(57)【要約】  細胞培養装置であって、播種された細胞が保持される細胞保持部と、それぞれに前記細胞保持部を有し、かつ、液体培地が貯留され、第１方向に沿って並列配置されたｍ個の培養チャンバーと、前記ｍ個の培養チャンバー間を互いに連通する１以上の連絡用流路と、を有し、前記ｍ個の培養チャンバーと前記連絡用流路とからユニットが構成され、ｎ個の前記ユニットが前記第１方向とは異なる方向である第２方向に沿って並列配置された連結培養容器と、前記連結培養容器において、前記第２方向に沿って同列に配置された同列配置培養チャンバー間を連通し、前記同列配置培養チャンバー間に同時に加圧可能または同時に大気圧開放可能であり、前記ｍ個の培養チャンバー内の圧力差により前記連絡用流路を通して前記液体培地を、前記ｍ個の培養チャンバーの間で液送可能な複数の空圧配管と、を備え、前記ｍは２以上の整数であり、前記ｎは２以上の整数である。
2016158233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
播種された細胞が保持される細胞保持部と、それぞれに前記細胞保持部を有し、かつ、液体培地が貯留され、第１方向に沿って並列配置されたｍ個の培養チャンバーと、前記ｍ個の培養チャンバー間を互いに連通する１以上の連絡用流路と、を有し、前記ｍ個の培養チャンバーと前記連絡用流路とからユニットが構成され、ｎ個の前記ユニットが前記第１方向とは異なる方向である第２方向に沿って並列配置された連結培養容器と、
前記連結培養容器において、前記第２方向に沿って同列に配置された同列配置培養チャンバー間を連通し、前記同列配置培養チャンバー間に同時に加圧可能または同時に大気圧開放可能であり、前記ｍ個の培養チャンバー内の圧力差により前記連絡用流路を通して前記液体培地を、前記ｍ個の培養チャンバーの間で液送可能な複数の空圧配管と、
を備え、
前記ｍは２以上の整数であり、前記ｎは２以上の整数である
細胞培養装置。
【請求項２】
前記連絡用流路から前記ｍ個の培養チャンバーへの流れの方向を制御可能な逆流防止機構を前記連絡用流路の末端もしくは内部に備える請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記ｍ個の培養チャンバーは、前記ｍ個の培養チャンバーのそれぞれに、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部と、を有する請求項１または２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけるように保持可能な蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、前記基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材と、を有する請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記槽本体が壁部と、連絡用流路を備えた底部プレートとを有する請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、
前記壁部押圧部は、前記基体部と前記基体部とに支持された前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記空圧配管を通して前記各培養チャンバーに予め設定されたスケジュールに従って、順次加圧あるいは大気圧開放可能な加圧装置を備える請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記培養チャンバーから前記連絡用流路に接続する部位に界面張力によって空気の流入を防止可能なラプラス弁を備える請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記ラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅がｗＬであり、前記マイクロ流路の深さがｈＬであり、前記界面張力がγであり、前記ラプラス弁のラプラス圧がΔＰＬａｐであるとき、
前記ラプラス圧がΔＰＬａｐ＝２γ（１／ｗＬ＋１／ｈＬ）の式で表され、
前記ラプラス圧ΔＰＬａｐが前記連結培養容器に加圧される圧力よりも大きくなるように、前記マイクロ流路が構成された請求項８に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記連絡用流路の一部に流量を調節するために、前記連絡用流路の流路断面積に対して、流路断面積が１／１０以下である抵抗流路部位を備えた請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記逆流防止機構が逆止弁である請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記逆流防止機構として、逆流防止ラプラス弁を備える請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
細胞培養方法であって、
ｍおよびｎが２以上の整数であるとき、ｍ個の培養チャンバーを１以上の連絡用流路で互いに連通し、前記ｍ個の培養チャンバーのそれぞれが第１方向に沿って並列配置された１ユニットの連結培養容器をｎユニット備え、前記ｎユニットの前記連結培養容器が前記第１方向とは異なる方向である第２方向に沿って並列配置された細胞培養装置を準備し、
前記連結培養容器の蓋を開き、前記細胞培養装置の各培養チャンバー内に細胞を播種して接着させる第１工程と、
前記細胞培養装置において、前記第２方向に沿って同列に配置された前記第１方向における１列目の培養チャンバーに液体培地を満たし、前記蓋を閉じる第２工程と、
前記１列目の培養チャンバー内を加圧し、前記第２方向に沿って同列に配置された前記第１方向における２列目の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて前記１列目の培養チャンバーから前記２列目の培養チャンバーに送液する第３工程と、
前記第１方向における列番号を順次１つずつ増やして加圧と大気圧開放を行うことにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて、前記第１方向におけるｍ−１列目の培養チャンバーからｍ番目の培養チャンバーに送液する第４工程と、
前記ｍ列目の位置の培養チャンバー内を加圧し、かつ、前記１列目の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて前記ｍ列目の位置の培養チャンバーから前記１列目の位置の培養チャンバーに送液する第５工程と、
前記第３工程から前記第５工程を繰り返すことにより前記細胞培養装置の前記各培養チャンバー内に前記液体培地を循環させる第６工程と、
を含む細胞培養方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置に細胞を入れた評価システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品や化成品の分析技術に関わるものであって、医薬品や化成品の薬効や毒性、および吸収、分布、代謝、排泄といった体内動態を、培養細胞を用いて分析するための細胞培養装置および細胞培養方法に関する。
本願は、２０１５年４月３日に日本に出願された特願２０１５−０７７１９６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医薬品開発コストの増大は著しく、Ｐａｍｍｏｌｌｉらが２０１１年に発表した非特許文献１によると、医薬品候補化合物が第二相および第三相臨床試験においてドロップアウトする確率が大きく上昇していることが大きな原因の一つであると指摘されている。開発成功率低下の原因が何であるかは議論のあるところだが、前臨床試験において有望とされた候補化合物が臨床試験でドロップアウトするのを防ぐためには、臨床試験と相関の良いデータを前臨床試験の段階で得ることが重要である。
前臨床試験においては、薬効・薬物動態・毒性の評価に培養細胞を用いた試験が利用されることが多い。培養細胞を用いた試験では、培養環境が生体内の環境と大きく異なることが臨床試験との相関の悪さの原因とされている。また、一種類の培養細胞で薬効・薬物動態・毒性を評価しても生体内で複数の臓器が関わる現象を評価することが難しく、これが培養細胞を用いた試験と臨床試験との相関性の悪さの一つの原因と考えられる。動物試験においては種の違いに起因する生物機能の差が試験結果の相関の悪さの大きな原因とされている。
Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムは、培養細胞を臓器モデルとして用い、複数の臓器モデルを連結して培養することで、複数の臓器が関わる生体内の現象を生体外で再構成する方法である。Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムは、通常動物実験を必要とする薬物動態解析をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる動物実験代替法としての可能性を秘めているとされ、近年急速に注目を集めている（非特許文献２、３参照）。特にヒト由来の培養細胞で薬物動態解析をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することができれば、臨床試験と相関の良いデータが取得できると期待される。
しかしながら、これらの研究の多くは２、３種類の臓器モデルを用いて検証の行いやすいモデル化合物を評価する原理検証研究に留まっており（非特許文献４〜６参照）、Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムと動物実験・臨床試験との相関性の評価は定まっていない。このｖｉｖｏ／ｖｉｔｒｏ相関を明らかにするためには様々な臓器モデルやモデル化合物を用いてＢｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムの有効性を検証する必要がある。さらに、Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムを動物実験代替法として創薬に利用していくためにも、多種類の化合物を同時に評価するハイスループットスクリーニングが必要であるが、この点は上述の原理検証研究においては未解決となっている。【０００３】
