(57)【要約】  末梢細胞に酸素を十分に供給する機能を有し、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果が十分に高く、安定的な効果が持続して得られる生体投与可能な水溶液及びその製造方法を提供する。本発明の生体投与可能な水溶液は、酸素ナノバブルを含み、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記酸素のナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上、好ましくは１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上である。本発明の生体投与可能な水溶液は、溶存酸素を含む水溶液を、２以上の貫通小穴を周方向に有する筒の外部から該貫通小穴を通して大気圧以上の圧力で噴射させ、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で前記筒の中心に水撃が集中するように衝突させて発生させた酸素ナノバブルを含む。
2017195852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素ナノバブルを含む生体投与可能な水溶液であって、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記酸素ナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とする生体投与可能な水溶液。
【請求項２】
氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記酸素ナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする請求項１に記載の生体投与可能な水溶液。
【請求項３】
前記生体投与可能な水溶液が、前記生体投与可能な水溶液の１００質量部に対して、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含む生理食塩水であることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体投与可能な水溶液。
【請求項４】
前記生体投与可能な水溶液が、５％ブドウ糖液を添加した低張複合電解質液、リンゲル液、高カロリー液及びヘパリンを含む生食液の群から選択されるいずれかの輸液であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液。
【請求項５】
前記生体投与可能な水溶液が、細胞培養液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液。
【請求項６】
前記生体投与可能な水溶液が、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止するために生体内への投与又は経口摂取によって使用する水溶液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液。
【請求項７】
溶存酸素を含む水溶液を、２以上の貫通小穴を周方向に有する筒の外部から該貫通小穴を通して大気圧以上の圧力で噴射させるときに、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通小穴のそれぞれの開口部から噴射した溶存液を前記筒の中心に水撃が集中するように衝突させることによって発生させた酸素ナノバブルを含有し、該酸素ナノバブルは、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項８】
前記酸素ナノバブルにおいて、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする請求項７に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項９】
気体及び液体をそれぞれ吸引する手段と、前記気体及び前記液体を同時に加圧して搬送する手段と、該搬送された気体を含む前記液体を新たな酸素と混合させることによって溶存酸素を富化させるための気液混合槽と、該気液混合槽において気液混合の状態にある溶存液を用いてナノバブルを発生させるために、空洞の筒、該筒の周方向に２以上の貫通小穴のそれぞれの開口部が前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通小穴、及び前記筒の少なくとも片端部にナノバブル吐出口を有し、前記貫通小穴は該貫通小穴の断面中心部を通る延長線のすべてが前記筒の中心で交差するように配置される噴射ノズルと、を備えるナノバブル発生手段によって前記酸素ナノバブルを発生させることを特徴とする請求項７又は８に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１０】
前記貫通小穴は、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように、前記筒の周方向等間隔に４個以上８個以内で設けられ、前記筒の空洞に通じる部分の孔径が０．１〜０．５ｍｍであることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１１】
前記生体投与可能な水溶液が、前記生体投与可能な水溶液の１００質量部に対して、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含む生理食塩水であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法において、前記溶存酸素を含む水溶液として塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含有する水溶液を使用することにより生理食塩水を製造することを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法において、前記溶存酸素を含む水溶液として塩化ナトリウムを含まない水溶液を使用し、前記酸素ナノバブルを含む水溶液を製造した後、前記酸素ナノバブルを含む水溶液に塩化ナトリウムを前記生理食塩水の１００質量部に対して０．８５〜０．９５質量％で配合することにより生理食塩水を製造することを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１４】
前記生体投与可能な水溶液が、カリウム及びカルシウムの少なくとも１種の元素、５％ブドウ糖液、アミノ酸並びにヘパリンの群からなる選択される少なくともいずれかの添加剤を含有して製造される輸液であることを特徴とする請求項７〜１３のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１５】
前記生体投与可能な水溶液が、細胞を培養するために使用する細胞培養液として製造されることを特徴とする請求項７〜１４のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【請求項１６】
前記生体投与可能な水溶液が、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止するために生体内への投与又は経口摂取によって使用する水溶液であることを特徴とする請求項７〜１４のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果の高い生体投与可能な水溶液及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ・ナノバブルは、非特許文献１に記載されているように、（ａ）気泡径が小さいこと、（ｂ）上昇速度が遅いこと、（ｃ）摩擦抵抗を低減すること、（ｄ））気泡内圧力が高いこと、（ｅ）気液界面が大きいこと、（ｆ）ガスの溶解量が大きいこと、（ｇ）溶解、収縮を伴うことと、及び（ｈ）気泡表面が負に帯電していること、等の様々な特徴を有する。特に、ナノバブルは粒径が１μｍ未満と非常に小さく、ナノバブルを含む液体では目視確認ができず無色透明になること、粒子径が小さくなるほど浮力が粘性力に比べて非常に小さくなるため、上面に浮上しないで液体中に超微細バブルのままで長期間存在できること、等が知られている。ナノバブルは、これらの特徴を利用して医療分野への応用が期待されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、気泡径が１〜１０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍの酸素ナノバブルを含んでなる、輸液が提案されている。前記特許文献１に記載の発明は、赤血球と接合している「接合型酸素」と、赤血球に溶解している「溶解型酸素」において、末梢細胞に酸素を供給することができる「溶解型酸素」の割合が非常に小さく、その不足分を補うために酸素含量の高い輸液を提供するものである。この輸液は、「脳低温療法」、「脳の無血手術」又は「末梢循環不全症への治療」への使用を目的としており、ラットを用いた脳の選択的冷却法に適用するときに、酸素ナノバブルを含有しない輸液（リンゲル液）に比べて高い酸素分圧を得ることができる。そして、前記特許文献１の実施例１には、酸素ナノバブル含有生理食塩水を、特許文献２に記載の方法によって製造することができることが記載されている。【０００４】
また、特許文献３には、動的光散乱法で求められる個数平均径が３００ｎｍ以下の気泡を含むナノバブル水を有効成分とするＮＫ（ナチュラルキラー）活性増強剤の存在下で培養して調整されるＮＫ活性増強リンパ球、ＮＫ活性増強単核球、又は細胞免疫製剤を含有する輸液製剤が提案されている。前記特許文献３に記載の発明は、動的散乱法において個数平均径が３００ｎｍ以下の微細気泡を含むナノバブル水に、ＮＫ活性を増強させる作用があることを見出してなされたものであり、実際に体積平均粒径が０．３７３４μｍ（３７３．４ｎｍ）、個数平均径が０．２９９５μｍ（２９９．５ｎｍ）の酸素ナノバブルを使用してＮＫ活性の増強が確認されている。【０００５】
