(57)【要約】  本発明は、HVJ-Eと相乗的に作用する分子を組み合わせることによって得られる新たな抗がん剤として、以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤を提供する。（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤
2017033912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項２】
CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、CXCL2をコードする塩基配列を含む発現ベクターである、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項３】
CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、HVJ-Eに封入されている、請求項１または２に記載の抗がん剤。
【請求項４】
CXCL2発現誘導剤が、合成した二本鎖RNA、Lipopolysaccharide、leukotriene 4、platelet-activating factor (PAF)、angiotensin II (Ang II)、tumor necrosis factor-α (TNF-α)およびInterleukin-17(IL-17)からなる群から選択される、請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項５】
合成した二本鎖RNAが、PolyI:Cである、請求項４に記載の抗がん剤。
【請求項６】
がんが、メラノーマ、肺がん、中皮腫、舌がん、食道がん、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫および平滑筋肉腫からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗がん剤。
【請求項７】
以下の（１）および（２）を含む、N1型好中球誘導剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項８】
CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、CXCL2をコードする塩基配列を含む発現ベクターである、請求項７に記載のN1型好中球誘導剤。
【請求項９】
CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、HVJ-Eに封入されている、請求項７または８に記載のN1型好中球誘導剤。
【請求項１０】
CXCL2発現誘導剤が、合成した二本鎖RNA、Lipopolysaccharide、leukotriene 4、platelet-activating factor (PAF)、angiotensin II (Ang II)、tumor necrosis factor-α (TNF-α)およびInterleukin-17(IL-17)からなる群から選択される、請求項７に記載のN1型好中球誘導剤。
【請求項１１】
合成した二本鎖RNAが、PolyI:Cである、請求項１０に記載のN1型好中球誘導剤。
【請求項１２】
以下の（１）および（２）を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項１３】
以下の（１）および（２）を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、N1型好中球誘導方法：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項１４】
がんの予防または治療に用いるための、以下の（１）および（２）を含む医薬組成物：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項１５】
N1型好中球の誘導に用いるための、以下の（１）および（２）を含む医薬組成物：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項１６】
抗がん剤を製造するための、以下の（１）および（２）の使用：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【請求項１７】
N1型好中球誘導剤を製造するための、以下の（１）および（２）の使用：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)およびCXCL2（またはCXCL2をコードする塩基配列を含む核酸、CXCL2産生誘導剤）を含む、抗がん剤に関する。本発明はまた、HVJ-EおよびCXCL2（またはCXCL2をコードする塩基配列を含む核酸、CXCL2産生誘導剤）を含む、N1型好中球誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫は、病原因子の侵入に対する脊椎動物の必須の防御システムであり、例えば、Toll様受容体(Toll-like receptors;TLRs)、レチノイン酸誘導性遺伝子I様受容体(retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors ;RLRs)、Nod様受容体(Nod-like receptors)、細胞質DNA受容体(cytosolic DNA receptors)、細胞表面C型レクチン受容体(cell surface C-type lectin receptors)などが主要な役割を果たしている。さらに、上記受容体のうち、TLRsは抗腫瘍免疫を担う役割があることも知られており、TLR2/4アゴニストとしてBCG、TLR3アゴニストとしてpoly I:C、TLR4アゴニストとしてmonophosphoryl lipid A(MLA)、TLR7アゴニストとしてImiquimod(合成イミダゾキノリン)、TLR9アゴニストとしてSD-101(ホスホロチオエート CpG ODN)などを用いることによって、がん患者を治療する臨床的な試みが続けられている。
一方、上記受容体のうちRLRsはこれまでに抗腫瘍免疫への関与について報告がほとんどなかったが、RIG-IおよびMDA5活性化を介して、合成DNAがインターフェロン非依存的なアポトーシスをヒトメラノーマに誘導できたことが報告された（非特許文献１）。発明者も、完全に不活性化されたHVJ(hemagglutinating virus of Japan)が、抗腫瘍免疫とがん細胞選択的アポトーシスの誘導を含む複数の抗腫瘍活性を有することを報告しており(非特許文献２）、HVJ-E内のウイルスRNA断片が膜融合を介して細胞質に輸送され、RIG-Iに認識され、ウイルスRNA/RIG-I複合体が、ミトコンドリア抗ウイルスシグナルタンパク質(MAVS)を介してNF-κB、IRF-3やIRF-7のような転写因子を活性化させ、ヒトがん細胞中ではTRAILやNOXAのようなプロアポトーシス分子を活性化させるが、非がん細胞では活性化させないことを見出した(非特許文献２、３）。発明者はまた、HVJ-Eは膜融合を介して細胞質内カルシウムを一時的に増加させ、カスパーゼ８欠損神経芽腫細胞にネクロトーシス(necroptosis)を誘導することも見出した(非特許文献４）。加えて、発明者は、膜融合を行わずとも、樹状細胞上の未知の細胞表面受容体とHVJ-EのFタンパク質の相互作用を介して、樹状細胞からIL-6の産生を刺激することによって、制御性T 細胞の機能を抑制し、抗腫瘍免疫の活性化に寄与することを報告した(非特許文献５、６）。
上記の通り、本発明者は、HVJ-Eが種々のシグナル伝達を活性化することでがん細胞の増殖を抑制できることを実証してきたが、TLRsを介するシグナル伝達を同時に活性化した場合に、HVJ-Eが有するがん細胞に対する増殖抑制効果がどのように変化するのかについては未だ不明なままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Besch R, Poeck H, Hohenauer T, Senft D, Hacker G, Berking C, Hornung V, Endres S, Ruzicka T, Rothenfusser S, Hartmann G. 2009. Proapoptotic signaling induced by RIG-I and MDA-5 results in type I interferon-independent apoptosis in human melanoma cells. J. Clin. Invest. 119: 2399-2411.
【非特許文献２】Kawaguchi Y, Mitamoto Y, Inoue T, Kaneda Y. Efficient eradication of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle. Int. J. Cancer 2009. 124: 2478-87.
【非特許文献３】Matsushima-Miyagi T., Hatano K., Nomura M., Li-Wen L., Nishikawa T., Saga K., Shimbo T、Kaneda Y. TRAIL and Noxa are selectively up-regulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by non-replicating Sendai virus particles. Clinical Cancer Research, 18, 6271-83, 2012.
