(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去剤。
【請求項２】
アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去剤。
【請求項３】
ＡＴＰ含有試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを添加することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去法。
【請求項４】
ＡＴＰ含有試料にアピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを併用添加することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去法。
【請求項５】
アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを徴とする生物発光法における生物細胞測定試薬。
【請求項６】
アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法における生物細胞測定試薬。
【請求項７】
生物細胞を含有する試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法。
【請求項８】
生物細胞を含有する試料にアピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法。
【請求項９】
生物細胞を含有する試料が飲食品、その半製品、またはその素材である請求項７または８に記載の生物細胞測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アデノシン−５´−三リン酸の（以下ＡＴＰという）消去剤、ＡＴＰ消去法、それを用いた生物細胞測定試薬及び生物細胞測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌、酵母菌、乳酸菌及びその他の生物細胞の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超純水、環境などの分野において非常に重要である。
一般に生物細胞の測定は、血球計算盤による顕微鏡下での計測法（顕鏡法）、濁度測定法、重量測定法、パックド・ボリウム（ｐａｃｋｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）測定法及びコロニ−計測法（以下混釈培養法という）等が知られている。
しかしながら、検鏡法、濁度測定法、重量測定法及びパックド・ボリウム測定法は、感度が低い、死菌体と生菌体の区別ができない問題を有し、混釈培養法は細胞の培養を必要とするので、測定に通常１日以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さない。
ところで、上記分野における細胞数測定には、迅速且つ高感度の測定が要求され、例えば食品衛生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の検査は必要不可欠であり、従来、この検査は混釈培養法により行なわれているが、検査に１日以上を要するために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかなければならない。このため流通効率の点で問題があるだけでなく、牛乳などの製品では保管時間が長くなるにつれて微生物汚染の可能性が高くなる。また食品で汚染を問題にする微生物濃度は総じて低濃度であるため、高感度な検査が要求される。
【０００３】
上記の要求を満たす微生物濃度測定法として、生きた微生物には必ず存在するＡＴＰを生物発光法を用いて測定する方法が知られている。この方法は細胞を含む試料を、界面活性剤、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリス緩衝液、エタノ−ル又は溶菌酵素等を含んだ抽出試薬と接触させて、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した後、抽出したＡＴＰを蛍の発光の基質であるルシフェリンと酵素であるルシフェラ−ゼを含んだ発光試薬と接触し、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼ及びＡＴＰによる酵素反応により生物発光させ、その生成した発光量を測定して細胞内ＡＴＰを測定し、細胞の測定を行う方法である。
ところが、ＡＴＰは本来、その量の差こそあれ、すべての生物の細胞内に含まれるもので、微生物ばかりでなく、単細胞生物にも、そして動植物組織の細胞にもいわゆる体細胞として存在し、またさらに生物細胞の周辺にはフリ−（遊離）のＡＴＰが存在する。
従って、ある生物細胞を含有する試料から生物細胞だけに存在するＡＴＰを検出しようとしても、生物細胞中のＡＴＰと、その周辺に存在する遊離ＡＴＰが一緒になって検出されてくる。即ち、生物細胞の測定にＡＴＰを指標にしようと思っても今述べた生物細胞以外の遊離ＡＴＰがバックグランド発光量（ノイズ）として同時に測定され、検出感度の低下を招来する欠点を有する。
【０００４】
この遊離のＡＴＰを除去するための技術として、試料よりメンブレンフィルタ−を用いて除去するメンブレンフィルタ−法、遠心分離により分離する遠心分離法、アピラ−ゼ、アデノシントリホスファタ−ゼ（ＡＴＰａｓｅ）、ヘキソキナ−ゼまたはＡＴＰピロホスファタ−ゼ等を用いて分解消去する方法（以下酵素法という）（月刊フ−ドケミカル、食品化学新聞社発行、９５年５月号、第５５〜６３ペ−ジ；特開平２−６５８００；ＵＳＰ５，３１６，９０７、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２１８巻  ２０−２５ページ  １９９４年；ビュレティン・オブ・ザ・ジャパニーズ・ソサイアティー・オブ・サイエンティフィック・フィッシャリーズ（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ）  第５２巻  ９号  １６９５ページ１９８６年；及びマリン・エコロジー−プログレス・シリーズ（ＭａｒｉｎｅＥｃｏｌｏｇｙ−Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）  １３巻  ３０５−３０９ページ  １９８３年）等が知られている。
【０００５】
しかしながら、メンブレンフィルタ−法は操作が煩雑で、試料によっては濾過性が非常に悪く、ＡＴＰ除去効果も十分でないという問題点を有している。
また、遠心分離法は操作が煩雑で、試料中の固形分も同時に沈降して菌体とともに分離されるため、精度良く測定できない欠点を有している。
また酵素法は、検体のもつバックグランドをなかなか下げることが難しく、ＡＴＰ除去効果が十分でないという問題点を有していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生物細胞を含有する試料から遊離ＡＴＰを極力低くできるような新規なＡＴＰの消去法を提供し、これと生物発光法とを組合わせて、精度良く生物細胞を測定できる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アデノシンリン酸デアミナ−ゼに着目し、これを単独で、もしくはこれとアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれた少なくとも一種とを併用することにより、試料に含まれるＡＴＰを極力低い値に消去できることを発見した。
またこのＡＴＰ消去法と生物発光法を組合わせるときは、生物細胞以外の遊離ＡＴＰを極力低い値まで消去し、バックグランド発光量（ノイズ）の影響を取り除いて、生物細胞のもつＡＴＰのみを測定することにより、精度良く生物細胞の推定が可能となることを知り、これらの知見に基ずいて本発明を完成した。
【０００８】即ち本発明は（１）アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去剤であり、また本発明は（２）アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去剤であり、また本発明は（３）ＡＴＰ含有試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを添加することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去法であり、また本発明は（４）ＡＴＰ含有試料にアピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを併用添加することを特徴とする生物発光法におけるＡＴＰ消去法であり、また本発明は（５）アデノシンリン酸デアミナーゼを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法における生物細胞測定試薬であり、また本発明は（６）アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを有効成分として含有することを特徴とする生物発光法における生物細胞測定試薬であり、また本発明は（７）生物細胞を含有する試料にアデノシンリン酸デアミナーゼを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法であり、また本発明は（８）生物細胞を含有する試料にアピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とアデノシンリン酸デアミナーゼとを作用させ該試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することを特徴とする生物細胞測定法である。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるアデノシンリン酸デアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）は、別名アデニンヌクレオチドデアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）とも称される酵素である。なおこの酵素は「エンザイム・クラシフィケイション（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（以下ともＥ．Ｃ．と略記する）Ｅ．Ｃ．３．５．４．１７」と登録されている。
この酵素はＡＭＰに対して特異的に作用するＡＭＰデアミナ−ゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．６）や、アデノシンに対して特異的に作用するアデノシンデアミナ−ゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．５．４．４）とは異なり、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（以下、ＡＤＰという）、アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰという）、アデノシン、サイクリックＡＭＰ等、リン酸基の数にかかわらず、広い基質に対して作用し、脱アミノ反応を触媒する酵素である。
本酵素は、基質としてＡＴＰを用いたときはイノシン三リン酸（以下ＩＴＰと略記する）を生成し、ＡＤＰを用いたときはイノシン二リン酸（ＩＤＰ）を生成し、ＡＭＰを用いたときはイノシンモノリン酸（ＩＭＰ）を生成する。（赤堀四郎編「酵素ハンドブック」朝倉書店１９８２年１２月１日発行、第６１１ペ−ジ；馬場茂明ら編集、「臨床酵素ハンドブック」講談社１９８２年９月１０日発行、第５５頁参照；及びザ・ジャ−ナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジ−（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１３巻、３３５〜３４７ペ−ジ、１９６７年参照）並びにアグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻、６号、５０８〜５１４ペ−ジ、１９６５年）。
【００１０】
なお、ＡＴＰデアミナ−ゼ（ＡＴＰ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．５４．１８）（同「酵素ハンドブック」第６１１ペ−ジ、及びザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第６１巻、第１号、１〜９ペ−ジ、１９６７年参照）もアデノシンリン酸デアミナ−ゼと同様な基質特異性を有することが判明した。
したがって、本発明のアデノシンリン酸デアミナ−ゼとは、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ及びＡＴＰデアミナ−ゼを意味する。
【００１１】
本発明において用いるアピラ−ゼ（Ａｐｙｒａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．６．１．５）は、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰからの脱リン酸反応を触媒する酵素である（同「酵素ハンドブック」第６１７ペ−ジ参照）
【００１２】
またアデノシントリホスファタ−ゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．６．１．３）は、ＡＴＰからの脱リン酸を触媒する酵素である（同「酵素ハンドブック」第６１６ペ−ジ参照）。
【００１３】
またヘキソキナ−ゼ（Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．２．７．１．１）は、アデノシン三リン酸のリン酸をＤ−ヘキソ−スに転移してＤ−ヘキソ−ス−６−リン酸を生成する酵素である（同「酵素ハンドブック」第３３０ペ−ジ参照）。
【００１４】
またホスファタ−ゼは、酸性ホスファタ−ゼ（Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２）、アルカリホスファタ−ゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）などであって、脱リン酸を触媒する酵素である（同「酵素ハンドブック」第４３４〜４３５ペ−ジ参照）。
【００１５】
なお、比較例において使用される５’−ヌクレオチダ−ゼ（５’−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．１．３．５）は５’−リボヌクレオチドまたは５’−デオキシリボヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドおよびリン酸を生成する酵素である（同「酵素ハンドブック」第４３６ペ−ジ参照）。
