【図９Ｂ】（b）U6プロモーターを有するgRNA発現カセットの配列（配列番号:2）を示す。
【図１０−１】qRT-PCRのための標準曲線を示す。各遺伝子について、最高の発現レベルを有する実験サンプルを標準曲線の作成のために希釈した。前記標準曲線を適切な動的範囲にわたって効率的な増幅を担保するためにqRT-PCRによってアッセイした。全増幅反応の効率は90−115％であった。
【図１０−２】qRT-PCRのための標準曲線を示す。各遺伝子について、最高の発現レベルを有する実験サンプルを標準曲線の作成のために希釈した。前記標準曲線を適切な動的範囲にわたって効率的な増幅を担保するためにqRT-PCRによってアッセイした。全増幅反応の効率は90−115％であった。
【図１１】図11(a)−11(b)はRNAガイド修繕の有効性を示す。図11(a)は、空ベクター（陰性コントロール）又はgRNAとともにCas9を細胞にコトランスフェクトしてから2日後に当該HEK293T細胞から採集したゲノムDNAのサーベイヤーアッセイの結果を示す。図11(b)はgRNA標的の位置を示す。図11(c)は各gRNAについて予想される切断サイズを示す。
【図１２】サーベイヤーアッセイによって示されるDMD8036(del48-50)細胞におけるRNAガイド修繕を示す。
【図１３】全遺伝子座にわたってPCRによって示されるDMD8036(del48-50)細胞におけるRNAガイド修繕を示す。野生型ジストロフィン遺伝子のPCRはサイズが1447bpのフラグメントを生じるが、DMD8036細胞株の変異遺伝子のPCRは約817bpの欠失を示す。CRISPR/Cas9依拠系の導入後の欠失バンドは約630bpであった。
【図１４】ウェスタンブロット（MANDYS8（抗ジストロフィン抗体）及びGAPDH抗体（陽性コントロール）を使用）によって示されるDMD8036(del48-50)細胞におけるRNAガイド修繕を示す。
【図１５】IL1RNプロモーターを標的とするiCas9-VP64の特異的結合を示すChIP配列決定データを示す。HEK293T細胞にIL1RNプロモーターを標的とするiCas9-VP64がトランスフェクトされた。
【図１６】ジストロフィン遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9を示す。（A）遺伝子編集が極めて多様な患者特異的変異から生じるジストロフィン発現を修復できるように、ジストロフィン遺伝子のエクソン45-55の変異ホットスポット領域中の配列と結合するsgRNA配列が設計された。イントロン内の矢印は、ゲノムから全エクソンを欠失させるために設計されたsgRNA標的を示す。エクソン内の矢印は、ジストロフィン遺伝子内に標的となるフレームシフトを作成するために設計されたsgRNA標的を示す。（B）CR3 sgRNAを用いるエクソン51のNHEJ DNA修繕による小さな挿入又は欠失に続くフレーム修正の例。（C）エクソン48−50の欠失を有する患者変異で、エクソン51を欠失させジストロフィンリーディングフレームを修復するために設計された複合sgRNA標的の模式図。（D）多様なDMD患者変異に対応できるように、全エクソン45-55領域を欠失させるために設計された複合sgRNA標的の模式図。
【図１７】表7の3日目遺伝子改変を測定するサーベイヤーアッセイの結果の定量に用いられるTBE-PAGEゲル像を示す。星印は、ヌクレアーゼ活性の指標となる予想バンドサイズを示す。
【図１８】表7の10日目遺伝子改変を測定するサーベイヤーアッセイの結果の定量に用いられるTBE-PAGEゲル像を示す。星印は、ヌクレアーゼ活性の指標となる予想バンドサイズを示す。
【図１９】遺伝的に改変されたDMD筋芽細胞を濃縮する蛍光活性化フロー選別を示す。（A）T2Aリボソームスキッピングペプチド配列を用いてGFPマーカーに連結されたヒトコドン最適化SpCas9タンパク質を発現するプラスミドを、sgRNA発現カセットを保持する1つ以上のプラスミドとともにヒトDMD筋芽細胞にコエレクトロポレートした。（B）表示のsgRNAを別個に、T2Aリボソームスキッピングペプチド配列によってSpCas9に連結されたGFPを有するSpCas9（下）又は前記のないSpCas9（上）を発現する別々のプラスミドとともにHEK239Tにコトランスフェクトした。遺伝子改変頻度をトランスフェクション3日後にサーベイヤーアッセイによって判定した。（C）ジストロフィン遺伝子のエクソン48-45の欠失を有するDMD筋芽細胞を、これらの患者細胞でジストロフィンリーディングフレームを修正するsgRNAで処置した。遺伝子改変は、エレクトロポレーション20日後に非選別（bulk）又はGFP＋選別細胞で判定した。（D）表示の発現プラスミドによるエレクトロポレーション3日後のDMD筋芽細胞におけるGFPの発現。トランスフェクション効率及び選別細胞集団はゲート領域で示される。
【図２０】CRISPR/Cas9を用いてジストロフィンのリーディングフレームを修復する標的のフレームシフトを示す。（A）エクソン51の5’領域が、sgRNA CR3（最初のアウトフレーム（out-of-frame）終止コドンの直近上流と結合する）を用いて標的とされた。PAM：プロトスペーサー隣接モチーフ。（B）エクソン51遺伝子座を、SpCas9及びCR3発現カセットで処理したHEK293T細胞からPCR増幅した。個々のクローンの配列をサンガーシークェンシングで決定した。一番上の配列（太字、エクソンは赤色）は天然の未改変配列である。各配列のクローンの数は括弧内に示されている。（C）全遺伝子編集効率及び（B）に示した遺伝子改変から生じるリーディングフレーム変換の要旨。（D）ジストロフィンリーディングフレームを修復する標的誘導フレームシフトを生じるSpCas9及びCR3 sgRNA発現カセット（図19C）で処理されたヒトDMD筋芽細胞でのジストロフィン発現についてのウェスタンブロット。ジストロフィン発現は、分化6日後にジストロフィンタンパク質のロッドドメインに対する抗体を用いて精査した。
【図２１】複合CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたヒトゲノムのエクソン51の欠失を示す。（A）エクソン48-50の欠失を有するヒトDMD筋芽細胞におけるエクソン51全体のエンドポイントゲノムPCR。一番上の矢印は完全長PCRアンプリコンの予想される位置を示し、下の2つの矢印は、表示のsgRNAの組み合わせによって生じる欠失を有するPCRアンプリコンの予想される位置を示す。（B）（A）のPCR生成物をクローニングし、個々のクローンの配列を決定して標的遺伝子座に存在する挿入及び欠失を決定した。一番上の列は野生型の未改変配列を示し、三角はSpCas9切断部位を示す。右側には予想される欠失連結配列を示す代表的なクロマトグラフィー図である。（C）表示のsgRNAで処理したCRISPR/Cas9改変ヒトΔ48-50 DMD筋芽細胞におけるジストロフィンmRNA転写物のエンドポイントRT-PCR分析である。予想される欠失PCR生成物の代表的なクロマトグラフィー図が右に示される。星印：欠失生成物鎖と未改変鎖とのハイブリダイゼーションから生じるバンド。（D）CRISPR/Cas9ゲノム編集によるジストロフィンタンパク質発現の回復が、ジストロフィンタンパク質に対するウェスタンブロット（ローディングコントロールとしてGAPDHを使用）によって判定された。矢印は予想される修復ジストロフィンタンパク質バンドを示す。
