(57)【要約】開示されているのは、(A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む、臓器又は組織の保存剤、該保存剤を含む臓器又は組織の保存液、並びに(A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む液体混合物に、臓器又は組織を浸漬する工程を含む臓器又は組織の保存方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む、臓器又は組織の保存剤。
【請求項２】
前記臓器又は組織が、心臓、肝臓、腎臓、膵臓又は膵島である、請求項１に記載の保存剤。
【請求項３】
請求項１に記載の保存剤を含む臓器又は組織の保存液。
【請求項４】
(A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む液体混合物に、臓器又は組織を浸漬する工程を含む臓器又は組織の保存方法。
【請求項５】
前記臓器又は組織が、心臓、肝臓、腎臓、膵臓又は膵島である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器又は組織の保存剤、該保存剤を含む臓器又は組織の保存液、及び臓器又は組織の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は細胞膜を挟んで細胞内外でイオンの組成が異なっており、この電荷を持つイオンの分布の差が、電位差をもたらす。通常、細胞内は細胞外に対して負の電位にあり(膜電位)、この膜電位は生物共通の基本原理として動植物を問わず存在している。膜電位の調節機構は生命維持及び細胞の機能を発揮するのに必須であり、その破綻は生命又は細胞の死に直結する。【０００３】
このため、細胞内外の膜上には様々なイオンポンプ及びイオンチャンネルがあり、恒常的にイオンバランスの調節が行われている。その最も重要な調節機構として、動物細胞ではナトリウムポンプ(Na+-K+ ATPase)が、植物細胞ではプロトンポンプ(H+-ATPase)が挙げられる。これらのイオンポンプはATPエネルギーを利用して特定のイオンを能動輸送する膜タンパク質である。何らかの原因によりATPが枯渇又は環境温度が至適範囲から逸脱するとイオンポンプの機能は低下又は停止することになる。【０００４】
動物細胞では生理的条件下では主にナトリウムポンプの働きによって、1回毎に細胞内のナトリウムイオン3つが細胞外に汲み出され、逆にカリウムイオン2つが細胞外から細胞内に汲み入れられる。したがって、通常、細胞内はカリウム濃度が高く(ナトリウム濃度は低く)、細胞外はナトリウム濃度が高く(カリウム濃度は低く)維持されている。細胞は一定の温度以下の低温になるとナトリウムポンプの機能が低下し、ナトリウムを細胞外に汲み出すことができなくなり、細胞内のナトリウム濃度が上昇する。ナトリウム濃度の上昇に伴い細胞内浸透圧が上昇し、水分子の流入により細胞が膨潤、最終的に細胞破裂(細胞傷害)に至る。【０００５】
医療現場での臓器移植又は組織移植に際し、臓器又は組織を低温保存した場合の細胞傷害は、上記のメカニズムが主要な原因の一つと考えられ、電解質の基本組成を細胞内型の低ナトリウム、高カリウムとした臓器又は組織保存液が開発された。その代表例がユーロコリンズ(EC)液及びUW (University of Wisconsin)液である。これらは、それまでのリンゲル液を中心とした細胞外型(高ナトリウム、低カリウム)の保存液と比べ、大幅な移植用臓器又は組織の保存期間の延長を可能とし、国内外において主要な移植用臓器又は組織の保存液として臨床応用されている。しかしながら、これら細胞内型保存液は保存温度が上昇した場合には一転して細胞傷害性を起こす危険性を有している。また、これらが全ての移植用臓器又は組織に適用できるわけではなく、更なる保存期間の延長も含め、より一層の性能向上が待望されている。【０００６】
臓器又は組織を保存する技術は、例えば、次の特許文献１〜８に開示されている。【０００７】
特許文献１には、一以上のポリフェノールを含む保存溶液を生物学的材料に添加し、冷却することによる生物学的材料の保存方法が開示されている。その実施例においてはポリフェノールとしてカテキン類が開示されているのみである。また、凍結保護物質として、スクロース、ブドウ糖、トレハロース等の糖類が開示されているが、該特許文献の実施例においてはトレハロースが使用されているに止まる。【０００８】
特許文献２には、細胞培養液中にエンケファリン誘導体を添加することによる、水が結晶化しない温度、例えば4℃前後の温度で細胞を冷蔵保存する方法が開示されている。しかしながら、該特許文献には糖類に関する記載はない。【０００９】
