【手続補正書】
【提出日】平成29年9月8日(2017.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元DNA構造における1つ以上の目的領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、
(a)架橋されたDNAのサンプルを提供するステップ、
(b)該架橋されたDNAを第1の制限酵素で消化するステップ、
(c)架橋されたヌクレオチド配列をライゲートするステップ、
(d)架橋を解消するステップ、
(e)(d)に由来するライゲートされた分子を断片化するステップ、
(f)ステップ(c)において別のヌクレオチド配列にライゲートされたヌクレオチド配列の末端について富化するために、(e)に由来する断片を、第1の制限酵素の切断部位に隣接する配列を表す1つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブが、マイクロアレイ上にスポットされるか若しくはビーズ上に捕捉されるか、又は溶液中に存在し、後にビーズ上に捕捉される、ステップ、及び
(g)相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、富化された断片のヌクレオチド配列を分析するステップであって、場合により、ステップ(g)が、富化されたヌクレオチド配列断片のハイスループット配列決定を含み、及び/又は、場合により、ステップ(g)の後に、バイオインフォマティクス分析、及び相互作用の可視化が続く、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
三次元クロマチン構造における1つ以上の目的ゲノム領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第1の制限酵素が、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素であり、場合により、第1の制限酵素が、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstI及びNdeIからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、
(i)第2の制限酵素による消化によって断片化され、場合により、第2の制限酵素が、4又は5bpのヌクレオチド配列認識部位を認識し、さらに場合により、第2の制限酵素が、TspEI、MaeII、AluI、NlaIII、HpaII、FnuDII、MaeI、DpnI、MboI、HhaI、HaeIII、RsaI、TaqI、CviRI、MseI、Sth132I、AciI、DpnII、Sau3AI及びMnlIからなる群から選択され、又は
(ii)せん断などの機械的手段によって断片化され、又は
(iii)2bpヌクレオチド配列認識部位を認識する制限酵素若しくは制限酵素の組み合わせを使用して、又は一般的ヌクレアーゼによる限定的消化を使用して断片化され、又は
(iv)放射線又は重イオンを用いて断片化される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(e)の後、断片化された分子のDNA末端が修復され、及び/又は、ステップ(e)の後、アダプターが配列決定目的のためにライゲートされ、場合により、アダプターがアドレス配列を含み、さらに場合により、多重化の場合に異なるサンプルの識別を可能にするために、異なるサンプルにおいて複数のアドレス配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドが使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位に隣接する配列を認識し、場合により、オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位の100bp以内の配列を認識する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ(f)において、ヌクレオチド配列断片が、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブのセットにハイブリダイズされ、この複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、目的ゲノム領域に由来するヌクレオチド配列上の第1の制限酵素の消化部位に隣接する配列にハイブリダイズし、
場合により、オリゴヌクレオチドプローブのセットが、第1の制限酵素を用いて目的ゲノム領域を処理することによって得ることができる実質的に全ての制限断片に特異的なプローブを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
三次元構造における特定の遺伝的要素の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、遺伝的要素との相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、ステップ(g)において、特定の遺伝的要素を含む富化されたヌクレオチド配列断片の配列のみが分析される、方法。
【請求項９】
遺伝子の発現状態を決定する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び遺伝子を含む目的領域における相互作用の数、種類又は密度を分析するステップを含む、方法。
【請求項１０】
2つのサンプル間の遺伝子の活性を比較する方法であって、両サンプルについて請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び目的領域における相互作用の数、種類又は密度を比較するステップを含む、方法。
【請求項１１】
特定の疾患状態を示す1つ以上のDNA-DNA相互作用を同定する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)において、架橋されたDNAのサンプルが罹患細胞及び非罹患細胞から提供され、罹患細胞及び非罹患細胞に由来するDNA配列間の三次元クロマチン構造におけるヌクレオチド配列の相互作用間の差異は、DNA-DNA相互作用又はDNA-DNA相互作用のパターンが特定の疾患状態を示すものであることを示す、方法。
【請求項１２】
DNA-DNA相互作用の変化によって引き起こされるか又はそれに関連する、疾患又は症候群の診断又は予後診断の方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)は、被験体に由来する架橋されたDNAのサンプルを提供することを含み、ステップ(f)は、DNA配列間の相互作用を、影響を受けていない対照のものと比較することを含み、対照と被験体の間の差異が、被験体が疾患若しくは症候群に罹患していることを示すか、又は被験体が疾患若しくは症候群に罹患するであろうことを示す、方法。
【請求項１３】
DNAの三次元構造をモジュレートする1つ以上の薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、
