(57)【要約】本発明は、加齢による生理機能の低下の回復および／または改善する組成物を提供する。ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現した細胞。ＧＤＦ６タンパク質を含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーのヒト発現用ベクターを含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞を含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
2017115789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
【請求項２】
ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーのヒト発現用ベクターを含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
【請求項３】
ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞を含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
【請求項４】
ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現した細胞。
【請求項５】
間葉系幹／間質細胞または血球細胞にＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現させて得られる、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
間葉系幹／間質細胞または血球細胞が老化した細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
ヒト細胞である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、請求項４〜７のいずれか一項に記載の細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
ＧＤＦ６タンパク質が、
（i）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するか、
（ii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示す配列を有するか、
（iii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有するか、または、
（iv）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、
請求項１〜３および８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーが、
（i）配列番号４に示される核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４に示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４に示される核酸配列において、１個〜１０個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、
請求項１、２または８に記載の組成物。
【請求項１１】
老化に関連する状態が、筋肉の老化、造血系の老化、神経系の老化、血管系の老化、皮膚組織の老化、毛髪の老化または細胞老化である、請求項１〜３および８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
老化に関連する状態が、老化に伴う以下の状態：筋肉の損傷の回復力の減少、リンパ球の減少、神経幹／前駆細胞の減少、血管壁の硬化、血管内腔の縮小、血管網の減退、皮膚組織の弾力の低下、皮膚組織の菲薄化、毛つやの低下、未分化細胞の減少またはＳＡＳＰ因子の分泌上昇である、請求項１〜３および８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＧＤＦ６タンパク質が、
（i）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するか、
（ii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示す配列を有するか、
（iii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有するか、または、
（iv）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーが、
（i）配列番号４に示される核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４に示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４に示される核酸配列において、１個〜１０個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢による生理機能の低下を回復または改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ６は、非特許文献１において初めてクローニングされたトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーの一員である。ＧＤＦ６は、ＢＭＰ−１３またはＣＤＭＰ−２とも呼ばれる。ヒトＧＤＦ６は、４５５アミノ酸（分子量：約５０ｋＤａ）のタンパク質であり、配列番号１の塩基配列によりコードされ、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ヒトＧＤＦ６は、成熟過程で開裂を受け、配列番号３で示される１２０アミノ酸の成熟タンパク質となる。成熟タンパク質は、生理的条件下で二量体（特にホモ二量体）を形成し、ＧＤＦ６としての生理的機能を発現する。ＧＤＦ６タンパク質の機能は、眼球、頭蓋骨、足の骨および関節の形成に関与していると考えられている（非特許文献２〜４）。【０００３】
ＴＧＦ−βファミリーの一員であるＧＤＦ１１は、老化と関連して発現が低下すること、老化と関連する状態（例えば、心不全）の処置に用いることが報告されている（特許文献１、非特許文献５）。一方で、ＧＤＦ１１は老化によって発現が上昇し、筋再生能を低下させるという報告もある（非特許文献６）。【０００４】
老化に伴って、筋肉の減少、皮膚組織の菲薄化、血管網の減退、リンパ球の減少、神経細胞の減少、脱毛、白髪などの状態変化に加え、がん、アルツハイマー病、動脈硬化、骨粗鬆症、肺線維症などの加齢性疾患の罹患または罹患の可能性が高い状態となることがよく知られている。また、老化によって、加齢性疾患のように明確な病態ではなくとも認知障害、せん妄、老人性うつ、運動機能障害、慢性めまい、食欲不振、創傷治癒力の低下などの老年性症候群の症状を呈するようになる。これらの状態は、生体組織または生物個体で確認される個体老化である。一方で、微視的な状態変化に着目すれば、老化に関連する状態には細胞老化も含まれる。【０００５】
細胞老化を起こした細胞（老化細胞）は炎症性サイトカイン、ケモカイン、ＭＭＰｓ（Matrix metalloproteases）および増殖因子などの様々な分泌因子を高発現していることが報告されている。このように細胞老化に伴って炎症性サイトカインなどが分泌される現象はＳＡＳＰ（Senescence Associated Secretory Phenotype）と呼ばれ、分泌されるタンパク質はＳＡＳＰ因子と総称される（非特許文献７〜９）。ＳＡＳＰ因子は周囲の細胞にパラクライン作用を及ぼして細胞老化を誘導することも報告されていることから（非特許文献１０）、細胞が老化して起こる現象にとどまらず、体内の様々な部位で老化を促進する因子でもある。また、ＳＡＳＰ因子は慢性炎症の惹起、各種の状態の憎悪およびがん発生に繋がることが指摘され、個体老化との関連が示されている（非特許文献１１〜１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１４２１１４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wolfman et al., J. Clin. Invest., 100 (2): 321-330, 1997
【非特許文献２】Asai-Coakwell M. et al., Am. J. Hum. Genet., 80, 306-315, 2007
【非特許文献３】Clendenning DE and Mortlock DP, PLoS One, 7, e36789, 2012