特許文献３には、ポリフェノールと0.0001〜0.05重量%のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩とを含有する、細胞保存剤、組織保存剤等として使用するための医用ポリフェノール溶液が開示されている。当該医用ポリフェノール溶液によりポリフェノールの分解が抑制され、過酸化水素の発生が抑制される。しかしながら、該特許文献の実施例においてはポリフェノールとしてはエピガロカテキンガレート(EGCg)が使用されているに止まる。また、適宜添加されてよい成分として、単糖類、二糖類、及び多糖類の化合物(グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む)等が開示されているが、該特許文献の実施例においては糖類の開示はない。【００１０】
特許文献４には、有効成分としてエピガロカテキンガレートを90質量%以上含有する保存剤用組成物が開示され、エピガロカテキンガレートを高純度に精製して用いることで細胞の保存効果をより一定にできることが記載されている。該特許文献の実施例においては、膵島の37℃での保存においてグルコースも使用されているが、本発明の糖類であるフルクトース及びスクロースの開示は一切ない。【００１１】
特許文献５及び特許文献６には、それぞれフラボノイド配糖体及びフラボノイド非配糖体化合物群が低温傷害保護効果を有することが開示されている。さらには、特許文献７には、フラボノイド配糖体及びフラボノイド非配糖体との併用により低温傷害保護効果がさらに高められることが開示されている。【００１２】
特許文献８には、ポリフェノールを有効成分とし、トレハロースを含んでいてよい細胞・組織保存液が細胞、臓器又は組織に対して保護作用を示すことが開示されている。該特許文献の実施例においてはポリフェノールであるカテキンとトレハロースとの併用が開示されているのみである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表2007-519712号公報
【特許文献２】特開2002-335954号公報
【特許文献３】特開2006-188436号公報
【特許文献４】特開2003-267801号公報
【特許文献５】国際公開第2013/047665号
【特許文献６】国際公開第2013/047666号
【特許文献７】国際公開第2014/162910号
【特許文献８】国際公開第02/001952号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献１〜８には臓器又は組織を保存する溶液にケルセチン及び本発明の特定の糖類を併用して使用することは実質的には開示されていない。【００１５】
細胞、組織、器官又は臓器などを低温下で簡便に保存することは、一般に実施されている方法である。しかしながら、対象物の凍結を伴わない場合でも、その低温条件に起因する傷害が発生することも知られている。これまでの保存技術は、全ての細胞、組織、器官又は臓器の保存に適用できるわけではなく、更なる保存期間の延長も含め、より一層の性能向上が待望されている。【００１６】
本発明は、これらの低温傷害等の問題を解決すべく、臓器又は組織の保存剤、該保存剤を含む臓器又は組織の保存液、及び臓器又は組織の保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、ケルセチンと特定の糖類とを併用し、凍結を伴わない低温から通常の冷蔵温度までの温度で細胞を保存することで、低温傷害保護効果が得られるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき完成されたものであり、以下の保存剤、保存液、及び保存方法を提供するものである。【００１８】
(I) 保存剤
(I-1) (A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む臓器又は組織の保存剤。
(I-2) 前記臓器又は組織が、心臓、肝臓、腎臓、膵臓又は膵島である、(I-1)に記載の保存剤。
(I-3) 低温保存用である、(I-1)又は(I-2)に記載の保存剤。
(I-4) (A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む、臓器又は組織の低温傷害保護剤。【００１９】
(II) 保存液
(II-1) (I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載の保存剤を含む臓器又は組織の保存液。
(II-2) 低温保存用である、(II-1)に記載の保存液。【００２０】
(III) 保存方法
(III-1) (A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む液体混合物に、臓器又は組織を浸漬する工程を含む臓器又は組織の保存方法。
