(57)【要約】      （修正有）【課題】抗がん剤の適切な放出を可能にし、したがって、治療期間を延長し、治療の有効性を高める生分解性尿管ステントを提供する。【解決手段】ポリマー基材を含むステントであって、ポリマー基材が１０〜５０％（ｗ／ｗ）のアルギン酸塩、４５〜８５％（ｗ／ｗ）のゼラチン、ポリマー基材をコーティングするためのポリマー生分解性樹脂、および、１０％（ｗ／ｗ）以下の抗がん剤を含む。【選択図】図２
0003233978.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー基材を含むステントであって、前記ポリマー基材が、
10〜50%（w/w）のアルギン酸塩；45〜85%（w/w）のゼラチン；前記ポリマー基材をコーティングするためのポリマー生分解性樹脂；および10%（w/w）以下の抗がん剤
を含む、ステント。
【請求項２】
5%（w/w）以下、好ましくは4.95%以下の抗がん剤を含む、請求項１に記載のステント。
【請求項３】
少なくとも1つの抗がん剤が、パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、およびそれらの混合物からなるリストより選択される、請求項１または２に記載のステント。
【請求項４】
以下の抗がん剤混合物：
パクリタキセルおよびエピルビシン；またはパクリタキセルおよびドキソルビシン；またはパクリタキセルおよびゲムシタビン；またはエピルビシンおよびドキソルビシン；またはエピルビシンおよびゲムシタビン；またはドキソルビシンおよびゲムシタビン；またはパクリタキセル、エピルビシンおよびドキソルビシン；またはエピルビシン、ドキソルビシンおよびゲムシタビン；またはパクリタキセル、エピルビシンおよびゲムシタビン、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のステント。
【請求項５】
前記ポリマー基材が、20〜40%（w/w）のアルギン酸塩および55〜70%（w/w）のゼラチンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のステント。
【請求項６】
前記樹脂が、3〜50%（w/v）、特に5〜20%（w/v）、さらにとりわけ5〜10%（w/v）の濃度を有する溶液中に添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のステント。
【請求項７】
造影剤、すなわちX線造影剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のステント。
【請求項８】
請求項７に記載のステントであって、
2〜5%（w/w）の造影剤、すなわち炭酸ビスマス（III）；
20〜40%（w/w）のアルギン酸塩および55〜70%（w/w）のゼラチンを含むポリマー基材
を含む、ステント。
【請求項９】
請求項８に記載のステントであって、
5%（w/w）の造影剤、すなわち炭酸ビスマス（III）；
30%（w/w）のアルギン酸塩および65%（w/w）のゼラチンを含むポリマー基材
を含む、ステント。
【請求項１０】
前記樹脂が以下のリスト：
ポリカプロラクトン樹脂、ポリグリコリドおよびそのコポリマー：乳酸との（乳酸-グリコール酸）コポリマー、ε-カプロラクトンとの（グリコリド-カプロラクトン）コポリマー、および炭酸トリメチレンとの（グリコリド-炭酸トリメチレン）コポリマー、またはそれらの混合物、特にポリカプロラクトン、
より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１１】
前記造影剤が以下のリスト：
バリウム塩、ビスマス塩、スピネル顔料、またはそれらの混合物、特に炭酸ビスマス（III）、
より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１２】
架橋剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１３】
前記架橋剤が以下のリスト：
1価または2価のイオンを含むイオン性架橋剤であって、
そのカチオンが、カルシウム、マグネシウム、バリウム、ストロンチウム、ホウ素、ベリリウム、アルミニウム、鉄、銅、コバルト、鉛、銀、およびこれらの混合物からなるリストより選択され；
そのアニオンが、塩化物、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩またはシュウ酸塩、およびそれらの混合物からなるリストより選択され、特に塩化カルシウムである、架橋剤、
より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１４】
以下のリスト：
メトトレキセート、ビンブラスチン、シスプラチン、顆粒球コロニー刺激因子、カルボプラチン、5-フルオロウラシル、イホスファミド、ペメトレキセド、マイトマイシンC、カペシタビン、カルメット・ゲラン桿菌（BCG）またはそれらの混合物、
より選択される第2の抗がん剤を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１５】
抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、またはそれらの混合物をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１６】
前記抗がん剤が、超臨界流体CO2によって前記ステントに含浸されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１７】
再生医療、組織工学における、またはがんの治療、予防もしくは療法、または泌尿器疾患の治療、予防もしくは療法における使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１８】
泌尿器疾患の治療における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のステント。
【請求項１９】
前記ステントが尿管ステントである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のステント。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗がん剤を含む生分解性尿管ステントと、チャネル、すなわち哺乳類の尿管
、例えば、尿石、新形成または外科的処置によって閉塞された尿管の開存性を確実にする
ために使用され得る医療用組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
上部尿路上皮癌（UTUC）は、尿路上皮癌の5〜10%を占め、膀胱癌として広くは研究され
ていない疾患である。薬物滞留性が乏しいために頻繁な薬物注入が必要であるなどの従来
の療法の問題を避けるため、本発明者らは、超臨界流体CO2（scCO2）によって、最も一般
的に使用される抗がん剤、すなわちパクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシン、お
よびゲムシタビンを含浸させた生分解性尿管ステント（BUS）を開発した。薬物溶出ステ
ントからの抗がん治療剤の放出動態は、人工尿溶液（AUS）において測定された。In vitr
o放出は、4つの抗がん剤で最初の72時間でより速い放出を示し、この時間の後にプラトー
に達し、最後に9日間後にステントが分解した。scCO2による含浸薬物の量に関して、ゲム
シタビンが最も高い負荷量（19.57μg薬物/mgポリマー：2%負荷）を示し、最も低い量は
パクリタキセル（0.067μg薬物/mgポリマー：0.01%負荷）で得られた。がん細胞株（T24
）を、各薬物の段階的濃度（0.01〜2000ng/ml）に4時間および72時間ばく露し、各薬物に
対する細胞の感受性（IC50）を測定した。抗がん生分解性尿管ステントのT24およびHUVEC
細胞株との直接的および間接的接触研究により、試験した4つの抗がん剤を含浸させたBUS
の抗腫瘍効果が確認され、72時間後のT24細胞株の約75%の生存率を低下させ、HUVEC細胞
に対する最小の細胞傷害性効果を実証した。
