【誤訳訂正書】
【提出日】平成29年1月12日(2017.1.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】キトサン由来組成物
【技術分野】
【０００１】
[0001]優先権の主張
本ＰＣＴ国際特許出願は、米国仮特許出願第６１／５８８，７８３号（発明の名称「Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０１２年１月２０日出願）に基づく優先権を主張するものであり、この仮出願の全内容が参照により全体として組み込まれる。
【０００２】
[0002]発明の分野
本発明は、全体的に、新生物、例えば悪性の肺、胸、前立腺、皮膚、甲状腺および腎臓の新生物、他の種類の悪性新生物、ならびに他の医学的障害を処置するための方法に関連して使用されるキトサン由来組成物を含む治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]キトサンは、ある種の甲殻類（例えば、カニ、ロブスター、エビ）の殻から通常単離される化合物キチンの誘導体である。キチンは、β１→４グリコシド結合によって連結されたＮ−アセチルグルコサミン単位から構成される直鎖状ホモポリマーである。キチン、キトサン（部分的に脱アセチル化したキチン）およびそれらの誘導体は、多様で膨大な数の産業および医学的用途と結びつく興味深い化学的および生物学的特性を有している。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７４７，４７５号（「キトサン由来バイオマテリアル」）に述べられている糖化（glycated）キトサンは、そのようなキトサン誘導体の一つである。
【０００４】
[0004]がんは年齢を問わず、あらゆる器官のあらゆる組織で発生し得る。一旦、がんについて疑いのない診断がなされた場合には、処置という判断が最優先事項となる。単一の処置アプローチが全てのがんに適用可能ということではないが、療法を成功させるためには、原発性腫瘍とその転移物の両方に照準を合わせなければならない。組織的、局所的、および局部的療法、例えば外科手術または放射線療法が、がんの処置において全身療法（例えば、化学療法薬）とともに使用されてきた。一部の成功にもかかわらず、従来の処置は所望される程度には有効でなく、より効果的な療法を求める探索が続けられてきた。より効果的ながん療法に対する満たされていない重大な要求が明らかにある。
【０００５】
[0005]従来の糖化キトサン調製物は、米国特許第５，７４７，４７５号（「キトサン由来バイオマテリアル」）に記載されているように、動物の転移性腫瘍モデルの処置における免疫アジュバントとして非常に有効であることが示されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]しかしながら、従来の糖化キトサン調製物は、水溶液中に分散、懸濁または溶解されると、用いられる生物医学的適用において注射および分配することが非常に困難となる。さらに従来の糖化キトサン調製物は、米国特許第５，７４７，４７５号（「キトサン由来バイオマテリアル」）に述べられているように、滅菌濾過が非常に困難であることから、現行の製造および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）に従った工業的生産に適さず、ヒトにおける使用に適さない。したがって、本発明の課題は、上述の不利益を受けることがほとんどない粘弾性の改善された糖化キトサン調製物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
[0007]一実施形態によれば、本発明は、全体的に、新生物および他の医学的障害を処置するための方法に関連して使用されるキトサン由来組成物を含む治療製剤に関する。本発明のさらなる態様および／または利点は、一部は、以下の詳細な説明に記載されており、一部は本発明の実施によって知得することができる。
【０００８】
図面の簡単な説明
[0008]本発明の上記および／または他の態様および利点は、添付の図面を参照することにより明らかであり、以下の実施形態の詳細な説明から容易に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0009]図１は、従来の糖化キトサン（例えば、ガラクトキトサン）の一例を示す。
【図２】[0010]図２は、親キトサンの脱アセチル化度（deacetylation）が８０％であり、利用可能な脱アセチル化アミノ基全体の糖化度（glycation）が１２．５％である、本発明の粘弾性糖化キトサンの一つの例示的構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0011]本発明の好ましい実施形態のさらなる目的および利点は、例示を目的として本発明の好ましい特定の実施形態および実施例を記載している以下の詳細な説明により、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。
【００１１】
詳細な説明
[0012]本発明は、全体的に、新生物および他の医学的障害を処置するための方法に関連して使用されるキトサン由来組成物を含む治療製剤に関する。本明細書で引用される全ての参照文献は参照により全体として組み込まれることが理解されるべきである。
【００１２】
[0013]本発明の特定の実施形態について言及がなされるが、その例は添付の図面に例証されており、参照されている同様の数字は、全体を通して同様の要素を指す。本発明は、様々な自明の観点において、全て本発明の趣旨および範囲を逸脱することのない範囲で改変し得るものであることが理解されるべきである。したがって、説明は、本質的に例示的なものであって、限定的なものではないと認識されるべきである。
【００１３】
糖化キトサン
[0014]糖化キトサンは、キトサンの遊離アミノ基を糖化（つまり、非酵素的にグリコシル化）し、次いで還元により安定化した生成物である。糖化により、有利な溶解特性および粘度特性がキトサンに付与され、これによりレーザーアシスト免疫療法および誘導体の他の用途に関連する誘導体の使用が容易になる。キトサンの糖化により、キトサンがより親水性になり、糖化されない場合より多くの水が、このポリマーに吸収および保持される。
【００１４】
[0015]本発明の好ましい実施形態によれば、キトサン由来バイオマテリアルは、脱アセチル化キチン（キトサン）の直鎖状ホモポリマーを含み、この脱アセチル化キチンは、そうでなければ遊離しているアミノ基の多数が、還元された単糖類またはオリゴ糖類のカルボニル基に結合して糖化キトサンを形成している。このように、糖化キトサンは、還元された単糖類またはオリゴ糖類のカルボニル基と脱アセチル化キチンの遊離アミノ基との反応生成物として得ることができる。したがって、用語「糖化キトサン」は、本明細書で使用するとき、キトサンの遊離アミノ基の糖化（つまり、非酵素的グリコシル化）と、その後の還元による安定化によって得られる生成物を指すことを意図している。一般的に、糖化（または非酵素的グリコシル化）は、酵素の作用なしに糖分子（例えば、フルクトースまたはグルコース）が基質（例えば、タンパク質または脂質分子）に結合するときに生じるプロセスを指す。そのような１つの例は、糖とタンパク質のアミン基との非酵素的な糖タンパク質形成の反応である。
【００１５】
[0016]したがって、糖化キトサンとしては、一般に、キトサンの遊離アミノ基と、還元単糖類および／またはオリゴ糖類のカルボニル基との反応から生じる生成物が含められる。この反応の生成物は、主にシッフ塩基（つまり、カルボニル基由来の炭素原子が、遊離アミンの窒素原子と二重結合を形成し、水一分子を放出した生成物）と、Ａｍａｄｏｒｉ生成物（つまり、前記カルボニル基の炭素原子が前記アミノ基の窒素原子と単結合し、一方で隣接する炭素原子が酸素原子に二重結合した生成物）との混合物であり、この生成物を、そのまま、または水素化物（例えば、水素化ホウ素還元剤（例えばＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３など）による還元もしくは適切な触媒下での水素曝露により安定化して、使用することができる。
【００１６】
[0017]キトサンにおける第一級および第二級アルコール基、ならびに第一級アミノ基の存在により、可溶性を達成するためおよび特定の用途に対する特別な特性を付与するための化学修飾に対する多数のアプローチが容易になる。
【００１７】
[0018]キチンとキトサンの可溶化は、オリゴ糖類への部分加水分解によって達成することができる。キトサンに関しては、様々な酸（有機酸および無機酸の両方）での処置により、遊離アミノ基がプロトン化されて可溶性キトサン様塩類が形成される。アミノ基のさらなる改変としては、化学基（例えば、カルボキシメチル基、グリセリル基、Ｎ−ヒドロキシブチル基など）の導入が挙げられる。キトサンの遊離アミノ基の糖化（つまり非酵素的グリコシル化）とその後の還元による安定化により、本発明で利用される様々な医薬製剤の調製に好ましいアプローチが提供される。
【００１８】
[0019]例証のために、従来の糖化キトサンの一つ、例えばガラクトキトサンを、以下の図１に示す。このキトサンは米国特許第５，７４７，４７５号にも記載および例示されている。
【００１９】
【化１】
2015513522.tif 000001
【００２０】
[0020]米国特許第５，７４７，４７５号における記載は非常に限られており、分子量の観点で１つに特定されたガラクトキトサンに関する記載のみである：具体的に、米国特許第５，７４７，４７５号には、１５００ｋＤａの分子量を有するガラクトキトサンが記載されるにすぎない。
【００２１】
[0021]米国特許第５，７４７，４７５号に記載される１５００ｋＤａの従来のガラクトキトサンと異なり、本発明の糖化キトサンは、本明細書に記載されるように、分子量が１５００ｋＤａ未満の糖化キトサンを含むことが意図される。また本発明の糖化キトサンは、従来のキトサンと異なり、予測外に優れた粘弾特性を含むいくつかの驚くべき予測外の特性、利益および利点を有しており、全く別の新規組成物である。
【００２２】
[0022]本発明の糖化キトサンは、シッフ塩基またはＡｍａｄｏｒｉ生成物の形態であり、好ましくは、それぞれ還元された第二級アミンまたはアルコールの形態である。別の実施形態では、糖化キトサンは、カルボニル反応基を有する。本発明の糖化キトサンは、キトサンと単糖類および／またはオリゴ糖類とを、好ましくは酸性化剤の存在下で、得られるキトサンポリマーのアミノ基の糖化度が約０．１％〜約３０％（最も好ましくは２％超）になるまで反応させて、糖のカルボニル基とキトサンの第一級アミノ基とでシッフ塩基を形成（本明細書ではアミノ基の糖化とも称する）して得ることが好ましい。好ましくは、さらにシッフ塩基と転位による誘導体（Ａｍａｄｏｒｉ生成物）を第二級アミンまたはアルコールに還元する安定化を行うことが好ましい。
【００２３】
[0023]本発明において、キトサンポリマーの約０．１％〜約３０％（最も好ましくは２％超）の糖化度の達成が初めて実証される。本発明とは反対に、この重要な結果を他者は達成または認識していなかった。したがって好ましい実施形態によれば、本発明は、糖化キトサンポリマーから本質的になる粘弾性糖化キトサン製剤であって、前記糖化キトサンポリマーは約５０，０００ダルトン〜約１，５００，０００ダルトンの分子量を有し、さらに前記糖化キトサンポリマーは、そうでなければ遊離しているアミノ基のうち約１０分の１パーセント〜約３０パーセントが糖化されている、製剤を提供する。
【００２４】
[0024]このように、キトサンの遊離アミノ基の非酵素的グリコシル化から生じる生成物は、主として、シッフ塩基（もとはカルボニル基の炭素原子が、アミノ基の窒素原子と二重結合を形成（イミン官能基としても知られる））と、Ａｍａｄｏｒｉ生成物（もとはカルボニル基の炭素原子が、アミノ基の窒素原子に単結合によって結合し、一方で隣接する炭素原子が酸素原子に二重結合してケトン基を形成）との混合物である。これらの生成物（非酵素的グリコシル化プロセスから得られる生成物）は、そのまま、または水素化物（例えば、水素化ホウ素還元剤（例えば、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３など）もしくは適切な触媒下での水素曝露による還元によって安定化して、使用することができる。
【００２５】
[0025]亜硝酸を用いるキトサン脱アミノ化を使用して、キトサンの糖化に適した還元アルドースおよびオリゴ糖を生成することができる。脱アセチル化グルコサミニル残基の亜硝酸による脱アミノ化により、２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基の形成を伴うグリコシド結合の選択的切断が生じる。キトサン鎖の特定領域の組成に応じて、アンヒドロヘキソースが単糖類として放出され、またはオリゴ糖の還元末端を占める場合がある。遊離のＮ−アセチルグルコサミンの放出は、キトサン鎖の一部の領域から生じてもよい。Ｎ−脱アセチル化糖タンパク質および糖脂質の同様の処理を利用して、糖化キトサンの特別な調製のための、定義された化学組成および生物活性を有するオリゴ糖を得ることができる。
【００２６】
[0026]キトサンの糖化によって得られる様々な生成物を、そのまま、または他の天然もしくは合成材料と反応させて利用することができる。例えば、糖化キトサンのアルデヒド含有誘導体と２以上の遊離アミノ基（例えば、コラーゲンなどにおけるリジン残基において豊富なアミノ酸の側鎖、キトサンおよび脱アセチル化糖接合体のヘキソサミン残基、または天然および合成ジアミンおよびポリアミン上のアミノ基）を含有する物質との反応が挙げられる。これにより、シッフ塩基形成を通した架橋の生成、およびその後の転位、縮合、脱水などが生じると予測される。修飾された糖化キトサン材料の安定化も化学的還元または自発的もしくは様々な温度、湿度および圧力条件下でのインキュベーションによる再転位、縮合もしくは脱水を伴う硬化によって行うことができる。Ａｍａｄｏｒｉ転位、シッフ塩基およびロイカート−ウォーラック（Ｌｅｕｋａｒｔ−Ｗａｌｌａｃｈ）反応の化学は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，  Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７６）  ｐｐ．  ＯＮＲ−３，  ＯＮＲ−５５およびＯＮＲ−８０，  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｃａｒｄ  Ｎｏ．７６−２７２３１に詳述されており、これらも参照により本明細書に組み込まれる。本発明で適用可能な求核付加反応の化学は、参照によって本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （ｅｉｇｈｔｈ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  １９７０），  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｃａｒｄ  Ｎｏ．  ６６−２５６９５の第１９章に詳述されている。