さらに、特許文献４には、心血管疾患又は状態の治療用薬剤の調整のために使用する界面動電的に改変された水性流体として、平均直径が約１００ｎｍ未満である酸素含有ナノバブルがイオン水性流中で安定的に形成され、帯電安定化した酸素含有ナノ構造のイオン水溶液を含む水性流体が開示されている。そして、前記イオン水溶液には食塩水を含むことが記載されている。【０００６】
一方、ナノバブルを含む輸液や生理食塩水は、上記のような治療目的だけでなく、癌の治療又は予防のための薬剤としての検討も行われている。例えば、特許文献５には実施例１において、オゾンナノバブル水及び酸素ナノバブル水とオゾンナノバブル水とを混合した塩分濃度が０．３質量％であるナノバブル水を癌の治療又は予防に適用することが提案されている。このときに使用するナノバブル水は、前記特許文献２に記載の方法によって製造することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１２７１号公報
【特許文献２】特開２００５−２４６２９４号公報
【特許文献３】特開２０１０−７５１８０号公報
【特許文献４】特表２０１３−５３８８０３号公報
【特許文献５】特開２００９−８４２５８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】柘植  秀樹、「マイクロバブル・ナノバブルの基礎」、Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｓｅａ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｃｉ．，Ｊｐｎ．、２０１０年、第６４巻、ｐ４−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
酸素ナノバブルを含む水溶液は、従来から生理食塩水、輸液又は細胞培養液等の生体投与可能な水溶液に適用することが検討されており、酸素供給能の向上や各種の治療に対してある程度の効果がみられている。しかしながら、その効果は期待されたものより小さく、また、効果のバラツキがみられ安定的に持続しないことから、医療効率及び安全性と安心の確保等の点から具体的な適用が進んでいないのが実情である。酸素ナノバブルを含む水溶液を生理食塩水、輸液又は細胞培養液に適用するためには、効果が明確に現れ、且つ、その効果が安定的に持続して得られることが必要不可欠な条件となる。【００１０】
前記の生体投与可能な水溶液において、生理食塩水は、輸液、各種添加剤を含む輸血又は注射用薬剤の溶媒として使用されることから特に有用である。そのため、末梢細胞に酸素を十分に供給する機能を有し、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果を高めることができる生理食塩水のニーズは極めて高い。【００１１】
前記特許文献１に記載されている輸液は、酸素ナノバブルの気泡径が１〜１０００ｎｍと規定されているものの、輸液を製造するために実際に検討された生理食塩水に含まれる酸素ナノバブルの気泡径は５０〜５００ｎｍである。前記特許文献１には、酸素ナノバブルを含有しない輸液（リンゲル液）に比べて高い酸素分圧が観測されることが記載されているが、その効果は定量的に検証されたものではなく、実際に低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果を十分に有するのか否かが不明である。本発明者等の検討によると、生理食塩水等の生体投与可能な水溶液に含まれる酸素ナノバブルの気泡径が５０ｎｍ以上であると、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果がほとんど得られず、酸素ナノバブルを含まない生理食塩水と比べて優位差がほとんど無いことが確認された。また、前記特許文献１に記載の発明と同じ方法で製造される前記特許文献２に記載の酸素ナノバブル水においても、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果が十分に得られないことが分かった。【００１２】
前記特許文献３に記載の輸液製剤は、動的光散乱法で求められる個数平均径が３００ｎｍ以下の酸素気泡を有するが、実際に実施例として検討された酸素ナノバブルの気泡径は個数平均径が２９９．５ｎｍである。そのため、前記特許文献１及び２と同じように、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果を十分に有するのか否かが不明である。気泡径が５０ｎｍ以上である酸素ナノバブルを有する生理食塩水を用いて本発明者らが行った上記の検討結果を鑑みると、前記特許文献３に記載の発明も、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果を得ることが難しい。【００１３】
また、前記特許文献４に記載の水性流体は、平均直径が約１００ｎｍ未満である酸素含有ナノバブルがイオン水性流中で安定的に形成されるものであるが、酸素含有ナノバブルの平均直径については実際に測定が行われておらず、０．２２及び０．１ミクロンフィルターを通過したときの溶解酸素測定結果から、酸素含有ナノバブルの平均直径を１００ｎｍ未満と推定しているに過ぎない。加えて、前記特許文献４には水性流体に含まれる酸素含有ナノバブルの密度が記載されておらず、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果を十分に奏する水性流体であるのか否かが不明である。【００１４】
さらに、前記特許文献５に開示されているように、ナノバブル水は癌の治療又は予防に効果があると期待されているものの、安定的に持続して顕著な効能が得られていないためナノバブル水の効能に対しては疑問視されており、具体的な治療への適用が進んでいないのが現状である。これは、従来から使用されているナノバブル水は気泡径が最小でも５０ｎｍであるため、温度や保管状態等の使用環境によってはナノバブルが急速に消失しやすく、且つ、生体内の細胞や血管への吸収性又は浸透性の点でも十分に機能していないためであると本発明等は考えた。前記特許文献５の発明においても、使用するナノバブル水は前記特許文献２に記載の方法で作製されており、その気泡径は５０ｎｍ以上である。【００１５】
本発明は、上記した従来の問題点に鑑みてなされたものであって、生理食塩水等の生体投与可能な水溶液に含まれる酸素ナノバブルの平均粒径が従来技術よりも小さく、且つ、その密度が高い場合に、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果が十分に得られるという検証に基づき、生体投与可能な水溶液に含まれる酸素ナノバブルの平均粒径をより小さくするだけでなく、酸素ナノバブルの密度についても高くする方向で最適化することによって、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果、及び嫌気性環境下で起きやすい癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果を高くするとともに、それらの効果が安定的に持続して得られる生体投与可能な水溶液及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、生理食塩水等の生体投与可能な水溶液に含まれる酸素ナノバブルの平均粒径を５０μｍ未満に小さくし、且つ、酸素ナノバブルの密度を高くする方向で規定するとともに、そのような性状と特性を有する酸素ナノバブルの形成方法を生体投与可能な水溶液の製造方法として適用することによって上記の課題を解決できることを見出して本発明に到った。【００１７】
すなわち、本発明の構成は以下の通りである。
[１]本発明は、酸素ナノバブルを含む生体投与可能な水溶液であって、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記酸素ナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とする生体投与可能な水溶液を提供する。
[２]本発明は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの前記酸素ナノバブルの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする前記[１]に記載の生体投与可能な水溶液を提供する。
[３]本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、前記生体投与可能な水溶液の１００質量部に対して、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含む生理食塩水であることを特徴とする前記[１]又は[２]に記載の生体投与可能な水溶液を提供する。
[４]本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、５％ブドウ糖液を添加した低張複合電解質液、リンゲル液、高カロリー液及びヘパリンを含む生食液の群から選択されるいずれかの輸液であることを特徴とする前記[１]〜 [３]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液を提供する。
[５] 本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、細胞培養液であることを特徴とする前記[１]〜[４]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液を提供する。
[６］本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止するために生体内への投与又は経口摂取によって使用する水溶液であることを特徴とする前記[１]〜[４]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液を提供する。
