(57)【要約】  本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法、褐色脂肪細胞を含む移植材料、褐色脂肪細胞を含む各種疾患、状態の予防剤又は治療剤、使用を提供することを課題とする。斯かる課題を解決する手段として、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、（３）cAMP誘導剤、及び（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞に変換することを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法を提供する。
2017026462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法。
【請求項２】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせるための誘導剤。
【請求項５】
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。
【請求項６】
前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、請求項１〜３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を用いた、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年８月７日に出願された、日本国特許出願第2015-157697号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法に関する。また、本発明は、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満とこれに関連する代謝疾患、例えば糖尿病、メタボリックシンドロームなどは、先進工業国において、極めて大きな医療、社会上の問題になっている。肥満症においては、白色脂肪細胞が、食物由来の余剰エネルギーを脂肪酸として貯蔵するのみならず、さまざまなホルモンやサイトカインを産生して耐糖能異常、脂質代謝異常を惹起し、II型糖尿病、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症・痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患等をもたらす。【０００４】
一方、褐色脂肪（Brown Adipose; BA）細胞は、白色脂肪細胞とは逆に、脂肪酸を酸化分解してそのエネルギーを熱として放出する細胞である。これは、BA細胞が特異的に発現するミトコンドリア内膜蛋白、UCP1（Uncoupling protein 1）が、酸化的リン酸化を脱共役させるためである。マウスなどげっ歯類では、BA細胞は肩甲骨間、後頚部、縦隔, 腎周囲等に存在する。また、UCP1ノックアウトマウスの解析等から、BA細胞は肥満と耐糖能異常を抑制することが知られている。【０００５】
褐色脂肪細胞は、ヒトでは乳児期にのみ存在し、成人では存在しないと考えられてきたが、2009年になって、成人でも鎖骨上部の皮下組織、大動脈周囲等に褐色脂肪細胞が存在することが明らかにされた（非特許文献１〜３）。褐色脂肪細胞の数と機能には大きな個人差があり、BMI（体格指数）と空腹時血糖に逆相関する。やせ型のヒトでは多く、肥満、糖尿病、高脂血症の患者では極端に低下している。したがって、肥満、糖尿病、高脂血症等の疾患の遺伝的素因を解析し、環境要因を探索し、病態を解明し、あるいは新しい診断法や治療効果の判定等の技術を開発する上で、褐色脂肪細胞は重要な意義を持つ。褐色脂肪細胞はまた、これら疾患に対する新しい治療薬の開発にも極めて有益であると考えられる。さらに肥満、糖尿病、高脂血症、メタボリック症候群等の患者に褐色脂肪細胞を補充することができれば、これら疾患に対する新しい治療手段となる可能性がある。【０００６】
ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞、次いで褐色脂肪細胞を得る方法は知られているが(非特許文献４、５)、線維芽細胞からiPS細胞を経て褐色脂肪細胞を誘導すると、最終の脂肪細胞を得るまでに時間がかかり、また得られた細胞を移植した際に、癌化する危険性を否定しにくい。【０００７】
体細胞のダイレクト・コンヴァージョンに関し、例えば以下の報告がある：
マウス線維芽細胞→軟骨細胞（SOX9 ＋ Klf4 ＋c-Myc遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→心筋細胞（GATA4 ＋ Mef2c ＋Tbx5遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→肝細胞（Hnf4α＋（Foxa1またはFoxa2またはFoxa3）遺伝子を導入）
マウス線維芽細胞→神経幹細胞（Sox2 ＋ FoxG1遺伝子を導入など）、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞。【０００８】
これまで、PRDM16とC/EBPβを筋芽細胞や線維芽細胞に遺伝子導入し、「褐色脂肪細胞様の細胞」に誘導することは知られている（特許文献２および非特許文献６）。しかし、PRDM16とC/EBPβで誘導した細胞は、UCP1の発現レベルが非常に低いなど、褐色脂肪細胞としての性質は不十分にしか有さない。【０００９】
特許文献３には、ヒト線維芽細胞にC/EBP-βとc-Myc遺伝子を導入して、高機能な褐色脂肪細胞を誘導する技術が開示されている（特許文献３）。特許文献３において、褐色脂肪細胞をマウスの線維芽細胞から誘導して糖尿病マウスに移植したところ、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症、体重増加がいずれも顕著に抑制できた。さらに、褐色脂肪細胞をマウスの線維芽細胞から誘導して同系マウスに移植した後、高脂肪食を与えると、食餌誘導性の肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症がほぼ完全に（通常食を与えたマウスと同レベルまで）抑制できた（特許文献３）。【００１０】
しかし、これらのように遺伝子を導入して褐色脂肪細胞を誘導する技術では、得られた褐色脂肪細胞を移植した後に移植した細胞が癌化する等の危険性を否定しにくかった。また誘導技術が煩雑であり、安全性の確保と検証のために高い経費を要した。【００１１】
もし、遺伝子導入を行うことなく、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァージョンする技術を提供できれば、より安全で安価で有用性の高い、糖尿病、肥満、メタボリック症候群等に対する再生医療を提供できる可能性がある。また、得られた褐色脂肪細胞を用いれば、これら疾患に対する新しい作用機序に基づく創薬開発等を行うことが期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2010/071210
【特許文献２】WO2010/080985A8
【特許文献３】WO2014010746 A1
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Saito M. et al., Diabetes 58:1526, 2009
【非特許文献２】Cypess A. M. et al., N Eng J Med 360: 1509, 2009
【非特許文献３】Van Merken Lichtenbelt W. D. et al., N Engl J Med 360: 1500, 2009
【非特許文献４】Tim Ahfeldt et al., Nature Cell Biology Vol.14, No.2, 2012
【非特許文献５】Nishio et al., Cell Metabolism, 16, 394, 2012
【非特許文献６】Kajimura S, et al. Nature 460: 1154, 2009
【非特許文献７】Callahan JF, et al., J Med Chem 45: 999, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、褐色脂肪細胞及びその調製方法、褐色脂肪細胞を含む移植材料、褐色脂肪細胞を含む各種疾患、状態の予防剤又は治療剤、使用を提供するものである。【００１５】
本発明は、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤、予防又は治療方法、該疾患又は状態の予防又は治療に有効な移植材料及びその調製方法を提供することを目的とするとも言える。【００１６】
具体的には、遺伝子導入を行うことなく、体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァージョンする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、（３）cAMP誘導剤、及び（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞に変換できることを見出した。【００１８】
これらの化合物を用いて、体細胞を褐色脂肪細胞に誘導したという報告はない。【００１９】
本発明は、以下の発明を包含する：
項１、  哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法。【００２０】
項２、  前記体細胞が線維芽細胞である、項１に記載の方法。【００２１】
項３、  前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、項１または２に記載の方法。【００２２】
項４、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物のを含む、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするための誘導剤。【００２３】
項５、（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。【００２４】
項６、  前記培地が、甲状腺ホルモン及びPPARγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である、項５に記載のキット。【００２５】
項７、  肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、項１〜３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。【００２６】
項８、  項１〜３のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を用いた、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。【００２７】
項９、  項１〜８のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
【発明の効果】
