(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法であって、前記方法が、
ａ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液であって、５００ｍＭ〜２Ｍのモル濃度を有するアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を準備する工程と；
ｂ）前記洗浄液と前記分離マトリックスを３０分から５０時間の接触時間の間、接触させることによって前記分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程と；
を含み、
前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、少なくとも配列番号５１または５２の３位のアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、方法。
【請求項２】
前記変異体が、配列番号５１または５２の１、２、７、１０、１５、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３９、４２および４３位の１以上においてさらなる変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号５１または５２の１位のグルタミン残基がアラニンに変異しており、および／または配列番号５１または５２の３５位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離マトリックスが、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含み、および／または前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記洗浄液が、Ｃ２−Ｃ７アルコールをさらに含み、および／または前記洗浄液が、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記分離マトリックスが、工程ｂ）の後にその最初の動的結合容量の少なくとも８０％を保持する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスの消毒のための、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液の、３０分から５０時間の接触時間の間の使用であって、
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が５００ｍＭ〜２Ｍのモル濃度を有し、
前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、少なくとも配列番号５１または５２の３位のアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法に関する。本発明はさらに、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスによる免疫グロブリンの精製においてキャリーオーバーを防ぐ方法、ならびに分離マトリックスの消毒のための少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中で製造または開発のいずれにおいても最も普及しているバイオ医薬品を代表する。この特定の治療薬市場の商業的需要の高まりとそれに伴う価値により、製薬会社は、それぞれの免疫グロブリン製造プロセスの生産性を最大化するとともに、関連するコストを抑えることに重点を置くようになっている。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）またはポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ）などの精製の重要なステップの１つとして、大部分の例で使用される。特に興味深い種類のアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変部分と特異的結合することの可能なタンパク質であり、そのような相互作用は、抗体の抗原結合特異性とは独立している。そのような試薬は、限定されるものではないが血清もしくは血漿調製物または細胞培養由来のフィードストックなどの異なる試料から、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用されることができる。そのようなタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分およびＦａｂ部分と結合することのできるドメインを含む、ブドウ球菌のプロテインＡである。これらのドメインは、一般にＥ−、Ｄ−、Ａ−、Ｂ−およびＣ−ドメインと表示される。
【０００４】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に基づく試薬は、その高い親和性および選択性に起因して、バイオテクノロジーの分野、特に抗体の捕捉および精製のための、ならびに検出または定量化のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡに基づくアフィニティー媒体は、おそらく、工業用の細胞培養上清を含む、異なる試料からモノクローナル抗体およびその断片を単離するための最も広く使用されるアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡ−リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインＡ（例えば、プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）の形態で市販されており、組換えプロテインＡからなるものもある（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。より具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で実施した遺伝子操作は、その支持体との付着を促進し、リガンドの生産性を増加することを目的とする。
【０００５】
これらの用途は、その他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、夾雑物を確実に除去することに総合的な注意を必要とする。そのような夾雑物は、例えば、クロマトグラフィー手順において固定相またはマトリックスに吸着される非溶出分子、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、エンドトキシン、細菌およびウイルスを含む、望ましくない生体分子または微生物であり得る。そのような夾雑物をマトリックスから除去することは、通常、その後の使用の前にマトリックスを再生するために、所望の生成物の最初の溶出の後に行われる。マトリックスからの夾雑物の洗浄は、通常、定置洗浄（ＣＩＰ）として知られている手順を伴い、固定相から夾雑物を溶出することのできる薬剤が使用される。微生物の不活性化は、通常、微生物を不活性化させる能力のある薬剤が使用される、定置消毒（ＳＩＰ）として公知の手順を伴う。一部の薬剤は、薬剤の濃度および分離マトリックスとの接触時間に応じて、分離マトリックスを洗浄することと消毒することの両方が可能である。多くの場合使用されるそのような薬剤の種類の１つは、前記固定相に通すアルカリ溶液である。現在、大部分の分離マトリックスに最も広く使用される洗浄および消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は、汚染の程度および性質に応じて０．１から例えば１Ｍまでの範囲であり得る。しかし、この戦略は、１３を上回るｐＨ値をもつ溶液にマトリックスを曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関して、そのようなアルカリ環境は非常に厳しい条件であり、結果的に、関与する高いｐＨに対するリガンドの不安定性による能力の低下をもたらす。
【０００６】
そのため、広範な研究がアルカリ性ｐＨ値に耐える能力の改善を示す、操作されたタンパク質リガンドの開発に着目してきした。例えば、Ｇｕｌｉｃｈら（Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ  Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ  Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ  Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ性環境での連鎖球菌アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためにタンパク質工学を提案した。Ｇｕｌｉｃｈらは、４つ全てのアスパラギン残基がロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）およびリジン（１つの残基）に置き換えられている、ＡＢＤの変異体を作製した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈらは、作製した変異体が天然のタンパク質に似た標的タンパク質結合挙動を示すこと、および操作されたリガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ条件に繰り返し曝露した後に、操作されていない親リガンドを用いて調製したカラムよりも高い結合容量を示すことを報告している。よって、４つ全てのアスパラギン残基は、構造および機能に重大な影響を及ぼすことなく置き換えられることができることがその中で結論付けられる。
【０００７】
最近の研究は、その変更をプロテインＡ（ＳｐＡ）にも行って類似した性質をもたらすことができることを示す。参照によりその全文が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号明細書は、少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン酸またはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させると、その変異が、約１３〜１４までのｐＨ値で親ＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢドメイン、または、ＳｐＡのＢドメインから誘導した合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５，１４３，８４４号明細書、参照によりその全文が援用される）などと比較して、増加した化学安定性を付与することを開示する。著者らは、これらの変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用する場合、予想通り分離媒体がアルカリ化剤を用いる洗浄方法により良く耐えることができることを示す。アルカリ安定性を向上させる目的をもつプロテインＡドメインのさらなる変異は、米国特許第８，３２９，８６０号、特開２００６−３０４６３３Ａ号、米国特許第８，６７４，０７３号、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８４４号、米国特許出願公開第２０１２／０２０８２３４号、米国特許第９，０５１，３７５号、米国特許出願公開第２０１４／００３１５２２号、米国特許出願公開第２０１３／０２７４４５１号および国際公開第２０１４／１４６３５０号にも公開されており、その全ては参照によりその全文が本明細書に援用される。しかし、現在利用可能な変異体はなおアルカリ性のｐＨに対して感受性があり、洗浄中のＮａＯＨ濃度は通常０．１Ｍに制限され、これは完全な洗浄を実現することが困難であることを意味する。さらに、そのような濃度のＮａＯＨは、アフィニティー分離マトリックスの効果的な消毒にそれ自体不十分であり、そのため消毒は、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコールを含む溶液を使用して実施される場合が多い。高いＮａＯＨ濃度は、洗浄および消毒を向上させるかもしれないが、アフィニティー分離マトリックスの容認できない容量の損失を招く。
【０００８】
よって、この分野では、アルカリ洗浄および消毒方法に対してさらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性がなおある。また、治療抗体の経済効率の高い精製を可能にする、改善された結合容量をもつ、そのような分離マトリックスも必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０７９０３３号
【発明の概要】
【００１０】
本発明の発明者らは、アルコール溶液がアフィニティー分離マトリックスの消毒に最適とはいえないことを認識していた。アルコールは可燃性であり、規制を受けていて、処分が困難である。さらに、本発明の発明者らは、低濃度のＮａＯＨ、例えば０．１Ｍ  ＮａＯＨなどが、分離マトリックスを多様な異なる免疫グロブリン製品の精製に使用することを可能にするための洗浄には不十分であることを認めた。代わりに、分離マトリックスは、一般に、１つの製品から別の製品への不純物のキャリーオーバーを防ぐために、１つの製品の個別のバッチを精製するためにだけ使用される。本発明者らは、濃アルカリ金属水酸化物水溶液が、洗浄および保存溶液としていくつかの利点を有することを認識した。濃アルカリ金属水酸化物溶液は静菌性であり、大部分のウイルス、細菌、酵母、真菌およびエンドトキシンを不活性化し得る。濃アルカリ金属水酸化物用液は、同じ分離マトリックスを使用して多様な免疫グロブリンを精製することができる程度に、分離マトリックスから不純物を効果的にストリッピングすることが可能である。このことは、分離マトリックスの分離プラットフォームとしての使用を促進する。さらに、濃アルカリ金属水酸化物溶液は比較的安価であり、処分が容易であり、分離マトリックスからの除去はｐＨおよび／または伝導率測定値を用いて検出が簡単である。
【００１１】
そのため、本発明の目的は、濃アルカリ金属水酸化物溶液の使用を可能にする、免疫グロブリンの精製のためのアフィニティー分離マトリックスを洗浄および消毒するための方法を提供することである。
【００１２】
この目的は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを洗浄および／または消毒する、添付される特許請求の範囲による方法によって達成される。アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。この方法は、
ａ）所望により、分離マトリックスを用いて第１の免疫グロブリンを含む混合物を精製する工程；
ｂ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を準備する工程；および
ｃ）洗浄液と分離マトリックスを所定の接触時間の間、接触させることによって分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程を含む。
【００１３】
上に定義されるような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを用いることにより、高い動的結合容量を有する、アルカリ安定性の高い分離マトリックスが得られる。本発明の発明者らは、そのような分離マトリックスが、濃アルカリ金属水酸化物水溶液を含浸すると比較的安定していて、そのような濃アルカリ金属水酸化物溶液と接触した後も動的結合容量を実質的に保持することを観察した。このことは、そのような分離マトリックスが濃アルカリ金属水酸化物溶液での洗浄および／または消毒に適していることを意味する。
【００１４】
さらに免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインへ変異させると、アルカリ安定性の向上などの特性のさらなる向上が得られることがある。例えば、配列番号５１または５２の１位のグルタミン残基は、アラニンに変異させてよい；かつ／または配列番号５１または５２の３５位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基は、アラニンに変異させてよい。
【００１５】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体であってよい。適切な多量体を使用することにより、分離マトリックスの免疫グロブリン結合容量およびアルカリ安定性が増加することがある。
【００１６】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、各々、多孔質支持体と共有結合するためのＣ末端システイン残基を含んでよい。免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、チオエーテル結合によって多孔質支持体に結合されてよい。これにより、リガンドを固相支持体に付着させる、堅牢で、アルカリ安定性の、十分に証明された方法が得られる。
【００１７】
分離マトリックスは、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌなどの、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含んでよい。このことが、良好な結合容量をもつ分離マトリックスを確実にする。
