(57)【要約】【課題】本発明の目的は、Ｌ−ＦＡＢＰの免疫学的測定において非特異反応が発生する可能性を低下させ、より正確で感度の良い測定法を提供することにある。さらに詳しくは、測定対象物が低濃度（例えば、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近）の場合であっても、正確で感度のよい測定方法を提供することにある。【解決手段】抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰの免疫学的測定方法において、配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを存在させることによって、高感度な測定であっても容易に非特異反応を抑制できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）を、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により検出する方法であって、
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が固定化された粒子、
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び
配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
を接触させる工程を含む前記方法。
【請求項２】
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物が、下記式（１）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（２）で表される化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である請求項１に記載の方法。
式（１）
【化１】
2016136917.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基であり、Ｒ２〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は−ＳＲ７（Ｒ７は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ７が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）を示す］の化合物もしくはその塩又はエステル。
式（２）
【化２】
2016136917.tif 000012
「式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基であり、
Ｘ１１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１であり、
Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎの値並びにＸ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線の結合は、Ｘ１１〜Ｘ１３の原子価と整合して定まる値及び結合を示す］化合物又はその塩。
【請求項３】
式（２）で表される化合物又はその塩が、以下の化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である請求項２に記載の方法。
式（２）
【化３】
2016136917.tif 000013
［式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基を示す］において、
Ｘ１１〜Ｘ１３、ｌ１+ｌ２、ｍ１+ｍ２、ｎ（ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を表す）及び二重破線の組み合わせは、
（ａ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｂ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｃ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｄ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｅ）Ｘ１１及びＸ１２は窒素原子、Ｘ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は二重結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、又は、
（ｆ）Ｘ１１及びＸ１２及びＸ１３は窒素原子であり、ｌ１+ｌ２は０、ｍ１+ｍ２は０、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩。
【請求項４】
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物が、ベンズアミジン、2-アミノ-2-チアゾリンのいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドとを接触させる工程が、
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物と前記ポリペプチドを接触させる工程の後、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と接触させる工程の順で行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物と前記ポリペプチドを接触させる工程における、前記ポリペプチドの濃度が、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３６ｍｍｏｌ／Ｌである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
粒子が、ラテックス粒子である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
互いに認識部位が異なる二種以上の抗Ｌ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法によりＬ−ＦＡＢＰを検出する、請求項７又は８に記載の方法
【請求項１０】
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体の、一方のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、他方のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、イムノクロマトグラフィーによりＬ−ＦＡＢＰを検出する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
試料が、尿、全血、血清又は血漿である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試料中のＬ−ＦＡＢＰを、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により検出するための粒子免疫測定法用試薬であって、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む前記試薬。
【請求項１３】
試料中のＬ−ＦＡＢＰを粒子免疫測定法により検出する方法において、Ｌ−ＦＡＢＰを含むことが疑われる試料と測定用試薬との混合液中に、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれていることを特徴とする、Ｌ−ＦＡＢＰ健常値付近における非特異反応の回避方法。
【請求項１４】
試料中のＬ−ＦＡＢＰを粒子免疫測定法により検出する方法において、Ｌ−ＦＡＢＰを含むことが疑われる試料と測定用試薬との混合液中に、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれていることを特徴とする、Ｌ−ＦＡＢＰ健常値付近における測定値を安定化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いた、Ｌ−ＦＡＢＰの免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ：fatty acid binding protein）は、サイトゾルに存在し、脂肪酸と結合する能力を有する分子量約１４キロダルトンの蛋白質群で、肝臓型（Ｌ−ＦＡＢＰ）、腸型（Ｉ−ＦＡＢＰ）、心筋型（Ｈ−ＦＡＢＰ）、脳型（Ｂ−ＦＡＢＰ）、皮膚型（Ｃ−ＦＡＢＰ/Ｅ−ＦＡＢＰ）、脂肪細胞型（ａＰ２）、末梢神経細胞型（ミエリンＰ２）等、少なくとも７つの分子種が知られており、これらは共通の祖先遺伝子から進化したファミリーであると考えられている。各型のＦＡＢＰは特異的な組識分布を示す一方で、その名称は、最初に見出された組織を意味しており、その組織にしか存在しないことを必ずしも意味していない。例えば、ヒトの腎臓組織中では、肝臓型（Ｌ−ＦＡＢＰ）と心筋型（Ｈ−ＦＡＢＰ）の少なくとも二種類のＦＡＢＰが発現しており、これらのうちＬ−ＦＡＢＰは近位尿細管に分布し、Ｈ−ＦＡＢＰは主として遠位尿細管に分布している（Maatmanら、Biochemical Journal、第288巻、第285-290頁、1992年；Maatmanら、Biochemical Journal、第273巻、第759-766頁、1991年）。【０００３】
