(57)【要約】  飼料の機能性を向上できる家畜用飼料効率改善剤、家畜用増体促進飼料、家畜の飼育方法、及びメタン発生抑制方法を提供する。本発明の家畜用飼料効率改善剤は、コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理されている。コーヒー成分は、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル体から選ばれる少なくとも一種を含んでもよい。バクテリオシン産生乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる少なくとも一種でもよい。家畜は、反芻動物でもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理された家畜用飼料効率改善剤。
【請求項２】
前記コーヒー成分は、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル体から選ばれる少なくとも一種を含む請求項１に記載の家畜用飼料効率改善剤。
【請求項３】
前記バクテリオシン産生乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる少なくとも一種である請求項１又は２に記載の家畜用飼料効率改善剤。
【請求項４】
前記家畜は、反芻動物である請求項１〜３のいずれか一項に記載の家畜用飼料効率改善剤。
【請求項５】
コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理された発酵成分を含有する家畜用増体促進飼料。
【請求項６】
前記コーヒー成分は、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル体から選ばれる少なくとも一種を含み、
前記バクテリオシン産生乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる少なくとも一種である請求項５に記載の家畜用増体促進飼料。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の家畜用飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌する家畜の飼育方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の家畜用飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌し、家畜を飼育するメタン発生抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コーヒー成分を含む家畜用飼料効率改善剤及び家畜用増体促進飼料、並びに家畜の飼育方法及びメタン発生抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、例えば食品・外食産業から、大量の食品残渣、例えば食品製造副産物等が廃棄されている。その食品残渣の多くは、焼却又は埋め立て処理されているのが現状である。そこで、従来より、資源の有効活用の観点から、食品残渣を食品循環資源として飼料化する方法が検討されている。食品残渣の有効利用は、環境負荷の低減を図る観点からも有効である。【０００３】
近年においては、世界的にコーヒーの消費拡大に伴い、その製造廃棄物の処理が問題となっている。コーヒー豆粕は、水分及び繊維質の含有量が高いため、直接焼却処理したり、飼料に再利用することは困難であった。例えば、特許文献１は、コーヒーの製造廃棄物を有効に使用しようとする試みとして、コーヒー豆粕を利用した家畜用飼料について開示する。この家畜用飼料は、コーヒー豆粕とバチルス属等の生菌剤を混合し、その後、好気的状況下で発酵させた飼料であり、発酵前よりもカフェイン含量が低下し、家畜にとっての嗜好性が改善されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１７９９１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、特許文献１に開示される家畜用飼料は、コーヒー豆粕の嗜好性の改善等、コーヒー豆粕の飼料への転用について検討したものであり、飼料の機能性を向上させることについては十分に検討されていない。【０００６】
