(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲンから切り出したシアリル糖鎖における、モノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比またはクロマトグラムの相対面積比を肝細胞癌の指標とすることを特徴とする肝細胞癌の生化学検査方法。
【請求項２】
請求項１記載の生化学検査方法と、ＡＦＰ法および／またはＰＩＶＫＡ−II法とを組み合わせて肝細胞癌の検査を行うことを特徴とする肝細胞癌の生化学検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液または組織液中の糖蛋白質フィブリノーゲンに結合しているシアリル糖鎖であるモノシアリル、ジシアリル糖鎖量を測定し、それらの濃度や濃度比から肝細胞癌などの疾患を診断する生化学的検査方法と、該検査方法に用いるフィブリノーゲンの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝炎をはじめとする肝疾患に対して、実に多くの検査方法がある。例えば血液中のトランスアミナーゼの定量を肝炎の一指標としたり、ＭＲＩなどの画像診断によって腫瘍の有無を確認する方法である。その中で肝機能を測定する検査の一つにシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）がある。シアル酸は一般に炎症マーカーとして利用され炎症時には高い値を示すが、様々な糖蛋白質成分としてそれぞれ機能が違うために疾患の特定の他、病態を決めることは難しいというのが現実である。
【０００３】
肝細胞癌における腫瘍マーカーは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ビタミンＫ欠乏によって誘導される異常なプロトロンビン（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）定量を行うことが主流であり、肝細胞癌の疑いのある患者には大抵この検査を行っている（間中  大ら，臨外，４７（５），  ５６９−５７１（１９９２）、菅原    俊ら，  診療と新薬，  ２６（２），  ２７６−２８１（１９８９））。しかし、それらの陽性率を調べてみると、ＡＦＰでは原発性肝癌の場合では７〜８割、ＰＩＶＫＡ−ＩＩでは５割であるといわれ確かにほとんどの肝細胞患者が含まれる感じに見受けられるが、両方のマーカーで陰性を示した肝細胞癌患者も数割存在することも事実である。従って、さらに診断の確率（陽性率）を上げるために、肝生検や色素注入方法のような患者に苦痛を伴う検査を行ったり、画像診断のような癌細胞の増殖のかなり進んだ段階でないと検出できないような検査を組み合わせて診断しなければならない大きな問題点も生じているのが現状である。本発明でいう肝細胞癌とは、一般的な肝癌又は肝腫瘍を示し、原発性肝癌や転移性肝癌が含まれる。特に、本発明は、原発性肝癌の検査に好適である。
【０００４】
このように、生体内の複雑な病変の情報を早期にかつ正確に捉えることは非常に難しい。このため、的中率の高い検査方法の探索研究が緊急、かつ、きわめて重要な課題になっている。
糖鎖の生体に関する情報の有意義性については、近年生化学、医学の知見より、臨床利用についての要望がさらに一層高まってきている。しかし微量な糖鎖の変化を検査する方法は、レクチン、抗体等で一部試みられてはいるが定量性に乏しく微量の変化は検出しにくいという欠点があり、また、それら疾患で変化することが明らかな例えばアルファ−１−酸性糖蛋白質や絨毛性ホルモンなどの糖蛋白質は、その存在量（濃度）が少なく、各患者より、定量性が高い方法で分析するだけの試料を得るのが困難であり、また疾患により糖鎖の濃度や組成や構造が変化することが予想され、糖鎖が臨床検査に利用できることが予想されていても各患者より試料を精製し、その糖鎖を詳細に分析することは困難であった。
【０００５】
このような現状に鑑み我々は、血液中に比較的多く存在する糖蛋白質、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖に注目し、臨床検査への利用を鋭意研究してきた。
フィブリノーゲンは約８割が血液、約２割が組織液に分布する分子量３４万の巨大な糖蛋白質であり、肝細胞（肝実質細胞）中で合成される。フィブリノーゲンはＡα、Ｂβ、γの３つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合して形成されるサブユニット構造（Ａα−Ｂβ−γ）が２個さらにジスルフィド結合した構造（Ａα−Ｂβ−γ）２を形成している。フィブリノーゲン１分子中のシアリル糖鎖の数は４本でフィブリノーゲン分子中のＢβ、γ鎖に付加され、フィブリノーゲン分子全体の約３％を占める。健常人の場合、血漿１ｍｌあたり約３ｍｇ含まれている。