(57)【要約】  本発明は、優れた育毛剤として提供される、ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤。
【請求項２】
ｃｈｉｒｏ−イノシトールがＤ体である、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．００１〜２０重量％である、請求項１または２に記載の育毛剤。
【請求項４】
ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．０１〜１０重量％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項５】
毛幹成長促進または発毛に用いるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項６】
毛幹伸長速度を向上させるために使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項７】
毛幹最大長を向上させるために使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項８】
毛幹径を増大させるために使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項９】
毛数を増加させるために使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１０】
発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が発毛することを促進するために使用する、請求項１〜５および９のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１１】
毛周期における休止期を短縮するために使用する、請求項１〜５、９および１０のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１２】
停止した毛周期を再開させるために使用する、請求項１〜５、９および１０のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１３】
溶液である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１４】
ヒトの頭髪用の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤に関する。さらに詳しくは、ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化およびストレス社会を反映し、育毛剤の需要が増大している。一般に、毛は、毛母細胞の分裂に伴う毛乳頭からの伸長、毛母細胞の分裂の停止に伴って毛が上に押し上げられ毛根と毛乳頭が分離する脱落のサイクル（毛周期）を繰り返している。毛周期は、毛根および毛幹が伸長する成長期、毛母細胞の分裂が停止して伸長が減衰するとともに毛根と毛乳頭の結合が緩む退行期、毛が脱落して毛乳頭が休止する休止期よりなる。毛周期のうち、休止期から成長期の期間は新たな毛包が形成される。【０００３】
イノシトール（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）は、シクロヘキサンの各炭素上の水素原子が１つずつヒドロキシ基に置換した構造を持ち、ビタミン様作用物質として知られている化合物である。イノシトールにはヒドロキシ基の立体配置の組み合わせにより、９種類の立体異性体が存在する。医薬品、医薬部外品の添加物として、ｍｙｏ−イノシトール（シス−１，２，３，５−トランス−４，６−シクロヘキサンヘキサオール）がイノシトール（イノシット）の名称で使用されている（非特許文献１〜３）。イノシトールを成分とした育毛剤について報告がされている（特許文献１）。また、インスリン感受性を高める物質（ＩＳＩＳ）がインスリン抵抗性に関連した脱毛の処置に有用であり、具体的な例としてメトホルミンおよびトログリタゾンが肥満マウスにおいて脱毛を予防し、または脱毛の進行を遅延することが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２８０２６号公報
【特許文献２】国際公開第２００１／０６２２３７号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】医薬部外品原料規格２００６統合版，薬事日報社，ｐ．３１８
【非特許文献２】医薬品添加物規格２００３，薬事日報社，ｐ．１０１−１０２
【非特許文献３】医薬品添加物事典２０００，薬事日報社，ｐ．２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、優れた育毛作用を有する育毛剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、イノシトールの立体異性体の内、ｃｈｉｒｏ−イノシトールのみに優れた育毛活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。【０００９】
［１］ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤。【００１０】
［２］ｃｈｉｒｏ−イノシトールがＤ体である、［１］に記載の育毛剤。【００１１】
［３］ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．００１〜２０重量％である、［１］または［２］に記載の育毛剤。【００１２】
［４］ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．０１〜１０重量％である、［１］〜［３］のいずれかに記載の育毛剤。【００１３】
［５］毛幹成長促進または発毛に用いるための、［１］〜［４］のいずれかに記載の育毛剤。【００１４】