【００２７】
[0027]本明細書でさらに詳述するように、糖化の特定の種類（例えば還元糖の特定の種類）および程度により、予測外の有利な可溶性がキトサンに付与され、これにより、糖化キトサンとレーザーアシスト免疫療法および他の治療適用とを組み合わせた使用が容易になることが分かった。キトサンの糖化は、キトサンをより親水性にするためにも有利であり、糖化されない場合より多くの水がポリマーに吸収され、保持される。Ｄ−ガラクトースの開鎖型の自然発生率が比較的高いことから、キトサンのＤ−ガラクトース誘導体が特に好ましい。糖化キトサンは、例えば、粉末形態で、粘性製剤として、または任意の他の適切な形態を含む任意の数の適切な製剤として、調製することができる。
【００２８】
[0028]本発明の他の好ましい実施形態によれば、キトサンは、いくつかの同じまたは異なる還元糖、例えば、同じまたは異なる単糖および／またはオリゴ糖のいずれかを利用して非酵素的に糖化されたものでもよい。そのような単糖類グリコシル化剤の例は、より天然で多く発生しているＤ−トリオース、Ｄ−テトロース、Ｄ−ペントース、Ｄ−ヘキソース、Ｄ−ヘプトースなど、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−イドース、Ｄ−タロース、Ｄ−フコース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−グロース、Ｄ−ハマメロース（ｈａｍｍｅｌｏｓｅ）、Ｄ−リキソース、Ｄ−リボース、Ｄ−ラムノース、Ｄ−トレオース、Ｄ−キシロース、Ｄ−プシコース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タガトース、Ｄ−グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、Ｄ−エリトロース、Ｄ−トレオース、Ｄ−エリトルロース、Ｄ−マンノヘプツロース、Ｄ−セドヘプツロースなどが挙げられる。適切なオリゴ糖としては、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）などが挙げられる。
【００２９】
好ましい粘弾特性
[0029]従来法で製造されたキトサン製品は、水溶液に分散、懸濁または溶解したとき、ＧＭＰ基準に従って製造することが非常に難しく、投与および他の用途においていくつかの不都合な点がある。
【００３０】
[0030]本発明の好ましい実施形態によれば、従来の手法による不利益を被ることのない粘弾性改善糖化キトサン調製物が提供され、治療用の改善キトサン製品に対する長い間満たされていなかった必要性が克服される。
【００３１】
[0031]用語「粘弾性」は、本明細書で使用するとき、特定の組成物、調製物、または製剤における粘度を指す。粘度は、ずれ応力または引張応力のいずれかにより変形される流体の抵抗性の尺度として認識される。別言すると、粘度は、流体が流れるための内部抵抗を説明するものであり、流体摩擦の尺度とみなすことができる。
【００３２】
ａ．ＧＣ調製物の注射性能における予測外の改善
[0032]糖化キトサン（ＧＣ）の製剤（例えば、溶液または懸濁液）の注射性能が、ＧＣの粘度および流動特性に非自明的に依存していることが驚くべきことにおよび予想外に発見された。そしてこれらの特性は、ＧＣの分子量、キトサンにとっての親キチンの重合度、親キチンの脱アセチル化の程度、およびキトサンの糖化の程度に大きく依存する。これらの後半の特性は、ＧＣのポリマー鎖のもつれ度、ならびにＧＣ分子に存在する置換基（つまりアセチルおよび糖）の数および性質によって引き起こされた分子内水素結合の程度により決定され、これらの両方が調製される溶液の粘度および他の流動特性に大きく寄与する。
【００３３】
[0033]驚くべきことにおよび予想外に、本発明の改善された粘弾性糖化キトサン調製物は多数の利点を有しており、例えば、（ｉ）患者の新生物を処置するための非毒性調製物の投与、（ｉｉ）臨床設定における従来の処置と比較してはるかに優れる注射性能（例えば、異なるゲージの注射針を利用可能）、（ｉｉｉ）粘弾性調製物の濾過滅菌の改善、および（ｉｖ）痛みが少なく、患者にとって改善された処置選択肢、が挙げられる。本明細書で使用される用語「注射性能」は、製剤または調製物（例えば糖化キトサン（ＧＣ）を含む製剤）が対象に注射される際の容易性を指す。
【００３４】
[0034]好ましい一実施形態によれば、本発明は、水溶液に分散、懸濁または溶解されたおよそ１重量％の上述の糖化キトサンを含む注射可能な粘弾性調製物を提供する。
【００３５】
[0035]本発明の好ましい実施形態は、比較的大きなゲージ（Ｇ）の針を介して速やかに注射可能であり、対象における痛みや不快感を軽減可能な粘度を有する糖化キトサン調製物（例えば、溶液または懸濁液）を含む。比較的大きなゲージの針の好ましい例としては、次の寸法を有する針が挙げられる：公称内径、約０．３３７ｍｍ（２３Ｇ）〜約０．２１０ｍｍ（２７Ｇ）。
【００３６】
[0036]一例において、粘弾性糖化キトサン調製物は、注射針の直径が約２０Ｇ〜約２２Ｇでチューブの有効長が約１，０００ｍｍ以上である注射針を使用する注射器を介して、約２〜約３大気圧で注射されるときに、注射可能な調製物の流入速度が約０．０５ｍｌ／秒〜０．１ｍｌ／秒の範囲であるように投与される。別の例において、粘弾性糖化キトサン調製物は、約２５Ｇ〜約２７Ｇの直径を有する注射針を有する注射器を介して投与することもできる。さらに本発明による粘弾性糖化キトサン調製物は、他の適切なゲージの注射針あるいは器具を使用して投与し得ることも理解されるべきである。
【００３７】
[0037]驚くべきことに、本発明の粘弾性糖化キトサン調製物（例えば溶液、懸濁液）は、最も一般に用いられているゲージのカテーテルまたは針の注射器で、比較的広範囲の濃度で注射可能であることが分かった。
【００３８】
[0038]またこれらの粘弾性改善糖化キトサン調製物（つまり粘度および流動特性が改善された糖化キトサン組成物）により、対象への調製物の投与の容易性が全体的に改善することが分かった。調製物の個々の投与（例えば、看護師、医師、医療技術者による）の容易性および糖化キトサン製剤のコンプライアンスおよび有効性も改善され得る。
【００３９】
ｂ．製造および濾過における予想外の改善
[0039]また驚くべきことに本発明の粘弾性改善糖化キトサン調製物を使用することにより、滅菌濾過が予想外に改善されることが見出された。米国特許第５，７４７，４７５号（「キトサン由来バイオマテリアル」）に述べられているように、従来の糖化キトサン調製物は０．２２μｍの滅菌濾過器を通す滅菌濾過が非常に困難であることが示されており、商業的なｃＧＭＰ製造には適したものでない。対照的に、本発明の粘弾性改善糖化キトサンは、予想外の流動特性を有することが見出され、滅菌濾過、ｃＧＭＰ製造およびヒトにおける使用に非常に適したものであることが示された。
【００４０】
[0040]さらに驚くべきことに、本発明の粘弾性改善糖化キトサン調製物を使用することで透析濾過と限外濾過が予想外に改善されることも見出された。従来の糖化キトサン調製物は濾過器を塞ぎ、透析濾過器および限外濾過器にかけることが難しく、商業的ｃＧＭＰ製造に適さないものであった。他方、粘弾性が改善された糖化キトサンは、透析濾過および限外濾過に高度に適しており、製造プロセスが顕著に改善される。
【００４１】
粘度決定のための例示的方法
[0041]化学分野におけるいくつもの適切な技術を使用して、糖化キトサン製剤の粘度を確実におよび正確に測定することができる。
【００４２】
[0042]粘度は、様々な種類の機器、例えば粘度計、流動計を用いて、確実に測定され得ることが理解されるべきである。流動計は、粘度を単独の値のみで定義できず、粘度計を用いる場合よりも多くのパラメータを設定および測定することが必要とされる流体に対して使用される。流体の綿密な温度制御が正確な測定を行うために必要不可欠であり、特に潤滑剤のような材料はわずか５℃の変化で粘度が２倍に増加し得る。
【００４３】
[0043]本発明によれば、糖化キトサン調製物の粘度は、当技術分野で公知の任意の適切な方法で決定することができる。
【００４４】
[0044]例えば、粘度はセンチポアズの単位で確実に測定することができる。ポアズは、ＣＧＳ（センチメートル、グラム、秒）単位系における動的粘度の１単位である。センチポアズは、ポアズの１００分の１であり、ＳＩ単位における１ミリパスカル−秒（ｍＰａ・ｓ）（１ｃＰ＝１０−２Ｐ＝１０−３Ｐａ・ｓ）である。センチポアズの適切な略称はｃＰであるが、代替の略語であるｃｐｓ、ｃｐおよびｃＰｓも一般に見られる。粘度計を使用してセンチポアズを測定することができる。センチポアズを決定するときは、他の全ての流体を水の粘度に合わせて調整することが一般的である。
【００４５】
糖化キトサン調製物の粘度の典型的な決定法
[0045]分子量以外にも、溶液、特にポリマー溶液の粘度に影響を与える多数の因子がある。糖化キトサン（ＧＣ）の場合には、ＧＣ溶液の注射性能は、溶液中のＧＣの粘度および流動特性に大きく依存している。これらの特性は、ＧＣの分子量、キトサンにとっての親キチンの重合度、親キチンの脱アセチル化の程度、およびキトサンの糖化の程度に大きく依存している。これらの後半の特性は、ＧＣのポリマー鎖のもつれ度ならびにＧＣ分子に存在する置換基（つまりアセチルと糖類）の数および性質によって引き起こされた分子内水素結合の程度により決定され、これらの両方が、調製される溶液の粘度に大きく寄与する。
【００４６】
[0046]驚くべきことに、糖化キトサン調製物の改善された粘度および流動特性が、糖化キトサンの特別の生理化学的特性に大きく依存することが分かった。用語「生理化学的特性」は、本明細書で使用するとき、糖化キトサンなどの分子構造の任意の物理的、化学的または物理化学的特性を含むが、これらに限定されない特性を意図している。本明細書でさらに記述されるように、これらの生理化学的特性のいくつかの例は次のとおりである：
（ｉ）糖化キトサンの分子量；
（ｉｉ）キトサンにとっての親キチンの重合度；
（ｉｉｉ）親キチンの脱アセチル化度；および
（ｉｖ）キトサンの糖化度。
【００４７】
図２に、分子量がおよそ２５０ｋＤａであり、親キチンの脱アセチル化度が約８０％であり、キトサンの遊離アミノ基の糖化度が約１２．５％である、本発明の粘弾性糖化キトサンの一例を示している。
【００４８】
【化２】
2015513522.tif 000002
【００４９】
（ｉ）糖化キトサンの分子量
[0047]化学分野で知られているいくつもの適切な技術を使用して、糖化キトサンの分子量（ＭＷ）を確実におよび正確に測定することができる。
【００５０】
[0048]粘弾性糖化キトサン調製物は、約１５００ｋＤａ未満の分子量（ＭＷ）を有する糖化キトサンを含む注射可能な製剤として調製することが好ましい。好ましい粘弾性糖化キトサン調製物の例としては、分子量（ＭＷ）が約５０キロダルトン（ｋＤａ）〜約１５００ｋＤａの糖化キトサンが挙げられる。
【００５１】
[0049]ある実施形態において、粘弾性糖化キトサン調製物は、分子量（ＭＷ）が約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａである糖化キトサンを含む。様々な技術が分子量を正確に決定するために使用できる。
【００５２】
[0050]本発明は、水溶性または水分散性のキトサン誘導体を含むキトサン由来組成物を包含する。驚くべきことに、本発明による特定の実施形態において、分子量（ＭＷ）が増加するに従って多くの水が糖化キトサン（ＧＣ）の溶解に必要であることも分かった。このことは、同様に「遊離」（ＧＣに水素結合していない）の水が少ない（溶液にさらなる水は加えられないと仮定する）ことを意味し、それ自体がより高い粘度に寄与する。下記実施例３に示されるように、この結果から、分子量のサイズの増加により与えられる粘度の増加が、粘度とＭＷとの線形の関係（濃度が補正される場合）ではなく、むしろ指数関数的に（またはこれと類似する関係で）増加することが予想外にも分かった。
【００５３】
（ｉｉ）キトサンにとっての親キチンの重合度（ＤＰ）
[0051]キトサンにとっての親キチンの重合度（ＤＰ）は、化学分野で知られているいくつもの適切な方法または技術に従って、確実におよび正確に測定することができる。
【００５４】
[0052]１つのアプローチにおいて、重合度（ＤＰ）は、キトサンの分子量をグルコサミンに結合している分子量で割り算することによって決定される。
【００５５】
（ｉｉｉ）親キチンの脱アセチル化度
[0053]別の生理化学的特性は、親キチンの脱アセチル化度である。化学分野で知られている任意の数の適切な技術を使用して、親キチンの脱アセチル化度を確実におよび正確に測定することができる。
【００５６】
[0054]ＮＭＲは、キチンまたはキトサンの脱アセチル化の程度を決定するために使用することができる技術の１つである。
【００５７】
（ｉｖ）キトサンの糖化度
[0055]化学分野で知られている任意の数の適切な技術を使用して、キトサンの糖化度を確実におよび正確に測定することができる。
【００５８】
[0056]ＮＭＲは、単糖類および／またはオリゴ糖のキトサンポリマーへの結合を検出し、測定することができる技術の１つである。
【００５９】
[0057]Ｃ／Ｎの元素燃焼分析は、糖化キトサン対親キトサンのＣ／Ｎ比率を比較する手段により、糖化キトサンの糖化度（％）を決定するために使用することができる別の技術である。
【００６０】
[0058]ＨＰＬＣと組み合わせる酵素消化は、糖化度（％）を決定するために使用することができるさらに別の技術である。
【００６１】
[0059]他の適切な分析法および機器を、試料中の複数の成分の同時検出、測定および同定、例えば、試料中の糖化および非糖化キトサンの同時検出、測定および同定のためにも使用し得ることが理解されるべきである。
【００６２】
[0060]ニンヒドリン反応などの、残存する遊離アミノ基に結合する化学物質の比色測定を使用して、糖化度を評価することもできる。
【００６３】
[0061]このような好ましい分子量、キトサンにとっての親キチンの重合度、親キチンの脱アセチル化度、およびキトサンの糖化度を有する糖化キトサンにより、比較的広い範囲の濃度の糖化キトサンを一般に使用されている規格のカテーテルまたは針を介して注射可能とする糖化キトサン溶液の調製の改善が可能であることが見出された。
【００６４】
糖化キトサンを調製するための好ましい方法
