(57)【要約】  γ-Glu-Val合成酵素の発現宿主として有用な微生物、及び同微生物で発現させたγ-Glu-Val合成酵素を用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。ybdK遺伝子にコードされるタンパク質（YBDK）の活性が低下するように改変されたエシェリヒア（Escherichia）属細菌等の細菌を発現宿主として発現させたγ-Glu-Val合成酵素を利用して、Glu、Val、及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｙｂｄＫ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変され、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子を有する細菌であって、
前記γ−グルタミルバリン合成酵素におけるγ−グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性の比率が３．０以上である、細菌。
【請求項２】
前記タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の細菌：
（ａ）配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質の活性が、ｙｂｄＫ遺伝子の発現を低下させることにより、またはｙｂｄＫ遺伝子を破壊することにより、低下した、請求項１または２に記載の細菌。
【請求項４】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌：
（ａ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する変異型グルタミン酸−システインリガーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
【請求項６】
前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、請求項５に記載の細菌：
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
【請求項７】
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項５または６に記載の細菌：
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
【請求項８】
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項５または６に記載の細菌：
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
【請求項９】
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の細菌：
（ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２４に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１０】
さらに、ｇｓｈＡ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１１】
さらに、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１２】
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１３】
エシェリヒア（Escherichia）属細菌である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１４】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１５】
γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造方法であって、
γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程を含み、
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細菌を発現宿主として得られたものである、方法。
【請求項１６】
前記グルタチオン合成酵素が前記細菌を発現宿主として得られたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、精製酵素である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、固定化酵素である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細菌の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細菌の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程がATPの存在下で実施される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程が２価の金属イオンの存在下で実施される、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-Glu-Val合成酵素）の発現宿主として有用な微生物、及び同微生物で発現させたγ−グルタミルバリン合成酵素を用いたγ−グルタミルバリルグリシンの製造法に関する。γ−グルタミルバリルグリシンは、食品及び医薬品等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
γ−グルタミルバリルグリシン（L-γ-glutamyl-L-valyl-glycine；以下、「γ-Glu-Val-Gly」ともいう。）のようなある種のペプチドは、カルシウム受容体活性化作用を有している（特許文献１）。このようなカルシウム受容体活性化作用を有するペプチドは、飲食品にコク味を付与できること（特許文献２）、低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさ、を改善できること（特許文献３）、及び、甘味物質のボディー感を改善し、甘味物質特有の苦味を改善できること（特許文献４）が知られている。【０００３】
また、前記のようなペプチドは、下痢（特許文献５）、糖尿病（特許文献６）の予防又は治療効果、及び、消化管の重炭酸分泌促進効果（特許文献７）を有することが知られている。【０００４】
一般に、γ−グルタミルトリペプチドの製造法としては、化学合成法および酵素法が知られている。化学合成法としては、N-保護グルタミン酸無水物を利用して、ジペプチドから選択的にγ−グルタミルトリペプチドを得る方法が知られている（特許文献８）。酵素法としては、グルタミン酸−システインリガーゼ（GSHA）およびグルタチオン合成酵素（GSHB）を利用する方法が知られている（特許文献９、１０）。また、酵素法としては、γ−グルタミルトランスフェラーゼを利用し、Val-Glyをγ−グルタミル化してγ-Glu-Val-Glyを生成する方法も知られている（特許文献１１）。【０００５】
グルタミン酸−システインリガーゼ（GSHA）は、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.2）として知られている。GSHAは、通常、酵素反応にMg2+やMn2+等の２価の金属イオンを要求する。【０００６】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のGSHAは、Mg2+またはMn2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ−グルタミルジペプチドを生成するが、補因子となる金属イオンの種類が基質特異性に影響することが知られている（非特許文献１）。具体的には、Mg2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 251 mol/mg/hr, Km = 17.6 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 59 mol/mg/hr, Km = 27.1 mMであると報告されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mg2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.15と算出できる。一方、Mn2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 39 mol/mg/hr, Km = 1.7 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 95 mol/mg/hr, Km = 21 mMであると示されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mn2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.20と算出できる。また、エシェリヒア・コリ由来GSHAの基質特異性に関しては、他の活性測定例も挙げることができる（非特許文献２）。同文献では、Mg2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質として反応を行い、γ-Glu-Gly生成活性を100%とした場合には、γ-Glu-Val生成活性は52%程度であると報告されている。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.52と算出できる。このように、エシェリヒア・コリのGSHAのγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.15〜0.5程度であると言える。また、エシェリヒア・コリのGSHAに各種変異を導入することにより、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率が高い変異型GSHAを取得したことが報告されている（特許文献１２）。【０００７】
また、グラム陰性細菌の１種であるプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）由来のGSHAは、Mg2+またはMn2+を補因子とし、Gluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ-グルタミルジペプチドを生成することが知られている（非特許文献３）。プロテウス・ミラビリス由来のGSHAについて、γ-Glu-Cys生成活性を100%とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は14.5%、γ-Glu-Val生成活性は7.2%であると報告されている。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.50と算出できる。【０００８】
また、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）由来のγ-glutamylcysteine synthetase-glutatione synthetase（γ-GCS-GS）は、Mg2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ−グルタミルジペプチドを生成することが知られている。ストレプトコッカス・アガラクチア由来のγ-GCS-GSについて、γ-Glu-Gly生成活性を100%とした場合に、γ-Glu-Val生成活性は21%程度であると報告されている（非特許文献２）。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.21と算出できる。【０００９】
また、ミクロコッカス・グルタミカス（Micrococcus glutamicus）の培養液を各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leuを単離したと報告されている（非特許文献４）。しかしながら、これらγ−グルタミルジペプチドの生合成経路については報告されていない。【００１０】
エシェリヒア・コリのybdK遺伝子にコードされるタンパク質（YBDK）は、γ-Glu-Cys生成活性を有することが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、エシェリヒア・コリのYBDKのγ-Glu-Cys以外のγ−グルタミルジペプチド生成活性については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2007/055388
【特許文献２】WO2007/055393
【特許文献３】WO2008/139945
【特許文献４】WO2008/139946
【特許文献５】WO2008/139947
【特許文献６】WO2009/107660
【特許文献７】WO2009/119554
【特許文献８】特開平08-119916
【特許文献９】WO2013/054447
【特許文献１０】特開2012-85637
【特許文献１１】WO2013/051685
【特許文献１２】WO2015/115612
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Brenda S. Kelly et al., J. Biol. Chem., 277, 50-58, 2002
【非特許文献２】Kino, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 352, 351-359, 2007
【非特許文献３】Kumagai, H. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1301-1309, 1982
【非特許文献４】Ronald A. Vitali et al., J. Biol. Chem., 240, 2508‐2511, 1965
【非特許文献５】Lehmann C. et al., Proteins. 2004 Aug 1;56(2):376-83.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-Glu-Val合成酵素）の発現宿主として有用な微生物、及び同微生物で発現させたγ−グルタミルバリン合成酵素を用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア・コリのYBDKがγ-Glu-Gly生成活性を有すること、およびYBDKを欠損させたエシェリヒア・コリがγ-Glu-Val合成酵素の発現宿主として有用であることを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
ｙｂｄＫ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変され、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子を有する細菌であって、
前記γ−グルタミルバリン合成酵素におけるγ−グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性の比率が３．０以上である、細菌。
［２］
前記タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記細菌：
（ａ）配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質。
［３］
前記タンパク質の活性が、ｙｂｄＫ遺伝子の発現を低下させることにより、またはｙｂｄＫ遺伝子を破壊することにより、低下した、前記細菌。
［４］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記細菌：
（ａ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［５］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する変異型グルタミン酸−システインリガーゼである、前記細菌：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
［６］
前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記細菌：
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
［７］
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記細菌：
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
［８］
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記細菌：
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
［９］
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、前記細菌：
（ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２４に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［１０］
さらに、ｇｓｈＡ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記細菌。
［１１］
さらに、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記細菌。
［１２］
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、前記細菌。
［１３］
エシェリヒア（Escherichia）属細菌である、前記細菌。
［１４］
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記細菌。
［１５］
γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造方法であって、
γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程を含み、
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、前記細菌を発現宿主として得られたものである、方法。
［１６］
