(57)【要約】  新たな酪酸産生菌の提供。  酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない、Clostridium leptum subgroupに属する酪酸産生菌。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない、Clostridium leptum subgroupに属する酪酸産生菌。
【請求項２】
菌数１．０×１０6 ｃｅｌｌｓを酢酸非存在のＹＣＧ培地２ｍＬに接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した際の酪酸産生量が、１０ｍＭ以上であり、かつギ酸産生量が１ｍＭ未満である請求項１記載の酪酸産生菌。
【請求項３】
下記の（１）及び（２）の性質を有する請求項１又は２記載の酪酸産生菌。
（１）１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列と配列番号３及び／又は配列番号４との相同性が９９％以上
（２）近縁種であるEubacterium desmolans  ＡＴＣＣ ４３０５８T及びButyricicoccus pullicaecorum  ２５−３TとのＤＮＡの相同性が２０％以下
【請求項４】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１０６として寄託されたＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０９５として寄託されたＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８８又はそれらの変異株である請求項１〜３のいずれか１項記載の酪酸産生菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の酪酸産生菌を含有することを特徴とする酪酸産生増強剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の酪酸産生菌を含有する飲食品、医薬又は飼料用組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の酪酸産生菌の飲食品、医薬又は飼料用組成物製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな酪酸産生菌及びそれを含有する酪酸産生増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌が産生する短鎖脂肪酸は、腸内のｐＨを下げ、有害菌の増殖を抑制し、また腸管上皮から速やかに吸収されることにより、門脈を経て宿主のエネルギー源として利用されている。特に酪酸は、腸上皮細胞の最も重要なエネルギー源であり、迷走神経を介してムチンの分泌を促進するなど、宿主に対して有益な作用を有すると考えられている。【０００３】
ヒト腸内最優勢菌群であるBlautia coccoides group及びClostridium leptum subgroupは、酪酸を産生する細菌種を数多く含んでおり、宿主の腸管環境維持に重要な役割を担っている。炎症性腸疾患患者では、Blautia coccoides group及びClostridium leptum subgroupの減少、それに伴う腸管内の酪酸濃度の減少が報告されている（非特許文献１）。さらに、Clostridium leptum subgroupに属する主要な酪酸産生菌種であるFaecalibacterium prausnitziiは、培養細胞を用いた実験系において抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を誘導し、炎症性腸疾患モデルマウスへの投与によっても抗炎症反応を示すことから、次世代プロバイオティクス候補の一つとして注目されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５２５１４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vermeiren, J. et al. 2012, FEMS Microbiol. Ecol.
【非特許文献２】Sokol, H. et al. 2008, Proc Natl Acad Sci USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来知られているClostridium leptum subgroupに属する菌は、酢酸非存在の培地中では酪酸を産生することができないか、又は酪酸とともにギ酸も産生する菌であった。
炎症性腸疾患患者では健常人と比較して酢酸、酪酸といった短鎖脂肪酸の量が低下することが知られており、そのような疾病の患者に対して、酢酸非存在でも酪酸を産生する菌を投与することは、腸内での酪酸の有益作用を考慮すると有用である。
また、ギ酸は、腐食性を有するほか、チトクロムｃオキシダーゼを阻害しうるミトコンドリア毒素としても知られており（特許文献１）、ギ酸を産生する菌を摂取することは好ましくない。【０００７】
従って、本発明の課題は、酢酸非存在であっても酪酸を産生し、さらに、ギ酸を産生しない新たな酪酸産生菌及びその菌を含有する酪酸産生増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、出願人が保有するサンプルライブラリーから、新たな酪酸産生菌の分離を試みた結果、酢酸非存在であっても酪酸を産生し、さらに、ギ酸を産生しないClostridium leptum subgroupに属する新たな酪酸産生菌を見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない、Clostridium leptum subgroupに属する酪酸産生菌。
