(57)【要約】本発明は、新規な気分障害を診断、治療又は予防する方法を提供する。気分障害を診断、治療又は予防する方法であって、生物学的試料において、融合タンパク質を用いて、当該抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定することを特徴とする。
2017115878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＳＩＴＨ−１タンパク質のＣ末端側に、前記ＣＡＭＬタンパク質のＮ末端側が結合したものである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＳＩＴＨ−１タンパク質のＮ末端側に、前記ＣＡＭＬタンパク質のＣ末端側が結合したものである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の融合タンパク質を固定化した担体。
【請求項５】
請求項２及び／又は請求項３の融合タンパク質をプローブとして用いた抗体検出器具。
【請求項６】
被験対象生物から分離された生物学的試料において、請求項１の融合タンパク質を用いて、当該抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項７】
請求項１の融合タンパク質を発現させた細胞に、標識した抗ＣＡＭＬ抗体を反応させる工程を含む、請求項６の測定方法。
【請求項８】
被験者における気分障害の診断方法であって、被験者から分離された生物学的試料において、請求項１に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、気分障害の診断方法。
【請求項９】
請求項２に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項８の診断方法。
【請求項１０】
請求項２の融合タンパク質を用いる、請求項９の診断方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定することを特徴とする、請求項８の診断方法。
【請求項１２】
請求項３の融合タンパク質を用いる、請求項１１の診断方法。
【請求項１３】
該被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含む、請求項８の診断方法。
【請求項１４】
請求項１の融合タンパク質の、気分障害診断のための使用。
【請求項１５】
請求項５の抗体検出器具を含む、請求項８の診断方法を行うための診断キット。
【請求項１６】
以下に示す（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される物質のうち、少なくとも２つの物質を含むことを特徴とする、気分障害の診断キット。
（ｉ）請求項２の融合タンパク質
（ｉｉ）請求項３の融合タンパク質
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬタンパク質
【請求項１７】
請求項２又は３の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７の核酸を導入してなる形質転換細胞。
【請求項２０】
被験者から分離された生物学的試料中の、請求項１に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定した結果、その値が高い被験者に、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法。
【請求項２１】
被験者の嗅上皮細胞にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする請求項２０に記載の気分障害の治療方法。
【請求項２２】
ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質を融合させて、可溶性の融合タンパク質を取得する工程を含む、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質の可溶性結合体を製造する方法。
【請求項２３】
被験者から分離された生物学的試料において、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する工程と抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、気分障害の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気分障害を診断、治療する方法に関し、具体的には、特定のタンパク質の融合タンパク質を認識する抗体レベルを指標とした気分障害の新規の診断、治療又は予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
気分障害は、うつ病や躁うつ病に代表される精神障害であり、近年増加傾向にあって大きな社会問題となっている。気分障害の治療の基本は薬物療法であり、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）などが用いられている。
ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６（ＨＨＶ；ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ））は、ＡＩＤＳ患者の末梢血から見出されたウイルスで、ヘルペスウイルスβ亜科に属する。ＨＨＶ−６にはＨＨＶ−６  バリアントＡ（ＨＨＶ−６Ａ）及びＨＨＶ−６  バリアントＢ（ＨＨＶ−６Ｂ）の２つのバリアントが存在する。ＨＨＶ−６Ｂは、乳幼児期にほとんどのヒトが初感染し、発症した場合は突発性発疹となる。ＨＨＶ−６Ｂは、初感染の急性期において、非常に高率で脳内に移行して潜伏感染を生じ、それが成人となった後も維持される（非特許文献１）。なお、潜伏感染とは、ウイルスが宿主細胞内で感染性のウイルス粒子を産生せずに存続し続ける感染状態をいう。ＨＨＶ−６Ｂは、脳内では主として前頭葉や海馬領域などのグリア細胞に潜伏感染していることが示唆されている（非特許文献２および３）。また、ＨＨＶ−６は末梢血中のマクロファージにも潜伏感染しており、日常生活の疲労等により再活性化して唾液中に放出される（特許文献１）。
ＨＨＶ−６の潜伏感染状態には、ウイルス産生は全く行われないが、比較的安定で遺伝子発現が活発な状態である「中間段階（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ）」が存在することが知られており、中間段階で発現するタンパク質としてＳｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６−１（以下、「ＳＩＴＨ−１」と称する）が同定されている（特許文献２）。このＳＩＴＨ−１に対する抗体が、うつ病などの気分障害患者から特異的に検出されることから、被験者検体中の抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出・測定することを特徴とする気分障害の診断方法が開発されている（特許文献２））。また、グリア細胞特異的発現プロモーターを連結したＳＩＴＨ−１遺伝子を、アデノウイルスベクターを用いてマウスの脳内に導入し、発現させたところ、マウスが精神疾患様の行動異常を起こすことが示されている（特許文献２）。
Ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｉｇｎａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ（ＣＡＭＬ）は、もともとＴ細胞受容体シグナル伝達を制御する小胞体膜タンパク質として単離されたが、その後、小胞体膜においてＴＲＣ４０の受容体として機能することが明らかになっている（非特許文献４）。ＣＡＭＬはリンパ球や脳内で強く発現し、細胞内でＳＩＴＨ−１と強く結合して細胞内カルシウムを上昇させる機能を持つことが知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６−００６６３４Ａ１号公報（２００６年１月１９日公開）
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００９−０４１５０１Ａ１号公報（２００９年４月２日公開）
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１５−１９９２４７Ａ１号公報（２０１５年１２月３０日公開）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｎｄｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１６７：１１９７−１２００，１９９３
【非特許文献２】Ｔｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０：３５５−３５９，２００４
【非特許文献３】Ｄｏｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．１５：９４３９−９４４８，２００５
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，４８，３８７−３９７（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
気分障害発症のメカニズムは未だ十分に解明されているとはいえない。特に、気分障害の診断や治療においては、更なる診断方法や治療方法の開発が望まれている。したがって、本発明は、従来技術よりも優れた気分障害の新規な診断方法及び／又は治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するべく、気分障害を診断する方法について、鋭意検討を重ねた。その結果、生物学的試料中において、特定タンパク質の融合タンパク質を認識する抗体の抗体レベルを測定することにより、被験者が気分障害に罹患しているかどうかだけではなく、被験者が対象疾患を発症するリスク（危険度）を評価することが可能であること、本方法の検出感度が従来法と比べても格段に向上することなどを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の発明群を含み得る。
（１）ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質。
（２）ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質を融合させて、可溶性の融合タンパク質を取得する工程を含む、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質の可溶性結合体を製造する方法。
（３）被験者から分離された生物学的試料において、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する工程と抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、気分障害の診断方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、新規な気分障害を診断、治療する方法を提供するという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、本発明の実施例１に係る、融合タンパク質の構造を示す図である。
図２は、本発明の実施例１に係る、融合タンパク質の使用による抗ＳＩＴＨ−１シグナルの増強を示す蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
図３は、本発明の実施例１に係る、融合タンパク質の使用による抗ＳＩＴＨ−１シグナルの増強を示す図である。
図４は、本発明の実施例２に係る、ヒトにおける抗ＣＡＭＬ抗体の存在を示す図である。
図５は、本発明の実施例２に係る、抗ＣＡＭＬ抗体のＩｍａｇｅＪを使用した解析を示す図である。
図６は、本発明の実施例２に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−１に対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図７は、本発明の実施例２に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図８は、本発明の実施例２に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図９は、本発明の実施例２に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１０は、本発明の実施例３に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−１に対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１１は、本発明の実施例３に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１２は、本発明の実施例３に係る、うつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１３は、本発明の実施例４に係る、各種タンパク質に対するうつ病患者血清と抗ＣＡＭＬ抗体の反応を示す図である。
図１４は、本発明の実施例５に係る、うつ状態の原因が異なる対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１５は、本発明の実施例５に係る、うつ状態の原因が異なる対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
図１６は、本発明の実施例６に係る、融合タンパク質を利用したＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。
図１７は、本発明の実施例７に係る、尾懸垂試験における無動時間の結果を示す図である。（Ａ）ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス３０匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス３０匹の尾懸垂試験を１０分間実施し、無動時間を比較した結果を示す図である。（Ｂ）ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与前２週間からＳＳＲＩを投与したマウス２１匹の尾懸垂試験を１０分間実施し、無動時間を比較した結果を示す図である（ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ−ＳＳＲＩ）。
図１８は、本発明の実施例７に係る、脳内におけるうつ病関連因子の遺伝子発現の結果を示す。（Ａ）ＣＲＨ遺伝子の結果を示す図である。（Ｂ）ＲＥＤＤ１遺伝子の結果を示す図である。（Ｃ）Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の結果を示す図である。
図１９は、本発明の実施例７に係る、嗅球におけるアポトーシス関連因子の遺伝子発現の結果を示す。（Ａ）アポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の遺伝子発現の結果を示す図である。（Ｂ）アポトーシス促進因子Ｂａｘの遺伝子発現の結果を示す図である。（Ｃ）アポトーシス指標Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２比を示す図である。
図２０は、本発明の実施例７に係る、嗅球のＴＵＮＥＬ染色の結果を示す図である。
（Ａ）ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球のＴＵＮＥＬ染色像を示す図である。（Ｂ）嗅球のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を計数した結果を示す図である。
図２１は、本発明の実施例７に係る、嗅上皮の抗ＳＩＴＨ−１抗体による免疫組織染色の結果を示す。ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅上皮細胞の免疫組織染色像を示す図である。
図２２は、本発明の実施例７に係る、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスのストレス脆弱性試験の結果を示す図である。
図２３は、本発明の実施例７に係る、ＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す図である。
図２４は、本発明の実施例７に係る、ＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す図である。
図２５は、本発明の実施例８に係る、ガンシクロビルによるＳＩＴＨ−１の発現の抑制を示す図である。
図２６は、本発明の実施例９に係る、ＳＩＴＨ−１又は各融合タンパク質の発現が細胞内カルシウム濃度に与える影響を示す図である。
図２７は、本発明の実施例１０に係る、健常者血清中の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体価とＢＤＩスコアとの相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａ、又はＡより大きい）Ｂ以下（Ｂ、又はＢより小さい）」を意味する。
〔用語の説明〕
本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」とも換言できる。「タンパク質」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、又はイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。「タンパク質」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するポリペプチドを包含する。
本発明において、「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であり、さらに好ましくは１個以下である）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。また、置換するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ，Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ，Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる。さらに、例えば、変異マトリクス（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｍａｔｒｉｘ）によってアミノ酸を分類することも周知である（Ｔａｙｌｏｒ  １９８６，Ｊ，Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．１１９，  ２０５−２１８；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ａ７．６−Ａ７．９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。この分類を以下に要約すると、脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ）、芳香族アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ）、荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ）、正荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、負荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、疎水性アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ，Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｋ）、極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、小型アミノ酸（Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）、微小アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｓ）及び大型（非小型）アミノ酸（Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ）が挙げられる。なお、上記括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す。置換するアミノ酸残基においては、同じ分類に属する別のアミノ酸に置換されることが好ましい。
