(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）の段階から成ることを特徴とする移植体の作成方法：
（１）  移植すべき部位の所望形状に予め成形した、内部に空洞を有する三次元の担体構造体を栄養液が通過可能な生体吸収性ポリマーを用いて作り、
（２）  得られた担体構造体の空洞内に被移植者に適合する細胞を入れ、
（３）  細胞を収容した担体構造体を外被で被覆し
（４）  担体構造体の空洞内に細胞間基質が形成されるまで細胞を収容した担体構造体を通って栄養液を潅流する。
【請求項２】
外被の材料として栄養液が担体構造体の内部へ拡散できる材料を選択する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞間基質の構成に必要な細胞生成物が外被によって担体構造体の内部に保持されるような外被の材料を選択する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
外被の材料がアガロースである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
担体構造体がポリマー繊維からなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞を担体構造体に入れる前に、担体構造体に付着因子を付ける請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
凍結乾燥で付着因子を担体構造体の表面に被着する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
担体構造体の内部空洞の寸法を栄養液が担体構造体中に拡散するような寸法にする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
潅流段階に休止期間を設けて細胞を収容した担体構造体に間欠的に潅流する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞を収容した担体構造体を潅流室に入れて潅流する請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞を培養基と一緒に懸濁液として担体構造体に入れ、この懸濁液に増粘物質をさらに添加する請求項１〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の形成および細胞間基質の形成を促進する組織形態形成因子を担体構造体にさらに加える請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
担体構造体の材料に組織形態形成因子を結合する請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
移植すべき所望形状に合わせて予め成形された三次元の安定した形状を有する自己支持性のある、内部に空洞を有する生体吸収性のある生体適合性担体構造体と、この担体構造体の上記空洞内に収容された被移植者に適合する細胞とからなる、移植後に生体に吸収される間も上記の安定した自己支持性を維持する移植体。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は細胞培養から移植体を作成する方法とそれによって得られた移植体とに関するものである。
本発明は特に、軟骨細胞を生体吸収性担体構造体に被せた軟骨細胞を用いた移植体の作成方法に関するものである。
従来の技術
失われた自己の組織、例えば軟骨組織を補充・再生するための従来の主要な方法は以下の２つである：
1.必要な組織を死体から取り出し、保存し、移植する方法。この場合には免疫反応が起こることがある。
2.除去された細胞の補充のために自家組織を用いる方法。この自家組織は患者の外部からは見えない別の部位から採取し、除去された組織の場所へ移植する。この場合には免疫反応の恐れはない。
これら２つの方法の決定的な欠点は材料の量が少な過ぎることで、益々増大する移植件数のニーズに組織の補充がしばしば追いつかず、不完全にしか行われないことである。
そこで考えられた第３の方法は通常の方法で分離、増殖した細胞を生体吸収性材料からなるポリマー繊維束上に被着し、この繊維束を移植する方法である。これに関しては下記特許文献１を参照されたい。
特許文献１  C.A.ヴァカンティ達（C.A.Vacanti et al）、「形成・再構成外科学、Plastic and Reconstructive Surgery」、第８巻、第５号、1991年11月、第753〜759頁
この方法では繊維束を積層、隣接配置して三次元積層移植体に形成することができる。ポリマー材料は移植後に人体に吸収され、個々の細胞の間に細胞間基質、特にコラーゲンからなる細胞間基質が構成され、最終的には周囲組織と一体化した完全に機能し得る組織構造ができる。しかし、この方法はまだ試験段階にあり、動物では実証されているが、人間医学ではまだ適用されていない。
上記方法の難しさは所望の移植体に成形するのが困難なことである。すなわち、積層、隣接配置した繊維束の形状が繊維材料の吸収時に安定していることは期待できない。また、大きな移植体の場合には移植体の内部にある細胞へ栄養を送るのが困難である。
発明が解決しようとする課題
本発明は、細胞組織、特に軟骨組織を移植に適した形状にすることができる移植体の作成方法を提供する。
この場合、移植体は成形が容易で、移植された状態で良好に形状を維持し、移植体の各細胞へ栄養が確実に供給されなければならない。
課題を解決するための手段
上記の本発明の課題は特許請求の範囲の請求項１に記載の方法で解決される。
発明を実施するための最良の形態
発明は、移植すべき場所に適した安定な形状を有する三次元の担体構造体（例えば、ポリマー繊維を用いて連続した接着性内面を有する小さな体積の担体構造体）を予め成形し、この担体構造体の内部空洞中に細胞を入れ、細胞を収容した担体構造体に栄養液を流すという基本的な考えに基づいている。
上記三次元の担体構造体は細胞間基質が少なくとも部分的に形成されたのちに直ちに移植することができる。
本発明では生体吸収時でも上記の三次元担体構造体によって細胞および細胞間基質の形状安定性が維持され、移植後も移植体の所望形状が確実に保持される。