〔２〕菌数１．０×１０6 ｃｅｌｌｓを酢酸非存在のＹＣＧ培地２ｍＬに接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した際の酪酸産生量が、１０ｍＭ以上であり、かつギ酸産生量が１ｍＭ未満である〔１〕記載の酪酸産生菌。
〔３〕下記の（１）及び（２）の性質を有する〔１〕又は〔２〕記載の酪酸産生菌。
（１）１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列と配列番号３及び／又は配列番号４との相同性が９９％以上
（２）近縁種であるEubacterium desmolans  ＡＴＣＣ ４３０５８T及びButyricicoccus pullicaecorum  ２５−３TとのＤＮＡの相同性が２０％以下
〔４〕ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１０６として寄託されたＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＹＩＴ １２７８７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０９５として寄託されたＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８８又はそれらの変異株である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酪酸産生菌。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酪酸産生菌を含有することを特徴とする酪酸産生増強剤。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酪酸産生菌を含有する飲食品、医薬又は飼料用組成物。
〔７〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酪酸産生菌の飲食品、医薬又は飼料用組成物製造のための使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の酪酸産生菌は、新菌種であり、酢酸非存在であっても、酪酸を産生し、さらにギ酸を産生しないことから、安全性が高く、腸内での酪酸産生増強剤として飲食品、医薬、飼料組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８７及びＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８８を含むC. leptum subgroupの系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の酪酸産生菌は、酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない菌であり、C.leptum subgroupに属する。
前述のように、従来のC.leptum subgroupに属する酪酸産生菌は、酢酸非存在で酪酸を産生することができないか、又は酪酸とともにギ酸を産生する菌であり、本発明の酪酸産生菌は新しい特性を有する新菌種である。
ここで、酢酸非存在とは、酢酸が存在しないか、存在する場合でも１ｍＭ以下の微量しか存在しないことを意味する。また、ギ酸を産生しないとは、ギ酸を全く産生しないか、産生する場合でも１ｍＭ未満であることを意味する。
【００１３】
本発明の酪酸産生菌の特性は、より詳細には、菌数１．０×１０6 ｃｅｌｌｓを酢酸非存在のＹＣＧ（yeast extract-casitone glucose）培地２ｍＬに接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した際の酪酸産生量が、１０ｍＭ以上であり、かつギ酸産生量が１ｍＭ未満であるのが好ましく、当該条件下の酪酸産生量が１０〜３０ｍＭであり、かつギ酸産生量が０．７ｍＭ未満であるのがより好ましい。
ここで菌は、菌数１．０×１０9 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの菌株凍結保存液を融解して１μＬ程度使用することが好ましい。また、菌株凍結保存液は、菌体を１０質量％スキムミルク培地又は２０質量％グリセロール添加ミューラーヒントン培地に懸濁した溶液が好ましい。
培養液中の酪酸、ギ酸等の有機酸濃度の測定は、有機酸濃度が測定可能な方法であれば特に限定されないが、例えば有機酸分析用ＨＰＬＣシステムで測定することができる。
【００１４】
また、本発明の酪酸産生菌は、酢酸を含有する培地でも酪酸を産生する。
【００１５】
本発明の酪酸産生菌の具体例としては、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１０６）、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ． ＹＩＴ １２７８８（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０９５）及びこれらの変異株が挙げられる。
ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８は、〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに２０１５年８月２０日及び２０１５年７月３１日にそれぞれ寄託した。
【００１６】
ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８について１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンス解析を行ったところ、ＹＩＴ １２７８７の１６Ｓ  ｒＲＮＡは配列番号３であり、ＹＩＴ １２７８８の１６Ｓ  ｒＲＮＡは配列番号４であった。本発明におけるＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８の変異株としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡの相同性が配列番号３及び／又は配列番号４との間で９９％以上の変異株が挙げられる。本発明において相同性とは、塩基配列の同一性をいう。
【００１７】
ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８と近縁種とのＤＮＡの相同性を検討したところ、ＹＩＴ １２７８７とEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８Tとの相同性は７．５〜１８．９％であり、ＹＩＴ １２７８７とButyricicoccus pullicaecorum ２５-３Tとの相同性は１０．３〜１４．３％であった。また、ＹＩＴ １２７８８とEubacteriumdesmolans ＡＴＣＣ ４３０５８Tとの相同性は７．９〜１７．８％であり、ＹＩＴ １２７８８とButyricicoccus pullicaecorum ２５-３Tとの相同性は１０．７〜１６．５％であった。従って、本発明の酪酸産生菌は、近縁種であるEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８T及びButyricicoccus pullicaecorum ２５-３TとのＤＮＡの相同性が２０％以下である。
【００１８】
かかる１６Ｓ  ｒＲＮＡの解析結果から、本発明の酪酸産生菌の系統樹は図１のとおりであり、C. leptum subgroupに属する新菌種である。また、本発明の酪酸産生菌には、下記（１）及び（２）の性質を有する菌が含まれる。
（１）１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列と配列番号３及び／又は配列番号４との相同性が９９％以上。
（２）近縁種であるEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８T及びButyricicoccus pullicaecorum ２５-３TとのＤＮＡの相同性が２０％以下。
【００１９】
また、本発明の酪酸産生菌は、以下に示す菌学的性質を有する。後記実施例に示すとおり、近縁種であるEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８T及びButyricicoccus pullicaecorum ２５-３Tとは糖発酵性状と酵素活性性状で異なっていることからも、本発明の酪酸産生菌が、C. leptum subgroupに属する新菌種であることがわかる。
【００２０】
（１）偏性嫌気性
（２）グラム陽性球菌
（３）胞子を形成しない
（４）運動性なし
（５）カタラーゼ陰性
（６）硫化水素陰性
（７）Ｇ＋Ｃ含量が５３．９％（ＹＩＴ １２７８７）、５４．１％（ＹＩＴ １２７８８）
（８）下記の糖発酵性状を有する
グルコース：＋
乳糖：−
サッカロース：−
マルトース：−
サリシン：−
キシロース：−
アラビノース：−
ゼラチン加水分解：−
エスクリン加水分解：−
グリセロール：−
セロビオース：−
マンノース：−
メレチトース：−
ラフィノース：−
ラムノース：−
トレハロース：−
（９）下記の酵素活性性状を有する
アルカリフォスファターゼ：＋
エステラーゼ（Ｃ４）：−
エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）：−
リパーゼ（Ｃ１４）：−
ロイシンアリルアミダーゼ：＋
バリンアリルアミダーゼ：−
シスチンアリルアミダーゼ：−
トリプシン：−
α−キモトリプシン：−
酸性フォスファターゼ：＋
ナフトール−AS−BI−フォスフォヒドロラーゼ：−
α−ガラクトシダーゼ：−
β−ガラクトシダーゼ：−
β−グルクロニダーゼ：−
α−グルコシダーゼ：−
β−グルコシダーゼ：−
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
α−マンノシダーゼ：−
α−フコシダーゼ：−
【００２１】
本発明の酪酸産生菌は、各種サンプルライブラリーや自然界から収集してきた微生物等を接種して培養し、生育したコロニーを釣菌して酢酸非存在の培地にて酪酸及びギ酸の産生能を測定することにより単離することができる。なお、本発明の酪酸産生菌の確認は、有機酸分析、シークエンス解析等により確認できる。
【００２２】
本発明の酪酸産生菌は、例えば、嫌気状態で作製したＧＡＭ培地やＰＹ（ペプトン・イーストエクストラクト）培地を用いて嫌気培養することにより、増殖、継代することができる。
【００２３】
本発明の酪酸産生菌は、安全性の問題がなく、酢酸非存在で酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない。従って、本発明の酪酸産生菌を含有する組成物は、飲食品、医薬又は飼料用組成物として有用である。当該組成物は、ヒトを含む動物の腸内で酪酸を産生することから酪酸産生増強剤として有用である。酪酸は、前述の如く、大腸粘膜上皮細胞のエネルギー源として利用されるだけでなく、上皮細胞の増殖促進作用、抗炎症作用、腸管の運動亢進作用を有し、また大腸癌や潰瘍性大腸炎の予防治療、エネルギー代謝調節作用を有することから、本発明の組成物は、これらの生理活性を有する医薬、飲食品、飼料として特に有用である。