本発明の目的とするところは、飼料の機能性を向上できる家畜用飼料効率改善剤、家畜用増体促進飼料、家畜の飼育方法、及びメタン発生抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、バクテリオシン産生乳酸菌を用いて発酵処理したコーヒー豆粕等により、飼料の機能性を向上できることを見出したことに基づくものである。
上記目的を達成するために本発明の一態様の家畜用飼料効率改善剤は、コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理されたことを特徴とする。【０００８】
前記コーヒー成分は、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル体から選ばれる少なくとも一種を含むことが好ましい。前記バクテリオシン産生乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。前記家畜は、反芻動物であることが好ましい。【０００９】
本発明の別態様である家畜用増体促進飼料は、コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理された発酵成分を含有することを特徴とする。前記コーヒー成分は、ヒドロキシ桂皮酸及びそのエステル体から選ばれる少なくとも一種を含み、前記バクテリオシン産生乳酸菌が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。【００１０】
本発明の別態様である家畜の飼育方法は、前記家畜用飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌することを特徴とする。
本発明の別態様であるメタン発生抑制方法は、前記家畜用飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌し、家畜を飼育することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、家畜用飼料に対して優れた機能性の向上効果を付与できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例５における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の写真。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（第１実施形態）
以下、本発明の家畜用飼料効率改善剤（以下、単に「飼料効率改善剤」という）を具体化した第１実施形態を詳細に説明する。本実施形態のコーヒー成分を含み、特定の乳酸菌により発酵処理されている飼料効率改善剤は、家畜用飼料に適用されることにより、飼料効率を改善する。コーヒー成分とは、コーヒー生豆又は焙煎されたコーヒー豆中に含有される成分であり、その典型例はコーヒーポリフェノールである。コーヒーポリフェノールとしては、例えばヒドロキシ桂皮酸、そのエステル体等が挙げられる。ヒドロキシ桂皮酸の具体例としては、例えば、コーヒー酸、ケイ皮酸、クロロゲン酸等が挙げられる。飼料効率改善剤中に含まれるコーヒー成分は、一種のみであってもよいし、二種以上の組み合わせであってもよい。
【００１４】
飼料効率改善剤中におけるコーヒー成分は、コーヒー成分を含有する素材に由来するものである。コーヒー成分を含有する素材としては、入手容易性の観点からコーヒー豆が好ましく使用される。コーヒー豆の種類としては、特に限定されず、公知のものを使用することができる。具体的には、アラビカ種、カネフォーラ種ロブスタ、コニロン又はリベリカ種、それらの雑種等が挙げられる。コーヒー豆は、生豆の状態でもよいし、焙煎等の熱処理した状態で使用することもできる。また、コーヒー成分を含有する素材として、焙煎コーヒー豆から公知の抽出方法に従って得られたコーヒーエキス、及び焙煎コーヒー豆からコーヒーエキスを抽出した後の残渣（コーヒー豆粕）等が用いられてもよい。コーヒーエキスの抽出方法は、特に限定されず、例えば水（熱水）抽出、アルコール抽出、及び含水アルコール抽出等の溶媒抽出、蒸気抽出、並びに超臨界抽出等が挙げられる。それぞれ公知の抽出方法を採用することができる。これらのコーヒー成分を含有する素材は、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのコーヒー成分を含有する素材の中で、資源の有効活用の観点からコーヒー豆粕が好ましく用いられる。
【００１５】
