【手続補正書】
【提出日】平成29年3月8日(2017.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
≧０．０９ｍＭ±０．０１４ｍＭのオルニチンおよび≧０．２０±０．０３ｍＭのプトレシンを含む、無血清である細胞培養培地。
【請求項２】
０．３±０．０５ｍＭ〜０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
（ａ）０．６±０．０９ｍＭでオルニチンを含む；ならびに／または
（ｂ）０．７１４±０．１１ｍＭでプトレシンを含む、
請求項１または２に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
（ａ）前記培地が、加水分解物を含まないか、または化学的に規定されている；
（ｂ）前記培地が、≧４０±６ｍＭのアミノ酸またはその塩の混合物を含み、好ましくは前記アミノ酸の混合物が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる；
（ｃ）前記培地が、１種または複数の脂肪酸を含み、好ましくは前記１種または複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される；
（ｄ）前記培地が、ヌクレオシドの混合物を含み、好ましくは前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうちの１種または複数を含む；
（ｅ）前記培地が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む；
（ｆ）前記培地が、１種または複数の二価カチオンを含み、好ましくは前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウムまたは両方である；ならびに／または
（ｇ）前記培地が、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む、
前記請求項のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項５】
細胞を培養するための方法であって、（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の細胞培養培地を提供するステップ、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップを含む、方法。
【請求項６】
（ａ）前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択され、好ましくは前記細胞がＣＨＯ細胞である；ならびに／または
（ｂ）前記細胞が目的のタンパク質を発現する、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である；
（ｂ）前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む；ならびに／または
（ｃ）前記目的のタンパク質が受容体−Ｆｃ−融合タンパク質であり、好ましくは前記受容体−Ｆｃ−融合タンパク質がｔｒａｐタンパク質である、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記目的のタンパク質が、ｔｒａｐタンパク質である受容体−Ｆｃ−融合タンパク質であり、前記ｔｒａｐタンパク質が、ＩＬ−１アンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記目的のタンパク質が、抗体または抗体断片であり、好ましくは前記抗体または前記抗体断片が、組換えヒト抗体またはその断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）前記細胞が、≦３０時間の平均倍加時間を有する；
（ｂ）前記細胞が、≦２４時間の平均倍加時間を有する；
（ｃ）前記細胞が、<０．３±０．０４５ｍＭのオルニチンおよび<０．２±０．０３ｍＭのプトレシンを含む細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも３分の１である平均倍加時間を有する；
（ｄ）前記細胞培養物が、<０．０９±０．０１４ｍＭのオルニチンおよび<０．２±０．０３ｍＭのプトレシンを含む培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも１５％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；
（ｅ）前記細胞培養物が、<０．０９±０．０１４ｍＭのオルニチンおよび<０．２±０．０３ｍＭのプトレシンを含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも３倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；ならびに／または
（ｆ）前記方法が、１種または複数のユースポイント添加物を前記細胞培養培地に添加するステップを含み、好ましくは前記ユースポイント添加物が、ＮａＨＣＯ３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＮｉＳＯ４、Ｎａ４  ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ３のうちの１種または複数を含み、ＮａＨＣＯ３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＮｉＳＯ４、Ｎａ４  ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ３の各々が、ユースポイント添加物として前記培地に添加される、
請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ；
（ｂ）前記核酸を保有する細胞を選択するステップ；
（ｃ）請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養培地において、または請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ；ならびに
（ｄ）前記細胞において前記目的のタンパク質を発現させるステップであって、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される、ステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である；
（ｂ）前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む；ならびに／または
（ｃ）前記目的のタンパク質が、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質、抗体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＳｃＦｖタンパク質からなる群より選択される、
請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記目的のタンパク質が、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも７％大きい平均７日目力価で生成される；
（ｂ）前記目的のタンパク質が、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも１４％大きい平均７日目力価で生成される；
（ｃ）前記目的のタンパク質が、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも８０％大きい平均７日目力価で生成される；
（ｄ）前記目的のタンパク質が、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも２倍大きい平均７日目力価で生成される；ならびに／または
（ｅ）前記目的のタンパク質が、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも３倍大きい平均７日目力価で生成される、
請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的のタンパク質が組換えヒト抗体である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
