(57)【要約】  本発明は、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドを含む代謝異常の予防または治療用組成物、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物、さらに、当該組成物を含む食品、医薬品、飼料等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物。
【請求項２】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物。
【請求項５】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物。
【請求項８】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
食品または食品添加物である、請求項１−８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬品である、請求項１−８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
飼料または飼料添加物である、請求項１−８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、代謝異常の予防または治療方法。
【請求項１３】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅方法。
【請求項１６】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下方法。
【請求項１９】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
代謝異常の予防または治療における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
【請求項２１】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項２０に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
【請求項２２】
代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２０または２１に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
【請求項２３】
腸管における短鎖脂肪酸量の増幅における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
【請求項２４】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項２３に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
【請求項２５】
短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２３または２４に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
【請求項２６】
腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
【請求項２７】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項２６に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
【請求項２８】
代謝異常の予防または治療用組成物を製造するための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
【請求項２９】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物の製造のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
【請求項３２】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３１または３２に記載の使用。
【請求項３４】
腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物の製造のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
【請求項３５】
ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、特に受託番号NITE BP-1519で寄託されたロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株またはその変異株が産生する菌体外多糖（エキソポリサッカライド（exopolysaccharide；EPSともいう））を有効成分として含む代謝異常の予防または治療用組成物または腸管における短鎖脂肪酸(Short-chain fatty acids:SCFA)量の増幅用組成物に関する。より詳細には、本発明は、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドの生理機能（体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下作用）を利用した、例えば、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症または脂肪肝などの予防または治療用組成物、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物または腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下用組成物に関する。また、本発明は、食品、医薬品または飼料等である当該組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、過食および運動不足等による肥満、特に内臓脂肪の蓄積を伴うメタボリックシンドロームが社会的問題となっている。メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満に、高血糖、高血圧、脂質異常症のうち２つ以上を合併し、動脈硬化が引き起こされやすくなった状態のことをいう。40〜74才の日本人、男性では２人に１人、女性では５人に１人が、メタボリックシンドローム及びその予備軍と推計されている。そのため、メタボリックシンドロームにおける脂質蓄積の進行防止・解消を目的に、食事療法により摂取カロリーの適正化を図ることの重要性が提唱されている。【０００３】
また最近、腸内細菌叢の変化が宿主のエネルギー調節や栄養摂取、免疫機能等に関与し、肥満や糖尿病等の病態に対して、直接影響することが明らかとなっている。発明者らは以前に、腸内細菌による発酵産物である短鎖脂肪酸がGPR41を介して交感神経を制御し、エネルギー消費を調節していること（非特許文献１）、短鎖脂肪酸が脂肪細胞のGPR43を介してインスリンシグナルを抑制することによってグルコース取り込みを抑制し、結果として脂肪蓄積を抑制していること、ならびに脂肪蓄積による肥満を抑制することで全身のインスリン感受性の低下を抑制していることを報告している（非特許文献２）。【０００４】
しかし、メタボリックシンドロームの予防や治療を目的として腸管における短鎖脂肪酸量を増加させるためには、適切に腸内細菌叢をコントロールする必要がある。そのためには、食習慣を含む生活様式を長期的に改善する必要があるため、より簡便かつ効率的な腸管における短鎖脂肪酸量の増幅方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】I. Kimura, et al., "Short-chain fatty acids and ketones directly regulate sympathetic nervous system via GPR41.", Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8030-8035 (2011).
