(57)【要約】  本発明の課題は、細胞接着性に優れる脱細胞化組織を提供することである。本発明は、生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織を提供する。脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織は、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であってもよい。
2016136633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、
脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織。
【請求項２】
脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であることを特徴とする請求項１に記載の脱細胞化組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療に有用な脱細胞化組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
他人や異種の動物の生体組織由来の移植片を移植する場合、被移植者側組織による移植片の拒絶反応が問題となる。このような問題の解決方法として、人工組織の開発が期待されている。素材として種々の高分子が試されているが、これら素材と生体組織との適合性が低いため、移植片と生体組織との接合部位における脱落や感染症が発生する場合がある。そこで、生体組織との適合性を向上すべく、生体組織から細胞を除却して残存する支持組織である脱細胞化生体組織を移植片として使用する技術が開発されてきた。脱細胞化の程度は、脱細胞化組織中のＤＮＡの含量により判断することができ、脱細胞化組織中のＤＮＡ含量が少ないほど拒絶反応が起こりにくいことが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。また、生体組織を脱細胞化する方法としては、界面活性剤を使用する方法（例えば、特許文献１、２を参照）、酵素を使用する方法（例えば、特許文献３を参照）、酸化剤を使用する方法（例えば、特許文献４を参照）、高静水圧処理による方法（例えば、特許文献５〜７を参照）、凍結融解処理による方法（例えば、特許文献８〜９を参照）、高張電解質溶液で処理する方法（例えば、特許文献１０を参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６０−５０１５４０号公報
【特許文献２】特表２００３−５１８９８１号公報
【特許文献３】特表２００２−５０７９０７号公報
【特許文献４】特表２００３−５２５０６２号公報
【特許文献５】特開２００４−０９４５５２号公報
【特許文献６】国際公開第２００８／１１１５３０号パンフレット
【特許文献７】特表２０１３−５０２２７５号公報
【特許文献８】特開２００５−１８５５０７号公報
【特許文献９】特開２００５−２１１４８０号公報
【特許文献１０】特開２０１０−２２１０１２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔ．  Ｗ．  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５２．１  （２００９）  １３５−１３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
再生医療において脱細胞化組織を使用する場合には、拒絶反応がないことに加えて、組織の再生が速やかに行えるかどうかが問題になる。同一の生体に由来する生体組織から得られた脱細胞化組織であって、同様の程度まで細胞が除去された脱細胞化組織であっても、脱細胞化の方法や手順が異なる場合には、脱細胞化組織への宿主細胞の接着性、宿主細胞の誘引効果、脱細胞化組織内への宿主細胞の浸潤等の速度に違いがでる場合があり、組織の再生に大きな影響があった。【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、細胞接着性に優れる脱細胞化組織を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、生体由来組織の脱細胞化の前後の示差走査熱量測定における吸熱量の変化が少ない脱細胞化組織を使用した場合に、組織が速やかに再生されることを見出し、本発明を完成させた。具体的には、本発明は下記のものを提供する。【０００８】
（１）  生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、
脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織。【０００９】
（２）  脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であることを特徴とする（１）に記載の脱細胞化組織。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞接着性に優れる脱細胞化組織が提供される。該脱細胞化組織は、細胞毒性が低く、細胞の誘引効果や分化誘導効果を有し、組織の再生効果が高いことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脱細胞化前の生体由来組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。
