(57)【要約】  骨髄毒性の臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の血液毒性評価方法、及び評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルの提供。  ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入され、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上であるヒト化された改変型ＮＯＧマウスに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、前記評価対象薬剤を投与した後の前記改変型ＮＯＧマウスの試料について、ヒト由来血球細胞の細胞数を測定し、前記評価対象薬剤に代えて溶媒を投与した対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程とを含む評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
2016194688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入され、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上である、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記改変型ＮＯＧマウスの試料について、ヒト由来血球細胞の細胞数を測定し、前記評価対象薬剤に代えて溶媒を投与した対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項２】
前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスが、改変型ＮＯＧマウスに放射線照射を行ってマウス由来骨髄細胞を排除し、ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞を移植し生着させることにより作製される請求項１に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項３】
前記評価対象薬剤が、前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスの試料に対して投与される請求項１から２のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項４】
前記ヒト由来血球細胞が、白血球、顆粒球、赤血球及び血小板の少なくともいずれかであり、
前記評価対象薬剤に血液毒性があるとの評価が、白血球減少、顆粒球減少、赤血球減少、血小板減少、白血球増加及び汎血球減少の少なくともいずれかに基づいて行われる請求項１から３のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項５】
前記ヒト由来血球細胞がヒト由来顆粒球であり、かつ前記評価対象薬剤に血液毒性があるとの評価が顆粒球減少に基づいて行われる請求項１から４のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項６】
前記評価対象薬剤が、抗がん剤である請求項１から５のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項７】
前記抗がん剤が、殺細胞型抗がん剤である請求項６に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項８】
前記殺細胞型抗がん剤が、カンプトテシン類縁体、カンプトテシン類縁体を内包する複合体、パクリタキセル類縁体、パクリタキセルを内包する複合体、及びプラチナ錯体誘導体の少なくともいずれかである請求項７に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項９】
前記殺細胞型抗がん剤が、イリノテカン、ノギテカン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、パクリタキセル、及びオキサリプラチンの少なくともいずれかである請求項７に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項１０】
前記対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した後に、前記評価対象薬剤の投与前の細胞数に回復する期間を測定し、前記期間に基づいて回復性を評価する工程を更に含む請求項１から９のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項１１】
前記ヒト由来血球細胞の細胞数と、前記マウス由来血球細胞の細胞数とを測定し、前記評価対象薬剤に代えて前記溶媒を投与した前記対照と比較して前記マウス由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程と、
前記ヒト由来血球細胞の評価結果と前記マウス由来血球細胞の評価結果とに基づいて、前記評価対象薬剤の血液毒性の種差を評価する工程とを更に含む請求項１から１０のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法。
【請求項１２】
ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入され、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上である、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスからなることを特徴とする評価対象薬剤の血液毒性評価用モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価対象薬剤の血液毒性評価方法、及び評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄障害に起因して発現する白血球減少などの血液毒性は、抗がん剤の主要な副作用であり（非特許文献１参照）、多くの抗がん剤において、投与量制限因子（ＤＬＦ）となっている。医薬開発の研究段階では、実験動物の末梢血を用いた血液学的検査により血液毒性の評価を行っている。しかし、前記実験動物を用いた抗がん剤の血液毒性の評価実験では、前記骨髄障害の程度が前記実験動物とヒトとでは異なる場合があり、臨床予見性に乏しい。特に、齧歯類を用いた実験においては、反応性や前記骨髄障害からの回復期間が前記ヒトの臨床知見とは異なる。この差異の要因として、主に前記ヒトと前記実験動物とでは、前記抗がん剤に対する骨髄細胞の感受性や細胞増殖時間が相違することなどが挙げられる。また、前記抗がん剤の造血系細胞の分化増殖能への影響を調べるため、コロニー形成試験やＡＴＰアッセイを行うこともあるが、これらｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、前記抗がん剤が体内で代謝を受けることによって効果を発現する場合、評価が困難であることに加え、回復性の推移についての検討も困難である。【０００３】
これまでの動物実験では、前記骨髄障害を引き起こす骨髄毒性についての臨床予見性が低く、前記動物実験での投与量から前記ヒトの臨床における投与量の推定が困難であった。したがって、骨髄毒性の臨床予見性の高い評価方法はこれまで報告されていない。【０００４】
また、重度免疫不全マウスであるＮＯＧマウス（特許文献１及び非特許文献２参照）にＸ線を全身照射し、骨髄を破壊した後、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスが報告されている（非特許文献３参照）。【０００５】
また、前記ＮＯＧマウスにＸ線を全身照射し、骨髄を破壊した後、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスと、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス骨髄由来のＬｉｎｅａｇｅ−細胞を移植したマウスとにおいて、ベンゼンによる血液毒性を評価したことが報告されている（非特許文献４及び非特許文献５参照）。【０００６】
しかしながら、ヒト化された前記ＮＯＧマウスにおいて、全ての組織由来の血球細胞中にヒト白血球系前駆細胞及びヒト白血球系成熟細胞が確認されているものの、骨髄球系細胞の分化は十分ではなく、特に、顆粒球の分化がほとんど認められない。したがって、ＮＯＧマウスを用いた場合であっても、骨髄毒性の臨床予見性の高い、評価対象薬剤の血液毒性評価を行うことは困難であり、評価対象薬剤の血液毒性評価に適したモデル動物は、未だ存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３７５３３２１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日薬理誌１３２、ｐ．３４３〜３４６（２００８）
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ  １００，ｐ．３１７５〜３１８２（２００２）
【非特許文献３】電力中央研究所報告  研究報告：Ｖ０９０１１、平成２２年４月
【非特許文献４】電力中央研究所報告  研究報告：Ｖ１１０６３、平成２５年１月