本発明者等は、既に、これまでの研究で多数の薬剤溶液を簡便に取り扱える「圧力駆動型の灌流培養マイクロチャンバーアレイ」を開発（非特許文献７、８参照）し、その後、使い勝手の良いプラットフォームを備えた循環培養システムを開発し、実用化のためのユーザー評価を実施するに至っている（非特許文献９、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特開２０１５−７３４６８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】F.Pammolli, et al., Nat. Rev. Drug Discov, 10, 428 (2011)
【非特許文献２】S.N.Bhatia and D.E.Ingber, Nat. Biotechnol., 32, 760(2014)
【非特許文献３】C.Y.Chan, et al., Lab Chip,13, 4697(2013)
【非特許文献４】J.H.Sung, et al., Lab Chip, 10,446(2010)
【非特許文献５】I.Wagner, et al., Lab Chip, 13,3538(2013)
【非特許文献６】J.H.Sung, et al., Lab Chip, 13,1201 (2013)
【非特許文献７】S.Sugiura, et al., Anal.Chem., 82, 8278 (2010)
【非特許文献８】S.Sugiura, et al., Biotechnol.Bioeng., 100, 1156 (2008)
【非特許文献９】K.Hattori, et al., J.Biosci.Bioeng., 118, 327 (2014)
【非特許文献１０】C.Zhang, et al., Lab Chip, 9, 3185 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステムを動物実験代替法として創薬に利用していくためには、多種類の化合物を同時に評価するハイスループットスクリーニングが必要であるが、この点は現在のところ実現できていない。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、本発明者等が既に蓄積してきた「圧力駆動型の灌流培養マイクロチャンバーアレイ」に関する知見をベースとし、これをさらに発展させて多種類の化合物を同時に評価するハイスループットスクリーニングが実現可能な「圧力駆動型Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステム」を開発し、様々な臓器連結モデルとモデル化合物を用いた評価を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明の一態様に係る細胞培養装置は、培養チャンバーをマイクロ流路で連結し、各培養チャンバーに圧力を分配する圧力配管ラインを接続し、圧力駆動で複数の培養チャンバー内の液体培地を同時に送液することで、多種類の化合物の同時評価を可能としたものである。【０００８】
本発明の第一態様に係る細胞培養装置は、播種された細胞が保持される細胞保持部と、それぞれに前記細胞保持部を有し、かつ、液体培地が貯留され、第１方向に沿って並列配置されたｍ個の培養チャンバーと、前記ｍ個の培養チャンバー間を互いに連通する１以上の連絡用流路と、を有し、前記ｍ個の培養チャンバーと前記連絡用流路とからユニットが構成され、ｎ個の前記ユニットが前記第１方向とは異なる方向である第２方向に沿って並列配置された連結培養容器と、前記連結培養容器において、前記第２方向に沿って同列に配置された同列配置培養チャンバー間を連通し、前記同列配置培養チャンバー間に同時に加圧可能または同時に大気圧開放可能であり、前記ｍ個の培養チャンバー内の圧力差により前記連絡用流路を通して前記液体培地を、前記ｍ個の培養チャンバーの間で液送可能な複数の空圧配管と、を備え、前記ｍは２以上の整数であり、前記ｎは２以上の整数である。【０００９】
前記連絡用流路から前記ｍ個の培養チャンバーへの流れの方向を制御可能な逆流防止機構を前記連絡用流路の末端もしくは内部に備えていてもよい。【００１０】
前記ｍ個の培養チャンバーは、前記ｍ個の培養チャンバーのそれぞれに、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部と、を有していてもよい。【００１１】
前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけるように保持可能な蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、前記基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材と、を有していてもよい。【００１２】
前記槽本体が壁部と、連絡用流路を備えた底部プレートとを有していてもよい。【００１３】
前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、前記壁部押圧部は、前記基体部と前記基体部とに支持された前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有していてもよい。【００１４】
前記空圧配管を通して前記各培養チャンバーに予め設定されたスケジュールに従って、順次加圧あるいは大気圧開放可能な加圧装置を備えていてもよい。【００１５】
前記培養チャンバーから前記連絡用流路に接続する部位に界面張力によって空気の流入を防止可能なラプラス弁を備えていてもよい。【００１６】
前記ラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅がｗＬであり、前記マイクロ流路の深さがｈＬであり、前記界面張力がγであり、前記ラプラス弁のラプラス圧がΔＰＬａｐであるとき、前記ラプラス圧がΔＰＬａｐ＝２γ（１／ｗＬ＋１／ｈＬ）の式で表され、前記ラプラス圧ΔＰＬａｐが前記連結培養容器に加圧される圧力よりも大きくなるように、前記マイクロ流路が構成されていてもよい。【００１７】
前記連絡用流路の一部に流量を調節するために、前記連絡用流路の流路断面積に対して、流路断面積が１／１０以下である抵抗流路部位を備えていてもよい。【００１８】
前記逆流防止機構が逆止弁であってもよい。【００１９】
前記逆流防止機構がラプラス弁であってもよい。【００２０】
本発明の第二態様に係る細胞培養方法は、ｍおよびｎが２以上の整数であるとき、ｍ個の培養チャンバーを１以上の連絡用流路で互いに連通し、前記ｍ個の培養チャンバーのそれぞれが第１方向に沿って並列配置された１ユニットの連結培養容器をｎユニット備え、前記ｎユニットの前記連結培養容器が前記第１方向とは異なる方向である第２方向に沿って並列配置された細胞培養装置を準備し、前記連結培養容器の蓋を開き、前記細胞培養装置の各培養チャンバー内に細胞を播種して接着させる第１工程と、前記細胞培養装置において、前記第２方向に沿って同列に配置された前記第１方向における１列目の培養チャンバーに液体培地を満たし、前記蓋を閉じる第２工程と、前記１列目の培養チャンバー内を加圧し、前記第２方向に沿って同列に配置された前記第１方向における２列目の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて前記１列目の培養チャンバーから前記２列目の培養チャンバーに送液する第３工程と、前記第１方向における列番号を順次１つずつ増やして加圧と大気圧開放を行うことにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて、前記第１方向におけるｍ−１列目の培養チャンバーからｍ番目の培養チャンバーに送液する第４工程と、前記ｍ列目の位置の培養チャンバー内を加圧し、かつ、前記１列目の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて前記ｍ列目の位置の培養チャンバーから前記１列目の位置の培養チャンバーに送液する第５工程と、前記第３工程から前記第５工程を繰り返すことにより前記細胞培養装置の前記各培養チャンバー内に前記液体培地を循環させる第６工程と、を含む。【００２１】
本発明の第三態様に係る評価システムは、上記態様に係る細胞培養装置に細胞を導入している。【００２２】
本発明の他の態様は、液体培地を貯留するためのｍ個の培養チャンバーと、各培養チャンバーには播種した細胞を保持するための細胞保持部が設けられ、前記ｍ個の培養チャンバーを１または複数の連絡用流路で互いに連通して１ユニットの連結培養容器を構成し、さらに、当該連結培養容器をｎユニット備えた細胞培養装置であって、ただし、ｍおよびｎは２以上の整数、各ユニットの連結培養容器の同位置の培養チャンバーを連通する空圧配管を設け、当該空圧配管を用いて加圧または大気圧開放することにより、各ユニットの連結培養容器の同位置の培養チャンバーに対して同時に圧力をかけ、あるいは同時に大気圧開放し、培養チャンバー内の圧力差により前記連絡用流路を通して液体培地の液送をすることを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記連絡用流路から前記培養チャンバーへの流れの方向を制御する逆止弁を前記連絡用流路の末端もしくは内部に備えていることを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記培養チャンバーは液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有することを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有することを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記槽本体が壁部と、連絡用流路を備えた底部プレートとを有することを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、前記壁部押圧部は、前記基体部と前記基体部に支持された前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有することを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記空圧配管を通して前記各培養チャンバーに予め設定されたスケジュールに従って、順次加圧あるいは大気圧開放する加圧装置を備えたことを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記培養チャンバーから前記連絡用流路に接続する部位に界面張力によって空気の流入を防止するラプラス弁を備えたことを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、上記細胞培養装置において、前記連絡用流路の一部に流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位を備えたことを特徴とする。
