(57)【要約】【課題】糖タンパク質を高精度に検出するために、糖タンパク質と糖結合化合物との反応による反応物の検出レベルを増大させる方法を提供する。【解決手段】本発明の糖タンパク質の検出方法は、該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、前記反応物を検出する工程を含む。糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質の検出方法であって、
該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、
前記反応物を検出する工程
を含む、前記糖タンパク質の検出方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ処理が、ペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理であることを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項３】
前記試料が血清であることを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項４】
前記糖結合化合物が、糖結合タンパク質である、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項５】
前記糖結合化合物が、フコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有することを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質は、担体に固定化されている、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項７】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項６に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項８】
前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブが、標識されている、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項９】
前記糖鎖が、複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖、又はＯ結合型糖鎖である、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項１０】
前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フコシル化αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、フコシル化前立腺特異抗原、チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の検出方法に関し、より詳細には、検出感度を向上させる糖タンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の半数以上が翻訳後に糖鎖修飾を受けている。糖鎖のタンパク質への結合様式は、アスパラギン残基のアミド基に結合するＮ結合型及びセリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基に結合するＯ結合型に分けられる。いずれの糖鎖修飾も、タンパク質の活性、細胞間相互作用、接着等に重要な役割を果たしている。糖鎖修飾の変化が疾患と関連することが数多く報告されている。【０００３】
例えば、血清に含まれるαフェトプロテイン（Ｎ結合型糖鎖）は、健康な成人の血清にほとんど存在しない。一方、良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン−Ｌ１型糖鎖（ＡＦＰ−Ｌ１）が増加し、肝臓ガン患者にはさらにフコシル化したαフェトプロテイン−Ｌ３型糖鎖（ｆＡＦＰ又はＡＦＰ−Ｌ３）が検出される。レクチンで検出される糖鎖の違いが、肝疾患診断に利用されている。【０００４】
ハプトグロビンは、β鎖に４個のＮ結合型糖鎖結合部位を有する糖タンパク質である。膵臓癌になると、ハプトグロビンにフコースが付加した病変ハプトグロビンが患者血清等から検出される。病変ハプトグロビンは、膵臓癌の病期の進行とともに増え、膵臓癌の腫瘍部摘出後には消失する。フコシル化ハプトグロビンの高精度かつ迅速な検出により、膵臓癌の早期発見が期待される。【０００５】
チログロブリンは、甲状腺の上皮細胞で合成され濾胞に貯留し、一般に全身の細胞に作用して細胞の代謝率を上昇させる働きをもつホルモンである。甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症の代表例が、バセドウ病である。バセドウ病は、手足の震え、眼球突出、動悸、甲状腺腫脹、多汗、体重減少、高血糖、高血圧等の症状を引き起こす。甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症の例が慢性甲状腺炎（橋本病）である。橋本病は、全身倦怠感、発汗減少、体重増加、便秘等の症状を引き起こす。このタンパク質は、糖鎖の一種であるフコースを有する。チログロブリンに付加した糖鎖の検出感度を高めることで、チログロブリン含量の測定精度を上げることができる。【０００６】
関節リウマチ患者では、血清中ＩｇＧの末端ガラクトースの付加率が減少し、末端にＮ−アセチルグルコサミンを持つ糖鎖の割合が増加する。ガラクトース欠損は、ＩｇＧの重要な生理機能である補体の活性化やＦＣ受容体への結合能を著しく損なう。【０００７】
トランスフェリン（ＴＦ）は、６７９個のアミノ酸を持ち、その４１３番目と６１１番目のアスパラギン酸残基が末端シアル酸を有する二個の分岐状糖鎖でＮ−グリコシル化されている糖タンパク質である。トランスフェリンには、５７０番目のアミノ酸残基がプロリンであるＴＦＣ１と、それがセリンで置換されたＴＦＣ２という多型が存在する。ＴＦＣ１Ｃ２のヘテロ接合体の遺伝子型を持つアルツハイマー疾患（ＡＤ）患者は、６個のシアル酸を有するＴＦの相対強度が、ＴＦＣ１Ｃ１ホモ接合体の遺伝子型を持つ患者よりも有意に減少している。【０００８】
ＡＤ患者から採取したＣＳＦ糖タンパク質は、シアル酸付加率が有意に低下している。シアル酸量の変化は、ＡＤ以外にも、心臓血管疾患、アルコール依存症、糖尿病等について観察されている。【０００９】
上記糖タンパク質を検出するために、糖結合化合物の一種であるレクチンの使用が公知である。レクチンは、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。特定の糖残基に親和性を有する植物、動物あるいは菌類由来のレクチンが数多く発見されている。【００１０】
レクチンを用いた糖タンパク質の検出方法として、レクチンＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）やレクチンアフィニティクロマトグラフィーが知られている。レクチンＥＬＩＳＡは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる等の長所を有する。レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンが特異的に糖鎖に結合する性質を利用したクロマトグラフィーであり、糖鎖構造のわずかな違いを見分けて分離する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のレクチンＨＰＬＣカラムを用いるレクチンアフィニティクロマトグラフィーは、糖鎖の分析だけでなく、精製にも有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許４５１４１６３（フコースα１→６特異的レクチン）
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙｕｋａ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆｕｃｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７，ｐ３３９７３−３３９８２
【非特許文献２】Ｎａｏｔｏ  Ｓｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  （Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．）  Ｂａｒｋ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８７，  ２６２，  ｐ  １５９６−１６０１
【非特許文献３】Ｔ．Ｂ  ＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍｉｍｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ’’Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ２８，  １９８６，  ｐ１６３−１７３
