(57)【要約】  本発明は、新規なキサンチンオキシダーゼ阻害剤を提供する。より詳細には、本発明は、以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、キサンチンオキシダーゼ阻害剤を提供する。2017038723.tif 000026（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
2017038723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、キサンチンオキシダーゼ阻害剤：
【化１】
2017038723.tif 000020
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
【請求項２】
テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を配合したものである、請求項１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
１回の経口摂取量単位の形態である、請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
血中尿酸低下剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
【請求項５】
尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項６】
高尿酸血症の治療剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項７】
組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の剤。
【請求項８】
飲食品または医薬品である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の剤。
【請求項９】
式（Ｉａ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩：
【化２】
2017038723.tif 000021
【請求項１０】
テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を剤中に配合することを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項１１】
前記テトラピロール含有物が、赤血球、ヘモグロビン、ヘミン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ビリルビンおよびクロロフィリンからなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記テトラピロール含有物の分解が、酸化反応、還元反応および酵素反応からなる群から選択される少なくとも一つの反応により行われる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、請求項１０に記載の方法：
【化３】
2017038723.tif 000022
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
【請求項１４】
キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物の使用。
【請求項１５】
前記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、請求項１４に記載の使用：
【化４】
2017038723.tif 000023
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
【請求項１６】
前記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤である、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含む、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療方法：
【化５】
2017038723.tif 000024
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
【請求項１８】
キサンチンオキシダーゼ阻害のため、または尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療のための、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩：
【化６】
2017038723.tif 000025
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１５年８月２８日に出願された日本国特許出願２０１５−１６９７５３号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、新規なキサンチンオキシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、食の欧米化やアルコール摂取量の増加と共に生活習慣病の増加が懸念されている。その中で、通常より血清尿酸値が高い状態を高尿酸血症というが、この状態が原因で引き起こされる痛風は、関節液中に尿酸が結石化して炎症を起こし、親指の付け根、足首、足の甲、膝、アキレス健などに激しい痛みを伴う疾患として知られている（非特許文献１）。【０００４】
国民生活基準調査（２００４年）によると、痛風患者数は８７万人を超えており、１９８６年と比べ３．４倍に急増している。また、高尿酸血症は、腎障害、尿路結石などの尿酸塩沈着症の原因となり、年齢・性別は問わず血清尿酸値が７．０ｍｇ／ｄＬを超えると高尿酸血症と定義される。近年の調査によると、成人男性における高尿酸血症の頻度は２１．５〜２６．２％とされ３０歳以降で３０％に達していると推定され、問題となっている。また、女性の場合、高尿酸血症の頻度は５０歳未満で１．３％、５０歳以降で３．７％と男性に比べ低頻度であるが、女性の場合、血清尿酸値が７．０ｍｇ／ｄＬ以下であっても、血清尿酸値の上昇とともに生活習慣病のリスクが高まるとされ、総死亡の相対危険度の上昇を伴う可能性が指摘されている。【０００５】
高尿酸血症には病型の分類があり、「尿酸生産過剰型」、「尿酸排泄低下型」、「混合型」に大別される。薬物治療において、尿酸排泄促進薬としてはプロベネシド、ベンズブロマロンなどがあり、尿酸生成抑制薬としては代表としてアロプリノールがある。また、同じく尿酸生成抑制薬として２０１１年５月よりフェブキソスタットが処方可能となった。病型に合わせた薬剤選択が基本原則にあるが、尿路結石の既往ないし合併がある場合は「尿酸排泄低下型」であっても尿酸生成抑制薬を選択する必要がある。この尿酸生成抑制薬は、生体内ではプリン体の代謝産物であるキサンチンから尿酸を生成する酵素（キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase：ＸＯＤ）、以下、ＸＯＤともいう）の活性を阻害する物質であり、尿酸の生成を抑制することによって血清尿酸値を低減・抑制する。しかしながら、これらの薬物では高い血清尿酸値の減少効果が期待できるが、重篤な腎機能および肝機能障害等の副作用も考慮しなければならない。現時点で薬物治療が必要としないレベルの無症状の高尿酸血症の患者においては、生活習慣の改善とプリン体の多い食品の摂取、アルコール類やカロリーの過剰摂取を避ける指導等で対処されている（非特許文献２）。【０００６】
高尿酸血症の状態は将来的に重篤な疾患に発展していく可能性があり、生活習慣の改善等の努力は言うまでもないが、血清尿酸値の低減作用を有する機能性物質が含まれる食品や尿酸値低減剤の摂取によって、より積極的に血清尿酸値をコントロールできる素材が求められている。これまでの特許文献、学術論文等において血清尿酸値低減作用があるとされている物質の多くは植物由来で、ポリフェノール類が殆どである。その尿酸値低減作用はポリフェノール類によるＸＯＤ阻害効果による。例外的に動物由来のアンセリン類に尿酸値低減作用があるとされているが、その作用機序はＸＯＤ阻害の場合とは異なり不明確な面もある。特に、天然物由来のＸＯＤ阻害物質で医薬品のアロプリノールの活性を超えた報告はない。【０００７】
また、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物と、ＸＯＤ阻害活性作用との関係についても何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】New Current 22(4) 2011
【非特許文献２】高尿酸血症・痛風の治療ガイドライン(第2版) 2012年追補
【０００９】
本発明は、ＸＯＤの活性を効果的に阻害する新たな技術的手段を提供することをその目的としている。【００１０】
