(57)【要約】  生理活性蛋白質と連結させてその蛋白質の血中安定性を高めることのできるヒト血清アルブミン変異体及びこれを連結させた蛋白質が開示されている。当該連結させた蛋白質は，該配列番号３で示されるアミノ酸配列，又はこれに対し１０個以下のアミノ酸残基が欠失し及び／又は１０個以下のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって，但し配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目のアスパラギン残基及び３２０番目のトレオニン残基がこれら２残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基（Ｘ）を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を含んでなる，ヒト血清アルブミン変異体，及びこれを連結させた生理活性蛋白質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，１０個以下のアミノ酸残基が欠失し及び／又は１０個以下のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって，但し配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目のアスパラギン残基及び３２０番目のトレオニン残基がこれら２残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基（Ｘ）を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を含んでなる，ヒト血清アルブミン変異体。
【請求項２】
該アミノ酸残基（Ｘ）がチロシンである，請求項１のヒト血清アルブミン変異体。
【請求項３】
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるものである，請求項２のヒト血清アルブミン変異体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列に対し，配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目〜３２０番目に対応する位置の配列部分以外において，１０個以下のアミノ酸残基が付加されてなり，且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列とは同一でないものである，ヒト血清アルブミン変異体。
【請求項５】
請求項１〜３の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列に対し，１０個以下のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端に付加されてなり，且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列とは同一でないものである，ヒト血清アルブミン変異体。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列を含んでなる第１のポリペプチド鎖と，これに連結された他の蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチド鎖とを含んでなるものである，ヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項７】
(a)該第１のポリペプチド鎖のＮ末端に該第２のポリペプチド鎖のＣ末端が，又は
(b)該第１のポリペプチド鎖のＣ末端に該第２のポリペプチド鎖のＮ末端が，
ペプチド結合を介して連結しているものである，請求項６のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項８】
該ペプチド結合を介した連結が，リンカーとのペプチド結合を含むものである，請求項７のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質。
【請求項９】
該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１０】
該リンカーが，１〜６個のアミノ酸残基からなるものである，請求項８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１１】
該リンカーが，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，配列番号４，配列番号５，及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるものである，請求項８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質。
【請求項１２】
該リンカーが，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒで示されるものである，請求項８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１３】
該蛋白質（Ａ）が，生体に投与したときに生理活性を示すものである，請求項６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１４】
該蛋白質（Ａ）が，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸−２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ，β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ，α−Ｌ−フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ，ヘパラン硫酸Ｎ−スルファターゼ，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ−１，６−グルコシダーゼ，ＣＬＮ１〜１０を含むリソソーム酵素，ＰＤ−１リガンド，骨形成蛋白質（ＢＭＰ），インスリン，プロラクチン，モチリン，副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)，メラノサイト刺激ホルモン(ＭＳＨ)，甲状腺ホルモン放出ホルモン(ＴＲＨ)，甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)，黄体形成ホルモン(ＬＨ)，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）トロンボポエチン，幹細胞因子（ＳＣＦ），レプチン，バソプレシン，オキシトシン，カルシトニン，グルカゴン，ガストリン，セクレチン，パンクレオザイミン，コレシストキニン，アンジオテンシン，アンジオスタチン，エンドスタチン，ヒト胎盤ラクトーゲン（ＨＰＬ），ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(ＨＣＧ)，エンケファリン，エンドルフィン，インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン２，サイモポイエチン，サイモスチムリン，胸腺液性因子(ＴＨＦ)，血中胸腺因子(ＦＴＳ)，サイモシン，サイミックファクターＸ，腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)，顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)，マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），ウロキナーゼ，組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ），ダイノルフィン，ボンベシン，ニューロテンシン，セルレイン，ブラディキニン，アスパラギナーゼ，カリクレイン，サブスタンスＰ，神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ），グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），骨形成蛋白質（ＢＭＰ），巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ），血液凝固因子VII，血液凝固因子VIII，血液凝固因子IX，スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ），塩酸リゾチーム，ポリミキシンＢ，コリスチン，グラミシジン，バシトラシン，胃酸分泌抑制ポリペプチド（ＧＩＰ），血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ），成長ホルモン分泌因子（ＧＲＦ），上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），エリスロポエチン，ソマトスタチン，インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１），２０Ｋ成長ホルモン，２２Ｋ成長ホルモン，及び��れらの塩若しくは変異体からなる群より選択されるものである，請求項６〜１３の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１５】
該蛋白質（Ａ）が，２２Ｋ成長ホルモンである，請求項６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１６】
該蛋白質（Ａ）が，２０Ｋ成長ホルモンである，請求項６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１７】
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるものである，請求項１５のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１８】
配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものである，請求項１６のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【請求項１９】
請求項６〜１８の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）を有効成分として含有してなる，医薬。
【請求項２０】
成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症，及びＳＧＡ性低身長症であって，何れも骨端線閉鎖を伴わないもの，並びに成人成長ホルモン分泌不全症，ＡＩＤＳによる消耗，及び拒食症による消耗からなる群より選択される疾患の治療剤である，請求項１９の医薬。
【請求項２１】
請求項１〜５の何れかのヒト血清アルブミン変異体をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項６〜１８の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２１又は２２のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３のベクターで形質転換された哺乳類細胞。
【請求項２５】
請求項２４の哺乳類細胞を，無血清培地で培養することにより得られる，ヒト血清アルブミン変異体又はヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質ヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，生理活性を有する蛋白質と連結させることにより，当該蛋白質の血中安定性を高めることのできる新規なヒト血清アルブミン変異体，及び当該ヒト血清アルブミン変異体と生理活性を有する蛋白質とを連結させたヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（ＨＳＡ変異体連結蛋白質），例えばヒト血清アルブミン変異体連結ヒト成長ホルモンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は，その成熟型が５８５個のアミノ酸からなる蛋白質である。ＨＳＡは，血漿蛋白質の中では最も量の多い成分で，血漿中での半減期が１４〜２０日と長い。ＨＳＡは，血漿の浸透圧の調節に寄与するとともに，血中の陽イオン，脂肪酸，ホルモン類，ビリルビンその他の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質と結合してそれらを運搬する機能を有する。一般に，ＨＳＡと結合した物質は，臓器に取り込まれ難くなり，血中をより長時間循環できるようになる。【０００３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）には，天然のバリアントが複数あることが知られている。ヒト血清アルブミンRedhillはその一つである（非特許文献１，２）。ヒト血清アルブミンRedhillは，５８５個のアミノ酸からなる上記の通常のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列と比べて，そのＮ末端側から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり，且つそのＮ末端にアルギニン残基が一つ付加している点で異なり，５８６個のアミノ酸からなる。上記アラニンのトレオニンへの変化により，アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列が生じ，この配列中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ−結合型グリコシド化される。このためアルブミンRedhillは，上記の通常のヒト血清アルブミンと比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。【０００４】
酵素等の蛋白質の血漿中での安定性を，当該蛋白質にＨＳＡを融合させることによって増加させる方法が報告されている（非特許文献３，特許文献１，２）。ＨＳＡと酵素等との融合蛋白質は，ＨＳＡをコードする遺伝子と酵素等の蛋白質をコードする遺伝子とをインフレームに結合させたＤＮＡを組込んだ発現ベクターを導入した形質転換細胞を作製し，この細胞を培養することにより，培地中又は細胞内に組換え蛋白質として作製される。【０００５】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合させて血漿中での安定性を増加させた蛋白質の例としては，ＨＳＡとＧ−ＣＳＦとの融合蛋白質（特許文献１，３），ＨＳＡとインターフェロンαとの融合蛋白質（特許文献４），ＨＳＡとＧＬＰ−１との融合蛋白質（特許文献５），ＨＳＡとインスリンとの融合蛋白質（特許文献６），ＨＳＡとエリスロポエチンとの融合蛋白質（特許文献７），ＨＳＡと成長ホルモンとの融合蛋白質（特許文献４，５及び８〜１１）等がある。【０００６】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は，視床下部の制御下で下垂体前葉から分泌される蛋白質である。ｈＧＨは，軟骨形成促進，蛋白質同化促進等の成長促進活性を示すほか，体組成及び脂質代謝改善作用を示す。ｈＧＨの分泌が少ない小児は，健常児と比較して低身長を呈する成長ホルモン分泌不全性低身長症を発症する。【０００７】
ｈＧＨ遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約２２ＫＤのｈＧＨを有効成分として含有する製剤（ｈＧＨ製剤）が，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，骨端線閉鎖を伴わないＳＧＡ（Small-for-Gestational Age）性低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床応用されている。ｈＧＨ製剤は，皮下又は筋肉内に投与されて血中を循環し，その成長促進活性により患者の成長を促す効果を奏する。また，ｈＧＨ製剤は，成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床応用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では，脂質代謝異常等種々の異常が認められるが，ｈＧＨ製剤の投与により，患者の脂質代謝が正常化する等，患者のＱＯＬが改善される。成長ホルモン分泌不全性低身長症，成人成長ホルモン分泌不全症等に対するｈＧＨ製剤としては，例えば，グロウジェクト（登録商標）がある。【０００８】
血漿中におけるｈＧＨの安定性を増加させる試みは，臨床上の要請によるものである。ｈＧＨの血漿中における半減期は２０分未満とされており，患者に投与されたｈＧＨは，速やかに血中から消失する。このため，ｈＧＨの薬効を患者で実質的に発揮させるには，患者にｈＧＨを週に３回筋肉内に又は毎日皮下に投与する必要がある。このような頻繁な投与は患者の負担となっている。従って，ｈＧＨの血漿中における安定性を増加させて半減期を延長させることにより患者へのｈＧＨの投与回数を減らすことができれば，患者の負担を軽減させることができ，好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表平７−５０３３６８号公報
【特許文献２】特開平３−１７８９９８号公報
【特許文献３】特表平７−５０３８４４号公報
【特許文献４】特表２００３−５３０８３８号公報
【特許文献５】特表２００５−５１４０６０号公報
【特許文献６】特表２０１０−５０００３１号公報
【特許文献７】特開２０１１−０１５６９０号公報
【特許文献８】特表２０００−５０２９０１号公報
【特許文献９】特表２００８−５１８６１５号公報
【特許文献１０】特表２０１３−５０１０３６号公報
【特許文献１１】特表２０１３−５１８０３８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Brand S. et al., Clin Chim Acta. 136, 197-202 （1984）
【非特許文献２】Brennan SO. et al.,  Proc Natl Acad Sci USA. 87, 26-30 (1990)
