(57)【要約】  本発明は、核酸を含有する検体から、特殊な機器を必要とせず、効率的に核酸を分離する方法及びそのための装置を提供することを解決すべき課題とする。  本発明の方法は、核酸を遊離させる処理試薬１０１を収容した処理試薬収容容器１００と、核酸吸着性担体２０５を備えた核酸採取部材２００とを備え、処理試薬収容容器１００には蓋体１０４が取り付けられており、核酸採取部材２００に処理試薬収容容器１００を接続する際に蓋体１０４による封止を開放し放出口１０２と処理試薬供給口２０４とを連通するように構成されている装置を用い、核酸採取部材２００に検体を収容する工程１と、核酸採取部材２００に処理試薬収容容器１００を接続して連通させる工程２と、検体と処理試薬とを混合して混合物４２１を形成し核酸を遊離させる工程３と、混合物４２１を担体２０５に通しながら排出して核酸を吸着する工程４とを含む。
2017043649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する方法であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、
を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置
を用い、
前記核酸採取部材の収容空間に検体を収容する工程１と、
工程１の後に、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続して、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通させる工程２と
工程２において形成された、前記処理試薬収容容器の容器内空間と前記核酸採取部材の収容空間とが一体となった混合用空間内で、前記検体と前記処理試薬とを混合して前記混合物を形成し、前記混合物内で前記検体中の核酸を遊離させる工程３と、
工程３において遊離された核酸を含む前記混合物を、前記処理試薬収容容器の容器内空間の体積を減少させることにより圧送し、前記核酸採取部材の混合物排出口から前記担体を介して排出する工程４と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも１つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び／又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程４の後に、洗浄液を用いて担体を洗浄し、担体から核酸以外の不要成分を除去する工程５を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程５の後に、核酸を溶離させる溶離液を担体と接触させ、担体から核酸を溶離させる工程６を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する装置であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置。
【請求項８】
前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている、
請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも１つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び／又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている、
請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記担体から核酸以外の不要成分を除去するための洗浄液を収容する洗浄液収容容器を更に備える、請求項７〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記担体から核酸を溶離させる溶離液を収容する溶離液収容容器を更に備える、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも１種の、微生物の感染性を低減する成分と、
アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の、核酸を遊離させる成分と
を含む、検体中の核酸を遊離させるための検体処理試薬。
【請求項１４】
カオトロピック剤及び有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の、核酸の担体への吸着を促進する成分を更に含有する、請求項１３に記載の検体処理試薬。
【請求項１５】
チオール系還元剤を更に含有する、請求項１３又は１４に記載の検体処理試薬。
【請求項１６】
微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを含み、
核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含む、
請求項１５に記載の検体処理試薬。
【請求項１７】
微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含む、請求項１５に記載の検体処理試薬。
【請求項１８】
微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを更に含む、請求項１７に記載の検体処理試薬。
【請求項１９】
前記検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるための、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の検体処理試薬。
【請求項２０】
核酸を含有し、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の検体処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法。
【請求項２１】
前記担体が、シリカを含む担体である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料等の、核酸を含有する検体から核酸を分離する方法に関する。本発明はまた、核酸を含有する検体から核酸を分離するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は、核酸を解析することにより高感度かつ短時間での結果判定が可能であり、医療、農畜水産、品質検査など多様な領域において応用される産業上重要な検査法である。本検査のためには、検体から核酸を溶離・精製する必要があり、核酸精製法としては、カオトロピック剤の存在下において核酸が核酸吸着性担体と結合する性質を応用したバインド・エリュート法が最も汎用されている（特許文献１、２）。この精製法は（ａ）溶解工程：検体の溶解と核酸の溶出、（ｂ）吸着工程：核酸吸着性担体と核酸の結合、（ｃ）洗浄工程：核酸吸着性担体に結合した核酸の洗浄、（ｄ）溶出工程：核酸の溶出、から構成され、特にスピンカラムと組み合わせたものは、高純度の核酸を精製することができる優れた方法である。【０００３】
しかしながら、この方法は熟練した研究者が設備の整った実験室などで遠心機やマイクロピペット、ボルテックスミキサー、インキュベーターなどの理化学機器を使用して作業する必要があり技術的難度の高い作業である。実際に遺伝子検査を必要としている、医療、農畜水産、食品などの領域においては、必要な技術を有する人材や設備が整っていない施設も多い。こういった施設では、本来短時間で結果判定が可能な遺伝子検査を、時間と費用のかかる外部機関に委ねているのが実情であり、遺伝子検査の特徴である結果判定の迅速性を十分に活用できていないのが実情であった。【０００４】
また、遺伝子検査の対象となる検体は、ウイルスや細菌といった病原性を有するものであることが多く、検査作業者への感染のリスクが常に問題となる。従って、遺伝子検査の多くが、バイオセーフティーレベルに応じた装備・設備の使用を必要とし、これらの設備や装備の使用は、それを必要としない場合に対して、非常に煩雑な操作である。作業者に対して多大な負担を課していることが実情であった。【０００５】
特許文献３では、検体から溶出された核酸を含む核酸抽出液をゼオライトに接触させて不要物をゼオライトに吸着させて核酸を精製する方法が開示されているが、この方法ではバインド・エリュート法のように核酸を濃縮精製する能力を有しておらず、検体中の核酸濃度に依存する課題を有する。また、吸着除去できる不純物に限度があり、精製度はバインド・エリュート法に対して劣り、バインド・エリュート法を代替するには技術水準が不十分である。【０００６】
特許文献４には、喀痰に含まれる抗酸菌の遺伝子検出のための前処理方法が開示されている。この方法は喀痰から抗酸菌の菌体を分離することを目的としており、遺伝子（核酸）を喀痰から抽出する方法ではない。【０００７】
特許文献５では、自動化及び小型化に適した、核酸吸着性多孔性膜を用いた核酸の分離精製方法が開示されている。特許文献５では核酸吸着性多孔性膜として、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用いることを特徴とする。特許文献５の方法もまた、従来のバインド・エリュート法の上記課題を解決できるものではない。【０００８】
特許文献６では、液中の核酸を固相担体に吸着させるためのカオトロピック剤の組成が開示されている。しかし特許文献６においても、従来のバインド・エリュート法の上記課題を解決するための手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−７８７９０号公報
【特許文献２】特表２０１４−５２６２５５号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００９／０６０８４７
【特許文献４】特開２００９−１００６８８号公報
【特許文献５】特開２００５−１６８４４９号公報
【特許文献６】米国特許公開ＵＳ２００９／０３０６３５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、核酸を含有する検体から効率的に核酸を分離する方法、そのための装置、及び、そのための試薬を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では上記課題を解決するための手段として以下の発明を提供する。【００１２】
本発明は、核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する方法であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、
を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置
を用い、
前記核酸採取部材の収容空間に検体を収容する工程１と、
工程１の後に、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続して、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通させる工程２と
工程２において形成された、前記処理試薬収容容器の容器内空間と前記核酸採取部材の収容空間とが一体となった混合用空間内で、前記検体と前記処理試薬とを混合して前記混合物を形成し、前記混合物内で前記検体中の核酸を遊離させる工程３と、
工程３において遊離された核酸を含む前記混合物を、前記処理試薬収容容器の容器内空間の体積を減少させることにより圧送し、前記核酸採取部材の混合物排出口から前記担体を介して排出する工程４と、
を含むことを特徴とする方法を提供する。【００１３】
本発明の方法に用いる装置は、好ましくは、後述する装置の特徴を備える。【００１４】
本発明の方法は、好ましくは、工程４の後に、洗浄液を用いて担体を洗浄し、担体から核酸以外の不要成分を除去する工程５を更に含む。【００１５】
本発明の方法は、好ましくは、工程５の後に、核酸を溶離させる溶離液を担体と接触させ、担体から核酸を溶離させる工程６を更に含む。【００１６】
本発明の方法では、好ましくは、前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む。【００１７】
本発明はまた、核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する装置であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置を提供する。【００１８】
ここで「前記核酸採取部材が、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている」という特徴の、具体的な態様としては、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に前記蓋体に押し込まれて前記蓋体を破壊する部分を、前記核酸採取部材が、備える態様が挙げられる。この態様では、前記部分が押し込まれることによる前記蓋体の破壊により、前記蓋体による前記放出口の封止が開放され、前記放出口と前記処理試薬供給口とが連通する。前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部である態様では、前記処理試薬供給口周縁部の端部が、前記部分として例示できる。この具体的な態様では、前記蓋体は、前記核酸採取部材が備える前記部分が押し込まれることにより破壊可能な蓋体であり、具体的には、フィルムにより形成された蓋体である。【００１９】
本発明の装置は、好ましくは、
前記処理試薬収容容器が、前記放出口の周縁を囲う放出口周縁部を備え、
前記核酸採取部材が、前記収容空間を囲う周壁部を備え、前記周壁部のうち、前記処理試薬供給口の周縁を囲う部分が処理試薬供給口周縁部であり、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とは、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とが当接した状態で接続することができるように構成されており、
前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている。【００２０】
ここで「前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部の、前記処理試薬供給口の側の端部は、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに前記処理試薬収容容器の前記蓋体を破壊するように構成されている」という特徴の、具体的な態様として、前記核酸採取部材の処理試薬供給口周縁部が、前記処理試薬供給口の側に、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを、前記放出口周縁部の内周面と前記処理試薬供給口周縁部の外周面とを当接させながら接続するときに、前記蓋体に押し込まれて前記蓋体を破壊する端部を含む態様が挙げられる。前記蓋体は、前記処理試薬供給口周縁部の前記端部が押し込まれることにより破壊可能な蓋体であり、具体的には、フィルムにより形成された蓋体である。この具体的な態様では、好ましくは、前記端部が鋭利な端部である。【００２１】
