(57)【要約】本発明は、ナノ粒子及び前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤及び下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む複合体に関する。2017131242.tif 000063一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。2017131242.tif 000064一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。本発明は、薬剤を効率良くエンドリソソームに運搬して、リソソーム酵素に低濃度で機能させることが可能な汎用性に富むシステム及びこのシステムを利用した抗ガン剤を提供する。
2017131242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子及び前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤及び下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む複合体。
【化１】
2017131242.tif 000051
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
【化２】
2017131242.tif 000052
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【請求項２】
ナノ粒子の表面に下記一般式（Ａ’）で示される物質がさらに担持された請求項１に記載の複合体。
【化３】
2017131242.tif 000053
（一般式（Ａ’）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【請求項３】
一般式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ａ’）において、ｎ１とｎ２の合計はｎ３以上である、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
自殺基質部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（以下、反応性基）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
自殺基質部位は、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−グガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基、及びシアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも１種の糖残基、並びにジフルオメチルアリール基、及びトリプルオメチルアリール基から成る群から選ばれる少なくとも１種の反応性基を有する請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
自殺基質部位は、下記官能基を含む請求項４に記載の複合体。
【化４】
2017131242.tif 000054
（式中、Ｒは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−グガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基、及びシアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも１種の糖残基であり、ＬＫはリンカーである。）
【請求項７】
自殺基質部位は、下記式で示されるいずれかの官能基を含む請求項４〜６のいずれかに記載の複合体。
【化５】
2017131242.tif 000055
【請求項８】
キナーゼ阻害部位は、キナーゼと反応性を有する基（以下、細胞膜キナーゼ反応性基）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
キナーゼ阻害部位は、下記式で示されるいずれかの官能基を含む請求項８に記載の複合体。
【化６】
2017131242.tif 000056
（式中、ＬＫはリンカーを示し、Ｒ１は電子吸引性基である。）
【請求項１０】
キナーゼ阻害部位は、下記式で示される官能基を含む請求項８又は９に記載の複合体。
【化７】
2017131242.tif 000057
【請求項１１】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００〜１０：１の範囲である、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
【請求項１２】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤と一般式（Ａ’）で示される物質のモル比率が１：１００〜１００：０の範囲である、請求項２〜１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１３】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、請求項１〜１２のいずれかに記載の複合体。
【請求項１４】
金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、及び鉄磁性ナノ粒子から成る群から選ばれる少なくとも１種の粒子である請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
半導体ナノ粒子は、量子ドットである請求項１３に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲である請求項１〜１５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
【請求項１８】
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である請求項１７に記載の抗ガン剤。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、
得られた表面修飾ナノ粒子にリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙ又はキナーゼ阻害剤前駆体Ｚを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤を形成する、
但し、リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙは、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（以下、反応性基）を含む自殺基質部位を含み、キナーゼ阻害剤前駆体Ｚはキナーゼと反応性を有する基を含むキナーゼ阻害部位を含む、
請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）、
を含む前記方法。
【化８】
2017131242.tif 000058
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。）
【化９】
2017131242.tif 000059
（一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。）
【化１０】
2017131242.tif 000060
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
【請求項２０】
リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙが、下記式で示されるいずれかの化合物である請求項１９に記載の製造方法。
【化１１】
2017131242.tif 000061
【請求項２１】
キナーゼ阻害剤前駆体Ｚが、下記式で示される化合物（３２）である請求項１９に記載の製造方法。
【化１２】
2017131242.tif 000062
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内物質移送システムおよびその利用に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月２９日出願の日本特願２０１６−１５７６０号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【背景技術】
【０００２】
治療効果が期待される医薬品の多くの標的タンパク質は細胞内の核を含む特定のオルガネラあるいは細胞質に分布している。このため、作用すべき細胞内の空間に送達できなければ期待された治療効果は得られない。【０００３】
そのための薬剤送達システムが種々考案され、特に、標的指向化を可能とする、ＥＰＲ効果等を利用した、例えば、高分子のナノ粒子、ミセル化ナノ粒子、磁性ナノ粒子などを使った種々のシステムが知られている。（例えば、特許文献１〜４参照）【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５３４３０９号公報
【特許文献２】特表２０１１−５２８２７５号公報
【特許文献３】特表２０１５−５２０１９４号公報
【特許文献４】特表２０１５−５２０１９７号公報
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎ−Ｉｃｈｉｒｏ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，３３８６−３３９０
【非特許文献２】Ａ．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２５０７−１２５１７
【非特許文献３】Ｂ．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６特許文献１〜４及び非特許文献１〜３の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、薬効を得るためには細胞内に薬効成分が取り込まれる必要があり（非特許文献１）、依然として低分子・高分子を問わず、薬剤を効率良く目的の細胞内スペースあるいは、エンドリソソームなどの特定のオルガネラに運搬して低濃度で機能させることが可能な汎用性に富むシステムは知られていない。新たな方法論の発見と新技術の開発がこの分野の最大の課題となっている。【０００７】
そこで本発明が解決すべき課題は、薬剤を効率良くエンドリソソームに運搬して、リソソーム酵素に低濃度で機能させることが可能な汎用性に富むシステムを提供することであり、本発明は、このようなシステムを提供することを目的とする。
さらに本発明は、薬剤を効率良くエンドリソソームに運搬する上記システムを利用して、細胞膜内の酵素、例えば、キナーゼ等に対する活性物質（例えば、阻害剤）を送達するシステムを提供することを目的とする。
加えて本発明は、このようなシステムを利用した抗ガン剤を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、癌に代表される分化・成長途上の段階にある多くの高活動状態の細胞は「エンドサイトシス」による高分子物質やナノ微粒子等の細胞内への取り込み速度が正常細胞に比して異常に高いことに着目して、広く低分子医薬品を細胞内へ効果的かつ特異的送達する方法を確立した。【０００９】
尚、非特許文献２には、金属ナノ粒子表面にリン脂質とともにシアル酸残基等を有する糖鎖との複合体が記載されている。この文献においては、前記複合体をマウスの尾血管に投与し、複合体が当初は全身に行き渡り、その後、特定の臓器に集まることが示されている。しかしながら、この文献においては、この複合体の癌細胞などの高活動状態の細胞における取込みについては、検討されていない。【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］
ナノ粒子及び前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤及び下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む複合体。
【化１】
2017131242.tif 000003
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
【化２】
2017131242.tif 000004
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
［２］
ナノ粒子の表面に下記一般式（Ａ’）で示される物質がさらに担持された［１］に記載の複合体。
【化３】
2017131242.tif 000005
（一般式（Ａ’）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
［３］
一般式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ａ’）において、ｎ１とｎ２の合計はｎ３以上である、［１］又は［２］に記載の複合体。
［４］
自殺基質部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（以下、反応性基）を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体。
［５］
自殺基質部位は、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−グガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基、及びシアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも１種の糖残基、並びにジフルオメチルアリール基、及びトリフルオメチルアリール基から成る群から選ばれる少なくとも１種の反応性基を有する［４］に記載の複合体。
［６］
自殺基質部位は、下記官能基を含む［４］に記載の複合体。
【化４】
2017131242.tif 000006
（式中、Ｒは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−グガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基、及びシアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも１種の糖残基であり、ＬＫはリンカーである。）
［７］
自殺基質部位は、下記式で示されるいずれかの官能基を含む［４］〜［６］のいずれかに記載の複合体。
【化５】
2017131242.tif 000007
［８］
