(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中ラクトフェリンおよび尿中ミエロペルオキシダーゼを測定対象にすることを特徴とする腎・尿路系疾患の鑑別診断用キット。
【請求項２】
免疫学的測定法を用いることを特徴とする請求項１に記載の腎・尿路系疾患の鑑別診断用キット。
【請求項３】
少なくとも、抗ラクトフェリン抗体と酵素標識抗ラクトフェリン抗体および抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体と酵素標識抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体と前記酵素測定用の試薬とを備え、免疫学的測定法によって尿中ラクトフェリンおよびミエロペルオキシダーゼ濃度を測定して尿路系疾患の診断をすることを特徴とする腎・尿路系疾患鑑別診断用キット。
【請求項４】
尿中ラクトフェリン濃度および尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度の各カットオフ値を、それぞれ105ng/ml、95ng/ml程度にすることを特徴とする請求項３に記載の腎・尿路系疾患の鑑別診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、腎・尿路系疾患の鑑別診断用キットに関し、特に、尿中のラクトフェリン、ミエロペルオキシダーゼおよびＣＥＡを測定対象として、該項目を複合測定することにより、腎と下部尿路系疾患を確実に鑑別診断するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎・尿路系の疾患を診断する上で重要な検査法として、尿沈渣がある。尿沈渣所見を十分得ることによって、腎における組織学的変化が推定できる。例えば、一般検尿で潜血反応が陽性の場合には、尿沈渣で赤血球の有無とその形態を観察することによって、その原因が血尿によるものか、他の色素尿によるものか、あるいは糸球体由来の血尿か、泌尿器科的疾患による血尿か鑑別できる。つまりこの方法は尿中の赤血球を観察することにより、腎・尿路系の疾患を鑑別しようとするものである。
一方、腎疾患の早期発見のマーカーとして尿中の微量蛋白を検出する方法が広く用いられている。アルブミン、トランスフェリン、プレアルブミンが測定対象とされ、特にトランスフェリンが腎の早期病変を反映するとの評価がある。また、尿路感染症は主として細菌の上行性感染により起こり、尿中に細菌とともに白血球が出現するため、その診断には尿沈渣の鏡検や尿の細菌学的検査が行われる。尿沈渣の鏡検（×４００）で白血球が５コ／ＨＰＦ以上検出されれば尿路感染症の存在が疑われ、膀胱や腎盂から直接得られた尿中に細菌を証明すれば診断は確定するが、膀胱や腎盂を直接穿刺して採尿することはむしろまれで、中間尿が採取されることが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、尿沈渣で尿中赤血球を観察することにより腎・尿路系の疾患を鑑別する方法では、変形赤血球と非変形赤血球を形態で見分ける作業が困難で技術的に熟練を要す。
尿中の微量蛋白を検出する腎病変の早期診断法についても感度的に十分とはいえない。
また、尿路感染症の診断法で尿中に細菌を証明する方法については、一般的に用いられる検体としての中間尿では尿道や外陰部の常在菌が混入する可能性があるため、１０５  ＣＦＵ／ｍｌ以上を有意の細菌尿とし１０３  ＣＦＵ／ｍｌ以下を汚染尿とすることが一般的である。このため尿路感染症の診断には尿中細菌の定量培養を行い、尿１ｍｌ中の細菌数を測定する必要があり繁雑で一般的に行える検査とは言いがたい。さらに、尿中の白血球も崩壊が激しいため沈渣鏡検法での成績の信頼度は低い。
この発明はこれらの問題点に着目してなされたものであって、上記の従来の方法にかわる新しい検査方法によって、腎・尿路系疾患の鑑別診断用キットを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成する為、この発明では、尿中の白血球の顆粒内成分と尿路系粘膜上皮細胞が産生するＣＥＡを測定対象にしている。
顆粒内成分としては、ラクトフェリン、顆粒球エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、リゾチーム、カテプシンＧ、プロナーゼ３などが該当するが、特にラクトフェリンやミエロペルオキシダーゼを測定対象とすることが望ましい。また、尿路系粘膜上皮細胞が産生するＣＥＡ以外にも分泌型ＩｇＡ  が測定対象として考えられるが、病原細菌の侵入を防御する成分としてはＣＥＡを測定対象とすることが望ましい。
なお、ラクトフェリンやミエロペルオキシダーゼ、ＣＥＡを検出するには、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫法（ＲＩＡ法）、発光酵素免疫法、ラッテクス凝集反応、金コロイド法など日常、多用されている免疫学的測定法を用いることができる。
【０００５】
腎炎において、多数の湿潤細胞（白血球）が糸球体内に集合することから、白血球の顆粒内成分のうち、尿に排泄しやすい成分（この時白血球は糸球体で崩壊するため尿中には排泄されない）と、排泄が困難な成分があれば、排泄しやすい成分を測定することにより腎の病変を早期に検出できると考えた。しかし、尿路感染症時には尿路に白血球が多数湿潤するために、尿中には白血球の顆粒成分が全て存在することになるので、白血球に存在を示すマーカー（腎炎時に糸球体に湿潤した白血球の顆粒内成分のなかで尿に排泄されない成分が適当）を設定する必要がある。この二種類の顆粒内成分を同時に測定すれば、理論的には腎・尿路系病変の鑑別診断が可能と考えられた。
白血球顆粒内成分の中でラクトフェリンが前者（尿中に排泄されやすい）として適当であり、ミエロペルオキシダーゼが後者（尿中に排泄されない、ミエロペルオキシダーゼは分子量が約１４０Ｋと大きく、また糸球体基底膜のヒアルロン酸に付着するため尿中に排泄されない）として適当であることを発見した。
【０００６】
若年者の腎疾患の早期診断法として学校検尿が実施されている。この検診で発見される腎炎の発症年齢は８０％の症例で１１〜１５才であることが知られている。
