(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）の菌体抽出物及び当該菌体の代謝産物からなる事を特徴とする界面活性剤。
【請求項２】
請求項１記載の界面活性剤を含有することを特徴とする保湿剤。
【請求項３】
請求項１記載の界面活性剤及び／または請求項２記載の保湿剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）をｎ−パラフィンを含む炭化水素以外の成分からなる培地で培養して得られた菌体抽出物及び当該菌体の代謝産物からなる事を特徴とする界面活性剤。
【請求項５】
請求項４記載の界面活性剤を含有することを特徴とする保湿剤。
【請求項６】
請求項４記載の界面活性剤及び／または請求項５記載の保湿剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物を利用した天然の界面活性を有する保湿剤であり、より詳しくは、主として糖類からなる物質により、優れた界面活性を有すると共に使用感が良く、肌をしっとりさせる界面活性剤及び保湿剤並びに外用剤に関する物である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、乳化技術の進歩は目覚ましい物があり、各方面でエマルジョンが広く利用されるようになった。従来の界面活性剤は▲１▼ポリオキシエチレン系、▲２▼脂肪酸系、▲３▼糖脂質等である。
【０００３】
現在よく使用される物としては、少量で高い界面活性力を有する合成のポリオキシエチレン系界面活性剤があるが、この様な合成の界面活性剤は自然界において微生物等による生分解が困難な為、環境中に長期間残留する。
【０００４】
それによって河川、海洋の富栄養化や泡立ちによる景観上の問題又、生態系に大きな影響を及ぼしている。その為、これらは近年問題となっている環境汚染に影響を与える物質の一つとなる。
【０００５】
一方、化粧品においても界面活性剤はローション、乳液、クリームなどの形で乳剤、軟膏剤等に使用されているが、これらの界面活性剤は直接皮膚に塗布されるので皮膚との親和性や使用感が重要な性質とされている。
【０００６】
しかし、従来の化粧品に配合される合成の界面活性剤は、界面活性力は強いが反面その強い界面活性力により細胞や皮膚組織へのダメージが大きく、皮膚刺激(溶血性、細胞毒性)等の問題を生じることがあった。
【０００７】
それに加え、合成の界面活性剤は防腐剤を強く取り込む作用がある為、しばしば防腐剤の不活化が生じる。その為、製品の微生物汚染を防ぐ目的で防腐剤の配合量が多くなり、それが又皮膚刺激を引き起こす要因となっていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】この様に、従来広く利用されている界面活性剤は、安全性面や環境面への配慮において不十分であった。そこで皮膚細胞に対して安全性が高く、環境に優しい界面活性物質が望まれていた。
【０００９】
よって、本発明の目的はシュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌が産生する界面活性物質を用いる事により安全性が高く、且つ、生分解性に優れ、環境に優しい物質を含有する事を特徴とする皮膚外用剤を提供することにある。
【００１０】
本物質は、微生物が産生する天然物である為、安全性が高く、且つ、強い界面活性作用を有する。
【００１１】
しかしながら、皮膚上で皮膚常在菌等の微生物により分解され易く、その為、塗布後いつまでも界面活性作用を示す事が無く、細胞毒性や溶血作用等、皮膚組織へのダメージが少ない。
【００１２】
よって、防腐剤の不活化を招く事も無く、皮膚刺激の２次要因であった防腐剤の添加量を多くする必要も無くなった。
【００１３】
更に、糖類を多く含む為、保湿性が高く、塗布時の使用感に優れた乳化物を提供する事が可能である。
【００１４】
又、環境汚染の面でも従来の界面活性剤と比較すると生分解性に優れ環境に適した物質である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】前記のような安全性の高い界面活性剤を有し、且つ、保湿性の高い物質を提供する為、微生物が産生する界面活性物質の研究を鋭意行った。その結果、シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌が産生する物質に強い界面活性物質及び保湿性を有する事を見いだし、本発明に至った。
【００１６】
シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌が産生する物質に強い界面活性物質の回収方法は特に限定しないが、その回収溶媒としては、エタノールやメタノール、アセトンなどの様な有機溶媒による沈殿法、もしくは、適当な濃度の、この２種以上を混合して得られる溶媒による沈殿法、又、硫安などの様な塩類による塩析、イオン交換体による吸着法、ポリエチレングリコールによる沈殿法、等電点沈殿法等を用いる事が出来る。
【００１７】
尚 、有機溶媒や塩類溶媒は例示した種類に限定されるものではない。
【００１８】
又、界面活性物質の回収方法は培養液からの回収だけに関わらず、菌体内から界面活性物質を、水、若しくは有機溶媒、及びその混合溶媒を用いた抽出によっても得られるものである。
【００１９】