［６］毛幹伸長速度を向上させるために使用する、［１］〜［５］のいずれかに記載の育毛剤。【００１５】
［７］毛幹最大長を向上させるために使用する、［１］〜［５］のいずれかに記載の育毛剤。【００１６】
［８］毛幹径を増大させるために使用する、［１］〜［５］のいずれかに記載の育毛剤。【００１７】
［９］毛数を増加させるために使用する、［１］〜［５］のいずれかに記載の育毛剤。【００１８】
［１０］発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が発毛することを促進するために使用する、［１］〜［５］および［９］のいずれかに記載の育毛剤。【００１９】
［１１］毛周期における休止期を短縮するために使用する、［１］〜［５］、［９］および［１０］のいずれかに記載の育毛剤。【００２０】
［１２］停止した毛周期を再開させるために使用する、［１］〜［５］、［９］および［１０］のいずれかに記載の育毛剤。【００２１】
［１３］溶液である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の育毛剤。【００２２】
［１４］ヒトの頭髪用の、［１］〜［１３］のいずれかに記載の育毛剤。【００２３】
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、優れた育毛剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（１０重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図２】図２は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図３】図３は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図４】図４は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（０．１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図５】図５は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（０．０１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図６】図６は、Ｌ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図７】図７は、ｍｙｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図８】図８は、ｍｙｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図９】図９は、ａｌｌｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１０】図１０は、ａｌｌｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１１】図１１は、ｅｐｉ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１２】図１２は、ｅｐｉ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１３】図１３は、ｍｕｃｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１４】図１４は、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（５重量％）を含む５０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない５０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図１５】図１５は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液である試験液塗布群のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス、および５０％エタノール水溶液を塗布した陰性対照群のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおける、塗布２１日目の抜毛領域に生えた体毛の毛幹径を示すグラフである。縦軸は毛幹径を表す。＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【図１６】図１６は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液である試験液塗布群のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス、および５０％エタノール水溶液を塗布した陰性対照群のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスにおける、発毛スコアの経時的変化を示すプロットである。縦軸は発毛スコアの合計を表し、横軸は除毛後の日数を表す。＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【図１７】図１７は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（１重量％）を含む５０％エタノール水溶液である試験液塗布群のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス、および５０％エタノール水溶液を塗布した陰性対照群のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスにおける、発毛のタイミングを示すグラフである。