(57)【要約】  バイオマーカーの検出方法は、バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズと、生体サンプルとを混合して、バイオマーカーを受容体に結合させ、バイオマーカーと受容体との結合を光学的検出方法により検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中のバイオマーカーの検出方法であって、
前記バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズと、前記生体サンプルとを混合して、前記バイオマーカーを前記受容体に結合させるステップと、
前記バイオマーカーと前記受容体との結合を光学的検出方法により検出するステップとを備えていることを特徴とするバイオマーカーの検出方法。
【請求項２】
前記受容体は、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１（ＬＯＸ−１）であり、前記バイオマーカーは、ＬＯＸ−１リガンドであることを特徴とする請求項１に記載のバイオマーカーの検出方法。
【請求項３】
前記光学的検出方法は、比濁法又は比朧法であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオマーカーの検出方法。
【請求項４】
前記ビーズは、ラテックスビーズであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオマーカーの検出方法。
【請求項５】
前記生体サンプルは、ヒトの血清、血漿又は尿であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオマーカーの検出方法。
【請求項６】
糖尿病、動脈硬化及び肝臓病から選択される少なくとも１つの疾患のリスクを評価するために行われることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のバイオマーカーの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いるための生体サンプル中のバイオマーカーの検出キットであって、
前記バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズを備えていることを特徴とするバイオマーカーの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の発症リスクや疾患の進行度を評価するためのバイオマーカーの検出方法及び検出キットに関し、特に、複数のマーカーを同時に検出できるバイオマーカーの検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の疾患の発症リスクの評価のために、患者の血液や尿等の体液をサンプルとして採取し、そのサンプル中に存在する疾患リスクと関連するバイオマーカーの量を評価することが行われている。また、現在も種々の疾患の発症リスクの評価に用いることが可能な新規のバイオマーカーの探索や研究が進められている。例えば、特許文献１には、脳梗塞や心筋梗塞等の心血管障害の発症リスクを示すバイオマーカーとしてＬＡＢ（LOX-1 ligand containingApoB）が提示されており、特許文献２には、糖尿病性血管障害の発症に関わるバイオマーカーとしてＡＧＥ（AdvancedGlycation End Products）が提示されている。また、特許文献３には、メタボリックシンドロームや糖尿病等の生活習慣病に関するバイオマーカーとして、酸化ＨＤＬ（high-density lipoprotein）が開示されている。【０００３】
これらの生体サンプル中に存在するバイオマーカーは、通常、検出したい所望のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いて検出される。例えば、特許文献３では、酸化ＨＤＬをリガンドとして結合する受容体を所定の担体に固定し、該担体に生体サンプルを接触させてサンプル中の酸化ＨＤＬを上記受容体に結合させ、受容体に結合された酸化ＨＤＬを、酸化ＨＤＬに特異的に結合する抗アポリポタンパク質Ａ１抗体を用いて検出している。具体的に、その検出には、酸化ＨＤＬに結合した抗アポリポタンパク質Ａ１抗体に結合する標識抗体（二次抗体）を用いて、酸化ＨＤＬの量を定量するような従来法であるサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法等を利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５５８１４３２号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２２９９４号公報