前記グルタチオン合成酵素が前記細菌を発現宿主として得られたものである、前記方法。
［１７］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、精製酵素である、前記方法。
［１８］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、固定化酵素である、前記方法。
［１９］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、前記細菌の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［２０］
前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［２１］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素が、前記細菌の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［２２］
前記工程がATPの存在下で実施される、前記方法。
［２３］
前記工程が２価の金属イオンの存在下で実施される、前記方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ−体である。
【００１７】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、ybdK遺伝子にコードされるタンパク質（「YBDK」ともいう）の活性が低下するように改変された細菌である。本発明の微生物は、具体的には、YBDKの活性が非改変株と比較して低下するように改変された細菌である。本発明の微生物は、例えば、下記のような細菌をYBDKの活性が低下するように改変することにより取得することができる。
【００１８】
細菌としては、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌が挙げられる。
【００１９】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００２０】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株（例えば、K-12株由来のJM109株）が挙げられる。
【００２１】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００２２】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２３】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２４】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
【００２５】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２６】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２７】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００２８】
バチルス属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりバチルス属に分類される細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）が挙げられる。バチルス・サブチリスとして、具体的には、例えば、バチルス・サブチリス168 Marburg株（ATCC 6051）やバチルス・サブチリスPY79株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）が挙げられる。バチルス・アミロリケファシエンスとして、具体的には、例えば、バチルス・アミロリケファシエンスT株（ATCC 23842）やバチルス・アミロリケファシエンスN株（ATCC 23845）が挙げられる。
【００２９】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号C6000-03）。また、BLR(DE3)株は、例えば、メルクミリポア社より入手可能である（製品番号 69053）。また、JM109株は、例えば、タカラバイオ社より入手可能である（製品番号 9052）。
【００３０】
YBDKは、GluとGlyとATPを基質として、γ-Glu-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質である。同活性を、「γ−グルタミルグリシン合成酵素（γ-glutamylglycine synthethase）活性」、「γ-Glu-Gly生成活性」、または「γ-Glu-Gly合成活性」ともいう。
【００３１】
また、GluとValとATPを基質として、γ-Glu-ValとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synthethase）活性」、「γ-Glu-Val生成活性」、または「γ-Glu-Val合成活性」ともいう。
【００３２】
また、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ-glutamylcysteine synthetase）活性」ともいう。
【００３３】
これらの酵素活性は、例えば、適切な条件で酵素を基質に作用させた際のγ−グルタミルジペプチドの生成に基づいて測定することができる。これらの酵素活性は、例えば、２価の金属イオンの存在下で測定することができる。２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋やＭｎ２＋が挙げられる。
【００３４】
Ｍｎ２＋存在下でのγ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性の測定条件としては、実施例３に記載の条件が挙げられる。すなわち、具体的な活性測定条件は以下の通りである。γ−グルタミルバリン合成酵素活性は、反応液（10mM グルタミン酸、10mM バリン、10mM ATP、10mM MnS04、100mM Tris-HCl (pH7.0〜9.0)）に適切な量の酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Val量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（Ｍｎ２＋存在下）とする。同様に、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性は、反応液（10mM グルタミン酸、10mM グリシン、10mM ATP、10mM MnS04、100mM Tris-HCl (pH7.0〜9.0)）に適切な量の酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Gly量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルグリシン合成酵素活性（Ｍｎ２＋存在下）とする。
【００３５】
また、10mM MnS04に代えて10mM MgS04を含有する反応液を用いることで、Ｍｇ２＋存在下でのγ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を測定することができる。すなわち、同反応液を用いて上記と同様の条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（Ｍｇ２＋存在下）とする。同様に、同反応液を用いて上記と同様の条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルグリシン合成酵素活性（Ｍｇ２＋存在下）とする。
【００３６】
また、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率（すなわち、γ−グルタミルバリン合成酵素活性の比活性／γ−グルタミルグリシン合成酵素活性の比活性）を「Val選択性」ともいう。Val選択性は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を測定し、算出できる。
【００３７】
YBDKは、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルグリシン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、YBDKは、γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synthethase）活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、YBDKは、γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ-glutamylcysteine synthetase）活性を有していてもよく、有していなくてもよい。YBDKは、適切な条件でγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有していればよい。YBDKは、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｎ２＋の存在下、でγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてよい。また、YBDKは、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH7.0、でγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてよい。
【００３８】
YBDKがγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有する限り、YBDKにおけるVal選択性は特に制限されない。YBDKは、後述するγ−グルタミルバリン合成酵素よりも低いVal選択性を示すものであってよい。YBDKにおいて、Val選択性は、例えば、３．０未満であってよい。YBDKは、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｎ２＋の存在下、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。また、YBDKは、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH7.0、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。
【００３９】
E. coli K-12 MG1655のybdK遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるYBDKのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５および１６に示す。すなわち、YBDKは、例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、YBDKは、例えば、配列番号１５に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００４０】
YBDKは、元の機能が維持されている限り、上記例示したYBDK（例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、ybdK遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したybdK遺伝子（例えば、配列番号１５に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。すなわち、「ybdK遺伝子」という用語は、上記例示したybdK遺伝子に加えて、その保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「YBDK」という用語は、上記例示したYBDKに加えて、その保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したybdK遺伝子やYBDKのホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００４１】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、YBDKにあっては、タンパク質のバリアントが、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有することをいう。同バリアントがγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有する限り、基質特異性、２価の金属イオンの要求性、ｐＨ依存性等の、同バリアントの酵素学的性質は、いずれも、元のタンパク質の酵素学的性質と同一であってもよく、同一でなくてもよい。例えば、同バリアントは、γ−グルタミルグリシン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、同バリアントは、上記例示したVal選択性を示してもよい。また、「元の機能が維持されている」とは、ybdK遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわちγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質）をコードすることをいう。
【００４２】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００４３】
上記ybdK遺伝子またはYBDKのホモログとしては、例えば、上記塩基配列またはアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得される遺伝子またはタンパク質が挙げられる。また、上記ybdK遺伝子のホモログは、例えば、各種微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００４４】
YBDKは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４５】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４６】
また、YBDKは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００４７】
また、YBDKは、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号１５に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
【００４８】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００４９】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、HigGlns et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、HigGlns et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００５０】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００５１】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００５２】
本発明の微生物は、さらに、γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性が低下するように改変されていてもよい。「γ−グルタミルシステイン合成酵素」とは、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をいう。γ−グルタミルシステイン合成酵素を、「グルタミン酸−システインリガーゼ」または「GSHA」ともいう。γ−グルタミルシステイン合成酵素は、さらに、γ−グルタミルバリン合成酵素活性やγ−グルタミルグリシン合成酵素活性等の、γ−グルタミルシステイン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有し得る。γ−グルタミルシステイン合成酵素は、後述するγ−グルタミルバリン合成酵素よりも低いVal選択性を示すものであってよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素において、Val選択性は、例えば、３．０未満であってよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素としては、gshA遺伝子にコードされるGshAタンパク質が挙げられる。一例として、エシェリヒア・コリのgshA遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２３及び２４に示す。γ−グルタミルシステイン合成酵素は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り、上記γ−グルタミルシステイン合成酵素のバリアントであってもよい。γ−グルタミルシステイン合成酵素やそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したYBDKやybdK遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、「gshA遺伝子」および「GshAタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したgshA遺伝子およびGshAタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。
【００５３】