飼料効率改善剤は、コーヒー成分を含有する素材をバクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理することにより得られる。乳酸菌の中には、バクテリオシンと称される抗菌ペプチドを生産するものが存在する。例えば、バクテリオシンとして、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus. lactis subsp. lactis）によって生産されるナイシンＡが広く知られている。本実施形態において用いられるバクテリオシン産生乳酸菌は、コーヒー成分の存在下においてバクテリオシンを産生する乳酸菌であればいずれであってもよく、バクテリオシンの産生能力に優れるラクトバチルス属が好ましい。より具体的には、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus. acidophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus. amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus. brevis）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus. crispahtus）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactobacillus. delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus. fermenturm）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus. gasseri）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus. pentosus）等が挙げられる。これらのバクテリオシン産生乳酸菌は、一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのラクトバチルス属乳酸菌の中で、酸性条件下におけるバクテリオシンの産生能力に優れ、さらにはコーヒーポリフェノールが含まれる環境下においても増殖特性に優れるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、及びラクトバチルス・ブレビスがより好ましく使用される。
【００１６】
コーヒー成分を含有する素材にバクテリオシン産生乳酸菌を混合して混合物を調製した後、発酵処理が行われる。発酵処理は、好ましくは嫌気条件下で行われる。発酵処理は、静置した状態で行っても、撹拌しながら行ってもよい。また、処理時間の短縮及び処理労力の低減の観点から、好ましくは公知の家畜用飼料の原料処理装置を使用してもよい。また、必要に応じて、混合物中にその他成分として有機質資材、ｐＨ調整剤として有機酸等を配合してもよい。有機質資材は、混合物中に糖分を付与し、発酵を促進するために配合してもよい。有機質資材の具体例としては、例えば豆乳粕、油粕、米糠、ふすま、コーンスティープリカー、黒砂糖、大豆油粕、酵母エキス粕、ビール粕等が挙げられる。これらの有機質資材は、一種のみを使用してもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。有機酸は、ｐＨを酸性側に低下させ、発酵処理中における腐敗菌の発生を抑制するために配合してもよい。有機酸の具体例としては、例えばクエン酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、プロピオン酸、これらの有機酸の塩等が挙げられる。これらの有機酸は、一種のみを使用してもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００１７】
発酵条件は、乳酸菌の種類により適宜設定することができる、発酵温度は、乳酸菌の増殖が可能な温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは２５〜４０℃である。発酵時間は、乳酸菌の種類及び発酵温度に応じ適宜設定することができるが、好ましくは１〜１４日、より好ましくは２〜４日程度が好ましい。発酵時間が短いと乳酸菌が十分に増殖することができず、発酵時間が長いと乳酸菌の増殖が衰退期に入り発酵処理速度は減少する。
【００１８】
