(57)【要約】  本発明は、糞便試料から物質を抽出する、より実用的な方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することを目的とする。糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、以下の工程Ａ〜Ｃを含むことを特徴とする。工程Ａ：以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程：    （ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：    （ｇ）水からなる溶媒：工程Ｂ：前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程：及び、工程Ｃ：前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程：
2017043087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｇ）水からなる溶媒：
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含むことを特徴とする、物質を抽出する方法。
【請求項２】
工程Ａが、（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ−１であることを特徴とする請求項１に記載の物質を抽出する方法。
【請求項３】
溶媒が水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が１０〜５０重量％の範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の物質を抽出する方法。
【請求項４】
工程Ａ−１におけるビーズの直径が、０．０２〜０．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項２又は３に記載の物質を抽出する方法。
【請求項５】
工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
【請求項６】
工程Ｘにおけるビーズの直径が、０．６〜１５ｍｍの範囲内であることを特徴とする請求項５に記載の物質を抽出する方法。
【請求項７】
溶媒が、さらに疎水性有機溶媒を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
【請求項８】
工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙをさらに含み、該工程Ｙで保存後の糞便試料を工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いることを特徴とする請求項１〜４及び７のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
（ｈ）水性溶媒及び７５重量％以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
【請求項９】
水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
【請求項１０】
親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
【請求項１１】
疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の物質を抽出する方法。
【請求項１２】
糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法で抽出した前記１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法であって、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、請求項１２に記載の方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
工程Ｑと工程Ｓの間に、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Ｒをさらに含み、
前記工程Ｒで標準化したデータを、工程Ｓにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便試料から物質を抽出する方法に関し、特に、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸管内には数百種類以上にも及ぶ腸内細菌が棲息しており、ヒト一人の腸内に棲息している腸内細菌の合計重量は約１．５ｋｇにもなる。腸内におけるこの腸内細菌の群衆は腸内細菌叢と呼ばれている。腸内細菌叢は、難消化性多糖の分解、必須栄養素であるビタミン等の産生、免疫システムの構築、病原性菌の増殖抑制などの役割を担い、人間の恒常性の維持に重要な存在である。しかし一方で、腸内細菌叢のバランスが崩れると、大腸がんなどをはじめとする様々な腸疾患（非特許文献１、２）、２型糖尿病などの代謝疾患（非特許文献３）、肥満の発症（非特許文献４）などにつながることが示唆されている。このように、腸内細菌叢は、人体に好影響も悪影響も及ぼし得る存在である。【０００３】
近年では、健康なヒトの便懸濁液を偽膜性大腸炎患者に移植するという便移殖療法により、抗生物質を用いて治療するよりも高い治療効果が得られたことが報告されていることから、腸内細菌叢や腸内環境の改善による、疾患治療の可能性も提示されている（非特許文献５）。このように腸内細菌叢とわれわれの健康との関連性が指摘されているが、腸内細菌叢が人体に影響を与えるメカニズムについては未だ不明瞭な点が多い。近年、腸内細菌叢のメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析により、腸内細菌叢の構成や遺伝子情報を得ることで、腸内細菌叢の生理学的機能が明らかになりつつある。しかし、腸内細菌叢の生理的機能の詳細を議論するためには、それら遺伝子機能だけでなく、宿主と腸内細菌とのやり取りの結果として生じる腸内の代謝物質情報も加味して議論する必要があると考えられることから、腸内代謝物質のメタボローム研究が近年注目されている。腸内代謝物質は宿主と腸内細菌の両者による代謝の結果として産生され、さらに、腸内細菌と宿主とが共通に利用するが、種々の先行研究から腸内細菌特有の代謝物質が宿主の生体応答に影響を与えることも徐々に明らかになってきた。例えば、腸内細菌叢から産生される酪酸は、宿主の制御性Ｔ細胞の分化を誘導し、腸管の炎症が軽減することが報告されており（非特許文献６）、また、酢酸を含む短鎖脂肪酸は全身のエネルギー代謝を活性化し肥満を防止することも報告されている（非特許文献７）。一方で、腸内細菌が一次胆汁酸を分解して産生する二次胆汁酸は、肝臓がんの発症を促進することも報告されている（非特許文献８）。このように、腸内細菌叢から産生される代謝物質には正負両面の機能がある。腸内代謝物質のメタボローム解析は、「宿主−腸内細菌叢間相互作用メカニズムの解明」、「腸内細菌叢から産生される代謝物質の新規機能物質の探索」、「腸内代謝物質プロファイルによる腸内環境の評価」などに有用だと考えられる。【０００４】
非特許文献９には、マウスの糞便をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline：PBS）溶液に溶解し、その上清をキャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析法（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ：Capillary Electrophoresis-Time of Flight Mass Spectrometry）で測定することで代謝物質を計測する方法が記載されている。しかしながら、腸内代謝物質の研究報告は少なく、腸内代謝物質の測定手法は確立しているとはいいがたい。【０００５】
また、糞便試料ではなく、動物細胞や血液などの試料から代謝物質を抽出する一般的な方法として、代謝酵素を失活させるためにメタノールやクロロホルムを用いる方法が知られており、例えば、メタノール、あるいは、水／メタノールの混合溶媒を用いて代謝物質を抽出する方法（非特許文献１０）や、クロロホルム／メタノールの混合溶媒を使用した液液分配により代謝物質を抽出する方法（非特許文献１１）などがよく用いられている。また、特許文献１には、メタノール、クロロホルム、水の共存下で、細胞から代謝物質を抽出する方法が記載されている。さらに、細菌や植物などの細胞壁をもつ細胞から代謝物質を抽出する場合は、ジルコニアビーズなどにより細胞を物理的に破砕し、メタノールなどの溶媒で抽出する方法が用いられている（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−００５７７８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arthur, J.C., et al. "Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. " Science;338(6103), 2012, pp.120-123.
【非特許文献２】Garrett, W.S., et al." Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system." Cell;131(1),2007, pp.33-45.
【非特許文献３】Vijay-Kumar, M., et al. "Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll-like receptor 5." Science;328(5975), 2010, pp.228-231
【非特許文献４】Turnbaugh, P.J., et al. "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest." Nature;444(7122), 2006, pp.1027-1031.
【非特許文献５】van Nood, E., et al. "Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile." The New England journal of medicine;368(5), 2013, pp.407-415.
【非特許文献６】Furusawa, Y., et al. "Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells." Nature;504(7480),2013, pp.446-450.
【非特許文献７】Kimura, I., et al. "The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43." Nature communications 2013;4:1829.
【非特許文献８】Yoshimoto, S., et al. "Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome." Nature;499(7456), 2013,pp.97-101.
【非特許文献９】Matsumoto, M., et al. "Impact of intestinal microbiota on intestinal luminal metabolome." Scientific reports 2012;2:233.
【非特許文献１０】Dietmair, S., et al. "Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: development of a metabolite extraction protocol." Analytical biochemistry;404(2),2010, pp.155-164.
【非特許文献１１】Kuwabara, H., et al. "Altered metabolites in the plasma of autism spectrum disorder: a capillary electrophoresis time-of-flight mass spectroscopy study." PloS one 2013;8(9):e73814.