【非特許文献５】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（１２）：ｅ５０４４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、骨髄毒性の臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の血液毒性評価方法、及び評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を解決すべく、鋭意検討した結果、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスを用いて、評価対象薬剤によるヒトの血液毒性を評価できることを見出し、本発明の完成に至った。【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入され、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上である、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記改変型ＮＯＧマウスの試料について、ヒト由来血球細胞の細胞数を測定し、前記評価対象薬剤に代えて溶媒を投与した対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜２＞  前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスが、改変型ＮＯＧマウスに放射線照射を行ってマウス由来骨髄細胞を排除し、ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞を移植し生着させることにより作製される前記＜１＞に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜３＞  前記評価対象薬剤が、前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスの試料に対して投与される前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜４＞  前記ヒト由来血球細胞が、白血球、顆粒球、赤血球及び血小板の少なくともいずれかであり、
前記評価対象薬剤に血液毒性があるとの評価が、白血球減少、顆粒球減少、赤血球減少、血小板減少、白血球増加及び汎血球減少の少なくともいずれかに基づいて行われる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜５＞  前記ヒト由来血球細胞がヒト由来顆粒球であり、かつ前記評価対象薬剤に血液毒性があるとの評価が顆粒球減少に基づいて行われる前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜６＞  前記評価対象薬剤が、抗がん剤である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜７＞  前記抗がん剤が、殺細胞型抗がん剤である前記＜６＞に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜８＞  前記殺細胞型抗がん剤が、カンプトテシン類縁体、カンプトテシン類縁体を内包する複合体、パクリタキセル類縁体、パクリタキセルを内包する複合体、及びプラチナ錯体誘導体の少なくともいずれかである前記＜７＞に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜９＞  前記殺細胞型抗がん剤が、イリノテカン、ノギテカン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、パクリタキセル、及びオキサリプラチンの少なくともいずれかである前記＜７＞に記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜１０＞  前記対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した後に、前記評価対象薬剤の投与前の細胞数に回復する期間を測定し、前記期間に基づいて回復性を評価する工程を更に含む前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜１１＞  前記ヒト由来血球細胞の細胞数と、前記マウス由来血球細胞の細胞数とを測定し、前記評価対象薬剤に代えて前記溶媒を投与した前記対照と比較して前記マウス由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程と、
前記ヒト由来血球細胞の評価結果と前記マウス由来血球細胞の評価結果とに基づいて、前記評価対象薬剤の血液毒性の種差を評価する工程とを更に含む前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の血液毒性評価方法である。
＜１２＞  ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入され、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上である、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスからなることを特徴とする評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、骨髄毒性の臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の血液毒性評価方法、及び評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ノギテカンの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。
【図２】図２は、ノギテカンの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。
【図３】図３は、ノギテカンの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）数の推移を示すグラフである。
【図４】図４は、ノギテカンの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（Ｇｒ−１＋）数の推移を示すグラフである。
【図５】図５は、パクリタキセルの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）の推移を示すグラフである。
【図６】図６は、パクリタキセルの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。
【図７】図７は、パクリタキセルの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）の推移を示すグラフである。
【図８】図８は、パクリタキセルの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（Ｇｒ−１＋）数の推移を示すグラフである。
【図９】図９は、パクリタキセルの血液毒性評価における、コントロール群のヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数及びマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の割合の推移を示すグラフである。
【図１０】図１０は、パクリタキセルの血液毒性評価における、パクリタキセル投与群のヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数及びマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の割合の推移を示すグラフである。
【図１１】図１１は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）の推移を示すグラフである。
【図１２】図１２は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。
【図１３】図１３は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）数の推移を示すグラフである。
【図１４】図１４は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（Ｇｒ−１＋）数の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（評価対象薬剤の血液毒性評価方法）
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法は、薬剤投与工程と、評価工程とを含み、更に必要に応じて、回復性評価工程、種差評価工程などのその他の工程を含む。
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの血液毒性評価方法であってもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血液毒性評価方法であってもよい。
【００１５】
＜薬剤投与工程＞
前記薬剤投与工程は、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスに対し、評価対象薬剤を投与する工程である。
