(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含む、Ｔ細胞受容体であって、（ｉ）ＴＣＲα鎖可変領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、そして（ｉｉ）ＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、
該ＴＣＲは、VLDGLDVLL（配列番号３２）のアミノ酸配列内に含まれるエピトープ又はそのＭＨＣ結合形に結合することができる、該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
（ｉｉｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＴＣＲα鎖可変領域、及び
（ｉｖ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＴＣＲβ鎖可変領域
を含む、請求項１記載のＴＣＲ。
【請求項３】
（ｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、若しくは配列番号１３から選択されたアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖；及び
（ｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４から選択されたアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖
を含む、請求項１記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲが、天然ＴＣＲ、ＴＣＲ変異体、ＴＣＲ断片、又はＴＣＲ構築物から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載のＴＣＲ。
【請求項５】
ＴＣＲヘテロ二量体又は多量体を形成するように互いに共有結合で連結された少なくとも１本のＴＣＲα鎖（群）及び少なくとも１本のＴＣＲβ鎖（群）を含む、請求項４記載のＴＣＲ構築物。
【請求項６】
場合により少なくとも１つのリンカーをさらに含む、Ｆｃ受容体；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭを含む、Ｆｃドメイン；ＩＬ−２又はＩＬ−１５を含むサイトカイン；毒素；抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、又は抗ＣＤ５６抗体、又はその抗原結合断片を含む、抗体又はその抗原結合断片；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４ドメイン、又はその組合せから場合により選択された１つ以上の融合成分（群）をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のＴＣＲ。
【請求項７】
（ｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか又はからなるＴＣＲα鎖可変領域を含む、少なくとも１つのＴＣＲα鎖；
（ｉｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか又はからなるＴＣＲβ鎖可変領域を含む、少なくとも１つのＴＣＲβ鎖；及び
（ｉｉｉ）リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向された、抗体又は一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
を含み、
ＴＣＲα鎖（群）及びＴＣＲβ鎖（群）は互いに連結され、場合によりリンカーを介して該抗体又はｓｃＦｖに融合している、請求項１〜６のいずれか一項記載のＴＣＲ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲをコードしている核酸。
【請求項９】
配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の核酸配列を含む、請求項８記載の核酸。
【請求項１０】
請求項８又は９のいずれか一項記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲ、請求項８若しくは９記載の核酸配列、又は請求項１０記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
（ｉ）前記ＴＣＲの発現を引き起こす条件下で請求項１１記載の宿主細胞をインキュベートする工程、及び
（ｉｉ）該ＴＣＲを精製する工程
を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲを得るための方法。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）請求項８若しくは９のいずれか一項記載の核酸、
（ｉｉｉ）請求項１０記載のベクター；及び／又は
（ｉｖ）請求項１１記載の宿主細胞、
のうち１つ以上、及び場合により薬学的賦形剤（群）
を含む、医薬組成物又は診断用組成物。
【請求項１４】
がんの検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲ、請求項８若しくは９記載の核酸、請求項１０記載のベクター、及び／又は請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１５】
（ａ）被験者の試料を準備する工程、該試料は１つ以上の細胞を含む；
（ｂ）該試料を、
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）請求項１１記載の宿主細胞、及び／又は
（ｉｉｉ）請求項１３記載の医薬組成物
と接触させることにより複合体を形成する工程、並びに
（ｃ）該複合体を検出する工程、該複合体の検出は、被験者におけるがんの存在の指標である
を含む、インビトロにおいて被験者におけるがんの存在を検出する方法。
【請求項１６】
改変されたリンパ球を生成するための、請求項１〜７のいずれか一項記載のＴＣＲ、請求項８若しくは９記載の核酸、及び／又は請求項１０記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
細胞媒介性免疫系の一部を形成するＴリンパ球（又はＴ細胞）は、病原体の根絶において主要な役割を果たす。Ｔ細胞は胸腺において発達し、Ｔ細胞の表面上にＴ細胞受容体分子を発現し、これは有核細胞上に発現された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子上に提示されたペプチド（抗原提示）の認識を可能とする。病原体の抗原、すなわち、ＭＨＣ分子によって提示された外来抗原は強力なＴ細胞応答を惹起し、一方、このようなＴ細胞の発達中の胸腺における自己抗原特異的Ｔ細胞のネガティブ選択のために、自己抗原は通常はＴ細胞応答を生じない。したがって、免疫系は、外来抗原又は自己抗原を提示している有核細胞を区別することができ、強力なサイトカイン遊離及びＴ細胞の細胞障害性機序を介して、感染した細胞を特異的に標的化及び根絶することができる。
【０００２】
免疫系の力は、将来のがん治療のための有望なツールとして認識されている。過去１０年間に、エキスビボで増殖させたドナー由来リンパ球の投与を含む、養子細胞移植（ＡＣＴ）を使用することによるＴ細胞の独特な特性を使用した研究が始まった。ＡＣＴは、がんの処置のための魅力的な概念である。なぜなら、それは患者の免疫応答能を必要とせず、移植されたリンパ球の特異性は、典型的には自己Ｔ細胞応答を効果的にトリガーすることのできない突然変異しておらず及びしたがって免疫原性の低い腫瘍抗原に対して標的化することができるからである。ＡＣＴは、様々な種類のがんの有望な処置であることが示されているが、臨床的処置としてのその幅広い適用は、各患者からの腫瘍特異的Ｔ細胞のカスタムな単離及び特徴付けの必要性によって妨害され、これは、困難かつ時間がかかる可能性があるだけでなく、しばしば高い結合力のＴ細胞を生じることができないプロセスである（Xue et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248）。
【０００３】
初代Ｔ細胞への腫瘍抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子導入は、ＡＣＴの現在の限界のいくつかを克服することができる。なぜなら、それは、免疫低下患者においてさえ規定の抗原特異性を有する腫瘍反応性Ｔリンパ球の迅速な生成を可能とするからである。しかしながら、インビボにおいて腫瘍抗原を特異的に認識しかつ望ましい抗腫瘍効果を示すＴＣＲを有する適切なＴ細胞クローンの同定は依然として進行中の研究の論題である。２０１２年には世界全体で約１４１０万件の新たながん症例が発生し、がんは現在、世界中の全ての人間の死因の約１４．６％を占めることを考えると、新規かつ効果的な処置選択肢が緊急に必要とされる。本発明の目的は上記に示されている必要性に応じることである。
【０００４】
要約
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞受容体、並びに、それを含む核酸、ベクター、宿主細胞；並びに、その様々な使用及び適用を提供する。
【０００５】
第一の態様では、本発明は、（ｉ）CAVHSTAQAGTALIF（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖可変領域の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、及び／又は、（ｉｉ）CASSTHRGQTNYGYTF（配列番号２）のアミノ酸配列、又は配列番号２に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。
【０００６】
本明細書において提供されるＴＣＲは、X1LX2GLDX3LL（配列番号３１）のアミノ酸配列内に含まれるエピトープ又はそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合形、好ましくはVLDGLDVLL（配列番号３２）のアミノ酸配列内に含まれるエピトープ又はそのＭＨＣ結合形に結合することができる。前記のアミノ酸配列は、多くの様々ながんによって発現されていると考えられるＰＲＡＭＥ（悪性黒色腫に優先的に発現されている抗原）のアミノ酸位置１００〜１０８に対応する。
【０００７】
ＴＣＲは、本発明によると、例えば、（ｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖可変領域を含み得る。本発明のＴＣＲはまた、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖に定常領域を含んでいてもよい。
【０００８】
特に、本明細書において提供されるＴＣＲは、（ｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、若しくは配列番号１３のいずれか１つから選択されたアミノ酸配列、又は、配列番号７、９、１１、若しくは１３に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖；及び／あるいは（ｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４のいずれか１つから選択されたアミノ酸配列、又は、配列番号８、１０、１２、若しくは１４に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖を含み得る。
【０００９】
本発明のＴＣＲは、様々な形態を有し得、例えばＴＣＲは、天然ＴＣＲ、ＴＣＲ変異体、ＴＣＲ断片、又はＴＣＲ構築物であり得る。互いに共有結合で連結されたＴＣＲα鎖及びβ鎖を含むヘテロ二量体及び多量体、並びに、１つ以上の融合成分を含むＴＣＲ構築物も本明細書において考えられる。有用なＴＣＲ構築物は、例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖（両方が互いに共有結合で連結されている）、及びリンパ球の表面上の抗原又はエピトープ（例えばＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、又はＣＤ５６）に対して指向されかつリンカーを介してＴＣＲ鎖に融合している抗体又は抗体断片、例えばｓｖＦｖを含む。
【００１０】
本発明のＴＣＲに共有結合で連結させることのできる他の有用な部分は、様々な標識を含む。本発明のＴＣＲはまた可溶形でも提供され得る。
【００１１】
さらに、本発明は、本明細書において提供されるＴＣＲのいずれかをコードしている核酸を提供し、該核酸は例えば、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０のいずれか１つの核酸配列を含むか又はからなる。
【００１２】
本明細書においてさらに提供されるのは、本発明に記載の核酸を含むベクターである。例示的なベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター又はガンマ−レトロウイルスベクターが挙げられる。
【００１３】
本発明のＴＣＲ、核酸、又はベクターを含む宿主細胞も本明細書において提供される。有用な宿主細胞としては、リンパ球、例えば細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δＴ細胞が挙げられる。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明のＴＣＲを得るための方法を提供する。
【００１５】
本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞を含む医薬組成物又は診断用組成物も本明細書において提供される。医薬品又は診断剤として、特にがんの検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療における、本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び／又は医薬組成物の使用も考えられる。がんを予防又は治療する有用な方法は、以下の工程を含む：（ａ）本明細書に開示されているＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び／又は医薬組成物の１つ以上を準備する工程；並びに（ｂ）前記の１つ以上をそれを必要とする被験者に投与する工程。本発明はまた以下を考える：（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料はリンパ球を含む）；（ｂ）本明細書に開示されているＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び／又は医薬組成物の１つ以上を準備する工程、並びに（ｃ）それを工程（ａ）で得られたリンパ球に導入し、それにより、改変されたリンパ球を得る工程、（ｄ）工程（ｃ）の改変されたリンパ球をそれを必要とする被験者又は患者に投与する工程。
【００１６】
本発明はさらに、（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料は１つ以上の試料を含む）；（ｂ）該試料を本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、又は宿主細胞と接触させ、それにより複合体を形成する工程、及び（ｃ）該複合体を検出する工程（該複合体の検出は、被験者におけるがんの存在の指標である）を含む、インビトロでの被験者におけるがんの存在を検出するためのインビトロでの方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、成熟樹状細胞を使用したプライミングアプローチの概略図を示す。ＰＲＡＭＥを用いてトランスフェクトした成熟樹状細胞を使用して、健康な自己ドナーのレパートリー内においてＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を新規に誘導した。
【図２】図２は、ペプチド（ＰＲＡＭＥ１００〜１０８「ＶＬＤペプチド」又は陰性対照としてのＰＲＡＭＥ３００〜３０９「ＡＬＹペプチド」、n.d.＝検出されず）の積載されたＴ２細胞と共培養されたＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９のマルチプレックスサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−４、ＩＬ−１β）分泌分析を示す。Ｔ４．８−１−２９は、配列番号１に示されるようなそのＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３を有することによって、及び／又は、配列番号２に示されるようなそのＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３を有することによって特徴付けられる。
【図３】図３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現している様々なヒト腫瘍細胞株と共培養されたＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９からのＩＦＮγ遊離を示し、図３の説明文に示されているように、腫瘍細胞株のいくつかは、ＰＲＡＭＥを発現している（緑色の棒グラフ）。ＰＲＡＭＥを発現していない腫瘍細胞株は、陰性対照としての役目を果たす（赤色の棒グラフ）。陽性対照：「ＶＬＤペプチド」の積載されたＴ２細胞（黒色の棒グラフ）、刺激を行なわないＴ細胞のバッググラウンドは、白色の棒グラフによって示される（「n.d.＝検出されず」）。
【図４】図４は、滴定量のＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチドの積載されたＴ２細胞と共培養されたＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９のＩＦＮγ遊離を示す。点線は、試験されたＴ細胞クローンの機能的結合力の尺度である、最大半量のＩＦＮγ分泌をもたらす１０−９〜１０−１０モル/Ｌ［Ｍ］のペプチド濃度を示す。
【図５】トランスジェニックＴＣＲの対形成及び機能性を証明するために、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドの積載されたＴ２細胞又は無関係のペプチドの積載されたＴ２細胞と共培養した、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９のトランスフェクトされたレシピエントＣＤ８＋Ｔ（レシピエントＴ細胞クローン＋Ｔ４．８−１−２９ｉｖｔＲＮＡ）細胞の特異的ＩＦＮγ遊離を、標準的なＥＬＩＳＡによって測定した。
【図６】図６は、標準的なＥＬＩＳＡを使用して測定された、自己ペプチドの積載された（計１３１個の遍在的な自己ペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１によりコードされる分子に結合している）Ｔ２細胞と共培養された、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現するように工学操作されたＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣからの特異的なＩＦＮ−γ遊離を示す。
【図７】図７は、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現するように工学操作されたＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣによる、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチド（「ＶＬＤペプチド」）又は無関係なペプチドSLLQHLIGL（「ＳＬＬペプチド」）のいずれかを積載されたＴ２細胞の溶解を示す。
【図８−１】図８は、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているヒトＰＢＭＣによる、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８を発現している標的細胞の溶解を示す。（Ａ）追加的にＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチド（「ＶＬＤペプチド」）の積載された、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のトランスフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性ヒトＫ５６２腫瘍細胞の溶解。（Ｂ）陰性対照としてのＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いて追加的にトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ＊０２陰性で内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２細胞は溶解されない。（Ｃ）は、ＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いて追加的にトランスフェクトされた、ＨＬＡ−Ａ＊０２のトランフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２細胞の溶解を示す。（Ｄ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２のトランフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２の溶解を示す。