【非特許文献１２】Wang, X., et al. "Evaluation and optimization of sample preparation methods for metabolic profiling analysis of Escherichia coli." Electrophoresis 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、糞便試料から物質を抽出する、より実用的な方法を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法において、
（Ａ）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｇ）水からなる溶媒：
（Ｂ）前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
（Ｃ）前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含むと、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１０】
また、本発明者らは、水性溶媒と、親水性有機溶媒及び／又は疎水性有機溶媒とを併用すると、より多種の物質を抽出できることを見いだした。さらに、本発明者らは糞便試料を溶媒中で懸濁する際に、ビーズを用いて破砕・懸濁処理すると、アミノ酸等の代謝物質がより効率良く抽出できることを見いだした。また、本発明者らは、糞便試料から抽出した物質をキャピラリー電気泳動やクロマトグラフィーで分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度を測定し、その測定データについてクラスター解析を行ったところ、物質プロファイルのうち、特徴的な物質ごとに、クラスター（グループ）に分類できることを見いだした。本発明者らは、これらのことなどをさらに見いだし、本発明を完成するに至った。【００１１】
また、本発明者らは、水性溶媒として水を用いた場合と、ＰＢＳ溶液を用いた場合を比較したところ、水を用いた方がより多数種の代謝物質を検出することができることを見いだした。また、ＰＢＳ溶液を用いた場合に、サンプルを濃縮して質量分析すると、塩濃度の影響で電流が過剰に流れてしまい、正確な測定ができなくなることも本発明者らは見いだした。本発明者らは、これらのことなどをさらに見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
また、本発明者らは、糞便試料を採取した後、その糞便試料から物質の抽出を行うまでの間、冷凍せずにその糞便試料を保存する場合に、その糞便試料を以下の（ｈ）、（ｉ）のいずれかの溶媒中で保存すると、保存中のその糞便試料における代謝物質プロファイルの変動が抑制されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
（ｈ）水性溶媒及び高濃度（例えば７５重量％以上）の親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｇ）水からなる溶媒：
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含むことを特徴とする、物質を抽出する方法や、
（２）工程Ａが、（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ−１であることを特徴とする上記（１）に記載の物質を抽出する方法や、
（３）溶媒が水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、かつ、前記溶媒中の水の含量が１０〜５０重量％の範囲内であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の物質を抽出する方法や、
（４）工程Ａ−１におけるビーズの直径が、０．０２〜０．５ｍｍの範囲内であることを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の物質を抽出する方法や、
（５）工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘをさらに含み、前記乾燥糞便小片を工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（６）工程Ｘにおけるビーズの直径が、０．６〜１５ｍｍの範囲内であることを特徴とする上記（５）に記載の物質を抽出する方法や、
（７）溶媒が、さらに疎水性有機溶媒を含むことを特徴とする上記（３）〜（６）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（８）工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙをさらに含み、該工程Ｙで保存後の糞便試料を工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いることを特徴とする上記（１）〜（４）及び（７）のいずれかに記載の物質を抽出する方法：
（ｈ）水性溶媒及び７５重量％以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：や、
（９）水性溶媒が、水、塩の水溶液、及び、緩衝水溶液からなる群から選択されることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（１０）親水性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の物質を抽出する方法や、
（１１）疎水性有機溶媒が、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の物質を抽出する方法に関する。【００１４】
また、本発明は、
（１２）糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法であって、
上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法で抽出した前記１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、前記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：
を含むことを特徴とする、方法や、
（１３）複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法であって、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記（１２）に記載の方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
を含むことを特徴とする、方法や、
（１４）工程Ｑと工程Ｓの間に、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程Ｒをさらに含み、
前記工程Ｒで標準化したデータを、工程Ｓにおけるクラスター解析に用いることを特徴とする上記（１３）に記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、糞便試料から１種又は２種以上の物質（好ましくは腸内の代謝物質）を効率的に抽出することができる。また、本発明によれば、糞便試料からより多数の種類の物質を抽出することができる。したがって、本発明によれば、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】代謝物質抽出法のフローチャートを示す図である。
【図２】抽出サンプル１〜５において検出された（陽イオン性）代謝物質のプロファイルを示す図である。サンプル及び代謝物質の階層的クラスタリングはピアソンの相関係数を用いて行った。ヒートマップの上部に記載された文字列のうち、ハイフンの前の文字列は抽出サンプルの種類（抽出サンプル１〜５）を表し、ハイフンの後ろの数字は用いた糞便の違いを表す。ヒートマップは各代謝物質のＺスコアを表し、黒は高濃度を、薄い灰色は低濃度を、白は検出限界以下を表す。
【図３】抽出サンプル３〜５において検出されたアミノ酸１９種（グルタミン［Ｇｌｎ］、アラニン［Ａｌａ］、アスパラギン［Ａｓｎ］、グリシン［Ｇｌｙ］、イソロイシン［Ｉｌｅ］、ロイシン［Ｌｅｕ］、リシン［Ｌｙｓ］、メチオニン［Ｍｅｔ］、フェニルアラニン［Ｐｈｅ］、セリン［Ｓｅｒ］、チロシン［Ｔｙｒ］、トリプトファン［Ｔｒｐ］、トレオニン［Ｔｈｒ］、バリン［Ｖａｌ］、アスパラギン酸［Ａｓｐ］、グルタミン酸［Ｇｌｕ］、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、プロリン［Ｐｒｏ］、及びアルギニン［Ａｒｇ］）の濃度を比較した結果を示す図である。３組の棒グラフは、左から順に、抽出サンプル３、４、及び５（条件３、４、及び５）において検出された各アミノ酸濃度（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示す。
【図４】抽出サンプル１〜５において検出された代謝物質数を比較した結果を示す図である。縦軸は各抽出条件で検出された代謝物質の種類数（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示し、横軸は各抽出条件を示す。
【図５】抽出サンプルＭｅ及び抽出サンプルＭｅＣｒにおいて検出された代謝物質を用いて、ＰＡＭ（Partitioning Around Medoids）クラスタリングを行った結果を示す図である。図中の［１］〜［３］は、それぞれButyrate（酪酸）、Cholate（コール酸）及びThiamine（ビタミンＢ１）を示し、［１］〜［３］を中心とした楕円は、それぞれ酪酸グループ、コール酸グループ及びビタミンＢ１グループを示す。
【図６】ＰＢＳ溶液又は水で抽出したサンプルにおいて、サンプルの濃縮率をそれぞれ変化させた場合に検出された代謝物質数を比較した結果を示す図である。縦軸は各抽出条件で検出された代謝物質の種類数（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）を示し、横軸は抽出条件及び濃縮率を示す。
【図７】糞便試料を室温で１〜２日間保存したときに、−８０℃保存に対する代謝物質プロファイルの変動を解析した結果を示す図である。図中の「I」は、糞便試料を室温で１〜２日間保存したときに、濃度増加が認められた代謝物質を示し、「II」は、糞便試料を室温で１日間保存したときに、濃度増加し、かつ室温で２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示し、「III」は、糞便試料を室温で１〜２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示す。
【図８】採便直後に−８０℃で保存、もしくは室温または４℃で１〜２日間保存した糞便試料から、メタノール・クロロホルム法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。
【図９】採便直後に−８０℃で保存、もしくは室温または４℃で１〜２日間保存した糞便試料から、５０％メタノール法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。
【図１０】採便直後に−８０℃で保存、もしくは室温または４℃または−２０℃で１〜２日間保存した糞便試料から、メタノール・クロロホルム法にて代謝物質を抽出し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。
【図１１】糞便試料を、各種有機溶媒（１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、５０％メタノール［５０％ＭｅＯＨ］、又は、メタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中もしくは有機溶媒非存在下で、室温、４℃もしくは−８０℃で２日間保存し、検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。プロットの形は保存に用いた有機溶媒の種類、色は保存温度を示している。
【図１２】図１１のうち、糞便試料を、１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、またはメタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中もしくは有機溶媒非存在下で、室温、４℃もしくは−８０℃で２日間保存した際に検出された代謝物質を用いて、主成分分析を行った結果を示す図である。プロットの形は保存に用いた有機溶媒の種類、色は保存温度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜糞便試料から物質を抽出する方法＞
本発明の「糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法」（以下、「本発明の抽出方法」とも表示する。）としては、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出する方法であって、
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程Ａ：
