(57)【要約】  培養液の混合性能に優れると共に、酸素要求量の高い好気性培養への適用が可能であるガス攪拌式発酵装置を提供する。該ガス攪拌式発酵装置は、培養槽と、培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管とを含み、ガス供給管が、焼結金属膜からなるガス放出部を備え、ガス放出部から放出されるガスにより培養槽内の培養液を攪拌可能としたことを特徴とする。
2017115855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養槽と、
培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、
培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管と、
を含み、
ガス供給管が、焼結金属膜からなるガス放出部を備え、
ガス放出部から放出されるガスにより培養槽内の培養液を攪拌可能としたことを特徴とする、ガス攪拌式発酵装置。
【請求項２】
焼結金属膜の平均細孔径が２０μｍ以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速（ガス放出量［ｍ３／ｓ］／焼結金属膜の表面積［ｍ２］）が、０．０４ｍ／ｓ以下である、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
培養槽の内径をＤ１、ドラフトチューブの内径をＤ２としたとき、Ｄ１とＤ２が、０．７＜Ｄ２／Ｄ１の関係を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
化学物質の生産能を有する微生物を含む培養液に、焼結金属膜からなるガス放出部からガスを放出し、放出されたガスを含有する培養液をドラフトチューブの内部を通過させて培養液を攪拌すること、及び
微生物を培養して化学物質を製造すること
を含む、化学物質の製造方法。
【請求項６】
化学物質が、可燃性物質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学物質が、疎水性物質である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
化学物質が、イソプレノイド化合物である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
焼結金属膜の平均細孔径が２０μｍ以下である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速（ガス放出量［ｍ３／ｓ］／焼結金属膜の表面積［ｍ２］）が、０．０４ｍ／ｓ以下である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガス攪拌式発酵装置に関する。さらには、化学物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の製造方法の一つとして、発酵法が知られている。例えば、特許文献１には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に代表されるイソプレン生産能を有する微生物を培養することによりイソプレンを製造する方法が開示されている。【０００３】
発酵法により製造可能な化学物質の中には、上記のイソプレンのような可燃性物質も含まれる。可燃性物質を製造対象とする場合には、燃焼の継続による火災や爆発の危険性を考慮した発酵装置の仕様が求められる。燃焼や爆発を起こす因子として、可燃性物質、酸素、着火源の３要素が存在し、燃焼や爆発を防止するためには、これら３要素のうち少なくとも１つを取り除く必要がある。しかしながら、イソプレンのような可燃性物質を発酵法により製造する場合、「製造対象である可燃性物質」、「酸素」、「着火源となる攪拌機の電気エネルギー」の３要素が存在することから、燃焼や爆発（以下「爆発等」ともいう。）の可能性が危惧される。【０００４】
爆発等の可能性を減じることが可能な発酵装置としては、従来の機械攪拌機を使用しない発酵装置が考えられる。例えば、非特許文献１には、培養槽下部に備え付けられたノズルからガスを放出し、培養槽内の培養液を攪拌することのできるエアリフト型リアクタが開示されている。【０００５】
また、特許文献２には、焼結金属膜を備えた散気管を用いて空気、酸素又はそれらの混合ガスを培養槽に分散供給して好気性培養を行う技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５８４９９７０号明細書
【特許文献２】特許第４２００６５５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】坂東芳行「ドラフトチューブ付気泡塔の流動特性とその性能改善」  化学工学論文集  第２７巻  第４号  ｐ．４３０−４４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１記載の技術において、ノズルから放出されたガスは培養槽内で気泡を形成する。斯かる気泡の運動により、培養槽内の培養液は攪拌されることとなる。発酵法による化学物質の製造に際して斯かる技術の適用を試みたところ、機械攪拌機を使用する従来の発酵装置と比較して培養液の混合性能が低下してしまうため、化学物質を十分に製造できない場合があることを見出した。さらに、非特許文献１記載の技術を使用して好気性培養を行うに際しては、酸素含有ガスをノズルから放出して、培養液の攪拌と培養液への酸素供給を行う必要があるが、機械攪拌機により培養液の攪拌を行う従来の発酵装置と比較して、気泡の剪断、分散作用が低下し、培養液への酸素供給性能が著しく低下する場合があることも見出した。【０００９】
特許文献２記載の技術は、機械攪拌機の使用を排除するものではなく、可燃性物質を製造する場合には爆発等の可能性が危惧される。【００１０】
本発明は、培養液の混合性能に優れるガス攪拌発酵装置を提供すること、特に酸素要求量の高い好気性培養への適用が可能であるガス攪拌式発酵装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題につき鋭意検討した結果、下記特定の構成を有するガス攪拌式発酵装置によれば上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の内容を含む。
［１］  培養槽と、
培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、
培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管と、
を含み、
ガス供給管が、焼結金属膜からなるガス放出部を備え、
ガス放出部から放出されるガスにより培養槽内の培養液を攪拌可能としたことを特徴とする、ガス攪拌式発酵装置。
［２］  焼結金属膜の平均細孔径が２０μｍ以下である、［１］に記載の装置。
［３］  焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速（ガス放出量［ｍ３／ｓ］／焼結金属膜の表面積［ｍ２］）が、０．０４ｍ／ｓ以下である、［１］又は［２］に記載の装置。
［４］  培養槽の内径をＤ１、ドラフトチューブの内径をＤ２としたとき、Ｄ１とＤ２が、０．７＜Ｄ２／Ｄ１の関係を満たす、［１］〜［３］のいずれかに記載の装置。
［５］  化学物質の生産能を有する微生物を含む培養液に、焼結金属膜からなるガス放出部からガスを放出し、放出されたガスを含有する培養液をドラフトチューブの内部を通過させて培養液を攪拌すること、及び
微生物を培養して化学物質を製造すること
を含む、化学物質の製造方法。
［６］  化学物質が、可燃性物質を含む、［５］に記載の方法。
［７］  化学物質が、疎水性物質である、［５］又は［６］に記載の方法。
［８］  化学物質が、イソプレノイド化合物である、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］  焼結金属膜の平均細孔径が２０μｍ以下である、［５］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］  焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速（ガス放出量［ｍ３／ｓ］／焼結金属膜の表面積［ｍ２］）が、０．０４ｍ／ｓ以下である、［５］〜［９］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、培養液の混合性能に優れるガス攪拌発酵装置、特に酸素要求量の高い好気性培養への適用が可能であるガス攪拌式発酵装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態におけるガス攪拌式発酵装置を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態におけるガス攪拌式発酵装置において培養液の循環流を説明するための模式図である。
【図３】図３は、本発明のガス攪拌式発酵装置の好適な寸法や配置を説明するための模式図である。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを示す図である。
【図５】図５は、ｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳのマップを示す図である。
【図６】図６は、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳ染色体固定用プラスミドを示す図である。
【図７】図７は、（Ａ）ＰｌｌｄＤ、（Ｂ）ＰｐｈｏＣ、または（Ｃ）ＰｐｓｔＳの転写制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを示す図である。
【図８】図８は、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲベクターの構築の概要を示す図である。
【図９】図９は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ染色体固定用発現ベクターを示す図である。
【図１０】図１０は、化学合成により得られたＫＤｙＩオペロン中のコドン最適化を示す図である。
【図１１】図１１は、コドン最適化したＫＤｙＩオペロンを保持する、（Ａ）ｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体固定プラスミドを示す図である。
【図１２】図１２は、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドを示す図である。