【図８−２】図８は、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているヒトＰＢＭＣによる、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８を発現している標的細胞の溶解を示す。（Ａ）追加的にＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチド（「ＶＬＤペプチド」）の積載された、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のトランスフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性ヒトＫ５６２腫瘍細胞の溶解。（Ｂ）陰性対照としてのＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いて追加的にトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ＊０２陰性で内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２細胞は溶解されない。（Ｃ）は、ＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いて追加的にトランスフェクトされた、ＨＬＡ−Ａ＊０２のトランフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２細胞の溶解を示す。（Ｄ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２のトランフェクトされた内因性ＰＲＡＭＥ陽性のヒトＫ５６２の溶解を示す。
【図９】図９は、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の有用な例のアミノ酸配列（配列番号１１及び１２）、並びに、ヒトＰＲＡＭＥのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。α鎖及びβ鎖におけるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列には下線が付され、ＣＤＲ３配列は灰色かつ大文字であり、可変領域は通常のフォントであり、定常領域はイタリック体である。
【図１０】図１０は、活性化により誘導されるＩＦＮγの遊離によって示されそして標準的なＥＬＩＳＡによって測定されるような、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９ＨＬＡ−Ａ＊０２を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣによる、様々なＨＬＡ−Ａ＊０２及びＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞株の認識を示す。
【図１１】図１１は、健康なドナーの形質導入されていないＰＢＭＣ、及び、本明細書に記載のＴＣＴ Ｔ４．８−１−２９構築物を含有しているプラスミドを用いて形質導入された健康なドナーの同ＰＢＭＣを示す。
【図１２】図１２は、Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９（点線の曲線）又はＴ４．８−１−２９を用いて形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ（実線の曲線）のいずれかを、ペプチドの積載されたＴ２細胞と共培養した後の、ＩＦＮγ分泌の検出によって測定されるような、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドに対する機能的なＴ細胞の結合力を示す。
【図１３】図１３は、Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣの抗原特異性の分析を示す。腫瘍細胞株ＯＰＭ−２及びＵ９３７（ＨＬＡ−Ａ２陰性及びＰＲＡＭＥ陰性）を、改変させずに、又はＨＬＡ−Ａ２をコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトしてのいずれかで試験した。
【図１４】図１４は抗原特異性の分析を示し、Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣを、様々な標的細胞株と共培養した。腫瘍細胞株Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ２陰性及びＰＲＡＭＥ陽性）、並びに、Ｋ５６２＿Ａ２及びＭｅｌ６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ陽性及びＰＲＡＭＥ陽性）及び６４７−Ｖ（ＨＬＡ−Ａ２陽性及びＰＲＡＭＥ陰性）を試験した。
【図１５】図１５は、細胞のライブイメージングを可能とする顕微鏡に基づいたシステムであるＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（登録商標）（生細胞分析システム）（エッセンバイオサイエンス社）を使用した、腫瘍細胞に対するＴ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターの細胞障害活性の分析を示す。
【図１６】図１６は、Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣの安全性プロファイルの分析を示す。
【００１８】
詳細な説明
本発明者らは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＰＲＡＭＥを発現している細胞を特異的に認識することができ；そして、サイトカインの産生及び標的細胞の細胞溶解などの有利なエフェクター機能を示す、Ｔ細胞クローンを同定した。それ故、該Ｔ細胞クローン及びそれらのＴ細胞受容体は、非常に特異的かつ効果的ながんの処置のための有望なツールである。したがって、同定されたＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲは、がんの養子Ｔ細胞療法に適している。高度に特異的にＰＲＡＭＥに結合することのできるＴＣＲの同定は、エクスビボにおいてＴ細胞を「武装化」しドナーにそれらを再導入することを可能とし、そこでそれらはＰＲＡＭＥを発現しているがん細胞を効果的に認識し特異的に排除することができる。さらに、本明細書において提供される新規なＴＣＲの抗原結合領域を使用して、直接投与のために容易に利用可能であるさらなる機能的な部分（例えば、薬物、標識、又は他の免疫細胞を誘引するさらなる結合ドメイン）を含む可溶性構築物を設計することができる。
【００１９】
可変領域
ＣＤＲ３ドメイン
第一の態様では、したがって、本発明は、（ｉ）CAVHSTAQAGTALIF（配列番号１）の配列を含むか若しくはからなるＴ細胞受容体α鎖ＣＤＲ３、及び／又は（ｉｉ）CASSTHRGQTNYGYTF（配列番号２）のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴ細胞受容体β鎖ＣＤＲ３を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。
【００２０】
本明細書においてさらに、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＣＤＲ３α、及び／又は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＣＤＲ３βを含む、ＴＣＲ配列変異体が考えられ；ただし、ＴＣＲは、添付の実施例において評価されたＴＣＲの有益な能力を保持し、すなわち、本明細書に明記された抗原標的に結合することができる。
【００２１】
本明細書において使用する「Ｔ細胞受容体」すなわち「ＴＣＲ」という用語は、天然ＴＣＲ、並びにＴＣＲ変異体、断片、及び構築物を含む。したがって、該用語は、場合によりさらなるドメイン及び／又は部分を含む；ＴＣＲα鎖及びβ鎖を含むヘテロ二量体、並びに、多量体及び一本鎖構築物を含む。
【００２２】
ＴＣＲは、その天然形では、Ｔ細胞の表面上にいくつかのタンパク質の複合体として存在する。Ｔ細胞受容体は、２本の（別々の）タンパク質鎖から構成され、これは独立したＴ細胞受容体のα及びβ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から生成され、アルファ鎖（α鎖）及びベータ鎖（β鎖）と呼ばれる。ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン様（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン／領域、１つのＩｇ定常様（Ｃ）ドメイン／領域、形質膜に鎖をアンカーする膜貫通領域／細胞膜横断領域、及びＣ末端における短い細胞質内尾部を有する。
【００２３】
抗原特異性は、α鎖及びβ鎖の可変領域によって付与される。ＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方の可変ドメインは、フレームワーク（ＦＲ）領域によって囲まれた、３つの超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ１α／β、ＣＤＲ２α／β、及びＣＤＲ３α／β）を含む。ＣＤＲ３は、抗原の認識及び特異性（すなわち、特定の抗原を認識しかつ相互作用する能力）の主な決定基であり、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は主に、抗原性ペプチドを提示しているＭＨＣ分子と相互作用する。
【００２４】
天然ＴＣＲは、抗原提示細胞の表面における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した（「提示された／示された」）抗原性ペプチドを認識する。ＭＨＣ分子上に提示された抗原性ペプチドは、本明細書において「ペプチド：ＭＨＣ複合体」とも呼ばれる。ＭＨＣ分子には２つの異なるクラス（ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ）が存在し、これは、異なる細胞区画に由来するペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトの身体全体の全ての有核細胞の表面上に発現され、細胞内区画に由来するペプチド又はタンパク質断片を細胞障害性Ｔ細胞に提示する。ヒトでは、ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。ＭＨＣクラスＩには主に３つの種類が存在する：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ。一旦ＴＣＲがその特定のペプチド：ＭＨＣ複合体に結合すると、Ｔ細胞は活性化され、生物学的エフェクター機能を発揮する。
【００２５】
本明細書において提供されるＴＣＲは有利には、以下に詳細に考察されるように、ＰＲＡＭＥ、特にそのＭＨＣ結合形のＰＲＡＭＥ１００〜１０８を（特異的に）認識することができる。抗原性ペプチドは、それがＭＨＣ分子と複合体を形成した場合に（これは、樹状細胞又は腫瘍細胞などの抗原提示細胞の表面上に存在していても、又は、それは例えばビーズ若しくはプレートにコーティングされることによって固定化されていてもよい）、その「ＭＨＣ結合形」で存在すると言われる。
【００２６】
ＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメイン
以前に示されているように、本発明のＴＣＲは、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣ−Ｉ分子、特にＨＬＡ−Ａ、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２、特に対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１によってコードされるＨＬＡ−Ａ２分子上に提示されると、それらの抗原標的ＰＲＡＭＥ１００〜１０８を認識すると考えられる（Ｔ細胞又はＴＣＲは、特定のＭＨＣ分子に「拘束」されると言われる）。また、本発明のＴＣＲは、他のＨＬＡ−Ａ＊０２対立遺伝子上に提示されたそれらの抗原標的を認識すると考えられ得る。以前に記載されているように、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２は主にＭＨＣの認識に関与していると考えられる。ＨＬＡ−Ａ＊０２拘束性の抗原認識に関与していることが知られているＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の「プール」は限定され、本発明のＣＤＲ３ドメインは原則的に配列番号３４〜２２４に示されるＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメインのいずれとも組み合わせることができると考えられ、ただし、ＴＣＲは、その抗原標的、好ましくはそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合形のその抗原標的を認識するその能力を、添付の実施例において評価されたＴＣＲと類似しているか、同じであるか、又はさらにはより高い程度で保持している。ＣＤＲ１ドメイン及びＣＤＲ２ドメインの有用な例としては、配列番号５に示されるようなVSGLRG配列を含むか又はからなるＣＤＲ１α、配列番号３に示されるようなLYSAGEE配列を含むか又はからなるＣＤＲ２α、配列番号６に示されるようなSGDLS配列を含むか又はからなるＣＤＲ１β、及び配列番号４に示されるようなYYNGEE配列を含むか又はからなるＣＤＲ２βが挙げられる。該ＣＤＲ配列は図９にも示される。
【００２７】
前記に従って、本発明はとりわけ、２本のポリペプチド鎖を含むＴＣＲを提供し、その各々はＴＣＲの少なくとも１つの相補性決定領域（すなわち、特にＣＤＲ３、好ましくはＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２）を含むヒト可変領域を含む。特に有益な特性（添付の実施例に示されているような）を有するＴＣＲは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、配列番号３のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、及び配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）を含む第一のポリペプチド鎖、並びに、配列番号６のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、及び配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はからなるＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）を含む第二のポリペプチド鎖を含む。
【００２８】
完全可変領域
本発明はさらに、配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖可変領域、及び／又は、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖可変領域を含む、ＴＣＲを提供する。該α鎖配列及びβ鎖配列は図９にも示されている（通常のフォント）。
【００２９】
配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び／又は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか又はからなるＴＣＲβ鎖可変領域を含む、ＴＣＲ配列変異体も本明細書において考えられ；ただし、ＴＣＲは、添付の実施例において評価されているＴＣＲの有益な能力を保持し、すなわち、本明細書に明記されている抗原標的に結合することができる。
【００３０】
接触領域
ＴＣＲはさらに、そのα鎖及び／又はβ鎖に定常（Ｃ）領域を含んでいてもよい。定常領域は、ヒト定常領域であり得るか又は別の種に由来し得、これにより「キメラ」ＴＣＲが生じる。例えば、ヒトα鎖及び／又はβ鎖は、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の選択的な対形成及びＣＤ３共受容体とのより安定な会合を支持することによって、ヒトＴＣＲの表面発現を増強させることが判明しているそれらのマウス対応物によって置換（「マウス化」）されていてもよい。α鎖の適切な定常領域は、例えば、配列番号１７（ヒト）、１９（最小限にマウス化されている）及び２１（マウス）から選択され得る。β鎖の適切な定常領域は、配列番号１８（ヒト）、２０（最小限にマウス化されている）及び２２（マウス）から選択され得る。本明細書の「ＴＣＲ配列変異体」の章にさらに説明されているように、完全ヒト定常領域をそれらのマウス対応物によって置き換える代わりに、ヒト定常領域内のいくつかのアミノ酸のみを、マウス定常領域の対応するアミノ酸と交換することも可能である（「最小限のマウス化」）。
【００３１】
α鎖及びβ鎖
本発明のＴＣＲの有用な例としては、配列番号７、９、１１又は１３に示されているようなアミノ酸配列を含むか又はからなるα鎖と、配列番号８、１０、１２又は１４に示されているようなアミノ酸配列を含むか又はからなるβ鎖とを含むＴＣＲが挙げられる。したがって、本発明はとりわけ、配列番号７に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるα鎖と、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるβ鎖とを含むか又はからなるＴＣＲ；配列番号９に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるα鎖と、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるβ鎖とを含むか又はからなるＴＣＲ；配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるα鎖と、配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるβ鎖とを含むか又はからなるＴＣＲ（両方共が図９にも示されている）；及び、配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるα鎖と、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はからなるβ鎖とを含むか又はからなるＴＣＲを提供する。
【００３２】
配列番号７、９、１１、若しくは１３に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むα鎖、及び／又は、配列番号８、１０、１２、若しくは１４に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲ配列変異体も本明細書において考えられ；ただし、ＴＣＲは、添付の実施例において評価されているＴＣＲの有益な能力を保持し、すなわち、本明細書に明記されている抗原標的に結合することができる。
【００３３】
抗原標的
本明細書において提供されるＴＣＲは有益には、（ヒト）ＰＲＡＭＥに結合することができる。ＰＲＡＭＥ（腫瘍において優先的に発現されている悪性黒色腫抗原、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７８３９５）は、ＭＡＰＥ（腫瘍において優先的に発現されている悪性黒色腫抗原）及びＯＩＰ４（ＯＰＡ相互作用タンパク質４）とも称されるが、これは機能が不明な精巣癌抗原（ＣＴＡ）であると報告されている。
【００３４】
特に、本発明は、配列番号３３（図９）に太文字で示されているようなＰＲＡＭＥアミノ酸配列のアミノ酸位置１００〜１０８に対応するアミノ酸配列内に含まれるエピトープに（特異的に）結合することができるＴＣＲを提供する。配列番号３２に示されるようなアミノ酸配列からなるＰＲＡＭＥペプチドは本明細書において、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８又は「抗原標的」又は「ＶＬＤペプチド」とも称される。本明細書の何処かで示されているように、本発明のＴＣＲは好ましくは、ＭＨＣ、特にＨＬＡ−Ａ＊０２に結合するとＰＲＡＭＥ１００〜１０８を認識するだろう。
【００３５】
