(57)【要約】本発明の抗体は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化したセリン４０残基に特異的に結合する。本発明は、前記抗体を用いて、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法である。本発明のタンパク質又はペプチドマーカーは、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンＨ２Ａタンパク質のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化したセリン４０残基に特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を用いて、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とするヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法。
【請求項３】
ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下及び非存在下において、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程と、
被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルが、被検物質の非存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃレベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の活性化剤であると判定する工程と、
を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
グルコースの存在下において、前記測定工程を行う請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＤＮＡに損傷を与えた条件下において、前記測定工程を行う請求項３又は４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される請求項３〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法であって、
グルコースの存在依存的に生じるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項８】
前記ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカーであって、
ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなることを特徴とするタンパク質又はペプチドマーカー。
【請求項１０】
エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を評価する方法であって、
ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカーであって、
ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなることを特徴とするタンパク質又はペプチドマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体、前記抗体を用いたヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法、グルコースの存在依存的に生じるヒストンタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化の変化を検出する方法、ゲノムＤＮＡの安定性を評価する方法、及びタンパク質マーカーに関する。
本願は、２０１５年９月９日に、日本に出願された特願２０１５−１７７１７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン構造は、ゲノム機能を調節するために、ヒストンタンパク質における様々な修飾によって制御されることが知られている。このような化学修飾において、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾はクロマチン再編成のための重要な決定因子として明らかになっており、可逆的なヒストン修飾の特異的な組み合わせは、クロマチンの活性状態に影響を及ぼしていると考えられている。この特異的な組み合わせは後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）に生じ、安定的であるにも関わらず、これらのいくつかは細胞外状態及び細胞活性に応答して一時的に再構成される。エピジェネティクス系はゲノムの長期的制御を担っており、エピジェネティクス修飾は細胞のゲノム制御に果たす役割や、発生や細胞分化の基盤として重要で、その破たんは疾患の原因となりうる。
現在、エピジェネティクス修飾には多数知られており、そのうち、ヒストン末端の特異的残基におけるヒストンタンパク質のアセチル化、メチル化、ユビキチン化は遺伝子の発現制御やゲノム安定性に関連していることが知られている。【０００３】
近年、上述のようなヒストンタンパク質の修飾として、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化が、ヒストンタンパク質に刻まれる新しいエピジェネティクス現象であることが明らかとなった。ＧｌｃＮＡｃ化は可逆的な現象であり、修飾反応はＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＯＧＴ）及びＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化酵素（ＯＧＡ）の二つの酵素により触媒されている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）によりサイトゾルにおいて生成されるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから得られる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの最初の供給源が細胞外グルコースであるため、ＧｌｃＮＡｃ化の程度は細胞外グルコース濃度及び細胞内のＨＢＰ活性と共に変動すると考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。また、血糖値の異常は細胞の長期的なゲノム機能の変化を起こし、様々な疾患の原因になる可能性が挙げられている（例えば、非特許文献２参照。）。【０００４】
ＧｌｃＮＡｃ化されるヒストンタンパク質中のアミノ酸は、セリン又はスレオニンであることが知られている。ヒストンタンパク質のうち、現在判明しているＧｌｃＮＡｃ化される部位は、ヒストンＨ２Ｂのアミノ酸配列のうちＮ末端から３６番目のセリン、５２番目のスレオニン、５５番目のセリン、５６番目のセリン、６４番目のセリン、９１番目のセリン、１１２番目のセリン及び１２３番目のセリン、ヒストンＨ２Ａのアミノ酸配列のうちＮ末端から１０１番目のスレオニン、ヒストンＨ３又はＨ３．３のアミノ酸配列のうちＮ末端から１０番目のセリン、３２番目のスレオニン及び８０番目のスレオニン、ヒストンＨ４のアミノ酸配列のうちＮ末端から４７番目のセリンである（例えば、非特許文献３、４参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kaoru Sakabe., et al., β-N-acetylglucosamine(O-GlcNAc) is part of the histone code, PNAS., 107(26), 19915-19920, 2010.
【非特許文献２】Pirola, L., et al., Epigenetic phenomena linked to diabeticcomplications., Nat Rev Endocrinol. 2010 Dec;6(12):665-75.
【非特許文献３】Maria Cristina Gambetta., et al., A critical perspective ofthe diverse roles of O-GlcNAc transferase in chromatin, Chromosoma, Review, DOI:10.1007/s00412-015-0513-1, 18 April 2015.
【非特許文献４】Lukas Lercher., et al., Generation of a synthetic GLcNAcylated nucleosome reveals regulation of stability by H2A-Thr101 GlcNAcylation, Nature Communications., 6, Article number:7978, 25 August 2015.
