(57)【要約】  本発明は、インターロイキンー５受容体（以下、「ＩＬ−５Ｒ」と略記する）阻害化合物を含む肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。より詳細には、ＩＬ−５Ｒの細胞外領域に特異的に結合する抗体又は該抗体断片を含む肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。
2016194897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキンー５受容体（ＩＬ‐５Ｒ）の細胞外領域に結合する抗体又は該抗体断片を含む肺高血圧症の治療薬。
【請求項２】
抗体が、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を除去する抗体である請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
抗体が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を有する抗体である請求項１又は２のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項４】
抗体が、ＩＬ−５Ｒ中和活性を有する抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項５】
抗体が、Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）依存性のＩＬ−５Ｒ発現細胞増殖を阻害する抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項６】
抗体が、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項７】
抗体が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項８】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項９】
インターロイキンー５受容体（ＩＬ‐５Ｒ）の細胞外領域に結合する抗体又は該抗体断片を投与し、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を阻害することを特徴とする肺高血圧症の治療方法。
【請求項１０】
抗体が、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を除去する抗体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を有する抗体である請求項９又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、ＩＬ−５Ｒ中和活性を有する抗体である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）依存性のＩＬ−５Ｒ発現細胞増殖を阻害する抗体である請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）ＩＬ−５Ｒ発現細胞が、好酸球、好塩基球及び肥満細胞の少なくとも１つの細胞である。
（ｉｉ）血管平滑筋細胞の増殖を抑制する。
（ｉｉｉ）肺血管リモデリングを抑制する。
【請求項１５】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療薬。
（ｉ）ＩＬ−５Ｒ発現細胞が、好酸球、好塩基球及び肥満細胞の少なくとも１つの細胞である。
（ｉｉ）血管平滑筋細胞の増殖を抑制する。
（ｉｉｉ）肺血管リモデリングを抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願]
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１５−１１１３９５号（２０１５年６月１日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
[技術分野]
本発明は、インターロイキンー５受容体（以下、「ＩＬ−５Ｒ」と略記する）阻害化合物を含む肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。より詳細には、ＩＬ−５Ｒの細胞外領域に特異的に結合する抗体又は該抗体断片を含む肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；  ＰＨ）は肺動脈圧の上昇を示す病態の総称であり、先行する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、突発性肺線維症、（ＩＰＦ）、間質性肺炎、肺気腫などの肺疾患、左心室不全症、弁膜疾患などの左心性疾患、サルコイドーシス，肺ランゲルハンス細胞組織球症，リンパ脈管筋腫症，神経線維腫症，血管炎などの全身性疾患などの基礎疾患に伴う肺高血圧症、肺動脈などの原発性の肺動脈性肺高血圧症など、複数の原因によって肺高血圧症が引き起こされることが知られているが、原因は特定されていない（非特許文献１）。【０００３】
肺高血圧症は、肺細動脈などにおいて血管抵抗が高くなった場合に、肺動脈圧が上昇することで引き起こされ、平均肺動脈圧が２５ｍｍＨｇ以上の場合、肺高血圧症として診断される。肺高血圧症が慢性化すると、高い肺動脈圧によって、特に肺末梢血管のリモデリング、血管狭窄が進行した結果、右心室負荷が増大して右心室不全になり、全身のうっ血、息切れ、易疲労、労作能低下、失神発作、腹水、チアノーゼなどの臨床症状を引き起こす。【０００４】
肺高血圧症の治療としては、カルシウム拮抗剤、プロスタグランジンＩ２誘導体製剤、一酸化窒素（ＮＯ）ガスなどを用いた血管拡張療法、酸素療法、心不全予防対策、ワーファリンなどによる抗血液凝固療法及び肺移植などの手術による治療が行われている。【０００５】
肺高血圧症の病態解析や治療方法探索のため、複数の動物モデルが知られている（非特許文献２）。特に分子メカニズムの解析のためにインターロイキンー３３（ＩＬ−３３）を投与したげっ歯類モデル（特許文献１）、特定の分子をノックアウトしたげっ歯類モデル（非特許文献３）、逆に特定の分子を発現させたトランスジェニックげっ歯類モデルが知られており、病態解析が行われている。【０００６】
その中でａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎノックアウトマウスの解析において、ＯＶＡ誘導性の肺高血圧症が引き起こされ、血管リモデリング及び好酸球の浸潤が増加することが知らており（非特許文献３）、また該ＰＨモデルにおいて抗インターロイキンー５（ＩＬ−５）リガンド抗体が好酸球の浸潤及び血管肥厚を減少させることが知られている（非特許文献４）。【０００７】
ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒを標的とした治療薬は喘息領域で開発されており、抗ＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）、Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）、抗ＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ（ＭＥＤＩ−５６３）が知られている（特許文献２及び３、非特許文献５及び６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１５−５０９４１
【特許文献２】ＷＯ１９９７／１０３５４
【特許文献３】ＷＯ２００５／３５５８３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｅｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌ．  Ｃａｒｄ．，  ２０１３；  ６２；  Ｄ１０９−Ｄ１１６
【非特許文献２】Ｍａａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ２０１３；３：７３９−７５６
【非特許文献３】Ｍｅｄｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２００９；  ４１：  ３９７−４０６
【非特許文献４】Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２０１１；  ３０１，  Ｌ９２７−９３６
【非特許文献５】Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｊ．，  ２０１４；  ７：  １−１４
【非特許文献６】Ｍｏｌｆｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｔ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１０，４２：７１２−７３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
肺高血圧症は、肺動脈又は肺組織内末梢血管における血管圧が亢進した結果引き起される急性又は慢性疾患であり、慢性期では肺血管のリモデリングが引き起こされる。本発明の課題は、肺高血圧症における病態の進行を抑制、予防し、肺高血圧症を治療する新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルが肺高血圧症の病態メカニズムにおいて重要な役割を果たすことを初めて明らかにし、そのシグナル伝達を阻害することで、肺高血圧症における病態の進行を抑制、予防し、肺高血圧症を効果的に治療しうることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）  インターロイキンー５受容体（ＩＬ‐５Ｒ）の細胞外領域に結合する抗体又は該抗体断片を含む肺高血圧症の治療薬。
（２）  抗体が、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を除去する抗体である（１）に記載の治療薬。
（３）  抗体が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を有する抗体である（１）又は（２）のいずれかに記載の治療薬。
（４）  抗体が、ＩＬ−５Ｒ中和活性を有する抗体である（１）〜（３）のいずれかに記載の治療薬。
（５）  抗体が、Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）依存性のＩＬ−５Ｒ発現細胞増殖を阻害する抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載の治療薬。
（６）  抗体が、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である（１）〜（５）のいずれかに記載の治療薬。
（７）  抗体が、ヒトＦｃ領域又はヒト定常領域を含む抗体である（１）〜（６）のいずれかに記載の治療薬。
（８）  抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれるいずれか１つの抗体である（１）〜（７）のいずれかに記載の治療薬。
（９）  インターロイキンー５受容体（ＩＬ‐５Ｒ）の細胞外領域に結合する抗体又は該抗体断片を投与し、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を阻害することを特徴とする肺高血圧症の治療方法。
（１０）  抗体が、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を除去する抗体である（９）に記載の方法。
（１１）  抗体が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を有する抗体である（９）又は（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  抗体が、ＩＬ−５Ｒ中和活性を有する抗体である（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  抗体が、Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  （ＩＬＣ２）依存性のＩＬ−５Ｒ発現細胞増殖を阻害する抗体である（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つを特徴とする、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（ｉ）ＩＬ−５Ｒ発現細胞が、好酸球、好塩基球及び肥満細胞の少なくとも１つの細胞である。
