(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式
【化１】
0003554707.tif 000013
（式中Ｒは、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基またはイソブチル基を意味する。）で示されるデプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１記載のデプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３】
抗腫瘍剤である請求項２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒト癌細胞に対する細胞傷害活性及びＴＧＦ−β様作用を有し、医薬、特に抗腫瘍剤として有用な新規化合物またはその製薬学的に許容される塩、及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物代謝産物由来の化合物であるマイトマイシンＣ、ブレオマイシン、又はアドリアマイシンなどがヒト癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことが知られており、これらの化合物は従来抗腫瘍剤として臨床で使用されている。また、デプシペプチド化合物が抗腫瘍物質として開示されている（欧州公開特許公報第３５２６４６号）。
現在においても、従来にない化学構造、新規骨格を有する抗腫瘍剤の創製が検討されている。
【０００３】
一方、ＴＧＦ−βは細胞の増殖を促進しかつ形質転換を促進する因子として着目され、その機能解明に向けて研究が始まったが、現在では、ＴＧＦ−βは各種動物細胞の生育阻害化合物として作用することが判明している （Ｃｅｌｌ， 第６３巻： ２４５−２４７頁， １９９０年）。さらに、腫瘍細胞との関連についても多数報告されている（Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ．， 第２９６巻： １６２１−１６２４頁， １９８８年、 Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， 第６１巻： ６１２−６１７頁， １９９０年、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， 第６９巻： １００６−１００９頁， １９９４年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， 第１７２巻： １−１１頁， １９９７年、Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒｓ．， 第７巻： ２０７−２１３頁， １９９２年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， 第２７２巻： ３９６７−３９７２頁， １９９７年、Ｎａｔｕｒｅ， 第３６０巻： ３６１−３６４頁， １９９２年）。また、ＴＧＦ−β受容体は、種々の腫瘍において腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）として作用すると報告されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， 第６５巻： ９７−１０４頁， １９９７年）。従って、ＴＧＦ−β様作用を有する化合物は、当該作用に関連した疾患の治療剤、例えば抗腫瘍剤となる可能性がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はヒト癌細胞に対する細胞傷害活性及びＴＧＦ−β様作用を有し、抗腫瘍剤として有用な新規化合物及びそれを含有する医薬の提供を目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、天然に存在する多くの微生物が産生する化合物につき、鋭意検討した結果、シュードモナス属に属する新種の微生物で、優れたヒト癌細胞に対する細胞傷害活性及びＴＧＦ−β様作用を有する化合物を産生する能力を有する微生物を見いだした。さらに本発明者等は該微生物を培養し、該培養物から上述の公知デプシペプチド化合物（欧州公開特許公報第３５２６４６号）と比し、下記化学構造上３位に水酸基を、４位にＲ基（イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基またはイソブチル基の何れかから選択された基）、８位にメチル基を有する点で全く構造を異にする新規なデプシペプチド化合物を単離することに成功し本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、▲１▼下記一般式
【０００７】
【化２】
0003554707.tif 000002
【０００８】
（式中Ｒは、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基またはイソブチル基を意味する。）で示されるデプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩に関する。
更に本発明は上記デプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、好ましくは抗腫瘍剤である該医薬組成物に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき詳述する。 本発明デプシペプチド化合物またはその製薬学的に許容される塩はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する当該化合物生産菌を栄養培地にて培養し、当該化合物を蓄積させた培養物から常法によって得られる。当該化合物の製造方法において使用する微生物は、シュードモナス属に属し当該化合物の生産能を有する微生物であればいずれも用いることができる。このような微生物としては、例えば、長野県北佐久郡望月町で採集された土壌より分離されたシュードモナス属に属する細菌シュードモナス  エスピー （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ７１５７６株を挙げることができる。本菌株の菌学的性状は次の通りである。
【００１０】
１）形態的性質
本菌株は、グラム陰性の桿菌であり、極鞭毛により運動性を有する。細胞の大きさは０．７〜０．９μｍ×１．０〜１．４μｍである。胞子の形成は認められない。
【００１１】
２）培養的性質
肉汁寒天培地上で、薄茶色のコロニーを形成する。コロニーは円形で表面はスムースである。肉汁液体培養では、培地表面に皮膜を形成し、培地全体が混濁した。肉汁ゼラチン穿刺培養では、ゼラチンを液化した。リトマスミルクでの培養では，１週間培養後、凝固およびペプトン化は認められなかった。
【００１２】
３）生理学的性質
【００１３】
【表１】
0003554707.tif 000003
【００１４】
【表２】
0003554707.tif 000004
【００１５】
【表３】