上記のようにして得られた飼料効率改善剤は、そのまま家畜に投与又は給餌してもよく、家畜用飼料に混合して投与又は給餌してもよい。家畜としては、例えば牛、豚、馬、羊、ヤギ、鳥等が挙げられる。また、家畜の用途としては、特に限定されず、食肉用、搾乳用、採毛・皮革用等のいずれであってもよい。これらの中で、牛、ヤギ、羊等の反芻動物用の飼料として適用されることが好ましい。飼料効率改善剤は、反芻動物の胃、特に第１胃（ルーメン）の中に存在する微生物による発酵作用を改善し、その結果、摂取した飼料がより効率よく家畜体内で利用されることを可能にする。
【００１９】
本実施形態の飼料効率改善剤は、摂取されることにより、摂取された飼料の機能性を向上する作用、すなわち優れた飼料効率の改善作用を発揮する。本実施形態の飼料効率改善剤を搾乳用家畜に適用した場合、飼料効率の改善により、搾乳量の増加、乳質の改善等の効果が期待される。また、食肉用家畜に適用した場合、酸化による肉質の低下を抑制して肉質を維持、改善する等の効果が期待される。また、投与又は給餌された家畜の増体、体質・体調の改善等の効果も期待される。
【００２０】
本実施形態の飼料効率改善剤によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態の飼料効率改善剤は、コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理されている。したがって、飼料効率の改善効果として、搾乳用の家畜に適用した場合は、搾乳量の増加、乳質の改善等の効果、食肉用家畜に適用した場合は、酸化による肉質の低下を抑制して肉質を維持、改善する等の効果が期待される。また、飼料効率の改善効果として、投与又は給餌された家畜の増体、体質・体調の改善等の効果も期待される。
【００２１】
（２）バクテリオシン産生乳酸菌としてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス、又はラクトバチルス・ブレビスを使用した場合には、コーヒーポリフェノールとしてヒドロキシ桂皮酸又は／及びそのエステル体を含む素材が発酵原料として適用された場合であっても、バクテリオシン産生乳酸菌による発酵が阻害されることなく、発酵処理が促進される。それにより、例えばコーヒー豆粕等のコーヒー成分を含有する素材は、飼料の機能性をより向上させる素材へと変化しうる
（３）本実施形態の飼料効率改善剤を反芻動物に投与又は給餌した場合、反芻動物の胃の中に存在する微生物による発酵作用が改善され、その結果、摂取した飼料がより効率よく家畜体内で利用されるようになる。
【００２２】
（４）コーヒー成分を含有する素材としてコーヒー豆粕を使用した場合、熱湯で抽出された直後のコーヒー残渣は、水分が高く、そのままの状態で飼料として適用することは、長期的な保存において腐敗する可能性があった。しかしながら、バクテリオシン産生乳酸菌による乳酸発酵処理により、発酵素材のｐＨが低下し、その結果、長期的な保存が可能となるまた、コーヒー豆粕の利用により、安価に飼料効率改善剤を提供することができ、資源の有効活用を図ることができる。
【００２３】
（５）例えば、ポリフェノールを多く含む食品残渣として、茶飲料の製造残渣が挙げられる。茶葉に含まれるポリフェノール、例えばカテキン、エピカテキン等は、その化学的性質によりタンニンと呼ばれている。タンニンは、タンパク質及び金属イオンと強く結合した不溶性物質となることが知られている。タンニンは、例えば、反芻動物の消化管内において飼料の栄養成分として給与されたタンパク質とルーメン内においてタンニン−タンパク質複合体を形成し、消化阻害を起こすことが知られている。したがって、茶の動物への摂取を難しくさせている。一方、コーヒー豆中にも、コーヒーポリフェノールとして、クロロゲン酸、又はクロロゲン酸の分解物質、例えばキナ酸、コーヒー酸、クマル酸、フェルラ酸等が含有されることが知られている。しかしながら、コーヒーポリフェノールは、タンニンの様にタンパク質と複合体を作ることはないため、家畜等の動物に対し、容易に適用することができる。
【００２４】
尚、上記第１実施形態は以下のように変更してもよい。
・コーヒー成分を含み、バクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理された発酵成分を家畜用増体促進飼料、搾乳家畜用の搾乳量増加剤又は乳質改善剤として構成して利用してもよい。
【００２５】
・上記実施形態の飼料効率改善剤は、本発明の効果及び使用目的を阻害しない範囲内において、その他の添加剤、例えば、賦形剤、各種ビタミン、各種ミネラル、栄養補助成分等を適宜配合してもよい。
【００２６】
（第２実施形態）
以下、本発明の家畜の飼育方法を具体化した第２実施形態を詳細に説明する。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明する。
