(57)【要約】本発明の目的は、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬの発現を簡便かつ効率的に促進する方法等を提供することにある。本発明としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａ；及び、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る工程Ｂ；を含む、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法が挙げられる。
2017033415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含有する、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤。
【請求項２】
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質が、ＴＰＯ又はその誘導体、ロミプロスチム(Romiplostim)、及びエルトロンボパグ オラミン（Eltrombopag olamine）からなる群から選択される１種又は２種以上の物質である請求項１に記載の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤。
【請求項３】
間葉系細胞が脂肪前駆細胞である請求項１又は２に記載の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤。
【請求項４】
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａ；及び、
細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る工程Ｂ；
を含む、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法。
【請求項５】
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質が、ＴＰＯ又はその誘導体、ロミプロスチム(Romiplostim)、及びエルトロンボパグ オラミン（Eltrombopag olamine）からなる群から選択される１種又は２種以上の物質である請求項４に記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法。
【請求項６】
間葉系細胞が脂肪前駆細胞である請求項４又は５に記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法。
【請求項７】
間葉系細胞培養用基本培地がさらに血清を含む請求項４〜６のいずれかに記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法。
【請求項８】
工程Ｂで得られる間葉系細胞の細胞集団におけるｃ−ＭＰＬ受容体陽性の間葉系細胞の割合が１％以上である請求項４〜７のいずれかに記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法。
【請求項９】
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａを含む、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤や、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法や、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板輸血は、事故に伴う出血や抗がん剤使用時などで起こる血小板減少の唯一の治療法であり、その際に用いられる血小板製剤は現在のところ善意の献血に１００％依存している。血小板は非常に脆く、これまでに治療を目的とした血小板の長期保存を可能にする方法は存在しない。実際には、血小板の保管寿命は、最新の医療機関において４日間とされるが、検査ならびに出荷に要する時間を考慮すると、診療所を含む臨床現場での実質的な保管寿命は約３日とされる。このように、多くの血液バンクは常に、血小板を新鮮に維持し貯蔵する難点を抱えており、さらに、献血に依存する血小板製剤の供給量は、献血者の減少や、ウイルス感染症を患った献血者の増加による影響を受けやすい状況にある。【０００３】
そこで、近年、このような問題を抱えた献血に代わる、新たな血小板供給源の開発が注目されている（非特許文献１）。例えば、体性幹細胞である造血幹細胞（臍帯血幹細胞）を利用して血小板を体外で大量に生産する技術開発がある。しかしながら、造血幹細胞自体を体外で増幅する方法が未だ確立されていないことから実用化には至っていない。一方、多能性幹細胞である胚性幹（ＥＳ）細胞は、体外で無限に増殖させることができるという利点があり、血小板を含む血液細胞を産生する供給源として注目されてきた。この点については、ヒトＥＳ細胞から成熟巨核球及び血小板を産生する技術が既に報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法では血小板の産生効率が悪く、１回の輸血製剤をつくるのに、シャーレが何万枚も必要となるなど、実用性は不十分であった。【０００４】
血小板の輸血においては、血小板輸血不応が問題点としてあげられる。輸血初回時は、患者のものと異なるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を有する血小板を使用できるが、輸血を繰り返すことで患者体内にこのＨＬＡに対する特異的抗体が産生され、その結果、輸血した血小板が迅速に拒絶される。あるいは、血小板は独自の血液型であるヒト同種抗原（ＨＰＡ）も有しており、この適合型の相違による輸血不応も認められる。この点の問題を解消し得る技術として、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から巨核球及び血小板を産生する技術が報告されている（非特許文献３）。例えば、患者由来のｉＰＳ細胞を用いて血小板を誘導すれば、理論上、拒絶を受けることのないオーダーメイドの血小板製剤を調製することが可能となる。しかし、ｉＰＳ細胞からの血小板産生は線維芽細胞から血小板産生に至るまでに約５０日も要するため（非特許文献３）、実用性は不十分であった。一方、線維芽細胞からダイレクトリプログラミングと呼ばれる手法により血小板を産生させる方法が知られている（非特許文献４）。この手法によれば、ｉＰＳ細胞を経由させる方法よりも、血小板産生に至るまでの期間を大幅に短縮することができ、約１４日で血小板産生に至るという利点を持つ。しかしながら、線維芽細胞を用いたダイレクトリプログラミングには遺伝子導入が必要であり、遺伝子導入用ベクターの混在による安全性への影響が懸念される。【０００５】
ところで、造血幹細胞を巨核球、血小板へと分化誘導し得る培養液として、ＭＫＬＩ培地（megakaryocyte lineage induction medium）が知られている。該ＭＫＬＩ培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、０．５％ウシ血清アルブミン、４μｇ／ｍＬ ＬＤＬコレステロール、２００μｇ／ｍＬ 鉄飽和トランスフェリン（鉄結合型トランスフェリン）、１０μｇ／ｍＬ インスリン、５０μＭ ２−β−メルカプトエタノール、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰを各２０μＭ）、及び５０ｎｇ／ｍＬ トロンボポエチン（thrombopoietin：ＴＰＯ）を添加した培地である（非特許文献５）。本発明者らはこれまでに、造血幹細胞以外の細胞から巨核球、血小板へと分化誘導する技術について研究を進めており、上記ＭＫＬＩ培地にて、ヒトの皮下脂肪組織由来の脂肪前駆細胞（非特許文献５、６）や、マウス由来の脂肪前駆細胞（非特許文献５、７）を培養すると巨核球、血小板へと分化し得ることを見いだしている。本発明者らはさらに研究を進め、巨核球及び／又は血小板を製造し得るより優れた方法を見いだしている（特許文献１）。この特許文献１の製造方法は、間葉系細胞を、鉄イオン及び鉄輸送体を含む間葉系細胞培養用基本培地で培養し、培養物から巨核球及び／又は血小板を採取することを特徴とする製造方法である。特許文献１の製造方法は、ＴＰＯ等を培地に添加しなくとも、脂肪前駆細胞等の間葉系細胞から、血小板産生能を有する巨核球及び／又は血栓形成能を有する血小板を、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかもより低コスト或いはより効率的に生体外で製造することが可能である。【０００６】
