(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−アルキルグアノシンを製造する方法であって、溶媒として水系の溶媒を使用し、ｐＨが１１以上、１３以下の塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシドをアルキル化リン酸で処理して２’−Ｏ−アルキル−２，６−ジアミノプリンリボシドを選択的に生成させ、これを水系溶媒中で脱アミノ化して２’−Ｏ−アルキルグアノシンを得ることを特徴とする２’−Ｏ−アルキルグアノシンの製造法。
【請求項２】
２’−Ｏ−アルキルグアノシンにおけるアルキルが、炭素数５以下の低級アルキルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
水系の溶媒が、水または緩衝液である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
塩基性条件が、ｐＨ１２〜１３の条件である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アルキル化リン酸が、トリアルキルリン酸またはジアルキルリン酸である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
脱アミノ化がアデノシンデアミナーゼを用いた酵素的な脱アミノ化である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−メチルグアノシンを製造する方法であって、溶媒として水系の溶媒を使用し、ｐＨが１１以上、１３以下の塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシドをメチル化リン酸で処理して２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシドを選択的に生成させ、これを水系溶媒中で脱アミノ化して２’−Ｏ−メチルグアノシンを得ることを特徴とする２’−Ｏ−メチルグアノシンの製造法。
【請求項８】
水系の溶媒が、水または緩衝液である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
塩基性条件が、ｐＨ１２〜１３の条件である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
メチル化リン酸が、トリメチルリン酸またはジメチルリン酸である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
脱アミノ化がアデノシンデアミナーゼを用いた酵素的な脱アミノ化である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、安全で、操作性、実用性に優れた２，６−ジアミノプリンリボシドからの２’−Ｏ−アルキルグアノシンの製造法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
２’−Ｏ−メチルグアノシンに代表される２’−Ｏ−アルキルグアノシンの製造法としては、グアノシンを原料とすると２’位水酸基のアルキル化反応が収率よく進行しない等の理由で、２，６−ジアミノプリンリボシドを原料とする方法が一般的である。
【０００３】
従来、２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−メチルグアノシンを得る方法としては、塩化第一スズ触媒下、ジアゾメタンを用いて２，６−ジアミノプリンリボシドの２’位水酸基をメチル化後、アデノシンデアミナーゼにより脱アミノ化して２’−Ｏ−メチルグアノシンを得る方法（Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ，  ５９：  ３３６０（１９８１））が知られていた。
【０００４】
しかし、この方法は、爆発性で毒性の強いジアゾメタンを使用することから工業的に使用し得る方法とはなりえなかった。このため、ジアゾメタンを使用しない方法が種々検討され、上記方法の改良法として、塩基存在下、ハロゲン化アルキルを用いて２，６−ジアミノプリンリボシドの２’位水酸基をメチル化後、アデノシンデアミナーゼにより脱アミノ化して２’−Ｏ−メチルグアノシンを得る方法（日本特許第３０１５４６４号）が報告された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記改良法であっても、メチル化反応時に共存させる塩基である水素化ナトリウムは発火性を有し、メチル化剤として使用するヨウ化メチルは、ジアゾメタンよりは毒性は低いものの、相変わらず毒性を有するため、上記改良法を実施する際にはこれらの化学物質を厳密に管理しなければならない等の問題を有していた。
【０００６】
