(57)【要約】  変異体によって生体内での作用が異なるタンパク質が多数存在する。生体内でのタンパク質の作用をより正確に把握するために、サンプル中のタンパク質を定量するにあたり、存在し得る各変異体の量をそれぞれ測定することが必要とされる。  2以上の変異体を有するタンパク質の各変異体を質量分析で並行して定量する方法であって、サンプル中のタンパク質をプロテアーゼ消化し、前記プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドを、分離することなく質量分析によって検出し、その結果に基づいてサンプル中の各変異体の量を決定することを含む、前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2以上の変異体を有するタンパク質の各変異体を質量分析で並行して定量する方法であって、
サンプル中のタンパク質をプロテアーゼ消化し、
前記プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの2種以上を質量分析によって検出し、
前記質量分析の結果に基づいてサンプル中の各変異体の量を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドを更に検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異体が前記タンパク質のスプライシングバリアントである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（VEGF）-Aである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記変異体が、以下のVEGF-Aのスプライシングバリアント：206（配列番号１）、189（配列番号２）、183（配列番号３）、165（配列番号４）、148（配列番号５）、145（配列番号６）、121（配列番号７）、165b（配列番号８）、121b（配列番号９）、及び111（配列番号１０）から選択される2種以上を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上を検出する、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）を用いて実施するために使用するキットであって、
プロテアーゼと、
前記タンパク質と前記プロテアーゼとを接触させて前記タンパク質を消化するための反応容器と、
前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記各変異体に特有のアミノ酸配列を有する１以上の内部標準ペプチドと、
を含む、上記キット。
【請求項８】
更に各変異体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを内部標準ペプチドとして含む、請求項７又は８記載のキット。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの1以上についての、親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、及び三連四重極のそれぞれにおける電圧のデータを含む、上記記録媒体。
【請求項１１】
請求項１０記載の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるタンパク質変異体の並行的検出のためのメソッドパッケージ。
【請求項１２】
前記データが、配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上に対するものである、請求項１０記載の記録媒体又は請求項１１記載のメソッドパッケージ。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質変異体の並行的定量方法に関し、より詳細には、サンプル中に混在し得るタンパク質変異体を分離することなく質量分析によって同時に検出及び定量することを可能とする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な組織と同様に、がんの増殖過程においても栄養素の供給は必須であり、同時に増殖過程で生成する老廃物の排出も重要である。そのため、がんは増殖が進むと、自己組織内に新たな血管を引き込み、その生存を図ろうとする。血管を引き込むためには、血管の成長を促す必要があるため、がん組織は自ら血管の成長因子を産生し、新たな血管を引き込む。このようにして、栄養素の供給と老廃物の排出経路を確保することで、さらなるがん組織の増殖が可能となる。このような成長因子として、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）が代表的な因子である。【０００３】
がんの化学療法において、この成長因子の作用を阻害し、新生血管の生成を抑えることで、がんの兵糧攻めを行う戦略がとられている。例えば、モノクローナル抗体であるベバシズマブ（商品名アバスチン）は、VEGFファミリーに属するVEGF-Aを中和することで抗がん効果を発揮する抗体医薬である。ベバシズマブは、VEGFの受容体結合部位に結合することで、VEGFと受容体との結合を競合的に阻害し、VEGFによる受容体の活性化を阻害する。また、低分子化合物の分子標的薬として、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するソラフェニブやスニチニブ等が知られている。【０００４】
VEGF-Aは1980年代に発見された成長因子であり、現在では、エクソンの組み合わせから様々なスプライシングバリアントが存在することが解っている（非特許文献１〜４）。それぞれ8つのエクソンの組み合わせ及び3’領域のスプライシングサイトの相違により、数多くのスプライシングバリアントが産生される。バリアントは、第８部位エクソンの近位のスプライス部位（Proximal splicing site（PSS））でスプライシングされたものがVEGF-Axxx、遠位のスプライス部位（Distal splicing site（DSS））でスプライシングされたものがVEGF-Axxxbと表され、主に、VEGF-A206、VEGF-A189、VEGF-A183、VEGF-A165、VEGF-A148、VEGF-A145、VEGF-A121、VEGF-A189b、VEGF-A183b、VEGF-A165b、VEGF-A145b、及びVEGF-A121bと呼ばれるバリアントが存在するとされている。このうちVEGF-Axxx型のバリアントは血管新生促進作用、VEGF-Axxxb型のバリアントは逆に血管新生抑制作用があるとされ、これらのバリアント発現が絶妙なバランスを保つことで、生体の血管増殖、新生血管の産生が制御されている。【０００５】
選択的スプライシングによるバリアントの生成は、約70％程度は遺伝子発現制御により決定される一方で、がん等の疾患の進行に伴い、スプライシングが制御されているという報告もされている。つまり、血管新生促進作用に伴うバリアント発現制御と、細胞の悪性化に伴う分子スイッチによるバリアント発現機構があるということである。【０００６】
タンパク質の定量のための最も一般的な技術はELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）である。これは測定対象のタンパク質に対する抗体を作製し、さらに検出用抗体でサンドイッチすることで、簡便に測定対象分子を定量する技術である。VEGF-Aを定量するための固相ELISAキットとして、例えばR&D systems社のHuman VEGF Quantikine ELISA Kit（http://www.rndsystems.com/Products/DVE00）が使用可能であり、これによると、測定範囲は15.6-1,000 pg/mL（細胞培養上清）、31.2-2,000 pg/mL（血清又は血漿）と記載されている。その他にもELISAキットは多数市販されている（IBL、フナコシ、シグマ、Pierce、ライフテクノロジーズなど）が、これらは全VEGF-A量を定量するキット、もしくは、一部のバリアントを定量できるキットとなっている。VEGF-A 165、VEGF-A 121、VEGF-A 110を同時に測定する3-ELISA systemというマルチプレックスELISAも開発されている（非特許文献５）。【０００７】
また、VEGF-Aの他にも、スプライシングバリアントが存在するタンパク質は種々知られている。更に、例えばヒトB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）は、32個のアミノ酸からなるペプチドであるが、プロセシングされたバリアントが血中に存在し、その混在するバリアントの比率が虚血性心疾患治療後のバイオマーカーとなり得ることが知られている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Harper, S. J. et al., VEGF-A splicing: the key to anti-angiogenic therapeutics?, Nat Rev Cancer, 2008
