【手続補正書】
【提出日】平成29年8月4日(2017.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含む、段階、
CRMタンパク質を細胞質において産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
該発現されたCRMタンパク質を単離する段階であって、該発現されたCRMタンパク質が可溶性である、段階。
【請求項２】
組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、請求項1記載の方法。
【請求項３】
発現ベクターが、リボソーム結合部位、開始コドン、およびCRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンとの間に少なくとも一つのスペーサーを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
発現された可溶性CRMタンパク質が、自然に折りたたまれたタンパク質を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
プロモーターが、誘導プロモーターである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
組み換え細胞が、約15℃〜約37℃の温度で増殖する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって単離される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィが、硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項8記載の方法により単離されたCRMタンパク質。
【請求項１１】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を有し、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含む、前記段階、
CRMコード配列からCRMタンパク質を細胞質において発現する段階、および
該発現されたCRMタンパク質を単離する段階であって、該発現されたCRMタンパク質が可溶性である、段階。
【請求項１２】
組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
CRMコード配列がCRM197をコードする、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
発現ベクターが、スペーサーを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
プロモーターが構成的プロモーターである、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
発現された可溶性CRMタンパク質が、自然に折りたたまれたタンパク質を含む、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
プロモーターが誘導プロモーターである、請求項11記載の方法。
【請求項２２】
組み換え細胞が、約15℃〜約37℃の温度で増殖する、請求項11記載の方法。
【請求項２３】
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、請求項11記載の方法。
【請求項２４】
クロマトグラフィが、硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
請求項23記載の方法により単離されたCRMタンパク質。
【請求項２６】
単離されたCRMタンパク質を結合する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項２７】
結合されたCRMタンパク質がワクチンである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
請求項27記載の方法により作製されたCRMタンパク質ワクチン。
【請求項２９】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
CRMコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
該CRMコード配列からCRMタンパク質を細胞質において発現する段階、および
該発現されたCRMタンパク質を単離する段階であって、該発現されたCRMタンパク質が可溶性であり、天然のジスルフィド結合を含む、段階。
【請求項３０】
組み換え細胞が、原核または真核細胞である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
原核細胞が、大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
プロモーターが構成的または誘導性である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
CRMコード配列が、CRM197をコードする、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
改変された組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサー配列を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３９】
発現ベクターが、発現エンハンサーを含む、請求項29記載の方法。
【請求項４０】
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位と開始コドンとを含む、請求項29記載の方法。
【請求項４１】
単離する段階が以下を含む、請求項29記載の方法：
ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムに、CRMタンパク質を負荷する段階、
一種または複数種の洗浄バッファーで該樹脂を洗浄する段階、
溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階。
【請求項４２】
ローディングバッファーおよび洗浄バッファーが同じであってもよい、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
ローディングバッファーおよび一種または複数種の洗浄バッファーが、約10 mS/cm以下の伝導率を有する低伝導率バッファーである、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
溶出バッファーが、約10 mS/cm以上の伝導率を有する高伝導率バッファーである、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
樹脂が、硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
以下を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法：
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および
測定された結合の量によって、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が、自然に折りたたまれたタンパク質を示す、前記段階。
【請求項４７】
ジフテリア毒素またはCRMが受容体結合ドメインを含有する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
CRMタンパク質がCRM197を含む、請求項46記載のCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法。
【請求項４９】
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質およびHB-EGFのうちの少なくとも一つが、固相支持体に結合されている、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量が、ELISAにより決定される、請求項46記載の方法。
【請求項５１】
HB-EGFに結合するCRMタンパク質がPBSにおいて可溶性であり、かつ約pH7.5のバッファー中5 mg/ml以上に濃縮される、請求項46記載の方法。
【請求項５２】
プロモーターと、それぞれがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンとを含む発現ベクターであって、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードし、各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有している、前記発現ベクター。
【請求項５３】
リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含む、請求項52記載の発現ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