本発明者らは、今般、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物またはそれら由来の特定化合物を用いて、ＸＯＤを効果的に阻害しうることを見出した。【００１１】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、キサンチンオキシダーゼ阻害剤：
【化１】
2017038723.tif 000003
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
（２）テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を含有させて得られたものである、（１）に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害剤。
（３）１回の経口摂取量単位の形態である、（１）または（２）に記載の剤。
（４）血中尿酸低下剤である、（１）〜（３）のいずれか一つに記載の剤。
（５）尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤である、（１）〜（４）のいずれか一つに記載の剤。
（６）高尿酸血症の治療剤である、（１）〜（５）のいずれかに記載の剤。
（７）組成物である、（１）〜（６）のいずれか一つに記載の剤。
（８）飲食品または医薬品である、（１）〜（７）のいずれか一つに記載の剤。
（９）式（Ｉａ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩：
【化２】
2017038723.tif 000004
（１０）テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を剤中に配合することを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法。
（１１）上記テトラピロール含有物が、赤血球、ヘモグロビン、ヘミン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ビリルビンおよびクロロフィリンからなる群から選択される少なくとも一つのものである、（１０）に記載の方法。
（１２）上記テトラピロール含有物の分解が、酸化反応、還元反応および酵素反応からなる群から選択される少なくとも一つの反応により行われる、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）上記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、（１０）に記載の方法：
【化３】
2017038723.tif 000005
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
（１４）キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物の使用。
（１５）前記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる、（１４）に記載の使用：
【化４】
2017038723.tif 000006
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
（１６）前記キサンチンオキシダーゼ阻害剤が、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤である、（１４）または（１５）に記載の使用。
（１７）式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含む、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療方法：
【化５】
2017038723.tif 000007
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。
（１８）キサンチンオキシダーゼ阻害のため、または尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療のための、式（Ｉ）で表される化合物またはその経口上許容可能な塩：
【化６】
2017038723.tif 000008
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）。【００１２】
本発明によれば、ＸＯＤを効果的に阻害することができる。また、本発明は、高尿酸血症等の対象において血中尿酸を効果的に低下させる上で有利に利用することができる。さらに、本発明は、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態を治療する上で有利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】種々のｐＨに調整されたブタ赤血球酵素分解産物のＸＯＤ阻害活性を示すグラフである。
【図２】赤血球酵素分解産物を逆相系樹脂のＯＤＳ−Ａカラムに供しアセトニトリル−ＴＦＡ系でグラージェント溶出させた溶出プロファイルを示すチャートである。矢印はＸＯＤ阻害活性を有するピークを示す。
【図３】図２におけるＸＯＤ阻害活性を有するピーク画分を逆相系のＯＤＳ−１２０Ｔに供しメタノール−ＴＦＡ系でグラージェント溶出させた溶出プロファイルを示すチャートである。最も阻害活性の高かったピークをＰ１、次に阻害活性の高かったピークをＰ２とした。
【図４】ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１、有機合成で得られたＰ１（以下、合成Ｐ１ともいう）およびアロプリノールのＸＯＤ阻害活性曲線を示す。
【図５】図３における逆相クロマトグラフィー後のＰ１を、陰イオン交換樹脂ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（東ソー製）に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９の条件下で吸着させ、塩化ナトリウムのグラージェントにより溶出させたチャートである。
【図６−１】ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１およびＰ２の吸収スペクトルを示す。
【図６−２】赤血球酵素分解産物由来Ｐ１のＬＣ／ＭＳ解析（ネガティブモード）結果、およびヘミン−過酸化水素反応物由来のＰ１およびＰ２のＬＣ／ＭＳ解析（ネガティブモード）結果を示す。
【図６−３】ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ２のＬＣ／ＭＳ解析結果およびＰ２の構造の推定を示す。
【図６−４】ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ結果を示す。
【図７】赤血球酵素分解産物由来Ｐ１、赤血球酵素分解産物の活性炭（活性炭１）による精製物またはこれら混合物の逆相クロマトグラフィーのチャートを示す。
【図８】合成Ｐ１のＬＣ／ＭＳ解析（ネガティブモード）結果を示す。
【図９】合成Ｐ１の１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す。
【図１０】オキソン酸カリウム投与群、オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１投与群、およびコントロール群における、マウスの血清尿酸値変化を示すグラフである。
【図１１】合成Ｐ１投与後６時間までの血清尿酸値についてのＡＵＣ（曲線下面積）の比較を示すグラフである。
【発明の具体的説明】
【００１４】
剤
本発明の剤は、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を配合していることを一つの特徴としている。
【００１５】
本発明において、テトラピロールは、４個のピロール環を含む化合物を意味し、直鎖状のものおよび環状のものを包含する。
【００１６】
直鎖状のテトラピロールとしては、ビリン（ビリルビン、ビリベルジン、ウロビリノーゲン、ウロビリン、ステルコビリン、フィトクロム、フィコビリン等）が挙げられる。
【００１７】
環状のテトラピロールとしては、ポルフィリン（エチオポルフィリン、メソポルフィリン、プロトポルフィリン、ジューテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、コプロポルフィリン、ウロポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン、ロドポルフィリン、フィトポルフィリン等）、クロリン類が挙げられる。
【００１８】
また、上記ポルフィリンには、鉄、銅、マグネシウム、コバルト等の金属原子が導入された分子内金属錯体も含まれる。例えば、ヘム、ヘマチン、ヘミン、クロロフィル、ビタミンＢ１２、鉄クロロフィリン、鉄クロロフィリンナトリウム、銅クロロフィリン、銅クロロフィリンナトリウム、マグネシウムクロロフィリン等である。
【００１９】
