(57)【要約】  多能性幹細胞から効率良く、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法の提供。  蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に、多能性幹細胞由来胚様体を培養することを特徴とする、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に、多能性幹細胞由来胚様体を培養することを特徴とする、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法。
【請求項２】
蝸牛由来フィーダー細胞が、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によりコロニーを形成した細胞である請求項１記載の内耳細胞の製造法。
【請求項３】
多能性幹細胞由来胚様体が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の添加剤の存在下に培養することにより得られた胚様体である請求項１又は２記載の内耳細胞の製造法。
【請求項４】
多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である請求項１〜３のいずれか１項記載の内耳細胞の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の新たな製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
難聴は、最もよくみられる先天性感覚障害であり、約１０００人に１人は、出生時又は幼児期に重度の難聴を発症し、これは言語習得時前難聴と定義されており、その約半分は遺伝的要因によるものである。同定された遺伝子座と関連して１００以上の形式の非症候性難聴があることが知られている。コネキシン２６（Ｃｘ２６）をコードするギャップ結合ベータ２遺伝子（ＧＪＢ２）における変異は、非症候性感音性難聴の原因の５０％を占める。Ｇｊｂ２およびＧｊｂ６にコードされるＣｘ２６及びＣｘ３０は、集合し細胞間のギャップ結合形成に関わる。これらのコネキシンは、蝸牛で最も豊富に発現するギャップ結合形成タンパク質の２つである。ギャップ結合は、蝸牛有毛細胞からのＫ+イオンの急速な除去を促進し、Ｋ+を内リンパに戻すことによって、蝸牛の恒常性が維持される。Ｃｘ２６及びＣｘ３０は、多くの蝸牛ギャップ結合プラーク（ＧＪＰｓ）及びインビトロの実験において、異種及び異型チャンネルを形成する。本発明者の最近の研究では、Ｃｘ  ＧＪＰの崩壊がＧＪＢ２関連難聴発症に関し、蝸牛ＧＪＰの集合がＣｘ２６に依存することが分かった（非特許文献１）。また、アデノ関連性ウイルスを使用したＧｊｂ２の蝸牛遺伝子導入により、顕著にＧＪＰ形成及び聴覚機能が改善したことを報告した（非特許文献２）。本発明者は、また骨髄間葉系幹細胞を用いた内耳細胞治療のための新たな戦略を開発した（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J. Clin. Invest. 124, 1598-1607(2014)
【非特許文献２】Hum. Mol. Genet. 24, 3651-3661(2015)
【非特許文献３】Am. J. Pathol. 171, 214-226(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、幹細胞からＣｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の効率的な製造法は報告がなく、細胞レベルでのＧＪＢ２変異型難聴の研究は不可能であった。従って、本発明の課題は、多能性幹細胞から効率良く、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、多能性幹細胞からＣｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞を作製すべく種々検討した結果、多能性幹細胞を分化誘導して胚様体を形成させた後、これを蝸牛由来のフィーダー細胞上において培養すれば、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が高い効率で得られることを見出し、本発明を完成した。【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。【０００７】
〔１〕蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に、多能性幹細胞由来胚様体を培養することを特徴とする、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法。
〔２〕蝸牛由来フィーダー細胞が、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によりコロニーを形成した細胞である〔１〕記載の内耳細胞の製造法。
〔３〕多能性幹細胞由来胚様体が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ及びＴＧＦ−β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の添加剤の存在下に培養することにより得られた胚様体である〔１〕又は〔２〕記載の内耳細胞の製造法。
