(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電線状分子の移動を制御するためのシステムであって、
シス空間とトランス空間との間に位置する基板と、
前記荷電線状分子の少なくとも一部が前記シス空間から前記トランス空間へ通過可能な、前記基板におけるナノ細孔と、
前記荷電線状分子の第１端部が直接的または間接的に付着される、前記シス空間に配置されたスキャンプレートと、
前記基板および前記スキャンプレートをナノメートルまたはサブナノメートル精度で移動させることができるように、前記基板と前記スキャンプレートとの間の距離を制御するアクチュエータと、
前記荷電線状分子の第２端部を誘導して前記ナノ細孔の中に入るようにするために、前記シス空間と前記トランス空間との間にバイアス電圧を印加するためのバイアス源と、
直接的または間接的に、その第１端部で前記荷電線状分子の前記第１端部に付着され、その第２端部で前記スキャンプレートに付着される可撓リンカ分子であって、（ａ）前記可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成である、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択され、（ｂ）前記可撓リンカ分子の長さは５μｍから１０００μｍである可撓リンカ分子と、
を備えるシステム。
【請求項２】
前記荷電線状分子が前記スキャンプレートと共に移動できるように、前記荷電線状分子の前記スキャンプレートへの付着を助ける付着システムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記基板は、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、複数の前記ナノ細孔の各々は、前記スキャンプレートの表面から実質的に等距離である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ナノ細孔は、生体細孔もしくは合成細孔、または、それらの組み合わせを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記生体細孔は、α‐ヘモリシン細孔、ＭｓｐＡ細孔、ＣｓｇＧ細孔、それらの修飾バージョン、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記合成細孔は、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、窒化ホウ素（ＢＮ）、グラフェン、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）もしくはポリマー、または、それらの混成物からできている、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記付着システムは、共有結合または非共有結合のいずれかであり、可逆的または非可逆的のいずれかである化学結合を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項８】
前記化学結合は、ビオチン‐ストレプトアビジン結合、アミド結合、リン酸ジエステル結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン結合、アルデヒド結合、水素結合、疎水結合、および、それらの組み合わせを含む群から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記付着システムは、前記荷電線状分子の前記第１端部に付着される磁気ビーズを含み、前記磁気ビーズは、（ａ）常磁性、（ｂ）超常磁性、（ｃ）強磁性、または（ｄ）反磁性の材料のうちの１つからできている、請求項２に記載のシステム。
【請求項１０】
前記システムは、電磁石、調節可能な永久磁石、一組の磁石、または、それらの組み合わせを含む制御可能磁石をさらに備え、前記制御可能磁石は、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに向かって引き付け、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに接した状態で保持する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記付着システムは、前記可撓リンカ分子を含み、前記可撓リンカ分子は、一端で前記荷電線状分子の前記第１端部に付着し、他端で前記スキャンプレートに付着する、請求項２に記載のシステム。
【請求項１２】
前記可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と同一種類の分子である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記付着システムはさらに、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置されるリンカノードを含み、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビーズ、または、それらの組み合わせである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と前記磁気ビーズとの間に配置される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１６】
前記可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と同一種類の分子である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記付着システムはさらに、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置されるリンカノードを含み、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子、または、非磁気ビーズ、または、それらの組み合わせである、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記システムは、前記荷電線状分子が前記ナノ細孔を通るとき、前記荷電線状分子の個々の基本単位の種類または特性を決定するための検出器をさらに備え、前記荷電線状分子の前記基本単位は、イオン電流阻害に与える影響、または、レコグニショントンネリング、または、電界効果トランジスタ、または、他の塩基検知方法、または、それらの組み合わせによって検出できる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記システムは、前記スキャンプレートの面上に付着または微細加工されたマイクロピラーをさらに備え、前記マイクロピラーは、前記荷電線状分子の前記第１端部の付着を可能にする尖端または平底端のいずれかを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記マイクロピラーは、前記基板の面上のナノ細孔のアレイと一致するように横方向に配置されている、前記スキャンプレートの面上のマイクロピラーのアレイである、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記アクチュエータは、基本単位の正確なシーケンシングを可能にする安定した速度で、前記荷電線状分子を前記ナノ細孔から引き出すか、または、前記ナノ細孔に挿入できるように、前記スキャンプレートと前記基板との間の距離を制御する高精度直線運動ステージを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記速度は、基本単位あたり約０．５ｍｓか、またはより遅い、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記速度は、基本単位あたり約３ｍｓから約２０ｍｓである、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記高精度直線運動ステージは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって駆動される直線運動ステージを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
前記アクチュエータは、前記スキャンプレートまたは前記基板をナノメートル精度またはサブナノメートル精度で移動させることを可能にする機械的減速によって前記スキャンプレートまたは前記基板に連結された粗精度アクチュエータを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルのサーボモータを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記システムは、シーケンシング前の位置調節のために、物体を横方向および／または縦方向に移動させる前記スキャンプレートまたは前記基板に連結されるマイクロメートル精度の調節ステージをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項２９】
複数の荷電線状分子が前記スキャンプレートにランダムに付着している、請求項１に記載のシステム。
【請求項３０】
複数の荷電線状分子が、前記スキャンプレートの面上のパターンのある領域に付着し、前記パターンのある領域における前記複数の荷電線状分子は、前記基板の面上の複数のナノ細孔と横方向に整列される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３１】
前記磁気ビーズを前記スキャンプレートから除去する副調節可能磁石をさらに備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、前記核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
荷電線状分子の移動を制御するための方法であって、
実質的に平行となるように、および、互いに横方向に整列するように配置されたスキャンプレートおよび基板プレートを設ける段階と、
直接的または間接的に、前記荷電線状分子の第１端部を前記スキャンプレートに付着させる段階と、
調節可能な機械的装置によって、前記荷電線状分子を前記基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階と、
電気力によって、前記荷電線状分子の第２端部を前記基板プレートにおける前記ナノ細孔へ誘導する段階と、
前記基板プレートおよび前記スキャンプレートをナノメートルまたはサブナノメートル精度で移動させることができるように、前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を調節することによって、前記荷電線状分子に前記ナノ細孔を通過させる段階と、
シーケンシング処理中に前記電気力を調節することによって、前記荷電線状分子における分子内張力を維持する段階と、
可撓リンカ分子を、直接的または間接的に、その第１端部で前記荷電線状分子の前記第１端部に付着させ、その第２端部で前記スキャンプレートに付着させる段階と
を備え、
（ａ）前記可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成である、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択され、（ｂ）前記可撓リンカ分子の長さは５μｍから１０００μｍである、方法。
【請求項３４】
前記調節可能な機械的装置は、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルの精度を有する、単一軸または複数軸の直線運動ステージを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を調節する段階は、アクチュエータを用いて前記スキャンプレートおよび／または前記基板プレートを移動させる段階を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記アクチュエータは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって駆動される直線運動ステージを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アクチュエータは、前記スキャンプレートまたは前記基板プレートのナノメートルまたはサブナノメートル精度の移動を提供する機械的減速によって前記スキャンプレートまたは前記基板プレートに連結された粗精度アクチュエータを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートル精度のサーボモータを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気力は、前記基板プレートにバイアス電圧を印加して電流が前記ナノ細孔を通ることを可能にし、さらに、前記荷電線状分子を引いて前記ナノ細孔を通過させる電気バイアス装置によって実現される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記可撓リンカ分子が前記荷電線状分子と前記スキャンプレートとの間に配置される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
リンカノードが、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置され、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害し、前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビーズ、または、それらの一部、または、それらの組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記荷電線状分子の前記第１端部を磁気ビーズに付着させる段階であって、前記磁気ビーズは、超常磁性ビーズ、常磁性ビーズ、強磁性ビーズおよび反磁性ビーズから成る群から選択される、段階と、
前記電気力が前記荷電線状分子の前記ナノ細孔への係合を維持している間、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに向かって引き付けるための磁場を印加することによって、前記荷電線状分子を前記ナノ細孔と整列させる段階であって、前記磁場は、電磁石、または、調節可能な永久磁石、または、一組の磁石、または、それらの組み合わせに由来し、前記磁気ビーズは、前記ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列した状態で、前記スキャンプレートの表面に接触し、および、前記磁場によって前記スキャンプレートにしっかりと保持される結果、前記磁気ビーズおよび前記荷電線状分子が実質的に前記スキャンプレートと共に移動する、段階と
をさらに備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記可撓リンカ分子が、前記荷電線状分子と前記磁気ビーズとの間に配置される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
リンカノードが、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置され、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害し、前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、非磁気粒子／ビード、または、それらの組み合わせであり、
前記荷電線状分子を前記基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階は、さらに、