また、本発明の他の態様は、ｍ個の培養チャンバーと、前記ｍ個の培養チャンバーを１または複数の連絡用流路で互いに連通して１ユニットの連結培養容器を構成し、さらに、当該連結培養容器をｎユニット備えた細胞培養装置を用い、ただし、ｍおよびｎは２以上の整数、
前記連結培養容器の蓋を開き、各ユニットの連結培養容器の各培養チャンバー内に細胞を播種して接着させる工程１と、
各ユニットの１番目の位置の培養チャンバーに液体培地を満たし、前記蓋を閉じる工程２と、
各ユニットの１番目の位置の培養チャンバー内を加圧し、かつ、２番目の位置の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じて１番目の位置の培養チャンバーから２番目の位置の培養チャンバーに送液する工程３と、
以下前記工程３を培養チャンバーの位置の番数を順次１つずつ増やして加圧と大気圧開放を行うことにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じてｍ−１番目の位置の培養チャンバーからｍ番目の位置の培養チャンバーに送液するまでに至る工程４と
各ユニットのｍ番目の位置の培養チャンバー内を加圧し、かつ、１番目の位置の培養チャンバー内を大気圧開放することにより、前記液体培地を前記連絡用流路を通じてｍ番目の位置の培養チャンバーから１番目の位置の培養チャンバーに送液する工程５と、
前記工程３から工程５を繰り返すことにより各ユニットのｍ個の培養チャンバー内に液体培地を循環させる工程６と、
を備えたことを特徴とする細胞培養方法である。
【発明の効果】
【００２３】
例えば、上記非特許文献３〜５では、それぞれ、容器を傾けて重力を利用する方法、ペリスタポンプを内蔵したデバイス、外部のシリンジポンプを用いて送液する方法が採用されているが、これらの方法では、装置が複雑になるため、多数の化合物を同時に評価することは難しかった。また、上記非特許文献３、５では、１種類の化合物しか評価できず、非特許文献４では、２種類の化合物の評価のみが可能であった。
しかしながら、本発明者等が先に出願した特許文献１の圧力駆動型の灌流培養システムをベースに、更に発展させた本発明によるBody-on-a-chipシステムでは、多数の薬剤の効果を複数の臓器の連結モデルで評価できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一作製例である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一作製例における２連培養チャンバー（Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐユニット）の拡大図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一例の全体構成図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一例の全体構成図（培養装置組み立て後の斜視図）である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置において、ホルダー中にマイクロ流路プレート（底部プレート）を収納した状態を示す斜視図である。
【図３】図３は、図２Ａに示した圧力駆動型細胞培養装置のマイクロ流路プレートの流路構成図（上面図）であり、２連培養チャンバー型の８ユニットシステム用（２臓器×８連プレート）の例である。
【図４】図４は、図３の１ユニットの流路構成図である。
【図５】図５は、図２Ａに示した圧力駆動型細胞培養装置のマイクロ流路プレートの流路構成図であり、４連培養チャンバー型の４ユニットシステム用（４臓器×４連プレート）の例である。
【図６】図６は、図５の１ユニットの流路構成図である。
【図７】図７は、２連培養チャンバー型のマルチユニットシステムを、肝臓やがんの細胞を臓器モデルとして利用し、かつ、２臓器連結モデルとして使用した例を示す。
【図８】図８は、４連培養チャンバー型のマルチユニットシステムを、肺、肝臓、腎臓、脂肪の細胞を導入して４臓器連結モデルとして使用した例を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａに示した２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａに示した２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａに示した２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ａに示した２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、図１０Ａに示した４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ラプラス弁を説明した図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ラプラス弁を説明した図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ラプラス弁を説明した図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一例における組み立て前の正面断面図と、組み立て後の正面断面図と、を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一例の組み立て前の側面断面図と、組み立て後の側面断面図と、を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、本発明の第１実施形態に係る圧力駆動型細胞培養装置の一例の上面図を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａに示した本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、図１３Ａに示した本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、図１３Ａに示した本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、図１３Ａに示した本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と使用方法を説明した図である。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置における４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの構成を説明した図である。
【図１４】図１４は、本発明の第３実施形態における細胞培養装置における４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
【図１５】図１５は、本発明の第３実施形態における細胞培養装置における４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実施例における肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）および大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）の培養プレート内の配置図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例における肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）および大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）の培養スケジュールを示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、実施例における循環培養を開始する直前（Ｄａｙ１）のＨｅｐＧ２の細胞の写真である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、実施例における循環培養を開始する直前（Ｄａｙ１）のＨＣＴ１１６の細胞の写真である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、実施例における循環培養を４８時間行った後のＨｅｐＧ２の細胞の写真である。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、実施例における循環培養を４８時間行った後のＨＣＴ１１６の細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１Ａおよび図１Ｂに示した８種の化合物を２種類の臓器の連結モデルで評価するシステムを例として、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置（Ｂｏｄｙ‐ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐユニット）１を説明する。図１Ａおよび図１Ｂの例では、図１Ｂに示すような臓器モデルとなる培養チャンバー２が２つ連結された２連培養チャンバー（２臓器連結モデル）３Ａを１ユニットとして、全８ユニットで構成されている。１ユニットを構成する培養チャンバー２同士はマイクロ流路４で接続されている。図１Ａの右側に接続されている空圧配管（加圧ライン）５により順次加圧することで、各臓器モデル培養チャンバー２間で培養液を循環させることができる。
【００２６】
図２Ａは、図１Ａおよび図１Ｂにおけるシステムをより詳細に示した本実施形態に係る細胞培養装置１の全体構成図であって、蓋（加圧蓋）６・貫通孔板７・マイクロ流路プレート８・ホルダー（基体部）９の４点のパーツで構成されている。臓器数や培地流量等のデザインに応じてマイクロ流路プレート（底部プレート）８を設計することで様々な臓器連結モデルに適用できる構成である。図２Ａの例では、２臓器連結モデル３Ａを８ユニット搭載したマイクロ流路プレート８Ａを用いることもでき、４臓器連結モデル３Ｂを４ユニット搭載したマイクロ流路プレート８Ｂを用いることもできる。本実施形態に係る細胞培養装置１は、マイクロ流路プレート８を交換するだけで、様々な臓器連結モデルに対応できる構成である。
図２Ａのシステムは、蓋６、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、ホルダー（基体部）９の各パーツを重ね合わせることでシステムが構成される。各パーツの詳細は後述する。蓋６は側面に加工された穴（図２では図示せず、図１２Ａ〜Ｃの空圧配管５、５Ａ〜５Ｄの導入孔を参照）に接続され、空圧配管５より導入される圧力を各培養チャンバー２に分配する役割を果たす。貫通孔板７は培養チャンバー２の壁面（壁部）７Ａを構成する。