[７]本発明は、溶存酸素を含む水溶液を、２以上の貫通小穴を周方向に有する筒の外部から該貫通小穴を通して大気圧以上の圧力で噴射させるときに、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通小穴のそれぞれの開口部から噴射した溶存液を前記筒の中心に水撃が集中するように衝突させることによって発生させた酸素ナノバブルを含有し、該酸素ナノバブルは、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ３０ｎｍ以下及び１ｍｌあたり１０１６個以上であることを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[８]本発明は、前記酸素ナノバブルにおいて、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径及び密度がそれぞれ１〜１０ｎｍ及び１ｍｌあたり１０１７個以上であることを特徴とする前記[７]に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[９]本発明は、気体及び液体をそれぞれ吸引する手段と、前記気体及び前記液体を同時に加圧して搬送する手段と、該搬送された気体を含む前記液体を新たな酸素と混合させることによって溶存酸素を富化させるための気液混合槽と、該気液混合槽において気液混合の状態にある溶存液を用いてナノバブルを発生させるために、空洞の筒、該筒の周方向に２以上の貫通小穴のそれぞれの開口部が前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように配置された前記２以上の貫通小穴、及び前記筒の少なくとも片端部にナノバブル吐出口を有し、前記貫通小穴は該貫通小穴の断面中心部を通る延長線のすべてが前記筒の中心で交差するように配置される噴射ノズルと、を備えるナノバブル発生手段によって前記酸素のナノバブルを発生させることを特徴とする前記[７]又は[８]に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１０]本発明は、前記貫通小穴が、前記筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように、前記筒の周方向等間隔に４個以上８個以内で設けられ、前記筒の空洞に通じる部分の孔径が０．１〜０．５ｍｍであることを特徴とする前記[７]〜[９]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１１]本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、前記生体投与可能な水溶液の１００質量部に対して、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含む生理食塩水であることを特徴とする前記[７]〜[１０]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１２]本発明は、前記[１１]に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法において、前記溶存酸素を含む水溶液として塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含有する水溶液を使用することにより生理食塩水を製造することを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１３]本発明は、前記[１１]に記載の生体投与可能な水溶液の製造方法において、前記溶存酸素を含む水溶液として塩化ナトリウムを含まない水溶液を使用し、前記酸素ナノバブルを含む水溶液を製造した後、前記酸素ナノバブルを含む水溶液に塩化ナトリウムを前記生理食塩水の１００質量部に対して０．８５〜０．９５質量％で配合することにより生理食塩水を製造することを特徴とする生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１４]本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、カリウム及びカルシウムの少なくとも１種の元素、５％ブドウ糖液、アミノ酸並びにヘパリンの群から選択される少なくともいずれかの添加剤を含有して製造される輸液であることを特徴とする前記[７]〜[１３]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１５]本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、細胞を培養するために使用する細胞培養液として製造されることを特徴とする前記[７]〜[１４]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
[１６］本発明は、前記生体投与可能な水溶液が、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止するために生体内への投与又は経口摂取によって使用する水溶液であることを特徴とする前記[７]〜[１４]のいずれかに記載の生体投与可能な水溶液の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の生体投与可能な水溶液は、従来よりも小さな平均粒径を有する酸素ナノバブルが大量に含まれることにより、末梢細胞に酸素を十分に供給する機能を有し、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果を高めることができる。さらに、細胞を保護する効果が長期間に亘って安定して得られるだけでなく、その効果のバラツキを大幅に低減することができる。【００１９】
さらに、本発明の生体投与可能な水溶液は気泡径が３０ｎｍ以下であり、好ましくは１〜１０ｎｍと従来よりも小さいため、ナノバブルの寿命が温度や保管状態等の使用環境によって影響を受けることが小さく、且つ、生体内の細胞や血管等へのナノバブル水の吸収性又は浸透性が優れる。そのため、嫌気性環境下で起きやすい癌細胞の増殖及び肥大化を抑制する効果を安定的に継続して得ることができる。【００２０】
また、本発明による生体投与可能な水溶液の製造方法は、従来のナノバブル発生装置と比べて、３０ｎｍ以下の平均粒径を有する酸素ナノバブルを大量に、且つ、安定的に発生することができるため、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護するという効果、及び嫌気性環境下で起きやすい癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果を長期に亘って安定的に得ることができる生体投与可能な水溶液を容易に製造することができる。そのような効果を有する生体投与可能な水溶液は、従来技術では製造することが困難であり、本発明の製造方法によって初めて得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の生体投与可能な水溶液を製造するための酸素ナノバブル発生装置を示す正面図及び斜視図である。
【図２】図１に示す酸素ナノバブル発生装置において、酸素ナノバブルを発生させるノズル形状及び処理液を噴射するノズルヘッダーの例をそれぞれ示す図である。
【図３】図２に示す液衝突ノズル１２の１個の形状を示す図である。
【図４】参考例１の空気ナノバブル水及びナノバブルを含まない水について、それらアモルファス氷の電子顕微鏡像の写真及びナノバブルの粒度分布を示す図である。
【図５】本発明の実施例１の酸素ナノバブル水について、アモルファス氷の電子顕微鏡像の写真を示す図である。
【図６】動的光散乱法で測定した実施例１の酸素ナノバブル水のバブル粒径を個数分布で示す図である。
【図７】本発明の実施例１及び比較例１において、嫌気性環境下に置く前と放置後での細胞の形態変化を示す写真撮影図である。
【図８】本発明の実施例１及び比較例１において、細胞障害時に漏れ出る酵素（ＬＤＨ）の量を嫌気性環境下に置く前と放置後でそれぞれ測定した結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例１及び比較例１において、細胞発育力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を嫌気性環境下に置く前と放置後でそれぞれ測定した結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例１と比較例２において、嫌気性環境下に放置後で撮影した細胞の形態変化を示す写真撮影図である。
【図１１】本発明の実施例１と比較例２において、嫌気性環境下に放置後で測定した細胞生存率を示す図である。
【図１２】本発明の実施例３と比較例３において、癌細胞の培養を行ったときに使用した市販の低酸素培養キットを示す図である。
【図１３】本発明の実施例３と比較例３において、Ｏ２濃度が約１％である低酸素雰囲気で６時間及び２４時間留置した後のＨＩＦ−１ａ及びＨＳＣ７０の各タンパク質の誘導結果を示す図である。
【図１４】図１２の（ａ）において黒く写っている部分の面積を画像処理によって数値化するときの手順を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
気体のマイクロナノバブル発生させる技術としては、前記非特許文献１に記載されているように、旋回液流式、スタティックミキサー式、ベンチュリー式、加圧溶解式、細孔式等の様々な方法が従来から提案されている。また、前記特許文献１及び２に記載されているように、水溶液中に含まれる酸素を含有する微小気泡に物理的刺激、例えば、水中放電による衝撃波等を加えることにより、より微細な酸素ナノバブル（気泡径５０〜５００ｎｍ）を発生させる方法も提案されている。しかしながら、これら従来のナノバブル発生方法で得られる気泡径は、最も小さいものでも５０ｎｍ位が限度である。加えて、１００ｎｍ以下の気体ナノバブルは可視光及び紫外光の波長よりも小さい直径を有する非常に微細な粒子であるため、粒径を精密に測定できる測定技術が確立されておらず、気体のナノバブルを含む水溶液として一般的に呼ばれるものは、数十ｎｍ以下の粒子径を有するナノバブルの存在を明確に証明することが困難であった。
【００２３】
