(57)【要約】  補酵素の添加なしに２級アルコールの一方の鏡像体のみを不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）とその固定化体、その製造方法、及び該蛋白質複合体の高分子化合物コーティングに関わる製造方法を提供する。  植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括する処理、該ゲルを空気酸化する処理、該ゲルからＨａｓＡ−レドキシン複合体を水溶液中に溶出させる処理を有する第１の工程と、前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体水溶液に重力を掛けてＨａｓＡ−レドキシン複合体を濃縮沈殿させる処理、該ＨａｓＡ−レドキシン複合体沈殿物を水溶液中にて再溶解し高分子化合物と均一に共存させる処理、該共存水溶液を脱水乾燥させて高分子化合物コーティング−ＨａｓＡ−レドキシン複合体を得る第２の工程、及び、蛍光菌ＨａｓＡを含む形質転換体（微生物）を用いて、ＨａｓＡ発現後、酸素含有の水溶液中にて撹拌・空気酸化させることにより、ＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）とすることを特徴とする、不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）とその固定化体の製造方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても過酸化水素との反応性を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体を、植物から製造する方法であって；以下の工程を含むことを特徴とする製造方法。
植物由来の組織をアルギン酸カルシウムゲルにて包括後、空気酸化させる第１の工程と；
該第１の工程で酸化された酸化生成物を遠心沈殿させる第２の工程。
【請求項２】
前記第２の工程における遠心沈殿処理後、沈殿物を乾燥してＨａｓＡ−レドキシン複合体を得るか、上清みを更に遠心濾過（分子量１０ｋＤａ；例えば、Vivaspin ２-１０ K）した後、高純度な乾燥−ＨａｓＡ−レドキシン複合体−乾燥品を得る請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第１の工程が、以下の（ａ１）〜（ａ３）の処理を含む、請求項１または請求項２に記載の製造方法。
（ａ１）植物組織由来粉砕物（葉、茎、根）を直にゲルに包括する包括化処理、
（ａ２）該ゲルを空気酸化させる処理、
（ａ３）該酸化処理後のゲルからＨａｓＡ−レドキシン複合体を溶出させる処理。
【請求項４】
前記第２の工程における遠心沈殿処理が重力を伴う沈殿処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｂ１）〜（ｂ３）の処理を含む、請求項２に記載の製造方法。
（ｂ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を、遠心上清画分の再遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）を通じて、高純度のＨａｓＡ−レドキシン複合体を乾燥回収させる処理、
（ｂ２）沈殿させた蛋白質複合体を５０ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０）緩衝液中に再溶解後、遠心沈殿させて沈殿回収させる処理、
（ｂ３）該５０ｍＭグリシンＮａＯＨ のｐＨがｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０である処理。
【請求項５】
前記第２の工程における沈殿回収処理が膜ろ過であって；且つ該第２の工程が以下の（ｃ１）〜（ｃ３）の処理を含む、請求項２に記載の製造方法。
（ｃ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、ＨａｓＡ−レドキシン複合体をガラスビーズや膜処理を用い固形部を分離回収させる処理、
（ｃ２）分離回収生成物を更に５０ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０）緩衝液中に再溶解して、ガラスビーズや膜処理を用い固形部を分離回収させる処理、
（ｃ３）分離回収生成物を脱水乾燥する処理の工程。
【請求項６】
前記第２の工程で得られた遠心沈殿のＨａｓＡ−レドキシン複合体を紛体化処理する請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体の製造方法。
【請求項７】
植物由来のＨａｓＡ−レドキシン複合体であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有することを特徴とするＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項８】
不斉酸化活性及び／又はカタラーゼ活性を有する細胞小器官に起因する機能を有する請求項７に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項９】
前記レドキシンが膜蛋白質及び／又はその近傍に存在し、ＩＲＰ、ＩＲＥ，ＩＲＲの何れか１つ以上の鉄イオウクラスタと複合体を形成した請求項８に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１０】
前記レドキシンが蛍光菌、緑膿菌、結核菌、マラリア菌由来ＨａｓＡと複合体を形成でき、且つ、カタラーゼ活性が局在する膜蛋白質に由来するものである請求項８に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１１】
前記レドキシンが膜蛋白質及び／又はその近傍に存在し、ＨａｓＡにフェレドキシン、アドレノドキシン、ルブレドキシンの何れか１つ以上の鉄イオウクラスタと複合体を形成した請求項８に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１２】
そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１領域に少なくとも、鉄−硫黄酸化物（Ｓ−ＯとＦｅ−Ｏ）のバイブレーションピークを有する請求項７〜請求項１１のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１３】
該領域がレドキシン内アミノ酸システインの空気酸化により生じる鉄−硫黄酸化物（Ｓ−Ｏ又はＦｅ−Ｏ）由来のピークである請求項１２記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１４】
そのＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列として、以下の配列：
ＭＳＸaＳＩＳＹＳＴＸb  ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬＸa  ＤＷＸbＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ（ＸaはおそらくＣｙｓ、Ｘbは不明）を含む成分であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有する成分を含む請求項７〜請求項１３のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１５】
前記配列より支持されるＨａｓＡ−レドキシン複合体が、ヘム捕獲タンパク質（ＨａｓＡ）とフェレドキシン、アドレノドキシン、ルブレドキシンよりなる複合体に由来する請求項１３に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１６】
前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物発現されたＨａｓＡに由来する請求項１５に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１７】
前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ−レドキシン複合体生成の期間（２〜３日）を要する請求項１６に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１８】
前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、高分子化合物コーティングされている請求項７〜請求項１７のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項１９】
前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、架橋化処理されている請求項７〜請求項１７のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項２０】
基質たるラセミ体アルコールに、請求項７〜請求項１９のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体を作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２１】
前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、請求項２０に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２２】
請求項１０に記載の沈殿されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における溶媒として水を用いる請求項２１に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の架橋化処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における溶媒としてグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる請求項２０に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載のＰＥＧ処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における水溶媒系の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも、該蛋白質複合体が触媒活性を損なわない、請求項２０に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の架橋化処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる請求項１２に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２６】
キャップフリー、ナノ酸素バブル水、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う請求項２０に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２７】
反応系におけるＨａｓＡ−レドキシン複合体の活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である請求項２０に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２８】
前記過酸化水素との反応性が、前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体（粒径５０μｍ）の１５ｍｇを直径１８ｍｍφの試験管に入れ、これに５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際に、酸素の発生に基づき、肉眼で視認可能な泡を生ずるレベルの反応性である請求項７に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項２９】
前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する請求項７に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３０】
前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である請求項７に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３１】
前記第２の工程における遠心沈殿処理後の高分子化合物（ＰＥＧ）コーティング処理にて、溶媒重量の１％〜２％の有機溶媒（トルエン、アセトニトリル、グルタルアルデヒド等）を用いる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記過酸化水素との反応性が、デジタル式過酸化水素濃度計による測定において、基質２ｍＭ−過酸化水素（１ｍL）中５分間の反応において、１μＭ−Ｈ２Ｏ２ａｑ．を分解できる量が２００μｇ以下である請求項７に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３３】
固定化用の担体と、該担体に固定化されたＨａｓＡ−レドキシン複合体とを含む固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３４】
前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体である請求項３３に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３５】
前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである請求項３３または３４のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３６】
前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体の多孔質担体への固定化が、吸着によるものである請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【請求項３７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【請求項３８】
前記固定化したＨａｓＡ−レドキシン複合体を第１回目の反応に供し、その後該複合体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ−２級アルコールのそれぞれの鏡像体を立体選択的に酸化できる不斉酸化反応を触媒することができ、及び／又は、非選択的酸化を触媒することができるＨａｓＡ−レドキシン複合体（「ヘム鉄活性型ＨａｓＡ」と称する場合がある）、その固定化体、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬、食品分野を始めとする種々の分野において、光学異性体を分離し、有用な一方の光学異性体を分取する技術の必要性が高まっている。例えば、光学異性体の一方を選択的に酸化還元又はデラセミ化する機能を有する不斉水素化（還元）酵素を用いて、医薬品や香料を生成させる方法について研究されている。【０００３】
このような酵素の作用・機構を有用物質生産や分析に利用するシステムがバイオリアクターであるが、リアクター中に留まる反応素子は金属イオンを活性中心にもつ酵素、即ち、金属酵素の有する電子伝達・移動に元づく機能として理解されてきた。【０００４】
ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群は、有機合成反応への利用が期待され、特に、シトクロムＰ４５０は、不活性な有機基質を水酸化できたり（非特許文献１を参照）、スチレン分子のエポキシ化できたり（非特許文献２を参照）、脱メチル化（非特許文献３を参照）できることが報告されている。【０００５】
鉄は、酸素をはじめとした気体と親和性を有し、中性ｐＨの還元環境下において容易に電子を授受できる。したがって、鉄は鉄イオンや鉄補欠分子族（鉄−硫黄クラスタ−やヘム）の形でタンパク質と結合し、酸素運搬、エネルギー産生、核酸合成をはじめとする種々の酸化還元反応の活性中心として利用されている。【０００６】
ヘムタンパク質の機能としては、ヘモグロビンによる酸素運搬（酸素分子の結合）やシトクロムｃによる電子伝達（酸化還元中心）が良く知られている。その働きの中で、コレラ菌由来タンパク質HutZに、１）ヘモグロビンから「ヘム」を菌体内に取込む機能、及び２）酸素を使ってヘム分解できる機能などが知られている（非特許文献４を参照）。【０００７】
「ヘム」をヘモグロビンから奪って菌体内に取込むタンパク質としては他に、病原性細菌（緑膿菌や結核菌）由来ヘモフォア（HasA；Heme Acquisition System A）がある（非特許文献５を参照）。酸化触媒活性のないヘムタンパク質HasAに、不斉酸化反応を付与する為にはＨａｓＡ−レドキシン複合体となる必要があり、鉄−硫黄クラスタ−であるレドキシンが活性中心となることでFenton反応は生じえる。【０００８】
鉄及び鉄補欠分子族の代謝調節に関しては、鉄代謝制御タンパク質（IRP: Iron Regulatory Protein）が、細胞内鉄イオン濃度が低い場合のみ、鉄応答性エレメント（IRE：Iron Responsive Element）と結合し、細胞内遊離鉄イオン濃度を高めるように作用することが知られている（非特許文献６を参照）。【０００９】
一方、鉄−硫黄クラスタ（鉄と硫黄によって構成される構造体で４Fe-４S、２Fe-２S型がある）は、ミトコンドリアのＩＳＣ（Iron-Sulfur Cluster assembly）machineryによって形成され、細胞質のcytoplasmic iron-sulfur cluster assembly (CIA) machineryによって運ばれてＩＲＰに挿入される。この鉄−硫黄クラスタのIRPへの脱着こそ、細胞内の鉄濃度変化を感知して鉄代謝を制御するメカニズムとの報告がある（非特許文献７を参照）。【００１０】
更に、ヘム生合成の抑制的な転写調節因子（IRR:  Iron Responsive Regulator）は、細胞内の鉄濃度のシグナル伝達分子としてヘムと結合し、そのヘムに分子状酸素が結合することによって活性酸素種が産生され、さらに、タンパク質の酸化修飾の進行を促し、転写抑制を解消させる仕組みも報告されている（非特許文献８を参照）。【００１１】
生物界に広範に存在するシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）は、薬物代謝や解毒、ホルモンの生合成などに関連した不活性な有機基質を水酸化する強力なヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群で、その有機合成反応への利用が期待されている。細菌由来Ｐ４５０は、動植物由来Ｐ４５０より比活性は高く、基質への基質特異性は高い。しかしながら、広範囲な基質酸化には対応できないデメリットがある。【００１２】
例えば、枯草菌由来Ｐ４５０BSβは過酸化水素を用いて長鎖脂肪酸を水素化することが知られており、シュードモナスプチダ由来のカンファー水酸化酵素のＰ４５０ｃａｍや巨大菌由来Ｐ４５０ＢＭ−３は非常に高い活性を示すことから、広く研究対象とされている（非特許文献１を参照）。また、Ｐ４５０は、他の基質の酸化反応にはまったく適用できないというデメリットも有している。【００１３】
【化１】
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【００１４】
また、Ｐ４５０反応として、例えば、枯草菌由来Ｐ４５０BSβによる、スチレンのエポキシ化反応がある（非特許文献２を参照）。【００１５】
【化２】
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【００１６】
更に、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、内在性の生理活性物質であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を基質とする。ＥＥＴ  は膜リン脂質から切り出されたアラキドン酸がシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）によってエポキシ化された脂肪酸である。即ち、P４５０はEET の合成酵素である。例えば、次のような脱メチル化反応を触媒することが知られている（非特許文献３を参照）。【００１７】
【化３】
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【００１８】
【化４】
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このように、ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群であるＰ４５０は、活性酸素種による鉄電子移動系の基質酸化として良く知られている一方で、２級アルコールの不斉脱水素酵素に関わるＰ４５０の報告は未だに確認されていない。【００１９】