また、本発明において、「相同性の高いアミノ酸配列」とは、対象のアミノ酸配列との相同性が、アミノ酸配列全体（若しくは機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上の配列の同一性を有する。配列の相同性は、例えばＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ  ＝  ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ  ＝  ３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象のアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
また、本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ等）を意図しているが、より好ましくは、一致したアミノ酸残基数の割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。
本明細書において「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。
したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
本明細書において「核酸」には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
本明細書において「塩基配列」は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（それぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
本発明において「気分障害」とは、ある程度の期間にわたって持続する気分（感情）の変調により、苦痛を感じたり、日常生活に何らかの支障をきたしたりする状態のことをいい、うつ状態のみが現れるうつ病と、躁状態とうつ状態を繰り返す躁うつ病に代表される。気分障害には様々な原因が考えられているが、詳細はわかっていないことも多い。医学的には米国精神医学会によって導入された精神障害の診断と統計の手引き（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  ＤＳＭ）又は国際疾病基準である疾病及び関連保健問題の国際統計分類（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ：  ＩＣＤ）によって定められた診断基準により操作的に診断される。気分障害は、好ましくはストレス因子による一過性うつ状態は含まない。
本発明において「うつ状態」とは、症状の継続時間や軽重に関係なく、うつ症状を呈する状態を意味する。うつ症状とは、憂うつ、将来に対する悲観、失敗への不安や恐れ、満足感の低下、異常な罪悪感、自分が罰を受けているという気持ち、自分に対する失望、劣等感、自殺企図、泣きたい気持ち、焦燥感、興味の消失、思考過程の渋滞および決断力の低下、自分の容姿に関する劣等感、精神運動抑制および行動の不自由感、不眠、易疲労感、食欲低下、体重減少、心身的症状及び健康への不安、性欲の低下、の少なくとも一つを特徴とする症状である。また本発明において「うつ病」とは、上述の通り、気分障害の一種であって、上述の診断基準で診断される障害を指す。
本明細書において「健常者」とは、気分障害に罹患していない正常な個体を指す。
本発明において「発症のリスク（危険度）を有する」とは、発症には至っていないが、発症の可能性が健常者と比べて高いことを意図しており、「気分障害」の発症のリスクを有するとは、気分障害の前段階であり気分障害に至る可能性の高い状態、及び気分障害の診断基準を満たさないうつ状態であることも包含する。また「気分障害の診断基準を満たさないうつ状態」は「発症には至っていないうつ状態」ともいう。
本発明において「気分障害の発症のリスク（危険度）を評価／検査／診断する」とは、気分障害の発症のリスク（危険度）の有無及び／又は程度（高低）を評価／検査／診断すること、並びに、うつ状態を呈するリスク（危険度）の有無及び／又は程度（高低）を評価／検査／診断することを含んでいる。すなわち、リスクの有無を評価／検査／診断してリスクがあると判定された場合に、さらにリスクの程度を評価／検査／診断する態様も包含する。
本発明において「診断」とは、被験者が対象となる障害に罹患しているかどうか、被験者が罹患している対象となる障害の重症度、被験者が対象となる障害を発症するリスク（危険度）、被験者の対象となる障害の素因の有無、及び／又は被験者が罹患している対象となる障害について施された治療に対する治療効果を、評価し、疾患又は病態の同定を行うことをいう。また、本明細書中の「検査」とは、医師による診断あるいは同定を必須としない、検査対象のヒト（「被験者」とも称する）における、対象となる障害に罹患しているかどうか、被験者が罹患している対象となる障害の重症度、被験者が対象となる障害を発症するリスク、被験者の対象となる障害の素因の有無、及び／又は被験者が罹患している対象となる障害について施された治療に対する治療効果の検査を指す。本発明の測定方法及び検査によって得られた結果は、診断の一材料になりうる。
本発明において「治療」とは、対象疾患の症状を完治又は軽減させること、対象疾患の症状の悪化を抑制すること、対象疾患の発症を抑制すること、又は遅延させることを含む。すなわち、被験者が対象疾患を発症していない場合の「予防」を含む。
本発明において、「ＨＨＶ−６」とは、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ；  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）であり、β−ヘルペスウイルス亜科に属する。ＨＨＶ−６にはＨＨＶ−６  Ｖａｒｉａｎｔ  Ａ  （ＨＨＶ−６Ａ）とＨＨＶ−６  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｂ（ＨＨＶ−６Ｂ）の２つのバリアントが存在するが、本発明においてＨＨＶ−６は、好ましくはＨＨＶ−６Ｂである。
本発明において「抗体」とは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）並びに抗体の機能的断片及び反応性を維持する範囲において変異導入された抗体の機能的断片を含む形態であることを意図している。「抗体の機能的断片」とは、前述の抗体の一部分の領域を有し、かつ抗原結合能を有しているもの（結合性断片と同義）を指す。抗体の機能的断片としては、具体的にはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｃフラグメントなどが挙げられる。本発明において、抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれの天然型抗体も含む。さらに、遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体、並びに当該抗体の機能的断片を含む。天然型抗体は、特に限定はされないが、ウシ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒト、マウス、ウサギ、ラット又はヒツジ等を含む、あらゆる生物種に由来し得る。
遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体を遺伝子改変して得られるヒト化抗体及び霊長類化抗体などのキメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、変異導入抗体及びグラフト結合抗体（例えば、他のタンパク質及び放射性標識などがコンジュゲート又は融合している抗体）が挙げられ、既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。
また、単鎖抗体及び抗イディオタイプ抗体等も本発明に係る抗体の例示として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の融合タンパク質を認識する抗体を「抗融合タンパク質抗体」と称する。ここで「抗体が認識する」とは、抗体が特異的に結合することを意味する。
本明細書において「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、生物個体内における実験系を意味し、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、生物個体内における実験系ではなく、例えば、培養された組織若しくは細胞、又は、単離されたタンパク質等を用いる系を意味する。
〔１．融合タンパク質〕
本発明は、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質（以下、「融合タンパク質」と称する。）を提供する。
本発明者らは、ＳＩＴＨ−１を細胞中で発現させると細胞内に存在するＣＡＭＬと結合することを見出したが（特許文献２）、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬを細胞中で共発現させると不溶性となり、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬの結合体を単離することはできなかった。ここで本発明者らは、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬの融合タンパク質とすることにより初めて、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬとの可溶性結合体を単離することに成功した。
従って、本発明の一態様は、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬとを融合させ、融合タンパク質とすることにより、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬとの可溶性結合体を取得する方法である。
本発明において、「ＳＩＴＨ−１」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質として単離・同定されたものであり、Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６（ＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質）−１と称する。ＳＩＴＨ−１は、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋ  ｕｎｄｅｒ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ＨＶ７６３９１３．１  ａｎｄ  ＨＶ７６３９１４．１）。なお、本明細書において「野生型ＳＩＴＨ−１」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。ＳＩＴＨ−１は、ＳＩＴＨ−１遺伝子によってコードされている。このＳＩＴＨ−１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１７９５塩基対（約１．７９ｋｂｐ）のサイズを有しており、９５４番目から９５６番目の塩基配列が開始コドン（Ｋｏｚａｋ  ＡＴＧ）であり、１４３１番目から１４３３番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＡ）である。したがって、上記ＳＩＴＨ−１遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列のうち、９５４番目から１４３０番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有しており、このＯＲＦは、４７７塩基対（約０．４８ｋｂｐ）のサイズを有している。ＳＩＴＨ−１のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ストップコドンの３塩基を含んで記載している。
本発明に係る、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質は、以下に示すＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質を包含するものである。
本発明において「ＳＩＴＨ−１タンパク質」とは、野生型ＳＩＴＨ−１のみならず、以下の（１）〜（４）に含まれるすべてのタンパク質を包含する、野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質をいう。
また、例えば、本発明においてＳＩＴＨ−１タンパク質は、以下の（１）〜（４）の何れかに示す、野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であり得る。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、かつ野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜３１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、１〜２３個であることが好ましく、１〜１５個であることがより好ましく、１〜７個であることがさらに好ましく、１〜５又は６個であることが特に好ましい。以下、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を、アミノ酸の変異と総称する場合がある。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、８８％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（４）上記（１）に記載の、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる野生型ＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
本発明において「ＣＡＭＬ」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、Ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｉｇｎａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄであり、２９６アミノ酸からなる、分子量約３８ｋＤａのタンパク質である。本発明において「野生型ＣＡＭＬ」とは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を指す。このＣＡＭＬ遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号５に示すように、１３５０塩基対（約１．３５ｋｂｐ）のサイズを有している。また、このＣＡＭＬ遺伝子のＯＲＦは配列番号２２に示す塩基配列を有する。
ＣＡＭＬは、もともとＴ細胞受容体シグナル伝達を制御する小胞体膜タンパク質として単離されたが、その後、小胞体膜においてＴＲＣ４０の受容体として機能することが明らかになっている（非特許文献４）。また、ＣＡＭＬはリンパ球や脳内で強く発現し、細胞内でＳＩＴＨ−１と強く結合して細胞内カルシウムを上昇させる機能を持つことが知られている（特許文献２）。
本発明において「ＣＡＭＬタンパク質」とは、野生型ＣＡＭＬのみならず、以下の（５）〜（８）に含まれるすべてのタンパク質を包含する、野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質を「ＣＡＭＬタンパク質」と称する。
本発明に係るＣＡＭＬタンパク質は、以下の（５）〜（８）の何れかに示す、野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であり得る。
（５）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、かつ野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。
（６）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１〜５９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、１〜４４個であることが好ましく、１〜２９個であることがより好ましく、１〜２３個であることがさらにより好ましく、１〜１４個であることがさらにより好ましく、１〜５又は６個であることが特に好ましい。
（７）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、かつ野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、８８％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（８）上記（１）に記載の野生型ＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＳＩＴＨ−１と結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
ＳＩＴＨ−１タンパク質及びＣＡＭＬタンパク質の由来は限定されず、例えば、化学合成されても、或いは、遺伝子組み換え技術を用いて産生されてもよい。より具体的には、ＳＩＴＨ−１タンパク質及びＣＡＭＬタンパク質は、単離精製されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチド、及び、遺伝子組み換え技術に基づいて宿主細胞から産生されたポリペプチドをその範疇に含む。なお、宿主細胞については「形質転換細胞」を説明する欄で詳述する。
ＳＩＴＨ−１タンパク質の一例は、配列番号１にそのアミノ酸配列を示す野生型のＳＩＴＨ−１タンパク質である。ＣＡＭＬタンパク質の一例は、配列番号４にそのアミノ酸配列を示す野生型のＣＡＭＬタンパク質である。
上記（２）〜（４）に示したタンパク質は、（１）に示したタンパク質を基準とした場合に、（６）〜（８）に示したタンパク質は、（５）に示したタンパク質を基準とした場合にそれぞれ変異体と捉えることができる。（２）〜（４）に示したタンパク質は、例えば、部位特異的な突然変異誘発法を用いて、上記（１）に示したタンパク質をコードするポリヌクレオチドに人為的に変異を導入したものを発現させることによって得ることが可能である。同様に、（６）〜（８）に示したタンパク質は、例えば、部位特異的な突然変異誘発法を用いて、上記（５）に示したタンパク質をコードするポリヌクレオチドに人為的に変異を導入したものを発現させることによって得ることが可能である。
本発明の融合タンパク質は、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質とが、いずれの順序で結合していてもよいが、好ましくはＳＩＴＨ−１タンパク質のＣ末端側にＣＡＭＬタンパク質のＮ末端側が結合した融合タンパク質（以下、「Ｓ−Ｃタンパク質」と称する。）又はＳＩＴＨ−１タンパク質のＮ末端側にＣＡＭＬタンパク質のＣ末端側が結合した融合タンパク質（以下、「Ｃ−Ｓタンパク質」と称する。）である。
また、ＳＩＴＨ−１タンパク質及びＣＡＭＬタンパク質の少なくとも一方が、融合タンパク質中に２つ以上含まれてなる構造を有していてもよい。Ｓ−Ｃタンパク質は、好ましくは細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有する。
融合タンパク質の準備の方法は特に限定されず、例えば公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させてもよい。例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌等の発現システムを用いて発現することによって取得することができる。
融合タンパク質において、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質とは直接結合していてもよく、あるいはリンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。
リンカーとしては、複数個のアミノ酸からなるポリペプチドのリンカーが挙げられる。このリンカーの長さに限定はないが、３００アミノ酸以下であってよく、好ましくは、２００アミノ酸以下、１７０アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１４０アミノ酸以下、１３０アミノ酸以下、１２０アミノ酸以下、１１０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下であり、より好ましくは４０アミノ酸以下である。また、このリンカーの長さは、５アミノ酸以上であってよく、好ましくは１０アミノ酸以上である。リンカーは例えば、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するものを例示できるが、これに限定されない。
