【手続補正書】
【提出日】平成29年4月27日(2017.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
更に、α−１抗トリプシン（ＡＡＴ）タンパク質の循環中のレベルの増大は、２５年以上に渡り幾つかのＡＡＴＤの長期的治療において処方された治療であった（Ｗｅｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）。この治療は、血液及び組織中のアルファ−１タンパク質をより高いレベルに維持することは、ＡＡＴがその主要な全身的阻害剤である好中球エラスターゼの効果に対して保護的であるという仮説に基づく。しかしながら、増強療法によるエラスチン分解に対する正の効果を示す試みは、一貫性が認められない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
補充の間、尿中へのデスモシン排出は、試行中と比較して変化しなかった。この試験において、補充治療を受けていない肺気腫に罹ったＡＡＴＤ対象は、健康な喫煙者又は通常のＡＡＴに罹ったＣＯＰＤ患者と比較してデスモシンの排出が多く、この結果は、非ＡＡＴＤのＣＯＰＤ患者よりもＡＡＴＤ患者において、ＤＩの血漿レベルが高いという最近の報告と一致する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【図７】図７は、アルファ−１抗トリプシン欠乏症における、血漿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対する、静脈内アルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。各ボックスの上半分は第三四分位数（７５ｔｈ  ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）、下半分は第一四分位数（２５ｔｈ  ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）を示す。各ボックスの上方及び下方のＷｈｉｓｋｅｒ（エラーバー）は、最大値及び最小値を示す。正常の平均±標準偏差（ＳＤ）：０．２２  ±  ０．０４，  ｎ＝４７；増強の平均±標準偏差（ＳＤ）：０．２５  ±  ０．０１  ，  ｎ＝５０；増強無しの平均±標準偏差（ＳＤ）：０．３６  ±  ０．０１  ，  ｎ＝５０。ｔ検定の結果は以下のようになった：正常対増強：Ｐ＝０．００３５；増強対増強無し：  Ｐ＜０．０００１；正常対増強無し：  Ｐ＜０．０００１。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
ＤＥＳ−ｄ４の化学合成
出発材料は、予め合成した４−アルキニルＤＥＳ誘導体化合物１（図１）である（Ｕｓｕｋｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２，  Ｙａｎｕｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２）。ＣＤ３ＯＤ（０．９ｍｌ）中の化合物１（３５．２  ｍｇ，  ２７．４μｍ，  １  ．０  ｅｑ）を１０％  Ｐｄ／Ｃ  （１４５．６  ｍｇ，  ０．１４  ｍｍｏｌ，  ５．０  ｅｑ）で処理し、Ｄ２大気下で、室温で、風船を使用して重水素化した。室温で６日間撹拌した後、反応混合物を中性シリカ上のセライトパッドを通して濾過して分離し、ＭｅＯＨで溶出し、濾過物を減圧下で濃縮して、黄色の固体として化合物２の粗混合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｄ４Ｈ６８Ｎ５Ｏ６［Ｍ］＋：  ９３０．５２，  ｆｏｕｎｄ：  ９３０．３９。得られた産物を更に精製せずに次の反応に使用した。ＴＦＡ及び蒸留水の混合物（７．０  ｍＬ，  ＴＦＡ／水＝  ９５／５）を室温で粗混合物２に添加し、２時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した。Ｃ１８カラムクロマトグラフィーで精製して（蒸留水中０．１％ＴＦＡ）、黄色の固体として、所望のＤＥＳ−ｄ４を得た（２８．９  ｍｇ，  ４４．９μｍｏｌ，  ｑｕａｎｔ  （２工程））；Ｒｆ０．２２  ［ＭｅＯＨ  （０．１  ％  ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ（０．１  ％  ＴＦＡ）  ＝  １  ：  ９］。ＤＥＳ−ｄ４の構造は、ＮＭＲ（図２）及びマススペクトル（図３）の両方によって確認された。新しく合成されたＤＥＳ−ｄ４は、酸性条件で安定なアルカン炭素が４つの重水素を有していた。この合成された重水素−ＤＥＳは、４つの重水素化アイソトポマーからなり：図３に示すＭＳスペクトルによって決定されるように、ＤＥＳ−ｄ４（５０．５３  ％）、−ｄ３  （３８．９３  ％）、−ｄ２（１０．１０  ％）、−ｄ１  （０．３９  ％）であった。最も豊富なＤＥＳ−ｄ４イオン（ｍ／ｚ  ５３０）が、同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に使用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
実施例６
