(57)【要約】  真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化の改善剤を提供することを目的とする。真皮空洞に脂肪幹細胞を誘引することにより、その周囲の真皮線維芽細胞が活性化することで真皮空洞を改善することができる。したがって、脂肪幹細胞誘引する物質をスクリーニングしたところ、ローズマリー抽出物及びカンゾウ抽出物が、脂肪幹細胞誘引能力を有することから、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化を改善することができる。
2017022091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物を含む、脂肪幹細胞誘引剤。
【請求項２】
請求項１に記載の脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【請求項３】
請求項１に記載の脂肪幹細胞誘引剤により真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、請求項２に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【請求項４】
前記誘引された脂肪幹細胞により、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、請求項３に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【請求項５】
請求項１に記載の脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【請求項６】
請求項１に記載の脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【請求項７】
脂肪幹細胞誘引剤を含む真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤であって、当該脂肪幹細胞誘引剤が脂肪幹細胞を真皮空洞に誘引し、誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、前記皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤に関する。より具体的には、脂肪幹細胞誘引剤として、カンゾウ抽出物及び／又はローズマリー抽出物が使用される。
【背景技術】
【０００２】
組織を新しく再生することを目指す再生医学の領域において、失われた組織の機能を回復させるために、各種幹細胞の活用が試みられている。再生医学は、医療領域のみならず、毛髪再生や皮膚再生など美容領域にも応用されてきている。【０００３】
幹細胞とは、自己複製能力と分化能力とを併せ持つ細胞である。幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のように一個体を形成する全ての系統の細胞種へ分化することのできる分化万能性を有する幹細胞の他、成人の体にも、分化万能性はないが、複数系統へ分化できる分化多能性を有する成体幹細胞（造血幹細胞や、間葉系幹細胞）が存在することが知られている。【０００４】
しかしながら、胚性幹細胞は発生初期の胚からしか得ることができず、採取時の母体への危険性や倫理的な問題なども加わって、手軽に研究・臨床の場に利用することは難しく、美容領域での利用は困難である。美容領域では、成体幹細胞の利用について研究が行われているが、その存在頻度が非常に低く単離が難しく、また自己複製能力と分化能力を維持させながら大量に培養することも困難である。【０００５】
幹細胞には様々な種類が存在するものの、脂肪組織から単離される脂肪幹細胞は、遊走能力を有することが知られており（特許文献１：特表2013-507958）、種々の細胞系列へと分化することができることも知られていることから、様々な再生治療への応用が期待されている（非特許文献１：World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68）。再生治療への応用として、例えば、脂肪幹細胞が、皮膚幹細胞の活性を制御する皮膚Niche細胞として機能することで、毛包の再生に寄与することが明らかになっている（非特許文献２：Cell, (2011)146, 761-771）。また、脂肪幹細胞の皮膚直下への移植が、皮膚の創傷治癒能力を早めることができることが示されている（非特許文献３：Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24)。また、脂肪幹細胞と真皮線維芽細胞とが接触することで真皮線維芽細胞の増殖を促すことが開示されており、創傷治癒や皮膚の再生に利用可能であることが知られている（非特許文献４：Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24）。さらに、脂肪幹細胞の移植試験により、コラーゲン６型を標的とする先天性筋ジストロフィーでの治療効果が示されており、脂肪幹細胞は、筋肉再生にも利用可能であることが知られている（非特許文献５：Stem Cell Research & Theapy 2014, 5;21）。【０００６】
