(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス マテンシス ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を、ｐＨ７〜ｐＨ９に保ちながら培養することを特徴とするラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
【請求項２】
菌株の培養を３０℃〜４３℃の培養温度で行うことを特徴とする請求項１記載のラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
【請求項３】
ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス マテンシス ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を、３９℃〜４３℃で培養することを特徴とするラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はβ−１，３グルカナーゼの一種である、ラミナリペンタオース生産酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラミナリペンタオース（以下ＬＰと略記する）の製造方法は化学的分解法と酵素的分解法に大別される。前者の方法は、β−１，３結合を有する多糖類のβ−１，３グルカンを硫酸等の酸類により加水分解して、目的とするＬＰのみをクロマトグラフィー等により得る方法である。しかしこのような方法は、糖鎖をランダムに切断するために重合度の異なるオリゴ糖が大量に生成し、ＬＰの収率は極めて低く、その精製工程も様々なクロマトグラフィーなどの手法を必要とする為、非常に煩雑で手間がかかり非効率的である。
【０００３】
一方後者の方法は、重合度の異なるオリゴ糖の生成を抑制し、極めて高い収率でＬＰを生成できること、またそのためにＬＰの分離精製が容易であるとの利点を有する。β−１，３グルカンからＬＰを生産するＬＰ生産酵素は、本発明者らにより特公平４−３７７１９号公報としてストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の放線菌により製造できることが知られている。該公報ではストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｍａｔｅｎｓｉｓ  ＤＩＣ−１０８）菌株を所定の液体培地（ｐＨ７．０）に接種し、培養中のｐＨ調整はせずに、培養温度３５℃で３日間培養することによってＬＰ生産酵素を得ていた。しかしこの方法によると、酵素生産量は発酵液１Ｌあたり３９７単位（酵素力価）であり、該酵素量はその定義よりβ−１，３グルカンからＬＰを１時間当たり２ｇ生成する量にすぎず、工業化のためには酵素生産量を飛躍的に高める必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＬＰは食品添加物、化粧品・医薬基剤などへの利用や、近年抗腫瘍活性や植物におけるエリシター活性について研究が進められており注目を集めている。またＬＰの誘導体が抗ウイルス活性を示すことも知られており、各種医薬品原料またはその中間体として大量かつ高純度の生産が切望されている。従って、本発明の目的は酵素法によってＬＰを工業規模で大量生産するために必要な、ＬＰ生産酵素を効率的に製造することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは酵素生産のための培養条件について鋭意研究を重ねた結果、菌体を培養するにあたり、特定のｐＨ、及び／または特定の培養温度とすることにより、酵素の生産性を従来の方法よりもはるかに高いレベルにすることに成功した。
【０００６】
即ち本発明は、ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養し、ラミナリペンタオース生産酵素を製造する方法であって、（１）該菌株の培養をｐＨ７〜ｐＨ９に保ちながら行うことを特徴とする製造方法及び、（２）該菌株の培養温度を３９℃〜４３℃とすることを特徴とする製造方法に関する。
【０００７】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明で用いるストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｍａｔｅｎｓｉｓ  ＤＩＣ−１０８）菌株とは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第２５３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２５３）として国際寄託されているストレプトマイセス  エスピ−ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ  ＤＩＣ−１０８）と同一である。また本発明で用いる菌株としては、該菌株を人工的に変異処理、例えば化学、物理的手段による変異誘発処理又は遺伝子組み替え体の創出を行うことにより得られる人為的突然変異体、あるいは自然変異株も含まれる。以下これらをまとめて本菌株とする。
