(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む精子低温保護剤。
【請求項２】
炭素数１０〜１３の脂肪族炭化水素を含む請求項１記載の保護剤。
【請求項３】
脂肪族炭化水素がデカンである請求項１記載の保護剤。
【請求項４】
炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む保護剤の存在下で精子を冷却する工程を含む精子の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、精子の低温保存に有用な保護剤に関するものである。また、本発明は、精子の生理的機能を実質的に保持したまま低温で保存する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
精子の低温保存のための保護剤として、従来、卵黄やその成分等が用いられている。これらは、急速冷却によって生じるコールドショック防止効果も有することが知られている。また、ナフタレンや  ＢＨＴ  （２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−  クレゾール）  等の芳香族化合物が、精子のコールドショックを防止し、その生理的機能を保護する作用を有することが知られている  （Ｂａｍｂａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｙａｇａｗａ，  Ｎ．，  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２９，  ｐｐ．５３３−５３６，  １９９２）。しかしながら、上記の保護剤はいずれも保護性能が十分とはいえず、特に、ＢＨＴ  は精子の運動性を抑制する作用が高く、精子の生理的機能を損なう可能性があった。一方、５  ℃での通常の低温保存には、コールドショック防止における至適濃度よりかなり低い濃度でも効果が見られることがＢＨＴ  で証明されている  （Ｂａｍｂａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｇｒａｎ，  Ｄ．Ｇ．，  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔ．，  ９５，  ｐｐ．６９−７７，  １９９２）  。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、精子の生理的機能を実質的に保持したまま低温保存するために有用な保護剤を提供することにある。また、本発明の別な目的は、上記の保護剤を用いて精子の生理的機能を実質的に保持したまま低温保存する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、デカン等の炭化水素類を用いることにより、精子を２−３  ℃に急速冷却することによるコールドショックを加えた後にも、精子の生理的機能が実質的に保持されることを見出した。本発明は上記の知見を基に完成されたものである。
すなわち本発明によれば、炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む精子低温保護剤、ならびに、その好ましい態様として、炭素数１０〜１３の脂肪族炭化水素を含む上記の保護剤；及び脂肪族炭化水素がデカンである上記の保護剤が提供される。また、本発明の別な態様によれば、炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素の存在下で精子を急速冷却する方法、並びに炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素の存在下で精子を冷却する工程を含む精子の保存方法が提供される。
【０００５】
本発明は、保存等の目的で精子を冷却、好ましくは急速冷却するにあたり、精子のコールドショック防止剤として有用な保護剤を提供するものであり、保護剤の有効成分として炭素数８〜１３、好ましくは炭素数１０〜１３の脂肪族炭化水素を用いることを特徴としている。炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素としては、直鎖または分枝のオクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカンであるアルカン類、あるいはこれらのアルカン類に任意の数の二重結合あるいは三重結合が導入されたアルケン類またはアルキン類を用いることができる。これらのうちデカンを用いることが好ましい。また、本発明の方法により好適に冷却保存できる細胞としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ等の哺乳類動物由来の精子を挙げることができる。
【０００６】
本発明の方法に従って精子を低温保存する方法の一例として、採取した精液の精子濃度を例えば１  ｍｌあたり約  ４×１０８  個程度になるように調節し、さらに本発明の保護剤を適宜の濃度となるように添加して、約  ２〜１０℃、好ましくは  ５℃程度の低温で保存する方法を挙げることができる。精液の精子濃度の調節には、精漿や生理食塩水等を希釈液として用いることができる。精液の希釈方法としては、例えば、濃厚部精液と希薄部精液とを分画採取し、希薄部精液を  １２００  ×Ｇ  程度で  １５  分間遠心分離して得た精漿を用いて濃厚部精液を希釈する方法を挙げることができる。上記の濃度調整工程は、２０〜３０℃、好ましくは２５℃で行えばよい。
【０００７】
本発明の保護剤は、有効成分である炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素の濃度が  ０．２５  〜４  ％  （Ｖ／Ｖ）  、好ましくは約  １％  （Ｖ／Ｖ）  となるように添加すればよい。炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素は、上記の濃度調整後の精液に対して必要量を直接添加してもよいが、上記の希釈液に必要量をあらかじめ添加しておいてもよい。あるいは、精液を適宜希釈した後に、炭化水素の希釈液を添加して所定の濃度の精液を調製してもよい。炭化水素の希釈液としては、ＢＴＳ  （Ｐｕｒｓｅｌ，  Ｖ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．，  ４０，  ｐｐ．９９−１０２，  １９７５）等を用いることができる。本発明の保護剤と精液との混合は２０〜３７℃、好ましくは  ２５  ℃で行えばよい。その後、混合液を所定の低温に冷却して精子を低温保存する。