【００１６】
本発明を実施するには、ＡＴＰ含有試料に、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で添加するか、または該酵素と共にアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを併用添加する。
これにより、該試料中のＡＴＰが効率よく強力に消去される。
【００１７】
本発明において用いられるＡＴＰ消去剤としては、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成分として含有するか、または該酵素とアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを有効成分として含有するＡＴＰ消去剤が挙げられる。
【００１８】
本発明の生物細胞の測定法は、大腸菌等の細菌、酵母菌、乳酸菌等の微生物細胞、植物細胞及び動物細胞等の生物細胞を含有する試料に、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で、又はこれにアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを併用添加して該試料中の遊離ＡＴＰを予め消去し、次いで該生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定することにより行なわれる。
【００１９】
上記生物細胞を含有する試料の具体例としては、飲食品製造工業、臨床検査工業、医薬品工業、排水処理工業、細菌検査、抗菌性テスト、抵抗性テスト等の微生物の生死のエンドポイントの測定、ＭＩＣ測定、その他ふき取り法による清浄度テスト等における任意の生物細胞を含有する試料を挙げることができる。
そして飲食品における生物細胞を含有する試料としては、飲食品、その半製品またはその素材等が挙げられる。その具体例としては蒲鉾、ハム等の魚介畜肉練製品；リンゴジュ−ス、トマトジュ−ス、牛乳等の飲料；豆腐などの植物蛋白加工食品；トマトケチャップ等の果物、野菜加工食品；醤油、味噌、清酒、ワイン、食酢等の醸造食品、ウスタ−ソ−ス、ポン酢醤油、つゆ、たれ、ドレッシング等の調味料、菓子パン、ウドン、蕎等の麺類、炊飯米等の穀類加工食品及び醤油麹、酵母エキス等の微生物培養物、その処理物等が挙げられる。
該試料が液体のものはそのまま一定量を、固体のものでは、その一定量をとって滅菌蒸留水を加え、粉砕機、マスティケ−タ−あるいはストマッカ−等にかけてホモジナイズする。あるいは強力に接触攪拌し、液体部分を回収して試料とする。
清浄度テストの場合は、綿棒のような拭き取りスティックを無菌水で湿らせ検査箇所を拭き取った後に、無菌水又は試薬液をいれた試験官の中ですすぎ、その液体部分を試料とする。
【００２０】
生物細胞を含有する試料に対し添加されるアデノシンリン酸デアミナ−ゼは、終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌが好ましい。
また、アピラ−ゼは、終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌが好ましい。
また、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼの添加量は、それぞれ終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜５０Ｕ／ｍｌが好ましい。
【００２１】
上記酵素の反応時におけるｐＨは、弱酸性〜弱アルカリ性の範囲において行うことが好ましい。
例えば、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ単独、またはこれにアピラ−ゼ併用の場合は、ｐＨ５．０〜８．０が好ましい。
試料のｐＨの調整には、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メス（ＭＥＳ）緩衝液などを使用することが好ましい。
【００２２】
上記酵素の反応時間は、生物細胞を含有する試料の種類・性状、反応時のｐＨ、酵素の添加濃度、反応温度により多少異なるが、約２時間以内、特に１〜３０分が好ましい。反応時間が長過ぎると、試料に含まれる微生物がその間に増殖するので、目的とする生物細胞数の正確な測定ができなくなり、測定値の精度・信頼性が損なわれる。
【００２３】
上記酵素の反応温度は、３０〜５０℃、特に４０〜４５℃が好ましい。
ＡＴＰ消去だけを目的とする場合は、上記温度範囲を採用することが好ましいが、生物細胞を含有する試料を対象とする場合は、温度が高すぎると該生物細胞が死滅する危険性を有するので、死滅しない温度範囲、即ち室温〜４０℃を採用することが好ましい。
【００２４】
本発明の生物細胞の測定試薬は、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で、又は該酵素とアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも１種とを併用して、反応液中における終濃度が以下の有効成分となるよう調製する。
併用する酵素の好適な濃度範囲を以下に示す。
アデノシンリン酸デアミナ−ゼ；終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌとなる濃度。
アピラ−ゼ；                  終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌとなる濃度。
アルカリホスファタ−ゼ；      終濃度で０．００１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０１〜５０Ｕ／ｍｌとなる濃度
酸性ホスファタ−ゼ；          同上
ヘキソキナ−ゼ；              同上
アデノシントリホスファタ−ゼ；同上
【００２５】
次に本発明の実施例において用いるＡＴＰ検量線を下記により作成した。
ベルト−ルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）社製ルミノメ−タ−  ルマット（Ｌｕｍａｔ）ＬＢ９５０１によるＡＴＰ検量線の作成を以下に示す。
既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに超純水１００μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ含有発光試薬（以下発光試薬ということがある）を１００μｌ添加し、ルミノメ−タ−  ＬＢ９５０１にて、１秒待ち３秒積算して相対発光量Ｓを求める、発光測定を行なった。
一方、超純水２００μｌにルシフェリンルシフェラ−ゼ発光試薬（以下発光試薬という）を１００μｌ添加し、同様に発光量Ｒを求める発光測定を行い、この測定値を試薬のブランク値Ｒとした。
Ｓ−Ｒを求めて、ＡＴＰの正味の発光量Ｚが求められるので、座標のＹ軸を正味の発光量Ｚとし、Ｘ軸をＡＴＰ濃度（Ｍ＝ｍｏｌ／ｌ）として、図１に示すＡＴＰ検量線を作成した。
【００２６】
次に、本発明の実施例において使用する酵素とその酵素活性の測定法を以下に示す。
（使用する酵素液）
（ａ）アデノシンリン酸デアミナ−ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来）５Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）（ｐＨ５．０）にＡＴＰを８０μＭとなるように溶解したものを基質溶液とした。基質液３ｍｌに酵素液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間反応した後に６０％過塩素酸１００μｌを添加して、反応を停止し、２６５ｎｍの吸光度ＯＤを測定した。
そしてＯＤ値が１分間当り２．４変化する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。
【００２７】
（ｂ）アピラ−ゼ  ｇｒａｄｅ  ＶＩＩＩ（ｆｒｏｍ  ｐｏｔａｔｏ）（シグマ社）５Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ６．５、３０℃において、ＡＴＰから１分間当り１．０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
【００２８】
（ｃ）酸性ホスファタ−ゼ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ（ｆｒｏｍ  ｗｈｉｔｅ  ｐｏｔａｔｏ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ４．８、３７℃において、１分間当り１．０μｍｏｌのパラニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分解する酵素量を１ユニットとした。
【００２９】
（ｄ）アデノシンデアミナ−ゼ  ｔｙｐｅ  Ｖ（ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｌｅｅｎ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ７．５、２５℃において、１分間当り１．０μｍｏｌのアデノシンを脱アミノしてイノシンに変換するする酵素量を１ユニットとした。
【００３０】
（ｅ）５´−ヌクレオチダ−ゼ（ｆｒｏｍ  ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ  ｖｅｎｏｍ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ９．０、３７℃において、アデノシン  ５′−モノリン酸を加水分解して、１分間当り１．０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
【００３１】
（ｆ）ＡＭＰデアミナ−ゼ（ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔ  ｍｕｓｃｌｅ）（シグマ社製）２５．５Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ６．５、２５℃において、１分間当り１．０μｍｏｌの５′−アデノシンモノリン酸を脱アミノして、５′−イノシンモノリン酸に変換する酵素量を１ユニットとした。
【００３２】
（ｇ）アデノシントリホスファタ−ゼ（ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）（シグマ社製）５Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ７．８、３７℃において、Ｎａ＋  、Ｋ＋  、Ｍｇ２＋の存在下で、ＡＴＰから１分間当り１．０μｍｏｌの無機リン酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
【００３３】
（ｈ）アルカリホスファタ−ゼ（ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ）（シグマ社製）２５０Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ９．８、３７℃において、１分間当り１．０μｍｏｌのパラニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分解する酵素量を１ユニットとした。
【００３４】
（ｉ）ヘキソキナ−ゼ（ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ）（ベ−リンガ−  マンハイム社製）５０Ｕ／ｍｌ
活性の測定法；ｐＨ７．６、２５℃において、１分間当たり１．０μｍｏｌのＡＴＰのリン酸をグルコースに転移する酵素量を１ユニットとした。
【００３５】
次に実施例を示して本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
（ＡＴＰを含有する酵母エキスに、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを単独で添加し、また該酵素と共にアピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群より選ばれる少なくとも一種とを併用添加して該ＡＴＰを消去する例）。
【００３６】
ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製粉末状酵母エキス１ｇを２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．８）１００ｍｌに溶解して、１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス（ｐＨ６．８）を調製した。
これを試料液として各５ｍｌづつ１９区分に分け、
第一区分（対照）には、超純水５０μｌを、
第二区分（本発明１）には、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第三区分（本発明２）には、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ及びアピラ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第四区分（本発明３）には、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、及び酸性ホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、０．０５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第五区分（本発明４）には、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液５０μｌ及びアデノシントリホスファタ−ゼ５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第六区分（本発明５）には、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ５０μｌ及びヘキソキナ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ及び０．５Ｕ／ｍｌ）を、