キナーゼ阻害部位は、キナーゼと反応性を有する基（以下、細胞膜キナーゼ反応性基）を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体。
［９］
キナーゼ阻害部位は、下記式で示されるいずれかの官能基を含む［８］に記載の複合体。
【化６】
2017131242.tif 000008
（式中、ＬＫはリンカーを示し、Ｒ１は電子吸引性基である。）
［１０］
キナーゼ阻害部位は、下記式で示される官能基を含む［８］又は［９］に記載の複合体。
【化７】
2017131242.tif 000009
［１１］
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００〜１０：１の範囲である、［１］〜［１］０のいずれかに記載の複合体。
［１２］
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤と一般式（Ａ’）で示される物質のモル比率が１：１００〜１００：０の範囲である、［２］〜［１］１のいずれかに記載の複合体。
［１３］
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の複合体。
［１４］
金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、及び鉄磁性ナノ粒子から成る群から選ばれる少なくとも１種の粒子である［１３］に記載の複合体。
［１５］
半導体ナノ粒子は、量子ドットである［１３］に記載の複合体。
［１６］
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲である［１］〜［１５］のいずれかに記載の複合体。
［１７］
［１］〜［１６］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
［１８］
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である［１７］に記載の抗ガン剤。
［１９］
［１］〜１６のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、
得られた表面修飾ナノ粒子にリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙ又はキナーゼ阻害剤前駆体Ｚを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤を形成する、
但し、リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙは、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（以下、反応性基）を含む自殺基質部位を含み、
キナーゼ阻害剤前駆体Ｚはキナーゼと反応性を有する基を含むキナーゼ阻害部位を含む、
［１］〜［１６］のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）、
を含む前記方法。
【化８】
2017131242.tif 000010
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。）
【化９】
2017131242.tif 000011
（一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。）
【化１０】
2017131242.tif 000012
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
［２０］
リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙが、下記式で示されるいずれかの化合物である［１９］に記載の製造方法。
【化１１】
2017131242.tif 000013
［２１］
キナーゼ阻害剤前駆体Ｚが、下記式で示されるいずれかの化合物である［１９］に記載の製造方法。
【化１２】
2017131242.tif 000014
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、例えば、細胞内リソソーム酵素又は細胞内キナーゼの特異的不活性化が可能となり、その結果、従来の抗腫瘍薬に比べて桁違いに低濃度で抗腫瘍効果を発揮する抗腫瘍剤を提供でき、極めて効果が高い抗腫瘍医薬品候補の創出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、ＭＡＬＤ−ＴＯＦＭＳによりナノ微粒子表面に化合物が提示されていることを確認した。
【図２ａ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動を示す。：（ａ）蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ７）培養開始後（１〜８時間）での細胞内動態（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。
【図２ｂ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動を示す。（ｂ）培養開始後２時間（上）と８時間（下）のＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ７（化合物７を担持した蛍光性ナノ微粒子）の細胞内分布の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。拡大図（左）と位相差画像（右）
【図３ａ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ａ）化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ７細胞の生存率をＭＴＡ法により定量した。
【図３ｂ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ｂ）各試験薬との９６時間共培養後の乳癌細胞の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。リソソームと核はそれぞれ緑と青で染色、ＱＤは赤い蛍光を示している。
【図３ｃ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ｃ）化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ７）培養開始後８時間でのＺ  ｓｔａｃｋで見た細胞内分布の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。
【図３ｄ】化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ｄ）ＧＦＰ発現細胞株を用いたライブセルイメージング：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）培養開始後８時間での細胞内動体（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。
【図４】実施例２において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりナノ微粒子表面に化合物が提示されていることを確認した。
【図５】化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動ａ示す。蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）培養開始後（１〜８時間）での細胞内動体（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。
【図６】化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ａ）化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ−７細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより定量した。（ｂ）各試験薬との９６時間培養後の乳癌細胞の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。リソソームと核はそれぞれ緑と青で染色、ＱＤは赤い蛍光を示している。
【図７】実施例３において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによりナノ微粒子表面に化合物が提示されていることを確認した。
【図８】化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）培養開始後（１〜８時間）での細胞内動体（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。
【図９】化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ−７細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより定量した。
【図１０Ａ】化合物７を担持した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）内挙動：阻害剤を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子と肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）の共培養開始後（１〜８時間）での細胞内挙動（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０ｍｍ）。
【図１０Ｂ】化合物１５を担持した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）内挙動：阻害剤を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子と肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）の共培養開始後（１〜８時間）での細胞内挙動（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０ｍｍ）。
【図１０Ｃ】化合物２０を担持した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞（ＨｅｐＧ２細胞）内挙動：阻害剤を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子と肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）の共培養開始後（１〜８時間）での細胞内挙動（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０ｍｍ）。
【図１１】阻害剤７（Ａ）、１５（Ｂ）、および２０（Ｃ）を担持した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ）の肝臓癌細胞殺傷作用：それぞれの阻害剤を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬の共存下で９６時間培養後のＨｅｐＧ２細胞の生存率をＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ（ＭＴＴ法）により定量した。
【図１２】化合物７を担持した蛍光性ナノ微粒子（１〜１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の肝細胞癌殺傷作用：化合物７を担持した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＨｅｐＧ２細胞の生存率をＣｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙにより定量した。
【図１３】化合物３２を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ
【図１４Ａ】化合物３２担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子と肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）の共培養開始後０．５〜２４時間での細胞内挙動を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａの一部の拡大図（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０ｍｍ）である。
【図１５】ソラフェニブ誘導体３２を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子（１〜１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ３２）と化合物３２（１〜１０６ｎＭ）の肝癌細胞殺傷作用：化合物３２を担持した蛍光ナノ微粒子、化合物３２単独およびナノ微粒子のみをそれぞれＨｅｐＧ２細胞と共に４８時間培養後の癌細胞の生存率をＭＴＴ法により定量した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜複合体＞
本発明は、ナノ粒子及び前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤及び下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む複合体に関する。
【００１４】
【化１３】
2017131242.tif 000015
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
【００１５】
【化１４】
2017131242.tif 000016
（一般式（Ｂ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【００１６】
リソソーム酵素阻害剤は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（反応性基）を含む自殺基質部位を含む。自殺基質部位は、リソソーム酵素に対する基質となり得る糖残基、および酵素不活性化のためのリソソーム酵素に対する反応性基を含む。
【００１７】
糖残基は、不活性化させたいリソソーム酵素の基質特異性に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−グガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基シアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも１種の糖残基である。
