(57)【要約】本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法は、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとを２０℃以上で混合して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成する工程を備え、前記ｇＲＮＡが標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法は、細胞の形質膜に連鎖球菌の酵素感受性毒素ストレプトリシンＯを作用させて、形質膜上の少なくとも一部に孔を形成する工程と、前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞に、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法で得られたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を導入する工程と、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞にカルシウムイオンを含む溶液を加え、形質膜上の少なくとも一部に形成された孔を再封入する工程と、を備える。
2017131150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ９）とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを２０℃以上で混合して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成するＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程を備え、
前記ｇＲＮＡが標的遺伝子中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
【請求項２】
前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において、前記Ｃａｓ９と前記ｇＲＮＡとを３０℃以上６５℃以下で混合する、請求項１に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
【請求項３】
前記Ｃａｓ９は、Ｎ末端又はＣ末端に核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）ペプチドが結合されている、請求項１又は２に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
【請求項４】
前記Ｃａｓ９は、Ｎ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｎ）とＣ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｃ）とに二分割されており、
前記Ｃａｓ９−Ｎ及び前記Ｃａｓ９−Ｃは、それぞれＮ末端又はＣ末端に光依存的又は化学物質依存的に二量体を形成するタンパク質が結合されており、
前記Ｃａｓ９は、光又は化学物質存在下でＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が回復する請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において、前記ｇＲＮＡを２種類以上混合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
【請求項６】
細胞の形質膜に穿孔物質を作用させて、形質膜上の少なくとも一部に孔を形成する穿孔工程と、
前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞に、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法で得られたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を導入する導入工程と、
前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞にカルシウムイオンを含む溶液を加え、形質膜上の少なくとも一部に形成された孔を再封入する再封入工程と、を備えることを特徴とするＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
【請求項７】
さらに、前記導入工程の前に、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と、前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞と同種の生物由来の細胞から採取した細胞質とを混合する第１の混合工程を備える、請求項６に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
【請求項８】
さらに、前記導入工程の前に、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と、相同組換えの阻害物質の抑制剤又は相同組換えの活性化剤とを混合する第２の混合工程を備える、請求項６又は７に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法で得られた細胞核内にＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入され、再封入された標的遺伝子を有する細胞において、前記Ｃａｓ９が、ＰＡＭ配列の所定塩基上流又は下流に位置する切断部位で標的遺伝子を切断する切断工程と、
前記ｇＲＮＡと前記標的遺伝子との相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的遺伝子を有する細胞を得る改変工程と、を備えることを特徴とする細胞内における標的遺伝子の改変方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法、及び細胞内における標的遺伝子の改変方法に関する。
本願は、２０１６年１月２９日に、米国に仮出願された米国特許第６２／２８８，４４９号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、次世代のゲノム編集技術として注目され、それを機に新しいゲノム編集技術の競争が激化している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの特徴は、ガイドＲＮＡがターゲット部位を決めることから、ガイドＲＮＡのデザインに要する時間だけで、迅速、簡便、且つ安価でゲノム編集ができること、また、複数のガイドＲＮＡを作用させることで、同時に複数の遺伝子を破壊できること、さらに、Ｃａｓ９に様々なタンパク質工学的改変を加えることで、転写制御やエピジェネティックな動態変化の誘導に使用可能であること等が挙げられる。最近では、特定の遺伝子座の可視化方法として、従来のＦＩＳＨ法に変わる新規可視化法としても注目されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chen, Baohui, et al., “19.Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System”, Cell, vol.155, p1479-1491, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを医療目的としたゲノム編集技術として応用するには以下に示すような問題がある。
（１）オフターゲットの問題：ＣＲＩＳＰＲには特異的なＤＮＡ切断（オンターゲット切断）の他に、非特異的なＤＮＡ切断（オフターゲット切断）が存在することがわかり、問題となっている。基本的にＣａｓ９がＤＮＡ上のどの部位を切断するかは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のプロトスペーサ―配列によるが、この配列と標的ＤＮＡ鎖とが完全に一致していなくてもＣａｓ９による切断が生じることが報告されている。これはＣａｓ９がＤＮＡを切断する必須プロセスによるものであるため、それを排除する方法として、例えば、ダブルニッカーゼを用いる方法、Ｆｏｋ１−ｄＣａｓ９（ｆＣａｓ９）を用いる方法等が使用されている。しかしながら、ｇＲＮＡと完全一致していないＤＮＡの切断を排除するだけでなく、さらにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの時間的及び空間的な機能制御が可能な、より効果的な解決策が求められている。【０００５】
（２）ゲノム傷害の問題：現行のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、主にレトロウイルス又はレンチウイルス等のウイルスベクターを利用した発現系を用いて実施されている。それらのウイルスベクターを利用した発現系を用いることで、Ｃａｓ９が恒常的に発現することによる標的細胞ゲノムの傷害はヒト遺伝子治療を目的としたゲノム編集においては大きな問題となる。
（３）Ｃａｓ９の核内（細胞内）導入の問題：現行のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムでは、上述したウイルスベクター発現系を使用して細胞内へ導入しない場合、予め発現させたＣａｓ９及びｇＲＮＡを導入する必要がある。このとき、Ｃａｓ９は疎水性が高く、インビトロで発現させたＣａｓ９は凝集体を形成しやすい。また、Ｃａｓ９は分子量が大きいため、エレクトロポレーション法等では細胞膜の透過が難しい。また、特に、エレクトロポレーション法を用いた導入では、細胞膜に電撃で穴を開けることによる細胞へのダメージが問題となる。また、マイクロインジェクション法では、ある程度サイズの大きい細胞にしか適用できず、さらに、細胞1つ1つへ導入する必要があるため、作業効率が悪い。
（４）複数遺伝子のゲノム編集が困難である問題：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９と特定の遺伝子とをターゲットにしたｇＲＮＡのみからなる簡単なシステムセットで機能させ得ることが大きな利点となっている。しかし、現行の発現系によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの両者を発現系に依存しているため、Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによって、細胞内において、異なる機能を持ったＣａｓ９とｇＲＮＡとの組み合わせを作り機能させることが難しい。具体的には、例えば、異なる色ＧＦＰ、ＣＦＰ、又はＹＦＰ等の融合タンパク質で、ゲノムの様々な部位のゲノム配列を可視化したい場合等、Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎでは、細胞内において、特定のｇＲＮＡと蛍光標識Ｃａｓ９との複合体の形成がランダムに起こるので、特定のゲノム部位を特定の蛍光で可視化することが難しい。【０００６】
（５）ゲノム編集の最適ニッチの問題：ゲノム編集の医療応用を考える際に、その目的は特定の遺伝子を標的にした効率の良い相同組換えやエピジェネティクス改変が必要とされる。相同組換えやエピジェネティクス改変の効率化には、核内（細胞質内）における様々な誘導タンパク質の活性化や阻害因子の不活性化、又は除去が必要不可欠になってくる。すなわち、相同組換えやエピジェネティクス改変の環境（ニッチ）の最適化が必要となる。
（６）大量の細胞を扱う際の問題：ゲノム編集を利用した遺伝子矯正細胞を作製し、遺伝子治療を行う場合、大量の細胞を同時にゲノム編集に供することが必要である。ウイルスベクターを利用した発現系では、その発現量のコントロールが難しいため、大量の細胞のゲノムを一度に均一に処理することが困難である。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、インビトロで安定して可溶化したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法を提供する。また、ウイルスベクターを細胞内に導入せず、ゲノム編集の核内ニッチが最適化されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法を提供する。また、オフターゲットが低減され、ウイルスベクターを細胞内に導入せず、ゲノム編集の核内ニッチが最適化され、且つ大量の細胞における複数の遺伝子座を同時編集可能な細胞内における標的遺伝子の改変方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の温度において、安定してＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成し可溶化すること、さらに、セミインタクト細胞リシール法を用いて前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を高効率で核内に導入可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ９）とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを２０℃以上で混合して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成するＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程を備え、前記ｇＲＮＡが標的遺伝子中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とするＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
［２］前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において、前記Ｃａｓ９と前記ｇＲＮＡとを３０℃以上６５℃以下で混合する、［１］に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
［３］前記Ｃａｓ９は、Ｎ末端又はＣ末端に核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）ペプチドが結合されている、［１］又は［２］に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
［４］前記Ｃａｓ９は、Ｎ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｎ）とＣ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｃ）とに二分割されており、前記Ｃａｓ９−Ｎ及び前記Ｃａｓ９−Ｃは、それぞれＮ末端又はＣ末端に光依存的又は化学物質依存的に二量体を形成するタンパク質が結合されており、前記Ｃａｓ９は、光又は化学物質存在下でＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が回復する［１］〜［３］のいずれか一つに記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
