(57)【要約】      （修正有）【課題】画像の品質を損なわずに光線量を制御して光漂白を減少させ得る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムを提供する。【解決手段】低蛍光漂白共焦点イメージングシステム２０は、共焦点イメージングモジュール２１０、電子制御モジュール２２０及びマスターコンピュータモジュール２３０を備え、共焦点イメージングモジュール２１０は、基準画像として画像共焦点画像を取得し、マスターコンピュータモジュール２３０は、基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、マスターコンピュータモジュール２３０は、また、蛍光分子密度に基づいて電子制御モジュールの作動を制御することに用いられ、電子制御モジュール２２０は、高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、それにより、共焦点イメージング時の蛍光漂白を効果的に低減させ、生物研究への共焦点イメージング技術の適用に寄与する。【選択図】図５
0003232024.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
低蛍光漂白共焦点イメージング方法であって、
１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定するステップと、
ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値であるリアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値との比較結果に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御するステップと、
低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得するステップと、を含むことを特徴とする低蛍光漂白共焦点イメージング方法。
【請求項２】
１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定するのは、
前記基準画素中の５％の最大画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）を高閾値に設定するステップと、
前記基準画素中の５％の最小画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）＋背景雑音の平均値を低閾値に設定するステップと、を含み、
前記意思決定時間は、フィードバックを一回目に読み取る時間であり、前記画素滞留時間は、スポット中心が単一の物側画素に留まる時間であり、前記フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った、サンプリング画素値と呼ばれる画素値であることを特徴とする請求項１に記載の低蛍光漂白共焦点イメージング方法。
【請求項３】
リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値との比較結果に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御するのは、
前記意思決定時間からフィードバックを読み取って前記閾値と比較し、フィードバックが前記低閾値未満である場合、画素の光照射時間をオフにし、フィードバックが前記高閾値よりも高い場合、画素の光照射時間をオフにするステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の低蛍光漂白共焦点イメージング方法。
【請求項４】
共焦点イメージングモジュール、電子制御モジュール、及びマスターコンピュータモジュールを備え、前記共焦点イメージングモジュールは、レーザー、光強度調整部材、高速光スイッチ、ダイクロイックミラー、反射鏡、リレーレンズ、チューブレンズ、対物レンズ、変位プラットフォーム、検出器、ピンホール、及び検出レンズを備え、前記電子制御モジュールは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記マスターコンピュータモジュールは、前記電子制御モジュールに電気的に接続され、
前記共焦点イメージングモジュールは、基準画像を形成することに用いられ、前記マスターコンピュータモジュールは、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記電子制御モジュールは、蛍光強度フィードバックの値を取得して前記閾値と比較し、最後に、比較結果に基づいて、前記高速光スイッチの開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、前記フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値であることを特徴とする低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。
【請求項５】
前記電子制御モジュールは、中央制御ユニットと光スイッチ制御ユニットから構成され、前記中央制御ユニットは、前記マスターコンピュータモジュールに電気的に接続されることに用いられ、前記光スイッチ制御ユニットは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記中央制御ユニットは、イーサネットを介して前記マスターコンピュータモジュールとリアルタイムに通信し、マスターコンピュータの送信したタスク命令を受信して解析し、ハードウェア状態を前記マスターコンピュータモジュールにフィードバックし、前記光スイッチ制御ユニットは、前記中央制御ユニットの命令に従って、前記高速光スイッチのオンを制御するための制御波形を出力することで、光路中の画素の光照射時間を制御する、ことを特徴とする請求項４に記載の低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。
