(57)【要約】  本発明の目的は、水を溶媒とした安定した分散液で投与できるα―ガラクトシルセラミド関連化合物のナノ粒子分散液を提供することである。  リン脂質等を用いてリポソームとして分散液にすることなく、ナノ粒子分散液を得ることができ、ナノ粒子のサイズも制御できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子。
【請求項２】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液。
【請求項３】
水分散液が疎水コロイド水分散液である請求項２の水分散液。
【請求項４】
水分散液が保護コロイド水分散液である請求項３の水分散液。
【請求項５】
スフィンゴ糖脂質が、式（１）で表される化合物およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の水分散液。
【化１】
2017099079.tif 000010
［式中、Ｒ1は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に炭素数１０〜２８の置換又は非置換の炭化水素基を示し、Ｙは−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）−又は−ＣＨ＝ＣＨ−を示し、Ａは、Ｏ又はＣを示す。］
【請求項６】
Ｒ1がヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ2が炭素数２４〜２８の置換又は非置換の炭化水素基であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の置換又は非置換の炭化水素基である請求項５に記載の水分散液。
【請求項７】
Ｒ2が炭素数２４〜２８の非置換の炭化水素基であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の非置換の炭化水素基であり、Ｙが−ＣＨ（ＯＨ）−である請求項６に記載の水分散液。
【請求項８】
スフィンゴ糖脂質が、ＫＲＮ７０００、ＲＣＡＩ−５６およびＲＣＡＩ−６１からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の水分散液。
【請求項９】
保護コロイドが、多糖類による親水コロイドとスフィンゴ糖脂質の疎水コロイドで形成される請求項４に記載の水分散液。
【請求項１０】
多糖類が、イヌリン、プルランおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される少なくとも１種である、請求項９に記載の水分散液。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載の水分散液を有効成分として含む、医薬。
【請求項１２】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法であって、スフィンゴ糖脂質を水と自由に混和できる有機溶媒に溶解し、その溶液と水とを混和することにより、ナノ粒子水分散液を製造する方法。
【請求項１３】
有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、ＤＭＳＯ、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、tert-ブチルアルコール、およびジメチルホルムアミドから選択される１つまたは２つ以上の有機溶媒の混和物である、請求項１２に記載のスフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法。
【請求項１４】
有機溶媒および水を５０℃以上で用いる請求項１２または請求項１３に記載のスフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ糖脂質のナノ粒子分散水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、様々な種類のスフィンゴ糖脂質の存在が知られている。生体内のスフィンゴ糖脂質は一般的に様々な糖がセラミドとβ-結合しており、器官によってその存在量は異なるが、様々な器官の細胞膜中に存在している。【０００３】
一方、糖がセラミドにα-結合しているスフィンゴ糖脂質が、強力な免疫賦活作用及び抗腫瘍活性を有することが近年報告された。アゲラスフィン類に代表されるα-ガラクトシルセラミドは、海綿の一種であるAgelas mauritianusの抽出液より単離された糖脂質であり、NKT細胞を強く活性化することが知られている（非特許文献１）。【０００４】
α-ガラクトシルセラミドは、樹状細胞（DC）などに代表される抗原提示細胞（APC）に取り込まれた後、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスＩ分子に類似したCD1dタンパク質によって細胞膜上に提示される。NKT細胞は、こうして提示されたCD1dタンパク質とα-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）との複合体を、TCRを用いて認識することにより活性化され、様々な免疫反応が開始される。【０００５】