今回、Ｐ４５０反応では導き得ない、２級アルコールの不斉酸化反応を触媒するＨａｓＡ−レドキシン複合体の存在を確認した。ＨａｓＡも鉄ポルフィリン錯体ではあるが、システイン配位ヘム構造を有して無い為に、一般的には、Ｐ４５０様の酸化活性は持ちえない。しかしながら、レドキシン（鉄イオウクラスタ）はフェントン反応に代表される（非特許文献９を参照）、活性酸素種による鉄電子移動系は認められているため、ＨａｓＡ−レドキシン複合体の不斉酸化触媒は認められえる。従って、持続可能社会の構築に配慮した新しい酵素として、触媒生産のコスト削減と引き続く創薬プロセス削減に期待できる。【００２０】
大腸菌発現系によるタンパク質発現は、ＨａｓＡに関しては、比較的に平易な技術である。生産プロセスとして１）蛍光菌ＨａｓＡ由来の遺伝子情報から人口遺伝子合成、２）プラスミド構築、３）小スケール大腸菌発現試験を実施後に発現条件の至適化（宿主、誘導・培養条件など）、４）スケールアップ発現、５）ヒスタグ精製によって生産可能である。例えば、和光純薬工業（株）における委託合成も、対応可能となっている。【００２１】
遺伝子のタンパク質の発現は、培養細胞・大腸菌・酵母菌・こうじ菌・Bacillus属菌などを用いて行うことができる。大腸菌を用いた発現技術の研究は、歴史が古く（１９７０年初頭）、種々の関連技術の開発が進んでいるため、さまざまな種類のタンパク質の発現に応用されている。汎用的ではあるが分泌による発現ができないため、菌体内部で発現したタンパク質は菌体内に蓄積されてしまい、生産量には限界があるといったデメリットもある。【００２２】
こうじ菌・Bacillus属菌などの分泌型の微生物は、菌体内で発現させた目的のタンパク質を次々と菌体外に分泌するため、発現量が多いという特長を有し、この特長を生かして洗剤用酵素などのタンパク質の発現技術として利用されている。【００２３】
しかしながら、分泌型の微生物は、多種のタンパク質を分泌するため、目的とするタンパク質を取り出すための精製が煩雑である。また、これら分泌型の微生物は、菌体外に存在するタンパク質を積極的に分解して利用するという性質をもっている。そのため、この発現方法に適応できるタンパク質は、分解されにくいタンパク質に限定されていた。すなわち、幅広い種類のタンパク質が発現できる汎用性をもちながら、分泌発現量も多い技術はこれまで存在していない。【００２４】
一方、エンドウ豆生産において、蛍光菌を散布する技術があり、成長促進や除草効果の目的を果たしている（非特許文献１０を参照）。蛍光菌（根粒菌の一種）は宿主に侵入して共生生物となり、光合成で作かれた宿主由来の化合物を二次代謝して除草剤などをつくる。従って、エンドウ豆内の蛍光菌は、生存に必須の鉄を獲得する意味で細胞内にＨａｓＡを生産できる可能性がある。【００２５】
従って、不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体発現は、微生物発現系による生産と、エンドウ豆抽出法の２通りがあり得る。微生物発現ＨａｓＡの場合、１）遺伝子発現後に酸素存在下にてＨａｓＡ−レドキシン複合体を形成させる２つの工程と、２）アルギン酸カルシウムゲルに包括したエンドウ豆タンパク質を空気酸化後、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を抽出・精製するエンドウ豆抽出法に関する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】特許第３２９４８６０号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ２０１０／１３４６４２号公報
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】“J. Am. Chem. Soc. １２０,（１９９８）１１０４４-１１０４８”（R Hydroxylation of Carboxylic Acids with Molecular Oxygen Catalyzed by the R Oxidase of Peas (Pisum satiVum): A Novel Biocatalytic Synthesis of Enantiomerically Pure (R)-２-Hydroxy Acids）「Waldemar Adamら」
【非特許文献２】“Tetrahedron ６０,(２００４) ５２５-５２８”（Alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P４５０ BM-３１３９-３）「Edgardo T. Farinasら」
【非特許文献３】“Chem. Res. Toxicol. ９ (１９９６) ３６５-３７３”（Involvement of Cytochrome P４５０ ３A４ Enzyme in the N-Demethylation of Methadone in Human Liver Microsomes）「Christelle Iribarneら」
【００２８】
【非特許文献４】“Chem. Commun. ４８,（２０１２）６７４１-６７４３”（A heme degradation enzyme, HutZ, from Vibrio cholerae）「Takeshi Uchidaら」
【非特許文献５】“J. Inorg. Biochem. １３８, (２０１４)３１-３８”（Spectroscopic studies on HasA from Yersinia pseudotuberculosis）「S. Ozakiら」
【非特許文献６】“Chem.Lett., ４３, (２０１４) １６８０-１６８９” （Unique Heme Environmental Structures in Heme-regulated Proteins Using Heme as the Signaling Molecule）「K. Ishimoriら」
【００２９】
【非特許文献７】“Annual Review of Biochemistry  ７４（２００５）２４７-２８１”（STRUCTURE, FUNCTION, AND FORMATION OF BIOLOGICAL IRON-SULFUR CLUSTERS）「Deborah C. Johnsonら」
【非特許文献８】“Biochemistry, ５０ (２０１１), １０１６-１０２２”（Unusual Heme Binding in the Bacterial Iron Response Regulator Protein: Spectral Characterization of Heme Binding to the Heme Regulatory Motif）「Haruto Ishikawaら」
【非特許文献９】“Inorg. Chem. ５３ (２０１４), ６４７３-６４８１”（Electronic Structure and Formation of Simple Ferryloxo Complexes: Mechanism of the Fenton Reaction）「Alban S. Petitら」
【００３０】
【非特許文献１０】“Nat. Biotechnol. ２３（２００５）、８７３−８７８”（Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-５）「Paulsen, I. T.ら」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的の一つは、ラセミ−２級アルコールのそれぞれの鏡像体を立体選択的に酸化できる不斉酸化反応を触媒することができ、及び／又は、非選択的酸化を触媒することができるＨａｓＡ−レドキシン複合体を提供することにある。【００３２】
本発明は、ＨａｓＡ（鉄ポルフィリン錯体）−レドキシン複合体が、２級アルコール基質の不斉酸化反応を触媒できることの発見に基づく。即ち、本発明は、システイン配位ヘム構造をもたないＨａｓＡがレドキシンと連結することにより、酸素存在下、活性酸素種―鉄電子移動系を与えることができ、基質２級アルコールの一方の鏡像体を立体選択的に不斉酸化を可能とすることの発見に基づく。【００３３】
【化５】
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【００３４】
本発明の他の目的は、更に、創薬プロセスの環境的側面および安全性およびコスト性に優れたＨａｓＡ−レドキシン複合体、及びその好適な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明者は、鋭意研究の結果、ラセミ−２級アルコールのR-アルコール不斉酸化を触媒してS-アルコールを回収可能なＨａｓＡ−レドキシン複合体、及びその製造方法について新たに発見した。該ＨａｓＡ−レドキシン複合体は、エンドウ豆タンパク質をアルギン酸カルシウムゲルに包括して空気酸化後、温水中に溶出させ、遠心濾過器などで精製するか、又は、蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子を微生物発現させることで得ることができる。【００３６】
本発明は、例えば、以下の様態を含むことができる。【００３７】
［１］  ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても過酸化水素との反応性を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体を、植物から製造する方法であって；以下の工程を含むことを特徴とする製造方法。
植物由来の組織をアルギン酸カルシウムゲルにて包括後、空気酸化させる第１の工程と；
該第１の工程で酸化された酸化生成物を遠心沈殿させる第２の工程。【００３８】
［２］  前記第２の工程における遠心沈殿処理後、沈殿物を乾燥してＨａｓＡ−レドキシン複合体を得るか、上清みを更に遠心濾過（分子量１０ｋＤａ；例えば、Vivaspin ２-１０ K）した後、高純度な乾燥−ＨａｓＡ−レドキシン複合体−乾燥品を得る［１］に記載の製造方法。【００３９】
［３］前記第１の工程が、以下の（ａ１）〜（ａ３）の処理を含む、［１］または［２］に記載の製造方法。
（ａ１）植物組織由来粉砕物（葉、茎、根）を直にゲルに包括する包括化処理、
（ａ２）該ゲルを空気酸化させる処理、
（ａ３）該酸化処理後のゲルからＨａｓＡ−レドキシン複合体を溶出させる処理。【００４０】
［４］前記第２の工程における遠心沈殿処理が重力を伴う沈殿処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｂ１）〜（ｂ３）の処理を含む、［２］に記載の製造方法。
（ｂ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を、遠心上清画分の再遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）を通じて、高純度のＨａｓＡ−レドキシン複合体を乾燥回収させる処理、
（ｂ２）沈殿させた蛋白質複合体を５０ｍMグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０）緩衝液中に再溶解後、遠心沈殿させて沈殿回収させる処理、
（ｂ３）該５０ｍＭグリシンＮａＯＨ  のｐＨがｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０である処理。【００４１】
［５］前記第２の工程における沈殿回収処理が膜ろ過であって；且つ該第２の工程が以下の（ｃ１）〜（ｃ３）の処理を含む、［２］に記載の製造方法。
（ｃ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、ＨａｓＡ−レドキシン複合体をガラスビーズや膜処理を用い固形部を分離回収させる処理、
（ｃ２）分離回収生成物を更に５０ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０）緩衝液中に再溶解して、ガラスビーズや膜処理を用い固形部を分離回収させる処理、
（ｃ３）分離回収生成物を脱水乾燥する処理の工程。【００４２】
［６］前記第２の工程で得られた遠心沈殿のＨａｓＡ−レドキシン複合体を紛体化処理する［１］〜［４］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体の製造方法。【００４３】
［７］植物由来のＨａｓＡ−レドキシン複合体であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有することを特徴とする蛋白質複合体。【００４４】
［８］  不斉酸化活性及び／又はカタラーゼ活性を有する細胞小器官に起因する機能を有する［７］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００４５】
［９］  前記レドキシンが膜蛋白質及び／又はその近傍に存在し、ＩＲＰ、ＩＲＥ，ＩＲＲの何れか１つ以上の鉄イオウクラスタと複合体を形成した［８］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００４６】
［１０］  前記レドキシンが蛍光菌、緑膿菌、結核菌、マラリア菌由来ＨａｓＡと複合体を形成でき、且つ、カタラーゼ活性が局在する膜蛋白質に由来するものである［８］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００４７】
［１１］前記レドキシンが膜蛋白質及び／又はその近傍に存在し、ＨａｓＡにフェレドキシン、アドレノドキシン、ルブレドキシンの何れか１つ以上の鉄イオウクラスタと複合体を形成した［８］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００４８】
［１２］そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１領域に少なくとも、鉄−硫黄酸化物（Ｓ−ＯとＦｅ−Ｏ）のバイブレーションピークを有する［７］〜［１１］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００４９】
［１３］  該領域がレドキシン内アミノ酸システインの空気酸化により生じる鉄−硫黄酸化物（Ｓ−Ｏ又はＦｅ−Ｏ）由来のピークである［１２］記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５０】
［１４］そのＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列として、以下の配列：
ＭＳＸaＳＩＳＹＳＴＸb  ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬＸa  ＤＷＸbＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ
（ＸaはおそらくCys、Ｘbは不明）を含む成分であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有する成分を含む［７］〜［１３］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５１】
［１５］  前記配列より支持されるＨａｓＡ−レドキシン複合体が、ヘム捕獲タンパク質（ＨａｓＡ）とフェレドキシン、アドレノドキシン、ルブレドキシンよりなる複合体に由来する［１３］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５２】
［１６］  前記ＨａｓＡが、蛍光菌、緑膿菌、及び／又は結核菌由来であって、大腸菌を含む微生物発現されたＨａｓＡに由来する［１５］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５３】
［１７］  前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ−レドキシン複合体生成の期間（２〜３日）を要する［１６］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５４】
［１８］  前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、高分子化合物コーティングされている［７］〜［１７］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５５】
［１９］  前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、架橋化処理されている［７］〜［１７］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５６】
［２０］  基質たるラセミ体アルコールに、［７］〜［１９］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体を作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。【００５７】
［２１］前記微生物発現ＨａｓＡの不斉酸化反応の発現には、溶存酸素存在下によるＨａｓＡ−レドキシン複合体生成の期間（２〜３日）要する［１６］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５８】
［２２］  前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、高分子化合物コーティングされている［７］〜［２１］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００５９】
［２３］前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、架橋化処理されている［７］〜［２１］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００６０】
［２４］基質たるラセミ体アルコールに、［７］〜［２３］のいずれか１項に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体を作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。【００６１】
［２５］前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６２】
［２６］  ［１０］に記載の沈殿されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における溶媒として水を用いる［２５］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６３】
［２７］  ［２３］に記載の架橋化処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における溶媒としてグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６４】
［２８］［２２］に記載のＰＥＧ処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における水溶媒系の補助溶媒として、３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも、該蛋白質複合体が触媒活性を損なわない、［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６５】
［２９］［２３］に記載の架橋化処理されたＨａｓＡ−レドキシン複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる［１２］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６６】
［３０］  キャップフリー、ナノ酸素バブル水、又は酸素供給装置系の反応系において、触媒反応を行う［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６７】
［３１］  反応系におけるＨａｓＡ−レドキシン複合体の活性中心が、活性酸素種による鉄電子移動を伴うレドキシン内の不斉酸化反応である［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００６８】
［３２］  前記過酸化水素との反応性が、前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体（粒径５０μｍ）の１５ｍｇを直径１８ｍｍφの試験管に入れ、これに５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際に、酸素の発生に基づき、肉眼で視認可能な泡を生ずるレベルの反応性である［７］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００６９】
［３３］前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［７］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７０】
［３４］前記複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［７］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７１】
［３５］前記第２の工程における遠心沈殿処理後の高分子化合物（ＰＥＧ）コーティング処理にて、溶媒重量の１％〜２％の有機溶媒（トルエン、アセトニトリル、グルタルアルデヒド等）を用いる［１］に記載の製造方法。【００７２】