開示に従って使用される「位置」という用語は、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、又は本明細書に示される核酸配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。本明細書において使用される「対応する」という用語はまた、位置が、前述のヌクレオチド／アミノ酸の番号によってのみ決定されるものではなく、むしろ、該配列の周囲の部分の状況から考えられるものであることを含む。したがって、開示による所与のアミノ酸又はヌクレオチドの位置は、配列内の何処か他の場所のアミノ酸又はヌクレオチドの欠失又は付加に因り変化し得る。したがって、位置が、開示により「対応する位置」と称される場合、ヌクレオチド／アミノ酸は、具体的な番号に関しては異なり得るが、依然として類似した隣接するヌクレオチド／アミノ酸を有し得ることが理解される。所与の配列内のアミノ酸残基（又はヌクレオチド）が、「親」アミノ酸のアミノ酸配列／ヌクレオチド配列における特定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段及び方法、例えば、手作業による又は例えば本明細書に例示されたコンピュータープログラムの使用による配列アラインメントを使用することができる。
【００３６】
「エピトープ」という用語は一般的に、結合ドメインが認識する、抗原上の部位、典型的には（ポリ）ペプチドを指す。その最も広義な意味における「結合ドメイン」という用語は「抗原結合部位」を指し、すなわち、抗原標的上の特定のエピトープと結合／相互作用する分子のドメインを特徴付ける。抗原標的は単一のエピトープを含み得るが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、コンフォメーション、及び種類に応じて任意の数のエピトープを含み得る。「エピトープ」という用語は一般的に、直鎖エピトープ及び立体構造エピトープを包含する。直鎖エピトープは、アミノ酸の一次配列内に含まれる連続エピトープであり、典型的には少なくとも２つ以上のアミノ酸を含む。立体構造エピトープは、標的抗原、特に標的（ポリ）ペプチドの折り畳みによって並べられた非連続アミノ酸によって形成される。
【００３７】
本発明の脈絡において、「結合ドメイン」という用語は特に、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖の可変領域、具体的にはＴＣＲのＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを指す。
【００３８】
本発明者らは、本発明のＴＣＲによって認識される最小のアミノ酸配列はアミノ酸配列X1LX2GLDX3LL（配列番号３１）に対応することを発見し、Ｘは任意のアミノ酸から選択される。具体的には、本発明のＴＣＲは、添付の実施例に示されているようなアミノ酸配列VLDGLDVLL（配列番３２）を含むか又はからなるアミノ酸配列を（特異的に）認識することが示された。したがって、本発明のＴＣＲは、アミノ酸配列X1LX2GLDX3LL（配列番号３１）を含むか若しくはからなる、好ましくはアミノ酸配列VLDGLDVLL（配列番３２）を含むか若しくはからなるアミノ酸配列、又はそのＭＨＣ結合形に結合することができる。例えば、認識されたペプチドは、配列番号３１、特に配列番号３２に示される認識モチーフのＣ末端及び／又はＮ末端に位置するさらに他のＣアミノ酸を含み得ると考えられる。具体的には、本明細書に記載のＴＣＲは、前記のアミノ酸配列内の少なくとも１つのエピトープを認識すると考えられる。全ての文法形における「に結合している」及び「認識している」という用語は本明細書において互換的に使用される。抗原標的は、ＭＨＣクラスＩ分子、具体的にはＨＬＡ−Ａ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２分子、特にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子に結合した場合に、本発明のＴＣＲによって認識されると特に考えられる。該ＭＨＣ分子、特にＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ａ＊０２分子は、細胞の表面上、例えば腫瘍細胞の表面上、又は（固形）担体上に提示され得る。
【００３９】
好ましくは、本発明のＴＣＲは、その抗原標的に特異的に結合する。「特異的に結合している」という用語は一般的に、ＴＣＲが、無作為な関連性のない非標的抗原よりも、その目的とする抗原標的に対してより容易にその抗原結合部位を介して結合することを示す。特に「特異的に結合する」という用語は、ＴＣＲの結合特異性が、非標的抗原に対するその結合特異性と比べて、その抗原標的に対して少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上であろうことを示す。
【００４０】
本明細書に記載のような天然ＴＣＲを発現しているエフェクター宿主細胞は、その抗原標的（すなわち、好ましくは抗原提示細胞によってＨＬＡ−Ａ＊０２上に提示されるＰＲＡＭＥ１００〜１０８）に高い機能的結合力で結合すると考えられる。「機能的結合力」という用語は、ＴＣＲ発現細胞（特に、本明細書に記載のような天然ＴＣＲを発現しているＴ細胞）がインビトロにおいて所与の濃度のリガンドに対して応答する能力を指し、これはＴＣＲ発現細胞のインビボにおけるエフェクター能に相関すると考えられる。定義によると、高い機能的結合力を有するＴＣＲ発現細胞は、インビトロの試験において非常に低い用量の抗原に対して応答する一方、低い機能的結合力を有するこのような細胞は、高い結合力のＴＣＲ発現細胞と同じような免疫応答を開始するには、より多量の抗原を必要とする。それ故、機能的結合力は、ＴＣＲ発現細胞の活性化閾値の量的な決定因子と考えられ得る。それは、インビトロにおいて様々な量の同族抗原に対してこのような細胞を曝露することによって決定される。高い機能的結合力を有するＴＣＲ発現細胞は、低い用量の抗原に応答する。例えば、ＴＣＲ発現細胞は典型的には、約１０−５〜約１０−１１Ｍの範囲（すなわち、約０．０５ng/mL〜約５ng/mL、０．０５ng/mL、０．１ng/mL、０．５ng/mL、１ng/mL、又は５ng/mL）という低い濃度のＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチド（ＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチドの分子量は９５６g/molである）の積載された抗原陰性ＨＬＡ−Ａ＊０２発現標的細胞と共培養すると、少なくとも約２００pg/mL以上（例えば２００pg/mL以上、３００pg/mL以上、４００pg/mL以上、５００pg/mL以上、６００pg/mL以上、７００pg/mL以上、１０００pg/mL以上、５，０００pg/mL以上、７，０００pg/mL以上、１０，０００pg/mL以上、又は２０，０００pg/mL以上）のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する場合に、その抗原標的に対して「高い」機能的結合力で結合すると判断されるだろう。
【００４１】
本発明のＴＣＲの特異的結合を決定するための他の方法としては、Gertner-Dardenne et al. J Immunol 188(9): 4701-4708によって記載された５１Ｃｒ遊離アッセイ、Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16: 2333-2343によって記載されたＣＤ１０７ａ／ｂ動員、及びWilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605によって記載されたペプチド：ＭＨＣ多量体結合分析が挙げられる。
【００４２】
変異体
以前に記載されているように、「ＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲの配列変異体、断片、及び構築物をはじめとする、ＴＣＲの変異体を包含する。全てのＴＣＲ変異体は、本発明のＴＣＲの機能的変異体であると考えられる。本明細書において使用する「機能的変異体」という用語は、親のＴＣＲ、その可変領域、又はその抗原結合領域に対してかなりの又は有意な配列同一率又は類似率を有する、ＴＣＲのポリペプチド又はタンパク質を指し、これはその生物学的活性、すなわち、本発明の親ＴＣＲが抗原特異性を示す抗原標的に対して、本明細書に開示されかつ添付の実施例で評価されたＴＣＲと類似しているか、同じであるか、又はさらにはより高い程度で特異的に結合する能力を共有する。
【００４３】
配列変異体
「ＴＣＲ変異体」という用語は、本明細書に開示されたＴＣＲの「配列変異体」、すなわち、上記のような本発明のＴＣＲ（「親」ＴＣＲとも称される）のアミノ酸配列を実質的に含んでいるが、「親」ＴＣＲアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変（すなわち、置換、欠失、又は挿入）を含有している変異体を含み、ただし、該変異体は好ましくは、本発明の「親」ＴＣＲの抗原特異性を保持している。本発明のＴＣＲ配列変異体は典型的には、適切なヌクレオチド変化を「親」ＴＣＲをコードしている核酸に導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。一般的には、前記のアミノ酸改変は、ＴＣＲの可変領域又は定常領域に導入され得るか又は存在し得、結合強度及び結合特異性、翻訳後プロセシング（例えばグリコシル化）、熱力学的安定性、溶解度、表面発現、又はＴＣＲの構築のような特性を調節する役目を果たし得る。
【００４４】
以前に示されているように、アミノ酸の改変は、例えば、親ＴＣＲのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換を含む。本発明のＴＣＲの例示的な挿入変異体としては、該ＴＣＲと、酵素又は別の機能的ポリペプチドとの融合産物が挙げられる。本発明のＴＣＲの例示的な置換変異体は、α鎖及び／若しくはβ鎖の可変領域若しくはＣＤＲ、フレームワーク領域、又は定常領域にアミノ酸置換を含んでいるものである。本明細書において特に考えられるのは保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当技術分野において公知であり、これは、特定の物理的及び／又は化学的特性を有するあるアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されているアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて作成され得る、酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸（例えばＡｓｐ又はＧｌｕ）で置換されたもの、非極性側鎖を有するアミノ酸が非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）で置換されたもの、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）で置換されたもの、極性側鎖を有するアミノ酸が極性側鎖を有する別のアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）で置換されたものなどであり得る。
【００４５】
システインによる改変
定常領域へのジスルフィド結合の付加は、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の正しい対形成を促進すると報告されている（Kuball J et al. Blood. 2007 Mar 15; 109(6):2331-8）。したがって、定常領域への１つ以上のシステイン結合の付加も本明細書において考えられる。
【００４６】
マウス化
以前に記載されているように、ＴＣＲのマウス化（すなわち、α鎖及びβ鎖におけるヒト定常領域を、そのマウス対応物と交換すること）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面発現を向上させるために一般的に適用される技術である。特定の理論に拘りたくはないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効果的に会合し；及び／又は、互いに優先的に対を形成し、所望の抗原特異性を有するＴＣＲを発現するようにエクスビボにおいて工学操作されたヒトＴ細胞上で混合型ＴＣＲを形成する傾向がより少ないが、依然としてそれらの「元来の」ＴＣＲを保持及び発現していると考えられる。
【００４７】
近年、マウス化ＴＣＲの改善された発現の原因となる９個のアミノ酸が同定され（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖定常領域内のアミノ酸残基の１つ又は全部を、それらのマウス対応物の残基で置換することが考えられる。この技術は「最小限のマウス化」とも称され、細胞表面発現を増強しつつ、同時にアミノ酸配列内の「外来」アミノ酸残基の数を減少させ、これにより免疫原性のリスクを低減させるという利点を与える。
【００４８】
一般的に、ＴＣＲ配列変異体は、本明細書に開示されているようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、α鎖可変領域、β鎖可変領域、α鎖及び／又はβ鎖の少なくとも１つを含むか、あるいは、本明細書に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなると考えられ、ただし、該変異体は添付の実施例において評価されたＴＣＲと比較して同等であるか、同じであるか、又は改善された結合特徴を示す。
【００４９】
本明細書において使用する「配列同一率」という用語は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が、アラインメント内の同じ位置に同一の残基を有する程度を示し、しばしば比率として表現される。好ましくは、同一率は、比較される配列の全長におよび決定される。したがって、正確に同じである配列の２つのコピーは１００％の同一率を有するが、あまり高度に保存されておらずかつ欠失、付加、又は置換を有する配列は、より低い程度の同一率を有する可能性がある。当業者は、配列同一率の決定のために、例えばＢｌａｓｔ（Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）、Ｂｌａｓｔ２（Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197）、及びＣｌｕｓｔａｌＷなどのいくつかのアルゴリズムを標準的なパラメーターを使用して利用可能であることを認識しているだろう。
【００５０】
したがって、配列番号１又は２のアミノ酸配列は、例えば、「サブジェクト配列」又は「リファレンス配列」としての役目を果たし得るが、それとは異なるＣＤＲ３のアミノ酸配列は、「クエリー配列」としての役目を果たし得る。
【００５１】
構築物及び断片
本明細書において使用する「ＴＣＲ」という用語はＴＣＲ構築物をさらに含む。「構築物」という用語は、本発明のＴＣＲの少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含むが、必ずしも天然ＴＣＲの基本的構造（すなわち、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖に取り込まれた可変ドメインが、ヘテロ二量体を形成している）を共有していない。ＴＣＲ構築物及び断片は典型的には、慣用的な遺伝子工学操作法によって得られ、追加の機能的タンパク質又はポリペプチドドメインを含むようにしばしば人工的に構築される。前記によると、本発明のＴＣＲ構築物及び断片は、本明細書の何処か他の場所で開示されているような少なくとも１つのＣＤＲ３α及び／又は少なくとも１つのＣＤＲ３βを含むと考えられる。本明細書においてさらに考えられるのは、本明細書において例示されているようなさらに他のタンパク質ドメイン又は部分と場合により組み合わせた、少なくとも１つのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、α鎖可変領域、β鎖可変領域、α鎖及び／又はβ鎖、あるいはその組合せを含んでいる、構築物及び断片である。本明細書に提供されたＴＣＲ構築物及び断片は、上記されそして添付の実施例において評価されている本発明のＴＣＲと同じ抗原標的に特異的に結合することができると考えられる。
【００５２】
多量体
「ＴＣＲ構築物」という用語は、少なくとも１つのＴＣＲα鎖可変領域又はＴＣＲα鎖と少なくとも１つのＴＣＲβ鎖可変領域が互いに共有結合で連結されている、ヘテロ二量体及び多量体を包含する。本発明による多価ＴＣＲ構築物は、その最も単純な形態では、好ましくはリンカー分子を介して、互いに会合した（例えば共有結合により又は別の方法で連結された）２つ又は３つ又は４つ又はそれ以上のＴＣＲの多量体を含む。
【００５３】
適切なリンカー分子としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及びエクストラアビジン（それぞれ、ビオチンに対する４つの結合部位を有する）などの多価付着分子が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、ビオチニル化ＴＣＲは、複数のＴＣＲ結合部位を有する多量体へと形成され得る。多量体におけるＴＣＲの数は、多量体を作製するために使用されたリンカー分子の量に関連したＴＣＲの量、及びまた任意の他のビオチニル化分子の有無にも依存するだろう。例示的な多量体は、二量体、三量体、四量体、又は五量体、又はそれより高次の多量体ＴＣＲ構築物である。本発明の多量体はまた、標識又は薬物又は（固形）担体などのさらなる機能的実体も含み得る。
【００５４】
「ＴＣＲ構築物」という用語はまた、適切なリンカーを介して、球状体、好ましくは均一なビーズ、より好ましくはポリスチレンビーズ、最も好ましくは生体適合性ポリスチレンビーズに連結されているＴＣＲ分子も包含する。このようなＴＣＲ構築物はまた、ビーズに取り込まれた本発明のＴＣＲ及び予め規定された蛍光色素を有するビーズを含み得る。
【００５５】
融合タンパク質
「ＴＣＲ構築物」という用語はまた、少なくとも１つのＴＣＲα鎖、ＴＣＲα鎖可変領域若しくはＣＤＲ３α、及び／又は少なくとも１つのＴＣＲβ鎖、ＴＣＲβ鎖可変領域若しくはＣＤＲ３β；並びにさらなる１つ以上の融合成分（群）を含む融合タンパク質又はポリペプチドに関する。有用な成分としては、Ｆｃ受容体；Ｆｃドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭに由来）；サイトカイン（例えばＩＬ−２又はＩＬ−１５）；毒素；抗体若しくはその抗原結合断片（例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、若しくは抗ＣＤ５６抗体、又はその抗原結合断片）；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４ドメイン；又はその任意の組合せが挙げられる。
【００５６】
融合成分として使用され得る例示的な抗体断片としては、完全長抗体の断片、例えば（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は「ｒＩｇＧ」（「ハーフ抗体」）；改変された抗体断片、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、又はｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ディアボディーズ、一本鎖ディアボディーズ、タンデム型ディアボディーズ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデム型ｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデム型ｔｒｉ−ｓｃＦｖ、ミニボディーズ、マルチボディーズ、例えばトリアボディーズ又はテトラボディーズ、及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディーズ、又はたった１つの可変ドメイン（ＶＨＨ、ＶＨ、又はＶＬであり得る）を含んでいる単一可変ドメイン抗体が挙げられる。
【００５７】
本発明のＴＣＲ構築物を、１つ以上の抗体又は抗体断片に融合させ得、その結果、一価、二価、及び多価（polyvalent）／多価（multivalent）構築物が得られ、したがって、たった１つの標的抗原に特異的に結合する単一特異的構築物、並びに、明確に異なる抗原結合部位を通して１つを超える標的抗原、例えば２つ、３つ又はそれ以上の標的抗原に特異的に結合する二重特異的及び多重特異的（polyspecific）／多重特異的（multispecific）構築物が得られる。
【００５８】
場合により、リンカーが、本発明のＴＣＲ構築物のドメイン又は領域の１つ以上の間に、すなわち、ＴＣＲα鎖ＣＤＲ３、ＴＣＲα鎖可変領域、及び／又はＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３、ＴＣＲβ鎖可変領域、及び／又はＴＣＲβ鎖、及び／又は本明細書に記載の１つ以上の融合成分（群）の間に導入されていてもよい。リンカーは当技術分野において公知であり、とりわけ、Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369によって考察されている。一般的に、リンカーとしては、可動性リンカー、切断可能なリンカー、剛直なリンカーが挙げられ、構築物の種類及び目的の使用／適用に応じて選択されるだろう。例えば、治療適用では、ドメイン間のある程度の可動性又は相互作用を確保しつつ、有害な免疫反応のリスクを低減させるために、非免疫原性で可動性のリンカーがしばしば好ましい。このようなリンカーは一般的に、小型の非極性（例えばＧｌｙ）又は極性（例えばＳｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸から構成され、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基鎖からなる「ＧＳ」リンカーを含む。これもまた本発明のＴＣＲ構築物に使用することを目的とした最も広く使用されている可動性リンカーの一例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２２５）の配列を有する。他の適切なリンカーは例えば、KESGSVSSEQLAQFRSLD（配列番号２２６）及びEGKSSGSGSESKST（配列番号２２７）及びGSAGSAAGSGEF（配列番号２２８）を含む。
