(57)【要約】      （修正有）【課題】励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させる、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供する。【解決手段】連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０であって、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニット１００を用い、サンプルの表層における興味がある領域の場合、ＳＴＥＤイメージングユニット２００を用いることができ、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングという２種の機能を集積させる。【選択図】図１
0003233779.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第３反射鏡、第１ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第４反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第２ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、フィルタ、第５反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第５反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、前記フェムト秒レーザー、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡、連続レーザー、第６反射鏡、第７反射鏡、第８反射鏡、位相板、前記第１ダイクロイックミラー、前記λ／４スライド、前記第４反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第２ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、前記サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記フィルタ、前記第５反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第５反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザーから放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡と前記第７反射鏡を経た後、前記第８反射鏡に入り、前記第８反射鏡を経た後、前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーによって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーを経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現することを特徴とする連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項２】
前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項３】
前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項４】
前記第６反射鏡及び前記第７反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項５】
前記第２レンズの光軸の、ｚ方向に沿う位置が調整可能であることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項６】
前記第３反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のｚ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることを特徴とする請求項３に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項７】
前記位相板上の位相分布は、０〜２πのらせん分布であることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項８】
二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かないことを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項９】
ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現することを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【請求項１０】
前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、顕微光学イメージングの技術分野に関し、特に、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
超解像度光学顕微鏡法では、イメージングの解像度が光回折の限界を超え、そのイメージング解像度が従来の光学顕微鏡よりもはるかに高く、近年の研究の焦点となっており、さまざまなタイプのものが現れる。誘導放出抑制（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ、ＳＴＥＤ）顕微鏡法は、初めて提案されており直接光回折の限界を克服する遠視野光学顕微鏡法であり、レーザー共焦点顕微イメージングに基づくものであり、他のタイプの超解像度顕微鏡法に比べて、イメージングの速度が高く、生細胞をイメージングすることができ、生物医学の研究においてより精細な構造を検出できる。
【０００３】
ＳＴＥＤイメージングは、解像度が極めて高いものの、イメージング深度が低く、二光子顕微イメージングは、解像度が悪いが、近赤外光を用いるため、イメージング深度が高く、しかしながら、現在、厚いサンプルの場合、二光子イメージングを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングを用い得る、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させた複合顕微鏡についての報告はまだ提案されていない。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００４】
これを鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させ得る、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供することが求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成させるために、本考案は下記の技術案を採用する。
【０００６】
連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡であって、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第３反射鏡、第１ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第４反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第２ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、フィルタ、第５反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第５反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、前記フェムト秒レーザー、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡、連続レーザー、第６反射鏡、第７反射鏡、第８反射鏡、位相板、前記第１ダイクロイックミラー、前記λ／４スライド、前記第４反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第２ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、前記サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記フィルタ、前記第５反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第５反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザーから放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡と前記第７反射鏡を経た後、前記第８反射鏡に入り、前記第８反射鏡を経た後、前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーによって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーを経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。
【０００７】
いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる。
【０００８】
いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできる。
【０００９】
いくつかの好適な実施例では、前記第６反射鏡及び前記第７反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできる。
【００１０】
いくつかの好適な実施例では、前記第３反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のＺ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせる。
【００１１】
いくつかの好適な実施例では、前記第２レンズの光軸の、ｚ方向に沿う位置が調整可能である。いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は、０〜２πのらせん分布である。
【００１２】
いくつかの好適な実施例では、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
【００１３】
いくつかの好適な実施例では、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現する。
【００１４】
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
【考案の効果】
【００１５】
本考案では、上記技術案による利点は以下のとおりである。
【００１６】
本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本考案の実施例又は従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に説明するが、無論、以下の説明における図面は本考案の実施例の一部に過ぎず、当業者であれば、創造的な努力を必要とせずに、これらの図面に基づいて他の図面を得ることもできる。
【図１】本考案の実施例に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の構造模式図である。
