(57)【要約】  サリチル酸等の芳香族化合物及びその誘導体を高い生産性で微生物によって製造する方法を提供する。  微生物のホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制し、該微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制し、そして該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入することを含む、糖代謝経路が改変された微生物の製造方法、該方法によって得られる改変された微生物、並びに該微生物を培養し、培養液から芳香族化合物等を回収することを含む、芳香族化合物及びその誘導体の製造方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖代謝経路が改変された微生物の製造方法であって、
微生物のホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制し、
該微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制し、そして
該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入する、
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
更にコリスミ酸からL-フェニルアラニンを合成する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
芳香族化合物がサリチル酸であり、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
芳香族化合物が4-ヒドロキシ安息香酸であり、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
芳香族化合物が3-ヒドロキシ安息香酸であり、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
芳香族化合物が4-アミノ安息香酸であり、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
芳香族化合物が2-アミノ安息香酸であり、アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
芳香族化合物がL-チロシンであり、コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
芳香族化合物がフェノールであり、チロシンフェノールリアーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
更にサリチル酸1-モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子及びカテコール1,2-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を導入する、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
更に3-ヒドロキシ安息香酸からゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、及び／又はマレイン酸を合成することを可能とする1種以上の遺伝子を導入する、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法によって得られる、糖代謝経路が改変された微生物。
【請求項１３】
微生物が細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される、請求項１２記載の微生物。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の微生物を培養し、培養液から芳香族化合物又はその誘導体を回収することを含む、芳香族化合物又はその誘導体の製造方法。
【請求項１５】
芳香族化合物がサリチル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、3-ヒドロキシ安息香酸、4-アミノ安息香酸、2-アミノ安息香酸、L-チロシン、又はフェノールであり、誘導体がムコン酸、ゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、又はマレイン酸である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
炭素源としてグルコースのみを添加する、請求項１４又は１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖代謝経路が改変された微生物の製造方法に関する。本発明はまた、該方法によって得られる改変された微生物、並びに該微生物を培養し、培養液から芳香族化合物又はその誘導体を回収することを含む、芳香族化合物等の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
持続可能な社会形成のために、環境負荷が大きく、また将来的な枯渇が懸念される石油依存型社会から、再生可能なバイオマス資源に依存したバイオリファイナリー型の社会への変革が求められており、近年、微生物を利用した芳香族化合物の製造が注目を集めている。【０００３】
微生物の代謝経路では、多くの芳香族化合物がシキミ酸経路を介して合成され得る。シキミ酸経路の最初の反応は、エリトロース-4-リン酸(E4P)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)から3-デオキシ-D-ヘプツロソン酸-7-リン酸(DAHP)への、DAHPシンターゼによって触媒される縮合反応である。この反応に続いて、芳香族アミノ酸を含む種々の芳香族化合物が、共通の前駆物質であるコリスミ酸を介して生成する。コリスミ酸は、わずかなステップによって数種の芳香族化合物に変換することが可能であり、芳香族化合物の生合成経路における主要な化合物となり得る。【０００４】
コリスミ酸誘導体であるサリチル酸は、医薬品・化粧品・食品等に利用される最も重要な芳香族化合物の一つであり、例えばアスピリン及びラミブジン(抗-HIV薬)製造の前駆物質である。近年では、微生物的及び化学的方法によってサリチル酸をナイロン-6,6の原料であるアジピン酸に変換させることができることが報告されている。【０００５】
微生物等の生体内において、サリチル酸は、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換するイソコリスミ酸シンターゼ（ICS）、及びイソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促すイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（IPL）によって触媒される2つの反応を介して合成され得る。非特許文献１においては、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来のサリチル酸合成遺伝子の解析を行い、上記2種の酵素の作用によってコリスミ酸からサリチル酸を生合成できることが示されている。また、大腸菌におけるICSであるEntCと緑膿菌由来のIPL（PchB）とを大腸菌で発現させ、サリチル酸を合成したことが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの方法でのサリチル酸の生産性は低く、実用上有効な生合成方法は未だに開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｒｉｎｏ  Ｌ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９５年、２４９巻、２号、２１７〜２２８ページ
【非特許文献２】Ｌｉｎ  Ｙ．ら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．、２０１４年、２３巻、６２〜６９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、サリチル酸合成酵素を大腸菌に発現させただけでは、満足できる程の生産性を得ることはできなかった。これは、大腸菌内で行われる種々の複雑な酵素反応の存在により、所望の反応を組み込むだけでは目的化合物の高い生産性が得られないことを示唆するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、芳香族化合物の生合成経路への炭素の流れを改善するために、いくつかの戦略を検討した。シキミ酸経路では、細胞内でのPEP及びE4Pの利用性が最も重要な因子の一つであり、芳香族化合物合成経路を強化する上で、細胞内でのPEP利用量の強化が重要である。【０００９】
微生物の主要な代謝経路において、PEPを消費する反応は2つ存在する。一方はホスホトランスフェラーゼ系(PTS)を用いたグルコースの取り込みであり、グルコース1 molを取り込むために1 molのPEPが消費されてピルビン酸となる。他方は解糖経路におけるピルビン酸キナーゼによるPEPのピルビン酸への変換である（図１）。【００１０】
PEP及びE4Pの利用性を改善するために、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsA）及びトランスケトラーゼ（tktA）を過剰発現させることが知られている。従って、これらの遺伝子の導入は、芳香族化合物の生産性を高める方法となり得るが、tktAによって触媒される反応は可逆反応であるため、反応はE4Pを蓄積する方向だけに進む訳ではない。また、ppsAを過剰発現させても、上記のPTS及びピルビン酸キナーゼによる反応の方がはるかに進行しやすく、十分な効果が得られていなかった。【００１１】
本発明者等は、芳香族化合物の合成のために炭素の流れを改変するには、上記の2つの反応でPEPを消費しないように代謝経路を改変することが必要と考え、種々検討する中で、サリチル酸合成に関する遺伝子を導入すると共に、細胞内でPEPをピルビン酸に変換する上記の2つの反応を不活化した結果、サリチル酸及びL-フェニルアラニンの生成量を、元の株よりもそれぞれ3倍及び2倍に上昇させることができた。【００１２】
次いで、サリチル酸合成への炭素の流れがL-フェニルアラニンへの炭素の流れと競合することにも着目し、L-フェニルアラニンの生合成経路を不活化することで、サリチル酸の生産性を更に向上させて収率を増大させることができた。この場合、微生物は、主としてサリチル酸合成経路を介してピルビン酸を得ることとなる。【００１３】
上記の改変により、PEP及びE4Pの利用性についてこれまで良く研究されてきた遺伝子(tktA、ppsA及びcsrB)を導入せずに、唯一の炭素源としてのグルコースからのサリチル酸の生産性を改良することができた。【００１４】