【００５９】
本発明により考えられる特に有用なＴＣＲ構築物は、場合により互いに連結されかつ、場合によりリンカーを介して、リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向される少なくとも１つの抗体又は抗体断片（例えば一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ））に融合している、本明細書において定義されているような少なくとも１つのＴＣＲα鎖、ＴＣＲα鎖可変領域、又はＣＤＲ３α、本明細書において定義されているような少なくとも１つのＴＣＲβ鎖、ＴＣＲβ鎖可変領域、又はＣＤＲ３βを含んでいるＴＣＲ構築物である。抗体又は抗体断片（例えばｓｃＦｖ）によって認識される有用な抗原標的としては、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６及びＣＤ５６が挙げられる。該構築物は一般的には、「ＴＣＲ部分」（すなわちＴＣＲα鎖及びβ鎖又はその可変領域又はそのＣＤＲ３）が本明細書に定義された抗原標的を認識するその能力を保持する限り任意の構造を有し得、「抗体部分」は所望の表面抗原又はエピトープに結合し、これにより、それぞれのリンパ球を標的細胞へと動員及び標的化する。このような構築物は有利には、抗原標的を提示している抗原提示細胞（例えば腫瘍細胞）と、リンパ球（例えば細胞障害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を互いに接続する「アダプター」としての役目を果たし得る。このような融合タンパク質の一例は、約５５キロダルトン（ｋＤ）の１本のペプチド鎖上における異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））の原則に従って工学操作された構築物である。したがって、本発明のＴＣＲ構築物は、所望の結合特異性（例えばＣＤ３又はＣＤ５６に対する）を有するｓｃＦｖ（又は他の結合ドメイン）に連結された、本明細書に記載のような少なくとも１つのＴＣＲ抗原結合ドメイン（例えば互いに融合したＴＣＲ可変α鎖及び可変β鎖）を含み得る。ｓｃＦｖ（又は他の結合ドメイン）は、例えばＣＤ３受容体を介してＴ細胞に又はＮＫ細胞活性化のためにＣＤ５６に結合し、その他は、腫瘍細胞上に特異的に発現された抗原標的を介して腫瘍細胞に結合する。また、本明細書では、本明細書に記載のような少なくとも１つのＴＣＲ抗原結合ドメイン、ｓｃＦｖ（又は他の結合ドメイン）、及び、例えば体内の作用部位に該構築物を標的化させるためのさらに他のドメイン（例えばＦｃドメイン）を含む、トリボディーズも考えられる。
【００６０】
単離形
本発明のＴＣＲは、「単離された」又は「実質的に純粋な」形態で提供され得る。本明細書において使用される場合の「単離された」又は「実質的に純粋な」は、ＴＣＲが、その産生環境の成分から同定、分離、及び／又は回収され、これにより「単離された」ＴＣＲは、その治療使用又は診断使用を妨害する可能性のあるその産生環境からの他の混入成分を含まないか又は実質的に含まないことを意味する。混入成分としては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が挙げられ得る。したがって、「単離された」ＴＣＲは、これらの混入成分を除去するか又は実質的に除去する少なくとも１回の精製工程によって調製されるだろう。前記の定義は、必要な変更を加えて、「単離された」ポリヌクレオチド／核酸に対して同等に適用可能である。
【００６１】
可溶化形
本発明のＴＣＲは、可溶化形で提供され得る。可溶性ＴＣＲは、可溶性ＴＣＲによって認識される抗原標的を発現している例えばがん細胞に対して、標的治療剤又はエフェクター細胞を特異的に標的化させる、診断ツール、及び担体又は「アダプター」として有用である。可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）は典型的には、ＴＣＲα鎖及び／若しくはβ鎖、又はその可変領域若しくはＣＤＲを含み、場合によりジスルフィド結合を介して安定化されているか、又は例えば本発明のＴＣＲ構築物の内容で上記されているような適切なリンカー分子を介して共有結合で連結されている断片又は構築物であろう。それらは典型的には、例えば膜貫通領域を含まないだろう。いくつかの環境では、分子の溶解度、並びに／又はα鎖及びβ鎖の正しい折り畳み及び対形成（所望であれば）（特に前記の特色を提供しない組換え宿主において産生される場合）を増強させるために、ポリペプチド配列内にアミノ酸改変を導入してもよい。例えば、産生宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉを使用する場合、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の折り畳み及び対形成は典型的にはインビトロで成し遂げられる。それ故、本発明によるＴＣＲは、例えば、本明細書の何処か他の場所で記載されているような追加のシステイン残基を含み得る。
【００６２】
追加のシステイン橋の他に、他の有用な改変としては、例えば、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖の折り畳み、発現、並びに／又は対形成を増加させるための、Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): e0119559に記載のような、例えばピコルナウイルス由来の配列２Ａのような、ロイシンジッパー及び／又はリボソームスキッピング配列の付加が挙げられる。
【００６３】
改変
本発明のＴＣＲはさらに、以下に記載のような１つ以上の改変を含み得る。以下に記載の改変は典型的には共有結合による改変であり、当技術分野において公知である標準的な技術を使用して成し遂げられ得る。いくつかの環境では、ＴＣＲ内のアミノ酸の改変が、該改変の導入を促進するために必要とされ得る。
【００６４】
標識
本発明のＴＣＲ、特に（可溶性）ＴＣＲは標識されていてもよい。有用な標識は当技術分野において公知であり、場合により様々な長さのリンカーを介して慣用的な方法を使用してＴＣＲ又はＴＣＲ変異体に結合させることができる。「標識」又は「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。一般的に、標識は、それらを検出しようとするアッセイに応じて、様々なクラスに分類される。以下の例には、同位体標識（これは放射性又は重同位体、例えば放射性同位体又は放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉであり得る）；磁気標識（例えば磁気粒子）；酸化還元活性部分；光学色素（発色団、リン光体、及びフルオロフォアを含むがこれらに限定されない）、例えば蛍光基（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン光体）、化学発光基、及びフルオロフォア（これは「低分子」フルオロフォア又はタンパク質性フルオロフォアのいずれかであり得る）；酵素基（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ビオチニル化基；又は二次リポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）が含まれるがこれらに限定されない。ＴＣＲ、ＴＣＲ変異体、又は特に可溶性のＴＣＲ構築物（例えば、本明細書に記載のような少なくとも１つのＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖を含むもの）を診断使用のために意図する場合には、標識が特に考えられる。
【００６５】
機能的部分
本発明のＴＣＲ、特に可溶性ＴＣＲは、例えば、免疫原性を低下させるために、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）、溶解度及び／又は安定性（例えば、タンパク質分解に対する増強された保護による）を増加させるために、並びに／あるいは、血清中半減期を延長させるために、さらに他の機能的部分を付着させることによって改変され得る。
【００６６】
本発明に従って使用するための例示的な機能的部分としては、ヒト体内の他のタンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域又は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））、様々な長さのポリペプチド鎖（例えばＸＴＥＮ技術又はＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））、非タンパク質性ポリマー（様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、又は糖質、例えばヒドロキシエチルデンプン（例えばＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））若しくはポリシアル酸（例えばＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術）のコポリマーを含むがこれらに限定されない）に結合しているペプチド又はタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
他の有用な機能的部分としては、患者の身体において本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するために使用され得る「自殺」又は「安全性スイッチ」が挙げられる。一例は、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235によって記載された誘導性カスパーゼ（ｉＣａｓｐ９）「安全性スイッチ」である。簡潔に言えば、エフェクター宿主細胞は、周知の方法によって、カスパーゼ９ドメインを発現するように改変され、その二量体化は、ＡＰ１９０３／ＣＩＰなどの低分子二量体化薬物に依存し、それにより改変されたエフェクター細胞のアポトーシスが迅速に誘導される。システムは例えば、欧州特許第２１７３８６９（Ａ２）号に記載されている。他の「自殺」「安全性スイッチ」の例は当技術分野において公知であり、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ＣＤ２０の発現、及びその後の抗ＣＤ２０抗体を使用した除去、又はｍｙｃタグ（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）である。
【００６８】
グリコシル化
改変されたグリコシル化パターンを有するＴＣＲも本明細書において考えられる。当技術分野において公知であるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列（例えば、以下に考察されている、特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）及び／又はタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の付着である。結合分子に対するＮ結合グリコシル化部位の付加は簡便には、アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）から選択された１つ以上のトリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって成し遂げられる。Ｏ結合グルコシル化部位は、出発配列への１つ以上のセリン残基又はトレオニン残基による付加又は置換によって導入され得る。
【００６９】
ＴＣＲの別のグルコシル化手段は、タンパク質に対するグリコシドの化学的又は酵素的結合による。使用される結合様式に応じて、糖（群）を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステイン基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン基、トレオニン基、又はヒドロキシプロリン基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン残基、チロシン残基、又はトリプトファン残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させ得る。
【００７０】
同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する糖質部分の除去）は、例えばＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝すことによって化学的に、又はエンドグルコシダーゼ及びエキソグルコシダーゼを使用することによって酵素的に成し遂げられ得る。
【００７１】
薬物抱合体
本発明のＴＣＲ、特に可溶性ＴＣＲに、低分子化合物などの薬物を付加することも考えられ得る。連結は、共有結合を介して、又は正電気力を通してなどの非共有結合的な相互作用を介して成し遂げられ得る。当技術分野において公知である様々なリンカーを、薬物抱合体を形成するために使用することができる。
【００７２】
タグ
本発明のＴＣＲ、特に可溶性ＴＣＲは、それぞれの分子（タグ）の同定、追跡、精製、及び／又は単離を補助する追加ドメインを導入するために改変されていてもよい。このようなタグの非制限的な例としては、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡＴ−タグ、ＨＡ−タグ、ＴＡＰ−タグ、ＧＳＴ−タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ−タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−タグ）、Ｆｌａｇ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、及びその変種（例えば、Ｓｔｒｅｐ ＩＩ−タグ）、Ｈｉｓ−タグ、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタグ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｔ７−タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）−タグ、又はＧＦＰ−タグとして知られるペプチドモチーフを含む。
【００７３】
エピトープタグは、本発明のＴＣＲに取り込まれることのできる有用なタグの例である。エピトープタグは、特異的な抗体の結合を可能とし、それ故、患者の身体又は培養（宿主）細胞内における可溶性ＴＣＲ又は宿主細胞の結合及び移動の同定及び追跡を可能とする、短鎖アミノ酸である。エピトープタグの検出、したがってタグ化ＴＣＲの検出は、多くの異なる技術を使用して達成され得る。このような技術の例としては、免疫組織化学法、免疫沈降法、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット（「ウェスタン」）、及びアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。エピトープタグは、例えば、６〜１５アミノ酸長、特に９〜１１アミノ酸長を有し得る。また、本発明のＴＣＲに１つを超えるエピトープタグを含めることも可能である。
【００７４】
タグはさらに、該タグに特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって本発明のＴＣＲを有する宿主細胞を刺激及び増殖させるために使用され得る。
【００７５】
本発明はさらに、本明細書に記載のＴＣＲをコードしている核酸を提供する。具体的には、ＴＣＲα鎖又はβ鎖、ＴＣＲα鎖又はβ鎖の可変領域、及びＴＣＲのＣＤＲ３α及びＣＤＲ３β、並びに、本発明のＴＣＲの変異体、構築物、及び断片をコードしているポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
【００７６】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、ポリリボヌクレオチド配列及びポリデオキシリボヌクレオチド配列、例えば、各々一本鎖及び／又は二本鎖形で鎖状若しくは環状の改変された又は改変されていないＲＮＡ又はＤＮＡ、又はその混合物（ハイブリッド分子を含む）を含む。したがって、本発明による核酸は、ＤＮＡ（例えばｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、その組合せ又はその誘導体（例えばＰＮＡ）を含む。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、慣用的なホスホジエステル結合又は非慣用的な結合（例えばアミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるような）を含み得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、１つ以上の改変された塩基、例えばトリチル化塩基及び異常な塩基、例えばイノシンも含有し得る。本発明の結合分子がポリヌクレオチドから発現され得る限り、他の改変（化学的改変、酵素的改変、又は代謝的改変を含む）も考えられ得る。ポリヌクレオチドは、本明細書の何処か他の場所で定義されているような単離形で提供されてもよい。ポリヌクレオチドは、調節配列、例えば転写制御配列（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなどを含み得る。
【００７８】
特に、本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０からなる群より選択された参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一である核酸を含むか又はからなるポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
上記のポリヌクレオチドは、例えば改変されたアミノ酸残基をコードしている追加の又は改変されたヌクレオチド配列、コードされているＴＣＲの分泌を指令するためのシグナルペプチド、定常領域、又は本明細書に記載のような他の異種ポリペプチドを含んでいても含んでいなくてもよい。したがって、このようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載の結合分子の融合ポリペプチド、断片、変異体、及び他の誘導体をコードし得る。
【００８０】
また、本発明は、上記の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物も含む。また、本明細書には、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドとを含む組成物も提供され、前記の第一のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のようなＴＣＲα鎖可変領域をコードし、前記の第二のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のようなＴＣＲβ鎖可変領域をコードしている。
【００８１】
本発明の核酸配列は、所望の宿主細胞（例えばヒト白血球）における最適な発現のために；又は、本発明の可溶性ＴＣＲの発現のために特に考えられた細菌細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞における発現のためにコドンが最適化されていてもよい。コドン最適化は、関心対象の配列における、所与の種の高度に発現されている遺伝子において一般的に稀であるコドンを、このような種の高度に発現されている遺伝子において一般的に頻繁であるコドンと交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンと同じアミノ酸をコードしている。したがって、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用頻度、並びにいくつかの所望の配列モチーフ及び所望ではない配列モチーフの存在に依存する。
【００８２】
ベクター
本明細書においてさらに、本明細書に記載のような１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。「ベクター」は、（外来）遺伝子材料を宿主細胞に導入するためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、その宿主細胞で例えば、複製及び／又は発現させることができる。
【００８３】