（ｉｉ）血管平滑筋細胞の増殖を抑制する。
（ｉｉｉ）肺血管リモデリングを抑制する。
（１５）  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも１つを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかに記載の治療薬。
（ｉ）ＩＬ−５Ｒ発現細胞が、好酸球、好塩基球及び肥満細胞の少なくとも１つの細胞である。
（ｉｉ）血管平滑筋細胞の増殖を抑制する。
（ｉｉｉ）肺血管リモデリングを抑制する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナル伝達系を標的とする、肺高血圧症の新規な治療手段が提供される。本発明の治療薬及び治療方法は、ＩＬ−５Ｒの細胞外領域に特異的に結合する抗体又は該抗体断片を用いて、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナル伝達を阻害することで、血管平滑筋細胞の増殖及び肺血管リモデリングを抑制し、肺高血圧症を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＰＢＳを投与又はＩＬ−３３を１週間ごとに３週間投与したＩＬ−５＋／Ｖｅｎｕｓ(Ｖ)マウス及びＩＬ−５Ｖ／Ｖ（ＩＬ−５欠損）マウスのＶｅｎｕｓ陽性細胞における血球系列（Ｌｉｎ）マーカー陰性細胞のパーセンテージ（％）を示す。白色ヒストグラムは、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞、グレーヒストグラムは、Ｖｅｎｕｓ陰性細胞を示す。各グラフとも縦軸が細胞数、横軸がＬｉｎ発現量を示す。
【図２】図２は、ＰＢＳを投与又はＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／Ｖマウス及びＩＬ−５Ｖ／ＶマウスのＬｉｎ陰性Ｖｅｎｕｓ陽性（Ｌｉｎ−Ｖｅｎｕｓ＋）細胞におけるＣＤ２５発現、ＳＴ２発現を示す。白色ヒストグラムは、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞、グレーヒストグラムは、Ｖｅｎｕｓ陰性細胞を示す。各グラフとも縦軸が細胞数、横軸がＣＤ２５又はＳＴ２の発現量を示す。
【図３】図３は、ＰＢＳを投与又はＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／Ｖマウス及びＩＬ−５Ｖ／ＶマウスのＬｉｎ−Ｖｅｎｕｓ＋細胞の細胞数を示す。白色グラフは、ＰＢＳ投与群、黒色グラフは、ＩＬ−３３投与群を示す。
【図４】図４は、ＰＢＳを投与又はＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウス、ＩＬ−５＋／Ｖマウス及びＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスにおける血漿ＩＬ−５濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。白色グラフは、ＰＢＳ投与群、黒色グラフは、ＩＬ−３３投与群を示す。
【図５】図５は、ＰＢＳを投与又はＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウス、ＩＬ−５＋／Ｖマウス及びＩＬ−５Ｖ／ＶマウスにおけるＳｉｇｌｅｃ−Ｆ陽性好酸球数を示す。白色グラフは、ＰＢＳ投与群、黒色グラフは、ＩＬ−３３投与群を示す。
【図６】図６は、ＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウス又はＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスにおける、動脈肥厚のＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類法による組織学的スコアーを示す。各４匹のマウスから無作為に選択した７０動脈部位について解析を行った結果である。
【図７】図７は、ＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウスに、抗マウスＩＬ−５ラットモノクローナル抗体又はコントロールラットＩｇＧ抗体を処置したマウスにおける、動脈肥厚の組織学的スコアーを示す。各４匹のマウスから無作為に選択した８２動脈部位について解析を行った結果である。
【図８】図８は、ＩＬ−３３を腹腔内投与したＩＬ−５＋／＋マウスに、ＰＢＳ又はイロプロストを経気道的に処置したマウスにおける、動脈肥厚の組織学的スコアーを示す。各４匹のマウスから無作為に選択した４２動脈部位について解析を行った結果である。
【図９】図９は、ＩＬ−３３を１週間ごとに１１週間の長期投与を行ったＩＬ−５＋／＋マウス又はＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスにおける、動脈肥厚の組織学的スコアーを示す。各４匹のマウスからそれぞれ無作為に選択した４５、５５動脈部位について解析を行った結果である。
【図１０】図１０は、ＩＬ−３３を１週間ごとに１１週間の長期投与を行ったＩＬ−５＋／＋マウス又はＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスにおける肺高血圧症状の比較を示す。肺高血圧症状の程度は、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）値で示した。縦軸がＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）値、横軸が各処置マウスを示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ−３３を１週間ごとに１１週間の長期投与を行ったＩＬ−５＋／＋マウスにおける血漿可溶性ＳＴ２の濃度を示す。縦軸が、ＳＴ２濃度（ｐｇ／ｍＬ）横軸がマウスの処置を示す。
【図１２】図１２は、キメラ抗体の抗原結合活性を示す。縦軸が蛍光強度（Ｇｅｏｍｅａｎ値）、横軸が抗体濃度を示す。
【図１３】図１３は、キメラ抗体のＹ１６細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。縦軸がＡＤＣＣ活性（％）、横軸が抗体濃度を示す。
【図１４】図１４は、キメラ抗ＩＬ−５Ｒα鎖抗体によるＹ１６細胞に対する増殖阻害能力（ＩＬ−５シグナル阻害機能）を示す。縦軸が４５０ｎｍにおける吸光度、横軸が抗体濃度を示す。
【図１５】図１５は、抗ＩＬ−５抗体又は抗ＩＬ−５Ｒ抗体によるＩＬ−３３誘発性血管肥厚の抑制効果（実施例１４）の実験スキームを示す。
【図１６】図１６は、Ｈ７−２、Ｈ７−４、抗ＩＬ−５抗体、ＫＭ８８０８、ＫＭ６１６１、Ｒａｔ  ＩｇＧによるＩＬ−３３誘発性血管肥厚の抑制効果をＦＣＭ法で評価した結果を示す。（ＩＬ−３３：ＩＬ−３３存在下、ＰＢＳ：ＩＬ−３３非存在下）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、インターロイキンー５受容体（ＩＬ−５Ｒ）阻害化合物を含む肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。具体的には、ＩＬ−５Ｒの細胞外領域に特異的に結合する抗体又は該抗体断片を含む、肺高血圧症の治療薬及び治療方法に関する。
【００１６】
本発明において「肺高血圧症」とは、肺動脈圧が増加した病態を示すものであれば、肺原発性であっても続発性であってもよく、他の疾患と併発しているものであってもよい。また、続発性に生じた肺高血圧症としては、基礎疾患がある場合、又は基礎疾患と同時に診断された場合いずれの場合であってもよい。
【００１７】
原発性の肺高血圧症としては、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）が中心的疾患として挙げられ種々の原因によって引き起こされ、更に、特発性肺動脈性肺高血圧症（ｉｄｅｏｐａｔｈｉｃ  ＰＡＨ）、遺伝性肺動脈性肺高血圧症（ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ＰＡＨ）、薬物・毒物誘発性肺動脈性肺高血圧症、結合組織病、ＨＩＶ感染症及び先天性心疾患などに伴う肺動脈性肺高血圧症などに分類される。
【００１８】
続発性の肺高血圧症としては、左室不全、弁膜症、先天性心疾患などの左心性心疾患に伴う肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺炎、肺気腫、睡眠時呼吸障害、肺胞低換気障害、発育障害などに伴う肺高血圧症、慢性血栓性／塞栓性高血圧症、慢性溶血性貧血、骨髄増殖性疾患、サルコイドーシス、肺ランゲルハンス細胞組織球症、リンパ脈管筋腫症、血管炎、糖原病、ゴーシェ病、甲状腺疾患、慢性腎不全等に伴う肺高血圧症などが挙げられる。
【００１９】
本発明において「ＩＬ−５Ｒ阻害化合物」とは、ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの間のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−５の生物学的活性を中和する又は阻害するものであればいかなるものでもよく、低分子であっても高分子であってもよい。
【００２０】
例えば「ＩＬ−５Ｒ阻害化合物」としては、ＩＬ−５アンタゴニスト、ＩＬ−５Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する抗体又はその抗体断片、ＩＬ−５中和抗体及び該抗体断片、ＩＬ−５Ｒ中和抗体及び該抗体断片等があげられる。
【００２１】
ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する抗体としては、ＩＬ−５に結合しかつＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する抗体、ＩＬ−５受容体に結合しかつＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害する抗体（抗ＩＬ−５Ｒ抗体）などがあげられ、好ましくはＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合を阻害した結果、ＩＬ−５Ｒのシグナルを阻害する抗体があげられる。
【００２２】
ＩＬ−５に結合してＩＬ−５Ｒのシグナルを阻害する抗体としては、例えば、抗ヒトＩＬ−５ヒト化抗体Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ１）、抗ヒトＩＬ−５抗体Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４／κ）などがあげられる。
【００２３】
ＩＬ−５Ｒに結合してＩＬ−５Ｒのシグナルを阻害する抗体としては、抗ＩＬ−５Ｒラットモノクローナル抗体Ｈ７（Ｈｉｔｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９１，３：１３５−１３９）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体、Ｈ７抗体と同じエピトープに結合する抗体、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂと同じエピトープに結合する抗体、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＣＤＲを含む抗体、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体及び抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂなどがあげられる。抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、ＩＬ−５Ｒ発現細胞に直接作用しＩＬ−５Ｒ依存的なシグナルを阻害した結果、ＩＬ−５Ｒ発現細胞の細胞増殖阻害、遊走阻害及び／又はアポトーシス誘導を引き起すと共に、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性によって除去できることから、ＩＬ−５Ｒ阻害化合物としてより好ましい。