【非特許文献４】Ｙａｓｕｏ  Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｎｅｗ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｔｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ  ｂｕｌｂｓ”，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １０８７，  １６５，  ｐ２９７−３０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
レクチンＥＬＩＳＡやレクチンクロマトグラフィー等の糖タンパク質の検出方法において、糖タンパク質とレクチンとの反応によるシグナルが低いと、糖タンパク質の正確な検出が困難である。糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断するためには、レクチン反応に基づくシグナルの増大が望ましい。【００１４】
そこで、本発明の目的は、糖タンパク質を高精度に検出するために、糖タンパク質とレクチンをはじめとする糖結合化合物との反応物に基づくシグナル（反応値）を増大させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖結合化合物反応前に糖タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、糖タンパク質の検出方法であって、
該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物反応物を検出する工程
を含む、前記糖タンパク質の検出方法を提供する。【００１６】
本明細書において、「糖タンパク質」という用語は、糖ペプチドを含む意味で用いられる。「糖鎖」の用語は、本明細書において、単糖を含む意味で用いられる。また、「糖結合化合物」とは、本明細書において、糖に結合する化合物を意味する。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。【００１７】
前記プロテアーゼ処理は、例えばペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理である。【００１８】
前記試料は、例えば血清である。【００１９】
前記糖結合化合物は、例えばフコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有する。【００２０】
前記糖タンパク質は、担体に固定化されていることが好ましい。【００２１】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。【００２２】
前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブは、標識されていることが好ましい。【００２３】
前記糖鎖は、例えば複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である。【００２４】
前記糖タンパク質は、例えばハプトグロビン、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フコシル化αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、フコシル化前立腺特異抗原、チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の糖タンパク質の検出方法によれば、プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応物に基づくシグナル（反応値）が、プロテアーゼ未処理のものより増大する。糖鎖の欠損や付加が疾患と関連することが知られている糖タンパク質では、シグナルの増大は、疾患の早期の発見、診断や治療につながる。また、疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の検出方法は、該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、及び
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、前記反応物を検出する工程を含む。本発明の方法は、糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程を必須に含む以外は、糖結合化合物を用いた従来の糖タンパク質の検出方法と同様である。
【００２７】
本発明の測定対象となる糖タンパク質は、糖鎖を有するタンパク質であれば、特に限定されない。糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖及びＯ結合型糖鎖が含まれる。Ｎ結合型糖鎖には、下記式：
【化１】
2017131022.tif 000002
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する〕
で示されるコア構造に、
フコース、シアル酸、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンで構成される側鎖（Ｎ−アセチルラクトサミン構造、ポリＮ−アセチルラクトサミン構造）が１〜６本付加した複合型糖鎖；
前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖；
；並びに
前記複合型と前記高マンノース型とが混成した混成型糖鎖；  
が含まれる。また、前記Ｎ結合型糖鎖には、前記コア構造の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが付加した糖鎖も含まれる。
【００２８】
本発明の検出対象となる糖残基には、シアル酸（Ｓｉａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）等が含まれる。これらの糖残基は、健常者が通常有する糖鎖構造に対して付加するものであっても、又は欠損するものであってもよい。
【００２９】
糖タンパク質の具体例には、ハプトグロビン（ＨＰ）、フコシル化ハプトグロビン（ｆＨＰ）、トランスフェリン（ＴＦ）、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フコシル化αフェトプロテイン（ｆＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３）、フィブリノーゲン、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、フコシル化前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、チログロブリン（ＴＧ）、フェツイン（ＦＥＴ）、アシアロフェツイン（ａＦＥＴ）等が挙げられる。糖タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。
【００３０】
糖タンパク質を含む試料の由来は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。好ましくは血液、血漿又は血清であり、特に好ましくは血清である。プロテアーゼ処理に際し、血清等の糖タンパク質を含む試料を予め希釈しておいてもよい。
【００３１】
本発明の方法では、糖タンパク質を糖結合化合物と反応させる前にプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で処理する。プロテアーゼは、糖タンパク質に作用して、糖ペプチドを生成させる酵素であれば、特に制限がない。該プロテアーゼを機能的に分類すると、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が含まれる。
【００３２】
上記プロテアーゼは、その由来を問わない。該プロテアーゼは、動物由来のプロテアーゼとしてペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンＤ、カルパイン等；植物由来のプロテアーゼとしてパパイン、キモパパイン、アクチニジン、カリクレイン、フィシン、ブロメライン等；そして微生物由来のプロテアーゼとしてバチルス属、アスペルギルス属、リゾプス属、アオカビ属（ペニシリウム属）、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属及びリソバクター属由来のものが挙げられる。
【００３３】
上記プロテアーゼは、市販のものを特に制限なく使用可能である。例えばペプシンとして、ブタ胃粘膜由来ペプシン（シグマ・アルドリッチ製）、パパインとして、パパイヤ由来パパイン（フナコシ（株）製）、ストレプトマイセス由来プロテアーゼとしてアクチナーゼＥ（科研製薬（株）製）等が挙げられる。
【００３４】