フィブリノーゲンは血液中からでも組織液中からでも採取は可能であるが、上記したフィブリノーゲンの存在量が、血液中に約８割と多く、また組織片を採取することなく精製が可能である等の点から、血液（血漿）から精製した方が好ましい。フィブリノーゲンの糖鎖は全てアスパラギンに結合しており、糖鎖の構造としては、いわゆるバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端にシアル酸が１つ（モノシアリル糖鎖）ないしは２つ（ジシアリル糖鎖）の２種類が存在する（松田道生ら編，止血・血栓・線溶，１７４−１８０，（１９９４）中外医学社出版）。フィブリノーゲンのシアリル糖鎖が２種類しか存在しないので、疾患によるフィブリノーゲンのシアリル糖鎖の構造変化も２種類しか存在しないことや、フィブリノーゲンが、同じ構造をしたサブユニット（Ａα−Ｂβ−γ）から形成しているため、変化したシアリル糖鎖を特定し分析することは、今の分析技術ではほとんど不可能である。しかし、本発明者らは、１）フィブリノーゲンは肝細胞で産生されること、２）シアル酸は炎症反応等により増加する傾向にあること、また、肝細胞癌患者でフィブリノーゲンのシアル酸が増加しているという報告がされている（Ｈａｒｖｅｙ  Ｒ．Ｇｒａｌｎｉｃｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９９（５），２２１−２２６（１９７８）  ）が、しかし、肝細胞癌等の肝疾患が起きることによって、フィブリノーゲン糖鎖構造が変化することを発明者らは初めて見出した。
【０００６】
フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の分離、分析は例えば陰イオンカラムやＯＤＳカラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す）による方法が一般的で簡単である。ＯＤＳカラムを用いたフィブリノーゲンのＨＰＬＣ溶出パターンは、第１図に示すとおりである。健常者の場合のフィブリノーゲンシアリル糖鎖のモノシアリル糖鎖、ジシアリル糖鎖の割合はほとんど一定している。シアリル糖鎖は生体内の環境の変化に支配されているので疾患との関わりが深いということ、また、フィブリノーゲンは肝細胞で産生されるということから、肝細胞癌のような肝臓の異変時には、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖にも必ず異変が起きていることは予想できることである。本発明者らは、健常人と肝炎、肝細胞癌患者のフィブリノーゲン糖鎖を分析した結果、肝細胞癌患者におけるフィブリノーゲンのシアリル糖鎖の含量とその比率が他に比べて大きく変化しているという事実を発見し、臨床検査方法として開発させた。
【０００７】
フィブリノーゲンの精製は松田道生らの論文（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．７２，  １０３４−１０４１（１９８３））による方法が良く知られている。以下に操作方法を順を追って説明する。
１）リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース（共にファルマシア社製）の２種類のアフィニティ担体を別々に詰めたカラムを連結させる。これらのアフィニティ担体は、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン等を特異的に結合させる作用がある。
２）血漿を通し、血漿中のフィブロネクチンやプラスミノーゲン等をアフィニティ担体と結合させて除去し、素通り画分を得る。
３）フィブリノーゲンを含んだ素通り画分に対して２５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加える。
【０００８】
この方法の問題点として次の２点が挙げられる。
・２つのカラムに別々にアフィニティ担体を詰め、これらを連結したものを用いてフィブリノーゲンを精製させるため１検体の精製に要する作業時間が長く、また手間もかかり、１検体づつ精製するので、多検体を扱う臨床検査としては不向きである。
・この方法で得られた素通り画分中には、血液成分中最も量の多い糖蛋白質であるＩｇＧが含まれ、硫安沈殿の際にＩｇＧも一緒に混在して沈殿してくることがあり、フィブリノーゲン糖鎖を分析するサンプルに使用することは不向きである。
【０００９】