（ａ）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｂ）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｃ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ）親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｅ）疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｆ）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｇ）水からなる溶媒：
前記懸濁液から、前記溶媒を含む液層を分取する工程Ｂ：及び、
前記液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程Ｃ：
を含んでいる限り、特に制限されない。
【００１８】
（糞便試料）
本発明における「糞便試料」の由来となる生物種としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
【００１９】
（物質）
本発明における「物質」としては、糞便試料中に含まれる物質である限り特に制限されないが、親水性物質、親油性物質、両親媒性物質が挙げられ、より詳しくは、酸性、中性又は塩基性の親水性物質、酸性、中性又は塩基性の親油性物質、酸性、中性又は塩基性の両親媒性物質が挙げられる。また、本発明における好ましい「物質」としては、腸内代謝物質；ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸；コール酸やデオキシコール酸などの胆汁酸；酢酸やプロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸；乳酸やコハク酸などの有機酸；アミノ酸；単糖や二糖、三糖などの糖質；インドキシル硫酸などの尿毒素；脂肪酸や中性脂肪などの脂質；等が挙げられる。
【００２０】
本明細書における「腸内代謝物質」とは、糞便試料の由来となる生物（宿主）及び／又は腸内細菌が外界から取り入れた物質をもとにして合成及び／又は分解して生成する物質であって、宿主の腸内（好ましくは大腸内）に存在している又は存在していた物質を意味する。腸内代謝物質として具体的には、炭素数２〜６の短鎖脂肪酸；アミノ酸；ビタミン類；ポリアミン；核酸；胆汁酸；糖質；尿毒素；等が挙げられ、中でも、後述の表２〜表５に記載された物質が好ましく挙げられる。本発明の抽出方法によれば、糞便試料から腸内代謝物質をより網羅的に抽出することができる。
【００２１】
（工程Ａ）
本発明の抽出方法における工程Ａとしては、上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に前記糞便試料を懸濁して懸濁液を得る工程である限り特に制限されない。
【００２２】
（溶媒）
これらの溶媒における「水性溶媒」としては、精製水等の水；緩衝水溶液；ｐＨ調整剤を含む水溶液；等が挙げられるが、より多種類の腸内代謝物質を抽出する観点から、水が好ましい。また、塩を含む緩衝水溶液を用いて抽出した抽出液を濃縮して質量分析法に供した場合、測定の際に過剰な電流が流れて測定が妨げられる可能性があるため、上記の水性溶媒としては、緩衝水溶液よりも、水が好ましい。緩衝水溶液や、ｐＨ調整剤を含む水溶液のｐＨとしては、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲内や、ｐＨ６〜８の範囲内とすることができる。上記の緩衝水溶液としては、例えば、リン酸塩緩衝水溶液、トリス−塩酸塩緩衝水溶液、グッド緩衝水溶液等を挙げることができる。これらの水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
【００２３】
本明細書において、「親水性有機溶媒」とは、水への溶解度が２０ｇ／１００ｇ（２０℃）超の有機溶媒を意味する。上記の「親水性有機溶媒」としては、親水性の有機溶媒である限り特に制限されず、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、テトラヒドロフラン及びジエチレングリコールからなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、及びアセトンからなる群から選択される１種又は２種以上を好ましく挙げることができ、中でも、メタノール及びエタノールをより好ましく挙げることができ、中でも、メタノールをさらに好ましく挙げることができる。これらの親水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
【００２４】
本明細書において、「疎水性有機溶媒」とは、水への溶解度が２０ｇ／１００ｇ（２０℃）以下の有機溶媒を意味する。上記の「疎水性有機溶媒」としては、疎水性の有機溶媒である限り特に制限されず、クロロホルム、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、ベンゼン、フェノール、及びイソアミルアルコールからなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、クロロホルム、ヘキサン、及びジエチルエーテルからなる群から選択される１種又は２種以上を好ましく挙げることができ、中でも、クロロホルム及びヘキサンをより好ましく挙げることができる。これらの疎水性溶媒は、市販のものを用いてもよいし、試薬を用いて調製したものを用いてもよい。
【００２５】
上記（ａ）〜（ｆ）の溶媒としては、以下の（ａ１）〜（ｆ１）の溶媒を好ましく挙げることができ、以下の（ａ２）〜（ｆ２）の溶媒をより好ましく挙げることができる。
（ａ１）水性溶媒及び親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｂ１）水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、親水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｃ１）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｄ１）親水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｅ１）疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｆ１）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含み、水性溶媒を含まない溶媒：
【００２６】
（ａ２）水性溶媒及び親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｂ２）水性溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｃ２）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｄ２）親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｅ２）疎水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｆ２）親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
【００２７】
上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１０〜９０重量％の範囲内であり、かつ、親水性有機溶媒の含量が９０〜１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１０〜５０重量％の範囲内であり、かつ、親水性有機溶媒の含量が９０〜５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９〜５：１の範囲内を好ましく挙げることができる。
【００２８】
上記の（ａ）、（ａ１）及び（ａ２）の溶媒における好適な態様としては、メタノール濃度が１０〜９０重量％の範囲内のメタノール水溶液を挙げることができ、中でも、メタノール濃度が１０〜５０重量％の範囲内のメタノール水溶液を好ましく挙げることができ、中でも、メタノール濃度が５０重量％のメタノール水溶液をより好ましく挙げることができる。
【００２９】
上記の（ｂ）、（ｂ１）及び（ｂ２）の溶媒における水性溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１０〜９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０〜１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１０〜５０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０〜５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ｂ）、（ｂ１）及び（ｂ２）の溶媒における水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９〜５：１の範囲内を好ましく挙げることができる。
【００３０】
上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が５〜８５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が５〜８５重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が５〜８５重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が５〜６０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が１０〜７０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１０〜７０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が５〜３０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が３０〜５０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が３０〜５０重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。また、上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比や、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比や、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができる。水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９〜４：６の範囲内を好ましく挙げることができ、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、１：９〜４：６の範囲内を好ましく挙げることができ、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、３：７〜７：３の範囲内を挙げることができる。
【００３１】
上記の（ｃ）、（ｃ１）及び（ｃ２）の溶媒における好適な態様としては、水の含量が５〜８５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が５〜８５重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が５〜８５重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水の含量が５〜６０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が１０〜７０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１０〜７０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水の含量が５〜３０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が３０〜５０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が３０〜５０重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。
【００３２】
上記の（ｄ）及び（ｄ１）の溶媒における親水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、親水性溶媒の含量が８０〜１００重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、親水性有機溶媒の含量が９５〜１００重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。
【００３３】
上記の（ｅ）及び（ｅ１）の溶媒における疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、疎水性溶媒の含量が８０〜１００重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、疎水性有機溶媒の含量が９５〜１００重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。