本発明のテトラピロール含有物は、テトラピロール自体であってもよく、テトラピロールを含有する組成物であってもよい。具体的には、テトラピロール含有物は、好ましくは赤血球、ヘモグロビン、葉緑体、ヘミン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ビリルビン、クロロフィル、クロロフィリン等であり、より好ましくは赤血球、ヘモグロビン、ヘミン、ヘマトポルフィリンまたはクロロフィリンである。
【００２０】
テトラピロール含有物の由来は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、哺乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等の脊椎動物等の血液を有する動物、又は葉緑体を有する植物および藻類が挙げられるが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物である。
【００２１】
また、テトラピロール含有物は、天然物から取得してもよく、市販品を用いてもよい。また、テトラピロール含有物はそのまま分解処理してもよく、噴霧乾燥、濃縮乾燥、凍結乾燥等の乾燥処理を行った後に分解処理に供してもよい。
【００２２】
テトラピロール含有物の分解は、好ましくは酸化反応、還元反応および酵素反応からなる群から選択される少なくとも一つの反応により行うことが好ましい。
【００２３】
上記テトラピロール含有物の酸化反応は、上記テトラピロール含有物を過酸化水素、次亜塩素酸、過マンガン酸塩等の酸化剤と反応させることにより実施することができる。より具体的には、酸化反応は、テトラピロール含有物（乾物換算）と、酸化剤とをモル比１：１０〜１：５００で混合し、４５〜６０℃で１〜１６時間実施することが好ましい。
【００２４】
テトラピロール含有物の還元反応は、上記テトラピロール含有物をシステイン（Ｃｙｓ）、グルタチオン（ＧＳＴ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、トコフェノール（ビタミンＥ）等の還元剤と反応させることにより実施することができる。より具体的には、還元反応は、テトラピロール含有物（乾物換算）と、還元剤とをモル比１：１〜１：１００で混合し、４５〜６０℃で1〜１６時間実施することが好ましい。
【００２５】
また、テトラピロール含有物の酸化または還元反応では、反応促進の観点から、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）等の鉄イオンを反応系中に添加することが好ましい。
【００２６】
また、テトラピロール含有物の酵素反応において使用される酵素は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）が好ましい。かかるプロテアーゼとしては、エンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼが挙げられ、また、かかるプロテアーゼはアルカリ性プロテアーゼであってよい。上記プロテアーゼとして、具体的には、アルカラーゼ（商標）、エスペラーゼ（商標）、ニュートラーゼ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）、オリエンターゼ（商標）９０Ｎ、オリエンターゼ（商標）２２ＢＦ（エイチビィアイ製）、サモアーゼ（商標）ＰＣ１０Ｆ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野製薬製）、マルチフェクト（商標） ＰＲ６Ｌ、マルチフェクト（商標）ＰＲ７Ｌ（ダニスコジャパン社製）が挙げられるが、好ましくは、アルカラーゼ、マルチフェクトＰＲ６Ｌである。より具体的には、酵素反応は、テトラピロール含有物（乾物換算）と、酵素とを重量比１００：１〜１００：１０で混合し４５〜６０℃で１〜１６時間実施することが好ましい。
【００２７】
また、本発明のテトラピロール含有物またはその抽出物は、式（Ｉ）の化合物またはその経口上許容可能な塩を含有していることが好ましい。したがって、好ましい態様によれば、本発明の剤は、式（Ｉ）の化合物またはその経口上許容可能な塩を含んでなる。
【化７】
2017038723.tif 000009
（式中、Ｒは、ＯＨまたはＨである）
【００２８】
さらに別の好ましい態様によれば、本発明の化合物は、式（Ｉａ）の化合物および／または式（Ｉｂ）の化合物からなる。
【化８】
2017038723.tif 000010
【化９】
2017038723.tif 000011
【００２９】
本発明において、式（Ｉ）の化合物の経口上許容可能な塩としては、特に限定されないが、無機酸塩、無機塩基塩、有機酸塩、有機塩基塩等が挙げられる。
【００３０】
また、式（Ｉ）の化合物またはその経口上許容可能な塩は、大気中に放置したりまたは再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明は、そのような各種の水和物、溶媒和物および結晶多形の化合物も包含する。
【００３１】
また、式（Ｉ）の化合物は、プロドラッグの形態にて剤中に配合してもよく、本発明はかかる態様も包含する。好適なプロドラッグとしては、例えば、式（Ｉ）、または式（Ｉａ）および／もしくは式（Ｉｂ）の化合物における窒素原子、カルボキシル基またはアルデヒド基が、イミン、ニトリル、ヒドロキシル、アミド、エステル、カルバモイル、酸無水物等に変換又は修飾された化合物等が挙げられる。
【００３２】
また、本発明の抽出物は、例えば、水性媒体（エタノール、水、またはそれらの混合物等）によるテトラピロール含有物分解産物の抽出物が挙げられるが、好ましくはエタノール抽出物である。好適な抽出条件としては、テトラピロール含有物（乾物換算）と、水性媒体とを重量比５：１〜１：５で混合し、２０〜６５℃で０．５〜３時間抽出を実施することが好ましい。
【００３３】
本発明の剤の製造においては、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩について、精製処理、濃縮処理または滅菌処理等を所望により実施してもよい。上記精製処理の例としては、活性炭、合成吸着樹脂、シリカゲル等の多孔質物質による吸着処理、ナノフィルター（ＮＦ膜）、限外濾過膜等による濾過処理、透析処理（電気透析等）、遠心分離処理等が挙げられる。また、濃縮処理の例としては、限外濾過処理、減圧濃縮処理、凍結乾燥処理等が挙げられる。
上記精製処理または濃縮処理は、非活性成分を分離、分解または除去し、式（Ｉ）の化合物またはその経口上許容可能な塩の含有濃度を上昇させる上で好ましい。また、上記精製処理、濃縮処理または滅菌処理等は、テトラピロール含有物分解産物の色素または臭気を大幅に低減することができる上でも好ましい。
かかる観点から、精製処理に用いる活性炭としては、木粉由来のもので粉末状が好ましく、最頻度細孔径が１〜３０ｎｍであるものが好ましい。活性炭の最頻度細孔径は、窒素ガス吸着法により測定することができる。また、用いる活性炭の量は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の０．１〜２０％とすることができ、好ましくは０．４〜１．２５％である。活性炭を用いる精製処理の好適な条件としては、ｐＨ２〜５に調整した、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩に対し活性炭を添加した後に回収し、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の０．３〜６０倍量の水で洗浄した後、ｐＨ９〜１１のアルカリ性緩衝液や０．０５〜０．１５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で溶出することが好ましい。上記アルカリ性緩衝液または水酸化ナトリウム溶液の量は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の０．０１〜１００倍量とすることができ、好ましくは０．１〜１０倍量である。また、上記合成吸着樹脂としては、スチレン−ジビニルベンゼン系が好ましく、最頻度細孔径が５〜１００ｎｍであるものが好ましい。合成吸着樹脂の最頻度細孔径は、水銀圧入法により測定することができる。また、用いる合成吸着樹脂の量は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の１０倍量量〜１／５０量とすることができ、好ましくは等量〜１／１０量である。
また、非活性成分の分離もしくは除去、またはテトラピロール含有物分解産物の色素もしくは臭気低減の観点から、精製処理に用いる上記ナノフィルターとしては、分画分子量１５０〜８００とすることができ、好ましくは１５０〜５００である。
また、本発明の剤の製造においては、例えば、凍結乾燥法またはスプレードライ法によってテトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を固形化処理または粉末化処理してもよい。
なお、上記各処理は、本発明の効果を妨げない限り、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の製造におけるいずれの段階で行ってもよい。
【００３４】
