(57)【要約】  本発明は、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物に関する。本発明によれば、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントが提供される。【選択図】図１
2016194685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物。
【請求項２】
前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１〜１０００μｇで含有される、請求項３に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して１０ｍｏｌ以上の割合で含有される、請求項３または４に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇである、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法。
【請求項１１】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程；および
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系とは、生体内に侵入した異物や異常細胞等を排除して、生体を病気等から保護する防御機構である。また、アジュバントとは、ワクチンの効果を増強するために用いられる物質である。【０００３】
免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。【０００４】
液性免疫は、抗体や補体など血清中に溶解して存在する成分を中心とした機構である。抗体の誘導は、ワクチンの観点から重要であり、通常、以下のように発現する。すなわち、生体内に侵入した細菌等の外因性抗原が、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、抗原提示細胞内のエンドソームでタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が、サイトカインの放出等を行うことにより、最終的にＢ細胞から抗体が産生される。なお、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞等に発現する。抗体を増強させるアジュバントは、公的に承認されたものが多数存在している。中でもアルミニウムを含有する物質は、古い歴史を有しており、全世界において広く使用されている。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらは単に、ａｌｕｍと総称されることもある。【０００５】
一方、細胞性免疫は、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞など、異物排除を担当する細胞を中心とした機構である。細胞性免疫の誘導は、ウイルス感染細胞や癌細胞などを排除することができるため、免疫による治療の観点から大きく注目されている。特に、ＣＴＬの誘導は癌免疫療法への応用から、実現が期待されている。ＣＴＬの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞や癌細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へと分化する。なお、上記ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどすべての有核細胞および血小板の細胞表面に存在する。【０００６】
近年では、外因性抗原を用いて積極的にＣＴＬを誘導する、いわゆるクロスプレゼンテーションについての検討も多くなされている。より詳細には、外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。しかしながら、クロスプレゼンテーションにおいては、一部の量でも、外因性抗原を細胞膜あるいはエンドソームの膜を通過させて細胞質基質に移行させることにより、細胞質基質に移行した外因性抗原が内因性抗原のように作用し、最終的にＭＨＣクラスＩ分子と結合して、ＣＴＬを誘導する。【０００７】
クロスプレゼンテーションにおいては、外因性抗原がエンドソームの膜を通過する必要があり、これについて種々の検討がなされている。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｆｅｂ．２０（２）：２４１−２４８には、ｐＨ感受性のポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）共役体を用いて抗原を効率良く細胞質基質に輸送することが記載されている。また、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｎｅｔｗ．  ２０１３  Ｏｃｔ  １３（５）  １７７−１８３には、癌免疫療法のためのナノ粒子に基づくワクチンデリバリーが記載されている。【０００８】
細胞性免疫を増強させるアジュバントは、現時点において、公的に承認されたものは存在しておらず、物質の探索や新規合成、あるいはウイルス成分の利用などが試みられている。アルミニウムを含有する物質など、抗体を増強するためのアジュバントは、残念ながら細胞性免疫を増強する効果を有していないことが報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４  ８２，４９７−５０５）。
【発明の概要】
【０００９】
ＣＴＬをはじめとする細胞性免疫の誘導は、治療を目的としたワクチン開発の観点から、実現が強く望まれており、アジュバント分子の探索やクロスプレゼンテーションを促進される検討が盛んに行われているが、依然として誘導の効果は十分とは言えない。
【００１０】
また、検討の多くは、新規の合成材料や、ウイルスの成分を用いたものが多く、安全性の観点から懸念が存在している。
【００１１】
そこで、本発明は、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントの提供を目的とする。
【００１２】
本発明者は鋭意研究を行った。その結果、ｐＨに感受性を有する担体に、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、単に「自然免疫を活性化する物質」と称する場合もある。）としてアルミニウムを含有する物質を併用することで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の上記課題は以下の手段により達成される。
【００１４】
（１）ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物；
（２）前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上である、（１）に記載のアジュバント組成物；
（３）前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、（１）または（２）に記載のアジュバント組成物；
（４）前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１〜１０００μｇで含有される、（３）に記載のアジュバント組成物；
（５）前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して１０ｍｏｌ以上の割合で含有される、（３）または（４）に記載のアジュバント組成物；
（６）（１）または（２）に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物；
（７）（３）〜（５）のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物；
（８）前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇである、（７）に記載のワクチン組成物；
（９）前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、（６）〜（８）のいずれかに記載のワクチン組成物；
（１０）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法；
（１１）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程；および
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
【図２】図２は、ワクチン組成物および比較試料（組成物）のＥＬＩｓｐｏｔ法による細胞性免疫（ＣＴＬ）の誘導を評価した結果を示す図である。ＭＨＣクラスＩ拘束性のペプチドであるＳＩＩＮＦＥＫＬに反応し、ＩＦＮγを産生した細胞をｓｐｏｔの形成により検出した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原とトコフェロールとの混合、（Ｃ）は抗原と酢酸トコフェロールとの混合、（Ｄ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｅ）は抗原とトコフェロールとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と酢酸トコフェロールとｐＨ感受性担体との混合、（Ｇ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣおよびデオキシコール酸の複合体を使用した。
【図３】図３は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、ＣｐＧ−ＯＤＮとの比較、および誘導した細胞性免疫の抗原特異性を評価した結果を示す図である。（Ａ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｂ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｃ）は抗原とＣｐＧ−ＯＤＮとの混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。（Ｄ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合により得られた組成物でマウスを免疫し、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えずにｓｐｏｔ形成を試みた結果である。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣおよびデオキシコール酸の複合体を使用した。
【図４】図４は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するために必要となるａｌｕｍの量を調べた結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原と１０μｇのａｌｕｍとの混合、（Ｃ）は抗原と１００μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原と１０μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｅ）は抗原と１μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と０．１μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。
【図５】図５は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するために必要なｐＨ感受性担体の量を調べた結果を示す図である。ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を基準とし、当該複合体を所定の濃度に希釈して各評価に用いた。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｃ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原とａｌｕｍと、１０倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、（Ｅ）は抗原とａｌｕｍと、１００倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原とａｌｕｍと、１０００倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。
【図６】図６は、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した結果を示す図である。液性免疫の誘導は、ＩｇＧ抗体価によって評価した。
【図７】図７は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するワクチン組成物の構成成分として適切なａｌｕｍの種類を調べた結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原と１０μｇのリン酸アルミニウムとの混合、（Ｂ）は抗原と１μｇのリン酸アルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｃ）は抗原と０．１μｇのリン酸アルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原と１０μｇの硫酸カリウムアルミニウムとの混合、（Ｅ）は抗原と１μｇの硫酸カリウムアルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と０．１μｇの硫酸カリウムアルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。
【図８】図８は、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した場合における、ａｌｕｍが及ぼすｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果への影響について評価した結果を示す図である。（Ａ）はａｌｕｍの種類、（Ｂ）はａｌｕｍの量に関して、評価した結果である。
【図９】図９は、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果に及ぼす、ａｌｕｍの影響を調べた結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ｐＨ感受性担体の組成、特にデオキシコール酸の量を変化させた場合における、ａｌｕｍが及ぼすｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果への影響について評価した結果を示す図である。（Ａ）はデオキシコール酸の量が０〜６４０ｎｍｏｌの範囲を調べた結果であり、（Ｂ）は０〜１００ｎｍｏｌの範囲を拡大したものである。
【図１１】図１１は、皮内の投与経路における、ワクチン組成物による細胞性免疫の誘導をＥＬＩｓｐｏｔ法により評価した結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｂ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｃ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮内投与した結果であり、（Ｄ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮内投与した結果である。また、（Ｅ）〜（Ｈ）は、抗原特異性の評価であり、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えずにｓｐｏｔ形成を試みたものである。（Ｅ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｆ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｇ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮内投与した結果であり、（Ｈ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮内投与した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物が提供される。上記アジュバント組成物により、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導することができるアジュバントが提供される。また、当該アジュバント組成物により、安全性の高いアジュバントが提供される。