また、上記に加え、他のポリペプチドをさらに結合させた融合タンパク質も本発明の範疇である。例えば、融合タンパク質の例えばＣ末端に、後の精製や検出用のタグを付加しても良い。このようなタグとして例えば、ｃ−ｍｙｃエピトープタグ（Ｍｕｎｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅｌｈａｍ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６：２９１−３００）やヒスチジンタグ（Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）ＢｉｏｓｕｒａｓｓｈｕＴｅｃｈｎｏｌ  ６：１３２１−１３２５，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：７２１１−７２１５）等があるがこれらに限定されるものではない。
なお、融合タンパク質は、昆虫細胞や植物細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、無細胞発現系など、他の公知の発現系で発現させてもよい。例えば、以下の〔４．形質転換細胞〕の項目の細胞並びに発現方法が好適に用いられる。
本発明に係る融合タンパク質は、例えば、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＳ−Ｃタンパク質、例えば、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するＣ−Ｓタンパク質が例示される。
また、本発明の融合タンパク質を認識する抗体も本発明の一態様である。
〔２．本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド〕
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記〔１．融合タンパク質〕に記載の融合タンパク質の何れかをコードするものである。このポリヌクレオチドは、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを例示できる。
（１）配列番号１７又は１８の何れかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）配列番号１７又は１８の何れかに記載のアミノ酸配列において１〜９６個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、１〜７２個であることが好ましく、１〜４８個であることがより好ましく、１〜２４個であることがより好ましく、１〜１９個であることがより好ましく、１〜１４個であることがより好ましく、１〜９個であることがさらにより好ましく、１〜４個、５個又は６個であることが特に好ましい。
（３）配列番号１７又は１８の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、（１）〜（３）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件などが挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などの付加的な配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではなく、本発明に係るポリヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法などの核酸合成法に従って合成してもよい。
また、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲなどの増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該ポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）などを鋳型にしてＰＣＲなどを行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
本発明に係るポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号１９及び２０に塩基配列を示すポリヌクレオチドなどを挙げることができる。
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、ＳＩＴＨ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＣＡＭＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に、上記リンカーをコードするポリヌクレオチドが挿入されたポリヌクレオチドであってよい。
〔３．融合タンパク質を固定化した担体〕
本発明は、本発明に係る融合タンパク質を固定化した担体を提供する。このような担体は、固体又は不溶性材料（例えば、濾過、沈殿、磁性分離などにより反応混合物から分離することができる材料）であれば特に限定されない。また、固体担体の形状は、例えば、平板形状（すなわち基板又はシート状）又は球形状等が挙げられるが特に限定されず、具体的には、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。融合タンパク質を担体に固定化する方法については、当業者は、担体の性質や目的に応じて、公知の方法を適宜利用可能である。
また、本発明に係るポリペプチドを基体に供して固定化する方法は基体の材質に応じて適宜選択すればよく、具体的には例えば、ビオチン−アビジン法、抗原抗体法、及びＨｉｓ−ｔａｇ等を利用したアフィニティタグ法などが利用できるがこれらに限定されない。
また、融合タンパク質遺伝子を導入して融合タンパク質を発現させる導入先となる細胞（宿主細胞）も、本発明の担体に含まれる。特に（間接）蛍光抗体法により測定を行う場合、このような態様が好ましい。なお、細胞は、公知技術に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、ヒト由来細胞、サル由来細胞、昆虫細胞を好ましく使用することができ、最も好ましくはヒト由来細胞である。なお、宿主細胞の詳細については、〔９．組換え発現ベクター〕に記載の通りである。
〔４．抗体検出器具〕
本発明において「抗体検出器具」とは、本発明の融合タンパク質をプローブとして用いたものである。すなわち、抗融合タンパク質抗体と特異的に結合する上記プローブを、担体上に固定化したもの等が挙げられる。担体としては、上述の〔３．融合タンパク質を固定化した担体〕の項目に記載のものが包含される。
〔５．抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する方法〕
本発明者らは、被験者から取得した生物学的試料中の、ＳＩＴＨ−１を認識する抗体を測定することにより、被験者が気分障害を有するか否かを診断できること、また、ＳＩＴＨ−１は、アストロサイトでＣＡＭＬと強く結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させることを見出している（特許文献２）。
その後、本発明者らは気分障害について、以下の発症機序を見出している（特許文献３）。すなわち、ＨＨＶ−６が嗅上皮に感染しＳＩＴＨ−１を発現すると、嗅覚系が障害され嗅球細胞のアポトーシスを生じる。このような嗅覚系の機能障害により、強い不正なシグナルが視床下部に伝達された結果、不正なストレス応答を起こしやすくなる状態である「ストレス脆弱性」を生じる。そして「ストレス脆弱性」が生じると、環境中のマイルドなストレスであっても過敏に反応してしまい、気分障害を発症する。そしてＨＨＶ−６が嗅上皮細胞に頻回感染することにより、気分障害の症状は一層重篤となる。なお、本書面において、嗅上皮細胞とは、嗅神経鞘細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を含む嗅上皮の細胞をいう。嗅上皮細胞は、好ましくは嗅上皮のグリア細胞である。
本発明者らは、さらに鋭意研究を進めた結果、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬの融合タンパク質を認識する抗体の抗体レベルを測定することにより、被験者が気分障害に罹患しているかどうかだけではなく、被験者が発症には至っていないうつ状態か否か、被験者が気分障害を発症するリスク（危険度）、被験者がうつ状態を呈するリスク（危険度）、気分障害の素因を有しているか否か、気分障害の重症度、及び／又は気分障害に罹患している被験者が施された気分障害に関する治療の効果を評価することができることを見出した。また、本測定方法は、従来法よりも検出感度が大幅に向上し、さらには気分障害の原因をも判別できることが明らかになった。その詳細について、以下に詳述する。
本発明は、抗融合タンパク質抗体の抗体レベル測定の対象物において、本発明に係る融合タンパク質を用いて、当該融合タンパク質を認識する抗体の抗体レベルを測定する方法を提供する。
一実施形態において、本発明に係る抗体レベルの測定方法は、１）本発明に係る融合タンパク質と、抗融合タンパク質抗体の抗体レベル測定の対象物とを接触させる接触工程、及び、２）接触工程後に当該抗体を検出し、抗体レベルを測定する測定工程、を含む方法である。
また、一態様として、本発明は、被験対象生物から分離された生物学的試料において、本発明に係る融合タンパク質を用いて、当該融合タンパク質を認識する抗体の抗体レベルを測定する方法を提供する。
本明細書において「被験対象生物」とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物を意味するが、好ましくはヒトである。
一実施形態において、本発明に係る抗体レベルの測定方法は、１）本発明に係る融合タンパク質と、被験対象生物から分離された生物学的試料とを接触させる接触工程、及び、２）接触工程後に当該抗体を検出し、抗体レベルを測定する測定工程、を含む方法である。
（接触工程）
抗体レベルの検出の対象物の種類は、抗体含有の有無、又はその含有量を検出したい対象物であれば特に限定されず、対象物としては、例えば、生物系試料、又は非生物系試料が挙げられる。好ましくは被験対象生物から分離された生物学的試料である。
本発明において「生物学的試料」は、抗体の量、抗体価を測定しうる生体由来の試料であれば特に限定されない。好ましくは、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、鼻汁、汗、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される１種又は２種以上であり、より好ましくは、血液、血清、血漿、又は脳脊髄液である。被験対象生物の侵襲度の低さという観点からは、血液試料のなかでも、末梢血が好ましい。また、ＩｇＡの抗体レベルを検出する場合には、唾液又は鼻汁が好ましい。
なお、非生物系試料としては、抗融合タンパク質抗体を所定の濃度で含む抗融合タンパク質抗体標準サンプルなどが挙げられる。
（測定工程）
上記測定工程は、上記接触工程後に行われ、抗融合タンパク質抗体を検出し、当該抗体の抗体レベルを測定する工程である。
本発明において「抗体レベル」とは、生物学的試料中に含まれる当該抗体の量あるいは抗体価をいう。これらの値の測定は、公知の方法を用いて行うことが可能である。限定されるものではないが、例えば、（間接）蛍光抗体法（本明細書において間接蛍光抗体法を、「ＩＦＡ」という場合がある。）、ドットブロットアッセイ法、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ法、直接吸着によるＥＬＩＳＡ法、競合によるＥＬＩＳＡ法を含む））、放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）、及び免疫拡散アッセイ法のような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫組織学的方法を利用したアッセイ法で検出できる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像解析等によって検出することもできる。
生物学的試料中に存在する抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば、健常者の標準試料若しくは典型的な気分障害患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。抗体を検出するためのこのようなアッセイ法は、例えば、ＥＬＩＳＡについて、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉｒａ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １１：１９−３０（１９８８）に記載されている。
適切な酵素標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来のものが挙げられる。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９ｍＴｃ））、並びに蛍光標識（例えば、フルオレセイン及びローダミン）並びにビオチンが挙げられる。
本発明において利用可能な標識について、具体的な例を以下に示す。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
適切な放射性同位体標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。１１１Ｉｎは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜならこれは、１２５Ｉ又は１３１Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さらに、この放射性核種は、イメージングのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓｒａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。適切な非放射性同位体標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、及び５６Ｆｅが挙げられる。
適切な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、及びフルオレサミン標識が挙げられる。
適切な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、及びコレラ毒素が挙げられる。
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、及びエクオリン標識が挙げられる。
核磁気共鳴コントラスト剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ、及びＦｅのような重金属原子核が挙げられる。
上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１−３１（１９７６））及びＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１：１−４０（１９７７））により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。
上記測定工程において、「Ｓ−Ｃタンパク質」を認識して結合する抗体（以下「抗Ｓ−Ｃ抗体」という。）を測定するために、Ｓ−Ｃタンパク質を好ましく用いることができる。また、「Ｃ−Ｓタンパク質」を認識して結合する抗体（以下「抗Ｃ−Ｓ抗体」という。）を測定するために、Ｃ−Ｓタンパク質を好ましく用いることができる。
抗体は抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルと抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルとを同時又は順次に測定してもよい。
本発明の抗体測定方法において、免疫組織学的方法による測定、好ましくはＩＦＡによる測定では、生物学的試料と標識した抗ＣＡＭＬ抗体の双方を融合タンパク質発現細胞に反応させることにより、トランスフェクション効率の確認、タンパク質の発現量、蛍光強度を測定する際の測定部位の確認などが可能となる。このような抗ＣＡＭＬ抗体は、限定されるものではないが、公知の手法で作製されたウシ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒト、マウス、ウサギ、ラット又はヒツジ由来のモノクローナル抗体を好適に用いることができる。このような二重染色を行うことにより、イメージアナライザーなどを用いた自動測定を容易に行うことができる。例えば、後述する実施例の図１３に示される二重染色では、気分障害患者血清のＩＦＡ蛍光強度を測定する際に、抗ＣＡＭＬマウス抗体によって赤色に染色された部分の緑色発光の強度を測定すれば、イメージアナライザーによる自動測定が容易である。また、抗ＣＡＭＬマウス抗体の赤色発光の強度を測定することで、各測定のタンパク質の発現量の補正が可能となる。
また、測定工程において、抗体レベルの検出の対象物、例えば、被験対象生物から分離された生物学的試料中の、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程をさらに包含していてもよい。抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの測定は、抗融合タンパク質抗体の抗体レベルの測定工程と同時又は抗融合タンパク質抗体の抗体レベルの測定工程と連続的に行ってもよく、測定される抗体の順序はいずれの順番であってもよい。測定に用いられるタンパク質は、例えば、配列番号４及び配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するＣＡＭＬタンパク質が例示される。
抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの測定工程を包含する測定方法の具体的な例として、例えば、ＣＡＭＬタンパク質を発現させた細胞に、抗融合タンパク質抗体の測定を行った血清と同じ血清を反応させることにより、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する方法が挙げられる。このようにして融合タンパク質に対する抗体のＩＦＡ蛍光強度を、ＣＡＭＬに対する血清抗体のＩＦＡ蛍光強度で補正することで、うつ病やうつ状態の診断成績が向上することが明らかになった（実施例３）。
（検査工程）
本発明に係る抗体レベルの測定方法は、さらに必要に応じて、上記測定工程での測定結果に基づき、気分障害の罹患の有無、気分障害の発症リスク、被験者（例えば健常者）がうつ状態を呈するリスク、被験者が気分障害の判断基準を満たさないうつ状態か否か、気分障害発症の素因の有無、又はうつ状態の原因、気分障害の重症度、又は気分障害に罹患している被験者が施された気分障害に関する治療の効果を検査する検査工程をさらに含んでいてもよい。当該検査は任意の試験者によって行われるものを意図し、医師等による診断を包含していない。検査工程は、以下に示す診断方法における診断工程と同様であり、詳細は以下の〔６．気分障害の診断方法〕に記載する。
〔６．気分障害の診断方法〕
本発明は、被験者から分離された生物学的試料において、本発明に係る抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する工程を包含する、被験者における気分障害の診断方法を提供する。
本明細書において「被験者」とは、対象のヒトを指す。被験者としては、年齢、性別等は特に限定されない。
一例において、抗融合タンパク質抗体は、抗Ｓ−Ｃ抗体又は抗Ｃ−Ｓ抗体であり得る。
例えば、一実施形態に係る被験者における気分障害の診断方法は、被験者から分離された生物学的試料において、本発明に係る抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する測定工程、及び、当該測定工程における測定結果に基づき、気分障害の罹患の有無、被験者が気分障害の診断基準を満たさないうつ状態か否か、気分障害の発症リスク、被験者（例えば健常者）がうつ状態を呈するリスク、気分障害発症の素因の有無、うつ状態の原因、気分障害の重症度、及び／又は気分障害に罹患している被験者が施された気分障害に関する治療の効果を診断する診断工程を包含する。本発明に係る診断方法における測定工程は、上述の〔５．抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する方法〕の（測定工程）の項目に記載した通りである。