【非特許文献４】Nomura M, Ueno A, Saga K, Fukuzawa M, Kaneda Y. Accumulation of cytosolic calcium induces necroptotic cell death in human neuroblastoma. Cancer Res. 74, 1056-1066, 2014.
【非特許文献５】Suzuki H, Kurooka M, Hiroaki Y, Fujiyoshi Y, Kaneda Y. Sendai virus F glycoprotein induces IL-6 production in dendritic cells in a fusion-independent manner. FEBS Letter, 2008. 582: 1325-29.
【非特許文献６】Kurooka M Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. Cancer Research, 67, 227-236, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、HVJ-Eによる抗腫瘍効果が、TLRsを介するシグナル伝達の活性化と協調的に作用してがん細胞の増殖をより強く抑制するのか否かを確認し、その結果を基にHVJ-Eと相乗的に作用する分子を組み合わせることによって得られる、がん細胞の増殖抑制効果が高い新たな抗がん剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決すべく、腫瘍マウスにHVJ-EとTLR3アゴニストであるPoly I:Cを組み合わせて投与した。その結果、HVJ-EはTLRsを介するシグナル伝達の活性化と協調的に作用してがん細胞の増殖を抑制できることが確認された。さらに、HVJ-Eを単独で投与した場合やPoly I:Cを単独で投与した場合に比べて、がん増殖抑制効果が当業者の予測を超えて高いことが分かった。また、Poly I:Cは腫瘍においてCXCL2を発現させ、好中球を腫瘍に呼び込んでいることが分かった。さらに、好中球は、HVJ-Eによって樹状細胞などから誘導発現されるIFN-βまたはHVJ-E自体によってN1型好中球に変換された。N1型好中球はがんの増殖抑制に関わることが知られている。加えて、腫瘍マウスにHVJ-EとCXCL2タンパク質またはCXCL2発現ベクターを組み合わせて投与した結果、HVJ-Eを単独で投与した場合やCXCL2を単独で投与した場合に比べて、がん増殖の抑制効果が当業者の予測を超えて高いことが分かった。以上の発見から、本発明が完成されるに至った。即ち、本発明は、
［１］以下の（１）および（２）を含む、抗がん剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［２］CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、CXCL2をコードする塩基配列を含む発現ベクターである、［１］に記載の抗がん剤；
［３］CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、HVJ-Eに封入されている、［１］または［２］に記載の抗がん剤；
［４］CXCL2発現誘導剤が、合成した二本鎖RNA、Lipopolysaccharide、leukotriene 4、platelet-activating factor (PAF)、angiotensin II (Ang II)、tumor necrosis factor-α (TNF-α)およびInterleukin-17(IL-17)からなる群から選択される、［１］に記載の抗がん剤；
［５］合成した二本鎖RNAが、PolyI:Cである、［４］に記載の抗がん剤；
［６］がんが、メラノーマ、肺がん、中皮腫、舌がん、食道がん、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫および平滑筋肉腫からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の抗がん剤；
［７］以下の（１）および（２）を含む、N1型好中球誘導剤：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［８］CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、CXCL2をコードする塩基配列を含む発現ベクターである、［７］に記載のN1型好中球誘導剤；
［９］CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸が、HVJ-Eに封入されている、［７］または［８］に記載のN1型好中球誘導剤；
［１０］CXCL2発現誘導剤が、合成した二本鎖RNA、Lipopolysaccharide、leukotriene 4、platelet-activating factor (PAF)、angiotensin II (Ang II)、tumor necrosis factor-α (TNF-α)およびInterleukin-17(IL-17)からなる群から選択される、［７］に記載のN1型好中球誘導剤；
［１１］合成した二本鎖が、PolyI:Cである、［１０］に記載のN1型好中球誘導剤；
［１２］以下の（１）および（２）を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、がんの予防または治療方法：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［１３］以下の（１）および（２）を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、N1型好中球誘導方法：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［１４］がんの予防または治療に用いるための、以下の（１）および（２）を含む医薬組成物：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［１５］N1型好中球の誘導に用いるための、以下の（１）および（２）を含む医薬組成物：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［１６］抗がん剤を製造するための、以下の（１）および（２）の使用：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
［１７］N1型好中球誘導剤を製造するための、以下の（１）および（２）の使用：
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤；
を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、有効成分としてHVJ-EにCXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤を組み合わせた、新たな抗がん剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を使用した場合における、MTSアッセイの結果を示す図である。
【図２】PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【図３】PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍体積を示す図である。
【図４】上段：PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍内のCXCL1およびCXCL2のタンパク質レベルの比較を示す図である。下段：PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍内のCXCL1およびCXCL2のmRNAレベルの比較を示す図である。
【図５】CXCL1中和抗体投与後、PBSまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍体積および腫瘍重量を示す図である。なお、ISOはCXCL1に特異性のない抗体(Isotype Control)を表す。
【図６】CXCL2中和抗体投与後、PBSまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍体積および腫瘍重量を示す図である。なお、ISOはCXCL2に特異性のない抗体(Isotype Control)を表す。
【図７】PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍内の好中球関連遺伝子のmRNAレベルの比較を示す図である。