【非特許文献５】Jessica Gagnon., et al., Undetectable histone O-GlcNAcylation in mammalian cells, Epigenetics, 10:8, 677-691, August 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、ＧｌｃＮＡｃ化は細胞外グルコース濃度と共に変動すると考えられているが、ＧｌｃＮＡｃは低分子量であり中性電荷であるため、検出することが難しく、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする技術については、未だ確立されていなかった（例えば、非特許文献５参照。）。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核内においてヒストンタンパク質のうち、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ヒストンＨ２Ａタンパク質のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化したセリン４０残基に特異的に結合することを特徴とする抗体。
［２］［１］に記載の抗体を用いて、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とするヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法。
［３］ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下及び非存在下において、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程と、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルが、被検物質の非存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃレベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の活性化剤であると判定する工程と、を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
［４］グルコースの存在下において、前記測定工程を行う［３］に記載のスクリーニング方法。
［５］ＤＮＡに損傷を与えた条件下において、前記測定工程を行う［３］又は［４］に記載のスクリーニング方法。
［６］前記ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される［３］〜［５］のいずれか一つに記載のスクリーニング方法。
［７］細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法であって、グルコースの存在依存的に生じるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とする方法。
［８］前記ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される［７］に記載の検出方法。
［９］細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなることを特徴とするタンパク質又はペプチドマーカー。
［１０］エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を評価する方法であって、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えることを特徴とする方法。
［１１］前記ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体により測定される［１０］に記載の方法。
［１２］エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなることを特徴とするタンパク質又はペプチドマーカー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ヒストンＨ２Ａタンパク質における３０番目〜５０番目のアミノ酸配列の種による違いを示す図である。
【図１Ｂ】ヒストンタンパク質の修飾の種による違いを示す図である。
【図２Ａ】実施例１におけるＨＰＬＣのピーク推移を表したグラフと、ＨＰＬＣにより得られた各フラクションのウエスタンブロッティング法による検出結果を示す画像である。
【図２Ｂ】実施例１における２種類の野生型Ｆｌａｇ−Ｈ２Ａ１Ａ及びＦｌａｇ−Ｈ２Ａ３、並びに変異体Ｆｌａｇ−Ｈ２Ａ３−Ｓ４０Ａ（ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のアミノ酸配列のうち４０番目のセリンをアラニンに変えた変異体）の組換えタンパク質を用いたウエスタンブロッティング法による検出結果を示す画像である。
【図３Ａ】実施例２におけるＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたマウスＥＳ細胞の免疫染色の結果を示す画像である。
【図３Ｂ】実施例２におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体を用いたマウスＥＳ細胞の免疫染色の結果を示す画像である。
【図３Ｃ】実施例２における異なるグルコース濃度の培地で培養したマウスＥＳ細胞及びマウスＴＳ細胞を用いたウエスタンブロッティング法による検出結果を示す画像である。
【図４Ａ】実施例３におけるＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いた、異なるグルコース濃度の培地で培養したヒトＥＡｈｙ細胞の免疫染色の結果を示す画像と、核内のＧｌｃＮＡｃドット数の変化を計測したグラフである。
【図４Ｂ】実施例３におけるＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いた、異なるグルコース濃度の培地で培養したヒトＲＰＴＥＣ細胞の免疫染色の結果を示す画像と、核内のＧｌｃＮＡｃドット数の変化を計測したグラフである。
【図５】実施例４における低糖及び高糖環境下で培養したマウスＥＳ細胞でのＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑの結果を示す図である。
【図６】実施例５における低糖及び高糖環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞でのＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑの結果を示す図である。
【図７】実施例６におけるＤＮＡ損傷に関連するヒストンバリアント及びタンパク質についてウエスタンブロッティング法による検出結果を示す画像である。
【図８】実施例７における野生型ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ又は変異型ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ−Ｓ４０Ａを高発現したヒトＥＡｈｙ細胞での紫外線照射により誘発されたＤＮＡ損傷（ピリミジンダイマー）を検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１３】
＜抗体＞
一実施形態において、本発明は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１４】
本実施形態の抗体によれば、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を容易かつ簡便に検出することができる。さらに、本実施形態の抗体を用いて、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を検出することで、糖尿病や肥満など代謝異常がリスク因子となる様々な疾患のエピジェネティクス異常を検出することができる。
【００１５】
本明細書中において、「ヒストンタンパク質」とは、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームを構成するコアヒストンタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）及びリンカーヒストンタンパク質（Ｈ１）のことを意味する。さらに、本明細書中において、「ヒストンタンパク質」には、これらのバリアント、例えばＨ２ＡＸ、Ｈ２ＡＺ等も含まれる。
元来、ヒストンＨ２Ａタンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸がアラニンであった（図１Ａ参照）が、進化の過程から哺乳類以降の動物において、ヒストンＨ２Ａタンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸がセリンであるバリアントが存在する（図１Ａ及び図１Ｂ参照）ことが知られている。本発明者らは、このヒストンＨ２Ａタンパク質のバリアントに着目したところ、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることを見出し、本発明を完成するに至った。
尚、本明細書及び特許請求の範囲において、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸を「アミノ酸４０残基」という。例えば、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸がセリンの場合には「セリン４０残基」という。
【００１６】
また、図１Ｂから、アセチル化、メチル化、ＧｌｃＮＡｃ化等のヒストンの修飾は様々な生物においてみられるが、ヒストンＨ２Ａタンパク質の４０番目のセリンのＧｌｃＮＡｃ化は、哺乳類以降の動物においてのみ行われるものである。