第七区分（本発明６）にはアデノシンリン酸デアミナーゼ酵素液５０μｌ、アルカリホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第八区分（本発明７）には、アデノシンリン酸デアミナーゼ酵素液５０μｌ、酸性ホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ）を
第九区分（比較例１）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第十区分（比較例２）には、同酵素液１００μｌ（終濃度０．１０Ｕ／ｍｌ）を、
第十一区分（比較例３）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及び、５’−ヌクレオチダ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第十二区分（比較例４）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、５’−ヌクレオチダ−ゼ酵素液５０μｌ及び、アデノシンデアミナ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）
第十三区分（比較例５）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及び酸性ホスファタ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第十四区分（比較例６）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ、酸性ホスファタ−ゼ酵素液５０μｌ及びアデノシンデアミナ−ゼ酵素液５０μｌ（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ、２．５Ｕ／ｍｌ及び２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第十五区分（比較例７）には、アピラ−ゼ酵素液５０μｌ及びＡＭＰデアミナーゼ酵素液５０μｌを（終濃度、それぞれ０．０５Ｕ／ｍｌ及び０．２５５Ｕ／ｍｌ）を、
第十六区分（比較例８）には、アデノシントリホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度、０．０５Ｕ／ｍｌ）を、
第十七区分（比較例９）には、ヘキソキナーゼ酵素液５０μｌ（終濃度０．５Ｕ／ｍｌ）を、
第十八区分（比較例１０）には、アルカリホスファターゼ酵素液５０μｌ（終濃度２．５Ｕ／ｍｌ）を、
第十九区分（比較例１１）には、酸性ホスファタ−ゼ酵素液５０μｌ、（終濃度２．５Ｕ／ｍｌ）を、
それぞれ添加し、３０℃で反応させ経時的に採取を行い、以下の方法により発光測定を行なった。
【００３７】
（発光測定法）
採取した試料１００μｌに超純水１００μｌを添加し、ルシフェリン、ルシフェラ−ゼを含む発光試薬を１００μｌ添加して、発光量Ｓを発光測定装置（ルミノメ−タ−  ＬＢ９５０１）を用いて、１秒待ち３秒積算し計測した。
一方上記計測法において「採取した試料１００μｌ」の代わりに「超純水１００μｌ」を用いる以外は全く同様にして発光量を測定し、この値を発光試薬のブランク値Ｒとした。
そしてＳ−Ｒを求めて正味の発光量Ａとした。
【００３８】
次にルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応は、試料中の成分により多少の発光阻害を受けるため、得られる発光量Ａは見かけ値である。そこで発光量Ａを以下のように補正する必要がある。
即ち、先ず下記式により発光率Ｋを求め、前記発光量Ａを発光率Ｋで除することにより補正値Ｙ（真の発光量）を求め、この補正値Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した検量線（図１）を利用して、真のＡＴＰ濃度を求めた（後述する実施例における補正発光値も、同様にして求めたものである）。
その結果を、図２に示す。
【００３９】
補正発光値Ｙの求め方。
Ｙ（補正発光値）＝    Ａ（見かけ値）／Ｋ（発光率）
Ｋ（発光率）＝「Ｈ（内標準値）−Ａ（見かけ値）」／Ｇ（本標準値）
Ｈ；経時的に採取し得られた各試料１００μｌにＡＴＰ標準液２×１０−９ｍｏｌ／ｌ（以下Ｍと略記する）１００μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラ−ゼ含有発光試薬１００μｌを添加し、発光測定を行い得られた値（内標準値）。
Ａ；上記各試料１００μｌに超純水１００μｌを添加し、同様に発光試薬１００μｌを添加し発光測定を行い得られた値（見かけ値）。
Ｇ；超純水１００μｌにＡＴＰ標準液２×１０−９Ｍ  １００μｌを添加し、発光試薬１００μｌを添加し、発光測定を行い得られた値（本標準値）。
Ｋ；発光率
Ｙ；補正発光値（真の発光測定値）
【００４０】
図２の結果から、アピラ−ゼ酵素液を、終濃度で０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加した比較例１及び同酵素液を０．１０Ｕ／ｍｌとなるように添加した比較例２、アピラ−ゼ及び５’−ヌクレオチダ−ゼを併用添加した比較例３、アピラ−ゼ、５’−ヌクレオチダ−ゼ及びアデノシンデアミナ−ゼを併用添加した比較例４、アピラ−ゼ及び酸性ホスファタ−ゼを併用添加した比較例５、アピラ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ及びアデノシンデアミナ−ゼを併用添加した比較例６、及びアピラ−ゼ及びＡＭＰデアミナ−ゼを併用添加した比較例７、アデノシントリホスファタ−ゼを添加した比較例８、ヘキソキナ−ゼを添加した比較例９、アルカリホスファタ−ゼを添加した比較例１０、酸性ホスファタ−ゼを添加した比較例１１は、いずれも酵母エキス中の初発のＡＴＰ濃度を約１／１０〜約１／１００に低減（１０−９Ｍ）するに止まり十分とは言えないことが判る。
【００４１】
これに対しアデノシンリン酸デアミナーゼを単独で添加した本発明１は、初発のＡＴＰ濃度を約数千分の一（１０−１１  Ｍ）まで低減することができ。
またアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加した本発明２、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ、アピラ−ゼ、及び酸性ホスファタ−ゼを併用添加した本発明３、アデノシンリン酸デアミナーゼとアルカリホスファターゼとを併用添加した本発明６及びアデノシンリン酸デアミナーゼと酸性ホスファターゼとを併用添加した本発明７は、約１０万分の一（１０−１３Ｍ）に低減することができることが判る。またアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアデノシントリホスファターゼを併用添加した本発明４は、約１万分の一に低減することができ、またアデノシンリン酸デアミナ−ゼとヘキソキナーゼを併用添加した本発明５は、約数万分の一（１０−１２Ｍ）に低減することができることが判る。
【００４２】
【実施例２】
（酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴＰを消去する場合の、該アデノシンリン酸デアミナ−ゼの好適濃度を求める例）
【００４３】
ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製粉末酵母エキスを１ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．８）に１％（Ｗ／Ｖ）添加溶解して、メンブレンフィルタ−（ミリポア社製ＭＩＬＬＥＸ−ＧＳ、孔径０．２２μｍ）で除菌濾過して無菌酵母エキス（ｐＨ６．８）とした。
この試料液を５ｍｌづつ８区分に分け、図３に示すごとく第１〜７の各区分に対しアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度となるように添加し、また比較のため第８区分にはアデノシンリン酸デアミナ−ゼを添加することなくアピラ−ゼのみを図３に示す終濃度となるように添加し、それぞれ３７℃で９０分反応させ、酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、得られた試料について、以下の方法により発光測定を行なった。
発光測定は、実施例１と同様にしてＡＴＰ濃度を求めた。
その結果を図３に示す。
【００４４】
図３の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを添加することなくアピラ−ゼのみを添加した区分では、ＡＴＰ濃度が１０−９Ｍ程度まで低減できるが、アピラ−ゼにアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加するときは、ＡＴＰ濃度をさらに低減することができ、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの濃度が増すにつれてＡＴＰの濃度を低減することができる。そして、その終濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上が好ましいことが判る。
【００４５】
【実施例３】
（アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用して予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素活性の存在下で既知濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ抽出剤とを添加する。そして通常のＡＴＰ抽出に要するといわれる時間、例えば２０秒間保持し、ＡＴＰの残存率を測定する。これにより生物細胞から抽出されるＡＴＰは、該抽出時間中にどれだけ分解消去されるかを推定することができる。また該アデノシンリン酸デアミナ−ゼ又は該アピラ−ゼの好適な濃度を求めることができる）
【００４６】
実施例２と同様にして、無菌の酵母エキスを５ｍｌづつ６区分に分け、各区分に図４に示す各終濃度となるように、アピラ−ゼ酵素液とアデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液を入れ、３７℃で９０分反応させ、酵母エキス中のＡＴＰを消去した。
得られた遊離ＡＴＰを消去した酵母エキス（両酵素の活性はそのまま維持）１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬を用いて希釈した２×１０−１１  ＭのＡＴＰ標準液を１００μｌ加え、速やかに実施例１と同様にして発光測定を行ない、その発光量Ａを求めた。
一方上記遊離ＡＴＰを消去した酵母エキス１００μｌ（同上）にキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加し、速やかに実施例１と同様にして発光測定を行ない、その発光量Ｃを求めた。
一方また上記遊離ＡＴＰを消去した酵母エキス（同上）１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬を用いて希釈した２×１０−１１  ＭのＡＴＰ標準液を１００μｌ加え、２０秒間保持した後実施例１と同様にして発光測定を行ない、その発光量Ｂを求めた。
初発のＡＴＰ標準液の発光量（Ａ−Ｃ）に対する２０秒経過後のＡＴＰ標準液の発光量（Ｂ−Ｃ）の百分率％「１００×（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）」を求めた。
それをＡＴＰ残存率として表示した。
その結果を図４に示す。
【００４７】
図４の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラーゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの濃度が高いとき、即ち終濃度が０．５〜０．２Ｕ／ｍｌであるときは、ＡＴＰ残存率が低く、約６０％以下となるが、終濃度が０．１Ｕ／ｍｌ以下の濃度であるときは、殆どＡＴＰが分解されることはなく、従ってＡＴＰ残存率を７０％以上保持することができることが判る。
そして、図３および図４の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼの終濃度は、低過ぎると酵母エキスの遊離ＡＴＰ消去が充分ではなく、反対に高過ぎると遊離ＡＴＰばかりでなく、抽出されたＡＴＰ（この実施例においては添加したＡＴＰ）をも分解消去し、そのため抽出されたＡＴＰの残存率が低下する危険性を有するので好ましくない。しかし、アデノシンリン酸デアミナ−ゼを０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ添加するときは遊離ＡＴＰ消去が充分に行なわれ、しかも該酵素は抽出されたＡＴＰに対しては殆ど影響をもたず、その残存率を７０％以上に保持することができることが判る。
【００４８】
【実施例４】
（酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴＰを消去する場合において、該アピラ−ゼの好適濃度を求める例）
【００４９】
実施例２と同様にして、無菌の酵母エキスを調製し、この酵母エキスを５ｍｌづつ８区分に分け、各区分に図５に示す各終濃度となるようにアデノシンリン酸デアミナ−ゼまたは、該酵素及びアピラ−ゼとを入れ、３７℃で９０分反応させ、該酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去した。
遊離ＡＴＰを消去し得られた酵母エキスの発光測定を行ない、実施例１と同様にしてＡＴＰ濃度を求めた。
その結果を図５に示す。
【００５０】
図５の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ単独添加区分では、ＡＴＰ濃度が１０−１１  Ｍ程度まで低減できるが、これにアピラ−ゼを併用添加するときは、ＡＴＰ濃度をさらに低減することができ、その終濃度が増すにつれてＡＴＰの濃度を低減することができる。そして、アピラ−ゼの終濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上、特に０．０５〜０．５Ｕ／ｍｌが好ましいことが判る。
【００５１】
【実施例５】
（アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用して予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素の活性が持続している状態において、既知濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ抽出剤を添加し、通常のＡＴＰ抽出に必要と言われる時間、例えば２０秒間保持したとき、該ＡＴＰがどれほど残存するを求めた例）
【００５２】