【非特許文献２】I. Kimura, et al., "The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43", Nature Communications 4, 1829 (2013).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、腸管における短鎖脂肪酸量を増加させること等による、代謝異常の予防または治療用組成物または腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行なった結果、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドが従来知られていない生理機能である、体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を有することを見出した。【０００８】
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物。
［２］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［１］に記載の組成物。
［３］代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物。
［５］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［４］に記載の組成物。
［６］短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［４］または［５］に記載の組成物。
［７］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物。
［８］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［７］に記載の組成物。
［９］食品または食品添加物である、［１］−［８］のいずれか１項に記載の組成物。
［１０］医薬品である、［１］−［８］のいずれか１項に記載の組成物。
［１１］飼料または飼料添加物である、［１］−［８］のいずれか１項に記載の組成物。
［１２］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、代謝異常の予防または治療方法。
［１３］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［１２］に記載の方法。
［１４］代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅方法。
［１６］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［１５］に記載の方法。
［１７］短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下方法。
［１９］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［１８］に記載の方法。
［２０］代謝異常の予防または治療における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
［２１］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［２０］に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
［２２］代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［２０］または［２１］に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
［２３］腸管における短鎖脂肪酸量の増幅における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
［２４］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［２３］に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
［２５］短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［２３］または［２４］に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
［２６］腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下における使用のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライド。
［２７］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［２６］に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
［２８］代謝異常の予防または治療用組成物を製造するための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
［２９］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［２８］に記載の使用。
［３０］代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、［２８］または［２９］に記載の使用。
［３１］腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物の製造のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
［３２］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、［３１］に記載の使用。
［３３］短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種である、［３１］または［３２］に記載の使用。
［３４］腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物の製造のための、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）が産生するエキソポリサッカライドの使用。
［３５］ロイコノストック  メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である［３４］に記載の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明において、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドが、従来知られていなかった生理機能である体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を有することを見出した。本発明は、当該機能に基づき、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物または腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下用組成物を提供する。当該組成物は、医薬品、食品、飼料等、様々な分野において使用し得ることからも、本発明は、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた際の体重の推移を示す。