【図８】左上：PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍内のCD45+細胞における好中球割合の比較を示す図である。左下：PBS、polyI:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍内の好中球におけるN1型好中球割合の比較を示す図である。右：PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+polyI:C (H+P)を投与した場合における、脾臓内のIFN-γ分泌細胞の数の比較を示す図である。
【図９】抗好中球抗体(anti Ly-6G antibodyまたは anti Neutrophil)を腫瘍内または腹腔内投与後、HVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合における、腫瘍体積および腫瘍重量を示す図である。なお、ISOは好中球に特異性のない抗体(Isotype Control)を表す。
【図１０】上段：CXCL2を使用した場合における、MTSアッセイの結果を示す図である。下段：PBS、CXCL2、HVJ-EまたはHVJ-E+CXCL2 (H+C)を投与した場合における、腫瘍体積および腫瘍重量を示す図である。
【図１１】左：PBS、CXCL2、HVJ-EまたはHVJ-E+CXCL2 (H+C)を投与した場合における、脾臓内のIFN-γ分泌細胞の数の比較を示す図である。右：抗好中球抗体(Neutrophil depletion)を投与後、HVJ-E（右上）またはHVJ-E+CXCL2 (H+C) （右下）を投与した場合における、脾臓内のIFN-γ分泌細胞の数の比較を示す図である。なお、ISOは好中球に特異性のない抗体(Isotype Control)を表す。
【図１２】HVJ-E、HVJ-E+pCY4B(H+vector)またはHVJ-E+pCY4B-CXCL2(H+CXCL2 vector)を投与した場合における、腫瘍体積および腫瘍重量を示す図である。
【図１３】PBSまたはHVJ-Eと共に培養した樹状細胞（DC）の培養上清を用いて好中球を培養した場合における、ICAM-1およびFasの発現レベルをフローサイトメトリー法で解析した結果を示す図である。
【図１４】PBSまたはHVJ-Eと共に好中球を培養した場合における、ICAM-1およびFasの発現レベルをフローサイトメトリー法で解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の（１）および（２）:
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤
を含む、抗がん剤を提供する。
本発明はまた、以下の（１）および（２）:
（１）HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)、
（２）CXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2発現誘導剤
を含む、N1型好中球誘導剤を提供する。
【０００９】
本発明において、センダイウイルスエンベロープ (hemagglutinating virus of Japan envelope、以下、本発明のHVJ-E)とは、センダイウイルス（hemagglutinating virus of Japan、以下、HVJ）由来のウイルスエンベロープをいう。HVJとは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。HVJ粒子は、その表面にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有するエンベロープをもち、直径150〜300 nmの多形性を示す。また、HVJは、約15,500塩基長のマイナス鎖RNAをゲノムとして有し、RNAポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。本発明のHVJ-Eの調製のために用いられるHVJとしては、例えばVR-105、VR-907等が挙げられ、American Type Culture Collection（ATCC）から購入することができる。また、HVJは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであっても良い。
【００１０】
本発明のHVJ-Eは、HVJのRNAを不活性化することによって調製することができる。本発明のHVJ-Eを調製するためのHVJの不活性化方法としては、例えばUV処理やアルキル化処理が挙げられる。不活性化処理により、ゲノムRNAがウイルスエンベロープ内で変性または断片化されてその活性を喪失し、ウイルスとしての複製能が失われる。本発明のHVJ-Eの調製方法は、具体的には、特開2001-286282号公報（WO01/57204号公報）、特開2002-065278号公報、WO03/014338号公報等に記載されており、特に特開2001-286282号公報の実施例８などに記載の方法に従って調製することができる。このようにして得られる本発明のHVJ-Eは複製能が消失しているため、遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入することによって、遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。本発明のHVJ-Eはまた、遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射によりRNAを不活性化したHVJとを融合することで得られる融合粒子（センダイウイルス−リポソーム）であってもよい。
【００１１】
本発明において、CXCL2は、配列番号：2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
CXCL2は、例えば、ヒトの細胞から単離・精製されるタンパク質であってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００１２】
配列番号：2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：2で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら,Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら, J .Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている]、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：2で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１３】
配列番号：2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。ここで「活性」とは、例えば、好中球リクルート活性などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、前記活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約0．1〜約10培、好ましくは約0．5〜約2倍）やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
前記活性の測定は、FACSなどの自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１４】
本発明のCXCL2は、好ましくは、配列番号：2で表されるアミノ酸配列からなるヒトCXCL2タンパク質である。
【００１５】
本明細書において、タンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：2で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のCXCL2は、C末端がカルボキシル基(-COOH)、カルボキシレート(-COO-)、アミド(-CONH2)またはエステル(-COOR)の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル-C1-2アルキル基；α-ナフチルメチルなどのα-ナフチル-C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のCXCL2がC末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のCXCL2には、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００１６】
本発明で用いられるCXCL2は塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１７】
