(57)【要約】  本発明は安全性の高い新しい中皮腫治療法を提供することを目的とする。ＣＤ２６は中皮腫において過剰発現されており、安全性が高いと考えられている。抗ＣＤ２６抗体と標準療法シスプラチン−ペメトレキシド併用とを組み合わせることにより、中皮腫の増殖抑制効果が増強されることを明らかとした。また、中皮腫細胞株の増殖に対してヒト化ＣＤ２６抗体とゲムシタビンとの併用の効果を検討した結果、抗ＣＤ２６抗体とゲムシタビンとを併用することにより治療効果が高く、安全性に優れた中皮腫治療方法を提供できることを見出した。更に、抗ＣＤ２６抗体を用いた併用療法において抗ＣＤ２６抗体（ＹＳ１１０）とトリプトライドとを二価架橋剤で結合させた結果、ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞に対して非常に効果の高い新規抗体薬剤複合体（Ｙ−ＴＲ１）を得ることに成功した。【選択図】なし
2017043613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２６抗体又はその断片とトリプトライドとが結合してなる複合体。
【請求項２】
抗ＣＤ２６抗体又はその断片が、ヒト化抗体又はその断片である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項６】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち第２０〜４６５番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち第２１〜２３４番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項７】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９〜２８からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、請求項２〜請求項６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記ヒト化抗体が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５を有し、ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１）と命名された株により生産される、請求項２に記載の複合体。
【請求項９】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるものである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
悪性中皮腫の治療用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体を含む、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体を含む、悪性中皮腫細胞の溶解剤。
【請求項１４】
悪性中皮腫の治療用の医薬組成物の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項１５】
抗ＣＤ２６抗体又はその断片と抗腫瘍剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、ペメトレキシド、ゲフェニチブ、及びゲムシタビンからなる群から選択される１以上の薬剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗ＣＤ２６抗体又はその断片が、ヒト化抗体又はその断片である、請求項１５又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち第２０〜４６５番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち第２１〜２３４番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９〜２８からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ヒト化抗体が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５を有し、ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１）と命名された株により生産される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるものである、請求項１５〜請求項２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
悪性中皮腫の治療用である、請求項１５〜請求項２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１５〜請求項２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤。
【請求項２７】
請求項１５〜請求項２４のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、悪性中皮腫細胞の溶解剤。
【請求項２８】
悪性中皮腫の治療用の医薬組成物の製造における、抗ＣＤ２６抗体及び抗腫瘍剤の使用。
【請求項２９】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、ペメトレキシド、ゲフェニチブ、及びゲムシタビンからなる群から選択される１以上の薬剤である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を呈する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップを備える方法：
（ａ）ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株、及び、ＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株を被検化合物の存在下で培養するステップ；
（ｂ）培養後の前記各々の腫瘍細胞株の細胞数を測定するステップ；
（ｃ）前記被検化合物のＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株の増殖抑制効果、及び、前記被検化合物のＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株の増殖抑制効果を比較し、ＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株の増殖抑制効果の方が優れる場合には、前記被検化合物は抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を呈する可能性が高い化合物として選択するステップ。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月１１日に日本国において出願された特願２０１５−１７９６７２号に基づき優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容の全体は、本明細書にそのまま援用される。また、本願において引用した特許、特許出願及び文献に記載された内容の全体は、本明細書にそのまま援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は抗ＣＤ２６抗体を有効成分として含む他の抗癌剤との併用のための癌治療用組成物に関する。また、本発明は抗体−医薬複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ））の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
中皮腫での化学療法においては、抗癌剤単剤での治療では薬剤反応性が２０％以下と低いことが報告されている（非特許文献１）。よって、より有効な中皮腫の治療を目指して、複数の薬剤を併用することが試みられている。例えば、シスプラチンとペメトレキシドは、単剤と比較して併用することにより治療効果が優れることが報告されている（非特許文献２）。このため、現在、中皮腫の標準化学療法としてシスプラチンとペメトレキシドとの併用が適用されている（非特許文献３）。しかし、本併用療法においても平均生存期間は１２か月弱に過ぎず、さらに治療効果の高い化学療法の開発が必要とされている。また、シスプラチンとペメトレキシドとの併用療法の癌細胞増殖抑制効果は細胞毒性が関与しており、ノンプラチナベース治療など患者に与える副作用が少ない療法が求められている。【０００４】
ゲムシタビンはデオキシシチジンの糖鎖の２′位の水素をフッ素に置換したヌクレオシド誘導体でありＤＮＡの合成阻害を作用機序とする。安全性に優れており（非特許文献４）、抗癌剤として広く使用されている。しかし、ゲムシタビン単剤の中皮腫に対する治療効果は十分ではなく、ゲムシタビンを適切な抗癌剤と組み合わせることで治療効果の高い併用療法を開発することが期待されている。例えば、それぞれ単独で抗癌剤として効果があることが示されているペメトレキシドとゲムシタビンの併用が試みられているが、中皮腫の治療では平均生存期間の延長においてペメトレキシド単独投与のと変わらない効果しか得られていない（非特許文献５）。さらに中皮腫の治療においてシスプラチン−ペメトレキシド併用とシスプラチン−ゲムシタビン併用を比較したところ、シスプラチン−ペメトレキシド併用が優れていたことが報告されている（非特許文献６）。また、エピルビシンとゲムシタビンを併用しても併用による改善効果がほとんど得られていない（非特許文献７）。同様に、ビンカアルカロイド系抗悪性腫瘍剤であるビノレルビンとゲムシタビンの併用では併用による改善効果がないことが報告されている（非特許文献８）。よって、これらの現在までに試みられたゲムシタビン併用剤では併用による改善効果が得られていない。【０００５】
一方で、ドセタキセルとゲムシタビンの併用では平均生存期間が１５ヶ月となることから、併用による若干の改善効果が認められている（非特許文献９）。また、葉酸代謝拮抗剤であるメトトキサレートとゲムシタビンを併用した場合、平均生存期間が１９．４ヶ月とわずかに延長されることが報告されている（非特許文献１０）。しかし、これらのゲムシタビンと併用している抗癌剤は非選択的に細胞に作用するため、副作用の誘発が懸念されている。【０００６】
中皮腫以外の癌においても併用は検討されており、例えば、肺癌においてシスプラチン−ペメトレキシドの併用は優れた効果を示している（非特許文献１１）。また、ＥＧＦＲ阻害剤であるゲフィニチブ（イレッサ）も高い頻度で使用されており、シスプラチン、ゲムシタビン以外の薬剤との併用療法の開発が必要とされている。【０００７】
シスプラチン−ペメトレキシド併用療法を更に他の薬剤との併用することで治療効果を上げる試みもある。中皮腫の標準療法では貧血がみられるためエリスロポイエチンを投与することがあるが、エリスロポイエチンはシスプラチン−ペメトレキシド併用の中皮腫細胞株に対する細胞毒性効果を増強していない（非特許文献１２）。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるボリノスタットは中皮腫患者においてプラセボと比較して延命効果の延長がないことが報告されている（非特許文献１３）。ＨＤＡＣ阻害剤で抗けいれん薬のバルプロ酸塩は中皮腫細胞株を用いた実験でシスプラチン−ペメトレキシド併用の抗腫瘍活性を増強することが報告されている（非特許文献１４）。しかし、バルプロ酸塩は使用において悪心、嘔吐などの副作用が出やすいこともあり、疲労感の激しい癌患者への投与は難しいと考えられる。【０００８】
遺伝子治療との併用が試みられており、中皮腫細胞株を用いた実験でＳＯＣＳ−１遺伝子の細胞内導入がシスプラチン−ペメトレキシド併用の細胞毒性効果を増強させることが報告されている（非特許文献１５）。また、中皮腫の多くではｐ５３遺伝子は正常であるが、ｐ１４（ＡＲＦ）やｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）の欠損によりｐ５３が不活性化されていることが知られている。中皮腫細胞株においてｐ５３遺伝子導入はシスプラチンやペメトレキシドの細胞毒性効果を相乗的に増強させること、特には、胸膜内に中皮腫を移植されたマウスにおいて、胸膜内へｐ５３遺伝子を導入することによりシスプラチンの抗腫瘍活性が増強されたことが報告されている（非特許文献１６）。しかし、遺伝子導入による治療は現在のところ臨床では困難であり、実用化における複雑さから、より簡便で効果の高い方法が望まれている。【０００９】
中皮腫の生検では大多数において血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の発現が認められており、ＶＥＧＦが中皮腫の増殖に関与する可能性が考えられる。そこで、標準療法に対する抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブの効果が第ＩＩ相臨床試験で検討された（非特許文献１７）が、ベバシズマブは標準療法シスプラチン−ペメトレキシド併用の治療効果を増強していない。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤である低分子化合物スニチニブを標準療法であるシスプラチン−ペメトレキシド併用療法に更に追加することが、第Ｉ相臨床試験の非小細胞癌１０例、中皮腫１例で検討されたが、薬物交互作用は確認されていない（非特許文献１８）。【００１０】
中皮腫細胞株を用いた実験では、インターフェロンβはシスプラチンやペメトレキシドの細胞毒性活性を相乗的に増強したことが報告されている（非特許文献１９）。この効果はインターフェロンβにより誘発されるｐ５３発現によると考えられる。しかし実用化にはインターフェロンβ投与に伴う発熱や倦怠感などの副作用の問題があると考えられる。【００１１】
中皮腫の臨床像は胸膜への浸潤がその特徴とされ（非特許文献２０）、症状としては胸膜浸潤による胸水の貯留による呼吸困難が強く出てくる。中皮腫の特徴は浸潤であるにも関わらず浸潤に対する作用は十分に解析されていない。上述の中皮腫細胞へのＳＯＣＳ−１遺伝子導入が、シスプラチン−ペメトレキシド併用の抗浸潤作用を相乗的に増加させることが報告されている（非特許文献２１）。メソセリンは中皮腫、膵臓癌、卵巣癌において過剰発現している４０ｋＤａの糖タンパク質であり、メソセリンが中皮腫細胞株の浸潤を促進することが報告されている（非特許文献２２）が、メソセリンに対する低分子化合物阻害剤や抗体で有効な薬剤は未だ報告されていない。また、中皮腫細胞株を用いた実験で妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰＡ）が浸潤を促進することが報告されている（非特許文献２３）が、ＰＡＰＰＡを標的とした中皮腫に有効な物質は報告されていない。【００１２】
よって、シスプラチン−ペメトレキシド併用による中皮腫治療におけるの問題を解決可能な実用化可能な治療方法は未だ見出されていない。【００１３】
抗体薬剤複合体は主に悪性腫瘍に対する標的療法として実用化されつつある。腫瘍細胞に特異的に結合する抗体に抗腫瘍作用のある薬剤を結合することで、薬剤を効率的に腫瘍細胞内に導入し、また非腫瘍細胞への毒性による副作用を軽減する利点がある。抗体薬剤複合体は以下の手順で作成される。腫瘍細胞に特異的に発現する抗原に対するマウス・モノクローナル抗体からｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｍｏｄｅｌｉｎｇの技術を用いてヒト化された抗体に、標的とする腫瘍細胞に極めて高い抗腫瘍作用を有する薬剤を選択し、これらとヒト化抗体を架橋剤により結合する。現時点で米国ＦＤＡに薬剤として認可された抗体薬剤複合体が２件（適応は急性骨髄性白血病および悪性リンパ腫）、２０１３年時点で臨床試験中のものが３５件ある。日本国内で承認されているものは未だない。抗体薬剤複合体は有効性の増強と副作用の軽減の両面から抗腫瘍薬として有望であるが、（１）抗原の選択、特異性の良好なモノクローナル抗体の作成（２）抗体のヒト化（３）抗体の腫瘍細胞内への導入（４）結合する薬剤の選択（５）架橋剤の選択（６）安全性など多段階の検討事項を有するため、いまだ実用化に至っているものが少ないのが現状である。悪性中皮腫は集学的治療によっても予後不良の疾患であり、新規治療法の開発が待たれるが、現在のところ悪性中皮腫に対する抗体薬剤複合体で医薬品として承認されたものはない。【００１４】
ＣＤ２６は膜貫通型のタンパクでＴ細胞の活性化に関与する共刺激分子であるが、近年悪性中皮腫を含む種々の悪性腫瘍で高発現していることが明らかになっている。ＣＤ２６は癌特異的であることから、その抗腫瘍効果が期待されている（特許文献１及び特許文献２）。特に、ＣＤ２６は中皮腫において過剰発現されており（非特許文献２４）、抗ＣＤ２６抗体は安全性が高いと考えられている。実際に、抗ＣＤ２６抗体は中皮腫細胞の増殖を抑制することから（非特許文献２５；特許文献３）、すでにヒト化抗ＣＤ２６抗体であるＹＳ１１０は、フランスでの第一相臨床試験が終了し、その安全性が確認されている（非特許文献２６）。しかし、これまで抗ＣＤ２６抗体と他の薬剤との併用については報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／１４４６２号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００７／０１４１６９号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８／１１４８７６号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｏｎｇ  Ｔ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ  ＮＪ，１９９６
【非特許文献２】Ｅｌｌｉｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；  Ｊａｅｎｎｅ  ＰＡ．，２００６
【非特許文献３】Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００３，Ｓｔａｈｅｌ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｏｏｎｓ  Ｃ．Ｃ．Ｌ．Ｍ．，２０１３
【非特許文献４】Ｔｏｓｃｈｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献５】Ｊａｎｎｅ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献６】Ｓｈｕｋｕｙａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献７】Ｏｋｕｎｏ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献８】Ｚａｕｄｅｒｅｒ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献９】Ｒａｌｌｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献１０】Ｋｕｒｉｂａｙａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献１１】Ｓｕｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ    Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３（２２）  ２４５０  ２０１５
【非特許文献１２】Ｐａｌｕｍｂｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献１３】Ｚａｕｄｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｋｒｕｇ，２０１２
【非特許文献１４】Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｔｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，２００９
【非特許文献１５】Ｉｗａｈｏｒｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３
【非特許文献１６】Ｌｉ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献１７】Ｄｏｗｅｌｌ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献１８】Ｃａｍｉｄｇｅ  ＤＲ  ｅ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献１９】Ｌｉ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献２０】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｋｅ，２００５
【非特許文献２１】Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献２２】Ｓｅｒｖａｉｓ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献２３】Ｈｕａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献２４】Ａｍａｔｙａ  ＶＪ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１
【非特許文献２５】Ｉｎａｍｏｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献２６】Ａｎｇｅｂｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ
【非特許文献２７】Ｙａｍａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３  Ａｐｒ  ２９；８（４）：ｅ６２３０４
【発明の概要】
【００１７】
上述のとおり、現在、中皮腫化学療法の標準療法はシスプラチン−ペメトレキシド併用療法の問題を解決すべく、他剤の併用など多くの検討が進められているがその実用化においては数々の課題がある。標準療法シスプラチン−ペメトレキシド併用の抗腫瘍効果は細胞毒性効果に基づいているため、標準療法に更に薬剤を追加する場合には、追加される薬剤には、細胞毒性に基づかないこと、安全性が高いこと、かつ効果が高いことが求められる。更には、標準療法とは異なる、細胞毒性に基づかない、非プラチナ療法に基づいた安全性の高い新しい治療法が望まれている。
【００１８】
また、中皮腫の病態的特徴は局所浸潤であるにも関わらず、従来は浸潤に注目した中皮腫治療薬の検討はほとんど行われてこなかった。本発明者らは、浸潤阻害効果に着目して中皮腫治療方法を開発することにより、良い効果の高い治療法が得られると考えた。
【００１９】
ＣＤ２６は中皮腫において過剰発現されており、安全性が高いと考えられている。実際に、抗ＣＤ２６抗体は中皮腫細胞の増殖を抑制することから、中皮腫患者に対して第Ｉ相臨床試験が進められている。そこで、本発明者らは、中皮腫細胞株における増殖および浸潤に対して抗ＣＤ２６抗体と標準療法シスプラチン−ペメトレキシド併用とを組み合わせた治療方法について検討した。その結果、抗ＣＤ２６抗体と標準療法シスプラチン−ペメトレキシド併用とを組み合わせることにより、中皮腫の増殖抑制効果が増強されることを明らかとした。また、本発明者らは、シスプラチンとペメトレキシドとの併用では浸潤抑制効果がわずかにしか増強されないのに対し、シスプラチン−ペメトレキシド併用に抗ＣＤ２６抗体を組み合わせることにより浸潤阻害効果が相乗的に増強されることを見出した。
【００２０】
また、本発明者は、浸潤阻害効果を増強する関与分子として抗ＣＤ２６抗体処理中皮腫細胞のマイクロアレイを解析した結果、ＡＡＭＰ、ＥＳＡＭ、ＦＵＴ８、ＲＡＣ１、ＦＹＮ、ＲＮＦ２０が関与することを見出した。
【００２１】
本発明者らは、ＣＤ２６と様々な薬剤との併用効果を検討した結果、中皮腫細胞株の増殖に対してヒト化ＣＤ２６抗体とゲムシタビン、又はゲフェチニブとを併用することにより治療効果が高く、安全性に優れた中皮腫治療方法を提供できることを見出した。
【００２２】
