(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法であって：
ｉ）添加時間の最後の５〜１０％を除き、ｐＨが３．０〜４．０に維持されるように、塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を撹拌下で水に添加して沈殿を得る；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
ことを含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まず、ｐＨ調整のために、他のいずれかの酸またはアルカリを添加しない、方法。
【請求項２】
使用する塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の濃度が４００〜５００ミリモル濃度（ｍＭ）の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用する塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の濃度が４８０〜４９０ｍＭの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の添加を、４００ｒｐｍ以上での撹拌下に実施する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の添加を、５００〜６００ｒｐｍでの撹拌下に実施する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）における添加を室温または２０℃〜２５℃の温度で実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
添加を１０〜６０分の期間実施する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
添加を３５〜５５分の期間実施する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｄ（９０）が＜１５μｍの範囲である粒度分布を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたリン酸アルミニウムゲル。
【請求項１０】
ｄ（９０）が５〜１０μｍの範囲である粒度分布を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたリン酸アルミニウムゲル。
【請求項１１】
方法が閉鎖系で実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が３．２〜３．５のｐＨ範囲で、他のいずれかの酸またはアルカリを添加せずに実施される、請求項１〜８及び１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
方法が沈降の工程を含まず、それによって上清の形成が無い、請求項１〜８、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法であって：
ｉ）添加時間の最後の５〜１０％を除き、形成される沈殿のｐＨが３．０〜４．０に維持されるように、塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を注射用水に撹拌下で６０分以内で添加する；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
工程を含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まず、ｐＨ調整のために、他のいずれかの酸またはアルカリを添加しない、方法。
【請求項１５】
添加を３５〜５５分の期間実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
形成される沈殿のｐＨを３．２〜３．５に維持する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜８及び１１〜１６のいずれか１項の記載の方法により製造したリン酸アルミニウムゲルに吸着した１以上の抗原を含むワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸アルミニウム（ＡｌＰｈｏｓ）ゲルを製造するための改良法に関する。本発明はまた、特に免疫原組成物および／またはワクチン組成物における、抗原（単数または複数）を吸着するためのリン酸アルミニウムゲルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン組成物は１種類以上のアジュバントを含むことができる。“アジュバント”は、抗原と共に取り込まれるかあるいは同時に注射され、続いて起きる免疫応答を非特異的に増強する物質である。生じる免疫応答は、投与された集団において十分なレベルの抗体が維持されることによってより長く持続する。実用上および経済上の理由で、この予防免疫化は、最少の投与回数で、効果的な免疫化と適合する最少量の抗原を用いて得られる必要がある。これらのアジュバントの性質は、ヒトのワクチンに最も一般的に用いられるミョウバン、たとえばリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムのように無機であってもよく、スクアレンのように有機アジュバントであってもよい。
