(57)【要約】  本発明の目的は、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、シゾフィランと複合化した場合に、RNaseに対する耐性が高く、しかも効果的にRNAi活性を示す化学修飾siRNAを提供することである。  センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている修飾siRNAにおいて、センス鎖の塩基配列におけるＣＡ、ＵＡ、及びＵＧのジヌクレオチド配列、及びアンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列におけるＣＡ、ＵＡ、及びＵＧのジヌクレオチド配列に対して、特定の化学修飾を施すことにより、前記課題が解決できる。
2018097296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、
センス鎖の塩基配列が、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列が、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含み、且つ
下記条件(i)〜(ix)を満たす化学修飾siRNA：
(i)センス鎖の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iv)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の５’末端側から１〜７番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
(viii)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の５’末端側から１番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ix)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。
【請求項２】
前記ポリデオキシアデニル酸が１０〜１００塩基長である、請求項１に記載の化学修飾siRNA。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化学修飾siRNAがシゾフィランと複合化されている、シゾフィラン／化学修飾siRNA複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明が、化学修飾siRNAに関する。より具体的には、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、シゾフィランと複合化した場合に、RNaseに対する耐性が高く、しかも効果的にRNAi活性を示す化学修飾siRNAに関する。
【背景技術】
【０００２】
1998年に発見されたRNA干渉（RNAi）、その効果の大きさや持続性が従来のアンチセンス法に比較して顕著に優れており、画期的な遺伝子発現阻害方法であることから医薬応用が期待されてきた。しかしながら、RNAi活性を示す2本鎖RNA（即ちsiRNA）は、投与から標的細胞に取り込まれる過程、もしくは細胞内で分解されることが多く、その活性本体であるRISC複合体を細胞内で形成することが困難であった。【０００３】
好適なアルゴリズムでデザインされた未修飾のsiRNAは、期待されるRNAi活性を果たすために生体内や細胞内での脆弱性から、例えば血中等に存在するRNaseにより極めて容易に分解され、標的細胞でRNAi効果を発揮するものは少ない。そこで、従来から、RNase耐性となるような様々な化学修飾をsiRNAに施すことが提案されている（非特許文献１〜３）。しかしながら、核酸医薬として開発されているsiRNAは、その殆どが全塩基に対して化学修飾を施しており、そのことが起因して、配列設計当初の未修飾のsiRNAに期待されたRNAi 活性を果たし得ない結果に繋がっている。即ち、少ない化学修飾でRNase耐性に優れ、且つ本来期待された通りにRNAi 活性を誘導するような化学修飾siRNAは見出されていないのが現状である(非特許文献４)。【０００４】
一方、siRNAのデリバリー技術として、ポリデオキシアデニル酸が付加されたsiRNAとシゾフィラン（SPG）のsiRNA/SPG複合体が提案されている（特許文献１を参照）。当該siRNA/SPG複合体は、樹状細胞等のDectin-1発現細胞に対してsiRNAを選択的に送達でき、しかも細胞内に送達されると、RNAi効果を有効に発揮できるので、核酸医薬としての実用化が期待されている。当該siRNA/SPG複合体は、siRNAがSPGによって包埋された状態になっているため、ある程度のRNase耐性は期待できるが、多くのRNaseが存在する血中内では、RNaseによる分解は避けられず、当該siRNA/SPG複合体を核酸医薬として開発するには、RNAi活性を維持させつつ、RNaseに対する耐性を向上させる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Development of Therapeutic-Grade Small Interfering RNAs by Chemical Engineering, Jesper B. Bramsen and Jorgen Kjems, Front Genet. 2012; 3: 154.
【非特許文献２】Oligonucleotide Therapies: The Past and the Present, Karin E. Lundin, Olof Gissberg, and C.I. Edvard Smith, Hum Gene Ther. 2015 Aug 1; 26(8): 475-485.
【非特許文献３】siRNAmod: A database of experimentally validated chemically modified siRNAs, Showkat Ahmad Dar, Anamika Thakur, Abid Qureshi & Manoj Kumar, Sci Rep.2016; 6: 20031.
【非特許文献４】Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics, Gulnihal Ozcan, Bulent Ozpolat, Robert L. Coleman, Anil K. Sood, and Gabriel Lopez-Berestein, Adv Drug Deliv Rev. 2015 June 29; 87: 108-119.