【００２４】
ＩＬ−５Ｒは、２種類のポリペプチド鎖、α鎖（以下「ＩＬ−５Ｒα鎖」と記載する）とβ鎖（以下「ＩＬ−５Ｒβ鎖」と記載する）からなる。ＩＬ−５との結合はＩＬ−５Ｒα鎖によって担われており、ＩＬ−５Ｒβ鎖単独ではＩＬ−５に対する結合能を示さない。したがって、本発明で用いられる抗体としては、ＩＬ−５Ｒα鎖に結合する抗体が好ましい。
【００２５】
また、本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒとの結合に関与するＩＬ−５Ｒの「細胞外領域」をエピトープとする抗体が好ましい。そのようなエピトープとしては、ＩＬ−５Ｒαの膜貫通領域以下を欠いたＮ末端アミノ酸に相当する細胞外領域１番目〜３１３番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の４１番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の５２番目〜６１番目のアミノ酸配列に存在するエピトープ、ＩＬ−５Ｒαの細胞外領域の６１番目のアミノ酸残基を含むエピトープ及び抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂが結合するエピトープがあげられる（Ｋｏｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１０、１２５：１３４４−１３５３）。
【００２６】
本発明に用いられる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくは単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体があげられる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体であってもよいし、遺伝子組換え技術によって作製された遺伝子組換え抗体であってもいずれのモノクローナル抗体でもよい。
【００２７】
本発明に用いられる抗体は、ヒトにおいて免疫原性を低下させるために、ヒトＦｃ領域を含む抗体、ヒト定常領域を含む抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体［ヒト型ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；（ＣＤＲ）移植抗体ともいう］及びヒト抗体などの遺伝子組換え抗体を用いることが好ましい。
【００２８】
キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）及び軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと略記する）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと略記する）とからなる抗体である。可変領域についての動物の種類は、マウスやラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。
【００２９】
ヒト型キメラ抗体は、ヒトＩＬ−５Ｒに特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製できる。
【００３０】
ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと略記する）であれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、ｈＩｇＧに属すれば特に限定されない。
【００３１】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体である。ヒト化抗体は、ＩＬ−５Ｒに特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと略記する）に移植した可変領域（以下、Ｖ領域と略記する）をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで、作製することができる。ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。ヒト化抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト化抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。
【００３２】
本発明で用いられる「抗体断片」は、上記各抗体の断片であって、ＩＬ−５又はＩＬ−５Ｒに結合してＩＬ−５Ｒのシグナルを阻害する限り特に限定されない。抗体断片の種類としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
【００３３】
Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＦａｂは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
【００３４】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＦ（ａｂ’）２は、抗ＩＬ−５Ｒ抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ’（後述）をチオエーテル結合又はジスルフィド結合で結合させることで、作製されうる。
【００３５】
Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＦａｂ’は、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
【００３６】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のｓｃＦｖは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
【００３７】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のｄｉａｂｏｄｙは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
【００３８】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のｄｓＦｖは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
【００３９】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＣＤＲを含むペプチドは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。また、抗ＩＬ−５Ｒ抗体のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。好ましくは、抗ＩＬ−５Ｒ抗体由来の６個のＣＤＲを含むペプチドがあげられる。
【００４０】
本発明の治療薬及び治療方法に用いられる抗体は、エフェクター活性を有することが好ましい。「エフェクター活性」とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる活性であって、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
【００４１】
エフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域のＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１）２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１−６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）又は、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。
【００４２】
抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−８，ＦＵＴ８）が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。
【００４３】
フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【００４４】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性若しくはＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、ＦｃγＲへの結合活性を増加させる又は低下させることによりＡＤＣＣ活性を制御することができるし、Ｆｃ領域のアミノ酸残基改変を行うことで、補体の結合活性を増加させるあるいは低下させることによりＣＤＣ活性を制御することができる。
【００４５】
例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書、米国特許第７，３１７，０９１号明細書及び国際公開第２００５／０７０９６３号に記載のアミノ酸残基改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
【００４６】
本発明で用いられる抗体は、上述した改変により、高いＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性、特に高いＡＤＣＣ活性を有することが好ましい。
【００４７】
本発明で用いられる抗体の好ましい例としては、ＩＬ−５Ｒαタンパク質のＮ末端の１番目〜３１３番目に含まれるエピトープに結合する抗ＩＬ−５Ｒ抗体、該エピトープに結合してＡＤＣＣ活性を有する抗ＩＬ−５Ｒ抗体、ＩＬ−５Ｒαタンパク質の４１番目〜６１番目に存在するエピトープに結合する抗ＩＬ−５Ｒ抗体、ＩＬ−５Ｒαタンパク質の５２番目〜６１番目に存在するエピトープに結合する抗ＩＬ−５Ｒ抗体、ＩＬ−５Ｒαタンパク質の６１番目Ｉｌｅに結合する抗ＩＬ−５Ｒ抗体、ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒαが結合する部分に存在するＩＬ−５Ｒα上のエピトープに結合する抗体、配列番号１〜３に表されるアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ１〜３及び配列番号４〜６に表されるアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖（Ｌ鎖）ＣＤＲ１〜３を含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＩＬ−５Ｒ抗体、配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含むＨ鎖及び配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含むＬ鎖を含む抗体、抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＣＤＲを含む抗体及び抗ヒトＩＬ−５Ｒα抗体ＢｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂのＶＨ及びＶＬを含む抗体などがあげられる。また、上述の抗体のＦｃ領域の２９７番目に結合するコアフコースが、低下又は欠損している抗体が好ましい。更により具体的には、抗ＩＬ−５Ｒヒト化抗体Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂがあげられる。一例として、抗ＩＬ−５Ｒラット抗体Ｈ７の遺伝子及びアミノ酸配列としては配列番号１３〜１８に示す配列が、該抗体のＣＤＲを含む遺伝子組換え抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が挙げられる。