【００１６】
−ヒト化された改変型ＮＯＧマウス（評価対象薬剤の血液毒性評価用モデル）−
前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスは、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上である、改変型ＮＯＧマウスである。
ここで、「ヒト化」とは、前記血液中にヒト由来の血液細胞が導入されたことを意味する。
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルは、前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスからなる評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルである。
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価用モデル動物は、本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法に好適に用いることができる。
【００１７】
−−改変型ＮＯＧマウス（Ｔｇ−ＮＯＧマウス）−−
前記改変型ＮＯＧマウス（以下、「Ｔｇ−ＮＯＧマウス」と称することがある。）とは、ＮＯＧマウスにヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入されたトランスジェニックＮＯＧマウス（Ｔｇ−ＮＯＧマウス）であり、より詳細には、前記ＮＯＧマウスに、ヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３遺伝子が導入されたＣ５７ＢＬ／６系統のトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｇマウス）を戻し交配させて得られ、全身的にヒトＧＭ−ＣＳＦ及びヒトＩＬ−３を産生する、改変型のＮＯＧマウスである。
前記改変型ＮＯＧマウスは、公益財団法人実験動物中央研究所において確立され、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１９１：２８９０−２８９９に記載された複合型免疫不全マウスである。前記改変型ＮＯＧマウスは、正式名「ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ  Ｔｇ（ＳＶ４０−ＣＳＦ２，ＩＬ３）１０−７  Ｊｉｃ／Ｊｉｃ」、簡略名「ＮＯＧ−ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３−Ｔｇ」であり、公益財団法人実験動物中央研究所より入手することができる。
【００１８】
−−−ＮＯＧマウス−−−
前記ＮＯＧマウスとは、公益財団法人実験動物中央研究所において確立され、Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００，３１７５−３１８２及び特許第３７５３３２１号公報に記載された複合型免疫不全マウスである。前記ＮＯＧマウスは、正式名「ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／Ｊｉｃ」、簡略名「ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ」であり、公益財団法人実験動物中央研究所より入手することができる。
【００１９】
前記ＮＯＧマウスは、免疫不全ＳＣＩＤマウスを改良したＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスと、数種のサイトカインレセプター共通ドメインであるＩＬ−２レセプターγ鎖ノックアウト（ＩＬ２ＲγＫＯ）マウスとを交配して得られた遺伝子改変マウスであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が欠失する複合型免疫不全マウスである。
前記ＮＯＧマウスは、従来の免疫不全マウスと比較して優れた異種細胞生着性を有しており、例えば、ヒト造血幹細胞を移入した場合、高いヒト白血球の分化を示し、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスでは見られなかったヒトＴリンパ球の分化が認められる。ただし、前記ＮＯＧマウスにおいて、骨髄球系細胞の分化は十分ではなく、特に、顆粒球の分化効率は極めて低い。
【００２０】
これに対して、前記改変型ＮＯＧマウスでは、ヒト造血幹細胞を移入した（ヒト化した）場合、前記ＮＯＧマウスと比較してヒト骨髄球系細胞の分化効率が上昇し、これまで見られなかったヒト顆粒球の分化が認められるなど極めて有用なヒト血球細胞の分化を示す。これらの知見に基づき、本発明者らは、前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスが、血液毒性の評価（特に、顆粒球減少の評価）に適することを見出した。
【００２１】
前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスは、前記改変型ＮＯＧマウスに放射線照射を行ってマウス由来骨髄細胞を排除し、ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞を移植し生着させることにより作製することができる。
【００２２】
前記放射線としては、例えば、Ｘ線、ガンマ線などが挙げられる。
前記照射の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
照射される前記放射線としては、前記Ｘ線の吸収線量で２．０Ｇｙ〜３．０Ｇｙが好ましい。前記放射線照射の照射回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記放射線照射の後、前記改変型ＮＯＧマウスに由来する骨髄細胞が排除されたことを確認してもよい。
前記改変型ＮＯＧマウスに由来する骨髄細胞が排除されたことは、例えば、以下の方法により確認することができる。
前記放射線照射の後（例えば、直後〜３日後）、前記改変型ＮＯＧマウスをイソフルラン麻酔下で腹大動脈から脱血安楽死処置後、大腿骨を採取する。大腿骨からイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）を用いて洗い出し、細胞懸濁液を調製する。ナイロンフィルターを通した濾液を骨髄細胞液として得る。血球自動分析装置などで骨髄細胞液中の総白血球数などを計測し、表面抗原マーカーを指標とした蛍光フローサイトメトリー（ＦＣＭ）測定によりにより得られる比率から、前記骨髄細胞液中のマウス由来の骨髄細胞（例えば、マウス由来ｍＣＤ１１ｂ＋細胞など）の細胞数を算出する。
【００２３】
造血幹細胞である前記ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞が前記改変型ＮＯＧマウスに移植され、生着すると、前記ｈＣＤ３４＋細胞から分化したヒト由来血球細胞（例えば、ヒト由来白血球ｈＣＤ４５＋細胞、ヒト由来顆粒球ｈＣＤ６６ｂ＋細胞など）が血液中に現れる。
【００２４】
前記ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞の移植方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
移植される前記ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋細胞であることが好ましい。前記ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋細胞としては、市販品であってもよく、健常人の臍帯血より分離したものであってもよい。
【００２５】
前記ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞の移植数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１×１０４（ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙ）〜１×１０６（ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙ）が好ましい。
【００２６】
前記ヒト由来血球細胞の生着を確認する方法としては、例えば、以下の方法により行うことができる。
前記ヒト由来ｈＣＤ３４＋細胞の移植後（５週間後〜７週間後）に、前記改変型ＮＯＧマウスの血液を眼窩静脈叢より採取する。血球自動分析装置などで血液中の総白血球数などを計測し、表面抗原マーカーを指標とした蛍光フローサイトメトリー（ＦＣＭ）測定によりにより得られる比率から、前記血液中のヒト由来血球細胞（例えば、ヒト由来白血球ｈＣＤ４５＋細胞）及びマウス由来血球細胞（例えば、マウス由来白血球ｍＣＤ４５＋細胞）の細胞数を算出する。
マウス由来白血球ｍＣＤ４５＋細胞及びヒト由来白血球ｈＣＤ４５＋細胞の比率を算出し、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％以上であれば、ヒト由来血球細胞が生着し、前記改変型ＮＯＧマウスがヒト化されたと判断する。
なお、前記ヒト由来血球細胞の生着の確認は、前記評価対象薬剤の投与前における、ヒト由来血球細胞の細胞数の測定と同時に行ってもよい。