このように特許文献１の製造方法は、造血幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いた血小板の従来の製造方法の欠点を解消した優れた製造方法である。しかし、巨核球や血小板へ分化誘導する前の脂肪前駆細胞等の間葉系細胞の表面抗原の種類と、該間葉系細胞を巨核球等へ分化誘導した際の巨核球等への分化効率との関係を本発明者らが解析した結果、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性の間葉系細胞を用いた場合は、ｃ−ＭＰＬ受容体陰性の間葉系細胞を用いた場合と比較して、巨核球や血小板へきわめて高効率で分化することが示された。しかし、脂肪前駆細胞等の間葉系細胞のうち、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性の細胞の割合は、０．５〜１％程度と、非常に少なかった。【０００７】
ｃ−ＭＰＬ受容体は、生体内におけるＴＰＯの受容体として知られている。すなわち、ＴＰＯは生体内におけるｃ−ＭＰＬ受容体のリガンドとして知られている。ｃ−ＭＰＬは、造血幹細胞や巨核球系の細胞に発現している糖タンパク質であり、サイトカイン受容体遺伝子ファミリーに属し、血小板造血に関与する新規因子の受容体として血小板造血に深く係わっていることが示唆されていた。ＴＰＯは、肝臓において３５３アミノ酸の前駆タンパク質として合成され、２１アミノ酸のシグナルペプチドが切断されて成熟分子となる。その成熟分子は、エリスロポエチンと相同性の高い２つのドメインと、そのタンパク質の安定性に重要な高度にグリコシル化されたカルボキシ末端より構成される（非特許文献８）。ＴＰＯ遺伝子又はｃ−ＭＰＬ受容体遺伝子を欠損したマウスは、血小板数が野生型マウスの１０〜２０％程度にまで減少することが報告されており（非特許文献９）、ＴＰＯやｃ−ＭＰＬ受容体が造血幹細胞から血小板を産生する経路の調節に関与していることが示されている。【０００８】
非特許文献１０には、ヒト巨核芽球系白血病細胞株であるＣＭＫ細胞における、ｃ−ＭＰＬ受容体遺伝子のプロモーターの活性が、ＴＰＯによって誘導される旨が記載されている。非特許文献１０では、ｃ−ＭＰＬ受容体遺伝子のプロモーターの活性を、該プロモーターの下流に連結したルシフェラーゼ遺伝子の発現によるルシフェラーゼ活性により測定している。しかし、非特許文献１０では、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現に対するＴＰＯの影響を確認しているわけではない。一方、非特許文献１１には、ＴＰＯがＣＭＫ細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を低下させることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１４／２０８１００号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Reems JA, Pineault N, Sun S. In vitro megakaryocyte production and platelet biogenesis: state of the art. Transfus Med Rev. 2010; 24 (1): 33-43.
【非特許文献２】Takayama N, Nishikii H, Usui J, et al. Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors. Blood. 2008; 111 (11): 5298-5306.
【非特許文献３】Nakamura S, Takayama N, Hirata S, et al. Expandable Megakaryocyte Cell Lines Enable Clinically Applicable Generation of Platelets from HumanInduced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 2014 Feb 12.pii: S1934-5909(14)00012-5. doi: 10.1016/j.stem.2014.01.011.
【非特許文献４】Ono Y, Wang Y, Suzuki H, et al. Induction of functional platelets from mouse and human fibroblasts by p45NF-E2/Maf. Blood. 2012; 120: 3812-3821.
【非特許文献５】Matsubara Y, Murata M, Ikeda Y.Culture of megakaryocytes andplatelets from subcutaneous adipose tissue and a preadipocyte cell line. MethodsMol Biol. 2012; 788: 249-258.
【非特許文献６】Matsubara Y, Saito E, Suzuki H, Watanabe N, Murata M, et al.Generation of megakaryocytes and platelets from human subcutaneous adipose tissues. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 378: 716-720.
【非特許文献７】Matsubara Y, Suzuki H, Ikeda Y, Murata M. Generation of megakaryocytes and platelets from preadipocyte cell line 3T3-L1, but not the parent cell line 3T3, in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 402: 796-800.
【非特許文献８】Kuter DJ, and Begley CG. Recombinant human thrombopoietin: basic biology and evaluation of clinical studies. Blood 2002; 100:3457-3469.
【非特許文献９】Murone M1, Carpenter DA, de Sauvage FJ. Hematopoietic deficiencies in c-mpl and TPO knockout mice. Stem Cells 1998; 16(1): 1-6.
【非特許文献１０】Sunohara M, Morikawa S, Fuse A, Sato I. GATA-dependent regulation of TPO-induced c-mpl gene expression during megakaryopoiesis. Okajimas Folia Anat Jpn. 2014; 90(4): 101-6.
