(57)【要約】  本発明は、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸の製造法を提供する。具体的には、本発明は、ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）を部分的にＮ−脱アセチル化した後にヘパリナーゼＩＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ  ＩＩＩ）で低分子化し、生成した低分子化物を抗凝固活性を有するヘパラン硫酸に変換することによる、所望の平均分子量を有するヘパラン硫酸の製造法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固活性を有するヘパラン硫酸の製造法であって、
（Ａ）ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化して、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを生成する工程、
（Ｂ）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩＩで処理して、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを生成する工程、
（Ｃ）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを硫酸化して、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を生成する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程Ａが、Ｎ−アセチル基の残存率が１％〜３３％となるように実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程Ａが、Ｎ−アセチル基の残存率が１１％〜３０％となるように実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘパラン硫酸のプルラン換算の重量平均分子量が５０００〜１０００００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘパラン硫酸のプルラン換算の重量平均分子量が８０００〜４１０００である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程Ｃが、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程から選択される１またはそれ以上の工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程Ｃが、少なくとも、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程Ｃが、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記工程Ｃが、下記工程Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３の順に実施される、請求項８に記載の方法：
（Ｃ１）Ｎ−硫酸化；
（Ｃ２）Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化；
（Ｃ３）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化。
【請求項１０】
前記工程Ｃ２において、Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化が、一部または全部の期間において同時に実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程Ｃ３が、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化の順に実施される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程Ｃ３が、６−Ｏ−硫酸化およびα−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化の順に実施される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化が、ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化する工程の後であって、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化する前にのみ行われる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸の製造法に関する。抗凝固活性を有するヘパラン硫酸は、例えば、医療分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
抗凝固活性を有するヘパラン硫酸としては、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）が知られている。ヘパリンは抗凝固薬の一つであり、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）や播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）の治療、人工透析や体外循環での血液凝固防止などに用いられる。特に、重量平均分子量４０００−６０００の低分子化ヘパリンは、出血の副作用が少ないため、近年使用頻度が増えてきている。【０００３】
低分子化ヘパリンを製造する方法は多数報告されており、それらの方法は大きく３つに分けられる。１つ目は、動物抽出ヘパリンを化学的、酵素的、または物理的手法を用いて部分消化し、低分子化する方法である。２つ目は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ５株等のヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）生産菌を用いた発酵法により得られるヘパロサンを化学的または酵素的手法を用いてヘパリン様物質に変換し、次いで、１つ目と同様の手法で低分子化する方法である。３つ目は、化学合成法で単糖から糖鎖を連結していく方法である。１つ目と２つ目の方法は低分子化工程を含む。低分子化の手法としては、例えば、亜硝酸分解、光分解、ラジカル反応による分解、ヘパリナーゼ（ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ）等の酵素による分解が知られている。【０００４】
ヘパリナーゼは、ヘパリンやヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の部位を切断する酵素である。ヘパリナーゼはヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩの３種に大別され、ヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩそれぞれの基質特異性を調べる研究がなされている（非特許文献１）。例えば、ヘパリナーゼＩおよびＩＩはヘパリンを消化するのに対し、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩはヘパラン硫酸を消化する。具体的には、ヘパリナーゼＩＩは２−Ｏ−硫酸基や６−Ｏ−硫酸基を有する二糖のグルコサミン残基の部位を特異的に切断するのに対し、ヘパリナーゼＩＩＩは２−Ｏ−硫酸基を有さない二糖のグルコサミン残基の部位を特異的に切断する。特に、ヘパリナーゼＩＩＩは２−Ｏ−硫酸基を有さないヘキスロン酸残基の下流のＮ−アセチルグルコサミン残基の部位を優先的に切断する。すなわち、ヘパリナーゼＩＩＩの基質特異性は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）≫Ｎ−フリーグルコサミン残基（ＧｌｃＮＨ２）である。【０００５】
このように、ヘパリナーゼＩ〜ＩＩＩはそれぞれ異なる特異性を持つ。従って、一種類のヘパリナーゼのみで様々な修飾を分子内にランダムに有するヘパリンやヘパリン様物質を低分子化しようとしても、均一な分子量のものが得られない、あるいは低分子化できないという問題がある。そのため、ヘパリナーゼを２種以上組み合わせてヘパリンやヘパリン様物質を低分子化する試みがなされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｅｉ  Ｚ１．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ａｐｒ  ２２；２８０（１６）：１５７４２−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヘパラン硫酸の分子量を制御する新規な技術を開発し、所望の平均分子量を有するヘパラン硫酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意検討の結果、ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化した後であってＮ−硫酸化する前にヘパリナーゼＩＩＩで低分子化することによって、所望の平均分子量を有する低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンが得られることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
抗凝固活性を有するヘパラン硫酸の製造法であって、
（Ａ）ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化して、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを生成する工程、
（Ｂ）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩＩで処理して、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを生成する工程、
（Ｃ）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを硫酸化して、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を生成する工程、
を含む、方法。
［２］
前記工程Ａが、Ｎ−アセチル基の残存率が１％〜３３％となるように実施される、前記方法。
［３］
前記工程Ａが、Ｎ−アセチル基の残存率が１１％〜３０％となるように実施される、前記方法。
［４］
前記ヘパラン硫酸のプルラン換算の重量平均分子量が５０００〜１０００００である、前記方法。
［５］
前記ヘパラン硫酸のプルラン換算の重量平均分子量が９０００〜４１０００である、前記方法。
［６］
前記工程Ｃが、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程から選択される１またはそれ以上の工程を含む、前記方法。
［７］
前記工程Ｃが、少なくとも、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程を含む、前記方法。
［８］
前記工程Ｃが、前記工程Ｂによる生成物をＮ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程を含む、前記方法。
［９］
前記工程Ｃが、下記工程Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３の順に実施される、前記方法：
（Ｃ１）Ｎ−硫酸化；
（Ｃ２）Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化；
（Ｃ３）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化。
［１０］
前記工程Ｃ２において、Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化が、一部または全部の期間において同時に実施される、前記方法。
［１１］
前記工程Ｃ３が、α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化の順に実施される、前記方法。
［１２］
前記工程Ｃ３が、６−Ｏ−硫酸化およびα−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化の順に実施される、前記方法。
［１３］
ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化が、ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化する工程の後であって、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化する前にのみ行われる、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、所望の平均分子量を有するヘパラン硫酸を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒドラジンによるヘパロサンのＮ−脱アセチル化を実施した際のＮ−アセチル基の残存率の経時変化を示す図である。
【図２】ＮａＯＨによるヘパロサンのＮ−脱アセチル化を実施した際のＮ−アセチル基の残存率の経時変化を示す図である。
【図３】Ｎ−アセチル基残存率１２．５％のＮ−脱アセチル化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩＩで消化し、次いでＮ−硫酸化した際の収率および平均分子量の経時変化を示す図である。横軸は、ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化反応の時間を示す。
【図４】Ｎ−アセチル基残存率１２．５％のＮ−脱アセチル化ヘパロサンを１０倍量のヘパリナーゼＩＩＩで消化し、次いでＮ−硫酸化した際の収率および平均分子量の経時変化を示す図である。横軸は、ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化反応の時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明においては、ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化した後にヘパリナーゼＩＩＩで低分子化し、生成した低分子化物を抗凝固活性を有するヘパラン硫酸に変換することにより、所望の平均分子量を有する、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を製造することができる。すなわち、本発明の方法は、（Ａ）ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化する工程、（Ｂ）前記工程Ａによる生成物をヘパリナーゼＩＩＩで低分子化する工程、および（Ｃ）前記工程Ｂによる生成物から抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を生成する工程、を含む、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸の製造法である。工程Ａを「Ｎ−脱アセチル化工程」、工程Ｂを「低分子化工程」、工程Ｃを「ヘパラン硫酸生成工程」ともいう。また、本発明の方法により得られるヘパラン硫酸を「本発明の多糖」ともいう。本発明の多糖は、例えば、公知のヘパラン硫酸（例えばヘパリン）と同様の構造を有していてもよく、そうでなくてもよい。
【００１４】
本発明の多糖は、単一の種類の糖鎖からなるものであってもよく、複数の種類の糖鎖の混合物であってもよい。本発明の多糖は、通常は、複数種の糖鎖の混合物として得られる。「複数種の糖鎖の混合物」とは、構造（糖連結数、分子量、および置換基の種類や位置、等）の異なる２種またはそれ以上の糖鎖の組み合わせをいう。本発明の多糖が単一の種類の糖鎖からなるものである場合にあっては、本発明の多糖を特定する各パラメータは、特記しない限り、当該糖鎖における該当パラメータを示す。本発明の多糖が複数の種類の糖鎖の混合物である場合にあっては、本発明の多糖を特定する各パラメータは、特記しない限り、当該混合物全体における該当パラメータの平均値を示す。本発明の多糖を製造する際の中間体等の他の多糖についても同様である。
【００１５】
本発明の多糖を特定する各パラメータは、例えば、多糖等の化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により決定することができる。そのような手法としては、例えば、二糖分析、分子量分析（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＰＣ））、紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ−ＲＩ／ＵＶ法）、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。これらの手法は、決定すべきパラメータの種類に応じて適宜選択できる。例えば、二糖構造やその含有率は、二糖分析により決定することができる。二糖分析は常法により実施できる。二糖分析は、例えば、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”  Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５−２９３（１９９６））の条件に従い実施することができる。すなわち、例えば、必要に応じてＮ−硫酸化した多糖をヘパリナーゼを用いて不飽和二糖に分解し、分解物を分離定量することにより、各構成二糖の量を定量することができる。ヘパリナーゼとしては、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩが挙げられる。ヘパリナーゼは、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用できる。用いるヘパリナーゼは、多糖に含まれるヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基を含む多糖の二糖分析には、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを組み合わせて利用することができる。また、例えば、α−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基を含む多糖の二糖分析には、ヘパリナーゼＩおよびＩＩを組み合わせて利用することができる。また、多糖を亜硝酸分解し、分解物を分離定量することにより、各構成二糖の量を定量することができる。分解物の分離定量は、例えば、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ等の化合物の同定に用いられる公知の手法により実施することができる。二糖分析の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。各構成二糖の量に基づき、標的の二糖単位の含有率を算出することができる。なお、ヘパリナーゼＩＩＩ等のヘパリナーゼで多糖を切断する場合、通常、それにより生じる非還元末端のＨｅｘＡ残基においてＣ４−Ｃ５間の結合が二重結合となる。Ｃ４−Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基はＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別がないため、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別が必要な場合は、亜硝酸分解等のＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基を区別できる手法により二糖分析を実施すればよい。本発明の多糖を製造する際の中間体等の他の多糖を特定する各パラメータについても同様に決定できる。
【００１６】
本発明において、ヘパラン硫酸の平均分子量（数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ））は、特に断りがなければ、プルランを標準として直接的に測定することができる。あるいは、ヘパラン硫酸の真の平均分子量は、真の平均分子量が既知である分子（例、エノキサバリンナトリウム）を基準に比例計算により間接的に算出してもよい。本発明では、上記のとおりヘパラン硫酸の平均分子量を直接的に測定しても、間接的に算出してもよいが、直接的に測定することが好ましい。
【００１７】
本発明において、「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）の総称として用いる。「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、すなわち「β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）」および「α−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）」という用語は、特記しない限り、本発明の方法の実施態様に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。「α−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）」という用語は、特記しない限り、本発明の方法の実施態様に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。なお、Ｃ４−Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基は、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別がないため、本発明の多糖等の多糖を特定する各パラメータを算出する際には、特記しない限り、ＨｅｘＡ残基には該当するが、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基のいずれにも該当しないものとして扱う。