(a)サンプルを1つ以上の薬剤と接触させるステップ、及び
(b)請求項１〜７のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップであって、ステップ(a)が、サンプルに由来する架橋されたDNAを提供することを含む、ステップ、
を含み、(i)薬剤の存在下でのDNA相互作用と(ii)薬剤の非存在下でのDNA相互作用の間の差異が、DNAの三次元構造をモジュレートする薬剤を示す、方法。
【請求項１４】
目視検査により10kbpより小さい分解能でゲノムの3D構造を同定するための、又は、
目視検査により10kbpより小さい分解能でクロマチン繊維コンホメーションを同定及び決定するための、又は、
目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のサブ染色体ドメイン構造を同定するための、又は、
目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、又は、
モンテ-カルロ(Monte-Carlo)及びブラウン動力学(Brownian-Dynamics)シミュレーションと比較した場合、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、又は、
相互作用間の遺伝的距離に応じて、及びモンテ-カルロ及びブラウン動力学シミュレーションからのスケーリング挙動、及びDNA自体における長距離相関のスケーリングと比較して、相互作用の頻度のスケーリング挙動から、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
上記明細書で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書中に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの種々の改変及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、分子生物学又は関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
本発明はまた以下に関する。
[項目１]
三次元DNA構造における1つ以上の目的領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、
(a)架橋されたDNAのサンプルを提供するステップ、
(b)該架橋されたDNAを第1の制限酵素で消化するステップ、
(c)架橋されたヌクレオチド配列をライゲートするステップ、
(d)架橋を解消する(reverse)ステップ、
(e)(d)に由来するライゲートされた分子を断片化するステップ、
(f)ステップ(c)において別のヌクレオチド配列にライゲートされたヌクレオチド配列の末端について富化するために、(e)に由来する断片を、第1の制限酵素の切断部位に隣接する配列を表す1つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ、及び
(g)相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、富化された断片のヌクレオチド配列を分析するステップ、
を含む、方法。
[項目２]
三次元クロマチン構造における1つ以上の目的ゲノム領域に由来する1つ以上のヌクレオチド配列の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析するための、項目１に記載の方法。
[項目３]
第1の制限酵素が、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素である、項目１又は２に記載の方法。
[項目４]
第1の制限酵素が、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstI及びNdeIからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
[項目５]
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、第2の制限酵素による消化によって断片化される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
[項目６]
第2の制限酵素が、4又は5bpのヌクレオチド配列認識部位を認識する、項目５に記載の方法。
[項目７]
第2の制限酵素が、TspEI、MaeII、AluI、NlaIII、HpaII、FnuDII、MaeI、DpnI、MboI、HhaI、HaeIII、RsaI、TaqI、CviRI、MseI、Sth132I、AciI、DpnII、Sau3AI及びMnlIからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
[項目８]
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、機械的手段によって断片化される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
[項目９]
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、せん断によって断片化される、項目８に記載の方法。
[項目１０]
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、2bp酵素を認識する制限酵素若しくは制限酵素の組み合わせを使用して、又は一般的ヌクレアーゼによる限定的消化を使用して断片化される、項目１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
ステップ(e)において、ライゲートされた分子が、放射線又は重イオンを用いて断片化される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
[項目１２]
ステップ(e)の後、断片化された分子のDNA末端が、修復される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
ステップ(e)の後、アダプターが、配列決定目的のためにライゲートされる、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
アダプターが、アドレス配列を含む、項目１３に記載の方法。
[項目１５]
多重化の場合に異なるサンプルの識別を可能にするために、異なるサンプルにおいて複数のアドレス配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドが使用される、項目１４に記載の方法。
[項目１６]
ステップ(f)において、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブが、マイクロアレイ上にスポットされるか若しくはビーズ上に捕捉されるか、又は溶液中に存在し、後にビーズ上に捕捉される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位に隣接する配列を認識する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