Ｌ−ＦＡＢＰは、組織障害が進行する前の尿細管の虚血（血流不全）や尿細管への酸化ストレスにより、尿中に排泄される。尿中Ｌ−ＦＡＢＰは、ヒト腎生検組織の間質尿細管障害の程度と相関し、尿細管障害を反映するマーカーである（Kamijoら、Am J Pathol、 第165巻、第4号、第1243-1255頁、2004年）。腎疾患の進行及び予後は、糸球体病変の程度より間質尿細管障害の程度と相関することが、古くから知られており（Risdonら、Lancet、第2巻、第363-366頁、1968年）、尿細管障害のマーカーである尿中Ｌ−ＦＡＢＰは、腎疾患の予後を推測するのに有用である。【０００４】
特許文献１には、腎組織中におけるＬ−ＦＡＢＰの発現と腎疾患の予後との関連性に着目し、被検試料中に存在する、腎臓組織由来の脂肪酸結合蛋白質を検出することを特徴とする、腎疾患の検査方法が開示されている。より具体的には、抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体を用い、腎疾患患者から採取した尿をサンプルとして、尿中に漏出しているＬ−ＦＡＢＰ量を免疫学的測定法であるサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した例が記載されている。免疫学的測定法においては、反応系の微量化や測定時間の短縮、測定感度を向上させることなどが重要な課題であり、Ｌ−ＦＡＢＰの測定においても測定感度の向上が望まれる。しかし、特許文献１には、詳細な測定条件（試料の処理や抗原抗体反応の条件）や検出感度、測定値等については記載されていない。【０００５】
免疫測定法の測定感度を向上させる方法としては、測定領域の検出上限を上げる方法と、検出下限を下げる方法がある。免疫測定法は、特異性の高さと感度の良さを特徴としているが、一方で抗原と抗体の特異的な反応の検出を妨害する種々の干渉が存在することも知られている。これらの干渉による非特異反応は測定値の正確性を損ね、真値とは異なる測定値を示すという問題がある。検出下限を下げて高感度化する（低濃度域まで正確に測定する）には、上記のような非特異反応を抑える必要がある。【０００６】
特許文献２には、非特異反応を抑制し、特に低濃度領域にて既存試薬を用いた場合の測定結果との相関を向上させることを目的として、ポリカルボン酸型界面活性剤の存在下で抗原抗体反応及び／又は測定を行う免疫学的測定法が示されている。【０００７】
また、特許文献３には、ブランクの測定値のばらつきを抑え且つブランク測定値を低下させ、被検物質の低濃度域における測定精度を高める目的で、反応系内にポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを共存させる免疫学的測定法が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２４２０２６号公報
【特許文献２】特開２０１３−２０５４０８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１０／１１３９４３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、Ｌ−ＦＡＢＰの免疫学的測定において非特異反応が発生する可能性を低下させ、より正確で感度の良い測定法を提供することにある。さらに詳しくは、測定対象物が低濃度（例えば、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近）の場合であっても、正確で感度のよい測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討の結果、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰの免疫学的測定方法において、配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを存在させることによって、高感度な測定であっても容易に非特異反応を抑制できることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］
試料中のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）を抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により検出する方法、又は、試料中のＬ−ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合蛋白質）を抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により検出する方法において測定値を安定化させる方法であって、
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が固定化された粒子、
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び
配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
を接触させる工程を含む前記方法。
［２］
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物が、下記式（１）で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式（２）で表される化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である［１］に記載の方法。
式（１）
【化１】
2016136917.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基であり、Ｒ２〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は−ＳＲ７（Ｒ７は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ７が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）を示す］の化合物もしくはその塩又はエステル。
式（２）
【化２】
2016136917.tif 000003
「式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基であり、
Ｘ１１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１であり、
Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎの値並びにＸ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線の結合は、Ｘ１１〜Ｘ１３の原子価と整合して定まる値及び結合を示す］化合物又はその塩。
［３］
式（２）で表される化合物又はその塩が、以下の化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である［２］に記載の方法。
式（２）
【化３】
2016136917.tif 000004
［式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基を示す］において、
Ｘ１１〜Ｘ１３、ｌ１+ｌ２、ｍ１+ｍ２、ｎ（ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を表す）及び二重破線の組み合わせは、
（ａ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｂ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｃ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｄ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｅ）Ｘ１１及びＸ１２は窒素原子、Ｘ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は二重結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、又は、