【００１８】
＜１＞ヘパロサン
本発明の方法においては、ヘパロサンを本発明の多糖の原料として用いる。ヘパロサンは、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン生産能を有する細菌（「ヘパロサン生産菌」ともいう）を利用した発酵法により製造できる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。
【００１９】
本発明において、「ヘパロサン生産能を有する細菌（ヘパロサン生産菌）」とは、培地で培養したときに、ヘパロサンを生成し、回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、５０ｍｇ／Ｌ以上、１００ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上、または３００ｍｇ／Ｌ以上の量のヘパロサンを培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００２０】
細菌の種類は特に制限されない。細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Ｂａｃｋｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．１９９６．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，ｐ．２４６０−２４８８．Ｔａｂｌｅ  １．Ｉｎ  Ｆ．Ｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）やＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ４７０７６）等のエシェリヒア・コリＫ−１２株；エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ  ２３５０６）；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００２１】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２  Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号Ｃ６０００−０３）。
【００２２】
ヘパロサン生産能を有する細菌は、本来的にヘパロサン生産能を有するものであってもよく、ヘパロサン生産能を有するように改変されたものであってもよい。本来的にヘパロサン生産能を有する細菌としては、エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ  ２３５０６）が挙げられる。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にヘパロサン生産能を付与することにより取得できる。また、本来的にヘパロサン生産能を有する細菌を、ヘパロサン生産能が増大するよう改変して用いてもよい。
【００２３】
ヘパロサン生産能は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、付与できる。ヘパロサン生産に関与するタンパク質としては、グリコシルトランスフェラーゼやヘパロサン排出担体タンパク質が挙げられる。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。遺伝子の導入は、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。
【００２４】
ここでいう「グリコシルトランスフェラーゼ」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）および／またはグルクロン酸（ＧｌｃＡ）を糖鎖非還元末端に付加し、ヘパロサン鎖を伸長する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「グリコシルトランスフェラーゼ活性」ともいう。グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、ｋｆｉＡ遺伝子、ｋｆｉＣ遺伝子、ｐｍＨＳ１遺伝子が挙げられる。
【００２５】
ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡ遺伝子がコードするＫｆｉＡタンパク質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として、ＧｌｃＮＡｃを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＣ遺伝子がコードするＫｆｉＣタンパク質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＡを基質として、ＧｌｃＡを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡおよびｋｆｉＣ遺伝子は、ｋｆｉＢおよびｋｆｉＤ遺伝子とともに、ｋｆｉＡＢＣＤオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ２ともいう）を構成する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡＢＣＤオペロンを含む領域の塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列中、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ、ｋｆｉＤ遺伝子は、それぞれ、４４５〜１１６４位の配列、１５９３〜３２８４位の配列、４５７６〜６１３８位の配列、６１８０〜７３５８位の配列に相当する。エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＡ、ＫｆｉＢ、ＫｆｉＣ、ＫｆｉＤタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２〜５に示す。
【００２６】
ｐｍＨＳ１遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ  タイプＤ株のｐｍＨＳ１遺伝子が挙げられる。パスツレラ・ムルトシダ  タイプＤ株のｐｍＨＳ１遺伝子がコードするＰｍＨＳ１タンパク質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡの両方を基質として、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＡを交互に糖鎖非還元末端に付加する。
【００２７】
ここでいう「ヘパロサン排出担体タンパク質」とは、細胞膜を通してヘパロサン鎖を細胞外へ排出する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「ヘパロサン排出活性」ともいう。ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子としては、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子が挙げられる。ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株やエシェリヒア・コリＢ株のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子が挙げられる。これらの株のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、およびｋｐｓＳ遺伝子は、ｋｐｓＦおよびｋｐｓＵ遺伝子とともに、ｋｐｓＦＥＤＵＣＳオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ１ともいう）を構成する。また、これらの株のｋｐｓＭおよびｋｐｓＴ遺伝子は、ｋｐｓＭＴオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ３ともいう）を構成する。
【００２８】
導入する遺伝子は、用いる細菌の種類等に応じて適宜選択できる。すなわち、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を有するように細菌を改変することにより、細菌にヘパロサン生産能を付与することができる。例えば、エシェリヒア・コリＢ株は、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子を有するが、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリＢ株にヘパロサン生産能を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２株は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ−１２株にヘパロサン生産能を付与することができる。
【００２９】
すなわち、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子を導入した株；Ｗ３１１０株やＭＧ１６５５株等のエシェリヒア・コリＫ−１２株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子、ならびにエシェリヒア・コリＫ５株またはエシェリヒア・コリＢ株由来のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子を導入した株；ならびにそれらの派生株が挙げられる。エシェリヒア・コリＢ株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子を導入した株として、具体的には、例えば、実施例に記載のエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９−ｋｆｉＡＢＣＤ（ＷＯ２０１５／０５０１８４）が挙げられる。
【００３０】
また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、同細菌がもともと有する遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株を、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＢ株を、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。
【００３１】
また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産能を損なわない限り、その他の改変がなされていてもよい。例えば、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＤ、ｋｐｓＦ、およびｋｐｓＵ遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入の際には、Ｒｅｇｉｏｎ２をまとめて導入してもよく、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の導入の際には、Ｒｅｇｉｏｎ１〜３をまとめて導入してもよい。ｋｆｉＢ遺伝子およびｋｆｉＤ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＢ遺伝子およびｋｆｉＤ遺伝子が挙げられる。ｋｐｓＦ遺伝子およびｋｐｓＵ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株やエシェリヒア・コリＢ株のｋｐｓＦ遺伝子およびｋｐｓＵ遺伝子が挙げられる。
【００３２】
また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ｒｂｓＲ、ｒｂｓＫ、ｒｂｓＢ、ｈｓｒＡ、ｇｌｇＢ、ｇｌｇＸ、ｍｉｃＦ、ｒｃｓＤ、ｒｃｓＢ、ｙｂｉＸ、ｙｂｉＩ、ｙｂｉＪ、ｙｂｉＣ、ｙｂｉＢ、ｒｆａＨ、ｎｕｓＧ、ｐｃｏＲ、ｐｃｏＳ、ｐｃｏＥ、ｙｈｃＮ、ｙｈｃＯ、ａａｅＢ、ａａｅＡ、ａａｅＸ、ｇ１４５５、ａｌｐＡ、ｇ１４５３、ｙｒｂＡ、ｍｌａＢ、ｍｌａＣ、ｍｌａＤ、ｍｌａＥ、ｍｌａＦ、ｙｒｂＧ、ｎｏｒＷ、ｙｂｊＩ、ｙｂｊＪ、ｙｂｊＫ、ｒｙｂＢ、ｙｊｊＹ、ｙｊｔＤ、ｔｈｒＬ、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｆｒｕＡ、ｐｓｕＫ、ｙｔｆＴ、ｙｊｆＦ、ｆｂｐ、ｙａｇＵ、ｐａｏＡ、ｐａｏＢ、ｇｓｉＣ、ｇｓｉＤ、ｙｌｉＥ、ｉｒｐ２、ｉｒｐ１、ｂｈｓＡ、ｙｃｆＳ、ｌｅｐＢ、ｒｎｃ、ｅｒａ、ｄａｐＡ、ｇｃｖＲ、ｂｃｐ、ｈｙｆＡ、ｒｐｏＥ、ｎａｄＢ、ｙｆｉＣ、ｓｒｍＢ、ｇ１４１４、ｇ１４１３、ｎｕｏＥ、ｎｕｏＦ、ｎｕｏＧ、ｇｌｍＺ、ｈｅｍＹ、ｈｅｍＸ、ｈｅｍＤ、ｒｌｍＬ、ａｒｔＱ、ａｒｔＭ、ａｒｔＪ、ｒｌｍＣ、ｙｂｊＯ、ｙｅｊＯ、ｙｅｊＭ、ｙｅｊＬ、ｒｐｏＳ、ｙｇｂＮ、ｙｇｂＭ、ｙｇｂＬ、ｇ３７９８、ｇ３７９７、ｇ３７９６、ｇ３７９５、ｇ３７９４、ｇ３７９３、ｇ３７９２、ｒｙｊＡ、ｓｏｘＲ、ｓｏｘＳ、ｙｊｃＣ、ｙｊｃＢ、ｅｆｅＵ、ｅｆｅＯ、ｓｌｙＡ、ｈｎｓ、ｐｇｍ、ｇａｌＦ、ｕｇｄ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭ、およびｒｃｓＡ遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるように改変されていてもよい（ＷＯ２０１５／０５０１８４、公開技報番号２０１５−５０１７７５）。これらの遺伝子としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｋ５株等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの遺伝子や、その他各種細菌の遺伝子が挙げられる。
【００３３】
「遺伝子の発現が増強される」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が増強される」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子のコピー数を増大させることや、遺伝子の転写や翻訳を増大させることにより、増強することができる。遺伝子のコピー数は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを宿主に導入することや、同遺伝子を宿主の染色体上に導入することにより、増大させることができる。導入する遺伝子は、例えば、同遺伝子を有する生物からのクローニングや、化学合成により、取得できる。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。遺伝子の転写や翻訳は、プロモーターやＳＤ配列等の遺伝子の発現調節配列を改変することにより、増大させることができる。
【００３４】
ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等の公用データベースや、ＷＯ２０１５／０５０１８４や公開技報番号２０１５−５０１７７５等の文献から取得できる。
【００３５】
なお、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。バリアントとしては、公知の遺伝子のホモログや人為的改変体が挙げられる。「元の機能が維持された」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼにあっては、タンパク質のバリアントがグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することをいい、ヘパロサン排出担体タンパク質にあっては、タンパク質のバリアントがヘパロサン排出活性を有することをいう。例えば、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個（例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列に対して、例えば、５０％以上、６５％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このようなバリアントについての記載は、ヘパリナーゼＩＩＩ等の他のタンパク質やそれをコードする遺伝子にも準用できる。
【００３６】
ヘパロサン生産菌を培養することにより、培地中にヘパロサンが蓄積する。ヘパロサン生産菌の培養条件は、所望の量のヘパロサンが得られる限り、特に制限されない。ヘパロサン生産菌の培養条件は、ヘパロサン生産に関与する遺伝子の発現系の構成や宿主の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。培養は、例えば、炭素源、窒素源、微量栄養素等の各種有機成分や無機成分を含有する液体培地を用いて、３０〜３７℃で、１６〜７２時間、好気的に実施することができる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。
【００３７】
ヘパロサンは、培養液に含まれたままＮ−脱アセチル化工程に供してもよく、培養液から回収してからＮ−脱アセチル化工程に供してもよい。培養液からヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。例えば、培養液から培養上清を分離し、次いで、エタノールやメタノール等の水と混和する有機溶媒の添加により上清中のヘパロサンを沈降させ、回収することができる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。添加する有機溶媒の量は、例えば、上清液量の２．５〜３．５倍量であってよい。ヘパロサンは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、Ｎ−脱アセチル化工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００３８】
＜２＞Ｎ−脱アセチル化工程
Ｎ−脱アセチル化工程は、ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化する工程である。Ｎ−脱アセチル化工程により部分的にＮ−脱アセチル化されたヘパロサンが生成する。Ｎ−脱アセチル化工程による生成物（部分的にＮ−脱アセチル化されたヘパロサン）を「Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン」ともいう。「ヘパロサンを部分的にＮ−脱アセチル化する」とは、ヘパロサンのＮ−アセチル基の一部が残存するように、ヘパロサンをＮ−脱アセチル化することをいう。ヘパロサンのＮ−アセチル基の一部を残存させることにより、低分子化工程においてＮ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断することができ、以て、所望の平均分子量を有するヘパラン硫酸を効率よく製造することができる。Ｎ−脱アセチル化の程度は、所望の平均分子量のヘパラン硫酸（本発明の多糖）を製造できる限り、特に制限されない。Ｎ−脱アセチル化工程は、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率が下記のような値となるように実施することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、例えば、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ−アセチル基の残存率は、具体的には、例えば、１％〜３３％、７％〜３３％、７％〜３０％、または１１％〜１７％であってもよい。例えば、Ｎ−アセチル基の残存率７％〜３０％は、概ね、Ｎ−アセチル基が６〜２８糖残基に１つ（二糖単位として３〜１４単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。また、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率１１％〜１７％は、概ね、Ｎ−アセチル基が１２〜１８糖残基に１つ（二糖単位として６〜９単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。Ｎ−脱アセチル化の程度（すなわちＮ−アセチル基の残存率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００３９】
なお、残存するＮ−アセチル基は、低分子化工程後に適宜除去してもよい。例えば、低分子化工程後のいずれかのタイミングで、さらにＮ−脱アセチル化を実施してもよいし、さらにＮ−脱アセチル化とＮ−硫酸化を実施してもよい。すなわち、最終的に得られる本発明の多糖において、Ｎ−アセチル基は残存していてもよく、いなくてもよい。本発明のヘパラン硫酸におけるＮ−アセチル基の残存率は、例えば、０％以上、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖におけるＮ−アセチル基の残存率は、具体的には、例えば、０％〜３３％、１％〜３３％、７％〜３３％、７％〜３０％、または１１％〜１７％であってもよい。
【００４０】
Ｎ−脱アセチル化工程を実施する手段は、所望のＮ−脱アセチル化の程度が得られる限り、特に制限されない。Ｎ−脱アセチル化工程は、例えば、脱アセチル化剤を利用して化学的に実施できる。脱アセチル化剤としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびヒドラジン等の塩基性物質が挙げられる。アルカリ金属塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウムおよび水酸化セシウムが挙げられる。アルカリ土類金属塩としては、例えば、水酸化ベリリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウムおよび水酸化バリウムが挙げられる。
【００４１】
