【手続補正書】
【提出日】平成29年10月19日(2017.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少量のターゲットDNA配列を含むと思われる体液由来のセルフリーDNAを含むサンプルにおいて、ターゲットDNA配列を濃縮するための方法であって、ここで、
前記ターゲットDNA配列は、前記サンプル中に存在するリファレンスDNA配列と1ヌクレオチド異なり、そして
前記リファレンスDNA配列は、前記サンプル中で、前記ターゲットDNA配列よりも多く見られ、前記方法が、
（a）前記サンプル、ポリメラーゼ、2つのプライマー、及びブロッカーを含む反応混合物を調製すること（ここで、
前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする第一プライマー及び前記リファレンスDNA配列の相補的配列にハイブリダイズする第二プライマーを含む2つのプライマーは、それぞれ、（i）前記ターゲットDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカーのTm超である融解温度（Tm）、及び（ii）前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカーのTm未満である融解温度（Tm）を有し；
前記ブロッカーは、前記リファレンスDNA配列と完全に相補的であるが、前記標的DNA配列とは完全に相補的ではなく；
前記2つのプライマーは、前記リファレンスDNA配列又はその相補的配列、及び前記ターゲットDNA配列又はその相補的配列と完全に相補的である）
（b）前記反応混合物を、
（1）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm超の温度に加熱し；
（2）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm未満の温度に冷却して、前記リファレンスDNA配列への、前記プライマーではなく、前記ブロッカーのハイブリダイズを可能にし；
（3）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm超の温度に加熱し；
（4）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記プライマー配列のTm未満の温度に冷却し；及び
（5）前記ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を可能にする
サイクルの2サイクル以上に供し、それにより前記サンプル中のターゲットDNA配列を濃縮すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長が、前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記プライマー配列のTm未満の温度である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ターゲットDNA配列が、EGFR Exon 20に存在し、及びT790M変異をコードする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットDNA配列が、KRAS Exon 2中に存在し、及びリファレンス配列由来の単一塩基置換である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つのプライマーが、前記ブロッカーとオーバーラップする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記ブロッカーが、40塩基対以下で構成される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッカーの3’末端が、伸長を妨げるためにブロックされる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記リファレンスブロッキング配列の5’末端が、Taq DNAポリメラーゼによる5’から3’へのエキソヌクレオリシスを妨げるヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1つのプライマーが、前記リファレンス配列、ターゲット配列、又はそれらの相補的配列に相補的ではないアダプター配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット配列が、BRAF、EGFR、c-MET、HER-2、HER-3、NRAS、PIK3CA、KRAS、AKT-1、MAP2PK、ER、AR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、PDGFR1、PDFGR2、PDGFR3、TP53又はSMAD1の変異配列である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲット配列が、KRAS、EGFR、PIK3CA、TP53又はBRAFの変異配列である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
サイクリング後、前記反応混合物のサンプルが、MALDI-TOF、HR融解曲線解析、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、パイロシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCR及び定量PCRからなる群から選択される方法の1つ以上を用いて分析される、請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
50 bp未満のアンプリコンが複製される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が、血漿、血液、血清又は尿である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記体液が尿である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
少量のターゲットDNA配列を含むと思われる体液由来のセルフリーDNAを含むサンプルにおいて、ターゲットDNA配列を濃縮するための方法であって、ここで、
前記ターゲットDNA配列は、前記サンプル中に存在するリファレンスDNA配列と1ヌクレオチド異なり、そして
前記リファレンスDNA配列は、前記サンプル中で、前記ターゲットDNA配列よりも多く見られ、前記方法が、
（a）前記サンプル、ポリメラーゼ、2つのプライマー、及びブロッカーを含む反応混合物を調製すること（ここで、
前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする第一プライマー及び前記リファレンスDNA配列の相補的配列にハイブリダイズする第二プライマーを含む2つのプライマーは、それぞれ、（i）前記ターゲットDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカーのTm超である融解温度（Tm）、及び（ii）前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカーのTm未満である融解温度（Tm）を有し；
前記ブロッカーは、前記リファレンスDNA配列と完全に相補的であるが、前記ターゲットDNA配列とは完全に相補的ではなく；
前記2つのプライマーは、前記リファレンスDNA配列又はその相補的配列、及び前記ターゲットDNA配列又はその相補的配列と完全に相補的である）
（b）前記反応混合物を、
（1）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm超の温度に加熱し；
（2）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm未満の温度に冷却して、前記リファレンスDNA配列への、前記プライマーではなく、前記ブロッカーのハイブリダイズを可能にし；
（3）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記ブロッカー配列のTm未満の温度よりも高い温度に加熱し；
（4）前記反応混合物を前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記プライマー配列のTm未満の温度に冷却し；及び
（5）前記ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を可能にする
サイクルの2サイクル以上に供し、それにより前記サンプル中のターゲットDNA配列を濃縮すること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長が、前記リファレンスDNA配列にハイブリダイズする前記プライマー配列のTm未満の温度である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つのプライマーが前記ブロッカーとオーバーラップする、請求項16又は17に記載の方法。
【請求項１９】
50 bp未満のアンプリコンが増幅される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が、血漿、血液、血清又は尿である、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。