［３６］前記過酸化水素との反応性が、デジタル式過酸化水素濃度計による測定において、基質２ｍＭ−過酸化水素（１ｍL）中５分間の反応において、１μＭ−Ｈ２Ｏ２ａｑ．を分解できる量が２００μｇ以下である［７］に記載のＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７３】
本発明は、以下の態様をも含むことができる。【００７４】
［Ａ３３］  固定化用の担体と、該担体に固定化されたＨａｓＡ−レドキシン複合体とを含む固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７５】
［Ａ３４］  前記担体が、微粒子化および／又は多孔質の担体である［Ａ３３］に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７６】
［Ａ３５］  前記多孔質担体が、無機質担体、有機質担体、または無機−有機ハイブリッド担体のいずれかである［Ａ３３］または［Ａ３４］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７７】
［Ａ３６］  前記ＨａｓＡ−レドキシン複合体の多孔質担体への固定化が、吸着によるものである［Ａ３３］〜［Ａ３５］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７８】
［Ａ３７］  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む測定方法により測定された「生成ケトンへの変換率」が４５％以下である［Ａ３３］〜［Ａ３６］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。【００７９】
（ａ）大腸菌により発現させた蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）の５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、振とう機を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分で４８時間撹拌して、蛍光菌ＨａｓＡを担体サンプルに固定化する。【００８０】
（ｂ）前記固定化操作後の「ＨａｓＡ溶液残渣」を採取する。【００８１】
（ｃ）該ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水  ４ｍＬ）に、基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）を添加し、５０時間、撹拌子による攪拌下で反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。【００８２】
［Ａ３８］  前記固定化したＨａｓＡ−レドキシン複合体を第１回目の反応に供し、その後該複合体を回収し、更に該回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上である［Ａ３３］〜［Ａ３７］のいずれか１項に記載の固定化ＨａｓＡ−レドキシン複合体。
【発明の効果】
【００８３】
本発明の特徴としては、例えば、以下の５点を挙げることができる。
（ａ）ヘモホア（ＨａｓＡ）遺伝子は既知であるため、日本を含む１９３か国が加盟している１９９３年１２月２９日に発効した生物多様性条約（ＣＢＣ：Convention on Biological Diversity）、及び２０１０年１０月の生物遺伝資源の利用と利益配分（ＡＢＳ：Access and Benefit-Sharing）に関わる名古屋議定書に関連する、微生物遺伝資源には属さないこと。
（ｂ）高等植物由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体であるので、未使用生物資源（バイオマス）の不斉酸化触媒への有効利用であること。
（ｃ）微生物発現ＨａｓＡを酸素存在下、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を形成後、２級アルコールの不斉酸化反応へ有効利用すること。
（ｄ）該ＨａｓＡ−レドキシン複合体が、酸素の存在下、活性酸素種の再合成系を通じて、２級アルコールの不斉酸化反応を触媒すること。
従って、本発明によれば、植物由来及び／又は微生物発現から作られる２級アルコールの不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体が提供される。【００８４】
上述したように本発明によれば、実用的な不斉酸化反応を触媒する活性を付与した植物由来のＨａｓＡ−レドキシン複合体、及び／又は微生物発現由来のＨａｓＡ−レドキシン複合体が提供される。
本発明によれば、更に、このような植物由来のＨａｓＡ−レドキシン複合体の紛体化に関わる好適な製造方法により、本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体（以下、ＭＥと称す。）を、環境に優しく低コスト生産を実現する、新規な不斉酸化触媒として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】植物由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体（以下、ＰＰ−ＨａｓＡと称す）の精製方法の一態様を表す概念図である。
【図２】微生物発現ＨａｓＡ−レドキシン複合体（以下、ＨａｓＡｐｆと称す）の製造方法の一態様を表す概念図である。
【図３】ＰＰ−ＨａｓＡとＨａｓＡｐｆの構成元素分析の結果を示すグラフ及び表の一例である。
【図４】ＰＰ−ＨａｓＡとＨａｓＡｐｆのＦＴＩＲの結果の一例を示すグラフである。
【図５】第１工程にて得られるＨａｓＡ−レドキシン複合体水溶液（以下、ＰＣと称す）を遠心分離して得られる各分取フラクション（上清み（Supernatant）、沈殿物（PC precipitate））とその沈殿物をセルロースコーティング（CM-Cellulose coating PC）又はグルタルアルデヒド架橋（ＣＬＰＣ）後にFD乾燥したサンプルの不斉酸化活性を示すグラフである。
【００８６】
【図６】図１の遠心分離して得られる各上清画分；ＰＣ（Ａ）、ＭＥ（Ｂ）、Vivaspin ２-１０K処理後のＢ（Ｃ）、不斉酸化反応後のＣ（Ｄ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の一例を示す写真である。
【図７】図２の大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子（ＨａｓＡｐｆ）による０．８ｍＭ基質ラセミ−１−（２−ナフチル）エタノール（以下、Ｒａｃ−２と称す）のナノ酸素バブル水溶媒（５．０ｍＬ）における不斉酸化反応を示すグラフである。
【図８】大腸菌発現ＨａｓＡｐｆによる不斉酸化反応の際のＤＯの変化を示すグラフの一例である。
【図９】ＰＰ−ＨａｓＡ（ａ）とＨａｓＡｐｆ（ｂ）のＥＳＲスペクトルの違いの一例を示すグラフである。
【図１０】エンドウ蛋白（ＰＰ）中の菌体同定と蛍光菌ＨａｓＡ（ＰＰ−ＨａｓＡ）  精製プロセス各画分の不斉酸化活性強度における一態様を表す概念図である。
【００８７】
【図１１Ａ】図６のバンド２のＮ末シーケンスで検出された３３アミノ酸の結果と引き続くＢＬＡＳＴ解析により得られた蛍光菌ＨａｓＡの遺伝子情報を示す。また、レドキシンのアミノ酸配列からＣｙｓの一例を示す。
【図１１Ｂ】図６のバンド２のＮ末シーケンスで検出された３３アミノ酸の結果と引き続くＢＬＡＳＴ解析により得られた蛍光菌ＨａｓＡの遺伝子情報を示す。また、レドキシンのアミノ酸配列からＣｙｓの一例を示す。
【図１２】第１工程で得られる乾燥ＰＣ、ＣＭＭＥ、ＡＧＭＥの蒸留水又はナノ酸素バブル水−溶媒（５．０ｍＬ）中、基質Ｒａｃ−２（０．８ｍＭ）に対する不斉酸化比活性（Unit(mg・min)）をまとめた表である。
【図１３】ＤＭＳＯ補助溶媒のナノ酸素バブル水−溶媒（５．０ｍＬ）中、基質Ｒａｃ−２（０．８ｍＭ）に対する不斉酸化に及ぼす影響を示したグラフの一例である。
【図１４】ＣＭＭＥとＡＧＭＥ不斉酸化反応を用いる、ナノ酸素バブル水−溶媒（５．０ｍＬ）中、基質Ｒａｃ−２（１．２ｍＭ）に対する両鏡像体の使い分けに関する模式図である。
【図１５Ａ】ヘム捕獲タンパク質（ＨａｓＡ）とヘム受取タンパク質（ＨａｓＲ）の分子機能に関わる一態様を示す模式図、および大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）のゲノム配列（６２７ｂｐ）を示す図である。
【図１５Ｂ】ｐＥＴ２８ａベクターのゲノム配列（５３６９ｂｐ）を示す図である。
【００８８】
【図１６】ＨａｓＡ−レドキシン複合体の活性酸素種−再合成系による、２級アルコール不斉酸化反応を示す模式図の一例である。
【図１７】本発明の蛋白質複合体を用いるナプロキセン前駆体の合成と；更なるナプロキセン合成を示す模式図の一例、及び、従来のナプロキセン合成フローを示す模式図の一例である。
【図１８】大腸菌発現ＨａｓＡ遺伝子の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図１９】ＨａｓＡｐｆ（０．３６ｍｇ）による基質ｒａｃ−２（０．４ｍｇ）／水溶媒中（４ｍＬ）不斉酸化反応の経時変化：光学純度（−●−：％ｅｅ），Ｓ−２（−□−：０．２ｍｇ），Ｒ−２（−○−：０．２ｍｇ），そして生成ケトン（−△−）。
【図２０】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（０．３６ｍｇ）／基質ｒａｃ−２（０．４ｍｇ）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応におけるＵＶ測定結果（０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後）である。
【００８９】
【図２１】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応０時間後と５０時間後のＥＳＲ測定結果である。
【図２２】蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応１００時間後のＥＳＲ測定結果である。
【図２３】ＨａｓＡ溶液（こげ茶色）／トヨナイトの２日振とう吸着後の透明度比較である。
【図２４】トヨナイト吸着後の１）ＨａｓＡ溶液残渣による生成ケトン％、２）各種トヨナイトによる生成ケトン％、３）光学純度の結果である。
【００９０】
【図２５】Ｔｏｙｏｎｉｔｅの細孔分布である。
【図２６】トヨナイトＴｏｙｏｎｉｔｅのＳＥＭ写真である。
【図２７】トヨナイトの４種類である。
【図２８】トヨナイトＨａｓＡｐｆ固定化担体（２００と２００Ａ）の基質濃度と連続再利用の様子である。
【００９１】
【図２９】トヨナイトＨａｓＡｐｆ固定化担体（２００Ｐと２００Ｍ）の基質濃度と連続再利用の様子である。
【図３０】ＨａｓＡｐｆの不斉変換機構である。
【図３１】ヘム代謝の経路である。
【００９２】
【図３２】サイリックなデラセミ化反応の模式図１である。
【図３３】サイリックなデラセミ化反応の模式図２である。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」及び「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【００９４】
（ＨａｓＡ−レドキシン複合体の概要）
本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体の製法、物性および反応性の概要は、以下の通りである（これらの詳細は、順次後述する）。なお、本発明の好ましい一態様において、本発明の蛋白質複合体（ＰＣ）は、少なくとも鉄を含有する蛋白質複合体であって、そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有し、且つ、過酸化水素との反応において顕著に泡立ち、酸素を放出するものである。本発明の複合体は、その過酸化水素活性の発現においてＮＡＤ（Ｈ）の存在を必要としない（すなわち、本発明の複合体は、ＮＡＤ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素活性の発現が可能である）。これは、レドキシン（鉄イオウクラスタ）が、Ｆｅ電子移動系に基づく活性酸素種の生成の活性中心と働き、ＮＡＤ（Ｈ）様に該過酸化水素への電子供与体として機能するためであると推定することができる。
【００９５】
＜製法＞
後述するＨａｓＡの製法により、植物由来のタンパク質から、または遺伝子工学的手法により、ＨａｓＡを得る。次いで、該ＨａｓＡを所定の処理（例えば、ゲル包括化→空気酸化→水溶液に溶出）に供して、本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体を得ることができる。
【００９６】
＜物性＞
本発明の蛋白質複合体は、そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有する。なお、本発明の好ましい一態様において、本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体は、少なくとも鉄と硫黄を含有するＨａｓＡ−レドキシン複合体であって、そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１の領域に、Ｓ−ＯとＦｅ−Ｏバイブレーションの強いピークを有する。ＨａｓＡ−レドキシン複合体のＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列が、以下の配列である。
ＭＳＣＳＩＳＹＳＴ＊  ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ  ＣＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬ  ＮＨＲＥ、
【００９７】
＜反応性−カタラーゼ活性＞
（カタラーゼ活性の測定法−１）
上述したように、本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体は、不斉酸化活性に加えてカタラーゼ活性を有する。このカタラーゼ活性は、前述したように、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応して酸素を放出する性質がある。粒径５０μｍの本発明のＡＧ／ＣＭ−ＭＥを、直径１８ｍｍφの試験管に１５ｍｇ入れ、５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際における、酸素発生に基づく「泡発生」レベルによって、好適に評価することができる（後述する表３を参照）。
【００９８】
この「泡発生」レベルの確認においては、酸素発生に基づく「泡発生」が肉眼で視認可能であれば足りる。より具体的には、「泡発生」レベル（ないし泡発生の試験管内における「高さ」）が、２ｍｍ以上であることが好ましい。更には、該泡発生の「高さ」は、５ｍｍ以上（更には８ｍｍ以上、特許１０ｍｍ以上）であることが更に好ましい。
【００９９】
（カタラーゼ活性の測定法−２）
他方、カタラーゼ活性は、上記反応における「過酸化水素」の消費量を測定することによっても、好適に評価することができる（後述する表３を参照）。
【０１００】
より具体的には、後述する実施例に示すように、市販の「パックテスト」（（株）共立理化学研究所製）を用いて、反応後の「過酸化水素」の残存量を測定することができる。この測定方法は、例えば、候補物質の「スクリーニング」等に好適に使用可能である。
【０１０１】
（カタラーゼ活性の測定法−３）
更に、後述する実施例に示すように、市販の「デジタル式  過酸化水素濃度計」、反応後の「過酸化水素」の残存量を測定し、これに基づき、本発明におけるＡＧ／ＣＭ−ＭＥ量の過酸化水素分解反応に対する比活性を測定することができる。
【０１０２】
「デジタル式  過酸化水素濃度計」を用いた場合の、本発明の鉄含有ＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体の過酸化水素分解反応に対する比活性（基質２ｍＭ−過酸化水素（１ｍL）中５分間の反応において、１μＭ−Ｈ２Ｏ２を分解できるＡＧ／ＣＭ−ＭＥ量量）は、２００μｇであることが好ましく、更には１５０μｇ（特に１３０μｇ）であることが好ましい。この場合のユニットは、本発明の鉄含有ＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体が「ＡＧ／ＣＭ−ＭＥ量」である態様においては、その過酸化水素分解反応に対する比活性（１μＭ−Ｈ２Ｏ２を分解できるＡＧ／ＣＭ−ＭＥ量が、１００μｇであることが好ましく、更には８０μｇ（特に６０μｇ）であることが好ましい。
【０１０３】
＜反応性−不斉酸化活性＞
＜不斉酸化活性−測定法１＞
本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有す。
【０１０４】
＜不斉酸化活性−測定法２＞
本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である。
【０１０５】
（ＨａｓＡ−レドキシン複合体の製造方法）
以下、本発明の好ましい一態様における、ＰＥＧ凝集沈殿−蛋白質複合体の製造方法について述べる。
【０１０６】
この態様において、ＨａｓＡ−レドキシン複合体の製造方法は、植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括してゲルビーズを得る包括化処理、該ゲルビーズを空気酸化させる空気酸化処理、空気酸化された該ゲルビーズを水溶液に溶出させてＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＰＣ）水溶液を得る溶出処理を有する第１の工程と；前記ＰＣ水溶液に重力を掛けてＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＰＣ）を沈殿させる濃縮処理、該ＰＣ沈殿物を水溶液中にて高分子化合物と共存させ、更に重力を掛けてＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＭＥ）を沈殿、上清画分を遠心濾過器（分子量１０ｋＤａ；例えば、Vivaspin ２-１０ K）して濾過液を乾燥し、純ピンのＨａｓＡ−レドキシン複合体を得るか、該沈殿物画分を直ちに凍結減圧乾燥（ＦＤ）処理して高分子化合物コーティング−ＨａｓＡ−レドキシン複合体とする第２の工程と、を含むことが特徴である。また、ＨａｓＡ遺伝子を大腸菌発現させ、ナノ酸素バブル水中２〜３日間振とうすることで、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を作成できる、ことを特徴として含む。
【０１０７】
（第１の工程；包括化処理）
この態様において、包括化処理では、まず、植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括して疎水性の担体を得る。
【０１０８】
ここで、植物由来水溶性粗蛋白質とは、植物から得られた粗蛋白質であり、市販のものを用いても、植物資源から直接抽出して用いても良い。市販品としては、オルガノフードテック株式会社より販売されている豌豆蛋白（商品名「エンドウたん白ＰＰ−ＣＳ」）などが挙げられる。
【０１０９】
このような「植物資源」としては、例えば、蕎麦、アマランサス、米、小麦、大麦、トウモロコシ、エンバク、ライ麦、粟、ヒエ、キビ、ハト麦、モロコシ等の穀類；小豆、インゲン豆、豌豆、リョクトウ、大豆等の豆類、更には一般的な草や雑草をも含めた、これらの種子、葉、茎、根、花、実の各植物組織も挙げられる。植物資源から粗蛋白質を抽出する方法は、特許文献１に開示されている方法などを適宜採用することが出来る。
【０１１０】
蛍光菌Pseudomonas fluorescensPf-５は、他の微生物の成長を抑え、抗菌物質などの化合物を生産して宿主成長を促すため、農業分野では散布薬として利用されている。これらの根粒菌は、植物内細胞・組織に保持される共生細菌として、子孫の初期胚に伝達される。従って、蛍光菌Pseudomonas fluorescensPf-５が産生するヘモフォアＨａｓＡ（鉄ポルフィリン錯体）は、ＢＬＡＳＴ解析ではヒットしないが「植物資源」から獲得できる。鉄及び鉄補欠分子族の代謝調節に関わる蛋白質：即ち、鉄代謝制御タンパク質（IRP: Iron Regulatory Protein）、鉄応答性エレメント（IRE：Iron Responsive Element）、ヘム生合成抑制的転写調節因子（IRR）、更には、フェレドキシン、アドレノドキシン、ルブレドキシンなども、「植物資源」から獲得できるバイオマスと言える。
【０１１１】
該植物組織粉砕物の包括ゲルを得る具体的な方法としては、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる（格子型）か、半透膜性の皮膜によって被覆する（マイクロカプセル型）包括法があるが、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を植物組織より分離する上では、アルギン酸のカルシウム塩を用いた包括化法が安価で環境に優しく、かつ、包括操作と回収操作が平易な点で最も好ましい。
【０１１２】