更に、得られた株を用いて4-ヒドロキシ安息香酸(PHBA)、3-ヒドロキシ安息香酸 (3HBA)、4-アミノ安息香酸(4ABA)、2-アミノ安息香酸 (2ABA)、L-チロシン、フェノール、cis,cis-ムコン酸(MA)、ゲンチジン酸、マレイルピルビン酸及びマレイン酸等の他のコリスミ酸誘導体の産生にも応用し、その多用途性を実証することができた。従って、本発明者等が作製した細胞株は、微生物における芳香族化合物生産のためのプラットフォーム細胞株となり得る。【００１５】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  糖代謝経路が改変された微生物の製造方法であって、
微生物のホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制し、
該微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制し、そして
該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入する、
ことを含む、上記方法。
２．  更にコリスミ酸からL-フェニルアラニンを合成する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを含む、上記１記載の方法。
３．  芳香族化合物がサリチル酸であり、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
４．  芳香族化合物が4-ヒドロキシ安息香酸であり、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
５．  芳香族化合物が3-ヒドロキシ安息香酸であり、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
６．  芳香族化合物が4-アミノ安息香酸であり、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
７．  芳香族化合物が2-アミノ安息香酸であり、アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
８．  芳香族化合物がL-チロシンであり、コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
９．  芳香族化合物がフェノールであり、チロシンフェノールリアーゼをコードする遺伝子を導入する、上記１又は２記載の方法。
１０．  更にサリチル酸1-モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子及びカテコール1,2-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を導入する、上記３記載の方法。
１１．  更に微生物が3-ヒドロキシ安息香酸からゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、及び／又はマレイン酸を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を導入する、上記５記載の方法。
１２．  上記１〜１１のいずれか記載の方法によって得られる、糖代謝経路が改変された微生物。
１３．  微生物が細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される、上記１２記載の微生物。
１４．  上記１２又は１３記載の微生物を培養し、培養液から芳香族化合物又はその誘導体を回収することを含む、芳香族化合物又はその誘導体の製造方法。
１５．  芳香族化合物がサリチル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、3-ヒドロキシ安息香酸、4-アミノ安息香酸、2-アミノ安息香酸、L-チロシン、又はフェノールであり、誘導体がムコン酸、ゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、又はマレイン酸である、上記１４記載の方法。
１６．  炭素源としてグルコースのみを添加する、上記１４又は１５記載の方法。【００１６】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-165023号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、大腸菌などの微生物の代謝経路を改変し、細胞内のPEP利用性を増大し、同時にL-フェニルアラニンへの炭素源の流れを阻止することで、グルコース等の炭素源から芳香族化合物を多量に製造することができる。また、本発明によって見出された細胞株を用いれば、種々のコリスミ酸誘導体を製造することもできる。【００１８】
本発明に係る改変された微生物は、PHBA、3HBA、PABA、2ABA、チロシン、フェノール、ムコン酸、ゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、又はマレイン酸等の芳香族化合物を、5mL試験管培養条件下で、グラムスケールで生産することが可能である。本発明により、重要なジカルボン酸であるムコン酸の生産株を取得することに成功した。これはグルコースを単一炭素源に使用したムコン酸生産に関する初めての報告である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】大腸菌におけるサリチル酸生成の代謝経路を示す。
【図２】プラスミドpCFTdeltainの構造を模式的に示す。
【図３】CFT01株、CFT11株及びCFT31株の培養特性を示す。(A)OD600、(B)グルコース濃度、(C)サリチル酸濃度、及び(D)L-フェニルアラニン濃度の経時的変化を示す。
【図４】CFT51株の培養特性を示す。(A)OD600、(B)グルコース濃度、及び(C)サリチル酸濃度の経時的変化を示す。
【図５】CFT01株、CFT11株、CFT31株及びCFT51株におけるサリチル酸の収量及び単位菌体当たりのサリチル酸生産能を示す。
【図６】2-リットルのジャーファーメンターにおけるCFT01株及びCFT51株の培養特性を示し、CFT01株の(A)細胞増殖（OD600）、(B)グルコース濃度変化、(C)サリチル酸濃度変化、及びCFT51株の(D)細胞増殖（OD600）、(E)グルコース濃度変化、(F)サリチル酸濃度変化を示す。
【図７】コリスミ酸から種々の芳香族化合物が生成する経路を示す。
【図８】CFT5株を用いたコリスミ酸誘導体の生成量の増大を示す。(A)4-ヒドロキシ安息香酸（PHBA）、(B)3-ヒドロキシ安息香酸（3HBA）、(C)4-アミノ安息香酸（PABA）、(D)2-アミノ安息香酸（2ABA）、(E)L-チロシン、及び(F)フェノールの生成量及び収率をそれぞれ示す。
【図９】コリスミ酸からゲンチジン酸、マレイルピルビン酸を介してマレイン酸を合成するための経路を示す。
【図１０】CMtS09株及びCMtS10株の培養特性を示す。(A)及び(B)は、CMtS09株及びCMtS10株のOD600（●）及びグルコース濃度（□）の経時的変化をそれぞれ示し、(C)及び(D)は、CMtS09株及びCMtS10株におけるマレイン酸（●）、3-ヒドロキシ安息香酸（■）、及びゲンチジン酸（▲）の生成量をそれぞれ示す。
【図１１】CMtS091株及びCMtS101株の培養特性を示す。(A)及び(B)は、CMtS091株及びCMtS101株のOD600（●）及びグルコース濃度（□）の経時的変化をそれぞれ示し、(C)及び(D)は、CMtS091株及びCMtS101株におけるマレイン酸（●）、3-ヒドロキシ安息香酸（■）、及びゲンチジン酸（▲）の生成量をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上記の通り、本発明者等は、微生物において芳香族化合物を過剰発現させるための新規代謝経路を設計した。
【００２１】
すなわち、本発明は、糖代謝経路が改変された微生物の方法であって、
微生物のホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制し、
該微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制し、そして
該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入する、
ことを含む、上記方法を提供する。
【００２２】
本明細書において、「糖代謝経路」とは、グルコース等の糖類をエネルギー源及び各種化合物の生合成のための原料とするために分解及び変換するための種々の生体内反応系を意味するものとし、解糖経路、TCA回路、ペントースリン酸経路、シキミ酸経路等を含めるものとする。例えば、図１に示すサリチル酸の生合成経路は、本発明の方法による糖代謝経路の改変を説明するためのものであるが、本明細書における「糖代謝経路」はこれに限定されることを意図するものではない。当業者であれば、糖類としてグルコース以外の糖類、あるいは糖類の分解産物等を用いて本発明の方法を適用することができる「糖代謝経路」を容易に想定することができる。
【００２３】
図１に示すように、本発明の方法では、微生物の生体内において、コリスミ酸（Cho）を、まずイソコリスミ酸シンターゼ（ICS）によってイソコリスミ酸（(Iso)Cho）に変換させ、次いでイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（IPL）によってイソコリスミ酸からピルビン酸（Pyr）を放出し、サリチル酸を生成させるように改変する。後者の反応では、サリチル酸合成に伴って、イソコリスミ酸からピルビン酸が放出される。ピルビン酸は微生物にとって必須の化合物であり、サリチル酸生成の過程で得られたピルビン酸は解糖経路に利用され得る。本発明の方法は、微生物が本来有する糖代謝経路を、例えばサリチル酸が生成する場合にのみピルビン酸が生じるように改変して、サリチル酸等の芳香族化合物の過剰発現に適した微生物を取得するものである。
【００２４】
本発明の方法において導入する遺伝子は、いずれかの微生物が本来有するものであり得るが、種々の発現制御メカニズム等によって、通常の培養条件下では発現がほとんど又は全くないものである。本発明の方法によって、微生物を用いた目的の芳香族化合物の生産量を劇的に増大させることができる。
【００２５】
本発明において改変することが意図される糖代謝経路は、ほとんど全ての微生物が有している。従って、本発明の方法において糖代謝経路を改変し得る微生物としては、培養及び目的化合物の回収が容易な微生物であればいずれでも良く、特に限定するものではない。好適に使用できる微生物として、例えば大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、枯草菌（Bacillus subtillis）等のバチルス属細菌、ストレプトミセス属、ストレプトコッカス属等の放線菌等の細菌類；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピチア属酵母等の酵母類；アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等のアスペルギルス属菌等の真菌類等が挙げられる。
【００２６】