【００１８】
多孔質支持体は、５６〜７０マイクロメートルの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）および５５〜８０ｍｇ／ｍｌの乾燥固体重量を有する架橋ポリマー粒子を含んでよい。多孔質支持体は、例えば高度に架橋されたアガロースビーズであってよい。
【００１９】
洗浄液で用いられるアルカリ金属水酸化物水溶液は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液またはその混合物、好ましくは水酸化ナトリウム溶液であってよい。水酸化ナトリウム溶液は比較的安価であり、容易に入手でき、洗浄および消毒溶液として広く認められている。アルカリ金属水酸化物水溶液は、５００ｍＭ〜５Ｍ、例えば１Ｍ〜２Ｍなどのモル濃度を有してよい。このことは、溶液が良好な殺菌性を有することを確実にする。
【００２０】
洗浄液は、場合によって、Ｃ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどをさらに含む。アルコールとアルカリ金属水酸化物を組み合わせた洗浄液は、特定の微生物、例えば一部の胞子形成細菌を不活性化するのにより効果的であり得る。
【００２１】
洗浄液は、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも９０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも９９体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含んでよい。
【００２２】
いくつかの例では、洗浄液は、アルカリ金属水酸化物水溶液からなるか、またはそれから本質的になってよい。
【００２３】
所定の接触時間は、分離マトリックスにおけるエンドトキシン濃度および／または微生物濃度の６−ｌｏｇ１０の減少をもたらすために十分な時間であってよい。所定の接触時間は、１０分〜５０時間、例えば３０分〜２４時間、または例えば１時間〜１２時間であってよい。そのような接触時間は一般に広範囲の微生物を不活性化するのに十分である。
【００２４】
上記の方法の工程ａ）〜ｃ）は、少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返されてよい。したがって、許容される精製を実現する十分な容量をなお保持している間は、分離マトリックスは何回も再使用されてよい。
【００２５】
本発明の目的は、添付される特許請求の範囲によって定義されるような多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスによる免疫グロブリンの精製において、キャリーオーバーを防ぐ方法によってさらに達成される。この方法は、第１の免疫グロブリンを精製する工程、ならびに、上記のような分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法の工程ａ）〜ｃ）を実施することによって、分離マトリックスを洗浄および消毒する工程を含む。この方法は、
ｄ）分離マトリックスを用いて第２の免疫グロブリンを含む混合物を精製する工程
をさらに含み、この際、第２の免疫グロブリンは、第１の免疫グロブリンとは異なっている。
【００２６】
アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。
【００２７】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００２８】
定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
【００２９】
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」、「Ｆｃ結合ドメイン」および「Ｆｃ結合タンパク質」とは、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）と結合することのできるポリペプチド、ドメインまたはタンパク質をそれぞれ意味し、それには、例えばプロテインＡおよびプロテインＧ、または結合特性が維持されたその任意のフラグメントまたは融合タンパク質が挙げられる。
【００３０】
用語「リンカー」は、本明細書において、多量体の２つのポリペプチド単位、単量体またはドメインを互いに連結する要素を意味する。
【００３１】
用語「スペーサー」は、本明細書において、ポリペプチドまたはポリペプチド多量体を支持体に結合する要素を意味する。
【００３２】
アミノ酸配列の比較に関する用語「同一性％」は、標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））などによって求められる。これのウェブベースのソフトウェアは、米国国立医学図書館のｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅから自由に入手可能である。ここでは、アルゴリズム「ｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）」が、クエリ配列と対象配列のアライメントおよび特に同一性％の決定に使用される。
【００３３】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；同様に、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有する。この用語はオープンエンドであり、列挙される内容の基本的または新規な特徴が、先行技術の実施形態を除いて列挙される内容よりも多く存在することで変化しない限り、列挙される内容よりも多くの存在が考慮に入れられる。
【００３４】
本発明ならびにそのさらなる目的および利点をより完全に理解するために、下に述べる詳細な説明は、添付の図面とともに読まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】配列番号１〜７および５１〜５２によって定義されるＦｃ結合ドメインのアライメントを示す図である。
【図２】ＳＰＲバイオセンサーチップと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性について実施例２から得た結果を示す図である。
【図３】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図４】アガロースビーズと結合した親および変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図５】異なる量の変異多量体バリアント（配列番号２０）が結合したアガロースビーズのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例７から得た結果を示す図である。結果は、１Ｍ  ＮａＯＨ中のインキュベーション時間に対する相対残存動的容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）としてプロットされる。
【図６】異なる量の変異多量体バリアント（配列番号２０）が結合したアガロースビーズのアルカリ安定性（１．０Ｍ  ＮａＯＨ）について実施例７から得た結果を示す図である。結果は、プロトタイプのリガンド含有量に対する、１Ｍ  ＮａＯＨ中３１時間のインキュベーション後の相対残存動的容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）としてプロットされる。
【図７】ａ）基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸおよびｂ）本発明によるマトリックスからの、ポリクローナルヒトＩｇＧのｐＨ勾配溶出の結果を示す図である。
【図８】図７のクロマトグラムの画分中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４成分の分析を示す図である。ａ）基準マトリックスおよびｂ）本発明によるマトリックス。各画分について、第１のバー（青色）はＩｇＧ１を表し、第２（赤色）はＩｇＧ４を表し、第３（緑色）はＩｇＧ２を表す。
【図９】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＭＳＳ  ＬＸ）および本発明によるマトリックスについて１Ｍ  ＮａＯＨインキュベーションによる、加速アルカリ安定性測定の結果を示す図である。安定性は、インキュベーション後に残っている１０％貫流容量の百分率として表される。
【図１０】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）および本発明による分離マトリックス（Ｉｎｖ．Ｅｘ）について、２Ｍ  ＮａＯＨを洗浄液として使用して繰り返したＣＩＰサイクルの結果を示す図である。初期容量（３５％貫流ＤＢＣへの負荷体積として求められる）に対する各分離マトリックスの容量は、サイクル数の関数として示される。
【図１１】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＭＳＳ  ＬＸ）および本発明による分離マトリックス（Ｉｎｖ．Ｅｘ）の１Ｍ  ＮａＯＨによるインキュベーションの結果を示す図である。標識ｈＩｇＧの結合に起因する相対蛍光が時間の関数として、０、１６および３２時間の設定期間の間インキュベートされた分離マトリックスの各々について示される。
【図１２】基準マトリックスＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＭＳＳ  ＬＸ）および本発明による分離マトリックス（Ｉｎｖ．Ｅｘ）の１Ｍ  ＮａＯＨによるインキュベーションの結果を示す図である。標識ｈＩｇＧの結合に起因する相対蛍光が時間の関数として、最大３２時間の設定期間の間インキュベートされた分離マトリックスの各々について示される。
【図１３】１Ｍ  ＮａＯＨを含む洗浄流体を使用する、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子の不活性化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の一態様は、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法に関する。
【００３７】
この詳細な説明を通して、２つの別個の番号付けの慣習が使用されることがある。別段の記載がない限り、図１のアミノ酸残基位置番号付けの慣習が使用され、位置番号は、配列番号４〜７の位置番号に対応するように指定される。これは多量体にもあてはまり、そこで位置番号は別段の記載がない限り、図１の慣習によるポリペプチド単位またはモノマーの位置を指定する。しかし、特許請求の範囲、発明の概要および時に発明を実施するための形態を通じて、配列番号５１および５２の位置番号に対応する位置番号が使用される。配列番号５１または配列番号５２の１位は配列番号４〜７の９位に相当すること、そしてこのように異なる番号付けの慣習は相互変換されてよいことに注意されたい。
【００３８】
本発明の免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、本明細書において「ポリペプチド」とも呼ばれ、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、この際、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。
【００３９】
配列番号５１（末端切断型Ｚｖａｒ）
ＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ
配列番号５２（末端切断型Ｃドメイン）
ＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ
そのような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、図１に図示される配列番号１（Ｅドメイン）、配列番号２（Ｄドメイン）、配列番号３（Ａドメイン）、配列番号２２（バリアントＡドメイン）、配列番号４（Ｂドメイン）、配列番号５（Ｃドメイン）、配列番号６（プロテインＺ）、配列番号７（Ｚｖａｒ）、配列番号５１（リンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないＺｖａｒ）または配列番号５２（リンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないＣドメイン）によって定義されるかあるいはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよく、この際、配列番号４〜７の１１位に対応する位置の少なくともアスパラギン（または配列番号２の例ではセリン）残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異しており、配列番号４〜７の２１位および５２位に対応するアスパラギン残基（配列番号５１または５２の１３位および４４位）は保存される。
【００４０】
上に列挙したＦｃ結合ドメインのいくつかを図１にアラインさせて示す。親の、すなわち操作されていないブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、ドメインＥ（配列番号１）、Ｄ（配列番号２）、Ａ（配列番号３）、Ｂ（配列番号４）およびＣ（配列番号５）と呼ばれる５つのＦｃ結合ドメインを含む。プロテインＺ（配列番号６）は、参照によりその全文がここに援用される米国特許第５１４３８４４号に開示される変異Ｂドメインである。配列番号７は、変異Ｎ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３Ｔを含む、本明細書においてＺｖａｒと呼ばれるプロテインＺのさらに変異したバリアントを示す。配列番号２２（図１に図示せず）は、図１の位置用語法を用いて、Ａ４６Ｓ変異を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｎ３１５株由来のプロテインＡのＡドメインの天然バリアントである。配列番号５１は、１〜８位および５６〜５８位にリンカー領域アミノ酸を含まないＺｖａｒ（配列番号７）である。配列番号５２は、図１に図示されるようにリンカー領域アミノ酸１〜８および５６〜５８を含まないプロテインＡのＣドメインである。
【００４１】
これらのドメインのＮ１１（配列番号５１：５２のＮ３）の変異は、アスパラギン残基Ｎ２１およびＮ５２（配列番号５１：５２のＮ１３およびＮ４４）の保存とともに、免疫グロブリン結合性を損なうことなく親ドメイン／ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。そのため、このポリペプチドは、Ｆｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド、あるいはＦｃまたは免疫グロブリン結合ポリペプチド単位としても記載され得る。
【００４２】
代わりの言葉で説明すると、免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５３によって定義されるか、あるいは、配列番号５３との少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなってよい。
【００４３】
配列番号５３
Ｘ１Ｑ  Ｘ２ＡＦＹＥＩＬＸ３ＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＸ４Ｘ５Ｆ  ＩＸ６Ｘ７ＬＫＤＸ８ＰＳＸ９  ＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＬＡＥＡＫＸ１３  Ｘ１４ＮＸ１５ＡＱ
ここで、互いに個別に：
Ｘ１＝Ａ、Ｑまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、ＨまたはＲ
Ｘ３＝ＨまたはＫ
Ｘ４＝ＡまたはＮ
Ｘ５＝Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、例えばＳ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫなど
Ｘ６＝ＱまたはＥ
Ｘ７＝ＳまたはＫ
Ｘ８＝ＥまたはＤ
Ｘ９＝Ｑ、Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋ、Ｒ、Ａまたは欠失
Ｘ１１＝Ａ、Ｅ、Ｎまたは欠失
Ｘ１２＝ＩまたはＬ
Ｘ１３＝ＫまたはＲ
Ｘ１４＝ＬまたはＹ
Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲ
である。
【００４４】
具体的には、配列番号５３のアミノ酸残基は、互いに個別に：
Ｘ１＝Ａまたは欠失
Ｘ２＝Ｅ
Ｘ３＝Ｈ
Ｘ４＝Ｎ
Ｘ６＝Ｑ
Ｘ７＝Ｓ
Ｘ８＝Ｄ
Ｘ９＝Ｖまたは欠失
Ｘ１０＝Ｋまたは欠失
Ｘ１１＝Ａまたは欠失
Ｘ１２＝Ｉ
Ｘ１３＝Ｋ
Ｘ１４＝Ｌ
である。
【００４５】
ある種の実施形態では、配列番号５３のアミノ酸残基は：
Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌであってよい。いくつかの実施形態では、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄであり、Ｘ１、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１の１以上は欠失している。さらなる実施形態では、Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ、あるいはＸ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、互いに個別に：
ａ）Ｘ１＝Ａまたは欠失、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖまたは欠失、Ｘ１０＝Ｋまたは欠失、Ｘ１１＝Ａまたは欠失、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝Ｌ；
ｂ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ；
ｃ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｅ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄ；または
ｄ）Ｘ１＝Ａ、Ｘ３＝Ｈ、Ｘ４＝Ｎ、Ｘ５＝Ａ、Ｘ６＝Ｑ、Ｘ７＝Ｓ、Ｘ８＝Ｄ、Ｘ９＝Ｖ、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ１１＝Ａ、Ｘ１２＝Ｉ、Ｘ１３＝Ｋ、Ｘ１４＝ＬおよびＸ１５＝Ｄであってよい。
【００４７】
Ｎ１１（Ｘ２）変異（例えばＮ１１ＥまたはＮ１１Ｋ変異）は、唯一の変異であってよく、あるいは、ポリペプチドは、さらなる変異、例えば配列番号４〜７の３、６、９、１０、１５、１８、２３、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４２、４３、４４、４７、５０、５１、５５および５７位に対応する位置の少なくとも１つでの置換などを含んでもよい。これらの位置の１または複数で、最初のアミノ酸残基は、例えばアスパラギン、プロリンまたはシステインでないアミノ酸で置換されていてよい。最初のアミノ酸残基は、例えばアラニン、バリン、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されていてよい。さらに、１または複数のアミノ酸残基が、例えば１〜６位および／または５６〜５８位から欠失されていてよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の９位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１）は、グルタミン、アスパラギン、プロリンまたはシステイン以外のアミノ酸、例えばアラニンなどであるか、あるいはそれは欠失され得る。９位および１１位の変異の組合せは、例によって示されるように、特に良好なアルカリ安定性をもたらす。具体的な実施形態では、配列番号７において９位のアミノ酸残基はアラニンであり、１１位のアミノ酸残基はリジンまたはグルタミン酸、例えばリジンなどである。９位の変異は、参照によりその全文が本明細書に援用される同時係属出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１４／０５０８７２号明細書においても考察されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の５０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１３）は、アルギニンまたはグルタミン酸である。
【００５０】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３位に対応する位置のアミノ酸残基は、アラニンであり、かつ／または配列番号４〜７の６位に対応する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸である。３位および６位のアミノ酸残基の１つはアスパラギンであってよく、代替実施形態では、３位および６位の両方のアミノ酸残基がアスパラギンであってよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１１）は、アラニンまたはグルタミン酸、例えばアラニンなどであるか、あるいはそれは欠失され得る。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸である。
【００５２】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の２８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ５）は、アラニンまたはアスパラギン、例えばアラニンなどである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ９）は、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸およびバリンからなる群から選択されるか、またはグルタミン酸およびバリンからなる群から選択されるか、またはバリンであるか、またはそれは欠失され得る。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびグルタミン酸であり、一方、４０位のアミノ酸残基は、バリンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００５４】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の４２位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１０）は、アラニン、リジンまたはアルギニンであるか、あるいはそれは欠失され得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ３）は、リジンまたはヒスチジン、例えばリジンなどである。
【００５６】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の３３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ７）は、リジンまたはセリン、例えばリジンなどである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の３７位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ８）は、グルタミン酸またはアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである。
【００５８】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７の５１位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１４）は、チロシンまたはロイシン、例えばチロシンなどである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の４４位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ１２）は、ロイシンまたはイソロイシンである。具体的な実施形態では、配列番号７の９位および１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニンおよびリジン／グルタミン酸であり、一方、４４位のアミノ酸残基はイソロイシンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニンまたはグルタミン酸であってよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、配列番号４〜７の１、２、３および４位、または３、４、５および６位に対応する位置のアミノ酸残基は欠失されている。これらの実施形態の特定のバリアントでは、親ポリペプチドは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号５）である。これらの欠失の天然のＣドメインへの影響は、参照によりその全文が本明細書に援用される米国特許第９０１８３０５号明細書および米国特許第８３２９８６０号明細書に記載されている。
【００６１】
ある種の実施形態では、配列番号４〜７における、例えば配列番号７における変異は、以下からなる群から選択される：Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｅ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｔ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ。これらの変異は、特に高いアルカリ安定性をもたらす。配列番号４〜７における、例えば配列番号７における変異はまた、以下からなる群から選択され得る：Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４ＩおよびＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になる：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０。それは例えば、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９。また、それは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり得る：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８。
【００６３】
ある種の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５４〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり；配列番号７１〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になり；あるいは、それは、配列番号７６〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。それはさらに、配列番号８９〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。
【００６４】
ポリペプチドは、例えば上記の群から、またはこれらの群の部分集合から選択される配列によって定義されてよいが、それはまた、Ｎおよび／またはＣ末端にさらなるアミノ酸残基、例えばＮ末端のリーダー配列および／またはＣ末端のテール配列を含んでもよい。
【００６５】
配列番号８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＡＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｑ４０Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＥ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ，Ｑ３２Ｅ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３６  Ｂ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３７  Ｃ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｅ４３Ａ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＹＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３９  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＴＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＦＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４１  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＬＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４２  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＷＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４３  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＩＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４４  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＭＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４５  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＶＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４６  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４７  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＨＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４８  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＲＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｇ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｓ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＳＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｙ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＹＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｑ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＱＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｔ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＴＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｎ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＮＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｆ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＦＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｌ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＬＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｗ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＷＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｉ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＩＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｍ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＭＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｖ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＶＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６６  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｄ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＤＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＥＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｈ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＨＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｒ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＲＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ａ２９Ｋ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＫＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＦＡＱＡＰＫ
配列番号７２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＹＡＱＡＰＫ
配列番号７３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＷＡＱＡＰＫ
配列番号７４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＫＡＱＡＰＫ
配列番号７５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｄ５３Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＲＡＱＡＰＫ
配列番号７６  Ｚｖａｒ（Ｑ９ｄｅｌ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥ＿Ｑ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０ｄｅｌ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳ＿  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２ｄｅｌ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  Ｓ＿ＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３ｄｅｌ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫ＿ＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号８９  Ｚｖａｒ（Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
Ｖ＿＿＿ＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９０  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８ｄｅｌ）
＿＿ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ＿
配列番号９１  Ｚｖａｒ（Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡ＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ａ５６ｄｅｌ，Ｐ５７ｄｅｌ，Ｋ５８ｄｅｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ＿＿＿
配列番号９３  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９４  Ｚｖａｒ（Ｖ１ｄｅｌ，Ｄ２ｄｅｌ，Ａ３ｄｅｌ，Ｋ４ｄｅｌ，Ｆ５ｄｅｌ，Ｄ６ｄｅｌ，Ｋ７ｄｅｌ，Ｅ８ｄｅｌ，Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）
＿＿＿＿＿＿＿＿ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５８＿ｉｎｓＹＥＤＧ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＹＥ  ＤＧ
分離マトリックスは、免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む。そのような多量体は、上記のいずれかの実施形態によって定義される複数の免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメイン（ポリペプチド単位）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。多量体を使用することにより、免疫グロブリン結合容量を増加させることができ、多量体はモノマーよりも高いアルカリ安定性を有することもができる。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体であり得る。多量体は、多量体の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、少なくとも１つの単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば、上記で開示された変異／保存を含むことによってアルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。あるいは、多量体中の２以上の単位は、オリゴマー種またはポリマー種、例えば最大２５または３０アミノ酸、例えば３〜２５または３〜２０アミノ酸などを有するペプチドを含むリンカーによって結合することができる。リンカーは、例えば、ＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫ、ＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥおよびＹＥＤＧからなる群から選択されるか、あるいは、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥおよびＹＥＤＧからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するペプチド配列を含むかまたはそれから本質的になる。それらはまた、ＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＶＦＤＫＥ、ＡＰＡＫＦＤＫＥ、ＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＡ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＫＦＤＫＥ、ＡＰＫおよびＡＰＫＹＥＤＧＶＤＡＫＦＤＫＥからなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるか、あるいはそれとの少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するペプチド配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥまたはＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥからならない、あるいは、ペプチドＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＦＮＫＥ、ＡＰＫＦＤＫＥ、ＡＰＫＶＤＫＥまたはＡＰＫＡＤＫＥからならない。
【００６６】
そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、前記リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにＮ末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、または切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば２０以下、例えば１５以下、例えば１０以下または５以下であってよい。具体例として、多量体はＡＱ、ＡＱＧＴ、ＶＤＡＫＦＤＫＥ、ＡＱＶＤＡＫＦＤＫＥまたはＡＱＧＴＶＤＡＫＦＤＫＥ配列をＮ末端に含むことがある。
【００６７】
ある種の実施形態では、多量体は、配列番号８０〜８７からなる群から選択される配列を含むかまたはそれから本質的になってよい。これらのおよびさらなる配列は下の表に記載され、親（変異）ｎと命名される。ここでｎは多量体中の単量体単位の数である。
【００６８】
配列番号１７  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１８  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１９  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ｅ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２０  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３０  Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｓ３３Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ，Ｋ５０Ｒ，Ｌ５１Ｙ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ  ＹＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３１  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｋ，Ｈ１８Ｋ，Ｄ３７Ｅ，Ａ４２Ｒ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ  ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３２  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｎ２８Ａ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３３  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）６
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３４  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｋ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３５  Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ，Ｎ１１Ｅ，Ｄ３７Ｅ，Ｑ４０Ｖ，Ａ４２Ｒ，Ｎ４３Ａ，Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ  ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８０  リンカーのＤ２、Ａ３およびＫ４が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８１  リンカーのＫ５８、Ｖ１およびＤ２が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８２  リンカーのＰ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２およびＡ３が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰ  ＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８３  リンカーのＫ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８４  リンカーのＡ５６、Ｐ５７およびＫ５８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８５  リンカーのＶ１、Ｄ２およびＡ３が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８６  リンカーのＶ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７およびＥ８が欠失したＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８７  ＹＥＤＧがリンカーのＫ５８とＶ１の間に挿入されたＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＹＥＤＧ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号８８  Ｚｖａｒ２
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ  ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
いくつかの実施形態では、上に開示されるポリペプチドおよび／または多量体は、Ｃ末端またはＮ末端に、１または複数のシステイン残基、複数のリジン残基および複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、１または複数の連結要素をさらに含む。１または複数の連結要素はまた、Ｃ末端またはＮ末端から１〜５アミノ酸残基の範囲内、例えば１〜３または１〜２アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばＣ末端の単一のシステインであることがある。１または複数の連結要素は、ＣまたはＮ末端に直接に結合してもよいし、あるいは連結要素は、最大１５アミノ酸、例えば１〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のために、ストレッチがアスパラギンを含まない場合に有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと支持体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。これは、結合容量にとって重要な、カップリングタンパク質の優れた可動性を提供する。
【００６９】
ポリペプチドまたは多量体のアルカリ安定性は、例えばＮＨＳ−またはマレイミドカップリング化学を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）チップ、例えば実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップとそれをカップリングさせ、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを用いてチップの免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１０分サイクル、例えば１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で１００回の１０分インキュベーションサイクルの後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも５５、例えば少なくとも６０、少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。あるいは、上記のように測定される特定の変異体の１００サイクル後の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の残存ＩｇＧ容量と比較することができる。この例では、変異体の残存ＩｇＧ容量は、親ポリペプチド／多量体の少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％などであることがある。
【００７０】
免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインおよび／またはその多量体は、核酸配列、例えばポリペプチドまたは多量体をコードするＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列などによってコードされることがある。コード配列に加えて必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターがポリペプチドまたは多量体の発現に使用されることがある。ベクターは、上記のような多量体をコードする核酸を含むことがあり、この際、各単位をコードする個別の核酸は、相同または異種のＤＮＡ配列を有することがある。
【００７１】
上記のような核酸またはベクターを含む発現系は、ポリペプチドまたは多量体の発現に使用されてよい。発現系は、例えば、本発明のポリペプチドまたは多量体を発現するよう改変されている、グラム陽性またはグラム陰性の原核生物宿主細胞系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）であってよい。あるいは、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など、または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞であってよい。
【００７２】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、上記のような免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００７３】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、少なくとも１１、例えば１１〜２１、１５〜２１または１５〜１８ｍｇ／ｍｌのＦｃ結合リガンドを含んでよく、この際：
ａ）リガンドはアルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含み、
ｂ）多孔質支持体は５６〜７０、例えば５６〜６６マイクロメートルの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）および５５〜８０、例えば６０〜７８または６５〜７８ｍｇ／ｍｌの乾燥固体重量を有する架橋ポリマー粒子を含む。架橋ポリマー粒子はさらに、分子量１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫｄ値０．６９〜０．８５、例えば０．７０〜０．８５または０．６９〜０．８０に相当する孔径を有してよい。多量体は、例えばアルカリ安定化プロテインＡドメインの四量体、五量体、六量体または七量体、例えばアルカリ安定化プロテインＡドメインの六量体などを含んでよい。高いリガンド含有量と粒度範囲、乾燥固体重量範囲および随意のＫｄ範囲を組み合わせることにより、例えば、ＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量が２．４分の滞留時間で少なくとも４５ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも５０または少なくとも５５ｍｇ／ｍｌであるような、高い結合容量が得られる。あるいは、またはさらに、ＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量は、６分の滞留時間で少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも６５、少なくとも７０または少なくとも７５ｍｇ／ｍｌなどであることがある。
【００７４】
アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体は、ＩｇＧに対して選択性が高く、分離マトリックスは、２０ｍＭリン酸緩衝液、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で、ヒトＩｇＧ２に対して０．２ｍｇ／ｍｌよりも低い、例えば０．１ｍｇ／ｍｌよりも低い解離定数を適切に有することができる。これは、Ｎ  Ｐａｋｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｓｃｉ  １２，１１３６−１１４１（２０１２）に記載の吸着等温線法に従って求めることができる。
【００７５】
ある種の実施形態では、分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した、少なくとも１５、例えば１５〜２１または１５〜１８ｍｇ／ｍｌのＦｃ結合リガンドを含み、この際、リガンドは、アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む。これらの多量体は、適切に、上記の実施形態または下に指定される実施形態のいずれかに開示される通りであり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、分離マトリックスは、支持体と結合した、５〜２５、例えば５〜２０ｍｇ／ｍｌ、５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌまたは６〜１１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは多量体を含む。結合したポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスで使用したポリペプチド／多量体の濃度、使用した活性化およびカップリング条件、および／または使用した支持体の多孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合容量は、カップリングされたポリペプチド／多量体の量に伴い、少なくとも細孔がカップリングされたポリペプチド／多量体によって著しく狭窄される点まで増加する。理論に縛られるものではないが、しかし、支持体に対して列挙されるＫｄ値に関して、結合したリガンドによる細孔の狭窄はそれほど重要ではないと思われる。カップリングされたポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合容量はカップリングレベルが高くなると減少し、上記の範囲内で最適な費用便益をもたらす。
【００７７】
そのような分離マトリックスは、免疫グロブリンまたはその他のＦｃ含有タンパク質の分離に有用である。そして、ポリペプチド／多量体のアルカリ安定性が改善されたために、マトリックスは洗浄中の高アルカリ条件に耐え、それはバイオプロセス分離の状況において長期の反復使用に不可欠である。マトリックスのアルカリ安定性は、指定された温度、例えば２２＋／−２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを使用して、免疫グロブリン結合容量を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．５Ｍまたは１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で何回かの１５分サイクル、例えば２５、５０または７５時間の総インキュベーション時間に相当する１００、２００または３００サイクルなどで実施することができる。２２＋／−２℃の０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で９６〜１００回の１５分インキュベーションサイクルあるいは２４または２５時間の総インキュベーション時間の後のマトリックスのＩｇＧ容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも８０、例えば少なくとも８５、少なくとも９０または少なくとも９５％などであり得る。２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ中で合計２４時間のインキュベーションの後のマトリックスの容量は、インキュベーション前のＩｇＧ容量の少なくとも７０、例えば少なくとも８０または少なくとも９０％などであり得る。２．４分または６分の滞留時間のＩｇＧに対する１０％貫流の動的結合容量（Ｑｂ１０％）は、例えば、２２＋／−２℃の１．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中、３１時間のインキュベーションの後に２０％未満低下していることがある。
【００７８】
当業者の理解するように、発現したポリペプチドまたは多量体は、支持体に固定される前に適切な程度まで精製されるべきである。そのような精製方法は当分野で周知であり、タンパク質に基づくリガンドの支持体への固定は標準法を用いて容易に実行される。適切な方法および支持体は、以下により詳細に述べる。
【００７９】
分離マトリックスの多孔質支持体は、任意の適した周知の種類のものであってよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合有機性であり、使用する水性媒体に親水性表面を曝露している、すなわちヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ２、Ｎ−置換型であってもよい）、アミノ（−ＮＨ２、置換されていてもよい）、オリゴ−またはポリエチレンオキシ基をそれらの外部に曝露し、存在する場合にはその内部にも曝露しているポリマーに基づく。支持体の空隙率は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載の方法による逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたＫａｖまたはＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。Ｋａｖは、比（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）として求められ、式中、Ｖｅは、プローブ分子の溶出量（例えば、デキストラン１１０ｋＤ）であり、Ｖ０は、カラムの空隙容量（例えば、高Ｍｗのボイドマーカー、例えば未加工のデキストランなどの溶出量）であり、Ｖｔはカラムの総容積である。Ｋｄは、（Ｖｅ−Ｖ０）／Ｖｉとして求めることができ、式中、Ｖｉは、マトリックス体積（マトリックスポリマー分子によって占有される体積）を除く全ての容積に入ることのできる塩（例えば、ＮａＣｌ）の溶出量である。定義上、ＫｄおよびＫａｖ値は両方とも常に０〜１の範囲内にある。有利には、分子量１１０ｋＤａのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、Ｋａｖ値は０．６〜０．９５、例えば、０．７〜０．９０または０．６〜０．８であり得る。分子量１１０ｋＤａのデキストランで測定されるＫｄ値は、適切には０．６８〜０．９０、例えば０．６８〜０．８５または０．７０〜０．８５などであり得る。この有利性は、支持体が、本発明のポリペプチド／多量体および該ポリペプチド／多量体に結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、結合部位への、および結合部位からの免疫グロブリンの質量輸送を提供することができる細孔を大きな割合で有することである。
【００８０】
ポリペプチドまたは多量体は、例えば、リガンド中に存在するチオール、アミノおよび／またはカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術を介して多孔質支持体に結合させることができる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、周知のカップリング試薬である。支持体とポリペプチド／多量体との間には、ポリペプチド／多量体の有効性を改善し、ポリペプチド／多量体と支持体との化学カップリングを促進する、スペーサーとして公知の分子を導入することができる。ポリペプチド／多量体の性質およびカップリング条件に応じて、カップリングは、マルチポイントカップリング（例えば複数のリジンを介するもの）であってもよいし、シングルポイントカップリング（例えば単一のシステインを介するもの）であってもよい。
【００８１】
特定の実施形態において、ポリペプチドまたは多量体は、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。このような結合を実施する方法は、この分野において周知であり、標準的な技術および装置を使用して当業者によって容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定であり、一般的にアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合が、ポリペプチドまたは多量体上の末端または近末端のシステイン残基を介している場合、カップリングされたポリペプチド／多量体の可動性が向上し、結合容量および結合反応速度が改善される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド／多量体は、上記のタンパク質に提供されるＣ末端システインを介してカップリングされる。このことは、システインチオールと支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等との効率的なカップリングを可能にし、その結果チオエーテル架橋結合となる。
【００８２】
特定の実施形態において、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基含量が高く、バイオプロセスに使用されるアルカリ清浄化液に対して一般に安定である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、支持体は、寒天またはアガロースを含む。本発明で使用する支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））により容易に調製することができる。または、塩基性マトリクッスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で販売されている架橋アガロースビーズなどの市販品である。大規模分離に特に有利な一実施形態において、支持体は、米国特許第６６０２９９０号または米国特許第７３９６４６７号（当該特許は参照によりその全文が本明細書に援用される）に記載されている方法を使用して、その剛性を増加させるように適合されており、そのためにマトリックスは高い流量により適したものとなる。
【００８４】
特定の実施形態において、支持体、例えばポリマー、多糖類またはアガロースなどは、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライドまたはアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であってよい。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【００８５】
あるいは、多孔質支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどに基づく。ジビニルおよびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックス表面は、多くの場合親水化されて、上で定義した親水性基を周囲の水性液体に曝露する。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造され、例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。または、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販品が使用される。別の代替法では、本発明による多孔質支持体は、無機性の支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００８６】
さらに別の実施形態において、固相支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルタ（例えば、膜または深層フィルタマトリックス）などの別の形態である。
【００８７】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態において、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態において、マトリックスは、多孔質または非多孔質であり得るビーズまたは粒子の形態である。ビーズまたは粒子の形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には、粒子またはビーズが自由に移動する膨張床および純粋な懸濁液として知られている形態が含まれる。モノリス、充填床および膨張床の場合、分離手順は一般に、濃度勾配を用いた従来のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ様式が使用される。
【００８８】
上に開示される分離マトリックスは優れたアルカリ安定性を有するので、アルカリ性洗浄液を用いて洗浄および／または消毒されてよい。分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法は、以下の
ａ）所望により、分離マトリックスを用いて第１の免疫グロブリンを含む混合物を精製する工程；
ｂ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を準備する工程；および
ｃ）洗浄液と分離マトリックスを所定の接触時間の間、接触させることによって分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程を含む。
【００８９】
洗浄および／または消毒は、使用前にマトリックスを消毒するために、これまでに使用されていない分離マトリックスで、例えば分離マトリックスを含むカラムを詰めた後に最初に実施されてよい。また、洗浄および／または消毒は、免疫グロブリンを精製するために分離マトリックスを使用した後に、すなわち上記の方法の工程ａ）の後に実施されてもよい。分離マトリックスを最大限に活用するために、免疫グロブリンを精製するために分離マトリックスを使用する工程と、その後に分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程は、繰り返されてよい。工程は、少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返されてよい。洗浄／消毒の工程ｃ）は、免疫グロブリンを精製する各工程ａ）の後に実施されてもよいし、それよりも少ない頻度で、例えば、２回の精製ごとに、または１０回の精製ごとになどで実施されてもよい。分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程ｃ）は、各回同じ条件を使用して実施する必要はない。例えば、分離マトリックスは、毎回の精製工程の後に第１の条件の組を用いて洗浄されてよく、ｎ回目の精製ごとにより厳しい条件を用いて消毒されてよい。