より具体的には、例えば、植物組織（種子、葉、茎、根、花、実）粉砕物を蒸留水に溶かした後、アルギン酸ナトリウム水溶液を加えて均一になるまで撹拌し、得られた混合液を塩化カルシウム水溶液中に滴下することで粗蛋白質ゲルを作成できる。ここで、塩化カルシウム水溶液の濃度は、０．５％〜１．０％（好ましくは０．６％）であることが好ましい。
【０１１３】
（第１の工程；空気酸化処理）
本発明の好ましい一態様において、空気酸化処理では、前記ゲルをザルを用いて水溶液と分離し、空気静置することで空気酸化させる。該空気酸化処理は、３０分〜３時間程度、より好ましくは１時間行うことで、最終的な本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体をより高収率で得ることができる。この処理が粗蛋白質中ＨａｓＡの、酸素によるヘム破壊、及びＨａｓＡ−レドキシン（鉄イオウクラスタ）複合体形成を促している。更に、レドキシン中のシステインが酸素と結合して硫黄酸化物（Ｆｅ−Ｏ及びＳ−Ｏ）に変化する為、 “水溶液中への「滲み出し」効果”と同様に、“不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体を溶出させる効果”を生んでいる。従って、空気酸化処理が本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体の製造方法の鍵であり、必要不可欠となる。
【０１１４】
該粗蛋白質包括ゲルの空気酸化過程では、３０℃以下が好ましく２０℃以下にて、細菌増殖を抑える点に注意して処理することがより好ましい。温水抽出まで速やかに処理を要するが、どうしても必要な場合は、１０℃以下４℃付近で該包括ゲルを冷蔵保存することもできるが、活性強度の劣化を防ぐことができない。
【０１１５】
（第１の工程；溶出処理）
本発明の好ましい一態様において、溶出処理は、空気酸化された該植物組織−包括ゲルを温水振とうすることで、ＨａｓＡ−レドキシン複合体を溶出させて得ることである。溶出させる手段としては、温水中で該ゲルビーズを振とう／撹拌させることが好ましい。水は温水であることが好ましく、水温は３０〜５０℃であることが好ましい。振とうの回転数としては、該ゲルビーズが振れる範囲で適宜採用することが出来る。振とう時間としては、２〜４日程度が好ましく、３日（７２時間）がより好ましい。振とう手段としては、恒温振とう培養器、撹拌調温タンクなどを用いることができる。
【０１１６】
該ゲルからＨａｓＡ−レドキシン複合体の溶出が進むにつれて独特の硫黄臭が生じはじめ、３０℃〜４０℃での温水抽出の過程における細菌増殖も防げないが、硫黄臭が腐敗臭に変わる前までに、濃縮（遠心）操作とＦＤ乾燥操作をより速やかに行うことが好ましい。細菌増殖を腐敗臭産生まで放置すると、１）活性強度の低下、２）立体選択性の消失の原因を招く。腐敗臭産生を防ぐには、該ゲルを１０℃以下４℃付近で冷蔵保存することもできるが、その活性強度の低下は防げない。該ゲルからＨａｓＡ−レドキシン複合体が溶出してできた水溶液を、以下、ＰＣと称す。
【０１１７】
（第２の工程；濃縮処理）
本発明の好ましい一態様において、濃縮処理では、前記第１の工程によって得られたＰＣ水溶液に重力を掛けることによって、水溶液中に残った不純物を取り除き、該ＨａｓＡ−レドキシン複合体の沈殿物を得ることが目的である。手段としては、自然放置して地球重力沈む沈殿物を更に、遠心分離機により物理的に強い重力を掛けて、水溶液画分を除去して、濃縮した不斉酸化活性を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体を得る方法が挙げられる。速やかに該ＨａｓＡ−レドキシン複合体を濃縮できる方法であれば、この遠心分離法にこだわる必要はない。
【０１１８】
この濃縮処理で得られたＨａｓＡ−レドキシン複合体を、更に活性を高めて洗浄・濃縮する目的として、更に５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０）緩衝液を加えて何度か遠心分離することが出来る。洗浄処理は、濃縮処理で得られたＨａｓＡ−レドキシン複合体−沈殿物に５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０）緩衝液を加えて再溶解した水溶液（以後、ＭＥと称す）に、再度重力を掛けて、水溶液画分を除去することによって活性を高めて洗浄することになる。更に、細胞膜から完全に分離されている純粋なＨａｓＡ−レドキシン複合体を得たい場合には、ＭＥ遠心上清−水溶液を限外濾過膜の付いた遠心濾過器（例えば、Vivaspin ２-１０ K）を用いて、濾過された水溶液を乾燥・濃縮するだけで得ることができる。
【０１１９】
（第２の工程；ＨａｓＡ−レドキシン複合体のＰＥＧコーティング処理）
本発明の好ましい一態様において、ＨａｓＡ−レドキシン複合体のＰＥＧコーティング処理では、前記濃縮処理（遠心分離など）で得られた沈殿物を５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０）緩衝液中にて再溶解したものに、０．５％〜１％ＰＥＧ（ＭＷ１０００（ＡＧＭＥ）又はＭＷ４０００（ＣＭＭＥ））を共存させて、３０分〜３時間程度、好ましくは２時間静置後、濃縮処理（遠心分離など）して凍結減圧乾燥（ＦＤ）処理によって好適に、Ｒ−／Ｓ−選択的な不斉酸化触媒となる。ＰＥＧコーティングによって、１）立体選択性の転換、だけでなく、３）反応活性の向上（０．６ｍＵ→０．８ｍＵ）が実現される。
【０１２０】
また、ＣＭＭＥとＡＧＭＥのそれぞれの比活性は、Ｒａｃ−１／−２（１．２ｍＭ）を蒸留水（５．０ｍＬ）溶媒系にて作用させた場合、０．６ｍＵ（ｍｇ・ｍｉｎ）と０．８ｍＵ（ｍｇ・ｍｉｎ）であるが、溶媒をナノ酸素バブル水にすると、それぞれの比活性は０．７ｍＵ（ｍｇ・ｍｉｎ）と０．９ｍＵ（ｍｇ・ｍｉｎ）に上昇する。したがって、０．１％濃度のＰＥＧコーティングが、１）該複合体の立体選択性の転換でき、２）ナノ酸素バブル水を溶媒に用いることで、比活性が向上させることができる。
【０１２１】
前記ＭＥ水溶液に添加するＰＥＧ量は、生産設備のスケールや、用いるＰＥＧの分子量によって適宜採用することができる。例えば、ＰＥＧ（ＭＷ：４０００）を用いる場合、前記濃縮処理で得られたＭＥ水溶液の重量に対して、０．１％〜１．０％重量％程度、好ましくは０．５％重量％のＰＥＧを用いることが好ましい。例えば、該ＭＥ水溶液重量２Ｌに対して、ＰＥＧ（１０ｇ）にて再溶解し、遠心沈殿物回収後、引き続いて凍結減圧乾燥（ＦＤ）させることにより、好適な活性強度を保持したＲａｃ−１／−２において、Ｒ−アルコール選択的酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体に加工できる。
【０１２２】
ＨａｓＡ−レドキシン複合体の高純度品は、ＭＥ遠心上清液から、限外濾過膜付遠心濾過器を使用して濾過するのみで好適に獲得できる。一方、ＭＥ沈殿画分は細胞膜を含んだ膜蛋白質（例えば、ＡＢＣトランスファー、ＨａｓＲ、ｅｔｃ）といった細胞膜断片から成るＨａｓＡ混合体である。更に、微生物発現させた蛍光菌ＨａｓＡの２００倍以上の活性を示すことより、不斉酸化反応を触媒するＨａｓＡ−レドキシン複合体の十分な構造を保持できていると予測できる。ＭＥをＰＥＧコーティングすることにより、水溶媒中の基質が、その界面活性剤効果にて、ＭＥ活性中心（ＨａｓＡ−レドキシン複合体）に接触しやすくなり、比活性の向上に寄与し、ナノ酸素バブル水を溶媒にすることで、更なる向上ができる。
【０１２３】
（第２の工程；紛体化処理）
本発明の好ましい一態様において、粉末状に加工する手段としては、真空凍結乾燥、熱風乾燥、加圧乾燥、減圧乾燥、自然乾燥などの方法が挙げられる。このうち真空凍結乾燥は、水分を短時間で効果的に完全に除去できることから好ましい。真空凍結乾燥を行う場合、例えば、−５０℃程度で１時間以上、好ましくは完全に凍結させた後、系内を真空状態にし、温度を約５０℃まで昇温することで水分を昇華させる。粉砕化する際、乾燥機内に空気（酸素、窒素、二酸化炭素など）を出来るだけ除去しつつ５０℃程度で乾燥させるべきであり、ＨａｓＡ−レドキシン複合体の空気（酸素、窒素、二酸化炭素など）との反応を避ける処置が活性維持のポイントとなる。乾燥処理において、ＨａｓＡ−レドキシン複合体が酸素と反応すると黒く変色する。
【０１２４】
乾燥化したＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＡＧＭＥやＣＭＭＥ）は、ボールミルを含む多くの粉砕機種をもって粉砕しても、比活性に影響を与えるものではない。また、ＣＭＭＥの比活性は、常温保存にて半年以上、冷蔵保存で２年間以上、冷蔵・アルゴンガス封入で３年以上保持できる。
【０１２５】
（ＨａｓＡ−レドキシン複合体）
本発明の好ましい一態様において、本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体は、少なくとも鉄と硫黄を含有するＨａｓＡ−レドキシン複合体であって、そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１の領域に、Ｓ−ＯとＦｅ−Ｏバイブレーションの強いピークを有する。ＨａｓＡ−レドキシン複合体のＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列が、以下の配列であり、
【０１２６】
ＭＳＣＳＩＳＹＳＴ＊  ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ  ＣＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬ  ＮＨＲＥ、
【０１２７】
蛍光菌ＨａｓＡと９３％の相動性を示す一方で、３番目と２１番目のＣｙｓ（Ｃ）はレドキシンから来る。且つ、過酸化水素との反応において顕著に泡立ち、酸素を放出することを特徴とする。
【０１２８】
（好ましい遺伝子工学的製法）
図２の第１工程の操作は、先ず、Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(HasA; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図１５)を遺伝子合成する。合成した遺伝子（HasA）を発現ベクター（pET２８a(+)；図１５）に挿入する。作製した発現ベクター（pET２８a/HasA）を大腸菌株（３種：BL２１, Rosetta２, SHuffle(NEB)）に形質転換し、形質転換体を作製する。得られた形質転換体３種を用いて、それぞれについて発現培養条件検討（培地２種：ＬＢ，  ＴＢ、誘導温度２点：３０℃，  ２０℃）を行い、得られた発現物の一部を用いて、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体によるウェスタンブロッティングにて発現を確認する。次に、最も可溶性画分に発現量が高かった培養条件を最適条件とし、１００ｍＬ培養液相当の発現物を作製する。得られた発現物を用いて、Ｎｉアフィニティーカラムにより精製を行う。精製物をウェスタンブロッティングにより確認後、濃度・純度を測定する。精製の蛍光菌ＨａｓＡは、ナノ酸素バブル水−溶媒中、３〜４日撹拌され、不斉酸化反応を触媒できるＨａｓＡ−レドキシン複合体を作成する。
【０１２９】
図３は、エンドウ豆由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＰＰ−ＨａｓＡ）と微生物発現させた蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）の乾燥体をイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）とＩＣＰ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＣＳ）による栄養素（重量％；炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ），酸素（Ｏ））と金属（ｐｐｍ；鉄（Ｆｅ））の結果を示している。この成分分析から、鉄／硫黄含量がほぼ近似している点から、１）ＰＰ−ＨａｓＡ（３ｐｐｍ／０．０５％）とＨａｓＡｐｆ（８ｐｐｍ／０．０９％）の高純度で精製されており、更に、ＰＰ−ＨａｓＡ（５，６％）はＨａｓＡｐｆ（３９％）の７倍の酸素含量を示すことより、２）活性酸素種による鉄電子移動が関与する不斉酸化反応であることが示唆されている。
【０１３０】
図４は、ＰＰ−ＨａｓＡとＨａｓＡｐｆを乾燥後、ＦＴ−ＩＲしたときの分子構造上違いを表す。即ち、前記７倍の酸素含量を示すＰＰ−ＨａｓＡは、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１の間にシステインチオラート配位ヘムに特徴的なＦｅ−ＯとＳ−Ｏバイブレーションを示している。一方、微生物発現のＨａｓＡｐｆでは、Ｈｙｓ・Ｔｙｒ−６配位型ヘムの為、この範囲でのバイブレーションは観られていない。しかしながら、ＨａｓＡｐｆをナノ酸素バブル水溶媒で混合・撹拌（３〜４日）後、溶存酸素がＨａｓＡ中のヘムを開裂、ノンヘムのレドキシン（鉄イオウクラスタ）と複合体を形成することにより、この範囲に特徴的なシステインチオラート配位ヘムのピークが生じる。
【０１３１】
図５は、ＰＣ懸濁液（PC suspension）、遠心分離ＰＣ上清（Supernatant）、遠心分離ＰＣ沈殿物（Precipitate）、カルボキシ−セルロースコーティングしたＰＣ沈殿物（CM-Cellulose coating PC）、及びグルタルアルデヒド架橋させたＰＣ沈殿物（CLPC）の示す不斉酸化活性の結果をまとめた図である。この結果から、好適な活性が観られる一方、遠心分離ＰＣ沈殿物では反応は好ましくなかった。図１０のように、ＰＣ沈殿物に５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０）緩衝液に再溶解することで、そのＭＥ沈殿物にも、ＰＣ懸濁液、遠心分離ＰＣ上清、及びセルロースコーティングＰＣと同様以上の活性を付与できる。ここに、ＰＣ→ＭＥプロセスの意義がある。
【０１３２】
図６は、遠心分離後のＰＣ上清（Ａ）、遠心分離後のＭＥ上清（Ｂ）、遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）されたＢ（Ｃ）、そして、Ｒａｃ−２酸化／ヘキサン抽出後のＣ（Ｄ）について、各サンプルでのＳＤＳ−Ｐａｇｅ結果である。結果から、ＭＥ上清（Ｂ）は遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）にて容易に、３９ｋＤａのＰＰ−ＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＰＰ−ＨａｓＡ）に生成できることを示した。更に、不斉酸化後、及びヘキサン抽出後にサンプルＣが、２１ｋＤａの緑膿菌ＨａｓＡに変化（Ｎ末シーケンス結果）することから、ＨａｓＡ−レドキシン複合体（３９ｋＤａ）は、基質Ｒａｃ−２酸化／ヘキサン抽出によって、ＨａｓＡとレドキシンに分離して反応が止まることが示された。
【０１３３】
図７は、蛍光菌ＨａｓＡを大腸菌発現させた「ＨａｓＡｐｆ（２０μＭ）」を、ナノ酸素バブル水溶媒（５ｍＬ）中、基質ラセミ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−２；０．８ｍＭ）に作用させ、凡そ、２日目（４８時間経過）後から不斉酸化反応を示し始め、その３日〜４日目（７２〜９６時間）を経て、Ｒ−２のみがケトンへ不斉酸化され、反応されないＳ−２が収率５０％（光学純度＞９９％ｅｅ）で得られるタイムコースを示している。この結果は、前記−図４のシステインチオラート配位ヘムのピークの形成に関わる説明をサポートしている。分光光度計のヘム吸収波長４１０ｎｍは、最初から２日目（４８時間経過）までは徐々に減少してゆき、その後、完全に消えた。
【０１３４】
図８は、図７のプロセス「蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（２１ｋＤａ）→ＨａｓＡ−レドキシン複合体（３９ｋＤａ）に関し、２４時間後に空気バブリングを開始した際における、ナノ酸素バブル水溶媒中の溶存酸素（ＤＯ）濃度をモニタリングした図である。この結果から、ナノ酸素バブル水溶媒中の蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（２１ｋＤａ）は酸素を取込み、最初の数時間でＤＯ濃度０．５ｍｇ／Ｌ以下まで下がり落ち着く。２４時間後、酸素供給を開始すると、一旦はＤＯ濃度７．０ｍｇ／Ｌ付近に上昇が認められるが、図８に示すように、ＤＯ濃度０．５ｍｇ／Ｌ付近で落ち着く。この結果は、酸素吸収による「ヘムの酸化開裂」と、引き続く、「ＨａｓＡ−レドキシン複合体」の形成、更には、この複合体による活性酸素種の再合成系（Ｆｅ２++Ｏ２→Ｆｅ３+−Ｏ−Ｏ−→Ｆｅ４+＝Ｏ（oxidizing  Rac-１／-２）→Ｆｅ２++H２O）のフェントン反応を示唆するものである。
【０１３５】
図９（ａ）は、エンドウ豆由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体（ＰＰ−ＨａｓＡ）のＥＳＲスペクトルを示している。この結果は、鉄イオウクラスタ（レドキシン）に特有の４．３ガウスノンヘム型の特徴を呈している。更に、ノンポラーなヘム型として、図４のＳ−ＯとＦｅ−Ｏバイブレーションを支持する。つまり、活性酸素種の再合成系を示唆するものである。
【０１３６】
また、図９（ｂ）は、蛍光菌ＨａｓＡを大腸菌発現させた「ＨａｓＡｐｆ」であるが、ＨａｓＡタンパク質中のアミノ酸Ｈｉｓ―３２とＴｙｒ―７２がヘムに配位した６配位のＥＳＲスペクトル（６ガウス）を示した。従って、図８の酸素吸収による、「ヘムの酸化開裂」と、引き続く、「ＨａｓＡ−レドキシン複合体」の形成、更には、この複合体による活性酸素種の再合成系は支持されている。
【０１３７】
図１０は、エンドウ豆から蛍光菌由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体が得られる理由について検討したものである。つまり、原料のエンドウ豆タンパク質中にコンタミする微生物は、１）耐熱性の胞子を形成するグラム陽性桿菌で自然界に広く分布している好気性芽胞菌と、２）人や動物の皮膚からよく分離されるカタラーゼ陽性グラム陽性球菌の２種類であり、その他の材料（アルギン酸ナトリウム粉末、塩化カルシウム粉末、蒸留水中には菌は居なかった。以上の理由から、エンドウ豆から溶出される蛍光菌ＨａｓＡは、他の微生物の成長を抑え、抗菌物質などの化合物を生産して宿主成長を促すため、農業分野では散布薬として利用された、植物内細胞・組織に保持される共生細菌の、蛍光菌Pseudomonas fluorescensPf-５に由来している。従って、蛍光菌ＨａｓＡは、エンドウ豆遺伝子としては無い為、ＢＬＡＳＴ解析してもヒットしない。
【０１３８】
図１１は、図６のサンプルＤ（バンド２）をＮ末シーケンスして得られた３３アミノ酸の結果と、そのＢＬＡＳＴ解析より９３％相同性にてヒットした「蛍光菌ＨａｓＡ」の遺伝子配列とアミノ酸配列を示している。図１５は、ＨａｓＡがヘモグロビンからヘムを奪い取り、そのヘムを膜蛋白ＨａｓＲに受け渡す様子の分子構造の変化の様子を示している。Ｎ末シーケンス結果からＮ末３番目のアミノ酸と２１番目のアミノ酸がＣｙｓが検出されており、ルブレドキシン（６ｋＤａ）や、例えば、フェレドキシン（９ｋＤａ）の２１番目のアミノ酸がＣｙｓである点など、ＨａｓＡ−レドキシン複合体として検出された結果として考察しえる。図１６は、ＨａｓＡ−レドキシン複合体が活性酸素種の再合成系に元づき、不斉酸化反応が触媒されているイメージを示す。
【０１３９】
図１２は、ＰＣ乾燥品、ＣＭＭＥ、及びＡＧＭＥによる比活性をまとめた図である。
【０１４０】
尚、本発明において、「ユニット」（Ｕｎｉｔ）とは、酵素活性の単位を示し、１ユニットは、１時間当たり１μモルの基質を変化させることができる酵素量（単位：μモル／ｈ）とする。また、「比活性」は、酵素の単位質量当たりの活性を示す。酵素１ｇあたりの比活性は、単位Ｕｎｉｔ／ｇで表した。この結果から、ＭＥの瞬間速度により算出した比活性は、概ね、１５〜３６Ｕｎｉｔ／ｇ（／時間）であった。また、同様に、反応時間１２時間での、平均速度により算出した比活性が、１４Ｕｎｉｔ／ｇ（／時間）であった。
【０１４１】
図１２の結果から、Ｕｎｉｔ（ｍｇ／ｍｉｎ）では、ＣＭＭＥの比活性は０．６±０．０２ｍＵ、ＡＧＭＥの比活性は０．８±０．０２ｍＵであり、処理可能な蒸留水溶媒中の基質濃度は０．０６％となった。更に、溶媒をナノ酸素バブル水に変えた時、比活性は０．７±０．０２ｍＵとなり、上昇した。本反応が、ＨａｓＡ−レドキシン複合体による活性酸素種の再合成系（Ｆｅ２++Ｏ２→Ｆｅ３+−Ｏ−Ｏ−→Ｆｅ４+＝Ｏ（oxidizing  Rac-１／-２）→Ｆｅ２++H２O）に元づくフェントン反応にあることを指示するデータ結果である。
【０１４２】
図１４は、水溶媒中（５ｍＬ）の基質Ｒａｃ−１／−２（１．２ｍＭ〜３．６ｍＭ）の、ＡＧＭＥとＣＭＭＥによる両鏡像体の使い分けを示した模式図である。この反応系において、補助溶媒としてＤＭＳＯを用い、ＭＥ活性に及ぼす影響をまとめたのが図１３である。この結果、３％未満の補助溶媒においては、本反応に影響されないことが確認された。ＣＭＭＥはカタラーゼ活性を有する。カタラーゼは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応して酸素を放出する性質がある。粒径５０μｍの本発明のＰＥＧ−ＰＣを、直径１８ｍｍφの試験管に１５ｍｇ入れ、５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えたとき、酸素の発生によって０．２ｃｍ〜３．５ｃｍ程度の泡を発生する。尚、この泡の高さは、表１１に示す通り、ＰＣ中の鉄濃度に比例し、ＣＬＰＣとの比較において、不斉酸化反応時間との比例した相関を確認できる。
