【手続補正書】
【提出日】平成29年3月2日(2017.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃ融合ポリペプチドと、
ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメインポリペプチドと、
によって、１つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間間隔で前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、かつ、前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間、前記細胞に連続的に供給され、
前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも２４時間間隔で前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生し、かつ前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したＭｙｃポリペプチドを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも７２時間間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドの前記Ｍｙｃポリペプチドが、ｎ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ、又はｓ−Ｍｙｃのうち１つ又はそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ又はそれ以上のＢｃｌ−２ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１のうち１つ又はそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又はそれ以上のＢｃｌ−２ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂｃｌ−２ポリペプチドが、Ｔａｔ、ＥＰＴＤ、及びｖｐｒからなる群から選択されるタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質形質導入ドメインがｖｐｒである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ３、ＩＬ６、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞が、約２８日間かけて約２７０倍、約１４日間かけて約１５０倍、約２１日間かけて１００倍、又は約９〜１４日間かけて約８５倍のうち、１つ又はそれ以上に増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞が、１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
８時間にわたって１μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃ融合ポリペプチドが供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも９６時間間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも９６時間間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給された４８時間後に前記細胞において検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも４８時間間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃ融合ポリペプチドであって、約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給されるＭｙｃ融合ポリペプチドと、
ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメインポリペプチドであって、約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給されるＢｃｌ−２ドメインポリペプチドと、
によって、１つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間間隔で前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、
前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも２４時間間隔で前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生し、かつ前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したＭｙｃポリペプチドを含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも４８時間間隔で供給される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドが、少なくとも７２時間間隔で供給される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ又はそれ以上のＢｃｌ−２ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｂｃｌ−２ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｍｙｃポリペプチドがｃ−Ｍｙｃであり、かつ前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ又はそれ以上の成体幹細胞が、１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意のベクター又は核酸を含む細胞が提供される。
[本発明1001]
ａ）細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃポリペプチドと、
ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−2ドメインポリペプチドと、によって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約96時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する、方法。
[本発明1002]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記Ｍｙｃポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、ｎ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ、又はｓ−Ｍｙｃのうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、約1μｇ／ｍＬ〜約50μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、約5μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、約1μｇ／ｍＬ〜約50μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、約10μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、ＢＨ1、ＢＨ2、ＢＨ3、及びＢＨ4を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記1つ又はそれ以上のＢｃｌ−2ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−2、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−1のうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記1つ又はそれ以上のＢｃｌ−2ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−2である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記Ｍｙｃポリペプチド又は前記Ｂｃｌ−2ポリペプチドのうち1つ又はそれ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記タンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記タンパク質形質導入ドメインがｖｐｒである、本発明1017の方法。
[本発明1021]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びＦｌｔ3−Ｌを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ3−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記成体造血幹細胞が、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とする、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、又は脂肪組織のうち、1つ又はそれ以上から単離される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が非ヒト動物細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
Ｖ5ドメインと、
6ヒスチジンエピトープタグと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1032]
約60分間より長い半減期を有する、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1033]
約48時間の半減期を有する、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1034]
約72時間まで検出可能である、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1035]
約48時間まで検出可能である、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1036]
細胞の核内に輸送可能である、本発明1031〜1034のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1037]
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1038]
タンパク質形質導入ドメインがＶｐｒである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1039]
タンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1040]
ａ）Ｍｙｃポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、
ｂ）Ｖ5ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、及び
ｃ）6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1041]
ａ）タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、
ｂ）Ｖ5ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及び、
ｃ）6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1042]
ＩＬ3と、ＩＬ6と、幹細胞因子と、トロンボポエチンと、Ｆｌｔ3−Ｌと、ＧＭ−ＣＳＦと、を含む、幹細胞増殖培地。
[本発明1043]
基本培地を更に含む、本発明1042の幹細胞増殖培地。
[本発明1044]
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドを更に含む、本発明1043の幹細胞増殖培地。
[本発明1045]
アポトーシスを阻害するＢｃｌ−2ドメインポリペプチドを更に含む、本発明1041〜1044のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1046]
前記基本培地が、ＳｔｅｍＳｐａｎ、Ｉｓｃｏ培地、ＲＰＭＩ、又はＤＭＥＭのうち、1つ又はそれ以上である、本発明1041〜1045のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1047]
ａ）タンパク質形質導入ドメインと、
ｂ）細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質であって、約60分間より長い半減期を有する、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1048]
本発明1031〜1041、及び1047のいずれかのタンパク質をコードする核酸。
[本発明1049]
本発明1048の核酸を含むベクター。
[本発明1050]
本発明1049のベクターを含む細胞。
[本発明1051]
8時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1052]
16時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1053]
24時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、本発明1001の方法。
[本発明1055]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
短いペプチドドメインと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1056]
前記短いペプチドドメインが、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、ＳｔｒｅｐＩＩ、又はＨＰＣのうち少なくとも1つから選択される、本発明1055のＭｙｃ融合。
[本発明1057]
ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ3−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む幹細胞増殖培地と、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
アポトーシスを阻害するＢｃｌ−2ドメインポリペプチドと、
を含む、ガス透過性容器。
[本発明1058]
前記容器がバッグ又はフラスコである、本発明1057のガス透過性容器。