「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、及びアデノウイルス随伴ベクター（ＡＡＶ）を含む）、ファージ、ファージミド、コスミド、及び人工染色体（ＢＡＣ及びＹＡＣを含む）を包含するがこれらに限定されない。ベクターそれ自体は一般的に、挿入断片（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」としての役目を果たすより長い配列を含む、ヌクレオチド配列、一般的にはＤＮＡ配列である。工学操作されたベクターは典型的には、宿主細胞における自己複製起点（ポリヌクレオチドの安定な発現が所望である場合）、選択マーカー、及び制限酵素切断部位（例えばマルチクローニングサイト、ＭＣＳ）を含む。ベクターはさらに、プロモーター、遺伝子マーカー、レポーター遺伝子、標的化配列、及び／又はタンパク質精製タグを含み得る。当業者には公知であるように、多くの適切なベクターが当業者には公知であり、多くが市販されている。適切なベクターの例は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（2012）に提供されている。
【００８４】
標的化ベクター
標的化ベクターを使用して、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（2012）によって記載のような当技術分野において公知の方法によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むことができる。簡潔に言えば、適切な手段としては、相同的組換え、すなわち組込み部位の配列に特異的に標的化するハイブリッドリコンビナーゼの使用が挙げられる。標的化ベクターは典型的には、相同的組換えに使用される前は環状及び鎖状である。代替選択肢として、外来ポリヌクレオチドは、融合ＰＣＲによって接続されたＤＮＡ断片又は合成により構築されたＤＮＡ断片であり得、これは次いで、宿主細胞に組み込まれる。また、無作為組込み又は非標的化組込みがもたらされる異種組換えを使用することも可能である。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸を含むベクターも提供する。
【００８６】
発現ベクター
本発明のベクターは発現ベクターであってもよい。「発現ベクター」又は「発現構築物」は、適切な宿主細胞における、異種ポリヌクレオチド配列、例えば本発明のＴＣＲをコードしている配列の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳のために使用され得る。このプロセスはまた、本明細書において本発明のＴＣＲの「発現」とも称される。
【００８７】
複製起点、選択マーカー、及び制限酵素切断部位の他に、発現ベクターは典型的には、発現させようとする異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含む。
【００８８】
「調節配列」という用語は、特定の宿主生物又は宿主細胞における（異種）ポリヌクレオチドの作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である核酸配列を指し、したがって、転写調節配列及び翻訳調節配列を含む。典型的には、原核細胞における異種ポリヌクレオチド配列の発現に必要とされる調節配列としては、プロモーター（群）、場合によりオペレーター配列（群）、及びリボソーム結合部位（群）が挙げられる。真核細胞では、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、及び場合によりスプライスシグナルも典型的には必要とされる。さらに、培養培地中への関心対象のポリペプチドの分泌を可能とするために、特定の開始シグナル及び分泌シグナルもベクターに導入してもよい。
【００８９】
核酸は、それが特に同じポリヌクレオチド分子上の別の核酸配列と機能的な関係になるように配置された場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現を発揮することができる場合に異種遺伝子のコード配列と作動可能に連結されている。プロモーターは典型的には、関心対象のポリペプチドをコードしている遺伝子の上流に配置され、該遺伝子の発現を調節している。
【００９０】
哺乳動物宿主細胞の発現のための例示的な調節配列としては、哺乳動物細胞において高いレベルのタンパク質の発現を指令するウイルス配列、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター及び／又はエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマが挙げられる。以前に示されているように、発現ベクターはまた、複製起点及び選択マーカーも含み得る。
【００９１】
以前に記載されているように、本発明のベクターはさらに、１つ以上の選択マーカーを含み得る。真核宿主細胞に使用するに適した選択マーカーとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。他の遺伝子としては、ｄｈｆｒ（メトトレキサート抵抗性）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸抵抗性）、ｎｅｏ（Ｇ−４１８抵抗性）、及びｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン抵抗性）が挙げられる。ベクターの増幅を使用して発現レベルを増加させることができる。一般的に、選択マーカー遺伝子は、発現させようとするポリヌクレオチド配列に対して直接連結されていても、又は同時形質転換によって同じ宿主細胞に導入されていてもよい。
【００９２】
上記を鑑みて、したがって、本発明はさらに、ベクターに挿入された（すなわち含まれる）本明細書に記載の１つ以上のヌクレオチド配列を提供する。具体的には、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明のＴＣＲ、又はそのα鎖若しくはβ鎖、又はα鎖若しくはβ鎖可変ドメイン、又はＣＤＲ３α若しくはＣＤＲ３βをコードしているヌクレオチド配列を含む（複製可能な）ベクターを提供する。
【００９３】
当業者は、例えば、ＴＣＲ発現を目的とした宿主細胞に基づいて、適切な発現ベクターを容易に選択することができるだろう。適切な発現ベクターの例は、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばＭＰ７１ベクター、又はレトロウイルスＳＩＮベクター；及びレンチウイルスベクター又はレンチウイルスＳＩＮベクターである。本発明のＴＣＲをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、例えば、リンパ球に感染することができ、これは続いて、異種ＴＣＲを発現すると考えられる。適切な発現ベクターの別の例は、眠れる森の美女（ＳＢ）トランスポゾントランスポザーゼＤＮＡプラスミド系、すなわちＳＢ ＤＮＡプラスミドである。本発明の核酸及び／又は特に発現構築物はまた、一過性ＲＮＡトランスフェクションによって細胞に導入されてもよい。
【００９４】
天然ＴＣＲ発現のために現在使用されているウイルスベクターは典型的には、１つのベクター内でＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子を、ブタテッショウウイルス由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又は２Ａペプチド配列のいずれかと連結させ、その結果、形質導入された細胞内のウイルスプロモーターの制御下で単一のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が発現される。
【００９５】
宿主細胞
本発明はさらに、本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９６】
様々な宿主細胞を、本発明に従って使用することができる。本明細書において使用する「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載のポリヌクレオチド若しくはベクターのレシピエントとなり得るか又は該レシピエントであった、及び／又は、本発明のＴＣＲを発現する（及び場合により分泌している）細胞を包含する。「細胞」及び「細胞培養液」という用語は互換的に使用され、そうではないと明記されない限り、ＴＣＲの発生源を示す。「宿主細胞」という用語はまた、「宿主細胞株」も含む。
【００９７】
一般的に、「宿主細胞」という用語は原核細胞又は真核細胞を含み、これには、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ラット細胞、マカク細胞、又はヒト細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
上記に鑑みて、したがって、本発明は、とりわけ、本明細書に記載のようなＴＣＲ又はＴＣＲ構築物をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる、ポリヌクレオチド又はベクター、例えば発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチド及び／又はベクターは、当技術分野において公知の慣用的な方法を使用して、例えばトランスフェクション、形質転換などによって宿主細胞に導入することができる。
【０１００】
「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に計画的に導入するプロセスである。一例は、ＲＮＡトランスフェクション、すなわち、ＲＮＡ（例えばインビトロで転写されるＲＮＡ、すなわちｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。該用語は主に、真核細胞におけるウイルスを用いない方法のために使用される。「形質導入」という用語は、ウイルスにより媒介される核酸分子又はポリヌクレオチドの導入を説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは典型的には、材料の取り込みを可能とするために、細胞膜に一過性の孔又は「穴」を開けることを含む。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法を使用して、電気穿孔法によって、細胞のスクイージング（squeezing）によって、又は陽イオン性脂質を材料と混合してリポソームを生成し、これを細胞膜と融合させ、その積荷を内側に蓄積させることによって行なわれ得る。真核宿主細胞をトランスフェクトするための例示的な技術としては、脂質小胞により媒介される取り込み、熱ショックにより媒介される取り込み、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡの共沈降）、マイクロインジェクション、及び電気穿孔法が挙げられる。
【０１０１】
「形質転換」という用語は、細菌細胞への、及びまた動物以外の真核細胞（植物細胞を含む）への、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）のウイルスを用いてない導入を説明するために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜（群）を通したその周囲からの直接的な取り込み及びその後の外来性遺伝子材料（核酸分子）の取り込みから生じる、細菌細胞又は動物以外の真核細胞の遺伝子改変である。形質転換は、人工的な手段によって行なわれ得る。形質転換が起こるためには、細胞又は細菌は、形質転換受容性状態になければならず、これは飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する期間限定の応答として起こり得る。原核細胞の形質転換のための技術としては、熱ショックにより媒介される取り込み、インタクトな細胞と細菌プロトプラストの融合、マイクロインジェクション、及び電気穿孔法が挙げられ得る。植物形質転換のための技術としては、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）によるアグロバクテリウムにより媒介される導入、急速に噴射されるタングステン又は金ミクロ射出粒子、電気穿孔法、マイクロインジェクション、及びポリエチレングリコールにより媒介される取り込みが挙げられる。
【０１０２】
上記を鑑みて、したがって、本発明はさらに、本明細書に記載のような少なくとも１つのポリヌクレオチド配列及び／又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１０３】
本発明のＴＣＲの発現のために、挿入されたポリヌクレオチド配列の発現を調節し、並びに／又は所望のように遺伝子産物（すなわちＲＮＡ及び／又はタンパク質）を修飾及びプロセシングする宿主細胞が選択され得る。遺伝子産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は、ＴＣＲの機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞が、遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有する。産物の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機序を有する真核宿主細胞を使用し得る。
【０１０４】
本明細書において、（ａ）特に可溶形の本発明のＴＣＲを発現及び得るための宿主細胞（「産生宿主細胞」）、及び（ｂ）本発明のＴＣＲを発現しかつエフェクター機能を有する宿主細胞（「エフェクター宿主細胞」）を提供することが考えられる。このような「フェクター宿主細胞」は治療適用に特に有用であり、それを必要とする被験者への投与のために考えられる。好ましい「エフェクター宿主細胞」としては、リンパ球、例えば細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δＴ細胞が挙げられる。
【０１０５】
「産生宿主細胞」
細胞
本発明の可溶性ＴＣＲの発現のために使用される「産生宿主細胞」は好ましくは、多量の組換えタンパク質を発現することができる。
【０１０６】
「産生宿主細胞」として使用され得る例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲマイナスＣＨＯ細胞、例えばＤＧ４４及びＤＵＸＢＩ １細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎臓細胞）、及びＳＰ２細胞（マウス骨髄腫細胞）が挙げられる。他の例示的な宿主細胞株としては、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（マウス腎臓株）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ＩｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、及びＲＡＪＩ（ヒト白血球）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は典型的には、業者、アメリカン・ティッシュ−・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）又は公開されている文献から入手可能である。
【０１０７】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞などの哺乳動物以外の細胞も容易に入手可能であり、これもまた、上記のような「産生宿主細胞」として使用することができる。例示的な細菌宿主細胞としては、腸内細菌科、例えば大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ；バチルス科、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌；連鎖球菌；及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）が挙げられる。他の宿主細胞としては、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）が挙げられる。昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０８】
前記によると、考えられる発現系（すなわち、上記のような発現ベクターを含む宿主細胞）としては、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ、枯草菌）などの微生物；組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス、ピキア）；組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させたか又は組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系が挙げられる。哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーター（ＭＩＥＰ）プロモーター）を含有している組換え発現構築物を有する哺乳動物発現系がしばしば好ましい。適切な哺乳動物宿主細胞は、公知の細胞株（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）から選択され得るが、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δＴ細胞などのリンパ球を使用することも考えられる。
【０１０９】
前記によると、本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載のようなＴＣＲの発現を引き起こす条件下で宿主細胞（すなわち産生宿主細胞）をインキュベートする工程、及び（ｉｉ）該ＴＣＲを精製する工程を含む、該ＴＣＲを生成及び得るための方法を提供する。
【０１１０】
培養
発現ベクターを有する宿主細胞を、本明細書に提供されているＴＣＲ、特に本明細書の何処か他の場所で記載されているようなα鎖及び／又はβ鎖の生成に適した条件下で増殖させ、α鎖及び／又はβ鎖のタンパク質合成についてアッセイする。二本鎖ＴＣＲの発現のために、α鎖及びβ鎖の両方をコードしているベクターを、完全分子の発現のために宿主細胞において共発現させ得る。
【０１１１】
精製
本発明のＴＣＲが一旦発現すると、それは、当技術分野において公知である任意の精製法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー（例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、アフィニティクロマトグラフィー、特にプロテインＡ、プロテインＧ、若しくはレクチンアフィニティクロマトグラフィー、サイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製され得る。当業者は、回収しようとするＴＣＲの個々の特徴に基づいて適切な精製法を容易に選択することができるだろう。
【０１１２】
「エフェクター宿主細胞」
以前に記載されているように、本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、ベクター、又はＴＣＲを含む「エフェクター宿主細胞」を提供する。該エフェクター宿主細胞は、慣用的な方法を使用して、本発明のＴＣＲをコードしている核酸配列を含むように改変され、本明細書に記載のＴＣＲを特に細胞表面上に発現すると考えられる。本発明の目的のために、「本発明のＴＣＲを発現している改変された宿主細胞」は一般的に、例えば添付の実施例に記載のようなＲＮＡトランスフェクションによって、本発明によるＴＣＲを発現するように処理又は改変された（エフェクター又は産生）宿主細胞を指す。本明細書の何処か他の場所で記載されているような、他の改変法又はトランスフェクション法又は形質導入法も考えられる。したがって、「改変された宿主細胞」という用語は、本発明のＴＣＲを好ましくは発現している「トランスフェクトされた」、「形質導入された」及び「遺伝子工学操作された」宿主細胞を含む。
【０１１３】
好ましくは、このような「（改変された）エフェクター宿主細胞」（特に「（改変された）エフェクターリンパ球」）は、ＴＣＲがその特異的な抗原標的に結合すると、細胞内シグナル伝達を通してエフェクター機能を媒介することができる。このようなエフェクター機能としては、例えば、パーフォリン（標的細胞膜に穴を作る）、グランザイム（細胞内で作用してアポトーシスをトリガーするプロテアーゼである）の遊離、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓを有する標的細胞においてアポトーシスを活性化する）の発現、並びにサイトカイン、好ましくはＴｈ１／Ｔｃ１サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αの遊離が挙げられる。したがって、処置される予定の被験者におけるその抗原標的を認識し結合することができる本発明のＴＣＲを発現するように工学操作されたエフェクター宿主細胞は、上記のエフェクター機能を実施し、これにより、標的（例えばがん）細胞を死滅させると考えられる。標的細胞の細胞溶解は、例えば、ＴＣＲのトランスフェクトされたレシピエントＴ細胞との共培養中の蛍光標識された標的細胞の消失を検出するＣＴＬ蛍光死滅アッセイ（ＣＴＬ、米国）を用いて評価され得る。
【０１１４】
