(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット核酸配列に相補的な一本鎖プローブ核酸配列のいずれかの片側、あるいは両側に二本鎖核酸ポリマーを結合した二重らせん核酸ポリマーに界面活性色素をインターカレートして形成した核酸ポリマー薄膜と、この薄膜の光導電性を検出する手段とを有することを特徴とする遺伝子センサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、遺伝子センサーに関するものである。さらに詳しくは、この発明は、目的とするターゲット遺伝子の有無を、簡便かつ正確に検出することのできる新しい遺伝子センサーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、核酸ポリマー中のターゲット配列の有無を検出したり、あるいは複数の核酸ポリマーの異同および相同性を判定する方法として、ターゲット核酸ポリマーの一部配列に相補的な一本鎖核酸配列をプローブとするハイブリダイゼーション法が知られている。すなわち、この方法は、一本鎖ターゲット配列をニトロセルロース膜またはナイロン膜に固定化し、放射性同位元素または酵素でラベルしたプローブ配列溶液を膜上に加える。プローブ配列がターゲット配列とハイブリダイズした場合には、水洗の後の膜にはターゲットと結合したプローブだけが残存する。そこで、プローブにラベルされた放射性同位元素からの放射能や、あるいは標識酵素が産出する化学発光や沈殿物の色を検出することにより、核酸ポリマー混合物中に目的とする核酸配列が存在するか否かを判定することができる。
【０００３】
しかしながら、放射性同位元素を扱うには特別な免許が必要であり、一般的ではない。また、一本鎖プローブ配列を酵素等のラベル化は多くのコストと手間がかかるという問題点を有している。
これに対して、この出願の発明者等は、界面活性色素（インターカレーター）を核酸ポリマー水溶液上に展開して核酸ポリマー・インターカレーター単分子膜を形成し、この膜の表面圧を測定することによって、水溶液中の核酸ポリマーの含量、一本鎖核酸ポリマー／プローブのハイブリダイゼーションの有無、および核酸ポリマーの塩基配列を識別する方法を発明し、既に特許出願している（特開平８−３１３５２１号公報）。また、この出願の発明者等は、核酸ポリマーとカチオン性界面活性剤との混合によるポリイオンコンプレックスを所定のパターンで薄膜化する方法を発明し、既に特許出願している（特願平９−２１４７７号）。
【０００４】
しかしながら、この出願の発明者等も含め、界面活性色素をインターカレートした核酸ポリマーやその薄膜が、核酸ポリマー本来の特性をどのように変化させるかについて報告した例は存在しない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明者等は、界面活性色素をインターカレートした二重らせん核酸ポリマーを薄膜状に単離し、その特性を検討した結果、本来は絶縁性を示す核酸ポリマーが、界面活性色素のインターカレーションにより光導電性を獲得することを見出した。そして、そのような導電性は、二重らせん核酸ポリマーの一部が一本鎖の場合には生じないことも見出している。
【０００６】
この出願の発明は、発明者等によるこのような新規な知見に基づいてなされたものであって、二重らせん核酸ポリマー薄膜の光導電性を利用した新しい遺伝子センサー提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する発明として、ターゲット核酸配列に相補的な一本鎖プローブ核酸配列を含む二重らせん核酸ポリマーに界面活性色素をインターカレートして形成した核酸ポリマー薄膜と、この薄膜の光導電性を検出する手段とを有することを特徴とする遺伝子センサーを提供する。
【０００８】
以下、この発明について、実施の形態を詳しく説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
この発明の遺伝子センサーの構成要素である核酸ポリマー薄膜は、ターゲット核酸配列に相補的な一本鎖プローブ核酸配列を含む二重らせん核酸ポリマーに界面活性色素をインターカレートして形成する。プローブ核酸配列は、二本鎖ターゲット核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一方のストランド、もしくはいずれかのストランドの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００１０】
そして、このようなプローブ核酸配列のいずれかの片側、より好ましくは両側に二本鎖核酸ポリマーを結合する。この二本鎖核酸ポリマーの配列等については特段の制限はなく、任意の二本鎖ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片等を用いることができる。
このような一部が一本鎖である核酸ポリマーへの色素のインターカレーションは、例えば、図１に例示したような方法で行うことがができる。すなわち、水層の気水界面に界面活性色素インターカレーター溶液と界面活性剤を展開し、この水層に核酸ポリマーを添加する。インターカレーターは正電荷を持つため、負電荷を持つ核酸ポリマーと気水界面でポリイオンコンプレックスを形成し、薄膜状となる。この時、二本鎖核酸ポリマーに対しては、色素は塩基間に挿入される（インターカレーション現象）。一方、一本鎖プローブ核酸配列部分においても、色素と核酸配列との上記のとおりの電荷の違いにより、界面活性色素インターカレーターは核酸配列に結合した状態となる。なお、各成分の添加の順番は上記の方法に限定されるものではなく、例えば、予め核酸ポリマーを水層中に添加して核酸ポリマー溶液とし、この溶液の気水界面にインターカレーター溶液と界面活性剤を展開するようにしてもよい。
【００１１】
界面活性剤としては、適宜なものを選択して使用することができ、例えば、第４級アンモニウム塩化合物やアミン化合物、それらの塩、カルバミン酸塩化合物等が挙げられる。