【００２８】
本発明では、低分子化合物の作用により分化した体細胞から短期間で褐色脂肪細胞を提供できる。この褐色脂肪細胞は、移植する本人の体細胞から容易に誘導できるので、褐色脂肪細胞自体又はそれから作製した骨組織を移植した場合にも免疫学的な拒絶応答などの問題は生じない。また、iPS細胞やES細胞を経由することなく直接体細胞から褐色脂肪細胞を誘導できるため、癌化などの多能性幹細胞に起因する問題を回避できる。一方で、あらかじめ作製してバンク化しておき、そこから患者へのアロ移植や異種移植に使うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Oil Red O染色した細胞の位相差顕微鏡像である。倍率ｘ１００
【図２】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図３】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図４】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでCIDEA遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図５】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでPGC-1α遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図６】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでAdipoQ遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図７Ａ】脂肪滴をBODIPYで染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００
【図７Ｂ】図７ＡのBODIPY染色の蛍光強度のグラフである。
【図７Ｃ】図７ＡのBODIPY染色像の白黒反転図である。
【図８Ａ】UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００
【図８Ｂ】図８ＡのUCP-1染色の蛍光強度のグラフである。
【図８Ｃ】図８ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。
【図９】Oil Red O染色した細胞の顕微鏡像である。倍率ｘ１００
【図１０Ａ】脂肪滴をBODIPYで染色し、またUCP1を免疫染色し、また核をDAPIで染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ２００
【図１０Ｂ】図１０Ａの染色像の白黒反転図である。
【図１１】TGFβ/SMADパスウェイの概要を模式的に表したものである。
【図１２】MEK/ERKパスウェイの概要を模式的に表したものである。
【図１３】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図１４Ａ】UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ１００
【図１４Ｂ】図１４ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。
【図１５】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【図１６Ａ】UCP1を免疫染色した細胞の、蛍光顕微鏡像である。倍率ｘ１００
【図１６Ｂ】図１６ＡのUCP-1染色像の白黒反転図である。
【図１７】細胞よりRNAを抽出し、real time RT-PCRでUCP-1遺伝子、CIDEA遺伝子及びKCNK3遺伝子のmRNA発現を定量したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、哺乳動物の分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートする方法に関する。当該方法により、体細胞を原材料として褐色脂肪細胞が調製される。「コンヴァート」とは、体細胞を目的の褐色脂肪細胞へと変換することを意味する。本発明の方法の好ましい態様の１つは、「ダイレクトリプログラミング」、「ダイレクトコンヴァージョン」ともよばれる、iPS細胞の作製に代表される細胞の初期化の工程を経ることなく、体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートする方法である。
【００３１】
褐色脂肪細胞
本発明は、褐色脂肪細胞の調整方法を提供する。褐色脂肪細胞とは、白色脂肪細胞とともに、ほ乳類に存在する脂肪細胞の２つのタイプの1つである。褐色脂肪細胞と類似の形態と機能をもつ細胞として、ベージュ（Beige）細胞やブライト（Brite）細胞と呼ばれる細胞も知られており、本明細書においてこれらの細胞も「褐色脂肪細胞」に包含される。
【００３２】
褐色脂肪細胞の存在は、公知の手法で確認をすることができる。例えば、細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素での染色、褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物（mRNA又はタンパク質）の検出が挙げられる。細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素としては、Oil Red O、BODIPYなどが挙げられる。褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物としては、UCP-1、CIDEA、PCG-1α、DIO2、Cox8b、Otop、AdipoQなどが挙げられる。中でも、UCP-1（Uncoupling protein 1）は、褐色脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子であり、酸化的リン酸化を脱共役させるミトコンドリア内膜タンパク質をコードし、褐色脂肪細胞の機能の根幹を担うと考えられるため、褐色脂肪細胞の指標として特に好ましいものの1つである。
【００３３】
体細胞
本発明の方法の対象となる哺乳動物の分化した体細胞としては、哺乳動物由来であって、褐色脂肪細胞そのもの及び生体内で褐色脂肪細胞へと分化する能力を有する細胞でない限り、特に限定されない。
【００３４】
体細胞の種類としては、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（皮膚表皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、腸管粘膜上皮細胞など）、表皮細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉、血液細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、歯肉細胞、口腔粘膜上皮細胞、歯髄細胞、脂肪細胞、表皮細胞（ケラチノサイト）、血液細胞などが挙げられる。
【００３５】
また、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）、神経幹細胞（Neural stem cell）、肝幹細胞（hepatic stem cell）、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて作製した体細胞も挙げられる。また、さまざまな体細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて別の体細胞に誘導した細胞も挙げられる。また、生殖系列の細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
【００３６】
また、胎性幹細胞（Embryonic stem cell：ES細胞）や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）から分化誘導し、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
【００３７】
また、厳密には体細胞ではないが、ES細胞、iPS細胞、あるいは生殖系列の細胞も本発明の「体細胞」に包含される（その際には、「体細胞」を「ES細胞」、「iPS細胞」あるいは「生殖系列の細胞」と読み替えるものとする）。
【００３８】
また、培養細胞も挙げられ、培養細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて誘導した体細胞も挙げられる。
【００３９】
哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられる。体細胞は、ヒト由来であることが特に好ましい。体細胞が由来する個体の年齢は限定されず、成人であっても小児であっても胎児であってもよい。なお、本明細書において、胎児由来の細胞、並びに、胎盤、羊膜、臍帯等由来の細胞も「体細胞」に包含される。 
【００４０】
調製した褐色脂肪細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞から作った褐色脂肪細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞から褐色脂肪細胞を作り、移植に用いることができる。または他人や他の動物の体細胞からあらかじめ作っておいた褐色脂肪細胞を、移植に用いることができる。すなわち、褐色脂肪細胞バンク、または褐色脂肪細胞前駆細胞のバンクを作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめ血液型とMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめ褐色脂肪細胞のキャラクターや造腫瘍性などを確認しておくことができる。
【００４１】
培地
本発明の方法で用いる培地は、特に限定されない。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）などの通常の液体培地を用いることができる。必要に応じて、血清成分（Fetal Bovine Serum（FBS）、Human Serum（Serum））、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗生剤、Non-Essential Amino Acid等の成分を添加することができる。
【００４２】
褐色脂肪細胞を調製できる効率が高いとの観点から、培地として脂肪細胞を分化させるための分化誘導培地を用いることが好ましい。「脂肪細胞を分化させるための分化誘導培地」とは、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞など）を脂肪細胞へと分化させることができる成分を含む培地を指す。分化誘導培地は、上記の通常の液体培地（必要に応じて加える成分を加えてもよい）に、下記の成分（１種又は２種以上）を添加したものが挙げられる：
