【手続補正書】
【提出日】平成29年6月7日(2017.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌無細胞合成系における生物活性のあるタンパク質の発現レベルを改善する方法であって、
ｉ）細菌抽出物を目的のタンパク質をコードする核酸と組み合わせて、細菌無細胞合成系をもたらすステップ；および
ｉｉ）前記細菌無細胞合成系を、前記目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現させることが可能な条件下でインキュベートするステップ
を含み、前記細菌抽出物が、活性な酸化的リン酸化系を有し、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含み、前記抽出物を、外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼを抽出物１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で発現する細菌から調製する、方法。
【請求項２】
前記抽出物を、外因性デアグリガーゼをさらに発現する細菌から調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出物が調製される細菌が、ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子、プロリルイソメラーゼをコードする遺伝子、またはデアグリガーゼをコードする遺伝子で共形質転換された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＣであり、前記外因性プロリルイソメラーゼがＦｋｐＡまたはＳｌｙＤであり、前記外因性デアグリガーゼがＳｋｐである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子から外因性ジスルフィドイソメラーゼ、プロリルイソメラーゼ、またはデアグリガーゼを発現する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌無細胞合成系の体積が０．５リットルから５００リットルの間であり、前記インキュベーションが１〜３６時間続く期間のインキュベーションである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞合成系であって、
ｉ）活性な酸化的リン酸化系を有する細菌の無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼが細菌において抽出物１リットル当たり少なくとも１ｇの総濃度で発現される、細菌の無細胞抽出物；ならびに
ｉｉ）目的のタンパク質をコードする核酸
を含み、目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現する、細菌無細胞合成系。
【請求項１２】
前記抽出物が調製される細菌が、前記ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子および前記プロリルイソメラーゼをコードする遺伝子で共形質転換された、請求項１１に記載の系。
【請求項１３】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＣであり、前記外因性プロリルイソメラーゼがＦｋｐＡまたはＳｌｙＤである、請求項１１または１２に記載の系。
【請求項１４】
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１１、１２または１３のいずれか１項に記載の系。
【請求項１５】
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子から前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼの少なくとも１つを発現する、請求項１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載の系。
【請求項１６】
前記抽出物がＥ．ｃｏｌｉのＳ３０抽出物である、請求項１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１項に記載の系。
【請求項１７】
適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質を細菌無細胞合成系において発現させる方法であって、
ｉ）細菌抽出物を目的のタンパク質をコードする核酸と組み合わせるステップ；ならびに
ｉｉ）前記細菌抽出物を、前記目的のタンパク質の発現および適正なフォールディングが可能になる条件下で前記核酸と共にインキュベートするステップ
を含み、前記細菌抽出物が、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸、リボソームと、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼとを含み、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の発現を改善するために十分な濃度で存在する、方法。
【請求項１８】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり１ｇから１リットル当たり１４ｇの間の総濃度で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的のタンパク質の発現が、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼとペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの両方ではなく一方が存在する場合であって、インキュベーション条件が他の点では同じである場合の濃度を上回る濃度まで改善される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、およびＤｓｂＤからなる群から選択され、前記ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼがＦｋｐＡおよびＳｌｙＤからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子から前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの少なくとも１つを発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞合成系であって、
ｉ）活性な酸化的リン酸化系を有する細菌無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼをさらに含み、
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼが、適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の発現を改善するために十分な濃度で存在する、細菌無細胞抽出物；ならびに
ｉｉ）目的のタンパク質をコードする核酸、
を含み、目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現する、細菌無細胞合成系。
【請求項２８】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、請求項２７に記載の系。
【請求項２９】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり１ｇから１リットル当たり１４ｇの間の総濃度で存在する、請求項２７に記載の系。
【請求項３０】
前記目的のタンパク質の発現が、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの両方ではなく一方が存在する場合であって、インキュベーション条件が他の点では同じである場合の濃度を上回る濃度まで改善される、請求項２７に記載の系。
【請求項３１】
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、およびＤｓｂＤからなる群から選択され、前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼがＦｋｐＡおよびＳｌｙＤからなる群から選択される、請求項２７に記載の系。
【請求項３２】
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子からタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの少なくとも１つを発現する、請求項２７に記載の系。
【請求項３３】
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項２７に記載の系。
【請求項３４】
