(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces  nobilis ）の菌体（培養液またはその乾固物を含まない）を酢酸エチル、アセトン、メタノールまたはこれらの混合液で抽出処理することを特徴とするアレルギー性炎症抑制物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｎｏｂｉｌｉｓ  、以下「Ｓ．ノビリス」と略記する）の菌体から溶剤抽出によりアレルギー性炎症抑制物質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アレルギーは、ある抗原との２度目の接触の際に生じる免疫反応が、個々人によって過度にあるいは不適当な形で現われる一種の病的症状であって、関与する抗体の性質の違いからＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ  型およびＩＶ型の反応に分類されている。これら４つの型のうち、ＩＩＩ  型反応（免疫複合体反応：アルサス反応）およびＩＶ型反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反応）に関与するアレルギー性炎症反応は慢性関節リウマチのような自己免疫疾患、更には喘息、肝炎、腎炎、皮膚炎のような種々の炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じていることが明らかになってきた。
【０００３】
しかしながら、従来の抗炎症剤であるアスピリン（日経サイエンス  ３：７０（１９９１））やインドメタシン（Ｔｈｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３：１０５７（１９８５）  ）は、アレルギー性炎症に対して抑制作用が極めて弱いという問題点がある。
【０００４】
ところで、従来より放線菌培養濾液中には種々の抗生物質が見つけられており、当該培養濾液は生理活性物質の宝庫と言われている。
【０００５】
本発明者らは、放線菌の培養液またはその乾固物の有機溶剤抽出物を用いてアレルギー性炎症抑制作用を有する物質の探索を行った結果、Ｓ．ノビリスの培養液またはその乾固物の有機溶剤抽出物中に顕著なアレルギー性炎症抑制作用を示し、かつヒトおよび動物に対する安全性についても全く問題がない物質を見いだすことに成功した（特開平５−２５０５３号公報参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、Ｓ．ノビリスの培養液またはその乾固物から有機溶剤によりアレルギー性炎症抑制物質を抽出してくる方法では、アレルギー性炎症抑制物質の生産量が低いことが問題となっていた。
【０００７】
本発明の目的は、このような実情から、アレルギー性炎炎症抑制物質をより効率的に得ることができる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｓ．ノビリスの菌体から有機溶剤で抽出した場合、より多くのアレルギー性炎症抑制物質が得られてくることを見いだし、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によるアレルギー性炎症抑制物質の製造方法は、放線菌Ｓ．ノビリスの菌体（培養液またはその乾固物を含まない）を酢酸エチル、アセトン、メタノールまたはこれらの混合液で抽出処理することを特徴とするものである。
【００１０】
本発明組成物の原料である放線菌Ｓ．ノビリスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ  ４２７４）（これは米国においてＡＴＣＣ  １９２５２およびオランダにおいてＣＢＳ  １９８．６５としても保存）などの菌が使用できる。
【００１１】
一般に放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、以下のような栄養物を含んだ培地を用いて行われる。すなわち、液体培地の場合、その成分として、ブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質類などの１種または複数種を含んだ水溶液が用いられる。その中でも好適な培地としては、澱粉・アンモニア系の液体培地が例示される。澱粉・アンモニウム系の培地の代表的な例としては、可溶性澱粉、リン酸水素二カリウム（Ｋ２  ＨＰＯ４  ）および塩化アンモニウム（ＮＨ４  Ｃｌ）を含む液体培地が挙げられ、より好ましくは同培地に酵母エキスおよび／またはＤ−セリンが添加される。
【００１２】
培地中の可溶性澱粉の濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％、Ｋ２  ＨＰＯ４  の濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％、ＮＨ４  Ｃｌの濃度は好ましくは０．０１〜５．０重量％である。また、培地中に酵母エキスおよび／またはＤ−セリンを添加する場合は、酵母エキスの濃度は好ましくは０．０１〜２０．０重量％、Ｄ−セリンの濃度は好ましくは０．００１〜１．０重量％である。
【００１３】