インスリン（Insulin）（例えば濃度0.01〜100μg/mL程度、より好ましくは0. 1〜10μg/mL程度）;3-イソブチル-1-メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine；IBMX)（例えば濃度0.01〜100 mM程度、より好ましくは0.1〜10ｍM程度）; デキサメタゾン（Dexametazone）（例えば濃度0.01〜100 μM程度、より好ましくは0.1〜10 μM程度）。また、インドメタシン（Indometacin）（例えば濃度0.001〜10 mM程度、より好ましくは0.01〜1 ｍM程度） を添加しても良い。
【００４３】
具体例として、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexametazone、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）を、脂肪細胞誘導培地として用いることができるが、これに限定されない。
【００４４】
脂肪細胞誘導培地に、褐色脂肪細胞にコンヴァートさせる効率が高いとの観点から、さらにトリヨードサイロニン（Triiodothyronine, T3）、サイロキシン（Thyroxine, T4）などの甲状腺ホルモン（例えば濃度0.01〜100 nM程度、より好ましくは0.1〜10nM程度）またはPeroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ)アゴニスト（例えば濃度0.01〜100 μM程度、より好ましくは0.1〜10 μM程度）を加えることが好ましく、両者を加えることがさらに好ましい。
【００４５】
PPAR-γアゴニストとしては、Rosiglitazone、Ciglitazone、GW1929、nTZDpa、Pioglitazone Hydrochloride、Troglitazoneなどのチアゾリジンジオン化合物が例示される。
【００４６】
褐色脂肪細胞を誘導するための培地の好ましい態様としては、[1] FBS 10%, 0.5 mM IBMX, 125 nM Indomethacin, 1 microM Dexamethasone, 850 nM insulin 、トリヨードサイロニン（Triiodothyronine, T3）、サイロキシン（Thyroxine, T4）などの甲状腺ホルモン（例えば濃度0.01〜100 nM程度、より好ましくは0.1〜10nM程度）1 μM Rosiglitazoneを添加したDMEM培地、[2] 10% FBS, 850 nM insulin, 1 nM T3, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ （PPAR-γ）アゴニスト（例えば濃度0.01〜100 μM程度、より好ましくは0.1〜10 μM程度）を添加したDMEM培地が例示される。第１〜２日に[1]を、第3日以降に[2]を用いることが特に望ましい。しかしこれらに限定されない。
【００４７】
化合物
本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
（１）TGFβ/SMADパスウェイ阻害剤、
（２）カゼインキナーゼ１阻害剤、
（３）cAMP誘導剤、及び
（４）MEK/ERKパスウェイ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養する。以下、各化合物について説明する。
【００４８】
TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤
TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤は、TGF-β/SMADパスウェイに属するタンパク質の活性を阻害できる化合物を意味する。TGF-β/SMADパスウェイは図１１に模式的に示す、当業者に公知のシグナル経路である。
【００４９】
TGF-β/SMADパスウェイは、TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質から構成されるリガンド（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、アクチビン-βA、アクチビン-βB、アクチビン-βC、アクチビン-βε、nodal、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP10, BMP15、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF15、AMH (MIS)など）、ヘテロ二量体型の受容体を構成するTGF-β type I receptorファミリーに属するタンパク質及びTGF-β type II receptorファミリーに属するタンパク質、並びに、細胞内のシグナル分子（エフェクター）であるSMADファミリーに属するタンパク質（とくにSMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5、またはSMAD8） が主に構成する。
【００５０】
TGF-β/SMADパスウェイにおいては、リガンドが二量体型の受容体に結合すると、キナーゼ型受容体であるTGF-β type I receptorタンパク質が、SMADタンパク質をリン酸化して、下流にシグナルを伝達する。したがって本明細書では、TGF-βスーパーファミリーのサイトカイン、TGF-β type I receptorファミリー、TGF-β type II receptorファミリー、SMADファミリータンパク（とくにSMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD1、SMAD5、またはSMAD8）のいずれかを抑制する分子を、TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤と呼ぶ。
【００５１】
「TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤」は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、受容体のアンタゴニスト、可溶性受容体、パスウェイのタンパク質に結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体タンパク質やペプチドやその類似体、パスウェイのタンパク質の発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
【００５２】
TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤の態様の1つとして、TGF-β type I receptorファミリー（Activin receptor like kinase（ALK）ファミリーともいう）に属するALKタンパク質（ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7）の阻害剤（ALK阻害剤）が例示される。また、TGF-β type II receptorファミリーに属するタンパク質（TGF-βRII（AAT3）、ACTRII、ACTRIIB、BMPRII、AMHRII）の阻害剤が例示される。 
【００５３】
具体的には、ALK5の阻害剤であるD4476（4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、ALK5 Inhibitor II（2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine；別名RepSox）、GW788388、SD-208；ALK5とTGF-βRII（AAT3）の阻害剤であるLY2109761、LY2157299（Galunisertiv, 4-[5,6-dihydro-2-(6-methyl-2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-6-quinolinecarboxamide）、LY364947；ALK4及びALK5の阻害剤であるSM16 (4-(5-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide)、EW-7197、SB525334；ALK4、ALK5及びALK7阻害剤であるSB431542（4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide）、SB505124、A83-01；ALK2及びALK3の阻害剤であるLDN-193189、Apigenin、DMH1、ML347；ALK１及びALK2の阻害剤であるLDN-214117；ALK1、ALK2及びALK3の阻害剤であるLDN-212854；ALK1、ALK2、ALK3及びALK6の阻害剤であるK02288が例示される。
【００５４】
ALK阻害剤としては、効果が高いとの観点から、少なくともALK5に対する阻害活性を有するもの（ALK5阻害剤）が好ましい。効果が特に高いとの観点から、ALK4及びALK5、又はALK5に対する特異的な阻害活性を有するもの（ALKタンパク質のうち、当該タンパク質への阻害活性が顕著に高いもの）が好ましい。
【００５５】
TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤の別の態様として、SMADタンパク質の阻害剤が例示される。
【００５６】
中でも、ALK5の下流に位置するSMAD2及びSMAD3、さらにはSMAD4の阻害剤が好ましい。
【００５７】
TGF-β/SMADパスウェイ阻害剤は、上記の化合物の誘導体も包含する。例えば、D4476に替えてその誘導体を使用することもできる。誘導体は、必ずしも、ALK5を阻害する活性を有さなくてもよい。例えば、WO00/61576号に記載の下記式（Ｉ）で表されるD4476の誘導体を使用することができる：
【００５８】
【化１】
2017026462.tif 000003
【００５９】
［式中、Ｒ1は、ハロゲン、Ｃ1-6アルコキシ（−Ｏ−Ｃ1-6アルキル）、Ｃ1-6アルキルチオ（−Ｓ−Ｃ1-6アルキル）、Ｃ1-6アルキル、−Ｏ−(ＣＨ2)n−Ｐh、−Ｓ−(ＣＨ2)n−Ｐh、シアノ、フェニル（Ｐｈ）、およびＣＯ2Ｒ（ここで、Ｒは、水素またはＣ1-6アルキルであり、ｎは、０、１、２または３である）からなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよいナフチル、アントラセニル、またはフェニルであるか；またはＲ1は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい５〜７員の芳香環または非芳香環と縮合したフェニルであり；
Ｒ2は、Ｈ、ＮＨ(ＣＨ2)n−ＰhまたはＮＨ−Ｃ1-6アルキルであり（ここで、ｎは、０、１、２または３である）；
