(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物培養細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物を、有効時間にわたり、被検物質で処理することにより、被検物質の直接の作用により培養物中へ放出された細胞内酵素を経時的に測定し、ある任意の障害率となる暴露時間と用いた被検物質の濃度との積を計算して毒性の指標とすることを特徴とする毒性評価方法。
【請求項２】
動物培養細胞が、ヒト繊維芽細胞である請求項１記載の毒性評価方法。
【請求項３】
被検物質の直接の作用により培養物中へ放出される細胞内酵素が、乳酸脱水素酵素である請求項１記載の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物培養細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物を用いた被検物質の毒性評価法に関し、特に実験動物を用いずに、簡便に化学薬品、化粧品、洗剤等の被検物質の毒性や安全性を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、化学薬品、化粧品、洗剤等の被検物質の毒性あるいは安全性試験は、ドレイズ試験法に代表されるように、実験動物を用いて行われてきた。しかし、その結果は、定量性や客観性の問題に加え、一種類の被検物質に多数の動物が必要とされることから、経済的観点または動物愛護の観点からも、動物実験に替わる方法が求められている。
【０００３】
動物実験代替法の一つとして、動物細胞を使った方法、特に単層培養系を用いた方法が行われている。しかし、生体内で該細胞は三次元的な配置、あるいはコラーゲン等の結合組織に内封された状態で存在するため、必ずしも単層培養系での結果が、生体にそのまま外挿できるとは限らない。また、単層培養系では生体内での機能が失われる例も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、Ｂｅｌｌらは、ヒト繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培養したものを報告している（米国特許第４，４８５，０９６  号明細書）。該培養物は、真皮結合組織中の繊維芽細胞と同じ形態を有しており、該培養物を用いての毒性評価キットも市販されている。該培養物を用いた毒性評価は、主にテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）を用いた刺激終点での生存率を指標にする方法が行われている。しかし、該方法では１つの培養物から１点の生存率データしか得られず、１種の被検物質の毒性を評価するには、濃度の異なるいくつかの点について、生存率を求めなければならないため、複数の培養物が必要となる。したがって、多数の被検物質の毒性評価を行う際は、経済的な負担となる問題があった。
【０００５】
その他、生体構造に類似した培養物を利用した方法としては、皮膚刺激能の評価方法として、ヒト皮膚ケラチン細胞または繊維芽細胞培養物、またはこれらの細胞の同時培養物を有効量の時間にわたり被検物質で暴露し、テトラゾリウム塩からホルマザン色素への還元により細胞生存率を測定することから、組成物の刺激ポテンシャルを測定する方法（特開平６−１８０３１１号公報）  、あるいはコラーゲンゲル上に動物細胞を播種し、定期的に培地交換を繰り返して、一定期間後、培地中に被検物質を添加し、一定時間経過後に、動物細胞の機能を測定する方法（特開平８−１６３９９６号公報）  等が公知である。しかしながら、いずれも  １つの培養物から  １点の生存率データしか得られず、Ｂｅｌｌらの方法と同様な問題を有している。
【０００６】
さらに、テトラゾリウム塩を利用しない毒性評価方法として、動物培養細胞を被検物質で処理した後、該細胞から遊離する乳酸脱水素酵素を測定する安全性評価試験法が公知である（特開平４−１４８６９５号公報）  。しかしながら、この測定法を用いても、毒性評価を行う際は、上記と同様の問題を有していた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、必要とする培養物の数量を少なくするために、被検物質の毒性検出ならびに評価法について、種々鋭意、検討を行った結果、被検物質の培養物から、培地中へ放出された乳酸脱水素酵素量の経時的変化に基づく、毒性評価法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は動物培養細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物を、有効時間にわたり、被検物質で処理することにより、被検物質から培養物中へ放出された細胞内酵素を経時的に測定することを特徴とする毒性評価方法である。
【０００９】
【発明の実施態様】
本発明では、動物培養細胞を包埋培養したコラーゲンゲル培養物を用いる。
使用する動物培養細胞としては、繊維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞などがあり、間葉系の細胞、特に繊維芽細胞が好適に使用される。また、株化した細胞であっても構わない。
動物種はヒト、ラット、マウス等の哺乳動物のものが使用できる。
【００１０】
コラーゲンゲルはラット尾や牛腱から調製できるが、市販のものが好適に使用できる。
【００１１】
包埋培養とは、動物培養細胞とコラーゲン溶液の混合液をゲル化させたものを培養することをいう。
動物培養細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物としては、例えば、ヒト培養繊維芽細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物があり、商標名、「マトレックスＴＭ」（製造・販売  東洋紡績）などがある。
