(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＮＥ法によりバンドウイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ、ガンジスカワイルカ、マッコウクジラ、ザトウクジラ、ナガスクジラ、及びミンククジラを含む鯨類内の種を判別する方法であって、以下のステップ：
判別しようとする上記鯨類内の１種からゲノムＤＮＡライブラリーを作成し；
上記ライブラリーから、配列番号６に示すＣＤ配列及び配列番号７に示すＣＤＯ配列から成る群から選ばれる配列を含むオルソロガス遺伝子座を含むクローンを単離し；
上記遺伝子座において上記ＣＤ配列又はＣＤＯ配列の両側に位置するフランキング配列にアニールするＰＣＲプライマーのセットを用いて、上記種について上記遺伝子座の配列をＰＣＲにより増幅し；そして
得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動して、上記遺伝子座の存在を示すバンドの有無により、上記種を判別する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号８〜２１のいずれか１に示す配列に相当するＢａｎｄｏ１であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がアマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号３６〜４６のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ１９であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ又はイッカクであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号４７〜５１のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ１４であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号５２〜６５のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ３６であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号６６〜７９のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ３８であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号２１１〜２２４のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２４であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号２２５〜２３８のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２６であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号８０〜９３のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ３２であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号９４〜９８のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ８であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ又はオオギハクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号９９〜１１２のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ１３であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ又はオオギハクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１１３〜１１７のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２１であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ又はガンジスカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号２３９〜２５２のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２２であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ又はガンジスカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１１８〜１２９のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ８であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ、ガンジスカワイルカ又はマッコウクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１３０〜１３５のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ２８であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ、ガンジスカワイルカ又はマッコウクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１３６〜１４０のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ４７であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がバンドウカワイルカ、コビレゴンドウ、イシイルカ、イッカク、ヨウスコウカワイルカ、アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ、ツチクジラ、オオギハクジラ、ガンジスカワイルカ又はマッコウクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１４１〜１４５のいずれか１に示す配列に相当するＡｍｚ１３であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がアマゾンカワイルカ又はラプラタカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１４６〜１５１のいずれか１に示す配列に相当するＡｍｚ１１であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がアマゾンカワイルカであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１５２〜１５６のいずれか１に示す配列に相当するＴｕｔｉ２４であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がツチクジラ又はオオギハクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１５７〜１７１のいずれか１に示す配列に相当するＴｕｔｉ３５であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がツチクジラ又はオオギハクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１７２〜１８５のいずれか１に示す配列に相当するＳｐ２であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がマッコウクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１８６〜１９０のいずれか１に示す配列に相当するＳｐ９であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がマッコウクジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号１９１〜２０４のいずれか１に示す配列に相当するＨｕｍｐ２０であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がザトウクジラ、ナガスクジラ又はミンククジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号２０５〜２１０のいずれか１に示す配列に相当するＨｕｍｐ２０３であり、そして前記ゲル電気泳動におけるその存在が、前記判別しようとする前記鯨類内の１種がザトウクジラ、ナガスクジラ又はミンククジラであることを指標する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＣＲプライマーが、配列番号２７６〜３２５から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＩＮＥ法により動物の種を判別する方法に関する。より特に、ＳＩＮＥサブファミリーを用いた鯨目を含む哺乳動物の種判別の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ配列決定及び分子クローニング技術の自動化は、生物のゲノムへのアクセスを劇的に拡大している。さらに、ゲノムのディジタル情報の洪水は、多数の生物学者をコンピューターを使用したバイオ・インフォマティックスティクに惹きつけている。ヒトゲノム計画の如き包括的な努力の結果は、核酸再生試験により３０年程前に明らかにされたものを極めて詳細に示した。すなわち、真核生物のゲノムの大部分は、特定のタンパク質産物をコードしておらず、明らかな機能をもたない反復要素から構成されている  （Ｋａｚａｚｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ゲノム解析の結果として、たんぱく質をコードしていない、いわゆる「ジャンクヤード」は、ＤＮＡタイプの転移因子やＲＮＡ性の転移因子などの活動的な要素で満ちたダイナミックな分子の「ジャングル」として新たに認識されている。レトロポゾンは、系統学の再構築及び集団分析のための分類学のツールとして利用されることができると考えられつつある興味深い遍在性の反復配列であり、上記ＲＮＡ性の転移因子の一員である（Ｂｒｏｓｉｕｓ，  １９９１；  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  ２０００）。これゆえ、レトロポゾンによる診断は、個体レベルあるいは種レベルにおける進化生物学の関連亜分野の間の重要な橋渡しをする。
【０００３】
用語「レトロポジション」とは、上記要素が、ＲＮＡ中間体によりゲノム内の親遺伝子座と標的遺伝子座の間でどのように移動するかをいう  （Ｒｏｇｅｒｓ，  １９８３）。このコピー・アンド・ペースト過程は、ＲＮＡから染色体ＤＮＡへの遺伝情報の逆流を作り出す  （Ｗｅｉｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃｈｍｉｄ，  １９９６）。それは親遺伝子座に元のコピーを残さないような様式、則ちカット・アンド・ペースト様式で、染色体の周辺をジャンプするＤＮＡタイプのトランスポゾン、例えば、ｍａｒｉｎｅｒ及びＰエレメントとは異なる  （Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｋｉｄｗｅｌｌ，  １９９７；  Ｈａｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。レトロポゾンを分類するために使用される重要な特徴は、自己増幅のために不可欠な酵素である逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）をコードしているか否かである  （Ｏｋａｄａ，  １９９１；  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，  １９９４）。自己増幅しないレトロポゾンンの中で、短い散在性の要素（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ＳＩＮＥｓ）は、ゲノム内に多数存在するので、真核生物の分類学の研究のためには極めて有用であると考えられる。ＳＩＮＥは、サイズが７０〜５００ｂｐの範囲にあり、そして２つのカテゴリー、ｔＲＮＡ由来のものと７ＳＬＲＮＡ由来のものに分類される。７ＳＬＲＮＡ由来のＳＩＮＥは、２つのＳＩＮＥファミリー、すなわち、霊長類のＡｌｕファミリーとげっ歯類のＢ１ファミリーだけを含む。それ以外のこれまで調べられた他のＳＩＮＥの全てがｔＲＮＡ由来であることが示されている。増幅のためのＲＴａｓｅをコードするＬＩＮＥも、２つのカテゴリーに分類される。すなわち、増幅のための特定の配列を必要とせずに単純なポリＡ配列のみを逆転写のために必要とする哺乳動物のＬ１、と増幅のためにＲＴａｓｅに認識されるべく３’末端に厳格な配列モチーフを必要とする、ほとんどのＬＩＮＥを含むの他のカテゴリーである。ほとんどの非哺乳動物のＳＩＮＥとＬＩＮＥは、同一の３’末端尾配列を共有し、その存在により、ＳＩＮＥは、ＬＩＮＥによりコードされるＲＴａｓｅにより増幅されることができる  （Ｏｈｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；  Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；  Ｔｅｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。哺乳動物の場合、ｔＲＮＡと７ＳＬＲＮＡ由来のものを含むＳＩＮＥは、哺乳動物のＬ１によりコードされるＲＴａｓｅの助けを借りて増幅されるようである。それゆえ、この場合、上記の保存された配列モチーフは、ＳＩＮＥの３’末端尾には観察されない。ＳＩＮＥのレトロポジションに関する一般ダイアグラムを図１に示す。
【０００４】
レトロポジションが一方向性に常に生じると云う事実とＳＩＮＥの１０４以上のコピーが宿主ゲノムの全体にわたって散在するという事実は、ＳＩＮＥ挿入分析が分子分類学への強力な新規アプローチであることを際立たせている。このＳＩＮＥ挿入分析は、キャラクター・データをもつ他の形態の、最も顕著にはＤＮＡ配列及び形態学の分析を補う  （例えば、Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８；  Ｎｉｋａｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９）。分類学のツールとしてのＳＩＮＥ進化とそれらの重要性に関する論文は入手できる  （Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｔｚｅｒ，  １９９３，  Ｓｃｈｍｉｄ，  １９９６，  Ｒｏｋａｓ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ，  ２０００；  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  ２０００，  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。
【０００５】
ところで、鯨類を含む動物種の判別においては、ＰＣＲでミトコンドリア遺伝子の或る特定の領域を増幅した後、それらをアガロース・ゲルで電気泳動して増幅を確認し、その後シークエンス法を用いて塩基配列を決定して、その配列の違いを指標にして種判別がなされてきた。シークエンス法実験設備は高額であるため、それらの解析は現在ほとんど専門会社により行われている。したがって、膨大な数の個体数についての種を判別するためには、その解析数も当然に膨大となり、そのコストは多大なものとなる。さらに、塩基配列の解析は、以下に述べるように未だ不十分・不確実な面もあり、それらの解釈もしばしば問題視されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、塩基配列の解析を用いずに、簡易・迅速・安価に、鯨類を含む動物種を判別するための検定方法の必要性が未だ存在する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今般、本願発明者は、ＳＩＮＥが、上述のように系統学・分類学の研究に利用できるだけでなく、鯨類を含む動物の種判別のための簡易・迅速・安価な検定方法に利用できることを発見した。そして広範囲にわたる試料について鋭意実験を重ねた結果その確実性を証明して本願発明を完成するに至った。すなわち、以下に詳細に述べるように、ＳＩＮＥの挿入が共通にあれば、それらの共通に挿入のある種どうしが互いに単系統であるということを系統学的に明らかにできるわけであるが、それらのＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの挿入が、ある特定の種内に特有であれば、その挿入の有無が種判別に利用できることがわかる。このような種に特有のＳＩＮＥサブファミリー配列の単離・同定方法も本願発明の範囲内にある。
従来ＳＩＮＥファミリーを使った系統樹作成はなされて来たが、それはＳＩＮＥファミリーを用いてサブファミリーとして分類する事なく行なわれて来た。種の同定を可能にするＳＩＮＥは、最近に増幅を行ったＳＩＮＥでなくては行う事が出来ないので、最近に増幅したサブファミリーを特異的に単離する必要が有る。本方法はその方法を提出するものである。
【０００８】
本願発明の１の態様においては、ＳＩＮＥ法により動物の種を判別する方法であって、以下のステップ：
判別しようとする１以上の動物種からそれぞれゲノムＤＮＡライブラリーを作成し；
上記各ライブラリーから、上記動物種の中の少なくとも１種においてＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーが特異的に挿入されているオルソロガス遺伝子座を含むクローンをそれぞれ単離し；
上記遺伝子座において上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーの両側に位置するフランキング配列にアニールするＰＣＲプライマーのセットを用いて、上記動物種のそれぞれについて上記遺伝子座の配列をＰＣＲにより増幅し；そして得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動して、上記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリー挿入遺伝子座の存在を示すバンドの有無により、上記動物の種を判別する；
を含む、前記方法が提供される。
前記ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーは、配列番号３〜７から成る群から選ばれる配列を有するＤＮＡ又は上記ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするＳＩＮＥ  ＤＮＡであることができる。例えば、前記ＳＩＮＥサブファミリーは、配列番号６に示すＣＤ配列又は配列番号７に示すＣＤＯ配列を有するＤＮＡである。
【０００９】
本願発明の他の態様においては、配列番号３〜７から成る群から選ばれる配列を有するＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーＤＮＡ又は上記ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするＳＩＮＥ  ＤＮＡが提供される。
前記オルソロガス遺伝子座が、配列番号８〜２１のいずれか１に示す配列に相当するＢａｎｄｏ１であるか、配列番号２２〜３５のいずれか１に示す配列に相当するＳｐ３１６であるか、配列番号３６〜４６のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ１９であるか、配列番号４７〜５１のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ１４であるか、配列番号５２〜６５のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ３６であるか、配列番号６６〜７９のいずれか１に示す配列に相当するＩｓｈｉ３８であるか、配列番号２１１〜２２４のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２４であるか、配列番号２２５〜２３８のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２６であるか、配列番号８０〜９３のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ３２であるか、配列番号９４〜９８のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ８であるか、配列番号９９〜１１２のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ１３であるか、配列番号１１３〜１１７のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２１であるか、配列番号２３９〜２５２のいずれか１に示す配列に相当するＭａｇｏ２２であるか、配列番号１１８〜１２９のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ８であるか、配列番号１３０〜１３５のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ２８であるか、配列番号１３６〜１４０のいずれか１に示す配列に相当するＳｐｅｒｍ４７であるか、配列番号１４１〜１４５のいずれか１に示す配列に相当するＡｍｚ１３であるか、配列番号１４６〜１５１のいずれか１に示す配列に相当するＡｍｚ１１であるか、配列番号１５２〜１５６のいずれか１に示す配列に相当するＴｕｔｉ２４であるか、配列番号１５７〜１７１のいずれか１に示す配列に相当するＴｕｔｉ３５であるか、配列番号１７２〜１８５のいずれか１に示す配列に相当するＳｐ２であるか、配列番号１８６〜１９０のいずれか１に示す配列に相当するＳｐ９であるか、配列番号１９１〜２０４のいずれか１に示す配列に相当するＨｕｍｐ２０であるか、又は配列番号２０５〜２１０のいずれか１に示す配列に相当するＨｕｍｐ２０３であることができる。