[0062]本発明のさらに他の実施形態は、糖化キトサン製剤を調製するための方法に関する。糖化キトサンは、好ましくは、キトサンと単糖類および／またはオリゴ糖類とを、好ましくは酸性化剤の存在下で、糖のカルボニル基とキトサンの第一級アミノ基との間のシッフ塩基の形成（本明細書ではアミノ基の糖化とも称する）を達成させて、少なくとも一定のキトサンポリマーの糖化率（％）（例えば、２％以上）が達成される程度に十分な時間、反応させることによって得られる。好ましくは、続けてシッフ塩基および転位誘導体（Ａｍａｄｏｒｉ生成物）をそれぞれ第二級アミンまたはアルコールへ還元して安定化する。ＮＭＲによる追跡を用いて、キトサンポリマーへの単糖類および／またはオリゴ糖類の結合を確認することができ、残存する遊離アミノ基の化学的測定（例えば、ニンヒドリン反応）を用いて、糖化度を評価することができる。
【００６５】
[0063]好ましい実施形態では、糖化キトサンの製造の間、所望の結果が得られるように必要に応じて条件を調節することができる。例えば、本発明によれば、実施例４に述べられているようにｐＨ条件を制御することによって、糖化キトサンの製造の改善を達成することができることが予想外に見出された。
【００６６】
[0064]本発明で使用される糖化キトサンの調製の一例によれば、およそ３グラムの還元された単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、リボース）または等量の還元オリゴ糖を、三角フラスコ中で穏やかに磁気撹拌しながら、１００ｍｌの蒸留水に溶解させる。ついで、およそ１グラムのキトサンを添加し、その後、適切な工程を実施して、所望の粘弾特性と所望の純度特性を有する糖化キトサン調製物を得ることができる。
【００６７】
[0065]キトサンの工業規模の生産のための典型的な１つの方法は、次の４ステップを含む：脱塩（ＤＭ）、除タンパク（ＤＰ）、脱色（ＤＣ）、および脱アセチル化（ＤＡ）。例えば甲殻類の殻からアルカリ酸処理によってキチンの抽出を実行することができる。試料をアルカリ性製剤で処理することによって除タンパクし、酸によって脱塩し、有機溶媒（例えば、アセトン）、続いて漂白剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）により脱色する。例えば、水酸化ナトリウム製剤を使用して、キチン脱アセチル化を実施する。キトサンの重合度は、脱重合によって調節される。最も都合のよい手法は、（１）重水素水中で亜硝酸分解を行うことである。この反応は選択的であり、ＧｌｃＮ（グルコサミン）に関して化学量論的であり、迅速であり、（２）酸加水分解による脱重合、または（３）商業的に調製された酵素分解（Ｐｅｃｔｉｎｅｘ  Ｕｌｔｒａ  Ｓｐｌ）で容易に制御される。酵素法により、より高い割合で完全に脱アセチル化したキトオリゴマーのより短い断片が得られる。反対に、開始キトサンの酸加水分解により、酵素法よりも多くのモノアセチル化された残基を有する断片が１６個までの重合度で得られる。
【００６８】
重合された糖化アミノ糖
[0066]本明細書に記述されるように、キトサン（部分的脱アセチル化キチン）は、キチンの誘導体（β１→４グリコシド結合によって連結されたＮ−アセチルグルコサミン単位から構成される直鎖状ホモポリマー）である。キトサン由来組成物は、部分的に脱アセチル化したキチンのホモポリマーを含み、この部分的に脱アセチル化したキチンのホモポリマーは、そうでなければ遊離している多数のアミノ基が還元された単糖類またはオリゴ糖類のカルボニル基に結合して、イミン結合（シッフ塩基）または関連生成物（Ａｍａｄｏｒｉ転位）を生成し、１分子の水を放出する。
【００６９】
[0067]キチンとキトサンはグルコサミンのポリマーであることから、本発明は、さらに非酵素的に糖化されたグルコサミン、例えば糖化グルコサミンモノマーまたは糖化グルコサミン単位も企図している。別言すると、本発明はさらに、アミノ糖モノマー全体の非酵素的糖化を企図している。
【００７０】
[0068]例えば、一例としてＮ−置換基がガラクトースである糖化グルコサミンが挙げられる。少なくとも一定の割合のグルコサミンモノマーを最初に脱アセチル化した後、グルコサミンモノマーを糖化することが好ましい。
【００７１】
[0069]さらに、本発明は、（１）糖化グルコサミン単位のポリマー（糖化アミノ糖の重合体）、（２）糖化および非糖化グルコサミンの複合ポリマー、および（３）糖化グルコサミンポリマーと非糖化グルコサミンポリマーとの組み合わせであって、
（ｉ）非脱アセチル化グルコサミンモノマーの割合が、約１％〜約３０％であり；
（ｉｉ）重合度（脱アセチル化、非脱アセチル化、糖化および非糖化グルコサミン単位の様々な組み合わせの重合度）が、約ｘｎ＝３００〜約ｘｎ＝８０００、最も好ましくは約ｘｎ＝１５００であり、および／または
（ｉｉｉ）脱アセチル化された重合グルコサミンの遊離アミノ基の糖化度（％）が約０．１％〜約３０％である、
組み合わせを包含する。
【００７２】
[0070]本発明は、糖化キトサンの用途と同じまたは類似の、重合糖化グルコサミンポリマーの用途も企図している。これらとしては、例えば、レーザーアシスト免疫療法（ＬＩＴ）などのｉｎ  ｓｉｔｕがんワクチン（ｉｎＣＶＡＸ）の状況における免疫アジュバントとしての特性および使用が挙げられる。
【００７３】
典型的な製剤および用途
[0071]本発明に従って使用することができる様々な種類の薬学的に許容され得る製剤または調製物の例としては、例えば、溶液、懸濁液、および粘弾性糖化キトサン調製物の注射用の他の種類の液体もしくは半液体製剤が挙げられる。例えば、薬学的に許容され得る製剤または調製物は、実質的に水性の製剤中に分散、懸濁または溶解した糖化キトサンを含むことができる。用語「実質的に水性」を使用するとき、製剤または調製物が、特定の実施形態において、一定の割合で１以上の非水性成分と、１以上の薬学的に許容され得る賦形剤を含み得ると理解されるべきである。
【００７４】
[0072]一例によれば、粘弾性調製物は、約５．０〜約７のｐＨを有する水溶液として製剤化されることが好ましい。
【００７５】
[0073]粘弾性調製物は、糖化キトサンから本質的になる緩衝化生理食塩水溶液を含む水溶液として製剤化することもできる。
【００７６】
[0074]粘弾性調製物は、糖化キトサンポリマーから本質的になるように製剤化することができ、この糖化キトサンポリマーは、そうでなければ遊離しているアミノ基のうち約１０分の１（０．１）パーセント〜約３０パーセントが糖化されている。
【００７７】
[0075]別の実施形態では、糖化キトサン（ＧＣ）ポリマーから本質的になる粘弾性調製物を製剤化することができ、この糖化キトサンポリマーは、そうでなければ遊離しているアミノ基のうち約２％が糖化されている。
【００７８】
[0076]別の実施形態では、糖化キトサン（ＧＣ）ポリマーから本質的になる粘弾性調製物を製剤化することができ、ここで糖化キトサンポリマーは、約５０，０００〜約１，５００，０００ダルトンの分子量を有する。
【００７９】
[0077]別の例としては、水溶液に分散された約１重量％の糖化キトサンポリマーを含み、前記水溶液は約２５℃での測定において約１〜約１００センチストークスの粘度を有する、粘弾性ＧＣ調製物が挙げられる。
【００８０】
[0078]さらに別の例では、約１重量％の糖化キトサンを含み、前記糖化キトサンの、そうでなければ遊離しているアミノ基のうち約１０分の１（０．１）パーセント〜約３０パーセントが糖化されている水溶液であって、前記水溶液は約１センチストークス〜およそ１００センチストークスの粘度を有する、水溶液が挙げられる。
【００８１】
[0079]さらに別の実施形態において、粘弾性調製物は、糖化キトサンポリマーから本質的になり、水溶液に分散された約１重量％または１重量％超の糖化キトサンポリマーを含み、前記糖化キトサンポリマーの、そうでなければ遊離しているアミノ基のうち約２％が糖化されており、前記水溶液は対象への容易な注射性能および投与に適した粘度を有する、調製物として製剤化し得る。
【００８２】
[0080]さらに別の実施形態では、粘弾性調製物は、糖化キトサンポリマーから本質的になり、さらに水溶液に混和性の１つ以上の異なる粘弾性材料を含むように製剤化することができる。適切な粘弾性材料の例としては、限定されないが、ヒアルロン酸、コンドロイチンスルフェートおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【００８３】
[0081]粘弾性調製物としては、そうでなければ遊離しているアミノ基に結合した単糖類を含む糖化キトサンポリマーを挙げることができる。糖化キトサンポリマーは、任意の適切な形態、例えば、シッフ塩基、Ａｍａｄｏｒｉ生成物またはそれらの混合物の形態をとることができる。また糖化キトサンポリマーは、還元されたシッフ塩基（第二級アミン）、還元されたＡｍａｄｏｒｉ生成物（アルコール）またはその混合物の形態をとることができる。
【００８４】
[0082]また粘弾性調製物は、糖化キトサンポリマーがいくつかの化学的に修飾された単糖またはオリゴ糖置換基を有するように製剤化することもできる。一実施形態において、単糖類はガラクトースを含む。
【００８５】
[0083]また本発明の製剤または調製物は、好ましくは、生理学的に適合性の担体中に糖化キトサンを含有する。本明細書で使用するとき、「生理学的に適合性の」とは、身体の組織に接触したときに身体に有害でない材料を指すと理解されるべきである。本文脈において、この用語は、限定されないが、目的の生理学的環境とほぼ等張性の水性製剤（例えば、溶液）を含むことが意図されている。非等張性製剤（例えば、溶液）は、例えば、脱水剤などとして、臨床的に有用である場合がある。本発明の溶液のさらなる成分としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａ系緩衝剤などの様々な塩類を挙げることができる。
【００８６】
[0084]上記および他の課題が本発明によって実現される。本発明の特定の好ましい実施形態は、予測外の驚くべき有益な特性を与える特別の生理化学的な特性を有する糖化キトサン調製物に関係する。
【００８７】
[0085]また本発明は、例えば、本明細書に詳述するがんのためのレーザーアシスト免疫療法のようなｉｎ  ｓｉｔｕ自己がんワクチンに関する免疫アジュバントとしての、予測外の驚くべき特性を有する粘弾性糖化キトサン調製物の広範囲の用途も包含する。
【００８８】
[0086]本発明の好ましい実施形態では、注射可能な粘弾性調製物を含む免疫アジュバントが提供される。したがって本発明の別の目的は、免疫アジュバントおよび免疫調節薬としての治療用途を含む粘弾性改善糖化キトサン調製物を、他の治療用途のために提供することである。
【００８９】
[0087]また、本発明は、粘弾性糖化キトサン免疫アジュバント製剤を投与する様々な経路、例えば、注射を介することを包含する。好ましいアプローチでは、免疫アジュバントは、腫瘤内部または腫瘤周囲への注入のための製剤として調製される。しかしながら、他の方法が、腫瘍部位に免疫アジュバントを局在させるために十分なものであることが認識されるべきである。１つのそのような代替的送達手段は、腫瘍部位への送達が増強されるように免疫アジュバントを組織特異抗体または組織特異的抗原にコンジュゲートさせることである。新生物内に十分な濃度の免疫アジュバントが存在することを確実にする送達メカニズムである限り、腫瘍部位に免疫アジュバントを局在化させるための任意の一つの方法または様々な方法の組み合わせが許容される。
【００９０】
[0088]特定の好ましい実施形態によれば、本発明は、下記にさらに詳述されるようなｉｎ  ｓｉｔｕ自己がんワクチン（ｉｎＣＶＡＸ）、例えばレーザーアシスト免疫療法、光線力学的がん療法（ＰＤＴ）および／または他の腫瘍免疫療法と組み合わせて使用される粘弾性糖化キトサンを含む様々な医薬製剤を提供する。注射可能または他の製剤として使用することができる適切な粘度を有する糖化キトサン調製物をｉｎＣＶＡＸおよび／またはＰＤＴおよび／または腫瘍免疫療法などの適用における免疫アジュバントとして利用することは望ましいことが認められる。そのような適用は、典型的には、患者の体への粘弾性糖化キトサン製剤の注入を含む。用語「免疫アジュバント」は、本明細書で使用するとき、抗原に対する免疫系の応答を増強させる作用を有する任意の分子、組成物または物質を意味し、例えば、腫瘍抗原に対する免疫系の応答を増強させる作用を有する糖化キトサンが挙げられる。
【００９１】
[0089]免疫アジュバント組成物は、糖化キトサンにコンジュゲートされた腫瘍特異的抗体をさらに含んでもよい。また免疫アジュバント組成物は、糖化キトサンにコンジュゲートされた腫瘍特異的抗原をさらに含んでもよい。糖化キトサンは、さらにカルボニル反応基を含んでもよい。
【００９２】
[0090]好ましい一実施形態によれば、本発明は、粘弾性糖化キトサンの懸濁液または溶液を含む免疫アジュバント製剤を提供する。この好ましい実施形態において、粘弾性糖化キトサンは、発色団を使用せずに光エネルギーが新生物に直接送達される新生物の光熱的処置と組み合わせて使用される。新生物が組織表面で接近可能な場合（例えば、メラノーマ）または外科的手段により露出される場合、光エネルギーを局所に到達させることができる。新生物が組織表面よりも下に存在している場合（例えば、乳がん）、および外科的に露出されない場合、光エネルギーを、例えば光ファイバーにより、新生物に到達させてもよい。
【００９３】
[0091]別の実施形態によれば、本明細書でさらに記載されるように、本発明の免疫アジュバント製剤は適切な発色団をさらに含むことができる。適切な発色団の選択は、主に放射と許容可能なレーザー波長との協調の問題である。使用される放射線の波長は、当然のことながら、発色団の光特性（つまり吸収ピーク）に相補的なものでなければならない。他の発色団の選択基準としては、熱エネルギーを生成する能力、一重項酸素および他の活発な分子を生じる能力、またはｃｉｓ−プラチニンのようにそれ自体が有害である能力などが挙げられる。本発明において、放射線の好ましい波長は８０５＋／−１０ｎｍである。好ましい発色団は、組織に対して比較的透過性である赤色および近赤外スペクトル領域に強い吸収を有している。この波長の別の利点は、ＵＶ励起増感物質との接触による潜在的な変異原性作用が回避されることである。しかしながら、１５０〜２０００ｎｍの波長は、個々の場合に有効な効果を生じる場合もある。好ましい発色団はインドシアニングリーンである。しかしながら、他の発色団も使用することができ、それらの選択は、光増感効率および光細胞毒性が決まる所望の光物理的および光化学的特性に基づくことができる。代替発色団の例としては、限定されないが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、バックミンスターフラーレン（Ｃ６０）、インドシアニングリーン、メチレンブルー、ＤＨＥ（ポリヘマトポルフィリンエステル／エーテル）、ｍｍ−ＴＨＰＰ（テトラ（メタヒドロキシフェニル）ポルフィリン）、ＡｌＰｃＳ４（アルミニウム・フタロシアニン・テトラスルホネート）、ＺｎＥＴ２（亜鉛エチオ（ｚｉｎｃ  ａｅｔｉｏ）−プルプリン）、またＢｃｈｌａ（細菌クロロフィルα）が挙げられる。