本発明の装置において、更に好ましくは、
前記核酸採取部材が、周壁部の外周面から外方向に張り出した張出部と、張出部の周縁から、前記周壁部の、前記処理試薬供給口が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部とを更に備え、
前記放出口周縁部の外周面と、前記混合物漏出防止壁部の内周面とのうち一方又は両方には、全周を囲うように周方向に延び、径方向に向け突出した、圧縮変形可能なリング状突起が少なくとも１つ形成されており、
前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とを接続するときに、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面とが対向し、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間で挟まれた前記リング状突起が圧縮変形して、前記放出口周縁部の外周面と前記混合物漏出防止壁部の内周面との間の前記混合物の通過、及び／又は、前記処理試薬供給口周縁部の外周面と前記放出口周縁部の内周面との間の前記混合物の通過が阻止されるように、前記処理試薬収容容器と前記核酸採取部材とが形成されている。【００２２】
本発明の装置は、好ましくは、前記担体から核酸以外の不要成分を除去するための洗浄液を収容する洗浄液収容容器を更に備える。【００２３】
本発明の装置は、好ましくは、前記担体から核酸を溶離させる溶離液を収容する溶離液収容容器を更に備える。【００２４】
本発明の装置において、好ましくは、前記処理試薬が、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む。【００２５】
本発明はまた、
有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも１種の、微生物の感染性を低減する成分と、
アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の、核酸を遊離させる成分と
を含む、検体中の核酸を遊離させるための検体処理試薬を提供する。【００２６】
本発明の検体処理試薬は、好ましくは、カオトロピック剤及び有機溶媒からなる群から選択される少なくとも１種の、核酸の担体への吸着を促進する成分を更に含有する。【００２７】
本発明の検体処理試薬は、好ましくは、チオール系還元剤を更に含有し、より好ましくは、微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを含み、且つ、核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含む。【００２８】
本発明の検体処理試薬は、好ましくは、チオール系還元剤を更に含有し、微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分としてアルカリ物質を含み、より好ましくは、微生物の感染性を低減する前記成分としてアルコールを更に含む。【００２９】
本発明の検体処理試薬は、好ましくは、前記検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるための、検体処理試薬である。【００３０】
本発明はまた、検体中の核酸を遊離させるための、前記検体処理試薬の使用を提供する。【００３１】
本発明の使用は、好ましくは、前記検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるための、前記検体処理試薬の使用である。【００３２】
本発明はまた、本発明の更なる方法として、
検体中の核酸を遊離する方法であって、
検体と前記検体処理試薬とを混合して混合物を形成し、該混合物中で、前記検体に含まれ得る微生物の感染性を低減するとともに、前記検体中の核酸を遊離させる工程１を含む方法、を提供する。【００３３】
本発明はまた、本発明の更なる方法として、
検体から核酸を分離する方法であって、
前記工程１と、
前記工程１で形成された混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させる工程２と
を含む方法、を提供する。【００３４】
本発明はまた、本発明の更なる方法として、
核酸を含有し、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
チオール系還元剤を含む前記検体処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法を提供する。【００３５】
本発明の更なる方法では、好ましくは、前記担体が、シリカを含む担体である。【００３６】
上記の本発明の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法の一実施形態では、核酸を含有する検体が、喀痰であり、好ましくは、感染性微生物又は感染性微生物に由来する核酸を含有する喀痰であり、特に好ましくは、抗酸菌（好ましくは結核菌、以下同じ）又は抗酸菌に由来する核酸を含有する喀痰である。この実施形態では、分離しようとする核酸は、喀痰中に含まれる核酸であり、好ましくは感染性微生物又は他の細胞（例えば喀痰中のヒト細胞又は他の動物の細胞）に由来する核酸であり、特に好ましくは、抗酸菌に由来する核酸である。この実施形態の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法では、使用する処理試薬は喀痰の流動性を向上させるための還元剤を含むことが好ましい。還元剤としては好ましくはチオール系還元剤であり、より好ましくはシステイン系還元剤であり、システイン系還元剤としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｌ−システインエチルエステル、Ｌ−システインメチルエステル、Ｎ−エチル−Ｌ−システイン、及びＮ−メチル−Ｌ−システイン並びにこれらの化合物の塩から選択される少なくとも１種が好ましい。前記塩としては還元剤として作用する形態であれば特に限定されず、ハロゲン化水素塩（塩酸塩等）、アルカリ金属塩（ナトリウム塩等）等の形態であってよく、例えば、Ｌ−システインエチルエステルの塩酸塩、Ｌ−システインメチルエステルの塩酸塩等が例示できる。また、使用する処理試薬は液体であることが好ましい。【００３７】
上記の本発明の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法の他の一実施形態では、核酸を含有する検体が、抗酸菌に由来する核酸を含有する検体である。この実施形態では、分離しようとする核酸は、抗酸菌に由来する核酸である。【００３８】
上記の本発明の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法の更に他の一実施形態では、核酸を含有する検体が、喀痰を除く検体であり、ここで除外される喀痰は、感染性微生物又は感染性微生物に由来する核酸を含有する喀痰であり、特に抗酸菌又は抗酸菌に由来する核酸を含有する喀痰である。この実施形態の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法では、使用する処理試薬は前記還元剤を含まないものとすることができる。【００３９】
上記の本発明の方法、装置、試薬、使用又は更なる方法の更に他の一実施形態では、核酸を含有する検体が、抗酸菌に由来する核酸以外の核酸を含有する検体である。この実施形態では、分離しようとする核酸は、抗酸菌に由来する核酸以外の核酸である。【００４０】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-178442号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、核酸を含有する検体から効率的に核酸を分離する方法、そのための装置、及び、そのための試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、処理試薬収容容器の一実施形態の断面模式図である。
【図２】図２は、核酸採取部材の一実施形態の断面模式図である。
【図３】図３は、検体受容部材の一実施形態の断面模式図である。
【図４−１】図４−１は、本発明の核酸の分離方法のうち、工程１を説明するための模式図である。
【図４−２】図４−２は、本発明の核酸の分離方法のうち、工程２及び３を説明するための模式図である。
【図４−３】図４−３は、本発明の核酸の分離方法のうち、工程４を説明するための模式図である。
【図４−４】図４−４は、本発明の核酸の分離方法のうち、工程５を説明するための模式図である。
【図４−５】図４−５は、本発明の核酸の分離方法のうち、工程６を説明するための模式図である。
【図５】図５は、本発明の処理試薬収容容器の他の一実施形態の断面模式図である。
【図６】図６は、本発明の処理試薬収容容器の更に他の一実施形態の断面模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
＜核酸を分離する方法＞
本発明は、処理試薬収容容器と核酸採取部材とを用いて、核酸含有検体から核酸を分離する方法に関する。処理試薬収容容器の具体例としては、図１に示す処理試薬収容容器１００を挙げることができ、核酸採取部材の具体例としては、図２に示す核酸採取部材２００を挙げることができる。以下、本発明に用いる各器具及びそれを用いた方法について図面に記載の実施形態を参照して説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００４４】
処理試薬収容容器１００は、容器内空間１１０に、検体中の核酸を遊離させる処理試薬１０１が収容されており、且つ、処理試薬１０１を放出する放出口１０２を有する。更に処理試薬収容容器１００は、容器内空間１１０の体積が減少可能なように構成されており、それを実現するための具体的な手段としては、後に詳述する圧送部１０３が例示できる。放出口１０２には、処理試薬１０１を容器内空間１１０に保持するように、放出口１０２を封止する蓋体１０４が取り付けられている。
【００４５】
図１に示す処理試薬収容容器１００では、放出口１０２は、放出口周縁部１０５により周縁が囲われて形成されている。放出口周縁部１０５は一方側が開放されて放出口１０２を囲い、他方側が圧送部１０３と接続されている。放出口周縁部１０５は好ましくは図示するように筒形状を有するがこれには限定されない。容器内空間１１０は、圧送部１０３の内部空間である圧送部内部空間１１１と、放出口周縁部１０５に囲われた空間である放出口近傍空間１１２とが一体となった空間である。圧送部１０３は、圧送部内部空間１１１の体積を減少させることができるように構成されている。圧送部内部空間１１１の体積が減少するに応じて容器内空間１１０の体積も減少する。圧送部１０３を作動させて容器内空間１１０の体積を減少させることにより、後述する混合物４２１を放出口１０２から圧送により送出することができる。ここで圧送部１０３を「作動」させるとは、容器内空間１１０の体積を減少させるように圧送部１０３を操作することを指し、図示する実施形態では圧送部１０３を変形させることを指す。
【００４６】
圧送部１０３は、図示するような、軸方向に伸縮可能な、放出口周縁部１０５に接続しない側の端部が閉塞した又は閉塞可能な、壁面が蛇腹構造を有する筒体であることが好ましいが、これには限定されない。図示する蛇腹構造を有する圧送部１０３は、変形して容器内空間１１０の体積を減少させることが可能な、処理試薬収容容器１００の部分構造の一例であり、蛇腹構造の筒体に限らず、開口が放出口周縁部１０５に接続され、他の部分が閉塞した又は閉塞可能な、容器内空間１１０の体積を減少させるように変形可能な袋体を備える圧送部１０３であれば同様に使用することができる。このように変形可能な圧送部１０３は、好ましくは弾性変形が可能であり、より好ましくは、容器内空間１１０の内外での気圧差のない条件下では、容器内空間１１０の体積を減少させるよう変形させた後に、容器内空間１１０の体積及び形状を復元することができるよう構成されている。圧送部１０３の他の例としては、一端が放出口周縁部１０５と接続した筒体と、該筒体の内壁に側壁が当接し且つ、該筒体の内壁と側壁とが空気を漏らさないように当接しながら該筒体の軸方向に沿って摺動可能なように収容されたピストンとの組合せであって、筒体内に形成された圧送部内部空間１１１及び容器内空間１１０の体積をピストンの動きにより減少させることが可能なものが挙げられる。
【００４７】
図示する放出口周縁部１０５及び圧送部１０３は、処理試薬１０１が放出される方向に対し垂直な平面よる断面が円形であるが、該断面の形状は限定されず、四角形（正方形、長方形）、三角形、五角形等の多角形であってもよい。円形には、真円、楕円、真円が扁平した形状、楕円が変形した形状などが含まれる。多角形には角部が丸みを帯びた形状も含まれる。
【００４８】
処理試薬収容容器１００の放出口１０２を封止する蓋体１０４は、別途詳述する通り、核酸採取部材２００の処理試薬供給口に処理試薬収容容器１００を接続する際に、破壊されるように構成されている。蓋体１０４は合成樹脂を含むフィルムや、アルミニウムフィルムなどの金属フィルムにより構成することができ、複数種類のフィルムが積層されたものであってもよい。蓋体１０４は、放出口周縁部１０５の放出口１０２を囲う端部に接着剤や、熱や超音波による溶着等の手段により固着されることができる。
【００４９】
処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の外周面１０５１上には、１又は複数の、放出口周縁部１０５の周囲を全周にわたって囲うように周方向に延び、径方向外側に向け突出したリング状突起１０５３−１、１０５３−２を形成することが好ましい。リング状突起１０５３−１、１０５３−２の機能については後述する。処理試薬収容容器１００は、少なくともリング状突起１０５３−１、１０５３−２の部分が、圧縮変形可能な材料により構成されていることが好ましい。
【００５０】
検体中の核酸を遊離させる処理試薬１０１の組成については別途詳述する。
【００５１】
図２に示す核酸採取部材２００は、検体を収容するための収容空間２０３が形成されており、収容空間２０３の一方側において、処理試薬１０１が供給可能なように処理試薬収容容器１００に接続される処理試薬供給口２０４が形成されており、収容空間２０３の他方側において、後述する混合物４２１を透過しつつ混合物４２１中で遊離した核酸を吸着する担体２０５を介して混合物４２１を排出する混合物排出口２０６が形成されている。
【００５２】