【非特許文献４】Settle SH Jr. et al., Dev. Biol., 254, 116-130, 2003
【非特許文献５】Loffredo et al., Cell, 153, 828-839, 2013
【非特許文献６】Egerman MA et al., Cell Metab, 22, 164-174, 2015
【非特許文献７】Acosta et al., Cell, 133, 1006-18, 2008
【非特許文献８】Kuilman et al., Cell, 133, 1019-31, 2008
【非特許文献９】Coppe et al., PLoS Biol., 6, 2853-68, 2008
【非特許文献１０】Acosta et al., Nat Cell Biol., 8, 978-90, 2013
【非特許文献１１】Takahashi et al., Mol Cell., 45, 123-31, 2012
【非特許文献１２】Velarde MC et al., Interdiscip Top Gerontol., 38, 17-27, 2013
【非特許文献１３】Yoshimoto et al., Nature, 499, 97-101, 2013
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、加齢による生理機能の低下を回復または改善する組成物を提供する。
【０００９】
本発明者らは、若齢時の間葉系幹／間質細胞（以下、ＭＳＣともいう。）は液性因子であるＧＤＦ６タンパク質を分泌すること、加齢によってＧｄｆ６の発現は低下すること、加齢によってｍｉＲ−１７ファミリーメンバーの発現が低下すること、ｍｉＲ−１７ファミリーを発現抑制するとＧｄｆ６の発現が若齢時でも低下することを見出した。その一方で、本発明者らは、Ｇｄｆ６タンパク質は組織幹細胞の潜在的な再生因子として機能すること、Ｇｄｆ６タンパク質は血中のＳＡＳＰ因子の量を下げること、およびＧｄｆ６タンパク質を介して、加齢による生理機能低下の回復または改善を誘導することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいてなされたものである。
【００１０】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
（２）ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーのヒト発現用ベクターを含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
（３）ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞を含む、老化に関連する状態を処置するための組成物。
（４）ＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現した細胞。
（５）間葉系幹／間質細胞または血球細胞にＧＤＦ６タンパク質またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現させて得られる、上記（４）に記載の細胞。
（６）間葉系幹／間質細胞または血球細胞が老化した細胞である、上記（５）に記載の細胞。
（７）ヒト細胞である、上記（４）〜（６）のいずれかに記載の細胞。
（８）細胞が、上記（４）〜（７）のいずれかに記載の細胞である、上記（３）に記載の組成物。
（９）ＧＤＦ６タンパク質が、
（i）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するか、
（ii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示す配列を有するか、
（iii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有するか、または
（iv）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、
上記（１）〜（３）および（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーが、
（i）配列番号４に示される核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４に示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４に示される核酸配列において、１個〜１０個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、
上記（１）、（２）または（８）に記載の組成物。
（１１）老化に関連する状態が、筋肉の老化、造血系の老化、神経系の老化、血管系の老化、皮膚組織の老化、毛髪の老化または細胞老化である、上記（１）〜（３）および（８）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１２）老化に関連する状態が、老化に伴う以下の状態：筋肉の損傷の回復力の減少、リンパ球の減少、神経幹／前駆細胞の減少、血管壁の硬化、血管内腔の縮小、血管網の減退、皮膚組織の弾力の低下、皮膚組織の菲薄化、毛つやの低下、未分化細胞の減少またはＳＡＳＰ因子の分泌上昇である、上記（１）〜（３）および（８）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１３）ＧＤＦ６タンパク質が、
（i）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するか、
（ii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示す配列を有するか、
（iii）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有するか、または
（iv）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、
上記（４）〜（７）のいずれかに記載の細胞。
（１４）ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーが、
（i）配列番号４に示される核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４に示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４に示される核酸配列において、１個〜１０個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、
上記（４）〜（７）のいずれかに記載の細胞。
【００１１】
本発明によれば、老化した対象において、加齢による生理機能の低下を回復または改善することができる。特に、ＧＤＦ６によって老化した細胞が分泌する老化促進効果が報告されている各種ＳＡＳＰ因子（炎症性サイトカインおよび／またはケモカイン）の血漿中のタンパク質濃度が低下したことは、単に細胞の機能低下を改善するに留まらず、全身性の加齢による生理機能の低下を改善することを示しており、本発明はがん、アルツハイマー病、動脈硬化、骨粗鬆症、肺線維症などの加齢性疾患の罹患または罹患可能性の状態を改善することにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、若齢時の間葉系幹／間質細胞（ＭＳＣ）と老齢時のＭＳＣとにおいて、骨芽細胞への分化能および脂肪細胞への分化能の相違（図１ａ）、Senescence-Associated Secretory Phenotype（SASP）様の炎症性因子の発現の相違（図１ｂ）並びに、成長因子の発現の相違（図１ｃ）を示す。
【図２】図２は、若齢時のＭＳＣと老齢時のＭＳＣとにおけるｍｉＲ−１７ファミリーメンバーの発現量の変化（図２ａ）、並びに、ｍｉＲ−１７を過剰発現させた細胞の骨細胞への分化能および脂肪細胞への分化能への影響（図２ｂおよびｃ）を示す。
【図３】図３は、ｍｉＲ−１７を導入した老いたＭＳＣを老齢マウスに投与するスキーム（図３ａ）、投与した細胞の組織への生着（図３ｂおよびｄ）、および、投与後のマウスにおけるリンパ球数の変化（図３ｃ）を示す。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１７を過剰発現したＭＳＣにおいて、発現量が老化に伴い低下し、ｍｉＲ−１７の過剰発現により回復する分泌因子のスクリーニングの結果を示す（図４ａおよびｂ）。図４ｃおよびｄは、同定した１３の候補遺伝子のうち、特にＧｄｆ６が加齢による生理機能の低下の回復および／または改善の強い作用を有することを示す。図４ｅは、Ｂｍｐ２／４の発現を示す。図４ｆは、ＢＭＰ２によるＭＳＣにおける骨細胞への分化能の変化を示す。
【図５】図５は、Ｇｄｆ６ノックダウンの細胞の分化能への影響を示す。