【００１０】
本願発明の他の態様においては、配列番号８〜２３８のいずれか１に示す配列を有するＤＮＡ又は上記ＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするオルソロガスＤＮＡが提供される。
前記ＰＣＲプライマーは、配列番号２７６〜３２５から成る群から選ばれることができる。前記動物が哺乳動物であることができる。かかる哺乳動物は鯨偶蹄目に属することができる。
【００１１】
本願発明の他の態様においては、ＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列の獲得方法であって、以下のステップ：
インビトロにおける全ゲノム転写又は６０ｋｂｐより大きなゲノムＤＮＡの自動配列決定により反復単位の多数コピーの配列を決定し；
数種由来の上記配列をアラインメントして、コンセンサス配列を得；
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための第２プロモーターのコンセンサス配列を見つけて、この配列を含むステム・ループ構造を作り；
上記ステム領域から５’上流方向にある５塩基を１ユニットとして、３’−ＰｙＰｙＰｕＰｕＰｕ−５’配列であることを確かめ；
ｔＲＮＡ構造のアンチコドン−ステム領域を形成する次の５塩基を、他のユニットとみなし；
ｔＲＮＡ構造のアンチコドン−ループ領域を形成する次の７塩基を、さらに他のユニットとみなし、ここで、その３’末端がＡＡ残基であり、かつ、５’末端が３’−ＴＣ−５’残基であることを確認し；
次の５塩基を他のユニットとみなし、アンチコドン−ステム領域に割り当てられた５塩基との塩基対の形成を確認し、ここで、このユニットを正確に整列させるために上記アンチコドン−ステムの３’側の第１塩基の位置に欠失を配置し；
このｔＲＮＡ様構造のＤ領域のためのステム・ループ構造を構築し、ここで、上記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの第１プロモーター領域内の２つのＧの存在を確認し；
上記配列とｔＲＮＡの間の配列類似性を、ＤＮＡデータベースを用いて検索して、その二次構造の類似性を確認し；
複数の種由来の上記のようにして得られたＳＩＮＥファミリー配列をアランメントして、特徴的なヌクレオチド又は欠失の存在からＳＩＮＥサブファミリーを得；そして
上記ＳＩＮＥサブファミリーのアラインメントからＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列を得る、
前記方法が提供される。
【００１２】
前記ＳＩＮＥサブファミリーは、上記のＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列の獲得方法により得られたＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列を有するＤＮＡであることができる。
本願発明の他の態様においては、上記のＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列の獲得方法により得られたＳＩＮＥサブファミリーのコンセンサス配列を有するＤＮＡが提供される。
【００１３】
定義
本願明細書中、「ＳＩＮＥ」とは、その１次構造上の長さは約１００〜４００塩基である短い散在性の反復配列であって、その５’末端から順にｔＲＮＡ相同領域、ｔＲＮＡ非相同領域、ＡＴに富む領域を含むものをいう。その両端にはＳＩＮＥがゲノム内に挿入される際にできると考えられている約５〜２０塩基の同方向の繰返し配列（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔｓ）が存在することを特徴とする。
本願明細書中、「ＳＩＮＥファミリー」とは、同一のｔＲＮＡに由来する、お互いに配列の似通ったＳＩＮＥのメンバーをいう。
一方、本願明細書中、「ＳＩＮＥサブファミリー」とは、同じ起源（ファミリー）に由来するが、特徴的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）な変異が見られるため、ＳＩＮＥファミリーの中の同じ祖先メンバーから増幅したようＳＩＮＥ群のメンバーをいう。サブファミリーはタイプとも互換使用される。
本願明細書中、オルソロガス遺伝子座とは、二つの遺伝子座がある共通祖先からの種分化に由来することをいう。一方，種分化ではなく遺伝子重複によって二つの遺伝子が生じたとき、それらは「パラロガス」である。分子系統樹の推定にとって必要な情報を与えるのは、パラロガス遺伝子ではなく、オルソロガス遺伝子である。
【００１４】
本願明細書中、「フランキング配列」とは、オルソロガス遺伝子座内に特異的にＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーが挿入された場合、その挿入部位の両側に位置する配列をいう。かかるフランキング配列内でＰＣＲプライマーを任意に設計することができる。
本明細書中、ストリンジェント条件とは、鋳型ＤＮＡを、ハイブリバックに入れ、そこにプレハイブリ溶液（６  Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ  ）  を適当量加え、ハイブリバックをシーラーでパックし１時間以上インキュベートし、溶液を捨て、ハイブリ溶液（６  Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ，  １  Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ，  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ  （Ｓｈａｒｅｄ  Ｈｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えた後、さらに予め調整したプローブを９５  ℃で３分間熱変性しておいたものを加え、またハイブリバックをシールし、その後４２  ℃のウォーターバスで一晩（〜１５時間程度）インキュベートし、それらのメンブレンを適当量のウォッシュ溶液（２Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ）で軽く濯いだとき、プローブが上記鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするような条件をいう。
【００１５】
本願明細書中、「外群比較」とは、系統推定論において，外群  （ｏｕｔｇｒｏｕｐ），すなわち対象生物群すなわち内群  （ｉｎｇｒｏｕｐ）に対して最も近縁であると仮定される種または種群に基づく形質極性の決定法をいう。外群を解析に含めることにより、内群根（内群系統樹全体の共通祖先）の位置を決めることができる。分岐分類学の初期の理論では、まず初めに外群のもつ形質状態に基づいて内群の形質状態の極性すなわち原始的形質状態と派生的形質状態の判定を行い、次に、あらかじめ判定された形質の極性に基づいて，派生的形質状態を共有する種を単系統群としてまとめる。外群比較は、とりわけ形態形質の極性を判別する主たる方法として広く用いられる。その論理的根拠は最節約原理とよばれるもので、内群根に連なる枝での仮想的形質状態（内群での極性判別の基準）を外群の形質分布から最節約的に推定しているからである。Ｍａｄｄｉｓｏｎ，  Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ＆  Ｍａｄｄｉｓｏｎ（１９８４）とＳｗｏｆｆｏｒｄ  ＆  Ｍａｄｄｉｓｏｎ（１９８７）は、外群比較に基づく内群の系統推定が、内群と外群をあわせた群に対する極性判定を行わない最節約的な系統推定と論理的に等価であることを証明した。
したがって，特に制限酵素の切断部位や核酸の塩基配列など極性判定が困難な分子データからも分岐分類学に基づく最節約系統推定が可能になった。
【００１６】
本願明細書中、「共有派生形質」とは、外群比較などを用いて極性の推定をした結果、派生的と判定された形質状態  （ａｐｏｍｏｒｐｈｙ）を共有することをいう。分岐分類学の理論では共有派生形質だけが系統関係を推定する情報を与えると主張される。推定された派生形質を共有する種群を生んだ直接共通祖先を仮定できるからである。したがって、共有派生形質は単系統群（正確には完系統群）を構築する手掛かりとなる。ここで，もしも形質分布に不整合が生じたときには，いくつかの形質の派生的形質状態は，ある共通祖先からではなく別々の枝で進化したホモプラシーであると考えなければならない。共有派生形質という仮説の妥当性は，最節約原理に基づいて選択された系統仮説，すなわち分岐図との整合性によって検証される。
【００１７】
本願明細書中、「極性」とは、ある形質の形質状態間の遷移順序の進化方向という。したがって、極性は遷移順序（ｏｒｄｅｒ）のモデルに依存する。形質状態の遷移順序は、系統推定に用いる形質データの形質を反映する。質的な形態形質では直線状または分岐状の遷移順序を仮定できることもまれではない。一方、核酸塩基配列や制限酵素切断サイトなどの分子データの多くは、形質状態の間に順序付けができない無順序的（ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ）な形質である。分岐分類学や進化分類学では、系統解析に先立って形質進化の極性推定を要求している。極性を推定する規準としては、外群比較あるいは化石記録や個体発生の情報などが利用されているが、もっとも広く用いられているのは外群比較である。
【００１８】
ＳＩＮＥの進化
系統推定及び本願発明に係る単離・同定方法並びに種判別方法に、ＳＩＮＥを有効に利用する為には、ＳＩＮＥがどのように進化してきたかを理解することが重要である。ＳＩＮＥは、以下詳細に記載するように、配列類似性に基づくファミリーと特徴的なヌクレオチド存在及び／又は欠失に基づくサブファミリーとに分類されることができる。一旦ゲノム内に挿入されたＳＩＮＥがどのような運命を辿るかは、染色体環境中の様々な要因（Ｓｃｈｍｉｔ  ａｎｄ  Ｍａｒａｉａ  １９９２）とＳＩＮＥに蓄積する増幅を妨げるような突然変異とのバランスによって決定される。さらに、ＳＩＮＥの増幅の為にはＬＩＮＥにコードされたＲＴａｓｅが必要であるので、ＬＩＮＥがゲノム中で増幅能力を失い死んでしまえば、それはその生物中でのＳＩＮＥの死も同時に意味するところとなる  （Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【００１９】
ゲノム内でＳＩＮＥが進化過程でどのように増幅するかに関しては、これまでにＳＩＮＥ進化の２つの対立モデル：マスター遺伝子モデルと多数源遺伝子モデルが提唱されて来た。マスター遺伝子モデル（図２（Ａ））は、１又は数個の「マスター」遺伝子座だけが、全ての子孫コピーの元であり、この子孫コピーはそれら自身の上で複製する能力はもたない、というものである。このシナリオにおいては、時間の経過にわたるその増幅率は、そのマスター遺伝子の条件及び活性に完全に依存する。一方、多数源遺伝子モデル（図２（Ｂ））では、子孫も親コピーと同様の増幅する能力を持つ事が出来るので、進化の時間の経過にわたり「多数源遺伝子」として機能する、というものである。後者モデルにおいては、増幅率は、源遺伝子の全てに由来する合計コピー数の増加又は減少率の関数である。マスター遺伝子モデルはげっ歯類のＩＤ  ＳＩＮＥ  （Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４）及びヒトＡｌｕ反復の初期の研究  （Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）  からの経験的証拠により提唱された。しかし、その後の詳細なＡｌｕ配列の研究や他の様々な分類群からの比較研究により、今では大部分のＳＩＮＥファミリーの増幅は、上記多数源遺伝子モデルにより起こると解釈することが最も妥当であると考えられている（Ｍａｔｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０；  Ｓｃｈｍｉｄ  ａｎｄ  Ｍａｒａｉａ，  １９９２；  Ｌｅｅｆｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２；  Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４；  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  ２０００）。実際には、特徴的なヌクレオチドの存在及び／又は欠失を特徴とするサブファミリーが、それぞれの源遺伝子を表すことになる。
【００２０】
ＳＩＮＥの誕生と死の間の期間が、宿主ゲノム内のＳＩＮＥの活動の期間であり、その寿命が分類学の及び本願発明におけるツールとしてのそれらの使用に直接関連する。ＳＩＮＥサブファミリーのメンバー間の平均配列相違度が小さい場合、そのサブファミリーはかなり若く、かつ、その宿主内で未だ活動的に増幅していると推定することが妥当である。そのＳＩＮＥサブファミリーのメンバー間の平均配列相違度が大きい場合、そのサブファミリーは比較的古く、かつ、その宿主内で既に不活性又は死んでいると推定することが妥当である。しかしながら、ＳＩＮＥ挿入を用いた宿主分類群間の共通先祖の診断は、与えられたサブファミリーの活動寿命内でのみ可能である。このＳＩＮＥ法の基本原理を、以下の「手順」欄でさらに説明する。
【００２１】
ＳＩＮＥ挿入動態及び特徴理論
ＳＩＮＥがなぜ強力な分類学のツールであるかということの鍵は、それらが宿主ゲノム内に不可逆的に独立して挿入されるということである  （Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３；  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ  ２０００）。ゲノムからＳＩＮＥを特異的に除去する既知のメカニズムは存在せず、かつ、２つの要素が全く同じ遺伝子座内に挿入され又は同一遺伝子座内から正確に切除される確率は極めて低いので、本願発明者は、２つの異なる分類群内の同一遺伝子座のＳＩＮＥの存在を、そのゲノムにおける極性化された派生表現型であるとみなすことができる。これは系統発生仮説を構築するために、共有派生形質、又は共有された派生した特性だけを使用するＨｅｎｎｉｇ  （１９６６）の方法の厳格な意味において、１の分岐群又は単系統群を定める。この分岐群においては、既知の先祖条件、又は与えられた遺伝子座におけるＳＩＮＥ挿入の欠如が、周知の人工物を作り出す競合方法を介して特性極性を確立する必要とせずに外群を一義的に定める（Ｈｅｎｄｙ  ａｎｄ  Ｐｅｎｎｙ，  １９８９）（図３参照）。
【００２２】
ＳＩＮＥの単離及び特徴付け方法
以下、ゲノム・ライブラリーから新規ＳＩＮＥを単離するための戦略、そのスクリーニング方法、クローンの配列決定及びＳＩＮＥのファミリーからサブファミリーへの特徴付け、代表的な宿主分類群におけるコピー数の定量、並びに系統発生学的な情報を提供するＳＩＮＥ挿入パターンの決定的な診断について説明する。
【００２３】
手順
ゲノム・ライブラリーを作成するための種の選択方法
ＳＩＮＥ法は、以下の基本ステップ：１）選択された種からのゲノム・ライブラリーの作成；２）ＳＩＮＥ遺伝子座を含むクローンの単離；３）クローンのＤＮＡ配列の決定；４）そのＳＩＮＥ遺伝子座のフランキング配列内でのポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）プライマーの設計；及び５）着目の関連種間のＳＩＮＥの存在又は非存在のＰＣＲ診断、を含む。ＳＩＮＥ法は一旦確立することができれば迅速・確実に確定的な結果を提供することができるけれども、その手順及び条件の確立及び立にはかなりの時間及び労力を要する。
【００２４】
例えば、密接に関連する種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの間の系統発生関係を決定する場合を考える。上記種の実際の系統樹を図４（Ａ）に示す。この場合、種Ｄが、それからＳＩＮＥを単離するための宿主として選ばれた場合、系統発生の情報を提供するＳＩＮＥ遺伝子座は得られない。なぜなら、種Ｄは、着目の４つの分類群の共通先祖内及びさらに古い起源内に挿入されたＳＩＮＥ遺伝子座を含むからである。４種の全ての先祖内に挿入された遺伝子座を図４（Ｂ）中ＳＩＮＥ３として示す。ＳＩＮＥ３の挿入の存在（＋）又は非存在（−）を示すＰＣＲの電気泳動ゲルのパターンを図４（Ｃ）の下段に示す。系統発生の情報を提供するＳＩＮＥを単離するためには、図４（Ｂ）中に示す３つのＳＩＮＥ遺伝子座、ＳＩＮＥ１、ＳＩＮＥ２、及びＳＩＮＥ３を提供することができる種Ａ又は種Ｂを選ばなければならない。これらの遺伝子座のそれぞれが、これらの種の進化の歴史において共通の先祖を共有する分岐群、又は単系統群を定める。
【００２５】
特定の種からの新規ＳＩＮＥファミリーの単離方法
特定の種、例えば、図４（Ａ）中の種ＡにおいてＳＩＮＥファミリーが全く知られていないとき、そのゲノムからＳＩＮＥファミリーを新たに単離し分析することが必要である。選択された種から新規ＳＩＮＥファミリーを単離することができる２つの方法がある。１は、インビトロにおける全ゲノムＤＮＡ転写  （Ｅｎｄｏｈ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  １９８６）を含み、そして他は、新たな高処理量自動ＤＮＡ配列決定法により容易化された約６０Ｋｂｐ以上のゲノムＤＮＡ配列決定（Ｎｉｋａｉｄｏ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  公表に至らず）を含む。
【００２６】
インビトロにおける全ゲノムＤＮＡ転写
ほとんどのＳＩＮＥは、ｔＲＮＡ由来であることが知られている、それゆえ、ＳＩＮＥは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための内部プロモーターをもっている。ＳＩＮＥはインビボにおいては極めて稀に転写されるけれども、ＳＩＮＥはインビトロにおいては裸ＤＮＡから容易に転写されることができる。放射標識された前駆体ヌクレオチド、例えば、アルファＰ３２−ＧＴＰを用いたＨｅＬａ細胞抽出物中である種の全ゲノムＤＮＡを転写するとき、通常、放射標識されたＲＮＡが転写される。いくつかの場合、これらの放射標識転写産物は、それらがゲル電気泳動に供されるときクリアなバンドを形成する（Ｅｎｄｏｈ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ．  １９８６；  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６）。
【００２７】
この放射標識されたＲＮＡは着目の選択された種からのゲノム・ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用されることができる。この転写産物がゲル内でクリアなバンドを形成する場合、それは実際のＳＩＮＥファミリーを表している。なぜなら、与えられたＳＩＮＥファミリーの各遺伝子座からの同一転写産物の全てが集合して区別されるバンドを形成するからである。ゲノムＤＮＡから不明瞭なバンドが生じた場合でさえ、スクリーニングのためのプローブとしてそれらを用いることができる。しかしながら、後者の場合には、その転写産物は多数のＳＩＮＥファミリーを表している可能性がある。
【００２８】
本願発明者のこれまでの経験から、脊椎動物及び／又は無脊椎動物のゲノム中に１０，０００以上のコピー数のＳＩＮＥが存在するとき、それらは全ゲノムＤＮＡのインビトロ転写産物により検出されることができる。図４は、選択された動物種由来の全ゲノムＤＮＡからの転写産物のいくつかのパターン例を示す（Ｅｎｄｏｈ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  １９８６）。
【００２９】
自動シーケンサーによる６０ｋｂｐより大きなゲノムＤＮＡの配列決定
本願発明者の経験によれば、ゲノム内のＳＩＮＥファミリーのコピー数は通常１０，０００を超える。全ゲノムが長さ３ｘ１０９ｂｐであり、かつ、あるＳＩＮＥのサイズが３００ｂｐであると仮定すると、このようなＳＩＮＥファミリーはそのゲノムの０．１％を占めることになる（例えば、３００ｘ１０４＝３ｘ１０６）。したがって、６０ｋｂｐ以上にわたり配列決定することによりこの種のランダムに単離されたＤＮＡ断片内に２つの独立したＳＩＮＥ配列を見つけることができるであろう（例えば、６００ｘ１００／０．１＝６ｘ１０６）。
【００３０】
これは、高処理量自動ＤＮＡシーケンサーの最新モデルへのアクセスにより実験室において簡単に達成できるようになってきた。例えば、新規ＳＩＮＥファミリーが最近ゾウのゲノムから特徴づけされ、そしてこの新規ＳＩＮＥがＡｆｒｏｔｈｅｒｉａの全ての種間に分布していることが示された  （Ｎｉｋａｉｄｏ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，未発表）。この方法は、全ての哺乳動物及びおそらくほとんどの脊椎動物のゲノムに適用されることができる。
