(57)【要約】  ビーズが分散された溶媒を流路に導入して流路の上方に形成されたウェルにビーズを収容する。本発明の一態様に係る生体物質検出方法は、マイクロビーズ（３）を収容可能な凹部からなる微小ウェル（２）が形成され微小ウェル（２）の開口側が下となる基材部（６）と微小ウェル（２）の開口側に基材部（６）と向かい合うように配置されたカバー部（９）との間の空間を流路（８）とし、マイクロビーズ（３）が分散された親水性溶媒（４）を流路（８）に導入してマイクロビーズ（３）を微小ウェル（２）に収容させる際に、親水性溶媒（４）の比重を、マイクロビーズ（３）の比重よりも大きくする。マイクロビーズ（３）は親水性溶媒（４）に浮かんだ状態であり、流路（８）内の上方に位置するため、流路（８）の上面に形成された微小ウェル（２）と対向する位置に達したときに微小ウェル（２）に収容される。
2017043530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一収容物を収容可能な凹部からなる第一ウェルが形成され前記第一ウェルの開口側が下となる第一基材と前記第一ウェルの開口側に前記第一基材と向かい合うように配置された第二基材との間の空間を流路とし、前記第一収容物が分散された溶媒を前記流路に導入して前記第一収容物を前記第一ウェルに収容させる収容工程を含み、
前記溶媒の比重は、前記第一収容物の比重よりも大きいことを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項２】
前記溶媒はシグナル増幅反応試薬を含み、
前記ウェル内でシグナル増幅反応を行い、前記ウェル内を対象としてシグナル検出を行うことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出方法。
【請求項３】
前記シグナル増幅反応は等温反応であることを特徴とする請求項２に記載の生体物質検出方法。
【請求項４】
前記等温反応は酵素反応であることを特徴とする請求項３に記載の生体物質検出方法。
【請求項５】
前記酵素反応はインベーダー反応であることを特徴とする請求項４に記載の生体物質検出方法。
【請求項６】
シグナルとして、前記ウェル内における生体物質の有無に対応した蛍光、発光、ｐＨ変化、吸光度変化、電位変化、電流変化の少なくとも何れか一つを検出することを特徴とする請求項２から請求項５のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
【請求項７】
前記溶媒は、解析対象物質としてＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質のいずれかを含むと共に、前記解析対象物質に対する特異的標識能を有する標識物質に鋳型核酸が含まれるか、又は結合可能な状態で前記標識物質が前記溶媒に含まれていることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
【請求項８】
前記標識物質が、前記鋳型核酸とは異なるＤＮＡ鎖、酵素、粒子、抗体、及びリポソームのうちの少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項７に記載の生体物質検出方法。
【請求項９】
前記収容工程の後に、前記空間に、前記溶媒と混合しない特性を有する封止液を前記流路に導入する工程を備えることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
【請求項１０】
前記第二基材は、第二収容物を収容可能な凹部からなる第二ウェルを備え、前記第二ウェルの開口側が上となっており、
前記溶媒には、前記第二収容物がさらに分散されており、
前記収容工程では、前記第一収容物を前記第一ウェルに収容させるとともに、前記第二収容物を前記第二ウェルに収容させ、
前記溶媒の比重は、前記第二収容物の比重よりも小さいことを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
【請求項１１】
前記第二収容物は、磁性ビーズであることを特徴とする請求項１０に記載の生体物質検出方法。
【請求項１２】
前記第一収容物は、ポリマービーズと生体物質の少なくとも一方であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質検出方法に関する技術としては、例えば、特許文献１〜３や非特許文献１〜２に記載されたものがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００３−５１１００９号公報
【特許文献２】特許第４９１１５９２号公報
【特許文献３】特許第５３３７３２４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｏｎ  ａ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ」、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、Ａｕｇｕｓｔ  ２００８、Ｖｏｌｕｍｅ３、Ｉｓｓｕｅ８、ｅ２８７６、ｐ１−ｐ９
【非特許文献２】「Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ」、２０１２、ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ２１ｃ４０６３２ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献２に開示された技術では、流路の底面に形成されたウェルにマイクロビーズを収容させることはできる。しかしながら、非特許文献２に開示された技術では、流路よりも上方に設けられた微小ウェルにマイクロビーズを収容させることはできない場合がある。
また、非特許文献２に開示された技術では、微小ウェル内の発光を顕微鏡で観察するときに、マイクロビーズが観察側であるウェル底面に接している。そのため、実際には、マイクロビーズの観察側の表面全体が発光していたとしても、ウェル底面を介して観察した場合に、ウェル底面に接している部分の発光を検出しにくく、発光した全ての光を検出することができない場合があるという課題があった。【０００６】
また、観察側が上方である場合に、底面のウェル及びマイクロビーズを観察しようとすると流路を通して観察することになるため、光学的に不利である。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、ウェルが流路内に多数形成されたマイクロアレイに対し、流路にビーズを含む試料を流して各ウェルにビーズを収容物（第一収容物）として収容させる方法を用いて、流路よりも上方に設けられたウェルに対してビーズを収容させることの可能な生体物質検出方法を提供し、上述の発光した全ての光を検出することができない場合があるという課題を解決することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明の一態様によれば、第一収容物を収容可能な凹部からなる第一ウェルが形成され第一ウェルの開口側が下となる第一基材と、第一ウェルの開口側に第一基材と向かい合うように配置された第二基材との間の空間を流路とし、第一収容物が分散された溶媒を流路に導入して第一収容物を第一ウェルに収容させる収容工程を含み、溶媒の比重を、第一収容物の比重よりも大きくした生体物質検出方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、より確実に、流路よりも上方に形成された第一ウェルに第一収容物を収容させることができ、発光した全ての光を観測することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の第１実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。