【非特許文献１１】Sato T, Fuse A, Niimi H, Fielder PJ, Avraham H. Binding and regulation of thrombopoietin to human megakaryocytes. Br J Haematol. 1998 Mar;100(4): 704-11.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬの発現を簡便かつ効率的に促進する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、脂肪前駆細胞等の間葉系細胞を基本培地で維持培養する際に、該基本培地にＴＰＯを添加すると、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進することを見いだし、本発明を完成するに至った。非特許文献１１には、ＴＰＯがＣＭＫ細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を低下させることが示されていたことを考慮すると、本発明者らが見いだした前述の知見は意外であった。【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含有する、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤や、
（２）ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質が、ＴＰＯ又はその誘導体、ロミプロスチム(Romiplostim)、及びエルトロンボパグ オラミン（Eltrombopag olamine）からなる群から選択される１種又は２種以上の物質である上記（１）に記載の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤や、
（３）間葉系細胞が脂肪前駆細胞である上記（１）又は（２）に記載の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤に関する。【００１４】
また、本発明は、
（４）ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａ；及び、
細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る工程Ｂ；
を含む、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法や、
（５）ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質が、ＴＰＯ又はその誘導体、ロミプロスチム(Romiplostim)、及びエルトロンボパグ オラミン（Eltrombopag olamine）からなる群から選択される１種又は２種以上の物質である上記（４）に記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法や、
（６）間葉系細胞が脂肪前駆細胞である上記（４）又は（５）に記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法や、
（７）間葉系細胞培養用基本培地がさらに血清を含む上記（４）〜（６）のいずれかに記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法や、
（８）工程Ｂで得られる間葉系細胞の細胞集団におけるｃ−ＭＰＬ受容体陽性の間葉系細胞の割合が１％以上である上記（４）〜（７）のいずれかに記載の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法に関する。【００１５】
さらに、本発明は、
（９）ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａを含む、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を促進する方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬの発現を簡便かつ効率的に促進することができる。すなわち、本発明によれば、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を簡便かつ効率的に製造することができる。【００１７】
細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞は、巨核球や血小板へ分化誘導した際に分化する割合が高いため（例えば後述の実施例２参照）、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞は、巨核球や血小板の効率的な製造等に好適に用いることができる。また、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の数は、巨核球や血小板へ分化誘導する間、あまり増加しないため、該間葉系細胞から巨核球や血小板へ分化誘導することへの本発明の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】３日間培養後のヒト脂肪前駆細胞を「蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体」及び「ＤＡＰＩ」で免疫染色した後、その蛍光を観察した結果を示す図である。右パネルは、ＴＰＯを添加した培養培地で培養したヒト脂肪前駆細胞の結果を示し、左パネルは、ＴＰＯを添加していない培養培地で培養したヒト脂肪前駆細胞の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜ｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法＞
本発明のｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」と表示する。）としては、
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａ；及び、
ｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る工程Ｂ；
を含む方法である限り特に制限されず、ここで「培地」とは、細胞を培養できる「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。脂肪前駆細胞等の間葉系細胞を、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で培養すると、作用機序の詳細は不明であるが、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進される。なお、本発明の製造方法における「ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質」として、後述の本発明の「間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤」を用いてもよい。
【００２０】
（工程Ａ）
上記工程Ａとしては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程である限り特に制限されない。かかる培養工程は、生体外での培養工程である。
【００２１】
（本発明に用いる間葉系細胞）
本発明に用いる間葉系細胞としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で培養することによって、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進され得る間葉系細胞である限り特に制限されない。該間葉系細胞としては（ａ）脂肪前駆細胞（preadipocytesあるいはadipose progenitor cells）、（ｂ）間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）、（ｃ）間質細胞（stromal cell）等を挙げることができ、上記間葉系幹細胞としては、皮下脂肪組織由来間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞を挙げることができ、上記間質細胞としては、脂肪組織由来間質細胞、骨髄間質細胞、前立腺由来間質細胞、子宮内膜由来間質細胞を挙げることができる。好ましい間葉系細胞として、脂肪前駆細胞、皮下脂肪組織由来間葉系幹細胞を挙げることができる。本発明に用いる間葉系細胞は、培養細胞株であってもよいし、組織から採取した細胞（初代培養細胞や継代培養細胞を含む）であってもよい。本発明に用いる間葉系細胞のより具体的な例として、ヒト初代培養脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ細胞）、マウス初代培養前駆細胞（皮下脂肪組織由来）、株化されたマウス間質細胞（ＯＰ９細胞）、株化されたマウス骨髄間葉系幹細胞（ＨＳ−２２細胞）、株化されたマウス脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞）などを挙げることができる。
【００２２】
上記間葉系細胞の培養細胞株や、組織から採取した間葉系細胞は、Lonza社やPromoCell社やCELL APPLICATIONS社や、独立行政法人医薬基盤研究所（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 に名称変更）ＪＣＲＢ細胞バンクなどの企業から市販されているものを用いてもよいが、本発明の製造方法により得られた「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」から分化誘導した巨核球や血小板を投与する対象の組織から採取した間葉系細胞を用いると、かかる巨核球や血小板のＨＬＡタイプやＨＰＡタイプが投与対象のタイプと一致するため、該巨核球や血小板をその対象に投与した場合に、内生の巨核球や血小板と交差反応する抗体を誘導するなどの問題が生じず、頻回輸血しても不応状態とならないため、かかる間葉系細胞を用いることを好ましく挙げることができる。
