【手続補正書】
【提出日】平成29年7月24日(2017.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（ＧＨ６１）酵素の変異体であって、前記変異体は、セルラーゼ活性を有し、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつ（ａ）発現、（ｂ）熱安定性及び／又はＴｍ、（ｃ）全加水分解産物希酸前処理トウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）加水分解アッセイの性能、並びに（ｄ）希アンモニア前処理トウモロコシ茎葉（ｄａＣＳ）加水分解アッセイの性能から選択される少なくとも１つにおいて、前記親ＧＨ６１酵素よりも向上した性質を有し、前記変異体は、配列番号３のアミノ酸１１１〜１１４及び１４４〜１６３に対応する１つ又は２つ以上の位置にて、少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、変異体。
【請求項２】
前記変異体は、向上した熱安定性及び／又はＴｍを有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｆ、Ｌ１４８Ｐ、Ａ１４９Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｖ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｑ、Ｎ１５２Ｓ、Ｎ１５２Ｙ、Ｌ１５５Ｍ、Ｒ１５６Ｓ、Ｈ１５７Ｗ、Ｅ１５８Ｗ、Ｅ１５８Ｙ、Ｉ１５９Ｑ、Ｉ１６０Ｄ、Ｉ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｅ、Ａ１６１Ｌ、Ａ１６１Ｙ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１６２Ｆ、Ｈ１６３Ｌ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体は、ｗｈＰＣＳ加水分解アッセイにて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｉ１４４Ｋ、Ｉ１４４Ｒ、Ｉ１４４Ｓ、Ｐ１４５Ｇ、Ｐ１４５Ｈ、Ｐ１４５Ｉ、Ｐ１４５Ｋ、Ｐ１４５Ｒ、Ｐ１４５Ｓ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ１４６Ａ、Ｄ１４６Ｃ、Ｄ１４６Ｅ、Ｄ１４６Ｆ、Ｄ１４６Ｋ、Ｄ１４６Ｍ、Ｄ１４６Ｑ、Ｄ１４６Ｔ、Ｄ１４６Ｙ、Ｎ１４７Ｆ、Ｎ１４７Ｍ、Ｌ１４８Ｋ、Ｌ１４８Ｖ、Ａ１４９Ｃ、Ａ１４９Ｄ、Ａ１４９Ｆ、Ａ１４９Ｇ、Ａ１４９Ｉ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｖ、Ｐ１５０Ａ、Ｐ１５０Ｃ、Ｐ１５０Ｄ、Ｐ１５０Ｅ、Ｐ１５０Ｆ、Ｐ１５０Ｇ、Ｐ１５０Ｈ、Ｐ１５０Ｉ、Ｐ１５０Ｋ、Ｐ１５０Ｌ、Ｐ１５０Ｑ、Ｇ１５１Ｅ、Ｇ１５１Ｆ、Ｇ１５１Ｈ、Ｇ１５１Ｉ、Ｇ１５１Ｋ、Ｇ１５１Ｍ、Ｇ１５１Ｐ、Ｇ１５１Ｑ、Ｇ１５１Ｓ、Ｇ１５１Ｖ、Ｇ１５１Ｗ、Ｇ１５１Ｙ、Ｎ１５２Ｅ、Ｎ１５２Ｆ、Ｎ１５２Ｇ、Ｎ１５２Ｈ、Ｎ１５２Ｋ、Ｎ１５２Ｐ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｋ、Ｙ１５３Ｌ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｐ、Ｙ１５３Ｑ、Ｙ１５３Ｒ、Ｙ１５３Ｓ、Ｙ１５３Ｖ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｃ、Ｖ１５４Ｄ、Ｖ１５４Ｅ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｈ、Ｖ１５４Ｋ、Ｖ１５４Ｎ、Ｖ１５４Ｐ、Ｖ１５４Ｑ、Ｖ１５４Ｒ、Ｖ１５４Ｔ、Ｌ１５５Ｃ、Ｌ１５５Ｆ、Ｌ１５５Ｋ、Ｌ１５５Ｍ、Ｌ１５５Ｎ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｃ、Ｒ１５６Ｄ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｆ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｉ、Ｒ１５６Ｋ、Ｒ１５６Ｌ、Ｒ１５６Ｍ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ｑ、Ｈ１５７Ｄ、Ｅ１５８Ａ、Ｅ１５８Ｃ、Ｅ１５８Ｄ、Ｅ１５８Ｆ、Ｅ１５８Ｈ、Ｅ１５８Ｉ、Ｅ１５８Ｌ、Ｅ１５８Ｍ、Ｅ１５８Ｎ、Ｅ１５８Ｐ、Ｅ１５８Ｓ、Ｅ１５８Ｔ、Ｅ１５８Ｗ、Ａ１６１Ｃ、Ｌ１６２Ｉ、Ｌ１６２Ｎ、Ｈ１６３Ａ、Ｈ１６３Ｃ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｅ、Ｈ１６３Ｆ、Ｈ１６３Ｇ、Ｈ１６３