【００９４】
[0092]一実施形態では、免疫アジュバント組成物は、溶液または懸濁液として製剤化される。溶液または懸濁液には、例えば、約０．２５重量％の発色団と、約１重量％の糖化キトサンを含むことができる。
【００９５】
[0093]別の好ましい実施形態によれば、本発明は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）に使用するための免疫アジュバントを含む組成物であって、免疫アジュバントが腫瘍特異的抗原にコンジュゲートしており、免疫アジュバントが糖化キトサンである組成物を提供する。
【００９６】
[0094]また別の実施形態によれば、本発明は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するための、発色団と免疫アジュバントとの組み合わせを含む組成物であって、発色団と免疫アジュバントとが腫瘍特異的抗原にコンジュゲートしており、免疫アジュバントが糖化キトサンである組成物を提供する。
【００９７】
[0095]別の好ましい実施形態によれば、本発明は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するための、免疫アジュバントを含む組成物であって、免疫アジュバントが腫瘍特異的抗体にコンジュゲートしており、免疫アジュバントが糖化キトサンである組成物を提供する。免疫アジュバントは、一定の場合には、糖化キトサンから本質的になるものであり得る。糖化キトサンは、さらにカルボニル反応基を含んでもよい。
【００９８】
[0096]別の実施形態によれば、本発明は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するための、発色団と免疫アジュバントとの組み合わせを含む組成物であって、発色団と免疫アジュバントとが腫瘍特異的抗体にコンジュゲートしており、免疫アジュバントが糖化キトサンである組成物を提供する。免疫アジュバントは、一定の場合には、糖化キトサンから本質的に成ってもよい。糖化キトサンは、さらにカルボニル反応基を含んでもよい。
【００９９】
[0097]このように、本発明は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するための注射可能な製剤を提供し、特定の場合に、当該製剤は発色団と免疫アジュバントとの組み合わせまたは混合物を含むことができ、この免疫アジュバントは糖化キトサンである。
【０１００】
[0098]さらに組成物は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するために、免疫アジュバントを含んで調製することができ、ここで免疫アジュバントは腫瘍特異的抗原にコンジュゲートしており、免疫アジュバントは、約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する粘弾性糖化キトサンである。
【０１０１】
[0099]また組成物は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置に使用するために、発色団と免疫アジュバントとの組み合わせを含んで調製することができ、ここで発色団と免疫アジュバントとは腫瘍特異的抗原にコンジュゲートしており、免疫アジュバントは、約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する粘弾性糖化キトサンである。
【０１０２】
[00100]さらに注射可能な溶液は、タンデム型の光物理的および免疫学的処置のための新生物の前処置のために、免疫アジュバントを含んで調製することができ、ここで免疫アジュバントは、約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する粘弾性糖化キトサンである。
【０１０３】
[00101]また注射可能な溶液を、新生物のタンデム型の光物理的および免疫学的処置の前処置に使用するために、発色団と免疫アジュバントとの混合物を含んで調製することができ、ここで免疫アジュバントは、約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する粘弾性糖化キトサンである。
【０１０４】
[00102]一例において、本発明の粘弾性糖化キトサン組成物は、免疫アジュバントとして新規がん処置法で使用される。光熱的療法と免疫学的療法とは、発色団を使用せずに腫瘍に直接的に新生物に照射し、次いでキトサン由来免疫アジュバントを照射された新生物の内部または周囲へ導入して、組み合わせられる。新生物細胞破壊を引き起こすために十分な出力密度でレーザーを適用後、放出される新生物抗原に対する細胞媒介性および体液性免疫応答が免疫アジュバント成分によって刺激される（増強される）。
【０１０５】
[00103]別の例では、発色団およびキトサン由来免疫アジュバント（免疫調節剤または免疫強化剤とも称される）の両方を新生物に導入することによって、光線力学的療法と免疫学的療法とを組み合わせる。新生物細胞破壊を引き起こすために十分な出力密度でレーザーを適用することにより、放出される新生物抗原に対する細胞媒介性および体液性免疫応答が、免疫アジュバント成分によって刺激される（増強される）。
【０１０６】
[00104]発色団と免疫アジュバントとは、腫瘤の中心へ注射するための１つの溶液内へ混合してもよく、または別々に腫瘤に注入してもよい。但し、他の方法が、腫瘍部位に発色団および免疫アジュバントを局在させるために十分な場合もあることを認識すべきである。１つのそのような代替的送達手段は、腫瘍部位への送達が増強されるように、発色団もしくは免疫アジュバントまたはその両方を組織特異抗体または組織特異的抗原にコンジュゲートさせることである。新生物内に十分な濃度の成分が存在することを確実にする送達メカニズムである限り、腫瘍部位に発色団と免疫アジュバントを局在化させるための任意の一つの方法または様々な方法の組み合わせが許容される。
【０１０７】
[00105]別の実施形態によれば、ヒトまたは他の動物宿主の新生物を処置するための方法は、（ａ）免疫アジュバントを選択するステップであって、免疫アジュバントが粘弾性糖化キトサンを含むステップと、（ｂ）前処置された新生物に照射し、それにより前処置された新生物の新生物細胞破壊を引き起こして、断片化された新生物組織および細胞分子を生じさせるステップと、（ｃ）新生物の内部または周囲へ免疫アジュバントを導入し、それが宿主の自己免疫防御システムを刺激して、断片化された新生物組織および細胞分子（例えば、腫瘍抗原）を処理させ、新生物細胞増幅に対する免疫を生じさせるステップとを含む。
【０１０８】
[00106]さらに別の実施形態によれば、ヒトまたは他の動物宿主の新生物を処置するための方法は、（ａ）発色団および免疫アジュバントを選択するステップであって、免疫アジュバントが粘弾性糖化キトサンを含むステップと、（ｂ）発色団および免疫アジュバントを新生物に導入して、前処置された新生物を得るステップと、（ｃ）前処置された新生物に照射を行い、それにより前処置された新生物の新生物細胞破壊を引き起こして、免疫アジュバントの存在下で断片化された新生物組織および細胞分子を生じさせ、それが新生物細胞増殖に対する宿主の自己免疫防御システムを刺激するステップとを含む。
【０１０９】
[00107]また別の実施形態では、腫瘍担持宿主における腫瘍特異的抗体を産生する方法は、腫瘍に可視、近赤外もしくは赤外線範囲の波長のレーザーを、新生物細胞破壊を引き起こすために十分な程度で照射するステップと、断片化された新生物組織および細胞分子を生成し、次いで免疫アジュバントを新生物の内部または周囲に注射により導入して、断片化された新生物性組織および細胞分子と相互作用して処理を行うように、宿主免疫系を刺激して、全身性抗腫瘍応答が誘導されるようにするステップとを含む。
【０１１０】
[00108]別の実施形態において、腫瘍担持宿主における腫瘍特異的抗体を産生する方法は、発色団および免疫アジュバントを新生物に腫瘍内注射により同時に導入して前処置された新生物を得るステップであって、発色団は近赤外または赤外波長範囲で活性化して熱エネルギーを生成するために適している、前記ステップと、発色団を活性化して新生物細胞破壊を引き起こす光熱的反応を生じさせるために十分な程度に、発色団を近赤外および赤外範囲波長のレーザーで活性化するステップと、断片化された新生物組織および細胞分子を生成するステップとを含む。
【０１１１】
[00109]光物理的に新生物を破壊し、同時に腫瘍担持宿主内でｉｎ  ｓｉｔｕ自己ワクチンを生成する一つの例示的な方法は、（ａ）免疫アジュバントを選択するステップと、（ｂ）新生物に、可視、近赤外または赤外範囲の波長のレーザーを、新生物細胞破壊を引き起こす光熱的反応を生じさせるために十分な出力および時間で照射して、断片化された新生物性組織および細胞分子を生成させるステップと、（ｃ）免疫アジュバントを新生物に腫瘍内注射により導入してｉｎ  ｓｉｔｕワクチンを生成するステップであって、前記ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンは、前記断片化された組織と細胞分子と前記免疫アジュバントとのアマルガムを含む、前記ステップと、（ｄ）前記ワクチンを局所的に提示させることにより新生物細胞増殖に対する自己免疫防御システムを刺激して、宿主内に全身的に抗腫瘍応答を引き起こすステップとを含む。
【０１１２】
[00110]光物理的に新生物を破壊し、同時に腫瘍担持宿主内でｉｎ  ｓｉｔｕ自己ワクチンを生成する別の例示的な方法は、（ａ）発色団および免疫アジュバントを選択するステップであって、発色団は近赤外または赤外線の波長範囲で活性化して熱エネルギーを生成するために適している、前記ステップと、（ｂ）発色団を腫瘍内注射によって新生物内に導入するステップと、（ｃ）発色団を活性化して新生物細胞破壊を引き起こす光熱的反応を生じさせるために十分な出力および時間で、新生物に可視、近赤外または赤外範囲の波長のレーザーを照射して、断片化された新生物組織および細胞分子を生成させるステップと、（ｄ）免疫アジュバントを腫瘍内注射により新生物に導入してｉｎ  ｓｉｔｕワクチンを生成するステップであって、前記ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンは、前記断片化された組織と細胞分子と前記免疫アジュバントとのアマルガムを含む、前記ステップと、（ｅ）前記ワクチンを局所的に提示させることにより新生物細胞増殖に対する自己免疫防御システムを刺激して、宿主内に全身的に抗腫瘍応答を引き起こすステップとを含む。
【０１１３】
[00111]光物理的に新生物を破壊し、同時に腫瘍担持宿主内でｉｎ  ｓｉｔｕ自己ワクチンを生成するさらに別の例示的な方法は、（ａ）発色団および免疫アジュバントを選択するステップであって、発色団は近赤外または赤外線の波長範囲で活性化して熱エネルギーを生成するために適している、前記ステップと、（ｂ）発色団および免疫アジュバントを、新生物へ腫瘍内注射により同時にまたは別個に導入して前処置された新生物を得るステップと、（ｃ）発色団を活性化して新生物細胞破壊を引き起こす光熱的反応を生じさせるために十分な出力および時間で、前処置された新生物に近赤外または赤外範囲の波長のレーザーを照射して、断片化された新生物組織および細胞分子を生成させることにより、ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンを生成するステップであって、前記ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンは、前記断片化された組織と細胞分子と前記免疫アジュバントとのアマルガムを含む、前記ステップと、（ｄ）前記ワクチンを局所的に提示させることにより、および前記ワクチンを宿主内に全身的に分散させることにより、新生物細胞増殖に対する自己免疫防御システムを刺激するステップとを含む。
【０１１４】
[00112]本明細書の他の箇所にも記載されているように、本方法は、免疫アジュバントを腫瘍特異的抗体にコンジュゲートさせて接合体を形成し、その接合体を宿主へ投与することをさらに含むことができる。または、本方法は、免疫アジュバントを腫瘍特異的抗原にコンジュゲートさせて接合体を形成し、その接合体を宿主へ投与することを含むことができる。任意の数の適切な発色団、例えば、インドシアニングリーン、ＤＨＥ、ｍ−ＴＨＰＰ、ＡｌＰｃＳ４、ＺｎＥＴ２、およびＢｃｈｌａを使用することができる。
【０１１５】
[00113]さらに、本方法は、発色団と免疫アジュバントとの組み合わせを腫瘍特異的抗体にコンジュゲートさせて接合体を形成し、その接合体を宿主へ投与することを含むことができる。または、本方法は、発色団と免疫アジュバントを腫瘍特異的抗原にコンジュゲートさせて接合体を形成し、その接合体を宿主へ投与することを含み得る。任意の数の適切な発色団、例えば、インドシアニングリーン、ＤＨＥ、ｍ−ＴＨＰＰ、ＡｌＰｃＳ４、ＺｎＥＴ２、およびＢｃｈｌａを使用することができる。
【０１１６】
[00114]粘弾性糖化キトサン（ＧＣ）調製物を含む本発明の調製物および製剤は、光線力学的療法（ＰＤＴ）と組み合わせて使用することもできる。光増感化合物は、光に曝されたときに光化学反応を示す。光線力学的療法（ＰＤＴ）では、そのような光増感化合物およびレーザーを使用して腫瘍壊死を生じさせる。ＰＤＴによる固形腫瘍の処置には、通常、腫瘍局在光増感化合物の全身投与と、その後のレーザーによる活性化が含まれる。増感物質は、適切な波長の光を吸収すると、安定な原子構造から励起状態に変換される。細胞毒性および結果として起こる腫瘍破壊には、増感物質と処置組織内の分子状酸素とが相互作用して細胞毒性一重項酸素が生じることが関係する。
【０１１７】
[00115]光の送達および投与パラメータも含め、ＰＤＴ、生物医学的レーザーおよび光増感化合物に関係する２つの好適な一般的参照文献としては、Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  １９８９  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｕ．Ｋ．，  ＩＳＢＮ  ０  ４７１  ９２３０８  ７，およびＰｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｓｅｒｓ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｉｌａｎ，  ２４−２７  Ｊｕｎ．  １９９２，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ８１４３０  ２が挙げられ、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