一方で、顔に生じる皮膚のたるみやしわは、美容における関心事である。特に、たるみはフェースラインの顎及び頬の近傍に生じ易い。たるみの原因としては、表情筋の機能低下、表情筋を支えている皮膚の弾力の低下、皮下脂肪の増大等が挙げられる(非特許文献６：Skin Research and Technology, 2009; 15; 299-305)。たるみを効果的に改善するためには、原因を特定し、それに沿った改善策を講じることが必要とされる。例えば、たるみの主原因が、表情筋の機能低下である場合、たるみを改善するためには表情筋のエクササイズが有効である。また、たるみの主原因が、皮膚の弾力低下である場合、皮膚の弾力に関わる弾性線維、例えばコラーゲンやエラスチンの産生促進剤の摂取が有効である。たるみの主原因が、皮下脂肪の増大である場合、エクササイズやカロリー制限、さらには体内脂肪を燃焼する添加剤が有効である（特許文献２：特開２００７−３３０１７８号）。これらのたるみの原因は、一つである場合は少なく、複合的であることが多い。そのため、たるみ改善を目的とする経口用組成物としては、複数の成分、例えば２種類以上のムコ多糖に、コラーゲン部分分解物とコエンザイムＱ１０を加え、これら３種の成分を有効成分とする組成物が開示されている（特許文献３：特開２００６−１４３６７１号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2013-507958号公報
【特許文献２】特開２００７−３３０１７８号公報
【特許文献３】特開２００６−１４３６７１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68
【非特許文献２】Cell, (2011)146, 761-771
【非特許文献３】Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24
【非特許文献４】Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24）
【非特許文献５】Stem Cell Research & Theapy 2014, 5;21）
【非特許文献６】Skin Research and Technology, 2009; 15; 299-305)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、皮膚のたるみを改善する薬剤の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、皮膚の老化現象、特に皮膚のたるみについて鋭意研究を行ったところ、たるみの原因の一つとして、真皮空洞化が生じることを見出した。そこで空洞化した真皮において空洞を充填することによるたるみの改善方法について鋭意研究を行ったところ、脂肪幹細胞を誘引することで、空洞の充填が可能になるとの知見を得た。さらに、脂肪幹細胞の誘引を可能にする化粧品素材をスクリーニングしたところ、カンゾウ及び/又はローズマリーの抽出物が、脂肪幹細胞を誘引することを見出し、本発明に至った。したがって、本発明は、以下に関する。【００１１】
［１］  カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物を含む、脂肪幹細胞誘引剤。
［２］  項目１に記載の脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［３］  項目１に記載の脂肪幹細胞誘引剤により真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、項目２に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［４］  前記誘引された脂肪幹細胞により、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、項目３に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［５］  項目１に記載の脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、項目２〜４のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［６］  項目１に記載の脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、項目２〜５のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［７］  脂肪幹細胞誘引剤を適用する工程を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化の改善のための美容方法。
［８］  適用された脂肪幹細胞誘引剤が真皮空洞に脂肪幹細胞を誘引し、誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、項目７に記載の美容方法。
［９］  前記真皮構造物が、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、項目８に記載の美容方法。
［１０］  適用された脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、項目７〜９のいずれか一項に記載の美容方法。
［１１］  適用された脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、項目７〜１０のいずれか一項に記載の美容方法。