0003554707.tif 000005
【００１６】
以上の微生物学的性質をまとめると，本菌株はグラム陰性好気性の桿菌で運動性を有する。生育温度範囲は３〜３２℃で，オキシダーゼ試験，カタラーゼ試験，ゼラチンの液化反応，クエン酸の利用性、無機窒素源の利用性、アルギニン分解反応が陽性であり、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ―グルコース、Ｄ―マンノースより酸を産生し、ＯＦテストの結果は酸化型である。一方，硫化水素の生成，インドールの生成，ＶＰ試験、硝酸塩の還元、脱窒反応の結果は陰性である。
【００１７】
上に記した性質に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジィ （Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９８９）及びその他の文献によって検索した結果，本菌株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌であると判断し，シュードモナス  エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｑ７１５７６と命名した。
【００１８】
なお、本菌株はシュードモナス  エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）  Ｑ７１５７６として工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６））に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４４号（寄託日１９９９年１月８日）として国際寄託されている。また、微生物は人工的に又は自然に変異を起こしやすいので、本発明において用いられるシュードモナス  エスピー （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） Ｑ７１５７６株は、天然から分離された微生物の他に、これに紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。
【００１９】
（製造方法）
本発明化合物はシュードモナス属 に属し、本発明化合物生産能を有する微生物を培養することによって得られる。培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
【００２０】
培養に用いられる培地としては、 シュードモナス  エスピー  Ｑ７１５７６株が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としてはＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクトース、トレハロース、キサンチン、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進化合物または消泡剤を添加することもできる。
【００２１】
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は３〜３２℃（上記生理学的性質の記載参照）の範囲、好ましくは２０〜２５℃付近で行われる。培地のｐＨは約４．５〜９、好ましくは約５〜７．５の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜７日程度、好ましくは２〜４日程度である。
【００２２】
培養物より目的とする本発明化合物を単離するには、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精製の手段が適宣利用できる。例えば培養化合物中の該化合物は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エチル等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養液を適宜の担体に接触させ、濾液中の生産化合物を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該化合物を抽出することができる。例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＣＨＰ−２０、又はダイヤイオンＳＰ−９００のような多孔性吸着樹脂に接触させて該化合物を吸着させる。次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル又はクロロホルム等の有機溶媒を単独若しくは混合した溶媒を、又は当該溶媒と水の混合液を用いて該化合物を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで上げていくことにより、該化合物の含まれる比率のより高い画分を得ることができる。酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれらの溶媒を加え、良く振盪し、該化合物を抽出する。次に、上記の各操作法を用いて得た該化合物含有画分は、シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の定法により、さらに純粋に分離精製することができる。
【００２３】
一方、ＴＧＦ−β様作用を指標として、適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性化合物の製造に用いられる手段によって、分離、精製することもできる。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。
【００２４】
本発明デプシペプチド化合物の製薬学的に許容される塩は、無機若しくは有機塩基との塩であり，製薬学的に許容しうる塩が好ましい。これらの塩としては，具体的にはナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウムなど無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，エタノールアミンなどの有機塩基，リジン，オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩等を挙げることができる。
【００２５】
また、本発明化合物は不斉炭素原子及び二重結合を有するので、これに基づく立体異性体（ラセミ体、光学異性体、ジアステレオマー等）及び幾何異性体（シス体又はトランス体）が存在する。従って本発明化合物は、これらの立体異性体又は幾何異性体の混合物もしくは単離されたものを包含する。
【００２６】
さらに、本発明は、当該化合物の水和物または各種溶媒和物を、又は当該化合物の結晶多型も包含する。
【００２７】
以下に本発明化合物の製剤化法、投与方法を詳述する。
本発明デプシペプチド化合物やその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は，通常用いられている製剤用の担体や賦形剤，その他の添加剤を用いて，錠剤，散剤，細粒剤，顆粒剤，カプセル剤，丸剤，液剤，注射剤，坐剤，軟膏，貼付剤等に調製され，経口的又は非経口的に投与される。