実施例２と同様にして得られた無菌の酵母エキスを５ｍｌづつ８区分に分け、各区分に図６に示す各終濃度となるように、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液とアピラ−ゼ酵素液を入れ、３７℃で９０分反応させ、酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、得られた反応液を用いてＡＴＰの残存率を測定した。
ＡＴＰ残存率の測定は、実施例３に記載された方法により行なった。
その結果を図６に示す。
【００５３】
図６の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼにアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、アピラ−ゼの濃度が高いとき、即ち終濃度０．５Ｕ／ｍｌであるときは、ＡＴＰ残存率が低く、６０％以下となるが、終濃度が０．２Ｕ／ｍｌ以下であるときは、殆どＡＴＰが分解されることはなく、従ってＡＴＰ残存率を７０％以上保持することができることが判る。
そして、図５および図６の結果から、アピラ−ゼの終濃度は、低過ぎるときはＡＴＰ消去が充分ではなく、反対に高過ぎるときはＡＴＰ残存率が低下する。これに対して、０．０１〜０．２Ｕ／ｍｌであるときはＡＴＰ消去が充分に行なわれ、しかもＡＴＰ残存率を７０％以上保持することができるので、好ましいことが判る。
【００５４】
【実施例６】
（アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用して予め酵母エキスの遊離ＡＴＰを消去し、次いで両酵素活性の存在下で様々な濃度のＡＴＰを含むＡＴＰ抽出剤を添加する。そして通常のＡＴＰ抽出に要するといわれる時間、１０秒、２０秒及び３０秒間保持し、ＡＴＰの残存率を測定する。これにより生物細胞から抽出される様々な濃度のＡＴＰは、所定の抽出時間帯に両酵素によってどれだけ分解消去されるかを推定することができる）
【００５５】
実施例２と同様にして無菌の酵母エキスを調製し、この酵母エキスにアデノシンリン酸デアミナ−ゼ酵素液とアピラ−ゼ酵素液を入れ、終濃度がそれぞれ０．０５Ｕ／ｍｌとなし、３０℃で１８０分反応させ、酵母エキス中のＡＴＰを消去した。
このＡＴＰを消去した酵母エキス１００μｌに、キッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬を用いて希釈した、図７に示すごとき様々な濃度のＡＴＰ標準液１００μｌを加え、図７に示す如き、初発、１０秒、２０秒及び３０秒保持したものについて、実施例１と同様にして発光測定を行ない、ＡＴＰの残存率を測定した。
ＡＴＰ残存率の測定は、実施例３に記載された方法により行なった。
その結果を図７に示す。
【００５６】
図７の結果から、アデノシンリン酸デアミナ−ゼにアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、添加されたＡＴＰ濃度は、高い（２×１０−９Ｍ）、低い（２×１０−１３  Ｍ）に拘らず、ＡＴＰはほぼ同じ割合で減少し、またその減少は緩やかで、３０秒保持後においても８０％以上残存することことが判る。
即ち、新たに添加されたＡＴＰは、微生物からのＡＴＰ抽出時間帯に相当する３０秒間保持しても殆ど分解されないため、抽出された（本実施例では添加された）ＡＴＰの正確な測定が可能となることが判る。
従って、微生物から抽出されたＡＴＰの正確な測定が可能となり、微生物の菌数の正確な測定が可能となる。
また、ＡＴＰ濃度により残存率の差は認められないので、生物細胞の濃度により影響は受けない特徴を有し、このことから、生物細胞の測定に際し、検体の希釈操作が簡略化できる効果を奏する。
【００５７】
【実施例７】
（酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴＰを消去する場合の、好適ｐＨを求める例）
【００５８】
ディフコ社製粉末酵母エキスを図８に記載の如く、各ｐＨを有する５ｍＭの緩衝液に１％（Ｗ／Ｖ）添加溶解してメンブレンフィルタ−で除菌濾過して各ｐＨを有する無菌の酵母エキスを調製した。
この酵母エキスを５ｍｌづつ７区分に分け、各区分に対しアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度が０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、それぞれ３７℃で３０分反応させ、得られた酵母エキスについて、以下の方法により発光測定を行なった。
発光測定は、実施例１と同様にして行いＡＴＰ濃度を求めた。
その結果を図８に示す。
【００５９】
図８の結果から、酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、該エキス中に存在する遊離ＡＴＰを消去する場合のｐＨは、５．０〜８．０が好ましく、特に５．０〜７．０がより好ましいことが判る。
【００６０】
【実施例８】
（酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、該エキスの遊離ＡＴＰを消去する場合の好適温度を求める例）
【００６１】
実施例２と同様にして無菌の酵母エキスを調製し、これを５ｍｌづつ９区分に分け、各区分に対しアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを各終濃度が０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、それぞれ図９に記載の如き各反応温度で３０分反応させ、得られたサンプルについて、以下の方法により発光測定を行なった。
発光測定は、実施例１と同様にして行いＡＴＰ濃度を求めた。
その結果を図９に示す。
【００６２】
図９の結果から、酵母エキス中にアデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して該エキスの遊離ＡＴＰを消去する場合の好適温度は、２５〜５５℃、より好ましくは３５〜５０℃、最も好ましくは４０〜４５℃であることが判る。
【００６３】
さて、ここで以下の本発明の実施例において採用するＡＴＰ検量線を、キッコーマン社製ルミノメーター、ルミテスタ−Ｋ−１００を用いて作成した。
即ち、既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに超純水１００μｌを添加し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を１００μｌ添加し、キッコーマン社製ルミノメーター、ルミテスターＫ−１００にて相対発光量Ｓを測定した。
一方、超純水２００μｌに発光試薬を１００μｌ添加し、同様に発光測定を行い、これを発光試薬の発光量Ｒ（ブランク値）を求めた。
Ｓ−ＲによりＡＴＰによる正味の発光量Ｚが求められるので、座標のＹ軸を正味の発光量Ｚの値、Ｘ軸をＡＴＰの濃度（Ｍ＝ｍｏｌ／ｌ）として、図１０に示す検量線を作成した。
【００６４】
【実施例９】
（ＡＴＰ消去剤の影響を取り除いた状態で、スタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰ量を測定した例）
【００６５】
以下の各工程をこの順序で行い、実際の被検微生物スタフィロコッカス・アウレウスの培養液の生物細胞数の測定を行った。
第一工程；被検微生物を標準液体培地で培養して、培養液を調製する。
第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消去
第三工程；標準液体培地を利用した希釈液の調製
第四工程；遊離ＡＴＰを消去した培養液を希釈液で希釈し被検微生物懸濁液の調製
第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定
第六工程；被検微生物懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴＰと、抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光測定
第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出
第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出
第九工程；補正値に対するＡＴＰ濃度の算出
第十工程；混釈培養法により、被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
【００６６】
（第一工程；被検微生物を標準液体培地で培養して、培養液を調製する）
オ−トクレ−ブにより滅菌処理した標準液体培地（０．２５％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐＨ７．１）８ｍｌにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３を一白金耳接種し、３５℃で一晩静置培養して、被検微生物の培養液を得た。
【００６７】
（第二工程；培養液から遊離ＡＴＰの消去）
該培養液（生菌体を多量に含有する）２ｍｌに、アピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３５℃で３０分間処理して、培養液の遊離ＡＴＰを予め消去した。
これによりＡＴＰのブランク値を低下させることができる。
【００６８】
（第三工程；標準液体培地を利用した希釈液の調製）
一方上記微生物を接種しない標準液体培地１００ｍｌにアピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３５℃で９０分反応して遊離ＡＴＰを消去し、ついでオ−トクレ−ブで１２０℃１５分間滅菌処理して両酵素を失活させ、遊離ＡＴＰが消去された無菌標準液体培地からなる希釈液を調製した。
【００６９】
（第四工程；遊離ＡＴＰを消去した培養液を希釈液で希釈して被検微生物懸濁液の調製）
第二工程で得られた、遊離ＡＴＰを消去した培養液に第三工程で得られた希釈液を添加して、被検微生物の１００００倍希釈懸濁液を調製した。
これを３５℃で３０分間保持して発光測定用の試料とした。
【００７０】
（第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定）
被検微生物の１００００倍希釈懸濁液１００μｌに、滅菌超純水１００μｌを添加し発光試薬１００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて発光測定した。
この測定により被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（以下フリ−の発光量Ｆという）を求める。
【００７１】
（第六工程；被検微生物の懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、該抽出剤添加前から存在する遊離ＡＴＰと、抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光測定）
被検微生物の希釈懸濁液１００μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光測定した。
この測定によって試料の遊離ＡＴＰと抽出剤の作用により微生物菌体外に抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）とのト−タルＡＴＰの発光量（Ｔ）を求めた。
【００７２】
（第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量算出）
前工程のト−タル発光量（Ｔ）からフリ−発光量（Ｆ）を減ずることにより、菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求めることができる。
【００７３】
（第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出）
ここに至るまでにおけるルシフェリン−ルシフェラ−ゼの生物発光反応は、試料に含まれる成分により多少の阻害を受けるため、発光阻害を受けないときの発光量を得るには補正をしなければならない。補正は以下のようにした行なった。
即ち、被検微生物懸濁液１００μｌに２×１０−１０ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて発光量を測定し、内標準発光量Ｈを求めた。
上記内標準発光量の測定法において、被検微生物懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にして発光量を測定し、本標準発光量Ｇを求めた。
内標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより、発光率Ｋを求め、第七工程で得られた菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより、発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量Ｙ（補正値）を求めた。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００７４】
（第九工程；補正値に対応するＡＴＰ濃度の算出）
発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求めた。
【００７５】
（第十工程；混釈培養法により、被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
滅菌シャ−レに適宜希釈した被検微生物懸濁液の一定量を滅菌ピペットで無菌的に加え、約５０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地（０．２５％酵母エキス、０．５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐＨ７．１、２．０％寒天）を加え、シャ−レの蓋をして、前後左右にゆるく動かし、かつ回すようにして被検微生物懸濁液と培地とを均一に混和し、３５℃で２４時間培養して、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から原液１ｍｌ当り存在する微生物数（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（ＣＦＵ））を推定する。
【００７６】
（第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定）