【００２４】
本発明の組成物中には、酪酸産生菌を生菌として１０4 ｃｆｕ〜１０14 ｃｆｕ含有するのが好ましい。
【００２５】
本発明の組成物は、飲食品、医薬又は飼料のそれぞれに適した形態とすることができる。医薬とする場合には、例えば、固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態とすることができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２６】
また、飲食品とする場合は、固形状、液状等のいずれの形態とすることもできる。飲食品とする場合は、そのまま、又は種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。具体的には、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形すればよい。飲食品の種類としては、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳等の食品や、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料が挙げられる。また飼料とする場合も同様である。
【００２７】
本発明の組成物は、ヒトを含む動物に投与する場合、腸内で酪酸を産生させる点から、経口的又は経腸的に投与するのが好ましく、その投与量は１日あたり酪酸産生菌として生菌数で１．０×１０4 ｃｆｕ以上が好ましく、さらに１．０×１０8 ｃｆｕ〜１．０×１０12 ｃｆｕがより好ましい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。【００２９】
実施例１  酪酸産生菌の分離
出願人が保有するサンプルライブラリーより２種（Ａ、Ｂ）のサンプルを選択し、ＹＣＦＡ−Ｍ培地（ムチンを０．５％添加したＹＣＦＡ（酢酸２０ｍＭ、プロピオン酸５ｍＭ）培地）１ｍＬに各サンプルの１０倍希釈液を１０μＬ接種し、３７℃、８時間嫌気培養後、４，０００Ｇ、５分間遠心後の上清１０μＬを新しいＹＣＦＡ−Ｍ培地２ｍＬに接種した。この操作を７回繰り返し、培養後の菌液を１０-6まで１０倍段階希釈した後、１０-4〜１０-6の各希釈液を１％グルコース添加変法ＧＡＭ寒天培地に塗抹し、３７℃、２〜３日間嫌気培養した。培養後のコロニーを形態別に分類し、形態ごとに８割以上のコロニー数を釣菌し、１％グルコース添加ＧＡＭブロスを用いて増菌した。３回の単コロニー分離を行った後、−８０℃に保存した。
その結果、２菌株を単離し、それぞれ菌株Ａ及び菌株Ｂと仮称した。【００３０】
実施例２  菌株Ａ及び菌株Ｂの酪酸及びギ酸産生能
（１）既知菌株との酪酸及びギ酸産生能の比較
菌株Ａ及び菌株Ｂについて、酢酸非存在の培地におけるC. leptum subgroupに属する菌を含む既知の酪酸産生菌１８菌株（表１）との酪酸産生量の比較を行った。
菌株Ａ、菌株Ｂ及び既知の酪酸産生菌１８菌株の凍結保存液（菌体を１０％スキムミルク培地又は２０％グリセロール添加ミューラーヒントン培地に懸濁した溶液）（菌数：１．０×１０9 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を融解し、その１μＬ（菌数：１．０×１０6 ｃｅｌｌｓ）を酢酸非存在のＹＣＧ（yeast extract-casitone glucose）培地（当該培地にはギ酸、酢酸、酪酸等の有機酸は存在せず、０．０ｍＭである）２ｍＬに接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した後、上清に１％濃度になるよう過塩素酸を添加し、一晩４℃に静置した。遠心後の上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液中の有機酸量を後述する有機酸分析用ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。なお、標準物質にはコハク酸、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、イソ酪酸ナトリウム、ｎ−酪酸ナトリウム、イソ吉草酸ナトリウム、ｎ−吉草酸ナトリウム及び乳酸リチウムの計９種類（全て関東化学株式会社製のＨＰＬＣグレード）の混合水溶液を用い、２点（０．０１及び０．２μｍｏｌ／１０μＬ）絶対検量線法で定量した。【００３１】
有機酸分析用HPLCシステム
分析機器：２６９５アライアンスシステム、反応ポンプ、４３２電気伝導度測定器、カラム温度コントロールシステム（以上Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：有機酸分析用カラムShodex  ＫＣ−８１１（昭和電工）
溶離液：１５ｍＭ過塩素酸＋７％アセトニトリル
ｐＨ調整剤：１５ｍＭ過塩素酸＋７％アセトニトリル＋６０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン
カラム温度：４２℃
セル温度：４５℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ【００３２】
結果を表１に示す。菌株Ａ及び菌株Ｂの酪酸産生量は、１０ｍＭ以上であった。一方、Roseburia intestinalis ＤＳＭ １４６１０T及びClostridium butyricum ＪＣＭ １３９１Tの２菌株を除く１６菌株では、酢酸非存在の培地では酪酸の産生量は非常に少ないか又は産生しなかった。
