(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌培地中で増殖している腸内細菌科の早期の検出及び計算を促進する細菌培地であって、トリプトースまたはゼラチンペプトン及び酵母抽出物、ラクトースまたはグルコース、塩化ナトリウム、胆汁塩、グアーガム並にび増殖している細菌の12時間よりも早い検出及び計算を可能にするために増殖している細菌にきわめて近接して高濃度の染料を供給するのに十分な、過剰量のスルホンフタレイン染料を含む、前記培地。
【請求項２】
染料の濃度が約160mg/lよりも大きい請求項１に記載の培地。
【請求項３】
染料の濃度が約1000mg/lよりも大きい請求項１に記載の培地。
【請求項４】
染料がブロムクレゾール  パープル、フェノールレッド及びクロルフェノールレッドから選択される請求項１に記載の培地。
【請求項５】
培地がさらにトリフェニルテトラゾリウム  クロライドを含む請求項１に記載の培地。
【請求項６】
約10〜20g/lのトリプトースまたは７〜14g/lのゼラチンペプトン及び３〜18g/lの酵母抽出物、2.5〜20g/lのラクトースまたは2.5〜20g/lのグルコース、2.5〜7.5g/lの塩化ナトリウム、1.35〜1.65g/lの胆汁塩、2.5〜7.5g/lのグアーガム、0.025〜0.250g/lのトリフェニルテトラゾリウムクロライド並びに0.16〜5.0g/lの染料を含有する請求項４に記載の培地。
【請求項７】
試料中の腸内細菌科の存在を検出する方法であって、請求項１の培地に細菌を含有する試料のアリコートを加える段階、前記培地の存在下に細菌を増殖させる段階及び染料の変色を12時間よりも早く検出する段階を含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１の培地で被覆されている自己支持性防水基体、発泡体スペーサー及び透明なカバーシートから本質的になる試料中の大腸菌の増殖を検出する装置。
【発明の詳細な説明】
この発明は一般的には試料中の細菌の存在を測定するのに用いられる生成物及び方法に関し、特に、大腸菌を含む腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の迅速な計算（Count）を可能にする製品及び方法に用い得る培地に関する。
技術の背景
試料中の細菌の存在及び数を決定するための古典的な方法は時間がかかり、退屈で、大きな労働力を要する。一般に、技術者は試薬と栄養素を調製し、栄養素と寒天を混合し、混合物を加熱し、混合物をペトリ皿に注ぎ、寒天をゲルにさせ、検体試料を得、検体試料を希釈し、希釈された試料のアリコートを寒天に加え、接種された皿を24〜48時間インキュベートし、最後にペトリ皿中の増殖している細菌コロニーの数を計算しなければならない。
調製時間を減少させ、細菌のより速い、迅速な計算を可能にする製品及び方法はこの分野で働くものにとって明らかに歓迎されるだろう。
上記調製時間を非常に節約する製品の１例は、ハンセン等（Hansen）の米国特許第4,565,783号明細書に記載された、増殖する微生物のための乾燥培養装置である。ハンセン等により報告された代表的な装置では、ゲル化剤と微生物増殖栄養素を含有する冷水可溶性乾燥粉末が防水基体上を覆っている。指示染料及び粉末状のゲル化剤を含有するアクリル系接着剤を表面に塗布された、透明な透し読みカバーシートがその覆われた基体に付着している。
装置を用いる時には、前もって決定された量の試料水溶液を一般的には前記覆われた基体と接触させて置き、カバーシートを試料と基体の上に置く。試料水溶液は、水溶液の乾燥粉末を水和し、次いでその粉末は微生物の増殖を持続させ得るゲル化された培地を形成する。増殖期間の間、カバーシートに接着した指示染料は生存可能な微生物の存在に反応し、培養装置上に増殖する細菌のコロニーを可視化させる、検出可能な応答を生じる。ハンセン等の報告に基づく乾燥培養装置はPETRIFILM大腸菌計算プレート（Coliform Count plates）（カタログ番号6400,3M,St.Paul,ミネソタ州）として市販されている。