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2009/078470公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸（特に限定されない限り、以下、ホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニル酸も含む意味で用いる）が付加されている化学修飾siRNAであって、シゾフィランと複合化した場合に、RNaseに対する耐性が高く、しかも効果的にRNAi活性を示す化学修飾siRNAを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されているsiRNAに対して、化学修飾を行ってRNaseに対する耐性を向上させる場合には、当業者であれば、通常、(1)センス鎖との接合力が特に弱いとされるアンチセンス鎖の５’末端側、(2)siRNAとポリデオキシアデニル酸のつなぎ目の近傍、の２カ所には化学修飾によるRNaseに対する耐性の強化が不可欠と考えられるところ、本発明者等は、これらの2カ所に化学修飾を施しても、RNaseに対する耐性が十分に向上しないことを確認した。更に、公知文献で報告されているsiRNAの化学修飾法について検討を行った。【０００９】
このような状況の下、本発明者等は、鋭意検討を行うことにより、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されているsiRNAに対して、通常のポリデオキシアデニル酸を付加しないsiRNAに比較して、特定の塩基に特定の化学修飾を施すことにより、比較的少ない化学修飾であっても、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されているsiRNAに対して、シゾフィランと複合化した際のRNaseに対する耐性を格段に向上させて、効果的にRNAi活性を示すことが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。下記項１の条件(i)〜(ix)に示す本発明の修飾法を本明細書中ではA-3修飾ともいう。
項１．  センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、
センス鎖の塩基配列が、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含み、
アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列が、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含み、且つ
下記条件(i)〜(ix)を満たす化学修飾siRNA：
(i)センス鎖の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iv)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の５’末端側から１〜７番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
(viii)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の５’末端側から１番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば２’位をフルオロ基で修飾されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば２’位をメトキシ基で修飾されている。
(ix)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。
項２．  前記ポリデオキシアデニル酸が１０〜１００塩基長である、項１に記載の化学修飾siRNA。
項３．  項１又は２に記載の化学修飾siRNAがシゾフィランと複合化されている、シゾフィラン／化学修飾siRNA複合体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、比較的少ない化学修飾を施すことにより、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている化学修飾siRNAであって、シゾフィランと複合化した場合に、RNaseに対する耐性が高く、しかも効果的にRNAi活性を示す化学修飾siRNAを提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考試験例１において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図２】参考試験例２において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図３】参考試験例３において、各種化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図４】参考試験例４において、各種化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図５】試験例１において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図６】試験例２において、各種修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図７】試験例３において、各種修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、x-vivo MLR（リンパ球混合培養）アッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図８】試験例４において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、２以上の塩基からなる塩基配列を示す場合には、塩基配列の左端が５’末端、右端が３’末端である。
【００１４】
１．化学修飾siRNA
ポリデオキシアデニル酸が付加されたsiRNAの塩基配列・構造
本発明の化学修飾siRNAは、センス鎖の５’末端にポリデオキシアデニル酸が付加されてなり、センス鎖及びアンチセンス鎖が特定のジヌクレオチド配列を含み、当該ジヌクレオチド配列に特定の化学修飾が施されていることを特徴とする。以下、本発明の化学修飾siRNAについて詳述する。
【００１５】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基配列については、標的遺伝子中の標的配列に応じて設定される。標的遺伝子中の標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）等に従って公知の手法で設定することができる。siRNAは、通常、当該標的配列に対して100％一致する配列を含むか、所望のRNA干渉効果が得られる限り当該標的配列から１又は数個の塩基が置換・付加されていている配列を含むように設計される。また、アンチセンス鎖の5’末端がA/Uペアであり、センス鎖の5’末端がG/Cペアであり、アンチセンス鎖の5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することによって、優れたRNA干渉効果をもつsiRNAをデザインできることも報告されている（Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)）。例えば、CD40に対するsiRNAとして、配列番号１に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号３に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号５に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号７に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号９に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１０に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA等が挙げられる。