本発明の微生物は、さらに、γ−グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。γ−グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質としては、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）が挙げられる。GGTの活性が低下することにより、γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyの分解を抑制することが出来る。GGTとしては、ggt遺伝子にコードされるGgtタンパク質が挙げられる。一例として、エシェリヒア・コリのggt遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２５及び２６に示す。GGTは、GGT活性を有する限り、上記GGTのバリアントであってもよい。GGTやそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したYBDKやybdK遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、「ggt遺伝子」および「Ggtタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したggt遺伝子およびGgtタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。
【００５４】
本発明の微生物を構築するための改変の順序は特に制限されない。
【００５５】
以下、YBDK、GSHA、GGT等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００５６】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して減少していることを意味してよい。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の微生物が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、エシェリヒア・コリK-12 MG1655株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、エシェリヒア・コリJM109株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も含まれる。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００５７】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００５８】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００５９】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【００６０】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００６１】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)）。
【００６２】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００６３】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子としては、遺伝子の全領域あるいは一部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を導入した遺伝子が挙げられる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００６４】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００６５】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【００６６】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００６７】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００６８】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００６９】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７０】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００７１】
＜２＞γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-Glu-Val合成酵素）の製造
本発明の微生物は、γ−グルタミルバリン合成酵素の発現宿主として利用することができる。すなわち、本発明の微生物は、γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子（「γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子」ともいう）を有していてよい。以下、「γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主」とは、本発明の微生物であって、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するものを指す。なお、「γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する」ことを、「γ−グルタミルバリン合成酵素を有する」ともいう。すなわち、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を、「γ−グルタミルバリン合成酵素を有する宿主」ともいう。
【００７２】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主は、本来的にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するものであってもよく、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するように改変された宿主としては、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子が導入された宿主が挙げられる。すなわち、本発明の微生物は、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子が導入されていてよい。本発明の微生物を構築するための改変の順序は特に制限されない。すなわち、例えば、本来的にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する細菌をYBDKの活性が低下するよう改変してもよい。また、例えば、YBDKの活性が低下するよう改変された細菌にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を導入してもよいし、細菌にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を導入してからYBDKの活性が低下するよう改変してもよい。
【００７３】
本発明において、「γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synthethase）（γ-Glu-Val合成酵素（γ-Glu-Val synthethase））」とは、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質をいう。本発明において、γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルバリン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有さないのが好ましい。γ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性の測定方法は上述したとおりである。γ−グルタミルバリン合成酵素は、適当な条件でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していればよい。γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｇ２＋の存在下、でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していてよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH9.0、でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していてよい。
【００７４】
γ−グルタミルバリン合成酵素は、YBDKよりも高いVal選択性を示すのが好ましい。γ−グルタミルバリン合成酵素において、Val選択性は、例えば、３．０以上、５．０以上、１０以上、１５以上、または２０以上であってよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素において、Val選択性は、例えば、１０００万以下、１００万以下、１０万以下、１万以下、１０００以下、１００以下、または５０以下であってよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素において、Val選択性は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素は、適切な条件で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｇ２＋の存在下、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH9.0、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。
【００７５】
特に、Val選択性が高いγ−グルタミルバリン合成酵素をグルタチオン合成酵素と組み合わせて利用することにより、Glu、Val、およびGlyを原料として、γ−グルタミルグリシンの副生を低減しつつγ−グルタミルバリルグリシンを効率的に生産できると期待される。また、特に、γ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）が高いγ−グルタミルバリン合成酵素を利用することにより、GluおよびValを原料としてγ−グルタミルバリンを効率的に生産できると期待される。
【００７６】
γ−グルタミルバリン合成酵素としては、例えば、コクリア（Kocuria）属細菌やミクロコッカス（Micrococcus）属細菌のγ−グルタミルバリン合成酵素が挙げられる。コクリア属細菌としては、コクリア・ロゼア（Kocuria rosea）やコクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）が挙げられる。ミクロコッカス属細菌としては、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）が挙げられる。すなわち、γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、このような細菌に由来するタンパク質であってよい。
【００７７】
コクリア・ロゼア（AJ3132）のγ−グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号１８および１７に示す。コクリア・リゾフィラDC2201株（ATCC 9341）のγ−グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号２０および１９に示す。ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株（ATCC 15307）のγ−グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号２２および２１に示す。すなわち、γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。
【００７８】
γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、上記例示したγ−グルタミルバリン合成酵素（例えば、配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、上記例示したγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子（例えば、配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子およびγ−グルタミルバリン合成酵素のバリアントについては、上述したybdK遺伝子およびYBDKの保存的バリアントに関する記載を準用できる。「元の機能が維持されている」とは、γ−グルタミルバリン合成酵素にあっては、タンパク質のバリアントが、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有することをいう。同バリアントがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、基質特異性、２価の金属イオンの要求性、ｐＨ依存性等の、同バリアントの酵素学的性質は、いずれも、元のタンパク質の酵素学的性質と同一であってもよく、同一でなくてもよい。例えば、同バリアントは、γ−グルタミルバリン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、同バリアントは、上記例示したVal選択性を示してもよい。
【００７９】
また、γ−グルタミルバリン合成酵素としては、例えば、WO2015/115612に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼ（変異型GSHA）が挙げられる。
【００８０】
本発明において、「変異型グルタミン酸−システインリガーゼ（変異型GSHA）」とは、「特定の変異」を有するGSHAをいう。また、本発明において、変異型GSHAをコードする遺伝子を、「変異型グルタミン酸−システインリガーゼ遺伝子（変異型gshA遺伝子）」ともいう。「特定の変異」については後述する。
【００８１】
本発明において、「特定の変異」を有しないグルタミン酸−システインリガーゼを「野生型グルタミン酸−システインリガーゼ（野生型GSHA）」ともいう。また、本発明において、野生型GSHAをコードする遺伝子を、「野生型グルタミン酸−システインリガーゼ遺伝子（野生型gshA遺伝子）」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。野生型GSHAとしては、例えば、エシェリヒア・コリのGshAタンパク質等の、上記例示したGSHAが挙げられる。また、上記例示したGSHAの保存的バリアントは、「特定の変異」を有しない限り、いずれも野生型GSHAである。野生型GSHAは、通常、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。ただし、本発明において、野生型GSHAは、それに対応する変異型GSHAがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性、γ−グルタミルバリン合成酵素活性、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性、またはそれらの任意の組み合わせを有していてもよく、それらのいずれも有していなくてもよい。
【００８２】
変異型GSHAは、野生型GSHAのアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。すなわち、例えば、変異型GSHAは、配列番号２４に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、配列番号２４に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、言い換えると、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、野生型GSHAと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２４に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
【００８３】
「特定の変異」とは、野生型GSHAに導入した際に、γ−グルタミルバリンの生成に適した性質を野生型GSHAに付与する変異をいう。すなわち、変異型GSHAは、「特定の変異」を有することにより、野生型GSHAと比較して、γ−グルタミルバリンの生成に適した性質を有する。γ−グルタミルバリンの生成に適した性質としては、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の上昇、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）の低下、Val選択性の上昇、およびそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、変異型GSHAにおいては、γ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）が、野生型GSHAの、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、または２０倍以上に上昇していてよい。
【００８４】
「特定の変異」としては、下記より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
上記表記において、数字は配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基（すなわち、変異前のアミノ酸残基；一文字表記）を、各々示す。すなわち、例えば、「L135」は、配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基を示す。
【００８５】
上記変異において、置換後のアミノ酸残基は、変異型GSHAがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、元のアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。置換後のアミノ酸残基として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。
【００８６】
「特定の変異」として、具体的には、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異が挙げられる。すなわち、「特定の変異」は、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異を含んでいてよい。「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれるいずれかの変異に相当する変異であってもよく、下記より選ばれる２又はそれ以上の変異の組み合わせに相当する変異であってもよい。また、「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異と、それ以外のL135、Q144、Y241、N243、Y300より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異との組み合わせに相当する変異であってもよい。