［５］前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において、前記ｇＲＮＡを２種類以上混合する、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法。
［６］細胞の形質膜に穿孔物質を作用させて、形質膜上の少なくとも一部に孔を形成する穿孔工程と、前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞に、［１］〜［５］のいずれか一つに記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法で得られたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を導入する導入工程と、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞にカルシウムイオンを含む溶液を加え、形質膜上の少なくとも一部に形成された孔を再封入する再封入工程と、を備えることを特徴とするＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
［７］さらに、前記導入工程の前に、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と、前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞と同種の生物由来の細胞から採取した細胞質とを混合する第１の混合工程を備える、［６］に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
［８］さらに、前記導入工程の前に、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と、相同組換えの阻害物質の抑制剤又は相同組換えの活性化剤とを混合する第２の混合工程を備える、［６］又は［７］に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法。
［９］［６］〜［８］のいずれか一つに記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法で得られた細胞核内にＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入され、再封入された標的遺伝子を有する細胞において、前記Ｃａｓ９が、ＰＡＭ配列の所定塩基上流又は下流に位置する切断部位で標的遺伝子を切断する切断工程と、前記ｇＲＮＡと前記標的遺伝子との相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的遺伝子を有する細胞を得る改変工程と、を備えることを特徴とする細胞内における標的遺伝子の改変方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、インビトロで安定して可溶化したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、ウイルスベクターを細胞内に導入せず、ゲノム編集の核内ニッチが最適化されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法を提供することができる。また、本発明によれば、オフターゲットが低減され、ウイルスベクターを細胞内に導入する必要なく、ゲノム編集の核内ニッチが最適化され、且つ大量の細胞における複数の遺伝子座を同時編集可能な細胞内における標的遺伝子の改変方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法の一実施形態を示す概略工程図である。
【図２】本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法の一実施形態を示す概略工程図である。
【図３】試験例１におけるｄＣａｓ９のみ、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体のみ、又はｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体及びＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を導入したＨｅＬａ細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した画像である。
【図４】試験例２におけるＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ及びｓｇＡＡＶＳ１の複合体とＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを用いたＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す画像である。
【図５】試験例３におけるＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９及びｓｇＴＥＴ１の複合体、又はＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９及びｓｇＴＥＴ２の複合体とＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを用いたＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す画像である。
【図６Ａ】試験例４における光誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｐａＣａｓ９）のＮ末端側及びＣ末端側の構成を示す概略図である。
【図６Ｂ】試験例４における光誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｐａＣａｓ９）のＮ末端側及びｓｇＡＡＶＳ１の複合体、又は光誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｐａＣａｓ９）のＣ末端側及びｓｇＡＡＶＳ１の複合体とＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した画像である。
【図７Ａ】試験例５におけるラパマイシン誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｒｐＣａｓ９）のＮ末端側及びＣ末端側の構成を示す概略図である。
【図７Ｂ】試験例５におけるラパマイシン誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｒｐＣａｓ９）のＮ末端側及びＣ末端側、並びにｓｇＡＡＶＳ１の複合体とＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを用いたＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法＞
一実施形態において、本発明は、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとを２０℃以上で混合して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成するＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程を備え、前記ｇＲＮＡが標的遺伝子中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法を提供する。
【００１３】
本実施形態のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法によれば、インビトロで安定して可溶化したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を得ることができる。
本発明者らは、Ｃａｓ９単体では、４℃程度の低温において凝集体を形成するが、２０℃以上の温度条件で、予め発現させたＣａｓ９及びｇＲＮＡを混合することで、安定したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成し、溶液中に可溶化することを見出し、本発明を完成するに至った。
本実施形態のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法について、図を参照しながら、以下に詳細を説明する。
【００１４】
［Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程］
図１は、本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法の一実施形態を示す概略工程図である。まず、予め発現しておいたＣａｓ９（１）及びｇＲＮＡ（２）を２０℃以上で混合しインキュベーションすることで、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）を形成させる。
このとき、温度は、２０℃以上であり、３０℃以上６５℃以下であることが好ましく、３０℃以上４０℃以下であることがより好ましく、３０℃以上３７℃以下であることがさらに好ましく、３２℃以上３７℃以下が特に好ましい。
通常、タンパク質を取り扱う際には、４℃等の低温であることが一般的である。これに対し、本実施形態においては、温度が上記範囲であることにより、Ｃａｓ９が凝集することを防ぎ、安定したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成し、溶液中に可溶化することができる。
【００１５】
また、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを混合する際に使用する媒体としては、例えば、水性溶媒が挙げられ、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水［Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＴＢ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  １．１５ｍＭ  ＫＯＡＣ，２５０μＭ  ＭｇＣｌ２, ｐＨ７．２）、グルコース水溶液、血清非添加培地等が挙げられ、これらに限定されない。
血清非添加培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられ、これらに限定されない。血清非添加培地は、後述の＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法＞において用いられる細胞の種類に応じて、適宜選択すればよい。
また、媒体は、ＡＴＰ再生系を含んでいていもよい。ＡＴＰ再生系としては、例えば、ＡＴＰ、クレアチンキナーゼ、及びクレアチンリン酸の組み合わせ等が挙げられる。
【００１６】
（Ｃａｓ９）
本明細書において、「Ｃａｓ９」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーの一つであり、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流又は下流で二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
【００１７】
本明細書において、Ｃａｓタンパク質ファミリーとしては、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知)、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、又はそれらの改変されたもの等が挙げられる。本実施形態において用いられるＣａｓ９は、Ｃａｓ９、それらのホモログ、又はそれらの改変されたものであればよい。
【００１８】
また、Ｃａｓ９の由来となる細菌種としては、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードマイコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチルス・サリヴァリゥス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス種、クロコスファエラ・ワストニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属、アセトハロビウム・アラバチカム、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダ・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・テルモフィルスム（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｍ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシホ・アフリカヌス、アカリオクロリス・マリーナ等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、本実施形態において用いられるＣａｓ９の由来となる細菌種としては、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）であることが好ましい。
【００１９】
Ｃａｓ９は、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の最初又は最後のヌクレオチドから、上流又は下流に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれ以上の塩基対以内での、一方又は両方の鎖の切断を指向する。ＰＡＭ配列の上流又は下流の何ｂｐのところを切断するかはＣａｓ９の由来となる細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９はＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
【００２０】