【００３１】
ＳＩＮＥファミリーを正確に同定し、そしてそのｔＲＮＡ構造を演繹する方法
上記の方法に従って反復単位の多数コピーの配列を決定した後、それらを整列させ、そして反復ファミリーのコンセンサス配列を演繹することができる。ＳＩＮＥ要素以外にもゲノム内には多くの反復配列が存在するので、その配列を適切に診断することが不可欠である。ほとんどのＳＩＮＥはｔＲＮＡ由来であることが知られているので、それらはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのためのプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは保存された配列ブロックであり、そのゲノム内で互いに分離された第１プロモーターと第２プロモーターの特性を有する。この第２プロモーターは高く保存されており、そして経験的に容易に認識されることができる。
【００３２】
以下、ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの例を考える。これらの要素のｔＲＮＡ様構造を以下のように確立することができる（図６参照）：
１．まず、ＣＨＲ−２のいくつかの配列の整列からＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのコンセンサス配列を構築する（図８参照）。
２．目視により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのための第２プロモーターのコンセンサス配列を検索する。この配列は５’−ＧＴ（又はＡ）ＴＣＧ（又はＡ）−３’である。このプロモーターをスクリーニングするとき、このモチーフに対する例外は存在しない。このモチーフが存在するとき、この第２プロモーター配列を含むステム・ループ構造を作る。ループ内の塩基の数は７であり、そしてステム内の塩基対の数は５である。ステム領域内の塩基の全てが塩基対を形成しない場合でさえも、図６（Ａ）に示すように、ｔＲＮＡ内の適当な位置にそれらの塩基を配置する。
【００３３】
３．上記ステム領域から５’上流方向にある５塩基を１のユニットを考える。なぜなら、原形質クラスＩｔＲＮＡにおいては、この余分ループ領域は５塩基から成るからである。ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの場合、５塩基のこのユニットの配列は３’−ＣＡＧＧＧ−５’である。３’−ＰｙＰｙＰｕＰｕＰｕ−５’配列がいくつかのｔＲＮＡにおけるこの余分ループに典型的であり（Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９      ８７）、そしてこれにより、上記ＳＩＮＥのｔＲＮＡ起源を演繹することができる（図６（Ｂ）参照）。
４．ｔＲＮＡ構造のアミノアシル−ステム領域を形成する次の５塩基を、他のユニットとみなす。この場合、３’−ＧＡＣＧＴ−５’である（図６（Ｃ）参照）。
５．ｔＲＮＡ構造のアンチコドン−ループ領域を形成する次の７塩基を、さらに他のユニットとみなす。この場合、３’−ＡＡＣＣＧＴＣ−５’である。その３’末端におけるＡＡ残基５’末端における３’−ＴＣ−５’残基はこのＳＩＮＥのｔＲＮＡ起源の良い指標である。なぜなら、これらの塩基はほとんどのｔＲＮＡにおいて高く保存されているからである（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。これはさらにこのＳＩＮＥのｔＲＮＡ起源を支持する（図６（Ｄ）参照）。
６．通常、次の５塩基は他のユニットとみなし、そしてそれらはアンチコドン−ステム領域（図６（Ｃ））に割り当てられた５塩基と塩基対を形成するはずである。この場合、その配列は３’−ＣＧＴＣＴ−５’であり、そしてその最初の４塩基だけが上記アンチコドン−ステム領域の相手とよくマッチする。このユニットを正確に整列させるためには、上記アンチコドン−ステムの３’側の第１塩基の位置に欠失を配置する（図６（Ｅ）参照）。
７．次に、このｔＲＮＡ様構造のＤ領域のためのステム・ループ構造を構築する。このステムとループの塩基の数は通常それぞれ４と８であるが、特にＳＩＮＥのｔＲＮＡ様構造においては、１〜２塩基程変化することができる。明らかに、ＣＨＲ−２次のいくつかの塩基対は意味のある二次構造を形成しない。この場合、その第１プロモーター領域に注目する。第１プロモーター領域における最も目立った特徴は、その領域内の２つのＧの存在である。他の特徴はこのループ内の１５位（ｔＲＮＡのナンバリングシステムによる。以下同じ。）におけるＧと１４位におけるＡである。この１４位におけるＡは５’側上そのループ内の最初の塩基である。それゆえ、これらの塩基を、このｔＲＮＡ様構造のループの対応の位置に配置する（図６（Ｆ）参照）。図６（Ｆ）中の最初の塩基であるＴはｔＲＮＡ分子の全てにおいて高く保存されていることは周知である。
８．ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様構造は、図６（Ｆ）に示す配列を、このファミリーのための他の配列（図７（Ａ））と併合することにより、演繹することができる。
９．次に、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡデータベース中のＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）、ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥと実際のｔＲＮＡの間の類似性について検索する。この例では、ｔＲＮＡ  ＧｌｕがＣＨＲ−２の配列に最も類似する。図７（Ｂ）はヒトｔＲＮＡ  Ｇｌｕの二次構造を示す。
【００３４】
ＳＩＮＥファミリーをサブファミリーに特徴付ける方法
あるＳＩＮＥファミリーが系統発生において種Ａのゲノム内に特徴付けられ、かつ、このＳＩＮＥファミリーが進化の間に最初に生成された時が知られていないと仮定する。さらに、このＳＩＮＥファミリーが図９中の分岐群Ｙの全ての分類群の古い共通先祖において最初に生成されたと仮定する。この場合、種Ａのゲノム内に存在するＳＩＮＥのコピーは、図９のｔの時に増幅された古いＳＩＮＥと、ｕの時に増幅された若いＳＩＮＥを含む。種Ａのゲノム・ライブラリーをこのＳＩＮＥファミリーのコンセンサス配列を用いてスクリーニングするとき、上記の古いＳＩＮＥと新しいＳＩＮＥの両者を単離することができる。種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの系統関係だけが求められているので、単離されたＳＩＮＥの増幅事件の全ての時を調べるのは効率が悪い。むしろ、種Ｄの分岐付近の時に増幅され、かつ、図９中の分岐群Ｘを含む４つの分類群の全ての分岐にわたるＳＩＮＥ遺伝子座を単離するように試みるのがはるかに効率がよい。
【００３５】
上述のように、ＳＩＮＥとＬＩＮＥは多数源遺伝子モデルに従って増幅されると信じられている  （Ｓｃｈｍｉｔ  ａｎｄ  Ｍａｒａｉａ  １９９２；  Ｓｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。ある源遺伝子が突然変異を受け、そして進化の間に首尾よく増幅された場合、この突然変異した源遺伝子はその対応のＳＩＮＥファミリー内のサブファミリーとして認識されることができる  （Ｂｒｉｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８；  Ｊｕｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。サブファミリーは進化のある段階において増幅される。それゆえ、あるサブファミリーが種Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤの共通先祖においてのみ増幅された場合、このサブファミリーのコピーは、これら４つの分岐群の系統発生関係を決定するために有効に使用されることができる。
【００３６】
種ＡにおけるＳＩＮＥファミリーのコンセンサス配列は、上記手順の一部として確立され、そしてそのＳＩＮＥ配列の５’末端における１のＰＣＲプライマー及びその３’末端付近の保存領域における他のプライマーの設計を可能にする。このプライマー・セットにより増幅される配列はそのＳＩＮＥ配列の全体を包含する。このプライマー・セットは、種Ａ由来のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによるＳＩＮＥの多くのコピーを増幅するために使用されることができる。この反応のＰＣＲ産物は適当なベクターＤＮＡ内でクローニングされ、そして配列決定されることができる。この時点で、そのＰＣＲ産物からのＳＩＮＥの１００コピーの配列決定は困難な仕事ではない。これらの配列を整列させることにより、このＳＩＮＥファミリーのサブファミリーを表す特徴的なヌクレオチド又は可能な欠失を同定することができる（図１０参照）。特徴的なヌクレオチドは、特定のサブファミリー内の３以上のヌクレオチド位置において協調的に変更されており、かつ、進化の間のＳＩＮＥ配列内でランンダムに蓄積した自然突然変異から区別されうるものとして定義される。特徴的なヌクレオチドの存在及びしばしば特異的な欠失に基づきサブファミリーを首尾よく特徴づけた後に初めて、ドット−ブロット・ハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより与えられたサブファミリーの分類学的分布を調べることができるようになる。
【００３７】
ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのサブファミリー
図８は、クジラ目（Ｃｅｔａｃｅａｎｓ）、猪豚亜目（Ｈｉｐｐｏｐｏｔａｍｕｓｅｓ）、及び核脚亜目（Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）のゲノム中に存在すると元々特徴づけられたＣＨＲ−２  ＳＩＮＥファミリー（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）のコピーのアラインメントを示す。ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥには６つのサブファミリーが存在することが容易に分かる。欠失の存在に因り、ＦＬ（完全長）、ＭＤＩ（中央欠失Ｉ）、ＭＤＩＩ（中央欠失ＩＩ）、及び最短群を特徴付けした。次に、この最短群を、ＤＴ（欠失型）、ＣＤ（クジラ欠失型）、及びＣＤＯ（クジラ欠失歯クジラ特異的）のサブファミリーに分類することができる。図１１は、これらサブファミリーのコンセンサス配列のアラインメント結果を示す。配列番号１は上位コンセンサス配列、配列番号２はＦＬコンセンサス配列、配列番号３はＭＤＩコンサンサス配列、配列番号４はＭＤＩＩコンセンサス配列、配列番号は５ＤＴコンセンサス配列、配列番号６はＣＤコンセンサス配列、そして配列番号７はＣＤＯコンサンサス配列を表す。
【００３８】
図１２に、ＣＤ，ＣＤＯ，及び他のサブファミリーに特異的なプローブを、それぞれ、用いたドット−ハイブリダイゼーション実験の結果を示す。この結果はＣＤサブファミリーがクジラ目（歯クジラ及び髭クジラ）のゲノムに特異的であり、そしてＣＤＯサブファミリーが歯クジラのゲノムに特異的であることをはっきりと示している。それゆえ、ＣＤサブファミリーに属するＳＩＮＥは、クジラ目の、特に髭クジラの系統関係を推定するために有用であり、一方、ＣＤＯサブファミリーに属するＳＩＮＥは、歯クジラの系統関係を推定するために有用である。ＣＤＯサブファミリーのコピーの分布は、哺乳動物の分類生物学において最も争いのある点の中の１つであったマッコウクジラを含む歯クジラ亜目の単系統性をも示唆する。
【００３９】
フランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲ
図９中に示す分岐群Ｘの共通先祖において生成されたサブファミリーに属する、種ＡからのＳＩＮＥ遺伝子座を単離し、そしてそれらの配列を決定した後、与えられた遺伝子座における挿入の存在又は非存在を診断するために、ＰＣＲ実験を行うことができる。そのフランキング（隣接）配列を見て、プライマー配列を選択する。プライマーの設計に際しては、二次構造の折り畳みの形成に対して及び上流プライマーと下流プライマーの間のタンデム・アニーリンングに対して注意しなければならない。これは、商業的に又はインターネットを通して入手できるＰＣＲプライマー設計を容易にするために書かれたさまざまな標準的なソフトウェア・プログラムを用いて容易にチェックすることができる。オリゴヌクレオチド・プライマーの溶融温度は５５℃付近に設定する。それゆえ、ＰＣＲのためのアニーリング温度は、種Ｂ，Ｃ，及びＤからのオルソロガスな遺伝子座の増幅を最適化するとき、この温度に基づかなければならない。ときに種Ｂ，Ｃ，及びＤについてのプライマー結合領域内の突然変異の蓄積が、この反応の間の効率的なプライマー−鋳型アニーリングを阻害する。この場合、アニーリング温度は、約４５〜５０℃まで低下されなければならない。ＰＣＲ産物が最初のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されない場合、ＰＣＲの効率を低下させるかもしれない潜在的な人工物に関してさらに注意して、新たなＰＣＲプライマーを設計すべきである。図１３にフランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲの原理を模式的に示す。
【００４０】
図１４は、ＰＣＲ結果の１例を示す。また、２つの異なるプローブを用いた同一フィルターを用いて行ったハイブリダイゼーション実験結果を同時に示す。図１４（Ａ）は、海イルカが単系統である証拠を提供するＰＣＲパターンである。なぜなら、海イルカからのＰＣＲ産物は挿入された要素を含む予想断片サイズをもっており、一方、他の歯クジラからの断片はＭａｇｏ  １９における挿入を欠く予想断片サイズをもつからである。図１４（Ｂ）は、ＳＩＮＥプローブを使用したハイブリダイゼーション実験を示し、一方、図１４（Ｃ）は、上記遺伝子座のフランキングＤＮＡを使用したハイブリダイゼーション実験を示す。この後者の実験は、オルソロガスな遺伝子座が、それから上記遺伝子座が元々単離されかつ特徴付けられたところのマゴンドウ以外の種においてＰＣＲにより忠実に増幅されたことを証明するために行われた。
【００４１】
ＰＣＲデータの解釈
比較的最近分岐した種を調べる場合、オルソロガスなＳＩＮＥ遺伝子座におけるフランンキング配列は忠実に保存され、そして典型的には、ＰＣＲ診断を阻害する問題を引き起こさない。しかしながら、比較的古く分岐した分類群を調べる場には、ＰＣＲはより頻繁に失敗し、そして実験結果の解釈を困難にする。不成功のＰＣＲにおいては、ＳＩＮＥ−マイナス・データが現れる。すなわち、ＳＩＮＥ挿入の非存在を示す与えられた遺伝子座における成功したＰＣＲ増幅がある。不成功のＰＣＲは、失われたデータを表し、そして挿入の存在又は非存在のパターンをコードするＳＩＮＥキャラクター・マトリックスの最節約分析を行うとき、そのまま（例えば、「？」）コードされる。
調べた独立した遺伝子座の間に矛盾した挿入パターンが存在するとき、先祖の多型性及びその後の不完全な系統分類が、あるはずである。
【００４２】
哺乳類ゲノム中のＳＩＮＥの分布
一般にほとんどの哺乳動物は大量のＳＩＮＥをもっている。それらは、調べた種間のハイブリダイゼーション・パターン（例えば、図１２中のＣＨＲ−２  ＳＩＮＥの分布）に基づき、明らかに目、亜目、上科、科、属、又は種に特異的である。このような経験的な証拠は、ＳＩＮＥファミリーが多くの先祖哺乳動物系統において新たに生成したことを示している。但し、その生成メカニズムは十分に理解されていない。哺乳動物のゲノム中にこのように多数のＳＩＮＥ又はレトロポゾンが存在する理由は、哺乳動物のＬ１によりコードされるＲＴａｓｅが哺乳動物の共通先祖においてその鋳型認識の特異性を変更したためであると思われる。これは、ステム−ループ構造の形成に責任を負う３’尾を厳格に認識する多くのＬＩＮＥ内に存在するレトロポジションのために要求されるポリＡ尾の認識を可能  （Ｏｈｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６；  Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７；  Ｋａｊｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）。このようなシナリオは、哺乳動物ゲノム内のＬ１  ＲＴａｓｅを介してポリＡ含有ＲＮＡが擬似遺伝子となることを可能にすることができたのであろう。
【００４３】
図１５は、最近提案された哺乳動物の系統樹を示す  （Ｗａｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｎｉｋａｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。現在まで特徴付けられた哺乳動物ＳＩＮＥファミリーを図１５上に記す。簡単に言えば、全哺乳動物ゲノム中に分布する最も古いＳＩＮＥファミリーはＭＩＲである  （Ｓｍｉｔ  ａｎｄ  Ｒｉｇｇｓ  １９９５；  Ｊｕｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。Ａｌｕファミリーは明らかに霊長類ゲノムに特異的であるが、その近縁種、例えば、ヒヨケザル間のその分布は詳細に調べられていない。げっ歯類Ｂ１，Ｂ２，及びＩＤはげっ歯目のゲノムに特異的である。ウサギのＣファミリーはウサギ目のゲノム内に報告されているが、その近縁種間の分布は報告されていない。鯨偶蹄目ゲノム内に存在するＳＩＮＥファミリー、例えば、ＣＨＲ−１，ＣＨＲ−２，ＣＨＲＳ，ＣＨＲＳ−Ｓ，ＰＲＥ−１，及びＢｏｖ−ｔＡは、詳細に調べられている  （Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７；  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｎｉｋａｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。ＣａｎＳＩＮＥＡはＣａｎｉｄａｅゲノムから最初に報告されたが（Ｍｉｎｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２；  Ｃｏｌｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ  １９９４）、多くの他の食肉目ゲノム内の進化の間に生じたことがその後示された  （ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ  ａｎｄ  Ｌｅｎｓｔｒａ  １９９５）。ＥＲＥファミリーと命名されたウマＳＩＮＥが報告され、そしてその分布が調べられた  （Ｓａｋａｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４；  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。コウモリＳＩＮＥファミリーがＢｏｒｏｄｕｌｉｎａ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒｏｖ  （１９９９）により単離され、そしてＶＥＳと命名され、そして他のコウモリＳＩＮＥファミリーも最近特徴付けられた  （Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ）。ゾウＳＩＮＥファミリーが最近単離され、Ａｆｒｏｔｈｅｒｉａの種間に分布していることが示された  （Ｎｉｋａｉｄｏ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ）。ここで、由来するｔＲＮＡが異なっていたり、まったく違った配列であるＳＩＮＥをｆａｍｉｌｙとして区別し、同じ起源に由来するがｄｉａｇｎｏｓｔｉｃな変異が見うけられるようなＳＩＮＥをＴｙｐｅまたはｓｕｂｆａｍｉｌｙとして区別している。あるＳＩＮＥはある時期に爆発的にそのコピー数を増やし、その爆発的増幅時期と生物全体の進化における時間軸がそれらの系統関係とＳＩＮＥの分布との関連性につながっていると考えられる。
【００４４】
重要なことは、哺乳動物ゲノム内に多くのＳＩＮＥファミリーが今日まで単離されてきたけれども、それらは未だそのサブファミリー構造まで特徴付けられていないということである。したがって、本願発明に従って、今後、そのサブファミリー構造が明らかにされるであろうし、新たな哺乳動物ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーもさらに獲得されることができる。
【００４５】
ＳＩＮＥの新しい増幅：固定及び短期間の種分岐
