【手続補正書】
【提出日】平成28年4月18日(2016.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【図１】本発明の方法により多能性幹細胞を誘導する実験過程全体を示す模式図である。
【図２】植物幹細胞抽出物を処理して５日目に観察された誘導多能性幹細胞を示す図である。
【図３】植物幹細胞抽出物を処理して８日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）に移して２日目に観察された誘導多能性幹細胞を示す図である。
【図４】植物幹細胞抽出物を処理して３２日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）に移して４回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞を示す図（Ａ）、および、典型的な胚性幹細胞を示す図（Ｂ）である。
【図５】植物幹細胞抽出物を処理して３２日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）に移して４回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞のリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図である。
【図６】植物幹細胞抽出物を処理して５０日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）に移して７回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞を示す図と、その細胞のリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図（Ａ）、およびＹａｍａｎａｋａの４  ｆａｃｔｏｒウイルスを利用して誘導されたヒト多能性幹細胞とリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図（Ｂ）である。
【図７】本発明の方法で誘導された多能性幹細胞の遺伝子発現を示す図である。
【図８】本発明に係るセコイアカルス抽出物のＨＰＬＣ結果を示すグラフである。ここでＳｈｉｋｉｍｉｃ  ａｃｉｄは、本明細書［化学式１］の構造を有するシキミ酸を示す。
【図９】本発明の方法により、シキミ酸またはこれを含む植物幹細胞抽出物を利用して多能性幹細胞を誘導する実験過程全体を示す模式図である。
【図１０】シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、ＨＤＦにおいてＯｃｔ３／４遺伝子の発現を示す図である。
【図１１】シキミ酸を濃度別に処理した後、ＨＤＦにおいてＯｃｔ３／４遺伝子の発現を示す図である。
【図１２】シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、ＡＬＰの発現増加を示す図である。
【図１３】シキミ酸を濃度別に処理した後、ＡＬＰの発現増加を示す図である。
【図１４】シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示す図である。
【図１５】シキミ酸を濃度別に処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示す図である。
【図１６】シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示すグラフである。
【図１７】シキミ酸を濃度別に処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示すグラフである。
【図１８】シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞の増殖力増加を示すグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
［試験例４‐１］真皮細胞のコロニー生成力増加実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９，  Ｌｏｎｚａ，  ＵＳＡ）５×１０５個に、透過化バッファー（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）とジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）１０μｇ／ｍｌを処理し、０．４μｍフィルターで濾過した実施例４によるセコイアカルス抽出物（ＢＧとＥｔＯＨの混合溶媒）１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍと、ＤＭＳＯ溶液２０ｐｐｍを処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。これを継代培養してから１０日目に、細胞を６０ｍｍプレートに２００個ずつ付けた後、２３日目に、氷の上でアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）ＰＢＳで洗浄し、−２０度で保管したアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）メタノールで細胞を１０分間固定した。エタノール原液（Ｅｔｈａｎｏｌ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にある１％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）を、ＰＢＳに１／１０で希釈して実験溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作成した後、これを細胞に５〜１０分間処理して染色した後、ＰＢＳで４回洗浄し、写真撮影をした。定量分析のために、５０％エタノール、４０％ＤＷ、１０％酢酸で構成された溶離バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を準備した後、５分間細胞に処理して溶出させた。その後、９６ウェルプレートに２００μｌずつ移して、５８０ｎｍで吸光度を測定した。写真撮影による結果は、図１４に示した。そして、吸光度測定による結果は、陰性対照群を基準とした倍数の結果として、図１６に示した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
また、図１６から見られるように、セコイアカルス抽出物を処理した場合、陰性対照群に比べてコロニー生成力の増加程度が約２．６倍に増加し、これは、統計的に有意なものである。また、シキミ酸の場合、陰性対照群に比べて約３．８倍増加した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
［試験例４‐２］真皮細胞のコロニー生成力増加実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９，  Ｌｏｎｚａ，  ＵＳＡ）１×１０６個に、シキミ酸１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭをそれぞれ処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。これを継代培養してから５日目に、細胞を６０ｍｍプレートに２００個ずつ付けた後、１７日目に、氷の上でアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）ＰＢＳで洗浄し、−２０度で保管したアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）メタノールで細胞を１０分間固定した。エタノール原液（Ｅｔｈａｎｏｌ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にある１％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）を、ＰＢＳに１／１０で希釈して実験溶液を作成した後、これを細胞に５〜１０分間処理して染色した後、ＰＢＳで４回洗浄し、写真撮影をした。定量分析のために、５０％エタノール、４０％ＤＷ、１０％酢酸で構成された溶離バッファーを準備した後、５分間細胞に処理して溶出させた。その後、９６ウェルプレートに２００μｌずつ移して、５８０ｎｍで吸光度を測定した。写真撮影による結果は、図１５に示した。そして、吸光度測定による結果は、陰性対照群を基準にした倍数の結果として、図１７に示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
図１５から見られるように、シキミ酸を処理した場合、何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌである陰性対照群に比べて染色された部分が相当に多く、これは、真皮細胞が活発に分化してコロニーを多く生成したことを意味し、細胞分化を促進することを確認することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シキミ酸；シキミ酸を含む植物抽出物；シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物；またはこれらのうち一つ以上を含む組成物を、成体由来細胞に処理することを含む、幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記植物幹細胞抽出物は、逆分化された多能性植物幹細胞の抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シキミ酸、抽出物または組成物を成体由来の細胞に注入するステップ；および、シキミ酸、抽出物または組成物が注入された細胞を培養するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