（診断工程）
診断工程において、被験者が気分障害に罹患しているかどうか、発症には至っていないうつ状態か否か、被験者が気分障害を発症するリスク（危険度）、被験者（例えば健常者）がうつ状態を呈するリスク（危険度）、気分障害発症の素因を有しているか否か、気分障害の重症度、及び／又は気分障害に罹患している被験者が施された気分障害に関する治療の効果を評価することを含む。この気分障害、及び気分障害の診断基準を満たさないうつ状態は、好ましくはストレス因子による一過性うつ状態は含まない。
別の実施形態では、本発明の診断方法は、被験者がうつ状態を呈する場合、当該うつ状態が、ストレス因子によって生じる一過性うつ状態か否かを判定する工程であってもよい。この方法により陽性と診断された場合は、本発明者らが見出した上述の発症機序によりうつ状態が生じていると判定できる。なお、本診断方法は、被験者の気分障害に関する素因を評価していると捉えることもできる。
診断工程において、被験者から分離された生物学的試料における、抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルを測定することにより、被験者が気分障害に罹患しているかどうかだけではなく、気分障害の診断基準を満たさないうつ状態であるかどうかを診断することができる。これは言い換えれば、被験者が気分障害を発症するリスクを評価することができるということに他ならない。さらには、当該被験者がうつ状態を呈する場合、当該うつ状態が、ストレス因子による一過性うつ状態かどうか、すなわちうつ状態の原因を判定することができる。さらに、当該被験者がうつ状態を呈していない健常者であっても、今後うつ状態となるリスクを評価することが可能である。
また、被験者から分離された生物学的試料において、抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルを測定することにより、発症している気分障害及び気分障害の診断基準を満たさないうつ状態を、健常状態と判別することができる。従って、これにより、当該被験者が気分障害を発症するリスクを評価することができる。さらには、当該被験者がうつ状態を呈する場合、当該うつ状態が、ストレス因子による一過性うつ状態かどうか、すなわちうつ状態の原因を判定することができる。
本発明者らは、上記抗体レベルの測定結果や各被験者群の気分障害の症状の有無及び重症度（実施例２、３）、ＳＩＴＨ−１がＣＡＭＬと結合して細胞中のカルシウム濃度を上昇させる事実や、後述する気分障害発症機序などから、嗅上皮細胞におけるＳＩＴＨ−１発現回数が増加するほど、気分障害発症リスク、気分障害の素因、及び気分障害の重症度が増し、それとともに、抗融合タンパク質抗体の抗体レベルが増加していることを見出した。
以上の研究結果から、限定されるものではないが、以下の機序が明らかになった。すなわち、もともとヒトはＣＡＭＬに対する自己免疫反応を生じているが、ＨＨＶ−６の嗅上皮への感染によりＳＩＴＨ−１が発現し、これにＣＡＭＬが結合すると、ＣＡＭＬに対する免疫がＣＡＭＬとＳＩＴＨ−１との結合体に移行し、その後ＨＨＶ−６の頻回感染に伴い、主要なエピトープが、抗Ｃ−Ｓ抗体認識部位から抗Ｓ−Ｃ抗体認識部位へ、さらには抗ＳＩＴＨ−１抗体認識部位へと移行していると考えられる。抗ＣＡＭＬ抗体が、健常者と比べ、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性のうつ病患者において有意に減少していることもこの機序を裏付けている（図９）。また、脳内や嗅上皮等に存在するアストロサイトでわずかにしか産生されないＳＩＴＨ−１が、血清抗体として感度よく検出される理由も、ＣＡＭＬに対する自己免疫による免疫反応の増強から説明することができる。
また、上記の機序を考慮すると、被験者から分離された生物学的試料における、抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベル、抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベル、及び／又は抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルの比較により、気分障害及び／又は気分障害の診断基準を満たさないうつ状態の、進行の程度の評価や予後の予測を行うことができることもまた明らかである。
以下に、診断工程についてさらに詳細に説明する。
「抗体レベル」について、当業者は、健常者における定量値（正常値）、典型的な気分障害患者の定量値（疾患値）、又は軽度、中度若しくは重度の気分障害患者の定量値（疾患値）を参考に、適切に閾値を設定することができる。すなわち、一般に診断薬における閾値（いわゆるカットオフ値）は、臨床試験から得られた健常者や患者の多くの測定値を基に、その目的に合わせて当業者が適切に設定するものであり（例えば、スクリーニング検査のように、疾患群を見逃さないことを最優先として二次検査以降で確定診断するような場合には、特異度よりも感度を優先し、カットオフ値を低く設定する、気分障害の症状の程度を診断する場合には、軽度、中度又は重度の気分障害患者の定量値を参考に閾値を高く設定する等）、本明細書に開示されている記載から、当業者は容易に診断のための閾値を決定することができる。診断に用いられる対照の数値については、健常者又は気分障害患者個人の試料の数値を直接利用してもよく、一定の人数の健常者又は気分障害患者の試料の数値を母集団としたときに得られる平均値を利用してもよい。
すなわち、例えば「抗体レベルの値が高い」ということは、測定した抗体レベルが上記閾値（例えば、健常者の抗体レベルの値）を上回るか否かによって判断することができ、「抗体レベルの値が低い」ということは、測定した抗体レベルが前記閾値を下回るか否かによって判断することができる。
つまり、気分障害の発症の有無、気分障害発症のリスク、被験者（例えば健常者）がうつ状態を呈するリスク、被験者が気分障害の診断基準を満たさないうつ状態か否か、うつ状態の原因、及び／又は気分障害発症の素因の有無、気分障害の重症度、及び／又は気分障害に罹患している被験者が施された気分障害に関する治療の効果の診断（評価）は、例えば、上述の測定工程により得られた、抗体レベルを、被験者から分離した試料の数値と、上述の対照となる正常値及び／又は疾患値あるいは閾値（カットオフ値）とで比較することによって行うことができる。診断の一例では、対照と比較して被験者から分離された生物学的試料における抗体レベルが有意に高い場合、被験者は、気分障害を発症している、気分障害の発症のリスクを有している、うつ状態がストレス因子によって生じる一過性うつ状態でない、気分障害発症の素因を有している、及び／又は気分障害に関する治療の効果が十分ではないと判定される。なお、抗体レベルが有意に高いとは、定量的測定による結果であっても定性的測定による結果であってもよい。すなわち、具体的な数値の比較のみならず、相対的な量の比較（実際に量を算出する必要は無く、ある基準より高いか低いかを判断する）も含む。対照試料の上記測定は、被験者の試料の測定と同時に行われてもよく、また別々に行われてもよい。すなわち、被験者の数値と比較される対照試料の数値は、被験者の試料が測定されるときとは異なるときに行われた測定で得られた値であってもよい。また、対照試料の測定は、被験者の測定を行う者自身が行う必要は無く、例えば、既に取得されデータベース等に蓄積されている対照試料の測定値を閾値として用いることもできる。
これらの診断方法においては、さらに抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの測定工程を包含してもよい。本発明者らは、ヒトの血清中に抗ＣＡＭＬ抗体が存在することを見出した（実施例２）。なお、ＣＡＭＬはヒトのタンパク質であることから、抗ＣＡＭＬ抗体は自己免疫反応による自己抗体であると考えられる。上記の融合タンパク質を用いた気分障害の診断方法で得られた各検体の抗体レベルの値を、各検体の抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの値で補正することにより、診断の精度を一層向上させることができる（実施例３）。限定されるものではないが、融合タンパク質を用いた気分障害の診断方法で得られた各検体の抗体レベルの値を、各検体の抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの値で除する補正を、好ましく用いることができる。
また、この診断精度向上効果は、本発明者が開発した「被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体を測定することにより、被験者が気分障害を有するか否かを診断する方法」（特許文献２。以下「従来法」という。）にも適用することができる（図６、図１０）。
従って、本発明の一態様は、被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する気分障害の診断方法において、該被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含む、診断方法である。
なお、１）被験対象生物から分離された生物学的試料における抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する工程、２）被験対象生物から分離された生物学的試料における抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する工程、を含む測定方法も、本発明の一態様である。抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルの測定は、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルの測定工程と同時又は抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルの測定工程と連続的に行ってもよく、測定される抗体の順序はいずれの順番であってもよい。
（その他の工程）
本発明に係る診断方法は、面接における問診及びＢＤＩなどのアンケートによる従来の診断方法の少なくとも一つ以上を、適宜組み合わせることもできる。
また、本発明の診断を行うためのデータを取得する方法も、本発明の一態様である。すなわち、上記診断方法の各工程を含むことを特徴とする診断のためのデータ取得方法も本発明に含まれる。例えば、上述の各工程を含む診断方法に利用するために、被験者から分離された生物学的試料の抗融合タンパク質抗体の抗体レベルのデータを取得する工程を包含することを特徴とする、気分障害の診断のためのデータ取得方法も本発明に含まれる。本発明のデータ取得方法において、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルのデータを取得する工程を含むことは、より好ましい。
実施例にも示す通り、本発明の診断方法、好ましくは抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルを測定する測定工程を包含する本発明の診断方法、又は、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルにより抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを補正する工程を含む本発明の診断方法は、従来法よりも検出感度が向上していることが明らかになった。これにより診断の技術的難易度が低下するとともに、非特異結合の影響を軽減できる。また、マウス等の非ヒト動物により作製された抗ＣＡＭＬ抗体を使用することにより、イメージアナライザー等の自動化手段の導入を容易に行うことができる（実施例４）。
（他疾患が原因となる気分障害の診断）
本発明の診断方法はいずれも、炎症性腸疾患及び／又は慢性呼吸器疾患に伴う気分障害の診断にも適用することができる。炎症性腸疾患や慢性呼吸器疾患は、高い頻度で気分障害を伴うことが知られているが、このような患者の抗ＳＩＴＨ−１抗体価は健常者と比べても高い。限定されるものではないが、このような気分障害の発症機序として、腸や肺に存在するアストロサイト様細胞に感染したＨＨＶ−６の再活性化に伴って発現したＳＩＴＨ−１が、ＣＡＭＬと結合して、中枢神経に影響を及ぼしていると考えられる。炎症性腸疾患や慢性呼吸器疾患に伴う気分障害は、原疾患の治療回復にも影響することが知られており、このような気分障害を適切に診断し治療に繋げることは、原疾患の治療にも有効である。本発明の一態様は、被験者における炎症性腸疾患及び／又は慢性呼吸器疾患に伴う気分障害を診断する方法であって、被験者から分離された生物学的試料において、抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定することを特徴とする、気分障害の診断方法である。その具体的な一態様として、炎症性腸疾患や慢性呼吸器疾患と診断された患者を対象に、該患者から分離された生物学的試料において、抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定することを特徴とする、気分障害の診断方法であってよい。なお、炎症性腸疾患は、好ましくはクローン病である。
（気分障害の診断方法によって得られた診断結果の利用）
上記で説明した診断方法を行うことによって得られた診断結果は、気分障害の診断資料の１つとして利用することができる。つまり、上記の診断方法を行うことによって得られた診断結果に基づいて、治療が必要か否か判定し、必要な場合に治療を行うことができる。治療方法としては、以下の〔８．気分障害の治療方法〕に記載の治療方法を適用することができる。
〔７．気分障害診断のための診断キット〕
本発明は、気分障害診断のための診断キットを提供する。本発明において「キット」とは、本発明の測定方法、データ取得方法、又は診断方法を実施するためのものであればよく、具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。
本発明の一態様は、Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質、ＣＡＭＬタンパク質から選択される物質のうち少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上を含み、上記の診断方法を行うための診断キットである。
本発明の診断キットは、限定されるものではないが、Ｓ−Ｃタンパク質を固定化した担体、Ｃ−Ｓタンパク質を固定化した担体、ＣＡＭＬタンパク質を固定化した担体のうち、少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上、さらに好ましくは少なくともＳ−Ｃタンパク質とＣＡＭＬタンパク質とを含んでいる、上記の診断方法を行うための診断キットであってよい。このような担体を用いることにより、例えば、同じ生物学的検体から一度に複数の抗体を検出する、いわゆる「マルチプレックスアッセイ」を好適に行うことができる。また、本発明の一態様は、Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質、ＣＡＭＬタンパク質から選択される物質のうち少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上、さらに好ましくは少なくともＳ−Ｃタンパク質とＣＡＭＬタンパク質とを、同一の担体に固定化した担体を含み、上記の診断方法を行うための診断キットであってもよい。
本発明に係る診断キットは、さらに、必要に応じて、抗融合タンパク質抗体の検出に用いる各種試薬及び器具（緩衝溶液、ピペットなど）、試料（測定の対象物）を調製するための各種試薬及び器具（試験管、緩衝溶液など）、検出キットの使用説明書、測定の時に用いられる対照用となる試料、検出結果を解析するときに用いられる対照用のデータ、などの少なくとも１つを備えていてもよい。対照用となる試料の例として、当該試料中の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベル、抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベル、及び／又は抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを、健常者における定量値（正常値）、典型的な気分障害患者の定量値（疾患値）、又は軽度、中度若しくは重度の気分障害患者の定量値（疾患値）を参考に、診断目的に応じて適切に調製した試料が挙げられる。限定されるものではないが、このような試料は、健常者や気分障害患者の血清、血漿、鼻汁、唾液などの生物学的試料を調製することにより作製することができる。このように調製された試料そのものも本発明の一態様である。なお、検出キットの使用説明書には、上記〔５．抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する方法〕の欄で説明した、本発明に係る測定方法の内容が記録されている。
〔８．気分障害の治療方法〕
本発明は、さらに、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法を提供する。
一実施形態において、被験者から分離された生物学的試料中の、本発明に係る抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定した結果、治療が必要と診断された被験者に対し、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法を提供する。一実施形態において抗体レベルの測定及び診断は、本発明に係る測定方法及び診断方法において行われる。一例において、治療が必要と診断される被験者は、上述の測定工程で得られた抗体レベルがある規定値（例えば対照から算出されたカットオフ値）より高い場合に、当該被験者に、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法を提供する。
また、他の実施形態において、本発明に係る治療方法は、被験者の嗅上皮細胞にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与する工程を包含する。嗅上皮細胞にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することによって、嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制することができる。
本発明者らは、上記した気分障害の発症機序を見出した（特許文献３）。これは、本発明者らが取得した以下の知見に裏付けられている。なお、本発明は、この発症機序に限定されるものではない。
本発明者らが、マウスの嗅上皮細胞（本書面において、嗅神経鞘細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を含む嗅上皮の細胞をいう。）においてＳＩＴＨ−１遺伝子を発現させたところ、当該マウス（以下「ＳＩＴＨ−１発現マウス」という。）は、嗅覚系細胞の障害、さらにはストレス脆弱性を生じ、気分障害を発症した。
上記嗅覚系細胞の障害の一例として、嗅球細胞のアポトーシスが挙げられる。ＳＩＴＨ−１発現マウスは対照マウスと比べ、嗅球においてアポトーシス関連遺伝子の発現が増大し（実施例７）、ＴＵＮＥＬ染色による嗅球の組織観察においても、より多くのアポトーシス細胞が検出された（実施例７）。
また、ＳＩＴＨ−１発現マウスでは、全脳においてＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）とウロコルチン（Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ）の異常産生が見られた（実施例７）。これらは視床下部のバイオマーカーであることから、視床下部に何らかの異常が生じていることを強く示唆していた。また脳ストレス応答因子であるＲＥＤＤ１の発現上昇も見られた（実施例７）。
そしてＳＩＴＨ−１発現マウスは、マイルドなストレスに晒すと気分障害症状を引き起こし（実施例７）、ストレス脆弱性を示した。なお、ストレス脆弱性とは、弱いストレッサ―に対して適切な応答ができない状態をいう。
さらに、ＳＩＴＨ−１発現マウスは、行動異常試験（尾懸垂試験）の結果、無動時間が延長し、うつ状態になっていることが分かった（実施例７）。この行動異常はＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）投与によって改善された（実施例７）。
以上の一連の結果から、本発明者らは、ＨＨＶ−６による気分障害発症について、上記の発症機序を見出したのである。
上記のとおり、本発明者らは、ＨＨＶ−６が嗅上皮細胞に感染してＳＩＴＨ−１を発現することで、さまざまな障害が生じることを見出した。ここで障害とは、嗅覚系細胞の障害、視床下部の異常、脳ストレス応答因子の異常発現、ストレス脆弱性、並びに、気分障害である。なお、限定されるものではないが、嗅覚系細胞の障害の一例として嗅覚系細胞のアポトーシス増加が、視床下部の異常の例としてＣＲＨ及び／又はウロコルチンの異常産生が、異常発現する脳ストレス応答因子の１つとしてＲＥＤＤ１が、それぞれ挙げられる。