【非特許文献２】Nowak, D. G. et al., Expression of pro- and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors, J Cell Sci, 2008
【非特許文献３】Rennel, E. S. et al., VEGF121b, a new member of the VEGF(xxx)b family of VEGF-A splice isoforms, inhibits neovascularisation and tumour growth in vivo, Br J Cancer, 2009
【非特許文献４】Woolard, J. et al., VEGF165b, an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant: mechanism of action, in vivo effect on angiogenesis and endogenous protein expression, Cancer Res, 2004
【非特許文献５】Gutierrez, J. et al., A new ELISA for use in a 3-ELISA system to assess concentrations of VEGF splice variants and VEGF(110) in ovarian cancer tumors, Clin Chem, 2008
【非特許文献６】Fujimoto, H. et al., Processed B-Type Natriuretic Peptide Is a Biomarker of Postinterventional Restenosis in Ischemic Heart Disease
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ELISAには、測定対象を直接測定していないため、異常値が出る場合があること、また測定対象ごとに抗体を作製する必要があり、時間やコストがかかること、複数の解析対象を同時に測定できないことなど、多くの課題が存在する。【００１０】
また、例えばVEGF-Aはシステインノットタンパク質という複雑かつ特徴的な構造をもつタンパク質であるため、VEGF-Aそのものの抗体は作製が容易で数多く存在するが、それぞれのバリアントに特異的な高親和性抗体を作製することは極めて困難である。そのため、バリアントを定量可能な抗体であっても、非特異的な結合を十分抑制できず、データのばらつきが増えることが想定される。【００１１】
動物試験フェーズで採用されたELISAの分析条件では、種間交差の問題等からそのまま大型動物やヒトには応用できない場合も多い。従って、創薬開発段階とヒト臨床試験では別々の測定条件で比較せざるを得ない。また、病変組織中の薬剤濃度のELISAでは、検出を阻害するマトリックス成分が異なるため、ELISAベースで薬物動態を行うためには複数の抗体の作製が必要となる。このことは、医薬品開発の上での膨大なコストや後期開発におけるドロップアウトなど、非常に大きなリスクをはらんでいる。【００１２】
更に、モノクローナル抗体は非常に高価な医薬であるため、その使用は薬効が期待される場合に限られるべきであり、患者への投与に先立って、その薬効が予測できることが望ましい。しかしながら、上述した通り、ベバシズマブの抗がん作用はVEGF-Aに結合することで発揮されるVEGF-Aの中和活性により血管新生を阻害するものであるが、このVEGF-A結合部位は、血管新生に対して促進及び抑制効果をもつバリアントが等しく有しているため、治療対象の患者由来のサンプルでVEGF-Aの全量を測定することは、予測される薬効を正確に反映するものとはならない。このことは、バリアントによって生体内での作用が異なる他のタンパク質でも同様である。【００１３】
上記の理由等から、生体内でのタンパク質の作用をより正確に把握するために、サンプル中のタンパク質を定量するにあたり、存在し得る各バリアントの量をそれぞれ測定することが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
質量分析を用いたタンパク質の定量および構造解析は、質量分析技術やデータ解析サーバ・ソフトウェアの発展と共に、飛躍的にその応用範囲を広げている。特に、質量分析を用いた絶対定量技術は、特異的抗体に依存しない方法として、認知度が高まっている。本発明者等は、タンパク質のバリアントを質量分析によって同時に定量する可能性を検討した。【００１５】
例として、VEGF-Aの全バリアントを一斉に定量することを可能とするために、各バリアントからプロテアーゼ消化で得られるペプチド断片を設計した。そして、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドを選択することで、それらを質量分析にて並行して検出し、バリアントの一斉定量解析を可能とする分析条件を開発することができた。本発明者等の開発した方法は、VEGF-Aに限らず、2以上の変異体を有するタンパク質に同様に適用可能な方法である。【００１６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）  2以上の変異体を有するタンパク質の各変異体を質量分析で並行して定量する方法であって、
サンプル中のタンパク質をプロテアーゼ消化し、
前記プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの2種以上を質量分析によって検出し、
前記質量分析の結果に基づいてサンプル中の各変異体の量を決定する
ことを含む、前記方法。
（２）  2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドを更に検出することを含む、上記（１）記載の方法。
（３）  変異体が前記タンパク質のスプライシングバリアントである、上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）  前記タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（VEGF）-Aである、上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）  前記変異体が、以下のVEGF-Aのスプライシングバリアント：206（配列番号１）、189（配列番号２）、183（配列番号３）、165（配列番号４）、148（配列番号５）、145（配列番号６）、121（配列番号７）、165b（配列番号８）、121b（配列番号９）、及び111（配列番号１０）から選択される2種以上を含む、上記（４）記載の方法。
（６）  配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上を検出する、上記（４）又は（５）記載の方法。
（７）  上記（１）〜（６）のいずれか記載の方法を高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）を用いて実施するために使用するキットであって、
プロテアーゼと、
前記タンパク質と前記プロテアーゼとを接触させてタンパク質を消化するための反応容器と、
前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記各変異体に特有のアミノ酸配列を有する１以上の内部標準ペプチドと、
を含む、上記キット。
（８）  更に各変異体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含む、上記（７）記載のキット。
（９）  配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを内部標準ペプチドとして含む、上記（７）又は（８）記載のキット。
（１０）  上記（１）〜（６）のいずれか記載の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの1以上についての、親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、及び三連四重極のそれぞれにおける電圧のデータを含む、上記記録媒体。
（１１）  上記（１０）記載の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるタンパク質変異体の並行的検出のためのメソッドパッケージ。
