【手続補正書】
【提出日】平成29年9月5日(2017.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アプタマーを含むｇＲＮＡであって、ｇＲＮＡが、アプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズしない、前記ｇＲＮＡと；（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体。
【請求項２】
アプタマーにリガンドが結合していて、任意に、リガンドが、小分子、代謝産物、ペプチド、または核酸である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体が標的核酸を結合する、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
アプタマーを含むｇＲＮＡであって、アプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズせず、アプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下ではＣａｓ９タンパク質を結合しない、前記ｇＲＮＡ。
【請求項５】
アプタマーが、アプタマーに特異的なリガンドにより結合されているとき、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質を結合する、請求項４に記載のｇＲＮＡ。
【請求項６】
アプタマーに結合する特異的リガンドの存在下または非存在下でＣａｓ９タンパク質を結合するが、アプタマーに結合した特異的リガンドの存在下でのみ標的核酸に結合する、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
【請求項７】
リガンドが、小分子、代謝産物、ペプチド、または核酸である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項８】
アプタマーがＲＮＡアプタマーである、請求項４〜７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項９】
ＲＮＡアプタマーがリボスイッチに由来し、任意に、リボスイッチが、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸エステル（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、またはプレケオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチである、請求項８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１０】
アプタマーがテオフィリンリボスイッチに由来し、配列番号３を含む、請求項９に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１１】
アプタマーが、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プラットフォームを使用して特異的リガンドを結合するよう操作されている、請求項４〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１２】
非アプタマー部分が、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み、アプタマーが、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００個のヌクレオチドを含む、請求項４〜１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１３】
（ｉ）請求項４〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体。
【請求項１４】
ＤＮＡを、（ｉ）ＤＮＡの部分を結合する配列を含む請求項４〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、（ｉｉ）ｇＲＮＡのアプタマーに結合した特異的リガンドと、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体に、Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡを切断する条件下で接触させることを含む、in vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法であって、任意に、ＤＮＡが細胞中にあり、任意に、細胞が真核細胞である、前記方法。
【請求項１５】
細胞において部位特異的ＤＮＡ切断を誘発するin vitroの方法であって、
（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを、細胞に接触させるかまたは細胞内で発現させること；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質を、細胞に接触させるかまたは細胞内で発現させること；および
（ｃ）ｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させ、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
細胞において部位特異的ＤＮＡ切断を誘発するin vitroの方法であって、（ａ）Ｃａｓ９タンパク質と、ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡとを含む複合体を、細胞に接触させること、および（ｂ）ｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させ、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成させることを含み、任意に、工程（ａ）および（ｂ）を、同時にまたは順次に任意の順番で実行する、前記方法。
【請求項１７】
Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡとを含む複合体であって、ｇＲＮＡが（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域とを含む、前記複合体。
【請求項１８】
（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域とを含むｇＲＮＡ。
【請求項１９】
領域（ｉ）、領域（ｉｉ）、および領域（ｉｉｉ）の各配列が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項２０】
ステムが領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部から形成されるステム・ループ構造を形成する、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡであって、任意に、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにあり、任意に、領域（ｉｉｉ）の配列とハイブリダイズする転写物の非存在下でステム・ループ構造が形成され、任意に、転写物が領域（ｉｉｉ）の配列を結合することにより、領域（ｉｉ）の配列が領域（ｉ）の配列とハイブリダイズしないように、ステム・ループ構造がアンフォールドされるか、またはステム・ループ構造の形成が阻止され、任意に、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質を結合し、領域（ｉｉｉ）の配列が転写物を結合すると領域（ｉ）の配列が標的核酸とハイブリダイズする、前記ｇＲＮＡ。
【請求項２１】
Ｃａｓ９タンパク質と、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡとを含む複合体。
【請求項２２】
ＤＮＡを請求項１７に記載の複合体と接触させることを含む、in vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法であって、任意に、ＤＮＡが細胞中にあり、任意に、細胞が真核細胞である、前記方法。
【請求項２３】
（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）標的核酸の他の領域とハイブリダイズする領域とを含むｇＲＮＡ。
【請求項２４】