プロテアーゼの使用量は、糖タンパク質とプロテアーゼとの反応が進行する量であればよい。反応時の濃度は、通常、０．０００１〜５ｍｇ／ｍＬでよい。特にペプシンは、０．０００１〜１ｍｇ／ｍＬのような少量で効果が得られる点で好ましい。
【００３５】
プロテアーゼ処理のｐＨ、温度、時間等の条件は、使用するタンパク分解酵素の種類に依存する。ペプシンを使用するプロテアーゼ処理は、通常、１．５〜５、好ましくは２〜４のｐＨ、及び、通常、１０〜６０℃、好ましくは１５〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度の下で、通常、１分間〜２４時間、好ましくは１分間〜１８０分間、より好ましくは２分間〜１２０分間、さらに好ましくは２分間〜６０分間行われる。パパインを使用するプロテアーゼ処理は、通常、３〜１０、好ましくは５〜８のｐＨ、及び、通常、２０〜８０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度の下で、通常、１分間〜２４時間、好ましくは１分間〜１８０分間、より好ましくは２分間〜１２０分間、さらに好ましくは２分間〜６０分間行われる。アクチナーゼＥを使用するプロテアーゼ処理は、通常、７〜１０、好ましくは７〜８．５のｐＨ、及び、通常、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度の下で、通常、１分間〜２４時間、好ましくは１分間〜１８０分間、より好ましくは２分間〜１２０分間、さらに好ましくは２分間〜６０分間行われる。
【００３６】
プロテアーゼ処理後、使用したプロテアーゼに基づいて、ｐＨの変更、加熱処理、酵素反応停止液の添加等の適宜の手段で酵素反応を停止させる。その後、反応液を濾過、透析、遠心分離等の分離手段によって、上清と固体残渣とに分離してもよい。
【００３７】
上記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る。
【００３８】
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応時に、糖タンパク質あるいは糖結合化合物を必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。
【００３９】
前記糖タンパク質の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。
【００４０】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。
【００４１】
抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。さらに、抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。
【００４２】
上記の抗体等が糖結合化合物と反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖結合化合物と反応する糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のＦｃ部をペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素により限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。
【００４３】
上記抗体の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体（例えば抗トランスフェリン抗体）の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。
【００４４】
抗体の結合した担体に糖タンパク質の溶液を添加することにより、糖タンパク質を抗原−抗体反応で結合させる。
【００４５】
本発明で使用する糖結合化合物は、糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する化合物を意味する。使用する糖結合化合物は、糖タンパク質に結合する糖鎖に依存して、適宜、選択される。
【００４６】
前記糖結合化合物は、例えば糖に結合するタンパク質（ペプチドを含む）、並びに糖に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸である。
【００４７】
前記糖結合タンパク質には、レクチン、抗糖鎖抗体、マルトース結合タンパク質、グルコース結合タンパク質、ガラクトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、炭水化物結合モジュールが含まれる。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質であり、より好ましくはレクチン及び抗糖鎖抗体であり、さらに好ましくはレクチンである。
【００４８】
前記糖結合化合物は、一種単独でもよく、または二種の併用でもよい。
【００４９】
前記レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示す。赤血球凝集反応阻害試験法は、特許文献１（特許４５１４１６３）に記載されている方法で行うことができる。特許４５１４１６３を参照のためにここに編入する。
【００５０】
前記レクチンは、天然由来レクチン、若しくは化学合成又は遺伝子工学的合成により得られるレクチンのいずれでもよい。天然レクチンの由来は、植物、動物及び菌類のいずれでもよい。以下に、本発明に使用可能な天然レクチンの例を示す。
【００５１】
ガラクトース（Ｇａｌ）／Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に親和性を有するレクチンの例には、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、ドリコスマメレクチン（ＤＢＡ）、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｐ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ダイズレクチン（ＳＢＡ）、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）が挙げられる。マンノース（Ｍａｎ）／グルコース（Ｇｌｃ）に親和性を有するレクチンの例には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ、ＬＣＡ−Ａ）、及びエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）が挙げられる。フコース（Ｆｕｃ）に親和性を有するレクチンの例には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ、ＬＣＡ−Ａ）、ロータスレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、ミヤコグサレクチン（ＬＴＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）、ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）、サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）、クリタケレクチン（ＮＳＬ）、コムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）、ベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）が挙げられる。このうち、ＰｈｏＳＬ、ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ及びＡＭＬは、α１→６フコースに特異的に結合するので、α１→６フコースの付加又は欠如が疾患と関連する糖タンパク質の検出に有利である。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に親和性を有するレクチンの例には、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、バンデリアマメレクチン−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）が挙げられる。シアル酸（Ｓｉａ）に親和性を有するレクチンの例には、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ−Ｉ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）、西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ−Ｉ）等が挙げられる。
【００５２】
糖結合化合物は、検出可能とするために、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。また、糖結合化合物は、糖結合化合物と反応するプローブ（例えば抗レクチン抗体のような糖結合化合物と結合する抗体）を介して検出してもよい。その際、プローブは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。糖結合化合物を検出するプローブは、一種単独、又は二種以上の併用でもよい。