【００４８】
また、本発明で用いられる抗体は、上述の抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド複合型糖鎖にフコースが結合していない割合が８０％以上、９０％以上、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上である抗体、より好ましくは当該糖鎖にフコースが結合していない抗体であることが好ましい。これにより、高いＡＤＣＣ活性が期待できる。
さらに本発明で用いられる抗体は、上述の抗体の物性を改善するため、上述のアミノ酸配列に改変を施したアミノ酸配列からなる抗体であってもよい。一例として、抗ＩＬ−５Ｒラット抗体Ｈ７の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３近傍、具体的にはＮ末端から８７番目に存在するＣｙｓ残基を、Ｓｅｒ残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２６で表わされる塩基配列にコードされるアミノ酸配列）からなるＶＬを含む抗体Ｈ７−２（Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（ＤＦ）およびＨ７−４（Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ））が挙げられる。
【００４９】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体及び該抗体断片は、前掲ＷＯ１９９７／１０３５４及びＷＯ２００５／３５５８３を参考にして製造することができる。
【００５０】
本発明で用いられる抗体は、「ＩＬ−５Ｒ発現細胞」に特異的に結合することで、ＩＬ−５依存的なＩＬ−５Ｒシグナルを阻害してＩＬ−５依存的細胞増殖、分化誘導、遊走活性、浸潤活性、抗アポトーシス活性を阻害することができる。また、該抗体はＩＬ−５依存的な細胞増殖下においてＩＬ−５Ｒ発現細胞にアポトーシスを誘導することができる。更に、ＡＤＣＣ活性によって、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を効率的に除去することができる。
【００５１】
「ＩＬ−５Ｒ発現細胞」としては、好酸球、好塩基球及び肥満細胞が挙げられる（Ｋｏｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１０、１２５：１３４４−１３５３）。本発明で用いられる抗体は、上記細胞のいずれか、好ましくは好酸球、又は好酸球及び好塩基球の両方において、該細胞上のＩＬ−５Ｒに結合し、ＩＬ−５依存的な細胞増殖、分化誘導、遊走活性、浸潤活性及び／又は抗アポトーシス活性を示す。
【００５２】
「ＩＬ−５Ｒ発現細胞」は、Ｇｒｏｕｐ  ２，  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）依存的なＩＬ−５によって肺血管周辺へ遊走され、炎症反応、血管壁の肥厚、肺血管リモデリングを引き起す。よって、本発明に係る抗体により、これらの炎症反応、血管壁の肥厚、肺血管リモデリングが抑制、予防される。
【００５３】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、好酸球だけでなく、好酸球と好塩基球との両方にそれぞれ結合することで、ＩＬ−５依存的なＩＬ−５Ｒαシグナルを阻害するとともに、ＡＤＣＣ活性及びアポトーシス誘導活性によって両細胞を阻害する（Ｍｏｌｆｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｔ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１１、４２：７１２−７３７）。従って、本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、両細胞が関与する肺高血圧症の病態進行及び悪化メカニズムを阻害することができる。
【００５４】
本発明で用いられる抗ＩＬ−５Ｒ抗体は、ＩＬＣ２依存性のＩＬ−５Ｒ発現細胞増殖を阻害することができる。この細胞増殖の阻害は、ＩＬ−５−ＩＬ５Ｒシグナルを阻害した結果、ＩＬ−５Ｒ依存的な細胞増殖を阻害すること、ＩＬ−５Ｒ抗体がＩＬ−５Ｒに結合した結果、アポトーシスを誘導することで細胞増殖を阻害すること、ＩＬ−５Ｒ抗体がＩＬ−５Ｒに結合した結果、ＡＤＣＣ活性などのエフェクター活性によって引き起こされる細胞傷害活性によって細胞増殖を阻害すること、いずれの場合であってもよい。
【００５５】
本発明の治療薬は、ＩＬ−５Ｒ阻害化合物（特に、抗ＩＬ−５Ｒ抗体又は該抗体断片）とその他の治療薬又は治療方法を併用するものであってもよい。例えば、カルシウム拮抗剤、エンドセリン受容体（ＥＴＲ）拮抗剤、プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）誘導体製剤、ｃＧＭＰ阻害剤、一酸化窒素（ＮＯ）ガスなどを用いた血管拡張療法、酸素療法、心不全予防対策、ワーファリンなどによる抗血液凝固療法などと併用して、ＩＬ−５Ｒ阻害化合物を用いることができる。この場合、抗ＩＬ−５Ｒ阻害化合物と他の治療薬又は治療方法は同時に投与又は処置されてもよく、連続的に投与又は処置されてもよい。
【００５６】
本発明の肺高血圧症の治療薬は、上述のＩＬ−５Ｒ阻害化合物（特に、抗ＩＬ−５Ｒ抗体又は該抗体断片）を有効成分として含む医薬組成物であればいかなるものでもよいが、通常は薬学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが望ましい。
【００５７】
好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
【００５８】
本発明の治療薬の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、髄腔内及び静脈内等の非経口投与を挙げることができるが、髄腔内投与又は静脈内投与が好ましい。
【００５９】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【００６０】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトール等の賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、又はグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００６１】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体そのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。
【００６２】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００６３】
本発明の治療薬の投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。具体的には、１回１０〜６００ｍｇ量を（フラットボリューム）、４週間（Ｑ４Ｗ）又は８週間（Ｑ８Ｗ）ごとに投与することが挙げられる。より具体的には１回３０ｍｇ、６０ｍｇ、１００ｍｇ又は２００ｍｇを、４週間又は８週間ごとに投与することが挙げられる。
【００６４】
肺高血圧症の発症及び／又は悪化に関連するメカニズムとしては、ＩＬ−５依存性細胞増殖、ＩＬ−５Ｒ発現細胞の細胞増殖、遊走又は浸潤、肺組織における炎症、白血球の浸潤、線維化及び瘢痕化、肺血管、肺動脈又は肺細動脈における血管内腔の減少、血管閉塞、血栓、炎症、血管平滑筋細胞の増殖、血管壁の肥大、肥厚、白血球の浸潤、線維化及び肺血管リモデリングなどが知られている。
【００６５】
「肺血管リモデリング」とは、血管内皮、血管中膜又は血管周辺の炎症等によって、肺動脈平滑筋細胞の増殖、肥大又は分化等によって肺血管壁の肥大、肥厚、線維化等が引き起こされた結果、血管内腔の低下又は閉塞が引き起される現象をいう。
【００６６】
本発明の治療薬は、ＩＬ−５Ｒ発現細胞の増殖を阻害することで、血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、肺高血圧症における肺血管リモデリングを抑制し、重篤な肺血管肥厚及び炎症を抑制することができる。
【００６７】
本発明は、本発明のＩＬ−５Ｒ阻害化合物、特に上記したＩＬ‐５Ｒの細胞外領域に結合する抗体又は該抗体断片を投与し、ＩＬ−５Ｒ発現細胞を阻害することを特徴とする肺高血圧症の治療方法も提供する。
【００６８】
本発明の治療方法は、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒのシグナル伝達を阻害することで、ＩＬＣ２が介在した好酸球遊走を直接阻害し、これに続く肺血管周辺の炎症反応、肺血管壁の肥厚及び肺血管リモデリングを抑制して、肺高血圧症を治療する。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７０】
ＩＬ−３３誘導性の肺動脈肥厚及び血管周辺におけるＩＬ−５依存的好酸球性炎症
本実施例では、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＩＬ−５＋／＋）（日本ＳＬＣ社）、蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓをＩＬ−５遺伝子のエキソン１に挿入してＩＬ−５遺伝子破壊したヘテロノックアウトマウス（ＩＬ−５＋／Ｖｅｎｕｓ、ＩＬ−５＋／Ｖとも記す）及びホモノックアウトマウス（ＩＬ−５Ｖ／Ｖ）（Ｉｋｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１２；  １８８：  ７０３−７１３、日本特許５１８６６３７）を用いた。リコンビナントＩＬ−３３（ｒＩＬ−３３）（Ｒ＆Ｄ社製）、４００ｎｇを０、７及び１４日にマウス腹腔内に投与した。２１日目に各マウスから、肺を摘出し組織切片を作製し組織学的解析を行った。【００７１】
Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色及びｅｌａｓｔｉｃａ  ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ  （ＥＶＧ）染色は、４％パラフォルムアルデヒドで固定化し、パラフィン包埋した肺組織片を用いて実施した。肺組織片は、ミクロトーム（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｋ社製）を用いて４μｍに薄切し、スライドを作製した。組織切片は、脱パラフィン後、染色に用いた。組織観察は、Ｄ−３３Ｅデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて行った。【００７２】
免疫蛍光染色は、４％パラフォルムアルデヒドで固定化し、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｋ社製）に包埋しした肺組織片を用いて実施した。肺組織片は、クリオスタット（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて３０μｍに薄切し、スライドを作製した。組織切片は、ＴＳＡ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてブロッキングを行い、洗浄した後、１次抗体を４℃、一晩反応させた。その後、洗浄した後、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５６８又はＡｌｅｘａ  ６４７がコンジュゲートされた２次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を反応させた。【００７３】