〔４〕多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の内耳細胞の製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法により得られる内耳細胞は、蝸牛と同様にＣｘ２６及びＣｘ２６を含有するギャップ結合プラークを形成するとともに、蝸牛細胞に局在するｐ２７を発現し、また発達期の蝸牛細胞に特徴的な自発カルシウム発火の伝達が見られる。従って、本発明により得られる内耳細胞を用いれば、ＧＪＢ２変異型難聴の遺伝性難聴の薬剤のスクリーニング、内耳再生医療に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】７日目におけるアグリゲートの形成と内耳誘導プロトコールの概要を示す。（ａ，ｅ，ｉ）７日目のアグリゲートの形態：（ａ）コントロールとして未処理のアグリゲート、（ｅ）ＢＭＰ／ＳＢ（Ｂ／Ｓ）、（ｉ）ＢＭＰ／ＳＢ＋ＦＧＦ／ＬＤＮ（Ｂ／Ｓ＋Ｆ／Ｌ）（ｂ，ｆ，ｊ）未分化細胞（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性領域：緑色）、核（ＤＡＰＩ：青色）（ｃ，ｇ，ｋ）７日目のアグリゲートにおける外層上皮の形成  ファロイジン染色（赤）により、アグリゲートが、外Ｆ−アクチン＋外層上皮を含むことを示していた。（ｄ，ｈ，ｌ）それぞれ（ａ−ｃ、ｅ−ｇ、ｉ−ｋ）中の囲み部分の拡大図である。外層上皮は、コントロールにおいて重層上皮を形成し、Ｂ／Ｓ及びＢ／Ｓ＋Ｆ／Ｌにおいて単層上皮を形成した。（ｍ）内耳誘導方法：ｄｅ：最後の外胚葉、ｎｎｅ：非神経外胚葉、ｐｐｅ：予定プラコード外胚葉。スケールバー：（ａ−ｃ、ｅ−ｇ、ｉ−ｋ）１００μｍ、（ｄ，ｈ，ｌ）１０μｍ。
【図２】未分化又は分化ｉＰＳ細胞におけるＣｘ２６及びＣｘ３０ｍＲＮＡ発現を示す。０日目（未分化ｉＰＳ細胞）と７日目のアグリゲートのｍＲＮＡに関する定量的なＰＣＲ分析。ｍＲＮＡの発現レベルを、未処理のアグリゲート（コントロール）に対して計算した。（ａ）Ｃｘ２６は、コントロールと比較して、ＢＭＰ、Ｂ／Ｓ、Ｂ／Ｓ＋ＦＧＦ、Ｂ／Ｓ＋ＬＤＮ及びＢ／Ｓ＋Ｆ／Ｌの各サンプルにおいて有意に上部制御されていた。（ｂ）Ｃｘ３０は、コントロールと比較して、ＢＭＰ、Ｂ／Ｓ、Ｂ／Ｓ＋ＦＧＦ、Ｂ／Ｓ＋ＬＤＮ及びＢ／Ｓ＋Ｆ／Ｌの各サンプルにおいて有意に上部制御されていた。統計的な差異を、スチューデントｔ検定、ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１で決定した。
【図３】三次元培養と二次元培養におけるＣｘ２６発現を示す。（ａ）未分化ｉＰＳ細胞は、Ｃｘ２６を発現しなかった（赤色）。囲み部分は、幾つかのコロニーにおけるＮａｎｏｇ−ＧＦＰである（緑色）。（ｂ）ＴＲＩＣは、Ｃｘ２６（赤色）もＣｘ３０（緑色）も発現しなかった。（ｃ−ｆ）７日目のＢＭＰ及びＢ／Ｓ処理アグリゲートにおけるＣｘ２６の発現（赤色）。（ｄ，ｆ）それぞれ（ｃ，ｅ）における囲み部分の拡大図。（ｇ）３Ｄ画像を、（ｆ）の画像から構築した。（ｈ−ｋ）１４日目（ｈ，ｉ）と２１日目（ｊ，ｋ）のＢＭＰ条件下での二次元培養におけるＣｘ２６の発現（赤色）。（ｉ，ｋ）それぞれ（ｈ，ｊ）における囲み部分の拡大図。（ｌ）３Ｄ画像を、（ｋ）の画像から構築した。（ｍ）７日目の三次元培養と２１日目のＴＲＩＣでの二元培養におけるＣｘ２６陽性細胞の割合（３つのアグリゲートにおいてｎ＝１５、２つの付着性細胞においてｎ＝１０、２つの別個の実験）。（ｎ）７日目のアグリゲートと２１日目のＴＲＩＣでの二次元培養の単層細胞境界に伴う最大ＧＪＰ長（２つの別個の実験においてｎ＝１５）。統計的な差異を、スチューデントｔ検定、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で決定した。核を、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。ＧＪＰに対して印された矢印。スケールバー：５０μｍ（ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｊ）、１０μｍ（ｄ、ｈ）、５μｍ（ｆ，ｉ，ｋ）、２μｍ（ｇ、ｌ）。
【図４】多能性幹細胞をＢＭＰ及びＴＧＦ−β１阻害剤の存在下に培養した胚様体の形態を示す。Ｃ：７日目のＢＭＰ及びＢ／Ｓ処理アグリゲートにおける実体顕微鏡像。Ｄ：Ｃにおける囲み部分の拡大図とアグリゲート内に局在する小胞。Ｅ：小胞の位相差顕微鏡像とＣｘ２６（赤色）の組み合わせ。Ｆ：Ｃｘ２６（赤色）と、核（青色）の組み合わせ。Ｇ：Ｆにおける囲み部分の拡大図。Ｈ：Ｇの画像から構築した３Ｄ画像。Ｉ：アグリゲートにおける外皮と小胞を示す走査顕微鏡像。J：Iにおける囲み部分の拡大図。Ｋ：Jにおける囲み部分の拡大図。