発明者らは、安定な重水素同位体ＤＥＳ−ｄ４を化学的に合成し、これはＤＥＳ分子中のアルキルアミノ酸のアルカニル炭素において４つの重水素を有しており、酸加水分解に対して安定である。後者の特徴は、弾性組織分解の生体マーカーとして２つの架橋分子ＤＥＳ及びＩＤＳを測定するのに必要である。ＤＥＳ分子の全合成における発明者らの最近の達成（Ｕｓｕｋｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｙａｎｕｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２）により、正確な同位体希釈マススペクトロメトリー解析のための理想的なＩＳとなり得る安定なＤＥＳ−ｄ４の合成が可能となった。過去に公開されたＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、ＩＳとして天然のＤＥＳから得られた化学的に交換された重水素化合物を使用する（Ｂｏｕｔｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  （１  ），  Ａｌｂａｒｂａｒａｗｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｂｏｕｔｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  （２），  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。この触媒的に交換された重水素化合物は酸性条件下で安定でなく、エラスチン分解の不正確な測定をもたらし得る。ＤＥＳ−ｄ４を使用した同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、酸性及び酵素的分解下での架橋ＤＥＳ及びＩＤＳ分子の解析に使用でき、エラスチン分解を含む生体医学及び病理学的研究における生体マーカーとしてＤＥＳ及びＩＤＳを正確に測定するための一般化された方法と見做される。この方法は、低レベルの血漿中の遊離ＤＥＳ及びＩＤＳの、及び更に低レベルのＢＡＬＦ中の全ＤＥＳ及びＩＤＳの検出によって示されるように、感度及び特異性を改善する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
静脈内置換を受けている１１名の患者において、治療のベースライン及び１２及び２４週でのＤＩのレベルは、両方の時点で血漿中のＤＩの統計的に顕著な減少を示した（即ち−１３．９％及び−２０．３％、ｐ＝０．０３８）（図８Ａ及び８Ｂ）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
ＡＡＴのエアロゾル投与を受けている患者におけるＢＡＬＦ中のＤＩの顕著な減少は、霧状のＡＡＴ自体が肺の好中球エラスターゼの活性を減少させることを示唆するものであり、この投与ルートがＡＡＴＤの効果的な治療であり得ることが示唆される。この限定された数の患者におけるＤＩの血漿レベルの減少は、静脈内投与を受けている患者の血漿中のＤＩの減少程はエアロゾル投与と一致していなかった。エアロゾル投与による血漿中のＤＩレベルの一貫していない減少は、静脈内投与と比べてエアロゾルにより投与されているＡＡＴの毎週の合計用量が少ないことに関連し得る。体重７０ｋｇの対象は、エアロゾルによる場合、毎週の用量がＩ．Ｖ．よりも４３％少なかった。１２週間の治療において同時に採取された血漿及びＢＡＬＦ中のＤＩレベルの正の相関（図１２）は、血漿中のレベルに正に寄与する肺内のＤＩのレベルと一致する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
喫煙歴についてのアンケート調査から得たこれらのコホートにおける患者からの情報は、この解析に加えるのに充分に信頼できるとは考えられなかった。患者アンケートは、２０箱以上の煙草を吸ったことの無い個人を非喫煙者と分類していた。患者が何時煙草を吸い始めて吸うのを止めたのかが特定できず、副流煙に晒された者を除外する情報が存在しなかった。従って、発明者らは、煙草の煙に晒された又は晒されていない者を分けずに、年齢に関する各コホートを解析した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
この研究における解析のための血漿、ＢＡＬＦ及び尿は、深冷凍状態（−２０℃）で数年間保存され得るが、長期間に渡る保存は、冷凍状態にあってもＤＩの含有量に影響を及ぼす。発明者らは、１）正常な対象及びＡＡＴＤコホートにおけるＤＩのレベルが類似のコホートからの新鮮な血漿試料において以前取得したものと同一の範囲内であったこと（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）；２）６年以上ラボ内で保存してあった血漿及び尿の凍結サンプルを反復して解析したがＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＤＩの定量値に変化が無いこと；３）この研究の目的が増強療法の実施前後のＤＩレベルの変化を決定することであるため、前後の試料は同一の保存条件に置かれること；及び４）ＤＩの化学結合は安定で、体液中でＤＩの分子が分解する化学的メカニズムは現在のところ示されていないこと；は、試料の長期の凍結保存のＤＩに対する影響が無視できるレベルである十分な根拠となり得ると考えている。試料の酸加水分解がＤＩを分解しないことは、既に示されている（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
この研究は、増強療法を受けていないＡＡＴＤ患者が、疾患の重症度が異なることにより、血漿中のＤＩレベルが高くなり得るという考察を導く。しかしながら、増強療法を受けている患者における平均ＦＥＶ１レベルが４１．３％（Ｓ．Ｄ．  ２２．１）であったのに対して、増強療法を受けていない者における平均ＦＥＶ１は、７２．７％（Ｓ．Ｄ．  ２９．３）であった。過去の研究はこの前提に対立し、尿及び血漿中のＤＩレベルはＦＥＶ１によって示唆されるように疾患の重症度の増大に伴って高くなることを示している（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｆｒｅｇｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法であって：