また、酪酸を１０ｍＭ以上産生する既知の２菌株については、腐食性や毒性があり、生体内で産生されるのが好ましくないギ酸を１ｍＭ以上産生した。一方、菌株Ａ及び菌株Ｂは、酢酸非存在の培地ではギ酸の産生量が１ｍＭ未満であり、ギ酸を産生しなかった。【００３３】
【表１】
2017033925.tif 000002
【００３４】
（２）各種培地での菌株Ａ及び菌株Ｂの有機酸産生能
菌株Ａ及び菌株ＢをＭ２ＧＳＣ（ギ酸０．９ｍＭ、酢酸０．９ｍＭ、イソ吉草酸２．３ｍＭ）、Ｍ２ＧＳＣ＋ＳＣＦＡ（ギ酸０．６ｍＭ、酢酸２０ｍＭ、プロピオン酸６ｍＭ、イソ吉草酸１．８ｍＭ）及びＹＣＦＡ（酢酸２０ｍＭ、プロピオン酸５ｍＭ）の各培地２ｍＬに対して、５×１０7ｃｅｌｌｓの菌数を接種し、それぞれ１週間、３７℃で培養後（培養後の菌数；５×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、実施例２の（１）記載の有機酸分析方法を用いて培養液中の酪酸濃度を測定した。【００３５】
各種培地を用いた菌株Ａ及び菌株Ｂの有機酸産生能の結果を表２に示した。菌株Ａ及び菌株Ｂは、酢酸非存在のＭ２ＧＳＣ培地では、１０ｍＭを超える酪酸を産生する一方で、ギ酸の産生量は１ｍＭ未満であり、ギ酸を産生しなかった。また、酢酸を添加したＭ２ＧＳＣ＋ＳＣＦＡ及びＹＣＦＡ培地では２０ｍＭ以上の酪酸を産生した。なお、Ｍ２ＧＳＣ＋ＳＣＦＡ及びＹＣＦＡ培地では、培養後の酢酸の濃度が当初含有量よりも大幅に低下した（表２）ことから、培地中の酢酸を利用して酪酸を産生しているものと考えられた。【００３６】
【表２】
2017033925.tif 000003
【００３７】
実施例３  菌株Ａ及び菌株Ｂの１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンス解析
菌株Ａ及び菌株Ｂについて、ビーズフェノール法によりＤＮＡを抽出した。すなわち、菌株Ａ及び菌株Ｂの菌液２００μＬを１．０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１５，０００ｒｐｍで遠心分離後上清を捨てるという操作を３回繰り返した。得られたペレットをまず４５０μＬのExtraction Buffer（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）と５０μＬの１０％ＳＤＳに浮遊し、０．３ｇのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）と５００μＬのＴＥ飽和フェノールを加えてFastPrep  ＦＰ１２０（パワーレベル５．０）により３０秒間激しく振とうした。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、イソプロパノール沈殿を行って、得られたＤＮＡを１，０００μＬのＴＥバッファーに溶解した。得られたＤＮＡ溶液を精製水で１０倍希釈し、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
鋳型ＤＮＡ溶液に対して、表３に示す８Ｆ及び１５Ｒプライマーを用いて、９５℃５分で反応後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分３０秒を１サイクルとして、３５サイクルのＰＣＲ反応を行い、その後７２℃５分反応を行った。ＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification Kit(Roche)を用いて精製し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit(Applied Biosystems)によるシークエンス反応に供した。得られた配列は日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のＢＬＡＳＴ検索に供し、既知菌種の配列データベースと照合した。さらに、Clustal  Ｗを用いた近隣結合（ＮＪ）法で分離株の配列を系統解析し、Tree-Viewプログラムを用いて系統樹を作成した。【００３８】
【表３】
2017033925.tif 000004
【００３９】
作成した系統樹を図１に示す。
１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンス解析及び系統解析の結果、菌株Ａは１，４９５ ｂｐ（配列番号３）、菌株Ｂは１，５００ ｂｐ（配列番号４）であった。また、両菌株はお互いに９９％以上の相同性を有していた。
系統解析の結果、菌株Ａ及び菌株Ｂは、C. leptum subgroupに属し、既知菌種であるEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８T 及びButyricicoccus pullicaecorum ２５−３T と近縁であると考えられた。また、菌株ＡとEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８Tとの相同性は９４．９％、Butyricicoccus pullicaecorum ２５−３Tとの相同性は９６．３％であった。菌株ＢとEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８Tとの相同性は９５．０％、Butyricicoccus pullicaecorum ２５−３Tとの相同性は９６．３％であった。
同菌種であれば１６Ｓ  ｒＲＮＡの相同性は９９％以上となるが、菌株Ａ及び菌株Ｂは、既知菌種との相同性が９９％未満であるため、C. leptum subgroupに属する新菌種であると考えられた。菌株ＡをＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＹＩＴ １２７８７、菌株ＢをＢｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＹＩＴ １２７８８と命名し、さらに新菌種に属するこれら菌株の性質を確認した。【００４０】
