(57)【要約】  α−アミラーゼの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供する。  本発明のα−アミラーゼ結合核酸は、α−アミラーゼに対する解離定数が、１７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とし、例えば、配列番号１から２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明の核酸分子によれば、唾液中におけるα−アミラーゼを検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−アミラーゼに対する解離定数が、１７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とするα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、下記（ａ）のポリヌクレオチド、またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを含む、請求項１記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ）配列番号１〜６および１８〜２１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項３】
前記部分配列からなるポリヌクレオチドが、下記（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである、請求項２記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ１）配列番号７〜１０および２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１１〜１４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号１５〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項４】
前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、請求項２または３記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項５】
前記修飾塩基が、修飾チミンである、請求項４記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項６】
前記修飾基が、アデニン残基または置換アデニン残基である、請求項４または５記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項７】
前記置換アデニン残基が、９位のＮに置換基を有する置換アデニン残基である、請求項６記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項８】
前記置換基が、アミジノアミノアルキル基である、請求項７記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項９】
前記アミジノアミノアルキル基が、４−アミジノアミノブチル基である、請求項８記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項１０】
前記修飾塩基が、プリン塩基の７位が前記修飾基で修飾された修飾プリン塩基またはピリミジン塩基の５位が前記修飾基で修飾された修飾ピリミジン塩基である、請求項４から９のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項２から１０のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とするα−アミラーゼ分析用センサ。
【請求項１３】
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項１から１１のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする、α−アミラーゼの分析方法。
【請求項１４】
前記試料が、唾液、尿、血漿および血清からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１３記載のα−アミラーゼの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−アミラーゼに結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ストレスが、疲労や鬱の一因となり得ることから、ストレスのチェックが重要視されている。しかしながら、ストレス状態か否かは、例えば、本人が気づいていない、または、主観的であるが故に他人によって判断することが難しいという問題がある。このため、ストレスを客観的に判断する方法の確立が求められている。【０００３】
ヒトは、ストレスを感じることにより、唾液中のα−アミラーゼの分泌が亢進することが知られている。そこで、前記唾液中のαアミラーゼを測定することで、間接的にストレスを評価する方法が試みられている。具体的には、α−アミラーゼを抗原とする抗体を使用したＥＬＩＳＡ法が報告されている（非特許文献１）。【０００４】
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J.  Christiana  K.  Verity  et  al.,  Development  of  a  Field  Enzyme-Linked  Immunosorbent  Assay  (ELISA)  for  Detection  of  α-Amylase  in  Preharvest-Sprouted  Wheat,  Cereal  Chemistry,  1999,  Vol.76,  no.5,  p673-681.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、α−アミラーゼの検出に利用可能な新たな分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、α−アミラーゼに対する解離定数が、１７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。【０００８】