また、本発明の剤は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（Ｉ）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩をそのまま用いて調製してもよく、また、経口上許容可能な添加剤をさらに配合してもよい。かかる経口上許容可能な添加剤としては、特に限定されないが、溶剤、溶解補助剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、界面活性剤、調整剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、防腐剤、増粘剤、着色剤、香料、芳香剤、湿潤剤、甘味料、または酸化防止剤が挙げられる。
また、本発明の剤のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ１〜１４とすることができ、好ましくはｐＨ３〜１１、より好ましくはｐＨ４〜１０である。
【００３５】
本発明の剤は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば、固形状、粉末状、顆粒状、カプセル状、ブロック状、液状（例えば、溶液、懸濁液、乳濁液）、スラリー状、ゲル状、糊状、またはペースト状のいずれの形態であってもよい。具体的な剤型としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等の固形製剤、ドリンク剤、ゼリー剤が挙げられる。
【００３６】
また、本発明の剤は、１回の経口摂取量単位の形態から構成されることが好ましい。本発明の剤は、１回の経口摂取量として、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を、乾燥質量換算で、好ましくは１〜５０００ｍｇ、より好ましくは１０〜１０００ｍｇ含有していてもよい。また、本発明の剤は、１回の経口摂取量として、式（I）の化合物またはその経口上許容可能な塩を、乾燥質量換算で、好ましくは０．０１〜３００ｍｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ含有していてもよい。
【００３７】
また、本発明の剤は包装形態で提供することが好ましい。包装形態としては、特に限定されず、パックまたは容器等が挙げられる。また、包装の表面には成分表示、用量・用法表示等を付していてもよい。かかる包装形態の好適な例としてはサプリメント、ドリンク剤または医薬製剤等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明の剤は、血中尿酸を低下または尿酸値を低減させ、または血中尿酸値上昇もしくは尿酸生成を抑制する上で有利に利用することができる。したがって、一つの態様によれば、本発明の剤は、好ましくは血中尿酸の低下剤、より好ましくは血清尿酸値の低下剤として提供される。また、別の態様によれば、本発明の剤は、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤として提供される。また、別の態様によれば、本発明の剤は高尿酸血症の治療剤として提供される。また、本発明の剤は、血中尿酸を低下させることにより、高尿酸血症に基づく痛風、尿路結石、腎機能障害（好ましくは、慢性腎臓病、慢性糸球体腎炎）、心血管系疾患（好ましくは、冠動脈疾患、虚血性心疾患）、高血圧、メタボリックシンドローム、悪性腫瘍等の各種疾患の治療、もしくは病状の低下または改善に有利に利用することができる。したがって、本発明の剤は、高尿酸血症、高尿酸血症に基づく痛風、尿路結石、腎機能障害（好ましくは、慢性腎臓病、慢性糸球体腎炎）、心血管系疾患（好ましくは、冠動脈疾患、虚血性心疾患）、高血圧、メタボリックシンドローム、悪性腫瘍等の各種疾患の治療、または病状の低下もしくは改善を表示して提供することができる。なお、本発明の「治療」は、確立された病態を治療することだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも包含する。また、本発明の「治療」は、医療行為のみならず、後述する飲食品を対象に摂取させることにより、既に発生したかまたは将来発生する可能性のある病態または状態を改善または予防する行為も好ましくは包含する。
【００３９】
また、本発明の剤は、複数の成分が配合された組成物の形態で提供することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を含んでなる、キサンチンオキシダーゼ阻害用、血中尿酸低下用、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療用、または高尿酸血症治療用の組成物が提供される。
【００４０】
本発明の剤は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を含んでなる限りにおいては、飲食品または医薬品であってもよい。したがって、別の態様によれば、本発明の剤は、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を含んでなる、キサンチンオキシダーゼ阻害用、血中尿酸低下用、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療用、または高尿酸血症治療用の飲食品組成物または医薬組成物である。
【００４１】
本発明の飲食品としては、特に限定されないが、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料等の飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等の小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類等の調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアル等の農産加工品；ハム、ベーコン、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工食品：冷凍食品等が挙げられる。
【００４２】
本発明の飲食品には、健康食品、機能性食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品または機能性表示食品を含む）、栄養補助食品、病者用食品、乳児用調製粉乳、妊産婦、授乳婦用粉乳、嚥下困難者用食品も包含される。また、本発明の飲食品には、キサンチンオキシダーゼ阻害、血中尿酸低下、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療、または高尿酸血症治療のために用いられるものである旨の表示を付してもよい。
【００４３】
また、本発明の医薬品もまた、キサンチンオキシダーゼ阻害、血中尿酸低下、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療、または高尿酸血症治療のために用いられるものである旨の表示を付したものであってもよい。かかる医薬品は上述の剤に関する記載に準じて調製することができる。
【００４４】
また、本発明の別の態様によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害方法であって、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる方法が提供される。また、本発明の好ましい別の態様によれば、上記方法は、血中尿酸の低下方法として提供される。また、本発明の好ましい別の態様によれば、上記方法は、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療方法として提供される。本発明のさらに好ましい別の態様によれば、上記方法は、高尿酸血症の治療方法として提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、医療行為を除くものであり、該行為は非治療的行為ともいう。本発明の上記方法は、本発明の剤の記載に準じて実施することができる。
【００４５】
本発明の剤の摂取方法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、好ましくは経口摂取とされる。
【００４６】
本発明における対象は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類等であり、好ましくはヒトである。
また、対象における血清尿酸値は、特に限定されないが、尿酸値低減による高尿酸血症の改善を勘案すれば、高レベルであることが好ましい。かかる血清尿酸値は好ましくは７．０ｍｇ／ｄＬを超える状態である。
また、本発明の別の態様によれば、対象は健常者であってもよい。
【００４７】