（１２）  前記データが、配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上に対するものである、上記（１０）記載の記録媒体又は（１１）記載のメソッドパッケージ。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-153656号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、サンプル中に混在し、作用が異なる変異体の量を一斉に検出することができ、従来ELISAを使用した場合には部分的にのみ得られていた情報をまとめて取得することが可能となった。【００１９】
例えば、VEGF-Aの質量分析定量における最適化条件を設定することで、VEGF-Aバリアントの一斉定量が可能となる。各バリアントの正確な検出・定量により、個々のがん患者の状態が、どの程度血管新生促進作用、もしくは血管新生抑制作用に暴露されたがんであるのかを把握することができ、がんの増殖性を規定することで、より有効な投薬戦略を立てることが可能になる。すなわち、増殖性の高いがんである場合には、抗体で中和することを基本とする化学療法が第一優先かつ最大薬効を得る投薬法となり得る。一方、増殖性はあまり高くないと判断された場合、低分子抗がん剤や放射線治療を優先することが良いことになる。従って、個々の患者に応じた抗がん治療を提供することができる。【００２０】
成長因子、サイトカインなどの機能性タンパク質において、それぞれ機能の異なる変異体を有するものが数多く存在する。例えば薬効を知るための免疫モニタリングにおいても、複数のサイトカインのバリアントを一斉に定量することで、現在の薬効指標を策定することが可能となる。【００２１】
更に、基礎研究分野においても、成長因子などホルモン分子のバリアントの一斉定量値と、生物学的機能との相関解析をすることで、各バリアントの活性指標を見ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】VEGFAバリアントの配列アライメントを示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】ペプチドP09（配列番号１９）の予備的MS分析及びQ3スキャン分析の結果を示す。
【図２−２】ペプチドP09（配列番号１９）のMS2分析結果及び選択されたプリカーサーイオンの分析で得られる予想プロダクトイオン及び検出されたプロダクトイオンの各ピークを示す。
【図２−３】ペプチドP09（配列番号１９）の分析のために使用するプロダクトイオンの検出のための衝突エネルギーの最適化条件の検討結果を示す（LCMS-8040を使用した場合）。
【図２−４】ペプチドP09（配列番号１９）の分析のために使用するプロダクトイオンの検出のための衝突エネルギーの最適化条件の検討結果を示す（LCMS-8050を使用した場合）。
【図２−５】最適化条件においてy(2)、y(3)、y(4)、y(5)イオンを検出することによってペプチドP09（配列番号１９）を定量した結果を示す。
【図３−１】ペプチドP14（配列番号２４）の予備的MS分析及びQ3スキャン分析の結果を示す。
【図３−２】ペプチドP14（配列番号２４）のMS2分析結果及び選択されたプリカーサーイオンの分析で得られる予想プロダクトイオン及び検出されたプロダクトイオンの各ピークを示す。
【図３−３】ペプチドP14（配列番号２４）の分析のために使用するプロダクトイオンの検出のための衝突エネルギーの最適化条件の検討結果を示す（LCMS-8050を使用した場合）。
【図３−４】ペプチドP14（配列番号２４）の分析のために使用するプロダクトイオンの検出のための衝突エネルギーの最適化条件の検討結果を示す（LCMS-8050を使用した場合）。
【図３−５】ペプチドP14（配列番号２４）のMS2分析結果及び選択されたプリカーサーイオンの分析で得られる予想プロダクトイオン及び検出されたプロダクトイオンの各ピークを示す。
【図３−６】ペプチドP14（配列番号２４）の分析のために使用するプロダクトイオンの検出のための衝突エネルギーの最適化条件の検討結果を示す（LCMS-8050を使用した場合）。
【図３−７】最適化条件においてy(2)、y(3)、y(4)、y(5)イオンを検出することによってペプチドP14（配列番号２４）を定量した結果を示す。
【図４】ペプチドP01〜P16の同時定量のために好適な分析条件の一例を示す。
【図５】ペプチドP01〜P16の同時定量の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［変異体の定量方法］
本発明は、2以上の変異体を有するタンパク質の各変異体を質量分析で並行して定量する方法であって、
サンプル中のタンパク質をプロテアーゼ消化し、
前記プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの2種以上を質量分析によって検出し、
前記質量分析の結果に基づいてサンプル中の各変異体の量を決定する
ことを含む、前記方法を提供する。
【００２４】
ここで、タンパク質の「変異体」とは、あるアミノ酸配列を有するタンパク質の一部に対して欠失、置換、付加等による相違を生じた異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をいい、当分野において通常「変異体」、「変異型」又は「バリアント」と呼ばれるものを含む。変異体は、天然に生じるものであっても人工的に作製されたものであっても良い。
【００２５】
本発明においては、2以上の変異体が同一のサンプル中に混在する場合を想定する。従って、本発明の方法は、サンプル中に「野生型」とは異なる「変異型」タンパク質のみが含まれる場合に、その「変異体（変異型）」を検出することを含むものではない。
【００２６】
変異体として、例えばスプライシングバリアントが挙げられる。スプライシングバリアントは、当分野で良く知られているように、真核生物のDNAからの転写において生成した一次転写産物（pre-mRNA）からエクソンが連結されてmRNAが生じる際に、異なる部位でのスプライシング及び異なるエクソンの選択等によって、複数種の異なる配列を有するmRNAが生じ、それぞれから異なるタンパク質が翻訳されたものを意味する。これらは同じタンパク質における「アイソフォーム」と記載される場合もある。本明細書においては、生じ得る全てのタンパク質を「変異体」又は「バリアント」と記載する。また、翻訳によって生じたタンパク質がその後にプロセシング等によって修飾を受けた場合、切断された場合には、その修飾産物及び切断産物がサンプル中に混在し得る限りにおいて、本発明の方法によって検出する対象の「変異体」又は「バリアント」に含めるものとする。
【００２７】
尚、「サンプル」とは、特定のタンパク質が存在することが想定される、被験者から採取したサンプルであって、例えば血液（全血、血清又は血漿）、唾液、胸水、腹水等の体液、組織由来のサンプル等であり得る。サンプルには、必要に応じて添加された試薬が含まれ得る。分析対象のタンパク質を血液等のサンプルから効率的に取得するために、例えばそのタンパク質に特異的な抗体を用いても良い。例えばタンパク質がVEGF-Aの場合には、ベバシズマブ等の抗-VEGF-A抗体を用い、患者血清から全VEGF-Aを免疫沈降により回収し、その中に含まれるVEGF-Aバリアントの割合を定量することができる。VEGF-Aと抗体複合体は、還元アルキル化後にプロテアーゼ消化することで、LCMS分析に供することができる。
【００２８】
本発明の方法によって検出する対象となるペプチドは、プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２９】
本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼは、質量分析による定量又は同定の対象となるタンパク質の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされず、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ（Lys-C）、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ（Asp-N）、ArgCプロテアーゼ（Arg-C）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼなどが挙げられる。プロテアーゼは２種以上を組み合わせて用いることもできる。より好適には、本発明において用いるプロテアーゼとして、トリプシン、Lys-C、Glu-C、Asp-N、キモトリプシン等が挙げられる。
【００３０】
上記プロテアーゼの中でも、本発明においては、トリプシンが特に好ましく用いられる。トリプシンは基質特異性が高く、また切断後のペプチドのC末端にLys又はArgがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のためのサンプルの作製のために特に好適である。本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