【００１６】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖の塩基配列は、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含み、且つアンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列が、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなる群から選択される少なくとも１種のジヌクレオチド配列を含む。かかるジヌクレオチド配列について、後述する特定の化学修飾を施すことにより、SPGと複合化した際に、RNAi活性を維持させつつRNaseに対する耐性を向上させることが可能になる。
【００１７】
本発明の化学修飾siRNAの標的遺伝子については、特に制限されず、当該化学修飾siRNAの用途に基づいて適宜選択すればよいが、医薬用途への使用という観点からは、病態に関与しており、その発現抑制が望まれている遺伝子が好適である。
【００１８】
本発明の化学修飾siRNAの標的遺伝子の好適な一態様として、Dectin-1発現細胞において発現され、且つ当該細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子が挙げられる。Dectin-1とは、細胞膜上に存在するC型レプチンタイプの糖鎖認識ドメインを有する受容体（Pattern Recognition Receptor）である。Dectin-1は、細胞外にSPGを特異的に認識する領域を有し、細胞内にITAM（immunoreceptor tyrosinase-based activation motif-1）と呼ばれる活性化シグナルを伝えるモチーフを持つ。Dectin-1はSPGを認識すると、NF-κBや炎症性サイトカインの産生を促し、生体防御反応を惹起する。Dectin-1発現細胞としては、具体的には、マクロファージ、樹状細胞、好中球等が挙げられる。SPGはβ-1,3-グルカン骨格を有しており、Dectin-1発現細胞の細胞膜に存在するDctin-1と結合することによって、エンドサイトーシスでDectin-1発現細部内に送達されることが知られている。本発明の化学修飾siRNAをSPGと複合化すると、SPGがDectin-1に認識されることにより、本発明の化学修飾siRNAがDectin-1発現細胞内に選択的に送達することが可能になる。また、本発明の化学修飾siRNAの標的遺伝子として、Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子を選択することにより、生体内の免疫抑制を誘導して、免疫を調節することが可能になる。
【００１９】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、Dectin-1発現細胞において発現され、当該細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子を標的遺伝子にする場合、その遺伝子の種類は特に制限されず、本発明の化学修飾siRNAの用途に基づいて適宜選択することができるが、生体内の免疫調節、とりわけ免疫抑制をより有効に誘導するとの観点から、好適な標的遺伝子として、CD40等の共刺激因子（共刺激分子ともいう）をコードする遺伝子をはじめとする抗原提示に関連する遺伝子等が挙げられる。
【００２０】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖の塩基長については、特に制限されないが、好ましくは２１が挙げられる。
【００２１】
また、本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖が、両３’末端の２〜５個程度度のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドからなるダングリングエンドを持つようにハイブリダイズして二本鎖を形成しているものであってもよい。
【００２２】
本発明の化学修飾siRNAの好適な態様の一例として、センス鎖及びアンチセンス鎖の塩基長が共に２１であり、且つセンス鎖の5'末端及びアンチセンス鎖の３'末端に２個のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドからなるダングリングエンドが形成されているものが挙げられる。即ち、このようなsiRNAの場合には、アンチセンス鎖の３'末端側から３〜２１番目のリボヌクレオチド配列は、センス鎖の5'末端側から１〜１９番目のリボヌクレオチド配列に相補的になる。
【００２３】
本発明の化学修飾siRNAでは、センス鎖の5'末端にポリデオキシアデニル酸が付加されている。当該ポリデオキシアデニル酸は、２本のSPGと３重螺旋構造を形成し、本発明の化学修飾siRNAをSPGと複合化させる役割を担う。
【００２４】
ポリデオキシアデニル酸を構成するデオキシアデニル酸残基の数としては、SPGとの複合体形成が可能であることを限度として、特に制限されるものではないが、例えば、１０〜１００個、好ましくは２０〜１００個、より好ましくは２０〜８０個、更に好ましくは３０〜５０個が挙げられる。
【００２５】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、ポリデオキシアデニル酸は、センス鎖の5'末端にホスホジエステル結合によって直接結合していることが好ましいが、センス鎖の5'末端にリンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。
【００２６】
また、本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖、アンチセンス鎖、及びポリデオキシアデニル酸のホスホジエステル結合は、一部又は全てがホスホロチオエート化（S化）されていてもよい。本発明の化学修飾siRNAのポリデオキシアデニル酸部分については、S化されていることが好ましい。S化されているホスホジエステル結合とは、ホスホジエステル結合部分のリン酸残基の酸素原子の一つが硫黄原子に置換されている結合構造である。
【００２７】
siRNAの化学修飾
本発明の化学修飾siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖に対して、後述する条件(i)〜(ix)に従った化学修飾（A-3修飾）が施されている。なお、本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖は後述する条件(i)〜(ix)以外の化学修飾は行わないことを要する。
【００２８】
＜センス鎖の化学修飾＞
本発明の化学修飾siRNAのセンス鎖は、以下の条件(i)〜(iii)を満たすように化学修飾が施される。
(i)センス鎖の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(ii)センス鎖の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(iii)センス鎖の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
【００２９】
即ち、例えば、siRNAのセンス鎖が表１の(A)に示す２１塩基長の塩基配列である場合には、条件(i)〜(iii)に従った化学修飾を施したものとして、表１の(B)に示す態様が挙げられる。
【表１】
2018097296.tif 000003
【００３０】
＜アンチセンス鎖の化学修飾＞
本発明の化学修飾siRNAのアンチセンス鎖は、以下の条件(iv)〜(vii)を満たすように化学修飾が施される。
(iv)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＣＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(v)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＡからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vi)アンチセンス鎖の５’末端側から８番目以降の塩基配列において、ＵＧからなるジヌクレオチド配列が含まれる場合には、当該ジヌクレオチド配列中のウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、当該ジヌクレオチド配列中のグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。