【図６】図６は、ＧＤＦ６発現ウイルスをマウス腹腔内に投与した実験の結果を示す。図６ａは、老齢マウスへのＧＤＦ６過剰発現用ウイルスの腹腔内投与実験のスキームを示す。図６ｂは、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスにおけるリンパ球数減少への回復効果を示す。図６ｃは、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスにおける筋再生能への回復効果を示す。
【図７】図７ａは、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスの脳における神経前駆細胞数の増加効果を示す。図７ｂは、血漿中におけるＧＤＦ６タンパク質の発現をウェスタンブロット法により確認した結果を示す。
【図８】図８は、ＧＤＦ６過剰発現用ウイルスを腹腔内投与した老齢マウスにおける血中の各種炎症性サイトカインをＭｕｌｔｉｐｌｅｘ法で測定し、ＥＧＦＰ発現レンチウイルスを投与したマウスの値を基準とした各種炎症性サイトカイン量の相対値を示す。
【図９】図９は、Ｇｄｆ６遺伝子を導入した細胞を老齢マウスに投与した後のリンパ球の割合を示す。
【図１０】図１０は、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスの脳組織切片における、抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織学染色像を示す（図１０左）。図１０はまた、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスの脳組織切片において血管が増加していることを示す（図１０右）。
【図１１】図１１は、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスの脳組織切片における、抗Ｄｃｘ抗体を用いた免疫組織学染色像を示す（図１１左）。図１１はまた、ＧＤＦ６過剰発現の老齢マウスの脳組織切片において神経芽細胞が増加していることを示す（図１１右）。
【図１２】図１２は、若齢マウスにおける毛の減少および毛のつやの低下をＧＤＦ６が回復することを示す図である。「ＧＤＦ６」はｈＧＤＦ６をコードするＤＮＡを発現可能に連結したレンチウイルスを投与したマウスの結果を示している。「ＣＴ」はウイルス投与をしていない陰性対照、「ＥＧＦＰ」はＧＤＦ６に代えてＥＧＦＰを発現させた陰性対照を指す。左側は投与から２ヵ月後、右側は投与から８カ月後の結果である。
【発明の具体的な説明】
【００１３】
本明細書で用いられる「細胞製剤」とは、生理機能が低下した状態を処置するために対象に投与される組成物であって、細胞を有効成分として含む組成物を意味する。本明細書で用いられる「タンパク質製剤」とは、タンパク質を有効成分とする組成物を意味する。
【００１４】
本明細書で用いられる「老化に関連する状態」または類似した表現は、細胞および／または組織の生理機能が加齢によって低下して起こる状態を意味する。老化に関連する状態としては、特に限定されないが例えば、リンパ球の減少（あるいはリンパ球産生能力の減少）、神経細胞の減少、筋肉の減少、皮膚組織の菲薄化、血管網の減退および細胞老化を起こした細胞（老化細胞）の増加が挙げられる。老化に関連する状態としてはまた、脳機能の低下、感染症発生率の上昇、癌発生率の上昇、筋肉における損傷の回復力の低下、創傷治癒力の低下、血管壁の硬化、血管内腔の縮小、皮膚組織の弾力の低下および毛つやの低下などの生理機能の低下、並びにこのような状態により生じる加齢性疾患および老年性症候群が挙げられる。細胞老化の状態としては、細胞内のＤＮＡ損傷の蓄積、Ｓｏｘ２陽性神経前駆細胞の減少若しくは消失、組織幹細胞の再生能の低下および細胞老化に伴うSenescenece Associated Secretory Phenotype（SASP）因子の分泌増加が含まれる。細胞老化に伴って分泌が増加するＳＡＳＰ因子としては、炎症性サイトカイン、ケモカイン、ＭＭＰｓ（Matrix metalloproteases）および増殖因子などが挙げられる。より具体的には、炎症性サイトカインとしてはＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、インターフェロンβおよび／またはＧ−ＳＣＦであり、ケモカインとしてはＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１１および／またはＭＣＰ‐１が挙げられる。ＳＡＳＰ因子の分泌増加は、例えば血中濃度の上昇として確認することができる。
【００１５】
本明細書で用いられる「処置」とは、「治療」および／または「予防」を意味する。本明細書で用いられる「治療」とは、状態の悪化を遅延させること、状態の悪化を防止すること、または、状態を改善することを意味する。本明細書で用いられる「予防」とは、状態の発症を抑制することを意味する。
【００１６】
本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄する条件とすることができる。
【００１７】
本明細書で用いられる「過剰発現」とは、目的のタンパク質をコードする外来の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工塩基またはこれらの組合せを含む）を対象の細胞に導入することで、目的のタンパク質の発現量が導入していない細胞と比較して増大している状態、または導入していない細胞では発現していなかった目的のタンパク質が発現するようになった状態を意味する。細胞におけるタンパク質や核酸の過剰発現の方法は当業者に周知であり、特に限定されないが例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスを用いて導入することができる。
【００１８】
本発明によれば、ＧＤＦ６タンパク質は、液性因子として機能し、血中を巡って全身に行き渡り、老化した対象において、加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を発揮する。具体的には、ＧＤＦ６タンパク質を過剰発現させることにより、老齢マウスにおいて、リンパ球の減少（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の減少）、筋肉の減少、神経の減少、血管網の減退および、毛つやの低下、Ｓｏｘ２発現細胞などの未分化細胞の減少またはＳＡＳＰ因子の血中濃度などの、老化に伴う状態が改善された。すなわち、ＧＤＦ６タンパク質により、リンパ球の増加（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増加）、筋肉再生量の増加、神経新生数の増加、血管若しくは血管網の増加および、毛つやの改善（つやが良くなる）、Ｓｏｘ２発現細胞などの未分化細胞の増加またはＳＡＳＰ因子の血中濃度の低下などの、老化に伴う状態の改善効果が見られた。このように、発明者らは、ＧＤＦ６タンパク質が、老齢マウスにおいて、加齢による生理機能の低下を回復および／または改善することを明らかにした。
【００１９】
従って、本発明によれば、ＧＤＦ６を細胞に発現させるためのベクターおよびこれを含む、加齢による生理機能の低下の回復および／または改善するための組成物が提供される。本発明によればまた、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞（例えば、血球細胞またはＭＳＣ）およびこれを含む、加齢による生理機能の低下の回復および／または改善するための組成物が提供される。本発明ではさらに、ＧＤＦ６タンパク質を含むタンパク質製剤などの加齢による生理機能の低下の回復および／または改善するための組成物が提供される。本発明ではさらにまた、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞を含む細胞製剤などの加齢による生理機能の低下の回復および／または改善するための組成物が提供される。
【００２０】