ＳＩＮＥがゲノムの進化においてひじょうに新しく増幅され、そして１の種の集団の間で固定されていない場合、共通派生形質としての地位は不安定であり、そしてそれは系統樹作成のために使用されるべきではない。しかしながら、このようなＳＩＮＥの分布は、集団構造の分析のためには使用されることができる  （例えば、Ｈａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。種分岐が短期間に生じた場合、すなわち、大部分のＳＩＮＥが遺伝的浮動を介して集団の間に固定される前には、先祖の多型性その後の不完全な系統分類は矛盾したＳＩＮＥ挿入パターンを作り出す。この現象は、ＳＩＮＥレトロポジションの不可逆な性質と結合して、爆発的に派生した分類群における系統分類の歴史的パターンを調べるためにＳＩＮＥを使用するためのバイアスを提供する。先祖に多型性があり、その後不完全にＳＩＮＥが子孫に分配され、矛盾する挿入パターンを作り出した場合には、系統樹作成法の一つである最節約法を用いて、各遺伝子座における挿入の存在又は非存在についてのＳＩＮＥキャラクター・マトリックスを評価することが有用である。固定されていない、多形性ＳＩＮＥは、高レベルの系統関係のためには有用ではないけれども、それらは、集団分析のための優れた分類学的ツールとなることが知られている（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｔｚｅｒ，  １９９４，  Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；  Ｈａｍａｄａ  ｅｔ    ａｌ，  １９９８）。したがって、本願明細書に記載する方法に従って、ＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーを同定し、かつ、特徴付けすることにより、かかるＳＩＮＥファミリー又はサブファミリーを利用して動物の種判別方法を行うことができる。
【００４６】
フランキング配列の機能及び価値（有用性）
ＳＩＮＥ挿入について調べられた遺伝子座内のヌクレオチド・フランキング配列の情報は有用である。もちろん挿入データは系統樹の作成及び本願発明に係る方法に使用するために有用であるけれども、フランキング配列との挿入配列の統合は、独立したＳＩＮＥ挿入事件により定められる分岐群間の枝の長さについての情報を提供する  （Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００；  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，  ２０００）。さらに、与えられた挿入要素と会合したフランキング配列は文字通り連結されているので、ＳＩＮＥ由来のトポロジー対フランキング配列の間の一貫性は、各遺伝子座における不可逆挿入の基本的仮定の評価への数多くのアプローチを提供する  （Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。独立したＳＩＮＥ遺伝子座にホモプラシー（成因的相同）、又は形質矛盾が存在する場合、系統発生樹の間には明らかに矛盾があるかもしれない。このようなアプローチはＳＩＮＥ分析の新たな次元として始まりつつあり、そしてＳＩＮＥ法の統計学的評価を高めるための基礎を提供する。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、以下の実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００４８】
材料及び方法
緩衝液、酵素類その他試薬
核酸の操作に用いる種々の緩衝液、酵素、大腸菌の培養に用いる培地、その他の試薬類は、和光純薬（株）、Ｓｉｇｍａ社、Ｄｉｆｃｏ社、ＦＭＣ社より購入したものをＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）の文献を参考にして調整した。各種制限酵素、修飾酵素、ベクターＤＮＡは、宝酒造（株）、東洋紡績（株）、アマシャムライフサイエンス社より購入した。ラジオアイソトープは、第一化学薬品（株）より購入した。ＰＣＲプライマーに関してはＯｌｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ（アマシャムファルマシアバイオテク（株））に合成を委託注文したものを使用した。
【００４９】
ゲノムＤＮＡ
本研究に使用した各種サンプル（組織もしくはＤＮＡ）について以下に示す。尚解析に用いた鯨、偶蹄類の英名、和名、学名等について以下の表１：
【表１】
0003600891.tif 000002
に示す。
フタコブラクダは東京大学医学部の吉田穣博士より提供された筋肉組織からＤＮＡを抽出した。ブタについては当研究室に保管されていたＤＮＡをそのまま用いた。ペッカリーは農水省畜産試験場の安江博博士より提供されたＤＮＡを用いた。ジャワマメジカは米国サンディエゴ動物園から提供されたＤＮＡを用いた。アクシスジカ、アミメキリン、セーブルアンテロープ、ニホンカモシカ、マーコール、ムフロン、カバに関しては千葉市立動物公園の宗近功氏より提供されたＤＮＡを用いた。ヒツジは長野県上田食肉衛生検査場の向井康氏より提供された肝臓から抽出したものを使用した。ウシに関しては神奈川県食肉衛生試験場相模出張所より提供された腎臓からＤＮＡを抽出して用いた。
【００５０】
イッカク、オオギハクジラのサンプルについては、千葉県立中央博物館の宮正樹博士より筋肉と思われる組織片を入手しＤＮＡを抽出して用いた。オオギハクジラのサンプルに関してはアカボウクジラ科オオギハクジラ属であることは判明しているが種名は不明である。カワイルカ類を除くその他のサンプルは、水産庁遠洋水産研究所大型鯨類研究室の加藤秀弘博士より提供された各種組織片からＤＮＡを抽出して用いた。カワイルカ類のサンプルについては、アメリカ合衆国南西漁業科学センターのブラウネル博士（Ｄｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．  Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，  Ｊｒ．：  Ｃｈｉｅｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｍａｍｍａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｐ．Ｏ．  ＢＯＸ  ２７１，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２０３８）により日本国への入手手続きを行ってもらった。それに基づいて、アマゾンカワイルカの皮下組織片、ラプラタカワイルカの肝臓組織片についてはカリフォルニア州立大学バークレー校のＨｅａｌｙ  Ｈ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  氏より提供を受けＤＮＡを抽出した。ガンジスカワイルカは乾燥骨サンプルを国立科学博物館の山田格氏より提供されＤＮＡを抽出した。ヨウスコウカワイルカに関しては中国科学院水生生物研究所の付属水族館に飼育されている個体から鮮血を採取しその場でヘパリン処理したものを研究所へ搬送し即座にＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、日本への持ち込みが不可能なため現在は中国の研究所において保管されている。
【００５１】
ゲノムＤＮＡの抽出
解析に用いた動物種の組織からのゲノムＤＮＡ抽出は、簡便法（Ｒａｐｉｄ法；ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを用いる方法）で行った。抽出したゲノムＤＮＡはライブラリーの作製及びＰＣＲの鋳型として使用した。また、それらは４℃で保管している。−４０℃のフリザーに保存しておいた鯨、偶蹄類の組織（肝臓、筋肉）をメスで数ミリ角に切り出し、マイクロチューブに移してから組織の重量を測った後、そのマイクロチューブに１Ｘ  ＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ８．０））を５００μｌ加えた。チューブ内の組織片をパスツールピペットを用いて細かく粉砕したらその、組織及びＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒに１Ｘ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （２０ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ，２％  ＳＤＳ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０））  を加え、転倒撹拌した後、５５℃のウォーターバスを用いてインキュベートし組織片を完全に溶解させた。その溶液と等量のフェノールを加え、ベリーダンサー（２００〜３００ｒｐｍ）で１〜２時間撹拌した。遠心分離後  （室温、１２０００ｒｐｍ，  ５ｍｉｎ），  上清を別の２．０ｍｌ  マイクロチューブに移した。同様にしてフェノール／クロロホルム抽出に続きクロロホルム抽出を繰り返し、最終的な上清に０．１倍量の３Ｍ  酢酸ナトリウム及び２倍量のエタノールを加えた。この際多くの場合ファイバーが確認され、その後７０％エタノールを用いてリンスした後適当量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加えペレットを溶解させた。ヨウスコウカワイルカの血液サンプルからのＤＮＡの抽出は市販のカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ／Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．２９３０６：  キアゲン（株）社製）を用いて行った。
【００５２】
フランキングＰＣＲ（主に相同遺伝子座の増幅に用いる）
フランキングＰＣＲとはＳＩＮＥ配列を挟む様にその両側（上流及び下流）の近傍領域にプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う事を意味している。その際に用いるプライマーは長さにしておよそ１７〜３０ヌクレオチドでＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値はおおよそ５５℃周辺になるように設計した。その設計に関しては、マッキントッシュ版フリーソフトとしてインターネット上でダウンロードが可能なＣＰｒｉｍｅｒ  （Ｖｅｒ．１．０８，  Ｂｒｉｓｔｏｌ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９５））を使用した。
反応組成：Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  （１００  〜  ５００  ｎｇ）；  １０  Ｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  （ｐＨ８．３），  ５００  ｍＭ  ＫＣｌ，  １５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５  μｌ；  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）  ４  μｌ；  Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  （５  ｐｍｏｌ／μｌ）  ２  μｌ  ｅａｃｈ；  ＴａＫａＲａ  ＴａｑＴＭ  （５  Ｕ／μｌ）  ０．２５  μｌ；  ａｄｄｓ  ｄｄＨ２Ｏ  ｕｐ  ｔｏ  ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ５０  μｌ。
反応条件：  ９４  ℃（Ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒｅ）  ２〜３  ｍｉｎ．；  ａｎｄ  ３０  ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  ９４  ℃  （Ｄｅｎａｔｕｒｅ）  ３０  ｓｅｃ．；  ４５  ℃〜６０  ℃（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）  １  ｍｉｎ；  ７２  ℃  （Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）  ３０〜９０  ｓｅｃ．。この際Ａｎｎｅａｌｉｎｇの温度はプライマーのＴｍ値はもちろんのこと、その遺伝子座の増えやすさなどに応じて適宜変えていき最適な温度を探した。
【００５３】
コロニーＰＣＲ
コロニーＰＣＲはサブクローニングを行う時、目的のＤＮＡ断片がインサートとしてあるクローンに含まれているか否かを選別するのに大変簡便な方法である。従来はプラスミドＤＮＡをＭｉｎｉｐｒｅｐによって調整した後に、制限酵素で消化してそのインサートの有無を確認していたが、この行程をＰＣＲによるチェックのみで済ませる事が可能となるので、時間と労力の大幅な短縮につながる。まずプレートに生えた大腸菌のコロニーを爪楊枝で軽くつつき０．５  ｍｌ  ＰＣＲ  用マイクロチューブに擦り付け、それを鋳型にして通常のＰＣＲを２０  μｌの反応系にして行うだけである。この際用いるプライマーはベクターに特異的な配列に基づいて作製されている。ＰＣＲ反応における熱変性の際に大腸菌の細胞膜が破壊され鋳型となるベクターＤＮＡが溶液中に溶け出すことでこのＰＣＲが可能になる。後で述べるがこのＰＣＲによってインサートの有無を確認した後、このＰＣＲ産物を直接ＡＢＩシークエンサーを用いて配列決定の鋳型とすることが可能なので、インサートチェックの直後にそのインサートのシークエンスも可能なので時間的にもかなりの短縮になった。
【００５４】
塩基配列の決定
塩基配列の決定には以下に示すシークエンサー及びシークエンス反応キットを使用した。ＬＩ−ＣＯＲ  ｄＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ｍｏｄｅｌ  ４０００）  を用いたシークエンス：ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  ＥＸＣＥＬＬ（商標）ＩＩ  Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｋｉｔ−ＬＣ  （Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＳＥ７７０１ＬＣ，  ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）；ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ（商標）  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  を用いたシークエンス：  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐ／Ｎ  ４３０３１５２，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）。
サブクローニングしたプラスミドＤＮＡをシークエンス反応の鋳型に用いる場合は、  ＳＤＳ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｇ沈殿法を用いて調整したものを使用した。
スクリーニングによって単離したＳＩＮＥ配列を含んだ遺伝子座の塩基配列を決定する場合はベクター配列上のＭ４及びＲＶ、そしてＳＩＮＥのコンセンサス配列に基づいて作製した蛍光の付加しているオリゴヌクレオチドプライマー（アロカ（株）社製）を用いた。
ＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスする場合は、ＰＣＲ産物にＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＳＡＰ）  ２Ｕ／μｌ  ０．５μｌ；  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  １０Ｕ／μｌ  ０．５  μｌ  （共にアマシャムライフサイエンス社製）を直接加え、３７  ℃で３０  分インキュベートしてオリゴヌクレオチドを分解した後、８５  ℃で１５  分間インキュベートして酵素を失活させたものをシークエンス反応の鋳型として用いた。
【００５５】
ゲノム・ライブラリーの作製
スクロース勾配
ゲノムＤＮＡ約５０  μｇを適当な制限酵素（本研究においては主にＨｉｎｄ  ＩＩＩを使用した）で完全消化し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った後、２００  μ  ｌ  の  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  に溶解した。１５  ｍｌ  の超遠心分離用プラスチックチューブ  （Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅｓ  −  ５０  Ｕｌｔｒａ  −  Ｃｌｅａｒ（商標）Ｔｕｂｅ  １４  Ｘ  ８９  ｍｍ，  Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．  ３４４０５９：  ＢＥＣＫＭＡＮ  社製）に１０−４０  ％スクロース勾配を作製し、この上にＤＮＡ  溶液を加え、ローターに取り付け、超遠心分離機（Ｌ８−７０Ｍ，  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．  ７Ｃ８６９：  ＢＥＣＫＭＡＮ  社製）で遠心分離（２５０００  ｒｐｍ．，  １５  ℃，  １５  時間）した。遠心後、１．５  ｍｌ  マイクロチューブに１０〜１５滴ずつ滴下して分画（約２５０〜４００  μｌ／フラクション）した。その分画を０．７〜１  ％アガロースゲル電気泳動し、約２〜４  ｋｂｐの断片を含むフラクションを挟むように４〜６本のフラクションチューブを選別しエタノール沈殿を行った後、適当量のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。再び０．７〜１  ％アガロース電気泳動を行い、ライブラリー作製に用いるフラクションを決定した。
【００５６】
プラスミド・ライブラリーの構築
今回の実験においてはｐＵＣ１８／ＨｉｎｄＩＩＩもしくはｐＵＣ１９／ＨｉｎｄＩＩＩを使用したプラスミド・ライブラリーのみを用い、ファージライブラリーは作製しなかった。それは鯨、偶蹄類ゲノム中にはＳＩＮＥのコピー数が十分量存在し、ファージライブラリーを使用しなくても十分量のポジティブクローンが得られる事が、当研究室での経験上わかっていたため、時間の節約を考えて比較的操作行程の少ないプラスミド・ライブラリーを活用した。プラスミド・ライブラリーの作製は以下の様にして行った。組成はＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１  Ａ液，  １２  μｌ；  同  Ｂ液，  １．５  μｌ；  Ｖｅｃｔｏｒ  ＤＮＡ  （ｐＵＣ１８  ｏｒ  １９／ＨｉｎｄＩＩＩ〜１００  ｎｇ／μｌ），  ０．５  μｌ；  Ｉｎｓｅｒｔ  ＤＮＡ  （Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ），  １．０  μｌ  ：  以上の溶液を０．５  ｍｌチューブ中で混合した後、クールブロック上で１６  ℃で３０分以上放置した。このゲノム・ライブラリーは−２０  ℃で保存している。
【００５７】
ＳＩＮＥ配列を含むクローン単離までの流れ
図１６にＳＩＮＥ法における実験の流れを示す。
スクリーニング
スクリーニングに使用するメンブレンの作製
０．５  ｍｌチューブに前述のゲノム・ライブラリー混合液を１  μｌ、大腸菌（  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５株）のコンピテントセルを適当量加えて混合した後、氷上で３０分間静置した。４２〜４５  ℃で  ４５  秒間ヒートショックした後、あらかじめ  ３７  ℃  でインキュベートしておいた  Ｌ／ａｍｐ／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧ  プレートにプレーティングし、３７  ℃インキュベーターに一晩放置した。プレート１枚当たりのコロニー数が２００〜３００個になるように調整し、プレート１０〜２０枚分のライブラリーをまいた。このプレート上に生えたコロニーをナイロンメンブレン（Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＮＥＦ−９７８：ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  社製）にトランスファーし、変性溶液（０．４  Ｍ  ＮａＯＨ，  ０．６  Ｍ  ＮａＣｌ），  中和溶液（１  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．５  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０））  の順に３分間程度放置した。そのメンブレンは水分を切った後よく乾燥させておいた。コロニーをトランスファーした後のプレートは３７℃でインキュベートして再度コロニーが十分に生えた状態にしておき、後述のポジティブクローンのピックアップをしやすいようにした。
【００５８】
スクリーニングに使用するプローブの作製
スクリーニングにはオリゴヌクレオチドもしくはＰＣＲ産物を使用した。実際に使用したオリゴヌクレオチド配列を以下の表２：
【表２】
0003600891.tif 000003