（ｆ）Ｘ１１及びＸ１２及びＸ１３は窒素原子であり、ｌ１+ｌ２は０、ｍ１+ｍ２は０、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩。
［４］
分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物が、ベンズアミジン、2-アミノ-2-チアゾリンのいずれかであることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［５］
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドとを接触させる工程が、
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物と前記ポリペプチドを接触させる工程の後、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と接触させる工程の順で行われる［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物と前記ポリペプチドを接触させる工程における、前記ポリペプチドの濃度が、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３６ｍｍｏｌ／Ｌである［５］に記載の方法。
［７］
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、［１］〜［６］に記載の方法。
［８］
粒子が、ラテックス粒子である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
互いに認識部位が異なる二種以上の抗Ｌ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法によりＬ−ＦＡＢＰを検出する、［７］又は［８］に記載の方法
［１０］
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体の、一方のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、他方のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、イムノクロマトグラフィーによりＬ−ＦＡＢＰを検出する、［７］に記載の方法。
［１１］
試料が、尿、全血、血清又は血漿である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
試料中のＬ−ＦＡＢＰを、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体により検出するための粒子免疫測定法用試薬であって、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む前記試薬。
［１３］
試料中のＬ−ＦＡＢＰを粒子免疫測定法により検出する方法において、Ｌ−ＦＡＢＰを含むことが疑われる試料と測定用試薬との混合液中に、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれていることを特徴とする、Ｌ−ＦＡＢＰ健常値付近における非特異反応の回避方法。
［１４］
試料中のＬ−ＦＡＢＰを粒子免疫測定法により検出する方法において、Ｌ−ＦＡＢＰを含むことが疑われる試料と測定用試薬との混合液中に、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び配列番号１に記載される大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列の４１９番目から６０７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれていることを特徴とする、Ｌ−ＦＡＢＰ健常値付近における測定値を安定化させる方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高感度な免疫学的測定法においても反応系由来の非特異反応を抑制することができるため、より正確で感度の良い免疫学的測定法を提供することができる。例えば、尿中Ｌ−ＦＡＢＰ測定における健常値（例えば、２．２±２．３μｇ／ｇＣＲ。レナプロ（登録商標）Ｌ−ＦＡＢＰテストＴＭＢ添付文書より）付近の検体をより正確に測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳述する。
【００１４】
（試料）
本発明に用いる試料としては、尿、血液（全血、血漿又は血清）、腎組織、腎組織からの抽出液等が挙げられる。これらのうち、特に尿が好適な試料である。Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料であれば、健常者由来の試料、患者由来の試料、罹病を疑われる者由来の試料等、いずれの試料も用いることができる。
【００１５】
（抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体）
本発明に用いる抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は、臓器、細胞、体液等から精製した天然のＬ−ＦＡＢＰを免疫原（抗原）として調製することができる。Ｌ−ＦＡＢＰは、主に肝臓又は腎臓に分布しているので、それらの臓器等から精製、単離することができる。また、Ｌ−ＦＡＢＰは、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット間でホモロジーが高く、アミノ酸レベルで９０％以上のホモロジーがあることが知られているので、ヒトのＬ−ＦＡＢＰと結合する抗体を得るために、例えばマウスＬ−ＦＡＢＰを抗原として用いることもできる。
【００１６】
天然のＬ−ＦＡＢＰの精製は、Kelvinらの文献（J. Biol. Chem.、第263巻、第15762-15768頁、1988年）記載の方法等に準じて実施できる。すなわち、摘出した臓器をホモジナイズした後、超遠心して得られる細胞質画分を、ゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により分画し、分子量や脂肪酸結合活性を指標としてＬ−ＦＡＢＰを含有する画分を選択して単離、精製する。前記選択された画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、精製蛋白質が単一のバンドとなっていること確認し、必要であればさらに精製を行う。精製蛋白質について、アミノ酸組成やＮ末端側アミノ酸配列を決定し、報告された組成や配列と比較することにより、目的とする分子種であることを確認できる。
【００１７】
抗原として用いるＬ−ＦＡＢＰは、遺伝子工学的手法によって製造されたリコンビナント蛋白質であってもよい。Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Veerkamp and Maatman、Prog. Lipid Res.、第34巻、第17-52頁、1995年）ので、例えば、それらをもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングすることができる。これを用いて遺伝子組換えを行うことにより、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰを調製することができる。また、抗原として、Ｌ−ＦＡＢＰの断片、又はその部分配列を有する合成ペプチド等を、必要に応じてキャリア高分子物質（ＢＳＡ、ヘモシアニン等）と結合させて用いることもできる。
【００１８】
Ｌ−ＦＡＢＰと特異的に結合する抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等のいずれであってもよい。
【００１９】