【００２７】
本実施形態の家畜の飼育方法は、上記第１実施形態の飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌する方法を含んでなる。飼料としては、特に限定されず、家畜の種類に応じて公知の家畜用飼料を適宜採用することができる。
【００２８】
家畜用飼料と飼料効率改善剤の混合割合は、飼料効率改善作用の向上の観点、経済性の観点、及び嗜好性の観点から、質量比で好ましくは１００：０．１〜１０、より好ましくは１００：１〜５である。
【００２９】
本実施形態の家畜の飼育方法は、飼料効率改善剤が家畜用飼料とともに家畜に投与又は給餌されることにより、より優れた飼料効率の改善作用を発揮する。特に、反芻動物の胃の中に存在する微生物による発酵作用を改善し、メタンの発生を抑制する。より具体的には、反芻動物の胃のルーメン内の古細菌の減少、プロピオン酸の増加、アンモニアの減少等により、胃内の環境を有意に改善させる。
【００３０】
本実施形態に係る家畜の飼育方法は、第１実施形態の効果に加えて以下の利点を有する。
（６）本実施形態の家畜の飼育方法によれば、飼料効率改善剤が飼料とともに家畜に投与又は給餌されるため、より優れた飼料効率の改善作用を発揮する。
【００３１】
（７）本実施形態の家畜の飼育方法を反芻動物に対して適用した場合、飼料効率改善剤が家畜用飼料とともに摂取されることにより、反芻動物の胃の中に存在する微生物による発酵作用が改善され、メタンの発生が抑制される。それにより、搾乳量の増加、乳質の改善等の効果、家畜の増体効果等の飼料効率の改善効果を、より効果的に発揮することができる。
【００３２】
（８）飼料効率改善剤が飼料に混合されたとしても、飼料の可消化養分総量（ＴＤＮ）を低下させることがない。つまり、コーヒー成分を含有する素材がバクテリオシン産生乳酸菌により発酵処理されることにより、コーヒー成分を含有する素材の飼料成分としての価値を向上させることができる。
【００３３】
尚、上記第２実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記第１実施形態の飼料効率改善剤を飼料に混合し、家畜に投与又は給餌し、家畜を飼育するメタン発生抑制方法として構成してもよい。
【実施例】
【００３４】
次に、実施例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。尚、本発明は、実施例欄に記載の構成に限定されるものではない。
＜試験例１：バクテリオシン産生乳酸菌の選定＞
下記実験１−１，２−１により、各種乳酸菌を所定環境下で培養し、増殖の有無について評価した。下記実験１−２，２−２により、バクテリオシン様物質の産生の有無について評価した。【００３５】
（実験１−１）
まず、下記表１に示される各種乳酸菌をそれぞれＭＲＳ培養液（DIFCO社製）にて３７℃で１６時間前培養した。次に、コーヒーポリフェノールとしてクロロゲン酸０．５水和物（ナカライテスク社製)を０．１質量％添加したＭＲＳ培養液を新たに調製した。クロロゲン酸入りＭＲＳ培養液に、前培養した各種乳酸菌をそれぞれ１％(ｖ／ｖ）接種し、３７℃にて１８〜２４時間培養した。乳酸菌の増殖の有無は、培養液の濁度（吸光度６６０ｎｍ）を測定することにより判断した。濁度を表１中の実験１−１欄に示す。【００３６】
（実験１−２）
まず、上記実験１−１において濁度を測定した培養液を遠心し、上清を採取した。得られた上清をペプトン食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で１００倍に希釈した。乳酸菌としてラクトバチルス属を培養した培養液の場合、バシルス・サブティリス（Bacillus. subtilis PCI 216）を塗抹した普通寒天培地に、希釈した上清を５０μＬスポットし、３７℃２４時間培養し、バクテリオシン様物質の産生による阻害域形成（ハロー形成）の有無を観察した。乳酸菌としてラクトコッカス属を培養した培養液の場合、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus. plantarum ATCC14917T）を塗抹した普通寒天培地に、希釈した上清を５０μＬスポットし、３７℃２４時間培養し、ハロー形成の有無を観察した。各乳酸菌のハロー形成の有無（＋，−）を表１中の実験１−２欄に示す。【００３７】
（実験２−１）