【００１８】
糖残基としては、リソソーム酵素の基質特異性を考慮するとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基、及び／又はガラクトース残基が好ましい。
【００１９】
１個の複合体粒子に複数の糖残基を使用してもよく、その場合、１個の複合体粒子に単一又は複数種の糖残基が存在しても良い。また、１個の複合体粒子には単一又は複数種の糖残基が存在し、かつ共存する異なる複合体粒子において、同一又は異なる単一又は複数種の糖残基が存在することもできる。
【００２０】
反応性基は、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基であればよく、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基としては、例えば、ジフルオメチルアリール基、及びトリフルオメチルアリール基から成る群から選ばれる少なくとも１種の反応性基であることができる。酵素の反応中心との反応性は、可逆的または非可逆的の何れであっても良い。
【００２１】
ジフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４４，１１６６９−１１６７５を参照できる。前記反応性基がジフルオメチルアリール基である自殺基質は、例えば、下記一般式（Ｅ）で示される基であることができる。
【化１５】
2017131242.tif 000017
式中、Ｒは、糖残基であり、Ｆはフッ素原子である。
【００２２】
一般式（Ｅ）はさらにリンカーＬＫを有する一般式（Ｅ’）であることができる。
【化１６】
2017131242.tif 000018
式中、Ｒは、糖残基であり、Ｆはフッ素原子である。リンカーＬＫは糖残基を有するアリール基と鎖状部位との間を架橋できる基であれば、特に制限はない。例えば、下記で示されるアルキレン基を含むリンカーであることができる。この式においては、左端がアリール基との結合部位であり、右端は鎖状部位との結合部位であり、鎖状部位末端の窒素原子（＝Ｎ）も表示されている。リンカーＬＫにおけるアルキレン基は、例えば、炭素数１〜１０の範囲であることができ、左端のアリール基との結合部位であるアミド基及び／又は右端の鎖状部位との結合部位であるイミノ基は、それぞれ他の連結基であることもできる。
【００２３】
【化１７】
2017131242.tif 000019
【００２４】
トリフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００１，１１，１７６９−１７７３を参照できる。
【００２５】
自殺基質部位は、例えば、下記式で示されるいずれかの官能基を含む部位であることができる。
【化１８】
2017131242.tif 000020
【００２６】
キナーゼ阻害部位は、キナーゼと反応性を有する基、好ましくは細胞膜のキナーゼと反応性を有する基を含む。そのようなキナーゼ阻害部位は、例えば、下記式で示される部位であることができる。
【化１９】
2017131242.tif 000021
式中、ＬＫはリンカーを示し、Ｒ１は電子吸引性基である。電子吸引性基としては、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、ニトロ基、シアノ基、トシル基、アシル基等を挙げることができる。
【００２７】
このキナーゼ阻害部位は、下記ソラフェニブを含む。
【化２０】
2017131242.tif 000022
【００２８】
さらに、ソラフェニブを含む部位の具体例としては下記の部位を挙げることができる。
【化２１】
2017131242.tif 000023
【００２９】
キナーゼは、タンパク質における特定の残基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。一般的に、キナーゼは、３つのグループに分けられる。優先的にセリンおよび／またはスレオニン残基をリン酸化するもの、優先的にチロシン残基をリン酸化するもの、およびチロシンおよびセリン／スレオニン残基の両方をリン酸化するものである。キナーゼは、受容体におけるサイトカインの活性化を含む細胞外シグナルを核に伝達し、種々の生物学的な事象を引き起こすためのシグナル伝達経路における重要な要素とされる。例えば、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ等があげられる。ソラフェニブは、チロシンキナーゼの阻害、Ｒａｆキナーゼ（細胞増殖シグナルに深く関与するセリン／スレオニンキナーゼの一種）の阻害する薬物として知られている。
【００３０】
本発明の複合体は、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤が有する自殺基質部位又は一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤が有するキナーゼ阻害部位を、ナノ粒子の表面に固定化した物であり、自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位をナノ粒子の表面に提示するものである。ここで、自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位の「提示」とは、ナノ粒子の表面に自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位を固定化することを意味する。
【００３１】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤は、式中のｎ１及びｎ２を選択することで、リソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができ、その結果、細胞内でのリソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用を調節することができる。ｎ１は２〜３０、好ましくは５〜１６、より好ましくは４〜１５の範囲の整数である。ｎ２は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。
【００３２】
一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質は、ナノ粒子の表面を修飾し、本発明の複合体が、エンドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を付与する。この観点からｎ３は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。
【００３３】
１個のナノ粒子に対する一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤及び一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質の担持量は、ナノ粒子の表面における金属元素（反応点）の８０％以上あることが好ましい。本発明の複合体同士の凝集抑制やエドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を考慮して適宜決定することができる。尚、前記担持量は、ナノ粒子の表面の全ての反応点を覆うことができる量であることがより好ましい。
【００３４】
本発明の複合体において、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質との比率は、細胞内でのリソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用とエンドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能のバランスを考慮して適宜選択することができ、例えば、モル比率が１：１００〜１０：１の範囲であることができ、好ましくは１：１０〜１：１の範囲である。
【００３５】
本発明の複合体は、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質に加えて、ナノ粒子の表面に下記一般式（Ａ’）で示される物質がさらに担持されたものであることができる。一般式（Ａ’）で示される物質は、後述する一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤の架橋用の前駆体Ｘに由来する。
【化２２】
2017131242.tif 000024
（一般式（Ａ’）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位である。）
【００３６】
尚、一般式（Ａ’）には、さらに、所望により糖鎖や抗体などの生理活性物質を担持させることもできる。
【００３７】
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ａ’）で示される物質のモル比率は、１：１００〜１００：０の範囲であることができ、１０：１００〜１００：１０の範囲であることができる。
【００３８】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子であることができる。金属ナノ粒子の材質には、特に制限はないが、金、白金、銀、鉄磁性体であることができ、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子は、鉄磁性体ナノ粒子であることができる。特に、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子が、生体に対する安全性という観点から好ましい。
【００３９】
半導体ナノ粒子の材質には、特に制限はない。半導体ナノ粒子は、量子ドットであることもできる。量子ドットとは半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度の小さな塊であり、蛍光性ナノ粒子である。粒子径により発光する蛍光の波長（色）が異なる。市販品を利用でき、本発明の複合体のナノ粒子に量子ドットを用いると、蛍光発光性の複合体とすることができ、生体内での動態をモニタリングすることも可能である。
【００４０】
ナノ粒子は、粒子径が０．１〜１００ｎｍの範囲であることができ、好ましくは、１〜５０ｎｍの範囲、より好ましくは５〜２０ｎｍの範囲、さらに好ましくは５〜１５ｎｍの範囲である。
【００４１】
本発明の複合体は、例えば、下記一般式（１０）で模式的に示すことができる。式中のリンカーＬＫから末端側の置換フェニル基は、リソソーム酵素阻害剤の例であり、キナーゼ阻害剤の場合には、ＬＫから末端側には、キナーゼ阻害部位の基が存在する（後述）。実際の複合体は、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質とは、それぞれ少なくとも１個以上、ナノ粒子ＮＰに担持されている。
【００４２】
【化２３】
2017131242.tif 000025
【００４３】
式中、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤に相当する枝においては、Ｒは糖残基であり、Ｆはフッ素原子であり、ＮＰはナノ粒子である。ＬＫは、糖残基を有するアリール基とナノ粒子ＮＰに連結する鎖状部位との間のリンカーである。リンカーＬＫは糖残基を有するアリール基と鎖状部位との間を架橋できる基であれば、特に制限はない。例えば、下記で示されるアルキレン基を含むリンカーであることができる。この式においては、左端がアリール基との結合部位であり、右端は鎖状部位との結合部位であり、鎖状部位末端の窒素原子（＝Ｎ）も表示されている。リンカーＬＫにおけるアルキレン基は、例えば、炭素数１〜１０の範囲であることができ、左端のアリール基との結合部位であるアミド基及び／又は右端の鎖状部位との結合部位であるイミノ基は、それぞれ他の連結基であることもできる。
【００４４】
【化２４】
2017131242.tif 000026
【００４５】
上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、ＬＫを具体化した下記一般式（２０）で模式的に記載することができる。Ｒ、Ｆ、ＮＰは、一般式（１０）と同様である。一般式（２０）で模式的に示される実際の複合体は、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質とは、それぞれ少なくとも１個以上、ナノ粒子ＮＰに担持されている。
【００４６】
【化２５】
2017131242.tif 000027
【００４７】
一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤を有する複合体は、下記一般式（３０）で模式的に記載することができる。
【化２６】
2017131242.tif 000028
【００４８】
式中、一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤に相当する枝においては、Ｒ１は電子吸引性基であり、電子吸引性基としては、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）またはニトロ基、シアノ基、トシル基、アシル基等を挙げることができ、Ｆはフッ素原子であり、ＱＤはナノ粒子の１種であるコロイド状の量子ドットである。ＬＫは、アミド基側とＱＤに連結する鎖状部位との間のリンカーである。リンカーＬＫはアミド基側と鎖状部位との間を架橋できる基であれば、特に制限はない。例えば、アルキレン基を含むリンカーであることができる。
【００４９】
上記一般式（３０）で模式的に示すことができる複合体は、ＬＫ及びＲ１を具体化した下記式（４０）で模式的に記載することができる。Ｆ、ＱＤは、一般式（３０）と同様である。式（４０）で示される複合体は、実際には、一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質とが、それぞれ少なくとも１個以上、ナノ粒子ＱＤに担持されている。
【化２７】
2017131242.tif 000029
＜複合体の製造方法＞
本発明は、上記本発明の複合体の製造方法を包含する。この方法は、
下記一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持して表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、
得られた表面修飾ナノ粒子にリソソーム酵素阻害剤Ｙ又はキナーゼ阻害剤前駆体Ｚを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤を形成する、本発明の複合体を得る工程（２）、
を含む。
【００５０】
【化２８】
2017131242.tif 000030
（一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数である。）
【化２９】