【００２３】
間葉系細胞として培養細胞株を用いる場合、用意した間葉系細胞を株化したものを用いてもよい。間葉系細胞の株化方法については特に制限されず、公知の方法などを用いることができる。脂肪前駆細胞を株化する好適な方法として、背景技術における特許文献１の実施例１５に記載されているように、脂肪前駆細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導した後、成熟脂肪細胞の株化方法として公知の天井培養法を適用することにより、脂肪前駆細胞株を得る方法を挙げることができる。間葉系細胞を株化すると、分化能及び増殖能が半永久的に維持されるため、間葉系細胞株を冷凍保存などしておけば、「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を速やかに製造することができ、巨核球や血小板が必要なときに該間葉系細胞を用いてすぐに巨核球や血小板の製造に着手することができるというメリットがある。
【００２４】
「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を巨核球や血小板の製造に用いる場合は、より効率的に巨核球や血小板を製造する観点から、本発明に用いる「間葉系細胞（好ましくは脂肪前駆細胞）」は、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性であることが好ましく、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性かつｃ−ＭＰＬ受容体陽性であることがより好ましく、また、上記の「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞（好ましくは脂肪前駆細胞）」は、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性であることが好ましい。なお、ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカーとして知られており、ＣＤ７１はトランスフェリン受容体として知られている。間葉系細胞からより効率的に巨核球や血小板を製造する観点から、間葉系細胞において、ＣＤ３１陰性や、ＣＤ７１陽性や、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性が好ましいことは、特許文献１に記載されている。前述したように脂肪前駆細胞を株化する場合、脂肪前駆細胞から、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性の脂肪前駆細胞、好ましくは、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性かつｃ−ＭＰＬ受容体陽性の脂肪前駆細胞をあらかじめ選択し、その細胞について前述の株化方法を適用してもよい。
【００２５】
上記の脂肪前駆細胞や皮下脂肪組織由来間葉系幹細胞は、皮下脂肪組織や内臓組織等の脂肪組織から採取することができ、骨髄間葉系幹細胞は骨髄組織から採取することができ、間質細胞は脂肪組織、骨髄組織、前立腺、子宮内膜などから採取することができるが、上記の脂肪前駆細胞や皮下脂肪組織由来間葉系幹細胞としては、採取する際の侵襲性が低く、より多数の間葉系細胞をより簡便に採取し得る点で、脂肪組織（好ましくは皮下脂肪組織）由来の間葉系細胞を好適に挙げることができる。間葉系細胞を組織から採取する方法は、常法を用いることができる。
【００２６】
ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性の間葉系細胞、あるいは、ＣＤ３１陰性、ＣＤ７１陽性かつｃ−ＭＰＬ陽性の間葉系細胞などの、特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞は、それらの特定の細胞表面マーカーの有無を指標として、間葉系細胞を含む細胞集団から選別することができる。ここで、「特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞を選別すること」には、間葉系細胞を含む細胞集団から、特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞のみを単離することの他、特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞が含まれる割合が、選別前の細胞集団よりも高くなるように処理することも含まれる。
【００２７】
上記の特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞を選別する方法としては特に制限されないが、より簡便かつ迅速に目的とする間葉系細胞を選別する観点から、上記の各細胞表面マーカーに対する抗体（好ましくは標識抗体、より好ましくは蛍光標識抗体）を用い、これら各抗体の特異的結合の有無を指標として、特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞を選別する方法を好適に例示することができる。上記の「抗体の特異的結合の有無を指標として選別する」とは、プロファイル中の陽性の細胞表面マーカーについては、該マーカーに対する抗体が特異的結合を示す細胞を選別し、プロファイル中の陰性の細胞表面マーカーについては該マーカーに対する抗体が特異的結合を示さない細胞を選別することを意味し、例えば、間葉系細胞集団からＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性の間葉系細胞を選別する場合は、抗ＣＤ３１抗体に対する特異的結合を示さず、かつ、抗ＣＤ７１抗体に対する特異的結合を示す細胞を選別することを意味する。抗体の特異的結合の有無を指標として、特定の細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞を選別する方法としては特に制限されないが、セルソーター、磁気ビーズ又は細胞吸着用カラム等を用いた方法を挙げることができ、より簡便かつ迅速である点で、セルソーターを用いた方法を好適に挙げることができる。セルソーターを用いた方法は、フローサイトメトリー法に基づくものであり、当業者に良く知られている。具体的な方法は、セルソーターの取扱説明書の他、特表２００９−５１３１６１号公報などにも記載されている。磁気ビーズを用いた方法は磁気分離法などとして当業者に良く知られており、具体的な方法としては、特定の抗体を担持した磁気ビーズを細胞に接触させた後、その磁気ビーズを磁石で回収することにより、その特定の抗体に特異的に結合する細胞を分離する方法などを挙げることができる。また、細胞吸着用カラムを用いた方法は当業者に良く知られており、具体的な方法としては、特定の抗体を担持する細胞吸着用カラムに細胞群を接触させ、目的とする細胞以外の細胞をカラムに吸着させる方法などを挙げることができる。
【００２８】
ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性の間葉系細胞（好ましくは脂肪前駆細胞）や、ＣＤ３１陰性、ＣＤ７１陽性かつｃ−ＭＰＬ陽性の間葉系細胞（好ましくは脂肪前駆細胞）を脂肪組織から採取する際は、これらの細胞表面マーカーに加えて、ＣＤ４５（赤血球及び血小板以外の造血細胞のマーカー）陰性及びＴｅｒ１１９（赤血球やその前駆細胞のマーカー）陰性であることを指標にすると、脂肪組織に含まれていた血液に関連する細胞を排除することができるため好ましい。間葉系細胞の表面ではＣＤ４５やＴｅｒ１１９は発現しないため、その細胞が間葉系細胞であれば、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９が陰性であることを確認する必要はない。また、細胞表面マーカーではないが、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）が陰性であることを指標にすると、脂肪組織に含まれていた死細胞を排除できるため好ましい。７−ＡＡＤは、死細胞のＤＮＡ鎖にインターカレートし、４８８ｎｍの励起光により赤色蛍光を発する。
【００２９】
蛍光標識抗ＣＤ３１抗体、蛍光標識抗ＣＤ７１抗体、蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体、蛍光標識抗ＣＤ４５抗体、蛍光標識抗Ｔｅｒ１１９抗体は、免疫生物研究所、BD Biosciences社などから市販されているものを用いることができる。また、７ＡＡＤについても、BD Biosciences社などから市販されているものを用いることができる。
【００３０】
本発明の製造方法において、ＣＤ３１陰性かつＣＤ７１陽性の間葉系細胞、好ましくはさらにｃ−ＭＰＬ陽性である間葉系細胞を用いる場合、これらの細胞表面マーカープロファイルを有する間葉系細胞を含む細胞集団を、該プロファイルを有する間葉系細胞を選別することなく、上記工程Ａの培養に用いてもよいが、プロファイルを有する間葉系細胞を選別した細胞集団を上記工程Ａの培養に用いることが好ましい。間葉系細胞を含む細胞集団として、脂肪組織由来の細胞集団を用いる場合は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ７１陽性、好ましくはさらにｃ−ＭＰＬ陽性という細胞表面マーカープロファイルに加えて、ＣＤ４５陰性及びＴｅｒ１１９陰性という細胞表面マーカープロファイルを指標とすると、間葉系細胞以外の、血液に関連する細胞を効率良く排除することができる点で好ましい。また、さらに７−ＡＡＤが陰性であることも確認すると、脂肪組織に含まれていた死細胞を効率良く排除できるため好ましい。
【００３１】
また、上記間葉系細胞の由来となる生物種としては脊椎動物である限り特に制限されず、該脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等を挙げることができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトを特に好ましく挙げることができる。