核酸採取部材２００は、収容空間２０３の周囲を囲う周壁部２１０を備える。周壁部２１０のうち、処理試薬供給口２０４の周縁を規定する部分を処理試薬供給口周縁部２１１とし、混合物排出口２０６の周囲を規定する部分を混合物排出口周縁部２１３とする。図示する実施形態では、処理試薬供給口周縁部２１１と混合物排出口周縁部２１３とを接続する部分を周壁接続部２１２とするが、この形態には限定されず、周壁部２１０は、処理試薬供給口周縁部２１１と混合物排出口周縁部２１３とが連続した一様な径を有する筒体等の様々な形状であることができる。担体２０５は、混合物排出口２０６に配置され、収容空間２０３で形成された混合物４２１が混合物排出口２０６から排出される際は、担体２０５を透過するように構成されている。担体２０５は、担体２０５を挟んで収容空間２０３の内部と外部とで実質的な気圧差がない条件で、重力下において収容空間２０３に処理試薬１０１、混合物４２１又は後述する検体Ｓを収容したとき、処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓを実質的に透過しないように構成されている。ここで担体２０５が処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓを「実質的に透過しない」とは、完全に透過しない場合だけでなく、本発明の用途に支障がない程度であれば微量の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓが透過してもよいことを包含し、例えば前記条件において重力下での処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの透過速度が１０μＬ／秒未満であることが例示できる。
【００５３】
周壁部２１０と担体２０５とはどのように接続されていてもよいが、好ましくは、周壁部２１０と担体２０５とを切り離し可能なように接続されている。より好ましくは、図２に示すように、核酸採取部材２００が、周壁部２１０を備える検体受容部材２４０と、担体２０５及び担体２０５を保持する保持部２３０を備える担体保持部材２５０とを備え、検体受容部材２４０と担体保持部材２５０とが切り離し可能なように接続される。
【００５４】
ここで担体２０５を保持するための保持部２３０は、担体２０５を保持し且つ担体２０５を透過した混合物４２１を通す排出流路２５１の起点となる開口が形成された主保持部２３１と、主保持部２３１から起立し排出流路２５１の周囲を規定する流路周縁部２３２と、主保持部２３１の周縁から、流路周縁部２３２の存在する側とは反対側に起立した検体受容部材接続部２３３と、主保持部２３１の周縁から、流路周縁部２３２の存在する側に起立した排出物収容容器接続部２３４とを備える。担体２０５は保持部２３０に固定されていればよい。図示する例では主保持部２３１の一方の面上に担体２０５が配置され、検体受容部材接続部２３３の主保持部２３１の近傍の部分が担体２０５の周縁に乗り上げて担体２０５を把持し固定されるが、この態様には限定されない。また、担体２０５は保持部２３０と分離可能なように構成されていてもよい。
【００５５】
担体保持部材２５０の検体受容部材接続部２３３と、検体受容部材２４０の混合物排出口周縁部２１３とは、図示するように、一方が他方に嵌合して接続されるよう構成されていてもよいし、図示しないが、一方が他方に螺合して接続されるよう構成されていてもよい。
【００５６】
図３には、図２に断面を示す、周壁部２１０を備える検体受容部材２４０を、担体保持部材２５０から分離した状態の斜視図を示す。図示する実施形態に係る検体受容部材２４０は、周壁部２１０に加えて、周壁部２１０の外周面から外方向に張り出した張出部２４１と、張出部２４１の周縁から、周壁部２１０の、処理試薬供給口２０４が存在する側に向けて起立する混合物漏出防止壁部２４２とを更に備える。混合物漏出防止壁部２４２の端部２４２２は、処理試薬供給口周縁部２１１の処理試薬供給口２０４側の端部２１１２よりも混合物排出口２０６から離れた位置に位置するように突出して形成されていれば、後述する漏出防止効果が更に高くなるため好ましい。混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１上には、周方向に延び、径方向内側に向け突出した壁面上リング状突起２４２３が少なくとも１つ形成されていることが好ましい。壁面上リング状突起２４２３は、混合物漏出防止壁部２４２の開放側端２４２２の近傍に形成されていることが好ましい。
【００５７】
核酸採取部材２００は、他の実施形態では、周壁部２１０と担体２０５とを備えた１つの部材からなる（図示せず）。この実施形態の核酸採取部材２００においても、周壁部２１０は、図２、図３に示すのと同様の構造を有していてよく、周壁部２１０が、張出部２４１及び混合物漏出防止壁部２４２と組み合わされていることがより好ましい。
【００５８】
検体受容部材２４０の周壁部２１０の処理試薬供給口周縁部２１１のうち、処理試薬供給口２０４を囲う端部２１１２は、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを接続するときに、処理試薬収容容器１００の蓋体１０４に押し込まれて蓋体１０４を破壊し、開口することができる部分であることが好ましく、具体的には、前記端部は、蓋体１０４を破壊することができるよう鋭利な形状を少なくとも一部に有することが好ましい。図示する例では、処理試薬供給口周縁部２１１のうち処理試薬供給口２０４を囲う部分は、壁面の厚さが、開放された端部に近づくほど薄くなるように、すなわち鋭利に、構成されている。更に、処理試薬供給口周縁部２１１のうち処理試薬供給口２０４を囲う部分は、処理試薬収容容器１００が接続されることとなる側に向けて突出した突出部２１１３を少なくとも１つ含むことが好ましい。突出部２１１３は、突出方向に対し垂直な平面による断面が先端に近づくほど小さくなるように、すなわち鋭利に、形成されていることが好ましい。図示する例では突出部２１１３は１つのみであるが、複数形成されていてもよい。
【００５９】
処理試薬収容容器１００のうち放出口周縁部１０５と、核酸採取部材２００の周壁部２１０の処理試薬供給口周縁部２１１とは、図示するように、一方が他方に嵌合して接続されるよう構成されていてもよいし、図示しないが、一方が他方に螺合して接続されるよう構成されていてもよい。放出口周縁部１０５と処理試薬供給口周縁部２１１とは通常は、相互に嵌合又は螺合することができる筒体の形状を有する。より好ましくは、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とは、処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の内周面１０５２と、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１とが当接した状態で接続することができるように構成されている。特に好ましくは、放出口周縁部１０５の内周面１０５２と処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１とが、それらの間の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの通過、特に混合物４２１の通過を阻止するように当接しながら、放出口周縁部１０５と処理試薬供給口周縁部２１１とが嵌合又は螺合、好ましくは嵌合できるように構成されている。このとき、破壊された蓋体１０４の一部を間に介して、放出口周縁部１０５の内周面１０５２と処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１とが当接するように、放出口周縁部１０５と処理試薬供給口周縁部２１１とが嵌合又は螺合されてもよい。
【００６０】
また、放出口周縁部１０５の内周面１０５２と処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１とは、図示する実施形態のように直接当接することには限定されず、シール材を間に介して当接してもよい。シール材は、ゴム等の圧縮変形可能な材料により構成することができ、放出口周縁部１０５の内周面１０５２上の部分、及び、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１上の部分のうち少なくとも一方に固定することができる。
【００６１】
核酸採取部材２００が混合物漏出防止壁部２４２を有する実施形態では、好ましくは、周壁部２１０の処理試薬供給口周縁部２１１と、混合物漏出防止壁部２４２とは、それぞれ、相互に同軸的に配置された筒体の形状を有する。この実施形態では、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との距離は、処理試薬収容容器１００のリング状突起１０５３−１、１０５３−２の頂部の、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２からの距離より僅かに小さく構成されており、且つ、リング状突起１０５３−１、１０５３−２は圧縮変形が可能な材料により構成されていることが好ましい。該材料は好ましくは弾性を有する。この場合、後述する工程２において、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを接続するときに、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１とが対向し、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間で挟まれたリング状突起１０５３−１、１０５３−２が圧縮変形して、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの通過、特に混合物４２１の通過が阻止される。また、より好ましい実施形態では、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを接続するときに、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間で圧縮変形したリング状突起１０５３−１、１０５３−２を介して放出口周縁部１０５が処理試薬供給口周縁部２１１に向けて付勢され、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と放出口周縁部１０５の内周面１０５２との間の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの通過、特に混合物４２１の通過が阻止される。この実施形態では、放出口周縁部１０５が処理試薬供給口周縁部２１１に向けて付勢されたときに、放出口周縁部１０５の内周面１０５２が処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１に向け付勢されるように、放出口周縁部１０５は弾性変形可能な材料により形成されることが好ましい。
【００６２】
図示しない他の実施形態では、混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１上に配置された壁面上リング状突起２４２３が、前記のリング状突起１０５３−１、１０５３−２と同様の機能を有する。具体的には、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間の距離が、壁面上リング状突起２４２３の頂部の混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１からの距離（すなわち高さ）よりも僅かに小さく構成されており、且つ、壁面上リング状突起２４２３は圧縮変形が可能な材料により構成されている実施形態である。該材料は好ましくは弾性を有する。この実施形態では、図示する形態と異なり、壁面上リング状突起２４２３は、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１とが対向する位置に、１つ以上形成されていることが好ましい。この実施形態でも同様に、後述する工程２において、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを接続するときに、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間で挟まれた壁面上リング状突起２４２３が圧縮変形して、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの通過、特に混合物４２１の通過が阻止される。また、放出口周縁部１０５の外周面１０５１と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との間で圧縮変形した壁面上リング状突起２４２３を介して放出口周縁部１０５が処理試薬供給口周縁部２１１に向けて付勢され、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と放出口周縁部１０５の内周面１０５２との間の処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓの通過、特に混合物４２１の通過が阻止される。この場合も、放出口周縁部１０５は弾性変形可能な材料により形成されることが好ましい。
【００６３】
以下に、図４−１〜４−５を参照して、本発明の核酸分離方法について説明する。
【００６４】
図示するような排出物収容容器４００を用意する。排出物収容容器４００は、排出物供給口４０１が形成されている。排出物収容容器４００のうち、排出物供給口４０１の周縁を規定する部分を排出物供給口周縁部４０２とする。
【００６５】
図４−１に示すように、まず核酸採取部材２００と、排出物収容容器４００とを組み合わせる。図示する実施形態では、核酸採取部材２００の排出物収容容器接続部２３４と、排出物収容容器４００の排出物供給口周縁部４０２とを一方を他方に嵌合して接続する。図示しないが、一方が他方に螺合して接続できるように排出物収容容器接続部２３４と排出物供給口周縁部４０２とがそれぞれ構成されていてもよい。
【００６６】
次いで、核酸を含有する可能性のある検体Ｓを核酸採取部材２００の収容空間２０３に収容する工程１を行う。
【００６７】
工程１の後に、図４−２に示すように、核酸採取部材２００の処理試薬供給口２０４に処理試薬収容容器１００を接続して、処理試薬供給口２０４と、処理試薬収容容器１００の放出口１０２とを連通させる工程２を行う。このとき放出口１０２を封止していた蓋体１０４は、処理試薬供給口周縁部２１１の処理試薬供給口２０４を囲う端部２１１２により破壊され、放出口１０２が開放される。図示する実施形態では、処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５と、核酸採取部材２００の処理試薬供給口周縁部２１１とはともに筒体であって、放出口周縁部１０５の内径が、処理試薬供給口周縁部２１１の外径と略同じであるか、放出口周縁部１０５の内径が、処理試薬供給口周縁部２１１の外径よりも若干大きく構成されており、放出口周縁部１０５の内部に処理試薬供給口周縁部２１１が嵌合又は螺合により接続される。
【００６８】