更に、本発明者らは、抗ＣＤ２６抗体を用いた抗体−薬物複合体について種々検討を行った。その結果、強い抗腫瘍細胞作用を持つことが知られながら、抗体薬剤複合体としての使用は報告されていないトリプトライドと、抗ＣＤ２６抗体（ＹＳ１１０）とを二価架橋剤で結合させることで、ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞に対して非常に効果の高い新規抗体薬剤複合体（Ｙ−ＴＲ１）を得ることに成功した。
【００２３】
よって、本発明は、抗ＣＤ２６抗体と他の薬剤とを併用する薬剤、又は抗ＣＤ２６抗体とトリプトライドとが結合してなる複合体に関するものである。より具体的には、本発明は以下の発明に関する。
（１）  抗ＣＤ２６抗体又はその断片とトリプトライドとが結合してなる複合体。
（２）  抗ＣＤ２６抗体又はその断片が、ヒト化抗体又はその断片である、（１）に記載の複合体。
（３）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、（２）記載の複合体。
（４）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、（２）又は（３）に記載の複合体。
（５）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の複合体。
（６）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち第２０〜４６５番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち第２１〜２３４番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の複合体。
（７）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９〜２８からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、（２）〜（６）のいずれか１項に記載の複合体。
（８）  前記ヒト化抗体が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５を有し、ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１）と命名された株により生産される、（２）に記載の複合体。
（９）  前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’‐ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるものである、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の複合体。
（１０）  （１）〜（９）のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する医薬組成物。
（１１）  悪性中皮腫の治療用である、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）  （１）〜（９）のいずれか１項に記載の複合体を含む、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤。
（１３）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の複合体を含む、悪性中皮腫細胞の溶解剤。
（１４）  悪性中皮腫の治療用の医薬組成物の製造における、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の複合体の使用。
（１５）  抗ＣＤ２６抗体又はその断片と他の抗腫瘍剤とを含有する、医薬組成物。
（１６）  前記他の抗腫瘍剤が、シスプラチン、ペメトレキシド、ゲフェニチブ、及びゲムシタビンからなる群から選択される１以上の薬剤である、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）  抗ＣＤ２６抗体又はその断片が、ヒト化抗体又はその断片である、（１５）又は（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものである、（１７）に記載の医薬組成物。
（２０）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、（１７）に記載の医薬組成物。
（２１）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列のうち第２０〜４６５番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の重鎖、および配列番号１８で示されるアミノ酸配列のうち第２１〜２３４番目のアミノ酸配列を含む少なくとも１本の軽鎖を含む、（１７）に記載の医薬組成物。
（２２）  前記ヒト化抗体又はその断片が、配列番号１９〜２８からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する、（１７）〜（２１）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２３）  前記ヒト化抗体が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５を有し、ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１）と命名された株により生産される、（１７）〜（２２）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２４）  前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’‐ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されるものである、（１５）〜（２３）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２５）  悪性中皮腫の治療用である、（１５）〜（２４）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（２６）（１５）〜（２４）のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤。
（２７）（１５）〜（２４）のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、悪性中皮腫細胞の溶解剤。
（２８）  悪性中皮腫の治療用の医薬組成物の製造における、抗ＣＤ２６抗体及び他の抗腫瘍剤の使用。
（２９）  前記他の抗腫瘍剤が、シスプラチン、ペメトレキシド、ゲフェニチブ、及びゲムシタビンからなる群から選択される１以上の薬剤である、（２８）に記載の使用。
【発明の効果】
【００２４】
ヒト化ＣＤ２６抗体とシスプラチン、ペメトレキシド、ゲフェニチブ、及びゲムシタビンからなる群から選択される１以上の薬剤とを組み合わせることにより、中皮腫の病態的特徴であり根本的課題である浸潤に対する抑制効果を相乗的増強し、かつ／又は、中皮腫細胞の増殖抑制効果を増強することから、中皮腫の治療において極めて有用であると考えられる。また、ゲフェニチブ又はゲムシタビンと抗ＣＤ２６抗体との併用は、非プラチナ療法であることから、安全性の高い中皮腫薬物療法を提供することができる。更に、ヒト化抗ＣＤ２６抗体にトリプトライドを結合させることにより、より少ない量のトリプトライドで効果的に悪性中皮腫細胞の増殖を抑制させることができる。よって、毒性の低く効果の高い抗悪性腫瘍剤を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦｍａｓｓ分析で測定した、非結合ＹＳ１１０とＹ−ＴＲ１（ＳＭＣＣ）のインタクト質量を表すグラフである。Ａは非結合ＹＳ１１０（測定値：１４７０１２．７）を示し、ＢはＹ−ＴＲ１（ＳＭＣＣ）（測定値：１５１８１５．６）を示す。
【図２】Ｙ−ＴＲ１の悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２（ＣＤ２６陽性）への結合を示すグラフである。第一抗体：Ｙ−ＴＲ１、第二抗体：ＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ。１０μｇ／ｍｌ以上のＹ−ＴＲ１がＣＤ２６陽性細胞へのインタクト結合を示している。縦軸は蛍光強度、横軸は細胞数を表す。
【図３】トリプトライドの悪性中皮腫細胞株及び及びＴ細胞系白血病細胞株に対する毒性の結果を示すグラフである。Ａ：ＭＳＴＯ野生型（ｗｔ）；Ｂ：ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２；Ｃ：ＪＭＮ；Ｄ：Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（−）；Ｅ：Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋）。縦軸は対照と比較した蛍光強度（％）を表し、横軸はトリプトライドの濃度（ｎＭ）を表す。
【図４】ＴＲ１の悪性中皮腫細胞株に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性を示すグラフである。縦軸は対照と比較した蛍光強度（％）を表し、横軸はＴＲ１の濃度（ｎＭ）を表す。
【図５】Ｙ−ＴＲ１の悪性中皮腫細胞株及び及びＴ細胞系白血病細胞株に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性を示すグラフである。Ａは、様々なリンカーを用いた場合のＹ−ＴＲ１のＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２に対する細胞毒性の比較を示す。ＳＭＣＣを用いたＹ−ＴＲ１が最も高い細胞毒性を示した。Ｂは、非結合ＹＳ１１０と比較した、ＴＲ１のＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＪＭＮに対する細胞毒性を示す。Ｃは、ＣＤ２６陰性細胞株ＭＳＴＯ野生型（ｗｔ）と比較したＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２に対するＹ−ＴＲ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を表すグラフである。Ｙ−ＴＲ１は、ＣＤ２６陰性細胞株ＭＳＴＯ野生型（ｗｔ）と比較してＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２に高い細胞毒性を示した。
【図６】モル濃度で比較した、非結合ＴＲ１及びＹ−ＴＲ１のＩＣ５０値を表すグラフである。
【図７】ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＪＭＮを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ  マウス異種移植モデルを用いたＹ−ＴＲ１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。Ｙ−ＴＲ１は腹腔内に４ｍｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅで週３回投与した。１×１０７細胞のＪＭＮ細胞を皮下摂取した０日目から合計９回Ｙ−ＴＲ１を投与した。５５日目の平均推定腫瘍体積をフィッシャーのＰＬＳＤ多重比較法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＰＬＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いて、３群間（対照群、ＹＳ１１０投与群、Ｙ−ＴＲ１投与群）で比較した。Ｙ−ＴＲ１投与群の平均腫瘍体積は、対照群及びＹＳ１１０投与群と比較して、顕著に低かった（ｐ＜０．０５）。縦軸は推定平均腫瘍体積（ｍｍ３）を表し、横軸は各群を表す。
【図８】中皮腫細胞株におけるＣＤ２６発現を表すグラフである。各グラフの上に用いた細胞を示した。
【図９】シスプラチンおよびペメトレキシドの用量作用曲線を表すグラフである。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸はシスプラチン又はペメトレキシドの濃度を表す。左のグラフは、ＭＥＳＯ１細胞を用いた結果を表し、右のグラフはＨ２４５２細胞を用いた結果を表す。上段はシスプラチン、下段はペメトレキシドの結果を表す。
【図１０】ＹＳ１１０とシスプラチン（Ｃｉｓ）又はペメトレキシド（ＰＭＴ）併用によるＭＥＳＯ１増殖抑制効果を表すグラフである。Ａはシスプラチンの結果を示し、Ｂはペメトレキシドの結果を表す。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸は各薬剤の投与量を表す。Ａｎｔｉ−ＣＤ２６は、抗ＣＤ２６抗体ＹＳ１１０を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】ＹＳ１１０とシスプラチン（Ｃｉｓ）又はペメトレキシド（ＰＭＴ）併用によるＨ２４５２増殖抑制効果を表すグラフである。Ａはシスプラチンの結果を示し、Ｂはペメトレキシドの結果を表す。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸は各薬剤の投与量を表す。Ａｎｔｉ−ＣＤ２６は、抗ＣＤ２６抗体ＹＳ１１０を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１２】ＹＳ１１０とシスプラチン（Ｃｉｓ）−ペメトレキシド（ＰＭＴ）併用を組み合わせた増殖抑制効果を表すグラフである。Ａは、ＭＥＳＯ１細胞の結果を表し、ＢはＨ２４５２細胞の結果を表す。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸は投与した薬剤を表す。Ａｎｔｉ−ＣＤ２６は、抗ＣＤ２６抗体ＹＳ１１０を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３】ＹＳ１１０によるシスプラチン（Ｃｉｓ）およびペメトレキシド（ＰＭＴ）のｉｎ  ｖｉｖｏのＪＭＮ細胞増殖抑制効果を表すグラフ及び写真である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【図１４】ＹＳ１１０によるシスプラチン（Ｃｉｓ）−ペメトレキシド（ＰＭＴ）併用のｉｎ  ｖｉｖｏのＪＭＮ細胞増殖抑制効果を表すグラフ及び写真である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１
【図１５】ＹＳ１１０によるシスプラチン−ペメトレキシド併用のｉｎ  ｖｉｖｏのＭＥＳＯ１細胞増殖抑制効果を表すグラフ及び写真である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１６】ＹＳ１１０によるシスプラチン（Ｃｉｓ）−ペメトレキシド（ＰＭＴ）併用のｉｎ  ｖｉｖｏのＨ２４５２細胞増殖抑制効果を表すグラフ及び写真である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１
【図１７】シスプラチン（Ｃｉｓ）又はペメトレキシド（ＰＭＴ）の細胞浸潤に対する作用を表すグラフである。縦軸は浸潤細胞数を表し、横軸は各薬剤の濃度（μＭ）を表す。左のグラフは、ＭＥＳＯ１細胞を用いた結果を表し、右のグラフはＨ２４５２細胞を用いた結果を表す。上段のグラフがシスプラチン、下段のグラフがペメトレキシドの結果を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８】シスプラチン（Ｃｉｓ）−ペメトレキシド（ＰＭＴ）併用の細胞浸潤抑制効果を表すグラフである。縦軸は浸潤細胞数を表し、横軸は各薬剤の濃度（μＭ）を表す。上のグラフは、ＭＥＳＯ１細胞を用いた結果を表し、下のグラフはＨ２４５２細胞を用いた結果を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９】Ａ：ＹＳ１１０とシスプラチン（Ｃｉｓ）の併用によるＭＥＳＯ１細胞の細胞浸潤抑制効果を表すグラフである。縦軸は浸潤細胞数を表し、横軸は各薬剤の濃度（μＭ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ：シスプラチンとＹＳ１１０のＭＥＳＯ１細胞浸潤抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２０】Ａ：ＹＳ１１０とシスプラチン（Ｃｉｓ）の併用によるＨ２４５２細胞の細胞浸潤抑制効果を表すグラフである。縦軸は浸潤細胞数を表し、横軸は各薬剤の濃度（μＭ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ：シスプラチンとＹＳ１１０のＨ２４５２細胞浸潤抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２１】中皮腫細胞株におけるゲムシタビンの用量作用曲線を表すグラフである。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸はゲムシタビンの濃度を表す。
【図２２】Ａ：肉腫型中皮腫ＭＥＳＯ１細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビン（Ｇｅｍ）の併用効果を表すグラフである。縦軸は細胞数（×１０３細胞）を表し、横軸は各薬剤の投与量を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｂ：ゲムシタビンとＹＳ１１０のＭＥＳＯ１細胞増殖抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２３】Ａ：肉腫型中皮腫ＪＭＮ細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビン（Ｇｅｍ）の併用効果を表すグラフである。縦軸は細胞数（×１０３細胞）を表し、横軸は各薬剤の投与量を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ：ゲムシタビンとＹＳ１１０のＪＭＮ細胞増殖抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２４】Ａ：上皮型中皮腫Ｈ２４５２細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビン（Ｇｅｍ）の併用効果を表すグラフである。縦軸は細胞数（×１０３細胞）を表し、横軸は各薬剤の投与量を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ：ゲムシタビンとＹＳ１１０のＨ２４５２細胞増殖抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２５】Ａ：上皮型中皮腫Ｈ２２６細胞増殖に対する抗ＣＤ２６抗体とゲムシタビン（Ｇｅｍ）の併用効果を表すグラフである。縦軸は細胞数（×１０３細胞）を表し、横軸は各薬剤の投与量を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ：ゲムシタビンとＹＳ１１０のＨ２２６細胞増殖抑制効果に対する交互作用を解析した結果を表す表である。
【図２６】シスプラチン（Ｃｉｓ）−ペメトレキシド（ＰＭＴ）に対するゲムシタビン（Ｇｅｍ）併用効果を示すグラフである。縦軸は生存細胞（濁度：ＯＤ）、横軸は投与した薬剤を表す。表の上に用いた細胞株を示す。黒四角は対照群を表し、黒丸はゲムシタビン３×１０−８Ｍ投与群を表し、黒三角はゲムシタビン１×１０−９Ｍ投与群を表す。
【図２７】上皮型中皮腫細胞Ｈ２２６細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果を表すグラフ、写真、及び、ゲムシタビンとＹＳ１１０の交互作用を表す表である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。
【図２８】肉腫型中皮腫細胞ＪＭＮ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果を表すグラフ、写真、及び、ゲムシタビンとＹＳ１１０の交互作用を表す表である。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。
【図２９】ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ８２７細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とシスプラチン−ペメトレキシドの併用効果を表すグラフである。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。写真は摘出した腫瘍サンプルである。
【図３０】ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ４００６細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲフィチニブの併用効果を表すグラフである。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。
【図３１】ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ８２７細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０ととゲフィチニブの併用効果を表すグラフである。グラフの縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を表し、横軸は投与した薬剤を示す。
【図３２】ＭＥＳＯ１細胞及びＪＭＮ細胞に対する、シスプラチン及びペメトレキシドの増殖抑制効果を比較したグラフである。縦軸は増殖阻害率（％）を表し、横軸は各薬剤の濃度（Ｍ）を表す。Ａ：シスプラチンの増殖抑制効果を比較した結果を示す。Ｂ：ペメトレキシドの増殖抑制効果を比較した結果を示す。
【図３３】ＭＥＳＯ１細胞とＪＭＮ細胞、及び、、Ｈ２４５２細胞とＨ２２６細胞に対する、ゲムシタビンの増殖抑制効果を比較したグラフである。Ａ：ゲムシタビンの増殖抑制効果をＭＥＳＯ１、ＪＭＮで比較した結果を示す。Ｂ：ゲムシタビンの増殖抑制効果をＨ２４５２、Ｈ２２６で比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．抗体
本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、抗体等の標的に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、前記用語は、完全体のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの抗体の任意のクラスを含み、特定のクラスである必要は無い。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化されうる。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。異なるクラスの免疫グロブリンごとのサブユニット構造および３次元構造は、よく知られている。
【００２７】