【００５３】
前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブの標識手段の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、ＣｙＤｙｅ等の蛍光化合物、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラッテクス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。
【００５４】
標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の基質としては３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］２アンモニウム塩、５−アミノサリチル酸、又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、アルカリホスファターゼの基質としてはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）又は４−メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてはｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを挙げることができる。
【００５５】
標識手段は、常法により、前記糖結合化合物又は前記糖結合化合物を検出するプローブへ結合することができる。特に、標識をストレプトアビジン（又はアビジン）−ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。
【００５６】
適宜、固定化された糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させるために、糖結合化合物を含む溶液に糖タンパク質を曝す。
【００５７】
上記糖結合化合物反応後、糖タンパク質と糖結合化合物との反応物を検出する。糖タンパク質と糖結合化合物との反応物の検出方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。検出方法の例としては、レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法、サンドイッチ法）、レクチンアフィニティクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ−レクチンカラムを使用）、レクチン親和電気泳動、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。表面プラズモン共鳴法は、担体に固定化した糖タンパク質量、及び、糖タンパク質に結合した検出糖結合化合物量を多段階法で同時に測定できるので利便である。
【００５８】
標識した糖結合化合物の標識物量（吸光度等）等で表わした糖鎖量は、標準試料のものと対比することによって、その変化を察知することができる。例えば、検体の糖タンパク質濃度を一定値に調整すると、検出糖結合化合物の測定結果は糖タンパク質に付加した特定の糖鎖量の変化を反映することになる。糖タンパク質の糖鎖量を健常者と患者との間で比較することにより、糖鎖変化に関連する疾患を従来よりも高い精度で診断できる。
【００５９】
糖残基量の変化率（糖付加や糖欠損の度合い）を定量化することは、糖鎖変化と関連する疾患の診断、治療及び予防、研究等に大いに役立つ。糖の付加率を求めるには、予め、糖鎖末端の全位置に目的とする糖残基が付加した参照試料（例えば、健常者の糖タンパク質や市販又は合成した試薬）の全糖残基量を本発明の検出方法で測定する。糖残基量を、標識した検出糖結合化合物の標識物量（吸光度等）で表わす。次いで、未知試料の糖残基量を本発明の検出方法で測定する。未知試料で測定された糖残基量を全糖残基量で除した値が糖付加率となる。糖付加率を１から減じたものが糖欠損率となる。
【００６０】
糖鎖量の変化率は、測定試料の糖タンパク質量に対する糖鎖量の比で表してもよい。まず、糖タンパク質の量を吸光度、酵素結合免疫吸着法、ブラッドフォード法、ローリー法等で求めておく。
【００６１】
糖付加率又は糖欠損率の導出に検量線を使用することは、測定作業の効率化の点で有利である。予め、目的糖残基量が既知で、糖残基量の異なる複数の標準試料を、本発明の検出方法で測定し、目的糖残基量と検出糖結合化合物の標識物量（吸光度等）との関係を求め、検量線を作成しておく。目的糖残基量が未知の試料の標識物量（吸光度等）を本発明の検出方法で求め、標識物量を前記検量線に当てはめる。
【００６２】
いくつかの代表的な検出方法を、以下に概説する。ＥＬＩＳＡ（直接吸着法）では、糖タンパク質を含む血清等の検体をＥＬＩＳＡプレートに添加して固定化する（検体反応）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応、１次反応）。２次標識化合物としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プローブ反応、２次反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の糖鎖を含む標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
【００６３】
ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）では、糖タンパク質（抗原）に結合する抗体をＥＬＩＳＡプレートに添加し抗体をプレートに固定化する。次いで、糖タンパク質を含む検体（血清等）を添加して、前記抗体と糖タンパク質とを反応させる（検体反応）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応）。２次プローブとしてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プローブ反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
【００６４】
本発明の方法によれば、糖タンパク質の検出感度が向上するので、糖鎖変化と関連する疾患の診断精度の向上に寄与する。ガラクトース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌、骨髄腫等がある。マンノース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、直腸癌等がある。フコース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、大腸癌、膵臓癌、肝癌等がある。Ｎ−アセチルグルコサミン残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、特発性正常圧水頭症、肝癌等がある。シアル酸残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、心筋梗塞、繊維症、膵炎、糖尿病、糖タンパク質糖鎖転移不全症等がある。
【実施例】
【００６５】
以下に本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。【００６６】
本発明に使用する試薬を、以下の手順で調製又は用意した。
（１）緩衝液
〔リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）〕
リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）５．７５ｇ、リン酸二水素カリウム（和光純薬工業（株）製）１．０ｇ、塩化カリウム（和光純薬工業（株）製）１．０ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）４０．０ｇを秤量し、水で５Ｌにメスアップした。これをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とした。【００６７】
〔０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ〕
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名  Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク（株）製）２．５ｍＬを５ＬのＰＢＳに溶解して、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液（以下、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳという）を得た。【００６８】
〔１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕  