【請求項６】
前記中央制御ユニットは、さらに、前記検出器及び変位プラットフォームに電気的に接続されることを特徴とする請求項５に記載の低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡の技術分野に関し、特に、低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光漂白の３つの要因は、蛍光分子、化学環境、光線量であり、漂白低減技術は、主にこの３つの点から対策を取り、特殊な蛍光染料たとえば量子ドットを使用する方法、又は耐漂白剤を添加するなど、蛍光分子の化学環境を変える方法は、通常の生物学的サンプルに適しておらず、イメージング技術を改良することにより光線量を減少させる方法のほうは、通常の生物学的サンプルに適している。
【０００３】
現在、共焦点顕微イメージングのすべてには、大口径の対物レンズを用いてフォーカスイメージングを行い、形成された高パワー密度のフォーカススポットがサンプルの蛍光漂白を引き起こしやすい。蛍光漂白を回避するために、単に光パワー密度を低下させるか、光照射時間を減少して光線量を減らすことにより、蛍光漂白の問題を軽減することができるが、有効蛍光信号が低下し、画像の細部が失われ、信号対雑音比が低下してしまう。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
これを鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びイメージングシステムに適用し、画像の品質を損なわずに光線量を制御して光漂白を減少させ得るイメージング技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成させるために、本発明は下記の技術案を採用する。
【０００６】
低蛍光漂白共焦点イメージング方法であって、
１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定するステップと、
ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値であるリアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値との比較結果に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御するステップと、
低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得するステップと、を含む。
【０００７】
いくつかの好適な実施例では、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定するのは、
前記基準画素中の５％の最大画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）を高閾値に設定するステップと、
前記基準画素中の５％の最小画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）＋背景雑音の平均値を低閾値に設定するステップと、を含み、
前記意思決定時間は、フィードバックを一回目に読み取る時間であり、前記画素滞留時間は、スポット中心が単一の物側画素に留まる時間であり、前記フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った、サンプリング画素値と呼ばれる画素値である。
【０００８】
いくつかの好適な実施例では、前記閾値に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御するのは、
前記意思決定時間からフィードバックを読み取って判断し、フィードバックが前記低閾値未満である場合、画素の光照射時間をオフにし、フィードバックが前記高閾値よりも高い場合、画素の光照射時間をオフにするステップを含む。
【０００９】
また、本発明は、共焦点イメージングモジュール、電子制御モジュール、及びマスターコンピュータモジュールを備え、前記共焦点イメージングモジュールは、レーザー、光強度調整部材、高速光スイッチ、ダイクロイックミラー、反射鏡、リレーレンズ、チューブレンズ、対物レンズ、変位プラットフォーム、検出器、ピンホール、及び検出レンズを備え、前記電子制御モジュールは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記マスターコンピュータモジュールは、前記電子制御モジュールに電気的に接続され、
前記共焦点イメージングモジュールは、基準画像を形成することに用いられ、前記マスターコンピュータモジュールは、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記電子制御モジュールは、蛍光強度フィードバックの値を取得して前記閾値と比較し、最後に、比較結果に基づいて、前記高速光スイッチの開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、前記フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値である低蛍光漂白共焦点イメージングシステムをさらに提供する。