に示す。その作製方法はまず、オリゴヌクレオチドの場合：ｄｄＨ２Ｏ  ２７〜３７μｌ；  Ｏｌｉｇｏ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  （５  ｐｍｏｌ／μｌ）  １  μｌ；  １０  Ｘ  Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５  μｌ；  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ２μｌ；  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ  ５〜１５μｌを０．５ｍｌチューブに混合した後、３７℃でインキュベートした。プローブとして用いたオリゴヌクレオチドの配列を上記表２に示す。ＰＣＲ産物を用いる場合（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法）：  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ，  ５００  μｇ；  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  （１２．５  ｎｍｏｌ／μｌ）  ２  μｌ；  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （１２．５  ｎｍｏｌ／μｌ）  ２  μｌ  ｄＤＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＴＴＰ）  ２．５  μｌ；  以上の混合液を９５  ℃で５分間熱変性し、続いて５５  ℃で１分間アニールさせた後氷上に移した。さらに以下の試薬を順に混合した後６０  ℃で３０分間インキュベートした。１０ＸＢｃａＢＥＳＴ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５  μｌ；  ＢｃａＢＥＳＴ（商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２  μｌ；  ［α−  ３２Ｐ］  ｄＣＴＰ。反応後のそれぞれのプローブはＮＩＣＫ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ：  アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）で溶出させて精製した。ＲＩのカウントは液体シンチレーションカウンターで測定した。（簡易的測定にガイガーカウンターも使用した。）
【００５９】
ハイブリダイゼーション
メンブレンをハイブリバックに入れ、そこにプレハイブリ溶液（６  Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ  ）  を適当量加えた。ハイブリバックをシーラーでパックし１時間以上インキュベートした。溶液を捨て、ハイブリ溶液（６  Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ，  １  Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ，  Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ  （Ｓｈａｒｅｄ  Ｈｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えた後、さらに予め調整したプローブを９５  ℃で３分間熱変性しておいたものを加え、またハイブリバックをシールした。その後４２  ℃のウォーターバスで一晩（〜１５時間程度）インキュベートした。それらのメンブレンを適当量のウォッシュ溶液（２Ｘ  ＳＳＣ，  １  ％  ＳＤＳ）で軽くすすぎカウントを測定し確認してから、さらに新たなウォッシュ溶液を用いてウォーターバスの温度を５５〜６０  ℃に設定してウォッシュを行った。
【００６０】
現像
ウォッシュ溶液を捨て新たなウォッシュ溶液で軽くすすいだ後、カウントを、ガイガーカウンターを用いて確認した。暗室内で台紙、メンブレン、Ｘ線フィルム、Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒの順にカセットを入れ、これを−８０  ℃のフリザーに入れて感光させた。暗室内でカセットからＸ線フィルムを取り出し、現像液、停止液、定着液の順にＸ線フィルムを入れて現像した。
【００６１】
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｌｏｎｅ  の単離
現像したＸ線フィルムとライブラリーをまいたプレートを重ね合わせる様にしてそのポジティブクローンの位置を確認した。そのポジティブクローンだと思われるコロニーについてはＭｉｎｉｐｒｅｐを行う前に、そのクローン中におけるＳＩＮＥ配列の有無の確認のためにベクターの配列ではなく、スクリーニングに用いたＳＩＮＥ配列のコンセンサス配列に基づいて作製したプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。その後、ポジティブクローンのプラスミドを調製し、ＬＩ−ＣＯＲシークエンサーを用いてその近傍領域の配列決定を行った。その後の操作に関しては上述の通りであるので、以下、簡単に述べる。
【００６２】
まず、そのフランキング配列を基にしてプライマーを作製し、種々の生物のゲノムＤＮＡを鋳型にしてフランキングＰＣＲを行った。そして多くの場合、スクリーニングに用いた生物種の近縁種に関しては相同遺伝子座を簡単に増幅させることが可能であるが、それとは遠縁のグループもしくは分岐が古い時代に起こったと考えられる種の相同遺伝子座については、その近傍領域における塩基置換がより多く蓄積しているのでスクリーニングに用いた１種の配列に基づいたプライマーではアニールがうまくいかず、最初のフランキングＰＣＲでは増幅できない場合もしばしば見られた。その際には増幅した様々な種の相同遺伝子座の塩基配列を決定してそれらのコンセンサスをとりそれを考慮してまた新たなフランキングプライマーを作製し再度ＰＣＲを行った。
【００６３】
鯨・偶蹄目間の系統関係の推定の際にはアガロース・ゲル電気泳動の後、増幅されたバンドが相同遺伝子座なのか否かを確認するためにサザンハイブリダイゼーションを行った。その行程は以下に示す。アガロース・ゲル電気泳動後エチジウム・ブロマイド（ＥｔＢｒ）溶液で染色し、デジタルカメラによって泳動パターンを確認、撮影した。その後変性溶液（０．４  ＮａＯＨ，  ０．６Ｍ  ＮａＣｌ）  に十分浸したメンブレン１枚、ろ紙２枚をこの順で、間に気泡が入らないようにゲルにのせてその上にＪＫワイパー、キムタオル（商標）、重しとして辞典などを載せ、一晩（〜１５時間）放置した。メンブレンを中和溶液（１  Ｍ    ＮａＣｌ，  ０．５  Ｍ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．０））に１５分程度放置して中和した後十分に乾燥させた。その後のハイブリダイゼーション、現像などの操作は前述のスクリーニングの時と同じなので省略する。また鯨目内の系統関係推定の際には殆どの遺伝子座についてそれらの塩基配列を決定したので基本的にサザンハイブリダイゼーションによる確認は行わなかった。
【００６４】
実施例１：鯨偶蹄目ゲノム内におけるＣＨＲ−２各サブファミリーの分布
鯨の起源ついてはその内部系統について形態による分類と分子による分類で見解がわかれている。鯨目は現生の多くの種類を含む歯鯨亜目と髭鯨亜目、そしてこれらの祖先となったと考えられている原鯨亜目（ムカシクジラ亜目とも呼ばれている）の３つの亜目に分けられており（Ｆｏｒｄｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、現生の鯨類の分類はその分類名からも明らかなように、歯を持つか否かによって区別されている。しかし、髭鯨類も発生のかなり最後の方の段階まで歯が確認できるし原鯨類の化石種の中には当然のことながら歯鯨と髭鯨の中間段階にあると思われるような形質を備えたもの（つまり歯を持った髭鯨）も存在しているので、実際の問題として歯の存在だけで歯鯨の単系統性を主張することはできない。それは系統的に考えた時に髭鯨の「髭」はおそらく共有派生形質であるが歯鯨の「歯」という形質は原始形質とみなされるためである。しかし歯鯨のみがエコロケーションをする能力を持ち、それに付随するメロン体の存在も歯鯨の単系統性を示唆する最も有名な形質のひとつである。
【００６５】
形態的分類が歯鯨、髭鯨類のそれぞれの単系統性を強く主張しているのに対して、現在までに行われてきた分子を用いた系統解析によればその殆どが歯鯨が単系統群を形成しないことを示唆している。その中でも大きな論争の火種となったのがＭｉｌｉｎｋｏｖｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９９３）のミトコンドリア遺伝子配列の比較解析により提唱された系統樹でこの解析によれば歯鯨に含まれているマッコウクジラ上科のグループが他の歯鯨類よりむしろ髭鯨類に近縁である（つまり歯鯨は多系統である）という。この結果に続いて多くの分子統計学的研究がなされたが多くは歯鯨が多系統もしくは解決不可能という結果となっていた（ｅ．  ｇ．，  Ａｒｎａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６：図１７参照）。そこで、以下の問題を解決すべくＳＩＮＥ法を用いて種判別を行った：問題（１）歯鯨の単系統性の問題；（２）全てのカワイルカ類を含めたそれらの鯨目における系統関係；（３）鯨類それぞれの分岐年代。本願発明により、系統関係の決定のみならず現在まで絶対的な信頼性をもって進められてきた統計学的解析の問題点なども明らかにすることができた。
【００６６】
上述のように、本願発明者は、偶蹄目ゲノム中に存在するＣＨＲ−２には大きく分けてＦＬ（Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ），  ＭＤ（Ｍｉｄｄｌｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ）、ＤＴ（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｔｙｐｅ）、ＣＤ（Ｃｅｔａｃｅａ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ）、  ＣＤＯ（Ｃｅｔａｃｅａ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ  Ｏｄｏｎｔｏｃｅｔｉ）のサブファミリーが存在することを発見した。それぞれのサブファミリーは進化の過程における増幅時期が異なるためそれらの分布は系統関係を反映すると考えられる。各サブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを図１８に示す。図１８から明らかなように各サブファミリーはそれらにＤｉａｇｎｏｓｔｉｃな塩基置換や欠失が認められる。
【００６７】
これらＳＩＮＥ各サブファミリーの鯨、偶蹄目における分布を確認するためにドットハイブリダイゼーションを行った。用いたプローブは、ＣＤとＣＤＯに関してはそれらの区別が可能な位置にオリゴプローブを設計し（アラインメントの太線）、ＦＬに関してはＰＣＲ産物を使用した。ドットハイブリダイゼーションの結果を図１２に示す。まずＦＬは全ての鯨目そして偶蹄目ではカバ、ウシ（反すう亜目を代表）のみに分布し、ブタやラクダ及びその他外群として加えた哺乳類ゲノム中には存在しないことが示唆された。次にＣＤは鯨目のみに特異的に分布し偶蹄目には分布してないと考えられ、鯨目の単系統性を強く支持している。さらにＣＤＯに関しては、歯鯨にのみ強くシグナルが確認されることからこのサブファミリーは歯鯨亜目特異的に爆発的な増幅をしたと考えられ、分子による解析から疑問視されている歯鯨の単系統性を支持するデータである。しかしドットハイブリダイゼーションによる解析においてシグナルが確認されないだけでは、単にその系統でコピー数が少なかっただけという可能性を否定できないので、その結果だけで系統関係を推定することはできない。そこで実際にそれらのＳＩＮＥが鯨目ゲノム中に挿入している様な遺伝子座を単離して系統関係の推定を行った。
【００６８】
実施例２−１：ＳＩＮＥのゲノム中への挿入を指標とした鯨目内部系統の解析
鯨目内部系統に関する研究においては、鯨目に存在するＳＩＮＥの中から鯨目全体に特異的に分布しているＣＤ及び、歯鯨亜目に特異的に増幅していると考えられるＣＤＯに注目し、鯨目各種のゲノム・ライブラリーからこれらのサブファミリーに属するＳＩＮＥ配列を含む遺伝子座の単離を行った。上述のように効率的に系統解析を行うにはサブファミリーの分布とその増幅時期を対応させて予測ができる。マッコウクジラの系統解析に関しては、歯鯨の単系統性を示唆するような遺伝子座の探索を続けられてきたにもかかわらずそのような遺伝子座が単離できなかった理由として、主に歯鯨にのみ分布しているＣＤＯに注目して行っていたからではないかと考えた。そこでマッコウクジラのゲノム・ライブラリーのスクリーニングだけはＣＤＯより一つ前に増幅したと思われるＣＤの配列を用いて行った。以下に記載する各遺伝子座の名称と使用したゲノム・ライブラリーがどの鯨種由来かの対応関係をまとめておく：Ｍａｇｏ：マゴンドウ、Ｉｓｉ：イシイルカ、  Ａｍｚ：アマゾンカワイルカ、Ｔｕｔｉ：ツチクジラ、Ｓｐ  及びＳｐｅｒｍ：マッコウクジラ、Ｂａｎｄｏ：バンドイルカ、並びに  Ｈｕｍｐ：ザトウクジラ。鯨目の系統関係を示唆する遺伝子座の単離に用いたＰＣＲプライマーを以下の表３：
【表３】
0003600891.tif 000004
に示す。
【００６９】
実施例２−２：鯨目の単系統性を支持する遺伝子座
遺伝子座Ｂａｎｄｏ１をバンドウイルカ、遺伝子座Ｓｐ３１６をマッコウクジラのゲノム・ライブラリーから単離した。これらの遺伝子座の塩基配列決定、ＳＩＮＥ近傍領域におけるプライマー設計、鯨偶蹄目のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応、アガロース・ゲル電気泳動による分離を行った。その結果、図１９に示す通り遺伝子座Ｂａｎｄｏ１とＳｐ３１６では鯨目に共通にＳＩＮＥの挿入があったようなバンドパターンが確認できた。最も近縁な外群として用いたカバにはこの挿入はないので、鯨目が共通祖先であった時期にその挿入が起こったものと考えられる。これらの遺伝子座は鯨目の単系統性を強く支持している。遺伝子座Ｂａｎｄｏ１においてはまずＣＤが鯨目の共通祖先時に挿入し、その後南米のカワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカの共通祖先種においてＣＤＯの挿入があったものと考えられる。よってこの遺伝子座は鯨目の単系統性だけでなく南米カワイルカの単系統性も同時に示唆している。遺伝子座Ｓｐ３１６ではＣＨＲ−１ｔｙｐｅＩＩＩが鯨目の共通祖先で挿入ことを示している。図２０〜２２に遺伝子座Ｂａｎｄｏ１のアラインメントの結果を、そして図２３に遺伝子座Ｓｐ３１６のアラインメントの結果を示す。
【００７０】
実施例２−３：イルカ上科の単系統性を支持する遺伝子座
遺伝子座Ｍａｇｏ１９においてはイルカ上科４種（マイルカ科：コビレゴンドウ、バンドウイルカ；ネズミイルカ科：イシイルカ；イッカク科：イッカク）に特異的なＣＤＯの挿入が確認された（図２４参照）。この遺伝子座はイルカ上科の単系統性を強く支持している。図２５と２６に遺伝子座Ｍａｇｏ１９のアラインメントの結果を示す。
【００７１】
実施例２−４：Ｉｎｆｒａｏｒｄｅｒ：  Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄａを支持する遺伝子座
遺伝子座Ｍａｇｏ２４，  Ｍａｇｏ２６，  Ｍａｇｏ３２，  Ｉｓｉ１４，  Ｉｓｉ３６，  Ｉｓｉ３８ではＣＤＯの挿入がイルカ上科４種、南米カワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ及びヨウスコウカワイルカにのみ確認された（図２７と２８参照）。よってこれらの遺伝子座はこのグループの単系統性を支持している。Ｍｕｉｚｏｎ（１９８８，１９９４）は形態的特徴からこれらのグループをＤｅｌｐｈｉｎｉｄａ下目（亜目よりも階級的には下）としてまとめているがこの考えにもよく一致している。またＡｒｎａｓｏｎ（１９９６）らのミトコンドリアＣｙｔｂ遺伝子の配列による解析でもこのことは強く支持されている。またカワイルカ類が多系統群でガンジスカワイルカが他のカワイルカ類より原始的であることを示唆している。図２９に遺伝子座Ｉｓｈｉ１４のアラインメントの結果を示す。図３０〜３１に遺伝子座Ｉｓｈｉ３６のアラインメントの結果を示す。図３２〜３３に遺伝子座Ｉｓｈｉ３８のアラインメントの結果を示す。図３４〜３５に遺伝子座Ｍａｇｏ２４のアラインメントの結果を示す。図３６〜３７に遺伝子座Ｍａｇｏ２６のアラインメントの結果を示す。図３８〜３９に遺伝子座Ｍａｇｏ３２のアラインメントの結果を示す。
【００７２】
実施例２−５：アカボウクジラ科の系統関係を示唆する遺伝子座
遺伝子座Ｍａｇｏ８，  Ｍａｇｏ１３においてはＤｅｌｐｈｉｎｉｄａとアカボウクジラ科に属する２種ツチクジラ、オオギハクジラに特異的なＣＤＯの挿入が確認された（図４０参照）。このことから現生種ではアカボウクジラ科がＤｅｌｐｈｉｎｉｄａに最も近縁な分類群であるといえる。またガンジスカワイルカ科はアカボウクジラ科よりさらに原始的なグループであることがわかる。図４１に遺伝子座Ｍａｇｏ８のアラインメントの結果を示す。図４２に遺伝子座Ｍａｇｏ１３のアラインメントの結果を示す。
【００７３】
実施例２−６：ガンジスカワイルカ科の系統関係を示唆する遺伝子座
遺伝子座Ｍａｇｏ２１，  Ｍａｇｏ２２においてはＤｅｌｐｈｉｎｉｄａ、アカボウクジラ科及びガンジスカワイルカに特異的なＣＤＯの挿入が確認された（図４３参照）。よってガンジスカワイルカ科（インダスカワイルカはサンプルがないため解析には加えていないがおそらくガンジスカワイルカと単系統群を形成する。）はマッコウクジラを除く歯鯨の中では最も原始的なグループであることが明らかとなった。図４４に遺伝子座Ｍａｇｏ２１のアラインメントの結果を示す。図４５〜４７に遺伝子座Ｍａｇｏ２２のアラインメントの結果を示す。
【００７４】
実施例２−７：歯鯨の単系統性を支持する遺伝子座
遺伝子座Ｓｐｅｒｍ８，  Ｓｐｅｒｍ２８，  Ｓｐｅｒｍ４７においてはマッコウクジラも含めた歯鯨亜目全ての種で共通にＣＤの挿入が確認された（図４８参照）。これらの遺伝子座の解析結果は分子統計学的研究から疑問視され続けてきた歯鯨の単系統性が強く支持された。図４９〜５０に遺伝子座Ｓｐｅｒｍ８のアラインメントの結果を示す。図５１に遺伝子座Ｓｐｅｒｍ２８のアラインメントの結果を示す。図５２に遺伝子座Ｓｐｅｒｍ４７のアラインメントの結果を示す。
【００７５】
実施例２−８：南米カワイルカの単系統性を支持する遺伝子座
遺伝子座Ａｍｚ１３，  Ｂａｎｄｏ１においては南米カワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカにおいて共通にＣＤＯの挿入が見られた（図５３参照）。南米カワイルカ２種及びヨウスコウカワイルカの３者の系統関係に関してはいくつかの仮説がありヨウスコウカワイルカが南米カワイルカ類のいずれかと単系統群を形成する説もあったが（Ｋａｓｕｙａ，  １９７３；  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）これら２つの遺伝子座によって南米カワイルカ類が単系統であることが強く支持された。今までに提唱されてきたいくつかの仮説の中では生物地理学的にも最も理想的な系統関係であると考えられる。図５４に遺伝子座Ａｍｚ１３のアラインメントの結果を示す。
【００７６】
実施例２−９：アマゾンカワイルカに特異的な遺伝子座Ａｍｚ１１
図５５にアマゾンカワイルカに特異的にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ａｍｚ１１のバンドパターンを示す。図５６に遺伝子座Ａｍｚ１１のアラインメントの結果を示す。
【００７７】
実施例２−１０：アカボウクジラ科に特異的な遺伝子座Ｔｕｔｉ２４，  Ｔｕｔｉ３５
図５７にアカボウクジラ科に特異的にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｔｕｔｉ２４，  Ｔｕｔｉ３５のバンドパターンを示す。図５８に遺伝子座Ｔｕｔｉ２４のアラインメントの結果を示す。図５９〜６０に遺伝子座Ｔｕｔｉ３５のアラインメントの結果を示す。
【００７８】
実施例２−１１：マッコウクジラ上科３種に特異的な遺伝子座Ｓｐ９、及びマッコウクジラ科に特異的なＳｐ２
図６１にマッコウクジラ上科３種にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｓｐ９、及びマッコウクジラ科に特異的なＳｐ２のバンドパターンを示す。図６２〜６３に遺伝子座Ｓｐ２のアラインメントの結果を示す。図６４に遺伝子座Ｓｐ９のアラインメントの結果を示す。
【００７９】
実施例２−１２：ナガスクジラ科（又は髭鯨）に特異的な遺伝子座Ｈｕｍｐ２０，  Ｈｕｍｐ２０３
図６５にナガスクジラ科（又は髭鯨）に特異的なＣＤの挿入があったことを示す遺伝子座Ｈｕｍｐ２０，  Ｈｕｍｐ２０３のバンドパターンを示す。図６６〜６８に遺伝子座Ｈｕｍｐ２０のアラインメントの結果を示す。図６９に遺伝子座Ｈｕｍｐ２０３のアラインメントの結果を示す。
【００８０】
実施例３：鯨目内部の系統樹の作成
以上の結果から得られたＳＩＮＥの挿入パターンをマトリックスにまとめた（図７０参照）。これに基づき推定される鯨目内部の系統発生樹を図７１に示す。
それぞれの遺伝子座の解析の際に得られたＰＣＲ産物の塩基配列は可能な限りすべて決定し、アラインメントした。その結果得られたバンドパターンが２次的な挿入や欠失などによってもたらされたものでないことを確認した。またこれらの配列は鯨目の核遺伝子配列情報として今後の研究に重要であると考えている。
【００８１】
結果
上記実施例によって明らかになった現生歯鯨類の系統関係を以下にまとめる。１．歯鯨類は単系統群を形成する。マッコウクジラ上科は現生歯鯨の中で最初に分岐したグループである。
２．ガンジスカワイルカ（おそらくインダスカワイルカと単系統）がマッコウクジラ類の次に分岐した。他のカワイルカ類とは別の系統群から派生したものである。
３．次にアカボウクジラ科のグループが分岐する。またアカボウクジラ科のＢｅ      ｒａｄｉｕｓ属及びＭｅｓｏｐｌｏｄｏｎ属は単系統である。
４．南米のカワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカが単系統である。