【図５】２１〜２３日目にＢＭＰ条件下で二次元培養により得られた分化細胞における特定の細胞マーカーの免疫組織化学を示す。（ａ−ｃ）二次元細胞の培養におけるＣｘ２６とＣｘ３０の二重染色。（ａ）Ｃｘ２６（赤色）。（ｂ）Ｃｘ３０（緑色）。矢印は、ＧＪＰを示す。（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ。核を、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。矢印は、ＧＪＰを示す。（ｄ−ｍ）不均一（ｄ−ｉ）と均一（ｊ−ｍ）ｐ２７kip1陽性領域での２１〜２３日目の二次元細胞の培養におけるＣｘ２６及びｐ２７kip1の二重染色。（ｅ，ｆ）での矢印は、ｐ２７kip1陽性細胞を示している（ｄ，ｇ，ｊ，ｌ）Ｃｘ２６（赤色）と核（青色）の組み合わせ。（ｅ，ｈ，ｋ，ｍ）ｐ２７kip1（緑色）とＣｘ２６（赤色）の組み合わせ。（ｆ，ｉ）ｐ２７kip1（緑色）と、Ｃｘ２６（赤色）と、核（青色）の組み合わせ。（ｄ−ｆ）と（ｊ，ｋ）における囲み部分は、それぞれ（ｇ−ｉ）と（ｌ，ｍ）での拡大図である。不均一性のｐ２７kip1陽性領域において、ｐ２７kip1＋／Ｃｘ２６＋細胞（ｇ−ｉ、矢印）およびｐ２７kip1陰性の有糸分裂細胞を観察した（ｇ−ｉのそれぞれにおける矢印）。スケールバー：５μｍ（ａ−ｃ）、１０μｍ（ｄ−ｍ）。
【図６】マウスのｉＰＳ由来細胞におけるギャップ結合の超微細構造を示す。（ａ）透過電子顕微鏡写真により、ＢＭＰ処理アグリゲートの分化細胞における３細胞結合を示している（緑色、ピンク色、青色）。（ｂ）（ａ）における囲み領域の拡大図である。３つのギャップ結合に対応する超微細構造が、３細胞結合で観察された。（ｃ−ｅ）（ｂ）における囲み領域の拡大図である。超微細構造は、原形質膜間に明らかな中間層を有する典型的なギャップ結合である。スケールバー：（ａ）５μｍ、（ｂ−ｅ）１００ｎｍ。
【図７】細胞のスクレープローディング後の蛍光色素移行を示す。スクレープローディング後の培養細胞のデジタル蛍光画像である。未分化ｉＰＳ細胞（ａ，ｄ，ｇ）、ＴＲＩＣ（ｂ，ｅ，ｈ）及び２１日目のｉＣｘ２６ＧＪＣを含むＢＭＰ処理ｉＰＳ由来二次元培養（ｃ，ｆ，ｉ）を、０．１％の蛍光色素ルシファーイエロー（ＬＹ）中でインキュベートし、そして手術用メスの刃で傷つけてから１５分後に撮影した。損傷細胞は、全てのケースで染色したものの、主要な損傷細胞から隣の細胞へ色素の移動はなかった。（ａ−ｃ）位相差顕微鏡法である。（ｄ−ｆ）ＬＹを使用する染色移動。（ｇ−ｉ）疑似カラー画像は、それぞれ（ｄ−ｆ）における画像の低信号強度（黒色）から高信号強度（赤色）までの範囲を示している。スケールバー：５０μｍ。
【図８】１５日目のＢ／Ｓ条件下での二次元培養における自発的Ｃａ2+シグナル伝達活性を示す。（ａ）４つの細胞における蛍光強度の経時変化である（１〜４に分類）。細胞に、Ｃａ2+レポーターｆｌｕｏ−４ＡＭを負荷し、２６０ｍｓにつき１フレームにて４０秒間撮影した。矢印は、（ｃ）に相当する時点を示している。（ｂ）二次元培養で関心のある領域である。（ｂ）での囲み領域を、（ｃ）において拡大した。（ｃ）各時点（０、２、１１、１８、２１、２５、２８及び４０秒）での４つの細胞における蛍光強度である。全てのスケールバーは２０μｍである。
【図９】ｉＣｘ２６ＧＪＣにおける自発的Ｃａ2+発火やその伝搬に対するｐ２ｘ受容体阻害薬（ＰＰＡＤＳ）およびコネキシンヘミチャネル阻害薬の影響を示す。Ａ：各時点（０、４、７、１０、２４及び５０秒）での細胞における蛍光強度である。Ｂ：疑似カラー画像は、Ａにおける画像の低信号強度（黒色）から高信号強度（白色）までの範囲を示している。Ｃ：ｐ２ｘ受容体阻害薬（ＰＰＡＤＳ）およびコネキシンヘミチャネル阻害薬をそれぞれｉＣｘ２６ＧＪＣへ添加した際の自発的Ｃａ2+発火による蛍光強度を示す。
【図１０】Ｃｘ２６欠損マウス由来のｉＰＳ細胞を用いて、本発明方法と同様に内耳細胞を作製した結果を示す。Ａ〜Ｆ：正常マウス（Ａ，Ｃ，Ｅ）またはＣｘ２６欠損マウス（Ｂ、Ｄ、Ｆ）の蝸牛細胞におけるＣｘ２６（Ａ、Ｂ）およびＣｘ３０（Ｃ〜Ｆ）により構成されるギャップ結合。Ｇ〜Ｎ：正常マウス由来ｉＰＳ細胞（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ）およびＣｘ２６欠損マウス由来ｉＰＳ細胞（Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎ）から作製したｉＣｘ２６ＧＪＣにおけるＣｘ２６（Ｉ、Ｊ）またはＣｘ３０（Ｋ〜Ｎ）により構成されるギャップ結合。Ｏ：正常マウスおよびＣｘ２６欠損マウスの蝸牛細胞の単一細胞境界に伴う最大ＧＪＰ長。Ｐ：正常マウス由来ｉＰＳ細胞およびＣｘ２６欠損マウス由来ｉＰＳ細胞から作製したｉＣｘ２６ＧＪＣの単一細胞境界に伴う最大ＧＪＰ長。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に、多能性幹細胞由来胚様体を培養することを特徴とする、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法である。
【００１１】
本発明に用いられる多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が挙げられる。また、多能性幹細胞としては、非ヒト動物由来の多能性幹細胞を用いることもできるが、ヒト由来のｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞を用いることもできる。
【００１２】