【００１７】
＜アジュバント組成物＞
本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体（以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある）と、アルミニウムを含有する物質と、を含む。すなわち、本形態のアジュバント組成物は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（自然免疫を活性化する物質）として、アルミニウムを含有する物質を含むものである。
【００１８】
本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、水性溶媒と、を含む。よって、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、が水性溶媒中に分散された形態であるのが好ましい。
【００１９】
また、本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する。
【００２０】
以下、図面を参照しながら、本実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００２１】
また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行う。
【００２２】
図１は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
【００２３】
図１によれば、アジュバント組成物４は、両親媒性物質１と、ｐＨ感受性化合物２と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質であるアルミニウムを含有する物質３と、を含む。図１に示すように、一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質３は、両親媒性物質１を構成する疎水性部分に、ｐＨ感受性化合物２とともに会合する。この場合、アジュバント組成物４は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質３は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２を含むｐＨ感受性担体と独立して存在する。
【００２４】
また、ワクチン組成物６は、アジュバント組成物４と、抗原５とを含む。図１に示されるように、抗原５は、上記２つの形態に係るアジュバント組成物４に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体４に抗原５が包含されるワクチン組成物６については、ワクチン複合体ともいうことができる。
【００２５】
本明細書において、「アジュバント組成物」とは、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合したものであってもよいし、ｐＨ感受性担体にアルミニウムを含有する物質を担持または包含したもの（アジュバント複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
【００２６】
また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される２種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの（ワクチン複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
【００２７】
［ｐＨ感受性担体］
ｐＨ感受性担体は、ｐＨに感受性を有し、ｐＨが酸性になると細胞内の抗原を細胞質基質に輸送できる機能を有する。
【００２８】
ｐＨ感受性担体としては、特に制限されないが、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現するものであることが好ましい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００２９】
以下、上記のｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む、膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体について詳細に説明する。
【００３０】
なお、本形態に係るｐＨ感受性担体は、２０１３年５月２４日に出願された国際公開第２０１３／１８０２５３号に記載された「ｐＨ感受性担体」が同様に使用できる。
【００３１】
（ｐＨ感受性担体の構造）
ｐＨ感受性担体は、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質を構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、ｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
【００３２】
（膜破壊機能促進効果）
「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００３３】
また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質が複合体（ｐＨ感受性担体）を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａおよび両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
【００３４】
【数１】
2016194685.tif 000003
【００３５】
上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、２．５以上であることがより好ましく、５以上であることがさらに好ましく、１０以上であることが特に好ましく、３０以上であることがもっとも好ましい。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、２．５以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましく、５以上であることがさらにより好ましく、１０以上であることが特に好ましく、１５以上であることがもっとも好ましい。
【００３６】
本発明の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ２以上（好ましくは５以上）であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むｐＨ感受性担体が好ましい。また、本発明の別の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ２以上（好ましくは５以上）であり、かつ、グリチルリチン酸またはグリチルレチン酸、および脂質を含むｐＨ感受性担体であることが好ましい。
【００３７】
ここで、本明細書において「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
【００３８】
ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【００３９】
ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合の状態を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答することによって膜破壊機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、細胞質基質）に溶出等する。
【００４０】
ｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。本形態のアジュバント組成物においては、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ５．０で２０％より大きいものであることが好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。本形態のアジュバント組成物は、上述のような膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体を用いればよい。
【００４１】
また、ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
【００４２】
本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００４３】
また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４、と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘ、と表す。
【００４４】
【数２】
2016194685.tif 000004
【００４５】
上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。
【００４６】
上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸および脂質を含むものが好ましい。
【００４７】
ｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
【００４８】
すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、抗原）は、再配列される膜から排除、放出される。
【００４９】
上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム（endosome）に取り囲まれ、細胞（抗原提示細胞等）に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される（その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示されうる）。このため、ほとんどの抗原は細胞質基質内にデリバリーされない。
【００５０】
これに対して、本形態に係るｐＨ感受性担体を使用すると、抗原（例えば、外因性抗原）を細胞質基質にデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨが低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。この膜破壊機能（または膜融合機能および膜破壊機能）に伴い、抗原がエンドソームから細胞質基質にデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすれば細胞質基質への輸送が可能となりうることから、抗原とｐＨ感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がｐＨ感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
【００５１】
（ｐＨ感受性化合物）
ｐＨ感受性化合物は、上記のように、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。上記「それらの塩」としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００５３】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが特に好ましい。
【００５４】
ｐＨ感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、ｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはそれらの塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましい。
【００５５】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１０ｍｏｌ以上の割合で含有されることが好ましく、１０〜６４０ｍｏｌの割合で含有されることがより好ましく、２０〜３２０ｍｏｌの割合で含有されることがさらに好ましく、２０〜１６０ｍｏｌの割合で含有されることが特に好ましい。なお、本明細書において、ｐＨ感受性化合物の、両親媒性物質１００ｍｏｌに対する含有量を、「ｐＨ感受性化合物の複合化量」とも称する。
【００５６】
（両親媒性物質）
両親媒性物質は、上記のように、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００５７】
なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００５８】
炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【００５９】
炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加した各ポリオキシエチレン鎖の重合度の合計が、１０〜２００であることが好ましく、１５〜１００であることがより好ましく、２０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１６〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）を用いることが好ましい。
【００６０】
炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル；ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５を用いることが好ましい。
【００６１】
モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）は、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００６２】
ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３〜２００であることが好ましく、５〜１００であることがより好ましく、１０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。例えば、ポリオキシエチレンの重合度が１０であるＰＥＧ（１０）ヒマシ油が好適に用いられる。
【００６３】
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
【００６４】
上述の両親媒性物質のうち、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることがより好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることがさらに好ましい。
【００６５】
（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
【００６６】
ｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。
【００６７】
より好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。
【００６８】
さらに好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣである。
【００６９】
［アルミニウムを含有する物質］
本発明のアジュバント組成物は、上述した両親媒性物質およびｐＨ感受性化合物から構成されるｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、「自然免疫を活性化する物質」と称する。）としてアルミニウムを含有する物質と、を含む。