大腸菌を用いる場合には、好ましくは、シキミ酸経路（フェニルアラニン合成経路）が活性化されていることにより、コリスミ酸をより生産性高く合成できるという観点から、フェニルアラニン高生産性大腸菌株が好ましい。そのような大腸菌株としては、例えば、ATCC31882株、ATCC31883株、ATCC31884株が挙げられるが、ATCC31882株がより好ましい。
【００２７】
本発明の実施例において親株として使用したATCC31882株はL-フェニルアラニン過剰産生株であり、L-フェニルアラニン産生に関するフィードバック阻害は既に解除されている。本発明者等は、ホスホエノールピルビン酸（PEP）の細胞内での利用性に着目し、サリチル酸合成のために利用できるPEP量を増大させることを検討した。まず、PEPの消費を低減させるために、本発明者等はホスホトランスフェラーゼ系（PTS）をガラクトースパーミアーゼ(GalP)及びグルコキナーゼ(Glk)の組み合わせの系と置き換えた。得られた本発明の改変株は0.55の比増殖速度(μ)を示し、ATCC31882株とほぼ同様の増殖及びグルコース消費速度であり、PTS-不活化株の作製に成功したことが示された。
【００２８】
従って本発明の方法は、ホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを含む。
【００２９】
本明細書において、「遺伝子」とは、タンパク質、特に酵素をコードするポリヌクレオチド配列を有するDNA及びRNAを意味し、天然の遺伝子であっても、天然の遺伝子に変異を加えたり、化学合成したものであっても良く、また当分野で周知の様々な修飾が施されたものであっても良い。また、目的の酵素活性を有する限りにおいて、酵素の全長タンパク質をコードするものだけでなく、酵素活性を有する機能性断片をコードするものも「遺伝子」に含めるものとする。
【００３０】
本明細書において、「ホスホトランスフェラーゼ系酵素」とは、細菌等の微生物における糖の輸送系の酵素であって、細胞外のグルコース等の糖を細胞内に取り込む際に、PEPのリン酸基をグルコースに転移させてピルビン酸を生成すると同時に、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換する酵素群を意味する。生成したグルコース-6-リン酸はその後解糖系で代謝される。「ホスホトランスフェラーゼ系」は、当分野において、「ホスホエノールピルビン酸・糖ホスホトランスフェラーゼ系」ということもある。
【００３１】
「ホスホトランスフェラーゼ系酵素」は、複数種の酵素から構成される。ホスホトランスフェラーゼ系酵素による酵素反応が起こらないようにするためには、ホスホトランスフェラーゼ系を構成する全ての酵素の発現を抑制する必要はなく、1種以上の酵素をコードする遺伝子、好ましくはptsH（例えばNCBI Gene ID: 946886）及びptsI（例えばNCBI Gene ID: 946879）の発現を抑制させることで達成することができる。
【００３２】
本明細書において、「遺伝子の発現を抑制する」とは、その遺伝子が本来コードするタンパク質が発現できないようにすることを意味し、微生物のゲノム遺伝子配列を変異させて遺伝子の一部又は全てを人為的に欠損させること、及び遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻害することを含み、当分野で用いられるいずれの方法を用いても良い。
【００３３】
遺伝子配列を変異させる方法としては、遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。遺伝子を欠失させるための方法として、限定するものではないが、例えば、実施例に記載するように、Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit (Funakoshi, Tokyo, Japan)等の市販のキットを用いることができる（http://www.funakoshi.co.jp/contents/580）。キットに含まれる遺伝子断片を鋳型とし、適切なプライマーを用いてPCRを行うことで、目的の遺伝子を破壊することができる。
【００３４】
また、実施例において使用したベクターpCFTdeltainは、ptsHIの破壊とGalP-Glkの導入を同時に行うことを目的として、破壊断片と導入遺伝子が融合した断片を作製するために使用することができる。その配列の一部を配列番号３６に示す。
【００３５】
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【００３６】
また、遺伝子の転写／翻訳を阻害するための方法としては、例えばアンチセンスRNA又はsiRNA等のRNA干渉を使用することができる。
【００３７】
当業者であれば、目的の遺伝子の発現を抑制するために使用するベクター及びアンチセンスRNA等を適宜設計し、合成し、あるいは入手することができる。
【００３８】
微生物においてホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制し、該酵素を欠損させた場合、グルコースからグルコース-6-リン酸への変換反応が生じなくなるため、グルコース-6-リン酸の生成を確保するために、この系を、PEPを利用しない反応である、ガラクトースパーミアーゼ(GalP)及びグルコキナーゼ(Glk)を組み合わせた系に置き換えることが好ましい。あるいは、他の糖化酵素又はヘキソキナーゼを導入することもできる。導入する酵素及び酵素系は、利用する炭素源等に応じて適宜選択することができる。
【００３９】
サリチル酸の生産性を更に増大させるために、本発明者等は、もう１つのPEP消費反応である、ピルビン酸キナーゼ(PykF及びPykA)によって触媒される、解糖経路でのPEPからピルビン酸への変換を不活化した。PEPは、解糖経路においてADPを補因子としてPykF及びPykAによってピルビン酸に変換される。この反応を触媒する酵素を欠損させることで、サリチル酸が生成した場合にのみ、微生物に必須のピルビン酸が生じるようにさせることができる。
【００４０】
従って本発明の方法は、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を欠失させるかまたはその発現を抑制することを含む。pykF（例えばNCBI Gene ID: 946179）及びpykA（例えばNCBI Gene ID: 946527）は、共にADPを補酵素とし、PEPからピルビン酸を生成する反応を触媒するピルビン酸キナーゼをコードしているが、大腸菌等の細胞では両方の遺伝子が相補的に働いているため、両遺伝子を欠損させなければ反応を完全に抑えることはできない。
【００４１】
本発明の方法は更に、該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入することを含む。
【００４２】
「コリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素」は、目的の芳香族化合物に応じて異なる。例えば、本発明の微生物及び方法を用いてサリチル酸を合成させる場合には、「コリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素」は、以下で詳細に説明する通り、イソコリスミ酸シンターゼ（ICS）及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（IPL）である。
【００４３】
本発明を用いた化合物の製造では、微生物が本来有する酵素反応を利用する場合もあり得る。従って、導入する遺伝子は、目的の化合物の合成のために必要な全ての酵素に対応させる必要はなく、促進させることが望まれる一部の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を導入すれば良い。また、目的の化合物に応じて必要とされる場合には、2以上の遺伝子を別個に、連続して、又は同時に導入させることができる。
【００４４】
また、本発明の微生物及び方法を用いて、コリスミ酸化合物から特定の芳香族化合物を経て、更に別の化合物を合成することもできる。更なる化合物は芳香族でない化合物も含み、従って、これらの化合物を意図するために、本明細書においては「芳香族化合物の誘導体」と記載する。あるいはまた、上記の化合物を、芳香族化合物も含め、コリスミ酸を出発化合物とする1以上の反応において生成させることができるという意味で、本明細書において、「コリスミ酸誘導体」と記載することがある。
【００４５】
微生物においてコリスミ酸又はイソコリスミ酸から合成可能な芳香族化合物又はその誘導体としては、特に限定するものではないが、例えばサリチル酸、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸（アスピリン）、カテコール、アジピン酸、1,6-ヘキサンジオール、4-ヒドロキシ安息香酸（PHBA）、3-ヒドロキシ安息香酸（3HBA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）、マレイルピルビン酸、マレイン酸、フマル酸、4-アミノ安息香酸（PABA）、2-アミノ安息香酸（2ABA）、L-トリプトファン、トリプタミン、アニリン、L-チロシン、フェノール、cis,cis-ムコン酸、trans,trans-ムコン酸等を挙げることができる。
【００４６】
尚、上記の本発明の方法は、
(1)微生物のホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する、
(2)該微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制する、
(3)該微生物がコリスミ酸又はイソコリスミ酸から芳香族化合物を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を微生物に導入する、
との3つのステップに分けて記載したが、この記載は、微生物の改変の順序を説明するものではなく、いかなる順序で実施しても、また同時に行っても良いことは理解されるであろう。
【００４７】
本発明の方法によってPEPの細胞内利用性を増大させることで、サリチル酸及びL-フェニルアラニンの生成量はいずれも、元の株よりも上昇する。本発明者等は更に、L-フェニルアラニンの生合成経路を不活化することで、サリチル酸の生産性を更に向上させて収率を増大させることができることを見出した。
【００４８】
従って本発明の方法は更に、コリスミ酸からL-フェニルアラニンを合成する酵素をコードする遺伝子を欠失させるか又はその発現を抑制することを含む。
【００４９】
特に限定するものではないが、以下に、本発明の方法を用いて芳香族化合物を製造するために導入することが想定される遺伝子の例を記載する。
【００５０】
目的の芳香族化合物がサリチル酸である場合、本発明の方法は、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００５１】
イソコリスミ酸シンターゼ（ICS）は、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する酵素である。本発明において使用可能なICSをコードする遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば大腸菌由来のmenF（NCBI Gene ID: 946712）及びentC（NCBI Gene ID: 945511）、緑膿菌（Psudomonas aeroginosa）由来のpchA（配列番号３７）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のAtICS、並びにブラキポディウム（Brachypodium distachyon）由来のBrICS等を挙げることができる。