グリシン（和光純薬工業（株）製）  ７５．０７ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加してｐＨメーターでｐＨ３．０に合わせ、さらに水で１０００ｍＬにメスアップした。【００６９】
〔０．５Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）〕
上記グリシン３７．５４ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ３．３に合わせ、水で１０００ｍＬにメスアップした。【００７０】
〔１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ナカライテスク（株）製）  ６０．６ｇを、水４００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ９．０に合わせ、水で５００ｍＬにメスアップした。【００７１】
〔０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕  
上記トリスヒドロキシメチルアミノメタン２０．２ｇを、水４００ｍＬ程度に溶解し、６  Ｎ  塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ９．０に合わせ、水で５００ｍＬにメスアップした。【００７２】
〔１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）〕
塩化カルシウム（和光純薬工業（株））０．７４ｇを５ｍＬチューブに量り取り、水５ｍＬで溶解して１Ｍ塩化カルシウム水溶液を得た。上記トリスヒドロキシメチルアミノメタンを１２．１１ｇ量り取り、水８０ｍＬで溶解後、６Ｎ塩酸溶液を加えてｐＨを７．８に調整し、さらに水で液量１００ｍＬまでメスアップして、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を得た。１Ｍ塩化カルシウム水溶液と１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）から１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を調製した。【００７３】
（２）  糖タンパク質溶液
以下の糖タンパク質を、それぞれ、濃度２ｍｇ／ｍＬになるように水に溶解して糖タンパク質溶液を得た。
トランスフェリン（ＴＦ）：シグマ・アルドリッチ製
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）：シグマ・アルドリッチ製
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）：フナコシ（株）製
αフェトプロテイン−Ｌ３（ＡＦＰ−Ｌ３）：非特許文献１に記載の方法に準じて調製した。【００７４】
（３）  プロテアーゼ溶液
以下に示すプロテアーゼ溶液を調製した。
〔ペプシン〕
ペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ・アルドリッチ製、コードＮｏ．Ｐ６８８７）を、１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１質量％）になるように溶解した。
〔パパイン〕
パパイン（パパイヤ由来、フナコシ（株）製、コードＮｏ．ＬＳ００３１２６）を、システイン溶液（１．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭ  システイン塩酸塩を含む０．２Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２質量％）になるように溶解した。
〔アクチナーゼＥ〕
アクチナーゼＥ（科研製薬製、コードＮｏ．９０００２−１６１１）を、１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で、濃度１０ｍｇ／ｍＬ（１質量％）になるように溶解した。【００７５】
（４）  ＰＭＳＦ溶液
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、和光純薬工業（株）製）１７．４  ｍｇを、５００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に溶解して、２００ｍＭ  ＰＭＳＦ溶液を調製した。これを使用直前に水で２０倍に希釈して、１０ｍＭ  ＰＭＳＦ溶液を調製した。【００７６】
（５）  ＢＳＡ／ＰＢＳ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ製）１ｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ＢＳＡ濃度１％）を調製した。【００７７】
（６）  レクチン
表１に示すレクチンを用意した。α１−６フコース特異的レクチンであるＰｈｏＳＬを、非特許文献１に記載の方法に従ってスギタケから精製した。また、ＰｈｏＳＬの合成ペプチドの一種である合成ＰｈｏＳＬペプチド（配列番号１）を非特許文献１に記載の方法に従って合成した。麹菌レクチン（ＡＯＬ）は、東京化成工業（株）から入手した。西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ−Ｉ）、ニガウリレクチン（ＭＣＬ）、及びチューリップレクチン（ＴｘＬＣ−Ｉ）は、それぞれ、非特許文献２〜４の方法で精製した。上記レクチンを非特許文献１に記載の方法に準じてビオチン標識化した。ビオチン標識化ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ビオチン標識化レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ビオチン標識化エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ビオチン標識化タチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、ビオチン標識化日本ニワトコレクチン（ＳＳＡ）、ビオチン標識化ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ビオチン標識化デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、及びビオチン標識化インゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ４）は、Ｊ−オイルミルズ製のビオチン標識化レクチンを使用した。すべてのビオチン標識化レクチンは、ＰＢＳで濃度１ｍｇ／ｍＬに調製し、使用の際、適切な濃度に希釈した。【００７８】
糖タンパク質のペプシン処理の手順を、以下に示す。
（１）反応溶液の調製
濃度２ｍｇ／ｍＬの糖タンパク質溶液２５質量部に、１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２５質量部加えた。
（２）ペプシン反応
ペプシン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ  １Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０））を、（１）の１質量部添加して、撹拌後、３７℃で静置した。
（３）反応停止
ペプシン反応５〜３０分間処理した後、２５質量部の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）と混合し反応を停止させた。これらの試料をペプシン処理後の糖タンパク質溶液とした。【００７９】
糖タンパク質のアクチナーゼＥ処理の手順を、ＡＦＰ―Ｌ３を例に以下に示す。
（１）酵素反応
前記１質量％アクチナーゼＥ溶液を、前記１０ｍＭ  塩化カルシウム／１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で濃度０．００１２５質量％になるまで希釈した。この希釈液４２μＬと濃度８ｍｇ／ｍＬのＡＦＰ−Ｌ３水溶液７０μＬとを混合し、３７℃の温度で３０分間、保温した。
（２）反応停止
上記反応液を１０ｍＭ  ＰＭＳＦ  １４μＬと混合してタンパク質分解反応を停止し、アクチナーゼＥ処理ＡＦＰ−Ｌ３の溶液を得た。【００８０】
糖タンパク質のパパイン処理の手順を、ＡＦＰ―Ｌ３を例に以下に示す。
（１）酵素反応
６ｍｇ／ｍＬ（水に溶解）のＡＦＰ−Ｌ３溶液５μＬに対して、２ｍｇ／ｍＬのパパイン溶液を５μＬ添加（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）し、３７℃で保温した。
（２）反応停止
パパイン溶液添加から３０分後に、濃度１０μｇ／ｍＬのアンチパイン（シグマ・アルドリッチ製）２μＬと混合して反応を停止させ、パパイン処理後のＡＦＰ溶液とした。【００８１】
レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の手順を以下に示す。
（１）抗体固定化