【図２Ａ】実施例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。
【図２Ｂ】実施例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。
【図３】実施例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡を使って蛍光観察した結果（写真）である。
【図４Ａ】比較例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。
【図４Ｂ】比較例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。
【図５】比較例１におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡を使って蛍光観察した結果（写真）である。
【図６Ａ】実施例２、３及び比較例２、３におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。
【図６Ｂ】実施例２、３及び比較例２、３におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。
【図７Ａ】比較例４から比較例７におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。
【図７Ｂ】比較例４から比較例７におけるアレイデバイスとマイクロビーズを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。
【図８】本発明の第２実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。
【図９】本発明の第２実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。
【図１０】本発明の第２実施形態の変形例に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。
【図１１】本発明の第３実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。
ここで、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なる。他にも、図面を簡潔にするために、周知の構造が略図で示されている。また、各図において、同様または類似した機能を発揮する構成要素には同一の参照符号を付し、重複する説明は省略する。また、以下に示す各実施形態は、本発明の技術的思想を具体化するための構成を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造等が下記のものに特定するものでない。また、本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された請求項が規定する技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１１】
（第１実施形態）
図１は、本発明の第１実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。なお、図１は、生体分子解析キットの一部を示す縦断面図であって、生体分子解析キットは、実際には後述する微小ウェル２が複数、縦横に整列して形成された図示しないアレイデバイスを備え、このアレイデバイスに、後述する親水性溶媒４や油性封止液１を導入することで、微小ウェル（第一ウェル）２にマイクロビーズ（第一収容物、ビーズ）３が収容された生体分子解析キットが形成される。また、以降の各図において、重力方向（鉛直方向）は、後述する基材部６側からカバー部９側に向かう方向を指す。
【００１２】
図１に示す、生体分子解析キットでは、解析する生体分子として、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質のいずれかが選ばれる。
生体分子解析キットは、図１に示すように、反応容器である微小ウェル２が複数整列配置された微小孔アレイ層７を有する基材部（第一基材）６と、カバー部（第二基材）９とを備え、基材部６とカバー部９（９ａ）との間に流路８が形成されている。ここで、本願発明において、「下」とは「重力方向（鉛直方向）」を意味し、「上」とは「重力方向（鉛直方向）の逆方向」を意味する。
基材部６は、ガラス基板５とこのガラス基板５に積層された反応場である微小孔アレイ層７とを備える。
【００１３】
微小孔アレイ層７に形成された微小ウェル２は、例えば、直径が５μｍ、深さが５μｍとなり一端に開口部を有する有底円柱形状の空間である。微小孔アレイ層７には、複数の微小ウェル２のアレイが形成されている。すなわち、微小ウェル２は、微小孔アレイ層７において縦横に整列配置されている。
例えば、微小ウェル２は、縦横５ｍｍの長方形をなす表面に対して、その各辺に沿った格子状をなして配列される。各微小ウェル２どうしの間隔は、各微小ウェル２において独立してシグナル検出ができる分解能に応じて設定される。
【００１４】
微小ウェル２の容積は適宜設定されてよいが、微小ウェル２の容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮可能である。一例として、微小ウェル２の容積は、１００ピコリットル又はそれ以下である。
微小孔アレイ層７とガラス基板５は同一の素材であってもよく、また、成型などで一体に形成してもよい。また、ガラス基板５上にフォトリソグラフィーを用いて樹脂等で形成された微小孔アレイ層７を形成してもよい。また、ガラス基板５とは別の部材に微小ウェル２を有する微小孔アレイ層７を形成し、この微小孔アレイ層７が形成された部材を、接着剤等でガラス基板５に固定することで、ガラス基板５の一方の面に微小孔アレイ層７を設けてもよい。
【００１５】
カバー部９ａは、基材部６の微小孔アレイ層７が形成された側の面に、基材部６との間に隙間を有し、且つ、微小孔アレイ層７の開口部分、すなわち微小ウェル２の開口部と向かい合うように、基材部６と向かい合わせて配置される。具体的には、カバー部９ａの上方に隙間をあけて基材部６が積層されるように配置される。そして、基材部６とカバー部９ａとの間に設けた隙間が、検出対象等の、各種の液体が流れる流路８となる。
カバー部９ａは、図１中に示す観察方向、すなわち、カバー部９ａの、流路８とは逆側の面側から微小ウェル２の方向を観察することができればよく、カバー部９ａは透明である方が好ましい。この場合の透明とは、観察する波長（励起光、蛍光など）が透過することも含む。
【００１６】