また、本実施形態で用いられるＣａｓ９としては、標的配列を含む標的遺伝子の一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体であってよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ(一本鎖を切断する)に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例には、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが含まれ、これらに限定されない。また、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン(ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ)は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く変異したＣａｓ９を生産することができる。この場合、その他のＤＮＡ切断活性を有する酵素と融合したキメラ酵素であることが好ましい。Ｄ１０Ａ変異は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９を生産するために、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ又はＮ８６３Ａ変異のうち１つ又は複数と組み合わされていてもよい。変異したＣａｓ９のＤＮＡの切断活性が、その非変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％又は０．０１％未満の場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くとみなされる。
【００２１】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列は、真核生物細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。真核生物細胞としては、特定の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又は非ヒト霊長類等が挙げられ、これらに限定されない。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される生物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される生物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１５年１２月１６日に訪問）に掲載されている「Codon  Usage  Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（例えば、Nakamura,Y.ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000」Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)、参照）。特定の生物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする配列中の１つ又は複数のコドンは、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【００２２】
本実施形態におけるＣａｓ９は、Ｎ末端又はＣ末端に核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）ペプチドが結合されていてもよい。
【００２３】
ＮＬＳとしては、例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）からなるポリペプチド、前記配列番号１からなるアミノ酸配列を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ;ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳ);アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ;配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ;インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）;筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）;ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）;マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）;インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲ（配列番号１２）;肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）;マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）;ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）;ステロイドホルモンレセプター（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２４】
なお、本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
【００２５】
また、本実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｎ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｎ）とＣ末端側Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ｃ）とに二分割されており、前記Ｃａｓ９−Ｎ及び前記Ｃａｓ９−Ｃは、それぞれＮ末端又はＣ末端に光依存的又は化学物質依存的に二量体を形成するタンパク質が結合されており、前記Ｃａｓ９は、光又は化学物質存在下でＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が回復するものであってもよい。
上記二分割されたＣａｓ９を用いることにより、細胞内でのＣａｓ９の活性をコントロールすることができ、オフターゲットをより低減することができる。
具体的には、後述の実施例に示す、光誘導型である配列番号１７及び１８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐａＣａｓ９）、ラパマイシン誘導型である配列番号１９及び２０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｒｐＣａｓ９）等挙げられる。
【００２６】
なお、本明細書において、「光依存的に二量体を形成するタンパク質」（光スイッチタンパク質）とは、東京大学大学院総合文化研究科の佐藤守俊准教授らの研究グループにより開発された（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，６２５６（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７２５６）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が有する小さな光受容体のヴィヴィッド（Ｖｉｖｉｄ）に対して多角的にプロテインエンジニアリングを施したタンパク質の対を意味する。光スイッチタンパク質の対は、暗所では単量体として存在し、青い光を受容するとヘテロ二量体を形成する。光による単量体と二量体の変換を利用して、さまざまな光活性化型のツールを設計及び開発することができる。
【００２７】
また、本明細書において、「化学物質依存的に二量体を形成するタンパク質」とは、化学誘導二量体形成法（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）に用いられるタンパク質であって、１９９３年にＦＫ１０１２を二量体形成物質としたモデルがはじめて提唱された（参考文献２：Tamsir, A., et al., “Controlling signal transduction with synthetic ligands”, Science, vol.262, p1019-1024, 1993）。その後、マクロライド系抗生物質であるラパマイシンを二量体形成物質としてＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＫＢＰ）とＦＫ５０６結合タンパク質とラパマイシンとの複合体に対する結合タンパク質であるＦＲＢを用いた方法（参考文献３：Bayle, J. H., et al, “Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonal control of protein activity”, Chem. Biol., vol.13, p 99-107, 2006）をはじめ、さまざまな手法が開発されている（参考文献４：Czlapinski, J. L. et al., “Conditional glycosylation in eukaryotic cells using a biocompatible chemical inducer of dimerization”, J. Am. Chem. Soc., vol.130, p13186-13187, 2008.；参考文献５：Liang, F. S., et al, “Engineering the ABA plant stress pathway for regulation of induced proximity”, Sci. Signal., vol.4, rs2, 2011.；参考文献６：Liberles, S. D., et al., “Inducible gene expression and protein translocation using nontoxic ligands identified by a mammalian three-hybrid screen”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, p7825-7830, 1997.）。
【００２８】
本実施形態におけるＣａｓ９の製造方法としては、例えば、まず、Ｃａｓ９をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換する。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、Ｃａｓ９が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＣａｓ９を適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９が得られる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は１つの環境から別の環境への実体の移行を可能にする又は促進するツールである。例として、組換えＤＮＡ技術において使用されるいくつかのベクターは、ＤＮＡのセグメント(例えば、異種ＤＮＡセグメント、例えば、異種ｃＤＮＡセグメント)等の実体が非ヒト生物の細胞中に移行されるのを可能にする。本実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルス/アデノ随伴ウイルスベクター等）、細菌ベクター、原生動物ベクター、ＤＮＡベクター又はそれらの組換えを含み得る組換えベクターを包含する。
【００３０】
（ｇＲＮＡ）
本明細書において、「ｇＲＮＡ」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものである。
本実施形態で用いられるｇＲＮＡは、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラであってもよく、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよい。
【００３１】
本実施形態におけるｇＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００３２】
本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的遺伝子中に存在し、Ｃａｓ９により認識され得る配列であって、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣａｓ９の由来となる細菌種によってさまざまである。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」(Ｎは任意の塩基を表す)の３塩基を認識する。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」(Ｎは任意の塩基を表す)の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。認識するＰＡＭ配列が短く編集可能な標的遺伝子が制限されにくいことから、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であることが好ましい。
【００３３】
ｇＲＮＡの製造方法としては、公知の方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法等）を用いて製造することができる。具体的には、例えば、まず、５‘−Ｔ７プロモーター配列−ｇＲＮＡ（以下、「配列１」と称する場合がある。）となるように配置したＤＮＡ２本鎖を設計する。次いで、ＰＣＲ産物が上記の配列１になるように、配列１の中央でアニールする２本の長いプライマーを設計する。次いで、ＰＣＲ増幅で配列１からなるＤＮＡ２本鎖をＰＣＲ産物として得る。次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及びピロリン酸分解酵素と、ＰＣＲ産物として得られたＤＮＡとを混合し、３７℃で２時間以上４時間以下程度インキュベーションする。次いで、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ等を用いてｇＲＮＡを精製する。
【００３４】
本実施形態のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において、ｇＲＮＡを２種類以上混合してもよい。ｇＲＮＡを２種類以上混合することにより、２種類以上のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を得ることができる。後述の＜細胞内における標的遺伝子の改変方法＞において、この２種類以上のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を用いることで、複数の遺伝子座を同時に編集することができる。
【００３５】
＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法＞