縦軸は発毛スコアが１以上となった除毛後の日数を表す。＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【図１８】図１８は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを毛乳頭培養培地へ添加した試験液Ａ（最終濃度０．１重量％）、ｍｙｏ−イノシトールを毛乳頭培養培地へ添加した試験液Ｂ（最終濃度０．１重量％）、およびＰＢＳのみを毛乳頭培養培地へ添加した陰性対照を培地とし、平面培養法により行った毛乳頭細胞の増殖試験の結果を示すグラフである。縦軸は陰性対照と比較した細胞増殖率（％）を表す。＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【図１９】図１９は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを毛乳頭培養培地へ添加した試験液Ａ１〜Ａ３（最終濃度０．０５、０．１、および１重量％）、ｍｙｏ−イノシトールを毛乳頭培養培地へ添加した試験液Ｂ１〜Ｂ３（最終濃度０．０５、０．１、および１重量％）、およびＰＢＳのみを毛乳頭培養培地へ添加した陰性対照を培地とし、３次元培養法により行った毛乳頭細胞の増殖試験の結果を示すグラフである。縦軸は陰性対照と比較した毛乳頭細胞の細胞塊（スフェロイド）の面積増加率（％）を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の育毛剤について説明する。
【００２７】
本発明の育毛剤は、ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤である。
【００２８】
本発明におけるｃｈｉｒｏ−イノシトールは、天然に存在する蕎麦、豆類、柑橘類などから抽出したものであってもよく、発酵法によりマメ科植物などで生成したものを抽出したものであってもよく、化学合成したものであってもよい。購入による入手も可能である。
【００２９】
本発明の育毛剤中におけるｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量は育毛剤全体に対して、例えば０．００１〜２０重量％、具体的には０．０１〜１０重量％、より具体的には０．１〜１０重量％である。
【００３０】
さらに具体的には、本発明の育毛剤中におけるｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量は育毛剤全体に対して、０．３〜５重量％であり、よりさらに具体的には０．５〜３重量％、最も具体的には０．７〜１重量％である。
【００３１】
本発明の育毛剤は、外用の医薬品、医薬部外品、化粧品（頭髪用化粧品および頭皮用化粧品を含む）などとして使用することができる。例えば、軟膏、パップ、リニメント、ローション、外用液剤、散布剤、クリーム、ジェル、乳液、ヘアトニック、ヘアスプレーなどとして使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の育毛剤は、ｃｈｉｒｏ−イノシトールを有効成分として含む他、医薬品、医薬部外品、化粧品（頭髪用化粧品および頭皮用化粧品を含む）などで通常許容される添加物等の他の成分を含有するものであってもよい。添加物等の他の成分としては、例えば賦形剤、安定剤、矯臭剤、基剤、分散剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、経皮吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着色剤、油分（油脂、鉱物油など）、保湿剤、アルコール、増粘剤、ポリマー、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、消臭剤、顔料、染料、香料、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸、有機アミン、植物抽出物などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の育毛剤は、発毛、育毛、養毛などの効果を有する公知の成分を含有するものであってもよい。
【００３４】
本発明の育毛剤の１投与あたりのｃｈｉｒｏ−イノシトールの投与量は、例えば０．００５〜２００ｍｇ、具体的には０．０５〜１００ｍｇ、より具体的には０．５〜１０ｍｇである。
【００３５】
本発明の育毛剤の投与回数は、例えば１日あたり１〜６回であり、具体的には１日あたり１〜３回であり、より具体的には１日あたり１〜２回である。
【００３６】
本発明の育毛剤は、毛幹成長促進、発毛および脱毛防止に関するものであり、好ましくは毛幹成長促進および発毛に関するものである。
【００３７】
本明細書において、「毛幹成長促進」は、毛幹伸長速度を向上させること、毛幹最大長を向上させること、および／または毛幹径を増大させることを意味する。
【００３８】
本明細書において、「発毛」は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させることを意味し、詳細には、毛周期における休止期を短縮すること、および／または停止した毛周期を再開させることを意味する。
【００３９】
本明細書において、「毛幹成長促進効果を有する」とは毛幹成長促進に有利に作用することを意味し、毛幹成長促進効果を示す特質を「毛幹成長促進活性」と称する。また、「発毛効果を有する」とは発毛に有利に作用することを意味し、発毛効果を示す特質を「発毛促進活性」と称する。
【００４０】
本明細書において、「脱毛」とは毛穴から毛幹が脱落する現象を意味し、詳細には、細胞増殖を阻害する抑制性サイトカイン等の増加および、それらの細胞死を意味する。脱毛防止効果を示す特質を「脱毛防止活性」と称する。また、「脱毛防止効果を有する」とは、抑制サイトカインの阻害もしくは減少、および細胞死の抑制を介して、毛穴からの毛幹の脱落数が減少することを意味し、毛幹成長促進、発毛効果を示す特質とは異なる生理現象である。本発明の育毛剤は、インスリン抵抗性でない使用者にも脱毛防止の効果を奏する。