【図２】実施例１の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。
【図３】実施例４の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。
【図４】比較例２の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
本発明の脱細胞化組織は、脱細胞化前の組織と比較して、示差走査熱量測定により測定される吸熱量があまり変化していないところに特徴がある。以下、本明細書では、示差走査熱量測定により測定される吸熱量を「ＤＳＣ吸熱量」という。生体由来組織やその脱細胞化組織では、５５〜７０℃の領域で吸熱がみられる。脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比を「脱細胞化吸熱量比」という。また、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比を「脱細胞化ＤＮＡ比」という。なお、生体由来組織や脱細胞化組織は、水分の吸収や乾燥により、質量が変化することがあることから、本発明では、脱細胞化ＤＮＡ比及び脱細胞化吸熱量比を、いずれも、生体由来組織及びその脱細胞化組織の乾燥質量を基準にしている。
【００１４】
〔脱細胞化吸熱量比〕
本発明の脱細胞化組織の脱細胞化吸熱量比は、０．７０以上であり、脱細胞化吸熱量比が０．７０よりも低い場合には、脱細胞化組織への細胞誘引性や細胞の分化誘導性が十分ではなく、脱細胞化組織による再生治療に悪影響がでる場合がある。脱細胞化吸熱量比は０．７２以上が好ましく、０．７４以上が更に好ましく、０．７７以上が最も好ましい。脱細胞化吸熱量比が０．７７以上であると、脱細胞化組織への細胞接着性を特に高めやすい点で好ましい。
【００１５】
脱細胞化吸熱量比の上限値は特に限定されないが、１．３以下、好ましくは１．２７以下、更に好ましくは１．２５以下、最も好ましくは１．２３以下であると、脱細胞化組織への細胞誘引性や細胞の分化誘導性が良好となりやすい点で好ましい。
【００１６】
脱細胞化吸熱量比を算出する場合には、示差走査熱量測定を行った後、測定に用いたサンプルの乾燥質量を測定して、乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量を算出し、脱細胞化前の組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量に対する、脱細胞化組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量から、脱細胞化吸熱量比を算出すればよい。なお、「サンプルを乾燥する」とは、サンプル中の水分含量が５質量％以下となるまでサンプルを乾燥させることをさす。サンプルを乾燥させる手段としては特に限定されないが、実施例で行った方法等が挙げられる。
（乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）＝（未乾燥試料のＤＳＣ吸熱量）×（乾燥後の試料の質量／（乾燥前の試料の質量））
（脱細胞化吸熱量比）＝（脱細胞化組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）／（脱細胞化前の組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）
【００１７】
生体由来組織の示差走査熱量測定における５５〜７０℃の領域の吸熱は組織中のコラーゲンの熱変形によるものと考えられる。コラーゲンは細胞外マトリクスの主成分であるが、生体由来組織中のすべてのコラーゲンが脱細胞化組織に保持されるとは限らず、脱細胞化する過程で、コラーゲンの一部が脱離する場合がある。本発明者らは、脱細胞化組織の、細胞の誘引効果や分化誘導効果は、脱細胞化組織のコラーゲンの含量と相関するものと想定していたが、必ずしも相関はなく、コラーゲンの含量が高くても細胞の誘引効果や分化誘導効果が低い脱細胞化組織があることや、脱細胞化組織の細胞接着性、細胞の誘引効果、及び分化誘導効果と、脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量との間に相関があり得ることを見出した。
【００１８】
生体組織中のコラーゲンはコラーゲンヘリックスと呼ばれる３重螺旋構造を有することが知られている。本発明者らは、生体由来組織や脱細胞化組織の５５〜７０℃の領域の吸熱は、３重螺旋構造をとるコラーゲンの、コラーゲンとコラーゲン又はコラーゲンと配位水との水素結合の開裂によるものであり、脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量は、脱細胞化組織のコラーゲンの含量ではなく、３重螺旋構造をとるコラーゲンの含量と相関するものと推定している。更に、本発明者らは、生体組織中のコラーゲンと同様の構造である、３重螺旋構造をとるコラーゲン含量が高い脱細胞化組織ほど、細胞の誘引効果や分化誘導効果が高いと推定している。
【００１９】
〔脱細胞化ＤＮＡ比〕