前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を、前記可撓リンカ分子の長さより大きくなるように設定する段階と、
前記磁気ビーズが受ける磁力が、前記磁気ビーズを持ち上げるのに十分であるが、前記リンカノードを実質的に持ち上げるのに十分でないように、磁場を印加する段階であって、前記リンカノードは、前記電気力によって、前記ナノ細孔に係合される、段階と、
前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を、前記可撓リンカ分子の長さより小さくなるように低減する段階であって、前記磁気ビーズは、前記スキャンプレートに接触し、前記ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列するように前記スキャンプレートによって保持され、結果として、前記磁気ビーズ、前記可撓リンカ分子および前記荷電線状分子の間で実質的に直交する整列が生じる、段階と
を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記荷電線状分子は、前記スキャンプレートの面上にランダムに分布し、直接的または間接的に付着する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
複数の前記荷電線状分子は、前記スキャンプレートの面上のパターンのある領域に分布し、直接的に付着するか、または間接的に付着し、前記スキャンプレートの面上の前記パターンのある領域の複数の前記荷電線状分子は、前記基板プレートの面上の複数の前記ナノ細孔と実質的に横方向に整列される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
前記基板プレートは、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、各ナノ細孔は、前記スキャンプレートの表面から実質的に等距離にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
前記スキャンプレートは、尖端または平端のいずれかを有する、前記ナノ細孔に面するマイクロピラーを有し、前記荷電線状分子の前記第１端部は、直接的または間接的に前記マイクロピラーに付着する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
前記スキャンプレートは、前記基板プレートの面上のナノ細孔のアレイと一致するマイクロピラーのアレイを有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、前記核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［技術分野］
本開示は一般に、ナノ細孔を通る、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）およびタンパク質、ならびに他の生体分子などの分子を検出、特性評価および／またはシーケンシングできるように、それらの移動を制御する方法に関する。
【０００２】
４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社が初の第２世代ＤＮＡシーケンシングシステムを２００５年に発売して以来、ＤＮＡシーケンシングは、もっとも注目を集める技術の１つとなり、その市場は急速に成長している。第２世代ＤＮＡシーケンシングの主な特徴は、大規模な並列シーケンシング能力であり、スループットが非常に高く、読み取り長が短い。それは第１世代技術、すなわちサンガー法より、はるかに速く、かつ、より安価である。しかしながら、読み取り長が短いため、デノボアセンブリ、全ゲノムフェージングおよび構造変異体解析が非常に困難であり、その能力は、反復配列またはヘテロ接合配列を有する複雑なＤＮＡ領域の解明に制限される。また、読み取り長が短いため、メタゲノミクスのプロジェクトにおける全ＲＮＡ転写物または一部の遺伝子配列のシーケンシングのような計算は困難または不可能である。ＤＮＡシーケンシングの重要な将来の応用は、臨床診断である。臨床診断では、より一層高速で、より安価で、より正確なシーケンシング技術が必要とされている。長い読み取り長（１０００塩基よりはるかに長い）、短い実行時間（ゲノムあたり１時間未満）、少ない費用（ゲノムあたり３００ドル未満）を可能にする新しいＤＮＡシーケンシング技術を発見することに、大きな関心がもたれている。ナノ細孔を利用するＤＮＡシーケンシング技術は、上記の要件を満たすことができる可能性がある、もっとも有望な第３世代の技術である。
【０００３】
ナノ細孔シーケンシングの概念は、α‐ヘモリシンの細孔を使用する、１９９６年のＪｏｈｎ  Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌの研究に基づいて発展した。α‐ヘモリシン細孔は、直径が１．５ｎｍであり、もっとも狭い場所でも一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が通れるほど十分に大きいが、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）にとっては小さすぎる。イオン緩衝液の２つのプールの間の膜の中に細孔が配置され、バイアス電圧が膜に印加される場合、細孔を通るイオン電流が検出されるであろう。ｓｓＤＮＡが細孔を通るとき、イオン電流は部分的に阻害されるであろう。阻害の大きさは、種々のＤＮＡ塩基ごとに特徴がある。ｓｓＤＮＡが細孔を通るときにイオン電流阻害を測定することにより、塩基をシーケンシングすることができる。同一の原理が、ＲＮＡ、ポリペプチド（アミノ酸）または他の線状分子の配列を決定するために適用できる。レコグニショントンネリング（Ｌｉｎｄｓａｙ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２００８，２０１６）およびナノワイヤＦＥＴ（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）など、他のナノ細孔ＤＮＡ塩基検知方法も開発中である。
【０００４】
ナノ細孔を使用するＤＮＡシーケンシングについて記載した最初の特許は、２００１年にＡｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌによって公開された。それ以来、学術的研究所および産業上の研究開発組織の両方から、大きな関心がもたれている。ＤＮＡシーケンシングに使用できるナノ細孔には、α‐ヘモリシン細孔（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ａｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｓｔｏｄｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）、ＭｓｐＡ（マイコバクテリウムスメグマチスポリンＡ）細孔（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，Ｐａｖｌｅｎｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、およびＣｓｇＧ細孔（カーリー固有遺伝子Ｇ）（Ｇｏｙａｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）などの、脂質二重膜上に保持されている生体（タンパク質）細孔、ならびに、固相ナノ細孔およびグラフェンナノ細孔（Ｗａｎｕｎｕ，２０１２）などの合成ナノ細孔が含まれる。ナノ細孔を使用するＤＮＡシーケンシングについての、現在までのもっとも困難な問題は、ＤＮＡ分子は塩基あたり約１μｓという非常に速い速度でナノ細孔を通るため、信頼性のある塩基検知を単一塩基の分解能で行うことが非常に困難または不可能であるという点である。ＤＮＡのシーケンシングを成功させるには、塩基あたり約１ｍｓ以下となるまで、ＤＮＡ転位速度を少なくとも１０００倍遅くする必要がある。現在の塩基検知技術では、信頼できる単一塩基分解能のために好ましい速度範囲は、塩基あたり３ｍｓから１０ｍｓ秒である。
【０００５】
ナノ細孔シーケンシングの概念が１９９０年代に登場して以来、ＤＮＡ転位速度を制御する、または遅くするためのさまざまな方法が提案されてきた。これらの方法は、以下の６つのカテゴリに分類できる。（１）分子モータ（ヘリカーゼ、ポリメラーゼなど）などの生物学的方法（Ａｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）およびｄｓＤＮＡヘアピンまたは相補的プローブＤＮＡ法（Ｓａｕｅｒ−Ｂｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｗａｎｕｎｕ  ２０１２）、（２）バッファ温度を下げる（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｆｏｌｏｇｅａ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）、塩化カリウムではなく塩化リチウム塩を使用する（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、または、バッファ粘度を増加させる（Ｆｏｌｏｇｅａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）などのバッファ調整法、（３）ナノ細孔表面電荷修飾またはナノ細孔へのポリマー結合（Ｗａｎｕｎｕ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ，２００７，Ｋｅｙｓｅｒ，２０１１）などの、（合成ナノ細孔のための）化学的方法、（４）ＤＮＡトランジスタ技術（Ｐｏｌｏｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２００７，２０１１）または横電場による引きずり（Ｔｓｕｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）などの電子的方法、（５）光学的ピンセット（Ｋｅｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｋｅｙｓｅｒ  ２０１１）、磁気ピンセット（Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎｇ，２００９）、および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）（Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ，２００５）などの機械的方法、（６）圧電層を合成ナノ細孔組織に統合する（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）などの電気機械的方法。これらすべての方法は、ＤＮＡの移動を制御する上で問題があるか、または、製造および計測が困難であるかのいずれかである。分子モータ法は、容易に制御できない、特定の酵素に固有の処理率の速度でＤＮＡを移動させる。これは生体細孔のみに適しており、酵素を各細孔に付着させるには、複雑な生化学的手順が必要である。ｄｓＤＮＡヘアピン／相補的プローブ法では、速度を有効に制御することができず、ＤＮＡの移動が散発的に遅くなり、また、サンプル処理に莫大な労力が必要である。バッファ調整法は、ＤＮＡ転位を５倍から１０倍遅くできるだけであり、必要とされる１０００倍には遠く及ばない。化学的方法、および、横電場引きずり法には、何らかの正確なＤＮＡ転位速度制御を実現するための機構が無い。ＤＮＡトランジスタ技術は、合成ナノ細孔内部のＤＮＡ塩基移動をいかにして制御するかについての機構を計算的に実証したが、非常に複雑なナノ細孔構造が必要なので実現が困難であり、製造および塩基検知の統合は非常に困難である。光学的ピンセットおよび磁気ピンセット、ならびにＡＦＭ法は、単一のＤＮＡ分子によるナノ細孔の通過を制御できる。これは学術的研究には良いが、大規模かつ安価な高スループットのＤＮＡシーケンシングおよび他の商業的応用には決して十分でない。Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）によって提案された電気機械的方法は、合成ナノ細孔組織における圧電層を使用して、ナノ細孔内部のナノ細孔のサイズを制御することにより、ＤＮＡ転位を遅くすることができる。しかしながら、ＤＮＡの移動をいかにして高精度で制御するかについての機構は提供されていない。
【０００６】
したがって、ナノ細孔を通るＤＮＡおよび他のポリマーの移動を制御するための改善されたシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、基本単位のシーケンシングを可能にするのに適切な速度で、かつ、十分な精度で、ナノ細孔を通る分子の転位速度を制御するための方法およびシステムに関する。本開示は、基本単位のシーケンシング、および／または、天然および合成両方の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および他の荷電生体分子、または、荷電標識された非荷電生体分子の分子構造解析に幅広く適用される。合成非生体分子も解析され得る。
【０００８】
一実施形態において、標的分子（例えば、シーケンシング対象のｓｓＤＮＡ断片）が、適切に選択された長さおよび組成を有する同一種類のリンカ分子（例えば、一本鎖λ‐ＤＮＡまたは合成オリゴＤＮＡ）を介して磁気ビードに付着される。荷電標的分子は、ナノ細孔を通るには大きすぎる磁気ビードによってその進行が妨害されるまで、電気力によって引かれてナノ細孔を通る。磁場を印加することにより、磁気ビードおよび付着したリンカをナノ細孔から離し、ナノ細孔の近くに配置された、ナノ細孔の軸に垂直なスキャンプレートの表面に向かって引くことができる。次に、磁気ビードは、磁場の強度のみによって、または、化学結合もしくは他の手段によって、スキャンプレートに接した状態で保持される。ＤＮＡおよびリンカは、ナノ細孔の内部で、ＤＮＡ塩基に対して作用する電気力を受けて伸ばされる。分子内張力が増加し、分子内張力と電気力との間で力の平衡状態が確立される。
【０００９】
高精度直線運動ステージを使用してスキャンプレートまたはナノ細孔基板のいずれかを移動させることによって、基本単位のシーケンシングに必要な速度で、標的分子をナノ細孔から引き出すか、または、ナノ細孔内に挿入することができる。標的分子は、ナノ細孔を通って自由に移動せず、むしろ、進行するにつれて、反対方向の力による一定の張力を受けてピンと張られる。標的分子がナノ細孔を通るとき、イオン電流阻害法、レコグニショントンネリング法または他の方法などの好適な塩基検知方法によって、その塩基が検知され、記録される。リンカ分子の一部は、所望される場合、シーケンシングのための較正テンプレートとして使用され得る。単一のナノ細孔または複数のナノ細孔（ナノ細孔アレイ）を用いて、複数の標的分子をシーケンシングすることができる。
【００１０】
本開示のいくつかの実施形態において、リンカ分子は、リンカが標的ＤＮＡに付着する場所に配置されるリンカノードを有し得る。リンカノードは、ナノ細孔へ入ることを防止する分子構造であり、一般に、ナノ細孔の入口より大きく、特定の実施形態において、ナノ細孔入口サイズの少なくとも２倍の大きさである。リンカノードは、巨大タンパク質（抗体、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンなど）、または、巨大ポリマー複合体、または、さらには非磁気ビードであり得る。リンカ分子は、標的分子と同一種類の分子である必要は無く、天然もしくは合成のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、または、セルロース繊維、または、他の可撓線状ポリマーであり得る。標的ＤＮＡが電場を受けてナノ細孔の中に引き込まれるとき、リンカノードはＤＮＡ転位のストッパまたはブレーキとして機能する。このリンカ＋リンカノードの構成があれば、標的分子およびリンカノードが電気力によってナノ細孔になおしっかりと保持されながら、最初に比較的弱い磁場を印加してリンカ分子の一端に付着している磁気ビードを持ち上げることができる。磁気ビードがスキャンプレートに接触する前に、磁気ビードをナノ細孔の上にまっすぐ浮遊させることにより、ビード、リンカ分子および標的分子の完璧な整列が達成され、標的分子の正確なシーケンシングが可能となる。