抗体は、高い特異性を有するものが好ましく、例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であれば、Ｈ−ＦＡＢＰとは実質的に交差反応しないことが望ましい。より特異性の高い抗体を取得するためには、より高度に精製され純度の高い抗原を用いることが望ましい。抗体の調製に際しては、ヒト以外の温血動物に、前記のごとく調製した精製抗原を接種して免疫する。免疫するヒト以外の温血動物としては、哺乳動物（ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ブタ等）、鳥類（ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）が挙げられる。ウサギの場合、例えば、抗原 １００μg〜１ｍｇ程度を約１ｍＬの生理食塩水及びフロイントの完全アジュバント中に乳化したものを、背部又は後肢掌皮下に接種し、２回目以降はアジュバントをフロイントの不完全アジュバントにかえて、これを２〜４週間おきに３〜８回接種して免疫し、最終接種の約７〜１２日後に産生された抗体を使用する。マウスの場合、１ 回あたり１０〜３０μg／匹の抗原を、通常、皮下、腹腔内、静脈内に、約２週間隔で３〜８回接種して免疫し、最終接種の約２〜４日後に産生された抗体を使用する。
【００２０】
ポリクローナル抗体は、前記のように免疫した動物から採血し、血清（抗血清）を分取して、得られた抗血清からＩｇ画分を回収して調製できる。例えば、抗血清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー等によりＩｇＧ画分を回収してポリクローナルＩｇＧを得ることができる。
【００２１】
モノクローナル抗体は、免疫動物から採取した抗体産生細胞を、不死化細胞と融合させて得られるハイブリドーマにより産生される。モノクローナル抗体のための免疫動物としてはマウス及びラットが好適に用いられる。ハイブリドーマの作製は、ケーラー及びミルシュタインの方法（Kohler & Milstein、Nature、第256巻、第495〜897頁、1975年）に準じて以下のように実施できる。前記のように免疫した動物から抗体産生細胞（例えば脾細胞又はリンパ節細胞等）を採取し、これを適当な不死化細胞と細胞融合させる。不死化細胞としては、例えば骨髄腫細胞の細胞株（NSI- Ag4/1、Sp2/O-Agl4等）が好適に用いられる。骨髄腫細胞は、それ自身が抗体又は免疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖を産生しない非分泌型であることが好ましい。また、未融合の骨髄腫細胞と融合したハイブリドーマとを選択培地中で選別し得るような選択マーカーを有していることが好ましい。例えば選択マーカーとして、8-アザグアニン耐性（ヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損）、チミジンキナーゼ欠損等を有する細胞株がよく使用される。細胞融合は、ポリエチレングリコール等、適当な融合促進剤を添加して行う。細胞融合は、不死化細胞当たり約１０の抗体産生細胞となる比率で行うことが好ましく、またおよそ抗体産生細胞１０6個／ｍＬの細胞密度で好適に実施できる。
【００２２】
融合処理した細胞を、適当に希釈した後、選択培地中で１〜２週間培養する。例えば、8-アザグアニンに耐性の骨髄腫細胞を用いる場合、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中で培養すると、未融合骨髄腫細胞は死滅し、また未融合の抗体産生細胞も分裂サイクルが限られているため死滅するが、融合細胞だけは選択培地中で分裂を続け生存できる。選択培地中での培養後、その上清について例えば抗原を固相に固定化したＥＬＩＳＡ等を行って目的とする抗体の有無を検出し、限界希釈法によってクローニングすることにより、目的抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択できる。選択に際しては、抗体価、抗体のクラス、サブクラス、抗原との親和性、特異性、エピトープ等、所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。モノクローナル抗体のクラスとしては一般にＩｇＧが好ましい。
【００２３】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、免疫に使用した動物と同種の動物の腹腔内に移植し、一定期間経過後、当該動物から腹水を採取し、目的のモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、ハイブリドーマを適当な動物細胞培養用の培地中で培養し、その培養液からモノクローナル抗体を単離することもできる。また、一旦目的のハイブリドーマを得たら、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を取得し、通常の遺伝子組換え技術により適当な宿主（例えばカイコ等）において目的のモノクローナル抗体を発現させ産生させることができる。抗体の分離・精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を必要に応じて組合せた通常の精製法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明に使用される抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体は、公知の抗体であってもよく、今後開発される抗体であってもよい。特に限定されないが、市販の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体である、Santa Cruz Biotechnology社のC-4（カタログＮｏ．sc-374537）、F-9 （カタログＮｏ．sc-271591）、R&D systems社の328607（カタログＮｏ．MAB2964）、Hycult biotech社のL2B10（カタログＮｏ．HA2049-IA）、Lifespan Biosciences社の2G4（カタログＮｏ．LS-B3001）等が利用可能である。これらの抗体は、ヒト由来Ｌ−ＦＡＢＰ蛋白質の内部領域やＮ末端領域等のポリペプチドと結合するが、本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造及び環状構造を有する化合物を用いれば、抗体がＬ−ＦＡＢＰ分子の内部領域と結合する場合であっても、より高感度、より特異的にＬ−ＦＡＢＰを検出することが可能である。
【００２５】
本発明における「抗体」には、完全な免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等、本技術分野において公知の抗原結合能を有する抗体断片又は抗体誘導体が含まれる。
【００２６】
（検出）
本発明の抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を用いたＬ−ＦＡＢＰを検出する方法は、免疫学的測定法である。より具体的には、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）等の粒子免疫凝集測定法、化学発光検出法、イムノクロマトグラフィー（ラテラルフロー式、フロースルー式）が挙げられるが、これらの例に限定されない。なかでも、Ｂ／Ｆ分離のための工程を含まない免疫学的測定法（ホモジニアス免疫測定法）がより好ましい。なお、本明細書において測定方法としてＬＴＩＡを記述する場合、その検出方法は、透過光（吸光度）の変化の測定、散乱光の変化の測定、粒子径の変化の測定等、公知の検出方法のいずれを用いても差し支えないものとして記述している。さらに、「検出」又は「測定」という用語は、Ｌ−ＦＡＢＰの存在の証明及び／又は定量等を含めて最も広義に解釈する必要があり、限定的に解釈してはならない。
【００２７】
（不溶性担体）
本発明で使用する不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂等の高分子基材、ガラス等の無機基材、セルロースやアガロース等の多糖類基材等からなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、ビーズあるいは粒子状（例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子）、板あるいはシート状（例えば、多孔性メンブレン）等、採用する測定法に応じた任意の形状を選択できる。
【００２８】
粒子の例としては、粒子免疫凝集測定法で一般的に用いられるポリスチレンを主成分とするラテックス粒子の他に、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー等を基材とする粒子が挙げられる。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することもできる。本発明で用いる担体粒子は同一種類の材質、あるいは二種類以上の材質を用いることができる。
担体粒子の粒子径としては、０．１５〜０．４５μｍ程度が好ましく、より好ましくは、０．２〜０．４μｍである。また、平均粒子径の異なる二種類以上の担体粒子を組み合わせて用いることもできる。
【００２９】