2017131242.tif 000031
（一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０の範囲の整数である。）
【化３０】
2017131242.tif 000032
（一般式（Ａ）中、ｎ１は２〜３０の整数であり、ｎ２は２〜３０の整数であり、−Ｓ−末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位である。）
【００５１】
工程（１）
一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持して表面修飾ナノ粒子を得る工程である。
【００５２】
一般式（Ｃ）は、自殺基質部位又はキナーゼ阻害部位を有さず、かつ末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と同様である。一般式（Ｃ）中、ｎ１は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。ｎ２は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。一般式（Ｄ）は、末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質と同様である。一般式（Ｄ）中、ｎ３は２〜３０、好ましくは５〜２０、より好ましくは７〜１５の範囲の整数である。一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、いずれも市販品を入手可能であり、また、参考文献（Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２５０７−１２５１７）に記載の方法で調製することもできる。
【００５３】
一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体及びナノ粒子の混合比率は、一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のナノ粒子に対する所望の担持量を考慮して適宜決定することができる。
【００５４】
下記に実施例１の工程（１）を参考に示す。下記スキーム中に示す一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘはｎ１が６であり、ｎ２が９であり、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のｎ３が９である。実施例１の反応スキームである下記スキームでは、アミノオキシリンカー（ＡＯ）とホスホリルコリンリンカー（ＰＣ）のモル比ＡＯ／ＰＣが１／２である。ＡＯ／ＰＣは、実施例２が１／２、実施例３が１／４、実施例５が１／１６である。モル比ＡＯ／ＰＣは、本発明の複合体における、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質との比率が、前述のように、例えば、モル比率が１：１００〜１０：１の範囲であることができ、好ましくは１：１０〜１：１の範囲であることから、これに準じた比であることができる。
【００５５】
【化３１】
2017131242.tif 000033
【００５６】
ナノ粒子は、複合体において説明したものと同様である。上記スキームでは、金属ナノ粒子の原料としてコロイド状の量子ドット（ＱＤｓ（ＱＤ：Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ））を用いた。コロイド状量子ドットは、直径の範囲が、例えば、１〜２０ｎｍの発光性の半導体ナノ粒子の表面に保護基を有する。上記スキームに示すコロイド状量子ドットは表面にトリアルキルリン酸基を有する。ナノ粒子が金属ナノ粒子の場合も、コロイド状の金属ナノ粒子を原料として用いることができる。コロイド状量子ドット及びコロイド状金属ナノ粒子は市販品を入手可能である。
【００５７】
一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、コロイド状ナノ粒子のナノ粒子表面に結合する官能基として、チオール（ＳＨ）基を有する。
【００５８】
コロイド状ナノ粒子と阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体とを、例えば、溶媒中で分散し、ナノ粒子の表面に２種類のリン脂質疑似物質を担持する。上記スキームでは溶媒としてヘキサンと水の混合溶媒を用い、室温（例えば、１５〜２５℃）で行う。使用する溶媒は、コロイド状ナノ粒子の種類、阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の種類に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子、阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の溶媒中の濃度や反応時間も、所望の表面修飾ナノ粒子に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子への担持方法の一般的な方法は、公知であり、例えば、以下の参考文献Ａ、Ｂに記載の方法を参照して実施することができる。
参考文献
Ａ．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２５０７−１２５１７（非特許文献２）
Ｂ．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６（非特許文献３）
【００５９】
工程（２）
工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子にリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙ又はキナーゼ阻害剤前駆体Ｚを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤を形成して、本発明の複合体を得る工程である。
【００６０】
下記に実施例１の工程（２）を参考に示す。リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙとして実施例１で合成された化合物７が使用される。
【化３２】
2017131242.tif 000034
【００６１】
工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子にリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤を形成して、本発明の複合体を得る。リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙは、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（反応性基）を含む自殺基質部位を含む。自殺基質部位については前記複合体に関する説明を参照できる。
【００６２】
リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙとしては、例えば、下記式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。上記スキームではリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙとして化合物（７）が用いられており、表面修飾ナノ粒子表面上の一般式（Ｃ）で示されるリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｘ由来のオキシアミノ基と反応して、一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤を形成する。
【００６３】
【化３３】
2017131242.tif 000035
【００６４】
式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物及びこれに類するリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙは、実施例１〜３のスキーム１、３、５を参照して、公知の糖化合物及び公知の原料化合物から調製することができる。尚、糖化合物とアリール化合物の縮合方法及び縮合したアリール化合物への側鎖の連結方法は、Ａ．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２５０７−１２５１７（非特許文献２）に記載の方法を参照して実施することができる。反応生成物は、公知の方法で分離生成することができる。
【００６５】
下記に実施例５のＢに示す工程（２）の例を示す。キナーゼ阻害剤前駆体Ｚとして実施例５のＡで合成された化合物３２が使用される。
【化３４】
2017131242.tif 000036
【００６６】
工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子にキナーゼ阻害剤前駆体Ｚを混合して、阻害剤架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤を形成して、本発明の複合体を得る。キナーゼ阻害剤前駆体Ｚは、キナーゼ阻害部位を含む。キナーゼ阻害部位については前記複合体に関する説明を参照できる。
【００６７】
キナーゼ阻害剤前駆体Ｚとしては、例えば、下記式（３２）で示される化合物を挙げることができる。但し、これに限定される意図ではない。上記スキームではキナーゼ阻害剤前駆体Ｚとして化合物（３２）が用いられており、表面修飾ナノ粒子表面上の一般式（Ｃ）で示される阻害剤架橋前駆体Ｘ由来のオキシアミノ基と反応して、一般式（Ａ）で示されるキナーゼ阻害剤を形成する。
【化３５】
2017131242.tif 000037
【００６８】
式（３２）で示される化合物及びこれに類するキナーゼ阻害剤前駆体Ｚは、実施例５Ａの合成スキームを参照して、公知の原料化合物から調製することができる。反応生成物は、公知の方法で分離生成することができる。
【００６９】
リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙ又はキナーゼ阻害剤前駆体Ｚと反応しなかった物質は、一般式（Ａ’）で示される物質としてナノ粒子表面に担持されたままで複合体を形成する。リソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙの種類や一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤の複合体における所望の担持量、反応条件等を考慮して、工程（２）におけるリソソーム酵素阻害剤前駆体Ｙの使用量等を適宜選択する。
【００７０】
【化３６】
2017131242.tif 000038
【００７１】
＜抗ガン剤＞
本発明は、前記の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤を包含する。本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として含有するガン（癌、悪性腫瘍）の予防又は／及び治療用の医薬組成物であり、任意で医薬的に許容される担体をさらに含むことができる。前記ガンとしては、本発明の複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高いガン細胞に起因する物であれば、制限はなく、例えば、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、及び脳腫瘍などを挙げることができる。好ましくは、乳癌、肝細胞癌、膵癌、及び脳腫瘍である。
【００７２】
細胞内小器官のひとつであるリソソームには、数多くのリソソーム酵素が存在し、複合糖質や脂質などの細胞内基質を分解する役割を担っている。リソソーム酵素には、多数の糖鎖分解酵素が含まれる。癌細胞（腫瘍細胞）のような高活動状態の細胞は、本発明の複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高く、その結果、高活動状態の細胞に、リソソーム酵素阻害剤を有する複合体が、選択的に取り込まれ、リソソーム酵素（例えば、糖鎖分解酵素）を不活性化する。リソソーム酵素の活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
【００７３】
細胞膜内及び膜上には様々な酵素が存在し、キナーゼはそのような酵素の典型例であり、様々な物質のリン酸化に寄与する。上記のように癌細胞（腫瘍細胞）のような高活動状態の細胞は、本発明の複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高く、その結果、高活動状態の細胞に、キナーゼ阻害剤を有する複合体が、選択的に取り込まれ、キナーゼを不活性化する。キナーゼの活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
【００７４】
本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００７５】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。
【００７６】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、リポソームも細胞送達のために該薬剤をカプセル化するために使用可能である。
【００７７】
投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
【００７８】
本発明の前記複合体の用量および投与方法は、患者の年齡、体重、性別、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により適宜選択することができる。本抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１，０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、患者あたり０．０１〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、性別、症状などにより変動するが、当事者であれば適宜選択することが可能である。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。【００８０】
実施例１  Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ阻害剤担持ナノ微粒子
（１）化合物７の合成法
【化３７】
2017131242.tif 000039
【００８１】