ＭＲＳ培養液について、乳酸を用いてｐＨ３．８に調整し、実験１−１欄において前培養した各種乳酸菌を１％（ｖ/ｖ）接種した以外、実験１−１と同様の方法により実験を行い、乳酸菌の増殖の有無を判断した。濁度を表１中の実験２−１欄に示す。【００３８】
（実験２−２）
上記実験２−１において濁度を測定した培養液を遠心し、上清を採取した。得られた上清をペプトン食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で１００倍に希釈した。ハロー形成の有無は、実験１−２と同様の方法により実験を行い、判断した。各乳酸菌のハロー形成の有無を表１中の実験２−２欄に示す。【００３９】
【表１】
2018003034.tif 000002
表１の実験２−１欄に示されるように、コーヒーポリフェノールとしてクロロゲン酸を含む培養液において、８種の乳酸菌においてハロー形成が認められた。実験２−２欄に示されるように、培養環境が、酸性条件下の場合、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス及びラクトバチルス・ブレビスの２種についてハローの形成が認められた。【００４０】
＜試験例２：コーヒー豆粕を用いた飼料効率改善剤の調製＞
コーヒー成分を含有する原料素材としてコーヒー豆粕を使用し、飼料効率改善剤を調製した。コーヒー豆粕の他、乳酸菌の発酵を促進するために糖分として豆乳搾出後の豆粕（豆乳粕）、及びフスマを添加した。原料混合物を酸性に調整し、発酵時の腐敗を防止するために、ｐＨ調整剤として食酢を添加した。バクテリシン産生乳酸菌として、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス及びラクトバチルス・ブレビスの２種により発酵処理された乳酸菌混合飼料を使用した。下記表２に示される各原料を混合し、脱気し、３７℃、１４日間暗所により撹拌せず発酵処理することにより飼料効率改善剤を得た。【００４１】
【表２】
2018003034.tif 000003
（含有成分）
発酵処理により得られた飼料効率改善剤の含有成分として、可消化養分総量（ＴＤＮ）及び粗タンパク質（ＣＰ）を測定した。ＴＤＮは、飼料中に含まれる家畜によって消化吸収される養分量を合計した値を示し、値が高いほど飼料のエネルギー含量が高いことを示す。比較のため、発酵処理前の混合物についても同様にＴＤＮ及びＣＰについて測定した。結果を表３に示す。【００４２】
【表３】
2018003034.tif 000004
表３に示されるように、バクテリオシン乳酸菌を用いた発酵処理により、コーヒー豆粕のＴＤＮ及びＣＰが向上したことが確認された。【００４３】
（抗菌活性）
発酵処理により得られた飼料効率改善剤について、抗菌活性を測定した。飼料効率改善剤１ｇ及び比較対称として発酵処理前の混合物１ｇをそれぞれＰＢＳで１０倍希釈し、上清を採取した。日本化学療法学会標準法にて最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。検定菌としてはバシルス・サブティリス（Bacillus. subtilis PCI 219）を用いた。また、陽性コントロールとして、マクロライド系抗生物質で知られるエリスロマイシンを使用した。【００４４】
その結果、飼料効率改善剤をＰＢＳで希釈した上清のＭＩＣは、エリスロマイシン１．５６μｇ／ｍＬと同等の抗菌活性を有していることが確認された。なお、発酵処理前の混合物は、抗菌活性が認められなかった。【００４５】
＜試験例３：飼料効率改善剤を用いた飼料の給餌試験＞
試験例２において得られた飼料効率改善剤を用いて、飼料効率改善剤入り飼料（以下、「コーヒー含有飼料」という）を調製した。コーヒー含有飼料は、表４に示される各原料を混合することにより調製した。比較対照として、表４に示される原料を混合し、飼料効率改善剤を含まない飼料（対照飼料）を調製した。得られた各飼料中の含有成分として、乾物中のＴＤＮ及びＣＰをそれぞれ求めた。各飼料の原料の含有量と、含有成分としてＴＤＮ及びＣＰ値をそれぞれ表４に示す。【００４６】
【表４】
2018003034.tif 000005
（給餌試験１）
得られた各飼料を乳牛（ホルスタイン種：経産数２〜３）に給餌し、飼料効率改善作用として搾乳量について評価した。各給餌群は、個体数をそれぞれ４頭とし、１ヶ月間給餌した。給餌期間１ヶ月間の一頭当たりの平均飼料摂取量（ｋｇ／ｄａｙ）と平均搾乳量（ｋｇ／ｄａｙ）をそれぞれ求めた。給餌期間経過後の平均体重、及び搾乳した牛乳の乳成分の含有量をそれぞれ測定した。結果を表５に示す。【００４７】
【表５】
2018003034.tif 000006