次に、実際に、シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌より界面活性物質を産生する方法を述べる。
【００２０】
まず、この発明に利用できる微生物（以下「供試菌株」と言う）は、原則として「シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌に属する界面活性物質を産生し得る全ての菌株」を利用する事が出来る。
【００２１】
シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌株の中でも特に好ましい供試菌株としては、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）（IFO 12996）、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）（IFO 13696）、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）（IFO 12653）、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）（IFO 3738）が特に好適である。
【００２２】
前記各菌株の中、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）(IFO 12996) シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）(IFO13696) シュウドモナスプチダ（Pseudomonas putida）(IFO 12653) シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）(IFO 3738)はいずれも財団法人発酵研究所より分譲入手した菌株である。
【００２３】
この発明おいて利用する前記供試菌株は、シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌の菌株を培養する場合に使用できる公知の培地組成物及びその改変培地が利用できる。
【００２４】
尚、次にこの発明において利用できる基本的な培地組成を例示するが、これらの例示的培地組成に限定されないのは言うまでもない。
【００２５】
すなわち、炭素源、窒素源、無機塩、及び微量栄養素等々を含有する培地組成物が利用できる。
【００２６】
例えば、前記炭素源としては、グルコースその他の各種糖類の他、有機酸、脂肪族アルコール類からなる物質群より選択された１種又は２種以上の物質を利用することが出来る。
【００２７】
窒素源としては、硫安、硝酸ナトリウム、その他の無機の窒素含有化合物群、及びペプトン、蛋白質、各種アミノ酸、各種ペプチド、酵母エキスその他の有機物からなる物質群の中いずれか一方の化合物群・物質群又は、両方の化合物群・物質群より選択された１種又は２種以上の化合物群・物質群を利用する事が出来る。
【００２８】
更に、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウムその他の各種ナトリウム塩、塩化マグネシウムその他の各種マグネシウム塩、塩化カリウムその他の各種カリウム塩からなる１つの化合物群又は２つ以上の化合物群より選択された１種又は２種以上の無機化合物を利用することが出来る。
【００２９】
そして、微量栄養素としては、鉄分、各種ビタミン類からなる物質群より選択された１種又は２種以上の物質を利用することが出来る。
【００３０】
この発明にかかる供試料、つまりシュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌に属する界面活性物質を産生する菌体は、純粋に経代培養した当該菌株を前期培地組成を有する液体培地又は固体培地上で公知の方法により培養し、当該菌体を収集し生理食塩水で洗浄した後、凍結乾燥したものを「この発明にかかる界面活性剤及び保湿剤の供試料」として用いる事が出来る。
【００３１】
「この発明にかかる界面活性剤及び保湿剤の供試料」として、この凍結乾燥菌体を用いるのは、界面活性剤としての菌体の保存性を高める為であり、凍結乾燥菌体の外の使用態様としては培養後の菌体をそのまま利用することが出来るというのは言うまでもない。
【００３２】
【実施例】
［実施例１］    培養条件
一般的に液体培地を用いて初発菌体濃度(１白金耳/培地約100〜200ml・500ml容フラスコ、好ましくは約1×106/ml・500ml容坂口フラスコ、培養条件約25〜37℃、好ましくは約30℃、約1〜5日間、好ましくは約2〜3日間)好気条件下において液体培養する方法による事が出来る。
【００３３】
尚、液体培養工程において指数関数的増殖期の後期又は、定常状態に入った直後の菌体を種菌として使用するのが最適である。
【００３４】
又、本培養の際には種菌を３〜10ml/100ml添加し２〜３日間培養するのが最適である。
【００３５】
［実施例 2］    培養培地
グリシンベタイン  1%,KH2PO4 0.6%,K2HPO4 0.6%,MgSO4 0.01%,yeast extract0.025%,ピルビン酸 0.025%,FeSO4 0.003%からなる基本培地を坂口フラスコ（500ml容)に100mlずつ分注し、pH7.0に調整後、オートクレーブ（121℃,15min)で殺菌し、27℃で48hr培養した。又、培養条件はpH4〜9,好ましくは６〜８，温度は20〜40℃,好ましくは25〜35℃である。