【０００８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
（１）  精液採取
大ヨークシャー種、ランドレース種、デュロック種から手掌圧迫法により濃厚部精液と希薄部精液を分画採取した。精液を採取した後、約３０℃で保温して２時間以内に下記の操作に供した。
（２）  精子濃度調整
濃厚部精液の精子濃度をトーマ血球計算板で測定した後、希薄部精液を  １２００  ×Ｇ  で１５分間遠心分離して得た精漿を加え、精子濃度が  ４×１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整した。
【０００９】
（３）  保護剤による処理
基本希釈液には  ＢＴＳ（Ｐｕｒｓｅｌ，  Ｖ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．，  ４０，  ｐｐ．９９−１０２，  １９７５，  成分  （ｍｇ／１００  ｍｌ）：Ｄ−グルコース：  ３７００；  クエン酸ナトリウム：  ６００；  ＮａＨＣＯ３；  ＥＤＴＡ−２Ｎａ：  １２５；  ＫＣｌ：  ７５；    硫酸ジベカシン：  １０）  を用いた。ナフタレンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してＢＴＳ  に  ２％  （ｖ／ｖ）  となるように添加した。原精液は等量のナフタレン添加  ＢＴＳ溶液と３７℃で５分間インキュベートした。ナフタレンの精子処理濃度は０．５  ｍＭとした。
一方、本発明の保護剤またはその他のアルカン類を  ＢＴＳに  ２％  となるように添加し、３７℃で原精液と１：１  の割合となるように希釈した。３７℃で５分間インキュベートする間に１分間にわたり手で激しく振盪攪拌した。各保護剤の処理濃度は  １％  （Ｖ／Ｖ）  とした。
【００１０】
（４）  コールドショック
３７℃の精液  １  ｍｌ  をガラス製小試験管  （１０×  ６０  ｍｍ）  にとり、直接  ２〜３  ℃の恒温水槽に移し、１０分間インキュベートすることによりコールドショックを与えた。
（５）  精子の評価
コールドショックの前後に精子運動率と頭帽正常率は以下の方法で調べた。
精子運動率：無水カフェイン（約２０μｇ／ｍｌ）  を塗布したスライドガラスの上に精液１０μｌ  をとり、カバーグラス（１８  ×  １８ｍｍ）で覆い、３７℃に温度制御した位相差顕微鏡下で運動精子の割合を判定した。
頭帽正常率：精液を３７℃の  １％  （ｖ／ｖ）  ホルマリン含有  ＢＴＳ溶液で希釈し、位相差顕微鏡  （×７５０）下で観察した。各区ごとに  ２００個の精子を観察し、正常頭帽と異常頭帽の精子とに分類し、正常頭帽精子の割合（％）  を頭帽正常率とした。
【００１１】
（６）  推計学的分析
推計学的分析は、精子運動率、頭帽正常率について全て角変換（Ａｒｃ  ｓｉｎ√％）した後、分散分析を行った。更に、各区間の差については  Ｔｕｋｅｙの方法  （Ｓｔｅｅｌ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｉｅ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって有意水準を検定した。各試験結果を３回の試験平均±標準偏差  （ＳＤ）  で表１に示した。なお、上記の各試験の詳細は、番場らの文献  （Ｂａｍｂａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｙａｇａｗａ，  Ｎ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｏｌｄ−Ｓｈｏｃｋ  Ｉｎｊｕｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｏａｒ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２９，  ｐｐ．５３３−５３６，  １９９２）  に記載されている。
【００１２】
【表１】
0003586797.tif 000002
【００１３】
コールドショック前の精子運動率については、オクタンおよびノナンを添加した場合に無添加の場合に比べて運動率が抑制され、運動性のパターンの変化、すなわち前進運動性の低下または消失がみられた。一方、本発明の保護剤であるデカン、ドデカンを用いた場合には精子運動率の抑制はみられなかった。コールドショック前の精子の頭帽正常率についてはナフタレンを添加した場合が最も低かった。アルカンの中ではオクタンで低下したが、他のアルカン類では顕著な影響がみられなかった。ナフタレンと比較した場合には、トリデカン、ヘキサデカンが有意に高い結果を示した（Ｐ＜０．０５）  。これらの結果は、Ｃ１０  〜Ｃ１６  のアルカン類が豚精子に対して無害である事を示している。
【００１４】
一方、コールドショック後の精子運動率と頭帽正常率を比較した場合、無添加区に比べてナフタレン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカンが有意に高い結果を示した（Ｐ＜０．０１）  。これらの結果から、Ｃ８〜Ｃ１３  のアルカンがコールドショック防止効果を示すことが明らかである。特に、デカンはナフタレンよりも運動率と頭帽正常率について共に高い値を示し、高いコールドショック防止効果を示した。
以上の結果によれば、炭素数８〜１３の脂肪族炭化水素を含む本発明の保護剤が精子のコールドショック処理後にも精子の生理的機能を実質的に損なわないことが明らかである。
【００１５】
【発明の効果】
本発明により、精子を冷却時のコールドショックから保護し、その生理的機能を実質的に損なわない保護剤が提供された。