【図１３】図１３は、（Ａ）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、（Ｂ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、および（Ｃ）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを示す図である。
【図１４】図１４は、Ａ）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）、および（Ｂ）Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）のゲノム改変物のマップを示す図である。
【図１５】図１５は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｃ）ΔａｍｐＣ：：Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体改変物のマップを示す図である。
【図１６】図１６は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ、および（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳの染色体改変物のマップを示す図である。
【図１７】図１７は、イソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株の培養による、（Ａ）増殖、ならびに（Ｂ）イソプレン生成量（ｍｇ／Ｂａｔｃｈ）を示す図である。
【図１８】図１８は、イソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株の培養における溶存酸素（ＤＯ）濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１６】
［ガス攪拌式発酵装置］
本発明のガス攪拌式発酵装置は、
培養槽と、
培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、
培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管と、
を含み、
ガス供給管が、焼結金属膜からなるガス放出部を備え、
ガス放出部から放出されるガスにより培養槽内の培養液を攪拌可能としたことを特徴とする。
【００１７】
ガス攪拌式発酵装置は、機械攪拌機を備えた従来の発酵装置とは異なり、ガスの流動作用のみで培養液の攪拌を行う発酵装置である。ガス攪拌式発酵装置では、培養槽に設置されたガス放出部からガスが放出されると、放出ガスからなる気泡が発生する。一般にガス放出部は培養槽の下部に設置されており、発生した気泡は培養槽内を上昇することとなる。培養槽内を気泡が上昇する際、培養槽の壁効果により、気泡は培養槽の中心部に集まる傾向がある。その結果、培養槽内の中心部分とその外側（壁面側）の部分とでは培養液の見掛け密度に差が生じる。この見掛け密度差に起因して、培養液は、培養槽の中心部では気泡と共に上昇し、その外側（壁面側）の部分では下降する。これにより、培養槽の内部で培養液の循環流が発生し、培養液の攪拌が行われる。
【００１８】
培養槽の内部にドラフトチューブを配置することで、上記の見掛け密度差をより大きくすることができ、培養液の攪拌を促進することができる。詳細には、気泡を多く含有する見掛け密度の低い培養液がドラフトチューブの内部を通過するように、ガス放出部とドラフトチューブとを位置合わせする。これにより、ドラフトチューブの内部と外部とで培養液の見掛け密度差を大きくすることが可能であり、培養液の攪拌を促進することができる。なお、ドラフトチューブの内部では培養液の上昇流が生じ（以下、斯かる培養液の上昇流を発現する作用を「ガスリフト作用」ともいう。）、ドラフトチューブの外部では培養液の下降流が生じる。
【００１９】
本発明は、ドラフトチューブを培養槽の内部に配置したガス攪拌式発酵装置において、ガス放出部として、焼結金属膜からなるガス放出部を使用することにより、従来のガス攪拌式発酵装置では達成し得ない、優れた培養液の混合性能を実現したものである。本発明ではさらに、ガス放出部から放出するガスとして酸素含有ガスを使用する場合には、酸素要求量の高い好気性培養にも適用可能な程度に、優れた酸素供給性能を実現することができる。
【００２０】
本発明のガス攪拌式発酵装置は、種々の化学物質、特に疎水性物質を製造するために好適である。疎水性物質は、培養液に対する溶解度が低く、容易に分離・回収することが可能である。例えば、疎水性物質の比重が培養液よりも大きい場合は、培養槽の下部から疎水性物質を回収すればよい。疎水性物質の比重が培養液よりも小さい場合は、培養槽の上部から疎水性物質を回収すればよい。本発明において、疎水性物質とは、使用する培養液から容易に分離する程度に培養液に対し低い溶解度を呈する物質をいう。培養液に対する疎水性物質の溶解度（常温）は、分離・回収が容易であることから、好ましくは１０ｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｇ／ｋｇ以下、１ｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｇ／ｋｇ以下である。
【００２１】
製造対象である疎水性物質は、発酵法により製造することが可能な限りにおいて特に限定されず、例えば、水素；メタン等の飽和炭化水素；エチレン、プロピレン、ブタジエン、イソブテン、イソプレン等の不飽和炭化水素；１，３アモルファジエン、ファルネセン、リモネン、カルボン、リナロール、ヌートカトン、バレンセン等のイソプレノイド化合物；ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、バニリン、オイゲノール、アネトール、トリメチルピラジン等の芳香族化合物；セラミド等の脂質化合物；ノナラクトン、デカラクトン等のラクトン化合物；酢酸イソペンチル、乳酸メンチル、コハク酸モノメンチル等の有機酸エステル化合物；キシリトール、アラビトール等の糖アルコール化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明のガス攪拌式発酵装置はまた、親水性若しくは水混和性の物質を製造するために好適である。本発明において、親水性若しくは水混和性の物質とは、使用する培養液から該物質を分離するにあたって、蒸留処理、膜分離処理等の精製処理を必要とする程度に培養液に対し高い溶解性若しくは混和性を呈する物質をいう。培養液に対する親水性若しくは水混和性の物質の溶解度（常温）は、１０ｇ／ｋｇを超え、通常、２０ｇ／ｋｇ以上、又は３０ｇ／ｋｇ以上である。斯かる親水性若しくは水混和性の物質としては、発酵法により製造することが可能な限りにおいて特に限定されず、例えば、エタノール、プロパノール等の低級（Ｃ１−Ｃ６）アルコール化合物が挙げられる。
【００２３】
イソプレノイド化合物は、ＩＰＰ及びその異性体であるＤＭＡＰＰに収斂する２つの異なる代謝経路を介して合成することができる。例えば、イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ５Ｈ８）ｎを有する１以上のイソプレン単位からなる。イソプレン単位の前駆体は、イソペンテニルピロリン酸、またはジメチルアリルピロリン酸である。３０，０００種のイソプレノイド化合物が同定されており、新たな化合物が同定されている。イソプレノイドはまた、テルペノイドとしても知られている。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類される〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、カルボン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンとしては、例えば、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６７４〜６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，２８３〜２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，９３７〜９４７（２００５）；Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８））。好ましくは、イソプレノイド化合物は、イソプレン（モノマー）である。
【００２４】
イソプレノイド化合物の生産能を有する微生物（以下、「イソプレノイド化合物生成微生物」ともいう。）は、ジメチルアリル二リン酸供給経路を有する。ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ、ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（メナキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７−１１４６）。ジメチルアリル二リン酸供給経路としては、例えば、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及びメバロン酸（ＭＶＡ）経路が挙げられる。
【００２５】
イソプレノイド化合物の材料（例えば、イソプレン合成の基質）であるＤＭＡＰＰは、通常、微生物が固有またはネイティブに有するメチルエリスリトールリン酸経路またはメバロン酸経路のいずれかにより生合成される。したがって、効率的なイソプレノイド化合物の製造のためのＤＭＡＰＰの供給の観点から、本発明で用いられるイソプレノイド化合物生成微生物は、後述するように、メチルエリスリトールリン酸経路および／またはメバロン酸経路が強化されていてもよい。
【００２６】
イソプレノイド化合物生成微生物は、好気性微生物であることが好ましい。イソプレノイド化合物生成微生物は、好気条件下で培養されることが好ましい。好気条件下で培養するときは、培地中の溶存酸素の濃度は微生物の増殖に十分な程度以上の濃度であればよい。好気性微生物の増殖に十分である培地中の溶存酸素の濃度は、好気性微生物の増殖を促進できる濃度である限り特に限定されず、例えば１ｐｐｍ以上、３ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、７ｐｐｍ以上、または７．２２ｐｐｍ以上であってもよい。好気性微生物の増殖のための溶存酸素の濃度はまた、例えば０．３ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。
【００２７】