[00116]ＰＤＴと関係する米国特許としては、Ｌｅｖｙらの米国特許第５，０９５，０３０号および第５，２８３，２２５号、Ｐａｎｄｅｙらの米国特許第５，３１４，９０５号、Ａｌｌｉｓｏｎらの米国特許第５，２１４，０３６号、および、Ｋｏｐｅｃｅｋらの米国特許第５，２５８，４５３号が挙げられ、それらは全て参照によって本明細書に組み込まれる。Ｌｅｖｙの特許には、腫瘍特異的抗体（例えば、受容体特異的リカンド、免疫グロブリン、または免疫グロブリンの免疫特異性部分）にコンジュゲートされた、６７０−７８０ｎｍの波長の作用を受ける光増感剤の使用が開示される。Ｐａｎｄｅｙ特許は、標準的な光線力学的療法で使用されるピロフェオホルビド化合物に関するものであり、Ｐａｎｄｅｙ特許でも配位子および抗体と組成物をコンジュゲートすることが開示される。Ａｌｌｉｓｏｎの特許は、緑色のポルフィリンを脂質複合体にコンジュゲートさせ、標的となる腫瘍細胞へのポルフィリン化合物の特異性を増加させており、Ｌｅｖｙの特許と類似している。Ｋｏｐｅｃｅｋ特許でも、がん組織を処置するための組成物が開示される。これらの組成物は、抗がん薬と光活性化薬との２つの薬剤を共重合担体に付着させて構成される。組成物は、飲作用によって標的細胞に侵入する。標的細胞に侵入した後、抗がん薬が作用する。一定期間の後、光源を使用して、感光される置換基を活性化する。
【０１１９】
腫瘍免疫療法に関するさらなる適用
[00117]粘弾性糖化キトサン（ＧＣ）調製物を含む本発明の調製物および製剤は、例えば免疫アジュバントとして、腫瘍免疫療法において使用することができる。
【０１２０】
[00118]免疫系の主要な機能は、「自己」の概念を発生させて「非自己」となるものを除去することである。微生物が日々遭遇する主な非自己実体であるが、免疫系は、さらに新生物と移植物を除去する作用も有する。
【０１２１】
[00119]免疫には、いくつかの異なるタイプがある。非特異性（または先天性）免疫は、従前の感染またはワクチン接種によって免疫化（過敏化またはアレルギー化）されたものではない、種に固有の抵抗性を指す。その主な細胞構成は、食細胞システムであり、侵入する微生物を飲み込み、消化することで機能する。食細胞としては、好中球、血液中の単球および組織内のマクロファージが挙げられる。補体蛋白質は、非特異性免疫における主な可溶性成分である。急性期の反応物質およびサイトカイン、例えばインターフェロンも、先天性免疫の一部である。
【０１２２】
[00120]特異性免疫は、刺激する抗原性決定基（感染剤または他の因子）に対する固有の反応性が変化している免疫状態である。それは、後天性免疫として参照されることもある。自然に獲得した（顕在的または潜在的）感染もしくは意図的なワクチン接種の結果による能動的もしくは特異的なものである場合があり、または別のヒトもしくは動物からの抗体の移行から獲得された受動的なものである場合がある。特異性免疫には、学習、順応、および記憶という顕著な特徴がある。細胞性成分は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）であり、免疫グロブリンは可溶性成分である。
【０１２３】
[00121]寄生細胞または外来性細胞を認識して破壊するＴ細胞およびＮＫ細胞の作用は、細胞媒介性免疫と称される。細胞媒介性免疫と対照的に区別される体液性免疫は、Ｂ細胞による複雑な認識プロセス後に産生される循環抗体と関係している。
【０１２４】
[00122]腫瘍免疫に関して、腫瘍免疫中のリンパ球様細胞の重要性が繰り返し示されてきた。腫瘍に対する細胞媒介性宿主反応には、免疫監視の概念が含まれ、これによれば細胞媒介性免疫に関連する細胞メカニズムは、腫瘍関連抗原（正常細胞上で明白でない腫瘍細胞に関連する抗原）を認識して新たに変形された腫瘍細胞を破壊する。この仕組みは、適合しないドナーからの移植組織に対する拒絶のプロセスと類似する。ヒトにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで患者の末梢血リンパ球の懸濁液と腫瘍細胞の懸濁液とを混合すると、腫瘍小結節の増殖がｉｎ  ｖｉｖｏで阻害されることがあり、腫瘍に対する細胞媒介免疫反応が示唆される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、特定の新生物を有する患者由来のリンパ球様細胞が、培養物内の対応するヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すことが明らかにされた。これらの細胞傷害性細胞は、一般にＴ細胞であり、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、結腸、胸、頚部、子宮内膜、卵巣、睾丸、鼻咽腔および腎臓の肉腫および癌で見出されてきた。腫瘍関連抗原、リンホカインあるいはインターフェロンが存在するとき、マクロファージも、腫瘍に対する細胞媒介性宿主応答に関与し得る。
【０１２５】
[00123]ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞と反応する体液性抗体は、癌原性化学物質またはウイルスによって引き起こされた様々な動物腫瘍に応じて産生される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのハイブリドーマ技術により、様々な動物およびヒトの新生物に対するモノクローナル抗腫瘍抗体の検出および生産が可能になった。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対する抗体媒介防御は、特定の動物の白血病およびリンパ腫においてしか実証されていない。対照的に、生体内のリンパ球様細胞を介した防御は、多種多様な動物の腫瘍系で生じている。
【０１２６】
[00124]がんのための免疫療法は、広い対象、すなわち生物学的療法の一部または生物学的応答調節剤の投与と考えることが最も適している。これらの薬剤は、（１）エフェクター細胞数の増加もしくは１つ以上の可溶性媒介物質の産生による宿主の抗腫瘍応答刺激、（２）エフェクターもしくは媒介物質として作用、（３）宿主の抑制機構の低下、（４）腫瘍細胞の免疫原性を増加もしくは免疫学的プロセスによる障害の受けやすくさせる変化、または（５）宿主の細胞毒性もしくは放射線療法に対する耐性の改善、のための様々な１つ以上の機構を介して作用する。これまでの細胞媒介腫瘍免疫療法の焦点は、インターロイキン２への接触によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた後のリンパ球を患者に再注入することであった。１つの変形例として、腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏで浸潤させたリンパ球、いわゆる腫瘍浸潤リンパ球の集団を単離し、増やすことが挙げられる。別の変形例は、インターフェロンを同時使用することであり、これは腫瘍細胞上の組織適合抗原および腫瘍関連抗原の発現を増加させて、浸潤したエフェクター細胞による腫瘍細胞の死滅を増強させると考えられる。
【０１２７】
[00125]体液性療法は、宿主自体の免疫系を刺激する活性化とは対照的に、受動免疫療法の一形態としての抗腫瘍抗体を長期間集中して使用するものである。もう一つ変形例は、リシンもしくはジフテリアのような毒素または放射性同位元素を備えた単クローン性抗腫瘍抗体との接合であり、これにより、抗体がこれらの毒性物質を腫瘍細胞に特異的に送達するようになる。照射、ノイラミニダーゼ処理、ハプテン接合またはハイブリダイゼーション後の宿主自身の腫瘍細胞に対する能動免疫も試みられてきた。そのように処置された患者の少数で臨床的改善が見られた。照射後の他者由来の腫瘍細胞が、緩解後の急性リンパ芽球性白血病と急性骨髄芽球白血病におけるアジュバントと組み合わされて使用されてきた。大部分ではないが、緩解の延長または再誘導割合の改善が、一連のケースで報告されてきた。インターフェロン、腫瘍壊死因子およびリンフォトキシンも、免疫学的に媒介されるメカニズムに作用を生じさせるために使用されてきた。細胞性および体液性メカニズムの両方を使用する最近のアプローチの一つが、腫瘍細胞と反応する一つの抗体が、細胞毒性エフェクター細胞と反応する第２の抗体に連結されたものを含み、後者を腫瘍に対してより特異的に標的化させる、「ヘテロ交差結合抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」の開発である。ＰＤＴで処置されたマウス腫瘍への宿主免疫細胞の浸潤が報告されている。
【０１２８】
ＰＤＴと免疫療法との併用
[00126]本発明によれば、注射可能な材料として使用可能な適切な粘度を有する糖化キトサン（ＧＣ）調製物を、さらなる用途、例えば、光線力学的がん療法（ＰＤＴ）および腫瘍免疫療法で使用することが望ましい。
【０１２９】
[00127]ＰＤＴと免疫療法との組み合わせによる可能性が、Ｋｏｒｂｅｌｉｋ，  Ｋｒｏｓｌ，  ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＣｈａｐｌｉｎにより探求された（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｓｅｒｓ，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．５１８−５２０を参照）。それらの研究では、ＰＤＴに対する免疫反応の増幅の可能性と、処置される腫瘍に対するより浸潤性の破壊に対する指向性が調査された。腫瘍（扁平上皮細胞癌ＳＣＣＶＩＩ）を、雌のＣ３Ｈマウスで増殖させた。免疫賦活剤ＳＰＧ（マクロファージとリンパ球様細胞を刺激して、サイトカインおよび他の免疫シグナルからの刺激に対する応答性をさらに大きくする高分子量のＢ−グルカン）を、ＰＤＴの１日前に終了するか、ＰＤＴ後すぐに開始するかのいずれかで７日間、毎日、筋肉内投与した。フォトフリンに基づくＰＤＴを使用し、フォトフリンを静脈内投与してから２４時間後に光療法を行った。ＳＰＧ免疫療法は、ＰＤＴの直接殺傷効果を増強することが示された。しかし、間接的殺傷効果（もとの位置に残された腫瘍細胞の生存率の減少として示される）は、ＳＰＧを受けていない動物の腫瘍でより顕著であった。ＰＤＴの前と後とのＳＰＧ免疫療法の効果の差異は、最大の相互作用が、光の到達時または直後に免疫活性化がピークとなるときに達成されることを示唆した。ＰＤＴ後に開始するＳＰＧ（５〜７日後に最適な免疫活性化に到達）では、有益な反応のためには明らかに遅すぎる。
【０１３０】
[00128]別の研究では、ＰＤＴの使用による、低酸素症の条件下で細胞毒性である生体反応性薬剤の効果の増強が調査された。Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｓｅｒｓ，  ｓｕｐｒａ，  ｐｐ．６９８−７０１を参照。そのような薬物の抗腫瘍活性はｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの薬物が腫瘍の低酸素状態を増加させる処置と組み合わされて使用されるときに増強され得ることが分かった。
【０１３１】
免疫アジュバントと組み合わせた光線力学的療法によるがん処置
[00129]本発明によれば、がんの処置に使用するための注射可能な材料として適切な粘度を有する糖化キトサン（ＧＣ）調製物を利用することが望ましい。これは、任意の適切な様式で、例えば、光熱的または光線力学的がん療法（ＰＤＴ）と腫瘍免疫療法との組み合わせなどの用法の組み合わせにおいて、達成され得る。用語「がん」は、本明細書で使用するとき、多数の様々な種類の悪性新生物のいずれかを含むことを意図する一般的な用語である。悪性新生物のほとんどは周囲組織に浸潤し、いくつかの部位に転移し得、試みられた除去の後で再発し、十分に処置しない限り、患者の死を引き起こす可能性がある。新生物とは、本明細書で使用するとき、通常より急速に細胞増殖によって成長する異常な組織を指す。その増殖を開始させた刺激が消えた後であっても、増殖は続く。新生物は、構造的組織および正常組織の機能的協調が部分的または完全に欠如しており、良性または悪性のいずれかの場合があるが、通常、顕著な塊を形成している。
【０１３２】
[00130]本発明において、注射可能な材料として適切な粘度を有する糖化キトサン（ＧＣ）調製物で処置可能ながんの特定の例としては、限定されないが、子宮頚部、胸、膀胱、結腸、前立腺、喉頭、子宮内膜、卵巣、口腔、腎臓、精巣（非セミノーマ）および肺（非小細胞）のがんが挙げられる。
【０１３３】
[00131]さらに、本発明によれば、他のタイプのがん処置（例えば放射線療法）と協働する適切な様式で処置を適用し得る。例えば、放射線は、ホジキン病、結節性およびびまん性非ホジキンリンパ腫、頭頚部の扁平上皮細胞癌、縦隔胚細胞腫、精上皮腫、前立腺がん、初期の乳がん、初期の非小細胞肺がん、および髄芽細胞腫の改善において、重要な役割を果たす。放射線は、骨転移が存在している前立腺がんおよび乳がん、多発性骨髄腫、進行期の肺および食道咽頭がん、胃がん、肉腫、および脳転移における緩和療法として使用することができる。処置可能ながんとしては、例えば、ホジキン病、初期非ホジキンリンパ腫、精巣（セミノーマ）、前立腺、喉頭、子宮頚部のがん、および頻度は少ないが、鼻咽腔、副鼻腔、胸、食道および肺のがんが挙げられる。
【０１３４】
[00132]他の種類の抗悪性腫瘍薬と協働する適切な様式の処置も適用し得る。抗悪性腫瘍薬としては、新生細胞の細胞分裂（有糸分裂）、発生、成熟または拡散を阻害する薬物が含まれる。理想的な抗悪性腫瘍薬は、正常細胞に対して悪影響または毒性を示さずにがん細胞を破壊するものであるが、そのような薬は存在しない。しかしながら、多くの薬物は、治療指数が狭いにもかかわらず、一部の患者を処置および治癒可能である。絨毛癌、ホジキン病、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫および白血病の特定の段階は、精巣（非セミノーマ）および肺（小細胞）のがんと同様に、抗悪性腫瘍薬に対して感受性であることが知られている。抗悪性腫瘍薬の一般的な分類には、限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、抗生物質、ニトロソ尿素、無機イオン、酵素、およびホルモンが含まれる。
【０１３５】
ｉｎ  ｓｉｔｕ自己がんワクチン、例えばレーザーアシスト免疫療法