【００３１】
プロテアーゼは、必要に応じて、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等等の支持体上に固定化して使用することもできる。質量分析のためのプロテアーゼ消化の手順は、当分野において通常行われているものであり、当業者であれば、詳細な反応条件を適宜決定することができる。
【００３２】
本発明の方法は、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドを検出することで、サンプル中の各変異体の存在及び量を決定することを可能にするものである。本明細書における「各変異体に特有のアミノ酸配列」とは、一部の変異体に存在し、他の変異体には存在しないアミノ酸配列を意味する。従って、「各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチド」は、あるタンパク質の1種又は複数種の一部の変異体のプロテアーゼ消化によって得られ、その存在に基づいてその1種又は複数種の一部の変異体の定量を可能とするペプチドを意味する。特に、1種の変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドについて、本明細書において「〜のみに特有のアミノ酸配列を有するペプチド」と記載する場合がある。
【００３３】
各変異体は、「特有のアミノ酸配列を有するペプチド」を1種含んでいるか、あるいは2種以上含み得る。タンパク質によって、ある変異体の存在及び量を特定するために2種以上のそのようなペプチドの検出が必要となる場合も生じ得る。
【００３４】
本発明の方法は、これに加えて、2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドを更に検出することを含んでいても良い。このようなペプチドは、サンプル中に存在する全ての変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。このようなペプチドも検出することにより、分析から得られる情報量が多くなり、検出結果の信頼性が更に高くなり得る。各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドに加えて、2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドを検出することで、意図するタンパク質が確実に測定できていることが確認できると共に、各変異体の定量が可能となる。更に、タンパク質の全量も定量できるため、変異体間で共通するアミノ酸配列を有するペプチドを定量することは非常に重要である。
【００３５】
一部の変異体は、それ自体は「特有のアミノ酸配列を有するペプチド」を含まない場合があり得る。例えば、あるタンパク質（変異体）の一部が欠失した変異体を生じる場合には、その欠失変異体は「特有のアミノ酸配列を有するペプチド」を含まない場合がある。その場合、それ以外の変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチド、および2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドの検出結果に基づいて、「特有のアミノ酸配列を有するペプチド」を含まない上記変異体の定量が可能となる。尚、様々な変異体が共存する場合等に、ある変異体のプロテアーゼ消化によって得られる複数種のペプチドの全てがいずれかの他の変異体と共通して含まれるペプチドである場合があり得る。その場合、本明細書において、それらのペプチドを識別するために、「（全ての）変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチド」及び「（複数種の）変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチド」と記載することとする。
【００３６】
例えばVEGF-Aのスプライシングバリアントの同時定量の場合、各バリアントに特有のアミノ酸配列を有するペプチドに加えて、バリアント間で共通のアミノ酸配列を有するペプチドを検出することで、VEGF-Aを確実に測定できているという証拠と、そのうちの各変異体の量等の情報を取得することができ、更に全VEGF-A量も参照できる。
【００３７】
本発明の方法は、プロテアーゼ消化されたペプチドの2種以上を質量分析に供する。プロテアーゼ消化されたペプチドが混在するサンプルは、例えばSDS-PAGE等で分離することなく、そのまま質量分析にかけることができる。しかしながら、必要に応じて、使用したプロテアーゼ等の除去を行うことができる。
［質量分析］
本発明の方法は、上記で得られた2種以上のペプチドを含むサンプルを、質量分析により分析することで、複数の変異体の同定や定量を同時に並行して行い得る。質量分析は、好ましくは、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）を用いる。
【００３８】
ペプチド断片の分離をより確実として、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前のサンプルを、液体クロマトグラフ（LC）により、分離・濃縮する。LCによりサンプルの分離を行う場合、LCからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供しても良い。LCとタンデム質量分析を組み合わせたLC/MS/MSやLC/MSnにより分析を行うこともできる。また、LCからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。LCのカラムは特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるC30、C18、C8、C4等の逆相カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。
【００３９】
質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいてサンプル中のペプチド断片の濃度を決定できる。分析に際しては、必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、サンプルを分析に用いてもよい。
【００４０】
質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、電界脱離（FD）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を採用し得る。イオン化されたサンプルの分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（IT）型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析を行うこともできる。
【００４１】
本発明の方法の使用において適した装置は、特に限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、及びLCMS-8060（いずれも島津製作所）、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF（島津製作所）を挙げることができる。
【００４２】
質量分析結果に基づいて、タンパク質を同定するために、既存のデータベースを用いることもできる。例えば、Mascot検索（Matrix Science社）を利用して、質量分析で得られたスペクトル情報から、想定される親イオンやフラグメントイオン系列の帰属を自動で行うことで、タンパク質候補の同定等、様々な情報を取得することができる。
【００４３】
また、多段階の質量分析等により、ペプチド断片のアミノ酸配列を特定することにより、タンパク質を同定することもできる。ある変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチド断片が検出できれば、目的の変異体を同定・定量することができる。
【００４４】
なお、検出対象のペプチドは、アミノ酸残基数が５〜３０程度のものが好ましく、７〜２５程度がより好ましい。アミノ酸残基数が過度に小さいと、カラム保持能が弱く精製が困難となったり、夾雑物や同一タンパク質の別の部位に由来するペプチド断片との区別がつき難く、誤検出等の原因となり得る。また、アミノ酸残基数が過度に大きいと、回収率の不安定化やイオン化が困難となる等の理由により、検出が困難となったり、定量性が低下する場合がある。
【００４５】
各変異体の濃度を定量する場合、検出されたペプチド断片イオン（多段階MSの場合は、親イオンの開裂により得られたフラグメントイオン）のピーク面積やピーク強度に基づいて、各変異体の量を算出できる。例えば、予め求められた検量線（校正曲線）とピーク面積との関連付けや、サンプル中に添加された内部標準に由来するピーク面積とサンプル由来のピーク面積との関連付け等によって、サンプル中のペプチド断片の濃度が算出され、ペプチド断片濃度に基づいて、各変異体の量や濃度が算出される。