これらの組成物は、老化した対象において、老化を伴う状態の改善、例えば加齢に伴う生理的機能の低下の回復および／または改善に用いることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴うリンパ球の減少および／またはリンパ球の機能を改善することに用いるためのものである。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う筋肉細胞の減少および／または筋肉細胞の機能を改善することに用いるための組成物とすることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う神経前駆細胞の減少および／または神経前駆細胞の機能を改善することに用いるための組成物とすることができる。本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う血管網の減退を改善することに用いるための組成物とすることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う創傷治癒力の低下を改善することに用いるための組成物とすることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う筋肉における創傷治癒力の低下を改善することに用いるための組成物とすることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴う未分化細胞の減少（例えば、Ｓｏｘ２発現細胞の減少）を回復することに用いるための組成物とすることができる。ある態様では、本発明の組成物は、老化した対象において、老化に伴うＳＡＳＰ因子（例えば、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、Ｇ−ＳＣＦ、ＣＣＬ１１、ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３および／またはＣＣＬ４）の血中の量を減少させることに用いるための組成物とすることができる。これらの組成物はまた、リンパ球の増加（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増加）、筋肉再生量の増加、神経新生数の増加、血管若しくは血管網の増加および、毛つやの改善（つやが良くなる）、Ｓｏｘ２発現細胞などの未分化細胞の増加またはＳＡＳＰ因子の血中濃度の低下などの、老化に伴う状態を改善することに用いるための組成物とすることができる。
【００２１】
本発明では、対象は、老化した、または老化が疑われるほ乳類（例えば、ヒト）である。老化した、または老化が疑われるヒトとしては、例えば、個人差があるが、２０歳以上のヒトであり、好ましくは４０歳以上のヒト、４５歳以上のヒト、５０歳以上のヒト、５５歳以上のヒト、６０歳以上のヒト、６５歳以上のヒト、７０歳以上のヒト、７５歳以上のヒト、または８０歳以上のヒトである。老化は、感染力の低下や記憶力の低下その他老化に伴う状態を有しているか否かにより医師等により容易に決定することができる。
【００２２】
本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、タンパク質プロセッシングにより分子内で切断されて１２０アミノ酸の成熟タンパク質（活性化型フォーム）として活性を発揮すると考えられる。従って、本発明の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、ＧＤＦ６タンパク質の活性化型フォーム、例えば、
（i）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
あるいは、他の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、
（ii）配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％の相同性（または同一性）を示す配列を有するか、または、
（iii）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、さらに好ましくは１個〜３個、さらにより好ましくは１個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質であり得る。本発明では、ＧＤＦ６タンパク質の活性化型フォームはホモ二量体を形成し得る。
【００２３】
ＴＧＦβファミリーのタンパク質は、前駆体を形成し、その後、細胞外でプロテアーゼにより分解されることが知られている。ＧＤＦ６も、前駆体形成の後、細胞外でプロテアーゼにより分解されると考えられる。従って、本発明の別の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、前駆体フォーム、例えば、
（i）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
あるいは、他の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、
（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％の相同性（または同一性）を示す配列を有するか、または、
（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、さらに好ましくは１個〜３個、さらにより好ましくは１個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質であり得る。本発明では、ＧＤＦ６タンパク質の前駆体フォームはホモ二量体を形成し得る。前駆体フォームが活性化型フォームに変換されるためには、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３３１番〜３３５番に対応するアミノ酸の配列が保存されていることが好ましい。従って、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質が前駆体フォームとして提供される場合には、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３３１番〜３３５番に対応するアミノ酸の配列が保存されているか、または、ＲＸＸＲモチーフ（ここでＸは任意のアミノ酸を意味する）が保存されているＧＤＦタンパク質を用いることが好ましい。
【００２４】
本明細書では、「相同性」は、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）が提供するBLASTプログラムでデフォルトパラメータ（初期設定）を用いて決定することができる（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi参照）。「同一性」は、２つのアラインメントされた配列間の正確な配列の一致数により決定される。アラインメントは、ClustalW Ver.2のデフォルトパラメータを用いて行うことができる。
【００２５】
ＧＤＦ６は、ＴＧＦβファミリーの増殖因子であり、老化した対象における加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用は、この増殖因子としての活性に起因するものであると考えられる。例えば、同じＴＧＦβ受容体（具体的にはＡＬＫ３／６）とＳｍａｄ１／５／８を共有するＢＭＰ２／４でも、弱いながらも部分的な機能を発揮する（図４ｆ）。従って、ＧＤＦ６による加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用は、部分的には、ＡＬＫ３／６の活性化によるものと考えられる。従って、本発明の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、ＡＬＫ３／６活性化能を有していてもよい。すなわち、本発明の好ましい態様では、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質は、(ii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％の相同性を示す配列を有するタンパク質は、ＡＬＫ３／６活性化能を有していてもよく、（iii）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、さらに好ましくは１個〜３個、さらにより好ましくは１個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＡＬＫ３／６活性化能を有していてもよい。
【００２６】
本発明によれば、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質をコードする核酸配列がプロモータに作動可能に連結された核酸配列を含む、細胞内発現ベクターが提供される。本発明の発現ベクターには、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質をコードする核酸配列の相補配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有する核酸を用いてもよい。本発明の細胞内発現ベクターは、ヒト発現用ベクターとすることができる。本発明のベクターは、酵母や大腸菌内などの微生物内での複製を可能とする複製起点を有していてよい。本発明のベクターは、ヒト体内で複製を可能とする複製起点を有していてもよいし、安全面を考慮してヒト体内では複製ができないベクターであってもよい。ベクターとしては、アデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスなどの当業者に周知のウイルスベクターを用いることができる。また、さらに安全面を考慮して、一過性の発現を目的とした場合には、ＧＤＦ６タンパク質をコードするｍＲＮＡ自体を対象に投与してもよい。ＧＤＦ６タンパク質は、ＧＤＦ６を発現する細胞から当業者に周知の方法により得ることができる。例えば、タグ融合タンパク質として発現させてタグを用いて精製する方法、抗ＧＤＦ６抗体を用いて免疫沈降させる原理を用いる方法、無細胞抽出系により発現させる方法、およびクロマトグラフィーによる生成方法などが知られている。