【０００３】
動物用ワクチンは一般に油性アジュバントを利用する。Ｈ５Ｎ１ウイルスにより引き起こされるインフルエンザ（一般にavian influenzaまたは“bird flu”（トリインフルエンザ）と呼ばれる）の予防に用いられるワクチンは、水中油型エマルジョンであるアジュバントＡＳ０３を含有する。ＡＳ０３アジュバントは、油性化合物Ｄ，Ｌ−アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、スクアレン、乳化剤ポリソルベート−８０（成分を互いに混和してそれらの分離を防ぐのを補助する）、少量の塩類を含有する水で構成される。
【０００４】
アルミニウム塩は１９３０年代以来、広く用いられている。安全かつ有効に用いられてきた長い歴史のためヒトのワクチンに用いるものとして米国食品医薬品局(Food and Drug Administration)が承認した唯一のアジュバントがアルミニウム含有アジュバントである。Glennyらはアジュバントとしてのアルミニウム化合物の効果を記載している(Glenny AT, Pope CG Waddington H, Wallace U. Immunological Notes XVII to XXIV. J. Pathol. 29, 31-40, 1926)。
【０００５】
それにもかかわらず、アルミニウム含有アジュバントは再現性のある物理化学的特性を備えたものを製造するのが困難であると記載されている。Scholtzらは１９８４年に、等モル量の塩化アルミニウムおよびリン酸三ナトリウムを用いて純粋なリン酸アルミニウムを製造した。
【０００６】
リン酸アルミニウムゲルは‘アジュバント’として液体五価ワクチン(liquid pentavalent vaccine)（ＬＰＶ）中に用いられ、ゲル粒子に吸着されたＢ型肝炎表面抗原、ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対して、またおそらく全細胞百日咳抗原に対しても、免疫原応答をブーストするのを補助する。アルミニウム塩はＤＴａＰワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチンおよびＢ型肝炎ワクチンに用いられる。代替アジュバントの探索が行なわれてはいるが、アルミニウム化合物（リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム）はそれらの安全性、低コスト、および多様な抗原とのアジュバント性という良好な実績のため、ヒトのワクチンのためのアジュバントとして長年使い続けられるであろう。
【０００７】
アルミニウム化合物を含むワクチンおよびトキソイドを調製するために一般に２つの方法が用いられている−抗原の存在下でのアルミニウム化合物のイン−サイチュ製造（本来は、ミョウバンと共に沈殿させることによりトキソイドを精製するために開発されたもの）、および予め形成したアルミニウムゲル上への抗原の吸着。アルミニウムアジュバント上への抗原の吸着は、アルミニウムアジュバントのイン−サイチュ沈殿に際してまたは予め形成したアルミニウムゲル上への吸着のいずれも、抗原の物理的および化学的特性、アルミニウムアジュバントのタイプ、ならびに吸着条件に依存する。これらの条件は見過ごされることがしばしばあり、配合不良のアルミニウムアジュバント製剤は最適なアジュバント性を示さない。
【０００８】
SU481539には、塩化アルミニウムを８５％リン酸と反応させることによって多孔質ヒドロゲルであるアルミノ−ホスフェート(alumino-phosphate)を製造する方法が開示されている。得られた溶液を−８〜−１０℃に冷却し、激しく撹拌しながら同じ温度に冷却したエチレンオキシドを徐々に導入した。得られたゲルを５０〜３５０℃の温度および１〜１７０気圧の水蒸気圧で２時間加熱し、蒸留水で洗浄し、２００℃で空気中において乾燥させ、６５０〜７００℃で４〜６時間、か焼した。
【０００９】
SU550340には、酢酸アルミニウムとリン酸の反応、続いて濾過、洗浄、３０〜４０℃で１２時間、次いで１１０〜１２０℃で４時間の乾燥、そして６００℃で４時間以内の生成物活性化により、リン酸アルミニウムゲルを製造する方法が開示されている。提唱されたこの方法も、長い乾燥時間および高温での最終生成物の活性化を必要とするので、複雑であり、手間がかかる。
【００１０】
SU559895には、硝酸アルミニウムおよびリン酸のモル比１：０．９５〜１．０５の溶液を反応させ、続いてアンモニアを用いて１５〜２０℃の範囲の温度でｐＨ＝６．０に中和することにより、非晶質リン酸アルミニウム水和物を製造する方法が開示されている。得られた生成物を濾過し、水で洗浄し、６０〜８０℃の温度で乾燥させる。
【００１１】
DE 2152228には、リン酸アルミニウムゲルを製造するための方法が開示され、それは水性媒体中におけるアルミン酸ナトリウム、リン酸および硫酸アルミニウムの混合物を作成し、生じる懸濁液のｐＨ値が５〜６になるように混合物を反応させ、沈殿したリン酸アルミニウムをそれの沈殿の途中または後に７０℃より高い温度に加熱することを含む。