【００１１】
本開示のいくつかの実施形態において、標的分子は、直接的に、または、リンカ分子を介して、しかし磁気ビード無しでスキャンプレートに付着する。ナノ細孔基板からの距離が１リンカ分子の長さより小さくようにスキャンプレートを配置することにより、標的分子を電場によってナノ細孔の中に引き込むことができる。分子の移動がスキャンプレートへの付着によって妨害されるとき、正確な基本単位の検知のために十分遅い、制御された一定速度で、分子をナノ細孔の外に移動させる、または、ナノ細孔の中に引き戻すことができる。複数の標的分子は、スキャンプレートの横方向に付着させることができる。スキャンプレートおよびナノ細孔基板は、分子をシーケンシングできるように、領域を走査するようなパターンで横方向に動かし、種々の分子をナノ細孔に係合させることができる。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態において、スキャンプレート表面には、標的分子を付着させるためのマイクロスポットまたはパッチのパターンを付けることができ、これらのマイクロパターンは、ナノ細孔アレイチップの面上のナノ細孔に対して高精度で整列されている。各スポットは、ナノ細孔チップの面上の１つのナノ細孔に対応する。各スポットは、複数の標的分子を含み得る。各シーケンシングの実行後、既にシーケンシングが完了した分子は、ナノ細孔から引き出され、スキャンプレートまたはナノ細孔チップは、走査モードで横方向に動くことにより、シーケンシング対象の別の標的分子を整列させてナノ細孔に入れる。このようにして、最終的に、標的分子のすべてまたは大部分をシーケンシングできる。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態において、尖端または平端のいずれかを有するマイクロピラーが、ナノ細孔基板に面するスキャンプレート表面上に付着するか、または、微細加工される。標的分子は、これらのマイクロピラーの端に直接、または、リンカ分子を通して、または、磁気ビードを介して付着する。これらのピラーは、ナノ細孔チップの面上のナノ細孔と整列される。スキャンプレートまたはナノ細孔チッププレートの制御された移動の結果、標的分子がシーケンシングされる。
【００１４】
別の実施形態において、標的分子（例えば、ｓｓＤＮＡ断片）は、適切に選択された長さおよび組成を有する同一種類のリンカ分子（例えば、天然または合成ｓｓＤＮＡ）を介して、磁気ビードに付着する。荷電標的分子は、ナノ細孔を通るには大きすぎる磁気ビードによってその進行が停止されるまで、電気力によって引かれてナノ細孔を通る。磁場を印加することにより、磁気ビードおよび付着したＤＮＡ分子は、ナノ細孔から引き離され、ナノ細孔からの距離がリンカ分子および標的分子を組み合わせた長さより十分に大きい、ナノ細孔の近くに配置された容器壁の表面に向かって引かれる。ビードおよび標的ＤＮＡ分子に作用する力（すなわちナノ細孔の磁場強度および電気力）のバランスを制御するだけで、塩基検知にとって十分に遅い速度でＤＮＡ分子を引き出すことができる。
【００１５】
ＤＮＡが所望の予測可能な速度で移動できるように、ＤＮＡの移動の開始時から、一定の力のバランスを維持することが重要である。これは、磁気ビードがナノ細孔入口の近くにあるか、または、それに接触しているときに磁気ビードに作用する付着力を完全に除去するか、または最低限に抑えることによって実現できる。付着力の主な発生源は、ビード上の電荷に由来する。磁気ビードを非荷電性にすることによって、付着力を大幅に減少させることができ、細孔を通るＤＮＡ分子の比較的円滑な移動を維持できる。ビードが移動するにつれて、標的分子が力を受けて伸ばされ、分子内張力が増加するであろう。標的分子が、制御された速度でナノ細孔を通過するにつれて、力の平衡状態が確立され、維持される。したがって、標的分子は、ナノ細孔を通って自由に移動せず、むしろ、進行するにつれて、反対方向の力による張力を受けてピンと張られる。標的分子がナノ細孔を通るとき、その塩基が好適な塩基検知方法によって検知され、記録される。標的分子のシーケンシングのキャリブレーションとして、同一種類のリンカ分子が使用され得る。リンカ分子の別の機能は、ＤＮＡの移動の開始時に発生する可能性がある何らかの揺らぎを低減または抑制できるように、緩衝領域を提供することである。単一のナノ細孔、または、複数のナノ細孔を用いて、複数の標的分子をシーケンシングできる。
【００１６】
本開示のいくつかの実施形態において、磁力によって制御されるＤＮＡの移動のために、リンカ分子と標的分子との間の接続部として、リンカノードが導入される。リンカノードは一般に、ナノ細孔入口より大きく、いくつかの実施形態において、ナノ細孔入口より少なくとも２倍大きく、それにより、ＤＮＡがバイアス電圧を受けてナノ細孔を通って転位するときに、ストッパまたはブレーキとして機能する。このとき、リンカノードはナノ細孔にあるので、非荷電である必要があるが、一方、磁気ビードは非荷電である必要はない。リンカノードは、（抗体、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンなどの）巨大タンパク質であり得るか、または、ナノ細孔入口より大きい任意のポリマー複合体、または、さらには非磁気ビードであり得る。
【００１７】
この開示の別の実施形態において、標的分子は、機械的に制御された移動、または、磁力で制御された移動のうちのいずれかの手法において、リンカ分子を使用することなく、磁気ビードに、または、直接スキャンプレートに付着し得る。
【００１８】
一実施形態は、荷電線状分子の移動を制御するためのシステムであって、シス空間とトランス空間との間に位置する基板と、荷電線状分子の少なくとも一部がシス空間からトランス空間へ通過可能な、基板におけるナノ細孔と、荷電線状分子の第１端部が直接的または間接的に付着される、シス空間に配置されたスキャンプレートと、基板およびスキャンプレートをナノメートル精度で移動させることができるように、その間の距離を制御するためのアクチュエータと、荷電線状分子の第２端部がナノ細孔の中に入るように誘導するために、シス空間とトランス空間との間にバイアス電圧を印加するためのバイアス源とを備えるシステムである。別の実施形態において、システムは、荷電線状分子がスキャンプレートと共に移動することができるように、荷電線状分子のスキャンプレートへの付着を助ける付着システムをさらに備える。別の実施形態において、基板は、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、各ナノ細孔は、スキャンプレートの表面から実質的に等距離である。別の実施形態において、ナノ細孔は、生体細孔もしくは合成細孔、または、それらの組み合わせを含む。一実施形態において、生体細孔は、α‐ヘモリシン細孔、ＭｓｐＡ細孔、ＣｓｇＧ細孔、それらの修飾バージョン、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、合成細孔は、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、窒化ホウ素（ＢＮ）、グラフェン、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）もしくはポリマー、または、それらの混成物からできている。一実施形態において、付着システムは、共有結合もしくは非共有結合のいずれかであり、かつ、可逆的または非可逆的のいずれかである化学結合を含む。一実施形態において、化学結合は、ビオチン‐ストレプトアビジン結合、アミド結合、リン酸ジエステル結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン結合、アルデヒド結合、水素結合、疎水結合、および、それらの組み合わせを含む群から選択される。一実施形態において、付着システムは、荷電線状分子の第１端部に付着される磁気ビードを含み、磁気ビードは、（ａ）常磁性、（ｂ）超常磁性、（ｃ）強磁性、または（ｄ）反磁性の材料のうちの１つからできている。一実施形態において、制御可能磁石は、電磁石、調節可能な永久磁石、一組の磁石、または、それらの組み合わせを含み、制御可能磁石は、磁気ビードをスキャンプレートに向かって引き付け、磁気ビードをスキャンプレートに接した状態で保持するように構成されている。一実施形態において、付着システムは、可撓リンカ分子を含み、可撓リンカ分子は、一端で荷電線状分子の第１端部に付着し、他端でスキャンプレートに付着する。一実施形態において、可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成のいずれかである、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、可撓リンカ分子は、荷電線状分子と同一種類の分子である。一実施形態において、付着システムはさらに、可撓リンカ分子と荷電線状分子との間に配置されるリン���ノードを含み、リンカノードは、リンカ分子がナノ細孔に入ることを阻害するように構成されている。一実施形態において、リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビード、または、それらの組み合わせである。一実施形態において、可撓リンカ分子は、荷電線状分子と磁気ビードとの間に配置される。一実施形態において、可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成のいずれかである、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、可撓リンカ分子は、荷電線状分子と同一種類の分子である。一実施形態において、付着システムはさらに、可撓リンカ分子と荷電線状分子との間に配置されるリンカノードを含み、リンカノードは、リンカ分子がナノ細孔に入ることを阻害するように構成されている。一実施形態において、リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子、または、非磁気ビード、または、それらの組み合わせである。一実施形態において、システムは、荷電線状分子がナノ細孔を通るとき、荷電線状分子の個々の基本単位の種類または特性を決定するための検出器を備え、荷電線状分子の基本単位は、イオン電流阻害に与える影響、または、レコグニショントンネリング、または、電界効果トランジスタ、または、他の塩基検知方法、または、それらの組み合わせによって検出できる。一実施形態において、システムは、スキャンプレートの面上に付着または微細加工されたマイクロピラーを備え、マイクロピラーは、荷電線状分子の第１端部の付着を可能にするように構成されている尖端または平底端のいずれかを有する。一実施形態において、マイクロピラーは、基板の面上のナノ細孔のアレイと一致するように横方向に配置されている、スキャンプレートの面上のマイクロピラーのアレイである。一実施形態において、アクチュエータは、基本単位の正確なシーケンシングを可能にする安定した速度で、荷電線状分子をナノ細孔から引き出すか、または、ナノ細孔に挿入できるように、スキャンプレートと基板との間の距離を制御するように構成されている高精度直線運動ステージを含む。一実施形態において、速度は基本単位あたり約０．５ｍｓか、または、それより遅い。一実施形態において、速度は基本単位あたり約３ｍｓから約２０ｍｓである。一実施形態において、高精度直線運動ステージは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって、駆動される直線運動ステージを含む。一実施形態において、アクチュエータは、スキャンプレートまたは基板をナノメートル精度またはサブナノメートル精度で移動させることを可能にする機械的減速によってスキャンプレートまたは基板に連結された粗精度アクチュエータを含む。一実施形態において、粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルのサーボモータを含む。一実施形態において、システム���、シーケンシング前の位置調節のために、物体を横方向および／または縦方向に移動させるように構成されているスキャンプレートまたは基板に連結されるマイクロメートル精度の調節ステージをさらに備える。一実施形態において、複数の荷電線状分子が、スキャンプレートにランダムに付着される。一実施形態において、複数の荷電線状分子が、スキャンプレートの面上のパターンのある領域に付着し、パターンのある領域における複数の荷電線状分子は、基板の面上の複数のナノ細孔と横方向に整列される。一実施形態において、システムは、磁気ビードをスキャンプレートから除去するように構成されている副調節可能磁石をさらに備える。一実施形態において、荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。
【００１９】
一実施形態は、荷電線状分子の移動を制御するための方法であって、実質的に平行となるように、および、互いに横方向に整列するように配置されたスキャンプレートおよび基板プレートを設ける段階と、直接的または間接的に、荷電線状分子の第１端部をスキャンプレートに付着させる段階と、調節可能な機械的装置によって、荷電線状分子を基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階と、電気力によって、荷電線状分子の第２端部を基板プレートにおけるナノ細孔へ誘導する段階と、スキャンプレートと基板プレートとの間の距離を調節することによって、荷電線状分子にナノ細孔を通過させる段階と、シーケンシング処理中に電気力を調節することによって、荷電線状分子における分子内張力を維持する段階とを備える方法である。一実施形態において、調節可能な機械的装置は、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルの精度を有する、単一軸または複数軸の直線運動ステージを有する。一実施形態において、スキャンプレートと基板プレートとの間の距離を調節する段階は、アクチュエータを用いてスキャンプレートおよび／または基板プレートを移動させる段階を含む。一実施形態において、アクチュエータは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって駆動される直線運動ステージを含む。一実施形態において、アクチュエータは、スキャンプレートまたは基板プレートのナノメートルまたはサブナノメートル精度の移動を提供する機械的減速によってスキャンプレートまたは基板に連結された粗精度アクチュエータを含む。一実施形態において、粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートル精度のサーボモータを含む。一実施形態において、電気力は、電流がナノ細孔を通ることを可能にするべく基板プレートにバイアス電圧を印加するように構成され、さらに、荷電線状分子を引いてナノ細孔を通過させるように構成されている電気バイアス装置によって実現される。一実施形態において、可撓リンカ分子が荷電線状分子とスキャンプレートとの間に配置され、可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成のいずれかである、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、リンカノードが、リンカ分子と荷電線状分子との間に配置され、リンカノードは、リンカ分子がナノ細孔に入ることを阻害するように構成され、リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビード、または、それらの一部、または、それらの組み合わせである。