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一抗体を産生する細胞集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その細胞集団に含まれる個々の抗体は、若干存在しうる可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗原を含む典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基を標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体産生細胞集団から得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、米国特許第４、８１６、５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法により調製されうる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４記載の技術を用いて作成されるファージライブラリーからも単離できる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列等）である、非ヒト（例えば、マウス）の抗体の形態のことをいう。幾つかのヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト由来残基により置換されている。幾つかのヒト化抗体は、所望の特異性、親和性および／または能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）由来の少なくとも１つ、通常２つの可変領域を含むが、１つ以上のＦｖフレームワーク領域の残基および／または１つ以上のＦｖＣＤＲ残基が対応するヒト残基（即ち、ヒト抗体配列由来の残基）により置換されている。最も一般的には、少なくとも複数のＦｖフレームワーク領域の残基は、ヒト化抗体の１つ以上の可変領域において置換されているであろう。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体でも移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうるが、抗体性能の更なる改良および最適化をするための残基を含みうる。
【００２９】
幾つかのヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域を実質的に全て含み、それらの可変領域において、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲである。幾つかのヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、それらの可変領域において、ＣＤＲのアミノ酸残基の大部分が非ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、そしてＦＲのアミノ酸残基の１つ以上がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲである。ヒト化抗体は、最も好ましくは、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）またはドメイン（一般的にはヒト免疫グロブリン）の少なくとも一部を含むであろう。幾つかのヒト化抗体は、国際公開公報第９９／５８５７２号に記載されるような修飾されたＦｃ領域を有する。ヒト化抗体の幾つかの形態は、元々の抗体に対して変更された１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有し、このＣＤＲは元々の抗体の１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００３０】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域、それぞれの単独または組み合わせを参照する。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、極近傍に保持されており、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するためには少なくとも２つの技術がある：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、ＫａｂａｔらＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（５ｔｈ  ｅｄ．、  １９９１、  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８））。さらに、これらの２つのアプローチの組合せが、ＣＤＲを決定するために当該技術分野で時々使用される。
【００３１】
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域、それぞれの単独のまたは組み合わせを参照する。
【００３２】
抗体に「特異的に結合する」エピトープは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、特異的結合を決定するための方法もまた、当該技術分野でよく知られている。分子が、別の細胞もしくは物質と反応するかまたは相互作用するよりも、特定の細胞もしくは物質と、より頻繁に、より急速に、より長時間持続して、および／またはより大きな親和性で反応するかもしくは相互作用する場合、分子は、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体が他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および／またはより長時間持続して結合する場合、抗体は、標的に、「特異的に結合する」。例えば、特異的に１つのＣＤ２６エピトープに結合する抗体は、他のＣＤ２６エピトープまたは非ＣＤ２６エピトープに結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および／またはより長時間持続してこのＣＤ２６エピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第２の標的に特異的に結合するかもしれないし、あるいは結合しないかもしれないということも、この定義から解釈される。このように、「特異的な結合」は、必ずしも排他的な結合を（含むことはできるが）必要としない。
【００３３】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを取り込むベクターのレシピエントになりうるか、または既にレシピエントになっている、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異により、(形態学的においてまたはゲノムＤＮＡ相補体において)本来の親細胞と必ずしも同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドでｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションした細胞を含む。
【００３４】
「単離された」、抗体、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然には見つけられない形態をしている抗体、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離された抗体、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、もはや、天然には見つけられない形態にまで精製されたものを含む。ある実施態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「治療」は、有益な、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的において、有益な、または所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、１つ以上の症状の軽減、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復または寛解、および緩解(部分的または全体)を含むが、これらに限定されるものではない。「治療」は、仮に治療を受けなかった場合の見込まれた余命に対して、余命を延ばすことも意味している。
【００３６】
「有効量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的において、本明細書中に記載される抗ＣＤ２６抗体複合体や、抗ＣＤ２６抗体と他の抗癌剤など有効量は、腫瘍増殖に関連する状態の進行を遅延させるのに十分な量である。当該技術分野で理解されるように、例えば、抗ＣＤ２６抗体複合体や、抗ＣＤ２６抗体と他の抗癌剤の有効量は、とりわけ、患者病歴、ならびに使用される抗ＣＤ２６抗体複合体や他の抗癌剤の種類（および／または量）などの他の要因に変動または依存してもよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」または「医薬的に許容される賦形剤」は、有効成分と組み合わせた場合に、その有効成分が生物活性を維持可能であり、送達された際に被験体の免疫系と非反応性であり、被験体に対して無毒性である任意の材料を含む。例として、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤などのあらゆる標準的な医薬の担体が含まれるが、これらに限定されるものではない。噴霧投与または非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝食塩水または生理食塩水（０．９％）である。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来法により、処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  １８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ、  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、  Ｅａｓｔｏｎ、  ＰＡ、  １９９０およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、  ２０００を参照のこと）。
【００３８】
抗ＣＤ２６抗体
ある実施態様において、本明細書において用いられる抗ＣＤ２６抗体は、ヒトＣＤ２６に特異的に結合する。ある実施態様において、本明細書において記載される抗ＣＤ２６抗体は、マウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０と同じエピトープに結合する。ある実施態様において、本明細書において記載される抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいて、ヒトＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０の結合を遮断する能力がある（マウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０と競合する）。ある実施態様において、本明細書において記載される抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいてヒトＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１Ｆ７の結合を遮断する能力がある（マウスモノクローナル抗体１Ｆ７と競合する）。競合アッセイは、固定化したエピトープ又は抗原に対して被験抗体を接触させた後、未結合の抗体を洗浄により除去し、次いで、標識化した１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体と該エピトープ又は抗原と接触させ、、未結合の抗体を洗浄により除去した後に結合した１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体を検出することにより行うことができる。被験抗体と接触させていないコントロールへの１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体とエピトープ又は抗原との結合と比較して、被験抗体を接触させた場合における１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体とエピトープ又は抗原への結合が減少している場合には、競合アッセイにおいて、１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体の結合を遮断する能力がある（１４Ｄ１０抗体又は１Ｆ７抗体と競合する）と判定することができる。
【００３９】
本明細書において用いられる抗ＣＤ２６抗体のヒトＣＤ２６への結合親和性としては、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満または１０−１１Ｍ未満の解離定数（即ち、Ｋｄ）を有する親和性が挙げられる。解離定数はまた、１０−１５Ｍ以上、５×１０−１５Ｍ以上、１０−１４Ｍ以上、５×１０−１４Ｍ以上、１０−１３Ｍ以上、５×１０−１３Ｍ以上、１０−１２Ｍ以上、５×１０−１２Ｍ以上、１０−１１Ｍ以上、５×１０−１１Ｍ以上、１０−１０Ｍ以上または５×１０−１０Ｍ以上であってもよい。親和性を決定するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、蛍光消光、蛍光転移、および/または酵母ディスプレイを使用して決定してもよい。親和性は、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングされることもありうる。
【００４０】
ＣＤ２６に対する抗体の結合親和性を決定するための１つの方法は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の親和性を測定することである。単官能性Ｆａｂ断片を得るために、抗体、例えば、ＩｇＧは、パパインで切断されるか、または組換え技術によって発現させることができる。モノクローナル抗体の抗ＣＤ２６Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標）、ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｗａｙ、ＮＪ）により決定することができる。供給業者の取扱説明書に従って、ＳＡチップ（ストレプトアビジン）は使用される。ビオチン化されたＣＤ２６を、ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｐ２０）中に希釈し、０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度でチップ上に注入することができる。個々のチップチャネルを横切る可変的な流動時間を使用して、抗原密度の２つの範囲が達成される：詳細な動力学的試験のためには１０〜２０応答ユニット（ＲＵ）、濃度のためには５００〜６００ＲＵ。Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液および４Ｍ  ＮａＣｌ（２：１）の混合物は、結合したＦａｂを効率的に除去する一方で、２００回以上の注入に対してチップ上のＣＤ２６の活性を保つ。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液は、ランニング緩衝液として全てのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに使用することができる。精製したＦａｂ試料の階段希釈溶液（０．１〜１０×見積もられたＫＤ）を１００μＬ／分で２分間注入し、３０分までの解離時間が通常許容される。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知濃度（アミノ酸分析により決定された）の標準的なＦａｂを使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳働により決定することができる。反応速度の結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにデータをフィットさせることにより（Ｌｏｆａｓ  ＆  Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、  １９９０）同時に得られる。平衡解離定数（ＫＤ）値はｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。
【００４１】
ある実施態様において、本発明は、ＣＤ２６を発現する細胞の増殖を阻害する、抗ＣＤ２６抗体−トリプトライド複合体、又は、抗ＣＤ２６抗体とその他の抗癌剤を含有する医薬組成物に関する。本発明は、前記複合体又は組成物が、ＣＤ２６発現に関連する状態（疾患または障害等）、例えば悪性中皮腫、の治療に有用である実施態様も包含する。ある実施態様では、本発明の複合体又は組成物は、１つ以上の次の特徴を有していてもよい：（ａ）ＣＤ２６に結合する、（ｂ）ＣＤ２６活性を調節する、（ｃ）Ｇ１／ＳチェックポイントでＣＤ２６＋細胞の細胞周期を停止させる、（ｄ）ＣＤ２６を発現する細胞（例えば、悪性中皮腫）の増殖を阻害する、（ｅ）ＣＤ２６の細胞外マトリックスに対する結合を阻害する、および／または（ｆ）ＣＤ２６発現に関連する状態の治療に有用である。ある実施態様において、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連する疾患または障害である。ある実施態様においては、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、少なくとも部分的には、ＣＤ２６により媒介されるものである。ある実施態様において、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６が発現している細胞の増殖に関連する状態である。ある実施態様において、前記疾患または障害は、癌（例えば、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはＣＤ２６の発現を伴うその他の悪性腫瘍）である。
【００４２】
ある実施態様において、本発明の複合体又は組成物が含有する抗体は、配列番号８−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１−７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含む。ある実施態様では、本発明の複合体又は組成物が含有する抗体は、配列番号８−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１−７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４３】
ある実施態様において、本発明の複合体又は組成物が含有する抗体は、配列番号１−１４のうちいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、または少なくとも約５０個の連続するアミノ酸を含む。
【００４４】
本発明は、さらに、本明細書にに記載されるようなの抗体配列（例えば、配列番号１−７、配列番号８−１４、配列番号：１５、および配列番号：１６のいずれか１つ）の断片を含む抗体を含有する、抗ＣＤ２６抗体−トリプトライド複合体、又は、抗ＣＤ２６抗体とその他の抗癌剤を含有する医薬組成物を提供する。ある実施態様において、前記抗体は、本明細書においてに記載されるようなされる抗体配列の断片であって、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約７５個のアミノ酸、または少なくとも約１００個のアミノ酸の長さの断片を含む。
【００４５】
配列番号：１５
ＥＶＱＬＶＸ１ＳＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＱＰＧＸ６Ｘ７ＬＲＬＸ８ＣＸ９ＡＳＧＸ１０Ｘ１１ＬＸ１２ＴＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＸ１３ＧＶＩＷＧＸ１４ＧＲＴＤＹＤＸ１５Ｘ１６ＦＭＳＲＶＴＩＳＸ１７ＤＸ１８ＳＫＸ１９ＴＸ２０ＹＬＱＸ２１ＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＸ２２ＲＸ２３ＲＨＤＷＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【００４６】
上記配列中、Ｘ１はＥまたはＱであり、Ｘ２はＡまたはＧであり、Ｘ３はＧまたはＥであり、Ｘ４はＬまたはＶであり、Ｘ５はＶ、Ｋ、またはＥであり、Ｘ６はＧまたはＥであり、Ｘ７はＴまたはＳであり、Ｘ８はＴまたはＳであり、Ｘ９はＴまたはＫであり、Ｘ１０はＦまたはＹであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＴ、Ｎ、またはＳであり、Ｘ１３はＶまたはＭ、Ｘ１４はＧまたはＤ、Ｘ１５はＡまたはＳであり、Ｘ１６はＡまたはＳであり、Ｘ１７はＫまたはＲであり、Ｘ１８はＮまたはＴであり、Ｘ１９はＳまたはＮであり、Ｘ２０はＶまたはＡであり、Ｘ２１はＭまたはＬであり、Ｘ２２はＶ、Ｍ、またはＴであり、そしてＸ２３はＮまたはＳである。
【００４７】
配列番号１６
ＸＩＩＸ２Ｘ３ＴＱＳＰＳＳＬＳＸ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７ＲＸ８ＴＩＸ９ＣＸ１０ＡＳＱＸ１１ＩＲＮＸ１２ＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＳＳＮＬＸＩ３Ｘ１４ＧＶＰＸ１５ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＸ１６Ｘ１７ＥＤＸ１８ＡＸ１９ＹＹＣＱＱＳＸ２０ＫＬＰＸ２１ＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ
【００４８】
上記配列中、Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＬまたはＥであり、Ｘ３はＭまたはＬであり、Ｘ４はＡまたはＶであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＬ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ７はＤまたはＥであり、Ｘ８はＶまたはＡであり、Ｘ９はＴまたはＳであり、Ｘ１０はＳまたはＲであり、Ｘ１１はＧまたはＤであり、Ｘ１２はＳまたはＮであり、Ｘ１３はＨまたはＱであり、Ｘ１４はＳまたはＴであり、Ｘ１５はＳ、Ｄ、またはＡであり、Ｘ１６はＥまたはＱであり、Ｘ１７はＰまたはＡであり、Ｘ１８はＦまたはＶであり、Ｘ１９はＴ、Ａ、またはＩであり、Ｘ２０はＩまたはＮであり、そしてＸ２１はＦまたはＬである。
【００４９】
表１は、Ｘ３７６（配列番号：１）、Ｘ３７７（配列番号：２）、Ｘ３７８（配列番号：３）、Ｘ３７９（配列番号：４）、Ｘ３８０（配列番号：５）、Ｘ３８１（配列番号：６）、およびＸ３９４（配列番号：７）であるヒト化ＶＬ変異体のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ番号および配列番号を付したスキームは、軽鎖可変領域が一致する。
【００５０】
表２は、Ｘ３８４（配列番号：８）、Ｘ３８５（配列番号：９）、Ｘ３８６（配列番号：１０）、Ｘ３８７（配列番号：１１）およびＸ３８８（配列番号：１２）、Ｘ３９９（配列番号：１３）およびＸ４２０（配列番号：１４）であるヒト化ＶＨ変異体のアミノ酸配列を示す。配列番号およびＫａｂａｔ番号スキームの両方を示す。Ｋａｂａｔ番号スキームは、８２ａ、８２ｂ、および８２ｃを含む。
【００５１】
【表１】
2017043613.tif 000003
【００５２】
【表２】
2017043613.tif 000004
【００５３】
前記抗体は、さらに、配列番号１７またはそれらの断片もしくは変異体を含んでもよい。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１７を含む。ある実施態様において、前記抗体は、シグナル配列を除く配列番号１７を含む（当業者は、ある実施態様において、抗体のシグナル配列が抗体から切断されるものであることを容易に理解するであろう）。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１７の可変領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は配列番号１７に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する、抗体（またはそれらの断片）を含む。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１７の断片であって、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸の長さの断片を含む。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＣＤ２６に結合する。
【００５４】