α-ガラクトシルセラミドは、スフィンゴシン塩基が長鎖脂肪酸によりアシル化されて形成されたセラミドに、ガラクトースがα-配置で結合したスフィンゴ糖脂質であるが、これまでに様々な下記のような関連化合物が合成され、その構造と活性との相関関係が調査されている。
【化１】
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［式中、Ｒ1は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に炭素数１０〜２８の置換又は非置換の炭化水素基を示し、Ｙは−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−又は−ＣＨ＝ＣＨ−を示し、Ａは、Ｏ又はＣを示す。］【０００６】
近年、このようなNKT細胞の機能に着目し、α-GalCerを有効成分として含有する治療薬が提案・開発されている。しかしながら、α-GalCerの投与によって活性化されたNKT細胞は、癌治療のために有用な、免疫賦活活性を誘導するサイトカインであるIFN-γ及びNKT細胞によるIFN-γ産生を増強する作用があり、樹状細胞が産生するサイトカインであるIL-12を産生するとともに、免疫抑制作用を誘導するサイトカインであるIL-4や免疫調節作用を誘導するサイトカインであるIL-10も同時に産生してしまう。その結果、免疫賦活活性の働きが抑制されてしまい、癌治療に対する効果が十分に得難くなるという問題がある。【０００７】
スフィンゴ糖脂質は水にはほとんど溶解せずに、DMSO溶液や界面活性剤を使用して溶解するかリン脂質等を用いてリポソーム(特許文献２)として用いられていた。しかしながら、DMSO溶液は、投与後にスフィンゴ糖脂質がどのような状態で存在するのかどうか不明であり、DMSOや界面活性剤はその毒性から投与量が制限される。また、リポソームはその安定性に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／１２０５７４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science 1997, 278, 1626-1629
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況に鑑み本発明はなされたものであり、その解決をしようとする課題は、水を溶媒とした安定した分散液で投与できるα―ガラクトシルセラミド関連化合物のナノ粒子分散液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、リン脂質等を用いてリポソームとして分散液にすることなく、ナノ粒子分散液を得ることができ、ナノ粒子のサイズも制御できることが分かった。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）スフィンゴ糖脂質のナノ粒子。
（２）スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液。
（３）水分散液が疎水コロイド水分散液である（２）の水分散液。
（４）水分散液が保護コロイド水分散液である（３）の水分散液。
（５）スフィンゴ糖脂質が、式（１）で表される化合物およびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、（２）〜（４）のいずれか一項に記載の水分散液。
【化２】
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［式中、Ｒ1は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に炭素数１０〜２８の置換又は非置換の炭化水素基を示し、Ｙは−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−又は−ＣＨ＝ＣＨ−を示し、Ａは、Ｏ又はＣを示す。］
（６）Ｒ1がヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ2が炭素数２４〜２８の置換又は非置換の炭化水素基であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の置換又は非置換の炭化水素基である（５）に記載の水分散液。
（７）Ｒ2が炭素数２４〜２８の非置換の炭化水素基であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の非置換の炭化水素基であり、Ｙが−ＣＨ（ＯＨ）−である（６）に記載の水分散液。
（８）スフィンゴ糖脂質が、ＫＲＮ７０００、ＲＣＡＩ−５６およびＲＣＡＩ−６１からなる群から選択される少なくとも１種である、（２）〜（７）のいずれか一項に記載の水分散液。
（９）保護コロイドが、多糖類による親水コロイドとスフィンゴ糖脂質の疎水コロイドで形成される（４）に記載の水分散液。