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。すなわち、例えば、「L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）」は、配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle、Phe、Met、Val、Gly、Ala、Trp、Lys、His、Arg、Cys、Asn、Ser、およびThrのいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。なお、各変異後のアミノ酸をカッコなしで表記してもよい。すなわち、例えば、「L135I」は、配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle残基に置換される変異を示す。
【００８７】
変異の組み合わせは特に制限されない。変異の組み合わせとして、具体的には、下記の組み合わせが挙げられる。
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
上記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、上記表記において、「/」で区切られた２又はそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「L135I/Q144R」は、L135IとQ144Rの二重変異を示す。
【００８８】
また、WO2015/115612の実施例においてγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の顕著な上昇が認められた変異として、下記の変異が挙げられる。
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
【００８９】
任意の野生型GSHAのアミノ酸配列において、「配列番号２４に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号２４に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異を意味する。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」とは、配列番号２４に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基（L135）に相当するアミノ酸残基がIle残基に置換される変異を示す。なお、ここでいう「L135に相当するアミノ酸残基」は、通常Leu残基であってよいが、Leu残基でなくてもよい。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」は、「L135に相当するアミノ酸残基」がLeu残基である場合に当該Leu残基がIle残基に置換される変異に限られず、「L135に相当するアミノ酸残基」がLys、Arg、His、Ala、Val、Gly、Ser、Thr、Pro、Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Asn、またはGln残基である場合に当該アミノ酸残基がIle残基に置換される変異も包含する。他の変異についても同様である。
【００９０】
任意の野生型GSHAのアミノ酸配列において、「配列番号２４に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象の野生型GSHAのアミノ酸配列と配列番号２４のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号２４に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記変異において、アミノ酸残基の位置は、必ずしも野生型GSHAのアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号２４に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなる野生型GSHAにおいて、n位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した場合、元のn位のアミノ酸残基はN末端から数えてn-1番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号２４に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。同様に、例えば、ある微生物のGSHAホモログのアミノ酸配列中の100位のアミノ酸残基が、配列番号２４に示すアミノ酸配列中の101位に相当するときは、当該アミノ酸残基は、当該GSHAホモログにおける「配列番号２４に示すアミノ酸配列における101位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」である。
【００９１】
アラインメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているClustalWなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987；Thompson JD et al., Nucleic acid Reseach, 22(22), 4673-80. 1994）。
【００９２】
γ−グルタミルバリン合成酵素は、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。「他のペプチド」は、γ−グルタミルバリン合成酵素がγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、特に制限されない。「他のペプチド」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のペプチド」としては、ペプチドタグ、シグナルペプチド、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のペプチド」は、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素のＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のペプチド」としては、１種のペプチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のペプチドを組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現したγ−グルタミルバリン合成酵素の検出や精製に利用できる。
【００９４】
シグナルペプチドは、γ−グルタミルバリン合成酵素を発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。シグナルペプチドは、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素の分泌生産に利用できる。シグナルペプチドを利用してγ−グルタミルバリン合成酵素を分泌生産する場合、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有さないγ−グルタミルバリン合成酵素が菌体外に分泌され得る。
【００９５】
プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現したγ−グルタミルバリン合成酵素の切断に利用できる。具体的には、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素をペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、γ−グルタミルバリン合成酵素とペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現したγ−グルタミルバリン合成酵素からプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有さないγ−グルタミルバリン合成酵素を得ることができる。
【００９６】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、上記例示したγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。具体的には、例えば、開始コドンがATG以外である場合に、開始コドンをATGに改変することができる。また、エシェリヒア・コリでの発現に最適化したコクリア・ロゼア（AJ3132）のγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の塩基配列を配列番号２９に示す。
【００９７】
なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子」とは、γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００９８】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【００９９】
また、取得したγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を適宜改変してそのバリアントを取得することもできる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【０１００】
また、変異型gshA遺伝子は、例えば、野生型gshA遺伝子を、コードされるGSHAが上記「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変のもとになる野生型gshA遺伝子は、例えば、野生型gshA遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型gshA遺伝子は、野生型gshA遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成等により変異型gshA遺伝子を直接取得してもよく、変異型gshA遺伝子をさらに改変することにより別の変異型gshA遺伝子を取得してもよい。
【０１０１】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有していてもよい。なお、「変異型gshA遺伝子を宿主に導入する」ことには、宿主の染色体上のgshA遺伝子を「特定の変異」を有するように改変することも含まれる。
【０１０２】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１０３】
また、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【０１０４】
γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を含むベクターを、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターは、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。また、コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、γ−グルタミルバリン合成酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にγ−グルタミルバリン合成酵素のコード領域を組み込んでもよい。
【０１０５】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【０１０６】
また、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。本発明の実施に不要な遺伝子としては、例えば、ybdK遺伝子、gshA遺伝子、ggt遺伝子が挙げられる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、γ−グルタミルバリン合成酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にγ−グルタミルバリン合成酵素のコード領域を組み込んでもよい。
【０１０７】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【０１０８】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
【０１０９】
また、本来的にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現が増大するよう改変してもよい。「遺伝子の発現が増大する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が増大する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味してよい。ここでいう「非改変株」とは、標的の遺伝子の発現が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現を増大させる手法としては、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子のコピー数を増加させることやγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の転写効率や翻訳効率を向上させることが挙げられる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子のコピー数の増加は、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を宿主に導入することにより達成できる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入されるγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、同種由来であってもよく、異種由来であってもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の、遺伝子の発現調節配列の改変により達成できる。例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の転写効率の向上は、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。より強力なプロモーターとしては、上述したような強力なプロモーターが挙げられる。
【０１１０】
γ−グルタミルバリン合成酵素は、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主にγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現を、「γ−グルタミルバリン合成酵素の発現」ともいう。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を培養することにより、γ−グルタミルバリン合成酵素を発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行う。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素を発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【０１１１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【０１１２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【０１１３】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。
【０１１４】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【０１１５】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【０１１６】
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、より好ましくは30℃〜37℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50%に、好ましくは10%程度に調節してよい。培養中のpHは、5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。
【０１１７】
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、γ−グルタミルバリン合成酵素を含む培養物が得られる。γ−グルタミルバリン合成酵素は、例えば、宿主の菌体内に蓄積し得る。尚、使用する宿主及びγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の設計によっては、ペリプラズムにγ−グルタミルバリン合成酵素を蓄積させることや、菌体外にγ−グルタミルバリン合成酵素を分泌生産させることも可能である。
【０１１８】
γ−グルタミルバリン合成酵素は、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。また、γ−グルタミルバリン合成酵素は、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
【０１１９】
例えば、宿主の菌体内にγ−グルタミルバリン合成酵素が蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、γ−グルタミルバリン合成酵素を回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にγ−グルタミルバリン合成酵素が蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からγ−グルタミルバリン合成酵素を回収することができる。
【０１２０】