一実施形態において、本発明は、細胞の形質膜に穿孔物質を作用させて、形質膜上の少なくとも一部に孔を形成する穿孔工程と、前記形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞に上述のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法で得られたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を導入する導入工程と、前記Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞にカルシウムイオンを含む溶液を加え、形質膜上の少なくとも一部に形成された孔を再封入する再封入工程と、を備えるＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法を提供する。
【００３６】
本実施形態の導入方法によれば、ウイルスベクターを細胞内に導入せず、ゲノム編集の細胞核内ニッチが最適化しながら、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を細胞核内に導入することができる。
本発明者らは、これまでに、連鎖球菌毒素ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いた可逆的膜穿孔法を開発してきた。可逆的膜穿孔法を用いることで形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞を得ることができる。
参考文献１（特開２０１３−２１３６８８号公報）に示されるように、セミインタクト細胞では、オルガネラや細胞骨格の構造や機能及びそれらの相対的空間配置はほぼインタクトに保持したまま、元の細胞質を流出させて他の細胞や臓器から調製した細胞質と「交換」することができる。例えば、セミインタクト細胞の細胞質と、病態細胞から得た細胞質とを交換することにより、細胞内に病態環境を構築できる。
本実施形態の導入方法について、図を参照しながら、以下に詳細を説明する。
【００３７】
［穿孔工程］
図２は、本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法の一実施形態を示す概略工程図である。まず、細胞Ａ（１２）の形質膜に穿孔物質を作用させて、形質膜上の少なくとも一部に孔を形成し、セミインタクト細胞Ａ（１２ａ）を得る。
【００３８】
（細胞）
本明細書において、「セミインタクト細胞」とは、形質膜を剥離するなどして、部分的に透過性にし、そこから細胞質を外部に流出させた細胞、又は外部から別の細胞質や他の物質（化合物等）を細胞の中に導入できるようにした細胞を意味する。
また、本実施形態の導入方法の適用対象となる細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３９】
本実施形態の導入方法の適用対象となる動物由来の細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたガン細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４０】
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４１】
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、ガン幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４２】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様ガン等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４３】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４４】
（穿孔物質）
穿孔物質としては、細胞毒素であるジキトニン、ａトキシン、ストレプトリシン、コレステロール依存性細胞溶解毒素等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、本実施形態における穿孔物質としては、動物細胞を用いる場合では、コレステロール依存性細胞溶解毒素であることが好ましい。
【００４５】
本明細書において、「コレステロール依存性細胞溶解毒素」とは、コレステロールと結合し、細胞膜に孔を形成させる（細胞膜を穿孔する）膜穿孔活性を有するものを指す。コレステロール依存性細胞溶解毒素としては、連鎖球菌が産生する毒素が知られている。該毒素はタンパク質であり、細胞膜上のコレステロールに結合した後、細胞膜上で自己集合して細胞膜に孔を形成する。
細胞にコレステロール依存性細胞溶解毒素を接触させると、細胞膜に孔が形成され、形成された孔を通じて所望の物質（本実施形態においては、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体）を導入できる。コレステロール依存性細胞溶解毒素により形成される孔によって、導入可能な物質の分子量としては、例えば１ｋ以上２００ｋ以下である。
コレステロール依存性細胞溶解毒素としてより具体的には、例えば、ストレプトリシンＯ（ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ：ＳＬＯ）、リステリオリシンＯ（Ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  Ｏ；ＬＬＯ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４６】
また、コレステロール依存性細胞溶解毒素は、低温（通常、４℃以下）では、細胞に結合するが穿孔活性は持たず、高温（約２５〜３７℃程度）においてはじめて穿孔活性を持つようになる。このような温度感受性を利用して、低温で穿孔物質を細胞の形質膜上に結合させ、その後、余分な穿孔物質を洗い流し、続いて高温（約２５〜３７℃程度）に昇温することにより、形質膜の脂質に穿孔物質が結合した特定部分だけを選択的に穿孔することができる。
また、コレステロール依存性細胞溶解毒素の活性には、至適ｐＨの存在が知られている。例えば、ＬＬＯは、ｐＨが６未満の範囲に、至適ｐＨを有するとされる（Schuerch, D.W., Wilson-Kubalek, E.M. and Tweten, R.K.(2005) Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. PNAS, 102, 12537-12542.）。
【００４７】
上記膜穿孔活性の至適温度は、例えば３０℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３３℃以上３８℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３７℃以下であってもよい。
上記膜穿孔活性の至適ｐＨは、例えばｐＨ１以上６未満であってもよく、例えばｐＨ３以上５．５以下であってもよく、例えばｐＨ４．５以上５．５未満であってもよい。
【００４８】
上記膜穿孔活性の至適ｐＨは公知の方法により測定できる。例えば、上記温度及びｐＨ条件で培養している赤血球に対してコレステロール依存性細胞溶解毒素を接触させ、赤血球膜が破壊されてヘモグロビンが溶出される血球の溶血活性（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｎｉｔ，ＨＵ）の程度を基準として膜穿孔活性を測定でき、膜穿孔活性が最大となるｐＨを、至適ｐＨと判断できる。
【００４９】
穿孔物質は、予め培養した細胞Ａ（１２）に対して、培地等に添加して使用すればよい。
本明細書において、「培養」とは、生体（個体）外で細胞を飼育又は生育させることを意味する。飼育又は生育の期間は、例えば１分以上７日以下であってもよく、例えば５分以上１６時間以下であってもよく、例えば１０分以上１時間以下であってもよい。
本明細書において、「培地」とは、細胞を培養可能なもの全般を指す概念である。培地において、穿孔物質を除いた残りの成分は、非常に短期間でも細胞を培養できるものであればよく、一般的に培地とは称されない水や緩衝液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水［Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＴＢ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  １．１５ｍＭ  ＫＯＡＣ，２５０μＭ  ＭｇＣｌ２, ｐＨ７．２）等）等であってもよい。培地に含まれ得る成分としては、通常の細胞培養用の培地に含有される成分が挙げられ、例えば、グルコース、塩化ナトリウム、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類等の栄養成分；成長因子、細胞増殖因子、分化誘導因子、抗菌剤、抗真菌剤等を挙げることができる。培地としてより具体的には、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられ、これらに限定されない。培地の組成は、用いる細胞Ａの種類に応じて、適宜選択すればよい。
【００５０】
培地に含まれる穿孔物質の含有量としては、例えば０．０１μｇ／ｍＬ以上１μｇ／ｍＬ以下であればよく、例えば０．０２５μｇ／ｍＬ以上０．６μｇ／ｍＬ以下であればよく、例えば０．０５μｇ／ｍＬ以上０．３μｇ／ｍＬ以下であればよく、例えば０．０８μｇ／ｍＬ以上０．１μｇ／ｍＬ以下であればよい。
穿孔物質の含有量が上記範囲であることにより、細胞に与えるダメージが少なく、且つ細胞への物質導入効果を均等なものとすることができる。
【００５１】
また、穿孔物質を含む培地のｐＨとしては、例えばｐＨ６以上１０以下であってもよく、例えば６．５以上８以下であってもよく、例えば７．０以上７．５以下であってもよい。ｐＨは３０℃以上４０℃以下の範囲における測定値とする。
培地のｐＨが上記範囲内であることにより、細胞を良好に培養できる。更には、ｐＨが０以上６未満の範囲に至適ｐＨを有する穿孔物質（特に、コレステロール依存性細胞溶解毒素）の膜穿孔活性が、穏やかに発揮される点からも好ましい。
【００５２】
培地に含まれる穿孔物質（特に、コレステロール依存性細胞溶解毒素）の量と細胞との量比は、細胞の種類に応じて適宜定めることができる。例えば、細胞の細胞膜中のコレステロール含量が多いほど、膜穿孔で必要な穿孔物質量（濃度）が少なくなると考えられる。細胞膜中のコレステロール含量が高い場合は、培地に含まれる穿孔物質の量（濃度）が少なくなる方向に調整すればよく、細胞膜中のコレステロール含量が低い場合は、培地に含まれる穿孔物質量（濃度）が多くなる方向に調整すればよい。
【００５３】
穿孔物質（特に、コレステロール依存性細胞溶解毒素）を含む培地で培養されるとき、細胞Ａの培養温度は、例えば０℃以上１０℃以下であればよく、例えば２℃以上５℃以下であればよい。具体的には、穿孔物質を含む培地と細胞Ａとを備える培養容器を氷上（ｏｎ  ｉｃｅ）に置くことで、培地の温度を管理してもよい。当該温度域では、穿孔物質（特に、コレステロール依存性細胞溶解毒素）の膜穿孔活性が抑制されている。そのため、穿孔物質を含む培地と細胞Ａとを接触させると、穿孔物質は細胞Ａの細胞膜に結合するものの、穿孔の作用が発揮され難く、細胞膜の穿孔の程度を制御しやすくできる。
【００５４】
穿孔物質を含む培地で細胞を培養した後、穿孔物質を含む培地を、穿孔物質を含まない培地に交換し、穿孔物質を含まない培地で細胞を培養して、細胞Ａの細胞膜を穿孔する。
穿孔物質を含む培地から、穿孔物質を含まない培地に交換することで、細胞Ａに結合した以外の穿孔物質は、培養容器内の反応系から取り除かれる。
【００５５】
穿孔物質を含まない培地で培養されるとき、細胞Ａの培養温度は、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、例えば３３℃以上３８℃以下であればよく、例えば３５℃以上３７℃以下であればよい。当該温度域で培養することで、穿孔物質（特に、コレステロール依存性細胞溶解毒素）の膜穿孔活性が発揮され、細胞Ａ（１２）の細胞膜が穿孔され、細胞膜に孔が形成された細胞Ａ（１２ａ）となる。穿孔物質を含まない培地には細胞Ａに結合した穿孔物質以外の穿孔物質が除かれているため、孔からさらに穿孔物質が細胞内に入り細胞質中のオルガネラが穿孔されることを防止できる。
【００５６】
穿孔物質を含まない培地で細胞Ａを培養する培養時間は、穿孔物質の種類や細胞種に応じて適宜定めればよい。例えば１分以上３０分以下程度が挙げられる。
【００５７】
穿孔物質を含まない培地としては、上記穿孔物質を含む培地で例示した培地と同じものが挙げられる。穿孔物質を含まない培地と穿孔物質を含む培地とは同じ種類の培地であってもよく、異なる種類の培地であってもよい。
【００５８】
穿孔物質を含まない培地で培養されるとき、培地の至適ｐＨとしては、例えばｐＨ６以上１０以下であればよく、例えば６．５以上８以下であればよく、例えば７．０以上７．５以下であればよい。ｐＨは３０℃以上４０℃以下の範囲における測定値とする。
培地の至適ｐＨが上記範囲内であることにより、細胞を良好に培養でき、穿孔物質の膜穿孔活性が、穏やかに発揮される点からも好ましい。
【００５９】
穿孔物質を含まない培地で培養されるとき、培地の至適温度としては、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、例えば３３℃以上３８℃以下であればよく、例えば３５℃以上３７℃以下であればよい。
【００６０】
［導入工程］
次いで、形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞（セミインタクト細胞）Ａ（１２ａ）に、上述のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）を導入する。
【００６１】
導入工程において、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は培地等に可溶化された状態であればよい。培地としては、上述の［穿孔工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６２】
導入工程において、温度は、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３８℃以下であればよく、例えば３２℃以上３７℃以下であればよい。
【００６３】
［混合工程］
また、上述のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）と共に導入する物質がある場合、導入工程の前に、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と当該物質とを混合する混合工程を備えていてもよい。
【００６４】
混合工程において、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と物質との混合に用いる媒体としては、上述の＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法＞の［Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６５】