使用者が増殖培地、寒天及び他の試薬を加熱及び混合し、次いでその混合物をペトリ皿に加えるか、または皿に注ぐ必要がないので、ハンセン等の乾燥培養装置は慣用のゲル化された寒天培地／ペトリ皿系よりもずっと使いやすい。さらに、ハンセン等の装置はコンパクトで処分しやすく、したがって、より使いやすく、より安全である。
ハンセン等の装置が慣用型の培養系にまさって有している多くの利益にもかかわらず、接種された薄膜プレートはいまだに細菌の数を測定するまでに24〜48時間インキュベートしなければならない。より早期に細菌の存在を検出または数を測定する能力は多くの情況で非常に貴重である。たとえば、食品産業では細菌のより速い検出及び迅速な計算は重要である。現在では、24〜48時間のインキュベーション時間後のみの細菌の測定は、加工業者に食物製品の流通を遅らせることを必要とさせ大量の汚染された製品の生産を許容するだろう。食品におけるより早い細菌の検出は、汚染または汚染のないことをより早く立証できるから、加工業者がより早期に食品を流通のために解放することを可能にするだろう。さらに、加工業者は大量の汚染された製品を捨てねばならないこともなく、細菌の汚染源を突き止めて、直すことができるだろう。したがって、24〜48時間よりも早い細菌汚染の検出は、食品加工業者にとってとりわけ有利であろう。
食品産業はより早期に細菌汚染を検出することにより明らかに利益を受けるであろうが、他の産業もより早く細菌を検出する機会を歓迎するであろう。腸内細菌科、たとえば大腸菌の早い検出及び迅速な計算を可能とする製品及び方法についてのニーズがある。
発明の概要
この発明は、腸内細菌科、たとえば大腸菌の早い検出及び迅速な計算を可能にする製品及び方法を提供することによって、上記に関する現在流通している製品及び方法の欠陥を克服する。この発明の１つの態様は培地（RCCM,rapid coliform count medium,迅速大腸菌計算培地）中で増殖している大腸菌の早い検出及び迅速な計算を促進する細菌培地である。培地は、トリプトース（tryptose）、ラクトース、塩化ナトリウム、胆汁塩（bile salts）、グアーガム及び12時間以内の増殖している細菌の検出及び計算を可能とするために増殖している細菌にきわめて近接して高濃度のフェノールレッドを供給するのに十分な、過剰量のフェノールレッドの混合物である。
代りに腸内細菌科により広く有用な培地は、培地中のラクトースをグルコースで置換する（RECM,rapid Enterobacteriaceae count medium,迅速腸内細菌科計算培地）。好ましい範囲のグルコース量は2.5〜20g/lである。
大腸菌検出のための好ましい液体培地は約７〜14g/lのゼラチンペプトン及び３〜18g/lの酵母抽出物または10〜20g/lのトリプトース、2.5〜20g/lのラクトース、2.5〜7.5g/lの塩化ナトリウム、1.35〜1.65g/lの胆汁塩、2.5〜7.5g/lのグアーガム及び0.16〜5.0g/lのフェノールレッドを含有する。特に好ましい液体培地は約15g/lのトリプトースまたは7g/lのゼラチンペプトン及び9g/lの酵母抽出物、10g/lのラクトース、5g/lの塩化ナトリウム、1.5g/lの胆汁塩、5g/lのグアーガム及び1.25g/lのフェノールレッドを含有する。
更なる培地の変形では、他のスルホンフタレイン型指示薬、たとえばブロムクレゾール  パープル及びクロルフェノールレッドが腸内細菌科、たとえば大腸菌の早い検出をもたらすために高濃度で有用であることも分かった。
この発明の培地は肉汁培地に、寒天にまたは薄膜装置たとえばPETRIFILMプレートに用い得る。PETRIFILMプレートで用いる時、装置の表面上に塗布された培地は次いで好ましくは乾燥させる。好ましい培地が薄膜上に乾燥状態にある時、培地は約4.8mg/in2のトリプトース、1.6mg/in2のラクトース、1.6mg/in2の塩化ナトリウム、0.5mg/in2の胆汁塩、1.6mg/in2のグアーガム及び0.4mg/in2のフェノールレッドを含有する。乾燥された培地を再水和する時、培地の上記の成分は前記好ましい液体培地中における濃度と同じである。乾燥された培地は、検体細菌の接種の前に部分的または完全に再水和することができる。