多孔性メンブレンとしては、公知のものが使用でき、また、任意の材質のものが使用できる。多孔性メンブレンの材質としては、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体等の多糖類あるいはセラミックス等が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社等より販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙等がある。
【００３０】
（不溶性担体への抗体の固定化）
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を不溶性担体上に固定化する方法としては特に制限はなく、公知の方法を使用することができる。抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を粒子上に固定化する場合、例えば、粒子と抗体を混合することによりおこる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジイミド等のカップリング剤により、粒子表面のカルボキシ基やアミノ基と抗体分子を化学的に結合させる化学結合法が用いられる。また、抗体分子はスペーサー分子を介して粒子に固定化させてもよい。さらに、アルブミン等の他のタンパク質に化学結合法を用いて抗体を結合させた後に、そのタンパク質を粒子に物理的あるいは化学的に固定化してもよい。
また、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体を多孔性メンブレン上に固定化する場合、例えば、抗体を含む溶液を一定量、ライン状、点あるいは、＋等の特定のシンボル状に、多孔性メンブレンに塗布することで固定化できる。
【００３１】
なお、本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。
【００３２】
（標識抗体）
抗体を標識するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。また標識物質と抗体との結合方法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法等の方法を用いることができる。標識物質、結合方法のいずれも、上記に限定されることなく公知の方法を用いることができる。標識の検出は、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、例えば1,2-フェニレンジアミンあるいは3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルホスフェート等）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともビオチン以外の標識物質で標識されたアビジンを反応させるのが一般的である。
【００３３】
（分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造及び環状構造を有する化合物）
本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物は、さらに環状構造を有することができ、式（１）及び式（２）で表される（本明細書において、「式（１）の化合物」、「式（２）の化合物」ということがある）。
【００３４】
式（１）の化合物は、
【化４】
2016136917.tif 000005
［式（１）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ２〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基、水酸基、カルボキシ基、アミノ基又は−ＳＲ７（Ｒ７は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ７が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）を示す］の化合物もしくはその塩又はエステルである。
【００３５】
式（２）の化合物は、
【化５】
2016136917.tif 000006
［式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基であり、
Ｘ１１は、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１であり、
Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎの値並びにＸ１１とＸ１３との間の二重破線及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線の結合は、Ｘ１１〜Ｘ１３の原子価と整合して定まる値及び結合を示す］化合物又はその塩である。
【００３６】
さらに式（２）の化合物は、
【化６】
2016136917.tif 000007
［式（２）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基、アミノ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は−ＳＲ１６（Ｒ１６は、水素原子、水酸基又は分岐していてもよい炭素数１、２又は３のアルキル基を表す。Ｒ１６が複数存在するときは、それぞれ同じ基であっても異なる基であってもよい。）であり、ここで、Ｒ１１とＲ１２の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、Ｒ１３とＲ１４の両方が存在する場合はそれぞれ一緒になってカルボニル基を形成していてもよく、
Ｒ１５は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が１、２又は３のアルキル基を示す］において、
Ｘ１１〜Ｘ１３、ｌ１+ｌ２、ｍ１+ｍ２、ｎ（ｌ１、ｌ２、ｍ１、ｍ２及びｎは、それぞれ独立して、０又は１を表す）及び二重破線の組み合わせは、
（ａ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｂ）Ｘ１１は硫黄原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｃ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は２、ｍ１+ｍ２は２、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間及びＸ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、
（ｄ）Ｘ１１は窒素原子、Ｘ１２及びＸ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合であるか、
（ｅ）Ｘ１１及びＸ１２は窒素原子、Ｘ１３は炭素原子であり、ｌ１+ｌ２は１、ｍ１+ｍ２は１、ｎは０であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は二重結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は単結合であるか、又は、
（ｆ）Ｘ１１及びＸ１２及びＸ１３は窒素原子であり、ｌ１+ｌ２は０、ｍ１+ｍ２は０、ｎは１であり、Ｘ１１とＸ１３との間の二重破線は単結合、Ｘ１２とＸ１３との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩である。
【００３７】
式（１）で表される化合物の例としては、ベンズアミジン誘導体が挙げられ、また、式（２）で表される化合物の例としては、アミノチアゾール誘導体、アミノトリアゾール誘導体、アミノテトラゾール誘導体、アミノイミダゾール誘導体が挙げられる。各分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素塩、ふっ化水素酸塩、ほうふっ化水素酸塩、しゅう酸塩、乳酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、よう化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩、マロン酸塩、重炭酸塩等特に制限は無く、本発明の効果以外に試薬としての取扱い易さや入手のしやすさ等を勘案して適宜選ぶことができる。