表５に示されるように、コーヒー含有飼料給餌群は、対照飼料給餌群に対して体重当たりの搾乳量の大幅な増加が確認された。したがって、コーヒー含有飼料の摂取により飼料効率の改善作用が確認された。なお、コーヒー含有飼料給餌群において、牛乳の品質に影響を与えるような乳成分の変化は認められなかった。【００４８】
（給餌試験２）
コーヒー含有飼料を北海道の牧場で飼育されている乳牛（約１７５０頭、ホルスタイン種：経産数２〜３）に給餌し、飼料効率改善作用として搾乳量について評価した。２０１３年１２月から給餌を開始し、２０１５年４月までの期間において、各月における一頭当たりの平均搾乳量（ｋｇ／ｄａｙ）、及び搾乳した牛乳の乳成分の含有量をそれぞれ求めた。なお、比較をより容易にするため、前年同月における各評価項目の変化率（前年同月比）を併せて示す。また、各月における乳牛の平均体重がほぼ同じになるように調整している。結果を表６に示す。【００４９】
【表６】
2018003034.tif 000007
表６に示されるように、給餌開始月（２０１３年１２月）から搾乳量が増加していることが確認される。また、前年同月比より、給餌期間が長くなるにつれて、搾乳量が増加傾向を示すことが確認された。したがって、コーヒー含有飼料の摂取により、飼料効率の改善作用が確認された。また、コーヒー含有飼料の長期的な継続摂取により、飼料効率の改善作用がより向上することが確認された。なお、コーヒー含有飼料給餌群において、牛乳の品質に影響を与えるような乳成分の変化は認められなかった。【００５０】
（給餌試験３）
コーヒー含有飼料又は対照飼料を熊本県内の牧場で飼育されている乳牛（ホルスタイン種：経産数２〜３）に給餌し、飼料効率改善作用として搾乳量について比較評価した。２０１５年７月から給餌を開始し、同年８月までの期間において、各月における一頭当たりの平均搾乳量（ｋｇ／ｄａｙ）をそれぞれ求めた。熊本県内の牧場として、牧場Ａ（鹿本地区約２００頭）、牧場Ｂ（鹿本地区約１００頭）、牧場Ｃ（玉名地区約８０頭）、牧場Ｄ（玉名地区約４０頭）、牧場Ｅ（熊本地区約５０頭）、牧場Ｆ（熊本地区約５０頭）、牧場Ｇ（菊池地区約６０頭）、牧場Ｈ（菊池地区約８０頭）に協力頂いた。コーヒー含有飼料は、牧場Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇの各乳牛に給餌した。対照飼料は、牧場Ｂ，Ｄ、Ｆ，Ｈの各乳牛に給餌した。なお、比較のため、給餌直前の６月の平均搾乳量、２０１３年、２０１４年の同月における各平均搾乳量も併せて示す。なお、各月における乳牛の平均体重がほぼ同じになるように調整している。結果を表７〜１０にそれぞれ示す。【００５１】
また、コーヒー含有飼料を給餌した牧場Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇの各乳牛より得られた牛乳について、２０１５年８月における各乳成分の含有量を求めた。結果を表１１に示す。なお、比較のため前年同月における各乳成分の含有量も併せて示す。【００５２】
【表７】
2018003034.tif 000008
【００５３】
【表８】
2018003034.tif 000009
【００５４】
【表９】
2018003034.tif 000010
【００５５】
【表１０】
2018003034.tif 000011
【００５６】
【表１１】
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表７〜１０に示されるように、コーヒー含有飼料を給餌した各牧場の平均搾乳量は、同じ地区の対照飼料を給餌した各牧場の同月の平均搾乳量と比較して増加していることが確認される。また、同じ牧場の前年又は前々年の同月の平均搾乳量と比較しても増加していることが確認される。なお、表１１に示されるように、コーヒー含有飼料給餌群において、牛乳の品質に影響を与えるような乳成分の変化は認められなかった。【００５７】
（給餌試験４）
試験例２で得られた飼料効率改善剤を育成牛（Ｆ１オス）に給餌し、飼料効率改善作用として増体について評価した。表１２に示される組成で、飼料効率改善剤を配合飼料に添加して調製された飼料を給餌した群（コーヒー含有飼料給餌群）と、飼料効率改善剤を添加しない配合飼料を給餌した群（対照飼料給餌群）に分けた。各群の個体数は５頭とした。本試験で用いた配合飼料中のＣＰの含有量は１６質量％、ＴＤＮは７２質量％である。３，５，７，９月齢の育成牛の平均体重を求めた。結果を表１２に示す。【００５８】
【表１２】