重鎖（配列番号１７）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＡＧＶＫＱＰＧＧＴＬＲＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＶＩＷＧＤＧＲＴＤＹＤＡＡＦＭＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＭＲＮＲＨＤＷＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００５５】
前記抗体は、さらに、配列番号１８、またはそれらの断片もしくは変異体を含む。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１８を含む。ある実施態様において、前記抗体は、シグナル配列を除く配列番号１８を含む。（当業者は、ある実施態様において、抗体のシグナル配列が抗体から切断されるものであることを容易に理解するであろう。）ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１８の可変領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は配列番号１８に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する、抗体（またはそれらの断片）を含む。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１８の断片であって、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸の長さの断片を含む。ある実施態様において、前記抗体は、配列番号１８、またはそのフラグメントもしくは変異体をさらに含む。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＣＤ２６に結合する。例えば、ある実施態様において、前記抗体は、それぞれがシグナル配列の無い配列番号１７を含む少なくとも１本の重鎖（例えば、２本の重鎖）、およびそれぞれがシグナル配列の無い配列番号１８を含む少なくとも１本の軽鎖（例えば、２本の軽鎖）を含む抗体である。
【００５６】
軽鎖（配列番号１８）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＬＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＴＰＧＥＲＡＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＳＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＱＰＥＤＶＡＡＹＹＣＱＱＳＩＫＬＰＦＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００５７】
本明細書において、ヒト化抗ＣＤ２６抗体である「ＹＳ１１０」とは、重鎖定常領域が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列からなり、軽鎖定常領域が配列番号１８に記載されたアミノ酸配列からなる抗体を意味する。ＹＳ１１０は悪性腫瘍細胞膜上のＣＤ２６と結合すると細胞内に取り込まれ、さらに核内にまで移行することが報告されている（Ｙａｍａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ、２０１３  Ａｐｒ  ２９；８（４）：ｅ６２３０４）。より具体的には、ＹＳ１１０はＣａｖｅｏｌｉｎ依存性のｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓにより細胞質内に取り込まれ、ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓによって核内に輸送されると考えられる。よって、一態様において、ＹＳ１１０とトリプトライド複合体による抗腫瘍効果（例えば、中皮腫に対する治療効果）は、ＹＳ１１０によるこのような作用に基づいていてもよい。即ち、本発明の抗ＣＤ２６抗体は、悪性腫瘍細胞膜上のＣＤ２６と結合すると細胞内に取り込まれ、さらに核内にまで移行する抗体であってもよい。抗体が悪性腫瘍細胞膜上のＣＤ２６と結合すると細胞内に取り込まれ、さらに核内にまで移行するか否かは、標識化した抗体と細胞を接触させた後、標識を基に抗体が存在する位置を顕微鏡等を用いて検出し、当該位置と細胞内の組織との位置関係を決定することにより行うことができる。
【００５８】
別の側面において、前記抗体は、ＹＳＬＲＷＩＳＤＨＥＹＬＹ（配列番号１９；ペプチド６）、ＬＥＹＮＹＶＫＱＷＲＨＳＹ（配列番号２０；ペプチド３５）、ＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）、ＬＷＷＳＰＮＧＴＦＬＡＹＡ（配列番号２２；ペプチド８４）、ＲＩＳＬＱＷＬＲＲＩＱＮＹ（配列番号２３；ペプチド１３２）、ＹＶＫＱＷＲＨＳＹＴＡＳＹ（配列番号２４；ペプチド３７）、ＥＥＥＶＦＳＡＹＳＡＬＷＷ（配列番号２５；ペプチド７９）、ＤＹＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬ（配列番号２６；ペプチド２９）、ＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬＥＹ（配列番号２７；ペプチド３０）、およびＩＹＶＫＩＥＰＮＬＰＳＹＲ（配列番号２８；ペプチド６３）からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する。ある実施態様において、前記抗体は、前記ペプチドの１つ以上に特異的に結合する。これらのペプチドは、ヒトＣＤ２６の領域である。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＣＤ２６の他の領域に対応する１つ以上のペプチドと比べて、ＹＳＬＲＷＩＳＤＨＥＹＬＹ（配列番号１９；ペプチド６）、ＬＥＹＮＹＶＫＱＷＲＨＳＹ（配列番号２０；ペプチド３５）、ＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）、ＬＷＷＳＰＮＧＴＦＬＡＹＡ（配列番号２２；ペプチド８４）、ＲＩＳＬＱＷＬＲＲＩＱＮＹ（配列番号２３；ペプチド１３２）、ＹＶＫＱＷＲＨＳＹＴＡＳＹ（配列番号２４；ペプチド３７）、ＥＥＥＶＦＳＡＹＳＡＬＷＷ（配列番号２５；ペプチド７９）、ＤＹＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬ（配列番号２６；ペプチド２９）、ＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬＥＹ（配列番号２７；ペプチド３０）、およびＩＹＶＫＩＥＰＮＬＰＳＹＲ（配列番号２８；ペプチド６３）からなる群から選択される、１つ以上のペプチドに特異的に結合する。
【００５９】
ある実施態様において、前記抗体は、次のそれぞれのペプチドに結合する：ＹＳＬＲＷＩＳＤＨＥＹＬＹ（配列番号１９；ペプチド６）；ＬＥＹＮＹＶＫＱＷＲＨＳＹ（配列番号２０；ペプチド３５）；ＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）；ＬＷＷＳＰＮＧＴＦＬＡＹＡ（配列番号２２；ペプチド８４）；およびＲＩＳＬＱＷＬＲＲＩＱＮＹ（配列番号２３；ペプチド１３２）に結合する。ある他の実施態様において、抗体は、次のそれぞれのペプチド：ＹＳＬＲＷＩＳＤＨＥＹＬＹ（配列番号１９；ペプチド６）；ＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）；ＲＩＳＬＱＷＬＲＲＩＱＮＹ（配列番号２３；ペプチド１３２）；ＹＶＫＱＷＲＨＳＹＴＡＳＹ（配列番号２４；ペプチド３７）；およびＥＥＥＶＦＳＡＹＳＡＬＷＷ（配列番号２５；ペプチド７９）。ある実施態様において、前記抗体は、次のそれぞれのペプチドに結合する：ＤＹＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬ（配列番号２６；ペプチド２９）；ＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬＥＹ（配列番号２７；ペプチド３０）；およびＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）。ある他の実施態様において、前記抗体は、次のそれぞれのペプチドに結合する：ＤＹＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬ（配列番号２６；ペプチド２９）；ＳＩＳＰＤＧＱＦＩＬＬＥＹ（配列番号２７；ペプチド３０）；ＴＷＳＰＶＧＨＫＬＡＹＶＷ（配列番号２１；ペプチド５５）；およびＩＹＶＫＩＥＰＮＬＰＳＹＲ（配列番号２８；ペプチド６３）。
【００６０】
競合アッセイを用いて、２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識することにより同じエピトープに結合するかどうか決定することができる。通常、抗原は、マルチウェルプレート上に固定され、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する性能が測定される。そのような競合アッセイのための一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。さらに、当業者に知られているエピトープマッピング技術を用いることにより、抗体が結合するエピトープを決定することができる。
【００６１】
ある実施態様において、前記抗体は、１つ以上の定常領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトの定常領域を含む。ある実施態様において、定常領域は、重鎖の定常領域である。別の実施態様においては、定常領域は、軽鎖の定常領域である。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトの定常領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有する定常領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は、Ｆｃ領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトのＦｃ領域を含む。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有するＦｃ領域を含む。
【００６２】
ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ２抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。
【００６３】
前記抗体は、単量体、二量体、および多量体の形態の抗体であってよい。例えば、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書において開示された抗体を使用して調製することができる（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、  １９８６、  １２１、  ２１０参照のこと）。従来より、二重特異性抗体の組換え生産は、異なる特異性を有する２つの重鎖を含む、２組の免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づいていた（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ、Ｃｕｅｌｌｏ、  Ｎａｔｕｒｅ、  １９８３、  ３０５、  ５３７−５３９）。
【００６４】
二重特異性抗体を作製するための１つのアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体‐抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常領域に融合している。好ましくは、前記融合部分は、少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含む、免疫グロブリンの重鎖定常領域を伴う。軽鎖の結合に必須な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を少なくとも１つの融合部分に有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡおよび所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時形質移入される。構築において使用される３つの抗体鎖の不等比が最適収量を提供する実施態様において、これら３つの抗体の相互比（ｍｕｔｕａｌ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を高い柔軟性で調製することが可能になる。少なくとも２つの抗体の等比での発現が高収率をもたらすか、または比率が特に重要ではない場合には、１つの発現ベクターに２つまたは３つ全ての抗体のコード配列を挿入してもよい。
【００６５】
１つのアプローチとして、一方のアームの第１の結合特異性を有するハイブリッド型免疫グロブリン重鎖、ならびに他方のアームのハイブリッド型重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性を有する）から構成される二重特異性抗体が挙げられる。この非対称の構造（二重特異性抗体分子の半分の部分だけに免疫グロブリン軽鎖を有する）により、所望でない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離することが容易になる。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開された国際公開公報第９４／０４６９０号に記載されている。
【００６６】
２つの共有結合した抗体を含む、ヘテロ結合抗体もまた、前記抗体の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４、６７６、９８０号）、またはＨＩＶ感染の治療のために使用されている（国際公開公報第９１／００、３６０号および第９２／２００、３７３号；欧州特許第０３０８９号）。ヘテロ結合抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製されてもよい。適切な架橋剤および架橋技術は、当該技術分野でよく知られており、米国特許第４、６７６、９８０号に記載されている。
【００６７】
特定の実施態様では、前記抗体は、抗体断片である。例えば、ある実施態様において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’‐ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される。ある実施態様において、抗体は、Ｆａｂである。様々な技術が抗体断片の生産のために開発されている。これらの断片は、完全体の抗体のタンパク質消化を介して得ることができ（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、  １９９２、  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７およびＢｒｅｎｎａｎら、  １９８５、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照のこと）、または組換宿主細胞により直接生産することもできる。例えば、Ｆａｂ’‐ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、  １９９２、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別の実施態様において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。他のアプローチによれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２の断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離される。
【００６８】
ある実施態様において、前記抗体は、その一本鎖（ＳｃＦｖ）、変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、一本鎖抗体、および任意の他の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子である。
【００６９】
一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用して、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作製される。Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの例は、一方の可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端との間約３．５ｎｍを架橋する、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２９）である。他の配列のリンカーも設計および使用されている。Ｂｉｒｄら（１９８８）。リンカーは、次に薬物の固定または固体担体に対する固定などの付加的機能のために修飾することができる。一本鎖変異体は、組換技術または合成技術のいずれによっても生産することができる。ｓｃＦｖを合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞、酵母（ｙｅａｓｔ）細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどのルーチン操作により作製することができる。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【００７０】
ｄｉａｂｏｄｙなどの他の形態の一本鎖抗体もまた前記抗体に包含される。ｄｉａｂｏｄｙは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一の抗体鎖上で発現する二価の二重特異性抗体であるが、同一鎖上でこれら２つのドメインが対形成するのには短すぎるリンカーを使用しており、そのために、強制的に、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が作り出される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、  Ｐ．ら（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、  Ｒ．  Ｊ．ら（１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００７１】
前記抗体は、本明細書中に記載される抗体に対する修飾を包含するが、このような修飾の例としては、該抗体の特性に著しく影響を与えない、機能的に等価な抗体および増強もしくは減弱された活性を有する変異体が挙げられる。抗体の修飾は、当該技術分野においてルーチン操作であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。修飾された抗体の例は、アミノ酸残基の保存的置換、著しく機能活性を悪化させない１以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を伴う抗体を含む。
【００７２】
アミノ酸配列の挿入または付加は、長さが１個の残基から１００個以上の残基を含む抗体までのアミノ末端および/またはカルボキシル末端での融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内の挿入を含む。末端の挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端またはＣ末端への、抗体の血清半減期を延長させる酵素もしくは抗体の融合を含む。
【００７３】
置換変異体では、抗体配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、その場所に異なる残基が挿入されている。置換的変異導入によって最も効果が得られる部位にはＣＤＲが含まれるが、ＦＲの変更も意図される。保存的置換を表３の表題：「保存的置換」に示す。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表３の「例示的置換」と命名されるか、または、さらにアミノ酸クラスに関して以下に記載されるような、より実質的な変化を導入して生成物をスクリーニングしてもよい。
【００７４】
【表３】
2017043613.tif 000005
【００７５】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシートもしくはヘリックスコンホメーションなどの、置換領域における抗体主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果を著しく変化させる置換を選択することにより達成される。天然状態で存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく次のグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７６】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスと交換することによりなされる。より保存的な置換は、あるクラスの１メンバーを同一クラスの他のメンバーと交換することを含む。
【００７７】
抗体の適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を妨ぐことができる。反対に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、システイン結合を抗体に付加することにより、抗体の安定性を向上させることができる。
【００７８】
アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化または修飾から可変領域等の領域の完全な再設計にわたる。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を変化させることができる。ある実施態様において、１〜５個以下の保存的なアミノ酸置換がＣＤＲドメイン内でなされる。他の実施態様において、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲ３ドメイン内でなされる。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲドメインはＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【００７９】
修飾もまた、グリコシル化および非グリコシル化抗体、ならびに、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有する抗体も含む。抗体は、それらの定常領域における保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、  １９９７、  Ｃｈｅｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６５：１１１−１２８；ＷｒｉｇｈｔならびにＭｏｒｒｉｓｏｎ、  １９９７、  ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、  １９９６、  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：１３１１−１３１８、ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、  １９９０、  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２９：４１７５−４１８０）ならびに糖タンパク質の立体構造および提示される三次元表面構造に影響を与え得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、  前掲、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、  １９９６、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ７：４０９−４１６）に影響を与える。所定の糖タンパク質は、オリゴ糖により、特異的認識構造に基づいて、ある種の分子を標的とする場合がある。抗体のグリコシル化もまた、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）に影響を与えることが報告されている。特に、二分しているＧｌｃＮＡｃの形成を触媒する糖転移酵素であるβ（１、４）‐Ｎ‐アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をテトラサイクリン制御下で発現させるＣＨＯ細胞では、ＡＤＣＣ活性が向上したと報告された（Ｕｍａｎａら、  １９９９、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０）。