非特許文献１に記載の方法に準じて糖鎖除去した固相化抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）のウェルに５０μＬ添加して４℃で１６時間放置後、添加した液を廃棄した。
（２）洗浄
ウェルに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。
（３）ブロッキング
ウェルにＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ添加して、３７℃で１時間放置後、添加した液を廃棄した。
（４）洗浄
ウェルに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（５）抗原抗体反応
ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した糖タンパク質溶液  ５０μＬをウェルに添加して、室温で１時間放置後、添加した液を廃棄した。
（６）洗浄
ウェルに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）レクチン反応
ビオチン標識化レクチン（１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ）を、適切な濃度になるように、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈した。このレクチン溶液５０μＬをウェルに添加して、４℃で３０分間放置後、添加した液を廃棄した。
（８）洗浄
ウェルに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応
１ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（フナコシ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した（１μｇ／ｍＬ）。これをウェルに５０μＬ添加して、室温で３０分間放置後、添加した液を廃棄した。
（１０）洗浄
ウェルに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（１１）発色反応
ＨＲＰ用発色基質（ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、フナコシ（株）製）を、ウェルに５０μＬ添加し、室温で５分間放置した。
（１２）反応停止
１Ｍリン酸を５０μＬ添加し、反応を停止した。【００８２】
プレートリーダー（製品名：ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ（登録商標）ＨＴ、バイオテック（株）製）を用いて、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を引いた値を検出値（シグナル：Ｓ）とした。糖タンパク質未添加の検出値（ノイズ：Ｎ）を、糖タンパク質添加の検出値（Ｓ）から引いた値を反応値（Ｓ−Ｎ）とした。【００８３】
式（１）に示すように、プロテアーゼ処理での反応値（Ｓ−Ｎ）ｐから、プロテアーゼ未処理での反応値（Ｓ−Ｎ）ｎｐを減じた値を増大量Δとした。
【数１】
2017131022.tif 000003
【００８４】
［実施例１〜１４］  フコース、シアル酸、ガラクトース、マンノース、グルコース等に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出（Ｉ）
糖タンパク質ＡＦＰ−Ｌ３を３０分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３をレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３（５，０００ｎｇ／ｍＬ）及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３（５，０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、表１に記載のビオチン標識化レクチンを使用し、また、レクチンの代わりに１μｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ抗体（ダコ・ジャパン製）を使用した。
（９）ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ＡＦＰ抗体を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（フナコシ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。【００８５】
ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３のレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表１に示す。【００８６】
【表１】
2017131022.tif 000004
【００８７】
すべての実施例において、プロテアーゼ処理したＡＦＰ−Ｌ３のレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のＡＦＰ−Ｌ３とレクチンとの反応値よりも増大した。一方、抗体を用いた比較例１では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理された糖タンパク質ＡＦＰ−Ｌ３とレクチンとの反応値の増大（すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上）は、糖タンパク質の固相抗体への結合量の増大が原因ではないことが確認された。【００８８】
［実施例１５〜２１］シアル酸、ガラクトース、マンノース、グルコース等に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰの検出
糖タンパク質ＡＦＰを３０分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＡＦＰをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、実施例７〜１３及び比較例１において、糖タンパク質をＡＦＰ−Ｌ３からＡＦＰに代えた以外は前記実施例又は比較例と同様の手順で行った。ペプシン処理ＡＦＰ及び未処理ＡＦＰの各レクチンに対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表２に示す。【００８９】
【表２】
2017131022.tif 000005
【００９０】
表２を見ると、すべての実施例において、プロテアーゼ処理したＡＦＰのレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のＡＦＰとレクチンとの反応値よりも増大した。一方、抗体を用いた比較例２では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理による糖タンパク質とレクチンとの反応値の増大、すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上は、糖タンパク質の固相抗体へのＡＦＰ結合量の増大が原因ではないことが確認された。【００９１】
［実施例２２］  フコースに親和性を有するレクチンによるアクチナーゼＥ処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出
実施例１において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からアクチナーゼＥ処理に変更した。具体的には、実施例１において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてアクチナーゼＥ処理後のＡＦＰ−Ｌ３（４００ｎｇ／ｍＬ）、及び未処理のＡＦＰ−Ｌ３（４００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。【００９２】
プロテアーゼ処理ＡＦＰ−Ｌ３及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３のレクチン反応値（Ｓ−Ｎ）、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表３に示す。
【表３】
2017131022.tif 000006
【００９３】
表３から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるアクチナーゼＥを用いても、プロテアーゼ処理により、ＡＦＰ−Ｌ３とレクチンの反応値が増大することがわかった。【００９４】
［実施例２３］  フコースに親和性を有するレクチンによるパパイン処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出