本発明のα−アミラーゼ分析用センサは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のα−アミラーゼの分析方法は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、α−アミラーゼに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のα−アミラーゼとの結合の有無によって、優れた精度で、α−アミラーゼを検出できる。したがって、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、すい臓がんや糖尿病などにおける病態診断、およびストレスの診断等の分野におけるα−アミラーゼの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施例１において、α−アミラーゼに対する、アプタマーの結合能を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施例１において、α−アミラーゼに対する、アプタマーの結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、α−アミラーゼに対するアプタマーの結合能の相対値を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例３において、各反応液におけるα−アミラーゼに対するアプタマーの結合能を示すクロマトグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例３において、各反応液におけるターゲットに対するアプタマーの結合能を示すクロマトグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３において、各反応液におけるターゲット対するアプタマーの結合能を示すクロマトグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む。本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、以下、「本発明の核酸分子」ともいう。
（ａ）配列番号１〜６および１８〜２１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１３】
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドである。
（ａ１）配列番号７〜１０および２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１１〜１４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号１５〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００１４】
本発明の核酸分子は、例えば、前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む。
【００１５】
本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾塩基が修飾チミンである。
【００１６】
本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾基が、アデニン残基または置換アデニン残基である。
【００１７】
本発明の核酸分子は、例えば、前記置換アデニン残基が、アデニン残基の９位のＮに置換基を有する。
【００１８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記置換基が、アミジノアミノアルキル基である。
【００１９】
本発明の核酸分子は、例えば、前記アミジノアミノアルキル基が、４−アミジノアミノブチル基である。
【００２０】
本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾塩基が、プリン塩基の７位が前記修飾基で修飾された修飾プリン塩基またはピリミジン塩基の５位が前記修飾基で修飾された修飾ピリミジン塩基である。
【００２１】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。
【００２２】
本発明の分析方法は、例えば、前記試料が、唾液、尿、血漿および血清からなる群から選択された少なくとも一つである。
【００２３】
以下、本発明について、具体的に説明する。
【００２４】
（１）α−アミラーゼ結合核酸分子
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、前述のように、α−アミラーゼに対する解離定数が、１７ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。
【００２５】
本発明の核酸分子は、前述のようにα−アミラーゼに結合可能である。前記α−アミラーゼは、特に制限されず、その由来は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。ヒトα−アミラーゼのアミノ酸配列の情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）アクセッション番号Ｐ０４７４５に登録されている。
【００２６】
本発明において、「α−アミラーゼに結合する」とは、例えば、α−アミラーゼに対する結合能を有している、または、α−アミラーゼに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記α−アミラーゼとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface  Plasmon  resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名  BioRad社）が使用できる。本発明の核酸分子は、α−アミラーゼに結合することから、例えば、α−アミラーゼの検出に使用できる。
【００２７】
本発明の核酸分子は、前記α−アミラーゼに対する解離定数が、例えば、１７ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記α−アミラーゼの検出限界濃度が、例えば、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭである。
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、下記表１Ａおよび表１Ｂに示す、下記（ａ）のポリヌクレオチドを含む核酸分子があげられる。
（ａ）配列番号１〜６および１８〜２１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００２９】
【表１Ａ】
2017081926.tif 000002
【００３０】
【表１Ｂ】
2017081926.tif 000003
【００３１】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子があげられる。