発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を第十工程で求めた被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍｌ）で除することにより、スタフィロコッカス・アウレウスの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。
その結果、２×１０−１７ｍｏｌ／ＣＦＵを得た。
以上の結果をまとめて表１に示す。
【００７７】
0003547882.tif 000002
【００７８】
【実施例１０】
（実施例９において得られたスタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣＦＵ当りのＡＴＰの測定値（約２×１０−１７ｍｏｌ）を用いてＡＴＰ消去剤の影響下、その活性を保持した状態でスタフィロコッカス・アウレウス培養液の希釈懸濁液の生菌体ＣＦＵの測定法）
第一工程；培養液を希釈液で所定濃度まで希釈し、被検微生物の希釈懸濁液の調製。
第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去。
第三工程；被検微生物の希釈懸濁液に微存する遊離ＡＴＰの発光測定
第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、微存する遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光測定
第五工程；菌体内ＡＴＰの算出
第六工程；補正発光量の算出
第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出
第八工程；スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出。
第九工程；比較例（混釈培養法による被検微生物の希釈懸濁液のｍｌ当たり  のＣＦＵの算出）
【００７９】
（第一工程；培養液を希釈液で所定濃度まで希釈し、被検微生物の希釈懸濁液の調製）
前記実施例の第一工程で得られたスタフィロコッカス・アウレウスの培養液を、オ−トクレ−ブにより加熱滅菌処理した標準液体培地（希釈液）で、１万倍、１０万倍、１００万倍、１０００万倍に希釈し、被検微生物の希釈懸濁液を得た。
【００８０】
（第二工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上記被検微生物の希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３５℃で３０分反応して、ＡＴＰを消去した。
【００８１】
（第三工程；被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量測定）
被検微生物の希釈懸濁液１００μｌに滅菌超純水１００μｌを添加し、発光試薬１００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。
この測定により被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（Ｆ）を求めることができる。
【００８２】
（第四工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、遊離ＡＴＰと抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量を求める）
被検微生物の希釈懸濁液１００μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。
この測定により、抽出剤の作用により抽出された菌体内ＡＴＰの発光量および懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の和を求めることができるので、これをト−タル発光量Ｔとした。
【００８３】
（第五工程；菌体内ＡＴＰの算出）
このト−タル発光量Ｔからフリ−発光量Ｆを減ずることにより、菌体内ＡＴＰの正確な発光量を求める。
【００８４】
（第六工程；補正発光量の算出）
ここに至る各工程においてルシフェリン−ルシフェラ−ゼによる生物発光反応は、懸濁液に含まれる成分により多少の阻害を受けるため、以下の方法により補正し阻害を受けない場合の発光量を求める。
被検微生物の希釈懸濁液１００μｌに２×１０−１０ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて内標準発光量Ｈを求めた。
上記内標準発光量Ｈの測定において、被検微生物の希釈懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にして本標準発光量Ｇを求めた。
内標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより発光率Ｋを求め、菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより、補正発光量Ｙを求める。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【００８５】
（第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出）
補正発光量Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求める。
【００８６】
（第八工程；スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出）
第七工程で求めた補正発光量に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を前記実施例９の第十一工程（最終工程）で求めたスタフィロカッカス・アウレウスのＣＦＵ当たりのＡＴＰ量、約２×１０−１７ｍｏｌで除することにより、スタフィロコッカス・アウレウスの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出した。
【００８７】
第九工程；比較例（混釈培養法による被検微生物の希釈培養液のｍｌ当たり  のＣＦＵの算出）
滅菌シャ−レに適宜希釈した被検微生物浮遊液の一定量を滅菌ピペットで無菌的に予め加え、約５０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地を加え、シャ−レの蓋をして、前後左右にゆるく動かし、かつ回すようにして被検微生物浮遊液と培地とを均一に混和し、３５℃で２４時間培養して、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物浮遊液のｍｌ中に存する微生物数（ＣＦＵ）を測定した。
こうして求めたＣＦＵ濃度を混釈法により求めた実測値（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
以上の結果をまとめて表２に示す。
【００８８】
0003547882.tif 000003
【００８９】
【実施例１１】
（エセリシア・コリのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法）
実施例９のスタフィロコッカス・アウレウスのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法において、「スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３」を用いる代わりに、「エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＩＳＬ  Ｂ−４３００」を用いる以外は、全く同様にしてＣＦＵ当りのＡＴＰ量を測定した。
その結果をまとめて表３に示す。
【００９０】
0003547882.tif 000004
【００９１】
【実施例１２】
（エセリシア・コリ培養液の希釈懸濁液の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定）
実施例１０のスタフィロコッカス・アウレウスの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定法において、被検微生物として「スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３」を用いる代わりに、「エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＩＳＬ  Ｂ−４３００」を用いる以外は、全く同様にしてエセリシア・コリ培養液の希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
その結果をまとめて表４に示す。
【００９２】
0003547882.tif 000005
【００９３】
【実施例１３】
（サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法）
実施例９のスタフィロコッカス・アウレウスのＣＦＵ当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）の測定法において、培地として「標準液体培地」を用いる代わりに「ＹＭ培地（ブドウ糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、ｐＨ６．０）」を用い、また「標準寒天培地」を用いる代わりに「寒天入りＹＭ培地（ブドウ糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、寒天２％、ｐＨ６．０）」を用い、また使用する被検微生物として「スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３」を用いる代わりに「サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８」を用いる以外は、全く同様にしてサッカロミセス・セレビシエの生菌数（ＣＦＵ）当りのＡＴＰ量（ｍｏｌ／ＣＦＵ）を測定した。
その結果をまとめて表５に示す。
【００９４】
0003547882.tif 000006
【００９５】
【実施例１４】
（サッカロミセス・セレビシエ培養液の希釈懸濁液の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定）
実施例１０のスタフィロコッカス・アウレウスの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定法において、被検微生物として「スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ２５９２３」を用いる代わりに、「サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８」を用いる以外は、全く同様にしてサッカロミセス・セレビシエ培養液の希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
その結果をまとめて表６に示す。
【００９６】
0003547882.tif 000007
【００９７】
表１〜表６の結果から、本発明の方法によれば、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言われている、混釈培養法に匹敵するＡＴＰの測定法を提供することができる。そして、本発明によれば従来法が必要としていた培養工程を省略することが可能となり、検査に要する時間が数十分にて完了できるので、処理時間を従来法に比べて大幅に短縮することができる。また、希釈するための実験器具、希釈したり培地を調製するための時間と労力を大幅に軽減することができることが判る。
また標準液体培地及びＹＭ培地において、遊離ＡＴＰはそれぞれ相対発光値（ＲＬＵ）で９２１００及び１３９３５０もあり、菌数の測定はできなかった。
しかし、ＡＴＰ消去試薬により遊離のＡＴＰを消去し、フリー発光値を低下させることにより、スタフィロコッカス  アウレウスや、サッカロミセス  セレビシエのように１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的多い場合では、数１０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能であり、エセリシア  コリのように、１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量が比較的少ない場合では、４０から５０ＣＦＵ／ｍｌから検出が可能となった。よって、ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも、検出感度が十分に高いことが判る。
なお、本発明の方法によって得られた計算値の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）と、混釈培養法によって得られた実測値の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の相関係数を求めたところ、いずれの菌の場合も０．９９であり、極めて良好な相関を示し、ＡＴＰ消去試薬が活性を保持した状態でも、正確な菌数の測定が可能であることが判る。
また、本発明により求められた各微生物から抽出されたＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）と混釈培養法により求められた実測値の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）との関係をまとめて図１１に示す。
この図から、いずれの微生物の場合も良好な検量線（直線性）を描くことができる。
以上のことから、本発明により求めた微生物から抽出されたＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）から菌数の正確な測定が可能であることが判る。
【００９８】
【実施例１５】
（液体栄養培地ＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰ消去法）
液体栄養培地ＳＣＤ培地（トリプトン１．５％、ソイトン０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．３）にアデノシンリン酸デアミナ−ゼを終濃度０．０１Ｕ／ｍｌとなるように加え、３５℃で１２０分保持し、経時的に試料を採取し、発光測定を行なった。
発光測定は試料１００μｌに０．３ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μｌ添加し、さらにキッコ−マン社製ルシフェ−ルＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）１００μｌを添加し、同社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて発光量を測定した。