【００４６】
各変異体の検出のためには、数ミリ秒〜数十ミリ秒の範囲の測定時間で各変異体の測定を行い、チャンネルを切り替えながら連続的に分析を行うことができる。これにより、サンプル中のあるタンパク質の定量および各変異体の存在比の決定等を目的として、サンプル中に存在し得る変異体を一斉に定量することができる。質量分析による検出は迅速かつ正確であり、短時間で非常に多くの情報量が得られる。本発明の方法によって並行して定量可能な変異体の数は、特に限定するものではないが、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上であり、10種以上、15種以上、あるいは20種以上であり得る。
［VEGF-Aバリアント］
本発明の好ましい一実施形態は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）-Aのスプライシングバリアントを検出・定量する方法である。
【００４７】
VEGF-Aは、約10種のスプライシングバリアントの存在が知られており、個々のヒト体内で存在するバリアントの混合物全体のバランスによって作用が決定されると考えられている。
【００４８】
VEGF-Aバリアントの各アミノ酸配列は、インターネット等によってアクセスすることができるデータベース、例えばSwissProtデータベース（http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?sp:VEGFA_HUMAN）を参照することによって得ることができる。
【００４９】
本発明者等は、10種のバリアント206、189、183、165、148、145、121、165B、121B及び111（配列番号１〜１０）の定量的分析のために適した部分ペプチドの選定のために、まずこれらのバリアントのアミノ酸配列を配列アライメントによって比較した。アライメントの結果を図１−１及び１−２に示す。
【００５０】
本発明者等は、VEGF-Aの全バリアントを一斉に定量することを可能とするために、プロテアーゼとしてトリプシンを使用した場合に各バリアントから生成されるペプチド候補を検討した。すなわち、各バリアントを識別可能に定量するために、上記のアライメントで全てのバリアントに共通の配列、及び1種もしくは数種のバリアントに特有の配列を有し、プロテアーゼによる消化で得られる断片（ペプチドP01〜P16、配列番号１１〜２６）を選択した。その結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2017022562.tif 000002
【００５２】
表１から理解される通り、ペプチドP01（配列番号１１）、P02（配列番号１２）及びP03（配列番号１３）は10種のバリアントの全てで検出されるペプチドである。また、ペプチドP07（配列番号１７）及びP08（配列番号１８）は10種中6種のバリアントで検出されるペプチドである。これに対して、ペプチドP05（配列番号１５）、P06（配列番号１６）、P11（配列番号２１）、P12（配列番号２２）、P14（配列番号２４）、P15（配列番号２５）、P16（配列番号２６）は、それぞれバリアント206、206、189、183、145、121、165Bでのみ検出されるペプチドである。
【００５３】
すなわち 、ペプチドP05、P06、P11、P12、P14、P15、及びP16は、それぞれバリアント206、206、189、183、145、121、165Bのみに特有のアミノ酸配列を有するペプチドであり、P01〜P03は、10種のバリアントに共通するアミノ酸配列を有するペプチドである。P04、P07〜P10、及びP13は、10種のバリアント中の一部のバリアントに特有のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００５４】
従って、ペプチドP01〜P16を組み合わせて検出することで、バリアント206、189、183、165、148、145、121、165B、121B及び111の全ての同定・定量が可能となる。すなわち、本発明は、一実施形態として、前記変異体が、以下のVEGF-Aのスプライシングバリアント：206（配列番号１）、189（配列番号２）、183（配列番号３）、165（配列番号４）、148（配列番号５）、145（配列番号６）、121（配列番号７）、165b（配列番号８）、121b（配列番号９）、及び111（配列番号１０）から選択される2種以上を含む、上記の方法を提供する。この実施形態は、特に限定するものではないが、例えば配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチド（P01〜P16）の1以上を検出することを含む。
【００５５】
上記の実施形態によって本発明の方法を更に説明すれば、サンプル中に含まれるバリアントが既に判明している場合、あるいは分析すべきバリアントが特定のものである場合には、表１に示すような、各バリアントのためのペプチドのみを検出すれば良い。
【００５６】
一方、サンプル中に含まれるバリアントが不明であり、各バリアントの一斉検出が望まれる場合、これらP01〜P16のペプチドを同時に定量することができる。ペプチドP01〜P16の検出結果に基づいて、サンプル中の各バリアントの量を算出することができる。
【００５７】
例えば、ペプチドP14（配列番号２４）は、バリアント145（配列番号６）のみに特有のアミノ酸配列を有するペプチドである。従って、サンプル中のバリアント145の存在及び量は、ペプチドP01、P02、P03、及びP04の検出と共に、又はこれらを検出せずに、P14を検出することで、決定することができる。
【００５８】
また、ペプチドP16（配列番号２６）は、バリアント165B（配列番号８）のみに特有のアミノ酸配列を有するペプチドである。従って、サンプル中のバリアント165Bの存在及び量は、ペプチドP01〜P04、P07〜P09、P13の検出と共に、又はこれらを検出せずに、P16を検出することで、決定することができる。
【００５９】
一方、バリアント165、148、121B及び111は、それぞれのバリアントのみに特有のアミノ酸配列を有するペプチドを含まない。しかしながら、これらのバリアントの存在及び量は、一部のバリアントに特有のアミノ酸配列を有するペプチドの検出結果に基づいて、あるいはそれに加えて全バリアントに共通するアミノ酸配列を有するペプチドの検出結果に基づいて、決定することができる。
【００６０】
例えば、バリアント165（配列番号４）は、トリプシン消化によって、10種のバリアントに共通するアミノ酸配列を有するペプチドP01〜P03と、一部のバリアントに特有のアミノ酸配列を有するペプチドP04、P07〜P10、及びP13を生成し得る。バリアント165はまた、バリアント165Bと比較すれば、ペプチドP01〜P04、P07〜P09、及びP13を含む点で一致し、ペプチドP10を含み、P16を含まない点で相違する。従って、サンプル中のバリアント165の存在及び量は、ペプチドP01、P02、P03に加えて、P04、P07、P08、P09、P10及びP13を検出し、その検出結果に基づいて、決定することができる。
【００６１】
バリアント111（配列番号１０）のトリプシン消化によって得られるペプチドは、10種のバリアントに共通するアミノ酸配列を有するペプチドP01〜P03と、6種のバリアント（206、189、183、165、121B及び111）に特有のアミノ酸配列を有するペプチドP10である。また、バリアント121B（配列番号９）のトリプシン消化によって得られるペプチドは、バリアント111のトリプシン消化によって得られる上記4種のペプチド、及びP04である。従って、サンプル中のこれらのバリアントの存在及び量も、これらのペプチドを検出し、その検出結果に基づいて、決定することができる。
【００６２】
更に、全バリアントに共通するアミノ酸配列を有するペプチドP01〜P03 を定量することによって、全VEGF-A量を定量することが可能となり、また、P01〜P03が同時に測定できていることは、間違いなくVEGF-Aを測定していることの検証データとしても用いることが可能である。
［定量条件の最適化］
本発明の方法は、サンプル中の各変異体を同定及び定量するものであり、検出は、サンプルのプロテアーゼ消化によって生成するペプチドを対象とする。しかしながら、各ペプチドの検出のための詳細な条件を確立するために、予め取得したアミノ酸情報に基づいてペプチドを化学合成することができる。ペプチドの合成は、当分野で通常行われる手法に基づいて行うことができる。
【００６３】
本発明の主要な目的は、臨床の場において速やかに検出ができる方法を確立することである。従って、本発明者等は、合成した各ペプチドについて、定量条件の最適化を検討した。以降の記載は、VEGF-Aに関して行った実験に基づいたものであるが、当業者であれば、同様の手順によって他のタンパク質の変異体の検出を行うことができることが理解される。