上記に鑑みて、エフェクター宿主細胞は好ましくは、機能的ＴＣＲ（すなわち、これは典型的には本明細書に記載のＴＣＲα鎖及びβ鎖を含む）；並びにまた、シグナル伝達サブユニットＣＤ３γ、δ、ε、及びζ（ＣＤ３複合体）を発現している。さらに、共受容体のＣＤ４又はＣＤ８の発現も望ましくあり得る。一般的に、抗原の結合、受容体の活性化、及び下流シグナル伝達に関与する必要とされる遺伝子（例えばＬｃｋ、ＦＹＮ、ＣＤ４５、及び／又はＺａｐ７０）を有するリンパ球、すなわちＴ細胞は、エフェクター宿主細胞として特に適している。しかしながら、「結合ドメイン」として本発明のＴＣＲを発現しているが、ＣＤ３シグナル伝達サブユニット及び／又は前記の下流シグナル伝達分子を含まない（すなわち、本明細書に記載の抗原標的を認識することはできるが、ＣＤ３及び／又は前記の下流シグナル伝達分子によって媒介されるエフェクター機能は有さない）エフェクター宿主細胞も本明細書において考えられる。このようなエフェクター細胞は、本明細書に記載の抗原標的を認識することができ、かつ場合によりＣＤ３シグナル伝達及び／又は前記の下流シグナル伝達分子のシグナル伝達に関連していない他の機能を奏功することができると考えられる。例としては、本願発明のＴＣＲを発現し、そして例えば、抗原標的の標識の際に細胞障害性顆粒を放出することができるＮＫ又はＮＫＴ細胞が挙げられる。
【０１１５】
したがって、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラル―キラー（ＮＴ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δＴ細胞は、有用なリンパ球エフェクター宿主細胞であると考えられる。本発明の組換えＴＣＲを発現しているこのようなリンパ球はまた、本明細書において「改変されたエフェクターリンパ球」とも呼ばれる。しかしながら、当業者は、一般的に所望のエフェクター機能をもたらすＴＣＲシグナル伝達経路の任意の成分を、当技術分野において公知である組換え遺伝子工学操作法によって適切な宿主細胞に導入することができることを容易に認めるだろう。
【０１１６】
エフェクター宿主細胞、特にリンパ球、例えばＴ細胞は、処置される予定の被験者から得られ、本発明のＴＣＲを発現するように形質転換又は形質導入された自己宿主細胞であり得る。典型的には、ＴＣＲの組換え発現は、添付の実施例に記載のようなウイルスベクターを使用することによって達成されるだろう。患者から細胞を入手及び単離するための技術は、当技術分野において公知である。
【０１１７】
以前に記載されているように、本明細書において提供されるエフェクター宿主細胞は、治療適用のために特に考えられる。治療効力を高めるためには、宿主細胞のさらなる遺伝子改変が望ましくあり得る。例えば、「エフェクター宿主細胞」として自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する場合、適切な追加の改変としては、内因性ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、及び／又はＰＤ−１の発現のダウンレギュレーション；並びに／又は、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７などの共刺激分子の増幅が挙げられる。前記の遺伝子改変を達成するための手段及び方法は、当技術分野において記載されている。
【０１１８】
宿主細胞の標的化ゲノム遺伝子工学操作法は当技術分野において公知であり、これには、ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子ノックダウンの他に、いわゆる「プログラム可能なヌクレアーゼ」、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びとりわけKim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334（2014）に論評されている細菌のクラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰返し（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムから誘導されるＲＮＡ誘導工学操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が挙げられる。例えば、ＴＡＬＥＮなどのプログラム可能なヌクレアーゼを使用して、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、又は内因性ＴＣＲなどの「所望ではない」タンパク質をコードするＤＮＡ領域を切断し、これにより、それらの発現を減少させることができる。Ｔ細胞を（エフェクター）宿主細胞として使用する場合、内因性ＴＣＲのダウンレギュレーションは、内因性及び外因性ＴＣＲα鎖／β鎖の所望ではない「誤対合」を減少させる利点を有する。
【０１１９】
医薬組成物／診断
本発明はさらに、１つ以上の活性薬剤として、本明細書に記載のようなＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞、並びに場合により１つ以上の薬学的賦形剤（群）を含む医薬組成物を提供する。したがって、医薬組成物又は医薬品の製造のための該ＴＣＲ、核酸、ベクター、及び宿主細胞の使用も本明細書において考えられる。
【０１２０】
「医薬組成物」という用語は特に、ヒトへの投与に適した組成物を指す。しかしながら、ヒト以外の動物への投与に適した組成物も一般的に該用語によって包含される。
【０１２１】
医薬組成物及びその成分（すなわち活性薬剤及び場合により賦形剤）は好ましくは、薬学的に許容可能であり、すなわち、レシピエントにおいて望ましくない局所作用又は全身作用を全く引き起こすことなく、所望の治療効果を惹起することができる。本発明の薬学的に許容される組成物は、例えば、無菌であり得る。具体的には、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より特定するとヒトにおける使用のために、規制当局又は他の一般的に認められている薬局方によって承認されていることを意味し得る。
【０１２２】
前記に記載の活性薬剤（例えば、宿主細胞又はＴＣＲ）は好ましくは、医薬組成物中に治療有効量で存在する。「治療有効量」によって、所望の治療効果を惹起する活性薬剤の量を意味する。治療効力及び毒性は、標準的な手順によって、例えば細胞培養液又は試験動物において、例えばＥＤ５０（個体群の５０％に治療効果がある用量）及びＬＤ５０（個体群の５０％に致死的である用量）で決定され得る。治療効果と毒性作用との間の用量比は治療指数であり、これはＥＤ５０／ＬＤ５０比として表現され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。
【０１２３】
用量
ＴＣＲポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞の正確な用量は、公知の技術を使用して当業者によって確認可能であろう。適切な用量は、十分な量の本発明の活性薬剤を提供し、好ましくは治療に有効であり、すなわち、所望の治療効果を惹起する。
【０１２４】
当技術分野において公知であるように、処置の目的（例えば寛解維持、対、疾患の急性増悪）、投与経路、投与時刻及び投与頻度、製剤、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、疾患状態の重症度、薬物の組合せ（群）、反応過敏性、及び治療法に対する耐容性／応答性のための調整が必要であり得る。例えば本明細書に記載のような可溶性ＴＣＲの適切な用量範囲は、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを使用して決定され得、これにはＥＤ５０が含まれ得る。典型的には、用量は、投与経路に応じて、０．１〜１０００００μgで変化し得、総用量は最大約２ｇであり得る。本発明の活性薬剤の例示的な用量は、約０．０１mg/kg〜約１０mg/kg、約０．１mg/kg〜約１０mg/kg、約１mg/kg〜約１０mg/kg、約１mg/kg〜約５mg/kg、約０．０１mg/kg〜約１mg/kg、又は約０．１mg/kg〜約１mg/kgの範囲内である。特定の用量及び送達法に関する指針は、文献に提供されている。処置は、本発明の活性薬剤の治療有効量の１回投与又は本発明の活性薬剤の治療有効量の複数回の投与を必要とし得ることが認められている。例えば、いくつかの医薬組成物は、特定の組成物の製剤、半減期、及びクリアランス速度に応じて、３〜４日間毎に１回、週１回、又は２週間毎に１回、又は１か月以内に１回投与され得る。
【０１２５】
以前に示されているように、医薬組成物は場合により、１つ以上の賦形剤及び／又は追加の活性薬剤を含み得る。
【０１２６】
賦形剤
「賦形剤」という用語は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、接着防止剤、潤滑剤、保存剤、抗酸化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘度付与剤、表面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定化剤、及び等張化剤を含む。所望の本発明の医薬組成物を調製するために適した賦形剤を選択することは当業者の知識範囲内である。本発明の医薬組成物に使用するための例示的な担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、及び水が挙げられる。典型的には、適切な賦形剤の選択はとりわけ、使用される活性薬剤、処置される予定の疾患、及び医薬組成物の所望の製剤に依存するだろう。
【０１２７】
追加の活性薬剤
本発明はさらに、上記に明記された１つ以上の本発明の活性薬剤（例えば、宿主細胞又はＴＣＲ構築物）と、処置される予定の疾患の治療及び／又は予防に適した１つ以上の追加の活性薬剤とを含む、医薬組成物を提供する。組合せに適した活性成分の好ましい例としては、公知の抗がん薬、例えばシスプラチン、マイタンシン誘導体、ラケルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ポルフィマーナトリウム（sorfimer sodium）、フォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、アウリスタチンＥ、ビンクリスチン、及びドキソルビシン；並びに、ペプチド細胞毒素、例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼ；放射性核種、例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５、及びアスタチン２１３；プロドラッグ、例えば抗体に指向する酵素プロドラッグ；免疫刺激剤、例えばＩＬ−２、ケモカイン、例えばＩＬ−８、血小板因子４、悪性黒色腫増殖刺激タンパク質など、抗体又はその断片、例えば抗ＣＤ３抗体又はその断片、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、及びウイルス／細菌ペプチドが挙げられる。
【０１２８】
投与
様々な経路が、本発明による医薬組成物の投与のために適用可能である。典型的には、投与は非経口的に達成されるだろう。非経口送達法としては、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、又は鼻腔内投与が挙げられる。
【０１２９】
製剤
本発明の医薬組成物は、とりわけ、使用される活性薬剤（例えば可溶性ＴＣＲ）に応じて様々な剤形で、例えば固形剤、液剤、気体剤形、若しくは凍結乾燥剤形で製剤化され得、とりわけ、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、散剤、錠剤、液剤、エアゾール、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳化剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、若しくは液体エキス剤の剤形で、又は、所望の投与法に特に適した剤形で製剤化され得る。医薬品を製造するためのそれ自体公知のプロセスは、Remington's Pharmaceutical Sciences（Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012）第２２版に示され、これは、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和（levigating）、乳化、カプセル化、封鎖（entrapping）又は凍結乾燥プロセスを含み得る。例えば、本明細書に記載のような宿主細胞又は可溶性ＴＣＲを含む医薬組成物は典型的には、液体剤形で提供され、好ましくは薬学的に許容される緩衝液を含む。
【０１３０】
本発明の医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、示された容態の処置のためにラベルを貼ることができる。このようなラベルは、例えば、投与量、投与頻度、及び投与法を含むだろう。
【０１３１】
処置
前記を鑑みて、したがって、本発明は、医薬品としての使用のための本明細書に記載のようなＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞を提供する。
【０１３２】
ＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞は一般的に、疾患又は障害の処置、検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療のために使用され得る。その全ての文法形の「処置」という用語は、それを必要とする被験者の治療的又は予防的処置を含む。「治療的処置又は予防的処置」は、臨床徴候及び／又は病的徴候の完全予防を目指した予防的処置、あるいは、臨床徴候及び／又は病的徴候の回復又は寛解を目指した治療的処置を含む。したがって、「処置」という用語はまた、疾患の回復又は予防も含む。
【０１３３】
「被験者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」という用語は本明細書において、療法が望まれる任意の被験者、特に哺乳動物被験者を指すために互換的に使用される。哺乳動物被験者としては一般的に、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが挙げられる。しかしながら、本明細書において提供されるＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び医薬組成物は、ヒト被験者、特にＨＬＡ−Ａ２陽性のヒト被験者の処置のために特に考えられることが容易に理解されるだろう。
【０１３４】
直接投与
療法のために、本発明のＴＣＲ、特に本発明の可溶性ＴＣＲ、核酸、ベクター（例えばウイルスベクター）、又は宿主細胞を、それを必要とする被験者に直接投与することができる。したがって、本発明は、がんの検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療の方法に使用するための、ＴＣＲ、核酸、ベクター、又は宿主細胞を提供する。該方法は、（ａ）本発明の（ｉ）ＴＣＲ、（ｉｉ）核酸、（ｉｉｉ）ベクター、（ｉｖ）宿主細胞、及び／又は（ｖ）医薬組成物のうち１つ以上を準備する工程；並びに（ｂ）（ｉ）〜（ｖ）のうち１つ以上をそれを必要とする被験者に投与する工程を含み得る。場合により、該方法は、がん療法のさらに他の工程、例えば放射線療法、又は１つ以上の抗がん剤の投与を含み得る。
【０１３５】
エクスビボでの処置
本発明による処置はまた、（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料はリンパ球を含む）；（ｂ）本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞、及び／又は医薬組成物のうち１つ以上を準備する工程、（ｃ）工程（ｂ）の（ｉ）〜（ｖ）のうち１つ以上を工程（ａ）のリンパ球に導入し、これにより、改変されたリンパ球を得る工程、（ｄ）工程（ｃ）の改変されたリンパ球をそれを必要とする被験者又は患者に投与する工程を含み得る。
【０１３６】
工程（ａ）において提供されるリンパ球は、前記に記載のような「エフェクター宿主細胞」であると特に考えられ、有利にはＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞から選択され；以前の工程（ａ'）において被験者の試料（特に血液試料）から当技術分野において公知な慣用的な方法によって得ることができる。しかしながら、本発明のＴＣＲを好ましくは発現することができ、本明細書に記載のような所望の生物学的エフェクター機能を発揮する他のリンパ球を使用することも考えられる。さらに、該リンパ球は典型的には、被験者の免疫系との適合性のために選択され、すなわち、該リンパ球は好ましくは免疫応答を惹起しないだろう。例えば、「遍在的レシピエント細胞」、すなわちインビトロで成長及び増殖させることのできる所望の生物学的エフェクター機能を発揮する遍在的な適合性のリンパ球を使用することが考えられる。したがって、このような細胞の使用は、工程（ａ）における被験者自身のリンパ球を入手及び準備する必要性がないだろう。
【０１３７】
エクスビボでの工程（ｃ）の導入は、本明細書に記載の核酸又はベクターを電気穿孔法を介してリンパ球に導入することによって、又は、エフェクター宿主細胞の内容で以前に記載されているようなレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターでリンパ球を感染させることによって実施され得る。他の考えられる方法としては、リポソームなどのトランスフェクション試薬の使用、すなわち一過性ＲＮＡトランスフェクションが挙げられる。例えば（レトロ）ウイルスベクター又は一過性ＲＮＡトランスフェクションによる（初代）Ｔ細胞への抗原特異的ＴＣＲ遺伝子の導入は、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞を作製し、続いてそれをドナーに再導入し、そこでそれらは該抗原を発現している腫瘍細胞を特異的に標的化及び破壊するための有望なツールを示す。本発明では、該腫瘍関連抗原は、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８、特にそのＨＬＡ−Ａ＊０２結合形である。
【０１３８】
上記に鑑みて、したがって、本発明のさらなる態様は、改変されたリンパ球の作製のための、本明細書の何処か他の場所に記載されているようなＴＣＲ、核酸配列、ベクター、及び／又は宿主細胞の使用である。例えば核酸及びベクターをリンパ球に導入するための手段及び方法は、本明細書の何処か他の場所に記載されている。
【０１３９】
診断用組成物
本発明はまた、１つ以上の診断剤（群）として、本明細書に記載のようなＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞を含む、診断用組成物を提供する。典型的には、該診断剤は、その抗原標的への結合を検出するための手段、例えば本発明のＴＣＲ構築物の内容で記載されているような標識を含むだろう。宿主細胞に関しては、例えば、抗原を認識すると遊離する色素又は造影剤を（細胞性顆粒の代わりに）含む、改変された宿主細胞を使用することが考えられる。
【０１４０】
使用
本発明は、インビボ又はインビトロで成し遂げられ得る、被験者におけるがんを検出、診断、及び／又は予後予測するための前記に記載の診断剤の使用を考える。
【０１４１】
したがって、本発明は、インビボで被験者におけるがんを検出、診断、及び／又は予後予測するのに使用するための診断用組成物を提供し、該組成物は、診断剤として、本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞を含む。該方法は典型的には、（ａ）該診断剤を被験者に投与する工程、及び（ｂ）該診断剤のその抗原標的への結合を検出する工程を含む。
【０１４２】
さらに、本発明は、インビトロで被験者におけるがんを検出、診断、及び／又は予後予測する方法を提供する。したがって、本発明はまた、（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料は１つ以上の細胞を含む）；（ｂ）該試料を、本発明のＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞と接触させ；これにより、複合体を形成する工程、並びに（ｃ）該複合体を検出する工程を含む、被験者におけるがんの存在を検出する方法を提供する。該複合体は、診断剤のその抗原標的への結合を示し、該抗原標的を発現している（がん）細胞の存在を示すと考えられる。
【０１４３】
どちらの方法でも、診断剤のその抗原標的への結合は、当技術分野において公知である慣用的な方法を使用して検出可能であり、とりわけ、使用される具体的な診断剤に依存する。本発明の診断剤に結合させることのできる適切な標識は、標識されたＴＣＲ構築物に関する章に例示されている。改変されたリンパ球を作製するための使用。
【０１４４】
本明細書において使用する「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」という単数形は、内容から明らかにそうではないと示されない限り複数の対象物も含むことが注記されなければならない。したがって、例えば、「試薬」への言及は、１つ以上のこのような異なる試薬を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法について改変又は置き換えられ得る当業者には公知な等価な工程及び方法への言及も含む。