(vii)アンチセンス鎖の５’末端側から１〜７番目のリボヌクレオチド残基は、化学修飾が施されていない。
【００３１】
即ち、例えば、siRNAのアンチセンス鎖が表２の(A)に示す２１塩基長の塩基配列である場合には、条件(iv)〜(vii)に従った化学修飾を施したものとして、表２の(B)に示す態様が挙げられる。
【表２】
2018097296.tif 000004
【００３２】
＜ポリデオキシアデニル酸の近傍における化学修飾＞
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基は、ポリデオキシアデニル酸に最も近接する位置に配されている。本発明の化学修飾siRNAでは、これらのリボヌクレオチド残基については、前記条件(i)〜(vii)をそのまま当てはめてはいけない場合がある。
【００３３】
具体的には、本発明の化学修飾siRNAでは、センス鎖及びアンチセンス鎖は、前記条件(i)〜(vii)に従って化学修飾が施されるが、かかる条件に従って化学修飾を施した場合、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない、又は共に化学修飾されている場合には、下記条件(viii)及び(ix)に従った化学修飾が必要になる。
(viii)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾されない場合には、センス鎖の５’末端側から１番目のリボヌクレオチド残基がシチジル酸残基又はウリジル残基であれば２’位をフルオロ基で修飾されており、当該リボヌクレオチド残基がアデニル酸残基又はグアニル酸残基であれば２’位をメトキシ基で修飾されている。
(ix)前記(i)〜(vi)に従って化学修飾を施すと、センス鎖の５’末端側から１番目及びアンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基が共に化学修飾される場合には、アンチセンス鎖５’末端側から１９番目のリボヌクレオチド残基は化学修飾が施されない。
【００３４】
＜化学修飾の方法＞
シチジル酸残基及びウリジル酸残基のリボース部分の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換(修飾)する方法、アデニル酸残基及びグアニル酸残基のリボース部分の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換(修飾)する方法は公知であり、本発明の化学修飾siRNAは、公知の手法で製造することができる。
【００３５】
２．SPG／化学修飾siRNA複合体
本発明の化学修飾siRNAは、SPGと複合化させて、シゾフィラン／化学修飾siRNA複合体の状態で使用される。SPGは、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖であり、シゾフィラン／化学修飾siRNA複合体は、SPGが前述の細胞表面に存在する受容体Dctin-1と結合することによって、エンドサイトーシスで細部内に送達される。
【００３６】
SPG／化学修飾siRNA複合体の構成成分であるシゾフィラン（SPGと略記することがある）は、文献（A.C.S.38(1),253(1997);Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)）記載の定法に従って製造することができる。このようにして得られたシゾフィランは、超音波処理により所望の分子量のシゾフィランを得ることができる。
【００３７】
SPG／化学修飾siRNA複合体に使用されるシゾフィランの分子量については、特に制限されず、化学修飾siRNAに付加されているポリデオキシアデニル酸の鎖長等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、シゾフィランの分子量として、通常２５，０００〜５００，０００、好ましくは２５，０００〜２５０，０００が例示される。
【００３８】
SPG／化学修飾siRNA複合体は、SPGとポリデオキシアデニル酸を複合化させる公知の方法に従って調製することができる。具体的には、以下の(1)〜(3)の工程で製造する方法が例示される：(1)ポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAを公知の方法に従って調製する、(2)また、別途、SPGを用意する、(3)次いで、化学修飾siRNAに結合しているポリデオキシアデニル酸とSPGとを用いて複合体を形成させる。
【００３９】
前記方法の(3)の工程において、化学修飾siRNAとSPGとの混合比は、ポリデオキシアデニル酸の鎖長やSPGの分子量に応じて適宜選択することができる。SPG／化学修飾siRNA複合体は、ポリデオキシアデニル酸のデオキシアデニル酸残基１個に対してSPGの主鎖のグルコース１分子が対応して、ポリデオキシアデニル酸１本とSPG２本が３重螺旋構造をとる。即ち、SPG／化学修飾siRNA複合体では、２本のSPGで形成された２重螺旋構造の１カ所又は2カ所以上にポリデオキシアデニル酸が取り込まれて３重螺旋構造が形成されている。例えば、４０塩基長のポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAと分子量１５００００のSPGであれば、分子量１５００００のSPG２分子に塩基長のポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAを１７分子含んで３重螺旋構造をとることができる。ポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAとSPGの好ましいモル比としては、２０:１〜１:５、好ましくは１０:１〜１:１で混合し、化学修飾siRNAに結合している1本鎖ポリデオキシアデニル酸領域とSPGを複合化させることが好ましい。このようなモル比で、ポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAとSPGとを複合体形成条件下に晒すことにより、両者を効率的に相互作用させることが可能になり、SPG／化学修飾siRNA複合体の製造効率を向上させることができる。
【００４０】
SPG／化学修飾siRNA複合体におけるポリデオキシアデニル酸とSPGとの３重鎖螺旋構造の形成は、具体的には以下の方法に従って実施できる。SPGは、天然若しくは水中では、3重螺旋構造をとっている。このSPGを、DMSO（ジメチルスルホオキシド）等の極性溶媒や水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液に溶解して1本鎖に変性させた後、ポリデオキシアデニル酸を含む化学修飾siRNAを加え、溶媒を水に戻すこと又はアルカリ水溶液を中和すること（再生過程）によって、化学修飾siRNAに連結したポリデオキシアデニル酸1本鎖部分と2本のSPGからなる、3重螺旋型に複合化された構造（会合構造）が形成される。このようなポリデオキシアデニル酸と多糖の複合化は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【００４１】
SPG／化学修飾siRNA複合体は、細胞内に導入されることにより、細胞内での標的遺伝子の発現を抑制することができるので、標的遺伝子の発現抑制を目的とした医薬組成物として使用できる。当該医薬組成物は、有効成分としてSPG／化学修飾siRNA複合体を治療有効量含有させ、更に薬学的に許容される担体を適宜組み合わせて調製することができる。このような担体としては、精製水、糖含有水溶液、緩衝液、生理食塩水、ヌクレアーゼフリーの水等の水性担体；賦形剤等が挙げられる。
【００４２】
SPG／化学修飾siRNA複合体の投与経路は、経口、非経口（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内投与を含む）、吸入、全身投与、局所投与（皮膚や頬面窩洞への外用；眼、耳、鼻等の実質的に血流に侵入しない部位への点滴注入を含む）等、患者の症状、病態、疾患の種類等に基づいて従来利用されている方法から適宜選択することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００４４】
製造例：SPG／化学修飾siRNA複合体の製造