また、上記従来法は、いずれも、ジアゾメタンやヨウ化メチルを用いたメチル化反応を水を含まない有機溶媒などの非水系で行い、アデノシンデアミナーゼを用いた脱アミノ化反応を水などの水系で行うという不連続な工程から構成されており、このような不連続な工程を一連の工程として行う場合には、各工程の取扱いを厳密に区別し、それを実行するための設備を整えなければならない等、誰でも行える簡便方法とは言えなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来法の問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−メチルグアノシンを製造する際、塩基性条件下、メチル化剤としてトリメチルリン酸を用いることにより、メチル化反応を水系の溶媒中で行うことができ、しかも２，６−ジアミノプリンリボシドの２’位水酸基が選択的にメチル化され、２’−Ｏ−メチルグアノシンを効率よく得ることができることを見いだした。
【０００８】
従来、トリメチルリン酸を用いたヌクレオシドのメチル化は、ヌクレオシドの核酸塩基のメチル化に主眼がおかれ、糖部水酸基のメチル化を主題とする報告はなされていない。ただし、塩基のメチル化の比較実験として、イノシンとアデノシンにおいてトリメチルリン酸により糖部水酸基のメチル化も若干進行し、たとえば、トリメチルリン酸を用いてイノシンをメチル化した場合、６５％のＮ１−メチルイノシンと３３％のＮ１，Ｏ２’（３’）−ジメチルイノシンが生成し、トリメチルリン酸を用いてアデノシンをメチル化した場合には３８％のＯ２’（３’）−メチルアデノシンと２４％のＮ６，Ｏ２’（３’）−ジメチルアデノシンが生成することが報告されていた（Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊｐｎ．，  ５４，  １５６９−１５７０（１９８１））。このような報告からして、トリメチルリン酸を用いて２，６−ジアミノプリンリボシドをメチル化したとしても２’位水酸基が選択的にメチル化されるとは到底考えられていなかったことから、本発明者らの上記知見はまったく驚くべきことであった。
【０００９】
本発明者らは、上記知見を基に更に検討を重ね、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−アルキルグアノシンを製造する方法であって、溶媒として水系の溶媒を使用し、ｐＨが１１以上、１３以下の塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシドをアルキル化リン酸で処理して２’−Ｏ−アルキル−２，６−ジアミノプリンリボシドを選択的に生成させ、これを水系溶媒中で脱アミノ化して２’−Ｏ−アルキルグアノシンを得ることを特徴とする２’−Ｏ−アルキルグアノシンの製造法に関するものである。
【００１０】
また、本発明は、２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−メチルグアノシンを製造する方法であって、溶媒として水系の溶媒を使用し、ｐＨが１１以上、１３以下の塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシドをメチル化リン酸で処理して２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシドを選択的に生成させ、これを水系溶媒中で脱アミノ化して２’−Ｏ−メチルグアノシンを得ることを特徴とする２’−Ｏ−メチルグアノシンの製造法に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
原料化合物である２，６−ジアミノプリンリボシドは公知化合物（下記式参照）である。このような化合物は化学的、酵素的に合成することが可能であり、あるいは市販品を使用してもかまわない。特に、酵素的に２，６−ジアミノプリンリボシドを合成した場合には、これを単離する必要はなく、酵素反応液そのもの、あるいは酵素反応液から粗精製品を原料として使用しても差し支えない。
【００１２】
【式１】
0003596669.tif 000002
【００１３】
本発明方法は、上述したように、最初に、水系の溶媒中、塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシドをアルキル化リン酸で処理して２’−Ｏ−アルキル−２，６−ジアミノプリンリボシド（下記式参照）を生成させる。
【００１４】
【式２】
0003596669.tif 000003
（式中、Ｒは炭素数５以下の低級アルキルを意味する）
【００１５】
アルキル化剤としては、アルキル化リン酸を使用することができ、具体的には、トリメチルリン酸、トリエチルリン酸、トリプロピルリン酸、エチルジメチルリン酸などのトリアルキルリン酸、ジメチルリン酸、ジエチルリン酸などのジアルキルリン酸を挙げることができる。特に、メチル化の場合には、トリメチルリン酸が好適である。
【００１６】
アルキル化反応は、水、緩衝液などの水系の溶媒中、塩基性条件下、２，６−ジアミノプリンリボシド１モルに対し、アルキル化リン酸を１〜１００モル、好ましくは１０〜３０モル使用し、１０〜９０℃、好ましくは３０〜７０℃で１〜２０時間程度反応させることにより実施することができる。
【００１７】
