(57)【要約】  ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークを、分子量４，０００〜９，５００の範囲に有する低分子リグニンおよび／または分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に有する高分子リグニンを有効成分とする、水産生物成長促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークを、分子量４，０００〜９，５００の範囲に有する低分子リグニンおよび／または分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に有する高分子リグニンを有効成分とする、水産生物成長促進剤。
【請求項２】
前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンがバガスのアルカリ熱水抽出物由来である、請求項１に記載の水産生物成長促進剤。
【請求項３】
甲殻類の脱皮を促進する、請求項１または２に記載の水産生物成長促進剤。
【請求項４】
前記水産生物成長促進剤を含む、水産生物成長促進用飼料。
【請求項５】
前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンを、ポリフェノール量としてカテキン換算０．００７重量％以上含む、請求項４に記載の水産生物成長促進用飼料。
【請求項６】
前記水産生物成長促進剤を水産生物に投与して、水産生物の成長を促進する方法。
【請求項７】
前記水産生物成長促進用飼料を水産生物に給餌して、水産生物の成長を促進する方法。
【請求項８】
前記水産生物が甲殻類である、請求項６または７に記載の水産生物の成長を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水産生物の成長を促進する剤、およびそれを用いた水産生物の成長促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜用の飼料に、従来廃棄されていた植物資源を有効利用する検討が行われており、例えば、木質系バイオマスはリグニンを除去することによって、家畜の飼料として有効活用されている（特許文献１）。また、飼料に様々な植物資源由来の化学物質を添加して、水産生物の肉質や成長を向上させる検討も行われており、例えば、ビタミンＥやビタミンＣを魚類の飼料に添加すると魚肉の褐変や脂質酸化の抑制に効果があることが古くから知られているが、最近では、エノキタケ廃菌床抽出物（非特許文献１）や、柚子の皮（非特許文献２）でも同様の効果が得られることが明らかになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０７−２３１７５２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｕｙｎｈ  Ｎ．Ｄ．  Ｂａｏら、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ２９５，  ２４３−２４９  （２００９）
【非特許文献２】Ｆｕｋａｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｑｕａｔｉｃ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，  ５，  ５１１−５２１  （２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
水産生物の成長促進を目的とした植物由来の安全な飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討の結果、ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークを、分子量４，０００〜９，５００の範囲に有する低分子リグニンおよび／または分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に有する高分子リグニンが、水産生物の成長を促進することを発見し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［３］の構成を有する。
［１］ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークを、分子量４，０００〜９，５００の範囲に有する低分子リグニンおよび／または分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に有する高分子リグニンを有効成分とする、水産生物成長促進剤。
［２］前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンがバガスのアルカリ熱水抽出物由来である、［１］に記載の水産生物成長促進剤。
［３］甲殻類の脱皮を促進する、［１］または［２］に記載の水産生物成長促進剤。
［４］前記水産生物成長促進剤を含む、水産生物成長促進用飼料。
［５］前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンを、ポリフェノール量としてカテキン換算０．００７重量％以上含む、［４］に記載の水産生物成長促進用飼料。
［６］前記水産生物成長促進剤を水産生物に投与して、水産生物の成長を促進する方法。
〔７〕前記水産生物成長促進用飼料を水産生物に給餌して、水産生物の成長を促進する方法。
［８］前記水産生物が甲殻類である、〔６〕または〔７〕に記載の水産生物の成長を促進する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、これまで水産生物用飼料として活用されてこなかったバガスのアルカリ抽出物を有効成分とし、水産生物の成長促進効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バガスアルカリ熱水抽出液のＧＰＣ分子量分析結果具体例
【図２】低分子リグニンのＧＰＣ分子量分析結果具体例
【図３】高分子リグニンのＧＰＣ分子量分析結果具体例