【図２２】複合CRISPR/Cas9遺伝子編集によるヒトDMD筋芽細胞における完全なエクソン45-55領域の欠失を示す。（A）表示のsgRNAによるHEK293T又はDMD筋芽細胞処理後のイントロン44とイントロン55の間の領域を検出する、ゲノムDNAのエンドポイントゲノムPCR。（B）（A）のDMD筋芽細胞由来の欠失のために予想されるサイズをもつPCR生成物の個々のクローンをサンガーシークェンシングで分析し、標的遺伝子座に存在するゲノムの欠失をもつ配列を決定した。下部は、予想される欠失連結配列を示す代表的なクロマトグラフィー図である。（C）表示のsgRNAで処理したCRISPR/Cas9改変ヒトΔ48-50 DMD筋芽細胞のジストロフィンmRNA転写物のエンドポイントRT-PCR分析。予想される欠失PCR生成物の代表的なクロマトグラフィー図は右に示されている。（D）イントロン44及び/又はイントロン55を標的とするsgRNAによるDMD筋芽細胞のエレクトロポレーション後のウェスタンブロットによる修復ジストロフィンタンパク質発現の分析。
【図２３】in vivo細胞移植実験で使用される遺伝子改変DMD筋芽細胞のフローサイトメトリーによる濃縮の証明を示す。DMD筋芽細胞をCR1及びCR5のためのsgRNA発現ベクターの存在下又は非存在下でCas9により処理し、フローサイトメトリーでGFP+細胞を選別した。エクソン51遺伝子座における欠失は該遺伝子座にフランキングするプライマーを用いてエンドポイントPCRによって検出した。Neg ctrl：DMD筋芽細胞をCas9のみで処理しGFP+細胞について選別した。
【図２４】CRISPR/Cas9処理ヒトDMD筋芽細胞の免疫不全マウスへの移植後に修復されたヒトジストロフィン発現を示す。ヒトΔ48-50DMD筋芽細胞をSpCas9、CR1及びCR5で処理しエクソン51を欠失させ、図19に示すようにGFP発現について選別した。これらの選別細胞及び未処理コントロール細胞を免疫不全マウスの後肢に注射し、移植から4週間後に筋肉線維におけるヒト特異的タンパク質発現について判定した。凍結切片を、表示のように抗ヒトスペクトリン（スペクトリンはマウス筋線維と融合した未修正及び修正筋芽細胞の両方で発現される）又は抗ヒトジストロフィン抗体で染色した。白い矢印はヒトジストロフィン陽性の筋肉線維を示す。
【図２５】ヒトジストロフィン発現を精査したさらに別の免疫蛍光像を示す。抗ヒトスペクトリンで染色した連続切片は上部左に示される。（A−C）未処理ヒトDMD筋芽細胞を注射した筋肉の切片。（D−F）フローサイトメトリーで濃縮したCR1/5処理ヒトDMD筋芽細胞注射筋肉の切片。白い矢印はジストロフィン陽性線維を示す。
【図２６】ヒト細胞におけるCRISPR/Cas9毒性及びエクソン51のCR1/CR5媒介欠失のオフターゲット作用の評価を示す。（A）ヒト最適化SpCas9及び表示のsgRNA構築物で処理したHEK293T細胞における細胞傷害性アッセイの結果。細胞傷害性は、表示のヌクレアーゼをコトランスフェクトされるGFP陽性細胞の生存を基準とする。I-SceIは特徴がよく調べられている非毒性メガヌクレアーゼであり、GZF3は公知の有毒なジンクフィンガーヌクレアーゼである。（B）Cas9及び表示のsgRNAをコードする発現カセットで処理された選別hDMD細胞におけるオフターゲット部位のサーベイヤー分析。hDMD細胞で試験したこれらの3つのオフターゲット部位は、HEK293T細胞で試験した50の予想部位のパネル（図27及び表4）から特定された。TGT：表示のsgRNAのオンターゲット遺伝子座。OT：オフターゲット遺伝子座。（C,D）Ca9及びCR1で処理したHEK293T細胞（C）又はCas9、CR1及びCR5で処理した選別hDMD細胞（D）で染色体転座を検出するエンドポイントネステッドPCR。模式図は、各転座事象のためにカスタマイズされたネステッドプライマー対の相対的な位置を示す。各バンドの予想されるサイズは、プライマーサイズ及び各遺伝子座における予想されるsgRNA切断部位の位置を基準に概算した。星印は予想サイズで検出されたバンドを示す。（C）のバンドの特定は各末端のサンガーシークェンシングによって立証した（図30）。HEK293T細胞のP2/P5転座の代表的なクロマトグラフィー図が示されている。
【図２７】表4のオンターゲット及びオフターゲット遺伝子改変を測定するためにサーベイヤーアッセイの結果の定量に用いられるTBE-PAGEゲル像を示す。星印はヌクレアーゼ活性の指標であるバンドの予想サイズを示す。
【図２８】ヒト細胞でCR3及びCR6/CR36に対してCRISPR/Cas9オフターゲット活性によってもたらされる染色体転座を検出するエンドポイントネステッドPCRを示す。ネステッドエンドポイントPCR分析を用いて、（A）表示のようにCas9及びCR3で処理したHEK239T又は選別hDMD細胞、（B）Cas9及びCR36単独で処理したHEK293T細胞、又は（C）Cas9、CR6及びCR36発現カセットで処理した選別hDMD細胞で転座を検出した。転座のための第二のネステッドPCR反応は、特異性を最大にするために各々予想される転座遺伝子座に対するカスタムプライマーを用いて増幅させた（表4参照）。模式図は、転座の存在について精査するために用いられるネステッドプライマー対の相対的位置を示す。各々可能な転座事象は、表示のsgRNAの存在下又は非存在下で処理した細胞から単離したゲノムDNAから第一に増幅された。第二のネステッドPCR反応は、転座から生じるであろうと予想されるPCRアンプリコン内のプライマーを用いて実施された。予想サイズは、表示のプライマー結合部位及び各遺伝子座の予想されるsgRNA切断部位を基準に概算した。*は、予想サイズで検出され、各末端のサンガーシークェンシングによって立証されたバンドを示す。＃は、サンガーシークェンシングが予想した転座以外の配列を示した（おそらくはネステッドPCR時のミスプライミングの結果）アンプリコンを示す。
【図２９】Cas9及びCR3遺伝子カセットで処理したHEK239T細胞でCR3及びCR3-OT1（それぞれ染色体X及び１上に存在）間の転座から生じる図28で検出されたバンドのサンガーシークェンシングクロマトグラフィー図を示す。矢印は、適切なsgRNAによってもたらされる予想される切断点近くの表示の染色体と相同性を有する領域を示す。配列決定の読みは、非相同性末端接合によるエラー多発性DNA修繕特性のために切断点近くでは一致しないことに留意されたい。
【図３０】図26Cで検出されたバンドについてのサンガーシークェンシングクロマトグラフィー図を示す（前記バンドはCas9及びCR1遺伝子カセットで処理したHEK293T細胞のCR1及びCR1-OT1（それぞれ染色体X及び16に存在する）間の転座の結果である）。矢印は、適切なsgRNAによってもたらされる予想される切断点近くの表示染色体に対する相動性領域を示す。配列決定の読みは、非相同性末端接合によるエラー多発性DNA修繕特性のために切断点近くでは一致しないことに留意されたい。
【図３１】in vivoでのAAV注射及び組織採集の大要を示す。