【非特許文献３】Poznansky MJ. et al., FEBS Letter. 239, 18-22 (1988)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記背景の下で，本発明の一目的は，所望の生理活性蛋白質（本明細書において蛋白質（Ａ）ともいう。）と結合させることによりその生理活性蛋白質の血中安定性を高めることのできる，新規なヒト血清アルブミン変異体を提供することである。本発明の更なる一目的は，所望の蛋白質（例えば，成長ホルモン）と，これに連結された当該ヒト血清アルブミン変異体とを含んでなる，ヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質を提供することである。本発明の尚も更なる一目的は，所望の蛋白質を当該ヒト血清アルブミン変異体と連結させることにより，当該蛋白質の血中安定性を高める方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは，上記目的に向けた研究において検討を重ねた結果，５８５個のアミノ酸からなる通常のヒト血清アルブミンと比較してそのＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基であるアルギニンがトレオニンで置き換わっているものであるアミノ酸配列よりなる変異体（ヒト血清アルブミン変異体）をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と連結させて得た化合物（ヒト血清アルブミン変異体連結ｈＧＨ）が，これを生体に投与したときに，元のヒト成長ホルモンに比べて著しく高い血中安定性を示すことを見出し，更に検討を続けて本発明を完成させた。すなわち，本発明は以下を提供する。
１．配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，１０個以下のアミノ酸残基が欠失し及び／又は１０個以下のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって，但し配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目のアスパラギン残基及び３２０番目のトレオニン残基がこれら２残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基（Ｘ）を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を含んでなる，ヒト血清アルブミン変異体。
２．該アミノ酸残基（Ｘ）がチロシンである，上記１のヒト血清アルブミン変異体。
３．配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるものである，請求項２のヒト血清アルブミン変異体。
４．上記１〜３の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列に対し，配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目〜３２０番目に対応する位置の配列部分以外において，１０個以下のアミノ酸残基が付加されてなり，且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列とは同一でないものである，ヒト血清アルブミン変異体。
５．上記１〜３の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列に対し，１０個以下のアミノ酸残基がＮ末端又はＣ末端に付加されてなり，且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列とは同一でないものである，ヒト血清アルブミン変異体。
６．上記１〜５の何れかのヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列を含んでなる第１のポリペプチド鎖と，これに連結された他の蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチド鎖とを含んでなるものである，ヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
７．(a)該第１のポリペプチド鎖のＮ末端に該第２のポリペプチド鎖のＣ末端が，又は
(b)該第１のポリペプチド鎖のＣ末端に該第２のポリペプチド鎖のＮ末端が，
ペプチド結合を介して連結しているものである，上記６のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
８．該ペプチド結合を介した連結が，リンカーとのペプチド結合を含むものである，上記７のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質。
９．該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１０．該リンカーが，１〜６個のアミノ酸残基からなるものである，上記８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１１．該リンカーが，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，配列番号４，配列番号５，及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるものである，上記８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質。
１２．該リンカーが，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒで示されるものである，上記８のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１３．該蛋白質（Ａ）が，生体に投与したときに生理活性を示すものである，上記６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１４．該蛋白質（Ａ）が，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸−２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ，β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ，α−Ｌ−フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ，ヘパラン硫酸Ｎ−スルファターゼ，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ−１，６−グルコシダーゼ，ＣＬＮ１〜１０を含むリソソーム酵素，ＰＤ−１リガンド，骨形成蛋白質（ＢＭＰ），インスリン，プロラクチン，モチリン，副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)，メラノサイト刺激ホルモン(ＭＳＨ)，甲状腺ホルモン放出ホルモン(ＴＲＨ)，甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)，黄体形成ホルモン(ＬＨ)，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）トロンボポエチン，幹細胞因子（ＳＣＦ），レプチン，バソプレシン，オキシトシン，カルシトニン，グルカゴン，ガストリン，セクレチン，パンクレオザイミン，コレシストキニン，アンジオテンシン，アンジオスタチン，エンドスタチン，ヒト胎盤ラクトーゲン（ＨＰＬ），ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(ＨＣＧ)，エンケファリン，エンドルフィン，インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン２，サイモポイエチン，サイモスチムリン，胸腺液性因子(ＴＨＦ)，血中胸腺因子(ＦＴＳ)，サイモシン，サイミックファクターＸ，腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)，顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)，マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），ウロキナーゼ，組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ），ダイノルフィン，ボンベシン，ニューロテンシン，セルレイン，ブラディキニン，アスパラギナーゼ，カリクレイン，サブスタンスＰ，神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ），グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），骨形成蛋白質（ＢＭＰ），巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ），血液凝固因子VII，血液凝固因子VIII，血液凝固因子IX，スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ），塩酸リゾチーム，ポリミキシンＢ，コリスチン，グラミシジン，バシトラシン，胃酸分泌抑制ポリペプチド（ＧＩＰ），血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ），成長ホルモン分泌因子（ＧＲＦ），上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），エリスロポエチン，ソマトスタチン，インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１），２０Ｋ成長ホルモン，２２Ｋ成長ホルモン��及びこれらの塩若しくは変異体からなる群より選択されるものである，上記６〜１３の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１５．該蛋白質（Ａ）が，２２Ｋ成長ホルモンである，上記６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１６．該蛋白質（Ａ）が，２０Ｋ成長ホルモンである，上記６〜１２の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１７．配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるものである，上記１５のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１８．配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものである，上記１６のヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
１９．上記６〜１８の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）を有効成分として含有してなる，医薬。
２０．成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症，及びＳＧＡ性低身長症であって，何れも骨端線閉鎖を伴わないもの，並びに成人成長ホルモン分泌不全症，ＡＩＤＳによる消耗，及び拒食症による消耗からなる群より選択される疾患の治療剤である，上記１９の医薬。
２１．上記１〜５の何れかのヒト血清アルブミン変異体をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
２２．上記６〜１８の何れかのヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
２３．上記２１又は２２のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
２４．上記２３のベクターで形質転換された哺乳類細胞。
２５．上記２４の哺乳類細胞を，無血清培地で培養することにより得られる，ヒト血清アルブミン変異体又はヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば，医薬品として動物（ヒトを含む）に投与されるべき生理活性のある所望の生理活性蛋白質の血中安定性を高めることができる。そのため，それらの生理活性蛋白質の薬効を高めることができ，その薬効の持続時間の延長ももたらすことができる。またそれにより，それらの生理活性蛋白質の投与量や投与頻度を減ずることも可能となり，患者のＱＯＬの向上を可能にすると共に，従来の頻繁な投与に起因する感染や医療事故の防止にも寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】pE-neoベクターの構築方法を示す流れ図。
【図２】pE-hygrベクターの構築方法を示す流れ図。
【図３−１】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−２】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−３】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−４】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−５】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−６】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−７】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−８】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図３−９】pE-IRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図４】pE-mIRES-GS-puroの構築方法を示す流れ図。
【図５】ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いたＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の細胞増殖活性の測定結果を示す図。縦軸は４９０ｎｍの吸光度，横軸は各検体の濃度（ｎＭ）を示す。縦棒は標準偏差を示す。
【図６】カニクイザルを用いたＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の薬物動態解析の結果を示すグラフ。縦軸はカニクイザル血漿中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度（ｎｇ／ｍＬ），横軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質を投与後の経過時間（時間）を示す。グラフ内の縦棒は標準偏差を示す。
【図７】カニクイザルを用いたＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の薬効解析の結果を示すグラフ。縦軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質を投与前の濃度を１００％としたときの，カニクイザル血漿中のＩＧＦ−１の濃度（％），横軸はＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質を投与後の経過時間（日）を示す。グラフ内の縦棒は標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において，単に「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」というときは，配列番号１で示される５８５個のアミノ酸残基からなる通常の野生型のヒト血清アルブミンに加え，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，置換，欠失，及び／又は付加（本明細書において，アミノ酸残基の「付加」は，配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。）されたものに相当するＨＳＡの変異体も特に区別することなく包含する。アミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。例えば，配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基が欠失した，５８４個のアミノ酸残基からなる変異体も，ヒト血清アルブミンに含まれる。また，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせてもよい。更に，通常の野生型のＨＳＡ又はその変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加（「付加」は配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。）されたものでもよい。このとき付加されるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。
【００１６】
これらアミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したＨＳＡの変異体としては，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０〜１０個のアミノ酸残基の欠失と，０〜１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０〜１０個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。より好ましくは，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対するそれら欠失，置換，及び／又は付加されるアミノ酸残基の個数は，好ましくはそれぞれ５個以下，更に好ましくは３個以下である。
【００１７】
本発明において，「ヒト血清アルブミンRedhill」（ＨＳＡ-Redhill）の語は，ヒト血清アルブミンのバリアントであって，配列番号２で示される５８６個のアミノ酸残基からなるものを意味する。ヒト血清アルブミンRedhillは，配列番号１で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり且つＮ末端にアルギニン残基が一つ付加したものに相当する。このアラニンのトレオニンへの置換により，アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ，この配列部分中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ−結合型グリコシド化されている。このためアルブミンRedhillは，通常の野生型アルブミン（配列番号１）と比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。
【００１８】