また、後述の実施例において示すように、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルは、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）を介した細胞外グルコース濃度の変化に応答して、増加又は減少することが、本発明者らにより初めて明らかとなった。よって、このヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化は、哺乳類以降の動物における糖尿病や肥満等の代謝異常がリスク因子となる様々な疾患のエピジェネティクス異常に関連していると考えられる。
【００１７】
本実施形態の抗体は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合することができる。また、ＧｌｃＮＡｃのヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基への結合の態様は、Ｏ結合型である。すなわち、本実施形態の抗体は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合することができる。上述したように、このヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化は新規に見出され、本実施形態の抗体は、この新規な抗原に対して特異的に結合する範囲において包含される。
【００１８】
本実施形態において、「抗体」の種類としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の機能的断片であってもよい。中でも、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。
【００１９】
本明細書中において、「特異的に結合」とは、抗体が標的タンパク質（抗原）にのみ結合することを意味し、例えば試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ等）における抗体の抗原のエピトープへの結合等により定量することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体−抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の結合親和性（ＫＤ）は、１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０−９Ｍ〜１０−１３ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００２０】
本実施形態において、「ポリクローナル抗体」とは、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物を意味する。すなわち、本実施形態の抗体がポリクローナル抗体である場合、Ｏ結合型ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含み、且つ、異なるアミノ酸配列からなるエピトープに対し、特異的に結合する異なる抗体を含み得る。
また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。
また、ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものを意味する。すなわち、本実施形態の抗体がモノクローナル抗体である場合、自然環境の成分から単離された抗体である。
本実施形態において、抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体等が挙げられる。
【００２１】
本実施形態の抗体がポリクローナル抗体である場合、抗原（例えば、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むヒストンＨ２Ａタンパク質、そのＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むペプチド断片、またはこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。また、本実施形態の抗体がモノクローナル抗体である場合は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００２２】
ハイブリドーマ法としては、例えば、ケーラーおよびミルスタインの方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原（例えば、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むヒストンＨ２Ａタンパク質、そのＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むペプチド断片、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的蛋白質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。
【００２３】
組換えＤＮＡ法としては、例えば上記本実施形態の抗体又は抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態の抗体を組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０）参照）。
本実施形態の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態の抗体は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合できるものであれば、アミノ酸配列変異体であってもかわない。
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。また、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８）参照）。
【００２５】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。
本明細書中において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、後述の実施例に記載のＯ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体等）よりも高いことが好ましい。
本実施形態の抗体（上述の抗体の機能的断片、アミノ酸配列変異体等も含む）の抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等により評価することができる。
【００２６】
＜抗体によるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の抗体を用いて、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備えるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出方法を提供する。
【００２７】
本実施形態の検出方法によれば、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を容易かつ簡便に検出することができる。さらに、糖尿病や肥満など代謝異常、神経疾患、循環器疾患等の様々な疾患のエピジェネティクス異常を検出することができる。
【００２８】
本実施形態において、上述の抗体を用いたヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する方法としては特に限定されず、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。
本実施形態の検出方法は、疾患、病態と関連するヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化と関連する疾患、病態の解析用の研究ツール、生活習慣のモニタリングのツール、疾患、病態などの発症予測、感受性などの診断ツール、さらには、後述のバイオマーカーを指標とする創薬ツールとして用いることができる。
【００２９】
＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞
一実施形態において、本発明は、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下及び非存在下において、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程と、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルが、被検物質の非存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤であると判定し、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃレベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の活性化剤であると判定する工程と、を備えるスクリーニング方法を提供する。
【００３０】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、容易かつ簡便にヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤を得ることができる。
【００３１】
［ＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程］
まず、被検物質の存在下及び非存在下における、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する。測定に用いられるヒストンＨ２Ａタンパク質としては、ヒストンＨ２Ａタンパク質のうち、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むペプチド断片であってもよい。
【００３２】
本実施形態のスクリーニング方法において、「被験化合物」としては特に制限されることはなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等が挙げられる。
【００３３】