（１０）多糖類が、イヌリン、プルランおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される少なくとも１種である、（９）に記載の水分散液。
（１１）（２）〜（１０）のいずれか一項に記載の水分散液を有効成分として含む、医薬。
（１２）スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法であって、スフィンゴ糖脂質を水と自由に混和できる有機溶媒に溶解し、その溶液と水とを混和することにより、ナノ粒子水分散液を製造する方法。
（１３）有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、ＤＭＳＯ、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、tert-ブチルアルコール、およびジメチルホルムアミドから選択される１つまたは２つ以上の有機溶媒の混和物である、（１２）に記載のスフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法。
（１４）有機溶媒および水を５０℃以上で用いる（１２）または（１３）に記載のスフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を製造する方法。
【発明の効果】
【００１３】
スフィンゴ糖脂質は、免疫賦活と免疫抑制のコントロールが難しく、市販された医薬品は現在のところ存在しない。本発明のスフィンゴ糖脂質水分散液は、樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれNKT細胞に提示されるが、その投与経路やスフィンゴ糖脂質の状態（サイズや分散形態）により、どの種類の抗原提示細胞への取り込みを優先させるのかをコントロールできるため、免疫賦活と免疫抑制を様々にコントロールでき、多くの免疫関連疾患の治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例５において、マウスに、イヌリンを使用したスフィンゴ糖脂質疎水コロイド溶液（iGal）、α-GalCer（KRN7000）またはα-GalCerリポソーム（RGI-2001）を尾静脈内に投与し、血清中のIL-2濃度を測定した結果を示す図である。
【図２】実施例５において、マウスに、iGal、KRN7000またはRGI-2001を尾静脈内に投与し、血清中のIL-4濃度を測定した結果を示す図である。
【図３】実施例５において、マウスに、iGal、KRN7000またはRGI-2001を尾静脈内に投与し、血清中のIL-10濃度を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例５において、マウスに、iGal、KRN7000またはRGI-2001を尾静脈内に投与し、血清中のIFN-γ濃度を測定した結果を示す図である。
【図５】実施例５において、マウスに、iGal、KRN7000またはRGI-2001を尾静脈内に投与し、血清中のTNF-α濃度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１６】
本発明で用いるスフィンゴ糖脂質とは、α−ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００：(2S, 3S, 4R)-1-O-(α-D-galactosyl)-N-hexacosanoyl-2-amino-1, 3, 4-octadecanetriol：下記構造式の化合物）の誘導体や類縁体である。
【化３】
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【００１７】
本発明で用いるスフィンゴ糖脂質として、好ましくは、下記式（１）で表される化合物又はその塩が挙げられる。
【化４】
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［式中、Ｒ1は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に炭素数１０〜２８の置換又は非置換の炭化水素基（当該炭化水素基は直鎖状又は分岐状、好ましくは直鎖状）を示し、Ｙは−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−又は−ＣＨ＝ＣＨ−を示し、Ａは、Ｏ又はＣを示す。］
【００１８】
本発明で用いるスフィンゴ糖脂質として、更に好ましくは、Ｒ1がヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ2が炭素数２４〜２８の置換又は非置換の炭化水素基（当該炭化水素基は直鎖状又は分岐状、好ましくは直鎖状）であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の置換又は非置換の炭化水素基である前記化合物である。
【００１９】
本発明で用いるスフィンゴ糖脂質として、より好ましくは、Ｒ２が炭素数２４〜２８の非置換の炭化水素基であり、Ｒ3が炭素数１１〜１５の非置換の炭化水素基（当該炭化水素基は直鎖状又は分岐状、好ましくは直鎖状）であり、Ｙは−ＣＨ（ＯＨ）−である前記化合物である。