【図４】バガス水熱処理液のＧＰＣ分子量分析結果具体例
【図５】リグノスルホン酸液のＧＰＣ分子量分析結果具体例
【図６】アルカリ水熱処理液のＧＰＣ分子量分析結果具体例
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明を実施するための形態に関し、詳細に説明する。
【００１１】
リグニンは植物由来の高分子フェノール性化合物である。リグニンは、複雑かつ多様な構造を有しているため、詳細な構造は明らかになっていない。また、バイオマスの種類、抽出方法、分析方法によって分子量が異なるが、報告されている一般的な数平均分子量は、２４００〜９７００である（Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＆  Ｂｉｏｒｅｆｉｎｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌｕｍｅ８，  Ｉｓｓｕｅ６，  ８３６−８５６（２０１４））。
【００１２】
本発明の水産生物成長促進剤は、波長２５４ｎｍにおけるＧＰＣ分子量分析において、分子量４，０００〜９，５００の範囲に分子量ピークを有する低分子リグニンおよび／または、分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に分子量ピークを有する高分子リグニンを有効成分とする。
【００１３】
本発明で用いる低分子リグニンが有する分子量ピークの好ましい分子量の範囲は、４，５００〜９，４００であり、さらに好ましくは５，０００〜９，３００である。
【００１４】
本発明で用いる高分子リグニンが有する分子量ピークの好ましい分子量の範囲は、１０，２００〜３７，０００であり、さらに好ましくは１１，０００〜３５，０００である。
【００１５】
また、リグニンの分子量は、数平均分子量でも判断することができる。本発明で用いる低分子リグニンの好ましい平均分子量は、ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析における数平均分子量として３，５００以上６，０００以下であり、より好ましくは３，６００以上５，０００以下である。本発明で用いる高分子リグニンの好ましい平均分子量は、ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析における数平均分子量として１０，０００以上２０，０００以下であり、より好ましくは１０，０００以上１５，０００以下である。本発明で用いる低分子リグニンおよび高分子リグニンが両方含まれるリグニンの好ましい数平均分子量は、ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析における数平均分子量として４，０００以上１５，０００以下であり、よりに好ましくは、６，０００以上１０，０００以下である。
【００１６】
また、本発明で用いる低分子リグニンおよび高分子リグニンには、上記の分子量範囲内であれば分子量ピークは複数あってもよい。さらに、上記の分子量範囲外に分子量ピークを有していてもよいが、その場合は、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークのうち、最大の高さを持つピークが、本発明で用いる低分子リグニンであれば分子量４，０００〜９，５００、本発明で用いる高分子リグニンであれば、分子量１０，０００〜４０，０００の範囲内であることが好ましい。
【００１７】
本発明で用いる低分子リグニンおよび本発明で用いる高分子リグニンを両方含んでいる場合の、ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析の具体例を図１に示す。また、本発明で用いる低分子リグニンの具体例を図２、本発明で用いる高分子リグニンの具体例を図３に示す。
【００１８】
以降、本明細書中では、本発明で用いる低分子リグニンを本発明の低分子リグニン、本発明で用いる高分子リグニンを本発明の高分子リグニンと記載する。
【００１９】
ＧＰＣは、Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ゲル浸透クロマトグラフィーの略であり、測定試料中の化合物を、分子サイズごとに分離することができる。また、分離したポリマーの相対量を検出器により検出することで、分子量も計算することができる。ＧＰＣ分子量分析では、標準ポリマーを用いて溶出時間と分子量との関係を予め求め、これに基づいて測定試料の分子量を換算する。本発明の低分子リグニンと本発明の高分子リグニンの分子量は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイドを標準ポリマーとして用いて測定した値である。
【００２０】
ＧＰＣ分子量分析の検出器はリグニンの吸収波長領域である２５０〜３００ｎｍを検出できる検出器を利用することができる。本発明では、ＧＰＣ分子量分析時に低分子芳香族であるクマル酸、フェルラ酸等の桂皮酸類の影響を除くために桂皮酸類の吸収を持たない２５４ｎｍで分析した値を用いている。本発明の低分子リグニンと本発明の高分子リグニンは、株式会社島津製作所製の多波長紫外−可視吸収検出器（ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ）で検出した値である。ＧＰＣ分子量分析では、以下の式１より数平均分子量を算出することができる。
【００２１】
Ｍｎ＝Σ（Ｍｉ・Ｎｉ）／Σ（Ｎｉ）＝ΣＣｉ／Σ（Ｃｉ／Ｍｉ）・・・式（１）。
ここでＭｎは数平均分子量、Ｍは分子量、Ｎはポリマーの数、Ｃは試料濃度を示す。
【００２２】
ＧＰＣ分子量分子量分析に用いるカラムとしては、特に制限はないが、本願発明の分子量はＴＳＫｇｅｌＧＭＰＷＸＬとＧ２５００ＰＷＸＬを使用して測定した値である。
【００２３】
本発明の低分子リグニン、および／または、本発明の高分子リグニンの原料となる植物としては、マツ、スギ、ヒノキなどの針葉樹、ユーカリ、アカシアなどの広葉樹、さとうきびの搾りかすであるバガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、さらに藻類、海草など水生環境由来のバイオマス、コーン外皮、小麦外皮、大豆外皮、籾殻などの穀物外皮バイオマスなどを用いることができる。好ましくはバガスである。