化合物７の合成工程：（ｉ）ＡｃＣｌ（２０ｅｑ．），ｒ．ｔ．，４８ｈ，６８％，（ｉｉ）５−Ｎｉｔｒｏ  ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ（３ｅｑ．），Ａｇ２Ｏ（１．３ｅｑ．），ＭｅＣＮ，３５℃，５３％，（ｉｉｉ）ＤＡＳＴ（５ｅｑ．），ＣＨ２Ｃｌ２，ｒ．ｔ．，２４ｈ，４８％，（ｉｖ）Ｐｄ／Ｃ（１０ｗ％），Ｈ２  ｇａｓ，ｒ．ｔ．，０．５ｈ，ｑｕａｎｔ，（ｖ）５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（５ｅｑ．），ＤＩＣ（５ｅｑ．），ＴＨＦ，ｒ．ｔ．，７ｈ，８８％，（ｖｉ）ＮａＯＭｅ（０．１ｅｑ．），ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，０．５ｈ，ｑｕａｎｔ．【００８２】
化合物７はＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅを出発物質として合成した。反応性糖供与体２と５−ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅのグリコシル反応によって化合物３をβ選択的に得、その後、ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＤＡＳＴ）により３のアルデヒド基のジフルオロメチル基への変換により化合物４とした。次いで、化合物４のニトロ基の還元により得られた５と５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄをＮ，Ｎ’−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＩＣ）の存在下で縮合して化合物６を誘導し、脱アセチル化により目的とする下記に示す化合物７を効率良く作製した。【００８３】
【化３８】
2017131242.tif 000040
【００８４】
化合物７の構造情報：１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｈｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ｐｐｍ  １．８２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−），１．９７（ｓ，３Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ３），２．１（ｓ，３Ｈ，ＮＨＡｃ），２．３２（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３），２．５６（ｔ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−），３．４７（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４），３．５６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−５），３．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−６），３．９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−６），５．０４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），６．７９（ｔ，１Ｈ，ＣＨＦ２），７．１８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ），７．５２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ４９７．１０３［Ｍ＋Ｎａ］＋【００８５】
（２）化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子の作成法
下記反応スキーム２に、化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）の作製法を示す。
【化３９】
2017131242.tif 000041
【００８６】
化合物７を参考文献２および３に記載の方法に従って蛍光性ナノ微粒子（量子ドット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｑｄｏｔ（Ｒ）６５５））に提示（固定化）した。【００８７】
反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）の作製：ＴＯＰＯ−ＱＤｓ（１μＭ，５０μｌ／ｏｃｔａｎｅ）に対しＭｅＯＨ（５０μｌ）、ｉ−ＰｒＯＨ（１００μｌ）を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン（５０μｌ）を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー（１０ｍＭ，１０μｌ／ＭｅＯＨ），ホスホリルコリンリンカー（１００ｍＭ，４μｌ／ＭｅＯＨ），ＮａＢＨ４（１μｌ，１２ｗｔ％ｉｎ  １４Ｎ  ＮａＯＨ），およびｍｉｌｌｉ  Ｑ（５０μｌ）を加えて３０分間撹拌し配位子交換して反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）とした。限外濾過（ＹＭ５０）により精製した後、化合物７との反応に供した。【００８８】
ナノ微粒子への化合物７の提示：ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）と化合物７（３０ｍＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）をＡｃＯＨ／ＡｃＯＮａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４，１００μｌ）に分散して３０分室温で撹拌し、限外濾過（ＹＭ５０）により精製することで目的物を得た。ＭＡＬＤ−ＴＯＦＭＳによりナノ微粒子表面に自殺基質部位である化合物７が提示されていることを確認した（図１）。【００８９】
（３）リソソーム酵素阻害剤（７）を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（１）（乳癌細胞増殖抑制効果）
細胞内イメージング：ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７，Ｐ１３，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃，５％ＣＯ２の条件下で４８時間インキュベートをした後に、化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子［１０ｎＭの化合物７担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）］および比較物質としてのＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）を添加してその後の８時間までの細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６（２００μｌ，５ｎＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２の条件下で３０分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Ｈｏｅｃｈｓｔ（２μｌ，０．１ｎｇ／μｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２雰囲気下でさらに１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄してイメージングを行った（図２）。【００９０】
化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子は乳癌細胞に速やかに取り込まれて１時間後にはリソソーム内に存在していたが（図２ａ−１ｈ）、２時間後には既にリソソームから脱出したナノ微粒子が観察されている（図２ａ−２ｈ）。４〜８時間ではほとんどのナノ微粒子が細胞内に分散して存在している（図２ａ−４ｈおよび８ｈ）。４〜８時間後の時点ではＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６により染色される領域の減少が顕著であった。一方、比較に用いた化合物７を担持していない蛍光性ナノ微粒子（ＱＤ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は８時間経過後もほぼ全てがリソソーム内にトラップされたままであった（図２ａ−８ｈ、最下部）。また、図２ｂ（培養開始後２および８時間）で散見される浮遊した死細胞においてはリソソームがほとんど検出されていない。【００９１】
（４）リソソーム酵素阻害剤（７）を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（２）（乳癌細胞殺傷作用）
ＭＴＡアッセイ法による死細胞の定量：ＭＣＦ７細胞（５×１０３／１００μｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０μｌの培地に対してＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ７（１μＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ），ＱＤ  ｃｏｎｔｒｏｌ，（１μＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ），ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ７（１μＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ），ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（１ｍＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）を加えて終濃度が１００ｎＭ（ただしシスプラチンは１００μＭ）となるように調整した。培養開始後９６時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液を１０μｌ採取してＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１．５時間インキュベートし４５０ｎｍでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。【００９２】
図３に化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ａ）化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ７細胞の生存率をＭＴＡ法により定量した。（ｂ）各試験薬との９６時間共培養後の乳癌細胞の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。リソソームと核はそれぞれ緑と青で染色、ＱＤは赤い蛍光を示している。（ｃ）化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ７）培養開始後８時間でのＺ  ｓｔａｃｋで見た細胞内分布の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。【００９３】
化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７）は有意に乳癌細胞ＭＣＦ７の生育を阻害し、共培養９６時間後に生存率３０％程度で１００μＭ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７の１０００倍の投与量）を遥かに凌ぐ強い抗癌作用を発現した（図３ａ）。また、形状が変化して浮遊した死細胞は１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７と１００μＭ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎを播種した実験系でのみ観察された（図３ｂ）。図３ｃでは、化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子が細胞内に取り込まれたことが分かる。【００９４】
（４）リソソーム酵素阻害剤（７）を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（３）
ＧＦＰ発現細胞を用いたイメージング：ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７，Ｐ１７，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートをした後に、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔＴＭ  Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ−ＧＦＰ  ＊ＢａｃＭａｍ  ２．０＊（１μｌ  ５０００Ｃｅｌｌ／μｌ／ｍｅｄｉｕｍ）を添加してさらに２４時間インキュベートしてリソソーム表面にＧＦＰを発現させた。その後、化合物７を提示した蛍光性ナノ微粒子［１０ｎＭの化合物７担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）］および比較物質としてのＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）を添加してその８時間後の細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（２００μｌ，０．００１ｎｇ／μｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化で１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄してイメージングを行った（図３ｄ）。【００９５】
図３ｄの結果からＮＡＧ自殺基質を提示したナノ粒子はリソソーム内に存在するＮＡＧと共有結合を作ることでリソソーム膜を破壊、もしくは透過することでリソソームから抜け出していると推察される。【００９６】
参考文献
１．Ｍ．Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００１，１１，１７６９−１７７３
２．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２５０７−１２５１７
３．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６【００９７】