本発明者等は、従来のマイクロナノバブル発生方法で得られる最も小さな気泡径として５０ｎｍを有する酸素ナノバブルを含む生理食塩水を用いて、低酸素性又は嫌気性の刺激下で細胞を保護する効果を検証した。検証は、酸素ナノバブルを含む生理食塩水を細胞培養液に５０％混合した状態で、嫌気性（低酸素）刺激下で細胞形態の変化及び細胞損傷の程度を定性的及び定量的に測定し、実際に細胞の保護がどの程度行えるかを調べることによって行った。その結果、細胞の損傷程度は、酸素ナノバブルを含まない生理食塩水と比べて効果の優位差がほとんど無く、５０ｎｍ以上の気泡径を有する酸素ナノバブルを含む生理食塩水では細胞の大きな細胞損傷が見られ、細胞障害が大きいことが分かった。したがって、細胞を保護する効果に対しては、生理食塩水に含まれる酸素ナノバブルの粒径として一般的に１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満又は１００ｎｍ未満と規定するだけでは十分でないことが明らかとなった。
【００２４】
本発明は、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の保護効果を検証する上記の結果から、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護する効果が、生理食塩水に含まれる酸素ナノバブルの平均粒径を従来方法よりもさらに小さく、且つ、その密度を高くすることによって十分に得られるではないかとの思想に基づいて、そのような性状及び特性を有する酸素ナノバブルを含む生理食塩水を製造できる方法について試行錯誤で検討を行い、実現可能な方法を見出すことによってなされたものである。そして、実際にその方法によって製造される生理食塩水を細胞培養液として使用することにより、低酸素性又は嫌気性の刺激下で細胞を保護する効果が確認された。なお、検証結果については、後述の実施例において詳細に説明する。
【００２５】
本発明において使用する生理食塩水に含まれる酸素ナノバブルの大きさは、平均粒径で規定することができる。平均粒径が小さいものほど、ナノレベルで含まれるバブルの量が多く、それよりも大きな粒径を有するバブルの量が少なくなる傾向にある。マイクロ・ナノバブルの大きさは、粒度分布（粒径の標準偏差）によっても影響を受けるが、その影響は小さく、生理食塩水に含まれるナノバブルは、平均粒径が５０ｎｍ未満のオーダーであり、できるだけ小さい平均粒径を有することが必要である。
【００２６】
本発明において、酸素ナノバブルは、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの平均粒径が３０ｎｍ以下であり、好ましくは１ｎｍ以上で１０ｎｍ以下である。酸素ナノバブルの平均粒径が３０ｎｍ以下であるときに、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果が高い状態で安定的に持続して得られる。さらに、１０ｎｍ以下であれば、著しく大きな効果を得ることができる。他方、細胞を保護する効果は、酸素ナノバブルの平均粒径が１ｎｍ未満であっても飽和する傾向にあり、酸素ナノバブル発生装置を製造するときの技術的なハードルの高さを考慮すると経済性及びメンテナンス容易性の観点から、平均粒径は１ｎｍ以上で規定するのが好ましい。
【００２７】
本発明においては、酸素ナノバブルの平均粒径だけでなく、さらに、生理食塩水等の生体付与可能な水溶液１ｍｌ中に含まれる個数、すなわち、酸素ナノバブルの密度を高い値に規定することが必要である。これは、酸素ナノバブルの平均粒径を３０ｎｍ以下と非常に小さくすることによりバブルの保存安定性及び粒径維持性の向上を図る一方で、低酸素性又は嫌気性の刺激下で細胞を保護する機能を十分に発揮できるように、生理食塩水等の生体付与可能な水溶液１ｍｌ中に含まれる酸素の総量を高くする必要があるためである。
【００２８】
本発明で使用する生理食塩水等の生体付与可能な水溶液に含まれる酸素ナノバブルの密度は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定したときの密度が生理食塩水等の生体付与可能な水溶液１ｍｌあたり１０１６個以上であることが必要であり、好ましくは１０１７個／ｍｌ以上である。本発明で利用する酸素ナノバブルは、そもそも平均粒径が非常に小さいため、その密度が１０１６個未満であると、単位体積当たりの生体付与可能な水溶液に含まれる酸素濃度が薄くなるため、低酸素性又は嫌気性の刺激下で細胞を保護する効果を十分に得ることができない。低酸素性又は嫌気性の刺激下で細胞を保護する効果は、酸素濃度が高いほど大きくなる。さらに、酸素ナノバブルの平均粒径が１〜１０ｎｍの場合は、生体付与可能な水溶液に含まれる酸素の濃度を十分に確保するため、酸素ナノバブルの密度が１０１７個／ｍｌ以上であるのが好ましい。
【００２９】
マイクロ・ナノバブルの粒径の測定方法としては、従来から様々な方法が知られている。それらの中で、ナノバブルの計測法は、光学的な観察が困難であるため、例えば、ミー散乱光を利用する光散乱法、レーザ回折・散乱法、液中のバブル粒子のブラウン運動を観測するナノ粒子トラッキング解析法、細孔電気抵抗法（コール・カウンター法）、動的光散乱法、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の梁を利用する共振式質量測定法等が提案されている。これらの方法以外にも、ゼータ電位測定によるナノバブルの粒子径を求める方法やスピントラップ剤を用いて電子スポン共鳴法（ＥＳＲ）によるナノバブルの存在を確認する方法が提案されている。
【００３０】
本発明等は、上記以外のマイクロ・ナノバブル計測法として、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法を提案している（特願２０１４−２３０４０７号を参照）。この方法は、液体を非晶質の固相状態にし、前記非晶質の固相状態にある液体に含まれる超微細バブルを透過型電子顕微鏡を用いて観察することによって、液中に含まれる超微細バブル及びその分布状態を直接的に画像として観測し解析できる。そのため、１０ｎｍ未満の粒径を有する超微細バブルを高精度に測定することができる。また、この方法は、酸素ナノバブルの平均粒径の他にも、粒径分布及び密度を求めることができるため、本発明において規定する酸素ナノバブルの平均粒径及び密度は、この方法で測定して求めたものである。
【００３１】
氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法は、マイクログリッド又はマイクロメッシュに保持した液体を試料として用い、エネルギーが１０〜３００キロエレクトロンボルト（ｋｅＶ）の透過型電子顕微鏡によって、観察のときに用いる電子線の数を１〜１０５電子／Å２に設定して測定が行われる。
【００３２】
なお、本発明で使用する酸素ナノバブル水のバブル粒径は、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法以外にも、例えば、動的光散乱法（光子相関法）によって測定することが可能である。例えば、大塚電子製の粒径・分子量測定システム（型番：ＥＬＳＺ−２０００Ｓ）又はゼータ電位・粒径・分子量測定システム（型番：ＥＬＳＺ−２０００ＺＳ）等の測定装置を用いて、特殊なデータ処理を行うことによって１０ｎｍ以下のバブル径の測定が可能になる。ここで、特殊なデータ処理とは、例えば、測定の積算回数を増やし、測定時に不確定乱反射するデータだけを削除することによって安定的に存在する粒子だけを抽出し、その粒径を測定する方法である。
【００３３】
本発明者等が検討を行った結果、動的光散乱法による測定方法でも、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法と同じような粒径測定結果が得られることが確認できた。両者の測定方法の対比については、後述の実施例１において具体的なデータを示しながら説明する。しかしながら、動的光散乱法は測定粒子が内実であるのか、又は中空であるのかを明確に区別することが極めて難しい。さらに、酸素ナノバブルの密度についても高精度測定を行うことが技術的な制約を受け、困難である。それに対して、本発明のように氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法は、電子顕微鏡によって測定粒子が内実か中空であるかを明確に区別して観測することができるだけでなく、酸素ナノバブルの密度も高精度で測定することが可能である。したがって、本発明においては、酸素ナノバブル径の測定方法として、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定する方法を採用する。
【００３４】
本発明の生体投与可能な水溶液は、通常の生理食塩水と同じように、浸透圧が血液又は体液に合致するように基本的に０．９質量％の塩化ナトリウムを含むことにより生理食塩水として使用することができる。本発明の生理食塩水において、塩化ナトリウムの含有量は、ある程度のバラツキがあっても許容されている。しかしながら、塩化ナトリウムの含有量が０．９質量％から極端に離れる場合は使用が大きく制限される。したがって、本発明の生体投与可能な水溶液を生理食塩水として使用する場合は、塩化ナトリウムを生理食塩水の１００質量部に対して０．８５〜０．９５質量％の範囲で含むことが好ましい。
【００３５】
本発明の生理食塩水は、人体の臓器又は生体内反応の酸化還元電位に合わせるために、酸化還元電位を調整する場合には、水素ナノバブルや他の電解質溶液を少量混入させてもよい。また、生理食塩水のｐＨを調整するため、電解質等からなるｐＨ調整剤を添加してもよい。
【００３６】
また、本発明の生体投与可能な水溶液は、次のような各種の添加剤を含む輸液として使用することができる。例えば、本発明の生理食塩水に、５％ブドウ糖液を所定の量で添加した低張複合電解質液、カリウムやカルシウムを加えたリンゲル液、ブドウ糖やアミノ酸を添加した高カロリー液、ヘパリンを添加した生食液である。本発明の輸液を製造する場合は、通常、本発明で得られる生理食塩水を溶媒として使用するが、必ずしも塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％の範囲で含む生理食塩水を使用することに限定されるものではない。本発明の輸液を生体に投与するとき、輸液の浸透圧を血液又は体液に厳密に合わせる必要が必ずしも無い場合には、塩化ナトリウムの含有量を低減したり、若しくは塩化ナトリウムを全く含まない水溶液、又は塩化ナトリウムの含有量を増やした水溶液を用いて、前記の各種添加剤を含有させたものを輸液として使用してもよい。