保育園児から高校生、社会人までの各年齢群について、尿中のラクトフェリンとミエロペルオキシダーゼを測定した結果、小学校４年生までの群（ｎ＝６４０）では、尿中ラクトフェリンとミエロペルオキシダーゼが良好な相関をもって存在する（白血球の存在を意味する）ことが解り、小学校５年生以上の群（ｎ＝７２０）でミエロペルオキシダーゼは低値にもかかわらず、ラクトフェリンが異常に高値を示す症例が認められた。（図１）
また尿中ラクトフェリン、ミエロペルオキシダーゼ共に正常な群と、ミエロペルオキシダーゼが低値でラクトフェリンのみ高値を示す群について尿中トランスフェリン（腎炎の早期診断マーカーとして、蛋白成分のなかでは最も感度が高いといわれている）濃度を比較した結果、ラクトフェリンのみ高値群でトランスフェリンが有意に高値を示した。（図２）この場合のトランスフェリン濃度はいずれも正常範囲内であったことから、尿中ラクトフェリン濃度を指標とする腎炎の早期診断の有用性が示唆された。
さらに尿中ミエロペルオキシダーゼが高値を示す場合は尿路系（腎から下）に白血球が存在することを意味するが、尿路感染症による白血球の増多か否かの鑑別にはＣＥＡを測定すれば良い。ＣＥＡは尿路系粘膜上皮細胞で産生され、その役割は病原微生物が生体内に侵入するのを防御する成分であるので、尿路感染症時には増加することが考えられる。尿中白血球陰性群と陽性群について、尿中のＣＥＡ濃度を比較すると白血球陽性群でＣＥＡ濃度が有意に高値を示した。（図３）
以上のごとく、尿中のラクトフェリンとミエロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼとＣＥＡを測定することにより腎・尿路系の疾患が鑑別できる。
【０００７】
【実施例】
（Ａ）尿試料の作成
トリトンＸ−１００を０．１％含む生理食塩水で２倍希釈した尿を試料とした。
（Ｂ）ＥＬＩＳＡによるラクトフェリンの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ，Ｊａｐａｎ  ）の各ｗｅｌｌに、抗ヒトラクトフェリン抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）  ５μｇ／ｍｌを含む０．１  ＭＴｒｉｓ緩衝液を１００  μｌづつ分注し、一夜４℃で放置して物理吸着させて表面に固相化する。    〔酵素標識抗体の調整〕
別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）を抗ヒトラクトフェリン抗体に酵素標識して調整する。
〔尿中ラクトフェリン測定〕
各ｗｅｌｌに１００  μｌの１％ＢＳＡ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）を含むＴｒｉｓ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ  ｐＨ８．０）を分注し、次いで、５０μｌの尿試料を加え、混和した後、３７℃で１時間反応させる。
次にＴｗｅｅｎ  ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトラクトフェリン抗体溶液（１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液）を各ｗｅｌｌに１００  μｌづつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
さらにＫｉｎｇ−Ｋｉｎｇ法の基質緩衝液１００  μｌを各ｗｅｌｌに加え、３７℃で３０分間反応させる。ここで基質緩衝液は、Ｓｉｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｅｎｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＷＡＫＯ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ製）０．２１５ｇ  と４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（ＷＡＫＯ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ  製）０．０９ｇを、炭酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／ｌ  ｐＨ１０．１５）１００ｍｌに溶解したものである。
次いで、１００  μｌの呈色液を各ｗｅｌｌに加えて呈色させる。ここで呈色液は、２００  ｍｌの脱イオン水に２．６ｇのホウ酸（ＷＡＫＯ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ  製）  を溶解させた後、０．３８ｇ  のＰｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｄｅ（ＷＡＫＯ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ製）  を溶解させたものである。
最後に、各ｗｅｌｌの呈色をマイクロプレート用比色計（Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ製）  を用いて５１０／６８０ｎｍ  の波長光で比色し、検量線から尿中のラクトフェリン濃度を算出する。
【０００８】
（Ｃ）ミエロペルオキシダーゼの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ，Ｊａｐａｎ）  の各ｗｅｌｌに、抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）５μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  緩衝液を１００  μｌづつ分注し、一夜４℃で放置して物理吸着させて表面に固相化する。
〔酵素標識抗体の調整〕
別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）  を抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体に酵素標識して調整する。