さらに詳しい式（１）の化合物としては、ベンズアミジン塩酸塩（CAS番号：1670-14-0）、ベンズアミジン塩酸塩水和物（CAS番号：206752-36-5）、4-フルオロベンズアミドオキシム（CAS番号：69113-32-2）、4-クロロベンズアミジン塩酸塩（CAS番号：14401-51-5）が挙げられる。さらに詳しい式（２）の化合物としては、アミノチアゾリン（CAS番号：1779-81-3）、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩（CAS番号：3882-98-2）、プソイドチオヒダントイン（CAS番号：556-90-1）、2-アミノ-5-ブロモチアゾール臭化水素酸塩（CAS番号：61296-22-8）、2-アミノ-4,5-ジメチルチアゾール臭化水素酸塩（CAS番号：7170-76-5）、2,4-ジアミノ-5-フェニルチアゾール一臭化水素酸塩（CAS番号：6020-54-8）が挙げられる。これらの中でも、ベンズアミジン塩酸塩、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩が特に好ましい。
【００３８】
さらに、本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物としては、グアニジノ基（Ｈ２Ｎ−（Ｃ＝ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ）を有する化合物が挙げられる。Ｒは、水素原子、アミノ基、フェニル基、アルキル基、カルボキシアルキル基、置換もしくは非置換アミノアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボキシアルキル基、置換もしくは非置換アミノカルボニルアルキル基、スルホニル基等である化合物又はその塩である。前記アルキル基としては、直鎖又は分枝上の炭素数が１，２，３，４，５又は６のアルキル基をあげることができ、該直鎖又は分枝上の炭素数が１，２，３，４，５又は６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を具体的に例示することができる。
【００３９】
前記グアニジノ基を持つ化合物の例としては、グアニジン塩又はその誘導体が挙げられる。さらに具体的な例としては、グアニジン（CAS番号：113-00-8）、グアニジンスルファミン酸塩（CAS番号：50979-18-5）、アミノグアニジン（CAS番号：79-17-4）が挙げられる。
【００４０】
本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４１】
（ＢＰＦ）
大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔとも呼称される。以下「ＢＰＦ」ということがある。）は、分子量約２２０００のペプチドで、免疫学的測定方法における新規なブロッキング用物質としてＷＯ２００５／００３１５５号パンフレットおよび高分子学会予稿集:55巻2 Disk1号5211-5212頁(2006年),Polymer Preprints, Japan Vol. 55, No.2, 5211-5212 (2006)に開示され、市販もされている。
本発明方法等に使用するＢＰＦは、ＷＯ２００５／００３１５５号パンフレットの記載に従い調製することができる。また、市販品（東洋紡社製、カタログ番号ＢＰＦ−３０１）を使用してもよい。
【００４２】
（Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、ＢＰＦを接触させる方法）
Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物、及びＢＰＦを接触させる工程は、Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物とＢＰＦを接触させる工程の後、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と接触させる工程の順に行われることを限度として、いずれの方法を用いてもよい。
例えば、Ｌ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と前記化合物及び／又はＢＰＦとを接触させる方法としては、例えば前記化合物及び／又はＢＰＦを含有する液状の試薬と試料とを混合する方法を挙げることができる。また、別の方法としては、前記化合物及び／又はＢＰＦを浸潤させた多孔性メンブレン等の不溶性担体に、試料を供給することによって接触させる方法を挙げることができる。なお、前記化合物とＢＰＦは、必ずしも同時にＬ−ＦＡＢＰの存在が疑われる試料と接触しなくてもよい。当業者であれば、測定用試薬の構成等を考慮して適宜設定することができる。
さらに試料中のＬ−ＦＡＢＰは、前記化合物及び／又はＢＰＦと接触した後、又は接触と同時に、不溶性担体に固定化された抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体と公知の適宜な方法により接触される。
また、本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物を試料と接触させる方法としては、試料の希釈液、試料の抽出液、あるいは試料の保存液、展開液などとして接触させる方法も含まれる。
【００４３】
本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物の濃度の好ましい範囲としては、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜６００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ〜９００ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ〜８００ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｍｍｏｌ／Ｌ〜６００ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｍｍｏｌ／Ｌ〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４５０ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。使用する分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物毎の最適な濃度は、本明細書の記載に従って実験的に求めることができる。
【００４４】
ＢＰＦの濃度好ましい範囲としては、０．０１〜５％、０．０２〜５％、０．０３〜５％、０．０４〜５％、０．０５〜５％、０．１〜５％、０．２〜５％、０．３〜５％、０．４〜５％、０．７５〜５％、１〜５％、１〜４％、１〜３％が挙げられ、好適には、０．０５〜５％、より好適には０．０７５〜５％、さらに好適には０．１〜３％（いずれもｗ/ｖ％）を例示することができる。当業者であれば、実験的に最適なＢＰＦの濃度を決定することができる。
また、例えば、分子量約２２０００のＢＰＦ−３０１を用いた場合、０．００４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．００９０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１３ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１８ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２２ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０９０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１３ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１８ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２２ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．８１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３６ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、好適には、０．０２２ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好適には、０．０３４ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．２７ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好適には０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３６ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００４５】
（測定キット）
