【手続補正書】
【提出日】平成29年6月8日(2017.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間質組織、結合組織又は支持組織からインプラントを製造する方法であって、実質的に灌流の全期間にわたって負圧下で、この組織を少なくとも一種の脱細胞化媒体で灌流する工程を少なくとも１回含む方法であって、この方法が更にその灌流工程又は各灌流工程の後に洗浄工程を含み、少なくとも１回の洗浄工程が負圧下で行われる方法。
【請求項２】
前記脱細胞化媒体の少なくとも一つが洗剤及び／又は酵素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が少なくとも２つの灌流工程を含み、少なくとも一つの灌流工程において脱細胞化媒体として洗剤を使用し、かつ少なくとも一つの灌流工程において脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記洗剤を使用する各灌流工程が負圧下で行われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼを使用する各灌流工程が負圧下で行われる請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
灌流工程の間に行われる洗浄工程の全てが負圧下で行われる請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各灌流工程の間に洗浄工程が行われ、かつ最後の灌流工程の後に洗浄工程が行われる請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が少なくとも３つの灌流工程を含み、１回目の灌流工程で脱細胞化媒体として洗剤を使用し、２回目の灌流工程で脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用し、かつ３回目の灌流工程で脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用する請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
全工程が負圧下で行われる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各灌流工程が５ｋＰａ以下の圧力で行われる請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
全工程が５ｋＰａ以下の圧力で行われる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インプラントに細胞を再播種する工程を含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が、気管、気管の部分又は気管組織；骨；腱；靭帯；骨−腱；軟骨；喉頭、咽頭の部分又は喉頭組織；大血管又はその一部；及び神経組織から成る群から選択される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
その結果得られたスカフォールドは、組織の修復及び再生のための優れたインプラントを提供する。
この脱細胞化プロセスは、脱細胞化媒体による灌流工程（複数可）に加えて、一以上の洗浄工程を含んでもよい。その洗浄工程又は各洗浄工程もまた、洗浄工程のほぼ全期間にわたって負圧で行われることが好ましい。
いくつかの実施形態では、このインプラントの製造方法の実質的全体は、負圧で行われる。
この脱細胞化媒体は、組織から細胞及び細胞成分を除去する一方で、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質へのダメージを最小限に抑えて、細胞外マトリックス（ECM）の構造と機能が可能な限り保存されたスカフォールドが得られるように選択される。
適切な脱細胞化媒体には、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、デオキシコール酸ナトリウム（SOC）、例えば、トリトンX-100（RTM）のような親水性ポリオキシエチレンオキシド部分と疎水性炭化水素部分を含む洗剤、などの洗剤、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や、DNase IのようなデオキシリボヌクレアーゼやRNaseのようなリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼなどの酵素、及びこれらの組み合わせが含まれる。トリスブチル-n-ホスフェート（TnBP）もまた、この脱細胞化媒体に含まれる。TnBPは、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する溶媒である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】ヒト気管の本発明の方法を用いて脱細胞化された断片（B）と対照断片（A）（非脱細胞化）の巨視的外観を示す写真である。
【図２】脱細胞化プロセスの間に真空を使用した場合と使用しない場合の、脱細胞化ブタ気管の組織学的評価を示す顕微鏡写真である。ＡとＤは、無傷の細胞と核（*）の存在を示す正常な組織（対照）を示す。ＢとＥは、灌流時に負圧を利用せずに脱細胞化された組織を示す（軟骨小腔内の無傷の軟骨細胞（*）に注意のこと）。ＣとＦは、本発明の方法を使用した脱細胞化された組織を示す（無傷の核は存在せず、軟骨小腔は空である（°））。