本発明のガス攪拌式発酵装置は、発酵法による化学物質の製造に広く適用可能である。製造対象である化学物質が可燃性物質を含む場合、燃焼の継続による火災や爆発の危険性を考慮した発酵装置の仕様が求められる。また、製造に用いる有機溶剤等の助剤が可燃性物質を含む場合も、燃焼の継続による火災や爆発の危険性を考慮した発酵装置の仕様が求められる。本発明のガス攪拌式発酵装置は、製造対象である化学物質そのものが引火性、発火性や爆発性を持つ場合の他、製造に用いる有機溶剤等の助剤が引火性、発火性や爆発性を持つ場合においても有効である。物質や助剤の爆発性については、可燃性ガス、蒸気の爆発限界を測定する一般的な試験方法により調査可能である。試験方法としては、爆発試験容器内に混合ガスを入れ、点火源を作動させて爆発の有無を温度センサー及び圧力センサーで検知するもので、混合ガスの濃度を変えて同様の操作を繰り返し、爆発範囲を求めることができる（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｆｌａｍｍａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｔ  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ＡＳＴＭ  Ｅ９１８  −  ８３（２０１１））。物質や助剤の引火点の測定方法として、例えばＪＩＳ規格、ＪＩＳ  Ｋ  ２２６５が知られている。物質や助剤の発火点の測定方法として、例えば、ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国試験材料協会）による「Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（ＡＳＴＭ  Ｅ６５９−１９７８）に規定される方法等が知られている。物質や助剤の沸点の測定方法として、例えばＪＩＳ規格  「自動車用非鉱油系ブレーキ液」（ＪＩＳ  Ｋ２２３３−１９８９）7.1に規定する「平衡還流沸点試験方法」に準ずる方法等が知られている。
【００２８】
中でも、製造対象である化学物質が可燃性物質を含み且つ該可燃性物質を好気性培養により製造する場合には、爆発等の可能性が危惧される。特に、可燃性物質が可燃性ガスを含む場合、培養槽の上部において可燃性ガスと酸素とが共存し易いため、特に爆発等の可能性が危惧される。この点、本発明のガス攪拌式発酵装置では、培養液の攪拌をガスの流動作用のみで実現することから、爆発等を起こす因子のうち、「着火源となる攪拌機の電気エネルギー」を排除することが可能である。これにより、本発明のガス攪拌式発酵装置では、爆発等の可能性を減じることが可能である。詳細は後述するが、本発明のガス攪拌式発酵装置ではさらに、酸素利用効率が極めて高く、培養槽上部に排出される酸素の濃度を低く抑えることが可能である。そのため、培養槽上部の雰囲気を可燃性ガスの燃焼範囲に入らないように調整することが可能であり、爆発等の可能性をより一層減じることが可能である。したがって、本発明のガス攪拌式発酵装置は、可燃性物質を製造するために特に好適である。本発明において、可燃性物質とは、１気圧２０℃で液状であり、かつ、引火点が７０℃以下の物質、あるいは、物質の燃焼限界の下限値が１０％以下、あるいは限界酸素濃度の下限値が１５％以下の物質をいう。
【００２９】
さらに本発明においては、疎水性物質を有機物質と共に培養する二相抽出発酵を用いた発酵を行い、疎水性物質を含む有機層をガスとして回収してもよい。二相抽出発酵で用いる有機物質は水と混和しない有機溶媒が好ましいがこれに限定されるものではない。用いる有機物質は発酵生産に用いられる微生物にとって無害である有機溶剤が好ましい。例えば有機溶剤としては、コーン油、ドデカン、ヘキサデカン、オレイルアルコール、オレイン酸ブチル、フタル酸ブチル、ドデカノール、フタル酸ビス(２−エチルヘキシル)、ファルネセン、ミリスチン酸イソプロピル、ブタノール、シクロヘキサン、ｎ−テトラデカンやこれらを混合して用いることが出来る（Ｂｒｅｎｎａｎ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｅｔ  ｆｕｅｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０９，  ２５１３−２５２２，  ２０１２）がこれに限定されるものではない。あるいは、トルエン、ベンゼンといった微生物に対して有害な有機溶剤に対して耐性がある微生物を用いる事もできる（本田孝祐ほか「有機溶媒耐性微生物を用いた非水系の世界でのものつくり」環境バイオテクノロジー学会誌  第６巻  第２号  ｐ．１０９−１１４，２００６）。
【００３０】
生産された疎水性物質は有機層に移動しており分注操作により発酵培地から取り出すことが出来る。また、他の種類の有機抽出剤と併用し、疎水性物質を発酵培地から取り出してもよい。大気、窒素、または二酸化炭素などの気体を発酵培地に対して通過させることによってガスストリッピングを行い、それによって疎水性物質含有気相を形成してもよい。疎水性物質生成物は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えば疎水性物質を濃縮するための冷水トラップ（ｃｈｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｔｒａｐ）を用いて、または気相を溶媒で洗い落とす（ｓｃｒｕｂｂｉｎｇ）ことにより、あるいは冷却、吸収、吸着、膜分離といった単位操作を組み合わせることにより疎水性物質含有気相から回収してもよい。
【００３１】
以下、本発明のガス攪拌式発酵装置に含まれる各部材について説明する。
【００３２】
−培養槽−
培養槽は、後述する焼結金属膜からなるガス放出部を備えたガス供給管とドラフトチューブとを設けることが可能である限りにおいて特に限定されない。製造対象である化学物質の性質（比重、可燃性の有無等）や製造規模、培養方法（バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等）、培養条件（好気性条件、嫌気性条件等）などに応じて、適切な培養槽を選択してよい。なお、培養液については後述することとする。
【００３３】
−ドラフトチューブ−
ドラフトチューブは、上記のガスリフト作用を達成し得る限りにおいて特に限定されず、公知のドラフトチューブ（「ガスリフト管」とも呼ばれる。）を使用してよい。
【００３４】
ドラフトチューブは、ガスリフト作用を効果的に達成する観点から、一般に、その管軸方向が水平面に対し垂直となるように、培養槽の内部に配置される。
【００３５】
ドラフトチューブを備えたガス攪拌式発酵装置では、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度を高くすると、ガスリフト作用が向上し、培養液の混合性能が高くなることが知られている。この点、焼結金属膜からなるガス放出部を使用する本発明のガス攪拌式発酵装置では、先述の非特許文献１に記載されるような、単孔ノズル等の粗なガス放出部を使用する従来の装置に比し、ガス空塔速度（Ｖ）を一定値（ΔＶ）高めた場合に得られる培養液の混合性能（ＰＭ）の上昇値（ΔＰＭ）が大きい。すなわち、本発明のガス攪拌式発酵装置では、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度を高くするほど、単孔ノズル等を使用する従来の装置に比して優れた混合性能を実現することができる。ドラフトチューブにおけるガス空塔速度は、所望の混合性能を実現すべく決定してよいが、好ましくは０．００１ｍ／ｓ以上、より好ましくは０．００５ｍ／ｓ以上、さらに好ましくは０．０１ｍ／ｓ以上である。該ガス空塔速度の上限は、培養液の混合性能の観点からは高いことが好ましいが、通常、０．２ｍ／ｓ以下、０．１ｍ／ｓ以下、０．０５ｍ／ｓ以下などとし得る。
【００３６】
好気性培養に際しては、酸素含有ガスをガス放出部から放出して、培養液の攪拌と培養液への酸素供給を行う。この点、本発明のガス攪拌式発酵装置では、後述する焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速を一定値以下とする限り、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度の広い範囲にわたって、単孔ノズル等を使用する従来の装置に比して著しく優れた酸素供給性能を実現し得ることを本発明者らは見出した。詳細には、本発明のガス攪拌式発酵装置は、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓ以下である限り、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度の広い範囲にわたって、亜硫酸ソーダ法に基づく酸素利用効率（酸素溶解効率や酸素移動効率とも呼ばれる。）が７０％を超えており、単孔ノズルを使用する従来の装置に比して実に１０倍以上も高い酸素利用効率を実現することができる。したがって、培養槽上部に排出される酸素の濃度を低く抑えることが可能であり、培養槽上部の雰囲気を可燃性ガスの燃焼範囲に入らないように調整することが可能であるため、爆発等の可能性をより一層減じることが可能である。
【００３７】
−ガス供給管−
ガス供給管は、培養槽の内部へとガスを供給する機能を有する。本発明のガス攪拌式発酵装置において、ガス供給管は、焼結金属膜からなるガス放出部を備えることを特徴とする。なお、培養槽の内部へと供給されるガスの詳細は後述することとする。
【００３８】
ガス供給管を通過したガスは、焼結金属膜からなるガス放出部から、培養槽の内部へと放出される。焼結金属膜は多数の細孔を有しており、ガスは該細孔の径に応じて、微細な気泡として培養槽の内部へと放出される。この結果、本発明のガス攪拌式発酵装置では、単孔ノズル等を使用する従来の装置に比し、培養液中における気泡の滞留時間が長くなり、ドラフトチューブの内部と外部とで培養液の見掛け濃度差がより大きくなり、先述のように優れた混合性能を呈することが可能である。また、微細な気泡を発生する本発明のガス攪拌式発酵装置では、酸素供給性能の指標となる酸素移動容量係数ＫＬａ（ここでＫＬは液境膜物質移動係数、ａは単位容積当たりの気液接触面積を表す。）のうち、ａ値を極めて高くすることが可能である。その結果、本発明のガス攪拌式発酵装置では、単孔ノズル等を使用する従来の装置に比し、酸素移動容量係数ＫＬａを高めることが可能であり、ひいては先述のように優れた酸素利用効率を呈することが可能である。
【００３９】
培養液の混合性能を高める観点、酸素要求量の高い好気性培養にも適用可能な優れた酸素供給性能を達成する観点から、焼結金属膜の平均細孔径は、好ましくは２０μｍ以下、より好ましくは１０μｍ以下、さらに好ましくは８μｍ以下、６μｍ以下、又は５μｍ以下である。焼結金属膜の平均細孔径の下限は特に限定されないが、通常、０．１μｍ以上、０．５μｍ以上、１μｍ以上などとし得る。
【００４０】
焼結金属膜は、粒子径分布の一様な金属粉末を加圧成形し、焼結することにより製造することができる。金属粉末の平均粒子径や焼結温度等を変化させることで、得られる焼結金属膜の平均細孔径を調整することが可能である。焼結金属膜の材質としては、例えば、ニッケル、ステンレス、インコネル、チタン等が挙げられる。機械的強度、耐薬品性、耐熱衝撃性等の観点から、ステンレス製の焼結金属膜が好ましい。