【０１４３】
（光学活性アルコールの製造方法）
本発明の好ましい一態様において、光学活性アルコールの製造方法は、基質たるラセミ体アルコールに、ＡＧＭＥとＣＭＭＥを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることが特徴である。
【０１４４】
また、ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法もまた、本発明により提供される。
【０１４５】
（推定メカニズム）
本発明者の知見によれば、本発明の好ましい一態様において、好適な植物由来、又は微生物発現から作られたＨａｓＡ−レドキシン複合体が提供されるのは、以下の理由によるものと推定される。
【０１４６】
安価な生物材料の植物由来の粗蛋白質は、アルギン酸カルシウムゲルに包括されることで、カルシウム存在下、空気中で空気酸化できる環境を得ることができ、（ｉ）ＨａｓＡ−レドキシン複合体内の、フェントン反応を持つ鉄イオウクラスタが酸素吸収によりシステインチオラートの水溶性へと性質変化を生じ、更に（ｉｉ）そのカチオン性を帯びた該ＰＣは水溶液をアルカリ側に変化させ、（ｉｉｉ）温水中で振るだけで好適に、不斉酸化反応を誘導するＰＣが溶出・精製されることとなる。
【０１４７】
温水中に溶出される溶存Ｃａ塩と酸素の存在は、ＨａｓＡ−レドキシン複合体内の、レドキシンが酸素吸収によりシステインチオラートへと性質変化、即ち、鉄―硫黄酸化物（Ｆｅ−Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）の生成に伴う水溶性への変化（ＰＰ→ＰＣ）を促し、温水中で容易に抽出できるよう助けている。ＰＣの触媒活性向上と収量向上と収量向上のポイントは、空気中で好適に該ゲルを空気酸化させる点と、温水中に溶け出す際の適度な溶存酸素量とＣａイオン濃度で「滲み出し」易くさせる点にある。
【０１４８】
本発明の製造方法においては、植物蛋白質の有する空気酸化に伴うこれらの「滲み出し効果」とそれに伴う「不斉酸化反応を有するＰＣの溶出効果」の特性を生かして、好適にＰＣを得ることであり、アルギン酸カルシウムゲルによる固定目的ではなくて、好適に不斉酸化反応を有するＰＣを水溶性に変えて水で抽出する目的といった「逆転の発想」により、酵素様に作用するＰＣを低コストで、環境に優しく、効果的に抽出することに特徴がある。
【０１４９】
（推定メカニズムの関連文献）
上記した本発明の「推定メカニズム」のサポートに関しては、薬物代謝や解毒、ホルモンの生合成などに関連したヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素群にある。例えば、以下の文献を挙げることができる。非特許文献１では、鉄結合蛋白質には、長鎖カルボン酸をエポキシ化と水酸化によって、二酸化炭素と水に分解するチトクロームＰ４５０が紹介されている。チトクロームＰ４５０を生体触媒とする有機合成反応例として、ここでは水酸化反応についての報告がなされている。
【０１５０】
【化６】
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【０１５１】
Ｐ４５０によるエポキシ化反応として、例えば、枯草菌由来Ｐ４５０BSβによる、スチレンのエポキシ化反応があり、更には、非特許文献２のＰ４５０ｂｍ−３を使ったアルケン類のエポキシ化反応がある。
【０１５２】
【化７】
2017038107.tif 000009
【０１５３】
更に、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）は、内在性の生理活性物質であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を基質とする。ＥＥＴ  は膜リン脂質から切り出されたアラキドン酸がシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）によってエポキシ化された脂肪酸である。即ち、Ｐ４５０はＥＥＴ  の合成酵素である。例えば、次のような脱メチル化反応を触媒することが知られている（非特許文献３を参照）。
【０１５４】
【化８】
2017038107.tif 000010
【０１５５】
【化９】
2017038107.tif 000011
【０１５６】
一方、ヘム（鉄ポルフィリン錯体）酵素Ｐ４５０は、活性酸素種による鉄電子移動系の基質酸化として良く知られている一方で、２級アルコールの不斉脱水素酵素に関わる報告は未だない。本特許は、Ｐ４５０以外のヘムタンパク質−レドキシン複合体を使って、不斉酸化反応を触媒する反応を見出した点にある。
【０１５７】
ヘモグロビンから「ヘム」を奪うタンパク質として、コレラ菌由来HutZ（非特許文献４を参照）、緑膿菌や結核菌由来ヘモフォア（HasA；Heme Acquisition System A）（非特許文献５を参照）が知られている。鉄及び鉄補欠分子族の代謝調節に関わるタンパク質としては、鉄イオウクラスタ（４Fe-４S、２Fe-２S型）の鉄代謝制御タンパク質（IRP: Iron Regulatory Protein）（非特許文献７を参照）、鉄応答性エレメント（IRE：Iron Responsive Element）の関与が知られている（非特許文献６を参照）。
【０１５８】
ヘムと鉄の摂取に関与するタンパク質として、タンパク質の酸化修飾の進行を促しその転写抑制を解消させる、ヘム生合成の抑制的な転写調節因子（IRR:  Iron Responsive Regulator）の仕組みも報告されている（非特許文献８を参照）。
【０１５９】
また、鉄イオウクラスタ（４Ｆｅ−４Ｓ、２Ｆｅ−２Ｓ型）のような構造は、アミノ酸システインは、空気酸化に伴うジスルフィド結合形成を形成し、フェントン反応を発現する（非特許文献９を参照）。アルギン酸Caゲルに包括させる意味は、この場合、植物蛋白質に含まれるアミノ酸システインの空気酸化に伴う鉄−硫黄酸化物（Ｆｅ−Ｏ及びＳ−Ｏ）の形成とそれによる「滲み出し効果」、更にはそれによる「不斉酸化反応を有するＰＣの溶出」を生かした「逆転の発想」によるもので、不斉酸化反応を有するＰＣを低コストで、環境に優しく、効果的に抽出することに特徴がある。
【０１６０】
（各種検討）
以下、本発明の好ましい一態様における、エンドウ豆由来蛍光菌ＨａｓＡｐｆ複合体（ＭＥ、ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＨａｓＡｐｆ）又は微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（ＨａｓＡｐｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）に関する種々の検討を記す。
【０１６１】
（各種検討；本発明のエンドウ豆抽出−蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（ＰＰ−ＨａｓＡ）、微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（ＨａｓＡｐｆ）の構成元素分析）
図１と図２から調整された純粋なＰＰ−ＨａｓＡとＨａｓＡｐｆを使って、イオンクロマト（ＩＣ）や原子発光分光光度測定（ＩＣＰ−ＡＥＳ）や蛍光Ｘ線・エネルギー分散型Ｘ線分光などを用いて、構成成分に元づく図３情報を得た。その結果、ＰＰ−ＨａｓＡの酸素含有量は、ＨａｓＡｐｆの７倍等量であり、システインチオラート−鉄による構造が支持された。更に、双方に関して、鉄と硫黄を含んでおり、鉄イオウクラスタとの複合体の存在を支持している。
【０１６２】
（各種検討；本発明のＰＰ−ＨａｓＡとＨａｓＡｐｆのＦＴ−ＩＲ分析）
図４（赤：ＰＰ−ＨａｓＡ）と（青：ＨａｓＡｐｆ）は、エンドウ豆抽出−蛍光菌ＨａｓＡｐｆと微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡｐｆについてのＦＴ−ＩＲによる違いを示している。９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１に、鉄−硫黄酸化物を示すＦｅ−Ｏ／Ｓ−Ｏバイブレーションの吸収が顕著に示され、ＰＰ−ＨａｓＡ内に、システインチオラート−鉄が存在；即ち、ＨａｓＡｐｆ−レドキシン（ｏｒ  鉄イオウクラスタ）複合体を支持する吸収である。
【０１６３】
図７（ＨａｓＡｐｆ）と図１５（ＰＰ−ＨａｓＡ）に示す通り、ＨａｓＡｐｆの不斉酸化活性は３日目（５０時間後）から進行し、その後、ＰＰ−ＨａｓＡと同様に、２４時間を要して、収率５０％の光学純度＞９９％ｅｅにて、Ｓ−１−（２−ナフチル）エタノールを分割する。Ｒ体は収率５０％のケトンに変換される。即ち、図７の０時間〜５０時間は、溶存酸素中の酸素による１）ヘム開裂と２）ＨａｓＡｐｆ−レドキシンの形成の段階である。分光光度計吸収４１０ｎｍは、１）５０時間後から消える点、２）５０時間以降は、９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１ＦＴ−ＩＲにて、図４（赤：ＰＰ−ＨａｓＡ）様の顕著な吸収が観られた点により確認されている。
【０１６４】
（各種検討；不斉酸化反応を触媒するタンパク質同定）
図６のＭＥ上清画分（サンプルＢ）は、引き続く、遠心濾過装置（Vivaspin ２-１０K）処理、濾過後ろ液を濃縮／乾燥するだけで、純粋なＰＰ−ＨａｓＡ（３９ｋＤａ）を調整できる。更に、Ｐ−３９をＲａｃ−２（０．８ｍＭ）／蒸留水（５．０ｍＬ）にて不斉酸化反応、ヘキサン抽出後に残るサンプルＣ溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果が、サンプルＤの２１ｋＤａピークを与える。
【０１６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの特徴となる濃いサンプルＤ−バンド２をＳＤＳ−ＰＡＧＥを、引き続きプロテインシーケンサーによりN末端シーケンスして得られた３３アミノ酸が図１１に示されている。そのＢＬＡＳＴ解析の結果から、活性に関わる酵素が、蛍光菌由来のＨａｓＡ（９３％の誤差範囲：HasAp gene product [Pseudomonas fluorescens Pf-５]）として同定された。分子量の２０.８５３ Daであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致した。以上から、蛍光菌ＨａｓＡ（２１ｋＤａ）を土台として、活性中心として鉄イオウクラスタ（レドキシン）を含むタンパク質複合体（３９ｋＤａ）が、不斉酸化反応を触媒するタンパク質として推測された。
【０１６６】
（各種検討；ＥＳＲによるＦｅ−Ｏ検査）
図９には、（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡと（ｂ）ＨａｓＡｐｆのそれぞれのＥＳＲ結果を示している。（ｂ）ＨａｓＡｐｆの微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡｐｆは、非特許文献５に示されるように、ヒツチジン（Ｈｉｓ）とチロシン（Ｔｙｒ）が配位した、低スピン状態６配位型のヘムタンパク質ＨａｓＡを示した。一方、エンドウ豆抽出−蛍光菌ＨａｓＡｐｆの（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡは、１）酸素含量７倍等量含み、２）分光光度計４１０ｎｍに吸収が無いノンヘム型、且つ、レドキシン（鉄イオウクラスタ）特有の４．３ガウスに特徴となる吸収を得た。これらの結果から、非特許文献１〜３の酸素駆動式Ｐ４５０に類似した、活性酸素種による酸化反応（Fe(II) + O２ → Fe(III)-O-O- → Fe(IV)=O (oxidizing rac-１／ -２) → Fe(II) + H２O）による活性であることが支持された。
【０１６７】
図１０に示す通り、蛍光菌ＨａｓＡは、材料中のコンタミとして存在していず、共生細菌として、エンドウ豆の細胞中に存在している。従って、エンドウ豆−蛍光菌は、塩化カルシウムゲルに包括されて、空気酸化後、温水抽出される“細胞内鉄イオン濃度が低い”場合にて、段階でＨａｓＡを生産できる。しかしながら、蛍光菌はＨａｓＡの発現だけでなく、発現を促す／制御する鉄イオウクラスタ（ＩＲＰ，ＩＲＥ、ＩＲＲなど）を産生している。従って、蛍光菌ＨａｓＡの微生物発現には、図３に示す通り、鉄と硫黄が検出される。
【０１６８】
図１に示す工程のように、蛍光菌ＨａｓＡは空気酸化後レドキシンと複合し、ＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体を含む膜蛋白質として温水中に溶出され、遠心分離により平易に濃縮沈殿できる。該沈殿物を、水溶液中にて高分子化合物と共存させ、ＦＤ処理することで保存性を高めた粉末のＡＧ／ＣＭ−ＭＥに加工でき、２級アルコールを不斉酸化できる触媒となる。
【０１６９】
ＡＧ／ＣＭ−ＭＥは、酸素と鉄依存の電子移動系であり、補因子のNAD（P）添加は要せず、緩衝液やpH条件の選定をも要しない。水溶媒中で、且つ、酸素存在下（キャップ無）の撹拌操作にて平易に、光学活性アルコールを得ることができる。
【０１７０】
ＡＧ／ＣＭ−ＭＥは、Ｒａｃ−１よりナプロキセン前駆体（S-１、＞９９％ｅｅ）を合成できる。図１７に従い、平易に医薬品“ナプロキセン”を合成できる。S-１からの有機合成プロセスは、１）水酸基（-OH）のブロモ化（-Br）→２）ニトリル化（-CN）→３）カルボン酸（−COOH）の有機合成できる。
【０１７１】
図１７（ｂ）には、ナプロキセン合成の従来方法によるフロー図を示している。ナプロキセンは、芳香族カルボン酸に分類される有機化合物で、鎮痛、解熱、抗炎症薬として用いられる非ステロイド性抗炎症薬 （NSAID） の一種である。
【０１７２】
本発明のＭＥは、細胞小器官、特には、ミトコンドリア由来膜蛋白質と推察でき、蛍光菌ＨａｓＡ及び、その発現に関与する鉄イオウクラスタ（レドキシン）に基づく鉄電子移動連鎖機能を有する膜蛋白と考えられる。
【０１７３】
図１は、工程１のフローを示す。空気酸化済のアルギン酸ゲル包括エンドウタンパク質から、図１２の２．６％含量カルシウムにコーティングされたＰＣが溶出され、０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ＝９〜１１）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００など）、及び／又は０．５ｍＭ有機溶媒（グルタルアルデヒド、アセトニトリルなど）処理にてＭＥとした後、該ＭＥ鉄電子移動系の作用より、各種２級アルコール分子の不斉酸化反応が生じる様子を表現している。
【０１７４】
図２は、大腸菌などの微生物に、蛍光菌由来ＨａｓＡ遺伝子を発現させて得られるＨａｓＡｐｆの製造方法に関するが、緑膿菌や結核菌由来ＨａｓＡ遺伝子により発現した場合においても、蛍光菌由来ＨａｓＡと同様のタイムコース、図７に示す不斉酸化反応を実現可能である。
【０１７５】
図８に示す通り、アルギン酸Ｃａゲル包括植物由来蛋白質は、空気酸化後、酸素の存在下、好適に空気酸化を誘発する。ＦＴ−ＩＲ測定にて得られる９５０ｃｍ−１〜１２５０ｃｍ−１の領域に現れる、Ｆｅ−Ｏ／Ｓ−Ｏバイブレーションのピークは鉄−硫黄酸化物を示すものであり、ＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体中のレドキシン、鉄イオウクラスタの酸化物に由来し活性中心として機能する。更に、その鉄イオウクラスタ酸化物により、温水中に溶出される効果を生んでいる。
【０１７６】
本発明で示す不斉酸化反応を触媒するＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体の構成は、（１）電子移動に関わる鉄イオウクラスタ（レドキシン）と（２）その土台となるＨａｓＡであり、酸化機能としては、酸素存在下、２級アルコール脱水素反応することを特徴としている。従って、本発明は、従来の２級アルコール脱水素酵素とは明確に異なる反応系を提供している。
【０１７７】
更に、ＭＥにはＳ選択的酸化反応を持つものとＲ選択的酸化に働く２種類が存在する。図１４に示されるように、本発明で示されるＭＥは、第１工程でのコーティングするＰＥＧ分子量を使い分けることで（ＡＧ／ＣＭ−ＭＥ）、立体選択性の異なる２種類の鏡像異性体を生産している。従って、その２種類のＭＥの使い分けにより、両鏡像体（Ｓ体とＲ体）の合成を可能にできる。
【０１７８】
以上から、この発見は、従来の煩雑で煩わしい酵素の精製や単離の工程を含む、従来の亜鉛と補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）電子移動系の２級アルコール脱水素酵素と比べて、不斉酸化反応が、１）補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）添加を要しない点、２）酸素依存的な不斉酸化反応である点、３）ｐＨ依存的でなく、水又はナノ酸素バブル水溶媒系の極めて温和な反応系である点、４）更には、両鏡像体の使い分けが可能な点からコスト的にも操作的にも優位な、しかも高選択的なので効果的に光学活性アルコール（収率５０％、９９％ｅｅ以上）が得られる不斉有機合成試薬を提供している。
【０１７９】
（ＨａｓＡ−レドキシン複合体の固定化）
本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）は、必要に応じて、種々の担体に固定化することができる。このように固定化した該複合体は、該固定化複合体を反応に供した後の、反応溶液と酵素の分離が容易であること、該複合体の再利用が容易であること、連続反応槽（流動槽，カラムなど）における使用が容易であること、等の利点を有する。
【０１８０】
上記固定化に使用すべき「担体」は、該担体に対する本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体の固定化が可能である限り、多孔質であるか否かは、特に制限されない。また、該多孔質材料は、例えば、有機質、無機質、有機−無機ハイブリッドのいずれであっても良い。例えば、無機質担体は、タンパク質等の固定に最適な細孔が容易であり、固定した酵素の高い活性発現、長期反応安定性の確保、圧力変形しない、高い耐薬品性等の点から好ましい。他方、有機質担体は、その可撓性（例えば、フィルム状とすること）が容易である。有機−無機ハイブリッド担体は、無機−有機の利点を、適宜、併せ有することが可能である。
【０１８１】
上記「固定化」メカニズムも特に制限されないが、本発明のＨａｓＡ複合体への分子レベルでの相互的適合性の点からは、該「固定化」メカニズムは、「吸着」であることが好ましい。
【０１８２】
上記固定化に使用すべき「担体」は、該担体の表面積が大きいもの（例えば、微粒子状および／又は多孔質の担体）であることが好ましい。本発明において好適に使用可能な担体であるか否かは、後述する「蛍光菌ＨａｓＡの吸着性」を利用するスクリーニングにより、好適に判別することができる。
【０１８３】
（多孔質担体）
多孔質担体としては、例えば、以下の物性を有するものが好適に使用可能である。
・比表面積：２〜３８ｍ２／ｇが好ましく、１０〜３０ｍ２／ｇが更に好ましく、１５〜２５ｍ２／ｇが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、比表面積＝２０ｍ２／ｇ）
・平均細孔径：３０〜１３０ｎｍが好ましく、５０〜１１０ｎｍが更に好ましく、７０〜１００ｎｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、平均細孔径＝８０ｎｍ）
・平均粒径：１０５〜２１０μｍが好ましく、１２５〜１９０μｍが更に好ましく、１４５〜１７０μｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、平均粒径＝１５５μｍ）
・見かけ嵩密度：０．１８〜１．１８ｇ／ｍが好ましく、０．３８〜０．９８ｇ／ｍが更に好ましく、０．５８〜０．７８ｇ／ｍが特に好ましい（トヨナイト２００シリーズは、見かけ嵩密度＝０．６８ｇ／ｍ）
【０１８４】
上記した多孔質担体へのＨａｓＡ−レドキシン複合体の固定化方法、多孔質担体の各物性の測定方法に関しては、例えば、下記の文献を参照することができる。
・特許第２８６２５０９号（トヨナイトを用いたタンパク質固定化法に関して）
・M.Kamoriら““Kamori５０９号（トヨナイトを用いたタンパク質固定化法に関して）を参照することができる。有機−無機ハイブリッド担体は、無機−有機の利点を、適宜、併せ有することが可能である。極めて温和な反応系である点、４）更には、両鏡像体の使い分けがe immobilized lipaseイ（２０００年）、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 発行、第９, ２６９  〜  ２７４頁
・酵素固定化担体Tｏｙｏｎｉｔｅパンフレット（英語バージョン、日本語パージョンの2種類）、東洋電化工業株式会社発行、
【０１８５】
（好適な担体）
本発明のＨａｓＡ−レドキシン複合体を固定化した態様においては、該固定化したＨａｓＡ−レドキシン複合体を第１回目の反応に供した後に、該複合体を回収し、更に該回収した複合体を第２回目の反応に供することが容易である。この場合、回収した複合体（すなわち、２回以上の反応に供すべきＨａｓＡ−レドキシン複合体）は、後述する実施例１２（および図２８〜２９）に記載した「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」（％）によって、その有用性を判断することができる。