[00133]本発明のキトサン由来組成物、特に粘弾性糖化キトサン調製物は、新生物および他の医学的障害の処置に有効である。糖化キトサンの単独あるいは他の薬との組み合わせのさらなる用途としては、がんおよび後天性免疫不全症候群を含むがこれらに限定されない免疫不全の患者の処置における免疫賦活剤としての使用が挙げられる。
【０１３６】
[00134]このように、本発明のキトサン由来組成物は、本明細書に詳細に記述されるように、例えば免疫アジュバントまたは免疫アジュバントの一成分としての使用を含む無数の用途に有用である。他の用途にかかわらず、キトサン由来組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕ自己由来がんワクチン（ｉｎＣＶＡＸ）、例えば、レーザーアシスト免疫療法（ＬＩＴ）と組み合わせた免疫アジュバントとして主に使用され、この用途でのキトサン由来組成物は、本明細書で詳細に記載される。
【０１３７】
[00135]本明細書でさらに記述されるように、本発明のさらなる実施形態は、がんの処置のための、一般にｉｎＣＶＡＸ、特にＬＩＴと組み合わせられる免疫アジュバントとしての本発明の糖化キトサン調製物の用途に関する。本発明を利用するレーザーアシスト免疫療法は、好ましくは新生物内部または新生物周囲に粘弾性キトサン由来組成物を含む免疫アジュバントを導入し、その後、同じ腫瘍に光熱的照射を行うことを包含する。光熱的作用は、新生物細胞破壊を引き起こすのに十分な出力密度で実行され（腫瘍内注射または他の送達手段による発色団を伴ってもしくは伴わずに、注射または他の方法による本発明の粘弾性糖化キトサン調製物と組み合わせて実行可能）、細胞媒介性および体液性の免疫反応を誘導する。
【０１３８】
[00136]好ましい実施形態では、改善されたＬＩＴが提供され、ここでの改善には、本明細書に記載された本発明の注射可能な粘弾性糖化キトサン調製物の使用が含まれる。また本発明は、一般にｉｎＣＶＡＸ、特にＬＩＴと組み合わせた免疫系の特定の成分のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化方法であって、粘弾性糖化キトサン調製物を用いた処置を含む方法を包含する。
【０１３９】
[00137]本明細書でさらに記述されるように、ＬＩＴにより、現在の免疫療法およびがんワクチンの制限を克服するｉｎ  ｓｉｔｕ自己由来がんワクチン（ｉｎＣＶＡＸ）が提供されることが分かった。ＬＩＴの根底にある２つの一般的な原理は、（１）腫瘍の活力を奪い、腫瘍抗原を放出させるレーザーによる原発性腫瘍の局部加熱、および（２）放出された腫瘍抗原と相互作用してがんに対する免疫反応を引き起こす強力で非毒性の免疫アジュバント（糖化キトサン（ＧＣ）を含む）の局所注射である。このように、ＬＩＴは、腫瘍抗原の事前選択またはｅｘ  ｖｉｖｏ調製を伴わずに、個々の患者からの腫瘍抗原を源として、全腫瘍細胞に使用されるｉｎ  ｓｉｔｕ自己がんワクチンとして有効に機能する。
【０１４０】
[00138]本発明によれば、本明細書で記載したＬＩＴと組み合わせた本発明の注射可能な粘弾性糖化キトサン調製物を使用する別の利点は、ＬＩＴアプローチの使用によって、樹状細胞（ＤＣ）の活性化と、その後の腫瘍抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏの活性化ＤＣの曝露が行なわれることである。このようにＬＩＴは、ｅｘ  ｖｉｖｏ調製の必要性をなくし、免疫アジュバントとしての粘弾性糖化キトサン調製物と組み合わせてＬＩＴを使用する点で、他の全細胞がんワクチンに対して有利な手法を示す。
【０１４１】
[00139]糖化キトサン調製物の１つの代表的な製剤は、ＰＲＯＴＥＣＴＩＮの名称下で製造されてきた。ＬＩＴと組み合わせたＰＲＯＴＥＣＴＩＮが、免疫系を刺激し、かつ１）樹状細胞の活性化、２）腫瘍細胞と樹状細胞との間の相互作用の増加、３）免疫系における腫瘍抗原提示の増加、により腫瘍特異的免疫を誘導することが観察された。
【０１４２】
[00140]本発明の他の粘弾性糖化キトサン調製物は、さらに免疫系を刺激し、かつ１）樹状細胞の活性化、２）腫瘍細胞と樹状細胞との間の相互作用の増加、３）免疫系における腫瘍抗原提示の増加、による腫瘍特異的免疫を誘導する機能を有する。
【０１４３】
[00141]したがって、本発明の好ましい実施形態に従った粘弾性糖化キトサンの製剤は、免疫系の１つ以上の成分を活性化して、所望の治療効果を奏する。
【０１４４】
[00142]本明細書でさらに記述されるように、活性化される免疫系の特定の成分としては、非特異性または生来の免疫成分、つまり組織内の血液およびマクロファージ中の好中球および単球を含む食細胞系、補体蛋白質、非特異性免疫の主要可溶性成分、および先天性免疫の一部である急性期反応物、およびサイトカイン、例えば、インターフェロンが挙げられる。特異性免疫にも多くの様々な成分があり、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および免疫グロブリンがある。また本発明の糖化キトサン製剤は、リンパ球様細胞と相互作用して腫瘍免疫を促進する。腫瘍関連抗原、リンホカインあるいはインターフェロンが存在するとき、マクロファージも、腫瘍に対する細胞媒介性宿主応答に関与しうる。
【０１４５】
[00143]免疫系の特定成分は、「光熱的」処置後に活性化する。光熱的破壊が生じると、断片化された組織および細胞分子が、キトサンなどの免疫増強物質の存在下で宿主内に放出される。実際上、ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンが生成される。次いでこの物質の混合物は宿主内を循環し、免疫監視システムによって検知される。続けて、ＮＫ細胞および補充キラーＴ細胞を含む細胞媒介性免疫が即時動員される。これらの細胞は、同様の抗原または化学物質の部位へ遊走する。そのうちに、細胞媒介性免疫から、細胞毒性抗体の産生を備えた体液性免疫へと移行する。これらの抗体は、自由に身体を循環し、細胞および材料（それらのためにこれらの抗体はコードされている）に付着する。この付着が補体因子の存在する状態で生じる場合、結果的に細胞死が起こる。
【０１４６】
[00144]本発明の注射可能な粘弾性糖化キトサン調製物は「ｉｎ  ｓｉｔｕがんワクチン」において予想外の有用性を有する。このワクチンは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）をｉｎ  ｓｉｔｕ活性化し、抗原提示細胞に腫瘍抗原を曝露することに基づく。本発明の注射可能な粘弾性糖化キトサン調製物は、限定されないが、治療効果に寄与する腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦａ）および一酸化窒素を含む他の細胞媒介物質を活性化する。
【０１４７】
[00145]本明細書で記述した本発明の注射可能な粘弾性糖化キトサン調製物をＬＩＴと組み合わせて使用する別の利点は、このアプローチを使用することにより、本方法が各個体の中の免疫反応を独立して引き起こすということであり、この反応は、（従来の抗体免疫療法および予防接種で必要とされるような）宿主間の腫瘍特異的抗原の発現における交差反応性を必要としない。組織化学的研究により、ＬＩＴ処理された腫瘍担持ラットの血清に、生存腫瘍細胞および保存腫瘍細胞の両方の原形質膜に結合する抗体が含有されていることが示された。血清（ＬＩＴにより成功裡に処置されたラット由来）を一次抗体の源として使用する腫瘍細胞タンパク質のウエスタンブロット解析により、固有のバンドが示され、腫瘍選択的抗体の誘導が示された。成功裡に処置されたラットは腫瘍の再負荷に対する長期抵抗性を得ている場合があり、養子免疫を成功裡に処置されたラットの脾臓細胞を使用した移植により、腫瘍特異的免疫が示され得ることも明らかにされた。
【０１４８】
[00146]したがって、本明細書に記載の本発明の注射可能な粘弾性の糖化キトサン調製物の使用は、有効ながん処置を提供する際の重大な要求を満たすいくつかの利点を備える。特にがん患者にとって有利であるが、その理由は、本発明が、予想外かつ驚くべきことに注射による投与が容易であり、これによりコンプライアンスを向上させ、後期転移がんに（１）有効、（２）無毒、および（３）実用的な処置を提供しない従来のアプローチに対する有効な代替処置法を提供するためである。乳がん療法における重大な問題は、現行の従来型の方法では全ての患者が処置可能という訳ではなく、後期に診断された患者は予後が悪く、処置のための有効な選択肢が少ないということである。また近年、乳がん処置において多くの進歩および開発があったものの、重大な問題は残ったままである。本発明の注射可能な粘弾性の糖化キトサン調製物は、本明細書に記述されるように、有効ながん処置を提供する際の重大なニーズを満たすいくつかの利点を備える。
【０１４９】
[00147]ＬＩＴは、樹状細胞の成熟（ＣＤ８０の発現により評価される）を誘導し、Ｔ細胞増殖を増強させ、ＩＦＮ−γの分泌を促進させ、ＨＳＰ７０の発現を増加させることが示されている。さらに、ＬＩＴの併用効果（例えば、本発明による腫瘍加熱レーザーと糖化キトサン調製物の注入）により、腫瘍特異的免疫が誘導され、処置後の腫瘍に対する腫瘍特異的な細胞毒性ＣＤ４およびＣＤ８細胞の浸潤が示される。
【０１５０】
[00148]さらに本明細書で詳述するように、ＬＩＴは、限定されないが、以下を含む多数の利点を提供する：
・処置された原発性腫瘍の除去
・処置されない転移の除去
・長期免疫および生存の誘導
・腫瘍再誘発に対する抵抗性の生成
・治療用量でのヒトでの使用において無毒で安全。
【０１５１】
[00149]本発明の一態様によれば、悪性腫瘍のような新生物に、可視、近赤外または赤外光を新生物の温度を新生物細胞破壊に誘導するレベルに上げるために十分な出力および期間で照射することで、新生物細胞増幅に対する自己免疫防御システムが刺激される。腫瘍の加熱を促進するために、適用された光の波長に対応する吸収ピークを有する発色団を光療法の適用前に注入してもよい。光の照射に続いて、粘弾性糖化キトサン由来免疫アジュバントを、腫瘍内または腫瘍近傍を囲む組織に例えば注射により投与する。
【０１５２】
[00150]本発明の別の態様によれば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）および糖化キトサンの溶液がキトサンに対するＩＣＧの濃度０．１〜２％で調製される。その溶液は新生物に注入され、次いで、新生物に、健常細胞組織を有意に破壊することなく十分に透過可能な放射波長を有するレーザーを使用して約５ワットの出力で照射される。照射は約１〜約１０分間継続されるが、この時間で、新生物の温度を、新生物細胞破壊を誘導し、細胞媒介性および体液性免疫応答を引き起こすレベルに上げるには十分である。
【０１５３】
[00151]さらに本明細書に記載されるように、本発明は他の通常のおよび通常でない処置様式に対していくつかの利点を有する。腫瘍破壊と免疫刺激アジュバントとの組み合わせが鍵となる。最も顕著な利点は、急性と慢性の腫瘍破壊の組み合わせである。大規模または制御された規模での、近隣領域での、新生物の組織の光気化（ｐｈｏｔｏｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ）、光除去（ｐｈｏｔｏａｂｌａｔｉｏｎ）あるいは熱による死滅によって引き起こされる急速な腫瘍の消失により、腫瘍の負荷、したがって増殖の基礎が縮小され、自己防御システムが、より弱い「敵」と戦うことができるようになる。局所腫瘍の破壊が生じるとき、糖化キトサンなどの免疫増強物質の存在下で、断片化された組織および細胞分子が宿主内に局所的に放出される。実際上、ｉｎ  ｓｉｔｕワクチンが生成される。続けて、ＮＫ細胞および補充キラーＴ細胞を含む細胞媒介性免疫が即時動員される。これらの細胞は、同様の抗原または化学物質の部位へ遊走する。そのうちに、細胞媒介性免疫から、細胞毒性抗体の産生を備えた体液性免疫へ移行する。これらの抗体は、自由に身体を循環し、細胞および材料（それらのためにこれらの抗体はコードされている）に付着する。この付着が補体因子の存在する状態で生じる場合、結果は細胞死となる。これらの２つの免疫学的作用様式の時間枠は、細胞媒介応答が０〜２週間であり、一方、体液性の応答は、ほぼ３０日で成熟し、長期間（最大で宿主の寿命の間）持続する。
【０１５４】
[00152]要約すると、がんの全体的な根絶を伴う長期生存が、本発明の粘弾性糖化キトサン調製物の使用により達成し得る。それは、除去的（例えば、光熱的）作用による腫瘍負荷低下と糖化キトサンまたは他の免疫調節物質による増強された免疫系応答とが組み合わされた結果である。
【０１５５】
[00153]他の実施形態によれば、本発明の糖化キトサン調製物は、抗菌および／または止血用途に使用されてもよい。このように糖化キトサン（ＧＣ）調製物は、例えば、抗菌性止血スプレーとして製剤化することができ、ここで、ＧＣ製剤は一定の粘度を有し、従来の容器からスプレー可能な流動特性を示す。さらに、ＧＣは、抗微生物および／または止血有効濃度で適用され、目的に適した容器から分配することが可能な粘度／流動特性を有することを条件として、他の製剤にも含めることができる。
【０１５６】
[00154]本発明を、以下の実施例により、さらに例証する。以下の実施例は、例示として提供されるものであって、いかなる点でも本発明の範囲を限定することを意図しない。したがって、実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではなく、むしろ本発明の好ましい実施形態の例示として見られるべきである。他の多くの変形が可能である。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
糖化キトサン（ＧＣ）の例示的な調製方法
糖化キトサンは、キトサンポリマーの所定の糖化度（％）が達成される所定の程度まで糖のカルボニル基とキトサンの第一級アミノ基とのシッフ塩基の形成（本明細書ではアミノ基の糖化とも称する）がなされるのに十分な時間、キトサンを単糖類および／またはオリゴ糖類と、好ましくは酸性化剤の存在下で、反応させることによって得られる。続けて、シッフ塩基とその転位誘導体（Ａｍａｄｏｒｉ生成物）の還元により、安定化が行なわれる。ＮＭＲによる追跡を用いて、キトサンポリマーへの単糖類および／またはオリゴ糖類の結合を確認することができ、残存する遊離アミノ基の化学的測定（例えば、ニンヒドリン反応）を用いて、糖化度が評価される。
【０１５８】
実施例２
濾過滅菌法
米国特許第５，７４７，４７５号に記載されるような、従来の１５００ｋＤａのガラクトキトサンは、合成は比較的簡単であるが、例えば０．２２ミクロンのフィルターを用いた滅菌はフィルターの完全性を損なわずに行うことはできないので、従来の糖化キトサンはＧＭＰ製造およびヒトでの使用に適さない。対照的に、本明細書に記載の新しい粘弾性糖化キトサンは、予期しなかった有利な生理化学的特性によりＧＭＰ製造および濾過滅菌法に関して顕著な利点を有する。例えば、２５０，０００Ｄａ（２５０ｋＤａ）の分子量（Ｍ．Ｗ．）において、０．２２ミクロンのフィルターを用いる滅菌濾過は、濾過中に材料を損失することなく１００ｍｌ／分の流量であり、高度に実現可能である。