【００５２】
2017033965.tif 000004
【００５３】
イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（IPL）は、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する酵素である。本発明において使用可能なIPLをコードする遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeroginosa）由来のpchB（配列番号３８）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のMbtI及びエンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）由来のIrp9が好ましく、pchBがより好ましい。
【００５４】
2017033965.tif 000005
【００５５】
目的の芳香族化合物が4-ヒドロキシ安息香酸である場合、本発明の方法は、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００５６】
コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（EC 4.1.3.40）は、コリスミ酸を4-ヒドロキシ安息香酸及びピルビン酸に変換する酵素である。本発明において使用可能な遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば大腸菌由来のubiC（配列番号３９）が挙げられる。
【００５７】
2017033965.tif 000006
【００５８】
目的の芳香族化合物が3-ヒドロキシ安息香酸である場合、本発明の方法は、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００５９】
3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ（EC 4.1.3.45）は、コリスミ酸を3-ヒドロキシ安息香酸及びピルビン酸に変換する酵素である。本発明において使用可能な遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えばストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（S. hygroscopicus）由来のhyg5（配列番号４０）及びストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）LZ35由来のcuv10（配列番号４１）が挙げられる。
【００６０】
2017033965.tif 000007
【００６１】
2017033965.tif 000008
【００６２】
目的の芳香族化合物が4-アミノ安息香酸である場合、本発明の方法は、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００６３】
アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ（EC 2.6.1.85）は、コリスミ酸とL-グルタミンとを4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸とL-グルタミン酸とに変換する酵素である。4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ（EC 4.1.3.38）は、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸を4-アミノ安息香酸とピルビン酸とに変換する酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子として、限定するものではないが、例えば大腸菌由来のpabA、pabB、及びpabC（配列番号４２）が挙げられる。
【００６４】
2017033965.tif 000009
【００６５】
目的の芳香族化合物が2-アミノ安息香酸である場合、本発明の方法は、アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００６６】
アントラニル酸シンターゼ（EC 4.1.3.27）は、コリスミ酸とL-グルタミンとをアントラニル酸、ピルビン酸、L-グルタミン酸に変換する酵素である。本発明において使用可能な遺伝子として、例えば大腸菌由来のtrpE（NCBI Gene ID: 945846）及びtrpG（NCBI Gene ID: 945109、Microbial Cell Factories 2009, 8:19, Doi: 10.1186/1475-2859-8-19）が挙げられる。
【００６７】
芳香族化合物がL-チロシンである場合、本発明の方法は、コリスミ酸ムターゼをコードする遺伝子及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００６８】
コリスミ酸ムターゼ（EC 5.4.99.5）は、コリスミ酸をプレフェン酸に変換するイソメラーゼである。プレフェン酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.51）は、プレフェン酸をフェニルピルビン酸と水及び二酸化炭素に変換する酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子として、大腸菌由来のtyrAfbr（配列番号４３）が挙げられる。
【００６９】
2017033965.tif 000010
【００７０】
目的の芳香族化合物がフェノールである場合、本発明の方法は、チロシンフェノールリアーゼをコードする遺伝子を導入することを含む。
【００７１】
チロシンフェノールリアーゼ（TPL、EC 4.1.99.2）は、L-チロシンと水をフェノール、ピルビン酸及びアンモニアに段階的に変換する反応を触媒する酵素である。本発明において使用可能なTPLをコードする遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えばパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のtpl（配列番号４４）が挙げられる。
【００７２】
2017033965.tif 000011
【００７３】
また、サリチル酸を合成できるように改変された微生物に更にサリチル酸1-モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子及びカテコール1,2-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を導入することにより、cis,cis-ムコン酸を合成させることができる。
【００７４】
サリチル酸1-モノオキシゲナーゼ（SMO、EC 1.14.13.1）は、NADHを補酵素としてサリチル酸をカテコールに変換する酵素である。カテコール1,2-ジオキシゲナーゼ（CDO、EC 1.13.11.1）は、カテコールをcis,cis-ムコン酸に変換する酵素である。これらの酵素をコードする遺伝子として、特に限定するものではないが、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） TK2440由来のnahGopt（配列番号４５）及びシュードモナス・プチダDOT-T1E由来のcatA（配列番号４６）が挙げられる。
【００７５】
2017033965.tif 000012
【００７６】
2017033965.tif 000013
【００７７】
また、3-ヒドロキシ安息香酸を合成できるように改変された微生物に、3-ヒドロキシ安息香酸からゲンチジン酸、マレイルピルビン酸、及び／又はマレイン酸を合成することを可能とする酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を導入することができる。この目的のために使用可能な遺伝子としては、3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ゲンチジン酸-1,2-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、及びマレイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする遺伝子が挙げられる（図９）。本発明の方法は、微生物が本来有する生合成経路を利用するものであるため、微生物の種類によって、導入が必須となる遺伝子は変動し得る。あるいは、上記の遺伝子は、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子と共に微生物に導入することができる。
【００７８】
3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼ（3H6H、EC 1.14.13.24）は、3-ヒドロキシ安息香酸をゲンチジン酸に変換する酵素である。この酵素をコードする遺伝子として、特に限定するものではないが、例えばロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1由来の3hb6h（配列番号４７）が挙げられる。
【００７９】
2017033965.tif 000014
【００８０】
ゲンチジン酸-1,2-ジオキシゲナーゼ（GDO、EC 1.13.11.4）は、ゲンチジン酸をマレイルピルビン酸に変換する酵素である。この酵素をコードする遺伝子（g12d）として、特に限定するものではないが、例えばロドコッカス属（Rhodococcus sp.）NCIMB 12038由来のmps2（配列番号４８）が挙げられる。
【００８１】
2017033965.tif 000015
【００８２】
マレイルピルビン酸ヒドロラーゼ（MPH、EC 3.7.1.23）は、マレイルピルビン酸をマレイン酸に変換する酵素である。この酵素をコードする遺伝子として、特に限定するものではないが、例えばシュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）NCIMB 9867由来のhbzF（配列番号４９）が挙げられる。
【００８３】
2017033965.tif 000016
【００８４】
微生物への導入を意図する遺伝子は、Invitrogen等の供給業者から市販されているものを好適に使用することができる。また、これらの遺伝子の塩基配列等の情報は、米国の国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、NCBI）等が公開しているデータベースにインターネットを介してアクセスして入手することができ、場合によっては、化学合成することもできる。
【００８５】