【０１４５】
特記しない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、シリーズの中の全ての要素を指すと理解されたい。当業者は、単に慣用的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様に対する多くの均等物を認識するか、又は確認することができるだろう。このような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【０１４６】
「及び／又は」という用語は本明細書において使用される場合にはいつでも、「及び」、「又は」及び「該用語によって接続される要素の全ての組合せ又は任意の他の組合せ」の意味を含む。
【０１４７】
本明細書において使用する「約」又は「およそ」という用語は、所与の数値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、それはまた具体数も含み、例えば「約２０」は２０を含む。
【０１４８】
「より少ない」又は「より多い」という用語は具体数を含む。例えば、２０より少ないは、２０未満か又はそれに等しいことを意味する。同様に、平均より大きいか又はより高いは、それぞれ、それより大きいか若しくは等しいか、又はより高いか若しくは等しいことを意味する。
【０１４９】
本明細書及びそれに続くクレームの全体を通して、内容から別様であることが必要とされない限り、「含む（comprise）」という単語及び「含む（comprises）」及び「含んでいる」などの変化形は、記載の整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群を排除するものではないと理解されるだろう。本明細書において使用する「含んでいる（comprising）」という用語は、「含有している」若しくは「含んでいる（including）」という用語、又は本明細書において使用する場合には時には「有している」という用語と置き換えることができる。
【０１５０】
本明細書において使用する「からなる」は、クレームの構成要件に明記されていないあらゆる要素、工程、又は成分を排除する。本明細書において使用する「実質的にからなる」は、クレームの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。
【０１５１】
本明細書における各々の場合において、「を含んでいる」、「実質的にからなる」及び「からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかと交換することができる。
【０１５２】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、材料、試薬、及び物質に限定されず、したがって変更され得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲はクレームのみによって定義される。
【０１５３】
本明細書の文書全体に引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学文献、製造業者の仕様書、説明書などを含む）（上記又は下記）はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。この中のいずれも、本発明が先行発明を理由としてこのような開示に先んじる権利がないことの承認であると捉えられるものではない。参照により組み込まれた材料が本明細書と相反するか又は矛盾する範囲で、明細書はあらゆるこのような材料を取り替えるだろう。
【０１５４】
本発明及びその利点のより良い理解は、説明のためだけに提供されている以下の実施例から得られるだろう。実施例は、いずれにしても本発明の範囲を限定するものではない。
【０１５５】
本発明は以下によっても特徴付けられる。
１．（ｉ）CAVHSTAQAGTALIF（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか又はからなるＴＣＲα鎖可変領域のＣＤＲ３、及び／あるいは
（ｉｉ）CASSTHRGQTNYGYTF（配列番号２）のアミノ酸配列、又は配列番号２に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか又はからなるＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
２．  前記ＴＣＲは、X1LX2GLDX3LL（配列番号３１）のアミノ酸配列内に含まれるエピトープ又はそのＭＨＣ結合形、好ましくはVLDGLDVLL（配列番号３２）のアミノ酸配列内に含まれるエピトープ又はそのＭＨＣ結合形に結合することができる、項目１記載のＴＣＲ。
３．（ｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖可変領域、及び／又は
（ｉｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖可変領域
を含む、項目１又は２のいずれかに記載のＴＣＲ。
４．（ｉ）ＴＣＲα鎖定常領域、及び／又は
（ｉｉ）ＴＣＲβ鎖定常領域
をさらに含む、項目１〜３のいずれかに記載のＴＣＲ。
５．（ｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、若しくは配列番号１３から選択されたアミノ酸配列、又は、配列番号７、１１、９、若しくは１３に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲα鎖；及び／又は
（ｉｉ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４から選択されたアミノ酸配列、又は、配列番号８、１０、１２、若しくは１４に対して少なくとも８０％の同一率、より好ましくは少なくとも８５％の同一率、より好ましくは９０％若しくは９５％の同一率を有するアミノ酸配列を含むか若しくはからなるＴＣＲβ鎖
を含む、項目１〜４のいずれかに記載のＴＣＲ。
６．  前記ＴＣＲが、天然ＴＣＲ、ＴＣＲ変異体、ＴＣＲ断片、又はＴＣＲ構築物から選択される、項目１〜５のいずれかに記載のＴＣＲ。
７．  ＴＣＲヘテロ二量体又は多量体を形成するように互いに共有結合で連結された少なくとも１本のＴＣＲα鎖（群）及び少なくとも１本のＴＣＲβ鎖（群）を含む、項目６記載のＴＣＲ構築物。
８．  場合により少なくとも１つのリンカーをさらに含む、Ｆｃ受容体；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭをはじめとする、Ｆｃドメイン；ＩＬ−２又はＩＬ−１５をはじめとするサイトカイン；毒素；抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ１６抗体、又は抗ＣＤ５６抗体、又はその抗原結合断片をはじめとする、抗体又はその抗原結合断片；ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４ドメイン、又はその組合せから場合により選択された１つ以上の融合成分（群）をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載のＴＣＲ。
９．（ｉ）項目１〜４のいずれかに定義されているような少なくとも１本のＴＣＲα鎖；及び
（ｉｉ）項目１〜４のいずれかに定義されているような少なくとも１本のＴＣＲβ鎖、
（ｉｉｉ）リンパ球の表面上の抗原又はエピトープに対して指向された、抗体又は一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）
を含み、
ＴＣＲα鎖（群）及びＴＣＲβ鎖（群）は互いに連結され、場合によりリンカーを介して該抗体又はｓｃＦｖに融合している、項目１〜８のいずれかに記載のＴＣＲ。
１０．  前記抗原が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、又はＣＤ５６から選択される、項目９記載のＴＣＲ。
１１．  少なくとも１つの標識をさらに含む、項目１〜１０のいずれかに記載のＴＣＲ。
１２．  可溶性である項目１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲ。
１３．  項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲをコードしている核酸。
１４．  配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の核酸配列を含む、項目１３記載の核酸。
１５．  項目１３又は１４のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
１６．  項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ、項目１２又は１３記載の核酸配列、又は項目１４記載のベクターを含む、宿主細胞。
１７．  細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、γ／δＴ細胞を含むがこれらに限定されないリンパ球から選択される、項目１６記載の宿主細胞。
１８．（ｉ）前記ＴＣＲの発現を引き起こす条件下で項目１７記載の宿主細胞をインキュベートする工程、
（ｉｉ）該ＴＣＲを精製する工程
を含む、項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲを得るための方法。
１９．（ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸、
（ｉｉｉ）項目１５記載のベクター；及び／又は
（ｉｖ）項目１６若しくは１７のいずれかに記載の宿主細胞、
のうち１つ以上、及び場合により薬学的賦形剤（群）
を含む、医薬組成物又は診断用組成物。
２０．  医薬品としての使用のための、項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ、項目１３若しくは１４記載の核酸、項目１５記載のベクター、及び／又は項目１６若しくは１７記載の宿主細胞。
２１．  がんの検出、診断、予後予測、予防及び／又は治療に使用するための、項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ、項目１３若しくは１４記載の核酸、項目１５記載のベクター、及び／又は項目１６若しくは１７記載の宿主細胞。
２２．  がんの予防及び／又は治療が、
（ａ）（ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）項目１３若しくは１４のいずれかに記載の核酸、
（ｉｉｉ）項目１５記載のベクター；及び／又は
（ｉｖ）項目１６若しくは１７のいずれかに記載の宿主細胞、
（ｖ）項目１９記載の医薬組成物
のうち１つ以上を準備する工程；並びに
（ｂ）（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つをそれを必要とする被験者に投与する工程
を含む、項目２１の使用のためのＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞。
２３．  がんの予防及び／又は治療が、
（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料はリンパ球を含む）；
（ｂ）（ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）項目１３若しくは１４のいずれかに記載の核酸、
（ｉｉｉ）項目１５記載のベクター；及び／又は
（ｉｖ）項目１６若しくは１７のいずれかに記載の宿主細胞、
（ｖ）項目１９記載の医薬組成物
のうち１つ以上を準備する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の（ｉ）〜（ｖ）の１つ以上を工程（ａ）のリンパ球に導入し、これにより改変されたリンパ球を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）の改変されたリンパ球を、それを必要とする被験者又は患者に投与する工程
を含む、項目２１の使用のためのＴＣＲ、核酸、ベクター、及び／又は宿主細胞。
２４．（ａ）被験者の試料を準備する工程（該試料は１つ以上の細胞を含む）；
（ｂ）該試料を、
（ｉ）項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ；
（ｉｉ）項目１３若しくは１４のいずれかに記載の核酸、
（ｉｉｉ）項目１５記載のベクター；及び／又は
（ｉｖ）項目１６若しくは１７のいずれかに記載の宿主細胞、
（ｖ）項目１９記載の医薬組成物
と接触させることにより複合体を形成する工程、並びに
（ｃ）該複合体を検出する工程（該複合体の検出は、被験者におけるがんの存在の指標である）
を含む、インビトロにおいて被験者におけるがんの存在を検出する方法。
２５．  改変されたリンパ球を生成するための、項目１〜１２のいずれかに記載のＴＣＲ、項目１３若しくは１４記載の核酸、及び／又は項目１５記載のベクターの使用。
【０１５６】
実施例
略称及び記号
【表１】
0006989138.tif 000002
【０１５７】
実施例１：ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの単離
本発明者らは、任意の所望のＭＨＣ拘束性及び抗原特異性を有するＴ細胞クローンを単離するためのインビトロにおけるプライミングアプローチを使用した。プライミングシステムは、抗原提示細胞として成熟樹状細胞（ｍＤＣ）及び応答細胞として自己ＣＤ８＋の豊富なＴ細胞を使用する。配列番号３３に参照されているような完全長ヒトＰＲＡＭＥアミノ酸配列をコードしているインビトロで転写されるＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）は、特異的な抗原の発生源としての役割を果たす。ｉｖｔＲＮＡは、ｍＤＣに電気穿孔された後、完全長タンパク質に翻訳され、これは続いてプロセシングされｍＤＣのＭＨＣ分子によってペプチドとして提示される。同じドナーに由来するｉｖｔＲＮＡのトランスフェクトされたｍＤＣとＴ細胞のインビトロにおける共培養により、対応するＴＣＲの発生源としての役目を果たす抗原特異的Ｔ細胞が新規に誘導される。抗原特異的Ｔ細胞は様々な方法によって強化され得、これは限界希釈法又はＦＡＣＳに基づいた単一細胞播種によってクローニングされる。
【０１５８】
実施例１．１：成熟樹状細胞を使用したプライミングアプローチ
樹状細胞による高親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のプライミングは、以下のプロトコールに従って自己ＭＨＣ分子によるペプチド提示を使用して成し遂げられた（図１）：
・ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＰＲＡＭＥプライミング
・ＤＣ用の適切な成熟カクテルを使用して産生された８日目のｍＤＣ。
・ＡＰＣの積載：ｉｖｔＲＮＡ。
・ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＲＰＡＭＥ１００〜１０８多量体を介した強化
・ＦＡＣＳ技術を使用した単一細胞選別
【０１５９】
実施例２：機能／特異性の分析
所望のＰＲＡＭＥエピトープ（ＲＰＡＭＥ１００〜１０８）を認識する候補Ｔ細胞クローン（Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９）の同定後、機能及び特異性に関する完全な特徴付けが実施された。分析は、様々なヒト腫瘍細胞株との共培養液中の単離されたＴ細胞クローン（Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９）のサイトカイン分泌パターン、クローンが様々な標的細胞を特異的に認識する能力、クローンの機能的結合力、並びにＴ２及び腫瘍細胞に対する細胞障害性を含んでいた。
【０１６０】
実施例２．１：元来のＴ細胞クローンＴ４．８−１−２９の分析
実施例２．１．１：ポリサイトカイン分析
実験の設計図：ペプチドの積載されたＴ２細胞による刺激
【０１６１】
サイトカイン遊離は、以下のプロトコールに従って測定された：
・ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−４、及びＩＬ−１βを検出する、マルチプレックス（登録商標）サイトカイン分析が実施された。
・細胞の刺激：飽和量（１０−５Ｍ）のＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチド（「ＶＬＤペプチド」）又は無関係のＰＲＡＭＥ３００〜３０９、すなわちALYVDSLFFLペプチド（「ＡＬＹペプチド」、配列番号２３０）の積載されたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性）。
・関係のあるペプチド又は無関係のペプチドの積載されたＴ２細胞とＴ細胞の共培養液の上清を２４時間後に収集し、続いて、マルチプレックス（登録商標）サイトカイン分析を使用して測定した。
【０１６２】
結果
・候補クローンは、バックグラウンドレベルを上回るＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−α（Ｔｈ１／Ｔｃ１サイトカイン）を分泌した。サイトカイン発現パターンは、良好な抗腫瘍エフェクター機能に関連したＴｈ１表現型を反映する（図２）。
・ＩＬ−５及びＩＬ−１３（Ｔｈ２／Ｔｃ２サイトカイン）分泌は検出されなかった（n.d.）。
【０１６３】
実施例２．２：腫瘍細胞の認識
実験の設計図：腫瘍細胞株による刺激
・ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを使用して、一連のヒト腫瘍細胞株を用いての刺激後のサイトカイン分泌を評価した（ＰＲＡＭＥの発現状態を、NanoString nCounter（登録商標）分析によって検出した）。
・Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９と、Ｋ５６２−Ａ２、Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｃｏｌｏ−６７８、６４７−Ｖ及びＳｕＤＨＬ−６（全てＨＬＡ−Ａ＊０２陽性）との共培養から最大２４時間後に上清を収集した。特異的なＩＦＮ−γ分泌を、標準的なＥＬＩＳＡを使用して評価した。
・標的細胞：
○Ｋ５６２−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○Ｍｅｌ−６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○Ｃｏｌｏ−６７８（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）
○６４７−Ｖ（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）
○ＳｕＤＨＬ−６（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）
【０１６４】
結果
・Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９は、ＰＲＡＭＥ陽性、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株Ｋ５６２−Ａ２、及びＭｅｌ−６２４．３８（陽性対照：ペプチドでパルスされたＴ２細胞）との共培養液中において高いＩＦＮ−γ分泌を示した。
・ＰＲＡＭＥ陰性、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株は全く、Ｔ細胞クローンＴ４．８（陰性対照；n.d.、検出されず）によって認識されなかった。
・ＨＬＡ−Ａ＊０２及びＰＲＡＭＥを発現している腫瘍細胞株のみが、自己拘束性Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９によって認識され、これにより抗原特異性が示された（図３）。
【０１６５】
実施例２．３：機能的結合力
実験の設計図：ペプチドでパルスされたＴ２細胞を用いての刺激
・ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドの認識のための機能的なＴ細胞の結合力を、ペプチドの積載されたＴ２細胞とクローンＴ４．８−１−２９の共培養後のＩＦＮ−γ分泌の検出によって測定した。
・標的細胞：滴定量の外因性ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチド（１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍ）の積載されたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）。
・エフェクター：標的の比（Ｅ：Ｔ）は１：１。
・相対的なＩＦＮ−γ遊離は、最大遊離に対する比率で示される。機能的結合力を規定する最大半量のＩＦＮ−γ分泌は、点線によって示される。
・培養上清を、共培養から約２４時間後に収集し、標準的なＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１６６】
結果