【００１２】
RU2149138Cには、リン酸アルミニウムゲルの製造方法が開示され、その際、水溶性アルミニウム塩類およびリン酸ナトリウムの初期溶液を閾値バンド幅０．２２ミクロンのマイクロフィルトレーションユニットで濾過し、可溶性アルミニウム塩をリン酸ナトリウムと反応させた。撹拌機の回転速度３．３〜８．３  ｓｅｃ−１で１５〜４５分間の激しい撹拌下に目的生成物を沈殿させた。１８〜６０℃の温度で５〜７日間、リン酸アルミニウムゲルを形成させ、続いてそれを洗浄する。
【００１３】
WO 2009/136233A1 には、１０００ｎｍ未満、好ましくは１０〜６００ｎｍの粒子直径をもつリン酸アルミニウムのナノ粒子を製造するための、下記を含む方法が開示されている：ａ．リン酸アルミニウムゲルを調製する；ｂ．リン酸アルミニウムゲルのｐＨを調整する；ｃ．リン酸アルミニウムゲルをサイズ低下処理する；ｄ．目的サイズのリン酸アルミニウムナノ粒子を取得する；そして、ｅ．場合によりナノ粒子を適切な緩衝液に懸濁する；その際、リン酸アルミニウムゲルは（ｉ）イン−サイチュで、（ｉｉ）リン酸アルミニウム粉末を適切な溶媒に懸濁することにより、または（ｉｉｉ）等モルの塩化アルミニウムをリン酸三ナトリウムで処理してリン酸アルミニウムゲルを形成させ、続いて必要ならばクロリドを除去することにより調製できる。
【００１４】
US Patent No. 8,540,955には、アルミニウムアジュバントＡｌＰＯ４を製造するための改良法が開示され、それは塩化アルミニウムの溶液と三塩基性リン酸ナトリウムの溶液を混合してリン酸アルミニウム沈殿を生成させる工程を含み、その際、改良点は約５０℃〜約７０℃の範囲の温度でリン酸アルミニウム沈殿を沈降させることを含む。
【００１５】
Burrell et al. [Vaccine. 1999 Jun 4;17(20-21):2599-603]には、リン酸アルミニウムアジュバントが１２１℃で３０または６０分間オートクレーブ処理した際に非晶質状態を維持したことが開示されている。しかし、ｐＨ低下によって明らかなように、脱プロトン反応および脱水反応が起きた。タンパク質吸着能、ｐＨ２．５における酸中和速度、およびゼロ電荷点(point-of-zero charge)も低下し、これらは脱プロトン／脱水反応の結果として表面積が低減したことを指摘する。
【００１６】
Burrell et al. [Vaccine. 2000 Sep 15;19(2-3):275-81]には、リン酸アルミニウムアジュバントを製造するための方法が開示され、その際、塩化アルミニウムおよびリン酸二水素ナトリウムを含有する水溶液を反応器に一定速度でポンプ送入した。第２ポンプにより、目的ｐＨを維持するために必要な速度で水酸化ナトリウム溶液を注入した。ｐＨ３．０〜７．５（ｐＨ０の間隔）で沈殿させた。
【００１７】
アルミニウムアジュバントの特性、たとえばゲル粒子のサイズ、吸着能、等電点、およびアルミニウム対リン酸の比は、これらのゲルを生成させる条件に依存し、それには試薬を添加する順序、試薬を添加および混合する速度、混合速度、ｐＨ調整に要する時間、ならびにゲル製造の規模が含まれる。したがって、アルミニウムアジュバントを物理−化学的に再現性のある様式で製造するのは困難であり、よってバッチ間変動が生じると記載されている。
【００１８】
前記の先行技術に開示されたリン酸アルミニウムゲル製造方法は冗長で複雑である。リン酸アルミニウムアジュバントを製造するための方法が記載されてはいるが、工業的規模においてより効率的である方法に対するニーズが依然として当技術分野にある。さらに、いずれの新規方法により製造されたリン酸アルミニウムアジュバントの特性も、それをワクチン製剤に使用できるためには、種々の市販製品に既に存在するアジュバントの性質を満たすことが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】SU481539
【特許文献２】SU550340
【特許文献３】SU559895
【特許文献４】DE 2152228
【特許文献５】RU2149138C
【特許文献６】WO 2009/136233A1
【特許文献７】US Patent No. 8,540,955
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Glenny AT, Pope CG Waddington H, Wallace U. Immunological Notes XVII to XXIV. J. Pathol. 29, 31-40, 1926
【非特許文献２】Burrell et al. [Vaccine. 1999 Jun 4;17(20-21):2599-603]
【非特許文献３】Burrell et al. [Vaccine. 2000 Sep 15;19(2-3):275-81]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の主な目的は、簡潔でコスト効果の高い方法によってリン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法を提供することである。