各遺伝子は、場合によって、そのヌクレオチド配列を改変し、その酵素活性を維持又はより向上させることもできる。従って、例えばイソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子として、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列と90％以上、95％以上、99％以上の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを使用することもできる。
【００８６】
遺伝子導入のために、それぞれの遺伝子に適したプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって遺伝子を増幅することが好ましい。その場合、鋳型及びプライマーを選択することによって、2以上の遺伝子が連結された形態で同時に増幅することもできる。
【００８７】
遺伝子の微生物への導入にあたっては、上記のそれぞれの酵素をコードする遺伝子を、適切な発現ベクターに組み込むことができる。その場合、宿主となる微生物に合わせてコドンの最適化を行うことが好ましい。
【００８８】
当業者であれば、本発明の方法において細菌類、酵母類、真菌類を使用及び改変する際に、それぞれにおける遺伝子導入に適した発現ベクターを選択することができる。遺伝子導入あるいは改変のための発現ベクターは、例えばInvitrogen、Life technologies、Expressys等の供給業者から市販品を購入することができ、またそれらに基づいて目的に応じて更に改変することができる。
【００８９】
尚、本明細書において、「発現ベクター」とは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、かかる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００９０】
発現ベクターは、微生物に遺伝子を導入して目的の酵素を発現させるために、該酵素をコードするポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するDNA配列や形質転換された大腸菌を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが望ましい。
【００９１】
発現を制御するDNA配列としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合配列（RBS）等がこれに含まれる。また、前記発現を制御するDNA配列以外に発現を誘導するDNA配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するDNA配列としては、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された大腸菌の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００９２】
2以上の遺伝子の導入を意図する場合には、それぞれの遺伝子を含む2以上の発現ベクターを同時または別々に導入しても良く、あるいはそれらの遺伝子を1つの発現ベクターにタンデムに組み込んでも良い。タンパク質はまた、適切なリンカーを介して、または介さずに、融合タンパク質の形態で発現させるようにしても良い。
【００９３】
また、本発明の方法において、導入した遺伝子がコードする酵素を、他の機能性タンパク質又はペプチドと融合させて発現させることもできる。他の機能性タンパク質又はペプチドは、酵素のアミノ末端、カルボキシ末端のどちらか一方又は両側に直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、必要とされる機能に応じて適宜選択される。例えば、タンパク質の精製や検出等のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェラーゼタンパク質、Myc-タグ（tag）タンパク質、His-タグタンパク質、ヘマグルチン（HA）-タグタンパク質、FLAG-タグタンパク質（登録商標、Sigma-Aldrich社）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質等を使用することができる。
【００９４】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる、糖代謝経路が改変された微生物を提供する。微生物は細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される。
【００９５】
本発明はまた、上記の本発明の改変された微生物を培養し、培養液から芳香族化合物又はその誘導体を回収することを含む、芳香族化合物又はその誘導体の製造方法を提供する。
【００９６】
微生物の培養条件は、選択する微生物に依存する。当業者であれば、種々の細菌類、酵母類、真菌類等の微生物に応じて適切な培地及び培養条件を選択することができ、特に限定するものではない。例えば大腸菌の培養条件は、以下及び実施例に記載した通りである。
【００９７】
培地は液体培地であっても固体培地であってもよいが、菌体外に分泌される生成物の回収のし易さという観点から、液体培地であることが好ましい。培地は、微生物の培養に必要な成分の他、高生産させることを意図する芳香族化合物等の生合成の原料となり得る炭素源を含むものであればよい。
【００９８】
炭素源としては、特に限定するものではないが、好ましくは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、グリセロール、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、フルクトース-1,6-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、1,3-ビスホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸、2-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルCoA等であり、より再生可能資源であるバイオマスを原料に用いたクリーンな製造方法を提供するために、バイオマスの主成分であるグルコースがより好ましい。本発明の一実施形態において、グルコースを唯一の炭素源として添加することができる。また、培地中に添加する炭素源の量は、炭素源の種類、微生物の種類等に応じて適宜調整され得るが、通常、20〜200 g/Lであり、好ましくは20〜50 g/Lである。
【００９９】
微生物の培養に必要な成分としては特に制限はないが、酵母抽出エキス、ポリペプトン、トリペプトン、カゼイン及びその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキス等の窒素源が挙げられる。また、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、マンガン塩等の金属塩が添加されていることが好ましい。金属塩としては、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄(II)、硫酸鉄(III)、塩化鉄(II)、塩化鉄(III)、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンが挙げられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類、核酸関連物質等を培地に添加してもよい。
【０１００】
また、培地には、タンパク質の発現を誘導するための物質、例えばIPTG等や、細胞の選択のために使用する抗生物質、例えば、ペニシリン系、β-ラクタム系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、ケトライド系、ポリエンマクロライド系、グリコペプチド系、核酸系、ポリドンカルボン酸系等の抗生物質を添加してもよい。
【０１０１】
培養の条件としては、微生物が培地中で増殖することができ、かつ目的化合物を生合成できる条件であればよく、当業者であれば、微生物の種類、用いる培地等に合わせて、培養温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のpH、培養の際の振盪速度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができるが、培養温度に関しては通常25℃〜40℃であり、大腸菌等の場合は増殖速度を最大にし易いという観点から、好ましくは37℃である。また、大腸菌を培養するために好適な培地のpHは7.0であり、培養の際の振盪速度としては、通常180〜300 rpmであり、好ましくは180〜200 rpmである。
【０１０２】
培養物からの芳香族化合物及び／又は誘導体の回収は、当分野で通常用いられる方法で行えばよく、特に限定するものではないが、例えば、必要に応じ、濾過、遠心分離、各種クロマトグラフィー等を用いた精製等の方法を単独でまたは組み合わせることができる。
【０１０３】
本発明の方法により、例えばサリチル酸、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸（アスピリン）、カテコール、アジピン酸、1,6-ヘキサンジオール、4-ヒドロキシ安息香酸（PHBA）、3-ヒドロキシ安息香酸（3HBA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）、マレイルピルビン酸、マレイン酸、フマル酸、4-アミノ安息香酸（PABA）、2-アミノ安息香酸（2ABA）、L-トリプトファン、トリプタミン、アニリン、L-チロシン、フェノール、cis,cis-ムコン酸、trans,trans-ムコン酸等を含む、種々の芳香族化合物又はその誘導体の製造が可能となる。
【実施例】
【０１０４】
＜細胞株及びプラスミド＞
本実施例で使用する細胞株及びプラスミドを表１及び表２に記載する。遺伝子のクローニングのためには大腸菌 NovaBlue コンピテント細胞 (Novagen, Cambridge, MA) を使用した。尚、表中で供給元の記載がないものは、本発明者等が作製したものである。【０１０５】
【表１】
2017033965.tif 000017
【０１０６】
【表２】
2017033965.tif 000018
【０１０７】
＜PCR用プライマー＞
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はKOD FX Neo (TOYOBO, Osaka, Japan)及び表３に示すプライマー対を用いて実施した。それぞれの遺伝子を、Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA)を用いて各プラスミドとアセンブルした。pCFTdeltain（図２）は市販品を購入した(Invitrogen, San Diego, CA)。【０１０８】
【表３】
2017033965.tif 000019
2017033965.tif 000020
【０１０９】
＜培養条件＞