液体培地のｐＨは２〜９の範囲が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ましい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日である。なお、固体培養の場合には、おもに上記の液体培養の培地にさらに寒天を含んだものを用いるが、固体培養の培養条件も液体培養のそれとほぼ同じである。
【００１４】
こうして、Ｓ．ノビリスを培養した後、菌体の溶剤抽出を行う。
【００１５】
溶剤抽出処理に当たり、超音波などで菌体を破壊してもよいし、そのまま菌体を溶剤と接触させてもよい。アレルギー性炎症抑制物質の抽出溶剤としては、酢酸エチル、アセトン、メタノールまたはこれらの混合液に限定される。
【００１６】
溶剤抽出の温度は特に限定されないが、好ましくは抽出を加熱下で行う。加熱温度は常圧下での溶剤の沸点以下の温度範囲である。また、抽出中は液を静置しておいても良いが、攪拌もしくは振とうする方が効率的である。好ましくは同一の菌体に対して抽出操作を複数回繰り返す。
【００１７】
本発明方法により得られたアレルギー性炎症抑制物質をアレルギー性炎症抑制剤に製剤化するには、通常はアレルギー性炎症抑制物質を製剤用担体と共に製剤組成物の形態とする。担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、滑沢剤などの稀釈剤あるいは賦形剤が例示される。また適当な溶剤を選定することにより、得られた溶剤抽出液ないしはその濃縮物をそのままの形態で外用液剤として使用することもできる。
【００１８】
本発明抽出物より得られたアレルギー性炎症抑制剤の投与単位形態としては、上記の如き外用液剤の外、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、軟膏剤などが例示される。
【００１９】
アレルギー性炎症抑制剤中に含有すべきアレルギー性炎症抑制物質の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好ましくは炎症抑制剤中に０．１〜５０重量％の範囲である。
【００２０】
本発明抽出物より得られたアレルギー性炎症抑制剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。たとえば上記の如き外用液剤の場合には、これを皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接塗布し、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与され、また軟膏剤の場合には塗布される。
【００２１】
アレルギー性炎症抑制剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択されるが、通常は１日当り本発明抽出物として０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組成物を３〜４回／日に別けて投与することももちろん差し支えない。
【００２２】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例を挙げて、本発明を具体的に実証する。
【００２３】
実施例１
５００ｍｌ容の坂口フラスコ２本において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に対し、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ２  ＨＰＯ４  を０．０５ｇ、ＮＨ４  Ｃｌを０．０５ｇを含む）をそれぞれ１２５ｍｌを調製した。ついで、これらの培地に、理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を接種し、振盪培養器（ＴＡＩＴＥＣ社製、Ｂｉｏ−Ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−３００Ｌ）を用いて、３０℃、１６０ｒｐｍで９６時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離（２５００Ｇ×１０ｍｉｎ）し、菌体を得た。この菌体にアセトンを３０ｍｌ添加し、３０分間ソニケーションをした。続いて、１０分間振盪後、遠心分離（３，０００Ｇ×１０ｍｉｎ）した。同操作を３回繰り返し、得たアセトン相を合わせてエバポレーターで濃縮乾固し、抽出物を得た。この抽出物を２ｍｌのメタノールに溶かしたものを、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する）を用いた分析用試料とした。
【００２４】