本発明の他の目的は、種々のｐＨ管理のために当技術分野で採用されていたアルカリまたは酸の添加を採用するのを避けて、むしろ最適な条件および濃度でリン酸アルミニウムゲルが製造されるようにプロセス材料およびパラメーターを調整することである；これによって、新たな種の塩類および不均一なゲル構造を作り出し、したがってそれらを除去することが必要となる可能性のある、カーボネートおよび水酸化物のようなアルカリの使用が避けられる。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は、簡潔で制御しやすく、製造がより速く、かつ極端な温度または長い熟成期間が避けられるなどの方法を得ることである。
本発明の最終目的は、前記に従って製造したリン酸アルミニウムゲルの、ワクチン製剤におけるアジュバントとしての適性を立証することである。
【００２３】
要するに、本発明は、良好な効率を備えているけれども時間、労力およびコストの低減した、無菌リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良された拡張性のある方法に関するものであり、安定なワクチン製剤の調製におけるそれの適性の立証を伴う。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法であって：
ｉ）撹拌下でｐＨを３．０〜４．０に維持することにより、アルミニウム塩の溶液およびリン酸アルカリ塩の溶液を水に添加して沈殿を得る；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
ことを含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まない方法を提供する。
【００２５】
本質的に、本発明は、溶液の濃度、混合パラメーターおよび添加速度を操作することにより、ただし分粒(sizing)およびゲル洗浄の工程を必要とせずに、制御された一定の粒度分布をもつリン酸アルミニウムゲルを製造するための方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、撹拌下でｐＨを３．０〜４．０に維持することにより、アルミニウム塩およびリン酸アルカリ塩を水に添加して沈殿を得る工程を含む、リン酸アルミニウムゲルの製造方法を提供する。
【００２７】
本発明に従って用いるアルミニウム塩は、塩化アルミニウム・６水和物の形態である。
本発明に従って用いるリン酸アルカリは、リン酸ナトリウム、好ましくは三塩基性リン酸ナトリウムまたは二塩基性リン酸ナトリウムである。
【００２８】
ｐＨは、特定濃度の塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を添加することにより維持される。好ましくは、４００〜５００ミリモル濃度（ｍＭ）の濃度を用い、より好ましくは４８０〜４９０ｍＭの濃度を用いる。
【００２９】
塩化アルミニウムおよびリン酸三ナトリウムを両方とも、１０〜６０分間、好ましくは３５〜５５分間の撹拌下で水に添加し、リン酸ナトリウム溶液を添加する１〜６０秒、好ましくは３０秒、より好ましくは２〜１０秒前に初回量の塩化アルミニウム溶液を添加し、それにより添加の最後の５〜１０％部分を除く反応のほぼ全体を通して沈殿のｐＨを３．０〜４．０、好ましくは３．２〜３．５に維持する。
【００３０】
それらの溶液を４００ｒｐｍ以上、好ましくは５００〜６００ｒｐｍ、より適切には中間ないしそれより高い範囲での撹拌下で水に添加する。
塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を、室温または２０℃〜２５℃の温度で水に添加する。
【００３１】
塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を、最低２個、好ましくは２〜４個のバッフルを備えた容器内で水に添加して混合する。撹拌機構は上置き型(top-mounted)であり、撹拌棒は少なくとも３つのインペラーを備え、それぞれが４つ以上のブレードをもつ。
【００３２】
本発明の方法によれば、ゲルは３．２〜３．５のｐＨ範囲で、他のいずれかの酸またはアルカリを添加せずに形成される。この方法を用いて、３ｍｇ／ｍＬを超えないアルミニウム濃度、好ましくは最大２．５ｍｇ／ｍＬまでの範囲の‘アルミニウム’濃度のゲルを得ることができる。
【００３３】
本発明に従って製造されたリン酸アルミニウムゲルは、ｄ（９０）が＜１５μｍ、好ましくは５〜１０μｍの範囲である粒度分布をもつ。
本方法の有効性は、塩化アルミニウムおよび三塩基性リン酸ナトリウムを一定の比率で水に添加することによって、かつｐＨおよび温度を維持することによって、有意に改良される。そのような方法により、最終製品、すなわちリン酸アルミニウムゲルの精製および濃縮に必要な工程も不必要になる。
【００３４】
さらに他の態様において、本方法は、リン酸アルミニウム沈殿を１２０℃以上、好ましくは１２０〜１５０℃の温度に３０分以上、好ましくは３０〜９０分の期間、加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌することを伴う。
【００３５】
本発明の他の改良点は、プロセス工程を閉鎖系内で実施し、それによって最終製品の無菌確実度が増し、無菌検査の必要性が減ることである。それによって実施する必要がある無菌検査の回数が減るので、これによって全体的プロセスがより効率的になる。