5 mLの試験管でのサリチル酸の製造のためにはM9最小培地を用いた。M9最小培地は、1リットル当たり20 g グルコース、0.5 g NaCl、17.1 g Na2HPO4・12H2O、3 g KH2PO4、2 g NH4Cl、246 mg MgSO4・7H2O、14.7 mg CaCl2・2H2O、2.78 mg FeSO4・7H2O、10 mg 塩酸チアミン、40 mg L-チロシン及び40mg L-トリプトファンを含有する (ATCC31882はL-チロシン及びL-トリプトファン要求性を示す)。必要に応じてアンピシリン、カナマイシン、及び／又はクロラムフェニコールをそれぞれ100、50、及び15μg/mLの最終濃度まで添加した。CFT5株の培養においては、L-フェニルアラニンを100 mg/Lの最終濃度まで添加した。また、CFT3株及びCFT5株の前培養においては、増殖を促進するために培地に0.2％ ピルビン酸ナトリウムを添加した。前培養培地を5 mL試験管中のM9培地に0.05の初期光学密度(OD600)で植菌した。試験管培養は、180 rpmで振とうしながら37℃で実施した。0.1 mM IPTGは最初に培地に添加した。【０１１０】
PHBA、PABA、2ABA、L-チロシン、3HBA、フェノール、MA、及びマレイン酸生成は、5 mLの試験管培養で実施した。PHBA及びL-チロシンの生成は0.1％のピルビン酸ナトリウムを添加したM9培地で、2ABA及びマレイン酸の生成は0.5％の酵母抽出物を添加したM9Y培地で、PABA、3HBA、フェノール及びムコン酸の生成は0.1％のピルビン酸ナトリウム及び0.5％の酵母抽出物を添加したM9Y培地で行った。それぞれの前培養培地を5 mL試験管の培地中に0.05の初期光学密度(OD600)で植菌した。試験管培養は、180rpmで振とうしながら37℃で実施した。【０１１１】
バッチ培養は、上記の培養条件を考慮して、当分野で通常行われる方法で実施した。サリチル酸のバッチ培養については、実施例５でより具体的に記載する。【０１１２】
＜各種生成物の分析＞
培養上清中のグルコース濃度は、Glucose CII test Wako (Wako, Kyoto, Japan)を使用して測定した。ピルビン酸ナトリウムを添加する場合、収率の評価のためにグルコース消費量の他にピルビン酸ナトリウムの消費量も考慮した([化合物生成量]-mol/[グルコース及びピルビン酸消費量]-mol%)。【０１１３】
GC-MSはCP-Sil 8 CB-MS キャピラリーカラム (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm; Agilent)を備えたGCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu, Kyoto, Japan)で実施した。キャリアガスとしてヘリウムを用い、流速2.1 ml/分を維持した。インジェクション量は1μl（スプリット比1:10）とした。【０１１４】
サリチル酸及びムコン酸の生成量は以下のようにして定量した。オーブンの初期温度を150℃として1分間保持した後、12℃/分で240℃まで昇温し、更に120℃/分で300℃まで昇温して、300℃で3分間維持した。全測定時間は10分間とした。他の設定条件は以下の通りとした：界面温度250℃、イオン源温度200℃、電子衝撃イオン化圧(EI) 70 eV。【０１１５】
乾燥させたサリチル酸及びムコン酸は、50μLのN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド (MSTFA)及び20μLのピリジン中80℃で60分間誘導体化させて分析した。内部標準としてピメリン酸を使用した。【０１１６】
PHBA、L-フェニルアラニン、及びL-チロシンの生成量は以下のようにして定量した。オーブンの初期温度を150℃として5分間保持した後、10℃/分で300℃まで昇温し、300℃で5分間維持した。全測定時間は25分間とした。他の設定条件は以下の通りとした：界面温度250℃、イオン源温度200℃、電子衝撃イオン化圧(EI) 70 eV。【０１１７】
4-ヒドロキシ安息香酸、4-アミノ安息香酸、L-フェニルアラニン、及びL-チロシンは、30μLのN-(tert-ブチルジメチルシリル)-N-メチル-トリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)及び30μLのN,N-ジメチルホルムアミド中で80℃で60分間誘導体化して分析した。内部標準としてシクロロイシンを使用した。【０１１８】
2ABA、PABA、3HBA及びフェノールの濃度は、5C18-AR-IIカラム (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC; Shimadzu, Kyoto, Japan)で測定した。測定条件は30℃で流速1.2 ml/分とした。溶媒系は、溶媒Aとしてリン酸水溶液 (50 mM, pH 2.5)、溶媒Bとしてアセトニトリルを用いた。濃度勾配は、70％の溶媒A及び30％の溶媒Bで開始し、溶媒A及びBの50-50混合液を3分から7分まで使用し、次いで溶媒A及びBの70-30混合液を7分から10分まで使用した。【０１１９】
2ABA、PABA、及び3HBAの濃度は254 nmの紫外線の吸光度検出器 (SPD-20AV, Shimadzu, Kyoto, Japan)で測定した。フェノールの場合は270nmの吸光を検出した。培養上清は、培養液を21,880 × g で20分間遠心分離することによって取得し、これをHPLCに用いた。2ABA、PABA、及び3HBAの測定の場合の内部標準としては安息香酸を用い、フェノールの場合には2ABAを用いた。【０１２０】
マレイン酸の濃度は、上記と同様に、培養液を21,880 × g で20分間遠心分離することによって分離させた培養上清で測定した。培養上清を、5C18-PAQカラム（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC; Shimadzu, Kyoto, Japan)で分析した。カラムは30℃で操作し、流速1.2 ml/分とした。溶媒系は、溶媒Aとしてリン酸水溶液 (50 mM, pH 2.5)、溶媒Bとしてアセトニトリルを用いた。濃度勾配は、100％の溶媒Aで開始し（0-3分）、溶媒A及びBの50-50混合液に徐々に変更し（3-6分）、溶媒A及びBの50-50混合液を維持し（6-7分）、続いて100％の溶媒Aに徐々に変更した（7-13分）。生成物の濃度は、210nmの紫外線の吸光度を検出した（SPD-20AV, Shimadzu, Kyoto, Japan）。内部標準としてフマル酸を用いた。【０１２１】
［実施例１］遺伝子欠損細胞株の作製
コリスミ酸誘導体の産生のために大腸菌の形質転換を試みた。親株として、大腸菌のL-フェニルアラニン過剰産生株(ATCC31882)を使用した。【０１２２】
GalP及びGlkをコードする遺伝子断片は、大腸菌MG1655 (ATCC700926)のゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーとしてglk_NI_f （配列番号２３）及びglk_NI_r（配列番号２４）、及びgalP_NI_f（配列番号２５）及びgalP_NI_r（配列番号２６）を用いたPCRによってそれぞれ増幅した。増幅した断片をpCFTdeltain（図２）のHindIII及びBamHI部位にタンデムに挿入した。得られたプラスミドをpCFTdeltain-GGと命名した。【０１２３】
遺伝子の欠失操作は、Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit (Funakoshi, Tokyo, Japan)を用い、その使用説明書のプロトコルに従って実施した。【０１２４】
ptsHIを破壊し、PA1lacO-1-Glk-GalPを導入するための断片は、pCFTdeltain-GGを鋳型とし、プライマーとしてdelta-ptsHI_NI_f（配列番号２７）及びdelta-ptsHI_NI_r（配列番号２８）を用いたPCRによって増幅して取得した。pykF、pykA、pheA遺伝子を不活化させるための断片は、大腸菌MG1655のゲノムDNAを鋳型とし、表３に示すプライマー（配列番号２９〜３４）をそれぞれ用いたPCRによって増幅して同様に取得した。【０１２５】
欠失のための遺伝子断片及びリコンビナーゼはGene Pulser II（Bio-Rad Laboratories社製）を使用してエレクトロポレーションによって細胞に導入した。ATCC31882株に基づいて得られた遺伝子不活化細胞株を、本明細書においてCFT1〜CFT5株と記載する。【０１２６】
表１に示す通り、CFT1株はGlk及びGalPをコードする遺伝子を有し、ptsHIを欠損している。従って、CFT1株では、生来のPTSがガラクトースパーミアーゼ(GalP)及びグルコキナーゼ(Glk)を組み合わせた系に置き換えられている。【０１２７】
CFT2株はCFT1株の変異に加えてpykFを欠損している。CFT3株はCFT2株の変異に加えてpykAを欠損している。pykF及びpykAは、共にADPを補酵素とし、PEPからピルビン酸を生成する反応を触媒するピルビン酸キナーゼをコードしているが、大腸菌等の細胞では両方の遺伝子が相補的に働いているため、両遺伝子を欠損させなければ反応を完全に抑えることはできない。CFT3株では、ピルビン酸を産生する2つの反応経路が遮断されている。【０１２８】
CFT4株はCFT3株の変異に加えてpheAを欠損している。従って、CFT4株は、ピルビン酸を産生する反応が欠損された上に、フェニルアラニン合成反応ができないように改変されている。CFT5株はCFT4株の変異に加えてtyrAを欠損し、チロシン合成反応ができないように改変されている。これらの両遺伝子を破壊することによって初めて、フェニルアラニンの合成を完全に抑制することができる。【０１２９】
［実施例２］サリチル酸合成細胞株の作製
ATCC31882株を用い、そのサリチル酸合成能を高めるために、ICS及びIPLをコードする遺伝子を導入した。本実施例ではICSをコードする遺伝子としてmenF、entC及びpchAを使用し、IPLをコードする遺伝子としてpchBを使用した。【０１３０】
緑膿菌（P. aeruginosa）由来のpchA及びpchBの遺伝子断片は市販品を入手し(配列番号３７及び３８、Invitrogen)、pchA及びpchBのコドン使用を大腸菌のために最適化した。【０１３１】
pchBをコードする遺伝子断片は、コドン最適化後の合成遺伝子断片を鋳型とし、プライマーとしてpchB_f（配列番号１）及びpchB_r（配列番号２）を用いたPCRによって増幅した。増幅した断片をpZE12MCS（Expressys社製）のHindIII部位に挿入した。得られたプラスミドをpZE12Iと命名した。【０１３２】
menF及びentCをコードする遺伝子断片は、大腸菌MG1655のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーとしてmenF_f（配列番号３）及びmenF_r（配列番号４）及びentC_f（配列番号５）及びentC_r（配列番号６）を用いたPCRによってそれぞれ増幅した。増幅したそれぞれの断片を、pchBをコードする遺伝子を含むpZE12IのKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpZE12mI及びpZE12eIと命名した。【０１３３】