【００３４】
上記の（ｆ）、（ｆ１）及び（ｆ２）の溶媒における親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば、親水性溶媒の含量が１０〜９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が９０〜１０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、親水性溶媒の含量が３０〜７０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が７０〜３０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができる。また、上記の（ｆ）、（ｆ１）及び（ｆ２）の溶媒における親水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、抽出目的である１種又は２種以上の物質の性質等に応じて適宜設定することができるが、例えば１：９〜９：１の範囲内を挙げることができ、中でも、３：７〜７：３の範囲内を挙げることができる。
【００３５】
（溶媒中に糞便試料を懸濁する方法）
上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中に糞便試料を懸濁する際には、上記溶媒中に上記糞便試料を添加して懸濁してもよいし、上記溶媒を上記糞便試料に添加して懸濁してもよい。上記溶媒中に上記糞便試料を懸濁する方法としては特に制限されず、上記溶媒及び上記糞便試料を振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が挙げられ、中でも、上記溶媒及び上記糞便試料を、超音波式、圧力式等のホモジナイザーで攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法や、上記溶媒及び上記糞便試料（好ましくはこれらを含む容器）をボルテックスミキサーで振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料を上記溶媒中に懸濁する方法が好ましく挙げられる。
【００３６】
（工程Ａ−１）
糞便試料からより多種の物質を抽出する観点や、糞便試料中の腸内細菌内からより多種の物質をより高濃度で抽出する観点から、上記工程Ａの中でも、以下の工程Ａ−１が好ましく挙げられる。
工程Ａ−１：上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかの溶媒中で、糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る工程Ａ−１：
【００３７】
上記の背景技術にも記載したように、近年、腸内細菌叢のメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析により、腸内細菌叢の構成や遺伝子情報を得ることで、腸内細菌叢の生理学的機能が明らかになりつつある。
一方、ビーズでの破砕処理を行うことによって、腸内細菌内に蓄積している代謝物質を含めた代謝物質プロファイルを取得できれば、より精度の高いメタボローム解析を行うことができる。この高精度のメタボローム解析の結果と、前述の遺伝子情報を統合すれば、腸内細菌叢の生理的機能をより詳細に解明することができると考えられる。
【００３８】
上記工程Ａ−１における溶媒中で、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法としては特に制限されず、上記溶媒と上記糞便試料とビーズとを共存させた状態で、上記溶媒、上記糞便試料及び上記ビーズを振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法が挙げられ、中でも、上記溶媒、上記糞便試料及び上記ビーズ（好ましくはこれらを含む容器）をボルテックスミキサーや、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）等の細胞破砕装置で振とう及び／又は攪拌することによって、上記糞便試料をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法が好ましく挙げられる。
【００３９】
上記工程Ａ−１におけるビーズの材質としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されないが、ジルコニア（二酸化ジルコニウム）、ジルコニウム、石英、シリカ、ステンレス、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化マンガン、マグネシウム、チタン、マンガンなどが挙げられる。
【００４０】
上記工程Ａ−１におけるビーズの形状としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されないが、略球状を挙げることができ、球状を好ましく挙げることができる。
【００４１】
上記工程Ａ−１におけるビーズの大きさとしては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されず、例えば、ビーズの最長部分の長さとしては、０．０２〜０．５ｍｍの範囲内、好ましくは０．０５〜０．３ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。ビーズが球状の場合、ビーズの直径としては、０．０２〜０．５ｍｍの範囲内、好ましくは０．０５〜０．３ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。
【００４２】
上記工程Ａ−１で用いるビーズは、市販されているものを用いることができる。
【００４３】
上記工程Ａ−１におけるビーズの添加量としては、糞便試料を破砕できる（好ましくは、糞便試料中の微生物を破砕できる）限り特に制限されず、例えば、溶媒１ｍＬ当たり１ｍｇ〜１ｇの範囲内、好ましくは１０〜８００ｍｇの範囲内、より好ましくは４０〜６００ｍｇの範囲内を挙げることができる。
【００４４】
上記工程Ａ−１におけるビーズとして、上記工程Ａ−１に関して例示したビーズと共に、後述の工程Ｘに関して例示するビーズを併用してもよい。
【００４５】
（工程Ｘ）
本発明の抽出方法は、以下の工程Ｘをさらに有していなくてもよいが、乾燥糞便小片を得ることによって、抽出に用いる各糞便試料の量をできるだけ揃えることができる点で、工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、以下の工程Ｘをさらに有していることが好ましい。
工程Ｘ：乾燥した糞便試料をビーズで破砕処理して乾燥糞便小片を得る工程Ｘ：
【００４６】
本発明の抽出方法が、工程Ｘをさらに有している場合は、工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として、上記工程Ｘで得られた乾燥糞便小片を用いる。
【００４７】
上記工程Ｘにおけるビーズの材質としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、具体的には、上記Ａ−１におけるビーズの材質として列挙されている材質を挙げることができる。上記工程Ｘにおけるビーズの材質は、上記Ａ−１におけるビーズの材質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４８】
上記工程Ｘにおけるビーズの形状としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されないが、略球状を挙げることができ、球状を好ましく挙げることができる。上記工程Ｘにおけるビーズの形状は、上記Ａ−１におけるビーズの形状と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４９】
上記工程Ｘにおけるビーズの大きさとしては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、例えば、ビーズの最長部分の長さとしては、０．６〜１５ｍｍの範囲内、好ましくは１．５〜９ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。ビーズが球状の場合、ビーズの直径としては、０．６〜１５ｍｍの範囲内、好ましくは１．５〜９ｍｍの範囲内が好適に挙げられる。
【００５０】
上記工程Ｘで用いるビーズは、市販されているものを用いることができる。
【００５１】
上記工程Ｘにおけるビーズの添加量としては、糞便試料を破砕できる限り特に制限されず、例えば、糞便試料１０ｍｇ（乾燥重量換算）当たり１ｍｇ〜１ｇの範囲内、好ましくは５０〜５００ｍｇの範囲内を挙げることができる。
【００５２】
本発明の抽出方法における上記工程Ａや工程Ａ−１の好適な態様は、抽出の目的とする物質の特性によって異なるが、その特性に応じて好適な態様を選択することができる。例えば、後述の実施例におけるクラスターIIの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ−１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行う方が好ましく、また、溶媒としては水性溶媒だけでなく親水性有機溶媒を併用する方が好ましい。一方、後述の実施例におけるクラスターＩの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ−１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行う方が好ましく、また、溶媒としては親水性有機溶媒を併用しない方が好ましく、水性溶媒のみを用いることが好ましい。また、後述の実施例におけるクラスターIIIの代謝物質を抽出する場合は、上記工程Ａ−１に記載されているようなビーズによる破砕処理を行うか否かによる差異はそれほど生じず、また、溶媒として水性溶媒のみを用いるか、親水性有機溶媒を併用するかによる差異もそれほど生じない。
【００５３】
（工程Ｙ）
本発明の抽出方法は、以下の工程Ｙをさらに有していなくてもよいが、糞便試料を採取した後、その糞便試料から物質の抽出を行うまでの間、冷凍せずにその糞便試料を保存する場合には、保存中のその糞便試料における代謝物質プロファイルの変動を抑制する観点から、工程Ａ又は工程Ａ−１より前に、以下の工程Ｙをさらに有していることが好ましい。
工程Ｙ：採取した糞便試料を以下の（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する工程Ｙ：
（ｈ）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｉ）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
【００５４】
本発明の抽出方法が、工程Ｙをさらに有している場合は、工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として、上記工程Ｙで保存後の糞便試料を用いる。
【００５５】
上記工程Ｙの溶媒における「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」の例や、好適な例としては、それぞれ、上記工程Ａの溶媒における「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」で挙げた例や、好適な例を挙げることができる。上記工程Ｙの溶媒で用いる「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」は、上記工程Ａ又は工程Ａ−１の溶媒に用いる「水性溶媒」、「親水性有機溶媒」、「疎水性有機溶媒」とそれぞれ同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００５６】
上記（ｈ）、（ｉ）の溶媒としては、以下の（ｈ１）、（ｉ１）の溶媒を好ましく挙げることができ、以下の（ｈ２）、（ｉ２）の溶媒をより好ましく挙げることができる。
（ｈ１）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒を含み、疎水性有機溶媒を含まない溶媒：
（ｉ１）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒を含む溶媒：
（ｈ２）水性溶媒及び７５％重量以上の親水性有機溶媒からなる溶媒：
（ｉ２）水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる溶媒：
【００５７】
上記（ｈ）の溶媒は、水性溶媒及び親水性有機溶媒を含む溶媒であって、溶媒中の親水性有機溶媒の含量が７５重量％以上である溶媒である。上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における親水性有機溶媒の含量としては、７５重量％以上である限り特に制限されないが、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上が挙げられる。また、上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における水性溶媒の含量としては、２５重量％未満である限り特に制限されず、親水性有機溶媒の含量に合わせて適宜設定することができ、例えば２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満などが挙げられる。また、上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における、水性溶媒に対する親水性有機溶媒の重量比としては、３倍より高ければ特に制限されないが、３倍より高く１００倍以下が挙げられる。