また、混合工程において、温度は、続く導入工程と同じ温度に調整すればよく、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、例えば３０℃以上３８℃以下であればよく、例えば３２℃以上３７℃以下であればよい。
【００６６】
該物質の分子量としては、例えば１ｋ以上２００ｋ以下であればよい。
また、該物質としては、細胞膜不透過性の性質を有するものであってもよい。「細胞膜不透過性を有する物質」とは、細胞膜の脂質二重膜に溶け込めず、脂質二重膜を透過できない性質を有する物質を意味する。本実施形態の導入方法によれば、細胞膜不透過性の物質であっても、前記孔を通じて、細胞内に高効率に導入可能である。
また、該物質としては、化合物であってよく、有機化合物であってよい。該物質は核酸を含んでいてもよく、例えば、アンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アプタマー等が挙げられる。これらの化合物は、核酸医薬の有効成分となり得る。これらの核酸を含む化合物は、通常は細胞膜不透過性であるが、実施形態の物質導入方法によれば、これらを効率よく細胞に導入可能である。
なお、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と共に導入する物質が細胞質、又は相同組換えの阻害物質の抑制剤若しくは相同組換えの活性化剤である場合について、以下に［第１の混合工程］、［第２の混合工程］として例示する。
【００６７】
（第１の混合工程）
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体に加えて、形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞（セミインタクト細胞）Ａ（１２ａ）と同種の生物由来の細胞Ｂ（１１）から採取した細胞質（１１ａ）を導入する場合、導入工程の前に、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）と、セミインタクト細胞Ａ（１２ａ）と同種の生物由来の細胞Ｂ（１１）から採取した細胞質（１１ａ）とを混合すればよい。
【００６８】
細胞質の由来となる細胞の由来生物、及び細胞の種類としては、上述の［穿孔工程］の（細胞）において例示されたものが挙げられる。また、細胞の種類は、細胞Ａと同じであってもよく、異なっていてもよい。
また、細胞Ａと細胞Ｂとが同じ種類の体細胞であり、細胞Ａが正常細胞であり、細胞Ｂががん細胞である場合、細胞Ａに細胞Ｂの細胞質を導入することにより、細胞Ｂの細胞質依存的に目的に生命現象を可視化及び再構築することができ、さらに、続く［再封入工程］の後に、細胞の形質（表現型）、遺伝子発現、及びエピジェノティクス動態変化等を解析することができる。
【００６９】
（第２の混合工程）
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体に加えて、相同組換えの阻害物質の抑制剤又は相同組換えの活性化剤を導入する場合、導入工程の前に、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）と、相同組換えの阻害物質の抑制剤又は活性化剤とを混合すればよい。
【００７０】
相同組換えの阻害物質としては、例えば、Ｃｕｌｌｉｎ  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅのファミリーであるＣＵＬ４Ａ／Ｂ、ＰＡＬＢ２をユビキチン化するユビキチン化酵素であるＣＵＬ３等が挙げられ、これらに限定されない。よって、これらの阻害物質の抑制剤としては、これら阻害物質に対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、抗体等が挙げられる。
【００７１】
また、相同組換えの活性化剤としては、例えば、ＤＮＡ相同組換え酵素であるＲａｄ５１及びＲａｄ５４等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７２】
［再封入工程］
次いで、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された形質膜上の少なくとも一部に孔が形成された細胞に、カルシウムイオンを含む溶液を加え、形質膜上の少なくとも一部に形成された孔を再封入する。
図２においては、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）及び細胞Ｂ（１１）の細胞質（１１ａ）が導入されたセミインタクト細胞Ａ（１２ｂ）が例示されている。
【００７３】
本明細書において「再封入（リシール）」とは、前記穿孔工程で細胞膜に形成された孔の開口が全部又は部分的に閉じられることを意味する。
再封入は、エンドサイトーシス及び／又はエキソサイトーシスによって、細胞膜から穿孔物質が取り除かれることにより生じるとされ、カルシウムイオンの存在により促進される。カルシウムイオンを含む溶液（培地）で培養されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（１０）及び細胞Ｂ（１１）の細胞質（１１ａ）が導入されたセミインタクト細胞Ａ（１２ｂ）は、細胞膜がリシールされ、リシール細胞Ａ（１２ｃ）となる。前記導入工程で細胞内に導入されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、再封入によって効率的にリシール細胞Ａ（１２ｃ）内に保持される。
【００７４】
培地が含有するカルシウムイオンの濃度は、例えば０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。
【００７５】
カルシウムイオンを含む溶液は、例えば、細胞培養用の培地に、カルシウムの塩を添加することで得ることができる。添加するカルシウムの塩としては、塩化カルシウム等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７６】
再封入工程において、外来の細胞質を含む溶液を前記孔が形成された細胞に接触させずに、前記孔を再封入してもよく、外来の細胞質を含む溶液を前記孔が形成された細胞に接触させて、前記孔を再封入してもよい。
【００７７】
本明細書において「外来の細胞質」とは、穿孔工程において穿孔された導入対象の細胞以外の細胞の細胞質を意味する。例えば、細胞膜に孔が形成された細胞Ａ（１２ａ）の細胞質は、外来の細胞質に該当しない。また、図２に示される例では、外来の細胞質とは、細胞Ａ以外の細胞から得られた細胞質、すなわち細胞Ｂの細胞質（１１ａ）である。なお、外来の細胞質の種類は、前記導入対象の細胞とは違う種類の細胞の細胞質でもよいし、同じ種類の細胞の細胞質でもよく、組織から調製した細胞質でもよい。
【００７８】
なお、本実施形態の導入方法では、穿孔工程と導入工程とを独立の工程として実施したが、穿孔と導入はほぼ同時に生じてもよい。その場合、本実施形態の導入方法では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は穿孔工程の後に、導入工程における培地に添加することを例示したが、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、穿孔工程における培地に添加されていてもよい。
【００７９】
＜細胞内における標的遺伝子の改変方法＞
一実施形態において、本発明は、上述のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法で得られた細胞核内にＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入され、再封入された標的遺伝子を有する細胞において、前記Ｃａｓ９が、ＰＡＭ配列の所定塩基上流又は下流に位置する切断部位で標的遺伝子を切断する切断工程と、前記ｇＲＮＡと前記標的遺伝子との相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的遺伝子を有する細胞を得る改変工程と、を備える細胞内における標的遺伝子の改変方法を提供する。
【００８０】
本実施形態の細胞内における標的遺伝子の改変方法によれば、オフターゲットが低減され、ウイルスベクターを細胞内に導入せずに標的遺伝子を簡便に改変することができる。また、ゲノム編集の核内ニッチが最適化された状態であり、大量の細胞における複数の遺伝子座を同時編集することができる。
本実施形態の細胞内における標的遺伝子の改変方法について、以下に詳細を説明する。
【００８１】
［切断工程］
まず、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、ガイドＲＮＡの一部が標的遺伝子に結合し、Ｃａｓ９が標的遺伝子中のＰＡＭ配列を認識する。続いて、所定塩基（例えば、３塩基）上流又は下流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断する。より具体的には、Ｃａｓ９がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、標的遺伝子の二重らせん構造が引き剥され、ガイドＲＮＡ中の標的遺伝子に相補的な塩基配列とアニーリングすることで、標的遺伝子の二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列の所定塩基（例えば、３塩基）上流又は下流に位置する切断部位で、標的遺伝子のリン酸ジエステル結合を切断する。
【００８２】
［改変工程］
続いて、前記ｇＲＮＡと前記標的遺伝子の相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた改変が施された標的遺伝子を得ることができる。
【００８３】
本明細書中において、「改変」とは、標的遺伝子の塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的遺伝子の切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたDNA末端どうしが再び結合すること）による標的遺伝子の塩基配列の変化等が挙げられる。本実施形態における標的遺伝子の改変により、標的遺伝子への変異の導入、又は、標的遺伝子の機能を破壊することができる。
よって、本実施形態において、標的遺伝子の機能が破壊（ノックアウト）又は置換（ノックイン）された細胞、又は該細胞を有する生物体を容易に作製することができる。
【００８４】
１つの標的遺伝子の２箇所以上を改変する場合、又は２つ以上の複数の遺伝子を標的遺伝子とする場合は、それぞれの遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むｇＲＮＡを２種類以上設計し、上述の＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法＞において２種類以上のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を製造し、次いで、上述の＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法＞を用いて２種類以上のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が導入された細胞を用いればよい。これにより、複数の異なる遺伝子又は同一遺伝子内の複数箇所を同時に高効率で編集することができる。
【００８５】
本実施形態の細胞内における標的遺伝子の改変方法において、＜Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法＞を用いて、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体とともに外来遺伝子を導入した細胞を用いてもよい。外来遺伝子を一緒に導入することにより、標的遺伝子が切断後、相同組換えにより標的遺伝子に外来遺伝子が挿入された核ゲノムを有する遺伝子改変非ヒト生物を得ることができる。
【００８６】
また、外来遺伝子は、ＰＡＭ配列を有さないことが好ましい。外来遺伝子において、例えば、アミノ酸配列を変更しない１塩基置換等により、ＰＡＭ配列をｎｏｎＰＡＭ配列に変更した場合、核ゲノム上に外来遺伝子を相同組換えにより挿入することができ、さらに、挿入された外来遺伝子が再度内在するＣａｓ９により切断されることを防ぐことができる。
【００８７】
外来遺伝子は、該外来遺伝子を含むベクターを用いて導入することが好ましい。また、外来遺伝子を含むベクターは、外来遺伝子の５’末端及び３’末端に、標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡが連結されていることが好ましい。標的遺伝子の挿入を行う部位と相同な配列を有するＤＮＡの塩基数としては、１００塩基以上３００塩基以下であることが好ましい。外来遺伝子を含むベクターは、外来遺伝子の５’末端又は３’末端に、各種プロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【００８８】
＜用途及び活用方法＞
一実施形態において、本発明は、遺伝子改変を実行するための方法及び組成物を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本発明は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞又は生物に適応可能である。細胞又は生物の標的遺伝子の任意のセグメントは、本発明の方法により改変され得る。この方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。
【００８９】
また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う方法を提供する。この方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入及びＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【００９０】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を提供する。
【００９１】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すための方法を提供する。ここで、「遺伝子」は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本発明の方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらし得る。
すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じ得る。
【００９２】