その結果を表７にまとめて示した。
表７の結果から、初発（即ちアデノシンリン酸デアミナ−ゼの作用がない）場合のＳＣＤ培地におけるＡＴＰ濃度は、相対発光量値で２７１８も存在するが、該酵素の作用が開始されると遊離ＡＴＰが速やかに減少し、６０分で殆ど消去されることが判る。
0003547882.tif 000008
【００９９】
【実施例１６】
（バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法）
実質的に無菌の醤油麹２０ｇにバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＨＵ１０３５を図１２に示す添加量（個／麹ｇ）となるように添加し、人為的にバチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹を得た。
この醤油麹に０．３ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を８０ｍｌ添加して、よく攪拌し懸濁液を調製した。
次いで、前記懸濁液８ｍｌに、上記実施例１５に記載したＳＣＤ培地の４倍濃度調製液（トリプトン６．０％、ソイトン２．０％、ＮａＣｌ２．０％、ｐＨ７．３）２ｍｌ及び２％ナイスタチン（麹菌の生育阻害剤）の７０％エタノ−ル溶液５０μｌ、アデノシンリン酸デアミナ−ゼ５Ｕ／ｍｌを２０μｌ（終濃度０．０１Ｕ／ｍｌ）を加えて３５℃でバチルス・ズブチリスのみを選択的に静置培養し、この培養の途中において培養液を経時的に１００μｌづつ採取して、キッコ−マン製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌ添加し、２０秒後にキッコ−マン製ルシフェ−ルＬＵ（ＡＴＰ測定試薬）の１００μｌを添加し、キッコ−マン製ルミテスタ−Ｋ−１００で発光測定（数値は相対発光量で示した）を行なった。
この発光量を測定することにより、バチルス・ズブチリスの経時的な相対増殖量を調べることができる。
その結果を図１２に示す。
【０１００】
前述したように表７の結果からＳＣＤ培地には高濃度の遊離ＡＴＰが存在し、相対発光量値は２７１８を示す。この値は本実施例の５．０×１０３個／  麹ｇの区分における４時間経過後のバチルス・ズブチリス由来のＡＴＰ濃度（相対発光量＝約３０００）と区別できない。そのため、ＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰを消去しない従来法においてはバチルス・ズブチリスの正確な測定ができないことが判明した。
これに対し本発明によれば、図１２の結果から明らかなように、予めＳＣＤ培地の遊離ＡＴＰを消去することにより、バチルス・ズブチリス由来の正確なＡＴＰ量の測定ができることが判る。
【０１０１】
【実施例１７】
（乳酸菌に汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法）
実施例１６のバチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法において、「バチルス・ズブチリス」の代わりに「乳酸菌ロイコノストック・メッセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＨＵ１０６５」を用いる以外は、全く同様にして、乳酸菌に汚染された醤油麹の該乳酸菌の定量法を実施した。
結果を図１３に示す。
【０１０２】
図１２及び図１３の結果から、醤油麹に混入したバチルス・ズブチリス及び乳酸菌の初発濃度がそれぞれ５×１０２個／ｇ麹及び４．３×１０２個／ｇ麹の区分においては４時間経過後においても相対発光量が殆ど増大しない。
これに対し、初発濃度がそれぞれ５×１０３個／ｇ麹及び３．３×１０３個／ｇ麹の区分においては相対発光量が４時間後において著しく増大することが判る。
この結果から、醤油麹の盛込原料の初発の汚染細菌（バチルス・ズブチリス及び乳酸菌）のおおまかな定量が可能であることが判る。
【０１０３】
【実施例１８】
（雑細菌に汚染された製麹原料の該雑細菌の定量法）
通常の醤油麹の製造法に従って、蒸煮した脱脂大豆に炒熬割砕した小麦を混和して製麹原料を調製した。
これに醤油用種麹を接種し、生活雑廃水から分離された各種雑細菌の懸濁液（生菌数１０９／ｍｌ）を均一に噴霧して、雑細菌に汚染された製麹原料を得た。
この原料は図１７に記載の如き雑細菌（個／ｇ麹）を有する製麹原料であった。
次いで、実施例１６のバチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該汚染菌の定量法において、「バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹」を用いる代わりに、上記「雑細菌に汚染された製麹原料」を用いる以外は、全く同様にして該雑細菌の定量を実施した。
結果を図１７に示す。
【０１０４】
図１７の結果から、一般の醤油麹の製造に際し、製麹開始時の雑細菌のおおまかな菌数の推定が可能であることが判る。
即ち、製麹原料に混入した各種雑細菌濃度が、１．５×１０２個／  ｇ原料においては４時間経過後においても相対発光量が殆ど増大しないが、３．２×１０３個／ｇ原料においては４  時間後において相対発光量が著しく増大することから初発の製麹原料の各種雑細菌のおおまかな定量が可能であることが判る。
【０１０５】
【実施例１９】
（サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量の測定法）
以下の各工程をこの順序で行い、サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当りのＡＴＰ量の測定を行った。
第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエの培養液の調製
第二工程；被検微生物培養液から遊離ＡＴＰの消去
第三工程；被検微生物培養液の希釈用リン酸緩衝液の調製
第四工程；被検微生物懸濁液の調製
第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定
第六工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、該抽出剤添加前の遊離ＡＴＰと、添加後抽出された菌体内ＡＴＰからなるト−タルＡＴＰの発光測定
第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量の算出
第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出
第九工程；補正発光値に対応するＡＴＰ濃度の算出
第十工程；混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出
第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
【０１０６】
第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエの培養液の調製
オ−トクレ−ブにより加熱殺菌処理したＹＭ培地（ブドウ糖１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、ｐＨ６．０）８ｍｌにサッカロミセス・セレビシエ、ＮＩＳＬ  Ｙ−３３９８を一白金耳接種し、３５℃で一晩静置培養して培養液を得た。
【０１０７】
第二工程；被検微生物培養液から遊離ＡＴＰの消去
前工程で得た培養液（生菌体を多量に含有する）２ｍｌに、アピラ−ゼ及びアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３５℃で３０分間処理して、培養液の遊離ＡＴＰを予め消去した。
これによりＡＴＰのブランク値を低下させることができる。
【０１０８】
第三工程；被検微生物培養液の希釈用リン酸緩衝液の調製
０．６２５ｍＭ・ＫＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）をオ−トクレ−ブで加熱殺菌して、前工程で得た遊離ＡＴＰ消去済培養液の希釈液（以下リン酸緩衝液という）を調製した。
【０１０９】
第四工程；被検微生物懸濁液の調製。
遊離ＡＴＰを消去した培養液に希釈用リン酸緩衝液を添加して、被検微生物サッカロミセス・セレビシエの１００，０００倍希釈液を調製し、２５℃で３０分放置してこれを発光測定用の試料とした。
【０１１０】
第五工程；被検微生物懸濁液の遊離ＡＴＰの発光測定
被検微生物サッカロミセス・セレビシエの１００，０００倍希釈懸濁液１００μｌに滅菌超純水１００μｌ及び発光試薬１００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。
この測定により被検微生物の希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量（以下フリ−の発光量Ｆという）を求める。
【０１１１】
第六工程；被検微生物の希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、該抽出剤添加前の遊離ＡＴＰと、添加後抽出されたＡＴＰからなるト−タルＡＴＰの発光測定  被検微生物の１００，０００倍希釈懸濁液１００μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。この測定法により、試料の遊離ＡＴＰと抽出剤の作用により微生物菌体外に抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）とのト−タルＡＴＰの発光量（Ｔ）を求めた。
【０１１２】
第七工程；菌体内ＡＴＰの発光量の算出
前工程で得たト−タル発光量（Ｔ）からフリ−発光量（Ｆ）を減ずることにより菌体内ＡＴＰの正確な発光量（Ｔ−Ｆ）を求める。
【０１１３】
第八工程；菌体内ＡＴＰの発光量の補正値の算出
これまでのルシフェリン−ルシフェラ−ゼ発光反応は、被検微生物懸濁液に含まれる種々の成分により多少の阻害を受けるため、真の発光測定値（即ち発光阻害を受けないときの発光量）を得るため以下に記載の通り補正を行なった。
被検微生物１００μｌに２×１０−１０ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて測定して、発光量を測定し、内標準発光量Ｈを求めた。
次に、上記内標準発光量の測定法において、被検微生物懸濁液１００μｌを使用する代わりに、滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にして発光量を測定し、本標準発光量Ｇを求めた。
内標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより、発光率Ｋを求め、第七工程で得られた菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより、発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）Ｙを求めた。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【０１１４】
第九工程；補正発光値に対応するＡＴＰ濃度の算出
発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求めた。
【０１１５】
第十工程；混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出
被検微生物懸濁液を滅菌処理したＹＭ培地で適宜濃度となるように希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有するＹＭ培地に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５℃で一晩培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。
【０１１６】
第十一工程；ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量の測定
発光阻害がないときの菌体内ＡＴＰの発光量（補正値）に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を第十工程で求めた被検微生物懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍｌ）で除することにより、被検微生物サッカロミセス・セレビシエの１ＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めた。
その結果、３．０７×１０−１６ｍｏｌ／ＣＦＵを得た。
なお、この結果は先の実施例１１のそれ（１．２１×１０−１６ｍｏｌ／ＣＦＵ）と若干相違するが、これは希釈懸濁溶液の相違に基ずくものであると判断される。
以上の結果をまとめて表８に示す。
【０１１７】
0003547882.tif 000009
【０１１８】
表８の結果から本発明によれば容易に被検微生物サッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当たりのＡＴＰ量を求めることができる。
【０１１９】
【実施例２０】
（ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）
以下の各工程をこの順序で行い、ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定を行なった。
第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液の調製
第二工程；トマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去
第三工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の測定
第四工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、微存する遊離ＡＴＰと菌体から抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量を求める
第五工程；菌体外に抽出されたＡＴＰの発光量の測定
第六工程；補正発光量の算出
第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出
第八工程；サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出