０．３±０．０５ｍＭ〜０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む細胞培養培地中で細胞を培養するステップであって、前記細胞が目的の外因性タンパク質をコードする核酸を含む、ステップ；ならびに
前記細胞から前記目的の外因性タンパク質を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記細胞が、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される細胞を提供するステップ；ならびに
０．３±０．０５ｍＭ〜０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む細胞培養培地中で前記細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞が、目的の外因性タンパク質を発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞培養培地が、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭ、または０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞培養培地が、０．６±０．０９ｍＭのオルニチンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞培養培地が、０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞培養培地が、０．００２５ｍＭを超えるプトレシンを含む、請求項１６から２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の外因性タンパク質が、
（ａ）抗体；
（ｂ）抗原結合タンパク質；
（ｃ）Ｆｃドメインを含むタンパク質；ならびに
（ｄ）受容体−Ｆｃ−融合タンパク質
からなる群より選択される、請求項１６、１７および１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）前記細胞が、≦２３時間の平均倍加時間を有する；
（ｂ）前記細胞が、≦２１時間の平均倍加時間を有する；
（ｃ）前記細胞が、０．１ｍＭ未満のオルニチンを含む細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも７０％減少した平均倍加時間を有する；または
（ｄ）前記細胞が、０．１ｍＭ未満のオルニチンを含む細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも２２％減少した平均倍加時間を有する、
請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）前記細胞が、０．１ｍＭのオルニチンを含む培地中で培養された類似の細胞よりも少なくとも１５％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；または
（ｂ）前記細胞が、０．１ｍＭ未満のオルニチンを含む類似の細胞培養培地中で培養された類似の細胞よりも２倍〜４倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、
請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）前記目的のタンパク質が、０．３ｍＭ未満のオルニチンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均力価よりも少なくとも４０％大きい平均最終力価で生成される；または
（ｂ）前記目的のタンパク質が、０．３ｍＭ未満のオルニチンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも２倍大きい平均７日目力価で生成される、
請求項１６、１７および１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
０．２±０．０３ｍＭ〜０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む、無血清である細胞培養培地。
【請求項２９】
０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６ｍＭ、または０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む、請求項２８に記載の細胞培養培地。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の細胞培養培地中で、目的の外因性タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養するステップ；ならびに
前記細胞から前記目的の外因性タンパク質を生成するステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
具体的な一実施形態では、この目的のタンパク質は、（１）目的のタンパク質、例えば抗体または他の抗原結合性タンパク質をコードする核酸配列をＣＨＯ細胞中に導入すること；（２）この核酸配列を保有する細胞を選択すること；（３）（ａ）０．０９±０．０１４、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭまたは０．９±０．１４ｍＭのいずれかのオルニチン；（ｂ）任意選択でさらに、０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６または０．７１４±０．１１ｍＭのいずれかのプトレシン；（ｃ）少なくとも４０ｍＭまたは少なくとも７０ｍＭの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物；（ｄ）トコフェロールおよび脂肪酸の混合物；（ｅ）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物、ならびに（ｆ）カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む無血清細胞培養培地中で、この選択された細胞を培養すること；ならびに（ｄ）このＣＨＯ細胞において目的のタンパク質を発現させることによって生成され、目的のタンパク質は培地中に分泌される。一部の実施形態では、この無血清細胞培養培地は、≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含み得る；または他の実施形態では、加水分解物を全く含まなくてもよい。
[本発明1001]
≧0．09ｍＭ±0．014ｍＭのオルニチンを含む、無血清である細胞培養培地。
[本発明1002]
≧0．20±0．03ｍＭのプトレシンを含む、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1003]
0．09±0．014ｍＭ〜0．9±0．14ｍＭのオルニチンを含む、本発明1001および1002のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1004]
0．09±0．014ｍＭ、0．3±0．05ｍＭ、0．6±0．09ｍＭまたは0．9±0．14ｍＭでオルニチンを含む、本発明1001から1003のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1005]
0．20±0．03ｍＭ〜0．714±0．11ｍＭのプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1006]
0．20±0．03ｍＭ、0．35±0．06または0．714±0．11ｍＭでプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1007]
加水分解物を含まない、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1008]
化学的に規定されている、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1009]
≧40±6ｍＭのアミノ酸またはその塩の混合物を含む、本発明1001から1008のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1010]
アミノ酸の前記混合物が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる、本発明1009の細胞培養培地。