本発明により提供される、本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物以外の、測定キットの構成物は、Ｌ−ＦＡＢＰを免疫学的に測定できることを限度として、特に限定されるものではない。以下、イムノクロマトグラフィー及びＬＴＩＡを例にそれぞれを説明する。
【００４６】
（イムノクロマトグラフィー）
一般的なイムノクロマトグラフィーでは、多孔性メンブレン等のシート状の不溶性担体上に、試料を含む溶液の展開方向に順に「１．試料供給部位」、「２．標識抗体を保持する部位（標識抗体保持部位）」、「３．標識抗体とＬ−ＦＡＢＰ抗体により形成された複合体を捕捉するための抗体を固定化する部位（捕捉抗体部位）」を具備した試験片が使用され、試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するように構成されている。イムノクロマトグラフィーでは、測定用キットは、上記のような試験片を少なくとも含む。
【００４７】
具体的には、Ｌ−ＦＡＢＰを含む試料を試料供給部位に所定量添加すると、試料は毛細管現象により標識保持部位に侵入し、Ｌ−ＦＡＢＰと標識抗体とが結合して複合体を形成する。該複合体は、メンブレンを展開し、捕捉抗体部位に侵入すると、メンブレンに固定化された抗体（捕捉抗体）に捕捉され、捕捉抗体−Ｌ−ＦＡＢＰ−標識抗体の三元複合体が形成される。そして標識を任意の方法（例えば、金コロイド粒子等の可視化可能な標識の場合にはその凝集像、酵素の場合には、基質を添加することによる発色反応）で検出することで、Ｌ−ＦＡＢＰの存在を検出することができる。
【００４８】
本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造有する化合物及び／又はＢＰＦは、例えば、試料希釈液等に添加しておいたり、試料供給部位や標識保持部位に含有させておいたりすることで、試料中のＬ−ＦＡＢＰと接触させることができる。
【００４９】
（ラテックス免疫凝集測定法）
ラテックス免疫凝集測定法では、測定用キットは少なくとも抗体が固定化されたラテックス粒子を含む。ラテックス免疫凝集測定法に使用される抗体としては、「抗原に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナル抗体」、「ポリクローナル抗体」、又は「モノクローナル抗体とポリクローナル抗体」のいずれの組合せも用いることが出来る。この場合、ラテックス粒子は、抗体を固定化する不溶性担体であると同時に、標識物質である。
【００５０】
これらの測定用試薬に使用されるラテックス粒子は、感度向上等の所望の性能を得るため、粒子径や材質を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スルフォン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等を基材とする粒子が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体とＬ−ＦＡＢＰとの凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。なお、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。
【００５１】
臨床検査で使用される一般的なＬＴＩＡ用の測定キットは、通常、第一試薬、第二試薬の形態で提供される。上記の抗体を固定化した二種類のラテックス粒子は、その両方又は一方を、第一試薬あるいは第二試薬に含有させることができる。一般には抗体を固定化したラテックス粒子の両方を第二試薬に含有させることが好適であるが、一方を第一試薬、他方を第二試薬に含有させることも可能である。
【００５２】
本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び／又はＢＰＦは、第一試薬に含まれていることが好ましい。本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び／又はＢＰＦを含む第一試薬と試料とを混合することにより、試料中のＬ−ＦＡＢＰと本発明の分子内にＮＨ２−Ｃ＝Ｎ−の部分構造を有する化合物及び／又はＢＰＦが接触する。
【００５３】
本発明のキットは、それぞれ上記の他に、適宜緩衝成分（緩衝液）を含む。本発明に用いることが出来る緩衝液としては、一般的に使用されるものであればよく、例えばトリス塩酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、グルタル酸、マレイン酸、グリシン及びそれらの塩等や、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグット緩衝液等が挙げられる。
【００５４】
また、本発明のキットは、測定感度向上や非特異的反応抑制の目的で、必要に応じて糖類やタンパク質等を含む。例えば、抗原抗体反応を促進する成分（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマー等の高分子化合物等）、タンパク質やペプチド（アルブミン、カゼイン等）、アミノ酸、糖類（ショ糖、シクロデキストリン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム、ＰｒｏＣｌｉｎ３００等）が挙げられる。
【００５５】
さらに、試料測定における標準物質（Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質）として、肝臓、腎臓等の各組織由来の天然のＬ−ＦＡＢＰが使用できるが、遺伝子工学的手法によって製造されたリコンビナント蛋白質であってもよい。Ｌ−ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Veerkamp and Maatman、Prog. Lipid Res.、第34巻、第17-52頁、1995年）ので、例えば、それらをもとにプライマーを設計し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニングすることができる。これを用いて遺伝子組換え技術より、リコンビナントＬ−ＦＡＢＰを調製することができる。標準物質として、構造が安定したリコンビナント蛋白質を用いることがより好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００５７】
（抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液）
（１）ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 ＣｌｏｎｅＬ（シミックホールディングス社製）を０．６４ｍｇ／ｍＬ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬに、平均粒径０．２１２μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液１３ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１３ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析して、ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
（２）Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体 Ｃｌｏｎｅ１（シミックホールディングス社製）を０．６４ｍｇ／ｍＬ含む５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬに、平均粒径０．３１５μｍの１％ラテックス粒子（積水化学工業社製）懸濁液８ｍＬを加え、４℃にて２時間撹拌した。これに、０．５％ＢＳＡを含む５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）８ｍＬを加え、４℃で１時間撹拌した。その後、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に透析してＣｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。【００５８】
（Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質は、特許文献１の記載に従い、遺伝子組換えにより得た。【００５９】
（Ｌ−ＦＡＢＰ基準測定方法：基準方法）
ＥＬＩＳＡによる体外診断用医薬品（レナプロ（登録商標）Ｌ−ＦＡＢＰテスト ＴＭＢ）を基準方法とした。【００６０】
（対照第一試薬：標準物質希釈液を兼ねる）