【０００３】
上部尿路上皮癌（UTUC）は、下部（膀胱および尿道）または上部（腎盂および尿管）の
尿路に位置し得る（非特許文献１）。UTUCは、多病巣性、局所再発、および転移の傾向を
有する進行性の泌尿器がんである（非特許文献２）。それらは膀胱がんと比較して珍しい
が、UTUCの60%は診断時に侵襲性である。尿路上皮癌（UC）は、4番目に多いタイプの腫瘍
である（非特許文献３）。利用可能な治療法は、2つのカテゴリーに分類される：カルメ
ット・ゲラン桿菌（BCG）ワクチン、マイトマイシンCまたは他の抗がん剤などのアジュバ
ント局所薬剤の適用による腎臓温存手術；および、大部分の場合、根治的腎摘出術が行わ
れ、続いて化学療法が行われる。UTUCは尿路上皮腫瘍であり、したがって、パクリタキセ
ル、ドキソルビシンおよびゲムシタビンなどの薬物は、膀胱がんと同様の治療効果を有す
ると予想される（非特許文献２；非特許文献４）。いくつかの研究は、UTUCに対する化学
療法の役割を調査しており、抗がん剤ベースのアジュバント化学療法（非特許文献４）の
全生存利益および無病生存利益があると思われる。
【０００４】
パクリタキセル、マイトマイシンC、ドキソルビシンおよびゲムシタビンのような薬物
は、異なる研究において、膀胱内薬物送達（IDD）システムを尿路で得るためにポリマー
材料に組み込むことができる薬物として報告されている（非特許文献５；非特許文献６；
非特許文献７）。膀胱内化学療法では、疎水性抗がん剤は、親水性薬物と比較して、尿路
上皮を通る優れた透過性の顕著な利点を提供する（非特許文献８；非特許文献９）。Lifs
hitzら（MitoGel（商標））が検討したある革新的なアイデアは、体温で凝固し、治療剤
の長期滞留性および持続放出を提供することができるマイトマイシンC含有ヒドロゲルの
使用である（非特許文献１０）。
【０００５】
この研究では、ヒドロゲル技術と従来の尿管ステントとを組み合わせた、薬物溶出生分
解性尿管ステントを用いるこれらの抗がん剤の送達の新しい概念を仮定した。異なる薬物
溶出性尿管ステントは、心臓血管用途および様々な用途において広範に使用されているが
（非特許文献１１；非特許文献１２）、泌尿器科では、それはまだ新しい領域である（非
特許文献１３）。いくつかの研究では、細菌の付着、バイオフィルムの形成および外被を
低減させ、側腹痛を減らすことにより患者の快適性を改善することを目的とする、トリク
ロサン（Triumph（登録商標））（非特許文献１４）およびケトロラク（Lexington（商標
））（非特許文献１５）などの薬物のポリウレタン系ステントへの含浸を報告した。これ
らの研究は、前臨床および臨床試験において、薬物溶出性の従来型のダブルJ尿管ステン
トは有効性が限られており、原因はおそらく尿管組織への乏しい薬物送達のためであると
実証している（非特許文献１５；非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００６】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を例示するために開示される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Babjuk, M., Burger, M., Zigeuner, R., Shariat, S.F., van Rhijn, B.W.G., Comperat, E., Sylvester, R.J., Kaasinen, E., Bohle, A., Palou Redorta, J., Roupret, M., 2013. EAU guidelines on non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder: update 2013. Eur. Urol. 64, 639-53.
【非特許文献２】Audenet, F., Yates, D.R., Cussenot, O., Roupret, M., 2013b. The role of chemotherapy in the treatment of urothelial cell carcinoma of the upper urinary tract (UUT-UCC). Urol. Oncol. 31, 407-13.
【非特許文献３】Munoz, J.J., Ellison, L.M., 2000. Upper tract urothelial neoplasms: incidence and survival during the last 2 decades. J. Urol. 164, 1523-1525.
【非特許文献４】Hellenthal, N.J., Shariat, S.F., Margulis, V., Karakiewicz, P.I., Roscigno, M., Bolenz, C., Remzi, M., Weizer, A., Zigeuner, R., Bensalah, K., Ng, C.K., Raman, J.D., Kikuchi, E., Montorsi, F., Oya, M., Wood, C.G., Fernandez, M., Evans, C.P., Koppie, T.M., 2009. Adjuvant chemotherapy for high risk upper tract urothelial carcinoma: results from the Upper Tract Urothelial Carcinoma Collaboration. J. Urol. 182, 900-6.
【非特許文献５】Hadaschik, B.A., Ter Borg, M.G., Jackson, J., Sowery, R.D., So, A.I., Burt, H.M., Gleave, M.E., 2008. Paclitaxel and cisplatin as intravesical agents against non-muscle-invasive bladder cancer. BJU Int. 101, 1347-1355.
【非特許文献６】Lu, S., Neoh, K.G., Kang, E.-T., Mahendran, R., Chiong, E., 2015a. Mucoadhesive polyacrylamide nanogel as a potential hydrophobic drug carrier for intravesical bladder cancer therapy. Eur. J. Pharm. Sci. 72, 57-68.
【非特許文献７】Papadopoulos, E., Yousef, G., Scorilas, A., 2015. Gemcitabine impacts differentially on bladder and kidney cancer cells: distinct modulations in the expression patterns of apoptosis-related microRNAs and BCL2 family genes. Tumor Biol. 36, 3197-3207.
【非特許文献８】Audenet, F., Traxer, O., Bensalah, K., Roupret, M., 2013a. Upper urinary tract instillations in the treatment of urothelial carcinomas: A review of technical constraints and outcomes. World J. Urol. 31, 45-52.
【非特許文献９】Lu, S., Neoh, K.G., Kang, E.-T., Mahendran, R., Chiong, E., 2015b. Mucoadhesive polyacrylamide nanogel as a potential hydrophobic drug carrier for intravesical bladder cancer therapy. Eur. J. Pharm. Sci. 72, 57-68.