【００３２】
前記部分配列からなるポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドがあげられる。
（ａ１）配列番号７〜１０および２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１１〜１４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号１５〜１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００３３】
前記（ａ１）は、配列番号１の部分配列の例であり、前記（ａ２）は、配列番号２の部分配列の例であり、前記（ａ３）は、配列番号３の部分配列の例である。これらの配列を、下記表２に示す。
【００３４】
【表２】
2017081926.tif 000004
【００３５】
図１Ａに配列番号１〜４、図１Ｂに配列番号５〜８、図１Ｃに配列番号９〜１２、図１Ｄに配列番号１３〜１６、図１Ｅに配列番号１７〜２０、図１Ｆに配列番号２１および２２の塩基配列からなるポリヌクレオチドの推定二次構造を示すが、本発明は、これには限定されない。
【００３６】
本発明の結合核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｂ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドの意味を含む。
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
【００３７】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３８】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００３９】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドであり、前記α−アミラーゼに結合する範囲であればよい。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００４０】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００４１】
前記（ａ１）〜（ａ３）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（ａ）のポリヌクレオチドの部分配列であることから、例えば、前記（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の一例ともいえる。
【００４２】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、以下、アプタマーともいう。
【００４３】
本発明の核酸分子は、例えば、前記いずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記いずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。ここで、前記リンカーとは、例えば、ポリヌクレオチド間の配列であり、前記付加配列とは、例えば、末端に付加された配列である。
【００４４】
本発明の核酸分子が、例えば、複数の前記ポリヌクレオチドを含む場合、前記複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。
【００４５】
前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００４６】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００４７】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）、その部分配列、前記（ｂ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００４８】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００４９】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。
【００５０】
前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基における塩基として、天然塩基を含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。前記天然塩基（非人工塩基）は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられ、好ましくは、シトシン（ｃ）、およびチミン（ｔ）である。
【００５１】
前記ポリヌクレオチドが前記修飾塩基を有する場合、その部位および個数は、特に制限されない。前記表１および前記表２のポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のチミンが、修飾塩基であり、具体的には、修飾チミンであることが好ましい。
【００５２】
前記修飾塩基は、例えば、塩基が修飾基で修飾されたものである。前記修飾基により修飾される塩基（被修飾塩基）は、例えば、前記天然塩基である。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、修飾ウラシルがあげられ、好ましくは、修飾チミンである。
【００５３】
前記修飾塩基は、例えば、前記被修飾塩基が、直接、前記修飾基で修飾されてもよいし、前記被修飾塩基が、間接的に、前記修飾基で修飾されてもよい。後者の場合、例えば、前記被修飾塩基が、リンカーを介して、前記修飾基で修飾される形態があげられる。前記リンカーは、特に制限されない。
【００５４】
前記被修飾塩基の前記修飾基による修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられ、７位が好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられ、５位が好ましい。前記ピリミジン塩基の５位が修飾される場合、チミンは、５位の炭素にメチル基を有することから、例えば、５位の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよいし、５位の炭素に結合したメチル基の炭素に、直接的または間接的に前記修飾基が結合してもよい。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００５５】