【００３６】
さらに他の態様において、本発明は容器内の予め滅菌したＷＦＩ、無菌濾過した化学薬品溶液、および他のプロセス関連アクセサリーを用いて、６０分以内、より好ましくは４５分以内に無菌リン酸アルミニウムゲルを無菌的に製造するための方法を提供し、それは精製、分粒または他の検査なしに直ちにワクチンの配合に使用できる。
【００３７】
さらに他の態様において、本発明により製造されたリン酸アルミニウムゲルは粒子のサイズおよび他の物理化学的パラメーターの変化をより生じにくい。さらに、滅菌後のゲルのｐＨは、抗原のブレンディングにいっそう適切な範囲にあり、それは５．０を超える等電点（ｐＩ）をもち、それによってｐＨ調整が不必要になる。
【００３８】
さらに他の態様において、本発明は無菌リン酸アルミニウムゲルを製造するための方法を提供し、それは意外にも沈降の工程を避けるのに役立ち、それによって上清の形成がない。よって、全プロセスが１〜５時間の期間内に完了し（続いて製造後滅菌を行なう場合は後者になる）、それによって本方法は簡潔で経済的になり、きわめて操作しやすくなる。
【００３９】
好ましい態様において、本方法はリン酸アルミニウムゲルを製造するための方法であって：
ｉ）形成された沈殿のｐＨを３．０〜４．０、好ましくは３．２〜３．５に維持することにより、塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を注射用水に撹拌下で６０分以内、好ましくは３５〜５５分で添加する；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
工程を含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まない方法を提供する。
【００４０】
本発明に従って製造されたリン酸アルミニウムゲルアジュバントは、室温以下で貯蔵した場合、貯蔵寿命期間中、安定なままである。
より好ましい態様において、本方法は、ｄ（９０）が＜１５μｍの範囲である粒度分布をもつリン酸アルミニウムゲルを製造するための方法であって：
ｉ）形成された沈殿のｐＨを３．０〜４．０、好ましくは３．２〜３．５に維持することにより、４００〜５００ミリモル濃度（ｍＭ）の濃度の塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を注射用水に撹拌下で６０分以内、好ましくは３５〜５５分で添加し、その際、リン酸ナトリウム溶液を添加する２〜１０秒前に初回量の塩化アルミニウム溶液を添加する；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
工程を含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まない方法を提供する。
【００４１】
アルミニウム化合物のアジュバント性のメカニズムには下記が含まれる：デポーが形成される；アルミニウム吸着された抗原粒子が粒子性および最適サイズ（＜１０μｍ）であるため抗原提示細胞によって効率的に取り込まれる；ならびに補体の活性化によって身体の免疫コンピテント細胞が刺激される。
【００４２】
さらに他の態様において、本発明はワクチンを製造するための方法であって：
ｉ．形成された沈殿のｐＨを３．０〜４．０、好ましくは３．２〜３．５に維持することにより、無菌濾過した塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を予め滅菌した注射用水に撹拌下で６０分以内、好ましくは３５〜５５分で添加する；
ｉｉ．抗原を、工程（ｉ）で得られたリン酸アルミニウムゲルに精製、滅菌、分粒を行なわずに直ちに添加する
工程を含む方法を提供する。
【００４３】
さらに他の態様において、本発明は、ワクチン製剤中の抗原を吸着するための、本方法により製造されたリン酸アルミニウムゲルの使用を提供する。
本発明の利点
１．本発明の方法は、ｐＨ調整のための酸／アルカリのいずれの添加も伴わない
２．本方法は、リン酸アルミニウムゲルの粒子サイズ低減のためのいかなる工程も伴わない
３．本方法は、沈降およびそれによる上清除去の工程を伴わない
４．本方法は、いかなる洗浄工程も伴わない
５．本方法は、高温条件および長期間の熟成を含まない。
【００４４】
以下の実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によって決して限定されず、本明細書に記載したパラメーター内での当業者に分かるようなそれらのバリエーションを含むということを理解すべきである。
【実施例】
【００４５】
実施例−１．リン酸アルミニウムゲルの製造
リン酸アルミニウムゲル製造のために、４８５±１ｍＭ濃度の塩化アルミニウム溶液およびリン酸三ナトリウム溶液を原料として用い、注射用水(Water For Injection)（ＷＦＩ）を溶媒として用いた。下記の表に示す両溶液を、一定速度で４５±１０分以内にＷＦＩ（溶液の体積の３．１〜３．１５×の体積）に、２〜４つのバッフル、異なる高さにあってそれぞれ４つのブレードをもつ最低３つのインペラーを備えた上置き型攪拌機をもつ容器に、５５０±５０ｒｐｍで撹拌しながら添加した。リン酸ナトリウム溶液の添加を開始する２〜５秒前に塩化アルミニウム溶液の添加を開始して、プロセス全体を通して沈殿のｐＨを３．５より低く維持した；ただし、添加時間の最後の５〜１０％を除く：この期間はｐＨが５．０付近にまで上昇するのがみられた。添加終了後、≧１２１．１℃の蒸気を用いて３０〜４５分間、ゲルをイン−サイチュ滅菌した。滅菌後にゲルのｐＨは約１単位低下して４．０±０．３付近に達した。