【００２０】
前記（１）で表される化合物の塩については、薬学的に許容されることを限度として、その種類については、特に制限されない。
【００２１】
本発明で用いるスフィンゴ糖脂質として、最も好ましくは、α−ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）、ＲＣＡＩ−５６、ＲＣＡＩ−６１である。
【００２２】
ＲＣＡＩ−５６、ＲＣＡＩ−６１の構造式はそれぞれ以下のとおりである。
【化５】
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【化６】
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【００２３】
本発明において、スフィンゴ糖脂質は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
スフィンゴ糖脂質ナノ粒子の安定化を促進する物質を使用する場合、スフィンゴ糖脂質と安定化を促進する物質との比率については、特に制限されないが、例えば、スフィンゴ脂質１重量部当たり、安定化を促進する物質が０．５〜１０００重量部、好ましくは０．５〜８５０重量部、更に好ましくは０．５〜５００重量部が挙げられる。
【００２５】
スフィンゴ糖脂質ナノ粒子は、スフィンゴ糖脂質単独または安定化を促進する物質との複合体からなる。ナノ粒子サイズは、水に対して均質に分散できるサイズであれば特に限定はなく、好ましくは１０００ナノメートル以下、さらに好ましくは５００ナノメートル最も好ましくは３００ナノメートル以下である。ナノ粒子のサイズは、動的光散乱法によって測定される。
【００２６】
スフィンゴ糖脂質ナノ粒子の安定化を促進する物質は、スフィンゴ糖脂質ナノ粒子とともに保護コロイドを形成する物質であればどのような物質でもよく、例えば、多糖類が好ましい。特に好ましいのは、イヌリン、プルランおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースである。これらの多糖類は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液において、スフィンゴ糖脂質の含有量については、特に制限されず、当該水分散液の用途等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．０００１〜５ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．００１〜５ｍｇ/ｍｌ、更に好ましくは０．０１〜５ｍｇ/ｍｌが挙げられる。
【００２８】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液は、スフィンゴ糖脂質を水と自由に混和できる有機溶媒に溶解し、その溶液と水とを混和することにより、製造することができる。
【００２９】
水と自由に混和できる有機溶媒には、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、tert-ブチルアルコール、アセトン、DMSO、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。好ましくはエタノールが挙げられる。これらの有機溶媒は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
有機溶媒に溶解させる際の有機溶媒中のスフィンゴ糖脂質の濃度については、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１５ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．０５〜１５ｍｇ/ｍｌ、更に好ましくは０．２５〜１５ｍｇ/ｍｌが挙げられる。
【００３１】
この時、混和する水が純水等である場合は、スフィンゴ糖脂質の疎水コロイド水分散液が形成される。水に親水性コロイドを形成するような多糖類が含まれる場合は、スフィンゴ糖脂質の疎水コロイドと一緒になり保護コロイドが形成されるため、α―ガラクトシルセラミド関連化合物のナノ粒子として安定に存在することができる。
【００３２】
スフィンゴ糖脂質が、水と混和する有機溶媒に難溶の時は加温することにより溶解して用いることができる。エタノールを溶媒として用いるときは、５０℃以上が好ましい。
【００３３】
スフィンゴ糖脂質を溶解させた有機溶媒と水との混合比については、スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液におけるスフィンゴ糖脂質濃度、有機溶媒に溶解しているスフィンゴ糖脂質濃度等を勘案して適宜設定すればよいが、例えば、スフィンゴ糖脂質を溶解させた有機溶媒１重量部当たり、水が３〜５００重量部、好ましくは３〜２５０重量部、更に好ましくは３〜１００重量部となる比率が挙げられる。
【００３４】
ナノ粒子のサイズは、溶解する有機溶媒、混和する温度、溶液の濃度等を調節することにより変更できる。また、フィルター等を用いることによりそのサイズを揃えることができる。