微小ウェル２の材質、つまり微小ウェル２の内壁を形成する微小孔アレイ層７の材質は、樹脂やガラス等であってよい。微小ウェル２の材質は、基材部６の材質と同じでもよいし基材部６の材質と異なっていてもよい。また、微小ウェル２は基材部６と同じ材料で一体化されていてもよく、また、微小ウェル２は基材部６と同じ材料で一体成型されていてもよい。
樹脂からなる基材部６を形成する微小孔アレイ層７の材質の例としては、シクロオレフィンポリマー、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂、ＣＹＴＯＰ（登録商標）等が挙げられる。
なお、微小ウェル２の例として示されたこれらの材質はあくまでも例であり、微小ウェル２の材質はこれらには限られない。
【００１７】
本実施形態に係る生体分子解析キットは、微小ウェル２の少なくとも一部が疎水性を有する構造であることが好ましい。言い換えれば、微小ウェル２の少なくとも一部が疎水性を有する部分を有していれば良い。ここでの疎水性とは、疎水性を有する部分（材料）の表面において、親水性溶媒４、油性封止液１の接触角を測定し、親水性溶媒４の接触角よりも、油性封止液１の接触角が小さいことをいう。接触角は、一般的な測定機器で計測することができる。
ガラス基板５の厚さは、ガラス基板５を基材として、例えばインプリント法を用いて複数の微小ウェル２を形成する場合には、微小ウェル２を形成する過程で十分な強度を有するように、適宜設定される。
また、微小ウェル２の容積は任意に設定することができる。例えば、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるまでに要する時間を短縮する目的がある場合には、解析対象の分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいて微小ウェル２の容積が設定される。
【００１８】
本実施形態における親水性溶媒４は、解析対象物質を含む試料及び前述の検出反応試薬（インベーダー反応試薬やＰＣＲ反応試薬）の少なくとも何れか一方と、を含む溶液である。また、この親水性溶媒４には、必要に応じて後述する吸着防止剤を含んでもよい。
親水性溶媒４は、基材部６とカバー部９ａとの間に形成された空間すなわち流路８に、図示しない注入口部から送液される。
マイクロビーズ３を分散させるための親水性溶媒４はマイクロビーズ３よりも比重が大きく、後述の油性封止液１と混合しなければよく、親水性であっても疎水性であっても良いが、透明であることが好ましい。さらに好ましくは、親水性溶媒４にマイクロビーズ３に捕捉した生体分子を検出するための試薬を親水性溶媒４に混合しておき、微小ウェル２に液滴を作った後に生体分子を検出するようにしてもよい。
【００１９】
マイクロビーズ３は親水性溶媒４よりも比重が小さく、微小ウェル２に入る大きさであればよく、材質は制限されない。好ましくは、生体分子を捕捉するための標識がされていることであって、例えばタンパク質を捕捉するためには抗体などが選ばれる。
また、人工的なマイクロビーズだけではなく、細胞や生態由来の粒子を用いることもできる。
【００２０】
マイクロビーズ３の一例として磁性ビーズを挙げることができる。磁性ビーズは磁性物質と、磁性物質を被覆するポリマー層を備える磁性ポリマー粒子である。磁性ポリマー粒子は、１個のポリマー粒子に、複数個の磁性物質が被覆されて存在していてもよい。ポリマー粒子に被覆される物質としては、水中での微粒子生成が可能なマグネタイトなどのフェライト粒子が好ましい。他方、フェライト以外の物質としては、例えば各種磁性金属の微粒子、又は各種磁性化合物が用いられ、これらの物質がそれぞれに有する特徴的な磁気的性質をさまざまに利用することもできる。そして、このマイクロビーズ３に解析対象物質が捕捉される。捕捉方法は、解析対象物が抗原タンパク質の場合には抗体を修飾したマイクロビーズを使った抗原抗体反応であり、解析対象物がＤＮＡの場合にはプローブを修飾したマイクロビーズを使ったハイブリダイズによって行われる。
また、マイクロビーズの他の例としてポリマービーズを挙げることができる。ポリマービーズは磁性ビーズよりも比重が小さいため、より効率的に微小ウェルに収容することができる。
【００２１】
親水性溶媒の比重は、マイクロビーズより大きければよく、比重の大きさは限定されないがマイクロビーズとの比重の差が大きいほど効果を得やすい。比重を大きくする方法としては、例えば、親水性溶媒に水溶性の物質を溶解させることができる。親水性溶媒に溶解させる水溶性の物質としては、微小ウェル中で酵素反応などを行う場合には酵素反応を阻害しない糖などの物質を選ぶことができる。例えば、ショ糖を水に飽和させると比重は１．３にすることが可能である。その他、一例として、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア社製）などの密度勾配を作製する試薬などを選ぶことができる。
【００２２】
油性封止液１は、基材部６とカバー部９ａとの間に形成された空間すなわち流路８に、図示しない注入口部から送液可能な溶液である。油性封止液１は、解析対象物質を含む試料を含む親水性溶媒４と混合しないものから選ぶことができる。油性封止液１はミネラルオイルを使用することもできる。油性封止液１は、親水性溶媒４が流路８に導入された後に、流路８内に導入される。
ここで、親水性溶媒４は、マイクロビーズ３が分散されており、親水性溶媒４の比重はマイクロビーズ３の比重よりも大きい。つまり、親水性溶媒４中のマイクロビーズ３は浮くことになる。
【００２３】
したがって、親水性溶媒４を流路８に導入すると、マイクロビーズ３は流路８の上方に位置する。また、微小ウェル２は流路８の上面に配置され、流路８側に開口している。そのため、親水性溶媒４に浮かんだマイクロビーズ３は、微小ウェル２と向かい合う位置に達した時点で微小ウェル２に収容されることになる。
そして、親水性溶媒４を流路８に導入した後、次に、流路８に油性封止液１を導入することにより、親水性溶媒４のうち余剰分、すなわち、微小ウェル２内に収容されない分が油性封止液１により押し出される状態となり、流路８が油性封止液１で満たされる状態となる。これにより、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容され、流路８が油性封止液１で満たされた生体分子解析キットが得られることになる。
【００２４】
したがって、例えば、予め親水性溶媒４に、シグナル増幅反応試薬を含めておき、微小ウェル２内でシグナル増幅反応を行い、各微小ウェル２に収容されたマイクロビーズ３についてシグナル検出を行うことにより例えば、濃度検出等を容易に行うことができる。
また、このようにして得られた生体分子解析キットにおいては、マイクロビーズ３は、流路８の底面、すなわちカバー部９ａ側に接していない。したがって、観察方向であるカバー部９ａ側から観察した場合に、マイクロビーズ３のカバー部９ａ側の領域全体の発光状況を検出することができる。そのため、マイクロビーズを流路の底面側に形成したウェルに収容する方法に比較して、より高精度に発光状況を検出することができ、すなわち、濃度検出等をより精度良く行うことができる。
【００２５】
シグナル増幅としては、等温反応であってもよく、等温反応が酵素反応であってもよい。また、酵素反応がインベーダー反応であってもよい。
また、シグナル検出は、微小ウェル内２における生体物質の有無に対応した蛍光や、発光、ｐＨ変化、吸光度変化、電位変化、電流変化のいずれか１つ又は複数を検出することによって、行うようにしてもよい。