５．イルカ上科に属するマイルカ科、ネズミイルカ科及びイッカク科は単系統群を形成する。
【００８２】
以上の系統関係は、系統発生学的に重要な意味をもつだけではなく、数種の動物から成る検体が提供された場合、ＳＩＮＥが挿入された適当な遺伝子座を選択することにより、塩基配列分析を省略してその検体がどの種であるか判別することができる本願発明に係るＳＩＮＥ法を用いた種判別方法の信頼性の基礎をなす。鯨目以外の動物についてもＳＩＮＥ法により、さらに系統発生樹を確立することによって、それらの目内においても鯨目内におけるものと同様な種判別方法を確立することができる。なぜなら、分子統計学的手法を用いた系統解析には以下に述べるように限界があるからである。
過去にマッコウクジラの系統関係に関して行われた分子統計学的な研究で歯鯨の単系統性を示唆するような結果は殆ど得られていなかった。これらの解析が主にミトコンドリア遺伝子の配列を用いていたことから当初はミトコンドリアに特異的な現象なのかとも考えられたが、ミオグロビンのアミノ酸配列の解析（Ｃｚｅｌｕｓｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）でも同じ結果であったし、核遺伝子ＩＲＢＰの解析  （Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）  でも歯鯨の多系統性（マッコウクジラがよりヒゲクジラに近縁である）の方が統計的に有利である結果を示していることから、分子配列を統計学的に解析するとどうしても歯鯨が多系統であるような結果が得られるようである（図７２参照）。しかし上記の結果は明らかに歯鯨が単系統群を形成する事を示唆しているし、また形態学的な特徴から考えても歯鯨の単系統性はまず間違いないであろう。
【００８３】
では何故鯨類を分子統計学的に解析するとマッコウクジラがヒゲクジラにより近縁であるような結果が出てしまうのだろうか。しばしば問題視されるのがアウトグループの選択である。つまり分子の情報からわかるのは各グループの分子的な距離だけでありそれらのグループ（この場合はイルカ、マッコウクジラ、ヒゲクジラ）が分岐する以前に分岐した外群を用いて系統樹の根（Ｒｏｏｔ）の位置を確定する必要がある。しかしその位置は外群の種類と数の違いによって異なる場合があり、初期のＡｒｎａｓｏｎ（１９９４）の解析のように外群をウシ一種しか用いない様な解析はかなり信頼度は低いと考えられる。実際にＣｙｔｂ遺伝子に関してはＡｄａｃｈｉとＨａｓｅｇａｗａ（１９９５）の研究によればアウトグループを変えることでその結果が大きく変わることがわかっている。しかしその後の多数の偶蹄目及びその他有蹄類を外群に用いて行った解析（Ａｒｎａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）でも、歯鯨の単系統性を示唆することができなかったことから単にアウトグループの選択が問題であったとは考えにくい。次に鯨類それぞれの分類群の間で分子進化速度が異なる可能性が考えられる。Ｍａｒｔｉｎ（１９９３）らの研究では塩基置換速度に影響を及ぼすと考えられる代謝の影響などと生物の体のサイズの相関関係を示し、一般に体のサイズが大きいほど塩基置換速度が遅くなる傾向があることを示唆した。つまりイルカ類などの小型の歯鯨類がマッコウクジラやナガスクジラ類の様な大型の髭鯨類に比べて分子進化速度が大きいために統計的な誤差をもたらしたとも考えられる。しかし最終的にＨａｓｅｇａｗａ（１９９７）らが解析に用いた最尤法（Ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は最大節約法（Ｍａｘｉｍｕｍ  ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）とは異なり、各分類群間で分子進化速度が違うような場合においても結果的に間違えた系統樹をつくることは少ないのが特徴であるにもかかわらず結果は変わらなかった。
【００８４】
また種の分岐が短時間の間に起こった可能性も十分に考えられる。例えば歯鯨類ニ髭鯨類の分岐の後、極めて短時間で歯鯨類からマッコウクジラ類が分岐してしまったような場合は歯鯨の間で共通な塩基置換が蓄積するのに十分な時間がなく、しかもマッコウクジラ類がその後の現在に至るまでの長い時間を独自の歴史を経てしまえばその間に蓄積した塩基置換が、歯鯨が共通祖先の時期に蓄積したであろうわずかな共通塩基置換をうやむやにしてしまうことが考えられる。実際に今から３５００万年程前に起きた、オーストラリア大陸の北偏がもたらした南極海流の成立で鯨類の適応放散による種分化はかなりのスピードで起こったことが予想される（Ｆｏｒｄｙｃｅ，  １９９２）。このような場合はどのような解析方法を用いても分子統計学的な解析による系統推定は不可能であると考えられる。また、もし様々な統計学的な仮定を前提にしてより確からしい系統推定ができたとしてもかなり人為的な系統樹になってしまうのではないだろうか。これでは形態的研究よりも勝っている「客観性」という観念からはずれてしまうように思われる。
【００８５】
【発明の効果】
本発明に係る動物種の判別方法の有利な効果の１つは、配列決定工程を省略できることである。一般に、シークエンス装置は最低でも１５００万円であり、そして消耗品については、１回のシークエンスにかかる費用はおよそ１２００円である。したがって、多数の検体を分析する場合、かなりの費用がかかる。さらに、検査会社により商業的に分析する場合、現状、１検体当たり１万円以上請求される。時間的にも、配列決定工程には１検体当たり少なくとも１時間３０分程かかるので、これが省略できるＳＩＮＥ法を用いた種判別方法は分析効率が高い。最も重要なことは、ＤＮＡ塩基配列の解析は統計的な操作を伴うということである。上述のように、このうような統計学的な手法はその解析方法によっても結果がことなるという問題が生じている。これに対し、ＳＩＮＥ法は、ＳＩＮＥの挿入という不可逆現象を指標として種判別を行うので、その結果は明瞭であり、特別な統計学的処理は必要とされない。結論として、本願発明に係るＳＩＮＥ法を用いた種判別方法は、従来技術の塩基配列の比較に基づく種判別方法よりも、金銭的に、時間的にさらにはその信頼性に関しても優れているといえる。
【００８６】
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７．Ｃａｏ  Ｙ，  Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｍ，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ．  Ｉｎｔｅｒｏｒｄｉｎａｌ        ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｉｍｅｓｃａｌｅ  ｏｆ  ｅｕｔｈｅｒｉａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｓ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ      ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａ．  ２０００  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
８．Ｃｌａｒｋ  ＪＢ，  Ｋｉｄｗｅｌｌ  Ｍ．  Ａ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  Ｐ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ        ｅｌｅｍｅｎｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１９７；      ９４：１１４２８−１１４３３
９．Ｃｏｌｔｍａｎ  ＤＷ，  Ｗｒｉｇｈｔ  ＪＭ．  Ｃａｎ  ＳＩＮＥｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ      ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｃａｎｏｉｄｅａ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ        Ｒｅｓ．  １９９４；２２：２７２６−２７３０
１０．Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＰＬ，  Ｂａｔｚｅｒ  ＭＡ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ．  Ｅｖｏｌ．  Ｂｉｏｌ．      １９９３；２７：１５７−１９６
１１．Ｄｅｒａｇｏｎ  ＪＭ，  Ｌａｎｄｒｙ  ＢＳ，  Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ  Ｔ，  Ｔｕｔｏｉｓ  ５，  Ｔｏｕｒｍｅｎｔｅ  ５，  Ｐｉｃａｒｄ        Ｇ．  Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ      ＳＩＮＥｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９４；  ３９：３７８−３８６
１２．Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ＴＨ．  Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ        ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｉｎ  Ｍｏｒｓｅ  ＳＳ．  ｅｄ；  Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ        Ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ．  １９９４．  Ｐｐ．１２１−１５７
１３．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ＰＣ，  Ｌｅａｒ  ＴＬ，  Ｃｏｏｇｌｅ  ＬＤ，  Ｂａｉｌｅｙ  Ｅ．  Ｔｗｏ  ＳＩＮＥ  ｆａｍｉｌｉｅｓ        ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｌｏｃｉ．  Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．  １９９９；  １０：        １４０−１４４
１４．Ｇａｌｌｉ  Ｇ，  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ，  Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ  ＭＬ．  Ｔｗｏ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｌｏｃｋｓ        ｗｉｔｈｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ        １９８１；２９４：６２６−６３１
１５．Ｈａｍａｄａ  Ｍ，  Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｒｅｉｓｔ  ＪＤ，  Ｄｅ  Ｃｉｃｃｏ，  Ｇｏｔｏ  Ａ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．      Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌｌｙ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＳＩＮＥｓ        ｔｏｗａｒｄ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｒｒ      ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；１５０：  ３０１−３１１
１６．Ｈａｒｔｌ  ＤＬ，  Ｌｏｈｅ  ＡＲ，  Ｌｏｚｏｖｓｋｙａ  ＥＲ．  Ｍｏｄｅｒｎ  ｔｈｏｕｇｈｔｓ  ｏｎ  ａｎ  ａｎｃｙｅｎｔ      ｍａｒｉｎｅｒｅ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７；      ３１：３３７−３５８．
１７．Ｈｅｎｄｙ  ＭＤ，  Ｐｅｎｎｙ  Ｄ．  Ｓｙｓｔ．  Ｚｏｏｌ．  １９８９；３８：２９７−０００
１８．Ｈｅｎｎｉｇ  Ｗ．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅ：        Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｐｒｅｓｓ．  １９６６．
１９．Ｈｉｌｌｉｓ  ＤＭ．  ＳＩＮＥｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，        ＵＳＡ  １９９９；９６：  ９９７９−９９８１
２０．Ｉｚｓｖａｋ  Ｚ，  Ｉｖｉｃｓ  Ｚ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｔｅｆａｎｉａ  Ｄ，  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  ＳＣ，  Ｈａｃｋｅｔｔ  ＰＢ．        ＤＡＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ，  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｈｏｒｔ      ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ        ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  （Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９６；９３：１０７７−      １０８１
２１．Ｊｕｒｋａ  Ｊ，  Ｚｅｉｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｅ，  Ｌａｂｕｄａ  Ｄ．  Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｗｉｄｅ        ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅａｔｓ  （ＭＩＲ５）  ａｒｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｓｓｉｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ      Ｍｅｓｏｚｏｎｉｃ  ｅｒａ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９５；２３：１７０−１７５
２２．Ｋａｓｓ  ＤＨ，  Ｒａｙｎｏｒ  ＭＥ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＴＭ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｂ１        ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｍｕｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．  ２０００；５１：２５６−６４
２３．Ｋａｚａｚｉａｎ  ＨＨ  Ｊｒ，  Ｍｏｒａｎ  ＪＶ．  Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｌｉ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ        ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；１９：１９−２４
２４．Ｋｉｄｏ  Ｙ，  Ｈｉｍｂｅｒｇ  Ｍ，  Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ        ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｄｕｒｉｎｇ        ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９４；２４１：  ６３３−６４４
２５．Ｋｉｄｏ  Ｙ，  Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，  Ｍｕｒａｔａ  ５，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ      ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｐａＩ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．      １９９５；４１：９８６−９９５
２６．Ｋｉｍ  Ｊ，  Ｍａｒｔｉｇｎｅｔｔｉ  ＪＡ，  Ｓｈｅｎ  ＭＲ，  Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，  Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｐ．  Ｒｏｄｅｎｔ  ＢＣ１        ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｍａｓｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ＩＤ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．      Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  １９９４；９１：  ３６０７−３６１１
２７．Ｋｒａｍｅｒｏｖ  Ｄ，  Ｖａｓｓｅｔｚｋｙ  Ｎ，  Ｓｅｒｄｏｂｏｖａ  Ｉ．  Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ        ｄｏｒｍｉｃｅ  （Ｇｌｉｒｉｄａｅ）  ｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔｉａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｈｏｒｔ        ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９９；１６：７１５−７１７
２８．Ｌｅｅｆｌａｎｇ  ＥＰ，  Ｌｉｕ  Ｗ−Ｍ，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｃ，  Ｃｈｏｕｄａｒｙ  ＰＶ，  Ｓｃｈｍｉｄ  ＣＷ．      Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｕ  ｓｏｕｒｃｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．        １９９２；３５：  ７−１６
２９．Ｌｕａｎ  ＤＤ，  Ｋｏｒｍａｎ  ＭＨ，  Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  ＪＬ，  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ＴＨ．  Ｒｅｖｅｒｓｅ      ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒ２Ｂｍ  ＲＮＡ  ｉｓ  ｐｒｉｍｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｉｃｋ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ      ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ：  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ＲＴＬ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １９９３      ；７２：  ５９５−６０５
３０．Ｌｕｍ  ＪＫ，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｓｈｉｍｏｄａｉｒａ  Ｈ，  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＡＭ，  Ｏｋａｄａ      Ｎ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ．  Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ＳＩＮＥ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｌａｎｋｉｎｇ        ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒｅｅ：  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌｓ．      Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２０００；  １７：１４１７−１４２４