【００３５】
このようにして得られたスフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液は、医薬の有効成分として用いることができる。その投与経路やスフィンゴ糖脂質の状態（サイズや分散形態）により、どの種類の抗原提示細胞への取り込みを優先させるのかをコントロールできるため、免疫賦活と免疫抑制を様々にコントロールできるため、多くの免疫関連疾患の治療に用いることができる。
【００３６】
例えば免疫抑制用途に用いるときは、調節性細胞であるNKTやIL-10産生Ｔr1細胞を誘導し、ヘルパーＴ細胞の活性化を抑制する活性を有し、且つB細胞から放出されるIgE抗体の産生抑制作用を有するため、本発明の医薬はIgE抗体に起因するアレルギー性疾患の予防剤ないし治療剤として有効である。IgE抗体は特にアレルギー性疾患との関連が深く、これらの産生（分泌）を抑制することにより、Ｉ型アレルギー性疾患の予防ないし治療効果を得ることができる。IgE抗体と関連するアレルギー性疾患としては、アトピー型気管支喘息、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性鼻炎や花粉症等のアレルギー性鼻炎が挙げられる。なお、本発明において、アレルギー性疾患の予防とは、アレルギー性疾患を患っていないヒトを含む哺乳動物が該疾患にかからないようにすることのみならず、症状が一時的に出ていないアレルギー性疾患患者（ヒトを含む哺乳動物）において症状がでないようにすることも含む。
【００３７】
また、スフィンゴ糖脂質はＴ細胞の活性化を抑制する作用を有しているため、本発明の医薬は劇症肝炎などの疾患の予防剤または治療剤としても有効である。
【００３８】
また、NKT細胞の免疫抑制機能を選択的に増強する効果を有しているため、スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液を有効成分として含有する医薬は、免疫抑制能を有する医薬としても有効である。具体的には、リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、膠原病などの自己免疫疾患のための医薬や、移植の際の拒絶反応などのGVHDのための医薬としても有効である。
【００３９】
免疫賦活作用を選択的に示す場合は、APCの持つCD1dタンパク質と複合体を形成し、NKT細胞に提示される。NKT細胞は、この複合体をTCRを介して認識し、それ自身の有する免疫調節能のうち、免疫細胞の働きを活性化するサイトカインの一種であるIFN-γを選択的かつ大量に産生する一方で、IL-4の産生を抑制することが可能である。また、スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液は、NKT細胞によるIFN-γ産生を増強する作用があるIL-12の産生を誘導する。したがって、本発明の化合物（１）又はその塩は、腫瘍増殖の阻害のための抗癌剤、免疫賦活剤、更には細胞増殖障害やTh1／Th2免疫バランスの是正のための治療に有用である。
【００４０】
癌治療の対象としては、例えば、食道、胃、肝臓、膵臓、乳房、結腸、腎臓、肺（小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む）、胆嚢、卵巣、精巣、膀胱、頸部、甲状腺、前立腺及び皮膚(扁平上皮細胞癌を含む)の腫瘍；リンパ系統の造血腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む）；骨髄系統の造血腫瘍（急性及び慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及び前骨髄急性白血病を含む）；間葉起源の腫瘍(線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む)；中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍（星状膠細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む）；他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ（keratoacanthoma）、甲状腺濾胞癌、カポージ肉腫を含む)が例示され、これらに限定されない。
【００４１】
また、細胞増殖障害とは、家族性腺腫性ポリポーシス、乾癬、良性前立腺過形成、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化症に関連する血管平滑細胞増殖、肺繊維症、関節炎、糸球体腎炎、術後の狭窄、再狭窄を含む概念である。
【００４２】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液の投与対象は、ヒト等の哺乳動物等が挙げられる。
【００４３】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液をヒトに投与する場合、それ自体又はそれを薬理学的に許容される担体等と混合し、経口投与剤、非経口投与剤の医薬組成物として経口的又は非経口的に安全に投与することができる。