この発明の他の態様は試料中の腸内細菌科、たとえば大腸菌の存在を検出する方法である。この方法を実施するために、細菌を含有する試料のアリコートを、トリプトース、ラクトースまたはグルコース、塩化ナトリウム、胆汁塩、細菌にきわめて近接して高濃度の指示薬を供給するのに十分な、過剰量のスルホンフタレイン指示薬たとえばブロムクレゾール  パープル、クロルフェノールレッドまたは好ましくはフェノールレッドを含む培地に加える。次に細菌を培地の存在のもとに増殖させ、細菌の存在を増殖する細菌が代謝物を産生する時の指示薬の変色を検出することにより決定する。この方法を用いると、大腸菌の検出及び計算が約12時間以内に、好ましくは約８時間以内に可能である。
培地中の細菌、たとえば大腸菌の検出を視覚的に、または器具を用いてなし得る。適当な器具は1993年12月13日に出願された、関連する米国出願第08/168,681号に記載されている。
この発明のさらにもう１つの態様は、試料中の細菌の増殖を検出する装置である。好ましい装置は自己支持性、防水基体及び透明なカバーシートを含む。本発明の培地を自己支持性防水基体に塗布し、次いで、12時間以内に増殖している細菌の検出及び計算を可能とするために、増殖している細菌にきわめて近接して高濃度のスルホンフタレイン、たとえばフェノールレッドを供給するために乾燥させた。培地の紫色〜赤色が腸内細菌科、たとえば大腸菌に典型的な酸性細菌性代謝物の存在で黄色に変化する時、装置上の増殖している細菌の検出は（視覚的にまたは器具を使用して）迅速になされる。
他の代りの態様では、本発明の培地は第２指示薬である、トリフェニルテトラゾリウムクロライドも含有する。この培地に用いる時、この第２指示薬は細菌の早い検出及び迅速な計算の確認をもたらす。更に具体的に言うと、スルホンフタレイン指示薬の変色による大腸菌の存在を検出後、増殖している細菌は酸を産生し続ける。十分に増殖している、酸を産生するコロニーが存在すると、培地はついには完全に赤色または紫色から黄色に変化する。約24時間後、そして、培地が赤色または紫色から黄色に変化した時、増殖している細菌のコロニーに起因する培地中のトリフェニルテトラゾリウムクロライドの変色を検出し得る。細菌の存在で、トリフェニルテトラゾリウムクロライドは赤色に変化する。トリフェニルテトラゾリウムクロライドの変色はスルホンフタレイン指示薬、たとえばフェノールレッドの変色に関連する初期の確認を可能にする。このより遅い確認は細菌の回りの細菌によって生成する気体の泡の存在によっても援助を受ける。
培地中にトリフェニルテトラゾリウムクロライドを用いる時、培地中の好ましいこの指示薬の量は約0.025〜0.250g/l、さらに好ましい量は約0.150g/lである。トリフェニルテトラゾリウムクロライドを薄膜装置に用いる時、好ましくは乾燥された培地は約0.02mg/in2（0.0031mg/cm2）のトリフェニルテトラゾリウムクロライドを含有する。トリフェニルテトラゾリウムクロライドは培地14の部分として供給するか、またはカバーシート上の塗布物の一部であってもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の培養培地を含有する装置の図である。
発明の詳細な説明
この発明は試料における、大腸菌を含む腸内細菌科の存在を約12時間よりも早く検出するのに用い得る製品及び方法を提供する（大腸菌はラクトース発酵するグラム陰性桿菌を包含するのに対し、他の腸内細菌科はグルコースを利用する）。種々の製品及び方法が腸内細菌科、特に大腸菌を検出するのに用いられたが、12時間より少ない検出及び計算時間は慣用の製品及び方法の検出時間よりも著るしく短かい。