［１２］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、カンゾウ抽出物及び／又はローズマリー抽出物を含む、項目７〜１１のいずれか一項に記載の美容方法。
［１３］  真皮空洞化による皮膚のたるみを患う対象において、脂肪幹細胞誘引剤を投与することを含む、皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１４］  適用された脂肪幹細胞誘引剤が真皮空洞に脂肪幹細胞を誘引し、誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、項目１３に記載の皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１５］  前記真皮構造物が、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、項目１４に記載の皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１６］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１７］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１８］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、カンゾウ抽出物及び／又はローズマリー抽出物を含む、項目１３〜１７のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善方法。
［１９］  真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善薬の製造のための、脂肪幹細胞誘引剤の使用。
［２０］  前記脂肪幹細胞誘引剤によって、真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、項目１９に記載の使用。
［２１］  前記真皮構造物が、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、項目２０に記載の使用。
［２２］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の使用。
［２３］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、項目１９〜２２のいずれか一項に記載の使用。
［２４］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、カンゾウ抽出物及び／又はローズマリー抽出物を含む、項目１９〜２３のいずれか一項に記載の使用。
［２５］  カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物を含む、脂肪幹細胞誘引剤。
［２６］  項目２５の脂肪幹細胞誘引剤を含む、間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善用組成物。
［２７］  前記間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善が、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生である、脂肪幹細胞誘引剤。
［２８］  脂肪幹細胞誘引を必要とする対象に対して、カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物を投与することを含む、脂肪幹細胞誘引方法。
［２９］  項目２８に記載の誘引方法により、間葉系幹細胞の治療標的となる症状を治療又は改善する方法。
［３０］  前記間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善が、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生を目的とする、項目２９に記載の方法。
［３０］  カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物を含む化粧料を適用することにより、脂肪幹細胞誘引による美容方法。
［３１］  発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生を目的とする、項目３０に記載の美容方法。
［３２］  脂肪幹細胞誘引のための医薬の製造のための、カンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物の使用。
［３３］  脂肪幹細胞の誘引により、間葉系幹細胞の治療標的となる疾患及び症状の治療のための、項目３２に記載の使用。
［３４］    前記間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善が、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生を目的とする、項目３３に記載の使用。