シキミ酸を含む植物抽出物は、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、キショウブ（Ｉｒｉｓ  ｐｓｅｕｄｏａｃｏｒｕｓ）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、アオトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｐｕｎｇｅｎｓ）、シロトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、シルバートップアッシュ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｉｅｂｅｒｉａｎａ）、ユーカリプタス・レグナンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｇｎａｎｓ）、ベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）、ナツメヤシ（Ｒｅｄ  Ｃｅｄａ，  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）、ダリア（Ｄａｈｌｉａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、エゾノコリンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、アカマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａａ）、クロマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ａｎｉｓａｔｕｍ）、タイサンボク（Ｍａｇｎｏｌｉａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ  ｃｏｒｄａｔａ）、ユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、テルミナリア・アルジュナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ａｒｊｕｎａ）、マスチックノキ（Ｐｉｓｔａｃｉａ  ｌｅｎｔｉｓｃｕｓ）、ゴールデンカラント（Ｒｉｂｅｓ  ａｕｒｅｕｍ）、コンフリー（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ホワイトコホシュ（Ａｃｔａｅａ  ｐａｃｈｙｐｏｄａ）、シログキウリノキ（Ａｌａｎｇｉｕｍ  ｓａｌｖｉｆｏｌｌｉｕｍ）、イチョウ（Ｇｉｎｇｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）、ベラトラム・バリッド（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｖｉｒｉｄｅ）、オニナベナ（Ｄｉｐｓａｃｕｓ  ｌａｃｉｎｉａｔｕｓ）、アガスタキ（Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｕｒｔｉｃｉｆｏｌｉａ）、オオグルマ（Ｉｎｕｌａ  ｈｅｌｅｎｉｕｍ）、セイヨウオトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｓｐｐ）、マルバツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、ギムネマ（糖殺草）（Ｇｙｍｎｅｍａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、訶子（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｃｈｅｂｕｌａ）、アメリカシキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｍ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｄｉｆｆｅｎｇｒｉ）、紅茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｈｅｎｒｙｉ）、八角茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｖｅｒｕｍ）、窄叶紅茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｐａｃｈｙｐｈｙｌｌｕｍ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ａｎｉｓａｔｕｍ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｒｅｌｉｇｉｏｓｕｍ）、ヘミデスムス・インディカス（Ｈｅｍｉｄｅｓｍｕｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ，  Ｓａｒｖｉａ）、シスタス・インカヌス（Ｃｉｓｔｕｓ  ｉｎｃａｎｕｓ）、ホソバキンゴジカ（Ｓｉｄａ  ａｃｕｔａ）、インテレクトツリー（Ｃｅｌａｓｔｒｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、トゲバンレイシ（Ｇｌｙｃｏｓｍｉｓ  ｍｕｒｉｃａｔａ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ，  Ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ヒペリカム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｄｏｌａｂｒｉｆｏｒｍｅ）、ディプサクス・ピロスス（Ｄｉｐｓａｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）、ミズオトギリ（Ｔｒｉａｄｅｎｕｍ  ｗａｌｔｅｒｉ）、ヒペリカム・フロンドサム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｆｌｏｎｄｏｓｕｍ）、およびテルミナリア・パリド（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｐａｌｌｉｄ）抽出物からなる群から選択された複数の抽出物をさらに含むものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物幹細胞抽出物は、カルス抽出物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物幹細胞は、セコイア幹細胞を利用し、詳しくは、セコイアは、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、その組成物の総体積を基準として、シキミ酸を１０μＭ〜３０ｍＭの濃度で含むか、または、抽出物を０．００１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
シキミ酸、抽出物または組成物の注入前に、前記成体由来細胞に細胞膜透過促進物質を処理するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞膜透過促進化合物は、ストレプトリジンＯまたはジギトニンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シキミ酸、抽出物または組成物が注入された成体由来細胞を、支持細胞層に移して、さらに培養するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持細胞は、ＳＴＯ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、又はそのいずれかのひとつ以上を含む組成物にとって成体由来細胞から誘導された誘導多能性幹細胞。
【請求項１３】
前記成体由来細胞は、誘導多能性幹細胞が投与される個体から由来した細胞であり、
前記幹細胞は、前記個体に対する特異的な誘導多能性幹細胞である、
請求項１２に記載の幹細胞。
【請求項１４】
有効成分として、請求項１２または１３に記載の誘導多能性幹細胞を含む、組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、細胞治療剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、またはシキミ酸を含む植物幹細胞抽出物を有効成分として含む、幹細胞活性化用、皮膚細胞増殖用、皮膚再生用または抗老化用組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、その組成物の総体積を基準として、シキミ酸を１０μＭ〜３０ｍＭの濃度で含むか、または、植物抽出物もしくは植物幹細胞抽出物を０．００１μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物は、薬学組成物または化粧品組成物である、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
シキミ酸を含有する植物抽出物は、請求項４に記載の植物抽出物である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物。