前記修飾基は、例えば、アデニン残基または置換アデニン残基が好ましい。すなわち、前記修飾塩基は、例えば、塩基が前記アデニン残基で修飾されている、または、塩基が前記置換アデニン残基で修飾されていることが好ましい。前記アデニン残基または前記置換アデニン残基が、前記被修飾塩基を修飾する部位は、特に制限されず、例えば、前記アデニン残基または前記置換アデニン残基における６位の炭素に結合するアミノ基があげられる。前記アデニン残基または前記置換アデニン残基で修飾される前記被修飾塩基は、特に制限されないが、例えば、チミンが好ましく、チミンの５位の炭素に結合したメチル基の炭素が、前記アデニン残基または前記置換アデニン残基で修飾されていることが好ましい。
【００５６】
前記修飾基が前記アデニン残基または前記置換アデニン残基の場合、例えば、以下に示すように、前記リンカーを介して、前記修飾基により前記被修飾塩基が修飾されていることが好ましい。
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］−［リンカー］−［置換アデニン残基］
【００５７】
前記リンカーは、特に制限されず、例えば、以下のように、前記ヌクレオチド残基と前記アデニン残基または前記置換アデニンとの間の式で表されるが、これには限定されない。下記式において、(CH2)nにおけるｎの数値は、例えば、１〜１０、２〜１０、２である。
［ヌクレオチド残基］  =C‐C(=O)-NH‐(CH2)n-  ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C‐C(=O)-NH‐(CH2)n-  ［置換アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C‐C(=O)-NH‐CH2-CH2-  ［アデニン残基］
［ヌクレオチド残基］  =C‐C(=O)-NH‐CH2-CH2-  ［置換アデニン残基］
【００５８】
前記式において、前記リンカーの一端［＝Ｃ］は、例えば、ヌクレオチド残基における被修飾塩基の炭素と二重結合を形成し、前記リンカーの他端［ＣＨ２‐］は、例えば、アデニン残基または置換アデニン残基のアミン（−ＮＨ）と結合している。
【００５９】
前記置換アデニン残基は、例えば、置換基を有する置換アデニン残基である。前記置換アデニン残基において、前記置換基による置換部位は、特に制限されず、アデニン残基の９位または６位があげられる。
【００６０】
前記置換基は、特に制限されず、例えば、アミジノアミノアルキル基、トリフルオロメチル基、メチルアミノ基、ジニトロフェニル基、リジル基があげられる。
【００６１】
前記アミジノアミノアルキル基において、前記アルキル基は、例えば、直鎖でも分岐鎖でもよく、前記アルキル基の炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜１２、２〜６、４である。
【００６２】
前記アミジノアミノアルキル基は、具体例として、例えば、４−アミジノアミノブチル基、４−アミジノアミノエチル基等があげられ、４−アミジノアミノブチル基が好ましい。
【００６３】
前記ポリヌクレオチドにおける前記アデニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記式（１）に示す残基（以下、「ＫＳ９」ともいう）、前記ポリヌクレオチドにおける前記置換アデニン残基で修飾されたチミジンヌクレオチド残基の具体例として、例えば、下記式（２）に示す残基（以下、「ＫＫ１０」ともいう）があげられる。なお、本発明は、これには限定されない。
【００６４】
【化１】
2017081926.tif 000005
【００６５】
【化２】
2017081926.tif 000006
【００６６】
前記表１および前記表２のポリヌクレオチドにおいては、例えば、下線部のチミンが、前記ＫＳ９および前記ＫＫ１０の少なくとも一方のヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００６７】
本発明の核酸分子が、例えば、前記チミジンヌクレオチド残基を有する場合、前記ポリヌクレオチドの合成には、例えば、下記式（３）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＫＳ９モノマー」ともいう）、または、下記式（４）に示すヌクレオチド三リン酸（以下、「ＫＫ１０モノマー」ともいう）を、モノマー分子として使用することができる。前記ポリヌクレオチドの合成において、例えば、前記モノマー分子は、ホスホジエステル結合により、他のヌクレオチド三リン酸と結合する。
【００６８】
【化３】
2017081926.tif 000007
【００６９】
【化４】
2017081926.tif 000008
【００７０】
前記修飾基としては、この他に、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、ベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、トリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【００７１】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられ、前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられ、前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられ、前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられ、前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
【００７２】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００７３】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００７４】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００７５】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００７６】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個、前述の範囲と同様である。
【００７７】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００７８】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００７９】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００８０】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００８１】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、α−アミラーゼが好ましい。