まず、ＨＰＬＣでアレルギー性炎症抑制物質を定量するために、以下のように検量線を作成した。アレルギー性炎症抑制物質は、ＯＤＳカラム（東ソー社製、ＯＤＳ−８０ＴＭ、φ４．６ＭＭＩＤ×２５．０ＣＭＬ）を用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６０００Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオーブン６５Ａ−５２）において、検出波長２１０ｎｍ、温度４０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎの条件で、溶離液として水：アセトニトリル：メタノール＝６：７：７を用いた場合、４１〜４５分のリテンションタイムを示すことがわかっている。このことを利用して、アレルギー性炎症抑制物質をメタノールに溶解させて  ２、  ５、１０、２０、５０、１００  μｇ／ｍｌとしたものの４０μｌ、すなわち０．０８、０．２  、０．４  、０．８  、２．０  、４．０  μｇをそれぞれ上記条件でＨＰＬＣに供し、アレルギー性炎症抑制物質量とピーク面積との関係を調べた。このとき、０．２  〜２．０  μｇの範囲で直線関係があることがわかり、直線回帰計算により得られた直線を、アレルギー性炎症抑制物質検量線とした。
【００２５】
次いで、上記の分析用試料を同じ条件でＨＰＬＣに供し、得られたアレルギー性炎症抑制物質のピーク面積から、上記検量線によりアレルギー性炎症抑制物質の含有量を計算した。
【００２６】
培養時間とアレルギー性炎症抑制物質生産量との関係を表１に示す。
【００２７】
実施例２
５００ｍｌ容の坂口フラスコ２本において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 を０．０５ｇ、ＮＨ4 Ｃｌを０．０５ｇを含む）に酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、イーストエクストラクト）０．２重量％を添加して、それぞれ液体培地１２５ｍｌを調製した。ついで、これらの培地に、理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を接種し、振盪培養器（ＴＡＩＴＥＣ社製、Bio-Shaker BR-300L）を用いて、３０℃、１６０ｒｐｍで９６時間振盪培養（種培養）した。さらに、１０リットル容ジャーファーメンター（三ツワバイオシステム社製、KMJ-10C-FPMIII）において、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に対し、可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 を０．０５ｇ、ＮＨ4 Ｃｌを０．０５ｇを含む）に酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、イーストエクストラクト）０．２重量％を添加して、液体培地６リットルを調製した。この培地に、上記種培養液の４２ｍｌを接種し、３０℃、３８０ｒｐｍで６日間、通気攪拌しながら培養を行った。なお、通気量は２リットル／ｍｉｎとし、ｐＨは０．１ＮのＨＣｌおよびＮａＯＨを用いて６．５に保った。培養終了後、培養液を遠心分離（３０００Ｇ×１０ｍｉｎ）し、菌体を得た。この菌体にアセトンを２００ｍｌ添加し、３０分間ソニケーションをした。続いて、１０分間振盪後、遠心分離（３，０００Ｇ×１０ｍｉｎ）した。同操作を５回繰り返し、得たアセトン相を合わせてエバポレーターで濃縮乾固し、抽出物を得た。この抽出物を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣ分析によりアレルギー性炎症抑制物質含有量を測定した。培養時間とアレルギー性炎症抑制物質生産量との関係を表２に示す。
【００２８】
比較例１
実施例１において培養液の遠心分離により得られた上清について、これと等量の酢酸エチルを用いて３回抽出を行った。得た酢酸エチル相を合わせてエバポレーターで濃縮乾固し、抽出物を得た。この抽出物を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣ分析によりアレルギー性炎症抑制物質含有量を測定した。
【００２９】
その結果を実施例１の結果とともに表１に示す。
【００３０】
アレルギー性炎症抑制物質を有機溶剤で抽出する際、培養液の上清を有機溶剤で抽出した場合には、培養液１リットル当たり４５．１３μｇの抑制物質を得た。これに対し、同培養液の遠心分離により得られた菌体を有機溶剤で抽出した場合には、培養液１リットル当たり１０４．１３μｇの炎症抑制物質を得た。すなわち、菌体からの抽出により、約２．３倍のアレルギー性炎症抑制物質を得ることができた。
【００３１】
比較例２
実施例２において培養液の遠心分離により得られた上清について、これと等量の酢酸エチルを用いて３回抽出を行った。得た酢酸エチル相を合わせてエバポレーターで濃縮乾固し、抽出物を得た。この抽出物を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣ分析によりアレルギー性炎症抑制物質含有量を測定した。
【００３２】
その結果を実施例２の結果とともに表２に示す。
【００３３】
アレルギー性炎症抑制物質を有機溶剤で抽出する際、培養液の上清を有機溶剤で抽出した場合には、培養液１リットル当たり１０４．９μｇの抑制物質を得た。これに対し、同培養液の遠心分離により得られた菌体を有機溶剤で抽出した場合には、培養液１リットル当たり６５７．７μｇの炎症抑制物質を得た。すなわち、菌体からの抽出により、約６．３倍のアレルギー性炎症抑制物質を得ることができた。
【００３４】
【表１】