（治療方法の対象）
本発明の治療方法の対象は、本発明の気分障害診断方法により気分障害である、気分障害の診断基準を満たさないうつ状態である、今後うつ状態を呈するリスク若しくは気分障害を発症するリスクを有している、気分障害の素因を有する、及び／又は気分障害に関して施された治療の効果が十分ではないと判断された被験者である。この気分障害には、好ましくはストレス因子による一過性うつ状態は含まない。抗融合タンパク質抗体の抗体レベルが高い被験者は、上記の機序で気分障害を発症している可能性が高い。本発明の治療方法により、このような被験者のＨＨＶ−６の嗅上皮細胞への頻回感染を防ぎ、症状悪化を抑制することができる。
また、本発明の治療方法の対象は、本発明の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルを測定することを特徴とする気分障害の診断方法により、気分障害の診断基準を満たさないうつ状態及び／又は被験者が気分障害を発症するリスクが高いと評価された被験者、並びに、本発明の抗Ｃ−Ｓタンパク質抗体の抗体レベルを測定することを特徴とする気分障害の診断方法により、気分障害に関して健常状態ではない、及び／又は、被験者が気分障害を発症するリスクが高いと評価された被験者、であってよい。このような被験者は、将来、上記の機序で気分障害を発症するリスクが高い。従って、このような被験者に対し、本発明の治療方法を行うことにより、気分障害の発症を予防することが可能となる。
また、本発明の治療方法の対象は、炎症性腸疾患や慢性呼吸器疾患を原因とする気分障害であると診断された患者であってよい。このような患者に対する本発明の治療は、気分障害のみならず、その原疾患の改善にも繋がると考えられる。
（治療剤及び投与方法）
本発明の治療方法において、治療剤として、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を用いることができる。
本発明におけるＨＨＶ−６感染阻害剤としては、ＨＨＶ−６の細胞への感染を阻害するものであればよいが、好ましくは、抗ＨＨＶ−６抗体、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ＨＨＶ−６ワクチン、糖水解酵素（グリコシダーゼ）阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ペプチド、糖鎖ポリペプチド、糖誘導体、等であり、より好ましくは、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ＨＨＶ−６ワクチンである。また、これらを適宜組み合わせてもよい。抗ＨＨＶ−６抗体としては、中和抗体を好ましく使用できる。
このようなＨＨＶ−６感染阻害剤は、嗅上皮細胞へのＨＨＶ−６感染を抑制できる任意の態様で投与することができるが、嗅上皮に投与することが好ましい。実際の治療にあたっては、これらのＨＨＶ−６感染阻害剤を、適量を鼻腔に噴霧する等して嗅上皮に投与することができる。
本発明で用いるＨＨＶ−６ワクチンは、好ましくは不活化ワクチン又は弱毒化ワクチン、より好ましくは不活化ワクチンである。不活化ＨＨＶ−６ワクチンは、公知のウイルス不活化処理、例えば、ホルマリン化学処理、熱や放射線などの物理的処理によってウイルスの複製能を失わせることにより、作製することができる。このワクチンには、適宜アジュバントを添加することが好ましい。当業者は公知のアジュバントを適宜選択し、使用することができる。限定するものではないが、アルミニウム塩アジュバント（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等）、乳化剤アジュバント（ＣＦＡ、ＩＦＡ、スクワレン、ＭＦ５９等）、ポリマー微粒子アジュバント（リポソーム、バイオポリマー等）、Ｔｏｌｌ様受容体（ｄｓＲＮＡ、ＣｐＧ−オリゴＤＮＡ、ＬＰＳ、βグルカン等）、イノシトール５リン酸、等を好ましく使用することができる。
なお、イノシトール５リン酸等のアジュバントは、ワクチンなしで単独で鼻腔に噴霧してもよい。これにより免疫が賦活化されて鼻腔中に存在するＨＨＶ−６に対する抗体の産生が高められることにより、ＨＨＶ−６感染を抑制することができる。
また、他のウイルスや細菌のワクチンや抗原もアジュバントとして用いることができる。一例としては、インフルエンザワクチンにＨＨＶ−６抗原を混合する態様が挙げられる。
本発明で用いるワクチンは、限定されるものではないが、好ましくは経鼻ワクチンである。ＨＨＶ−６ワクチンを鼻粘膜に噴霧し、鼻汁中に主に抗ＨＨＶ−６  ＩｇＡ抗体を産生させることにより、ＨＨＶ−６の鼻腔から脳への侵入を抑制することができる。経鼻ワクチンを使用するにあたっては、適宜鼻腔での付着性を向上させる物質、例えばゲル化剤や増粘剤を用いてもよい。
ところで、ヘルペスウイルスは細胞への感染、潜伏感染、増殖、及び再活性化というステージを採りうる。ヒトがストレスを受けると、潜伏感染しているＨＨＶ−６は、唾液腺で増殖・再活性化し、その一部が嗅上皮細胞に到達すると考えられる。よって、限定されるものではないが、ＨＨＶ−６抑制剤を利用して、唾液腺におけるＨＨＶ−６の増殖・再活性化を抑制することは、気分障害の治療に有効であると考えられる。
このようなＨＨＶ−６抑制剤は、好ましくは、抗ヒトヘルペスウイルス６薬（抗ＨＨＶ−６薬）又はウイルス再活性化抑制剤である。
抗ＨＨＶ−６薬の作用機序は特に限定されないが、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害薬、プロテアーゼインヒビター、ターミナルトランスフェラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤などが、その例として挙げられる。
好ましくは、抗ＨＨＶ−６薬は、アシクロビル（グラクソ・スミスクライン）、ガンシクロビル（シン  テックス）、バルガンシクロビル（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ）、フォスカルネット（アストラゼネカ）、ファムシクロビル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びイドキシウリジン（ＩＤＵ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９６４，９２：５５０−５５４．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ５−Ｉｄｏｏ−２−Ｄｅｓｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＩＤＵ）ｏｎ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｏ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｄｕｋｅｓ）からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
より好ましくは、抗ＨＨＶ−６薬は、ガンシクロビル又はバルガンシクロビルである。いずれも公知の化合物であり、当業者は容易に入手可能、あるいは製造可能である。
ウイルス再活性化抑制剤とは、ウイルス粒子形成やウイルス複製の直接的な抑制だけでなく、その準備段階における抑制、例えば中間段階における遺伝子発現の抑制なども含む。限定されないが、ウイルス再活性化抑制剤は、Ｄ−リボース、ビタミンＣ及び活性ヘミセルロース集合体（Ａｃｔｉｖｅ  Ｈｅｘｏｓｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＡＨＣＣ（アミノアップ化学））からなる群から選択される。
また、抗酸化作用や抗疲労作用を有する物質は、ウイルス再活性化を抑制することが多く、そのような物質も好ましく使用することができる。
これらの効果は穏やかではあるが、いずれも強い副作用がないため、継続服用が容易となる。従って、気分障害症状がない者をも対象とした、気分障害症状の予防に好ましく使用することができる。
これらの剤は、好ましくは１又はそれより多くの医薬的に許容できる担体と共に投与可能である。医薬的に許容できる担体は、投与の経路について医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、アジュバント、賦形剤、及びビヒクル、並びに適した分散剤、湿潤剤、及び懸濁剤を使用して処方される、水性の又は油性の懸濁液であってよい。
医薬的に許容できる担体は、一般的に無菌であり、そして発熱性がなく、そして水、油、溶媒、塩、糖、及び他の炭水化物、乳化剤、緩衝剤、抗菌剤、及びキレート剤を含んでよい。特定の医薬的に許容できる担体及び担体に対する活性化合物の比は、組成物の溶解度及び化学特性、投与の方式、並びに標準の医薬実務により決定される。
ＨＨＶ−６抑制剤はその種類に応じた、適切な方式で患者に投与される。例えば、唾液腺、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内、鼻腔内、硬膜外、経口、局所、皮下、又はいずれかの他の適した技術により投与可能である。好ましくは、静脈内又は腹腔内に投与され、唾液腺に移行する方式である。最適な薬剤処方は、意図される投与経路、搬送形式及び望ましい投薬量に応じて、当業者が容易に決定可能である。
投与されるＨＨＶ−６抑制剤の量は、年齢、治療しようとする状態、体重、治療の望ましい期間、投与の方法、並びに他のパラメーターに依存する。有効な用量は、医師又は他の有資格の医学専門家により日常的に決定される。好ましくは、通常ＨＨＶ−６抑制剤として提供される投与量で用いられる。
〔９．組換え発現ベクター〕
本発明は、また、融合タンパク質遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。当該ベクターの種類は、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドなど）でもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
組換え発現ベクターの作成には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと融合タンパク質遺伝子を各種プラスミドに組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。係る発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター、及びウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルス）、並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、又は荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。また、レトロウイルスベクターは、複製可能か又は複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。
また、目的の遺伝子に対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、又は宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。この点に関する好ましい実施態様としては、ベクターは、誘導性及び／又は細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するものであることが好適である。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度及び栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、及びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。
本発明に係る遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。すなわち、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このような選択マーカーとしては、例えば、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、その他にも宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明に係る遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。また、本発明に係る遺伝子は、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合されてもよい。
また、ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、当業者に公知のものを利用可能である。
本発明において、使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーター及びλＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、並びにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。
また本発明において、使用に適した公知の哺乳類細胞用プロモーターの例として、サイトメガロウイルスエンハンサー及びニワトリβ−アクチンプロモーターを含むプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、並びにＴｅｔ−ｏｎ又はＴｅｔ−ｏｆｆプロモーターが挙げられる。
組換え発現ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、及び、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
また、高等真核生物によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
また、上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ヒト由来細胞、サル由来細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞。なお、ヒト由来細胞は、ＨＨＶ−６が感染する細胞（グリア細胞、マクロファージ等）であってよく、又、ＨＨＶ−６が感染しない細胞であってもよい）；並びに植物細胞が挙げられる。より具体的には、ヒトやマウス等の哺乳類の細胞だけでなく、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で公知のものを利用可能である。
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、カルジオトキシンを用いる方法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
る。
〔１０．形質転換細胞〕
さらに本発明は、細胞内で融合タンパク質が産生されていることを特徴とする形質転換細胞を提供する。このような形質転換細胞は、宿主細胞に融合タンパク質遺伝子を導入することで作製することができる。具体的には、本発明に係るポリヌクレオチド、又は、本発明に係る組換え発現ベクター（本発明の核酸構築物と総称する）を上述した宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を作製することができる。
細胞は、好ましくはヒト細胞である。
宿主細胞への融合タンパク質遺伝子導入方法については、上述の〔９．組換え発現ベクター〕の項目に記載の通りであり、各細胞の種類に応じて適宜選択される。
上記の形質転換細胞は、導入された核酸構築物の発現を可能にする条件下で、適切な培養培地中で培養し、必要に応じて、形質転換細胞の培養物から、本発明に係る融合タンパク質を単離精製することも可能である。
さらに本発明は、融合タンパク質を嗅上皮細胞で産生させたことを特徴とする気分障害モデル動物を提供する。上記の気分障害発症機序から、融合タンパク質を嗅上皮細胞で産生させた動物が気分障害を発症する。このような気分障害モデル動物は、本発明のベクターなどを用いて、動物の嗅上皮細胞に融合タンパク質遺伝子を導入することにより作製することができる。融合タンパク質は、好ましくはＳ−Ｃタンパク質である。導入の対象となる動物は、実験動物として利用可能なものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ラット、サル等を挙げることができる。本発明のモデル動物は、気分障害の治療法の検討、薬剤の効果の検討、判定、薬剤以外の治療方法（温熱療法等）の評価等に好適に利用することができる。
〔１１．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は、以下の発明群を含み得る。
（１）ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質との融合タンパク質。
（２）前記ＳＩＴＨ−１タンパク質のＣ末端側に、前記ＣＡＭＬタンパク質のＮ末端側が結合したものである、（１）の融合タンパク質。
（３）前記ＳＩＴＨ−１タンパク質のＮ末端側に、前記ＣＡＭＬタンパク質のＣ末端側が結合したものである、（１）の融合タンパク質。
（４）前記（１）〜（３）の何れかに記載の融合タンパク質を固定化した担体。
（５）前記（２）及び／又は（３）の融合タンパク質をプローブとして用いた抗体検出器具。
（６）被験対象生物から分離された生物学的試料において、前記（１）の融合タンパク質を用いて、当該抗融合タンパク質抗体の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする測定方法。
（７）前記（１）の融合タンパク質を発現させた細胞に、標識した抗ＣＡＭＬ抗体を反応させる工程を含む、（６）の測定方法。
（８）被験者における気分障害の診断方法であって、被験者から分離された生物学的試料において、前記（１）に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、気分障害の診断方法。
（９）前記（２）に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、（８）の診断方法。
（１０）前記（２）の融合タンパク質を用いる、（９）の診断方法。
（１１）前記（３）に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定することを特徴とする、（８）の診断方法。
（１２）前記（３）の融合タンパク質を用いる、（１１）の診断方法。
（１３）該被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含む、（８）の診断方法。
（１４）前記（１）の融合タンパク質の、気分障害診断のための使用。
（１５）前記（１５）の抗体検出器具を含む、（８）の診断方法を行うための診断キット
（１６）以下に示す（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される物質のうち、少なくとも２つの物質を含むことを特徴とする、気分障害の診断キット。
（ｉ）前記（２）の融合タンパク質
（ｉｉ）前記（３）の融合タンパク質
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬタンパク質
（１７）前記（２）又は（３）の融合タンパク質をコードする核酸。
（１８）前記（１７）の核酸を含む組換え発現ベクター。
（１９）前記（１７）の核酸を導入してなる形質転換細胞。
（２０）被験者から分離された生物学的試料中の、前記（１）に記載の融合タンパク質を認識する抗体（抗融合タンパク質抗体）の抗体レベルを測定した結果、その値が高い被験者に、ＨＨＶ−６感染阻害剤及び／又はＨＨＶ−６抑制剤を投与することを特徴とする気分障害の治療方法。
（２１）被験者の嗅上皮細胞にＨＨＶ−６感染阻害剤を投与することを特徴とする（２０）に記載の気分障害の治療方法。
（２２）ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質を融合させて、可溶性の融合タンパク質を取得する工程を含む、ＳＩＴＨ−１タンパク質とＣＡＭＬタンパク質の可溶性結合体を製造する方法。
（２３）被験者から分離された生物学的試料において、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する工程と抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、気分障害の診断方法。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００１０】
〔実施例１．融合タンパク質の使用によるシグナルの増強〕