【非特許文献１０】D., L., M., M., M., K., M., S., 2014. Hydrogel based drug retention system for the treatment of upper tract urothelial carcinoma. Eur. Urol. Suppl. 13, e25-e25a.
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【非特許文献１２】Shaikh, M., Kichenadasse, G., Choudhury, N.R., Butler, R., Garg, S., 2013. Non-vascular drug eluting stents as localized controlled drug delivery platform: preclinical and clinical experience. J. Control. Release 172, 105-17.
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【非特許文献２１】Suleiman, D., Antonio Est??vez, L., Pulido, J.C., Garc??a, J.E., Mojica, C., 2005. Solubility of anti-inflammatory, anti-cancer, and anti-HIV drugs in supercritical carbon dioxide. J. Chem. Eng. Data.
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【非特許文献２９】Browne, S., Pandit, A., 2014. Multi-modal delivery of therapeutics using biomaterial scaffolds. J. Mater. Chem. B 2, 6692-6707.
【考案の概要】
【０００８】
本開示は、抗がん剤を含む生分解性尿管ステントと、チャネル、すなわち哺乳類の尿管
、例えば、尿石、新形成または外科的処置によって閉塞された尿管の開存性を確実にする
ために使用され得る医療用組成物とに関する。
【０００９】
本開示で開示される生分解性尿管ステント（BUS）は、予想外に抗がん剤の適切な放出
を可能にし、したがって、治療期間を延長し、治療の有効性を高め、生分解性尿管ステン
トの適否に影響を及ぼさない。
【００１０】
本開示の態様は、ポリマー基材を含む生分解性ステントに関し、
ポリマー基材は、10〜50%（w/w）のアルギン酸塩
45〜85%（w/w）のゼラチン；
前記ポリマー基材をコーティングするためのポリマー生分解性樹脂；
および10%（w/w）以下の抗がん剤を含む。
【００１１】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、5%（w/w）以
下、好ましくは4.95%（w/w）以下の抗がん剤を含み得る。
【００１２】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、パクリタキセ
ル、エピルビシン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、およびそれらの混合物からなるリス
トより選択される少なくとも1つの抗がん剤を含み得る。
【００１３】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、以下の抗がん
剤混合物の1つを含み得る：パクリタキセルおよびエピルビシン；またはパクリタキセル
およびドキソルビシン；またはパクリタキセルおよびゲムシタビン；またはエピルビシン
およびドキソルビシン；またはエピルビシンおよびゲムシタビン；またはドキソルビシン
およびゲムシタビン；またはパクリタキセル、エピルビシンおよびドキソルビシン；また
はエピルビシン、ドキソルビシンおよびゲムシタビン；またはパクリタキセル、エピルビ
シンおよびゲムシタビン。
【００１４】
より良好な結果のための一実施形態では、ポリマー基材は、20〜40%（w/w）のアルギン
酸塩および55〜70%（w/w）のゼラチンを含み得る。
【００１５】
より良好な結果のための一実施形態では、樹脂は、3〜50%（w/v）、特に10〜20%（w/v
）、さらにとりわけ5〜10%（w/v）の濃度を有する溶液中に添加され得る。
【００１６】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、造影剤、すな
わちX線造影剤をさらに含み得る。
【００１７】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、
2〜5%（w/w）の造影剤、すなわち炭酸ビスマス（III）；
20〜40%（w/w）のアルギン酸塩および55〜70%（w/w）のゼラチンを含むポリマー基材を含
み得る。
【００１８】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、5%（w/w）の
造影剤、すなわち炭酸ビスマス（III）；30%（w/w）のアルギン酸塩および65%（w/w）の
ゼラチンを含むポリマー基材を含み得る。
【００１９】
より良好な結果のための一実施形態では、樹脂は以下のリストより選択され得る：ポリ
カプロラクトン樹脂、ポリグリコリドおよびそのコポリマー：乳酸との（乳酸-グリコー
ル酸）コポリマー、ε-カプロラクトンとの（グリコリド-カプロラクトン）コポリマー、
および炭酸トリメチレンとの（グリコリド-炭酸トリメチレン）コポリマー、またはそれ
らの混合物、特にポリカプロラクトン。
【００２０】
より良好な結果のための一実施形態では、造影剤は以下のリストより選択される：バリ
ウム塩、ビスマス塩、スピネル顔料、またはそれらの混合物、特に炭酸ビスマス（III）
。
【００２１】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、架橋剤をさら
に含み得る。好ましくは、前記架橋剤は以下のリストより選択される：1価または2価のイ
オンを含むイオン性架橋剤であって、
そのカチオンは、カルシウム、マグネシウム、バリウム、ストロンチウム、ホウ素、ベリ
リウム、アルミニウム、鉄、銅、コバルト、鉛または銀であり；
そのアニオンは塩化物、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、コハク酸塩、マレイ
ン酸塩もしくはシュウ酸塩、またはそれらの混合物からなる群より選択され；特に塩化カ
ルシウムである、架橋剤。