［３５］  脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［３６］  前記脂肪幹細胞誘引剤によって、真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞に起因して、真皮空洞が真皮構造物により充填される、項目３５に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［３７］  前記真皮構造物が、真皮線維芽細胞と、当該真皮線維芽細胞から産生される間質成分とを含む、項目３６に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［３８］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、付属器官を介して浸透する、項目３６又は３７に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［３９］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、真皮空洞にて作用する、項目３５〜３８のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［４０］  前記脂肪幹細胞誘引剤が、カンゾウ抽出物及び／又はローズマリー抽出物を含む、項目３５〜３９のいずれか一項に記載の皮膚のたるみ又は老化改善剤。
［４１］  脂肪幹細胞誘引剤を含む真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤であって、当該脂肪幹細胞誘引剤が脂肪幹細胞を真皮空洞に誘引し、誘引された脂肪幹細胞に起因して真皮空洞が真皮構造物により充填される、前記皮膚のたるみ又は老化改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤に用いられる脂肪幹細胞誘引剤は、真皮空洞に脂肪幹細胞を誘引することにより作用する。脂肪幹細胞は、真皮線維芽細胞の増殖や、真皮線維芽細胞による間質成分の産生を促進することができ、これにより皮膚のたるみ又は老化の原因となる真皮空洞を充填することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、若齢者及び高齢者の皮膚から取得された皮膚組織切片における真皮層の染色図である。高齢者では、皮下組織が隆起することにより真皮空洞が形成されていることが示される。
【図２】図２Aは、空洞化程度と年齢との関係を示す図である。図２Bは、皮膚物性と空洞化程度との関係を示す図である。図２Cは、たるみ程度と空洞化程度との関係を示す図である。
【図３】図３は、脂肪幹細胞の存在下及び非存在下における培養真皮線維芽細胞の変化を示す写真（図３A）及びグラフ（図３B）である。
【図４】図４は、脂肪幹細胞の存在下及び非存在下における、培養真皮線維芽細胞の数の変化を示すグラフ（図４A）、及びコラーゲンの産生量の変化を示すグラフ（図４B）である。
【図５】図５は、ローズマリー抽出物による脂肪幹細胞の誘引作用（図５A）及びカンゾウ抽出物による脂肪幹細胞の誘引作用（図５B）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、脂肪幹細胞誘引剤を含む、真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤に関する。脂肪幹細胞誘引剤とは、脂肪幹細胞を誘引することができる薬剤をいう。好ましい態様では、脂肪幹細胞誘引剤は、脂肪幹細胞を皮膚の真皮空洞に誘引することができる。
【００１５】
脂肪幹細胞とは、脂肪組織由来中間葉幹細胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)ということもでき、脂肪組織中に存在する間葉系幹細胞の一種である。脂肪幹細胞は、遊走能力を有することが知られており（非特許文献１及び特許文献１)、脂肪組織中を移動することができると考えられている。脂肪幹細胞は、ＣＤ９０マーカー、ＣＤ１０５マーカー等の発現により特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。脂肪幹細胞は、種々の細胞増殖因子又は細胞間情報伝達因子を発現しており、これらの因子は真皮線維芽細胞の増殖や真皮線維芽細胞からの間質成分、特にコラーゲンの産生を促進することができる。したがって、脂肪幹細胞が誘引されることにより、その周囲の真皮線維芽細胞は活性化される。
【００１６】
脂肪幹細胞誘引剤は、脂肪幹細胞を誘引することができれば任意の物質であってもよい。脂肪幹細胞誘引剤は、誘引効果とは別に、脂肪幹細胞の遊走及び増殖を促進することができる薬剤であってもよい。脂肪幹細胞誘引剤として、ケモカインやサイトカインなどの生体内因子や、ポリペプチド及びタンパク質などであってもよいし、低分子化合物、高分子化合物、及び抽出物などの化粧品素材や医薬品素材であってもよい。脂肪幹細胞誘引剤としては用いることができる物質として、ＳＤＦ１αが挙げられる。また、美容の目的で用いる観点から、化粧品素材が好ましく、例えばカンゾウ抽出物、ローズマリー抽出物などの植物抽出物が挙げられる。前記脂肪幹細胞誘引剤は、前記抽出物の１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができるし、既存の脂肪幹細胞誘引剤と組み合わせて使用されてもよい。
【００１７】
植物抽出物を得るために用いる抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合されてなる抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整することができる。前記抽出溶媒としては、少なくとも水を含む水含有抽出溶媒が好ましい。