【００２７】
ある態様では、ＧＤＦ６タンパク質のアミノ酸の一部を置換する場合には、保存的置換が可能である。保存的置換とは、アミノ酸を、性質の類似した他のアミノ酸に置換することを意味する。下記の同一群内における置換は、保存的置換の非限定的な例である：グルタミン酸およびアスパラギン酸などの酸性アミノ酸からなる群；リジンおよびアルギニンなどの塩基性アミノ酸からなる群；ロイシン、アラニン、グリシン、およびイソロイシンなどの疎水性アミノ酸からなる群；グルタミン、ヒスチジン、メチオニンおよびアスパラギンなどの極性アミノ酸からなる群；トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸からなる群；グリシン、アラニン、セリンおよびトレオニンなどの分子量の小さいアミノ酸からなる群；並びに、システインおよびメチオニンなどの含硫アミノ酸からなる群。
【００２８】
本発明によれば、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞を含む、老化に関連する状態を処置するための細胞製剤などの組成物が提供される。ＧＤＦ６タンパク質は、前駆体として分泌され得る。ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞は、例えば、ＧＤＦ６タンパク質を細胞に過剰発現させて得ることができる。ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞としては、特に限定されないが例えば、血液細胞またはＭＳＣにＧＤＦ６タンパク質を過剰発現させて得られる細胞を用いることができる。血液細胞としては、一種類の細胞または複数の細胞が混ざった細胞群でもよく、例えば対象から採取した末梢血を用いてもよい。また、ある態様では、血液細胞としては、赤血球または白血球を用いることができる。白血球としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球または単球を用いることができる。また、リンパ球としては長寿命細胞であるメモリーＢ細胞、メモリーＴ細胞などを用いても良い。これらの細胞にＧＤＦ６タンパク質を発現させる方法は、当業者に周知である。本発明のある態様では、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞は、ほ乳類、より好ましくはヒトから単離したＧＤＦ６タンパク質分泌細胞であってもよい。
【００２９】
本発明のある態様では、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞は、老化した対象から得られた老化した細胞にＧＤＦ６タンパク質を過剰発現させて得てもよい。
【００３０】
本発明によれば、ＧＤＦ６タンパク質は、細胞にｍｉＲ−１７ファミリーメンバーの過剰発現させることにより分泌され得る。従って、本発明では、ＧＤＦ６タンパク質を過剰発現した細胞は、細胞にｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現させた細胞として得てもよい。本発明によればまた、老化した細胞であっても、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現させることでＧＤＦ６タンパク質を過剰発現させることができた。従って、本発明のある態様では、ＧＤＦ６タンパク質を過剰発現した細胞は、老化した細胞にｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現させて得ることもできる。本発明のある態様では、老化した細胞は、老化した対象若しくは老化が疑われる対象から得られたＭＳＣ、または血液細胞とすることができる。これらの細胞にｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを発現させる方法は、当業者に周知である。
【００３１】
ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、およびｍｉＲ−９３からなる群より選択される１以上のマイクロＲＮＡを意味し、好ましくはｍｉＲ−１７である。「ｍｉＲ−１７」は、上記マイクロＲＮＡの前駆体も成熟型のどちらも含む意である。例えば、ｍｉＲ−１７前駆体は配列番号４の塩基配列を有する。成熟型ｍｉＲ−１７としては、配列番号５（miR-17-5p）または配列番号６（miR-17-3p）が例示される。例えば、ｍｉＲ−２０ａ前駆体は配列番号７の塩基配列を有し、成熟型ｍｉＲ−２０ａは、配列番号８（miR-20a-5p）および配列番号９（miR-20a-3p）が例示される。例えば、ｍｉＲ−１０６ｂ前駆体は配列番号１０を有し、成熟型ｍｉＲ−１０６ｂとしては、配列番号１１（miR-106b-5p）および配列番号１２（miR-106b-3p）が例示される。例えば、ｍｉＲ−９３前駆体は配列番号１３を有し、成熟型ｍｉＲ−９３としては、配列番号１４（miR-93-5p）および配列番号１５（miR-93-3p）が例示される。例えば、ｍｉＲ−１０６ａ前駆体は配列番号１６を有し、成熟型ｍｉＲ−１０６ａとしては、配列番号１７（miR-106a-5p）および配列番号１８（miR-106a-3p）が例示される。例えば、ｍｉＲ−２０ｂ前駆体は配列番号１９の塩基配列を有し、成熟型ｍｉＲ−２０ｂとしては、配列番号２０（miR-20b-5p）および配列番号２１（miR-20b-3p）が例示される。ｍｉＲ−１７ファミリーは、ＧＤＦ６タンパク質を発現誘導できる限り、どのような配列を有していてもよい。例えば、ｍｉＲ−１７ファミリーとしては、
（i）配列番号４〜２１のいずれかの核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４〜２１のいずれかに示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４〜２１のいずれかに示される核酸配列において、１個〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、さらにより好ましくは１個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、ＲＮＡとすることができる。例えば、ｍｉＲ−１７としては、
（i）配列番号４に示される核酸配列を有するか、
（ii）配列番号４に示される核酸配列と９０％以上の同一性を有するか、または、
（iii）配列番号４に示される核酸配列において、１個〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、さらにより好ましくは１個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する核酸配列を有する、ＲＮＡとすることができる。ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーがＧＤＦ６タンパク質を発現誘導するか否かは、例えば、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現する細胞またはその培養上清をウェスタンブロット法により分析することにより評価できる。
【００３２】
本発明ではまた、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを含む、老化に関連する状態を処置するための細胞製剤などの組成物が提供される。
【００３３】
また、本発明によれば、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーをコードするＤＮＡがプロモータに作動可能に連結された核酸配列を含む、細胞内発現ベクターが提供される。本発明の細胞内発現ベクターは、ヒト発現用ベクターとすることができる。本発明のベクターは、酵母や大腸菌内などの微生物内での複製を可能とする複製起点を有していてよい。本発明のベクターは、ヒト体内で複製を可能とする複製起点を有していてもよいし、安全面を考慮してヒト体内では複製ができないベクターであってもよい。ベクターとしては、アデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスなどの当業者に周知のウイルスベクターを用いることができる。また、さらに安全面を考慮して、一過性の発現を目的とした場合には、ｍｉＲＮＡ自体を対象に投与してもよい。