pchAをコードする遺伝子断片は、コドン最適化後の合成遺伝子断片を鋳型とし、プライマーとしてpchA_f（配列番号７）及びpchA_r（配列番号８）を用いたPCRによって増幅した。増幅した断片を、pchBをコードする遺伝子を含むpZE12IのKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpZE12pIと命名した。【０１３４】
menF-pchB（menF及びpchBの融合タンパク質）をコードする遺伝子断片は、pZE12mIを鋳型とし、プライマーとしてmenF_f（配列番号３）及びpchB_r（配列番号２）を用いたPCRによって増幅した。増幅した断片をpZA23MCS（Expressys社製）のKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpZA23mIと命名した。【０１３５】
各プラスミドを用いた菌株の形質転換は、Gene Pulser II (Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて実施した。必要に応じて、100μg/L アンピシリン及び50μg/L カナマイシンを培地に添加した。【０１３６】
上記のプラスミドpZE12mI、pZE12eI、pZE12pI、及びpZA23mIをATCC31882株に導入して得られた形質転換体を、本明細書においてそれぞれCFT01株、CFT02株、CFT03株、及びCFT09株と記載する。これらの形質転換体を炭素源としてグルコースを含むM9最小培地で培養した。尚、IPTGは最初の培地(OD600=0.05)に添加した。【０１３７】
図３にCFT01株の培養特性を示す。menF及びpchBを有するCFT01株によって生成するサリチル酸及びL-フェニルアラニンの量はそれぞれ210及び350 mg/Lに達し、グルコースを唯一の炭素源としてサリチル酸を製造することができた。これは、CFT02株、CFT03株及びCFT09株よりも高い値であった。従って、以降の実験では、ICSをコードする遺伝子としてmenFを使用することとした。【０１３８】
［実施例３］サリチル酸生合成経路の導入
ATCC31882株の代わりに、実施例１で作製した変異株に、実施例２で作製したプラスミドを導入してサリチル酸の生成能を検討した。【０１３９】
Glk及びGalPをコードする遺伝子を有し、ptsHIを欠損しているCFT1株にpZE12mIを導入して、menF及びpchBを発現できる株を作製した。本明細書において、これをCFT11株と記載する。【０１４０】
CFT11株を、CFT01株と同様に、グルコースを唯一の炭素源として含むM9最小培地で培養して評価した。図３に、CFT11株の培養特性を示す。サリチル酸及びL-フェニルアラニンの生成量はそれぞれ311及び358 mg/Lに達した。サリチル酸の生産性はCFT01株と比較して1.5-倍に増大したが、L-フェニルアラニンの生産性はほぼ同じであった。【０１４１】
次いで、CFT1株の変異に加えてpykF及びpykAをいずれも欠損しているCFT3株にpZE12mIを導入して、menF及びpchBを発現できる株を作製した。本明細書において、これをCFT31株と記載する。【０１４２】
グルコースを唯一の炭素源として含むM9最小培地でCFT31株を培養した結果、図３に示すように、サリチル酸及びL-フェニルアラニンの生成量はそれぞれ603及び694 mg/Lに達した。図３(A)及び(B)に示すように、CFT31株の細胞増殖及びグルコース消費速度はCFT01株及びCFT11株よりも若干低下する傾向があったが、CFT31株のサリチル酸生成量は他の株よりも高かった。【０１４３】
［実施例４］L-フェニルアラニン生産能の不活化
CFT3株の変異に加えてpheA及びtyrAを欠損しているCFT5株にpZE12mIを導入して、menF及びpchBを発現できる株を作製した。本明細書において、これをCFT51株と記載する。【０１４４】
CFT51株を、グルコースを唯一の炭素源として含むM9最小培地で培養した。図４は、CFT51株の培養特性を示す。その結果、サリチル酸の生成量は48時間の培養後に1,480 mg/L（約1.5g/L）に達した。この値は、menF及びpchBを発現できるが、他の経路を遮断する操作を行っていないCFT01株と比較して、約7.5倍の上昇であった。一方、L-フェニルアラニンの生成は観察されなかった（データは示さない）。【０１４５】
作製した細胞株におけるサリチル酸及びL-フェニルアラニン以外の副産物の生成量をみるために、大腸菌培養における主要な副産物である培養上清中の有機酸の量を測定した（表４）。【０１４６】
【表４】
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【０１４７】
表４に示す通り、CFT01株及びCFT11株では主として酢酸及びピルビン酸が生成し、生成した酢酸の量はそれぞれ19.5及び30.6 mM (1.17及び1.84 g/L)に達した。一方、CFT31株及びCFT51株は少量の酢酸を生じたが、培養上清中にピルビン酸の蓄積は全く見られず、ピルビン酸の生成は、PEPをピルビン酸に変換する反応の破壊に伴って減少していた。CFT31株及びCFT51株において生成した有機酸の総量は8.5 mM未満であり、CFT01株及びCFT11株と比較して劇的に減少していた。【０１４８】
上記の結果から、CFT31株及びCFT51株では副産物である有機酸の生産が押さえられており、グルコースを効率よくサリチル酸に変換していることが考えられる。これは、pykF及びpykAの不活性化により、ピルビン酸の供給が緩やかになり、ピルビン酸から派生する乳酸や酢酸といった有機酸の生産が低減するためと考えられる。【０１４９】
図５は、CFT01株、CFT11株、CFT31株、及びCFT51株における、グルコースからのサリチル酸生成の収量と、OD600当たりのサリチル酸生産能を示す。CFT51株におけるサリチル酸の収量及びOD600当たりの生産能はCFT01株よりもそれぞれ6.2及び7.6倍に増大し、サリチル酸の生産性が劇的に増大したことが実証された。【０１５０】
［実施例５］バッチ培養によるサリチル酸の製造
得られた細胞株を用い、大量培養によるサリチル酸の製造を行った。
バッチ培養は2.0リットルのジャーファーメンター（作業容積400 mL）で実施した。ジャーファーメンターでのサリチル酸の製造のために、0.4% 酵母抽出物を含むM9培地からなるM9Y培地を使用した。4mLの前培養培地を、400 mLの培地を入れたジャーファーメンターに入れた。培養中のpHを7.0に維持するために、NH4OHを自動的に添加するようにした。撹拌速度を自動制御し、37℃で酸素を供給することで、溶存酸素(DO)濃度を3.0 ppm以上に維持した。グルコースの初期濃度は40 g/Lとした。5時間培養した後に0.1 mM IPTGを培地に添加した。【０１５１】
図６は、CFT01株及びCFT51株の培養特性を示す。CFT01株と比較して、CFT51株の細胞増殖及びグルコース消費速度は改善されている（図６(A)、(B)、(D)、及び(E))。48時間の培養後、CFT01株において生成したサリチル酸量はわずか0.9 g/Lであったのに対し、CFT51株において生成したサリチル酸量は約11 g/Lに達した(図６(C)及び(F))。【０１５２】
CFT51株における10g/Lを超える生産性は、大腸菌を用いた回文式培養による芳香族化合物生産試験において世界最高レベルである（元株と比較して14倍）。グルコースを単一の炭素源としたサリチル酸生産の例は過去に無く、グルコース及びグリセロールを炭素源に用いた過去の報告を上回る生産量であった。【０１５３】
［実施例６］4-ヒドロキシ安息香酸の生成促進
CFT51株の親株であるCFT5株は、細胞内にコリスミ酸を蓄積することが想定された。従って本発明者等は、次にCFT5株に基づいて他のコリスミ酸誘導体の製造を試み、この株の多用途性を実証し、芳香族化合物製造のためのプラットフォームを構築することができた。【０１５４】
まず、サリチル酸の構造異性体である4-ヒドロキシ安息香酸（PHBA）の生成について検討した。コリスミ酸からPHBAを生成することを可能とするために、大腸菌由来のコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ(EC 4.1.3.40)をコードする遺伝子(配列番号３９、ubiC)を導入した。【０１５５】
大腸菌 MG1655のゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーとしてubiC_f（配列番号９） and ubiC_r（配列番号１０）を用いたPCRによって、ubiCをコードする遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpTrcHis B（Life technologies社製）のBamHI部位に挿入した。得られたプラスミドをpTrcBubiCと命名した。このプラスミドpTrcBubiCを実施例１で作製したCFT5株に導入してCFT54株を作製した。【０１５６】
図８(A)は、CFT54株の培養液中のPHBAの生成量及び収率を示す。CFT54株におけるPHBAの生成量は、96時間の培養後に1,820 mg/Lに達した。また、PHBAの収率は、ATCC31882株にpTrcBubiCを導入した対照株であるCFT04株と比較して15.8 倍に増大した。【０１５７】
［実施例７］3-ヒドロキシ安息香酸の生成促進
実施例６と同様にサリチル酸の構造異性体である3-ヒドロキシ安息香酸（3HBA）の生成について検討した。コリスミ酸から3HBAを生成することを可能とするために、S. hygroscopicus 由来の3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼ (EC 4.1.3.45)をコードする遺伝子（配列番号４０、Hyg5）を導入した。【０１５８】
合成遺伝子断片を鋳型として用い、プライマーとしてhyg5_f（配列番号１９）及びhyg5_r（配列番号２０）を用いたPCRによって、hyg5をコードする遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片を、pTrcHis B（Life technologies社製）の断片と共にGibson Assembly（New England BioLabs社製）を用いて組み立てた。得られたプラスミドをpTrcBhyg5と命名した。このプラスミドpTrcBhyg5を実施例１で作製したCFT5株に導入してCFT58株を作製した。【０１５９】
図８(B)は、CFT58株の培養液中の3HBAの生成量及び収率を示す。CFT58株における3HBAの生成量は、72時間の培養後に2,180 mg/Lに達した。また、3HBAの収率は、ATCC31882株にpTrcBhyg5を導入した対照株であるCFT08株と比較してそれぞれ310倍に増大した。【０１６０】
［実施例８］4-アミノ安息香酸の生成促進