また、親水性溶媒４は、解析対象物質としてＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質のいずれかを含むと共に、解析対象物質に対する特異的標識能を有する標識物質に鋳型核酸が含まれるか、又は結合可能な状態で標識物質が溶媒に含まれていてもよい。
このとき、標識物質が、鋳型核酸とは異なるＤＮＡ鎖、酵素、粒子、抗体、及びリポソームのうちの少なくとも一つを含んでいてもよい。
【００２６】
（第１実施形態の変形例）
本実施形態では、ガラス基板５を用いた場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、ガラス基板５に代えて、透明な高分子材料で形成された基材を用いてもよい。
【００２７】
［第１実施例］
以下の実施例により、本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこの例に限定されるものではない
（実施例１）
＜アレイデバイスの作製＞
０．５ｍｍ厚のガラス基板５にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートし、１８０℃で３時間熱硬化させ、フォトリソグラフィー技術を使って直径５μｍの孔を１００万個持つ基材部６を作製した。ＣＹＴＯＰをスピンコートすることによりガラス基板５に形成された層がフォトリソグラフィーにより成形されることにより、微小孔アレイ層７が形成された。ＣＹＴＯＰをスピンコートすることによりガラス基板５に形成された層、つまり、微小孔アレイ層７の厚さは３μｍである。
続いて、基材部６との隙間が１００μｍとなるように、カバー部９ａとしてカバーガラスを設置した。基材部６とカバー部９ａとの間には、粘着テープからなるスペーサーが配され、流路８が形成された。さらに、基材部６とカバー部９ａとの間に、溶媒を置換液として送液し、直径５μｍの孔と、基材部６とカバー部９ａとの間の隙間との全体に、溶媒を満たした。本実施例では溶媒の組成は２０μＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。
【００２８】
＜ビーズの送液＞
アレイデバイスを、微小ウェル２が流路８よりも上方になるように設置した。直径３μｍのマイクロビーズ（蛍光マイクロビーズ）３を親水性溶媒４と混合し、流路８に流し込んだ後、油性封止液１であるＦＣ−４０（シグマ社製）を流路８に流し込み、マイクロビーズ３を微小ウェル２に収容した。本実施例では溶媒の組成は２０μＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。なお、親水性溶媒４の比重をマイクロビーズ３よりも大きくするために、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア社製）を添加して親水性溶媒４の比重を調整した。
【００２９】
＜封入されたマイクロビーズの測定＞
次に、微小ウェル２に収容されたマイクロビーズ３の数を蛍光顕微鏡で観察した。ここでは、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）、光源（ＬＥＪ社、ＦｌｕｏＡｒｃ００１．２６Ａ  Ｕｓａｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ＨＢＯ  １０）、センサー（浜松ホトニクス社）、蛍光フィルター、解析ソフト（モレキュラーデバイス社製、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）を用いてマイクロビーズ３を観測した。直径３μｍのマイクロビーズ３であれば透過光による明視野観察も可能であるため、明視野での観察も行った。
【００３０】
（比較例１）
親水性溶媒４の比重をマイクロビーズ３よりも小さくしたこと以外は、実施例１と同様にして封入されたマイクロビーズ３を顕微鏡で測定した。
（観察結果）
図２Ａは、実施例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。また、図２Ｂは、実施例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。なお、図２Ｂは図２Ａの要部を示したものである。また、図２Ａと図２Ｂとは同じスケールで示されている。以降、図２Ａと図２Ｂとを合わせて、「図２」と称する。
【００３１】
図３は、実施例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡を使って蛍光観察した結果（写真）である。
図４Ａは、比較例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。また、図４Ｂは、比較例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。なお、図４Ｂは図４Ａの要部を示したものである。また、図４Ａと図４Ｂとは同じスケールで示されている。以降、図４Ａと図４Ｂとを合わせて、「図４」と称する。
【００３２】
図５は、比較例１における、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容されたアレイデバイスを、顕微鏡を使って蛍光観察した結果（写真）である。
なお、図２及び図４に示す顕微鏡の透過光による観察結果において、アレイデバイス中の黒点が、透過光が検出された微小ウェル２を表し、すなわちマイクロビーズ３が収容されていない微小ウェル２であることを意味する。つまり、比較例１よりも実施例１の方がマイクロビーズ３が収容されていない微小ウェル２が少なく、すなわちより多くのマイクロビーズ３が収容されていることがわかる。なお、図２及び図４において、丸で囲んだ部分が黒点を表す。図２及び図４は、一例として、一部の黒点を丸で囲んだものであり、丸で囲んだ以外にも黒点は存在するが、図２の方がより多くの黒点が観察されている。
【００３３】
また、図３及び図５に示す顕微鏡を使った蛍光観察の結果において、アレイデバイス中の白点が、マイクロビーズの蛍光発光を表し、すなわち、マイクロビーズ３が収容されている微小ウェル２であることを意味する。つまり、比較例１よりも実施例１の方がマイクロビーズ３が収容されている微小ウェル２が多く、すなわちより多くのマイクロビーズが収容されていることがわかる。
これらの結果より、マイクロビーズ３よりも親水性溶媒４の比重を大きくした実施例１の方が微小ウェル２へのマイクロビーズ３の封入効率が高くなることが確認された。
【００３４】
以下の実施例では、親水性溶媒４及びマイクロビーズ３の各比重を、上述した実施例１及び比較例１よりも細かく調整した。こうすることで、微小ウェル２へのマイクロビーズ３の封入効率をより詳細に検討した。
【００３５】
（実施例２）
親水性溶媒４の比重を１．０９にし、マイクロビーズ３の比重を１．０３にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（実施例３）
親水性溶媒４の比重を１．１３にし、マイクロビーズ３の比重を１．０３にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（実施例４）
