(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールである、二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供する。【解決手段】二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０は、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズ（ＯＬ）で集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せる。【選択図】図１
0003235223.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１ダイクロイックミラー、第２フィルタ、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第７反射鏡、第２ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第６反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第３ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、第３フィルタ、第８反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第２反射鏡と前記第１反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記第２フィルタに入り、前記第２フィルタを透過して射入した励起光ビームは、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第２レンズから射出された後、前記第７反射鏡によって反射されて前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第６反射鏡によって反射されて、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーによって反射され、前記第３フィルタに入り、前記第３フィルタは、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第３フィルタを透過した蛍光は、前記第８反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、スーパコンティニウムレーザー、光ファイバスプライス、前記第１ダイクロイックミラー、前記第２フィルタ、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第７反射鏡、前記第２ダイクロイックミラー、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、位相板、前記λ／４スライド、前記第６反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第３ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記第３フィルタ、第８反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第８反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記スーパコンティニウムレーザーから放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライスによってコリメート出力され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーを経た後、波長が第１波長未満の光が前記第１ダイクロイックミラーにより反射され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーによって反射された部分は、前記第２フィルタでフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第２レンズから射出された後、前記第７反射鏡によって反射され、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過し、
前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーを経た後、波長が前記第１波長よりも大きい光が、前記第１ダイクロイックミラーを透過し、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーを透過した部分は、前記第１フィルタでフィルタリングされて光損失となり、前記光損失は、前記第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡を順に経て前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、且つ前記励起光と前記光損失は、前記第２ダイクロイックミラーを経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドによって偏光調整され、前記第６反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、前記第３ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーによって反射され、前記第３フィルタに入り、前記第３フィルタは、射入されたレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第８反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記第３フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する、ことを特徴とする二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項２】
前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、前記第６反射鏡、前記第７反射鏡、及び第８反射鏡は、いずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる、ことを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項３】
前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡システムに素早く接続できることを特徴とする請求項２に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項４】
前記第２レンズの光軸のＺ方向に沿う位置が調整可能である、ことを特徴とする請求項２に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項５】
前記第７反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のＺ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることを特徴とする請求項４に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項６】
前記光ファイバスプライスは４自由度レギュレータに挟持され、前記４自由度レギュレータは、前記光ファイバスプライスのＸＹ軸方向の周りの２自由度回転とＸＹ軸方向に沿う２自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光の位置及び伝送方向を調整することを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項７】
前記第１波長は５３２ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項８】
前記第２フィルタの中心波長は４８８ｎｍであり、前記第１フィルタの中心波長は５９２ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項９】
前記位相板上の相位分布は、０−２πのらせん分布であることを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項１０】
二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かないことを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項１１】
ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現することを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項１２】
前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーは、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる、ことを特徴とする請求項１に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、顕微光学イメージングの技術分野に関し、特に、二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学超解像度顕微鏡法では、イメージングの解像度が光回折の限界を超え、そのイメージング解像度が従来の光学顕微鏡よりもはるかに高く、近年の研究の焦点となっており、さまざまなタイプのものが現れる。誘導放出抑制（ＳｔｉｍｕｌａｔｅｄＥｍｉｓｓｉｏｎＤｅｐｌｅｔｉｏｎ、ＳＴＥＤ）顕微鏡法は、初めて提案されており直接光回折の限界を克服する遠視野光学顕微鏡法であり、レーザー共焦点顕微イメージングに基づくものであり、他のタイプの超解像度顕微鏡法に比べて、イメージングの速度が高く、生細胞をイメージングすることができ、生物医学の研究においてより精細な構造を検出できる。
【０００３】
ＳＴＥＤイメージングは、解像度が極めて高いものの、イメージング深度が低く、二光子顕微イメージングは、解像度が悪いが、近赤外光を用いるため、イメージング深度が高く、しかしながら、現在、厚いサンプルの場合、二光子イメージングを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングを用い得る、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させた複合顕微鏡の技術についての報告はまだ提案されていない。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
これを鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させ得る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供することが求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成させるために、本考案は下記の技術案を採用する。
【０００６】
二光子誘導放出抑制複合顕微鏡であって、