また、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを発現するベクターは当業者に周知の方法で作製できる。マイクロＲＮＡは、当業者に周知の方法により調製することができる。例えば、抗Ａｇｏ２抗体を用いて細胞抽出物からマイクロＲＮＡを精製する方法が知られている。
【００３４】
本発明の細胞製剤は、細胞と薬学的に許容可能な賦形剤、担体またはビヒクルを含んでいてもよい。本発明の細胞製剤は、特に限定されないが例えば、静脈内投与、体腔内投与、脳室内投与、心室内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与により非経口的に投与することができる。本発明の細胞製剤は、医薬組成物として使用してもよい。
【００３５】
本発明のタンパク質製剤は、ＧＤＦ６タンパク質と薬学的に許容可能な賦形剤、担体またはビヒクルを含んでいてもよい。本発明のタンパク質製剤は、特に限定されないが例えば、静脈内投与、体腔内投与、心室内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与により非経口的に投与することができる。本発明のタンパク質製剤は、医薬組成物として使用してもよい。
【００３６】
本発明のベクターを含む組成物は、ベクターと薬学的に許容可能な賦形剤、担体またはビヒクルを含んでいてもよい。本発明のベクターを含む組成物は、特に限定されないが例えば、静脈内投与、体腔内投与、心室内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与により非経口的に投与することができる。本発明のベクターを含む組成物は、医薬組成物として使用してもよい。
【００３７】
本発明の別の側面では、老化した対象または老化が疑われる対象において、老化に関連した状態を処置する方法であって、本発明で用いられるＧＤＦ６タンパク質、ＧＤＦ６タンパク質を分泌する細胞、またはＧＤＦ６を発現させるベクターをその必要のある対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明のある態様では、老化した対象または老化が疑われる対象において、老化に関連した状態を処置する方法であって、本発明で用いられるｍｉＲ−１７ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを発現させるベクターまたはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを過剰発現する細胞をその必要のある対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３９】
また、ＧＤＦ６またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを発現する細胞と被検化合物と接触させ、当該接触後のＧＤＦ６の発現量および／またはＧＤＦ６タンパク質の分泌量の変化を検出し、ＧＤＦ６の発現および／またはＧＤＦ６タンパク質の分泌を向上させる化合物を選択することにより、老化に関連した状態を処置するための候補化合物をスクリーニングすることができる。
【００４０】
スクリーニングに用いる「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、および動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物由来の抽出物、植物または動物由来の抽出物、土壌、並びにランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００４１】
ＧＤＦ６を発現する細胞と被検化合物との「接触」は、例えば、ＧＤＦ６またはｍｉＲ−１７ファミリーメンバーを発現する細胞を培養、維持している培地中への添加することによって行うことができる。
【００４２】
被検化合物の接触後のＧＤＦ６の発現量および／またはＧＤＦ６タンパク質の分泌量の変化の検出は、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、検出は、ＧＤＦ６のＲＮＡ量を測定するＲＴ−ＰＣＲ法、および培養上清を回収して行う免疫沈降などが挙げられる。
【００４３】
以下の実施例は、発明を説明するために例示的に示されるものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められる。
【実施例】
【００４４】
実施例１：間葉系幹／間質細胞（ＭＳＣ）の老化と遺伝子発現の変化
本実施例では、ＭＳＣの老化に伴う遺伝子発現の変動を解析した。【００４５】
初代ＭＳＣは、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性、ＴＥＲ１１９陰性、Ｐｄｇｆｒａ陽性かつＳｃａ−１陽性であり、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスから常法を用いて調製した（Morisawa S et al., J Exp. Med., 206: 2483-2496, 2009参照）。２〜３週齢のマウスから調製したものを、若いＭＳＣ（Young MSC）とし、１８月齢以降のマウスから調製したものを、老化ＭＳＣ（Old MSC）として用いた（本明細書ではそれぞれ「若齢時のＭＳＣ」および「老齢時のＭＳＣ」ということがある）。ＭＳＣの培養は、アルファ改変最小必須培地（α-MEM）中で３７℃５％ＣＯ2インキュベーターを用いて行った。【００４６】
骨分化および脂肪分化は、Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenic/Adipogenic Differentiation BulletKit Medium（Lonza社製）を用いて製造者マニュアルに従って行った。骨芽細胞の検出は、Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて行い、脂肪細胞の検出は、オイルレッドＯ（武藤化学（株）、40491）を用いて脂肪細胞が産生する油滴を検出することにより常法に従い行った。【００４７】
過去の報告の通り、Young MSCは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋芽細胞および神経への良好な多能性（multipotency）を維持していた。これに対して、Old MSCは、骨形成能および脂肪形成能が低下していた（図１ａ）。図１ａの左のグラフにより示されるように、Old MSCでは、ＡＬＰ陽性細胞の面積がYoung MSCに対して約２０％に低下していた。これによりＭＳＣは老化に伴いその脂肪細胞分化能を低下させることが明らかとなった。また、図１ａの右のグラフにより示されるように、Old MSCでは、オイルレッドＯ陽性細胞の面積がYoung MSCに対して半分以下に低下していた。これにより、ＭＳＣは老化に伴いその骨分化能を低下させることが明らかとなった。実験は、３回繰り返した。いずれの結果も統計学的有意差を示した（ｐ＜０．０５）。【００４８】
Old MSCにおいて、Senescence-Associated Secretory Phenotype（SASP）様の炎症性因子の発現増加が見られ、また、ある種の成長因子の発現レベルが変動していた（図１ｂおよびｃ）。【００４９】
実施例２：ＭＳＣの老化に関連する因子の同定
本実施例では、実施例１で示された老化に伴うＭＳＣの能力の低下に関連する因子を同定した。【００５０】
この目的のために、ＲＮＡを、Old MSCとYoung MSCとからそれぞれ抽出して、マイクロアレイ（Agilent社製, SurePrint G3 Mouse GE microarray）およびmiRNA qPCR array（Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems社製, TaqMan Array Rodent MicroRNA A+B Cards Set v3.0）を用いて、細胞の老化に関連するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現の変化を分析した。分化の測定は、Hybrid Cell Count programとBZ-X700 顕微鏡 (KEYENCE社製)、およびImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。【００５１】
すると、ｍｉＲ−１７ファミリーメンバーのいずれもが老化と関連してその発現を低下させることを見出した（図２ａ）。【００５２】
ｍｉＲ−１７は、ＭＳＣの骨芽細胞への分化を促進するとも抑制するとも報告されており、未分化ＭＳＣの分化能に対するその役割は不明である。そこで、ｍｉＲ−１７（配列番号４）をレンチウイルスを用いてＭＳＣに導入し、１週間培養してその分化能を評価した。レンチウイルスの作成は常法を用いて行った（Naka-Kaneda H., PNAS, 111:1604-1609, 2014）。陰性対照として、ｍｉＲ−ＬａｃＺを組込んだレンチウイルスを用いた。【００５３】