Ｉ、Ｈ１６３Ｋ、Ｈ１６３Ｍ、Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１６３Ｒ、Ｈ１６３Ｔ、Ｈ１６３Ｖ、Ｈ１６３Ｗ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体は、ｄａＣＳ加水分解アッセイにおいて向上した性能を有し、前記少なくとも１個のアミノ酸置換は、Ｆ１１２Ｖ、Ｋ１１３Ｌ、Ｋ１１３Ｍ、Ｋ１１３Ｎ、Ｋ１１３Ｒ、Ｋ１１３Ｓ、Ｉ１１４Ｆ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１４４Ｆ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１４５Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｖ１５４Ｔ、Ｈ１６３Ｄ、Ｈ１６３Ｙ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１、２、又は３に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体は、Ｆ１１２Ｍ、Ｆ１１２Ｗ、Ｋ１１３Ｐ、Ｋ１１３Ｔ、Ｉ１１４Ｌ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１４４Ａ、Ｉ１４４Ｃ、Ｉ１４４Ｄ、Ｉ１４４Ｅ、Ｉ１４４Ｈ、Ｉ１４４Ｎ、Ｉ１４４Ｐ、Ｉ１４４Ｑ、Ｉ１４４Ｔ、Ｉ１４４Ｗ、Ｉ１４４Ｙ、Ｐ１４５Ｃ、Ｐ１４５Ｄ、Ｐ１４５Ｅ、Ｐ１４５Ｆ、Ｐ１４５Ｌ、Ｐ１４５Ｍ、Ｐ１４５Ｎ、Ｐ１４５Ｑ、Ｐ１４５Ｔ、Ｐ１４５Ｗ、Ｐ１４５Ｙ、Ｄ１４６Ｇ、Ｄ１４６Ｈ、Ｄ１４６Ｉ、Ｄ１４６Ｌ、Ｄ１４６Ｎ、Ｄ１４６Ｐ、Ｄ１４６Ｒ、Ｄ１４６Ｓ、Ｄ１４６Ｖ、Ｄ１４６Ｗ、Ｎ１４７Ａ、Ｎ１４７Ｃ、Ｎ１４７Ｄ、Ｎ１４７Ｅ、Ｎ１４７Ｇ、Ｎ１４７Ｈ、Ｎ１４７Ｉ、Ｎ１４７Ｋ、Ｎ１４７Ｌ、Ｎ１４７Ｐ、Ｎ１４７Ｑ、Ｎ１４７Ｒ、Ｎ１４７Ｓ、Ｎ１４７Ｔ、Ｎ１４７Ｖ、Ｎ１４７Ｗ、Ｎ１４７Ｙ、Ｌ１４８Ａ、Ｌ１４８Ｃ、Ｌ１４８Ｄ、Ｌ１４８Ｅ、Ｌ１４８Ｆ、Ｌ１４８Ｇ、Ｌ１４８Ｈ、Ｌ１４８Ｉ、Ｌ１４８Ｍ、Ｌ１４８Ｎ、Ｌ１４８Ｑ、Ｌ１４８Ｒ、Ｌ１４８Ｓ、Ｌ１４８Ｔ、Ｌ１４８Ｗ、Ｌ１４８Ｙ、Ａ１４９Ｅ、Ａ１４９Ｈ、Ａ１４９Ｋ、Ａ１４９Ｌ、Ａ１４９Ｍ、Ａ１４９Ｑ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｓ、Ａ１４９Ｔ、Ａ１４９Ｗ、Ａ１４９Ｙ、Ｐ１５０Ｍ、Ｐ１５０Ｎ、Ｐ１５０Ｒ、Ｐ１５０Ｓ、Ｐ１５０Ｔ、Ｐ１５０Ｖ、Ｐ１５０Ｗ、Ｐ１５０Ｙ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５１Ｃ、Ｇ１５１Ｄ、Ｇ１５１Ｌ、Ｇ１５１Ｎ、Ｇ１５１Ｒ、Ｇ１５１Ｔ、Ｎ１５２Ａ、Ｎ１５２Ｃ、Ｎ１５２Ｄ、Ｎ１５２Ｉ、Ｎ１５２Ｌ、Ｎ１５２Ｍ、Ｎ１５２Ｒ、Ｎ１５２Ｔ、Ｎ１５２Ｖ、Ｎ１５２Ｗ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｃ、Ｙ１５３Ｄ、Ｙ１５３Ｅ、Ｙ１５３Ｇ、Ｙ１５３Ｈ、Ｙ１５３Ｉ、Ｙ１５３Ｎ、Ｙ１５３Ｔ、Ｙ１５３Ｗ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｉ、Ｖ１５４Ｌ、Ｖ１５４Ｍ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ｗ、Ｖ１５４Ｙ、Ｌ１５５Ａ、Ｌ１５５Ｄ、Ｌ１５５Ｅ、Ｌ１５５Ｇ、Ｌ１５５Ｈ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｐ、Ｌ１５５Ｑ、Ｌ１５５Ｒ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｔ、Ｌ１５５Ｖ、Ｌ１５５Ｗ、Ｌ１５５Ｙ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｎ、Ｒ１５６Ｔ、Ｒ１５６Ｖ、Ｒ１５６Ｗ、Ｒ１５６Ｙ、Ｈ１５７Ａ、Ｈ１５７Ｃ、Ｈ１５７Ｅ、Ｈ１５７Ｆ、Ｈ１５７Ｇ、Ｈ１５７Ｉ、Ｈ１５７Ｋ、Ｈ１５７Ｌ、Ｈ１５７Ｍ、Ｈ１５７Ｎ、Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１５７Ｑ、Ｈ１５７Ｒ、Ｈ１５７Ｓ、Ｈ１５７Ｔ、Ｈ１５７Ｖ、Ｈ１５７Ｙ、Ｅ１５８Ｇ、Ｅ１５８Ｋ、Ｅ１５８Ｒ、Ｅ１５８Ｖ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｃ、Ｉ１５９Ｄ、Ｉ１５９Ｅ、Ｉ１５９Ｆ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１５９Ｈ、Ｉ１５９Ｋ、Ｉ１５９Ｌ、Ｉ１５９Ｍ、Ｉ１５９Ｎ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ｓ、Ｉ１５９Ｔ、Ｉ１５９Ｖ、Ｉ１５