図示する実施形態では更に、核酸採取部材２００が混合物漏出防止壁部２４２を有し、周壁部２１０の処理試薬供給口周縁部２１１と、混合物漏出防止壁部２４２とが、それぞれ、相互に同軸的に配置された筒体の形状を有する。この実施形態では、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１との距離は、処理試薬収容容器１００のリング状突起１０５３−１、１０５３−２の頂部の、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２からの距離より小さく構成されており、且つ、リング状突起１０５３−１、１０５３−２は圧縮変形が可能な材料により構成されている。この場合、核酸採取部材２００の混合物漏出防止壁部２４２の内側に処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５を嵌め合わせ、処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の内側に核酸採取部材２００の周壁部２１０の処理試薬供給口周縁部２１１を嵌め合わせて、処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の端部１０５４と核酸採取部材２００の張出部２４１とが当接するまで押し込むと、蓋体１０４が処理試薬供給口周縁部２１１の端部２１１２により破壊されるとともに、全周にわたり、処理試薬収容容器１００のリング状突起１０５３−１、１０５３−２の表面と混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１とが混合物４２１が漏れないように当接し、且つ、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２とが、混合物４２１が漏れないように当接することができる。この構成により、検体Ｓ、及び検体Ｓを含む混合物４２１に作業者が接触する危険性を低減することができる。本実施形態では、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２とが、破壊された蓋体１０４の一部を間に介して当接してもよい。
【００６９】
図示する実施形態では更に、処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の外周面１０５１に少なくとも１つのリング状突起１０５３−１、１０５３−２が形成されており、且つ、混合物漏出防止壁部２４２の内周面２４２１に少なくとも１つの壁面上リング状突起２４２３が形成されており、リング状突起１０５３−１、１０５３−２のうち１つ（図示する例では１０５３−２）と、壁面上リング状突起２４２３のうち１つとが、リング状突起１０５３−２のほうが壁面上リング状突起２４２３よりも張出部２４１寄りの位置となった状態で係合し、処理試薬収容容器１００の核酸採取部材２００からの脱落を防止することができるように構成されている。具体的には、混合物漏出防止壁部２４２に壁面上リング状突起２４２３が形成されており、且つ、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを、上記のように処理試薬収容容器１００の放出口周縁部１０５の端部１０５４と核酸採取部材２００の張出部２４１とが当接するまで押し込んで接続すると、リング状突起のうちの１つであるリング状突起１０５３−２と壁面上リング状突起２４２３とが、リング状突起１０５３−２のほうが壁面上リング状突起２４２３よりも張出部２４２３寄りの位置となった状態で係合し、処理試薬収容容器１００の核酸採取部材２００からの脱落を防止することができるように構成されている。この構成により、検体Ｓ、及び検体Ｓを含む混合物４２１に作業者が接触する危険性を更に低減することができる。
【００７０】
図示しない別の実施形態では、放出口周縁部１０５が弾性を有する材料により構成されており、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２とが、全周にわたり、混合物４２１が漏れないように当接するように構成してもよい。この場合、処理試薬供給口周縁部２１１の外周面２１１１と、放出口周縁部１０５の壁部の内周面１０５２とが、破壊された蓋体１０４の一部を間に介して当接してもよい。この実施形態では、処理試薬収容容器１００のリング状突起１０５３−１、１０５３−２を省略することもできる。
【００７１】
工程２では、処理試薬収容容器１００の容器内空間１１０と、核酸採取部材２００の収容空間２０３とが一体となって、混合用空間４２０が形成される。
【００７２】
次いで工程３では、工程２において形成された混合用空間４２０内で、検体Ｓと処理試薬１０１とが混合して混合物が形成され、混合物内で、検体Ｓに含まれ得る核酸が遊離する。検体Ｓと処理試薬１０１との混合物を混合物４２１とする。工程２での処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００との接続により混合用空間４２０内の気圧が排出物収容容器４００内の気圧よりも若干高くなることがあるが、核酸採取部材２００に含まれる担体２０５は、圧送部１０３を作動させない条件、すなわち容器内空間１１０及び混合用空間４２０の体積を減少させない条件では、混合用空間４２０内の混合物４２１を重力下において実質的に透過しないように構成されている。より好ましくは更に、後述するように工程３で混合物４２１を混合用空間４２０内で振り混ぜた場合でも担体２０５は混合物４２１を実質的に透過しない。ここで担体２０５が混合物４２１を「実質的に透過しない」とは、完全に透過しない場合だけでなく、本発明の用途に支障がない程度であれば微量の混合物４２１が透過してもよいことを包含し、例えば混合物４２１の透過速度が１０μＬ／秒未満であることが例示できる。核酸の十分な溶出のためには、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００と排出物収容容器４００とを図４−２に示す状態で接続したものの全体を手で十分に振り混ぜるなどして、混合用空間４２０内で混合物４２１を十分に撹拌することが好ましい。工程３は室温（２０〜３０℃程度）で行うことができ、混合後数分間例えば３〜７分間静置して核酸の遊離を進めることが好ましい。
【００７３】
次いで工程４を行う。工程４は、図４−３に示すように、工程３において遊離された核酸を含む混合物４２１を、処理試薬収容容器１００の圧送部１０３を作動させることにより、すなわち容器内空間１１０及び混合用空間４２０の体積を減少させることにより圧送し、核酸採取部材２００の混合物排出口２０６から担体２０５を介して排出する工程である。排出物収容容器４００と核酸採取部材２００とは完全に気密に接続されているわけではなく排出物収容容器４００内の空間は周辺大気と接続している。圧送部１０３を作動させる（図示する例では蛇腹構造の圧送部１０３を圧縮変形させて容器内空間１１０及び混合用空間４２０の体積を減少させる）ことにより混合用空間４２０内の気圧が高まると、混合物４２１は担体２０５を透過して混合物排出口２０６から排出流路２５１を通って排出物収容容器４００内に排出される。このとき、混合物４２１に遊離して存在する核酸は、担体２０５に吸着され、混合物４２１の他の成分は排出されて排出物収容容器４００に至る。図４−３では、工程４終了後の担体２０５を特に担体２０５’とし、工程４終了後の排出された混合物４２１を特に混合物４２１’とする。
【００７４】
工程４により担体２０５’に吸着された核酸を回収する工程を適宜行う。核酸の回収方法は特に限定されない。
【００７５】
典型的には、工程４の後に、洗浄液を用いて担体２０５’を洗浄し、担体から核酸以外の不要成分を除去する工程５を行う。工程５を行うための装置の構成の一例を図４−４に示す。図４−３で示した工程４の終了後の装置から、処理試薬収容容器１００及び検体受容部材２４０を取り外し、担体保持部材２５０及び排出物収容容器４００を残す。次いで図４−４に示すように、洗浄液収容容器４４０を、担体保持部材２５０に、適宜、連結部材４５０を介して接続する。洗浄液収容容器４４０は、洗浄液４４３を収容した容器であれば特に限定されないが、好ましくは圧送部４４１と、内部に洗浄液４４３の排出流路を形成する洗浄液排出首部４４２とを備える。圧送部４４１の具体的な形態や他の形態は処理試薬収容容器１００の圧送部１０３について上記したのと同様である。連結部材４５０は、洗浄液排出首部４４２と適合した形状の貫通孔が形成された連結部材本体４５１と、連結部材接続部４５２とを備える。洗浄液排出首部４４２と連結部材本体４５１の貫通孔とは、一方が他方に嵌合して接続されるよう構成されていてもよいし、一方が他方に螺合して接続されるよう構成されていてもよい。連結部材接続部４５２と、担体保持部材２５０の検体受容部材接続部２３３とは、一方が他方に嵌合して接続されるよう構成されていてもよいし、一方が他方に螺合して接続されるよう構成されていてもよい。工程５では、図４−４に示すように洗浄液収容容器４４０を、担体保持部材２５０に、連結部材４５０を介して接続した状態で、圧送部４４１を作動させて洗浄液４４３を圧送して担体２０５’に透過させ、核酸以外の不要成分を除去する。排出された液は、洗浄液収容容器４４０内の工程４での混合物４２１’と混合され、廃棄物として廃棄処理される。工程５において不要成分が洗浄除去された、核酸を含む担体を特に担体２０５’’とする。
【００７６】
工程５の後に、核酸を溶離させる溶離液を担体と接触させ、担体から核酸を溶離させる工程６を行うことが好ましい。工程６を行うための装置の構成の一例を図４−５示す。図４−４で示した装置を用いて工程５を行った後、排出物収容容器４００と、洗浄液収容容器４４０を取り外し、担体２０５’’を含む担体保持部材２５０及び連結部材４５０を残す。次いで核酸回収容器４７０を、担体保持部材２５０の排出流路２５１の下流に配置する。そして連結部材４５０に溶離液収容容器４６０を設置する。ここで溶離液収容容器４６０は、溶離液４６３を収容した容器であれば特に限定されないが、好ましくは圧送部４６１と、内部に溶離液４６３の排出流路を形成する溶離液排出首部４６２とを備える。圧送部４６１の具体的な形態や他の形態は処理試薬収容容器１００の圧送部１０３について上記したのと同様である。連結部材４５０の連結部材本体４５１に形成された貫通孔は、溶離液排出首部４６２とも適合した形状に構成されている。溶離液排出首部４６２と連結部材本体４５１の貫通孔とは、一方が他方に嵌合して接続されるよう構成されていてもよいし、一方が他方に螺合して接続されるよう構成されていてもよい。工程６では、図４−５に示すように溶離液収容容器４６０を、担体保持部材２５０に、連結部材４５０を介して接続した状態で、圧送部４６１を作動させて溶離液４６３を圧送して担体２０５’’に透過させ、担体２０５’’に吸着された核酸を溶離させる。排出された核酸含有液は核酸回収容器４７０に収容され、検体Ｓからの核酸抽出物として分析に用いることができる。
【００７７】
工程６により回収された核酸含有液は、好ましくは精製された核酸を含む。核酸の精製とは、検体に含まれる核酸を核酸以外の夾雑物から分離精製することを示し、精製度の目安としては、精製した核酸を用いてＰＣＲや等温核酸増幅法などの核酸増幅法、制限酵素処理、クローニング、塩基配列解析、サザンブロット、ノーザンブロット、ハイブリットキャプチャー解析、ラインプローブアッセイ、マイクロアレイ解析、電気泳動、質量分析、蛍光染色、色素染色、天然型あるいは非天然型核酸鎖同士の相補的結合を利用した解析などの分子生物学的解析を問題無く実施可能な程度である。
＜核酸を分離するための装置＞
本発明はまた核酸を含有する検体から核酸を分離する装置を提供する。
【００７８】
本発明の装置は好適には、上記方法に関して詳述した、処理試薬収容容器１００と核酸採取部材２００とを備える。本発明の装置は複数の構成要素を含むため「キット」と称することもできる。
【００７９】
本発明の装置は更に好ましくは、上記方法に関して詳述した、洗浄液収容容器４４０及び／又は溶離液収容容器４６０を更に備える。
【００８０】
本発明の装置は、必要に応じて、上記方法に関して詳述した、排出物収容容器４００、連結部材４５０及び核酸回収容器４７０から選択される１つ以上を更に含んでいてもよい。
【００８１】
本発明の装置、又は、本発明の装置に含まれる各要素は、核酸調製装置、核酸増幅装置、核酸自動解析装置などの構成要素の一部に組み込まれてもよい。
＜処理試薬＞
検体中の核酸を遊離させる処理試薬は、核酸を遊離させる成分を含み、好ましくは更に、微生物の感染性を低減する成分、及び、核酸の担体への吸着を促進する成分から選択される１種以上を含む。処理試薬は、前記成分として、或いは前記成分以外の成分として水や、有機溶媒等の液体媒体を含むことができる。
【００８２】
処理試薬は、図１〜４−４に示す実施形態では液体であるが、液体には限らず、固体であってもよい。例えば図５に示す処理試薬収容容器１００の実施形態では、処理試薬１０１が粉体、顆粒等の固体であり、その他の特徴は図１に示す処理試薬収容容器１００と同様である。
【００８３】
処理試薬及び検体のうち少なくとも１つが液体を含み、処理試薬と検体とが混合して形成される混合物が液体となることが好ましい。例えば、検体が尿、血液、飲料、河川水、海水等のような液体である場合は、処理試薬は粉体、顆粒等の固体であっても混合物は液体となり、検体が固体、又は、喀痰、鼻汁等の固体に近い性状である場合には、処理試薬として液体を用いることにより混合物を液体とすることができる。
【００８４】
微生物の感染性を低減する成分は、検体中に含まれ得る感染性微生物の感染性を低減することが可能な成分であり、一般的に殺菌剤、消毒薬として使用されるものが使用できる。微生物の感染性を低減する成分としては、例えば、有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも１種の成分が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、微生物の感染性を低減する成分としては、有機溶媒、グルタールアルデヒド、フタラール、過酢酸、ポビドンヨード、次亜塩素酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の成分（「第１群の成分」とする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、微生物の感染性を低減する成分の別の例としては、上記の、有機溶媒、アルデヒド系消毒剤、ヨウ素剤、塩素剤、過酢酸、オゾン、過酸化水素、メルブロミン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、界面活性剤、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも１種の成分のうち、前記第１群の成分を除く他の成分が例示でき、より具体的には、オゾン、過酸化水素、二酸化塩素、メルブロミン、グルコン酸クロルヘキシジン、乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジン、塩化セチルピリジニウム、ホルムアルデヒド、及び、アルカリ物質からなる群から選択される少なくとも１種の成分（「第２群の成分」とする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。乳酸6,9-ジアミノ-2-エトキシアクリジンは一水和物の形態のものを添加することができる。
【００８５】
有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール、フェノール、クレゾール等のフェノール類等が例示でき、複数種の有機溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。アルデヒド系消毒剤としては、グルタールアルデヒド、フタラール及びホルムアルデヒドから選択される１以上が例示できる。ヨウ素剤としては、ポビドンヨードが例示できる。塩素剤としては、次亜塩素酸塩及び二酸化塩素から選択される１以上が例示でき、ここで、次亜塩素酸塩としては次亜塩素酸ナトリウムが例示できる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種が例示できる。陽イオン性界面活性剤（逆性石けん）としては塩化ベンザルコニウム及び塩化セチルピリジニウムから選択される少なくとも１種が例示できる。両性イオン性界面活性剤（両性石けん）としては、グルコン酸クロルヘキシジンが例示できる。アルカリ物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、アンモニア、トリメチルアミン等の塩基性物質の他、炭酸ナトリウム等の塩基性を示す塩類が例示できる。本発明で用いる処理試薬における微生物の感染性を低減する成分の量は、検体中に含まれ得る微生物の感染性を低減できる有効量であることができる。微生物の感染性を低減する成分の処理試薬中での濃度及び量は、成分ごとに最適点は異なるが、当業者によれば容易に最適値を決定することができる。