【００４４】
スフィンゴ糖脂質のナノ粒子水分散液の投与量は、年齢、体重、症状、剤形、投与方法、投与期間などにより異なるが、例えば、患者（成人、体重約６０ｋｇ）一人あたり、通常、１日０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．８〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり、これを１回から数回に分けて経口又は非経口投与することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４６】
実施例１．イヌリンを用いたスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の調製
KRN7000（RCAI-56、またはRCAI-61も同様）を試験管に秤量し99.5%エタノールを加え4 mg/mLの濃度に調製した後、76℃に加温して完全に溶解し、これをスフィンゴ糖脂質溶液とした。他方、イヌリンを試験管に秤量し滅菌蒸留水を加え35 mg/mLの濃度に調製後、完全に溶解し、これをイヌリン溶液とした。スフィンゴ糖脂質溶液 50 μLを新たに準備した試験管に移し、ここにイヌリン溶液 950 μLを加え速やかにボルテックスで混合し、室温にて一晩静置した後、等量の純水を加え２分の一の濃度に希釈した。得られた分散溶液を動的光散乱法（ゼータサイザーナノ ZS、Malvern）で平均粒子径と粒子分布を測定した。測定の結果、保護コロイドを使用しない場合は多分散粒子より成る平均粒子径の大きな凝集コロイドになるのに対し、イヌリンを用いた場合には単分散且つ平均粒子径の小さな保護コロイド溶液になることが明らかとなった（表１）。本法によるスフィンゴ糖脂質親水保護コロイド溶液の最終内容物および濃度は、スフィンゴ糖脂質 0.1 mg/mL、イヌリン 17.5 mg/mL、エタノール2.5%である。【００４７】
実施例２．プルランを用いたスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の調製
KRN7000（RCAI-56、またはRCAI-61も同様）を試験管に秤量し99.5%エタノールを加え4 mg/mLの濃度に調製した後、76℃に加温して完全に溶解し、これをスフィンゴ糖脂質溶液とした。他方、プルランを試験管に秤量し滅菌蒸留水を加え10 mg/mLの濃度に調製後、完全に溶解し、これをプルラン溶液とした。スフィンゴ糖脂質溶液 50 μLを新たに準備した試験管に移し、ここにプルラン溶液 950 μLを加え速やかにボルテックスで混合し、室温にて一晩静置した後、等量の純水を加え２分の一の濃度に希釈した。得られた分散溶液を動的光散乱法（ゼータサイザーナノ ZS、Malvern）で平均粒子径と粒子分布を測定した。測定の結果、保護コロイドを使用しない場合は多分散粒子より成る平均粒子径の大きな凝集コロイドになるのに対し、プルランを用いた場合には単分散且つ平均粒子径の小さな保護コロイド溶液になることが明らかとなった（表１）。本法によるスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の最終内容物および濃度は、スフィンゴ糖脂質0.1 mg/mL、プルラン 5.0 mg/mL、エタノール2.5%である。【００４８】
実施例３．ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）を用いたスフィンゴ糖脂質親水コロイド溶液の調製
KRN7000（RCAI-56、またはRCAI-61も同様）を試験管に秤量し99.5%エタノールを加え4 mg/mLの濃度に調製した後、76℃に加温して完全に溶解し、これをスフィンゴ糖脂質溶液とした。他方、HPMCを試験管に秤量し滅菌蒸留水を加え1 mg/mLの濃度に調製後、完全に溶解し、これをHPMC溶液とした。スフィンゴ糖脂質溶液 50 μLを新たに準備した試験管に移し、ここにHPMC溶液 950 μLを加え速やかにボルテックスで混合し、室温にて一晩静置した後、等量の純水を加え２分の一の濃度に希釈した。得られた分散溶液を動的光散乱法（ゼータサイザーナノ ZS、Malvern）で平均粒子径と粒子分布を測定した。測定の結果、保護コロイドを使用しない場合は多分散粒子より成る平均粒子径の大きな凝集コロイドになるのに対し、HPMCを用いた場合には単分散且つ平均粒子径の小さな保護コロイド溶液になることが明らかとなった（表１）。本法によるスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の最終内容物および濃度は、スフィンゴ糖脂質 0.1 mg/mL、HPMC 0.5 mg/mL、エタノール2.5%である。【００４９】
【表１】
2017099079.tif 000009
【００５０】
実施例４．スフィンゴ糖脂質を溶解する有機溶媒の検討