(III-2) 前記臓器又は組織が、心臓、肝臓、腎臓、膵臓又は膵島である、(III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記工程において前記液体混合物を低温に保持する、(III-1)又は(III-2)に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の保存剤及び方法により、臓器又は組織に対する低温傷害保護効果が得られる。したがって、臓器又は組織の保存に適し、且つ低温傷害を抑制することができる条件で、臓器又は組織を長期間に亘って保存することが可能となる。【００２２】
そのため、本発明は、臓器移植、組織移植などの分野における応用が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の臓器又は組織の保存剤は、(A)ケルセチン、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含むことを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の臓器又は組織の保存方法は、(A)ケルセチン(Quercetin)、並びに(B)フルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む液体混合物に臓器又は組織を浸漬する工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明に使用されるケルセチン及び糖類は、公知の方法により化学的に合成することができるし、植物等の生物に含まれているので、これらから公知の方法により抽出することで入手することもできる。また、ケルセチン及び糖類は、市販品により入手することも可能である。
【００２７】
本明細書で使用する低温傷害とは、低温により引き起こされる細胞傷害を意味し、低温傷害保護効果とは、該低温傷害から細胞を保護する効果を意味する。したがって、この意味を勘案すると、本発明の保存剤は低温傷害保護剤と称することもできる。
【００２８】
本発明において、臓器又は組織はいずれの動物由来であってもよい。中でも哺乳類(ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど)由来の臓器又は組織が望ましい。
【００２９】
臓器又は組織は、好ましくは臓器移植又は組織移植に適用される。臓器としては、例えば、心臓、肺臓、肝臓、腎臓、膵臓、小腸などが挙げられ、好ましくは、心臓、肝臓、腎臓及び膵臓であり、特に好ましくは、心臓及び肝臓である。組織としては、例えば、角膜、皮膚、骨、血管、心臓弁、羊膜、膵島などが挙げられ、好ましくは、膵島である。
【００３０】
本発明の保存剤は、ケルセチン並びにフルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類以外にも、公知の添加剤が適宜配合されていてもよい。
【００３１】
本発明の臓器又は組織の保存液は、上記保存剤を含むことを特徴とする。本発明において臓器又は組織を保存する際には、ケルセチン並びにフルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類は、液体混合物(すなわち、液状の混合物、望ましくは溶液)(本明細書における保存液に対応する)として使用され、該液体混合物には、ケルセチン並びにフルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類に加えて、通常、溶剤を含有する。該溶剤としては、特に限定されず、例えば、生理食塩水、輸液類(電解質輸液、栄養輸液、糖質輸液、アミノ酸輸液、ブドウ糖液、リンゲル液、酢酸リンゲル液、乳酸リンゲル液等)、緩衝液(PBS、トリス緩衝液、Hepes緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液等)、細胞培養液(RPMI1640、DMEM等)、臓器又は組織保存液(EC液、UW液、ET-Kyoto液等)、モデナ液などが挙げられる。
【００３２】
本発明の保存液におけるケルセチンの濃度としては、通常、0.001〜1000μg/ml、好ましくは0.01〜100μg/mlである。本発明の保存液における糖類の濃度としては、通常、0.01〜0.8M、好ましくは0.025〜0.4Mである(フルクトース及びスクロースを両方含む場合は、合計の濃度を示す)。なお、本発明の保存液には従来の他の成分、例えば、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖質、脂質、ビタミン、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、pH指示薬、キレート剤、浸透圧調節剤などを含むこともできる。