ホルダー９は蓋６、貫通孔板７、およびマイクロ流路プレート８を固定する。この際に、蓋６と貫通孔板７との間にシリコーン樹脂シートやＯリングなどの柔軟性のある部品（封止剤２１）を配置することで、蓋６と貫通孔板７との隙間からの圧力漏れを防ぐことが可能となる。また、マイクロ流路プレート８もシリコーン樹脂製等、柔軟性のある部品を使用することで、マイクロ流路プレート８と貫通孔板７との間およびマイクロ流路プレート８とホルダー９との間からの、圧力漏れおよび液漏れを防止することが可能となる。また、培養液を循環させるために、貫通孔板７に逆止弁１１を設置することもできる。２臓器連結モデル３Ａでは、逆止弁１１の設置は必須ではない。
なお、図２Ａには、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９が別々に形成されている例を示している。
図２Ａ、および、後に示す図１２Ａ〜図１２Ｃに示すように、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９が別々に形成されてもよいし、後に示す図９Ａ〜図９Ｅおよび図１０Ａ〜図１０Ｇに示すように、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９を一体形成してもよい。
なお、図９Ａ〜図９Ｅにおいては、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９を一体形成した部材を本体（槽本体）１Ａとして示し、図１０Ａ〜図１０Ｇにおいては、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９を一体形成した部材を本体（槽本体）１０１Ａとして示している。
【００２７】
図２Ｂは、図２Ａにおいて示した蓋６、貫通孔板７、マイクロ流路プレート８、およびホルダー９を組み立てた状態における培養装置の組み立て後の斜視図である。
図２Ｃは、ホルダー９中にマイクロ流路プレート８Ａを収納した状態の一例を示す斜視図である。
図２Ｃに示すように、例えばマイクロ流路プレート８Ａをホルダー９に収納し、さらにホルダー９に収納されたマイクロ流路プレート８Ａの上に貫通孔板７を載せる。図２Ｂに示すように、蓋６を貫通孔板７に取り付け、第１の留め金２０で蓋６を固定することができる。この際、第１の留め金（蓋部押圧部、押圧部材）２０によって、蓋６を槽本体１Ａに向けて押さえつけるように保持することができる。
また、図２Ｂに示すように、第２の留め金（壁部押圧部、押圧部材）２０Ａによって、貫通孔板７をマイクロ流路プレート（底部プレート）８に向けて押さえつけて保持することができる。
【００２８】
図３は、２連培養チャンバー３Ａ型の８ユニットシステムにおけるマイクロ流路プレート（２臓器×８連プレート）８Ａの流路構成図（上面図）であり、図４は２臓器×８連プレート８Ａのうちの１ユニットの流路構成（２連培養チャンバー）３Ａを詳細に説明した図である。
図４の破線は各培養チャンバー２の内壁７Ａを示しており、第１の培養チャンバー２Ａおよび第２の培養チャンバー２Ｂは、それぞれ、上流口１２、ウェル１３、下流口１４を備えている。第１の培養チャンバー２Ａの第１の下流口１４Ａと第２の培養チャンバー２Ｂの上流口１２Ｂとが第１の連絡流路１５Ａで連結されている。第２の培養チャンバー２Ｂの第２の下流口１４Ｂと第１の培養チャンバー２Ａの上流口１２Ａとが第２の連絡流路１５Ｂで連結されている。各連絡流路１５（１５Ａ、１５Ｂ）の途中には流量を調整するための抵抗流路１６（１６Ａ、１６Ｂ）が設けてあり、抵抗流路１６の断面積は、好ましくは連絡流路１５の断面積の１／１０以下であり、抵抗流路１６の断面積は連絡流路１５の断面積と比較して著しく小さい。そのため、連絡流路１５を流れる液の液量は抵抗流路１６の断面積および長さと空圧配管５より導入する圧力により、簡便に計算することができる。各培養チャンバー２（２Ａ、２Ｂ）のウェル１３（１３Ａ、１３Ｂ）は凹部から構成される細胞保持部であるが、細胞保持部は細胞を保持できればウェルに限定されず、保持シート、ゲルなどであってもよい。
また、各培養チャンバー２（２Ａ、２Ｂ）の上流口１２（１２Ａ、１２Ｂ）には逆止弁１１、下流口１４（１４Ａ、１４Ｂ）にはラプラス弁１７（後述の「ラプラス弁の説明」の項、および、「ラプラス弁の設計について」の項を参照）を設けることが望ましい。図４において、ウェル１３（１３Ａ、１３Ｂ）は直径６ｍｍ×深さ２ｍｍに形成し、連絡流路１５（１５Ａ、１５Ｂ）を幅１ｍｍ×深さ０.５ｍｍに形成し、抵抗流路１６（１６Ａ、１６Ｂ）は幅０.２ｍｍ×深さ０.１ｍｍ、ラプラス弁１７（１７Ａ、１７Ｂ）は幅０.１ｍｍ×深さ０.０１６ｍｍのマイクロ流路３６本で構成されている（この数値は図１Ａおよび図１Ｂの作製例の数値を例示したものであり、これに限定されるものではない）。
【００２９】
図５は、４連培養チャンバー型の４ユニットシステムにおけるマイクロ流路プレート８Ｂの流路構成図である。図６は図５のマイクロ流路プレート８Ｂのうち１ユニット（４連培養チャンバー）３Ｂの流路構成を詳細に説明した図である。図６において、図４と同様にウェル１１３（１１３Ａ、１１３Ｂ、１１３Ｃ、１１３Ｄ）は直径６ｍｍ×深さ２ｍｍ、連絡流路１１５（１１５Ａ、１１５Ｂ、１１５Ｃ、１１５Ｄ）を幅１ｍｍ×深さ０.５ｍｍ、抵抗流路１１６（１１６Ａ、１１６Ｂ、１１６Ｃ、１１６Ｄ）は幅０.２ｍｍ×深さ０.１ｍｍ、ラプラス弁１１７（１１７Ａ、１１７Ｂ、１１７Ｃ、１１７Ｄ）は幅０.１ｍｍ×深さ０.０１６ｍｍのマイクロ流路３６本で構成されている（この数値は図１Ａおよび図１Ｂの作製例の数値を例示したものであり、これに限定されるものではない）。第１〜第４の培養チャンバー１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃ、１０２Ｄは、それぞれ、第１〜第４の上流口１１２（１１２Ａ、１１２Ｂ、１１２Ｃ、１１２Ｄ）、第１〜第４のウェル１１３（１１３Ａ、１１３Ｂ、１１３Ｃ、１１３Ｄ）、第１〜第４の下流口１１４（１１４Ａ、１１４Ｂ、１１４Ｃ、１１４Ｄ）を備えている。上流側の培養チャンバー（第１の培養チャンバー）１０２Ａの下流口（第１の下流口）１１４Ａと下流側の培養チャンバー（第２の培養チャンバー）１０２Ｂの上流口（第２の上流口）１１２Ｂとが連絡流路（第１の連絡流路）１１５Ａで接続されている。最下流側の培養チャンバー（第４の培養チャンバー）１０２Ｄの下流口（第４の下流口）１１４Ｄと最上流側の培養チャンバー（第１の培養チャンバー）１０２Ａの上流口（第１の上流口）１１２Ａとが連絡流路（第４の連絡流路）１１５Ｄで接続されている。なお、臓器モデルによっては、途中の培養チャンバー（例えば、第２の培養チャンバー１０２Ｂ、第３の培養チャンバー１０２Ｃ）の下流口（第２の下流口１１４Ｂ、第３の下流口１１４Ｃ）から連絡流路を分岐させて上流側の培養チャンバーの上流口に接続させることもできる。
各培養チャンバー１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃ、１０２Ｄのウェル１１３（１１１３Ａ、１１３Ｂ、１１３Ｃ、１１３Ｄ）には様々な培養細胞を臓器モデルとして搭載することができる。
図７は２連培養チャンバー型の８ユニットシステム８Ａを、肝臓１９Ａやがん１９Ｂの細胞を臓器モデルとして利用して２臓器連結モデル３Ａとして使用した例で、ある。
図８は４連培養チャンバー型の４ユニットシステム８Ｂを、肺１９Ｃ、肝臓１９Ａ、腎臓１９Ｄ、脂肪１９Ｅの細胞を導入して４臓器連結モデル３Ｂとして使用した例である。
【００３０】
（２連培養チャンバー３Ａ系のマルチユニットシステムの動作原理）
図９Ａ〜図９Ｅは、２連培養チャンバー３Ａ系のマルチユニットシステムの動作原理を説明するための図である。
マイクロ流路プレートは図３に示す２連培養チャンバー３Ａ型の８ユニットシステム（２臓器×８連プレート）のマイクロ流路プレート８Ａを使用する。
図９Ａに示すような構成で、下からホルダー９、マイクロ流路プレート８Ａ、貫通孔板７および蓋６を重ねて留め金（蓋部押圧部、壁部押圧部）２０、２０Ａで固定して、２臓器連結培養用の培養容器（培養装置）１を形成する。
なお、図９Ａに示す構成では、ホルダー９、マイクロ流路プレート８Ａ、貫通孔板７が一体形成された部材の一例を示しており、当該部材を本体（槽本体）１Ａと呼ぶ。図９Ａに示す例では、逆止弁１１Ａ、１１Ｂを設置し、培養液を循環させることのできる構成である。
また、図９Ａに示すような一体形成型の構成では、本体（槽本体）１Ａに、蓋６の押圧部（蓋部押圧部）として第１の留め金２０（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図１２Ａ〜図１２Ｃを参照、図９Ａ〜図９Ｅでは不図示）が設けられていればよい。第１の留め金２０を外すことにより、蓋６は開閉可能、または、着脱可能である。
なお、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図１２Ａ〜図１２Ｃに示すように、ホルダー９、マイクロ流路プレート８Ａ、貫通孔板７が個別に設けられる場合（一体形成型でない場合）には、ホルダー９には留め金が、第１の留め金（蓋部押圧部）２０と第２の留め金（壁部押圧部）２０Ａとの２組設置されており、第２の留め金２０Ａによりマイクロ流路プレート８Ａと貫通孔板７を固定した状態（本体（槽本体）１Ａ）で、蓋６のみを開閉することができる。
蓋６を閉じたときはＯリング等の封止材２１で蓋と本体１Ａとの間の気密性を確保する。なお、以下の工程は、全てのユニットで同時に同じ工程が行われる。
以下、図９Ｂ〜図９Ｅを用いて培地循環の工程を説明する。なお、図９Ｂ〜９Ｅは、図９Ａの２連培養チャンバー３Ａの構成に対応した図であり、培地の流れを説明する図である。
（１）第１工程（図９Ｂを参照）
培養容器１の蓋６を開き、貫通孔板７によってマイクロ流路プレート８Ａ上に形成される第１のウェル１３Ａおよび第２のウェル１３Ｂ内に細胞１９を播種して接着させる。
（２）第２工程（図９Ｃを参照）
第１の培養チャンバー２Ａに培地３１を満たし、培養プレートの蓋６を閉じる。
（３）第３工程（図９Ｄを参照）
第１の培養チャンバー２Ａ内を第１のエアフィルター２２Ａを介して加圧し、第２の培養チャンバー２Ｂを第２のエアフィルター２２Ｂを介して大気圧開放する。第１の逆止弁（チェックバルブ１）１１Ａが閉塞状態になり、第２の逆止弁（チェックバルブ２）１１Ｂが開放状態になるため、培地は第１の下流口１４Ａから第１の連絡流路１５Ａを通じて第２の培養チャンバー２Ｂに送液される。第１のウェル１３Ａは第１下流口１４Ａよりも低い位置にあるため、第１の培養チャンバー２Ａ内を加圧し続けた場合でも第１のウェル１３Ａ内の培地は枯渇せず残留する。このように、ウェルを含む細胞保持部が培養チャンバー内に設けられることにより、培地が枯渇せず、細胞は死滅しない。