【００８６】
本発明において核酸の「遊離」とは、検体中に存在する分離対象の核酸を、担体が吸着できる状態にすることを指し、例えば検体中で核酸が細胞やウイルス等の生体膜内に含まれた状態で存在する場合、生体膜を破壊して、核酸を生体膜外に遊離させて担体が吸着できる状態にすることを指す。
【００８７】
核酸を遊離させる成分としては、例えば、検体中の核酸を包む膜（細胞又はウイルスが有する生体膜等）を可溶化する効力を持つ成分が利用でき、アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種が例示できる。本発明で用いる処理試薬における核酸を遊離させる成分の量は、検体中に含まれ得る核酸を遊離させることができる有効量であることができる。
【００８８】
アルカリ物質は、微生物の感染性を低減する成分であるとともに、核酸を遊離させる成分でもある。核酸を遊離させる成分として有用なアルカリ物質は、微生物の感染性を低減する成分として有用なアルカリ物質として挙げた具体例と同様の範囲から選択することができる。
【００８９】
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種が例示できる。界面活性剤は、微生物の感染性を低減する成分であるとともに、核酸を遊離させる成分でもある。核酸を遊離させる成分として有用な界面活性剤は、微生物の感染性を低減する成分として有用な界面活性剤として挙げた具体例と同様の範囲から選択することができる。
【００９０】
核酸の担体への吸着を促進する成分としては、有機溶媒やカオトロピック剤が例示できる。
【００９１】
核酸の担体への吸着を促進する成分として有用な有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコールや、フェノール、クロロホルムが例示でき、複数種の有機溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。カオトロピック剤としては、グアニジン塩（例えば、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、グアニジン塩酸塩等から選択される１種以上）、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム及びトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種が例示され、より好ましくはグアニジン塩、尿素及びヨウ化ナトリウムから選択される１種であり、最も好ましくはグアニジン塩である。これらのカオトロピック剤は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。また、カオトロピック剤は、核酸の核酸吸着性担体への吸着を促進するだけでなく、タンパク質変性剤としても働き、核酸の抽出にも作用する。核酸の担体への吸着を促進する成分の量は、核酸の担体への吸着を促進するために十分量であれば良く、当業者によれば容易に最適値を決定することができるが、一例として、核酸の担体への吸着を促進する成分が有機溶剤であれば、処理試薬の全量に対して２０重量％以上、好ましくは４０重量％以上となる量であり、核酸の担体への吸着を促進する成分がカオトロピック剤であれば、検体と混合した時の混合物中での終濃度が０．１Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上、さらに好ましくは１Ｍ以上となる量である。
【００９２】
本発明で用いる処理試薬が、検体に含まれ得る病原性微生物の感染性を低減し、かつ検体中の核酸を遊離させ、かつ核酸吸着性担体に核酸を吸着させるという３つの効力を併せ持つためには、先述の成分を複数組み合わせて使用することが好ましい。また、１つの物質が複数の機能を有する場合がある。例えば、アルコール等の有機溶剤は、微生物の感染性を低減する成分としての機能と、核酸の担体への吸着を促進する成分としての機能を併せ持つ。複数の機能を有する成分を処理試薬中に配合してもよい。
【００９３】
本発明で用いる処理試薬は、好ましくは、微生物の感染性を低減する成分と、核酸を遊離させる成分とを含む。各成分については既述の通りである。微生物の感染性を低減する成分と核酸を遊離させる成分としては、それぞれ別の物質である必要はなく、２つの成分として機能する物質を１種以上用いてもよい。アルカリ物質及び界面活性剤は、上記の通り、微生物の感染性を低減し且つ核酸を遊離させる成分である。従って、本発明で用いる処理試薬は、微生物の感染性を低減し且つ核酸を遊離させる成分として、アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことができ、より好ましくは、前記少なくとも１種以外に、微生物の感染性を低減する成分を更に含む。本発明で用いる処理試薬における、アルカリ物質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の量は、微生物の感染性を低減することができ且つ核酸を遊離させることができる有効量であることができる。具体的には、アルカリ物質の濃度としては、処理試薬全量に対して０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは２重量％よりも大きく、更に好ましくは３重量％以上であり、更に好ましくは４重量％以上である。上限は特に限定されないが、２０重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましい。界面活性剤の濃度としては、処理試薬全量に対して、好ましくは０．０５重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上、好ましくは５重量％以下、より好ましくは２重量％以下が挙げられる。
【００９４】
本発明で用いる処理試薬は、一体の成分として処理試薬収容容器１００の容器内空間１１０に収容されている必要はなく、複数の分離した成分として収容されていてもよい。この場合、容器内空間１１０は複数の区画に分割され、各区画に１種以上の処理試薬が収容されることができる。例えば図６に示す処理試薬収容容器１００の実施形態では、放出口周縁部１０５の、放出口１０２の側の端と、圧送部１０３と接続する側の端との間の位置に、隔壁６００が設けられており、隔壁６００は、放出口近傍空間１１２を、放出口近傍空間放出口側部分１１２（１）と、放出口近傍空間圧送部側部分１１２（２）とに区切り、これによって、容器内空間１１０を、放出口近傍空間放出口側部分１１２（１）と、圧送部内部空間１１１及び放出口近傍空間圧送部側部分１１２（２）が一体となった空間とに分割する。この実施形態では処理試薬は第１処理試薬１０１（１）と第２処理試薬１０１（２）とを含み、第１処理試薬１０１（１）は、放出口近傍空間放出口側部分１１２（１）に収容され、第２処理試薬１０１（２）は、圧送部内部空間１１１及び放出口近傍空間圧送部側部分１１２（２）が一体となった空間に収容される。図６に示す実施形態では、第１処理試薬１０１（１）が粉体、顆粒等の固体であり、第２処理試薬１０１（２）が液体であるが、この態様には限定されず、例えば第１処理試薬１０１（１）と第２処理試薬１０１（２）とが共に固体であってもよいし、共に液体であってもよい。また処理試薬は３種以上の成分からなってもよく、その場合も各成分は液体、固体等の任意の形状をとることができる。容器内空間１１０を区切る隔壁６００は、蓋体１０４と同様に、核酸採取部材２００の処理試薬供給口２０４に処理試薬収容容器１００を接続する際に、破壊されるように構成されている。隔壁６００は、蓋体１０４と同様に、合成樹脂を含むフィルムや、アルミニウムフィルムなどの金属フィルムにより構成することができ、複数種類のフィルムが積層されたものであってもよい。隔壁６００は、放出口周縁部１０５の内周面１０５２に、接着剤や、熱や超音波による溶着等の手段により適宜固着して固定することができる。
【００９５】
本発明で用いる処理試薬中の成分の好ましい組み合わせとしては、アルコールとアルカリ物質との組み合わせが挙げられ、前述の３つの効力を増強するためにカオトロピック剤、界面活性剤及び消毒薬からなる群から選択される少なくとも１種の成分や、前記の還元剤を追加してもよい。水等の液体媒体を更に含んでもよい。アルコールとしてはメタノール、エタノール及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、アルカリ物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム及び水酸化カルシウムからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。より好ましくは、エタノールと水酸化ナトリウムの組み合わせである。本発明で用いる処理試薬がアルコールとアルカリ物質とを含む場合、それぞれの濃度は当業者が適宜決定することができるが、一例としては、アルコールの濃度としては、処理試薬全量に対して２０重量％以上が好ましく、４０重量％以上がより好ましく、上限は特に限定されないが、９９重量％以下が好ましく、８０重量％以下がより好ましい。これらのアルコールの濃度は処理試薬が液体である場合に特に好ましい。アルカリ物質の濃度としては、処理試薬全量に対して０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは２重量％以上である。上限は特に限定されないが、２０重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましい。これらのアルカリ物質の濃度は処理試薬が液体である場合に特に好ましい。
【００９６】
本発明で用いる処理試薬がカオトロピック剤を含む場合、カオトロピック剤の量は検体と混合した時の終濃度が０．１Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上となる量である。カオトロピック剤の終濃度の上限は特に限定されないが、１０Ｍ以下が好ましく、より好ましくは５Ｍ以下となる量がより好ましい。
【００９７】
検体が喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む粘性の高い検体である場合、処理試薬中に還元剤、好ましくはチオール系還元剤、特に好ましくはＮ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｌ−システインエチルエステル、Ｌ−システインメチルエステル、Ｎ−エチル−Ｌ−システイン、Ｎ−メチル−Ｌ−システイン等のシステイン系還元剤を配合して、検体中のＳ−Ｓ結合を切断し流動性を向上させることが好ましい。これらの還元剤は塩の形態であってよいことは既述の通りである。処理試薬中での還元剤の濃度としては、０．５重量％以上が好ましく、より好ましくは２重量％以上である。上限は特に限定されないが、１５重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましい。これらの還元剤の濃度は処理試薬が液体である場合に特に好ましい。
＜核酸＞
本発明における核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡといったデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドの重合体が例示される。核酸の起源は特に限定されず、真核生物、細菌、アーキア、ウイルス、ウイロイド、人工合成物などに由来する核酸であってよい。
＜核酸を含有する検体＞
本発明に用いることができる検体は核酸を含有する検体（核酸を含有している可能性のある検体も包含する）であれば特に限定されない。核酸を含有する検体としては例えば生体試料、飲食物、河川水、海水等が挙げられる。生体試料はヒト等の動物に由来するものであってもよいし、植物に由来するものであってもよいし、微生物に由来するものであってもよい。生体試料としては血液、尿、糞便、喀痰、唾液、鼻汁、拭い液等が挙げられる。
【００９８】
本発明は特に、感染性微生物を含む検体（感染性微生物を含む可能性のある検体も包含する）に対して好適に用いることができる。感染性微生物は感染症の原因となり得る。このような検体としては、感染症に罹患した又は罹患した可能性のある動植物に由来する生体試料や、感染性微生物に汚染された又は汚染された可能性のある飲食物、河川水や海水などが挙げられる。
【００９９】
本発明において分離しようとする検体中の核酸は、検体中の感染性微生物に由来する核酸には限らず、検体中の他の細胞、例えばヒト細胞又は他の動物の細胞、に由来する核酸であってもよい。
＜感染性微生物＞
本発明における感染性微生物とは、他の生物に感染して宿主に感染症を起こす性質や能力を有する微生物のことを指し、例えば、梅毒トリポネーマやボレリアなどのスピロヘータ、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、抗酸菌（結核菌等）、破傷風菌、大腸菌などの病原性細菌や、病原性真菌などが挙げられる。感染性微生物としては更に、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオウイルスなどのウイルスも例示できる。すなわち、本明細書において「微生物」という用語の範囲にはウイルスも含まれる。
＜核酸を吸着する担体＞
本発明における核酸を吸着する担体（以下「核酸吸着性担体」という場合がある）とは、処理試薬と検体との混合物の存在下において、遊離した核酸を吸着することが可能な核酸吸着性担体を指す。
【０１００】
担体としては、シリカ等の無機核酸吸着性担体、樹脂、不溶性多糖等の有機核酸吸着性担体が例示されるがこれに限定されない。これらの核酸吸着性担体は粉末状、繊維状、多孔質状であっても良く、磁性を帯びていても良く、任意の修飾をされていても良い。核酸吸着性担体はカラム状、メンブレン状等の形状に成形されたものを用いることができる。メンブレン状の核酸吸着性担体の厚さは特に限定されないが、好ましくは１．０ｍｍ〜１．５ｍｍである。メンブレン状の核酸吸着性担体の平面視形状は特に限定されないが、好ましくは直径１ｍｍ〜１０ｍｍの円形である。多孔質状の核酸吸着性担体としては、例えば、モノリス構造の多孔質担体が例示でき、特に好ましくはモノリス型シリカである。モノリス型シリカとしては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真から求めたスルーポア径の平均値が５〜５０μｍ、より好ましくは５〜４０μｍの範囲のモノリス型シリカが特に好ましい。
【０１０１】