γ−グルタミルバリン合成酵素の精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ−グルタミルバリン合成酵素の精製は、所望の程度に行うことができる。例えば、GGT等のγ−グルタミルペプチドの分解に関与する成分がγ−グルタミルバリン合成酵素と共存している場合には、そのような成分を除去するのが好ましい。
【０１２１】
精製されたγ−グルタミルバリン合成酵素は、本発明の方法における「γ−グルタミルバリン合成酵素」として利用できる。
【０１２２】
また、精製されたγ−グルタミルバリン合成酵素に限られず、γ−グルタミルバリン合成酵素を含有する任意の画分を本発明の方法における「γ−グルタミルバリン合成酵素」として利用してもよい。すなわち、本発明の方法における「γ−グルタミルバリン合成酵素」とは、そのような画分に含有されるものであってよい。γ−グルタミルバリン合成酵素を含有する画分は、γ−グルタミルバリン合成酵素がGluおよびValに作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主（γ−グルタミルバリン合成酵素を有する宿主）の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたγ−グルタミルバリン合成酵素と共に利用されてもよい。
【０１２３】
＜３＞グルタチオン合成酵素およびその製造
「グルタチオン合成酵素（glutathione synthase）」は、通常、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）とADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.3）として知られている。同活性を、「グルタチオン合成酵素活性」ともいう。
【０１２４】
また、γ-Glu-ValとGlyとATPを基質として、γ-Glu-Val-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素（gamma-Glutamylvalylglycine synthethase）活性」または「γ-Glu-Val-Gly生成（合成）活性」ともいう。
【０１２５】
本発明において、グルタチオン合成酵素としては、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するものを用いる。すなわち、本発明において、「グルタチオン合成酵素」とは、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質をいう。
【０１２６】
本発明において、グルタチオン合成酵素は、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルバリルグリシン以外のγ−グルタミルトリペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【０１２７】
グルタチオン合成酵素のγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を12.5 mMγ-Glu-Val、12.5 mM Gly、12.5 mM ATP、12.5 mM MgS04、2 mMジチオスレイトール、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、反応温度37℃、反応時間1分〜50時間として、適切な量のグルタチオン合成酵素を用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性とする。
【０１２８】
グルタチオン合成酵素としては、gshB遺伝子によりコードされるGshBタンパク質やGSH2遺伝子によりコードされるGsh2タンパク質が挙げられる。gshB遺伝子としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌のgshB遺伝子が挙げられる。GSH2遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母のGSH2遺伝子が挙げられる。また、グルタチオン合成酵素としては、WO2013/054447に記載の変異型グルタチオン合成酵素も挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshB遺伝子の塩基配列は、GenBank accession NC_000913.3としてNCBIデータベースに登録されているゲノム配列中の3,089,900〜3,090,850位の配列に相当する。MG1655株（エシェリヒア・コリK-12 W3110株においても同一）のgshB遺伝子の塩基配列を配列番号２７に示す。また、同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。すなわち、グルタチオン合成酵素は、例えば、配列番号２７に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、グルタチオン合成酵素は、例えば、配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。グルタチオン合成酵素は、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、上記グルタチオン合成酵素のバリアントであってもよい。グルタチオン合成酵素やそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したYBDKやybdK遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、「gshB遺伝子」および「GshBタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したgshB遺伝子およびGshBタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。また、「GSH2遺伝子」および「Gsh2タンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したGSH2遺伝子およびGsh2タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。グルタチオン合成酵素は、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質については、上述したγ−グルタミルバリン合成酵素における融合タンパク質に関する記載を準用できる。
【０１２９】
グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子（「グルタチオン合成酵素遺伝子」ともいう）を有する宿主にグルタチオン合成酵素遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、「グルタチオン合成酵素遺伝子を有する」ことを、「グルタチオン合成酵素を有する」ともいう。すなわち、例えば、グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を、「グルタチオン合成酵素を有する宿主」ともいう。また、グルタチオン合成酵素遺伝子の発現を、「グルタチオン合成酵素の発現」ともいう。グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主は、本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有するものであってもよく、グルタチオン合成酵素遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主としては、上記gshB遺伝子を有するエシェリヒア・コリや上記GSH2遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ等の微生物が挙げられる。グルタチオン合成酵素遺伝子を有するように改変された宿主としては、グルタチオン合成酵素遺伝子が導入された宿主が挙げられる。グルタチオン合成酵素遺伝子を導入する宿主は、機能するグルタチオン合成酵素を発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌が挙げられる。宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。また、本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を、グルタチオン合成酵素遺伝子の発現が増大するよう改変してもよい。グルタチオン合成酵素遺伝子の導入等の宿主の改変については、上述したγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の導入等の宿主の改変に関する記載を準用できる。ベクターやプロモーター等の宿主の改変に利用する材料は宿主の種類に応じて適宜選択できる。グルタチオン合成酵素遺伝子を発現するための宿主は、YBDKの活性が低下するように改変されていてもよい。また、グルタチオン合成酵素遺伝子を発現するための宿主は、γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性が低下するように改変されていてもよい。また、グルタチオン合成酵素遺伝子を発現するための宿主は、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）等のγ−グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。
【０１３０】
本発明の微生物を、グルタチオン合成酵素の発現宿主として利用することもできる。すなわち、本発明の微生物は、グルタチオン合成酵素遺伝子を有していてもよい。また、本発明の微生物は、グルタチオン合成酵素遺伝子とγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の両方を有していてもよい。
【０１３１】
また、グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【０１３２】
グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を利用したグルタチオン合成酵素の製造については、上述したγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を利用したγ−グルタミルバリン合成酵素の製造に関する記載を準用できる。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。製造されたグルタチオン合成酵素（精製されたグルタチオン合成酵素やグルタチオン合成酵素を含有する画分）は、本発明の方法における「グルタチオン合成酵素」として利用できる。なお、グルタチオン合成酵素は、単独で製造してもよく、γ−グルタミルバリン合成酵素とまとめて製造してもよい。すなわち、本発明の微生物がグルタチオン合成酵素遺伝子とγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子の両方を有する場合、本発明の微生物にそれらの遺伝子を発現させることにより、グルタチオン合成酵素とγ−グルタミルバリン合成酵素をまとめて製造することができる。
【０１３３】
＜４＞γ−グルタミルバリルグリシン（γ-Glu-Val-Gly）の製造法
本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素を利用したγ-Glu-Valの製造法やγ−グルタミルバリン合成酵素を利用したγ-Glu-Val-Gly（CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ）の製造法を提供する。これらの方法を総称して、「本発明の方法」ともいう。γ-Glu-Val-Glyの構造式を下記式（Ｉ）に示す。
【０１３４】
【化１】
2017039001.tif 000002
【０１３５】
＜４−１＞酵素法
本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素を利用してγ-Glu-Val-Glyを酵素的に製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）」ともいう。
【０１３６】
本発明においては、γ−グルタミルバリン合成酵素を利用することにより、GluとValとを反応させ、γ-Glu-Valを生成することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、反応液から回収することができる。
【０１３７】
さらに、生成したγ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造することができる。γ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する方法としては、グルタチオン合成酵素を利用する方法が知られている（特開2012-85637）。具体的には、グルタチオン合成酵素を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の一態様（「第１の態様」ともいう）は、（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１３８】
第１の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。反応開始時にγ−グルタミルバリン合成酵素、グルタチオン合成酵素、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることで、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始することができる。また、グルタチオン合成酵素および／またはGlyが反応系に共存していない条件下で工程（Ａ）を開始し、工程（Ａ）の進行中または完了後にグルタチオン合成酵素および／またはGlyを反応系に共存させることで、工程（Ｂ）を開始することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを用いて工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
【０１３９】
なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）の工程（Ａ）は、例えば、第１の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
【０１４０】
また、本発明においては、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を利用することにより、GluとValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の別の態様（「第２の態様」ともいう）は、（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。第２の態様においては、γ−グルタミルバリン合成酵素、グルタチオン合成酵素、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることにより、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyにまとめて作用させ、γ-Glu-Val-Glyを製造することができる。
【０１４１】
本発明の方法において、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を総称して「酵素」ともいう。Glu、Val、およびGlyを総称して「アミノ酸」ともいう。γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyを総称して「ペプチド」ともいう。Glu、Val、Gly、およびγ-Glu-Valを総称して「基質」ともいう。「基質」には、特記しない限り、さらにATPを含めてよい。酵素とそれに対応する基質との反応を「酵素反応」ともいう。なお、酵素法において、「γ−グルタミルバリン合成酵素」とは、本発明の微生物を発現宿主として得られたものを指す。
【０１４２】
本発明の方法に用いられる各酵素の態様は上述した通りである。すなわち、各酵素としては、例えば、精製された酵素、酵素を含有する任意の画分、またはそれらの組み合わせを用いることができる。各酵素としては、１種の酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。
【０１４３】
アミノ酸としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。アミノ酸の製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。アミノ酸は、例えば、化学合成、酵素反応、またはその組み合わせにより製造することができる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養し、培養物から当該アミノ酸を回収することにより、製造することができる。アミノ酸の生産能を有する微生物としては、例えば、後述するようなアミノ酸生産菌を利用できる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸を含有する農水畜産物から回収することにより、製造することができる。アミノ酸としては、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、当該アミノ酸を含有する素材を用いてもよい。アミノ酸を含有する素材は、酵素が当該アミノ酸に作用できる態様で当該アミノ酸を含有する限り特に制限されない。アミノ酸を含有する素材として、具体的には、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養して得られた培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、それらの濃縮物（濃縮液）や濃縮乾燥物等の処理物が挙げられる。
【０１４４】
本発明の方法において、アミノ酸およびペプチドは、いずれも、特記しない限り、フリー体、もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミノ酸、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。また、「ペプチド」という用語は、特記しない限り、フリー体のペプチド、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩は、化学的に許容されるものであれば特に制限されない。また、製造されるγ-Glu-Val-Glyを経口用途（例えば飲食品への添加用途）に用いる場合、γ-Glu-Val-Glyの塩は、化学的に許容される可食性のものであれば特に制限されない。「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【０１４５】