【００７０】
アルミニウムを含有する物質は、自然免疫を活性化する物質の１種である。自然免疫を活性化する物質とは、構造パターン認識受容体に認識される、あるいは免疫担当細胞に刺激を与え、免疫担当細胞を活性な状態に導く物質を意味する。
【００７１】
本明細書中において、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として「ａｌｕｍ」と表記する。よって、「ａｌｕｍ」としては、「アルミニウムを含有する物質」も意味する。
【００７２】
本発明で用いられるアルミニウムを含有する物質としては、ｐＨ感受性担体との併用によって細胞性免疫が誘導可能なものであれば特に制限されないが、アルミニウム塩であるのが好ましく、例えば、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン、ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）などが挙げられる。これらのうち、細胞性免疫の誘導の効果の観点から、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上であるのが好ましい。また、アルミニウムを含有する物質が水酸化アルミニウムであるのがより好ましい。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは水に不溶であり、そのためアジュバント組成物に用いる際には分散媒体に分散させて用いるのが好ましく、このような水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムを用いることで、ゲルタイプアジュバントとすることができる。
【００７３】
アルミニウムを含有する物質としては、市販品として入手できるアルミニウム化合物を用いることができる。
【００７４】
例えば、水酸化アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「水酸化アルミニウム」、ＯＺ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ製「ＡｌｕｍＶａｘ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ２％」、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ２％」等が挙げられる。上述の水酸化アルミニウムのうち、「ＡｌｕｍＶａｘ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ２％」、「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ２％」は、アルミニウムが、金属換算で約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に分散された形態である。
【００７５】
リン酸アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「リン酸アルミニウム」、ＯＺ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ製「ＡｌｕｍＶａｘ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ２％」、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ製「Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ」等が挙げられる。上述のリン酸アルミニウムのうち、「Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ」は、アルミニウムが、金属換算で約５ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に分散された形態である。また、「ＡｌｕｍＶａｘ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ２％」についても、リン酸アルミニウムが水溶液に分散された形態である。
【００７６】
硫酸アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「硫酸アルミニウム」等を用いることができる。
【００７７】
硫酸カリウムアルミニウム（Aluminium potassium sulfate）としては、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製「ａｌｕｍ  ｃｒｙｓｔａｌｓ」等が挙げられる。
【００７８】
塩化アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「塩化アルミニウム」等を用いることができる。
【００７９】
分散液形態の「アルミニウムを含有する物質」は分散液のまま用いることができる。特に、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムについては、水溶液中のアルミニウムの凝集粒子が制御しやすいという観点では、分散液の形態の「アルミニウムを含有する物質」をｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液（溶液））と混合するのが好ましい。
【００８０】
また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムとして固体状態のアルミニウム化合物を用いる場合は、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合させる前にあらかじめ、アルミニウム化合物を分散媒体に分散させて分散液とした形態で用いるのが好ましい。
【００８１】
アルミニウムを含有する物質として硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、塩化アルミニウムを用いる場合は、固体状態のままｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合してもよいし、あらかじめこれらアルミニウム化合物を水性溶媒に溶解させてから、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合してもよい。
【００８２】
アルミニウムを含有する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８３】
また、アルミニウムを含有する物質の含有量は、使用するアルミニウムを含有する物質の種類によっても異なるが、アルミニウムを含有する物質が、両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１〜１０００μｇで含有されるのが好ましく、１〜５００μｇで含有されるのがより好ましく、１〜１００μｇで含有されるのがさらに好ましい。両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が１μｇ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が１０００μｇ以下であると、副反応が低減できることから好ましい。また、特に、アジュバント組成物１００μＬ中に含まれる両親媒性物質が１０ｎｍｏｌ未満の場合、両親媒性物質１ｎｍｏｌ当たりのアルミニウムを含有する物質の割合は１０〜１００μｇとなるのが好ましい。
【００８４】
アジュバント組成物中のアルミニウムを含有する物質の含有量（濃度）は、アジュバント組成物が水性溶媒に分散された形態である場合、アルミニウムの金属換算で、１μｇ／１００μＬ以上であることが好ましく、１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬであることがより好ましく、１０μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬであることがさらに好ましい。アルミニウムを含有する物質の含有量が１μｇ／１００μＬ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、アルミニウムを含有する物質の含有量が１００μｇ／１００μＬ以下であると、副反応が低減できることから好ましい。
【００８５】
［水性溶媒］
アジュバント組成物は、水性溶媒（以下、「水性媒体」と称する場合もある。）を含んでいてもよい。
【００８６】
アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、ｐＨ感受性担体、アルミニウムを含有する物質は、水性溶媒中で分散した分散液（以下、「水性溶液」とも称する。）となりうる。
【００８７】
この際、ｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性媒体中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である）を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎｏＺＳ９０）により測定することができる。
【００８８】
また、アジュバント組成物は、水性媒体中で、複合体を形成したｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含む複合体（アジュバント複合体）を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、ｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物および両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。
【００８９】
なお、アジュバント組成物を含む水性溶液中、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも１つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
【００９０】
本発明のアジュバント組成物を含む水性溶液の溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
【００９１】
緩衝剤としては、アジュバント組成物のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤；トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤；またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１００ｍＭであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
【００９２】
ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１５０ｍＭであることがより好ましい。
【００９３】
水性溶液中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、７．３μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、８．０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、６．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましく、４．２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがもっとも好ましい。
【００９４】
さらに、副反応の低減の観点から、特に好ましい形態としては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、１００μｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜２８０ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
【００９５】
また、水性溶液中のアルミニウムを含有する物質は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬ、より好ましくは１０μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬの濃度となるようにアルミニウムを含有する物質を用いるのが好ましい。
【００９６】
［他の成分］
アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
【００９７】
安定化剤としては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサドデカノール、１−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４〜２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２〜１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸エチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１〜３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のＤ（Ｌ）−アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８〜１６のジ脂肪酸グリセロール；α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００９８】
これら他の成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１５０ｍｏｌ以下であることが好ましく、０ｍｏｌを超えて６６．４ｍｏｌ以下であることがより好ましい。
【００９９】
本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
【０１００】
すなわち、本形態に係るアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体に、アルミニウムを含有する物質を併用しても、ｐＨ感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）を好適に発揮することができる。また、ｐＨ感受性担体とともにアルミニウムを含有する物質を用いると、アルミニウムを含有する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
【０１０１】
すなわち、ｐＨ感受性担体は、好ましい形態において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果（場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果）を有する。この際、前記膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）は、上述のように、酸性環境下におけるｐＨ感受性化合物によるｐＨ感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、ｐＨ感受性担体にアルミニウムを含有する物質を併用しても、ｐＨ感受性化合物のｐＨ感受性は変動しないため、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨ感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、ｐＨ感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、アルミニウムを含有する物質をｐＨ感受性担体と併用しても、ｐＨ感受性担体の機能は損なわれない。そして、アルミニウムを含有する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりｐＨ感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にｐＨ感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、ｐＨ感受性担体の機能により抗原を細胞質基質に導入することができるとともに、アルミニウムを含有する物質が作用することにより、細胞質基質に導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的に細胞性免疫（ＣＴＬ）を誘導することができる。