親水性溶媒４の比重を１．３にし、マイクロビーズ３の比重を１．０３にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
【００３６】
（比較例２）
親水性溶媒４の比重を１にし、マイクロビーズ３の比重を１．０３にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（比較例３）
親水性溶媒４の比重を１．０３にし、マイクロビーズ３の比重を１．０３にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（比較例４）
親水性溶媒４の比重を１にし、マイクロビーズ３の比重を１．８（±０．５）にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（比較例５）
親水性溶媒４の比重を１．０３にし、マイクロビーズ３の比重を１．８（±０．５）にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
【００３７】
（比較例６）
親水性溶媒４の比重を１．０９にし、マイクロビーズ３の比重を１．８（±０．５）にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（比較例７）
親水性溶媒４の比重を１．１３にし、マイクロビーズ３の比重を１．８（±０．５）にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
（比較例８）
親水性溶媒４の比重を１．３にし、マイクロビーズ３の比重を１．８（±０．５）にしたこと以外は、実施例１と同様にした。
【００３８】
＜観察結果＞
図６Ａは、実施例２、３および比較例２、３において得られた各アレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。また、図６Ｂは、実施例２、３および比較例２、３において得られた各アレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。なお、図６Ｂは図６Ａの要部を示したものである。また、図６Ａと図６Ｂとは同じスケールで示されている。以降、図６Ａと図６Ｂとを合わせて、「図６」と称する。
図６（ａ）、（ｅ）が比較例２、図６（ｂ）、（ｆ）が比較例３、図６（ｃ）、（ｇ）が実施例２、図６（ｄ）、（ｈ）が実施例３の場合にそれぞれ対応する。なお、実施例４において得られたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果については記載を省略する。
【００３９】
図７Ａは、比較例４〜７において得られた各アレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（写真）である。また、図７Ｂは、比較例４〜７において得られた各アレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果（説明図）である。なお、図７Ｂは図７Ａの要部を示したものである。また、図７Ａと図７Ｂとは同じスケールで示されている。以降、図７Ａと図７Ｂとを合わせて、「図７」と称する。
図７（ａ）、（ｅ）が比較例４、図７（ｂ）、（ｆ）が比較例５、図７（ｃ）、（ｇ）が比較例６、図７（ｄ）、（ｈ）が比較例７の場合にそれぞれ対応する。なお、比較例８において得られたアレイデバイスを、顕微鏡の透過光で観察した結果については記載を省略する。
【００４０】
図６及び図７では、矢印でマイクロビーズ３を収容した微小ウェル２を示している。つまり、比較例２〜７よりも実施例２〜３の方がマイクロビーズ３を収容した微小ウェル２の数が多く、すなわちより多くのマイクロビーズ３がアレイデバイスに収容されていることがわかる。なお、図６及び図７において、矢印で示した部分以外にもマイクロビーズ３を収容した微小ウェル２は存在する。
本実施例では、実施例２〜３および比較例２〜７で得られた各アレイデバイスの微小ウェル２に収容されたマイクロビーズ３の数を測定した。その結果を表１に示す。なお、表１では、マイクロビーズ３の比重１．８（±０．５）を、単に「１．８」と表記している。
【００４１】
【表１】
2017043530.tif 000003
【００４２】
実施例２で微小ウェル２に収容されたマイクロビーズ３の数は１５個であった。また、実施例３では３７個であった。さらに、実施例４では約４０００個であった。一方、比較例２では０個であった。また、比較例３では２個であった。また、比較例４〜８では０個であった。なお、表中において、生体物質検出方法で用いるアレイデバイスとして、使用不能なものを「×」、使用可能なものを「△」、好適なものを「○」、最適なものを「◎」として表記している。
以上の結果から、マイクロビーズ３よりも親水性溶媒４の比重を大きくすることで微小ウェル２へのマイクロビーズ３の封入効率が高くなることがより詳細に確認された。
【００４３】
（第２実施形態）
図８は、本発明の第２実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。本実施形態に係る生体分子解析キットは、図８に示すように、反応容器である微小ウェル２が複数整列配置された微小孔アレイ層７を有する基材部６と、反応容器である微小ウェル（第二ウェル）１２が複数整列配置された微小孔アレイ層１７を有するカバー部９（９ｂ）とを備え、基材部６とカバー部９ｂとの間に流路８が形成されている。そして、この流路８に上述の親水性溶媒４や油性封止液１を導入することで、微小ウェル２にマイクロビーズ３が、微小ウェル１２に後述するマイクロビーズ（第二収容物、ビーズ）１３が収容された生体分子解析キットが形成される。
【００４４】
つまり、本実施形態に係る生体分子解析キットは、カバー部９ｂ及びマイクロビーズ１３以外の構成は、第１実施形態で説明した生体分子解析キットと同じ構成をしている。よって、ここでは、第１実施形態に係る生体分子解析キットと異なる部分であるカバー部９ｂ及びマイクロビーズ１３の各構成について説明し、その他の部分についての説明は省略する。
カバー部９ｂは、カバーガラス１０とこのカバーガラス１０に積層された反応場である微小孔アレイ層１７とを備える。
カバーガラス１０は、第１実施形態で説明したカバー部９ａの同じものを用いることができる。つまり、第１実施形態で説明したカバーガラスを同じものを用いることができる。また、微小孔アレイ層１７は、第１実施形態で説明した微小孔アレイ層７の同じものを用いることができる。
【００４５】
カバー部９ｂは、基材部６の微小孔アレイ層７が形成された側の面に、基材部６との間に隙間を有し、且つ、微小孔アレイ層７の開口部分、すなわち微小ウェル２の開口部と向かい合うように、基材部６と向かい合わせて配置される。具体的には、カバー部９ｂの上方に隙間をあけて基材部６が積層されるように配置される。そして、基材部６とカバー部９ｂとの間に設けた隙間が、検出対象等の、各種の液体が流れる流路８となる。換言すると、流路８の上方には微小ウェル２が位置しており、流路８の下方には微小ウェル２と対向するように微小ウェル１２が位置している。
カバー部９ｂは、図８中に示す観察方向、すなわち、カバー部９ｂの、流路８とは逆側の面側から微小ウェル２の方向を観察することができればよく、カバー部９ｂは透明である方が好ましい。
【００４６】
本実施形態では、第１実施形態で説明した親水性溶媒４に、第１実施形態で説明したマイクロビーズ３と共にマイクロビーズ１３を分散させている。