３１．Ｍａｔｅｒａ  Ａ  Ｇ，  Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｕ，  Ｓｃｈｍｉｄ  ＣＷ．  Ａ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｎｄ        ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ａｌｕ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０；      ｉ０：  ５４２４−５４３２
３２．Ｍｉｎｎｉｃｋ  ＭＦ，  Ｓｔｉｌｌｗｅｌｌ  ＬＣ，  Ｈｅｉｎｅｉｎａｎ  ＪＭ，  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ  ＧＬ．  Ａ  ｈｉｇｈｌｙ        ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｓｓｉｂｌｙ  ｕｎｉｑｕｅ  ｔｏ  ｃａｎｉｄｓ．  Ｇｅｎｅ  １９９２；  １１０：      ２３５−２３８
３３．Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ＭＭ．  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＳＩＮＥｓ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｈｉｓｔｏｒｙ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ        Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００；９：８１６−８１９
３４．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｋ，  Ｕｍｅｄａ  Ｍ，  Ｏｈｔｓｕｂｏ  Ｈ，  Ｏｈｔｓｕｂｏ  Ｅ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ        ｐｌａｎｔ  ＳＩＮＥ，  ｐ−ＳＩＮＥ１，  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｇｅｎｏｉｎｅｓ．  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２；  ６７：      １５５−１６６
３５．Ｍｕｒａｔａ  Ｓ，  Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ        ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓａｌｍｏｎｉｄｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ        ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ａｓ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌａｎｄｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．        Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  １９９３；  ９０：  ６９９５−６９９９
３６．Ｍｕｒａｔａ  Ｓ，  Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，  Ｔａｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ      ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｉｎｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ａ        ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｌ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ  ｓａｌｍｏｎ        ａｎｄ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｔｌａｎｔｉｃ  ｓａｌｍｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｏｕｔ      （Ｓａｌｍｏ）．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９６；１４２：９１５−９２６
３７．Ｎａｇａｈａｓｈｉ  ５，  Ｅｎｄｏｈ  Ｈ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ      ｔａｎｄｅｍｌｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ        ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９１；  ２２２：      ３９１−４０４
３８．Ｎｅｉ，  Ｍ，  Ｋｕｍａｒ  Ｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｏｘｆｏｒｄ      Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ２０００．
３９．Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＡＰ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ        ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ        ｅｌｅｍｅｎｔｓ：  Ｈｉｐｐｏｐｏｔａｍｕｓｅｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｅｘｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ  ｏｆ        ｗｈａｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  １９９９；９６：  １０２６１−１０２６６
４０．Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｎｏ  Ｆ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ，  Ｂｒｏｗｎｅｌｌ  Ｊｒ．  ＲＬ，  Ｃａｏ  Ｙｉｎ，  Ｄｉｎｇ      Ｗａｎｇ，  Ｚｕｏｙａｎ  Ｚｈｕ，  Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＡＭ，  Ｆｏｒｄｙｃｅ  Ｅ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．      Ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｃｅｔａｃｅａｎ  ｌｉｎｅａｇｅｓ：  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｐｈｙｌｙ  ｏｆ      ｔｏｏｔｈｅｄ  ｗｈａｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｒａｐｈｙｌｙ  ｏｆ  ｒｉｖｅｒ  ｄｏｌｐｈｉｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．        Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００１  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
４１．Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｈａｒａｄａ  Ｍ，  Ｃａｏ  Ｙ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｍｏｎｏｐｈｙｌｅｔｉｃ        ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒｄｅｒ  Ｃｈｉｒｏｐｔｅｒａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ        ｍａｍｍａｌｉａ，  ａｓ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ      ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｏｆ  ａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｍｅｇａｂａｔ，  ｔｈｅ  Ｒｙｕｋｙｕ  ｆｌｙｉｎｇ  ｆｏｘ      （Ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｄａｓｙｍａｌｌｕｓ）．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２０００；５１  ：３１８−３２８
４２．Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｋｏｉｓｈｉ  Ｒ，  Ｍａｔｓｕｏ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｓｅｖｅｒａｌ  ｓｈｏｒｔ        ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｉｎ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｍａｙ        ｈａｖｅ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ：        ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｑｕｉｄ  ＳＩＮＥ  ａｎｄ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ        ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ        １９９３；９０：６２６０−６２６４
４３．Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｇｅｎｅｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔＲＮＡ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ      ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ        ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｃｔｏｐｕｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．      Ｂｉｏｌ．  １９９４；２４３：２５−３７
４４．Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｈａｍａｄａ  Ｍ，  Ｔｅｒａｉ  Ｙ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｔｈｅ  ３’  ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡｄｅｒｉｖｅｄ        ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ３’      ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．        １９９６；１６：  ３７５６−３７６４
４５．Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥｓ：  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ        ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ．  ＴＲＥＥ  １９９１ａ；６：３５８−３６１
４６．Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  １９９１ｂ；１：４９８−５０４
４７．Ｏｋａｄａ  Ｎ，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＳＩＮＥｓ．  Ｉｎ  Ｍａｒａｉａ  ＲＪ．        ｅｄ；  Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ        ｇｅｎｏｉｎｅ．  Ａｕｓｔｉｎ：  ＲＧ  Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏ．  １９９５．  ｐ  ６２−７９．
４８．Ｏｋａｄａ  Ｎ，  Ｈａｍａｄａ  Ｍ，  Ｏｇｉｗａｒａ  Ｉ，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ．  ＳＩＮＥｓ  ａｎｄ  ＬＩＮＥｓ  ｓｈａｒｅ      ｃｏｍｍｏｎ  ３’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｇｅｎｅ  １９９７；２０５：  ２２９−２４３
４９．Ｗａｄｄｅｌ  ＰＪ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ，  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｏｒｄｉｎａｌ        ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；４８：１−５
５０．Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ．  Ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；３０１：４６０
５１．Ｒｏｋａｓ  Ａ，  Ｈｏｌｌａｎｄ  ＰＷＨ．  Ｒａｒｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ      ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ＴＲＥＥ  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
５２．Ｓａｋａｇａｍｉ  Ｍ，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｍｕｋｏｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｓｕｅ  Ｈ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔＲＮＡ        ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ      （ＳＩＮＥｓ）．  Ｅｑｕｉｎｅ  ＳＩＮＥｓ  ｍａｙ  ｈａｖｅ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）．  Ｊ．  Ｍｏｌ．        Ｂｉｏｌ．  １９９４；２３９：７３１−７３５
５３．Ｓｃｈｍｉｄ  Ｃ．  Ａｌｕ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｏｒｉｇｉｎ，  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ        ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｅ−ｔｅｎｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ．  Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ａｎｄ  Ｍｏｌ．        Ｂｉｏｌ．  １９９６；５３：２８３−３１９
５４．Ｓｃｈｍｉｄ  ＣＷ，  Ｍａｒａｉａ  Ｒ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ        ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ＳＩＮＥ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．        Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖｅｌ．  １９９２；２：  ８７４−８８２
５５．Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｊ，  Ｏｈｘｎｅ  Ｍ，  Ｚｉｓｃｈｌｅｒ  Ｈ．  ＳＩＮＥ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｌａｄｉｓｔｉｃ      ａｎａｌｙｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｓｉｕｓ  ｂａｎｃａｎｕｓ  ｔｏ        ｏｔｈｅｒ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００１  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
５６．Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，  ＡＭ．，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ：  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ        ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２０００；  ２２：１４８−１６０
５７．Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＡＭ，  Ｍｉｌｉｎｋｏｖｉｔｃｈ  ＭＣ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ｍｉｓｓｉｎｇ      ｄａｔａ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｗｈａｌｅｓ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２０００；  ４９：８０８−８１７
５８．Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＡＭ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ：  ｔｒａｃｋｉｎｇ      ｔｈｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ．  ＴＲＥＥ  ２００１
５９．Ｓｈｅｎ  ＭＲ，  Ｂａｔｚｅｒ  ＭＡ，  Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＰＬ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ａｌｕ  Ｇｅｎｅ      （ｓ）．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９１；３３：  ３１１−３２０
６０．Ｓｈｅｒｒｙ  ＳＴ，  Ｈａｒｐｅｎｄｉｎｇ  ＨＣ，  Ｂａｔｚｅｒ  ＭＡ，  Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇ  Ｍ．  Ａｌｕ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ        ｈｕｍａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ      ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９７；  １４７：１９７７−１９８２