0003602567.tif 000002
【表２】
0003602567.tif 000003
試験例１  ＩＩＩ  型アレルギー反応に対する作用
ｉ）  ウサギ抗オボアルブミン  （ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）血清の調製
江田らの方法（日薬理誌、６６巻、２３７頁、１９７０年）に準じて、つぎの手法でウサギ抗オボアルブミン血清を調製した。すなわち、生理的食塩水に溶解したオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  社製）との等量混合乳化液よりなる抗原液を調製した。この抗原液の０．５ｍｌずつを体重約３ｋｇのニュージーランド産ホワイト種の雄性家兎の左右臀筋内に１週間毎に４回注射した。最終注射の７日後に頸動脈から採血し、血清のみを分離取得し、ウサギ抗オボアルブミン血清とした。この抗血清のラット４時間異種受身皮膚アナフィラキシー（４時間  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＣＡ）反応の力価は１：３２であった。
【００３５】
ｉｉ）    ラット４時間異種ＰＣＡ反応（  ＩＩＩ型アレルギー性皮膚反応）
に対する作用
実施例２で得られた菌体抽出物を、最終濃度が５０ｍｇ／ｍｌ（アレルギー性炎症抑制物質として０．２５ｍｇ／ｍｌ相当量）になるように、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加してなる溶液に懸濁した。こうして得られた懸濁液を供試液とした。被検動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００３６】
まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ（アレルギー性炎症抑制物質として０．５ｍｇ／ｍｌ）で腹腔内投与しておいた。
【００３７】
ついで供試液投与の１８〜２２時間後に、上記ウサギ抗オボアルブミン血清を生理的食塩水で４倍に希釈してなる注射液０．０５ｍｌを、上記ラットの背部皮内に注射し、ラットを上記抗血清で感作した。
【００３８】
つぎに、上記抗血清投与の４時間後に、対応する抗原として２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む０．５重量％エバンスブルー生理的食塩水を２．５ｍｌ／ｋｇ静脈内注射して、４時間異種ＰＣＡ反応を惹起した。
【００３９】
こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色素を、Ｈａｒａｄａらの方法（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２３巻、２１８頁、１９７１年）に従って抽出定量した。すなわち、抗原注射の１時間後に動物を屠殺し、４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚を細切し、これを０．３％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム水溶液３容とアセトン７容の混合液中に２４時間浸漬放置し、漏出色素を抽出した。こうして抽出した色素を６２０ｎｍで比色定量し、漏出色素量を求め、これをウサギ抗オボアルブミン血清を注射した部位（ｓｉｔｅ）当たりの漏出色素量（μｇ）として表わした。
【００４０】
比較のために、比較例２で得られた培養液上清抽出物を、最終濃度が５５ｍｇ／ｍｌ（アレルギー性炎症抑制物質として０．２５ｍｇ／ｍｌ相当量）になるように、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加してなる溶液に懸濁した。こうして得られた懸濁液を比較用供試液とし、その他の点は上記操作と同様に行って漏出色素量を求めた。
【００４１】
この試験のコントロールとして、上記抽出物含有液の代わりに、アレルギー性炎症抑制物質を含まない上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上記操作と同様に行って漏出色素量を求めた。
【００４２】
これらの試験は、それぞれ５匹のラットを用いて行い、漏出色素量（μｇ／ｓｉｔｅ）はこれらラットについて得られた値の平均値をとった。
【００４３】
なお、コントロールは上記それぞれの試験毎にコントロール試験を行った。
【００４４】
その結果、菌体抽出物を含有する供試液を投与した群は、培養液上清抽出物を含有する供試液を投与した群とともに、コントロール群にくらべ、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色素量が大幅に減少し、顕著なアレルギー性炎症抑制活性を示した。すなわち、菌体中に存在する物質においても、培養液中の物質と同様にアレルギー性炎症抑制活性を有することがわかった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、放線菌ストレプトマイセス・ノビリスの菌体を酢酸エチル、アセトン、メタノールまたはこれらの混合液で抽出処理することにより、アレルギー性炎症抑制物質を効率的に得ることができる。