ＧｌｃＮＡｃ化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば質量分析を用いた方法、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法、オートラジオグラフィーによりヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を検出する方法等が挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。
抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞と同様のものを使用することができる。
【００３４】
例えば、ヒストンＨ２Ａタンパク質が基板に固定されており、上記の抗体が酵素又は蛍光色素で標識されていてもよい。この場合、基板を洗浄後、酵素の基質を反応させて基質の発色若しくは発光を測定することにより、又は蛍光色素の蛍光を測定することにより、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定することができる。
【００３５】
あるいは、ヒストンＨ２Ａタンパク質が基板に固定されていない場合、例えば次のような方法によりＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定することもできる。例えば、ヒストンＨ２Ａタンパク質を、予めＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を起こす１組の蛍光色素の一方で標識しておく。また、上記の抗体を上記の１組の蛍光色素の他方で標識しておく。ＦＲＥＴを起こす色素分子の組としては特に限定されず、例えばＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
【００３６】
この原理を利用すれば、本工程を終始溶液状態で行う均一系アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）で行うことができる。均一系アッセイでは、測定に洗浄操作が不要であるため、操作が簡便になるという利点がある。尚、ＥＬＩＳＡ法等の、基板上に固定化された抗原等を用いて反応、洗浄が行なわれる検出方法は、不均一系アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）と呼ばれる。
【００３７】
本実施形態のスクリーニング方法において、後述の実施例において示すように、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルは、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）を介した細胞外グルコース濃度の変化に応答して、増加又は減少することから、グルコースの存在下において、測定工程を有することが好ましい。
【００３８】
また、後述の実施例において示すように、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルは、ＤＮＡの修復能力に比例して、増加又は減少することから、本実施形態のスクリーニング方法において、ＤＮＡに損傷を与えた条件下において、測定工程を有することが好ましい。係る工程により、例えばゲノム修復能力を有する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００３９】
ＤＮＡに損傷を与える方法としては、例えば、紫外線（ＵＶ）照射、放射線照射、活性酸素等による酸化ストレス、アルキル化剤の添加、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド等）の添加等が挙げられ、これらに限定されない。
また、ＤＮＡに損傷を与えたかどうかの確認方法については、ＤＮＡの損傷方法に応じて適宜選択すればよい。
例えば、紫外線照射等により生じたピリミジンダイマーを検出する場合は、ＤＮＡ損傷抗体（例えば、抗シクロブタン型ピリミジンダイマー抗体、抗６−４型光産物抗体、抗Ｄｅｗａｒ型光産物抗体等）を用いた液後面液法等が挙げられる。
または、例えば、酸化ストレス等により生じた脱塩基部位を検出する場合は、ＡＲＰ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅ）を用いたＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
または、例えば、放射線照射等により生じた二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）を検出する場合は、ヒストンＨ２ＡＸ のセリン１３９残基のリン酸化抗体（抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体）を用いた免疫蛍光染色法等が挙げられる。
【００４０】
［判定する工程］
続いて、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルが、被検物質の非存在下における前記ＧｌｃＮＡｃ化レベルと比較して低かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤であると判定することができる。
【００４１】
一方、被検物質の存在下における前記ＧｌｃＮＡｃレベルが、被検物質の非存在下における前記リン酸化レベルと比較して高かった場合に、前記被検物質はヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の活性化剤であると判定することができる。
【００４２】
＜細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法＞
一実施形態において、本発明は、細胞外グルコース濃度の変動をモニターする方法であって、グルコースの存在依存的に生じるヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備える方法を提供する。
【００４３】
従来、ヒストンタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化がグルコース濃度と共に変動することを示すデータはなく、本発明において、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化がグルコース濃度と共に変動することを初めて明らかにした。
【００４４】
本実施形態の方法によれば、糖尿病や肥満など代謝異常がリスク因子となる様々な疾患のエピジェネティクス異常を検出することができる。
【００４５】
本実施形態の方法において、ＧｌｃＮＡｃ化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞と同様のものが挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞と同様のものを使用することができる。
【００４６】
＜細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカー＞
一実施形態において、本発明は、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなるタンパク質又はペプチドマーカーを提供する。
【００４７】
従来、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾（ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化）をモニターするマーカーはなく、本発明において、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基が細胞外グルコース濃度をモニターするマーカーとなり得ることを初めて明らかにした。
【００４８】
本実施形態のマーカーによれば、糖尿病や肥満など代謝異常がリスク因子となる様々な疾患のエピジェネティクス異常を検出することができる。
また、糖尿病患者ではヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化のグルコース応答性が変化することから、応答性の回復を診ることで治療経過を判断することができる。このことから、本発明のマーカーは、代謝疾患の診断マーカー、治療の経過観察マーカーとして応用できる。
【００４９】
本実施形態のマーカーは、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含んでいればよく、ヒストンＨ２Ａタンパク質であってもよいし、又はそのペプチド断片であってもよい。
【００５０】
本実施形態のマーカーの検出方法は、上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞と同様のものが挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞と同様のものを使用することができる。
【００５１】
＜ＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法＞
一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法であって、ＤＮＡの損傷の存在依存的に生じるヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備える方法を提供する。
【００５２】
本実施形態の方法によれば、簡便にＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターすることができる。
【００５３】
本実施形態の方法において、ＤＮＡに損傷を与える方法としては、例えば、上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
また、ＤＮＡに損傷を与えたかどうかの確認方法については、ＤＮＡの損傷方法に応じて適宜選択すればよく、上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００５４】