１次抗体は、抗ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＳＭＡ）抗体（１Ａ４）（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ抗体（Ｅ５０−２４４０）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ１３．３）、抗ＣＤ３ε抗体（１４５−２Ｃ１１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＦＰ）ポリクローナル抗体（医学生物学研究所製）を用いた。反応後のスライドを、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に設置し、蛍光像は、ＴＳＣ  ＳＰ５共焦点顕微鏡・イメージングシステム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて観察した。【００７４】
その結果、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を投与した野生型マウス、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは肺組織での変化は確認されなかったが、ｒＩＬ−３３を投与したマウスでは肺組織に炎症反応が認められた。また、ｒＩＬ−３３を投与した野生型マウスでは、重篤な血管周辺の炎症反応と血管壁の肥厚が点在して確認されたのに対して、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは、わずかに認められたにすぎなかった。また、野生型マウスにおける血管周辺炎症部位には、好酸球を含む免疫細胞が高度に浸潤しているのに対して、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスではほとんど確認されなかった。【００７５】
更に、野生型及びＩＬ−５＋／Ｖマウスでは、平滑筋細胞周辺に大部分の好酸球が集積している一方、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは完全に集積が阻害されていた。【００７６】
従って、ＩＬ−３３応答性にＩＬ−５Ｒ+好酸球が肺血管周辺に遊走、集積することで、血管周辺の炎症、及び血管壁の肥厚が引き起こされることが明らかになった。
【実施例２】
【００７７】
ＩＬ−３３応答性好酸球集積へのＩＬ−５産生Ｇｒｏｕｐ  ２  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）の関与
ｒＩＬ−３３の長期継続投与によって引き起こされる肺の炎症組織においてＩＬ−５を産生している（Ｖｅｎｕｓ陽性）ＣＤ３ε陰性ＩＬＣ２が増加しているか否かについて検討を行った。各マウスから摘出した肺を５ｍＬ  ＰＢＳで灌流し回収した。全肺葉は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍｇ／ｍＬ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）及び１００μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｒｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０を１  ｍＬ加えて細かく刻んだ。３７℃、１時間、ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした後、刻んだ肺葉は、注射器で７０μｍナイロンメッシュを通した。この細胞懸濁液を肺細胞懸濁液とした。【００７８】
肺細胞懸濁液は、各種抗体を用いてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）法で、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて解析した。ＦＣＭには、抗マウスＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＨＬ３）、抗ＣＤ１９抗体（１Ｄ３）、抗ＣＤ４５抗体（３０−Ｆ１１）、抗Ｇｒ１抗体（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＦｃεＲＩ抗体（ＭＡＲ−１）、抗Ｍａｃ−１抗体（Ｍ１／７０）及び抗ＴＥＲ−１１９抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のものを使用した。抗ＣＤ４９ｂ抗体（ＤＸ５）及び抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製のものを使用した。抗Ｔ１／ＳＴ２抗体（ＤＪ９）は、ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のものを使用した。肺細胞懸濁液は、抗マウスＦｃγＲ抗体（２．４Ｇ２）を用いてブロッキングを行った。血球系列（Ｌｉｎ）マーカーは、抗マウスＢ２２０、ＣＤ３ε、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、ＦｃεＲＩ、Ｇｒ１、Ｍａｃ−１、ＮＫ１．１及びＴＥＲ−１１９カクテル抗体を用いて染色した。【００７９】
血漿ＩＬ−５濃度は、ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−５  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。【００８０】
その結果、ＩＬ−５＋／Ｖ及びＩＬ−５Ｖ／ＶいずれのマウスにおいてもＶｅｎｕｓ陽性細胞が増加しており、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の９０％以上は、Ｌｉｎ陰性であることが明らかになった（図１）。更に、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞は、ＣＤ２５及びＳＴ２の両方を発現していることから、Ｌｉｎ陰性ＣＤ２５陽性ＳＴ２陽性Ｖｅｎｕｓ陽性のｇｒｏｕｐ  ２  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ（ＩＬＣ２）であることが明らかになった（図２）。ＩＬ−５＋／Ｖマウス及びＩＬ−５Ｖ／Ｖマウス、それぞれにおいて、ＰＢＳ投与群のコントロールマウスと比べて、ｒＩＬ−３３投与群では、Ｌｉｎ陰性ＣＤ２５陽性ＳＴ２陽性Ｖｅｎｕｓ陽性ＩＬＣ２は、９０倍、５０倍増加していた（図３）。【００８１】
一方、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウス及びＩＬ−５＋／Ｖマウスでは、ＩＬ−５の顕著な産生増加が認められ、末梢血液中のＩＬ−５濃度も増加していたが（図４）、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５Ｖ／ＶマウスではＩＬ−５の増加は全く認められなかった。また、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウス及びＩＬ−５＋／Ｖマウスでは、ＰＢＳ投与したＩＬ−５＋／＋マウス及びＩＬ−５＋／Ｖマウスと比べて、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ陽性好酸球が約５０倍に増加したが、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは好酸球の増加は殆ど認められなかった（図５）。【００８２】
従って、ｒＩＬ−３３誘導性に発生した肺血管壁の肥厚及び血管周辺の炎症には、Ｖｅｎｕｓ陽性ＩＬＣ２が関与しており、ＩＬＣ２依存的な好酸球の遊走誘導、集積及び浸潤によって肺血管周辺の炎症が引き起こされていることが明らかになった。
【実施例３】
【００８３】
好酸球依存的な重篤な動脈肥厚
ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウスでは、内膜肥厚及び中膜肥厚に起因する動脈壁の肥厚が顕著に確認されたことから、Ｈｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類に基づき、ＩＬ−５＋／＋マウス及びＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスにおける血管壁の肥厚程度を定量的に分類した。各マウスに４００ｎｇ  ｒＩＬ−３３を、０、７及び１４日目に投与し、２１日目に肺組織を摘出して病理観察を行いＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類に基づき組織分類を行った。【００８４】
本分類体系では、グレート１；中膜肥厚、グレード２；内膜肥厚、グレード３；進展した内膜肥厚及び中膜肥厚、グレード４；進展した内膜肥厚及び中膜肥厚に加え叢状病変として評価を実施した。【００８５】
その結果、本分類では、ＩＬ−５＋／＋マウスでは、グレード１；４％、グレード２；２７％、グレード３；６０％及び変化無し；９％であったのに対して、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは、グレード１；２４％、グレード２；６％、グレード３；６％及び変化無し；６４％であった。また、本試験ではグレード４は確認されなかった（図６）。【００８６】
以上の結果から、ＩＬ−５＋／＋マウスでは、ｒＩＬ−３３依存的な重篤な肺血管肥厚が確認されたのに対して、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは明らかに肺血管肥厚が減少しており、わずかに低グレードの血管肥厚像を認めるだけであった。従って、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルが肺血管肥厚等に関与しており、肺高血圧症の重篤化に関与していることが明らかになった。このことから、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルを阻害することで、肺血管肥厚に起因する肺高血圧症の治療を行うことができることが、示唆された。
【実施例４】
【００８７】
抗ＩＬ−５中和抗体による好酸球依存的な重篤な動脈肥厚の抑制効果
実施例３と同様な実験系において、抗ＩＬ−５中和抗体による内膜肥厚及び中膜肥厚の抑制効果を確認するために、ＩＬ−５＋／＋マウスに、ｒＩＬ−３３投与日の２日前から、計３回、３日間連続で、１００μｇ  抗ＩＬ−５ラットモノクローナル抗体（ＮＣ１７）（Ｈｉｔｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９１；  ３；  １３５−１３９）又は、ラットＩｇＧコントロール抗体（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を腹腔内投与した。その後、２１日目に肺組織を摘出して病理観察を行いＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類に基づき組織分類を行った。【００８８】
その結果、コントロールＩｇＧ抗体投与群では、ＩＬ−５＋／＋マウスにｒＩＬ−３３を投与した場合と同様に、重篤な肺血管肥厚及び炎症が確認されたのに対して、抗ＩＬ−５モノクローナル抗体投与群では、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスで観察されたのと同様に、明らかに肺血管肥厚及び炎症組織が減少しており、正常組織又は低グレードの肺血管肥厚の割合が顕著に増加した（図７）。従って、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルが肺血管の重篤な肥厚及び炎症反応に関与していることが実施例３と同様明らかにされた。更に、ＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルを阻害する抗体によって、肺血管の炎症反応を有意に減少させることが明らかになった。このことは、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−５Ｒ抗体及びＩＬ−５Ｒシグナル特異的阻害化合物いずれによっても、肺組血管肥厚及び炎症反応を治療できることを示唆している。
【実施例５】
【００８９】
イロプロストによる好酸球依存的な重篤な動脈肥厚の抑制効果
実施例３と同様な実験系において、プロスタサイクリン誘導体である肺動脈性肺高血圧症治療剤イロプロスト（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）による効果を確認するため、ＩＬ−５＋／＋マウスにｒＩＬ−３３を投与する７及び１４日目に、イロプロスト又はＰＢＳを気管支内投与した。【００９０】