有機溶媒にDMSOを用いスフィンゴ糖脂質の疎水コロイド溶液調製を検討した。KRN7000を試験管に秤量しDMSOを加え2 mg/mLの濃度に調製し、85℃に加温して完全に溶解し、これをスフィンゴ糖脂質溶液とした。他方、イヌリンを試験管に秤量し滅菌蒸留水を加え35 mg/mLに調製した後完全に溶解し、これをイヌリン溶液とした。スフィンゴ糖脂質溶液 200 μLを新たに準備した試験管に移し、ここにイヌリン溶液 800 μLを加えボルテックスで速やかに混合し、室温にて一晩静置した。得られた分散溶液を動的光散乱法（ゼータサイザーナノ ZS、Malvern）で平均粒子径と粒子分布を測定した。測定の結果、保護コロイドを使用しない場合は多分散粒子より成る平均粒子径の大きな凝集コロイドになるのに対し、イヌリンを用いた場合には単分散且つ平均粒子径345.5 nmの小さな保護コロイド溶液になることが明らかとなった。本法によるスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の最終内容物および濃度は、スフィンゴ糖脂質 0.4 mg/mL、イヌリン 28 mg/mL、DMSO 20%である。【００５１】
実施例５．イヌリンを用いたスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液の生物活性試験
実施例１で調製したスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液（スフィンゴ脂質としてKRN7000を使用）（以下、iGal）について生物活性試験を行った。対照物質としてα-GalCer（KRN7000）溶液とα-GalCer（KRN7000）リポソーム（以下、RGI-2001）を用いた。【００５２】
α-GalCer（KRN7000）溶液の調製は、まずα-GalCer（KRN7000）について1mg/mLの濃度のジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製し、次にこのDMSO溶液を0.5%のTween20（Bio-Rad社製）を含有するリン酸緩衝液（和光純薬工業株式会社製）を用いて５倍に希釈しストック溶液とした。ＲＧＩ−２００１の調製は、Ishii et al Front Sci (2008)の方法で調製した。本試験では、いずれも１匹のマウスにつき100μLを尾静脈内に投与した際、α-GalCerの投与量が50μg/kg体重になるように、各サンプルを注射用蒸留水またはリン酸緩衝液を用いて希釈した。【００５３】
1群3匹のC57BL/6J雌マウス（7週齢）に、調製したiGalの溶液100μLを、尾静脈内に７日間隔で合計4回注射した（1回1匹あたり約1μgのα-GalCerを投与）。対照物質として、α-GalCer（KRN7000）とRGI-2001を用い、同様の方法によりα-GalCerの投与量が50μg/kg体重となるように調製したα-GalCer（KRN7000）とRGI-2001の溶液100μLを尾静脈内に注射した。iGalおよび対照物質の投与直前、各投与後２および２４時間経過後の血液を、眼下静脈叢より80μL採取し血清を調製し、血清中の各サイトカイン濃度を、サイトカイン多項目同時測定法（Luminex）にて測定した。また、コントロールとして、各サンプルの代わりにリン酸緩衝液（vehicle）を使用して、同様に試験を行った。【００５４】
投与直前、１回目投与後２および２４時間経過後、２回目投与後２および２４時間経過後、３回目投与後２および２４時間経過後、ならびに４回目投与後２および２４時間経過後の血清中のIL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、およびTNF-αの各濃度の測定結果（平均値）およびそれらの標準偏差（STDEV）を図１〜５に示す。これらの結果から、iGalはα-GalCer（KRN7000）とRGI-2001よりも単回投与後のIFN-γ産生を強く誘導することが確認された。一方、複数回投与後のIL-2、IL-4、IL-10、TNF-αのサイトカイン誘導については、α-GalCer（KRN7000）とRGI-2001に比べて誘導活性が複数回に渡り持続しており、特に３回投与後にIL-10の産生を顕著に誘導したことから、iGalはα-GalCer（KRN7000）およびRGI-2001とは全く異なる強力かつ持続性のあるサイトカイン誘導能を有することが示された。即ち、イヌリンを用いてα-GalCer（KRN7000）を保護コロイド化してナノ粒子化することで、Th1型とTh2型のサイトカインの産生をα-GalCer（KRN7000）とRGI-2001に比して強力に誘導できることが明らかとなった。【００５５】
また、実施例２及び３で製造した、プルランやHPMCなどの多糖を用いてα-GalCer（KRN7000）を保護コロイド化してナノ粒子化したスフィンゴ糖脂質保護コロイド溶液を使用して、同様の試験をした結果、Th1型とTh2型のサイトカインの産生は、α-GalCer（KRN7000）とRGI-2001に比して強力に誘導できることも確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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