二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１ダイクロイックミラー、第２フィルタ、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第７反射鏡、第２ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第６反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第３ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、第３フィルタ、第８反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第２反射鏡と前記第１反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記第２フィルタに入り、前記第２フィルタを透過して射入した励起光ビームは、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第２レンズから射出された後、前記第７反射鏡によって反射されて前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第６反射鏡によって反射されて、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順次経て前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーによって反射され、前記第３フィルタに入り、前記第３フィルタは、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第３フィルタを透過した蛍光は、前記第８反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、スーパコンティニウムレーザー、光ファイバスプライス、４自由度レギュレータ、前記第１ダイクロイックミラー、前記第２フィルタ、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第７反射鏡、前記第２ダイクロイックミラー、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、位相板、前記λ／４スライド、前記第６反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第３ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記第３フィルタ、第８反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第８反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、前記光ファイバスプライスは、前記４自由度レギュレータに挟持され、前記４自由度レギュレータは、前記光ファイバスプライスのＸＹ軸方向の周りの２自由度回転とＸＹ軸方向に沿う２自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザーの位置と伝送方向を調整し、
前記スーパコンティニウムレーザーから放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライスによってコリメート出力され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーを経た後、波長が第１波長未満の光が前記第１ダイクロイックミラーにより反射され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーによって反射された部分は、前記第２フィルタでフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第２レンズから射出された後、前記第７反射鏡によって反射され、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過し、
前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーを経た後、波長が前記第１波長よりも大きい光が、前記第１ダイクロイックミラーを透過し、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーを透過した部分は、前記第１フィルタでフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡を順次経て前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第２ダイクロイックミラーを経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第６反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順次経た後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、前記第３ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーによって反射され、前記第３フィルタに入り、前記第３フィルタは、射入されたレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第８反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記第３フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。
【０００７】
いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、前記第６反射鏡、前記第７反射鏡、及び第８反射鏡は、いずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる。
【０００８】
いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡システムに素早くアクセスできる。
【０００９】
いくつかの好適な実施例では、前記第２レンズの光軸のＺ方向に沿う位置が調整可能である。
【００１０】
いくつかの好適な実施例では、前記第７反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のＺ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせる。
【００１１】
いくつかの好適な実施例では、前記第１波長は５３２ｎｍである。
【００１２】
いくつかの好適な実施例では、前記第２フィルタの中心波長は４８８ｎｍであり、前記第１フィルタの中心波長は５９２ｎｍである。
【００１３】
いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の相位分布は、０−２πのらせん分布である。
【００１４】
いくつかの好適な実施例では、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
【００１５】
いくつかの好適な実施例では、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルを走査して移動させ、イメージングを実現する。
【００１６】
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーは、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
【考案の効果】
【００１７】
本考案では、上記技術案による利点は以下のとおりである。
【００１８】
本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本考案の実施例に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の構造模式図である。
【図２】本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布である。
【図３】本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布である。
【考案を実施するための形態】
【００２０】
本願の目的、技術案及び利点をより明確に説明するために、以下、図面及び実施例を参照しながら、本願をさらに詳細に説明する。なお、ここで説明する特定の実施例は本願を解釈するために過ぎず、本願を限定するものではない。
【００２１】
図１は、本考案の実施例に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０の構造模式図を示し、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備える。
【００２２】
前記二光子イメージングユニット１００は、フェムト秒レーザー１１０、第１反射鏡Ｍ１、第２反射鏡Ｍ２、第１ダイクロイックミラーＤＭ１、第２フィルタＦ２、第１レンズＬ１と第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダ、第７反射鏡Ｍ７、第２ダイクロイックミラーＤＭ２、λ／４スライド１２０、第６反射鏡Ｍ６、ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、走査レンズＳＬ、チューブレンズＴＬ、第３ダイクロイックミラーＤＭ３、対物レンズＯＬ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、第３フィルタＦ３、第８反射鏡Ｍ８、第３レンズＬ３、及び光電子増倍管（ＰＭＴ）１５０を備える。
【００２３】
本考案の実施例に係る二光子イメージングユニット１００の作動方式は以下のとおりである。
【００２４】
前記フェムト秒レーザー１１０から放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡Ｍ１と前記第２反射鏡Ｍ２によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１に入り、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過した後、前記第２フィルタＦ２に入り、前記第２フィルタＦ２を透過して射入した励起光ビームは、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第７反射鏡Ｍ７によって反射されて前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第６反射鏡Ｍ６によって反射されて、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順次経て前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３に入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３を透過した光ビームは、前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３に入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３によって反射され、前記第３フィルタＦ３に入り、前記第３フィルタＦ３は、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第３フィルタＦ３を透過した蛍光は、前記第８反射鏡Ｍ８によって反射され、前記第３レンズＬ３に入り、前記第３レンズＬ３によって集束された光ビームは前記光電子増倍管（ＰＭＴ）に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現する。