【００３７】
本発明の生理食塩水又は輸液は、血管平滑筋細胞等の各種細胞を培養するための水溶液として使用することができる。例えば、運動中や運動後の低血糖状態や低酸素状態における細胞障害の低減を図り、心筋梗塞、脳梗塞及びその他の循環血流障害による細胞障害に対する保護を高めたいときに大きな効果を得ることができる。
【００３８】
また、本発明の生体投与可能な水溶液は、低酸素濃度の嫌気性雰囲気下で起こる癌の増殖及び肥大化を抑制又は防止するために生体に投与又は経口摂取する水溶液として使用することができる。従来から癌細胞は嫌気性雰囲気下で増殖しやすいことが知られており、癌細胞の周りを酸素濃度の高い好気性にすることにより、その増殖及び肥大化が抑えられるではないかと考えられていた。そのため、例えば、前記特許文献５に開示されているように、気泡径が５０ｎｍ〜５００ｎｍのナノバブル水を癌治療用として使用することが提案された。しかしながら、生体内の正常な細胞や血管の表面に存在する孔径は３０ｎｍ以下、具体的には数ｎｍ〜十数ｎｍの範囲であるため、酸素又はオゾンのナノバブル水内に存在する気泡径が５０ｎｍ以上では、生体内の細胞又は血管の内部への吸収性又は浸透性が必ずしも十分であるとは言えなかった。さらに、生体は通常３５〜３７℃とやや高温に維持されているため、ナノバブルの気泡径が大きくなるほど、バブルの大径化が加速されバブル消失が促進されることから、癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果が十分に得られなかった。仮に、その効果があったとしても安定的に持続するものではなかった。
【００３９】
それに対して、本発明の生体投与可能な水溶液に含まれるナノバブルは、気泡の平均粒径が３０ｎｍ以下、好ましくは１〜１０ｎｍであり、加えてバブルの密度が非常に高いため、生体内細胞内への吸収性又は浸透性が優れるとともに、その気泡径で存在するナノバブルの寿命が相対的に長くなる。それにより、従来のオゾンナノバブル水又はオゾンと酸素のナノバブル水を併用した場合に比べて、本発明のように酸素ナノバブルだけを含む水溶液であっても癌細胞の周辺環境を酸素濃度の高い好気性に長期間維持することが可能になり、癌の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果が高くなる。さらに、その効果を相対的に長い期間にわたって持続することが可能になる。このように、本発明の生体投与可能な水溶液は、癌の増殖及び肥大化を抑制又は防止するための薬剤としての機能を有しており、そのような癌治療等の医療分野において好適な水溶液である。
【００４０】
次に、本発明の生理食塩水を製造するための酸素ナノバブル発生装置について図面を用いて説明する。
【００４１】
図１は本発明で使用する酸素ナノバブル発生装置の一例を示す図であり、基本的な構成は特許第５５５５８９２号公報に記載されている装置と同じである。図１において（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ酸素ナノバブル発生装置の正面図と斜視図である。図１に示す酸素ナノバブル発生装置１において、２がベローズシリンダポンプ、３が気液混合槽、４がポンプコントローラ、５が圧力センサ、６がマイクロ・ナノバルブ発生用ノズル取付部、７が液吸引管、８が気体吸引口、９が気体吸引調整バルブである。
【００４２】
これらは、図１の（ｂ）に示す斜視図のように配置する。接液部をフッ素樹脂で作成したベローズシリンダポンプ２で７の液吸引管、９の気体吸引調整バルブを使用して気体量を調整してポンプ内部に液と気体を混ぜた状態で吸い込んでベローズ内部で撹拌、溶存させて、圧縮液の中に酸素を溶存させる。本発明においては、ベローズシリンダポンプ２はメタルフリーであれば良く、フッ素樹脂以外のプラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエチレンテレフタレート等の汎用プラスチック、ポリアセタール、ポリアミド、ポリカーボネート及び変性ポリフェニレンエーテル等のエンジニアリングプラスチック、ポリエーテルサルフォン、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン及び液晶ポリマー等のスーパーエンジニアリング等の少なくとも１種を使用しても良い。その場合、ポンプだけでなく、液設部にもフッ素樹脂を始め、前記の各種プラスチックを用いることによって、信頼性の高い清浄な酸素ナノバブル発生装置とすることができる。また、本発明において、厳密なメタルフリー化による洗浄や殺菌が要求されない場合には、上記のプラスチックだけでなく、金属やセラミックスを使用しても良い。
【００４３】
次に、気液混合槽３に気体と液をポンプ２で撹拌して圧送する。ポンプ２は、主に圧縮空気起動式ベローズシリンダポンプを使用するが、電動式のものであっても良い。気液混合槽３の気体と液とは、ポンプ２からの圧力を受けており、気体が溶存しやすくなる。つまり気体と液体とをポンプ２から圧送する圧力を５の圧力センサでチェックしている。この方法によって溶存気体の量を多くしてナノバブルの発生量を増やす準備を行う。本発明の酸素ナノバルブ発生システムはポンプ２としてベローズシリンダポンプを用いるのが実用的であるが、用途に応じて、従来から送液ポンプとして公知のピストンポンプ、プランジャーポンプ又はダイヤフラム等の往復動ポンプや、ギヤーポンプ、偏心ポンプ又はネジポンプ、カスケードポンプ、ベーンポンプ等の回転ポンプ等を適用することができる。
【００４４】
圧送されて気液混合槽３に入った液は酸素と混合して、酸素を液の内部に溶存させてからナノバルブ発生用ノズル取り付け部６に送る。ナノバルブ発生用ノズル取り付け部６は、溶存した酸素を直径が３０ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ〜１０ｎｍの大きさの酸素ナノバルブを大量に作成するノズルと接続する部分である。
【００４５】
このとき、５の圧力センサでノズル６と気液混合槽３との間の液圧力の変動をみて気液の溶存状態を監視する。こうすることで安定したナノバルブ用発生ノズルに必要な一定した圧力状態を実現する。
【００４６】
図１の（ａ）及び（ｂ）に示す本発明で使用する酸素ナノバルブ発生装置を用いて実施する工程は次の通りである。液吸引管７、気体（酸素）吸引口８及び気体吸引調整バブル９を用いて行うのが気体・液体吸引工程である。圧力は、圧力センサ５で調整する。次に、ベローズシリンダポンプ２を用いて酸素を含有する気体を含む液体を加圧する工程が気体・液体加圧工程である。引き続き、加圧された前記の気体を含む液体を新たな酸素と混合させるために、ポンプコントローラ４及び気液混合槽３を用いて行う工程が溶存気体富化工程である。その後、後述する本発明の発生ノズルを酸素ナノバルブ発生用ノズル取付部６に接続してから酸素ナノバブルを発生させる。この工程を溶存気体微細化工程と呼ぶが、酸素ナノバブルは、２以上の貫通小穴を有する筒の外部から該貫通小穴を通して大気圧以上の圧力で噴射し、前記筒の内部の一点で衝突させることによって発生させることができる。
【００４７】
本発明で使用する酸素ナノバルブ発生装置においては、空気が含まれる通常の液体を真空下で脱気処理することにより液体中に含まれる空気をできるだけ除いた状態にした液体を使用してもよい。脱気処理後の液体は、気体吸入口８から吸引した酸素及び／又は溶存気体富化工程において新たな酸素とそれぞれ混合された後、本発明で使用するバブル発生ノズルを用いて酸素ナノバブルの発生を行うことにより、酸素ナノバブルを含む液体として使用される。この方法は、酸素を混合する前に液体を脱気することにより、後で行う酸素の混合及び溶存の工程で液体中の酸素濃度をより高める効果が得られることから本発明の製造方法において好適に採用される。
【００４８】
図２に  図１の洗浄装置において、酸素ナノバブルを発生させるノズル形状及び処理液を噴射するノズルヘッダーの例をそれぞれ示す。図２において、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれノズルヘッダー１０の断面図及び上面図である。図２の（ａ）は、（ｂ）のＤ−Ｄ断面を示している。
【００４９】
図２の（ａ）及び（ｂ）に示すように、ノズルヘッダー１０は、処理液を噴射するための噴射ノズル１１及び酸素ナノバブルを吐出させるための液衝突ノズル１２と台１３とから構成されており、液衝突ノズル１２の１個又は２個以上を１３の台上に取り付け配置する。ここで、液衝突ノズル１２が、酸素ナノバブルを発生させるノズル形状の例である。
【００５０】
図３は、図２の（ａ）に示すノズルヘッダー１０の液衝突ノズル１２を配置した部分の拡大図である。図３に示すように、１２の液衝突ノズルの１個の形状において、１２ａの小さな穴は１２の中心に向かって空いている。この小さな穴１２ａを通り、高圧で入った液を液衝突ノズル１２の中心部分で衝突させてナノバブルを発生させ、矢印Ｑで示す方向に噴射する。実験の結果、液の速度Ｖをコントロールすれば、発生したナノバブルの量が多く、かつバブルの寿命が長くなることがわかった。速度Ｖの目安として、２５m／秒を超える速度になると安定したナノバブル発生ノズルになる。
【００５１】
図２及び図３において液衝突ノズル１２から噴射した水溶液（Ｑ）は、例えば、酸素ナノバブルを含む生理食塩水を製造するときに、次の２つの方法に従って調整する。第１の方法は、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含有する水溶液を使用し、該水溶液に酸素を溶存させた後に噴射ノズル１１から噴射して得られる気液混合液をそのまま生理食塩水とする方法である。また、第２の方法においては、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として塩化ナトリウムを含まない水溶液（純水を含む）を使用し、酸素ナノバブルを含む水溶液を製造した後、前記酸素ナノバブルを含む水溶液に、塩化ナトリウムを前記生理食塩水の１００質量部に対して０．８５〜０．９５質量％で配合することにより生理食塩水として用いる。