【００４１】
本発明の育毛剤は、毛幹伸長速度または毛幹最大長を向上させるために使用することができる。毛幹伸長速度については、毛周期の標準データにおける毛幹伸長速度と比較して、例えば最大１１０％程度向上させることができ、具体的には２５〜１１０％程度向上させることができ、より具体的には３３〜１１０％程度向上させることができる。毛幹最大長については、毛周期の標準データにおける毛幹最大長と比較して、例えば最大４９％程度向上させることができ、具体的には１〜４９％程度向上させることができ、より具体的には２〜４９％程度向上させることができる。
【００４２】
本発明の育毛剤は、毛幹径を増大させるために使用することができる。
【００４３】
本発明の育毛剤は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させるために使用することができ、詳細には毛周期における休止期を短縮する、および／または停止した毛周期を再開させるために使用することができる。
【００４４】
１つの態様において、本発明の育毛剤は、例えばインスリン抵抗性に関連した脱毛への適用を含まない。
【００４５】
本発明の育毛剤は、ヒトの他、家畜・愛玩動物などの動物用に使用することもできる。本発明の１つの側面において、ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤を対象に投与することを含む、育毛方法（医療行為を除く）が提供される。
【実施例】
【００４６】
実施例１  Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの育毛活性評価（１）
ヌードマウス（三協ラボサービスより入手）の背に、有毛マウスの毛包（外科的方法により調製）を移植し、毛の１本１本を判断でき、複数回毛周期を観察出来るように加工した移植マウスを作製した。【００４７】
まず、第一毛周期の発毛時において５０％エタノール水溶液（１２．５μｌ）を１日あたり４回塗布し（薬剤は含まれず）、毛周期の標準データを取得した。第一毛周期が終了して毛が脱落した後、第二毛周期の発毛時において、薬剤を所定の量で含む５０％エタノール水溶液（１２．５μｌ）を１日あたり４回塗布し、薬剤作用のデータを取得した。第二毛周期が終了して毛が脱落した後、第三毛周期の発毛時において、薬剤を第二毛周期での場合と同じ量で含む５０％エタノール水溶液（１２．５μｌ）を第二毛周期での場合と同様に塗布し、薬剤作用の再現性のデータを取得した。【００４８】
薬剤は、以下の薬剤：Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（和光純薬工業製）ならびにｃｈｉｒｏ−イノシトールの立体異性体であるＬ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（東京化成工業製）、ｍｙｏ−イノシトール（和光純薬工業製）、ａｌｌｏ−イノシトール（シス−１，２，３，４−トランス−５，６−シクロヘキサンヘキサオール）（東京化成工業製）、ｅｐｉ−イノシトール（シス−１，２，３，４，５−トランス−６−シクロヘキサンヘキサオール）（東京化成工業製）、ｍｕｃｏ−イノシトール（シス−１，２，４，５−トランス−３，６−シクロヘキサンヘキサオール）（東京化成工業製）、およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（シス−１，３，５−トランス−２，４，６−シクロヘキサンヘキサオール）（東京化成工業製）を使用した。【００４９】
薬剤ごとに、２〜３日おきに毛幹の長さを計測し、経日的に変化する各時点での毛幹の長さの平均値を１つのドットとしてグラフにプロットし、同様のプロットを３〜４匹分繰り返した。結果を表１〜１４および図１〜１４に示す。【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
【表４】
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【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
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【００５６】
【表７】
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【００５７】
【表８】
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【００５８】
【表９】
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【００５９】
【表１０】
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【００６０】
【表１１】
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【００６１】
【表１２】
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【００６２】
【表１３】
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【００６３】
【表１４】
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【００６４】
表１〜１４中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。【００６５】