Ｒ3は、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＣＮ、ＮＯ2、Ｃ1-6アルキルチオ、−ＳＯ2−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ＳＯＮＨ2、ＣＯＮＨＯＨ、ＮＨ2、ＣＨＯ、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＮＨ2、またはＣＯ2Ｒであり（ここで、Ｒは、水素またはＣ1-6アルキルである）；  Ｘ1およびＸ2のうち一方は、ＮまたはＣＲ'であり、他方は、ＮＲ'またはＣＨＲ'である（ここで、Ｒ'は、水素、ＯＨ、Ｃ1-6アルキル、またはＣ3-7シクロアルキルである）か；またはＸ1およびＸ2のうち一方がＮまたはＣＲ'である場合、他方は、ＳまたはＯであってもよい］。
【００６０】
Ｃ1-6アルキルとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキル、具体的には、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、n−ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。
【００６１】
Ｃ3-7シクロアルキルとしては、炭素数３〜７のシクロプロピル、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。
【００６２】
Ｒ1が、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい５〜７員の芳香環または非芳香環と縮合したフェニルである場合、具体例としては、ベンゾ[１,３]ジオキソリル、２,３−ジヒドロベンゾ[１,４]ジオキシニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ[１,２,５]オキサジアゾリル、ベンゾ[１,２,５]チアジアゾリル、ジヒドロベンゾフラニルが挙げられる。
【００６３】
このようなD4476の誘導体として、下記の化合物が例示される：
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−(２−ピリジル)−１−ヒドロキシ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンゾニトリル；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−(２−ピリジル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンゾニトリル；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−(２−ピリジル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]安息香酸；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−(２−ピリジル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]安息香酸メチル；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−(２−ピリジル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]安息香酸エチル；
４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−１−ヒドロキシ−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)ベンゾニトリル；
４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)ベンゾニトリル；
４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)安息香酸；
２−[４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−２−(４−ニトロフェニル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]ピリジン；
３−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)フェニルアミン；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−２−(４−ニトロフェニル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]ピリジン；
４−[４−(４−フルオロフェニル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)フェニルアミン；
４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)フェニル]メタノール；
４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)ベンズアミド；
４−[４−(２,３−ジヒドロ−ベンゾ[１,４]ジオキシン−６−イル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−ベンゾニトリル；
４−[４−(２,３−ジヒドロ−ベンゾフラン−５−イル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンズアミド；
３−[４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)ベンゾニトリル；
４−[４−(２,３−ジヒドロ−ベンゾフラン−６−イル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンゾニトリル；
４−[４−(２,３−ジヒドロ−ベンゾフラン−６−イル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンズアミド；
３−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル)安息香酸；
４−[４−(４−メトキシフェニル)−５−(２−ピリジル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンゾニトリル；
４−[４−(２,２−ジフルオロ−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル)−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンズアミド；
４−[４−(２,３−ジヒドロ−ベンゾ[１,４]ジオキシン−６−イル)−１−メチル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンズアミド；
４−[５−(２,３−ジヒドロ−ベンゾ[１,４]ジオキシン−６−イル)−１−メチル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]ベンズアミド；
４−(５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−オキサゾール−２−イル)ベンゾニトリル；
４−(５−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−オキサゾール−２−イル)ベンズアミド；および ４−(４−ベンゾ[１,３]ジオキソール−５−イル−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピロール−２−イル)ベンズアミド。
【００６４】
カゼインキナーゼ阻害剤
カゼインキナーゼ阻害剤は、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２などのサブタイプが存在するカゼインキナーゼに対する阻害剤を広く包含する。カゼインキナーゼ阻害剤は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、カゼインキナーゼに結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体タンパク質やその類似体、カゼインキナーゼの発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
【００６５】
褐色脂肪細胞を誘導する効果が高いとの観点から、カゼインキナーゼ１阻害剤が好ましい態様として挙げられる。
【００６６】
カゼインキナーゼ１阻害剤としては、D4476、IC261、CK1-7、A3、SB-431542、DRB、ハイメニアルディシン、マタイレジノール、5-ヨードツベルジシン、メリジアニン、SB-203580などの化合物（カゼインキナーゼ１を特異的に阻害する化合物を含む。）が、好適な例として挙げられる。
【００６７】
その他、ファスジル、ヒドロキシファスジル、フェンレチニド、PKZ-ζペプチド偽基質、ジメチルスフィンゴシン、CVS-3989、AG1024、648450、K252a、C3トランスフェラーゼ、553502、LY333531、ルボキシスタウリン、Go-6976、IWR-1-endo（IWR1e）、IWP-2などのカゼインキナーゼ１を阻害する活性を有する化合物も挙げられる。
【００６８】
カゼインキナーゼ２阻害剤としては、CX-4945が例示される。
【００６９】
また、カゼインキナーゼ阻害剤は上記の化合物の誘導体も包含する。
【００７０】
cAMP誘導剤
cAMP誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤と換言することもできる）としては、アデニル酸シクラーゼの活性化作用により細胞内のcAMP（サイクリックAMP）レベルを上昇させる化合物を広く包含し、例えば、フォルスコリン（FSK）、イソプロテレノール、NKH 477、PACAP 1-27、PACAP 1-38などが挙げられる。
【００７１】
また、cAMP誘導剤は上記の化合物の誘導体も包含する。
【００７２】
MEK/ERKパスウェイ阻害剤
MEK/ERKパスウェイ阻害剤は、MEK/ERKパスウェイに属するタンパク質の機能発現を阻害できる化合物を意味する。MEK/ERKパスウェイは図１２に示す、当業者に公知のシグナル経路である。
【００７３】
MEK/ERKパスウェイは、サイトカインや成長因子（Growth factors）が結合することによって活性化するレセプターである、EGFレセプター、HER2、IGF1レセプター、VEGFレセプター、Flt-3、c-kit、PDGF-R等のレセプター；これらレセプターによって活性化するRas；Rasシグナルを受けて活性化するMAPKKKタンパク質であるA-Raf、B-Raf、ｃ-Raf、Mos、Tpl；MAPKKKによってリン酸化（活性化）されるMAPKKタンパク質であるMEK1、MEK2（MEK1/2）、MAPKKによってリン酸化されるMAPKタンパク質であるERK1、ERK2（ERK1/2）；下流の転写因子等であるElk-1、Est2、RSK、MNK、MSK、cPLA2、CREB、Fos、 globin transcription factor 1等が主に構成する。
【００７４】