その結果、ＰＢＳ投与群に比べてイロプロスト投与群では、明らかな肺血管肥厚の減少が認められ、低グレードの肺血管肥厚が顕著に増加した（図８）。従って、プロスタサイクリン誘導体が、本ｒＩＬ−３３誘導性の肺血管肥厚や炎症反応に対して有効に作用することが明らかになった。
【実施例６】
【００９１】
ＩＬ−３３誘導性動脈肥厚のヒトＰＡＨに対する病理学的関連
ｒＩＬ−３３の長期処置によるマウスの血管形態学的解析及び右心室肥大解析を実施するために、ＩＬ−５＋／＋マウス及びＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスに１１週に渡り、毎週４００  ｎｇｒＩＬ−３３を腹腔内投与した。投与後、肺組織を摘出して病理観察を行いＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類に基づき組織分類を行うと共に、右室自由壁（ＲＶ）、左室＋中隔（ＬＶ＋Ｓ）を摘出して、各重量を測定し、（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）比を算出した。【００９２】
（１）組織学的解析
結果、ｒＩＬ−３３を長期処置したＩＬ−５＋／＋マウスでは、実施例３で示した３週間、ｒＩＬ−３３を投与したマウスと同様に、重篤な肺血管肥厚が確認されたのに対して、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは、肺血管肥厚が顕著に減少し、正常組織又は低グレードの肺血管肥厚の組織であった（図９）。また、ヒト肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）患者から得られる肺組織は最終病期段階のものであり、そのような組織では好酸球の浸潤、集積は殆ど確認されない。驚くべきことに、本ｒＩＬ−３３長期投与マウスモデルでは、ＰＡＨ患者由来組織と非常に類似した病理像を示しており、ＩＬ−５＋／＋マウスでは好酸球の浸潤は著しく障害され、平滑筋細胞の増加が確認された。一方、ＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは、３週間、ｒＩＬ−３３を投与したマウスと同様に好酸球の浸潤、平滑筋細胞の増加は確認されなかった。【００９３】
更に、心室重量を測定した結果から、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５＋／＋マウスでは、ＰＢＳ投与マウスと比べて（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）比が有意に増加しているのに対して、ｒＩＬ−３３を投与したＩＬ−５Ｖ／Ｖマウスでは、ＰＢＳ投与マウスと比べて（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）比の増加は認められなかった（図１０）。【００９４】
一方、５例の肺高血圧症患者由来組織を用い病理組織解析の再検討を行ったところ、殆どの動脈は血管壁の肥厚が進行したステージにあり、血管周辺の炎症所見は殆ど確認されなかった。２／５例で血管周辺に好酸球の浸潤が確認され、好酸球数に応じた中程度の血管肥厚が確認された。【００９５】
以上の結果から、ｒＩＬ−３３長期処置マウスモデルは、ＰＡＨ患者の組織像を反映しており、慢性期の肺動脈周辺の炎症、肺動脈肥厚及び肺血管リモデリングを反映しているものと考えられる。また、本長期処置においてもＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナル系が、ＰＡＨの病態増悪、進行に関与していることが明らかになった。【００９６】
（２）血漿ＳＴ２マーカー解析
一方、ＰＡＨ患者の末梢血液中には、可溶性ＳＴ２が増加していることが報告されていることから、本試験系のマウスの血漿ＳＴ２濃度を測定した。測定には、マウスＳＴ２ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。その結果、ｒＩＬ−３３投与マウスでは有意に、ＳＴ２濃度が増加しており（図１１）、ヒトＰＡＨ患者の病態を反映していることが明らかになった。【００９７】
以上の結果から、ＩＬ−３３応答性によってＩＬＣ２が介在した好酸球遊走が引き起こされ、肺血管周辺の炎症反応、肺血管壁の肥厚及び肺血管リモデリングが段階的に引き起こされることによって、急性期から慢性期の肺高血圧症が引き起こされることが明らかになった。本肺高血圧症の病態メカニズムにおいてＩＬ−５−ＩＬ−５Ｒシグナルは重要な役割を果たしており、ＩＬ−５Ｒを発現している好酸球を直接阻害、除去できる抗ＩＬ−５Ｒ抗体が肺高血圧症治療に有用であることが示唆された。
【実施例７】
【００９８】
抗ＩＬ−５Ｒラットモノクローナル抗体Ｈ７の遺伝子配列の取得
ラットハイブリドーマＨ７（Ｈｉｔｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９０；  １４４；  ４２１８−４２２５）からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製） を用いて１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。キットに付属のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘとラット軽鎖、重鎖定常領域を認識するプライマー（ｒａｔ  ｋａｐｐａ  ｒｅ；配列番号１１、ｒａｔ  ｇａｍｍａ  ｒｅ；配列番号１２）を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製） によってＰＣＲを行い、抗体遺伝子断片を増幅させた。ＰＣＲは９６℃で２ｍｉｎインキュベートした後、９８℃  １０ｓｅｃ、５５℃  １５ｓｅｃ、７２℃  １０ｓｅｃを３５サイクル繰り返すことにより行った。増幅させた遺伝子断片はアガロースゲルで分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲルから切り出して精製した。Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、増幅させた抗体遺伝子断片をｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクターへサブクローニングし、シークエンス解析 (プライマーは添付のＭ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ配列を使用)を行い、Ｈ７抗体の抗体遺伝子及びアミノ酸配列を決定した。得られた塩基配列およびアミノ酸配列を、配列番号１３〜１８に示した。
【実施例８】
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ 活性評価用の抗ＩＬ−５Ｒラットモノクローナル抗体Ｈ７の各種組換えキメラ抗体の作製
（１） 抗体発現ベクターへのサブクローニング
Ｈ７組換えキメラ抗体の活性評価を行うために、ラットモノクローナル抗体Ｈ７の定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域に組換え、かつコアフコースが結合していないヒト型キメラ抗体（以下、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ型抗体ともいう）を作製して用いることとした。ＡＤＣＣ活性のないコントロールとしては、ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  Ｎ２９７Ａのアミノ酸残基置換を含む変異ＩｇＧ１配列を使用してＮ型糖鎖を欠失させたヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）型抗体を用いた。ｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクターを鋳型として、ＶＬ領域もしくはＶＨ領域をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応用に設計したプライマー（ＶＬ ｆｗ、ＶＬ ｒｅ、ＶＨ ｆｗ、ＶＨ ｒｅ；配列番号１９〜２２) を用いてＰＣＲ（９６℃で２ｍｉｎインキュベートした後、９８℃  １０ｓｅｃ、５５℃  ５ｓｅｃ、７２℃  １０ｓｅｃを３０サイクル)で増幅させ、実施例７と同様にゲルから切り出して精製した。また、Ｈ７  ＶＬ領域のＣＤＲ３近傍、具体的にはＮ末端から８７番目にはフリーのＣｙｓが存在し、物性に影響を与えている可能性が考えられたため、このＣｙｓをＳｅｒへ置換するために変異を入れたプライマー（ＶＬ（ＣＳ）  ｆｗ、ＶＬ（ＣＳ）  ｒｅ；配列番号２３、２４）を用いてＨ７（ＣＳ） 改変体用のＶＬ領域を作製した。サブクローニング用のベクターとしては以下のものを使用した。VL領域用はシグナル配列付きヒト軽鎖定常領域挿入ベクターであるｐＣI−ｎｅｏ’＿ｈＫベクター（プロメガ社製ｐＣＩベクターを改変）を制限酵素ＸｂａＩ、ＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ社製）で切断してゲルから切り出して精製したものを用いた。ＶＨ領域用はシグナル配列付きヒトＩｇＧ１重鎖定常領域挿入ベクターであるｐＣＩ−ｐｕｒｏ＿ｈＧ１（プロメガ社製ｐＣＩベクターを改変）または、ｐＣＩ−ｐｕｒｏ  ｈＧ１（Ｎ２９７Ａ）ベクターを制限酵素ＦｓｐＡＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮｈｅＩ（ＮＥＢ社製）で切断してゲルから切り出して精製したものを用いた。精製したＨ７  ＶＬまたはＨ７（ＣＳ）  ＶＬ断片と切断したｐＣＩ−ｎｅｏ’ｈＫベクターを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用し、ベクター断片と抗体遺伝子断片のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｈ７  ＶＨ断片は、ｐＣＩ−ｐｕｒｏ＿ｈＧ１またはｐＣＩ−ｐｕｒｏ＿ｈＧ１（Ｎ２９７Ａ）ベクターへＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応後の液を用いてＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、コロニーを得た。いくつかのコロニーを培養してプラスミドを抽出し（ＰＩ−５０，クラボウ社製)、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製）によって正しい配列が挿入されたクローンを選択した。大腸菌をスケールアップして培養し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  ＥＦ（タカラバイオ社製）によりプラスミドを調製した。【０１００】
（２）キメラ抗体の動物細胞による一過性発現
作製したキメラ抗体発現ベクターを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して一過性に、各種キメラ抗体を発現させた。ポテリジェント型（Ｄｅｆｕｃｏｓｅ，ＤＦ）抗体の発現には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｆｕｔ８−／−）(国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号)を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に馴化した株を、宿主細胞として使用した。Ｎ２９７Ａ型抗体の発現には、該当キットに添付のＣＨＯ−Ｓ細胞を使用した。プラスミドの導入の方法は添付書類に従い、軽鎖の発現ベクターと重鎖の発現ベクターは、１：２の比率で混合して導入した。プラスミド導入後の細胞を、２００  ｍＬの培養液中で、３７℃、５％  ＣＯ２、１２５ｒｐｍの条件下で、５日間培養した。その後、細胞培養液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を通して培養上清を回収した。作製したキメラ抗体と、宿主細胞、トランスフェクションしたプラスミドの組み合わせを表１に示した。【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