ＭＳＣの骨芽細胞への分化能は、ＡＬＰ陽性の面積を測定することにより評価した。また、ＭＳＣの脂肪細胞への分化能は、オイルレッドＯ陽性の面積を測定することにより評価した。ｍｉＲ−１７を過剰発現させたOld MSCでは、骨形成能および脂肪形成能が部分的に回復した（図２ｂおよびｃ）。ＡＬＰ陽性面積は、ｍｉＲ−１７導入細胞で、陰性対照よりも約１．６倍増加し、オイルレッドＯ陽性面積は、ｍｉＲ−１７導入細胞で、陰性対照よりも約１．７倍増加した（図２ｂおよびｃのグラフ）。【００５４】
実施例３：ｍｉＲ−１７を強制発現させたOld MSCの移植実験
実施例２では、ｍｉＲ−１７を強制発現させたOld MSCにおいて、老化現象に特徴的であった骨形成能や脂肪形成能が部分的に回復した。本実施例では、このように老化に伴う能力低下を回復させたＭＳＣを移植してこれがレシピエントにおけるリンパ球再生能に及ぼす影響を確認した。【００５５】
移植実験は、図３ａに図示するスキームにより行った。すなわち、１８月齢以降の老齢マウスからＰαＳ細胞（ＰＤＧＦＲα＋、ＳｃａＩ＋細胞）としてＭＳＣ細胞を調製した１週間後に、レンチウイルスを用いてｍｉＲ−１７またはＬａｃＺを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と共にＭＳＣ細胞に強制発現させた。その後、さらに１週間培養してから細胞を回収し、回収した細胞を１８月齢以降の老齢マウスに静脈投与した。１６週間後に移植を受けた老齢マウスを分析した。【００５６】
まず、末梢血におけるＢ２２０陽性Ｂ細胞、ＣＤ３ε陽性Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ陽性ミエロイド細胞の割合をＦＡＳＣにより分析した。【００５７】
すると、ｍｉＲ−１７を強制発現させたOld MSCを移植したマウスでは、老化に伴い減少するリンパ球の比率を顕著に回復させた（図３ｃ）。【００５８】
移植したＭＳＣの体内での分布を確認するため、骨髄、肺、肝臓、脾臓および末梢血を回収し、ＦＡＣＳによりそのＧＦＰ発現を分析した。その結果、移植されたＭＳＣは肺のみから検出された（図３ｂ参照）。一方で、骨髄、肝臓、脾臓および末梢血からは移植されたＭＳＣは検出されなかった（図３ｂおよびｄ）。【００５９】
図３ｂおよびｄの結果から、移植されたＭＳＣは骨髄にも末梢血にも存在しなかった。しかしながら、図３ｃの結果によると、miR-17を過剰発現したＭＳＣを移植することにより老化に伴うリンパ球数の減少に遅延／回復効果が観察された。これらの結果は、移植されたＭＳＣ自体ではなくむしろ、移植したmiR-17を過剰発現するＭＳＣから放出される分泌性因子がリンパ球の回復を担うことを示唆する。【００６０】
実施例４：老化を回復する分泌性因子の同定
実施例３の結果から、ＭＳＣは老化を回復する分泌性因子を放出して老齢マウスに対して加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を発揮させることが明らかとなった。本実施例では、加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を担う分泌性因子を同定した。【００６１】
Young MSC、Old MSC、およびｍｉＲ−１７を強制発現させたＭＳＣを移植した老齢マウスの間で、遺伝子発現プロファイルを実施例２の記載のようにマイクロアレイにより分析して各群間で比較した。下記候補遺伝子を選択する基準により５９，３０５遺伝子（プローブ）から７０１遺伝子（プローブ）を絞り込んだ（図４ａ）。【００６２】
候補遺伝子を選択する基準
（１）発現量が、Young MSCと比較してOld MSCにおいて0.7倍未満である
（２）発現量が、Young MSCと比較して陰性対照（ｍｉＲ−ＬａｃＺ）を導入したOld MSCにおいて0.7倍未満である
（３）発現量が、Young MSCと比較してｍｉＲ−１７を強制発現させたOld MSCにおいて0.7倍以上である
（４）発現量が、陰性対照を導入したOld MSCと比較してｍｉＲ−１７を強制発現させたOld MSCにおいて1.5倍を超える【００６３】
上記基準の（１）および（２）は、老化したＭＳＣにおいて発現量が低下するという条件に関し、上記基準の（３）および（４）は、ｍｉＲ−１７の強制発現により発現量が改善されるという条件に関するものである。【００６４】
絞り込まれた７０１遺伝子から、遺伝子オントロジー解析により分泌因子と考えられる遺伝子として１３遺伝子を選択した（図４ｂの下線で示された遺伝子）。この１３遺伝子の中に加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を担う分泌性因子が存在すると考えられた。【００６５】
従って、図４ｃに示されるように、上記１３遺伝子それぞれをYoung MSCのｃＤＮＡライブラリーからクローニングして、２９３Ｔ細胞に導入し、それぞれの遺伝子から産生される分泌因子を含む培養上清を回収した。【００６６】
次いで、回収された培養上清を用いて細胞の骨分化アッセイを行った。アッセイは図４ｃに記載されるスキームに従って行った。具体的には、１８月齢以降の老齢マウスの骨髄から骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を採取して培養ディッシュに播種した。ＭＳＣ成長培地（α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で５日間培養した後、細胞を再播種した。播種１日後、回収された培養上清を５０％含む、または含まない骨芽細胞分化培地（Lonza, PT-3002）で１４日間培養した。【００６７】
回収した細胞をＡＬＰで染色すると、Ｇｄｆ６を導入した２９３Ｔ細胞の培養上清で培養したOld MSCのみがＡＬＰ陽性であった（図４ｄ）。【００６８】
Ｇｄｆ６は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する分泌因子であり、目、頭蓋骨、一部の骨および足の関節の形成に必要であることで知られている（Asai-Coakwell M, et al., Am. J. Hum. Genet., 80, 306-315, 2007およびClendenning D.E. & Mortlock D.P., PLoS One, 7, e36789, 2012）。Ｇｄｆ６は、Ｂｍｐ２／４と同じＢＭＰ受容体を利用することで知られている（Mazerbourg S, et al., J. Biol. Chem., 280, 32122-32132, 2005）。そこで、Ｂｍｐ２／４とＧｄｆ６の性質を比較する実験を行った。【００６９】
Ｂｍｐ２／４の発現を、Young MSCとOld MSCとで比較すると、Young MSCとOld MSCとで大きな相違は観察されず（図４ｅ）、細胞の老化で大きく変化しないことが分かった。Ｂｍｐ２／４をYoung MSCおよびOld MSCにそれぞれ導入すると、Ｂｍｐ２／４はYoung MSCにおいては骨分化を顕著に増強させたが、Old MSCにおいては改善効果はあったものの小さな改善効果であった（図４ｆ）。この結果から、Ｇｄｆ６は、Ｂｍｐ２／４とは独立した経路により、Old MSCにおける骨形成能を改善していることが示唆された。【００７０】
実施例５：Ｇｄｆ６の生理的役割および老化に対する効果の検証１
本実施例では、ＭＳＣを用いてインビトロでＧｄｆ６をノックダウンすることにより、Ｇｄｆ６の生理的意義を分析した。本実施例ではまた、インビボでＧｄｆ６を老齢マウスに発現させて老化現象に対する効果を検証した。【００７１】
Ｇｄｆ６のノックダウンは、３種のｓｈＲＮＡを用いて検証した。用いたｓｈＲＮＡの配列は、配列番号２３（ｓｈＧｄｆ６‐１）、配列番号２４（ｓｈＧｄｆ６‐２）および配列番号２５（ｓｈＧｄｆ６‐３）に示される通りであった。ｓｈＲＮＡは、常法によりYoung MSCに導入した。コントロールｓｈＲＮＡとしては、２２を用いた。【００７２】
クローニングしたＧｄｆ６のＮ末側に赤色蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を付加した融合タンパク質を発現するベクターを作成し、ＧＦＰをレポーターとして組み込んだ前記ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターと２９３Ｔ細胞に共導入してＦＡＣＳで解析した。ＧＦＰ発現強度からｓｈＲＮＡの発現量を読み取り、ｍＫａｔｅ２発現強度からＧｄｆ６の発現量を読み取り、ノックダウン効率を評価した。コントロールｓｈＲＮＡを導入した際のｍＫａｔｅ２陽性細胞数を基準値として、ｓｈＧｄｆ６‐１、−２、または−３を導入した際のｍＫａｔｅ２陽性細胞数がどのぐらい減少しているかを相対定量した結果、ｓｈＧｄｆ６‐１が最も効果的にノックダウンできることが確認された。【００７３】