【００５８】
上記の（ｈ）、（ｈ１）及び（ｈ２）の溶媒における好適な態様としては、メタノール濃度が７５重量％以上（好ましくは８０重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上）で１００重量％未満のメタノール水溶液や、１００重量％メタノール溶液を挙げることができ、中でも、１００重量％メタノール溶液をより好ましく挙げることができる。
【００５９】
上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における水性溶媒や親水性有機溶媒や疎水性有機溶媒の含量としては特に制限されず、適宜設定することができるが、例えば、水性溶媒の含量が１〜４０重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が１０〜９５重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が５〜６０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１〜２５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が２０〜９０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１０〜５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水性溶媒の含量が１〜１５重量％の範囲内であり、親水性有機溶媒の含量が４０〜８０重量％の範囲内であり、かつ、疎水性有機溶媒の含量が１５〜４５重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。また、上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比や、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比や、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比としては特に制限されず、適宜設定することができる。水性溶媒と親水性有機溶媒との重量比として、例えば１：３０〜１：３の範囲内を挙げることができ、中でも、１：２０〜１：５の範囲内を好ましく挙げることができ、水性溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば１：１５〜１：１．５の範囲内を挙げることができ、中でも、１：１０〜１：２．５の範囲内を好ましく挙げることができ、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒との重量比として、例えば６：１〜２：３の範囲内を挙げることができ、中でも、４：１〜１：１の範囲内を挙げることができる。
【００６０】
上記の（ｉ）、（ｉ１）及び（ｉ２）の溶媒における好適な態様としては、例えば、水の含量が１〜４０重量％の範囲内であり、メタノールの含量が１０〜９５重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が５〜６０重量％の範囲内である溶媒を挙げることができ、中でも、水の含量が１〜２５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が２０〜９０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１０〜５０重量％の範囲内である溶媒を好ましく挙げることができ、中でも、水の含量が１〜１５重量％の範囲内であり、メタノールの含量が４０〜８０重量％の範囲内であり、かつ、クロロホルムの含量が１５〜４５重量％の範囲内である溶媒をより好ましく挙げることができる。
【００６１】
上記工程Ｙにおいて、採取した糞便試料を上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中で保存する方法としては、かかる糞便試料が、上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒中に含まれるようにする方法である限り特に制限されず、例えば、糞便試料に上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒を添加してもよいし、上記（ｈ）又は（ｉ）の溶媒に糞便試料を添加してもよい。
【００６２】
上記工程（Ｙ）において保存する際の温度としては、特に制限されないが、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制する観点から、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下、さらに好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１５℃以下、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは５℃以下、より好ましくは０℃以下、さらに好ましくは−５℃以下、より好ましくは−１５℃以下、さらに好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−４０℃以下、さらに好ましくは−６０℃以下、より好ましくは−８０℃以下が挙げられる。一方、冷凍設備などが使用できず、糞便試料を冷凍状態で保存することができない場合であっても、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制するという本発明の意義がより多く享受する観点から、保存する際の温度として、例えば０℃以上、３℃以上、４℃以上、６℃以上、１０℃以上が挙げられる。
上記工程（Ｙ）において保存する際の温度範囲としてより具体的には、−９０〜４０℃の範囲内、−９０〜３０℃の範囲内、−８０〜３０℃の範囲内、−８０〜２５℃の範囲内、−６０〜２０℃の範囲内などが挙げられる。また、本発明の意義がより多く享受する観点で好適な保存温度の範囲としてより具体的には、０〜４０℃の範囲内、０〜３０℃の範囲内、０〜２５℃の範囲内、０〜２０℃の範囲内、０〜１５℃の範囲内、０〜１０℃の範囲内、０〜５℃の範囲内、３〜２５℃の範囲内、３〜２０℃の範囲内、３〜１５℃の範囲内、３〜１０℃の範囲内、３〜５℃の範囲内、４〜２５℃の範囲内、４〜２０℃の範囲内、４〜１５℃の範囲内、４〜１０℃の範囲内、４〜５℃の範囲内、６〜２５℃の範囲内、６〜２０℃の範囲内、６〜１５℃の範囲内、６〜１０℃の範囲内などが挙げられる。
【００６３】
上記工程（Ｙ）において保存する期間としては、特に制限されず、保存する際の温度等に応じて適宜設定することができ、例えば保存温度が０℃未満の場合は、１分間〜１ヶ月間の範囲内、２０分間〜３週間の範囲内、１時間〜２週間の範囲内などが挙げられ、保存温度が０℃以上である場合は、１分間〜７日間の範囲内、２０分間〜３日間の範囲内、１時間〜２日間の範囲内などが挙げられる。
【００６４】
工程Ｙで保存後の糞便試料は、工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いることができる。工程Ｙで保存後の糞便試料を、工程Ａ又は工程Ａ−１の糞便試料として用いる方法としては、特に制限されず、工程Ｙで保存に用いた溶媒（以下、単に「保存溶媒」とも表示する。）の一部又は全部を、工程Ｙの保存後に除去してもよいし、除去しなくてもよいが、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルが変動することを抑制する観点から、保存溶媒を除去しないことが好ましい。
【００６５】
工程Ｙの保存後に保存溶媒を除去しない場合であって、かつ、かかる保存溶媒が上記（ａ）〜（ｇ）のいずれかの抽出溶媒である場合は、前記保存溶媒をそのまま抽出溶媒として、上記工程Ａや工程Ａ−１を行ってもよい。また、上記Ｙの保存後に保存溶媒を除去しない場合、その保存溶媒に、水性溶媒、親水性有機溶媒及び疎水性有機溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の溶媒を含有させることによって、保存溶媒を抽出溶媒に変化させることが好ましい。例えば、上記（ｈ）の保存溶媒は、そのまま上記（ａ）の抽出溶媒として用いてもよいし、水性溶媒、親水性有機溶媒等を保存溶媒に添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ａ）の抽出溶媒として用いてもよいし、疎水性有機溶媒等を保存溶媒に添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよい。また、上記（ｉ）の保存溶媒は、そのまま上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよいし、水性溶媒、親水性有機溶媒、疎水性有機溶媒等を添加すること等によって、保存溶媒から組成等を変化させた溶媒を上記（ｃ）の抽出溶媒として用いてもよい。
【００６６】
（工程Ｂ）
本発明の抽出方法における工程Ｂとしては、上記工程Ａ又は工程Ａ−１で得た懸濁液から、上記溶媒を含む液層を分取する工程である限り特に制限されない。
【００６７】
（液層を分取する方法）
上記懸濁液から、上記液層を分取する方法としては、特に制限されないが、例えば、上記懸濁液を遠心してその上清を分取する方法を好ましく挙げることができる。懸濁液の遠心は、市販の遠心分離装置を用いて行うことができる。
【００６８】
（工程Ｃ）
本発明の抽出方法における工程Ｃとしては、上記工程Ｂで分取した液層からタンパク質を除去した後、１種又は２種以上の物質を得る工程である限り特に制限されない。
【００６９】
（液層からタンパク質を除去する方法）
上記工程Ｂで分取した液層からタンパク質を除去する方法としては、特に制限されず、限外濾過フィルターや、逆浸透フィルター等のフィルターを用いて上記液層のタンパク質を除去する方法を好ましく挙げることができる。限外濾過フィルターや、逆浸透フィルターは、市販のものを用いることができる。
【００７０】
上記液層のタンパク質を除去して得られた液体に、糞便試料から抽出した１種又は２種以上の物質が含まれている。抽出した物質の保存性の観点から、上記液体を乾燥することが好ましい。かかる乾燥した物質は、質量分析法や核磁気共鳴分光法に供する際に、再度水等の溶媒を添加及び溶解して用いることができる。また、該溶媒を添加する際、質量分析法や核磁気共鳴分光法用の内部標準物質も添加することが好ましい。
【００７１】
＜糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法＞
本発明の「糞便試料中の１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する方法」（以下、「本発明の同定・測定方法」とも表示する。）としては、本発明の抽出方法で抽出した１種又は２種以上の物質をクロマトグラフィー又はキャピラリー電気泳動で分離し、質量分析法及び／又は核磁気共鳴分光法に供することによって、上記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、上記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｐ：を含んでいる限り、特に制限されない。上記工程Ｐにおける「クロマトグラフィー」としては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーが挙げられ、液体クロマトグラフィーが好ましく挙げられる。クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動（ＣＥ：Capillary Electrophoresis）による物質の分離は、市販のクロマトグラフ（クロマトグラフィー用の装置）や、キャピラリー電気泳動装置を用いて、常法により行うことができる。
【００７２】
上記の質量分析法とは、イオン源を用いて物質を気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化した物質を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析装置を用いた測定方法である。
【００７３】
イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化した物質を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。上記工程Ｐにおける質量分析法としては、市販の質量分析装置を用いた従来公知の質量分析法を利用することができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。
【００７４】