また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すための方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために選択され得る。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトされ得る。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。
【００９３】
また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入をさらに提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。
例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病を被る個体を治療することができる。
【００９４】
また、前記ドナーＤＮＡは作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物の生成を引き起こし得る。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼ、ヘモグロビン等）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、又は誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成し得る。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。遺伝子改変植物又は遺伝子改変生物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１０６６−１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０）を用いる方法で作製され得る。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用され得る。
【００９５】
また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞内で利用され、計画された様式で挿入が生じ、後の全ての細胞分裂が、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成する細胞を選択し得る。
【００９６】
また、一実施形態において、本発明は、すべての生物、培養細胞、培養組織、培養核（インタクトな生物を再生するために使用され得る細胞、組織又は核を含む）、配偶子（例えば、それらの発達の様々な段階の卵又は精子）において適用され得る。
また、一実施形態において、本発明は、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、並びに他の哺乳動物（イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられ、これらに限定されない）に由来する細胞に適用され得る。
また、一実施形態において、本発明は病態モデル動物（例えば、病態モデルマウス）の作製において適用され得る。
【００９７】
また、一実施形態において、本発明は、植物において使用され得る。植物としては、特別な限定はなく、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において使用され得る。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。【００９９】
［試薬類］
本実施例で用いた試薬類を以下に示す。
・ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）：（バイオアカデミア製、型番：０１−５３１）【０１００】
また、使用したＣａｓ９及びｇＲＮＡの配列番号を以下の表１に示す。なお、表１において、ＳａＣａｓ９とは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９を意味し、ＳｐＣａｓ９とは化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は由来のＣａｓ９を意味する。また、ｄＣａｓ９とはエンドヌクレアーゼ活性が不活化したＳｐＣａｓ９を意味し、ＮＬＳは核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌを意味する。なお、ＮＬＳのアミノ酸配列は配列番号１に示した。【０１０１】
【表１】
2017131150.tif 000003
【０１０２】
［実施例１］Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製
（１）ｓｇＲＮＡの調製
各ｇＲＮＡ（配列番号２５、２６、及２７）を９５℃で１分間インキュベーションし、３２℃ヒートブロック上で冷まし、ｓｇＲＮＡを調製した。【０１０３】
（２）Ｃａｓ９の調製
Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ｔｅｖプロテアーゼサイト−ＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９、ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、及びＨｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳのコンストラクトを有する発現ベクター（東京大学大学院理学研究科の濡木理教授らの研究グループより譲渡）をそれぞれ大腸菌へ形質転換した。その後、抗生物質を含む０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで２０℃の条件で１８時間培養した。培養後、大腸菌を回収した。次いで、ソニケーションにより大腸菌を破砕した。
次いで、ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳはＣ末端に付加された標的タグを認識するＰ２０．１抗体カラムで精製し、ＨｉＴｒａｐＳＰ（ＧＥ社）にかけて、ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ、及びＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳを得た。
また、Ｈｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳはＮｉＮＴＡで精製し、ＨｉＴｒａｐＳＰ（ＧＥ社）にかけて、Ｈｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳを得た。
また、Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ｔｅｖプロテアーゼサイト−ＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９はＮｉＮＴＡで精製し、ｔｅｖプロテアーゼを用いて、切断した。再度ＮｉＮＴＡで精製し、ＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９を得た。【０１０４】
（３）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製
次いで、（１）で調製したｓｇＲＮＡ及び（２）で調製したＣａｓ９をそれぞれ２０μＬ  ＴＢ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  １．１５ｍＭ  ＫＯＡＣ，２５０μＭ  ＭｇＣｌ２, ｐＨ７．２）中で混合し、３２℃で１０分間インキュベーションした。対照群として、ｇＲＮＡと混合せずに、２０μＬ  ＴＢにＣａｓ９のみを添加し、氷上で静置した。【０１０５】
いずれのＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体もＣａｓ９の凝集体は発生せず、可溶化していた（図示せず）。一方、２０μＬ  ＴＢにＣａｓ９のみを添加し、氷上で静置したサンプルでは、Ｃａｓ９の凝集体が発生し、沈殿が見られた（図示せず）。
以上のことから、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとは細胞導入前に複合体を形成させることで、Ｃａｓ９の凝集体の形成を抑制することができる。【０１０６】
［試験例１］ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入
（１）Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質の調製
１５０ｍｍのディッシュで培養したＬ５１７８Ｙ細胞を５０ｍＬチューブに回収し、２０００ｒｐｍで３分遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞をＰＢＳで懸濁して１本の５０ｍＬチューブに集めた。続いて、２０００ｒｐｍで３分遠心後、上清を除去した。次いで、低張バッファー（１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１μＭ  ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｄ）を加えて懸濁した後、５分静置して細胞を膨張させた。次いで、１５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を除去して得られた細胞のペレットをダウンスホモジナイザーに移し、プロテアーゼインヒビター（ａｎｔｉｐａｉｎ、ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎの４種類を各２５μｇ／ｍＬ）を加えて、氷上で５回ストロークした。続いて、ペレットに対し１／１０量の１０×ＴＢ（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１１５０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加え、さらに１０回以上ストロークして細胞を破砕した。破砕後、サンプルを１２０００ｒｐｍ、４℃の条件で１６分間遠心した。遠心後、上清を回収し、１００，０００ｇ、４℃の条件で９０分間遠心した。次いで、得られた上清（細胞質）にＡＴＰ再生系（ＡＴＰ、クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＣＫ）、クレアチンリン酸（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＣＰ）、ＧＴＰ、及びグルコース）を含むＴＢを混合し、３２℃で１０分間インキュベーションした。【０１０７】
（２）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の調製
次いで、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたＨｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳとｓｇＡＡＶＳ１との複合体（以下、「ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を合計１００μＬとなるように混合し、使用するまで３２℃で保存した。ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の組成は以下の表２に示す。【０１０８】
【表２】
2017131150.tif 000004
【０１０９】
（３）ＨｅＬａ細胞の穿孔
次いで、３．５ｃｍディッシュ、四角カバーガラス上に８０％コンフルエントのＨｅＬａ細胞を準備した。次いで、ＨｅＬａ細胞を氷上へ移し、予め冷やしておいたＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＳＬＯ（０．１２５μｇ／ｍＬ）含有Ｄ−ＭＥＭ（ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）不含）１ｍＬを加え、氷上で５分間インキュベーションした。次いで、予め冷やしておいたＰＢＳで３回洗浄した。次いで、３７℃のＴＢ（ＥＧＴＡ不含）  １ｍＬ加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。次いで、ＴＢ（ＥＧＴＡ不含）で２回洗浄した。【０１１０】
（４）ＨｅＬａ細胞へのｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の導入
次いで、カバーガラスをパラフィルムに取り出し、（１）で調製したｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液１００μＬを乗せて、３２℃で３０分間インキュベーションした。対照群として、ｉ) Ｈｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳのみで細胞質のないサンプル、ｉｉ）ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体のみで細胞質のないサンプルを乗せて試験を行った。【０１１１】
（５）ＨｅＬａ細胞の再封入
次いで、前記混合液を回収し、１００ｍＭ塩化カルシウム１μＬと混合し、再びカバーガラス上に戻し、３２℃で１０分間インキュベーションした。次いで、カバーガラスを新しい３．５ｃｍディッシュに移し、ＰＢＳで２回洗浄した。【０１１２】
（６）ＨｅＬａ細胞の蛍光染色
次いで、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）含有Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳ含有）２ｍＬ加え、３７℃、５％二酸化炭素の条件で培養した。培養から__＿時間後の各細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図３に示す。図３において、ｉ)はＨｉｓ６−ＮＬＳ−ＧＦＰ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳのみで細胞質のないサンプル、ｉｉ）はｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体のみで細胞質のないサンプル、ｉｉｉ）はｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液を用いたサンプルを意味する。また、「ＧＦＰ−ｄＣａｓ９」はＧＦＰの蛍光を用いてｄＣａｓ９の細胞内外で局在を観察した画像を意味し、「ＰＩ」はＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅを用いて核を染色した画像を意味し、「ｍｅｒｇｅ」は「ＧＦＰ−ｄＣａｓ９」及び「ＰＩ」の画像を合わせた画像を意味する。【０１１３】