【００１８】
植物抽出物を得るための抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出においては、抽出原料として各植物の抽出部位をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。抽出した後においては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。脂肪幹細胞誘引剤又は皮膚のたるみ若しくは老化改善剤は、最終製品に添加して用いられる。最終製品中に含まれる上記各抽出物の濃度は、特に限定されず、例えば、十分な脂肪幹細胞誘引効果を発揮する観点から概ね組成物に対して、抽出物を典型的には０．００１〜１０質量％の範囲、好ましくは０．００１〜１質量％の範囲、最も好ましくは０．０１〜０．５質量％の範囲で配合される。
【００１９】
ローズマリー抽出物は、地中海沿岸を原産とするシソ科の常緑低木であるローズマリー（Rosmarinus officinalis）に由来する芳香性の抽出物であり、該植物の根、葉、茎、花、植物全体を原材料として用いることができる。抽出方法は任意の方法を用いることができるが、例えばローズマリーの葉について水蒸気蒸留や溶媒抽出を行うことで抽出物を得ることができる。また溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。
【００２０】
カンゾウ抽出物は、マメ科の多年草のカンゾウ（Glycyrrhiza glabra L．または Glycyrrhiza uralensis Fisher）に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、茎、花、植物全体を原材料として用いることができる。カンゾウの根には、グリチルリチン、ブドウ糖、ショ糖などの甘味成分が含まれる。グリチルリチンは、その分解産物が生体の肝臓で有害産物と結合して解毒することでよく知られている。カンゾウ抽出物としては、カンゾウの根を原材料として抽出することが好ましく、抽出方法は任意の方法、例えば水蒸気蒸留や、溶媒抽出を行うことができる。溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。カンゾウ抽出物としては、化粧品種別配合成分規格のカンゾウ抽出末やカンゾウフラボノイド（油溶性甘草エキス）であってもよいし、局方品カンゾウ粗エキス、局方品カンゾウエキスを用いることもできる。
【００２１】
脂肪幹細胞の誘引は、in vitro及びin vivoのいずれでも確認することができる。in vitroの実験では、脂肪幹細胞誘引剤の濃度差がある培地中で脂肪幹細胞を培養して遊走を検出することで、脂肪幹細胞誘引剤の誘引効果を決定することができる。in vivoでの確認は、脂肪幹細胞誘引剤を投与した後に組織切片にて脂肪幹細胞の数又は割合を算出することで、誘引の有無を調べることができる。
【００２２】
真皮空洞とは、加齢やその他なんらかの原因により、皮下組織が部分的に真皮層側に隆起することで形成される洞をいう（図１）。真皮空洞の大きさは、おおよそ１０μｍ〜１０００μｍの直径を有する略球状であるが、その形状は一定ではない。真皮空洞内は皮下組織により充填されていることから、単に真皮洞ともいうことができる。真皮層中に含まれる細胞成分や間質成分が、真皮空洞内には含まれないことにより、皮膚の弾力が失われ、たるみが生じ、皮膚の老化に繋がる。また、真皮空洞が存在することで、真皮が部分的に菲薄化することが、皮膚のたるみ及び老化の一因でもある。実際に真皮空洞化の程度が高い程、皮膚の弾性が低く、また外観のたるみ程度が高いことが分かった（図２Ｂ、Ｃ）。
【００２３】
真皮空洞の程度は、皮膚断面において、一定の長さにおける真皮の厚さ、即ち表皮との境界から、皮下組織との境界までの厚さを積算することで計測することができる。真皮空洞が存在すると、皮下組織が真皮層側に隆起することで、真皮の厚さが低下する。通常表皮の厚さは一定であり、かつ真皮に比較して十分に薄いため、単に皮膚表面から皮下組織までの厚さを積算することで計算することもできる。真皮空洞の程度は、肌の弾性と相間しているため（図２B）、キュートメーター等の肌の弾性を測定する機器を用いて肌の弾性を示す指標、例えばＵｖ／Ｕｅ値を測定することで、代用することもできる。
【００２４】
脂肪幹細胞誘引剤により、真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞に起因とは、誘引された脂肪幹細胞が、直接又は間接的に作用することをいう。すなわち、真皮空洞に誘引された脂肪幹細胞は、様々な細胞活性化因子を分泌することにより周囲に存在する真皮線維芽細胞を間接的に活性化することができる。このようにして活性化された真皮線維芽細胞は、細胞増殖を行うとともに、間質成分の産生量が増大する。増殖した真皮線維芽細胞と、産生された間質成分とは、重層化することで真皮構造物を形成し、真皮空洞が真皮構造物によって充填される。また、脂肪幹細胞は間葉系の幹細胞であることから、真皮細胞、例えば線維芽細胞などへ分化することができ、これにより直接的に真皮空洞を改善することができる。したがって、真皮空洞に脂肪幹細胞が誘引されることで、真皮空洞が改善する。
【００２５】