酵素反応は、酵素と基質を反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、酵素反応は、適当な反応液中で実施できる。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、酵素と基質を混合することにより、酵素反応を実施できる。酵素反応は、静置で実施してもよく、撹拌や振盪下で実施してもよい。カラム式の場合は、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムに基質を含有する反応液を通液することにより、酵素反応を実施できる。反応液としては、必要な成分を含有する、水や緩衝液等を用いることができる。反応液は、例えば、酵素、基質、ATP、２価の金属イオンを含有していてよい。酵素反応に用いられる成分の組み合わせは、実施する工程の種類およびその実施態様（複数の工程を同時に実施するか等）に応じて適宜選択することができる。
【０１４６】
γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素は、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系（反応液）は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、粉末あるいは水溶液等の任意の形態で、反応液に添加することができる。また、ATPは、例えば、ATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPを生成または再生する方法としては、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法（Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997)）、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法（Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005)）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29：789-790 (1988)）、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988)）等が知られている。
【０１４７】
また、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素は、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系（反応液）は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。２価の金属イオンは、γ−グルタミルバリン合成酵素活性が得られるものであれば特に制限されない。２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋やＭｎ２＋が挙げられ、好ましい２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋が挙げられる。２価の金属イオンの濃度は、例えば、１〜２００ｍＭであってよい。
【０１４８】
反応条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り特に制限されない。
【０１４９】
反応液のpHは、例えば、通常6.0〜10.0、好ましくは6.5〜9.0であってよい。
【０１５０】
反応温度は、例えば、通常15〜50℃、好ましくは15〜45℃、より好ましくは20〜40℃であってよい。
【０１５１】
反応時間は、第１の態様の工程（Ａ）および工程（Ｂ）のそれぞれについて、例えば、5分〜200時間であってよい。反応時間は、第２の態様の工程（Ｃ）について、例えば、5分〜200時間であってよい。反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
【０１５２】
反応液中の各基質の濃度は、例えば、通常0.1〜2000ｍM、好ましくは1〜2000ｍM、より好ましくは10〜1000ｍMであってよい。
【０１５３】
反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ａ）については、例えば、通常、Glu：Val：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ｂ）については、例えば、通常、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよい。すなわち、例えば、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第２の態様の工程（Ｃ）については、例えば、通常、Glu：Val：Gly：ATP＝1：1：1：2であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよく、ATPの比率を0.2〜20に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：Gly：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10：0.2〜20であってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様における各基質のモル比については、適宜、第２の態様における各基質のモル比を参考にしてもよい。
【０１５４】
酵素の使用量は、例えば、酵素活性に基づいて設定することができる。γ−グルタミルバリン合成酵素の使用量は、GluおよびValの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val生成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。ここでいう「γ-Glu-Val生成活性」とは、適切な条件、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｇ２＋の存在下、pH7.0〜9.0、特にpH9.0、で測定されたγ-Glu-Val生成活性であってよい。グルタチオン合成酵素の使用量は、第１の態様の工程（Ｂ）については、γ-Glu-ValおよびGlyの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。グルタチオン合成酵素の使用量は、第２の態様の工程（Ｃ）については、Gluの半量、Valの半量、およびGlyの全量の合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様におけるグルタチオン合成酵素の使用量については、適宜、第２の態様におけるグルタチオン合成酵素の使用量を参考にしてもよい。
【０１５５】
いずれの態様においても、酵素反応の過程において、基質、酵素、および／またはその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応条件は、酵素反応の開始から終了まで均一であってもよく、酵素反応の過程において変化してもよい。「反応条件が酵素反応の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で酵素反応を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
【０１５６】
このようにして酵素反応を実施することにより、γ-Glu-Val-Glyを含有する反応液が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、反応液から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶液からの結晶化、再結晶が挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。回収されるγ-Glu-Val-Glyは、γ-Glu-Val-Gly以外の成分、例えばγ-Glu-Val-Glyの製造に用いられた成分や水分等、を含んでいてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、所望の程度に精製されていてよい。γ-Glu-Val-Glyは、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上の純度に精製されてよい。また、γ-Glu-Valの回収も、γ-Glu-Val-Glyの回収と同様に行うことができる。
【０１５７】
＜４−２＞発酵法
本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素を利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）」ともいう。
【０１５８】
本発明においては、γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を利用することにより、GluとValからγ-Glu-Valを発酵生産することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、培養物から回収することができる。
【０１５９】
さらに、グルタチオン合成酵素を有する微生物を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の一態様（「第３の態様」ともいう）は、（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することにより工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１６０】
第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。また、第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物と、それとは別個の、グルタチオン合成酵素を有する微生物を用いて実施してもよく、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する単一の微生物を用いて実施してもよい。例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する微生物を利用し、Glu、Val、およびGlyが利用可能な状態で培養を実施すれば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを培地に添加して工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
【０１６１】
なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の工程（Ａ）は、例えば、第３の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
【０１６２】
また、本発明においては、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する微生物を利用することにより、GluとValとGlyとからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の別の態様（「第４の態様」ともいう）は、（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１６３】
発酵法において、酵素、アミノ酸、ペプチド、基質、酵素反応等の用語は、酵素法と同様の意味で使用する。また、γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物、グルタチオン合成酵素を有する微生物、およびγ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物を総称して「微生物」ともいう。なお、発酵法において、「γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物」とは、本発明の微生物であって、γ−グルタミルバリン合成酵素を有するものを指す。また、発酵法において、「γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する微生物」とは、本発明の微生物であって、γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有するものを指す。
【０１６４】
基質となる各アミノ酸の供給方法は、酵素反応に当該アミノ酸を利用できる限り特に制限されない。各アミノ酸は、例えば、各工程で用いられる微生物により生合成されてもよく、培地に添加されてもよく、その組み合わせであってもよい。すなわち、例えば、Glu、Val、およびGlyの全てが微生物により生合成されてもよく、Glu、Val、およびGlyの全てが培地に添加されてもよい。また、例えば、Glu、Val、およびGlyの内、１種または２種のアミノ酸が微生物により生合成され、他のアミノ酸が培地に添加されてもよい。Glu、Val、およびGlyのいずれも、微生物により生合成され、且つ、培地に添加されてもよい。
【０１６５】
すなわち、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の一態様は、例えば、（Ａ１）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよく、（Ａ２）γ−グルタミルバリン合成酵素を有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよい。
【０１６６】
また、第３の態様の一態様は、例えば、（Ａ１）と（Ａ２）のいずれか、および、（Ｂ１）と（Ｂ２）のいずれかを含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい：
（Ａ１）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ａ２）γ−グルタミルバリン合成酵素を有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ｂ１）グルタチオン合成酵素を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程；
（Ｂ２）グルタチオン合成酵素を有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【０１６７】
また、第４の態様の一態様は、例えば、（Ｃ１）γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物をGlu、Val、およびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよく、（Ｃ２）γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有し、且つ、Glu、Val、およびGlyの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。
【０１６８】
γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物としては、上述したような本発明の微生物であって、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するものを、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。グルタチオン合成酵素を有する微生物としては、上述したようなグルタチオン合成酵素遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物としては、上述したような本発明の微生物であって、γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子とグルタチオン合成酵素遺伝子の両方を有するものを、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。
【０１６９】
アミノ酸の生産能を有する微生物は、本来的にアミノ酸の生産能を有するものであってもよく、アミノ酸の生産能を有するように改変されたものであってもよい。アミノ酸の生産能を有する微生物は、微生物にアミノ酸生産能を付与することにより、または、微生物のアミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子および／またはグルタチオン合成酵素遺伝子の導入等の酵素生産能の付与または増強と、アミノ酸生産能の付与または増強とは、いずれを先に実施してもよい。すなわち、γ−グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有し、且つ、アミノ酸の生産能を有する微生物は、γ−グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有する微生物を、アミノ酸生産能を有するように改変することにより取得してもよく、アミノ酸生産能を有する微生物を、γ−グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有するように改変することにより取得してもよい。Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。
【０１７０】
Ｌ−グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869株より取得されたodhA欠損株に、V197M変異を有するmviN遺伝子を導入した組換え株（特開2010-161970）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来gltA（クエン酸シンターゼ）遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスAJ13355株（特許第4285582号）、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたグルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属細菌（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）などが例示できる。Ｌ−バリン生産菌としては、エシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5658766号）、エシェリヒア属に属し、生育のためにリポ酸を要求する変異および／またはH+-ATPaseを欠損する変異を有するエシェリヒア属細菌、および、これらの性質に加えて、少なくともilvG、ilvM、ilvE、およびilvDの各遺伝子を発現し、且つ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌（WO96/06926）などが例示できる。すなわち、例えば、これらの改変を微生物に導入することにより、アミノ酸生産能を付与または増強できる。