【００８０】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ‐結合型またはＯ‐結合型のいずれかである。Ｎ‐結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン‐Ｘ‐セリン、アスパラギン‐Ｘ‐スレオニン、およびアスパラギン‐Ｘ‐システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ‐結合型グリコシル化は、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの糖質の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５‐ヒドロキシプロリンまたは５‐ヒドロキシリジンが使用されてもよい。
【００８１】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、抗体が、上記トリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変させることにより都合よく達成される（Ｎ‐結合型グリコシル化部位のための）。改変はまた、本来の抗体の配列に対する１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基による、付加または置換によりなされてもよい（Ｏ‐結合型グリコシル化部位のための）。
【００８２】
抗体のグリコシル化パターンもまた、根本的なヌクレオチド配列を改変せずに改変されてもよい。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。考えられる治療法として、組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現のために使用される細胞の種類が天然の細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの多様性を予想することができる（例えば、Ｈｓｅら、  １９９７、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：９０６２−９０７０を参照のこと）。
【００８３】
宿主細胞の選択に加え、抗体の組換え生産の間にグリコシル化に影響を与える要因は、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等を含む。様々な方法が、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変するために提唱されてきたが、これらにはオリゴ糖生産に関与する特定の酵素を導入するか過剰発現させることが含まれる（米国特許第５、０４７、３３５号、第５、５１０、２６１号、および第５、２７８、２９９号）。グリコシル化または特定の種のグリコシル化は、酵素により、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して、糖タンパク質から取り除くことができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種の多糖のプロセシングが欠損するように遺伝子改変することができる。これら技術および類似する技術は、当該技術分野でよく知られている。
【００８４】
修飾の他の方法としては、当該技術分野で知られているカップリング技術の使用が挙げられ、そのような技術の例としては、酵素による手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。修飾を用いることにより、例えば、免疫測定法のための標識を付加することができる。修飾された抗体は、当該技術分野で確立された手順を使用して作製され、当該技術分野で知られている標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができるが、そのうちの幾つかの方法を以下および実施例に記載する。
【００８５】
他の抗体修飾は、１９９９年１１月１８日に公開された国際公開公報第９９／５８５７２号に記載されるように修飾された抗体を含む。これらの抗体は、標的分子に対して指向した結合ドメインに加え、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全てまたは一部に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、著しい補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性の破壊なしに、標的分子に結合する能力がある。ある実施態様において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは、通常、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、慢性型の抗体療法において使用するのに特に適しており、従来の抗体療法に対する炎症および他の有害反応を回避するものである。
【００８６】
前記抗体は、親和性の成熟した実施態様を含む。例えば、親和性成熟抗体は、当該技術分野で知られている方法により生産することができる（Ｍａｒｋｓら、  １９９２、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  １０：７７９−７８３；Ｂａｒｂａｓら、  １９９４、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ、  ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、  １９９５、  Ｇｅｎｅ、  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、  １９９５、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、  １５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、  １９９５、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、  １５４（７）：３３１０−９；Ｈａｗｋｉｎｓら、  １９９２、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、  ２２６：８８９−８９６；および国際公開公報第２００４／０５８１８４号）。候補となる親和性成熟抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を使用したスクリーニング方法ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む当該技術分野で知られている任意の選択方法を含む、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、改善および／または改変された結合親和性に基づいてスクリーニングまたは選択することができる。
【００８７】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、  １９７５、  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５により記載されているような、ハイブリドーマ法を使用して調製してもよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、通常、免疫剤で免疫することにより、該免疫剤に特異的に結合する抗体を生産するか、または生産可能なリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。
【００８８】
モノクローナル抗体（および他の抗体）もまた、米国特許第４、８１６、５６７号に記載されるような、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来方法を使用して単離および配列決定がなされる。単離後に、ＤＮＡは発現ベクターに組み込まれ、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、または該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされることにより、該組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。
【００８９】
ある実施態様において、前記抗体は、細菌、酵母、植物、昆虫、および哺乳類を含むがこれらに限定されるものでない、任意の生物または任意の生物に由来する細胞において発現される。細胞の特定の型は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびその他の酵母、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＳＦ９細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、繊維芽細胞、シュワン腫セルライン、不死化哺乳類骨髄およびリンパ系セルライン、Ｊｕｒｋａｔ細胞、肥満細胞およびその他の内分泌および外分泌細胞、ならびに神経細胞を含むがこれらに限定されるものではない。
【００９０】
抗体の生産に有用な様々なタンパク質発現系、ベクター、および細胞培地は、当業者に知られている。例えば、以下を参照：国際公開公報第０３／０５４１７２号、第０４／００９８２３号、および第０３／０６４６３０号（これらの全文は参照によって本明細書中に組み込まれる）。ある実施態様において、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現系は、前記抗体の発現に使用される。
【００９１】
好ましくは、前記抗体は、発現した後に、当業者に知られた方法に従って精製または単離される。精製方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的ならびにクロマトグラフィー的手法が挙げられ、そのような手法としては、イオン交換、疎水親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、および等電点電気泳動が挙げられる。必要な精製の程度は、抗体の用途により変更しうる。実施態様によっては、精製は不要である。
【００９２】
ＤＮＡは、例えば、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリン抗体のコード配列の全てまたは一部を共有結合的に連結することにより修飾されうる。そのようにして、本明細書中に開示されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。通常、そのような非免疫グロブリン抗体は、本発明の抗体の定常ドメインによって置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインによって置換されることにより、ＣＤ２６の１つの表面エピトープに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原もしくはＣＤ２６エピトープに対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラの二価抗体が作り出される。
【００９３】
前記抗体は、ヒト化抗体も包含する。治療抗体は、投与された抗体に対する免疫応答を誘発することが部分的な原因となって、副作用をしばしば誘発する。その結果、薬効の低下、標的抗原を有する細胞の減少、および望ましくない炎症反応が起こりうる。上記を回避するために、組換え抗ＣＤ２６ヒト化抗体を作製してもよい。抗体のヒト化の一般原理は、抗体の抗原結合部分の基本的な配列を維持すること含み、一方、抗体の非ヒト残部の少なくとも一部分をヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するための４つの従来からの一般的なステップは、（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計する、つまり、ヒト化する工程において、いずれの抗体フレームワーク領域もしくは残基および／またはＣＤＲ残基を使用するのかを決定すること、（３）実際のヒト化する方法論／技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現を含むが、これらに限定されるものではない。抗体がヒトにおける臨床試験および治療において使用される場合、免疫応答を回避するために、定常領域も組換え技術によってヒト定常領域により近づけることができる。例えば、米国特許第５、９９７、８６７号および第５、８６６、６９２号を参照のこと。
【００９４】
組換えヒト化抗体において、Ｆｃγ部分を修飾することにより、Ｆｃγ受容体および補体免疫系との相互作用を回避することができる。そのような抗体の調製技術は、国際公開公報第９９／５８５７２号に記載される。
【００９５】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が報告されており、それらの例としては、げっ歯類Ｖ領域とそれらに関連した相補性決定領域（ＣＤＲ）とがヒト定常ドメインに融合したものが挙げられる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）  ；  Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＩ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；  Ｓｈａｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８：４５３４−４５３８（１９８７）；およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照のこと。他の参考文献には、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に組み込まれたげっ歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５（１９８６）参照のこと。もう１つの参考文献には、組換えベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域に支持されたげっ歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、欧州特許公開第５１９、５９６号を参照のこと。これらの種類の「ヒト化」分子は、ヒト移植患者におけるそれらの部分の治療適用の期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する不要な免疫学的応答を最小限にするために設計されている。他の利用可能な抗体のヒト化方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、  １９：２４７１−２４７６（１９９１）ならびに米国特許第６、１８０、  ３７７号；第６、０５４、２９７号；第５、９９７、８６７号；第５、８６６、６９２号；第６、２１０、６７１号；第６、３５０、８６１号；および国際公開公報第０１／２７１６０号中に開示されている。
【００９６】
抗体をヒト化するさらなる例示的な方法は、国際公開公報第０２／０８４２７７号および米国特許公開公報第２００４／０、１３３、３５７号中に記載され、それら両方の全文が本明細書中に参照により組み込まれる。
【００９７】
さらに他の代替において、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう操作された市販されているマウスを使用することにより完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば、完全にヒト抗体）またはより頑強な免疫応答を生じるよう設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用されてもよい。そのような技術の例は、アブジェニクス社（フリーモント、カリフォルニア州）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにメダレックス社（プリンストン、ニュージャージー州）からのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【００９８】
他の代替では、抗体は、ファージディスプレイ技術により組換えで作製されてもよい。例えば、米国特許第５、５６５、３３２号；第５、５８０、７１７号；第５、７３３、７４３号および第６、２６５、１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３−４５５（１９９４）を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））は、ヒト抗体およびヒト抗体断片を、未免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産するために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄ等の糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーなコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に表示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、機能的特性に基づいて抗体を選択することは、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の幾つかを擬似している。ファージディスプレイは様々な方式で実行することができる。参考のために、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、  Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ、  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、  ５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。ファージディスプレイには、複数のＶ遺伝子セグメント供給源を使用することができる。
【００９９】
Ｃｌａｃｋｓｏｎら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから単離した。未免疫ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを、構築することができ、多様なアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、Ｍａｒｋら、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：７２５−３４（１９９３）により記載される技術に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞性超変異）。導入された変化の幾つかは高度な親和性を付与することとなり、高親和性の表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は優先的に複製され、続く抗原チャレンジの際に分化する。この天然のプロセスは、「チェインシャフリング」として知られている技術を用いることにより模倣することができる。Ｍａｒｋｓら、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：７７９−７８３（１９９２））。この方法において、ファージディスプレイにより得られた「初代の」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、未免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体（レパートリー）のレパートリーと順次置換することにより向上させることができる。この技術により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能になる。非常に多量のファージ抗体レパートリー（「全ライブラリーの母体」としても知られている）を作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されている。
【０１００】
ヒト抗体が、出発げっ歯類抗体と同程度の親和性および特異性を有する場合には、遺伝子シャフリングを用いることにより、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもできる。「エピトープインプリンティング」とも参照されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、げっ歯類ヒトキメラが作り出される。抗原に基づく選択は、機能的抗原結合部位を再建することができるヒト可変領域の単離をもたらす。つまり、エピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残存するげっ歯類Ｖドメインを置換するために上記方法を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された国際公開公報第９３０６２１３号を参照されたい）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有していない完全にヒト型の抗体を提供する。上記の議論はヒト化抗体に関係するものであるが、議論された一般的な原理は、たとえばイヌ、ネコ、霊長動物、ウマ、およびウシでの使用のための抗体のカスタマイズに適用可能であることは明らかである。
【０１０１】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体もまた、架橋剤を使用する方法を含む、合成タンパク質化学の公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラートおよびメチル‐４‐メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
【０１０２】
一本鎖Ｆｖ断片はまた、Ｉｌｉａｄｅｓら、  １９９７、  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、  ４０９：４３７−４４１に記載されるように生産されてもよい。様々なリンカーを使用した、そのような一本鎖断片のカップリングは、Ｋｏｒｔｔら、  １９９７、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、  １０：４２３−４３３に記載されている。抗体の組換え生産および組換え操作についての様々な技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０１０３】