【０１８６】
より具体的には、実施例１２（および図２８〜２９）に記載した方法によって、回収した複合体について「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」を測定した場合に、該「５０ｈ生成ケトンのパーセンテージ」の値が、３０％以上であることが好ましい。この値は、３５％以上であることが好ましく、更には４０％以上であることが好ましく、特に４５％以上であることが好ましい。
（ＨａｓＡの吸着性を利用する担体スクリーニング）
基本的には、後述する「実施例１２」の条件を使用することが好ましい。すなわち、担体スクリーニングは、以下の方法で行うことが好ましい。なお、以下の記載から明らかなように、このスクリーニング方法においては、遠心管（いわゆる「スピッツ管」；長さ１８ｍｍ、容量１５ｍＬ程度）を用いて簡便に行うことができる。例えば「振とう機による攪拌」を使用した場合には、１００本程度の遠心管を一度に攪拌することにより、１００種類程度の担体サンプルを一度にスクリーニングすることができる。
【０１８７】
（１）大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液：実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）の方法より、大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）を調製する。
（２）固定化：上記（１）の操作で得られたＨａｓＡ溶液５ｍＬを遠心管内に入れ、次いでスクリーニング対象たる「担体サンプル」（１０００ｍｇ）を該遠心管内に投下し、２０〜４０時間、振とう機（例えば、東洋電化工業株式会社製、商品名トヨナイト２００、２００Ａ、２００Ｐ、２００Ｍ）を用いて、「８の字振盪」、５００〜７００回／分（rpm：rotation per minute）の条件で、２４〜４８時間撹拌する。この操作により、蛍光菌ＨａｓＡが担体サンプルに固定化される。
（３）固定化ＨａｓＡの後処理：
上記（２）の操作で得られた固定化ＨａｓＡは低温風またはデシケータ中で乾燥し（例えば、２４〜４８時間程度）、ＨａｓＡに適した暗所・低温条件下で保管する。
【０１８８】
実施例１２に記載したように、ＨａｓＡｐｆの「トヨナイト」固定化担体への吸着性は、トヨナイト２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順で良好に進行したことが判明した。茶色ＨａｓＡｐｆ溶液は次の様に変化した（図２３を参照）。
・Ｔ２００・・・ＨａｓＡ溶液が透明となった。
・Ｔ２００Ａ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｐ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色（ほぼ透明）となった。
・Ｔ２００Ｍ・・・ＨａｓＡ溶液は薄茶色（やや濃い目）だった。
【０１８９】
すなわち、上記「実施例１２」と同様にして、担体サンプルの使用可能性が簡便に「色」でも判断できる。上記の例では、「トヨナイト２００、トヨナイト２００Ｐおよびトヨナイト２００Ａ」が、このスクリーニングにおいて「使用可能」と判断できる。
【０１９０】
（ケトン変換率による担体の評価）
上記の「担体サンプル」の評価においては、実施例１２（図２４）に示す方法・条件により、各種「担体」吸着−４８時間後の「ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度」（生成ケトンへの変換率）を測定することができる。この測定値の例は、図２４における、各棒グラフのグループ（例えば、トヨナイト−２００に対するグループ）のうちの、最も左側の棒グラフによって示される。例えば、トヨナイト−２００に対する上記の「ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度」（生成ケトンへの変換率）は、約１３％と読み取れる。この生成ケトンへの変換率は、以下の方法によって、測定することができる。
・（最も左側の棒グラフ）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、の各ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水（４ｍＬ／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた後、生成したケトン変換率（％）を測定する。
【０１９１】
上記した「生成ケトンへの変換率」が小さい程、「より多くのＨａｓＡ」が、担体に固定化されていることとなる。本発明においては、該「生成ケトンへの変換率」が４５％以下であることが好ましい。更には、該「生成ケトンへの変換率」は、４０％以下であることが好ましく、３５％以下、更には３０％以下、更には２５％以下、更には２２％以下、更には２０％以下、更には２０％以下、更には１８％以下、特に１６％以下であることが好ましい。
【０１９２】
（担体の具体例）
本発明ＨａｓＡ−レドキシン複合体の固定化においては、例えば、以下のような市販の担体（例えば、有機物ないしタンパク質の固定化に使用可能な担体）が好適に使用可能である。
・「トヨナイト」（Toyonite；東洋電化工業（株）；カオリナイト物質を酸性水熱処理後、造粒焼成し、表面を有機官能基で修飾した多孔質セラミックス球状担体）
トヨナイト−２００（有機官能基として水酸基を持つ担体）、２００Ａ（有機官能基としてアミノ基を持つ担体）、２００Ｐ（有機官能基としてフェニルアミノ基を持つ担体），２００Ｍ（メタクリロ基を持つ担体）
【実施例】
【０１９３】
次に、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これは説明のためのものであって、これにより限定して解すべきではない。【０１９４】
尚、各実施例において、不斉酸化反応を有するＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体は、実施例１（植物由来の蛍光菌ＨａｓＡ抽出方法）記載、及び実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）記載の方法により得た。【０１９５】
実施例１（植物由来の蛍光菌ＨａｓＡ抽出方法）
豌豆蛋白粉（オルガノフードテック株式会社製、商品名「エンドウたん白ＰＰ−ＣＳ」）３００ｇに、蒸留水３０００ｍＬを加え、更に３％アルギン酸ナトリウム水溶液３０００ｍＬを加えて均一になるまで撹拌した。得られた粗蛋白質―アルギン酸ナトリウム混合液を撹拌しながら、分液漏斗を用いて４％塩化カルシウム水溶液中を滴下し、ゲルビーズを作成した。【０１９６】
次いで、溶液部分を捨て、前記ゲルビーズを回収し、空気中で１〜５時間静置して空気酸化させた。空気酸化させたゲルビーズに４０００ｍＬの蒸留水を添加し、恒温振とう培養器を用いて４０℃にて４８時間振とうし、該ゲルビーズ中のＰＣを溶出させることによってＰＣ水溶液を得た。【０１９７】
前記ＰＣ水溶液を、遠心分離機（日立工機株式会社製、ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ）を用いて１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、ＰＣ沈殿物（８０ｇ〜１２０ｇ）を得た。このＰＣ沈殿物１００ｇに、３〜７％（３〜７ｇ）ＰＥＧ（１０００）／０．５％グイシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ＝９〜１１、７００ｍＬ）を加えてよく撹拌し、少量の３〜７重量％（３〜７ｇ）アセトニトリル又はグルタルアルデヒドを高分子化合物コーティングと共存させ、１時間〜３時間、撹拌して均一化した。【０１９８】
均一化されたＭＥ水溶液を、遠心分離後、沈殿物を真空凍結乾燥機（日精株式会社製、ＲＬＥII２０３）を用いて乾燥して、ボールミルにて粉砕した。ＦＤ条件は、−５０℃にて凍結後、系内を真空状態にして、温度を５０℃まで昇温し、充分に水分昇華させた。精製プロセスにおいて、遠心分離後のＭＥ上清を遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）後、ろ液をＦＤ乾燥することで、好適に本発明のＨａｓＡｐｆ−レドキシン複合体を精製できた。乾燥工程は、真空に近い状態で乾燥するのが好ましい。熱による空気酸化―変色とそれに伴う活性低下が生じるためである。【０１９９】
実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）
Pseudomonas protegens Pf-５遺伝子配列(HasA; accession No. YP_２６２４４５.１, or WP_０１１０６３６００；図１５)を遺伝子合成する。必要に応じて、大腸菌用に配列を最適化して合成を行う。目的遺伝子の両末端には、発現ベクターへの乗せ替え用に制限酵素部位を付加して合成を行った。受託メーカー依頼して、合成遺伝子をｐＵＣ−５７ベクターに挿入した形で納品することもできる。【０２００】
３７℃で３時間以上、制限酵素（ＮＥＢ）処理してｐＵＣ−５７から切断した蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子は、アガロースゲルから切り離して精製（ＤＮＡ精製Ｋｉｔ：ＢＥＸ  ＤＮＡ生成キットＩ（ＰＣＲ＆ＧＥＬ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ））され、ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ；図１５）、ｐＥＴ−４７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、又はｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケア）へ導入された。ベクター導入時の試薬として、Ｌｉｇａｔｉｏｎ試薬（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ））、大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ））、抗生物質（アンシピリン又はカナマイシン）、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））を使った。【０２０１】
ベクターと蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子の連結は、シーケンサー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて、シーケンス試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｅｓ  ｖ１．１  ｃｙｃぇＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使って確認した。【０２０２】
構築した発現ベクターは、大腸菌ＢＬ（ＤＥ３；Ｎｏｖａｇｅｎ）又はＢＬ２１、Ｒｏｓｅｔｔａ２、ＳＨｕｆｆｌｅ（ＮＥＢ）に形質転換し、クローニングする。クローン体をピックアップして、２ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）にて３７℃、一晩、培養する。１０ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）に、前培養液を１ｍＬ添加し、３７℃にて培養する。発現誘導前のサンプルとして、菌体を一部改修しておく。ＯＤ＝１．０付近になったら、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、３０℃で１６ｈ、引き続き培養した。【０２０３】
その後、発現大腸菌を遠心分離にて回収し、１ｍＬの大腸菌溶解バッファー（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ））又は超音波破砕によって、溶菌する。大腸菌溶解液を遠心分離し、可溶性画分の上清を回収する。不溶性画分の沈殿物は、変性バッファー（８Ｍ  Ｕｒｅａ，ＰＢＳ）１ｍＬにて可溶化する。可溶化後、遠心分離を行い、上清を不溶性画分として回収する。【０２０４】
発現誘導前のサンプル、発現誘導後の可溶性画分、発現誘導後の不溶性画分をそれぞれ２×サンプルバッファーと等量混合し、９９℃で５分、熱処理を行い、泳動サンプルとした。５−２０％グラジエントゲルで２０ｍＡ、７０分ほどＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動の結果、蛍光菌ＨａｓＡが好適に発現できていることを確認した。【０２０５】
大腸菌のグリセロールストックから植菌し、１０ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）にて３７℃、一晩、培養した。１００ｍＬのＴＢ培地（抗生物質入り）に、前培養液を１０ｍＬ添加し、３７℃にて培養した。ＯＤ＝１．０付近になったら、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、３０℃で１６ｈ、引き続き培養した。【０２０６】
発現大腸菌を遠心分離して回収し、１０ｍＬの大腸菌溶出バッファー（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ））又は超音波洗浄することで溶菌した。大腸菌溶解液を遠心分離し、可溶性の上清を回収する。Ｎｉアフィニティーカラムに１ｍＬのレジン（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ））を添加し、平衡化する。上清を平衡化したレジンに添加し、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質を結合させる。カラムに１０ｍＬの洗浄バッファーを添加し、レジンを洗浄する。カラムに３ｍＬの溶出バッファーを添加して、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質を溶出した。【０２０７】
尚、その際、平衡化／洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）、溶出バッファー（１５０ｍＭ  意味だぞぇ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ３００ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８）を使用した。【０２０８】
３ｍＬの溶出バッファー中の蛍光菌ＨａｓＡ（濃度：６３０μM）として得られた。１８ｍｍφ試験管中に撹拌子を入れ、該ＨａｓＡ濃度（２０μＭ）を調整済のナノ酸素バブル水（５ｍＬ）を入れ、３日以上、栓をせずに７００ｒｐｍにて撹拌することにより、該ＨａｓＡのヘムが崩壊（４１０ｎｍの吸収が消え）して、不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体が形成（ｇ＝６→ｇ＝４．３）される。尚、蛍光菌ＨａｓＡ（濃度：６３０μＭ）を自然乾燥したサンプルを用い、ＦＴＩＲやＥＳＴなどの測定に用いることができる。【０２０９】
尚、上述の大腸菌発現からの蛍光菌ＨａｓＡ産生プロセスは、緑膿菌由来ＨａｓＡや結核菌由来ＨａｓＡについても対応している。即ち、緑膿菌や結核菌由来の大腸菌発についても、ＨａｓＡ濃度（２０μＭ）にてナノ酸素バブル水（５ｍＬ）溶媒中、３日以上、栓をせずに７００ｒｐｍにて撹拌することで、不斉酸化反応を発現する。【０２１０】
微生物発現−蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）の構成成分は、図３（構成成分）に示す分布にあり、図４（ＦＴＩＲ）のＦｅ−Ｏ／Ｓ−Ｏバイブレーション、図９（ＥＳＲ）のノンヘム型吸収（活性酸素種：Ｆｅ−Ｏ、ｇ＝  ４．３）などの物理化学的な分子構造測定より参考にできる。【０２１１】
実施例３（本発明の（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡと（ｂ）ＨａｓＡｐｆのＦＴ−ＩＲ分析）
図４は、ＦＴ−ＩＲ（株式会社エス・テイ・ジャパン、ポータブル ＡＴＲ 装置  (A２ Technologes, ML version)、ＡＴＲ法）にて調べた結果である。（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡは、第１工程にて得られるＭＥ上清液を遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）したろ液の乾燥品である。尚、（ｂ）ＨａｓＡｐｆは、前記の手法にて、蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子を大腸菌発現して得られたタンパク質である。【０２１２】
実施例３（本発明の（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡと（ｂ）ＨａｓＡｐｆのＥＳＲ分析）
図９は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）装置（日本電子製ＪＥＳＦＡ２００型）の測定装置、測定条件：Magnetic field (３２２.５±２５０mT) ,Modulation Field (０.６mT), Time Constant (０.３ sec), Microwave Power (１mW), Sweep Time （８ｍｉｎ），Temperature （−１６２℃）で測定した結果である。（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡの乾燥条件は、室温大気下で水分を蒸発、得られた固形分を真空乾燥、そしてＥＳＲ試料管に分取し、真空脱気してサンプルとした。（ｂ）ＨａｓＡｐｆの乾燥は、室温大気下で水分を蒸発後、得られた固形分をＥＳＲ試料管に分取し、真空脱気してサンプルとした。【０２１３】
ＥＳＲの結果、（ａ）ＰＰ−ＨａｓＡはＦｅ３+のｇ＝４．３の吸収が、（ｂ）ＨａｓＡｐｆでは、ｇ＝６．０の吸収から、ヘム鉄状態にて確認された。蛍光菌ＨａｓＡ遺伝子発現HasA pfは、６３０μM(APPROX)／１.０mL、His-Tag MW:２３０６）の液体を大気乾燥させた。【０２１４】
実施例４（活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
下記Ａ〜Ｄのサンプル各１０μＬについて、テフコ(株)製プレキャストゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ mini）を用いて、分子量の決定を行った。染色には、ＣＢＢ染色液を用いた。尚、遠心分離は、日立工機株式会社製、ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇを用いて、１０，０００ｒｐｍ、１０分間にて行った。
Ａ）実施例１のＰＰゲルより溶出のＰＣ水溶液。
Ｂ）該遠心分離沈殿物を０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ＝９〜１１）に再溶解させたて得られたＭＥ溶液の遠心上清画分。
Ｃ）該サンプルＢを遠心濾過（Vivaspin ２-１０ K）したろ液画分。
Ｄ）基質Ｒａｃ−２による不斉酸化反応とヘキサン抽出を実施後のサンプルＣ残存物。【０２１５】
結果を図６に示す。バンド１（３９ｋＤａ）は、不斉酸化反応後及び／又はヘキサン抽出後に、バンド２（２１ｋＤａ）へ変化した。即ち、不斉酸化活性は、バンド１（３９ｋＤａ）のＨａｓＡ−レドキシン複合体にあり、不斉酸化反応後及び／又はヘキサン抽出後に、活性を失ったバンド２（２１ｋＤａ）のＨａｓＡへと変化している。【０２１６】
実施例５（バンド２の蛋白質同定）
実施例４で得た、ＳＤＳバンド２を切り離し、プロテイシーケンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−２１Ａ）にてアミノ酸配列解析を行った。結果を表１に示す。【０２１７】
【表１】
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【０２１８】
更に、表１のアミノ酸配列を、蛋白質の為の同定データベースにて解析（ＢＬＡＳＴ）を行った。このＢＬＡＳＴは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ解析ページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中の「protein blast」から、テキストボックスに検索したいアミノ酸配列を入力することで得ることが出来る。ＢＬＡＳＴによる検索結果のうち、９３％以上の誤差範囲にてヒットしたものを表２に示す。【０２１９】
【表２】
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【０２２０】
以上の結果より、バンド２は、蛍光菌ＨａｓＡであることを導いた。【０２２１】
実施例６（第２の工程、ＰＣとＭＥの生化学的性質）