【００５２】
また、前記水溶液（Ｑ）を輸液として調整する場合も、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として、カリウム及びカルシウムの少なくとも１種の元素、５％ブドウ糖液、アミノ酸並びにヘパリンの群から選択される少なくともいずれかの添加剤をあらかじめ含有する水溶液を使用し、該水溶液に酸素を溶存させた後に噴射ノズル１１から噴射して得られる気液混合液をそのまま輸液として使用することができる。このとき、必要に応じて塩化ナトリウムを同時に含有させてもよい。この方法以外にも、図１に示す液吸引管７によって吸引する液として前記添加剤を含まない水溶液を使用し、酸素ナノバブルを含む水溶液を製造した後、前記酸素ナノバブルを含む水溶液に、前記添加剤を所定の含有量で配合することにより輸液として使用する。このとき、前記添加剤を含まない水溶液としては、純水だけではなく、塩化ナトリウムを含む生理食塩水を使用してもよい。
【００５３】
液噴射ノズル１１からの水流を用いて酸素ナノバルブを作成する方法について説明する。高速ジェット液噴射ノズル１１から出たベローズシリンダポンプ２からなる高圧ポンプの吐出圧力（大気圧以上）状態から圧力を急激に解放するので、酸素が溶存する液が互いに激突し、その水撃力で炸裂する力で気体を溶存した液を砕いて酸素ナノバルブを大量に含む状態にする。ただし解放する方法によっては、酸素ナノバブルの発生量が少なくなってしまう場合があるが、本発明による方法と装置によって酸素ナノバブルを大量に発生させることができる。
【００５４】
本発明の生理食塩水に含まれる酸素ナノバブルは、例えば、図２及び図３に示すような構造を有する液衝突ノズル１２を使用することによって、気液混合の状態にある溶存液を噴射するときの圧力が大気圧（約０．１ＭＰａ）以上であれば、酸素ナノバブルの発生量を従来と同等以上にすることができる。さらに、この圧力を０．２ＭＰａ以上に設定することによって、十分な量で発生させた酸素ナノバブルを含む生理食塩水を製造することができる。このように、本発明においては溶存液の噴射圧力の下限値を０．２ＭＰａと従来よりも低くできるため、金属コンタミの影響を無くすために好適なポンプ、例えば、フッ素樹脂で作製した圧縮空気駆動式又は電動式のベローズシリンダポンプ２を使用することが可能となる。酸素溶存液の噴射圧力の上限値は特に規定されないが、噴射圧力の増大に伴う酸素ナノバブル発生装置１の負荷を低減したい場合には１．０ＭＰａ以下に設定することが好ましい。
【００５５】
本発明の生理食塩水を製造するときに使用する酸素ナノバブル発生装置のノズルは、大気圧以上、好ましくは０．２ＭＰａ以上という従来よりも低い圧力でも溶存液のジェット流を噴射できるように設計する。気体溶存液のジェット流の噴射及び衝突によって得られる水撃力をＦとする。水撃力Ｆは、液の密度をρ、小さい穴の大きさをＳ、液の速度をＶとするとき、Ｆ＝ρSV2の関係が成り立つ。Ｆを最適値にするためには、穴の大きさSと速度Ｖの関係を考慮した最適設計が必要になる。
【００５６】
本発明で使用する酸素ナノバブル発生装置においては、図２及び図３の１２で示す液衝突ノズルが有する貫通孔の径Ｓ、すなわち小さな穴１２ａの径が０．１〜０．５ｍｍであることが好ましく、さらに０．２〜０．４ｍｍであることがより好ましい。ここで、液衝突ノズル１２の穴１２ａの径が０．１ｍｍ未満であると、粒径が小さな微細酸素バブルの生成量は増える傾向にあるものの、１ｎｍ以上の粒径を有するバブルの生成量が急激に少なくなるため、酸素ナノバブルの発生量が低下して、酸素ナノバブルの密度低下が顕著になる。また、液衝突ノズル１２の穴１２ａの径が０．５ｍｍを超えると、１ｎｍ以上の粒径を有するバブルの総生成量は増えるものの、逆に、１０ｎｍ以下の小粒径バブルの生成量が急激に減少するため、平均粒径の増大に伴って酸素ナノバブルの安定性が急激に低下し、本発明の効果を十分に奏することができない。したがって、本発明においては、酸素ナノバブルの平均粒径を３０ｎｍ以下と小さくし、酸素ナノバブルの密度を生理食塩水１ｍｌあたり１０１６個以上と大量にするために、液衝突ノズル１６の貫通小孔径は０．１〜０．５ｍｍの範囲で設けることがより好ましい。さらに、液衝突ノズル１６の貫通小孔径を０．２〜０．４ｍｍの範囲で設けることにより、酸素ナノバブルの平均粒径及び密度をそれぞれ１〜１０ｎｍ及び生理食塩水１ｍｌあたり１０１７個以上にすることができる。
【００５７】
同じ効果は、四方から中心に向けて発射してセンターに水撃を集中させることで速度をより高めることができ、平均粒径がより小さな酸素ナノバブルを大量に発生させることができる。そのため、四方からの水撃を行う場合には、水噴射の速さが同じある場合、貫通孔の穴の個数に応じてより大きな効果を得ることができる。例えば、F=ρSV2なので貫通小孔が４穴あり、それらが中心に集中する場合は、中心に集まる力F=４ρSV２になり、貫通孔の穴の個数が２の場合と比べて２倍の水撃力が得られる。このように液が衝突して中心に水撃を集中させるのにノズルの小さい穴の個数を多くすると、流量が多くなるため液の衝突するエネルギーが高くなる。酸素ナノバブルの発生量は液の衝突するエネルギーが大きくなれば、より小さな平均粒径を有する酸素ナノバブルを大量に発生させることができる。
【００５８】
本発明においては、液衝突ノズル１２の貫通小孔径を０．１〜０．５ｍｍと規定することにより、酸素溶存液の速度Ｖが上昇し、発生する酸素ナノバブルの平均粒径を小さくできる効果が得られる。加えて酸素ナノバブルの密度も同時に高くする必要があるため、液衝突ノズル１２の貫通小孔の個数は、液衝突ノズル１２の筒の周方向等間隔に４個以上８個以内で設けることが好ましい。液衝突ノズル１２の貫通小孔の個数が３個以下であると、酸素ナノバブルの密度の低下が顕著になる。また、貫通小孔の個数が９個以上である場合は、酸素ナノバブルの密度向上の効果が飽和するだけでなく、液衝突ノズル１２の貫通小孔の位置合せを行うときに高精度が要求されるため、液衝突ノズル１２の製造が非常に困難になる。
【００５９】
また、本発明で使用する酸素ナノバブル発生装置においては、液衝突ノズル１２の形状は、１２ａの小穴を４〜８個で周方向に等間隔に設けるだけでなく、例えば、液衝突ノズル１２の長手方向に２段以上で並行して貫通小孔の穴をあけ、液の水撃の発生する場所を２ヵ所以上にしてもよい。それによりナノバブルを大量に発生させることが可能になるので、ノズルの小型化と効率化には有効な方法である。さらに、４個以上の小穴から液を同時に吐出させることで水撃の強度を増加させることができるため、液の速度Ｖを上げなくとも３０ｎｍ以下の平均粒径を有する酸素ナノバブルを大量に発生できる。そのため、高圧で液を吐出させるポンプが必要でなくなり、負担が少なくて済むため、工業的には、非常に有益な技術で、エネルギー効率の良いノズルの開発ができる。
【実施例】
【００６０】
以下において、本発明に基づく実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。【００６１】
＜参考例１＞
特許第５５５５８９２号公報に開示された方法に従ってナノバブル水作製装置ΣPM-5  (ベローズポンプ式) (シグマテクノロジー有限会社製)により空気ナノバブル水を作製し、純水によって１００倍に希釈して測定用試料として用いた。液噴射ノズルとして、図２に示す液衝突ノズル１２を有するものを使用した。液衝突ノズル１２に設ける貫通小孔の穴は、液衝突ノズル１２を構成する筒の径方向断面と平行な同一平面上で対向するように、前記筒の周方向等間隔に６個で設けられており、前記筒の空洞に通じる部分の孔径が０．３ｍｍである。また、参考用試料としてナノバブル作製前の純水を用いた。ナノバブル作製前の純水は、ナノバブルを含まない水に相当する。【００６２】
試料急速凍結装置Vitrobot Mark IV (FEI社製)により作製直後の前記空気ナノバブル水を急速凍結してナノバブルをアモルファス氷中に包埋した試料を作製し、観察用試料とした。試料厚さは２００ｎｍである。一方、ナノバブルを含まない水（純水）についても同じ試料急速凍結装置により急速凍結して参考用試料とした。試料厚さは２００ｎｍである。３００ｋｅＶの電子エネルギーを有するクライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、試料温度約８０Ｋにおいてアモルファス氷中に包埋されたナノバブルを直接観察した。観察に用いる電子線は、Ｌｏｗ  ｄｏｓｅ技術によって２０ 電子/Å２程度であり、撮影中の試料温度の上昇はほとんどなかった。【００６３】
図４に、空気ナノバブルを含む純水を凍結したアモルファス氷及び純水（ナノバブルを含まない水）を凍結したアモルファス氷について電子顕微鏡像の写真を示す。また、空気ナノバブル水については、電子顕微鏡写真の下にバブルの粒度分布（サイズ分散を示すヒストグラム）を示す。【００６４】
図４の左側に示す電子顕微鏡像の写真は、ΣＰＭ−５によって作製後、ただちに観察された空気ナノバブルであり、写真中に観察される円形のコントラストがナノバブルである。画像処理の結果、平均粒径は７ｎｍである。ヒストグラムの測定に用いたアモルファス氷の体積は3.2×10-14 cc（400 nm×400 nm×200 nm厚さ）であり、その中にバブルは約260個含まれている。100倍に希釈したナノバブル水を観察していることから、このナノバブル水の空気ナノバブルの濃度は、8.1×1017個/cc (mｌ)（81京個/cc (mｌ)）であると評価される。それに対して、図４の右側に示す電子顕微鏡像の写真はアモルファス氷でありコントラストの変化はなく、バブルが含まれない水であることが確認できる。このように、本発明による測定方法及び測定装置によって、水に含まれるナノバブルの存在を直接的に画像として確認することができるだけでなく、ナノバブルの粒子径、個数、粒度分布及び形態に関する情報を取得することができる。【００６５】
＜実施例１＞