【０００８】
本菌株から生産されるラミナリペンタオース生産酵素（以下ＬＰＨａｓｅと略記する）とはβ−１，３グルカナーゼの一種であり、β−１，３グルカンを加水分解し、ラミナリペンタオース（ＬＰ）を高収率で生成する酵素である。
【０００９】
ここでいうβ−１，３グルカンとは、例えばカードラン、パキマン、ラミナリン、酵母細胞壁等に含まれるグルコースがβ−１，３グリコシド結合している多糖である。またＬＰとはグルコースがβ−１，３グリコシド結合でつながっている重合度が５の直鎖状オリゴ糖であり、Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドで表される化合物である。
【００１０】
以下に本発明によるＬＰ生産酵素製造のための本菌株の培養方法について述べる。
培地は通常の固体培地又は液体培地を使用することができ、培養に用いる炭素源としてはＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、シュークロース、ラクトース等の単糖類、少糖類及び糖アルコール類、あるいはグリセリン等の多価アルコール類等を使用することができる。また、廃糖蜜、デンプン分解物、チーズホエーなどの農産廃棄物の利用も可能である。これら炭素源の使用濃度としては、培地あたり０．１重量％〜５０重量％が好ましい。
【００１１】
酵素生産の為の誘導基質にはα−１，４、α−１，６グリコシル化合物であるデンプンや、β−１，４グリコシル化合物であるセルロース、あるいはそれらの部分分解物なども使用できるが、酵素生産性を高めるためにはβ−１，３グリコシル化合物が望ましい。β−１，３グリコシル化合物としては例えばラミナリビオース、ラミナリトリオース等のオリゴ糖類や、カードラン、パキマン、ラミナリン、リケナン、酵母細胞壁又はその部分分解物、リュウコシン、カロース、パラミロン等の多糖類等が挙げられ、好ましくはカードランが挙げられる。これらの使用濃度としては、培地当たり０．１重量％〜１０重量％が好ましい。これらの酵素誘導基質は通常培地作製時に他の培地成分と同じように培地中に添加して加熱殺菌することができるが、カードランのように加熱時に凝固するもの、あるいは他の培地成分と反応し着色するオリゴ糖等は別殺菌してから、別途培地に添加するのが望ましい。これらの酵素誘導基質は培養開始時に添加することも、培養途中に添加することもできる。また本菌株は酵素誘導基質であるこれらのオリゴ糖類や多糖類を炭素源にして生育することも可能なので、その場合は炭素源を添加することなく酵素生産が可能となる。
【００１２】
培地に用いる窒素源としてはポリペプトン、乾燥酵母、乾燥酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、麦芽エキス、カゼイン、オートミール、味液、魚粉、ポテトエキス、硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素等、有機窒素、無機窒素等を使用することができる。これら窒素源の使用濃度としては０．１重量％〜１０重量％の範囲が望ましい。
【００１３】
無機物としてはリン酸カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム等のリン酸塩又はそのナトリウム塩、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩又はそのカリウム塩、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩等が使用でき、これらの成分を複数用いることも可能である。その他、必要に応じてビタミン類及び重金属類等を添加することもできる。これら無機物の使用濃度としては０．０５重量％〜１重量％が好ましい。また発酵中の発泡を抑制するために０．０００１重量％〜０．５重量％の消泡剤を添加しても良い。消泡剤としては、ポリアルキレングリコール系、シリコーンエマルジョン系、アセチレン系、植物あるいは動物油脂系等通常の消泡剤が使用できる。
【００１４】
培養は通常通気攪拌、振盪等による好気的条件下で行うのが好ましいが、静置条件下で行うこともできる。例えば液体培養の場合は振盪培養、通気攪拌培養等の好気的液体培養が適しておりジャーファーメンターを使用する場合には通気量０．２ｖｖｍ〜２ｖｖｍ、好ましくは０．８ｖｖｍ〜１．２ｖｖｍ、攪拌回転数１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは４００ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの範囲で培養を行うことが望ましい。