このマイクロビーズ１３はマイクロビーズ３や親水性溶媒４よりも比重が大きく、微小ウェル１２に入る大きさであればよく、材質は制限されない。好ましくは、生体分子を捕捉するための標識がされていることであって、例えばタンパク質を捕捉するためには抗体などが選ばれる。
マイクロビーズ１３の一例として磁性ビーズを挙げることができる。磁性ビーズは磁性物質と、磁性物質を被覆するポリマー層を備える磁性ポリマー粒子である。磁性ポリマー粒子は、１個のポリマー粒子に、複数個の磁性物質が被覆されて存在していてもよい。ポリマー粒子に被覆される物質としては、水中での微粒子生成が可能なマグネタイトなどのフェライト粒子が好ましい。他方、フェライト以外の物質としては、例えば各種磁性金属の微粒子、又は各種磁性化合物が用いられ、これらの物質がそれぞれに有する特徴的な磁気的性質をさまざまに利用することもできる。そして、このマイクロビーズ１３に解析対象物質が捕捉される。捕捉方法は、解析対象物が抗原タンパク質の場合には抗体を修飾したマイクロビーズを使った抗原抗体反応であり、解析対象物がＤＮＡの場合にはプローブを修飾したマイクロビーズを使ったハイブリダイズによって行われる。
【００４７】
上述のように、親水性溶媒４は、マイクロビーズ３及びマイクロビーズ１３がそれぞれ分散されており、親水性溶媒４の比重はマイクロビーズ３の比重よりも大きく、マイクロビーズ１３の比重よりも小さい。つまり、親水性溶媒４中のマイクロビーズ３は浮き、マイクロビーズ１３は沈むことになる。
したがって、親水性溶媒４を流路８に導入すると、マイクロビーズ３は流路８の上方に位置し、マイクロビーズ１３は流路８の下方に位置する。また、微小ウェル２は流路８の上面に配置され、微小ウェル１２は流路８の下面に配置されており、それぞれが流路８側に開口している。そのため、親水性溶媒４に浮かんだマイクロビーズ３は、微小ウェル２と向かい合う位置に達した時点で微小ウェル２に収容されることになる。そして、親水性溶媒４に沈んだマイクロビーズ１３は、微小ウェル１２と向かい合う位置に達した時点で微小ウェル１２に収容されることになる。
【００４８】
そして、親水性溶媒４を流路８に導入した後、次に、流路８に油性封止液１を導入することにより、親水性溶媒４のうち余剰分、すなわち、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内に収容されない分が油性封止液１により押し出される状態となり、流路８が油性封止液１で満たされる状態となる。これにより、マイクロビーズ３が微小ウェル２に収容され、マイクロビーズ１３が微小ウェル１２に収容され、流路８が油性封止液１で満たされた生体分子解析キットが得られることになる。こうして得られた、本実施形態に係る生体分子解析キットの断面図を図９に示す。
【００４９】
したがって、例えば、予め親水性溶媒４に、シグナル増幅反応試薬を含めておき、例えば、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内でシグナル増幅反応をそれぞれ行い、各微小ウェル２に収容されたマイクロビーズ３及び各微小ウェル１２に収容されたマイクロビーズ１３についてそれぞれシグナル検出を行うことができる。こうすることで、例えば、異なる分析を同時に行いつつ、各分析における濃度検出等を容易に行うことができる。
なお、上述のシグナル増幅反応については、第１実施形態で説明したシグナル増幅反応と同じであるため、ここではその説明を省略する。
【００５０】
ここで、図８及び図９に示す生体分子解析キットでは、観察方向であるカバー部９ｂ側から見て、微小孔アレイ層７に配置された微小ウェル２と、微小孔アレイ層１７に配置された微小ウェル１２とが重なっている。
この生体分子解析キットを用いて発光状況を検出する場合、例えば、まず、基材部６側の領域全体の発光状況を基材部６側に焦点を合わせた検出装置で検出する。次に、基材部６側に合った焦点をカバー部９ｂ側に合わせ、カバー部９ｂ側の領域全体の発光状況をその検出装置で検出する。こうすることで、異なる分析の濃度検出等を同時に行うことができる。
【００５１】
（第２実施形態の変形例）
本実施形態では、図８及び図９に示すように、観察方向であるカバー部９ｂ側から見て、微小ウェル２と微小ウェル１２とが重なっている場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、図１０に示すように、観察方向であるカバー部９ｂ側から見て、微小ウェル２と微小ウェル１２とが重ならないように配置してもよい。この形態であれば、観察方向であるカバー部９ｂ側から観察した場合に、微小ウェル２と微小ウェル１２とが重ならないため、微小ウェル２における発光状況の検出精度と、微小ウェル１２における発光状況の検出精度とを共に高めることができる。以下、この点について、詳しく説明する。
【００５２】
マイクロビーズ１３として用いることが可能な磁性ビーズは、一般に黒色のものが多い。このため、図８及び図９に示すような、観察方向であるカバー部９ｂ側から見て、微小ウェル２と微小ウェル１２とが重なっている生体分子解析キットで、マイクロビーズ１３として磁性ビーズを用いると、微小ウェル１２における発光状況の検出精度が低下することがある。また、微小ウェル２における発光状況の検出精度も低下することがある。これは、磁性ビーズが黒色であるため、観察方向であるカバー部９ｂ側から見た場合、磁性ビーズが「影」となり、微小ウェル２と微小ウェル１２の発光状況の検出領域が狭くなることがあるからである。
【００５３】
［第２実施例］
以下の実施例により、本発明の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこの例に限定されるものではない。
Ｐｅｒｃｏｌｌで比重１．１３に調整した親水性溶媒中に、比重１．０３の蛍光ポリマービーズと比重１．８（±０．５）の磁性ビーズを分散させた。
微小ウェルを備える２枚のプレートを対向させ、流路８となる隙間を設けて両面テープで貼り合わせた。
【００５４】
プレートの送液ポートからビーズが混合された親水性溶媒４を送液し、２分間放置した後に油性封止液１を送液した。
顕微鏡により、各プレートに収容されているビーズを透過光で明視野観察した。
また、顕微鏡により、各プレートに収容されているビーズを蛍光で観察した。
結果、上部に配置されて微小ウェルが下向きに開口しているプレートに収容されているビーズは全て蛍光を発していたため、比重が１．０３の蛍光ポリマービーズであった。また、下部に配置されて微小ウェルが上向きに開口しているプレートに収容されているビーズは、蛍光を発していないため、比重が１．８（±０．５）の磁性ビーズであった。
【００５５】
（第３実施形態）
図１１は、本発明の第３実施形態に係る生体物質検出方法を適用した生体分子解析キットの構成を示す断面図である。本実施形態に係る生体分子解析キットは、図１１に示すように、反応容器である微小ウェル２が複数整列配置された微小孔アレイ層７を有する基材部６と、カバー部９ａとを備え、基材部６とカバー部９ａとの間に流路８が形成されている。そして、この流路８に上述の親水性溶媒４や油性封止液１を導入することで、微小ウェル２に生体物質１４が収容された生体分子解析キットが形成される。
【００５６】