上記工程Ｐにおける好適な質量分析法としては、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析法（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）、ガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ: Gas Chromatography-Mass Spectrometry）や液体クロマトグラフ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ: Lipid Chromatography-Mass Spectrometry）が挙げられ、中でもＣＥ−ＴＯＦＭＳが好ましく挙げられる。ＣＥ−ＴＯＦＭＳは、イオン性の低分子化合物の測定に優れ、分離能が高く、より多種の代謝物質を同時に測定することができる。ＣＥ−ＴＯＦＭＳは、例えば大腸菌における主要な代謝物質の約９０％を測定することが可能である（Ohashi, Y., et al. "Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS." Molecular bioSystems;4(2), 2008, pp.135-147）。また、ＣＥ−ＴＯＦＭＳは、中性物質や脂溶性物質の測定には必ずしも向いていないが、腸内代謝物質として主要な物質である短鎖脂肪酸、アミノ酸、一部のビタミン類、ポリアミンなどを同時に測定することが可能であるため、腸内代謝物質のプロファイリングに適している。なお、ＧＣ−ＭＳは、短鎖脂肪酸などの揮発性物質の測定には優れるものの、一部のアミノ酸など、測定できない物質もある。ＬＣ−ＭＳは、多様な代謝物質の測定が可能であるが、測定対象となる物質ごとに最適なカラムや測定メソッドを選択する必要があり、一度の測定における網羅性ではＣＥ−ＴＯＦＭＳに劣る。
【００７５】
質量分析法を用いて、上記１種又は２種以上の物質を同定し、及び、前記１種又は２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する場合、物質の種類と濃度が既知の物質を内部標準として用いることができる。内部標準物質としては、メチオニンスルホン、Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］、２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］、３−アミノピロリジン、トリメセートなどを挙げることができる。上記の内部標準物質は、糞便試料中の物質と区別できるように、安定同位体や蛍光等で標識されていることが好ましい。内部標準物質は、１種又は２種以上の物質を抽出する前の糞便試料に添加してもよいし、糞便試料から１種又は２種以上の物質を抽出した後のサンプルに添加してもよい。
【００７６】
上記の核磁気共鳴分光法とは、上記１種又は２種以上の物質を強い磁場の中に置き、核スピンの向きを揃えた分子にパルス状のラジオ波を照射し、核磁気共鳴させた後、分子が元の安定状態に戻る際に発生する信号を検知して分子構造などを解析する方法である。
【００７７】
核磁気共鳴分光法の方法としては特に制限されず、フーリエ変換ＮＭＲであってもよいし、連続波法ＮＭＲであってもよい、また、一次元ＮＭＲであってもよいし、二次元ＮＭＲであってもよい。核磁気共鳴分析法は、市販の核磁気共鳴装置を用いて、常法により行うことができる。
【００７８】
＜複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法＞
本発明の「複数の対象を２以上のクラスターに分類する方法」（以下、「本発明の分類方法」とも表示する。）としては、
複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程Ｑ：及び、
前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程Ｓ：
を含んでいる限り、特に制限されない。
【００７９】
（対象）
本発明の分類方法における「対象」とは、糞便試料の採取源である生物を意味する。かかる生物の種類としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、中でも、ヒトが好ましく挙げられる。
【００８０】
（クラスター）
本発明の分類方法において分類する「クラスター」とは、糞便試料中の１種又は２種以上のうち、いずれか１種又は２種以上（好ましくは１種）の物質の有無や、濃度の高低などから選択される１種又は２種以上（好ましくは１種）の特性が共通する「対象の集団」を意味する。
【００８１】
（工程Ｑ）
本発明の分類方法における工程Ｑとしては、複数の対象から得られた糞便試料のそれぞれについて、上記の本発明の同定・測定方法を行うことによって、２種以上の物質を同定し、及び、前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合を測定する工程である限り特に制限されない。
【００８２】
（工程Ｓ）
本発明の分類方法における工程Ｓとしては、前記工程Ｑで得られた前記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータについてクラスター解析を行い、物質プロファイルの類似度によって、前記複数の対象を２以上のクラスターに分類する工程である限り特に制限されない。上記工程Ｓにおけるクラスター解析の手法としては、複数の対象を２以上のクラスターに分類できる限り特に制限されず、階層的クラスタリングであってもよいし、分割最適化クラスタリングであってもよく、該分割最適化クラスタリングとしては、ＰＡＭクラスタリング（partitioning around medoid clustering）を好ましく挙げることができる。これらのクラスター解析は、市販のソフトウェアにより行うことができる。
【００８３】
上記工程Ｓにおける「物質プロファイルの類似度」とは、上記工程Ｑで同定された２種以上の物質の種類や、該工程Ｑで測定された２種以上の物質の濃度、組成又は割合が、ある対象と別の対象において類似している度合を意味する。かかる類似度は、市販のクラスター解析ソフトウェアなどによって評価することができる。
【００８４】
分類するクラスターの数としては特に制限されないが、例えばCalinski-Harabasz (CH) indexに基づいて導かれたクラスター数を好ましく挙げることができる。ただし、CH indexに基づいて導かれたクラスター数に分けたときにエラーが発生した場合は、導かれたクラスター数よりも１つ多いクラスター数に分類することを好ましく挙げることができる。
【００８５】
（工程Ｒ）
本発明の分類方法は、上記の工程Ｑと工程Ｓの間に工程Ｒをさらに含んでいなくてもよいが、工程Ｒをさらに含んでいてもよい。該工程Ｒとしては、上記工程Ｑで得られた上記２種以上の物質の濃度、組成又は割合のデータを標準化する工程である限り特に制限されない。かかるデータの標準化は、市販のソフトウェアなどを用いて行うことができる。
【００８６】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８７】
１．代謝物質の抽出１
糞便試料中の腸内細菌の代謝物質を、キャピラリー電気泳動（capillary electrophoresis：ＣＥ）−飛行時間型質量分析計（Time-of-Flight mass spectrometer;ＴＯＦＭＳ）(ＣＥ−ＴＯＦＭＳ)を用いて検出するために、まず、代謝物質の抽出の条件検討を行った。【００８８】
１−１  方法
１−１−１  代謝物質の抽出法
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、採取後直ちに−８０℃で保存した。
〔２〕内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する０．１×ＰＢＳ溶液（以下、単に「ＰＢＳ溶液」という）を、１０ｍｇの糞便試料あたり１００μＬの割合で加え、ハンディーホモジナイザー（SIGMA社製）で糞便試料全体が均一になるまで撹拌し、糞便懸濁液を調製した。
〔３〕糞便懸濁液を１００μＬずつ４本のスクリューキャップチューブ（バイオメディカルサイエンス社製）に分注し、以下の〔４〕〜〔９〕に示す抽出条件（図１及び表１）により抽出サンプル１、及び２〜５をそれぞれ得た。
〔４〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬを、１７，８００×ｇで１０分間遠心し、上清（上清ａ）を回収した。上清ａを除いた後の沈殿物に、ＰＢＳ溶液を、１０ｍｇの糞便試料あたり１００μＬの割合で加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、上清（上清ｂ）を回収した。上清ａと上清ｂを、それぞれ分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で２倍に希釈したものを測定に用いた。測定後、上清ａと上清ｂから得られた濃度を足しあわせたものを抽出サンプル１とした。
〔５〕上記工程〔４〕において、上清ｂを除いた後の沈殿物に、１０ｍｇの糞便試料に対して１００μＬのＰＢＳ溶液を加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、１７，８００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清を取り除く洗浄工程を２度繰り返し、細胞外代謝物質と内部標準物質を除いた。沈殿物に、１００μＬの５０％メタノール溶液／上記内部標準物質３種含有MilliQ水、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び約０．１ｇの０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル２」）を回収した。抽出サンプル２を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔６〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌した。この際、ビーズの添加は行っていない。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル３」）を回収した。抽出サンプル３を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液をMilliQ水で２倍に希釈し測定に用いた。
〔７〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇを加え、Shakemaster NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル４」）を回収した。抽出サンプル４を、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。
〔８〕上記工程〔３〕で調製した糞便懸濁液１００μＬに、１００％ メタノール溶液を１００μＬ（最終濃度では５０％のメタノール）、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１７，８００×ｇで５分間遠心し、上清（「抽出サンプル５」）を回収した。抽出サンプル５を分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、５０μＬのMilliQ水に再溶解したものを測定に用いた。【００８９】
【表１】
2017043087.tif 000003
【００９０】
１−１−２  ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
抽出サンプルはＣＥ−ＴＯＦＭＳ（Agilent Technologies社製）の陽イオンモードで測定を行った。ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる測定は、文献（Hirayama, A., et al. "Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry." Cancer research;69(11)2009, pp.4918-4925.）に記載の方法にしたがって行った。ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより測定したデータは、解析ソフトウェアMaster Hands（Sugimoto, M., et al. "Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles." Metabolomics : Official journal of the Metabolomic Society;6(1), 2010, pp.78-95.）を用いて、代謝物質の同定と濃度を算出した。抽出条件ごとの代謝物濃度を比較するため、各条件の代謝物濃度からＺスコアを算出し（すなわち、各条件の代謝物濃度を標準化し）、MeV TM4 version 4.8（Saeed, A.I., et al. "TM4 microarray software suite." Methods in enzymology 2006;411:134-193.）を用いてヒートマップを作製し、代謝物質についてk-meansを用いたクラスタリングを行った。また、同定された代謝物質の種類とその濃度について、各抽出サンプル間で階層的クラスタリングを行った。【００９１】
１−２  結果及び考察
各抽出条件での代謝物質濃度を比較するため、各代謝物質の濃度をＺスコアに変換し、得られた代謝物質の種類とその濃度を可視化し、代謝物質についてk-meansクラスタリングを行い、抽出条件ごとの特徴を反映したクラスターＩ〜ＩＶに分類した（図２）。【００９２】
クラスターＩには、４５種類の代謝物質（表２）が分類された。【００９３】
【表２】
2017043087.tif 000004
【００９４】