【０１７１】
また、微生物は、培地中に添加されたアミノ酸を取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、その利用態様に応じて、生成したγ-Glu-Valを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよく、培地中に添加されたγ-Glu-Valを取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、生成したγ-Glu-Val-Glyを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよい。
【０１７２】
培養条件は、微生物が増殖でき、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り、特に制限されない。培養条件については、上述したγ−グルタミルバリン合成酵素の製造法における培養条件の記載を参照できる。
【０１７３】
γ−グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素は、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、各工程で用いられる微生物により生成されてもよく、上述したようなATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPの供給には、例えば、通常のエネルギー代謝によるATP再生系が強化された微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する能力を有する微生物を培養液中に共存させる方法等の共培養系（特公平7-16431、特公平6-69386）が好適に利用できる。
【０１７４】
また、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素は、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。
【０１７５】
アミノ酸を含有する培地を用いる場合、アミノ酸は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。添加のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜変更できるが、一例としては、培養終了時の好ましくは０〜５０時間前、より好ましくは０．１〜２４時間前、特に好ましくは０．５〜６時間前であってよい。アミノ酸は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。培地中の各アミノ酸の濃度は、例えば、通常0.1〜2000ｍM、好ましくは1〜2000ｍM、より好ましくは10〜1000ｍMであってよい。また、培地中の各基質のモル比については、酵素法における反応液中の各基質のモル比に関する記載を準用してもよい。
【０１７６】
このようにして培養を行うことにより、γ-Glu-Val-Glyを含む培養物が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、上述したように、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、培養物から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、上述したように、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってγ-Glu-Val-Glyを回収することができる。
【０１７７】
また、グルタチオン合成酵素を有する微生物が酵母であり、γ-Glu-Val-Glyが菌体内に蓄積する場合、同酵母は、例えば、γ-Glu-Val-Glyを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明は、同酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Val-Glyを含有する酵母エキスの製造法を提供する。酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【実施例】
【０１７８】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。【０１７９】
〔実施例１〕ybdK遺伝子発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）のybdK遺伝子の発現プラスミドpSF12-EcybdKを以下の手順で構築した。ybdK遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるYBDKアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に示す。なお、pSF12-EcybdKによれば、YBDKはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。【０１８０】
初めに、エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）由来のγ-グルタミルトランスペプチダーゼをコードするggt遺伝子とrpoHプロモーターを含むpUC18由来プラスミドpSF12_ggt（WO2013/051685A1）をNdeI/PstI消化し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）にて精製し、約3.0kbの断片を得た。【０１８１】
次に、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型として、PrimeSTAR Maxポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して、製造元のプロトコールに従ってPCRを行い、ybdK遺伝子を含む約1.2kbの断片を得た。プライマーとしては、配列番号１および配列番号２のプライマーの組み合わせ（表１）を使用した。【０１８２】
次に、pSF12_ggtをNdeI/PstI消化して得られた約3.0kbの断片とPCRで得られたybdK遺伝子を含む約1.2kbの断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて、製造元のプロトコールに従って融合させた。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地（1.0%（w/v）ペプトン、0.5%（w/v）酵母エキス、1.0%（w/v）NaCl、1.5%（w/v）寒天）に塗布後、30℃で20時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3130ジェネティックアナライザー（Life Technologies社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSF12-EcybdKと命名した。【０１８３】
【表１】
2017039001.tif 000003
【０１８４】
〔実施例２〕C末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリMG1655株由来YBDKの精製
実施例１で取得したpSF12-EcybdKプラスミドを有するJM109株を100μg/mLのAmpを含むLB培地3 mLに接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養することで前培養液を得た。得られた前培養液150μLを、100μg/mLのAmpを含むTB培地（1.2%（w/v）トリプトン、2.4%（w/v）酵母エキス、0.4%（w/v）グリセロール、0.23%（w/v）KH2PO4、1.25%（w/v）K2HPO4）15 mLを張り込んだ70 mL容の試験管（φ25mm）に接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養した。遠心分離（4℃、12,000×g、5分）によって集菌し、得られた菌体を0.2 mLの緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）に懸濁し、冷却しながら超音波破砕処理に供して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（4℃、29,100×ｇ、10分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。【０１８５】
得られた無細胞抽出液を、予め緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）で平衡化したNi Sepharose 6 Fast Flowビーズ（GEヘルスケア社製）にアプライし、溶離緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 250 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）により酵素を溶出し、活性画分を得た。この活性画分を精製YBDKとして、以降の実験に用いた。【０１８６】
〔実施例３〕精製YBDKによるγ−グルタミルジペプチドの生成
実施例２で取得した精製YBDKについて、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。【０１８７】
γ-Glu-Val合成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は10 mM グルタミン酸、10 mM バリン、10 mM ATP、10 mM MnS04、100 mM Tris-HCl (pH7.0)とした。反応液量は0.2 mLとし、精製酵素を添加することによって酵素反応を開始した。この時、精製YBDKは0.1 g/Lとなるように反応液に添加した。反応温度は30℃とし、反応時間は30分間とした。反応を停止する際には、反応液0.2 mLに対して、0.2 mLの200 mM 硫酸を添加した。反応終了後に、HPLCにて生成したγ-Glu-Valを定量した。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Val合成活性とした。【０１８８】
γ-Glu-Valの定量条件は以下の通りである。カラムには、Phenomenex社製Synergi 4μ Hydro-RP 80A（粒子径4μm、内径4.6 mm、長さ250 mm）を用いた。溶離液には、溶離液A（50 mMリン酸二水素ナトリウム（pH2.5、リン酸によってpH調整））、及び、溶離液B（溶離液Aとアセトニトリルの1:1（v/v）の混合液）を93:7（v/v）の比率で混合した混合液を用いた。流速は1.0 mL/min、カラム温度は40℃、UV検出波長は210 nmとした。【０１８９】
γ-Glu-Gly合成活性を測定する場合には、上記反応液中のバリンをグリシンに置き換え、精製YBDKを0.025 g/Lとなるように反応液に添加し、酵素反応を実施した。上記の手順で反応を停止した後、生成したγ-Glu-Glyを定量した。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Gly合成活性とした。【０１９０】
γ-Glu-Glyの定量条件は以下の通りである。カラムには、ジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3（粒子径5μm、内径4.6 mm、長さ250 mm）を用いた。溶離液には、溶離液C（100 mMリン酸二水素カリウム、5 mMオクタンスルホン酸ナトリウム（pH2.2、リン酸によってpH調整））を用いた。流速は1.5 mL/min、カラム温度は40℃、UV検出波長は210 nmとした。【０１９１】
以上の方法により、γ-Glu-Val生成量及びγ-Glu-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表２に示す。表中、「反応(A)」はγ-Glu-Gly合成活性の比活性、「反応(B)」はγ-Glu-Val合成活性の比活性、「(B)/(A)」は、γ-Glu-Gly合成活性の比活性に対するγ-Glu-Val合成活性の比活性の比率をそれぞれ示す。【０１９２】
【表２】
2017039001.tif 000004
【０１９３】
〔実施例４〕エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子、gshA遺伝子、及びybdK遺伝子の三重破壊株の作製
（１）エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子破壊株の作製
エシェリヒア・コリJM109株を親株として、GGT非産生株の構築を行った。ggt遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGGTのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５および配列番号２６に示す。【０１９４】
遺伝子の破壊は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）を組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）によって行った。「Red-driven integration」法によれば、標的遺伝子の一部に対応する配列を5'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRにより得られた抗生物質耐性遺伝子を含むPCR産物を用いて、染色体上の標的遺伝子を抗生物質耐性遺伝子に置換し、遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。【０１９５】
「Red-driven integration」法のPCRの鋳型としては、pMW118-attL-Cm-attR（WO2006/078039）を使用した。pMW118-attL-Cm-attR（WO2006/078039）は、pMW118（ニッポンジーン社製）にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-cat-attRの順で挿入されている。このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3'末端に、標的遺伝子の一部に対応する配列をプライマーの5'末端に有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行い、遺伝子破壊用断片を得た。得られた遺伝子破壊用断片を用いて遺伝子破壊株を構築した。手順を以下に示す。【０１９６】
ggt遺伝子破壊用断片は次のようにして取得した。すなわち、エシェリヒア・コリJM109株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて、KOD-plus-Ver.2（東洋紡社製）にて製造元のプロトコールに従ってPCRを行うことで、ggt遺伝子上流0.3kbを増幅し、DNAフラグメントAを得た。同様に、エシェリヒア・コリJM109株のゲノムDNAを鋳型に、配列番号５および配列番号６のプライマーを用いてPCRを行うことで、ggt遺伝子下流領域0.3kbを増幅し、DNAフラグメントCを得た。同様に、pMW118-attL-Cm-attRを鋳型として、配列番号７および配列番号８のプライマーを用いてPCRを行うことで、1.6kbのDNAフラグメントBを得た。50μLのPCR反応液に対してフラグメントA／B／Cを50/10/50ngとして、10サイクルのPCR反応を行った。この反応液（１μL）を鋳型として、配列番号３および配列番号６のプライマーを用いて、2kbのDNA断片を増幅し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）にて精製し、ggt遺伝子破壊用断片を得た。用いたプライマーを表３に示す。【０１９７】
【表３】
2017039001.tif 000005
【０１９８】
得られたggt遺伝子破壊用DNA断片を、プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）を含むエシェリヒア・コリJM109株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46は、アラビノース誘導性PａｒａＢプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRedレコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL Accession；JO2459、第31088〜33241位）を含む、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。プラスミドpKD46は遺伝子破壊用DNA断片をJM109株の染色体に組み込むために必要である。【０１９９】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg/LのAmpを含んだLB培地中で30℃、20時間培養したプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリJM109株を、Amp（100mg/L）を含んだ2mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrrok, J.ら，Cold SpringHarbor Laboratory Press（1989年））で50倍希釈した。得られた希釈物を30℃でOD610が約0.3になるまで生育させた後、10%（v/v）のＬ−アラビノースを70μL添加し、37℃で1時間培養した。得られた培養液を65倍に濃縮し、10%（v/v）グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーション用のコンピテントセルを得た。【０２００】