本発明において，「ヒト血清アルブミン変異体」（ＨＳＡ変異体）の語は，通常の野生型ＨＳＡ（配列番号１）に対する上述の変異体であって，但し配列番号２で示されるバリアント（ＨＳＡ-Redhill）以外のものをいう。本発明において好ましいＨＳＡ変異体は，配列番号３で示されるものに加え，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，他のアミノ酸残基へ置換され，欠失し，或いは付加されたアミノ酸配列であって，但し配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目のアスパラギン残基及び３２０番目のトレオニン残基が，これら２残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基（Ｘ）を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を有するものを含む。当該アミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。例えば，配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基が欠失した，５８４個のアミノ酸残基からなる変異体でもよい。また，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせたものであってもよい。更に，それら変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。即ち，配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，アミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したものであって，０〜１０個のアミノ酸残基の欠失と，０〜１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０〜１０個のアミノ酸残基の付加とを行ったものであることができる。但し，配列番号３に示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８〜３２０番目のアミノ酸残基はアスパラギン−Ｘ−トレオニン（「Ｘ」はプロリン以外のアミノ酸残基）でなければならず，好ましくは，アスパラギン−チロシン−トレオニンである。
【００１９】
本発明の種々のＨＳＡ変異体における通常の野生型ＨＳＡと比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失，置換，付加）は，両ＨＳＡのアミノ酸配列のアラインメントにより，容易に確認することができる。
【００２０】
後述の実施例において作製されたヒト血清アルブミン変異体（本発明のＨＳＡ変異体の典型的一例）は，５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列（配列番号１）に対し，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンである点においてのみ異なる（配列番号３）。この相違により，当該ＨＳＡ変異体（「ＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）」という。）ではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ，この配列部分においてAsn（アスパラギン）残基がＮ−結合型グリコシド化されることができる。
【００２１】
本発明のＨＳＡ変異体は，本発明のＨＳＡ変異体をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え蛋白質として製造することができる。
【００２２】
本発明において，ヒト血清アルブミン変異体に連結される相手となる生理活性を有する蛋白質（本明細書において，「蛋白質（Ａ）」ともいう。）は，血清アルブミン（変異体か否かを問わない）以外の蛋白質であって生理活性を有するものをいう。また，ここに「生理活性」とは，生体に対し作用して何等かの特定の生理的変化をもたらす能力をいい，例えば，種々の酵素（例えば，リソソーム酵素群），ペプチドホルモン（蛋白質ホルモン），神経伝達物質，成長因子，シグナル伝達因子等，種々の生理的調節（促進，抑制）に関与する蛋白質を含む。
【００２３】
本明細書において，「ヒト血清アルブミン変異体連結蛋白質（Ａ）」又は「ＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）」の語は，本発明のＨＳＡ変異体が連結されている蛋白質（Ａ）をいい，これは両者の各アミノ酸配列を有するポリペプチド同士を連結させることで得られる化合物である。ここで，それらのポリペプチドを「連結」させる」とは，一方のＮ末端と他方のＣ末端との間の直接のペプチド結合による場合のみならず，両ポリペプチドをリンカーを介して間接的に結合させる場合も含む。
【００２４】
ここに「リンカー」は，上記２つのポリペプチドの間にあって両者を共有結合で連結する構造部分であり，本発明のＨＳＡ変異体とその連結相手である蛋白質（Ａ）の何れの末端にも由来しないものである。リンカーは，両ポリペプチドとペプチド結合した，単一のアミノ酸残基であるか又は２個以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖部分（ペプチドリンカー）であることができ，これら１個以上のアミノ酸残基からなるリンカーを，本明細書において包括的に「ペプチドリンカー」という。本発明においてリンカーは，ペプチドリンカー以外の２価の基であってＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）との間を共有結合により連結する構造部分であることもでき，それらを本明細書において「非ペプチドリンカー」という。また，本明細書において，ＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）が「ペプチド結合を介して」連結しているというときは，両者が直接ペプチド結合により連結している場合と両者がペプチドリンカーとの結合により連結している場合とを包含する。なお，本明細書において，ＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）とが直接に又はペプチドリンカーを介して結合している場合，当該化合物である「ＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）」は，「ＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）」ともいう。
【００２５】
本発明のＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）がペプチドリンカーを介して連結されているとき，そのリンカーは，好ましくは１〜５０個，より好ましくは１〜１７個，更に好ましくは１〜１０個，尚も好ましくは１〜６個のアミノ酸残基で構成されており，例えば，２〜１７個，２〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個又は２５〜２９個のアミノ酸で構成されるものであり，更に例えば，１個のアミノ酸残基のみで，又は２個，３個，５個，６個又は２０個のアミノ酸残基から構成されるものである。ペプチドリンカーで連結されたＨＳＡ変異体部分がＨＳＡとしての機能を保持し且つ蛋白質（Ａ）の部分も生理的条件下で蛋白質（Ａ）の生理活性を発揮できる限り，ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基又はアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。ペプチドリンカーの好適な例として，Gly-Ser，Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号４），Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５），Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号６）からなるもの，及びこれらアミノ酸配列を含んでなるものが挙げられる。これらのアミノ酸配列の何れか一種が２〜１０回，あるいは２〜５回連続してなる配列を有するものも，ペプチドリンカーとして好適に使用でき，また，これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさって１〜１０回，あるいは２〜５回連続してなる配列を有するものも，ペプチドリンカーとして好適に使用できる。これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさったペプチドリンカーの好適なものとして，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５）が３個連続してなる計２０個のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００２６】
２つの異なるポリペプチドを連結する方法としては，例えば，一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え融合蛋白質として発現させる方法が一般的であり，本発明において利用できる。
【００２７】
組換え体として形質転換細胞に発現させることによりＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）を産生させる場合，蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに連結された形の融合蛋白質が得られる。
【００２８】
ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのＮ末端側に蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを連結させる場合，蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで連結させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して２つのポリペプチドを間接的に連結させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで挿入される。
【００２９】
ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末端側に蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを連結させる場合，蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで連結させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して２つのポリペプチドを間接的に連結させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで挿入される。
【００３０】
ＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）を宿主細胞に産生させるには，それらの何れかをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが宿主細胞に導入される。このために用いることのできる宿主細胞は，そのような発現ベクターを導入することにより本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）を発現させることができるものである限り特に制限はなく，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞，大腸菌，枯草菌等の原核細胞の何れであってもよいが，哺乳動物細胞が特に好適である。但し，糖鎖修飾された蛋白質（Ａ）として発現させる場合の宿主細胞は，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞から選択される。通常野生型のＨＳＡの３２０番目のアミノ酸残基がトレオニンとなることにより生じるAsn−Tyr−Thrで表される配列部分のＡｓｎ残基，又はAsn−Ｘ−Thr（「Ｘ」はプロリン以外のアミノ酸残基）で表される配列中のＡｓｎ残基は，ＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）の発現を真核生物細胞で行わせることによりＮ−結合型グリコシド化される。
【００３１】
哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合，該哺乳動物細胞の種類について特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。またこのとき本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入したとき該遺伝子の発現をもたらすものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
【００３２】
このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれている蛋白質を発現するようになるが，その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）を効率よく生産するためには，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から，これらの発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために，発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。
【００３３】
選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン，ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素（薬剤耐性マーカー）である。哺乳動物細胞は通常一定濃度以上のこれらの薬剤の存在下で死滅する。しかし，薬剤耐性マーカー遺伝子の組み込まれた発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現された薬剤耐性マーカーにより上記薬剤を分解し，これを無毒化又は弱毒化することができるため，上記薬剤存在下でも生存可能となる。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーが組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し，その薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含有する選択培地中で，その薬剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度の薬剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，薬剤耐性マーカーとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００３４】
また，選択マーカーとして，グルタミン合成酵素（ＧＳ）を用いることもできる。グルタミン合成酵素は，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞を，グルタミン合成酵素の阻害剤，例えばメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有し，且つグルタミンを含有しない選択培地中で培養すると，細胞は通常死滅する。しかし，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能となる。このとき，ＭＳＸの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，グルタミン合成酵素とともに，一般に，発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００３５】
また，選択マーカーとして，ジヒドロ葉酸レデクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いることもできる。ＤＨＦＲを選択マーカーとして用いる場合，発現ベクターを導入した哺乳動物細胞は，メトトレキセート，アミノプテリン等のＤＨＦＲ阻害剤を含有する選択培地中で培養される。ＤＨＦＲ阻害剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＤＨＦＲ阻害剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，ＤＨＦＲとともに，一般に，発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【００３６】
目的の蛋白質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ：internal ribosome entry site）を介して，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）を配置した発現ベクターが知られている（国際特許公報ＷＯ２０１２／０６３７９９，ＷＯ２０１３／１６１９５８）。これら文献に記載された発現ベクターは，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）の製造に特に好適に使用することができる。
【００３７】
例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，第１の遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，上記第１の遺伝子発現制御部位の又はこれとは別の第２の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる発現ベクターは，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）の製造に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて，第１の遺伝子発現制御部位又は第２の遺伝子発現制御部位としては，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１αプロモーター（ｈＥＦ−１αプロモーター），ヒトユビキチンＣプロモーターが好適に用いられるが，ｈＥＦ−１αプロモーターが特に好適である。
【００３８】