空気に代えて酸素を用いる以外は、前記参考例１と同様の装置と方法によって酸素ナノバブルを含む水溶液を製造した。本実施例による酸素ナノバブル水は、クライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、参考例１と同じ条件と方法によって平均粒径及び密度を測定した。図５に、酸素ナノバブルを含む純水を凍結したアモルファス氷について電子顕微鏡像の写真を示す。【００６６】
図５において、写真の中央部付近に実線の円で囲った領域には平均粒径は３ｎｍ の暗いコントラストが認められる。また、写真の下部付近に点線の円で囲った領域には暗いコントラストが連続的につながって配列し、線のように観察される部分が存在しているが、これも酸素ナノバブルである。この結果から、３ｎｍの平均粒径を有する酸素ナノバブルは、孤立して存在するのではなく、一部凝集した配列をとることが明らかになった。このアモルファス氷の体積１．８×１０−１４ ｃｃ（３００ｎｍ×３００ｎｍ×２００ｎｍ厚さ）中には酸素ナノバブルが３６０個含まれていることが分かり、酸素ナノバブル水を１００ 倍に希釈した水を用いて観察していることから、このナノバブル水の酸素ナノバブルの密度は、２×１０１８個／ｃｃ（ｍｌ）（２００ 京個／ｃｃ（ｍｌ））であると評価される。【００６７】
図６には、参考までに大塚電子製の粒径・分子量測定システム（ＥＬＳＺ−２０００Ｓ）を用いて動的光散乱法で測定した本実施例の酸素ナノバブル水のバブル粒径を個数分布で示す。図６に示す個数分布は、前記で述べたように特殊なデータ処理を行った後の測定結果である。図６に示すように、本実施例の酸素ナノバブルは、粒径が１〜１０ｎｍの狭い範囲で分布しており、図５に示す結果とほぼ同じような粒度分布が得られている。また、平均粒径として３μｍに近い値を有することが容易に見て取れる。このように、氷包埋法によってクライオ透過型電子顕微鏡で測定を行う本発明の測定方法は、酸素ナノバブル水のバブル粒径を正確に測定できることが動的光散乱法との対比からも確認できた。【００６８】
このようにして製造された酸素ナノバブルを含む水に、塩化ナトリウムの含有量が生理食水１００質量部に対して０．９質量％となるように配合することにより本実施例の生理食塩水を製造した。この生理食塩水を実施例１とする。【００６９】
＜比較例１＞
前記参考例１で検討した酸素ナノバブルを発生させる前の純水に、塩化ナトリウムを前記生理食塩水の１００質量部に対して０．９質量％で配合することにより比較例１の生理食塩水を製造した。【００７０】
以上のようにして製造された酸素ナノバブルを含む細胞培養液（実施例１）及び酸素ナノバブルを含まない細胞培養液（比較例１）を用いて、嫌気性（低酸素）の刺激下で細胞形態の変化及び細胞損傷の程度を定性的及び定量的に測定し、細胞の保護がどの程度行えるかを検証した。検証は、以下の方法で行った。【００７１】
実施例１及び比較例１の生理食塩水を用いて細胞培養液を作成し、１２時間嫌気性環境下で血管平滑筋細胞の培養を行い、嫌気性環境下に置く前と放置後での細胞の形態変化を写真撮影して比較した。また、細胞が障害を受ける場合は細胞障害時に漏れ出る酵素（ＬＤＨ）の量が多くなるため、嫌気性環境下に置く前と放置後でのＬＤＨの量を測定した。ＬＤＨは、この量が高いほど細胞障害が高いことを意味する。さらに、ミトコンドリアの機能（ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ）の比較を行うため、嫌気性環境下に置く前と放置後での細胞発育力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙは、この値が低いほど細胞障害が高いことを意味する。【００７２】
実施例１及び比較例１の各生理食塩水について細胞の形態変化を写真撮影した結果、ＬＤＨの量の測定結果、及びｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｔｙの測定結果を、それぞれ図７、図８及び図９に示す。図７において、「検証前」は通常の細胞培養液中に見られる血管平滑筋細胞の形態を示し、「比較例１（前）」及び「実施例１（前）」は嫌気性環境下に置く前を、「比較例１（後）」及び「実施例１（後）」は１２時間嫌気性環境下に放置後を、それぞれ意味する。【００７３】
図７に示すように、実施例１は嫌気性環境下１２時間放置後でも細胞形態が保持されるのに対して、比較例１では細胞が小さくなり死にかけているのが分かる。また、図８に示すＬＤＨ量の測定結果から分かるように、実施例１は比較例１と比べて、嫌気性環境下１２時間放置後においてＬＤＨの流出が優位に少なくなっている。図９に示すｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙの値についても、実施例１は比較例１と比べて、嫌気性環境下に置く前と１２時間放置後との差が小さく、ミトコンドリアの機能が保持されていることを示している。【００７４】
以上の結果から、血管平滑筋細胞においては実施例１（酸素ナノバブルを含む細胞培養液）が嫌気性（低酸素性）の刺激から細胞及びミトコンドリアを保護する機能が非常に高いことが確認された。本検証では例として血管平滑筋細胞を用いたが、血管平滑筋細胞に限らず、すべての細胞について同じ結果が得られるものと推察できる。例えば、本発明の酸素ナノバブルを含む生理食塩水は低血糖状態における細胞障害が低減できるため、運動中又は運動後における低血糖状態での細胞障害低減効果が期待できる。また、本発明の酸素ナノバブルを含む生理食塩水は低酸素状態における細胞障害が低減できるため、心筋梗塞、脳梗塞及びその他の循環血流障害による細胞障害に対する保護効果も期待される。【００７５】
＜比較例２＞
前記特許文献２に開示された方法に従って、気泡径５０〜５００ｎｍを有する酸素気ナノバブルを含む水溶液を製造し、この水溶液を用いて細胞培養液を作製した。この細胞培養液を比較例２とする。比較例２の細胞培養液について細胞毒性を確認するため、まず通常環境下で一晩血管平滑筋を培養した。比較として通常の細胞培養液、及び前記実施例１で製造した酸素ナノバブルを含有する細胞培養液を用いた。細胞傷害の指標として、細胞形態の変化及び細胞損傷の程度を定性的及び定量的に測定し、細胞の保護がどの程度行えるかを検証し、細胞の保護の程度を前記実施例１の生理食塩水と比較した。検証は、実施例１と同じ方法で行い、嫌気性環境下に放置後での細胞の形態変化の観察とともに、ミトコンドリアの機能を測る試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）として、嫌気性環境下に放置後の細胞生存率を測定した。【００７６】
実施例１及び比較例２の各細胞培養液について細胞の形態変化を写真撮影した結果及びＭＴＴ ａｓｓａｙによる細胞生存率の測定結果を、それぞれ図１０及び図１１に示す。図１０において、上段の左側に示す「通常の細胞培養液」の写真図は、酸素ナノバブルを含まない細胞培養液であり、嫌気性環境下に置く前の状態のものである。また、図１０において上段中央及び上段右側は、嫌気性環境下で一晩放置後の細胞の形態変化を示す写真図である。他方、図１０において下段中央及び下段右側は、細胞を含まない培養液のみを使用し、嫌気性環境下で一晩放置後の培養液の変化を撮影したときの写真図である。【００７７】
図１０の上段に示す写真から分かるように、実施例１は嫌気性環境下で一晩放置後でも細胞形態が保持されており、培養液細胞毒性が認められなかった。それに対して、比較例２（気泡径５０〜５００ｎｍを有する酸素気ナノバブルを含む水溶液を含有する細胞培養液）は非常に強い細胞毒性を示し、一晩放置後にはほぼ全ての細胞が死滅した。また、図１０の下段に示す培養液のみの写真において、実施例１は沈殿物がないのに対して、比較例２では培養液中に沈殿物が多く存在していることが観測された。このように、比較例２では培養液中のタンパク等が凝集する作用が働き、細胞毒性が認められる結果になったものと考えている。この結果は、図１１に示す細胞生存率の測定結果からも容易に読み取ることができる。すなわち、実施例１は、嫌気性環境下で一晩放置後において細胞生存率が放置前と比べて変化がないのに対して、比較例２は、細胞生存率の大きな低下がみられた。以上の結果から、平均粒径が３０ｎｍ以下、好ましくは１〜１０ｎｍの酸素ナノバブルを、１×１０１６以上、好ましくは１×１０１７以上の密度で大量に含む本発明の生理食塩水を使用することにより、細胞毒性が抑制され、初めて生体に安全に投与できることが確認された。【００７８】
＜実施例２＞
水溶液として、塩化ナトリウムを０．８５〜０．９５質量％で含有する水溶液を使用する以外は、実施例１と同じ装置を用いて同じ方法及び条件で酸素ナノバブルを含む生理食塩水を製造した。この生理食塩水は、酸素ナノバブルを発生させた後に塩化ナトリウムを添加しないで、そのまま生理食塩水として使用した。本実施例による酸素ナノバブルを含む生理食塩水は、クライオ透過型電子顕微鏡Titan Krios (FEI社製)を用いて、上記と同じ条件と方法によって酸素ナノバブルの平均粒径及び密度を測定した結果、酸素ナノバブルの平均粒径及び密度は、それぞれ３ｎｍ及び２×１０１８個／ｃｃ（ｍｌ）であることが確認された。本実施例の生理食塩水を実施例２とする。【００７９】
このようにして得られた実施例２の生理食塩水を用いて作成した細胞培養液で、嫌気性（低酸素）の刺激下で細胞形態の変化及び細胞損傷の程度を定性的及び定量的に測定し、細胞の保護がどの程度行えるかを検証し、細胞の保護の程度を前記実施例１の生理食塩水と比較した。検証は、実施例１と同じ方法で行い、嫌気性環境下に置く前と放置後での細胞の形態変化の観察とともに、細胞障害時に漏れ出る酵素（ＬＤＨ）の量及び細胞発育力（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の値をそれぞれ測定した。【００８０】
検証の結果、実施例２の細胞培養液は、実施例１と同じようなデータが得られ、細胞毒性が認められなかった。このように、本発明の生理食塩水を用いて作製した細胞培養液は、塩化ナトリウムの添加が酸素ナノバブルを発生させる工程の前後によって影響されないことが分かり、嫌気性（低酸素性）の刺激下において細胞を保護するという効果は両者とも同じように得られることを確認した。【００８１】
＜実施例３＞