【０１０２】
なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０３】
また、本発明の好ましい一実施形態によれば、液性免疫をも好適に誘導することができる。
【０１０４】
上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。
【０１０５】
本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、ＣＴＬを誘導する場合には、ｐＨ感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原やアルミニウムを含有する物質が細胞質基質に導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原およびアルミニウムを含有する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
【０１０６】
したがって、本発明の別の一実施形態によれば、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
【０１０７】
＜ワクチン組成物＞
ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
【０１０８】
［アジュバント組成物］
アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
【０１０９】
［抗原］
抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
【０１１０】
前記ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、癌抗原、アレルギー関連抗原、疾患関連抗原、移植片拒絶関連抗原等が挙げられる。
【０１１１】
前記ウイルス抗原としては、特に制限されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ−Ｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、並びにＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス抗原；風疹ウイルス抗原；ロタウイルス抗原；サイトメガロウイルス抗原；呼吸器合胞体ウイルス抗原；単純ヘルペスウイルス抗原；水痘帯状疱疹ウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
【０１１２】
前記細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原；ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原、連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、他のマイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；肺炎球菌細菌性抗原；インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌細菌性抗原；リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
【０１１３】
前記真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；ヒストプラズマ真菌性抗原；クリプトコッカス真菌性抗原；コクシジオイデス真菌性抗原；白癬真菌性抗原等が挙げられる。
【０１１４】
前記原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；リーシュマニア抗原；トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
【０１１５】
前記癌抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来する癌抗原が挙げられる。当該癌としては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、癌抗原の具体例を挙げると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ  ｒｅｌａｔｅｄ  ２）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＸＡＧＥ（Ｘ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ／ｍａｒｔ−１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＭＵＣ−１（Ｍｕｃｉｎ−１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＷＴ−１（Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  １）、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ  Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、等が挙げられる。
【０１１６】
前記アレルギー関連抗原としては、特に制限されないが、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原；ライグラス花粉抗原等の花粉抗原；イエダニ抗原、ネコ抗原等の動物由来抗原；組織適合性抗原、ペニシリン等の治療薬等が挙げられる。
【０１１７】
前記疾患関連抗原（自己免疫疾患、アレルギー等）は、特に制限されないが、糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、ウェゲナー肉芽腫症、スティーブンス・ジョンソン症候群、間質性肺線維症等が挙げられる。具体例を挙げると、例えば、自己免疫疾患に関与する抗原の例として、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡ９Ｄ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、サイログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。
【０１１８】
前記移植片拒絶関連抗原としては、特に制限されないが、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植片コンポーネント等の移植片レシピエントに移植される移植片の抗原性コンポーネントが挙げられる。
【０１１９】
上述の抗原は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２０】
抗原の含有量は、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２〜４００μｇであることが好ましく、１６μｇ〜８０μｇであることがより好ましい。
【０１２１】
抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、３％以上であることが好ましく、５〜８０％であることがより好ましく、１０〜６０％であることがより好ましい。組込率が３％以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、実施例に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
【０１２２】
［添加剤］
ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
【０１２３】
使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
【０１２４】
ワクチン組成物が錠剤およびカプセルである場合には、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末又は液体のいずれを含有することもできる。
【０１２５】
また、ワクチン組成物が固形製剤である場合には、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、
ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含みうる。
【０１２６】
一方、ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。なお、前記溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
【０１２７】
本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原を効率良くクロスプレゼンテーションさせることにより、細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、ＣＴＬを誘導することができる。なお、本明細書において、「細胞性免疫を誘導する」とは、本明細書に記載のＥＬＩｓｐｏｔ法にて、ワクチン組成物未処置のコントロール（すなわち、抗原とアルミニウムを含有する物質との混合物）と対比して、多くのｓｐｏｔ形成を得られることを意味する。
【０１２８】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫を誘導することができる。これにより、ＩｇＧ等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、抗原を投与したコントロールと対比して高いＩｇＧ抗体価となることを意味する。
【０１２９】
［用途］
本形態のワクチン組成物は、対象者に投与されると、ワクチン組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よく細胞質基質に放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫を誘導することができ、免疫を付与することができる。
【０１３０】
よって、本発明の一形態によると、治療または予防を必要とする対象者に、上記のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
【０１３１】
ワクチン組成物の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与；静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。
【０１３２】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【０１３３】
上記疾患としては、例えば、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）、肝炎、インフルエンザ等のウイルス感染症；百日咳、ジフテリア、破傷風、結核、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌等による細菌感染症；カンジダ等の真菌感染症；マラリア等の原虫性または寄生虫性感染症；白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等の癌；スギ花粉等によるアレルギー；糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の移植による拒絶反応が挙げられる。
【０１３４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
【０１３５】
また、本発明の一実施形態において、ワクチン組成物は、培養により、細胞に抗原を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、抗原を細胞に輸送するための培養方法が提供される。
【０１３６】
前記培養方法は、細胞を、ワクチン組成物を含む培地で培養する工程を含む。
【０１３７】
前記培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等が挙げられる。
【０１３８】
前記培地へのワクチン組成物の添加量としては、特に制限されないが、両親媒性物質のモル濃度が０．６６μｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、６．６μｍｏｌ／Ｌ〜０．８８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、７．２μｍｏｌ／Ｌ〜０．５６ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【０１３９】
また、前記培地のｐＨは、７．０以上であることが好ましく、７．２〜７．８であることがより好ましい。培地のｐＨが７．０以上であると、培地中でのｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物の不安定化を防止できることから好ましい。
【０１４０】
前記細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
【０１４１】
この際、前記対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
【０１４２】
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、リンパ球細胞等を用いることがより好ましく、樹状細胞を用いることがさらに好ましい。
【０１４３】
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者から採血、生検等により当該細胞を採取する。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
【０１４４】
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
【０１４５】
好ましい一実施形態において、前記治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、ワクチン組成物を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
【０１４６】
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、前記疾患は上述のとおりである。
【０１４７】
＜アジュバント組成物の製造方法＞
本発明に係るアジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。
【０１４８】
例えば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合することにより製造することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、ｐＨ感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とを会合させることにより製造することができる。
【０１４９】
以下、ｐＨ感受性担体として、所定のｐＨ感受性化合物および所定の両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体を用いる好ましい形態について、以下に詳細に説明する。
【０１５０】
本形態に係るアジュバント組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程を含む。
【０１５１】
ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質を会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質が、水性溶液中で接触すればよい。したがって、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。
【０１５２】
ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）＜ａ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法；＜ｂ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法；＜ｃ＞ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。なお、前記バンガム法の具体的な方法としては、例えば以下の方法で行うことができる。すなわち、ガラス容器中で、ｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、５〜３５℃でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。薄膜成分を水性溶液に分散することで、ｐＨ感受性担体を含む水溶液（ｐＨ感受性担体の分散液）が得られる。当該ｐＨ感受性担体を含む水性溶液（ｐＨ感受性担体の分散液）とアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを混合することにより、アジュバント組成物が得られる。ここで、薄膜に添加する水性溶液としてアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を用いる場合は、薄膜を分散することによりアジュバント組成物を得ることができる。バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【０１５３】
上記の（１）製造方法において、分散液を調製する際に強く分散させるには、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いればよい。また、両親媒性物質を含む水性溶液に、ｐＨ感受性化合物、アルミニウムを含有する物質を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。上記（１）の方法では、各水性溶液を調製する際の温度および水性溶液を混合する温度は、特に制限されないが、５〜３５℃であるのが好ましく、常温の１５〜２５℃であるのがより好ましい。
【０１５４】
なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および／またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、アジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
【０１５５】
ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液は、後述の「ワクチン組成物の製造方法」に用いる溶液と同様のもの、またはそれを参考にして調製したものが用いられうる。
【０１５６】
＜ワクチン組成物の製造方法＞
本発明に係るワクチン組成物の製造方法は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。一実施形態に係るワクチン組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程；および前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む。
【０１５７】
会合体に抗原を混合する工程においては、会合体を含む水性溶液に、抗原を混合すればよい。例えば、上記（１）または（２）の方法により得られたアジュバント組成物と、抗原と、を混合することで、ワクチン組成物が得られる。具体的には、（Ｖ−１）＜ａ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液と、抗原を含む水性溶液と、を別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてワクチン組成物を得る方法；＜ｂ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質（またはそれを含む水性溶液）および抗原（またはそれを含む水性溶液）を混合して、ワクチン組成物を得る方法；＜ｃ＞ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質（またはそれを含む水性溶液）および抗原（またはそれを含む水性溶液）を混合して、ワクチン組成物を得る方法；（Ｖ−２）上記（２）のバンガム法により得られたアジュバント組成物に、抗原または抗原を含む水性溶液を混合し、ワクチン組成物を得る方法、が挙げられる。この際、ｐＨ感受性担体の構成成分で形成される薄膜に添加する水性溶液として、アルミニウムを含有する物質と抗原とを含む溶液を用いてもよい。また、薄膜に添加する水性溶液として、抗原を含む水性溶液を用いて、その後にアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合してもよい。
【０１５８】
アジュバント組成物またはｐＨ感受性担体の分散液に抗原を含む水性溶液を混合する際の温度は、特に制限されないが、５〜３５℃、好ましくは常温の１５〜２５℃であるのが好ましい。
【０１５９】
ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液、および抗原とアルミニウムを含有する物質とを含む水性溶液は、下記のように調製したものが用いられうる。
【０１６０】
（ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液）
前記ｐＨ感受性化合物を含む溶液は、ｐＨ感受性化合物および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【０１６１】
前記ｐＨ感受性化合物としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【０１６２】
前記溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液の他、滅菌水等が用いられうる。これらのうち、ワクチン組成物を生体に好適に投与する観点から、生理食塩水、滅菌水、緩衝液を用いることが好ましい。
【０１６３】
前記ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液において、ｐＨ感受性化合物のモル濃度は、５μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、１０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中のｐＨ感受性化合物のモル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましい。
【０１６４】
さらに、副反応の低減の観点から、ｐＨ感受性化合物のモル濃度は、１００μｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
【０１６５】
（両親媒性物質を含む水性溶液）
前記両親媒性物質を含む溶液は、両親媒性物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【０１６６】
前記両親媒性物質および前記溶媒としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
【０１６７】
前記両親媒性物質を含む水性溶液において、両親媒性物質のモル濃度は、５μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、１０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、５００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中の両親媒性物質のモル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましく、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがもっとも好ましい。
【０１６８】
さらに、副反応の低減の観点から、両親媒性物質のモル濃度は、５０μｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、５００μｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
【０１６９】
（アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液）
前記アルミニウムを含有する物質を含む溶液は、アルミニウムを含有する物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【０１７０】
前記アルミニウムを含有する物質および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【０１７１】
前記アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液におけるアルミニウムの濃度は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬ、より好ましくは１０μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬである。
【０１７２】
（抗原を含む水性溶液）
前記抗原を含む溶液は、抗原および溶媒を含む。
【０１７３】
前記抗原および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
【０１７４】
混合
上述のｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液の混合方法は特に制限されない。
【０１７５】
得られた混合液を撹拌することにより構成成分を分散させることが好ましく、当該撹拌は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
【０１７６】
なお、一実施形態において、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液は、別々の溶液とせず、２種以上の成分を組み合わせた混合液としてもよい。例えば、ｐＨ感受性化合物およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を調製し、これを、両親媒性物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液と混合してもよい。
【実施例】
【０１７７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【０１７８】
＜原料＞
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。【０１７９】
（１）ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質等
・デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・コール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・ケノデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ヒオデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・グリコデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・グリチルリチン酸モノアンモニウム（東京化成工業社製）
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−５０）
・ＤＤＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１０１０）
・ＤＬＰＣ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１２１２）
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０，８０：東京化成工業社製）
・ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ８０：ナカライテスク社製−ソルビタンモノオレエート）
・ポリオキシエチレンヒマシ油（和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン１０ヒマシ油）・トコフェロール（ナカライテスク社製、ＤＬ−α−トコフェロール）
（２）自然免疫を活性化する刺激を有する物質等
・ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、ＯＤＮ−２３９５）
・酢酸トコフェロール（酢酸ＤＬ−α−トコフェロール：ナカライテスク社製）
・水酸化アルミニウム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２％）
・リン酸アルミニウム（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉａｏｎａｌ社製、Ａｄｊｕｐｈｏｓ）
・硫酸カリウムアルミニウム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、ａｌｕｍ  ｃｒｙｓｔａｌｓ）
（３）溶媒等
・注射用水：（大塚製薬株式会社製）
・ＭＥＳ−Ｎａ（メルク社製）
・塩化ナトリウム（関東化学社製）
・ＰＢＳ  Ｔａｂｌｔｅｓ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：タカラバイオ社製）
・メタノール（ナカライテスク社製）
・エタノール（関東化学社製）
・クロロホルム（和光純薬工業社製）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・ＯＶＡペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ピーエイチジャパン委託合成）（以下、単に「ペプチド」とも称する。）
・ＯＶＡタンパク質（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：和光純薬工業社製、オボアルブミン低エンドトキシン）（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する。）
（４）培地等
・ＲＰＭＩ（ナカライテスク社製、ＲＰＭＩ  １６４０培地（液体））
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ  Ｏｒｉｇｉｎ：Ｇｉｂｃｏ社製）
・ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）：赤血球溶血バッファー
・ＨＢＳＳ（Ｈａｂｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ナカライテスク社製）
・Ｄ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ナカライテスク社製）
（５）その他試薬
・リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社製）
・ＤＰＸ（ｐ−ｘｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（和光純薬工業社製）
・ＮＢＤ−ＰＥ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ（７−ｎｉｔｒｏ−２−１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ社製）・Ｒｈ−ＰＥ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ社製）：蛍光標識脂質
・Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ（ＢＤ  バイオサイエンス社製）
・ＡＥＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ（ＢＤ  バイオサイエンス社製）
・炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）
・炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・二次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）
・アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト株式会社製）
（６）動物
雌、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６−８週齢）は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。【０１８０】
＜使用機器＞
超音波照射装置：ＵＳＣ−Ｊ
分光光度計：ＦＰ−６５００
ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計：ＵＶ−３６００
ＣＯ２、インキュベーター：ＭＣＯ２０ＡＩＣ
＜細胞の培養＞
細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。【０１８１】
＜試料の調製等＞
（ＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）
ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭの配合量で調製した。ＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒは、特別な記載のない限りｐＨは７．４である。
（ＰＢＳ）
ＰＢＳは、１０錠のＰＢＳ  Ｔａｂｌｔｅｓ（タカラバイオ社製）を、１０００ｍＬの蒸留水に溶解させ、調製した。なお、ｐＨは、７．３５〜７．６５である。あるいは、購入したＤ−ＰＢＳをＰＢＳとして使用した。
（ＲＰＭＩメディウム）
抗生物質としてペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。また、必要に応じてＦＢＳを追加で添加し、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムとした。
（自然免疫を刺激する物質の候補（以下、候補物質とも表記）の一次溶液）
・トコフェロールの一次溶液
１０ｍｇのトコフェロールを秤量し、１．０ｍＬのエタノールに溶解させた。さらに、ＰＢＳにて１０倍に希釈し、トコフェロールの一次溶液を調製した。
・酢酸トコフェロールの一次溶液
１０ｍｇの酢酸トコフェロールを秤量し、１．０ｍＬのエタノールに溶解させた。さらに、ＰＢＳにて１０倍に希釈し、酢酸トコフェロールの一次溶液を調製した。
・ａｌｕｍの一次溶液
ａｌｕｍとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。【０１８２】
用いたａｌｕｍが水酸化アルミニウムの場合、最終濃度が１００μｇ／１００μＬにおいては、購入した試薬の原液（アルミニウムの濃度（アルミニウム金属換算）：約１０ｍｇ／ｍＬ）を、ａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が、１００μｇ／１００μＬよりも薄い場合、購入した試薬の原液をＰＢＳにて希釈し、ａｌｕｍの一次溶液とした後、アジュバント組成物の調製に用いた。具体的には、最終濃度が１０μｇ／１００μＬの場合、購入した試薬の原液をＰＢＳにて１０倍に希釈し、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が１μｇ／１００μＬの場合は、ＰＢＳにて１００倍に希釈し、最終濃度が０．１μｇ／１００μＬの場合は、ＰＢＳにて１０００倍に希釈したものを、ａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。【０１８３】
用いたａｌｕｍがリン酸アルミニウムの場合、水酸化アルミニウムと同様に、購入した試薬の原液、および購入した試薬の原液をＰＢＳにて希釈したものをａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。【０１８４】
硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）は、１０ｍｇを秤量し、１ｍＬの注射用水にて溶解させた。本溶液を、水酸化アルミニウムにおける、購入した試薬の原液と同様に扱い、アジュバント組成物の調製に使用した。【０１８５】
（ｐＨ感受性担体の調製）
バンガム法による製造
メタノール（またはクロロホルム）に溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、メタノール（またはクロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物を、１０ｍＬナスフラスコ混合し、溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に０．５ｍＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（溶出性試験および膜融合試験の場合）または０．５ｍＬのＰＢＳ（マウスへの免疫の場合）を添加し、超音波照射装置を用いて分散させ、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、ＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳにて希釈した。【０１８６】
混合による製造
所定量のｐＨ感受性化合物を秤量し、ＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳに溶解させ、ｐＨ感受性化合物の溶液を調製した。次に、所定量の両親媒性物質を秤量し、先に調製したｐＨ感受性化合物に溶液に添加し、混合することで、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。操作は、室温にて実施した。具体的には、１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸から成るｐＨ感受性担体の場合、１３．８ｍｇのデオキシコール酸ナトリウム一水和物を秤量し、１０ｍＬのＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳに溶解させた。次に、１２．４ｍｇのＤＬＰＣを秤量し、先に調製したデオキシコール酸の溶液に添加し、混合することで、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、ＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳにて希釈した。【０１８７】
なお、両親媒性物質とｐＨ感受性化合物との比率は、所望の比率となるよう調整した。また、複数の両親媒性物質を使用する場合は、両親媒性物質の総量が、所望のモル数（１０００ｎｍｏｌ）となるように調整した。また、実施例や図の説明におけるｐＨ感受性化合物の使用量は、１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対する使用量である。【０１８８】
（アジュバント組成物およびワクチン組成物の調製）
調製したｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、自然免疫を刺激する物質の候補（以下、候補物質とも表記）の一次溶液を添加し、混合した。濃度を調製するための追加のＭＥＳ
ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。【０１８９】
また、得られたアジュバント組成物に、所定量のＯＶＡを溶解させたＰＢＳを添加し、混合することで、ワクチン組成物を調製した。【０１９０】
評価（４）の実験以外は、１００ｎｍｏｌ／１００μＬの両親媒性物質の濃度になるように、ｐＨ感受性担体、アジュバント組成物、およびワクチン組成物を調製した。評価（４）の実験は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を、希釈して使用した。最終的に、１００ｎｍｏｌ／１００μＬ〜０．１ｎｍｏｌ／１００μＬの両親媒性物質の濃度となるようにワクチン組成物を調製した。【０１９１】
ＣｐＧ−ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を用いる場合は、２００μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを２００μＬの注射用水に溶解させ、候補物質の一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に使用した。【０１９２】
（比較試料の調製）
比較試料として、抗原のみ、抗原と候補物質の混合（候補物質単独とも表記）、を調製した。また、溶出性試験においては、両親媒性物質単独の分散液、ｐＨ感受性担体単独の分散液も調製した。【０１９３】
＜測定方法＞
（溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定）
Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８  １９  １０４０−１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。【０１９４】
クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒとＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ−テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて濃度を調整した。【０１９５】
濃度を調製したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調整した２９６０μＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ−６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。【０１９６】
なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。【０１９７】
【数３】
2016194685.tif 000005
【０１９８】
（膜融合試験：Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）の測定）
Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８  ２９  ４０２９−４０３６に記載の方法に従い、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して評価した。蛍光標識は、ＮＢＤ−ＰＥ、Ｒｈ−ＰＥを用いた。【０１９９】
ＥＹＰＣに対して０．６ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥ、およびＲｈ−ＰＥを含むＥＹＰＣ（ＥＹＰＣ１０００ｎｍｏｌ）の薄膜を作製し、１．０ｍＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。【０２００】
二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調製した２９６０μＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて６０分間インキュベーションした後、分光光度計（ＦＰ−６５００）を用いて４５０ｎｍの励起光による５００ｎｍ〜６２０ｎｍの蛍光スペクトルを測定し、５２０ｎｍと５８０ｎｍとの蛍光強度比を求めた。【０２０１】
融合率は、上記で得られた二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比を０％とし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と、評価サンプル分散液と、をメタノール処理したものを１００％として算出した。なお、メタノール処理は二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液との両者をメタノールに溶解させた後、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とし、３．０ｍＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒと超音波照射装置を用いて分散させて実施した。【０２０２】
具体的には、融合率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定して得られた蛍光強度比をＲとし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比をＲ０、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液をメタノール処理して得られた蛍光強度比をＲ１００と表す。【０２０３】
【数４】
2016194685.tif 000006
【０２０４】
（マウスへの免疫）
投与は麻酔下にて実施した。皮下投与の場合は、背部１箇所に１００μＬ／ｈｅａｄにて皮下注射した。ａｌｕｍの投与量は０〜１００μｇ／ｈｅａｄとし、自然免疫を刺激する物質の候補は１０μｇ／ｈｅａｄとした。ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：１００ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：１０〜６４０ｎｍｏｌ／ｈｅａｄを、基本の投与濃度とし、一部、希釈した条件にて投与を行った。抗原は、ＯＶＡタンパク質、あるいはＯＶＡペプチドを使用し、８０μｇ／ｈｅａｄとした。また、皮内投与の場合は、皮下投与と同様の投与液を用いて、背部１箇所に２０μＬ／ｈｅａｄにて皮内注射した。細胞性免疫を評価する場合は、投与を１回とし、投与から７日後にアッセイを実施した。液性免疫を評価する場合は、投与を２回とし、初回投与から１４日後に２回目の投与を行った。さらに、２回目の投与から１４日後にアッセイを実施した。【０２０５】
（マウス脾臓からの細胞分散液の調製）
最終の投与から７日目においてマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。３．０ｍＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加した後、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。【０２０６】
（ＥＬＩｓｐｏｔ法）
ＥＬＩｓｐｏｔ法は、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔを用いて実施した。細胞を播種する前日に、９６ｗｅｌｌ  ＥＬＩｓｐｏｔプレートにキットに付属のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて洗浄した後、２００μＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加し、３７℃にて２時間静置しブロッキングを行った。１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにてプレートを洗浄した後、抗原の再刺激を加える場合は、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加し、抗原の再刺激を加えない場合は１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加した。前記プレートに、脾臓の細胞分散液を所定の細胞数となるように播種し、最後に、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて１穴あたりの全量が２００μＬとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。【０２０７】