本実施形態の方法において、ＧｌｃＮＡｃ化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞において例示された方法と同様の方法が挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。
抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞に記載されたものと同様のものを使用することができる。
【００５５】
＜ＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカー＞
一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターするマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなるタンパク質又はペプチドマーカーを提供する。
【００５６】
本実施形態のマーカーによれば、簡便にＤＮＡ損傷が及ぼすヒストン修飾をモニターすることができる。
【００５７】
本実施形態のマーカーは、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含んでいればよく、ヒストンＨ２Ａタンパク質であってもよいし、又はそのペプチド断片であってもよい。
【００５８】
本実施形態のマーカーの検出方法は、上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞と同様のものが挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞と同様のものを使用することができる。
【００５９】
＜エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を評価する方法＞
一実施形態において、本発明は、エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を評価する方法であって、ヒストンＨ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルを測定する工程を備える方法を提供する。
【００６０】
実施例にて後述するように、本発明者らは、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることにより、ゲノムＤＮＡの修復能が発揮され、損傷を受けたＤＮＡが修復されることを明らかにした。
本実施形態の方法によれば、エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を簡便に評価することができる。
尚、本明細書及び特許請求の範囲において、「ゲノムＤＮＡの安定性」とは、ゲノムＤＮＡが損傷を受けない状態、又はゲノムＤＮＡが損傷を受けても修復される状態が維持されていることを意味する。
【００６１】
また、一般に、エピジェネティクス修飾（本実施形態においては、主にＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化）は、該エピジェネティクス修飾が関与する遺伝子群の発現における現在、過去、及び未来の状況、すなわち（１）現在の転写プログラム（例えば、遺伝子発現が活発であれば、クロマチン構造が緩んでいる状態等）、（２）分化及び発達におけるこれまでの遺伝子発現の歴史、及び（３）今後の遺伝子発現の態勢、を反映していると考えられている（参考文献：Ｈａｍｍｏｕｄ  Ｓ．  Ｓ．，  “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ”，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．１５，  ｐ２３９−２５３，  ２０１４．）。
よって、例えば、現在の転写プログラムにおいてクロマチン構造が緩み、遺伝子発現が活発である場合、ＤＮＡ損傷を受けやすいと考えられるが、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることで、ゲノムＤＮＡの修復能が発揮され、損傷を受けても直ちに修復され、問題なく転写を行うことができる。
また、例えば、今後の遺伝子発現におい必要な遺伝子である場合、予めヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることで、発現が上昇するまでＤＮＡ損傷から遺伝子を保護することができる。この新たに見出した機能より、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ修飾の程度を解析することにより、細胞、組織または個体のＤＮＡ損傷に対して感受性であるか、抵抗性であるかを判定・診断することができる。
【００６２】
また、一般に、細胞の分化の段階（例えば、幹細胞、前駆細胞、成熟細胞等）、及びＤＮＡ損傷のタイプによって、ＤＮＡの修復経路が異なり、さらにＤＮＡの修復経路の異常によりゲノムの安定性が失われ、各種疾患が起こることが知られている（参考文献：ＭｃＫｉｎｎｏｎ  Ｐ．  Ｊ．，  “Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ”，  ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｓｅ，  ｖｏｌ．１６，  ｎｏ．１１，  ｐ１５２３−１５２９，  ２０１３．）。
本実施形態の方法において、細胞の分化の段階、及びＤＮＡの損傷を与える方法を適宜選択することで、各種疾患におけるエピジェネティクス異常の発生メカニズムを検証することができる。
【００６３】
本実施形態の方法において、ＧｌｃＮＡｃ化レベルの測定方法は特に限定されず、例えば上述の上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞において例示された方法と同様の方法が挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。
抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞に記載されたものと同様のものを使用することができる。
【００６４】
＜エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカー＞
一実施形態において、本発明は、エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカーであって、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含む、Ｈ２Ａタンパク質又はそのペプチド断片からなるタンパク質又はペプチドマーカーを提供する。
【００６５】
従来、エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカーは存在せず、本発明において、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基がエピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を検出するマーカーとなり得ることを初めて明らかにした。
【００６６】
本実施形態のマーカーによれば、エピジェネティクス修飾によるゲノムＤＮＡの安定性を評価することができる。
本実施形態のマーカーが検出される場合、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化に関与する遺伝子領域はＤＮＡ損傷から保護されており、ゲノムＤＮＡは安定していると判定できる。
一方、本実施形態のマーカーが検出されない場合、ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化に関与する遺伝子領域での発現が低下している、又はエピジェネティクス異常が起きていると判定できる。
【００６７】
本実施形態のマーカーは、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含んでいればよく、ヒストンＨ２Ａタンパク質であってもよいし、又はそのペプチド断片であってもよい。
【００６８】
本実施形態のマーカーの検出方法は、上述の＜ヒストンＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法＞と同様のものが挙げられる。中でも、ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体を用いた方法が好ましい。抗体を用いた方法として、より具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法等が挙げられる。ヒストンＨ２Ａタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基に特異的に結合する抗体としては、上述の＜抗体＞と同様のものを使用することができる。
【００６９】
＜抗体のその他用途＞
ヒストンタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化特異的抗体のその他用途としては、例えば、前記抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ法（クロマチン免疫沈降法（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）と次世代シークエンサーとを組み合わせた技術）を行うことで、ＧｌｃＮＡｃ化したセリン４０残基を含むＨ２Ａタンパク質の近くに存在し、ＤＮＡ損傷から保護されているるゲノム上の領域を特定することができる。
【００７０】
また、後述の実施例に示す通り、前記抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ法によって、異なる細胞におけるエピジェネティクス修飾（本実施形態においては、主にＨ２Ａタンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化）が関与する遺伝子群の違い、及び前記遺伝子群の発現パターンの違いを解析することができる。
【００７１】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。【００７３】