CXCL2は、前述した哺乳動物の細胞から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ、該上清を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりCXCL2またはその塩を調製することができる。
【００１８】
CXCL2は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。CXCL2を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするタンパク質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（1）および（2）に記載された方法に従って行われる。
(1)M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2)SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York(1965年)
【００１９】
このようにして得られたCXCL2は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるCXCL2が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にCXCL2が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２０】
さらに、CXCL2は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からCXCL2を分離精製することによって製造することもできる。CXCL2をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
CXCL2をコードするDNAとしては、ゲノムDNA、ヒトの細胞由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。CXCL2をコードするゲノムDNAであれば、前記動物のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］より調製したゲノムDNA画分を鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）によって直接増幅することができ、CXCL2をコードするcDNAであれば、細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、PCR法およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、CXCL2をコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００２１】
CXCL2をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：1で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含むDNAなどが挙げられる。
配列番号：1で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むDNAとしては、例えば、配列番号：1で表される塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したCXCL2と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝1；ミスマッチスコア＝-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００２２】
CXCL2をコードするDNAは、好ましくは配列番号：1で表される塩基配列で示されるヒトCXCL2タンパク質をコードする塩基配列を含むDNAである。
【００２３】
CXCL2をコードするDNAは、該CXCL2をコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、CXCL2の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版(J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0.1％SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２４】
CXCL2をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、CXCL2をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；動物細胞発現プラスミド（例：pCY4B、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、CXCL2またはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
【００２６】
上記したCXCL2をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、CXCL2を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60巻, 160(1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）,9巻,309(1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），120巻，517（1978）〕，エシェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー, 41巻, 459(1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔ジェネティックス(Genetics), 39巻, 440(1954)〕などが用いられる。
【００２７】
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO（dhfr−）細胞と略記）、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いられる。
【００２８】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69巻, 2110(1972)やジーン(Gene), 17巻, 107(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8  新細胞工学実験プロトコール，263-267 （1995）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456（1973）に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００２９】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），431−433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔サイエンス（Science），122巻，501（1952）〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔ヴィロロジー（Virology），8巻，396（1959）〕，RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association），199巻，519（1967）〕，199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），73巻，1（1950）〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にCXCL2を製造せしめることができる。
【００３０】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からCXCL2を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、CXCL2を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、CXCL2が菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれるCXCL2の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００３１】