６１．Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｙａｓｕｅ  Ｈ，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ａｂｅ  Ｈ，  Ｋａｔｏ  Ｈ，  Ｋｉｓｈｉｒｏ  Ｔ，  Ｇｏｔｏ  Ｍ，        Ｍｕｎｅｃｈｉｋａ  Ｉ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ  ｔｈａｔ        ｗｈａｌｅｓ  ｆｏｒｍ  ａ  ｄａｄｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｅｖｅｎ−ｔｏｅｄ  ｕｎｇｕｌａｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８８：      ６６６−６７０
６２．Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ，  Ａｂｅ  Ｈ，  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｍ，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ｇｅｎｅａｌｏｇｙ  ｏｆ        ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ＳＩＮＥｓ  ｉｎ  ｃｅｔａｃｅａｎ  ａｎｄ  ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌｓ：  Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ        ｈｕｇｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔＲＮＡＧ１ｕ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ＳＩＮＥｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．        Ｅｖｏｌ．  １９９９；１６：１０４６−１０６０
６３．Ｓｍｉｔ  ＡＦＡ，  Ｔｏｔｈ  Ｇ，  Ｒｉｇｇｓ  ＡＤ，  Ｊｕｒｋａ  Ｊ．  Ａｎｃｅｓｔｒａｌ，  ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｗｉｄｅ      ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ＬＩＮＥ−ｉ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９５；        ２４６：４０１−４１７
６４．Ｓｍｉｔ  ＡＦＡ，  Ｒｉｇｇｓ  ＡＤ．  ＭＩＲ５  ａｒｅ  ｃｌａｓｓｉｃ，  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＳＩＮＥｓ  ｔｈａｔ        ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｅｆｏｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９５；      ２３：９８−１０２
６５．Ｓｐｒｉｎｚｌ  Ｍ．  Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｔ，  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ｆ，  Ｍｏｌｌ  Ｊ，  Ｖｏｒｄｅｒｗｉｉｌｂｅｃｋｅ  Ｔ．        Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ        Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８７；１５：ｒ５３−ｒ１８８
６６．Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｕ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ        ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｌａｒｇｅｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａ．  Ｇｅｎｏｍｅ        Ｒｅｓ．  １９９７；７：１０６１−１０７１
６７．Ｓｕｒｚｙｃｋｉ  ＳＡ，  Ｂｅｌｋｎａｐ  ＷＲ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ        ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；４８：６８４−６９１
６８．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｔｅｒａｉ  Ｙ，  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｍ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ        ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｆｒｏｍ  ｃｉｃｈｌｉｄｓ：  ｔｈｅ        ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＩＮＥｓ  ａｔ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｏｕｓ  ｌｏｃｉ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｅ      ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｙｌｙ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｃｉｃｈｌｉｄ  ｆｉｓｈｅｓ  ｉｎ  Ｌａｋｅ        Ｔａｎｇａｎｙｉｋａ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９８；１５：３９１−４０７
６９．Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｍｕｒａｔａ  ５，  Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，  Ｐａｒｋ  Ｌ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．        Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ        ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ：  Ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ      ｐａｒａｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｉｒｅ  ｇｅｎｏｉｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ        ｓａｌｍｏｎｉｄｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９４；９１：  １０１５３−１０１５７
７０．Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｐａｒｋ  Ｌ，  Ｋａｅｒｉｙａｉｎａ  Ｍ，  Ｇｈａｒｒｅｔｔ  ＡＪ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．        Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＳＩＮＥｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ        ｓａｌｍｏｎｉｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  −  ｃｈｕｍ  ｓａｌｍｏｎ，  ｐｉｎｋ  ｓａｌｍｏｎ，  ａｎｄ  ｋｏｋａｎｅｅ：  ｔｈｅ        ｌｏｃａｌ  ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｉｎｅ  ｍａｙ  ｂｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ      ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｇｅｎｅ  ａｔ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｅｄ  ｌｏｃｕｓ．        Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９６；４２：１０３−１０６
７１．Ｔｅｒａｉ  Ｙ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ．  ＳＩＮＥ  Ｃｏｕｓｉｎｓ：  Ｔｈｅ  ３’  ｅｎｄ  ｔａｉｌｓ  ｏｆ        ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｏｌｄｅｓｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ＳＩＮＥｓ  ａｒｅ      ｄｅｓｃｅｎｄｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ３’  ｅｎｄｓ  ｏｆ  ＬＩＮＥｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｇｅｎｅｏｌｏｇｉｃａｌ        ｏｒｉｇｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９９８；１５：  １４６０−１４７１
７２．Ｕｎｓａｌ  Ｋ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＧＴ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ      ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＳＩＮＥｓ）  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ        ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ−      ｒｅｐｅａｔ  ＳＩＮＥｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９５；  ２４８：８１２−８２３
７３．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ  ＨＨＪ，  Ｌｅｎｓｔｒａ  ＪＡ．  ＳＩＮＥ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ．        Ｍａｍｍａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １９９５；６：４９−５１
７４．Ｗｅｉｎｅｒ  Ａ，  Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＰＬ，  Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ  Ａ．  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎｓ：        ｇｅｎｅｓ，  ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ      ｒｅｖｅｒｓｅ  ｆｌｏｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８６；５５：      ６３１−６６１
７５．Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｙ，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ５，  Ｋｏｊｉｉｎａ  ５，  Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｏｋａｄａ  Ｎ，  Ｍａｃｈｉｄａ  Ｙ．        Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ      ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ      ｔＲＮＡ５．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９３；  ９０：６５６２−６５６６
【００８７】
【配列表】
0003600891.tif 000005
0003600891.tif 000006
0003600891.tif 000007
0003600891.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＩＮＥのレトロポジションに関する一般ダイアグラム。
【図２】図２（Ａ）はマスター遺伝子モデルを表し、そして図２（Ｂ）は多数源遺伝子モデルを表す。
【図３】ＳＩＮＥの進化の指標としての有用性を示す。
【図４】種Ａ〜Ｄの系統樹モデルを表す。図４（Ｃ）はＰＣＲパターンを示す。
【図５】選択された動物種由来の全ゲノムＤＮＡからの転写産物のいくつかのパターン例である。
【図６】ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様構造を示す。
【図７】図７（Ａ）はＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのｔＲＮＡ様二次構造を示し、そして図７（Ｂ）はヒトｔＲＮＡ  Ｇｌｕの二次構造を示す。
【図８】ＣＨＲ−２のいくつかの配列アラインメントからのＣＨＲ−２  ＳＩＮＥのコンセンサス配列の構築を表す。
【図９】ｔの時に増幅された古いＳＩＮＥと、ｕの時に増幅された若いＳＩＮＥを含む系統分類樹。
【図１０】アラインメントによるＳＩＮＥファミリーのサブファミリーを表す特徴的なヌクレオチド又は可能な欠失の同定を表す。
【図１１】ＣＨＲ−２  ＳＩＮＥファミリーのサブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを示す。
【図１２】ＣＤ，ＣＤＯ，及び他のサブファミリーに特異的なプローブを、それぞれ、用いたドット−ハイブリダイゼーション実験の結果を示す。
【図１３】フランキングＳＩＮＥ  ＰＣＲの原理を模式的に示す。
【図１４】フランキングＰＣＲ結果の１例を示す。また、図１４（Ｂ）と（Ｃ）に２つの異なるプローブを用いた同一フィルターを用いて行ったハイブリダイゼーション実験結果を同時に示す。
【図１５】哺乳動物の系統発生樹を示す。
【図１６】ＳＩＮＥ法における実験の流れを示す。
【図１７】分子統計学的研究から提唱された系統樹（歯鯨類の単系統性の問題をめぐる論争）を示す。
【図１８】ＣＨＲ−２各サブファミリーのコンセンサス配列のアラインメントを示す。
【図１９】鯨目に共通にＳＩＮＥの挿入があったことを示す遺伝子座Ｂａｎｄｏ１とＳｐ３１６のバンドパターンを示す。
【図２０】遺伝子座Ｂａｎｄｏ１のアラインメントの結果を示す。
【図２１】遺伝子座Ｂａｎｄｏ１のアラインメントの結果を示す。
【図２２】遺伝子座Ｂａｎｄｏ１のアラインメントの結果を示す。
【図２３】遺伝子座Ｓｐ３１６のアラインメントの結果を示す。
【図２４】イルカ上科４種（マイルカ科：コビレゴンドウ、バンドウイルカ；ネズミイルカ科：イシイルカ；イッカク科：イッカク）に特異的なＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｍａｇｏ１９のバンドパターンを示す。この遺伝子座はイルカ上科の単系統性を強く支持する。
【図２５】遺伝子座Ｍａｇｏ１９のアラインメントの結果を示す。
【図２６】遺伝子座Ｍａｇｏ１９のアラインメントの結果を示す。
【図２７】イルカ上科４種、南米カワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ及びヨウスコウカワイルカにＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｉｓｉ１４，  Ｉｓｉ３６，  Ｉｓｉ３８のバンドパターンを示す。
【図２８】イルカ上科４種、南米カワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカ及びヨウスコウカワイルカにＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｍａｇｏ２４，  Ｍａｇｏ２６，  Ｍａｇｏ３２のバンドパターンを示す。
【図２９】遺伝子座Ｉｓｈｉ１４のアラインメントの結果を示す。
【図３０】遺伝子座Ｉｓｈｉ３６のアラインメントの結果を示す。
【図３１】遺伝子座Ｉｓｈｉ３６のアラインメントの結果を示す。
【図３２】遺伝子座Ｉｓｈｉ３８のアラインメントの結果を示す。
【図３３】遺伝子座Ｉｓｈｉ３８のアラインメントの結果を示す。
【図３４】遺伝子座Ｍａｇｏ２４のアラインメントの結果を示す。
【図３５】遺伝子座Ｍａｇｏ２４のアラインメントの結果を示す。
【図３６】遺伝子座Ｍａｇｏ２６のアラインメントの結果を示す。
【図３７】遺伝子座Ｍａｇｏ２６のアラインメントの結果を示す。
【図３８】遺伝子座Ｍａｇｏ３２のアラインメントの結果を示す。
【図３９】遺伝子座Ｍａｇｏ３２のアラインメントの結果を示す。
【図４０】Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄａとアカボウクジラ科に属する２種ツチクジラ、オオギハクジラに特異的なＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｍａｇｏ８，  Ｍａｇｏ１３のバンドパターンを示す。
【図４１】遺伝子座Ｍａｇｏ８のアラインメントの結果を示す。
【図４２】遺伝子座Ｍａｇｏ１３のアラインメントの結果を示す。
【図４３】Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄａ、アカボウクジラ科及びガンジスカワイルカに特異的なＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｍａｇｏ２１，  Ｍａｇｏ２２のバンドパターンを示す。
【図４４】遺伝子座Ｍａｇｏ２１のアラインメントの結果を示す。
【図４５】遺伝子座Ｍａｇｏ２２のアラインメントの結果を示す。
【図４６】遺伝子座Ｍａｇｏ２２のアラインメントの結果を示す。
【図４７】遺伝子座Ｍａｇｏ２２のアラインメントの結果を示す。
【図４８】マッコウクジラも含めた歯鯨亜目全ての種で共通にＣＤの挿入があったことを示す遺伝子座Ｓｐｅｒｍ８，  Ｓｐｅｒｍ２８，  Ｓｐｅｒｍ４７のバンドパターンを示す。
【図４９】遺伝子座Ｓｐｅｒｍ８のアラインメントの結果を示す。
【図５０】遺伝子座Ｓｐｅｒｍ８のアラインメントの結果を示す。
【図５１】遺伝子座Ｓｐｅｒｍ２８のアラインメントの結果を示す。
【図５２】遺伝子座Ｓｐｅｒｍ４７のアラインメントの結果を示す。
【図５３】南米カワイルカ２種アマゾンカワイルカ、ラプラタカワイルカにおいて共通にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ａｍｚ１３，  Ｂａｎｄｏ１のバンドパターンを示す。
【図５４】遺伝子座Ａｍｚ１３のアラインメントの結果を示す。
【図５５】アマゾンカワイルカに特異的にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ａｍｚ１１のバンドパターンを示す。
【図５６】遺伝子座Ａｍｚ１１のアラインメントの結果を示す。
【図５７】アカボウクジラ科に特異的にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｔｕｔｉ２４，  Ｔｕｔｉ３５のバンドパターンを示す。
【図５８】遺伝子座Ｔｕｔｉ２４のアラインメントの結果を示す。
【図５９】遺伝子座Ｔｕｔｉ３５のアラインメントの結果を示す。
【図６０】遺伝子座Ｔｕｔｉ３５のアラインメントの結果を示す。
【図６１】マッコウクジラ上科３種にＣＤＯの挿入があったことを示す遺伝子座Ｓｐ９、及びマッコウクジラ科に特異的なＳｐ２のバンドパターンを示す。
【図６２】遺伝子座Ｓｐ２のアラインメントの結果を示す。
【図６３】遺伝子座Ｓｐ２のアラインメントの結果を示す。
【図６４】遺伝子座Ｓｐ９のアラインメントの結果を示す。
【図６５】ナガスクジラ科（又は髭鯨）に特異的なＣＤの挿入があったことを示す遺伝子座Ｈｕｍｐ２０，  Ｈｕｍｐ２０３のバンドパターンを示す。
【図６６】遺伝子座Ｈｕｍｐ２０のアラインメントの結果を示す。
【図６７】遺伝子座Ｈｕｍｐ２０のアラインメントの結果を示す。
【図６８】遺伝子座Ｈｕｍｐ２０のアラインメントの結果を示す。
【図６９】遺伝子座Ｈｕｍｐ２０３のアラインメントの結果を示す。
【図７０】ＳＩＮＥの挿入パターンをまとめたマトリックスを示す。
【図７１】図７０に示すマトリックスに基づき推定される鯨目内部の系統発生樹を示す。
【図７２】分子統計学的解析の結果（限界）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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