核酸吸着性担体は、担体２０５に関して詳述した通り、核酸吸着性担体により区切られる２つの空間に実質的な気圧差がない条件下では、核酸吸着性担体の前記２つの空間の一方の側に配置された処理試薬１０１、混合物４２１又は検体Ｓを重力下において実質的に透過しない形態のものであることが好ましい。「実質的に透過しない」の意図は担体２０５に関して既述の通りである。
＜洗浄液＞
本発明に用いる洗浄液は、核酸が吸着した核酸吸着性担体に残存する可溶化試薬や試料由来の夾雑物を洗浄できるものであれば良く、核酸が溶解しない有機溶媒や水溶性高分子溶液、糖水溶液が例示されるがこれに限定されない。
【０１０２】
洗浄液として用いることができる有機溶媒としてはエタノール、イソプロパノール、アセトンなどが挙げられる。有機溶媒として水溶性有機溶媒を用いる場合、有機溶媒の水溶液を用いることができ、その濃度は当業者によれば容易に最適値を決定することができるが、一例として２０〜１００重量％、好ましくは３０〜９０重量％、より好ましくは４０％〜８０重量％が挙げられる。
＜溶離液＞
本発明に用いる溶離液は、核酸吸着性担体に吸着された核酸を溶離させることが可能な液体であれば特に限定されない。溶離液としては水、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液等が挙げられる。溶離液には溶離液としての機能を阻害しない限り、またＰＣＲ反応を阻害しない限り、ｐＨ緩衝性成分、塩等の成分が含まれていてもよい。
＜本発明の装置の各要素を構成する材料＞
本発明の装置の各要素を構成する材料は、一般的に液体を保存する容器に使用することができる材料を用いればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフラート、ポリ塩化ビニル、テフロン（登録商標）、アクリロニトリルブタジエンスチレン、アクリルなどの合成樹脂が挙げられる。また、ガラスや金属といった一般的に液体を保存する容器に使用されている材料であってもよい。これらの中から複数を組み合わせて使用することも可能である。経済性の観点から好ましくは合成樹脂である。
＜本発明の処理試薬の好ましい実施形態＞
喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体中の核酸を遊離させるための処理試薬の好適な実施形態は、微生物の感染性を低減する前記成分と、核酸を遊離させる前記成分に加えて、更にチオール系還元剤を含む処理試薬である。本実施形態の処理試薬は、喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるために特に好適に用いることができる。チオール系還元剤としてはＮ−アセチル−Ｌ−システインが好ましい。本実施形態の処理試薬におけるチオール系還元剤の濃度は上記の通りである。処理試薬は、好ましくは、微生物の感染性を低減する前記成分と、核酸を遊離させる前記成分と、チオール系還元剤とが水中に溶解した水溶液である。微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分として、微生物の感染性を低減し且つ核酸を遊離させる成分を用いてもよい。処理試薬はより好ましくは、処理試薬全量に対して、０．５重量％以上のチオール系還元剤を含む水溶液であり、該濃度の更に好ましい範囲は上記の通りである。本実施形態の処理試薬は、上記の他の成分を更に含んでもよい。他の成分としてはカオトロピック剤が好ましく、カオトロピック剤の量は検体と混合した時の終濃度が上記の範囲となる量であることが好ましい。
【０１０３】
本実施形態の処理試薬は、より好ましくはアルカリ物質とチオール系還元剤とを含み、特に好ましくはアルコールを更に含む。本実施形態の処理試薬は、喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体中の核酸を遊離させ、シリカを含む担体に吸着させるために特に好適に用いることができる。各成分の具体例は上記の通りであり、特に、アルカリ物質としては水酸化ナトリウムが好ましく、チオール系還元剤としてはＮ−アセチル−Ｌ−システインが好ましく、アルコールとしてはエタノールが好ましい。本実施形態の処理試薬において、チオール系還元剤の濃度は上記の通りである。本実施形態の処理試薬において、アルカリ物質の濃度としては、処理試薬全量に対して０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは２重量％よりも大きく、更に好ましくは３重量％以上であり、更に好ましくは４重量％以上である。上限は特に限定されないが、２０重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましい。これらのアルカリ物質の濃度は処理試薬が液体である場合に特に好ましい。本実施形態の処理試薬がアルコールを更に含む場合、アルコールの濃度としては、処理試薬全量に対して２０重量％以上が好ましく、４０重量％以上がより好ましく、上限は特に限定されないが、９９重量％以下が好ましく、８０重量％以下がより好ましい。これらのアルコールの濃度は処理試薬が液体である場合に特に好ましい。本実施形態の処理試薬はより好ましくは、処理試薬全量に対して、０．１重量％以上のアルカリ物質、及び、０．５重量％以上のチオール系還元剤を含む水溶液であり、より好ましくは、処理試薬全量に対して２０重量％以上のアルコールを更に含む水溶液である。各成分の濃度の更に好ましい範囲は上記の通りである。本実施形態の処理試薬は、上記の他の成分を更に含んでもよい。他の成分としてはカオトロピック剤が好ましく、カオトロピック剤の量は検体と混合した時の終濃度が上記の範囲となる量であることが好ましい。
【０１０４】
微生物の感染性を低減する前記成分と、核酸を遊離させる前記成分と、チオール系還元剤とを含む本実施形態の処理試薬は、（１）喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む粘性の高い検体の粘性を低下させる；（２）シリカへの核酸の吸着を促進する；（３）殺菌する；（４）検体中の微生物又は他の細胞（例えば検体中のヒト細胞）から核酸を抽出する、という４つの効果を同時に奏することができる。このため、本実施形態の処理試薬は、喀痰等の粘性の高い検体から、微生物又は他の細胞由来の核酸を分離する場合に、本実施形態の処理試薬と検体とを混合して形成された混合物を、シリカを含む担体に接触させるだけでよく、操作が簡便である。本実施形態の処理試薬を用いれば、検体の粘性を低減させるための前処理と、核酸を抽出する処理を別の工程として行う必要がない。また、前記混合物中に遊離した核酸をシリカに吸着させて回収する方法では、シリカへの吸着により核酸が濃縮されるため、核酸の回収効率が高い。核酸と不純物とを含む試料から核酸を回収する方法として、従来から、核酸と不純物とを含む試料をゼオライトに通して不純物をゼオライトに吸着させ除去し、ゼオライトを通過した核酸を回収する方法が知られているが、この方法では核酸は濃縮されないため、核酸の回収効率が低い。また、従来、喀痰検体の粘性を低減させる検体の処理方法として、ＮＡＬＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）−ＮａＯＨ法が知られているが、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法は処理後の検体を培養試験や塗抹試験に用いるための方法であるため、上記（３）と（４）の効果を奏するものではない。従来は、喀痰等の粘性の高い検体中の微生物を核酸検査する方法は、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法により検体の粘度を低減させる工程と、検体中の核酸を加熱抽出等により抽出する工程とを含み、操作が非常に煩雑であった。
【０１０５】
また、本実施形態の処理試薬で検体を処理して該検体中の核酸を遊離させた混合物を核酸吸着性担体と接触させ、前記担体に核酸を吸着させて回収する方法は、核酸を濃縮させる効果を持ち、核酸の回収効率が高い。このことは、特に核酸濃度（菌濃度）の低い検体からの核酸抽出において効果を発揮し、従来法（ゼオライトを用いる方法およびＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法）に拠る前処理では核酸増幅法で検出不可能な検体からも、検出可能な濃度の核酸を濃縮して抽出回収することが可能となる。  また、前記担体に核酸を吸着させて回収する方法では、前記担体に核酸を吸着させた後に、核酸を溶出しない物質を用いて前記担体を洗浄することが可能であり、この場合、核酸以外の不純物を除去できる。核酸以外の不純物、例えばタンパク質や脂質、多糖類などは、核酸増幅反応に悪影響をおよぼすことが知られており、特に、検体中の増幅対象の核酸が微量の場合は増幅阻害により、検出感度以下の増幅量にとどまる場合も考えられる。従って、不純物を除去することで、核酸増幅法の検出能力を向上させることが可能となる。
＜本発明の核酸の分離方法の好ましい実施形態＞
本発明の他の実施形態は、
核酸を含有し、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体から核酸を分離する方法であって、
微生物の感染性を低減する前記成分、核酸を遊離させる前記成分、及び、チオール系還元剤を含む処理試薬と前記検体との混合物の存在下において、前記検体から遊離した核酸を担体に吸着させること
を含む方法に関する。
【０１０６】
微生物の感染性を低減する前記成分及び核酸を遊離させる前記成分として、微生物の感染性を低減し且つ核酸を遊離させる成分を用いてもよい。
【０１０７】
喀痰等の、Ｓ−Ｓ結合により架橋した成分を含む検体は、粘性が高く流動性が低いことが通常であるが、チオール系還元剤を含む前記処理試薬を前記検体と混合することにより、流動性を高めることができる。また、前記処理試薬と前記検体との混合物中では、検体の感染性が低減され、核酸の遊離が促進され、前記混合物を担体に接触させることにより、前記混合物中における前記検体から遊離した核酸が担体に吸着される。
【０１０８】
本実施形態の方法では、上記の通り、前記混合物中で検体から遊離した核酸が前記担体により吸着され濃縮されるため核酸の回収効率が高く、従来法では核酸濃度が低く核酸を回収不能な検体からも核酸を回収することができる。
【０１０９】
前記混合物は、前記検体からの核酸を十分に遊離させるために、混合後数分間例えば３〜７分間経過させてから、前記担体と接触させることが好ましい。前記混合物と前記担体との接触は室温、例えば２０〜３０℃の温度条件で行うことができる。
【０１１０】
本実施形態の方法において担体はシリカを含むことが好ましい。シリカを含む担体の具体的な態様は上記の＜核酸を吸着する担体＞の欄に記載の通りである。シリカを含む担体は通液性が比較的高いため、前記混合物を、手作業で発生させることができる小さな圧力差により透過させることが容易である。このため、前記混合物を前記担体に接触させながら手作業で通液させることが可能である。
【０１１１】
本実施形態の方法では、前記担体に核酸を吸着させた後、前記担体から核酸を回収する方法は特に限定されない。例えば、前記担体に核酸を吸着させた後、核酸を吸着させた前記担体を洗浄液により洗浄し、その後に、核酸を溶離させる溶離液を前記担体と接触させ、前記担体から核酸を溶出させ回収することができる。前記洗浄液及び前記溶離液の具体的な態様については、上記の＜洗浄液＞の欄及び＜溶離液＞の欄に記載の通りである。
【０１１２】
本実施形態の方法で用いる、微生物の感染性を低減する前記成分、核酸を遊離させる前記成分、及び、チオール系還元剤を含む処理試薬の具体的な態様については既述の通りである。該処理試薬は、より好ましくは、アルコールと、アルカリ物質と、チオール系還元剤とを含む。
【０１１３】
本実施形態の方法は、本発明の装置に含まれる形態の前記担体を用いて前記検体から核酸を分離する方法と、本発明の装置に含まれない形態の前記担体を用いて前記検体から核酸を分離する方法の両方を包含する。ここで「本発明の装置」とは、本願特許請求の範囲及び明細書に記載の、
「核酸を含有する検体と、検体中の核酸を遊離させる処理試薬との混合物を、核酸を吸着する担体と接触させることにより、核酸を含有する検体から核酸を分離する装置であって、
検体中の核酸を遊離させる処理試薬が容器内空間に収容されており、前記処理試薬を放出する放出口を有する、容器内空間の体積が減少可能なように構成された処理試薬収容容器と、
検体を収容するための収容空間が形成されており、前記収容空間の一方側において、処理試薬が供給可能なように前記処理試薬収容容器に接続される処理試薬供給口が形成されており、前記収容空間の他方側において、前記混合物を透過しつつ前記混合物中で遊離した核酸を吸着する担体を介して前記混合物を排出する混合物排出口が形成されている核酸採取部材と、を備え、
前記処理試薬収容容器の放出口には、前記放出口を封止する蓋体が取り付けられており、
前記核酸採取部材は、前記核酸採取部材の処理試薬供給口に前記処理試薬収容容器を接続する際に、前記蓋体による前記放出口の封止を開放し、前記放出口と前記処理試薬供給口とを連通するように構成されている装置」又はその好ましい実施形態を指す。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
図示するような処理試薬収容容器１００と、核酸採取部材２００と、排出物収容容器４００と、洗浄液収容容器４４０と、連結部材４５０と、溶離液収容容器４６０と、核酸回収容器４７０とを用いて以下の操作を行った。核酸採取部材２００は、図２に示すように検体受容部材２４０と担体保持部材２５０とを組み合わせたものである。担体保持部材２５０は、担体２０５として、円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体（膜厚１．５ｍｍ、口径４ｍｍ、スルーポア径３０〜４０μｍ（測定法：走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値））を備える。ただし溶離液収容容器４６０としては、図４−５に示す形態とは異なり、圧送部４６１が、押し潰すことにより、圧送部内部空間１１１及び容器内空間１１０の体積が減少するように変形可能な袋体からなるものを用いた。
（核酸の抽出）
図４−１に示すように核酸採取部材２００を排出物収容容器４００に接続し、抗酸菌の一種であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の培養液（１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）を検体Ｓとして、検体３ｍＬを核酸採取部材２００の収容空間２０３に入れた。次いで図４−２に示すように、５重量％の水酸化ナトリウムと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが処理試薬１０１として封入された処理試薬収容容器１００を核酸採取部材２００に接続した。次いで、検体Ｓと処理試薬１０１との混合物４２１を混合用空間４２０内で、装置の全体を１０回上下に振り混ぜることにより混合した後、室温条件で５分間静置した。【０１１５】