表１〜３および図１〜３から明らかであるように、薬剤としてＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを１０重量％、５重量％、および１重量％で含有する場合には、標準データと比較して毛幹成長速度および毛幹最大長ともに有意に向上しており、育毛活性が認められた。一方、表４および図４から明らかであるように、薬剤としてＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを０．１重量％で含有する場合には、標準データと比較して毛幹成長速度には有意差は見られなかったものの、第三毛周期において毛幹最大長が有意に向上した。このことから、少なくとも毛幹長に正に作用するという点において、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを０．１重量％で含有する場合にも育毛活性が認められた。また、表５および図５から明らかであるように、薬剤としてＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを０．０１重量％で含有する場合には、標準データと比較して毛幹成長速度および毛幹最大長ともに、本実験において有意傾向であった。したがって、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの育毛活性の有効下限は、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量として０．００１重量％から０．０１重量％の間であることが示唆された。【００６６】
ｃｈｉｒｏ−イノシトールの立体異性体については、表６〜１４および図６〜１４から明らかであるように、それぞれＬ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを５重量％、ｍｙｏ−イノシトールを５重量％または１重量％、ａｌｌｏ−イノシトールを５重量％または１重量％、ｅｐｉ−イノシトールを５重量％または１重量％、ｍｕｃｏ−イノシトールを５重量％、およびｓｃｙｌｌｏ−イノシトールを５重量％含有する場合の全てで、標準データと比較して毛幹成長速度および毛幹最大長ともに、本実験において有意差は見られず、育毛活性は認められなかった。【００６７】
実施例２  Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの育毛活性評価（２）
毛幹径（太さ）の増大の観点から、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの育毛活性の評価を行った。【００６８】
Ｃ５７ＢＬ６/Ｎマウスは、背部体毛を抜毛すると、抜毛領域の毛周期が強制的に退行期に移行され、結果として抜毛領域の毛周期が同期化されることが知られている。したがって、毛周期のばらつきを抑えて成長期のみの毛を観察することが可能となる。抜毛後７日程度で、成長期の兆候として、色素のある毛の生成に加え、毛包中のメラノサイトがメラニンを合成し始めるにつれ、皮膚が灰色に変色する様子が観察される。さらに、抜毛後１０日程度で、抜毛領域における発毛が確認され、抜毛後２１日程度で抜毛領域と非抜毛領域の境界線が見えなくなり退行期に移行し、毛幹成長が停止する。したがって、抜毛後２１日程度の抜毛領域に生えた体毛の毛幹径を測定することで、毛幹径の増大の観点から育毛活性を評価することが可能である。【００６９】
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（７週齢、メス）の背部体毛を抜毛し、５０％エタノールへ溶解した濃度１重量％のＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（和光純薬工業製）を試験液として、該抜毛領域に対して塗布（１回／日、１００μｌ）を２１日間にわたって行った。【００７０】
塗布は１群６匹で行い、２群（試験液塗布群および陰性対照群（５０％エタノール塗布群））で実施し、塗布２１日目に塗布領域の毛幹をピンセットにて採取した。１匹あたり２０本程度を採取し、１群６匹から採取した毛幹合計１２０本からランダムに１０本選出して、毛幹径を計測した。毛幹径は光学顕微鏡下の１視野において、１本の毛幹の異なる３箇所の部位の直径を計測し、その平均値を１本あたりの直径とし、同様の計測を行った毛幹１０本の平均値として算出した。結果を図１５に示す。【００７１】
図１５から明らかであるように、塗布２１日目において、試験液塗布群と陰性対照群の毛幹径には顕著な差が見られ、試験液塗布群の毛幹径の方が有意に大きかったことから、毛幹径の増大の観点からもＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの育毛活性が認められた。【００７２】
実施例３  Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの発毛促進活性評価
毛幹を産生する毛包は、生涯にわたり唯一成長と退行を繰り返すことが知られている器官である。その規則的な成長と退行は、毛周期として、成長期、退行期、休止期に分別される。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの背部体毛は、生後４５〜９５日の間が休止期に拘束されており、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスなどの汎用のマウスでは背部体毛毛周期が成長期、退行期、休止期を合わせて約２１日であるのに比べ、非常に長い休止期拘束期が観察される。一般的に、毛包が成長期に入ると、皮膚は次第に灰色を呈し、その後徐々に再生毛が皮膚上に観察されることで発毛が確認されるようになる。したがって、生後４５〜９０日の間のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを用いることで、発毛促進活性を評価することが可能である。【００７３】