【００１０】
いくつかの好適な実施例では、前記電子制御モジュールは、中央制御ユニットと光スイッチ制御ユニットから構成され、前記中央制御ユニットは、前記マスターコンピュータモジュールに電気的に接続されることに用いられ、前記光スイッチ制御ユニットは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記中央制御ユニットは、イーサネットを介して前記マスターコンピュータモジュールとリアルタイムに通信し、マスターコンピュータの送信したタスク命令を受信して解析し、ハードウェア状態を前記マスターコンピュータモジュールにフィードバックし、前記光スイッチ制御ユニットは、前記中央制御ユニットの命令に従って、前記高速光スイッチのオンを制御するための制御波形を出力することで、光路中の画素の光照射時間を制御する。
【００１１】
いくつかの好適な実施例では、前記中央制御ユニットは、さらに、前記検出器及び変位プラットフォームに電気的に接続される。
【考案の効果】
【００１２】
本発明では、上記技術案による利点は以下のとおりである。
【００１３】
本発明に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びシステムでは、まず、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、次に、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御し、最後に、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。本発明に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びシステムでは、各物側画素の光照射時間を制御することで、蛍光情報をより効率的に利用し、画像の品質を維持しながら、蛍光漂白を低減させることができ、様々な生物学的サンプルに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の実施例又は従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に説明するが、無論、以下の説明における図面は本発明の実施例の一部に過ぎず、当業者であれば、創造的な努力を必要とせずに、これらの図面に基づいて他の図面を得ることもできる。
【図１】本発明の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法のステップのフローチャートである。
【図２（ａ）】本発明の実施例１に係る蛍光分子が極めて低密度である場合のフィードバック判断過程の模式図である。
【図２（ｂ）】本発明の実施例１に係る蛍光分子が高密度である場合フィードバック判断過程の模式図である。
【図２（ｃ）】本発明の実施例１に係る蛍光分子の密度が中等である場合のフィードバック判断過程の模式図である。
【図３】本発明の実施例１に係る高閾値の判断過程の段階的な模式図である。
【図４（ａ）】本発明の実施例１に係る画素の光照射時間の分布図である。
【図４（ｂ）】本発明の実施例１に係るサンプリング画素値の分布図である。
【図４（ｃ）】本発明の実施例１に係るＣＬＥ−ＣＭ復元画像である。
【図５】本発明の実施例２に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムの構造模式図である。
【図６】本発明の実施例２に係る電子制御モジュールの作動原理模式図である。
【考案を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施例の図面を参照しながら、本発明の実施例の技術案を明瞭かつ完全に説明するが、無論、説明する実施例は、本発明の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに得たすべてのほかの実施例は、本発明が保護する範囲に属する。
【００１６】
実施例１
図１は、本発明の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法１０のステップのフローチャートであり、ステップＳ１１０〜ステップＳ１３０を含む。
【００１７】
ステップＳ１１０：１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定する。
【００１８】
なお、低蛍光漂白共焦点イメージング方法（Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ−Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＣＬＥ−ＣＭ）では、イメージング前に、１つの基準共焦点画像を基準画像として、該基準画像について閾値を設定する。
【００１９】
いくつかの好適な実施例では、上記ステップＳ１１０は、具体的には、
前記基準画素中の５％の最大画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）を高閾値に設定するステップＳ１１１と、
前記基準画素中の５％の最小画素値の平均値・（意思決定時間／画素滞留時間）＋背景雑音の平均値を低閾値に設定するステップＳ１１２と、を含む。
【００２０】
ステップＳ１２０、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値との比較結果に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御する。