（１．１  間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）による観察）
抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性、かつ気分障害と診断された患者の血漿をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４０倍に希釈し、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）にて染色を行った。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）  をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２００倍に希釈して用いた。抗原用の発現プラスミドとして、ＣＡＭＬ、ＳＩＴＨ−１、ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬ、ＣＡＭＬ−ＳＩＴＨを、図１のように構築し、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−５ａのＣＭＶプロモーターとＦＬＡＧタグの間に挿入したプラスミドと、コントロールとしてＬＩＴＭＵＳ２８ｉを用いた。それぞれのプラスミドを、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｎｕｎｃ）で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションし、その後４８時間培養したものを、乾燥固定後に−２０℃  ５％メタノール添加アセトンで５分間固定し、ＩＦＡ抗原として用いた。これらを間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）により、蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、抗ＳＩＴＨ−１抗体のシグナルは、ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬ及びＣＡＭＬ−ＳＩＴＨを抗原とした際に増強した（図２）。
図１は融合タンパク質の構造を示す図である（Ｓ：スペーサー、Ｈｉｓ：ヒスチジンタグ）。
図２は融合タンパク質の使用による抗ＳＩＴＨ−１シグナルの増強を示す、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
上記（１．１  間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）による観察）に記載の方法でＩＦＡによる染色を行った後、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを使用して、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性のうつ病患者血清（２２名）のＩＦＡ染色細胞の蛍光光度（各検体５個ずつ）を数値化した。数値はそれぞれの蛍光光度の平均値からＬＩＴＭＵＳ２８ｉクローニング用プラスミドをトランスフェクションした細胞の蛍光顕微鏡における視野全体の数値（バックグラウンド）を引き算したものを、バックグラウンドとの比率で表した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
その結果、うつ病患者では特にＳ−Ｃタンパク質においてシグナルが有意に増強されることが判った（図３）。
図３は融合タンパク質の使用による抗ＳＩＴＨ−１シグナルの増強を示す図である。
〔実施例２．  うつ病患者及びうつ状態を訴える人の病態と融合タンパク質に対する抗体の関係〕
気分障害と融合タンパク質に対する抗体レベルとの関係を検討するために、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性のうつ病患者［ＳＩＴＨ−１（＋）］２２名（以下「Ａ群」という。）、気分障害の診断基準を満たさないものの、うつ病自己評価尺度（Ｂｅｃｋ  Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ：ＢＤＩ）でうつ状態であると診断される（１１以上）が、付帯情報からストレス因子による一過性うつ状態と判断された被験者を除いた１３名（以下「Ｂ群」という。）、ＢＤＩが１０以下でうつ状態ではないと考えられる人（ＢＤＩ１０以下）１８名（以下「Ｃ群」という。）に関し、血清中の、ＣＡＭＬ、ＳＩＴＨ−１、各融合タンパク質のそれぞれに対する抗体価を評価した。抗体価の評価は、実施例１で記載したＩＦＡ法によって行った。また、抗体価の数値化はＩｍａｇｅＪを使用して、実施例１と同様の方法で行い、値をバックグラウンドとの比率で表した。
まず、ＣＡＭＬに対する抗体について検討したところ、全ての対象者において抗ＣＡＭＬ抗体が存在することが判明した。ＣＡＭＬはヒトの自己抗原であるので、抗ＣＡＭＬ抗体は自己免疫反応による自己抗体であると考えられた。図４にＩＦＡによる代表例を示す。
抗ＣＡＭＬ抗体の陽性率を検討するために、ＩＦＡ（目視）とＩＦＡのＩｍａｇｅＪを使用した解析を行った。ＩＦＡの目視によって、対象とした全ての検体で抗ＣＡＭＬ抗体が確認できた。ＩｍａｇｅＪを使用した数値化においても、ＣＡＭＬに対する対象者血清の蛍光強度は、全ての対象者においてバックグラウンドよりも高く（図５）、ヒトが抗ＣＡＭＬ抗体を持つことが判った。
ＳＩＴＨ−１に対してＩｍａｇｅＪを使用した解析結果では、Ａ群とＢ群との間に有意差が認められた（図６）。これにより、抗ＳＩＴＨ−１抗体がうつ病の診断に有用であるとする先行特許（特許文献２）の結果が、改めて確認された。
Ｓ−Ｃタンパク質に対してＩｍａｇｅＪを使用した解析結果では、うつ病患者（Ａ群）とうつ状態の被験者（Ｂ群）との間に加えて、うつ状態の被験者（Ｂ群）と健常者（Ｃ群）の間にも有意差が認められた（図７）。このことは、Ｓ−Ｃタンパク質を使用することで、うつ病患者だけでなく、うつ病発症に至る前のうつ状態も検出可能となることを示している。
さらに驚くべきことに、Ｃ−Ｓタンパク質を抗原としてＩｍａｇｅＪを使用した解析結果から、うつ病患者（Ａ群）とうつ状態の被験者（Ｂ群）の間に有意差が見られないのに対し、うつ状態の被験者（Ｂ群）と健常者（Ｃ群）の間に有意差が認められることが判った（図８）。この結果から、Ｃ−Ｓタンパク質を抗原とした検査では、気分障害の診断基準を満たさないものの、気分障害発症の前段階にあってうつ状態を呈する健常者を検出できることが判明した。
さらに、ＣＡＭＬに対してＩｍａｇｅＪを使用した解析結果では、うつ病患者（Ａ群）では健常者（Ｃ群）と比較して、有意に減少していることが観察された（図９）。
以上の結果は、融合タンパク質を利用した抗ＳＩＴＨ−１抗体の測定が、単に感度を上げるという量的な作用だけではなく、患者の性質を判定するという質的な変化をもたらすことを示している。
図４はヒトにおける抗ＣＡＭＬ抗体の存在を示す図である。
ＩＦＡによりヒトが自己抗体である抗ＣＡＭＬ抗体を持つことが判った。代表例を示す。
図５は抗ＣＡＭＬ抗体のＩｍａｇｅＪを使用した解析を示す図である。
ＣＡＭＬに対する蛍光高度とバックグラウンドの蛍光高度の比を示す。全てのポピュレーションにおいて、１を超えていた。
図６はうつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−１に対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。
バックグラウンドに対する比で表示した。うつ病患者以外では、ＳＩＴＨ−１に対するシグナルは検出されないので、便宜上ＳＩＴＨ−１をトランスフェクションした細胞のバックグラウンドをＳＩＴＨ−１の値とした。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
図７はうつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。バックグラウンドに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
図８はうつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。バックグラウンドに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
図９：うつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。バックグラウンドに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
〔実施例３．ＳＩＴＨ−１、融合タンパク質とＣＡＭＬの組み合わせによるうつ病診断成績の向上〕
ＳＩＴＨ−１や融合タンパク質を用いた測定方法に、ＣＡＭＬを組み合わせることによって、さらに診断成績が向上するかどうかを検討した。
具体的には、実施例２の記載の方法において、バックグラウンドに代えてＣＡＭＬの蛍光強度を用い、これとＳＩＴＨ−１、Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質の蛍光強度との比率を計算した場合の診断成績を検討した。
ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬのＩＦＡ蛍光強度の比率と、うつ病・うつ状態との関係を図１０に示す。上記の図６の場合に比してＳＩＴＨ−１陽性うつ病患者とＢＤＩ１１以上のうつ状態の者との有意差検定のＰ値がより小さくなった。
Ｓ−Ｃタンパク質に関して同様の検討を行った結果を図１１に示す。図７に比し、Ａ群とＢ群との有意差検定のＰ値も、Ｂ群とＣ群とのＰ値も格段に小さくなっていた。このことより、Ｓ−Ｃタンパク質とＣＡＭＬとを組み合わせることにより、診断力の大幅改善が認められた。
Ｃ−Ｓタンパク質に関して同様の検討を行った結果を図１２に示す。図８に比し、Ｂ群とＣ群とのＰ値も格段に小さくなっており、うつ状態と健常との判別能力が大幅に改善されたことが判った。さらにその一方で、Ａ群とＢ群との値は有意差がないままであり、Ｃ−Ｓタンパク質検査が健常とうつ状態の間の判定に特異性をもつという性質は、そのまま保存されていた。
発明者らは、別途出願中（特許文献３）の特許において、ＳＩＴＨ−１によって生じるうつ病や気分障害を、ＨＨＶ−６の抑制剤や唾液中のＨＨＶ−６の嗅上皮細胞への感染を防止することによって、予防又は治療可能であることを示している。Ｃ−Ｓタンパク質に対する抗体は、ＳＩＴＨ−１が関連するうつ状態やうつ病の最も早期又は最も症状の軽い時に出現するため、Ｃ−Ｓタンパク質に対する抗体検査は、ＳＩＴＨ−１が関係する、うつ病、うつ状態、気分障害、クローン病による気分障害などの予防及び早期治療の指標として極めて重要であると考えられる。
図１０はうつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−１に対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。ＣＡＭＬに対する比で表示した。うつ病患者以外では、ＳＩＴＨ−１に対するシグナルは検出されないので、便宜上ＳＩＴＨ−１をトランスフェクションした細胞のバックグラウンドをＳＩＴＨ−１の値とした。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
図１１はうつ病に関する各段階の対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。ＣＡＭＬに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
図１２はうつ病に関する各段階の対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。ＣＡＭＬに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。
〔実施例４．  融合タンパク質とＣＡＭＬとを利用したうつ病検査の標準化及び効率化〕
上記のように、融合タンパク質に対する抗体のＩＦＡ蛍光強度を、ＣＡＭＬに対する血清抗体のＩＦＡ蛍光強度で補正することで、うつ病やうつ状態の診断成績が向上することが明らかになった。Ｓ−Ｃタンパク質及びＣ−Ｓタンパク質は、ウサギなどで作成した抗ＣＡＭＬ抗体と二重染色することで、トランスフェクション効率の確認、タンパク質の発現量、蛍光強度を測定する際の測定部位の確認などが可能となる。例えば、図１３に示される二重染色では、ＣＡＭＬ、Ｃ−Ｓタンパク質、Ｓ−Ｃタンパク質の患者血清のＩＦＡ蛍光強度を測定する際に、抗ＣＡＭＬマウス抗体によって赤色に染色された部分の緑色発光の強度を測定すれば、イメージアナライザーによる自動測定が容易である。また、抗ＣＡＭＬマウス抗体の赤色発光の強度を測定することで、各測定のタンパク質の発現量の補正が可能となる。
患者の血漿をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で４０倍に希釈したものと、Ａｎｔｉ−ＣＡＭＬＧウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を１０００倍に希釈したものを混合し、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）抗原と３７℃１時間反応させた。ＩＦＡ抗原は実施例１で用いたものと同様のものを用いた。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２００倍に希釈したものと  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で５００倍に希釈したものを混合し、３７℃３０分間反応させた。
図１３は各種タンパクに対するうつ病患者血清と抗ＣＡＭＬ抗体の反応を示す図である。
図に示される各タンパク質に対し、うつ病患者血清（緑）と抗ＣＡＭＬマウス抗体（赤）の二重染色を行った。
〔実施例５．気分障害の前段階であるうつ状態とストレス因子により一過的に生じるうつ状態の判別〕
うつ状態には、ストレス因子により一過的に生じるものがあることが知られている。このようなストレスは、ライフイベントとも呼ばれ、肉親の死、離婚、転職、失業、転居、ペットロスなどが挙げられる。
ここでは融合タンパク質による診断方法において、気分障害の前段階であるうつ状態と、ストレス因子により一過的に生じるうつ状態を判別することが可能であるか検証を行った。
対象者群を、Ｂ群（ＢＤＩでうつ状態であると診断される（１１以上）が、付帯情報からストレス因子による一過性うつ状態と判断された被験者を除いた１３名）と、ＢＤＩでうつ状態であると診断される（１１以上）が、付帯情報からストレス因子による一過性うつ状態と診断された被験者（以下「Ｄ群」という。）として測定した。
結果を図１４、１５に示す。Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質ともに、非常に小さいＰ値の有意差がＢ群とＤ群との間に示された。
これによって、Ｓ−Ｃタンパク質やＣ−Ｓタンパク質を用いたうつ病検査は、気分障害の前段階であるうつ状態と、ストレス因子により一過的に生じるうつ状態の判定も可能であることが示された。
図１４はうつ状態の原因が異なる対象者血清のＳＩＴＨ−ＣＡＭＬに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。ＣＡＭＬに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。なお、ここでは、ストレス因子により一過的に生じるうつ状態を「心因性」と記載した。
図１５はうつ状態の原因が異なる対象者血清のＣＡＭＬ−ＳＩＴＨに対するＩＦＡ蛍光強度を示す図である。ＣＡＭＬに対する比で表示した。シャピロ＝ウィルク検定にて非正規分布であることを確認後、ｔ検定（Ｗｅｌｃｈ補正）にて有意差検定を行った。なお、ここでは、ストレス因子により一過的に生じるうつ状態を「心因性」と記載した。
〔実施例６．融合タンパク質を利用したＥＬＩＳＡ法によるうつ病診断〕
融合タンパク質を利用したうつ病診断法は、ＥＬＩＳＡ法によっても実施可能であるかどうかを検討した。ＩＦＡによる抗ＳＩＴＨ−１抗体が弱陽性ＳＩＴＨ−１（±）、陽性ＳＩＴＨ−１（＋）、強陽性ＳＩＴＨ−１（２＋）の患者と抗ＳＩＴＨ−１抗体陰性の健常人におけるＳＩＴＨ−１、Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質のＥＬＩＳＡ法による測定を行った。
抗原用の発現プラスミドは、図１で示したＳＩＴＨ−１、ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬ、ＣＡＭＬ−ＳＩＴＨの３’側にＨｉｓタグを付加した構造、ＳＩＴＨ−１−Ｈｉｓ、ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬ−Ｈｉｓ、ＣＡＭＬ−ＳＩＴＨ−Ｈｉｓｗｏ、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−５ａのＣＭＶプロモーターとＦＬＡＧタグの間に挿入したプラスミドを用いた。それぞれのプラスミドを、６ウエルプレートで培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションし、その後４８時間培養したものを、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ０．５ｗ／ｖ％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，  ０．１ｗ／ｖ％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ，  １．０ｗ／ｖ％  ＮＰ−４０）に溶解して作成した。
コントロールには、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで溶解したものを用いた。融合タンパク質は抗原液を、ＨｉｓＧｒａｂ（商標）Ｎｉｃｋｅｌ  Ｃｏａｔｅｄ  ８−ｗｅｌｌ  ｓｔｒｉｐに直接固定し、ＰＢＳ（−）  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングを行った。ヒト血清はＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋＴＭ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ−２０で３，２００倍に希釈し、融合タンパク質と３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ（−）０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。
二次抗体は、ＰＢＳ（−）  ５ｍｌに、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｋｉｔに付属しているｎｏｒｍａｌｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍを５０μｌとｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ２５μｌ入れて作成した。二次抗体反応は３７℃で３０分間行った後、ＰＢＳ（−）  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。さらに、同キットに付属しているＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）  ＡＢＣ  Ｒｅａｇｅｎｔと室温で３０分間反応させて、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）を結合させた。ＥＬＩＳＡ反応の検出は、１−Ｓｔｅｐ（商標）  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡによる発色反応の後２Ｍ硫酸を加え、吸光度計で４５０ｎｍの測定を行った。
その結果、図１６に示される様に、ＳＩＴＨ−１のＥＬＩＳＡ法の値は、ＩＦＡと同様に、Ｓ−Ｃタンパク質及びＣ−Ｓタンパク質の利用によりシグナル強度が増強することが判った。また、分子種間のシグナル強度に差が見られることから、気分障害が重症化するにつれて、エピトープが移行していることが示唆された。
図１６は融合タンパク質を利用したＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。
〔実施例７〕
（１）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスの調製
モデル動物に感染し、ＳＩＴＨ−１を発現させるウイルスとして組換えアデノウイルスを構築した。組換えアデノウイルスの構築は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）の標準プロトコールに従った。