つまり、本実施形態に係る生体分子解析キットは、微小ウェル２に生体物質１４が収容されている点を除けば、第１実施形態で説明した生体分子解析キットと同じ構成をしている。よって、ここでは、第１実施形態に係る生体分子解析キットと異なる部分である生体物質１４について説明し、その他の部分についての説明は省略する。
生体物質１４として、例えば、ウイルス粒子、細菌や組織の細胞、エクソソーム、ＤＮＡなどの核酸、タンパク質を用いることができる。これらの生体物質であれば、比重が１．０〜１．２程度であり、一般的なマイクロビーズ３の比重１．０〜２．５と比べて小さい。このため、種々の親水性溶媒４に浮かべることができる。
【００５７】
したがって、生体物質よりも比重を大きくすることで、親水性溶媒４を流路８に導入すると、生体物質１４は流路８の上方に位置する。また、微小ウェル２は流路８の上面に配置され、流路８側に開口している。そのため、親水性溶媒４に浮かんだ生体物質１４は、微小ウェル２と向かい合う位置に達した時点で微小ウェル２に収容されることになる。
そして、親水性溶媒４を流路８に導入した後、次に、流路８に油性封止液１を導入することにより、親水性溶媒４のうち余剰分、すなわち、微小ウェル２内に収容されない分が油性封止液１により押し出される状態となり、流路８が油性封止液１で満たされる状態となる。これにより、生体物質１４が微小ウェル２に収容され、流路８が油性封止液１で満たされた生体分子解析キットが得られることになる。
【００５８】
したがって、例えば、予め親水性溶媒４に、シグナル増幅反応試薬を含めておき、微小ウェル２内でシグナル増幅反応を行い、各微小ウェル２に収容された生体物質１４についてシグナル検出を行うことにより例えば、濃度検出等を容易に行うことができる。
また、このようにして得られた生体分子解析キットにおいては、生体物質１４は、流路８の底面、すなわちカバー部９ａ側に接していない。したがって、観察方向であるカバー部９ａ側から観察した場合に、生体物質１４のカバー部９ａ側の領域全体の発光状況を検出することができる。そのため、生体物質１４を流路８の底面側に形成したウェルに収容する方法に比較して、より高精度に発光状況を検出することができ、すなわち、濃度検出等をより精度良く行うことができる。
なお、上述のシグナル増幅反応については、第１実施形態で説明したシグナル増幅反応と同じであるため、ここではその説明を省略する。
【００５９】
（第３実施形態の変形例）
本実施形態では、図１１に示すように、流路８の上方にのみ微小ウェル２が位置する場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、第２実施形態で説明したように、流路８の下方に微小ウェル１２が位置していてもよい。このような形態であれば、例えば、異なる分析を同時に行いつつ、各分析における濃度検出等を容易に行うことができる。
【００６０】
（各実施形態の効果）
（１）本発明の一態様に係る生体物質検出方法は、マイクロビーズ３を収容可能な凹部からなる微小ウェル２が形成され微小ウェル２の開口側が下となる基材部６と微小ウェル２の開口側に基材部６と向かい合うように配置されたカバー部９ａとの間の空間を流路８とし、マイクロビーズ３が分散された親水性溶媒４を流路８に導入してマイクロビーズ３を微小ウェル２に収容させる収容工程を含み、親水性溶媒４の比重は、マイクロビーズ３の比重よりも大きい。
この構成であれば、従来技術と比較して、より確実に、流路８よりも上方に形成された微小ウェル２にマイクロビーズ３を収容させることができ、発光した全ての光を観測することができる。
【００６１】
（２）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、親水性溶媒４はシグナル増幅反応試薬を含み、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方でシグナル増幅反応を行い、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方を対象としてシグナル検出を行ってもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して高精度で、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方を対象としたシグナル検出を行うことができる。
【００６２】
（３）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、シグナル増幅反応は等温反応であってもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して高精度で、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方を対象としたシグナル検出を行うことができる。
（４）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、等温反応は酵素反応であってもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して高精度で、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方を対象としたシグナル検出を行うことができる。
【００６３】
（５）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、酵素反応はインベーダー反応であってもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して高精度で、微小ウェル２内及び微小ウェル１２内の少なくとも一方を対象としたシグナル検出を行うことができる。
（６）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、シグナルとして、微小ウェル２内における生体物質の有無に対応した蛍光、発光、ｐＨ変化、吸光度変化、電位変化、電流変化の少なくとも何れか一つを検出してもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して汎用性を高めることができる。
【００６４】
（７）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、親水性溶媒４は、解析対象物質としてＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質のいずれかを含むと共に、解析対象物質に対する特異的標識能を有する標識物質に鋳型核酸が含まれるか、又は結合可能な状態で標識物質が親水性溶媒４に含まれていてもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して汎用性を高めることができる。
（８）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、標識物質が、鋳型核酸とは異なるＤＮＡ鎖、酵素、粒子、抗体、及びリポソームのうちの少なくとも一つを含んでもよい。
この構成であれば、従来技術と比較して汎用性を高めることができる。
【００６５】
（９）本発明の一態様に係る生体物質検出方法は、収容工程の後に、親水性溶媒４と混合しない特性を有する油性封止液１を流路８に導入する工程を備えてもよい。
この構成であれば、微小ウェル２にマイクロビーズ３を安定して収容させることができ、発光した全ての光を観測することができる。