本発明における、多能性幹細胞を原料とする胚様体の形成は、多能性幹細胞に種々の成長因子を添加し培養して行うことができるが、本発明においては、多能性幹細胞をＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の存在下に培養することにより胚様体を得るのが、Ｃｘギャップ結合を有する内耳細胞を効率良く得るうえで好ましい。ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング増殖因子β１）受容体阻害剤、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）等を用いることができる。ここで、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤としては、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７に対する阻害剤であるＳＢ−４３１５４２、Ａ８３−０１等、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３に対する阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９等を用いることができる。ＢＭＰとしては、ＢＭＰ−４が好ましい。ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）としてはＦＧＦ−２が好ましい。本発明においては、ＢＭＰ及びＴＧＦ−β１受容体阻害剤から選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好ましく、これらを併用するのがより好ましい。
【００１３】
多能性幹細胞由来胚様体の形成には、Ｎ２β２７培地、Ｇ−ＭＥＭ培地等の培地中、多能性幹細胞にＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤、ＦＧＦ等を添加し、３０〜４０℃で７〜１０日培養するのが好ましい。ＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤、ＦＧＦの添加量は、種類により異なるが、例えばＢＭＰの場合１〜５０ｎｇ／ｍＬ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤の場合１０ｎＭ〜５μＭ、ＦＧＦの場合５〜５０ｎｇ／ｍＬが好ましい。胚様体の形成は細胞の凝集体の形成、感覚上皮細胞への分化により確認することができる。また、感覚上皮細胞への分化は、Ｃｘ２６及びＣｘ３０のｍＲＮＡ濃度の上昇により確認することができる。
【００１４】
多能性幹細胞由来胚様体を、蝸牛由来フィーダー細胞上で培養すれば、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が得られる。
当該蝸牛内耳フィーダー細胞は、例えば、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によってコロニーを形成した細胞であるのが好ましい。蝸牛外側壁およびコルチ器を含む蝸牛膜迷路組織にトリプシン０．２５％を添加して培養し、コロニーを形成した細胞を取得するのが好ましい。
分解した胚様体を培養するために用いる蝸牛由来フィーダー細胞の播種量は、５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2〜５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2が好ましい。培地は、ＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％ウシ胎児血清が用いられる。培養は３０〜４０℃で３〜４日間が好ましい。
【００１５】
前記培養により、Ｃｘ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が効率良く得られる。ここでＣｘ２６発現の確認は、Ｃｘ２６のｍＲＮＡ濃度の上昇により確認することができる。また、本発明により得られる内耳細胞は、蝸牛細胞に局在するｐ２７を発現し、また発達期の蝸牛細胞に特徴的な自発カルシウム発火の伝達が見られる。従って、本発明により得られる細胞を用いれば、ＧＪＢ２変異型難聴の遺伝性難聴の薬剤のスクリーニング、内耳再生医療に応用可能である。
【実施例】
【００１６】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。【００１７】
実施例１
（１）方法
理研バイオリソースセンターの細胞バンクから提供されたマウスｉＰＳ細胞（細胞名：ｉＰＳＭＥＦ−Ｎｇ−１７８Ｂ−５）を、２ｉ−ＬＩＦ培地（下記を参照；ＬＩＦ、白血病阻害因子）を使用したフィーダーフリーの条件で維持した。ｉＰＳ細胞をゼラチンで維持し、１０継代後、実験に用いた。Ｎ２Ｂ２７培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａの１：１の混合物に、１ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（インビトロジェン）、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、１μＭ  ＰＤ０３２５９０１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社）およびＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したものである。２ｉ−ＬＩＦ培地は、Ｎ２Ｂ２７培地に１μＭ  マウス  ＬＩＦ（ミリポア社）を添加して調製した。