色素インターカレーターとしては、核酸ポリマーの塩基対間へのインターカレーション現象が知られているアクリジンオレンジや臭化エチジウム等の公知の色素に対して疎水基修飾して両親媒性を付与したものを使用する。また、この出願の発明者等による先願発明（特開平８−３１３５２１号公報）に開示されている次式の界面活性色素インターカレーターを使用することもできる。
【００１２】
【化１】
0003547599.tif 000002
【００１３】
【化２】
0003547599.tif 000003
【００１４】
このようにして形成した核酸ポリマー薄膜は、例えば、表面を圧縮し、水層内に挿入した基板に移し取ることによって単離することができる。乾燥させ、基板から分離することによって、核酸ポリマー薄膜が得られる。また、基板と一体化したままの状態であってもよい。基板としては、ガラス、雲母、石英、シリコン、炭素、各種の金属、無機物、有機樹脂等を適宜に選択して用いることができる。また、基板の形状も板材等の固形形状だけではなく、フィルム等の可塑形状とすることもできる。さらに、例えば１対の幅広くし型電極等に一体化することもできる。
【００１５】
また、この発明の核酸ポリマー薄膜は、実施例に示したように、上記混合溶液遠心して、ポリイオンコンプレックスを沈殿物として回収し、水洗し、乾燥させて得ることもできる。
以上のとおりにして製造された核酸ポリマー薄膜は、例えば、図２および図３に示したような電気回路の構成部材とすることができる。この例の場合には、核酸ポリマー薄膜（１）は１対のくし型電極（２）にキャストされ、電極（２）には電源（Ｖ）および電流計（Ａ）を接続して回路が形成されている。
【００１６】
この場合、核酸ポリマー薄膜（１）は、光照射によっても導電性を示すことはなく、従って、電圧を印加しても電極（２）は電気的に非接触状態であり、電流計による計測値に変化はない。しかしながら、例えば核酸ポリマー薄膜（１）をターゲット核酸配列を含む溶液中に入れ、核酸ポリマー薄膜（１）のプローブ核酸配列（３）にターゲット配列（４）がハイブリダイズするとこれらが二本鎖を形成し、核酸ポリマー薄膜（１）は光伝導性を獲得する。
【００１７】
図２および図３に例示したようなセンサーの場合には、ターゲット核酸配列（４）の存在は、電流計（Ａ）による計測によって確認することができる。あるいはまた、図５に示したように、ランプ（５）を接続し、ランプ（５）の点滅によってターゲット核酸配列の存在を確認するようにしてもよい。
もちろんこの発明は、以上の実施形態によって限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００１８】
以下、参考例として、色素をインターカレートした二重らせん核酸ポリマーの光伝導性の確認に関する試験例を示す。
参考例
ウシ胸腺ＤＮＡの水溶液（３３ｍｇ／５０ｍｌ純水）に脂質（界面活性剤）と両親媒性色素インターカレーターを添加し（２Ｃ１６Ｎ＋  ２Ｃｌ−  ：Ｃ１８ＡＯ＋  Ｉ−  ＝９：１）（２８ｍｇ／５０ｍｌ純水）、室温で混合し、混合溶液を遠心することによって生成したポリイオンコンプレックスを回収した。これを水洗し、乾燥して、ＤＮＡ−脂質ポリイオンコンプレックスを得た。
【００１９】
なお、界面活性剤としては次式で表される２Ｃ１６Ｎ＋  ２Ｃｌ−  を用いた。
【００２０】
【化３】
0003547599.tif 000004
【００２１】
また、両親媒性色素インターカレーターは、次式で表されるＣ１８ＡＯ＋  Ｉ−  を用いた。
【００２２】
【化４】
0003547599.tif 000005
【００２３】
次いで、このポリイオンコンプレックスのクロロホルム溶液（１  ｍｇ／１０ｍｌ）を１対のくし型電極（長さ２ｍｍ；電極ギャップ１００  μｍ  ）  にキャストして、この発明の核酸ポリマー薄膜（膜厚約１０μｍ  ）を作成した。
電極には電源および電流計を接続し、電源から所定の電圧を印加して、４６０ｎｍ  のカットフィルターを通した５００Ｗキセノンランプ光を薄膜に照射し、電極間を流れる光電流を計測した。
【００２４】
結果は図５および図６に示したとおりである。図５に示したとおり、光照射によって電極間に電流が流れることが確認された。また、図６に示したとおり、印加する電圧に依存して光電流も変化することも確認された。
さらに、一定電圧を印加した場合であっても、照射光の強度または波長を変えることによって電流値が変化することも確認された。
【００２５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明により、ターゲット核酸配列の有無を簡便かつ確実に検出することのできる新しい光応答性遺伝子センサーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸ポリマーと色素インターカレターのポリイオンコンプレックスの形成状態を示した模式図である。
【図２】この発明の核酸ポリマー薄膜を用いた光応答性遺伝子センサーの一例を示した模式図である。
【図３】図２に示した光応答性遺伝子センサーの作用を示した模式図である。
【図４】この発明の核酸ポリマー薄膜を用いた光応答性遺伝子センサーの別の例を示した模式図である。
【図５】色素をインターカレートした核酸ポリマー薄膜を用いた電気回路における光電流の計測結果を示したグラフ図である。
【図６】色素をインターカレートした核酸ポリマー薄膜を用いた電気回路における光電流の別の計測結果を示したグラフ図である。
【符号の説明】
１  導電性核酸ポリマー薄膜
２  くし型電極
３  プローブ核酸配列
４  ターゲット核酸配列
５  ランプ
Ｖ  電源
Ａ  電流計
Ｌ  光
Ｓ  ソース
Ｄ  ドレイン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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