更に、前記抗体は、水溶性のポリマー部分と結合していてもよい。前記抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ‐ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等と結合していてもよい。前記抗体は、分子上の無作為な位置、または分子上の予め決定した位置で修飾してもよく、そして１つ、２つ、または３つ以上の結合部分を含んでいてもよい。前記ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝状または非分枝状のものであってもよい。ある実施態様において、前記部分は、リンカーを介して抗体に結合される。ある実施態様において、前記結合部分は、動物体内での抗体の循環半減期を増加させる。抗体に対するＰＥＧなどのポリマーの結合方法は、当該技術分野でよく知られている。ある実施態様において、前記抗体はＰＥＧ化された抗体などのＰＥＧ化された抗体である。また、前記複合体は、更に異なる化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、造影剤、毒素、生物学的作用剤、酵素阻害剤、または抗体などの他の薬剤と結合していてもよい。
【０１０４】
２．抗体−医薬複合体
ある実施態様において、本発明は前記抗体とトリプトライドとが結合してなる複合体に関する。トリプトライドはＩＵＰＡＣ名（３ｂＳ、４ａＳ、５ａＳ、６Ｒ、６ａＲ、７ａＳ、７ｂＳ、８ａＳ、８ｂＳ）−６−Ｈｙｄｒｏｘｙ−６ａ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−８ｂ−ｍｅｔｈｙｌ−３ｂ、４、４ａ、６、６ａ、７ａ、７ｂ、８ｂ、９、１０−ｄｅｃａｈｙｄｒｏｔｒｉｓｏｘｉｒｅｎｏ［６、７：８ａ、９：４ｂ、５］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ［１、２−ｃ］ｆｕｒａｎ−１（３Ｈ）−ｏｎｅであり、下記式で表される構造を有する：
【０１０５】
【化１】
2017043613.tif 000006
【０１０６】
よって、本発明の抗体−トリプトライド複合体は、以下の式で表すことができる：
【０１０７】
【化２】
2017043613.tif 000007
［式中、Ａｂは抗体を表し、Ｌはリンカーを表し、ｎは自然数であり、抗体と結合するトリプトライドの数を表す。］
【０１０８】
抗体とトリプトライドとは、リンカーＬを介して共有結合で結合している。抗体とトリプトライドとを結合するリンカーＬは、多価性のリンカー（例えば、二価性のリンカー）を用いることができる。抗体と医薬とを結合させることができるリンカーは本技術分野においてよく知られている。該リンカーは、分解性であってもよく、又は非分解性であってもよい。また、該リンカーは硫黄原子を含んでいるか、又は硫黄原子を含んでいない。例えば、リンカーは、酸分解性、光分解性、ペプチダーゼ分解性、エステラーゼ分解性、ジスルフィド結合還元性、又は疎水性とすることができる。リンカーは、例えば、マレイミド基又はハロアセチル基を基本骨格として有していても良い。
【０１０９】
リンカーとしては、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）、Ｎ−［γ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ］ｓｕｃ、ｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＧＭＢＳ）、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−［（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ］ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙ−（６−ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＫＭＵＡ）、ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＥＭＣＳ）、ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＡＭＳＡ）、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＳＭＰＨ）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｙｒａｔｅ（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ｐ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ（ＰＭＩＰ）、ＰＥＧを含むマレイミドベースの架橋剤、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＩＡ）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＢＡ）、及びＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＢＡＰ）を挙げることができる。
【０１１０】
原料となるトリプトライドは、保存安定性を高めるために以下の構造を有する二量体とすることができ、この二量体を還元してそのまま使用することができる。
【０１１１】
【化３】
2017043613.tif 000008
【０１１２】
この場合、二量体を還元することにより各々のトリプトライドに４−Ｏｘｏ−４−［（２−ｔｈｉｏｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ基が結合した以下の物質が得られる。
【０１１３】
【化４】
2017043613.tif 000009
【０１１４】
トリプトライドに結合した４−Ｏｘｏ−４−［（２−ｔｈｉｏｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ基は、そのままリンカーＬとして用いてもよい。または、４−Ｏｘｏ−４−［（２−ｔｈｉｏｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ基を除去して、上述のリンカーのみをリンカーＬとして直接トリプトライドに結合させても良い。あるいは、リンカーＬは、上述の２価性のリンカーと４−Ｏｘｏ−４−［（２−ｔｈｉｏｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ基とが結合した基であってもよい。例えば、リンカーＬとして４−Ｏｘｏ−４−［（２−ｔｈｉｏｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ及びＳＭＣＣを用いた場合、本発明の抗体−トリプトライド複合体は、以下の式で表すことができる：
【０１１５】
【化５】
2017043613.tif 000010
【０１１６】
抗体１分子に結合するトリプトライドの数（前記式におけるｎ）は、少なくとも１あればよいが、例えば、２又はそれ以上、２．５又はそれ以上、３又はそれ以上、３．５又はそれ以上、４又はそれ以上、４．５又はそれ以上、５又はそれ以上、５．５又はそれ以上、６又はそれ以上、６．４８９又はそれ以上、６．５又はそれ以上、７又はそれ以上、７．５又はそれ以上、８又はそれ以上、８．５又はそれ以上、９又はそれ以上、９．５又はそれ以上、あるいは、１０又はそれ以上とすることができる。また、抗体１分子に結合するトリプトライドの数（前記式におけるｎ）は、３又はそれ以下、３．５又はそれ以下、４又はそれ以下、４．５又はそれ以下、５又はそれ以下、５．５又はそれ以下、６又はそれ以下、６．５又はそれ以下、７又はそれ以下、７．５又はそれ以下、８又はそれ以下、８．５又はそれ以下、９又はそれ以下、９．５又はそれ以下、あるいは、１０又はそれ以下とすることができる。あるいは、抗体１分子に結合するトリプトライドの数は、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、９〜１０、あるいは、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、６．４８９、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０とすることができる。
【０１１７】
リンカーの抗体への結合は、通常、抗体のリシン残基をアシル化することにより達成される。抗体へのトリプトライドの結合位置は、抗体の特異性に影響を与えない位置であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、抗体の定常領域に結合する。
【０１１８】
本発明の抗体−医薬複合体は当業者に良く知られた方法により製造することができる。例えば、抗体とリンカーを先に反応させて結合させた後、医薬（トリプトライド）をリンカーと結合させることができる。具体的には、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中、室温で３０分間、抗体とＤＭＳＯに溶解させた１０〜５０モル倍量のリンカーと反応させ、未反応のリンカーを除去することにより抗体にリンカーを結合させることができる。トリプトライド誘導体のダイマーを１００％エタノールに溶解させ、２時間還元させ、リンカー修飾抗体とトリプトライドとを、１：５．６８の比で、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５中、室温で一晩反応させることにより、抗体−リンカー−トリプトライドの結合物を得ることができる。
【０１１９】
３．併用剤
本発明は、更に、前記抗体と他の抗腫瘍剤との併用剤に関する。前記抗体と併用可能な抗腫瘍剤としては、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ等のナイトロジェンマスタード類、及び、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロミド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチン等のニトロウレア類を含むアルキル化薬；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなどの白金化合物；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、デカフール、デカフール・ウラシル、デカフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、ペメトレキシド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬；イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなどの植物アルカロイド又は微小管阻害薬；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルピシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシンなどの抗癌性抗生物質；シプリューセル−Ｔ等の癌ワクチン；イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブ等の分子標的薬；アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾールなどのホルモン剤；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナンなどの生物学的応答調節剤を挙げることができ、好ましくは、シスプラチン、ペメトレキシド、ゲムシタビンであり、より好ましくは、ゲムシタビンである。
【０１２０】
本発明の併用剤（２以上の薬剤を含有する医薬組成物）は、一つの製剤中に併用される２種類以上の全ての又は一部の薬剤が含有されていてもよいし、併用を目的とした、それぞれの薬剤を単独で含有する製剤として提供されてもよい。あるいは、本発明の併用剤は、併用される２種類以上の全ての又は一部の薬剤について、それぞれの薬剤を単独で含有する製剤を備える併用のためのキットとして提供されてもよい。
【０１２１】
４．用途
本発明の複合体又は併用剤は、治療方法、悪性細胞の溶解方法を含む様々な適用に有用であるが、これらに限定されるものではない。例えば、本発明は、本発明の複合体又は併用剤を有効成分として含有する医薬組成物、悪性中皮腫治療薬、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤、悪性中皮腫細胞の溶解剤を含む。又は、本発明は、医薬組成物、悪性中皮腫治療薬、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤、悪性中皮腫細胞の溶解剤として使用するための本発明の複合体又は併用剤であってもよい。あるいは、本発明は、医薬組成物、悪性中皮腫治療薬、悪性中皮腫細胞の増殖阻害剤、悪性中皮腫細胞の溶解剤の製造における、本発明の複合体の使用又は抗ＣＤ２６抗体及び抗腫瘍剤の使用であってもよい。一態様では本発明は、有効量の本発明の複合体又は併用剤をそれを必要とする患者に投与することを備える、悪性中皮腫の治療方法、悪性中皮腫細胞の増殖阻害方法、悪性中皮腫細胞の溶解方法を含む。よって、本発明は、ＣＤ２６発現細胞の増殖を阻害する方法も提供する。ＣＤ２６発現細胞の増殖阻害は、部分的な増殖阻害ないし完全な増殖阻害を含む、観察可能なあらゆるレベルの阻害を含む。ある実施態様では、細胞増殖は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約１００％阻害される。本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。ある実施態様では、方法は、細胞を本明細書中に記載される複合体又は併用剤と接触させる工程を含む。一般には、細胞増殖を阻害するのに十分な量の複合体又は併用剤と細胞とを接触させる。
【０１２２】
ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、癌細胞である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍である。ある実施態様では、腫瘍細胞は、悪性または良性である。
【０１２３】
細胞増殖の阻害を評価する方法は、当該分野で公知であり、ＭＴＴアッセイが挙げられる（例えば、Ａｙｔａｃら（２００３）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８８：  ４５５−４６２、Ｈｏら（２００１）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：  ２０３１−２０４０、Ｈａｎｓｅｎ  ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、  １１９：  ２０３−２１０、およびＡｙｔａｃら（２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：  ７２０４−７２１０を参照。）。
【０１２４】
更に、本発明は、対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態の治療方法を提供する。対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態の治療法は、本明細書中に記載される複合体又は併用剤を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６の異常発現に関連してもよい。ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現の変化または異常（ある実施態様では、ＣＤ２６発現量の増加もしくは減少（正常サンプルとの比較において）、ならびに／または不適切な発現、例えば、通常ＣＤ２６を発現しない組織および／もしくは細胞内での発現、または通常ＣＤ２６を発現する組織もしくは細胞内でのＣＤ２６発現の欠如）に関連する状態であってもよい。ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連している状態であってもよい。ＣＤ２６発現に関連している状態は、少なくとも部分的にＣＤ２６によって媒介されていてもよく、ＣＤ２６発現細胞に関連する状態であってもよく、又は、ＣＤ２６発現細胞の増殖に異常が認められる状態であってもよい。ＣＤ２６発現細胞は、Ｔ細胞、又は腫瘍細胞であってもよく、該腫瘍細胞は、悪性または良性のものであってもよい。
【０１２５】
対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態は、増殖性疾患、特には癌を含む。癌は、悪性中皮種、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍である。
【０１２６】
本明細書中に記載された方法（治療方法を含む）は、単一部位あるいは複数部位への単一の時点あるいは複数の時点における単回直接注射によってなされれてもよい。投与はまた、複数部位へほぼ同時に行ってもよい。投与頻度は、治療過程の上で決定および調整され、達成が望まれる結果に基づく。場合によっては、本発明の複合体又は併用剤、および医薬組成物の徐放持続製剤が適切であり得る。徐放を達成するための様々な製剤や装置は、当該分野で周知である。
【０１２７】
治療又は予防対象は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物を含み、好ましくは、ヒトである。
【０１２８】
複合体又は併用剤は、好ましくは、担体（好ましくは医薬的に許容される担体）に含まれた状態で哺乳動物に投与される。適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、  Ｅａｓｔｏｎ、  ＰＡ、  １９９０年およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、  ２０００年に記載されている。通常、適切量の医薬的に許容される塩が製剤に用いることにより該製剤に等張性を有することになる。担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。これらの溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。更に、担体としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマー製の半透性マトリクスなどの徐放製剤が挙げられ、そのマトリクスは、例えば、フィルム、リポソームまたはマイクロ粒子などの造形品の形態にある。例えば、投与される抗体の投与経路および濃度に依存して、ある異種の担体がより好ましくなる場合があることは、当業者には明らかであろう。
【０１２９】
複合体又は併用剤は、哺乳動物に注射（例えば、全身、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内）によって投与されてもよく、または有効な形態での血流への送達を確実にするその他の方法（例えば、注入）によって投与されてもよい。複合体又は併用剤は、局所で治療効果を得るために、組織内単離灌流などの単離灌流法でも投与してもよい。静脈注射が好ましい。
【０１３０】
本発明の複合体又は併用剤を投与するための有効用量およびスケジュールは、経験的に決定され、そのような決定方法は当該技術分野の技術常識の範囲内である。当業者であれば、投与すべき複合体又は併用剤の用量が、例えば、複合体又は併用剤を接種する哺乳動物、投与経路、使用する抗体の具体的な種類および前記哺乳動物に投与される他の薬剤に依存して変わることを理解するであろう。単独で使用される複合体又は併用剤１日当たりの典型的な投与量は、前述の要素にもよるが、１日当たり約１μｇ／体重ｋｇから１００ｍｇ／体重ｋｇまたはそれ以上までの範囲であってもよい。一般に、以下のいずれの投与量が使用されてもよい：少なくとも約５０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１μｇ／体重ｋｇの投与量、またはこれを上回るの投与量が投与される。
【０１３１】
複合体又は併用剤は、哺乳動物に有効量の他の１つ以上の治療薬と更に併用投与されてもよい。複合体又は併用剤は、連続的または同時に、他の１つ以上の治療薬と投与されてもよい。複合体又は併用剤および治療薬の量は、例えば、どのような種類の薬剤を使用するか、治療される病理学的状態、ならびに投与スケジュールおよび投与経路に依存するが、一般的には、仮に該複合体又は併用剤および該治療薬を個別に使用する場合より少ない量になるであろう。
【０１３２】
哺乳動物への複合体又は併用剤の投与後、哺乳動物の生理状態は、当業者に周知の様々な方法でモニターすることができる。
【０１３３】
５．抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的効果を相する化合物のスクリーニング方法
更に別の態様において、本発明は、抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的効果を示す化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、ＣＤ２６とＣＤ９は相互作用を行い、互いにｃｏｕｎｔｅｒしている（Ｏｋａｍｏｔｏら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ（２０１４）９（１）：ｅ８６６７１）ことに基づく。候補化学療法剤がＣＤ２６と相互作用している場合にはその効果がＣＤ９により減弱されることから、ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している細胞株とＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株との間で増殖抑制効果に差がある場合には、抗ＣＤ２６抗体との併用により相乗的効果を相する薬物であると決定することができる。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、
抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を呈する化合物のスクリーニング方法であって、以下のステップを備える方法：
（ａ）ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株、及び、ＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株を被検化合物の存在下で培養するステップ；
（ｂ）培養後の前記各々の腫瘍細胞株の細胞数を測定するステップ；
（ｃ）前記被検化合物のＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株の増殖抑制効果、及び、前記被検化合物のＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株の増殖抑制効果を算出するステップ；
（ｄ）前記被検化合物のＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株の増殖抑制効果、及び、前記被検化合物のＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株の増殖抑制効果を比較し、ＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株の増殖抑制効果の方が優れる場合には、前記被検化合物は抗ＣＤ２６抗体と併用することにより相乗的な抗腫瘍効果を呈する可能性が高い化合物として選択するステップ。
【０１３４】
本方法において、ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している腫瘍細胞株としては、中皮腫細胞株ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２を用いることができる。また、ＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株としては、ＪＭＮ、Ｈ２２６を用いることができる。
【０１３５】
腫瘍細胞株の細胞数を測定するステップは、細胞数を反映する測定値が得られる方法であれば公知のあらゆる方法を採用することができ、例えば、細胞数の変わりに、濁度、ＭＴＴアッセイの測定値など、細胞数の指標となる他の数値で代用してもよい。
【０１３６】
腫瘍細胞株の増殖抑制効果は、コントロールを１００とした場合の細胞数として算出してもよいし、ＩＣ５０等の薬効の指標となる数値を算出してもよい。増殖抑制効果が優れるか否かは、増殖抑制した細胞数が多い場合にあ増殖抑制効果が優れるとして判定することができる。
【０１３７】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【０１３８】