かくして得られるCXCL2の存在は、CXCL2に対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００３２】
本発明において、CXCL2発現誘導剤とは、CXCL2の発現させうる化合物であれば特に制限はないが、例えば、合成した二本鎖RNA(例えば、polyinosinic-polycytidylic acid (PolyI:C))、lipopolysaccharide、leukotriene 4、platelet-activating factor (PAF)、angiotensin II (Ang II)、tumor necrosis factor-α (TNF-α)、interleukin-17(IL-17)等が挙げられる。
本発明において、合成した二本鎖RNAとしては、塩基対間の水素結合により二本鎖を形成する合成RNAであって、TLR3シグナルを伝達することによってCXCL2を発現させうるものであれば特に制限はないが、例えば、塩基としてイノシンのみからなるRNA鎖と塩基としてシチジンのみからなるRNA鎖によって形成されるPolyI:Cが挙げられる。また、本発明において、PolyI:Cの分子量は、約100 kDa〜約110kDaであることが好ましい。さらに、本発明において、PolyI:Cの長さは、約140bp〜約180bpであることが好ましい。
【００３３】
以上の通りにして得られるHVJ-EとCXCL2（特に言及しない限り、医薬組成物に関する記述においては、CXCL2はCXCL2タンパク質だけでなく、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸およびCXCL2発現誘導剤をも含む）を含有する医薬組成物は、抗がん剤として提供することができる。
【００３４】
本明細書の後述する実施例においては、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、HVJ-E単独、CXCL2単独またはPolyI:C単独よりも担癌マウスの腫瘍増殖を抑制する効果を示した。以上のことから、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、がんの発症、進行を治療できることが示唆される。従って、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、抗がん剤として用いることができる。
【００３５】
本発明のHVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物の投与対象は、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）があげられる。
【００３６】
本発明のHVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物の適用対象となるがんは、例えば、固形がんであれば特に制限はないが、メラノーマ、肺がん、中皮腫、舌がん、食道がん、胃がん、肝がん、大腸がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、脳腫瘍、甲状腺がん、血管肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫等があげられるが、これらに制限されない。その中でも、メラノーマが好ましく挙げられる。
【００３７】
本発明のHVJ-EおよびCXCL2を含有する医薬組成物は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができ、非経口投与が好ましい。
【００３８】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のHVJ-EおよびCXCL2を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記HVJ-EおよびCXCL2を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００３９】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４０】
本発明のHVJ-EおよびCXCL2を含有する上記医薬組成物は、例えば、成人のがん患者に注射により投与する場合、腫瘍部位、またはその周辺部に、HVJ-EおよびCXCL2を直接注射により投与することができる。また、その投与量は、腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたり１回当たりのHVJ-Eの投与量を3HAU〜600万HAU、好ましくは30HAU〜300万HAU、さらに好ましくは300HAU〜150万HAU、(例えば8,000HAU〜37,000HAU)とすることができる。あるいはまた、体重1kgあたり、10万HAU以下であることが好ましい。また、CXCL2の投与量は、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのCXCL2の投与量を0.001ng〜1,000μg、好ましくは0.01ng〜500μg、更に好ましくは0.1ng〜250μg（例えば0.96ng 〜4.4ng）とすることができる。また、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸の投与量は、上記のCXCL2の投与量に対応する核酸量であってよい。また、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸の投与量は、上記のCXCL2の投与量に対応する核酸量であってよい。腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのCXCL2をコードする塩基配列を含む核酸の投与量を0.15μg〜6mg、好ましくは1.5μg〜3mg、更に好ましくは15μg〜1,500μg（例えば160μg 〜740μg）とすることができる。また、CXCL2発現誘導剤として、例えば、PolyI:Cの投与量は、腫瘍体積が1000mm3以下（例えば、200mm3程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのCXCL2の投与量を0.1μg〜4mg、好ましくは1μg〜2mg、さらに好ましくは10μg〜1mg（例えば80μg〜741μg）とすることができる。HVJ-E自体の抗がん効果とCXCL2の抗がん効果とが相まって、それぞれ単独に用いた場合では実現できない抗がん活性を達成することが可能であるため、HVJ-EやCXCL2を、それぞれ単独で投与する場合と比較して、HVJ-E及びCXCL2それぞれの投与量を減らすことが可能であり、安全性の観点から有利である。また、投与回数も腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。
【００４１】
なお、前記した各組成物は、本発明のHVJ-EおよびCXCL2との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００４２】
さらに、本発明の後述する実施例においては、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、CXCL2によって担癌マウスの腫瘍内に呼び込んだ好中球を、HVJ-Eによる刺激によって樹状細胞から産生されるサイトカインまたはHVJ-E自体によってN1型好中球に変換させる効果を示した。以上のことから、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、投与対象や投与部位にN1型好中球を誘導できることが示唆される。従って、HVJ-EとCXCL2を含有する医薬組成物は、N1型好中球誘導剤として用いることができる。投与対象、剤型、投与量、投与ルートなどは、本発明の抗がん剤と同様であってよい。
【実施例】
【００４３】
細胞株とマウス
B16-F10マウスメラノーマ細胞株を10%FBS (BioWest, Nuaille, France)および0.1 mg/mlペニシリン‐ストレプトマイシン混合溶液 (Nacalai Tesque Inc.)を含有するDMEM培地 (Nacalai Tesque Inc.)中で維持培養した。Clea Japanより購入した6週齢の雌C57BL/6NマウスおよびMyd88-/-マウスをTRIF-/-マウスと交配することによって得られる Myd88-/-TRIF-/- ダブルノックアウトマウスを室温調節下、無菌室で維持し、大阪大学(Suita, Japan)の動物実験規定の承認プロトコールおよびガイドラインに従って、取り扱った。【００４４】
ウイルス