【００３２】
（ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質）
本発明の培養に用いる培地は、間葉系細胞培養用基本培地にｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含有させた培地である。
【００３３】
上記ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質としては、ｃ−ＭＰＬ受容体を作動させ得る物質、すなわち、ｃ−ＭＰＬ受容体作動活性を有する物質である限り特に制限されず、タンパク質であってもよいし、分子量１万以下の低分子化合物であってもよい。かかるタンパク質としては、ＴＰＯ又はその誘導体；ロミプロスチム(Romiplostim)；ｃ−ＭＰＬ受容体に対するアゴニスト抗体（特開２００９−０１７８８１号公報）などを挙げることができ、分子量１万以下の低分子化合物としては、エルトロンボパグ オラミン（Eltrombopag olamine）；などを挙げることができる。ｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進効果が優れている点で、ＴＰＯ又はその誘導体、ロミプロスチムを好ましく挙げることができ、ＴＰＯをより好ましく挙げることができる。上記のロミプロスチムとしては、例えばロミプレート（登録商標）（協和発酵キリン株式会社製）が挙げられ、上記のエルトロンボパグ オラミンとしては、例えばレボレード（Revolade）（グラクソ・スミスクライン株式会社製）が挙げられる。
【００３４】
上記のＴＰＯ又はその誘導体としては、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２．５％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ｃ−ＭＰＬ受容体作動活性を有するタンパク質が挙げられる。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、全長のヒトＴＰＯのアミノ酸配列であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、天然のヒトＴＰＯの生物活性ドメインに相当するアミノ酸番号１〜１６３のアミノ酸配列である。配列番号２に示されるヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号４に示されるヌクレオチド配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
【００３５】
上記の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、化学合成、遺伝子工学的手法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ）や、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは上記の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
【００３６】
上記の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、化学合成、遺伝子工学的手法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは上記の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
【００３７】
上記の配列番号１又は３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号２又は４に示されるヌクレオチド配列と一定以上（例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２．５％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を有するＤＮＡとして作製することができる。具体的には、配列番号２や４に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３８】
上記のＴＰＯ又はその誘導体等のｃ−ＭＰＬ受容体作動物質は、化学的又は生物学的に改変されていなくてもよいが、ｃ−ＭＰＬ受容体作動活性を有している限り、化学的又は生物学的に改変されていてもよい。かかる改変としては、アミノ酸のグリコシル化のほか、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質の末端等へのペプチドやタンパク質やポリマーの付加等が挙げられる。かかるポリマーとしてはポリエチレングリコールが挙げられる。また、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質へ付加する（融合させる）ペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）の断片、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−チューブリンの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質へ付加する（融合させる）他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００３９】
上記のグリコシル化は、グリコシル化酵素を用いて行うことができる。また、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質の末端等へのペプチドやタンパク質の付加（融合）は、例えば、該ＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質をコードするＤＮＡと、付加するペプチドやタンパク質をコードするＤＮＡとを連結した態様で適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは該融合タンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。また、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質の末端等へのポリマーの付加は、例えば、反応基を有するポリマーと、上記のＴＰＯ又はその誘導体のタンパク質とを混合することにより、行うことができる。
【００４０】
前述の改変されたＴＰＯ又はその誘導体としては、天然のＴＰＯと同じ全長アミノ酸配列を有するグリコシル化分子である組換えヒトＴＰＯ（ｒＨｕＴＰＯともｒＨＴＰＯとも表示される。）や、天然のＴＰＯの生物活性ドメインに相当する１−１６３アミノ酸を含む非グリコシル化分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合組換えヒト巨核球成長及び発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）が好ましく挙げられる（Blood 2002; 100:3457-3469や、Semin Hematol 2000; 37:41-49）。
【００４１】
本明細書中、「ｃ−ＭＰＬ受容体作動活性を有する物質」とは、ｃ−ＭＰＬ受容体を発現している細胞においてｃ−ＭＰＬ受容体に係る細胞内シグナル伝達を生じさせる物質（すなわち、ｃ−ＭＰＬ受容体を活性化する物質）をいい、（ａ）Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路におけるＳＴＡＴのリン酸化、（ｂ）Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路におけるＭＡＰＫのリン酸化、及び、（ｃ）ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路におけるＡｋｔのリン酸化から選択されるいずれか１つ又は２つ以上（好ましくは３つ）のリン酸化を生じさせる物質が好ましく含まれる。
【００４２】
ある物質が、ｃ−ＭＰＬ受容体作動活性を有しているかどうかは、公知の方法により確認することができる。かかる方法としては、ｃ−ＭＰＬ受容体の活性化による下流のシグナル伝達を解析する方法が挙げられ、具体的には、ｃ−ＭＰＬ受容体の活性化によって生じる（ａ）Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路におけるＳＴＡＴのリン酸化、（ｂ）Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路におけるＭＡＰＫのリン酸化、及び、（ｃ）ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路におけるＡｋｔのリン酸化を解析する方法が挙げられる。かかるリン酸化は、リン酸化ＳＴＡＴ、リン酸化ＭＡＰＫ、リン酸化Ａｋｔに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法により解析することができる。かかる特異的な抗体は市販されているものを用いることができる。なお、ヒトｃ−ＭＰＬ受容体は、アミノ酸配列が公知（Genbank: NP_005364参照）であるので、当業者に周知の方法により、化学合成、遺伝子工学的手法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる
【００４３】