ほとんどの試料における大腸菌の早期検出及び迅速な計算は種々の理由のため問題を含んでいた。ほとんどの場合、試料に存在する大腸菌はストレスがかけられてきて、最適水準で増殖していない。最適増殖（及びしたがって早期の検出を可能とする）をもたらすために、ストレスをかけられた細菌を誘導されたストレスから回復させるための時間を与えなければならない。本発明は大腸菌の急速な回復を与える。この培地は市販されている既知の試薬及び栄養素を含む。これらの試薬及び栄養素はペプトン及び酵母抽出物、たとえば、トリプトース、ラクトース、塩化ナトリウム、及びアキュメデア会社（Accumedia,Inc,バルチモア，メリーランド州）から市販されている胆汁塩の混合物を含む。培地はローンプーラン社（Rhone−Poulenc,Inc.,Kreuzlinger,スイス）から市販されているグアーガム、アルドリッチケミカル会社（Aldrich Chemical Corp.,ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から市販されているフェノールレッド及びアムレスコ（AMRESCO,ソロン，オハイオ州）から市販されているトリフェニルテトラゾリウムクロライドも含有する。好ましい試薬及び物質を計量し、慣用方法を用いて混合する。
本培地はスルホンフタレインpH指示薬、たとえばフェノールレッド、ブロムクレゾール  パープル、グロルフェノールレッド及びその他類似物を含む。これらの指示薬は変色が起こるpHのために変化するが、同様な結果をもたらす。ブロムクレゾール  パールは約pH6.8以上で紫色からpH5.2以下で黄色に変色する。クロルフェノールレッドはpH6.2で赤色で、pH4.8で黄色に変わる。少々のpHの相違で変化する培地を望む時は、これらの変化は指示薬系を適合させることを可能とする。これらの染料が基本とするフェノールスルホンフタレイン核を下記に示す。
0003549892.tif 000002
これらの指示薬は共通の核を有しているから、それらは同様な望ましい性質、たとえば十分な水溶性及び腸内細菌科に対する比較的に低い毒性を共にする。
特に本培地は、好まれているpH指示薬であるフェノールレッドを含む。フェノールレッドは酸の存在で赤色から黄色に変色する既知の指示薬である。細菌のコロニーが増殖するにつれ、コロニーは、指示薬と反応してコロニーを取り囲む黄色の領域を生成する代謝の酸を産生する。
この指示薬は他の培地に用いられたが、一般に非常に小量で、典型的には約10〜30mg/lよりも小量で用いられる（Manual of Methods of General Bacteriology,第440頁（1981年））。特に、フェノールレッドは約18〜24mg/lの間の程度で、いくつかの培地に報告されている（BBL Manual of Products and Laboratory Procedures,第131ページ（1973年））。しかしながら、本発明によりフェノールレッドの量は、一般に報告された培地に用いられているフェノールレッドまたは他の指示薬の量よりも実質上多い。たとえば、慣用の培地で用いられる量の約10倍過剰のフェノールレッドである１l当り160mgより多いフェノールレッドを用いると、早期検出及び迅速計算の利益をもたらす。さらに慣用の培地に用いられる量の約1000倍過剰である、１l当り1000mgよりも多く用いると増強されたカラーコントラストをもたらし、それは本培地中の好ましい濃度である。
驚くべきことに、大腸菌はこのように大過剰のスルホンフタレイン、たとえばフェノールレッドを含有する培地で非常に良く回復し、そして増殖するように見え、明らかにこれらの濃度で大腸菌への毒性はない。１l当り約5000mgの程度のフェノールレッド、（フェノールレッドの水への溶解度の上限）は大腸菌に非毒性であることが分かった。大腸菌の増殖はpHに感受性と思われるから、大過剰のフェノールレッドは培地の緩衝剤としての役に立ち、したがって、回復及び／または増殖を促進するのだろう。培地に緩衝能を与えるのに十分な量のフェノールレッドを用いることは、指示薬は一般に大量に用いられるか、または溶液に緩衝能を与えるように選択される試薬でないから、認められた日常操作ではない。
培地にいくらかの緩衝能を与えるために、過剰量のスルホンフタレイン、たとえばフェノールレッドを用いることができる他の利点は、培地中の代謝の酸の拡散の防止である。培地中の制御されない酸の拡散は、増殖しているコロニーの取り囲む黄色に着色した領域を重ならせるか、または混合させるかもしれない。黄色に着色した領域が重なるか、または混ざると、生じたコロニーの計算を得るのが困難であるか、または不正確である。