また，内部リボソーム結合部位としては，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルスからなる群より選択されるウイルスのゲノム，又はヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが，マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合，野生型のもの以外に，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また，この発現ベクターにおいて，好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は，好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり，より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。
【００３９】
また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子−１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１３／１６１９５８に記載された発現ベクターが挙げられる。
【００４０】
また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子−１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１２／０６３７９９に記載されたpE-mIRES-GS-puro及びＷＯ２０１３／１６１９５８に記載されたpE-mIRES-GS-mNeoが挙げられる。
【００４１】
野生型のマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の３’末端には，３つの開始コドン（ATG）が存在しており，その３つの開始コドンを含む配列部分は配列番号７（5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3'：開示コドンのATGを大文字で示す）で示される。この配列部分中の開始コドンのうちの一部が破壊されたものとして，例えば，配列番号８（5'-atgataagcttgccacaaccatg-3'）で示されるものがあり，上記のpE-mIRES-GS-puro及びpE-mIRES-GS-mNeoは，配列番号８で示される配列を含むIRESを有する発現ベクターである。
【００４２】
本発明において，本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，これらの発現レベルの高い細胞を選択するために，選択培地中で選択培養される。
【００４３】
選択培養において，ＤＨＦＲを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＤＨＦＲ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは０．２５〜５μＭであり，より好ましくは０．５〜１．５μＭであり，更に好ましくは約１．０μＭである。
【００４４】
ＧＳを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＧＳ阻害剤がＭＳＸの場合，好ましくは１００〜１０００μＭであり，より好ましくは２００〜５００μＭであり，更に好ましくは約３００μＭである。またこのとき，一般的にグルタミンを含有しない培地が選択培地として用いられる。
【００４５】
ピューロマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるピューロマイシンの最大濃度は，好ましくは３〜３０μｇ／ｍＬであり，より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１０μｇ／ｍＬである。
【００４６】
ネオマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧ４１８の最大濃度は，好ましくは０．１ｍｇ〜２ｍｇ／ｍＬであり，より好ましくは０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１ｍｇ／ｍＬである。
【００４７】
また，哺乳動物細胞の培養のための培地としては，選択培養で用いる培地，後述する組換え蛋白質を生産するために用いる培地（組換え蛋白質生産用培地）ともに，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。ＨＳＡは血清中に含まれる成分を吸着する性質を有するため，血清を含有する培地を用いてＨＳＡを生産した場合には，血清中の不純物を吸着したＨＳＡが得られることから，その後の工程でこの不純物を除去する必要が生じる。
【００４８】
本発明のＨＳＡ変異体又はＨＳＡ変異体融合蛋白質（Ａ）は，特に，これらを発現している細胞を無血清培地で培養して得られるものである。無血清培地を用いることにより，ＨＳＡへの不純物の吸着量を低減することができるので，その後の精製工程を簡便化することができる。
【００４９】
選択培養により選択された組換え蛋白質の発現レベルの高い細胞が組換え蛋白質の生産に用いられる（組換え蛋白質産生細胞）。組換え蛋白質の生産は，組換え蛋白質産生細胞を組換え蛋白質生産用培地中で培養することにより行われる。この培養を生産培養という。
【００５０】
本発明において，組換え蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を３〜７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３〜１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１〜２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
【００５１】
組換え蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社，旧ライフテクノロジーズ社），ＩＳ  ｃｈｏ−ＶＴＭ 培地（Irvine Scientific社），ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０２培地又はＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３２５−ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。
【００５２】
ＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）を得るためには，両蛋白質を別々に作製し，それぞれのポリペプチドを非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーで連結するという方法も採用してもよい。非ペプチドリンカーの例としては，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，若しくはこれらの誘導体，又はこれらを組み合わせたものを用いることができる。他方，ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１〜５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ本発明のＨＳＡ変異体又は所望の蛋白質の何れかとペプチド結合を形成することにより，本発明のＨＳＡ変異体と所望の蛋白質とを連結するものである。
【００５３】
非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明のＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）とを連結させたものは，これを特記する場合，ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結蛋白質（Ａ）という。ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結蛋白質（Ａ）は，ＨＳＡ変異体とＰＥＧを結合させ（ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体），これに蛋白質（Ａ）を結合させることにより，又は，先に蛋白質（Ａ）とＰＥＧとを結合させ（ＰＥＧ化生理活性蛋白質（Ａ）），これにＨＳＡ変異体を結合させることによって，製造することができる。ＰＥＧをＨＳＡ変異体又は蛋白質（Ａ）と結合させるには，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に本発明のＨＳＡ変異体及び蛋白質（Ａ）のアミノ基と反応することにより，本発明のＨＳＡ変異体及び蛋白質（Ａ）が共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００〜６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００〜２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
【００５４】
例えば，ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体は，本発明のＨＳＡ変異体とアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ALD-PEG-ALD）とを，ＨＳＡ／(ALD-PEG-ALD) のモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，上記ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体を，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，蛋白質（Ａ）と反応させることにより，ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結蛋白質が得られる。逆に，先に蛋白質（Ａ）とALD-PEG-ALDとを結合させてＰＥＧ化蛋白質（Ａ）を作製し，これと本発明のＨＳＡ変異体とを結合させることによっても，本発明のＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結蛋白質（Ａ）を得ることができる。
【００５５】
本発明のＨＳＡ変異体と連結させる蛋白質（Ａ）は，好ましくは生体に投与したときに生理活性を示す蛋白質であり，所望により選択される。このような蛋白質としては，α−Ｌ−イズロニダーゼ，イズロン酸−２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β−ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β−ヘキソサミニダーゼＡ，β−ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフォトランスフェラーゼ，α−マンノシダーゼ，β−マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ，α−Ｌ−フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−ガラクトシダーゼ，β−グルクロニダーゼ，ヘパラン硫酸Ｎ−スルファターゼ，α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ−１，６−グルコシダーゼ，ＣＬＮ１〜１０を含むリソソーム酵素，ＰＤ−１リガンド，骨形成蛋白質（ＢＭＰ），インスリン，プロラクチン，モチリン，副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)，メラノサイト刺激ホルモン(ＭＳＨ)，甲状腺ホルモン放出ホルモン(ＴＲＨ)，甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)，黄体形成ホルモン(ＬＨ)，卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）トロンボポエチン，幹細胞因子（ＳＣＦ），レプチン，バソプレシン，オキシトシン，カルシトニン，グルカゴン，ガストリン，セクレチン，パンクレオザイミン，コレシストキニン，アンジオテンシン，アンジオスタチン，エンドスタチン，ヒト胎盤ラクトーゲン（ＨＰＬ），ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(ＨＣＧ)，エンケファリン，エンドルフィン，インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン２，サイモポイエチン，サイモスチムリン，胸腺液性因子(ＴＨＦ)，血中胸腺因子(ＦＴＳ)，サイモシン，サイミックファクターＸ，腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)，顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)，マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），ウロキナーゼ，組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ），デイノルフィン，ボンベシン，ニューロテンシン，セルレイン，ブラディキニン，アスパラギナーゼ，カリクレイン，サブスタンスＰ，神経成長因子（ＮＧＦ），毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ），脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ），グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ），ニューロトロフィン３，ニューロトロフィン４／５，ニューロトロフィン６，ニューレグリン１，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２），血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ），骨形成蛋白質（ＢＭＰ），巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ），血液凝固因子VII，血液凝固因子VIII，血液凝固因子IX，スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ），組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ），塩酸リゾチーム，ポリミキシンＢ，コリスチン，グラミシジン，バシトラシン，胃酸分泌抑制ポリペプチド（ＧＩＰ），血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ），血小板由来成長因子（ＰＤＧ��），成長ホルモン分泌因子（ＧＲＦ），上皮細胞成長因子（ＥＧＦ），エリスロポエチン，ソマトスタチン，インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１），２０Ｋ成長ホルモン，２２Ｋ成長ホルモン，及びこれらの塩，若しくは変異体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明において，ＨＳＡ変異体と連結させるべき蛋白質（Ａ）は，それが由来する生物種に特に限定はないが，好ましくは哺乳動物由来の蛋白質であり，より好ましくは，ヒト，アフリカミドリザル等の霊長類，マウス，ラット，チャイニーズハムスター等のげっ歯類，ウサギ，イヌ由来の蛋白質であり，特に好ましくはヒト由来の蛋白質である。
【００５７】
本発明において，蛋白質（Ａ）は，野生型のものに限られない。即ち，野生型のアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸が置換，欠失，及び／又は付加された変異体であって，元の蛋白質（Ａ）の生理活性を保持するものの他，野生型の蛋白質（Ａ）と拮抗して機能する（これは，内因性の蛋白質（Ａ）の働きに影響を及ぼす）ものでもあってもよい。置換，欠失，及び／又は付加されていてよいアミノ酸の個数は，各変異タイプにつき，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個である。これらアミノ酸の置換，欠失及び／又は付加は組み合わせて起こっていることができる。
【００５８】
本発明のＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）は，ＨＳＡ変異体が連結していない元の蛋白質（Ａ）に比べ，血中での安定性が高まり半減期が長くなる。投与経路や投与量により変動はするが，皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期（ｔ１／２β）が概ね５時間以上と，血中で極めて安定になる。例えば，本発明のＨＳＡ変異体連結ヒト成長ホルモンの血中半減期（ｔ１／２β）は，０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したとき，血中半減期（ｔ１／２β）は，５〜４０時間である。
【００５９】
本発明のＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）は，生体に投与したときに蛋白質（Ａ）の部分が示す活性によって，医薬として使用することができる。ここに，「生体」とは，ヒトを含む哺乳類，特に好ましくはヒトの生体である。
【００６０】
本発明のＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）は血中での安定性が高められているため，従来は血中で不安定で投与後すぐに分解されて十分な薬効を示すことができなかった蛋白質（Ａ）であっても，これに本発明のＨＳＡ変異体を連結させることにより，血中で安定化させその生理活性を発揮させることが可能となり，医薬としての開発の途が開かれる。
【００６１】
また，従来医薬として使用可能であった蛋白質（Ａ）であっても，これに本発明のＨＳＡ変異体を連結させることにより，血中での安定性を更に向上させて長期に渡って活性を保持した状態で血中に留まらせることができるため，蛋白質（Ａ）の投与頻度又は投与量を減じることが可能となる。例えば，毎日投与が必要である医薬の投与頻度を，本発明のＨＳＡ変異体と連結させることにより，例えば３〜３０日毎の投与とすることができる。また，当該医薬の投与量を，モル比で例えば１／３〜１／１００にまで減じることができる。
【００６２】
本発明のＨＳＡ変異体連結蛋白質（Ａ）を有効成分として含有してなる医薬は，注射剤として静脈内，筋肉内，腹腔内又は皮下に投与することができる。医薬の投与経路は，その剤形，適用症等により適宜選択される。それらの注射剤は，凍結乾燥製剤又は水性液剤として供給することができる。水性液剤とする場合，バイアルに充填した形態としてもよく，注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合，使用前に水性媒質に溶解し復元して使用する。