【００８２】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記α−アミラーゼに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記α−アミラーゼへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記α−アミラーゼに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００８３】
（２）α−アミラーゼ分析用センサ
本発明の分析用センサは、前述のように、α−アミラーゼの分析用センサであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の分析用センサは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の分析用センサを使用すれば、例えば、前記核酸分子と前記α−アミラーゼとを結合させることで、前述のように、前記α−アミラーゼを検出できる。
【００８４】
本発明の分析用センサは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類および前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の分析用センサの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
【００８５】
（３）分析方法
本発明の分析方法は、前述のように、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のα−アミラーゼ分析用センサを使用してもよい。
【００８６】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、α−アミラーゼに特異的に結合することから、例えば、α−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のα−アミラーゼを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のα−アミラーゼの有無またはα−アミラーゼの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
【００８７】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、唾液、尿、血漿および血清等があげられる。
【００８８】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００８９】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のα−アミラーゼの有無または量を分析する工程を含む。
【００９０】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００９１】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。
【００９２】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００９３】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のα−アミラーゼの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のα−アミラーゼの量を分析（定量）できる。
【００９４】
そして、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にα−アミラーゼは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にα−アミラーゼが存在すると判断できる。
【００９５】
前記α−アミラーゼと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記α−アミラーゼと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
【００９６】
（４）検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記α−アミラーゼの検出等を行うことができる。
【００９７】
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【実施例】
【００９８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【００９９】
［実施例１］
本例では、配列番号１〜２２のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能および動態パラメータを、ＳＰＲにより確認した。【０１００】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。配列番号１〜１７および２２のアプタマーは、下記表３Ａの下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記式（１）に示すヌクレオチド残基であり、配列番号１８〜２１のアプタマーは、下記表３Ｂの二重下線で示すチミンを含むヌクレオチド残基が、前記式（２）に示すヌクレオチド残基である。【０１０１】
【表３Ａ】
2017081926.tif 000009
【０１０２】
【表３Ｂ】
2017081926.tif 000010
【０１０３】
前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。【０１０４】
（２）試料
市販のヒトα−アミラーゼ（Lee  Biosolutions社製、以下同様)を、試料として、以下の試験に使用した。【０１０５】
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。【０１０６】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、２００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を３００秒間行った。前記試料における前記ヒトα−アミラーゼ濃度は、４００ｎｍｏｌ／Ｌとした。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。インジェクション開始を０秒として、１１５〜１２５秒の間におけるシグナル強度の平均値を求め、これを、前記アプタマーとタンパクの結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。そして、タンパク質結合測定値（Ｂ）をアプタマー固層化測定値（Ａ）で割った値（Ｂ／Ａ）を、相対値（Relative  Unit）として求めた。また、比較例１−１および１−２は、前記ポリｄＡ付加アプタマーに代えて、α−アミラーゼに結合性を示さないネガティブコントロール１（配列番号２３）およびネガティブコントロール２（配列番号２４）を使用し、同様にして、シグナル強度の測定を行った。