水酸化ナトリウムを利用したＮ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：  ５２６１３−５２６２１．やＵＳ２０１１２８１８２０Ａ１）の条件を参照することができる。すなわち、Ｎ−脱アセチル化は、例えば、ヘパロサンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、加熱することにより実施できる。各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間は、所望のＮ−脱アセチル化の程度が得られるように、適宜設定することができる。ヘパロサン濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）であってよい。水酸化ナトリウム濃度は、例えば、１Ｍ〜５Ｍであってよい。反応温度は、例えば、４０〜８０℃であってよい。反応時間は、例えば、５分〜３０時間であってよい。
【００４２】
ヒドラジンを利用したＮ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（［１］Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（２０００）１５９−１７１  ［２］Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９０（１９９６）８７−９６  ［３］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７（１９８４）１８７−１９７）の条件を参照することができる。また、ヒドラジンを利用したＮ−脱アセチル化の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。すなわち、Ｎ−脱アセチル化は、例えば、ヘパロサンを、硫酸または硫酸ヒドラジンを含有するヒドラジン水溶液に溶解し、気相を窒素等の不活性ガスで置換し、加熱することにより実施できる。ヒドラジンとしては、無水ヒドラジンやヒドラジン１水和物が挙げられる。例えば、ヒドラジン１水和物を、そのまま、あるいは適宜希釈して、ヒドラジン水溶液として利用してよい。加熱後、氷冷により反応を停止することができる。次いで、ヨウ素により糖鎖末端を還元できる。各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間は、所望のＮ−脱アセチル化の程度が得られるように、適宜設定することができる。ヘパロサン濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）であってよい。ヒドラジン濃度は、例えば、１０％（ｗ／ｖ）〜７０％（ｗ／ｖ）であってよい。硫酸または硫酸ヒドラジン濃度は、例えば、０．０１Ｍ〜０．１Ｍであってよい。反応温度は、例えば、６０〜１１８℃であってよい。反応時間は、例えば、５分〜２０時間であってよい。具体的には、例えば、実施例に記載の条件でＮ−脱アセチル化を実施する場合、反応時間は、例えば、４〜５時間であってもよい。
【００４３】
このようにしてＮ−脱アセチル化を実施することにより、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンが生成する。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンは、Ｎ−脱アセチル化工程の反応液に含まれたまま低分子化工程に供してもよく、反応液から回収して低分子化工程に供してもよい。反応液からＮ−脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンは、適宜、精製、中和、脱塩、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、低分子化工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００４４】
＜３＞低分子化工程
低分子化工程は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩＩで切断し、低分子化する工程である。低分子化工程により低分子化されたＮ−脱アセチル化ヘパロサンが生成する。低分子化工程による生成物（低分子化されたＮ−脱アセチル化ヘパロサン）を「低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン」ともいう。低分子化の程度は、所望の平均分子量のヘパラン硫酸（本発明の多糖）を製造できる限り、特に制限されない。低分子化工程は、例えば、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの平均分子量が後述する本発明の多糖の平均分子量（例えば、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００〜１５００００、好ましくは、８０００〜６００００の数平均分子量（Ｍｎ）および２０００〜３０００００、好ましくは、１００００〜１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ））となるように実施することができる。
【００４５】
低分子化の程度は、例えば、分子量を測定することにより確認することができる。分子量の測定は常法により実施できる。分子量の測定法としては、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＰＣ）および紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ−ＲＩ／ＵＶ法、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）準拠）が挙げられる。ＧＰＣによる分子量の測定条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、１０００〜１５００００、３０００〜３６０００、または４０００〜２６０００であってよく、あるいは、５０００〜３６０００、または１２０００〜２６０００であってよい。低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、２０００〜３０００００、５０００〜６００００、６０００〜７００００、または９０００〜３５０００であってよく、あるいは、７０００〜６００００、または１７０００〜３５０００であってよい。また、後述する硫酸化工程等のヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後に分子量を測定して、低分子化の程度を確認することもできる。ヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後に分子量を測定する場合は、実施した工程に応じた分子量の変動を考慮することができる。ヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後の生成物の分子量を測定する場合、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、同生成物の数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１０００〜１５００００、２０００〜１０００００、４０００〜８００００、７０００〜４２０００、または１５０００〜３００００であってよく、同生成物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、２０００〜３０００００、５０００〜１５００００、５０００〜１０００００、８０００〜７００００、８０００〜４１０００、または２１０００〜４１０００であってよい。なお、ＥＰ準拠ＳＥＣ−ＲＩ／ＵＶ法による分子量測定値は、ＧＰＣによるプルラン換算の分子量測定値を、エノキサパリンナトリウムのＧＰＣ法測定値１６２１５をＥＰ準拠ＳＥＣ−ＲＩ／ＵＶ法での測定値４３２５で除した値である、換算係数３．７５で除した値に相当する。
【００４６】
「ヘパリナーゼＩＩＩ」とは、ヘパロサン等のグリコサミノグリカンの、Ｎ−硫酸化またはＮ−アセチル化されたグルコサミン残基の部位を切断する酵素（典型的には、ＥＣ４．２．２．８）をいう。本発明において用いられるヘパリナーゼＩＩＩは、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断できるものであれば、特に制限されない。「Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を、Ｎ−アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位よりも優先的に切断することをいう。「Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位は切断するが、Ｎ−アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位は実質的に切断しないことであってもよい。「グルコサミン残基の部位を切断する」とは、グルコサミン残基とその下流（還元末端側）のグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基との間のα−１，４グリコシド結合を切断することをいう。
【００４７】
ヘパリナーゼＩＩＩの由来は特に制限されず、微生物、動物、植物等いずれの由来のものを用いてもよい。また、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、公知のヘパリナーゼＩＩＩのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。ヘパリナーゼＩＩＩとして、具体的には、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ等の細菌のヘパリナーゼＩＩＩが挙げられる。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ  ＡＴＣＣ  １３１２５のヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列およびヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号１６および１７にそれぞれ示す。
【００４８】
ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリナーゼＩＩＩをコードする遺伝子（ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子）を有する宿主に同遺伝子を発現させることにより製造できる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を、ヘパリナーゼＩＩＩを有する宿主ともいう。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主は、本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するものであってもよく、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主としては、上記のようなヘパリナーゼＩＩＩが由来する細菌が挙げられる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するように改変された宿主としては、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子が導入された宿主が挙げられる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を導入する宿主は、機能するヘパリナーゼＩＩＩを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。細菌としては、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌やコリネ型細菌が挙げられる。腸内細菌科の細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。また、本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子の発現が増強されるよう改変して用いてもよい。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を培養することにより、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を発現させることができ、ヘパリナーゼＩＩＩを含有する培養物が得られる。宿主の培養条件は、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子の発現系の構成や宿主の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００４９】
また、ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００５０】
また、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、市販品を用いることもできる。
【００５１】
ヘパリナーゼＩＩＩは、培養物等に含まれたまま使用してもよく、培養物等から回収してから使用してもよい。すなわち、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、精製されたヘパリナーゼＩＩＩ（精製酵素）を使用してもよく、ヘパリナーゼＩＩＩを含有する任意の画分を使用してもよい。ヘパリナーゼＩＩＩの回収は、タンパク質を分離精製する公知の手法により実施することができる。ヘパリナーゼＩＩＩは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパリナーゼＩＩＩは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。ヘパリナーゼＩＩＩを含有する画分は、ヘパリナーゼＩＩＩがＮ−脱アセチル化ヘパロサンに作用できるように含有される限り特に制限されない。ヘパリナーゼＩＩＩを含有する画分としては、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）が挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよく、精製されたヘパリナーゼＩＩＩと共に利用されてもよい。
【００５２】
低分子化工程は、ヘパリナーゼＩＩＩをＮ−脱アセチル化ヘパロサンに作用させることにより、実施できる。ヘパリナーゼＩＩＩをＮ−脱アセチル化ヘパロサンに作用させることは、具体的には、ヘパリナーゼＩＩＩとＮ−脱アセチル化ヘパロサンとを反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、低分子化工程は、適当な反応液中で実施できる。低分子化工程は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、ヘパリナーゼＩＩＩとＮ−脱アセチル化ヘパロサンとを混合することにより、低分子化工程を実施できる。低分子化工程は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体または固定化酵素を充填したカラムにＮ−脱アセチル化ヘパロサンを含有する反応液を通液することにより、低分子化工程を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
【００５３】
反応液は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンに加えて、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン以外の成分を必要に応じて含有してよい。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン以外の成分としては、金属イオンやｐＨ緩衝剤が挙げられる。反応液に含有される成分の種類や濃度は、用いるヘパリナーゼＩＩＩの性質等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００５４】
低分子化工程の条件（反応液のｐＨ、反応温度、反応時間、各種成分の濃度等）は、所望の低分子化の程度が得られる限り特に制限されない。すなわち、反応条件は、所望の低分子化の程度が得られるように、適宜設定することができる。反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。反応液中のＮ−脱アセチル化ヘパロサンの濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）であってよい。反応液中のヘパリナーゼＩＩＩ濃度は、例えば、６．３ＩＵ／Ｌ〜６．３×１０４ＩＵ／Ｌ、または６．３×１０１ＩＵ／Ｌ〜６．３×１０３ＩＵ／Ｌであってよい。反応液のｐＨは、例えば、通常６．０〜１０．０、好ましくは６．５〜９．０であってよい。反応温度は、例えば、通常１５〜５０℃、好ましくは１５〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃であってよい。反応時間は、例えば、通常５分〜２０時間、好ましくは１０分〜１０時間であってよい。具体的には、例えば、実施例４または１１に記載の条件で低分子化を実施する場合、反応時間は、例えば、５〜１０時間であってもよい。カラム法の場合、反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
【００５５】
ヘパリナーゼＩＩＩの活性は、例えば、ヘパロサンを基質としてｐＨ７．０、３７℃で酵素反応を実施し、酵素および基質依存的な不飽和ヘキスロン酸の生成に基づいて測定できる。不飽和ヘキスロン酸の生成は、２３２ｎｍの吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）の増加として測定できる。１分間に１μｍｏｌの不飽和ヘキスロン酸を生成する酵素量を１国際単位（ＩＵ）と定義する。
【００５６】
低分子化工程の過程において、ヘパリナーゼＩＩＩ、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応液に供給してもよい。これらの成分は、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。
【００５７】
また、反応条件は、低分子化工程の開始から終了まで均一であってもよく、低分子化工程の過程において変化してもよい。「反応条件が低分子化工程の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で低分子化工程を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
【００５８】
このようにして低分子化工程を実施することにより、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンが生成する。低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンは、低分子化工程の反応液に含まれたままヘパラン硫酸生成工程に供してもよく、反応液から回収してヘパラン硫酸生成工程に供してもよい。反応液から低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、ヘパラン硫酸生成工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００５９】
＜４＞ヘパラン硫酸生成工程
ヘパラン硫酸生成工程は、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから本発明の多糖を生成する工程である。ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを、Ｎ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化する工程から選択される１またはそれ以上、例えば全て、の工程を含んでいてよい。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類は、本発明の多糖の構造に応じて適宜設定できる。ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、少なくとも、硫酸化（Ｎ−硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化、または６−Ｏ−硫酸化）の工程を含んでいてよい。
【００６０】
ヘパラン硫酸生成工程に含まれる各工程の実施順序は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる各工程の実施順序は、各工程を実施する手段や各工程に用いられる酵素の基質特異性等の諸条件に応じて適宜設定できる。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程は、それぞれ別個に実施してもよく、そうでなくてもよい。すなわち、ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の一部または全部を、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。
【００６１】
ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、下記工程Ｃ１およびＣ３の順に実施されてよい：
（Ｃ１）Ｎ−硫酸化；
（Ｃ３）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化。
【００６２】
ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、下記工程Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３の順に実施されてよい：
（Ｃ１）Ｎ−硫酸化；