【００２４】
前記植物から本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを抽出する方法としては、有機溶媒（エタノール、酢酸エチル等）による抽出、酸抽出、アルカリ抽出、水熱抽出、アルカリ水熱抽出またはアルカリ熱水抽出等があり、好ましくはアルカリ抽出またはアルカリ熱水抽出であり、さらに好ましくは、アルカリ熱水抽出である。
【００２５】
アルカリ抽出、アルカリ水熱抽出またはアルカリ熱水抽出に用いるアルカリ化合物は特に制限されないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニアなどが挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムであり、さらに好ましくは水酸化ナトリウムである。
【００２６】
アルカリ熱水抽出の条件は、ｐＨ１０〜１３．５、温度８０℃〜１２０℃、処理時間０．５時間以上が好ましく、ｐＨ１０．５〜１３．０、温度９０℃〜１２０℃、処理時間１時間以上反応させることがより好ましい。アルカリ濃度の上限は、本発明の低分子リグニンと本発明の高分子リグニンを得られれば特に制限はないが、バイオマスに対してアルカリ濃度が高すぎる場合は最終的に添加する飼料のｐＨに影響し、水産生物の飼料への嗜好性や生育環境の変化を伴うため、４（ｗｔ／ｗｔ）％以下が好ましい。
【００２７】
水熱処理は、加圧熱水（１８０〜２４０℃）で処理しリグニンを抽出する方法である。
【００２８】
アルカリ水熱抽出は、アルカリ熱水抽出のｐＨ条件において、加圧熱水（１８０〜２４０℃）で処理しリグニンを抽出する方法である。
【００２９】
アルカリ熱水抽出方法の具体例としては、例えばバガス５（ｗｔ／ｗｔ）％（乾燥重量）濃度の溶液に対し、９０℃、０．４５（ｗｔ／ｗｔ）％の水酸化ナトリウム水溶液で２時間反応させることによって本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを抽出することができる。上記の乾燥重量とはバガスを１０５℃で重量が一定になるまで乾燥させた後の重量である。
【００３０】
本発明の低分子リグニンと本発明の高分子リグニンを分離したい場合には、ｐＨ５以下に中和して固液分離することで、液体画分に本発明の低分子リグニンを、固体画分に本発明の高分子リグニンを分離することができる。これは、ｐＨ５以下の条件で本発明の低分子リグニンは水に溶解するのに対し、本発明の高分子リグニンは水に溶解せず沈殿する特長を有しているためである。ｐＨ５以下の条件で不溶化した高分子リグニンはｐＨを再度ｐＨ５よりアルカリ側に、例えばｐＨ８以上にすることで水に再溶解させることができる。
【００３１】
本発明の水産生物成長促進剤の水産生物への投与の形態は、本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを薬剤として有効量を水産生物に投与する形態であってよく、また、本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを飼料に配合して水産生物成長促進用飼料として給餌する形態であってもよいが、水産生物成長促進用飼料の形態をとることが好ましい。
【００３２】
本発明が水産生物成長促進用飼料である場合は、該飼料に本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンをポリフェノール量としてはカテキン換算０．００７重量％以上含んでいることが好ましく、有量は、０．０１２８重量％以上含んでいることがより好ましく、０．１４重量％以上含んでいることがさらに好ましい。ポリフェノール量の上限は成長促進効果が発揮されれば特に制限はないが、他の飼料成分の相対的な割合低下がほとんど影響のない程度である０．５重量％以下が好ましい。
【００３３】
本発明でのカテキン換算のポリフェノール量はフォーリンチオカルト法によって算出した値である。フォーリンチオカルト法は、元来、チロシン、トリプトファン等の芳香族アミノ酸やこれらを有するたんぱく質の分析を目的に開発された方法である。フェノール性水酸基がアルカリ性でリンタングステン酸、モリブデン酸を還元して生ずる青色を７００〜７７０ｎｍで比色定量する方法である。没食子酸、カテキン等特定の基準物質で同様の操作を行い、その化合物換算で定量値を示すことができる。
【００３４】
本発明の低分子リグニンおよび／または高分子リグニンを有効成分とする水産生物成長促進剤または、当該水産生物成長促進剤を含む飼料を水産生物に与えると、当該有効成分を含まない水産生物用飼料を与えた場合と比べて、水産生物の成長が促進される。ここでいう成長促進とは、水産生物の体重（生物内に水分を含んだ調理前の魚の重量）、体長が増加すること、あるいは甲殻類等での脱皮回数の増加、あるいは過密な養殖条件下における斃死率の低下（生残率の増加）である。
【００３５】
本発明の水産生物成長促進用飼料の調製方法としては、本発明の有効成分を含む液体を通常の水産生物用飼料に噴霧したり、各種飼料原料の配合時に水などのバインダーと共に添加したりしても良い。また、本発明の有効成分を含む液体を濃縮したり、乾燥させたり、上記のように本発明の高分子リグニンのｐＨをｐＨ５以下に調整して沈殿を生じさせたりして固体とし、通常の水産生物用飼料に混ぜ込んで与えたりすることもできる。また本発明の有効成分を通常の水産生物用飼料に噴霧したり、混ぜ込んだりした場合には、本発明の有効成分を飼料中に十分に保持させることを目的として、当該飼料の表面に疎水性の物質などでコーティングしても良い。コーティングに用いる疎水性物質としては、例えば脂肪酸を含む植物油、植物油を精製したサラダ油、動物性の油などが挙げられる。
【００３６】
本発明の水産生物成長促進用飼料に含まれる水産成長促進剤以外の飼料原料としては、飼料に適用できるものであれば特に制限はないが、魚粉、オキアミミール、イカミール、エビミール、コペポーダ粉末、デンプン、魚介抽出物、レシチン、飼料用酵母、酵母抽出物、リン酸カルシウム、精製魚油、天然ベタイン、甘草末、スケトウダラ肝油、各種ビタミンなどがある。飼料の分析組成についても、粗タンパク、粗脂肪、粗繊維、粗灰分、カルシウム、リンなどが水産生物の生育に著しく問題がない程度に十分量含有されていれば特に制限はない。