本発明の培養に用いる培地におけるｃ−ＭＰＬ受容体作動物質の濃度としては、そのような濃度のｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養することにより、「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を製造し得る培地であれば特に制限されないが、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ〜１．２５μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２０〜１２５ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは２５〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは３０〜７０ｎｇ／ｍＬの範囲内を挙げることができる。かかる濃度範囲は、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質がＴＰＯ又はその誘導体である場合に特に好適に挙げることができる。
【００４４】
（間葉系細胞培養用基本培地）
本発明に用いる間葉系細胞培養用基本培地としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を添加した場合に、その培地で間葉系細胞を培養することにより「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を製造し得る培地であれば特に制限されないが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培地が好ましく、１又は２種類以上の糖（類）、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び、任意で１又は２種類以上のその他成分を含むことが好ましい。
【００４５】
上記糖類としては、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましく、これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。
【００４６】
上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、亜セレン酸ナトリウム五水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができるが、間葉系細胞からの「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」の製造に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類又はその組合せも用いることができる。
【００４７】
上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を挙げることができ、上記システインとしては、Ｌ−システイン二塩酸塩、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を挙げることができ、上記チロシンとしては、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を挙げることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を挙げることができ、上記リジンとしては、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができる。
【００４８】
上記ビタミン類としては、具体的には、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸から選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を挙げることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を挙げることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を挙げることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を挙げることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を挙げることができ、アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ascorbic acid 2-phosphate）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を挙げることができる。
【００４９】
上記その他成分としては、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、ピルビン酸、及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物、フェノールレッドなどを挙げることができ、上記抗生物質の派生物としては、ペニシリンＧナトリウムや硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を好ましく挙げることができ、ピルビン酸の派生物としてはピルビン酸ナトリウムを好ましく挙げることができる。その他成分として血清を間葉系細胞培養用基本培地に添加する場合の血清濃度としては、１〜２０重量％の範囲内が挙げられ、５〜１５重量％の範囲内が好ましく挙げられ、７〜１３重量％の範囲内がより好ましく挙げられる。
【００５０】
上記間葉系細胞培養用基本培地の具体例としては、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、Ｆ１２培地等の公知の化学合成培地や、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等のこれらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地や、これらのいずれかの培地に、ＦＢＳ等の血清；ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質；及び、追加のアミノ酸（好ましくは非必須アミノ酸）；からなる群から選択される１種又は２種以上の物質をさらに添加した培地を好ましく挙げることができ、特にＤＭＥＭやＩＭＤＭやＲＰＭＩ １６４０培地にＦＢＳ等の血清、抗生物質（好ましくはペニシリンＧナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）及び追加の非必須アミノ酸をさらに添加した培地をより好ましく挙げることができ、中でも、ＤＭＥＭに血清（好ましくはＦＢＳ）、抗生物質（好ましくはペニシリンＧナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）及び追加の非必須アミノ酸をさらに添加した培地を特に好ましく挙げることができる。
【００５１】
本発明において特に好適な間葉系細胞培養用基本培地としては、後述の組成のＤＭＥＭに対して、１０％（最終濃度）の血清（好ましくはＦＢＳ）、１％（最終濃度）の非必須アミノ酸製品、１００Ｕ／ｍＬ（最終濃度）のペニシリン−ストレプトマイシン溶液を添加した培地（以下、「本発明における特に好適な基本培地」と表示する。）や、本発明における特に好適な基本培地における各成分の濃度に対して、各成分ごとに独立に７０％〜１３０％の範囲内の割合の濃度の各成分を含む培地を挙げることができる。
【００５２】
（ＤＭＥＭの組成）
２００ｍｇ／Ｌ 無水塩化カルシウム、０．１ｍｇ／Ｌ Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／Ｌ 塩化カリウム、９７．６７ｍｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム、６４００ｍｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、３７００ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、１２５ｍｇ／Ｌ リン酸二水素ナトリウム一水和物、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、１５ｍｇ／Ｌ フェノールレッド、１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−塩酸アルギニン、６３ｍｇ／Ｌ Ｌ−シスチン二塩酸塩、５８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、３０ｍｇ／Ｌグリシン、４２ｍｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、１０５ｍｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン、１０５ｍｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン、１４６ｍｇ／Ｌ Ｌ−リジン塩酸塩、３０ｍｇ／Ｌ Ｌ−メチオニン、６６ｍｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアラニン、４２ｍｇ／Ｌ Ｌ−セリン、９５ｍｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン、１６ｍｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン、１０４ｍｇ／Ｌ Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物、９４ｍｇ／Ｌ Ｌ−バリン、４ｍｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム、４ｍｇ／Ｌ 塩化コリン、４ｍｇ／Ｌ 葉酸、７．２ｍｇ／Ｌ ｉ−イノシトール、４ｍｇ／Ｌ ニコチン酸アミド、４ｍｇ／Ｌ ピリドキシン塩酸塩、０．４ｍｇ／Ｌ リボフラビン、４ｍｇ／Ｌ 塩酸チアミン。
【００５３】