実施例１において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からパパイン処理に変更した。具体的には、実施例１において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてパパイン処理後のＡＦＰ−Ｌ３（１０００ｎｇ／ｍＬ）及び未処理のＡＦＰ−Ｌ３（１０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。【００９５】
プロテアーゼ処理ＡＦＰ−Ｌ３及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３のレクチン反応値（Ｓ−Ｎ）、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表４に示す。
【表４】
2017131022.tif 000007
【００９６】
表４から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるパパインを用いても、プロテアーゼ処理により、ＡＦＰ−Ｌ３とレクチンの反応値が増大することがわかった。【００９７】
［実施例２４］  シアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理トランスフェリン（ＴＦ）の検出
糖タンパク質ＴＦを５分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＴＦをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体（ウサギ）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＴＦ溶液（１μｇ／ｍＬ）及び未処理のＴＦ溶液（１μｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、表１に記載のビオチン標識化ＳＳＡ（１μｇ／ｍＬ）を使用した。また、レクチンの代わりに０．２μｇ／ｍＬの抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体（マウス）（コスモ・バイオ（株）製）を使用した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ＴＦ抗体を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体溶液（インビトロジェン製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。【００９８】
ペプシン処理ＴＦ及び未処理ＴＦのレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表５に示す。
【表５】
2017131022.tif 000008
【００９９】
表５から、トランスフェリンをシアル酸特異的レクチンＳＳＡで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大させられることがわかった。一方、トランスフェリンを抗ＴＦ抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるトランスフェリン量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。【０１００】
［実施例２５〜２６］  シアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の検出
糖タンパク質ＩｇＧを５分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＩｇＧをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＩｇＧ溶液（１μｇ／ｍＬ）及び未処理のＩｇＧ溶液（１μｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ及びビオチン標識化ＡＡＬ（いずれも１μｇ／ｍＬ）を使用した。また、レクチンの代わりに、０．２μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）を使用した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗ヤギＩｇＧ抗体溶液（コスモ・バイオ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。【０１０１】
ペプシン処理ＩｇＧ及び未処理ＩｇＧのレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表６に示す。
【表６】
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【０１０２】
表６から、ＩｇＧをフコース特異的レクチンであるＰｈｏＳＬ又はＡＡＬで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。一方、ＩｇＧを抗ＩｇＧ抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるＩｇＧ量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。【０１０３】
［実施例２７〜３４］  フコース又はシアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出（ＩＩ）
ＡＦＰ−Ｌ３を添加した血清を用いて、ペプシン処理を行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ−Ｌ３の検出試験を行った。ＡＦＰ−Ｌ３の血清溶液のペプシン処理手順を、以下に示す。
（１）ＡＦＰ−Ｌ３溶液の調製
ヒトプール血清（１００％血清、（株）ケー・エー・シー製）９９２μＬ、及びこの１００％血清をＰＢＳで１０倍希釈した１０％血清９９２μＬに、それぞれ、５０μｇ／ｍＬのＡＦＬ−Ｌ３溶液８μＬを添加し、ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清、及びＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清を調製した（いずれもＡＦＰ−Ｌ３濃度：４００ｎｇ／ｍＬ）。
（２）ペプシン反応
ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清５５μＬには、４００μｇ／ｍＬのペプシン／１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２２μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。ＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清５５μＬには、１０μｇ／ｍＬのペプシン／１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２２μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。
（３）反応停止
ペプシン溶液添加３０分後、それぞれ、０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３３μＬ添加し、反応を停止させ、ペプシン処理後のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及びペプシン処理後のＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清を得た。【０１０４】
レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清、ペプシン処理後のＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清、未処理のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清、及び未処理のＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清を使用した（いずれもＡＦＰ−Ｌ３濃度：０．２μｇ／ｍＬ）。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ、ビオチン標識化ＡＡＬ、ビオチン標識化ＳＮＡ−Ｉ、ビオチン標識化ＳＳＡ（いずれも０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。【０１０５】
ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及びペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清、  未処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３／１０％血清のレクチンに対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表７に示す。
【表７】
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【０１０６】