第九工程；比較例（混釈培養法によるサッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
【０１２０】
第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液の調製
市販のトマトケチャップ２．０ｇに、サッカロミセス・セレビシエの培養液をリン酸緩衝液（希釈液）で１０倍に希釈したもの８μｌを添加した。さらに同希釈液１８ｍｌを添加し均一に混和した。
次いで、そのうちの１ｍｌを採取し同希釈液１９ｍｌを添加し均一に混和して、被検微生物を含むトマトケチャップの２００倍希釈懸濁液を調製した。
【０１２１】
第二工程；トマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去
トマトケチャップ希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液を得た。
また比較のため、本実施例においてアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する代わりに、アピラ−ゼを単独で終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように用いる以外は全く同様にして遊離ＡＴＰを消去した。
それらの結果をまとめて、図１５に示す。
【０１２２】
図１５の結果から、アピラ−ゼを単独ではトマトケチャップの希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去できないが、アピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加するときは、該希釈懸濁液の初発遊離ＡＴＰ濃度を約１万分の一にまで低減できることが判る。
【０１２３】
第三工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの発光量の測定
遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液１００μｌに、滅菌超純水１００μｌ及び発光試薬１００μｌを添加し、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて遊離ＡＴＰの発光量を測定した。
この測定により、かすかに残存する遊離ＡＴＰの発光量（Ｆ）を求めることができる。
【０１２４】
第四工程；遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液にＡＴＰ抽出剤を添加し、微存する遊離ＡＴＰと菌体から抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量を求める
遊離ＡＴＰを消去したトマトケチャップ希釈懸濁液１００μｌにキッコ−マン社製ＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加して室温で２０秒経過後に、発光試薬を１００μｌを添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて、発光量を測定した。
この測定により、該懸濁液にかすかに残存する遊離ＡＴＰと菌体から抽出されたＡＴＰ（菌体内ＡＴＰ）からなるト−タルＡＴＰの発光量（Ｔ）を求めることができる。
【０１２５】
第五工程；菌体外に抽出されたＡＴＰの発光量の測定
このト−タル発光値Ｔからフリ−発光値Ｆを差引くことにより、菌体外に抽出されたＡＴＰ由来の正確な発光量（Ｔ−Ｆ）を求めることができる。
【０１２６】
第六工程；補正発光量の算出
ここに至る各工程においてルシフェリン−ルシフェラ−ゼによる生物発光反応は、懸濁液に含まれる成分により多少の阻害を受けるため、以下の方法により補正し、阻害を受けない場合の真の発光量を求める。
即ち、該懸濁液１００μｌに２×１０−１０ＭのＡＴＰ標準液１００μｌを添加し、２０秒後に発光試薬を１００μｌ添加して、キッコ−マン社製ルミテスタ−Ｋ−１００にて内標準発光量Ｈを求めた。
上記内標準発光量Ｈの測定において、懸濁液１００μｌを使用する代わりに滅菌超純水１００μｌを使用する以外は、全く同様にして本標準発光量Ｇを求めた。
内標準発光量Ｈからフリ−発光量Ｆを差引いた値を本標準発光量Ｇで除することにより発光率Ｋを求め、菌体内ＡＴＰの発光量（Ｔ−Ｆ）を前記発光率Ｋで除することにより、補正発光量Ｙを求めた。
Ｙ＝（Ｔ−Ｆ）／Ｋ
Ｋ＝（Ｈ−Ｆ）／Ｇ
【０１２７】
第七工程；補正発光量に対応するＡＴＰ濃度の算出
補正発光量Ｙに対応するＡＴＰ濃度を予め作成した図１０に示す検量線に従い求めた。
【０１２８】
第八工程；サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出
本実施例の第七工程で求めた補正発光量に対応するＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）を前記実施例１９の第十一工程（最終工程）で求めたサッカロミセス・セレビシエのＣＦＵ当たりのＡＴＰ量、３．０７×１０−１６ｍｏｌで除することにより、サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当りのＣＦＵ濃度を算出した。即ち、トマトケチャップ中のサッカロミセス・セレビシエ生細菌の算出結果を得た。
【０１２９】
第九工程；比較例（混釈培養法によるサッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
サッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液をＹＭ培地で適宜濃度となるように希釈し、寒天入りＹＭ培地に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５℃で２４時間培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から希釈懸濁液ｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。
こうして求めた生菌数濃度を混釈培養法によりもとめた実測値（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
以上の結果を表９にまとめて示す。
【０１３０】
0003547882.tif 000010
【０１３１】
表９の結果から本発明の方法により得られたサッカロミセス・セレビシエを含有するトマトケチャップの希釈懸濁液（トマトケチャップの２００倍希釈液）の生菌数濃度（計算値）は９．２３×１０ＣＦＵ／ｍｌであって、従来最も精度が高く測定値の信頼性が高いと言われる混釈培養法により得られたそれ８．１５×１０ＣＦＵ／ｍｌにほぼ匹敵する値が容易に得られる。
また本発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率２００倍をかけることによりトマトケチャップ１ｇ中のサッカロミセス・セレビシエ生菌数は１．８５×１０４個であることが判る。
これにより迅速にトマトケチャップのサッカロミセス・セレビシエ生菌数の測定ができることが判る。
【０１３２】
【実施例２１】
（サッカロミセス・セレビシエの混入したりんごジュ−ス希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）において、「トマトケチャップ」の代わりに市販の「１００％混濁タイプのりんごジュ−ス」を用い、第一工程の「被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含有するりんごジュ−ス希釈懸濁液の調製」を以下とする以外は、全く同様にして、サッカロミセス・セレビシエの混入したりんごジュ−ス希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジュ−スの希釈懸濁液の調製  市販の１００％混濁タイプリンゴジュ−ス５ｍｌにサッカロミセス・セレビシエの培養液を５μｌ添加し均一に混和した後、その１ｍｌを採取し、これに希釈液（リン酸緩衝液）１９ｍｌを添加して、サッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジュ−スの２０倍希釈懸濁液を調製した。」
そして、このりんごジュ−ス希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴＰを消去した。
また比較のため、本実施例においてアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する代わりに、アピラ−ゼを単独で終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように用いる以外は全く同様にして遊離ＡＴＰを消去した。
それらの結果をまとめて、図１６に示す。
【０１３３】
図１６の結果から、比較例のアピラ−ゼを単独で添加する区分はリンゴジュ−スの遊離ＡＴＰを僅かしか消去することはできないが、本発明のアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分は、りんごジュ−スの初発の遊離ＡＴＰ濃度を約数百分の一にまで低減できることが判る。
【０１３４】
【実施例２２】
（りんごジュ−スに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定）実施例２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャップ」を用いる代わりに市販の「１００％混濁タイプりんごジュ−ス」を用い、また第一工程を次の通りとする以外は同様にして被検微生物を含有するりんごジュ−ス希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；被検微生物サッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジュ−スの希釈懸濁液の調製
市販の１００％混濁タイプリンゴジュ−ス５ｍｌにサッカロミセス・セレビシエの培養液を５μｌ添加し均一に混和した後、その１ｍｌを採取し、これに希釈液（リン酸緩衝液）１９ｍｌを添加して、サッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジュ−スの２０倍希釈懸濁液を調製した。」
そして、りんごジュ−スに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定を行なった。
その結果を表１０に示す。
【０１３５】
0003547882.tif 000011
【０１３６】
表１０の結果から、本発明の方法により得られたサッカロミセス・セレビシエを含有するリンゴジュ−スの２０倍希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）（計算値）は２．４７×１０３であって、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言われている、混釈培養法により得られたそれ（実測値）１．４７×１０３にほぼ匹敵する値が容易に得られる。
また本発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率２０倍をかけることによりリンゴジュ−ス１ｇ中のサッカロミセス・セレビシエ生細菌は４．９３×１０４個であることが判る。
これにより、迅速にリンゴジュ−スのサッカロミセス・セレビシエ生細菌数の測定ができることが判る。
【０１３７】
【実施例２３】
（雑菌に汚染された豆腐希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）において、「トマトケチャップ」の代わりに市販の「絹ごし豆腐」を用い、また第一工程を以下とする以外は、全く同様にして、雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液の調製
市販の新鮮な「絹ごし豆腐」に、予め生活雑廃水から分離された細菌懸濁液を適当量添加して、雑菌に汚染された豆腐を得、この１０ｇにリン酸緩衝液（希釈液）９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−  ４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて、豆腐の希釈懸濁液を調製した。これを１ｍｌ採り、これに同希釈液３９ｍｌを添加して、均一に混和し最終的に４００倍豆腐希釈懸濁液を調製した。」
そして、この豆腐希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴＰを消去した。
この結果を図１７に示す。
【０１３８】
図１７の結果から、アピラ−ゼを単独で添加する比較例の区分は３０分間保持すると約一万分の一まで消去することができるが、アピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する本発明の区分は、初発の遊離ＡＴＰ濃度を約数十万分の一にまで消去できることが判る。
【０１３９】
【実施例２４】
（豆腐に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測定）
実施例２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャップ」を用いる代わりに市販の「絹ごし豆腐」を用い、また第一工程を以下とする以外は全く同様にして、雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；雑細菌の混入した絹ごし豆腐希釈懸濁液の調製
市販の新鮮な「絹ごし豆腐」に、予め生活雑廃水から分離された細菌懸濁液を適当量添加して、雑菌に汚染された豆腐を得、この１０ｇにリン酸緩衝液（希釈液）９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−  ４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて、豆腐の希釈懸濁液を調製した。これを１ｍｌ採り、これに同希釈液３９ｍｌを添加して、均一に混和し最終的に４００倍豆腐希釈懸濁液を調製した。」
そして、絹ごし豆腐に混入した雑菌の生菌体濃度の測定を行なった。
その結果を表１１に示す。
（１）なお表１１に記載の実測値（混釈培養法）は以下のようにして求めたものである。
（混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液体培地」で適宜希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有する「標準寒天培地」に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５℃で２日培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。