大過剰のブロムクレゾール  パープル、フェノールレッドまたはクロルフェノールレッドを用いる他の予期しない利点は、中性溶液または塩基性溶液中の強い、たとえばフェノールレッドのあざやかな赤色またはクロルフェノールレッドのあざやかな赤紫色またはブロムクレゾールの紫色と酸の存在でのブロムクレゾール  パープル、フェノールレッドまたはクロルフェノールレッドの黄色の間のコントラストを最大にすることである。培地のあざやかな色と増殖している大腸菌を取り囲む区域の黄色の間の最大のコントラストは慣用の製品または方法の検出時間に比較して、ずっと早い時間で大腸菌の視覚的な検出を可能にする。
この明細書では、「12時間より早く増殖している細菌の検出及び計算をさせるために、高濃度のフェノールレッドを増殖している大腸菌にきわめて近接して生じさせるのに十分な過剰量のフェノールレッド」という句は、大腸菌代謝物により生ずる紫色または赤色から黄色への変色の可視化または器具検出を可能にする。約160mg/lより大きい、好ましくは1000mg/lよりも大きいフェノールレッドまたは同等なスルホンフタレイン指示薬の濃度を意味する。
他の変形では、指示薬培地は緩衝液、好ましくは約pH7で最適条件を与える緩衝液、たとえばモノ塩基酸及び２塩基性リン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液を含む。この変形は染色区域のサイズをより小さい領域に限定することを望む時に特に有用である。
図１は本発明の培地の使用に適する薄膜培養装置を図示する。簡単に言うと、その装置は、両方共これらの型の培養装置を作りそして用いる方法を記載する、米国特許第4,565,783号明細書及び米国特許第5,089,413号明細書に記載されている。
薄膜培養装置10は自己支持性、防水基体12を有する本体部材を含む。基体12は、好ましくは水を吸収しない防水物質、たとえばポリエステル、ポリプロピレンまたはポリスチレンから作られた比較的剛い物質である。他の適当な防水物質は防水ポリエチレン被覆を含有する紙のような基体を含む。
基体12の上の表面に培地の層を塗布し、次いで乾燥させて基体上に乾燥培地をもたらす。代りに、基体12上に接着剤の層を塗布し、その接着剤は粉末として適用し得る培地を固定するのに役立つ。接着剤は水和された時に、塗布された基体を通して基体の表面上に増殖している細菌のコロニーを見ることを可能にするのに十分に透明でなければならない。接着剤は、また、その接着剤中に培地が完全に埋め込まれずに、そして乾燥培地で均一に基体が塗布されることを可能とする厚さで基体上に塗布されるべきである。
この発明の液体培地を乾燥形で、または乾燥粉末として用いるなら、試薬、栄養素及び指示薬、たとえばフェノールレッドを乾燥させる。この発明の培地を、約220゜Fのオーブン中で液体培地を本質的に液体培地中のすべての水が蒸発するまで加熱することにより、速みやかに乾燥させ得る。しかしながら、水が蒸発した後に培地を加熱すると、培地は分解し始める。
発泡体中に環状の開口を有する発泡体のスペーサー16を基体12の培地を塗布された表面に接着させる。基体12の表面を覆う発泡体スペーサーは試料を接種される領域を画定し、基体から試料が漏れるのを防止するのに役立つ。代りの態様では、装置は試料を含有する発泡体層を含まなくてよい。この装置では、全試料が培地のみの成分により基体上に含有される。
カバーシート20を発泡体スペーサーの上の表面の１端に結合させる。基体上に存在する細菌のコロニーの計算を容易にするために、カバーシート20は好ましくは透明なフィルムまたはシート物質から作る。さらに、カバーシート20は、成分の汚染と劣化の危険を避けるために、好ましくは細菌及び水蒸気不透過性である。カバーシート20として用いるのに好ましい物質は２軸延伸ポリプロピレンである。