一実施形態において、方法は、荷電線状分子の第１端部を磁気ビードに付着させる段階であって、磁気ビードは、超常磁性ビード、常磁性ビード、強磁性ビードおよび反磁性ビードから成る群から選択される、段階と、電気力が荷電線状分子のナノ細孔への係合を維持している間、磁気ビードをスキャンプレートに向かって引き付けるための磁場を印加することによって、荷電線状分子をナノ細孔と整列させる段階であって、磁場は、電磁石、または、調節可能な永久磁石、または、一組の磁石、または、それらの組み合わせに由来し、磁気ビードは、ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列した状態で、スキャンプレートの表面に接触し、および、磁場によってスキャンプレートにしっかりと保持される結果、磁気ビードおよび荷電線状分子が実質的にスキャンプレートと共に移動する、段階とをさらに備える。一実施形態において、可撓リンカ分子が、荷電線状分子と磁気ビードとの間に配置され、可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成のいずれである、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、リンカノードが、リンカ分子と荷電線状分子との間に配置され、リンカノードは、リンカ分子がナノ細孔に入ることを阻害するように構成され、リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、非磁気粒子／ビード、または、それらの組み合わせであり、荷電線状分子を基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階は、さらに、スキャンプレートと基板プレートとの間の距離を、リンカ分子の長さより大きくなるように設定する段階と、磁気ビードに対する磁力が、磁気ビードを持ち上げるのに十分であるが、リンカノードを実質的に持ち上げるのに十分でないように、磁場を印加する段階であって、リンカノードは、電気力によって、ナノ細孔に係合される、段階と、スキャンプレートと基板プレートとの間の距離を、リンカ分子の長さより小さくなるように低減する段階であって、磁気ビードは、スキャンプレートに接触し、ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列するようにスキャンプレートによって保持され、結果として、ビード、リンカ分子および荷電線状分子の間で実質的に直交する整列が生じる、段階とを有する。一実施形態において、荷電線状分子は、スキャンプレートの面上にランダムに分布し、直接的または間接的に付着する。一実施形態において、複数の荷電線状分子は、スキャンプレートの面上のパターンのある領域に分布し、直接的に付着するか、または間接的に付着し、スキャンプレートの面上のパターンのある領域における複数の荷電線状分子は、基板プレートの面上の複数のナノ細孔と実質的に横方向に整列される。一実施形態において、基板プレートは、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、各ナノ細孔は、スキャンプレートの表面から実質的に等距離にある。一実施形態において、スキャンプレートは、尖端または平端のいずれかを有する、ナノ細孔に面するマイクロピラーを有し、荷電線状分子の第１端部は、直接的または間接的にマイクロピラーに付着する。一実施形態において、スキャンプレートは、基板プレートの面上のナノ細孔のアレイと一致するマイクロピラーのアレイを有する。一実施形態において、荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本開示の簡略化された実装を示す。リンカ分子に付着したＤＮＡ断片がナノ細孔を通り、ナノ細孔チップとスキャンプレートとの間の間隙を跨いでいる。
【図２】スキャンプレートおよびナノ細孔チップが圧縮要素によって押し隔てられているサブアセンブリを示す。スキャンプレートおよびナノ細孔チップを押して互いに近づけることができる高精度解析アクチュエータを含む剛性フレーム内部のサブアセンブリが示されている。
【図３】別個のスプリングおよびシールを有する代替的な動的チャンバサブアセンブリを示す。
【図４】粗調節ステージおよび別個の高精度解析ステージを含む高精度ステージ、ならびに剛性フレームコンポーネントを使用してスキャンプレートおよびナノ細孔チップを共に剛性的に接続するためのオプションを示す。
【図５】ナノ細孔の種類、すなわち合成ナノ細孔および生体ナノ細孔を示す。
【図６】制限開口部および一体型塩基検知電子部品を有するナノ細孔設計を示す。制限開口部は、１つのＤＮＡ分子だけが細孔に入ることを可能にし、２つまたは複数のＤＮＡコピーが同時に細孔に入ることを防止する。制限開口部は、サイズを制限する構造であるか、または、化学的制限、または、電気的もしくは磁気的制限のいずれか、またはそれらの組み合わせによって形成され得る。
【図７】種々の細孔アレイまたはナノ細孔チップ構成を示す。
【図８】スキャンプレート表面へのＤＮＡの付着を示す。（ａ）はランダム分布であり、（ｂ）はパターンのある付着領域である。
【図９】マイクロピラーに対するＤＮＡの付着を示す。（ａ）は尖端マイクロピラーであり、可撓リンカ分子を使用した、ＤＮＡと細孔との位置ずれの補償を示す。（ｂ）は平底マイクロピラーであり、複数のＤＮＡの付着を使用して、横方向の位置ずれを最低限に抑えている。
【図１０】種々のシスおよびトランス電極、ならびにマイクロピラーの配置を示す。
【図１１】区分的反復シーケンシング方式を示す。
【図１２】磁気ビードを用いた、ＤＮＡの自動整列を示す。
【図１３】自動整列のための、ＤＮＡサンプル調製の例を示す。
【図１４】リンカ分子およびリンカノードビードを用いたＤＮＡ‐ナノ細孔の自動整列を示す。
【図１５】ｓｓＤＮＡリンカを用いた、ＤＮＡとナノ細孔との自動整列を示す。
【図１６】平底マイクロピラーを用いた、個々のＤＮＡ‐ナノ細孔の自動整列を示す。
【図１７】リンカ分子として使用される、修飾されたｄｓλ‐ＤＮＡを示す。
【図１８】リンカ分子として使用されるｓｓλ‐ＤＮＡの調製処理を示す。
【図１９】非荷電磁気ビードを作る反応を示す。
【００２１】
【図２０】連結ハブ上の結合部位を制限することによって（ビードがある、または無い）単一リンカ分子に連結された単一コピーのＤＮＡを示す。（ａ）２つの結合部位と単連結リンカ、（ｂ）３つの結合部位と二重連結リンカ、（ｃ）４つの結合部位と三重連結リンカ。
【００２２】
【図２１】磁気ビードを単一のシーケンシングＤＮＡに連結するリンカ分子として使用される二本鎖および一本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）を示す。（ａ）は二価ストレプトアビジン、または、２つの結合部位を有する他のタンパク質、（ｂ）は抗体、または、３つの結合部位を有する他のタンパク質、（ｃ）はストレプトアビジンもしくはニュートラアビジンもしくはアビジン、または、４つの結合部位を有する他のタンパク質を介する。
【図２２】エマルション滴法による、ＤＮＡまたはリンカ分子のビードへの付着を示す。
【図２３】ナノ細孔を通るＤＮＡの移動の磁気制御を示す。
【図２４】ナノ細孔を通る、種々のリンカ分子を有するＤＮＡの移動の磁気制御を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［第１章：ＤＮＡおよび他の生体分子によるナノ細孔の通過の機械的制御］  本開示は、機械的装置によって、または、より具体的には、ナノメートル（ｎｍ）もしくはサブナノメートル（サブｎｍ）の高精度圧電駆動装置または複数の駆動装置の組み合わせによって、ＤＮＡなどの分子によるナノ細孔の通過を高精度で制御する方法を提供する。この方法は、電気力と組み合わせることにより、選択された塩基検知方法に応じた、信頼できる塩基検知にとって十分な速度、または十分に遅い速度で、連続的または段階的にＤＮＡをナノ細孔の中へ、または、ナノ細孔の外へ移動させる。例えば、タンパク質のナノ細孔を使用するイオン電流阻害塩基検知方法は、塩基あたり、少なくとも１ｍｓ（ミリ秒）の検知時間を必要とする。
【００２４】
［基本原理‐力の平衡］
基本原理は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を例として使用して、図１に示されている。ナノ細孔（５００）は、ナノ細孔チップ（５０１）の一部である。スキャンプレート（５１０）は、ナノ細孔チップに対して平行となるように取り付けられる。ナノ細孔チップおよびスキャンプレートの両方は、その離隔距離（５７１）を制御できる解析ステージ（５７０）に連結されている。解析ステージは、好適に選択された自動化高精度直線運動ステージである。ナノ細孔チップは、バッファボリュームを、ナノ細孔の反対側にあるシス（６５０）側およびトランス（６５１）側のバッファボリュームに機械的に分割する。シス側バッファボリューム（ｂｕｆｆｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ）およびトランス側バッファボリュームは、ナノ細孔基板によって流体的および電気的に絶縁され、ナノ細孔の通路のみを通して連通されている。電気バイアス源（５３０）は、ナノ細孔にかかる電圧を維持する。
【００２５】
シーケンシング中、解析されているＤＮＡ分子（６００）は、ナノ細孔を通ることによって、シス側バッファボリュームおよびトランス側バッファボリュームに跨る。ナノ細孔のシス側では、ＤＮＡは、スキャンプレート（５１０）に付着している可撓リンカ分子（６０２）に連結されている。ＤＮＡへのリンカの付着部分（すなわちリンカノード）（６０１）およびスキャンプレートへのリンカの付着部分（６１０）は、後の章でさらに説明される。
【００２６】
ＤＮＡは負に荷電しているので、ナノ細孔内部の強い電場によって、ナノ細孔を通ってトランス側へ引かれる。シス側のＤＮＡが減少したとき、ＤＮＡおよび可撓リンカ分子の両方は、スキャンプレートとナノ細孔との間でピンと張られる。リンカおよびＤＮＡは、張力を受けて幾分伸び、ＤＮＡ塩基は、伸びたＤＮＡの張力が、ＤＮＡ塩基に作用する電気力と一致するまで、ナノ細孔のトランス側への通過を継続する。この平衡張力は、バイアス電圧に依存し、ＤＮＡ塩基の特定の引張間隔に対応する。ナノ細孔およびスキャンプレートが近づくように移動するか、または、遠ざかるように移動するとき、ＤＮＡ内の張力も（わずかに）変化し、その結果、平衡状態に戻るようにＤＮＡが移動する。離隔速度が適切かつ一定であれば、ＤＮＡは、移動しているときに一定の張力を受け続ける。ＤＮＡは、ナノ細孔から引き出され得るか、または、ナノ細孔内に挿入され得るかのいずれかである。したがって、ナノ細孔バイアス電圧の極性または大きさを変更することなく、ＤＮＡをいずれの方向でもシーケンシングできる。
【００２７】
正確なシーケンシングのためには、特定のレベルの張力を維持する必要がある。
・ナノ細孔を通るＤＮＡの進行速度は、張力を受けて伸びているとき、すなわちピンと張っているときに、より良く制御される。
・ＤＮＡが特定のレベルの張力を受けるように維持することにより、ブラウン運動に起因する動きの揺らぎが低減される。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）によれば、ＤＮＡがナノ細孔を自由に通るとき、ブラウン運動の力は、約４ｋＢＴ／ａのオーダーである。ここで、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔはバッファ温度（単位：ケルビン）であり、ａはＤＮＡ塩基対の間隔である。ｓｓＤＮＡの場合、完全に伸びているとき、ａは約０．７ｎｍである。室温（約２２℃）では、ブラウン運動の力は、約２３ｐＮに達し得る。しかしながら、ＤＮＡがナノ細孔に留められている（張力を受けて伸びている）とき（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）、ブラウン運動の力は、ｋＢＴ／Ｌｓのオーダーであり、Ｌｓは、ＤＮＡのクーン長である。ｓｓＤＮＡの場合、Ｌｓは約１．５ｎｍである。したがって、ｓｓＤＮＡが張力を受けて伸びていて、ナノ細孔が横方向の動きを制限しているとき、塩基検知に影響するブラウン運動の力は、約３ｐＮである。正確な塩基検知のためには、ナノ細孔の電気力（＝ＤＮＡ内張力）は、３ｐＮよりはるかに大きい（例えば、１０倍より大きい）必要がある。より大きいほど良いが、ＤＮＡの付着の結合力より小さい必要がある。
【００２８】
［動き制御のオプションおよび考慮事項］
上記のように、ナノ細孔を通るＤＮＡの制御された動きは、ナノ細孔とスキャンプレートとの間の離隔距離（５７１）によって決定される。離隔距離の制御は、それらの要素の間の振動を最低限に抑えることによって、および、十分に高精度な動き制御を有する解析ステージを実装することによって達成される。
【００２９】
振動制御はいくつかの方式で達成される。
・ナノ細孔とスキャンプレートとの間の機械的経路は可能な限り短くする必要がある。小型アセンブリが利用できる。
・ナノ細孔とスキャンプレートとの間の機械的接続は、可能な限り堅い、または、剛性が高い必要がある。このことは、堅い材料から厚みのあるコンポーネントを作ることを意味する。
・機構は、外部の振動およびノイズから絶縁される必要がある。原子間力顕微鏡検査および干渉法において使用されているものと同様の標準的な受動および能動振動防止方法を利用できる。
【００３０】
解析ステージ（５７０）には、いくつかの要件がある。
・その作動装置は、堅い、または、剛性が高い必要がある。上で列挙された振動制御手段を損なってはならない。
・ＤＮＡ塩基検知の場合は、約０．１ｎｍから約１ｎｍのサブナノメートル（サブｎｍ）の分解能、または、基本単位の間隔距離がより大きい分子の場合、１ｎｍから１０ｎｍのナノメートルの分解能など、十分な高精度を有する必要がある。
【００３１】
これらの仕様を満たす機構は、圧電駆動装置（代替的に、圧電ステージ、圧電スタック、圧電アクチュエータ、または、圧電変換器とも呼ばれる）である。圧電装置は、非常に堅く、必要な精度を有し、振動無しで動く。
【００３２】
また、代替的な機構も好適であり得る。いくつかの可能なオプションには、必要な精度を実現するために機械的減速（すなわち、レバレッジ）と組み合わせられた、より精度が低いアクチュエータが含まれる。振動を最低限に抑えることができれば、サーボ駆動アクチュエータが役立つと考えられる。圧電リニアモータも、振動を除去するように制御される場合、役立ち得る。
【００３３】
ステージの動きに必要な精度の程度は、現代の技術で確実に達成できる。ナノメートル精度の圧電駆動装置の例は、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）において見つけることができる。これらは、生体微細構造解析において幅広く使用されている。ＫｉｎｇおよびＧｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ（２００５）は、ＡＦＭの先端部を使用して、長さ１０５ｎｍ、直径５ｎｍのナノチューブをナノ細孔に通せることを実証した。また、約８００ｎｍ／秒の速度で、ナノチューブをナノ細孔の中および外へ移動させ、イオン電流の変化を測定することができた。一本鎖ＤＮＡの単位長が０．７ｎｍであることを考慮すると、この速度は塩基あたり約１ｍｓと同等である。
【００３４】
商業的に入手可能なナノメートル精度の圧電駆動装置の別の例は、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．のＰ−６２ｘシリーズ高精度Ｚステージである。これは、０．１〜１ｎｍの精度を有し、位置決めの正確度は０．０２％、移動範囲は５０〜４００μｍである。荷重および動作周波数が適切であれば、塩基あたり１ｍｓ〜１０ｍｓの速度を容易に実現できる。これは、塩基検知には十分遅く、さらに、高速ＤＮＡシーケンシングには十分速い。例えば、１００ｋｂのＤＮＡ鎖は、塩基あたり５ｍｓのスループットで、約８分でシーケンシングできる。