【００２８】
本発明化合物のヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状，体重，年令や性別等を考慮して適宜決定される。
【００２９】
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つ又はそれ以上の活性化合物が，少なくとも一つの不活性な希釈剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は，常法に従って，不活性な希釈剤以外の添加剤，例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤，ラクトースのような安定化剤，溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖，ゼラチン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣または胃溶性あるいは腸溶性化合物のフィルムで被膜してもよい。
【００３０】
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳濁剤，溶液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な希釈剤，例えば精製水，エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に溶解補助剤，湿潤剤，懸濁剤のような補助剤，甘味剤，風味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
【００３１】
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の溶液剤，懸濁剤，乳濁剤を包含する。水性の溶液剤，懸濁剤の希釈剤としては，例えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤，懸濁剤の希釈剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エチルアルコールのようなアルコール類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は，さらに等張化剤，防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤（例えば，ラクトース），溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらは又無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
【００３２】
本発明化合物の溶解性が低い場合には，可溶化処理を施してもよい。可溶化処理としては，医薬製剤に適用できる公知の方法，例えば界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類，ポリオキシエチレンソルビタン高級脂肪酸エステル類，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類，ショ糖脂肪酸エステル類等）を添加する方法，薬物と可溶化剤例えば高分子（ハイドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の水溶性高分子，カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ），ハイドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），メタアクリル酸メチル−メタアクリル酸共重合体（オイドラギットＬ，Ｓ，商品名；ローム・アンド・ハース社製）等の腸溶性高分子）との固体分散体を形成する方法が挙げられる。更に必要により，可溶性の塩にする方法，サイクロデキストリン等を用いて包接化合物を形成させる方法等も採用できる。可溶化の手段は，目的とする薬物に応じて適宜変更できる［「最近の製剤技術とその応用Ｉ」，内海勇ら，医薬ジャーナル１５７−１５９（１９８３）及び「薬学モノグラフＮｏ．１，生物学的利用能」，永井恒司ら，ソフトサイエンス社，７８−８２］（１９８８）参照］。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例にて具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
グルコース１０ｇ、ポテトスターチ２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、炭酸カルシウム４ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを、５００ｍＬ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。ベネット寒天培地に良く生育させたシュードモナス  エスピーＱ７１５７６株を掻き取って接種し、２８℃、２００回転／分の条件で３日間振盪培養し、種培養液とした。次にグリセロール３０ｇ、グルコース１ｇ、ポリペプトン５ｇ、肉エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、消泡剤（ＮＫＬ５４３０）０．５ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地（ｐＨ７．０）を１００ｍＬずつ５００ｍＬ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。この培地に前記種培養液を２ｍＬずつ接種し、２８℃、２００回転／分の条件で３日間、振盪培養した。
【００３５】
このようにして培養した培養液２．５Ｌについて、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清液を酢酸エチルにて抽出し、硫酸ナトリウムを添加して脱水した後、減圧下で濃縮乾固した。油状の粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （３０ ｉ．ｄ．×２００ ｍｍ） に供し、クロロホルム−メタノール（２０：１）で洗浄後、クロロホルム−メタノール（５：１）で溶出し、活性画分を濃縮した。次に、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー （２０ ｉ．ｄ．×５００ ｍｍ） に供し、クロロホルム−メタノール（１：１）でゲル濾過を行った。活性画分を濃縮後、ＣＰＣ （ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ） に供し、クロロホルム−メタノール−水（５：６：４）の溶媒系にて上昇法を用いて不純物を除去した。最終的に活性画分を濃縮乾固した後、メタノールに溶解し、センシュー科学社製  ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳカラム （２０ ｉ．ｄ．×２５０ ｍｍ） を用い、３５％アセトニトリル水溶液にて逆相ＨＰＬＣ（流速１０ｍＬ／分）を行った。その結果、化合物Ａは１０．８分に、化合物Ｂは１５．４分にピークが認められ、それぞれのピークを分取することにより化合物Ａ及びＢの白色粉末を各１０ｍｇ得た。