（２）また被検微生物希釈懸濁液の生菌数の算出には、当該生菌体のＡＴＰを予め求めたおいたＣＦＵ当たりのＡＴＰ量で除することにより求めたが、本実施例では一般の生細菌のＣＦＵ当りのＡＴＰ量、３×１０−１８ｍｏｌ／ＣＦＵを利用して、豆腐に混入した生菌体の濃度を求めた  。
その結果を表１１に示す。
【０１４０】
0003547882.tif 000012
【０１４１】
表１１の結果から、本発明の方法により得られた雑細菌で汚染された豆腐の４００倍希釈懸濁液の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）（計算値）は２．６０×１０４であって、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言われている、混釈培養法により得られたそれ（実測値）２．３２×１０４にほぼ匹敵する値が得られる。また、本発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率４００倍をかけることにより豆腐１ｇの汚染細菌数は１．０４×１０７であることが判る。  これにより、迅速に豆腐の汚染細菌の測定ができることが判る。
【０１４２】
【実施例２５】
（雑菌に汚染されたカニ足肉様蒲鉾のＡＴＰの消去法）
上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）において、「トマトケチャップ」の代わりに市販の「カニ足肉様蒲鉾」を用い、また第一工程を以下とする以外は、全く同様にして、雑細菌の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；被検微生物の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸濁液の調製
市販の新鮮な「カニ足肉様蒲鉾」に予め生活雑廃水から分離された雑細菌懸濁液を適当量散布して、雑菌に汚染されたカニ足肉様蒲鉾を得、この１０ｇに希釈用リン酸緩衝液９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて破壊し、カニ足肉様蒲鉾の希釈懸濁液を調製した。この上澄み液１ｍｌを採り、これに同希釈液９ｍｌを添加して、均一に混和し最終的にカニ足肉様蒲鉾１００倍希釈懸濁液を調製した。
そして、この希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴＰを消去した。
この結果を図１８に示す。
【０１４３】
図１８の結果から、比較例のアピラ−ゼを単独で添加する区分では、懸濁液の遊離ＡＴＰを十分に消去できないが、本発明のＡＴＰ消去酵素アピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分は、初発の遊離ＡＴＰ濃度を約数十万分の一に消去できることが判る。
【０１４４】
【実施例２６】
（カニ足肉様蒲鉾に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測定）
実施例２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャップ」を用いる代わりに市販の「カニ足肉様蒲鉾」を用い、また第一工程を以下とする以外は全く同様にして、雑細菌の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；被検微生物の混入したカニ足肉様蒲鉾希釈懸濁液の調製
市販の新鮮な「カニ足肉様蒲鉾」に予め生活雑廃水から分離された雑細菌懸濁液を適当量散布して、雑菌に汚染されたカニ足肉様蒲鉾を得、この１０ｇに希釈用リン酸緩衝液９０ｍｌを添加して、押圧破砕機「ストマッカ−４００−Ｔ（オルガノ社製）」にて破壊し、カニ足肉様蒲鉾の希釈懸濁液を調製した。この上澄み液１ｍｌを採り、これに同希釈液９ｍｌを添加して、均一に混和し最終的にカニ足肉様蒲鉾１００倍希釈懸濁液を調製した。」
そして、カニ足肉様蒲鉾に混入した雑菌の生菌体濃度の測定を行なった。
その結果を表１２に示す。
（１）なお表１２に記載の実測値（混釈培養法）は以下のようにして求めたものである。
（混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液体培地」で適宜濃度となるように希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有する「標準寒天培地」に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５℃で２日培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。
（２）また被検微生物希釈懸濁液の生菌数の算出には、当該生菌体のＡＴＰを予め求めたおいたＣＦＵ当たりのＡＴＰ量で除することにより求めたが、本実施例では一般の生細菌のＣＦＵ当りのＡＴＰ量、３×１０−１８ｍｏｌ／ＣＦＵを利用して、カニ足肉様蒲鉾に混入した生菌体の濃度を得る。
その結果を表１２に示した。
【０１４５】
0003547882.tif 000013
【０１４６】
表１２の結果から雑細菌に汚染されたカニ足肉様蒲鉾の接触液を１００倍希釈した液中の生菌数濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）（計算値）は４．２７×１０４であって、従来最も精度が高く、測定値の信頼性が高いと言われている、混釈培養法により得られたそれ（実測値）６．１８×１０４にほぼ匹敵する値が得られる。
また本発明によって得られた生菌数濃度（計算値）に希釈率１００倍をかけることによりカニ足肉様蒲鉾の１ｇ中の雑細菌数は４．２７×１０６であることが判る。
そして、本発明によれば迅速なカニ足肉様蒲鉾中の雑細菌の測定ができることが判る。
【０１４７】
【実施例２７】
（雑菌に汚染された米飯希釈懸濁液の遊離ＡＴＰの消去）
上述の実施例２０（トマトケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法）において、「トマトケチャップ」の代わりに「米飯」を用い、また第一工程を以下とする以外は、全く同様にして、雑細菌の混入した米飯希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；雑細菌の混入した炊飯希釈懸濁液の調製
通常の「炊飯米」を１０ｇづつ多数区分に分け、予め生活雑廃水から分離された細菌懸濁液を噴霧して、雑菌に汚染された米飯を得た。
滅菌処理したプラスチックチュ−ブ（内径約２５ｍｍ、長さ１１０ｍｍ、容量５０ｍｌ）（ファルコンチュ−ブ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に上記雑菌汚染炊飯米３ｇを入れ、またリン酸緩衝液（希釈液）６ｍｌを添加して、人為的に約１分振盪して、この上澄み液３ｍｌを採取し、米飯の希釈懸濁液を調製した。
そして、米飯希釈懸濁液にアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼをそれぞれ終濃度０．０５Ｕ／ｍｌとなるように添加して、２５℃で３０分反応して、遊離ＡＴＰを消去した。
この結果を図１９に示す。
【０１４８】
図１９の結果から、比較例のアピラ−ゼを単独で添加する区分は、３０分保持しても充分には消去することができないが、本発明のアピラ−ゼとアデノシンリン酸デアミナ−ゼを併用添加する区分は、初発の遊離ＡＴＰ濃度を、約数千分の一にまで消去できることが判る。
【０１４９】
【実施例２８】
（米飯に混入した汚染細菌の生菌体濃度の測定）
実施例２０の「ケチャップに混入したサッカロミセス・セレビシエの生菌体濃度の測定法」において、「トマトケチャップ」を用いる代わりに「炊飯米（米飯）」を用い、また第一工程を以下とする以外は全く同様にして、雑細菌の混入した米飯希釈懸濁液を調製した。
「第一工程；雑細菌の混入した米飯希釈懸濁液の調製
通常の「炊飯米」を１０ｇづつ多数区分に分け、予め生活雑排水から分離された細菌懸濁液を噴霧して、雑菌に汚染された米飯を得た。
滅菌処理したプラスチックチュ−ブ（内径約２５ｍｍ、長さ１１０ｍｍ、容量５０ｍｌ）（ファルコンチュ−ブ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に上記雑菌汚染炊飯米３ｇを入れ、またリン酸緩衝液（希釈液）６ｍｌを添加して、人為的に約１分振盪して、この米飯３ｇに付着する雑菌を２倍量の希釈液６ｍｌに回収した。そしてその上澄み液３ｍｌを採取し、米飯の希釈懸濁液を調製した。
なお、この希釈懸濁液１ｍｌには０．５ｇの米飯に付着していた雑菌が回収されていることになる。」
そして、米飯に混入した雑菌の生菌体濃度の測定を行なった。
こうして得られた米飯の希釈懸濁液１ｍｌ当りの雑細菌のＡＴＰ量の対数ｌｏｇ  ｍｏｌ／ｍｌを座標のＸ軸に、また混釈培養法により得られた炊飯米１ｇ当りの雑細菌数の対数ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの値をＹ軸にして、その相関を調べた。
得られた結果を図２０に示した。
（１）なお上記混釈培養法による雑菌数の測定は以下のようにして求めたものである。
（混釈培養法による被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵの算出）
被検微生物懸濁液を滅菌処理した「標準液体培地」で適宜濃度となるように希釈し、滅菌処理した、寒天２％を含有する「標準寒天培地」に混釈培養法によりプレ−ティングして、３５℃で２日培養し、出現したコロニ−数を計測し、希釈率から被検微生物懸濁液のｍｌ当たりのＣＦＵを算出した。そしてこの値を２倍することにより炊飯米１ｇ当りの雑菌数ＣＦＵ／ｇを得た。
【０１５０】
図２０の結果から、雑菌数がｇ当り１００ＣＦＵ以上（即ちＹ軸における目盛り２以上）において、雑菌由来のＡＴＰ量の対数ｌｏｇ  ｍｏｌ／ｍｌと、混釈培養法により求めた雑菌数の対数ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇは、正の相関（相関係数０．９７６）関係を示し、この結果から、本発明方法により炊飯米の雑菌を正確に、しかも簡便、迅速に感度良く定量することができることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベルト−ルド社製ルミノメ−タ−「ルマット  ＬＢ９５０１」によるＡＴＰ検量線を示す。
【図２】酵素によるＡＴＰ消去法において、酵素反応の時間と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図３】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、該アデノシンリン酸デアミナ−ゼの活性と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図４】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において該アデノシンリン酸デアミナ−ゼの活性とＡＴＰ残存率の関係を示す
。
【図５】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、該アピラ−ゼの活性と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図６】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において該アピラ−ゼの活性とＡＴＰ残存率の関係を示す。
【図７】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼの存在下、各濃度のＡＴＰ標準液を加えて反応させた場合の経時的なＡＴＰ残存率を示す。
【図８】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、酵素反応におけるｐＨと反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示す
。
【図９】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加するＡＴＰ消去法において、酵素反応における温度と反応後に残存するＡＴＰ濃度の関係を示
す。
【図１０】キッコ−マン社製ルミノメ−タ−「ルミテスタ−Ｋ−１００」によるＡＴＰ検量線を示す。
【図１１】本発明により求められた各微生物菌体由来のＡＴＰ濃度と混釈培養法により得られた菌数との関係を示す。
【図１２】バチルス・ズブチリスに汚染された醤油麹の該バチルス・ズブチリスの定量結果を示す。
【図１３】乳酸菌に汚染された醤油麹の該乳酸菌の定量結果を示す。
【図１４】雑細菌に汚染された醤油麹盛込み原料の該雑細菌の定量結果を示す。
【図１５】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、酵母に汚染されたトマトケチャップ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係を示す
【図１６】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、酵母に汚染されたリンゴジュ−ス希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係を示す
【図１７】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、雑菌に汚染された豆腐希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係を示す
【図１８】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、雑菌に汚染された、かにかまぼこ希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係を示す
【図１９】アデノシンリン酸デアミナ−ゼとアピラ−ゼを併用添加して、雑菌に汚染された米飯希釈懸濁液の遊離ＡＴＰを消去する場合の反応時間とＡＴＰ濃度の関係を示す。
【図２０】米飯の希釈懸濁液１ｍｌ当りの雑細菌のＡＴＰ量の対数ｌｏｇ  ｍｏｌ／ｍｌと混釈培養法により得られた炊飯米１ｇ当りの雑細菌数の対数ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇとの相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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