以下の試験例で用いたSPG／化学修飾siRNA複合体は次のようにして形成した。分子量約15万のSPGを、0.25N水酸化ナトリウム水溶液に最終濃度15mg/mlになるように調製した後、1時間振動攪拌して4℃で１日静置し変性させた。330mMの第１リン酸ナトリウムに溶解させた、S化されたポリデオキシアデニル酸を付加した所定配列の化学修飾siRNAの溶液を、この変性SPG溶液に加えて中和し4℃で24時間以上静置した。この時、化学修飾siRNA 1モルに対してSPGが0.27モルとなるようにした。なお、S化されたポリデオキシアデニル酸を付加した化学修飾siRNAは、siRNAのセンス鎖5’末端に40個のデオキシアデニル酸が、リン酸エステル結合によって連結されたものである。【００４５】
参考試験例１
化学修飾がなされたCD40に対する化学修飾siRNA（表３に示すNJ050.11及びNJ050.13）を用いて、SPG／化学修飾siRNA複合体を調製した。また、ポリデオキシアデニル酸が付加されていない化学修飾siRNAとして、表３に示すNJ050.12及びNJ050.13を準備した。当該化学修飾siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号１及び２に該当している。【００４６】
NJ050.11では、センス鎖において、全てのアデニル酸及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換し、全てのシチジル酸及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換しており、アンチセンス鎖において、５’末端側から８番目以降のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換し、５’末端側から８番目以降のシチジル酸及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換している。【００４７】
NJ050.12では、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方において、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなるジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換し、且つ、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している。【００４８】
NJ050.13では、センス鎖において、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなるジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換し、且つ、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換しており、アンチセンス鎖において、５’末端側から８番目以降のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換し、５’末端側から８番目以降のシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のメトキシ基をフルオロ基で置換している。
【表３】
2018097296.tif 000005
【００４９】
各SPG／化学修飾siRNA複合体及び化学修飾siRNAを、20万個のc-wrt-7LR細胞（ラット骨髄単球性白血病由来細胞）に電気穿孔法によって導入した。導入後、各細胞を48穴プレートに2×105cells/wellとなるように播種して、37℃、5% CO2下で2時間インキュベートした。その後、各穴に10ng/mLになるようにリポポリサッカライド（LPS）を添加し、37℃、5% CO2下で22時間インキュベートした。次いで、細胞から全RNAを抽出し、全RNAからcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、CD40 primerを用いてリアルタイムPCRを行い、CD40のmRNA量を測定した。siRNAを挿入することなくLPS処理を行ったものを陽性コントロールとし、siRNAを挿入することなくLPS処理も行なわなかったものを陰性コントロールとした。また、CD40のmRNA量は、ハウスキーピング遺伝子である18SrRNA量で補正した。【００５０】
得られた結果を図１に示す。図１中、「LPS(-)」は陰性コントロール、「LPS(+)」は陽性コントロール、「21bp of NJ050.12」はNJ050.12の化学修飾siRNA（21塩基長）、「21bp of NJ050.13」はNJ050.13の化学修飾siRNA（21塩基長）、「NJ050.11（dA40-dsRNA）」はNJ050.11の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、及び「NJ050.13（dA40-dsRNA）」はNJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を示す。【００５１】
この結果、NJ050.13の化学修飾siRNAは、NJ050.12の化学修飾siRNAよりも、CD40のmRNA量が低下しており、アンチセンス鎖において５’末端側から７番目までのリボヌクレオチド残基は化学修飾を施さない方が、遺伝子発現抑制効果が高くなることが確認された。一方、NJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体では、遺伝子発現抑制効果は認められなかった。【００５２】
参考試験例２
NJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体では、遺伝子発現抑制効果は認められなかった要因として、塩基配列の脆弱性に起因するRLCへの取り込み不全の可能性が考えられたことから、本試験では、化学修飾siRNA、及びSPG／化学修飾siRNA複合体の血清中での安定性の評価を行った。【００５３】
センス鎖5’末端に40個のデオキシアデニンをリン酸エステル結合によって連結させたNJ050.13の化学修飾siRNA（Naked）を１μMになるように、10容量％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI1640培地(Gibco)に添加し、37℃で16時間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸200ng相当量を15％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。また、コントロールとして、センス鎖5’末端に40個のS化したポリデオキシアデニル酸をリン酸エステル結合によって連結させたNJ003.2のdsRNAを使用した。NJ003.2のdsRNAの塩基配列は、表４に示す通りであり、血清中でも比較的安定であることが分かっている。【００５４】
また、NJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、及びNJ003.2のdsRNAを使用したSPG／siRNA複合体についても、電気泳動に供する核酸量を400ngに設定したこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００５５】
得られた結果を図２に示す。図２の（Ａ）には、NJ050.13の化学修飾siRNA（Naked）、及びNJ050.13の化学修飾siRNA（Naked）の結果を示す。図２の（Ａ）中、「Naked」とはFBS存在下でインキュベートを行わなかった場合、「Naked in FBS」とはFBS存在下でインキュベートを行なった場合である。図２の（Ｂ）には、NJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、及びNJ003.2のdsRNAを使用したSPG／siRNA複合体の結果を示す。図２の（Ｂ）中、「Naked」とは、NJ050.13の化学修飾siRNA又はNJ003.2のdsRNAをFBS存在下でインキュベートを行わなかった場合、「Complex」とはSPG／化学修飾siRNA複合体又はSPG／siRNA複合体をFBS存在下でインキュベートを行なった場合、「Complex in FBS」とはSPG／化学修飾siRNA複合体又はSPG／siRNA複合体をFBS存在下でインキュベートした場合である。【００５６】