使用に際しては、カバーシート20を引き戻して、基体12の真中に試料の水溶液または水を加えることにより、前もって決定された量の接種材料、典型的には約1mlの接種材料を図１に図示されている装置に加える。次にカバーシート20を基体上のもとの所に置き、接種材料を基体上に均一に広げる。これを行う便利な道具は接種材料を基体12の特定の領域に閉じ込めるのにも用いられる計量された環状の鋳型である。接種材料が基体12上に接触し、広がるにつれ、基体12上の培地は水和して増殖−支持栄養ゲルを形成する。次に接種された装置を前もって決定された時間インキュベートし、その後、基体上に増殖している細菌のコロニーの数を透明なカバーシート20を通して計算し得る。
この発明の薄膜装置上の培地の使用を上記したけれども当業者はこの培地を当業界で公知の他の栄養装置に用い得ることが分かるだろう。たとえば、その培地を肉汁培地として用いることができ、そして、懸濁液中で細菌を増殖するのに用いることができるか、または、その培地を公知の寒天プレート上で細菌を増殖するのに用い得る。
次の例は本発明の実施に関連する詳細及び態様を提供しようとするものである。これらの例は説明のためのものであって、添付された請求の範囲に規定された本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。
例１−迅速大腸菌計算培地中の大腸菌の増殖
この例は、本発明の好ましい液体培地（RCCM,迅速大腸菌計算培地）を、大腸菌を肉汁培地中で、寒天中で、または薄膜プレート中で増殖するのに用い得ることを説明する。この発明において用いられる培地は、肉汁培地中ではトリフェニルテトラゾリウムクロライドを用いなかったことを除いて、15g/lのトリプトース、5g/lの塩化ナトリウム、1.5g/lの胆汁塩、5g/lのグアーガム、0.050g/lのトリフェニルテトラゾリウムクロライド及び1.25g/lのフェノールレッド（すべての成分は上記の出所から市販されていた）を含有していた。
下記の表１に記載された種々の細菌を最初にトリプチカーゼ大豆肉汁培地（Difco Laboratories,Inc.,デトロイト，ミシガン州）中で35℃で18〜24時間増殖させた。表１に記載された細菌はシリッカー製造所（Sillicker Laboratories,シカゴ，イリノイ州、菌名の後に“s"で表示する）から購入したか、または3M微生物製品製造所（3M Microbiology Products Laboratory,セントポール，ミネソタ州）によって用いられた品質管理単離物であった。当業者は同等の株または種の細菌が市販されているか、または良く知られた方法を用いて単離し得ることが分かるであろう。
トリプチカーゼ大豆肉汁培地中での約24時間の増殖後、約108〜109細菌/mlを含有している増殖している培養を連続的にバターフィールド標準方法緩衝液（Butterfields Standard Methods Buffer,SMB,Fisher Scientific,ミネアポリス、ミネソタ州）中に約106〜107倍に希釈した。希釈された培養のアリコート（約1ml）をペトリ皿、ねじぶたガラス管またはRCCMを含有しているペトリフィルムプレート（PETRIFILM plate）に接種するのに用いた。
寒天中の増殖については、ペトリ皿に培養アリコートを加え、次にRCCMと寒天（約１重量／容積％の寒天を含有する培地の約12ml）をかぶせ、次に35℃で24時間インキュベートした。肉汁培地中の増殖については、培養アリコートをRCCM（約10ml）を含有するねじぶたガラス管及びダラム（durham）管に加えた。管にふたをし、また、35℃で24時間インキュベートした。
薄膜上の増殖については、室温でRCCMの層を小さな穴から押し出して、7.5ミルのポリエステル基体フィルム（Imperial Chemical Industries,ウィルミントン，デラウェア州）を覆った。次に被覆されたポリエステルフィルムを約200〜250゜Fで約１〜20分間乾燥させた。18ミルのスタイロフォーム  スペーサーシートをポリエステルフィルムを覆うために切断し、スタイロフォームに環状の開口を切断した。切断されたスタイロフォームの１表面にイソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（アクリレート対アクリルアミドの比率96/4重量％）を塗布し、そのスタイロフォームシートをポリエステルフィルムの被覆された表面に接着させた。