【００３５】
［動的チャンバ‐機械的経路長を最低限に抑える］
振動を最低限に抑えるための１つの手法は、ナノ細孔およびスキャンプレートを、図２に概略的に描かれているものなどの小型サブアセンブリ（５７９）に組み立てることである。スキャンプレート（５１０）およびナノ細孔チップ（５０１）は、これらを押し離す圧縮要素（５７６）の外向きの弾性力（大きい垂直の矢印で示される）によって、離れた状態で保持される。圧縮要素（５７６）は、チャンバの周囲に液体シールも提供し得て、または、独立した内側のシールが利用され得る。独立のシールが含まれる場合、圧縮要素（５７６）は、ウェーブスプリングまたは湾曲マウントなど、非シーリングタイプであり得る。
【００３６】
示されている配置において、ナノ細孔チップは、スキャンプレートの動きを制限する、および、その弛緩位置（すなわち、ナノ細孔チップからの最大離隔）を決定する剛性フレーム（５７５）に接着されている。サブアセンブリ（５７９）を包む剛性フレーム（５９０）に連結されている解析アクチュエータ（５９１）を使用してサブアセンブリ（５７９）を圧搾することによって、スキャンプレートをナノ細孔に向かって移動させることができる。
【００３７】
この設計は、スキャンプレートとナノ細孔チップとの間の間隙を埋めることによって、機械的経路を短くする。圧縮要素（５７６）は縦方向に圧搾できるが、強いカプラとして機能するように、大きい力が必要となるように選択できる。また、圧縮要素は、異方性が強いことがあり得る。つまり、縦方向に圧搾できるが、横方向のせん断変形に強く抵抗し得る（すなわち、横方向に非常に堅いことがあり得る）ことを意味する。また、圧縮要素は、防振性を有し得るか、または、振動をさらに低減する防振要素と並行して取り付けられ得る。
【００３８】
図２は、スキャンプレートおよびナノ細孔を小型サブアセンブリの中にまとめる主な原理をさらに示している。この概念は、多くの方式で実装できる。
【００３９】
一実施形態は、サブアセンブリが休止状態にあるときにスキャンプレートおよびナノ細孔が共に押されるか、または、互いにほぼ近接するように押され、外部の解析アクチュエータがサブアセンブリに作用しているときに引き離されるサブアセンブリを開示する。この実装は、サブアセンブリが休止状態（すなわち、外部から作用されていない状態）にあるとき、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが実質的に平行であり、かつ、（例えば、マイクロメートルのシムまたはパッチを使用して）予め定められた最小距離だけ離隔されているようにサブアセンブリを製造することを可能にするので、有利であり得る。手順上、これはシーケンシングにとって都合が良い。これについては、後の章で説明する。
【００４０】
このサブアセンブリを作成するときは、「圧縮ひずみ」、または、より一般には、「非弾性変形」を考慮することが重要である。いくつかの実施形態において、復元力（すなわち弾性力）を有するゴムなどの変形材料は、長時間にわたって圧縮または伸長される場合、劣化し得る。「ひずみ」の影響に対処するには、動作状態時は、保管時より、移動要素が平衡から離れているようにサブアセンブリを設計することがもっとも良い。代替的に、スプリングスチールなど、劣化しない材料を選択することもできる。
【００４１】
図２において、スプリングとして、かつ、ナノ細孔の上のシス側バッファを閉じ込めるシールとしても機能する圧縮要素が示されている。これらの機能は、例えば、ナノ細孔チップ（５０１）とスキャンプレート（５１０）との間のチャンバの外周壁を形成する独立の可撓シール、および、チャンバの外側にあり、外方向の力を提供する、別個の圧縮スプリングに分割することができる（図３を参照）。引張スプリングなど、休止位置から外方向に延ばされているときに復元力を提供する要素を使用できる。リーフスプリングなど、休止位置から曲げられているときに復元力を提供する要素を使用できる。張力または屈曲の下で伸びるシールも復元力を提供し得る。図３は、代替的形態の１つを提供する。図３に示されている動的チャンバサブアセンブリは、別個のシーリング要素（５７８）およびスプリング要素（５７７）を有する。これらの機能を分割することによって、圧縮要素における弾性が消失（すなわち、非弾性変形／圧縮ひずみ）するリスク無しで、スプリングの力を実質的に増加させることができる。スキャンプレート（５１０）の底面（５１５）は、スキャンプレートマウント（５１６）の離隔シム（５１７）の底面に対して窪んだ位置にある。これにより、ナノ細孔チップ（５０１）との接触を防止する。特定の実施形態において、各ナノ細孔（５００）は、トランス側で、絶縁されたウェル（５０９）を有する。
【００４２】
図２および図３の両方において、外部の流体容器との間の流体連通またはバッファ交換のための入口および出口は示されていないが、これらは、ナノ細孔チップサブアセンブリまたはスキャンプレートサブアセンブリのいずれかに通路またはポートを追加することによって、容易に実現できる。
【００４３】
［整列およびスキャンのための追加ステージ］
スキャンプレートおよびナノ細孔チップは、ＤＮＡシーケンシングに必要な解析ステージ／解析アクチュエータの動きに加えて、それらの相対位置の調節を必要とし得る。これらの調節は、サンプルローディング、または、解析ステージの動きの延長に必要であり得る。また、これらは、後の章に記載されている、特定のシーケンシングプロトコルを実装するために必要であり得る。
【００４４】
図４は、離隔距離（５７１）を制御する高精度解析ステージ（５７２）に加えて、調節ステージ（５７３）を含めることの基本概念を示す。これらのステージは、スキャンプレート（５１０）およびナノ細孔チップ（５０１）に剛性的に連結されている。これらは各々、共通の剛性フレーム（５７４）に連結されている。この図は、ステージおよびフレームのマウントのオプションを示しているに過ぎないことに留意すべきである。代替的な実施形態は、振動を最低限に抑え得る、スキャンプレートおよびナノ細孔チップのカンチレバーマウント配置を回避し得る機能設計を包含し得る。
【００４５】
調節などに使用される追加のステージは、解析ステージと同一の精度を必ずしも必要としない。動きの精度がより粗い（すなわち、μｍ精度）ステージでも十分であり得て、より長い動きの範囲を提供し得る。これらのステージは、図に示されているように共に実装される必要はない。例えば、Ｘ軸およびＹ軸は、剛性フレーム（５７４）に対してナノ細孔チップ（５０１）を移動させるために実装され得て、Ｚ軸は、剛性フレーム（５７４）に対して解析ステージ（および、したがってスキャンプレート）を移動させるために実装され得る。また、必須なのはスキャンプレートおよびナノ細孔チップの相対的な離隔だけなので、解析ステージは、ナノ細孔チップにおいても実装され得る。
【００４６】
また、図では、ナノ細孔チップ表面が水平方向を向くように示されているが、この慣例は、理解を容易にするために使用されているものであり、要件ではないことに留意すべきである。いくつかの実施形態は、ナノ細孔チップ表面およびスキャンプレートを、鉛直方向に向け、または、狭角が斜角となるように向け、または、さらには反転させ、ステージの動きをそれに応じた方向に向けることがあり得る。
【００４７】
上の段落では、スキャンプレートおよびナノ細孔チップの相対位置の調節における柔軟性を説明した。アセンブリの機械的な堅さ／剛性が損なわれるべきでないことを覚えておくことは重要である。ナノ細孔チップからスキャンプレートまでの機械的経路が延びる原因となり得る不要な調節ステージを取り除くことは可能である。
【００４８】
［位置較正］
時折、整列手順中に、スキャンプレートをナノ細孔チップに近接した位置へ移動させる必要がある。シーケンシング手順を実行する前に、解析ステージまたはアクチュエータの位置を較正する必要があり得て、これにより、最小離隔距離および座標、すなわち、スキャンプレートとナノ細孔チップ表面との間のもっとも近い接点に対応する、位置決めシステムドライバにおける数値位置が分かる。この位置は、数ミクロンの正確度で分かる必要がある。
【００４９】
較正は、いくつかの手段で実行できる。  光学：この種類の較正は、スキャンプレートとナノ細孔との間の間隙を観察および測定することを可能にする窓または光路を必要とする。
【００５０】
電気接触：この種類の較正は、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが、流体で充填されていることを必要とし、スキャンプレートおよびナノ細孔チップの各々の一部が導電性材料からできていることを必要とし得る。これらの導体は、シーケンシング測定に干渉し得る。製造が十分に高精度である場合、１つまたは複数の電気接触点が、シールによってバッファ溶液から隔離された場所に作られ得る。
【００５１】
力：解析ステージが、スキャンプレートおよびナノ細孔チップをゆっくり近づける。高感度の力変換器が、それらがいつ接触するかを決定する。代替的に、スキャンプレートもしくはナノ細孔チップのうちのいずれか、または両方にある、既知の高さの隆起部が最初に接触し、これにより、ＤＮＡプレートまたはナノ細孔チップの起こり得る損傷を回避する。これは、実際的な解決法である。なぜなら、力センサは、機械的アクチュエータに追加することができ、プレートもしくはナノ細孔、またはアクセス要件へのさらなる変更が必要ないからである。力センサの配置は、最低限の力がナノ細孔チップおよびスキャンプレートに加えられるように設計できる。
【００５２】
離隔フィードバック：ナノ細孔チップおよびスキャンプレートは、上記の「隆起部」などの表面接触無しで、サブアセンブリ内で互いに近づくように押されると想定する。これは、図２および図３などの、アセンブリにおける受動スプリング要素によって達成可能であり得る。解析ステージは、サブアセンブリを引き離すように構成され得て、サブアセンブリ内ではナノ細孔チップおよびスキャンプレートが弛緩状態において近づくように押されている。位置フィードバックは、シーケンシング手順のいくつかの段階で、塩基検知から生成され得る。これは、「機能的フィードバック」とみなされ得る。なぜなら、ＤＮＡをナノ細孔から引き出すことを開始するのに必要な解析ステージの位置を示すからである。電気接触または力の測定値も、解析ステージがどのようにサブアセンブリに接触するかについてのフィードバックとして使用され得る。
【００５３】
［センサの形状およびアレイ］
ナノ細孔を通るＤＮＡ転位の高精度機械的制御のための、本開示に記載されている方法は、非限定的な例として、合成ナノ細孔（図５のａ、Ｓｉ３Ｎ４細孔、グラフェン細孔、ＭｏＳ２（二硫化モリブデン）細孔、および、他の任意の固相ナノ細孔など）、または、生体ナノ細孔（図５のｂおよびｃ、α‐ヘモリシン細孔およびＭｓｐＡ細孔など）のいずれか、または、さらには合成細孔および生体細孔の組み合わせなど、任意の種類のナノ細孔に適用される。ナノ細孔は、合成細孔（図６のａおよびｂ）または生体細孔（図６のｃ）のいずれかと一体化した塩基検知装置を有し得る。塩基検知装置は、基板の内部かつナノ細孔の位置（図６のａ）にあるか、または、ナノ細孔の周辺（図６のｂ）のいずれかにある。
【００５４】
本開示において言及されるナノ細孔チップは、単一の細孔もしくは複数の細孔、または、アレイ状の細孔を含み得る。チップ上のナノ細孔のパターンは、正方形、長方形、線状、長い長方形、分割された長方形、円形、楕円形または環状など、任意の形状にすることができる（図７の（ｉ）から（ｉｉｉ）を参照）。好適なパターンは、製造方法、流体フロー、および周辺からの電気接続など、実際的な考慮事項によって決定される。
【００５５】
イオン電流検知などの特定の塩基検知方法は、ナノ細孔を跨ぐ（すなわち、１つの電極がナノ細孔のトランス側、１つの電極がナノ細孔のシス側にある）電気測定を必要とする。複数のナノ細孔について、これらの測定を行うには、各ナノ細孔の少なくとも一方の側における電気接触部を囲むバッファを、他のすべてのナノ細孔から電気的に絶縁する必要があり得る。ナノ細孔のいずれかの側における共通のウェルおよび絶縁されたウェルのこれらの様々な組み合わせを図７に示す。電気的絶縁が塩基検知方法の要件である場合、あり得る配置は、共通のシス側ウェルと、絶縁されたバッファおよび検知電極を含む絶縁されたトランス側ウェルとを有する配置である（図７のｃ）。これは、絶縁されたトランス側ウェルにバッファ溶液が充填され、サンプルＤＮＡが共通のシス側ウェルから導入された状態で製造することができる。
【００５６】
［パターンのあるＤＮＡの付着］
一実施形態において、ＤＮＡ分子は、リンカ分子を用いて、または、リンカ分子を用いず、スキャンプレートに付着させることができる。もっとも単純な手段は、ＤＮＡをスキャンプレート表面上にランダムに付着させ（図８のａ）、次に、反復的シーケンシングのための領域走査パターンで、スキャンプレートまたはナノ細孔基板を横方向に移動させることである。ナノ細孔チップ上のナノ細孔は、バッファウェル製造および電気測定の離隔要件に起因して、近すぎる距離に配置することができない。ナノ細孔は、互いに干渉しないように、互いに対して十分に間隔を空ける必要がある。一実施形態において、ナノ細孔間隔は、１００μｍ、または、さらには１ｍｍを超え、走査ピッチはシーケンシングサイクルあたり数μｍ以下であり、すべての標的ＤＮＡ分子をシーケンシングするためには、ナノ細孔間の空間を走査するのに時間がかかりすぎることがあり得る。この問題に対する解決法として、ナノ細孔アレイチップ上の各ナノ細孔に対応する、例えば数μｍ以下の、非常に小さいパターンのある領域（５１１）のみにＤＮＡ分子を付着させることができる（図８のｂを参照）。このようにして、走査領域が減少し、すべてまたは大部分のＤＮＡ分子のシーケンシングをより短い時間で完了できる。パターンのある付着は、パターンのある領域とナノ細孔との間の高精度の整列（μｍの正確度）を必要とし得る。これは、現代の製造および計測を用いて容易に実行できる。
【００５７】
［マイクロピラー‐必要な場合］
平坦なスキャンプレートの利用は例示的な実施形態であるが、ウェルおよびＤＮＡの付着のいくつかの構成では、マイクロピラーがスキャンプレートの面上に含まれている必要がある（図９および図１０）。マイクロピラー（５１２、５１３）とは、スキャンプレートから突出し、ナノ細孔の間隔および横方向の配置（パターン）と一致する延長部である。これらは、付着によって作られるか、または、スキャンプレートの連続部分として、もしくは、様々な微細加工手段によって形成され得る。マイクロピラーは、ＤＮＡの付着（または接触）場所をスキャンプレートから外方向へ延長する。これはいくつかの理由から行われる。
・マイクロピラーは、ＤＮＡ付着部位の上に間隙を追加することによって、より大きい流体流路を提供できる。このことは、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが近づけられ、ＤＮＡ付着部位とナノ細孔チップとの間の空間が制限されているときに重要であり得る。流体流路を増加させることによって、流体の流速が低下し、離隔距離が近くなるように動く間に増加した圧力を低下させる。
・マイクロピラーは、ＤＮＡ付着部位とのより良い流体接触を提供する。マイクロピラーの先端部が比較的狭い場合、ＤＮＡ付着部位は、より多くの流れを受ける。また、マイクロピラーは、混合の促進を助ける横方向の流れに対して障害を追加する。
・ＤＮＡの付着部をマイクロピラーの先端部に配置することで、ＤＮＡのより集中的な付着を可能にする。これにより、シーケンシング処理をより効率的にできる。なぜなら、ＤＮＡがナノ細孔とより容易に係合することを可能にし得るからである。
・絶縁されたウェルがナノ細孔のシス側上に含まれる場合、マイクロピラーは、電気的絶縁を維持しながら、バッファで充填された個別のウェル内にＤＮＡの付着部を延長できる（図１０のｂおよび図１０のｄ）。このことは、各マイクロピラーが他のマイクロピラーから電気的に絶縁されていることを必要とする。これは、図１０のｄ（５１４、５３５）に示されているものなどの、対応するナノ細孔を通過するＤＮＡを検知するためにマイクロピラー内部に配置された電気プローブと組み合わせされ得る。これらの配置において、ナノ細孔アレイのシス側は、電気的に絶縁されたウェル（６５３）に分割される。