【図２】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた後の血糖値を示す。**:P<0.01
【図３】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた後の皮下脂肪組織重量を示す。*:P<0.05
【図４】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた後の精巣周囲脂肪組織重量を示す。*:P<0.05
【図５】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた後の腎臓周囲脂肪組織重量を示す。**:P<0.01
【図６】高脂肪食負荷マウスにEPSを摂取させた後の糞便中の短鎖脂肪酸量を示す。*:P<0.05、**:P<0.01
【図７】マウスにEPSを摂取させ、グルコース負荷した際の血糖値を示す。
【図８】高脂肪食負荷マウスにEPSを長期摂取させた際の体重の推移を示す。
【図９】高脂肪食負荷マウスにEPSを長期摂取させた後の糞便中の短鎖脂肪酸量を示す。
【図１０】高脂肪食負荷マウスにEPSを長期摂取させた後の糞便中のFirmicutes/Bacteroidetesを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ロイコノストック  メセンテロイデス（好ましくは、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株又はその変異株）が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物または腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下用組成物を提供する。
【００１２】
本発明において、エキソポリサッカライド（以下、本発明のエキソポリサッカライド）とは、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生する多糖類であり、ホモ多糖類及びヘテロ多糖類に分類することができる。ホモ多糖類は、単一の型の単糖から構成される。例えば、α-グルカン、β-グルカン、ガラクタン等が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロ多糖類は、2種類以上の異なる単糖の反復単位から構成される。反復単位を構成する単糖の種類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、フコース、グルクロン酸、非糖置換基（例えば、アセチル基、グリセロール等）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のエキソポリサッカライドは、グルコースを構成糖とするホモ多糖類でα-1,6結合を主鎖としα-1,3結合を分岐鎖とするα-グルカン、あるいはフルクトースを構成糖とするホモ多糖類でβ-2,1結合のフルクタンあるいはβ-2,6結合のフルクタンが好ましい。さらには、構成糖が官能基によって修飾されていてもよい。また、ロイコノストック  メセンテロイデスを培養し、分離することによって得られるエキソポリサッカライドの平均分子量は、公知の方法により求めることができ、例えば、GPC液体クロマトグラフィーやGFC液体クロマトグラフィーによる相対分子量測定法等を使用することができる。本発明のエキソポリサッカライドの分子量は、特に制限されるわけではないが、30,000〜50,000であることが好ましい。
【００１３】
本発明において、エキソポリサッカライドを産生するロイコノストック  メセンテロイデス（以下、本発明のロイコノストック  メセンテロイデス）は、特定の株に限定されないが、特に受託番号NITE BP-1519で寄託されたロイコノストック  メセンテロイデスNTM048株またはその変異株が好ましい。上記NTM048株は、２０１３年１月２５日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。また、上記変異株は、上記変異株が産生するエキソポリサッカライドの体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用が、NTM048株が産生するエキソポリサッカライドにおける当該作用と同等以上であるような変異株であることがより好ましい。変異の導入法としては、ニトロソ化合物（ニトロソアミン、ニトロソグアニジン等）、アルキル化剤（EMS；ethyl methanesulfonate）のような化学物質処理による方法、紫外線照射、放射線照射等が挙げられるが、これらに限定されない。得られた変異株が産生するエキソポリサッカライドが、NTM048株が産生するエキソポリサッカライドと同等以上の体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を示すか否かは、該変異株が産生するエキソポリサッカライドについて後述する代謝異常の指標を測定し、これをNTM048株が産生するエキソポリサッカライドで策定された結果と比較することにより検定することができる。
【００１４】
本発明のエキソポリサッカライドは、本発明のロイコノストック  メセンテロイデスを培養して製造することができる。本発明のロイコノストック  メセンテロイデスは、MRS培地などの乳酸菌培養用の培地（固形培地、又は液体培地等）を用いて培養することができる。
【００１５】
当該培地には、必要に応じて、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE等、又はこれらの誘導体も含む）、各種アミノ酸（天然アミノ酸又は合成アミノ酸も含む）、核酸塩基（プリン、ピリミジン）、無機塩類（MgSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl等）等を添加することができる。
【００１６】
本発明のロイコノストック  メセンテロイデスは、培養温度として、３０〜３７℃、より好ましくは３０〜３５℃、培養期間は、１６時間〜３日間、より好ましくは１〜２日間、pHは３〜８、より好ましくはpH４〜７で培養し、調製することができる。
【００１７】
培養液からのエキソポリサッカライドの分離法は、エキソポリサッカライドが得られれば特に限定はないが、培養液を遠心分離等により、上清と細胞とに分離し、該上清に酸（例えば、トリクロロ酢酸、過塩素酸等）又は有機溶剤（例えば、アセトン、メタノール、エタノール等）を添加してタンパク質を除去し、さらにアルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール等）を添加してエキソポリサッカライドを沈殿させて回収することができる。該沈殿はさらに精製（例えば、透析等）を行ってよい。前記分離法は、培養液、培養条件等に応じて、適宜調整することができる。
【００１８】
後述する実施例の通り、本発明のエキソポリサッカライドは、体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を示した。従って、本発明のエキソポリサッカライドは、代謝異常の予防または治療用組成物または腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物（以下、本発明の組成物）として使用することができる。