代替株として、別のマウスｉＰＳ細胞株を、センダイウイルスベクター（Ｃｙｔｏｔｕｎｅ−ｉＰＳ、ディナベック社）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のマウス胎児繊維芽細胞（オリエンタル酵母社）から作製した。これらｉＰＳ細胞は、上述と同じ方法により維持し、再現性を確かめるために、次の実験に使用した。実験の０−１１日での分化は、下記の方法で行った。即ち、ｉＰＳ細胞を、分化培地に再懸濁したＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に溶解して分化培地に再懸濁し、９６ウェル低細胞接着Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ（セルシード社）に、ウェルあたり１００μＬを配した。以下の小分子および組み換えタンパク質を使用した：組み換えヒトＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、ヒトＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、ＳＢ−４３１５４２（１μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＬＤＮ−１９３１８９（１００ｎＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）。分化培地は、１．５％ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを添加したＧ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。１日目に、各ウェルの培地の半分を、４％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ｖ／ｖ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）含有の新鮮な分化培地で交換した。３日目に、各ウェルに、５倍濃度のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）及びＳＢ−４３１５４２（１μＭ最終濃度）を２５μＬの新鮮な分化培地で添加した。４日目に、各ウェルに、６倍濃度のＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍＬ最終濃度）及びＬＤＮ１９３１８９（１μＭ最終濃度）を２５μＬの新鮮な分化培地で添加した。７〜１１目に、未分化細胞を除き、凝集体を、成長培地中の内耳由来のフィーダー細胞へ移した。成長培地は、ＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ社）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含む。【００１８】
（蝸牛フィーダー細胞の作製）
出生後蝸牛組織をトリプシンに過剰露出させ間葉細胞様細胞を含むトリプシン耐性コロニーをスクリーニングすることにより作成した。使用する蝸牛組織は生後１０週程度で蝸牛コルチ器、基底板、外側壁を含む領域を分離して用いた。トリプリン濃度は０．２５％程度、露出時間は１７時間程度とした。この細胞株は内耳細胞を増殖させるための内耳由来フィーダー細胞（トリプシン耐性内耳細胞：ＴＲＩＣ）として用いた。フィーダー細胞として用いるための前処置として、ゼラチンコーティングまたは非コーティング培養皿に３×１０5／ｃｍ5程度の濃度で播種し、マイトマイシンＣ（約１０μｇ／ｍＬ）を添加後３〜６時間ほど培養して細胞増殖活性を失活させてから用いた。【００１９】
（２）定量的ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを単離し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  II  １st  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて逆転写によりｃＤＮＡを合成した。逆転写産物、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステムによりリアルタイムＰＣＲを行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  ソフトウェアを用いて、内在性コントロール（ＡＣＴＢ）で標準化した各ｍＲＮＡのＣT値を解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｓｓａｙ  ＩＤ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、マウスＧＪＢ２（Ｍｍ００４３３６４３＿ｓ１）、ＧＪＢ６（Ｍｍ００４３３６６１＿ｓ１）及びＡＣＴＢ（Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１）の発現を検出するのに使用した。【００２０】
（３）免疫組織化学
凝集体（アグリゲート）を、リン酸緩衝生理食塩水中４％パラホルムアルデヒドにより室温で１時間固定した。免疫蛍光染色のため、一次抗体及び二次抗体を１％ＢＳＡ溶液で希釈した。凝集体は、ブロッキング後、一次抗体溶液中で１時間インキュベートした。一次抗体として、抗Ｃｘ２６抗体（マウスＩｇＧ、１：１５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗Ｃｘ３０抗体（ウサギＩｇＧ、１：３００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び抗ｐ２７kip1抗体（ウサギＩｇＧ、１：１００、Ｎｅｏ  Ｍａｒｋｅｒｓ）を使用した。