かかるクラスターＩの代謝物質群は、抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）において最も高濃度で検出された。このクラスターＩには１５種のアミノ酸や３種のジペプチドが含まれていた。また、このクラスターＩの代謝物質は、抽出サンプル３（ビーズ破砕処理無し）と比較して、抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）で高濃度に検出される傾向にあった（図３）。そのため、これらの代謝物質は菌体外にも存在するが、菌体内にも一定量存在しており、ビーズによる菌体破砕を行うことで検出量が増加したと考えられる。さらに、これらのクラスターＩの代謝物質は、抽出サンプル５（メタノールで抽出）と比較して、抽出サンプル４（ＰＢＳで抽出）において高濃度で検出される傾向にあるため、メタノールに溶出しにくいことが示された（図３）。【００９５】
クラスターIIには、２３種類の代謝物質（表３）が分類された。【００９６】
【表３】
2017043087.tif 000005
【００９７】
かかるクラスターIIの代謝物質群は、特に、抽出サンプル５において高濃度に検出された。これらの代謝物質はビーズ破砕を行い、メタノールを添加した条件で最も高濃度で抽出される傾向にあるため、菌体内の存在量が多く、メタノールに溶解しやすい代謝物質であると考えられる。このクラスターにはguanine、cytidine、adenosineなどの核酸の構成要素や、thiamine、pyridoxalなどのビタミンが含まれていた。【００９８】
クラスターIIIには、５２種類の代謝物質（表４）が分類された。【００９９】
【表４】
2017043087.tif 000006
【０１００】
かかるクラスターIIIの代謝物質群は、抽出サンプル２において検出量が少なく、抽出サンプル１及び３〜５では同程度に検出された。また、抽出サンプル３（ビーズ破砕処理無し）と抽出サンプル４（ビーズ破砕処理有り）において検出量の違いが少ないことからも、これらの代謝物質は菌体内の存在量が少ないことが示された。また、抽出サンプル４（ＰＢＳで抽出）と、抽出サンプル５（メタノールで抽出）とを比較しても、検出濃度に大きな差がないことから、ＰＢＳでもメタノールでも同程度に抽出可能な代謝物質であることが示された。【０１０１】
クラスターＩＶには、２１種類の代謝物質（表５）が分類された。【０１０２】
【表５】
2017043087.tif 000007
【０１０３】
かかるクラスターＩＶの代謝物質群は、いくつかの抽出条件で検出されなかったものである。したがって、これらの代謝物質に注目する際は抽出条件を慎重に検討する必要があると考えられる。【０１０４】
以上の結果を踏まえ、各抽出条件の特徴をサンプル間の階層的クラスタリングから比較すると、抽出サンプル２ではほぼ全ての代謝物質濃度が他の抽出方法と比較して低いことが示された。これは、糞便中代謝物質の多くが菌体外に存在していることを示している。腸管内では常に腸内細菌の増殖や溶菌（死滅）が起こるため、腸管内や糞便中には溶菌した腸内細菌由来の代謝物質も多量に存在していると考えられる。抽出サンプル２では、糞便中に存在はするが溶菌していない細菌細胞に含有されている代謝物質を検出しているが、抽出サンプル２で検出される代謝物質濃度が全体的に低濃度であったことから、このような細胞に含まれる代謝物質は全体から比べると微量であると考えられる。他の抽出条件については、階層的クラスタリングの結果から抽出サンプル１と抽出サンプル３が類似していることが示された。抽出サンプル１と抽出サンプル３の抽出手法の違いは、抽出サンプル３では撹拌を行ったのに対し、抽出サンプル１は撹拌を行わなかった点のみであり、抽出溶媒などの条件は同一である。また、抽出サンプル３の撹拌ではビーズを用いていないため、菌体の破砕は起こらなかったと考えられる。本研究の結果から、糞便中代謝物質は主に菌体外に存在することが示されているため、結果として抽出サンプル１と抽出サンプル３は類似した抽出条件になっていたと考えられる。抽出サンプル１と抽出サンプル３に次いで、類似した代謝物質プロファイルが得られた手法は抽出サンプル４であった。抽出サンプル３と抽出サンプル４ではビーズ破砕の有無に差があるにも関わらず、クラスターIに属するアミノ酸などを除いて代謝物質プロファイルは類似していた。抽出サンプル５は抽出サンプル１、抽出サンプル３、および抽出サンプル４とは異なるクラスターに分類された。抽出サンプル１、条抽出サンプル３、抽出サンプル４は溶媒にメタノールを含まないが、抽出サンプル５は溶媒にメタノールが含まれているため、溶媒の違いが得られる代謝物質プロファイルに影響を及ぼすことが示された。また、抽出サンプル３と抽出サンプル４はビーズによる破砕の有無が異なり、抽出サンプル４と抽出サンプル５はメタノール添加の有無が異なるが、抽出サンプル３と抽出サンプル４の差よりも、抽出サンプル４と抽出サンプル５の差の方が大きいことを示しており、メタノール添加の有無はビーズ破砕の有無よりも大きな影響をおよぼすことが示された。【０１０５】
次に、個別の代謝物質に注目し、溶媒の違いや菌体の破砕の有無によって有意に濃度が異なる代謝物質を調べた。溶媒の違いによる影響の分析には抽出サンプル４と抽出サンプル５の比較を、菌体破砕の有無による影響の分析には抽出サンプル３と抽出サンプル４の比較を行った。なお、比較した結果、偽陽性率（False Discovery Rate：ＦＤＲ）が０．０５以下の有意差があるものを選択した。【０１０６】
溶媒の違いの比較（抽出サンプル４と抽出サンプル５の比較）から、検出された１４１物質のうち２９物質の代謝物質の濃度に、溶媒の違いによる有意差が認められた（表６）。そのうち１４物質はアミノ酸で、いずれも抽出サンプル４において有意に高濃度で検出された。アミノ酸は水溶液中では双性イオンとなり、有機溶媒よりも水に溶解しやすい性質があるため、このような結果が得られたと考えられる。また、メタノールを添加した抽出サンプル５において有意に高濃度であった物質にはadenineや2'-deoxyguanosineなど核酸の構成要素が含まれていた。【０１０７】
【表６】
2017043087.tif 000008
【０１０８】
ビーズによる菌体破砕の有無の比較（抽出サンプル３と抽出サンプル４の比較）では４種のアミノ酸を含む７物質の代謝物質の濃度に有意差が認められた（表７）。これらすべての代謝物質が菌体破砕を行った抽出サンプル４において高濃度であった。【０１０９】
【表７】
2017043087.tif 000009
【０１１０】
抽出サンプル１〜５において検出できた代謝物質の数を解析したところ、抽出サンプル５において検出された代謝物質の数は平均１３１種であり、最も多かった（図４）。これは抽出サンプル１と抽出サンプル２のように菌体と上清を分離していないことに加え、有機溶媒を用いることでＰＢＳ溶液には溶解しにくい代謝物質も抽出できたことに起因すると考えられる。また、抽出サンプル２では検出された代謝物質が平均８３種と最も少なかった。本研究によって菌体内の代謝物質の存在量は菌体外に比べて少ないことが示されているが、この結果は菌体内のみから代謝物質を得ても検出限界に満たない物質が３０〜４０％程度存在していることを示している。【０１１１】
これらの結果より、ＣＥ−ＴＯＦＭＳによって得られる糞便中の陽イオン代謝物質プロファイルは、抽出に用いる溶媒やビーズによる菌体破砕の有無による影響を受けることが示された。上清画分、沈殿画分、および糞便懸濁液全体の代謝物質プロファイルの比較から、多様な代謝物質が上清画分に含有されていることが明らかとなった。抽出サンプル１〜５の比較では特にアミノ酸の濃度が抽出条件の影響を受けやすく、菌体破砕を行い、メタノールを添加しない抽出サンプル４において最も高濃度で検出される傾向にあった。また、検出可能な代謝物質の数の比較では、メタノールを添加し、ビーズを用いて菌体破砕を行った抽出サンプル５において最も多くの種類の代謝物質が検出された。
【実施例２】
【０１１２】
２．代謝物質の抽出２
抽出サンプル５が得られた条件を基に、代謝物質抽出の条件検討をさらに行った。すなわち、抽出サンプル５が得られた条件と同様に、メタノールを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合（以下、「メタノール法」という）と、メタノール及びクロロホルムを溶媒として用い代謝物質を抽出した場合（以下、「メタノール・クロロホルム法」という）とで、検出できる代謝物質の差異をＣＥ−ＴＯＦＭＳにより分析した。【０１１３】
２−１  方法
２−１−１  メタノール法
〔１〕健常人（男女計７５名）から糞便試料をそれぞれ採取し、凍結乾燥処理した。
〔２〕凍結乾燥処理後の糞便試料に、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）４個を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて糞便試料全体が均一になるまで撹拌した。
〔３〕撹拌処理後の糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する５０％メタノールを４００μＬ、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＭｅ」）を回収した。抽出サンプルＭｅを分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３−アミノピロリジン及び２００μＭトリメセート）を含有するMilliQ水を１００μＬ加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。【０１１４】
２−１−２  メタノール・クロロホルム法
上記「２−１−１  メタノール法」の工程〔２〕で撹拌処理した糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１００％メタノールを５００μＬ、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を０．１ｇ加え、さらに、５００μＬのクロロホルム及び２００μＬのMilliQ水を加えた後、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＭｅＣｒ」）を回収した。抽出サンプルＭｅＣｒを分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３−アミノピロリジン及び２００μＭトリメセート）を含有するMilliQ水を１００μＬ加え、よく攪拌して再溶解したものを測定に用いた。【０１１５】
２−１−３  ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析は、上記「１−１−２  ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。【０１１６】
２−２  結果
メタノール法で抽出された代謝物質のプロファイルと、メタノール・クロロホルム法で抽出された代謝物質のプロファイルとはよく類似していた。一方、かかる２種類の抽出方法で抽出された代謝物質の濃度について比較したところ、全体的にメタノール・クロロホルム法よりもメタノール法で抽出した方が検出される代謝物質の濃度は高かった。すなわち、両方法で１．５倍以上の差異が認められた代謝物質は、表８に示す２９種類の物質であったが、そのうちメタノール・クロロホルム法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は４種類あったのに対して、メタノール法で抽出した方が検出される濃度が高い代謝物質は２５種類もあった（表８）。【０１１７】
【表８】
2017043087.tif 000010
【０１１８】
表８中の左から２及び３番目の列の数値は、それぞれ「Ｍｅ（抽出サンプルＭｅ）」及び「ＭｅＣｒ（抽出サンプルＭｅＣｒ）」において検出された各代謝物質の濃度（内部標準物質に対する相対値）を示す。また、表中の右から１番目の列の数値は、「Ｍｅ（抽出サンプルＭｅ）」において検出された各代謝物質の濃度に対する、「ＭｅＣｒ（抽出サンプルＭｅＣｒ）」において検出された各代謝物質の濃度の比（ＭｅＣｒ／Ｍｅ）を示す。【０１１９】
ヒト腸内細菌叢の構成は、食生活の特徴によって２〜３つのエンテロタイプに分けられると考えられている。そこで、健常な被験者１８名から各被験者あたり９回ずつ糞便試料の採取を行い、上記「２−１−１  メタノール法」の項目に記載の方法にしたがって検出された代謝物質全てを用い、文献（Arumugam, M., et al. "Enterotypes of the human gut microbiome." Nature;473(7346), 2011, pp.174-180.）に記載の方法にしたがって、ＰＡＭクラスタリングによるエンテロタイプを分類した。分類に適したクラスター数を３に設定しＰＡＭクラスタリングを行った結果、Butyrate（酪酸）、Cholate（コール酸）、及びThiamine（ビタミンＢ１）グループに分類することができた（図５）。
【実施例３】
【０１２０】
３．代謝物質の抽出３
３−１−１  ＰＢＳ溶液での抽出
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、凍結乾燥処理した。