実施例２  ガラクトシダーゼ阻害剤担持ナノ微粒子【００９８】
（１）化合物１５の合成法
反応スキーム３
【化４０】
2017131242.tif 000042
【００９９】
化合物１５の合成工程：（ｉ）Ａｃ２Ｏ（１０ｅｑ．），ｒ．ｔ．，４８ｈ，（ｉｉ）３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ（５．０ｅｑ．），ｒ．ｔ．，０．５ｈ，（ｉｉｉ）５−Ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｉｄｅ（３ｅｑ．），Ａｇ２Ｏ（１．３ｅｑ．），ＭｅＣＮ，ｒ．ｔ．，ｔｈｒｅｅ  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ９６％，（ｉｖ）ＤＡＳＴ（３ｅｑ．），ＣＨ２Ｃｌ２，ｒ．ｔ．，１８ｈ，７２％，（ｖ）Ｐｄ／Ｃ（１０ｗ％），Ｈ２  ｇａｓ，ｒ．ｔ．，６ｈ，ｑｕａｎｔ，（ｖｉ）５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（３ｅｑ．），ＥＤＣ（３ｅｑ．），ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，８ｈ，７８％，（ｖｉｉ）ＮａＯＭｅ（０．１ｅｑ．），ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，０．５ｈ，ｑｕａｎｔ．【０１００】
自殺基質部位の前駆体である化合物１５はＧａｌａｃｔｏｓｅを出発物質として文献１を参考に合成した。反応性糖供与体１０と５−ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｈｙｌａｌｄｅｈｙｄｅのグリコシル化反応によって化合物１１を選択的に得、その後、ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ  ｓｕｌｆｅｒ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＤＡＳＴ）により１１のアルデヒド基のジフルオロメチル基への変換により化合物１２とした。次いで、化合物１２のニトロ基の還元により得られた１３と５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）の存在下で縮合して化合物１４を誘導し、脱アセチル化反応により目的とする下記に示す化合物１５を効率よく作成した。【０１０１】
【化４１】
2017131242.tif 000043
【０１０２】
化合物１５の構造情報：１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｈｚ，Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １．８１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−），２．０９（ｓ，３Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ３），２．３１（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ３−），２．５５（ｔ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−），３．６７（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−５，Ｈ−６），３．７４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−６），３．９０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４），４．９７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），７．０２（ｔ，１Ｈ，ＣＨＦ２），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ），７．４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ），７．５４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ４５６．１３０［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１０３】
（２）化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子の作製法
下記反応スキーム４に化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）の作製法を示す。
【化４２】
2017131242.tif 000044
【０１０４】
化合物１５を参考文献２および３に記載の方法に従って蛍光性ナノ微粒子（量子ドット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｑｄｏｔ（Ｒ）６５５）に提示した。【０１０５】
反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）の作製：ＴＯＰＯ−ＱＤｓ（１μＭ，５０μｌ／ｏｃｔａｎｅ）に対しＭｅＯＨ（５０μｌ）、ｉ−ＰｒＯＨ（１００μｌ）を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン（５０μｌ）を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー（１０ｍＭ，１０μｌ／ＭｅＯＨ）、ホスホリルコリンリンカー（１００ｍＭ，４μｌ／ＭｅＯＨ）、ＮａＢＨ４（１μｌ，１２ｗｔ％ｉｎ  １４  Ｎ  ＮａＯＨ）、およびｍｉｌｌｉ  Ｑ（５０μｌ）を加えて３０分間撹拌し配位子交換をして反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）とした。限外濾過（ＹＭ５０）により精製した後、化合物１５との反応を行った。【０１０６】
ナノ微粒子への化合物１５の提示：ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）と化合物１５（３０ｍＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）をＡｃＯＨ／ＡｃＯＮａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４，１００μｌ）に分散して３０分室温で撹拌し、限外濾過（ＹＭ５０）により精製をすることで目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりナノ微粒子表面に自殺基質部位である化合物１５が提示されていることを確認した（図４）。【０１０７】
（３）化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（１）（乳癌細胞増殖抑制効果）
細胞内イメージング：ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７，Ｐ１７，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化で４８時間インキュベートをした後に、化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子［１０ｎＭの化合物１５担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）］を添加してその後の８時間までの細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６（２００μｌ，５ｎＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２の条件下で３０分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（２μｌ，０．１ｎｇ／μｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化でさらに１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄してイメージングを行った（図５）。図５化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）培養開始後（１〜８時間）での細胞内動体（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。図５から、化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子が細胞内に取り込まれることが分かる。【０１０８】
（４）化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（２）（乳癌細胞殺傷作用）
ＭＴＴアッセイ法による死細胞の定量：ＭＣＦ−７細胞（５×１０４／１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０ｍｌの培地に対してＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １５（１μＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）を加えて終濃度が１００ｎＭ（ただしシスプラチンは１００μＭ）となるように調整した。培養開始後９６時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液に対し１０μｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で１．５時間インキュベートし４５０ｎｍでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。【０１０９】
図６に化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５）の乳癌細胞殺傷作用の結果を示す。（ａ）化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ−７細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより定量した。（ｂ）各試験薬との９６時間培養後の乳癌細胞の様子（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。リソソームと核はそれぞれ緑と青で染色、ＱＤは赤い蛍光を示している。【０１１０】
化合物１５を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５）は有意に乳癌細胞ＭＣＦ−７の生育を阻害し、培養後９６時間後に生存率２０％程度で１００ｍＭ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５の１０００倍の投与量）を遥かに凌ぐ強い抗癌作用を発現した（図６ａ）。また、形状が変化して浮遊した死細胞は１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５と１００μＭ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎを播種した実験系でのみ観察された（図６ｂ）。【０１１１】
参考文献
１．Ｍ．Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，４４７０４−４４７１２
２．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２０５７−１２５１７
３．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６【０１１２】
実施例３  シアリダーゼ阻害剤担持ナノ微粒子
（１）化合物２０の合成法
反応スキーム５
【化４３】
2017131242.tif 000045
【０１１３】
化合物２０の合成工程：（ｉ）１）ＡｃＣｌ，ｒ．ｔ．，４８ｈ，２）５−Ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｉｄｅ（１．５ｅｑ．），ＤＩＥＡ（１．５ｅｑ．），ＭｅＣＮ，ｒ．ｔ．，ｔｏｗ  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ７７％，（ｉｉ）ＤＡＳＴ（２．５ｅｑ．），ＣＨ２Ｃｌ２，ｒ．ｔ．，１５ｈ，７７％，（ｉｉｉ）１）Ｚｎ（４０ｅｑ．），ＡｃＯＨ，ｒ．ｔ．，０．５ｈ，２）５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（１．５ｅｑ．），ＥＤＣ（１．５ｅｑ．），ＨＯＢｔ（１．５ｅｑ．），ＭｅＣＮ，ｒ．ｔ．，２０ｈ，７５％，（ｉｖ）１）ＮａＯＭｅ（ｃａｔ．），ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，８ｈ，．２）ＮａＯＨ（２．０ｅｑ．），Ｈ２Ｏ，０℃，１Ｈ【０１１４】
化合物２０はＳｉａｌｉｃ  ａｃｉｄを出発物質として合成した。化合物１６をハロゲン化することで糖反応供与体とし５−ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｈｙｌａｌｄｅｈｙｄｅとのグリコシル化反応によって化合物１７を選択的に得、その後、ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ  ｓｕｌｆｅｒ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＤＡＳＴ）により１７のアルデヒド基のジフルオロメチル基への変換により化合物１８とした。次いで、化合物１８のニトロ基を還元した後５−ｏｘｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）の存在下で縮合して化合物１９を誘導し、脱アセチル化反応と脱メチル化反応により目的とする下記に示す化合物２０を効率よく作成した。【０１１５】
【化４４】
2017131242.tif 000046