【００２２】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、以下のリスト
より選択される第2の抗がん剤をさらに含み得る：メトトレキセート、ビンブラスチン、
シスプラチン、顆粒球コロニー刺激因子、カルボプラチン、5-フルオロウラシル、イホス
ファミド、ペメトレキセド、マイトマイシンC、カペシタビン、カルメット・ゲラン桿菌
（BCG）またはそれらの混合物。
【００２３】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の生分解性ステントは、抗炎症剤、抗
菌剤、抗ウイルス剤、またはそれらの混合物をさらに含み得る。
【００２４】
より良好な結果のための一実施形態では、生分解性ステントの抗がん剤は、ステントに
、好ましくは超臨界流体CO2によって含浸され得る。
【００２５】
より良好な結果のための一実施形態では、ステントは尿管ステントである。
【００２６】
本開示の別の態様に関して、生分解性ステントは、再生医療、組織工学において、また
はがんもしくは泌尿器疾患の治療、予防もしくは療法において使用され得る。
【００２７】
本開示の別の態様では、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリマー生分解性樹脂および10%（w
/w）以下の抗がん剤を含む医療用組成物に関し、
前記組成物は生分解性ステント内に施され、
前記ステントは10〜50%（w/w）のアルギン酸塩、45〜85%（w/w）のゼラチン；前記ポリマ
ー基材をコーティングするためのポリマー生分解性樹脂；および5%（w/w）以下の抗がん
剤を含む。
【００２８】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の組成物は、5%（w/w）の抗がん剤、
好ましくは4.95%（w/w）以下の抗がん剤を含み得る。
【００２９】
より良好な結果のための一実施形態では、本開示の組成物は、パクリタキセル、エピル
ビシン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、およびそれらの混合物からなるリストより選択
される少なくとも1つの抗がん剤を含み得る。
【００３０】
一実施形態では、本開示の組成物は、再生医療、組織工学において、またはがんもしく
は泌尿器疾患の治療、予防もしくは療法において使用され得る。
【００３１】
以下の図面は、説明を例示するための好ましい実施形態を提供するものであり、発明の
範囲を限定するものとして見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】UTUC療法の潜在的薬物送達システムとしての抗がん剤溶出生分解性尿管ステントの概念図。
【図２】生分解性尿管ステントに使用される抗がん剤の超臨界流体プロセス含浸および装置の図。
【図３】市販の非分解性尿管ステント（Biosoft（登録商標）duo、Porges、Coloplast）PCL樹脂でコーティングされたBUSおよび含浸後に調製されたBUSステントの一部の図。
【図４】試験されたさまざまな条件について、37℃での人工尿溶液AUS（pH 5.5）中の生分解性および非生分解性尿管ステントからの累積抗がん剤放出の図。ステントは9日後に分解した。
【図５Ａ】抗がん剤に異なる濃度で4時間または72時間ばく露した後のT24細胞およびHUVEC細胞のin vitro生存率の図。細胞生存率は、対照の%として表される。縦線は、scCO2によりバイオステントに含浸された薬物の量を表す。示されたデータは、少なくとも3回の独立した実験の平均である。
【図５Ｂ】抗がん剤に異なる濃度で4時間または72時間ばく露した後のT24細胞およびHUVEC細胞のin vitro生存率の図。細胞生存率は、対照の%として表される。縦線は、scCO2によりバイオステントに含浸された薬物の量を表す。示されたデータは、少なくとも3回の独立した実験の平均である。
【図６】間接接触による72時間のばく露後のT24がん細胞株の細胞生存率の図。統計学的有意差は、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001とみなした。
【図７】直接接触による72時間のばく露後のT24がん細胞株およびHUVEC細胞の細胞生存率の図。BUSコートは、抗がん剤を含浸させていないPCLコーティングを有するBUSである。統計学的有意差は、*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001とみなした。
【図８】抗がん剤を含浸させた生分解性尿管ステントへの直接接触によるばく露の4時間後および72時間後のT24細胞形態の光学顕微鏡画像（10倍）の図。対照実験は、T24細胞および薬物を含まないステントで72時間行った。
【考案を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、抗がん剤を含む生分解性尿管ステントと、チャネル、すなわち哺乳類の尿管
、例えば、尿石、新形成または外科的処置によって閉塞された尿管の開存性を確実にする
ために使用され得る医療用組成物とに関する。
【００３４】
一実施形態では、疎水性抗がん剤、特に、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビ
シン、および／またはゲムシタビンを、超臨界流体技術によって生分解性尿管ステントに
含浸させた。
【００３５】
一実施形態では、アルギン酸ナトリウム塩、ゼラチン、塩化カルシウム、クロロホルム
、エタノールおよび炭酸ビスマス（III）塩基を、Sigma-Aldrich（ドイツ）から購入した
。オルトリン酸二水素カリウム（99.5%）および塩化マグネシウム六水和物（99%）を、Ri
edel-de Haen（ドイツ）から入手した。TONE（商標）ポリマーとして市販されているポリ
カプロラクトン樹脂PCL 787を、ニュージャージー州バウンドブルックのUnion Carbideの
化学・プラスチックス部門から入手した。人工尿溶液（AUS）、パクリタキセル99.5%（PA
）、ドキソルビシン98%（DOX）、エピルビシン99%（EP）、ゲムシタビン99%（GEM）はFis
her Scientific（USA）から。二酸化炭素（99.998mol%）は、Air Liquide（ポルトガル）
から供給された。全ての試薬は、それ以上精製することなく受け取ったままで使用した。
【００３６】
簡単に説明すると、ポリマーを熱蒸留水（70℃）に溶解させた。溶液を1時間撹拌し、
ポリマー溶液を型に注入して管状構造体を得た。1時間後、品物を型から取り出し、アル
コール溶液（100%エタノール）中に1時間入れた。次いで、BUSを、好ましくは0.48Mの塩