【図３】対照ブタ組織と本発明の方法を使用して又は使用せずに脱細胞化したブタ組織のDNA定量化、及び対照ヒト気管組織と本発明の方法を使用して脱細胞化したヒト気管組織のDNA定量化の棒グラフを示す。
【図４】本発明の方法を用いて脱細胞化したヒト気管を示す顕微鏡写真である。ＡとＣは、対照正常組織を示す（無傷の軟骨細胞（*）、及び核物質と外側結合組織（**）を示す）。ＢとＤは、本発明の方法を用いて調製した脱細胞化組織を示す（軟骨小腔（°）は空である）。
【図５】ピクロシリウスレッド−ミラーズエラスチン(PSR-ME)染色された切片の顕微鏡写真を示す。Ａ〜Ｈは、ブタ（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）とヒト（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）の明視野顕微鏡光下で撮影した気管組織を示す。Ｉ〜Ｌは、ブタ（Ｉ、Ｊ）とヒト（Ｋ、Ｌ）の偏光下で撮影した気管組織を示す。本発明の方法によって調製された脱細胞化組織（Ｂ、Ｆ、Ｊ、Ｄ、Ｈ、Ｌ）と、比較のための対照（Ａ、Ｅ、Ｉ、Ｃ、Ｇ、Ｋ）を示す。矢印は、保存された弾性繊維（ｅ）とコラーゲン繊維（ｃ）を示す。
【図６】ブタ及びヒトの気管の、対照組織と脱細胞化組織における、コラーゲン含有量を示す棒グラフである。真空なしで脱細胞化したブタ組織の初期データ（n=2）を含む。両種（ブタ及びヒト）とも、対照組織と脱細胞化気管サンプルとの間に有意な差を示さない。
【図７】気管組織の走査型電子顕微鏡(SEM)写真を示す。Ａ、Ｃ、Ｅは対照組織を示し、Ｂ、Ｄ、Ｅは、本発明の方法によって調製された脱細胞化気管を示す。Ａ〜Ｄのコラーゲン束はブタであり、ＥとＦはヒト気管である。「*」で示す矢印は、対照組織（Ｃ）の細胞を示し、「ｆ」で示す矢印はコラーゲン繊維を示す。
【図８】アルシアンブルー染色された組織の顕微鏡写真を示す。ＡとＥは、ブタ気管の対照組織、ＣとＧは、ヒト気管の対照組織、ＢとＦは、本発明の方法によって調製された脱細胞化ブタ気管、ＤとＨは、本発明の方法によって調製された脱細胞化ヒト気管を示す。
【図９】ブタ及びヒト組織の定量的グリコサミノグリカン（GAG）分析を示す棒グラフであり、比較のための対照組織と脱細胞化組織サンプル（本発明の方法を使用したものと、使用しないもの）を示す。
【図１０】気管サンプルの生体力学的試験のための装置の概略図を示す。
【図１１】ブタ気管対照（A）及び本発明に従って製造された脱細胞化ブタ気管（C）、並びにヒト気管対照（B）及び本発明に従って製造された脱細胞化ヒトタ気管（D）のMHC-I免疫染色の顕微鏡写真である。「*」で示す矢印は細胞膜の陽性染色を示し、「°」で示す矢印はMHC-I染色が陽性染色と予測された領域を示す。（E）はHLA-1で染色した脱細胞化ヒト気管を示し、（F）はHLA-1で染色した非脱細胞化ヒト気管を示す。HLA-1陽性染色はこの領域全体に見られ、上皮は強烈な陽性を示す。(G)は、本発明に従って製造された脱細胞化ヒトの気管のHLA-1染色（エオシンで後染色）を示す。これは軟骨やコラーゲンには陽性を示さない。(H)は、一晩HLA-1で染色しエオシンで後染色した脱細胞化ヒト気管の免疫染色を示す図である。
【図１２】生体適合性実験の巨視的画像を示す一連の写真である。Ａ（矢印「ｔ」）は、本発明に従って作製された脱細胞化ヒト気管サンプルのスプラーグドーリーラットへの移植を示す。Ｂは、移植領域（矢印「ｉ」）を示す。Ｃ（矢印「ｓ」）は、２週間後の外植された組織サンプルを示す。
【図１３】異種動物モデルへの移植の2週間後の、本発明に従って製造された外植ヒト脱細胞化気管組織のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡写真である。Ａは、下に横たわる筋肉（矢印「ｍ」）と移植されたスカフォールド（矢印「ｓ」）を示す。ＢとＣは、外植後の画像を示し、その領域は、血管新生（「ｖ」で示す）と、軽度の急性炎症を示す複数の好中球細胞（「*」で示す）を有する薄い線維性被膜との統合を示す。
【図１４】ラットへの移植の2週間後の、本発明に従って製造された脱細胞化ヒト気管スカフォールドのピクロシリウスレッド−ミラーズエラスチン(PSR-ME)染色像の顕微鏡写真である。スカフォールドの保存された細胞外マトリックス構造を示し、軟骨部（矢印「*」）とコラーゲン繊維（矢印「ｃ」）を有する。
【図１５】本発明に従って製造された脱細胞化ブタ及びヒト気管組織サンプルのDNAゲル電気泳動図を示す。比較のため1kbaまでの対照マーカーも示す。
【図１６】本発明に従って製造された脱細胞化ブタ腱組織のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡写真である。
【図１７】脱細胞化時に負圧を使用せずに作られた対照脱細胞化ブタ腱組織のＨ＆Ｅ染色の顕微鏡写真である。
【図１８】ブタ骨サンプルのＨ＆Ｅ染色の顕微鏡写真である。（ａ）は、対照サンプル（脱細胞化時に負圧を不使用、倍率40倍）、（ｂ）は、対照サンプル（倍率200倍）、（ｃ）は、真空サンプル（1％SDS、低張液36時間、倍率40倍）、（ｄ）は、真空サンプル（1％SDS、低張液36時間、倍率200倍）を示す。(AD)は、脂肪細胞、（HSC）は、造血幹細胞、（OC）は、海綿骨小腔内の骨細胞、（TB）は、ピンクに染色された海綿骨を示す。