本発明の細胞株による4-アミノ安息香酸（PABA）の生成について検討した。コリスミ酸からPABAを製造するために、大腸菌由来のアミノデオキシコリスミ酸シンターゼ(EC 2.6.1.85)及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ (EC 4.1.3.38) (PabA、PabB、及びPabC)を用いた。【０１６１】
大腸菌 MG1655のゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーとしてpabA_f（配列番号１１）及びpabA_r（配列番号１２）、及び pabB_f（配列番号１３）及びpabB_r（配列番号１４）をそれぞれ用いたPCRによって、pabA及びpabBをコードする遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpZE12MCS（Expressys社製）のKpnI部位にタンデムに挿入した。得られたプラスミドをpZE12pabABと命名した。大腸菌由来のpabCの遺伝子断片は市販のものを入手した (配列番号４２、Invitrogen)。この遺伝子断片をpZE12pabABのPstI部位に直接挿入した。得られたプラスミドをpZE12pabABCと命名した。このプラスミドpZE12pabABCを実施例１で作製したCFT5株に導入してCFT55株を作製した。【０１６２】
図８(C)は、CFT55株の培養液中のPABAの生成量及び収率を示す。48時間の培養後のPABAの生成量は2,880 mg/Lであった。また、PABAの収率は、ATCC31882株にpZE12pabABCを導入した対照株であるCFT05株よりも32.1倍に増大した。【０１６３】
［実施例９］2-アミノ安息香酸の生成促進
本発明の細胞株による2-アミノ安息香酸（2ABA）の生成について検討した。コリスミ酸から2ABAを製造するために、大腸菌のL-トリプトファン生合成経路の一部を利用することができるため、大腸菌由来のアントラニル酸シンターゼ(EC 4.1.3.27)をコードする遺伝子(trpE及びtrpG)を導入した。【０１６４】
大腸菌 MG1655のゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーとしてtrpEG_f（配列番号１５）及びtrpEG_r（配列番号１６）を用いたPCRによって、trpEGをコードする遺伝子断片を増幅した。増幅した断片をpZE12MCS（Expressys社製）のKpnI部位に挿入した。得られたプラスミドをpZE12trpEGと命名した。このプラスミドpZE12trpEGを実施例１で作製したCFT5株に導入してCFT57株を作製した。【０１６５】
図８(D)は、CFT57株の培養液中の2ABAの生成量及び収率を示す。48時間の培養後の2ABAの生成量は1,830 mg/Lであった。また、2ABAの収率は、ATCC31882株にpZE12trpEGを導入した対照株であるCFT07株よりも46.5倍に増大した。【０１６６】
［実施例１０］L-チロシンの生成促進
CFT5株を用い、L-チロシンを産生できる大腸菌株を作製した。コリスミ酸からL-チロシンを製造するために、大腸菌由来のコリスミ酸ムターゼ/プレフェン酸デヒドラターゼ(EC 5.4.99.5 及び EC 4.2.1.51)をコードする遺伝子(配列番号４３、tyrAfbr)を導入した。【０１６７】
大腸菌由来のtyrAfbr の遺伝子断片は市販のものを入手した(Invitrogen)。この遺伝子断片をpZA23MCS（Expressys社製）のKpnI部位に直接挿入した。得られたプラスミドをpZA23tyrAfbrと命名した。このプラスミドpZA23tyrAfbrを実施例１で作製したCFT5株に導入してCFT56株を作製した。【０１６８】
図８(E)は、CFT56株の培養液中のL-チロシンの生成量及び収率を示す。L-チロシンの生成量は、96時間の培養後に1,620 mg/Lに達し、ATCC31882株にpZA23tyrAfbrを導入した対照株であるCFT06株と比較して収率は10.8倍高いものであった。【０１６９】
［実施例１１］フェノールの生成促進
実施例１０で得られたL-チロシン過剰産生株を用い、L-チロシンからチロシンフェノールリアーゼ(TPL) [EC 4.1.99.2]によって合成され得るフェノールを製造する株を作製した。【０１７０】
パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のTPLをコードする遺伝子の配列(配列番号４４、tpl)に基づいて合成した遺伝子断片を鋳型として用い、プライマーとしてtpl_f（配列番号１７）及びtpl_r（配列番号１８）を用いたPCRによって、tplをコードする遺伝子断片を増幅した。pTrcHis Bの遺伝子断片もpTrcHis B（Life technologies社製）を鋳型として用い、プライマーとしてpTrc_inv_f（配列番号２１）及びpTrc_inv_r（配列番号２２）を用いたPCRによって増幅した。各断片をGibson Assembly（New England BioLabs社製）を用いて組み立てた。得られたプラスミドをpTrcBtplと命名した。このプラスミドpTrcBtplを実施例１０で作製したCFT56株に導入してCFT561株を作製した。【０１７１】
図８(F)は、CFT561株の培養中のフェノール生成量及び収率を示す。フェノールの生成量は、96時間の培養後に1,100 mg/Lに達し、CFT06株にpTrcBtplを導入した対照株であるCFT061株よりも顕著に高いフェノール生成能を示した。【０１７２】
［実施例１２］ムコン酸の生成促進
サリチル酸 1-モノオキシゲナーゼ (SMO) 及び カテコール 1,2-ジオキシゲナーゼ (CDO) によって触媒される反応によって、サリチル酸からムコン酸の生成が可能である（図７）。【０１７３】
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） KT2440由来のSMO（配列番号４５、nahGopt）及びシュードモナス・プチダ DOT-T1E由来のCDO（配列番号４６、catA）の遺伝子断片は、市販品を使用した(Invitrogen)。pZE12MCS（Expressys社製）のKpnI部位にnahGopt の遺伝子断片を直接挿入し、これをpZE12nahGと命名した。次いで、catAの遺伝子断片をpZE12nahGのHindIII部位に挿入した。得られたプラスミドをpZE12nGcAと命名した。このプラスミドpZE12nGcAをpZA23mIと共にCFT5株に導入してCFT591株を作製した。【０１７４】
96時間の培養後、唯一の炭素源としてのグルコースからのムコン酸の生成量はCFT591株の培養液中で830 mg/Lに達し、実施例２で作製したCFT09株にpZE12nGcAを導入した対照株であるCFT091株よりも顕著に高いムコン酸生成能を示した。【０１７５】
［実施例１３］マレイン酸の生成促進
本発明の細胞株を利用して、コリスミ酸から3-ヒドロキシ安息香酸、ゲンチジン酸、マレイルピルビン酸を介してマレイン酸を生成する株を作製した（図９）。
実施例１で作製したCFT5株に、3-ヒドロキシ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子、3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ゲンチジン酸-1,2-ジオキシゲナーゼ、及びマレイルピルビン酸ヒドロラーゼをコードする遺伝子を導入した。【０１７６】
本実施例で用いたS. hygroscopicus由来のhyg5（配列番号４０）、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1由来の3hb6h（配列番号４７）、ロドコッカス属種（Rhodococcus sp.）NCIMB 12038由来のmps2（配列番号４８）、及びシュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）NCIMB 9867由来のhbzF（配列番号４９）の遺伝子断片は、市販品を使用した(Invitrogen)。【０１７７】
上記の3hb6h遺伝子断片を鋳型として用い、プライマーとして3hb6h_f（配列番号５０）及び3hb6h_r（配列番号５１）を用いたPCRによって、3H6Hをコードする遺伝子断片を増幅した。同様にして、mps2遺伝子断片及びhbzF遺伝子断片を用いて、GDOをコードする遺伝子断片、MPHをコードする遺伝子断片を増幅した。【０１７８】
増幅したmps2、hbzF、hyg5及び3hb6h遺伝子断片を、pTrcHisB（Life technologies社製）にタンデムに挿入し、得られたプラスミドをpT2t01と命名した。このプラスミドpT2t01を実施例１で作製したCFT5株に導入してCFMt1株を作製した。その結果、遺伝子導入前のCFT5株においてはマレイン酸の生成は確認されなかったのに対して、CFMt1株におけるマレイン酸の生成量は、144時間の培養後に1,210 mg/Lに達し、マレイン酸の生成量が顕著に増大していることが確認された。【０１７９】
次いで、マレイン酸生成能を更に高めた細胞株を得るために、更なる遺伝子導入を検討した。hyg5遺伝子断片をPtrcプロモーターと共に含む2種のプラスミドpS09及びpA09、更にhyg5及び3hb6h遺伝子断片をPtrcプロモーターと共に含むプラスミドpS10をそれぞれ作製した（表２参照）。プラスミドpS09及びpS10を、上記のCFMt1株にそれぞれ導入して、CMtS09株及びCMtS10株を作製した。更に、プラスミドpA09をCMtS09株及びCMtS10株に導入して、CMtS091株及びCMtS101株を作製した（表１参照）。【０１８０】
図１０は、CMtS09株及びCMtS10株の培養液中のマレイン酸の生成量を、図１１は、CMtS091株及びCMtS101株の培養液中のマレイン酸の生成量をそれぞれ示す。示されるように、これらの細胞株は、CFMt1株よりも更に高いマレイン酸生成能を有しており、CFMtS101株では、72時間の培養後、マレイン酸の生成量が2,000 mg/Lに達した（図１１(D)）。これらの細胞株では、3-ヒドロキシ安息香酸及びゲンチジン酸の生成も確認されたが、マレイルピルビン酸の生成はほとんど確認されず、用いた細胞株におけるマレイン酸への速やかな変換が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明により、糖代謝経路が改変された種々の微生物が提供される。微生物細胞内のPEP利用性を増大し、L-フェニルアラニンおよびL-チロシンへの炭素源の流れを阻止することで、グルコース等の炭素源からのサリチル酸の生成量及び収率を大きく増大させることができる。また、本発明の微生物を用いれば、コリスミ酸から誘導される種々の芳香族化合物を製造することもできる。本発明はまた、芳香族化合物合成のためのプラットフォーム細胞株を提供することができる。本発明により、バイオマスの主成分であるグルコースを炭素源とし、微生物によって様々な芳香族化合物を高い生産性をもって得ることができる。【０１８２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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