【００４６】
【表１】
0006989389.tif 000002
【００４７】
前記方法を用いてリン酸アルミニウムゲルを１Ｌから４０Ｌまでの規模で製造して、それぞれの規模でパラメーターが一定範囲内にある再現性のある結果を得た。この方法は、他の沈降、精製−すなわちいずれかの緩衝液、たとえば生理食塩水などを用いるゲルの洗浄がなく、よってきわめて簡潔、簡単であり、そのままブレンディングに使用できるゲルを生成する。それによってこの方法はそれの多能性、拡張性およびコスト効果が立証され、それによって商業的生産に対するそれの適性が確認される。
【００４８】
実施例−２．リン酸アルミニウムゲル製品の粒子サイズ
実施例１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルの粒子サイズを決定して、いずれかの追加処理工程、たとえば均質化、微粒子の選択／除去などを行なわずに平均粒子サイズは７μｍ以下であり、ｄ（１０）、ｄ（５０）および（９０）範囲はそれぞれ＞１μｍ、３〜８μｍおよび＜１４μｍであることが認められた。１８Ｌおよび４０Ｌ規模で行なったゲルロットの製造に際してのｐＨおよび粒子サイズについての代表的データを、推定したＰＺＣおよびゼータ電位値と共に表−２に挙げる（滅菌の前と後の両方）。これらのデータは、いずれかの追加プロセスを必要としないこの方法の簡潔性および再現性が立証されたことを指摘する。
【００４９】
【表２】
0006989389.tif 000003
【００５０】
実施例−３．免疫原組成物中におけるリン酸アルミニウムゲルアジュバントの配合物
実施例−１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルを、抗原成分としてのジフテリアトキソイド(Diphtheria toxoid)（ＤＴ）、破傷風トキソイド(Tetanus Toxoid)（ＴＴ）、全細胞百日咳(Whole-cell pertussis)（ｗＰ）、Ｂ型肝炎表面抗原(Hepatitis-B surface antigen)（ＨＢｓＡｇ）、およびインフルエンザｂ型菌(Haemophilus influenzae type-b)ポリリボシルリビトールホスフェート(Polyribosyl Ribitol phosphate)−ＴＴコンジュゲート（Ｈｉｂ）を最終希釈剤としての生理食塩水中に含む液体五価ワクチン（ＬＰＶ）の配合物中に用いた。この配合に際し、実施例−１に従って得られたゲルに、２００〜３００ｒｐｍにおける撹拌下でＨＢｓＡｇ、ＤＴおよびＴＴ抗原を、ｐＨ調整の必要なしに順次添加した；文献によれば、かつ本発明者らの試験で証明したように、それはゲル（アジュバント）へのそれらの吸着に理想的ｐＨであるので。次いでこのブレンドに最終体積調整に必要な生理食塩水の最大８０％を添加し、続いてｗＰを添加した；次いで全ブレンドを１０℃より低温に冷却し、撹拌しながらＨｉｂ成分を添加した。次いで最終体積を生理食塩水で必要レベルに調整した。次いで必要な場合にはブレンドのｐＨを６．２〜６．５に調整したが、大部分の場合は不必要であることが認められた。
【００５１】
前記方法を、実施例１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルを用いる種々の規模でのＬＰＶブレンディング法に最適化した。１００ｍＬから６０Ｌまでの範囲の体積のＬＰＶブレンドをこの方法で調製し、すべてを検査して、安全性および配合物中に用いた各抗原の力価パラメーターを含めたワクチン規格に適合することが証明された。
【００５２】
このリン酸アルミニウムゲルは、抗原成分としてのジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、全細胞百日咳（ｗＰ）、およびインフルエンザｂ型菌ポリリボシルリビトールホスフェート−ＴＴコンジュゲート（Ｈｉｂ）を最終希釈剤としての生理食塩水中に含む液体四価ワクチン（ＬＱＶ）の調製に適することも示された。このワクチンの配合は、ＬＰＶ製剤において最初に添加するＨＢｓＡｇを用いないこと以外は、同じ抗原およびそれらの添加順序に従う。
【００５３】
１Ｌから６０Ｌまでの範囲の体積のＬＱＶブレンドをこの方法で調製し、すべてを検査して、安全性および配合物中に用いた各抗原の力価パラメーターを含めたワクチン規格に適合することが証明された。
【００５４】
実施例−４．抗原吸着能の操作および結果