実施例４  各種生化学的性状
（１）糖発酵性状試験
アピケンキ（シスメックス・ビオメリュー）を用い、添付説明書に従って実施した。使用菌株は、ＹＩＴ １２７８７、ＹＩＴ １２７８８のほか、近縁種であるEubacterium desmolans ＡＴＣＣ ４３０５８T(E.desmolans)及びButyricicoccus pullicaecorum ２５−３T (B.pullicaecorum)を用いた。結果判定は、菌液接種３０時間後に目視により行った。
糖発酵性状試験の結果を表４に示す。ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８はグルコース資化性が陽性であった。E.desmolansでは、すべて陰性であった。B.pullicaecorumでは、グルコース、サッカロース、サリシン及びキシロースの資化性、エスクリンの加水分解が陽性であった。【００４１】
【表４】
2017033925.tif 000005
【００４２】
（２）酵素活性性状試験
アピザイム（シスメックス・ビオメリュー）を用い、添付説明書に従って実施した。使用菌株は、ＹＩＴ １２７８７、ＹＩＴ １２７８８のほか、近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumを用いた。結果判定は、菌液接種５時間後に色調の変化を目視により５段階で評価した。
酵素活性試験の結果を表５に示す。表中の数値が３以上を陽性反応とした。ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８はアルカリフォスファターゼ、ロイシンアリルアミダーゼ及び酸性フォスファターゼ活性が陽性であった。E.desmolansでは、エステラーゼ（Ｃ４）及び酸性フォスファターゼ活性が、B.pullicaecorumでは、アルカリフォスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）、ロイシンアリルアミダーゼ及び酸性フォスファターゼ活性が陽性であった。【００４３】
【表５】
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【００４４】
前述の（１）及び（２）の結果より、ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８は、E.desmolansとは、グルコースの資化性、並びにアルカリフォスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）及びロイシンアリルアミダーゼ活性の有無で鑑別可能であった。また、B.pullicaecorumとは、サッカロース、サリシン及びキシロースの資化性、並びにエスクリンの加水分解能、エステラーゼ（Ｃ４）活性の有無で鑑別可能であった。【００４５】
（３）菌体ＤＮＡのＧＣ含量測定
ＹＣＦＡＧ培地（ＹＣＦＡに１％グルコースを添加した培地、ＹＩＴ １２７８７、ＹＩＴ １２７８８及びB.pullicaecorumの培養に使用）又は１％イノシトール添加ＧＡＭ培地（E.desmolansの培養に使用）に、１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬの各菌株液を培地量に対して１／１０００量接種し、１３〜１８時間培養し、対数増殖期の菌体1〜2ｇを回収し、直ちに終濃度１％のパラホルムアルデヒド-ＰＢＳ溶液で２日間固定した。固定後の菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で３回洗浄した後、６ｍＬの同溶液に再懸濁し、６００Ｕ/ｍＬアクロモペプチダーゼ及び５０ｍｇ/ｍＬリゾチームをそれぞれ１ｍＬずつ添加して３７℃、２時間溶菌した。溶菌後の試料にＳＤＳ溶液を０．６ｍＬを加えて６０℃で１０−３０分処理した。さらに１０ｍｇ/ｍＬ プロテイナーゼＫを１５０μＬ加えて６５℃、６時間処理を行った後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５：２４：１）を２０ｍＬ加えて、３０分間振とうした。８，０００Ｇ、１５分間遠心後の上清を回収し、クロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を１６ｍＬ加え、３０分間振とう後、８，０００Ｇ、１５分間遠心して上清を回収した。クロロホルム/イソアミルアルコール処理を再度行い、回収した上清からエタノール処理により粗ＤＮＡを得た。粗ＤＮＡをTEバッファー適量に溶解し、ＲＮａｓｅ溶液（８０℃、５分間加熱処理した１ｍｇ/ｍＬのＲＮａｓｅＡ  １ｍＬにＲＮａｓｅＴ１  ４μＬを加えたもの）をＤＮＡ溶液量に対して１/２０量加え、３７℃、１時間処理を行い、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５：２４：１）及びクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）処理による除蛋白後、エタノール処理を行い、精製ＤＮＡ溶液を調製した。調製したＤＮＡサンプルについて、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の確認、及びＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた濃度測定を行った。