図１における第１の工程“空気酸化処理”“溶出処理”“遠心沈殿物回収”（ＰＣ溶出・ＰＣ沈殿物回収）、第２の工程“ＰＣ沈殿物コーティング処理”“遠心沈殿物回収”（ＭＥ沈殿物回収）段階における、１）各種フラクションの活性強度モニタリング（図５）と、２）その溶存酸素濃度（ＤＯ）変化のモニタリング（図８）、更に、第３の工程“ＡＧ／ＣＭ−ＭＥ”の３）ＤＭＳＯ添加濃度の及ぼす活性への影響（図１３）を調べたものである。【０２２２】
図５は、ＰＣ懸濁液（PC suspension）、遠心ＰＣ上清（Supernatant）、遠心ＰＣ沈殿物（Precipitate）、カルボキシ−セルロースコーティングしたＰＣ沈殿物（CM-Cellulose coating PC）、及びグルタルアルデヒド架橋させたＰＣ沈殿物（CLPC）の示す不斉酸化活性の結果をまとめた図である。この結果から、好適な活性が観られる一方、遠心分離ＰＣ沈殿物では反応は好ましくなかった。図１０のように、ＰＣ沈殿物に５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０〜ｐＨ１１．０）緩衝液に再溶解することで、そのＭＥ沈殿物は、セルロースコーティングＰＣ様に活性化する。詳細変化を追跡できないまでも、ＰＣ→ＭＥ処理の生化学的意義は確認できている。【０２２３】
図８に示すように、ジャーファメンタ中のＰＣ上清画分、ＰＣ沈殿物、ＭＥ上清画分、ＭＥ沈殿物の溶存酸素量（ＤＯ）は、何れについても数時間で０．２ｍｇ／Ｌとゼロ近くまで低下する。２４時間後、酸素供給を開始してもＤＯは０．６ｍｇ／Ｌ付近で安定する。以上から、ＰＣ及びＭＥ中のＨａｓＡ−レドキシン複合体は、常時、溶存酸素濃度を低下させる働きを示す一方で、０．６ｍｇ／Ｌ以下には低下しない。【０２２４】
更なるＨａｓＡ−レドキシン複合体の生化学的性質を探索する目的で、図１３は、ナノ酸素バブル水溶媒中（５ｍＬ）におけるＲａｃ−２（１．２ｍＭ×３）の、補助溶媒ＤＭＤＯ(ＩＰＡ，エタノール)濃度（２％、４％、６％、８％）における、ＡＧ／ＣＭ−ＭＥ（５０ｍｇ）不斉酸化活性への影響の概略をグラフ化したものである。“１．２ｍＭ×３”とは、２０,０００ｐｐｍ基質溶液３０μＬをそれぞれ０時間後添加（１．２ｍＭ）、１５時間後添加（２．４ｍＭ）、３０時間後添加（３．６ｍＭ）の濃度にまで加えた時の、ＤＭＤＯ(ＩＰＡ，エタノール)濃度の影響を示している。【０２２５】
図１３より、ＡＧ／ＣＭ−ＭＥ酸化活性は、０％〜３％まで補助溶媒ＤＭＤＯの影響を受けないが、濃度６％以上になると不斉酸化活性は半分以下に低下している。これらの結果から、ＨａｓＡ−レドキシン複合体は、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＩＰＡ，エタノール、ジエチルエーテル、ヘキサンなど）濃度が３％以上となると、ＨａｓＡとレドキシンに分解してしまい、その活性を失ってゆく。従って、ＡＧ／ＣＭ−ＭＥを連続再利用する場合は、有機溶媒濃度に注意する必要がある。３％以下のＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノールからなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも、該蛋白質複合体が触媒活性を損なわなわれない。【０２２６】
実施例８（エンドウ蛋白質中の蛍光菌ＨａｓＡについて）
図１０は、エンドウ豆から蛍光菌由来ＨａｓＡ−レドキシン複合体が得られる理由について検討したものである。つまり、原料のエンドウ豆タンパク質中にコンタミする微生物は、その他の材料（アルギン酸ナトリウム粉末、塩化カルシウム粉末、蒸留水中には菌は居なかった。以上の理由を以下のように詳述する。【０２２７】
図１０より、原料のエンドウ蛋白質（ＰＰ）中の微生物コンタミとしては、１）耐熱性の胞子を形成するグラム陽性桿菌で自然界に広く分布している好気性芽胞菌と、２）人や動物の皮膚からよく分離されるカタラーゼ陽性グラム陽性球菌の２種類が確認された。アルギン酸ゲル包括エンドウ蛋白（ＰＰ  ｇｅｌ）、ＰＣ溶出液、ＭＥ溶液の菌対数は何れも∞、一方、ＦＤ乾燥後の各沈殿物のフラクションの菌体数はＮＤを示した。【０２２８】
エンドウ豆から溶出される蛍光菌ＨａｓＡは、他の微生物の成長を抑え、抗菌物質などの化合物を生産して宿主成長を促すため、農業分野では散布薬として利用されている。蛍光菌Pseudomonas fluorescensPf-５は共生細菌として、宿主に同化し、植物内細胞・組織に保持され、子孫に受け継がれる。従って、エンドウ豆遺伝子中にＨａｓＡがＢＬＡＳＴヒットしない理由は、検出される蛍光菌ＨａｓＡがエンドウ豆共生の蛍光菌に由来するものであるからである。従って、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図６）とＮ末端シーケンス（図１１）から確認される蛍光菌は妥当性を有し、更に、蛍光菌ＨａｓＡは、宿主のエンドウ豆中で、酸素存在下でＨａｓＡ−レドキシン複合体を形成することにより、シトクロムＰ４５０と同様に、物質変換の二次代謝系に寄与していることを新たに示すことを示している。【０２２９】
実施例７（ＳＤＳ−ｐａｇｅの膜蛋白質（ＭＥ）の成分検討）
また、実施例４の他のＳＤＳバンド（図６：バンド３〜４）につき、LCMS-IT-TOF（SHIMAZU: mode; nanoESI+: MS range: MS１ （m/z ４００-１５００） MS２ （m/z ５０-１５００） data-dependent scan; flow rate: ３００ nL/min; flow solvent: A = ０.１％ formic acid/２％ acetonitrile, B = ０.１％ formic acid/８０％ acetonitrile; gradient: ５-４０％ B/０-３０  ｍｉｎ, ４０-１００％ B/３０-４０  ｍｉｎ, １００％ B/４０-６０  ｍｉｎ）とMASCOT解析による蛋白質同定を示した結果が表４（バンド５のみ）、表２のその他のバンドの蛋白質同定関してはPMF法（BIFLEX III （Bruker Daltonics: mode; positive/reflector: matrix; α-cyano-４-  hydroxy cinnamic acid （CHCA）; target plate; peptide calibration standards; angiotensin II （[M+H]+ = １０４６.５４２）, angiotensin I  （[M + H]+ = １２９６.６８５）, substance （[M + H]+ = １３４７.７３６）, bombesin （[M + H]+  = １６１９.８２３）, ACTH１-１７ （[M + H]+ = ２０９３.０８７）, ACTH１８-３９ （[M + H]+ = ２４６５.１９９））とMASCOT解析により判定した。【０２３０】
【表３】
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【０２３１】
表２のバンド４のABC−Transporterは、ＨａｓＡの隠れ家となる膜タンパク質であり、膜（脂肪酸とグリセリン）と共に容易に遠心沈殿できる。以上の理由から、ＨａｓＡを含む膜組織、更には、空気酸化によって形成されたＨａｓＡ−レドキシン複合体として、沈殿回収できたと考えられる。膜蛋白中から離れた水溶性ＨａｓＡは、上清画分に存在し、図１の遠心濾過工程（分子量１０ｋＤａ； Vivaspin ２-１０ K）を組合せて、純粋なＨａｓＡ−レドキシン複合体に生成可能であった。【０２３２】
更に、表２のバンド３のligand-binding receptorは、ＨａｓＲと呼ばれる膜タンパク質であり、ＨａｓＡが捕獲したヘムを受取り、菌体内へ取込む機能を果たしている。従って、ＨａｓＡを含む膜組織、更には、酸化形成されたＨａｓＡ−レドキシン複合体として沈殿回収できる。ここでレドキシンとは、鉄イオウクラスタ構造を有するタンパク質（フェレドキシンやルブレドキシンなど）であるが、例えば、前述したＨａｓＡ発現に関与するタンパク質（ＩＲＰ、ＩＲＥ，ＩＲＲ）も、ＨａｓＡ−レドキシン複合体のレドキシン類として含むもととする。【０２３３】
実施例８（ＨａｓＡ−レドキシン複合体のカタラーゼ活性）
図３と図４と図９の無機元素分析の結果より、ヘム蛋白質又は鉄イオウクラスタによるフェントン反応系（Fe(II) + O２ → Fe(III)-O-O- → Fe(IV)=O (oxidizing rac-１／ -２) → Fe(II) + H２O）が示めされたことより、該カチオン性蛋白質のカタラーゼ活性について、その特徴について検討した。表３にまとめた。【０２３４】
カタラーゼ試験は、１８ｍｍφ試験管中に１５ｍｇの各サンプルを入れ、５％−Ｈ２Ｏ２水溶液（１ｍＬ）を加えてその泡立つ高さを比較したものである。表３に示す不斉酸化活性は、ＭＥ沈殿物はＰＣ沈殿物との間で約２．５倍のカタラーゼ活性強度を示し、微生物発現ＨａｓＡｐｆ−乾燥品に対しては、凡そ２．５倍のカララーゼ活性強度を示した。尚、該カタラーゼ活性の測定は、実施例８に基づく「泡立ち」視認によって評価された。【０２３５】
【表４】
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【０２３６】
実施例８（カタラーゼ活性の測定；「泡立ち」視認による測定）
実施例７で得られたＭＥ沈殿物（１５ｍｇ）とＰＣ沈殿物（１５ｍｇ）と微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１５ｍｇ）に対して、１８ｍｍφ試験管中それぞれ、５％−Ｈ２Ｏ２（１ｍＬ）を添加したところ、ＭＥ沈殿物溶液は、ＰＣ沈殿物に比べて顕著に激しく泡立ち、該溶液１．０ｍＬの嵩を泡容積により５倍膨張させ、ＰＣ沈殿物は４倍程度に膨張、約５分後には、元の嵩に落ち着いた。一方、微生物発現ＨａｓＡｐｆにおいては、該溶液表層部で２倍程度に酸素発生し、５分後には泡立ちは収まった。
以下の各実施例において、反応後のＨ２Ｏ２残存量とＨ２Ｏ２消費量を算出して、カタラーゼ活性の強度を調べた。【０２３７】
実施例９（カタラーゼ活性の測定；過酸化水素濃度計による測定）
水中に含まれる過酸化水素の屈折率の強さから濃度を算出できるアタゴ社製の過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓ（デジタル表示）を用いて、ＰＣのカララーゼ活性を測定した。なお、ここで使用した過酸化水素濃度計の詳細に関しては、必要に応じて、下記のＵＲＬを参照することができる。
http://www.atago.net/japanese/products_pal_top.html【０２３８】
カタラーゼ活性の測定は、１８ｍｍφ試験管中に、各サンプル：１）ＭＥ沈殿物（１５ｍｇ）、２）ＰＣ沈殿物（１５ｍｇ）、又は３）微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１５ｍｇ）と５％過酸化水素水（１ｍL）を加え、３７℃で５分間、撹拌（７００ｒｐｍ）した。該反応液を遠心分離（３６００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して、その上清み０．３ｍＬを、過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓのプリズム面にたらして測定した。同時に、同条件にて、５％過酸化水素水（１ｍL）と純水（１ｍL）を入れ替えて測定を行い、ＭＥ沈殿物（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク１」、ＰＣ沈殿物（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク２」、微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク２」とした。【０２３９】
以上から、ＰＥＧ−ＰＣを使用した場合の反応系におけるＨ２Ｏ２消費量と、ＣＬＰＣを使用した場合の反応系におけるＨ２Ｏ２消費量とは、以下のように計算することができる。表４にはその結果を示す。
反応後のＨ２Ｏ２残存量（ＭＥ沈殿物）＝（実測値：８．０％）−（ブランク１値：２．２％）＝５．８％
反応後のＨ２Ｏ２残存量（ＰＣ沈殿物）＝（実測値：８.２％）−（ブランク２値：２．４％）＝６．０％
反応後のＨ２Ｏ２残存量（微生物発現ＨａｓＡｐｆ）＝（実測値：８.４％）−（ブランク３値：２．０％）＝６．４％
Ｈ２Ｏ２消費量（ＭＥ沈殿物）＝（ＢＬＡＮＫ系におけるＨ２Ｏ２残存量：６．８％）−（ＭＥ沈殿物反応後のＨ２Ｏ２残存量：５．８％）＝１．０％（相対値で１４．７％消費）
Ｈ２Ｏ２消費量（ＰＣ沈殿物）＝（ＢＬＡＮＫ系におけるＨ２Ｏ２残存量：６．８％）−（ＣＬＰＣ−ＰＣ反応後のＨ２Ｏ２残存量：６．０％）＝０．８％（相対値で１１．８％消費）
Ｈ２Ｏ２消費量（微生物発現ＨａｓＡｐｆ）＝（ＢＬＡＮＫ系におけるＨ２Ｏ２残存量：６．８％）−（ＣＬＰＣ−ＰＣ反応後のＨ２Ｏ２残存量：６．４％）＝０．４％（相対値で５．９％消費）【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
表４に示した過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓの結果から、実験において発生した「泡」の正体は酸素であって、過酸化水素を水と酸素に変えるカタラーゼ活性の酵素の関与が確定された。従って、ＭＥ沈殿物（１５ｍｇ）は、５％−過酸化水素水に対して、およそ１０，０００ｐｐｍ消費のカタラーゼ活性、ＰＣ沈殿物（１５ｍｇ）についてはおよそ８０００ｐｐｍ消費のカタラーゼ活性、微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１５ｍｇ）についてはおよそ４０００ｐｐｍ消費のカタラーゼ活性を示した。【０２４２】
従って、１分間当りに１μモルの基質（Ｈ２Ｏ２：ＭＷ３４）を変化させることができるＭＥ沈殿物量又はＰＣ沈殿物量又は微生物発現ＨａｓＡｐｆを計算することで、各触媒の活性（ユニット）を、以下のように算出できる。
６．８％−Ｈ２Ｏ２ａｑ．＝６８ｍｇ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２＝２ｍＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２【０２４３】
このうち、各触媒の消費量は、上記の「表４］の消費％を参考にすると、５分間当りでは、以下の通りとなる。
＊ＭＥ沈殿物（１５ｍｇ）＝２ｍＭ／ｍＬ×０．１４７＝２９４μＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２従って、ユニット＝１５０００÷２９４≒５０μｇ／μＭ。
＊ＰＣ沈殿物（１５ｍｇ）＝２ｍＭ／ｍＬ×０．１１８＝２３６μＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２従って、ユニット＝１５０００÷２３６≒６３．５μｇ／μＭ。
＊微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１５ｍｇ）＝２ｍＭ／ｍＬ×０．０５９＝１１８μＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２
従って、ユニット＝１５０００÷１１８≒１２７μｇ／μＭ。【０２４４】
以上の結果から、５分間当りに１μモルの基質（Ｈ２Ｏ２：ＭＷ３４）を変化させることができるＭＥ沈殿物（５０μｇ）のもつカタラーゼ活性は、ＰＣ沈殿物（６３．５μｇ）の１．３倍、微生物発現ＨａｓＡｐｆ（１１８μｇ）の２．３倍であることが明らかとなった。この結果は。表３で示したＭＥ沈殿物とＰＣ沈殿物と微生物発現ＨａｓＡｐｆの泡の観察結果とほぼ同等の結果であった。【０２４５】
以上の各実施例の結果、ＭＥ沈殿物に比べて、微生物発現ＨａｓＡｐｆの２．３倍、ＰＣ沈殿物の１．３倍のカタラーゼ活性及び／又はレドキシン類量（フェレドキシン、ルブレドキシン、ＩＲＰ、ＩＲＥ，ＩＲＲなど）を含まれることが示唆でき、これらのレドキシン類が蛍光菌ＨａｓＡと複合体を形成することにより、不斉酸化活性を発現するものと確認できた。微生物発現ＨａｓＡｐｆは、分光光度計４１０ｎｍにヘム吸収が観られる一方、ナノ酸素バブル水中にて５０時間程度の共存・撹拌することで、不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体を形成；即ち、５０時間以降、分光光度計４１０ｎｍにピークは無くなりノンヘム型−レドキシン酸化物を形成する（図４と図９を参照）。【０２４６】
実施例１０（ＣＭＭＥの連続再利用の有効性）
図１４に示すように、ＣＭＭＥ（２０ｍｇ）とＡＧＭＥ（２０ｍｇ）を蒸留水（４ｍＬ）／ＤＭＳＯ（＜１．０％（ｖ／ｖ））中、基質Ｒａｃ−２（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）の添加にて反応させた。反応終了後は、遠心分離して上清を回収、沈殿物に蒸留水（４ｍＬ）を加え、基質Ｒａｃ−２（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）を加え反応させた。【０２４７】
連続再利用の操作は、ＣＭＭＥ（Ｓ体の合成）において、１回目−１６時間後、２回目−２８時間後、３回目−３８時間後、ＡＧＭＥ（Ｒ体の合成）において、１回目−１３時間後、２回目−２０時間後、３回目−２５時間後を目途に行い、各上清は、ヘキサン（４．０ｍＬ）を加え均一後、ヘキサン１０μＬを光学分割カラムに挿入ＨＰＬＣ測定により定量と光学純度を行った。その結果を表５に示す。【０２４８】
【表６】
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【０２４９】
表５と図１４から、最低３回までの連続再利用が光学純度と収率を損なうことなく可能であることが分かった。ＣＭＭＥは立体選択的なＲ体酸化により、Ｓ−２（＞９９％ｅｅ／〜５０％）を合成できるのに対し、ＡＧＭＥは立体選択的なＳ体酸化により、Ｒ−２（＞９９％ｅｅ／〜５０％）を合成できた。但し、ＡＧＭＥのＳ体酸化は、引き続き、Ｒ体酸化を生じて全てケトンとなる為、反応を停止させる時間を厳守する必要がある。【０２５０】
以上の結果、ＣＭＭＥとＡＧＭＥのようなコーティングするＰＥＧ分子量の違い（ＣＭＭＥはＰＥＧ４０００コーティング、ＡＧＭＥはＰＥＧ１０００コーティング）だけで、両鏡像体の使い分け合成が可能となる。
本発明では、ＨａｓＡ−レドキシン複合体が不斉酸化触媒となるだけでなく、コーティング剤により、目的に応じた立体選択性を示す該複合体の処理方法を開示している。【０２５１】
実施例１１（酵素固定化担体−蛍光菌HasA生産とその構造機能）
ＣＭＭＥとＡＧＭＥ反応系での連続再利用は、水溶液中の有機溶媒濃度が３％以上となると活性が激減するデメリットが有る為、１）有機溶媒耐性、且つ２）連続再利用の有効性の固定化酵素を見出す必要性があった。そこで、実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）より得られる大腸菌発現−蛍光菌HasA溶液（１．８ｍｇ／ｍＬ）×５倍量を、酵素固定化担体−東洋電化工業製トヨナイト（１０００ｍｇ）に吸着固定化することで、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用の有効性、そして３）有機合成反応後の容易分離を可能にすることができた。トヨナイトを使った詳しい手順は次の通りである。【０２５２】
実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）より調整された大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ量は、１回目（６００ｍＬフラスコ培養規模）で凡そ３６ｍｇ（１．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、液量２０ｍｌ）、２回目（４０００ｍＬフラスコ培養規模）で凡そ２００ｍｇ（１．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、液量１１０ｍｌ）であった。図１８には、その蛍光菌ＨａｓＡ（ＨａｓＡｐｆ）精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。【０２５３】
図１９には、大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（凡そ０．４ｍｇ／４ｍＬ−イオン交換水）による基質ｒａｃ−１（凡そ０．３６ｍｇ／４ｍＬ−イオン交換水）の不斉酸化反応に供した結果を示している。具体的な反応操作方法としては、イオン交換水２０ｍＬに対して、大腸菌発現させた蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（１．８ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加して、４ｍＬづつ５本のスピッツ管に分注し、触媒濃度としておよそ０．３６ｍｇ／４ｍＬ溶液を調整し、予め４０℃環境下として撹拌子を挿入した。【０２５４】
図１９は、各スピッツ管に基質ｒａｃ−１／ＩＰＡ（２−プロパノール）溶液（４０，０００ｐｐｍ：１０μＬ）をそれぞれ加えることで、基質濃度（およそ０．４ｍｇ）／４ｍＬ溶液として、４０℃で撹拌／反応を開始、任意に反応追跡を行った結果である。図７との違いは蛍光菌ＨａｓＡｐｆ濃度であり、図１９は図７の時の濃度の凡そ２倍となっている。その結果、反応時間は約２０時間短縮された結果となっている。【０２５５】
【表７】
2017038107.tif 000018
【０２５６】