HVJ (VR-105 parainfluenza  Sendai/52 Z strain)をATCC (Manassas, VA)から購入し、Cancer Res. 67, 227-236, 2007に記載の方法に従い調製した。簡潔に述べると、HVJの種溶液を10日齢の孵化鶏卵に注射し、3日間、37℃で培養器中で培養した。3日後に、HVJを注射した鶏卵から尿膜腔液を採取した。回収したウイルス(生HVJ)をUV照射(198 mJ/cm2)によって不活性化し、HVJ-Eを調製した。【００４５】
Poly I:CおよびMLA
合成性monophosphoryl Lipid A (MLA)をInvivogen (San Diego, USA)より購入した。また、Poly I:C (約100 kDa〜110kDa；約140bp〜約180bp)をSigma-Aldrich Japan (Tokyo, Japan)から購入した。【００４６】
MTSアッセイ
細胞の生存を、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega)を用いて検出した。細胞をpoly I:C、HVJ-EまたはCXCL2で用量依存的に処理後、100μlのCellTiter 96 Aqueous One Solutionを培地1mLに加えた。96-well Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader (Berthold Technologies GmbH & Co.KG, Bad Wildbad, Germany)を用いて、490nmで吸光度を測定した。【００４７】
腫瘍接種試験
50μlのPBS中に懸濁したB16-F10マウスメラノーマ細胞106個をC57BL/6Nマウスの背部に皮内注射した。6日後、腫瘍の直径が3-5mmになった時、総量50μlのPBS中に懸濁したHVJ-E (粒子数2.5 × 109(2500HAU)または(粒子数5.0 × 109(5000HAU))、poly I:C (25 μgまたは50μg)、組換えCXCL-2 (Biolegend) (0.3 ng)、poly I:C (25μg)を組み合わせたHVJ-E (粒子数2.5 × 109(2500HAU))またはCXCL2(0.3 ng)を組み合わせたHVJ-E (粒子数2.5 × 109(2500HAU))を2日ごとに計3回マウスに腫瘍内注射した。腫瘍体積は、ノギスを用いて盲検下で計測し、以下の式を用いて計算した:
腫瘍体積(mm3) =長さ×(幅)2/2【００４８】
腫瘍組織におけるサイトカインアレイ
HVJ-E、poly I:C、CXCL2、HVJ-E+poly I:CまたはHVJ-E+CXCL2の最終注射から24時間後、腫瘍担持マウスから腫瘍組織を採取した。採取した組織をPBS中に浸し、Multi-Beads Shocker(Yasui Kikai Co. Osaka, Japan)を用いて20秒間、2500 rpmでホモジナイズした。ホモジナイズした後、プロテアーゼ阻害剤と共に、終濃度0.1%のTriton X-100を加えた。得られた試料を-80℃で凍結し、融解させ、5分間、10,000 x gで遠心し、細胞デブリを除去することで腫瘍組織ライセートを得た。サイトカインアレイは、タンパク質400μg当量を含む腫瘍組織ライセートを使用し、cytokine array panel A (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて説明書に従い実施した。結果をImageQuant TL (GE Healthcare)によって解析した。【００４９】
プラスミドおよび遺伝子コンストラクト
Sino Biological Inc. (North Wales, USA)からマウスCXCL2遺伝子を購入した。iProofTMHigh-Fidelity DNA polymerase (Bio-Rad)および以下のプライマーを用いてCXCL2遺伝子を増幅した：
Forward: 5’-AAGCTTGCCACCATGGCCCCTCCCACCT-3’  （配列番号３）
Reverse: 5’-CTCGAGTCAGTTAGCCTTGCCTTTG-3’  （配列番号４）
遺伝子治療実験用にCXCL2遺伝子をpCY4Bベクターにクローニングした。【００５０】
HVJ-Eに担持されたCXCL2発現ベクターによる遺伝子治療
遺伝子治療実験では、C57BL6/NマウスのB16-F10腫瘍にCXCL2発現ベクタープラスミド(pCY4B-CXCL2)を導入するためにHVJ-Eを用いた。鶏卵由来のHVJ-EをGenomeONE transfection kit buffer (GenomeONE; Ishihara-Sangyo Kaisha Ltd., Osaka, Japan)で処理した。pCY4B-CXCL2 (マウス1匹につき50μg/50μl)と共にHVJ-E (2500 HAU)を2日ごとに計3回B16-F10担持マウスに腫瘍内注射した。腫瘍サイズを25日目まで観察した。【００５１】
脾臓細胞の調製
C57BL/6Nマウスから脾臓を採取し、該脾臓由来の細胞を40-μmメッシュを通し、溶血バッファー(Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.)で溶血させた。培地で脛骨および大腿骨の骨髄を洗い出し、40-μmメッシュを通し、マウス樹状細胞を単離した。洗浄後、細胞を10ng/mLの組換えマウスGM-CSFを含む培地で培養した。6日後に、フローサイトメトリーを用いて、CD11c発現を評価することによって非接着およびゆるく接着した細胞を樹状細胞として同定した。【００５２】
ELISpotアッセイ
PBS、poly I:C、CXCL2、HVJ-E、HVJ-E+poly I:CまたはHVJ-E+CXCL2を2日ごとに計3回B16-F10担持マウスに腫瘍内注射した。最後の注射から10日後にマウスから脾臓を採取し、上記脾臓細胞の調製において記載した通り、脾臓から脾臓細胞を調製した。マイトマイシンンC (15 μg/ml)で45分間 B16-F10メラノーマ細胞を処理した。脾臓細胞とマイトマイシンンCで処理されたB16-F10メラノーマ細胞を10:1の割合で混合した。48時間後、非接着性の脾臓細胞を回収し、the Mouse IFN-γ Development Module (R&D Systems) およびELISpot Blue Color Module (R&D Systems)を用いてELISpotアッセイを実施した。その後、IFN-γ分泌細胞の数をカウントした。【００５３】
CXCL2中和および好中球の阻害
CXCL1/CXCL2中和実験について、PBS、HVJ-E、poly I:CまたはHVJ-E+poly I:Cの腫瘍内注射の24時間前に、B16-F10担持C57BL6/NマウスにCXCL1またはCXCL2中和抗体(R&D Systems)を予め腹腔内注射した。PBS、HVJ-E、poly I:CまたはHVJ-E+poly I:Cの最終注射後に、腫瘍サイズを2−3日ごとに観察した。実験終了時に、腫瘍を回収し、重量を計測した。
好中球の阻害について、PBS、poly I:C、CXCL2、HVJ-E、HVJ-E+poly I:CまたはHVJ-E+CXCL2の腫瘍内注射前または腫瘍内注射間に、Ly-6G (1A8)抗体を腫瘍内注射(50 μg)または腹腔内注射(100 μg)した。PBS、poly I:C、CXCL2、HVJ-E、HVJ-E+poly I:CまたはHVJ-E+CXCL2の最終注射後に、腫瘍サイズを2−3日ごとに観察した。実験終了時に、腫瘍を回収し、重量を計測した。【００５４】
量的リアルタイムRT-PCR
切除し、PBS中で洗浄した腫瘍からIsogen (Wako, Osaka, Japan)を用いて全RNAを抽出した。RNAを定量し、2μgを用いてcDNAに逆転写した(Applied Biosystems)。マウスLy-6G、CXCL1、CXCL2およびβ-actinのプライマーセット（下記）と共にSYBR qPCR Mix (Toyobo CO.,LTD)を用いて量的PCRを行った。CFX384 Real-time system (Bio-Rad, CA, USA)を用いて、標的遺伝子の濃度を計測した。全ての作業は説明書に従い実施した。
Ly-6G
Forward: 5’-TGGACTCTCACAGAAGCAAAG-3’  （配列番号５）
Reverse: 5’-GCAGAGGTCTTCCTTCCAACA-3’  （配列番号６）
CXCL1
Forward: 5’-GACTCCAGCCACACTCCAAC-3’  （配列番号７）
Reverse: 5’-TGACAGCGCAGCTCATTG-3’  （配列番号８）
CXCL2 
Forward: 5’-AAAATCATCCAAAAGATACTGAACAA-3’  （配列番号９）
Reverse: 5’-CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG-3’  （配列番号１０）
β-actin