【００１９】
本発明において、「代謝異常」とは、脂質代謝、糖代謝及びエネルギー代謝からなる群から選択される少なくとも１つの代謝の異常をいう。
脂質代謝の異常とは、体組織、血中、又はリンパ組織中に存在する脂質の分解が過度に抑制される状態、脂質の合成が過度に促進される状態、および該脂質分解抑制と脂質合成促進の結果、脂肪組織等の体組織へ脂質が過度に蓄積される状態をいう。ここで「脂質」とは、中性脂肪（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド）、コレステロール（特に、LDLコレステロール）をいう。
糖代謝の異常とは、空腹時血糖値が過度に上昇する状態、食事後の糖代謝が過度に抑制される状態をいう。さらに、糖代謝の異常には、耐糖能異常も含まれる。ここで「糖」とは、単糖、二糖または多糖をいう。
エネルギーの代謝異常とは、摂取エネルギー量及び放出エネルギー量のバランスが、異常である状態又は正常に調節できない状態をいう。
【００２０】
本発明における「代謝異常」としては、具体的には、肥満（成人肥満、小児肥満）、糖尿病（例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、妊婦糖尿病、糖尿病合併症（動脈硬化症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）など）、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症（高脂血症）（例えば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高LDLコレステロール血症、低HDLコレステロール血症）、脂肪組織（例えば、皮下脂肪、腹腔内脂肪）の増加、脂肪肝などが挙げられる。また本発明の「代謝異常」には、生活習慣病も含まれ得る。「生活習慣病」とは、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症、進行に関与する疾患群をいい、栄養失調症、拒食症、胃がん、大腸がん、痛風、高血圧、腎臓結石、心筋梗塞、狭心症、胃潰瘍、腎臓病、骨粗しょう症、歯周囲炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝臓がん、肺がん、気管支炎、肺気腫、歯周病、脳卒中、脳梗塞、動脈瘤、過労死、不眠症等が挙げられる。
【００２１】
前記代謝異常の指標として、腸管における短鎖脂肪酸の量を用いることができる。本発明の短鎖脂肪酸としては、炭素数が６以下の脂肪酸が挙げられ、そのような短鎖脂肪酸としては、例えば、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸（より好ましくは、乳酸、酢酸およびプロピオン酸）等が挙げられ、これらは日々のエネルギー利用において重要な部分を占める。発明者らは以前に、腸内細菌による発酵産物である短鎖脂肪酸が脂肪酸受容体GPR41を介して、交感神経を直接的に調整することを明らかにしている。GPR41は交感神経節という交感神経細胞の集合体に豊富に存在し、短鎖脂肪酸はこのGPR41を介して交感神経を活性化し、エネルギー消費を増大させる。また、発明者らは、短鎖脂肪酸が脂肪細胞の脂肪酸受容体GPR43を介してインスリンシグナルを抑制することによってグルコース取り込みを抑制し、結果として脂肪蓄積を抑制していること、ならびに脂肪蓄積による肥満を抑制することで全身のインスリン感受性の低下を抑制していることを報告している。従って、腸管における短鎖脂肪酸量を測定することによって、代謝異常の程度や治療効果を評価することができる。より具体的には、腸管における短鎖脂肪酸量が代謝異常の治療前より増加している場合、代謝異常が改善していると判断することができる。
【００２２】
または、代謝異常の指標として、高脂肪食を摂取させた動物の体重、皮下または臓器周囲の脂肪重量、血糖値を用いることができる。高脂肪食を摂取させる動物としては、当該性質を示す動物であれば限定されない。例えば、前記モデル動物として、市販のC57BL/6Jマウス、 KKAyマウス、NODマウス、NSYマウス、TSODマウス、ZDF/Crl-Leprfaラット、SDT/Jclラット等が挙げられる。従って、体重、皮下または臓器周囲の脂肪重量または血糖値を測定することによって、代謝異常の程度や治療効果を評価することができる。より具体的には、体重、皮下または臓器周囲の脂肪重量または血糖値が代謝異常の治療前より減少している場合、代謝異常が改善していると判断することができる。一方、体重、皮下または臓器周囲の脂肪重量または血糖値が代謝異常の治療前より増加している場合、代謝異常が増悪していると判断することができる。
【００２３】
あるいは、代謝異常の指標として、腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合を用いることができる。ヒトの腸内には100兆以上の細菌が存在しており、その約90%がフィルミクテス門及びバクテロイデーテス門に分類される。フィルミクテス門はさらに、Bacilli、Clostridia、及びErysipelotrichiaの綱に分類され、Bacillus、Alicyclobacillus、Listeria、Paenibacillus、Pasteuria、Planococcus、Sporolactobacillus、Staphylococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Aerococcus、Carnobacterium、Enterococcus、Leuconostoc、Weissella、Streptococcus、Lactococcus、Clostridium、Eubacterium、Gracilibacter、Heliobacterium、Peptococcus、Peptostreptococcus、Ruminococcus、Syntrophomonas、Veilonella、Anaerococcus、Acidaminobacter、Anaerovorax、Anaerobranca、Aminobacterium、Carboxydocella、Sulfobacillus、Symbiobacterium、Acetoanaerobium、Halanaerobium、Caldicellulosiruptor、Erysipelothrixなどの属の細菌が含まれる。バクテロイデーテス門はさらに、Bacteroidetes、Flavobacteria、及びSphingobacteriaの綱に分類され、Bacteroides、Fusobacterium、Flavobacteria、Sphingobacteriumなどの属の細菌が含まれる。
腸内細菌叢の大部分を構成するフィルミクテス門に属する細菌及びバクテロイデーテス門に属する細菌は肥満との関連性があり、肥満の個体ではフィルミクテス門に属する細菌が多く、バクテロイデーテス門に属する細菌が少ないことが知られている。従って、腸内細菌叢を解析して求められるFirmicutes/Bacteroidetesは、代謝異常の程度や治療効果を評価することができる。より具体的には、腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合が代謝異常の治療前より低下している場合、代謝異常が改善していると判断することができる。