【００４１】
焼結金属膜からなるガス放出部は、該ガス放出部から放出されたガスを含有する培養液が上記ドラフトチューブの内部を通過するように、ドラフトチューブと位置合わせする。通常、焼結金属膜からなるガス放出部は、ドラフトチューブの下側開口の近傍に配置される。
【００４２】
本発明のガス攪拌式発酵装置においては、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度が同一の場合であっても、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速（ガス放出量［ｍ３／ｓ］／焼結金属膜の表面積［ｍ２］）に応じて、培養液の混合性能に差が生じる場合がある。詳細には、該放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓ以下の範囲においては、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度が同一であれば、放出ガス線速が変化しても培養液の混合性能にほとんど影響はない。すなわち、放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓ以下の範囲では、培養液の混合性能においてガス空塔速度の影響が支配的である。放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓを超えると、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度が同一であっても、培養液の混合性能は徐々に低下する。したがって、所期のガス空塔速度を達成し得る限りにおいて、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速は、０．０４ｍ／ｓ以下であることが好ましい。放出ガス線速の下限は、所期のガス空塔速度を達成し易い観点から、好ましくは０．００５ｍ／ｓ以上、より好ましくは０．０１ｍ／ｓ以上、０．０２ｍ／ｓ以上、又は０．０３ｍ／ｓ以上である。
【００４３】
また、酸素供給性能の観点から、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速は、０．０４ｍ／ｓ以下とすることが好ましい。該放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓ以下であると、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度の広い範囲にわたって、７０％を超える酸素利用効率を達成することが可能である。放出ガス線速が０．０４ｍ／ｓを超える範囲では、放出ガス線速が高くなるほど、酸素利用効率が低下することを本発明者らは見出した。
【００４４】
培養液の混合性能に優れると共に、酸素要求量の高い好気性培養への適用が可能であるガス攪拌式発酵装置を実現する観点から、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速は、好ましくは０．０４ｍ／ｓ以下、より好ましくは０．００５〜０．０４ｍ／ｓの範囲、さらに好ましくは０．０１〜０．０４ｍ／ｓの範囲、０．０２〜０．０４ｍ／ｓの範囲、又は０．０３〜０．０４ｍ／ｓの範囲である。
【００４５】
焼結金属膜からなるガス放出部の形状や寸法は、上記の好適な放出ガス線速を達成し得る限りにおいて特に限定されない。上記の好適な放出ガス線速を達成すると共に、所期のガス空塔速度を達成するにあたって、焼結金属膜からなるガス放出部は、複数設けてもよい。
【００４６】
本発明のガス攪拌式発酵装置は、発酵法により化学物質を製造するために必要となる他の要素を含んでもよい。斯かる他の要素としては、例えば、培養槽の内部に培養液を供給する培養液供給管、培養槽の内部にｐＨ調整用の塩基化合物を供給する塩基化合物供給管、製造された化学物質を回収する回収管、培養槽上部のガスを外部に取り出すガス排出管、培養槽の温度を調整する温度調整器等が挙げられる。これらは、発酵装置に通常使用される公知の要素を使用してよい。
【００４７】
以下、本発明のガス攪拌式発酵装置の実施形態について、図面を参照しつつ、説明することとする。
【００４８】
図１には、本発明の一実施形態におけるガス攪拌式発酵装置の模式図を示す。図１において、ガス攪拌式発酵装置１０は、培養槽１、培養槽の内部に配置されたドラフトチューブ２、培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管３とを含み、ガス供給管３は、焼結金属膜からなるガス放出部４を備える。ガス攪拌式発酵装置１０は、ガス放出部から放出されるガスにより培養槽内の培養液５を攪拌することが可能である。図１には、焼結金属膜からなるガス放出部を１つ備えた実施形態を示すが、好適な放出ガス線速を達成すると共に、所期のガス空塔速度を達成するにあたって、焼結金属膜からなるガス放出部は、複数設けてもよい。
【００４９】
図２には、本発明の一実施形態におけるガス攪拌式発酵装置において培養液の循環流を説明するための模式図を示す。各符号の意味は図１と同じである。ガス攪拌式発酵装置１０において、ガス供給管３を通過したガスは、焼結金属膜からなるガス放出部４から、培養槽１の内部へと放出される。焼結金属膜は多数の細孔を有しており、ガスは該細孔の径に応じて、微細な気泡として培養槽の内部へと放出される。気泡を多く含有する見掛け密度の低い培養液はドラフトチューブ２の内部を上昇する。ドラフトチューブの外部では、気泡の含有量が少なく見掛け密度の高い培養液が下降する。こうして、ドラフトチューブの内部では培養液の上昇流が生じ、ドラフトチューブの外部では培養液の下降流が生じる。そのため、培養槽の内部で培養液の循環流が発生し、培養液の攪拌が行われる。
【００５０】
図３には、本発明のガス攪拌式発酵装置の好適な寸法や配置を説明するための模式図を示す。各符号の意味は図１と同じである。
【００５１】
図３に示すように、培養槽１の内径をＤ１、ドラフトチューブ２の内径をＤ２としたとき、本発明のガス攪拌式発酵装置は、培養液の混合性能をより一層高める観点から、０．７＜Ｄ２／Ｄ１の関係を満たすことが好ましい。Ｄ２／Ｄ１比は、培養液の混合性能の観点から、より好ましくは０．７５以上、さらに好ましくは０．８以上、０．８２以上、０．８４以上、０．８６以上、又は０．８８以上である。Ｄ２／Ｄ１比の上限は、培養液の混合性能の観点から、好ましくは０．９８以下、より好ましくは０．９６以下、さらに好ましくは０．９４以下、又は０．９２以下である。培養液の円滑な循環流を実現する観点から、ドラフトチューブ２は、培養槽１と同軸上に配置することが好ましい。
【００５２】
また、培養槽１の内径をＤ１、ドラフトチューブ２の内径をＤ２、培養槽１の底部からの培養液５の液面高さをＨＬ、培養槽１の底部からのドラフトチューブ２の最上部の高さをＨ２ｍａｘ、培養槽１の底部からのドラフトチューブ２の最下部の高さをＨ２ｍｉｎとしたとき、本発明のガス攪拌式発酵装置は、以下の条件（ｉ）、（ｉｉ）のうち少なくとも一方を満たすことが好ましい。
（ｉ）：１≦（ＨＬ−Ｈ２ｍａｘ）／Ｄ１
（ｉｉ）：Ｈ２ｍｉｎ／Ｄ２≦２
【００５３】
条件（ｉ）について、培養液の混合性能を高める観点から、（ＨＬ−Ｈ２ｍａｘ）／Ｄ１比は、より好ましくは１．５以上、さらに好ましくは２以上である。（ＨＬ−Ｈ２ｍａｘ）／Ｄ１比の上限は、培養液の円滑な循環流を達成し得る限り特に限定されないが、通常、５以下、４以下などとし得る。
【００５４】
条件（ｉｉ）について、培養液の混合性能を高める観点から、Ｈ２ｍｉｎ／Ｄ２比は、より好ましくは１．５以下、さらに好ましくは１以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、又は０．６以下である。Ｈ２ｍｉｎ／Ｄ２比の下限は、培養液の円滑な循環流を達成し得る限り特に限定されないが、通常、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上などとし得る。
【００５５】
本発明のガス攪拌式発酵装置は、培養液の攪拌をガスの流動作用のみで実現することが可能であり、機械撹拌機は実質的に排除し得る。他方において、本発明のガス攪拌式発酵装置では、酸素利用効率が極めて高く、培養槽上部に排出される酸素の濃度を低く抑えることが可能である。そのため、培養槽上部の雰囲気を燃焼範囲に入らないように調整することが可能であり、たとえ機械撹拌機を使用する場合であっても爆発等の可能性を減じることが可能である。
【００５６】
［化学物質の製造方法］
本発明の化学物質の製造方法は、
化学物質の生産能を有する微生物を含む培養液に、焼結金属膜からなるガス放出部からガスを放出し、放出されたガスを含有する培養液をドラフトチューブの内部を通過させて培養液を攪拌すること、及び
微生物を培養して化学物質を製造すること
を含む。
【００５７】
製造対象である化学物質、焼結金属膜からなるガス放出部、ドラフトチューブは、上記［ガス攪拌式発酵装置］において記載したとおりである。本発明の化学物質の製造方法では、焼結金属膜からなるガス放出部から放出されたガスのガスリフト作用により培養液を攪拌することを特徴としており、従来のガス攪拌式発酵法では達成し得ない、優れた培養液の混合性能を実現する。さらに、ガス放出部から放出するガスとして酸素含有ガスを使用する場合には、酸素要求量の高い好気性培養にも適用可能な程度に、優れた酸素供給性能を実現することができる。本発明のガス攪拌式発酵装置について説明した有利な効果は、本発明の化学物質の製造方法についても同様に適用される。
【００５８】
本発明において、「化学物質の生産能を有する微生物」には、１）本来的に化学物質の生産能を有する微生物と、２）本来的には化学物質の生産能を有しない又は実質的に有しないが化学物質生産遺伝子を遺伝子組み換えにより導入されて後天的に化学物質の生産能を有するに至った微生物の双方が含まれる。化学物質の生産能を有する微生物に関しては、化学物質の種類に応じて種々の微生物が知られており、本発明においては、これら既知の微生物を広く使用してよい。また、化学物質の生産能を有する限り、今後開発される微生物に関しても本発明を広く適用することが可能である。
【００５９】
以下、製造対象である化学物質がイソプレノイド類化合物である実施形態について、好適な微生物を例示する。
【００６０】
グラム陽性細菌としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
【００６１】
グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開第０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開第０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）およびパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）が挙げられる。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開第０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７  Ｍａｒ  ２７；９８（２）：３４０−３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００６２】
真菌としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、例えば、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、例えば、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
【００６３】
本来的にイソプレノイド化合物の生産能を有しない又は実質的に有しない微生物は、ジメチルアリル二リン酸供給経路の酵素であるイソプレノイド化合物合成酵素をコードする遺伝子を発現ベクターにて導入する、あるいは染色体上に遺伝子組換えで導入することにより、イソプレノイド化合物の生産能を付与することができる。
【００６４】
例えば、ジメチルアリル二リン酸供給経路としては、例えば、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及びメバロン酸（ＭＶＡ）経路が挙げられる。
【００６５】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路とは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の生合成経路である（Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  Ｒｅｐ．  １６  （５）：  ５６５−５７４  １９９９）。代謝中間体としてメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰまたはＤＯＸＰ）を生合成することから、ＭＥＰ経路、ＤＸＰ経路、ＤＯＸＰ経路、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路とも呼ばれる。
【００６６】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。
【００６７】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路はイソプレノイドの出発合成物質であるイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸をアセチルＣｏＡから合成する生合成経路である。メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例５、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する１以上の酵素（例、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする遺伝子は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
【００６８】
イソプレノイド化合物生成微生物は、さらにイソプレノイド化合物の材料（例、イソプレンシンターゼの基質）であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、イソプレノイド化合物生成微生物に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、イソプレノイド化合物生成微生物に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、組込み型ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を一緒または個別に発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
【００６９】
製造対象である化学物質がイソプレンである場合、上記のＭＥＰ経路またはＭＶＡ経路の酵素に加え、イソプレンシンターゼを細胞内で強化することが好ましい。イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ  ｂｒａｃｔｅａｔａ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｒｉａ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、茶ノ木（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）由来のイソプレンシンターゼが挙げられる（例、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ６７  （４），１０２６−１０４０（２０１３）を参照）。イソプレノイド化合物合成酵素発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。
【００７０】
製造対象である化学物質が炭化水素のように炭素含有物質である場合、培養液は炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素原子数が１の化合物；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；及びこれらの組み合わせが挙げられる。製造対象である化学物質が水素である場合、培養液は、上記炭素源として例示した材料のうち、水素含有材料を含むことが好ましい。培養液はさらに、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含むことが好ましい。斯かる窒素源、無機イオン及びその他の有機微量成分としては、従来公知の任意の成分を使用してよい。
【００７１】
イソプレノイド化合物がイソプレンである場合、本発明の方法は、液相および気相を備える系において、行うことができる。このような系としては、生成するイソプレンの拡散による消失を回避するため、閉鎖されている系、例えば、発酵槽、発酵タンク等の反応器を利用することができる。液相としては、イソプレン生成微生物を含む培地を用いることができる。気相は、系における液相上部の空間であり、ヘッドスペースとも呼ばれ、発酵ガスを含む。イソプレンは、標準大気圧で沸点が３４℃であり、かつ水に対して難溶性（水に対する溶解性：０．６ｇ／Ｌ）で２０℃における蒸気圧が６０．８ｋＰａであることから（例、Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ（ＰＴＢ），２００８）、イソプレン生成微生物を３４℃以上の温度条件下の液相中で培養した場合、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得る。したがって、このような系を用いる場合、液相中で生成したイソプレンを、気相中から回収することができる。また、液相中で生成したイソプレンは容易に気相中に移行し得ることから、液相中のイソプレン生成微生物によるイソプレン生成反応（イソプレンシンターゼによる酵素反応）を、常に、イソプレン生成側に傾斜させることもできる。
【００７２】
液相および気相を備える系において本発明の方法が行われる場合、気相中の酸素濃度を制御することが望ましい。イソプレンは爆発限界が１．０〜９．７％（ｗ／ｗ）（例、Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｈ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ（ＰＴＢ），２００８）であり爆発し易い性質を有すること、およびイソプレンは気相中での酸素との混合比率に応じて爆発範囲が変動することから（ＵＳ８４２０３６０Ｂ２、図２４を参照）、爆発の回避の観点から、気相中の酸素濃度を制御する必要があるためである。
【００７３】
気相中の酸素濃度の制御は、酸素濃度を調節した気体を系中に供給することにより行うことができる。系中に供給される気体は、窒素、二酸化炭素、アルゴン等の酸素以外の気体成分を含んでいてもよい。より具体的には酸素濃度が爆発範囲を持つガスの限界酸素濃度以下になるよう不活性ガスを加えることで気相中の酸素濃度を制御できる。酸素以外の気体成分としては不活性ガスが望ましい。好ましくは、酸素濃度を調節した気体は液相中に供給され、それにより気相中の酸素濃度が間接的に制御される。気相中の酸素濃度は、以下のとおり、液相中の溶存酸素濃度の調節により制御できるためである。
【００７４】
液相中に供給された気体中の酸素は液相中に溶存し、やがて飽和濃度に達する。一方、微生物が存在する系においては、液相中の溶存酸素は、培養される微生物の代謝活動により消費され、その結果、溶存酸素濃度は飽和濃度以下に低下する。飽和濃度以下の酸素を含む液相において、気液平衡により気相中の酸素、あるいは新たに供給する気体中の酸素は液相への移動が可能である。すなわち、微生物の酸素消費速度に依存して、気相中の酸素濃度は低下する。また、培養される微生物の酸素消費速度を制御することにより、気相中の酸素濃度を制御することも可能である。
【００７５】
例えば、微生物の炭素源の代謝速度を上げることにより、酸素消費速度をあげ、気相中の酸素濃度を９％（ｖ／ｖ）以下（例、５％（ｖ／ｖ）以下、０．８％（ｖ／ｖ）以下、０．６％（ｖ／ｖ）以下、０．５％（ｖ／ｖ）以下、０．４％（ｖ／ｖ）以下、０．３％（ｖ／ｖ）以下、０．２％（ｖ／ｖ）以下、もしくは０．１％（ｖ／ｖ）以下）または実質的に０％（ｖ／ｖ）に設定することができる。あるいは、初期に供給する気体中の酸素濃度を、低く設定することでも成し得る。したがって、気相中の酸素濃度は、液相中の微生物による酸素の消費速度と供給する気体中の酸素濃度を考慮した上で、設定することができる。
【００７６】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、異なってもよい。培養開始時に培地に含有される微生物の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。
【００７７】
培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【００７８】