ポリエステル／スタイロフォーム積層フィルムを覆うために透明なポリプロピレンフィルムを切断した。ポリプロピレンフィルム（1.6ミル、3M,セントポール，ミネソタ州）の１表面にイソオクチルアクリレート／アクリルアミド感圧接着剤（アクリレート対アクリルアミドの比率94/4重量％）を塗布し、グアーガム（Rhone−Poulenc,Inc.Kreuzlinger,スイス）の層を塗布した。１層の両面接着剤塗布テープ（3M,セントポール，ミネソタ州）をスタイロフォーム  スペーサーの露出された１端に置き、ポリプロピレンフィルムの前記ガムを含有している表面をスタイロフォーム  スペーサーの１端にそって接着させた。
培養アリコート（1ml）をスタイロフォーム  スペーサーの開口に置き、そのポリプロピレンフィルムを用いて接種材料を覆い、その薄膜を35℃で24時間インキュベートした。
24時間のインキュベーション後、ペトリ皿、ガラス管及び薄膜プレートを、皿もしくはプレートの赤い背景上の黄色の領域として同定される酸性区域の存在及び／または気泡の存在について評価した。肉汁培養は赤色から黄色への変色及びダルハム管中の気泡の存在について評価した。
下記表１に記載されたデータはRCCMが増殖している大腸菌について選択的であったことを示す。
0003549892.tif 000003
例２−指示薬染料の濃度効果
この例は過剰量の指示染料、たとえばフェノールレッド、すなわち約160mg/lより多量のフェノールレッドは大腸菌の早期の検出及び計算をもたらす。この例では、種々の細菌は3M微生物製品製造所（セントポール，ミネソタ州）により用いられた品質管理単離体であった。これらの細菌はセラチア属リケファシエンス（Serratia liquefaciens,3M株C1、３つの異なった希釈液、すなわち、約25細菌/ml、50細菌/ml及び75細菌/mlで用いられた）、ハフニア  アルベイ（Hafnia Alvei,3M株C2）、エンテロバクター属サカザキ（Enterobacter sakazaki,3M株C3）、クレブシエラ属オキシトカ（Klebsiella oxytoca,3M株C4）、エンテロバクター属クロアカエ（Enterobacter cloacae）及び大腸菌（E.coli 149,ATCC受託番号55535、３つの異なった希釈液、すなわち、約25細菌/ml、50細菌/ml及び75細菌/mlで用いられた）。同等な株または種の細菌は当業者により容易に分かるであろう。細菌を増殖させ、例１に記載したように希釈し、ポリエステルフィルム上に被覆された培地中のフェノールレッドの濃度を0.04〜2.5g/lに変化させた以外は例１に記載されたように薄膜プレートに加えた。
下記表２中のデータは24時間で計算されたコロニーの数に比較した、12時間で計算したコロニーの％を記載している。24時間計算は気体を産生したコロニー及びトリフェニルテトラゾリウムクロライドの変色により検出されたコロニーを同定することにより行った。データは、160mg/lより多量のフェノールレッドは、安定した早期の検出及び迅速な計算をさせ、酸を産生する細菌のより速い定量化を提供したことを示す。
0003549892.tif 000004
例３−比較例
１つの実験では、本発明の培地（RCCM）を含有する薄膜プレートと市販されているPETRIFILM大腸菌計算プレート（PETRIFILM coli form count plate,3M,セントポール，ミネソタ州）及びバイオレットレッド、胆汁、寒天（Violet Red Bile Agar,Difco Laboratories,inc.）を含有する慣用の注ぎ（pour）プレートとを比較した。
RCCMを含有する薄膜プレートを例１に記載したように調製した。
薄膜プレートに接種するのに用いられたアリコートは、例１に記載したように希釈された、日常品質管理研究所（Dairy Quality Control Institute,ミネアポリス，ミネソタ州）から請求により入手できる牛乳試料から得た。異なった各試料について、1mlのアリコートを各々異なった型の培地を有する３つのプレートに加え、次いで接種されたプレートを35℃でインキュベートした。接種されたプレートの各々を毎時間視覚的に評価した。