また、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能の有効量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、純度、対象の種類、性質、性別、年齢、症状、状態等に応じて当業者によって、適宜決定される。本発明の剤は、有効量として、テトラピロール含有物分解産物またはその抽出物を、乾燥質量換算で、０．０５〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは０．５〜２５ｍｇ／体重ｋｇ／日とすることができる。また、本発明の剤は、例えば、有効量として、式（I）の化合物またはその経口上許容可能な塩を、乾燥質量換算で、０．０１〜１５ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは０．１〜５ｍｇ／体重ｋｇ／日とすることができる。
【００４８】
本発明における摂取計画は、本発明の効果を妨げない限り、対象の種、年齢、性別、症状、状態に応じて当業者が適宜設定することができる。また、本発明における上記１日の摂取の回数は、例えば、１日１〜６回であり、好ましくは１日３回である。
【００４９】
また、本発明の別の態様によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、血中尿酸低下剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、高尿酸血症の治療剤の製造における、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。
【００５０】
また、本発明の別の態様によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害剤としての、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、血中尿酸低下剤としての、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤としての、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、高尿酸血症の治療剤としての、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩の使用が提供される。本発明の一つの好ましい別の態様によれば、本発明の使用は、非治療的使用とされる。
【００５１】
また、本発明の別の態様によれば、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を剤中に配合することを特徴とする、キサンチンオキシダーゼ阻害剤の製造方法が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を剤中に配合することを特徴とする、血中尿酸低下剤の製造方法が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を剤中に配合することを特徴とする、尿酸の過剰生成または排泄低下に起因する疾患または状態の治療剤の製造方法が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩を剤中に配合することを特徴とする、高尿酸血症の治療剤の製造方法が提供される。
【００５２】
また、本発明の別の態様によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害のための、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、血中尿酸の低下のための、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態の治療、または尿酸の過剰生成もしくは排泄低下に起因する疾患もしくは状態のリスクの低減のための、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、高尿酸血症の治療または高尿酸血症のリスクの低減のための、テトラピロール含有物分解産物もしくはその抽出物または式（I）の化合物もしくはその経口上許容可能な塩が提供される。かかる態様はいずれも、本発明の剤および方法に関する記載に準じて実施することができる。
【００５３】
上記使用、製造方法の態様はいずれも、本発明の剤および方法に関する記載に準じて実施することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、特に指摘されない限り、本発明で用いられる全てのパーセンテージおよび比率は質量による。また、特に指摘されない限り、本明細書に記載の単位および測定方法は日本工業規格（ＪＩＳ）による。【００５５】
試験例１：テトラピロール含有物分解産物（ブタ赤血球酵素分解産物）の調製
原料として、赤血球パウダーを用いた。上記赤血球パウダーは、ブタの血液を遠心分離することで赤血球を得、該赤血球を噴霧乾燥させることで得られた。
赤血球酵素分解産物の調製はヘム鉄複合物の製造方法（特開平４−０１３６８０）を参考に以下のように行った。まず赤血球パウダーにその約７倍量の蒸留水を添加し溶解させた後、水酸化ナトリウムを適宜添加しｐＨ９．５±０．５に調整しながら、微生物由来のエンド型プロテアーゼ（アルカラーゼ）（Novozymes社製）を赤血球パウダーの約１０％量添加し、５５±１℃で１時間以上酵素反応させた。さらに、上記酵素反応液を分画分子量１００００以下の限外濾過膜で処理することで、高分子量の物質を除き、赤血球酵素分解産物を得た。【００５６】
上記赤血球酵素分解産物について塩酸を添加し各種ｐＨへ調整後、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
in vitro ＸＯＤ阻害活性は、増田等の方法（仁愛女子短期大学研究紀要, 第41号 平成20年）を参考に測定した。具体的には、キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase：ＸＯＤ）に、基質としてキサンチンを加えることにより生成する尿酸の変化量より阻害活性を求めた。
まず、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）  ２４０μＬに上記赤血球酵素分解産物１０μＬを添加した。コントロール（ＸＯＤ阻害物質無し）としては０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）  １０μＬを添加した。次に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解した０．２４Ｕ／ｍＬ  ウシバターミルク由来ＸＯＤ（オリエンタル酵母工業製）を５０μＬ添加して撹拌後、１分間静置した。そこに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解した０．１ｍＭキサンチン（和光純薬工業製）溶液３００μＬを添加し、即座に分光光度計（ＤＵ７４００、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用い波長２９５ｎｍについて基質添加後（０分後）および１分後の吸光値を測定した。測定および使用した試液は全て室温のものを用いた。得られた吸光値から０→１分間のΔＡＢＳを求め、下記に示す式で試料の阻害活性を算出した。これらの反応は全てセル内で行った。なお、この測定系における０．７ｍｇ／ｍＬアロプリノール（和光純薬工業製）（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）に溶解）の阻害活性は９９％以上を示した。
式）Ａ：試料ΔＡＢＳ  （０−１ｍｉｎ）
Ｂ：コントロールΔＡＢＳ  （０−１ｍｉｎ）
阻害活性％＝１００−｛Ａ／Ｂ×１００｝【００５７】
試験例１の赤血球酵素分解産物によるＸＯＤ阻害活性の測定結果を表１および図１に示す。その結果、赤血球酵素分解産物のＸＯＤ阻害活性はｐＨにより変動し、ｐＨ１０における阻害活性は３１．５％であったが、ｐＨ４では６２．４％を示した（図１、表１）。【００５８】
試験例２：テトラピロール含有物分解産物（ウシ赤血球酵素分解産物）の調製
ブタ由来赤血球パウダーの替わりにウシ血液由来ヘモグロビンパウダー（和光純薬工業製）を用い、試験例１と同様の方法でウシ赤血球酵素分解産物を得た。【００５９】
さらに、上記ウシ赤血球酵素分解産物に塩酸を添加しｐＨ４へ調整後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、５４．６％のＸＯＤ阻害活性が認められた（表１）。
したがって、赤血球酵素分解産物のＸＯＤ阻害活性は生物種固有のものではないと推測された。【００６０】
試験例３：テトラピロール含有物分解産物（ヘミンとアルブミンの混合物の酵素反応物）の調製
ヘモグロビンはヘムとグロビンで構成されているが、ヘムとグロビン以外のタンパク質の混合物を酵素反応させてもＸＯＤ阻害活性を示すか確認した。
ここでは、ヘムとしてヘミンを用いた。ヘミン（Kodak社製）とウシ由来アルブミン（和光純薬工業製）を約１：１０の割合で混合した後、試験例１と同様の方法でプロテアーゼを添加し反応させ、ヘミンとアルブミンの混合物の酵素反応物を得た。【００６１】