MEK/ERKパスウェイ阻害剤としては、上記の分子のいずれか（MEKの上流のサイトカインや成長因子とそのレセプター、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2、ERKの下流の因子等）を阻害するものが含まれる。中でも、MAPKKタンパク質のMEK1、MEK2及び、MAPKタンパク質のERK1、ERK2の機能発現を阻害する化合物（阻害剤）が好ましく、MEK1、MEK2に対する阻害剤が特に好ましい。
【００７５】
MEK/ERKパスウェイ阻害剤としては、PD0325901（N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-benzamide；MEK1/2に対する阻害剤である）、AS703026、AZD8330、BIX02188、BIX02189、CI-1040、Cobimetinib、GDC-0623、MEK162、PD318088、PD98059、Refametinib、RO4987655、SCH772984、Selumetinib、SL327、Trametinib、ARRY-142886 、XL518,RDEA119などが例示される。
【００７６】
また、MEK/ERKパスウェイ阻害剤は上記の化合物の誘導体も包含する。MEK/ERKパスウェイ阻害剤は狭義の阻害剤である低分子化合物に止まらず、MEK/ERKパスウェイのたんぱく（たとえばMEK1,MEK2,ERK1,ERK2）に結合しその作用を阻害する活性を有する抗体、アプタマー、ペプチド、ドミナントネガティブとして働く変異体たんぱくやその類似体、MEK/ERKパスウェイのたんぱく（たとえばMEK1,MEK2,ERK1,ERK2）の発現を抑制するsiRNA、shRNA、マイクロRNAなどを包含する。
【００７７】
上記（１）〜（４）からなる群から選択される化合物の培地中の濃度は、当業者が適宜設定することができる。通常は、0.01 μＭ〜100μＭ程度、特に0.1 μＭ〜10 μＭ程度である。
【００７８】
培養
本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を培地中、上記（１）〜（４）からなる群から選択される少なくとも１種の化合物の存在下に培養する。
【００７９】
培養は、細胞及び培地を格納するための適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO2インキュベータを用いて行なうことができる。
【００８０】
上記（１）〜（４）からなる群から選択される少なくとも１種の化合物は、全培養期間の内の一部の期間のみで添加してもよい。哺乳動物の分化した体細胞を、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。また、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、通常培地中上記化合物の非存在下に培養し、その後誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。また、通常培地中上記化合物の存在下に培養した後で、誘導培地中上記化合物の存在下に培養し、その後誘導培地中上記化合物の非存在下に培養してもよい。このように、上記化合物の存在下で培養することと、誘導培地で培養することの両方の過程を含んでさえいれば、それらは同時でなくてもよいし、それぞれは全培養期間の一部だけであってもよい。 
【００８１】
培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、24時間から60日間程度、好ましくは3〜30日、より好ましくは10〜20日程度、特に好ましくは14日程度とすることができる。
【００８２】
効果が高いとの観点から、全培養期間中、（例えば６〜１０日程度、特に８日程度）誘導培地中上記化合物の存在下での培養をし、その後誘導培地中上記化合物の非存在下での培養とすることができる。この場合の上記化合物の存在下での培養は、全培養期間中、培養開始からであっても、所定期間上記化合物の非存在下で培養した後であってもよい。
【００８３】
培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前または直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜交換することもできる。
【００８４】
かくして、体細胞が褐色脂肪細胞にコンヴァートし、褐色脂肪細胞が調製される。
【００８５】
褐色脂肪細胞が得られたことは、前述の細胞中の脂肪滴を検出できる蛍光色素での染色、褐色脂肪細胞において発現する遺伝子産物の検出により確認することができる。
【００８６】
具体的には、褐色脂肪細胞が得られたことは、Oil Red O染色やBodipy染色で染められる、多房性脂肪滴を有する特有の形態や、UCP-1、CIDEA、KCNK3、PCG-1α、Cox8b、Otop、ELOVL3遺伝子などの発現によって検出することができる。中でも、UCP-1（Uncoupling protein 1）は、褐色脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子であり、酸化的リン酸化を脱共役させるミトコンドリア内膜タンパク質をコードし、褐色脂肪細胞の機能の根幹を担うと考えられるため、褐色脂肪細胞の指標として特に好ましいものの1つである。
【００８７】
治療又は予防剤；移植材
本発明の方法により調製される褐色脂肪細胞は、生体に移植することで、肥満、メタボリックシンドローム、或いはこれらに関連する疾患又は状態の予防又は治療に使用することができる。
【００８８】
対象とする疾患には、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病性合併症（網膜症、末梢神経症、腎症、大血管障害、糖尿病性壊疽、骨粗鬆症、糖尿病性昏睡等）、耐糖能異常、インスリン抵抗性、アシドーシス、ケトーシス、ケトアシドーシス、肥満、中枢性肥満とその合併症、内臓肥満症候群、高血圧、食後高脂血症、脳血管障害、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、メタボリック・シンドローム、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低HDL血症、腎臓疾患 （糖尿病性ネフロパシー、ネフローゼ症候群等）、動脈硬化症、血栓性疾患、心筋梗塞、虚血性心疾患、狭心症、心不全、脳血管障害（脳梗塞、脳卒中等）、末梢血行障害、知覚障害、高尿酸血症、痛風、感染症（呼吸器感染症、尿路感染症、消化管感染症、皮膚感染症、軟部組織感染症等）、悪性腫瘍、白内障、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、骨粗鬆症が含まれる。褐色脂肪細胞による脂質の燃焼と糖・脂質代謝異常の改善によって、これら疾患に対する予防と治療効果が得られると考えられる。
【００８９】
また、褐色脂肪細胞は、腹部や顎の周り、太ももなどの脂肪を除去する美容的な用途にも使用できる。褐色脂肪細胞は、乳房などに導入する美容的処置の移植材料として使用することもできる。
【００９０】
褐色脂肪細胞を投与すると、脂肪量、特に内臓脂肪、皮下脂肪などの白色脂肪細胞が減少し、また高カロリー食を摂取した場合にも体重増加が抑制されるため、肥満、メタボリックシンドローム、或いはこれらの関連する疾患又は状態の予防と治療の両方に有用である。本発明はまた、疾患の予防又は治療に限らず、健康増進や美容（例えば腹部、顎、腕、太ももなどの内臓脂肪、皮下脂肪の除去）等の目的で用いることもできる。その際、ヒトに対する処置も、本明細書では便宜上治療と呼び、「患者」は「健常者」あるいは「ヒト」、「疾患」は「健康増進」や「美容」等と読み替えることができる。
【００９１】
本発明はまた、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜の疾患の治療にも用いることが可能である。その場合、「患者」あるいは「ヒト」を「患畜」あるいは「動物」と読み替えることとする。
【００９２】
移植材料とは、褐色脂肪細胞を生体内に導入する材料をいう。褐色脂肪細胞は、乳房などに導入する美容的処置の移植材料として使用することもできる。移植材料は、インビトロで体細胞から褐色脂肪細胞に変換した後、同一または別の個体に移植する材料を包含する。
【００９３】
また、得られた褐色脂肪細胞を用いれば、糖尿病（特にII型糖尿病）、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患などに対する新しい作用機序に基づく創薬開発等を行うことができる。
【実施例】
【００９４】
以下に実施例を示すが、本発明はこの実施例だけに限定されるものではない。【００９５】
以下に、実施例で用いた化合物の構造を示す。【００９６】
【化２】
2017026462.tif 000004
【００９７】
【化３】
2017026462.tif 000005
【００９８】
以下、本明細書中及び図中において、「ALK5 Inhibitor II」を「ALK5 Inhibitor」、「ALK5IH」または「ALK5i」と記載する場合がある。【００９９】
実施例１
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１００】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１０１】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM 
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。【０１０２】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１０３】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、10%ホルマリンにて固定した。滅菌蒸留水で3回洗浄した後、Oil Red O染色液を加え、室温で15分間インキュベートした。その後滅菌蒸留水にて洗浄し、位相差顕微鏡で100倍の倍率で撮影した。【０１０４】
結果を図１に示す。脂肪細胞誘導培地にT3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、ALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養した場合に、顕著なOil Red O染色が観察された（図中、＃４、＃６、＃７）。一方、通常培地、T3およびRosiglitazoneを添加しない脂肪細胞誘導培地、並びに、p53阻害剤であるPifithrin alphaを添加した脂肪細胞誘導培地の場合には、殆どOil Red O染色が観察できなかった。また、T3およびRosiglitazoneのみを添加した脂肪細胞誘導培地ではOil Red O染色の程度が低かった。以上のことから、T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、ALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞が褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１０５】
実施例２