３００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．９）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．４７〜０．５７％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ＢＬ４０３ＳＥ
（第二試薬）
５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
３．７５Ａｂｓ／ｍＬ ＣｌｏｎｅＬ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
３．７５Ａｂｓ／ｍＬ Ｃｌｏｎｅ１抗体固定化ラテックス粒子懸濁液（注）
（注）Ａｂｓは２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
（標準液）
Ｌ−ＦＡＢＰ標準物質を、標準物質希釈液を用いて所望濃度に調整し、標準液とした。
（凍結融解尿）
採取後、−３０℃で凍結保存されていた部分尿（n＝３２、基準法での測定値０．３〜４．６ｎｇ/ｍＬ）を、一度だけ融解して測定に使用した。【００６１】
（ＬＴＩＡの測定条件）
（１）分析装置：日立７１７０型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）
（２）試料量及び試薬量：試料３μＬ、第一試薬１５０μＬ、第二試薬５０μＬ
（３）反応時間（反応温度）：第一試薬５分（３７℃）、第二試薬５分（３７℃）
（４）測光ポイント及び測光対象：第二試薬添加直後と添加５分後の間の吸光度変化量【００６２】
［実施例１］ＢＰＦによるＬ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近の検体における非特異反応抑制効果の確認１
第一試薬に添加する蛋白質が、添加なし（対照例１）、ＢＳＡ（比較例１）、０．１％ ＢＰＦ（実施例１）の場合の、健常値付近のＬ−ＦＡＢＰ濃度域における非特異反応抑制効果を比較した。
１．操作
（１）実施例１
凍結融解尿を試料として、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ 式（１）の化合物（ベンズアミジン塩酸塩）及び０．１％ ＢＰＦを含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。
（２）対照例１
凍結融解尿を試料として、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ 式（１）の化合物（ベンズアミジン塩酸塩）を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。
（３）比較例１
凍結融解尿を試料として、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ 式（１）の化合物（ベンズアミジン塩酸塩）及び０．１％ＢＳＡを含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のＬ−ＦＡＢＰの測定を行った。【００６３】
２．結果
実施例１、対照例Ａ、及び比較例１、それぞれの試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のＬ−ＦＡＢＰ濃度（基準測定値）をｘ軸、それぞれの試験より求められたＬ−ＦＡＢＰ濃度（試験測定値）をｙ軸として、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近における、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表１に示した。【００６４】
【表１】
2016136917.tif 000008
【００６５】
対照例１における測定値と基準測定値とのＲ２は０．０２４と低く、対照例１の条件が臨床検査の検体として使用される尿を試料とする測定には適用できないことが確認された。また、比較例１における測定値と基準測定値とのＲ２は０．００７と蛋白質を添加しない対照例より悪い結果であった。一方、実施例１における測定値と基準測定値とのＲ２は０．８９１であり、相関関係は良好であった。これより、ラテックス免疫凝集測定法を用いたＬ−ＦＡＢＰの測定において、ＢＰＦを添加することにより、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近の検体を正確に測定することが可能であることが確認された。【００６６】
［実施例２〜５］ＢＰＦによるＬ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近の検体における非特異反応抑制効果の確認２
第一試薬に、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ 式（１）の化合物（ベンズアミジン塩酸塩）及び０．０１〜１％ ＢＰＦ（実施例２〜５）を添加した場合の、健常値付近のＬ−ＦＡＢＰ濃度域における非特異反応抑制効果を比較した。
１．操作
検体として、採取後、−３０℃で凍結保存されていた部分尿（n＝１０、基準法での測定値０．６〜４．９ｎｇ/ｍＬ）を、一度だけ融解して測定に使用した。また、第一試薬には、表２に記載の量のＢＰＦが添加された。それら以外、実施例２は、実施例１と同様の方法で行われた。【００６７】
２．結果
実施例２〜５の試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のＬ−ＦＡＢＰ濃度（基準測定値）をｘ軸、それぞれの試験より求められたＬ−ＦＡＢＰ濃度（試験測定値）をｙ軸として、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近における、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表２に示した。【００６８】
【表２】
2016136917.tif 000009
【００６９】
実施例２〜５における測定値と基準測定値とのＲ２は０．８９６〜０．９３９であり、相関関係は良好であった。【００７０】
［実施例６〜９］ＢＰＦによるＬ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近の検体における非特異反応抑制効果の確認３
第一試薬に、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ 式（２）の化合物（2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩）及び０．０１〜１％ ＢＰＦ（実施例６〜９）を添加した場合の、健常値付近のＬ−ＦＡＢＰ濃度域における非特異反応抑制効果を比較した。
１．操作
検体として、採取後、−３０℃で凍結保存されていた部分尿（n＝１０、基準法での測定値０．６〜４．９ｎｇ/ｍＬ）を、一度だけ融解して測定に使用した。また、第一試薬には、式（２）の化合物（2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩）及び表３に記載の量のＢＰＦが添加された。それら以外、実施例３は、実施例１と同様の方法で行われた。【００７１】
２．結果
実施例６〜９の試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてＬ−ＦＡＢＰ濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のＬ−ＦＡＢＰ濃度（基準測定値）をｘ軸、それぞれの試験より求められたＬ−ＦＡＢＰ濃度（試験測定値）をｙ軸として、Ｌ−ＦＡＢＰ濃度が健常値付近における、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表３に示した。【００７２】
【表３】
2016136917.tif 000010
【００７３】
実施例６〜９における測定値と基準測定値とのＲ２は０．５７９〜０．６７３であった。ＢＰＦの添加なし（対照例１）あるいは０．１％ＢＳＡ添加（比較例１）と比較し、相関関係は良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、高感度な免疫学的測定法においても反応系由来の非特異反応を抑制することができるため、より正確で感度の良い免疫学的測定法を提供することができる。例えば、尿中Ｌ−ＦＡＢＰ測定における健常値（例えば、２．２±２．３μｇ／ｇＣＲ。レナプロ（登録商標）Ｌ−ＦＡＢＰテストＴＭＢ添付文書より）付近の検体をより正確に測定することができる。
【配列表】
2016136917000001.app
【国際調査報告】
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2016136917.tif 000015
2016136917.tif 000016
2016136917.tif 000017