【００３７】
また、有効成分以外の物質として、植物由来物質が含まれていてもよい。有効成分以外の物質としては例えば、植物由来のクマル酸、フェルラ酸等の桂皮酸類が挙げられる。その他の成分として飼料中に含まれる濃度としては、高濃度の場合は添加のためのコストがかかる事から、クマル酸０〜０．０２重量％フェルラ酸０〜０．０１重量％が好ましく、さらに好ましくはクマル酸０．０００１〜０．０１重量、フェルラ酸０．００００１〜０．０１重量％である。これらのクマル酸、フェルラ酸は精製したものでも良いし、粗抽出物の状態でも良い。
【００３８】
また、飼料の保管中の酸化防止を目的とした抗酸化剤が含まれていても良い。具体的には、エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。
【００３９】
水産生物への飼料の給餌方法としては、常法に則った給餌タイミング、給餌量であれば特に制限はないが、たとえば、１日〜１週間に１度給餌することができ、好ましくは、１日１〜３回、水産生物の体重の２〜５重量％にあたる飼料を、残餌量に合わせて調整して給与することがよい。
【００４０】
成長促進の対象となる水産生物としては、海水、淡水で生活する生物であれば特に制限はないが、好ましくは魚類または甲殻類であり、より好ましくは甲殻類である。
【００４１】
魚類の具体例としては、カクレクマノミ、スズキ、スズメダイ、マグロ、カツオなどのスズキ目、ウナギなどのウナギ目、チョウザメなどのチョウザメ目、ニシン、マイワシなどのニシン目、コイ、フナ、ドジョウなどのコイ目、ナマズなどのナマズ目、アユ、サケ、ニジマスなどのサケ目、キンメダイなどの棘鰭上目、スケトウダラなどのタラ目、オコゼ、アンコウなどのアンコウ目、アカエイなどのエイ目、カサゴ、ホウボウなどのカサゴ目、カレイ、ヒラメなどのカレイ目、カワハギ、フグなどのフグ目が挙げられ、さらに好ましくはスズキ目である。
【００４２】
甲殻類の具体例としては、シリプトシャコ科、フトユビシャコ科、ハナシャコ科、トゲシャコ科、シャコ科、チヒロエビ科、クダヒゲエビ科、クルマエビ科、イシエビ科、サクラエビ科、ヒオドシエビ科、ヌマエビ科、オキエビ科、ミカワエビ科、テナガエビ科、テッポウエビ科、モエビ科、タラバエビ科、トゲヒラタエビ科、エビシャコ科、アメリカザリガニ科、ザリガニ科、アカザエビ科、オサテエビ科、センジュエビ科、イセエビ科、セミエビ科、アナエビ科、ヨシオリエビ科、カニダマシ科、タラバガニ科、サワガニ科、アサヒガニ科、コウナガカムリ科、カイカムリ科、ミズヒキガニ科、ホモラ科、ヘイケガニ科、カラッパ科、クモガニ科、ヤワラガニ科、ヒシガニ科、イチョウガニ科、コブシガニ科、クリガニ科、ヒゲガニ科、ガザミ科、オオエンコウガニ科、オウギガニ科、エンコウガニ科、スナガニ科、イワガニ科、カクレガニ科などが挙げられる。このうち、特に、イセエビ科のイセエビ、セミエビ科のウチワエビ、ゾウリエビ、セミエビ、クルマエビ科のブラックタイガー、ホワイトタイガー、クルマエビ、シバエビ、アカエビ、バナメイエビ、アシアカエビ、サクラエビ科のサクラエビ、タラバエビ科のアマエビ、ボタンエビ、アカザエビ科のアカザエビが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明を具体的に説明する。【００４４】
（参考例１）ＧＰＣ分子量分析測定
ＧＰＣ分子量分析は以下の条件で実施した。
検出器：多波長紫外−可視吸収検出器  ＵＶ（株式会社島津製作所製ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、波長２５４ｎｍ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧＭＰＷＸＬ、Ｇ２５００ＰＷＸＬ各１本（φ７．８ｍｍ×３０ｃｍ、東ソー）
溶媒：アンモニア緩衝液（ｐＨ１１）／メタノール（１／１＝ｖ／ｖ）
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２３℃
注入量：０．２ｍＬ
標準試料：東ソー株式会社製、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製単分散ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール。【００４５】
標準試料であらかじめ溶出時間と分子量の対数との関係を取得し、ＬｏｇＭ（Ｍは分子量）あたりの重量分率ｄＷ／ｄｌｏｇＭ（Ｗは重量）で変換し、横軸を分子量の対数、縦軸をピーク面積が１になるようにプロットして解析した。【００４６】
（参考例２）ポリフェノール量の測定
適宜希釈した測定試料１．０ｍＬ、フェノール試液（ナカライテスク社）１．０ｍＬ、水５ｍＬを２５ｍＬのメスフラスコに入れて５分間室温で放置し、これに７％炭酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加える。更に水を加えて２５ｍＬとして混合し、２時間室温で放置する。反応液の一部を取り、φ０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過し、７５０ｎｍで吸光度を測定する（吸光度は０．６ＡＢＳ以下となるようにサンプルを適宜希釈）。標準物質としてカテキン試薬（シグマ社、純度９８％以上）を用い、カテキン換算値として算出した。【００４７】
（参考例３）芳香族化合物の測定
クマル酸、フェルラ酸等の芳香族化合物濃度の測定は以下の条件で実施した。
機器：日立高速液体クロマトグラムＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｉｔｅ
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ２．５μ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ１００Ａ  １００×３．００ｍｍ  （Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