次いで、凝集体を二次抗体溶液中で１時間インキュベートした。二次抗体として、マウス抗Ｃｘ２６抗体に対してはＣｙ３標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗Ｃｘ３０抗体及び抗ｐ２７kip1抗体に対してはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びファロイジンＴＲＩＴＣ（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。ＬＳＭ５１０−ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により蛍光共焦点画像を取得した。Ｚ−ｓｔａｃｋ画像を０．５μｍ幅で取得し、ＬＳＭイメージブラウザ（Ｚｅｉｓｓ）にて単一画像を構築した。Ｚ−スタック共焦点画像からＩＭＡＲＩＳ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて３Ｄ画像を構築した。【００２１】
（４）透過電子顕微鏡
凝集体をリン酸緩衝食塩水、次いでカコジル酸緩衝液中２％パラホルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒドで固定した。凝集体を切り出し、固定液で室温にて２時間洗浄した。洗浄後、試料をリン酸緩衝液中２％四酸化オスミウムで１．５時間後固定し、段階的なエタノールシリーズで脱水し、エポンに包埋した。凝集体切片を酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で観察した（モデルＨ−７７００、株式会社日立ハイテクノロジーズ）。【００２２】
（５）Ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ法による色素移行
Ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇアッセイを用い、色素移行について検討した。ｉＣｘ２６ＧＪＣ含有増殖性細胞をＴＲＩＣフィーダー細胞上に移した後、７〜１４日間培養した。コントロールとして、未分化ｉＰＳ細胞及びＴＲＩＣフィーダー細胞をカバーグラス上でコンフルエントになるまで培養した。培地を０．１％ＬＹ（ＬＹ  ＣＨ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたハンクス平衡塩溶液に交換した。かみそりで多くの平行状の切り込みを入れ、１５分後、ＬＹが取り込まれた細胞をハンクス平衡塩溶液で３回洗浄し、画像を取得した。【００２３】
（６）Ｃａ2+イメージング
ｉＣｘ２６ＧＪＣにおけるギャップ結合を介した自発的Ｃａ2+発火の伝達を、先の研究から改良した方法により実施した。細胞を、ローディング溶液、すなわち５μＭ  Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ（同仁化学研究所）、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２５０μＭ  スルフィンピラゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたＤＰＢＳに２ｍＭ  ＣａＣｌ2（ナカライテスク株式会社）を含有する高カルシウムＤＰＢＳ中、３７℃で２０分間インキュベートした。自発的Ｃａ2+発火を記録するため、ローディング溶液を２０μＭ  ＣａＣｌ2を含有する低カルシウムＤＰＢＳに交換した。ニポウディスク共焦点システム（ＣＳＵ２２、横河電機株式会社）及びＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳソフトウェア（浜松ホトニクス株式会社）を用いて、連続蛍光画像を取得した。生細胞イメージング実験は全て室温（２４〜２６℃）で実施した。シグナルは、蛍光強度の相対変化（Δｆ／ｆ0）として測定した。ここで、ｆ0は最小蛍光を、ｆは記録された蛍光を示し、Δｆはｆ−ｆ0である。【００２４】
（７）結果
（ｉ）内耳感覚上皮（図１のｍ）の分化に関する先行研究（Nature 500, 217-221(2013)、Nat Protoc, 9, 1229-1244(2014)（文献ａ、ｂ）の方法を改良して用い、ｉＰＳ細胞由来のＣｘ２６を発現するギャップ結合形成細胞を誘導した。具体的には、アグリゲート形成の後に、フィーダー細胞として調製したトリプシン耐性内耳細胞（ＴＲＩＣ）上での培養を行う。全ての補足培地の条件（骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４：ＢＭＰ）、ＳＢ−４３１５４２（ＳＢ）、ＢＭＰ／ＳＢ（Ｂ／Ｓ）、Ｂ／Ｓ＋線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２：Ｂ／Ｓ＋ＦＧＦ）、Ｂ／Ｓ＋ＬＤＮ−１９３１８９（Ｂ／Ｓ＋ＬＤＮ）又はＢ／Ｓ＋ＦＧＦ／ＬＤＮ（Ｂ／Ｓ＋Ｆ／Ｌ）の添加を含む）において、明瞭な上皮構造が示され、また当該上皮厚は、コントロールとしての未処理群のアグリゲートと比較し薄かった（図１のｄ〜ｌ）。