【特許文献３】特開２０１５−１０８７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のような抗体を用いたバイオマーカーの検出方法の場合、抗体は通常、一種類の抗原としてのバイオマーカーに特異的に結合するため、すなわち一種類のバイオマーカーのみを検出するため、一度に複数種のバイオマーカーを検出することはできない。また、上記方法では、所望のバイオマーカーをリガンドとして結合する受容体と、該バイオマーカーに特異的に結合する一次抗体と、さらに該一次抗体に結合する標識化された二次抗体とを必要とするため、多くの試薬が必要となり、さらにそれぞれを結合させる反応時間が必要となるので、バイオマーカーの検出に多くの時間がかかることとなる。【０００６】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、必要な試薬及び時間を低減し、簡便に生体中の疾病に関わる複数種のバイオマーカーを一度に検出できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の目的を達成するために、本発明は、生体サンプル中のバイオマーカーの検出方法を、バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズを用いて、抗体を用いることなくバイオマーカーを検出するような方法とした。【０００８】
具体的に、本発明は、生体サンプル中のバイオマーカーの検出方法であって、バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズと、生体サンプルとを混合して、バイオマーカーを受容体に結合させるステップと、バイオマーカーと受容体との結合を光学的検出方法により検出するステップとを備えていることを特徴とする。【０００９】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法によると、バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズを生体サンプルと混合し、得られた混合液に対して例えば吸光度測定を利用した比濁法等の光学的検出方法を行うことにより、所望のリスクマーカーを極めて簡便に検出することができる。また、用いる試薬もバイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズのみであり、抗体等の材料を必要としないためコストを低減でき、さらに一次抗体や二次抗体の反応時間を必要としないため短時間で当該方法を実施することができる。また、本発明に係る方法では、一度に一種類のバイオマーカーのみならず、用いる受容体にリガンドとして結合する複数種のバイオマーカーを一度に検出することができる。【００１０】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法において、受容体として、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１（ＬＯＸ−１）を用いることができ、その場合、バイオマーカーとしてＬＯＸ−１リガンドを検出することができる。【００１１】
ＬＯＸ−１リガンドとしては、酸化ＬＤＬ（low-density lipoprotein）、酸化ＨＤＬ、レムナント様粒子、ＣＲＰ（C-reactiveprotein）、ＨＳＰ（Heat shock protein）７０、ＨＳＰ６０、ヘパリン、ＡＧＥ、並びに老化した赤血球及び細胞等が挙げられる。このうち、酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ、ＣＲＰ及びＡＧＥは、動脈硬化、糖尿病及び肝臓病に関わり、生体中のそれらのマーカーの増大はそれらの疾病の発症のリスクを示す。このため、本発明の受容体としてＬＯＸ−１を用いることにより、上記疾病の発症リスクを評価することができる。【００１２】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法において、光学的検出方法としては比濁法又は比朧法を用いることができる。【００１３】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法において、ビーズは、ラテックスビーズであることが好ましい。【００１４】
ラテックスビーズは、容易にその表面に受容体を担持することができ、その受容体にリガンドが結合すると、ラテックスビーズの凝集が生じて、これにより生じるサンプル液中の光学的変化を検出でき、例えばサンプル液中のラテックスビーズの凝集による濁度の増大を、比濁法を利用して検出することができ、これにより、受容体とリガンドとの結合の量を検出することができる。【００１５】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法において、生体サンプルは、ヒトの血清、血漿又は尿であることが好ましい。【００１６】
血清、血漿及び尿は、比較的に容易にヒトから採取することができるため、これらを生体サンプルとして用いることにより、ヒトのバイオマーカーの検出が容易となる。【００１７】
また、本発明は、上記各バイオマーカーの検出方法を行うための、キットを提供し、具体的に、当該キットは、バイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズを備えていることを特徴とする。【００１８】