領域（ｉ）および領域（ｉｉ）の各配列が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含み、領域（ｉｉｉ）の配列が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のｇＲＮＡであって、任意に、ステムが領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部から形成されるステム・ループ構造を形成するｇＲＮＡでって、任意に、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにあり、任意に、（ｉｉｉ）中の配列と相補し結合する標的核酸の領域の非存在下でステム・ループ構造が形成され、任意に、標的核酸の領域が領域（ｉｉｉ）の配列へハイブリダイゼーションすることにより、領域（ｉｉ）の配列が領域（ｉ）の配列とハイブリダイズしないように、ステム・ループ構造がアンフォールドされるか、またはステム・ループ構造の形成が阻止され、および任意に、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質を結合し、（ｉｉｉ）中の配列が標的核酸を結合すると（ｉ）中の配列が標的核酸を結合する、前記ｇＲＮＡ。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載のｇＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体であって、任意に標的核酸を含み、任意に、複合体の形成により、標的核酸が切断される、前記複合体。
【請求項２６】
請求項４〜１２、１８〜２０、２３および２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡをコードする単離したポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドおよび任意にＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
請求項４〜１２、１８〜２０、２３および２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび任意にＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現用ベクター。
【請求項２９】
請求項４〜１２、１８〜２０、２３および２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡおよび任意にＣａｓ９タンパク質を発現する遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項３０】
ＤＮＡを請求項１〜３、１３、１７、２１および２５のいずれか一項に記載の複合体に接触させることを含む、in vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法であって、任意に、ＤＮＡが細胞中にあり、任意に、細胞が真核細胞である、前記方法。
【請求項３１】
ＤＮＡを、Ｃａｓ９とｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡとを含む複合体と接触させることを含むin vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法であって、複合体のＤＮＡへの結合によりＤＮＡが切断され、任意に、ＤＮＡが細胞中にあり、任意に、細胞が真核細胞である、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本明細書で使用される「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子中のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することが可能な、例えばタンパク質または小分子などの薬剤を意味する。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、例えば核酸分子を結合し、核酸分子内のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断可能な酵素などのタンパク質である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、あるいはポリヌクレオチド鎖の末端リン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、本明細書では「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」、または「標的部位」とも呼ばれる特異的なヌクレオチド配列内の特異的なリン酸ジエステル結合を連結および／または切断する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、標的部位に相補する配列を有するＲＮＡ（例、ガイドＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」）と複合体を形成する（例えばそれと結合する）ことでヌクレアーゼの配列特異性を提供するＲＮＡ誘導型（すなわち、ＲＮＡプログラム可能）ヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、一本鎖標的部位を認識する。他の実施態様では、ヌクレアーゼは、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位などの二本鎖標的部位を認識する。例えば多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼなどの多くの天然に存在するヌクレアーゼ標的部位は、当業者には公知である。多くのケースでは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩなどのＤＮＡヌクレアーゼは、長さが４〜１０個の塩基対のパリンドロームである二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識し、標的部位内の特異的な位置で二本のＤＮＡ鎖の各鎖を切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を対称的に、すなわち本明細書では平滑末端とも呼ぶ末端が塩基対をなすヌクレオチドからなるように両鎖を同じ位置で切断する。他のエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を非対称的に、すなわち末端が対をなさないヌクレオチドからなるように両鎖を異なる位置で切断する。二本鎖ＤＮＡ分子の末端の不対のヌクレオチドは、不対のヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’または３’末端を形成するかにより、例えば「５’突出」または「３’突出」のように「突出」とも呼ばれる。末端が不対のヌクレオチドである二本鎖ＤＮＡ分子の末端は、相補的不対ヌクレオチドを含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に「粘着」可能なので、粘着末端とも呼ばれる。ヌクレアーゼタンパク質は、通常タンパク質と核酸基質との相互作用を仲介し、更にいくつかのケースでは、特異的に標的部位に結合する「結合ドメイン」と、核酸主鎖内のリン酸ジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」とを含む。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体の形態で核酸分子を結合・切断可能であるが、他の実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために二量体化または多量体化する必要がある。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインと、融合して特異的な標的部位に結合するヌクレアーゼを作成可能なモジュールの結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者には公知である。例えば、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）の結合ドメイン、すなわち不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質を、所望の標的部位を特異的に結合する結合ドメイン（例、ｇＲＮＡに結合して標的部位への結合を指示する）として使用し、例えばＦｏｋＩの切断ドメインなどの切断ドメインと融合または接合し標的部位を切断するよう操作されたヌクレアーゼを作成することが可能である。