（Ｃ２）Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化；
（Ｃ３）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化。
【００６３】
工程Ｃ２は、Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化の順に実施されてもよいし、２−Ｏ−硫酸化およびＣ５−エピメリ化の順に実施されてもよい。また、工程Ｃ２において、Ｃ５−エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化は、一部または全部の期間において同時に実施されてもよい。
【００６４】
工程Ｃ３は、例えば、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化および６−Ｏ−硫酸化の順に実施されてもよく、６−Ｏ−硫酸化およびＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化の順に実施されてもよい。
【００６５】
以下、特記しない限り、ヘパラン硫酸生成工程が、Ｎ−硫酸化、Ｃ５−エピメリ化、２−Ｏ−硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化の順に実施されることを前提として、各工程について説明する。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類および各工程の実施順序がそれとは異なる場合は、選択した工程の種類および設定した実施順序に応じて適宜説明を読み替えることができる。
【００６６】
Ｎ−硫酸化は、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基を硫酸化する工程である。Ｎ−硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することができる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。Ｎ−硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。Ｎ−硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：５２６１３−５２６２１．；ＵＳ８２２７４４９Ｂ２（Ｊｕｌ．２４、２０１２））の条件を参照することができる。また、Ｎ−硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。Ｎ−硫酸化の程度は、所望の性質を有するヘパラン硫酸（本発明の多糖）が得られる限り、特に制限されない。Ｎ−硫酸化は、例えば、本発明の多糖におけるＮ−硫酸化率が下記のような範囲となるように実施することができる。本発明の多糖におけるＮ−硫酸化率は、例えば、６０％以上、７０％以上、または８０％以上であってもよく、１００％以下、９５％以下、または９０％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖におけるＮ−硫酸化率は、具体的には、例えば、７０％〜１００％、または８０％〜９５％であってもよい。また、Ｎ−硫酸化は、例えば、Ｎ−脱アセチル化されたグルコサミン残基の９０％以上、９５％以上、９９％以上、または全てがＮ−硫酸化されるように実施することができる。Ｎ−硫酸化の程度（すなわちＮ−硫酸化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、Ｎ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、Ｎ−硫酸基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００６７】
Ｃ５エピメリ化は、Ｎ−硫酸化による生成物中のグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基をイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基へ異性化する工程である。Ｃ５エピメリ化は、例えば、Ｃ５−エピメラーゼを利用して酵素的に実施することができる。Ｃ５−エピメラーゼは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基のイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基への異性化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、Ｃ５エピメリ化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有するＣ５−エピメラーゼを選択して用いてもよい。Ｃ５−エピメラーゼは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。Ｃ５−エピメラーゼとしては、例えば、ヒトのＣ５−エピメラーゼを利用することができる。また、Ｃ５−エピメラーゼとしては、公知のＣ５−エピメラーゼのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。Ｃ５−エピメラーゼの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。Ｃ５エピメリ化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。Ｃ５エピメリ化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）の条件を参照することができる。また、Ｃ５エピメリ化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。Ｃ５エピメリ化の程度は、所望の性質を有するヘパラン硫酸（本発明の多糖）が得られる限り、特に制限されない。Ｃ５エピメリ化は、例えば、本発明の多糖におけるエピメリ化率が下記のような範囲となるように実施することができる。本発明の多糖におけるエピメリ化率は、例えば、０％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、または５０％以上であってもよく、１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、または６０％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖におけるエピメリ化率は、具体的には、例えば、０％〜７０％、２０％〜７０％、または３０％〜６０％であってもよい。ここでいう「エピメリ化率」とは、ＨｅｘＡ残基の総量に対するＩｄｏＡ残基の量の比率（モル比）である。ただし、エピメリ化率を算出する際の「ＨｅｘＡ残基」とは、ＩｄｏＡ残基およびＧｌｃＡ残基をいい、Ｃ４−Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基は除くものとする。Ｃ５エピメリ化の程度（すなわちエピメリ化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、エピメリ化率は、多糖を二糖分析に供した際の、ＩｄｏＡ残基またはＧｌｃＡ残基を有する二糖単位の総量に対する、ＩｄｏＡ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００６８】
２−Ｏ−硫酸化は、Ｃ５エピメリ化による生成物中のＩｄｏＡ残基の２−Ｏ位を硫酸化する工程である。２−Ｏ−硫酸化は、例えば、２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。２−ＯＳＴは、ＩｄｏＡ残基の２位水酸基の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。２−ＯＳＴは、さらに、ＧｌｃＡ残基の２位水酸基の硫酸化を触媒できてもよい。２−ＯＳＴは、さらに、Ｃ４−Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基の２位水酸基の硫酸化を触媒できてもよい。また、２−Ｏ−硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する２−ＯＳＴを選択して用いてもよい。２−ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。２−ＯＳＴとしては、例えば、ハムスターの２−ＯＳＴを利用することができる。また、２−ＯＳＴとしては、公知の２−ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。２−ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。２−Ｏ−硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。２−Ｏ−硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）の条件を参照することができる。また、２−Ｏ−硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。２−Ｏ−硫酸化の程度は、所望の性質を有するヘパラン硫酸（本発明の多糖）が得られる限り、特に制限されない。また、ＩｄｏＡ残基に加えて、ＧｌｃＡ残基が２−Ｏ−硫酸化され得る。２−Ｏ−硫酸化は、例えば、本発明の多糖における２−Ｏ−硫酸化率が下記のような範囲となるように実施することができる。本発明の多糖において、ＨｅｘＡ残基（ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の総称）の２−Ｏ−硫酸化率、ＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率、ＧｌｃＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、それぞれ、例えば、０％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってもよく、１００％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、または３０％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。本発明の多糖において、ＨｅｘＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、具体的には、例えば、０％〜８０％、１０％〜７０％、または１５％〜７０％であってもよい。本発明の多糖において、ＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、具体的には、例えば、０％〜１００％、１５％〜１００％、または３０％〜１００％であってもよい。本発明の多糖において、ＧｌｃＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、具体的には、例えば、０％〜５０％、０％〜４０％、または０％〜３０％であってもよい。ここでいう「ＨｅｘＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率」とは、ＨｅｘＡ残基の総量に対する２−Ｏ−硫酸化されたＨｅｘＡ残基の量の比率（モル比）である。ここでいう「ＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率」とは、ＩｄｏＡ残基の総量に対する２−Ｏ−硫酸化されたＩｄｏＡ残基の量の比率（モル比）である。ここでいう「ＧｌｃＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率」とは、ＧｌｃＡ残基の総量に対する２−Ｏ−硫酸化されたＧｌｃＡ残基の量の比率（モル比）である。２−Ｏ−硫酸化の程度（すなわち２−Ｏ−硫酸化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、ＨｅｘＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、２−Ｏ−硫酸化されたＨｅｘＡ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、ＩｄｏＡ残基を有する二糖単位の総量に対する、２−Ｏ−硫酸化されたＩｄｏＡ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＧｌｃＡ残基の２−Ｏ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、ＧｌｃＡ残基を有する二糖単位の総量に対する、２−Ｏ−硫酸化されたＧｌｃＡ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
【００６９】
Ｃ５−エピメラーゼによるＧｌｃＡ残基のＩｄｏＡ残基への異性化は、可逆平衡反応である。すなわち、Ｃ５−エピメラーゼを利用してＣ５エピメリ化を実施する場合、Ｃ５エピメリ化により生成したＩｄｏＡ残基の一部はＧｌｃＡ残基へ再度変換され得る。一方、２−Ｏ−硫酸化されたヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基は、一般的に、Ｃ５−エピメラーゼの基質とならない。よって、例えば、Ｃ５エピメリ化と２−Ｏ−硫酸化をカップリングして実施することにより、Ｃ５エピメリ化により生成したＩｄｏＡ残基を逐次２−Ｏ−硫酸化することができ、以て、ＩｄｏＡ残基がＧｌｃＡ残基へ再度変換されるのを阻止することができる。したがって、Ｃ５エピメリ化と２−Ｏ−硫酸化をカップリングして実施することにより、例えば、Ｃ５エピメリ化率を高めることができる。このように、Ｃ５エピメリ化と２−Ｏ−硫酸化を、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。例えば、Ｎ−硫酸化による生成物と、Ｃ５−エピメラーゼおよび２−ＯＳＴとを反応系に共存させることにより、Ｃ５エピメリ化と２−Ｏ−硫酸化をまとめて実施することができる。Ｃ５エピメリ化と２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。
【００７０】
６−Ｏ−硫酸化は、２−Ｏ−硫酸化による生成物中のＮ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基の６−Ｏ位を硫酸化する工程である。
【００７１】
６−Ｏ−硫酸化は、例えば、６−Ｏ−硫酸化酵素（６−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。６−ＯＳＴは、Ｎ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基の６位水酸基の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、６−Ｏ−硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する６−ＯＳＴを選択して用いてもよい。６−ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。６−ＯＳＴとしては、６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２、６−ＯＳＴ−３が挙げられる。６−ＯＳＴとしては、例えば、ハムスターの６−ＯＳＴ−１やマウスの６−ＯＳＴ−３を利用することができる。また、６−ＯＳＴとしては、公知の６−ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。６−ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。６−Ｏ−硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。６−ＯＳＴを利用した６−Ｏ−硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）の条件を参照することができる。
【００７２】
６−Ｏ−硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することもできる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。６−Ｏ−硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。硫酸化試薬を利用した６−Ｏ−硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（ＵＳ８２２７４４９Ｂ２（Ｊｕｌ．２４、２０１２））の条件を参照することができる。また、硫酸化試薬を利用した６−Ｏ−硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。硫酸化試薬を利用した６−Ｏ−硫酸化は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中で実施することができる。６−Ｏ−硫酸化の反応温度は、例えば、−２０℃〜５℃、好ましくは−２０℃〜０℃であってよい。６−Ｏ−硫酸化に使用する硫酸化試薬の量は、６−Ｏ−硫酸化の対象となる水酸基の量に対し、例えば、１．５〜１０モル当量、好ましくは２〜５モル当量であってよい。
【００７３】
６−Ｏ−硫酸化の程度は、所望の性質を有するヘパラン硫酸（本発明の多糖）が得られる限り、特に制限されない。６−Ｏ−硫酸化は、例えば、本発明の多糖における６−Ｏ−硫酸化率が下記のような範囲となるように実施することができる。本発明の多糖における６−Ｏ−硫酸化率は、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよく、１００％以下、または９５％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖における６−Ｏ−硫酸化率は、具体的には、例えば、５０〜１００％、６０〜１００％、または７０〜１００％であってもよい。ここでいう「６−Ｏ−硫酸化率」とは、グルコサミン残基の総量に対する６−Ｏ−硫酸化されたグルコサミン残基の量の比率（モル比）である。６−Ｏ−硫酸化の程度（すなわち６−Ｏ−硫酸化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、６−Ｏ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、６−Ｏ−硫酸化されたＧｌｃＮ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
【００７４】
ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化は、６−Ｏ−硫酸化による生成物中のＮ−硫酸化・６−Ｏ−硫酸化グルコサミン残基の３位水酸基を硫酸化する工程である。ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化は、例えば、３−Ｏ−硫酸化酵素（３−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。３−ＯＳＴは、Ｎ−硫酸化・６−Ｏ−硫酸化グルコサミン残基の３位水酸基の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する３−ＯＳＴを選択して用いてもよい。３−ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。３−ＯＳＴとしては、３−ＯＳＴ−１、３−ＯＳＴ−２、３−ＯＳＴ−３、３−ＯＳＴ−４、３−ＯＳＴ−５が挙げられる。３−ＯＳＴとしては、例えば、マウスの３−ＯＳＴ−１を利用することができる。また、３−ＯＳＴとしては、公知の３−ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。３−ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。３−Ｏ−硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）の条件を参照することができる。また、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化の程度は、所望の性質を有するヘパリンが得られる限り、特に制限されない。ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化は、例えば、本発明の多糖におけるＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率が下記のような範囲となるように実施することができる。本発明の多糖におけるＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率は、例えば、０％以上、０．５％以上、１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、または１３％以上であってもよく、４５％以下、４０％以下、３３％以下、２０％以下、１０％以下、６％以下、または４％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。本発明の多糖におけるＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率は、例えば、０．５〜１０％、１〜６％、または２〜４％であってもよく、１３％〜４５％、１３％〜４０％、または１３〜３３％であってもよい。ここでいう「ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率」とは、グルコサミン残基の総量に対する３−Ｏ−硫酸化されたグルコサミン残基の量の比率（モル比）である。ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化の程度（すなわちＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化されたＧｌｃＮ残基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