【０１５９】
実施例３
糖化キトサン（ＧＣ）の粘度
ＧＣ調製物の分子量をより高くすると、より高い粘度（Ｃｐで測定）が示される。
ＧＣのｋＤａ Ｃｐ
１００            ０．９１４
２５０            ７．６８
５００            ２０．７９
１５００          ８４．７
下記のグラフは、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの範囲の分子量を有するＧＣサンプルにおける粘度（単位Ｃｐ、ｙ軸）対分子量（単位ｋＤａ、ｘ軸）を示す。この実験において、溶液中のＧＣの濃度は、分子量が増加するにつれて低下し、０．６％（１００ｋＤａ）〜０．１１％（１，５００ｋＤａ）の範囲であった。
【０１６０】
【化３】
2015513522.tif 000003
【０１６１】
非常に驚くべきことに、試料中のＧＣ濃度が分子量の増加につれて低下する場合のみ、粘度が分子量の増加に対して直線的に増加することが分かった。下記の表およびグラフは、上記の粘度実験で使用した試料の溶液中のＧＣパーセントを示す。
サイズｋＤａ      試料中のＧＣパーセント
１００            ０．６
２５０            ０．３
５００            ０．１４
１５００          ０．１１
【０１６２】
【化４】
2015513522.tif 000004
【０１６３】
結果から、１）ＧＣ調製物の分子量が高いほど、相関して粘度（Ｃｐで測定）が高くなること、および２）この粘度と分子量との相関関係は、濃度が一定に保たれる場合には直線関係にないこと、が明白に示される。別言すると、粘度は分子量の増加とは不均衡に増加し、このために（米国特許第５，７４７，４７５号に示されるような）高分子量の糖化キトサンは、注射または濾過滅菌に適さなくなる。
【０１６４】
したがって、低い分子量（つまり約４００ｋＤ未満）の糖化キトサンを含む粘弾性糖化キトサン調製物は、注射性能が改善している；これらの調製物は、例えば、新生物細胞破壊を引き起こし、新生物細胞に対する自己免疫防衛システムを刺激するための、光線力学的療法およびレーザーアシスト免疫療法を利用するがんの処置に有用である。
【０１６５】
実施例４
製造上の改善
この例示的研究では、糖化キトサンの製造における全体的な収率を向上させるために必要に応じて実験条件を調整し得ることが分かった。予想外にも、ＧＣの製造がｐＨ条件を制御して糖化度（％）を制御することにより改善され得ることが分かった。これは具体的には水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の半減期がｐＨに比例しており、低いｐＨではＮａＢＨ４の半減期が非常に短く、高いｐＨでのみＮａＢＨ４がやや安定になるためであることが分かった。このように、ＮａＢＨ４は、低いｐＨでのシッフ塩基およびＡｍｉｄｏｒｉ生成物の還元による糖化キトサンの安定化には有効でないと判断された。例えば、ｐＨが５未満（ｐＨ＜５）に維持した時、ＮａＢＨ４の半減期は非常に短いため、シッフ塩基およびＡｍａｄｏｒｉ生成物の還元があまり効率的ではなく、したがってＧＣの糖化度（％）が低下した。
【０１６６】
しかしながら、より高いｐＨでは、製剤が「ゲル化」し、非ニュートン流体になることが分かった。例えば、ｐＨを６（ｐＨ＞６）より上に維持したとき、製剤のゲル化が観察され、このためにバッチを廃棄しなければならなかった。別言すると、効率的なＧＣ製造の目的を達成するために、ｐＨは、製剤が「ゲル化」するような高さに維持しないが、ＮａＢＨ４の短い半減期により糖化度（％）が最小化するような低さにも維持しなかった。
【０１６７】
実施例５
ヒト臨床試験でのレーザーアシスト免疫療法（ＬＩＴ）処置
調査者で実施した乳がんの臨床試験を、進行した乳がんを有する１０人の患者（５人は病期ＩＶ、５人は病期ＩＩＩ）で行った。ほとんどの患者は、従来の療法に少ししかまたは全く反応せず、粘弾性糖化キトサンを免疫アジュバントとして使用した少なくとも１つのレーザーアシスト免疫療法（ＬＩＴ）による処置を受けた。２人の患者が、試験と関連のない理由により早期に試験から外れ、評価可能な対象は８人であった。治験の前に、独立した調査者によりＩＲＢと政府の承認を得た。生検および医用画像（ＣＴスキャンなど）を使用して原発性病変と転移を評価した。
【０１６８】
主要な有効性パラメータは、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）を使用した調査者の評定による全体的応答の最高値とした。完全応答（ＣＲ）は、全ての標的病変における評価に係る（qualifying）代謝活性の消失または欠如として定義した。部分応答（ＰＲ）は、活性のベースラインまたは標的病変の最長直径の合計から３０％以上の低下として定義した。進行性疾患（ＰＤ）は、標的病変の最長直径の合計が２０％以上増加または１つ以上の新しい病変の出現として定義する。安定な疾患（ＳＤ）は、ＰＲと評価するために十分な低減も、ＰＤと評価するために十分な増加もないことと定義した。
【０１６９】
評価可能な８人の乳がん患者のうち、ＣＲが１人の患者で、ＰＲが４人の患者で、ＳＤが１人の患者で観察された。評価可能な患者では、客観的反応率（ＣＲ＋ＰＲ）は６２．５％であり、臨床的に有益な反応率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は７５％であった。ＰＤが２人の患者で観察された。レーザーで照射した全ての局所的病変は、ＬＩＴに応答した。さらに、これらの患者の遠隔転移のほとんどがＬＩＴに応答した。数人の患者におけるリンパ節、肺および肝臓の転移の直径および活性は、劇的に減少した。
【０１７０】
局所および全身毒性を、国立がん研究所の共通毒性基準第３．０版によって類別した。実験室評価および身体検査は周期的に行った。有害事象を緊密に観察し、試験期間を通して記録した。ＬＩＴは、乳がん患者の処置領域内で局所的反応のみ引き起こし、そのほとんどは、局所的レーザー処置の熱的効果と関連するものであった。処置領域の発赤、疼痛、浮腫および潰瘍が共通の有害事象（ＡＥ）であった。グレード３または４の有害事象は観察されなかった。事前に放射線療法を受けなかった患者では、腫脹は小さかった。事前に放射線療法を受けた患者では、腫脹はより顕著であり長期間続いた。
【０１７１】
実施例６
糖化キトサンを伴うレーザーアシスト免疫療法は、マウスのＢ１６メラノーマ腫瘍に対する抗腫瘍免疫を示す
雌のＣ５７ＢＣ／６マウス（８週齢、１２匹のマウス／群）に、Ｂ１６−Ｆ１メラノーマ腫瘍（１０６生存腫瘍細胞）を背中へ皮下接種した。腫瘍は移植後約７日で処置サイズ（直径７〜８ｍｍ）に達した。試験には５つの処置群（１２匹の雌マウス／群）、つまり、未処置対照群、レーザーアシスト免疫処置対照群、ならびに０．２ｍＬの１％糖化キトサンをレーザー処置の２４時間前、直後もしくは２４時間後に腫瘍周囲に注入したレーザーアシスト免疫処置群を含めた。８０５ｎｍのダイオードレーザーを、パラメータ設定２Ｗ、１０分間持続で、レーザー照射に使用した。レーザーは、処置部位の末端にある拡散レンズを備えた光ファイバーを通して方向づけ、レーザーチップは皮膚から４ｍｍの距離に維持した。
【０１７２】
動物の生存率を評価した。処置部位におけるマウス皮膚の黒色化および硬化をレーザー処置後に観察した。腫瘍の再発は、通常、処置の数日後に生じた。糖化キトサンの適用と組み合わせた熱処置により、動物の生存が著しく改善し、レーザー照射の２４時間前に糖化キトサンを投与した場合が最も顕著な改善を示した（下記表を参照）。
【０１７３】
【表１】
2015513522.tif 000005
【０１７４】
実施例７
８０５ｎｍのレーザーおよび糖化キトサンを使用する転移性乳腺モデルでの組織内レーザーアシスト免疫療法
最適な組織内レーザー用量と最適な糖化キトサン用量を決定するための試験を行った。雌のヴィスター・フュルト・ラット（５〜６週齢、１００〜１２５ｇ）に、ＤＭＢＡ−４の移植可能な転移性乳腺腫瘍（１０５生存腫瘍細胞）を背中へ皮下注射した。ＤＭＢＡ−４腫瘍は、元々は化学的に誘導したものであり、転移性が高く、免疫原性が低い。腫瘍はリンパ管に沿って転移し、遠位部位に複数の転移を迅速に形成し、全てのラットを腫瘍移植後、３０〜４０日で死亡させる。原発性腫瘍が０．２〜０．５ｃｍ３になった時、腫瘍を覆う毛を切り取り、麻酔をかけた動物（２％イソフルラン）にレーザーアシスト免疫療法を行なった。８０５ｎｍダイオードレーザーを使用して標的腫瘍に近赤外線を送達した。連続的なレーザー出力を鋭敏な（active）円筒状チップを備えた光ファイバーを介して送達した。鋭敏なチップを保護する透明なプラスチック製の覆いを備えた１．０ｃｍの鋭敏なチップを使用した。鋭敏なファイバーチップの挿入のために、ニードルガイドまたは穿刺支援挿入方法のいずれかを使用した。ファイバーの腫瘍内位置を８０５ｎｍのレーザーからの赤外光を捕捉できるデジタルカメラによって確認した。ラットを毎日観察し、少なくとも１００日間、週に２度、腫瘍を観察した。処置が成功したことの基準は、腫瘍移植後１００日間生存することとした。最適な組織内レーザー用量は、対照（９匹のラット、処置なし）、組織内レーザー出力１、１．５、２、２．５および３Ｗ／ｃｍ２を１０分間（１４匹のラット／群）、ならびに組織内レーザー出力２Ｗ／ｃｍ２を３０分間（１４匹のラット／群）における効果を評価することによって決定した。１０分で３Ｗ、３０分で２Ｗにおけるラットは、他の群より高い平均生存率を有するようであった。最適な糖化キトサン用量は、組織内レーザーアシスト免疫療法を２．５Ｗで２０分間行い、続けて０．１、０．２、０．４および０．６ｍＬの１％糖化キトサンを投与した後の生存率を評価することによって決定した。処置を受けなかったラットの群もコントロールとして含めた。最良の生存率は４２％であり、０．２ｍＬの糖化キトサン投与の後で観察された（下記図を参照）。
【０１７５】
【化５】
2015513522.tif 000006
【０１７６】
０．２ｍＬのＧＣを伴う組織内レーザーアシスト免疫療法の後の生存率。
【０１７７】
実施例８
レーザーアシスト免疫療法を使用したラットでのＤＭＢＡ−４転移性乳腺腫瘍に対して誘導された抗腫瘍免疫
雌のヴィスター・フュルト・ラット（６〜７週齢、１１０〜１３０ｇ）に、ＤＭＢＡ−４の移植可能転移性乳腺腫瘍（１０５生存腫瘍細胞）を鼠蹊領域へ接種した。原発性腫瘍は、全体的に接種後７〜１０日後に現れ、３週間以内でほぼ１〜５ｇとなった。腫瘍は、リンパ管を介して鼠蹊および腋窩リンパ節へ転移した。処置は、原発性腫瘍が０．２〜０．５ｃｍ３となったとき（一般に接種後１０〜１５日）、開始した。ラットに、０．２５％のインドシアニングリーンと１％の糖化キトサン溶液（０．２０ｍＬ）を、腫瘍の中心に直接注射して投与し、その後、照射を行った。８０５ｎｍダイオードレーザーを、パラメータ設定２Ｗ、１０分間持続で、レーザー照射に使用した。レーザーは、光ファイバーによって処置部位に向けた。照射に続いて、動物を個別に収容し、観察結果および腫瘍測定結果を週に２度記録した。成功裡に処置されたラット（治癒したラット）を、１匹のラット当たり１０５〜１０７生存腫瘍細胞の腫瘍用量レベルで、同じ腫瘍細胞で繰り返し再負荷し、動物を腫瘍発生について４ヶ月観察した。レーザーアシスト免疫療法によって処置した３２匹のラットのうち、８匹のラットは成功裡に処置され、接種後１２０日を超えて腫瘍はなかった。全ての治癒したラットでは、処置後も転移は発生し続け、その後、徐々に低減し、最後はさらなる処置なしで消失した。７匹の成功裡に処置されたラットに、１注射あたり１０５〜１０７の生存腫瘍細胞の範囲の用量レベルで、３回まで再負荷した。これらの動物のいずれにおいても、原発性または転移性腫瘍の再発はなく、動物は、１２０日を超えて生存し、一方で、処置していない対照ラットでは原発性および転移性腫瘍が発生し、平均生存期間は３０日であった。
【０１７８】
実施例９
キトサン由来免疫アジュバントによるレーザーがん処置の増強
レーザーアシスト免疫療法処置中の免疫アジュバントの効果をラットで４つの異なる免疫アジュバントを使用して評価した。雌のヴィスター・フュルト・ラット（６〜８週齢、１５０〜２００ｇ）に、ＤＭＢＡ−４の移植可能な転移性乳腺腫瘍（１０５生存腫瘍細胞）を鼠蹊の脂肪肉趾へ皮下接種し、その７〜１０日後に処置を行った。原発性腫瘍は一般に５〜７日で触知できるようになり、遠位の鼠蹊および腋窩の転移は接種後１５〜２０日で現れた。原発性腫瘍が０．２〜０．５ｃｍ３に達したとき、レーザーアシスト免疫療法処置を開始した。レーザー療法は、全体的に１０日目に実施した。免疫アジュバントには、１％の糖化キトサン水溶液（０．２ｍＬ用量、２つの実験でｎ＝４８のラット）、５０％の完全フロイントアジュバント（０．２ｍＬ用量；ｎ＝３３のラット）、５０％の不完全フロイントアジュバント（０．２ｍＬ用量；ｎ＝３０のラット）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）（３５μｇ／ラット用量；ｎ＝３２のラット）を含めた。免疫アジュバントを０．２５％のインドシアニングリーンと混合し、腫瘍の中心に直接注射し、２時間後、８０５ｎｍのダイオードレーザーで照射した。動物には照射に先立って麻酔をかけ、原発性腫瘍に重なる毛は切り取った。レーザーパラメータは、２Ｗで１０分間、３ｍｍ直径レーザー療法部位とし、１ｃｍ径の腫瘍について９６Ｊ／ｃｍ２のフルエンスとなった。動物は個別に収容し、毎日観察し、腫瘍負荷の測定値は１週間に２回、収集した。
【０１７９】
この試験のデータを、いくつかの異なる実験の腫瘍担持対照ラット（ｎ＝３８のラット）からのデータと比較した。全ての免疫アジュバントは、対照データ（ｐ＜０．０５）と比較して、生存率が統計学的に有意に増加した。１％糖化キトサンは、２９％の長期生存率を示し、最も有効な免疫アジュバントと考えられた（下記表参照）。糖化キトサンアジュバントを、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ（ｐ＝０．００９）および不完全フロイントアジュバント（ｐ＝０．０３）と比較したとき、統計学的有意が観察された。顕著ではないが、比較可能な治癒率（１８％）を有する完全フロイントアジュバントと比較されたとき、認識し得る生存率の改善が観察された。相対的に低い生存率が、不完全フロイントアジュバントとＣ．ｐａｒｖｕｍを用いた処置後に観察された。
【０１８０】
【表２】
2015513522.tif 000007
【０１８１】
実施例１０
キトサン由来免疫アジュバントによる光線力学的療法の増強