一方、血液中の白血球におけるヒト由来白血球の含有量が２０個数％未満である場合には、ヒト由来顆粒球の出現数が少なすぎ（顆粒球は白血球のうちの５個数％程度）、高いヒト化効率を有する本発明のヒト化された改変型ＮＯＧマウスの特性として不十分である点で、血液毒性の評価に適さない。
【００２７】
−評価対象薬剤−
前記評価対象薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗がん剤、抗菌薬、抗痙攣薬、抗甲状腺薬などが挙げられる。これらの中でも、抗がん剤が好ましい。また、前記評価対象薬剤は、治療薬、被検薬、及び医薬品候補となる試験化合物のいずれであってもよいし、天然化合物及び合成化合物のいずれであってもよい。
【００２８】
−−抗がん剤−−
前記抗がん剤とは、がんの増殖を抑えることを目的とした薬剤を意味し、例えば、分子標的薬、殺細胞型抗がん剤などが挙げられる。
ここで、「がん」とは、上皮組織由来の悪性腫瘍である癌腫；非上皮組織由来の悪性腫瘍である肉腫；血液悪性腫瘍（白血病など）を含む、広義の悪性腫瘍を意味する。
【００２９】
−−−分子標的薬−−−
前記分子標的薬とは、がん細胞に特異的に発現する分子（タンパク質、遺伝子など）を標的として作用する薬剤であり、作用メカニズムの観点から、例えば、がん細胞の増殖因子のシグナル伝達を阻害する抗がん剤、がん細胞に発現しているがん細胞の増殖に関するタンパク質等の機能を阻害する抗がん剤、免疫システムを介してがん細胞の増殖を抑制する抗がん剤などが挙げられる。
前記分子標的薬としては、例えば、低分子阻害薬、抗体医薬などが挙げられる。
前記低分子阻害薬としては、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒａｆキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害薬、ヤヌスキナーゼ阻害薬などが挙げられる。
前記抗体医薬としては、例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ヒトＩＬ−６受容体抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＤ５２抗体などが挙げられる。
【００３０】
−−−殺細胞型抗がん剤−−−
前記殺細胞型抗がん剤とは、ＤＮＡ合成や細胞分裂を阻害することによりがん細胞を死滅させる抗がん剤をいう。
前記殺細胞型抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗菌剤、プラチナ錯体誘導体などが挙げられる。これらの中でも、トポイソメラーゼ阻害剤、及びプラチナ錯体誘導体が好ましい。
【００３１】
前記アルキル化剤としては、例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチンなどが挙げられる。
【００３２】
前記代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサートなどが挙げられる。
【００３３】
前記トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、カンプトテシン及びその類縁体、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシンなどが挙げられる。これらの中でも、カンプトテシン及びその類縁体が好ましい。
前記カンプトテシン類縁体としては、例えば、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン（トポテカン）、ＤＢ６７、ＢＮＰ１３５０、エキサテカン、ルートテカン、ＳＴ１４８１、ＣＫＤ６０２、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）、及びこれらの薬理学的に許容される塩などが挙げられる。
これらの中でも、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン（トポテカン）、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）が好ましい。
【００３４】
また、前記カンプトテシン類縁体は、前記カンプトテシン及びカンプトテシン類縁体のいずれかを内包する複合体の形態であってもよい。
前記複合体としては、例えば、カンプトテシン類縁体をリポソーム内に封入したもの、カンプトテシン類縁体とリン脂質との複合体、カンプトテシン類縁体をポリマーミセル内に封入したもの、カンプトテシン類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものなどが挙げられる。
前記カンプトテシン類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表されるカンプトテシン類縁体の高分子誘導体が挙げられる。
【００３５】
【化１】
2016194688.tif 000003
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔは５〜１１，５００の整数を示し、Ａは結合基を示し、ｄ、ｅ及びｆは整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆは３〜２００の整数を示し、Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は置換基を有していてもよいシリル基を示し、Ｒ３は水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ４は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基を示し、Ｐは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基を示す。
【００３６】
前記有糸分裂阻害剤としては、例えば、パクリタキセル及びその類縁体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなどが挙げられる。これらの中でも、前記パクリタキセル及びその類縁体が好ましい。
前記パクリタキセル及びその類縁体は、タキサン系の構造を有する化合物であり、例えば、パクリタキセル（ＣＡＳ  Ｎｏ．３３０６９−６２−４）、７α‐グルコシルオキシアセチルパクリタキセル、ドセタキセル、及びこれらの薬理学的に許容される塩などが挙げられる。
【００３７】
また、前記パクリタキセル類縁体は、前記パクリタキセル及びパクリタキセル類縁体のいずれかを内包する複合体の形態であってもよい。
前記複合体としては、例えば、パクリタキセル類縁体をアルブミンと結合させたもの、パクリタキセル類縁体をリポソーム内に封入したもの、パクリタキセル類縁体とリン脂質との複合体、パクリタキセル類縁体をポリマーミセル内に封入したもの、パクリタキセル類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものなどが挙げられる。
前記パクリタキセル類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものとしては、例えば、パクリタキセル類縁体を下記一般式（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーで封入したものなどが挙げられる。
【００３８】
【化２】
2016194688.tif 000004
前記一般式（ＩＩ）中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ５）アルキレン基を示し、Ｒ３はメチレン基又はエチレン基を示し、Ｒ４は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ５は水酸基、置換基を有していてもよいアリール（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ基、又は−Ｎ（Ｒ６）−ＣＯ−ＮＨＲ７を示し、Ｒ６及びＲ７は互いに同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ６）環状アルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル基を示し、ｎ、ｍ、ｘ及びｙは整数を示し、ｎは５〜１，０００、ｍは２〜３００、ｘは０〜３００、ｙは０〜３００を示す。ただし、ｘとｙの和は１以上で且つｍより大きくないものとし、Ｒ５が水酸基である割合がｍの０％〜８８％であり、置換基を有していてもよいアリール（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ基である割合がｍの１％〜８９％であり、−Ｎ（Ｒ６）−ＣＯ−ＮＨＲ７である割合がｍの１１％〜３０％である。
【００３９】
前記抗腫瘍性抗菌剤としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、アドリアマイシン、ドキソルビシンなどが挙げられる。
【００４０】
前記プラチナ錯体誘導体としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどが挙げられる。これらの中でも、前記オキサリプラチンが好ましい。
【００４１】
本発明が、ｉｎ  ｖｉｖｏの血液毒性評価方法の場合には、前記改変型ＮＯＧマウスに前記評価対象薬剤を投与すればよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血液毒性評価方法の場合には、前記改変型ＮＯＧマウスの試料に前記評価対象薬剤を投与すればよい。