ＡＬＰ陽性細胞の面積（図５ａ）およびオイルレッドＯ陽性細胞の面積（図５ｂ）は、Ｇｄｆ６をノックダウンした場合に増大した。Ｇｄｆ６は、脂肪形成と骨形成の両方に関与していることが明らかとなった。【００７４】
次に、ヒトＧＤＦ６を１８月齢以上の老齢マウスに強制発現させてその効果を確認した。ヒトＧＤＦ６としては、配列番号１に示される配列を有するＧＤＦ６（以下、「ｈＧＤＦ６」という）を用いた。ｈＧＤＦ６をコードするＤＮＡを発現可能に連結したレンチウイルスをマウスの腹腔内に注射した。陰性対象としては、注射をしないマウスおよびＧＤＦ６に代えてＥＧＦＰを発現させたマウスを用いた。レンチウイルスの注射は、腹腔内にウイルスを１日おきに３回注射することにより行った。【００７５】
注射から４、８、１２および１６週後に末梢血を回収し、末梢血細胞種の割合を分析した（図６ａ）。すると、ｈＧＤＦ６を導入した老齢マウスでは、リンパ球系細胞であるＢ２２０陽性細胞（すなわち、Ｂ細胞）およびＣＤ３ｅ陽性細胞（すなわち、Ｔ細胞）が増加し、ＣＤ１１ｂ陽性細胞（すなわち、ミエロイド細胞）の割合が低下した（図６ｂ左ドットプロット）。老齢マウスにｈＧＤＦ６を導入することによってミエロイド細胞の割合およびＢ細胞の割合が若いマウスと同等のレベルに回復していた（図６ｂ右グラフ）。【００７６】
次に、レンチウイルス注射の１６週後に前脛骨筋をカルジオトキシン（ＣＴＸ）の局所注射により損傷させ、その５日後に損傷の修復を観察した（図６ａ）。修復は、胚性ミオシン重鎖陽性（ｅＭＨＣ＋）の新生筋芽細胞の存在の有無により検証した。【００７７】
免疫組織学染色は以下のように行った。まず、常法により、損傷箇所の組織をパラフィン包埋し、抗ｅＭＨＣ抗体（MYH3; 1:50, Santa Cruz Biotechnology sc-53091）を用いてｅＭＨＣ陽性細胞を染色し、抗Ｓｏｘ２抗体（1:100, Abcam ab92494）を用いてＳｏｘ２陽性細胞を染色した。二次抗体としては、Alexa Flour結合抗マウスおよびウサギＩｇＧ抗体（1:500, Thermo Fisher Scientific A21424, A21206）を用いた。BZ-X700 顕微鏡(KEYENCE社製)とそれに付属するハイブリッドセルカウント機能を用いて切片を解析した。【００７８】
結果は、図６ｃに示される通りであった。図６ｃに示される通り、若いマウスではｅＭＨＣ陽性筋芽細胞が多く出現するのに対して、老齢マウスやＥＧＦＰ導入老齢マウスではその量は少なかった。これに対して、ｈＧＤＦ６を強制発現させた老齢マウスでは、ｅＭＨＣ陽性筋芽細胞が顕著に多く出現した（図６ｃ）。単位面積あたりのｅＭＨＣ陽性筋芽細胞の数を比較すると、ｈＧＤＦ６を導入することによって老齢マウスにおける筋肉の再生が若いマウスと同等以上になることが明らかとなった（図６ｃ）。【００７９】
さらに、Ｓｏｘ２陽性神経前駆細胞をレンチウイルス注射１６週後のマウスにおいて確認した。すると、老齢マウスでは減少するＳｏｘ２陽性細胞の割合が、ｈＧＤＦを強制発現させることにより若いマウスと同等のレベルにまで回復した（図７ａ）。この割合の回復は、脳室下帯および線条体を含む広範な領域において認められた。老齢マウスの脳組織切片を血管内皮マーカーであるＣＤ３１に対する抗体で免疫組織学染色を行ったところ、図１０に示されるように、ＧＤＦ６を強制発現したマウスの脳組織では血管組織が大幅に増加していることが明らかであった。さらにＤｃｘに対する抗体で老齢マウスの脳組織切片を染色して神経芽細胞を観察したところ、図１１に示されるように、ＧＤＦ６により神経芽細胞が増加し、神経新生が改善していることが明らかであった。【００８０】
マウス血漿中のｈＧＤＦ６をウェスタンブロット法により確認した。血漿をAurum Serum Protein Mini Kit (Bio-Rad, 7326701)により精製し、ウェスタンブロット法では、抗ＧＤＦ６抗体（Sigma-Aldrich, PRS4691）を検出抗体として用いた。その結果、不活性型フォームである全長形態および活性化型フォームであるダイマー形態のｈＧＤＦ６が、レンチウイルス注射１０日後〜５ヶ月後にわたり血漿中に確認された（図７ｂ）。【００８１】
実施例６：Ｇｄｆ６の生理的役割および老化に対する効果の検証２
本実施例では、細胞老化に伴うＳＡＳＰ因子の分泌をＧＤＦ６が抑制することができるかどうかを調べた。【００８２】
実施例５と同様に、ｈＧＤＦ６をコードするレンチウイルスを腹腔内投与してｈＧＤＦ６を強制発現させた１８月齢以上の老齢マウスより、注射から１２週後に末梢血を回収し、遠心分離により血漿を採取した。ＳＡＳＰ因子として知られる炎症性サイトカインまたはケモカインのＩＬ１−ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、Ｇ−ＳＣＦ、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１ａ（ＣＣＬ３）およびＭＩＰ−１ｂ（ＣＣＬ４）の血漿中のタンパク質量を、Bio-Plex Pro マウスサイトカインアッセイ（BIO-RAD社）およびBio-Plex200（Bio-Rad社）を用いて定量した。比較対象としてＥＧＦＰを発現させたマウスの血漿中の炎症性サイトカインおよびケモカイン量を基準値（１）として相対値を求めた。【００８３】
結果は図８に示される通りであった。図８に示されるように、ＧＤＦ６によってＳＡＳＰ因子の各種炎症サイトカインおよびケモカインの量がいずれも０．５以下に減少していることが確認された（図８）。このことより、ＧＤＦ６は細胞老化に伴うＳＡＳＰ因子の分泌を抑制することが示された。【００８４】
実施例７：Ｇｄｆ６遺伝子を導入した細胞による老化に対する効果の検証
実施例５および６では、老齢マウス自体にレンチウイルスを投与してＧＤＦ６をマウスに強制発現させたが、本実施例では、ＧＤＦ６を強制発現させた末梢血を老齢マウスに投与して老化に対する効果を検証した。【００８５】
若いマウス２０匹から末梢血を２００μｌずつ採取し、赤血球を溶血して得られた白血球分画の半分に前期実施例のｈＧＤＦ６発現用レンチウイルスを、もう半分にＥＧＦＰ発現用レンチウイルス（対照）を導入して３時間培養した。レンチウイルスによるｈＧＤＦ６またはＥＧＦＰの発現を確認し、培養上清から十分なｈＧＤＦ６の分泌を確認した。前記の培養後、全細胞約５千万〜２億個のＧＤＦ６発現細胞群またはＥＧＦＰ発現細胞群をそれぞれ老齢マウスに静脈投与で移植した。各細胞群を投与した老齢マウスから４週後に末梢血を回収し、実施例５と同様に末梢血細胞種の割合リンパ球を分析した。【００８６】
結果は図９に示される通りであった。図９に示されるように、ｈＧＤＦ６発現細胞群を導入した老齢マウスでは、リンパ球系細胞であるＢ２２０陽性細胞（すなわち、Ｂ細胞）およびＣＤ３ｅ陽性細胞（すなわち、Ｔ細胞）が増加し、ＣＤ１１ｂ陽性細胞（すなわち、ミエロイド細胞）の割合が低下していた。
以上より、老齢マウスにｈＧＤＦ６を過剰発現する細胞を投与することで、ｈＧＤＦ６の遺伝子発現用ベクターの導入と同様の効果を得ることが確認された。【００８７】
これらの実施例により、ｍｉＲ−１７の強制発現によりＭＳＣが老齢マウスに対して加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を発揮するようになること、この作用は、分泌因子を介して発揮されること、分泌因子であるＧＤＦ６が加齢による生理機能の低下の回復および／または改善作用を担うことが明らかとなった。具体的には、ＧＤＦ６の血漿における存在は、老化に伴うリンパ球の減少、損傷に対する筋再生能の減少、神経前駆細胞の減少、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌を抑制／回復することができた。また、ＧＤＦ６を強制発現させた老齢マウスでは、毛のつやが回復した。このように、ＧＤＦ６は、老化に伴う様々な状態を処置することに用いることができることが明らかとなった。【００８８】
実施例８：Ｇｄｆ６の毛に対する効果の検証
次に、前述の実施例と同じｈＧＤＦ６をコードするＤＮＡを発現可能に連結したレンチウイルスを若齢マウスの腹腔内に１日１回の頻度として３日連続で投与し、老化に伴うマウスの毛の減少および毛のつやについて経過観察した。陰性対象としては、ウイルス投与をしていないマウスおよびＧＤＦ６に代えてＥＧＦＰを発現させたマウスを用いて、同ケージ内で飼育した。結果は図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、投与から２カ月後及び８カ月後のそれぞれにおいて、ｈＧＤＦ６を発現させたマウスでは、陰性対照と比較して背中全体で毛および毛のつやが維持されていることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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