本発明に係るバイオマーカーの検出キットによると、上記の各方法を簡便に行うことができ、これにより、所望のリスクマーカーを極めて簡便に検出することができる。また、用いる試薬もバイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズのみであり、抗体等の材料を必要としないためコストを低減でき、さらに一次抗体や二次抗体の反応時間を必要としないため短時間で当該方法を実施することができる。さらに、一度に一種類のバイオマーカーのみならず、用いる受容体にリガンドとして結合する複数種のバイオマーカーを一度に検出することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るバイオマーカーの検出方法及び検出キットによると、所望のリスクマーカーを極めて簡便で且つ短時間に検出することができる。また、用いる主な試薬もバイオマーカーをリガンドとして結合する受容体が担持されたビーズのみであり、抗体等の材料を必要としないため低コストで当該方法を実施することができる。さらに、一度に一種類のバイオマーカーのみならず、用いる受容体にリガンドとして結合する複数種のバイオマーカーを一度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（ａ）〜（ｃ）はＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを用いて各ＬＯＸ−１リガンドの検量線を作成した結果を示すグラフであり、（ａ）は酸化ＬＤＬの検量線であり、（ｂ）は酸化ＨＤＬの検量線であり、（ｃ）はＣＲＰの検量線である。
【図２】ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを用いて健常者及び糖尿病患者の血液サンプルにおけるＬＯＸ−１リガンドの量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２２】
本発明の一実施形態に係る生体サンプル中のバイオマーカーの検出方法は、所定のバイオマーカーをリガンドとして結合する受容体を担持したビーズを、生体サンプルと混合し、得られた混合液に対して比濁法等の光学的検出方法を行うにより、生体サンプル中のバイオマーカーと受容体との結合量を測定して、生体サンプル中に存在するバイオマーカーを検出するものである。
【００２３】
本実施形態において、生体サンプルとは、生物から採取される試料であり、以下のものに限定されないが、例えば、ヒト等の哺乳動物の血液、血漿、血清、尿、唾液、涙液及び髄液等の体液である。これらの中でも、特にヒトの血漿、血清及び尿を生体サンプルとして用いるのが好ましい。
【００２４】
本実施形態において、バイオマーカーとは、所定の疾患に関連するペプチド、タンパク質、核酸、脂質又はその他の低分子化合物であり、その生体中の濃度の増減が当該疾患の存在又は進行度に反映するものである。例えば、糖尿病、動脈硬化及び肝臓病のバイオマーカーとしては、酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ及びＣＲＰ等が知られている。
【００２５】
本実施形態において、受容体とは、上記バイオマーカーがリガンドとして結合できる受容体（レセプター）であり、複数種のリガンドに結合できることが好ましい。用いる受容体は、発症リスクを評価したい疾病によって選択することができ、例えば、ＬＯＸ−１、ＣＤ３６、ＳＲ−ＢＩ、ＳＲＥＣ及びＳＲ−ＰＳＯＸ等のスカベンジャー受容体や、ＲＡＧＥ等の種々の受容体を用いることができる。例えば、上記酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ及びＣＲＰの全てを結合できる受容体としては、ＬＯＸ−１を選択することができる。このような受容体を選択することにより、単一のリガンドではなく、当該受容体に結合し得るリガンドとしての全てのバイオマーカーの存在を検出することができる。すなわち、例えばＬＯＸ−１を受容体として選択した場合、生体サンプル中の酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ及びＣＲＰの少なくとも１つの存在を検出することができる。
【００２６】
本実施形態において、ビーズとは、受容体を担持するための粒子状の担体である。ビーズは、その表面に受容体を担持することができ、後に説明する光学的検出方法に用いることができれば、その材料は特に限定されず、例えばラテックスビーズ、磁気ビーズ及び金コロイド等を用いることができ、特にラテックスビーズを用いることが好ましい。ビーズの粒径は、上記光学的検出方法に用いることができれば特に限定されないが、例えば８０ｎｍ〜５５０ｎｍの粒径を有するビーズを用いることができる。
【００２７】