化カルシウム（CaCl2）架橋溶液に室温で移した。架橋後、BUSをアルコール溶液（100%エ
タノール）に移してアルコールゲルを得た。本主題のバイオステントを、超臨界二酸化炭
素（scCO2）を含む高圧容器を用いて、40℃および100バールで90分間、連続モードで乾燥
させた。ステントのコーティングは、クロロホルムに溶解した、好ましくは（Mw  80,000
g mol-1）の10%ポリカプロラクトン（PCL）樹脂787に浸漬することによって行った。
【００３７】
一実施形態では、抗がん剤の超臨界CO2含浸を、本開示の生分解性尿管ステント（BUS）
に実施した。図２に従い、製造された生分解性尿管ステントを、抗がん剤（10mg）と共に
高圧容器に入れた。抗がん剤を、共溶媒の存在下または非存在下でステントに含浸させた
。使用したscCO2の含浸条件は、100バールで40℃および90分であった。二酸化炭素を液化
し、膜ポンプ（MCPV-71、Haskel、ドイツ）を用いて所望の圧力に圧送した。含浸はバッ
チモードで90分間行い、続いて系を速やかに減圧した。共溶媒を使用する場合、10%（v/v
）エタノールを使用した。市販の非分解性尿管ステント（Biosoft（登録商標）duo、Porg
es、Coloplast）に、同じ薬物を同じ条件下で共溶媒と共に含浸させ、対照として使用し
た。ステントの機械的特性を高めるために、PCLコーティングを施した。薬物の放出に対
するコーティングの効果を評価するために、条件BUS+共溶媒を2回調製し、このバッチの1
つをPCL樹脂でコーティングした。各条件に用いた名称を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0003233978.tif 000003
【００３９】
一実施形態では、含浸後、バイオステントの1バッチをPCL樹脂でコーティングし、新し
い条件（薬物.コート）を評価した。
【００４０】
抗がん剤含浸収率（I）を、式（1）から算出した：
I(%) = m薬物 / mステント + m薬物 x 100        方程式(1)
ここで、mステントはプロセス開始時のポリマー質量であり、m薬物はAUSにおけるステン
トの完全な分解後に放出されるそれぞれの抗がん剤の質量である。抗がん剤濃度を、標準
溶液から調製した較正曲線から算出した。マイクロプレートリーダー（SpectraMax i3、M
olecular Devices、USA）を用いるUV分光法により、各薬物の最大吸光度（PAについては2
27nm、EPおよびDOXについては254nm、GEMについては268nm）で試料を分析した。全ての実
験を3回実施した。
【００４１】
一実施形態では、生分解性尿管ステントからの抗がん剤放出の測定を行い、開発された
抗がん剤溶出生分解性尿管ステントの放出動態を人工尿溶液（AUS）で測定した。In vitr
o抗がん剤、特にパクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシンおよびゲムシタビンの
含浸生分解性尿管ステントからの放出を3回行った。含浸試料10mgを秤量し、37℃で10ml
のAUSに60rpmで撹拌しながら浸漬させた。所定時間に（0分、5分、15分、30分、1時間、3
時間、5時間、7.5時間、24時間、48時間、72時間、6日目および10日目）、放出溶液の0.5
mlのアリコートを採取し、その容量を新しいAUSと交換した。抗がん剤濃度は、標準溶液
から作成した較正曲線から算出した。好ましくは、薬物の濃度を、上述のようにUV分光法
によって測定した。特に、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、Bio-Tek Instrument
s、USA）を用いるUV分光法により、PAでは227nm、EPおよびDOXでは254nm、GEMでは268nm
である各薬物の最大吸光度で試料を分析した。
【００４２】
一実施形態では、本開示は、ヒト尿路上皮癌細胞株T24（ATCC、USA）をがん細胞株とし
て使用し、尿路上皮癌およびヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC（ATCC、USA）を対照の非がん性
細胞株としてモデル化した。T24細胞株およびHUVEC細胞を、RPMI-1640およびEGM（商標）
-2培地でそれぞれ（10%ウシ胎仔血清（FBS）、1mMのL-グルタミンおよび1%のペニシリン
／ストレプトマイシンと共に）培養し、細胞を37℃で加湿した5%CO2雰囲気中で培養した
。
【００４３】
一実施形態では、T24細胞およびHUVEC細胞に対する抗がん剤のin vitro有効性- IC50の
測定。パクリタキセル、エピルビシン、ドキソルビシンおよびゲムシタビンの細胞傷害性
は、遊離薬物を0.01〜2000ng/mlの濃度範囲で含む培地にばく露した後のT24およびHUVEC
細胞の生存率を測定することによって評価した。培地中の遊離薬物は、最初に抗がん剤を
DMSO（50mg/ml）に溶解して調製し、この溶液を培養培地に希釈して所望の濃度にした。
標準的なMTT細胞増殖アッセイ（CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell P
roliferation Assay）を使用して細胞生存率を試験し、両方の細胞系で実施して各薬物の
半最大阻害濃度（IC50）を測定した。1ウェルあたり5000個の細胞を、T24およびHUVEC細
胞用の100μlの培地を含む96ウェルプレートに播種した。24時間のインキュベーション後
、各ウェルの培地を吸引し、細胞を様々な濃度の薬物を含む100μlの新しい培地に4時間
および72時間ばく露させた。4時間の処理後の細胞を新しい（薬物を含まない）培地中で
さらに72時間培養した。その後、各ウェルの培養培地を100μlの培地および20μlのCellT
iter96（登録商標）AQueous One Solution Reagentと交換し、4時間37℃でインキュベー
トした。ラテックスゴム抽出物を細胞死の陰性対照として使用した；一方、細胞培養培地
を陽性対照として使用した。細胞生存率をUV分光法により定量し、マイクロプレートリー
ダー（SpectraMax i3、Molecular Devices、USA）で490nmでのホルマザン吸光度を読み取
った。各試料製剤および対照を、12の反復実験を用いて試験した。
【００４４】
一実施形態では、IC50を、MTTによって測定された細胞生存率の曲線と薬物濃度のフィ
ッティングから測定した。フィッティングは、GraphPadソフトウェア（GraphPad Prism 6
.00ソフトウェア、サンディエゴ、USA）を用いて行った。
【００４５】