（３）培養上清からの抗体の小スケール精製
培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたアフィニティー精製により、精製抗体を取得した。具体的には、カラムに充填したレジンをＰＢＳで平衡化した後、当該カラムに培養上清を添加し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｗａｓｈバッファー１（ＰＢＳ  ｗｉｔｈ  １Ｍ  ＮａＣｌ）、Ｗａｓｈバッファー２（２０ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ５．０）で各１回洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ３．４）を用いて抗体を溶出した。得られた抗体溶液に中和バッファー(１Ｍ  リン酸−ＮａＯＨ，ｐＨ  ７．０)を１/１０ 量加えて中和し、ＮＡＰ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて抗体溶液の溶媒をＰＢＳに置換した。バッファー置換後の抗体溶液について、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社製）を用いて限外濾過による濃縮を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して吸光度Ａ２８０ を測定し、抗体溶液の濃度測定と調製を行った。
【実施例９】
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｖｏ 活性評価用のＨ７組換えキメラ抗体の作製
適当な動物細胞用抗体発現ベクター(ヒトκ鎖定常領域、ヒトＩｇＧ１鎖定常領域もしくはＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）鎖定常領域を含む)の適当な位置に、Ｈ７キメラ抗体またはＨ７（ＣＳ）キメラ抗体のＶＨおよびＶＬをコードする塩基配列をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇを利用して、それぞれをタンデムに組み込んだ。発現させたＨ７キメラ軽鎖、Ｈ７（ＣＳ）キメラ軽鎖、Ｈ７  キメラＩｇＧ１重鎖、Ｈ７  キメラＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）重鎖の可変領域をコードする塩基配列を配列番号２５〜２８に示した。作製した抗体発現ベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１もしくはＣＨＯ−Ｋ１（Ｆｕｔ８−／−）株にエレクトロポレーション法にて導入し、薬剤選抜を行い表１のＨ７−１〜４に対応するキメラ抗体を発現する安定発現細胞株を取得した。【０１０４】
取得した各種組換えキメラ抗体発現株を、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ  ＋  ＢａｌＡｎＣＤ ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  １培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４００ｍＬスケールで１０日間培養し、培養上清を取得した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムによるアフィニティー精製の後、ｈＩｇＧ１型抗体はＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍ）（ミリポア社製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによって、モノマー含量の高い画分を分離し、ＮＡＰ２５を用いてＰＢＳにバッファー置換を行った。ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）型抗体は初期モノマー含量が少なかったため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製） を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりモノマー画分を分離して取得した。得られた抗体溶液は、リムルスＥＳ−ＩＩテストワコー(和光純薬工業社製)によってエンドトキシンフリーであることを確認した。また、アイソタイプコントロール抗体として、コアフコースが結合していない抗ｄｉｎｉｏｔｒｏｐｈｅｎｏｌ  （ＤＮＰ）ラット/ヒトキメラ抗体ＫＭ８８０８、およびＮ結合型糖鎖が結合していないＮ２９７Ａアミノ酸残基置換を含む抗ＤＮＰラット/ヒトキメラ抗体ＫＭ６１６１も同様にして作製した。
【実施例１０】
【０１０５】
Ｈ７組換えキメラ抗体の細胞反応性の評価
ＩＬ−５Ｒαを発現しているマウス由来細胞株Ｙ１６を用いて、実施例８で作製したキメラ抗体の抗原結合活性を評価した。Ｙ１６細胞をＳＭ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ２％  ＦＣＳ，０．０５％  ＮａＮ３，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）で洗浄した後、Ｍｏｕｓｅ ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ社製）を５μｇ／ｍＬの濃度で添加して４℃，３０ｍｉｎ静置した。細胞数を１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅに播種し、最終濃度１００００，２５００，６２５，１５６，３９，１０，２．４，０．６ｎｇ／ｍＬに調整した各キメラ抗体を添加した後、４℃で６０ｍｉｎの反応を行った。ラット／ヒトキメラ型のコントロール抗体としては、ｒｔＤＮＰ−１  ｈＩｇＧ１（ＤＦ）抗体（ＫＭ８８０８）およびｒｔＤＮＰ−１  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）抗体（ＫＭ６１６１）を使用した。各アイソタイプコントロール抗体の可変領域の塩基配列、アミノ酸配列は配列番号２９〜３４に示した。細胞をＳＭで洗浄した後、ＳＭで５００倍に希釈したＧｏａｔ  ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＰＥ（γｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、４℃で６０ｍｉｎの反応を行った。ＳＭで細胞を洗浄した後、細胞を５０μＬのＳＭで再懸濁し、蛍光強度をＦＣＭ法（フローサイトメーターＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社製））で測定した。データはＦｌｏｗＪｏ  ７．６５（トミーデジタルバイオロジー社製）によって解析し、各濃度におけるＧｅｏｍｅａｎ値を算出した。
結果を図１２に示した。抗ＤＮＰ抗体はいずれも全く結合しなかった一方、コアフコースが結合していないＨ７キメラ抗体Ｈ７  ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−１）およびＮ結合型糖鎖が欠損したＨ７キメラ抗体Ｈ７  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−３）は、マウスＩＬ−５Ｒα発現細胞Ｙ１６に対して同等に反応することが確認され、これはＣｙｓ置換を行ったＨ７キメラ抗体Ｈ７（ＣＳ）改変体（Ｈ７−２およびＨ７−４）についても同様であった。またＨ７−１とＨ７−２を比較した場合、Ｃｙｓ置換体であるＨ７−２の方が、僅かながら結合力が上昇している傾向がみられた。
【実施例１１】
【０１０６】
Ｈ７組換えキメラ抗体のマウスＦｃγＲ反応性の評価
実施例８で作製した各種Ｈ７キメラ抗体、および親抗体であるＨ７  ｒａｔＩｇＧ２ａ型抗体について、マウスＦｃγＲとの親和性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ−２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製） によって評価した。ＣＭ５センサーチップ上にアミンカップリングキット（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用してａｎｔｉ−ｔｅｔｒａ  Ｈｉｓマウス抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）を８０００ＲＵを目安に固相化した。カップリングバッファーには、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．５）を使用した。リガンドとして、ＨＢＳ−ＥＰ（＋）に２μｇ／ｍＬとなるように溶解したＨｉｓタグ融合マウスＦｃγＲＩ，ＩＩｂ，ＩＩＩおよびＩＶタンパク質（いずれもＲ＆Ｄ社製）を２μＬ／ｍｉｎ、３０ｓｅｃキャプチャーさせた後、アナライトとして８０，４０，２０，１０，５，２．５，１．２５，０．６２５μｇ／ｍＬの濃度に段階希釈した各種抗体をマルチサイクル法によって添加した。流速は５μＬ／ｍｉｎ、ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅおよびｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅはどちらも２４０ｓｅｃの条件で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅの Ｓｔｅａｄｙ  Ｓｔａｔｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙモードで実施した。結果を表２に示す。Ｈ７の定常領域をｒａｔＩｇＧ２ａ型からｈＩｇＧ１型にすることによって、マウスｉｎ ｖｉｖｏのエフェクター活性に関与するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＶへの結合活性の上昇が認められた。【０１０７】
【表２】
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【実施例１２】
【０１０８】
Ｈ７組換えキメラ抗体のＡＤＣＣ活性の評価
実施例８で作製したＨ７組換えキメラ抗体のＹ１６細胞に対するＡＤＣＣ活性を、ヒト凍結末梢血単核球（ＰＢＭＣ） （ＡＬＬＣＥＬＬＳ社製）をエフェクター細胞として用いて評価した。ヒト凍結ＰＢＭＣを５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、振とう培養（３７℃，５％  ＣＯ２，Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）した。ターゲット細胞であるＹ１６細胞およびエフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣをＡＤＣＣ  ａｓｓａｙ  ｍｅｄｉｕｍ（５％  Ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＢＳを含むＲＰＩＭ１６４０）を用いて洗浄し、それぞれ細胞密度が、２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび３×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。培地により２回洗浄後、細胞密度がいずれも４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。９６−ｗｅｌｌ  Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅに最終濃度が０．０００１，０．００１，０．０１，０．１，１，１０，１００及び１０００ｎｇ／ｍＬになるように調整したキメラ抗体、ターゲット細胞（２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）及び、エフェクター細胞 （５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の順にそれぞれ５０μＬずつ添加した。コントロール抗体としては、実施例１０で用いたｒｔＤＮＰ−１  ｈＩｇＧ１（ＤＦ）抗体（ＫＭ８８０８）およびｒｔＤＮＰ−１  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）抗体（ＫＭ６１６１）を、最終濃度を１０００ｎｇ／ｍＬとなるように調整して使用した。プレートを遠心分離（５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した後、インキュベーター内で静置した（３７℃，５％  ＣＯ２，４ｈｒｓ）。プレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、上清を９６−ｗｅｌｌ Ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ社製）に５０μＬずつ回収した。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、上清中のＬａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）活性を検出し、プレートリーダーＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ３４０  ＰＣ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）により４９０ｎｍの吸光度を測定した。ＡＤＣＣ活性（％）はバックグランド補正した測定値を用いて、以下の式により算出した。