また、下流口１４Ａに近い位置には、ラプラス弁１７（１７Ａ）が設けられているので、後述する「ラプラス弁」の機能により、培地送液後に第１の培養チャンバー２Ａ内を加圧しても第１の連絡流路１５Ａに空気が流入することはない。なお、送液流量は圧力およびマイクロ流路プレート８Ａ上の第１の連絡流路１５Ａの途中に設けた抵抗流路１６Ａの抵抗により調整される。
（４）第４工程（図９Ｅを参照）
第２の培養チャンバー２Ｂ内を加圧し、第１の培養チャンバー２Ａ内を大気圧開放する。第３工程と同様の過程で第２の培養チャンバー２Ｂ内の培地は第１の培養チャンバー２Ａに送液される。
（５）培地循環
第３工程と第４工程とを繰り返すことにより、２つの培養チャンバー内において（第１の培養チャンバーと第２の培養チャンバーとの間において）培地を循環させる。
【００３１】
（４連培養チャンバー３Ｂ系のマルチユニットシステムの動作原理）
図１０Ａ〜図１０Ｇは、４連培養チャンバー３Ｂ系のマルチユニットシステムの動作原理を説明するための図である。
マイクロ流路プレートは図５に示す４連培養チャンバー３Ｂ型の４ユニットシステム（４臓器×４連プレート）のマイクロ流路プレート８Ｂを使用する。図１０Ａに示す構成で、下からホルダー９、マイクロ流路プレート８、貫通孔板７および蓋６を重ねて留め金（蓋部押圧部、壁部押圧部）２０、２０Ａ（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図１２Ａ〜図１２Ｃ参照）で固定して、４臓器連結培養用の培養容器１０１を形成する。
なお、図１０Ａに示す構成では、ホルダー９、マイクロ流路プレート８Ｂ、貫通孔板７が一体形成された部材の一例を示しており、当該部材を本体（槽本体）１０１Ａと呼ぶ。図１０Ａに示す例では、第１〜第４の逆止弁１１１Ａ、１１１Ｂ、１１１Ｃ、１１１Ｄを設置し、培養液を循環させることのできる構成となっている。
また、図１０Ａに示すような一体形成型の構成では、本体（槽本体）１０１Ａに、蓋６の押圧部（蓋部押圧部）として第１の留め金２０（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図１２Ａ〜図１２Ｃを参照、図１０Ａ〜図１０Ｇでは不図示）が設けられていればよい。第１の留め金２０を外すことにより、蓋６は開閉可能、または、着脱可能である。
なお、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図１２Ａ〜図１２Ｃに示すように、ホルダー９、マイクロ流路プレート８Ａ、貫通孔板７が個別に設けられる場合（一体形成型でない場合）には、ホルダー９には、第１の留め金（蓋部押圧部）２０と第２の留め金（壁部押圧部）との２組設置されており、第２の留め金２０Ａによりマイクロ流路プレート８Ｂと貫通孔板７を固定した状態（以下本体（槽本体）１０１Ａと呼ぶ）で、第１の留め金２０を外すことにより、蓋６のみを開閉することができる。蓋６を閉じたときはＯリング等の封止材２１で蓋６と本体１０１Ａとの間の気密性を確保する。また、図６に対応するように、図１２Ａ〜図１２Ｃの４連培養チャンバーには、第１〜第４の上流口１１２Ａ〜１１２Ｄ、および、第１〜第４のラプラス弁１１７Ａ〜１１７Ｄが設けられている。なお、以下の工程は、全てのユニットで同時に同じ工程が行われる。
以下、図１０Ｂ〜図１０Ｇを用いて培地循環の工程を説明する。なお、図１０Ｂ〜１０Ｅは、図１０Ａの４連培養チャンバー３Ｂの構成に対応した図であり、培地の流れを説明する図である。
（１）第１工程（図１０Ｂを参照）
培養容器１０１の蓋６を開き、第１のウェル１１３Ａ、第２のウェル１１３Ｂ、第３のウェル１１３Ｃ、第４のウェル１１３Ｄ内に細胞１９を播種して接着させる。
（２）第２工程（図１０Ｃを参照）
第１の培養チャンバー１０２Ａに培地３１を満たし、培養容器（プレート）１０１の蓋６を閉じる。
（３）第３工程（図１０Ｄを参照）
第１の培養チャンバー１０２Ａ内を第１のエアフィルター１２２Ａを介して加圧し、第２の培養チャンバー１０２Ｂ内を第２のエアフィルター１２２Ｂを介して大気圧開放する。第１の逆止弁（チェックバルブ１）１１１Ａが閉塞状態になり、第２の逆止弁（チェックバルブ２）１１１Ｂが開放状態になるため、培地３１は第１の下流口１１４Ａから第１の連絡流路１１４Ａを通じて第２の培養チャンバー１０２Ｂに送液される。第１のウェル１１３Ａは第１の下流口１１４Ａよりも低い位置にあるため、第１の培養チャンバー１０２Ａ内を加圧し続けた場合でも第１のウェル１１３Ａ内の培地は枯渇せず残留する。このように、ウェルを含む細胞保持部が培養チャンバー内に設けられることにより、培地が枯渇せず、細胞は死滅しない。
また、第１の下流口１１４Ａに近い位置には、ラプラス弁１１７（第１のラプラス弁１１７Ａ）が設けられているので、後述する「ラプラス弁」の機能により、培地送液後に第１の培養チャンバー１０２Ａ内を加圧しても第１の連絡流路１１５Ａに空気が流入することはない。なお、送液流量は圧力および連絡流路１１５Ａの途中に設けた第１の抵抗流路１１６Ａの抵抗により調整される。
（４）第４工程（図１０Ｅを参照）
第２の培養チャンバー１０２Ｂ内を第２のエアフィルター１２２Ｂを介して加圧し、第３の培養チャンバー１０２Ｃ内を第３のエアフィルター１２２Ｃを介して大気圧開放する。第３工程と同様の過程で第２の培養チャンバー１０２Ｂ内の培地は第３の培養チャンバー１０２Ｃに送液される。
（５）第５工程（図１０Ｆを参照）
第３の培養チャンバー１０２Ｃ内を第３のエアフィルター１２２Ｃを介して加圧し、第４の培養チャンバー１０２Ｄ内を第４のエアフィルター１２２Ｄを介して大気圧開放する。第４工程と同様の過程で第３の培養チャンバー１０２Ｃ内の培地は第４の培養チャンバー１０２Ｄに送液される。
（６）第６工程（図１０Ｇを参照）
第４の培養チャンバー１０２Ｄ内を第４のエアフィルター１２２Ｄを介して加圧し、第１の培養チャンバー１０２Ａ内を第１のエアフィルター１２２Ａを介して大気圧開放する。第５工程と同様の過程で第４の培養チャンバー１０２Ｄ内の培地は第１の培養チャンバー１０２Ａに送液される。
（７）培地循環
第３工程から第６工程を繰り返すことにより、第１〜第４の４つの培養チャンバー内に培地を循環させる。
【００３２】
（ラプラス弁の説明）
ラプラス弁１７の構造と機能を、図１１Ａ〜図１１Ｃを用いて説明する。図１１Ａは、ラプラス弁１７が設けられた培養チャンバー２の部分拡大図を示す。図１１Ｂは、ラプラス弁１７を介して下流口１４から連絡流路１５に培地３１が流入する場合の模式図を示す。図１１Ｃは、下流口１４に空気が流入した際に、ラプラス弁１７が機能している際の模式図を示す。図１１Ｃに示すように、微細な流路内において、培地３１と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において培地が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。本明細書において、当該微細流路で構成される空気流入防止機構を「ラプラス弁」と呼称する。図３、４、５、および６に図示したマイクロ流路プレート８Ａ、８Ｂでは、各培養チャンバー２Ａ、２Ｂ、１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃ、１０２Ｄの下流口１４、１１４と連絡流路１５、１１５との間に３６個の「ラプラス弁」が放射状に設けられている。
【００３３】
（ラプラス弁の設計について）
上述したラプラス弁１７の設計について、以下に説明する。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力（ラプラス圧、限界圧力）（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅（ｗＬ）および深さ（ｈＬ）によって以下の式（１）で計算できる。
ΔＰＬａｐ＝２γ（１／ｗＬ＋１／ｈＬ）                      （１）
本実施形態および以下に示す実施形態に係る培養装置１を駆動するための現実的な圧力範囲は市販の圧力制御装置で調整可能な圧力範囲および細胞の耐圧性によって決定されると考えられる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度（３０ｋＰａ＝２２５ｍｍＨｇ）とすると、本実施形態および以下に示す実施形態に係る培養装置１を駆動するために現実的な圧力範囲は１ｋＰａ〜３０ｋＰａ程度となる。培養液の界面張力は６０ｍＮ／ｍ程度であり、ラプラス弁１７を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりｗＬ＝ｈＬの場合、３０ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法は上記式（１）よりｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ程度、１ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法はｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ程度と推算される。
ラプラス弁１７を構成するマイクロ流路の寸法を上記寸法（３０ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ、１ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ）よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁１７に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁１７が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔＰＬａｐが、培養装置１で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁１７を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁１７に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、ｗＬとｈＬの比率が１：１でない場合も同様に式（１）に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
以下に示す実施例では、マイクロ流路の幅及び深さを２００μｍおよび２５μｍと設計し、ラプラス圧が５．４ｋＰａと推算して本装置をこの圧力以下で運用した。