図３から、ｉ)では、ｄＣａｓ９が溶液中で巨大複合体を形成して凝集するため、形質膜に非特異的に吸着し、細胞内に導入されなかった。また、ｉｉ）では、凝集体形成は顕著に減少し、細胞質内にｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を導入させることができたが、核内への移行は観察されなった。
これらに対し、ｉｉｉ）では、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質とを用いることで、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の核内への移行が観察された。これは、細胞質に含まれる因子の影響により、ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の核内への移行が促進されたことによると推察された。【０１１４】
以上の結果から、Ｃａｓ９とｇＲＮＡとは細胞導入前に複合体を形成させることで、Ｃａｓ９の凝集体の形成を抑制し、細胞導入が可能となること、さらに細胞質はＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の核内意向を促進することが明らかとなった。【０１１５】
［試験例２］ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体及び細胞質を導入したＨｅＬａ細胞を用いたＴ７Ｅ１アッセイ
（１）Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質の調製
試験例１の（１）と同様の方法を用いて、Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質を調製した。【０１１６】
（２）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の調製
次いで、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳとｓｇＡＡＶＳ１との複合体（以下、「ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を合計１００μＬとなるように混合し、使用するまで３２℃で保存した。ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の組成は上記表２と同様である。表２において、ｄＣａｓ９の含有量として記載された５μｇ／１００μＬ中がＳｐＣａｓ９の含有量である。【０１１７】
（３）ＨｅＬａ細胞の穿孔
試験例１の（３）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞の少なくとも一部に孔を形成させた。【０１１８】
（４）ＨｅＬａ細胞へのＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の導入
ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の代わりに、ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液を用いた以外は、試験例１の（４）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞へＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液を導入した。【０１１９】
（５）ＨｅＬａ細胞の再封入
試験例１の（５）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞を再封入した。次いで、Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳ含有）２ｍＬ加え、３７℃、５％二酸化炭素の条件で、２４時間培養した。【０１２０】
（６）再封入したＨｅＬａ細胞からのゲノム抽出
次いで、２４時間培養後の再封入したＨｅＬａ細胞（以下、「リシールＨｅＬａ細胞」と称する場合がある。）をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、リシールＨｅＬａ細胞に１％ＳＤＳ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５００μＬ加えて、３７℃、５％二酸化炭素の条件で、３時間インキュベーションした。次いで、シャーレ上の溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、２０ｍｇ／ｍＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ２．２５μＬを加えて、混合し、５０℃で一晩インキュベーションした。次いで、１０ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  ７．５μＬを加え、さらに１％ＳＤＳ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬを加えて混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、フェノール／クロロホルム  ７５０μＬ加えてボルテックスし、遠心（１４，０００ｒｐｍ、室温、１０分間）した。遠心後、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、同様に、フェノール／クロロホルム抽出を行った。次いで、上清に２−プロパノール  ７５０μＬを加え、１０回転倒混合を行い、遠心（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。遠心後、ペレットを７０％エタノールで洗浄後、真空乾燥した。次いで、ペレットを２０μＬのｄｅｉｏｎｉｚｅｄ−ｄｅｓｔｉｌｌｅｄ  Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）に溶解し、ゲノム溶液を調製した。【０１２１】
（７）ＡＡＶＳ１領域のＰＣＲ増幅
次いで、（６）で得られたゲノム溶液を用いて、ＡＡＶＳ１領域のＣａｓ９の標的配列をを含む約１ｋｂｐの産物を作るようにｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ、２回目のＰＣＴで用いたプライマーを以下の表３に示す。【０１２２】
【表３】
2017131150.tif 000005
【０１２３】
サイクル数は、１回目のＰＣＲでは２０サイクル、２回目のＰＣＲでは３５サイクルで行った。また、ＰＣＲの鋳型として、１回目のＰＣＲでは（６）で調製したゲノムＤＮＡ  １０ｎｇを用いて行い、２回目のＰＣＲでは１回目のＰＣＲ産物の１０倍希釈溶液  １μＬ用いて行った。ＰＣＲ増幅後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、ＰＣＲ産物をｄｄＨ２Ｏ  ２０μＬに溶解した。次いで、ＰＣＲ産物を２μｇ／２０μＬとなるようにｄｄＨ２Ｏを用いて希釈し、サーマルサイクラーを用いて熱変性と再アニールとを行った（９５℃  ２分／８５℃→３５℃  １０分かけて冷却／１６℃）。【０１２４】
（８）Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイとは、Ｔ７エンドヌクレアーゼがＤＮＡ二本鎖のミスマッチ部位（Ａ−ＴやＣ−Ｇのような水素結合を形成できる塩基対ではない部位）を認識及び切断する作用を持つことを利用し、ゲノム中の変異を検出及び定量する方法である。
次いで、（７）で得られた再アニール産物８．８７５μＬに対し、ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ２  １μＬ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（１０，０００Ｕ／ｍＬ）０．１２５μＬを加え、３７℃で２０分間インキュベーションした。反応後、１０×Ｌｏａｄｈｉｎｇ  Ｄｙｅ  １μＬを混合し、２％アガロースゲルで１７分間、１３５Ｖで電気泳動して、イルミネーター上でバンドを確認した。結果を図４に示す。図４において、レーン１は対照群としてＴ７エンドヌクレアーゼ１による反応を行わなかったサンプル、レーン２はＴ７エンドヌクレアーゼ１による反応を行ったサンプル、レーンＭはマーカーを示している。【０１２５】
図４から、ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞（レーン２）では、Ｔ７エンドヌクレアーゼによる切断を受けたバンドが生成されており、ＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体によって、ＨｅＬａ細胞の核内のゲノムに変異が導入されたことが確かめられた。【０１２６】
［試験例３］ＳａＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体及び細胞質を導入したＨｅＬａ細胞を用いたＴ７Ｅ１アッセイ
（１）Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質の調製
試験例１の（１）と同様の方法を用いて、Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質を調製した。【０１２７】
（２）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の調製
次いで、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９とｓｇＴＥＴ２との複合体（以下、「ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を合計１００μＬとなるように混合し、使用するまで３２℃で保存した。ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体と細胞質との混合液の組成は上記表２と同様である。表２において、ｄＣａｓ９の含有量として記載された５μｇ／１００μＬ中がＳａＣａｓ９の含有量である。
また、対照群として、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたＨＡ−ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９とｓｇＴＥＴ１との複合体（以下、「ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ１複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質との混合液も調製した。【０１２８】
（３）ＨｅＬａ細胞の穿孔
試験例１の（３）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞（付着性細胞）の少なくとも一部に孔を形成させた。また、ＨｅＬａ細胞をトリプシンで引き剥がし、浮遊性細胞として用いて、試験例１の（３）と同様の方法を用いて、少なくとも一部に孔を形成させた。【０１２９】
（４）ＨｅＬａ細胞へのＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ１複合体又はＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体と細胞質との混合液の導入
ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の代わりに、ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ１複合体又はＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体と細胞質との混合液を用い、さらに、ＨｅＬａ細胞（付着性細胞）及びＨｅＬａ細胞（浮遊性細胞）を用いた以外は、試験例１の（４）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞（付着性細胞）及びＨｅＬａ細胞（浮遊性細胞）へＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ１複合体又はＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体と細胞質との混合液を導入した。対照群として、ＳａＣａｓ９のみをＨｅＬａ細胞へ導入した。【０１３０】
（５）ＨｅＬａ細胞の再封入
試験例１の（５）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞（付着性細胞）及びＨｅＬａ細胞（浮遊性細胞）を再封入した。次いで、Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳ含有）２ｍＬ加え、３７℃、５％二酸化炭素の条件で、２４時間培養した。【０１３１】
（６）再封入したＨｅＬａ細胞からのゲノム抽出
試験例２の（６）と同様の方法を用いて、ゲノム溶液を調製した。【０１３２】
（７）ＴＥＴ２領域のＰＣＲ増幅
次いで、（６）で得られたゲノム溶液を用いて、ＴＥＴ１領域又はＴＥＴ２領域のＣａｓ９の標的配列をを含む約１ｋｂｐの産物を作るようにｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ、２回目のＰＣＴで用いたプライマーを以下の表４に示す。【０１３３】
【表４】
2017131150.tif 000006
【０１３４】
サイクル数は、１回目のＰＣＲでは２０サイクル、２回目のＰＣＲでは３５サイクルで行った。また、ＰＣＲの鋳型として、１回目のＰＣＲでは（６）で調製したゲノムＤＮＡ  １０ｎｇを用いて行い、２回目のＰＣＲでは１回目のＰＣＲ産物の１０倍希釈溶液  １μＬ用いて行った。ＰＣＲ増幅後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、ＰＣＲ産物をｄｄＨ２Ｏ  ２０μＬに溶解した。次いで、ＰＣＲ産物を２μｇ／２０μＬとなるようにｄｄＨ２Ｏを用いて希釈し、サーマルサイクラーを用いて熱変性と再アニールとを行った（９５℃  ２分／８５℃→３５℃  １０分かけて冷却／１６℃）。【０１３５】
（８）Ｔ７Ｅ１アッセイ
試験例２の（８）と同様の方法を用いて、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。結果を図５に示す。図５において、インタクトとは対照群としてＳａＣａｓ９のみをＨｅＬａ細胞へ導入したサンプルを意味し、付着リシールは付着性細胞であるリシールＨｅＬａ細胞を用いたサンプルを意味し、浮遊リシールは浮遊性細胞であるリシールＨｅＬａ細胞を用いたサンプルを意味し、ＴＥＴ１はｓｇＴＥＴ１を用いたサンプル、ＴＥＴ２はｓｇＴＥＴ２を用いたサンプルを意味する。【０１３６】
図５から、ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ１複合体を用いたサンプルでは、変異の導入は観察されなかったが、ＳａＣａｓ９−ｓｇＴＥＴ２複合体を用いたサンプルでは、変異の導入が観察された。