【００５８】
マイクロピラーは、必要な機能に応じて、短くまたは高くできる。付着表面は、付着の方法に応じて、丸く、または、平坦にできる。ＤＮＡの付着のための種々の方法は、後の章において説明される。
【００５９】
マイクロピラーは、対応するナノ細孔への高精度の整列を必要とする。これは、高精度に製造されたサブアセンブリを用いて、または、ナノ細孔センサからのフィードバックと組み合わされた、電動の横方向調節駆動装置を使用することによって実現できる。
【００６０】
マイクロピラーに付着するＤＮＡ鎖の数は、ＤＮＡの付着の領域を決定する製造方法によって主に決定される。この領域は、所望のシーケンシング方法に応じて、一本鎖から、数百以上まで、任意の数のＤＮＡ鎖に合わせてサイズ調整できる。また、ＤＮＡの密度は、付着が行われるときの、溶液中のＤＮＡの濃度によって影響を受ける。
【００６１】
［調製およびシーケンシング手順］
［概要］
シーケンシング手順は、説明の目的のために、２つのフェーズに分割することができる。
【００６２】
ＤＮＡ係合：ＤＮＡの自由端をナノ細孔に十分に近づけ、ナノ細孔に係合または挿入できるようにする（例えば、電気力によってナノ細孔に引き込む）。
シーケンシング：センサから記録しながら、ナノ細孔を通してＤＮＡをゆっくり引き込む。必要に応じて、方向転換および繰り返しを行う。
【００６３】
ＤＮＡ係合フェーズは、スキャンプレートの形状、スキャンプレートの面上におけるＤＮＡの空間的分布、ＤＮＡとスキャンプレートまたはマイクロピラーへのその付着部との間の可撓リンカ分子の有無に応じて、いくつかの大きく異なるバリエーションがある。
【００６４】
［ＤＮＡの係合‐可撓リンカの使用］
ＤＮＡは、可撓リンカ分子を一端に追加し、リンカ分子をスキャンプレートまたはマイクロピラーに付着させることによって、長くすることができる。この実施形態は、ＤＮＡの全長をシーケンシングしながら、スキャンプレート上の付着位置と、ナノ細孔位置との間の位置ずれをある程度許容する。また、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが接触していない状態で、ＤＮＡがナノ細孔と係合することを可能にする。
【００６５】
図１は、リンカ分子をスキャンプレートおよびナノ細孔チップと関連させながら示している。リンカ分子（６０２）は、セルロース繊維、長いポリペプチド鎖もしくはオリゴヌクレオチド、またはバクテリア／ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡ、または線状ポリマー鎖などの、任意の線状分子または分子複合体であり得る。一実施形態の長さは、約１０〜約５０マイクロメートル（μｍ）である。別の例示的な長さは、約５〜約１００μｍである。さらに別の例示的な長さは、約５〜約１０００μｍである。λ‐ＤＮＡ（バクテリオファージラムダから単離）は、リンカ分子の例である。その長さは、４８．５キロ塩基である。完全に広げられている（引き延ばされることなく、まっすぐに引かれている）とき、長さは約３４μｍ長（一本鎖）または１６μｍ長（二本鎖）であり、リンカ分子として使用するのに理想的な長さである。
【００６６】
スキャンプレート付着部（６１０）は、スキャンプレート（５１０）への直接的な、またはマイクロピラーへの、ＤＮＡまたはリンカ分子の付着部である。
【００６７】
リンカノード（６０１）は、ＤＮＡ鎖（６００）と可撓リンカ分子（６０２）との間の接続の場所である。それは、ストレプトアビジンもしくはニュートラアビジンもしくは抗体などのタンパク質、または、非磁気ビード、または、ただ単に、標的ＤＮＡがリンカλ‐ＤＮＡにライゲーションするときのリン酸ジエステル結合などの化学結合であり得る。
【００６８】
永久的な付着は許容可能であるが、シーケンシングされたＤＮＡを解離して新しいＤＮＡを再び付着させることによってシーケンシングを繰り返すことができるように、ＤＮＡ／リンカのスキャンプレート（６１０）への付着部は、ビオチン‐ストレプトアビジンのカップリングなどの可逆的な非共有結合、または、特定のバッファ条件もしくは触媒の下で切断可能な共有結合でもあり得る。ビオチン‐ストレプトアビジン結合は非常に強く、シーケンシング中にＤＮＡをスキャンプレートの面上に保持するのに十分な強度を有する。しかしながら、７０℃より高い温度で、非イオン性水溶液の中で短時間インキュベートすることによる可逆性を有する（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。共有結合は通常、非共有結合よりはるかに強い。可逆的共有結合の例は、カルボン酸とアミンとの間に形成されるアミド結合である。ＤＮＡの付着のために、スキャンプレート表面をカルボン酸で官能基化し、アミド結合を通してアミン修飾ＤＮＡまたはリンカ分子を表面に付着させることができる。シーケンシングされたＤＮＡを後に除去する必要があるとき、アミド結合は、強酸（ＨＣｌなど）または強塩基（ＮａＯＨなど）の存在下で加水分解によって切断できる。カルボキシル基とヒドロキシル基との間に形成されるエステル結合は、同一の挙動を示し、強酸および強塩基、ならびに高い温度によって切断できる。金属、ガラスまたはプラスチックのいずれかである固体表面へのＤＮＡまたはタンパク質の付着に関する他の方法は、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）およびＳａｓｓｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）のレビュー論文、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｕｃｈ（２００３）およびＦｉｘｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）の論文、ならびに、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社およびインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社など、いくつかのバイオテクノロジー企業のウェブサイトで見つけることができる。
【００６９】
［ＤＮＡ係合‐ＤＮＡ堆積パターンに一致させるための横方向の整列］
スキャンプレートおよびナノ細孔チップ表面は、互いに実質的に平行である。ＤＮＡがナノ細孔に係合するのに十分なリーチを有するには、これらのＤＮＡ付着表面（すなわち、スキャンプレート、鈍いマイクロピラーの表面、または、尖ったマイクロピラーの先端部）は、典型的には数ミクロン以内に近づけられる必要がある。ＤＮＡは、最適化などの理由により、様々なパターンでスキャンプレートに付着させることができる。これらの配置は、ナノ細孔チップに対する、スキャンプレートの横方向の必要な位置決めを決定する（図８および図９は、これらの配置のいくつかを示している）。
１）尖ったマイクロピラーが使用される場合（５１２）、マイクロピラーの先端部は、合理的な誤差許容範囲内（いくつかの実施形態では、通常、数ナノメートルから数マイクロメートル）でナノ細孔アレイ位置に一致するように、横方向に位置決めされる必要がある。必要な許容範囲は、任意の横方向の位置ずれ（６０９）を補償できる可撓リンカ（６０２）の長さによって決定される。ＤＮＡがリンカ無しでスキャンプレートに直接付着される場合、横方向の位置ずれは、サンプルＤＮＡのうち、どれほどの長さの部分がシーケンシングから除外されても許容されるかによって決定される（図９のａ）。長いＤＮＡ断片の場合、数千塩基が除外されても許容可能であり得る。
２）ＤＮＡの付着は、ナノ細孔チップ上のナノ細孔パターンに一致する、スキャンプレートの面上におけるパターンの場所に制限することができる（図８のｂ）。この「マッチングパターン」の手法では、横方向の位置決めによって、可撓リンカがナノ細孔に届くことができる範囲内で、ＤＮＡパターンを対応するナノ細孔パターンに対して整列させる必要がある。図９のｂのように、平底マイクロピラー（５１３）を使用するスキャンプレートにＤＮＡが付着する場合、同様に、近くへの整列を実行する必要がある。
３）ＤＮＡの付着は、スキャンプレート全体にわたって均一に行われ得る（図８のａ）。これは、すべてのＤＮＡを走査するために、および、繰り返しの走査を最低限に抑えるために、有用な手法であり得る。ナノ細孔と直接的に整列された場所にあるＤＮＡは、もっとも近いため、そのナノ細孔に係合される可能性が常にもっとも大きい。各ＤＮＡ配列が記録された後、スキャンプレートおよびナノ細孔チップの整列が新しい場所にシフトできる場合、その新しい場所におけるＤＮＡは、ナノ細孔に入りやすい。Ｘ軸およびＹ軸の横方向調節を使用して系統的に位置変更を行うことにより、Ｘ軸およびＹ軸のオフセットの小さい領域を網羅できる。ナノ細孔アレイの横方向の間隔に対応する寸法を有する領域をサンプリングすることにより、スキャンプレート上のすべてのＤＮＡを等しい確率でシーケンシングできる。
【００７０】
［シーケンシング‐バッファ条件、バイアス］
一実施形態において、シスおよびトランス側の容器（６５０および６５１）は、一般に、導電性の塩のバッファ（例えば、１Ｍ  ＫＣｌ  １０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファ、ｐＨ８）で充填されている（図１を参照）。使用されるバッファの種類は、解析される分子、細孔表面の化学的性質、および、塩基検知要件に大きく依存する。いくつかの実施形態において、トランス側容器は、異なるｐＨまたは塩濃度、ＥＤＴＡまたはミネラルの追加、界面活性剤など、異なる条件または組成を有する異なるバッファで充填される必要がある。いくつかの実施形態において、トランス側容器は、標的分子が化学的に修飾されることなく通過することを可能にするゲルまたは他の物質で充填される必要がある。ナノ細孔バイアス電圧（５３０）が、シス側容器およびトランス側容器に配置された２つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極を通して、ナノ細孔チップ（５０１）に印加される。いくつかの塩基検知方法では、ナノ細孔チップが複数のナノ細孔を有する場合、これらの電極のうち少なくとも１つは、各ナノ細孔に固有である必要がある。バッファのイオン含有量は、導電性を有するのに十分であるが、ナノ細孔電圧バイアスからの電場はナノ細孔の外側にある程度拡がり、近くの荷電ＤＮＡを引く。
【００７１】
標的ＤＮＡ断片がナノ細孔内に係合されると、上記のように、中および外に転位できる。ＤＮＡ（６００）は、イオン電流阻害、レコグニショントンネリングまたはナノワイヤＦＥＴなどの好適な塩基検知方法を用いて、ナノ細孔を通って転位されるときにシーケンシングされ、記録される。
【００７２】
［シーケンシング‐区分的反復シーケンシング方式］
いくつかの実施形態において、必要な正確度を実現するためには、ＤＮＡは複数回シーケンシングされる必要があり得る。一般的な方式は、ＤＮＡをナノ細孔から完全に引き出し、次に、再びナノ細孔に挿入することを複数回行うことによって、ＤＮＡ全体の塩基検知を記録することである。ナノ細孔のアレイの場合、異なる長さを有する多くのＤＮＡ断片が同時にシーケンシングされる必要がある。各シーケンシングの実行中、いくつかのＤＮＡ断片は、他よりはるかに早く完了するであろう。時折、挿入プロセス中に、いくつかのＤＮＡは、細孔の中に入ることができず、シーケンシングの繰り返しに失敗することがあり得る。
【００７３】
ここでは、各ＤＮＡ断片が同一の繰り返し数の記録を受けることを保証する、図１１に示されている区分的反復シーケンシング方式を紹介する。手順は次の通りである。
１．ナノ細孔に係合し、完全に挿入されているＤＮＡから開始する。
２．繰り返し対象であるＤＮＡの第１部分（例えば１０００塩基）をナノ細孔から引き出す。
３．１０００塩基を再びナノ細孔に完全に挿入する。
４．２０００塩基のＤＮＡを引き出す。第１の１０００塩基は既に細孔の検知点を３回通過しているが、一方で、第２の１０００塩基は、繰り返し対象となる新しい区画である。
５．新しい１０００塩基の区画を細孔に再び挿入し、次に、追加の１０００塩基と共に引き出す。
【００７４】
ステップ５の繰り返しを継続する。図１１に示されているように、ＤＮＡは、塩基位置１０００、２０００、３０００、４０００などまで漸進的に引き出される。この手順は、ＤＮＡ全体がナノ細孔から引き出され、したがって係合しなくなるまで継続する。例（図１１）において、ＤＮＡサンプルは４６００塩基長であり、ＤＮＡが位置５０００まで引き出されると、手順は終了する。
【００７５】
ＤＮＡが細孔から引き出されている間、および、ＤＮＡが細孔に挿入されている間の両方の方向で、塩基検知を記録できる。データ解析にとっては、ＤＮＡを引き出している間だけ記録する方が、より都合が良いことがあり得る。同一の塩基検知方法を、両方の方向で使用でき、または、異なる方法を挿入中に使用でき得る。この結果、塩基検知のコントラストにおいて有用な変化がもたらされる場合、または、単に、塩基検知無しで挿入をより高速に実行するために、より速い、または、より遅い速度が挿入中に使用され得る。
【００７６】
例において、ＤＮＡの各区画は３回シーケンシングされる。ＤＮＡ断片が細孔から完全に引き出されるとき、最後の部分的な区画だけは、１回シーケンシングされる。大部分のＤＮＡ断片は３回シーケンシングされる。より多くの繰り返しが必要とされる場合、各区画の記録回数をより多くするために、引き出しおよび挿入の長さを調節できる。境界における塩基の記録の繰り返しが十分であることを確実にするために、隣接する区画が重複するように、いくつかの塩基を余分に挿入することが有利であり得る。
【００７７】
［第２章：ナノ細孔に対するＤＮＡおよび他の分子の自動整列］
また、本開示は、調節可能磁石および磁気ビードを使用して、ナノ細孔に対してＤＮＡを自動整列するための方法を提供する。ＤＮＡの整列とは、ナノ細孔チップの表面に対して直角な、実質的な直線状となるように、および、解析ステージの動き方向と一致するように、ＤＮＡをナノ細孔から引き離すことを意味する。これにより、解析ステージの動きの方向に沿って、ナノ細孔に直接一致するスキャンプレートの場所にＤＮＡの端が配置され（または、付着したリンカの端が配置され）、その結果、それはナノ細孔からまっすぐに引き離される。このＤＮＡの整列は、伸びたＤＮＡがナノ細孔を（中または外のいずれかへ）通過する長さが、ステージが移動する距離と厳密に等しくなることを確実にする。ＤＮＡがランダムに付着される場合のように、付着場所が位置ずれしている場合、速度は、離隔距離の関数として変化し、ＤＮＡをスキャンプレートに結合または保持するのに必要な力は、より大きくなる。
【００７８】
［磁石］
磁石の目的は、ナノ細孔のシス側にあるＤＮＡまたはリンカの端をスキャンプレートに向かって引くことである。したがって、ナノ細孔チップとスキャンプレートとの間の空間において、磁場が有効である必要がある。磁気ビードなどの磁性材料の塊に作用する磁石の力
【数１】
0006986270.tif 000002
は、磁場の勾配
【数２】
0006986270.tif 000003
、材料の磁化
【数３】
0006986270.tif 000004
、および、ビード中の磁性材料の体積ＶＢＥＡＤにほぼ比例し、下の公式
【数４】
0006986270.tif 000005
（完全な公式）で求められる。
【００７９】
磁場が強い場合、磁気ビードの磁化は、その飽和限界に近づき、もはや駆動磁場に比例しない。力の公式は、
【数５】
0006986270.tif 000006
（飽和磁性材料について簡略化された公式）のように簡略化できる。ここで、
【数６】
0006986270.tif 000007
は、飽和時のビードの磁化であり、
【数７】
0006986270.tif 000008
は、磁場の勾配である。
【００８０】
実際的な適用において、このことは、磁気ビードの磁化を飽和させるべく、スキャンプレートとナノ細孔チップとの間の間隙において、磁場が強い必要があり、磁場は、スキャンプレートに向かって増加する強い勾配を有する必要があることを意味する。