本実施例では、毛周期が休止期にあるＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本ＳＬＣ）（８週齢、メス）の背中をバリカンを用いて短毛化した後に、除毛剤を用いて完全に背部体毛を除去（除毛）した。２４時間の回復期間をおいた後、５０％エタノールへ溶解した濃度５重量％のＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（和光純薬工業製）を試験液として、該除毛領域に対して塗布（１回／日、１００μｌ）を２１日間にわたって行った。【００７４】
塗布は１群５匹で行い、２群（試験液塗布群および陰性対照群（５０％エタノール塗布群））で実施し、塗布領域における休止期を脱して再生期に入った部分の外観変化による発毛スコアの基準（表１５）に基づいて、除毛後、０、４、５、６、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１日で経時的に、塗布領域における発毛の程度を数値化（２項目についての発毛スコアを合計した０〜１０の範囲）した。数値が高いほど発毛の程度が高いことを示している。数値は１群５匹のスコアの平均値として算出した。また、同様の試験を３回実施し、除毛後の発毛タイミングを日数で算出し、陰性対照と比較したＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの毛周期における休止期の短縮の観点からも発毛促進活性を検証した。結果を図１６および１７に示す。【００７５】
【表１５】
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【００７６】
図１６から明らかであるように、除毛後２１日目において、試験液塗布群と陰性対照群の発毛スコアには顕著な差が見られ、試験液塗布群の発毛スコアの方が有意に高かったことから、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの発毛促進活性が認められた。【００７７】
また、図１７は、それぞれの群の発毛スコアが１以上になった発毛タイミングの除毛後の日数を示すが、陰性対照群の平均の発毛タイミングが９日目であるのに対し、試験液塗布群では４日目であったことから、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの毛周期における休止期短縮が認められた。【００７８】
実施例４  サルにおける発毛試験
ヒトのモデル動物として、サルを用いた発毛試験を行った。【００７９】
カニクイサル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、哺乳網霊長目オナガザル科マカク属に分類されるサルで、顎関節の形態などヒトに類似する点が多く、また繁殖・飼育の容易さから形態的研究や投薬研究における実験動物として多用される。カニクイサルは、１年の間に６ヶ月周期で体毛が入れ替わることが知られており、出産を繰り返した高齢雌サルおよび社会的地位の低い高齢雄サルの中には薄毛や疎毛症状が確認される個体が低頻度で出現する。これらの固体の薄毛や疎毛の部位は毛穴から毛管が露出していない、あるいは著しく短毛化、細毛化して肉眼では認識できない状態にある。【００８０】
本実施例では、頭部体毛に疎毛を示す高齢カニクイサル（１９歳、オス）を用いて、５０％エタノールへ溶解した濃度１重量％のＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール（和光純薬工業製）を試験液Ａとし、５０％エタノールへ溶解した濃度１重量％のｍｙｏ−イノシトールを試験液Ｂとして、同一個体頭部の正中線を挟んだ左右約４平方センチメートル（２センチメートル×２センチメートル）の疎毛領域に対して、連日塗布を施した。塗布（１回／日、１５０μｌ）は８週間行い、陰性対照には５０％エタノールを塗布した。８週目終了時に、同領域における毛幹をバリカンを用いて毛穴から体外方向へ２〜３ｍｍ残して刈り取ることで、試験塗布領域における毛穴から発毛している毛髪総数をカウントした。試験開始時、薬剤塗布前の同領域における毛穴から発毛している毛髪本数を１００％とした場合の、８週目終了時の毛髪本数の増加率を算出し発毛率とした。結果を表１６に示す。【００８１】
【表１６】
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【００８２】
表１６から明らかであるように、試験液Ｂおよび陰性対照と比較して試験液Ａの塗布によって顕著に高い発毛率が得られており、サルにおいてもＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの発毛促進活性が認められた。また、データは示していないが、試験液Ｂおよび陰性対照と比較して試験液Ａを塗布した領域の毛幹は顕著に太くなっており、サルにおいてもＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの毛幹成長促進活性が認められた。【００８３】
実施例５  平面培養による毛乳頭細胞増殖試験
毛乳頭細胞は、シグナル伝達物質を介して発毛シグナルを毛母細胞などに伝えて活性化することにより、発毛および毛の伸長のプロセスをコントロールしている。したがって、毛乳頭細胞の増殖率から、試験物質の毛幹成長促進活性などを評価することができる。【００８４】