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、請求項２７に記載の系。
【請求項３５】
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、請求項２７に記載の系。
【請求項３６】
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項２７に記載の系。
【請求項３７】
細菌抽出物を調製するための方法であって、
ｉ）外因性タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼを発現する細菌を培養するステップ、ならびに
ｉｉ）活性な酸化的リン酸化系を有し、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含む抽出物を調製するステップ
を含み、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、方法。
【請求項３８】
活性な酸化的リン酸化系を含む、生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼをさらに含み、
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、細菌無細胞抽出物。
【請求項３９】
前記目的のタンパク質が、１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で発現される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項４０】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり１ｇ〜１リットル当たり２０ｇの濃度で発現される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項４１】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり２．５ｇ〜１リットル当たり４．１ｇのレベルで発現され、前記外因性プロリルイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり３．４ｇ〜１リットル当たり１３．９ｇのレベルで発現される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項４２】
前記目的のタンパク質が、６００ｍｇ／Ｌ超の濃度で発現される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項４３】
前記目的のタンパク質が、１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で発現される、請求項１１〜１６に記載の系。
【請求項４４】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり１ｇ〜１リットル当たり２０ｇの濃度で発現される、請求項１１〜１６に記載の系。
【請求項４５】
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり２．５ｇ〜１リットル当たり４．１ｇのレベルで発現され、前記外因性プロリルイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり３．４ｇ〜１リットル当たり１３．９ｇの濃度で発現される、請求項１１〜１６に記載の系。
【請求項４６】
前記目的のタンパク質が、６００ｍｇ／Ｌ超の濃度で発現される、請求項１１〜１６に記載の系。
【請求項４７】
前記目的のタンパク質が、１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で発現される、請求項１７〜２６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり１ｇ〜１リットル当たり２０ｇの濃度で発現される、請求項１７〜２６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ジスルフィドイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり２．５ｇ〜１リットル当たり４．１ｇのレベルで発現され、前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記細菌中で、抽出物１リットル当たり３．４ｇ〜１リットル当たり１３．９ｇの濃度で発現される、請求項１７〜２６に記載の方法。
【請求項５０】
前記目的のタンパク質が、６００ｍｇ／Ｌ超の濃度で発現される、請求項１７〜２６に記載の方法。
【請求項５１】
前記目的のタンパク質の濃度が、インキュベーション条件が他の点では同じであり、前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼを別々に発現する細菌によって発現される濃度の合計を超えている、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項５２】
前記目的のタンパク質の濃度が、インキュベーション条件が他の点では同じであり、前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼを別々に発現する細菌によって発現される濃度の合計を超えている、請求項１１〜１６に記載の系。
【請求項５３】
前記適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の濃度が、インキュベーション条件が他の点では同じであり、前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼを別々に発現する細菌によって発現される濃度の合計を超えている、請求項１７〜２６に記載の方法。
【請求項５４】
前記適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の濃度が、インキュベーション条件が他の点では同じであり、前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼを別々に発現する細菌によって発現される濃度の合計を超えている、請求項２７〜３６に記載の系。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
第５の態様では、Ｅ  ｃｏｌｉ細胞培養物の生命力および／または成長速度を改善する方法が記載され、当該方法は、
ｉ）構成的プロモーターに作動可能に連結した、タンパク質ＤｓｂＣを発現する核酸でＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するステップ；および
ｉｉ）形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＤｓｂＣタンパク質を少なくとも１ｍｇ／ｍｌの細胞内濃度まで過剰発現させることが可能になる条件下で培養するステップ
を含む。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
細菌無細胞合成系における生物活性のあるタンパク質の発現レベルを改善する方法であって、
ｉ）細菌抽出物を目的のタンパク質をコードする核酸と組み合わせて、細菌無細胞合成系をもたらすステップ；および
ｉｉ）前記細菌無細胞合成系を、前記目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現させることが可能な条件下でインキュベートするステップ
を含み、前記細菌抽出物が、活性な酸化的リン酸化系を有し、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含み、前記抽出物を、外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼを抽出物１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で発現する細菌から調製する、方法。
（項目２）
前記抽出物を、外因性デアグリガーゼをさらに発現する細菌から調製する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抽出物が調製される細菌が、ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子、プロリルイソメラーゼをコードする遺伝子、またはデアグリガーゼをコードする遺伝子で共形質転換された、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＣであり、前記外因性プロリルイソメラーゼがＦｋｐＡまたはＳｌｙＤであり、前記デアグリガーゼがＳｋｐである、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子から外因性ジスルフィドイソメラーゼ、プロリルイソメラーゼ、またはデアグリガーゼを発現する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細菌無細胞合成系の体積が０．５リットルから５００リットルの間であり、前記インキュベーションが１〜３６時間続く期間のインキュベーションである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞合成系であって、