上記ヘミンとアルブミンの混合物の酵素反応物についてｐＨ４へ調整後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、２３．７％のＸＯＤ阻害活性が認められた（表１）。【００６２】
試験例４：テトラピロール含有物分解産物（ヘミンと各種還元剤との反応物）の調製
赤血球酵素分解産物中のＸＯＤ阻害物質は、上記検討からヘモグロビンおよびミオグロビンに存在するヘム（ヘミン）の分解産物の可能性が示唆された。
そこで、終濃度１０μｍｏｌ／ｍＬのヘミン（Kodak社製）溶液に対し、終濃度１００μｍｏｌ／ｍＬとなるようにシステイン（Ｃｙｓ）（和光純薬工業製）、グルタチオン（ＧＳＨ）（和光純薬工業製）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業製）等の還元剤を加え、０．１Ｍの水酸化ナトリウム（和光純薬工業製）溶液にてｐＨ１０に調整後、６０℃で一晩反応させ、反応物を得た。【００６３】
上記ヘミンと各種還元剤との反応物についてｐＨ４に調整後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、全ての反応物においてＸＯＤ阻害活性を検出することができた（表１）。また、これら反応物の逆相クロマトグラフィー上のＸＯＤ阻害活性を有するピークは赤血球酵素分解産物由来のＸＯＤ阻害活性を有するピークと溶出位置が重なった。したがって、上記反応物においてＸＯＤ阻害活性を示している物質は、赤血球酵素分解産物由来のＸＯＤ阻害物質と同一の物質であることが示唆された。【００６４】
試験例５：テトラピロール含有物分解産物（テトラピロール化合物とシステインとの反応物）の調製
また、鉄を含まないプロトポルフィリン（東京化成工業製）、ヘム（ヘミン）とは別のテトラピロール化合物であるヘマトポルフィリン（Sigma-Aldrich社製）、およびヘムの分解中間体であるビリルビン（東京化成工業製）にシステインを作用させ反応物を得た。具体的には、終濃度１０μｍｏｌ／ｍＬのプロトポルフィリン溶液、終濃度１０μｍｏｌ／ｍＬのヘマトポルフィリンまたは終濃度１０μｍｏｌ／ｍＬのビリルビンに対し終濃度１００μｍｏｌ／ｍＬとなるようにシステイン（Ｃｙｓ）を加え、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ１０に調整後、６０℃で一晩反応させ、反応物を得た。
さらに、プロトポルフィリンまたはビリルビンとシステインとの反応物に終濃度１０μｍｏｌ／ｍＬとなるように塩化鉄（ＩＩ）（和光純薬工業製）を添加し、ｐＨ１０に調整後、６０℃で一晩反応させ、塩化鉄（ＩＩ）添加反応物を得た。【００６５】
上記テトラピロール化合物とシステインとの反応物について塩酸を加えてｐＨ４に調整した後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、全ての反応物においてＸＯＤ阻害活性を検出することができた（表１）。
また、上記塩化鉄（ＩＩ）添加反応物に関しても、塩酸を加えてｐＨ４に調整した後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、塩化鉄（ＩＩ）添加反応物は塩化鉄（ＩＩ）を添加していない反応物に比して更にＸＯＤ阻害活性を１０％程度高めることができた（表１）。このことから、鉄の存在がＸＯＤ阻害物質の生成率を高めている可能性が示唆された。【００６６】
試験例６：テトラピロール含有物分解産物（ヘミンと過酸化水素との反応物）の調製
ヘミンと還元剤との反応物ではなく、ヘミンと過酸化水素との反応物（以後、ヘミン−過酸化水素反応物という）においてもＸＯＤ阻害活性が検出できるか検討した。
ヘミンと過酸化水素との反応方法は廣田の方法（岡大医短紀要，４：３１〜３６，１９９３）を参考にした。具体的には、まず、ヘミン１０ｍｇ／ｍＬ溶液に、２８％アンモニア（和光純薬工業製）を１／４０量添加しヘミンを溶解した。その溶液を６０℃で加熱しながら、その溶液にヘミン溶液の半分量の終濃度１５％過酸化水素水（和光純薬工業製）（２８％アンモニアを１／３３量含む）を少しずつ添加後、６０℃で１時間反応させた。反応後室温まで冷却し反応物を得た。【００６７】
上記ヘミン−過酸化水素反応物について、塩酸を加えてｐＨ４に調整した後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、上記反応物のＸＯＤ阻害活性は８７．５％を示した（表１）。【００６８】
試験例７：テトラピロール含有物分解産物（クロロフィリンと過酸化水素との反応物）の調製
植物、植物プランクトンおよび藻類等の光合成を行う生物に関与するテトラピロール化合物であるクロロフィリンと過酸化水素との反応物もＸＯＤ阻害活性を検出できるか検討した。
ヘミンに代えて鉄クロロフィリンＮａ（鉄葉緑素）（日本葉緑素製）を用いる以外は、上記試験例６に記載の、ヘミンと過酸化水素との反応物と同様の調製方法で調製した。【００６９】
上記クロロフィリンと過酸化水素との反応物について、塩酸を加えてｐＨ４に調整した後、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、上記反応物のＸＯＤ阻害活性は２４．２％を示した（表１）。
【表１】
2017038723.tif 000012
【００７０】
試験例８：テトラピロール含有物分解産物（赤血球酵素分解産物またはヘミン−過酸化水素反応物）からのＸＯＤ阻害物質の単離
赤血球酵素分解産物にＸＯＤ阻害活性が確認されたことから、各種クロマトグラフィーを用いてＸＯＤ阻害物質の単離を行った。
まず、試験例１で得られた赤血球酵素分解産物をｐＨ４に調整後、５倍量の２−プロパノールを添加しＸＯＤ阻害物質を抽出した。この２−プロパノール抽出画分を逆相系樹脂のＯＤＳ−Ａカラム（ワイエムシィ製）に供し、アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）系でグラージェント溶出させた（図２）。その結果、図２で示すように、３１３ｎｍで検出した矢印で示されるピークの画分に明確なＸＯＤ阻害活性を有していた。他のピークではＸＯＤ阻害活性は殆ど検出されなかった。さらに、上記阻害活性を有するピーク画分を逆相系のＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー製）に供し、メタノール−ＴＦＡ系でグラージェント溶出させた（図３）。その結果、３１３ｎｍの検出波長で３つのピークが得られた。これらピークに関してＸＯＤ阻害活性を測定した結果、最初と二番目のピークの画分でＸＯＤ阻害活性が示された。ＸＯＤ阻害活性が確認されたピーク画分を回収し、３１３ｎｍの吸光値を約1に調整した溶液とした。上記溶液において、６３％のＸＯＤ阻害活性を示したピークをＰ１ピーク、４８％のＸＯＤ阻害活性を示したピークをＰ２ピークとした（図３）。Ｐ１ピークについて画分を分取し、ＯＤＳ−１２０Ｔにて再精製し、赤血球酵素分解産物から精製したＸＯＤ阻害物質Ｐ１を得た（以下、赤血球酵素分解産物由来Ｐ１という）。また、同様の単離方法で、試験例６のヘミン−過酸化水素反応物からも上記の赤血球酵素分解産物由来Ｐ１およびＰ２と同等の物質を得ることができた（以下、ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１およびＰ２という）。ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１およびＰ２について分光光度計（ＤＵ７４００、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）により吸収スペクトルを測定した結果、各最大吸収波長は３０８ｎｍおよび３２２ｎｍ付近で、スペクトルは類似していた（図６−１）。
得られたヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１について、凍結乾燥後、Ｐ1濃度が０．７ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に溶解し、試験例１と同様の方法で、in vitroでＸＯＤ阻害活性を測定した。
その結果、ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は２．４５μｇ／ｍＬであった。（図４）
上述のように、ＸＯＤ阻害物質は逆相クロマトグラフィーを用いて分取することが可能ではあるが、逆相クロマトグラフィーの後にイオン交換樹脂を用いても分取精製することができた。ＯＤＳ−１２０Ｔ逆相クロマトグラフィー後に得られたＰ１について陰イオン交換樹脂ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（東ソー製）に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９の条件下で吸着させ、塩化ナトリウムのグラージェントによりＰ１を溶出させ分取することができた（図５）。【００７１】
試験例９：テトラピロール含有物分解産物（赤血球酵素分解産物、またはヘミン−過酸化水素反応物）由来のＸＯＤ阻害物質の分子量・構造解析