［実施例１］ヒストンタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化部位の検出及びヒストンタンパク質のＧｌｃＮＡｃ化特異的抗体の作製
（１）新規ＧｌｃＮＡｃ化ヒストンを認識するモノクローン抗体の作製
ＧｌｃＮＡｃ化はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）で見られる。さらに、これまでに明らかにされたＧｌｃＮＡｃ化タンパク質の情報から複数のヒストンアミノ酸配列（「・・・ＹＴ・・・」および「・・・ＹＳ・・・」）を推測し、数種類のＧｌｃＮＡｃ化ペプチドを作製した。続いて、作製したＧｌｃＮＡｃ化ペプチドをウシ血清アルブミン又はＧＳＴタンパク質と結合させた融合タンパク質を抗原とし、常法に従いマウスに免疫し抗体産生ミエローマ細胞を得た。合計３００以上のクローンをスクリーニングし、ＧｌｃＮＡｃ化ヒストンを認識する抗体を得た。【００７４】
（２）ヒストン抽出とＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による分画及び精製
Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社製）を用いて、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞からヒストンを抽出した。続いて、抽出されたヒストンを水で透析し、逆相クロマトグラフィーカラム（Ａｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ３．６μｍ  ＸＢ−Ｃ８）をセットしたＨＰＬＣユニット（ＬＣ−１０Ａｉ、島津製作所社製）により、アセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＡ（５％ａｃｅｔｏｎｉｔｌｉｅ，０．１％ＴＦＡ）、ＳｏｌｖｅｎｔＢ（９０％ａｃｅｔｏｎｉｔｌｉｅ，０．１％ＴＦＡ））溶液を用いたグラジエント法（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）で分画した。結果を図２Ａに示す。
分画した各フラクション（１５〜７２．５分）は、フラクションコレクターＦＲＣ−１０Ａ（島津製作所社製）を用いて、回収した。【００７５】
（３）ヒストンのＧｌｃＮＡｃ化部位の検出
（２）で得られた各フラクションについて、常法に従い、（１）で得られた抗体、Ｈ２Ａ抗体、Ｈ２Ｂ抗体、Ｈ３抗体及びＨ４抗体を用いたウエスタンブロッティング法による検出を行った。また、各フラクションに含まれるタンパク質量を比較する為に銀染色を行った。結果を図２Ａに示す。【００７６】
図２Ａから、（１）で得られた抗体がＨ２ＡのＧｌｃＮＡｃ化部位を認識していることが確かめられた。【００７７】
（４）抗体の特異性の検討
常法に従い、２種類の野生型Ｆｌａｇ−Ｈ２Ａ１Ａ及びＦｌａｇ−Ｈ２Ａ３、並びに変異体Ｆｌａｇ−Ｈ２Ａ３−Ｓ４０Ａ（ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４０番目のセリンをアラニンに変えた変異体）の組換えタンパク質を調製した。続いて、それぞれの組換えタンパク質について、（１）で得られた抗体、Ｈ２Ａ抗体及びＦｌａｇ抗体を用いたウエスタンブロッティング法による検出を行った。結果を図２Ｂに示す。【００７８】
図２Ｂから、（１）で得られた抗体は、ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のアミノ酸配列のうち、４０番目のセリンのＧｌｃＮＡｃ化を特異的に検出することが明らかとなった。以下、（１）で得られた抗体を、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体と呼ぶ。【００７９】
［実施例２］マウスＥＳ細胞及びマウスＴＳ細胞におけるヒストンＨ２Ａ３タンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出
（１）マウスＥＳ細胞およびマウス胎盤栄養膜細胞幹（ＴＳ）細胞の培養
マウスＥＳ細胞はＪ１株を用いた(Ｌｉ，Ｅ．，Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．＆Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｒ．Ｃｅｌｌ  １９９２，６９，９１５−９２６．)。ＥＳ細胞用培地（１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｗａｋｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＤＭＥＭ（２５ｍＭグルコース含有）（Ｗａｋｏ社製）に添加したもの）に、１０００ＵのＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を添加し、ゼラチンコート済み培養皿上で培養した。【００８０】
また、ＴＳ細胞は、既報に従い（Ｈａｙａｋａｗａ  Ｋ１，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ. ２０１５  Ｆｅｂ  ２；３２：１Ｅ．４．１−１Ｅ．４．３２．）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来胚盤胞より樹立した。続いて、ＴＳ細胞用培地 （２０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｗａｋｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）、２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＲＰＭＩ−１６４０（２５ｍＭグルコース含有）に添加したもの）に、２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ４ 、アクチビンＡ（Ｗａｋｏ社製）及びヘパリン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、培養を行った。【００８１】
続いて、１、５、１０ｍＭグルコース含有ＥＳ細胞用培地及びＴＳ細胞用培地を、グルコース不含ＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ社製）又はグルコース不含ＲＭＰＩ−１６４０を用いて、調製した。続いて、調製した各培養液を用いてＥＳ細胞及びＴＳ細胞をコンフルエントになるまで培養した。続いて、培養した細胞を、遠心により細胞をペレット状にし、培養液を除去して、回収した。続いて、直ちに液体窒素中で凍結させ、使用するまで−８０℃で保存した。【００８２】
（３）マウスＥＳ細胞の免疫染色
マウスＥＳ細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。続いて、ブロッキング溶液（５％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ））、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（−））を用いて、４℃で一晩処理した。続いて、５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で希釈したヒストンＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体又はＯ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。続いて、ＰＢＳ（−）で希釈した二次抗体に室温1時間反応させた。さらに、１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）で室温１０分間、核を染色した。続いて、封入液（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ社製）で封入し、プレパラートを作製した。観察は一体型共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０ｉ，オリンパス社製）を用いて行った。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３ＡがＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体で染色した結果であり、図３ＢがＯ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体で染色した結果である。図３Ａにおいて、「Ｏ−ＧｌｃＮＡｃペプチド吸収」とは、実施例１の（１）で作製したＧｌｃＮＡｃ化ペプチドを添加して免疫染色を行ったものを示し、「マウスＩｇＧ」とは、マウスＩｇＧを用いて免疫染色を行ったものを示す。【００８３】
図３Ａ及び図３Ｂから、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体で免疫染色したＥＳ細胞は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体で免疫染色したＥＳ細胞と染色像が異なり、核内にドット状のシグナルが検出された。また、実施例１の（１）で作製したＧｌｃＮＡｃ化ペプチド及びマウスＩｇＧで処理したＥＳ細胞では、ＧｌｃＮＡｃ化のシグナルが検出されなかった。【００８４】
（４）グルコース濃度の変化に応じたＧｌｃＮＡｃ化の検証
（２）で作製した異なるグルコース濃度で培養したマウスＥＳ細胞及びマウスＴＳ細胞について、常法に従い、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体、Ｈ２Ａ抗体、及びコントロールとしてアクチンβ抗体を用いたウエスタンブロッティング法による検出を行った。結果を図３Ｃに示す。【００８５】
図３Ｃから、マウスＥＳ細胞ではグルコース濃度の低下に伴いヒストンのＧｌｃＮＡｃ化レベルは増加することが明らかとなった。一方、マウスＴＳ細胞ではグルコース濃度の上昇に伴い、ＧｌｃＮＡｃ化レベルが増加することが明らかとなった。
以上のことから、ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４０番目のセリンのＧｌｃＮＡｃ化は、細胞の種類により異なったグルコース反応性を示すことが明らかとなった。【００８６】