移動相：０．１％リン酸：アセトニトリル＝９３：７から５：９５までグラジェント
検出器：Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃。【００４８】
（試験例１）クルマエビの脱皮促進効果（本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
バガス１ｋｇ（台糖農産株式会社より購入、ベトナム製）を０．４５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液に乾燥重量で５ｗｔ％添加・混合し、９０℃、２時間反応させ、６Ｎ塩酸を用いてｐＨを７に調整した後、ザルで固体を分離し、ＭＦ膜（商品名：トレフィルＨＦＳタイプ、東レ社製）で濾過を行い、バガスアルカリ熱水抽出液を作製した。このアルカリ抽出液を参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った。分析結果は図１に示すとおりで、分子量７，０００にピークを有する本発明の低分子リグニン、および分子量２１，０００に分子量ピークを有する本発明の高分子リグニンを含有することを確認した。また、数平均分子量は８，９００であった。更にこのバガスアルカリ抽出液を参考例２に従ってポリフェノール量を測定したところ、カテキン換算で０．２重量％であった。また、参考例３に記載の方法でクマル酸、フェルラ酸を測定したところ、クマル酸が０．０８重量％、フェルラ酸が０．０１６重量％であり、同濃度のクマル酸、フェルラ酸のみ含有した液体のポリフェノール含量はカテキン換算で０．０７２重量％であった。このことから、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンのポリフェノール含量はカテキン換算で０．１２８重量％あることが分かる。このバガスアルカリ熱水抽出液（固形分２％、固形分あたりポリフェノール含量はカテキン換算１０％）を溶質の重量ベースで配合飼料（ヒガシマル醤油株式会社製、ノーサン印くるまえび育成用配合飼料  Ｈ  クルマエビ  スーパーＢ）に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりポリフェノール含量はカテキン換算０．０２％、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンのポリフェノール含量はカテキン換算０．０１２８重量％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面にコーティングした。作製した飼料を本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００４９】
［成長促進効果の評価］
平均体重１４．１ｇ（標準偏差１．５）、平均全長１４３．１ｍｍ（標準偏差６．０）のクルマエビ２４尾を１水槽あたり８尾（１２．５尾／ｍ２）３水槽で本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料の水産生物成長促進効果を評価した。水槽底部には底砂をひき、海水は天然濾過海水を加温し、２０〜２５℃とし、換水率は３．８回／日とした。光条件は１２時間明、１２時間暗とし、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料を１回／日、消灯直後に給餌した。給餌量は開始時のエビ体重比３％で計量し、その後、試験開始９日目に同比４％、試験開始２０日目に同比５％と摂餌状況に応じて段階的に給餌量をあげていった。３０日間試験を実施し、その期間中の２４尾の合計脱皮回数を計測した。結果を表１に示す。【００５０】
（試験例２）クルマエビの脱皮促進効果（本発明の低分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例１で作製したバガスアルカリ熱水抽出液を６Ｎ塩酸でｐＨ５に中和し、本発明の高分子リグニンを沈殿させた。珪藻土を１％添加・混合後、フィルタープレス（薮田機械社株式会社製ＹＴＯ型）を用いて固液分離を行い、本発明の低分子リグニン液をろ液側に、本発明の高分子リグニンを固形分側に分離した。得られたろ液を水酸化ナトリウム５０％（ｗｔ／ｖ）溶液でｐＨ７に調整し本発明の低分子リグニン液を得た。この本発明の低分子リグニン液を参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った。結果は図２に示すとおりで、分子量７，０００にピークを有する本発明の低分子リグニンを含有することを確認した。また、ＧＰＣ分子量分析結果から求められる数平均分子量は４，０００であった。更にこの低分子リグニン液を参考例２に従ってポリフェノール量を測定したところ、カテキン換算で０．１％であった。また、参考例３に記載の方法でクマル酸、フェルラ酸を測定したところ、クマル酸が０．０６重量％、フェルラ酸が０．０１２重量％であり、同濃度のクマル酸、フェルラ酸のみ含有した液体のポリフェノール含量はカテキン換算で０．０５重量％であった。このことから、本発明の低分子リグニンはカテキン換算で０．０５重量％あることが分かる。この低分子リグニン液（固形分１．５％、固形分あたりカテキン換算７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（ヒガシマル醤油株式会社製、ノーサン印くるまえび育成用配合飼料  Ｈ  クルマエビ  スーパーＢ）に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０１４％、本発明の低分子リグニンのポリフェノール含量はカテキン換算０．００７重量％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。作製した飼料を本発明の低分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００５１】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１と同様とした。結果を表１に示す。【００５２】