[本発明1001]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードするポリシストロン性遺伝子配列に機能的に連結した誘導プロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1002]
組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1001の方法。
[本発明1003]
各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ポリシストロン性遺伝子配列が、一つまたは複数のリボソーム結合部位と一つまたは複数の開始コドンとの間に少なくとも一つのスペーサーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
本発明1008の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1011]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結された誘導プロモーター、リボソーム結合部位と開始コドンなどのスタートコドンとの間のスペーサー配列、該CRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、前記段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1012]
組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
組み換え細胞の改変が、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる、本発明1011の方法。
[本発明1016]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1011の方法。
[本発明1017]
CRMコード配列がCRM197をコードする、本発明1011の方法。
[本発明1018]
スペーサーが9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1011の方法。
[本発明1019]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む、本発明1011の方法。
[本発明1021]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1011の方法。
[本発明1022]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1011の方法。
[本発明1023]
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、本発明1011の方法。
[本発明1024]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1011の方法。
[本発明1025]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
本発明1024の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1027]
単離されたCRMタンパク質を結合する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1028]
結合されたCRMタンパク質がワクチンである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
本発明1028の方法により作製されたCRMタンパク質ワクチン。
[本発明1030]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
CRMコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
該CRMコード配列からCRMタンパク質を発現する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1031]
組み換え細胞が、原核または真核細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
原核細胞が、大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プロモーターが構成的または誘導性である、本発明1030の方法。
[本発明1034]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1030の方法。
[本発明1035]
CRMコード配列が、CRM197をコードする、本発明1030の方法。
[本発明1036]
組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている、本発明1030の方法。
[本発明1037]
改変された組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1036の方法。
[本発明1038]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサー配列を含む、本発明1030の方法。
[本発明1040]
スペーサーが、9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1042]
発現ベクターが、発現エンハンサーを含む、本発明1030の方法。
[本発明1043]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位と開始コドンとを含む、本発明1030の方法。
[本発明1044]
単離する段階が以下を含む、本発明1030の方法：
ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムに、CRMタンパク質を負荷する段階、
一種または複数種の洗浄バッファーで該樹脂を洗浄する段階、
溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階。
[本発明1045]
ローディングバッファーおよび洗浄バッファーが同じであってもよい、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ローディングバッファーおよび一種または複数種の洗浄バッファーが、約10 mS/cm以下の伝導率を有する低伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1047]
溶出バッファーが、約10 mS/cm以上の伝導率を有する高伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1048]
樹脂が、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂からなる群より選択される、本発明1044の方法。
[本発明1049]
以下を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法：
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および
測定された結合の量によって、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が正しい折りたたみを示す、前記段階。
[本発明1050]
ジフテリア毒素またはCRMが受容体結合ドメインを含有する、本発明1049の方法。
[本発明1051]
CRMタンパク質がCRM197を含む、本発明1049のCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法。
[本発明1052]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質およびHB-EGFのうちの少なくとも一つが、固相支持体に結合されている、本発明1049の方法。
[本発明1053]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量が、ELISAにより決定される、本発明1049の方法。
[本発明1054]
HB-EGFに結合するCRMタンパク質がPBSにおいて可溶性であり、かつ約pH7.5のバッファー中5 mg/ml以上に濃縮される、本発明1049の方法。
[本発明1055]
プロモーターと、それぞれがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンとを含む発現ベクターであって、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードし、各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有している、前記発現ベクター。
[本発明1056]
リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含む、本発明1055の発現ベクター。
[本発明1057]
スペーサーが、5〜20ヌクレオチドを含む、本発明1056の発現ベクター。
[本発明1058]
スペーサーが9ヌクレオチドを含まない、本発明1056の発現ベクター。
本発明の別の態様および利点は、一部は以下の説明に記述されており、および一部はこの説明から自明であるか、または本発明の実施から認識されるであろう。