真皮は、線維芽細胞、組織球、肥満細胞、形質細胞、及び樹状細胞などの細胞成分と、細胞の間を埋める間質成分とから主に構成される。間質成分は、コラーゲンから構成される膠原線維、フィブリンやエラスチンから構成される弾性線維、及び線維や細胞の間に存在する糖タンパク質やプロテオグリカンを主成分とする基質に大別される。
【００２６】
本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤は、真皮空洞による皮膚のたるみ及び/又は老化を患う対象に投与することができる。たるみの原因は、表情筋の機能低下、表情筋を支えている皮膚の弾力の低下、皮下脂肪の増大等が挙げられ、これらの原因は独立に又は協働して、たるみを引き起こし、外観の老化をもたらす。本発明では、皮膚のたるみを患う対象に投与されるが、このような対象は、たるみの主原因が、皮膚の弾力低下、特に真皮空洞による真皮層の厚さの減少に伴う皮膚の弾力低下であることが好ましい。真皮空洞が、皮膚のたるみの主原因であることを確認するために、真皮空洞化程度を測定することもできる。空洞下程度が高い対象に対し、本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤や、美容方法を適用することが好ましい。真皮空洞化程度の数値から決定された閾値に基づき、閾値を超えた対象を空洞下程度の高い対象と決定することもできる。
【００２７】
本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤は、経口又は非経口投与など、任意の経路で投与することができるが、皮膚に直接投与する観点から経皮投与が好ましい。経皮投与された脂肪幹細胞誘引剤は、皮膚に存在する毛穴や汗腺などの付属器官を介して浸透することができる。付属器官は、通常真皮層の最深部に達していることから、真皮空洞が存在する場合、その極めて近くに達している。したがって、経皮投与された脂肪幹細胞誘引剤は、付属器官を介して浸透することで作用部位である真皮空洞部に送達することができる。また、付属器官を介して、作用部位である真皮空洞部への浸透を促進するために、皮膚のたるみ又は老化改善剤は、その粘度、表面張力、親水性、疎水性を適宜選択することができる。さらに、真皮空洞への浸透を促進するために、本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤の適用後に、高周波数の振動又は音波を適用することもできる。
【００２８】
本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤は、化粧品、医薬品、又は医薬部外品に配合することができる。美容の目的では化粧品に配合することが好ましい。配合される化粧品の剤型は任意であり、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等の形態で配合して用いることができる。配合される化粧品、医薬品、又は医薬部外品としては、外用薬用製剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、除毛剤、脱毛剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、プレヘアートリートメント、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料等の頭髪化粧料、浴用剤など様々な製品に応用できる。
【００２９】
本発明の別の態様では、本発明は真皮空洞化による皮膚のたるみ又は老化改善剤をスクリーニングする方法に関してもよい。当該スクリーニング方法は、脂肪幹細胞を試験物質の濃度差のある培地中で培養することにより、試験物質の誘引能力を検討することができる。より具体的には、細胞培養細胞が通過できる程度の直径を有する１又は複数の流路を設け、流路の一方の出入り口に細胞培養ウェルを配置し、もう一方に試験物質添加ウェルを配置する構成を取る細胞遊走試験ウェルを用いることができる。流路は一定の孔径を有する膜により置き換えることもできる。スクリーニングに用いる試験物質薬剤は任意の薬剤を用いることができるが、化粧用品の開発のためには、既に安全性が確認できている化粧品素材ライブラリーから試験物質を選択することができる。
【００３０】
上記スクリーニングにより、得られたカンゾウ抽出物又はローズマリー抽出物は、脂肪幹細胞誘引活性を有しており、脂肪幹細胞誘因剤又は組成物として使用することができる。脂肪幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、及び神経細胞等の種々の間葉系細胞へと分化することが知られている間葉系幹細胞である（非特許文献１）。この非特許文献１には、脂肪幹細胞由来の軟骨細胞が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等の治療に用いることができること、脂肪幹細胞由来の骨芽細胞が、骨欠損箇所に適用できること、心筋や血管細胞へと分化することで心機能の改善に寄与することが開示されている。さらに、脂肪幹細胞からの分泌因子により、血管新生の亢進、細胞アポトーシスの減少、及び神経発芽の促進が生じることから、脂肪幹細胞が標的細胞に分化する直接的な再生医療への応用の他に、分泌因子を介した間接的な再生医療への応用が期待されている。したがって、本発明の脂肪幹細胞誘引組成物は、間葉系幹細胞、特に脂肪幹細胞の治療標的となる症状を治療又は改善するために用いることができる。