［実施例３］ヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞及びヒト腎近位尿細管上皮（ＲＰＴＥＣ）におけるヒストンＨ２Ａ３タンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化の検出
（１）ヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞及びヒト腎近位尿細管上皮（ＲＰＴＥＣ）細胞の培養
ヒトＥＡｈｙ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）より購入したものを使用した。コントロール培地 （１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、５０ Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース含有）（Ｗａｋｏ社製）に添加したもの）で維持したヒトＥＡｈｙ細胞を、４ウェルディッシュに、１ウェル当たり１×１０４個になるように播種した。
続いて、コントロール培地（５ｍＭグルコース含有）又は高グルコース培地（１０ｍＭグルコース含有又は２５ｍＭグルコース含有）（１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、５０ Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＤＭＥＭ（１０ｍＭグルコース含有又は２５ｍＭグルコース含有）（Ｗａｋｏ社製）に添加したもの）で４日間培養した。【００８７】
（２）ヒトＥＡｈｙ細胞及びヒトＲＰＴＥＣ細胞の免疫染色
（１）で培養したヒトＥＡｈｙ細胞及びヒトＲＰＴＥＣ細胞を用い、さらに、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体を用いた染色を行わなかった以外は、実施例２の（３）と同様の方法を用いて、免疫染色を行った。結果を図４Ａ及び図４Ｂの左側に示す。図４Ａは、ヒトＥＡｈｙ細胞の免疫染色結果であり、図４ＢはヒトＲＰＴＥＣ細胞の免疫染色結果である。
また、図４Ａ及び図４Ｂの画像取得後、画像解析ソフトＣｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒ．ｏｒｇ）で核内のＧｌｃＮＡｃ化シグナルのドット数を測定した。統計処理はウィルコクソンの順位和検定で行った。結果を図４Ａ及び図４Ｂの右側に示す。【００８８】
図４Ａ及び図４Ｂから、ヒトＥＡｈｙ細胞及びヒトＲＰＴＥＣ細胞においても、グルコース濃度増加に伴い、ＧｌｃＮＡｃ化レベルが増加することが明らかとなった。【００８９】
［実施例４］低糖及び高糖環境下でのマウスＥＳ細胞におけるＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ
（１）クロマチン免疫沈降法（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰアッセイは、ＣｈＩＰ−ＩＴ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（アクティブモチーフ社製）を用いて、製造元の指示に従い、行った。
まず、低糖（１ｍＭグルコース含有）及び高糖（２５ｍＭグルコース含有）環境下で培養したマウスＥＳ細胞にクロマチン断片化試薬を添加して３７℃で１０分間インキュベートし、細胞を破砕し、クロマチンを断片化した。続いて、１００μＬの断片化されたクロマチンを含む溶液に、３μｇのＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体及び４０μＬの磁気ビーズ（ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体結合ダイナビーズＭ−２８０、又はプロテインＧ結合ダイナビーズ（インビトロゲン社製））を混合し、４℃で撹拌しながら一晩インキュベートした。免疫沈降後、溶出バッファー（１０％ＳＤＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて６５℃で６時間インキュベーションし、ＤＮＡを溶出した。続いて、得られたＤＮＡをＣｈＩＰ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ザイモリサーチ社製）を用いて精製し、続くシークエンスに用いた。【００９０】
（２）シークエンス
ハイスループットＤＮＡシーケンシングのためのライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖ２  Ｋｉｔ，  Ｓｅｔ  Ａ／Ｂ  （イルミナ社製、ＦＣ−１２１−２００１／−２００２）を用いて製造元の指示に従い、準備した。
まず、５０ｎｇの（１）で得られたＤＮＡ、又はインプットＤＮＡの３’末端のアデニル化を修復し、アダプターオリゴを連結した。続いて、ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓ（ベックマン・コールター社製、Ａ６３８８０）を用いて、１２０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、さらにＰＣＲを用いて増幅した。続いて、ライブラリーＤＮＡを２％アガロースゲル上で電気泳動し、その後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（ザイモリサーチ社製、Ｄ４００７）を用いて精製した。精製されたライブラリーＤＮＡはＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ２０００（アジレント社製）を用いて定量した。シークエンスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００  ｓｙｓｔｅｍｓを用いた。【００９１】
続いて、ＣｈＩＰの生データについてシークエンスのアダプター配列と低品質の読み込み情報を削除する事前フィルタリング処理を行い、Ｂｏｗｔｉｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、マウスゲノム（ｍｍ９）からタグをマッピングし、Ｇａｌａｘｙ  ｂｒｏｗｓｅｒ（ｗｗｗ．ｇａｌａｘｙ．ｐｓｕ．ｅｄｕ）におけるＭＡＣＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ピークを検出した。また、ベン図及びジーンオントロジー分析はそれぞれ、ＢｉｏＶｅｎｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｃｍｂｉ.ｒｕ.ｎｌ／ｃｄｄ／ｂｉｏｖｅｎｎ/）及びＤＡＶＩＤ  ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐｓ：//ｄａｖｉｄ.ｎｃｉｆｃｒｆ.ｇｏｖ/）を用いて行った。これらの解析結果を全て図５に示す。【００９２】
図５から、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下で培養したマウスＥＳ細胞よりも（５４．７％）、低糖（１ｍＭグルコース）環境下で培養したマウスＥＳ細胞のほうが（５８．９％）、ゲノムのコーディング領域にセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質が存在する割合が高いことが明らかとなった。
また、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下で培養したマウスＥＳ細胞よりも、低糖（１ｍＭグルコース）環境下で培養したマウスＥＳ細胞のほうが、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体による免疫沈降で得られたＤＮＡ断片が多かった。
さらに、低糖（１ｍＭグルコース）環境下で培養したマウスＥＳ細胞では、セリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質が転写開始点に多く存在する（８．１％）ことが明らかとなった。【００９３】
また、ジーンオントロジー分析から、低糖（１ｍＭグルコース）環境下及び高糖（２５ｍＭグルコース）環境下ではセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質により制御される遺伝子群は一部共通するもの（例えば、タンパク質修飾プロセスに関与する遺伝子群、Ｗｎｔシグナル経路に関与する遺伝子群等）もあったが、異なるものが複数存在することが明らかとなった。【００９４】
［実施例５］ヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞におけるＨ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ
（１）クロマチン免疫沈降法（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）
マウスＥＳ細胞の代わりにヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞を用いた以外は、実施例４の（１）に記載の方法と同様の方法を用いて、ＣｈＩＰアッセイを行い、ＤＮＡ断片を得た。【００９５】
（２）シークエンス
マウスゲノムの代わりにヒトゲノムを用いて、実施例４の（２）と同様の方法を用いて、（１）で得られたＤＮＡ断片のシークエンスを行った。解析結果を図６に示す。【００９６】
図６から、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞と低糖（１ｍＭグルコース）環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞とで、転写開始点、ゲノムのコーディング領域、及びノンコーディング領域におけるセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質の存在比率に大きな差はなかった。