図４−３に示すように処理試薬収容容器１００の蛇腹構造の圧送部１０３を押し潰して、混合物４２１を担体２０５に通液させた。核酸が吸着された未洗浄の担体２０５を担体２０５’とする。処理試薬収容容器１００と、核酸採取部材２００の検体受容部材２４０とを同時に取り外した。次に図４−４に示すように、４０重量％エタノール水溶液１５ｍＬが洗浄液４４３として封入された洗浄液収容容器４４０を、連結部材４５０を介して担体保持部材２５０に接続した。そして洗浄液収容容器４４０の蛇腹構造の圧送部４４１を押し潰して、洗浄液４４３を担体２０５’に通液させた。その後、圧送部４４１が元の形状に復帰するのを待ち、再度圧送部４４１を押し潰して、洗浄液収容容器４４０内の空気を担体２０５’に通気させた。核酸が吸着された洗浄後の担体２０５を担体２０５’’とする。洗浄液収容容器４４０を取り外し、図４−５に示すように、溶離液４６３として水が封入された溶離液収容容器４６０を連結部材４５０を介して担体保持部材２５０に接続するとともに、排出物収容容器４００を取り外して核酸回収容器４７０を担体保持部材２５０に接続した。そして溶離液収容容器４６０の圧送部４６１を構成する前記袋体を押し潰して、溶離液４６３を担体２０５’’に通液させ、核酸回収容器４７０内に回収した。担体２０５’’を透過した溶離液４６３の１０μＬを採取し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２］
検体ＳとしてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの培養液（１．０×１０４ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例３］
検体ＳとしてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例４］
洗浄液４４３として６０重量％エタノール水溶液１５ｍＬが封入された洗浄液収容容器４４０を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例５］
洗浄液４４３として２０重量％エタノール水溶液１５ｍＬが封入された洗浄液収容容器４４０を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例６］
処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと６０重量％のエタノールを含む水溶液３ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例７］
処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと６０重量％のエタノールを含む水溶液１５ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例８］
処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウム、３０重量％のヨウ化ナトリウム（検体と混合したときの終濃度がおおよそ１．３Ｍ）、及び６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例９］
処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウム、２０重量％のヨウ化ナトリウム（検体と混合したときの終濃度がおおよそ０．８Ｍ）、及び６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１０］
処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウム、２０重量％の尿素（検体と混合したときの終濃度がおおよそ２．１Ｍ）、及び６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１１］
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚１．０ｍｍ、口径４ｍｍ、スルーポア径３０〜４０μｍ（測定法：走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値）のものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１２］
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚１．５ｍｍ、口径１０ｍｍ、スルーポア径３０〜４０μｍ（測定法：走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値）のものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１３］
円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体として、膜厚１．０ｍｍ、口径４ｍｍ、スルーポア径５〜１０μｍ（測定法：走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値）のものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。【０１１６】
実施例１〜１３における、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの核酸を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、フォワードプライマー／５’−ＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡ−３’）（配列番号１）、リバースプライマー／（５’−ＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号２）を用いた。リアルタイムＰＣＲ試薬はタカラバイオ社製ポリメラーゼＴＡＫＡＲＡ  ＴａｑＨＳを用い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を終濃度にて１／２００００希釈となるように添加し行った。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９８℃／１分の後、９８℃／１０秒→６０℃／１０秒→７２℃／１０秒のＰＣＲサイクルを４０サイクル行い、核酸増幅反応をモニタリングした。
［実施例１４］
図示するような処理試薬収容容器１００と、核酸採取部材２００と、排出物収容容器４００と、洗浄液収容容器４４０と、連結部材４５０と、溶離液収容容器４６０と、核酸回収容器４７０とを用いて以下の操作を行った。核酸採取部材２００は、図２に示すように検体受容部材２４０と担体保持部材２５０とを組み合わせたものである。担体保持部材２５０は、担体２０５として、円形でメンブレン状のシリカモノリスからなる核酸吸着能を持つ担体（膜厚１．５ｍｍ、口径４ｍｍ、スルーポア径３０〜４０μｍ（測定法：走査型電子顕微鏡画像から算出した平均値）を備える。ただし溶離液収容容器４６０としては、図４−５に示す形態とは異なり、圧送部４６１が、押し潰すことにより、圧送部内部空間１１１及び容器内空間１１０の体積が減少するように変形可能な袋体からなるものを用いた。【０１１７】
図４−１に示すように核酸採取部材２００を排出物収容容器４００に接続し、結核菌の一種であるＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０４ＣＦＵ／ｍＬ）を検体Ｓとして、検体３ｍＬを核酸採取部材２００の収容空間２０３に入れた。次いで図４−２に示すように、５重量％の水酸化ナトリウムと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが処理試薬１０１として封入された処理試薬収容容器１００を核酸採取部材２００に接続した。次いで、検体Ｓと処理試薬１０１との混合物４２１を混合用空間４２０内で、装置の全体を１０回上下に振り混ぜることにより混合した後、室温条件で５分間静置した。【０１１８】
図４−３に示すように処理試薬収容容器１００の蛇腹構造の圧送部１０３を押し潰して、混合物４２１を担体２０５に通液させた。核酸が吸着された未洗浄の担体２０５を担体２０５’とする。処理試薬収容容器１００と、核酸採取部材２００の検体受容部材２４０とを同時に取り外した。次に図４−４に示すように、４０重量％エタノール水溶液１５ｍＬが洗浄液４４３として封入された洗浄液収容容器４４０を、連結部材４５０を介して担体保持部材２５０に接続した。そして洗浄液収容容器４４０の蛇腹構造の圧送部４４１を押し潰して、洗浄液４４３を担体２０５’に通液させた。その後、圧送部４４１が元の形状に復帰するのを待ち、再度圧送部４４１を押し潰して、洗浄液収容容器４４０内の空気を担体２０５’に通気させた。核酸が吸着された洗浄後の担体２０５を担体２０５’’とする。洗浄液収容容器４４０を取り外し、図４−５に示すように、溶離液４６３として水が封入された溶離液収容容器４６０を連結部材４５０を介して担体保持部材２５０に接続するとともに、排出物収容容器４００を取り外して核酸回収容器４７０を担体保持部材２５０に接続した。そして溶離液収容容器４６０の圧送部４６１を構成する前記袋体を押し潰して、溶離液４６３を担体２０５’’に通液させ、核酸回収容器４７０内に回収した。担体２０５’’を透過した溶離液４６３の１０μＬを採取し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．Ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１５］
検体ＳとしてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１６］
検体ＳとしてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（５．０×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１７］
検体ＳとしてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（２．５×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１８］
検体ＳとしてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（５．０×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）に、豚由来ムチンを２０重量％となるように加えた粘稠な溶液を用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容容器１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例１９］
検体Ｓとしてグラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は、実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｅ．Ｃｏｌｉの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２０］
検体Ｓとしてグラム陽性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は、実施例１４と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２１］
（殺菌効力の試験）
本実施例では、核酸分離装置に用いる処理試薬のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ＢＣＧ）に対する殺菌効力を評価した。
＜菌液の調製＞
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、抗酸菌増菌用液体培地（極東製薬工業社製）を用いて３７℃で二週間培養した。培養した菌液をポアサイズが５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｋ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）でろ過し不要な菌塊を除いた。本ろ過液を吸光度５３０ｎｍにて測定し、ろ過液のＯ．Ｄ．が０．１になっているのを確認した。本ろ過液を、１ｍｌ中に１０の７乗個相当の菌が含まれている菌液として後述する殺菌効力評価に用いた。【０１１９】
また、上述した菌液とブタ胃由来ムチン粉末（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を混ぜ合わせムチン濃度を２０重量％に調製した溶液を調製した。本溶液を、流動性を喀痰に似せたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ擬似喀痰として後述する殺菌効力評価に用いた。【０１２０】
ＢＣＧもＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓと同様の液体培地で三週間培養し、上述したＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌液および擬似喀痰と同様の調製法で、殺菌効力評価に用いるＢＣＧ菌液およびＢＣＧ擬似喀痰を調製した。
＜処理試薬の調製＞
本評価に用いる処理試薬として、エタノール（ＥｔＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の二成分を混ぜた組成、これら二成分にＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）の三成分を混ぜた組成、これら三成分にグルタールアルデヒドを混ぜた組成を調製した。またポジティブコントロール（ＰＣ）としてフェノール溶液を、ネガティブコントロール（ＮＣ）として生理食塩水を設定した。本評価に用いた処理試薬の組成を表１に示す。表１中、各組成物は水溶液であり、各組成物中の各成分の割合を重量％で示す。【０１２１】
【表１】
2017043649.tif 000003
【０１２２】
＜殺菌効力評価＞
上述したＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌液、ＢＣＧ菌液、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ含有擬似喀痰、ＢＣＧ含有擬似喀痰の四種類を用いて、各処理試薬の殺菌効力の評価を行った。【０１２３】
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、ＢＣＧの各菌液５００μＬに対し、表１に示した各処理試薬２５０〜１５００μＬを混ぜ合わせ、転倒混和後、５分間室温で放置した。その後、処理試薬を取り除くため、遠心（５６００ｒｐｍ，４℃，２０分）し、上清を除いて生理食塩水に置換した。後述する培養で処理試薬の静菌作用による影響を受けないよう、遠心して生理食塩水に置換する操作を三回繰り返した。【０１２４】
三回繰り返した後、生理食塩水を用いて希釈系列（〜１０５倍希釈）を調製し、７Ｈ１１Ｃ寒天培地（極東製薬工業社製）に播き、３７℃で培養して生菌数（コロニー数）をカウントした。得られた生菌数を基に殺菌効力の指標として殺菌率を算出した。殺菌率は以下の式で算出した。
殺菌率（％）
＝［（ＮＣの生菌数）−（処理試薬使用時の生菌数）］／（ＮＣの生菌数）×１００
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ擬似喀痰、ＢＣＧ擬似喀痰に対する殺菌効力評価も、上述した菌液に対する評価と同様の手法で行い、殺菌率を算出した。【０１２５】