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターを含むｐＧｆａ２Ｌａｃプラスミドは、Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｉｋｕｔａ博士（オリジナルは、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｒｅｎｎｅｒ博士）から提供を受けた。
ｐＧｆａ２Ｌａｃプラスミドより得たＧＦＡＰプロモーターと、ＰＣＲによって増幅したＳＩＴＨ−１遺伝子とを、標準的な方法で、アデノウイルスコスミドベクターにクローニングした（Ａｄ−ＧＦＡＰ−ＳＩＴＨ−１）。このＡｄ−ＧＦＡＰ−ＳＩＴＨ−１コスミドベクター、及び対照として目的遺伝子が挿入されていないコスミドベクター（ｐＡｘｃｗｉｔ）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。組換えアデノウイルスを２９３細胞で調製し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて精製した。さらに、精製したウイルスの力価はＡｄｅｎｏ−Ｘ  ｒａｐｉｄ  ｔｉｔｅｒ  ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって決定した。
（２）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウス
嗅上皮細胞にＳＩＴＨ−１を発現させた際の行動及び遺伝子発現の変化を解析するために、ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルス（ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ）をマウスの鼻腔に投与した。対照として、ＳＩＴＨ−１遺伝子が挿入されていないコスミドベクター由来のアデノウイルス（ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ）を使用した。
（２．１）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスの鼻腔投与
８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスは、室温２４±１℃、消灯１２時間、点灯１２時間の照明時間で飼育した。マウスにイソフルランで麻酔をかけた後、鼻腔に２．５×１０７ｉｆｕ相当のＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ若しくはｅｍｐｔｙ／Ａｄｖを滴下し、呼吸と共に吸引させ、飼育ケージに戻した。
（２．２）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの尾懸垂試験
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ若しくはｅｍｐｔｙ／Ａｄｖの鼻腔投与から７日後に、１０分間の尾懸垂試験を行い、無動時間をＴａｉｌＳｕｓｐＳｃａｎＴｏｐＳｃａｎ（ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ社）で計測した。尾懸垂試験は、尾の端から１ｃｍの箇所をテーピングすることにより、各マウスを懸垂して行った。懸垂の間に、活動的ではなく全く動かない場合に、マウスは無動であるとした。なお、いずれの群のマウスも３０匹ずつ実験に用いた。
図１７は尾懸垂試験における無動時間の結果を示す図である。
ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間を比較した結果を図１７の（Ａ）に示す。統計学的有意（＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
図１７の（Ａ）より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間はｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの無動時間よりも有意に増加していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、うつ病様行動を示すことが明らかとなった。
続いて、抗うつ薬のＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）がＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与によって誘導される無動時間の増加を抑制するかについて検討した。６週齢のマウスに飲料水として８０ｍｇ／Ｌ  Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ溶液を与え、２週間飼育した。２週間後にＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与し、鼻腔投与後７日目に１０分間の尾懸垂試験を行った。ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与後も８０ｍｇ／Ｌ  Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ溶液を与えて飼育した。このようなＳＳＲＩ投与群としてマウス２１匹を実験に使用した。ＳＳＲＩの投与による無動時間への影響を図１７の（Ｂ）に示す。
統計学的有意（＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
図１７の（Ｂ）より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスで観察された無動時間の増加は、ＳＳＲＩの投与により抑制されたことから、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与で誘導されるうつ病様行動はＳＳＲＩの投与によって改善されることが示された。なお、ＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅはＢｃｌ−２発現を促進することを考慮すると、この結果は、Ｂｃｌ−２発現を促進する気分障害治療剤が、ＳＩＴＨ−１発現により生じる気分障害の治療薬として使用できることを裏付けている。
（２．３）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの遺伝子発現解析
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与した結果、遺伝子発現が変化するかを検討するために、尾懸垂試験から２４時間後に、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス及びＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球と脳を採取した。嗅球と脳のＲＮＡを精製し、うつ病に関わる因子及びアポトーシス関連因子のｍＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。リファレンス遺伝子として、β−アクチン遺伝子を用いた。
うつ病に関わる因子として、嗅球を除く全脳のＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、及びＵｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の発現量を図１８に示す。図１８の（Ａ）はＣＲＨ遺伝子の結果を示す図である。図１８の（Ｂ）はＲＥＤＤ１遺伝子の結果を示す図である。図１８の（Ｃ）はＵｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の結果を示す図である。なお、図１８（Ｂ）のＤｄｉｔ４は、ＲＥＤＤ１の別名である。さらに、嗅球のＢｃｌ−２、Ｂａｘ遺伝子の発現量及びその比（Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２）を図１９に示す。統計学的有意（＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。図１９の（Ａ）はアポトーシス抑制因子Ｂｃｌ−２の遺伝子発現の結果を示す図である。図１９の（Ｂ）はアポトーシス促進因子Ｂａｘの遺伝子発現の結果を示す図である。図１９の（Ｃ）はアポトーシス指標Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２比を示す図である。
うつ病に関わる因子については、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２５匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２５匹の全脳（嗅球を除く）の各遺伝子の発現量を比較した。一方、アポトーシス関連因子については、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２０匹とＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウス２０匹の嗅球のアポトーシス関連遺伝子の発現量を比較した。
図１８より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの全脳におけるＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、及びＵｒｏｃｏｒｔｉｎ遺伝子の発現量は、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスよりも有意に増加していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、うつ病患者と同様に、ＣＲＨ、ＲＥＤＤ１、及びＵｒｏｃｏｒｔｉｎの発現増加を示すことが明らかとなった。
また、図１９より、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球において、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスよりもアポトーシス抑制因子であるＢｃｌ−２の発現が有意に低下していた（図１９Ａ）。一方、アポトーシス促進因子であるＢａｘの発現量に有意な差は見られなかった（図１９Ｂ）。アポトーシス指標となるＢａｘ／Ｂｃｌ−２比を求めた結果、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球で有意な上昇が認められた（図１９Ｃ）。
従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスは、嗅球においてアポトーシスが誘導されており、この結果は、うつ病患者で観察される嗅球の萎縮に関連していると考えられる。
（２．４）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスの免疫組織染色
尾懸垂試験から２４時間後に、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウス及びＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスを１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、頭蓋骨上顎部位のパラフィン切片を作製した。
（２．４．１）  マウス頭蓋骨上顎部位パラフィン切片のＴＵＮＥＬ染色
パラフィン切片スライドのＴＵＮＥＬ染色は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）の標準プロトコールに従った。核の対比染色としてＰＩを含む封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。嗅球のＴＵＮＥＬ染色の結果を図２０に示す。図２０の（Ａ）は、蛍光顕微鏡で観察した結果であり、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球のＴＵＮＥＬ染色像を示す図である。図２０の（Ｂ）は、嗅球に存在するＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を計数した結果を示す図である。図２０の（Ａ）では、アポトーシスによって断片化されたゲノムがＴＵＮＥＬ染色により緑色に染色されており、細胞の核がＰＩにより赤色に染色されている。図２０の（Ｂ）において、統計学的有意（＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスと比較して、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅球で、ＴＵＮＥＬ染色された細胞が多数観察された。この結果は、遺伝子発現解析の結果と一致しており、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与は、嗅球のアポトーシスを誘導することが示された。
（２．４．２）  マウス嗅上皮細胞のＳＩＴＨ−１発現
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与することにより、嗅上皮細胞でＳＩＴＨ−１タンパク質が発現していることを確認するために、パラフィン切片の免疫組織染色を行った。パラフィン切片スライドは、脱パラフィン処理した後に、９８℃のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ９．０）に２０分間浸すことで抗原の賦活化を行った。賦活化後のスライドにＩｍａｇｅ−ｉＴ（商標）  ＦＸ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を滴下し、室温で３０分間静置することでブロッキング反応を行った。
その後、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（ＴＯＹＯＢＯ）でウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体及びマウス抗ＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ）を１００倍希釈した溶液を滴下し、４□で一晩静置した。反応終了後にスライドグラスを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。
Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ２５０倍、４００倍希釈した溶液を滴下し、３７□で１時間静置した。
反応終了後にスライドグラスを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、スライドを乾燥させ、封入剤ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてカバーグラスを固定した。蛍光顕微鏡で観察した嗅上皮の抗ＳＩＴＨ−１抗体による免疫組織染色の結果を図２１に示す。図２１は、ｅｍｐｔｙ／Ａｄｖ鼻腔投与マウスとＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅上皮細胞の免疫組織染色像を示す図である。
図２１において、矢印で示す細胞はＳＩＴＨ−１タンパク質の発現が見られるアストロサイトである。図２１より、抗ＳＩＴＨ−１抗体と抗ＧＦＡＰ抗体の両方で染色される細胞はＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスの嗅上皮細胞でのみ観察された。すなわち、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖの鼻腔投与により、マウスの嗅上皮細胞でＳＩＴＨ−１タンパク質が発現することを確認できた。
（２．５）  ＳＩＴＨ−１発現アデノウイルスを鼻腔投与したマウスのストレス脆弱性試験
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与することにより、マウスがストレスに対して過敏になり脆弱性が増す可能性を検討するために、ストレス脆弱性の検討を行った。
８週齢のマウスを単離飼育し、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを投与する３日前から、飲料水として、水と１％スクロース溶液を与え、２種類の飲料の飲水割合を平衡化させた。３日後にＳＩＴＨ−１／Ａｄｖを鼻腔投与し、半数のマウスのケージを２０度に傾けて飼育した。２４時間毎に飲水量を記録した。ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスのストレス脆弱性試験の結果を図２２に示す。
ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与後７日目において、水平の飼育ケージで単離飼育したマウス（ｎｏｒｍａｌ；ｎ＝２０）と２０度に傾けたケージで単離飼育したマウス（ｓｌａｎｔ；ｎ＝２０）の１％スクロース溶液の飲水割合（１％スクロース溶液の飲水量／全飲水量（水の飲水量＋１％スクロース溶液の飲水量））を図２２に示した。統計学的有意（＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す）は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて算出した。
図２２より、ケージを傾けるマイルドストレスの付与によりＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスのスクロース嗜好性は低下していた。従って、ＳＩＴＨ−１／Ａｄｖ鼻腔投与マウスはマイルドストレスに対して過敏になり、うつ病患者で観察される「喜びの喪失」行動を示すことから、嗅上皮アストロサイトにおけるＳＩＴＨ−１タンパク質の発現はストレス脆弱性を引き起こすと考えられる。
（３）  ＨＨＶ−６感染阻害剤によるＳＩＴＨ−１発現の抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤によって、ＨＨＶ−６宿主細胞におけるＳＩＴＨ−１発現が抑制されるかどうかを検証した。
（３．１）  ＨＨＶ−６中和抗体によるＳＩＴＨ−１の発現抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤としてＨＨＶ−６の中和抗体を用いて、実験を行った。中和抗体として抗ＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体を使用した。また、健常人血清においても抗ＨＨＶ−６抗体が含まれていることから、１０倍の希釈系列を作成して実験に使用した。
健常人血清を５６□で３０分間置いた（非働化）。ＨＨＶ−６  ＨＳＴ株ウイルス液（２．９×１０６ｆｆｕ／ｍｌ）と、非働化した健常人血清（希釈なし、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）にて１０倍、１００倍希釈）又は抗ＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＯＨＶ−３）（培地にて１０倍希釈）、及び対照として培地のみを同量混合し、３７□で１時間反応させた。
次に、処理したウイルス液をＵ３７３アストロサイトーマ細胞に遠心法で細胞１個に対するウイルス数（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）３で感染させ、ＣＯ２インキュベーターにて、３７□で４８時間培養した。得られた感染細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、標準プロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。さらに、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
最後にＳＩＴＨ−１、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。測定は、下記の条件で２回行った。リアルタイムＰＣＲ条件：Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）  １２．５μｌ、ＰＣＲフォワードプライマー（１００μＭ）  ０．２２５μｌ、ＰＣＲリバースプライマー（１００μＭ）  ０．２２５μｌ、ＴａｑＭａｎプローブ（１０μＭ）  ０．６２５μｌ、Ｒｏｘ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ  ０．５μｌ、ｃＤＮＡ  ２μｌ、ＰＣＲ等級水  ８．９２５μｌの計２５μｌ。初期ステップが、９５℃で３０秒、次に、９５℃で５秒、６０℃で３１秒を４５サイクル。
プローブ及びプライマーの配列は下記の通りである：