一般に脱細胞化組織のＤＮＡ含量は少ないことが好ましいとされているが、本発明の脱細胞化組織では、脱細胞化ＤＮＡ比は、０．３００以下であることが好ましい。脱細胞化ＤＮＡ比が０．３００を超える場合は、再生医療に使用した場合に拒絶反応が発生する場合がある。細胞の誘引効果や分化誘導効果の点から、本発明の脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比は、０．２００以下が好ましく、０．１５０以下が更に好ましく、０．０８０以下が最も好ましく、０．００５以下が特に好ましい。脱細胞化ＤＮＡ比が０．０８０以下であると、脱細胞化組織への細胞接着性を特に高めやすい点で好ましい。
【００２０】
脱細胞化ＤＮＡ比の下限は、低いほど好ましく、実現のしやすさから好ましくは０．００１以上、更に好ましくは０．００２以上である。
【００２１】
脱細胞化ＤＮＡ比を求めるためのＤＮＡ含量の測定方法は特に限定されず、公知の方法によればよく、例えば、タンパク質部分を酵素等で分解除去した後、ＤＮＡと特異的に結合する蛍光試薬組織を反応させて、蛍光強度を測定する方法（例えば、非特許文献１を参照）等により測定することができる。脱細胞化ＤＮＡ比は、乾燥質量を基準にした比であるから、ＤＮＡ含量の測定は組織を乾燥させてから行うことが好ましい。
（脱細胞化ＤＮＡ比）＝（乾燥した脱細胞化組織のＤＮＡ含量）／（乾燥した脱細胞化前の組織のＤＮＡ含量）
【００２２】
しかし、脱細胞化組織を乾燥してからＤＮＡ含量を測定する場合は、測定値の誤差が大きくなる場合があることから、別途乾燥前後の組織の質量の比（乾燥減量比）を測定しておき、未乾燥の状態で測定したＤＮＡ含量をこの乾燥減量比で補正して算出してもよい。
（乾燥減量比）＝（乾燥後の質量）／（乾燥前の質量）
（乾燥した組織のＤＮＡ含量）＝（未乾燥の組織のＤＮＡ含量）／（乾燥減量比）
【００２３】
〔生体組織〕
本発明の脱細胞化組織に使用する生体組織は、脊椎動物由来の生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜又はヒト由来の生体組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ、エミュー等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
【００２４】
生体組織の部位としては、細胞外にマトリクス構造を持った部位が使用でき、このような部位としては、例えば、肝臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃、食道、胃、小腸、大腸、肛門、膵臓、心臓、血管、脾臓、肺、脳、骨、脊髄、軟骨、精巣、子宮、卵管、卵巣、胎盤、角膜、骨格筋、腱、神経、皮膚等が挙げられる。生体組織の部位として、組織再生の効果が高いことから軟骨、骨、肝臓、腎臓、心臓、心膜、血管、皮膚、小腸粘膜下組織、肺、脳、及び脊髄が好ましい。
【００２５】
〔本発明の脱細胞化組織を得る方法〕
本発明の脱細胞化組織を得る方法は、脱細胞化吸熱量比が０．７〜１．３となる脱細胞化方法であれば、特に限定されない。
【００２６】
本発明の脱細胞化組織を得るのに好ましい方法としては、例えば、高静水圧処理による方法、凍結融解処理による方法等が挙げられ、脱細胞化ＤＮＡ比を下げることが容易であることから、高静水圧処理による方法が好ましい。
【００２７】
生体由来組織の高静水圧処理は、界面活性剤を含有する洗浄液中で行うことが好ましい。かかる場合の、界面活性剤の含量は、洗浄する生体由来組織や、界面活性剤の種類により異なるが、０．０１質量％以上２．００質量％以下が好ましく、０．０３質量％以上１．００質量％以下が更に好ましく、０．０５質量％以上０．５０質量％以下が最も好ましい。なお、高静水圧が印加された生体由来組織の洗浄に、核酸分解酵素及び界面活性剤を使用すると、洗浄効果を上げることができる。界面活性剤を含有する洗浄液を使用した後に、核酸分解酵素を使用すると、更に洗浄効果を上げることができる。
【００２８】
高静水圧処理による方法により、本発明の脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織に媒体中で５０〜１５００ＭＰａの静水圧を印加する。印加する静水圧が５０ＭＰａよりも低い場合には、脱細胞化が不十分となる場合があり、高静水圧処理後に界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄する工程での組織へのダメージが大きくなり、１５００ＭＰａを超える場合は印加に耐えられる圧力容器が必要であり、多大なエネルギーを要すると共に、印加に用いる媒体が水性媒体の場合には氷が生成し、生成した氷により組織がダメージを受ける場合がある。印加する静水圧は８０〜１３００ＭＰａが好ましく、９０〜１２００ＭＰａが更に好ましく、９５〜１１００ＭＰａが最も好ましい。
【００２９】
静水圧の印加に使用する媒体としては、水、生理食塩水、プロピレングリコール又はその水溶液、グリセリン又はその水溶液、糖類水溶液等が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。糖類水溶液の糖類としては、エリトロース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【００３０】