[本発明1011]
1種または複数の脂肪酸を含む、本発明1001から1010のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1012]
前記1種または複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される、本発明1011の細胞培養培地。
[本発明1013]
ヌクレオシドの混合物を含む、本発明1001から1012のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1014]
ヌクレオシドの前記混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうちの1種または複数を含む、本発明1013の細胞培養培地。
[本発明1015]
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む、本発明1001から1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1016]
1種または複数の二価カチオンを含む、本発明1001から1015のいずれかの細胞
培養培地。
[本発明1017]
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウムまたはそれらの両方である、本発明1016の細胞培養培地。
[本発明1018]
Ｃａ2＋およびＭｇ2＋を含む、本発明1001から1017のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1019]
細胞を培養するための方法であって、（ａ）本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地を提供するステップ、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップを含む、方法。
[本発明1020]
前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞がＣＨＯ細胞である、本発明1019または本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、本発明1019から1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
前記目的のタンパク質が受容体−Ｆｃ−融合タンパク質である、本発明1022から1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記受容体−Ｆｃ−融合タンパク質がｔｒａｐタンパク質である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記ｔｒａｐタンパク質が、ＩＬ−1アンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記目的のタンパク質が、抗体または抗体断片である、本発明1022または1023の方法。
[本発明1029]
前記抗体または前記抗体断片が、組換えヒト抗体またはその断片である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記細胞が、≦30時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記細胞が、≦24時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記細胞が、＜0．3±0．045ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．03ｍＭのプトレシンを含む細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも3分の1である平均倍加時間を有する、本発明1019から1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記細胞培養物が、＜0．09±0．014ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．0
3ｍＭのプトレシンを含む培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記細胞培養物が、＜0．09±0．014ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．03ｍＭのプトレシンを含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
1種または複数のユースポイント添加物を、前記細胞培養培地に添加するステップを含む、本発明1019から1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記ユースポイント添加物が、ＮａＨＣＯ3、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ4、ＺｎＳＯ4、ＦｅＣｌ3、ＮｉＳＯ4、Ｎａ4  ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ3のうちの1種または複数を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
ＮａＨＣＯ3、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ4、ＺｎＳＯ4、ＦｅＣｌ3、ＮｉＳＯ4、Ｎａ4  ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ3の各々が、ユースポイント添加物として前記培地に添加される、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
タンパク質を生成するための方法であって、前記方法は、（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ；（ｂ）前記核酸を保有する細胞を選択するステップ；（ｃ）本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地において、または本発明1019から1037のいずれかの方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ；および（ｄ）前記細胞において前記目的のタンパク質を発現させるステップを含み、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される、方法。
[本発明1039]
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、293細胞またはＢＨＫ細胞である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1038または1039の方法。
[本発明1041]
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、本発明1038から1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記目的のタンパク質が、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質、抗体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＳｃＦｖタンパク質からなる群より選択される、本発明1038から1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも7％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも14％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも80％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも2倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも3倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記目的のタンパク質が組換えヒト抗体である、本発明1038から1047のいずれかの方法。