表７から、血清存在下、フコース特異的レクチンＰｈｏＳＬ又はＡＡＬでＡＦＰ−Ｌ３を検出した場合であっても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。表７から、シアル酸特異的レクチンＳＮＡ−Ｉ又はＳＳＡで検出した場合も同様に、ペプシン処理により反応値を増大できることが確認された。したがって、ヒト血清中の糖タンパク質においても、反応値を増大できることが確認できた。【０１０７】
〔実施例３５〕  フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出（ＩＩＩ）
ＡＦＰ−Ｌ３を添加した血清のペプシン処理を、時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ−Ｌ３の検出試験を行った。ペプシン処理手順は、実施例３１のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清（ＡＦＰ−Ｌ３：４００  ｎｇ／ｍＬ）をペプシン処理手順において、ペプシン添加後反応を停止するまでの時間を、３０分間から５、１０、１５、３０、４５又は６０分間に変えた以外は、実施例３１と同様に行った。【０１０８】
レクチンによる検出試験は、実施例３１と同様の操作で行った。【０１０９】
ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清のレクチンに対する反応値（Ｓ−Ｎ）及び増大量Δを表８に示す。
【表８】
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【０１１０】
表８から、ペプシン処理５分後、反応値の増大量が０．２４１まで増大した。ペプシン処理１０〜６０分間での増大量は、０．３３１〜０．３６４であり、ほぼ一定であった。増大効果は、反応時間が５分間から少なくとも６０分間までで得られることがわかった。【０１１１】
［実施例４０］ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３のＨＰＬＣ−レクチンカラムでの検出
糖タンパク質にＡＦＰ−Ｌ３を用いてペプシン処理を３０分間行い、ＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬカラムによりペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３の結合試験を行った。その具体的手順を以下に示す。
（１）ＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬカラムの作製
活性化ハードゲル（（株）Ｊ−オイルミルズ製）にＰｈｏＳＬを添付マニュアルに従って固定化後、ステンレスカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）に充填した。【０１１２】
（２）ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３のＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬカラムによる分析
１．ＨＰＬＣ用緩衝液の調製
緩衝液Ａ  （５０ｍＭ酢酸アンモニウム）：１Ｍ酢酸アンモニウム（和光純薬（株）製）５０ｍＬを水で１０００ｍＬにメスアップした。
緩衝液Ｂ（０．２Ｎアンモニア）：２５％アンモニア水溶液（シグマ・アルドリッチ製）７．５５ｍＬを水で５００ｍＬにメスアップした。【０１１３】
２．ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析装置（システム：  ＬＣ−８０２０、ポンプ：ＤＰ−８０２０、いずれも（株）東ソー社製）を用いて、ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３又はペプシン未処理ＡＦＰ−Ｌ３を、緩衝液Ａで１０倍希釈したものを１００μＬインジェクトした。緩衝液Ａを１０分間流し、非吸着ピークを得た後、緩衝液Ｂを１０分間流し、吸着溶出ピークを得た。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出は、ＵＶ２８０ｎｍ（ＵＶ−２０８０、（株）東ソー社製）とした。【０１１４】
未処理、ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３をＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬで分析したときの、非吸着ピークエリアの面積及び吸着溶出ピークエリアの面積を測定した。結合率を以下の式に従って計算した。
【数２】
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【０１１５】
ペプシン処理  ＡＦＰ−Ｌ３のＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬによる非吸着ピーク面積、吸着溶出ピーク面積及び結合率（％）を、表９に示す。
【表９】
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【０１１６】
表９から、ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３のＨＰＬＣ−ＰｈｏＳＬによる検出値（結合率）は、未処理のものより増大することがわかった。【０１１７】
〔実施例４１〕  フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３の検出（ＩＶ）
ＡＦＰ−Ｌ３を添加した血清のペプシン処理を、ペプシン濃度と時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ−Ｌ３の検出試験を行った。ペプシン処理は、以下のように行った。【０１１８】
（１）ＡＦＰ−Ｌ３溶液の調製
ヒトプール血清に、ＡＦＰ−Ｌ３溶液を添加し、ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清（ＡＦＰ−Ｌ３濃度：２００ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
（２）試薬の調製
〔１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）〕
グリシン  ９０．０８ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加してｐＨメーターでｐＨ３．２５に合わせ、さらに水で１０００ｍＬにメスアップした。
〔０．１％ＢＳＡ／１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）〕
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ製）０．１ｇを１００ｍＬの１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）に溶解して調製した。
（３）ペプシン反応
上記ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清６０μＬに、ペプシンを０．１％ＢＳＡ／１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）に溶解したもの（０．４７〜１．１ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。
（４）反応停止
５、７、９、１１、１３又は１５分後、０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３０μＬ添加し、反応を停止させた。【０１１９】
レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、上記ペプシン処理後のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及び未処理のＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清を使用した（いずれもＡＦＰ−Ｌ３濃度：０．１μｇ／ｍＬ）。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。【０１２０】
ペプシン処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ−Ｌ３／１００％血清のレクチンに対する検出値を、表１０に示す。【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
表１０で示したように、ペプシンの濃度を変えることで、短時間でも十分に反応値を高められることがわかった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017131022.tif 000016
2017131022.tif 000017
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