ＳＩＴＨ−１フォワードプライマー：配列番号８
ＳＩＴＨ−１リバースプライマー：配列番号９、
ＳＩＴＨ−１プローブ：配列番号１０（５’末端にＦＡＭ配列、及び３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）、
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：配列番号１１、
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：配列番号１２、及び
ＧＡＰＤＨプローブ：配列番号１３（５’末端にＦＡＭ配列、及び３’末端にＴＡＭＲＡ配列が付加されている）。
なお、データの解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。得られた結果を図２３に示した。図２３はＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す図である。
その結果、健常人血清については希釈するほどＳＩＴＨ−１発現量が増加した（図２３のＡ）ことから、健常人血清に含まれる抗ＨＨＶ−６抗体によりＨＨＶ−６感染が妨げられ、ＳＩＴＨ−１の発現が抑制されたと考えられる。また、ＨＨＶ−６を感染前にＨＨＶ−６Ｂ  ｐ９８（ｇＨ）モノクローナル抗体と反応させることで、Ｕ３７３細胞でのＳＩＴＨ−１の発現が抑制された（図２３のＢ）。
以上から、抗ＨＨＶ−６抗体を増加させることにより、ＳＩＴＨ−１の発現を抑制することが示された。
（３．２）  ヘパリン、抗ヘパラン硫酸ペプチドによるＳＩＴＨ−１の発現抑制
ＨＨＶ−６感染阻害剤としてヘパリン及び抗ヘパラン硫酸ペプチドを用いて、実験を行った。
Ｕ３７３アストロサイトーマ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）を加えて、１×１０５細胞／ｍＬとした。次にＵ３７３細胞とノボ・ヘパリン（持田製薬）１０単位／ｍＬ又はａｎｔｉ−３−ＯＳ  Ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＨＳ）  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．１ｍＭ、及び対照として培地のみとを４□で１時間反応させた。培地にて、得られた細胞を３回洗浄した。そしてＨＨＶ−６  ＨＳＴ株ウイルス液（２．９×１０６ｆｆｕ／ｍｌ）を洗浄したＵ３７３細胞に遠心法にて、ＭＯＩ３で感染させた。ＣＯ２インキュベーターにて、３７□で４８時間培養した。
得られた感染細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、標準プロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。最後にＳＩＴＨ−１、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量を上記３．１と同様の方法で測定した。得られた結果を図２４に示す。図２４はＨＨＶ−６感染Ｕ３７３におけるＳＩＴＨ−１の発現の結果を示す図である。
ヘパリン、抗ヘパラン硫酸ペプチドのいずれを用いた場合も、ＨＨＶ−６感染前にＵ３７３細胞と反応させることで、Ｕ３７３細胞でのＳＩＴＨ−１の発現が抑制された（図２４のＡ及び２４のＢ）。
〔実施例８．ガンシクロビル存在下でのＳＩＴＨ−１発現〕
ガンシクロビル存在下で、ヒトグリア細胞株（Ｕ３７３）にＨＨＶ−６を感染させ、当該感染細胞におけるＳＩＴＨ−１発現量を、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により検出した。
Ｕ３７３細胞は、グラフに示される濃度のガンシクロビル存在下で、一晩培養した後、ＨＨＶ−６  ｖａｒｉａｎｔ  Ｂ  ＨＳＴ株を感染し、感染後１日経過した細胞におけるＳＩＴＨ−１発現量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法にて検出した。
ＨＨＶ−６  ｖａｒｉａｎｔ  Ｂに対するガンシクロビルの有効濃度は、ＩＣ５０が約１０μＭであると考えられているので、１０μＭを中心に３倍希釈の濃度を用いた。
プライマーとＴａｑＭａｎプローブは、以下の配列のものを用いた。
2017115878.tif 000003
結果を図２５に示す。図２５はガンシクロビルによるＳＩＴＨ−１の発現の抑制を示す図である。図の縦軸は、ＳＩＴＨ−１  ｍＲＮＡ発現量をガンシクロビル（−）を１として、比率で表示したものである。ガンシクロビルは、ＨＨＶ−６が感染したグリア細胞株（Ｕ３７３）におけるＳＩＴＨ−１発現を抑制することが判った。ガンシクロビルを３μＭ、１０μＭそして３０μＭ使用した用いた場合に、ＳＩＴＨ−１のｍＲＮＡの発現量が、各々約、２０％、４０％、８０％以上抑制された。
〔実施例９．融合タンパク質が細胞内カルシウム濃度に与える影響〕
本発明者は、ＳＩＴＨ−１が細胞内で発現すると細胞中のＣＡＭＬと結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させることを見出している（特許文献２）。この知見を踏まえ、細胞内で融合タンパク質を発現させた場合に、細胞内カルシウム濃度にどのような影響を与えるか検討を行った。
細胞内で、ＳＩＴＨ−１、Ｓ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質を発現させるために、哺乳動物用発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ｂ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いて、ＳＩＴＨ−１／ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ｂ，  ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬ／ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ｂ，ＣＡＭＬ−ＳＩＴＨ／ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ｂを構築した。なお、いずれの融合タンパク質においても、ＳＩＴＨ−１とＣＡＭＬの間に図１に記載のスペーサー（配列番号６）を挿入した。また対照としてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ｂを用いた。各ベクターをＣａｌＰｈｏｓＴＭ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、各タンパク質を細胞内で一過性過剰発現させた。
Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ  −  Ｆｌｕｏ  ４（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて、トランスフェクションから２４時間後の細胞にＦｌｕｏ  ４−ＡＭを取り込ませた後、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＸＴＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、各タンパク質発現細胞７００〜１３００個の蛍光強度（λｅｘ＝４８５ｎｍ，λｅｍ＝５１８）を測定した。
得られた結果を図２６に示す。図２６は、ＳＩＴＨ−１、Ｓ−Ｃタンパク質又はＣ−Ｓタンパク質の発現が細胞内カルシウム濃度に与える影響を示す図である。中央値、最大値及び最小値を箱ひげ図として示した。統計学的有意（＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す）は、Ｓｃｈｅｆｆｅ法による多重比較検定を用いて行った。
図２６から、ＳＩＴＨ−１発現細胞では、対照と比較して細胞内カルシウム濃度が上昇していることが確認され、これまでの知見が裏付けられた。また、Ｓ−Ｃタンパク質発現細胞では、細胞内カルシウム濃度がＳＩＴＨ−１発現細胞よりも大きく上昇しているのに対し、Ｃ−Ｓタンパク質発現細胞では、対照と比べても細胞内カルシウム濃度は低かった。この結果から、細胞内でＳＩＴＨ−１が発現してＣＡＭＬと結合した結合体の立体構造は、Ｓ−Ｃタンパク質に類似の構造を有することが示唆された。
〔実施例１０．健常者におけるＳ−Ｃタンパク質に対する抗体価とＢＤＩスコアとの関係〕
ＢＤＩの結果、健常者と判断された（ＢＤＩ：１０以下）８３名の被験者について、間接蛍光抗体法を用いて、血清中のＳ−Ｃタンパク質に対する抗体価を測定した。そして測定された抗体価とＢＤＩスコアとの相関関係について評価した。
ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬとＣＡＭＬを図１のように構築し、哺乳動物用発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ａ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に導入して、抗原用の発現プラスミドｐＣＭＶ−ＳＩＴＨ−ＣＡＭＬとｐＣＭＶ−ＣＡＭＬを得た。それぞれのプラスミドを、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｎｕｎｃ）で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションし、その後４８時間以上培養したものを、乾燥固定後に冷却した３％メタノール添加アセトンで５分間固定し、ＩＦＡ抗原として用いた。
被験者の血清は、ＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で８０倍に希釈し、間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）にて染色を行った。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳ／２％  ＢＳＡ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で２００倍に希釈して用いた。
これらを用いて間接蛍光抗体法を実施した。ＣＣＤカメラ（ＤＰ７３）を備えた蛍光顕微鏡により得られた画像から、ＩｍａｇｅＪを使用してＩＦＡ染色細胞の蛍光強度の数値化を行った。なお、実施例３の結果を踏まえ、抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体価は、抗Ｓ−Ｃタンパク質抗体のＩＦＡ蛍光強度を抗ＣＡＭＬ抗体のＩＦＡ蛍光強度で除することにより補正した。
得られた結果を図２７に示す。図２７は、健常者血清中の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体価とＢＤＩスコアとの相関を示す図である。抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体価とＢＤＩスコアとの相関を決定するために、スピアマンの順位相関係数を用いた。その結果、両者の間には強い正の相関がみられた（ρ＝０．８３  ｐ＝１．３９ｘ１０−２２）。この結果から、うつ状態になく健常者と判断される被験者であっても、抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体価が大きくなるほど、うつ状態になるリスクや気分障害を発症するリスクが上昇すると考えられた。
以下、本実施例の結果のまとめを示す。
（１）抗Ｓ−Ｃタンパク質抗体の抗体レベルを測定する工程を包含する気分障害の診断方法
ＳＩＴＨ−１陽性、かつ、うつ病と診断された患者群（以下「Ａ群」という。）、ＢＤＩ  １１以上であったため、うつ状態と診断された対象者群（但し、付帯情報からストレス因子による一過性うつ状態と判断された者は除いた。以下「Ｂ群」という。）、ＢＤＩ１０以下であった健常者群（以下「Ｃ群」という。）の３つの群から得られた血清について、「抗Ｓ−Ｃ抗体」の抗体レベルを測定したところ、Ａ群とＢ群との間、Ｂ群とＣ群との間、Ａ群とＣ群との間、いずれも有意差が認められ、その抗体レベルは、高い方からＡ群、Ｂ群、Ｃ群の順であった（図７）。よって、抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルを測定する本測定方法により、気分障害の診断基準を満たさないうつ状態、すなわち気分障害発症には至っていないうつ状態を、発症した気分障害や健常状態と判別することができることが示された。
さらには、上記抗体レベルの測定結果、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の気分障害の症状の有無及び重症度、ＳＩＴＨ−１がＣＡＭＬと結合して細胞中のカルシウム濃度を上昇させる事実や上記の気分障害発症機序などから、嗅上皮細胞におけるＳＩＴＨ−１発現回数が増加するほど、気分障害発症リスク及び気分障害の重症度が増し、それとともに、抗Ｓ―Ｃ抗体の抗体レベルが増加すると考えられる。従って、Ｂ群は気分障害の高リスク群であると想定される。
さらには、健常者群の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルとＢＤＩスコアが強い正の相関を示していた（図２７）ことから、うつ状態を呈していない場合であっても、抗Ｓ−Ｃ抗体が大きくなるほど、うつ状態になるリスクや気分障害を発症するリスクが上昇すると想定される。この想定は上記の機序とも整合している。
以上から、血清中の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルを測定することにより、被験者が気分障害に罹患しているかどうかだけではなく、被験者が気分障害を発症するリスク（危険度）又はうつ状態となるリスク（危険度）を評価することができることが明らかになった。
さらに本発明者らが、Ｂ群と、Ｂ群から除いた「ＢＤＩ１１以上であったが、付帯情報からストレス因子による一過性うつ状態と判断された被験者群」（以下「Ｄ群」という。）について、血清中の抗Ｓ−Ｃ抗体の抗体レベルの比較を行ったところ、両者に有意な差が見られた（図１４）。
（２）抗Ｃ−Ｓタンパク質抗体の抗体レベルを測定する気分障害の診断方法
次に、上記Ａ群、Ｂ群、Ｃ群から得られた血清について、「抗Ｃ−Ｓ抗体」の抗体レベルを測定したところ、Ａ群とＢ群の間には有意差が見られないのに対し、Ａ群とＣ群の間、Ｂ群とＣ群の間に有意差が認められ、その抗体レベルは高い方からＡ群、Ｂ群、Ｃ群の順であった（図８）。よって、抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルを測定する本測定方法により、発症している気分障害及び気分障害発症には至っていないうつ状態を、健常状態と判別することができることが示された。
さらには、上記抗体レベルの測定結果、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の気分障害の症状の有無及び重症度、ＳＩＴＨ−１がＣＡＭＬと結合して細胞中のカルシウム濃度を上昇させる事実や上記の気分障害発症機序などから、嗅上皮細胞におけるＳＩＴＨ−１発現回数が増加するほど、気分障害発症リスク及び気分障害の重症度が増し、それとともに、抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルが増加すると考えられる。従って、Ｂ群は気分障害の高リスク群であると想定される。
以上から、血清中の抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルを測定することにより、被験者が対象疾患を発症するリスク（危険度）を評価することができることが明らかになった。
さらに本発明者らが、Ｂ群とＤ群について、血清中の抗Ｃ−Ｓ抗体の抗体レベルの比較を行ったところ、両者に有意な差が見られた（図１５）。
（３）抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含む気分障害の診断方法
さらに本発明者らは、上記Ａ群、Ｂ群、Ｃ群から得られた血清について、抗ＣＡＭＬ抗体の有無を調べたところ、驚くべきことに全ての対象者において抗ＣＡＭＬ抗体が存在することを見出した。ＣＡＭＬはヒトのタンパク質であることから、抗ＣＡＭＬ抗体は自己免疫反応による自己抗体であると考えられる。なお、これまでに自己抗体としての抗ＣＡＭＬ抗体の報告はない。また、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルについて、その抗体レベルは低い方からＡ群、Ｂ群、Ｃ群の順であり、Ａ群はＣ群と比べて有意に低かった（図９）。この結果を踏まえ、上記融合タンパク質を用いた気分障害の診断方法で得られた各検体の抗体レベルの値を、各検体の抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルで除する補正を行ったところ、このような補正を行わない場合と比べて有意差検定のＰ値が格段に小さくなった（図７と図１１、図８と図１２）。以上から、上記気分障害の診断方法に、抗ＣＡＭＬ抗体測定の結果を組み合わせることにより、診断の精度が一層向上することが見出された。
また、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群について、本発明者が開発した「被験者から分離された生物学的試料中の抗ＳＩＴＨ−１抗体を測定することにより、被験者が気分障害を有するか否かを診断する方法」（特許文献２。以下「従来法」という。）を行ったところ、上記と同様に抗ＣＡＭＬ抗体測定の結果を組み合わせることにより、診断の精度が大きく向上した（図６、図１０）。
従って、本発明の一態様は、被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＳＩＴＨ−１抗体の抗体レベルを測定する気分障害の診断方法において、該被験者から分離された生物学的試料中の、抗ＣＡＭＬ抗体の抗体レベルを測定する工程を含む、診断方法である。
なお、本発明の診断を行うためのデータを取得する方法も、本発明の一態様である。すなわち、上記診断方法の各工程を含むことを特徴とする診断のためのデータ取得方法も本発明に含まれる。
以上の研究結果から、限定されるものではないが、以下の機序が明らかになった。すなわち、もともとヒトはＣＡＭＬに対する自己免疫反応を生じているが、ＨＨＶ−６の嗅上皮への感染によりＳＩＴＨ−１が発現し、これにＣＡＭＬが結合すると、ＣＡＭＬに対する免疫がＣＡＭＬとＳＩＴＨ−１との結合体に移行し、その後ＨＨＶ−６の頻回感染に伴い、主要なエピトープが、抗Ｃ−Ｓ抗体認識部位から抗Ｓ−Ｃ抗体認識部位へと移行していると考えられる。抗ＣＡＭＬ抗体が、健常者と比べ、抗ＳＩＴＨ−１抗体陽性のうつ病患者において有意に減少していることもこの機序を裏付けている（図９）。また、脳内や嗅上皮に存在するアストロサイトでわずかにしか産生されないＳＩＴＨ−１が、血清抗体として感度よく検出される理由も、ＣＡＭＬに対する自己免疫による免疫反応の増強から説明することができる。なお、このようにエピトープが移行する現象は、Ｄｉｒｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８９，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ｆｅｂ．１５，１９９９  ７０１−７０９などでも報告されている。
（４）本発明の診断方法の検出感度
本発明の診断方法の検出感度について検討を行った。本発明者らが、上記Ａ群について、ＳＩＴＨ−１、Ｓ−Ｃタンパク質及びＣ−Ｓタンパク質をそれぞれ抗原としてＩＦＡにより顕微鏡下で観察したところ、Ｓ−Ｃタンパク質の像は、ＳＩＴＨ−１と比べて遥かに明るく染色されていた（図２）。次に画像解析ソフトを用いてこれらの蛍光光度を測定したところ、高い方からＳ−Ｃタンパク質、Ｃ−Ｓタンパク質、ＳＩＴＨ−１の順となり、Ｓ−Ｃタンパク質とＳＩＴＨ−１との間には有意な差が見られた。このことから気分障害患者において、Ｓ−Ｃタンパク質を抗原として使用すると、抗体のシグナルが有意に増強されることが示された（図３）。
さらに本発明者らは、この結果について融合タンパク質を単離した実験系でも確認を行った。具体的には、ＥＬＩＳＡ法によりＳ−Ｃタンパク質とＳＩＴＨ−１の抗体シグナルを比較したところ、うつ病患者におけるＳ−Ｃタンパク質に対する抗体のシグナルは、ＳＩＴＨ−１の場合と比べて高いことが示された（図１６）。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の気分障害を診断、治療又は予防する方法は、臨床医学的な利用をはじめ、種々の分野で利用することができる。
配列表
ＪＴ１５２８８  配列表
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2017115878.tif 000059
2017115878.tif 000060
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