上記のＤＮＡサンプルについて、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲ-Ｆｒｅｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ＬＳ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及びＤＮＡ  Ｓｈｅａｒｉｎｇ  システム  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ）を用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａより提供されたプロトコルに従ってシーケンスライブラリの調製を行った。調製したシーケンスライブラリを、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による２５０ｂｐ×２のペアエンドシーケンスに供試し、塩基配列の解読を行い、得られた塩基配列の結果を基にＧＣ％を算出した。
その結果、菌体ＤＮＡのＧＣ含量は、ＹＩＴ １２７８７が５３．９％、ＹＩＴ １２７８８が５４．１％、近縁種のE.desmolansが５４．３％、B.pullicaecorumが５４．０％であった。【００４６】
（４）E.desmolans及びB.pullicaecorumとのＤＮＡ-ＤＮＡ相同性
ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８と、近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumとの、ＤＮＡ-ＤＮＡ相同性を確認するために、実施例４の（３）の方法で得たＤＮＡサンプルをマイクロプレートに固定し、フォトビオチンで標識したＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行い、反応後の蛍光強度の数値から、各菌株間のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を算出した。
結果を表６に示す。ＹＩＴ １２７８７とＹＩＴ １２７８８間の相同性は６７．３−７０．９％であり、同一菌種（亜種を含む）であることが示された。一方、ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８と近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumとのＤＮＡの相同性は、いずれも２０％未満であり、別菌種であることが示された。よって、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の結果からもＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８が新菌種であることが示された。【００４７】
【表６】
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【００４８】
（５）その他の生化学的性状
ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８は、以下の共通の生化学的性状を有する。
（ｉ）偏性嫌気性
（ii）グラム陽性球菌
（iii）胞子を形成しない
（iv）運動性なし
（ｖ）カタラーゼ陰性
（vi）硫化水素陰性【００４９】
実施例５  新たな単離株の性質
出願人が保有するサンプルライブラリーより１種（Ｃ）のサンプルを選択し、実施例１に記載の方法で菌株Ｃを単離した。
菌株Ｃの１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンス解析を実施例３の方法で行ったところ、菌株ＣとＹＩＴ １２７８７とは９９．１％、菌株ＣとＹＩＴ １２７８８とは９９．３％の１６Ｓ  ｒＲＮＡの相同性を有しており、ともに９９％以上であった。
また、菌株ＣのE.desmolans及びB.pullicaecorumとのＤＮＡ-ＤＮＡ相同性を実施例４の（４）の方法で測定したところ、菌株ＣとE.desmolansとの相同性は８．８〜１８．９％であり、菌株ＣとB.pullicaecorumとの相同性は１０．６〜１５．５％であった。よって、菌株ＣとE.desmolans及びB.pullicaecorumとのＤＮＡ-ＤＮＡ相同性はともに２０％以下であった。【００５０】
菌株Ｃの酪酸及びギ酸の産生能を実施例２の（１）の方法で測定した。その結果、菌株Ｃの酪酸産生量は１３．３ｍＭであり、ギ酸の産生量は０．０ｍＭであった。
よって、ＹＩＴ １２７８７及びＹＩＴ １２７８８の１６Ｓ  ｒＲＮＡとの相同性が９９％以上であり、また、E.desmolans及びB.pullicaecorumとのＤＮＡの相同性が２０％未満である菌株Ｃは、菌数１．０×１０6ｃｅｌｌｓを酢酸非存在のＹＣＧ培地２ｍＬに接種し、３７℃で７２時間嫌気培養した際の酪酸産生量が１０ｍＭ以上であり、かつギ酸産生量が１ｍＭ未満である、C.leptum subgroupに属する酪酸産生菌であることが分かった。【００５１】
実施例６  錠剤の製造
下記表７の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。【００５２】
【表７】
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【００５３】
１）ＹＩＴ １２７８７の生菌体を凍結乾燥して製造した（生菌体１０10個／ｇを含む）。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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