【００２５】
なお、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
【００２６】
前記ＳＴＥＤイメージングユニット２００は、スーパコンティニウムレーザー２１０、光ファイバスプライス２２０、４自由度レギュレータ２３０、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１、前記第２フィルタＦ２、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなる前記ビームエキスパンダ、前記第７反射鏡Ｍ７、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２、第３反射鏡Ｍ３、第４反射鏡Ｍ４、第５反射鏡Ｍ５、位相板２４０、前記λ／４スライド１２０、前記第６反射鏡Ｍ６、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、前記走査レンズＳＬ、前記チューブレンズＴＬ、前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３、前記対物レンズＯＬ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、前記第３フィルタＦ３、第８反射鏡Ｍ８、第４レンズＬ４、ピンホール２５０、及びアバランシェダイオード２６０を備え、前記第８反射鏡Ｍ８は、所在する光路の外に移動可能であり、前記光ファイバスプライス２２０は、前記４自由度レギュレータ２３０に挟持され、前記４自由度レギュレータ２３０は、前記光ファイバスプライス２２０のＸＹ軸方向の周りの２自由度回転とＸＹ軸方向に沿う２自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光の位置及び伝送方向を調整する。
【００２７】
本考案の実施例に係るＳＴＥＤイメージングユニット２００の作動方式は以下のとおりである。
【００２８】
前記スーパコンティニウムレーザー２１０から放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライス２２０によってコリメート出力され、前記光ファイバスプライス２２０から出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を経た後、波長が第１波長未満の光が前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１により反射され、前記光ファイバスプライス２２０から出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１によって反射された部分は、前記第２フィルタＦ２でフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第７反射鏡Ｍ７によって反射され、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過し、
前記光ファイバスプライス２２０から出力されたレーザー光は、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を経た後、波長が前記第１波長よりも大きい光が、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過し、前記光ファイバスプライス２２０から出力されたレーザー光のうち、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過した部分は、前記第１フィルタＦ１でフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第３反射鏡Ｍ３、第４反射鏡Ｍ４、第５反射鏡Ｍ５を順次経て前記位相板２４０に入り、前記位相板２４０を透過した光ビームは、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライド１２０に入って偏光調整され、前記第６反射鏡Ｍ６によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０に入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０から射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順次経た後、前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３に入り、前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３を透過した光ビームは、前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム１４０上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３に入り、且つ前記第３ダイクロイックミラーＤＭ３によって反射され、前記第３フィルタＦ３に入り、前記第３フィルタＦ３は、射入されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第８反射鏡Ｍ８は所在する光路の外に移動され、前記第３フィルタＦ３を透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズＬ４の焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホール２５０から射出された光ビームは、前記アバランシェダイオード２６０に入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。
【００２９】
なお、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルを走査して移動させ、イメージングを実現する。
【００３０】
いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡Ｍ１、前記第２反射鏡Ｍ２、第３反射鏡Ｍ３、第４反射鏡Ｍ４、第５反射鏡Ｍ５、前記第６反射鏡Ｍ６、前記第７反射鏡Ｍ７及び第８反射鏡Ｍ８は、レーザー光の光ビームが顕微鏡システムに精度よく結合して入力されるように、すべてＸＹ軸方向の周りに角度を調整することができる。
【００３１】
なお、フェムト秒レーザーについては、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、ＸＹ軸の周りに角度を調整可能な第１反射鏡Ｍ１と第２反射鏡Ｍ２が使用され、Ｍ１とＭ２を調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスできる。
【００３２】
なお、スーパコンティニウムレーザーについては、光ファイバを用いてコリメートレーザー光を出力し、光ファイバの末端には光ファイバスプライスがあり、光ファイバスプライスが４自由度レギュレータに挟持され、この４自由度レギュレータによって光ファイバスプライスはＸＹ方向の周りに移動したり、ＸＹ軸の周りに回転したりすることができ、それによって、光ファイバスプライスから放射されたレーザー光は光路に素早く正確に結合できる。
【００３３】
いくつかの好適な実施例では、前記第１波長は５３２ｎｍであり、前記第２フィルタＦ２の中心波長は４８８ｎｍであり、前記第１フィルタＦ１の中心波長は５９２ｎｍである。
【００３４】
いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は０−２πのらせん分布である。
【００３５】
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー１１０及び前記スーパコンティニウムレーザー２１０は、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
【００３６】
なお、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡で使用されるフェムト秒レーザー光とスーパコンティニウムレーザーは、両方ともに体積が大きく、顕微鏡の輸送や位置移動時に、これらのレーザーを顕微鏡から取り外す必要があり、フェムト秒レーザー光及びスーパコンティニウムレーザーが顕微鏡システムに素早く接続できるように、前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーが二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられ、それにより、取り外しや輸送が簡便になる。
【００３７】
図２は、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、励起光が対物レンズを経た後、長い楕円形の中実三次元スポットとして集束される。
【００３８】
図３は、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、損失光が、対物レンズを経た後、柱体形状の中空三次元スポットとして集束される。
【００３９】
なお、ＳＴＥＤイメージングには、励起スポットと損失光スポットを三次元方向に精度よく重なり合わせる必要があり、損失光スポットの位置を基準（一定に維持）として、励起光スポットと精度よく重なり合うように励起光スポットの三次元位置を調整し、Ｘ軸又はＹ軸の周りに第３反射鏡Ｍ７の角度を調整することにより、励起光スポットのＸ方向又はＹ方向での位置を変えることができ、光軸のＺ方向に沿って第２レンズＬ２の位置を調整することにより、励起光スポットのＺ方向での位置を変えることができ、それにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることができる。
【００４０】
本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
【００４１】
もちろん、本考案による二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本考案の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形を含むべきである。
【００４２】
本考案では、現在の好適な実施形態を参照しながら説明したが、当業者が理解できるように、上記の好適な実施形態は、本考案を説明するためのものに過ぎず、本考案の保護範囲を限定するものではなく、本考案の精神及び原則の範囲内で行われる任意の修飾、等価置換、改良などはすべて本考案の実用新案登録請求の範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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