ＬＰＶの配合に用いた抗原のうち、ＨＢｓＡｇ、ＤＴおよびＴＴがリン酸アルミニウムゲルに結合する３つであった。ＬＰＶにおける結合についての社内要求は、ＨＢｓＡｇについて≧９０％であり、ＤＴのものについてそれは≧２８％であり、ＴＴについてそれは≧３０％であった。種々の規模で製造したリン酸アルミニウムゲルは、最大４０Ｌのゲルロットおよび最大６０ＬのＬＰＶブレンド体積で調製したものについて検査した場合、一貫してこれらの要求に適合した。両方を異なる規模で行なった実施例−１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルを用いて調製したＬＰＶブレンド間の吸着値％の変動は有意でない。同様に、ワクチンをストレス条件（３７℃で１４日間）に曝露しても吸着値％は有意には変化しなかった。異なる規模（１Ｌおよび１８Ｌ）で実施し、２Ｌおよび６０Ｌ規模のＬＰＶブレンディングに用いたこの特性のゲルの代表例を、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ（販売業者）のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を用いて調製した２Ｌおよび６０ＬのＬＰＶブレンドと共に、表−３にまとめる。
【００５５】
実施例−１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルを用いて調製したゲル／ＬＰＶブレンドの安定性試験の一例として、調製して０日目（リリース）、３７℃でのインキュベーション後５、７および１４日目に検査した４ＬのＬＰＶブレンドの３つの抗原についての吸着％の結果を表−４にまとめる。
【００５６】
【表３】
0006989389.tif 000004
【００５７】
表−３に提示したデータにより、実施例−１の記載に従って製造したリン酸アルミニウムゲルの吸着％はＢｒｅｎｎｔａｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのものと一致することが確認される。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
実施例−５．ゲルを特性分析するための他の方法およびそれらの結果
実施例１の記載に従って製造した数ロットのリン酸アルミニウムゲルを、それらが十分に特性分析されるように種々の物理化学的特性について分析した。ｐＨ以外に、粒子サイズおよびアルミニウム含量、さらに他の幾つかのパラメーターも検査し、それらの分析理由と共に表−５にまとめる。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
実施例−１に記載した方法に従って１８Ｌ規模で製造した６バッチのリン酸アルミニウムゲルからの代表的定量データを、ＬＰＶおよびＬＱＶバッチのプロセスバリデーションバッチについて表６および７にまとめる。これらのバッチはすべて、滅菌後および滅菌前の両方で検査したすべてのパラメーターについて要求に適合した；一方、すべてのバッチが外観、無菌性および不純物レベルについての規格に適合し、それらのうち定量パラメーターをこれらの表中で分析した。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
個々の粒度分布範囲を考慮せずに検査したすべてのパラメーターについてのＣＶ（Co-efficient of Variation）（変動係数）値は、十分に１０％以内であり、滅菌段階後についてはなおさらそうであった；これは、６か月間にわたって種々のロットの装入材料を用いて製造された６つの分析バッチにわたるゲル製造法の良好な一貫性を指摘した。これらのデータにより、滅菌後にゲルの物理化学的パラメーターにわずかな有意ではない変化が起きたにすぎないことも確認された。
【００６４】
【表７】
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【００６５】
数バッチについて、これらのパラメーターのうち幾つかをゲルの貯蔵期間（最大７日間）にわたって、種々の貯蔵時点で、すなわち製造後、イン−サイチュ滅菌後、およびイン−サイチュ滅菌ゲルのオートクレーブ処理後に検査した。種々のパラメーターに対する貯蔵の影響を試験した１バッチからの代表的データを表−８にまとめる。これらのデータにより、滅菌／オートクレーブ処理後７日目まではパラメーターはそれほど変化しないことが確認される。これらの特性分析データおよびそれらの解析により、種々の規模で製造したゲルの一貫性が確認され、ゲル製造法の堅実性も確認される。
【００６６】
【表８】
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【００６７】
実施例−６．ワクチン製剤におけるアジュバントとしてのＡｌＰｈｏｓゲルの有効性およびそれらの安定性
実施例−１の記載に従って製造した３つの異なるバッチのリン酸アルミニウムゲルを用いて３バッチの６０ＬのＬＰＶを配合し、かつ‘対照’としてのＢｒｅｎｎｔａｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓゲルを用いて１バッチの６０ＬのＬＰＶを配合した−実施例−１の記載に従って製造した製品とＢｒｅｎｎｔａｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓゲルの比較のため。滅菌溶液を用いて無菌容器内でリン酸アルミニウムゲルを１８Ｌ規模で製造し、オートクレーブ処理による滅菌のために無菌ガラスボトルに移した；この無菌ゲルをＬＰＶブレンディング用のブレンディング容器へ移した。
【００６８】
社内リン酸アルミニウムゲルを用いて、下記のバッチ番号をもつ３つの最終ＬＰＶバルクを調製した（実施例−５の表６および７に述べたとおり）：ＬＰＶ−１、ＬＰＶ−２およびＬＰＶ−３。ＢｒｅｎｎｔａｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを用いて調製した‘参照’バッチのＬＰＶ最終バルクに番号‘ＬＰＶ−４’を付与した。