前記試料としては、前記改変型ＮＯＧマウスに由来する試料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨髄細胞、血液細胞、脾細胞、肝細胞などが挙げられる。これらの中でも、骨髄細胞、血液細胞が好ましい。
【００４２】
前記骨髄細胞は、例えば、以下の方法により調製することができる。
前記ヒト化された改変型ＮＯＧマウスを、イソフルラン麻酔下で腹大動脈から脱血安楽死処置後、大腿骨を採取する。大腿骨から無菌的にイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）を用いて洗い出し、細胞懸濁液を調製する。ナイロンフィルター（例えば、３５μｍ径、セルストレイナー、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通した濾液を、骨髄細胞を含む試料として得る。
【００４３】
前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
例えば、ノギテカンを評価する場合は、３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、３０ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与が好ましく、パクリタキセルを評価する場合は、２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、７０ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与が好ましく、オキサリプラチンを評価する場合は、２．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、２０ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与が好ましい。
或いは、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、評価しようとする投与経路、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。これにより、各々の薬剤について、適した（例えば、血液毒性の少ない、回復性に優れる等の）投与条件を評価し選定することが可能となる。
本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血液毒性評価方法の場合には、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の各種条件を選択することができ、例えば、前記評価対象薬剤を含む培地を前記改変型ＮＯＧマウスの試料に投与すればよい。
【００４４】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記評価対象薬剤を投与した後の前記改変型ＮＯＧマウスの試料について、ヒト由来血球細胞の細胞数を測定し、対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程である。
【００４５】
−試料−
前記試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血液、骨髄細胞、脾細胞、肝細胞などが挙げられる。これらの中でも、血液が好ましい。
前記血液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静脈血、末梢血などが挙げられる。これらの中でも、被験体である前記改変型ＮＯＧマウスに対する負担が低く、採取が容易である点で、末梢血が好ましい。
【００４６】
−ヒト由来血球細胞−
前記ヒト由来血球細胞は、白血球、顆粒球、赤血球及び血小板の少なくともいずれかであることが好ましい。
前記ヒト由来白血球としては、例えば、顆粒球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞などが挙げられる。これらの中でも、従来の実験マウスでは見られなかったヒト由来顆粒球の分化が前記改変型ＮＯＧマウスにおいて初めて認められ、よって評価が可能となった点で、ヒト由来顆粒球が好ましい。
【００４７】
なお、本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血液毒性評価方法の場合には、前記評価対象薬剤を投与した後の前記改変型ＮＯＧマウス由来の試料について、ヒト由来血球細胞の細胞数を測定すればよい。
【００４８】
前記ヒト由来血球細胞の細胞数と、前記マウス由来血球細胞の細胞数とを測定することが好ましい。
【００４９】
前記測定は、投与後の特定の時間経過後の測定点１点で行ってもよいが、所定のスケジュールで経時的に（複数の測定点で）行うことが好ましい。言い換えると、前記測定工程は、投与後の前記改変型ＮＯＧマウスの試料を経時的に採取し、前記試料中のヒト由来血球細胞の細胞数を経時的に測定することが好ましい。
前記経時的な測定のスケジュールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、投与後４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目及び４２日目のスケジュールなどが挙げられる。
【００５０】
前記試料中のヒト由来血球細胞の細胞数を測定する方法としては、例えば、投与後の特定時間経過後、前記改変型ＮＯＧマウスの血液を眼窩静脈叢より採取し、血球自動分析装置などで血液中の総白血球数などを計測し、ヒトに特異的な表面抗原マーカーを指標とした蛍光フローサイトメトリー（ＦＣＭ）測定により得られる比率から、前記血液内のヒト由来血球細胞の細胞数を算出することにより測定することができる。
前記マウス由来血球細胞の細胞数についても、マウスに特異的な表面抗原マーカーを用いて同様に測定できる。
【００５１】
前記表面抗原マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて公知の血球細胞の検出に用いるものを適宜選択することができ、例えば、以下の通りである。
前記白血球全体に関連する表面抗原マーカー：ＣＤ４５等
前記顆粒球に関連する表面抗原マーカー：ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１６、Ｇｒ−１等
前記Ｂ細胞に関連する表面抗原マーカー：ＣＤ１９等
前記Ｔ細胞に関連する表面抗原マーカー：ＣＤ３等
【００５２】
白血球は、以下の表面抗原マーカーを指標に分類し、比率を算出することにより、ヒト由来白血球及びマウス由来白血球を区別して検出することができる。
・ヒト由来血球細胞：ｈＣＤ４５＋細胞（ヒト白血球）、ｈＣＤ６６ｂ＋細胞（ヒト顆粒球）、ｈＣＤ６６ｂ＋ｈＣＤ１６＋細胞（ヒト好中球）、ｈＣＤ１９＋細胞（ヒトＢ細胞）
・マウス由来血球細胞：ｍＣＤ４５＋細胞（マウス白血球）、ｍＧｒ−１＋細胞（マウス顆粒球）
【００５３】
また、血球自動分析装置（例えば、ＸＴ−２０００ｉＶ、シスメックス株式会社）などで血液中の総白血球数を計数し、蛍光フローサイトメトリー（ＦＣＭ）から得られる比率から各血球細胞の細胞数を算出する。
前記蛍光フローサイトメトリー（ＦＣＭ）測定としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の装置を適宜選択することができ、例えば、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）等のＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置などが挙げられる。
【００５４】
赤血球は、以下の表面抗原マーカーを指標に分類し、比率を算出することにより、ヒト由来赤血球及びマウス由来赤血球を区別して検出することができる。
・ヒト由来血球細胞：ｈＣＤ２３５ａ＋細胞（ヒト赤血球）
・マウス由来血球細胞：ｍＴＥＲ１１９＋細胞（マウス赤血球）
【００５５】
血小板は、以下の表面抗原マーカーを指標に分類し、比率を算出することにより、ヒト由来血小板及びマウス由来血小板を区別して検出することができる。
・ヒト由来血小板：ｈＣＤ４１ａ＋細胞（ヒト血小板）
・マウス由来血小板：ｍＣＤ４１＋細胞（マウス血小板）
【００５６】
−対照−
前記対照とは、前記評価対象薬剤に代えて、薬剤に用いた溶媒のみを投与したこと以外は、前記改変型ＮＯＧマウスと同様に処理した対照マウスである。
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの血液毒性評価方法の場合、前記対照とは、前記薬剤に代えて、薬剤に用いた溶媒のみを投与したこと以外は、前記改変型ＮＯＧマウスの試料と同様に処理した対照試料である。
前記溶媒としては、前記評価対象薬剤を溶解することができ、医薬的に許容されるものであれば、特に制限はなく、使用する前記評価対象薬剤に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩液、５ｗ／ｖ％グルコース溶液、５ｖ／ｖ％エタノール／５ｖ／ｖ％クレモホール含有生理食塩液などが挙げられる。
【００５７】
−血液毒性の評価−
前記評価対象薬剤に血液毒性があるとの評価は、白血球減少、顆粒球減少、赤血球減少、血小板減少、白血球増加及び汎血球減少の少なくともいずれかに基づいて行われることが好ましい。
【００５８】