【００２１】
本実施例では、フィードバックとは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取ったサンプリング画素値と呼ばれる画素値Ｉであり、フィードバックを一回目に読み取る時間Ｔｄは意思決定時間、スポット中心が単一の物側画素に留まる時間Ｔｐは画素滞留時間、ＣＬＥ−ＣＭレーザー光の実際オン時間Ｔｅは画素実際光照射時間、Ｔｅに対応するＩｅは実際画素値と呼ばれる。
【００２２】
いくつかの好適な実施例では、ステップＳ１２０は、具体的には、ステップＳ１２１とステップＳ１２２を含む。
【００２３】
ステップＳ１２１、前記意思決定時間からフィードバックを読み取って判断し、フィードバックが前記低閾値未満である場合、画素の光照射時間をオフにする。
【００２４】
なお、各画素走査過程前の短時間内で光照射を保ち、意思決定時間からフィードバックを読み取って判断し、フィードバックが低閾値に達していない場合、画素内の蛍光分子が極めて低密度であることを示し、蛍光情報を提供できず、直ちにレーザー光をオフにし、つまり画素の光照射時間をオフにし、図２（ａ）には、蛍光分子が極めて低密度である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されている。
【００２５】
ステップＳ１２２、フィードバックが前記高閾値よりも高い場合、画素の光照射時間をオフにする。
【００２６】
なお、フィードバックが高閾値に達した場合、画素内の蛍光分子が十分に高密度であり、十分な蛍光情報を取得したことを示し、すぐにレーザー光をオフにし、画素の光照射時間をオフにし、図２（ｂ）には、蛍光分子が高密度である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されており、画素滞留時間の終了時のサンプリング画素値が高閾値に達していない場合、該画素内の蛍光分子の密度が中等であり、光線量が過剰ではないことを示し、図２（ｃ）には、蛍光分子密が中等である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されている。
【００２７】
さらに、フィードバック判断の理想的な状況は、リアルタイムでフィードバックを監視し、高閾値に達した時刻にレーザー光をオフにするが、実際には、このようなリアルタイム監視が困難であるため、近似法を使用し、画素滞留時間を図３に示すようなＮ個の期間に分け、各期間の末期にフィードバックを読み取る。また、画素実際光照射時間は、数式１のように表される。
【００２８】
【数１】
0003232024.tif 000003
【００２９】
ここで、δＴは隣接する判断の時間間隔である。理論的には、Ｎが大きいほど、ｋの取る値の範囲が大きくなり、画素光照射時間の変化が微細になる。
【００３０】
ステップＳ１３０、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。
【００３１】
なお、ＣＬＥ−ＣＭでは、１つの画像の走査が終了すると、２組のデータが得られ、一方は、図４（ａ）に示すように、各画素の実際の光照射時間であり、他方は、図４（ｂ）に示すように、各画素の実際の画素値である。
【００３２】
レーザー光の強度が一定であるため、蛍光が飽和しておらず、蛍光強度が変わらないと、画素値は蛍光強度と画素滞留時間Ｔ＿ｐ内の光照射時間との積に等しく、図４（ｃ）に示すように両方の線形関係に従ってＣＬＥ−ＣＭ画像を復元できる。
【００３３】
本発明の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法では、まず、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、次に、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御し、最後に、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。上記方法は、各物側画素の光照射時間を制御することで、蛍光情報をより効率的に利用し、画像の品質を維持しながら、蛍光漂白を低減させることができ、様々な生物学的サンプルに適用できる
【００３４】
実施例２
図５は、本発明の実施例２に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステム２０の構造模式図であり、共焦点イメージングモジュール２１０、電子制御モジュール２２０及びマスターコンピュータモジュール２３０を備える。前記共焦点イメージングモジュール２１０は、レーザー２１１、光強度調整部材２１２、高速光スイッチ２１３、ダイクロイックミラー２１４、反射鏡２１５、リレーレンズ２１６、チューブレンズ２１７、対物レンズ２１８、変位プラットフォーム２１９、検出器２１１０、ピンホール２１１１及び検出レンズ２１１２を備える。前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３に電気的に接続される。前記マスターコンピュータモジュール２３０は、前記電子制御モジュール２２０に電気的に接続される。
【００３５】
なお、前記共焦点イメージングモジュール２１０は基準画像として共焦点画像を取得し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、また、蛍光分子密度に基づいて前記電子制御モジュールの作動を制御し、前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで画素の光照射時間を制御する。
【００３６】