化合物２０の構造情報：１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｈｚ，Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．５６（ｄ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，１Ｈ），７．２５（ｄ，１Ｈ），６．９８（ｔ，１Ｈ），３．８２−３．７１（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｄｄｄ，１Ｈ），３．５３−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｑ，６Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），２．５３（ｔ，２Ｈ），２．２９（ｔ，２Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），１．９２（ｓ，３Ｈ），１．８６−１．７７（ｍ，３Ｈ），１．１７（ｔ，８Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ５６１．１９０１［Ｍ＋Ｈ］＋【０１１６】
（２）化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子の作製法
下記反応スキーム６に、化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）の作製法を示す。
【化４５】
2017131242.tif 000047
【０１１７】
化合物２０を参考文献１および２に記載の方法に従って蛍光性ナノ微粒子（量子ドット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＱｄｏｔＲ６５５）に提示した。反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／４）の作製：ＴＯＰＯ−ＱＤｓ（１μＭ，５０μｌ／ｏｃｔａｎｅ）に対しＭｅＯＨ（５０μｌ）、ｉ−ＰｒＯＨ（１００μｌ）を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン（５０μｌ）を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー（１０ｍＭ，１０μｌ／ＭｅＯＨ）、ホスホリルコリンリンカー（１００ｍＭ，４μｌ／ＭｅＯＨ）、ＮａＢＨ４（１μｌ，１２ｗｔ％ｉｎ  １４  Ｎ  ＮａＯＨ）、およびｍｉｌｌｉ  Ｑ（５０μｌ）を加えて３０分間撹拌し配位子交換をして反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／４）とした。限外濾過（ＹＭ５０）により精製した後、化合物２０との反応を行った。【０１１８】
ナノ微粒子への化合物２０の提示：ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／４）と化合物２０（３０ｍＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）をＡｃＯＨ／ＡｃＯＮａ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４，１００μｌ）に分散して３０分室温で撹拌し、限外濾過（ＹＭ５０）により精製をすることで目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによりナノ微粒子表面に化合物２０が提示されていることを確認した（図７）。【０１１９】
（３）化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（１）（乳癌細胞増殖抑制効果）
細胞内イメージング：ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７，Ｐ１６，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化で４８時間インキュベートをした後に、化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子［１０ｎＭの化合物２０担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）］を添加してその後の８時間までの細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６（２００μｌ，５ｎＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２の条件下で３０分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（２μｌ，０．１ｎｇ／μｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化でさらに１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄してイメージングを行った（図８）。図８．化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（１０ｎＭ）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）培養開始後（１〜８時間）での細胞内動体（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ  ｓｉｚｅ＝５０μｍ）。図８から、化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子が細胞内に取り込まれることが分かる。【０１２０】
（４）化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（２）（乳癌細胞殺傷作用）
ＭＴＴアッセイ法による死細胞の定量：ＭＣＦ−７細胞（５×１０４／１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０ｍｌの培地に対してＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １５（１μＭ，１０μｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）を加えて終濃度が１００ｎＭ（ただしシスプラチンは１００μＭ）となるように調整した。培養開始後９６時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液に対し１０μｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で１．５時間インキュベートし４５０ｎｍでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。【０１２１】
図９．化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５）の乳癌細胞殺傷作用：化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子および比較に用いた各種試験薬共存下で９６時間培養後のＭＣＦ−７細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより定量した。化合物２０を提示した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ  ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ２０）による乳癌細胞ＭＣＦ−７の成長阻害に対する有意差は確認できなかった。化合物２０は、この系では、弱いながらも自殺基質活性を示した。【０１２２】
参考文献
１．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２０５７−１２５１７
２．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６【０１２３】
実施例４：リソソーム酵素阻害剤を担持したナノ微粒子の肝細胞癌に対する効果
Ａ：リソソーム酵素阻害剤を担持した蛍光性ナノ微粒子の細胞内イメージング
ヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２，Ｐ３，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００ｍｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で４８時間インキュベートをした後に、化合物７、１５、および２０を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子溶液［１０ｎＭの阻害剤担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／２）、既報（Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２０５７−１２５１７）に従い調製した。］をそれぞれ添加して、共培養後８時間までの癌細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡によりイメージングした。以下にそのプロトコルの概要を示す。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６（２００ｍｌ、５ｎＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（２ｍｌ，０．１ｎｇ／ｍｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化でさらに１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄して蛍光顕微鏡によりそれぞれを観察・イメージングした（図１０）。【０１２４】
図１０Ａ−Ｃに示すとおり、いずれの場合もリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子（赤色）は癌細胞と共培養開始後１時間で既にリソソームから一部が脱出している。８時間後にはほぼ大部分がリソソームには局在せず、細胞質内を自由に移動しているように見える。阻害剤を担持していないリン脂質被覆ナノ微粒子は癌細胞の種類を問わず細胞質内を移動すること無く、リソソーム内に局在し続ける（Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６）ことが既に報告されている。化合物７、１５、および２０はそれぞれヘキソサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびシアリダーゼの非可逆的阻害剤であり、阻害反応に際して標的酵素の活性中心周辺でのコンホメーション変化を誘起することが予想される。一方、リソソームに分布するこれらの糖分解酵素はいずれもリソソーム膜の安定化に強く寄与していると考えられ、これらの酵素に対する阻害反応によりリソソーム膜の構造や物性に著しい変化（膜の損傷）が生じた結果、ナノ微粒子が細胞質内へ漏出したものと思われる。【０１２５】
Ｂ：リソソーム酵素阻害剤を担持した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（肝細胞癌殺傷作用）
ＨｅｐＧ２細胞（５×１０４／１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０ｍｌの培地に対して化合物７、１５、および２０（ｍｉｌｌｉＱに溶解して１ｍＭとした溶液の１０ｍｌ）を加えて終濃度が１００ｎＭとなるように調整した。共培養開始後９６時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液に対し１０ｍｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１．５時間インキュベートし４５０ｎｍでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。対照薬として１００ｎＭ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ溶液（５−ＦＵ）を用いた（図１１）。【０１２６】
図１１Ａ−Ｃに示すとおり、化合物７と１５を担持した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ）は有意に肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２の生育を阻害しており、共培養後９６時間の生細胞はそれぞれ１５％および３０％程度であった。いずれの実験においても対照薬として用いた５−ＦＵ（１００ｎＭ）には有意な抗腫瘍活性は観察されていないため、化合物７と１５を担持した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ）は５−ＦＵ（１００ｎＭ）を遥かに凌ぐ強力な抗癌作用を発揮したと判断できる（図１１ＡおよびＢ）。【０１２７】
一方、化合物２０を担持した蛍光性ナノ微粒子（１００ｎＭ）は同様の条件では上記２薬剤に比してかなり弱い抗腫瘍効果を発揮するに留まっていた。これは１）リソソーム内のシアリダーゼ発現量がガラクトシダーゼやヘキソサミニダーゼに比してかなり低いため、２）α−シアロシド結合が他のグリコシド結合より酸性条件下で不安定であるためリソソーム内である程度加水分解される可能性が高いため、また、３）シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）は本来ヘキソサミン合成経路で鍵となるＧｌｃＮＡｃから誘導されるＭａｎＮＡｃを中間体として（経由して）アルドール反応により合成されることからシアリダーゼによるシアル酸の再生はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの供給経路としての貢献度が必ずしも高くないことにも起因すると考えられる。
Ｃ：リソソーム酵素阻害剤７および１５を担持した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（ＩＣ５０の決定）【０１２８】
上記の実験結果（図１１）をうけて、比較対照薬５−ＦＵに比して有意な癌細胞成長阻害活性の確認できた阻害剤７および１５を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果についての投与量依存性を評価してＩＣ５０値を決定することとした。ＨｅｐＧ２細胞（５×１０４／１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０ｍｌの培地に対してＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７あるいはＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  １５（１−０．０５ｍＭ，１０ｍｌ／ｍｉｌｌｉＱ），ＱＤ  ｃｏｎｔｒｏｌ（１−０．０５ｍＭ，１０ｍｌ／ｍｉｌｌｉＱ），５−ＦＵ（１−０．０１ｍＭ，１０ｍｌ／ｍｉｌｌｉＱ）をそれぞれ加えて終濃度が１００、５０，２５、１０、および５ｎＭとなるように調整した。共培養開始後９６時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液に対し１０ｍｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で１．５時間インキュベートしたのちに上清の吸光度（４５０ｎｍ）を測定することで癌細胞の生存率を定量した。【０１２９】