プレートの呈色は、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ、およびＡＥＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔに記載のプロトコールに従って実施した。【０２０８】
（抗体価の測定）
２回目の投与を行う前日に部分採血を行い、１回投与の抗体価を調べた。また、２回目の投与から１４日後に採血を行い、２回投与の抗体価を調べた。採血した血液を室温にて２時間静置し、遠心分離することにより血清を得た。５００ｍＬのＰＢＳに５ｇのアルブミンを溶解し、Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒとした。１．４７ｇの炭酸水素ナトリウムと０．８０ｇの炭酸ナトリウムを５００ｍＬの水に溶解させ、Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒとした。プレートの洗浄には、５００ｍＬのＰＢＳに２．５ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を添加したものを使用した。【０２０９】
ＯＶＡタンパク質をＣｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、０．１μｇ／ｗｅｌｌ（１００μＬ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに添加した。３７℃にて２時間静置した後、３００μＬのＢｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒと置換し、４℃にて一晩静置した。プレートを洗浄した後、所定の倍率に希釈した血清を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、Ｂｌｏｃｋ  ｂｕｆｆｅｒにて１０００倍希釈した二次抗体溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色を行い、抗体価を求めた。【０２１０】
［評価］
前記記載の方法に従って調製した分散液を用いて各種評価を行った。【０２１１】
（１）ｐＨ感受性担体との併用に適切な、自然免疫を活性化する物質の選定
ｐＨ感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導する高い効果を有する、自然免疫を活性化する物質の選定を行った。入手性および注射実績を考慮して、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ａｌｕｍ（水酸化アルミニウム）を、自然免疫を活性化する物質の候補（以下、候補物質とも表記）とし、ｐＨ感受性担体との併用による、細胞性免疫誘導の効果を調べた。【０２１２】
ｐＨ感受性担体は、１匹あたり１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用した。候補物質らは、いずれも１匹あたり１０μｇとし、抗原は、１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、投与量を調製するためのＰＢＳに、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）、候補物質、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。なお、投与液は、１００μＬ中、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）、候補物質、抗原が所定の濃度となるように調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。【０２１３】
また、比較試料としては、抗原のみ、抗原と候補物質との混合とし、投与液としては、ＰＢＳに抗原、または抗原および候補物質を混合して調製し、１匹あたり１００μＬを投与した。【０２１４】
また、ＥＬＩｓｐｏｔ法による細胞性免疫（ＣＴＬ）の誘導は、コントロール（抗原およびアルミニウムを含有する物質の混合）との比較を目視で行い、以下の基準により評価した。【０２１５】
○：コントロールと比べて、明確に細胞性免疫の誘導が見られる
△：コントロールと比べて、わずかに細胞性免疫の誘導が見られる
×：コントロールと同等または同等以下の細胞性免疫の誘導である。【０２１６】
評価の結果、当然のことながら、抗原のみはｓｐｏｔの形成に至らず、細胞性免疫は誘導されなかった（図２（Ａ））。また、比較試料である、トコフェロール、および酢酸トコフェロールにおいても、抗原のみと同等にｓｐｏｔは形成されず、細胞性免疫は誘導されなかった（図２（Ｂ）（Ｃ））。さらに、ａｌｕｍは細胞性免疫を誘導できないことが広く知られていることから、図２（Ｄ）におけるｓｐｏｔ形成は、細胞性免疫を誘導していないものと判断した。それゆえ、図２（Ｄ）よりも多くのｓｐｏｔ形成数である場合において、細胞性免疫を誘導したものと考える。【０２１７】
トコフェロールとｐＨ感受性担体との併用、および酢酸トコフェロールとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独（図２（Ｄ）の抗原＋ａｌｕｍ）によるｓｐｏｔ形成数と同程度であり、細胞性免疫を誘導できなかった（図２（Ｅ）（Ｆ））。一方、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独のｓｐｏｔ形成と比較して、非常に多くのｓｐｏｔを形成した（図２（Ｇ））。ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用することにより、細胞性免疫の誘導に至ることが示された。本結果から、ａｌｕｍは、ｐＨ感受性担体との併用に適切な、自然免疫を刺激（活性化）する物質であると示された。【０２１８】
（２）ＣｐＧ−ＯＤＮとの比較、および抗原特異性の評価
ＣｐＧ−ＯＤＮは特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドであり、細胞性免疫を誘導することが報告されている試薬である。本試薬をポジティブコントロールとして用いることで、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、細胞性免疫の誘導活性の高さを評価した。ＣｐＧ−ＯＤＮは、１匹あたり１０μｇを使用し、他の実験条件は全て（１）と同じとした。評価は（１）のＥＬＩｓｐｏｔと同一のプレートにて、実施した。【０２１９】
ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって得られたｓｐｏｔ形成は、ＣｐＧ−ＯＤＮによって得られたものと比較して、多数であった（図３（Ｂ）（Ｃ））。一般に知られている試薬であるＣｐＧ−ＯＤＮと比較して高い活性であったことから、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、細胞性免疫の高い誘導を可能とすることが明らかとなった。【０２２０】
また、誘導した免疫が抗原特異的であることは、実使用の観点から非常に重要である。そこで、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫に対して、抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。具体的には、免疫した動物から回収した脾臓細胞の分散液を、ＥＬＩｓｐｏｔプレートに播種し、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えることなく、ＩＦＮ−γ産生細胞によるｓｐｏｔ形成を行った。その結果、ｓｐｏｔ形成は全く見られず、図３（Ｂ）における、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって得られるｓｐｏｔの形成は、完全に消失した（図３（Ｄ））。ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫は、確かに抗原特異的であることが示された。また、誘導された細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬのクラスＩペプチドに反応したことからＣＴＬであることが示唆された。【０２２１】
（３）細胞性免疫を誘導するために必要なａｌｕｍの量について
ａｌｕｍ（水酸化アルミニウム）は、ｐＨ感受性担体との併用し、細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。そこで、細胞性免疫を誘導するために必要となるａｌｕｍの量を調べた。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１匹あたり、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。ａｌｕｍは、１匹あたり１００〜０．１μｇとし、抗原は１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。なお、ａｌｕｍ単独とは、抗原とａｌｕｍとを混合したものを指す。【０２２２】
評価の結果、１００〜１μｇのａｌｕｍであるワクチン組成物（溶液中のａｌｕｍ濃度としては１００μｇ／１００μＬ〜１μｇ／１００μＬ）（図中、抗原＋ａｌｕｍ＋ｐＨ感受性担体）は、形成されたｓｐｏｔ数が、ａｌｕｍ単独（図中、抗原＋ａｌｕｍ）によるそれより多かった（図４（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ））。一方、ａｌｕｍの使用量が０．１μｇの場合、形成されたｓｐｏｔ数は、ａｌｕｍ単独のそれと同等であった（図４（Ｂ）（Ｆ））。以上の結果から、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１〜１００μｇのａｌｕｍの量（溶液中のａｌｕｍ濃度としては１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導する効果が確認された。１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対して、１〜１００μｇのａｌｕｍの量（ａｌｕｍ濃度：１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。【０２２３】
（４）細胞性免疫を誘導するために必要なｐＨ感受性担体の量について
次に、細胞性免疫を誘導するために必要な、ｐＨ感受性担体の量を調べた。１匹あたり１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、種々の倍率に希釈したｐＨ感受性担体の分散液を用いて、投与液を調製した。ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸である複合体を使用した。その他の条件は（１）および（３）と同様とした。【０２２４】
評価の結果、ｐＨ感受性担体の希釈倍率が、１〜１００倍である場合、調製した投与液によるｓｐｏｔの形成は、ａｌｕｍ単独よりも、多数であった（図５（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ））。一方、希釈倍率が１０００倍の投与液は、ａｌｕｍ単独よりも若干多めのｓｐｏｔ形成数であった（図５（Ｂ）（Ｆ））。以上より、ｐＨ感受性担体を構成するＤＬＰＣが１〜１０００ｎｍｏｌ／１００μＬの濃度、デオキシコール酸が１．６〜１６０ｎｍｏｌ／１０００μＬの濃度にて調製した投与液は、細胞性免疫を誘導することが確認された。すなわち、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質の濃度が、１〜１０００ｎｍｏｌ／１００μＬである場合、ワクチン組成物は、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。【０２２５】
（５）液性免疫の誘導について
ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した。液性免疫の誘導は、ＩｇＧ抗体価によって評価した。１回あたりの投与量として、ａｌｕｍは１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体は１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸からなる複合体を使用した。抗原は、８０μｇのＯＶＡタンパク質とした。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。液性免疫を評価するため、投与は２回行った。抗体価の評価は、前記記載の抗体価の測定に従って実施した。【０２２６】
評価の結果、ａｌｕｍ単独が最も高いＩｇＧ抗体価を示し、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、次に高い抗体価を示した（図６、２回投与）。また、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ＰＢＳや抗原のみの群と比較して、高いＩｇＧ抗体価を示した（図６、２回投与）。この結果から、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用したワクチン組成物は、液性免疫を誘導することが可能であることが示された。【０２２７】
ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用したワクチン組成物は、細胞性免疫および液性免疫の双方を誘導・増強することが可能であると明らかとなった。したがって、本発明に係るアジュバント組成物は、優秀なアジュバントとして利用されうる。【０２２８】
（６）ａｌｕｍの種類に関して
本明細書中において、ａｌｕｍは、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として用いている。ａｌｕｍの種類としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらの中から、入手が可能、かつｐＨ感受性担体との併用によって、細胞性免疫の誘導が可能なものを調べた。【０２２９】
本実施例において、ａｌｕｍはリン酸アルミニウム、および硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。また、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１匹あたり、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。ａｌｕｍは、（３）の実施例を参考にして、１匹あたり１〜０．１μｇとし、抗原は１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。【０２３０】
評価の結果、抗原とリン酸アルミニウム、および抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものは、ｓｐｏｔの形成をほとんど認められず、細胞性免疫を誘導できなかった（図７（Ａ）（Ｄ））。１μｇのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合よりも多くのｓｐｏｔ形成がなされ、細胞性免疫が誘導された（図７（Ｂ））。一方、０．１μｇのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合と、同様のｓｐｏｔ形成となり、細胞性免疫は誘導されなかった（図７（Ｃ））。ワクチン組成物における、細胞性免疫を誘導するａｌｕｍの最小量として、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様の結果を示したことから、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様に、１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対して、１〜１００μｇのａｌｕｍの量（ａｌｕｍ濃度：１μｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。【０２３１】