外側のＦ−アクチン＋上皮構造は、層化した上皮から単純な上皮に変化したが（図１のｃ、ｄ）、それについては、特にＢ／Ｓ（図１のｇ、ｈ）及びＢ／Ｓ＋Ｆ／Ｌ（図１のｋ、ｌ）の条件下での、ＥＳ細胞の感覚上皮細胞への分化において報告されている（前記文献ａ、ｂ）。Ｎａｎｏｇプロモーター制御されたＧＦＰシグナル（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ）を用い、残りの未分化細胞をモニターした。分化の７日間後、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性細胞を、主にこれらのアグリゲートのコア領域について観察したが、外部上皮周辺のこれらの細胞数は、コントロールと比較し、著しく減少した（図１のｂ、ｆ、ｊ）。明瞭に上皮が形成されたｉＰＳのアグリゲート（分化７〜１１日目）を分解し、ＴＲＩＣフィーダー細胞の上で二次培養した（図１のｍ）。【００２５】
（ii）７日目における、アグリゲート中のＣｘ２６及びＣｘ３０のｍＲＮＡ濃度を解析した（図２）。Ｃｘ２６／３０のレベルは、コントロールと比較し、５つの条件（すなわち、ＢＭＰ、Ｂ／Ｓ、Ｂ／Ｓ＋ＦＧＦ、Ｂ／Ｓ＋ＬＤＮ及びＢ／Ｓ＋Ｆ／Ｌ）において顕著に高く、Ｂ／Ｓで処理されたアグリゲートにおいて最も高かった。他方、Ｂ／Ｓ＋Ｆ／Ｌ（ｉＰＳの内耳感覚上皮への分化条件であることが報告されている前記文献ａ、ｂ）におけるＣｘ２６／３０のｍＲＮＡレベルは、ＢＭＰ及びＢ／Ｓほど高くなかった。【００２６】
（iii）ｉＰＳアグリゲート中でのＣｘ２６の局在化を解析するため、ＢＭＰ及びＢ／Ｓ条件で最も高いＣｘ２６／３０のｍＲＮＡ増加を示した７日目のアグリゲートにおいて、免疫組織化学的解析を実施した（図２）。これらのアグリゲートにおいて、大きな平面状のＣｘ２６を含むＧＪＰが、多くの細胞中において容易に識別された（図３のｃ〜ｇ）。ｉＰＳ由来Ｃｘ２６発現ＧＪＰ形成細胞（ｉＣｘ２６ＧＪＣ）と称するこれらの細胞は、アグリゲートの外部上皮全体にわたり拡散していた。ＴＲＩＣ及び未分化ｉＰＳ細胞は、Ｃｘ２６もＣｘ３０も発現しなかった（図３のａ、ｂ）。【００２７】
（iv）ｉＣｘ２６ＧＪＣを含む領域を、７〜１１日目のアグリゲートから単離し、ＴＲＩＣフィーダー細胞上、増殖培地中（ＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％ウシ胎児血清）で二次培養した（図１のｍ）。他のフィーダー細胞（例えばニワトリ胚の内耳由来フィーダー細胞）上、又は非フィーダー条件（コーティングなし、及びゼラチンコーティングしたシャーレ上）では、分解播種された胚様体は増殖せず、実際上は死滅していた。マトリゲルでコーティングしたシャーレで二次培養したｉＰＳアグリゲートは、増殖したが、免疫組織化学分析の結果、Ｃｘ２６タンパク質は観察されなかった。ＴＲＩＣフィーダー細胞において、二次培養されたｉＣｘ２６ＧＪＣｓは、接着性の培養条件下で顕著に増殖し、Ｃｘ２６含有ＧＪＰｓは、アグリゲート中（図３のｃ．ｆ）で維持されていた（図３のｈ〜ｋ）。ｉＣｘ２６ＧＪＣｓの割合は、ＢＭＰ及びＢ／Ｓのアグリゲートではそれぞれ、わずか１．８±１．０％及び１．８±１．０％であったが、それらは、ＴＲＩＣフィーダー細胞上では、２次元培養において３０．３±７．７％及び２４．０±６．２％まで増加した（図３のｍ）。細胞境界の最大ＧＪＰ長は、ＢＭＰ又はＢ／Ｓで処理されたアグリゲートではそれぞれ、２．４６±０．４５μｍ又は１．８６±０．１５μｍであり、またそれらは、ＴＲＩＣフィーダー細胞上では、２次元培養において５．７６±０．３９μｍ及び３．１２±０．１９μｍと顕著に増加した（図３のｎ）。【００２８】
（ｖ）多能性幹細胞をＢＭＰ及びＴＧＦ−β１受容体阻害剤から選ばれる１種又は２種以上の存在下に培養することにより得られた胚様体は図４のような形態的特徴を有する。すなわち、ｉＰＳ細胞を、ＢＭＰ４及びＢ／Ｓを添加した分化培地中で三次元培養して得られた胚様体の実体顕微鏡像を図４に示す。胚様体は外皮（ｏｕｔｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）構造を有し、中心部に未分化マーカー陽性の細胞塊が見られる。外皮と未分化細胞塊との間隙にＣｘ２６ギャップ結合を有する細胞が集合した小胞（ｓｍａｌｌ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が確認できる。この小胞を含む領域を顕微鏡下で分離し、蝸牛フィーダー細胞上へ播種する（図４のｃ〜ｋ）。【００２９】
（vi）蝸牛細胞との類似点を解析するため、免疫組織化学分析を用いて既知の蝸牛タンパク質の発現を解析した。Ｃｘ３０タンパク質（遺伝性難聴頻度の高い他の原因遺伝子産物）は、分化した細胞の大部分のＣｘ２６−ＧＪＰｓにおいて、Ｃｘ２６と共局在化していた（図５のａ〜ｃ）。したがって、Ｃｘ２６及びＣｘ３０が、蝸牛支持細胞の場合のように、これらのＧＪＰｓにおける主な２成分であると推察した。更に、ＴＲＩＣフィーダー細胞の上のｉＣｘ２６ＧＪＣｓは、蝸牛支持細胞で発現されるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であるｐ２７ｋｉｐ１を共発現した（図５のｄ〜ｍ）。ｐ２７Ｋｉｐ１シグナルが２１日目後に観察され、それはコロニー拡大がほとんど停止する段階（１９〜２３日目）と一致した。同じ条件で、ｉＣｘ２６ＧＪＣｓを含む不均一なｐ２７Ｋｉｐ１陽性領域（図５のｄ〜ｉ）及び均一なｐ２７Ｋｉｐ１陽性領域（図５のｊ〜ｍ）を観察した。【００３０】