【００２４】
本発明の組成物は、例えば、医薬品、食品、飼料等として、あるいはそれらに配合して使用することができる。
【００２５】
本発明の組成物を医薬品として使用する場合、当該医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。
【００２６】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラワー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料等を挙げることができる。なお、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。
【００２７】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。
【００２８】
本発明の組成物を食品もしくは食品添加物として使用する場合、当該食品は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。
【００２９】
上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
【００３０】
本発明の組成物を飼料もしくは飼料添加物として使用する場合、当該飼料としては、ペットフード、畜産又は水産養殖飼料添加物等が挙げられる。
【００３１】
本発明の組成物を投与するまたは摂取させる対象としては、ヒト、又はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ニワトリ、インコ、九官鳥、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。
【００３２】
本発明の組成物の投与または摂取量は、投与または摂取対象、対象疾患、症状、投与または摂取ルートなどによっても異なるが、例えば、本発明の組成物に含まれるエキソポリサッカライドを1日投与または摂取量として、通常、0.5μg〜30g、好ましくは、5μg〜10g、より好ましくは、50μg〜5gを、経口的または非経口的に投与または摂取することができる。投与または摂取は１日に複数回に分けてもよい。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００３３】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
培地、菌株
培地： MRS培地（Difco社製）
菌株：NTM048株［えんどう豆から単離した（受託番号：NITE BP-1519、寄託日：2013年1月25日）］、JCM6124株（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）［独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）より購入した。］【００３５】
エキソポリサッカライド（EPS）の産生と精製方法
EPSの抽出はthe production and purification method for EPS of L. mesenteroides strain(Sarwat,Ul Qader,Aman,&Ahmed,2008)に従い行った。
一晩培養したロイコノストック  メセンテロイデス培養液500μLをEPS産生用培地50mL（組成：15% sucrose、0.5%bacto-peptone、0.5% yeast extract、1.5% K2HPO4、0.001% MnCl2・H2O、0.001% NaCl、 0.005% CaCl2）に添加し、30℃で24時間培養した後、遠心分離して菌体を取り除いた。上清と同量の冷エタノールを添加して沈殿させ、激しく振とうした後、10,000rpmで15分間遠心分離し上清を取り除いた。この工程を２回繰り返した。沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。不純物を取り除くために、蒸留水にEPSの沈殿物を溶かし、再びその懸濁液と同量の冷エタノールを添加して沈殿させた。この工程を２回繰り返し、沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。このEPSを高脂肪食マウスにおける効果の測定に使用した。NTM048株より産生したEPSを「NTM048-EPS」、JCM6124T株より産生したEPSを「JCM6124T-EPS」と示す。【００３６】
実施例１  高脂肪食マウスにおけるEPSの効果
高脂肪食を与えたマウスにおけるロイコノストック  メセンテロイデス由来EPSの体重、脂肪組織および血糖値に対する効果を評価した。C57BL/6Jマウス（オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した）を、市販の普通飼育飼料（ND）で2週間予備飼育した後、3群に分け、それぞれに、高脂肪飼料（HFD）を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10％になるように配合した飼料（Control群用）、基本飼料にNTM048-EPSが5％及びCelluloseが5％になるように配合した飼料（NTM048群用）、基本飼料にJCM6124T-EPSが5％及びCelluloseが5％になるように配合した飼料（JCM6124T群用）を17日間投与し、飼育した。各群のC57BL/6Jマウスの体重の推移を図１に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも体重増加の抑制が認められた。また、飼育17日目に血糖値を測定し、各群のC57BL/6Jマウスを解剖後、皮下脂肪組織、精巣周囲脂肪組織、腎臓周囲脂肪組織をそれぞれ測定した。各群のC57BL/6Jマウスの血糖値を図２に示す。NTM048群においてControl群よりも血糖値の有意な低下が認められた。また、JCM6124T群においても、Control群に比べて血糖値の低下傾向が認められた。また、皮下脂肪組織重量（図３）及び精巣周囲脂肪組織重量（図４）においても、NTM048群においてControl群よりも有意な低下が認められ、JCM6124T群においても、Control群に比べて低下傾向が認められた。腎周囲脂肪組織重量（図５）ではNTM048群とJCM6124T群のいずれもControl群よりも有意に低い結果が得られた。【００３７】
実施例２  高脂肪食マウスにおける糞便中短鎖脂肪酸の測定