【００１２】
本発明に使用される被検物質としては、化学薬品、化粧品、洗剤等が広く用いられる。
【００１３】
本発明では、これらの被検物質を水、生理食塩水、培地等に溶解、あるいは固形の状態で、動物培養細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物に添加し、有効時間にわたり処理する。
【００１４】
ここで、有効時間とは、被検物質がコラーゲンゲル内の動物細胞に作用し、その被検物質が有する毒性を発揮するのに充分な時間を指し、一般に、３０分〜２４時間が望ましい。
コラーゲンゲル培養物に被検物質を暴露している間、細胞活動が維持できるよう培地にて培養しながら行う。用いる培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＥＭＥＭ培地、ＰＢＳなどがあり、特に血清を含有しないＤＭＥＭ培地を使用することが好ましい。
培養物は本培地にて、例えば３７℃で３０分間〜２４時間培養を行う。
【００１５】
特に、平板状のコラーゲンゲルについては、上面を被検物質に暴露させ、もう一方の面（下面）を培地に接触させながら、培養を行うのが望ましい。この場合、コラーゲンゲルの培養器材として、ミリセル（ミリポア社製）、セルカルチャーインサート（ファルコン社製）などがあり、例えば、トランスウェル（コースター社製）が好適に使用できる。
【００１６】
被検物質によってコラーゲンゲル中の動物細胞が死滅すると、該細胞死による細胞膜の溶解もしくは被検物質の直接の作用による細胞膜の破壊が生じ、動物細胞内に存在する種々の酵素が培地中に放出される。
【００１７】
本発明では被検物質の処理中に経時的に上記培地を採取し、その中に含まれる細胞内酵素量を測定する。
測定する細胞内酵素としては乳酸脱水素酵素、アルカリホスファターゼ等があげられるが、特に乳酸脱水素酵素は多くの細胞種について、細胞内に存在しており、簡単に酵素量が測定ができるため、便利である。
【００１８】
乳酸脱水素酵素量の測定は、抗体による定量法等もあるが、一般に該酵素活性を測定することが簡便である。この場合、市販の乳酸脱水素酵素活性測定キットが好適に使用される。
【００１９】
本発明における毒性の評価は、培地中に放出された細胞内酵素量の経時的変化を観察することにより行う。例えば、ある一定量の酵素量が放出されるまでに要する時間の長さを指標として、それが短時間であるほど、毒性が強いと判断できる。また、濃度の異なる被検物質間の毒性を比較する場合は、（濃度）×（時間）積を指標とすることも可能である。
【００２０】
本発明方法を用いることにより、１つの濃度点のみで毒性評価が可能となり、必要とする培養物数量も従来より少なくすることができる。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明を具体的に実施例でもって説明する。
実施例１
培養されたヒト繊維芽細胞を包埋し、培養したコラーゲンゲル培養物は、商標名、マトレックス（製造・販売  東洋紡績）を用いた。該培養物は、培養されたヒト繊維芽細胞とコラーゲンゲルとの混合物を一定期間培養して、製造したものである。
【００２２】
上記コラーゲンゲル培養物をアッセイプレート（６穴プレート）に入れ、コラーゲンゲル培養物上にアッセイ培地（製造・販売  東洋紡績）を５ｍｌ加え、室温で３０分間放置し、コラーゲンゲル培養物の洗浄をアッセイ培地で行った。
各ウェル内のアッセイ培地を吸引して抜き取り、キット添付のアッセイ・リングにシリコンを塗布し、コラーゲンゲル培養物上面に密着させた。
【００２３】
アッセイプレートの各ウェルにアッセイ培地（製造・販売  東洋紡績）を１．５ｍｌ加えた。３７℃インキュベーター内（湿度９５％以上）にて、１時間、上記ウェルを入れて、前培養を行った後、ウェル内のアッセイ培地を吸引除去し、新たに各ウェルにアッセイ培地を１．５ｍｌ加えた。
蒸留水で溶解した表１に示される被検物質６種を８０μｌ、培養物上面に付着させたアッセイ・リング中央部に添加した。このとき、何も添加していないコラーゲンゲル培養物をネガティブコントロールとして用いた。
３７℃インキュベーター内（湿度９５％以上）にて、上記被検物質を暴露させたコラーゲンゲル培養物の培養を行い、０．５、１、２、４、８、１６時間経過後、ウェル内のアッセイ培地から、１００μｌの培地を採取し、次いで抜き取った分のアッセイ培地を新たに補充し、培養を継続した。
【００２４】
ポジティブコントロールサンプルは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−アッセイ培地により、コラーゲンゲル培養物全組織から抽出されたサンプル液を用いた。
サンプリングしたアッセイ培地（Ｓ）、ネガティブコントロール（ＮＣ）、ポジティブコントロール（ＰＣ）、ブランク（新鮮なアッセイ培地のみ、ＢＬ）について、市販の乳酸脱水素酵素活性測定キット（和光純薬工業（株））を用い、乳酸脱水素酵素活性を測定した。ポジティブコントロールの活性量を１００％として、各サンプルの障害率を以下の計算式にて算出した。
障害率（Ｔ、％）＝｛（Ｓ）−（ＢＬ）｝×１００／（ＰＣ）。
ここで、Ｔ＝２０％となる暴露時間（ＥＴ２０）と、用いた被検物質の濃度（Ｃ）との積をＣＴ２０値とした。
用いた被検物質及び得られた結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0003596658.tif 000002
【００２６】
表１から明らかなように、ＣＴ２０値の低いもの程、毒性が強くなる傾向が認められた。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によると、１つの濃度点のみで毒性評価が可能となり、必要とする培養物数量も従来より少なくすることができる。よって、他種類の被検物質の毒性をスクリーニングする場合、必要な経費が少なくすみ、また簡便に行うことができる。