【手続補正書】
【提出日】平成28年12月21日(2016.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球から血小板を生成するための方法であって、
ａ）巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；
ｂ）該巨核球をＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ；および
ｃ）該血小板を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
巨核球から血小板を生成するための方法であって、
巨核球の非接着性培養物を提供するステップ；
該巨核球を、造血拡大増殖培地ならびに任意選択で（１）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または（２）ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１と接触させて、培養中において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ；および
該血小板を単離するステップ
を含む方法。
【請求項３】
前記ＴＰＯアゴニストが、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビン、コラーゲン、ＴＰＯ−Ｒアゴニスト、ＴＰＯ模倣物、第２世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ（ＳＢ４９７１１５、Ｐｒｏｍａｃｔａ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）、Ｆａｂ  ５９、ＡＭＧ  ５３１、Ｐｅｇ−ＴＰＯｍｐ、ＴＰＯ非ペプチド模倣物、ＡＫＲ−５０１、モノクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ポリクローナルＴＰＯアゴニスト抗体、ＴＰＯミニボディ、ＶＢ２２Ｂ  ｓｃ（Ｆｖ）２、ドメインサブクラス変換ＴＰＯアゴニスト抗体、ＭＡ０１Ｇ４Ｇ３４４、組換えヒトトロンボポエチン、組換えＴＰＯ融合タンパク質またはＴＰＯ非ペプチド模倣物のうち１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
実質的に全ての前記単離された血小板が機能的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
巨核球の前記非接着性培養物が、フィーダーフリーの培養物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）における前記培養が、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）および１０〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、ならびに／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）における前記培養が、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビター、および／または２．５〜２５単位／ｍｌのヘパリンのうち１つまたは複数を含む培地中である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のＲＯＣＫインヒビターがＹ２７６３２を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｙ２７６３２が、２〜２０μＭ、約３〜１０μＭ、約４〜６μＭまたは約５μＭの濃度内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記巨核球を剪断力に供するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
巨核球１個当たり少なくとも２個、３個、４個または５個の血小板が生成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
巨核球１個当たり少なくとも５０個の血小板が生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
巨核球１個当たり少なくとも１００個、５００個、１０００個、２０００個、５０００個または１００００個の血小板が生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血小板の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、ＣＤ４１ａ＋およびＣＤ４２ｂ＋である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記血小板が、フィーダー細胞または間質フィーダー細胞の非存在下で生成される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血小板が、全ての異種細胞の非存在下で生成される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記血小板がヒトのものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記巨核球が、外因的に添加されたプロテアーゼインヒビターの存在下で培養される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰインヒビターの存在下で培養される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰ８インヒビターの存在下で培養される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記巨核球が、外因的に添加されたＭＭＰ８特異的インヒビターおよび汎ＭＭＰインヒビターの存在下で培養される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記巨核球が、約３９℃の温度で培養される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記巨核球が、
多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞（ＰＶＥ−ＨＥ）を形成するステップ；
該造血性内皮細胞を培養して、ＭＬＰを形成するステップ；および
該ＭＬＰを培養して、巨核球を形成するステップ
を含むステップによって生成される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＥＴインヒビターが、ステップ（ｂ）における前記培養物に添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢＥＴインヒビターがＩＢＥＴ１５１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多能性幹細胞がヒトのものである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｉＰＳＣがヒトのものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記造血性内皮細胞が、１％〜１０％の酸素、２％〜８％の酸素、３％〜７％の酸素、４％〜６％の酸素または約５％の酸素を含む低酸素条件下で、前記多能性幹細胞から分化させられる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＬＰが、３８〜４０セルシウス度の間の温度、または約３９セルシウス度の温度で培養されて、巨核球を形成する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成された血小板を含む医薬調製物。
【請求項３４】
ヒト患者における使用に適切であり、少なくとも１０８個の血小板を含む、請求項３３に記載の調製物。
【請求項３５】
ヒト患者における使用に適切であり、白血球を実質的に含まない、請求項３３に記載の調製物。
【請求項３６】
前記請求項のいずれかに記載の組成物または前記請求項のいずれかに記載の方法によって生成された組成物の使用であって、それを必要とする患者あるいは凝固に影響する疾患もしくは障害に罹患している患者またはそれによって処置可能な疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における使用。
【請求項３７】
前記疾患または障害が、血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
巨核球またはＭＬＰから血小板を生成するための方法であって、
プロテアーゼインヒビターの存在下において、剪断力条件下で、ＭＬＰの巨核球の非接着性集団を培養するステップ、および
該培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップ
を含む方法。
【請求項３９】
前記プロテアーゼインヒビターがＭＭＰインヒビターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記剪断力条件が一定の剪断力条件である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記剪断力条件が、１〜４．１ダイン／ｃｍ２の剪断力を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記巨核球またはＭＬＰが、マイクロ流体デバイス中で培養される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記巨核球またはＭＬＰが、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または天然に存在するＣＤ３４＋細胞、任意選択で、骨髄もしくは臍帯血ＣＤ３４＋細胞から誘導される、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロテアーゼインヒビターがＧＭ６００１である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記プロテアーゼインヒビターがＭＭＰ８特異的インヒビターである、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＭＭＰ８特異的インヒビターが、ＭＭＰ８−Ｉ（（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
２種またはそれより多くのプロテアーゼインヒビターが使用される、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記２種のプロテアーゼインヒビターが、ＭＭＰ一般的インヒビターおよびＭＭＰ８特異的インヒビターである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プロテアーゼインヒビターが、前記培養物内の血小板のピーク生成の時点で添加される、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記巨核球またはＭＰＬが、ＴＰＯまたはＴＰＯアゴニストの存在下で培養されて、前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記巨核球またはＭＰＬが、造血拡大増殖培地中、および任意選択で
ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−９または
ＴＰＯもしくはＴＰＯアゴニスト、ＳＣＦおよびＩＬ−１１
中で培養されて、培養において前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記巨核球またはＭＰＬが、３７℃よりも高く４０℃と等しいかまたはそれより低い温度で培養される、請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記巨核球またはＭＰＬが約３９℃の温度で培養される、請求項５２に記載の方法。