本実施例において、本発明の生体投与可能な水溶液を用いて癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果について検証を行った。具体的には、実施例１と同じ方法で製造された平均粒径が３ｎｍの酸素ナノバブルを含む水溶液を用いて血清と培地とを有する細胞培養液を作製し、この細胞培養液を注入したガラス製の細胞培養用ウエルプレート中に、癌細胞として肺扁平上皮版細胞株ＥＢＣ−１の肺がん細胞を入れた後、低酸素状態で所定時間留置するときに前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ−１ａ）の発現の程度を調べた。【００８２】
図１２に、癌細胞の培養を行ったときに使用した市販の低酸素培養キットを示す。図１２に示すように、この低酸素培養キットはラインＡ及びラインＢの各線に沿ってクリップ１４、１５が設けられており、ガスバリア性パウチ袋１６の内部を２つの空間に区分けすることにより、それぞれの空間をクリップ１４、１５によって密閉状態に保つことができる。ラインＡの奥の方にはＯ２センサ１７が配置され、該Ｏ２センサ１７のすぐ横には培養液を満たした細胞培養用ウエルプレート１８を載置し、ラインＡとラインＢとの間には、ガス濃度調整剤１９を入れる。ガス濃度調整剤１９は使用時にアルミ袋から開封して取り出し、ラインＡより入口近くに置き、ラインＢに設けたクリップ１４を用いて密封する。それにより、ガスバリア性パウチ袋１６の内部のＯ２が短時間で吸収され、低酸素環境が創り出される。ガスバリア性パウチ袋１６の内部のＯ２濃度は、Ｏ２センサ１７の目盛を監視し、希望するＯ２濃度に近づいた時点で細胞培養用ウエルプレート１８の内部の空気をガスバリア性パウチ袋１６の内部の空気と入れ替える。そして、Ｏ２濃度が希望する値よりやや低くなった時点で、ラインＡに設けるクリップ１５によって封鎖してＯ２の吸収を停止させる。ラインＡとラインＢとの間の空間内のＯ２濃度は、ラインＡに設けるクリップ１５を用いて調整することができる。本実施例においては、ラインＡとラインＢとの間の空間内のＯ２濃度が約１％となるように調整した。【００８３】
低酸素雰囲気で留置するときに前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ−１ａ）の発現の程度はウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法により測定した。ウエスタンブロッティング法とは、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出する手法であり、たんぱく質の検出や解析に利用される公知の測定方法である。本実施例では、前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ―１ａ）に加えて、細胞培養用ウエルプレート中の試料に確実にタンパク質が含まれていること、及びウエスタンブロッティング法で使用される総たんぱく量が一定であることを確認する目的で、タンパク発現のコントロール（基準）として前記肺扁平上皮版細胞株ＥＢＣ−１に含まれるＨＳＣ７０のタンパク質についても測定を行った。【００８４】
＜比較例３＞
実施例３において、酸素ナノバブルを含む水溶液に代えて、酸素ナノバブルを全く含まない水溶液を用いたこと以外には、実施例３と同じ方法で、前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ−１ａ）の発現を検証した。前記肺がん細胞によって誘導されるタンパク（ＨＩＦ−１ａ）の発現の測定方法は、実施例３と同じウエスタンブロッティング法で行った。この検証例を比較例３とする。【００８５】
図１３に、Ｏ２濃度が約１％である低酸素雰囲気で６時間及び２４時間留置した後の実施例３及び比較例３について、ＨＩＦ−１ａ及びＨＳＣ７０の各タンパク質の誘導結果を示す。図１３に示す［Ｎｏｒｍｏｘｉａ］、［Ｈｙｐｏｘｉａ  ６ｈ］及び［Ｈｙｐｏｘｉａ  ２４ｈ］は、それぞれ低酸素雰囲気に留置する前の状態、低酸素雰囲気で６時間及び２４時間留置した状態を意味する。また、図中において［Ｍｅｄｉｕｍ］で表示した「Ｏ２」及び「ＤＷ」はそれぞれ実施例３及び比較例３を意味し、「Ｏ２」及び「ＤＷ」で表示した縦の各欄に、それぞれの検証例で測定したタンパク質の発現結果を示している。【００８６】
図１３の（ａ）はウエスタンブロッティング法による測定結果であり、黒く写っている部分がＨＩＦ−１ａ及びＨＳＣ７０の各タンパク質の発現を示す部分である。図中の黒い部分が濃いほど、タンパク質の発現が強いことを示している。また、図１３の（ｂ）は、（ａ）に示す図において黒く写っている部分の面積を算出し、コントールであるＨＳＣ７０に対するＨＩＦ−１ａの面積比を求めたデータである。図１３の（ａ）において黒く写っている部分の面積は、図１４に示すように画像処理によって数値化することができる。図１４において、例えば、低酸素雰囲気で載置する前の状態（Ｎｏｒｍｏｘｉａ）に着目すると、ＨＩＦ−１ａの発現はほとんど観測されず、面積が平均（Ｍｅａｎ）として３２．２１とカウントされているのに対して、ＨＳＣ７０の発現は面積（Ｍｅａｎ）が２２６．９０２とカウントされており、ＨＳＣ７０に対するＨＩＦ−１ａの面積比（Ｒａｔｉｏ）は０．１４であることは分かる。ここで、ＨＳＣ７０の発現は低酸素雰囲気の載置前後で大きな変化がなく、ほぼ一定であることが分かる。さらに、低酸素雰囲気で６時間及び２４時間留置した後の実施例３（Ｏ２）及び比較例３（ＤＷ）についても同様の処理を行って、ＨＳＣ７０に対するＨＩＦ−１ａの面積比（Ｒａｔｉｏ）を算出し、Ｎｏｒｍｏｘｉａの場合を１として規格化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）することによりＨＳＣ７０に対するＨＩＦ−１ａの面積比を求めたのが図１３の（ｂ）に示す結果である。【００８７】
図１３の（ｂ）に示すように、Ｎｏｒｍｏｘｉａの場合を１として規格化した場合、低酸素雰囲気で６時間（Ｈｙｐｏｘｉａ  ６ｈ）においては実施例３（Ｏ２）と比較例３（ＤＷ）の間でＨＩＦ−１ａの発現に大きな差がみられなかった。それに対して、２４時間（Ｈｙｐｏｘｉａ  ２４ｈ）と低酸素雰囲気で長時間留置することによりＨＩＦ−１ａの発現に対する抑制効果には大きな差異がみられ、実施例３は比較例３に比べてＨＩＦ−１ａの発現が顕著に抑制されることが分かる。これは、低酸素雰囲気の６時間留置は留置時間が短いため酸素ナノバブルの効果が実質的に観測されない過渡的な現象を示しているに過ぎないと考えられるが、Ｈｙｐｏｘｉａ  ２４ｈの結果から留置時間の経過とともに酸素ナノバブルの効果が強まってくることを示している。図１３には示していないが、低酸素雰囲気で４８時間留置したときでも同じような方法で検証を行った。その結果、２４時間留置した場合と同等か、それ以上の抑制効果が得られることを確認した。したがって、酸素ナノバブルを含む水溶液は、癌細胞の増殖を抑える効果を十分に有するものと推察できる。【００８８】
以上のように、本発明の生体投与可能な水溶液は、末梢細胞に酸素を十分に供給する機能を有し、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞の損傷又は障害が少なく、細胞を保護する効果、及び嫌気性環境下で起きやすい癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果を高めることができる。さらに、細胞を保護する効果が長期間に亘って安定して得られるだけでなく、その効果のバラツキを大幅に低減することができる。したがって、生体への投与又は経口摂取を安全に行うことができる。【００８９】
また、本発明による生体投与可能な水溶液の製造方法は、従来のナノバブル発生装置と比べて、より小さな粒径を有する酸素ナノバブルを大量に、且つ、安定的に発生することができ、低酸素性又は嫌気性の刺激下において細胞を保護するという効果、及び嫌気性環境下で起きやすい癌細胞の増殖及び肥大化を抑制又は防止する効果を長期に亘って安定的に得ることができる生体投与可能な水溶液を容易に製造することができる。そのような効果を有する生体投与可能な水溶液は、従来技術では製造することが困難であり、本発明の製造方法によって初めて得られたものである。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
したがって、本発明の生体投与可能な水溶液は、生理食塩水又は輸液として生体への投与又は経口摂取を行ったり、細胞培養液として使用することにより、低酸素性又は嫌気性の刺激下における細胞の保護並びにそれらの雰囲気下で起きやすい癌の増殖及び肥大化を抑制又は防止することができるため、様々な医療の分野においてその有用性は極めて高い。
【符号の説明】
【００９１】
１・・・酸素ナノバブル発生装置、２・・・べローズシリンダポンプ、３・・・気液混合槽、４・・・ポンプコントローラ、５・・・圧力センサ、６・・・マイクロ・ナノバブル用ノズル取付部、７・・・液吸引缶、８・・・気体吸引口、９・・・気体吸引調整バルブ、１０・・・ノズルヘッダー、１１・・・噴射ノズル、１２・・・液衝突ノズル、１３・・・台。１４・・・クリップ、１５・・・クリップ、１６・・・ガスバリア性パウチ袋、１７・・・Ｏ２センサ、１８・・・細胞培養用ウエルプレート、  １９・・・ガス濃度調整剤。
【図１】
2017195852.tif 000003
【図２】
2017195852.tif 000004
【図３】
2017195852.tif 000005
【図４】
2017195852.tif 000006
【図５】
2017195852.tif 000007
【図６】
2017195852.tif 000008
【図７】
2017195852.tif 000009
【図８】
2017195852.tif 000010
【図９】
2017195852.tif 000011
【図１０】
2017195852.tif 000012
【図１１】
2017195852.tif 000013
【図１２】
2017195852.tif 000014
【図１３】
2017195852.tif 000015
【図１４】
2017195852.tif 000016
【国際調査報告】
2017195852.tif 000017
2017195852.tif 000018
2017195852.tif 000019
2017195852.tif 000020