【図３２】AAV-SASTG-ROSAデリバリー後の骨格筋におけるin vitro及びin vivoのRosa26 ZFN活性のサーベイヤー分析を示す。矢印はサーベイヤー切断から生じる予想されるバンドを示す。n.d.＝検出されず。（a）増殖C2C12に表示の量のウイルスを形質導入し、感染4日後に採集した。矢印はサーベイヤー切断から生じる予想されるバンドサイズを示す。（b）C2C12を5日間分化培地でインキュベートし、続いて24ウェルプレートで表示の量のAAV-SASTG-ROSAウイルスを形質導入した。サンプルは形質導入10日後に収集した。（c）表示量のAAV-SASTG-ROSAをC57BL/6Jマウスの前脛骨筋に直接注射し、感染後4週間で筋肉を採集した。採集したTA筋をゲノムDNA分析のために8つの別々の細片に分けた。各々は別々のレーンに示されている。
【図３３】Rosa T2A opt DNA配列（配列番号:434）及びRosa T2A optタンパク質配列（配列番号:435）を示す。
【図３４−１】SASTGキャプシドDNA配列（配列番号:436）を示す。
【図３４−２】SASTGキャプシドペプチド配列（配列番号:437）を示す。
【図３５】DZF16 ZFN標的部位配列（配列番号:442）、DZF16-L6左完全アミノ酸配列（配列番号:443）及びDZF16-R6右完全アミノ酸配列（配列番号:444）を示す。
【図３６】E51C3 ZFN標的部位配列（配列番号:445）、E51C3-3L左完全アミノ酸配列（配列番号:446）及びE51C3-3R右完全アミノ酸配列（配列番号:447）を示す。
【図３７】DZF15 ZFN標的部位配列（配列番号:448）、DZF15-L6左完全アミノ酸配列（配列番号:449）、DZF15-R6右完全アミノ酸配列（配列番号:450）、DZF15-L5左完全アミノ酸配列（配列番号:451）、DZF15-R5右完全アミノ酸配列（配列番号:452）を示す。
【図３８】E51C4 ZFN標的部位配列（配列番号:453）、E51C4-4L左完全アミノ酸配列（配列番号:454）及びE51C4-4R右完全アミノ酸配列（配列番号:455）を示す。
【図３９】“単一ベクター、複合CRISPR系”、“二重ベクター、複合CRISPR系”及び“単一ベクター、単一gRNA系”の模式図を示す。
【図４０】SaCas9-NLS（NLSには下線が付される）（配列番号:64）及びSaCas9 gRNA（配列番号:116）のヌクレオチド配列を示す。
【図４１】NmCas9（NLS1は下線で、NLS2は下線付き太字で、HAタグは太字示される）、NmCas9ショートヘアピン（出典：Thomson PNAS 2013）（配列番号:118）、及びNmCas9ロングヘアピン（出典：Church Nature Biotech 2013）（配列番号:119）を示す。
【図４２】sgRNA及びレンチウイルスCas9発現構築物の正当性の立証を示す。（a）AAVS1遺伝子座を標的とするsgRNAを発現する固有のPolIIIプロモーターをコードする構築物又は発現終止のために直後にポリ-チミジン（“ポリT”）が続くhU6プロモーターを含む構築物をHEK293T細胞にトランスフェクトした。エンドポイントRT-PCRを用いて、トランスフェクション2日後にそれぞれ表示のプロモーター/sgRNAの発現について精査した。-RT：逆転写酵素コントロール無し。（b）HEK293TにAAVS1ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はCas9-T2A-GFPをコードする発現ベクター及び表示のプロモーター/sgRNA発現カセットをトランスフェクトし、トランスフェクション３日後にサーベイヤーアッセイを用いて遺伝子改変レベルを判定した。（c）表示のCas9-T2A-GFP構築物をコードするレンチウイルス構築物でsgRNAの非存在下にてHEK293T細胞を形質導入し、形質導入7日後にCas9タンパク質のN-末端のFLAGエピトープタグについて精査することによって、Cas9発現をウェスタンブロットで判定した。
【図４３】単一レンチウイルスCRISPR/Cas9発現カセットのゴールデンゲートアッセンブリーを示す。
【図４４】複合CRISPR/Cas9系の単一レンチウイルスデリバリーを示す。（a）別個のゲノム遺伝子座を標的とする4つのsgRNAを、活性なCas9ヌクレアーゼを発現するレンチウイルスベクターでクローニングした。（b）HEK293及び初代ヒト皮膚線維芽細胞を表示のsgRNAを発現するレンチウイルスで形質導入し、サーベイヤーアッセイを用いて切断事象についてアッセイした。HEK293細胞は形質導入7日後にアッセイした。ヒト線維芽細胞は形質導入10日後にアッセイした。
【図４５】dCas9-VP64を安定的に発現するHEK293Tにおける一過性遺伝子活性化を示す。HEK293Tにレンチウイルスを形質導入してdCas9-VP64を安定的に発現させ、続いて表示のsgRNAの組み合わせを発現するプラスミドをトランスフェクトした。デリバーされるsgRNAの数を変化させることによって、内因性IL1RN（a）及びHBG1（b）遺伝子座の調整可能な内因性遺伝子活性化がトランスフェクション3日後に達成された。内因性IL1RN（c）及びHBG1（d）のピークレベルはトランスフェクション後3−6日に観察され、活性化レベルは15から20日目にバックグラウンドレベルに復帰した。重要なことには、細胞株は第二のトランスフェクション後20日目に再活性化させることができたが、ただしレベルは以前に観察されたレベルより低かった。
【図４６】単一レンチウイルス複合dCas9-VP64ベクターを用いたHEK293Tにおける安定的な遺伝子活性化を示す。HEK293Tにレンチウイルスを形質導入してdCas9-VP64及び表示のgRNA組合せを安定的に発現させた。デリバーされるsgRNAの数を変化させることによって、内因性IL1RN（a）及びHBG1（b）遺伝子座の調整可能な内因性遺伝子活性化が形質導入7日後に達成された。内因性IL1RN（c）及びHBG1（d）のピークレベルは形質導入後6日で観察され、該活性化レベルは21日目まで持続した。
【図４７】IL1RN mRNA発現レベルを示す。
【図４８】BAMニューロン転写因子の異所性発現による線維芽細胞のニューロンへの直接変換を表す模式図を示す。
【図４９】（A）dCas9-VP64構築物の模式図を示す。dCas9-VP64は、VP16転写活性化ドメインのテトラマーに融合されたCas9タンパク質の触媒的に不活性な形である。（B）RNAによってガイドされるdCas9-VP64のゲノム標的への補充メカニズムを示す模式図である。（C）CRISPR/Cas9転写因子によりiNを生成する実験的プロトコルの模式図である。
【図５０】dCas9-VP64を形質導入し、さらにASCL1プロモーター、ASCL1 cDNA又はルシフェラーゼを標的とするgRNAをトランスフェクトしたMEFで、（A）qRT-PCR又は（B）免疫蛍光によって全ASCL1タンパク質を決定した3日目の内因性ASCL1発現を示す。アステリスク（*）は、4つのgRNAと比較して8つのgRNAの共同デリバリーによるASCL1発現における有意な（p＜0.05）増加を示す。ASCL1の異所性発現は、dCas9-VP64及びASCL1プロモーターを標的とする8つのgRNAによって誘導されるタンパク質よりも多くのタンパク質を生成したが、培養では3日目までに内因性遺伝子座を活性化しなかった。