培養は、好気条件で行ってもよく、微好気条件で行ってもよく、嫌気条件で行ってもよい。培養は、微好気条件または嫌気条件で行うのが好ましい。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である０．３３ｐｐｍ以上であることをいい、好ましくは１．５ｐｐｍ以上であることであってよい。微好気条件とは、培養系に酸素が供給されているが、液体培地中の溶存酸素濃度が０．３３ｐｐｍ未満であることをいう。嫌気条件とは、培養系に酸素が供給されない条件をいう。培養は、その全期間において上記で選択された条件で行われてもよく、一部の期間のみ上記で選択された条件で行われてもよい。すなわち、「好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において好気条件で培養が行われることをいう。また、「微好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において微好気条件で培養が行われることをいう。また、「嫌気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において嫌気条件で培養が行われることをいう。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。なお、「培養の全期間」とは、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合には、本培養の全期間を意味してよい。また、通気量や攪拌速度を低下させる、容器を密閉して無通気で培養する、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の手段により、液体培地中の溶存酸素濃度を低下させ、微好気条件または嫌気条件を達成できる。
【００７９】
培地のｐＨは、例えば、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ４．０〜９．５であってよい。培養中、必要に応じて培地のｐＨを調整することができる。培地のｐＨは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。
【００８０】
培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン、炭酸ガス、またはそれらの組み合わせが含有されていてよい。これらの成分は、例えば、微生物の代謝により供給されてもよく、ｐＨ調整に用いられる炭酸塩および／または重炭酸塩から供給されてもよい。また、これらの成分は、必要に応じて、炭酸、重炭酸、それらの塩、または炭酸ガスを別途添加することにより供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムが挙げられる。炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンは、例えば、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加してよい。炭酸ガスを含有させる場合は、例えば、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させてよい。
【００８１】
培養温度は、例えば、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１０時間〜１２０時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは微生物の活性がなくなるまで、継続してもよい。
【００８２】
本発明の方法では、焼結金属膜からなるガス放出部からガスを放出し、放出されたガスを含有する培養液をドラフトチューブの内部を通過させて培養液を攪拌する。ガスを含有する培養液は見掛け密度が低く、通常、水平面に対し垂直に上昇する。したがって、本発明の方法では、ガスを含有する見掛け密度の低い培養液がドラフトチューブの内部を通過するように、その管軸方向が水平面に対し垂直となるようにドラフトチューブを設け、ドラフトチューブの下側開口部の近傍に設けたガス放出部からガスを放出することが好ましい。ガスリフト作用による培養液の攪拌機構に関しては先述のとおりである。
【００８３】
本発明において、ガス放出部から放出するガスは、微生物の培養条件（好気性条件、嫌気性条件等）に応じて決定してよい。好気性条件にて微生物を培養する場合、ガス放出部から放出するガスは、酸素含有ガスが好ましい。酸素含有ガスとしては、好気性条件にて微生物を培養するのに十分な酸素濃度を有する限り特に限定されず、例えば、空気、酸素濃化した空気、純酸素、及びこれらと不活性ガス（窒素等）との混合ガスが挙げられる。嫌気性条件にて微生物を培養する場合、ガス放出部から放出するガスとしては、酸素を実質的に含有しない限り特に限定されず、例えば、窒素、二酸化炭素、水素、メタン、一酸化炭素、及びこれらの混合ガスが挙げられる。
【００８４】
焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速、ドラフトチューブにおけるガス空塔速度の好適な範囲は、上記［ガス攪拌式発酵装置］に記載のとおりである。好適な一実施形態において、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速は、好ましくは０．０４ｍ／ｓ以下である。
【００８５】
本発明の方法は、化学物質を回収することをさらに含んでもよい。化学物質は、培養液に対する溶解度が低く、容易に分離・回収することが可能である。化学物質の種類に応じて、液体として化学物質を回収してもよく、気体として化学物質を回収してもよい。高純度の化学物質を得るべく、公知の方法により、精製・単離処理を行ってもよい。
【実施例】
【００８６】
調製例１：微好気誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ）及びリン酸欠乏誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭ，ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ）、アラビノース誘導型イソプレノイド化合物生成微生物（ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ）の構築
１−１）ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
１−１−１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号５、及び配列番号６にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号７に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。【００８７】
１−１−２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号８、及び配列番号９にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号１０に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。【００８８】
１−１−３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号１１と配列番号１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号１３と配列番号１４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号１５と配列番号１６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを鋳型として配列番号１７と配列番号１８に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号１１と配列番号１４に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号１５と配列番号１８に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（（株）ニッポンジーン製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。【００８９】
１−２−１）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。【００９０】
ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図４）。【００９１】
オペロンのプロモーター欠損バリアントを得るために、ｐＭＷ２１９−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、同じ組込み型ベクター中にサブクローニングした。得られたプラスミドのマップを、図５に示す。【００９２】
異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを構築した。この目的のために、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含むポリリンカーを、ｍｖａＥＳ遺伝子の上流に位置する唯一のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位中に挿入した。この目的を達成するために、プライマー１および２（表５）とポリヌクレオチドキナーゼを用いてアニーリングを行った。得られた二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ポリヌクレオチドキナーゼで５’リン酸化し、得られたリン酸化フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳプラスミドにライゲーション反応により挿入した。得られたｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳプラスミド（図６）は、ｍｖａＥＳ遺伝子の前で所望の配向性を保ちながらプロモーターをクローニングに都合が良いものである。ｌｌｄＤ、ｐｈｏＣおよびｐｓｔＳ遺伝子の調節領域を保持するＤＮＡフラグメントを、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ならびにプライマー３および４、プライマー５および６、ならびにプライマー７および８（表１）をそれぞれ用いて、ＰＣＲにより生成し、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳの適切な制限酵素認識部位中にクローニングした。得られたプラスミドを、図７に示す。クローニングされたプロモーターフラグメントの配列決定を行い、予想されるヌクレオチド配列に正確に対応することを確認した。【００９３】
１−２−２）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体固定用プラスミドの構築
ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを、プライマー９および１０（表１）、ならびにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ  ＬＡおよびＲｏｓｅ  ＲＥ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲが得られた（図８）。【００９４】
Ｐｔａｃプロモーターを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲベクター（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ認識部位に挿入した。その結果、染色体固定用発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃが構築された。クローニングしたプロモーターフラグメントの配列を決定し、設計通りの配列であることを確認した。ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃのマップを、図９に示す。【００９５】
ＡＴＧ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｇｅｎｅ（ロシア）により化学合成された、レアコドンを同義コドンに置換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙＩＤＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（図１０）を、染色体固定用ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ制限酵素認識部位中にサブクローニングした。化学合成されたＫＤｙＩオペロンを含むＤＮＡ配列を配列番号４３に示す。Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ発現カセットを保持する得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩを、図１１（Ａ）に示す。その後、薬剤耐性マーカー遺伝子を置換する目的でｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲにて対応するフラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを得た（図１１（Ｂ））。【００９６】
古典的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ［完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照］由来の推定ｍｖｋ遺伝子のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメントを、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。ｍｖｋ遺伝子を保持する染色体固定プラスミドのマップを、図１２に示す。【００９７】
１−３）レシピエント株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築
ａｔｔＬｐｈｉ８０およびａｔｔＲｐｈｉ８０に隣接したｋａｎ遺伝子、ならびに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージｐｈｉ８０  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存的な除去（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド［Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３］を鋳型として用いて、プライマー１１および１２、ならびにプライマー１３および１４（表１）をプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨおよびａｍｐＣ遺伝子領域への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。プライマー１５および１６、ならびにプライマー１７および１８（表１）を、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。【００９８】
並行して、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０  ３２０ｋｂメガプラスミド上に位置するｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）にしたがって行った。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、プライマー１９および２０（表１）を用いる反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と名付けた。プライマー２１および２２（表１）を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）。オリゴヌクレオチド２１および２２を、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図１３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示す。【００９９】
上記ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に組み込んだ。プラスミドの組込みを、プライマー２１および２３、ならびにプライマー２２および２４（表１）を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図１４（Ａ）に示す。
その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４）を介してＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の遺伝形質をＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０へ移行させた。得られた株はテトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＲＡをマーカーとして利用している。ｔｅｔＲＡマーカー遺伝子を含むｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分を、既報のｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミド［Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；１０：３４］を用いて除去した。その結果、マーカー遺伝子欠損株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図１４（Ｂ）に示す。【０１００】
１−４）ＳＷＩＴＣＨ株のセットの構築
ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがい、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３−ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍＲクローンを、プライマー１１および１５、ならびにプライマー１１および１７（表１）を用いたＰＣＲ反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０またはΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体改変物のマップを、図１５（Ａ）および（Ｂ）に示す。
ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ（ここで、Ｐｘは、以下の調節領域のうちの一つである：ａｒａＣ−Ｐａｒａ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＰｌｌｄＤ、ＰｐｈｏＣ、ＰｐｓｔＳ）を、既報のプロトコル［Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５−６０］にしたがってｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）およびＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ  Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株のａｔｔＢｐｈｉ８０部位に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−１およびＳＷＩＴＣＨ−Ｐｘ−２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｘ−ｍｖａＥＳ染色体改変物のマップを図１６に示す。【０１０１】
【表１】
2017115855.tif 000003
【０１０２】
１−５）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
常法に従いＳＷＩＴＣＨ菌のエレクトロコンピテントセルを作成し、エレクトロポレーションによりムクナ由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドであるｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（ＷＯ２０１３／１７９７２２）を導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐｌｌｄ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｓｔＳ／ＩｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ／ＩｓｐＳＭと命名した。【０１０３】
調製例２：ＳＣ１７（０）ΔｇｃｄとＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣΔｇｃｄの構築とイソプレンシンターゼの導入
Ｐ．アナナティスのｇｃｄ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼをコードしており、Ｐ．アナナティスは好気性増殖中にグルコン酸を蓄積することが知られている（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｍａｙ；３１８（１）：５５−６０）。