前記変化とは、対照に対し、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）増加又は減少することである。
前記変化の程度としては、特に制限はなく、目的とする薬剤、血液毒性、投与条件などに応じて適宜選択することができ、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上などが挙げられる。
また、血液毒性の有無（定性的な評価）に加え、複数の測定点（例えば、投与後の経過日、薬剤、投与量などが異なる測定点）における変化の程度を比較することにより、血液毒性の強弱の比較等の定量的な評価を行うことができる。
【００５９】
−−白血球減少−−
前記対照と比較して、前記白血球の細胞数が、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）減少した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
【００６０】
−−顆粒球減少−−
前記対照と比較して、前記顆粒球の細胞数が、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）減少した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
従来の実験マウスでは見られなかったヒト由来顆粒球の分化が前記改変型ＮＯＧマウスにおいて初めて認められ、よって評価が可能となった点で、ヒト由来血球細胞がヒト由来顆粒球であり、かつ血液毒性が顆粒球減少であることが好ましい。
【００６１】
−−赤血球減少−−
前記対照と比較して、前記赤血球の細胞数が、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）減少した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
【００６２】
−−血小板減少−−
前記対照と比較して、前記血小板の細胞数が、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）減少した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
【００６３】
−−白血球増加−−
前記対照と比較して、前記白血球の細胞数が、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）増加した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
前記白血球増加は、白血球異常増殖などの骨髄異常増殖と密接に関連する。
【００６４】
−−汎血球減少−−
前記対照と比較して、前記白血球、前記赤血球及び前記血小板の細胞数がそれぞれ、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）減少した場合に、前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する。
【００６５】
また、ヒト由来血球細胞の評価を行う前記評価工程に加えて、マウス由来血球細胞の評価を行うことが好ましい。すなわち、対照と比較して前記マウス由来血球細胞の細胞数が変化した場合に、前記前記評価対象薬剤に血液毒性があると評価する工程を更に含むことが好ましい。
【００６６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、例えば、回復性評価工程、種差評価工程などが挙げられる。
【００６７】
＜＜回復性評価工程＞＞
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法は、回復性評価工程を更に含むことが好ましい。
前記回復性評価工程は、前記対照と比較して前記ヒト由来血球細胞の細胞数が変化した後に、前記評価対象薬剤の投与前の細胞数に回復する期間を測定し、前記期間に基づいて回復性を評価する工程である。
これにより、血液毒性からの回復の程度も予測することができ、ヒトの臨床における薬剤の用量反応性や薬剤の適切な投与間隔を推定することができるため、抗がん剤を投与されるヒトの身体的負担を減少させる他、投与計画の立案が容易である。
【００６８】
ここで、「投与前の細胞数に回復する」とは、投与前のヒト由来血球細胞の細胞数に対する変化の程度が、統計的に有意（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）ではないことを意味する。
【００６９】
＜＜種差評価工程＞＞
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法は、種差評価工程を更に含むことが好ましい。
前記種差評価工程は、前記ヒト由来血球細胞の評価結果と前記マウス由来血球細胞の評価結果とに基づいて、血液毒性の種差を評価する工程である。
これにより、血液毒性の種差が評価できるため、前記改変型ＮＯＧマウスとは異なるマウスを用いた既存の血液毒性評価結果では得ることができないヒトの評価結果を推測することができる。
【００７０】
前記「種差」があるとは、同一測定点において、対照に対する前記ヒト由来血球細胞の変化の程度と対照に対する前記マウス由来血球細胞の変化の程度とが、統計的に有意に（例えば、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）、相違することである。
前記変化の程度としては、特に制限はなく、目的とする薬剤、血液毒性、投与条件などに応じて適宜選択することができ、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上などが挙げられる。
また、血液毒性の有無（定性的な評価）に加え、複数の測定点（例えば、投与後の経過日、薬剤、投与量などが異なる測定点）における変化の程度を比較することにより、定量的な評価を行うことができる。
【００７１】
本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法によれば、ヒトの骨髄毒性の臨床予見性に優れた、血液毒性評価方法を提供することができる。特に、ヒトの顆粒球減少症の臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の血液毒性評価方法を提供することができる。本発明の評価対象薬剤の血液毒性評価方法によれば、齧歯類で血液毒性評価を行うことができるため、類人猿を用いる評価実験を大幅に減少させることができる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系では不可能である、体内で代謝を受けて初めて効果を発現する抗がん剤等の薬剤の血液毒性評価を行うことができる。また、ヒトの臨床予見性に優れた本発明を用いることにより、ヒトへの薬剤の投与量の設定をもって行うことができ、血液毒性の発生を抑制する投与条件を選定することができる。本発明は、薬剤の投与条件（投与経路、投与量、投与スケジュール等）の検証や、経時的な変動プロファイルの分析を行うことができるため、ヒトの臨床における薬剤の用量反応性や薬剤の適切な投与間隔を推定することができる。また、血液毒性からの回復の程度も予測することができる。このため、薬剤を投与されるヒトの身体的負担を減少させる他、投与計画の立案が容易である。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。【００７３】
実施例で用いたマウス等の詳細は、以下のとおりである。
（マウス）
「Ｔｇ−ＮＯＧマウス」：公益財団法人実験動物中央研究所作製
・性別：雌雄
・購入時の週齢：１０週齢〜１８週齢
・Ｘ線照射時の週齢：６週齢〜１０週齢
・ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞移植時の週齢：６週齢〜１０週齢
・「殺細胞型抗がん剤」投与開始時の週齢：１０週齢〜１８週齢
（機器）
・Ｘ線照射装置：ＭＢＲ−１５０５Ｒ（株式会社日立メディコ製）
・ＦＡＣＳ：ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）
・血球分析装置：ＸＴ−２０００ｉＶ（シスメックス株式会社製）
（試薬）
・ノギテカン：Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（シグマアルドリッチジャパン製）、生理食塩液で濃度３ｍｇ／ｍＬに溶解した。
・パクリタキセル（ＰＴＸ）：ＩＮＤＥＮＡ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ａ社製、無水エタノール及びクレモホールＥＬの等量混合液で３５ｍｇ／ｍＬに溶解した。投与直前に生理食塩液で１０倍希釈した。
・オキサリプラチン：オキサリプラチン（ＮＫ）、日本化薬株式会社製、５ｗ／ｖ％グルコース水溶液で２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、及び４ｍｇ／ｍＬに希釈した。
・７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＥＨＣ）：東京化成株式会社製
・抗ｈＣＤ４５抗体、抗ｈＣＤ６６ｂ抗体、抗ｈＣＤ１６抗体、抗ｈＣＤ１９抗体、抗ｈＣＤ３抗体、抗ｍＣＤ４５抗体、抗ｍＧｒ−１抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製
・５ｗ／ｖ％グルコース水溶液：日本薬局方  ブドウ糖注射液（大塚糖液５％）、株式会社大塚製薬工場製