ネガティブコントロール１（KS9  random  pool）
GGATACCTTAACGCCGCCTATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGTTGCACCCGTCTCGAAATC
ネガティブコントロール２（KK10  random  pool）
GGTTACGCCCAGGACACATTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAAGCTCGGTCTCCTCGGATAATC【０１０７】
前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．４とした。【０１０８】
これらの結果を図２および図３に示す。図２Ａおよび図２Ｂは、前記α−アミラーゼに対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０〜１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である（以下、同様）。図３は、前記結合能の相対値（Ｂ／Ａ）を示すグラフであり、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、前記相対値を示す。【０１０９】
図２および図３に示すように、実施例のいずれのアプタマーを使用した場合も、前記ヒトα−アミラーゼに対して、結合性を示した。特に、図３に示すように、配列番号２２のアプタマー（AML1243KR8m1_KS9-3_mini）を使用した場合、極めて高い結合性を示した。これに対して、ネガティブコントロール１および２では、前記ヒトα−アミラーゼに対して、結合性を示さなかった。【０１１０】
［実施例２］
本例では、配列番号１〜３、７〜１９、２１および２２のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能（解離定数）を、ＳＰＲにより確認した。【０１１１】
前記試料におけるα−アミラーゼ濃度を複数の濃度に設定した以外は、前記実施例１と同様にして、前記アプタマーについて、ＳＰＲによる結合能の解析を行った。前記濃度は、２０ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ、２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、１．２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、得られたＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータおよびカイ二乗値を算出した。これらの結果を下記表４に示す。下記表４に示すように、いずれのアプタマーも、ヒトα−アミラーゼに対する解離定数（ＫＤ）は、１７ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。【０１１２】
【表４】
2017081926.tif 000011
【０１１３】
［実施例３］
本例では、本発明のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能を、キャピラリー電気泳動（以下、「ＣＡＥ」という）により、確認した。【０１１４】
（１）アプタマー
配列番号１、２、３および１９のアプタマーの５’末端を、蛍光物質（ＴＹＥ６６５、ＩＤＴ社製）で標識化して、この標識化アプタマーを本実施例に使用した。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、前記実施例１と同じネガティブコントロール１（配列番号２３）の５’末端を、同様にラベル化して使用した。【０１１５】
（２）試料
前記市販のヒトα−アミラーゼまたはヒトの唾液を、試料として、以下の実験に使用した。【０１１６】
（３）ＣＡＥによる結合能の解析１
前記標識化アプタマー（配列番号１）を含む反応液を調製した。前記反応液を、下記条件でＣＡＥに供し、前記反応液中の成分を分離しながら移動させ、前記蛍光物質の最大吸収波長（６６５ｎｍ）における蛍光を測定した。前記反応液は、前記標識化アプタマーのみを含む反応液１、前記標識化アプタマーとα−アミラーゼとを含む反応液２、前記標識化アプタマーと唾液とを含む反応液３、ネガティブコントロールの前記標識化アプタマーと唾液とを含む反応液４を使用した。前記各反応液において、前記標識化アプタマーの濃度は、２００ｎｍｏｌ／Ｌとした。前記反応液２において、前記α−アミラーゼの濃度は、２μｍｏｌ／Ｌとし、前記反応液３および４において、前記唾液の濃度は、１０％とした。そして、前記各反応液の残分は、緩衝液で調製した。前記緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２とした。【０１１７】
（ＣＡＥ条件）
測定装置：ＳＶ１２１０形コスモアイ（日立ハイテクノロジー社）
測定チップ：ｉ−チップ１２（日立化成社）
泳動ゲル：０．６％  ヒドロキシプロピル）メチルセルロース（粘度２．６００−５．６００、シグマ社、＃Ｈ７５０９）
ゲル溶解バッファー：４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２
インジェクション電圧：６００ｖ
インジェクション時間：１２０秒
分離電圧：３５０ｖ
分離時間：２４０ｓｅｃ【０１１８】
これらの結果を図４に示す。図４は、各反応液における前記α−アミラーゼに対するアプタマーの結合能を示すクロマトグラフであり、横軸は、電気泳動時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度を示す。【０１１９】
図４に示すように、前記実施例の標識化アプタマーのみを含む反応液１においては、一つのピークが確認された。このピークは、ターゲットと未結合の前記標識化アプタマーのピークである。これに対して、α−アミラーゼを含む反応液２および唾液を含む反応液３については、それぞれ、前記反応液１と同じ泳動時間（Ａ１）にピークが見られ、さらに、それより遅い泳動時間（Ａ２）にピーク（図において矢印で示すピーク）が見られた。アプタマーにターゲットが結合すると、ターゲットと未結合のアプタマーよりも分子量は大きくなる。したがって、反応液２および３における前記泳動時間（Ａ２）のピークは、前記標識化アプタマーとα−アミラーゼとが結合した複合体であるといえる。なお、ネガティブコントロール（ＮＣ）を含む反応液４については、前記反応液１と同じ泳動時間（Ａ１）において、ピークが確認されたのみであり、α−アミラーゼと結合していないことがわかった。【０１２０】