さらに、RCCM及びPETRIFILM薄膜プレートの両方を30分毎に異なった２つの波長でカメラを用いてプレートを画像化することによって評価した。次に両波長での画像をデジタル化し、電子光学的に蓄積した。蓄積された画像を２つの波長の画像に分割し、次に30分早く作られた画像から算出された分割された画像から、前記分割された画像を減じることによって更に処理した。この画像分析の過程はフローダー他の米国特許第5,403,722号に記載されている。３つの培地からのコロニー形成単位の検出と計算は手動的に測定した。
上記比較によりもたらされたデータは下記表３に記載されている。データは本発明の培地は、他の培地のいずれかと比較した時に、早期の検出及び計算を可能とすることを立証する。
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他の実験では、この発明の培地（RCCM）を含有する薄膜プレートを、市販されているPETRIFILM大腸菌計算プレート（3M,セントポール，ミネソタ州）、フェノールレッドもしくはニュートラルレッド（Sigma−Aldrich Corp.,ミルウォーキー、ウィスコンシン州から入手し得る、他の一般的に用いられる指示薬）のいずれかを有する修飾されたPETRIFILM大腸菌計算プレート及びフェノールレッドを、異った普通に用いられる指示薬で置換した以外はRCCMと同じ培地で被覆された薄膜プレートと比較した。
異なった培地及び指示薬を含有する薄膜プレートを例１に記載されているように調製し、下記表４に記載された細菌を含有している希釈されたアリコートを接種した。この例で用いられた細菌は上記例２で用いられた。データはトリフェニルテトラゾリウムクロライドの変色及び気泡の生成によって検出された、24時間後に観察されたコロニーの100％を計算するのに必要な時間を示す。
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例４−比較例
この実験では、本発明の培地の変形（RCCM及びRECM）を含有する薄膜プレートを指示染料としてニュートラルレッドを用いる市販のPETRIFILM大腸菌計算プレート（PCC−NR,3M,セントポール，ミネソタ州）と比較した。
RCCM及びRECMを含有する薄膜プレートを例１に記載したように調製した。しかしながら、成分の量がいくらか異り、１塩基性及び２塩基性リン酸塩を下記表５に記載したように加えた。
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培地配合物に染料の１つ、ブロムクレゾール  パープル、クロルフェノールレッドまたはフェノールレッド（すべてAccumediaから入手できる）を表５に示す被覆濃度（最終（乾燥）濃度の２倍）で加え、配合物を裏打ち材上にナイフ塗布し220゜F（104℃）で５〜10分間乾燥させた。
細菌大腸菌149（ATCC番号55535）をトリプシン大豆肉汁（Trypticsoy broth,Dimed Corporation,セントポール、ミネソタ州）中で35℃で１夜増殖させた。培養を約10-7倍にバターフィールド緩衝液（Fischer Scientific,シカゴ、イリノイ州）で希釈して、約20〜50コロニー形成単位/mlとした。各染料型と濃度の２つのプレートに1mlの細菌懸濁液を接種し、実験の残りの間35℃でインキュベートした。プレートを、酸生成細菌の存在を表す、黄色区域の存在について調べた。結果をプレート上の24時間での最終コロニー数の％として表６及び表７に表示する。
これらの結果は、染料を高濃度で用いた時にはすべてのスルホンフタレイン染料は腸内細菌科のより迅速な検出をもたらす。
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【図１】
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