この結果から、センス鎖の5'末端にS化したポリデオキシアデニル酸を付加したNJ050.13の化学修飾siRNAは、ポリデオキシアデニル酸とセンス鎖の結合部位付近で切断されている可能性が示唆された。【００５７】
参考試験例３
参考試験例２の結果から、S化したポリデオキシアデニル酸とsiRNAのセンス鎖との結合部位付近の安定性を高める必要性が示唆されたことから、センス鎖の接合部位に化学修飾を入れることとした。また、参考試験例１の結果から、NJ050.11で採用したセンス鎖修飾では活性を喪失することが懸念されるため、表４に示すNJ050.14の化学修飾を施したsiRNAを調製した。
【表４】
2018097296.tif 000006
【００５８】
2×104 cells/wellとなるようにdRAW細胞（マウスマクロファージ；Dectin-1を過剰発現するRAW264細胞）を48穴プレートに播種して、37℃、5% CO2下で24時間インキュベートした。次いで、SPG／化学修飾siRNA複合体を200nM又は400nMとなるように添加して、37℃、5% CO2下で12時間インキュベートした。その後、各穴に0.2ng/mLになるようにインターフェロンγ(IFNr)を添加して37℃、5% CO2下で4時間インキュベートした。次いで、細胞から全RNAを抽出し、全RNAからcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、CD40 primerを用いてリアルタイムPCRを行い、CD40のmRNA量を測定した。SPG／化学修飾siRNA複合体を添加することなくIFNr処理を行ったものを陽性コントロールとし、SPG／化学修飾siRNA複合体を添加することなくIFNr処理も行なわなかったものを陰性コントロールとした。また、CD40のmRNA量は、ハウスキーピング遺伝子である18SrRNA量で補正した。【００５９】
得られた結果を図３に示す。図３中、「NT」は陰性コントロール、「IFNγ(+)」は陽性コントロール、「NJ050.13 SPG complex」はNJ050.13の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、「NJ050.14 SPG complex」はNJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を示す。この結果から、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体は、NJ050.13の化学修飾siRNAを使用した複合体の場合と同程度に良好な遺伝子発現抑制効果を有していることが確認された。【００６０】
参考試験例４
NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体200ngを血清（マウス血清、ヒト血清、及びFBS）に添加し、37℃で1分間又は30分間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸200ng相当量を15％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。【００６１】
得られた結果を図４に示す。図４中、レーン１の「Naked」とは、S化したポリデオキシアデニル酸が付加されたNJ050.13の化学修飾siRNAを血清存在下でインキュベートを行わなかった場合、レーン２の「Complex」とは、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を血清存在下でインキュベートを行わなかった場合、レーン３〜５及び9〜１１の「NJ050.14 complex」とは、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、レーン１２の「21mer」とは、NJ003.2の化学修飾siRNA部分のセンス鎖配列でありサイズマーカーとして用いた。この結果から、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体は、血清存在下で比較的安定であることが確認された。【００６２】
試験例１
NJ050.14の化学修飾siRNAは、アデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している箇所が多く、製造上、収率が低下することが懸念される。また、NJ050.14の化学修飾siRNAは、血清存在下で比較的安定であるとはいえ、NJ050.13の化学修飾siRNAよりも血清下での安定性が悪く、in vivoでの使用に耐えないと考えられる。そこで、S化したポリデオキシアデニル酸とsiRNAのセンス鎖との結合箇所への化学修飾は不可欠とするも、安定性を犠牲にしても、可能な限り化学修飾の数を減らして、適切な遺伝子発現抑制効果を備える化学修飾siRNAを開発することが必要になる。【００６３】
そこで、表５に示すNJ050.15の化学修飾を施したsiRNAを調製した。NJ050.15の化学修飾を施したsiRNAは、本発明で規定している条件(i)〜(ix)を満たすものである。
【表５】
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【００６４】
5×104 cells/wellとなるようにdRAW細胞（マウスマクロファージ；Dectin-1を過剰発現するRAW264細胞）を48穴プレートに播種し、同時に200nMのSPG／化学修飾siRNA複合体（NJ050.14及びNJ050.15の化学修飾siRNAを使用）、及び0.2ng/mLのインターフェロンγ(IFNr)を添加して、37℃、5% CO2下で24時間インキュベートした。次いで、細胞から全RNAを抽出し、全RNAからcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、CD40 primerを用いてリアルタイムPCRを行い、CD40のmRNA量を測定した。SPG／化学修飾siRNA複合体を添加することなくIFNr処理を行ったものを陽性コントロールとし、SPG／化学修飾siRNA複合体を添加することなくIFNr処理も行なわなかったものを陰性コントロールとした。なお、CD40のmRNA量は、ハウスキーピング遺伝子である18SrRNA量で補正した。また、比較のために、S化したポリデオキシアデニル酸が付加されたNJ050.14及びNJ050.15の化学修飾siRNAを使用して、同様に試験を行った。【００６５】
得られた結果を図５に示す。図５中、「NT」は陰性コントロール、「IFNγ(+)」は陽性コントロール、「NJ050.14 naked」は、センス鎖5’末端に40個のデオキシアデニンをリン酸エステル結合によって連結させたNJ050.14の化学修飾siRNA、「NJ050.14 complex」は、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、「NJ050.15 naked」は、センス鎖5’末端に40個のデオキシアデニル酸をリン酸エステル結合によって連結させたNJ050.15の化学修飾siRNA、「NJ050.15 complex」は、NJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体である。この結果、NJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体は、NJ050.14の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体に比べて、同等若しくは良好な遺伝子発現抑制効果を有していることが確認された。【００６６】
試験例２
NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、及び表６に示す化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した。具体的には、各SPG／化学修飾siRNA複合体を1μMとなるように血清（ヒト血清、及びFBS）に添加し、37℃で16時間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸20ng相当量を15％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。分解されていない化学修飾siRNAについて、Image J解析ソフトを用いて定量を行い、残存率（％）を求めた。