（４）ＣＡＥによる結合能の解析２
前記標識化アプタマー（配列番号１、２、３および１９）を使用した以外は、前記（３）と同様にして、前記反応液２を調製し、ＣＡＥにより結合能の解析を行った。また、前記標識化アプタマーのα−アミラーゼに対する特異性を確認するために、前記α−アミラーゼに代えて、Ｎ末端にＨｉｓタグが融合したヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ、組換え全長タンパク質、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ社、#CHGA-26904TH）またはヒトＩｇＡ（分泌性、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＬＣ−Ｃａｐｐｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、#55905）を用いた以外は、前記反応液２と同様して、ＣＡＥにより結合能の解析を行った。【０１２１】
これらの結果を図５および図６に示す。図５および図６は、各反応液におけるターゲット（α−アミラーゼ、クロモグラニン、ＩｇＡ）に対するアプタマーの結合能を示すクロマトグラフであり、横軸は、ｄａｔａ  ｐｏｉｎｔ（電気泳動時間に対応）を示し、縦軸は、シグナル強度を示す。【０１２２】
図５および図６に示すように、いずれの実施例の標識化アプタマーも、α‐アミラーゼを含む反応液において、未結合の標識化アプタマーとは異なる泳動時間にピークが確認されたのに対して、クロモグラニンまたはＩｇＡを含む反応液においては、未結合の標識化アプタマーを示す電気泳動時間にピークが確認されたのみであった。これらの結果から、実施例のアプタマーは、前記ヒトα−アミラーゼに対して、特異的に結合性を示すことが確認できた。【０１２３】
［実施例４］
本例では、配列番号１のアプタマーについて、α−アミラーゼに対する結合能を、磁気ビーズによるプルダウンにより確認した。【０１２４】
（１）アプタマー結合ビーズ
磁気ビーズの表面にストレプトアビジン（ＳＡ）が結合したＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、商品名ＭｙＯｎｅ−ＳＡ  Ｃ１）に、前記アプタマーを結合させ、アプタマー結合ビーズを作製した。具体的には、まず、前記アプタマーに１００％相補的な相補鎖を調製した。他方、前記アプタマーの５’領域の配列（配列番号２５、GGATACCTTAACGCCGCCTATTG）を準備し、その５’末端をビオチン化して、ビオチン化プライマーを調製した。そして、前記相補鎖を鋳型として、前記ビオチン化プライマーを用い、ＰＣＲによる増幅を行い、５’末端がビオチン化された前記アプタマーを合成した。前記合成された前記アプタマーと前記相補鎖とからなる二本鎖に対して、前記ＳＡビーズを反応させ、前記二本鎖におけるビオチンと前記ＳＡビーズのアビジンとを結合させた。つぎに、前記二本鎖とＳＡビーズとが結合した複合体を、ＮａＯＨでアルカリ処理し、前記二本鎖の解離を行うことによって、前記相補鎖を除去した。これによって、前記ＳＡビーズに、ビオチン−アビジン結合により前記ビオチン化アプタマーが結合した、前記アプタマー結合ビーズを作製した。【０１２５】
（２）試料
ヒトの唾液を、試料として、以下の実験に使用した。【０１２６】
（３）プルダウンアッセイ
前記アプタマー結合ビーズ（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）と前記試料（終濃度９０％）とを、ＳＢ１Ｔ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）中で混合し、この反応液を、室温で３０分間反応させた。前記反応液を遠心して前記ビーズを回収し、前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で３回遠心洗浄した。前記アプタマーがα−アミラーゼに結合する場合、前記ビーズには、前記アプタマーを介してα−アミラーゼが結合していることになる。そこで、前記ビーズをＳＤＳバッファー緩衝液に混合し、９５℃で１０分間、加熱処理することによって、前記ビーズからα−アミラーゼを遊離させた。そして、加熱処理後の前記ＳＤＳ緩衝液から、前記ビーズを除去して、ＰＡＧＥＬ（Ｃ５２０Ｌ、アトー社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動用のバッファーは、前記ＳＤＳバッファーを使用した。前記ＳＤＳバッファーの組成は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン、０．１％  ＳＤＳとした。【０１２７】
つぎに、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ後のゲルについて、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて染色を行った。なお、分子量マーカーとして、Ｂｅｎｃｈ  Ｍａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。また、コントロール１として、前記アプタマー結合ビーズに代えて、前記ビオチン化プライマーを結合させた前記ＳＡビーズを使用した以外は、同様にして、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥと検出とを行った。また、コントロール２として、前記ヒトα−アミラーゼについて、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥと検出とを行った。【０１２８】
これらの結果を図７に示す。図７は、前記アプタマー結合ビーズから遊離させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図７において、写真の左側が、分子量を示し、レーンＭは、分子量マーカー（Ｍ）、レーン１は、前記実施例のアプタマーを結合させた前記アプタマー結合ビーズを用いた結果、レーン２は、前記プライマーを結合させた前記ＳＡビーズを用いた結果、レーン３は、ヒトα−アミラーゼの結果である。【０１２９】
図７に示すように、前記アプタマー結合ビーズを用いたレーン１は、α−アミラーゼを示すレーン３と同じ部位にバンドが確認された（図において矢印で示すバンド）。他方、前記プライマー結合ビーズを用いた場合、α−アミラーゼと同じ部位にバンドは確認できなかった。【０１３０】