図６に示すように、前記電子制御モジュール２２０は、中央制御ユニット２２１と光スイッチ制御ユニット２２２とから構成される。前記中央制御ユニット２２１は、前記マスターコンピュータモジュール２３０に電気的に接続される。前記光スイッチ制御ユニット２２２は前記高速光スイッチ２１３に電気的に接続される。
【００３７】
中央制御ユニット２２１は、ＡＲＭ、ＦＰＧＡ制御ボードからなり、中央制御ユニット２２１は、イーサネットを介してマスターコンピュータモジュール２３０とリアルタイムに通信し、マスターコンピュータモジュール２３０の送信したタスク命令を受信して解析し、また、中央制御ユニット２２１は、ハードウェア状態をマスターコンピュータモジュール２３０にフィードバックし、各ハードウェア制御ユニットを効果的に制御できる。
【００３８】
光スイッチ制御ユニット２２２は、中央制御ユニット２２１からのフィードバックを受信し、閾値と比較し、判断結果に基づいて制御波形を出力し、前記制御波形は、高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで、光路中のレーザー光のオン・オフを制御する。
【００３９】
いくつかの好適な実施例では、前記中央制御ユニット２２１は、また前記検出器２１１０及び変位プラットフォーム２１９に電気的に接続され、前記中央制御ユニット２２１によって検出器２１１０と変位プラットフォーム２１９への走査を同期制御し、光線量を制御可能な共焦点イメージングを可能とする。
【００４０】
本発明に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムは、共焦点イメージングモジュール２１０、電子制御モジュール２２０及びマスターコンピュータモジュール２３０を備え、前記共焦点イメージングモジュール２１０は、基準画像として画像共焦点画像を取得し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、また、蛍光分子密度に基づいて前記電子制御モジュールの作動を制御することに用いられ、前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、それにより、共焦点イメージング時の蛍光漂白を効果的に低減させ、生物研究への共焦点イメージング技術の適用に寄与する。
【００４１】
もちろん、本発明の低蛍光漂白共焦点イメージング方法にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本発明の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形を含むべきである。
【図１】
0003232024.tif 000004
【図２】
0003232024.tif 000005
【図３】
0003232024.tif 000006
【図４】
0003232024.tif 000007
【図５】
0003232024.tif 000008
【図６】
0003232024.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月25日(2020.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、共焦点顕微鏡の技術分野に関し、特に、低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光漂白の３つの要因は、蛍光分子、化学環境、光線量であり、漂白低減技術は、主にこの３つの点から対策を取る。このうち、特殊な蛍光染料たとえば量子ドットを使用する方法、又は耐漂白剤を添加するなど、蛍光分子の化学環境を変える方法は、通常の生物学的サンプルには適しておらず、イメージング技術を改良することにより光線量を減少させる方法のほうが、通常の生物学的サンプルに適している。
【０００３】
現在、共焦点顕微イメージングには、すべて大口径の対物レンズを用いたフォーカスイメージングが採用されており、形成された高パワー密度のフォーカススポットがサンプルの蛍光漂白を引き起こしやすい。蛍光漂白を回避するために、単に光パワー密度を低下させるか、光照射時間を減少させて光線量を減らすことにより、蛍光漂白の問題を軽減することができるが、有効蛍光信号が低下し、画像の細部が失われ、信号対雑音比が低下してしまう。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
これに鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、低蛍光漂白共焦点イメージング方法及びイメージングシステムに適用し、画像の品質を損なわずに光線量を制御して光漂白を減少させ得るイメージング技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成させるために、本考案は下記の技術案を採用する。
【０００６】
本考案は、共焦点イメージングモジュール、電子制御モジュール、及びマスターコンピュータモジュールを備え、前記共焦点イメージングモジュールは、レーザー、光強度調整部材、高速光スイッチ、ダイクロイックミラー、反射鏡、リレーレンズ、チューブレンズ、対物レンズ、変位プラットフォーム、検出器、ピンホール、及び検出レンズを備え、前記電子制御モジュールは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記マスターコンピュータモジュールは、前記電子制御モジュールに電気的に接続され、前記共焦点イメージングモジュールは、基準画像を形成することに用いられ、前記マスターコンピュータモジュールは、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記電子制御モジュールは、蛍光強度フィードバックの値を取得して前記閾値と比較し、最後に、比較結果に基づいて、前記高速光スイッチの開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、前記フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値である低蛍光漂白共焦点イメージングシステムを提供する。