９Ｗ、Ｉ１５９Ｙ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｃ、Ｉ１６０Ｅ、Ｉ１６０Ｇ、Ｉ１６０Ｈ、Ｉ１６０Ｋ、Ｉ１６０Ｌ、Ｉ１６０Ｍ、Ｉ１６０Ｎ、Ｉ１６０Ｐ、Ｉ１６０Ｑ、Ｉ１６０Ｒ、Ｉ１６０Ｓ、Ｉ１６０Ｔ、Ｉ１６０Ｖ、Ｉ１６０Ｗ、Ｉ１６０Ｙ、Ａ１６１Ｄ、Ａ１６１Ｆ、Ａ１６１Ｇ、Ａ１６１Ｈ、Ａ１６１Ｉ、Ａ１６１Ｋ、Ａ１６１Ｍ、Ａ１６１Ｎ、Ａ１６１Ｐ、Ａ１６１Ｑ、Ａ１６１Ｒ、Ａ１６１Ｓ、Ａ１６１Ｔ、Ａ１６１Ｖ、Ａ１６１Ｗ、Ｌ１６２Ｃ、Ｌ１６２Ｄ、Ｌ１６２Ｅ、Ｌ１６２Ｇ、Ｌ１６２Ｈ、Ｌ１６２Ｋ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６２Ｐ、Ｌ１６２Ｑ、Ｌ１６２Ｒ、Ｌ１６２Ｓ、Ｌ１６２Ｔ、Ｌ１６２Ｖ、Ｌ１６２Ｗ、Ｌ１６２Ｙ、Ｈ１６３Ｑ、Ｈ１６３Ｓ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の第２のアミノ酸置換を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体は、１〜１０個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体は、組み合わせ変異体である、請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
前記親ＧＨ６１ポリペプチドは、真菌グリコシルヒドロラーゼ６１ａ（ＧＨ６１Ａ）であり、かつ前記真菌ＧＨ６１Ａは、ヒポクレア・ジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、ヒポクレア・ルーファ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｒｕｆａ）、ヒポクレア・オリエンタリス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ヒポクレア・アトロビリディス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ヒポクレア・ビレンス（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）、エメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ゲウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、トリコデルマ・サツリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、ニューロスポラ・テトラスペルマ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フミゲート（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｕｍｉｇａｔｅ）、ネオサルトリヤ・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｕｍ  ｓｐ．）、及びシエラビア・ヘテロタリカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の親ＧＨ６１ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターは発現ベクターである、ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は真菌細胞又は細菌細胞である、宿主細胞。
【請求項１４】
前記真菌細胞は、トリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・セルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される糸状菌細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＧＨ６１ポリペプチドの変異体を産生する方法であって、前記変異体を産生するのに好適な条件下において、好適な培地にて、請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＨ６１変異体を含む組成物であって、前記組成物は、洗剤、飼料、飼料添加物、及び細胞培養上清からなる群から選択される、組成物。
【請求項１７】
セルロース基質を加水分解する方法であって、前記基質を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１８】
エタノールを産生する方法であって、セルロース性基質を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体ＧＨ６１ポリペプチドと接触させることを含む、方法。