糖化キトサンと組み合わせた直接腫瘍破壊のための方法としての光線力学的療法を評価するために、フォトフリンおよびメソ置換されたテトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ）に基づいた光線力学的療法と糖化キトサン注入との組み合わせを、それぞれＥＭＴ６乳腺肉腫およびＬｉｎｅ１肺腺癌マウスモデルにおいて、試験した。各モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０６の生存腫瘍細胞を、低部背側領域へ皮下接種した。腫瘍は７日後に処置サイズ（７〜８ｍｍ）であった。
【０１８２】
ＥＭＴ６乳腺肉腫モデルにおいて、評価された処置群を、下記表に詳述する。フォトフリン（Ｍｏｎｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｈｉｌａｉｒｅ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ）を、５％滅菌デキストロース中で調製して１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。５ｍｇ／ｋｇ用量のフォトフリンを、照射前２４時間に静脈内投与した。動物は、光増感剤注入直後から光線力学的処置３日後まで直射日光から遮蔽した。マウスは光処理の間、麻酔をかけずに、背中を露出させながらホルダー内で拘束した。光（６３０ｎｍ）は、直径８ｍｍの液体光導波路を通して送達した。出力密度は、１００ｍＷ／ｃｍ２に設定し、合計の光量は６０Ｊ／ｃｍ２であった。光照射直後、適用可能であれば、動物に０．５または１．５％糖化キトサンを腫瘍周囲に投与した。動物は、光線力学的処置後、２日ごとに９０日まで腫瘍の発現を観察し、腫瘍体積の変化を１週間に３回測定した。
【０１８３】
【表３】
2015513522.tif 000008
【０１８４】
光線力学的処置ラットおよび光線力学的糖化キトサン処置ラットでは、全て処置の翌日までに完全に腫瘍が退縮した。腫瘍の再発は、一般に、処置後２週間以内に検出された。標準光線力学的療法の効果は、３７．５％であったが、０．５および１．５％の糖化キトサンの投与後に増加し、それぞれ６２．５および７５％の値となった。糖化キトサンは、光線力学的処置のみ（ｐ＜０．０５）の場合と比較して、腫瘍担持マウスの生存率を有意に増加させた。
【０１８５】
Ｌｉｎｅ１肺腫瘍モデルでは、処置群は下記表に示されるとおりであった。ｍＴＨＰＣは、エタノール、ポリエチレングリコール４００および水の２：３：５（ｖ／ｖ／ｖ）の混合物中で０．０２ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように調製した。０．１ｍｇ／ｋｇ用量のｍＴＨＰＣを、照射の２４時間前に静脈内投与した。動物は、光増感剤注入直後から光線力学的処置３日後まで、直射日光から遮蔽した。マウスは光処置の間、麻酔をかけずに、背中を露出させながらホルダー内で拘束した。０．２５Ｗダイオードレーザーからの６５２ｎｍの光を直径８ｍｍの液体光導波路を通して送達した。出力密度は１１０ｍＷ／ｃｍ２に設定し、合計光量は３０Ｊ／ｃｍ２であった。光照射直後、適用可能であれば、動物に、１．６７％の糖化キトサンを腫瘍周囲に投与した。動物は、光線力学的処置後、２日ごとに９０日まで腫瘍の発現を観察し、１週間に３回、腫瘍サイズの変化を測定した。
【０１８６】
【表４】
2015513522.tif 000009
【０１８７】
腫瘍の再発が３週間以内に全てのマウスで観察された。ｍＴＨＰＣに基づく光線力学的療法後、１．６７％の糖化キトサン投与により３７．５％の生存率が得られたが、他の組み合わせは有効ではなかった。Ｌｉｎｅ１肺腫瘍モデルは、免疫原性の低い腫瘍モデルと考えられた。ｍＴＨＰＣに基づく光線力学的療法に対するマウスＬｉｎｅ１腫瘍の反応に与える腫瘍局在化糖化キトサン処置の効果を下記の図に示す。
【０１８８】
【化６】
2015513522.tif 000010
【０１８９】
マウスＬｉｎｅ１腫瘍におけるｍＴＨＰＣに基づくＰＤＴに対する応答に与える腫瘍局在化糖化キトサン処置の効果。
ＧＣ＝糖化キトサン
ｍＴＨＰＣ＝メソ置換されたテトラ（メタヒドロキシフェニル）クロリン
ＰＤＴ＝光線力学的療法
これらの試験結果は、光療法の効率を増大させるために活発な免疫学的刺激が必要であることを示す。
【０１９０】
実施例１１
ラットの転移性腫瘍の処置におけるレーザーアシスト免疫療法の異なる構成要素の影響
レーザーアシスト免疫療法システムの３つの構成要素の様々な組み合わせを、転移性乳房腫瘍および前立腺腫瘍をそれぞれ担持する雌および雄のラットを使用して、この試験で評価した。レーザーアシスト免疫療法システムは、最大出力２５Ｗの近赤外線レーザーによるダイオードレーザーと、レーザー吸収色素であるインドシアニングリーンと、免疫アジュバントである糖化キトサンとから構成される。原発性腫瘍が０．２〜０．５ｃｍ３になったとき、腫瘍担持ラットで処置を開始した。０．２ｍＬのＧＣおよび／またはＩＣＧ溶液を、全ての群で原発性腫瘍の中心に注射した。レーザー処置を受けるラットは、照射の２時間前に注射を行い、動物には麻酔をかけ、腫瘍を覆う毛は切り取った。レーザーの設定は２Ｗ、１０分間であり、レーザー・ファイバーチップは上を覆う皮膚から４ｍｍの距離に維持し、レーザーエネルギーは光ファイバーによって処置部位に向けた。動物は処置後、個別に収容した。生存試験においては、乳房腫瘍または前立腺腫瘍を担持するラットを毎日観察し、各腫瘍の三次元を毎週測定した。雌のヴィスター・フュルト・ラット（５〜６週齢、１００〜１２５ｇ）にＤＭＢＡ−４の移植可能な転移性乳腺腫瘍（１０５生存腫瘍細胞）を各ラットの一方の鼠蹊の脂肪肉趾へ皮下接種した。原発性腫瘍は、接種後、７〜１０日で発生した。リンパ管に沿ったおよび遠隔部位への転移性腫瘍は、通常、ほぼ２週間で触知できるようになった。処置なしの場合は、腫瘍担持ラットは、平均生存期間が３５日間であった。転移性乳房腫瘍担持ラットの８つの群を、下記表に詳述されるように異なる構成要素のレーザーアシスト免疫療法システムで処置した。生存率ならびに原発性および転移性腫瘍プロフィールを、個々の構成要素および構成要素の様々な組み合わせについて決定した。さらに、雌のラットの３つの群（ｎ＝１６／群）を、０．５、１．０および２．０％の糖化キトサンで処置し、免疫アジュバントの濃度のラット生存に対する影響を評価した。
【０１９１】
【表５】
2015513522.tif 000011
【０１９２】
転移乳腺腫瘍担持ラットにおいて、単一構成要素の処置では、インドシアニングリーンおよびレーザーのみの処置群全てが死に至り、平均生存期間は対照群と同様であった。生存した糖化キトサン群の２匹のラットは、１匹のラットが長期生存ラットであり、他の１匹のラットは生存延長ラット（＞１２０日）とみなされた。２つの構成要素を備えた処置の後、１匹および２匹の長期生存ラットが、それぞれレーザー＋糖化キトサン群およびインドシアニングリーン＋糖化キトサン群で観察された。単一構成要素の処置群または２つの構成要素の処置群を対照群と比較した場合、生存期間に統計学的有意差はなかった。９匹のラットが、３つの構成要素のレーザーアシスト免疫療法（つまり、糖化キトサンと組み合わせた光熱的適用）処置後に、長期生存を示し、２つの別個の実験での３１匹のラットにおいて、およそ３０％の治癒率が得られた。処置ラットの生存期間中央値に、対照ラットと比較して、有意差（ｐ＜０．０００１）が観察された。レーザーアシスト免疫療法システムの１つ、２つまたは３つの構成要素での処置後のラットの生存率を、以下の図で示す。転移性腫瘍は、通常、原発性腫瘍の接種後２週間で出現し、退縮の前に大きさがピークに達した。
【０１９３】
【化７】
2015513522.tif 000012
【０１９４】
レーザーアシスト免疫療法システムの１つ、２つまたは３つの構成要素での処置後のラット生存率。
ＧＣ＝１．０％糖化キトサン。
ＩＣＧ＝０．２５％インドシアニングリーン。
【０１９５】
実施例１２
レーザーアシスト免疫療法によって誘導される抗腫瘍免疫およびその養子免疫移植
レーザーアシスト免疫療法によって誘導される抗腫瘍免疫のメカニズムを調べるために、免疫脾臓細胞を使用する養子免疫移植を行った。雌ヴィスター・フュルト・ラットに、ＤＭＢＡ−４移植可能転移性乳腺腫瘍（１０５生存腫瘍細胞）を、各ラットの一方の鼠蹊の脂肪パッドへ皮下接種し、７〜１０日後、レーザーアシスト免疫療法処置を行った。処置なしでは、腫瘍担持ラットは、平均しておよそ３０日間、生存した。レーザー処置ラットでは、レーザーで処置する前に、０．２５％インドシアニングリーンと１％糖化キトサンとの両方を含有する０．２ｍＬの溶液を原発性腫瘍に直接投与した。照射には、８０５ｎｍのレーザーを２Ｗで１０分間使用した。誘導された免疫の保護能力は、生存腫瘍細胞を増加接種用量で繰り返し負荷した、成功裡に処置された腫瘍担持ラットのいくつかの群で評価した。さらに、レーザーアシスト免疫療法後の腫瘍の負荷に対する抵抗性および腫瘍成長阻害を、未処置ラットで評価した。
【０１９６】
レーザーアシスト免疫療法によって成功裡に処置された１５匹のラットを、最初の接種から１２０日後に１０６生存腫瘍細胞で再負荷した。１８匹の未処置の年齢一致ラット（２５週齢）に、比較のために、１０６生存腫瘍細胞を接種した。成功裡に処置されたラットの全てが負荷に完全な抵抗性を示し、原発性腫瘍も転移も観察されなかった；しかしながら、年齢一致対照ラットでは、原発性腫瘍および転移性腫瘍が発症し、接種後３０日以内に死亡した。若いラット（ほぼ８週齢）の別個の群に、１０５生存腫瘍細胞を接種した。生存は、腫瘍用量に依存しているようであり、１０５および１０６の生存腫瘍細胞を接種された対照ラットは、それぞれ平均して３３日および２８日生存した。成功裡に処置されたラットは、通常、処置された原発性腫瘍および未処置の転移の両方で、段階的な退縮を示した。
【０１９７】
最初の再負荷の後、いくつかの実験群のラットに、１〜５ヶ月の時間間隔で、１０６生存腫瘍細胞で２回再負荷を行った。レーザーアシスト免疫療法によって成功裡に処置されたラットは、３回の腫瘍負荷に対して全く無反応であった。このデータを、下記の表中に示す。対照的に、年齢が一致する対照の腫瘍担持ラットでは、遠位の鼠蹊および腋窩の領域で複数の転移が発生し、３５日以内に死亡した。１０５の生存腫瘍細胞を接種した２０匹の対照ラット全てで複数の転移が発生したが、これらのラットは、より多くの１０６の生存腫瘍細胞用量を接種された年齢一致対照ラットと比較して、生存期間がわずかに増加した。成功裡に処置されたラットでの腫瘍再負荷に対する抵抗性は、腫瘍選択的免疫を強く示唆する。
【０１９８】
【表６】
2015513522.tif 000013
【０１９９】
養子免疫処置実験では、生きているＤＭＢＡ−４腫瘍担持ラットから回収した生存腫瘍組織を、ゆるく合わせた擦りガラス・ホモジナイザーで粉砕して単細胞懸濁液に分散させた。長期生存ラットを１０６の生存腫瘍細胞で腫瘍再負荷後、２８日で犠牲にし、それらの脾臓を解剖して脂肪を取り除いた。対照腫瘍担持ラット由来の脾細胞を使用して、２つの別個の実験を行った。脾臓細胞は、腫瘍接種後、第１回目の実験では２２日後、第２回目の実験では３９日後にそれぞれ回収した。細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清を含む培地中へ機械的破砕することによって調製した。脾臓細胞は、腫瘍細胞への事前曝露のない未処置ラットからも回収した。脾臓細胞および生存腫瘍細胞を血球計で計数した後、４００：１の脾臓細胞：腫瘍細胞の比率で混合した。未処置のラットに、４×１０７の脾臓細胞と１０５の生存腫瘍細胞とを含有する体積０．２ｍＬの混合物を接種した。養子免疫移植実験のため、４群の未処置雌ヴィスター・フュルト・ラットに腫瘍細胞を接種した。処置群は、未処置で１０５の生存腫瘍細胞を接種した腫瘍担持対照ラットのＡ群、対照腫瘍担持ラット由来の脾臓細胞と混合した腫瘍細胞を接種したラットのＢ群、腫瘍再負荷の２８日後にレーザーアシスト免疫療法で成功裡に処置した腫瘍担持ラット由来の脾臓細胞と混合した腫瘍細胞を接種したラットのＣ群、および先に腫瘍曝露のない未処置ラット由来の脾臓細胞と混合した腫瘍細胞を接種したラットのＤ群であった。実験は二連で行い、両方の実験のラットの生存率を組み合わせ、下記の図に示した。Ｃ群のラットにおいて原発性腫瘍または転移性腫瘍は観察されず、このことは、レーザーアシスト免疫療法からの脾臓細胞が、レシピエントラットに１００％の保護を与えることによりラットを成功裡に処置したことを示している。Ａ群の腫瘍担持対照ラットの全てで、腫瘍接種後３５日までに複数の転移と死亡が観察された。Ｄ群において、健常ラット由来の脾臓細胞では保護はもたらされなかった。Ｂ群の１０匹のラットのうち１匹のラットは生存したが、このラットは後に原発性腫瘍と転移の両方が発生した。Ｃ群のラットは全て養子免疫移植の６０日後に再負荷を受けたが、全てのラットがこの負荷に耐えた。Ｃ群のラットの免疫脾臓細胞を回収し、最初の養子免疫移植と同じ比率で腫瘍細胞と混合し、これらの動物の脾臓細胞がこの混合物を接種した健常ヴィスター・フュルト・レシピエントラット（ｎ＝６）のその後のコホートを保護する能力を評価した。Ｃ群のラット由来の免疫細胞により、６匹の未処理ラットのうち５匹が保護され、原発性腫瘍も転移性腫瘍も観察されなかった。死亡したラットは、対照群と比較して、生存期間が延長され（６０日対３０日）、接種後の腫瘍の発現も遅延した（３７日対７〜１０日）。
【０２００】
腫瘍を再負荷したときの、成功裡に処置されたラットが示す抵抗性は、腫瘍選択的免疫が長時間持続することを強く示唆する。
【０２０１】
【化８】
2015513522.tif 000014
【０２０２】
免疫細胞としてラット脾細胞を使用した養子免疫移植実験のラット生存曲線。
Ａ群＝腫瘍対照ラットの結果。
Ｂ群＝未処置の腫瘍担持ラット由来の脾臓細胞を混合した腫瘍細胞を注入したラットの結果。
Ｃ群＝レーザーアシスト免疫療法で成功裡に処置されたラット由来の脾臓細胞を混合した腫瘍細胞を注射したラットの結果。
Ｄ群＝未処置ラット由来の脾臓細胞を使用した結果。
注記：２つの別個の実験から収集したデータを組み合わせ、一緒にプロットした。
【０２０３】
実施例１３
レーザーアシスト免疫療法と低用量化学療法との組み合わせ
１つの典型的な臨床試験において、２人の乳がん患者に、シクロホスファミドを、毎週（ｉｎＣＶＡＸ処置後に）、用量１５０〜２００ｍｇ／ｍ２で投与した。患者は、初期にはこの処置によく応答し、腫瘍は収縮し、有害な作用は最小であった。数か月後、反応が鈍くなったため、腫瘍医が低用量化学療法を、パクリタキセルを７５ｍｇ／ｍ２で毎週投与するレジメンに切り替えたところ、再び、反応が非常に良好となり、腫瘍が縮小した。新たな転移は発生しなかった。患者は低用量の化学療法を受け続けた。３番目の患者は、低用量の化学療法後に手術可能となり、乳房切除術を行なったので、外科手術との組み合わせも選択肢の一つであった。