【００３４】
（抵抗流路の設計について）
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量（Ｑ）と圧力損失（ΔＰ）には以下の関係がある（F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照）。
【００３５】
【数１】
2016158233.tif 000003
【００３６】
【数２】
2016158233.tif 000004
上記式（２）および式（３）において、ΔＰはマイクロ流路の入口と出口の圧力差、Ｒは流路抵抗、μは流体の粘度、ｌはマイクロ流路の長さ、ｗはマイクロ流路の幅、ｈはマイクロ流路の深さである。当該式（２）および式（３）はｗ＞ｈの条件で成立する。
例えば、本実施形態および以下に示す実施形態に係る細胞培養装置は、前記連絡用流路の一部に流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位を備えていてもよい。
この時、連絡用流路の抵抗流路部位と、連絡用流路の抵抗流路以外の部位と、の長さが等しい場合を考える。この時、抵抗流路の断面積が連絡用流路の１／１０となると、幅ｗ、深さｈが１／１００．５となり、式（３）の抵抗流路の流路抵抗Ｒが、連絡用流路の抵抗流路以外の部位の流路抵抗Ｒの１００倍となる。
式（２）より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、連絡用流路の抵抗流路以外の部位の圧力損失の１００倍となる。この時、流路全体を流れる流量を推算する際に、抵抗流路の抵抗と流路全体にかかる圧力のみを考慮して流量を推算した場合の推算誤差が１／１００となり、これは許容できる誤差と言える。
すなわち、連絡用流路の一部に流量を調節するために流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位が設けられた場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
【００３７】
図１２Ａ〜図１２Ｃは、図２および図３で示した細胞培養装置１における２連培養チャンバー３Ａ型の８ユニットシステム８Ａとしての詳細な細胞培養装置１の組み立て図である。
図１２Ａにおいて細胞培養装置１における正面断面図（組み立て前）を符号２０１Ａ１で示し、図１２Ｂにおいて細胞培養装置１における側面断面図（組み立て前）を符号２０１Ｂ１で示す。
また、図１２Ａにおいて、細胞培養装置１における正面断面図（組み立て後）を符号２０１Ａ２で示し、図１２Ｂにおいて細胞培養装置１における側面断面図（組み立て後）を符号２０１Ｂ２で示す。
さらに、図１２Ｃにおいて、組み立て後の細胞培養装置１における上面図を符号２０１Ｃで示す。
図１２Ｃにおいて、蓋６に設けられた４本の空圧配管（加圧ライン）５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄについて説明すると、上面図２０１Ｃにおける一番上の空圧配管（第１の空圧配管）５Ａが貫通孔板７に設けた一番上に並んだ（同列に配置された）４つの培養チャンバー（縦方向（第１方向）における第１列目の培養チャンバー群）２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ａ４に連通している。
当該４つの培養チャンバー２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ａ４を同時に加圧すること、または、当該４つの培養チャンバー２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ａ４を同時に大気圧開放することができる構成となっている。
他の３本の空圧配管（第２〜第４の空圧配管）５Ｂ、５Ｃ、５Ｄも、当該第１の空圧配管５Ａと同様の構成となっている。
なお、２連培養チャンバー３Ａ型であるので、横方向（第２方向）における第１列目の培養チャンバー２Ａ１と培養チャンバー２Ｂ１とは連通している。
同様に、横方向の第１列目における培養チャンバー２Ｃ１と２Ｄ１とは連通している。
他の、培養チャンバーも図１２Ｃの上面図２０１Ｃに示すように、同様の構造を有する。
なお、図１２Ａ〜図１２Ｃにおける符号１３５（１３５Ａ〜１３５Ｄ）は、空圧配管に接続するフィルターを示している。
ここでは、空圧配管に接続するフィルター１３５（１３５Ａ〜１３５Ｄ）として示したが、フィルター１３５が各培養チャンバーに予め設定されたスケジュールに従って、順次加圧あるいは大気圧開放可能な加圧装置であってもよい。
したがって、例えば、「２連培養チャンバー３Ａ系のマルチユニットシステムの動作原理」の項に示した２連培養チャンバー３Ａ系のマルチユニットシステムの第３工程では、図１２Ｃの上面図２０１Ｃにおける上から１番目の空圧配管（第１の空圧配管）５Ａおよび３番目の空圧配管（第３の空圧配管）５Ｃを加圧し、２番目の空圧配管（第２の空圧配管）５Ｂおよび４番目の空圧配管（第４の空圧配管）５Ｄを大気圧開放すればよい。また、次の第４工程では、１番目の空圧配管（第１の空圧配管）５Ａおよび３番目の空圧配管（第３の空圧配管）５Ｃを大気圧開放し、２番目の空圧配管（第２の空圧配管）５Ｂおよび４番目の空圧配管（第４の空圧配管）５Ｄを加圧すればよい。
なお、マイクロ流路プレートを入れ替えて４連培養チャンバー型の４ユニットシステム８Ｂとした場合における「４連培養チャンバー３Ｂ系のマルチユニットシステムの動作原理」に記載の第３工程では、上から１番目の空圧配管（第１の空圧配管）５Ａを加圧し、２番目の空圧配管（第２の空圧配管）５Ｂを大気圧開放すればよい。
次の第４工程では、上から２番目の空圧配管（第２の空圧配管）５Ｂを加圧し、３番目の空圧配管（第３の空圧配管）５Ｃを大気圧開放すればよい。
次の第５工程では、上から３番目の空圧配管（第３の空圧配管）５Ｃを加圧し、４番目の空圧配管（第４の空圧配管）５Ｄを大気圧開放すればよい。
次の第６工程では、上から４番目の空圧配管（第４の空圧配管）５Ｄを加圧し、１番目の空圧配管（第１の空圧配管）５Ａを大気圧開放すればよい。
【００３８】
上記説明では、２連培養チャンバー３Ａ型の８ユニットシステムと４連培養チャンバー３Ｂ型の４ユニットシステムとの兼用タイプの細胞培養装置１で説明したが、これら上述の例に限らず、ｍ連培養チャンバー型のｎユニットシステム（ここで、ｍおよびｎは２以上の整数）として、細胞培養装置を実現できる。
すなわち、本実施形態における細胞培養装置は、例えば、図１２Ｃにおける縦方向（第１の方向、２Ａ１、２Ｂ１、２Ｃ１、２Ｄ１）に沿ってｍ個の培養チャンバーが並列配置されたｍ連培養チャンバーが設けられ、当該縦方向に略垂直に配置される横方向（第２の方向）に沿ってｎユニットのｍ連培養チャンバーが並列に配置された構成を有することができる。
本実施形態における細胞培養装置においては、空圧配管が第２方向に沿って同列に配置されたｎ個の培養チャンバーから構成される同列配置培養チャンバー（例えば、図１２Ｃにおける培養チャンバー２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ａ４）間を連通し、ｎ個の培養チャンバーから構成される同列配置培養チャンバー間に同時に加圧可能または同時に大気圧開放可能な構成を有している。
そのため、本実施形態における細胞培養装置は空圧配管の存在により、ｍ個の培養チャンバー内の圧力差によって、連絡用流路を通してｍ個の培養チャンバーの間で液体培地を液送可能に構成されている。
ユニット毎に異なる医薬品等の液体培地を用いれば、ｎ種類の医薬品の薬効等が一度に分析でき、同じ液体培地を用いれば同一の条件下でｎ回の分析が一度にできる。
また、圧力駆動に用いる気体は、細胞培養に適した二酸化炭素および酸素の含有量に調整すると好ましい。
上述の実施形態においては、逆止弁１１を用いる例を示したが、培地等の液の逆流を防止できる機構であれば（逆流防止機構が設けられていれば）、逆止弁に限定されない。
例えば、逆止弁１１に代えて、逆流を防ぐために逆流を防ぎたい側の培養チャンバーを加圧することによっても逆流を防止することもできる。
また、逆止弁１１に代えて、ラプラス弁を用いてもよい。
【００３９】
以下、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置を、図面に基づいて説明する。
【００４０】
図１３Ａ〜１３Ｅは、本実施形態における細胞培養装置における２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と２連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
本実施形態において上述した第１実施形態と異なるのは、上述の第１実施形態における逆止弁１１に代えて、ラプラス弁（逆流防止ラプラス弁）３１７（３１７Ａ、３１７Ｂ）を逆流防止機構として用いた点であり、逆流防止機構以外の対応する構成に関しては、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。
【００４１】
図１３Ａは、連結した２連培養チャンバー３０３Ａの断面図である。
図１３Ｂ〜１３Ｅは、図１３Ａの構成に対応した図であり、培地の流れを説明する図である。
連結した２連培養チャンバー３０３Ａは、第１の培養チャンバー３０２Ａ１と、第２の培養チャンバー３０２Ａ２とを有する。
当該第１の培養チャンバー３０２Ａ１の底部は、第１の仕切り部３３０Ａにより、第１の流路導入口３１１Ａが設けられた部位（第１ＣＶ部）３５０Ａ１と、第１のラプラス弁３１７Ａおよび第１のウェル３１３Ａが設けられた部位（第１ＬＶ部）３５０Ａ２とに分けられている。
同様に、当該第２の培養チャンバー３０２Ａ２の底部は、第２の仕切り部３３０Ｂにより、第２の流路導入口３１１Ｂが設けられた部位（第２ＣＶ部）３５０Ｂ１と、第２のラプラス弁３１７Ｂおよび第２のウェル３１３Ｂが設けられた部位（第２ＬＶ部）３５０Ｂ２とに分けられている。
また、第１の培養チャンバー３０２Ａ１における第１の流路導入口３１１Ａと、第２の培養チャンバー３０２Ａ２における第２のラプラス弁３１７Ｂと、は第１流路３１５Ａで接続されている。
また、第１の培養チャンバー３０２Ａ１における第１のラプラス弁３１７Ａと、第２の培養チャンバー３０２Ａ２における第２の流路導入口３１１Ｂと、は第２流路３１５Ｂで接続されている。
図１３Ａにおいては、第１流路３１５Ａにおける第１の流路導入口３１１Ａから第１のラプラス弁３１７Ｂまでの間の部位、および、第２のウェル３１３Ｂに、第１培地３３１Ａが満たされている状態を示す。
また、図１３Ａにおいては、第２流路３１５Ｂ、第１のラプラス弁および第１のウェル３１３Ａが設けられた第１ＬＶ部３５０Ａ２から第２の流路導入口３１１Ｂが設けられた第２ＣＶ部３５０Ｂ１まで第２培地３３１Ｂが満たされている状態を示す。