試験例８の各種クロマトグラフィーで得られた赤血球酵素分解産物由来Ｐ１、へミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１およびＰ２についてＬＣ／ＭＳ（ＳｙｎａｐｔＧ２−Ｓ型, Ｗａｔｅｒｓ社製）による分子量および構造の予測を行った。
その結果、Ｐ１およびＰ２の分子量が推測でき、ヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１と赤血球酵素分解産物由来Ｐ１とは、試験例８に示す逆相系ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー製）によるピークの溶出時間が一致した上に、ＬＣ／ＭＳ解析（ネガティブモード）によるＰ１の分子イオンｍ／ｚ  ２２４とその他のフラグメントイオンのシグナルがほぼ一致していることが確認された。これらから、赤血球酵素分解産物由来Ｐ１とヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１は同一物質であることが確認された（図６−２）。
更にヘミン−過酸化水素反応物由来Ｐ１については１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび差ＮＯＥ測定による構造解析を行った（ＡＶＡＮＣＥ５００型, ＢＲＵＫＥＲ社製）。なお、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲで用いた溶媒は重メタノールであった。ＬＣ/ＭＳ（ネガティブモード）およびＮＭＲの結果から、Ｐ１は分子量２２５であり（図６−２）、ピロール環にメチル基、アルデヒド基、カルボキシル基、プロピオン酸を有する構造であることが分かった。その構造からポルフィリン環構造の一部で構成されていることが確認された（図６−４）。Ｐ２については、Ｐ１と同じヘミン−過酸化水素反応物由来であり、吸収スペクトルも類似していることから、Ｐ２はＰ１に類似した異性体であることが予測された。
そこで、Ｐ２のＬＣ/ＭＳのデータから分子量および構造の推定を行った。先ず、ＬＣ/ＭＳ（ネガティブモード）の結果よりＰ２の分子量は２０９と推定された（図６−２）。また、ＬＣ/ＭＳ（ポジティブモード）の結果より、Ｐ２はイオン化の際 (a)〜（ｆ）にフラグメント化しており、各フラグメントイオンの分子量とフラグメント化された場合の予測構造の分子量が一致した（図６−３）。これらの結果よりＰ２構造が推定された。Ｐ１およびＰ２構造を下記に示す。
【化１０】
2017038723.tif 000013
上記化学式から明らかなように、ＸＯＤ阻害物質Ｐ１およびＰ２はプリン骨格を有していない。これに対し、高尿酸血症治療薬のアロプリノールはプリン骨格を有していることにより、プリン代謝に関与する副作用（腎毒性等）が発現する場合がある。この点からも、ＸＯＤ阻害物質Ｐ１および／またはＰ２は血中尿酸の低下や高尿酸血症の治療において非常に有益なものとなると考えられる。【００７２】
試験例１０：テトラピロール含有物分解産物（赤血球酵素分解産物）からのＸＯＤ阻害物質の製造法
試験例１０−１：ＸＯＤ阻害物質の活性炭による精製法
脱色や脱臭等で使われている食品製造用または医薬品製造用の活性炭を用い、赤血球酵素分解産物からＸＯＤ阻害物質を効率良く精製し、ＸＯＤ阻害物質の含有量を高めた本発明の剤の原料を製造することができた。
まず、ｐＨ４に調整した、試験例１の赤血球酵素分解産物に対し、その赤血球酵素分解産物の約１．２％、０．６％または０．４８％量の活性炭を添加し、ＸＯＤ阻害物質を吸着させた後、活性炭を回収した。回収した活性炭を赤血球酵素分解産物と等量の水で洗浄した後、ｐＨ９若しくはｐＨ１０．５のアルカリ性緩衝液や０．０７Ｍの水酸化ナトリウム溶液で溶出することにより、効果的にＸＯＤ阻害物質を精製しＰ１の濃度を高めることができた。検討に使用した活性炭は、活性炭１（白鷺Ｐ）、活性炭２（白鷺Ａ）（以上、最頻度細孔径2.2ｎｍ付近、木質由来・水蒸気賦活炭）、活性炭３（ＦＰ−３（メーカー仮称））（最頻度細孔径１．７ｎｍ付近、ヤシ殻由来・水蒸気賦活炭）、活性炭４（ＦＰ−６（メーカー仮称））（最頻度細孔径３．３ｎｍ付近、木質由来・塩化亜鉛賦活炭）（以上、日本エンバイロケミカルズ社製）、活性炭５（ダイアホープ６ＥＤ（木質由来・塩化亜鉛賦活炭）（カルゴンカーボンジャパン社製））であった。検討の結果、この中で最もＸＯＤ阻害物質の吸着能が高かったのは活性炭４で、次いで活性炭５であり、活性炭１および活性炭２は色素の溶出が少なかった。これらの活性炭のうち、活性炭１は赤血球酵素分解産物と等量の５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．０でＸＯＤ阻害物質を溶出させたところ、ＸＯＤ阻害の比活性を６２．８倍に高めることができた。活性炭４および活性炭２に関しては、赤血球酵素分解産物の１／１０量の１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．５にて溶出させたところ、活性炭２ではＸＯＤ阻害の比活性を６７．７倍に、活性炭４では７５倍に高めることができ、７０ｍＭ水酸化ナトリウムを用いた活性炭４の場合は、阻害の比活性を約１１０倍に高めることが可能であった（表２）。なお、表２において、阻害活性収率とは、精製前の赤血球酵素分解産物のＸＯＤ阻害率を１００%とした場合、精製後のＸＯＤ阻害率の比率を示す。活性炭４による精製物は、活性炭２による精製物に比べ色は濃いものの、ＸＯＤ阻害の比活性は高かった。この活性炭による赤血球酵素分解産物からの精製法は使用する活性炭量が反応液量の１．２５％以下と非常に少なくてすみ、溶出に溶媒も不要なため、非常に低コストで低環境負荷の製造法であると考えられた。この活性炭による精製法により得た液は乾燥させ粉末化・可溶化が可能であり、経口剤の原料として利用できる。【００７３】
【表２】
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【００７４】
なお、上記活性炭による精製物におけるＸＯＤ阻害活性が、赤血球酵素分解産物中のＸＯＤ阻害物質由来か検証した。検証は試験例８で得られた赤血球酵素分解産物由来Ｐ１と赤血球酵素分解産物の活性炭（活性炭１）による精製物を用いた。これら試料を単独若しくは混合物で逆相クロマトグラフィーに供し、ピークの重なりを確認した。その結果、赤血球酵素分解産物由来Ｐ１と赤血球酵素分解産物の活性炭による精製物中のピークの１つが重なり、面積値の増加が認められた（図７）。したがって、赤血球酵素分解産物の活性炭による精製物におけるＸＯＤ阻害活性はＰ１由来であることが確認された。【００７５】
試験例１０−２：ＸＯＤ阻害物質の熱エタノールによる抽出法
赤血球酵素分解産物ｐＨ４の乾燥品から、熱エタノールを用いてＸＯＤ阻害物質を効率良く抽出することにより、その濃度を高めることができた。
まず、試験例１の赤血球酵素分解産物の乾燥品に対し２〜５倍量の８５〜９０％のエタノールを添加後、室温または６５℃に加熱し、この液を常温に戻すことによって、不必要な固形分を析出させた。遠心分離により固形分を除去し、熱エタノール抽出液とした。
熱エタノール抽出液を乾燥しエタノールを除去した後、ＸＯＤ阻害活性を測定した。赤血球酵素分解産物の２倍量の９０％熱エタノールで抽出した場合、塩分濃度を元の３６％程度まで低下させ、ＸＯＤ阻害比活性を３倍近くに高めることができた（表３）。なお、表３において、塩分残量とは、エタノール抽出前の固形分中の塩分濃度を１００%とした場合、抽出後の固形分中の塩分濃度の比率を示す。また、塩分濃度は、乾燥させた熱エタノール抽出液を水に溶解した後、塩分計（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｂ−７２１、堀場製作所社製）にて測定した。熱エタノール抽出により、同時に色素および臭気も低減することができた。この熱エタノール抽出液は粉末化・可溶化が可能であり、経口剤の原料として利用できる。【００７６】
【表３】
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【００７７】
試験例１０−３：ＸＯＤ阻害物質のＮＦ濾過膜を用いた精製法
ＸＯＤ阻害物質Ｐ１、Ｐ２は分子量２２５、２０９の物質である。その為適切な分画分子量の濾過膜を使用することで、ＸＯＤ阻害物質を効率良く精製することにより、その濃度を高めることができた。
濾過膜としては、ＮＦ膜（ナノフィルター）（室町ケミカル製）４種を用いた。用いたＮＦ膜は、ＮＦ膜１（ＮＦＸ（分画分子量１５０−３００））、ＮＦ膜２（ＮＦＷ（分画分子量３００−５００））、ＮＦ膜３（ＮＦＧ（分画分子量６００−８００））、ＮＦ膜４（ＮＦ２７０（分画分子量２００−４００））である。上記ＮＦ膜を用い、試験例１のブタ赤血球酵素分解産物をｐＨ４に調整後透過した。
その結果、何れの膜においてもＸＯＤ阻害比活性を高めることができ、特にＮＦ膜１で固形分を１％程度まで減らすことができ、ＸＯＤ阻害比活性を５８．７倍高めることができた（表４）。また、何れの膜を用いた場合でも色素・臭気について大幅に低減できた。
このＮＦ濾過膜法により得られた液は粉末化・可溶化が可能であり、経口剤の原料として利用できる。【００７８】
【表４】
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【００７９】