本実施形態において、バイオマーカーと受容体との結合は、光学的検出方法により検出される。本実施形態において、光学的検出方法としては比濁法及び比朧法等を用いることができる。本実施形態において、比濁法は、ビーズに担持された受容体にバイオマーカーが結合し、それらが複合体を形成することにより該ビーズが凝集する性質を応用するものである。例えば、受容体を担持するビーズと生体サンプルとを混合した混合液の吸光度を測定することによりその濁度を測定できる。この測定した濁度の大きさで生体サンプル中のバイオマーカーと受容体との結合量を評価でき、すなわち、生体サンプル中のバイオマーカーの量を定量することができる。上述のようなビーズと生体サンプルとの混合液に対する光学的検出方法の実施は、例えば手動で上記混合液をマイクロチューブや、複数のウェルを有するマイクロプレートに入れて、光学測定装置により測定することで行うことができる。この他に、例えば生化学自動分析装置を用いて自動で測定してもよい。
【００２８】
本実施形態によると、上述のように、受容体を担持するビーズを生体サンプルと混合して、その混合液の濁度を測定するといった極めて簡単な操作のみで生体サンプル中のバイオマーカーを検出することができる。また、本実施形態では、上記ビーズ以外に抗体等の材料を必要としないため、コストを低減でき、さらに、複数のリガンドに結合する受容体をビーズに担持することにより、生体サンプル中のその受容体に結合し得るリガンドの存在を一度に検出することができる。
【００２９】
また、本発明の他の実施形態は、上記受容体を担持するビーズを含む生体サンプル中のバイオマーカーの検出キットである。当該検出キットは、上記の本発明に係る生体サンプル中のバイオマーカーの検出方法に用いるためのものであり、該キットが含む受容体を担持するビーズを生体サンプルに混合し、得られた混合液の濁度を吸光度等で測定するといった簡便な操作で生体サンプル中のバイオマーカーの定量を可能とする。従って、本実施形態に係る検出キットを用いることで、生体サンプル中の複数種のバイオマーカーを容易に検出することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明に係るバイオマーカーの検出方法を詳細に説明するための実施例を示す。本実施例では、ビーズとしてラテックスビーズを用い、受容体としてＬＯＸ−１を用い、該ＬＯＸ−１をラテックスビーズに担持し、得られたＬＯＸ−１担持ラテックスビーズのいくつかのＬＯＸ−１リガンド検出能を検討した。以下に、その方法及び結果について説明する。【００３１】
最初にＬＯＸ−１担持ラテックスビーズの作製方法について説明する。まず、１０％ラテックス原液（平均粒径３４０ｎｍ 化学結合用ラテックス（藤倉化成））を感作バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）により２０倍希釈して、０．５％（５ｍｇラテックス／ｍＬ）の濃度に調製した。次に、水溶性架橋剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を純水で溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、ラテックス分散液１ｍＬ当たり得られた溶液を３００μＬ添加した。続いて、その溶液をローテーターで３０分間転倒混和した。その後、ボルテックスミキサーで撹拌しながら５ｍｇのラテックスに対し、０．５ｍｇのＬＯＸ−１を添加し、ローテーターを用いて室温条件下で１．５時間転倒混和した。その後、８０００×ｇで１０分、２０℃の条件下で遠心して上清を除き、粒子洗浄液（０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を１ｍＬ添加して超音波装置で再分散させた。続いて、上記遠心条件で遠心して上清を除き、ブロッキング液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭＭＥＳ，ｐＨ６．０）を感作ラテックスに１ｍＬ加え、超音波装置で再分散させた。得られた溶液を室温条件下にてローテーターで１時間転倒混和し、未反応の官能基をブロッキングした。その後、上記遠心条件で遠心して上清を除き、試薬用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）に分散させた。これらの工程により、ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを得た。【００３２】
次に、上記のとおりに作製したＬＯＸ−１担持ラテックスビーズのＬＯＸ−１リガンドの検出能について評価した。そのために、上記ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを、ＬＯＸ−１リガンドである酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ及びＣＲＰのそれぞれの標品と反応させて、比濁法によりビーズとそれらリガンドとの結合量を測定した。その方法を以下に詳しく説明する。【００３３】
まず、酸化ＬＤＬの調製について説明する。精製したヒトＬＤＬ分画をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬ（タンパク質濃度）に希釈し、終濃度１００μＭとなるように硫酸銅を添加した。その後、ローテーターを用いて３７℃の下、４８時間転倒混和し、終濃度２ｍＭとなるようＥＤＴＡを添加し、反応を停止させた。これにより、酸化ＬＤＬの標品を得た。また、酸化ＨＤＬの標品もヒトＨＤＬ分画を用いて、上記酸化ＬＤＬの標品と同じ方法で得た。ＣＲＰの標品は、Life Diagnostics, Inc.(US, Westchester, PA)から購入したものを用いた。【００３４】