T24細胞およびHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）との間接的かつ直接的な接触による抗が
ん剤溶出生分解性尿管ステントのin vitro抗腫瘍／がん効果を評価した。
【００４６】
一実施形態では、ヒト尿路上皮癌細胞株における抗がん剤溶出生分解性尿管ステントの
抗がん効果を、間接的および直接的接触によるT24細胞の生存率を測定することによって
評価した。HUVECを、非がん性対照細胞株として用いた。T24細胞株およびHUVEC細胞を、R
PMI-1640およびEGM（商標）-2培地でそれぞれ（10%ウシ胎仔血清（FBS）、1mMのL-グルタ
ミンおよび1%のペニシリン／ストレプトマイシンと共に）培養した。間接的な接触によっ
て、放出された薬物ならびに生分解性尿管ステントからの浸出物の効果を評価し、4時間
および72時間後に新しい培地にステントを置いた。一方、直接接触により、10mgのステン
トを各ウェルの細胞層と直接接触させて配置した。両方の試験を4時間および72時間行っ
た。細胞の生存率は、標準MTT試験を用いて行った。簡潔には、1ウェルあたり5000個の細
胞を、T24およびHUVEC細胞用の100μL培地を含む96ウェルプレートに播種した。24時間の
インキュベーション後、各ウェルの培地を吸引し、細胞を間接接触試験でステントの抽出
物を含む培地にばく露した。直接接触において、細胞を、ステントの存在下で100μLの新
しい培地にばく露した。4時間の処理後の細胞をさらに新しい培地中で72時間培養した。
その後、各ウェルの培養培地を100μLの培地および20μLのCellTiter96（登録商標）AQue
ous One Solution Reagentと交換し、37℃で4時間インキュベートした。細胞培養培地お
よび非含浸ステント（BUSおよび市販のステント）を陰性対照として使用した。各試料製
剤および対照を3回の反復実験で試験した。
【００４７】
一実施形態では、光学顕微鏡検査を行った。4時間および72時間の直接接触後にウェル
プレートの底で培養された細胞を、それらの形態の評価に対する効果を視覚的に評価する
ために、光学顕微鏡（Axio Imager Z1m、Zeiss、ドイツ）で観察した。抗がん剤を含浸さ
せた生分解性尿管ステントに直接接触させることによる4時間および72時間のばく露後のT
24細胞の画像を、倍率10倍で撮影した。対照実験は、T24細胞および薬物を含まないステ
ントで72時間行った。
【００４８】
一実施形態では、全てのデータ値を平均±標準偏差（SD）として示す。統計分析は、Gr
aph Pad Prism 6.00ソフトウェア（サンディエゴ、USA）を用いて行った。統計的有意差
（各試料のデータ分布の正規性は、Shapiro-Wilk検定を用いて評価した（全ての場合にお
いてp<0.05で確認された）。試料間の有意差はt検定を用いて評価し（*p<0.05、*p<0.01
および***p<0.001）、平均3〜12回の反復実験について一元配置分散分析（ANOVA）を使用
して測定し、その後、全てのペアワイズ平均比較についてのpost hoc Tukey検定を行った
。
【００４９】
一実施形態では、天然由来のポリマーから生分解性尿管ステントを前述のように調製し
（図３）、図２に示すように、抗がん剤をscCO2によってBUSに充填した。scCO2は、環境
に優しく、非可燃性、および非毒性の溶媒であり、非常に豊富で低コストであるため、他
の含浸溶媒に優る利点を提供する。さらに、含浸プロセスの終了時および減圧工程後に、
最終生成物が乾燥形態で得られ、その後の乾燥および精製工程の必要性を回避する。さら
に、溶媒はリサイクルして再使用することができる。（非特許文献１６）。
【００５０】
Kazarianら（非特許文献１７；非特許文献１８）によると、超臨界流体による含浸を説
明する2つの機構が主に存在する。1つは、系が減圧されたときに膨潤するマトリックス中
に薬物が単純に沈着することである。この機構では、薬物はCO2に可溶化され、所定の時
間、ポリマーマトリックスと接触して置かれる。この手順の後、減圧下で、CO2分子は急
速にポリマーマトリックスから離れ、可溶化された薬物は沈殿し、ポリマーネットワーク
内に堆積する。この機構は、超臨界流体と接触しているときのポリマーマトリックスの膨
潤能力に大きく依存する。一方、Kazarianらによって説明された含浸の第2の機構は、ポ
リマーマトリックスに対する薬物の親和性により依存すると言われている。
【００５１】
一実施形態では、抗がん剤の含浸に使用される条件は、共溶媒の存在下および非存在下
でのステントの乾燥に使用される条件（100バールで40℃および90分）と同じであった。
エタノールなどの極性溶媒のscCO2への添加は、この研究で使用される薬物のような、大
きな分子量および／または分子極性を有し、したがって二酸化炭素への溶解度が低い、多
くの極性物質の溶解性を増加させることが知られている（非特許文献１９）。10%エタノ
ールの使用は、文献（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献１
９）に報告されている超臨界CO2への薬物溶解度によって決定した。
【００５２】
一実施形態では、生分解性尿管ステント（BUS）における抗がん剤の含浸効率を、ポリ
マーの質量（mg）当たりの抗がん剤の質量（μg）の関数として測定した。結果を表２に
示す。薬物EtOH条件では、ステントに含浸される抗がん剤の量はより多く、これは、薬物
のCO2への溶解度の向上におけるエタノールの共溶媒効果のために予想される。純粋なscC
O2中の含浸パクリタキセル（PAbio）の量は0.046μg mg-1であったが、PAEtOH条件のもの
は30%高かった（0.067μg mg-1）。同様の割合がYodaらによって報告され（非特許文献１
９）、著者らは非晶質ポリ（DL-乳酸）（PDLLA）マトリックス中でのパクリタキセルの含
浸を報告している。YodaらによってPDLLAに含浸されたパクリタキセルの量は、この研究
で得られたアルギン酸塩／ゼラチンマトリックスと比較して2〜3倍高かった。これは、疎
水性PDLLAマトリックスにおける薬物-CO2溶液のより高い親和性によって正当化され得る
（非特許文献１８）。さらに、PDLLAは、scCO2の存在下でアルギン酸塩／ゼラチンポリマ
ーブレンドよりも大きく膨潤し得る（非特許文献２３；非特許文献１９）。他の薬物に関
して、結果は、エタノールを共溶媒として使用した場合、EPで15%、DOXで12%、GEMで8%の
含浸収率の増加を示した。Biosoft（登録商標） duo、Porges、Coloplastステントの場合
、含浸される薬物の量は、同じ条件下でパクリタキセルを含浸したBUSと比べて6分の1で