【００７５】
各工程による生成物は、各工程の反応液に含まれたまま次の工程に供してもよく、反応液から回収して次の工程に供してもよい。反応液から各生成物を回収する手段は、特に制限されない。各生成物を回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。各工程による生成物は、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解、酵素の失活等の処理に供してから、次の工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００７６】
このようにしてヘパラン硫酸生成工程を実施することにより、所望の平均分子量を有するヘパラン硫酸（本発明の多糖）が生成する。本発明の多糖の数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、１０００以上、１５００以上、２０００以上、２５００以上、３０００以上、３５００以上、４０００以上、４５００以上、５０００以上、５５００以上、６０００以上、６５００以上、７０００以上、８０００以上、１００００以上、１２０００以上、１５０００以上、または１８０００以上であってもよく、１５００００以下、１３００００以下、１２００００以下、１１００００以下、１０００００以下、９００００以下、８００００以下、７００００以下、６００００以下、５００００以下、４５０００以下、４３０００以下、４００００以下、３５０００以下、３００００以下、２５０００以下、２００００以下、１８０００以下、１５０００以下、または１２０００以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖の数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、具体的には、例えば、１０００〜１５００００、２０００〜１０００００、４０００〜８００００、８０００〜６００００、１８０００〜４３０００、または１５０００〜３００００であってもよい。本発明の多糖の重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、２０００以上、２５００以上、３０００以上、３５００以上、４０００以上、４５００以上、５０００以上、５５００以上、６０００以上、６５００以上、７０００以上、７５００以上、８０００以上、８５００以上、９０００以上、１００００以上、１２０００以上、１５０００以上、２１０００以上、または２５０００以上であってもよく、２０００００以下、１７００００以下、１６００００以下、１５００００以下、１４００００以下、１３００００以下、１２００００以下、１１００００以下、１０００００以下、９００００以下、８５０００以下、８００００以下、７５０００以下、７００００以下、６５０００以下、６００００以下、５５０００以下、５００００以下、４５０００以下、４１０００以下、４００００以下、３５０００以下、３００００以下、２５０００以下、２００００以下、１８０００以下、１５０００以下、または１２０００以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖の重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、具体的には、例えば、２０００〜１２００００、１００００〜１０００００、２５０００〜６００００、５０００〜６００００、または８０００〜４１０００であってもよい。本発明の多糖は適宜反応液から回収することができる。本発明の多糖の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収される本発明の多糖は、本発明の多糖以外に、本発明の多糖を製造する際に用いられた成分や水分等の成分を含んでいてもよい。すなわち、本発明の多糖は、例えば、本発明の多糖を含有する混合物として提供されてもよい。本発明の多糖は、所望の程度に精製されていてよい。本発明の多糖は、本発明の多糖の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、本発明の多糖は、医薬組成物の有効成分として配合して利用するために薬理学的に許容される程度に精製して提供されてよい。本発明の多糖の純度は、具体的には、例えば、３０％（ｗ／ｗ）以上、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、または９５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【００７７】
本発明の多糖は、抗凝固活性を有する。抗凝固活性とは、具体的には、抗凝血活性を意味する。抗凝固活性としては、Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性やＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性が挙げられる。本発明の多糖は、例えば、少なくともＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性を有していてよい。本発明の多糖におけるＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性は、例えば、１００ＩＵ／ｍｇ以上、２００ＩＵ／ｍｇ以上、３００ＩＵ／ｍｇ以上、または４００ＩＵ／ｍｇ以上であってよい。また、本発明の多糖におけるＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性は、上限は特にないが、例えば、５０００ＩＵ／ｍｇ以下、２０００ＩＵ／ｍｇ以下、または１０００ＩＵ／ｍｇ以下であってもよい。また、本発明の多糖は、高いＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性／Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性比を有していてよい。本発明の多糖におけるＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性／Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性比は、例えば、１．０以上、１．５以上、２以上、または２．５以上であってよい。また、本発明の多糖におけるＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性／Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性比は、上限は特にないが、例えば、５０以下、２０以下、または１０以下であってもよい。Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性およびＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性は、いずれも、常法により測定することができる。Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性およびＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性の測定法として、具体的には、例えば、実施例に記載の方法が挙げられる。
【００７８】
本発明の多糖は、フリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの混合物であってもよい。すなわち、「本発明の多糖（例えばヘパラン硫酸）」という用語は、特記しない限り、フリー体の多糖、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味する。すなわち、本発明の多糖に存在する塩を形成し得る官能基は、いずれも、特記しない限り、フリー体であってもよく、塩を形成していてもよく、それらの組み合わせであってもよい。本発明の多糖に存在する塩を形成し得る官能基としては、ＨｅｘＡ残基の硫酸基（−ＳＯ３Ｈ）およびカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、ならびにＧｌｃＮ残基の硫酸基（−ＳＯ３Ｈ）およびアミノ基（−ＮＨ２）が挙げられる。すなわち、例えば、「硫酸基」という用語は、特記しない限り、フリー体の硫酸基、もしくは塩を形成した硫酸基、またはそれらの組み合わせを示す。当該硫酸基についての説明は、塩を形成し得る他の官能基にも準用できる。塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられる。薬理学的に許容される塩は、本発明の多糖の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。薬理学的に許容される塩としては、以下のようなものが挙げられる。すなわち、例えば、硫酸基等の酸性基に対する塩としては、具体的には、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。好ましくは、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩から選択される。また、例えば、アミノ基の塩基性基に対する塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。なお、塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
本発明の多糖は、例えば、血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療に利用できる。血液凝固に起因する症状としては、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓塞栓症（静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、手術中・術後の血栓塞栓症等）、人工透析における血液凝固、体外循環における血液凝固が挙げられる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例をもとに、本発明をより具体的に説明する。【００８１】
実施例１：ヘパロサンの調製
（１）ヘパロサン発酵
ＷＯ２０１５／０５０１８４の実施例１に記載のヘパロサン生産菌（エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９−ｋｆｉＡＢＣＤ株）および培養条件にてヘパロサンを含有する培養液を得た。【００８２】
（２）ヘパロサンの精製
培養液から遠心分離により培養上清を回収した。培地成分を除去するために１ｍＬの培養上清をＵＦ膜を用いてｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、２５０μＬまで濃縮した。ＵＦ膜濃縮液２５０μＬに５００μＬの１００％エタノールを加え、遠心分離によってヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、ヘパロサンを得た。残りの培養上清から同様の手順でヘパロサンを精製し、ヘパロサン計１０ｇを得た。【００８３】
実施例２：ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
１）  ヘパロサン１．２２ｇにＨｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏ６１ｍＬと１Ｎ硫酸４．７ｍＬを添加し、気相を窒素置換後、１００℃に加温し、４．７５時間反応させた。
２）  氷冷により反応を停止させた後、１６％ＮａＣｌ水溶液６１ｍＬおよびＭｅＯＨ６１０ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿をＨ２Ｏ５０ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮した。
３）  得られた濃縮液に２倍量のＨ２Ｏおよび等量の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加後、０．２Ｍ  Ｉ２／０．４Ｍ  ＫＩ溶液を黄色に呈色するまで滴下した。その後Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏを滴下し、余剰のヨウ素をヨウ素イオンに還元後、再度ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、濃縮液を減圧乾固してＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は１４．９％であった（後述）。【００８４】
実施例３：Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化
（１）ヘパリナーゼＩＩＩの調製
＜Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドの構築＞
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ  １３１２５）よりヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子をｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０ベクター（米国特許出願公開２００５０１９６８４６号）にクローニングし、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒには強力なｎｌｐ０プロモーター（Ｐｎｌｐ０）とｒｒｎＢターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Ｐｎｌｐ０」はエシェリヒア・コリＫ−１２株由来の野生型ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーターを示す。【００８５】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（配列番号６）及びプライマーＰ２（配列番号７）を用いたＰＣＲによって、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで処理し、ｐＭＩＶ−５ＪＳ（特開２００８−９９６６８）のＳａｌＩ−ＰａｅＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片の塩基配列は配列番号８に示したとおりである。【００８６】
次に、ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（配列番号９）及びプライマーＰ４（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号１１）を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒを取得した。【００８７】
次に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ  １３１２５）のｈｅｐＣ遺伝子のＯＲＦ（Ｓｕ  Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，６２：２７２３−２７３４）を含むＤＮＡ鎖を人工合成した。そのＤＮＡ鎖をテンプレートとして、プライマーＰ５（配列番号１２）及びプライマーＰ６（配列番号１３）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｈｅｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃８分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０をテンプレートＤＮＡとし、プライマーＰ７（配列番号１４）及びプライマーＰ８（配列番号１５）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。クローニングされたｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に、それがコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。【００８８】
＜エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株のｈｅｐＣ遺伝子発現株の構築及びヘパリナーゼＩＩＩ酵素液の調製＞
ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ライフテクノロジーズ社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ；８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ、キュベット；０．１ｍＬ）により導入し、ヘパリナーゼＩＩＩ生産株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣ株を得た。この株を２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール添加ＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を、坂口フラスコに３００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度２％ｖ／ｖとなるよう植菌した。３７℃にて４時間振とう培養を行い、培養を終了した。遠心分離後、菌体を０．８５％ＮａＣｌにて２回洗浄し、３０ｍＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）にて懸濁した。懸濁液を超音波破砕に供して菌体を破砕した。細胞破砕液を遠心分離し、上清（無細胞抽出液）としてヘパリナーゼＩＩＩ酵素液を調製した。【００８９】
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
実施例２で得られたＮ−アセチル基残存率１４．９％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇおよび３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２ｍＬを１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解し、３７℃にて５．３時間反応させた。反応液に１６％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬおよびＥｔＯＨ９００ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。【００９０】
実施例４：低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
１）  実施例３で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇをｍｉｌｌｉＱ水５０ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を５０ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
２）  ＥｔＯＨ１Ｌを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
３）  得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水に溶解して５００μＬとし、二糖分析を行ってＮ−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を求めた。また、ＧＰＣ分析に供し、分子量分布を求めた。手順を以下に示す。【００９１】
＜二糖分析＞
Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンの二糖分析は、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５−２９３（１９９６））の条件に従い実施した。すなわち、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。【００９２】
同様に、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析を実施した。なお、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化してから実施した。すなわち、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した後、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化は、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化と同様に実施した。【００９３】
二糖分析は、具体的には、以下の手順で実施した。
１）  ヘパリナーゼＩＩ０．２Ｕ（Ｓｉｇｍａ）、ヘパリナーゼＩＩＩ０．０２〜０．０３ｍＩＵ、多糖サンプル５μｇ、および酵素消化用ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ，ｐＨ７．０）１０μＬを混合し、ｍｉｌｌｉＱ水で１００μＬにメスアップし、反応溶液とした。
２）  反応溶液を３７℃で１６時間以上反応させた後、１００℃にて２分間煮沸し、反応を停止させた。
３）  ０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した溶液を二糖分析用サンプルとした。