【００３６】
使用菌株においてはシュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌（IFO No.12996,13696,12653,3904）を使用した土壌中より分離した前記４種以外のシュウドモナス属プチダ（Pseudomonas
putida）菌においても可能であり、シュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌であれば、これに限るものではない。
【００３７】
［実施例 3］ 菌体量と界面活性物質量の測定
菌体量は培養液の濁度を吸光度660nmにて測定することによって求めた。培養液中の界面活性物質の産生量は培養液から菌体を遠心分離(7000rpm,10min)で除去した後、その上清100mlにエタノール１00mlを添加(最終溶液中のエタノール濃度 50%)し得られた沈殿物、更にエタノール１00ml添加(最終溶液中のエタノール濃度 66%)し得られた沈殿物を凍結乾燥にかけ、その重量によって求めた。
【００３８】
［実施例 4］
次に、界面活性作用を調べる為に様々な油を用いた乳化能の測定をおこなった。
【００３９】
方法
上記培養液から得られた沈殿物の濃度1%サンフ゜ル水溶液にそれぞれ、メチルフェニルポリシロキサン（以下シリコンKF-56と言う)、スクワラン、オクタン酸セチル（以下テルコールNo.4と言う)、リンゴ酸ジイソステアリル（以下、コスモール222と言う)、ヒマシ油等に代表される油類を10％加え超音波破砕機（KUBOTA INSONATOR  MODEL 200M)にて乳化させる。乳化時間は200Wで１分間行った。
【００４０】
乳化後30分間放置させ、各濃度に希釈したサンプルを分光光度計にてOD660nmの濁度によって測定し、乳化状態を判定しその結果を［表１］［表２］に示す。
【表１】
0003539780.tif 000002
【表２】
0003539780.tif 000003
［結果］
［実施例 3］に記載した方法に準じて処理した物を試験試料として［実施例 4］に記載した方法に準じて各油に対する乳化能試験を行った。
【００４１】
［表１］［表２］は全て精製水にて1/200希釈したOD660nmの測定値である。
【００４２】
サンプルの乳化能は代表的な非イオン界面活性剤であるポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(以下tween 80と言う)と比較すると全体的に、いずれの油においても大差は見られず、特にシリコンKF-56乳化における濁度はTween 80によるシリコンKF-56乳化とほぼ同等の、良好なエマルジョンを形成している。
【００４３】
又、テルコールNo.4、コスモール222、ヒマシ油、においては、乳化直後ではtween 80より勝っており、安定性に関してもシリコンKF-56乳化においては室温にて1週間は比較的、濁度変化は見られず安定であり高い乳化活性が認められた。
【００４４】
次に、本発明の界面活性物質を含有する化粧料の処方例を示す。本発明に配合する本発明の界面活性物質の配合量は、特に限定しないが通常0.01〜10.00重量％(以下Wt%と記載する）が用いられる。製品の乳化安定性や肌への効果を考慮すると、0.5〜5.0Wt%が望ましい。この処方例により本発明の皮膚組成物が何らの制限を受けるものではない。
【００４５】
0003539780.tif 000004
製法：水相の成分を混合し、加熱して70℃に保ち水相部とする。一方、他の成分を混合し、加熱溶解して70℃に保ち油相部とする。この油相部を前述の水相部に加えて乳化を行い、30℃まで冷却して製品のクリームを得る。
【００４６】
0003539780.tif 000005
製法：水相の成分を混合し、加熱して70℃に保ち水相部とする。一方、他の成分を混合し、加熱溶解して70℃に保ち油相部とする。この油相部を前の水相部に加えて乳化を行い、30℃まで冷却して製品の乳液を得る。
【００４７】
［実施例 5］
本発明の効果を明らかにするため、人による使用試験を行った。
【００４８】
処方例 １,２に示したクリーム、乳液と、そこから本発明品を除き、代替品として  tween 80を添加したクリーム、乳液を、顔面半顔ずつに通常通りの使用方法で10名のパネラーに１ヶ月間連続塗布し、その後肌の潤い、水々しさ、滑らかさ、艶のそれぞれを、“ほとんどない”の１点から“非常にある”の５点までの５段階評価で表した。［表４］,［表５］に処方例１、２の結果を示した。
【００４９】
表中の数値は、［表３］の評価基準に基ずいて評価した10名のハ゜ネラーの平均点である。［表４］［表５］の結果より本発明品の界面活性物質を含有した化粧料は、対照品と比べて優れた整肌効果が認められた。
【００５０】
【表３】
0003539780.tif 000006
【００５１】
【表４】
0003539780.tif 000007
【００５２】
【表５】
0003539780.tif 000008
【００５３】
【発明の効果】本発明のシュウドモナス属プチダ（Pseudomonas putida）菌が産生する界面活性剤は、各種油類を乳化する作用が強く且つ、生分解性に優れている。よって、これを皮膚外用剤に使用することによりフィーリングが良く且つ、安全性にも優れた整肌効果の高い製品を提供することが可能になる物である。