当該試料を式（１）
【化１】
2016524133.tif 000001
の化合物と接触させる工程；及び
当該式（１）の化合物を含有する試料に対してマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記式（１）の化合物の量が予め決定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、マススペクトロメトリーの前に、前記式（１）の化合物を含有する試料を酸加水分解に供する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、結合組織マトリックス、尿、血漿、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患しているおそれのある患者から取得されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化、大動脈瘤、皮膚損傷、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＯＰＤが肺気腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中のデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中のデスモシン及びイソデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マススペクトロメトリーが、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）又は液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マススペクトロメトリーが、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを診断する方法であって：
（ａ）当該対象から取得した試料を式（１）
【化２】
2016524133.tif 000002
の化合物と接触させる工程；及び
（ｂ）当該試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって測定する工程；
を含む、方法。
【請求項１５】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化、大動脈瘤、皮膚損傷、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料中のデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料中のデスモシン及びイソデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
試料中の弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法であって、当該マーカーは、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され：
（ａ）弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患しているおそれのある対象から取得した試料を式（１）
【化３】
2016524133.tif 000003
の化合物と接触させる工程；
（ｂ）当該式（１）の化合物を含有する工程（ａ）の試料の酸加水分解を実施する工程；及び
（ｃ）酸加水分解された工程（ｂ）の試料に対しマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む、方法。
【請求項２１】
対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットであって：式（１）
【化４】
2016524133.tif 000004
の化合物及び説明書を備え、当該弾性繊維損傷のマーカーが、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、キット。
【請求項２２】
正常な肺機能を有する対象におけるアルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防する方法であって：
（ａ）当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーをマススペクトロメトリーによって測定する工程；及び
（ｂ）当該患者の弾性繊維損傷のマーカーの量が通常よりも高い場合、ＡＡＴＤ増強治療剤を投与する工程；
を含む、方法。
【請求項２３】
前記対象が哺乳類である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、マススペクトロメトリーを実施する前に、式（１）
【化５】
2016524133.tif 000005
の化合物と接触させられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が、結合組織マトリックス、尿、血漿、血清、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
正常な肺機能を有する対象における肺エラスチンの分解を検出する方法であって、当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーを、マススペクトロメトリーによって測定する工程を含む、方法。