【００６３】
本発明のＨＳＡ変異体と連結させるべき蛋白質（Ａ）の一つとしてヒト成長ホルモンが挙げられる。ヒト成長ホルモンには，主に２２Ｋヒト成長ホルモンと２０Ｋヒト成長ホルモンの分子量の異なる２種類がある。２２Ｋ成長ホルモンは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する，１９１個のアミノ酸から構成される蛋白質である。通常，「ヒト成長ホルモン（又はｈＧＨ）」というときは，この２２Ｋ成長ホルモンのことを意味するが，本明細書において，単に「ヒト成長ホルモン（又はｈＧＨ）」というときは，２２Ｋヒト成長ホルモンと２０Ｋヒト成長ホルモンの双方を包含する。
【００６４】
本明細書において，単に「２２Ｋヒト成長ホルモン（又は２２ＫｈＧＨ）」というときは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する野生型の２２ＫｈＧＨに加え，これに対し１個又は複数個のアミノ酸が，置換，欠失及び／又は付加されたものである２２ＫｈＧＨ変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換，欠失及び／又は付加されてよいアミノ酸の個数は，各変異タイプにつき，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１〜２個である。
【００６５】
野生型の２０Ｋヒト成長ホルモンは，野生型の２２Ｋ成長ホルモン（配列番号９）を構成する１９１個のアミノ酸のうちＮ末端から数えて３２番目〜４６番目の１５個のアミノ酸が欠失したものに相当し，１７６個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列（配列番号１０）よりなる，成長促進活性を有する蛋白質である。但し，本明細書において，単に「２０Ｋヒト成長ホルモン（又は２０ＫｈＧＨ）」というときは，配列番号１０で示される野生型の２０ＫｈＧＨに加え，当該配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸が，置換，欠失及び／又は付加されたものに相当する２０ＫｈＧＨの変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換，欠失及び／又は付加されてよいアミノ酸の個数は，各変異タイプにつき，好ましくは１〜８個であり，より好ましくは１〜４個であり，更に好ましくは１〜２個である。
【００６６】
ｈＧＨ遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約２２ＫＤのｈＧＨを有効成分として含有する製剤（ｈＧＨ製剤）が，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，骨端線閉鎖を伴わないＳＧＡ性低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，及び軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床使用されている。ｈＧＨ製剤は，皮下又は筋肉内に投与されることで成分のｈＧＨが血中を循環し，その成長促進活性により患者の成長を促進する効果を発揮する。また，ｈＧＨ製剤は，成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床使用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では，脂質代謝異常が認められるが，ｈＧＨ製剤の投与により，患者の脂質代謝等が正常化し，患者のＱＯＬが改善される。ＡＩＤＳによる消耗の治療剤としても成長ホルモンは臨床応用されている。成長ホルモン分泌不全性低身長症，成人成長ホルモン分泌不全症等のｈＧＨ製剤としては，例えば，グロウジェクト（登録商標）がある。
【００６７】
本発明において，ヒト血清アルブミン変異体（ｍＨＳＡ）の連結相手である蛋白質（Ａ）としてヒト成長ホルモンを採用したものを，「ヒト血清アルブミン変異体連結ヒト成長ホルモン」又は「ｍＨＳＡ連結ｈＧＨ」等といい，ペプチド結合を介して連結させてある場合は，特に，ヒト血清アルブミン変異体融合ヒト成長ホルモン」，「ｍＨＳＡ融合ｈＧＨ」等ともいう。
【００６８】
本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを連結させる具体的方法としては，例えば，一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え蛋白質として発現させる方法が一般的であり，本発明において利用できる。
【００６９】
組換え蛋白質として形質転換細胞に発現させる方法によりｍＨＳＡ連結ｈＧＨを作製するとき，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドは，本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側の何れかに，直接，又はリンカーを介して間接的に連結される。
【００７０】
本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＮ末端側にｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドを連結する場合，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。２つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に連結する場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで配置される。
【００７１】
本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末端側にｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドを連結する場合，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に，本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。２つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に連結する場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで配置される。
【００７２】
その他，本発明のＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを連結する方法としては，例えば組換え蛋白質として２つのポリペプチドを別々に作製し，次いで，それら２つを，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して連結させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。他方，ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１〜５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ本発明のＨＳＡ変異体又は所望の蛋白質の何れかとペプチド結合を形成することにより，本発明のＨＳＡ変異体と所望の蛋白質とを連結するものである。
【００７３】
非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いてＨＳＡ変異体と蛋白質（Ａ）とを連結させたものは，リンカーを明示する場合，ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結蛋白質（Ａ）という。即ち，蛋白質（Ａ）としてｈＧＨを選択した場合には，ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結ｈＧＨという。ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結ｈＧＨは，ＨＳＡ変異体とＰＥＧとを先ず結合させ（ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体），これにｈＧＨを結合させることにより，又は，先にｈＧＨとＰＥＧとを結合させ（ＰＥＧ化ｈＧＨ），これにＨＳＡ変異体を結合させることによって，製造することができる。ＰＥＧを本発明のＨＳＡ変異体又はｈＧＨと結合させるには，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に本発明のＨＳＡ変異体及びｈＧＨ分子のアミノ基と反応することにより，本発明のＨＳＡ変異体及びｈＧＨが共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００〜６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００〜２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
【００７４】
例えば，ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体は，本発明のＨＳＡ変異体とアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ALD-PEG-ALD）とを，ＨＳＡ／(ALD-PEG-ALD) のモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，上記ＰＥＧ化ＨＳＡ変異体を，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，ｈＧＨと反応させることにより，ＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結ｈＧＨが得られる。逆に，先にｈＧＨとALD-PEG-ALDとを結合させてＰＥＧ化ｈＧＨを作製し，これとＨＳＡ変異体とを結合させることによっても，本発明のＨＳＡ変異体ＰＥＧ連結ｈＧＨを得ることができる。
【００７５】
本発明において，ｍＨＳＡ連結（融合）ｈＧＨの好適な一例として，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端に，リンカーを介さずに，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する２２Ｋヒト成長ホルモンのＣ末端をペプチド結合により連結させたものである，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するｍＨＳＡ連結ｈＧＨが挙げられる。本発明において，この順序でＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）と２２ＫｈＧＨとを連結したものを，「２２Ｋヒト成長ホルモン−ｍＨＳＡ」又は「２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ」という。同様に，ＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＣ末端に，リンカーを介さずに，２２Ｋヒト成長ホルモンのＮ末端がペプチド結合により結合したものを「ｍＨＳＡ−２２Ｋヒト成長ホルモン」又は「ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ」という。
【００７６】
また，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端に，リンカーを介さずに，配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する２０Ｋヒト成長ホルモンのＣ末端をペプチド結合により連結させたものである，配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するｍＨＳＡ連結ｈＧＨを，「２０Ｋヒト成長ホルモン−ｍＨＳＡ」又は「２０ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ」という。同様に，ヒト血清アルブミン（Ａ３２０Ｔ）のＣ末端に，リンカーを介さずに，２０Ｋヒト成長ホルモンのＮ末端がペプチド結合により連結したものを「ｍＨＳＡ−２０Ｋヒト成長ホルモン」又は「ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ」という。
【００７７】
本発明のＨＳＡ変異体連結ヒト成長ホルモンは，皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期（ｔ1/2β）が概ね１０時間以上と血中で極めて安定になることを特徴とする。投与量により変動はするが，例えば，４ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したときの，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡの血中半減期（ｔ1/2β）は，２０〜３５時間である。
【００７８】
本発明のＨＳＡ変異体連結ヒト成長ホルモンは，医薬として使用することができる。ヒト成長ホルモンとＨＳＡ変異体の生体内における機能を協働させることにより，医薬として使用することもできる。
【００７９】
本発明のＨＳＡ変異体連結ヒト成長ホルモンは，血中で極めて安定である。従って，本発明によればヒト成長ホルモンを血中で安定化させて長時間に渡って活性を保持した状態で血中に留まらせることができ，医薬として用いる場合のヒト成長ホルモンの投与頻度又は投与量を減じることが可能となる。例えば，毎日投与が必要である医薬の投与頻度を，本発明のＨＳＡ変異体と連結することにより，例えば３〜３０日毎の投与とすることも可能となる。また，当該医薬の投与量を，モル比で１／３〜１／１００にまで減じることも可能となる。
【００８０】
本発明のＨＳＡ変異体連結ヒト成長ホルモンは，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症，ＳＧＡ性低身長症であって，何れも骨端線閉鎖を伴わないもの，成人成長ホルモン分泌不全症，ＡＩＤＳによる消耗，及び拒食症による消耗を対象疾患とする医薬として使用することができるが，これに限らず，成長ホルモンの有する軟骨形成促進，蛋白質同化促進等の成長促進活性，体組成及び脂質代謝改善作用等の生理活性を，長期に渡って作用させることにより症状が改善され得る疾患の治療剤として使用することができる。
【００８１】
ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わない成長ホルモン分泌不全性低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１〜０．７ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わないターナー症候群における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１５〜１．４ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わない慢性腎不全による低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１〜１．４ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わないプラダーウィリー症候群における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１２〜０．９８ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わない軟骨異栄養症における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１５〜１．４ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，骨端線閉鎖を伴わないＳＧＡ性低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．０１２〜１．９ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，成人成長ホルモン分泌不全症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．００１〜０．３４ｍｇ／Ｋｇ体重である。ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを，ＡＩＤＳにより消耗した患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は０．００５〜０．４ｍｇ／Ｋｇ体重である。但し，投与量は患者の検査所見等によって，適宜変更されるべきものである。また，これら疾患における，好ましいｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨの投与間隔は，７〜３０日毎に１回であり，患者の検査所見等によって，７〜１４日毎，１０〜２０日毎，又は１４〜２１日毎に１回と適宜変更されるべきものである。また，投与方法は，好ましくは皮下注射，筋肉内注射又は静脈注射であり，より好ましくは皮下注射又は筋肉内注射である。
【００８２】
本発明のＨＳＡ変異体連結蛋白質を有効成分として含有してなる医薬は，注射剤として静脈内，筋肉内，腹腔内，皮下又は脳室内に投与することができる。それらの注射剤は，凍結乾燥製剤又は水性液剤として供給することができる。水性液剤とする場合，バイアルに充填した形態としてもよく，注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合，使用前に水性媒質に溶解し復元して使用する。
【実施例】
【００８３】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００８４】
〔実施例１〕pE-mIRES-GS-puroの構築
pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，制限酵素（KpnI及びNcoI）で消化し，ＥＦ-１αプロモーター及びその第一イントロンを含むDNA断片を切り出し，このDNA断片をT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に，pCI-neo（インビトロジェン社）を，制限酵素（BglII及びEcoRI）で消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ-１αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域（平滑末端化処理後のもの）を挿入して，pE-neoベクターを構築した（図１）。【００８５】