【００６９】
本発明に従って製造したゲルの影響とＢｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒにより製造された市販のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓの影響との比較ができるように、ＬＰＶ−１とＬＰＶ−４の配合に用いた抗原のロットは同じであった。
【００７０】
すべての定性および定量試験の結果は各パラメーターについての許容基準と適合し、よって本発明に従って製造したＡｌＰｈｏｓゲルにより、ＢｒｅｎｎｔａｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを用いて調製したものとの適合度の高いＬＰＶロットが調製され、よってワクチン製剤の調製における社内ＡｌＰｈｏｓゲルの適性が確認された。
【００７１】
ＬＰＶと同様に、３つの最終ＬＱＶバルク（Ｄ−Ｔ−Ｐ−Ｈｉｂワクチン）も、本発明に従って製造したリン酸アルミニウムゲルを用いて下記のバッチ番号で調製された（実施例−５の表６および７に述べたとおり）：ＬＱＶ−Ａ、ＬＱＶ−ＢおよびＬＱＶ−Ｃ。すべての定性および定量試験の結果は、各パラメーターについての許容基準（ＬＰＶに関するものと同じ）と適合し、よってＬＱＶロットのブレンディングのために本発明に従って製造したゲルも同様に一貫性が高いことが再確認された。これらのデータにより、ワクチン製剤の調製における本発明のＡｌＰｈｏｓゲルの適性が再確認された。
【００７２】
前記に従って調製したすべてのロットのＬＰＶおよびＬＱＶを単回量（０．５ｍＬ）、１０回量（５．０ｍＬ）体裁でガラスバイアルに充填し、リアルタイム（２〜８℃）および促進（２５±２℃）温度貯蔵条件で安定性試験を行なった。安定性を検査するための試験パラメーターを評価し、両方の条件で両方のワクチンについて、最終試験した３か月目の貯蔵まですべてが規格に適合した；ＬＰＶ−１およびＬＰＶ−４から充填した最終ロットについて試験した安定性パラメーターの結果は、この場合もリアルタイム貯蔵条件で貯蔵した９か月目の時点まで同等であり、これは試験したパラメーターのいずれにもＡｌＰｈｏｓゲル源における変化による変化がないことを指摘する。
【００７３】
よって、新規方法を用いてリン酸アルミニウムゲルを製造するための本発明方法は、容易に再現でき、スケーラブルであり、かつワクチン製剤にアジュバントとして使用するのにきわめて適切であることが証明された。
本発明の態様には、下記も含まれる。
態様１
リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法であって：
ｉ）撹拌下でｐＨを３．０〜４．０に維持することにより、アルミニウム塩の溶液およびリン酸アルカリ塩の溶液を水に添加して沈殿を得る；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
ことを含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まない方法。
態様２
使用する塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の濃度が４００〜５００ミリモル濃度（ｍＭ）、好ましくは４８０〜４９０ｍＭの範囲である、態様１に記載の方法。
態様３
塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液の添加を、４００ｒｐｍ以上、好ましくは５００〜６００ｒｐｍでの撹拌下に実施する、態様１に記載の方法。
態様４
工程（ｉ）における添加を室温または２０℃〜２５℃の温度で実施する、態様１に記載の方法。
態様５
添加を１０〜６０分、好ましくは３５〜５５分の期間実施する、態様１に記載の方法。
態様６
ｄ（９０）が＜１５μｍ、好ましくは５〜１０μｍの範囲である粒度分布を有する、態様１に記載の方法により製造されたリン酸アルミニウムゲル。
態様７
方法が閉鎖系で実施される、態様１に記載の方法。
態様８
方法が３．２〜３．５のｐＨ範囲で、他のいずれかの酸またはアルカリを添加せずに実施される、態様１に記載の方法。
態様９
方法が沈降の工程を含まず、それによって上清の形成が無い、態様１に記載の方法。
態様１０
リン酸アルミニウムゲルを製造するための改良法であって：
ｉ）形成された沈殿のｐＨを３．０〜４．０、好ましくは３．２〜３．５に維持することにより、塩化アルミニウムの溶液およびリン酸三ナトリウムの溶液を注射用水に撹拌下で６０分以内、好ましくは３５〜５５分で添加する；
ｉｉ）リン酸アルミニウム沈殿を１２０〜１５０℃の範囲の温度に３０〜９０分の期間加熱することにより、工程（ｉ）のリン酸アルミニウム沈殿を滅菌する；そして
ｉｉｉ）３．０μｍ〜９．０μｍの範囲のｄ（５０）を有するサイズ分布および７μｍ未満の平均粒子サイズをもつ粒子を有する、リン酸アルミニウムゲルを得る
工程を含み、リン酸アルミニウム懸濁液を沈降させて上清を除去する工程を含まない方法。
態様１１
態様１〜１０のいずれか１項の記載により製造したリン酸アルミニウムゲルに吸着した１以上の抗原を含むワクチン組成物。