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表１２に示されるように、コーヒー含有飼料給餌群は、対照飼料給餌群よりも肥育牛の増体量が大きいことが確認された。したがって、コーヒー含有飼料の摂取により飼料効率の改善作用が確認された。【００５９】
＜試験例４：飼料効率改善剤のルーメン内への影響１＞
試験例３により得られたコーヒー含有飼料を乳牛（ホルスタイン種：経産数２〜３）に給餌した際のルーメン内への影響について評価した。比較対照として、試験例３に記載される比較飼料を使用した。各給餌群は、個体数をそれぞれ４頭とし、１月の給餌期間とした。１月の給餌期間完了後に、各給餌群のルーメン内の胃液と取り出し、胃液中における各揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の含有量及びアンモニア濃度を測定した。ＶＦＡとして酢酸、プロピオン酸、及び酪酸の含有量をそれぞれ求めた。結果を表１３に示す。【００６０】
【表１３】
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表１３に示されるように、コーヒー含有飼料の摂取により、ルーメン中におけるプロピオン酸量が増加し、アンモニア濃度が低下したことが確認された。プロピオン酸の増加は、メタンのエネルギーがプロピオン酸に変化したことによるものと考えられる。したがって、摂取した飼料エネルギーがメタンとして放出される量が減少していることが示唆された。また、アンモニア濃度の減少により、肝・腎機能の負荷を軽減し、身体的ストレスの軽減も示唆された。【００６１】
＜試験例５：飼料効率改善剤のルーメン内への影響２＞
（菌体の増殖試験（ＤＧＧＥ分析試験））
試験例３により得られたコーヒー含有飼料を基礎飼料３０ｋｇ／日に対し、１．５ｋｇ／日混合した飼料を調製した。かかる飼料を乳牛（ホルスタイン種：経産数２〜３）３頭（Ａ，Ｂ，Ｃ）に給餌した。給餌１週間後に、ルーメン内フローラの変化をＤＧＧＥで分析した。【００６２】
給餌前の各個体（Ａ，Ｂ，Ｃ）、給餌１週間後の各個体（Ａ’，Ｂ’，Ｃ’）のフローラの経時変化を、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）測定により評価した。ＤＧＧＥは、濃度勾配を有するＤＮＡ変性剤、例えば尿素等を含有するゲルを電気泳動に用いることにより、種固有のＧＣ比とＡＴ比とに基づいてＤＮＡの分離を行う試験である。電気泳動で得られたＤＮＡバンドに対して塩基解析を行うことにより、各バンドが由来する菌株の帰属分類群を推定した。【００６３】
本分析試験では、公知のＤＧＧＥ及び塩基解析を採用した。即ち、本試験では、電気泳動において１０％ポリアクリルアミドゲル及びＤＮＡ変性剤として尿素（３０〜６０％への濃度勾配を有する）を使用し、２００Ｖ、４時間で泳動を行なった。泳動後、ゲルをSYBER Green（タカラバイオ社製）で染色し、ＵＶ（３１０ｎｍ）照射下で発光するバンドを撮影した。電気泳動の結果を図１に示す。なお、図１において、バンドの位置を容易に視認するために、泳動結果の写真を、その白黒を反転して表示している。【００６４】
図１に示されるように、コーヒー含有飼料によってルーメン中フローラの著しい変化は認められなかった。
（古細菌の測定）
給餌前の各個体（Ａ，Ｂ，Ｃ）、給餌１週間後の各個体（Ａ’，Ｂ’，Ｃ’）のルーメン内の古細菌の量を古細菌プローブによりＰＣＲ定量した。古細菌プローブとして古細菌用16SrDNA V3 領域（約１７５ｂｐ）を適用した。【００６５】
給餌前と給餌後の各３頭の乳牛ルーメン液よりサンプル調整したＤＮＡをテンプレートとし、１／３希釈を繰り返したものについてＰＣＲ定量を実施した。希釈倍率の高い中からＤＮＡが検出されると多くの古細菌が存在することを示す。結果を表１４に示す。表中において、各希釈液中において、古細菌が見出されたものを＋、見出されなかったものを−として示す。【００６６】
【表１４】
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表１４に示される結果より、メタン菌を含む古細菌がコーヒー含有飼料の給餌により１／９から１／２４３に減少したことが確認された。なお、メタン菌の減少は水素イオン濃度の低下によるメタン菌の餌不足等が原因であると考えられる。
【図１】
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【国際調査報告】
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