高静水圧処理の温度は、氷が生成せず、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、脱細胞処理が円滑に行われ組織への影響も少ないことから０〜４５℃が好ましく、４〜３７℃が更に好ましく、１５〜３５℃が最も好ましい。高静水圧処理の時間は、短すぎると細胞の破壊が十分行われず、長い場合にはエネルギーの浪費につながることから、高静水圧処理において、目的とする印加圧力を維持する時間は、５〜６０分が好ましく、７〜３０分が更に好ましい。
【００３１】
高静水圧が印加された生体組織は、組織中の細胞が破壊されており、この細胞は洗浄液により除去される。洗浄液は、高静水圧処理の媒体と同じでもよいし異なっていてもよい。洗浄液は、核酸分解酵素、有機溶媒又はキレート剤を含有することが好ましい。核酸分解酵素は、静水圧が印加された生体組織からの核酸成分、有機溶媒は脂質、それぞれの除去効率を向上させることができ、キレート剤は、脱細胞化組織中のカルシウムイオンやマグネシウムイオンを不活性化することにより、本発明の粒子化脱細胞化組織を疾患部に適用した場合の石灰化を防ぐことができる。有機溶剤としては、脂質の除去効果が高いことから、水溶性の有機溶剤が好ましく、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシドが好ましい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、３−ヒドロキシ−２，２’−イミノジコハク酸（ＨＩＤＡ）、ジカルボキシメチルアスパラギン酸（ＡＳＤＡ）等のイミノカルボン酸系キレート剤又はその塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸等のヒドロキシカルボン酸系キレート剤又はその塩が挙げられ、これらのキレート剤の塩としては、ナトリウム塩又はカリウム塩が挙げられる。
【００３２】
洗浄効率が上がることから、洗浄液は、界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤としては、脂肪酸石鹸、アルコシキカルボン酸塩、ポリオキシエチレンアルコシキカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、アシル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−アルキルサルコシン塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩等のアニオン性界面活性剤；
【００３３】
アルキルジメチルアミン、アルキルジエタノールアミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤；
【００３４】
アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミドプロピルスルホベタイン、アルキルイミダゾニウムベタイン、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）等の両性界面活性剤；
【００３５】
グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、トレハロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、アルキル（ポリ）グリセリンエーテル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド、アルキル（ポリ）グリコシド、アルキルマルトシド、アルキルチオグルコシド、アルキルマルトピラノシド、アルカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（ＢＩＧＣＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド（ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ）等のノニオン性界面活性剤が挙げられる。
【００３６】
界面活性剤としては、細胞の除去の点から、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキル（ポリ）グリコシドが好ましく、アルキルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキル（ポリ）グリコシドが更に好ましい。
【００３７】
高静水圧が印加された生体組織を洗浄する場合の温度は、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、洗浄性が良好で組織への影響も少ないことから０〜４５℃が好ましく、１〜４０℃が更に好ましく、２〜３５℃が最も好ましい。洗浄する場合には、必要に応じて、洗浄液を振盪又は撹拌してもよい。
【００３８】
凍結融解処理による方法により、本発明の脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織を−８０〜−２０℃、好ましくは−８０〜−４０℃の温度で１〜４８時間、好ましくは１０〜３０時間保持して凍結させた後、２０〜３７℃の温度で融解する工程を、１回又は２回以上、好ましくは２〜５回繰り返して行う。凍結融解処理された生体組織は、組織中の細胞が破壊されており、この細胞は洗浄液により除去される。洗浄の方法は、高静水圧処理における洗浄と同様の方法でよい。
【００３９】