（試験例３）クルマエビの脱皮促進効果（本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例１で作製したバガスアルカリ熱水抽出液を６Ｎ塩酸でｐＨ３に中和し、本発明の高分子リグニンを沈殿させた。濾過助剤として珪藻土を１％添加・混合後、フィルタープレス（薮田機械株式会社製ＹＴＯ型）を用いて固液分離を行い、固体として珪藻土を含有した本発明の高分子リグニンを得た。珪藻土を含有した本発明の高分子リグニンを乾燥させ、固形分８５％とした。この本発明の高分子リグニン（固形分あたりのポリフェノール量がカテキン換算で７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（ヒガシマル醤油株式会社製、ノーサン印くるまえび育成用配合飼料  Ｈ  クルマエビ  スーパーＢ）に飼料乾燥重量あたり０．２％で混合した（飼料乾燥重量あたりポリフェノール含量はカテキン換算０．０１４％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。作製した飼料を本発明の高分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００５３】
一方、飼料作製とは別に、本発明の高分子リグニンの分画分子量の測定を実施した。珪藻土含有不溶性本発明の高分子リグニンに対し、５０％（ｗｔ／ｖ）の水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１２に調整し、本発明の高分子リグニンを溶解した。この本発明の高分子リグニン液に６Ｎ塩酸でｐＨ７に調整し、参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った。結果を図３に示す。この分析結果から、得られたリグニンは、分子量２１，０００にピークを有する本発明の高分子リグニンであり、本発明の低分子リグニンは含有していないことを確認した。また、この分析結果から求められる数平均分子量は１３，８００であった。この時調整した本発明の高分子リグニン液を参考例２に従ってポリフェノール量を測定したところ、カテキン換算で０．１重量％であった。また、参考例３に記載の方法でクマル酸、フェルラ酸を測定したところ、クマル酸、フェルラ酸は検出されなかった。【００５４】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１と同様とした。結果を表１に示す。【００５５】
（試験例４）クルマエビの脱皮促進効果（無添加）
［飼料の調製］
配合飼料（ヒガシマル醤油株式会社製、ノーサン印くるまえび育成用配合飼料  Ｈ  クルマエビ  スーパーＢ）に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させ、無添加飼料を作製した。【００５６】
［成長促進効果の評価］
本試験例での無添加飼料を用いる以外は試験例１と同様とした。結果を表１に示す。【００５７】
（試験例５）クルマエビの脱皮促進効果（バガス水熱処理液）
［飼料の調製］
バガスを乾燥重量３０％に調整し、高圧で１８０℃、１０分水熱処理（高圧蒸煮処理）を行った。得られたバガス熱水処理液を、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７に調整した。バガス熱水処理液を参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った結果を図４に示す。この分析結果から、バガスの熱水処理液は、ピーク高さが高い順に、分子量３，２００、分子量６，０００および分子量１７，０００に分子量ピークを有するリグニンを含んでいることがわかった。また、ＧＰＣ分子量分析結果から求められる数平均分子量は２，８７０であった。バガス水熱処理液は、ピーク高さが最高となる有効成分は分子量４，０００以下にピークをもち、このピーク高さが最高となる有効成分は本発明の低分子リグニン、本発明の高分子リグニンとは異なるものの、組成としては本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する。また、このバガス水熱処理液を参考例２に従ってポリフェノール量を測定したところ、カテキン換算で０．００１％であった（固形分１．０％、固形分あたりのカテキン換算０．１％）。このバガス水熱処理液を溶質の重量ベースで配合飼料（ヒガシマル醤油株式会社製、ノーサン印くるまえび育成用配合飼料  Ｈ  クルマエビ  スーパーＢ）に飼料乾燥重量あたり０．２％で混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０００２％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。【００５８】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１と同様とした。結果を表１に示す。【００５９】
【表１】
2018079641.tif 000002
【００６０】
表１に示す通り、試験例１〜３の本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを含有する飼料を用いた場合、試験例４の無添加飼料を用いた場合と比べてクルマエビの脱皮回数が増加することが分かった。【００６１】
（試験例６）カクレクマノミの成長促進効果（本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例１で作製したバガスアルカリ熱水抽出液（固形分２％、固形分あたりカテキン換算１０％）を溶質の重量ベースで配合飼料（Ｆｅｅｄ  Ｏｎｅ社製、アンブローズ４００）に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０２％、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンはカテキン換算０．０１２８重量％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。【００６２】
［成長促進効果の評価］