ロイコノストック  メセンテロイデス由来EPSおよび高脂肪食を与えたマウスの糞便中に産生された短鎖脂肪酸を測定した。実施例１と同様に、C57BL/6Jマウスを、市販の普通飼育飼料（ND）で2週間予備飼育した後、3群に分け、それぞれに、高脂肪飼料（HFD）を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10％になるように配合した飼料（Control群用）、基本飼料にNTM048-EPSが10％になるように配合した飼料（NTM048群用）、基本飼料にJCM6124T-EPSが10％になるように配合した飼料（JCM6124T群用）を投与し17日間飼育した。飼育17日目の糞便を採取し、短鎖脂肪酸（SCFAs：乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）を測定した。C57BL/6Jマウスの糞便中の短鎖脂肪酸（SCFAs）はYMC社製「高速液体クロマトグラフィー用長鎖・短鎖脂肪酸分析用ラベル化試薬」を用いて測定した。採取したマウス糞便0.1gに対し、蒸留水0.2mL、12%過塩素酸0.03mLを添加し懸濁後、遠心分離し (14000 rpm, 1min)、上層100μL を採取した。1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (1-EDC/HCL)存在下、これに2-nitrophenyl-hydrazine hydrochloride(2-NPH/HCL)を反応させ、ヘキサンおよびエーテルにて抽出し、得られたサンプルをHigh-performance liquid chromatography (HPLC) 装置にて測定した。HPLC条件は以下の通りである。
HPLC条件
・測定装置：SCL-10Av および SPD-20A (Shimadzu Seisakusho, Kyoto, Japan)
・カラム：YMC-Pack FA（脂肪酸分析専用カラム）
・アセトニトリル：メタノール：水＝22：8：70
・流速：1.0ml/min 
・分析時間：30分
・検出感度：UV at 400nm
・温度：50℃
C57BL/6Jマウスの糞便について短鎖脂肪酸（SCFAs：乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）の測定結果を図６に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも短鎖脂肪酸量が多いことが認められた。【００３８】
実施例３  マウスにおける食後過血糖値に対するＥＰＳの効果
ロイコノストック  メセンテロイデス由来EPSの食後高血糖に対する効果を評価した。C57BL/6Jマウス（オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した）を、市販の普通飼育飼料（ND）で予備飼育した後、3群に分け、24時間絶食させた後、それぞれに、Celluloseを含まない飼料を基本飼料として、基本飼料0.1g（Control群用）、基本飼料0.1gにCellulose 0.1gを配合した飼料0.2g（Cellulose群用）、基本飼料0.1gにNTM048-EPS 0.1gを配合した飼料0.2g（NTM048群用）を与えた。その後、グルコース溶液（300mg/mL）を100μL/20g体重で経口投与し、経時的（グルコース負荷後0, 15, 30, 60, 120分後）に血糖値を測定した。各群のC57BL/6Jマウスの血糖値の推移を図７に示す。NTM048群において、グルコース投与後15分および60分でCellulose群よりも血糖値が低い結果が得られた。【００３９】
実施例４  高脂肪食マウスにおけるEPSの効果
C57BL/6Jマウス（オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した）を、市販の普通飼育飼料（ND）で2週間予備飼育した後、3群に分け、高脂肪飼料（HFD）を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10％になるように配合した飼料（Control群用）、基本飼料にNTM048-EPSが10％になるように配合した飼料（NTM048群用）、基本飼料にJCM6124T-EPSが10％になるように配合した飼料（JCM6124T群用）を、それぞれ16週間投与し飼育した。実施例１と同様に、各群のC57BL/6Jマウスの体重の推移を図８に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも体重増加の抑制が認められた。
また、飼育16週目の糞便を採取し、実施例２と同様に、短鎖脂肪酸（SCFAs：酢酸、プロピオン酸、酪酸）を測定した。C57BL/6Jマウスの糞便について短鎖脂肪酸（SCFAs：酢酸、プロピオン酸、酪酸）の測定結果を図９に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも短鎖脂肪酸量が多いことが認められた。
さらに、同じく飼育16週目に採取した糞便の菌叢を解析した。糞便からDNAを抽出及び精製し、バクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌の測定には5´-CRAACAGGATTAGATACCCT-3´（配列番号：１）及び5´-GGTAAGGTTCCTCGCGTAT-3´（配列番号：２）を共通のプライマーとして用いて、フィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の測定には5´-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3´（配列番号：３）及び5´-AGCTGACGACAACCATGCAC-3´（配列番号：４）を共通のプライマーとして用いてリアルタイムPCRを実施し、バクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合（Firmicutes/Bacteroidetes）を測定した（図10）。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりもFirmicutes/Bacteroidetesが低下した。【００４０】
以上の結果から、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドは体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を有することが示された。特に、NTM048株が産生するエキソポリサッカライドは代謝異常の改善作用が強いことが示された。【００４１】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドの生理機能として、従来知られていない、体重増加に対する抑制作用、脂肪組織増加に対する抑制作用、血糖値上昇に対する抑制作用、腸管における短鎖脂肪酸量の増加作用および腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下作用を有することを明らかにした。当該ロイコノストック  メセンテロイデスが産生するエキソポリサッカライドを含む代謝異常の予防または治療用組成物、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物または腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合の低下用組成物は、医薬品、食品、飼料等様々な分野へ適用可能であり、本発明は産業上極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願２０１６−０３２８８９（出願日：平成２８年２月２４日）および特願２０１６−１３４９９７（出願日：平成２８年７月７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
2017146213.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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