間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善として、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生が挙げられる。これらうち、脂肪幹細胞と発毛促進との関係については、非特許文献２に、皮膚幹細胞の活性を制御する皮膚Niche細胞として機能することで、毛包の再生に寄与することが明らかになっており、脂肪幹細胞の誘引により発毛促進を可能にすることが開示されている。また、脂肪幹細胞と創傷治癒及び/又は皮膚の再生との関係については、非特許文献３に、脂肪幹細胞と真皮線維芽細胞とが接触することで真皮線維芽細胞の増殖を促すことが開示されており、創傷治癒や皮膚の再生に利用可能であることが知られている。さらに、脂肪幹細胞と筋肉再生との下案啓については、非特許文献４に脂肪幹細胞の移植試験により、コラーゲン６型を標的とする先天性筋ジストロフィーでの治療効果が示されており、脂肪幹細胞は、筋肉再生にも利用可能であることが開示されている。
【実施例】
【００３１】
真皮空洞化の検出
若齢及び高齢の被験者の女性腹部から皮膚組織切片を取得し、ヘマトキシリン-エオジン染色に供した。ヘマトキシリン・エオジン染色用試薬を、常法に則って行い、染色された組織を顕微鏡下で観察した（図１）。若齢者の皮膚組織切片では、真皮組織と皮下組織との境界が平滑であった一方で、高齢者の皮膚組織切片では真皮組織と皮下組織との境界が乱れており、皮下組織の一部が隆起することで真皮空洞が形成していた。【００３２】
皮膚のたるみの計測
ボディマス指数（ＢＭＩ）２５未満の標準体型を有する３０〜５０代の３０名の健常女性被験者（国籍：日本国）に対し試験を行った。被験者は、洗顔を行い、標準的な環境下に順応させた。標準光条件下で、デジタルカメラ(Nikon D-100; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)で、着席状態で、左右４５°の角度から顔の写真を撮影した。上頬のたるみ重篤度を、写真に基づく６グレードの評価基準に基づく既報の方法（Ezure T, Hosoi J, Amano S, Tsuchiya T. Skin Res Technol. 2009 Aug;15(3):299-305.)に従い評価した。【００３３】
真皮空洞化の観察
真皮層の内部構造を、超音波検査法を用いて非侵襲的に観察した。キュートメーターによる計測箇所と同じ箇所を同じ体位で測定した。１３MHzのプローブであるProsound alpha 5 (Aloka Co., Ltd., Tokyo, Japan)を、超音波ゲルの薄層で被膜した皮膚に対して垂直に適用し、そしてBモードを用いて皮膚構造を測定した。Image Jを用い、表皮からの脂肪層までの最短の距離を計測し、正負を逆転させた値（mm）を真皮空洞化の程度とした。【００３４】
真皮弾性の計測
真皮の弾性を、吸引と解放の際の皮膚の変形と回復の計測に基づく非侵襲性皮膚弾性計測器(Cutometer MPA 580（登録商標）, Courage & Khazaka, Cologne, Germany)で真皮弾性を評価した。大直径（6mm）の吸引プローブを用いた。被験者をベッドに横たえ、そして真皮弾性の計測の際に重力の影響を低下させるために、４５°の角度で顔を傾けた。計測点は、上頬の中心にセットした。皮膚吸引を４００ｍｂａｒの圧力で２秒間行い、続いて２秒間の弛緩期とし、Ｕｅ（immediate distension of the skin, representing elastic deformation）、Ｕｖ（viscoelastic creep occurring after the elastic deformation）、Ｕｆ（final distension at the end of the vacuum period, representing the total extensibility of the skin）、Ｕｒ（(the immediate retraction of the skin meaning elastic deformation recovery）を皮膚変形曲線から得た。Ｕｖ／Ｕｅ（ratio of viscoelastic to elastic distention）値を計算し、皮膚物性とした(Skin Research and Technology 2010; 16: 332-338, Skin Research and Technology 2012; 18: 259-264)。【００３５】
上で決定された空洞化程度、皮膚物性、年齢、及びたるみ程度について、年齢と空洞化程度との関係を図２（Ａ）に示し、空洞化程度と皮膚物性との関係を図２（Ｂ）に示し、空洞化程度とたるみ程度との関係を図２（Ｃ）に示した。図２Ａの年齢と空洞化程度との関係、及び図２（Ｂ）の空洞化程度と皮膚物性との関係について、ピアソン検定を行った。また、図２（Ｃ）の空洞化程度とたるみ程度との関係について、スピアマン検定を行った。【００３６】
脂肪幹細胞の真皮線維芽細胞活性化試験