脱細胞化ＤＮＡ比及び脱細胞化吸熱量比の測定は、宿主細胞の誘引、接着、浸潤等に優れた脱細胞化組織の選別方法として優れていることから、脱細胞化を製造する場合に、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３以下であることを確認する工程（即ち、脱細胞化ＤＮＡ比が０．３以下であることを確認する工程）と脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７〜１．３であることを確認する工程（即ち、脱細胞化吸熱量比が０．７〜１．３であることを確認する工程）を組み込むことにより、良好な脱細胞化組織得を製造することができる。脱細胞化ＤＮＡ比が０．３以下であることを確認する工程及び脱細胞化吸熱量比が０．７〜１．３であることを確認する工程は、脱細胞化組織を洗浄する工程の後であることが好ましく、脱細胞化組織を殺菌又は滅菌する工程がある場合には、脱細胞化組織を洗浄する工程の後、殺菌又は滅菌する工程の前であることが好ましい。
【００４０】
本発明の脱細胞化組織は、単独で適用してもよいし、疾患部位の再生・治癒効果のある他の成分と共に適用してもよい。このような他の成分としては、成長因子、プロテオグリカン又はグリコサミノグリカン、細胞、β−１，３−グルカン、メバロン酸等が挙げられる。
【００４１】
成長因子としては、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、造血促進因子（ＥＰＯ）、顆粒大食細胞成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒細胞成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、ヘパリン結合（ＥＧＦ）等が挙げられる。プロテオグリカン又はグリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン等が挙げられる。
【００４２】
本発明の脱細胞化組織は、そのまま移植に用いてもよいし、細胞を播種し培養してから用いてもよい。また、本発明の脱細胞化組織は、切断、スライス、粉砕してシート状、粒状、微粉末状、ゲル状等に加工して用いてもよく、脱細胞化組織がシート状である場合には、脱細胞化組織同士又は他のシート状のものと組み合わせて多層化して用いてもよく、管状に加工してもよい。
【００４３】
本発明によれば、細胞の誘引効果に優れる脱細胞化組織が提供される。脱細胞化組織の細胞の誘引効果は、実施例に記載した方法で脱細胞化組織を細胞接着性試験に供することで評価できる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。【００４５】
〔実施例１〕
ポリエチレン製チャック付き袋に、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（以下、該シート状の内膜を「内膜シート」という。）と、高静水圧処理の媒体として生理食塩水と、を入れ、研究開発用高圧処理装置（神戸製鋼製、商品名：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて、１００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。高静水圧処理した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより洗浄し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例１の脱細胞化組織を得た。【００４６】
〔実施例２〕
実施例１において、ＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中での振盪時間を９６時間から８時間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い実施例２の脱細胞化組織を得た。【００４７】
〔実施例３〕
内膜シートを、ドライアイスで凍結させ、ドライアイスを入れた保冷箱中（約−７８℃）で２０時間保存した後、２５℃で溶解させた。この凍結融解を３回繰り返した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例３の脱細胞化組織を得た。【００４８】
〔実施例４〕
内膜シートを、０．１質量％のドデシルスルホン酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）を含有する生理食塩水中、２５℃で９６時間振盪することにより脱細胞した。ＳＤＳ処理した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例４の脱細胞化組織を得た。【００４９】
〔実施例５〕
実施例１と同様の方法で、内膜シートに対し、１０００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。高静水圧処理した内膜シートを、０．１質量％のドデシルスルホン酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）を含有する生理食塩水中、２５℃で８時間振盪し、次いで、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、２５℃で２４時間振盪することにより洗浄した。更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例５の脱細胞化組織を得た。【００５０】