【図５１】異所性BAM因子によって又はdCas9-VP64及びBRN2とASCL1プロモーターを標的とするgRNAによって生じたTUJ1及びMAP2陽性細胞、（B）N3培地で11日目にhSyn-RFPレポーターを発現するニューロンの形態を有する細胞を示す。
【図５２−１】（A）培養液中でKClの存在下（下）又は非存在下（上）でGCaMP5カルシウムインジケーターについて陽性であるニューロンの形態を有する細胞を示す。  図52は、dCas9-VP64転写因子を用いて線維芽細胞をニューロンに変換したときのiCas9-VP64処理ネズミ胚線維芽細胞におけるAscl1及びBrn2（すなわちマスター調節遺伝子）の下流標的の活性化を示す。ネズミ胚線維芽細胞（MEF）にコントロールGFP発現プラスミド又はiCas9-VP64発現プラスミド及びAsc11とBRN2を標的とする8つのgRNA発現プラスミドの組合せをトランスフェクトした。dCas9転写因子はウイルスによりデリバーした。神経誘導培地で10日後に、細胞をTuj1（ニューロン分化の初期マーカー）及びMAP2（より成熟したニューロンの分化マーカー）について染色した。ニューロンへの変換は効率的であった。
【図５２−２】（B）KClの添加に応答して細胞の脱分極を示す、時間経過における標準化蛍光強度の記録を示す。  図52は、dCas9-VP64転写因子を用いて線維芽細胞をニューロンに変換したときのiCas9-VP64処理ネズミ胚線維芽細胞におけるAscl1及びBrn2（すなわちマスター調節遺伝子）の下流標的の活性化を示す。ネズミ胚線維芽細胞（MEF）にコントロールGFP発現プラスミド又はiCas9-VP64発現プラスミド及びAsc11とBRN2を標的とする8つのgRNA発現プラスミドの組合せをトランスフェクトした。dCas9転写因子はウイルスによりデリバーした。神経誘導培地で10日後に、細胞をTuj1（ニューロン分化の初期マーカー）及びMAP2（より成熟したニューロンの分化マーカー）について染色した。ニューロンへの変換は効率的であった。
【図５３】哺乳動物遺伝子の調節制御のためのCRISPR/Cas9プラットフォームを示す。A．Cas9系エフェクターは、Cas9と複合体を形成する定常領域（標的部位特異性を付与する交換可能な20bpのプロトスペーサーが先行する）から成るキメラgRNA分子の存在下でゲノム配列と結合する。B．Cas9系合成転写因子は、RNAポリメラーゼ活性と干渉することによって又はプロモーター内で結合して内因性転写因子の結合部位をブロックすることによって標的遺伝子の転写を抑制する。調節エレメント（例えばエンハンサー）を標的とすることはまた多数の遠位遺伝子の発現をブロックする可能性がある。
【図５４】CRISPR/dCas9-KRABを用いるHS2エンハンサーのターゲティングを示す。HS2領域は、10kbよりも下流のグロビン遺伝子の発現を遠位で調節できる強力なエンハンサーである。エンハンサー領域沿いの部位を標的とするために一組の単一gRNAを設計した。
【図５５−１】HS2エンハンサーを標的とする単一gRNAはグロビン遺伝子の強力な転写抑制をもたらすことを示す。A．dCas9及びdCas9-KRABリプレッサーはレンチウイルスベクターでデリバーされる。スクリーニングのために単一gRNAを一過性にトランスフェクトした。
【図５５−２】トランスフェクション後3日で定量的RT-PCRでアッセイしたとき、dCas9-KRABを発現するK562は、gRNA処理を受けなかったコントロール細胞と比較して、γ-グロビン遺伝子（B）、ε-グロビン遺伝子（C）及びβ-グロビン遺伝子（D）の80％までの抑制を達成した。
【図５５−３】トランスフェクション後3日で定量的RT-PCRでアッセイしたとき、dCas9-KRABを発現するK562は、gRNA処理を受けなかったコントロール細胞と比較して、γ-グロビン遺伝子（B）、ε-グロビン遺伝子（C）及びβ-グロビン遺伝子（D）の80％までの抑制を達成した。
【図５５−４】トランスフェクション後3日で定量的RT-PCRでアッセイしたとき、dCas9-KRABを発現するK562は、gRNA処理を受けなかったコントロール細胞と比較して、γ-グロビン遺伝子（B）、ε-グロビン遺伝子（C）及びβ-グロビン遺伝子（D）の80％までの抑制を達成した。
【図５５−５】D．dCas9又はdCas9-KRABを発現しかつCr4又はCr8で処理された細胞でのタンパク質発現は、β-アクチンコントロールと比較して、3日目にγ-グロビン発現の穏やかな抑制を示す。
【図５６Ａ】以下で処理した細胞に種々の用量のgRNAプラスミドをデリバーすることによるグロビン遺伝子座の遺伝子発現を示す：A．無レンチウイルス。デリバーされるCr4 gRNAプラスミドの用量の増加はdCas9-KRAB処理細胞における抑制を強化し、dCas9-KRABエフェクター及び標的に到達したgRNAの両方が抑制の達成に役割を果たすことを示唆している。
【図５６Ｂ】以下で処理した細胞に種々の用量のgRNAプラスミドをデリバーすることによるグロビン遺伝子座の遺伝子発現を示す：B．dCas9レンチウイルス。デリバーされるCr4 gRNAプラスミドの用量の増加はdCas9-KRAB処理細胞における抑制を強化し、dCas9-KRABエフェクター及び標的に到達したgRNAの両方が抑制の達成に役割を果たすことを示唆している。
【図５６Ｃ】以下で処理した細胞に種々の用量のgRNAプラスミドをデリバーすることによるグロビン遺伝子座の遺伝子発現を示す：C．dCas9-KRABレンチウイルス。デリバーされるCr4 gRNAプラスミドの用量の増加はdCas9-KRAB処理細胞における抑制を強化し、dCas9-KRABエフェクター及び標的に到達したgRNAの両方が抑制の達成に役割を果たすことを示唆している。
【図５７−１】dCas9-KRABとともに単一gRNAを安定的にデリバーしてグロビン遺伝子の発現をサイレント化することを示す。A．dCas9及びdCas9-KRABリプレッサーを、単一gRNAとともにレンチウイルスベクターで共同発現させた。形質導入後7日で定量的RT-PCRによってアッセイしたとき、dCas9-KRABを発現するK562は、レンチウイルス処理を受けなかったコントロール細胞と比較して、γ-グロビン（B）、ε-グロビン（C）及びβ-グロビン（D）の95％までの抑制を達成した。
【図５７−２】dCas9-KRABとともに単一gRNAを安定的にデリバーしてグロビン遺伝子の発現をサイレント化することを示す。A．dCas9及びdCas9-KRABリプレッサーを、単一gRNAとともにレンチウイルスベクターで共同発現させた。形質導入後7日で定量的RT-PCRによってアッセイしたとき、dCas9-KRABを発現するK562は、レンチウイルス処理を受けなかったコントロール細胞と比較して、γ-グロビン（B）、ε-グロビン（C）及びβ-グロビン（D）の95％までの抑制を達成した。
【図５８】dCas9融合物のみを介するヒストン標的後成的改変のためのp300HAT“コア”の単離を示す。
【図５９】化膿連鎖球菌（S.ピオゲネス（S. pyogenes））dCas9-VP64融合物（上）及びdCas9-p300コア融合物（下）の単純化模式図を示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）は標的遺伝子の遺伝子座で矢印により示され、合成ガイドRNA（gRNA）は影付き矢印（hatched arrow）で示される。