ある。含浸された薬物の量が少ないことは、市販のステントのポリマーマトリックスのsc
CO2における低い膨潤能力および／またはBiosoft（登録商標）duo、Porges、Coloplastス
テントの組成材料との薬物の低い親和性によるものであり得る。
【００５３】
【表２】
0003233978.tif 000004
【００５４】
一実施形態では、人工尿溶液中のin vitro放出動態を実施した。含浸バイオステントお
よび市販の尿管ステントからの抗がん剤の放出は、in vivoでの条件を模倣するために、A
US中で37℃で行った。人工尿溶液（pH5.5）を放出培地として選択し、この培地を定期的
に交換してシンク条件を提供した。図４は、ステントからの薬物の放出プロファイルを示
す。
【００５５】
一実施形態では、BUSに含浸された4つの抗がん剤について同様の放出が観察された。BU
Sがコーティングされている条件（薬物コート）と非コーティング条件とを比較すると、B
USのPCLコーティングはAUSにおける薬物の放出に影響しないと結論を下すことが可能であ
る。親水性ポリマーゼラチン+アルギン酸塩と疎水性PCLとの界面接着性が悪いため、PCL
層はステントの表面から剥離する。生理学的AUSに浸漬させると、PCLコーティングが表面
から剥離するため、異なる薬物のコーティングされたステントまたはコーティングされて
いないステントからの放出プロファイル間の有意差は観察されない。市販のステントの場
合、含浸された全ての薬物は最初の24時間で放出される。生分解性システムでは、最初の
4時間で含浸された薬物量の約50%が放出され、残りの薬物は72時間までAUSにおいて持続
的に放出されたことは注目に値する。ステントは9日後に分解した。
【００５６】
一実施形態では、非分解性ステントにおいて、BUSと比較してより速い放出を観察した
。このより速い放出は、合成ポリマーの乏しい含浸のために正当化され得る。この場合、
高密度ポリマーネットワークのために、薬物はポリマーマトリックスのバルクに深く浸透
するのではなく、むしろステントの表面上にまたはその近くに位置し、したがって培地へ
より容易に放出される（非特許文献９）。生分解性ステントの場合は、94%の水および高
度に多孔質のポリマーネットワークから構成されている。さらに、AUSの酸性および高い
イオン強度は、ステントを膨潤させ放出を促進させ得る。図４に示すこれらの4つの抗が
ん剤の放出プロファイルは、UTUCにおける膀胱内化学療法に有望である（非特許文献６）
。
【００５７】
一実施形態では、T24およびHUVEC細胞と接触したときの抗がん剤の効果（IC50）を、細
胞生存率試験、すなわちMTTアッセイによって調べた。これから、2つの細胞株のそれぞれ
における4つの薬物のそれぞれについて、IC50を計算した。この場合、IC50は、細胞の生
存を阻害するのに必要な濃度の尺度であり、薬物のin vitro効力を特定するために通常使
用される（非特許文献２４）。T24細胞系を筋肉浸潤性尿路上皮がんとして選択し、HUVEC
細胞を非がん性対照細胞として使用した。細胞傷害性の評価は、異なる濃度の遊離薬物へ
の細胞の4時間または72時間のばく露後のいずれかで行った（図５ＡおよびＢ）。4つの抗
がん剤は、がん細胞株およびHUVEC細胞の両方の生存の濃度依存性阻害プロファイルを有
することを示した。図５（ＡおよびＢ）では、両方の細胞型について、濃度依存性細胞傷
害性の傾向を見ることができる。これらは全ての場合で類似しており、72時間のばく露は
より高い殺傷効果を示すことが予想されるであろう。2つの細胞間の結果を比較すると、
がん細胞は、HUVEC細胞と比較して抗がん剤に対する感受性がはるかに高いと結論を下す
ことが可能である。
【００５８】
図５（ＡおよびＢ）では、BUSに含浸された薬物の量に対応する垂直線が各薬物につい
てプロットされている。結果は、全ての薬物について、BUSに含浸された薬物の量がT24細
胞のIC50値よりも高く、HUVEC細胞のIC50値よりも低いことを示している。重要なことに
は、これは、この研究で含浸されたBUSが、T24細胞に対して細胞傷害性効果を有するが、
HUVEC細胞に対しては効果がない可能性があることを示す。ゲムシタビンの場合、BUS中の
薬物の量は依然としてHUVECのIC50よりも低いが、理論上の薬物の量はHUVEC細胞に影響を
及ぼす能力を有し、72時間の間に細胞生存率を50%近くまで低下させる。直接接触法の場
合、HUVECに対する効果は観察されなかったが、Browneらは、遅延放出が毒性を低下させ
得ることを示唆した（非特許文献２５）。
【００５９】
一実施形態では、4つの薬物は、T24およびHUVEC細胞に対して異なる細胞傷害性濃度を
示した。結果は、試験した抗がん剤に対するT24およびHUVECの時間依存性および濃度依存
性細胞傷害性を有することを示す。IC50値を表３に示す。T24について、パクリタキセル
の4時間のばく露時間でのIC50は281.98ng/mlであり、HUVECの対応する値（849.81ng/ml）
の〜3分の1である。ばく露時間を72時間に増加させると、2つの細胞間の差異は、T24では
7.30ng/ml、HUVEC細胞では501.50ng/mlと、さらに大きい。他の薬物については、細胞は
感受性が低いようである。これらの場合、IC50値はμg/mlの範囲であり、パクリタキセル
プロファイルで観察されるようにng/mlではない。文献と比較すると、72時間後のパクリ
タキセルについて得られた値（7.30ng ml-1）は、Hadaschikらによって得られたIC50値（
2.85ng ml-1）よりも高い（非特許文献５）。Luら（非特許文献６）およびYuら（非特許
文献２６）は、ドキソルビシンのT24がん細胞についてのIC50を報告し、その結果も濃度
依存性細胞傷害性であることが示されたが、異なる範囲のIC50値、11.6ng ml-1および4μ
g ml-1をそれぞれ示した。ゲムシタビンの場合は、Papadopoulosら（非特許文献７）。
【００６０】
【表３】
0003233978.tif 000005
【００６１】
一実施形態では、T24細胞およびHUVECの両方の生存率をステントと細胞との間接的かつ
直接的な接触により測定することによって、開発された抗がん生分解性尿管ステントの抗
腫瘍／抗がん効果を評価した。図６は、72時間のばく露後のT24がん細胞に対する間接接
触によって試験した4つの薬物についての結果を示す。使用した対照は、薬物を含まない
培地中のT24細胞および薬物を含浸させていないステントであった。T24がん細胞は、薬物
負荷ステントと接触したときに、試験した種々の薬物にばく露されたときと同様の挙動を
示す。薬物放出培地と接触した4時間後および72時間後、がん細胞の生存率は、ほとんど