（細胞）
・ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞：凍結ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞（単一ドナー）、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｖｉａｌ、ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＬＬＣより購入【００７４】
実施例１  ノギテカンの血液毒性評価
１７週齢のＴｇ−ＮＯＧマウス（雄１６匹、雌２匹）に２．５ＧｙのＸ線を照射した後、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙ移植した。移植後７週間目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の生着を確認した。結果を表１に示す。【００７５】
【表１】
2016194688.tif 000005
【００７６】
評価に適したマウス１２匹を選択し、１群６匹として、２群に分け、一方に５ｗ／ｖ％グルコース溶液を、他方にノギテカン３０ｍｇ／ｋｇ（３ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈より単回静脈内投与した。動物の割付は、ヒト白血球数及びヒト顆粒球数の平均値がほぼ均一になるように群分けを行った。【００７７】
投与日、投与後３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の白血球（ＷＢＣ）数をＦＡＣＳで計測した。図１〜図４に結果を示す。【００７８】
図１は、ノギテカンの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。図２は、ノギテカンの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。図３は、ノギテカンの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６ｂ＋）数の推移を示すグラフである。図４は、ノギテカンの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）数の推移を示すグラフである。図１〜図４において、―○―はコントロール群（５ｗ／ｖ％グルコース投与群）、―●―はノギテカン３０ｍｇ／ｋｇ群を示す。【００７９】
Ｔｇ−ＮＯＧマウスにおいて、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）及びマウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）数がノギテカンの投与後３日目〜５日目に最低値を示したが、７日目には回復に転じた。減少の程度は投与前値の約５０％程度であった。【００８０】
Ｔｇ−ＮＯＧマウスにおいて、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６ｂ＋）はノギテカンの投与後７日目〜１０日目にかけて著減し、顆粒球数は投与後２８日目でも回復傾向は見られなかった。このことから、ヒトではノギテカン３０ｍｇ／ｋｇは、顆粒球減少症を引き起こす可能性が高いことがわかる。
ヒト及びマウス白血球の変動を分別測定することによって、ノギテカン投与後の白血球減少に及ぼす影響はマウスよりヒトで強く発現することが示され、血液毒性の種差を確認することが可能であることが分かる。【００８１】
実施例２−１  ＰＴＸの血液毒性評価
９週齢のＴｇ−ＮＯＧマウス（雌３５匹）に２．５ＧｙのＸ線を照射し、３時間〜５時間後に、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙ移植した。移植後５週間目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の生着を確認した。結果を表２に示す。【００８２】
【表２】
2016194688.tif 000006
【００８３】
評価に適したマウス９匹を選択し、コントロール群５匹、ＰＴＸ投与群４匹に分け、コントロール群にＰＴＸの溶媒溶液（５ｖ／ｖ％エタノール／５ｖ／ｖ％クレモホール含有生理食塩液）を、ＰＴＸ投与群にＰＴＸ７０ｍｇ／ｋｇ（３．５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＬ／ｋｇ）を、尾静脈内より単回静脈内投与した。動物の割付は、ヒト白血球数及びヒト顆粒球数の平均値がほぼ均一になるように群分けを行った。【００８４】
投与後４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、及び４２日目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の白血球数をＦＡＣＳで計測した。図５〜図１０に結果を示す。【００８５】
図５は、パクリタキセルの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）の推移を示すグラフである。図６は、パクリタキセルの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。図７は、パクリタキセルの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６ｂ＋）の推移を示すグラフである。図８は、パクリタキセルの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）数の推移を示すグラフである。図５〜図８において、□はコントロール群（５ｖ／ｖ％エタノール／５ｖ／ｖ％クレモホール含有生理食塩液投与群）、■はパクリタキセル７０ｍｇ／ｋｇ群を示す。【００８６】
図９は、パクリタキセルの血液毒性評価における、コントロール群のヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数及びマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の割合の推移を示すグラフである。図１０は、パクリタキセルの血液毒性評価における、パクリタキセル投与群のヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数及びマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の割合の推移を示すグラフである。図９〜図１０において、□はマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数、■はヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）数を示す。【００８７】
Ｔｇ−ＮＯＧマウスにおいて、マウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）はＰＴＸ投与後４日目に減少を示し、投与後７日目では回復性を示した。ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６ｂ＋）及びヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）は、ＰＴＸの投与後２１日目にかけて減少し、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６ｂ＋）数は、投与後４日目〜２１日目で低値を示し、投与後２８日目で増加に転じ、回復性を示した。このことから、ヒトでは、ＰＴＸ７０ｍｇ／ｋｇは顆粒球減少症を引き起こす可能性が高いことがわかる。また、ＰＴＸ投与後のヒト及びマウスの白血球変動の分別測定した結果からはどちらも減少を示し、反応性に大きな種差がないことが分かる。減少から回復の期間の推移では、マウスは投与後から７日の期間であったのに対し、ヒトは投与後から２８日の期間を示し、回復期間に種差があることが分かる。このことから、本モデルを利用することにより、ヒト白血球への減少程度の推測と同時に回復期間の推測も可能であることがわかる。回復期間の推測から、ヒトにおける投与間隔の設定も可能である。【００８８】
実施例２−２  オキサリプラチンの血液毒性評価
６週齢のＴｇ−ＮＯＧマウス（雌２４匹）に２．５ＧｙのＸ線を照射し、３時間〜４時間後に、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｂｏｄｙ移植した。移植後５週間目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の生着を確認した。結果を表３に示す。【００８９】
【表３】
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【００９０】
評価に適したマウス１１匹を選択し、コントロール群５匹、オキサリプラチン投与群６匹に分けた。コントロール群には５ｗ／ｖ％グルコース溶液を、オキサリプラチン投与群は６匹の各２匹にそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ（２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ）、３０ｍｇ／ｋｇ（３ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ）、及び４０ｍｇ／ｋｇ（４ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈より単回静脈内投与した。動物の割付は、ヒト白血球数及びヒト顆粒球数の平均値がほぼ均一になるように群分けを行った。【００９１】