【図６０Ａ】60A−60Cは、dCas9-VP64及び一切の融合エフェクタードメインを持たないdCas9と比較して、ヒト293T細胞培養株でdCas9-p300を用いる活性化の有効性を明らかにする3つのヒト遺伝子座における代表的なデータを示す。
【図６０Ｂ】60A−60Cは、dCas9-VP64及び一切の融合エフェクタードメインを持たないdCas9と比較して、ヒト293T細胞培養株でdCas9-p300を用いる活性化の有効性を明らかにする3つのヒト遺伝子座における代表的なデータを示す。
【図６０Ｃ】60A−60Cは、dCas9-VP64及び一切の融合エフェクタードメインを持たないdCas9と比較して、ヒト293T細胞培養株でdCas9-p300を用いる活性化の有効性を明らかにする3つのヒト遺伝子座における代表的なデータを示す。
【図６１Ａ】61A−61CはCas9構築物のアミノ酸配列を示す。図61A−61Cの全ての説明は図61Aに示されている。
【図６１Ｂ】61A−61CはCas9構築物のアミノ酸配列を示す。図61A−61Cの全ての説明は図61Aに示されている。
【図６１Ｃ】61A−61CはCas9構築物のアミノ酸配列を示す。図61A−61Cの全ての説明は図61Aに示されている。
【図６２】HAT-dCas9-p300融合タンパク質は遺伝子発現を活性化できないことを示す。
【図６３】gRNAはまたdCas9-p300コアと相乗的に作用することを示す。
【図６４】ジストロフィン遺伝子に種々の欠損を保有するヒトDMD患者に由来する骨格筋芽細胞株のジストロフィンのDP427m骨格筋アイソフォームの5’UTRへのミニジストロフィンのTALEN媒介組込みを示す。DMD患者の細胞に5’UTRで活性なTALEN対をコードする構築物及びミニジストロフィン遺伝子を保有するドナー鋳型をエレクトロポレートした。（a）ミニジストロフィンが5’UTRにどのように組み込まれるかを示す模式図である。（b）ヒグロマイシン耐性クローン細胞株を単離し、（a）に示したプライマーを用いて5’UTRへの首尾よい位置特異的組込みについてPCRでスクリーニングした。星印は（c）での更なる分析のために選別されたクローンを示す。（c）組込み事象が検出されたクローン単離DMD筋芽細胞を6日間分化させ、ミニジストロフィンのC末端に融合させたHAタグの発現を判定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
［実施例２４］
図64は、ジストロフィン遺伝子に種々の欠失を保持するヒトDMD患者由来の骨格筋筋芽細胞で、ジストロフィンのDp427m骨格筋アイソフォームの5’UTRへのミニジストロフィン組込みをTALENが媒介することを示している。5’UTR 遺伝子座で活性なTALENペアをコードする構築物及びミニジストロフィン遺伝子を保持するドナー鋳型がDMD患者細胞にトランスフェクトされた。図64(a)は、ミニジストロフィンがどのように5’UTRに組み込まれたかを示す模式図である。図64(b)は、ヒグロマイシン耐性クローン細胞株の単離、及び図64(a)に示したプライマーを用いた5’UTRにおける首尾よい位置特異的組込みのPCRによるスクリーニングを示す。星印は図64(c)での更なる分析のために選択したクローンを示す。図64(c)は、検出された組込み事象を有するクローン単離DMD筋芽細胞を6日間分化させ、ミニジストロフィンのC末端に融合させたHAタグの発現について判定したことを示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
前述の詳細な記載及び随伴する実施例は単なる例示であり、本発明の範囲（前記は添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ範囲が決定される）の制限と解されるべきではないことは理解されよう。
開示の実施態様に対する多様な変更及び改変は当業者には明白であろう。そのような変更及び改変（化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成、処方、又は本発明の使用方法に関するものを含むが、ただしこれらに限定されない）は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく成し得る。
次に、本発明の態様を示す。
１.  2つの異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第一のポリペプチドドメインが、集合等間隔配置短パリンドローム配列リピート随伴（Cas）タンパク質を含み、第二のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン改変活性、ヌクレアーゼ活性、核酸結合活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性から成る群から選択される活性を有する、前記融合タンパク質。
２.  Casタンパク質がCas9を含む、上記１に記載の融合タンパク質。
３.  Cas9が、Cas9のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも1つのアミノ酸変異を含む、上記２に記載の融合タンパク質。
４.  前記少なくとも1つのアミノ酸変異がD10A及びH840Aの少なくとも1つである、上記３に記載の融合タンパク質。
５.  Cas9タンパク質がiCas9（配列番号:1のアミノ酸36−1403）を含む、上記３又は４に記載の融合タンパク質。
６.  第二のポリペプチドドメインが転写活性化活性を有する、上記１から５のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
７.  第二のポリペプチドドメインが、少なくとも1つのVP16転写活性化ドメインリピートを含む、上記６に記載の融合タンパク質。
８.  第二のポリペプチドドメインが、VP16テトラマー（“VP64”）又はp65活性化ドメインを含む、上記７に記載の融合タンパク質。
９.  第一のポリペプチドドメインを第二のポリペプチドドメインに結びつけるリンカーをさらに含む、上記１から８のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
１０.  融合タンパク質がiCas9-VP64を含む、上記１から９のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
１１.  上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含むDNAターゲティング系。
１２.  前記少なくとも1つのgRNAが、標的DNA配列の12−22塩基対の相補性ポリヌクレオチド配列とその後に続くプロトスペーサー隣接モチーフを含む、上記１１に記載のDNAターゲティング系。
１３.  前記少なくとも1つのgRNAが、遺伝子のプロモーター領域、遺伝子のエンハンサー領域、又は遺伝子の転写領域を標的とする、上記１１又は１２に記載のDNAターゲティング系。
１４.  前記少なくとも1つのgRNAが遺伝子のイントロンを標的とする、上記１３に記載のDNAターゲティング系。
１５.  前記少なくとも1つのgRNAが遺伝子のエクソンを標的とする、上記１３に記載のDNAターゲティング系。