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝
［［サンプルの吸光度］−［ターゲット細胞およびエフェクター細胞の自然遊離吸光度］］／［［ターゲット細胞全遊離の吸光度］−［ターゲット細胞自然遊離の吸光度］］【０１０９】
結果を図１３に示した。コアフコースが結合していないＨ７組換えキメラ抗体Ｈ７  ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−１）およびＨ７（ＣＳ）  ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−２）は、抗体濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示した。一方、Ｎ結合型糖鎖が欠損しているＨ７組換えキメラ抗体Ｈ７  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−３）およびＨ７（ＣＳ）  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−４）、並びに抗ＤＮＰ抗体ＫＭ８８０８およびＫＭ６１６１は、ＡＤＣＣ活性を示さなかった。以上の結果より、Ｈ７組換え抗体とＣｙｓ置換を含む抗体Ｈ７（ＣＳ）の生物活性には大きな差は認められないこと、および、Ｎ結合型糖鎖が欠損したＨ７組換えキメラ抗体は、エフェクター活性を有さないことが明らかになった。
【実施例１３】
【０１１０】
組換えキメラ抗ＩＬ−５Ｒα鎖抗体によるＩＬ−５シグナル阻害機能の検証
実施例８で作製した各種組換えキメラ抗体がＩＬ−５シグナルを阻害する機能を有するか否かを、Ｙ１６の増殖阻害を指標に検討した。２×１０３個のＹ１６をｒＩＬ−５（５ユニット／ｍＬ）の存在下もしくは非存在下で、Ｃｙｓ置換を含むコアフコースが結合していないＨ７組換えキメラ抗体Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−２）、Ｎ結合型糖鎖が欠損したＨ７組換えキメラ抗体Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−４）、並びに抗ＤＮＰ抗体ＫＭ８８０８およびＫＭ６１６１を０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し２４時間培養した。２４時間後、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用い増殖阻害能力を評価した。細胞増殖アッセイキットの試薬添加後の培養時間は１時間とした。
その結果、Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−２）抗体、およびＨ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−４）抗体は抗体濃度依存的にＹ１６の細胞増殖を阻害した（図１４）。アイソタイプコントロールｒｔＤＮＰ-1  ｈＩｇＧ1（ＤＦ）抗体（ＫＭ８８０８）、およびｒｔＤＮＰ-1  ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）抗体（ＫＭ６１６１）による増殖阻害は認められず、またｒＩＬ−５非存在下では、いずれの実験群でもＹ１６の増殖は観察されなかった。以上より、今回作製した抗ＩＬ−５Ｒα鎖Ｈ７組換えキメラ抗体はＩＬ−５シグナルを阻害する機能を有することが確認された。またＨ７−２とＨ７−４は同定程度の阻害能力を有していた。
【実施例１４】
【０１１１】
抗ＩＬ−５Ｒα鎖Ｈ７組換えキメラ抗体及び抗ＩＬ−５抗体によるＩＬ−３３誘発性血管肥厚の抑制効果の検証
実施例３と同様な実験系において、抗ＩＬ−５Ｒ抗体および抗ＩＬ−５中和抗体による血管肥厚の抑制効果を確認するために、ＩＬ−５＋／＋マウスに、１００μｇのＨ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（ＤＦ）（Ｈ７−２）抗体、Ｈ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（Ｈ７−４）抗体、抗ＩＬ−５抗体（リガンドに対する中和抗体、クローン名：ＴＲＦＫ５）、抗ＤＮＰ抗体ＫＭ８８０８、抗ＤＮＰ抗体ＫＭ６１６１、Ｒａｔ  ＩｇＧ（クローン名：ＨＲＰＮ）を最初のｒＩＬ−３３投与日（０日目）の２日前から、３日間連続で３回、２回目のｒＩＬ−３３投与日（７日目）に１回、２回目のｒＩＬ−３３投与日（１４日目）に１回、合計５回腹腔内投与した（図１５）。その後、２１日目に肺組織を摘出して、ＦＣＭ法と免疫蛍光染色法で評価した。【０１１２】
ＦＣＭ法では、肺細胞懸濁液中の細胞（１ｘ１０６個）を、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体（３０−Ｆ１１）、ＡＰＣコンジュゲート抗Ｇｒ１抗体（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＰＥコンジュゲート抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ抗体（Ｅ５０−２４４０）（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で染色した。ＣＤ４５陽性Ｇｒ１陰性Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ陽性細胞を好酸球とし、抗体投与による影響を観察した。【０１１３】
免疫蛍光染色法では、組織を３０μｍに薄切し、スライドを作製した後、Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートＳＭＡ抗体（１Ａ４）（Ａｂｃａｍ社製）、Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ抗体（Ｅ５０−２４４０）で染色した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で染色した。ここではＳＭＡ陽性細胞（主要な中膜構成細胞）の増殖の程度を観察した。【０１１４】
ＦＣＭ法による実験結果では、Ｈ７−２抗体ではほぼ完全に、Ｈ７−４抗体ではＨ７−２に劣る程度で、抗ＩＬ−５抗体ではＨ７−２には劣るもののＨ７−４よりも効果的に好酸球の増加を抑制していた（図１６）。一方、ネガティブコントロール抗体（ＫＭ８８０８、ＫＭ６１６１、Ｒａｔ  ＩｇＧ抗体）ではＩＬ−３３による好酸球増加を全く抑制していなかった。各抗体について、ＩＬ−３３存在下または非存在下での好酸球の存在比率（％）を表３に示す。【０１１５】
【表３】
2016194897.tif 000005
【０１１６】
免疫蛍光染色法による実験結果から、Ｈ７−２抗体で最も強力に、Ｈ７−４抗体と抗ＩＬ−５抗体ではＨ７−２に劣る程度で血管肥厚を抑制した。一方、コントロール抗体（ＫＭ８８０８、ＫＭ６１６１、Ｒａｔ  ＩｇＧ抗体）ではＩＬ−３３による血管肥厚の抑制は観察されなかった。【０１１７】
以上の結果から、ＡＤＣＣ活性を有する抗体（Ｈ７−２）は、Ｎ結合型糖鎖の欠損によりそのＡＤＣＣ機能を消失させた抗体（Ｈ７−４）や抗ＩＬ−５抗体に比べて、好酸球の増殖抑制機能に秀でていることが判明した。そのため、より効果的な血管肥厚の抑制にも貢献していることも明らかとなった。Ｈ７−２とＨ７−４は同等の抗原認識能力とＩＬ−５シグナル阻害能力を持つために、ここでみられた結果はＡＤＣＣの有無によるものと判断される。また、ＡＤＣＣ活性を有するＨ７−２抗体は、Ｈ７−４やＩＬ−５リガンド中和抗体よりも優れた血管肥厚抑制効果を示した。【０１１８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明は、肺高血圧症の治療薬及び治療方法として有用である。【０１２０】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号１：ＨＣＤＲ１
配列番号２：ＨＣＤＲ２
配列番号３：ＨＣＤＲ３
配列番号４：ＬＣＤＲ１
配列番号５：ＬＣＤＲ２
配列番号６：ＬＣＤＲ３
配列番号７：ＶＨ
配列番号８：ＶＬ
配列番号９：Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ
配列番号１０：Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ
配列番号１１：ｒａｔ  ｋａｐｐａ  ｒｅ
配列番号１２：ｒａｔ  ｇａｍｍａ  ｒｅ
配列番号１３：シグナル配列を含むＨ７抗体軽鎖可変領域の塩基配列
配列番号１４：シグナル配列を含むＨ７抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：シグナル配列を除いたＨ７抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６：シグナル配列を含むＨ７抗体重鎖可変領域の塩基配列
配列番号１７：シグナル配列を含むＨ７抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８：シグナル配列を除いたＨ７抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９：ＶＬ  ｆｗ
配列番号２０：ＶＬ  ｒｅ
配列番号２１：ＶＨ  ｆｗ
配列番号２２：ＶＨ  ｒｅ
配列番号２３：ＶＬ（ＣＳ）  ｆｗ
配列番号２４：ＶＬ（ＣＳ）  ｒｅ
配列番号２５：組換え発現させたＨ７抗体軽鎖可変領域の塩基配列
配列番号２６：組換え発現させたＨ７（ＣＳ）抗体軽鎖可変領域の塩基配列
配列番号２７：組換え発現させたＨ７またはＨ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１抗体重鎖可変領域の塩基配列
配列番号２８：組換え発現させたＨ７またはＨ７（ＣＳ）ｈＩｇＧ１（ｎ２９７Ａ）抗体重鎖可変領域の塩基配列
配列番号２９：シグナル配列を含むｒｔＤＮＰ−１抗体軽鎖可変領域の塩基配列
配列番号３０：シグナル配列を含むｒｔＤＮＰ−１抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３１：シグナル配列を除いたｒｔＤＮＰ−１抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３２：シグナル配列を含むｒｔＤＮＰ−１抗体重鎖可変領域の塩基配列
配列番号３３：シグナル配列を含むｒｔＤＮＰ−１抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３４：シグナル配列を除いたｒｔＤＮＰ−１抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016194897.tif 000023
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