Forward: 5’-GGAGGGGGTTGAGGTGTT-3’  （配列番号１１）
Reverse: 5’-GTGTGCACTTTTATTGGTCTCAAG-3’  （配列番号１２）
ICAM-1
Forward: 5’-GTGGCGGGAAAGTTCCTG-3’  （配列番号１３）
Reverse: 5’-CGTCTTGCAGGTCATCTTAGGAG-3’  （配列番号１４）
MMP8
Forward: 5’-AACGGGAAGACATACTTCTTCATAA-3’  （配列番号１５）
Reverse: 5’-GGGTCCATGGATCTTCTTTG-3’  （配列番号１６）
IFN-β
Forward: 5’-CACAGCCCTCTCCATCAACTA-3’  （配列番号１７）
Reverse: 5’-CATTTCCGAATGTTCGTCCT-3’  （配列番号１８）
TGF-β
Forward: 5’-TGGAGCAACATGTGGAACTC-3’  （配列番号１９）
Reverse: 5’-GTCAGCAGCCGGTTACCA-3’  （配列番号２０）【００５５】
腫瘍のフローサイトメトリー解析
腫瘍をマウスから回収し、2 % FBSおよび2.5 mg/mL collagenase A (Roche, Indianapolis, IN)を含有する消化バッファー中で細断した。細断物を消化バッファー中で37℃、1時間、振とうしながら培養し、70-μmフィルターでろ過し、PBSで2回洗浄した。回収した細胞を以下の蛍光標識抗体で染色した：CD45(30-F11)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(1A8)、ICAM-1(YN1/1.74) (BioLegend Inc.)およびFas (eBioscience, San Diego, USA)。全てのフローサイトメトリーをCSCantoTM II (Becton, Dickinson and Company, USA)上で実施し、FlowJo software (FLOWJO LLC, Oregon, USA)を用いて解析を行った。【００５６】
HVJ-Eによる好中球の処理
Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を用いて、説明書に従い、抗好中球抗体でMACSによりマウス骨髄から好中球を単離した。96穴プレート中の2 x 105の好中球を500 m.o.i.のHVJ-Eで24時間処理した。また、別の方法として、上記のように単離した骨髄由来マウス樹状細胞(2 x 105)を500 m.o.i.のHVJ-Eで24時間処理した。培地をクリアにするために185,00 gで5分間遠心することによって樹状細胞とHVJ-Eを含まない馴化培地を調製した。好中球(2 x 105)を36時間馴化培地で培養した。HVJ-Eと共培養した場合と馴化培地で培養した場合において、好中球をFACSに供試し、FasおよびICAM-1の発現を解析した。【００５７】
統計解析
GraphPadによるStudent's unpaired t-testを用いて統計解析を実施し、P＜0.05を統計的に有意差があるとみなした。【００５８】
実施例１  HVJ-EとPolyI:Cの併用剤の抗腫瘍効果１
マウスメラノーマ細胞株B16-F10を播種し、PBS、poly I:C (0.1 μg/ml、0.25 μg/mlまたは1 μg/ml（24時間培養の場合）、あるいは0.625 μg/ml、1.25 μg/mlまたは5 μg/ml（48時間培養の場合）)、HVJ-E(1000moi、2500moiまたは10000moi)またはHVJ-E+ poly I:C (H+P) (1000moi+0.625 μg/ml、2500moi+1.25 μg/mlまたは10000moi+5 μg/ml)で処理後、24時間または48時間培養した。CellTiter 96 Aqueous One Solution 100μlを培地に加え、490nmで吸光度を測定した。結果を図１に示す。In vitroでは、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+ poly I:C (H+P)のいずれも細胞の増殖に影響を与えなかった。
また、マウスメラノーマ細胞株B16-F10を担持したC57BL/6NマウスにPBS、poly I:C (25 μg)、HVJ-E(2500 HAU)またはHVJ-E+poly I:C (H+P) (2500HAU+25 μg)を2日ごとに計3回マウスに腫瘍内注射し、継時的に腫瘍体積を計測した。結果を図２に示す。In vivoでは、poly I:C、HVJ-Eに比べてHVJ-E+poly I:C (H+P)が腫瘍の増殖抑制に効果を示した。【００５９】
実施例２  HVJ-EとPolyI:Cの併用剤の抗腫瘍効果２
実施例１では、poly I:C (25 μg)とHVJ-E(2500 HAU)の両者は、同程度の腫瘍増殖抑制効果が確認できた。そこで実施例１と同様に、マウスメラノーマ細胞株B16-F10を担持したC57BL/6NマウスにPBS、実施例１の2倍量のpoly I:C (50 μg)、実施例１の2倍量のHVJ-E(5000 HAU)または実施例1と等量のpoly I:C とHVJ-E を組み合わせたHVJ-E+poly I:C (H+P) (2500HAU+25 μg)を2日ごとに計3回マウスに腫瘍内注射し、継時的に腫瘍体積を計測した。結果を図３に示す。In vivoでは、poly I:C (50 μg)、HVJ-E(5000 HAU) に比べてHVJ-E+poly I:C (H+P) (2500HAU+25 μg)がより高い腫瘍の増殖抑制に効果を示した。【００６０】
実施例３  PolyI:Cによって誘導されるサイトカイン
B16-F10担持C57BL/6NマウスにPBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、24時間後の腫瘍組織を採取し、PBS中でホモジナイズした後、プロテアーゼ阻害剤、Triton X-100を加えて遠心し、腫瘍組織ライセートを得た。該腫瘍組織ライセートを使用し、サイトカインアレイを実施した。その結果、PolyI:Cを単独またはHVJ-Eと組み合わせて投与した場合は、PolyI:Cを投与しない場合に比べて、腫瘍内ではCXCL1およびCXCL2のタンパク質レベルが上昇していた（図４上段）。
また、B16-F10担持C57BL/6NマウスにPBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、24時間後に腫瘍を切除し、該腫瘍から全RNAを抽出した。該RNAを逆転写してcDNAを取得し、マウスCXCL1、CXCL2のプライマーセットを用いて量的PCRを行った。その結果、PolyI:Cを単独またはHVJ-Eと組み合わせて投与した場合は、PolyI:Cを投与しない場合に比べて、腫瘍内ではCXCL1およびCXCL2のmRNAレベルが上昇していた（図４下段）。【００６１】
実施例４  CXCL1の阻害がHVJ-EとPolyI:Cの併用剤の抗腫瘍効果へ与える影響
B16-F10担持C57BL/6NマウスにCXCL1中和抗体を腹腔内注射し、24時間後に、PBSまたはHVJ-E+ poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、腫瘍サイズを2−3日ごとに観察した。また、最後に腫瘍を回収し、重量を計測した。結果を図５に示す。CXCL1中和抗体を投与した場合(H+P antiCXCL1)、中和抗体を投与しなかった場合(H+P)、CXCL1に特異性のない抗体(Isotype Control(ISO))を投与した場合(H+P ISO)の３条件間で腫瘍体積および腫瘍重量に差が生じず、HVJ-E+poly I:C (H+P)による腫瘍抑制作用はCXCL1に依存しないことが示唆された。【００６２】
実施例５  CXCL2の阻害がHVJ-EとPolyI:Cの併用剤の抗腫瘍効果へ与える影響
CXCL1中和抗体の代わりにCXCL2中和抗体を用いた点以外は、実施例４と同様の操作を行い、腫瘍サイズおよび腫瘍の重量を計測した。結果を図６に示す。CXCL2中和抗体を投与した場合(H+P antiCXCL2)およびCXCL2に特異性のない抗体を投与した場合(H+P ISO)は、中和抗体を投与しなかった場合(H+P)と比べて腫瘍体積に差が生じ（上段）、CXCL2中和抗体を投与した場合(H+P antiCXCL2)とCXCL2に特異性のない抗体を投与した場合(H+P ISO)を比較した場合には腫瘍重量にも有意な差が生じた（下段）。したがって、HVJ-E+poly I:C (H+P)による腫瘍抑制作用は、CXCL2に依存していることが示唆された。【００６３】
実施例６  腫瘍組織における好中球関連遺伝子発現のプロファイル