４）  分析は、カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  １５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒子径５μｍを用い、温度は５０℃、流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２３０ｎｍ、溶離液はＡ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、１．２ｍＭ  Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを用い、Ｂ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、０．１Ｍ  ＣｓＣｌを用い、Ｂ液１−９０％のグラジエント条件で行った。【００９４】
各多糖サンプルから生成した構成二糖の量の合計から、収率を算出した。すなわち、収率は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖の全量に対する、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンから生成した二糖の全量の比率（モル比）として算出した。また、この時、得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、Ｎ−脱アセチル化により生じたアミノ基の９９％以上がＮ−硫酸化されていることを確認した。【００９５】
また、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した各構成二糖の量に基づき、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるＮ−アセチル基の残存率を算出した。すなわち、アセチル基の残存率は、二糖の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖の量の比率（モル比）として算出した。アセチル基の残存率は、１４．９％であった。【００９６】
＜ＧＰＣ分析＞
Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサン及びヘパラン硫酸（ｍｉｌｌｉＱ水に１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したもの）をＨＰＬＣによるゲルろ過（ＧＰＣ分析）に供した。カラムにはＧＳ５２０（Ｓｈｏｄｅｘ、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５２０ＨＱ、７．５ｍｍ×３００ｍｍ，粒子径７μｍ）を、溶離液には１００ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液を用い、流速０．６ｍＬ／分、カラム温度４０℃、検出波長２００ｎｍで分析した。平均分子量（ＭｎおよびＭｗ）は、プルランの分子量マーカー（Ｓｈｏｄｅｘ、ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、分子量範囲５９００〜７０８０００）を標準として算出した。【００９７】
実施例５：Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応
（１）Ｃ５−エピメラーゼの発現と精製
Ｃ５−エピメラーゼとしては、ヒト由来のＣ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｎ２９−Ａｓｎ６１７）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ−Ｃ５−エピメラーゼ）を利用した。そのため、同触媒部位をコードする塩基配列をｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングし、ＭＢＰ−Ｃ５−エピメラーゼの発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉを構築した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクターによれば、クローニングした遺伝子がＭＢＰとの融合タンパク質として発現する。【００９８】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。Ｊｉｎ−ｐｉｎｇ  Ｌｉらの報告（Ｌｉ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：２８１５８−２８１６３）を参照して、ヒト由来のＣ５−エピメラーゼのｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｃ５−ｅｐｉ  ｆｗ（配列番号１８）及びＣ５−ｅｐｉ  ｒｖ（配列番号１９）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｎ２９−Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（配列番号２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号２１及び配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社）を用いて連結し、Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列とｐＭＡＬ−ｃ２ｘにもともと含まれるＭＢＰ遺伝子の融合した、ＭＢＰ−Ｃ５−エピメラーゼの発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉを構築した。Ｃ５−エピメラーゼ挿入断片の塩基配列（Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号２３および２４に示す。【００９９】
ＭＢＰ−Ｃ５−エピメラーゼ発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉおよびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ；８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ、キュベット；０．１ｍＬ）により導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉ／ｐＧｒｏ７株を得た。この株をＬＢ培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）に１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した培地に植菌し、３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を坂口フラスコに１００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度１％となるよう植菌した。３７℃にて３時間振とう培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭ、アラビノース（和光純薬工業社）を終濃度０．２％となるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。【０１００】
培養液を遠心分離後、菌体を回収し、洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）により１回洗浄し、同洗浄液にて懸濁した。得られた懸濁液にＦａｓｔＢｒｅａｋ（プロメガ社）を添加し、３０℃で１０分間から１時間保温後、９，１００ｇにて１０分間遠心分離を行い、得られた上清を菌体抽出液とした。【０１０１】
（２）２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の発現と精製
２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）としては、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体の触媒部位（Ａｒｇ５１−Ａｓｎ３５６）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ−２−ＯＳＴ）を利用した。そのため、同触媒部位をコードする塩基配列をｐＭＡＬ−ｃ２ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングし、ＭＢＰ−２−ＯＳＴの発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴを構築した。【０１０２】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。小林らの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：１３９８０−１３９８５）を参照して、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体のｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により作製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、２−ＯＳＴ  ｆｗ（配列番号２５）及び２−ＯＳＴ  ｒｖ（配列番号２６）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、２−ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｒｇ５１−Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘをテンプレートＤＮＡとし、配列番号２１及び配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、２−ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列とｐＭＡＬ−ｃ２ｘにもともと含まれるＭＢＰ遺伝子の融合した、ＭＢＰ−２−ＯＳＴの発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴを構築した。２−ＯＳＴ挿入断片の塩基配列（２−ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号２７および２８に示す。【０１０３】
ＭＢＰ−２ＯＳＴ発現プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴおよびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ実施例５（１）と同様の手法により導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴ／ｐＧｒｏ７株を得た。この株をＬＢ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した培地に植菌し、３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を坂口フラスコに１００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度１％となるよう植菌した。３７℃にて３時間振とう培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭ、アラビノース（和光純薬工業社）を終濃度０．２％となるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。【０１０４】
培養液から以下の手順で精製ＭＢＰ−２−ＯＳＴを調製した。まず、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。次いで、菌体を超音波破砕し菌体抽出液を得た。次いで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌにより平衡化したＡｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）に菌体抽出液を混和しＭＢＰ−２−ＯＳＴをレジンに吸着させた。その後、レジンの４倍量の平衡化バッファーにて洗浄し、１０ｍＭのマルトースを添加した平衡化バッファー（溶出バッファー）を添加し、ＭＢＰ−２−ＯＳＴが含まれるフラクションを分取し、精製ＭＢＰ−２−ＯＳＴとした。【０１０５】
（３）酵素反応（Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応）
調製されたＭＢＰ−Ｃ５−エピメラーゼ菌体抽出液及び精製ＭＢＰ−２−ＯＳＴを用い、Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化を行った。１６６ｍｇの実施例４で得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサン、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＰＡＰＳの混合液７０３ｍＬに、終濃度０．９ｍｇ／ｍＬとなるようＣ５−エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液１０８ｍＬと、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう精製ＭＢＰ−２−ＯＳＴ１６．９ｍＬを加えて総量８２８ｍＬの反応液を調製し、３７℃で２４時間反応させた。【０１０６】
（４）変換率の定量
変換率（Ｃ５エピメリ化率および２−Ｏ−硫酸化率）の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。【０１０７】
＜試薬＞
ＮａＮＯ２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７６３２−００−０，ＭＷ：６９．０１）
クエン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７７−９２−９，ＭＷ：１９２．１）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１９−２６−６，ＭＷ：１９８．１）５０％含水品（略：ＤＮＰＨ）
Ｈｅｐａｒｉｎ（Ａｌｄｒｉｃｈ製）【０１０８】
＜試験液＞
Ｈｅｐａｒｉｎ標準溶液：１ｍｇ／ｍＬ
ＮａＮＯ２水溶液：試薬４９．５ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
クエン酸水溶液：試薬３８４．２ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
ＤＮＰＨ溶液：試薬２０．４ｍｇ（５０％含水）をアセトニトリル１ｍＬに溶解【０１０９】
＜ＬＣ−ＭＳ分析条件＞
＜ＬＣ条件＞
カラム：住化分析センター製ＯＤＳ  Ｚ−ＣＬＵＥ３μｍ  ２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム槽温度：５０℃
溶離液流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３６５ｎｍ
注入量：５μＬ
溶離液組成：Ａ液  ５０ｍＭ−ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．５）
Ｂ液  ＭｅＣＮ【０１１０】
【表１】
2017115674.tif 000002
【０１１１】
＜ＭＳ条件＞
イオン化法      ；エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ（＋／−））
ＤＬ温度        ：２５０℃
ヒートブロック  ：２５０℃
ネブライザーガス流速：１．５Ｌ／ｍｉｎ
ドライガス流速  ：１５Ｌ／ｍｉｎ【０１１２】
【表２】
2017115674.tif 000003
【０１１３】
＜分析手順および結果＞
１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にＨｅｐａｒｉｎ標準液、クエン酸ｂｕｆｆｅｒ水溶液２０μＬ、ＮａＮＯ２水溶液１０μＬを順に添加し、混合溶液を６５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液４０μＬにＤＮＰＨ溶液２０μＬを添加し、４５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成をＬＣ−ＭＳで分析した。Ｈｅｐａｒｉｎ標準液を分析して得られるＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のピークから換算係数（１ｍｇ×ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ純度／ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ値）を算出し、被験液中の各二糖誘導体のａｒｅａ値からその濃度を求めた。算出された二糖構造とその割合を表３に示す。表中、Ｎ−アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。Ｃ５−エピメリ化率（ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の割合の和）は５８％、２−Ｏ−硫酸化率（ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の割合の和）は６５％であることが確認された。【０１１４】
【表３】
2017115674.tif 000004
【０１１５】
実施例６：６−Ｏ−硫酸化反応
＜反応前の精製＞
実施例５で得られた酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応後の反応液）３０ｍＬを遠心分離し（７０００Ｇ、３０分）、その上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾過液２７．３ｇをファルマシア製カラム（型番：ＸＫ２６）に充填した弱アニオン交換樹脂１５ｇ（ＤＩＡＩＯＮ、ＷＡ−３０三菱化学製  事前に２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ５．５に調整）に投入して多糖成分を吸着し、洗浄液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））４８０ｍＬを通液した（流速：６．４ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、溶離液（２Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））２３０ｍＬを通液し（流速６．４ｍＬ／ｍｉｎ）、多糖成分を含む溶離液を得た。得られた溶離液をＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水１００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液１１ｇを取得した。【０１１６】
＜イオン交換＞
強カチオン交換樹脂（ＤＩＡＩＯＮ、ＵＢＫ５５０三菱化学製  予め１Ｍ塩酸でＨ型に変換）３ｍＬに洗浄濃縮液１１ｇを通液した後（ｐＨ２．２５）、トリブチルアミン２．３６ｍｇ／エタノール１０μＬの混合液１．８ｍＬを添加して中和した（ｐＨ８．３６）。得られた中和液を凍結乾燥した。【０１１７】
＜６−Ｏ−硫酸化反応＞
アルゴン気流下で凍結乾燥物全量にＤＭＦ１．９２ｍＬ及び三酸化硫黄ピリジン付加物７６．４ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、−１０℃で４８時間撹拌した。反応液に５Ｍ酢酸Ｎａ水溶液２．８ｍＬ及び水３１ｍＬを添加して室温で１時間撹拌することで反応を停止した。反応停止液を０．２μｍのフィルターで濾過し、その濾過液をＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水２０ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を２回実施して洗浄濃縮液３．９２ｇを取得した。得られた洗浄濃縮液をサンプリングし、実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行った。その結果、洗浄濃縮液３．９２ｇ中に二糖単位の量に換算して７６．５ｍｇの反応生成物（多糖）が含まれていることを確認した。【０１１８】
実施例７：ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化反応
（１）３−Ｏ−硫酸化酵素（３−ＯＳＴ）発現株の作製
マウス由来３−ＯＳＴ−１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：ＮＰ＿０３４６０４；配列番号２９）をＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）データベースより取得した。既報（Ｅｄａｖｅｔｔａｌ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（２４）２５７８９−９７）を参考に、エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに合わせて最適化した、同３−ＯＳＴ−１の触媒部位（Ｇｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１）をコードする塩基配列（配列番号３０）を含むＤＮＡ断片を合成した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入して、３−ＯＳＴ−１発現プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１を構築した。この発現プラスミドによれば、Ｎ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇが付加された３−ＯＳＴ−１が発現するため、Ｈｉｓタグによる３−ＯＳＴ−１の精製が可能となる。この発現プラスミドをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株へ実施例５（１）と同様の手法で導入し、３−ＯＳＴ−１発現株ｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１／ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。【０１１９】