１６.  前記少なくとも1つのgRNAが、ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2及びMYOD1から成る群から選択される遺伝子のプロモーター領域を標的とする、上記１１又は１２に記載のDNAターゲティング系。
１７.  前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号:5-40、65-144、492-515、540-563及び585-625の少なくとも1つを含む、上記１０から１６のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系。
１８.  ジストロフィン遺伝子と結合する、Cas9及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含むDNAターゲティング系。
１９.  前記少なくとも1つのgRNAがジストロフィン遺伝子のイントロンを標的とする、上記１８に記載のDNAターゲティング系。
２０.  前記少なくとも1つのgRNAがジストロフィン遺伝子のエクソンを標的とする、上記１８に記載のDNAターゲティング系。
２１.  前記少なくとも1つのガイドRNAが、配列番号:5-40、65-144、492-515、540-563及び585-625の少なくとも1つを含む、上記１８に記載のDNAターゲティング系。
２２.  1つから10の異なるgRNAを含む、上記１１から２１のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系。
２３.  上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質又は上記１１から２２のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系をコードする単離ポリヌクレオチド。
２４.  上記２３に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
２５.  上記２３に記載の離ポリヌクレオチド又は上記２４に記載のベクターを含む細胞。
２６.  細胞で哺乳動物遺伝子発現を調整する方法であって、細胞を上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質、上記１１から２２に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド、又は上記２４に記載のベクターと接触させる工程を含む、前記方法。
２７.  前記遺伝子発現が誘導される、上記２６に記載の方法。
２８.  細胞をトランス分化させるか又は細胞の分化を誘発する方法であって、細胞を上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質、上記１１から１７のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド、又は上記２４に記載のベクターと接触させる工程を含む、前記方法。
２９.  細胞が線維芽細胞又は人工多能性幹細胞である、上記２８に記載の方法。
３０.  線維芽細胞がニューロン細胞又は筋原性細胞にトランス分化される、上記２９に記載の方法。
３１.  上記１１から２０のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系が細胞と接触され、少なくとも1つのgRNAが、ASCL1、BRN2、MYOD1及びMYT1Lから成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモーター領域を標的とする、上記２８から３０のいずれか1項に記載の方法。
３２.  DNAターゲティング系が、ASCL1遺伝子のプロモーター領域を標的とする少なくとも1つのgRNA、及びBRN2遺伝子のプロモーター領域を標的とする少なくとも1つのgRNAを含む、上記３１に記載の方法。
３３.  DNAターゲティング系が1つから20の異なるgRNAを含む、上記３１又は３２に記載の方法。
３４.  DNAターゲティング系が8から16の異なるgRNAを含む、上記３３に記載の方法。
３５.  DNAターゲティング系がdCas9-VP64を含む、上記２８から３４のいずれか1項に記載の方法。
３６.  DNAターゲティング系が細胞にウイルス的に又は非ウイルス的にデリバーされる、上記２８から３５のいずれか1項に記載の方法。
３７.  細胞で変異遺伝子を修正する方法であって、上記１１から２２のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド又は上記２４に記載のベクターを含む細胞に投与する工程を含む、前記方法。
３８.  変異遺伝子の修正が相同性指向修繕を含む、上記３７に記載の方法。
３９.  さらに細胞にドナーDNAを投与する工程を含む、上記３８に記載の方法。
４０.  変異遺伝子が、未成熟終止コドン及び切端遺伝子生成物を生じさせるフレームシフト変異を含む、上記３７に記載の方法。
４１.  変異遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介非相同性末端接合を含む、上記４０に記載の方法。
４２.  変異遺伝子の修正が、未成熟終止コドンの欠失、スプライスアクセプター部位の破壊、1つ以上のエクソンの欠失又はスプライスドナー配列の破壊を含む、上記３７に記載の方法。
４３.  前記1つ以上のエクソンの欠失がリーディングフレームの修正をもたらす、上記４２に記載の方法。
４４.  その必要がある変異ジストロフィン遺伝子保有対象動物を治療する方法であって、前記対象動物に上記１１から２２のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド又は上記２４に記載のベクターを投与する工程を含む、前記方法。
４５.  対象動物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを罹患する、上記４４に記載の方法。
４６.  細胞で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、変異ジストロフィン遺伝子を含む細胞に、上記１８から２２のいずれか1項に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド、上記２４に記載のベクター、又は上記２５に記載の細胞を投与する工程を含む、前記方法。
４７.  変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン、遺伝子欠損により破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、又は異常なスプライスドナー部位を含み、標的領域が、前記未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位又は異常なスプライスドナー部位の上流又は下流に存在する、上記４６に記載の方法。
４８.  変異ジストロフィン遺伝子の修正が相同性指向修繕を含む、上記４６に記載の方法。
４９.  さらに細胞にドナーDNAを投与する工程を含む、上記４８に記載の方法。
５０.  変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン及び切端遺伝子生成物を生じさせるフレームシフト変異を含む、上記４６に記載の方法。