以上の問題点から、本発明者らは短時間で多検体のフィブリノーゲンを精製する方法を鋭意研究した結果、上記２種類のアフィニティ担体にＩｇＧを結合させるプロテインＧ（ファルマシア社製）を加えて３種類の担体を混合させ、これをメンブレンフィルター付き容器に詰めたものを用いて遠心力によって連続的に流動させてフィブリノーゲンを分画すれば、一度に多検体を処理でき、しかも夾雑物のほとんどないフィブリノーゲンを精製することができた。さらに試験を積み重ねた結果、血漿１００μｌ程度でフィブリノーゲンを精製することに成功し、フィブリノーゲン糖鎖の変化を詳細に分析することができるようになった。この方法は通常の臨床検査で採血した残りの血漿で本発明で定量する糖鎖が分析でき、患者に余計な負担をかけることなく糖鎖を分析する精製方法として画期的な方法である。さらに上記の３種類のアフィニティ担体に別の種類の例えば血液中のプロトロンビンと結合するアルギニンセファロース（ファルマシア社製）を付加すれば、精製効率をさらに上昇させることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の生化学検査方法は、上記のような事情を鑑みてなされたものであり、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の有する生体情報により新規な生化学検査方法を提供することと該検査方法に用いるフィブリノーゲンの効率的な精製方法を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一は、フィブリノーゲンから切り出したシアリル糖鎖を疾患の指標とすることを特徴とする疾患の生化学検査方法である。
本発明の第二は、疾患の指標が、モノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度、またはモノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比もしくはクロマトグラムの相対面積比であることを特徴とする上記記載の生化学検査方法である。
【００１２】
本発明の第三は、疾患が、肝細胞癌であることを特徴とする上記記載の生化学検査方法である。
本発明の第四は、上記記載の生化学検査方法と、ＡＦＰ法および／またはＰＩＶＫＡ−ＩＩ法とを組み合わせて肝細胞癌の検査を行うことを特徴とする肝細胞癌の生化学検査方法である。
【００１３】
本発明の第五は、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン、ＩｇＧなどの血液成分と親和性のある少なくとも３種類のアフィニティ担体を用いて血漿又は組織液からフィブリノーゲンを精製することを特徴とするフィブリノーゲンを精製する方法である。
本発明の第六は、アフィニティ担体を、メンブレンフィルタ付きの容器内で混合もしくは重層してフィブリノーゲンを精製することを特徴とする上記記載のフィブリノーゲンの精製方法である。
【００１４】
本発明において、モノシアリル糖鎖とは、下記の式（Ｉ）で示すようにバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端の内の一つにシアル酸が１つ結合した糖鎖である。また、ジシアリル糖鎖とは、下記の式（ＩＩ）で示すようにバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端にシアル酸が一つづつ結合した糖鎖である（図１において、ピークＡがモノシアリル糖鎖、ピークＢがジシアリル糖鎖を示す）。
【００１５】
【化１】
0003547879.tif 000002
【００１６】
【化２】
0003547879.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｓはシアル酸、Ｇはガラクトース、ＧＮがＮ−アセチルグルコサミン、Ｍはマンノースを表す。）
本発明による生化学検査方法は、本発明者らによって行われてきたフィブリノーゲンついての一層正確な病変の情報の取得と、的中率の高い診断法としての確立に関する研究に基づいて完成されたものである。そしてこの方法は、血液中のフィブリノーゲン糖鎖が肝細胞癌における量的変化だけでなく、質的変化、即ちフィブリノーゲン結合糖鎖のプロフィールを詳細に検討することによって、的確な肝細胞癌の情報を取得し、従来の肝細胞癌の腫瘍マーカーと組み合わせることにより、より陽性率の高い肝細胞癌の診断法として確立すべく努めてきた成果によるものである。
【００１８】
本発明に関する２つのシアリル糖鎖を定量する方法としては、たとえば、ＨＰＬＣが有効である。
以下、本発明を詳細に説明する。
（ヒト血漿からのフィブリノーゲン精製方法）
体液からフィブリノーゲンを精製する方法は、従来の技術の項目で述べた松田らのアフィニティカラムを用いた方法を適用することも可能であるが、精製度や作業の点での問題もあるため、ＩｇＧのような血液中に多く存在する成分を効率良く除去するためには松田らが用いた２種の担体のほか、ＩｇＧに親和性を示す担体を用いてフィブリノーゲンを精製することが望ましい。ＩｇＧに親和性を示す担体としては、プロテインＧが結合した担体を例示することができる。
【００１９】