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１０６】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１０７】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
Forskolin（FSK）: 2 μM 
PD0325901: 1 μM
SB431542: 2 μM。【０１０８】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１０９】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mixと、UCP1遺伝子またはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman probeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCR（定量的RT-PCR）を行った。UCP1遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１１０】
その結果を図２に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、FSK、PD0325901またはSB431542のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。さらに、D4476とFSKの共添加により、もっともUCP1を強く発現する細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１１１】
実施例３
実施例２と同様の実験を行い、通常培地で培養した細胞、T3とRosiglitazoneを添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞と、T3、RosiglitazoneとD4476 を添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞を準備した。これら細胞に、図中に記載のように１０ μMのIsoproterenol、またはFSKを添加した。コントロールとして添加しない群も作った。5時間後に各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。実施例２と同様にqRT-PCRを行った。UCP1遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１１２】
その結果を図３に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476 を添加した脂肪細胞誘導培地で14日間培養した細胞は、Isoproterenol、またはFSKの刺激によりUCP1のmRNAをさらに強く発現することがわかり、これら刺激に対して褐色脂肪細胞様の応答能を有することがわかる。【０１１３】
実施例４
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１１４】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１１５】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。【０１１６】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mixと、CIDEA遺伝子またはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman probeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。CIDEA遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１１７】
その結果を図４に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431542、またはALK5 Inhibitor のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がCIDEA遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１１８】
実施例５
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１１９】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１２０】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
Forskolin（FSK）: 2 μM 
PD0325901: 1 μM。【０１２１】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１２２】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mix、および、PGC-1alphaまたはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman pobeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。PGC-1alpha遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１２３】
その結果を図５に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、Forskolin（FSK）またはPD0325901のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がPGC-1alpha遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１２４】
実施例６
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2 /95% humid air 37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１２５】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１２６】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。
Pifithrin alpha［p53阻害剤］: 5 μM 
PD0325901: 1 μM
SB431542: 2 μM 
ALK5 Inhibitor II: 2 μM。【０１２７】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１２８】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを抽出した。このRNAから、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。このcDNAにReal-time PCR Master Mix、および、AdipoQまたはβアクチン遺伝子に特異的なprimersとTaqman pobeを混和した。AB7300 Real-time PCR systemを用いてqRT-PCRを行った。AdipoQ遺伝子のmRNAレベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１２９】
その結果を図６に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、PD0325901、SB431542またはALK5 Inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がAdipoQ遺伝子のmRNAを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１３０】
実施例７
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１３１】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１３２】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
SB431541: 2 μM
ALK5 inhibitor II: 2 μM。【０１３３】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１３４】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄した。その後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS（−）にて洗浄した後、BODIPY 493/503 (Invitrogen）/PBS溶液にて室温で5分間反応させ、PBSで3回Washした。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行い、また蛍光強度を計測した。【０１３５】
その結果を図７Ａ（蛍光顕微鏡像）と図７Ｂ（蛍光強度）に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431541、またはALK5 inhibitor IIのいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がBODIPYで染色される脂肪滴を有する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。 【０１３６】
実施例８
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１３７】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１３８】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM
SB431541: 2 μM
ALK5 inhibitor II: 2 μM
PD0325901: 1 μM
Forskolin（FSK）: 2 μM。【０１３９】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１４０】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（−）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X添加PBS）を加えて15分間インキュベートした。PBS（−）にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。【０１４１】