体長２０±３ｍｍのカクレクマノミを１水槽あたり１０固体（１０固体／２０Ｌ）３水槽で本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料の水産生物成長促進効果を評価した。海水は天然濾過海水を加温し、約２５℃とし、換水率は１日に５０％換水とした。光条件は１２時間明、１２時間暗とし、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料を１回／日、消灯直後に給餌した。給餌量は開始時のカクレクマノミ体重比３％とした。７日間試験を実施し、試験終了後にカクレクマノミを回収し１個体当たりの平均体重を測定した。結果を表２に示す。【００６３】
（試験例７）カクレクマノミの成長促進効果（本発明の低分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例２で作製した本発明の低分子リグニン液（固形分１．５％、固形分あたりカテキン換算７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（Ｆｅｅｄ  Ｏｎｅ社製、アンブローズ４００）に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０１４％、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンはカテキン換算０．００７重量％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。【００６４】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した本発明の低分子リグニンを含有する飼料を用いる以外は試験例６と同様とした。結果を表２に示す。【００６５】
（試験例８）カクレクマノミの成長促進効果（本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例３で作製した不溶性の本発明の高分子リグニン（固形分８５％、固形分あたりカテキン換算７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（Ｆｅｅｄ  Ｏｎｅ社製、アンブローズ４００）に飼料乾燥重量あたり０．２％で混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０１４％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。【００６６】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した本発明の高分子リグニンを含有する飼料を用いる以外は試験例６と同様とした。結果を表２に示す。【００６７】
（試験例９）カクレクマノミの成長促進効果（無添加）
［飼料の調製］
配合飼料（Ｆｅｅｄ  Ｏｎｅ社製、アンブローズ４００）に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させ、無添加飼料を作製した。【００６８】
［成長促進効果の評価］
本試験例での無添加飼料を用いる以外は試験例６と同様とした。結果を表２に示す。【００６９】
（試験例１０）カクレクマノミの成長促進効果（バガス水熱処理液）
［飼料の調製］
試験例５で作製したバガス熱水処理液（固形分１％、固形分あたりのカテキン換算０．１％）を溶質の重量ベースで配合飼料（Ｆｅｅｄ  Ｏｎｅ社製、アンブローズ４００）に飼料乾燥重量あたり０．２％で混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０００２％）。更に飼料重量の１％の油（日清オイリオ株式会社製、日清サラダ油）を飼料表面に浸漬させた。【００７０】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製したバガス水熱処理液含有する飼料を用いる以外は試験例６と同様とした。結果を表２に示す。【００７１】
【表２】
2018079641.tif 000003
【００７２】
表２に示す通り、試験例６〜８の本発明の低分子リグニンおよび／または本発明の高分子リグニンを含有する飼料を用いた場合、試験例９の無添加飼料を用いた場合と比べて、カクレクマノミの平均体重が増加することが分かった。【００７３】
（試験例１１）クルマエビの成長促進効果（本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例１で調製したバガスアルカリ熱水抽出液（固形分２％、固形分あたりカテキン換算１０％）を溶質の重量ベースで配合飼料（バイオ科学社製、エビコング）造粒時に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０２％、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンはカテキン換算０．０１２８重量％）。作製した飼料を本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００７４】
［成長促進効果の評価］
平均体重３２．２ｍｇ（標準偏差１１．３）、平均全長１５．５ｍｍ（標準偏差１．９）のクルマエビを１水槽あたり１５０尾（１，５００尾／ｍ２）で本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料の水産生物成長促進効果を評価した。水槽底部には底砂をひかず、海水は天然濾過海水を加温し、２０〜２５℃とし、換水率は５回／日とした。光条件は１２時間明、１２時間暗とし、本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料を１日３回給餌した。給餌量はエビ体重比３〜５％で摂餌状況に応じて段階的に給餌量をあげていった。５０日間試験を実施し、その期間中の生残数、平均体重、平均全長を測定した。結果を表３に示す。【００７５】