【表６】
2018097296.tif 000008
【００６７】
得られた結果を図６に示す。図６の（Ａ）にはヒト血清を使用した結果、（Ｂ）にはFBSを使用した結果を示す。意外なことに、NJA050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体は、NJA050.14を使用した場合に比して、化学修飾の数が少ないにも拘らず、それと同等若しくは良好な安定性を備えていた。【００６８】
試験例３
NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を用いて、x-vivo MLR（リンパ球混合培養）アッセイを行い、細胞増殖抑制効果を評価した。具体的には、NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を0.2μg/head又は2μg/headとなるように、BALB/cマウス(オス、9週齢）に尾静脈より投与した。20時間経過後、BALB/cマウスより脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞（5×106 cells/mL）を調製した。得られた脾臓細胞に15Gyの放射線を照射して不活性化処理を行い、stimulator細胞を準備した。別途、C57BL/6マウス(オス、9週齢）の脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞（5×106 cells/mL）を調製し、responder細胞を準備した。96穴プレートの各穴にstimulator細胞及びresponder細胞をそれぞれ100μLを入れて、37℃、5% CO2下で96時間混合リンパ球反応(MLR)を行った。反応後、細胞をCell Proliferation ELISA, BrdU kit(Roche Lifescence)を用いて細胞増殖を測定した。なお、SPG／化学修飾siRNA複合体の代わりに、PBSを使用したものをコントロールとした。【００６９】
得られた結果を図７に示す。この結果から、NJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体は、より少ない化学修飾で、安定性を向上させ、且つ高いノックダウン活性を誘導できることが確認された。【００７０】
試験例４
特定の法則の下で化学修飾を施したsiRNA（CD40に対するsiRNA、ヒト配列用）を用いてSPG／化学修飾siRNA複合体を調製した。具体的には、表７に示す各種化学修飾siRNAのセンス鎖5’末端に40個のS化されたデオキシアデル酸が、リン酸エステル結合によって連結されたものを準備し、前述する方法で各種SPG／化学修飾siRNA複合体を調製した。なお、表７に示すhsiCD40(208)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号３及び４に該当し、hsiCD40(867)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号５及び６に該当し、hsiCD40(1019)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号７及び８に該当し、hsiCD40(998)のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列は、それぞれ配列番号９及び１０に該当している。【００７１】
表７に示す化学修飾パターンA-1は、事前にS化したポリデオキシアデニンが付加したsiRNAとSPGとの複合体の安定化検討の結果、見出した比較的安定性が高く、活性の強い修飾パターンである。当該化学修飾パターンA-1は、センス鎖において、5’末端側から１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１３、１６、１７、及び１８番目のリボヌクレオチド残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換し、5’末端側から６、１２、１４、１５、及び１９番目のリボヌクレオチド残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している。また、当該化学修飾パターンA-1は、アンチセンス鎖において、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなるジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換し、且つ、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している。【００７２】
表７に示す化学修飾パターンA-2は、センス鎖において、全てのシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基がフルオロ基で置換されており、全てのアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシキ基がメトキシ基で置換されている。また、当該化学修飾パターンA-2は、アンチセンス鎖において、ＣＡ、ＵＡ、及びＵＧからなるジヌクレオチド配列中のシチジル酸残基及びウリジル酸残基の２’位のヒドロキシ基をフルオロ基で置換し、且つ、当該ジヌクレオチド配列中のアデニル酸残基及びグアニル酸残基の２’位のヒドロキシ基をメトキシ基で置換している。但し、ただし、アンチセンス鎖の5’末端側からから１〜７番目のリボヌクレオチド残基に対しては修飾を行なっていない。【００７３】
表７に示す化学修飾パターンA-3は、本発明で規定している条件(i)〜(ix)を満たすものである。【００７４】
【表７】
2018097296.tif 000009
【００７５】
各SPG／化学修飾siRNA複合体400nMを50万個のヒト末梢血単核球細胞(PBMC)に電気穿孔法によって導入した。導入後、各細胞を48穴プレートに2×105cells/wellとなるように播種し、同時にTNFαを2.5ng/mLとなるように添加して、37℃、5% CO2下で24時間インキュベートした。次いで、細胞から全RNAを抽出し、全RNAからcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、CD40 primerを用いてリアルタイムPCRを行い、CD40のmRNA量を測定した。siRNAを挿入することなくLPS処理を行ったものを陽性コントロールとし、siRNAを挿入することなくLPS処理も行なわなかったものを陰性コントロールとした。また、結果の解析はΔΔCT法にて行い、CD40のmRNA量は、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH量で補正した。また、比較のために、SPG／化学修飾siRNA複合体の代わりに、化学修飾を施していないsiRNAを使用したSPG／siRNA複合体、及びセンス鎖5’末端にS化した40個のデオキシアデニル酸がリン酸エステル結合によって連結した各種化学修飾siRNAを使用して同様に試験を行った。【００７６】
得られた結果を図８に示す。図８中、「Complex」とは化学修飾を施していないsiRNAを使用したSPG／siRNA複合体、「A-1」とは化学修飾パターンA-1を施した化学修飾siRNAのセンス鎖5’末端にS化した40個のデオキシアデニル酸をリン酸エステル結合によって連結させたもの、「Complex A-1」とは化学修飾パターンA-1を施した化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、「A-2」とは化学修飾パターンA-2を施した化学修飾siRNAのセンス鎖5’末端にS化した40個のデオキシアデニル酸をリン酸エステル結合によって連結させたもの、「Complex A-2」とは化学修飾パターンA-2を施した化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、「A-3」とは化学修飾パターンA-3を施した化学修飾siRNAのセンス鎖5’末端にS化した40個のデオキシアデニル酸をリン酸エステル結合によって連結させたもの、「Complex A-3」とは化学修飾パターンA-3を施した化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体である。この結果、化学修飾パターンA-3を施した化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体を使用した場合に、遺伝子発現抑制効果が最も高くなっていた。【００７７】