抗USP-1抗体を加えて室温で2時間反応させた後、Wash bufferにて3回washした。Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig抗体を加えて室温で1時間反応させた後、Wash bufferにて5回washした。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行い、また蛍光強度を計測した。【０１４２】
その結果を図８Ａ及び図８Ｃ（蛍光顕微鏡像）と図８Ｂ（蛍光強度）に示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476、SB431541、ALK5 inhibitor II、PD0325901、またはForskolin（FSK）のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1たんぱくを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。またPD0325901またはForskolinを添加培養することにより、UCP-1たんぱく発現が増加することが分かる。さらに、T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476とForskolinを共添加して培養することにより、線維芽細胞がよりUCP1たんぱくを強く発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。 【０１４３】
実施例９
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×104 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１４４】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１４５】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。【０１４６】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１４７】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、10%ホルマリンにて固定した。滅菌蒸留水で3回洗浄した後、Oil Red O染色液を加え、室温で15分間インキュベートした。その後滅菌蒸留水にて洗浄し、顕微鏡で100倍の倍率で撮影した。【０１４８】
結果を図９に示す。RosiglitazoneおよびT3に加えてD4476を添加培養することにより、線維芽細胞が対照と比べて顕著なOil Red O染色が観察される褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１４９】
実施例１０
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBSを添加したDulbecco’s modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを1×10^4 cells/wellの濃度で24-well plateに播種し（day 0）、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日、培養上清を吸引除去し、図中に記載のとおり、通常培地、脂肪細胞誘導培地、または各小分子化合物等を加えた脂肪細胞誘導培地を、500 μL/well加えた。【０１５０】
脂肪細胞誘導培地は、10% FBS添加DMEM＋MDI培地（0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、および1 μg/mL Insulinを添加した、10% FBS添加DMEM）である。【０１５１】
添加物の濃度は以下のとおりである：
T3: 1 nM 
Rosiglitazone: 1 μM 
D4476: 2 μM。【０１５２】
3〜4日に1度、培養液をフレッシュなものに置換し、day 14まで培養した。【０１５３】
Day 14に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（−）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X添加PBS）を加えて15分間インキュベートした。PBS（−）にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。【０１５４】
抗USP-1抗体を加えて室温で2時間反応させた後、Wash bufferにて3回washした。Alexa 546-conjugated anti-mouse Ig抗体を加えて室温で1時間反応させた後、Wash bufferにて5回washした。その後、BODIPY 493/503 (Invitrogen）/PBS溶液にて室温で5分間反応させ、PBSで3回Washし、DAPIで染色した。蛍光顕微鏡を用いて倍率200倍で写真撮影を行った。【０１５５】
その結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。T3およびRosiglitazoneに加えて、D4476を添加培養することにより、線維芽細胞がBodipyで染色される脂肪滴とUCP1たんぱくを発現する褐色脂肪細胞にコンヴァートしたことがわかる。【０１５６】
実施例１３(図13）
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium（DMEM））に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、通常培地（群１）、、脂肪細胞誘導培地（群２）、またはALK5 inhibitor IIを4 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地(群３〜８)を、1 mL/well 加えた。【０１５７】
脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。【０１５８】
2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換した。群３〜７は、それぞれDays 0〜2、Days 0〜4、Days 0〜6、Days 0〜8、Days 0〜10の期間のみALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養し、その後はALK5 inhibitor IIを添加しない脂肪細胞誘導培地で培養した。群８は、Days 0〜14の全期間、ALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培地を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を、混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβ アクチン遺伝子ｍRNAレベルに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１５９】
結果を図１３に示す。脂肪細胞誘導培地中で、ALK5 inhibitor IIを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1 遺伝子を強発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIを0-8日間加え、その後、ALK5 inhibitor IIを含まない脂肪細胞誘導培地で６日間培養した群（群６）において最も高くUCP1 遺伝子の発現が誘導され、もっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導することがわかる。ALK5 inhibitor IIの存在下で培養を行った他の条件（群３〜５、７、８）においてもUCP1遺伝子の高い発現が誘導された。【０１６０】
実施例１４(図14)
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium（DMEM））に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、通常培地（群１）、脂肪細胞誘導培地（群２）、またはALK5 inhibitor IIを4 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地(群３〜８)を、1 mL/well 加えた。【０１６１】
脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。【０１６２】
2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換した。群３〜７については、それぞれDays 0〜2、Days 0〜4、Days 0〜6、Days 0〜8、Days 0〜10の期間のみALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養し、その後はALK5 inhibitor IIを添加しない脂肪細胞誘導培地で培養した。群8は、Days 0〜14の全期間、ALK5 inhibitor IIを添加した脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、Day 14 に、各well から培養液を吸引除去し、PBS（−）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（−）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X 添加PBS）を加えて15 分間インキュベートした。PBS（−）にて3 回洗浄した後、Blocking One を加えて、室温で60 分間インキュベートした。抗UCP-1 抗体(RD MAB6158)を加えて室温で2 時間反応させた後、Wash buffer にて3 回wash した。CF488-conjugated anti-mouse Ig 抗体(Biotum 20014)を加えて室温で2 時間反応させた後、PBS(-) にて3 回wash した。Lifetechnology社製SlowFade Gold antifade reagent with DAPIで核染色したのち蛍光顕微鏡を用いて倍率100 倍で写真撮影を行った。【０１６３】
結果を図１４Ａ及び１４Ｂ（蛍光顕微鏡像）に示す。ALK5 inhibitor IIを加えた群では、線維芽細胞がUCP1タンパク質を高発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIを0-8日間加え、その後、ALK5 inhibitor IIを含まない脂肪細胞誘導培地で６日間培養した群（図中、＃６）においてUCP1タンパク質の染色強度が高くかつ染色陽性の細胞が多く、もっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導することがわかる。ALK5 inhibitor IIの存在下で培養を行った他の条件（図中、＃２〜５、７、８）においてもUCP1タンパク質の高発現が検出された。【０１６４】
実施例１５(図15）