【０００７】
いくつかの好適な実施例では、前記電子制御モジュールは、中央制御ユニットと光スイッチ制御ユニットから構成され、前記中央制御ユニットは、前記マスターコンピュータモジュールに電気的に接続されることに用いられ、前記光スイッチ制御ユニットは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記中央制御ユニットは、イーサネットを介して前記マスターコンピュータモジュールとリアルタイムに通信し、マスターコンピュータの送信したタスク命令を受信して解析し、ハードウェア状態を前記マスターコンピュータモジュールにフィードバックし、前記光スイッチ制御ユニットは、前記中央制御ユニットの命令に従って、前記高速光スイッチのオン／オフを制御するための制御波形を出力することで、光路中の画素の光照射時間を制御する。
【０００８】
いくつかの好適な実施例では、前記中央制御ユニットは、さらに、前記検出器及び変位プラットフォームに電気的に接続される。
【考案の効果】
【０００９】
本考案による効果は以下のとおりである。
【００１０】
本考案に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムでは、まず、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、次に、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御し、最後に、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。また、本考案に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムでは、各物側画素の光照射時間を制御することで、蛍光情報をより効率的に利用し、画像の品質を維持しながら、蛍光漂白を低減させることができるため、様々な生物学的サンプルに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本考案の実施例又は従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に説明するが、無論、以下の説明における図面は本考案の実施例の一部に過ぎず、当業者であれば、創造的な努力を必要とせずに、これらの図面に基づいて他の実施例を得ることもできる。
【図１】本考案の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法のステップのフローチャートである。
【図２（ａ）】本考案の実施例１に係る蛍光分子が極めて低密度である場合のフィードバック判断過程の模式図である。
【図２（ｂ）】本考案の実施例１に係る蛍光分子が高密度である場合フィードバック判断過程の模式図である。
【図２（ｃ）】本考案の実施例１に係る蛍光分子の密度が中等である場合のフィードバック判断過程の模式図である。
【図３】本考案の実施例１に係る高閾値の判断過程の段階的な模式図である。
【図４（ａ）】本考案の実施例１に係る画素の光照射時間の分布図である。
【図４（ｂ）】本考案の実施例１に係るサンプリング画素値の分布図である。
【図４（ｃ）】本考案の実施例１に係るＣＬＥ−ＣＭ復元画像である。
【図５】本考案の実施例２に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムの構造模式図である。
【図６】本考案の実施例２に係る電子制御モジュールの作動原理模式図である。
【考案を実施するための形態】
【００１２】
以下、本考案の実施例の図面を参照しながら、本考案の実施例の技術案を明瞭かつ完全に説明するが、無論、説明する実施例は、本考案の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。本考案の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに得たすべてのほかの実施例は、本考案が保護する範囲に属する。
【００１３】
実施例１
図１は、本考案の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージング方法１０のステップのフローチャートであり、ステップＳ１１０〜ステップＳ１３０を含む。
【００１４】
ステップＳ１１０では、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定する。
【００１５】
なお、低蛍光漂白共焦点イメージング方法（Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ−Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＣＬＥ−ＣＭ）では、イメージング前に、１つの基準共焦点画像を基準画像として、該基準画像について閾値を設定する。
【００１６】
いくつかの好適な実施例では、上記ステップＳ１１０は、具体的には、前記基準画素中の５％の最大画素値の平均値×（意思決定時間／画素滞留時間）を高閾値に設定するステップＳ１１１と、前記基準画素中の５％の最小画素値の平均値×（意思決定時間／画素滞留時間）＋背景雑音の平均値を低閾値に設定するステップＳ１１２と、を含む。