本発明では、潅流によって担体構造体の内部に置かれた細胞に栄養液を十分に供給できる。この供給は細胞間基質が少なくとも部分的に構成されたときでも引き続き維持することができる。担体構造体への栄養液の進入・浸透は、本発明の担体構造体の構造および必要に応じて行われる適当な調製によって、実質的に拡散だけで行うことができる。これは生体内での状況と同じである。また、担体構造体中に収容された細胞への拡散による栄養供給は実質的に拡散のみが可能な材料で担体構造体全体を被覆することによって可能になる。このような材料の例はアガロースである。
拡散による担体構造体の細胞への栄養供給によって、細胞生成物、特に細胞間基質の構成に必要なコラーゲンおよびプロテオグリカンが細胞連結体から洗い流されてしまうのを防止することができる。担体構造体への栄養液の潅流を間欠的に行うことによって必要因子の拘束すなわち保持を一層改善できかつ促進できる。細胞生成物は潅流休止時にその場に保持され、細胞との結合を形成する。潅流段階で不要な細胞生成物を担体構造体および基質から洗い流すこともできる。
本発明の上記以外の構成は従属請求項の記載から明らかであろう。
実施例
以下、添付図面を用いて本発明で使用する装置と、本発明の実施例とを詳細に説明する。なお、下記説明では軟骨組織の生体外生成のみを説明するが、これ以外の細胞組織も同様に取り扱うことができるということは明らかである。
先ず、移植のために患者自身の軟骨細胞を常法により培養基で増殖する。
次に、生体吸収性があり且つ形状安定なポリマー繊維層で担体構造体を作成する。この形状が移植体の形状に相当する。上記ポリマー繊維層の材料の例はポリグリコールまたはポリラクチドである。これによって大きな連続した内面を有し且つ材料の体積が極めて小さい細胞層が作成される。
次に、担体構造体の連続した内面を付着因子、例えばポリＬリシンで被覆または湿潤する。この湿潤処理は例えば担体構造体をポリリシン液に浸漬した後、凍結乾燥することによって行われる。付着因子は担体構造体のほぼ全ての内面を被覆する。
上記細胞は、細胞培養に十分な数の細胞になった段階で、培養基と一緒に懸濁液にし、適当に調製した三次元担体構造体中に充填する。懸濁液の粘度を増すために生体吸収可能な増粘物質、例えばアガロースをこの懸濁液に加えることができる。
次に、例えば担体構造体を２％アガロース溶液に浸漬して細胞を収容した担体構造体をアガロースで被覆する。その後、例えば約４℃の冷水浴に浸漬して担体構造体を寒冷ショックに曝す。その際、被覆のアガロースが（場合によっては懸濁液に添加したアガロースも）固化する。この処置によってその後の取扱いが容易になる。
こうして調製された担体構造体が添付図面に１で示されている。この担体構造体１を潅流装置２に入れる。この潅流装置２は潅流室４を内部に有するハウジング３からなる。担体構造体１は潅流室４に入れる。ハウジング３には栄養液供給管５が接続されている。栄養液は先ず混合室６に入り、ここで流れが均一化された後に潅流室４に入る。潅流室４には流出室７が接続し、ここから流出管８が受液容器９へ通じている。潅流室４のハウジング３はカバー10で覆われ、ヒータ11によって37℃の平均体温に相当する一定温度に保持される。
潅流室４を別のアガロースで少なくとも部分的に充填することができる。
潅流室４には栄養液、例えばHAMSF12の名称で市販される液が供給される。この栄養液はポンプ12、例えば蠕動ポンプによって送られる。ポンプ12は供給管５に配設され、栄養液を貯蔵容器13から吸引する。この貯蔵容器13は例えば温度４℃の水浴14中にある。蠕動ポンプ12の単位時間当たりの輸送量は極めて小さい。例えば、軟骨組織の生成のために毎時約１ミリリットルに調整されている。この量で複数の担体構造体１（図面には潅流室４の中に３個の担体構造体）が十分に栄養される。なお、この担体構造体１は最大で親指爪の大きさの横断面を有している。
蠕動ポンプ12はタイマー15によって間欠的に制御される。間欠の間隔は担体構造体１と潅流室４の大きさとに応じて調整できる。実際にはポンピングおよび休止インターバルは分または時間単位の範囲内であろう。ポンピングおよび休止インターバルが各々約30分の時に好結果を得た。
潅流装置２自体は公知のものである。この潅流装置２はメンブレン膜に付着させた細胞を連続培養するにも使用され、従って、従来のペトリ皿に代わる役目をする。この場合、細胞培養が被着された膜はスリットを通して潅流室に入れることができる。
潅流装置２に通された栄養液はアガロースの被覆を通って担体構造体１中に拡散するので、その中に収容された細胞が栄養される。栄養液の流れとインターバル制御は、細胞間基質の形成のために必要な細胞生成物が洗い流されないで、その場所にとどまるように調整されている。時がたつにつれて細胞間基質のコラーゲン繊維が細胞の間に形成されて細胞が互いに結合される。この長く続く過程の間に、担体構造体とアガロースとが少なくとも部分的に溶解することができる。こうして形成された細胞間基質の形状は所定形状の移植体でも維持される。
一般に、約10日ないし数週間で細胞間基質が十分に形成される。その段階で担体構造体１を潅流室４から取り出して移植する。時とともに基質が形成を続け、担体構造体は生体に吸収される。
本発明方法で実際に細胞間基質が生体外で形成されることが確認された。このことは出願人の知る限り従来観察されていないことである。
なお、いわゆる組織形態形成因子を担体構造体の繊維層に付加することもできる。このような形態形成因子は細胞形成および細胞間基質の形成、さらには軟骨の形成を刺激する。このような因子は潅流室での細胞間基質の形成時に担体構造体に入れるか、移植後に担体構造体に入れることができる。巧妙な解決策は、組織形態形成因子を繊維層材料に直接に結合するか、抗体に結合し、抗体が付加されたハプテンを担体構造体の繊維層材料に備えることである。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の一つの実施例を示す概念図。
（参照記号）
１  担体構造体
２  潅流装置
３  ハウジング
４  潅流室
７  流出室
８  流出管
９  受液容器
10  カバー
11  ヒータ
12  ポンプ12
13  貯蔵容器
14  水浴
15  タイマー
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