また、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞と低糖（１ｍＭグルコース）環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞とで、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体による免疫沈降で得られたＤＮＡ断片の量に差はなかった。
さらに、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下で培養したヒトＥＡｈｙ細胞では、セリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質が転写開始点に多く存在することが明らかとなった。【００９７】
また、ジーンオントロジー分析から、高糖（２５ｍＭグルコース）環境下でセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されたヒストンＨ２Ａ３タンパク質により制御される遺伝子群はプリン代謝に関与する遺伝子群等５種類の遺伝子群であることが明らかとなった。【００９８】
［実施例６］低糖及び高糖環境下でのマウスＥＳ細胞におけるウエスタンブロッティング法によるＤＮＡ修復関連タンパク質の検出
（１）核内タンパク質の回収
まず、低糖（１ｍＭグルコース含有）及び高糖（２５ｍＭグルコース含有）環境下で、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ；ＣＰＴ）、若しくはエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ；ＥＴＰ）添加、又はＣＰＴ及びＥＴＰ無添加（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）条件にて培養したマウスＥＳ細胞から、ＬｙｓｏＰｕｒｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いて、製造元の指示に従い、核内タンパク質を回収した。
なお、ＣＰＴはＤＮＡ酵素のＩ型トポイソメラーゼ（トポＩ）の働きを阻害するキノリンアルカロイドであり、ＥＴＰはＤＮＡを切断した後、トポイソメラーゼＩＩと複合体を形成し、ＤＮＡの再結合を阻害する抗悪性腫瘍剤であり、共にＤＮＡ傷害を引き起こす化合物である。【００９９】
（２）ウエスタンブロッティング法によるＤＮＡ修復関連タンパク質の検出
次いで、回収された核内タンパク質を用いて、常法に従い、γＨ２ＡＸ抗体（セリン１３９残基がリン酸化されたＨ２ＡＸに特異的に結合する抗体）、Ｈ２ＡＸ抗体、ＡｃＨ２ＡＺ抗体（リジン４残基、リジン７残基、及びリジン１１残基がアセチル化されたＨ２ＡＺに特異的に結合する抗体）、Ｈ２ＡＺ抗体、Ｈ２Ａ３−Ｓ４０−ＧｌｃＮＡｃ抗体、Ｈ２Ａ抗体、ｐ５３結合タンパク質１（ｐ５３−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ 1；５３ＢＰ１）抗体（ｐ５３に結合し、ｐ５３の転写活性を増強するタンパク質である５３ＢＰ１に特異的に結合する抗体）、及びＲａｄ５１抗体（真核生物におけるＤＮＡ二重鎖切断の修復に関与するタンパク質であるＲａｄ５１に特異的に結合する抗体）を用いたウエスタンブロッティング法による検出を行った。結果を図７に示す。【０１００】
図７から、低糖（１ｍＭグルコース含有）及び高糖（２５ｍＭグルコース含有）環境下であってＣＰＴ及びＥＴＰ無添加（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）条件にて培養したマウスＥＳ細胞では、セリン１３９残基がリン酸化されたヒストンＨ２ＡＸタンパク質は検出されなかった。
一方、低糖（１ｍＭグルコース含有）及び高糖（２５ｍＭグルコース含有）環境下であって、ＣＴＰ又はＥＴＰ処理を行い、人工的にＤＮＡ損傷を生じさせたＥＳ細胞では、ヒストンＨ２ＡＸタンパク質におけるセリン１３９残基のリン酸化レベルが増加し、さらに５３ＢＰ１及びＲａｄ５１が誘導されており、一方で、核内におけるヒストンＨ２ＡＺタンパク質のアセチル化レベルは下がっていた。【０１０１】
また、低糖（１ｍＭグルコース含有）環境下で培養したマウスＥＳ細胞では、ＣＴＰ又はＥＴＰ処理の有無にかかわらず、ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが高かった。一方、高糖（２５ｍＭグルコース含有）環境下で培養したマウスＥＳ細胞では、ＣＴＰ又はＥＴＰ処理によって、ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のセリン４０残基のＧｌｃＮＡｃ化レベルが顕著に増加していた。【０１０２】
［実施例７］野生型ヒストンＨ２Ａ３タンパク質（ＷＴ）又は変異型Ｈ２Ａ３タンパク質（Ｈ２Ａ−Ｓ４０Ａ）を高発現したヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞における紫外線照射時間の違いによるＤＮＡ修復能試験
（１）野生型ヒストンＨ２Ａ３タンパク質（ＷＴ）又は変異型Ｈ２Ａ３タンパク質（Ｈ２Ａ−Ｓ４０Ａ）を高発現したヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞の調製
野生型ヒストンＨ２Ａ３タンパク質（ＷＴ）又は変異型Ｈ２Ａ３タンパク質（Ｈ２Ａ−Ｓ４０Ａ）を高発現したヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞をそれぞれ１０ｃｍディッシュに３×１０５個となるように播種し、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（５ｍＭ  グルコース)下で９６時間培養した。【０１０３】
（２）紫外線照射
続いて、（１）で予め培養しておいた細胞に紫外線（ＵＶ−Ｃ、２５４ｎｍ）を０分、１分、又は５分照射した。【０１０４】
（３）抗シクロブタン型ピリミジンダイマー抗体を用いたＥＬＩＳＡ法
続いて、（２）の紫外線照射処理後ただちに回収した細胞をＬｙｓｉｓバッファー［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｕｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ］で懸濁し、５５℃で一晩振盪しながらインキュベートした。その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（以下、「ＰＣＩ」と称する場合がある。）で1回抽出し、３７℃、３０分間ＲＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）処理し、ＲＮＡを分解させた。もう一度、ＰＣＩ抽出し、エタノールでゲノムＤＮＡを沈殿させ、エタノールを除去後、ＴＥバッファー[１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）]で溶解した。ゲノムＤＮＡは使用するまで４℃で保存した。
続いて、１０ｎｇのゲノムＤＮＡを９６ウェルプロタミン表面コートプレートに加えて、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、２％ウシ胎児血清及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて、３７℃で３０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。続いて、抗シクロブタン型ピリミジンダイマー（Ｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｅ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  Ｄｉｍｅｒｓ：ＣＰＤ）抗体（コスモバイオ社製、ＮＭ−ＤＮＤ−００１）（ＰＢＳを用いて、１０００分の１に希釈）を１次抗体として用いて、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）（ＰＢＳを用いて、２０００分の１に希釈））を２次抗体として用いて、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗浄後、ＯＰＤ基質を含有した１×安定化過酸化物基質バッファー（テルモ社製）を加え、ｉＭａｒｋ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図７に示す。【０１０５】
図７から、野生型ヒストンＨ２Ａ３タンパク質（ＷＴ）を高発現したヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞は、変異型Ｈ２Ａ３タンパク質（Ｈ２Ａ−Ｓ４０Ａ）を高発現したヒト血管内皮（ＥＡｈｙ）細胞よりも、ピリミジンダイマーの生成量が抑えられていた。これは、ヒストンＨ２Ａ３タンパク質のセリン４０残基がＧｌｃＮＡｃ化されることにより、ＤＮＡ修復能が発揮され、紫外線照射により生じたプリミジンダイマーの一部が修復されたためであると推察された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、細胞外グルコース濃度の変動が及ぼすヒストン修飾をモニターする方法を提供することができる。
また、本発明によれば、ゲノムＤＮＡの安定性を簡便に評価することができる。
【図１Ａ】
2017043593.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2017043593.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図５】
2017043593.tif 000011
【図６】
2017043593.tif 000012
【図７】
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【図８】
2017043593.tif 000014
【配列表】
2017043593000001.app
【国際調査報告】
2017043593.tif 000015
2017043593.tif 000016
2017043593.tif 000017
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