【００９０】
アルカリ金属水酸化物水溶液は効果的な洗浄剤であり、それ自体殺菌性であるので、そのようなアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を用いて洗浄および消毒することにより、洗浄および消毒剤としてアルコールを使用する必要性はより少ない。アルカリ金属水酸化物は、アルコールと比較して安価であり、規制上の負担になりにくい。さらに、アルカリ金属水酸化物は不燃性であり、処分が容易である。
【００９１】
分離マトリックスは、多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む、上に開示されるような分離マトリックスであり、この際、アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるかあるいはそれとの少なくとも８０％、例えば９０％、９５％または９８％などの同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくともアスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している。免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインは、さらなる変異を含むことがある。例えば、配列番号５１または５２の１位のグルタミン残基は、アラニンに変異させてよい；かつ／または配列番号５１または５２の３５位のアスパラギンまたはグルタミン酸残基は、アラニンに変異させてよい。
【００９２】
アルカリ安定化プロテインＡドメインのアルカリ安定性が高いために、分離マトリックスは、結合容量を過剰に失うことなく、濃アルカリ金属水酸化物溶液を使用してさえ、大規模な洗浄および消毒処置に耐えることができる。例えば、分離マトリックスは、洗浄および／または消毒の後に、その最初の動的結合容量の少なくとも８０％を保持することがある。
【００９３】
洗浄液は、少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む。アルカリ金属水酸化物水溶液は、単一のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ金属水酸化物の混合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムと水酸化カリウムの混合物などを含んでよい。アルカリ金属水酸化物水溶液は、アルカリ金属水酸化物の混合物を使用する場合のアルカリ金属水酸化物の総合濃度として表して、５００ｍＭ〜５Ｍ、例えば１Ｍ〜２Ｍなどのモル濃度を有してよい。洗浄液は、アルカリ金属水酸化物水溶液から本質的になるか、またはそれからなってよい。しかし、洗浄液は、いくつかの実施形態においてさらなる成分も含んでよい。そのようなさらなる成分には、アルコール、例えばＣ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたは安息香酸アルコールなどが含まれてよい。そのようなさらなる成分には、塩、例えば塩化ナトリウムなどが含まれてよい。アルコールおよび／または塩を洗浄液中に使用することにより、ある種の微生物、例えば胞子形成細菌などを抑制または不活性化する洗浄液の効力を増加させることができる。
【００９４】
洗浄液の限定されない例としては、以下が挙げられる：
水酸化ナトリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
水酸化カリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
１０〜２０体積％のエタノールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
１０〜５０体積％のイソプロパノールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
１〜５体積％のベンジルアルコールを含む水酸化ナトリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
１０〜２０体積％のエタノールを含む水酸化カリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；
１０〜５０体積％のイソプロパノールを含む水酸化カリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）；または
１〜５体積％のベンジルアルコールを含む水酸化カリウム溶液（０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍ）。
【００９５】
比較的濃縮されたアルカリ金属水酸化物溶液、例えば０．５Ｍ〜５Ｍ溶液などを使用することにより、タンパク質および核酸などのマトリックス夾雑物の例外的な除去、ならびにウイルス、細菌、酵母および真菌の迅速かつ効果的な不活性化がもたらされる。一般に用いられる消毒効力の尺度は、測定される微生物または夾雑物の６−ｌｏｇ１０減少である。濃アルカリ金属水酸化物溶液による消毒は、大部分の微生物およびエンドトキシンを６−ｌｏｇ１０減少させることが可能である。
【００９６】
分離マトリックスの洗浄中、夾雑物をマトリックスから流すために、洗浄液は適した流量で分離マトリックスに通されるべきである。消毒の間、分離マトリックスに洗浄液が完全に浸透するまで、洗浄液は最初のうちは適した流量で分離マトリックスに通される。洗浄液は、好ましくは、消毒工程の全ての期間の間、適した流量で分離マトリックスに通される。しかし、必要に応じて、分離マトリックスを通る洗浄液の流れは、ひとたび分離マトリックスに洗浄液が完全に浸透すると停止されてよい。これは消毒工程を実施するために必要な洗浄流体の量を減らすが、一定流量の洗浄流体が適用される手順と比較して、分離マトリックスの不十分な洗浄を提供する。
【００９７】
アルカリ金属水酸化物水溶液は分離マトリックスから夾雑物を除去することにとても効果的であるので、宿主細胞タンパク質の混入またはキャリーオーバーの危険の低い、多様な免疫グロブリンの精製のための精製プラットフォームとして分離マトリックスを使用することができる。第１の免疫グロブリン生成物の精製の後、分離マトリックスはまず、第２の免疫グロブリン生成物の精製で使用する前に、アルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を用いて十分に洗浄および消毒される。
【００９８】
実施例
タンパク質の変異誘発
部位特異的変異誘発を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて２工程のＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ、ＢまたはＣのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌発現ベクターに連結した。ＤＮＡ塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
【００９９】
変異体の多量体を形成するために、アミノ酸ＶＤに対応する、Ｂ、ＣまたはＺドメインの出発コドン（ＧＴＡ  ＧＡＣ）に位置するＡｃｃ  Ｉ部位を使用した。単量体ドメインのベクターをＡｃｃ  Ｉで消化し、ホスファターゼ処理した。各々のバリアントに特異的なＡｃｃ  Ｉ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各々の鋳型から作製した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を比較することによって濃度を推定した。等量の対のＰＣＲ産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした（４５分で９０℃→２５℃）。結果として得られる産物は、Ａｃｃ  Ｉ部位（正しいＰＣＲ断片および／または消化ベクター）に連結される可能性の高い断片の約１／４からなる。ライゲーションおよび形質転換の後、コロニーをＰＣＲスクリーニングして所望の変異体を含む構築物を同定した。陽性クローンは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【０１００】
構築物の発現および精製
構築物を、標準培地中の大腸菌Ｋ１２の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径０．２μｍの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
【０１０１】
各々の構築物（ここでは濾過工程からの透過液中にある）を、アフィニティーによって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧ（ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するクロマトグラフィー培地に添加した。添加した産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることによって溶出した。
【０１０２】
溶出プールを中性ｐＨ（ｐＨ８）に調節し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次に、試料を陰イオン交換体に添加した。洗浄工程の後、構築物をＮａＣｌ勾配に溶出し、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。固定ＩｇＧ培地での構築物のアフィニティー精製の成功は、問題の構築物がＩｇＧに対して高い親和性を有することを意味することに留意する必要がある。
【０１０３】
精製したリガンドをＲＰＣ  ＬＣ−ＭＳで分析して、純度を求め、分子量が（アミノ酸配列に基づく）予測値と一致することを確かめた。
【実施例１】
【０１０４】
配列番号８〜１６、２３〜２８および３６〜４８についてＮ末端のＡＱＧＴリーダー配列およびＣ末端のシステインをさらに含む、表１に記載の精製単量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを９６〜１００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表１に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ１）、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）１およびＺｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）１、ならびに２９位にＧ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＲまたはＫを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種、５３位にＦ、Ｙ、Ｗ、ＫまたはＲを有するＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種、およびＱ９、Ｑ４０、Ａ４２またはＮ４３を欠失しているＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１の変種が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドＢ（Ｑ９Ａ、Ｎ１��Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１およびＣ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）１は、基準として使用した親ＢドメインおよびＣドメインと比較して安定性が改善された。
【０１０５】
表１．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した単量体リガンド
【０１０６】
【表１−１】
0006987424.tif 000002
【０１０７】
【表１−２】
0006987424.tif 000003
Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、リガンドとＩｇＧとの結合速度および解離速度を求めるためにも使用することができる。これを上記の設定でプローブ分子としてＩｇＧ１モノクローナル抗体を用いて使用した。基準Ｚｖａｒ１に関して、オンレート（１０５Ｍ−１ｓ−１）は３．１であり、オフレート（１０５ｓ−１）は２２．１であり、親和性（オフレート／オンレート）は７１３ｐＭとなった。Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１（配列番号１１）に関して、オンレートは４．１であり、オフレートは４３．７で、親和性は１０７０ｐＭであった。このようにＩｇＧ親和性は変異バリアントについて多少高かった。
【実施例２】
【０１０８】
表２に記載の精製二量体、四量体および六量体リガンドを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００〜１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合容量を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２＋／−２℃）１０分間、５００ｍＭ  ＮａＯＨを流した。これを３００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合容量（シグナル強度）として追跡した。結果は表２および図２に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４およびＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。六量体リガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６も、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ６と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、２つの単量体単位間のリンカー領域のａ）Ｄ２、Ａ３、Ｋ４；ｂ）Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２；ｃ）Ｐ５７、Ｋ５８、Ｖ１、Ｄ２、Ａ３；ｄ）Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８；ｅ）Ａ５６、Ｐ５７、Ｋ５８；Ｖ１、Ｄ２、Ａ３またはｆ）Ｖ１、Ｄ２、Ａ３、Ｋ４、Ｆ５、Ｄ６、Ｋ７、Ｅ８が欠失した、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。また、リンカー領域のＫ５８とＶ１の間にＹＥＤＧが挿入された、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）二量体は、Ｚｖａｒ２と比較してアルカリ安定性を改善させた。
【０１０９】
表２．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した二量体、四量体および六量体リガンド
【０１１０】
【表２−１】
0006987424.tif 000004
【０１１１】
【表２−２】
0006987424.tif 000005
【実施例３】
【０１１２】
実施例２のような５００ｍＭの代わりに１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、３つのリガンドの１００回のＣＩＰサイクルを用いて実施例２を繰り返した。結果は表３に示され、３つ全てのリガンドが、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較して１Ｍ  ＮａＯＨ中でも安定性を改善したことを示す。
【０１１３】
表３．Ｂｉａｃｏｒｅ（１Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した四量体リガンド
【０１１４】
【表３】
0006987424.tif 000006
【実施例４】
【０１１５】
表２の精製四量体リガンド（全てＮ末端にさらなるシステインを含む）を、下に記載される方法を用いてアガロースビーズに上に固定化し、能力および安定性について評価した。結果を表４および図３に示す。
【０１１６】
表４．カラム（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）で評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【０１１７】
【表４】
0006987424.tif 000007
活性化