試験例１０−４：ＸＯＤ阻害物質の合成吸着樹脂による精製法
赤血球酵素分解産物から合成吸着樹脂を用いてＸＯＤ阻害物質を効率良く精製することにより、その濃度を高めることができた。
合成吸着樹脂としては、合成吸着樹脂１（ダイアイオンＨＰ２０（スチレン−ジビニルベンゼン系、最頻度細孔径５８ｎｍ））、合成吸着樹脂２（ＨＰ２０ＳＳ（スチレン−ジビニルベンゼン系、最頻度細孔径５８ｎｍ））、合成吸着樹脂３（ＳＰ８５０（スチレン−ジビニルベンゼン系、最頻度細孔径９ｎｍ））、合成吸着樹脂４（ＨＰ２ＭＧＬ（脂肪族エステル系、最頻度細孔径４８ｎｍ））（三菱化学製）を用いた。まず、試験例１の赤血球酵素分解産物の１／１０量の樹脂をｐＨ４に調整した試験例１の赤血球酵素分解産物に添加し、ＸＯＤ阻害物質を吸着させた。この吸着後、樹脂を樹脂体積の１０倍量以上の水で洗浄した後、樹脂体積の１０倍量の０．０１Ｍ  塩酸を含む４０％エタノール溶液でＸＯＤ阻害物質を溶出した。溶出液を濃縮乾燥させてエタノールを除去した後、再溶解し、阻害活性を測定した。その結果、ＸＯＤ阻害比活性を９〜１４倍に高めることができた（表５）。
また、ｐＨ９以上の緩衝液を用いてもＸＯＤ阻害物質を溶出させることができた。溶出において上記４０％エタノール溶液をトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９とする以外は上記方法と同様に合成吸着樹脂を用いて精製した場合、ＸＯＤ阻害比活性を１３．６倍に高めることができた（表５）。
合成吸着樹脂を用いた精製法でも塩、色素および臭気を大幅に低減することができた。
合成吸着樹脂により精製された液は粉末化・可溶化が可能であり、経口剤の原料として利用できる。【００８０】
【表５】
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【００８１】
試験例１１：有機合成によるＸＯＤ阻害物質の製造法
ＸＯＤ阻害物質は上記の赤血球酵素分解産物やヘム等の生体有機物の反応物から得るだけでなく、有機合成することができた。
下記に示す合成スキーム（Ａ）〜（Ｆ）にてＸＯＤ阻害物質Ｐ１を合成した。
（Ａ）まず、モノエチルコハク酸（化合物１）７．３ｇのテトラヒドロフラン溶液にカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ, ９．７ｇ）を加え１時間撹拌後、塩化マグネシウム（４．８ｇ）、モノエチルマロン酸カリウム（８．５ｇ）を添加し６０℃で１時間反応させ、ジエチル ３−オキソヘキサンジオネート（化合物２）を得た。（Ｂ）化合物２（５２．２５ｇ）と酢酸（１００ｍＬ）の混合物に亜硝酸ナトリウム（１７．４６ｇ）の水溶液（７０ｍＬ）を添加した後、ターシャリーブチルアセトアセテート（４５．３７ｇ）と酢酸（１００ｍＬ）の混合物と亜鉛末（５０ｇ）および酢酸アンモニウム（５０ｇ）を添加し５０〜７０℃で３０分反応させ、４−ターシャリーブチル ２−エチル  ３−（２−（エトキシカルボニル）エチル）−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２，４−ジカルボキシレート（化合物３）を得た。（Ｃ）化合物３（１０ｇ）をＮ−メチルピロリドン（７０ｍＬ）に添加し、４−トルエンスルホン酸（p-TSA, １０ｇ）を加え、１６０℃で３時間反応させ、エチル ３−（２−（エトキシカルボニル）エチル）−５−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（化合物４）を得た。（Ｄ）化合物４（５．０６ｇ）にヨウ化水素酸（５０ｍＬ）、無水酢酸（５０ｍＬ）および次亜リン酸（１０ｍＬ）の溶液にパラホルムアルデヒド（１．２ｇ）を加え２５分間反応させ、エチル ３−（２−（エトキシカルボニル）エチル）−４，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（化合物５）を得た。（Ｅ）化合物５（１５ｇ）のテトラヒドロフラン（５３６ｍＬ）、酢酸（１３５ｍＬ）および水（５３６ｍＬ）の溶液に硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム  （ＣＡＮ, １２０ｇ）を加え、室温で２時間反応させ、エチル ３−（２−（エトキシカルボニル）エチル）−５−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシレート（化合物６）を得た。（Ｆ）化合物６（３ｇ）のＴＨＦ−Ｈ２Ｏ  （５：１）  １１５ｍＬ溶液に、水酸化リチウム・一水和物（１．７８ｇ）を加え、Ｎ２存在下、７０℃で４時間反応させ合成ＸＯＤ阻害物質Ｐ１ ３−（２−カルボキシエチル）−５−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸を得た。
【化１１】
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ＸＯＤ阻害物質Ｐ１の合成スキーム【００８２】
なお、有機合成で得られたＰ１（以下、合成Ｐ１ともいう）の構造をＬＣ／ＭＳ １２００Ａ（アジレント・テクノロジー社製）および１Ｈ−ＮＭＲ Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｌｕｓ ４００ ＭＨｚ（バリアン社製）により確認した。ＬＣ／ＭＳ解析（ネガティブモード）においてＰ１の分子イオンｍ／ｚ  ２２４のシグナルが検出され（図８）、１Ｈ−ＮＭＲにおいてＰ１構造に矛盾しないプロトンのシグナルが得られた（図９）。なお、１Ｈ−ＮＭＲで用いた溶媒は重ＤＭＳＯであった。以上より、合成Ｐ１はヘミン−過酸化水素由来Ｐ１と同一の構造を持つことが確認できた。【００８３】
試験例１２：有機合成により得られたＸＯＤ阻害物質の阻害活性の測定
試験例１１で得られた合成Ｐ１（純度９５％以上）のＸＯＤ阻害活性を測定したところ、阻害活性曲線はヘミン−過酸化水素由来Ｐ１と同様の阻害活性挙動を示した（図４）。
合成Ｐ１のＩＣ５０値は１．５６μｇ／ｍＬでアロプリノールのＩＣ５０値４２．８μｇ／ｍＬに比べ約２７倍の阻害活性を示した（表６）。【００８４】
【表６】
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試験例１３：有機合成により得られたＸＯＤ阻害物質のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
合成Ｐ１の高尿酸血症モデルラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ評価を行った。
具体的には、ラットにオキソン酸カリウムを腹腔内投与することにより、血中尿酸値を上昇させた高尿酸血症モデルラットを用いて血中尿酸の低下効果を試験した。試験では、５週齢の雄ラットに試験開始１時間前、開始１時間後、開始３時間後の３回、オキソン酸カリウムをラットの体重に対し２５０ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与した（オキソン酸カリウム群）。１回目のオキソン酸カリウム投与の１時間後に試料（合成Ｐ１）をラットの体重に対し１０ｍｇ／ｋｇになるように経口投与した（オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１群）。採血は合成Ｐ１投与後、０、０．５、１、２、３、４、６、８、２４時間に尾静脈から行った。血清尿酸値は尿酸Ｃテストワコー（和光純薬工業製）を用いて測定した。オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１群の結果を図１０、図１１に示す。データは、平均±標準誤差の値である。
その結果、オキソン酸カリウム群は未処理のコントロール群に比べ血中への尿酸の蓄積が認められるが、オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１群は、投与後０．５時間で顕著に血清尿酸値が低下し、投与後４時間までは尿酸の蓄積が殆どなく、投与後８時間までその効果が持続していた（図１０）。各測定時間の血清尿酸値について、オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１群は、投与後０．５〜８時間において、オキソン酸カリウム群に比べ有意（投与後１、４、６、８時間：Ｐ＜０．０１、投与後０．５、２、３時間：Ｐ＜０．０５）に血中への尿酸の蓄積を抑制していることが認められた（図１０）。この試験における合成Ｐ１投与後６時間までの血清尿酸値についてＡＵＣ（曲線下面積）を比較した（図１１）。オキソン酸カリウム群はコントロール群に比べ有意（Ｐ＜０．０１）に尿酸の蓄積が確認できるが、オキソン酸カリウム＋合成Ｐ１群は顕著に（Ｐ＜０．０１）尿酸の蓄積を抑制していることが認められた（図１１）。
これらの結果より、ＸＯＤ阻害物質Ｐ１は経口投与によって消化管を介しても、生体内において高い効果が得られることが認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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