[項目１８]
オリゴヌクレオチドプローブが、第1の制限酵素の制限部位の100bp以内の配列を認識する、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
ステップ(f)において、ヌクレオチド配列断片が、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブのセットにハイブリダイズされ、この複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、目的ゲノム領域に由来するヌクレオチド配列上の第1の制限酵素の消化部位に隣接する配列にハイブリダイズする、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
オリゴヌクレオチドプローブのセットが、第1の制限酵素を用いて目的ゲノム領域を処理することによって得ることができる実質的に全ての制限断片に特異的なプローブを含む、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
ステップ(g)が、富化されたヌクレオチド配列断片のハイスループット配列決定を含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
ステップ(g)の後に、バイオインフォマティクス分析、及び相互作用の可視化が続く、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２３]
目的ゲノム領域が、目的の遺伝子座を含む、項目２に記載の方法。
[項目２４]
目的領域が、1〜10MBである、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
三次元構造における特定の遺伝的要素の、他のヌクレオチド配列との相互作用を分析する方法であって、項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、遺伝的要素との相互作用に関与するヌクレオチド配列を同定するために、ステップ(g)において、特定の遺伝的要素を含む富化されたヌクレオチド配列断片の配列のみが分析される、方法。
[項目２６]
遺伝的要素が、転写因子の結合部位又はインシュレーター(insulator)若しくはバリヤー(barrier)要素を含む、項目２５に記載の方法。
[項目２７]
遺伝的要素が、目的領域中にある、項目２５又は２６に記載の方法。
[項目２８]
遺伝子の発現状態を決定する方法であって、項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び遺伝子を含む目的領域における相互作用の数、種類又は密度を分析するステップを含む、方法。
[項目２９]
2つのサンプル間の遺伝子の活性を比較する方法であって、両サンプルについて項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップ、及び目的領域における相互作用の数、種類又は密度を比較するステップを含む、方法。
[項目３０]
サンプルが、同じ被験体からの異なる組織に由来する; 異なる時点にわたる単一の被験体に由来する; 異なる被験体からの同等の組織に由来する、項目２９に記載の方法。
[項目３１]
特定の疾患状態を示す1つ以上のDNA-DNA相互作用を同定する方法であって、項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)において、架橋されたDNAのサンプルが罹患細胞及び非罹患細胞から提供され、罹患細胞及び非罹患細胞に由来するDNA配列間の三次元クロマチン構造におけるヌクレオチド配列の相互作用間の差異は、DNA-DNA相互作用又はDNA-DNA相互作用のパターンが特定の疾患状態を示すものであることを示す、方法。
[項目３２]
DNA-DNA相互作用の変化によって引き起こされるか又はそれに関連する、疾患又は症候群の診断又は予後診断の方法であって、項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップを含み、ステップ(a)は、被験体に由来する架橋されたDNAのサンプルを提供するステップを含み、ステップ(f)は、DNA配列間の相互作用を、影響を受けていない対照のものと比較するステップを含み、対照と被験体の間の差異が、被験体が疾患若しくは症候群に罹患していることを示すか、又は被験体が疾患若しくは症候群に罹患するであろうことを示す、方法。
[項目３３]
疾患が、遺伝子疾患である、項目３２に記載の方法。
[項目３４]
疾患が、ガンである、項目３２又は３３に記載の方法。
[項目３５]
DNAの三次元構造をモジュレートする1つ以上の薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、
(a)サンプルを1つ以上の薬剤と接触させるステップ、及び
(b)項目１〜２４のいずれか一項に記載のステップ(a)〜(g)を実施するステップであって、ステップ(a)が、サンプルに由来する架橋されたDNAを提供することを含む、ステップ、
を含み、(i)薬剤の存在下でのDNA相互作用と(ii)薬剤の非存在下でのDNA相互作用の間の差異が、DNAの三次元構造をモジュレートする薬剤を示す、方法。
[項目３６]
本明細書に実質的に記載され、実施例又は図面のいずれかに関連する、方法又はアッセイ。
[項目３７]
目視検査により10kbpより小さい分解能でゲノムの3D構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目３８]
目視検査により10kbpより小さい分解能でクロマチン繊維コンホメーションを同定及び決定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目３９]
目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のサブ染色体ドメイン構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のサブ染色体ドメイン構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目４１]
目視検査により10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目４２]
モンテ-カルロ(Monte-Carlo)及びブラウン動力学(Brownian-Dynamics)シミュレーションと比較した場合、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目４３]
相互作用間の遺伝的距離に応じて、及びモンテ-カルロ及びブラウン動力学シミュレーションからのスケーリング挙動、及びDNA自体における長距離相関のスケーリングと比較して、相互作用の頻度のスケーリング挙動から、10kbpより小さい分解能で染色体のループ凝集体/ロゼット構造を同定するための、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。