（実施例１）抗体−薬物の結合
（１）原料
ヒト化抗ＣＤ２６抗体ＹＳ１１０は、既に報告された手法により抗ＣＤ２６マウス抗体１４Ｄ１０を元として設計し、発現させた（国際公開公報ＷＯ２００７／０１４１６９）；Ｉｎａｍｏｔｏ  Ｔら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００７）１３：４１９１−２００参照）。以下の構造を有するトリプトライド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍｕｌａ：  Ｃ２０Ｈ２４Ｏ６；ＭＷ＝３６０．４）は、Ｓｈａａｎｘｉ  Ｔａｉｊｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（陝西省、中国）から購入した。
【０１３９】
【化６】
2017043613.tif 000011
【０１４０】
（２）結合プロトコル
ＣｈｅｍＧｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（東京、日本）により、トリプトライドにＳＨ基を導入した。得られたトリプトライド誘導体をＴＲ１と命名した。ＴＲ１は科学的安定性を高めるため、以下の構造を有するＳ−Ｓ結合で結合した二量体として提供された。
【０１４１】
【化７】
2017043613.tif 000012
【０１４２】
ヘテロ二価性リンカーである、ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（カタログ番号２１８５７、Ｔｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ］ｓｕｃ、ｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（カタログ番号２２３０９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］  ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カタログ番号２２３６０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用直前にＤＭＳＯに溶解させた。ＹＳ１１０は、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中、室温で３０分間、ヘテロ二価性リンカーＳＰＤＰ（１５モル倍量）、ＧＭＢＳ（３０モル倍量）、又はＳＭＣＣ（２０モル倍量）と反応させて修飾した。未反応のリンカーをＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（カタログ番号２１８５７、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で除去した。トリプトライド誘導体ＴＲ１  Ｓ−Ｓダイマーを１００％エタノールに溶解させ、固定化ＴＣＥＰ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｇｅｌ（カタログ番号７７７１２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で２時間還元させた。還元されたＴＲ１−ＳＨのＳＨ基の濃度をＤＴＮＢ（（５、５−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））アッセイで測定した。リンカー修飾ＹＳ１１０とＴＲ１−ＳＨを、１：５．６８の比で、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５中、室温で一晩反応させた。未反応のＴＲ１−ＳＨをＰＤ−１０カラム（カタログ番号１７０８５１０１、ＣＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で除去した。本反応の概略は以下のとおりである。
【０１４３】
【化８】
2017043613.tif 000013
【０１４４】
得られた産物をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ０．２２ｕｍ（Ｃａｔ  ｎｏ．  ＳＬＧＶ  ０１３ＳＬ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いてフィルター滅菌し、最終濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（カタログ番号２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて測定した。産物中の結合しなかった残りのＴＲ１−ＳＨをＤＴＮＢ  ａｓｓａｙで測定した。
【０１４５】
（３）結果
前記方法に従って、ヘテロ二価性リンカー（ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ、ＳＭＣＣ）を用いてＹＳ１１０とＴＲ１を結合させた。ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により測定された最終産物濃度は約１ｍｇ／ｍｌであった。ＤＴＮＢ  ａｓｓａｙにより産物中の残存非結合ＴＲ１−ＳＨを測定したが、ほとんど検出できなかった（データ非図示）。
【０１４６】
（実施例２）細胞培養
ＣＤ２６陰性悪性中皮腫細胞株であるＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＭＳＴＯ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）にＣＤ２６遺伝子を導入し、ＭＳＴＯ−ｃｌｏｎｅ１２と名づけた（Ａｏｅ  Ｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１２）１８：１４４７−５６）。ＣＤ２６陰性Ｔ細胞系白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）にＣＤ２６遺伝子を導入し、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋）と名づけた（Ｔａｎａｋａ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：４５８６−９０）。悪性中皮腫から樹立したＣＤ２６陽性細胞株ＪＭＮは、東京大学医科学研究所の森本  幾夫先生から提供いただいた。全ての細胞株は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＡＢＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ培地（カタログ番号１１８７５−０９３、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。
（実施例３）マススペクトルアッセイ
Ｙ−ＴＲ１の薬剤／抗体比は、限外ろ過の後、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦｍａｓｓ）により分析した。
【０１４７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦｍａｓｓで分析した非結合ＹＳ１１０及びＹ−ＴＲ１（ＳＭＣＣ）のインタクト質量は、それぞれ、１４７０１２．７及び１５１８１５．６であった（図１）。抗体と結合したＴＲ１及びＳＭＣＣ基の推定分子量は７３９．６であった。この分子量に基づき、１分子のＹＳ１１０に結合しているＴＲ１−ＳＭＣＣ基の平均値は、｛（１５１８１５．６−１４７０１２．７）／７３９．６｝の計算式で計算することができ、その結果は６．４８９であった。これは平均で６．４８９分子のＴＲ−１分子が１分子のＹＳ１１０に結合していることを意味する。
【０１４８】
（実施例４）結合アッセイ
Ｙ−ＴＲ１のＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞結合を調べるため、培養したＭＳＴＯ−ｗｔ細胞（ＣＤ２６陰性）及びＭＳＴＯ−ｃｌｏｎｅ１２細胞（ＣＤ２６陽性）を回収し、１×１０６細胞を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌのＹ−ＴＲ１と共に４℃で３０分間培養した。細胞を３回洗浄し、１：１００希釈でＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ（カタログ番号６１４０−０２、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）と共に４℃で３０分間培養した。３回洗浄後、Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０１４９】
Ｙ−ＴＲ１のＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２へのインタクトな結合がフローサイトメトリー分析により確認された（図２）。
【０１５０】
（実施例５）細胞毒性アッセイ
トリプトライド、ＹＳ１１０及びＹ−ＴＲ１の悪性中皮腫細胞株及びＴ細胞系白血病細胞株に対する細胞毒性は、ホルマザン色素の比色検出に基づくｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−１（カタログ番号１１６４４８０７００１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。概略としては、５×１０３細胞のＭＳＴＯ−ｗｔ、ＭＳＴＯ−ｃｌｏｎｅ１２、ＪＭＮ、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（−）、及びＪｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋）細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、ＡＢＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ培地中、９６ウェルプレート内で、トリプトライド（０〜１００ｎＭ）、ＴＲ１（０〜１００ｎＭ）、ＹＳ１１０（０〜１００μｇ／ｍｌ）、又はＹ−ＴＲ１（０〜１００ｕｇ／ｍｌ）と共に、３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。ＷＳＴ−１アッセイは、製造者が提供するマニュアルに従って実施した。各サンプルの６３０ｎｍにおけるバックグラウンド吸光度を４５０ｎｍにおける測定値から差し引いた。実験はトリプリケートで行い、代表的な結果を示した。
【０１５１】
図３に示すとおり、トリプトライドは、４８時間処理後に、悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ−ｗｔ、ＭＳＴＯ−ｃｌｏｎｅ１２、ＪＭＮ、及びＴ細胞系白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋）に対して、用量依存的毒性効果を示した。これらの細胞株に対するトリプトライドのＩＣ５０値を表４に示す。
【０１５２】
リンカーへの結合用にデザインされたトリプトライド誘導体ＴＲ１の細胞毒性及びＩＣ５０値を同様に試験した結果を図４及び表４に示す。ＴＲ１は、アッセイ前に固定化  ＴＲ−１  ＴＣＥＰ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により、ＳＳ二量体から還元した。
【０１５３】
Ｙ−ＴＲ１は、ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株及び白血病細胞株に対して、用量依存的細胞毒性を示した（図５）。ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２に対するＹ−ＴＲ１の細胞毒性を３種類のリンカー（ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ及びＳＭＣＣ）間で比較した（図５Ａ）。３種類のヘテロ二価性リンカー間での比較を行った結果、ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ  １２に対する、ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳ及びＳＭＣＣ  を用いたＹ−ＴＲ１のＩＣ５０値は、それぞれ、３８μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ及び１５μｇ／ｍｌであった（表５）。本実験において、ＳＭＣＣ  により結合されたＹ−ＴＲ１が最も優れた細胞毒性を示したため、以後の実験においてはＹ−ＴＲ１（ＳＭＣＣ）を用いた。Ｙ−ＴＲ１の、ＣＤ２６陽性又はＣＤ２６陰性悪性中皮腫細胞株及び白血病細胞株に対する細胞毒性を非結合ＹＳ１１０と比較した（図５Ａ、Ｂ）。様々な細胞株に対するＹ−ＴＲ１（ＳＭＣＣ）のＩＣ５０値を表４に示す。ＣＤ２６陽性細胞（ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２、ＪＭＮ、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋））に対し、Ｙ−ＴＲ１はＹＳ１１０と比較して顕著に高い細胞毒性を示した。対応するＣＤ２６陰性細胞（ＭＳＴＯ  ｗｔ、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（−））と比較して、ＣＤ２６陽性細胞株（ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ２６（＋））は、Ｙ−ＴＲ１細胞毒性に対する感度がより高かった（図５Ｃ、Ｄ）。ＭＳＴＯ  ｃｌｏｎｅ１２細胞株に対する、Ｙ−ＴＲ１に相当するフリーのＴＲ−１を、Ｙ−ＴＲ１（約１５μｇ／ｍｌ＝９９ｎＭ）及び非結合ＴＲ−１（２５０ｎＭ）のＩＣ５０値から計算した結果、１分子のＹ−ＴＲ１は２．５分子のＴＲ１に相当した（図６）。このことから、抗ＣＤ２６抗体ＹＳ１１０と結合させることにより、トリプトライド１分子あたりの中皮腫細胞株に対する細胞毒性作用が顕著に増大することが確認された。よって、より少ない投与量で悪性中皮腫を治療可能であることが示された。
【０１５４】
【表４】
2017043613.tif 000014
【０１５５】
【表５】
2017043613.tif 000015
【０１５６】
（実施例６）Ｉｎ  ｖｉｖｏ効果アッセイ及び毒性研究
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ）マウスを特定病原体不在（ＳＰＦ）施設内のマイクロアイソレーターケージで維持し、滅菌食及び滅菌水を自由摂取させた。動物実験プロトコルは動物実験委員会の承認を得て行った。
１×１０７細胞の培養ＪＭＮ細胞を６−８週齢のメスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下投与した。全部で３０匹の動物をランダムに３種類の治療群、すなわち、対照群、ＹＳ１１０投与群、及びＹ−ＴＲ１投与群に分けた。移植日からＹＳ１１０及びＹ−ＴＲ１群は４ｍｇ／ｋｇ／ｄｏｓｅのＹＳ１１０又はＹ−ＴＲ１を腹膜内に週３回投与し、全部で９回投与した。対照群は同量のＰＢＳを投与した。腫瘍が明らかに目視できる用になった時点で腫瘍を摘出し、大きさをノギスで計測した。推定腫瘍体積は、式：π／６×Ｌ×Ｗ×Ｗを計算して求めた（Ｔｏｍａｙｋｏ  ＭＭら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８９）２４：１４８−５４）。各群の平均腫瘍体積間の統計的有意性は、フィッシャーのＰＬＳＤ多重比較法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＰＬＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いて決定した。統計分析はＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）を用いて行った。
【０１５７】
ＣＤ２６陽性悪性中皮腫細胞株ＪＭＮ  を用いたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植モデルにおける非結合ＹＳ１１０と比較したＹ−ＴＲ１のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の結果を図７に示す。ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａ（π／６×Ｌ×Ｗ×Ｈ）（Ｔｏｍａｙｋｏ  ＭＭら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８９）２４：１４８−５４）で推定された５５日目の平均腫瘍体積を、フィッシャーのＰＬＳＤ多重比較法（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＰＬＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いて３群（対照、ＹＳ１１０、Ｙ−ＴＲ１）間で比較した。Ｙ−ＴＲ１投与群（全部で３６ｍｇ／ｋｇのＹ−ＴＲ１を腹腔内投与）の平均腫瘍体積は、対照群及びＹＳ１１０投与群と比較して顕著に低かった（ｐ＜０．０５）。Ｔｗｏ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｎｅ  Ｙ−ＴＲ１投与群の９匹のうち２匹のマウスは、実験終了時（５５日目）に肉眼で完全な腫瘍増殖抑制が確認された。図７は、２回得られた同様な実験結果のうち代表的な一例を示す。実験終了時の各群のマウスの平均体重は顕著に異ならなかった。
【０１５８】
（実施例７）中皮腫細胞株におけるＣＤ２６の発現の確認
中皮腫細胞株におけるＣＤ２６発現をＦＡＣＳにより測定して確認した。ＣＤ２６陽性中皮腫細胞株のうち、肉腫型中皮腫細胞株としてＡＣＣ−ＭＥＳＯ１、ＪＭＮを、上皮型中皮腫細胞株としてＮＣＩ−Ｈ２４５２、ＮＣＩ−Ｈ２２６を使用した。ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１、ＪＭＮ、ＮＣＩ−Ｈ２４５２、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を抗ＣＤ２６モノクローナル抗体−ＦＩＴＣで染色後、ＦＡＣＳ解析した。
結果を図８に示す。実験した全ての細胞株において、ＣＤ２６が発現していることが確認された。
【０１５９】
（実施例８）中皮腫細胞におけるシスプラチン−ペメトレキシドとＹＳ１１０の併用による細胞増殖抑制効果の増強
（１）シスプラチン及びペメトレキシドの用量作用曲線
ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２細胞（２×１０３／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後にシスプラチン又はペメトレキシドを１０−９、１０−８、１０−７、１０−６、１０−５、１０−４Ｍで添加した（ｎ＝６）。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
結果を図９に示す。シスプラチン及びペメトレキシドは用量依存的にＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２の増殖を抑制した。
【０１６０】
（２）ＹＳ１１０によるシスプラチン及びペメトレキシドのＭＥＳＯ１細胞増殖抑制効果の増強
ＭＥＳＯ１細胞（２×１０３／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後に、シスプラチン０．３、３、１０μＭとＹＳ１１０の０．１、３、１０μｇ／ｍｌとの組み合わせ、又は、ペメトレキシド０．０３、０．３、１μＭとＹＳ１１０の０．１、３、１０μｇ／ｍｌとの組み合わせを添加した。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）を用いて行った。
結果を図１０に示す。ＹＳ１１０はシスプラチンおよびペメトレキシドの細胞増殖抑制効果を増強した。
ペメトレキシド
【０１６１】
（３）ＹＳ１１０によるシスプラチン及びペメトレキシドのＨ２４５２細胞増殖抑制効果の増強
Ｈ２４５２細胞（２×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、シスプラチン０．０３、０．３、１μＭとＹＳ１１０の０．１、３、１０μｇ／ｍｌとを組み合わせ、又は、ペメトレキシド０．０１、０．１、０．３μＭとＹＳ１１０の０．１、３、１０μｇ／ｍｌを組み合わせを添加した（ｎ＝６）。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）を用いて行った。
結果を図１１に示す。ＹＳ１１０はシスプラチンおよびペメトレキシドの細胞増殖抑制効果を増強した。
【０１６２】
（４）ＹＳ１１０によるシスプラチン−ペメトレキシド併用のＭＥＳＯ１細胞増殖抑制効果増強
ＭＥＳＯ１細胞（２×１０３細胞／ｗｅｌｌ）又はＨ２４５２細胞（２×１０３細胞／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、シスプラチン０．３μＭ−ペメトレキシド０．１μＭの組み合わせ、又は、ＹＳ１１０（１０μｇ／ｍｌ）をシスプラチン０．３μＭ−ペメトレキシド０．１μＭに追加した組み合わせを添加した（ｎ＝６）。２日目にＭＴＴａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）を用いて行った。
結果を図１２に示す。ＹＳ１１０はシスプラチン−ペメトレキシドの細胞増殖抑制効果を増強した。
【０１６３】
（５）ＹＳ１１０によるシスプラチンおよびペメトレキシドのＪＭＮ細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制効果の増強
ＪＭＮ細胞（３×１０５細胞／匹）をメスＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植した。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）単独、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）単独、ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）単独、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）とＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用、又は、ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）とＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用を腹腔内投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１３に示す。ＹＳ１１０はシスプラチンおよびペメトレキシドのｉｎ  ｖｉｖにおける腫瘍増殖抑制効果を増強した。
【０１６４】
（６）ＹＳ１１０によるシスプラチン−ペメトレキシド併用のＪＭＮ細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制効果の増強
ＪＭＮ細胞（５×１０３細胞／匹）をメスＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植した。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）−ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）併用、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）単独、又は、前記シスプラチン−ペメトレキシド併用とＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用を腹腔内投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１４に示す。ＹＳ１１０はシスプラチン−ペメトレキシドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を増強した。
【０１６５】