〔実施例６〕
実施例５において、高静水圧処理の静水圧を１０００ＭＰａから４００ＭＰａに変更した以外は実施例５と同様の操作を行い実施例６の脱細胞化組織を得た。【００５１】
〔実施例７〕
実施例５において、高静水圧処理の静水圧を１０００ＭＰａから６００ＭＰａに変更した以外は実施例５と同様の操作を行い実施例６の脱細胞化組織を得た。【００５２】
〔実施例８〕
実施例１において、高静水圧処理の静水圧を１００ＭＰａから６００ＭＰａに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い実施例８の脱細胞化組織を得た。【００５３】
〔比較例１〕
実施例４において、ＳＤＳの濃度を０．１質量％から、１質量％に変更した以外は実施例４と同様の操作を行い比較例１の脱細胞化組織を得た。【００５４】
〔比較例２〕
実施例４において、０．１質量％のＳＤＳを含有する生理食塩水を１質量％のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル：以下、ＴＸ）を含有する生理食塩水に変更した以外は実施例４と同様の操作を行い比較例２の脱細胞化組織を得た。【００５５】
〔比較例３〕
比較例２において、ＴＸの濃度を１質量％から、０．１質量％に変更した以外は比較例３と同様の操作を行い比較例３の脱細胞化組織を得た。【００５６】
〔比較例４〕
内膜シートを、生理食塩水中で、超音波処理（強度：１０Ｗ／ｃｍ２  、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）した。超音波処理した内膜シートについて、比較例２と同様の操作を行い、比較例４の脱細胞化組織を得た。【００５７】
〔比較例５〕
比較例４において、ＴＸの濃度を１質量％から、０．１質量％に変更した以外は比較例５と同様の操作を行い比較例５の脱細胞化組織を得た。【００５８】
〔比較例６〕
リン酸緩衝液に、ＣＨＡＰＳ、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡをそれぞれ、８ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した液を、脱細胞化液とした。内膜シートを、この脱細胞化液中、２５℃で９６時間振盪することにより脱細胞し、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、２５℃で２４時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、比較例６の脱細胞化組織を得た。【００５９】
〔脱細胞化ＤＮＡ比の算出〕
各脱細胞化組織の質量を測定し、これを試験片とし、タンパク質分解酵素溶液に浸漬して溶解した後、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをピコグリーン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により蛍光染色して蛍光強度を測定することによりＤＮＡを定量し、試験片の質量とＤＮＡの量から、試験片のＤＮＡ含量を算出した。なお、ＤＮＡの定量には、ピコグリーンに添付された標準ＤＮＡを用いて作成した検量線を用いた。別の試験片を用いて、試験片の質量と乾燥した試験片（６０℃の恒温槽に１２時間保存したもの）の質量とから、乾燥減量比を求め、試験片のＤＮＡ含量と乾燥減量比から、試験片の乾燥質量あたりのＤＮＡ含量を算出した。
（試験片のＤＮＡ含量）＝（ＤＮＡの量）／（試験片の質量）
（乾燥減量比）＝（乾燥した試験片の質量）／（試験片の質量）
（乾燥試験片のＤＮＡ含量）＝（試験片のＤＮＡ含量）／（乾燥減量比）【００６０】
内膜シートの乾燥試験片のＤＮＡ含量と脱細胞化組織の乾燥試験片のＤＮＡ含量の比から脱細胞化ＤＮＡ比の算出した。結果を表１に示す。
（脱細胞化ＤＮＡ比）＝（脱細胞化組織の乾燥試験片のＤＮＡ含量）／（内膜シートの乾燥試験片のＤＮＡ含量）【００６１】
〔脱細胞化吸熱量比の算出方法〕
３ｍｍ×３ｍｍに切断した試験片を、質量を測定したアルミ製の試料パンに入れ、示差走査熱量測定機（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＲＥＤＯ社製、型式ＤＳＣ１）を用い、測定開始温度２５℃、昇温速度３℃／分、測定終了温度９０℃の条件で示差走査熱量を測定した。５５〜６８℃の領域にコラーゲン由来とみられる吸熱がみられることから、この吸熱量を試験片の吸熱量とした。脱細胞化前の生体由来組織、実施例１及び４の脱細胞化組織、比較例２の脱細胞化組織の吸熱量をそれぞれ図１〜４に示す。吸熱量の測定後の試料パンは穴を開けて、６０℃の恒温槽に１２時間保存して乾燥させてから、乾燥した試験片が入った試料パンの質量を測定し、下記の式より試験片の乾燥質量あたりの吸熱量を算出した。
（試験片の乾燥質量あたりの吸熱量）＝（吸熱量）／｛（乾燥した試験片が入った試料パンの質量）−（試料パンの質量）｝【００６２】
内膜シートの乾燥質量あたりの吸熱量と脱細胞化組織の乾燥質量あたりの吸熱量から下記の式により脱細胞化吸熱量比を算出した。結果を表１に示す。
（脱細胞化吸熱量比）＝（脱細胞化組織の乾燥質量あたりの吸熱量）／（内膜シートの乾燥質量あたりの吸熱量）【００６３】
〔細胞接着性試験〕