【００１７】
ステップＳ１２０では、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値との比較結果に基づいて、画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御する。
【００１８】
本実施例では、フィードバックとは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取ったサンプリング画素値と呼ばれる画素値Ｉであり、フィードバックを一回目に読み取る時間Ｔｄは意思決定時間、スポット中心が単一の物側画素に留まる時間Ｔｐは画素滞留時間、ＣＬＥ−ＣＭレーザー光が実際にオンにされた時間Ｔｅは画素実際光照射時間、Ｔｅに対応するＩｅは実際画素値と呼ばれる。
【００１９】
いくつかの好適な実施例では、ステップＳ１２０は、具体的には、ステップＳ１２１とステップＳ１２２を含む。
【００２０】
ステップＳ１２１では、前記意思決定時間からフィードバックを読み取って判断し、フィードバックが前記低閾値未満である場合、画素の光照射時間を停止させる。
【００２１】
すなわち、各画素走査過程前の短時間内で光照射を保ち、意思決定時間からフィードバックを読み取って判断し、フィードバックが低閾値に達していない場合、画素内の蛍光分子が極めて低密度であることを示し、蛍光情報を提供できないため、直ちにレーザー光をオフにし、画素の光照射時間を停止させる。図２（ａ）には、蛍光分子が極めて低密度である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されている。
【００２２】
ステップＳ１２２では、フィードバックが前記高閾値よりも高い場合、画素の光照射時間を停止させる。
【００２３】
すなわち、フィードバックが高閾値に達した場合、画素内の蛍光分子が十分に高密度であり、十分な蛍光情報を取得したことを示すため、すぐにレーザー光をオフにし、画素の光照射時間を停止させる。図２（ｂ）には、蛍光分子が高密度である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されており、画素滞留時間の終了時のサンプリング画素値が高閾値に達していない場合、該画素内の蛍光分子の密度が中等であり、光線量が過剰ではないことを示し、図２（ｃ）には、蛍光分子密が中等である場合のフィードバック判断過程の模式図が示されている。
【００２４】
さらに、フィードバック判断の理想的な状況は、リアルタイムでフィードバックを監視し、高閾値に達した時刻にレーザー光をオフにするが、実際には、このようなリアルタイム監視が困難であるため、近似法を使用し、画素滞留時間を図３に示すようなＮ個の期間に分け、各期間の末期にフィードバックを読み取る。この場合、画素実際光照射時間Ｔｅは、数１のように計算される。
【数１】
0003232024.tif 000010
【００２５】
ここで、δＴは隣接する判断の時間間隔である。理論的には、Ｎが大きいほど、ｋの取る値の範囲が大きくなり、画素光照射時間の変化が微細になる。
【００２６】
ステップＳ１３０では、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。
【００２７】
なお、ＣＬＥ−ＣＭでは、１つの画像の走査が終了すると、２組のデータが得られ、一方は、図４（ａ）に示すように、各画素の実際の光照射時間であり、他方は、図４（ｂ）に示すように、各画素の実際の画素値である。
【００２８】
レーザー光の強度が一定であるため、蛍光が飽和しておらず、蛍光強度が変わらないと、画素値は蛍光強度と画素滞留時間Ｔｐ内の光照射時間との積に等しいため、図４（ｃ）に示すように両方の線形関係に従ってＣＬＥ−ＣＭ画像を復元できる。
【００２９】
本考案の実施例１に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムでは、まず、１つの共焦点画像を基準画像として、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、次に、リアルタイム蛍光強度のフィードバックと前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、画素内の蛍光分子密度に基づき、画素の光照射時間を制御し、最後に、低蛍光漂白共焦点イメージング画像を取得する。上記方法は、各物側画素の光照射時間を制御することで、蛍光情報をより効率的に利用し、画像の品質を維持しながら、蛍光漂白を低減させることができ、様々な生物学的サンプルに適用できる。
【００３０】
実施例２
図５は、本考案の実施例２に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステム２０の構造模式図であり、共焦点イメージングモジュール２１０、電子制御モジュール２２０及びマスターコンピュータモジュール２３０を備える。前記共焦点イメージングモジュール２１０は、レーザー２１１、光強度調整部材２１２、高速光スイッチ２１３、ダイクロイックミラー２１４、反射鏡２１５、リレーレンズ２１６、チューブレンズ２１７、対物レンズ２１８、変位プラットフォーム２１９、検出器２１１０、ピンホール２１１１及び検出レンズ２１１２を備える。前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３に電気的に接続される。前記マスターコンピュータモジュール２３０は、前記電子制御モジュール２２０に電気的に接続される。