本実施例では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスより頬髭領域皮膚を採取し、実体顕微鏡下で単離頬髭毛包から毛乳頭を摘出した。６０ｍｍプラスチックシャーレ（住友ベークライト社製）底面に６個の毛乳頭を固定し、これを３７℃の５％炭酸ガス存在下で、ＰＣＧＭ基礎培地へ２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、０．６％ＩＴＴ（インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液）、１％ＢＰＥ（ウシ下垂体抽出液）、０．６％Ｃｙｐ（サイプロテロン溶液）を添加した毛乳頭培養培地を用いて、初代培養を行った。以後、２〜３日毎に培地交換を行い、約２週間ごとに継代を繰り返した。実験には３継代以内の毛乳頭細胞を用いた。まず、２４ウェルの細胞培養用マイクロプレート（住友ベークライト社製）を用いて、毛乳頭細胞を１００００細胞／ウェルになるように播種し、ＰＢＳへ溶解したＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを最終濃度０．１重量％で毛乳頭培養培地へ添加した培地である試験液Ａ、ＰＢＳへ溶解したｍｙｏ−イノシトールを最終濃度０．１重量％で毛乳頭培養培地へ添加した培地である試験液Ｂ、ＰＢＳのみを毛乳頭培養培地へ添加した培地である陰性対照を用いて、３日間培養した。そして、３日間培養後の細胞数を血球計算盤を用いて計測し、陰性対照における増殖率を１００％とした場合の試験液Ａおよび試験液Ｂにおける増殖率を算出した。結果を図１８に示す。【００８５】
図１８から明らかであるように、試験液Ａを用いて培養した場合には、陰性対照を用いて培養した場合と比較して有意に増殖率が増加し、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールに毛乳頭細胞の増殖を促進する活性が認められたのに対し、試験液Ｂを用いて培養した場合には、有意差が見られず、ｍｙｏ−イノシトールに毛乳頭細胞の増殖を促進する活性は認められなかった。【００８６】
実施例６  ３次元培養による毛乳頭細胞増殖試験
３次元培養法は、生体により近い状態を反映した３次元の細胞塊（スフェロイド）の面積で細胞の増殖性を算出するため、細胞生長と細胞数の増加という２つの要素を複合的に捉えて細胞の増殖性を評価することができる。【００８７】
本実施例では、９６ウェルのＵ字底の細胞培養用マイクロプレート（住友ベークライト社製）を用いて、実施例４と同様に準備した毛乳頭細胞を６０００（細胞／ウェル）になるように播種し、プレート遠心機にて室温１０００ｒｐｍの回転数で１分遠心し、３次元的な毛乳頭細胞スフェロイドを得た。ＰＢＳへ溶解したＤ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールをそれぞれ最終濃度０．０５重量％、０．１重量％、１重量％で毛乳頭培養培地へ添加した培地である試験液Ａ１〜Ａ３、ＰＢＳへ溶解したｍｙｏ−イノシトールをそれぞれ最終濃度０．０５重量％、０．１重量％、１重量％で毛乳頭培養培地へ添加した培地である試験液Ｂ１〜Ｂ３、ＰＢＳのみを毛乳頭培養培地へ添加した培地である陰性対照を用いて、３日間培養した。そして、３日間培養後のスフェロイドをデジタルマイクロスコープＶＨＸ２０００（キーエンス）を用いて撮影し、スフェロイドの面積をデジタルマイクロスコープ解析ツールを用いて算出した。陰性対照の面積増加率を１００％とした場合の試験液ＡおよびＢのスフェロイド面積増加率を算出することで、より生体に近い状態での毛乳頭細胞の増殖性を数値化した。結果を図１９に示す。【００８８】
図１９から明らかであるように、試験液Ａ１〜Ａ３を用いて培養した場合には、陰性対照を用いて培養した場合と比較して有意にスフェロイド面積が増加し、試験をした０．０５重量％、０．１重量％、１重量％）の全ての最終濃度において、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールに毛乳頭細胞の増殖を促進する活性が認められたのに対し、試験液Ｂ１〜Ｂ３を用いて培養した場合には、有意差が見られず、試験をした０．０５重量％、０．１重量％、１重量％の全ての最終濃度において、ｍｙｏ−イノシトールに毛乳頭細胞の増殖を促進する活性は認められなかった。なお、スフェロイド面積の増加率の程度から、試験液Ａ１〜Ａ３を用いて培養した場合の毛乳頭細胞の増殖には、細胞数の増加が大きく寄与していると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月19日(2017.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン抵抗性でない対象に投与するための、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールを含む外用剤である育毛剤。
【請求項２】
Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．００１〜２０重量％である、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトールの含有量が全体に対して０．０１〜１０重量％である、請求項１または２に記載の育毛剤。
【請求項４】
毛幹成長促進に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項５】
発毛に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項６】
毛幹伸長速度を向上させるために使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項７】
毛幹最大長を向上させるために使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項８】
毛幹径を増大させるために使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項９】
溶液である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１０】
ヒトの頭髪用の、請求項１〜９のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法（ヒトに対する医療行為を除く）。
【国際調査報告】
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