本発明の培養に用いる特に好適な培地として、前述の本発明における特に好適な基本培地に、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含有させた培地を挙げることができ、中でも、前述の本発明における特に好適な基本培地にｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を単独の有効成分として含有させた培地をより好ましく挙げることができる。
【００５４】
本発明の培養に用いる培地には、ＬＤＬコレステロール、インスリン、２−β−メルカプトエタノール、鉄イオン、鉄輸送体等を添加してもよいが、巨核球や血小板への分化誘導が進んでしまうため、添加しない方が好ましい。
【００５５】
（培養方法）
本発明における培養の方法としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養することにより、「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を製造し得る限り特に制限されないが、例えば細胞外マトリックスでコーティングされた培養容器内で接着培養する方法を挙げることができ、培養温度として通常１２〜４５℃の範囲内、好ましくは１５〜３７℃の範囲内を挙げることができ、培養期間として１〜１５日間の範囲内や、２〜１０日間の範囲内や、２〜４日間の範囲内や、３日間を挙げることができる。また、かかる培養において、間葉系細胞を継代してもよい。継代する際は、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を選別して継代することが好ましい。
【００５６】
（工程Ｂ）
本発明の製造方法は、上記工程Ａの後に、上記工程Ｂを含んでいる。上記工程Ｂとしては、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る工程である限り特に制限されない。
【００５７】
本明細書において「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」とは、ｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤を間葉系細胞培養用基本培地に添加しないこと以外は同様の方法で間葉系細胞を培養して得られた間葉系細胞（以下、「コントロール間葉系細胞」と表示する。）の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の数と比較して、細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の数が多い間葉系細胞を意味し、間葉系細胞が細胞集団の場合は、コントロール間葉系細胞の細胞集団の全て又は一部の細胞（例えば、該細胞集団に含まれる任意の１０個〜１００個の範囲内の細胞）の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の平均数（１細胞当たりの平均数）と比較して、細胞集団の全て又は一部（例えば、該細胞集団に含まれる任意の１０個〜１００個の範囲内の細胞）の細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の平均数（１細胞当たりの平均数）が多い間葉系細胞の細胞集団を意味する。また、本明細書における「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」には、コントロール間葉系細胞の細胞集団におけるｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合と比較して、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合が高い間葉系細胞の細胞集団が好適に含まれる。また、本明細書における「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」には、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合が１％以上、好ましくは２％以上、さらに好ましくは３％以上である間葉系細胞の細胞集団が好適に含まれる。細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進されていない間葉系細胞の細胞集団では、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合は、通常０．８％未満である（後述の実施例１における「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ−）」のｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合を参照）。
【００５８】
細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進されているかどうかは、ｃ−ＭＰＬ受容体に対する抗体（好ましくは標識抗体、より好ましくは蛍光標識抗体）を用い、該抗体の特異的結合の有無を指標として、ｃ−ＭＰＬ受容体を発現する間葉系細胞（例えば、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性の間葉系細胞）を選別すること等によって確認することができる。かかる選別を行う方法としては、セルソーター、磁気ビーズ又は細胞吸着用カラム等を用いた方法を挙げることができ、より簡便かつ迅速である点で、セルソーターを用いた方法を好適に挙げることができる。セルソーターを用いた方法は、フローサイトメトリー法に基づくものであり、当業者に良く知られている。
【００５９】
上記の「コントロール間葉系細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の数と比較して、細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の数が多い間葉系細胞」としては、細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の数が、コントロール間葉系細胞の１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上である間葉系細胞を好適に挙げることができる。また、上記の「コントロール間葉系細胞の細胞集団の全て又は一部の細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の平均数（１細胞当たりの平均数）と比較して、細胞集団の全て又は一部の細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の平均数（１細胞当たりの平均数）が多い間葉系細胞の細胞集団」としては、細胞集団の全て又は一部の細胞の表面に発現しているｃ−ＭＰＬ受容体の平均数（１細胞当たりの平均数）が、コントロール間葉系細胞の細胞集団の１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上である間葉系細胞の細胞集団を好適に挙げることができる。
【００６０】
細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を得る方法としては、上記工程Ａの培養で得られた細胞集団であって、「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を含む細胞集団をそのまま得る方法であってもよいし、上記工程Ａの培養で得られた細胞集団から、「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を選別して得る方法であってもよい。本明細書において、特定の間葉系細胞を選別することには、（ｐ）細胞集団から特定の間葉系細胞のみを単離することのほか、（ｑ）選別後の細胞集団に含まれる特定の間葉系細胞の割合（細胞数の割合）が、選別前の細胞集団に含まれる特定の間葉系細胞の割合（細胞数の割合）より高くなるように処理することも便宜上含まれる。
【００６１】
「細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞」を選別する方法としては特に制限されないが、より簡便かつ迅速に目的とする間葉系細胞を選別する観点から、ｃ−ＭＰＬ受容体に対する抗体（好ましくは標識抗体、より好ましくは蛍光標識抗体）を用い、これら各抗体の特異的結合の有無を指標として、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を選別する方法を挙げることができる。かかる間葉系細胞を選別する方法としては、前述したようにセルソーター、磁気ビーズ又は細胞吸着用カラム等を用いた方法を挙げることができ、より簡便かつ迅速である点で、セルソーターを用いた方法を好適に挙げることができる。
【００６２】
＜間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を促進する方法＞
本発明の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現を促進する方法（以下、単に「本発明の促進方法」）としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で間葉系細胞を培養する工程Ａを含んでいる限り特に制限されない。かかる工程Ａは、上記の本発明の製造方法における工程Ａと同じである。
【００６３】
＜間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤＞
本発明の間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現促進剤（以下、単に「本発明の発現促進剤」）としては、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含有している限り特に制限されないが、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を有効成分として含有することが好ましく、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を単独の有効成分として含有することがより好ましい。