５１.  変異ジストロフィン遺伝子の修正がヌクレアーゼ媒介非相同性末端接合を含む、上記５０に記載の方法。
５２.  変異ジストロフィン遺伝子の修正が、未成熟終止コドンの欠失、破壊されたリーディングフレームの修正、又はスプライスアクセプター部位の破壊若しくはスプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調整を含む、上記４６に記載の方法。
５３.  変異ジストロフィン遺伝子の修正がエクソン45-55又はエクソン51の欠失を含む、上記５２に記載の方法。
５４.  上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質、上記１１から２２に記載のDNAターゲティング系、上記２３に記載の単離ポリヌクレオチド、上記２４に記載のベクター、又は上記２５に記載の細胞を含むキット。
５５.  細胞で哺乳動物の遺伝子発現を調整する方法であって、DNAターゲティング系をコードするポリヌクレオチドと前記細胞を接触させる工程を含み、前記DNAターゲティング系が、上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含む、前記方法。
５６.  DNAターゲティング系が1から10の異なるgRNAを含む、上記５５に記載の方法。
５７.  前記異なるgRNAが標的遺伝子内の異なる領域と結合する、上記５６に記載の方法。
５８.  前記標的領域が少なくとも1つのヌクレオチドで分離される、上記５７に記載の方法。
５９.  前記標的領域が約15から約700塩基対で分離される、上記５７に記載の方法。
６０.  前記異なるgRNAの各々が少なくとも1つの異なる標的遺伝子と結合する、上記５６に記載の方法。
６１.  前記異なる標的遺伝子が同じ染色体に位置する、上記６０に記載の方法。
６２.  前記異なる標的遺伝子が異なる染色体に位置する、上記６０に記載の方法。
６３.  少なくとも1つの標的領域が、ノンオープンクロマチン領域、オープンクロマチン領域、標的遺伝子のプロモーター領域、標的遺伝子のエンハンサー領域、標的遺伝子の転写領域、又は標的遺伝子の転写開始部位の上流領域内に存在する、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６４.  少なくとも1つの標的領域が、標的遺伝子の転写開始部位の約1から約1000塩基対上流に位置する、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６５.  少なくとも1つの標的領域が、標的遺伝子の転写開始部位の約1から約600塩基対上流に位置する、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６６.  前記遺伝子発現が誘導される、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６７.  DNAターゲティング系が、2つの異なるgRNA、3つの異なるgRNA、4つの異なるgRNA、5つの異なるgRNA、6つの異なるgRNA、7つの異なるgRNA、8つの異なるgRNA、9つの異なるgRNA、又は10の異なるgRNAを含む、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６８.  少なくとも1つのガイドRNAが、ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2及びMYOD1から成る群から選択される遺伝子のプロモーター領域を標的とする、上記５５から６２のいずれか1項に記載の方法。
６９.  少なくとも1つのガイドRNAが、配列番号:5-40、65-144、492-515、540-563及び585-625の少なくとも1つを含む、上記５５から６８のいずれか1項に記載の方法。
７０.  少なくとも1つの標的領域が標的遺伝子のイントロン又はエクソン内に存在する、上記５５から６５のいずれか1項に記載の方法。
７１.  細胞で哺乳動物の遺伝子発現を誘導する組成物であって、上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含む、前記組成物。
７２.  細胞で哺乳動物の遺伝子発現を誘導する組成物であって、上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列及び少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）を含む、前記組成物。
７３.  少なくとも１つのガイドRNAが、ASCL1、BRN2、MYT1L、NANOG、VEGFA、TERT、IL1B、IL1R2、IL1RN、HBG1、HBG2及びMYOD1から成る群から選択される遺伝子のプロモーター領域を標的とする、上記７１又は７２に記載の組成物。
７４.  前記少なくとも1つのガイドRNAが、配列番号:5-40、65-144、492-515、540-563及び585-625の少なくとも1つを含む、上記７１又は７２に記載の組成物。
７５.  上記７１から７４のいずれか1項に記載の組成物を含む細胞。
７６.  上記７１から74のいずれか1項に記載の組成物又は上記７４に記載の細胞を含むキット。
７７.  細胞で哺乳動物の遺伝子発現を誘導するキットであって、上記７１から７４のいずれか1項に記載の組成物又は上記７５に記載の細胞を含む、前記キット。
７８.  対象動物の筋肉でゲノム編集する組成物であって、改変されたアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター及び位置特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該筋肉が骨格筋又は心筋である、前記組成物。
７９.  改変AAVベクターが心筋及び骨格筋組織向性が強化されてある、上記７８に記載の組成物。
８０.  位置特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALエフェクターヌクレアーゼ、又はCRISPR/Cas9系を含む、上記７８又は７９に記載の組成物。
８１.  位置特異的ヌクレアーゼが筋肉細胞内の遺伝子又は遺伝子座と結合する、上記７８から８０のいずれか1項に記載の組成物。
８２.  遺伝子又は遺伝子座がジストロフィン遺伝子である、上記８１に記載の組成物。
８３.  さらにドナーDNA又はトランスジーンを含む、上記７８から８２のいずれかに記載の組成物。
８４.  対象動物の筋肉でゲノム編集する方法であって、上記７８から８３のいずれか1項に記載の組成物を筋肉に投与する工程を含み、前記筋肉が骨格筋又は心筋である、前記方法。
８５.  ゲノム編集が変異遺伝子の修正又はトランスジーンの挿入を含む、上記８４に記載の方法。
８６.  異遺伝子の修正が、変異遺伝子の欠失、再編成又は取替えを含む、上記８５に記載の方法。
８７.  異遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介非相同性末端接合又は相同性指向修繕を含む、上記８５又は８６のいずれか1項に記載の方法。
８８.  対象動物を治療する方法であって、上記７８から８３のいずれか1項に記載の組成物を対象動物の筋肉に投与する工程を含み、前記筋肉が骨格筋又は心筋である、前記方法。