【００３３】
本発明は、臓器又は組織が凍結をしない温度(低温)で実施されることが好ましい。臓器又は組織が凍結しない温度とは、保存剤又は保存液に含まれる成分及び組成、保存期間、保存対象の臓器又は組織等により変化するため一概に定義できない。本発明の低温傷害保護効果の発揮の観点からは、例えば-15℃〜20℃、好ましくは0℃〜20℃、より好ましくは0℃〜10℃の温度が挙げられる。
【００３４】
臓器又は組織を冷却するに当たっては、臓器又は組織が凍結をしない限り、上記液体混合物に臓器又は組織を浸漬する前に予め該混合液を冷却してもよいし、また臓器又は組織を浸漬した後の液体混合物を冷却してもよい。また、臓器又は組織を含む液体混合物が一旦冷却された後は、臓器又は組織が凍結をしない限り、該液体混合物は同温度に保持されるが、常に一定の温度に維持される必要はなく、短時間なら前記の範囲外の温度になってもよい。
【００３５】
本発明のケルセチン並びにフルクトース及びスクロースからなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類を含む液体混合物を使用することにより、低温傷害保護効果が得られる。本発明は、臓器又は組織の保存に適した条件下で、それに起因する低温傷害を抑制できるので、臓器又は組織を適切な状態で保存することが可能となる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【００３７】
試験例１(臓器保存試験におけるケルセチンと糖類との併用効果)
臓器移植又は組織移植に際して用いる臓器又は組織の保存液の保護作用を想定し、UW液、ケルセチン及び糖類を併用した保存液の処方を、肝臓の傷害度を指標として評価した。【００３８】
臓器灌流液として、Williams液(GIBCO、No.12551-032)のみ、ケルセチン(Sigma-Aldrich 337951-25G)(10μg/ml)を含有したWilliams液、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.05M〜0.4M)(関東化学株式会社 Code No.16065-00)(0.05M〜0.4M)とを含有したWilliams液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.025M〜0.2M)(ナカライテスク株式会社 Code No.30404-45)(0.025M〜0.2M)とを含有したWilliams液を用いた。次に、臓器保存液として、UW液(アステラス製薬株式会社、VSP1000ビアスパン1000 mL)のみ、ケルセチン(10μg/ml)を含有したUW液、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.05M〜0.4M)とを含有したUW液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.025M〜0.2M)とを含有したUW液を用いた。【００３９】
SDラット(雄、体重255.4 g〜339.0 g)を麻酔下で門脈からヘパリンを注入後、室温の生理食塩水(8 cmH2O、約100 ml)で灌流し、次いで室温の各臓器灌流液(8 cmH2O、約100 ml)で灌流後、肝臓を摘出して各臓器保存液20 mlに浸漬して4℃で保存した。保存開始から1日後、3日後、5日後及び7日後に、各臓器保存液の一部を採取して、ALT (アラニンアミノトランスフェラーゼ)(IU/L)を測定し、肝臓の低温保存における傷害度の指標とし、表１及び表２に示した(n=3の平均値±標準偏差)。【００４０】
【表１】
2017038805.tif 000002
【００４１】
【表２】
2017038805.tif 000003
【００４２】
ケルセチンとトレハロースとを含有したUW液に保存したとき、ケルセチンとフルクトース又はケルセチンとスクロースとを含有したUW液に保存したときより、ALT値は大きくなった。【００４３】
試験例２(臓器保存試験におけるケルセチンと糖類との併用効果)
肝臓を心臓に変更し、試験例１と同様にUW液、並びにケルセチン及び糖類を併用した保存液の処方を、心臓の傷害度を指標として評価した。【００４４】
臓器灌流液として、Williams液のみ、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.2M)とを含有したWilliams液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したWilliams液を用いた。次に、臓器保存液として、UW液のみ、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.2M)とを含有したUW液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したUW液を用いた。【００４５】