CXCL2は好中球を誘引する機能を有することが知られている。腫瘍に誘引された好中球はtumor associated neutrophils (TANs)と呼ばれ、腫瘍に対して腫瘍増殖抑制活性を有するN1型好中球と増殖促進活性を有するN2型好中球に分類される。poly I:Cが腫瘍内においてCXCL2レベルを上昇させていること、およびHVJ-E+ poly I:C (H+P)による腫瘍抑制作用はCXCL2に依存していることから、腫瘍内における好中球およびその分類を検証した。
実施例３と同様に、B16-F10担持C57BL/6NマウスにPBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、24時間後に腫瘍を切除し、該腫瘍から全RNAを抽出した。該RNAを逆転写してcDNAを取得し、マウスCXCL2、ICAM-1（N1型好中球マーカー）、MMP8（N1型好中球マーカー）、IFN-β（好中球をN1型好中球へ変換する）、TGF-β（好中球をN2型好中球へ変換する）のプライマーセットを用いて量的PCRを行った。結果を図７に示す。PolyI:Cを単独投与した場合は、HVJ-E を単独投与した場合に比べて、腫瘍内のCXCL2のmRNAレベルが有意に上昇した。また、HVJ-E+ poly I:C (H+P) を投与した場合は、PolyI:C 単独投与やHVJ-E 単独投与に比べて、N1型好中球マーカーICAM-1のmRNAレベルが有意に上昇し、N1型好中球マーカーMMP8のmRNAレベルも上昇した。また、HVJ-Eを単独またはPolyI:Cと組み合わせて投与した場合は、HVJ-Eを投与しない場合に比べて、腫瘍内のTANsをN1型に変換するIFN-βのmRNAレベルの上昇がみられたが、N2型に変換するTGF-βのmRNAレベルには群間で差が見られなかった。【００６４】
実施例７  腫瘍組織における好中球およびN1型好中球の割合および脾臓におけるIFN-γ分泌細胞
B16-F10担持C57BL/6NマウスにPBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、マウスから切除した腫瘍を消化バッファーで処理し、回収した細胞を以下の蛍光標識抗体で染色した：CD45(30-F11)、CD11b(M1/70)、Ly-6G(1A8)、ICAM-1(YN1/1.74) (BioLegend Inc.)およびFas (eBioscience, San Diego, USA)。染色した細胞をフローサイトメトリーで解析した。その結果、PolyI:Cを投与した場合は、PolyI:Cを投与しない場合に比べて、腫瘍内の好中球の割合が有意に上昇した（図８左上）。また、HVJ-E+ poly I:C (H+P) を投与した場合、それ以外の場合に比べて、腫瘍内のN1型好中球の割合が上昇していた（図８左下）。
また、PBS、poly I:C、HVJ-EまたはHVJ-E+poly I:C (H+P)をB16-F10担持マウスに腫瘍内注射し、10日後にマウスから脾臓を採取した。脾臓から脾臓細胞を調製し、マイトマイシンンC処理したB16-F10メラノーマ細胞と脾臓細胞を混合し、48時間後、非接着性の脾臓細胞を回収してELISpotアッセイを実施し、IFN-γ分泌細胞の数をカウントした。その結果、HVJ-E+poly I:C (H+P)を投与した場合は、溶媒（PBS）やHVJ-E単剤を投与した場合に比べて、脾臓内のIFN-γ分泌細胞の数が有意に上昇していた（図８右）。【００６５】
実施例８  好中球の阻害がHVJ-EとPolyI:Cの併用剤の抗腫瘍効果へ与える影響
B16-F10担持C57BL/6Nマウスに抗好中球抗体Ly-6G (1A8)抗体を腫瘍内注射または腹腔内注射し、24時間後に、HVJ-E+poly I:C (H+P)を腫瘍内注射し、腫瘍サイズを2−3日ごとに観察した。また、実験終了時に、腫瘍を回収し、重量を計測した。結果を図９に示す。抗好中球抗体を投与した場合は、該抗体を投与しなかった場合と比べて腫瘍体積に差が生じ、腫瘍重量にも有意な差が生じた。したがって、HVJ-E+poly I:C (H+P)による腫瘍抑制作用は好中球に依存することが示唆された。【００６６】
実施例９  HVJ-EとCXCL2の併用剤の抗腫瘍効果
マウスメラノーマ細胞株B16-F10を播種し、CXCL2 (0 ng/ml、3 ng/ml、30 ng/ml、300 ng/mlまたは600 ng/ml)で処理後、24時間または48時間培養した。CellTiter 96 Aqueous One Solution 100μlを培地に加え、490nmで吸光度を測定した。結果を図１０上段に示す。In vitroでは、いずれの濃度のCXCL2で処理した場合であっても、細胞の増殖に有意な差が確認できなかった。
また、マウスメラノーマ細胞株B16-F10を担持したC57BL/6NマウスにPBS、CXCL2(0.3 ng)、HVJ-E(2500 HAU)またはHVJ-E+CXCL2 (H+C) (2500HAU+0.3 ng)を2日ごとに計3回マウスに腫瘍内注射し、継時的に腫瘍体積を計測した。結果を図１０下段に示す。In vivoでは、CXCL2単独投与は腫瘍抑制効果がなかった。また、HVJ-E単独投与に比べてHVJ-E+ CXCL2 (H+C)投与は腫瘍の増殖抑制により高い効果を示した。【００６７】
実施例１０  脾臓におけるIFN-γ分泌細胞と好中球阻害の影響
poly I:Cの代わりにCXCL2を用いた点以外は、実施例７と同様の操作を行い、IFN-γ分泌細胞の数をカウントした。その結果、脾臓内ではHVJ-E+ CXCL2 (H+C)を投与した場合、HVJ-E 単独投与の場合に比べて、IFN-γ分泌細胞の数が有意に上昇していた（図１１左）。
また、B16-F10担持C57BL/6Nマウスに抗好中球抗体Ly-6G (1A8)抗体を腹腔内注射し、上記と同様の操作を行い、ELISpotアッセイを実施し、IFN-γ分泌細胞の数をカウントした。その結果、HVJ-E単独投与の場合では、好中球阻害によってIFN-γ分泌細胞の数に差は見られなかった（図１１右上）。一方、HVJ-E+CXCL2 (H+C)を投与した場合、好中球阻害によってIFN-γ分泌細胞の数が有意に下降していた（図１１右下）。【００６８】
実施例１１  HVJ-EとCXCL2遺伝子発現ベクターの併用剤の抗腫瘍効果
マウスメラノーマ細胞株B16-F10を担持したC57BL/6NマウスにHVJ-E、HVJ-E+ pCY4BまたはHVJ-E+pCY4B-CXCL2を2日ごとに計3回に腫瘍内注射し、腫瘍サイズを観察した。結果を図１２に示す。HVJ-E+ pCY4Bに比べてHVJ-E+pCY4B-CXCL2がより高い腫瘍の増殖抑制に効果を示した。【００６９】
実施例１２  HVJ-Eによる樹状細胞を介した好中球からN1型好中球への変換
HVJ-Eと共に培養した樹状細胞（DC）の培養上清を用いて好中球を培養し、好中球からN1型好中球への変換を誘導するか否かを検討した。マウス骨髄より分離した2x108個の樹状細胞をHVJ-E(500 m.o.i)と共に24時間培養し、そのconditioned medium 5 mlを遠心(18500 g, 15 min, 4℃)することによって細胞とHVJ-Eを除去した。その培養上清で好中球を36時間培養し、フローサイトメトリー（FACS）でN1型好中球マーカーであるFasとICAM-1の発現を解析した。その結果、HVJ-Eと共培養した樹状細胞の培養上清は、好中球をN1型好中球へ変換した（図１３）。【００７０】
実施例１３  HVJ-Eの直接的な作用による好中球からN1型好中球への変換
HVJ-Eが直接好中球に作用し、好中球からN1型好中球への変換を誘導するか否かを検討した。マウス骨髄より分離した細胞から、Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec 商品番号130-097-658)を使って、Kitの使用説明通り、MACSで好中球を分離した。その後に2x105細胞の好中球を96 well plateに播種し、500 moiでHVJ-Eを作用させ、24時間後に、フローサイトメトリー（FACS）でN1型好中球マーカーであるFasとICAM-1の発現を解析した。その結果、HVJ-Eと共培養した好中球はN1型好中球へ変換した（図１４）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
HVJ-E (hemagglutinating virus of Japan envelope)およびCXCL2、CXCL2をコードする塩基配列を含む核酸またはCXCL2産生誘導剤を有効成分とする抗がん剤は、それぞれ単独で使用した場合よりも低用量かつ著しい抗腫瘍効果を発揮し、新規ながん治療剤として有用である。
本出願は、日本で出願された特願２０１５−１６４６００（出願日：平成２７年８月２４日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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