図１３Ａに示すように、第１培地３３１Ａおよび第２培地３３１Ｂのいずれも、培地の表面が第１の仕切り部３３０Ａよりも低い位置にある場合には、第１培地３３１Ａおよび第２培地３３１Ｂのいずれも第１の仕切り部３３０Ａを超えて移動することはできない。図１３Ａに示すように、仕切り部３３０Ａが所定の高さを有することにより、逆止弁を設けずとも、ラプラス弁３１７Ｂの機能により、培地の逆流が防止される。
なお、本実施形態に係る逆流防止機構においては、例えば、仕切り部３３０Ａを用いずとも連絡流路（第１流路）３１５Ａの出口（第１の流路導入口３１１Ａ）がもう一方の連絡流路（第２流路）３１５Ｂの入り口（第１のラプラス弁３１７Ａ）よりも高い位置に配置することでも機能し、培地の逆流を防止することができる。
【００４２】
図１３Ｂに、第１の培養チャンバー３０２Ａ１を加圧した場合の図を示す。
第１の培養チャンバー３０２Ａ１を加圧すると、第１の流路導入口３１１Ａから第２のラプラス弁３１７Ｂに第１培地３３１Ａが送液される。
同様に、第１の培養チャンバー３０２Ａ１を加圧することにより、第１のラプラス弁３１７Ａから第２の流路導入口３１１Ｂに第２培地３３１Ｂが送液される。
図１３Ｂにおいては、第１の流路導入口３１１Ａ（第１ＣＶ部３５０Ａ１）に存在した第１培地３３１Ａは、全て第２のラプラス弁３１７Ｂ側（第２ＬＶ部３５０Ｂ２）に送液される。
このとき、第１の流路導入口３１１Ａ、第１流路３１５Ａ、第２のラプラス弁３１７Ｂの容量の合計の一例は、２０μＬ未満である。第１の培養チャンバー３０２Ａ１の容量に比べて、第１の流路導入口３１１Ａ、第１流路３１５Ａ、第２のラプラス弁３１７Ｂの合計の容量に特段の制限はない。一方、第１の培養チャンバー３０２Ａ１の容量に比べて、第１の流路導入口３１１Ａ、第１流路３１５Ａ、第２のラプラス弁３１７Ｂの合計の容量が少なければ、第１の培養チャンバー３０２Ａ１のウェル（第１のウェル）３１３Ａに存在する細胞と接触した培地がより多く第２の培養チャンバー３０２Ａ２に流入するため、第１の培養チャンバー３０２Ａ１に存在する細胞より分泌された物質を効率的に第２の培養チャンバー３０２Ａ２に存在する細胞に作用させることが可能となる。従って、第１の流路導入口３１１Ａ、第１流路３１５Ａ、および第２のラプラス弁３１７Ｂの合計の容量は、第１の培養チャンバーの容量の同程度以下が好ましく、２分の１以下がより好ましく、１０分の１以下がさらに好ましい。
【００４３】
図１３Ｃにおいては、第１の培養チャンバー３０２Ａ１において、第１ＬＶ部３５０Ａ２に存在する第２培地３３１Ｂは、第１の培養チャンバー３０２Ａ１の第１のラプラス弁３１７Ａに空気が到達するまで、第２の培養チャンバー３０２Ａ２に送液される。
ラプラス弁３１７Ａに空気が到達した場合には、ラプラス弁の機能が働き、第２培地３３１Ｂの送液が停止する。
このような培地の移動により、第１培地３３１Ａと第２培地３３１Ｂとは混合され、混合培地３３１Ｃが形成される。
【００４４】
図１３Ｄおよび図１３Ｅに示すように、第２の培養チャンバー３０２Ａ２を加圧すると、上述の図１３Ｂ、図１３Ｃに係る説明で示した機構と、同様の機構により、第２の培養チャンバー３０２Ａ２から第１の培養チャンバー３０２Ａ１に混合培地３３１Ｃが送液される。
以降、図１３Ｂに示す操作から図１３Ｄに示す操作までを繰り返すことにより混合培地３３１Ｃは循環し、混合培地３３１Ｃをより均一に混合することができる（均一な混合培地３３１Ｃを形成できる）。
【００４５】
なお、図１３Ａ〜１３Ｅにおいては、２連培養チャンバー３０３Ａを用いた例を示しているが、第１実施形態に示したように、第２実施形態においても４連培養チャンバー式を用いることが可能である。
４連培養チャンバー式を用いた場合にも、２連培養チャンバー３０３Ａの例と同様に、ラプラス弁（逆流防止ラプラス弁）を逆流防止機構として用いることにより、第１実施形態に示したような逆止弁を設けずとも、培地の逆流を防止しつつ、各培養チャンバー間における培地の移動が可能であり、各培地の混合が可能である。
すなわち、４連培養チャンバーにおいても、各培養チャンバーを順次加圧することにより、培地循環が可能となる。
【００４６】
図１３Ｆは、本実施形態における４連培養チャンバー３０３Ｂの一例を示す断面図である。
連結した４連培養チャンバー３０３Ｂは、第１の培養チャンバー１３０２Ａ１、第２の培養チャンバー１３０２Ａ２、第３の培養チャンバー１３０２Ａ３、および第４の培養チャンバー１３０２Ａ４を有する。
当該第１の培養チャンバー１３０２Ａ１の底部は、第１の仕切り部１３３０Ａにより、第１の流路導入口１３１１Ａが設けられた部位（第１ＣＶ部）１３５０Ａ１と、第１のラプラス弁１３１７Ａおよび第１のウェル１３１３Ａが設けられた部位（第１ＬＶ部）１３５０Ａ２とに分けられている。
同様に、当該第２の培養チャンバー１３０２Ａ２の底部は、第２の仕切り部１３３０Ｂにより、第２の流路導入口１３１１Ｂが設けられた部位（第２ＣＶ部）１３５０Ｂ１と、第２のラプラス弁１３１７Ｂおよび第２のウェル１３１３Ｂが設けられた部位（第２ＬＶ部）１３５０Ｂ２とに分けられている。
同様に、当該第３の培養チャンバー１３０２Ａ３の底部は、第３の仕切り部１３３０Ｃにより、第３の流路導入口１３１１Ｃが設けられた部位（第３ＣＶ部）１３５０Ｃ１と、第３のラプラス弁１３１７Ｃおよび第３のウェル１３１３Ｃが設けられた部位（第３ＬＶ部）１３５０Ｃ２とに分けられている。
さらに、当該第４の培養チャンバー１３０２Ａ４の底部は、第４の仕切り部１３３０Ｄにより、第４の流路導入口１３１１Ｄが設けられた部位（第４ＣＶ部）１３５０Ｄ１と、第４のラプラス弁１３１７Ｄおよび第４のウェル１３１３Ｄが設けられた部位（第４ＬＶ部）１３５０Ｄ２とに分けられている。
また、第１の培養チャンバー１３０２Ａ１における第１の流路導入口１３１１Ａと、第２の培養チャンバー１３０２Ａ２における第２のラプラス弁１３１７Ｂと、は第１流路１３１５Ａで接続されている。
また、第２の培養チャンバー１３０２Ａ２における第２の流路導入口１３１１Ｂと、第３の培養チャンバー１３０２Ａ３における第３のラプラス弁１３１７Ｃと、は第２流路１３１５Ｂで接続されている。
また、第３の培養チャンバー１３０２Ａ３における第３の流路導入口１３１１Ｃと、第４の培養チャンバー１３０２Ａ４における第４のラプラス弁１３１７Ｄと、は第３流路１３１５Ｃで接続されている。
さらに、第４の培養チャンバー１３０２Ａ４における第４の流路導入口１３１１Ｄと、第１の培養チャンバー１３０２Ａ１における第１のラプラス弁１３１７Ａと、は第４流路１３１５Ｄで接続されている。
【００４７】
上述のように構成された本実施形態における４連培養チャンバー３０３Ｂにおいて、第１〜第４のウェル１３１３Ａ〜１３１３Ｄのそれぞれに細胞を播種し、第１〜第４の培養チャンバー１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４のそれぞれに培地を加える。そして、２連培養チャンバー３０３Ａの例と同様に、第１〜第４の培養チャンバー１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４のそれぞれを順次加圧することにより、培地の逆流を防止しつつ、第１〜第４の培養チャンバー１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４間における培地の移動が可能であり、各培地の混合が可能である。
本実施形態に係る４連培養チャンバー３０３Ｂを用いることにより、例えば、第１のチャンバー１３０２Ａ１に存在する細胞より分泌された物質を効率的に、第２の培養チャンバー１３０２Ａ２に存在する細胞に作用させることが可能となる。さらに、第２の培養チャンバー１３０２Ａ２に存在する細胞より分泌された物質を効率的に、第３の培養チャンバー１３０２Ａ３に存在する細胞に作用させることが可能となる。加えて、第３の培養チャンバー１３０２Ａ３に存在する細胞より分泌された物質を効率的に、第４の培養チャンバー１３０２Ａ４に存在する細胞に作用させることが可能となる。そして、第４の培養チャンバー１３０２Ａ４に存在する細胞より分泌された物質を効率的に、第１の培養チャンバー１３０２Ａ１に存在する細胞に作用させることが可能となる。
このように、本実施形態に係る４連培養チャンバー３０３Ｂを用いることにより、第１〜第４の培養チャンバー１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４の間において、それぞれ配置された細胞より分泌された物質を順次サイクルさせることができる。
本実施形態に係る４連培養チャンバー３０３Ｂによれば、例えば、第１実施形態に係る図８において示した４連培養チャンバー型の４ユニットシステム８Ｂのように、肺１９Ｃ、肝臓１９Ａ、腎臓１９Ｄ、脂肪１９Ｅのモデルとなるような細胞を導入して４臓器連結モデル３Ｂと同様に、細胞間の影響を評価することができる。
【００４８】
本実施形態に係る４連培養チャンバー３０３Ｂにおける第１〜第４の培養チャンバー１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４、第１〜第４のラプラス弁１３１７Ａ〜１３１７Ｄ、第１〜第４の流路導入口１３１１Ａ〜１３１１Ｄ、および第１〜第４流路１３１５Ａ〜１３１５Ｄなどの各構成要素の容量、寸法等は、本実施形態の２連培養チャンバー３０３Ａにおいて説明した上述の例と同様であってよい。
本実施形態においては、２連培養チャンバーおよび４連培養チャンバーの例について言及したが、２つ以上の培養チャンバーを有していればよく、培養チャンバーの数はこれらに限定されない。
【００４９】
以下、本発明の第３実施形態に係る細胞培養装置を、図面に基づいて説明する。
【００５０】
図１４および図１５は、本実施形態における細胞培養装置における４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの動作原理と４連培養チャンバー系のマルチユニットシステムの使用方法を説明した図である。
本実施形態において上述した第１実施形態と異なるのは、（１）上述の第１実施形態における逆止弁１１に代えて、ラプラス弁（逆流防止ラプラス弁）４１７を逆流防止機構として用いた点、および、（２）図１４に示すような４連培養チャンバーを用いている点であり、当該（１）および（２）以外の対応する構成に関しては、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。
図１４および図１５に示す本実施形態に係る空気圧駆動型の培地循環方式の細胞培養装置について、以下に説明する。
【００５１】