実施例１〜７又は比較例１〜６の脱細胞化組織を、直径６ｍｍの生検トレパンを用いて円盤状に切り抜いたものを試験片とした。円盤状試験片の内膜側を上にして９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｄｉｓｈに設置し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ培地で３７℃で１２時間、前培養した。ＭＥＭ培地を除去した後、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種（２．７×１０３細胞／ｗｅｌｌ）し、３７℃で３時間培養した。試験片から、付着していない細胞をリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄及び除去した後、試験片をＷｓｔ−８（同人化学研究所製）で染色し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。別途、ＮＨＤＦの数と、Ｗｓｔ−８により染色した場合の検量線を作成しておき、試験片の吸光度と検量線から、試験片に付着したＮＨＤＦ数を算出した。結果を表１に示す。【００６４】
【表１】
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【００６５】
表１の結果から、実施例の脱細胞化組織はいずれも、比較例の脱細胞化組織に比べて細胞接着数が多く、細胞の誘引効果に優れて、組織の再生効果が高いことが示唆される。【００６６】
〔実施例９〜１２、比較例７〜１０〕
実施例１〜８、比較例１〜６で使用したブタ大動脈内膜シート以外の生体組織について、本発明の脱細胞化組織の製造例を実施例９〜１２に示す。また比較の製造例を比較例７〜１０に示す。実施例の脱細胞化組織はいずれも、比較例の脱細胞化組織に比べて細胞接着数が多く、細胞の誘引効果に優れていた。【００６７】
〔実施例９〕
実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの大動脈そのものを使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例９の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００６８】
〔実施例１０〕
実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの皮膚（真皮を含む）を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１０の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００６９】
〔実施例１１〕
実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの心膜を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１１の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７０】
〔実施例１２〕
実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ウシの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１２の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７１】
〔比較例７〕
比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの大動脈そのものを使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例７の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７２】
〔比較例８〕
比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの皮膚（真皮を含む）を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例８の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７３】
〔比較例９〕
比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの心膜を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例９の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７４】
〔比較例１０〕
比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ウシの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例１０の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。【００７５】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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