（試験例１２）クルマエビの成長促進効果（本発明の低分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例２で調製した低分子リグニン（固形分１．５％、固形分あたりカテキン換算７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（バイオ科学社製、エビコング）造粒時に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０１４％、本発明の低分子リグニンはカテキン換算０．００７重量％）。作製した飼料を本発明の低分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００７６】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１１と同様とした。結果を表３に示す。【００７７】
（試験例１３）クルマエビの成長促進効果（本発明の高分子リグニン）
［飼料の調製］
試験例３で調製した珪藻土を含有した本発明の高分子リグニン（固形分あたりのポリフェノール量がカテキン換算で７％）を溶質の重量ベースで配合飼料（バイオ科学社製、エビコング）造粒時に飼料乾燥重量あたり０．２％で噴霧・混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０１４％）。作製した飼料を本発明の高分子リグニンを含有する飼料として用いた。【００７８】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１１と同様とした。結果を表３に示す。【００７９】
（試験例１４）クルマエビの成長促進効果（無添加）
［飼料の調製］
配合飼料（バイオ科学社製、エビコング）を何も添加することなく造粒し無添加飼料を作製した。【００８０】
［成長促進効果の評価］
本試験例での無添加飼料を用いる以外は試験例１１と同様とした。結果を表３に示す。【００８１】
（試験例１５）クルマエビの成長促進効果（バガス水熱処理液）
［飼料の調製］
試験例５で調製したバガス水熱処理液を溶質の重量ベースで配合飼料（バイオ科学社製、エビコング）造粒時に飼料乾燥重量あたり０．２％で混合した（飼料乾燥重量あたりカテキン換算０．０００２％）。【００８２】
［成長促進効果の評価］
本試験例で調製した飼料を用いる以外は試験例１１と同様とした。結果を表３に示す。【００８３】
【表３】
2018079641.tif 000004
【００８４】
表３に示す通り、試験例１１〜１３の本発明の低分子リグニンおよび本発明の高分子リグニンを含有する飼料、本発明の低分子リグニンを含有する飼料、本発明の高分子リグニンを含有する飼料を用いた場合、試験例１４の無添加飼料に比べてクルマエビの生残数、体重、全長が増加することが分かった。【００８５】
（参考例４）リグノスルホン酸液のＧＰＣ分子量分析
一般的なリグニン市販品であるリグノスルホン酸（日本製紙ケミカル社製  サンエキスＰ２５２をＮａＯＨでｐＨ１０に調整した水溶液に３％溶解させたもの）を参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った。結果を図５に示す。この結果から、得られたリグニンは、分子量１００，０００にピークを有するリグニンを含有し、本発明の低分子リグニン、高分子リグニンを含有しないことを確認した。また、数平均分子量は３９，０００であった。【００８６】
（参考例５）ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークが４，０００以下に有するリグニンのＧＰＣ分子量分析
バガス１ｋｇ（台糖農産株式会社より購入、ベトナム製）を０．６（ｗｔ／ｗｔ）％水酸化ナトリウム水溶液に乾燥重量で５ｗｔ％添加・混合し、１８０℃、５分反応させ、６Ｎ塩酸を用いてｐＨを７に調整した後、ザルで固体を分離し、ＭＦ膜（商品名：トレフィルＨＦＳタイプ、東レ社製）で濾過を行い、バガスアルカリ水熱処理液を作製した。このアルカリ水熱処理を参考例１に記載の方法でＧＰＣ分子量分析を行った。分析結果を図６に示す。この分析結果から、得られたリグニンは、分子量３，７００にピークを有するリグニンを含有し、本発明の低分子リグニン、高分子リグニンを含有しないことを確認した。また、数平均分子量は３，３００であった。【００８７】
【図１】
2018079641.tif 000005
【図２】
2018079641.tif 000006
【図３】
2018079641.tif 000007
【図４】
2018079641.tif 000008
【図５】
2018079641.tif 000009
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月19日(2018.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ検出器を用いたＧＰＣ分子量分析において、波長２５４ｎｍにおける分子量ピークを、分子量４，０００〜９，５００の範囲に有する低分子リグニンおよび／または分子量１０，０００〜４０，０００の範囲に有する高分子リグニンを有効成分とする、水産生物成長促進剤。
【請求項２】
前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンがバガスのアルカリ熱水抽出物由来である、請求項１に記載の水産生物成長促進剤。
【請求項３】
甲殻類の脱皮を促進する、請求項１または２に記載の水産生物成長促進剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の水産生物成長促進剤を含む、水産生物成長促進用飼料。
【請求項５】
前記低分子リグニンおよび／または高分子リグニンを、ポリフェノール量としてカテキン換算０．００７重量％以上含む、請求項４に記載の水産生物成長促進用飼料。
【請求項６】
請求項１または２に記載の水産生物成長促進剤を水産生物に投与して、水産生物の成長を促進する方法。
【請求項７】
請求項４または５に記載の水産生物成長促進用飼料を水産生物に給餌して、水産生物の成長を促進する方法。
【請求項８】
前記水産生物が甲殻類である、請求項６または７に記載の水産生物の成長を促進する方法。
【国際調査報告】
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