また、１μｇの硫酸カリウムアルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものよりも若干多くのｓｐｏｔ形成が見られ、細胞性免疫が誘導されていることが示唆された（図７（Ｅ））。【０２３２】
以上の結果から、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは、硫酸カリウムアルミニウムに比べて効果が高いことがわかった。【０２３３】
ｐＨ感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導するワクチン組成物の構成成分として、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムは、特に有用であることが明らかとなった。【０２３４】
（７）ａｌｕｍが及ぼす、ｐＨ感受性担体の機能への影響について
（７−１）膜破壊機能促進効果に及ぼす、ａｌｕｍの種類、およびａｌｕｍの量の影響について
ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果は、細胞のエンドソーム膜を破壊し、クロスプレゼンテーションを促進させるための、重要な機能である。また、ａｌｕｍは種々の物質を吸着させることが知られている。そのため、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した場合における、ｐＨ感受性担体の機能への影響を調べた。【０２３５】
まず、膜破壊機能促進効果に及ぼす影響について調べた。評価サンプルの全量を１００μＬとなるように、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合して調製した。一晩インキュベートした後、これらの評価サンプルの一部（２０μＬ）を用いて、溶出性試験を行った。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。１００μＬ中の量として、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸である複合体を使用し、ａｌｕｍは、１０μｇの、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。【０２３６】
デオキシコール酸単独は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて１５％程度の溶出率であり、ａｌｕｍを混合していないｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて６０％程度の溶出率であった（図８（Ａ））。ＤＬＰＣ単独の溶出率は、ｐＨ５．０にて２％以下であったことから（図１０（Ａ））、確かに、ｐＨ感受性担体は膜破壊機能促進効果を有していた。また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）の、いずれのａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体においても、それらはｐＨ７．４においてほとんど溶出を引き起こさず、ｐＨ５．０では６０％程度の溶出を引き起こした（図８（Ａ））。すなわち、いずれのａｌｕｍを混合した場合においても、ｐＨ感受性担体は、式（１）および式（２）を満たし、確かに膜破壊機能促進効果を有することが確認された。また、いずれのａｌｕｍにおいても、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４および５．０において、ａｌｕｍと混合していないｐＨ感受性担体と、同様の溶出率を示したことから、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが明らかとなった。【０２３７】
続いて、混合するａｌｕｍの量の影響について検討した。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）のａｌｕｍを、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸であるｐＨ感受性担体に対して、０〜１００μｇとなるように混合し（全量１００μＬ）、一晩インキュベートした後、溶出性試験を行った。なお、１００μｇの硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）の溶液は、低いｐＨとなったため、測定を行わなかった。その結果、いずれのａｌｕｍの、いずれの添加量においても、ｐＨ５．０の溶出率は６０％程度の値を示し、ａｌｕｍを混合しなかったものから、変化しなかった（８図（Ｂ））。したがって、いずれの種類の、いずれの添加量においても、ａｌｕｍは、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが示唆された。【０２３８】
（７−２）膜融合機能促進効果に及ぼすａｌｕｍの影響
続いて、膜融合機能促進効果に及ぼすａｌｕｍの影響を調べた。図９は、種々のａｌｕｍと混合した場合における、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果を調べた結果である。両親媒性物質は１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とし、ａｌｕｍは１０μｇとした。全量を１００μＬとなるように、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を膜融合試験にて評価した。膜融合試験は、前記記載の膜融合試験に従って実施した。【０２３９】
ｐＨ感受性担体は、いずれのａｌｕｍを混合した場合においても、ｐＨ５．０において約７０％もの融合率を示し、式（３）を満たす結果となった（図９）。すなわち、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、確かに膜融合機能促進効果を有していた。また、いずれのａｌｕｍにおいても、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４および５．０において、ａｌｕｍと混合していないｐＨ感受性担体と同様の融合率を示した（図９）。それゆえ、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果に影響を及ぼさないことが確認された。【０２４０】
ｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合に関わらず、同様の膜破壊機能促進効果、および膜融合機能促進効果を示したことから、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが明らかとなった。【０２４１】
（７−３）種々のデオキシコール酸量であるｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
次に、ｐＨ感受性担体の組成を変化させた場合における、ｐＨ感受性担体の機能に及ぼすａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとして、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体として、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと、種々の量のデオキシコール酸からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７−１）と同様に、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。【０２４２】
ｐＨ５．０において、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれの量のデオキシコール酸においても、ａｌｕｍと混合していないものと同等の溶出率であった（図１０（Ａ）（Ｂ））。すなわち、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと、１０〜６４０ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物であるｐＨ感受性担体に対して、ａｌｕｍとの混合は、機能に影響を及ぼさないことが示された。いずれのｐＨ感受性化合物の量である、ｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍの混合は、機能に影響を及ぼさないと示唆された。【０２４３】
また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物の量が１０〜６４０ｎｍｏｌのいずれの量においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。【０２４４】
（７−４）種々のｐＨ感受性化合物から成るｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
さらに、種々のｐＨ感受性化合物から構成されるｐＨ感受性担体の機能において、ａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとしては、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体としては、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌの種々のｐＨ感受性化合物からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７−１）と同様に、ｐＨ感受性担体とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。ＤＬＰＣ（両親媒性物質）単独による溶出率は、ｐＨ５．０にて２．０％以下であった。【０２４５】
いずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製したｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍと混合したものは、ａｌｕｍと混合していないものと比べて、同等の溶出率を示した（表１、ｐＨ７．４、およびｐＨ５．０）。いずれのｐＨ感受性化合物においても、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが確認された。【０２４６】
また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれのｐＨ感受性化合物を用いた場合においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる（表１）。【０２４７】
【表１】
2016194685.tif 000007
【０２４８】
（７−５）種々の両親媒性物質からなるｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
また、種々の両親媒性物質からなるｐＨ感受性担体の機能において、ａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとしては、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体としては、１００ｎｍｏｌの種々の両親媒性物質および１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７−１）と同様に、１００ｎｍｏｌの所定の両親媒性物質および１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。【０２４９】
いずれの両親媒性物質を用いて調製したｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍと混合したものは、ａｌｕｍと混合していないものと比べて、同等以上の溶出率を示した（表２−２、表２−３）。なお、デオキシコール酸（ｐＨ感受性化合物）単独による溶出率は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて１５％程度であった。【０２５０】
また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれの両親媒性物質を用いた場合においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる（表２−２、表２−３）。【０２５１】
【表２−１】
2016194685.tif 000008
【０２５２】
【表２−２】
2016194685.tif 000009
【０２５３】
【表２−３】
2016194685.tif 000010
【０２５４】
（８）投与経路の検討
一般的に、皮内には多くの免疫担当細胞が存在しており、皮内にワクチンを接種することで、免疫惹起の亢進や抗原量の削減が可能であることが知られている。そこで、ワクチン組成物を皮内に投与した場合における、細胞性免疫の誘導を確認した。【０２５５】
ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。皮下投与の場合、１匹あたりの投与量を１００μＬとし、１０μｇのａｌｕｍ、８０μｇのＯＶＡ、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣを含むｐＨ感受性担体を投与した。また、皮内投与の場合、１匹あたりの投与量を２０μＬとし、２μｇのａｌｕｍ、１６μｇのＯＶＡ、２０ｎｍｏｌのＤＬＰＣを含むｐＨ感受性担体を投与した。具体的には、皮内投与は、皮下投与に用いた投与液を使用し、投与量を１００μＬから２０μＬとすることで、前記記載の量を調製した。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。【０２５６】
評価の結果、皮内投与におけるａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独と比較して、多数のｓｐｏｔを形成した（図１１（Ｃ）（Ｄ））。ワクチン組成物は、皮内の投与経路においても、細胞性免疫を誘導することが確認された。また、得られた結果を皮下投与と比較したところ、ワクチン組成物の皮内投与は、少ない投与量であるにも関わらず、ワクチン組成物の皮下投与よりも多数のｓｐｏｔを形成した（図１１（Ｂ）（Ｄ））。ワクチン組成物の細胞性免疫を誘導する効果は、皮内投与によって、より高まることが明らかとなった。【０２５７】
続いて、誘導した細胞性免疫の抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。その結果、ワクチン組成物の皮内投与は、ｓｐｏｔを形成しなかった（図１１（Ｈ））。ワクチン組成物を皮内投与することによって誘導された細胞性免疫は、抗原特異的であることが明らかとなった。【０２５８】
本出願は、２０１５年６月２日に出願された日本特許出願番号２０１５−１１２５１９号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として組み入れられている。
【図１】
2016194685.tif 000011
【図２】
2016194685.tif 000012
【図３】
2016194685.tif 000013
【図４】
2016194685.tif 000014
【図５】
2016194685.tif 000015
【図６】
2016194685.tif 000016
【図７】
2016194685.tif 000017
【図８】
2016194685.tif 000018
【図９】
2016194685.tif 000019
【図１０】
2016194685.tif 000020
【図１１】
2016194685.tif 000021
【国際調査報告】
2016194685.tif 000022
2016194685.tif 000023
2016194685.tif 000024
2016194685.tif 000025
2016194685.tif 000026
2016194685.tif 000027