（vii）ｉＰＳ由来のアグリゲートの透過型電子顕微鏡観察により、細胞の結合領域における超微細構造を解析した。超微細構造がギャップ結合に特有であることを見出した。すなわち、２枚のそれぞれの原形質膜間の細胞間層が、約２．４ｎｍの均一な膜間空間を有していた（図６）。図６のｃ〜ｅは、３つのｉＰＳ由来細胞間での、３細胞により形成される結合部位付近の３つの異なるギャップ結合を示す。そのような特徴的なギャップ結合の超微細構造は、他の２つの培地条件：ＢＭＰ（図６）及びＢ／Ｓで観察されたが、他の条件では観察されなかった。【００３１】
（viii）増殖したｉＣｘ２６ＧＪＣｓ（図３、６）で観察されるギャップ結合の構造が、ギャップ結合の細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）ネットワークの形成に寄与するか否かを解析するため、増殖したｉＣｘ２６ＧＪＣｓに対するルシファーイエロー（ＬＹ）を用いたスクレープローディングアッセイを行った（未分化ｉＰＳ細胞及びＴＲＩＣフィーダー細胞をコントロールとして用いた）（図７）。我々は、異なる２つのｉＰＳ細胞株を用い、少なくとも３回実験を繰り返し、同様の結果を得た。ｉＣｘ２６ＧＪＣの培養において、ＬＹが傷害を有する親細胞を越えて拡散することを観察し、それらがコミュニケーション能力を有することを確認した（図７のｆ）。対照的に、未分化ｉＰＳ細胞又は蝸牛フィーダー細胞のケースでは、ＬＹの移動が示されなかった（図７のｄ、ｅ、ｇ、ｈ）。【００３２】
（ix）ｉＣｘ２６ＧＪＣｓが自発的Ｃａ2+濃度変化を成長過程にある蝸牛組織様のギャップ結合を介して広げるか否かを試験するために、Ｃａ2+指示薬ｆｌｕｏ−４を用いてＣａ2+イメージングを行った。自発的Ｃａ2+濃度変化およびその伝播はＢ／Ｓ条件下で２Ｄ培養において検出された（図８）。ＢＭＰ条件はまた同じＣａ2+濃度変化と伝播（データ示さず）を示したが、その頻度はＢ／Ｓ条件下よりもずっと低かった。【００３３】
（ｘ）ｉＣｘ２６ＧＪＣにおける自発的Ｃａ2+発火やその伝搬は、発達期の蝸牛と同様にＡＴＰおよびコネキシンヘミチャネルに依存的な反応であるかを確認するためにＡＴＰ受容体であるｐ２ｘ受容体阻害薬（ＰＰＡＤＳ）およびコネキシンヘミチャネル阻害薬（ＦＦＡ：ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）の添加による評価を行った。すなわち、ＰＰＡＤＳおよびＦＦＡを添加または除去した際の自発的Ｃａ2+発火の頻度を観察し、これらが添加されている時間のみに発火頻度が低下することを確認した。その結果、これらの添加により自発的Ｃａ2+発火やその伝搬は著しく阻害された（図９）。【００３４】
（xi）ｉＣｘ２６ＧＪＣがＣｘ２６変異型遺伝性難聴における内耳の病態を再現できるかを評価するため、Ｃｘ２６欠損マウスよりｉＰＳ細胞を樹立し、前記の方法と同様にしてｉＣｘ２６ＧＪＣを作製した。この細胞のギャップ結合プラークを解析したところ、蝸牛と同様にギャップ結合プラークが崩壊し、プラーク長が著しく低下していた（図１０）。【００３５】
本発明によれば、幾つかの培養条件下におけるｉＰＳ細胞の凝集体形成、その後の蝸牛フィーダー細胞による接着培養によって、１）Ｃｘ２６及びＣｘ３０をコードするｍＲＮＡのアップレギュレーション、２）Ｃｘ２６及びＣｘ３０から構成されるギャップ結合形成、３）ギャップ結合の特有の超微細構造、そして４）発生期の蝸牛に特有のＣａ2+伝播が誘導されることを初めて示した。これらの現象は、蝸牛支持細胞の生物学的特徴として知られている。蝸牛支持細胞は、Ｃｘ２６を最も多く有する細胞であり、イオン輸送を介して適切な蝸牛内電位を維持するのに重要な役割を担う。そして、これらの細胞は、患者から得ることが可能であり、薬剤のスクリーニングやギャップ結合ベータ２（ＧＪＢ２）が関与する聴力喪失を対象とする内耳細胞の治療に特に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月7日(2017.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に、多能性幹細胞をＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の存在下に培養することにより得られた多能性幹細胞由来胚様体を培養することを特徴とする、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法。
【請求項２】
蝸牛由来フィーダー細胞が、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によりコロニーを形成した細胞である請求項１記載の内耳細胞の製造法。
【請求項３】
多能性幹細胞由来胚様体が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の添加剤の存在下に培養することにより得られた胚様体である請求項１又は２記載の内耳細胞の製造法。
【請求項４】
多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である請求項１〜３のいずれか１項記載の内耳細胞の製造法。
【国際調査報告】
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