エレクトロポレーション後、細胞懸濁液に、0.3mLのSOC培地を加えて37℃で3時間培養した後、37℃でクロラムフェニコール（Cm）（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。【０２０１】
次に、pKD46プラスミドを除去するために、Cm（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で42℃にて培養し、得られたコロニーのAmp耐性を試験し、pKD46が脱落しているAmp感受性株を取得した。Cm耐性遺伝子によって識別できた変異体のggt遺伝子の破壊を、PCRによって確認した。得られたggt遺伝子破壊株をJM109Δggt:att-cat株と命名した。【０２０２】
次に、ggt遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子の除去を行うために、ヘルパープラスミドとしてpMW-intxis-ts（WO2007/037460）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、及び、エクシジョナーゼ（Xis）をコードする遺伝子を搭載する、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pMW-intxis-ts導入により、染色体上のattLあるいはattRを認識して組換えを起こし、attLとattRの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはattLあるいはattR配列のみ残る。上記で得られたJM109Δggt:att-cat株を、pMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/LのAmpを含むLB-寒天培地上にて培養し、Amp耐性株を選択した。【０２０３】
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地にて42℃で培養し、得られたコロニーのAmp耐性及びCm耐性を試験して、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落し、かつ、ggt遺伝子が破壊された株である、Cm及びAmp感受性株を取得した。この株をJM109Δggt株と命名した。【０２０４】
（２）エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子及びgshA遺伝子の２重破壊株の作製
エシェリヒア・コリJM109Δggt株を親株として、GGT及びGSHA非産生株の構築を行った。gshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および配列番号２４に示す。【０２０５】
gshA遺伝子破壊用DNA断片は、pMW118-attL-Cm-attRを鋳型とし、配列番号９および配列番号１０のプライマー（表４）を用いて、KOD-plus-Ver.2（東洋紡社製）にて製造元のプロトコールに従ってPCRを行うことで得た。そのgshA遺伝子破壊用DNA断片を、pKD46を含むJM109Δggt株にエレクトロポレーションにより導入した。pKD46を含むJM109Δggt株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは、実施例４（１）に記載の方法と同様の手法で取得した。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液に、0.3mLのSOC培地を加えて37℃で3時間培養した後、37℃でCm（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Cm（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で42℃にて培養し、得られたコロニーのAmp耐性を試験し、pKD46が脱落しているAmp感受性株を取得した。Cm耐性遺伝子によって識別できた変異体のgshA遺伝子の破壊を、PCRによって確認した。得られたgshA遺伝子破壊株をJM109ΔggtΔgshA:att-cat株と命名した。【０２０６】
次に、gshA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子の除去を行うために、上記で得られたJM109ΔggtΔgshA:att-cat株を、pMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/LのAmpを含むLB-寒天培地上にて培養し、Amp耐性株を選択した。【０２０７】
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地にて42℃で培養し、得られたコロニーのAmp耐性及びCm耐性を試験して、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落し、かつ、gshA遺伝子が破壊された株である、Cm及びAmp感受性株を取得した。この株をJM109ΔggtΔgshA株と命名した。【０２０８】
【表４】
2017039001.tif 000006
【０２０９】
（３）エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子、gshA遺伝子、及びybdK遺伝子の３重破壊株の作製
エシェリヒア・コリJM109ΔggtΔgshA株を親株として、GGT、GSHA、及びYBDK非産生株の構築を行った。ybdK遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるYBDKのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および配列番号１６に示す。【０２１０】
ybdK遺伝子破壊用DNA断片は、pMW118-attL-Cm-attRを鋳型とし、配列番号１１および配列番号１２のプライマー（表５）を用いて、PrimeSTAR Maxポリメラーゼ（タカラバイオ社製）にて製造元のプロトコールに従ってPCRを行うことで得た。そのybdK遺伝子破壊用DNA断片を、pKD46を含むJM109ΔggtΔgshA株にエレクトロポレーションにより導入した。pKD46を含むJM109ΔggtΔgshA株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは、実施例４（１）に記載の方法と同様の手法で取得した。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液に、0.3mLのSOC培地を加えて37℃で3時間培養した後、37℃でCm（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。【０２１１】
次に、pKD46プラスミドを除去するために、Cm（50mg/L）を含むLB-寒天培地上で42℃にて培養し、得られたコロニーのAmp耐性を試験し、pKD46が脱落しているAmp感受性株を取得した。Cm耐性遺伝子によって識別できた変異体のybdK遺伝子の破壊を、PCRによって確認した。得られたybdK遺伝子破壊株をJM109ΔggtΔgshAΔybdK:att-cat株と命名した。【０２１２】
次に、ybdK遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子の除去を行うために、上記で得られたJM109ΔggtΔgshAΔybdK:att-cat株を、pMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/LのAmpを含むLB-寒天培地上にて培養し、Amp耐性株を選択した。【０２１３】
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地にて42℃で培養し、得られたコロニーのAmp耐性及びCm耐性を試験して、att-cat及びpMW-intxis-tsが脱落し、かつ、ybdK遺伝子が破壊された株である、Cm及びAmp感受性株を取得した。この株をJM109ΔggtΔgshAΔybdK株と命名した。【０２１４】
【表５】
2017039001.tif 000007
【０２１５】
〔実施例５〕コクリア・ロゼア由来γ-Glu-Val合成酵素発現株の構築
エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子及びgshA遺伝子の２重破壊株（JM109ΔggtΔgshA）およびggt遺伝子、gshA遺伝子、及びybdK遺伝子の３重破壊株（JM109ΔggtΔgshAΔybdK）を発現宿主として、コクリア・ロゼア由来γ-Glu-Val合成酵素発現株を構築した。コクリア・ロゼア（AJ3132）株由来のγ-Glu-Val合成酵素をコードするKrgshA遺伝子の塩基配列を配列番号１７に示す。同遺伝子にコードされるγ-Glu-Val合成酵素のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、KrgshA遺伝子の発現プラスミドpSF-KrgshAの構築に際し、KrgshA遺伝子の塩基配列（配列番号１７）を基に、エシェリヒア・コリ発現用にコドンを最適化した塩基配列をデザインした。エシェリヒア・コリ発現用にコドンを最適化したKrgshA遺伝子の塩基配列を配列番号２９に示す。【０２１６】
初めに、エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）由来のγ-グルタミルトランスペプチダーゼをコードするggt遺伝子とrpoHプロモーターを含むpUC18由来プラスミドpSF12_ggt（WO2013/051685A1）をNdeI/PstI消化し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）にて精製し、約3.0kbの断片を得た。【０２１７】
次に、コクリア・ロゼア（AJ3132）由来のKrgshA遺伝子の塩基配列（配列番号１７）を基に、エシェリヒア・コリ発現用にコドンを最適化したcDNA（配列番号２９）をユーロフィンジェノミクス株式会社に発注した。納品されたプラスミドを鋳型にPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（FINNZYMES社製）を使用して、製造元のプロトコールに従ってPCRを行い、KrgshA遺伝子を含む約1.2kbの断片を得た。プライマーとしては、配列番号１３および配列番号１４の組合せ（表６）を使用した。【０２１８】
次に、PCRで得られたKrgshA遺伝子を含む約1.2kbのPCR断片とpSF12_ggtをNdeI/PstI消化して得られた約3.0kbの断片を、In-fusion HD Cloning Kit（Clonech社製）を用いて、製造元のプロトコールに従って融合させた。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地に塗布後、30℃で20時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3130ジェネティックアナライザー（Life Technologies社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpSF12-KrGshAと命名した。【０２１９】
実施例４にて取得したJM109ΔggtΔgshA株とJM109ΔggtΔgshAΔybdK株をpSF12-KrgshAにてそれぞれ形質転換し、pSF12KrgshAを有する形質転換体を得た。この形質転換体を、それぞれJM109ΔggtΔgshA/pSF12-KrgshA株およびJM109ΔggtΔgshAΔybdK/pSF12-KrgshA株と命名した。【０２２０】
【表６】
2017039001.tif 000008
【０２２１】
〔実施例６〕コクリア・ロゼア由来γ-Glu-Val合成酵素発現株の無細胞抽出液を用いたγ−グルタミルジペプチドの生成
エシェリヒア・コリJM109株由来ggt遺伝子及びgshA遺伝子の２重破壊株（JM109ΔggtΔgshA）およびggt遺伝子、gshA遺伝子、及びybdK遺伝子の３重破壊株（JM109ΔggtΔgshAΔybdK）を発現宿主として構築したコクリア・ロゼア由来γ-Glu-Val合成酵素発現株の無細胞抽出液を用いたγ−グルタミルジペプチドの生成を検討した。【０２２２】
実施例５で取得したJM109ΔggtΔgshA/pSF12-KrgshA株とJM109ΔggtΔgshAΔybdK/pSF12-KrgshA株をそれぞれ100μg/mLのAmpを含むLB培地3mLに接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養することで前培養液を得た。得られた前培養液150μLを、100μg/mLのAmpを含むTB培地15mLを張り込んだ70mL容の試験管（φ25mm）に接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養した。遠心分離（4℃、12,000×g、5分）によって集菌し、得られた菌体を0.2 mLの緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）に懸濁し、冷却しながら超音波破砕処理に供して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（4℃、29,100×ｇ、10分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。【０２２３】
まず、該無細胞抽出液を用いてγ-Glu-Val合成活性を測定した。反応液組成は100 mM グルタミン酸、100 mM バリン、40 mM ATP、20 mM MgS04、100 mM Tris-HCl (pH 7.0)とした。反応液量は0.5 mLとした。0.25 mgのタンパク質を含む無細胞抽出液を添加することによって酵素反応を開始した。反応温度は30℃とし、反応時間は30分間とした。反応を停止する際には、反応液0.5 mLに対して、0.5 mLの200 mM硫酸を添加した。反応終了後に、実施例３に示した方法でγ-Glu-Valを定量し、無細胞抽出液当たりのγ-Glu-Val合成活性を算出した。その結果を表７に示す。【０２２４】
【表７】
2017039001.tif 000009
【０２２５】
続いて、得られた無細胞抽出液を用いて、Glu、Val、及びGly存在下でのγ-Glu-Val合成量及びγ-Glu-Gly合成量を測定した。反応液組成は100 mM グルタミン酸、50 mM バリン、50 mM グリシン、40 mM ATP、20 mM MgS04、100 mM Tris-HCl (pH 7.0)とした。無細胞抽出液を添加することによって酵素反応を開始した。反応を停止する際には、反応液量と等量の200mM 硫酸を添加した。反応終了後に、実施例３に示した方法でγ-Glu-Val及びγ-Glu-Glyを定量した。その結果を表８と表９に示す。なお、表８は、γ-Glu-Val合成酵素活性が0.004 Uとなるように無細胞抽出液を反応液に添加した場合の結果を示す。その際の反応液量は0.2 mLとし、反応温度は30℃、反応時間は16時間とした。また、表９は、2.5 mgのタンパク質を含む無細胞抽出液を反応液に添加した場合の結果を示す。その際の反応液量は0.5 mLとし、反応温度は30℃、反応時間は2.5時間とした。【０２２６】
【表８】
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【０２２７】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【０２２８】
本発明によれば、γ-Glu-Val合成酵素の発現宿主として有用な微生物を提供できる。同微生物で発現させたγ-Glu-Val合成酵素を利用して、γ-Glu-Valやγ-Glu-Val-Glyを効率よく製造することができる。例えば、同微生物で発現させたγ-Glu-Val合成酵素をグルタチオン合成酵素と組み合わせて利用することにより、Glu、Val、及びGlyを原料として、γ-Glu-Glyの副生を低減しつつγ-Glu-Val-Glyを製造することができると期待される。【０２２９】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜１４：プライマー
配列番号１５：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のybdK遺伝子の塩基配列
配列番号１６：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のYBDKのアミノ酸配列
配列番号１７：コクリア・ロゼア（AJ3132）のγ-Glu-Val合成酵素遺伝子の塩基配列
配列番号１８：コクリア・ロゼア（AJ3132）のγ-Glu-Val合成酵素のアミノ酸配列
配列番号１９：コクリア・リゾフィラDC2201株のγ-Glu-Val合成酵素遺伝子の塩基配列
配列番号２０：コクリア・リゾフィラDC2201株のγ-Glu-Val合成酵素のアミノ酸配列
配列番号２１：ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株のγ-Glu-Val合成酵素遺伝子の塩基配列
配列番号２２：ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株のγ-Glu-Val合成酵素のアミノ酸配列
配列番号２３：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のgshA遺伝子の塩基配列
配列番号２４：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のGSHAのアミノ酸配列
配列番号２５：エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のggt遺伝子の塩基配列
配列番号２６：エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のGGTのアミノ酸配列
配列番号２７：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のgshB遺伝子の塩基配列
配列番号２８：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のGSHBのアミノ酸配列
配列番号２９：エシェリヒア・コリでの発現に最適化したコクリア・ロゼア（AJ3132）のγ-Glu-Val合成酵素遺伝子の塩基配列
【配列表】
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【国際調査報告】
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