（２）３−ＯＳＴ−１の発現と精製
エシェリヒア・コリｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１／ＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に接種し、３７  ℃で一晩静置培養した。寒天培地上に生育した菌体２０μＬをＬＢ培地１ｍＬに懸濁し、そのうち５０μＬをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＢ培地（メルク社、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）５０ｍＬを張り込んだ坂口フラスコに添加した。植菌した坂口フラスコ１６本を２２℃、１２０往復／分で２４〜２６時間振とう培養した後に、遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、５分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を１６０ｍＬの平衡化バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に懸濁し、再度遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、５分）することによって菌体を洗浄した。洗浄操作を２回繰り返した後、沈殿として得られた菌体を１６０ｍＬの平衡化バッファーに再度懸濁し、氷水で冷やしながら超音波破砕（１９０Ｗ、２０分間）を行った。破砕液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、１０分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。【０１２０】
得られた無細胞抽出液を、予め平衡化バッファーで平衡化したＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅカラム５ｍＬ（クロンテック社製）を３本連結したカラムにアプライして３−ＯＳＴ−１を吸着し、洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）にて洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）により３−ＯＳＴ−１を溶出し、３−ＯＳＴ−１の活性画分を得た。得られた活性画分を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いマニュアルに従ってバッファー交換（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）した。バッファー交換後の酵素溶液を精製３−ＯＳＴ−１として以降の実験に用いた。【０１２１】
（３）酵素反応（ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化反応）
実施例６で得られた反応生成物全量、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２２１μＭ  ＰＡＰＳの混合液３２６．５ｍＬを調製した。水浴中で予め３７℃に保温した同混合液に終濃度２３４ｍｇ／Ｌとなるよう精製３−ＯＳＴ−１  ５６ｍＬを添加して全量３８２．５ｍＬの反応液を調製し、反応を開始した。３７℃で緩やかに撹拌しながら反応を進行させ、２４時間経過後に９０℃２０分加熱し酵素を失活させた。【０１２２】
（４）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率の定量
実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表４に示す。【０１２３】
【表４】
2017115674.tif 000005
【０１２４】
実施例８：反応生成物の精製
実施例７で得られた酵素反応液（ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化反応後の反応液）３７１ｇを遠心分離し（８０００Ｇ、３０分）、その上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。その濾過液をＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水２００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液１１．６ｇを取得した。その洗浄濃縮液をファルマシア製カラム（型番：ＸＫ１６）に充填した弱アニオン交換樹脂７．５ｇ（ＤＩＡＩＯＮ、ＷＡ−３０三菱化学製  事前に２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ５．５に調整）に投入して多糖成分を吸着し、洗浄液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））５００ｍＬを通液した（流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、溶離液（２Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））５００ｍＬを通液し（流速３．０ｍＬ／ｍｉｎ）、多糖成分を含む溶離液を得た。得られた溶離液１７１ｇをＡｍｉｃｏｎ−５０Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた透過液を更にＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００  Ｇ）を行った。得られた濃縮液に水１００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液８．５８ｇを取得した。得られた洗浄濃縮液を凍結乾燥して精製多糖４１ｍｇを取得した。【０１２５】
実施例９：精製多糖の品質分析
実施例８で得られた精製多糖について、表５に示す項目の測定を実施した。測定法は後述する。結果を表５に示す。【０１２６】
【表５】
2017115674.tif 000006
【０１２７】
実施例１０：構造の異なる硫酸化多糖の作製
エピメリ化率、２−Ｏ−硫酸化率、ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率等のパラメータの異なる複数種の硫酸化多糖の作製し、抗凝固活性の評価を実施した。【０１２８】
（１）Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応
実施例５（３）と同様の反応液組成で総量１００ｍＬの反応液を調製し、０時間、４時間、８時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表６に示す。表中、Ｎ−アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。【０１２９】
【表６】
2017115674.tif 000007
【０１３０】
（２）６−Ｏ−硫酸化反応
得られた酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応後の反応液）各１００ｍＬについて、実施例６と同様の手順で精製および６−Ｏ−硫酸化反応を行い、洗浄濃縮液を取得した。得られた洗浄濃縮液をサンプリングし、実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行った。その結果、各サンプルについて、洗浄濃縮液中に二糖単位の量に換算して約８０μｇの反応生成物（多糖）が含まれていることを確認した。【０１３１】
（３）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化反応
得られた６−Ｏ−硫酸化反応の反応生成物について、実施例７と同様の反応液組成で総量３００μＬの反応液を調製し、２４時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表７に示す。表中、４時間および８時間のサンプルについては、未同定ピークのデータは割愛し、表に示す二糖単位の総量を１００％とした。【０１３２】
【表７】
2017115674.tif 000008
【０１３３】
（４）精製多糖の抗凝固活性
実施例８と同様の手順でＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化反応の反応生成物を精製し、抗凝固活性の測定を実施した。結果を表８に示す。【０１３４】
【表８】
2017115674.tif 000009
【０１３５】
＜測定法＞
実施例９および１０において、各項目は以下に示す手順で測定した。【０１３６】
＜Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ＞
・使用キット：テストチーム  ヘパリンＳ（清水メディカル製）
・低分子ヘパリン標準品：日本薬局法標準品（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団製  Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ：１７５０ＩＵ）
・使用器具：
ミキサー＆恒温機：Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｐａｃｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）
ＵＶ吸光度計：ＰＤ−３０３Ｓ（（株）アペル製）
ＵＶ−セル：アクリル製角セル（光路長１０ｍｍ）【０１３７】
試薬の調製
・基質液：基質剤１バイアルをミリＱ水２０ｍＬで溶解した。
・アンチトロンビンＩＩＩ液：アンチトロンビンＩＩＩ剤１バイアルをミリＱ水１０ｍＬに溶解した。
・ファクターＸａ液：ファクターＸａ剤１バイアルをミリＱ水１０ｍＬに溶解した。
・緩衝液：付属のバイアルをそのまま使用した。
・正常血漿：正常血漿剤１バイアルをミリＱ水１．０ｍＬで溶解した。
・反応停止液：氷酢酸（特級）２０ｍＬにミリＱ水を加え全量を４０ｍＬにした。
・ヘパリン標準液：
一次希釈ヘパリン溶液（３５ＩＵ／ｍＬ）：ヘパリン１７５０ＩＵをミリＱ水５０ｍＬに溶解した。
二次希釈ヘパリン液（０．１７５ＩＵ／ｍＬ）：一次希釈ヘパリン溶液１００μＬに緩衝液９００μＬを正確に加えて混合した。更に、混合液５０μＬに緩衝液９５０μＬを正確に加えて混合した。
ヘパリン標準液：二次希釈ヘパリン溶液を表９に示す通りに希釈して混和した。【０１３８】
【表９】
2017115674.tif 000010
【０１３９】
検体（測定サンプル）の調製
基質濃度が２μｇ／ｍＬになるように精製多糖をミリＱで希釈又は溶解し、希釈液Ａを得た。希釈液Ａに表１０に示す割合で試薬を添加し、検体を調製した。【０１４０】
【表１０】
2017115674.tif 000011
【０１４１】
測定手順
測定用及び検体ブランク用マイクロチューブのそれぞれに検体２００μＬを正確に採取して、３７℃で４分加温撹拌した。測定用マイクロチューブにファクターＸａ液１００μＬを加えてよく混和し３０秒静置した後、３７℃で正確に３０秒間加温した。測定用マイクロチューブに予め３７℃に加温した基質液２００μＬを加えてよく混和し３０秒静置した後、３７℃で正確に１８０秒間加温した。各マイクロチューブに反応停止液３００μＬを加え、直ちに混和した。ＵＶセルに反応液８００μＬを分注し、波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。同様に、各希釈系列のヘパリン標準液について測定を行い、ヘパリン標準液から算出される検量線を基に、検体のＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ活性を求めた。１ｍＬの血液凝固を１時間抑制する濃度を１  ＩＵ／ｍＬと定義した。【０１４２】
＜Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ＞
・使用試薬および使用キット：
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）測定用塩化カルシウム溶液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ  ＧＭＹ−３００Ａ）シスメックス（株）製
活性化部分トロンボプラスチン時間キット  アクチンＦＳＬ  ＧＡＣ−２００Ａ  シスメックス（株）製
正常コントロール血漿  デイドサイトロール  レベル１  ＧＣＡ−１１０Ａ  シスメックス（株）製
低分子ヘパリン標準品：日本薬局法標準品（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団製  Ａｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ：６７０  ＩＵ）
・使用器具：
半自動血液凝固測定装置（ＣＡ−１０４  シスメックス（株）製）【０１４３】
測定手順
キュベットに標準液（低分子ヘパリン標準品の希釈系列）又は被験液（精製多糖の溶液）１０μＬ、アクチン５０μＬ、コントロール血漿５０μＬを加え、直ちに検出部に挿入し遮光蓋を閉じた。３分撹拌した後、導入部から塩化カルシウム溶液５０μＬを添加した。凝固時間が自動的に表示された。標準液から算出される検量線を基に、被験液のＡｎｔｉ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩａ活性を求めた。１ｍＬの血液凝固を１時間抑制する濃度を１  ＩＵ／ｍＬと定義した。【０１４４】
＜ＬＰＳ分析法＞
・使用機器：Ｔｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒ  ＥＴ−６０００（和光純薬製）
・使用試薬：ライセート試薬（ｌｉｍｕｌｕｓ  ＥＳ−ＩＩ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｗａｋｏ）
標準ＬＰＳ（ＪＰＳＥ１００００）
・ＬＰＳ標準溶液（ＥＵ／ｍＬ）：０．０１，０．１，１【０１４５】
測定手順
ＥＳ−ＩＩシングルテストワコーにＬＰＳ標準溶液又は被験液（精製多糖の溶液）２００μＬ分注し、ミキサーで５秒撹拌した。チューブ内に大きな気泡がないことを確認してから、Ｔｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒのポジション１に挿入した（自動的に測定開始）。透過率９４．９％になる時間を求め、ＬＰＳ標準溶液から算出される検量線を基に、被験液中のＬＰＳ濃度を求めた。【０１４６】
＜タンパク質分析＞
・使用機器：プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ１９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）
・使用試薬：
ＮａＯＨ／Ｎａ２ＣＯ３溶液：ＮａＯＨ２ｇ及びＮａ２ＣＯ３１０ｇを水に溶解し全量を５００ｍＬに調整した。
硫酸銅／酒石酸Ｎａ溶液：硫酸銅５水和物２．５ｇ及び酒石酸Ｎａ２水和物５．９６ｇを水に溶解し全量を５００ｍＬに調整した。
硫酸銅アルカリ溶液：ＮａＯＨ／Ｎａ２ＣＯ３溶液５ｍＬ及び硫酸銅／酒石酸Ｎａ溶液１ｍＬを混合した（用時調製）。
フォーリン水溶液：Ａｌｄｒｉｃｈ製フォーリン試薬（Ｆ９２５２−１００ｍＬ）を水で２倍希釈した。
アルブミン標準液：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の標準液（２ｍｇ／ｍＬ）を用いて０．１２５，０．２５，０．５，１ｍｇ／ｍＬに希釈した。【０１４７】
測定手順
１．５ｍＬマイクロチューブにアルブミン標準液又は被験液（精製多糖の溶液）２０μＬと硫酸銅アルカリ溶液３００μＬを分注し、ミキサーで撹拌後１０分間静置した。更にフォーリン水溶液３０μＬを添加して撹拌後３０分静置した。得られた発色液３００μＬを９６穴プレートに注ぎ７５０ｎｍの吸光度を求めた。アルブミン標準液から算出される検量線を基に、被験液中のタンパク質濃度を求めた。【０１４８】
＜二糖分析＞
実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行い、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）の含有率を算出した。【０１４９】
＜平均分子量測定＞
実施例４と同様の手順でプルランの分子量マーカーを標準としてＧＰＣ分析を行い、平均分子量（ＭｎおよびＭｗ）を算出した。【０１５０】
実施例１１：ヘパロサンの部分的Ｎ−脱アセチル化による低分子化の制御
（１）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
１）  ヘパロサン１００ｍｇにＨｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏ５ｍＬと１Ｎ硫酸３８５μＬを添加し、気相を窒素置換後、１００℃に加温し、０時間〜４．７５時間反応させた。
２）  氷冷により反応を停止させた後、１６％ＮａＣｌ水溶液５ｍＬおよびＭｅＯＨ５０ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿をＨ２Ｏ５０ｍｌに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮した。
３）  得られた濃縮液に２倍量のＨ２Ｏおよび等量の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加後、０．２Ｍ  Ｉ２／０．４Ｍ  ＫＩ溶液を黄色に呈色するまで滴下した。その後Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏを滴下し、余剰のヨウ素をヨウ素イオンに還元後、再度ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、濃縮液を減圧乾固してＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。
４）  得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンの一部をＮ−硫酸化後、二糖分析で解析し、Ｎ−アセチル基の残存率を求めた。手順を以下に示す。【０１５１】
＜Ｎ−硫酸化＞
Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン２０ｍｇをｍｉｌｌｉＱ水１ｍＬに溶解し、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３を１ｍＬ添加して、５５℃で一晩反応させた。反応液にＭｅＯＨを５．７ｍＬ加えて、遠心分離によってＮ−硫酸化ヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、Ｎ−硫酸化ヘパロサンを得た。【０１５２】
＜二糖分析＞
二糖分析は、実施例４と同一の条件で実施した。【０１５３】
Ｎ−アセチル基の残存率の経時変化を図１に示す。Ｎ−脱アセチル化反応時間が４．７５時間のＮ−脱アセチル化ヘパロサンにおいては、グルコサミン骨格のうち１２．５％にＮ−アセチル基が残っていることが確認された。【０１５４】
（２）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化
１）  実施例１１（１）で得られたＮ−アセチル基残存率１２．５％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン５ｍｇおよび３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液１０μＬを１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）５００μＬに溶解し、３７℃にて０時間〜２１時間反応させた。
２）  反応液に１６％ＮａＣｌ水溶液５００μＬおよびＥｔＯＨ４．５ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。【０１５５】
（３）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
１）  実施例１１（２）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水２００μＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を２００μＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
２）  ＥｔＯＨ４．５ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
３）  得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水に溶解して５００μＬとし、二糖分析を行ってＮ−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を求めた。また、ＧＰＣ分析を行い、分子量分布を求めた。手順を以下に示す。【０１５６】
＜二糖分析＞
二糖分析は、実施例４と同一の条件で実施した。また、この時、得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、Ｎ−脱アセチル化により生じたアミノ基の９９％以上がＮ−硫酸化されていることを確認した。【０１５７】
＜ＧＰＣ分析＞
ＧＰＣ分析は、実施例４と同一の条件で実施した。【０１５８】