【００６４】
［１．構造の同定、MS/MS イオンの確認］
合成したペプチドは、必須の段階ではないが、まず、構造の確認を行うことが好ましい。例えばLCMS-IT-TOF（島津製作所）でMS及びMS/MSイオンの確認、及び構造の詳細解析を行うことが好ましい。
【００６５】
上記の目的で、例えば本発明者等はFlow inject MS / MSオート分析を行った。
【００６６】
VEGF-Aバリアントを組み込んだプライベートデータベースを作製し、これに対し、Mascot検索を行うMascot MS/MS ion search を用いてフラグメントイオン系列の帰属を行うことができる。オート分析でMS/MSにかからなかったペプチドは再度、親イオンを指標にマニュアルMS/MS分析を実施することもできる。
【００６７】
さらにMascot検索の結果、クライテリアにかからない小さな鎖長のペプチドフラグメントについては、Fragment ion calculator（http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html）にてフラグメントイオンの照合を行うことができる。
【００６８】
以下の表２は、ペプチドの構造の同定、及びMS/MSイオンの確認のために行うことができる質量分析条件の例を示す。
【００６９】
【表２】
2017022562.tif 000003
【００７０】
本発明者等は、合成したペプチドP01〜P16のそれぞれについて、上記の条件で検出される親イオンの価数同定を行った。表３にその結果を示す。表中に計算上の親イオンのm/z値を示し、構造決定のために適したLCMS-IT-TOF及び定量に適したLCMS-8050（いずれも島津製作所）の双方で検出された親イオンを太字及び下線で示し、LCMS-IT-TOF又はLCMS-8050のいずれか一方のみで検出された親イオンを下線で示す。
【００７１】
【表３】
2017022562.tif 000004
【００７２】
［２−１．使用する装置（LCMS-8040）におけるMRM条件の最適化］
質量分析条件は、使用する装置によって異なり得る。従って、実際に測定に使用する装置における最適なMRM条件を決定することが必要である。
【００７３】
本発明者等は次いで、例えばこれも定量に適したLCMS-8040（島津製作所）でQ3スキャン及びプロダクトイオンスキャンを行った。
【００７４】
LCMS-IT-TOFで帰属したイオンと照らし合わせ、計算値および実測値に基づいてMRMゲートに用いるプリカーサーイオン及びプロダクトイオンを選択する。プロダクトイオンは、配列特異性をもつyイオン系列から求めることが好ましい。しかしながら、yイオンの選択が困難な場合、場合によってはbイオン系列も定量対象のトランジションとすることができる。
【００７５】
配列特異的なフラグメントは優先的に選択することが好ましい。例えばProのC末端側断片など構造上ひずみの大きな断片を指標にすることができる。
【００７６】
Flow inject MRMで最適な衝突エネルギーを求めることができる。
【００７７】
表４は、VEGF-Aバリアントの検出のために最適化されたMRM条件の例を示す。
【００７８】
【表４】
2017022562.tif 000005
【００７９】
［２−２．使用する装置（LCMS-8050）におけるMRM条件の最適化］
本発明者等は次いで、LCMS-8040で決定したMRMゲート候補がLCMS-8050においても使用できるか否かを確認した。また、Q1 Pre Bias 電圧、衝突エネルギー、Q3 Pre Bias電圧の最適化を行った。
【００８０】
ここで、分解能を「unit」から「high」に変更し、高分解能MRMモードにて、プリカーサーイオンのm/zを最適化することとした。
【００８１】
表５は、VEGF-Aバリアントの検出のために最適化されたMRM条件の例を示す。
【００８２】
3種類のLCMSを使用することで、生成イオンの安定性、再現性、機種依存性の確認を行い、MRMトランジションが確実に機能することを確認することができた。
【００８３】
【表５】
2017022562.tif 000006
【００８４】
［３．カラムの保持時間の決定 , MRM分析］
次いで、LCMS-8050のL-column2（2μm, 2.1 x 50 mm（化学物質評価研究機構、CERI））を用い、保持時間の決定、及び決定された条件におけるMRM測定を行った。使用したLC条件を以下に示す。
［LC 条件］
Inject : 200 fmol / μL    5 μL  (inject時 1 pmol)
流速 : 0.4 mL / 分
B濃度 :   1 - 40%
A : 0.1% ギ酸 / DDW (wako DDW 3 L + FLUKA FA 3 mL ) 
B : 0.1% ギ酸 / アセトニトリル (wako ACN 1 L + FLUKA FA 1 mL )
タイムプログラム: 1.00 分  コントローラ  イベント2（Flow MS側）
2.00 分  ポンプ  B.Conc 1%
10.00 分  ポンプ  B.Conc 40%
11.00 分  ポンプ  B.Conc 98%
11.00 分  コントローラ  イベント0（Flow Drain側）
13.00 分  ポンプ  B.Conc 98%
13.50 分  ポンプ  B.Conc 1%
15.00 分  ポンプ  B.Conc 1%
15.00 分  コントローラ  Stop
測定時間 ： 1.00 - 11.00 分
表６は、最適化された条件下でペプチドP01〜P16（配列番号１１〜２６）のそれぞれについて、好適に選択された測定フラグメントの例を示したものである。表６は、各ペプチドについて1種のフラグメントイオンのm/z値及び保持時間が示してある。これらのフラグメントイオンを検出することで、ペプチドP01〜P16の検出を行うことができる。
【００８５】
【表６】
2017022562.tif 000007
【００８６】
あるいはまた、本発明の方法は、ペプチドP01〜P16の検出のために、それぞれ2種以上のフラグメントイオンを選択し、同時に検出することもできる。表７は、ペプチドP01〜P16のそれぞれの定量のための最適化した分析条件をまとめたものである。
【００８７】
【表７】
2017022562.tif 000008
【００８８】
2017022562.tif 000009
【００８９】
本発明の方法を用いたタンパク質の定量の他の例として、限定するものではないが、例えばアンジオテンシンバリアントの定量が挙げられる。アンジオテンシンは、アンジオテンシノゲンから酵素分解によって生成されるペプチドであり、I〜IVの4種のバリアントが存在する。このうちアンジオテンシンII〜IVが血圧上昇作用を有するが、アンジオテンシンIには血圧上昇作用はないことが知られている。従って、本発明の方法のために、アンジオゲンシノゲン（SwissProt: P01015）及びアンジオテンシンI〜IVのアミノ酸配列に基づいて、各バリアントの質量分析による定量に適したペプチドを選択することができる。
【００９０】
［キット］
本発明はまた、本発明の方法を高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）を用いて実施するために使用するキットであって、
プロテアーゼと、
前記タンパク質と前記プロテアーゼとを接触させて前記タンパク質を消化するための反応容器と、
前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記各変異体に特有のアミノ酸配列を有する１以上の内部標準ペプチドと、
を含む、上記キットを提供する。
【００９１】
質量分析による測定は、非常に高精度な分析ができる一方、適切なサンプル調製と適正な分析条件の設定が非常に重要である。例えば臨床の場においてより簡便に正確な検査結果が得られるようにするために、本発明は、上記の方法を実施するために利用できるキットを提供する。
【００９２】
本発明のキットに含まれる反応容器としては、分析対象のタンパク質と、プロテアーゼとを液相中で接触させることが可能な容器であればいずれでも良く、特に限定するものではないが、質量分析で検出する後の操作を考慮すれば、マイクロチューブやプレートとすることが好ましい。当業者であれば、反応のために行うボルテックス又はローテーターによる混合、反応後のペプチドとプロテアーゼとの分離のためのろ過等の反応工程を考慮して、適切な反応容器を想定することができる。
【００９３】
本発明のキットに含まれる緩衝液は、前記タンパク質を含有するサンプル及びプロテアーゼと共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるためのものであって、プロテアーゼ消化のために適した反応条件を提供するものである。反応条件は、選択されるプロテアーゼ等によって、適宜決定することができ、緩衝液の組成も適宜決定することができる。