血漿からフィブリノーゲンを精製する具体的な方法を以下に示す。まず、メンブレンフィルタ付き容器（例えばミリポア社ウルトラフリー）内でフィブロネクチン親和性アフィニティ担体、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ親和性アフィニティ担体、ＩｇＧ親和性アフィニティ担体の３種のアフィニティ担体（例えば、リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース、プロテインＧ結合セファロース（共にファルマシア社製））とプラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン、ＩｇＧ等の血液成分を結合させる。メンブレンフィルタで濾過することにより、ほとんど夾雑物の除かれたフィブリノーゲンを得ることができる。この３種のアフィニティ担体の詰め方は３種を層状にして詰めても混合させても同じ効果が得られる。ただ層状にして詰めるやり方は、技術的に手間がかかるので、多検体を扱う臨床検査に使用する場合には不向きである。従って同じ効果で比較的簡単にできる３種のアフィニティ担体を混合して詰めるやり方が良い。
（糖鎖の切り出し・精製）
糖鎖を調整する方法としては、酵素を用いて糖鎖を遊離する方法と、無水ヒドラジンにより化学的に糖鎖を切り出す方法とがある。何れの方法を用いても本分析結果に影響はしないが、酵素を用いた方法の方が熟練を必要とせず、毒物指定されている無水ヒドラジンを使用しないで済むため有利である。しかし、近年この無水ヒドラジンによる糖鎖の遊離を行う装置が市販されており、それらを利用しても差し支えない。酵素を用いる方法としては糖鎖をできるだけシアル酸の結合した状態で切り出すことが必要十分な条件である。従って強酸性下での酵素消化は糖鎖中のシアル酸の解離が起こる可能性があり、望ましくない。その上では蛋白分解酵素としてトリプシン、キモトリプシンを用いた方がシアル酸の解離を防ぐことができる。蛋白分解の後、グリコアミダーゼＡで糖鎖を切り出し、後で糖鎖を精製しやすいようにプロナーゼ消化する。切り出した糖鎖を陽および陰イオン交換樹脂を用いて精製する。
（糖鎖の標識化）
糖鎖を標識する方法としては、２アミノピリジンで蛍光標識する方法と、トリチウムラベルで放射線標識する方法が一般的である。本発明者らは、一般の研究室で取り扱いやすいことと、また高速液体クロマトグラフで検出しやすいこと、分離が良くなることにより、２アミノピリジンで蛍光標識する方法が好適である。２アミノピリジンで蛍光標識する方法としては、長谷等によって開発された２アミノピリジン塩酸溶液を蛍光標識剤として、水素化シアノホウ素ナトリウムを還元剤として使用する方法（Ｓ．Ｈａｓｅ，Ｔ．Ｉｂｕｋｉ，Ｔ．Ｉｋｅｎａｋａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５，１９７−２０３（１９８４））  と、近藤等が開発した２アミノピリジン無水酢酸溶液を蛍光標識剤として、ボランジメチルアミンコンプレックスを還元剤として使用する方法（Ｋｏｎｄｏ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９−２１７０（１９９０））があるが、何れの方法でも本分析結果に影響しないが、長谷等の方法が用意する装置が少なく、手軽にできる。近藤等の方法はその方法を行う装置（宝酒造製）が市販されており、それを利用しても良い。蛍光標識化した糖鎖は、化学的に安定であり、ＨＰＬＣ分析により短時間で高感度に分析できるという利点がある。
（糖鎖の分析）
本発明においては、以上のようにフィブリノーゲンから切り出され、標識化されたシアリル糖鎖を指標として疾患の検査を行う。ここで検査の対象とすることのできる疾患としては、肝細胞癌を挙げることができるが、これに限定されない。具体的な検査方法としては、モノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度を指標として行う方法と、モノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比を指標として行う方法の二つの方法を挙げることができる。いずれの方法も、まず、蛍光標識化した糖鎖をゲル濾過により精製し、ＨＰＬＣ分析に供する。ＨＰＬＣに用いるカラムとしては、ＯＤＳ−シリカカラムが好ましいが、ＯＤＰカラムやＤＥＡＥカラムを用いても差し支えない。次に、ＨＰＬＣの溶出ピークパターンから、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の含量（濃度）に対応するモノシアリル、ジシアリル糖鎖のピーク面積値を割り出す。上記のモノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度を指標とする方法では、モノシアリル糖鎖のピーク面積値とジシアリル糖鎖のピーク面積値とから、両糖鎖の濃度を算出する。いずれか一方の糖鎖の濃度あるいは両者の濃度を健常人あるいは良性疾患患者の濃度と比べて、高値低値によって肝細胞癌などの各種疾患について陽性であるか否かを判定する。モノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比を指標とする方法では、モノシアリル糖鎖のピーク面積値とジシアリル糖鎖のピーク面積値とから、ジシアリル糖鎖量に対するモノシアリル糖鎖量の比を算出する。この量比の値を健常人、あるいは良性疾患患者の値と比べて、高値低値によって肝細胞癌などの各種疾患について陽性であるか否かを判定する。