（１０）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、カバー部９ｂは、マイクロビーズ１３を収容可能な凹部からなる微小ウェル１２を備え、微小ウェル１２の開口側が上となっており、親水性溶媒４には、マイクロビーズ１３がさらに分散されており、収容工程では、マイクロビーズ３を微小ウェル２に収容させるとともに、マイクロビーズ１３を微小ウェル１２に収容させ、親水性溶媒４の比重は、マイクロビーズ３の比重より大きく、マイクロビーズ１３の比重よりも小さくてもよい。
この構成であれば、微小ウェル２内と微小ウェル１２内とで発光した全ての光を観測することができる。つまり、微小ウェル２内と微小ウェル１２内とで異なる分析を行うことができる。
【００６６】
（１１）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、マイクロビーズ１３は、磁性ビーズであってもよい。
この構成であれば、マイクロビーズ１３を確実性を高めて微小ウェル１２内に収容することができる。
（１２）本発明の一態様に係る生体物質検出方法では、マイクロビーズ３は、ポリマービーズと生体物質の少なくとも一方であってもよい。
この構成であれば、マイクロビーズ３を、確実性を高めて微小ウェル２内に収容することができる。
【００６７】
以上、特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、これら説明によって発明を限定するものではない。本発明の説明を参照することにより、当業者には、開示された実施形態の種々の変形例とともに本発明の別の実施形態も明らかである。したがって、特許請求の範囲は、本発明の範囲及び要旨に含まれるこれらの変形例又は実施形態も網羅すると解すべきである。
【００６８】
[参考例]
以下、本発明に係る生体物質検出方法以外の生体物質検出方法を本発明の参考例として、簡単に説明する。
従来、疾患や体質の診断を、生体分子を解析することによって行うことが知られている。例えば、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）解析による体質診断、体細胞変異解析による抗がん剤の投与判断、ウイルスのタンパク質やＤＮＡの解析による感染症対策等が知られている。
例えば、がんの治療薬では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害薬）の投与前後で変異型ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のコピー数を定量することで、治療効果の指標とできることが示唆されている。
【００６９】
従来、リアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた定量が行われていたが、検査に使用された核酸の総量が変化することが定量性に影響を与えることがわかっており、今日では核酸の総量が定量性に影響しないデジタルＰＣＲ技術が開発されている。
デジタルＰＣＲ技術とは、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合液を多数の微小液滴に分割し、これらの微小液滴に対して、混合液中の核酸のうち検出対象となる核酸を鋳型とするＰＣＲ増幅を行う。そして、鋳型核酸を含んだ微小液滴からＰＣＲ増幅による蛍光等のシグナルを検出し、微小液滴の全数のうちシグナルが検出された微小液滴の割合を求めることによって、試料中の検出対象である核酸を定量する技術である。
【００７０】
例えば特許文献１や非特許文献１には、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことで、デジタルＰＣＲを利用して生体物質検査を行うことができることが示されている。
デジタルＰＣＲに使用される微小液滴の作製方法として、試薬と核酸との混合液を封止液で分断化することで微小液滴を作製する方法や、基板上に孔を空け、この孔の中に試薬と核酸との混合液を入れた後に封止液で孔を封止することで微小液滴を作製する方法等が知られている。また、特許文献２には、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得するためにマイクロチャンバー内でエマルジョンを製造する方法が開示されている。
デジタルＰＣＲでは、１つの微小液滴に存在する鋳型核酸が１個又は０個となるように、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合液は希釈されている。デジタルＰＣＲでは、核酸増幅の感度を高めるために、また多数の微小液滴に対して同時に核酸増幅を行うために、各微小液滴の体積は小さい方が好ましい。
【００７１】
例えば、非特許文献１には、各ウェルの容積が６ｎｌ（ナノリットル）となるように形成されたマイクロアレイ状の反応容器が開示されている。
また、非特許文献２には、深さ３μｍ、直径５μｍのウェルが流路内に多数形成されたマイクロアレイに対し、流路に試料を流して各ウェルに試料を導入した後、流路内の余剰試薬を封止液で押し出すことによって、各ウェル内に試料を導入する方法が開示されている。
また、微小液滴中に効率よく生体物質を入れるために、生体物質を結合させたマイクロビーズを利用しており、特許文献３にはオイルを使ってマイクロビーズを封入する方法が開示されている。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本願発明は、生化学反応用の微小反応容器にビーズを収容して、生体物質検出を行うようにした生体分子解析キットや、生体成分核酸定量用アレイデバイス等への利用が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１    油性封止液
２    微小ウェル
３    マイクロビーズ
４    親水性溶媒
５    ガラス基板
６    基材部
７    微小孔アレイ層
８    流路
９    カバー部
９ａ  カバー部
９ｂ  カバー部
１０    カバーガラス
１２    微小ウェル
１３    マイクロビーズ
１４    生体物質
【図１】
2017043530.tif 000004
【図２Ａ】
2017043530.tif 000005
【図２Ｂ】
2017043530.tif 000006
【図３】
2017043530.tif 000007
【図４Ａ】
2017043530.tif 000008
【図４Ｂ】
2017043530.tif 000009
【図５】
2017043530.tif 000010
【図６Ａ】
2017043530.tif 000011
【図６Ｂ】
2017043530.tif 000012
【図７Ａ】
2017043530.tif 000013
【図７Ｂ】
2017043530.tif 000014
【図８】
2017043530.tif 000015
【図９】
2017043530.tif 000016
【図１０】
2017043530.tif 000017
【図１１】
2017043530.tif 000018
【国際調査報告】
2017043530.tif 000019
2017043530.tif 000020
2017043530.tif 000021
2017043530.tif 000022