また、付着性細胞及び浮遊性細胞において、変異導入効率（３．５％及び２．６％）に差は見られなかった。【０１３７】
［試験例４］光誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｐａＣａｓ９）及び細胞質の細胞への導入
（１）Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質の調製
試験例１の（１）と同様の方法を用いて、Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質を調製した。【０１３８】
（２）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の調製
次いで、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたＰａＣａｓ９−Ｎ（ｎＭａｇ−Ｈｉｇｈ１−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ＮＬＳ）又はＰａＣａｓ９−Ｃ（ＨｉｓＴａｇ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｐＭａｇ）とｓｇＡＡＶＳ１との複合体（以下、「ｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体」又は「ｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を合計１００μＬとなるように混合し、使用するまで３２℃で保存した。
なお、図６Ａは、ＰａＣａｓ９−Ｎ（ｎＭａｇ−Ｈｉｇｈ１−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ＮＬＳ）及びＰａＣａｓ９−Ｃ（ＨｉｓＴａｇ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｐＭａｇ）の構成を示す概略図である。また、試験例４において用いられたＳｐＣａｓ９（Ｎ）及びＳｐＣａｓ９（Ｃ）は不活性型であるｄＣａｓのＮ末端側及びＣ末端側である。
ｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体又はｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質との混合液の組成は上記表２と同様である。表２において、ｄＣａｓ９の含有量として記載された５μｇ／１００μＬ中がＰａＣａｓ９−Ｎ又はＰａＣａｓ９−Ｃの含有量である。【０１３９】
（３）ＨｅＬａ細胞の穿孔
試験例１の（３）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞の少なくとも一部に孔を形成させた。【０１４０】
（４）ＨｅＬａ細胞へのｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体又はｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質との混合液の導入
ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の代わりに、ｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体又はｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質との混合液を用いた以外は、試験例１の（４）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞へｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体又はｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質との混合液を導入した。【０１４１】
（５）ＨｅＬａ細胞の再封入
試験例１の（５）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞を再封入した。【０１４２】
（６）ＨｅＬａ細胞の蛍光染色
次いで、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）含有Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳ含有）２ｍＬ加え、３７℃、５％二酸化炭素の条件で培養した。培養から__＿時間後の各細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定化した。次いで、固定化したＨｅＬａ細胞に抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて、蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図６Ｂに示す。図６Ｂにおいて、「ｎＭａｇ−ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ」とはｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞を意味し、「ｐＭａｇ−ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ」とは、ｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞を意味し、「Ｃａｓ９なし」とは対照群として何も導入していないＨｅＬａ細胞を意味する。また、図６Ｂの各群において、左側は抗Ｈｉｓタグ抗体を用いてｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）又はｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）を検出した画像であり、右側はＰＩを用いて核を染色した画像である。【０１４３】
図６Ｂから、ｎＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞、及びｐＭａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ｓｇＡＡＶＳ１複合体と細胞質とを導入したＨｅＬａ細胞ともに、細胞核内においてシグナルが検出された。
このことから、光誘導系のＣａｓ９は本発明の導入方法を用いて、細胞核内に導入できることが確かめられた。【０１４４】
［試験例５］ラパマイシン誘導型であるスプリット型ＳｐＣａｓ９（ｒｐＣａｓ９）及び細胞質を導入したＨｅＬａ細胞を用いたＴ７Ｅ１アッセイ
（１）Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質の調製
試験例１の（１）と同様の方法を用いて、Ｌ５１７８Ｙ細胞の細胞質を調製した。【０１４５】
（２）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の調製
次いで、「１．Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作製」で得られたｒｐＣａｓ９−Ｎ（ＨｉｓＴａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ）及びｒｐＣａｓ９−Ｃ（ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−Ｈｉｓｔａｇ）とｓｇＡＡＶＳ１との複合体（以下、「ｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体」と称する場合がある。）と、（１）で得られたＬ５１７８Ｙ細胞の細胞質を合計１００μＬとなるように混合し、使用するまで３２℃で保存した。
なお、図７Ａは、ｒｐＣａｓ９−Ｎ（ＨｉｓＴａｇ−ＳｐＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ）及びｒｐＣａｓ９−Ｃ（ＳｐＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−Ｈｉｓｔａｇ）の構成を示す概略図である。
ｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の組成は上記表２と同様である。表２において、ｄＣａｓ９の含有量として記載された５μｇ／１００μＬ中がｒｐＣａｓ９−Ｎ及びｒｐＣａｓ９−Ｃの合計の含有量である。【０１４６】
（３）ＨｅＬａ細胞の穿孔
試験例１の（３）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞の少なくとも一部に孔を形成させた。【０１４７】
（４）ＨｅＬａ細胞へのｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の導入
ｄＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液の代わりに、ｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液を用いた以外は、試験例１の（４）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞へｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質との混合液を導入した。【０１４８】
（５）ＨｅＬａ細胞の再封入
試験例１の（５）と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞を再封入した。次いで、２００ｎＭラパマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳ含有）２ｍＬ加え、３７℃、５％二酸化炭素の条件で、１８時間培養した。【０１４９】
（６）再封入したＨｅＬａ細胞からのゲノム抽出
次いで、１８時間培養後の再封入したＨｅＬａ細胞を用いた以外は試験例２と同様の方法を用いて、ゲノム溶液を調製した。【０１５０】
（７）ＡＡＶＳ１領域のＰＣＲ増幅
次いで、（６）で得られたゲノム溶液を用いて、試験例２の（７）と同様の方法を用いて、ＡＡＶＳ１領域のＣａｓ９の標的配列を含む約１ｋｂｐの産物を作るようにｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。【０１５１】
（８）Ｔ７Ｅ１アッセイ
次いで、試験例２の（７）と同様の方法を用いて、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。結果を図７Ｂに示す。図７Ｂにおいて、「Ｔ７Ｅ１（＋）」はＴ７Ｅ１アッセイを行ったサンプルを意味し、「Ｔ７Ｅ１（−）」はＴ７Ｅ１アッセイを行っていないサンプルを意味する。また、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ  ＋  ｒａｐａｍｙｃｉｎ」はｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質とを導入したリシールＨｅＬａ細胞にラパマイシンを添加して培養したサンプルを意味し、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ×２  ＋  ｒａｐａｍｙｃｉｎ」はＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体形成工程において前記「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ  ＋  ｒａｐａｍｙｃｉｎ」よりもｇＲＮＡの添加量が２倍であるｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）−ｇＲＮＡ複合体と細胞質とを導入したリシールＨｅＬａ細胞にラパマイシンを添加して培養したサンプルを意味する。また、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃａｓ９  −  ｒａｐａｍｙｃｉｎ」はｒｐＣａｓ９（Ｎ）−ｒｐＣａｓ９（Ｃ）のみを導入したリシールＨｅＬａ細胞であって、ラパマイシン未添加で培養したサンプルを意味し、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃａｓ９なし）」は何も導入しせず、ラパマイシン未添加で培養したサンプルを意味する。【０１５２】
図７Ｂから、ラパマイシン未添加で培養したサンプル（ネガディブコントロールも含む）においては、切断が起こらず、切断されたＤＮＡのバンドは見られなかった。一方、ラパマイシンを添加して培養したサンプルでは、切断されたＤＮＡのバンドが検出されており、ｓｇＲＮＡの添加量に依存的に切断されたＤＮＡ量が増加していた。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の製造方法によれば、インビトロで安定して可溶化したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を得ることができる。また、本発明のＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の細胞核内への導入方法によれば、ウイルスベクターを細胞内に導入せず、ゲノム編集の核内ニッチが最適化された状態でＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を細胞核内で導入することができる。また、本発明の細胞内における標的遺伝子の改変方法によれば、オフターゲットが低減され、ウイルスベクターを細胞内に導入する必要なく、ゲノム編集の核内ニッチが最適化され、且つ大量の細胞における複数の遺伝子座を同時に編集することができる。
【符号の説明】
【０１５４】
１…Ｃａｓ９、２…ｇＲＮＡ、１０…Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体、１１…細胞Ｂ、１１ａ…細胞Ｂの細胞質、１２…細胞Ａ、１２ａ…セミインタクト細胞Ａ、１２ｂ…Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体及び細胞Ｂの細胞質が導入されたセミインタクト細胞Ａ、１２ｃ…リシール細胞Ａ
【図１】
2017131150.tif 000007
【図２】
2017131150.tif 000008
【図３】
2017131150.tif 000009
【図４】
2017131150.tif 000010
【図５】
2017131150.tif 000011
【図６Ａ】
2017131150.tif 000012
【図６Ｂ】
2017131150.tif 000013
【図７Ａ】
2017131150.tif 000014
【図７Ｂ】
2017131150.tif 000015
【配列表】
2017131150000001.app
【国際調査報告】
2017131150.tif 000016
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