ｉ）活性な酸化的リン酸化系を有する細菌の無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性プロリルイソメラーゼが細菌において抽出物１リットル当たり少なくとも１ｇのレベルで発現された、細菌の無細胞抽出物；ならびに
ｉｉ）目的のタンパク質をコードする核酸
を含み、目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現する、細菌無細胞合成系。
（項目１２）
（削除）
（項目１３）
前記抽出物が調製される細菌が、前記ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子および前記プロリルイソメラーゼをコードする遺伝子で共形質転換された、項目１１に記載の系。
（項目１４）
前記外因性ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＣであり、前記外因性プロリルイソメラーゼがＦｋｐＡまたはＳｌｙＤである、項目１１または１３に記載の系。
（項目１５）
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目１１または１３に記載の系。
（項目１６）
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子から前記外因性ジスルフィドイソメラーゼおよび前記外因性プロリルイソメラーゼを発現する、項目１１、１３または１５に記載の系。
（項目１７）
前記抽出物がＥ．ｃｏｌｉのＳ３０抽出物である、項目１１、１３または１６に記載の系。
（項目１８）
適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質を細菌無細胞合成系において発現させる方法であって、
ｉ）細菌抽出物を目的のタンパク質をコードする核酸と組み合わせるステップ；ならびに
ｉｉ）前記細菌抽出物を、前記目的のタンパク質の発現および適正なフォールディングが可能になる条件下で前記核酸と共にインキュベートするステップ
を含み、前記細菌抽出物が、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸、リボソームと、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼとを含み、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の発現を改善するために十分な濃度で存在する、方法。
（項目１９）
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの総濃度が、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの濃度で存在する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの総濃度が、前記抽出物中、１リットル当たり１ｇから１リットル当たり１４ｇの間の濃度で存在する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記目的のタンパク質の発現が、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼとペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの両方ではなく一方が存在する場合であって、インキュベーション条件が他の点では同じである場合の濃度を上回る濃度まで改善される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、およびＤｓｂＤからなる群から選択され、前記ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼがＦｋｐＡおよびＳｌｙＤからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子からタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの少なくとも１つを発現する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞合成系であって、
ｉ）活性な酸化的リン酸化系を有する細菌無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼをさらに含み、
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼが、適正にフォールディングされた生物活性のあるタンパク質の発現を改善するために十分な濃度で存在する、細菌無細胞抽出物；ならびに
ｉｉ）目的のタンパク質をコードする核酸、
を含み、目的のタンパク質を少なくとも約１００ｍｇ／Ｌの濃度まで発現する、細菌無細胞合成系。
（項目２９）
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの総濃度が、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの濃度で存在する、項目２８に記載の系。
（項目３０）
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの総濃度が、前記抽出物中、１リットル当たり１ｇから１リットル当たり１４ｇの間の濃度で存在する、項目２８に記載の系。
（項目３１）
前記目的のタンパク質の発現が、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの両方ではなく一方が存在する場合であって、インキュベーション条件が他の点では同じである場合の濃度を上回る濃度まで改善される、項目２８に記載の系。
（項目３２）
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、およびＤｓｂＤからなる群から選択され、前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼがＦｋｐＡおよびＳｌｙＤからなる群から選択される、項目２８に記載の系。
（項目３３）
前記抽出物が調製される細菌が、構成的プロモーターに作動可能に連結した遺伝子からタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼの少なくとも１つを発現する、項目２８に記載の系。
（項目３４）
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目２８に記載の系。
（項目３５）
前記目的のタンパク質が、その生物活性のあるコンフォメーションにおいて少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、項目２８に記載の系。
（項目３６）
前記目的のタンパク質が、少なくとも２つのプロリン残基を有する、項目２８に記載の系。
（項目３７）
前記目的のタンパク質が抗体または抗体断片である、項目２８に記載の系。
（項目３８）
細菌抽出物を調製するための方法であって、
ｉ）外因性タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび外因性ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼを発現する細菌を培養するステップ、ならびに
ｉｉ）活性な酸化的リン酸化系を有し、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含む抽出物を調製するステップ
を含み、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、方法。
（項目３９）
活性な酸化的リン酸化系を含む、生物活性のあるタンパク質を発現させるための細菌無細胞抽出物であって、無細胞タンパク質合成に必要な生物学的機能性ｔＲＮＡ、アミノ酸およびリボソームを含有し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼをさらに含み、
前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび前記ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼが、前記抽出物中、１リットル当たり少なくとも約１ｇの総濃度で存在する、細菌無細胞抽出物。