【００２０】
以上により、この発明した方法は、診断法として有効な情報を実用的な処理に適応しえるものとした。
以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【発明の実施の態様】
【００２２】
【実施例】
〔実施例１〕
健常人、慢性Ｃ型肝炎、原発性肝細胞癌患者の血漿を用いてフィブリノーゲン及びフィブリノーゲン糖鎖を精製し、ＨＰＬＣ分析した。ジシアリル糖鎖の変化量を調べた。
【００２３】
リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース、プロテインＧ結合セファロース（共にファルマシア社製）を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．５にそれぞれ膨潤させた。検査検体１件当たり膨潤ゲル各２５０μｌを混合させてメンブレンフィルター付き容器（商品名    ウルトラフリーチューブ、ミリポア社製）に詰めた。次に血漿１００μｌを入れて、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン等を上記アフィニティ担体と結合させて遠心分離（１５００ｒｐｍ×１０秒）した。さらに上記バッファーを２ｍｌ加えて再び遠心分離（上記）を行い、素通りした画分を得た（溶液量として約２．５ｍｌ）。以上の作業は約２時間で終了した。なお、常法ではフィブリノーゲン１検体精製するのに約５時間必要であるが、この方法では遠心分離器の作業可能な検体数に応じて数１０検体を一度に取扱うことができ、検体数が増えても約２時間で終了するので効率的である。
【００２４】
得られた素通り画分に対して、２５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて混合させることにより、フィブリノーゲン（約０．３ｍｇ）を沈殿させた。フィブリノーゲン溶液を遠心分離（２５００ｒｐｍ×２０分）にかけ、得られた沈殿（フィブリノーゲン）に０．１Ｍトリス−塩酸、２％塩化ナトリウム溶液  ｐＨ８．２を加えてフィブリノーゲンを溶かした。健常人の場合、血漿１００μｌから約０．３ｍｇフィブリノーゲンを得ることができた。
【００２５】
フィブリノーゲンの精製具合はＳＤＳ電気泳動で確認した。フィブリノーゲンは健常人の血漿から精製し、対照として市販のヒトフィブリノーゲン、ＩｇＧ試薬（以上Ｓｉｇｍａ社製）を用いて蛋白非還元の状態でそれぞれ同量（各１０μｇ）を泳動させた。
電気泳動の条件
・使用電源：ＡＴＴＯ    ＤＩＧＩ−ＰＯＷＥＲ    ＳＪ−１０８１
・使用電気泳動装置：テフコ・セル・ミニ    Ｍｏｄｅｌ  ＴＣ−８０８（ＴＥＦＣＯ社製）
・使用ゲル：ＳＤＳ−ｍｉｎｉ（ＴＥＦＣＯ社製）、ゲル濃度    ４％、厚さ１．５ｍｍ
・サンプリング：
0003547879.tif 000004
【００２６】
各サンプル１０μｇ分の溶液量に対してサンプルバッファーを加えて５倍希釈し、沸騰水中で５分間加熱したものを泳動した。
・泳動条件：２７ｍＡ    定電流で７０分
図２に結果を示した。精製物（レーン３）のバンドは、市販のフィブリノーゲン（レーン１）と同じ位置にあり、これ以外にバンドは見えないことが確認できた。さらに後に述べるＨＰＬＣによる分析結果によっても市販品と精製物とは同一のクロマトグラムを示したことから、上記方法によって、フィブリノーゲンは精製できた。
【００２７】
次に得られたフィブリノーゲン溶液を加熱処理（９０℃、１０分）した後、トリプシン（Ｓｉｇｍａ製）、キモトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を加えて酵素消化した。反応後再び加熱処理（９０℃、１０分）して溶液を濃縮乾固した後、反応溶液をｐＨ  ４〜６に調整し、グリコペプチダーゼＡ（生化学工業製）を加え酵素により糖鎖を遊離させた。次にプロナーゼ（商品名    アクチナーゼＥ、科研製薬製）を加えてペプチドをさらに細かく切断した後、固形物を遠心分離により除き、上清を予めイオン交換水で平衡化させた陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂で脱塩、精製した。脱塩、精製溶液を濃縮乾固し、２−アミノピリジン１ｇを５６０μｌの濃塩酸に溶解した溶液４０μｌを加え、９０℃、１０分間置いた後、２０ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを１２μｌの水に溶解させた水溶液４μｌを加え９０℃で１時間反応させた。セファンデックスＧ−１５（ファルマシア製）のカラムを用いて糖鎖を精製した。２−アミノピリジン−糖鎖画分を集め、乾固した後ＨＰＬＣ分析に供した。
【００２８】