このアルキル化反応は、塩基性条件下で行うのが肝要であり、塩基性条件の具体例としてはｐＨ１１以上、好ましくはｐＨ１２〜１３を例示される。ｐＨが１１未満の条件ではアルキル化反応が遅く、ｐＨ１３を越える条件ではメチル化反応の２’位水酸基への選択性が低下することから好ましくない。なお、上記塩基性条件は、反応の開始から終了まで維持または調整されるのが望ましいが、少なくとも反応当初のｐＨを上記塩基性条件に調整しておくことが大切である。
【００１８】
このようにして生成された２’−Ｏ−アルキル−２，６−ジアミノプリンリボシドは、必要により公知の精製法（例：溶媒抽出法、イオン交換樹脂、活性炭等のカラムクロマトグラフィー法）で精製し、次ぎの脱アミノ化反応に供する。
【００１９】
脱アミノ化反応は、アデノシンデアミナーゼを用いた公知の方法で実施することができる。すなわち、アデノシンデアミナーゼとしては、２’−Ｏ−アルキル−２，６−ジアミノプリンリボシドのＮ６位のアミノ基を脱アミノできる酵素であれば動物、微生物などいずれの由来のものも使用することができる。特に、大腸菌由来の酵素は、反応効率や価格の点で有利である。
【００２０】
脱アミノ化反応は、使用する酵素によって変動するものの、水または緩衝液中、ｐＨ６〜８の条件下、過剰量のアデノシンデアミナーゼを使用し、２０〜５０℃で１〜１００時間程度反応させることにより実施することができる。
反応後、得られた２’−Ｏ−アルキルグアノシン（下記式参照）は、公知の方法（例：結晶化法、溶媒抽出法、吸着樹脂などによるクロマトグラフィー法など）により単離精製することができる。
【００２１】
【式３】
0003596669.tif 000004
（式中、Ｒは炭素数５以下の低級アルキルを意味する）
【００２２】
【発明の効果】
本発明方法は、発火性や毒性のある薬品を使用することなく、水系の溶媒を用いて２，６−ジアミノプリンリボシドから２’−Ｏ−アルキルグアノシンを効率よく製造することができる極めて有用性の高い方法であり、特別な設備や作業管理も不要であることから、２’−Ｏ−アルキルグアノシンの大量合成法として極めて実用的な方法である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
【００２４】
実施例１：２’−Ｏ−メチルグアノシンの合成（その１）
２，６−ジアミノプリンリボシド（５．６５ｇ、２０ｍｍｏｌ）をトリメチルリン酸（４０ｍｌ）と脱イオン水（４０ｍｌ）との混合液に懸濁し、５０℃に加温しながら、反応液のｐＨが１２．０〜１２．５になるように水酸化ナトリウム水溶液で調整しながら攪拌反応させた。
反応開始７時間後、ＨＰＬＣで反応液を分析した結果、２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド及び３’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシドがそれぞれ４１％と８．５％（ＨＰＬＣ：ＵＶ２６０ｎｍで分析）生成した。
【００２５】
反応液を脱イオン水で４００ｍｌに希釈し、塩酸でｐＨを７．６に調整し、大腸菌由来アデノシンデアミナーゼ（１５００単位）を添加して、３７℃で攪拌反応させた。反応途中、塩酸水溶液でｐＨを７．６に調整しながら、８８時間脱アミノ化反応を行った後、反応液を１０分間煮沸し、反応を停止した。
反応液をろ過し、ろ液を吸着樹脂カラムに吸着後、脱イオン水で溶出し、２’−Ｏ−メチルグアノシンの溶出画分を５０ｍｌまで減圧濃縮し、一晩冷却した。生じた沈殿をろ取後乾燥を行い、２’−Ｏ−メチルグアノシンの結晶を１．７２ｇ得た。
【００２６】
実施例２：２’−Ｏ−メチルグアノシンの合成（その２）
ウリジン（１４．６ｇ，６０ｍｍｏｌ）と２，６−ジアミノプリン（６ｇ，４０ｍｍｏｌ）を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０００ｍｌ）に懸濁し、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（２１００単位）とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（５４００単位）を添加し、５０℃で１００分間攪拌反応させた。反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。
反応終了後、ＨＰＬＣで分析したところ、対２，６−ジアミノプリン当たりの２，６−ジアミノプリンリボシドへの転換率は９５．７％であった。
【００２７】
反応液を２００ｍｌまで濃縮し、トリメチルリン酸（１５０ｍｌ）を加え、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２〜１２．５の範囲に調節しながら５０℃で７時間反応させた。
得られた反応液をＨＰＬＣで分析したところ、２，６−ジアミノプリンリボシドから４７％の転換率で２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシドが得られた。
このようにして得られた反応液を実施例１と同様に脱アミノ化処理して２’−Ｏ−メチルグアノシンを得た。