（７）ＹＳ１１０によるシスプラチン−ペメトレキシド併用のＭＥＳＯ１細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制効果の増強
ＭＥＳＯ１細胞（３×１０５細胞／匹）をメスＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植した。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）単独、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）−ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）併用、又は、前記シスプラチン−ペメトレキシド併用とＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用を腹腔内投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１５に示す。ＹＳ１１０はＭＥＳＯ１細胞においてシスプラチン−ペメトレキシドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を増強した。
【０１６６】
（８）ＹＳ１１０によるシスプラチン−ペメトレキシド併用のＨ２４５２細胞ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制効果の増強
Ｈ２４５２細胞（３×１０５細胞／匹）をメスＳＣＩＤマウスの背部皮下に移植した。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）単独、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）−ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）併用、又は、前記シスプラチン−ペメトレキシド併用とＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用を腹腔内投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１６に示す。ＹＳ１１０はＨ２４５２細胞においてシスプラチン−ペメトレキシドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を増強した。
【０１６７】
（実施例９）中皮腫細胞におけるシスプラチン−ペメトレキシドとＹＳ１１０の併用による細胞浸潤抑制効果の増強
（１）シスプラチンおよびペメトレキシドの細胞浸潤に対する作用
ＭＥＳＯ１細胞又はＨ２４５２細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒに撒いた１時間後、シスプラチン（５、１０、３０μＭ）又はペメトレキシド（１、１０、３０μＭ）を添加して（ｎ＝５）、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。細胞播種から２４時間後に浸潤細胞をＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔで染色した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１７に示す。シスプラチンは１０および３０μＭにおいてｉｎｖａｓｉｏｎを抑制した。一方、ペメトレキシドは３０μＭにおいてもｉｎｖａｓｉｏｎに対して抑制作用を示さなかった。
【０１６８】
（２）シスプラチン−ペメトレキシド併用の細胞浸潤抑制効果
ＭＥＳＯ１細胞又はＨ２４５２細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒに撒いた１時間後、シスプラチン（０、３、１０μＭ）とペメトレキシド（０、１０、３０μＭ）とを組み合わせを添加して（ｎ＝５）、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。細胞播種から２４時間後に浸潤細胞をＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔで染色した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図１８に示す。シスプラチンは１０μＭにおいて細胞浸潤を抑制したがペメトレキシドは３０μＭにおいてもシスプラチンによる細胞浸潤抑制効果を増強しなかった。したがって、シスプラチンにペメトレキシドを組み合わせても細胞浸潤に対する抑制効果は増強されず、細胞浸潤に対してはシスプラチンとシスプラチン−ペメトレキシドは同等であることが示された。
【０１６９】
（３）ＹＳ１１０はＭＥＳＯ１細胞においてシスプラチンの細胞浸潤抑制効果を増強
ＭＥＳＯ１細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒに撒き、１時間後にシスプラチン（０、３、１０μＭ）とＹＳ１１０（０、１０、２０μｇ／ｍｌ）の組み合わせを添加して（ｎ＝５）、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。細胞播種から２４時間後に浸潤細胞をＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔで染色した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次にＹＳ１１０と  シスプラチン−ペメトレキシドの併用における交互作用を検討した。交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図１９に示す。ＹＳ１１０はシスプラチン−ペメトレキシドの細胞浸潤抑制作用を増強した（Ａ）。ＹＳ１１０（１０μｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（１０μＭ）、およびＹＳ１１０（２０μｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（１０μＭ）の組み合わせにおいて交互作用があった（Ｂ）。
【０１７０】
（４）ＹＳ１１０はＨ２４５２細胞においてシスプラチンの細胞浸潤抑制効果を増強
Ｈ２４５２細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）ををＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒに撒き、１時間後にシスプラチン（０、３、１０μＭ）とＹＳ１１０（０、１０、２０μｇ／ｍｌ）の組み合わせを添加して（ｎ＝５）、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。細胞播種から２４時間後に浸潤細胞をＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ−ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔで染色した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次にＹＳ１１０とシスプラチン−ペメトレキシドの併用における交互作用を検討した。交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２０に示す。ＹＳ１１０はシスプラチン−ペメトレキシドの細胞浸潤抑制作用を相乗的に増強した（Ａ）。ＹＳ１１０（１０μｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（１０μＭ）、およびＹＳ１１０（２０μｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（１０μＭ）の組み合わせにおいて交互作用があった（Ｂ）。
【０１７１】
（実施例１０）中皮腫細胞におけるゲムシタビンとＹＳ１１０の併用
（１）中皮腫細胞株におけるゲムシタビンの用量作用曲線
中皮腫細胞株の増殖に対するゲムシタビンの効果を検討した。中皮腫細胞株ＭＥＳＯ１、ＪＭＮ、Ｈ２４５２、Ｈ２２６（２×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、ゲムシタビン（１０−９、１０−８、１０−７、１０−６、１０−５、１０−４Ｍ）を添加した（Ｎ＝６）。２日後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図２１に示す。ゲムシタビンはＪＭＮ、Ｈ２２６においてより強く増殖を抑制した。
【０１７２】
（２）肉腫型中皮腫ＭＥＳＯ１細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果
ＭＥＳＯ１細胞（２×１０３細胞／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、ゲムシタビン（０、１０−８、３×１０−８、１０−７Ｍ）とＹＳ１１０（０、１、３、１０μｇ／ｍｌ）を組み合わせて添加した。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次に薬物併用における交互作用を検討した（ｎ＝６）。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２２に示す。ゲムシタビンの増殖抑制効果はＹＳ１１０により増強された（Ａ）。また、ゲムシタビン（１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせにおいて交互作用が認められた（Ｂ）。
【０１７３】
（３）肉腫型中皮腫ＪＭＮ細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果
ＪＭＮ細胞（２×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、ゲムシタビン（０、３×１０−１０、１０−９、３×１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（０、１、３、１０μｇ／ｍｌ）を組み合わせて添加した。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次に薬物併用における交互作用を検討した（ｎ＝６）。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２３に示す。ゲムシタビンの増殖抑制効果はＹＳ１１０により増強された（Ａ）。また、ゲムシタビン（３×１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（３μｇ／ｍｌ）、およびゲムシタビン（３×１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせにおいて交互作用が認められた（Ｂ）。
【０１７４】
（４）上皮型中皮腫Ｈ２４５２細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果
Ｈ２４５２細胞（２×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、ゲムシタビン（０、１０−８、３×１０−８、１０−７Ｍ）とＹＳ１１０（０、１、３、１０μｇ／ｍｌ）を組み合わせて添加した。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次に薬物併用における交互作用を検討した（ｎ＝６）。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２４に示す。ゲムシタビンの増殖抑制効果はＹＳ１１０により増強された（Ａ）。また、ゲムシタビン（１０−７Ｍ）とＹＳ１１０（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせにおいて交互作用が認められた（Ｂ）。
【０１７５】
（５）上皮型中皮腫Ｈ２２６細胞増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用効果
Ｈ２２６細胞（２×１０３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに撒いた１時間後、ゲムシタビン（０、１０−８、３×１０−８、１０−７Ｍ）とＹＳ１１０（０、１、３、１０μｇ／ｍｌ）とを組み合わせて添加した。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。次に薬物併用における交互作用を検討した（ｎ＝６）。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２５に示す。ゲムシタビンの増殖抑制効果はＹＳ１１０により増強された（Ａ）。また、ゲムシタビン（１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせ、ゲムシタビン（３×１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせ、ゲムシタビン（３×１０−８Ｍ）とＹＳ１１０（１０μｇ／ｍｌ）の組み合わせにおいて交互作用が認められた（Ｂ）。
【０１７６】
（６）標準療法  シスプラチン−ペメトレキシドに対するゲムシタビンの併用
ＭＥＳＯ１、ＪＭＮ、Ｈ２４５２およびＨ２２６細胞（２×１０３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに撒いた１時間後、シスプラチン（０、０．１、０．３、１μＭ）とペメトレキシド（０、０．０３、０．１、０．３μＭ）の組み合わせに、ゲムシタビン３×１０−８Ｍ、又は１０−７Ｍを併用して添加した（ｎ＝６）。２日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
結果を図２６に示す。シスプラチン−ペメトレキシドの組み合わせに対するゲムシタビンの併用はシスプラチン−ペメトレキシドの増殖抑制作用を増強しなかった。
【０１７７】
（７）上皮型中皮腫細胞Ｈ２２６のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用
メスＳＣＩＤマウス背部皮下にＨ２２６を移植（３．８×１０５細胞／匹）した。移植した日を０日目として、２日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン（２０ｍｇ／ｋｇ）、又は、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ゲムシタビン（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した（ｎ＝６）。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２７に示す。ＹＳ１１０単独、ゲムシタビン単独、ＹＳ１１０＋ゲムシタビンの各群はそれぞれ３４％、２９％、および８８％の抑制効果を示し、それぞれ有意な抑制効果を示した。また、ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用には交互作用が認められた。
【０１７８】
（８）肉腫型中皮腫細胞ＪＭＮのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲムシタビンの併用
メスＳＣＩＤマウスの背部皮下にＨ２２６細胞を移植した（３×１０５細胞／匹）。移植した日を０日目として、２日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ゲムシタビン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した（ｎ＝６）。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用における交互作用はＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで解析した。
結果を図２８に示す。ＹＳ１１０単独、ゲムシタビン単独、ＹＳ１１０＋ゲムシタビンの各群はそれぞれ３４％、２９％、および８８％の抑制効果を示し、それぞれ有意な抑制効果を示した。また、ＹＳ１１０とゲムシタビンの併用には交互作用が認められた。
【０１７９】
（実施例１１）ＣＤ２６陽性肺癌細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０との併用
（１）ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ８２７のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とシスプラチン−ペメトレキシドの併用
メスＳＣＩＤマウスの背部皮下にＨＣＣ８２７細胞を移植した（１．８×１０５細胞／匹）。移植した日を０日目として、１日目にＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）単独、シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）、又は、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ）＋シスプラチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋ペメトレキシド（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、４日目に１日目と同じ薬剤を同量、同じ方法で投与した（ｎ＝６）。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図２９に示す。ＹＳ１１０はシスプラチン−ペメトレキシドの効果を増強した。
【０１８０】
（２）ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ４００６細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０とゲフィチニブの併用
メスＳＣＩＤマウスの背部皮下にＨＣＣ８２７細胞を移植した（０．５×１０５細胞／匹）。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）、ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与）、又は、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）＋ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与）を投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図３０に示す。ＹＳ１１０はゲフィチニブの効果を増強した。
【０１８１】
（３）ＣＤ２６陽性肺癌細胞株ＨＣＣ８２７のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対するＹＳ１１０ととゲフィチニブの併用
メスＳＣＩＤマウスの背部皮下にＨＣＣ８２７細胞を移植した（０．９×１０５細胞／匹）。移植した日を０日目として、１日目と４日目の２回、ＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）、ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与）およびＹＳ１１０（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）＋ゲフィチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与）を投与した。７日目に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。有意差検定はＴｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（ｖｓ  Ｃｏｎｔ）により行った。
結果を図３１に示す。ＹＳ１１０はゲフィチニブの効果を増強した。
【０１８２】
（実施例１２）化学療法剤がＣＤ２６抗体との併用により相乗効果が期待できるかどうかのスクリーニング系の検討
薬物療法における相乗効果は互いの関与分子が相互作用していることによりもたらされると考えられる。したがって、ある化学療法剤がＣＤ２６と相互作用しながら抗癌効果を発揮している場合にはＣＤ２６抗体との併用で相乗効果の期待できる可能性が考えられる。ＣＤ２６とＣＤ９は相互作用を行い、互いにｃｏｕｎｔｅｒしている（Ｏｋａｍｏｔｏら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ（２０１４）９（１）：ｅ８６６７１）。したがってある化学療法剤がＣＤ２６と相互作用している場合にはその効果がＣＤ９により減弱される可能性がある。よって、ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している中皮腫細胞株ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２とＣＤ２６を発現しているがＣＤ９を発現していない細胞株ＪＭＮ、Ｈ２２６を用いて化学療法剤がＣＤ２６抗体との併用により相乗効果が期待できるかどうかのスクリーニング系設定の検討を行った。
【０１８３】
（１）ＭＥＳＯ１、ＪＭＮ細胞株を用いた、シスプラチン、ペメトレキシドの増殖抑制効果の比較
ＭＥＳＯ１、ＪＭＮ細胞株を用いて、シスプラチン（１０−９〜１０−４Ｍ）及びペメトレキシド（１０−９〜１０−４Ｍ）の増殖抑制効果を比較した。
結果を図３２に示す。Ａ：シスプラチンの増殖抑制効果を比較した結果、シスプラチンの増殖抑制効果はＭＥＳＯ１、ＪＭＮ間で差がなかった。Ｂ：ペメトレキシドの増殖抑制効果を比較した結果、ペメトレキシドの増殖抑制効果はＭＥＳＯ１、ＪＭＮ間で差がなかった。したがって抗ＣＤ２６抗体とシスプラチンとの併用、抗ＣＤ２６抗体とペメトレキシドとの併用では相乗効果が期待されない可能性が示唆された。
【０１８４】
（２）ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２、ＪＭＮ、Ｈ２２６細胞株を用いた、ゲムシタビンの増殖抑制効果の比較
ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２、ＪＭＮ、Ｈ２２６細胞株を用いて、ゲムシタビン（１０−９〜１０−４Ｍ）の増殖抑制効果を比較した。
結果を図３３に示す。Ａ：ゲムシタビンの増殖抑制効果をＭＥＳＯ１、ＪＭＮで比較した結果、ゲムシタビンはＪＭＮにおいてＭＥＳＯ１においてよりも有意に強い増殖抑制効果を示した。Ｂ：ゲムシタビンの増殖抑制効果をＨ２４５２、Ｈ２２６で比較した結果、ゲムシタビンはＨ２２６においてＨ２４５２においてよりも有意に強い増殖抑制効果を示した。ゲムシタビンはＭＥＳＯ１とＪＭＮ、Ｈ２４５２とＨ２２６間での比較においてＣＤ９の発現していないＪＭＮ、Ｈ２２６では強い増殖抑制効果が観察された。したがって、抗ＣＤ２６抗体とゲムシタビンの併用では相乗効果の期待できる可能性が示唆された。
【０１８５】
以上のとおり、シスプラチン、ペメトレキシドは、ＭＥＳＯ１細胞（ＣＤ９＋）とＪＭＮ細胞（ＣＤ９−）間で増殖抑制効果に差はなかった。上述の実験で抗ＣＤ２６抗体とシスプラチン、ペメトレキシドとの併用は相加効果であることが確認されていることから、ＭＥＳＯ１細胞（ＣＤ９＋）とＪＭＮ細胞（ＣＤ９−）間で増殖抑制効果に差がない場合には、抗ＣＤ２６抗体との併用において相乗的効果が得られることが示された。一方、ゲムシタビンはＭＥＳＯ１（ＣＤ９＋）とＪＭＮ（ＣＤ９−）、Ｈ２４５２（ＣＤ９＋）とＨ２２６（ＣＤ９−）間において増殖抑制効果に有意な差が認められた。上述の実験でゲムシタビンは抗ＣＤ２６抗体との併用で相乗効果が認められていることから、ＣＤ９＋細胞とＣＤ９−細胞で増殖抑制効果に差がある場合には、抗ＣＤ２６抗体との併用において相乗的効果が得られることが示された。以上より、ＣＤ２６とＣＤ９を共発現している細胞（例えば、ＭＥＳＯ１、Ｈ２４５２）とＣＤ２６は発現しているがＣＤ９を発現していない細胞（ＪＭＮ、Ｈ２２６）を用いることによりＣＤ２６抗体との併用により相乗効果をもたらす化学療法剤をスクリーニングできることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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