プライマーｇｃｄ−ａｔｔＬおよびｇｃｄ−ａｔｔＲ（表２）及び鋳型としてｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｋａｎ−ａｔｔＲプラスミドを用いるＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存的な組込み（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）により、ｇｃｄ遺伝子が破壊されたＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株を構築する。組込み体を確認するため、プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２（表２）を用いる。
ＳＣ１７（０）Δｇｃｄ株のゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ）を用いて単離し、既報の方法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがってＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ株のマーカーを含まない誘導体中に電気形質転換する。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−Δｇｃｄ（ＫｍＲ）株を得る。プライマーｇｃｄ−ｔ１およびｇｃｄ−ｔ２（表２）を、得られた組込み体のＰＣＲ解析に用いる。カナマイシン耐性マーカー遺伝子を、標準的なλＩｎｇ／Ｘｉｓ媒介手法〔Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩら，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４〕にしたがって得る。得られた株を、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株と命名する。
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株のコンピテントセルを標準的な方法にしたがって調製し、ムクナ由来のイソプレンシンターゼ発現用ベクターであるｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（ＷＯ２０１３／１７９７２２）をエレクトロポレーションにより導入した。得られたイソプレノイド化合物生成微生物を、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＩｓｐＳＭと命名した。【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
実施例１：  ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＩｓｐＳＭの培養評価
１）イソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株のジャー培養条件
イソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株の菌体増殖のため、ジャー培養を行う。ジャー培養には３Ｌ容積のガス攪拌式発酵装置（エイブル（株）製）を使用する。グルコース培地は表３に示す組成になるように調整する。前培養としてクロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにイソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ―ＰｐｈｏＣΔｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施する。２Ｌのグルコース培地を３Ｌ容積のガス攪拌式発酵装置に投入後、充分に増殖したプレート７枚分の菌体を接種し、培養を開始する。ガス攪拌式発酵装置は内部に配置されたドラフトチューブと、培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管とを含み、ガス供給管が平均細孔径５．０μｍの焼結金属膜からなるガス放出部を備える。培養条件は、ｐＨ６．８（アンモニアガスにて制御）、３４℃であり、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速が０．０３ｍ／ｓｅｃとなるように２．３Ｌ／ｍｉｎ（酸素濃度：２０％（ｖ／ｖ）の空気を培地中に供給する。ガルバニ式ＤＯセンサー（エイブル（株）製）を用いて培養液中の溶存酸素（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｉｇｅｎ，ＤＯ）濃度を測定し、４８時間培養を行う。培養中は、培地中のグルコース濃度が１５ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加する。【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
Ａ区とＢ区を１Ｌ調整後、１２０℃、２０ｍｉｎで加熱滅菌を行う。放冷後、Ａ区とＢ区を１：１で混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用する。【０１０８】
２）発酵排気ガス中の酸素とイソプレン濃度の測定方法
発酵排気ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製  Ｆ１０）を用いて測定する。発酵排気ガス中の酸素、炭酸ガス濃度はガス分析装置（エイブル（株）製  ＤＥＸ−１５６２Ａ）を用いて測定する。【０１０９】
実施例２：  ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ/ＩｓｐＳＭの培養評価
ガス攪拌式発酵装置を用いて、イソプレン生成微生物ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ/ＩｓｐＳＭ株の培養試験を実施した。培養には３Ｌ容積のガス攪拌式発酵装置（エイブル（株）製  ＢＭＡ−０２ＰＩ型）を使用した。該ガス攪拌式発酵装置は、培養槽と、培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管とを含み、ガス供給管が平均細孔径５．０μｍの焼結金属膜からなるガス放出部を備えた。培養槽の内径Ｄ１は７．６ｃｍ、ドラフトチューブの内径Ｄ２は５．５ｃｍ、培養槽の底部からのドラフトチューブの最上部の高さＨ２ｍａｘは３３．１ｃｍ、培養槽の底部からのドラフトチューブの最下部の高さＨ２ｍｉｎは９．８ｃｍであった。
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ/ＩｓｐＳＭ株のグリセロールストックを融解し、菌体懸濁液５０μＬを６枚の６０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、前培養として３４℃にて１６時間培養した。
次いで、発酵培地２．０Ｌをガス攪拌式発酵装置の培養槽に注入した。ここで、発酵培地は、表４記載のＡ区とＢ区をそれぞれ１Ｌ調製した後、１２０℃で２０分加熱滅菌を行い、放冷後、Ａ区とＢ区を１：１で混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加して調製した。得られた前培養プレート６枚分の菌体の全量を発酵培地に植菌し、培養を開始した。培養槽の底部からの培養液の液面高さＨＬは３４．８ｃｍであった。
培養温度は３４℃とし、焼結金属膜からなるガス放出部の放出ガス線速０．０３ｍ/ｓｅｃとなるように２．３Ｌ/ｍｉｎ（酸素濃度：２１％（ｖ／ｖ））の無菌空気を発酵培地中に供給した。発酵培地のｐＨはアンモニアガスを用いて６．８に制御し、ガルバニ式ＤＯセンサー（エイブル（株）製  ＳＤＯＵ−１０Ｌ１６０−１２５）を用いて発酵培地中のＤＯ濃度を測定しながら、２４時間培養を行った。植菌前の培養開始時のＤＯ濃度を２１％とし、飽和亜硫酸ナトリウム溶液中のＤＯ濃度を０％とした。ｐＨ調整用のアンモニアガスは、発酵装置上部からアンモニアガス供給専用のガス供給管を発酵培地に繋いで供給し、培養温度はシリコンラバーヒーターと冷却水を用いて制御した。培養中は、発酵培地中のグルコース濃度が２０ｇ/Ｌから４０ｇ/Ｌの範囲になるように、７００ｇ/Ｌに調整したディスホームＧＤ−１１３Ｋ  ０．０７ｍＬ/Ｌを含むグルコース培地を連続的に添加した。【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
培養開始後、適宜サンプリングし、Ｏ．Ｄ.値とグルコース濃度の分析を実施した。発酵排気ガス中のイソプレン濃度はマルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製  Ｆ１０）を用いて測定し、発酵排気ガス中の酸素、炭酸ガス濃度はガス分析装置（エイブル（株）製  ＤＥＸ―１５６２Ａ）を用いて測定した。Ｏ.Ｄ.値は分光光度計（（株）日立ハイテクサイエンス製  Ｕ−２９００）によって発酵ブロスを１０１倍に希釈した後、６００ｎｍで測定した。【０１１２】
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ株／ＩｓｐＳＭ株の培養終了時のＯ．Ｄ．値とイソプレン生成量を表５に示す。また、培養時のＯ．Ｄ．値とイソプレン生成量の経時変化のグラフをそれぞれ図１７（Ａ）、図１７（Ｂ）に示す。また、発酵培地中のＤＯ濃度の経時変化のグラフを図１８に示す。【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
２４時間の培養でＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ  Δｇｃｄ／ＩｓｐＳＭ株は３６４ｇのグルコースを消費し、イソプレンの生成量は４４０ｍｇであった。また、発酵培地中のＤＯ濃度は培養の全期間にわたって５％以上を維持した。この結果から、培養層と、培養槽の内部に配置されたドラフトチューブと、培養槽の内部へとガスを供給するガス供給管とを含み、ガス供給管が焼結金属膜からなるガス放出部を備えるガス攪拌式発酵装置を使用することで、化学物質（イソプレン）の製造が可能であることを実証した。
【符号の説明】
【０１１５】
１  培養槽
２  ドラフトチューブ
３  ガス供給管
４  焼結金属膜からなるガス放出部
５  培養液
１０  ガス攪拌式発酵装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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