・クローンＴ４．８−１−２９は、約１×１０−９〜１×１０−１０モル/Ｌ［Ｍ］濃度のＰＲＡＭＥ１００〜１０８ペプチドで最大半量のＩＦＮ−γ分泌を示し（２回の独立した実験の平均値）、これはウイルス特異的Ｔ細胞の生理学的範囲内にあり、効率的な抗腫瘍効力にとって望ましい機能的結合力を示すと報告されている（Aleksic, M et al. Eur. J. Immunol.;42 (12):3174-3179）。
・→ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９：約１×１０−９モル/Ｌ［Ｍ］（図４）。
【０１６７】
実施例２．３：トランスジェニックＴ細胞受容体：ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の分析
ＰＲＡＭＥ１００〜１０８特異的Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９が同定されたので、次の工程は、対応するＴＣＲ鎖をコードしているＤＮＡ配列情報の単離、クローニングされたＴＣＲを適切なレシピエントＴ細胞に導入、続いて、ＴＣＲの工学操作されたＴ細胞の機能的分析を含んでいた。
【０１６８】
実施例２．３．１：Ｔ細胞受容体配列の分析
元来のクローンＴ４．８−１−２９のＴＣＲα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列を、社内で次世代型シークエンス（ＮＧＳ−ＴＣＲｓｅｑ）によって分析した。対応するＴＣＲα及びβのＤＮＡ配列をＤＮＡ遺伝子合成（GeneArt、レーゲンスブルク）によって再構築し、ｉｖｔＲＮＡ産生のためにｐＧＥＭベクター骨格に並びに安定な形質導入のためにレトロウイルスベクターにクローニングした。
【０１６９】
実施例２．３．２：トランスジェニックＴＣＲの機能的検証
Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９のＴＣＲ配列をレシピエント細胞に導入
元来のＴ細胞クローンＴ４．８−１−２９のＴＣＲ ＤＮＡ配列を、電気穿孔法によるレシピエントエフェクター細胞の一過性トランスフェクションのために、完全なＴ４．８−１−２９ＴＣＲ配列をコードしているＲＮＡにインビトロで転写したか、又は、これもまた完全なＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９配列をコードしているレトロウイルスベクター構築物を使用することによるエフェクター細胞の安定な形質導入のために使用した。
【０１７０】
実験の設計図：ペプチドでパルスされたＴ２細胞による刺激
・ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞との共培養液中の、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９のトランスフェクトされたレシピエントＴ細胞（ＣＤ８陽性レシピエントＴ細胞クローン＋Ｔ４．８−１−２９ｉｖｔＲＮＡ）の特異的なＩＦＮ−γ分泌を、標準的なＥＬＩＳＡを使用して測定した。
・標的細胞：１０−５ＭのＶＬＤ（関連性のある）ペプチド又は「ＥＬＡペプチド」（無関係の）ペプチド（ELAGIGILTV、ＭｅｌａｎＡ、配列番号２３１）を用いてパルスされたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）。
【０１７１】
結果
・ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９のトランスフェクトされたレシピエントＴ細胞は、関連性のあるペプチドの積載されたＴ２細胞に対する良好な認識を示したが、Ｔ２細胞に無関係のペプチドを積載した場合には全く認識しなかった。
・Ｔ４．８−１−２９のＴＣＲα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列は正しく再構築され、導入遺伝子として良好な機能を示した（図５）。
【０１７２】
実施例２．４：自己ペプチドの認識の分析
実験の設計図：ペプチドの積載されたＴ２細胞との共培養時におけるＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌
１０−５ＭのＰＲＡＭＥ１００〜１０８ＶＬＤペプチド又はＨＬＡ−Ａ＊０２から溶出した遍在的な自己ペプチド（１３１個の自己ペプチド）の積載された、Ｔ２標的細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）と共培養されたクローンＴ４．８−１−２９のＴ細胞受容体を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。
【０１７３】
結果
・クローンＴ４．８−１−２９のＴ細胞受容体を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣは、遍在的な自己ペプチド（陽性対照：ＰＲＡＭＥ１００〜１０８の積載されたＴ２細胞）の積載されたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）と共培養された場合にはＩＦＮ−γの分泌を全く示さず、これによりＴＣＲ４．８−１−２９の高い特異性が反映される（図６）。
【０１７４】
実施例２．５：細胞障害性分析
実験の設計図：ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解
・ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解を、Ｔ４．８−１−２９ＴＣＲを発現しているＣＤ８の豊富なＰＢＭＣとの共培養中の蛍光標識された標的細胞の消失を決定する、ＴＶＡ（商標）蛍光死滅アッセイ（ＣＴＬ、セルラー・テクノロジー有限会社、米国）を使用することによって測定した。
・標的細胞：ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣと共培養された１０−５ＭのＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）（関連性のある）ペプチド又はＳＬＬ（SLLQHLIGL（配列番号２２９）、ＰＲＡＭＥ、無関係）ペプチドを用いて段階的なＥ：Ｔ比でパルスされたＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陰性）。
【０１７５】
結果
・Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣは、低いＥ：Ｔ比でさえ、関連性のある（ＶＬＤ）ペプチドの積載されたＴ２細胞の効率的な溶解を示す。
・関連性のないＳＬＬペプチド（ＰＲＡＭＥ）の積載されたＴ２細胞は、どのＥ：Ｔ比でも溶解されなかった（陰性対照）（図７）。
【０１７６】
実験の設計図：腫瘍細胞の溶解
・腫瘍細胞に対する細胞障害活性を、Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９のトランスジェニックＴＣＲを発現しているＰＢＭＣとの共培養中の蛍光標識された標的細胞の消失を検出する、ＴＶＡ（商標）蛍光死滅アッセイ（ＣＴＬ、セルラー・テクノロジー有限会社、米国）を使用して分析した。
・標的細胞：ヒト腫瘍細胞株Ｋ５６２を実験に使用した。Ｋ５６２細胞を、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２：０１をコードしているｉｖｔＲＮＡ及び／又はヒトＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを使用してトランスフェクトした。ヒトＫ５６２は、内因性ＰＲＡＭＥ発現を示す（ナノストリングによって決定されそして文献に報告されているような）。さらに、ＰＲＡＭＥ発現は、ヒトＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてのＫ５６２細胞のトランスフェクションによって、又はＰＲＡＭＥ１００〜１０８ＶＬＤペプチドの外来的積載によって増加した。
○ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１をコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトされ、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドの積載されたＫ５６２：Ｋ５６２−（ＰＲＡＭＥ＋/Ａ２−）＋Ａ２−ｉｖｔＲＮＡ＋ＶＬＤペプチド（図８Ａ）。
○ＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡを用いて形質導入されたＫ５６２：Ｋ５６２−（ＰＲＡＭＥ＋/Ａ２−）＋ＰＲＡＭＥ−ｉｖｔＲＮＡ（図８Ｂ）。
○ＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡ及びＨＬＡ−Ａ＊０２をコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＫ５６２：Ｋ５６２−（ＰＲＡＭＥ＋/Ａ２−）＋Ａ２−ｉｖｔＲＮＡ（図８Ｃ）。
○ＨＬＡ−Ａ＊０２をコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＫ５６２：Ｋ５６２−（ＰＲＡＭＥ＋/Ａ２−）＋Ａ２−ｉｖｔＲＮＡ＋ＰＲＡＭＥｉｖｔＲＮＡ（図８Ｄ）。
・腫瘍細胞を、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣと段階的なＥ：Ｔ比で共培養した。
【０１７７】
結果
・ＰＲＡＭＥ ｉｖｔＲＮＡを用いてのトランスフェクション、並びに、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現しているＫ５６２細胞へのＶＬＤペプチドの積載は、トランスジェニックＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣによる比溶解を増加させた（図８Ａ〜Ｄ）。
【０１７８】
実施例２．５：ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣによる、腫瘍細胞の認識
実験の設計図：腫瘍細胞株による刺激
・ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを使用して、一連のヒト腫瘍細胞株を用いての刺激後のサイトカイン分泌を評価した（ＰＲＡＭＥの発現状態を、NanoString nCounter（登録商標）分析によって検出した）。
・Ｔ細胞受容体Ｔ４．８−１−２９を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣと、Ｋ５６２−Ｂ３５、Ｋ５６２−Ａ２、Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｃｏｌｏ−６７８、及びＳＫＭＥＬ２３との共培養から最大２４時間後に上清を収集した。特異的なＩＦＮ−γ分泌を、標準的なＥＬＩＳＡを使用して評価した。
・標的細胞：
○Ｋ５６２−Ｂ３５    （ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○Ｋ５６２−Ａ２    （ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○Ｋ５６２−Ａ２    ＶＬＤペプチドが積載された（ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○Ｍｅｌ−６２４．３８    （ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
○ＳｋＭＥＬ２３    （ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、ＰＲＡＭＥ陽性）
【０１７９】
結果
・Ｔ細胞受容体Ｔ４．８−１−２９を発現しているＣＤ８＋の豊富なＰＢＭＣは、ＰＲＡＭＥ陽性、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性腫瘍細胞株Ｋ５６２−Ａ２、さらにＶＬＤペプチドの積載されたＫ５６２−Ａ２との共培養液中では高いＩＦＮ−γ分泌を示し、ＰＲＡＭＥ陽性、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性、Ｍｅｌ−６２４．３８、及びＳｋＭＥＬ２３との共培養時には中程度のＩＦＮ−γ分泌を示した。
・ＨＬＡ−Ｂ＊３５の発現を有するＰＲＡＭＥ陽性Ｋ５６２はＩＦＮ−γ分泌を誘導せず、これにより、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９のＨＬＡ−Ａ＊０２拘束性が確認された。
【０１８０】
実施例２．６：ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を用いてのＰＢＭＣの形質導入
・健康なドナーのＣＤ８の豊富なＰＢＭＣを、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９構築物を含有しているプラスミドを用いて形質導入した。ＴＣＲの形質導入効率を分析するために、形質導入されていない及びＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣの表面染色後にＦＡＣＳ分析を実施した。細胞を、ＣＤ８、及びＴＣＲβ鎖のＴＣＲ可変領域（ＴＲＢＶ９）に対して特異的な抗体を用いて染色した。対照エフェクター細胞個体群において、内因的にＴＲＢＶ９を発現しているＴ細胞は８％存在するが、形質導入後にはＴ細胞の６０％がＴＲＢＶ９を発現した。このことは、５０％を超える形質導入効率を示す（図１１）。
【０１８１】
実施例２．７：Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９及びＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９を用いて形質導入されたＰＢＭＣによる、ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドに対する機能的Ｔ細胞の結合力
・ＰＲＡＭＥ１００〜１０８（ＶＬＤ）ペプチドの認識についての機能的Ｔ細胞の結合力を、Ｔ細胞クローンＴ４．８−１−２９（実線の曲線）又はＴ４．８−１−２９を用いて形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ（点線の曲線）のいずれかを、ペプチドの積載されたＴ２細胞と共培養した後のＩＦＮ−γ分泌の検出によって測定した。Ｔ２細胞に、１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの濃度範囲の滴定量のペプチドを積載した。共培養上清を、共培養から約２４時間後に収集し、標準的なＥＬＩＳＡによって評価し、相対的なＩＦＮ−γ遊離は最大遊離に対する比率で示される。機能的結合力を規定する最大半量のＩＦＮ−γ分泌（ＥＣ５０）は点線によって示される。元来のＴ細胞クローン及びトランスジェニックＴＣＲの機能的結合力は非常に類似している（図１２）。
【０１８２】
実施例２．８：異なる標的細胞（ＯＰＭ−２及びＵ９３７）を用いた、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣの抗原特異性の分析
・抗原特異性を分析するために、Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣを、異なる標的細胞と共培養した。腫瘍細胞株ＯＰＭ−２及びＵ９３７（ＨＬＡ−Ａ２陰性及びＰＲＡＭＥ陰性）を、改変せずに、又はＨＬＡ−Ａ２をコードしているｉｖｔＲＮＡを用いてトランスフェクトさせて試験した。さらに、該細胞はまた、ＨＬＡ−Ａ２とＰＲＡＭＥをコードしているｉｖｔＲＮＡ、又はＨＬＡ−Ａ２と無関係の抗原をコードしているｉｖｔＲＮＡの組合せを用いてトランスフェクトした後に試験した。対照として、エフェクターもまた、ＰＲＡＭＥＶＬＤペプチド（１０−５Ｍ）又は無関係のＰＲＡＭＥＳＬＬペプチド（１０−５Ｍ）の積載されたＴ２細胞と共に培養した。２４時間共培養した後、上清を収集し、ＩＦＮ−γの分泌量を、標準的なＥＬＩＳＡによって測定した。ＶＬＤの積載されたＴ２細胞との共培養液中のＴＣＲの形質導入されたＰＢＭＣについて、多量のＩＦＮ−γが測定された。また、ＨＬＡ−Ａ２及び抗原ＰＲＡＭＥを用いてトランスフェクトされた両方の腫瘍細胞株が、ＴＣＲの形質導入されたＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌を誘導した。抗原ＰＲＡＭＥと組み合わせた、必要とされるＭＨＣ拘束性成分としてＨＬＡ−Ａ２を発現している腫瘍細胞のみが認識され、これによりＴ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣが活性化された（図１３）。
【０１８３】
実施例２．９：様々な標的細胞（Ｋ５６２、Ｋ５６２＿Ａ２及びＭｅｌ６２４．３８）を用いての、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣの抗原特異性の分析
・抗原特異性を分析するために、Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターＰＢＭＣ及び形質導入されていない対照ＰＢＭＣを、様々な標的細胞株と共培養した。腫瘍細胞株Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ２陰性及びＰＲＡＭＥ陽性）並びにＫ５６２＿Ａ２及びＭｅｌ６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ陽性及びＰＲＡＭＥ陽性）及び６４７−Ｖ（ＨＬＡ−Ａ２陽性及びＰＲＡＭＥ陰性）を試験した。対照として、エフェクターも、ＰＲＡＭＥＶＬＤペプチド（１０−５Ｍ）又は無関係のＰＲＡＭＥＳＬＬペプチド（１０−５Ｍ）の積載されたＴ２細胞と共培養した。２４時間共培養した後、上清を収集し、ＩＦＮ−γの分泌量を標準的なＥＬＩＳＡによって測定した。ＶＬＤの積載されたＴ２細胞との共培養中のＴＣＲの形質導入されたＰＭＢＣにおいて多量のＩＦＮ−γが測定された。
【０１８４】
測定されたＩＦＮ−γ値は、ＶＬＤペプチドの積載されたＴ２細胞並びに腫瘍細胞株Ｋ５６２＿Ａ２及びＭｅｌ６２４．３８による、ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣの活性化を示した。よって、ＨＬＡ−Ａ２陽性で内因的にＰＲＡＭＥを発現している腫瘍細胞株のみが、形質導入されたＰＢＭＣによって認識され、一方、ＨＬＡ−Ａ２又は抗原のいずれかが存在しなければ、活性化は妨げられた（図１４）。
【０１８５】
実施例２．１０：腫瘍細胞に対するＴ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターの細胞障害活性の分析
・腫瘍細胞に対するＴ４．８−１−２９の形質導入されたエフェクターの細胞障害活性を、細胞のライブイメージングを可能とする顕微鏡に基づいたシステムであるＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（登録商標）（生細胞分析システム（エッセンバイオサイエンス社））を使用して分析した。
【０１８６】
ＴＣＲ Ｔ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣ及び形質導入されていないエフェクターＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＰＲＡＭＥ陽性の悪性黒色腫細胞株Ｍｅｌ６２４．３８と共培養した。悪性黒色腫細胞を９６ウェルプレートに播種し、約６０％のコンフルエント状態に達するとエフェクター細胞を加えた。細胞死を可視化するために、赤色のアネキシンＶ色素を同様に加え、１日１回４日間画像を撮影した。形質導入されていないエフェクターと共培養中の悪性黒色腫細胞株Ｍｅｌ６２４．３８は経時的に増殖し（上の列）、死滅細胞の事象はほんの稀にしか見られなかったが、ＴＣＲの形質導入されたエフェクターは腫瘍細胞の増殖を妨げ、これにより多量の死滅細胞を含む細胞クラスターが形成された。このことは、Ｔ４．８−１−２９を発現しているエフェクター細胞は、ＰＲＡＭＥを発現している腫瘍細胞を効率的に溶解し、数日間におよび腫瘍細胞の増殖を妨げることができることを示す。
【０１８７】
実施例２．１１：Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣの安全性プロファイルの分析
・Ｔ４．８−１−２９を発現しているＰＢＭＣの安全性プロファイルを分析するために、健康なヒト組織の認識を排除しなければならない。それ故、２人の異なるドナーに由来するＴ４．８−１−２９の形質導入されたＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーの健康な組織から得られた細胞と共培養した。一例として、形質導入されたＰＢＭＣ並びに形質導入されていないＰＢＭＣを、ヒト腎臓毛細血管上皮細胞（ＨＲＣＥｐＣ）と共培養した。対照としてＨＲＣＥｐ細胞にさらに、ＶＬＤペプチド（１０−５Ｍ）を積載した。２４時間共培養した後、上清を収集し、ＩＦＮ−γの分泌量を標準的なＥＬＩＳＡによって測定した。ＴＣＲの形質導入されたＰＢＭＣは、ペプチドの積載された標的細胞との共培養時にのみ活性化されたが、改変されていないＨＲＣＥｐ細胞は全く認識されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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