【００３１】
なお、前記共焦点イメージングモジュール２１０は基準画像として共焦点画像を取得し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、また、蛍光分子密度に基づいて前記電子制御モジュールの作動を制御し、前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで画素の光照射時間を制御する。
【００３２】
図６に示すように、前記電子制御モジュール２２０は、中央制御ユニット２２１と光スイッチ制御ユニット２２２とから構成される。前記中央制御ユニット２２１は、前記マスターコンピュータモジュール２３０に電気的に接続される。前記光スイッチ制御ユニット２２２は前記高速光スイッチ２１３に電気的に接続される。
【００３３】
中央制御ユニット２２１は、ＡＲＭ、ＦＰＧＡ制御ボードからなり、中央制御ユニット２２１は、イーサネットを介してマスターコンピュータモジュール２３０とリアルタイムに通信し、マスターコンピュータモジュール２３０の送信したタスク命令を受信して解析し、また、中央制御ユニット２２１は、ハードウェア状態をマスターコンピュータモジュール２３０にフィードバックし、各ハードウェア制御ユニットを効果的に制御できる。
【００３４】
光スイッチ制御ユニット２２２は、中央制御ユニット２２１からのフィードバックを受信し、閾値と比較し、判断結果に基づいて制御波形を出力し、前記制御波形は、高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで、光路中のレーザー光のオン・オフを制御する。
【００３５】
いくつかの好適な実施例では、前記中央制御ユニット２２１は、また前記検出器２１１０及び変位プラットフォーム２１９に電気的に接続され、前記中央制御ユニット２２１によって検出器２１１０と変位プラットフォーム２１９への走査を同期制御し、光線量を制御可能な共焦点イメージングを可能とする。
【００３６】
本考案に係る低蛍光漂白共焦点イメージングシステムは、共焦点イメージングモジュール２１０、電子制御モジュール２２０及びマスターコンピュータモジュール２３０を備え、前記共焦点イメージングモジュール２１０は、基準画像として画像共焦点画像を取得し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記閾値に基づいて画素内の蛍光分子密度を判断し、前記マスターコンピュータモジュール２３０は、また、蛍光分子密度に基づいて前記電子制御モジュールの作動を制御することに用いられ、前記電子制御モジュール２２０は、前記高速光スイッチ２１３の開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、それにより、共焦点イメージング時の蛍光漂白を効果的に低減させ、生物研究への共焦点イメージング技術の適用に寄与する。
【００３７】
もちろん、本考案の低蛍光漂白共焦点イメージング方法にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本考案の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形が含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
共焦点イメージングモジュール、電子制御モジュール、及びマスターコンピュータモジュールを備え、前記共焦点イメージングモジュールは、レーザー、光強度調整部材、高速光スイッチ、ダイクロイックミラー、反射鏡、リレーレンズ、チューブレンズ、対物レンズ、変位プラットフォーム、検出器、ピンホール、及び検出レンズを備え、
前記電子制御モジュールは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記マスターコンピュータモジュールは、前記電子制御モジュールに電気的に接続され、
前記共焦点イメージングモジュールは、基準画像を形成することに用いられ、前記マスターコンピュータモジュールは、前記基準画像の画素値に基づいて閾値を設定し、前記電子制御モジュールは、蛍光強度フィードバックの値を取得して前記閾値と比較し、最後に、比較結果に基づいて、前記高速光スイッチの開閉を制御することで画素の光照射時間を制御し、
前記蛍光強度フィードバックは、ある画素の走査過程におけるある時刻に読み取った画素値であることを特徴とする低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。
【請求項２】
前記電子制御モジュールは、中央制御ユニットと光スイッチ制御ユニットから構成され、前記中央制御ユニットは、前記マスターコンピュータモジュールに電気的に接続されることに用いられ、前記光スイッチ制御ユニットは、前記高速光スイッチに電気的に接続され、前記中央制御ユニットは、イーサネットを介して前記マスターコンピュータモジュールとリアルタイムに通信し、マスターコンピュータの送信したタスク命令を受信して解析し、ハードウェア状態を前記マスターコンピュータモジュールにフィードバックし、前記光スイッチ制御ユニットは、前記中央制御ユニットの命令に従って、前記高速光スイッチのオンを制御するための制御波形を出力することで、光路中の画素の光照射時間を制御する、ことを特徴とする請求項１に記載の低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。
【請求項３】
前記中央制御ユニットは、さらに、前記検出器及び変位プラットフォームに電気的に接続されることを特徴とする請求項２に記載の低蛍光漂白共焦点イメージングシステム。