SDラット(雄、体重：257.4 g〜280.3 g)を麻酔下で肝上部下大静脈からヘパリンを注入後、室温の生理食塩水(8 cmH2O、約100 ml)で灌流し、次いで室温の各臓器灌流液(8 cmH2O、約100 ml)で灌流後、心臓を摘出して各臓器保存液20 mlに浸漬して4℃で保存した。保存開始から1日後、2日後、3日後及び4日後に、各臓器保存液の一部を採取して、LDH (乳酸脱水素酵素)(IU/L)を測定し、心臓の低温保存における傷害度の指標とし、表３に示した(n=3の平均値±標準偏差)。【００４６】
【表３】
2017038805.tif 000004
【００４７】
試験例３(臓器又は組織保存試験におけるケルセチンと糖類との併用効果、病理組織学的変化)
UW液、並びにケルセチン及び糖類を併用した保存液の処方を、肝臓の病理組織学的変化を指標として評価した。【００４８】
臓器灌流液として、Williams液のみ、ケルセチン(10μg/ml)のみを含有したWilliams液、フルクトース(0.2M)のみを含有したWilliams液、スクロース(0.1M)のみを含有したWilliams液、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.2M)とを含有したWilliams液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したWilliams液を用いた。次に、臓器保存液としてUW液のみ、ケルセチン(10μg/ml)のみを含有したUW液、フルクトース(0.2M)のみを含有したUW液、スクロース(0.1M)のみを含有したUW液、ケルセチン(10μg/ml)とフルクトース(0.2M)とを含有したUW液又はケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したUW液を用いた。【００４９】
SDラット(雄、体重：264.1 g〜317.2 g)を麻酔下で門脈からヘパリンを注入後、室温の生理食塩水(8 cmH2O、約100 ml)で灌流し、次いで室温の各臓器灌流液(8 cmH2O、約100 ml)で灌流後、肝臓を摘出して各臓器保存液20 mlに浸漬して4℃で保存した。保存開始から1日後及び2日後に、全ての肝臓を10%リン酸緩衝ホルマリン水溶液にて固定後、常法に従いパラフィンに包埋した。約6μmに薄切し、ヘマトキシリン・エオジン重染色標本を作製し、鏡検した。認められた病理組織学的変化の程度を、以下のようにスコア値化し累積値として集計し、表４及び５に示した。
スコア0；変化を認めず、スコア0.5；軽微な変化、スコア1.0；軽度な変化、スコア2.0；中等度の変化、スコア3.0；高度な変化。【００５０】
【表４】
2017038805.tif 000005
【００５１】
【表５】
2017038805.tif 000006
【００５２】
試験例４(臓器又は組織保存試験におけるケルセチンと糖類との併用効果、ラット同所性肝臓移植)
UW液、並びにケルセチン及び糖類を併用した保存液の処方効果を、ラット同所性肝臓移植にて評価した。【００５３】
臓器灌流液として、Williams液のみ、ケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したWilliams液を用いた。次に、臓器保存液としてUW液のみ、ケルセチン(10μg/ml)とスクロース(0.1M)とを含有したUW液を用いた。【００５４】
ドナーのSDラット(雄、体重273.8 g〜335.7 g)を麻酔下で門脈からヘパリンを注入後、室温の生理食塩水(8 cmH2O、約100 ml)で灌流し、次いで室温の各臓器灌流液(8 cmH2O、約100 ml)で灌流後、肝臓を摘出して各臓器保存液20 mlに浸漬して4℃で保存した。保存開始から1日後に、レシピエントラットに同所性移植し、移植2時間後に血中ALTを測定し、肝臓の低温保存における傷害度の指標とし、表６に示した(n=3の平均±標準偏差)。また、同時に全ての肝臓を10%リン酸緩衝ホルマリン水溶液にて固定後、常法に従いパラフィンに包埋した。約6μmに薄切し、ヘマトキシリン・エオジン重染色標本を作製し、鏡検した。認められた病理組織学的変化の程度を、以下のようにスコア値化し累積値として集計し、表７に示した。
スコア0；変化を認めず、スコア0.5；軽微な変化、スコア1.0；軽度な変化、スコア2.0；中等度の変化、スコア3.0；高度な変化。【００５５】
【表６】
2017038805.tif 000007
【００５６】
【表７】
2017038805.tif 000008
【国際調査報告】
2017038805.tif 000009
2017038805.tif 000010