８９.  対象動物が骨格筋の症状又は遺伝子疾患を罹患する、上記８８に記載の方法。
９０.  対象動物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを罹患する、上記８９に記載の方法。
９１.  対象動物で変異遺伝子を修正する方法であって、上記７８から８３のいずれか1項に記載の組成物を対象動物の筋肉に投与する工程を含み、前記筋肉が骨格筋又は心筋である、前記方法。
９２.  前記組成物が対象動物の骨格筋に注射される、上記８４から９１のいずれか1項に記載の方法。
９３.  前記組成物が全身的に対象動物に注射される、上記８４から９１のいずれか1項に記載の方法。
９４.  骨格筋が前脛骨筋である、上記９２に記載の方法。
９５.  上記７８から８３のいずれか1項に記載の組成物を含むキット。
９６.  上記１から１０のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド配列及び少なくとも1つのsgRNAをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む、対象動物でゲノム編集する改変レンチウイルスベクター。
９７.  第一のポリヌクレオチド配列が第一のプロモーターに作動可能に連結される、上記９６に記載の改変レンチウイルスベクター。
９８.  前記第一のプロモーターが構成的プロモーター、誘導可能プロモーター、抑制可能プロモーター、又は調節可能プロモーターである、上記９７に記載の改変レンチウイルスベクター。
９９.  前記第二のポリヌクレオチド配列が1から10の異なるsgRNAをコードする、上記９６から９８のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクター。
１００.  前記第二のポリヌクレオチド配列が、2つの異なるsgRNA、3つの異なるsgRNA、4つの異なるsgRNA、5つの異なるsgRNA、6つの異なるsgRNA、7つの異なるsgRNA、8つの異なるsgRNA、9つの異なるsgRNA、10の異なるsgRNAをコードする、上記９６から９９のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０１.  異なるsgRNAをコードするポリヌクレオチド配列の各々がプロモーターに作動可能に連結される、上記１００に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０２.  異なるsgRNAに作動可能に連結されるプロモーターの各々が同じプロモーターである、上記１０１に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０３.  異なるsgRNAに作動可能に連結されるプロモーターの各々が異なるプロモーターである、上記１０１に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０４.  プロモーターが、構成的プロモーター、誘導可能プロモーター、抑制可能プロモーター、又は調節可能プロモーターである、上記１０１に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０５.  sgRNAが標的遺伝子に結合する、上記９５から１０３のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０６.  sgRNAの各々が1つの標的遺伝子座内の異なる標的領域に結合する、上記１０５に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０７.  sgRNAの各々が異なる遺伝子座内の異なる標的と結合する、上記１０５に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０８.  融合タンパク質がCas9タンパク質又はiCas9-VP64タンパク質を含む、上記１０５に記載の改変レンチウイルスベクター。
１０９.  融合タンパク質がVP64ドメイン、p300ドメイン又はKRABドメインを含む、上記１０５に記載の改変レンチウイルスベクター。
１１０.  2つ以上の内因性遺伝子が転写的に活性化される、上記１０８に記載の改変レンチウイルスベクター。
１１１.  2つ以上の内因性遺伝子が抑制される、上記１０８に記載の改変レンチウイルスベクター。
１１２.  細胞で内因性遺伝子を活性化させる方法であって、細胞を上記９６から１１１のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクターと接触させる工程を含む、前記方法。
１１３.  内因性遺伝子が一過性に活性化される、上記１１２に記載の方法。
１１４.  内因性遺伝子が安定的に活性化される、上記１１２に記載の方法。
１１５.  内因性遺伝子が一過性に抑制される、上記１１２に記載の方法。
１１６.  内因性遺伝子が安定的に抑制される、上記１１２に記載の方法。
１１７.  融合タンパク質がsgRNAと類似レベルで発現される、上記１１２に記載の方法。
１１８.  融合タンパク質がsgRNAと異なるレベルで発現される、上記１１２に記載の方法。
１１９.  細胞が初代ヒト細胞である、上記１１２に記載の方法。
１２０.  細胞での複合遺伝子編集の方法であって、細胞を上記９６から１０７のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクターと接触させる工程を含む、前記方法。
１２１.  複合遺伝子編集が少なくとも1つの変異遺伝子の修正又はトランスジーンの挿入を含む、上記１２０に記載の方法。
１２２.  変異遺伝子の修正が、少なくとも1つの変異遺伝子の欠失、再整理又は取替えを含む、上記１２０又は１２１のいずれか1項に記載の方法。
１２３.  少なくとも1つの変異遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介非相同性末端接合又は相同性指向修繕を含む、上記１２０又は１２１のいずれか1項に記載の方法。
１２４.  複合遺伝子編集が少なくとも1つの遺伝子の欠失を含み、前記遺伝子が内因性の正常遺伝子又は変異遺伝子である、上記１２０に記載の方法。
１２５.  複合遺伝子編集が少なくとも2つの遺伝子の欠失を含む、上記１２４に記載の方法。
１２６.  複合遺伝子編集が2つから10の遺伝子の欠失を含む、上記１２４に記載の方法。
１２７.  細胞で少なくとも1つの標的遺伝子の遺伝子発現を調整する方法であって、細胞を上記９６から１０７のいずれか1項に記載の改変レンチウイルスベクターと接触させる工程を含む、前記方法。
１２８.  少なくとも2つの遺伝子の遺伝子発現が調整される、上記１２７に記載の方法。
１２９.  2つの遺伝子から10の遺伝子の遺伝子発現が調整される、上記１２７に記載の方法。
１３０.  少なくとも1つの標的遺伝子の正常な遺伝子発現レベルと比較して前記少なくとも1つの標的遺伝子の遺伝子発現レベルが増加又は低下するとき、前記少なくとも1つの標的遺伝子の遺伝子発現が調整される、上記１２７に記載の方法。
補遺
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016521555000001.app