【００８１】
この磁場の条件は、図１２に示されているように、極がナノ細孔チップに面するように、磁石をスキャンプレートのすぐ後ろに配置することによって達成できる。磁石は、電磁石または永久磁石のいずれでもよい。電磁石は、駆動電流を変化させることによって容易に制御できる。また、間隙における永久磁石の磁場は、単に永久磁石をスキャンプレートに近づけように、または、それから遠ざかるように動かすことによって、増加または減少させることができる。永久磁石、特に、ネオジム磁石（ＮｄＦｅＢ磁石）は非常に強い磁場を有し得る。磁場の強さおよび磁場の勾配は、両方とも、ハルバッハ配列などのように、磁場を形成および増強するように複数の永久磁石を並べることによって強化できる。
【００８２】
［磁気ビード］
整列手順にはいくつかのバリエーションがあるが、それらはすべて、磁気ビードの何らかのバリエーションを利用する。ビードは超常磁性であり得て、すなわち、磁場の存在下で磁化できるが、磁場が消失したとき、その磁性を失う。ビードは、ナノ細孔へ向かうＤＮＡの移動を妨げることを回避するために、可能な限り小さく、かつ軽い必要があるが、ビードがナノ細孔に入ることを防止するために、および、標的ＤＮＡ分子を保持して動かすのに十分な磁力を発生させるほど十分な磁気成分を有するようにするために、十分に大きい必要がある。一実施形態において、サイズ範囲は約２００ｎｍから３μｍである。別の実施形態において、サイズ範囲は約５０ｎｍから約１０μｍである。いくつかの実施形態において、サイズ範囲は約１０ｎｍから５０μｍである。必要なビードサイズは、必要な力の量によって決定される。第１章で説明された、スキャンプレートに対するＤＮＡ／リンカ分子の付着と同様に、可撓リンカ分子は共有結合または非共有結合を介して磁気ビードに付着され得る。
【００８３】
［バリエーション］
整列は、いくつかの異なるＤＮＡおよび磁気ビードの調製を用いて実行され得る。これらの調製は、図１３に示されている。この図において、λ‐ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）または同様の線状ポリマーをリンカ分子として使用することを想定している。
【００８４】
［方法１：停止したリンカを使用する整列］
可撓リンカ分子（６０５）は、一端で磁気ビード（６２０）に付着し、ナノ細孔の入口より大きい、肥大したリンカノード（６０１）を通してサンプルＤＮＡ（６００）に連結する（図１３のａ）。リンカノードは、ＤＮＡがナノ細孔を通って転位するとき、ブレーキまたはストッパとして機能する。リンカノードは、タンパク質、または可撓リンカ分子をサンプルＤＮＡに付着させることができる他の手段（６０３）を指す。リンカノードは、非磁気ビードまたは巨大タンパク質複合体（抗体、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、またはアビジンなど）、または、巨大ポリマー球、または他の分子であり得て、シーケンシング緩衝液において非荷電性または弱荷電性であることが望ましい。いくつかの実施形態において、リンカノードは、ナノ細孔入口より少なくとも２倍大きい必要がある。
【００８５】
ＤＮＡは、以下のように磁気ビードで標識される。  ［磁気ビード］＋［可撓リンカ分子］＋［リンカノード］＋［任意の較正オリゴＤＮＡ］＋［ｓｓＤＮＡサンプル］
【００８６】
これの具体例は、その下で二本鎖λ‐ＤＮＡを可撓リンカとして使用する、磁気ビード標識ＤＮＡアセンブリである。二本鎖λ‐ＤＮＡは、約５０キロ塩基であり、引き伸ばされていないときの長さは、約１６μｍである。
【００８７】
［１μｍのＤｙｎａＢｅａｄ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（登録商標）カルボン酸ビード］＋［アミンおよびビオチンで修飾されたｄｓλ‐ＤＮＡ］＋［ニュートラアビジン］＋［ビオチン化ｓｓＤＮＡサンプル］
【００８８】
一実施形態において、アミンおよびビオチンで修飾したｄｓλ‐ＤＮＡが、図１７に示されている。ｄｓλ‐ＤＮＡの一端に、両方の鎖上でアミンリンカが追加され、カルボン酸で修飾された磁気ビード表面とのアミド結合の形成を容易にする。２つのアミンリンカは、各々が異なる長さの炭素鎖（Ｃ６およびＣ３）（ａ）、または、同一の長さの炭素鎖（Ｃ６およびＣ６）（ｂ）を有し、両方のλ‐ＤＮＡ鎖上にアミド結合を形成するための可撓自由端を提供する。ｄｓλ‐ＤＮＡの他端はビオチン化され、４つのビオチン結合部位を有するニュートラアビジンに付着させるための、２つの等しい（等しくなくても良い）可撓自由端を有する。両方の鎖を付着させることにより、リンカ分子の強度が増加する。
【００８９】
代替的に、中性荷電ビード表面のために、カルボン酸官能基化ビードを置き換えるべく、ＢＳ３架橋剤などの架橋剤と共に、アミン修飾ｄｓλ‐ＤＮＡに結合するためにアミン官能基化ビードが使用され得る。
【００９０】
図１４は、ナノ細孔チップ（５０１）、スキャンプレート（５１０）、磁石（５２０）、および、バッファ溶液中に浮遊する、標識されたＤＮＡを示す、簡略化された物理的配置を示している。
【００９１】
整列手順は以下の通りである。
１．ナノ細孔アレイのシス側のチャンバが、（上記のように）磁気ビードで標識されたＤＮＡを含むバッファ溶液で充填される。
２．負に荷電したＤＮＡをナノ細孔に引き込むために、ナノ細孔バイアス電圧がかけられる（図１４のａ）。ＤＮＡ（６００）の自由端はナノ細孔（５００）に入る。これは、ナノ細孔の開孔電流をモニタリングすることによって検出できる。ＤＮＡ分子のナノ細孔への進入は、ナノ細孔に入ることができないリンカノードによって停止される。また、適切に選択されたリンカノードは、他のＤＮＡがナノ細孔に入ることを阻害できる。
３．いくつかの標識されたＤＮＡサンプルは、ナノ細孔に収まらず、ナノ細孔チップ表面上に、または、シス側バッファ容器内に、散在したままになる。ナノ細孔内部の標識されたＤＮＡを「係合されている」と呼び、一方、細孔の外側にある標識されたＤＮＡを「係合されていない」と呼ぶ。干渉が懸念される場合、係合されているＤＮＡのシーケンシング中、係合されていないＤＮＡをシス側容器から除去することが望ましいことがあり得る。これは、磁場が印加される前に実行される洗浄段階によって達成できる。未使用ＤＮＡは保管容器内に隔離でき、次回のシーケンシング処理のために、切り替え可能な磁石によって保持または解放され得る。
４．スキャンプレート（５１０）は、ナノ細孔表面の比較的近くに移動されるが、その間隙は、もっとも長いリンカ分子の長さより十分に大きい。Ｆｍを、磁気ビードに作用する磁力、Ｆｅｓを、係合されていないＤＮＡに作用する電気力、Ｆｅｌを、係合されているＤＮＡに作用する電気力として想定する。Ｆｅｌの大きさはＦｅｓより数オーダー大きいので、調節可能磁石（５２０）を作動させ、ゼロまたは非常に弱い磁場から開始し、Ｆｅｓ＜＜Ｆｍ＜＜Ｆｅｌ（＜＜は、左辺が右辺よりはるかに小さいことを意味する）となるように、徐々に磁場強度を増加させる（図１４のｂ）。磁力は、残っているすべての係合されていないＤＮＡをスキャンプレートへ引き寄せるのに十分であるが、非常に強い電気力によって保持されている、係合されているＤＮＡをナノ細孔から引き出すには不十分である。係合されているＤＮＡに連結している磁気ビード（６２０）は、リンカノードビード（６０３）のまっすぐ上に浮遊し、ＤＮＡと完全に整列し、したがって、対応するナノ細孔と完全に整列する（図１４のｂを参照）。５．次に、スキャンプレートはさらに下げられ、係合されているＤＮＡに対応するすべての磁気ビードが、その真上にあるスキャンプレートに接触することを可能にする。すべての磁気ビード（６２０）が接触した後、磁場を増加させ、係合されているＤＮＡに作用する電気力Ｆｅｌよりはるかに大きい磁力Ｆｍを作る（Ｆｍ＞＞Ｆｅｌ）。磁気ビード（６２０）は、スキャンプレート（５１０）にしっかりと接した状態で引かれ、その結果、磁気ビードは、スキャンプレート（５１０）の動きを高精度で追跡する（図１４のｃ）。スキャンプレート（またはナノ細孔基板）を高精度で制御された速度で動かすことによって、ＤＮＡを必要に応じて何度も細孔に出入りさせながらシーケンシングできる。ＤＮＡのシーケンシング後、磁力をオフにしてからオンにすることにより、標識されたＤＮＡを解放および再混合、または循環し、バッファ交換または追加のサンプル処理無しで、短時間で別の回のシーケンシングを開始する。磁場がオフになった後もいくつかの磁気ビードが残存磁化を有し、スキャンプレート表面に付着したままであり得るいくつかの状況において、磁気ビードを引き離すために、ナノ細孔のトランス側に、副調節可能磁石が配置され得ることに留意されたい。副磁石は、主磁石よりはるかに弱くて良い。代替的に、ゆるく付着した磁気ビードを除去するために、誘電力、流体せん断力などの他の手段を使用できる。
６．代替的に、ビードとスキャンプレート表面との間のしっかりした接触を保証するために、最初の接触で、磁気ビードをスキャンプレートに化学的に結合させることができる。それにより、ビードひいてはリンカ分子、および、付着したＤＮＡは、スキャンプレートの移動に合わせて高精度で動くことができる。このことは、例えば、より小さい磁気ビードを使用する必要がある場合など、必要な最大磁力について妥協が生じるいくつかの特殊な場合において必要とされ得る。
【００９２】
［方法２：一本鎖ＤＮＡをリンカとして使用する整列］
磁気ビード（６２０）には、ライゲーションまたは他の手段によってサンプルＤＮＡ（６００）に連結される可撓リンカ分子（６０６）が付着する（図１３のｂ）。可撓リンカ分子は、サンプルＤＮＡと同一種類であり、付着は、単一の連続的な一本鎖分子が結果として生じるような方式である。したがって、連続する分子全体は、リンカとサンプルＤＮＡとの間の移行部での妨害を生じさせることなく、ナノ細孔を通ることができる。標識されたＤＮＡは、以下のように構築される。
［磁気ビード］＋［可撓リンカ分子］［ライゲーション］［ＤＮＡサンプル］
【００９３】
これの具体例は、その下で一本鎖λ‐ＤＮＡ（ｓｓλ‐ＤＮＡ）を可撓リンカとして使用する、磁気ビード標識ＤＮＡアセンブリである。ｓｓλ‐ＤＮＡは約５０キロ塩基であり、完全に引き伸ばされたときの長さは約３４μｍである。
【００９４】
［１μｍ  ＤｙｎａＢｅａｄ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（登録商標）カルボン酸ビード］＋［アミン修飾ｓｓλ‐ＤＮＡ］＋［末端修飾ｓｓＤＮＡサンプル］
【００９５】
サンプル処理に関連するステップが図１８に簡単に示されている。起こり得るヘアピン形成または異なるＤＮＡ断片間の架橋を回避するべく、サンプルは、ｄｓλ‐ＤＮＡの形式で保管される。ｄｓλ‐ＤＮＡの不要な鎖は、使用前に変性され、除去される。
【００９６】
整列手順は以下の通りである。
１．ナノ細孔アレイのシス側のチャンバが、（上記のように）磁気ビードで標識されたＤＮＡを含むバッファ溶液で充填される。
２．サンプルＤＮＡ（６００）をナノ細孔に引き入れるために、ナノ細孔バイアス電圧がかけられる（図１５のａ）。ＤＮＡの自由端がナノ細孔に入る。これは、ナノ細孔開孔電流をモニタリングすることによって検出できる。ナノ細孔へのＤＮＡ分子の進入は、ナノ細孔を通ることができない磁気ビード（６２０）の位置で初めて停止する。ｓｓＤＮＡサンプル（６００）および可撓リンカ（６０６）のほぼ全体は、両方ともナノ細孔を通ってトランス側に出る（図１５のｂ）。
３．いくつかの標識されたＤＮＡサンプルは、ナノ細孔に収まらず、ナノ細孔チップ表面上に、または、シス側バッファ容器内に、散在したままになる。ナノ細孔内部の標識されたＤＮＡを「係合されている」と呼び、一方、細孔の外側にある標識されたＤＮＡを「係合されていない」と呼ぶ。干渉が懸念される場合、係合されているＤＮＡのシーケンシング中、係合されていないＤＮＡをシス側容器から除去することが望ましいことがあり得る。これは、磁場が印加される前に実行される洗浄段階によって達成できる。未使用ＤＮＡは保管容器内に隔離でき、後に使用するために、切り替え可能な磁石によって保持または解放され得る。
４．スキャンプレート（５１０）およびナノ細孔チップ（５０１）は、比較的近い距離に近づけられ、離隔距離は、可撓リンカの長さより小さい。λ‐ＤＮＡ可撓リンカの場合、約１０〜１５μｍが適切である。離隔はこの位置で保持される。
５．磁石が係合され、最大の力までゆっくり上昇される。遅い上昇のある時点において、磁力はナノ細孔の電気力に一致した後に超過し（Ｆｍ≧Ｆｅｌ）、磁気ビードは、ｓｓＤＮＡを引き出し始める。ｓｓＤＮＡは、磁気ビードがナノ細孔の真上にあるスキャンプレートに接触する（すなわち、ｓｓＤＮＡが適切にナノ細孔に整列される）まで、引き出され続ける（図１５のｃ）。  ６．このとき、ｓｓＤＮＡのいくつかは、わずかに収縮し、余分な塩基をナノ細孔から引き出し得る。これが発生する理由は、ｓｓＤＮＡが最初にナノ細孔を出る時間と、それがスキャンプレートに接触するときとの間に、磁力（Ｆｍ）がいくらか上昇したからである。バッファ溶液を通過するためには、磁気ビードの力は、動きを妨げる、いくらかの流体抗力に匹敵する必要がある。これにより、ｓｓＤＮＡがやや過剰に伸ばされる。収縮の後、ｓｓＤＮＡは、その塩基と塩基との間の延びによる張力がナノ細孔電気力と厳密に一致する平衡に達する（ＴｓｓＤＮＡ＝Ｆｅｌ）。
７．このとき、ビードをスキャンプレートにしっかりと保持するために、磁力は最大限まで増加される。シーケンシングは、塩基認識のために必要な速度でスキャンプレートを動かすことによって進行する。ｓｓＤＮＡは、事前に張力を加えられ、シーケンシング処理中も張力を受け続ける。
８．サンプル断片が読まれる前に、ナノ細孔のトランス側にあるλ‐ＤＮＡ（または代替的なリンカ）の残りの部分がシーケンシングされる必要がある。これは必要な非効率である。λ‐ＤＮＡは較正として機能し得るか、または、カスタムｓｓＤＮＡ配列がリンカおよびセンサ較正のために使用され得る。最初の離隔距離が、伸ばされた可撓リンカの長さよりごくわずかに短くなるように、ナノ細孔チップおよびスキャンプレートを厳密に平行にする場合、読まれるλ‐ＤＮＡの長さを最低限に抑えることができる。
９．シーケンシング完了後、ナノ細孔バイアスが停止または反転され得て、磁石が離れることにより、標識されたＤＮＡがバッファと再び混ざり、サイクルを繰り返すことを可能にする。ここでも、方法１の整列手順のステップ５において説明されたように、磁気ビードの解離を助けるために、副磁石または他の手段が使用され得る。
【００９７】
この方法には、いくつかの重要な利点がある。リンカからサンプルＤＮＡへの移行部が完全に円滑であることは特に有用である。これにより、サンプルＤＮＡを端から端まで解析することができる。カスタムリンカ分子が使用される場合、いくつかの較正配列が含まれ得て、データ解析における使用について各ナノ細孔を特性評価することを可能にする。この較正は、繰り返しの塩基に対する反応など、塩基から塩基への様々な移行に対するセンサの反応を記録するために使用され得る。カスタムリンカ分子の例は、較正配列が追加されたλ‐ＤＮＡである。この追加は、記録されることを確実にするために、サンプルＤＮＡが付着する端の近くで行われる必要がある。
【００９８】
［方法３：直接的なＤＮＡの付着を使用する整列］
この方法の手順は、「一本鎖ＤＮＡリンカを用いる整列」方法と同一である。ＤＮＡアセンブリは図１３のｃに示される。違いは次の通りである。
・ＤＮＡと磁気ビードとの間に長い「可撓リンカ分子」が無い。代わりに、サンプルＤＮＡが磁気ビードに直接付着している。
［磁気ビード］＋［ｓｓＤＮＡサンプル］
より具体的な例は次の通りである。
［１μｍ  ＤｙｎａＢｅａｄ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（登録商標）カルボン酸ビード］＋［アミン端修飾ｓｓＤＮＡサンプル］
別の例：
［１μｍ  ＤｙｎａＢｅａｄ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（登録商標）ストレプトアビジンビード］＋［ビオチン化ｓｓＤＮＡサンプル］
【００９９】