図１２Ａ−Ｄに示すとおり、化合物７と１５を担持した蛍光性ナノ微粒子（ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７  ａｎｄ  １５）はいずれも濃度依存的に肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２の生育を阻害し、共培養から９６時間後において比較対照薬とした５−ＦＵ（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）を遥かに凌ぐ強い抗腫瘍作用を発現した（ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ７：ＩＣ５０＝１０．７ｎＭ、ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ１５：ＩＣ５０＝５９．３ｎＭ）。本来、化合物７、１５および２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける各グルコシダーゼに対するＩＣ５０はいずれもｍＭオーダーであることから（参考文献１〜３）、図１２に示した結果は「ナノ微粒子に担持したことによる低分子非可逆的阻害剤のリソソーム内への特異的（局所的）濃縮効果」が極めて有効であることを証明している。【０１３０】
参考文献
化合物（非可逆的反応機構による糖分解酵素阻害剤）の合成法に関連する文献
１．Ｍ．Ｉｃｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００１，１１，１７６９−１７７３．
２．Ｍ．Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９，４４７０４−４４７１２．
３．Ｈ．Ｈｉｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５，４４，１１６６９−１１６７５．
リン脂質単分子膜被覆量子ドット（生体膜模倣蛍光性ナノ微粒子）の作製法と性質に関連する文献
４．Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２０５７−１２５１７．
５．Ｒ．Ｓ．Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，２０７３−２０８６．【０１３１】
実施例５：キナーゼ阻害剤（新規ソラフェニブ誘導体）を担持したリン脂質単分子膜被覆蛍光性ナノ微粒子の合成および肝細胞癌ＨｅｐＧ２に対する抗腫瘍効果
Ａ：新規ソラフェニブ誘導体（３２）の合成
肝細胞癌および腎細胞癌の治療薬であるソラフェニブは疎水性構造が原因で癌患者の血液中ではそのほとんどが血清アルブミンやａ１−酸性タンパク質と非特異的に吸着するため、癌組織（癌細胞）への取り込み効率が著しく低いことが明らかとなっている。このため標的キナーゼ群を発現する培養癌細胞による実験で見られたようなＩＣ５０＝４．５ｍＭレベルの有意な抗腫瘍活性が、実際には疾患モデル動物や患者に対するｉｎ  ｖｉｖｏの実験系においては充分発揮できていない可能性が高いことが最近指摘されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｈｏｕｇｔｏｎ，Ｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３，１９，２８２８−２８３３）。【０１３２】
ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）の活性構造による優れたキナーゼ阻害剤としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの基本性能（例えばリコンビナントＲａｆ−１、ＢＲＡＦおよびＶＥＧＦＲ２に対するＫｉ（ＩＣ５０）＝６．０，２２．０，および９０ｎＭ、Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，６４，７０９９−７１０９）を失うこと無くリン脂質被覆ナノ微粒子に固定化できれば、本薬剤の難溶性を大幅に向上すると同時に、癌細胞の活発なエンドサイトシスによる細胞質内への効果的な取り込みを実現できる可能性が高い。ソラフェニブとキナーゼ（ＶＥＧＦＲ２）の共結晶の３次元構造情報（Ｋａｎｉａ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１２，１０９，１８２８１−１８２８９）によるとソラフェニブのピリジン環の２−メチルカルバモイル基はＶＥＧＦＲ２の活性サイト中心部から一部が露出して比較的自由度が大きい状態で結合していることが判明している。この結果より、Ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ領域での化学修飾は本来のキナーゼ阻害活性には影響しないと判断し、この位置でのソラフェニブの反応性リンカーでの化学修飾による化合物３２の合成を計画した（下記合成スキーム参照）。化合物３２はリン脂質単分子膜被覆ナノ微粒子への担持が可能な新規ソラフェニブ誘導体である。【０１３３】
【化４６】
2017131242.tif 000048
【０１３４】
【化４７】
2017131242.tif 000049
【０１３５】
化合物３２のソラフェニブ基本構造３０は既報（Ｈａｍｍｏｃｋ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１３，２３，３７３２−３７３７）を参考にして、Ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ２５のメタ位のクロロ化後、カルボン酸の保護により化合物２６を、さらに４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌとの縮合反応により化合物２７として、ｂｉｓ（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ２８の存在下、化合物２９との縮合により調製した。一方、ソラフェニブのＰｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ領域での修飾を目的として、購入可能な出発物質２１から誘導した機能性リンカー前駆体２４を合成した。前述のソラフェニブ誘導体３０と化合物２４を１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ・ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢＯＰ）の存在下で縮合して化合物３１を誘導し、最終的にイソプロピリデンケタール基を脱保護することで目的とする化合物３２を効率良く合成した。【０１３６】
化合物３２の構造情報：１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｈｚ，ＤＭＳＯ）ｄ  ｐｐｍ  ９．２２（ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｔ，１Ｈ），８．５１（ｄ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，２Ｈ），７．５９（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄ，２Ｈ），３．２４（ｔ，２Ｈ），２．４３（ｔ，２Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ  ５７１．０４０６［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１３７】
Ｂ：新規ソラフェニブ誘導体（３２）を担持するリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子の合成
既報（Ｔ．Ｏｈｙａｎａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１２０５７−１２５１７）に従い、ＴＯＰＯ−ＱＤｓ（１ｍＭ，５０ｍｌ／ｏｃｔａｎｅ）に対しＭｅＯＨ（５０ｍｌ）、ｉ−ＰｒＯＨ（１００ｍｌ）を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン（５０ｍｌ）を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー（１０ｍＭ，５ｍｌ／ＭｅＯＨ）、ホスホリルコリンリンカー（１００ｍＭ，８ｍｌ／ＭｅＯＨ）、ＮａＢＨ４（１ｍｌ，１２ｗｔ  ％  ｉｎ  １４  Ｎ  ＮａＯＨ）、およびｍｉｌｌｉ  Ｑ（５０ｍｌ）を加えて３０分間撹拌し配位子交換をして反応性ナノ微粒子前駆体ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／１６）とした。限外濾過（ＹＭ５０）により精製した後、化合物３２とのカップリングに供した（下記スキーム参照）。図１３のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに示すとおり、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基の化合物３２との置換反応が確認できた。【０１３８】
化合物３２を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子の作製法
【化４８】
2017131242.tif 000050
【０１３９】
Ｃ：ソラフェニブ誘導体３２を担持した蛍光性ナノ微粒子の癌細胞内イメージング
ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２，Ｐ８，ＡＴＣＣより入手）を５０００ｃｅｌｌ／２００ｍｌ／ｗｅｌｌで播種し、Ｄ−ＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）中、３７℃，５％ＣＯ２雰囲気化で４８時間インキュベートをした後に、１０ｎＭ蛍光性ナノ微粒子［化合物３２担持型ＡＯ／ＰＣ  ＳＡＭ−ＱＤｓ（ＡＯ／ＰＣ＝１／１６）］を添加、共培養してその後の２４時間までの癌細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄後Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６（２００ｍｌ，５ｎＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（２ｍｌ，０．１ｎｇ／ｍｌ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でさらに１５分間インキュベートして核を染色した後にＯｐｔｉ−ＭＥＭで３回洗浄してイメージングを行った（図１４）。【０１４０】
図１４−ＡおよびＢ（拡大図）から明らかなように、ソラフェニブ誘導体３２を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子（赤色）はＨｅｐＧ２細胞との共培養開始から２４時間後においてもリソソーム内に留まっていることが示された。この結果はソラフェニブが標的とするキナーゼ群はリソソーム内には分布せず、癌細胞質内に非局在化していることが予想されるため、エンドリソソームから活性本体（ソラフェニブ誘導体）がナノ微粒子にリンカーによって固定化された状態で留まっているとすれば抗癌剤としてのソラフェニブの効果の向上は期待できないことを示唆している。しかし、ソラフェニブとナノ微粒子を連結するリンカー部に位置するオキシム結合はリソソーム内の酸性環境下（ｐＨ４〜５）では比較的容易に加水分解されることも予想されるため、本薬剤のＨｅｐＧ２細胞に対する生育阻害効果（抗腫瘍活性）を低分子ソラフェニブ誘導体３２と比較して評価することとした。【０１４１】
２−Ｄ：ソラフェニブ誘導体３２を担持した蛍光性ナノ微粒子の抗腫瘍効果（肝細胞癌殺傷作用）
Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙによる死細胞の定量：ＨｅｐＧ２細胞（５×１０４／１００ｍｌ／ｗｅｌｌ）を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で２４時間インキュベートした後にそれぞれ９０ｍｌの培地に対してＱＤ（１０００〜１０ｎＭ，１０ｍｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）、ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ３２（１０００〜１０ｎＭ，１０ｍｌ／ｍｉｌｌｉ  Ｑ）、およびソラフェニブ誘導体３２（１０×１０７〜１０ｎＭ，１０ｍｌ／ＤＭＳＯ）を加えて終濃度が１００〜１ｎＭ（ただし、化合物３２はＩＣ５０値がｍＭレベルであることが推察されたので１×１０６〜１ｎＭ）となるように調整した。共培養開始後４８時間で培地成分により３回洗浄を行い、細胞培養液に対し１０ｍｌのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気化で１．５時間インキュベートし４５０ｎｍでの吸光度を測定することで癌細胞の生存率を定量した（図１５）。【０１４２】
驚くべきことに、ソラフェニブ誘導体３２を担持したリン脂質被覆ナノ微粒子（ＱＤ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ３２）は図１５に示す通り、強力に肝癌細胞ＨｅｐＧ２の生育を阻害することが判明した（ＩＣ５０＝３３．５ｎＭ）。一方、ナノ微粒子に担持していない低分子化合物３２のみを癌細胞と共に培養した場合の抗腫瘍活性（ＩＣ５０＝２．１ｍＭ）はソラフェニブのＨｅｐＧ２細胞に対する抗腫瘍効果（ＩＣ５０＝４．５ｍＭ、Ｌｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６，１１８５１−１１８５８）とほぼ一致している。この実験結果はリン脂質被覆ナノ微粒子に担持することでソラフェニブの抗腫瘍活性は１００倍以上増強できる（換言すると、患者への投与量を１／１００程度に抑えることが可能である）ことを証明している。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明は、抗ガン剤に関連する分野において有用である。
【図１】
2017131242.tif 000065
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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