使用したベースマトリックスは、参照によりその全文がここに援用される米国特許第６６０２９９０号に記載の方法に従って調製し、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ  ６−１３に記載の方法に従う、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫａｖ値０．７０に相当する孔径をもつ、８５マイクロメートル（容積重量、ｄ５０Ｖ）の中位径の硬質架橋アガロースビーズであった。
【０１１８】
２５ｍＬ（ｇ）の水切りしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水および２．０２ｇのＮａＯＨを、１００ｍＬフラスコ中で機械的に撹拌しながら２５℃において１０分間混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、反応を２時間進行させた。活性化されたゲルを、１０ゲル沈殿物体積（ＧＶ）の水で洗浄した。
【０１１９】
カップリング
５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ３、２１ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１７５ｍｇのＮａＣｌおよび７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５〜１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【０１２０】
活性化したゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗浄し、次に参照によりその全文がここに援用される米国特許第６３９９７５０号に記載の方法に従ってリガンドを結合させた。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、リガンド溶液の量および濃度を変化させることによって制御することができた。
【０１２１】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ  リン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝および０．５Ｍ  ＨＡｃで、その後８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【０１２２】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ１６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化緩衝液中２ｍｇ／ｍｌに希釈。
【０１２３】
平衡化緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
吸着緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
溶出緩衝液
１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ２．９
動的結合容量
２ｍｌの樹脂を、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５  １００カラムに充填した。貫流容量を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムで滞留時間６分（流量０．３３ｍｌ／分）で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは自動ゼロ化の前に行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに適用した。その後、安定したベースラインが得られるまで、平衡バッファーを再度適用した。
【０１２４】
ＵＶシグナルが最大吸光度の８５％に達するまで試料をカラムに添加した。その後、流量０．５ｍｌ／分の５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。タンパク質を５ＣＶの溶出緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で溶出した。次に、カラムを流量０．２ｍｌ／分の０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、平衡化緩衝液で再び平衡化させた。
【０１２５】
１０％の貫流容量の計算には、下の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧの濃度がフィード液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムに添加されるＩｇＧの量である。
【０１２６】
【数１】
0006987424.tif 000008
Ａ１００％＝１００％ＵＶシグナル；
Ａｓｕｂ＝非結合ＩｇＧサブクラスによる吸光度への寄与；
Ａ（Ｖ）＝所与添加容量での吸光度；
Ｖｃ＝カラム容量；
Ｖａｐｐ＝１０％貫流までの添加量；
Ｖｓｙｓ＝システムのデッドボリューム；
Ｃ０＝フィード濃度。
【０１２７】
１０％貫流での動的結合容量（ＤＢＣ）を計算した。動的結合容量（ＤＢＣ）は、１０および８０％貫流について計算した。
【０１２８】
ＣＩＰ−０．５Ｍ  ＮａＯＨ
１０％貫流のＤＢＣ（Ｑｂ１０）は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、０．５Ｍ  ＮａＯＨを０．５／分の速度で２０分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを４時間静置するＣＩＰ工程が含まれた。曝露は室温（２２＋／−２℃）で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。表４は、６回の４時間サイクル後の残存容量（すなわち、０．５Ｍ  ＮａＯＨへの累積曝露時間は２４時間）を、絶対数で、そして初期容量と比較して表す。
【実施例５】
【０１２９】
実施例４を、表５に示される四量体リガンドを用いて、但しＣＩＰ工程で０．５Ｍの代わりに１．０Ｍ  ＮａＯＨを使用して繰り返した。結果を表５および図４に示す。
【０１３０】
表５．カラム−１．０Ｍ  ＮａＯＨで評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【０１３１】
【表５】
0006987424.tif 000009
【実施例６】
【０１３２】
ベースマトリックス
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って調製され、上記の方法に従って、０．２Ｍ  ＮａＣｌ中のプロトタイプとプローブ分子として一連のデキストラン画分を充填したＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる（流量０．２ｍｌ／分）分子量１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫｄ値０．６２〜０．８２に相当する孔径をもつ、５９〜９３マイクロメートル（体積加重、ｄ５０Ｖ）の中位径（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００レーザー回折装置で測定）の、一組の剛性架橋アガロースビーズ試料であった。１．０ｍｌの排水した濾過ケーキ試料を１０５℃で一晩乾燥させ、秤量することによって求めたビーズ試料の乾燥重量は、５３から８６ｍｇ／ｍｌに及んだ。
【０１３３】
表６ベースマトリックス試料
【０１３４】
【表６】
0006987424.tif 000010
カップリング
１００ｍｌのベースマトリックスをガラスフィルタ上で１０ゲル体積の蒸留水で洗った。ゲルを秤量し（１ｇ＝１ｍｌ）、撹拌器を備えた２５０ｍｌフラスコ中で３０ｍｌの蒸留水および８．０８ｇのＮａＯＨ（０．２０２ｍｏｌ）と混合した。温度は水浴中２７＋／−２℃に調節した。１６ｍｌのエピクロロヒドリン（０．２０２ｍｏｌ）を、９０＋／−１０分の間に激しい撹拌下で（約２５０ｒｐｍ）添加した。反応をさらに８０＋／−１０分間継続させ、その後、ゲルをガラスフィルタ上で１０ゲル体積を上回る蒸留水で中性のｐＨに達するまで洗った。この活性化したゲルを下のようなカップリングに直接使用した。
【０１３５】
５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中１６．４ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１３９ｍｇのＮａＨＣＯ３、１７．４ｍｇのＮａ２ＣＯ３、１４３．８ｍｇのＮａＣｌおよび１４１ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５〜１０分間載せた後、６３ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【０１３６】
活性化したゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗い、次に、かなり高いリガンド量であるが、米国特許第６３９９７５０号明細書５．２．２に記載の方法に従ってリガンドを結合させた（下記参照）。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、ゲル１ｍｌ当たり５〜２０ｍｇのリガンドを添加して、リガンド溶液の量および濃度を変化させることによって制御した。リガンドは、アルカリ安定化変異体の四量体（配列番号２０）かまたは六量体（配列番号３３）であった。
【０１３７】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ  リン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝および０．５Ｍ  ＨＡｃで、その後８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【０１３８】
評価
２．４分および６分の滞留時間でのポリクローナルヒトＩｇＧに対するＱｂ１０％動的容量を、実施例４に概説されるように決定した。
【０１３９】
表７．プロトタイプの結果
【０１４０】
【表７−１】
0006987424.tif 000011
【０１４１】
【表７−２】
0006987424.tif 000012
【実施例７】
【０１４２】
上記の通り調製した、異なるリガンド含有量をもつ一連のプロトタイプ（四量体、配列番号２０）を１Ｍ  ＮａＯＨ中２２＋／−２℃で４、８および３１時間インキュベートし、インキュベーションの前後に動的ＩｇＧ容量（Ｑｂ１０％、滞留時間６分）を測定した。プロトタイプを表８に示し、結果を図５および６に示す。この厳しいアルカリ処理に対する安定性は、リガンド含有量の増加に伴って増加することが分かる。
【０１４３】
表８．１Ｍ  ＮａＯＨでのインキュベーションの試料
【０１４４】
【表８】
0006987424.tif 000013
【実施例８】
【０１４５】
上記の通り調製した、異なるリガンド含有量（六量体、配列番号３３）、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）６２μｍおよび分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄ０．７０をもつ、２つの架橋アガロースビーズプロトタイプを、実際のｍＡｂフィード液によって評価した。プロトタイプＡのリガンド含有量は１４．３ｍｇ／ｍｌであり、プロトタイプＢのリガンド含有量は１８．９ｍｇ／ｍｌであった。比較のために、市販品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。樹脂をＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にベッド高１０ｃｍまで詰めて、２ｍｌのベッドボリュームを得、カラムが０．８〜１．５の区間内でピーク非対称を有することが示された。負荷した試料は、生理学的ｐＨで４．９ｍｇ／ｍｌのモノクローナルＩｇＧ１抗体を含む清澄化したＣＨＯ細胞上清であり、実験条件は下の表９に記載される通りであった（ＣＶ＝カラム体積、ＲＴ＝滞留時間）。
【０１４６】
表９．実際のフィード液による評価の条件。
【０１４７】
【表９】
0006987424.tif 000014
ＵＶウォッチ機能（ＵＶ  ｗａｔｃｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いてｍＡｂピークを回収し、２８０ｎｍでのＵＶ測定によってｍＡｂの濃度を求めた（吸光係数１．５）。全ての吸光度の検出は、分光光度計を使用して実施された（収量計算のための測定を含む）。
【０１４８】
ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）分析用の試料は、各回の実施後に、１０％保存緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ（５．３％）、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏ（９４．７％）、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ  ｐＨ８）を直接試料に（例えば５０μｌの保存緩衝液を４５０μｌの試料に）添加することによって調製した。ＨＣＰ含有量は、市販の抗ＣＨＯ抗体（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＧｙｒｏｌａｂ（Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ、スウェーデン）ワークステーションを用いて測定した。
【０１４９】
結果は下の表１０に示され、プロトタイプの成績が市販品と同じ範囲内であることを示す。フィード液中のＨＣＰ含有量は３３１０００ｐｐｍであった。
【０１５０】
表１０．実際のフィード液での評価の結果
【０１５１】
【表１０】
0006987424.tif 000015
【実施例９】
【０１５２】
上記の通り調製した、１４．５ｍｇ／ｍｌのリガンド（六量体、配列番号３３）を含み、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）が５７．４μＭであり、分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄが０．７２であり、乾燥重量が７０．３ｍｇ／ｍｌである、架橋アガロースビーズマトリックスのプロトタイプを、２つの実際のｍＡｂフィード液（ｍＡｂ１  ２．４ｇ／ｌおよびｍＡｂ２  ４．９ｇ／ｌ）ＩｇＧ１の溶出ｐＨ、生理学的ｐＨ、およびポリクローナルヒトＩｇＧの試料（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）について評価した。比較のために、市販品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。樹脂をＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にベッド高１０ｃｍまで詰めて、２ｍｌのベッドボリュームを得、カラムが０．８〜１．５の区間内でピーク非対称を有することが示された。負荷した試料は、生理学的ｐＨでＩｇＧ１  ｍＡｂｓを含む清澄化したＣＨＯ細胞上清であり、実験条件は下の表１１に記載される通りであった（ＣＶ＝カラム体積、ＲＴ＝滞留時間）。
【０１５３】
表１１．溶出ｐＨの評価の条件。
【０１５４】
【表１１】
0006987424.tif 000016
結果は下の表１２に示され、特定の抗体と樹脂の組合せに応じていくつかの個々の変化を伴うが、抗体が基準と同様のｐＨレベルで溶出することを示す。
【０１５５】
表１２．溶出ｐＨの評価の結果
【０１５６】
【表１２】
0006987424.tif 000017
ポリクローナルＩｇＧのｐＨ勾配溶出から得られる画分も、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ計測器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化された４つの異なるＩｇＧクラスに対する抗体とともに用いて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の含有量について分析した。
【０１５７】
基準およびプロトタイプのポリクローナルＩｇＧのクロマトグラムを図７に示し、ＩｇＧクラス分析を図８に示す。データは、３つ全てのクラスが同様の方法で両方の樹脂と結合すること、および第１のピークが主にＩｇＧ２を含み、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４は主に第２のピークで溶出することを示す。抗ＩｇＧ３抗体はＩｇＧ４と交差反応したので、ＩｇＧ３について信頼できる結果は得られなかった。ＩｇＧ３は通常、プロテインＡと結合しないか、ごく弱くしか結合しないことが公知である。
【実施例１０】
【０１５８】