【図２】本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布である。
【図３】本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布である。
【考案を実施するための形態】
【００１８】
以下、本考案の実施例の図面を参照しながら、本考案の実施例の技術案を明瞭かつ完全に説明するが、無論、説明する実施例は、本考案の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。本考案の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに得たすべてのほかの実施例は、本考案が保護する範囲に属する。
【００１９】
図１は、本考案の実施例に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０の構造模式図を示し、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備える。
【００２０】
前記二光子イメージングユニット１００は、フェムト秒レーザー１１０、第１反射鏡Ｍ１、第２反射鏡Ｍ２、第１レンズＬ１と第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダ、第３反射鏡Ｍ３、第１ダイクロイックミラーＤＭ１、λ／４スライド１２０、第４反射鏡Ｍ４、ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、走査レンズＳＬ、チューブレンズＴＬ、第２ダイクロイックミラーＤＭ２、対物レンズＯＬ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、フィルタＦ１、第５反射鏡Ｍ５、第３レンズＬ３、及び光電子増倍管１５０を備える。
【００２１】
本考案の実施例に係る二光子イメージングユニット１００の作動方式は以下のとおりである。
【００２２】
前記フェムト秒レーザー１１０から放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡Ｍ１と前記第２反射鏡Ｍ２によって反射され、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第３反射鏡Ｍ３によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１に入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過した後、前記λ／４スライド１２０に入り、さらに前記第４反射鏡Ｍ４によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０に入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０から射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順に経て前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過した光ビームは、前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム１４０にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、前記フィルタＦ１に入り、前記フィルタＦ１は、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタＦ１を透過した蛍光は、前記第５反射鏡Ｍ５によって反射され、前記第３レンズＬ３に入り、前記第３レンズＬ３によって集束された光ビームは、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１５０に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現する。
【００２３】
なお、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
【００２４】
前記ＳＴＥＤイメージングユニット２００は、前記フェムト秒レーザー１１０、前記第１反射鏡Ｍ１、前記第２反射鏡Ｍ２、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡Ｍ３、連続レーザー２１０、第６反射鏡Ｍ６、第７反射鏡Ｍ７、第８反射鏡Ｍ８、位相板２２０、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１、前記λ／４スライド１２０、前記第４反射鏡Ｍ４、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、前記走査レンズＳＬ、前記チューブレンズＴＬ、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２、前記対物レンズＯＬ、前記サインプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、前記フィルタＦ１、前記第５反射鏡Ｍ５、第４レンズＬ４、ピンホール２３０、及びアバランシェダイオード２４０を備え、前記第５反射鏡Ｍ５は、所在する光路の外に移動可能である。
【００２５】
本考案の実施例に係るＳＴＥＤイメージングユニット２００の作動方式は以下のとおりである。
【００２６】
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡Ｍ１と前記第２反射鏡Ｍ２によって反射され、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第３反射鏡Ｍ３によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１に入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザー２１０から放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡Ｍ６と前記第７反射鏡Ｍ７を経た後、前記第８反射鏡Ｍ８に入り、前記第８反射鏡Ｍ８を経た後、前記位相板２２０に入り、前記位相板２２０を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１によって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡Ｍ４によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０に入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０から射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過した光ビームは前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム１４０にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、前記フィルタＦ１に入り、前記フィルタＦ１は、射入されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡Ｍ５は所在する光路の外に移動され、前記フィルタＦ１を透過した蛍光は、前記第４レンズＬ４に直接入り、前記第４レンズＬ４の焦点位置でのピンホール２３０に集束され、前記ピンホール２３０から射出された光ビームは、前記アバランシェダイオード２４０（ＡＰＤ）に入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。
【００２７】
なお、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現する。
【００２８】
いくつかの好適な実施例では、レーザー光が顕微鏡システムに結合して入力されるように、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる。
【００２９】
具体的には、フェムト秒レーザー１１０については、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、ＸＹ軸の周りに角度を調整可能な第１反射鏡Ｍ１と第２反射鏡Ｍ２が使用され、Ｍ１とＭ２を調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスでき、連続光レーザー２１０については、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、ＸＹ軸の周りに角度を調整可能な第６反射鏡Ｍ６と第７反射鏡Ｍ７が使用され、Ｍ６とＭ７を調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスできる。
【００３０】
いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は０〜２πのらせん分布である。
【００３１】
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
【００３２】
なお、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡で使用されるフェムト秒レーザー光及び連続光レーザーは、両方ともに体積が大きく、顕微鏡の輸送や位置移動時に、これらのレーザーを顕微鏡から取り外す必要があり、フェムト秒レーザー光及び連続光レーザーが顕微鏡システムに素早く接続できるように、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーが前記連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられ、それにより、取り外しや輸送が簡便になる。
【００３３】
図２は、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、励起光が対物レンズを経た後、長い楕円形の中実三次元スポットとして集束される。
【００３４】
図３は、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、損失光が、対物レンズを経た後、柱状の中空三次元スポットとして集束される。
【００３５】
なお、ＳＴＥＤイメージングには、励起スポットと損失光スポットを三次元方向に精度よく重なり合わせる必要があり、損失光スポットの位置を基準（一定に維持）として、励起光スポットと精度よく重なり合うように励起光スポットの三次元位置を調整し、Ｘ軸又はＹ軸の周りに第３反射鏡Ｍ３の角度を調整することにより、励起光スポットのＸ方向又はＹ方向での位置を変えることができ、光軸のＺ方向に沿って第２レンズＬ２の位置を調整することにより、励起光スポットのＺ方向での位置を変えることができ、それにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることができる。
【００３６】
本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡では、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡はＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
【００３７】
もちろん、本考案の連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本考案の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形を含むべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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