【００１５】
本発明において培養液のｐＨ及び／または温度管理は重要である。
本菌体を培養する際に、中性培地を用いた場合でも、通常培養液のｐＨは培養初期においては低下傾向にあり、ｐＨ５程度の酸性になるが、培養後期には上昇傾向にあり、最終的にはｐＨが８．５程度のアルカリ性になる。本菌体の培養時、培養液が酸性側に移行することは酵素の生産量が低くなり好ましくない。例えば３５℃で培養した場合、酵素生産量が反応開始から３６時間で頭打ちになってしまう（図１参照）。従って、培養初期にはアルカリ溶液を適宜添加して、弱アルカリ側に保つ必要がある。従って、本発明の培養は適時アルカリまたは酸溶液を添加して中性から弱アルカリ性、好ましくはｐＨを７〜９、より好ましくは７．５〜８．５の範囲に保ちながら行う。特に好ましくは適宜アルカリ又は酸溶液を培養液に添加して、ｐＨを一定の値とし、できるだけｐＨ値を変動させないように調整することが良い。従って、ｐＨ７〜９、好ましくは７．５〜８．５の間の設定値に調節しながら培養を行うことがより望ましい。このようにすることで、同じ温度でｐＨを無調整にした場合に比べて、酵素生産量が３倍以上になる。
【００１６】
本発明で使用できる酸溶液としては、硫酸、塩酸、硝酸等の無機酸の他、酢酸、乳酸等の有機酸も使用することができる。また本発明で使用できるアルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液、アンモニア水等を使用することができる。ｐＨを上記の範囲に保ちながら培養する場合、培養は２０〜５０℃で行えるが、好ましくは３０〜４３℃であり、より好ましくは３５〜４３℃、特に好ましくは３９℃〜４１℃である。
【００１７】
更に本菌体を培養する際に、培養温度を３９〜４３℃、好ましくは３９〜４１℃の範囲に調節することにより、培養液のｐＨを無調整で行った場合でも、３５℃で培養した場合と比べて酵素生産量が６倍以上になる。培養温度はできるだけ変動させないように調整することが望ましい。従って３９℃〜４３℃、好ましくは３９〜４１℃の間の設定値に調節しながら培養を行うことが望ましい。温度を上記の範囲で培養する場合、培養液のｐＨは無調整であっても良いが、好ましくはｐＨ７〜９、より好ましくは７．５〜８．５の範囲に保ちながら、特に好ましくはこれらの範囲の間の設定値に調節しながら培養することが好ましい。
【００１８】
また、培養の方法は、回分培養、連続培養、半連続培養、流加培養等のいずれの方法でも行うことができ、培養時間は培養方法や培養温度、接種菌体量、必要とするＬＰＨａｓｅ量によっても異なるが、回分培養の場合、通常１日〜５日程度、好ましくは２日〜３日である。
【００１９】
培養終了後培養物からＬＰＨａｓｅを採取する方法としては、ＬＰＨａｓｅが菌体外に生産される酵素であるので、培養終了後、培養液から菌体を、遠心分離又は膜濾過等の一般に用いられる方法により分離することで、その菌体及び培養濾液からＬＰＨａｓｅを採取することができる。酵素を菌体中からも回収する場合は超音波処理、溶菌酵素処理、ガラスビーズによる破砕処理などを行い酵素を菌体外に取り出す。このとき必要があれば、界面活性剤等を添加しＬＰＨａｓｅの回収率を高めることもできる。
【００２０】
培養液の遠心分離上清画分及び菌体から採取した酵素は、一般に用いられる精製法、例えば塩析法、有機溶媒添加による沈殿法、限外濾過法、イオン交換樹脂による吸着法等を単独で、あるいは適宜組み合わせて精製することができる。塩析法は例えば、硫安、硫酸ナトリウム等によって塩析した沈殿を、濾別あるいは遠心分離後、脱塩して凍結乾燥品を得る。沈殿法は例えばアセトン、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の有機溶剤を加え、酵素を沈殿物として取得し、乾燥、保存する。また、限外濾過膜法は例えばボルテックスフロー濾過装置（メンブレックス社製）等を用いて濃縮し緩衝液置換後、脱塩、凍結乾燥する。イオン交換樹脂法は例えばストリームラインＳＰ、ＤＥＡＥ（ファルマシア社製）等の樹脂に液中の酵素蛋白を直接吸着させる方法である。
【００２１】
酵素を更に精製するためには、例えばＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロースを用いるようなイオン交換クロマトグラフィー、あるいはセファデックスＧ−１００（ファルマシア社製）によるゲル濾過クロマトグラフィー等を単独であるいは併用して精製すればよい。
【００２２】
なお、本発明の方法によれば、酵素の濃度及び純度が高いので、特に精製することなく培養液をそのままの状態で、あるいは菌体を除去した培養液を、ＬＰ生成反応のための酵素源として使用することができる。また、遠心分離によって集菌した菌体を緩衝液に再分散して酵素源として使用することもできる。本菌株から生産されるＬＰＨａｓｅからＬＰを製造する方法は、特公平４−３７７１９号公報に詳述されている。
【００２３】
【実施例】