上記の通り調製した、１２．６ｍｇ／ｍｌのリガンド（四量体、配列番号２０）を含み、ビーズメジアン径（ｄ５０，ｖ）が８４．９μｍであり、分子量１１０ｋＤのデキストランのＫｄが０．７１であり、乾燥重量が６２．２ｍｇ／ｍｌである、架橋アガロースビーズマトリックスのプロトタイプを、市販品のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸを基準として用いてアルカリ安定性に関して評価した。樹脂を１０ｃｍのベッド高まで詰めたＴｒｉｃｏｒｎ５カラムを、３カラム体積の１Ｍ  ＮａＯＨでフラッシした。それから、流れを２４０分間（１５分／サイクルの通常のＣＩＰサイクル１６回に相当）停止させた後、３カラム体積のＰＢＳ緩衝液でＮａＯＨ溶液を洗い流した。次に、ポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の動的結合容量を測定し、１Ｍ  ＮａＯＨをもう１回注入してこのプロセスを繰り返した。動的容量は、１Ｍ  ＮａＯＨによる各２４０分のインキュベーションサイクルの後に測定した。容量測定では、カラムをＰＢＳ緩衝液で平衡化し、その後に最大吸光度の８５％のＵＶシグナルに達するまで２ｍｇ／ｍｌの試料を負荷した（滞留時間６分）。次に、カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５００ｍＭ酢酸ｐＨ３．０で溶出し、再平衡化した。１０％および８０％貫流の動的結合容量を上記のように計算した。結果は図９に示され、プロトタイプが市販品よりも大いに安定していたことを示す。
【実施例１１】
【０１５９】
本発明による分離マトリックスを、２Ｍ  ＮａＯＨを用いるＣＩＰサイクルの繰り返しに対する許容量について試験した。本発明の例（Ｉｎｖ．Ｅｘ．）を、基準として市販品のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）と比較した。この調査は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ４−カラム周期的向流（ＰＣＣ）クロマトグラフィー設定を使用して５０サイクル実施された。
【０１６０】
各カラムは、３．５ｍｌ／分の流れで１０分間、２０％エタノール＋０．２Ｍ  ＮａＣｌの溶液を用いて詰められた。充填チューブおよびトップフィルタを除去し、アダプターをカラムの上部に設置した。３．５ｍｌ／分で１０分間のさらなる充填流の後、アダプターをベッド面に寄せて調整した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅの１．０２ｍｌと比較して、本発明の例の充填カラム体積Ｖｃは１．０４ｍｌであった。
【０１６１】
次に、以下の条件を用いてＰＣＣ設定を動作させた：
【０１６２】
【表１３】
0006987424.tif 000018
結果は図１０に示され、そこで、各マトリックスの３５％貫流の動的結合容量に対する負荷体積は、３５％ＤＢＣに対するその負荷体積に対して正規化される。市販基準ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）が、各サイクルでその免疫グロブリン結合容量の一部を失い、１６サイクル後にはその最初の容量の８０％未満が残ることが分かる。一方、本発明の例（Ｉｎｖ．Ｅｘ．）は、結合容量の損失はほとんどなく、７５０分の接触時間に相当する、２Ｍ  ＮａＯＨ中で５０回のＣＩＰサイクルの後に、その最初の結合容量の９５％が残存することを示す。
【実施例１２】
【０１６３】
１Ｍおよび２Ｍ  ＮａＯＨに対するリガンド安定性を、共焦点顕微鏡を用いて、本発明による分離マトリックスについて調査した。本発明の例（Ｉｎｖ．Ｅｘ．）を、基準としての市販品のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＭＳＳ  ＬＸ）と比較した。調査は以下の通り実施した：
分離マトリックスの調製
分離マトリックスゲルをその保存溶液から洗浄して、遠心分離によって水を加え、１：１ゲルスラリーを得た。各ゲルについて、２ｍｌの水中１：１スラリーを５０ｍＬのファルコンチューブに添加し、遠心し、デカントした。各チューブに１９ｍｌの１Ｍまたは２Ｍ  ＮａＯＨを添加した（２種類の分離マトリックス＊２種類の［ＮａＯＨ］濃度→合計４本のチューブ）。ゲルをＨｅｉｄｏｌｐｈシェーカー（１３００ｒｐｍ）で振盪しながら室温でインキュベートした。ゲルスラリーの１５００μｌの試料を２、４、６、８、１６、２４および３２時間のインキュベーションの後に取り、２ｍｌエッペンドルフチューブ中で遠心分離によって洗浄した（１３０００ｒｐｍ、エッペンドルフ遠心機）。洗浄工程は以下の通りであった：
２×１．８ｍＬ  ＭＱ水
１×１．８ｍＬ  ＨＡｃ緩衝液
２×１．８ｍＬ  Ｔｒｉｓ緩衝液
２×１．８ｍＬ  ＰＢＳ緩衝液
最後のデカンテーションの後、７５μｌのＰＢＳ緩衝液でゲルを再懸濁して、約１：１  ＰＢＳゲルスラリーを得た。
【０１６４】
プレインキュベーション
ＮａＯＨ中でインキュベートしていない各ゲルの試料、すなわち最初の１：１  ゲル水スラリーを交換して、１：１  ＰＢＳスラリーを得た。各ゲルスラリーの１６μｌ試料を５００μｌのＣｙ５−ｈＩｇＧ溶液（Ｃｙ５標識したヒト免疫グロブリンＧ）に添加し、錫箔で覆って、室温で週末に回転して混合した。
【０１６５】
顕微鏡設定
Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を調査に使用した。顕微鏡設定は、本発明の例を使用して決定し、飽和がどのゲルでも得られないことを確認するために、ＭＳＳ  ＬＸを使用してチェックした。
【０１６６】
対物レンズ：６３ｘ／１３０  Ｇｌｙｃ  ２１Ｃ（Ｌｅｉｃａ）
レーザー：６３８ｎｍ
検出器ＰＴＭゲイン：６２９．６Ｖ
検出器オフセット：−０．８％
走査速度：４００Ｈｚ
フレームサイズ：５１２×５１２ピクセル
フレーム平均：２
反応速度実験（時間の関数としてのゲルでのｈＩｇＧの吸着）
各々ＮａＯＨでインキュベートし、洗浄した、１：１  ゲルスラリー１５μｌの試料を５００μｌのＣｙ５−ｈＩｇＧに添加し、＞３００ｍｇ  Ａｂ／ｍｌゲル未満の混合物を得た。これらの混合物を１３００ｒｐｍのＨｅｉｄｏｌｐｈシェーカーで室温でインキュベートした。所定の時間（５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０および２４０分）に、１５μｌの試料を取り出し、顕微鏡を用いて画像化した。共焦点画像を積分し、各ビーズの相対蛍光、Ｑｒｅｌを計算することによって吸着曲線を得た、式１を参照されたい。
【０１６７】
【数２】
0006987424.tif 000019
（式１）
式中、ｒｏｕｔおよびｒｉｎは、ビーズの蛍光領域の外側および内側の境界半径を示す（顕微鏡ソフトウェア、ＬＡＳ−Ｘのラインツールを用いて決定）および
【０１６８】
【数３】
0006987424.tif 000020
（式２）
式中、Ｆｒｉｎｇは、ＬＡＳ−Ｘのサークルツールを用いて決定したビーズの蛍光領域の合計蛍光である。
【０１６９】
式１と２を組み合わせると式３が得られる：
【０１７０】
【数４】
0006987424.tif 000021
（式３）。
【０１７１】
この手順は、Ａ．Ｌｊｕｎｇｌｏｆ、Ｊ．Ｔｈｏｍｍｅｓ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ８１３（１９９８）３８７−３９５に提示される研究から得られる。
【０１７２】
結果、分析および結論
１Ｍ  ＮａＯＨ中でのインキュベーション後の時間の関数として決定された分離マトリックスの相対蛍光Ｑｒｅｌを、図１１ａ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）および１１ｂ（本発明の例）として示す。基準（アルカリ処置なし、すなわち０時間）と比較して、ＭＳＳ  ＬＸ（図１１ａ）は、その最初の結合容量の約５０％を失い、１Ｍ  ＮａＯＨ中で１６時間のインキュベーションの後に、より速く飽和に達することが分かる。１Ｍ  ＮａＯＨ中で３２時間のインキュベーションの後、それはほぼ全てのＩｇ結合容量を失った。対照的に、本発明の例の分離マトリックス（図１１ｂ）は、１Ｍ  ＮａＯＨ中でのインキュベーションに安定していて、その最初の結合容量を１Ｍ  ＮａＯＨ中で３２時間のインキュベーション後も実験変動内で維持する。
【０１７３】
２Ｍ  ＮａＯＨ中でのインキュベーション後の時間の関数として決定された分離マトリックスの相対蛍光Ｑｒｅｌを、図１２ａ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）および１２ｂ（本発明の例）として示す。ＭＳＳ  ＬＸ（図１２ａ）の容量損失の速度は、２Ｍ  ＮａＯＨでのインキュベーションによって加速されることが分かる。８時間のインキュベーションの後、Ｉｇ結合容量の約５０％が失われ、２Ｍ  ＮａＯＨ中１６時間のインキュベーションの後、ほぼ全てのＩｇ結合容量が失われる。対照的に、本発明の例（図１２ｂ）はアルカリに対して比較的安定していて、２Ｍ  ＮａＯＨ中１６時間以下のインキュベーションの後にその最初の結合容量を少なくとも実験変動内で維持する。しかし、２Ｍ  ＮａＯＨ中で２４時間以上のインキュベーションの後、本発明の例は結合容量を失うこと、そして３２時間のインキュベーションの後に結合容量の約５０％が失われたことが分かる。また、結合容量が失われるので、より速く飽和に達し、３２時間インキュベートした試料で最も明白に分かる。
【０１７４】
これらの結果は、本発明の例の分離マトリックスが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸよりもはるかにアルカリ安定性が高く、大量輸送および結合容量にあまり影響を及ぼすことなく最大１６時間の２Ｍ  ＮａＯＨインキュベーションに耐えると思われることを実証する。
【実施例１３】
【０１７５】
枯草菌胞子の不活性化を、本発明による様々な洗浄液を用いて調べた。胞子形成枯草菌（ＡＴＣＣ第６６３３）は、ＮａＯＨ消毒に抵抗性のある微生物の１つであることが公知である。枯草菌のコロニーを様々な洗浄液（１Ｍ  ＮａＯＨ、２％  ＢｎＯＨを含む１Ｍ  ＮａＯＨ、および４０％  ＩＰＡを含む１Ｍ  ＮａＯＨ）でインキュベートし、様々な所定のインキュベーション時間でコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）の数を求めた。図１３は、調査の結果を、インキュベーション時間および洗浄液の関数としてのＣＦＵ／ｍｌとして示す。１Ｍ  ＮａＯＨを単独で使用することは、２４時間消毒した後でさえも、枯草菌を完全に不活性化するには不十分であることが分かる。２％ベンジルアルコールを洗浄液に添加しても、著しい改善は得られない。しかし、洗浄液として１Ｍ  ＮａＯＨを４０％イソプロピルアルコールとともに使用すると、４時間の処置後に検出可能なレベル以下まで枯草菌を減少させることができる。
［実施態様１］
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法であって、前記方法が、
ａ）所望により、前記分離マトリックスを用いて第１の免疫グロブリンを含む混合物を精製する工程と；
ｂ）少なくとも５０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液を準備する工程と；
ｃ）前記洗浄液と前記分離マトリックスを所定の接触時間の間、接触させることによって前記分離マトリックスを洗浄および／または消毒する工程と；
を含み、
前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは、配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくとも前記アスパラギン残基は、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸、例えばグルタミン酸などに変異している、方法。
［実施態様２］
前記変異体が、配列番号５１または５２の１、２、７、１０、１５、２０、２１、２４、２５、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３９、４２および４３位の１以上においてさらなる変異を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
配列番号５１または５２の１位の前記グルタミン残基がアラニンに変異している、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
配列番号５１または５２の３５位の前記アスパラギンまたはグルタミン酸残基がアラニンに変異している、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体または九量体からなる群から選択されるホモ多量体である、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、各々、前記多孔質支持体と共有結合するためのＣ末端システイン残基を含む、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様７］
前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体が、チオエーテル結合によって前記多孔質支持体に結合されている、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様８］
前記分離マトリックスが、少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、１５〜２１、１７〜２１または１８〜２０ｍｇ／ｍｌなどの、前記多孔質支持体と共有結合した前記免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様９］
前記多孔質支持体が高度に架橋されたアガロースビーズである、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１０］
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液またはその混合物、好ましくは水酸化ナトリウム溶液である、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記アルカリ金属水酸化物水溶液が、５００ｍＭ〜５Ｍ、例えば１Ｍ〜２Ｍなどのモル濃度を有する、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１２］
前記洗浄液が、Ｃ２−Ｃ７アルコール、例えばエタノール、イソプロパノールまたはベンジルアルコールなどをさらに含む、実施態様１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１３］
前記洗浄液が、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、例えば少なくとも９０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは少なくとも９９体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１４］
前記所定の接触時間が、前記分離マトリックスにおけるエンドトキシン濃度および／または微生物濃度の６−ｌｏｇ１０の減少をもたらすために十分な時間である、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１５］
前記所定の接触時間が、１０分〜５０時間、例えば３０分〜２４時間、または例えば１時間〜１２時間である、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１６］
工程ａ）〜ｃ）が少なくとも１０回、例えば少なくとも５０回または５０〜２００回繰り返される、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスによる免疫グロブリンの精製においてキャリーオーバーを防ぐ方法であって、前記アルカリ安定化プロテインＡドメインは配列番号５１または配列番号５２によって定義されるブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含み、配列番号５１または５２の１３位および４４位のアミノ酸残基はアスパラギンであり、配列番号５１または５２の３位の少なくとも前記アスパラギン残基はグルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異していて；前記方法が：
実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載の分離マトリックスを洗浄および／または消毒する前記方法の前記工程ａ）〜ｃ）を実施することにより、第１の免疫グロブリンを精製する工程ならびに前記分離マトリックスを洗浄および消毒する工程を含み；さらに、
ｄ）前記分離マトリックスを用いて第２の免疫グロブリンを含む混合物を精製する工程であって、前記第２の免疫グロブリンが前記第１の免疫グロブリンとは異なる工程を含む、方法。
［実施態様１８］
前記分離マトリックスが、工程ｃ）の後にその最初の動的結合容量の少なくとも８０％、例えばその最初の動的結合容量の少なくとも９０％などを保持する、実施態様１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１９］
多孔質支持体と共有結合した免疫グロブリン結合アルカリ安定化プロテインＡドメインの多量体を含む分離マトリックスの前記消毒のための、少なくとも７０体積％のアルカリ金属水酸化物水溶液を含む洗浄液の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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