次に、上記ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを用いて得られた各標品の検量線の作成を試みた。そのために、まず、上記のように作製した各標品を希釈液（５％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて所定の濃度に希釈した。具体的に、酸化ＬＤＬでは１００００ｎｇ／ｍＬから１５６．３ｎｇ／ｍＬまでの２倍の系列希釈溶液を調製し、酸化ＨＤＬでは１０００００ｎｇ／ｍＬから２５０００ｎｇ／ｍＬまでの２倍の系列希釈溶液を調製し、ＣＲＰでは５００μｇ／ｍＬから１５．６μｇ／ｍＬまでの２倍の系列希釈溶液を調製した。そして、調製した各標品溶液をＵＶ透過９６穴マイクロプレートの各ウェルに１８０μＬずつ分注した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェル内の溶液の３４０ｎｍ（測定波長：Ａ３４０）及び７００ｎｍ（参照波長：Ａ７００）の吸光度を測定した。次に、上記のようにして得られた０．１％ＬＯＸ−１担持ラテックスを６μＬ／ｗｅｌｌ添加した後、マイクロプレートシェーカーを用いて３７℃の下、６００ｒｐｍで反応させた。反応時間は０．５〜２時間とした。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェル内における溶液の３４０ｎｍ（測定波長：Ｂ３４０）及び７００ｎｍ（参照波長：Ｂ７００）の吸光度を測定した。そして、得られた吸光度（＝Ｂ３４０−Ｂ７００）から上記ビーズの添加前の吸光度（＝Ａ３４０−Ａ７００）を差し引いて測定値を算出し、検量線を作成した。その結果を図１に示す。【００３５】
図１（ａ）は酸化ＬＤＬの検量線を示し、図１（ｂ）は酸化ＨＤＬの検量線を示し、図１（ｃ）はＣＲＰの検量線を示している。これらの図に示すように、各リガンドの濃度依存的に吸光度が増大していることが分かる。すなわち、ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズが各リガンドの検出能を有し、また、濃度依存的に吸光度が増大するため検量線を作成することが可能であることが認められる。【００３６】
次に、健常者と糖尿病患者とから血液サンプルを採取し、得られた血液サンプルに対して上記ＬＯＸ−１担持ラテックスビーズを用いて上記と同様の測定を行い、健常者と糖尿病患者とのＬＯＸ−１リガンドの量を比較した。なお、上述のとおり、ＬＯＸ−１リガンドである酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ及びＣＲＰは糖尿病のリスクを評価するためのバイオマーカーであり、糖尿病患者の血中では健常者と比較して、それらのマーカーの量が増大することが知られている。【００３７】
バイオマーカー量の測定は、具体的に、まずそれぞれ８人ずつの健常者及び糖尿病患者から得られた血液サンプルを希釈液（５％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて２０〜１００倍希釈し、それらを９６穴ＵＶ透過マイクロプレートに１８０μＬずつ分注した。また同様に、検量線の作成のためのスタンダードとして上記酸化ＬＤＬの標品（２倍系列希釈）を９６穴ＵＶ透過マイクロプレートに１８０μＬずつ分注した。その後、上記試験と同様に、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェル内の溶液の３４０ｎｍ（測定波長：Ａ３４０）及び７００ｎｍ（参照波長：Ａ７００）の吸光度を測定し、０．１％ＬＯＸ−１担持ラテックスを６μＬ／ｗｅｌｌ添加した。その後、マイクロプレートシェーカーを用いて３７℃の下、６００ｒｐｍで反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェル内の溶液における３４０ｎｍ（測定波長：Ｂ３４０）及び７００ｎｍ（参照波長：Ｂ７００）の吸光度を測定した。そして、得られた吸光度（Ｂ３４０−Ｂ７００）から上記ビーズの添加前の吸光度（Ａ３４０−Ａ７００）を差し引いて測定値を算出し、得られた検量線から、各血液サンプル中のＬＯＸ−１リガンド量を導出した。その結果を図２に示す。【００３８】
図２に示すように、健常者と比較して糖尿病患者の方が、血液中により多くのＬＯＸ−１リガンドを含んでいることが認められる。この結果から、本発明に係る方法が、疾患の発症リスクや疾患の進行度を評価するためのバイオマーカーの検出方法となり得ることが認められる。また、本発明に係るバイオマーカーの検出方法によると、上記のような簡便な方法で生体サンプル中のバイオマーカーの量を簡便に測定することができる。
【図１】
2017006431.tif 000002
【図２】
2017006431.tif 000003
【国際調査報告】
2017006431.tif 000004
2017006431.tif 000005