〔尿中ミエロペルオキシダーゼ測定〕
各ｗｅｌｌに１００  μｌの１％ＢＳＡ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）  を含むＴｒｉｓ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ  ｐＨ８．０）を分注し、次いで、５０μｌの尿試料を加え、混和した後、３７℃で１時間反応させる。
次にＴｗｅｅｎ  ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体溶液（１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液）を各Ｗｅｌｌに１００  μｌづつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
さらにＫｉｎｇ−Ｋｉｎｇ法の基質緩衝液１００  μｌを各ｗｅｌｌに加え、３７℃で３０分間反応させる。
次いで、１００  μｌの呈色液を各ｗｅｌｌに加えて呈色させる。最後に、各ｗｅｌｌの呈色をマイクロプレート用比色計（Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ製）  を用いて５１０／６８０ｎｍ  の波長光で比色し、検量線から尿中のミエロペルオキシダーゼ濃度を算出する。
【０００９】
（Ｄ）尿中ＣＥＡの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ，Ｊａｐａｎ）  の各ｗｅｌｌに、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（特殊免疫、ＮＣＡと交差反応を示さない）５μｇ／ｍｌを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  緩衝液を１００  μｌづつ分注し、一夜４℃で放置させて表面に固相化する。
〔酵素標識抗体の調整〕
別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）  を抗ヒトＣＥＡ抗体（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ，Ｄｅｎｍａｒｋ）  に酵素標識して調整する。
〔尿中ＣＥＡ測定〕
各ｗｅｌｌに１００  μｌの１％ＢＳＡ（Ｂｅｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ）  を含むＴｒｉｓ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ  ｐＨ８．０）を分注し、次いで、５０μｌの尿試料を加え、混和した後、３７℃で１時間反応させる。
次にＴｗｅｅｎ  ２０を０．０５％含む脱イオン水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＣＥＡ抗体溶液（１％ＢＡＥを含むトリス緩衝液）を各ｗｅｌｌに１００  μｌづつ加え混和した後３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
さらにＫｉｎｇ−Ｋｉｎｇ法の基質緩衝液１００  μｌを各ｗｅｌｌに加え、３７℃で３０分間反応させる。
次いで、１００  μｌの呈色液を各ｗｅｌｌに加えて呈色させる。最後に、各ｗｅｌｌの呈色をマイクロプレート用比色計（Ｓａｎｋｏ  Ｊｕｎｙａｋｕ  Ｊａｐａｎ製）  を用いて５１０／６８０ｎｍ  の波長光で比色し、検量線から尿中のＣＥＡ濃度を算出する。
【００１０】
（Ｅ）尿中ミエロペルオキシダーゼ、ラクトフェリン、ＣＥＡカットオフ値
健常人尿中のミエロペルオキシダーゼ濃度は２７．０±３４．１ｎｇ／ｍｌであり、カットオフ値は９５ｎｇ／ｍｌと設定した。尿中ラクトフェリン濃度は３１．１±３６．２ｎｇ／ｍｌでありカットオフ値は１０５ｎｇ／ｍｌと設定した。また尿中ＣＥＡ濃度は３．８±２．１ｎｇ／ｍｌであり、カットオフ値は８．０ｎｇ／ｍｌと設定した。
（Ｆ）判定
▲１▼尿中ラクトフェリン濃度と、尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度の測定結果から、以下の（ａ）〜（ｃ）に振り分ける。
（ａ）  尿中ラクトフェリン濃度（Ｌｆ）が１０５ｎｇ／ｍｌ以下で、尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度（ＭＰＯ）が９５ｎｇ／ｍｌ以下の場合は、正常と判定する。
（ｂ）  尿中ラクトフェリン濃度（Ｌｆ）が１０５ｎｇ／ｍｌ以上で、尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度（ＭＰＯ）が９５ｎｇ／ｍｌ以下の場合であって、ＭＰＯ／Ｌｆが０．２未満であれば、腎炎の可能性が大であると判定する。
（ｃ）  尿中ラクトフェリン濃度（Ｌｆ）が１０５ｎｇ／ｍｌ以上で、尿中ミエロペルオキシダーゼ濃度（ＭＰＯ）が９５ｎｇ／ｍｌ以上の場合は、尿路感染症の疑いがある。
▲２▼上記した（ｃ）の場合には、さらに尿中ＣＥＡ濃度を測定して、これが８．０ｎｇ／ｍｌ以上であれば、尿路感染症の可能性が大であると判定する。
▲３▼なお、予め尿路感染症と診断がついている場合は、ＭＰＯとＣＥＡのみを測定して経過観察をする。
【００１１】
【発明の効果】
以上説明したように、尿中の白血球の顆粒内成分、特にラクトフェリンやミエロペルオキシダーゼおよびＣＥＡを測定対象として、組み合わせ測定すれば、腎・尿路系疾患の鑑別診断が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】尿中ラクトフェリンとミエロペルオキシダーゼの相関図である。
【図２】尿中ラクトフェリン濃度と尿中トランスフェリン濃度の関係を図示したものである。
【図３】尿中白血球陰性群と陽性群について、尿中のＣＥＡ濃度を比較した結果を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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