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した（Day -1）。コントロール（Ctrl）群は、翌日（Day 0）培養上清を吸引除去し、2 日に1 度培地をフレッシュなものに置換しながら、Day 14まで通常培地で培養した。コントロール（Ctrl）群以外の群は、Day 0に培養上清を吸引除去し、脂肪細胞誘導培地、またはALK5 inhibitor II、SB431542、LY2157299及びD4476のいずれかの化合物をそれぞれ4 μM、8 μM、12 μM、16 μMの濃度で添加した脂肪細胞誘導培地を、1mL/well 加えた。【０１６５】
脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。【０１６６】
2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9 − Day 14は、ALK5 inhibitor II、SB431542、LY215799及びD4476のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、すべての群のwell から培地を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を、混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβ アクチン遺伝子ｍRNAレベルに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１６７】
結果を図１５に示す。ALK5 inhibitor II、SB431541、LY2157299及びD4476のいずれかを添加して培養することにより、線維芽細胞がUCP1 遺伝子を強発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくにALK5 inhibitor IIがもっとも強く線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導し、LY2157299がそれに次ぐことがわかる。本実施例においては、褐色脂肪細胞への誘導効率はALK5 inhibitor II＞LY2157299＞SB431541＞D4476の順であった。【０１６８】
実施例１６(図16)
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した。翌日（Day 0）、培養上清を吸引除去し、ALK5 inhibitor II (4 μM)、LY2157299 (8 μM)、SB431542 (4 μM)及びD4476 (4 μM)のいずれかの化合物を加えた脂肪細胞誘導培地を、1mL/well 加えた。【０１６９】
脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および10% FBSを添加したDMEMである。
2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9からDay 14は、ALK5 inhibitor II、SB431542、LY215799及びD4476のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、各well から培地を吸引除去し、PBS（−）で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS（−）にて洗浄し、Perm Buffer（0.2% Triton-X 添加PBS）を加えて15 分間インキュベートした。PBS（−）にて3 回洗浄した後、Blocking One を加えて、室温で60 分間インキュベートした。抗UCP-1 抗体(RD MAB6158)を加えて室温で2 時間反応させた後、Wash buffer にて3 回wash した。CF488-conjugated anti-mouse Ig 抗体(Biotum 20014)を加えて室温で2 時間反応させた後、PBS (-) にて3 回wash した。Lifetechnology社製SlowFade Gold antifade reagent with DAPIで核染色したのち蛍光顕微鏡を用いて倍率100 倍で写真撮影を行った。【０１７０】
その結果を図１６Ａ及び図１６Ｂ（蛍光顕微鏡像）に示す。ALK5 inhibitor II、LY2157299、SB431541、D4476、のいずれかを添加培養することにより、線維芽細胞がUCP1 たんぱくを発現する褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくに、AKL5 inhibitor IIがもっとも強くUCP1遺伝子の発現を誘導し、LY2157299がそれに次ぐことがわかる。【０１７１】
実施例１７(図17）
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（human dermal fibroblasts; HDFs）を通常培地（10% FBS を添加したDulbecco's modified minimum essential medium; DMEM）に縣濁した。これを 3×104 cells/well の濃度で12-well plate に播種し、5% CO2/95% humidified air、37℃で培養を開始した（Day -1）。コントロール（Ctrl）群は、翌日（Day 0）培養上清を吸引除去し、2 日に1 度培地をフレッシュなものに置換しながら、Day 14まで通常培地で培養した。コントロール（Ctrl）群以外の群は、Day 0に培養上清を吸引除去し、ALK5 inhibitor II（4μM）及びLY2157299（8μM）のいずれかの化合物を添加した脂肪細胞誘導培地を、1 mL/well 加えた。【０１７２】
脂肪細胞誘導培地は、1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine（IBMX）、0.5 μM dexamethason、1 μg/mL Insulin および 10% FBSを添加したDMEMである。
2 日に1 度、培地をフレッシュなものに置換してDay 9まで培養した。その後、Day 9 − Day 14は、ALK5 inhibitor IIとLY215799のいずれの化合物も含まない脂肪細胞誘導培地で培養した。Day 14 に、すべての群のwellから培地を吸引除去し、PBS（−）で洗浄後、細胞からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、UCP-1遺伝子、CIDEA遺伝子、KCNK3遺伝子またはβ アクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を混和した。AB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。UCP1 遺伝子のmRNA レベルをβアクチン遺伝子ｍRNAに対する比として定量し、通常培地で培養した線維芽細胞の値を１として算出した。【０１７３】
結果を図17に示す。ALK5 inhibitor II、LY2157299、のいずれかを8日間添加して培養することにより、線維芽細胞がUCP1遺伝子、CIDEA遺伝子及びKCNK3遺伝子発現がする褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。とくに、AKL5 inhibitor IIがより強くUCP1遺伝子の発現を誘導したことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月26日(2017.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の分化した体細胞を培地中、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤の存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法であって、前記培地が、甲状腺ホルモン及びＰＰＡＲγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地である方法。
【請求項２】
哺乳動物の分化した体細胞を培地中、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤及びフォルスコリンの存在下に培養して前記体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせることを特徴とする、褐色脂肪細胞を調製する方法。
【請求項３】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤及びフォルスコリンを含む、分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートさせるための誘導剤。
【請求項５】
ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤、フォルスコリン、及び培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。
【請求項６】
ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤、並びに、甲状腺ホルモン及びＰＰＡＲγアゴニストを添加した脂肪細胞誘導培地を含む分化した体細胞を褐色脂肪細胞にコンヴァートするためのキット。
【請求項７】
肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、請求項１〜３、１０及び１１のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
【請求項８】
請求項１〜３、１０及び１１のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を用いた、肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
【請求項９】
請求項１〜３、１０及び１１のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
【請求項１０】
ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤が、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、ＳＢ４３１５４１及びＬＹ２１５７２９９から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＦβ／ＳＭＡＤパスウェイ阻害剤が、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、ＳＢ４３１５４１及びＬＹ２１５７２９９から選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
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