図２０は、図１９の不斉酸化反応開始後0ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後のＵＶスペクトルを測定した結果を示す。蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／ヘムの状態を知る目的であるが、生成ケトンのスペクトル（３５０ｎｍ）が反応時間が進むにつれ、徐々に強い吸光度を示す一方、ヘム（ポルフィリン鉄錯体）スペクトル（４１０ｎｍ）の示す吸収強度差が殆どない点から、不斉酸化反応に伴うＨａｓＡｐｆ／ヘムのノンヘム型への変化は、７２ｈ反応期間中、生じないことが確認された。【０２５７】
そこで、この不斉変換時におけるHasApf／ヘムの構造的変化を更にESRスペクトルにて確認した。図２１は、図１９の不斉酸化反応開始後０ｈ、５０ｈ、１００ｈ後のＥＳＲスペクトルをモニタリングした結果である。０ｈ後のＥＳＲシグナル（ｇ＝２．８、２．２２、１．７２）が確認できることより、蛍光菌ＨａｓＡｐｆヘムは、近接ヒツチジン（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｉｔｅ）と末端チロシン（ｄｉｓｔａｌ  ｓｉｔｅ）の６配位の低スピン状態にあり、チトクロームＰ４５０のように近接システイン且つ酸素分子が自由配位できる末端オープン構造にないことが確認できた。５０ｈ後の状態から、ＥＳＲシグナル（ｇ＝２．８、２．２２、１．７２）が消失しており、低スピン状態の酸化型ヘムの信号ｇ＝２．８，  ２．２２，  １．７２が消失する点から、ＯＨ−などの強い配位子場を与える配位子がヘムの上下に結合して歪みが生じ、活性酸素種生成に伴う酸化反応がおこることが確認できた。【０２５８】
更に、図２２より、不斉酸化反応開始１００ｈ後のＥＳＲシグナルｇ＝４．３と２．０を示すことから、オキソフェリル種（ＦｅＩＶ＝Ｏ）が確認されるに至り、以上の結果から、ヘモフォアＨａｓＡｐｆ／ヘムはチトクローム−Ｐ４５０と同様に、活性酸素種生成に伴う酸化反応機構（ＦｅＩＩ＋Ｏ２→ＦｅＩＩＩ-Ｏ-Ｏ-→ＦｅＩＶ＝Ｏ（ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｒａｃ−１）→ＦｅＩＩ＋Ｈ２Ｏ）を有することを明確化できた。図９にもＥＰＲシグナルを示しているが、図２０と図２１と図２２によって、不斉酸化反応に伴うヘモフォアＨａｓＡｐｆのヘムの上下に結合して歪みの状態までも推定しており、チトクロームＰ４５０のように酸素分子が自由配位できる５配低型高スピン状態末端オープン構造にないＨａｓＡにあっても酸化的触媒機能は起こり得ることが明確化された。【０２５９】
実施例１２（酵素固定化担体−蛍光菌HasAのトヨナイトへの吸着性）
そこで、該ＨａｓＡｐｆを更に、固定化担体トヨナイトに吸着固定化させたＨａｓＡｐｆを用いた連続再利用の有効性について詳しく述べる。先ず、トヨナイトはリパーゼ不斉加水分解酵素を吸着固定化した実績があるため、トヨナイト固定化担体の概要について説明する。図２５と図２６と図２７は、Ｔｏｙｏｎｉｔｅの細孔分布、ＳＥＭ写真、トヨナイトの種類について同社パンフレットから引用したものである。【０２６０】
トヨナイトは、カオリナイト物質を酸性水熱処理後、造粒焼成し、表面を有機官能基で修飾した多孔質セラミックス球状担体で（図２５と図２６）、酵素の固定化力が強く活性発現及び長期安定性に優れ、医薬や農薬の中間体、化学品等の工業スケールの製造に適し、東洋電化工業より発売されている酵素固定化担体である。【０２６１】
Toyonite特徴を要約：（１）酵素の固定化が容易：  微細な細孔（細孔分布及びSEM写真）と担体表面の有機官能基の効果により、粗酵素溶液に投入撹拌するだけで酵素蛋白を容易に固定化できる。（２）高い活性の発現: それぞれの酵素に応じた表面修飾タイプの選択により、酵素と結合力を高め、多量の酵素を固定化でき、高い活性を発現します。そのため、バイオリアクター及び関連装置のコンパクト化が可能。（３）長期反応安定化の確保: 表面を修飾した有機官能基が酵素と強固に結合する為、活性の低下が非常に少なく長期くり返し使用が可能。（４）圧力変形しない：強度に優れた球状のセラミックス担体は、カラムに充填しても圧力変形をしない。そのため、工業スケールにおける圧密の心配がない。（５）強い耐薬品性：  カオリナイト質セラミックス担体であるため、酸、アルカリ、有機溶媒等の耐薬品性に優れている。【０２６２】
物性：平均粒径−１５５±１５μｍ、見かけ嵩密度−０．６８±０．１５ｇ／ｍＬ、耐薬品性−酸、アルカリ  ｐＨ２〜１０で使用可能、耐熱性−１２０℃の加熱殺菌が可能です。【０２６３】
Ｔｏｙｏｎｉｔｅの種類：トヨナイトは、２００と２００−Ａと２００−Ｐと２００−Ｍの４種類の有機官能基を持った担体が有り（図２７）、酵素の種類によって選択することができる。また、酵素の性質に応じて種々の官能基で表面を修飾することにより固定化の性能を向上させることが可能です。タイプ１：Ｔｏｙｏｎｉｔｅ２００−有機官能基として水酸基を持つ担体、タイプ２：Ｔｏｙｏｎｉｔｅ２００Ａ−有機官能基としてアミノ基を持つ担体、タイプ３：Ｔｏｙｏｎｉｔｅ２００Ｐ−有機官能基としてフェニルアミノ基を持つ担体、タイプ４：Ｔｏｙｏｎｉｔｅ２００Ｍ−有機官能基としてメタクリロ基を持つ担体  の４種類がある。【０２６４】
本題のＨａｓＡｐｆのトヨナイトへの吸着固定化について述べるが、先ず、図２３のように、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体への吸着性（結論として、２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ）を検討した実施例（吸着固定化手順、反応操作方法など）を詳述する。【０２６５】
大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（１．８ｍｇ／ｍＬ）５倍量を、酵素固定化担体−東洋電化工業製トヨナイト（１，０００ｍｇ）に吸着固定化させた。
（１）ＨａｓＡ溶液：  実施例２（ＨａｓＡ遺伝子の微生物発現方法）の方法より大腸菌発現−蛍光菌ＨａｓＡ溶液（濃度：１．８ｍｇ／ｍＬ）を調整する。
（２）固定化：上記（１）の操作で得られたＨａｓＡ溶液５ｍＬに対して、トヨナイト（１０００ｍｇ）を投下し、２０〜４０時間撹拌します。撹拌は撹拌羽根または振とう機を使用します。マグネティックスターラを使用すると担体粒子を破壊したり、撹拌子が摩耗する恐れがある。固定化後、ろ過により固定化酵素を得る。
（３）固定化ＨａｓＡの後処理：上記（２）の操作で得られた固定化ＨａｓＡは低温風またはデシケータ中で乾燥し、それぞれのＨａｓＡに適した条件で保管した。【０２６６】
図２３のように、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト固定化担体への吸着性はトヨナイト２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順で良好に進行した。茶色ＨａｓＡｐｆ溶液は次の様に変化した。
・Ｔ２００・・・ＨａｓＡ溶液が透明となった。
・Ｔ２００Ａ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｐ・・・ＨａｓＡ溶液が薄茶色となった。
・Ｔ２００Ｍ・・・ＨａｓＡ溶液は薄茶色（やや濃い目）となった。【０２６７】
次に、各種トヨナイト吸着−４８時間後の１）ＨａｓＡ溶液残渣による活性強度、２）各種トヨナイトによる活性強度、３）その光学純度の結果を図２４に示した。茶色ＨａｓＡ溶液のオリジナルな不斉酸化反応を図１９に示すが、図２４では、ＨａｓＡｐｆのトヨナイト吸着率を示す。青・赤・黄色グラフの具体的な説明は次の通りである。
１．（青）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、の各ＨａｓＡ残渣（０．２ｍＬ／イオン交換水（４ｍＬ／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた生成ケトン％結果である。
２．（赤）−スピッツ管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）に、ＨａｓＡ固定化担体（１０ｍｇ分／イオン交換水（４ｍＬ）／基質ｒａｃ−１（０．４ｍｇ）スケールで５０時間、撹拌子反応させた生成ケトン％結果である。
３．（緑）−ＨａｓＡ固定化担体（１０ｍｇ分：赤スケール）における、Ｓ−アルコールの光学純度を示す。【０２６８】
以上の結果から、ＨａｓＡｐｆはトヨナイト固定化担体と好適に吸着固定化され、トヨナイトがリパーゼのときと同様に、固定化剤として利用可能であることが示された。トヨナイトのＨａｓＡｐｆ吸着性については、ＨａｓＡｐｆ溶液濁度の色の変化から、Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍの順であった。この吸着性の違いは、トヨナイト４種類の有機官能基の効果にあり、更に基質濃度を０．８ｍＭから１．２ｍＭと２．０ｍＭへ変化させ、ヘキサン（有機溶媒）抽出後の反応溶液の連続再利用を４回まで繰り返すことより、１）有機溶媒への耐性、及び２）連続再利用の効果を確認することにした。【０２６９】
実施例１３（酵素固定化担体−トヨナイトテストを用いた連続再利用の有効性）
図２８と図２９は、試験管（１８ｍｍ×１５ｍＬ）中にて、基質ｒａｃ−１（０．８  ｍＭ、１．２  ｍＭ、２．０  ｍＭ；  ０．２４〜０．４８  ｍｇ相当）／トヨナイト固定化ＨａｓＡｐｆ担体（３０ｍｇ）／イオン交換水（４ｍＬ）にて、４０℃の環境にて撹拌（７００ｒｐｍ）反応させ、反応時間５０ｈ又は７２ｈ後にヘキサン（４ｍＬ）抽出して、ＳとＲ体の比率の光学純度（％ｅｅ）と生成ケトンへの変換率（％）を確認した結果を示している。【０２７０】
本研究は、水溶液中有機溶媒濃度３％以上で失活するＣＭＭＥ／ＡＧＭＥ系について、ＨａｓＡｐｆ固定化トヨナイト担体で解決することを目的とした。即ち、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用の有効性の固定化酵素、３）反応後処理の容易分離を可能にすること目的とした試験である。【０２７１】
図２８と図２９に示すように、ヘキサン抽出後の固定化ＨａｓＡｐｆについて、更に、基質ｒａｃ−１  （０．８  ｍＭ、１．２  ｍＭ、２．０  ｍＭ；  ０．２４〜０．４８  ｍｇ相当）を添加したみたところ、酵素等の失活は確認されず、繰り返し４回以上、連続再利用が可能であることを発見した。同時に、基質濃度を０．８ｍＭから１．２ｍＭや２．０ｍＭに変えてみた時の結果の方かを以下の様にまとめる。【０２７２】
ＨａｓＡｐｆ固定化担体としてトヨナイト２００、トヨナイト２００Ａ、トヨナイト２００Ｐ、トヨナイト２００Ｍの４種類についての評価を行った結果、
1.  トヨナイト固定化担体にＨａｓＡｐｆを吸着させることにより、ヘキサン抽出後も不
斉酸化活性が少なくとも４回以上は再現でき、有機溶媒に耐性となっていることを示
した。
2.  基質濃度１．２ｍＭ／７２ｈを参考とする結果から、各固定化担体の活性強度順は、
”Ｔ２００＞Ｔ２００Ｐ＝Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ”であり、ＨａｓＡ吸着性”Ｔ２
００＞Ｔ２００Ｐ＞Ｔ２００Ａ＞Ｔ２００Ｍ”と同様の順となった。以上から、Ｈａ
ｓＡ活性はトヨナイトへの吸着率に依存していることと判定できた。
3.  トヨナイト２００が最もＨａｓＡ吸着率が高いことが判った。【０２７３】
基質中濃度系（１．２ｍＭ、７２ｈ）において、トヨナイト２００には若干に劣るが、２００Ａも２００Ｐも２００Ｍも、光学純度（＞９５％ｅｅ）で得られる点で、好適なラセミアルコールの分割剤となることが判った。しかし、トヨナイト２００ＭはＨａｓＡ吸着量が低い為、基質濃度の上昇につれ、活性が低下する。従って、踏み込んだ考察としては、以下のように追記できる。
4.  ＨａｓＡ吸着量が活性強度を示す要因であり、トヨナイト固定化担体の有機官能基の
種類による効果は、吸着性に依存するとことが判った。
5.  基質濃度１．２  ｍＭは、ＰＰ−ＨａｓＡ同様に最適濃度である一方、固定化Ｈａｓ
Ａｐｆは、１）有機溶媒耐性、２）連続再利用有効性、３）反応後の容易分離のメリ
ットを持つ。
6.  不斉酸化反応におけて使用するＨａｓＡｐｆ量が図１９（０．３６ｍｇ）に対して、
図２８・図２９の固定化ＨａｓＡｐｆ量は（０．０９ｍｇ：１０ｍｇ）であり、凡そ
４倍の酵素量で同様の活性を賄えることを確認した。
7.  更に、図１９（０．３６ｍｇ）に対する基質濃度は０．８ｍＭ／４ｍＬ−水系なのに
対し、図２８・図２９の固定化ＨａｓＡｐｆ量は（０．０９ｍｇ：１０ｍｇ）は、１
．２ｍＭ／４ｍＬ−水系であり、約１．５倍の基質ラセミアルコールの分離に寄与で
きることを確認した。【０２７４】
以上の結果から、図３０に示すように、ＨａｓＡｐｆは、１）溶存酸素をヘムが活性酸素種に変えて、２）基質ラセミ２級アルコールの一方のみを立体選択的に酸化する反応機構を有し、３）カオリナイト物質由来固定化担体（トヨナイト）に好適に固定化できる。また、図３１に示す通り、その活性中心であるＨａｓＡｐｆ／ヘムのヘム代謝は、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ：ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）や（ＭｈｕＤ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｅｎｚｙｍｅ）が酸素依存的に触媒する系として研究されている一方で、不斉酸化反応を触媒する機能系は今回初めて発見された事例である。【０２７５】
これらをサポートする有力なデータとして、図２１や図２２のＥＳＲスペクトルでｇ＝２．８、２．２２、１．７２が消失する知見があり、従来のチトクロームＰ４５０のような、ヘムにシステインが配位した５配位型のみが酸素を配位できる活性型ヘムタンパクだけでなく、毒物分解に寄与できるという新しい概念を、本発明データは言及している。【０２７６】
実施例１４（ＰＰ−ＨａｓＡとNaBH4を用いるサイクリック−デラセミ化反応）
ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ（０．１ｇ、０．５ｇ、１．０ｇ、３．０ｇ）を生体触媒として、水溶媒系中（４００ｍＬ）、反応環境は４０℃にて基質ｒａｃ−２（１００ｍｇ）を作用させた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４：５０ｍｇ）を任意に反応系に投入し、１）デラセミ化を検討すると同時に、２）基質／触媒／溶媒の最適な反応スケールを確かめることにした。【０２７７】
先ずは、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ複合体（０．１ｇ、０．５ｇ、１．０ｇ、３．０ｇ）の最適量について調べた結果を次に示す。【０２７８】
結果から、基質１００ｍｇを０．５ｇ以上のＰＰ−ＨａｓＡｐｆにて分割合成できることが判った。従って、基質（１００ｍｇ）に対して、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ量が５００ｍｇ以上であれば完全に光学分割できることを導いた。尚、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ量５００ｍｇ／基質１００ｍｇにおいて、イオン交換水（４００ｍＬ→３００ｍＬ→２５０ｍＬ→２００ｍＬ）として検討した場合、２５０ｍＬ以上であれば、完全に光学分割できることを確認した。しかし、４０℃環境下で５０時間程度の反応であるため、水溶媒量４００ｍＬが３００ｍＬ近くまで減少することを考慮し、４００ｍＬからデータに統一した。【０２７９】
【表８】
2017038107.tif 000019
【０２８０】
次に、図３２に示す通り、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4：50ｍｇ）を定期的に投与することにより、サイクリックデラセミ化反応を生じさせる。即ち、図３３に示すように、HasApfはR-１のみをケトンに不斉酸化し、生成ケトンはNaBH4によりラセミのS体とR体へ均等に還元され、そのサイクルを継続させることで最終的に、S-アルコールの化学収率を向上させる方法である。【０２８１】
鋭意、検討を重ねた結果、次のような反応操作手順を組めば、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ（１００ｍｇ）を収率９０％以上、光学純度９８％ｅｅ以上でデラセミ化合成できることを明確化した。
（反応操作手順）
１  基質（４５ｍｇ）／水（４００ｍＬ）／ＰＰ−ＨａｓＡ  （０．５  ｇ〜３．０  
ｇ）  ａｔ  ４０℃  →  １６時間
２  基質（５５ｍｇ）添加  →  ８時間
３  ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  ５時間
４  ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  ５時間
５  ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加  →  ８時間後、修了。【０２８２】
サイクリックデラセミ化反応の結果は次の様にまとめられ、即ち、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）添加が１回きりであれば、基質ｒａｃ−２（１００ｍｇ）を作用させた場合に、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ（０．５ｇ）で収率７０％程度は得られるが、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）×３回では力価が足らずに、９１％ｅｅで収率８０％程度の成果に至る。一方、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆ  量を１．０ｇ〜２．０ｇへアップさせると、力価が十分となり、ＮａＢＨ４（５０ｍｇ）×３回でも、９９％ｅｅ以上で収率９０％以上の成果に至る。必要であることを導いた。【０２８３】
【表９】
2017038107.tif 000020
【０２８４】
以上の結果から、ＰＰ−ＨａｓＡｐｆは、ＮａＢＨ４によるサイクリックデラセミ化反応が可能であり、目的の光学活性アルコールの収量をこの添加のみで向上させ得ることを新たに見出した。ＨａｓＡｐｆ固定化担体についても、同様のａＢＨ４によるサイクリックデラセミ化反応も確認しており、このＰＰ−ＨａｓＡｐｆによる成果をＨａｓＡｐｆ固定化担体に置換えて解釈しても問題は無い。【０２８５】
なお、図１８〜３３の概略的な説明は、以下の通りである。
図の説明：
図１８：大腸菌発現ＨａｓＡ遺伝子の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果
図１９．ＨａｓＡｐｆ（０．３６ｍｇ）による基質ｒａｃ−２（０．４ｍｇ）／水溶媒中（４ｍＬ）不斉酸化反応の経時変化：光学純度（−●−：％ｅｅ），Ｓ−２（−□−：０．２ｍｇ），Ｒ−２（−○−：０．２ｍｇ），そして生成ケトン（−△−）．
図２０．蛍光菌ＨａｓＡｐｆ（０．３６ｍｇ）／基質ｒａｃ−２（０．４ｍｇ）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応におけるＵＶ測定結果（０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後）．【０２８６】
図２１．蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応０時間後と５０時間後のＥＳＲ測定結果。
図２２．蛍光菌ＨａｓＡｐｆ／基質ｒａｃ−２（ｒａｃ−２）／水溶媒中（４ｍＬ）の不斉酸化反応１００時間後のＥＳＲ測定結果。
図２３．ＨａｓＡ溶液（こげ茶色）／トヨナイトの２日振とう吸着後の透明度比較
図２４．トヨナイト吸着後の１）ＨａｓＡ溶液残渣による生成ケトン％、２）各種トヨナイトによる生成ケトン％、３）光学純度の結果【０２８７】
図２５．Ｔｏｙｏｎｉｔｅの細孔分布
図２６．ＴｏｙｏｎｉｔｅのＳＥＭ写真
図２７．４種類のＴｏｙｏｎｉｔｅの有機官能基の違いを示す図である。
図２８．トヨナイトＨａｓＡｐｆ固定化担体（２００と２００Ａ）の基質濃度と連続再利用の様子【０２８８】
図２９．トヨナイトＨａｓＡｐｆ固定化担体（２００Ｐと２００Ｍ）の基質濃度と連続再利用の様子
図３０．ＨａｓＡｐｆの不斉変換機構
図３１．ヘム代謝の経路【０２８９】
図３２．サイリックなデラセミ化反応の模式図１
図３３．サイリックなデラセミ化反応の模式図２
【産業上の利用可能性】
【０２９０】
上述したように、本発明によれば、ラセミ−２級アルコールのそれぞれの鏡像体を立体選択的に酸化できる不斉酸化反応を触媒することができ、非選択的酸化を触媒することができるＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）とその固定化体、およびその製造方法を提供することができる。【０２９１】
本発明の不斉酸化反応を有するＨａｓＡ−レドキシン複合体（ヘム鉄活性型ＨａｓＡ）とその固定化体は、医薬品や香料や食品等のファインケミカル分野において合成される光学活性アルコールなどの光学異性体を製造安価で、環境に優しく、且つ平易に生産することができる新規な不斉酸化触媒である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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