投与後４日目、７日目、１４日目、１７日目、２１日目、及び２８日目にイソフルラン麻酔下で眼窩静脈叢より末梢血を採取し、末梢血中の白血球数をＦＡＣＳで計測した。３０ｍｇ／ｋｇ投与動物、及び４０ｍｇ／ｋｇ投与動物は投与後７日目までに死亡したため、２０ｍｇ／ｋｇ投与群の結果を図１１〜図１４に結果を示す。【００９２】
図１１は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）の推移を示すグラフである。図１２は、オキサリプラチンの血液毒性評価における、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）数の推移を示すグラフである。図１３はオキサリプラチンの血液毒性評価における、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６＋）の推移を示すグラフである。図１４はオキサリプラチンの血液毒性評価における、マウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）の推移を示すグラフである。図１１〜図１４において、―○―はコントロール群（５ｗ／ｖ％グルコース投与群）、―●―はオキサリプラチン２０ｍｇ／ｋｇ群を示す。【００９３】
Ｔｇ−ＮＯＧマウスにおいて、マウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）、及びマウス由来顆粒球（ｍＧｒ−１＋）はオキサリプラチン投与後に著しい減少を示し、回復傾向を示すことなく、投与後１７日目には瀕死状態となった。【００９４】
Ｔｇ−ＮＯＧマウスにおいて、ヒト由来顆粒球（ｈＣＤ６６＋）はオキサリプラチンの投与後４日目に軽度な減少を示し、７日目以降は緩やかな回復傾向を示した。このことから、ヒトではマウスに対して著しい顆粒減少を示す投与量においても顆粒球減少症を引き起こす可能性は低いことがわかる。
ヒト及びマウス白血球の変動を分別測定することによって、オキサリプラチン投与後の白血球減少に及ぼす影響はヒトよりマウスで強く発現することが示され、血液毒性評価においてノギテカンとは異なる種差を確認することも可能であることが分かる。【００９５】
実施例３−１  コロニー形成試験による顆粒球系骨髄造血前駆細胞に対するＥＨＣ及びＰＴＸの影響
ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４＋細胞移植後１４週間目のマウスをイソフルラン麻酔下で腹大動脈から脱血安楽死処置後、大腿骨を採取した。大腿骨から無菌的にイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて洗い出し、細胞懸濁液を調製した。ナイロンフィルター（３５μｍ径、セルストレイナー、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通した濾液を骨髄細胞液とした。骨髄細胞液の一部でＦＡＣＳ解析を行い、ヒト由来白血球（ｈＣＤ４５＋）及びマウス由来白血球（ｍＣＤ４５＋）の細胞数の比率を算出した。【００９６】
ヒトＣＤ４５＋細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／１．１ｍＬ／ディッシュになるようにメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４５３４、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、ＥＨＣを０．１４ｎＭ、０．４ｎＭ、１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭで、ＰＴＸを０．１２ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭでそれぞれ加えた後、ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１６日間培養した。
マウスＣＤ４５＋細胞を２×１０４  ｃｅｌｌｓ／１．１ｍＬ／ディッシュになるようにメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｍ３５３４、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁し、ＥＨＣを１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭで、ＰＴＸを０．１２ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、９０ｎＭでそれぞれ加えた後、ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で８日間培養した。
溶媒対照には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、最終濃度０．００２ｖ／ｖ％）を用いた。各濃度２ディッシュで行った。【００９７】
培養期間終了後に顆粒球系由来のコロニー形成数を計数し、各濃度のコロニー数の平均値を算出した。溶媒対照の平均コロニー数を１００％とした相対値として表し、５０％及び９０％のコロニー形成抑制率を示す濃度（ＩＣ５０値、ＩＣ９０値）を算出した。結果を表４に示す。【００９８】
【表４】
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【００９９】
ＥＨＣの骨髄中顆粒球系前駆細胞に対する影響は、マウスに比べてヒトで高いことがわかった。この結果は、末梢血の解析結果でマウス白血球が一過性の減少後に回復を示したのに対して、ヒト白血球は減少からの回復性が見られず、反応性に大きな差が認められたことと一致する。ＰＴＸの骨髄中顆粒球前駆細胞に対する影響は、ヒトとマウスでほぼ同程度であり、末梢血の解析結果でヒトとマウスの白血球減少がほぼ同程度であったことと一致する。【０１００】
実施例３−２  コロニー形成試験による顆粒球系骨髄前駆細胞に対するノギテカン及びオキサリプラチンの影響
骨髄細胞の採取調製、培養、及びコロニー形成抑制率の算出は、実施例３−１に記載したものと同様に実施した。【０１０１】
ヒトＣＤ４５＋細胞に対するノギテカンの曝露濃度は、０．４１ｎＭ、１．２ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭで、オキサリプラチンの曝露濃度は、１２３ｎＭ、３７０ｎＭ、１，１１１ｎＭ、３，３３３ｎＭ、１０，０００ｎＭ、３０，０００ｎＭで行った。
マウスＣＤ４５＋細胞に対するノギテカンの曝露濃度は、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、９００ｎＭで、オキサリプラチンの曝露濃度は、１３．７ｎＭ、４１．２ｎＭ、１２３ｎＭ、３７０ｎＭ、１，１１１ｎＭで行った。
溶媒対照には、ノギテカンでは生理食塩液を、オキサリプラチンでは蒸留水を用いた。【０１０２】
溶媒対照の平均コロニー数を１００％とした相対値として表し、５０％及び９０％のコロニー形成抑制率を示す濃度（ＩＣ５０値、ＩＣ９０値）を算出した。結果を表５に示す。【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
ノギテカンの骨髄中顆粒球前駆細胞に対する影響は、ＥＨＣと同様にマウスに比べてヒトで高いことが示された。この結果は、ノギテカン投与後のＴｇ−ＮＯＧマウスの末梢血中のヒト白血球が著明な減少からの回復がみられず、マウス白血球の変動推移と大きな差が認められたことと一致する。
オキサリプラチンの骨髄中顆粒球前駆細胞に対する影響は、ノギテカン及びＥＨＣとは逆にヒトに比べてマウスで高いことが示された。この結果は、オキサリプラチン投与後のＴｇ−ＮＯＧマウスの末梢血中のヒト白血球が著明な減少を示さなかったことに対して、マウス白血球は著明な減少を示し、反応性に大きな差が認められたことと一致する。【０１０５】
これらのことから、Ｔｇ−ＮＯＧマウスの末梢血中のヒト及びマウスの白血球画分の変動推移は、骨髄中のヒト及びマウス造血前駆細胞に対する影響を反映しており、抗がん剤投与時の骨髄毒性に起因して生じる血液毒性を評価するモデルとして、また、投与計画の立案に有用であることを示している。【０１０６】
また、Ｔｇ−ＮＯＧマウスは、マウス体内で分化維持されるヒト由来白血球とマウス由来白血球とに対する薬剤応答性を同時に解析することにより、血液毒性の反応性や回復性並びに感受性の種差について評価できるモデルであることが示された。【０１０７】
したがって、ヒト化された改変型ＮＯＧマウスを用いることにより、マウス由来の血球細胞に対するものとは異なる、ヒト由来の血球細胞に対する血液毒性の反応性や回復性が、特定の評価対象薬剤に限定されることなく適切に評価できることがわかった。本発明によれば、骨髄毒性のヒトの臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の血液毒性評価方法、及び評価対象薬剤の血液毒性評価用モデルを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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