真皮線維芽細胞はLonzaより購入し、10%FBSを含むDMEMにて培養した。脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）はInvitrogenより購入し、MessenPro RS medium培地にて培養した。真皮線維芽細胞を1×104cells/ wellとなるようにトランスウェル(trans well for 6 well plate：Falcon)の上層に播種した。ＡＤＳＣは10μg/mL マイトマイシンで3時間処理後、2×105cells/ wellとなるようにトランスウェル(trans well for 6 well plate)の下層に播種した。24時間後に培地を10%FBS、250uMアスコルビン酸を含むDMEMに交換し、共培養を開始した。7日後に上層をパラホルムアルデヒドにて固定し、ＨＥ染色を行い観察した（図３Ａ）。上層の厚みを計測して示した（図３Ｂ）。対照群としてＡＤＳＣ無しで線維芽細胞単独で培養を行った。ＡＤＳＣ存在下では、真皮線維芽細胞が活性化し、真皮層の厚みが増大した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。【００３７】
真皮線維芽細胞はLonzaより購入し、10%FBSを含むDMEMにて培養した。脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）はInvitrogenより購入し、MessenPro RS medium培地にて培養した。真皮線維芽細胞を1×105cells/ wellとなるようにトランスウェル(trans well for 6 well plate：Falcon)の上層に播種した。ＡＤＳＣは10μg/mL マイトマイシンで3時間処理後、2×105cells/ wellとなるようにトランスウェル(trans well for 6 well plate)の下層に播種した。24時間後に培地を10%FBS、250uMアスコルビン酸を含むDMEMに交換し、共培養を開始した。４８時間後に細胞を回収し、ＲＴ-ＰＣＲ及びＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイに供した。ＲＴ-ＰＣＲは、Light cyclerキット(Roche)を製品説明書に従って用いて逆転写を行い、下記のプライマーを用いて定量した（図４Ｂ）。また、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイでは、AlamarBlue (Bio-Rad Company)を、製品説明書に従って用いて、生細胞数を測定した（図４Ａ）。ＡＤＳＣの存在下では、生細胞数が増加する（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）とともに、コラーゲン（COL1A1）の発現量も増加した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。
【表１】
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【００３８】
脂肪幹細胞の誘引試験
脂肪由来幹細胞（Invitrogen (Carlsbad, CA))を、MessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))を含むフラスコ中で、３７℃５％ＣＯ2加湿下で培養した。サブコンフルエントになった際にAccutase（PAA (Linz, Austria)）を用いて細胞を回収し、そして２μMのPKH６７（Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)）を用いて製品説明書に従い標識化した。３×１０4標識細胞／wellを２４well Fluoroblok plate(Becton Dickinson (Mountain View, CA))の上部ウェルに播種した。６時間のインキュベーション後に、培地をサプリメントを伴わないMessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))に置き換えた。インキュベーションを１２時間続け、試験物質をFluoroblokの下部ウェルに０．１％の濃度で加えた。８時間後、Fluorobolok膜の下側を、蛍光フィルターを備えた顕微鏡を通して写真を撮り、膜を通して誘引された細胞を、Image J. を用いて孔サイズよりも大きい蛍光領域として計数した。脂肪由来幹細胞の誘引活性は、対照ウェルでの蛍光値と、試験ウェルでの蛍光値との比較により評価した。【００３９】
試験抽出物として、多数の化粧品素材をスクリーニングに供したところ、その中で、ローズマリー（Rosemarinus Officinalis)の葉抽出物（丸善製薬、商品コード：6435、抽出溶媒：５０％（w／ｖ）のブチレングリコール）及びカンゾウ（Glycyrrhiza Glabra）根抽出物（丸善製薬、商品コード：9488、抽出溶媒：５０％（w／ｖ）のブチレングリコール）が、優れた脂肪幹細胞誘因活性を有することが示された。ローズマリー抽出物及びカンゾウ抽出物を添加したウェルは、抽出物を伴わず、抽出溶媒のみを含む対照ウェルと比較して有意に高い蛍光を示した（表１、図５Ａ及びＢ、スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。ローズマリー抽出物及びカンゾウ抽出物の場合、その抽出溶媒は、５０％（w／ｖ）のブチレングリコールであり、試験抽出物の代わりにこの溶媒のみを対照ウェルに加えた。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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