以下実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。文中「部」及び「％」は重量基準であるものとする。また本実施例中で測定した酵素力価の定義を以下に記載する。
（酵素力価の決定）
１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にカードラン１％を懸濁させ、それに適量の酵素を加えて水で５．０ｍｌとし、４５℃で反応させる。１時間に１ｍｇのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とする。
【００２４】
実施例１
ポリペプトン（牛乳カゼインの酵素分解物、和光純薬工業株式会社販売）０．２％、酵母エキス（オキソイド社製、関東化学株式会社販売）０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）２．５Ｌを（株）丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−５Ｌジャーファーメンターに仕込み、１２１℃、３０分湿熱殺菌した。培地の温度が常温に下がったところで同条件であらかじめ湿熱殺菌しておいたグルコース（和光純薬工業株式会社販売）と１８０℃、１時間の条件で乾熱殺菌しておいた酵素誘導基質であるカードラン（武田薬品工業株式会社販売）をそれぞれ０．５重量％となるように添加し、その後、３５℃で２日間振盪培養しておいたストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）の培養液を２．５ｍｌ接種した。培養液のｐＨは培養開始時から終了時まで５Ｎの水酸化ナトリウム溶液及び２Ｎ硫酸水溶液を適宜添加する事により８に調整した。ｐＨ計測にはインゴールド社製ｐＨ複合電極（タイプ：４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ／３２５）を使用し、ｐＨ制御には（株）丸菱バイオエンジ製バイオプロセスコントローラー  ＭＤＩＡＣタイプＳ３を使用した。回転翼はバッフルタービン型を使用し攪拌回転数５００ｒｐｍ、空気通気量１ｖｖｍ、培養温度３５℃で２日間培養した。その結果得られた酵素の生産量は３１８６単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００２５】
実施例２
実施例１において、培養温度を４０℃とした以外は、実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は７９３８単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００２６】
実施例３
実施例１において、培養ｐＨを７とした以外は、実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は１９９８単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００２７】
実施例４
実施例１において、培養ｐＨを９とした以外は、実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は１１８８単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００２８】
実施例５
実施例１において、培養温度を３０℃とした以外は、実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は２３７６単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００２９】
実施例６
実施例１において、ｐＨを無調整、培養温度を３９℃とした以外は、実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は２７７９単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００３０】
比較例
実施例１において、ｐＨを無調整とした以外は実施例１と同様にストレプトマイセス  マテンシス  ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は３９７単位／Ｌ培養液であった。結果を表１に記載する。
【００３１】
【表１】
0003601618.tif 000002
【００３２】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、従来生産量がきわめて微量であったＬＰＨａｓｅを大量に生産することが可能であり、ＬＰの工業生産上きわめて有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】３５℃、ｐＨ無調整で培養したときの、ｐＨ及び酵素生産量の経時変化を表したグラフである。
【図１】
0003601618.tif 000003