【００９４】
本発明のキットはまた、プロテアーゼ消化反応後にプロテアーゼ等を除去して、消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜を含むことができる。
【００９５】
本発明のキットにはまた、キットの使用方法、及び／又は各変異体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含めることができる。
【００９６】
本発明のキットはまた、１以上の内部標準ペプチドを含めることができる。内部標準ペプチドは、検体と同時に、又は別個に、同じ条件で分析することで、より確実な分析結果を提供する。内部標準ペプチドは、測定対象の変異体に特有のアミノ酸配列を含み、本発明のキットに含まれるプロテアーゼによる消化によって生じ得るアミノ酸配列を有するペプチドとする。内部標準ペプチドは、例えば安定同位体によって標識することができる。その場合、同位体を含まないペプチドと比較すると質量分析定量条件が若干異なり得るため、内部標準用定量条件を同封することが好ましい。
【００９７】
例えば測定対象がVEGF-Aのスプライシングバリアントである場合、配列番号１１〜２６のいずれか１以上のアミノ酸配列を有するペプチドを内部標準ペプチドとして含むことができる。
【００９８】
本発明のキットを使用することにより、プロテアーゼ消化断片ペプチドの調製等の前処理、及び質量分析の操作をより簡便にすることができ、装置による自動化も容易になし得る。特に、トリプシン等のプロテアーゼを固定化酵素の形態でキットの構成要素として提供すれば、ペプチド調製操作をさらに簡略化できる。
【００９９】
キットには更に、試薬品質保証データ（原子純度測定結果等）を含めることもでき、また上記の他種々の試薬等をふくめることができる。キットの任意的構成要素は、特に限定されるものではない。
【０１００】
［記録媒体］
本発明はまた、上記の本発明の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、限定するものではないが、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの1以上についての、親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、及び三連四重極のそれぞれ（第１四重極、第２四重極、第３四重極）における電圧のデータを含む、上記記録媒体を提供する。
【０１０１】
尚、上記の予想保持時間、電圧データ等は、使用する機器及び測定条件等によって変動する数値であり、機器に合わせて提供することが好ましい。また、当業者には理解されるように、条件によって変動する数値についてはその変動幅も併せて提供することが好ましい。
【０１０２】
記録媒体はどのような形態のものでも良く、特に限定するものではない。例えば情報を磁気的、光学的に記録することが可能なディスクやメモリを挙げることができる。
【０１０３】
より具体的には、上記のメソッドパッケージ中には、例えば以下の情報及びソフト機能を含むことができる。
【０１０４】
・最適化※されたペアレントイオンm/z値
・最適化されたフラグメントイオンm/z値
・最適化されたQ1 pre bias電圧値
・最適化されたQ2 衝突エネルギー電圧値
・最適化されたQ3 pre bias電圧値
・目的イオンの予想保持時間及び質量分析時間
・定量値換算式
・解析結果レポート出力機能
※：各条件項目を実測し、最もイオン強度の高いもの、及び最も再現性のあるm/z値を採択し、これを最適値とする。
【０１０５】
例えばVEGF-Aのスプライスバリアントの定量のためのデータとして、上記の表６及び／又は表７に記載された条件／パラメータを含めることができる。
【０１０６】
［メソッドパッケージ］
本発明はまた、上記の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるタンパク質変異体の並行的検出のためのメソッドパッケージを提供する。
【０１０７】
本明細書において、「メソッドパッケージ」とは、特定の分析対象のタンパク質に対する液体クロマトグラフ質量分析の分析条件を読取り可能な形態で含み、単独で流通可能なものをいう。メソッドパッケージに含まれるデータをLC-MSにインポートすることで、詳細な検討の末に得られた最適測定条件で分析することが可能となる。
【０１０８】
上記した通り、質量分析による測定は、非常に高精度な分析ができる一方、目的のイオンによって分析条件が全く異なってくるため、適正な分析条件の設定が非常に重要でありながら、非常に困難であり、条件設定のために膨大な時間を要する。こうした条件を予め準備しておくことで、実際に質量分析を行うユーザーの利便性を向上させることができる。本出願人はこれまでに、ユーザーが例えば農薬や動物医薬品の質量分析をより簡便に行うことを可能とするために、これらのLC-MSによる分析のためのメソッドパッケージを提供してきた。
【０１０９】
上記の記録媒体又はメソッドパッケージの例として、特定のバリアントに限定した情報のみを含むものが挙げられる。従って、分析対象の変異体が、例えばVEGF-Aのスプライシングバリアントである場合、それらに適した分析条件を記載した記録媒体又はメソッドパッケージを提供することができる。
【０１１０】
この場合、記録媒体に含まれるデータは、例えば配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上に対する分析条件に関するものとすることができる。
【０１１１】
メソッドパッケージは、複数の質量分析装置で共通のデータを記載するものであっても良く、あるいは特定の質量分析装置による分析に適した種々のデータを記載するものであっても良い。
【０１１２】
記録媒体又はメソッドパッケージは、上記の本発明のキットと併せて、あるいはキットと別個に提供することができる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【０１１４】
＜実施例１＞
［ペプチドP09（QLELNER、配列番号１９）の検出］
VEGF-Aバリアント206、189、183、165、及び165Bに含まれる配列を有し、トリプシン消化によりこれらのバリアントから生成するペプチドP09の検出のための条件の最適化及び検出を行った。ペプチドP09は、本実施例のために化学合成した。【０１１５】
［１．構造の同定、MS/MS イオンの確認］
まず、検出される親イオンP09の価数同定を行った。
ペプチドP09の計算上の価数（+1〜+5）に対するm/z値を表３に示す。このうち、+2価のイオンがLCMS-IT-TOF、LCMS-8040及びLCMS-8050の全てで検出された（図２−１）。【０１１６】
［２．MRM条件の最適化］
次いで、ペプチドP09の+2価のイオンをプリカーサーイオンとして、MRM分析を行った。図２−２は、LCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の分析結果を示す。
Mascot検索では、図２−２の下図に示すように、それぞれ6種のyイオン及びbイオン及びそれらの種々の分解物に相当する様々なイオンの生成が予測されるが、この中で、4種のyイオン（y(2)、y(3)、y(4)、y(5)）がLCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の双方で検出された。従って、これらのイオンをプロダクトイオンとして検出することが好適であることが示唆された。【０１１７】
［３．LCMS-8050 MRM条件の最適化］
選択された4種のイオン（y(2)、y(3)、y(4)、y(5)）のそれぞれについて、LCMS-8040及びLCMS-8050によってMRMで検出する場合の衝突エネルギーの最適条件を検討した。結果をそれぞれ図２−３及び２−４に示す。
図２−３の結果から、分析装置としてLCMS-8040を用いた場合には、4種のイオンの検出のために最適な衝突エネルギーはいずれも20Vであることが示された。また、図２−４の結果から、分析装置としてLCMS-8050を用いた場合には、4種のイオンの検出のために最適な衝突エネルギーは15V又は20Vであることが示された。【０１１８】
［４．カラムの保持時間の決定, MRM分析］
２．３．で最適化された条件を用い、カラム保持時間の設定を行った。分析装置としてLCMS-8050を用いた。尚、HPLCは、表５に記載した条件で実施した。
図２−５に示すように、ペプチドP09の+2価のイオンをプリカーサーイオンとしてy(2)、y(3)、y(4)、y(5)イオンを検出する場合、保持時間は約4.6分であり、測定時間として4.20〜5.20分の幅で十分な検出が行えることが判明した。下図は、確定した測定条件を用いて測定した結果を示す。【０１１９】
＜実施例２＞
［ペプチドP14（SWSVCDKPR、配列番号２４）の検出］