ＨＰＬＣの分析条件
・溶出液Ａ：１０ｍＭ    リン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ３．８）
・溶出液Ｂ：溶出液Ａにｎ−ブタノールを最終濃度０．５％になるように加えた液
・カラム：Ｎａｋａｎｏｐａｋ  ＯＤＳ−Ａ（６．０φ×１５０ｍｍ、中埜酢店製）
・蛍光検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＲＦ−５５０（島津製作所製）
・検出：蛍光検出（励起波長：３２０ｎｍ、蛍光波長：４００ｎｍ）
・溶出液流速：１ｍｌ／分
・糖鎖の溶出条件：溶出液Ｂの濃度を分析開始から６０分までに、２０％から５０％に上昇させる条件
ＨＰＬＣ分析後の解析
ＨＰＬＣによって検出されたクロマトグラムから、フィブリノーゲン糖鎖のモノシアリル糖鎖とジシアリル糖鎖のピーク（図１参照）の面積値を得る。肝細胞癌ではモノシアリル糖鎖に対するジシアリル糖鎖の割合が増えてくる（図３−Ｂ）ので、面積値からジシアリル糖鎖の増加量に注目して、次のように面積比（量比）を算出する：
ジシアリル糖鎖の増加割合＝ジシアリル糖鎖のピーク面積／モノシアリル糖鎖のピーク面積
（以下ｄｉ／ｍｏｎｏと略す）
結果
ここで用いた検体数は、健常人（７例）、慢性Ｃ型肝炎（４０例）、原発性肝癌（３７例）であった。添付した図３は、上記のようにして得られたＨＰＬＣの溶出パターンを示し、大きく２種類存在するフィブリノーゲン糖鎖が、ＯＤＳ−シリカカラムへの微妙な親和性の差異に基づいて得られた溶出プロフィールを示している。先に述べたように、健常人のフィブリノーゲン糖鎖ではモノシアリル、ジシアリル糖鎖の量割合がほとんど一定である（図３−Ａ）。
【００２９】
この結果を基に統計的に健常人を含む各疾患グループに分けて解析し、健常人と慢性Ｃ型肝炎患者、健常人と肝細胞癌患者、慢性Ｃ型肝炎患者と肝細胞癌患者との間に有意な差が果たして出るか調べてみた（図４）。その結果健常人と慢性Ｃ型肝炎患者との間では有意な差は出なかったが、健常人と肝細胞癌及び肝炎患者と肝細胞癌患者との間では有意差が見られた（Ｐ＜０．００１）。さらにこの図から慢性Ｃ型肝炎患者のｄｉ／ｍｏｎｏ値の上限が０．８なので、肝細胞癌患者でｄｉ／ｍｏｎｏ値が０．８以上（つまり陽性）の例が３７例中２８例であり、この結果、陽性率として７５．７％であった。
〔実施例２〕
さらに肝細胞癌患者３７例の中で、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖のｄｉ／ｍｏｎｏ値と、腫瘍マーカーとしてよく利用されているＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩとの陽性率の比較を行った。この結果を表１と図５に示した。
【００３０】
【表１】
0003547879.tif 000005
【００３１】
この結果、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖分析によってのみ陽性と認められた患者７例を加えると、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩのみで判定された陽性率が７５．７％から９４．６％に上昇した。このことから、本発明は、肝細胞癌の腫瘍マーカーとして有用であり、既存の検査方法との併用によって肝細胞癌の陽性率を高いレベルで検査できることから、非常に効果的であることがわかる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の生化学検査方法により、肝細胞癌をはじめとする各種疾患をより高い確率で発見することができる。
また、本発明のフィブリノーゲンの精製方法により、簡易な操作で夾雑物の少ないフィブリノーゲンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】フィブリノーゲンから切り出したシアリル糖鎖のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図２】本発明の精製方法により精製されたフィブリノーゲンのＳＤＳ電気泳動を示す写真である。
【図３】健常人及び肝細胞癌患者のシアリル糖鎖のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図４】健常人、慢性Ｃ型肝炎患者、肝細胞癌患者のｄｉ／ｍｏｎｏ値を示す図である。
【図５】ｄｉ／ｍｏｎｏ値、ＡＦＰ法、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ法の３種の検査方法による陽性率の比較を示す図である。
【図１】
0003547879.tif 000006
【図２】
0003547879.tif 000007
【図３】
0003547879.tif 000008
【図４】
0003547879.tif 000009
【図５】
0003547879.tif 000010