本評価の結果を表２に示す。算出した殺菌率が９９．９９９９９％に達していれば、核酸分離装置に用いる処理試薬として有効な薬剤組成とみなした。下記表中「○」は「Ａ」、「×」は「Ｂ」と表してもよい。【０１２６】
【表２】
2017043649.tif 000004
【０１２７】
＊表中の「○」は殺菌率が９９．９９９９９％に達していることを示し、「×」は殺菌率が９９．９９９９９％に達していないことを示し、「−」は試験を行っていないことを示す。【０１２８】
本評価に用いた処理試薬により、菌液および擬似喀痰中のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、ＢＣＧが９９．９９９９９％殺菌されることが示された。
［実施例２２］
検体Ｓとしてマウスの血液３ｍＬにＭ．ｂｏｖｉｓの培養液（１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を３μＬ添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２３］
検体Ｓとしてマウスの筋肉組織３ｃｃをすりつぶしたものにＭ．ｂｏｖｉｓの培養液（１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を３μＬ添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２４］
検体ＳとしてＥ．ｃｏｌｉの培養液（１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）３ｍＬにＭ．ｂｏｖｉｓの培養液（０．５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を３μＬ添加して十分に混合したものを用いた以外は実施例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２５］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：２＋、培養検査：陽性）を用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。【０１２９】
本明細書において「塗抹検査」とは、「結核検査指針２００７」（発行：財団法人結核予防会）に記載の塗抹検査法に従って、喀痰の前処理および染色、鏡検により、抗酸菌の有無を確認する方法である。採取した喀痰に対して倍容量のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ試薬（ＢＤ ＭｙｃｏＰｒｅｐ、日本ＢＤ製）を加えてボルテックスミキサーで撹拌した。全量が５０ｍＬ容量となるように０．０７Ｍの滅菌リン酸緩衝液を加えて、３０００ｇ、２０分間遠心した。上清を破棄し、沈渣を１ｍＬの滅菌リン酸緩衝液で懸濁した。懸濁液０．０５ｍＬをスライドガラス上に塗抹して、自然乾燥させた後、ガスバーナーの炎の中を４回通過させて固定した。固定した塗抹標本をＺ−Ｎ法に従って染色し、光学顕微鏡を用いて１０００倍拡大で観察した。観察した視野内の菌数を「結核検査指針２００７」に記載の鏡検における検出菌数記載法に従って、記録した。【０１３０】
本明細書において「培養検査」とは、「結核検査指針２００７」（発行：財団法人結核予防会）に記載の分離培養法に従って、喀痰の前処理、集菌、接種、培養を経て、抗酸菌の発育の有無を確認する方法である。前述の塗抹検査と同一の方法で得た懸濁液０．１ｍＬを寒天平板培地（ミドルブロック７Ｈ１０寒天培地）に接種して塗布し、３７℃で培養した。週２回、８週まで観察し、培地表面の集落の有無を記録した。
［実施例２６］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：１＋、培養検査：陽性）を用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２７］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：±、培養検査：陽性）を用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２８］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例２９］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を１０倍に希釈したものを用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例３０］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を１００倍に希釈したものを用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［実施例３１］
検体Ｓとして喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を１０００倍に希釈したものを用い、処理試薬１０１として５重量％の水酸化ナトリウムと５重量％のＮ−アセチル−Ｌ−システインと６０重量％のエタノールを含む水溶液５ｍＬが封入された処理試薬収容溶液１００を用いた以外は実施例１４と同じ方法で核酸を抽出・精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約７分であった。
［比較例１］
結核菌の一種であるＭ．Ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０４ＣＦＵ／ｍＬ）を検体として、栄研化学（株）より販売されているＬｏｏｐａｍｐ（登録商標）  ＰＵＲＥ  ＤＮＡ抽出キットを用い、キットの取扱説明書に準じて核酸の抽出を行った。培養液６０μＬを検体処理チューブに添加して９０℃で５分間加熱し、２分間室温で放置した。吸着剤チューブに検体処理チューブを接続して、上下左右に振盪して混合させた。滴下注入キャップを接続して、吸着剤チューブを絞り、核酸抽出液を採取した。採取した核酸抽出液１０μＬを採取し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．Ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約９分であった。
［比較例２］
検体としてＭ．Ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約９分であった。
［比較例３］
検体としてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（５．０×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、Ｍ．ｂｏｖｉｓの核酸抽出を確認した。ＰＣＲに要した時間を除く、核酸の抽出、精製に要した時間は約９分であった。
［比較例４］
検体としてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（２．５×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出したところ、リアルタイムＰＣＲでは核酸の増幅は検出されなかった。
［比較例５］
検体としてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０３ＣＦＵ／ｍＬ）に、豚由来ムチンを２０重量％となるように加えた粘稠な溶液を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出したところ、リアルタイムＰＣＲでは核酸の増幅は検出されなかった。
［比較例６］
検体としてＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ株）の培養液（１．０×１０２ＣＦＵ／ｍＬ）に、豚由来ムチンを２０重量％となるように加えた粘稠な溶液を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出したところ、リアルタイムＰＣＲでは核酸の増幅は検出されなかった。
［比較例７］
検体として実施例２８と同一の喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を用い、結核検査指針２００７（発行：財団法人結核予防会）に記載のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムＰＣＲで増幅、検出し、結核菌群の核酸抽出を確認した。
［比較例８］
検体として実施例３０と同一の喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を１００倍希釈したものを用い、結核検査指針２００７（発行：財団法人結核予防会）に記載のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムＰＣＲに供したところ、核酸の増幅は検出されなかった。
［比較例９］
検体として実施例３１と同一の喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を１０００倍希釈したものを用い、結核検査指針２００７（発行：財団法人結核予防会）に記載のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法を用いて喀痰の消化・汚染除去を行い、続いてアンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添付文書に記載の手順に従って核酸抽出した。得られた核酸抽出物をリアルタイムＰＣＲに供したところ、核酸の増幅は検出されなかった。
［比較例１０］
検体として実施例２８と同一の喀痰（塗抹検査：−、培養検査：陽性）を用いた以外は比較例１と同じ方法で核酸を精製し、リアルタイムＰＣＲで増幅、検出したところ、リアルタイムＰＣＲでは核酸の増幅は検出されなかった。【０１３１】
実施例１４〜１８、２２〜２４および比較例１〜６における、Ｍ．ｂｏｖｉｓを対象としたリアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、フォワードプライマー／５’−ＡＣＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣ−３’）（配列番号３）、リバースプライマー／（５’−ＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧ−３’）（配列番号４）を用いた。リアルタイムＰＣＲ試薬はタカラバイオ社製ポリメラーゼＴＡＫＡＲＡ  ＴａｑＨＳを用い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を終濃度にて１／２００００希釈となるように添加し行った。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９８℃／１分の後、９８℃／１０秒→６０℃／１０秒→７２℃／１０秒のＰＣＲサイクルを５０サイクル行い、核酸増幅反応をモニタリングした。【０１３２】
実施例１９におけるＥ．ｃｏｌｉを対象としたリアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、フォワードプライマー／５’−ＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣ−３’）（配列番号５）、リバースプライマー／（５’−ＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＡ−３’）（配列番号６）を用いた。リアルタイムＰＣＲ試薬はタカラバイオ社製ポリメラーゼＴＡＫＡＲＡ  ＴａｑＨＳを用い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を終濃度にて１／２００００希釈となるように添加し行った。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９８℃／１分の後、９８℃／１０秒→６０℃／１０秒→７２℃／１０秒のＰＣＲサイクルを４０サイクル行い、核酸増幅反応をモニタリングした。【０１３３】
実施例２０におけるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを対象としたリアルタイムＰＣＲ用のプライマーはフォワードプライマー／５’−ＧＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣ−３’）（配列番号７）、リバースプライマー／（５’−ＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号８）を用いた。リアルタイムＰＣＲ試薬はタカラバイオ社製ポリメラーゼＴＡＫＡＲＡ  ＴａｑＨＳを用い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を終濃度にて１／２００００希釈となるように添加し行った。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９８℃／１分の後、９８℃／１０秒→６０℃／１０秒→７２℃／１０秒のＰＣＲサイクルを４０サイクル行い、核酸増幅反応をモニタリングした。【０１３４】
実施例２５〜３１および比較例７〜１０における結核菌群を対象としたリアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、フォワードプライマー／５’−ＡＣＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣ−３’）（配列番号３）、リバースプライマー／（５’−ＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧ−３’）（配列番号４）を用いた。リアルタイムＰＣＲ試薬はタカラバイオ社製ポリメラーゼＴＡＫＡＲＡ  ＴａｑＨＳを用い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を終濃度にて１／２００００希釈となるように添加し行った。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９８℃／１分の後、９８℃／１０秒→６０℃／１０秒→７２℃／１０秒のＰＣＲサイクルを５０サイクル行い、核酸増幅反応をモニタリングした。
【符号の説明】
【０１３５】
Ｓ・・検体、１００・・処理試薬収容容器、１０１・・処理試薬、１０２・・放出口、１０３・・圧送部、１０４・・蓋体、１１０・・・容器内空間、２００・・核酸採取部材、２０３・・収容空間、２０４・・処理試薬供給口、２０５・・核酸を吸着する担体、２０６・・混合物排出口、４２０・・・混合用空間、４２１・・・混合物
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2017043649.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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