の場合、それぞれ約25%および50%低下する。エタノールを共溶媒（薬物EtOH）として使用
し、したがってより多くの薬物をステントに含浸させた条件は、72時間のばく露後の全て
の薬物について、約65%高い殺傷効果も示す。BUSのコーティング（薬物コート）の効果を
考慮すると、これらは非コーティングステントと比較してわずかに低い有効性を示す。他
方、市販のステント（薬物市販）は、含浸結果において観察されるように、ステントに含
浸される薬物の量がより少ないために、著しく低い殺菌効果（〜10%）を示す。
【００６２】
得られた驚くべき結果および尿管の癌腫の治療用に抗がん剤と共に尿管ステントを用い
る新しい概念は、がん細胞の生存率の評価をより密接に正当化している。含浸ステントを
、4時間および72時間、T24がん細胞に直接接触させ、対照としてHUVECも使用した。図６
は、直接接触による72時間のばく露後のT24がん細胞株およびHUVEC細胞の細胞傷害性アッ
セイを示す。T24がん細胞の間接接触によって観察されたものと同様の結果であり、含浸
ステントの死滅効力と試験された種々の条件を比較した。それにもかかわらず、全ての条
件は、間接接触の結果と比較して、約10%増加したより高い死滅効果を示す。含浸された
薬物の量が多いために、薬物EtOH条件が最も高い抗がん効果を有することが再び示された
。対照細胞として使用されたHUVEC細胞は、試験したいずれの条件においても72時間のイ
ンキュベーション後に生存率の低下を示さなかった。図５（ＡおよびＢ）を振り返ると、
ステントに含浸された薬物の測定されたIC50値との密接な濃度のために、特にHUVEC細胞
と接触したゲムシタビンを用いる条件で細胞傷害性効果が見られると予想されたが、これ
は観察されず、細胞生存率はほぼ100%のままであった。したがって、scCO2により生分解
性尿管ステントに含浸された抗がん剤の量は、T24がん細胞で75%の殺滅効果を有したが、
非がん性細胞（HUVEC）には影響を与えなかった。
【００６３】
一実施形態では、UTUCの治療において、まだ標準的な化学療法は定義されていない。例
えば膀胱がんに使用される用量は、最初の1〜3日の間、パクリタキセルについてはおよそ
50mg m-2、ドキソルビシンおよびエピルビシンについては30mg m-2、ゲムシタビンについ
ては75mg m-2である（非特許文献２７）。したがって、ここで測定された濃度（表２）と
報告された値との間の比較を確立することは困難である。それにもかかわらず、ここに提
示されたin vitroの結果は、開発されたシステムが、上部尿路内でのそのような薬物の送
達において顕著な可能性を有し、in vitro有効性を実証することを示している。異なる研
究が、シスプラチンとパクリタキセルなどの1つより多くの適用される薬物を組み合わせ
ることによる高い細胞傷害性および相乗効果が実証したため（非特許文献５；非特許文献
２８）、BUSの死滅効果を高めるために、1つより多くの薬物をポリマーマトリックスに含
浸させることができる（非特許文献２９）。
【００６４】
一実施形態では、様々な抗がん剤を含浸させた生分解性尿管ステントのT24がん細胞に
おける効果を光学顕微鏡検査によって調査した。図７は、4時間および72時間の直接接触
後に試験した4つの異なる抗がん剤のそれぞれを含浸させたバイオステントと接触したT24
がん細胞の光学顕微鏡画像を示す。4時間のばく露時間後、T24細胞の大部分が多角形細胞
でコンフルエントであることが分かり[40]、いくつかの細胞は細胞死を示す丸い形状を提
示し始める。ばく露時間が72時間に増加すると、細胞は円形形態を示し、多くの細胞が分
離して増殖培地中に浮遊し、含浸生分解性尿管ステントのT24がん細胞に対する死滅効果
が確認された。対照において、細胞が正常なコンフルエントであることを見ることができ
る。
【００６５】
一実施形態では、生分解性尿管ステント（非分解性）に、4つの抗がん剤（パクリタキ
セル、エピルビシン、ドキソルビシンおよびゲムシタビン）を超臨界二酸化炭素（scCO2
）によって含浸させた。抗がん剤は生分解性尿管ステントにうまく含浸され、その放出は
人工尿溶液中で持続的であった。全ての場合において、BUSを支持体として使用した場合
、含浸薬物の100%の放出は72時間後に達成された。市販のステントの場合、含浸された薬
物の量はより少なく、放出は全ての薬物でより速く、24時間以内に100%の放出を達成した
。抗がん生分解性ステントとの直接接触によるin vitro死滅効果は、試験した全ての薬物
について同様であった。本発明者らの結果は、開発された含浸生分解性尿管ステントが、
抗がん剤の担体として機能し、潜在的に上部尿路上皮癌治療のための有効的かつ持続性の
あるIDDシステムであり得ることを示している。
【００６６】
用語「含む」は、本明細書で使用されるときはいつでも、記載の特徴、整数、工程、構
成要素の存在を示すことを意図しているが、1つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素
もしくはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【００６７】
当業者であれば、本明細書中で他に示されない限り、記載の特定の一連の工程は例示的
なものに過ぎず、本開示から逸脱することなく変更することができることを理解するであ
ろう。したがって、特に明記しない限り、記載の工程は順序通りではないため、可能であ
れば、工程は任意の好都合なまたは所望の順序で実行され得ることを意味する。
【００６８】
開示は、記載の実施形態に限定されるものではなく、当業者は、それらの変更の多くの
可能性を予見するであろう。
【００６９】
上記の実施形態は組み合わせ可能である。以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実
施形態をさらに説明する。
【００７０】
以下の参考文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれるとみなされるべきである：
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【図１】
0003233978.tif 000006
【図２】
0003233978.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
0003233978.tif 000010
【図５Ｂ】
0003233978.tif 000011
【図６】
0003233978.tif 000012
【図７】
0003233978.tif 000013
【図８】
0003233978.tif 000014