VEGF-Aバリアント145のみに含まれる配列を有し、トリプシン消化によりこのバリアントから生成するペプチドP14の検出のための条件の最適化及び検出を行った。ペプチドP14は、本実施例のために化学合成した。【０１２０】
［１．構造の同定、MS/MS イオンの確認］
まず、検出される親イオンP14の価数同定を行った。
ペプチドP14の計算上の価数（+1〜+5）に対するm/z値を表３に示す。このうち、+2価及び+3価のイオンがLCMS-IT-TOF、LCMS-8040及びLCMS-8050の全てで検出された（図３−１）。【０１２１】
［２．MRM条件の最適化（１）］
次いで、ペプチドP14の+2価のイオンをプリカーサーイオンとして、MRM分析を行った。図３−２は、LCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の分析結果を示す。
Mascot検索では、図３−２の下図に示すように、それぞれ8種のyイオン及びbイオン及びそれらの種々の分解物に相当する様々なイオンの生成が予測されるが、この中で、1種のbイオン（b(2)）及び6種のyイオン（y(3)、y(4)、y(5)、y(6)、y(7)及びy(7)++）がLCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の双方で検出された。また、y(2)イオンはLCMS-8050で高いピークで検出された。従って、これらのイオンをプロダクトイオンとして検出することが好適であることが示唆された。【０１２２】
［３．LCMS-8050 MRM条件の最適化（１）］
7種のイオン（y(2)、b(2)、y(3)、y(7)++、y(5)、y(6)及びy(7)）のそれぞれについて、分析装置としてLCMS-8050を用いて検出する場合の衝突エネルギーの最適条件を検討した。結果を図３−３及び３−４に示す。
図３−３及び３−４の結果から、分析装置としてLCMS-8050を用いた場合には、上記のイオンの検出のために最適な衝突エネルギーは15V〜25Vの範囲にあることが示された 。【０１２３】
［４．MRM条件の最適化（２）］
上記の２と並行して、ペプチドP14の+3価のイオンをプリカーサーイオンとしてMRM分析を行い、より好適な分析条件を検討した 。図３−５は、LCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の分析結果を示す。
Mascot検索で予測されたイオンの中で、4種のイオン（y(2)、y(3)、y(4)及びy(5)）がLCMS-IT-TOFによるMS2分析及びLCMS-8050の双方で検出された。従って、これらのイオンをプロダクトイオンとして検出することが好適であることが示唆された。【０１２４】
［５．LCMS-8050 MRM条件の最適化（２）］
4種のイオン（y(2)、y(3)、y(4)及びy(5)）のそれぞれについて、分析装置としてLCMS-8050を用いて検出する場合の衝突エネルギーの最適条件を検討した。結果を図３−６に示す。
図３−６の結果から、分析装置としてLCMS-8050を用いた場合には、4種のイオンの検出のために最適な衝突エネルギーは15V（y(4)及びy(5)）又は20V（y(2)及びy(3)）であることが示された。【０１２５】
［６．カラムの保持時間の決定, MRM分析］
４．５．で最適化された条件を用い、カラム保持時間の設定を行った。分析装置としてLCMS-8050を用いた。尚、HPLCは、表５に記載した条件で実施した。
図３−７に示すように、ペプチドP14の+3価のイオンをプリカーサーイオンとしてy(2)、y(3)、y(4)、y(5)イオンを検出する場合、保持時間は約4.61分であり、測定時間として4.20〜5.20分の幅で十分な検出が行えることが判明した。下図は、確定した測定条件を用いて測定した結果を示す。【０１２６】
＜実施例３＞
実施例１及び２と同様にして、P01〜P16の10種のペプチドのそれぞれについて、最適な分析条件を検討した。その結果を図４に示す。尚、詳細なデータは示さないが、図４の結果は、各ペプチドについてP09及びP14と同様の検討を行った結果得られたものである。【０１２７】
＜実施例４＞
ペプチドP01〜P16を特定の量比で混合したサンプルを、本発明者等の方法によって実際に分析した。より具体的には、図４に示す条件に従って、イベント時間0.023秒、Dwell Time 20.0 m秒でチャンネルを切り替えながら連続的に分析を行った。結果を図５に示す。
図５の結果から、サンプル中に混合して含まれるペプチドを、並行して同時に検出することができることが明らかとなった。各ペプチドの量及び相対比は、予め測定サンプル中に添加したペプチド量をそれぞれ反映するものであった。 
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明の方法により、従来は複数の変異体を有するタンパク質が存在しても全体としての定量又は一部の変異体の定量しかできず、混在する変異体の複合的な結果として作用が現れる臨床の場でそのような情報を利用することには問題があった。【０１２９】
本発明の方法では、各変異体の情報をMRM分析により同時に並行して得ることが可能となり、得られた定量値を即座に医師にフィードバックし、臨床的投薬、治療法の選択肢の指標とすることが可能となる。これは従来全く提案されていない、新しい医療を提供するものである。【０１３０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月31日(2018.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2以上の変異体を有するタンパク質の各変異体を質量分析で並行して定量する方法であって、
サンプル中のタンパク質をプロテアーゼ消化し、
前記プロテアーゼ消化によって得られるペプチドのうち、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの2種以上を質量分析によって検出し、
前記質量分析の結果に基づいてサンプル中の各変異体の量を決定する
ことを含み、前記各変異体が新生血管の産生又は血管内皮細胞の増殖のいずれかに関連するタンパク質のスプライシングバリアントである、前記方法。
【請求項２】
2以上の変異体に共通するアミノ酸配列を有するペプチドを更に検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（VEGF）-Aである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記変異体が、以下のVEGF-Aのスプライシングバリアント：206（配列番号１）、189（配列番号２）、183（配列番号３）、165（配列番号４）、148（配列番号５）、145（配列番号６）、121（配列番号７）、165b（配列番号８）、121b（配列番号９）、及び111（配列番号１０）から選択される2種以上を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上を検出する、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法を高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）を用いて実施するために使用するキットであって、
プロテアーゼと、
前記タンパク質と前記プロテアーゼとを接触させて前記タンパク質を消化するための反応容器と、
前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
前記各変異体に特有のアミノ酸配列を有する1以上の内部標準ペプチドと、
を含む、上記キット。
【請求項７】
更に各変異体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを内部標準ペプチドとして含む、請求項６又は７記載のキット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、各変異体に特有のアミノ酸配列を有するペプチドの1以上についての、親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、及び三連四重極のそれぞれにおける電圧のデータを含む、上記記録媒体。
【請求項１０】
請求項９記載の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるタンパク質変異体の並行的検出のためのメソッドパッケージ。
【請求項１１】
前記データが、配列番号１１〜２６に示すアミノ酸配列を有するペプチドの1以上に対するものである、請求項９記載の記録媒体又は請求項１０記載のメソッドパッケージ。
【国際調査報告】
2017022562.tif 000026
2017022562.tif 000027
2017022562.tif 000028
2017022562.tif 000029