pE-neoベクターを，制限酵素（SfiI及びBstXI）で消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１kbpの領域を切除した（図２）。pcDNA3.1/Hygro(+)（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5'（配列番号１３）及びプライマーHyg-BstX3'（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲによりハイグロマイシン遺伝子を増幅した（図２）。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，制限酵素（SfiI及びBstXI）で消化し，上記のpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した（図２）。【００８６】
発現ベクターpPGKIH (Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000))を制限酵素（XhoI及びBamHI）で消化し，マウス脳心筋炎ウイルス（EMCV）に由来する内部リボソーム結合部位（IRES），ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygr遺伝子）及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（mPGK）のポリアデニル化領域（mPGKpA）を含む塩基配列IRES-Hygr-mPGKpA（配列番号１５：５’末端から，塩基１〜６からなる領域が「XhoI部位」，塩基１２０〜７１５及びこれに続く塩基７１６〜７１８（atg）からなる領域が「マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を含む塩基配列」，該塩基７１６〜７１８（atg）を含む塩基７１６〜１７４１からなる領域が「ハイグロマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列」，塩基１７４７〜２２１０からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（mPGK）のポリアデニル化領域を含む塩基配列」，及び３’末端の６個の塩基（塩基２２１１〜２２１６）からなる領域が「BamHI部位」である。）よりなるＤＮＡ断片を切り出した（なお，Hygr遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号１６で示されたものである。）。このDNA断片をpBluescript SK(-)（Stratagene社）のXhoI部位とBamHI部位の間に挿入し，これをpBSK（IRES-Hygr-mPGKpA）とした（図３−１）。【００８７】
pBSK（IRES-Hygr-mPGKpA）を鋳型とし，プライマーIRES5'（配列番号１７）及びプライマーIRES3'（配列番号１８）を用いて，ＰＣＲによりEMCVのIRESの一部を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片を制限酵素（XhoI及びHindIII）で消化し，pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)のXhoI部位とHindIII部位の間に挿入し，これをpBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)とした（図３−２）。pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)を制限酵素（NotI及びBamHI）で消化し，pE-hygrベクターのNotI部位とBamHI部位の間に挿入し，これをプラスミドpE-IRES-Hygrとした（図３−３）。【００８８】
発現ベクターpPGKIHを鋳型とし，プライマーmPGKP5'（配列番号１９）及びプライマーmPGKP3'（配列番号２０）を用いて，ＰＣＲによりmPGKのプロモーター領域（mPGKp）を含む塩基配列（配列番号２１：５’末端から，塩基４〜９が「BglII部位」，これに続く塩基１０〜５１６からなる領域が「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む塩基配列」，これに続く塩基５２４〜５２９からなる領域が「EcoRI部位」である。）よりなるDNA断片を増幅した。このDNA断片を制限酵素（BglII及びEcoRI）で消化し，pCI-neo（プロメガ社）のBglII部位とEcoRI部位の間に挿入し，これをpPGK-neoとした（図３−４）。pE-IRES-Hygrを制限酵素（NotI及びBamHI）で消化してDNA断片（IRES-Hygr）を切り出し，pPGK-neoのNotI部位とBamHI部位の間に挿入し，これをpPGK-IRES-Hygrとした（図３−５）。【００８９】
ＣＨＯ-Ｋ１細胞からcDNAを調製し，このcDNAを鋳型とし，プライマーGS5'（配列番号２２）及びプライマーGS3'（配列番号２３）を用いて，ＰＣＲによりＧＳ遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片を制限酵素（BalI及びBamHI）で消化し，pPGK-IRES-HygrのBalI部位とBamHI部位の間に挿入し，これをpPGK-IRES-GS-ΔpolyAとした（図３−６）。【００９０】
pCAGIPuro（Miyahara m. et.al., J. Biol. Chem. 275,613-618(2000））を鋳型とし，プライマーpuro5'（配列番号２４）及びプライマーpuro3'（配列番号２５）を用いて，ＰＣＲによりピューロマイシン耐性遺伝子（puro遺伝子）を含む塩基配列（配列番号２６：５’末端から，塩基２〜７からなる領域が「AflII部位」，これに続く塩基８〜６０７からなる領域が「ピューロマイシン耐性遺伝子（puro遺伝子）をコードする塩基配列」，及び，その次の塩基６０８〜６１９からなる領域が「BstXI部位」である。）よりなるＤＮＡ断片を増幅した（なお，puro遺伝子に対応するアミノ酸配列は，配列番号２７で示されたものである。）。このＤＮＡ断片を制限酵素（AflII及びBstXI）で消化し，発現ベクターpE-neoのAflII部位とBstXI部位の間に挿入し，これをpE-puroとした（図３−７）。【００９１】
pE-puroを鋳型とし，プライマーSV40polyA5'（配列番号２８）及びプライマーSV40polyA3'（配列番号２９）を用いて，ＰＣＲによりSV40後期ポリアデニル化領域を含むDNA断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素（NotI及びHpaI）で消化し，発現ベクターpE-puroのNotI部位とHpaI部位の間に挿入し，これをpE-puro(XhoI)とした（図３−８）。pPGK-IRES-GS-ΔpolyAを制限酵素（NotI及びXhoI）で消化し，IRES-GS領域を含むDNA断片を切り出し，このDNA断片を発現ベクターpE-puro(XhoI)のNotI部位とXhoI部位の間に挿入し，これをpE-IRES-GS-puroとした（図３−９）。【００９２】
発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型とし，プライマーmIRES-GS5'（配列番号３０）及びプライマーmIRES-GS3'（配列番号３１）を用いて，ＰＣＲにより，EMCVのIRESからＧＳにかけての領域を増幅し，EMCVのIRESの５’側から２番目に位置する開始コドン（atg）に変異を加えて破壊したDNA断片を増幅した。発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型として，このDNA断片と上記のプライマーIRES5'を用いて，ＰＣＲによりIRESからＧＳにかけての上記領域を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片を制限酵素（NotI及びPstI）で消化し，切り出されたDNA断片を，発現ベクターpE-IRES-GS-puroのNotI部位とPstI部位の間に挿入し，哺乳動物細胞用の発現ベクターpE-mIRES-GS-puroとした（図４）。【００９３】
〔実施例２〕ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターの構築
野生型ＨＳＡ（配列番号１）のＣ末端と２２ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させたものである融合蛋白質ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列を，配列番号３２に示す。このアミノ酸配列中，１〜５８５番目のアミノ酸残基が野生型の成熟ＨＳＡのアミノ酸配列（配列番号１）に相当し，５８６〜７７６番目のアミノ酸残基が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当する。ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨをコードする遺伝子（HSA-22KhGH遺伝子）を含む配列番号３３で示した塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において，塩基１１〜８２がＨＳＡのリーダーペプチドを，塩基８３〜１８３７が成熟型ＨＳＡを，そして塩基１８３８〜２４１０が成熟型ｈＧＨを，それぞれコードする。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，実施例１で作製したpE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターpE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)を構築した。【００９４】
〔実施例３〕ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターの構築
ＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）（配列番号３）のＣ末端と２２ＫｈＧＨのＮ末端とを融合させたものである，配列番号３４で示すアミノ酸配列を有する融合蛋白質を，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨとした。配列番号３４で示すアミノ酸配列中，１〜５８５番目のアミノ酸残基がｍＨＳＡのアミノ酸配列に相当し，５８６〜７７６番目のアミノ酸残基が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当する。実施例２で作製したpE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)を鋳型として，プライマーYA082（配列番号３５）及びプライマーYA083（配列番号３６）を用いて，ＰＣＲによりｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH)を構築した。【００９５】
〔実施例４〕２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ発現用ベクターの構築
２２ＫｈＧＨのＣ末端と野生型ＨＳＡ（配列番号１）のＮ末端とを融合させたものである，配列番号３７で示したアミノ酸配列を有する融合蛋白質を，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡとした。配列番号３７で示したアミノ酸配列中，１〜１９１番目のアミノ酸残基が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当し，１９２〜７７６番目のアミノ酸残基がＨＳＡのアミノ酸配列に相当する。２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡをコードする遺伝子（22KhGH-HSA遺伝子）を含む配列番号３８で示した塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において，塩基１１〜８８がｈＧＨのリーダーペプチドを，塩基８９〜６６１が成熟型ｈＧＨを，塩基６６２〜２４１６が成熟型ＨＳＡを，それぞれコードする。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，実施例１で作製したpE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を構築した。【００９６】
〔実施例５〕２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現用ベクターの構築
２２ＫｈＧＨのＣ末端とＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）（配列番号３）のＮ末端とを融合させたものである，配列番号３９に示したアミノ酸配列を有する融合蛋白質を，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡとした。実施例４で作製したpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を鋳型として，プライマーYA082（配列番号３５）及びプライマーYA083（配列番号３６）を用いて，ＰＣＲにより２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を構築した。【００９７】
〔実施例６〕融合蛋白質発現細胞の作製
ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡの各融合蛋白質を発現させるための細胞を次のようにして作製した。チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に，Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム（Bio Rad社）を用いて，実施例２〜５で作製した，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターpE-mIRES-GS-puro(HSA-22KhGH)，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用ベクターpE-mIRES-GS-puro(mHSA-22KhGH)，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ発現用ベクターpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現用ベクターpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)をそれぞれ導入した。それぞれの発現ベクターを導入した細胞を，メチオニンスルホキシミン（SIGMA社）及びピューロマイシン（SIGMA社）を含むCD OptiCHOＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を用いて選択培養し，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現細胞，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現細胞，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ発現細胞，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現細胞をそれぞれ確立した。選択培養の際には，メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて，最終的にメチオニンスルホキシミンの濃度を３００μＭ，ピューロマイシンの濃度を１０μｇ／ｍＬとして，より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。【００９８】
こうして得られたＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用細胞，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現用細胞,２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現用細胞を，ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質発現細胞と総称し，それらの細胞を培養することにより得られるＨＳＡとｈＧＨとの融合蛋白質を，ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質と総称する。【００９９】
〔実施例７〕融合蛋白質発現細胞の培養
ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現細胞，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ発現細胞，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ発現細胞，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ発現細胞の培養を，次のようにして行った。CD OptiCHOＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）に，メチオニンスルホキシミンとピューロマイシンとを，それぞれ３００μＭ及び１０μｇ／ｍＬの濃度となるように添加して，細胞培養用培地を調製した。実施例６で作製した各発現細胞を，それぞれ２×１０５ 個／ｍＬの細胞密度となるように５ｍＬの細胞培養用培地に添加し，５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。５日毎に，２×１０５ 個／ｍＬの細胞密度となるように，細胞を新しい培養用培地に移して，継代培養を行った。【０１００】
〔実施例８〕ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の精製
ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ，及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡの精製を次のようにして行った。実施例７で継代培養した各発現細胞を，それぞれ細胞培養用培地に全量が２４０ｍＬとなるように２×１０５個／ｍＬの密度で懸濁した。この細胞懸濁液を３０ｍＬずつ，径１５ｃｍのシャーレ８枚に加えて，５日間，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養した。培養終了後に培地を回収し，膜フィルター（孔径０．２２μｍ，Millipore社）でろ過して，培養上清とした。次いで，各培養上清に，１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を加えて，ｐＨを７．０〜７．２に調整した。【０１０１】
ポリプロピレン製のカラム（ポリプレップＴＭカラム，バイオラッド社）に，５ｍＬの抗ヒト成長ホルモン抗体を結合させた樹脂（Capture SelectＴＭ anti hGH resin，Thermo Fisher Scientific社）を充てんし，カラム体積の５倍容の５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂を平衡化させた。次いで，ｐＨを調整した上記の培養上清を，カラムに約２．５ｍＬ／分の流速で負荷し，ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質をそれぞれ樹脂に吸着させた。引き続き，同流速で，カラム体積の５倍容の５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の５倍容の１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）でＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質をそれぞれ樹脂から溶出させた。ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質を含む溶出画分を回収し，直ちに７％（ｖ／ｖ）の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した。溶出画分に含まれるＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度を，PierceＴＭ BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用い，ＢＳＡを標準物質として測定した。【０１０２】
〔実施例９〕ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞の作製
ヒトＧＨ受容体（ｈＧＨＲ）遺伝子をマウスＢａＦ３細胞に導入することによりＧＨ依存性増殖能を獲得させたＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を，以下の通りにして作製した。配列番号４０に示した塩基配列を有するｈＧＨＲ ＥＣＤ人工合成遺伝子（ｈＧＨＲの細胞外領域（Extra Cellular Domain）をコードするｈＧＨＲ遺伝子の５’側断片）を鋳型として，プライマーYA034（配列番号４１）及びプライマーYA035（配列番号４２）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供し，QIAEX II（QIAGEN社）を用いて精製した。このDNA断片をメガプライマーとした。ヒト肺由来cDNAを鋳型として，プライマーK708（配列番号４３）及びプライマーK709（配列番号４４）を用いてＰＣＲを行い，ｈＧＨＲ遺伝子の全長を含むDNA断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供し，QIAEX IIを用いて精製した。次いで，精製したｈＧＨＲ遺伝子の全長を含むDNA断片を鋳型として，上記メガプライマー及びプライマーK709（配列番号４４）を用いてＰＣＲを行い，５’側にｈＧＨＲ ＥＣＤ人工合成遺伝子配列を有するｈＧＨＲの全長をコードする遺伝子を含む，配列番号４５に示した塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片を制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，レトロウイルスベクターであるpMX-II（Ono Y., Oncogene. 19. 3050-8(2000)）のMluIとNotIの間に組み込み，これをｈＧＨＲ発現用レトロウイルスベクター（hGHR/pMX-II）とした。【０１０３】
１０ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に６×１０６個の２９３細胞（大日本製薬社）を懸濁させ，これを細胞培養用１０ｃｍディッシュに添加し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した。なお，ここで用いた２９３細胞は，アデノウイルスのＥ１遺伝子により形質転換されたヒト胎児腎細胞である。【０１０４】
５００μＬのOpti-MEMIＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）に，１５μＬのX-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent（Roche社）を加えて混合し，これに更に５μｇのレトロウイルスパッケージングベクターであるpCL-Eco（IMGENEX社）と，５μｇのhGHR/pMX-IIを加えて混合した。この混合液を，室温にて１５分間静置した後，上記の２９３細胞を２４時間培養させた１０ｃｍディッシュに添加した。次いで，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で２４時間培養した後，培地を３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収した。回収した上清をｈＧＨＲ発現レトロウイルス液とした。【０１０５】
ＷＥＨＩ−３細胞（理化学研究所）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した後，培地を３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収した。２ｍＬのｈＧＨＲ発現レトロウイルス液に，５００μＬのＷＥＨＩ−３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて混合した。この混合液を，２×１０６個のＩＬ−３依存性細胞株であるＢａＦ３細胞（理化学研究所）に添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を７５ｃｍ２培養フラスコに移し，細胞を５％ＣＯ２存在下，３７℃で８時間培養し，更に，５００μＬのＷＥＨＩ−３細胞の培養上清と２．５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１６時間培養した。培養終了後，細胞を遠心して回収し，ＰＢＳで３回洗浄した。回収した細胞に１００ｎｇ／ｍＬの２２ＫｈＧＨを含む１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍＬ添加して細胞を懸濁させ，次いで，この細胞懸濁液を培養フラスコに移し，５％ＣＯ２存在下，３７℃で培養し，ｈＧＨＲ遺伝子が発現することによりｈＧＨ依存的増殖能を獲得したＢａＦ３細胞を得た。この細胞をＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞とした。【０１０６】
〔実施例１０〕ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定
ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の細胞増殖活性を，実施例９に記載の方法で作製したＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いて評価した。【０１０７】
対数増殖期にあるＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後，１％ウマ血清を含む１５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０６個／ｍＬになるように希釈し，５％ＣＯ２存在下３７℃で１６時間培養した。培養後，細胞を３×１０５個／ｍＬになるよう同培地で希釈し，９６ウェル培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ播種した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて，実施例８で精製したＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ-２２ＫｈＧＨ，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ）を希釈し，それぞれ７段階の濃度（９０．３ｎＭ，１８．１ｎＭ，３．６ｎＭ，０．７２ｎＭ，０．１４ｎＭ，０．０２９ｎＭ，及び０．００５８ｎＭ）の希釈液を調整した。【０１０８】
こうして調製した検体希釈液を，ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を播種した９６ウェル培養プレートの各ウェルに２０μＬずつ添加し，プレートシェーカーを用いて混合した後，細胞を５％ＣＯ２存在下３７℃で２２時間培養した。培養後，生細胞数を測定する比色定量分析用試薬であるCellTiter 96ＴＭ Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay試液（プロメガ社）を２４μＬずつ各ウェルに加えて混和し，更に３時間培養した。次いで，プレートリーダーを用いて各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり，測定値をプロットした。４９０ｎｍにおける吸光度は，生細胞数の相対値を示すことから，測定値をプロットして得られた曲線は，検体の濃度と細胞の増殖量との相関を示すものであり，この曲線で求められる細胞の増殖量の最大値に対して，細胞の増殖量が５０％であるときの検体の濃度をＥＣ５０として求めた。なお，何れの検体についても測定は３回実施した。【０１０９】
〔実施例１１〕カニクイザルを用いた薬物動態及び薬効解析
実施例８で精製したＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ）を，それぞれ，４．０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与した。なお，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨの投与は３匹のカニクイザルを用いて行い，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡの投与については，それぞれ１匹のカニクイザルを用いて行った。【０１１０】
薬物動態解析用に，投与１５分後，１，４，８，１２，２４，４８，７２，１２０，１６８，及び２１６時間後に動物の末梢血を採取した。血液をＥＤＴＡ２カリウム入り採血管に採り，氷冷した後，遠心分離（１７００×ｇ，５分間，４℃）して血漿を分離した。調製した血漿中に含まれるＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度を実施例１２で詳述する方法により測定し，縦軸にＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度を，横軸に投与後の時間をプロットすることによりＣmax，ＡＵＣ0-216h，ＡＵＣ0-inf及びｔ1/2βを求めて薬物動態解析を行った。【０１１１】
また，ＩＧＦ−１分泌促進を指標とし，ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の薬効を次のようにして解析した。ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質投与前，投与６，１２時間後，１，２，３，４，５，６，７，８，及び９日後に末梢血を採血し，上記の手法により末梢血より血漿を調製した。血漿中に含まれるＩＧＦ−１の濃度を実施例１３で詳述する方法により測定し，縦軸にＩＧＦ−１の濃度を，横軸に投与後の時間をプロットすることにより薬効解析を行った。また，コントロールとして更に１匹のカニクイザルを準備して，これに０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２２ＫｈＧＨ（グロウジェクト（登録商標））を７日間連続して皮下投与し，血漿中のＩＧＦ−１の濃度を同様に測定した。【０１１２】
〔実施例１２〕血漿中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の定量
マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体及びマウス抗ｈＧＨ抗体を，当業者に周知の手法により，ＨＳＡ又はｈＧＨで免疫したマウスの脾細胞をそれぞれミエローマ細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞を培養して得た。マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ９）で透析した後，溶液中の抗体濃度をNanoDropＴＭ（Thermo Scientific社）を用いて測定した。次いで，５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解したEZ-LinkＴＭ NHS-LC-Biotin（Thermo Fisher Scientific社）を，１ｍｇの抗体当たり６０μｇのNHS-LC-Biotinの比率で抗体溶液に添加し，室温で２時間反応させた後，反応溶液をＰＢＳで透析しビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を得た。下記の定量法において，マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体を一次抗体，ビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体を二次抗体として使用した。【０１１３】
血漿中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度は，Sector Imager 6000（Meso Scale Diagnostics社）を用いて，電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ法により測定した。ＥＣＬイムノアッセイ法は，ルテニウム錯体であるSULFO-TAGでラベルした二次抗体にプレート上で電気化学的刺激を与え，SULFO-TAGの電解酸化・還元による波長６２０ｎｍの発光をＣＣＤカメラで検出することにより，検体を定量する方法である。
測定は，Sector Imager 6000の使用説明書に従って，概ね下記のとおり実施した。マウス抗ＨＳＡモノクローナル抗体をHigh Bind Plate（Meso Scale Diagnostics社）に添加し，１時間静置して抗ＨＳＡ抗体（一次抗体）をプレートに固定した。次いで，Superblock Blocking buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）をプレートに添加して１時間振盪し，プレートをブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ（0.05% Tween20を含有するＰＢＳ）で洗浄した後，検体を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，ビオチン化マウス抗ｈＧＨモノクローナル抗体（二次抗体）を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，SULFO-Tag-Streptavidin（Meso Scale Diagnostics社）を添加して１時間振盪した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後，Read buffer T（Meso Scale Diagnostics社）を添加し，Sector Imager 6000（Meso Scale Diagnostics社）で波長６２０ｎｍの発光を測定した。同様にして同一プレート上で既知濃度のＨＳＡ−ｈＧＨを定量して標準曲線を求め，これに検体の測定値を内挿し，血漿中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の濃度を求めた。【０１１４】
〔実施例１３〕血漿中のＩＧＦ−１の定量
血漿中に含まれるＩＧＦ−１の定量は，Human IGF-I Quantikine ELISA kit（R&D systems）を用いて，ELISA法により行った。【０１１５】
〔実施例１４〕結果と考察
（１）ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定
図５は，縦軸に４９０ｎｍにおける吸光度，横軸に各検体のモル濃度（ｎＭ）をとり測定値をプロットした，ＢａＦ３／ｈＧＨＲ細胞を用いた細胞増殖活性の測定結果を示す図である。この図から，各検体のＥＣ５０を求めた結果を表１に示す。【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
表１に見られる通り，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２２ＫｈＧＨとｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＥＣ５０は，それぞれ１．３８×１０−１ｎＭと１．５３×１０−１ｎＭであり，両者はほぼ同等の細胞増殖活性を有する。また，ヒト血清アルブミンのＮ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものである２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡと２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡについてみると，それらのＥＣ５０はそれぞれ８．７８×１０−１ｎＭと１．２０ｎＭであり，これらも互いにほぼ同等の細胞増殖活性を有することが示された。【０１１８】