図１４は、上から（１）本実施形態に係る４連培養チャンバー４０３の流路を示す上面図、（２）４連培養チャンバー４０３の構成要素の結合を単純化した図、および（３）４連培養チャンバー４０３の断面模式図である。
図１５は、本実施形態に係る４連培養チャンバー４０３を用いた場合における空気圧駆動型の培地循環方式の細胞培養装置の動作概念図である。
【００５２】
図１５（Ａ）に示すように、４連培養チャンバー４０３には、第１〜第４の培養チャンバー４０２Ａ〜４０２Ｄが設けられている。
また、第１〜第４の培養チャンバー４０２Ａ〜４０２Ｄには、それぞれ第１〜第４のウェル４１３Ａ〜４１３Ｄが設けられている。
まず、図１５（Ａ）に示すように、第１〜第４のウェル４１３Ａ〜４１３Ｄの各ウェルに細胞４１９を播種して接着させる。
【００５３】
次いで、図１５（Ｂ）に示すように、第２のウェル４１３Ｂに培地４３１を注ぐ。
【００５４】
次に、図１５（Ｃ）に示すように、第１の培養チャンバー４０２Ａ、第２の培養チャンバー４０２Ｂ、および第４の培養チャンバー４０２Ｄを加圧する。
なお、この際加圧する圧力は、第１〜第４の培養チャンバー４０２Ａ〜４０２Ｄ間において略等圧であり、４連培養チャンバー４０３に設けたラプラス弁４１７におけるラプラス圧よりも低い圧力である。
このとき、図１５（Ｃ）に示すように、第１の培養チャンバー４０２Ａおよび第４の培養チャンバーに存在する培地の培地表面は、ラプラス弁が設けられた位置よりも低い位置にあるため、培地の流出は生じない。
また、ラプラス圧よりも低い圧力による加圧を行っているため、ラプラス弁４１７が機能して、流路４１５への空気の流入も生じない。
さらに、第１の培養チャンバー４０２Ａと第２の培養チャンバー４０２Ｂとは等圧で加圧されているため、第２の培養チャンバー４０２Ｂから第１の培養チャンバー４０２Ａへの培地の移送は生じない。
図１５（Ｃ）に示すように、第２の培養チャンバー４０２Ｂに注いだ培地４３１は、大気開放されている第３の培養チャンバー４０２Ｃのみに移送される。
【００５５】
次に、図１５（Ｄ）に示すように、図１５（Ｃ）に示したような培養チャンバーの加圧操作を繰り返すことにより、培地の片道循環を行うことができる。
当該培養チャンバーの加圧操作および培地の片道循環を繰り返すことにより、各チャンバーにおける培地の混合を促進することができる。
本実施形態では、第１〜第４の培養チャンバー４０２Ａ〜４０２Ｄを設けた例を示したが、３つ以上の培養チャンバーがあれば、同様の操作が可能である。
本実施形態に係る培養チャンバーは、３つ以上の培養チャンバーを有していればよく、４連培養チャンバーに限定されない。
【実施例】
【００５６】
次に、本発明の上記実施形態に係る細胞培養装置１について、実施例を示して詳細に説明する。なお、下記の実施例は、本発明が適用された具体的な一例であり、本発明を何ら限定しない。【００５７】
肝臓と癌組織の共培養モデルとして肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）および大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）の培養を２臓器×８連の培養システム（細胞培養装置）を用いて行った。培養プレート内の各細胞の配置を図１６Ａに示す。なお、図１６Ａに示す図は、図７の２臓器連結モデル３Ａに対応している。
図１６Ａに示すように、細胞培養装置の横方向に沿って配置され、かつ、縦方向における第１列目の培養チャンバー群に肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）を配置した。
細胞培養装置の横方向に沿って配置され、かつ、縦方向における第２列目の培養チャンバー群に大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を配置した。
また、細胞培養装置の横方向に沿って配置され、かつ、縦方向における第３列目の培養チャンバー群に肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）を配置した。
細胞培養装置の横方向に沿って配置され、かつ、縦方向における第４列目の培養チャンバー群に大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を配置した。
また、肝癌細胞ＨｅｐＧ２（肝臓モデル）および大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞）の培養スケジュールを図１６Ｂに示す。
ＨｅｐＧ２を培養するウェルをＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  （ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘ、新田ゼラチン）でメーカーの提供するプロトコルに従ってコートした。
大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を培養するウェルはＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液（２８．３ｕｇ／ｍｌ）５０ｕｌでコートした。
Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ溶液によるコート後、各ウェルを培養培地で洗浄し、細胞を播種した。この際に、ＨｅｐＧ２細胞は１００万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＷｉｌｌｉａｍ’Ｓ  Ｅ培地中に懸濁させ、ＨＣＴ１１６は１０万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＭＥＭ培地中に懸濁させ、各ウェル５０ｍｌ液量で添加した。
細胞を播種して３時間後に各ウェルの存在する培養チャンバー毎に３００ｍｌずつの培養培地を添加した。この際に、ＨｅｐＧ２を含むチャンバーにはＷｉｌｌｉａｍ’Ｓ  Ｅ培地を添加し、ＨＣＴ１１６を含むチャンバーにはＭＥＭ培地を添加した。
オーバーナイトで静置培養した後に各チャンバーの培地をＷｉｌｌｉａｍ’Ｓ  Ｅ培地３００ｍｌに置換し、循環培養を行った。
循環培養はＨｅｐＧ２を添加したチャンバーとＨＣＴ１１６を添加したチャンバーに対して４ｋＰａの加圧を１０分おきに繰り返すことによって行った。
循環培養を開始する直前（Ｄａｙ１）のＨｅｐＧ２の細胞の写真を図１７Ａに示す。
循環培養を開始する直前（Ｄａｙ１）のＨＣＴ１１６の細胞の写真を図１７Ｂに示す。
循環培養を４８時間行った後のＨｅｐＧ２の細胞の写真を図１７Ｃに示す。
循環培養を４８時間行った後のＨＣＴ１１６の細胞の写真を図１７Ｄに示す。
ＨｅｐＧ２およびＨＣＴ１１６の両細胞ともに循環培養の間、ウェルの底面に接着している様子が観察され、ＨＣＴ１１６細胞は増殖している様子が観察された。
なお、循環培養を行う際に使用する培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’Ｓ  Ｅ培地３００ｍｌ）にモデル化合物を添加することで、モデル化合物の肝臓と癌への影響を同時に評価すること、および、臓器間相互作用をリアルタイムに反映した状態で評価することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の細胞培養装置および細胞培養方法を利用すれば、医薬品や化成品の薬効や毒性、および吸収、分布、代謝、排泄といった体内動態を、培養細胞を用いて分析することが可能となる。また、本発明は、動物実験代替法として、医薬品や化成品の分析に利用することができる。
【符号の説明】
【００５９】
１、１０１  細胞培養装置（Ｂｏｄｙ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐユニット）
１Ａ、１０１Ａ  本体（槽本体）
２、２Ａ、２Ａ１〜２Ａ４、２Ｂ、２Ｂ１〜２Ｂ４、２Ｃ１〜２Ｃ４、２Ｄ１〜２Ｄ４、１０２Ａ〜１０２Ｄ、３０２Ａ１、３０２Ａ２、４０２Ａ〜４０２Ｄ、１３０２Ａ１〜１３０２Ａ４  培養チャンバー（臓器モデル培養チャンバー）
３Ａ、３０３Ａ  ２連培養チャンバー（２臓器連結モデル、２連培養チャンバー型ＰＤＭＳプレート）
３Ｂ、３０３Ｂ、４０３  ４連培養チャンバー（４臓器連結モデル、４連培養チャンバー型ＰＤＭＳプレート）
４、１５、１５Ａ、１５Ｂ、１１５、１１５Ａ〜１１５Ｄ、３１５Ａ、３１５Ｂ、４１５  連絡流路（マイクロ流路、臓器連結マイクロ流路）
５、５Ａ〜５Ｄ  空圧配管（加圧ライン、圧力配管ライン）
６  蓋（加圧蓋）
７  貫通孔板
７Ａ  壁面（壁部、培養チャンバーの壁面、貫通孔板およびチャンバーの内壁）
８  マイクロ流路プレート
８Ａ  ２臓器×８連プレート（２連培養チャンバー型の８ユニットシステム、底部プレート）
８Ｂ  ４臓器×４連プレート（４連培養チャンバー型の４ユニットシステム、底部プレート）
９  ホルダー（基体部）
１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１１Ａ〜１１１Ｄ  逆止弁（チェックバルブ）
１２、１２Ａ、１２Ｂ、１１２  上流口
１３、１３Ａ、１３Ｂ、１１３、１１３Ａ〜１１３Ｄ、３１３Ａ、３１３Ｂ、４１３Ａ〜４１３Ｄ、１３１３Ａ〜１３１３Ｄ  ウェル
１４、１４Ａ、１４Ｂ、１１４、１１４Ａ〜１１４Ｄ  下流口
１６、１６Ａ、１６Ｂ、１１６  抵抗流路
１７、１７Ａ、１７Ｂ、３１７、３１７Ａ、３１７Ｂ、４１７、４１７Ａ〜４１７Ｄ、１３１７Ａ〜１３１７Ｄ  ラプラス弁
１９Ａ  肝臓
１９Ｂ  がん
１９Ｃ  肺
１９Ｄ  腎臓
１９Ｅ  脂肪
２０  第１の留め金（蓋部押圧部、押圧部材）
２０Ａ  第２の留め金（壁部押圧部、押圧部材）
２１  封止材
２２Ａ、２２Ｂ、１２２Ａ〜１２２Ｄ  エアフィルター
１３５、１３５Ａ〜１３５Ｄ  フィルター（加圧装置）
２０１Ａ１  細胞培養装置の正面断面図（組み立て前）
２０１Ｂ１  細胞培養装置の側面断面図（組み立て前）
２０１Ａ２  細胞培養装置の正面断面図（組み立て後）
２０１Ｂ２  細胞培養装置の側面断面図（組み立て後）
２０１Ｃ  細胞培養装置の上面図
３１１Ａ、３１１Ｂ、１３１１Ａ〜１３１１Ｄ  流路導入口
３３０Ａ、３３０Ｂ、１３３０Ａ〜１３３０Ｄ  仕切り部
３３１Ａ、３３１Ｂ、４３１  培地
３３１Ｃ  混合培地
３５０Ａ１、３５０Ｂ１、１３５０Ａ１〜１３５０Ｄ１  ＣＶ部（流路導入口が設けられた部位）
３５０Ａ２、３５０Ｂ２、１３５０Ａ２〜１３５０Ｄ２  ＬＶ部（ラプラス弁およびウェルが設けられた部位）
４１９  細胞
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【国際調査報告】
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