そこで、このレーン１のバンドが、α−アミラーゼのバンドであることを、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所製）を用い、以下の方法により確認した。まず、図７のゲルから、レーン１の矢印で示すバンドを切り出し、１ｍｍ角に細断した。前記細断したゲルをトリプシンで消化後、移動相Ａ液１０μＬに溶解し、溶解サンプルとした。前記溶解サンプルを、以下の条件で、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に供した。そして、ＬＣにより分離したサンプルを、以下の条件で、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにより検索した。前記検索には、データベース検索エンジンとしてＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  社）を用い、ＮＣＢＩデータベースを用いた。なお、検索の際、生物種としてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｃｅ（ｈｕｍａｎ）を指定した。この検索において、マスコットスコア（Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｃｏｒｅ）は、タンパク質候補の確度を示し、このスコアが最も高いものを、分析対象のタンパク質と同定できる。【０１３１】
［ＬＣの実験条件］
カラム：ＰｉｃｏＦｒｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ  ＢｅｔａＢａｓｉｃ  Ｃ１８（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社）
移動相Ａ液：０．１％ギ酸／２％アセトニトリル
移動相Ｂ液：０．１％ギ酸／８０％アセトニトリル
グラジエント：
０−３０分    ５−  ４０％  Ｂ液
３０−４０分  ４０−１００％  Ｂ液
４０−６０分        １００％  Ｂ液
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
〔ＭＳの実験条件〕
イオン化モードｎａｎｏＥＳＩ＋
ＭＳ測定範囲：ＭＳ１  ｍ／ｚ４００−１５００、ＭＳ２  ｍ／ｚ５０−１５００×３
ｄａｔａ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔスキャンモード【０１３２】
その結果、レーン１のバンドのタンパク質は、理論質量（Ｔｈｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍａｓｓ）５８３９８であり、ヒトα−アミラーゼについてのマスコットスコア（Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｃｏｒｅ）が、１６３８と高い値を示した。この結果から、レーン１のバンドのタンパク質が、ヒトα−アミラーゼであることが確認できた。【０１３３】
これらの結果から、前記実施例のアプタマーは、前記ヒトα−アミラーゼに対して、結合性を示すことがわかった。【０１３４】
この出願は、２０１５年１１月１３日に出願された日本出願特願２０１５−２２２９５２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、α−アミラーゼに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子によれば、例えば、試料中のα−アミラーゼとの結合の有無によって、優れた精度で、α−アミラーゼを検出できる。したがって、本発明のα−アミラーゼ結合核酸分子は、例えば、予防医学、健康管理、すい臓がんや糖尿病などにおける病態診断、およびストレスの診断等の分野におけるα−アミラーゼの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月11日(2018.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｃ）のポリヌクレオチドからなる核酸分子であることを特徴とするα−アミラーゼ結合核酸分子。
（ａ）配列番号１〜２２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記α−アミラーゼに結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
前記結合核酸分子が、塩基が修飾基で修飾された修飾塩基を含む、請求項１記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項３】
前記修飾塩基が、修飾チミンである、請求項２記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項４】
前記修飾基が、アデニン残基または置換アデニン残基である、請求項２または３記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項５】
前記置換アデニン残基が、９位のＮに置換基を有する置換アデニン残基である、請求項４記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項６】
前記置換基が、アミジノアミノアルキル基である、請求項５記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項７】
前記アミジノアミノアルキル基が、４−アミジノアミノブチル基である、請求項６記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項８】
前記修飾塩基が、プリン塩基の７位が前記修飾基で修飾された修飾プリン塩基またはピリミジン塩基の５位が前記修飾基で修飾された修飾ピリミジン塩基である、請求項２から７のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子を含むことを特徴とするα−アミラーゼ分析用センサ。
【請求項１０】
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のα−アミラーゼを検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項１から８のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のα−アミラーゼと前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のα−アミラーゼを検出することを特徴とする、α−アミラーゼの分析方法。
【国際調査報告】
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