【００６４】
本発明の発現促進剤は、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質のみからなってもよいし、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を常法によって製剤としたものであってもよい。本発明の発現促進剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいし、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤であってもよい。ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００６５】
本発明の発現促進剤は、間葉系細胞培養用基本培地に添加し、その培地で間葉系細胞を生体外で培養するなどして使用することができる。上記基本培地への添加濃度としては、乾燥状態のｃ−ＭＰＬ受容体作動物質換算濃度で１ｎｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲内を挙げることができる。かかる濃度範囲は、ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質がＴＰＯである場合に特に好適に挙げることができる。
【００６６】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例の記載における培地成分の濃度はいずれも、培地における最終濃度を表す。
【実施例１】
【００６７】
［ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地での間葉系細胞の培養］
ｃ−ＭＰＬ受容体作動物質を含む間葉系細胞培養用基本培地で培養することによって、間葉系細胞の細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進するかどうかを調べるために、以下の培養実験を行った。なお、この培養実験では、間葉系細胞として脂肪前駆細胞を用いた。【００６８】
CELL APPLICATIONS社製のヒト初代培養脂肪前駆細胞（Human Preadipocytes：ＨＰＡｄ）を用意した。培養ディッシュにコラーゲンをコーティングし、そこに培養培地を添加した。培養培地としては、ＤＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、ライフテクノロジー社製）に、１０％ウシ胎児血清（シグマ社製）、１％非必須アミノ酸（ライフテクノロジー社製)、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 (ライフテクノロジー社製)、及び５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＴＰＯ（R&D Systems社製）を添加した培地を用いた。上記脂肪前駆細胞を、上記培養培地にて、３７℃で３日間培養した。培養後の脂肪前駆細胞を分取した。該脂肪前駆細胞（以下、「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ＋）」と表示する。）を蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体（BD Bioscience社製）でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定することによって、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合を測定したところ、３．６８±０．３９％であった。なお、脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ＋）を「蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体」及び「ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）」で免疫染色した結果を図１の右パネルに示す。該右パネルには、ＤＡＰＩ染色された核の円形の蛍光の周囲に、蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体による蛍光が見られる細胞、すなわち、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞が比較的多く存在することが示されている。【００６９】
他方、培養培地に組換えヒトＴＰＯを添加しなかったこと以外は同様の方法で培養して得られた脂肪前駆細胞（以下、「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ−）」と表示する。）におけるｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合を上記のフローサイトメトリー法で測定したところ、０．６７±０．１２％であった。なお、脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ−）を「蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体」及び「ＤＡＰＩ」で免疫染色した結果を図１の左パネルに示す。該左パネルには、ＤＡＰＩ染色された核の円形の蛍光の周囲に、蛍光標識抗ｃ−ＭＰＬ抗体による蛍光が見られる細胞、すなわち、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞が少ないことが示されている。【００７０】
以上のように、脂肪前駆細胞を培養する際に、培養培地にＴＰＯを添加すると、ＴＰＯを添加しない場合に対して、ｃ−ＭＰＬ受容体陽性細胞の割合が約５．５倍に増加することが示された。
【実施例２】
【００７１】
［脂肪前駆細胞から、巨核球・血小板への分化誘導］
上記の実施例１で得られた「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ＋）」が、巨核球・血小板（巨核球及び／又は血小板）の効率的な製造に実際に用い得るかを確認するために、特許文献１に記載の方法にしたがって、脂肪前駆細胞から巨核球・血小板への分化誘導を行った。【００７２】
培養ディッシュにコラーゲンをコーティングし、そこに培養培地を添加した。培養培地としては、造血幹細胞を巨核球、血小板へと分化誘導し得る培地として知られているＭＫＬＩ培地（megakaryocyte lineage induction medium）を用いた。該ＭＫＬＩ培地は、ＩＭＤＭ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium、ライフテクノロジー社製）に、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジー社製）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ライフテクノロジー社製）、０．５％  ＢＳＡ（シグマ社製）、４μｇ／ｍＬ  ＬＤＬコレステロール（シグマ社製）、２００μｇ／ｍＬ  鉄飽和トランスフェリン（シグマ社製）、１０μｇ／ｍＬ  インスリン（シグマ社製）、５０μＭ  ２−β−メルカプトエタノール（ライフテクノロジー社製）、２０μＭ  各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、及びＣＴＰ）（ライフテクノロジー社製）、及び５０ｎｇ／ｍＬ  ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、Stem Cell Technologies製）を添加し作製した。【００７３】
上記の実施例１で得られた「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ＋）」を、上記のＭＫＬＩ培地にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養した。培養後の細胞集団を分取した後、該細胞集団におけるＣＤ４１（巨核球や血小板の特異的マーカー）陽性細胞の割合（％）を測定した。かかる測定は、ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）標識抗ＣＤ４１抗体で直接ラベルし、フローサイトメトリー法を用いて行った。かかる細胞集団におけるＣＤ４１陽性細胞の割合は２８．５±２．１％であった。【００７４】
他方、上記の実施例１で得られた「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ−）」におけるＣＤ４１陽性細胞の割合を上記のフローサイトメトリー法で測定したところ１７．０±５．７％であった【００７５】
以上のように、組換えＴＰＯを添加した培地で培養して得られた脂肪前駆細胞（「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ＋）」）を用いた場合は、組換えＴＰＯを添加していない培地で培養して得られた脂肪前駆細胞（「脂肪前駆細胞の細胞集団（ＴＰＯ−）」）を用いた場合と比較して、約１．７倍の数の巨核球・血小板を製造できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、間葉系細胞の表面におけるｃ−ＭＰＬの発現を簡便かつ効率的に促進することができる。すなわち、本発明によれば、細胞表面におけるｃ−ＭＰＬ受容体の発現が促進された間葉系細胞を簡便かつ効率的に製造することができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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