〔２〕凍結乾燥処理後の糞便試料１０ｍｇに対して、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１×ＰＢＳ溶液を５００μＬ、３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）４個、及び、約０．１ｇの０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）を加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで５分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清（「抽出サンプルＰＢＳ溶液」）を回収した。抽出サンプルＰＢＳ溶液を分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、内部標準物質２種（２００μＭ ３−アミノピロリジン及び２００μＭ トリメセート）を含有するMilliQ水を２０μＬ加えてよく攪拌して再溶解した。この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率（以下、「この溶液の濃縮率」とも表示する。）は１５倍であり、この溶液のＰＢＳ濃度は１５×ＰＢＳとなっている。この溶液にMilliQ水を加え、この溶液の、糞便試料の最初の懸濁液からの濃縮率がそれぞれ１０倍（×１０）、５倍（×５）、１倍（×１）、０．２倍（×０．２）となるように希釈した。これらの希釈溶液を、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより分析した。【０１２１】
３−１−２  水での抽出
上記「３−１−１  ＰＢＳ溶液での抽出」の工程〔２〕における「上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有する１×ＰＢＳ溶液」に代えて、上記内部標準物質３種（２０μＭ メチオニンスルホン、２０μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び２０μＭ ２-モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有するMilliQ水を用いて同様の抽出処理を行い、得られた各希釈溶液を、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより分析した。【０１２２】
３−１−３  ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析
上記３−１−１や３−１−２で得られた各希釈溶液の代謝物質の、ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる測定及び解析は、上記「１−１−２  ＣＥ−ＴＯＦＭＳによる代謝物質の測定及び解析」の項目に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行い、代謝物質濃度を算出した。【０１２３】
３−２  結果
各希釈液において検出された代謝物質の種類数を図６に示す。ＰＢＳ溶液で抽出した場合は、５倍以上の濃縮率のサンプル（ＰＢＳの×５、×１０、×１５）では、塩濃度の影響で電流が過剰に流れてしまい、正確に測定することができなかった。ＰＢＳ溶液で抽出した、×０．２や×１の希釈溶液（サンプル）と、水で抽出した、×０．２や×１の希釈溶液（サンプル）との間で、検出された代謝物質の種類数を比較したところ、水で抽出したサンプルは、ＰＢＳで抽出したサンプルよりも、割合として１１〜１７％程度多い代謝物質が検出された（図６）。【０１２４】
なお、水で抽出した場合、５倍以上の濃縮率でも電流値には問題はなかったが、特にアニオンモードで測定する際は、ピークの形状がややブロードになる傾向があった。したがって、水で抽出した場合で、アニオンモードで測定する場合は、１倍以下の濃縮率で測定を行うことが望ましいことが分かった。
【実施例４】
【０１２５】
４．糞便試料の保存方法の検討１
糞便試料を採取してから、代謝物質を検出するまでの糞便試料の保存状態が、代謝物質の検出にどのような影響を及ぼすかについて検討した。具体的には、健常人から糞便試料を採取し、室温（２０〜２５℃）で１〜２日間保存した後、実施例２に記載の方法にしたがって、５０％メタノールを溶媒として代謝物質を抽出し、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより代謝物質を測定した。測定は実施例１に記載の方法に加えて陰イオンモードでも測定を行った。なお、コントロールとして、健常人から糞便試料を採取した後、直ちに超低温フリーザー（−８０℃）で保存したものを用いた。【０１２６】
その結果、糞便試料を採取後、室温で１〜２日間保存すると、−８０℃で保存した場合と比べ、少なくとも４７種類の代謝物質について、濃度の増減が認められた（図７）。例えば、図７において、「I」は、糞便試料を室温で１〜２日間保存したときに、濃度増加が認められた代謝物質を示し、「II」は、糞便試料を室温で１日間保存したときに、濃度増加し、かつ室温で２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示し、「III」は、糞便試料を室温で１〜２日間保存したときに、濃度減少が認められた代謝物質を示す。また、例えば、Butanoate（Butyrate）、Propionate等の１０種類の代謝物質は、その濃度が２倍以上増加していたのに対して、Cholate等の１０種類の代謝物質は、その濃度が１／２倍以下に減少していた（図７）。また、保存期間が、１日間の場合よりも、２日間の場合の方が、−８０℃で保存した場合と比較した代謝物質濃度の増減の割合が高かった。【０１２７】
さらに、採取後の糞便試料を冷蔵（４℃）又は冷凍（−２０℃）で保存した場合や、代謝物質の抽出を「メタノール・クロロホルム法」により行った場合についても合わせて検討した。その結果、糞便試料を４℃で保存した場合や、代謝物質の抽出を「メタノール・クロロホルム法」により行った場合も同様に、−８０℃で保存した場合と比べ、代謝物質濃度の増減が認められるとともに、保存期間が、１日間の場合よりも、２日間の場合の方が代謝物質濃度の増減の割合が高かった（図８、図９）。一方、糞便試料を−２０℃で保存した場合は、−８０℃で保存した場合と類似の代謝物質プロファイルを示した（図１０）。【０１２８】
これらの結果は、糞便試料を冷凍（少なくとも−２０℃以下）保存すると、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを良好に維持できるものの、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、代謝物質プロファイルが変動するため、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを維持することは難しいことを示している。特に、糞便試料を冷蔵や常温で保存した場合、4-beta-Acetylaminoethyl imidazole、Riboflavin、Octanoate、beta-Ala、Quinate、Malate、Choline等の代謝物質の濃度は、ある被験者から得た糞便試料では増加するのに対して別の被験者から得た糞便試料では減少するなど、個々の被検者間で増減の仕方が異なることが示された。この結果から、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、糞便試料に含まれる細菌叢や代謝物質の違いによって、同じように保存した場合であっても、代謝物質プロファイルの変化の仕方が異なる可能性が考えられる。そのため、糞便試料の冷蔵や常温での保存による代謝物質プロファイルの変動に基づいて、保存後の糞便試料における代謝物質プロファイルから採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを推測することは困難であることから、糞便試料の保存による代謝物質プロファイルの変動を、最小限に留める必要があると考えられる。
【実施例５】
【０１２９】
５．糞便試料の保存方法の検討２
冷凍設備のない場所で糞便試料を採取して、該糞便試料を遠方の分析施設まで移送する場合など、糞便試料を採取した後、直ちに冷凍保存することが困難な場合も考えられる。そこで、冷凍以外の保存方法を検討するために、糞便試料を、各種有機溶媒（１００％メタノール［１００％ＭｅＯＨ］、５０％メタノール［５０％ＭｅＯＨ］、又は、メタノール・クロロホルム［ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３］）中に保存した場合に、代謝物質プロファイルがどのように変動するかについて解析した。具体的には、糞便試料を１００％メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法１」）、糞便試料を５０％メタノール液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法２」）、糞便試料を５０％メタノール液中で保存後、メタノール及びＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール；２５：２４：１）液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法３」）、並びに糞便試料をメタノール・クロロホルム液中で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法４」）を検討した。なお、コントロールとして、糞便試料を有機溶媒非存在下で保存後、メタノール・クロロホルム液で代謝物質を抽出する方法（表９の「方法Ｃ」）を行った。また、各々の抽出方法において、糞便試料を各種有機溶媒中に加えた直後（方法１〜４）、もしくは糞便試料を有機溶媒非存在下（方法Ｃ）で直ちに−８０℃で保存した試料をコントロールに用いた。詳細な方法を以下に示す。【０１３０】
５−１  方法
〔１〕健常人から糞便試料を採取し、重量を測定し、保存用溶媒（表９の「保存用溶媒」）を添加した。
〔２〕室温（２０〜２５℃）、４℃、又は−８０℃で２日間保存した。
〔３〕代謝物質の抽出条件（表９の「抽出溶媒の組成」）となるように、添加用溶媒（表９の「添加用溶媒」）を保存用溶媒に添加した。またその際に、内部標準物質３種（１０００μＭ メチオニンスルホン、１０００μＭ Ｄ−カンファー１０−スルホン酸［ＣＳＡ］及び１０００μＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ］）を含有するMilliQ水を１０μＬ添加した。
〔４〕３ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）３個、及び０．１ｍｍジルコニアビーズ（TOMY社製）約０．１ｇ加え、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて、１，５００ｒｐｍで１０分間撹拌することで細胞破砕処理を行った。
〔５〕１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を回収した後、分画分子量５ｋＤａの限外濾過フィルターを用いてタンパク除去を行い、濾液を真空乾燥機（LABCONCO社製）で４０℃、３時間乾固させた後、１００μＬの内部標準物質２種（２００μＭ ３−アミノピロリジン及び２００μＭ トリメセート）を含有するMilliQ水に再溶解し、実施例１に記載の方法にしたがって、ＣＥ−ＴＯＦＭＳにより代謝物質を測定した。【０１３１】
【表９】
2017043087.tif 000011
【０１３２】
５−２  結果
糞便試料を、有機溶媒非存在下（すなわち保存溶媒なし）（表９の「方法Ｃ」）で４℃又は室温で保存した場合、或いは５０％メタノール液中（表９の「方法２」や「方法３」）で４℃又は室温で保存した場合は、それぞれ−８０℃で保存した場合と比べ、代謝物質濃度の増減がより多く認められた（図１１）。一方、糞便試料を、１００％メタノール液中（表９の「方法１」）で４℃又は室温で保存した場合や、メタノール・クロロホルム液中（表９の「方法４」）で４℃又は室温で保存した場合は、それぞれ−８０℃で保存した場合と類似の代謝物質プロファイルを示し、保存による代謝物質濃度の増減が抑制された（図１１、図１２）。【０１３３】
これらの結果は、糞便試料を冷蔵や常温で保存すると、代謝物質プロファイルは変動するが、糞便試料を１００％メタノール液、メタノール・クロロホルム液等の有機溶媒中で保存すると、かかる代謝物質プロファイルの変動の程度が抑制され、採取直後の糞便試料における代謝物質プロファイルを良好に維持できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明によれば、糞便試料から１種又は２種以上の物質（好ましくは腸内の代謝物質）を効率的に抽出することができる。また、本発明によれば、糞便試料からより多数の種類の物質を抽出することができる。したがって、本発明によれば、質量分析法や核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析や、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析等の解析を行うのに適した、糞便試料中の物質の抽出方法を提供することができる。
【図１】
2017043087.tif 000012
【図２】
2017043087.tif 000013
【図３】
2017043087.tif 000014
【図４】
2017043087.tif 000015
【図５】
2017043087.tif 000016
【図６】
2017043087.tif 000017
【図７】
2017043087.tif 000018
【図８】
2017043087.tif 000019
【図９】
2017043087.tif 000020
【図１０】
2017043087.tif 000021
【図１１】
2017043087.tif 000022
【図１２】
2017043087.tif 000023
【国際調査報告】
2017043087.tif 000024
2017043087.tif 000025
2017043087.tif 000026
2017043087.tif 000027