以上の試験例１〜４の結果から、本発明で規定している条件(i)〜(ix)を満たす化学修飾を施した化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体によって、RNaseに対する耐性及びRNAi活性が共に高く、in vivoで使用しても、十分な遺伝子発現効果が奏され得ることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月1日(2018.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】参考試験例１において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図２】参考試験例２において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図３】参考試験例３において、各種化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図４】参考試験例４において、各種化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図５】試験例１において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図６】試験例２において、各種修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した結果を示す図である。
【図７】試験例３において、各種修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、ex-vivo MLR（リンパ球混合培養）アッセイにより細胞増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図８】試験例４において、各種化学修飾siRNA、及び化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、遺伝子発現抑制効果を評価した結果を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の化学修飾siRNAにおいて、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基配列については、標的遺伝子中の標的配列に応じて設定される。標的遺伝子中の標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）等に従って公知の手法で設定することができる。siRNAは、通常、当該標的配列に対して100％一致する配列を含むか、所望のRNA干渉効果が得られる限り当該標的配列から１又は数個の塩基が置換・付加されていている配列を含むように設計される。また、アンチセンス鎖の5'末端がA/Uペアであり、センス鎖の5'末端がG/Cペアであり、アンチセンス鎖の5'末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することによって、優れたRNA干渉効果をもつsiRNAをデザインできることも報告されている（Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)）。例えば、CD40に対するsiRNAとして、配列番号１に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号３に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号５に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号７に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号８に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA、配列番号９に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１０に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖からなるsiRNA等が挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の化学修飾siRNAの標的遺伝子の好適な一態様として、Dectin-1発現細胞において発現され、且つ当該細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子が挙げられる。Dectin-1とは、細胞膜上に存在するC型レクチンレプチンタイプの糖鎖認識ドメインを有する受容体（Pattern Recognition Receptor）である。Dectin-1は、細胞外にSPGを特異的に認識する領域を有し、細胞内にITAM（immunoreceptor tyrosinase-based activation motif-1）と呼ばれる活性化シグナルを伝えるモチーフを持つ。Dectin-1はSPGを認識すると、NF-κBや炎症性サイトカインの産生を促し、生体防御反応を惹起する。Dectin-1発現細胞としては、具体的には、マクロファージ、樹状細胞、好中球等が挙げられる。SPGはβ-1,3-グルカン骨格を有しており、Dectin-1発現細胞の細胞膜に存在するDctin-1と結合することによって、エンドサイトーシスでDectin-1発現細部内に送達されることが知られている。本発明の化学修飾siRNAをSPGと複合化すると、SPGがDectin-1に認識されることにより、本発明の化学修飾siRNAがDectin-1発現細胞内に選択的に送達することが可能になる。また、本発明の化学修飾siRNAの標的遺伝子として、Dectin-1発現細胞が担う生体内機能に影響を及ぼす遺伝子を選択することにより、生体内の免疫抑制を誘導して、免疫を調節することが可能になる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
即ち、例えば、siRNAのアンチセンス鎖が表２の(A)に示す２１塩基長の塩基配列である場合には、条件(iv)〜(vii)に従った化学修飾を施したものとして、表２の(B)に示す態様が挙げられる。
【表２】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
試験例２
NJ050.14又はNJ050.15の化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体、及び表６に示す化学修飾siRNAを使用したSPG／化学修飾siRNA複合体について、血清中での安定性を評価した。具体的には、各SPG／化学修飾siRNA複合体を1μMとなるように血清（ヒト血清、及びFBS）に添加し、37℃で16時間インキュベートした。次いで、試料と同量のTE飽和フェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスで強撹拌した後、12000 ×gで15分間遠心分離した。次いで、上清を回収し、上清中の核酸濃度を分光光度計で測定し、核酸20ng相当量を15％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。分解されていない化学修飾siRNAについて、Image J解析ソフトを用いて定量を行い、残存率（％）を求めた。
【表６】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
【表７】
2018097296.tif 000020
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
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【国際調査報告】
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2018097296.tif 000023
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