・ＤＮＡの一部は読むことができない。サンプルＤＮＡの一部は、整列手順中にナノ細孔からスキャンプレートに跨る必要があるので、それらの塩基は適切に記録することができない。
【０１００】
この手法は、リンカ分子が無いことに起因して、一本鎖リンカの方法より単純で、幾分安価である。十分に大きいＤＮＡのサンプルを用いる、長いＤＮＡ断片のシーケンシングの場合、断片を最後までシーケンシングできないことは、重要な問題にならないことがあり得る。より短い長さのＤＮＡ断片、または、材料に制限があるサンプルの場合、このことは、深刻な程度に処理を妨げる。
【０１０１】
［考察］
本開示の自動整列方法は、マイクロピラー無しのスキャンプレート（図１４および図１５）に、および、共通または個別のシス側ウェルを有し、平底マイクロピラーを有するスキャンプレート（図１６）適用される。ビードが表面上で横方向に動くことなく、磁場が磁気ビード（６２０）をマイクロピラーに当てながら真上に引くことができるように、平端であることが必要である。
【０１０２】
このような、磁気ビードに補助される、スキャンプレートへのＤＮＡの付着は、付着および解離のための複雑な化学的性質または試薬を用いることなく、装置内におけるＤＮＡの解離および再付着をはるかに容易にする。磁気によって自動化されるＤＮＡ‐ナノ細孔の整列は、複雑で高精度な計器の整列を不要にして、計器の設計を大幅に簡略化する。また、完璧な整列は、一定および予測可能な塩基／秒の速度ですべてのＤＮＡ分子が細孔を通過することを可能にし、塩基検知アルゴリズムを大幅に簡略化する。
【０１０３】
磁気による整列の方法の要件は、磁石が磁気ビードに加える走査方向の力が、ナノ細孔内部のＤＮＡ塩基に作用する電気力より大きいことである。このため、大きい電磁石、大きく移動可能な永久磁石、または、さらには永久磁石のアレイが必要であり得る。この要件は、磁気ビードについての最小サイズを決定し得る。
【０１０４】
磁気による整列は、ビードおよびスキャンプレートの化学的な付着および解離と組み合わせられ得る。これは、磁気ビードのサイズを最低限に抑え、それらがより長く浮遊状態に留まることを可能にするために使用され得る。そのような手順では、より小さいビードにかかる低減された力でＤＮＡをナノ細孔から引き出すことができるように、ＤＮＡが係合された後に、ナノ細孔バイアス電圧を減少させることが必要となり得る。スキャンプレートへの化学的付着の後、張力を追加するために、ナノ細孔バイアス電圧が増加され得る。シーケンシングの完了後、ＤＮＡは解離または分解され得る。
【０１０５】
より小さい磁気ビード、または、より強くない磁石の使用を可能にする別の手段は、磁気ビードを非荷電状態、または、弱荷電状態にして、それにより、特に磁気ビードがナノ細孔に係合したときに磁気ビードに作用する必須でない電気力を最低限に抑えることである（図１３のｂおよび図１３のｃ、ならびに図１５）。１つの解決法は、磁気ビードに連結したニュートラアビジン（または他の中性複合体）を使用することである。ニュートラアビジンの等電点は６．３なので、通常のバッファのｐＨの下で、ほぼ中性としての挙動を示す。別の解決法は、カルボン酸官能基化された磁気ビードを使用することである。アミン修飾ＤＮＡまたはリンカ分子のカップリングの反応後、ビード製造元の一般的な推奨であるＴｒｉｓ‐ＨＣｌバッファまたはエタノールアミンの代わりに、過剰な量のエチルアミンを用いて反応を停止させる。その結果、ビードは非荷電ながら親水性になる。図１９を参照されたい。
【０１０６】
図１４および図１５において、調節可能磁石（５２０）およびスキャンプレート（５１０）は、共に移動するように示されているが、これは本質的特徴ではないことに留意すべきである。離隔距離を変更するために、スキャンプレートを独立に動かすことができ、または、ナノ細孔チップを動かすことができる。必要な場合、調節可能磁石は独立に動かすことができる。
【０１０７】
［第３章：ＤＮＡ、リンカ分子およびビードの架橋の防止］
上記のような、磁気ビードに補助されるＤＮＡ‐ナノ細孔整列およびシーケンシングの手法については、単一のサンプルＤＮＡが付着した単一リンカ分子が付着した単一の磁気ビードが一実施形態である。しかしながら、磁気ビードおよびリンカノード上に複数の結合部位があることに起因して、現実には実現が困難である。複数の結合部位があるリンカノードが使用される場合、特に、リンカノードがビードである場合、複雑なビード／ＤＮＡ架橋ネットワークが形成され得るが、このことは絶対に回避する必要がある。以下は、複雑なリンカネットワークの生成を最低限に抑えるために提案される方法である。
【０１０８】
（１）混合物におけるＤＮＡ／ビード比の制御：
ポアソン分布の法則に基づくと、ＤＮＡ分子／断片がビードと１：１の比で混合される場合、結果として、ＤＮＡを有さないビードが約３６．８％でき、ＤＮＡを有する残りの６３．２％のビードの間では、８７．３％が１または２つのコピーを有し、９７％が１、２または３つのコピーを有する。比を１：２に減少させると、約３９．３％のビードのみがＤＮＡを有することになるが、そのうちの９６．３％は、１または２つのコピーを有し、９９．６％は、１、２または３つのコピーを有する。４つまたはそれより多くのＤＮＡコピーを有するビードは事実上存在しない（＜０．５％）。ＤＮＡを有さないビード（ヌルビード）は、濃縮（自由溶液電気泳動または他の方法）を通して除去できる。
（２）リンカビードの代わりとしての連結タンパク質の使用：
ニュートラアビジンおよび抗体などの、いくつかの巨大タンパク質は、ナノ細孔でのＤＮＡブレーキとしてリンカノードビードの代わりに使用できるほど十分に大きい。これらのタンパク質は、結合部位が非常に限定されており、例えば、ニュートラアビジンのビオチン結合部位は４つのみであり、抗体は、結合に用いられる３つの枝分かれを有する。ストレプトアビジンおよびアビジンは、ニュートラアビジンと同一である。２つの結合部位のみを有する二価ストレプトアビジンタンパク質が存在し、それらの部位は、両方とも互いに隣り合っているか（シス二価）、または、反対側にあるか（トランス二価）のいずれかである。２つの結合部位だけを有するタンパク質の場合、１つの単連結リンカ分子を最初に付着させ、１つの部位のみを、シーケンシングＤＮＡの結合のために残すことができ、これにより、単一のＤＮＡの付着が保証される（図２０を参照）。３つの結合部位を有するタンパク質の場合、１つの二重連結リンカ分子を最初に付着させ、やはり、１つの結合部位だけをシーケンシングＤＮＡのために残すことができる。さらに、ストレプトアビジンなどの、４つの結合部位を有するタンパク質の場合、１つの三重連結リンカ分子を最初に付着させ、１つの空の結合部位を残すか、または、１つの二重連結リンカ分子を付着させ、２つの空の結合部位を残す。２つのシーケンシングＤＮＡ分子を獲得する確率は非常に小さく、また、自動整列方式のためには、２つのコピーＤＮＡが１つの磁気ビードに（リンカ分子を介して）連結することは、１つのＤＮＡが２つの磁気ビードに連結することより良い。図２１は、１つの結合部位（一本鎖のみがビオチン化されたｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）または２つの結合部位（末端にプライマがハイブリダイズされたｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）のいずれかを提供する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が、リンカ分子として使用されることを示している。二価ストレプトアビジンもしくは通常のストレプトアビジン、または抗体と併せることによって、単一のシーケンシングＤＮＡ分子のみを磁気ビードに連結することが可能である。
（３）エマルション滴法：マイクロ流体技法、または、バルク振動もしくは他の混合技法のいずれかを使用して、１つの滴が、ランダムに分配されたＤＮＡ分子と共に、１つのビードのみ、または、最大でも２つのビードのみを含むことができるように、ビードサイズより大きく、かつ、それと同程度のサイズの油中水滴を生成する。最後に、反応は停止され、ＤＮＡを有するビードは、遊離ＤＮＡおよび空のビードから分離される。結果は、同一のポアソン分布の法則に起因して、方法（１）と同様であるが（図２２を参照）、ビード間の架橋を効果的に回避できる。
（４）ｓｓＤＮＡ可撓リンカ分子の一本鎖サンプルＤＮＡへの直接接続：
図１３のｂおよび図１５に示されているように、サンプルｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡリンカにライゲーションされ、新しい連続の単一分子を形成する。この方法は、複数の接続の問題を本質的に回避する。なぜなら、ｓｓＤＮＡは、別のｓｓＤＮＡの端に直接接続することのみできるからである。複雑なビード／ＤＮＡのネットワークの問題は、この手法に存在しない。
【０１０９】
［第４章：ＤＮＡの移動の磁気制御］
この開示はまた、図２３および図２４に示されるように、制御可能磁石を用いて、ナノ細孔を通るＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の生体分子を制御するための方法を提供する。制御されたスキャンプレートの移動は必要ないので、計器の設計が大幅に簡略化され、計器の費用が低減される。ここでは、スキャンプレートは、容器壁（５２１）によって置き換えられている。容器壁は、スキャンプレートと同一の方式で配置されているが、スキャンプレートおよびナノ細孔基板が動くときの、その間の最大動的間隙に等しいか、またはより大きい距離に固定されている。
【０１１０】
図２３のａは、標的ＤＮＡ（６００）が磁気ビード（６２１）に直接付着していることを示している。ＤＮＡは、バイアス電圧（５３０）によってナノ細孔チップ（５０１）の面上のナノ細孔（５００）内に送られるが、磁気ビードによって停止される。電磁石または永久磁石のいずれかである調節可能磁石（５２０）が作動または位置変更され、ゼロに近い磁場強度から開始する。図２３のｂに示されるように、磁気ビード（６２１）に作用する多くの力がある。
・磁力（Ｆｍ）
・バッファボリュームの置換に起因する浮力（Ｆｂ）
・荷電ＤＮＡに作用する電気力（Ｆｅ）
・ビード表面の電荷に起因してビードに直接作用する電気力（Ｆｂｅ）
・ＤＮＡが付着した磁気ビードの重量（Ｆｗ）
・摩擦力（Ｆｆ）（動く前にビードと細孔の入口の間に存在する）または抗力（Ｆｄ）（動くときに周囲のバッファによってビードに作用する）
【０１１１】
互いに平行であるスキャンプレートおよびナノ細孔チップが水平方向の姿勢であり、ビードがナノ細孔からスキャンプレートに向かって鉛直方向に移動すると想定すると、引く力は、ＦｍおよびＦｂの和であり、反対方向の力は、Ｆｅ、Ｆｂｅ、Ｆｗ、ＦｆおよびＦｄの和である。磁力を徐々に増加させることにより、引く力は最終的に、反対方向の力を上回り（下を参照）、その結果、ＤＮＡをナノ細孔から引き出すことができる。
Ｆｍ＋Ｆｂ≧Ｆｅ＋Ｆｂｅ＋Ｆｗ＋Ｆｆ＋Ｆｄ
【０１１２】
塩基のシーケンシングを成功させるためには、ＤＮＡの移動が遅く、かつ、制御可能である必要がある。このことは、結果として生じる力のバランスが平衡に近く、安定している必要があることを意味する。すべての力の中で、ＦｗおよびＦｂは一定である。Ｆｅは、バイアス電圧、バッファ条件、ナノ細孔状態、および、ナノ細孔内部のＤＮＡ塩基の数に依存し、通常は一定でない。Ｆｄは、ビードが移動しているときだけ存在する受動的な力であり、ＤＮＡの動きの揺らぎを安定化および抑制する。Ｆｍは、制御可能な磁場の大きさによって決定される。
【０１１３】
残りの２つの力であるＦｂｅおよびＦｆは、場所に固有であり、したがって、遅く制御可能なＤＮＡの移動という目標を達成する上で問題となる。電場は、細孔において、および細孔の付近において、非常に強いが、細孔から遠く離れると非常に弱くなる。Ｆｂｅは、ＤＮＡが移動する前は強いが、ビードが移動して細孔から離れるとき、ゼロ近くに低下することがあり得る。また、摩擦力Ｆｆは、もし存在する場合、細孔において非ゼロであるが、ビードが細孔から出たとき、すぐにゼロに低下する。磁気ビードがナノ細孔のすぐ近くから離れるにつれて、力が突然に不均衡になることにより、ＤＮＡの移動の突然の加速が生じる。
【０１１４】
ＤＮＡを遅く、かつ、円滑で予測可能な速度で移動させるためには、付着力（Ｆｂｅ＋Ｆｆ）は、完全に除去されるか、または、大幅に低減される必要がある。これは、張り付かない磁気ビードを選択し、ビードを非荷電にすることによって行うことができる。付着力をゼロに、または、ほぼゼロに低減させることにより、力のバランスを、ひいてはＤＮＡの移動を高精度で制御できる。
【０１１５】
ビードを非荷電にするための手段にはいくつかある。１つは、磁気ビードに連結したニュートラアビジン（または他の中性複合体）を使用することである。ニュートラアビジンの等電点は６．３なので、通常のバッファのｐＨの下で、ほぼ中性としての挙動を示す。別の解決法は、カルボン酸官能基化された磁気ビードを使用することである。アミン修飾ＤＮＡのカップリングの反応後、ビード製造元の一般的な推奨であるＴｒｉｓ‐ＨＣｌバッファまたはエタノールアミンの代わりに、過剰な量のエチルアミンを用いて反応を停止させる。その結果、ビードは非荷電ながら親水性になる。図１９を参照されたい。
【０１１６】
ＤＮＡの加速を生じさせる、力のわずかな不均衡は、常にある。これは特に、複数の細孔を有する大量のビードがナノ細孔アレイ上にある場合に当てはまり、この場合、磁力Ｆｍは、アレイ全体にわたって異なり得る。ＤＮＡの移動を遅く、かつ、予測可能に維持するために重要なことは、塩基検知信号の解析に基づいて、ＤＮＡの速度を推定し、それにしたがって、磁場またはバイアス電圧の大きさを調節することである。このようにして、適切な塩基検知方法、ならびに、巧みに設計されたコンピュータプログラムおよび較正機構を用いて、ＤＮＡシーケンシングを行うことができる。
【０１１７】
ブラウン運動は、ＤＮＡの移動の不安定性を生じさせ得る。この問題を解決するための１つのオプションは、バッファ温度を下げ、バッファ粘度を増加させることにより、ブラウン運動の大きさを低減させることである。別のオプションは、実現可能な最大磁力より小さい状態で電気力を維持するという条件で、より高いバイアス電圧を使用することによって、電気力Ｆｅを増加させることである。ビードが移動するにつれて、標的ＤＮＡ分子は力を受けて伸ばされ、分子内張力が増加する。それにより、標的分子は、ナノ細孔を通って自由に移動するのではなく、進入するにつれて、反対方向の力による張力を受けて、ピンと張られる。これは機械的制御手法と同様である。
【０１１８】
さらに、標的分子の同一種類のリンカ分子を使用して、標的分子をビードに連結させることができる。例えば、一本鎖λ‐ＤＮＡをリンカとして使用して、サンプルｓｓＤＮＡにライゲーションさせることができ、その結果、図１３のｂおよび図２４のａに示されるように、長い連続するｓｓＤＮＡが形成される。リンカ分子は、較正の手段として機能し得て、同時に、緩衝領域を提供し得て、その結果、実際のＤＮＡサンプルがシーケンシングされる前に、開始時における、ＤＮＡの移動の何らかの急激な加速を抑制できる。
【０１１９】
代替的に、リンカ分子（６３２）と標的分子（６００）との間に、リンカノード（６３３）が接続部として導入される（図２４のｂ）。リンカノードは、ナノ細孔入口より少なくとも２倍大きいので、ＤＮＡがバイアス電圧を受けてナノ細孔を通って転位するときに、ストッパまたはブレーキとして機能するであろう。このとき、リンカノードはナノ細孔にあるので、シーケンシング緩衝液内において非荷電である必要があるが、一方、磁気ビード（６２０）は、非荷電である必要はない。リンカノードは、（抗体、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、またはその他などの）巨大タンパク質であり得るか、または、ナノ細孔入口より大きい任意のポリマー複合体、または、さらには非磁気ビードであり得る。
【０１２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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