収率および平均分子量の経時変化を表１１および図３に示す。ＭｎおよびＭｗを対数でプロットした結果、Ｍｎは４．８時間、Ｍｗは５．３時間まで直線的に低下し、その後、一定あるいは微減傾向になった。また、一定あるいは微減傾向時の平均分子量は目標値の範囲（一例として、ＧＰＣ分析による分子量；１５０００≦Ｍｎ≦３００００、２１０００≦Ｍｗ≦４１０００）に収まり、想定通りにＮ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位が選択的に切断されたことが分かった（ヘパリナーゼＩＩＩの基質認識：ＮＡｃ≫ＮＨ２）。また、収率は常に減少傾向にあるため、本条件では、Ｍｗが一定あるいは微減傾向になる５．３時間で低分子化反応を停止することで、収率低下を最小限に抑え、目標の分子量のものが得られることが明らかとなった。【０１５９】
【表１１】
2017115674.tif 000012
【０１６０】
実施例１２：ヘパリナーゼＩＩＩの増量による低分子化反応時間の短縮
実施例１１（１）で得られたＮ−アセチル基残存率１２．５％のＮ−脱アセチル化ヘパロサンを、低分子化およびＮ−硫酸化に供し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを調製した。低分子化およびＮ−硫酸化の条件は、ヘパリナーゼＩＩＩの使用量を実施例１１の１０倍量とした（３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液１０μＬに替えて３１３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液１０μＬを用いた）以外は、実施例１１の条件と同一である。得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例１１と同一の手法で収率および分子量分布を求めた。【０１６１】
収率および平均分子量の経時変化を表１２および図４に示す。２．５時間の時点で過度な低分子化が観察された。これは、Ｎ−アセチル基を有さないグルコサミン残基（Ｎ−脱アセチル化されたグルコサミン残基）の部位もヘパリナーゼＩＩＩによって分解され始めたためと考えられる。よって、本条件では、０．４〜２．５時間の間に最適な低分子化反応時間があると考えられ、ヘパリナーゼＩＩＩの増量により低分子化反応時間を短縮できると明らかになった。このように、ヘパリナーゼＩＩＩの使用量に応じて、適宜好適な反応時間を選択することができる。【０１６２】
【表１２】
2017115674.tif 000013
【０１６３】
実施例１３：高アセチル基残存率を有するＮ−硫酸化ヘパロサンの分子量の低減化
（１）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
１）  ヘパロサン１２０ｍｇに２Ｍ  ＮａＯＨ６ｍＬを添加し、４８℃に加温し、４．１時間反応させた。
２）  ６Ｎ  ＨＣｌ２ｍＬを添加して反応を停止させた後、ＭｅＯＨ４５ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿を０．２５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ８ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、６ｍＬのＮ−脱アセチル化ヘパロサン溶液を得た。得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は２７．６％であった（後述）。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
（１）で得られたＮ−アセチル基残存率２７．６％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン溶液６ｍＬおよび１０ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２２１μＬを１Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）０．６ｍＬと混合した後にｍｉｌｌｉＱ水を添加して１２ｍＬとし、３７℃にて８時間反応させた。反応液にＥｔＯＨ  ８６ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。
（３）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
１）  （２）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン全量をｍｉｌｌｉＱ水６ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を６ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
２）  ＥｔＯＨ８６ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
３）  得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で平均分子量を求めた。【０１６４】
実施例１４：Ｎ−アセチル基残存率に依存した低分子化Ｎ−硫酸化ヘパロサンの分子量の制御
（１）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
実施例１３と同様にしてヘパロサンをＮ−脱アセチル化反応に供し、反応時間を制御することによりＮ−アセチル基残存率が２．６％〜２９．６％のＮ−脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
（１）で得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化を実施例１３と同様の条件でヘパリナーゼＩＩＩと反応させ、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（３）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
（２）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを実施例１３と同様の条件でＮ−硫酸化反応に供し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
（４）平均分子量の集計
得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で平均分子量を求めた。得られた収率および平均分子量（プルラン換算）の結果を表１３に示す。
表１３の結果により、Ｎ−アセチル基残存率を高くすることにより分子量を低減させるように制御できることが示された。【０１６５】
【表１３】
2017115674.tif 000014
【０１６６】
実施例１５：分子量による活性の違いを見るための低分子化Ｎ−硫酸化ヘパロサンの調製
Ｎ−アセチル基の残存量がヘパラン硫酸の活性に影響するため、分子量の違いの活性への影響を調べる目的でＮ−アセチル基の残存量の等しい異なる分子量の低分子化Ｎ−硫酸化ヘパロサンを調製した。分子量は、低分子化反応の反応時間で制御した。
（１）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
実施例１３と同様にしてヘパロサンをＮ−脱アセチル化反応に供し、Ｎ−アセチル基残存率が２９．４％のＮ−脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
（１）で得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化を実施例１３と同様の条件でヘパリナーゼＩＩＩと反応させ、酵素添加量と反応時間で分子量を制御し、４種類の低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（３）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
（２）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン４種類を実施例１３と同様の条件でＮ−硫酸化反応に供し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
（４）得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で分子量分布を求めた。【０１６７】
【表１４】
2017115674.tif 000015
【０１６８】
実施例１６：分子量の異なる硫酸化多糖の作製
（１）Ｃ５−エピメラーゼの発現と精製
Ｃ５−エピメラーゼとしては、ヒト由来のＣ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）と、Ｃ末端３アミノ酸を置換したマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ＊，既報（Ｒｏｂ  Ｊ．Ｃｅｎｔｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｃｒｉｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ２１  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ７，  １６１２−１６１９  （１９９８）））との融合タンパク質（ＭＢＰ＊−Ｃ５−エピメラーゼ（Ｇ１０１））を利用した。【０１６９】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。まず、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（配列番号２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号３１及び配列番号３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、ＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片を得た。上記ＰＣＲ反応においては、５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドＤＮＡおよびＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドを得た。ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドの塩基配列を配列番号３３に示す。【０１７０】
実施例５で作製したｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉプラスミドをテンプレートＤＮＡとし、配列番号３４及び配列番号３５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、Ｃ５−エピメラーゼ（Ｇ１０１）のＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応において、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩ、３’末端に制限酵素ＸｈｏＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−Ｃ５ｅｐｉプラスミドＤＮＡおよびＣ５−エピメラーゼ（Ｇ１０１）のＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）プラスミドを得た。挿入断片の塩基配列（Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号３６および３７に示す。実施例５と同様の方法によりＭＢＰ＊−Ｃ５−エピメラーゼ（Ｇ１０１）発現プラスミドｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）およびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）／ｐＧｒｏ７株を得た。この株を用いて、実施例５と同様の方法により、菌体抽出液を調製した。【０１７１】
（２）２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の発現と精製
２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）としては、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８−Ａｓｎ３５６）と、ＭＢＰ＊との融合タンパク質（ＭＢＰ＊−２−ＯＳＴ（Ｄ６８））を利用した。【０１７２】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。実施例５で作製したｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴプラスミドをテンプレートＤＮＡとし、配列番号３８及び配列番号３９のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、２−ＯＳＴ（Ｄ６８）のＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応において、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩ、３’末端に制限酵素ＸｈｏＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ−ＭＢＰ−２ＯＳＴプラスミドＤＮＡおよび２−ＯＳＴ（Ｄ６８）のＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴ（Ｄ６８）プラスミドを得た。挿入断片の塩基配列（２−ＯＳＴの触媒部位（Ａｓｐ６８−Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号４０および４１に示す。実施例５と同様の方法によりＭＢＰ＊−２−ＯＳＴ（Ｄ６８）発現プラスミドｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴ（Ｄ６８）およびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴ（Ｄ６８）／ｐＧｒｏ７株を得た。この株を用いて、実施例５と同様の方法により、２−ＯＳＴ精製蛋白質を調製した。【０１７３】
（３）Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応
実施例１５で調製した１４ｍｇ  Ｎ−硫酸化ヘパロサンＮｏ．１、Ｎｏ．２、またはＮｏ．３、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５ｍＭ  ＰＡＰＳを反応液組成とした混合液６８．９ｍｌに、終濃度０．０９ｍｇ／ｍＬのＣ５−エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液０．７ｍｌおよび終濃度０．０７ｍｇ／ｍＬの２−ＯＳＴ精製蛋白質０．４  ｍｌを加えて総量７０ｍＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で１０時間反応させた。【０１７４】
実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１５に示す。表中、Ｎ−アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。【０１７５】
【表１５】
2017115674.tif 000016
【０１７６】
（４）Ｃ５エピメリ化反応
実施例１５で調製した１４ｍｇ  Ｎ−硫酸化ヘパロサンＮｏ．１、Ｎｏ．２、またはＮｏ．３、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌを反応液組成とした混合液５．４ｍｌに、終濃度１．０ｍｇ／ｍＬのＣ５−エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液０．６ｍｌを加えて総量５ｍＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で２４時間反応させた。使用したＣ５−エピメラーゼは実施例１６（１）と同一のもの使用した。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１６に示す。【０１７７】
【表１６】
2017115674.tif 000017
【０１７８】
（５）６−Ｏ−硫酸化反応
得られたＮｏ．４−Ｎｏ．９の酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２−Ｏ−硫酸化のカップリング反応後、または、Ｃ５エピメリ化単独反応の反応液）について、実施例６と同様の手順で精製および６−Ｏ−硫酸化反応を行い、洗浄濃縮液を取得した。【０１７９】
（６）３−Ｏ−硫酸化反応
得られた６−Ｏ−硫酸化反応の反応生成物各８０μｇについて、実施例７と同様の反応液組成で総量３００μＬの反応液を調製し、２４時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１７に示す。未同定ピークのデータは割愛し、表に示す二糖単位の総量を１００％とした。【０１８０】
【表１７】
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【０１８１】
（７）精製多糖の抗凝固活性
実施例８と同様の手順で３−Ｏ−硫酸化反応の反応生成物を精製し、抗凝固活性の測定を実施した。結果を表１８に示す。【０１８２】
【表１８】
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【０１８３】
＜配列表の説明＞
配列番号１：エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡＢＣＤオペロンの塩基配列
配列番号２：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＡタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＢタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＣタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＤタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６、７：プライマー
配列番号８：野生型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ０）を含むＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片の塩基配列
配列番号９、１０：プライマー
配列番号１１：ｒｒｎＢターミネーターの塩基配列
配列番号１２〜１５：プライマー
配列番号１６：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ  ＡＴＣＣ  １３１２５のｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列
配列番号１７：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ  ＡＴＣＣ  １３１２５のＨｅｐＣタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１８、１９：プライマー
配列番号２０：ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ
配列番号２１、２２：プライマー
配列番号２３：Ｃ５−エピメラーゼ挿入断片の塩基配列（ヒト由来Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列）
配列番号２４：ヒト由来Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位のアミノ酸配列
配列番号２５、２６：プライマー
配列番号２７：２−ＯＳＴ挿入断片の塩基配列（チャイニーズハムスター由来２−ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列）
配列番号２８：チャイニーズハムスター由来２−ＯＳＴ変異体の触媒部位のアミノ酸配列
配列番号２９：マウス由来３−ＯＳＴ−１のアミノ酸配列
配列番号３０：エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに合わせて最適化した、マウス由来３−ＯＳＴ−１の触媒部位（Ｇｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１）をコードする塩基配列
配列番号３１、３２：プライマー
配列番号３３：ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊
配列番号３４、３５：プライマー
配列番号３６：Ｃ５−エピメラーゼ（Ｇ１０１）挿入断片の塩基配列（ヒト由来Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列）
配列番号３７：ヒト由来Ｃ５−エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１−Ａｓｎ６１７）のアミノ酸配列
配列番号３８、３９：プライマー
配列番号４０：２−ＯＳＴ（Ｄ６８）挿入断片の塩基配列（チャイニーズハムスター由来２−ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８−Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列）
配列番号４１：チャイニーズハムスター由来２−ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８−Ａｓｎ３５６）のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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