他方，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨと２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡのＥＣ５０を比較すると，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡのＥＣ５０はＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＥＣ５０の約６．４倍を示し，また，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨと２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡのＥＣ５０を比較すると，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡのＥＣ５０はｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＥＣ５０の約７．８倍を示した。【０１１９】
これらの結果は，２２ＫｈＧＨとヒト血清アルブミンを連結させて融合蛋白質とする場合，少なくともin vitroでは，２２ＫｈＧＨをヒト血清アルブミンのＮ末端側に連結させるよりもＣ末端側に連結させる方が，２２ＫｈＧＨの有する細胞増殖活性のより高い融合蛋白質が得られることを示すものである。従って，上記結果はまた，２２ＫｈＧＨとヒト血清アルブミンを連結させて成長ホルモン分泌不全性低身長症等の治療剤とする場合，２２ＫｈＧＨをヒト血清アルブミンのＣ末端側に結合させる方が好ましいことを示唆するものである。【０１２０】
（２）カニクイザルを用いた薬物動態解析
図６は，縦軸にカニクイザル血清中のＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ及び２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ）の濃度，横軸にＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質を投与後の経過時間をプロットした，ＨＳＡ−ｈＧＨ融合蛋白質の薬物動態解析の結果を示す図である。この図から，各検体のＣmax，ＡＵＣ0-216h，ＡＵＣ0-inf及びt1/2βを求めた結果を表２に示す。【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
表２に見られるとおり，ＡＵＣは，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２２ＫｈＧＨとｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＡＵＣ0-infについては，それぞれ７５２±５５μｇ・時／ｍＬ，７３７μｇ・時／ｍＬの値を示している。これに対し，ヒト血清アルブミンのＮ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものである２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡと２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡのＡＵＣ0-infは，それぞれ２２２０μｇ・時／ｍＬと３２６０μｇ・時／ｍＬであり，このことは，ヒト血清アルブミンのＮ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものは，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものに比較して，血中で遥かに安定であることを明らかにしている。また，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２２ＫｈＧＨとｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ同士は同等のＡＵＣ0-inf値を示したが，ヒト血清アルブミンのＮ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものである２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡと２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡとの比較では，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡのＡＵＣ0-infが，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡに比して約１．４７倍の高値を示し，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡが血中で特に安定であることを示している。【０１２３】
これらの結果は，予想外にも，ヒト血清アルブミンのＣ末端にヒト成長ホルモンのＮ末端を連結させた場合と，逆にヒト成長ホルモンのＣ末端にヒト血清アルブミンのＮ末端を連結させた場合とで，それらの融合蛋白質の血中安定性が各段に相違し，後者の場合において遥かに高い安定性が達成できることを示している。加えてこれらの結果は，ヒト成長ホルモンのＣ末端側にＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端側を連結した場合にヒト成長ホルモンの血中安定性が特に顕著に高まること，即ちＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）が，そのＮ末端側に連結させた蛋白質の血中安定性を顕著に高める能力を有することも示している。即ち，総合すると，これらの結果は，医薬品としてヒトその他の動物に投与されるべき成長ホルモン等の種々の蛋白質を投与後の血中において安定化する手段として，それらの蛋白質とＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）を連結させることが有効であり，特にそれらの蛋白質のＣ末端をＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端と，例えばペプチド結合により，連結させることが有効であることを示すものである。【０１２４】
（３）カニクイザルを用いた薬効解析
図７は，ＨＳＡ融合２２ＫｈＧＨの薬物動態解析の結果を示す図であり，縦軸は血漿中のＩＧＦ−１の濃度を，横軸はＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ融合蛋白質を投与後の経過時間を表す。ＩＧＦ−１は成長ホルモンによって分泌が誘導される骨成長促進作用等の活性を有するポリペプチドであり，ｈＧＨの生理活性の一部はＩＧＦ−１を介して発揮されることが知られている。【０１２５】
図７に見られるように，ヒト血清アルブミンのＣ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ又はｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを投与した動物において，血漿中ＩＧＦ−１濃度は，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ投与動物では投与後３日目に投与前の約１．５倍と最大値を示し，ＨＳＡ−ｍ２２ＫｈＧＨ投与動物では投与後２日目に投与前の約２倍と最大値を示している。しかし，何れにおいてもその後は血漿中ＩＧＦ−１濃度は低下し，投与後５日目以降は，対照である２２ＫｈＧＨとほぼ同等の値となっている。なお，図７で２２ＫｈＧＨの投与後に血漿中ＩＧＦ−１濃度の顕著な上昇が認められないのは，２２ＫｈＧＨの血中半減期が約２０分と短く，血液を採取した時点においてＩＧＦ−１濃度がほぼ投与前の値にまで戻ったためと考えられる。また，２２ＫｈＧＨ投与動物の血漿中ＩＧＦ−１の濃度は，２日目から上昇し，その後測定最終日である９日目までの間，投与前の値よりも高い値を示しているが，これは，２２ＫｈＧＨのみ７日間連続投与を行ったことにより，２２ＫｈＧＨの効果が蓄積して表れたためと考えられる。【０１２６】
他方，ヒト血清アルブミンのＮ末端側に２２ＫｈＧＨを連結させたものであるＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ又はｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを投与した動物の血漿中ＩＧＦ−１の濃度は，２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ投与動物では投与後７日目に投与前の約２．０倍と最大値を示し，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ投与動物でも投与後７日目に投与前の約２．０倍と最大値を示している。また，何れも，対照である２２ＫｈＧＨと比較して，投与後９日目においても血漿中のＩＧＦ−１の濃度は高値に維持されている。更に，ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨとｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨを比較すると，投与後３日目まではＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＩＧＦ−１濃度がより高い傾向にあったものの，投与後５日目以降はｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨのＩＧＦ−１濃度の方が一貫して高く，ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨがＨＳＡ−２２ＫｈＧＨと比較して，より長期に渡り血中のＩＧＦ−１濃度を高値に持続できることが示されている。【０１２７】
これらの結果は，成長ホルモンをＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端側に連結させることにより，成長ホルモンの薬効を顕著に長期化できることを示すものであり，従って，既存の成長ホルモン製剤（グロウジェクト（登録商標）等）よりも薬効が長時間にわたって続く持続型の成長ホルモンとして，成長ホルモンのＣ末端側をＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端側に連結させたものである２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡを好適に使用し得ることを示す。更には，これらの結果は，医薬品等として動物に投与されるべき生理活性蛋白質をＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端側に連結させることにより，それらの生理活性蛋白質の活性を血漿中において顕著に持続できることを示すと共に，薬効が長時間にわたって続く持続型の医薬品を製造する手段として，生理活性蛋白質をＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）と連結させることが有効であり，特に生理活性蛋白質のＣ末端をＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端とペプチド結合させることが有効であることを示すものである。【０１２８】
２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ投与動物では，投与後９日目においても血漿中ＩＧＦ−１濃度が非常に高値に維持されていることから，２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡを成長ホルモン不全性低身長症，成人成長ホルモン不全症等の患者に投与する場合，投与間隔を７日〜１４日としても，その薬効が十分に発揮されるであろうと合理的に予測される。表３に２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡを成長ホルモン不全性低身長症，成人成長ホルモン不全症等の患者に投与するときの用法・用量を例示する。表３に示した投与量，投与間隔は，臨床症状及びＩＧＦ−１濃度等の検査所見に応じて適宜増減されるべきものである。また，好ましくは２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡは，筋肉内注射又は皮下注射の形で患者に投与される。【０１２９】
【表３】
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【０１３０】
〔製剤実施例１〕水性注射剤
リン酸水素二ナトリウム七水和物・・・・１．３３ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム・・・・・・・・１．５７ｍｇ
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシ
プロピレン（３０）グリコール・・・・・３ｍｇ
ベンジルアルコール・・・・・・・・・１３．５ｍｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・・・５２．５ｍｇ
２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ・・・・・・・・１ｍｇ
上記成分比率で各成分を注射用水に溶解させ，ｐＨを６．０〜６．４に調整し，液量を１．５ｍＬとして水性注射剤とする。【０１３１】
〔製剤実施例２〕水性注射剤
Ｌ−ヒスチジン・・・・・・・・・・・・１ｍｇ
フェノール・・・・・・・・・・・・・・４．５ｍｇ
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシ
プロピレン（３０）グリコール・・・・・４．５ｍｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・・・６０ｍｇ
２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ・・・・・・・・１ｍｇ
上記成分比率で各成分を注射用水に溶解させて，ｐＨを６．０〜６．４に調整し，液量を１．５ｍＬとして水性注射剤とする。【０１３２】
〔製剤実施例３〕凍結乾燥剤
リン酸水素二ナトリウム七水和物・・・・２．４７５ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム・・・・・・・・０．３９４ｍｇ
塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・１．１２５ｍｇ
アミノ酢酸・・・・・・・・・・・・・１１．２５ｍｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・・・２２．５ｍｇ
２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ・・・・・・・・１ｍｇ
上記成分からなる凍結乾燥剤を，使用時に９．７ｍｇのベンジルアルコールを含有する１ｍＬの注射用水に溶解する。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明によれば，医薬品として動物に投与されるべき所望の蛋白質の血中安定性を高めることができるので，医薬品として投与したときの当該所望の蛋白質の投与量を減ずることのできる，新たな医薬品を提供することができる。
【符号の説明】
【０１３４】
１    LacZプロモーター
２    ｍPGKプロモーター
３    配列番号７に示す塩基配列を含む野生型マウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の部分配列
３ａ  配列番号８に示す塩基配列を含む変異型マウス脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位の部分配列
４    ｍＰＧＫのポリアデニル化領域（ｍＰＧＫｐＡ）
５    ＥＦ−１ｐ及び第一イントロンを含む塩基配列
６    ＳＶ４０後期ポリアデニル化領域
７    ＳＶ４０初期プロモーターを含む領域
８    合成ポリアデニル化領域
９    サイトメガロウイルスプロモーターを含む領域
１０  グルタミン合成酵素遺伝子
【配列表フリーテキスト】
【０１３５】
配列番号３：ヒト血清アルブミン変異体（Ａ３２０Ｔ）
配列番号４：リンカー例
配列番号５：リンカー例
配列番号６：リンカー例
配列番号８：変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分配列，合成
配列番号１１：２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ，成熟型
配列番号１２：２０ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ，成熟型
配列番号１３：プライマーHyg-Sfi5'，合成
配列番号１４：プライマーHyg-BstX3'，合成
配列番号１５：IRES-Hygr-mPGKpA，合成
配列番号１６：ハイグロマイシン耐性遺伝子に対応するアミノ酸配列
配列番号１７：プライマーIRES5'，合成
配列番号１８：プライマーIRES3'，合成
配列番号１９：プライマーmPGKP5'，合成
配列番号２０：プライマーmPGKP3'，合成
配列番号２１：mPGKp，合成
配列番号２２：プライマーGS5'，合成
配列番号２３：プライマーGS3'，合成
配列番号２４：プライマーpuro5'，合成
配列番号２５：プライマーpuro3'，合成
配列番号２６：ピューロマイシン耐性遺伝子を含む配列
配列番号２７：ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するアミノ酸配列
配列番号２８：プライマーSV40polyA5'，合成
配列番号２９：プライマーSV40polyA3'，合成
配列番号３０：プライマーmIRES-GS5'，合成
配列番号３１：プライマーmIRES-GS3'，合成
配列番号３２：ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，成熟型
配列番号３３：ＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ遺伝子を含む配列，合成
配列番号３４：ｍＨＳＡ−２２ＫｈＧＨ，成熟型
配列番号３５：プライマーYA082，合成配列
配列番号３６：プライマーYA083，合成配列
配列番号３７：２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ，成熟型
配列番号３８：２２ＫｈＧＨ−ＨＳＡ遺伝子を含む配列，合成
配列番号３９：２２ＫｈＧＨ−ｍＨＳＡ
配列番号４０：ｈＧＨＲ ＥＣＤをコードする人工合成遺伝子の配列
配列番号４１：プライマーYA034，合成
配列番号４２：プライマーYA035，合成
配列番号４３：プライマーK708，合成
配列番号４４：プライマーK709，合成
配列番号４５：ｈＧＨＲをコードする人工合成遺伝子の塩基配列，合成
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017043569.tif 000021
2017043569.tif 000022
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