【００３６】
実施例２
グルコース１０ｇ、ポテトスターチ２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、炭酸カルシウム４ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地（ｐＨ７．０）を１００ｍＬずつ５００ｍＬ容の付き三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。ベネット寒天培地に良く生育させたシュードモナス  エスピー Ｑ７１５７６株を掻き取って接種し、２８℃、２００回転／分の条件で３日間振盪培養した。同培地４００ｍＬを２Ｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した後、前記培養液８ｍＬを植菌し、２８℃、２００回転／分の条件で３日間振盪培養し、種培養液とした。次にマンニトール３０ｇ、ポリペプトン５ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水道水１Ｌを含む培地（ｐＨ７．０）を１８Ｌずつ３０Ｌ容ジャーファーメンター３基に分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。この培地に前記種培養液を３６０ｍＬずつ接種し、２４℃、１５０回転／分、１ｖｖｍで６４時間培養を行った。
【００３７】
シャープレスにて菌体と分離した培養液５０ ＬをＨＰ−２０を充填したカラムに供し、水、２０％アセトン水溶液、４０％メタノール水溶液で洗浄後、８０％アセトン水溶液で溶出した。溶出画分を濃縮して得られた水溶液についてクロロホルム、酢酸エチルで抽出を行い、各抽出物を混合して濃縮後、シリカゲルを充填したカラムに供した。クロロホルム−メタノール（５０：１）、（２０：１）、（１０：１）で溶出し、クロロホルム−メタノール（２０：１）および（１０：１）溶出画分の一部を混合して濃縮後、エタノールに溶解して再結晶を行い、化合物Ａ，Ｂ及びＣを含む混合物として、白色粉末７７６ｍｇを得た。得られた粉末について、ＯＤＳ−ＨＰＬＣカラム（ｃｏｓｍｏｓｉｌ ＡＲ−ＩＩ ２０ ｉ．ｄ．×２５０ ｍｍ）による化合物Ｃ溶出画分の分取を行い、化合物Ｃの白色粉末として２０ ｍｇを得た。
【００３８】
本発明化合物の物理化学的性状
上記の手法で抽出、精製及び単離した化合物Ａ、Ｂ及びＣは、下記の物理化学的性状を示した。
【００３９】
【表４】
0003554707.tif 000006
【００４０】
化合物Ａ，Ｂ及びＣの１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト値（重クロロホルム中）をそれぞれ以下に示す。
【００４１】
【表５】
0003554707.tif 000007
【００４２】
【表６】
0003554707.tif 000008
【００４３】
【表７】
0003554707.tif 000009
【００４４】
上記の物理化学的性状から化合物Ａ、Ｂ及びＣの化学構造式を下記の如く決定した。
【００４５】
【化３】
化合物Ａ
0003554707.tif 000010
【００４６】
【化４】
化合物Ｂ
0003554707.tif 000011
【００４７】
【化５】
化合物Ｃ
0003554707.tif 000012
【００４８】
【発明の効果】
本発明化合物は、ヒト癌細胞に対する細胞障害活性及びＴＧＦ−β様作用を有するので、抗腫瘍剤、例えば大腸癌、肺癌、前立腺癌又は子宮頸癌等に対する薬剤等として有用である。
本発明化合物のヒト癌細胞に対する細胞傷害活性およびＴＧＦ−β様作用を以下の方法で確認した。
【００４９】
ヒト癌細胞に対する細胞傷害活性測定法（１）
９６穴テストプレート中に、６×１０４個／ｍＬに調製したＨｅＬａ Ｓ３細胞を２００μＬ、種々の濃度の化合物Ａ及び化合物Ｂを４μＬ加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、３日間培養した。培養後、細胞増殖度をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ製）を用いて測定し、各濃度における増殖抑制率を求め、ＩＣ５０値を算出した。その結果、化合物Ａ及び化合物ＢはＨｅＬａ Ｓ３細胞に対し、それぞれＩＣ５０値１．６μＭ、１．２μＭの値で細胞傷害活性を示した。
【００５０】
ヒト癌細胞に対する細胞傷害活性測定法（２）
９６穴テストプレート中に、６×１０４個／ｍＬに調製したヒト大腸癌ＷｉＤｒ細胞、４×１０４個／ｍＬに調製したヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞、又は６×１０４個／ｍＬに調製したヒト前立腺癌ＤＵ−１４５細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。２４時間後、種々の濃度の化合物Ａ、化合物Ｂ又は化合物Ｃを１００μＬ加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でさらに７２時間培養した。培養後、スルフォローダミンＢで細胞数を定量し、細胞増殖に対する各化合物のＩＣ５０値を算出した。その結果、化合物Ａ，Ｂ及びＣはＷｉＤｒ細胞、Ａ５４９細胞、又はＤＵ−１４５細胞に対し、それぞれの細胞種で優れた細胞増殖抑制活性を示した。細胞種により異なるが、例えばＡ５４９細胞に対しＩＣ５０値は５．０ｎＭ以下の活性を示した。
【００５１】
ＴＧＦ−β様作用測定法
ＴＧＦ−β様活性を検出するため、レポーター遺伝子発現を利用したスクリーニング系を構築した。ＴＧＦ−β受容体を過剰に発現し、ＴＧＦ−βによりプラスミノーゲン活性化因子−１（ＰＡＩ−１）の発現が引き起こされるミンク肺上皮細胞（Ｍｖ１Ｌｕ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２６２巻： １７４６７−１７４７４頁， １９８７年） にＰＡＩ−１プロモーター遺伝子の下流に組み込んだ蛍のルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクションした （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２１６巻： ２７６−２８４頁， １９９４年）。
上記細胞を用いて、化合物を添加したときに得られる蛍光度をＴＧＦ−β様活性の指標にした。その結果、ＴＧＦ−βはＰＡＩ−１プロモーター遺伝子の下流に組み込んだ蛍のルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導による蛍光度を増加させた。同様に、化合物Ａは２６ｎＭ〜１００μＭの濃度で、化合物Ｂは１２ｎＭ〜１００μＭの濃度で蛍光度を増加させた。