(57)【要約】  生きている状態で単離された全汗腺を染色試薬によって染色し、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって支持体に全汗腺を保持させた観察試料を用いる、化粧料などの外用剤の開発などに有用な汗腺の動態の観察方法および被験物質の評価方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺の動態を観察するステップ
を含む汗腺の動態の観察方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ｂ）において、支持体上に保持された全汗腺上に緩衝液を添加する請求項１に記載の汗腺の動態の観察方法。
【請求項３】
前記緩衝液が塩化ナトリウム１００〜１５０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム０．５〜２ｍＭと塩化マグネシウム０．５〜２ｍＭと炭酸水素ナトリウム２０〜３０ｍＭとリン酸二水素ナトリウム０．５〜２ｍＭとグルコース２〜８ｍＭと脂肪酸不含ウシ血清アルブミン５〜１５ｍｇ／１００ｍＬとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液である請求項２に記載の汗腺の動態の観察方法。
【請求項４】
前記ステップ（Ｃ）において、前記観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させ、前記刺激薬に起因する全汗腺の動態を観察する請求項１〜３のいずれか１項に記載の汗腺の動態の観察方法。
【請求項５】
被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、
（ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ、および
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で観察された全汗腺の動態に基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）において、支持体上に保持された全汗腺上に緩衝液を添加する請求項５に記載の被験物質の評価方法。
【請求項７】
前記緩衝液が塩化ナトリウム１００〜１５０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム０．５〜２ｍＭと塩化マグネシウム０．５〜２ｍＭと炭酸水素ナトリウム２０〜３０ｍＭとリン酸二水素ナトリウム０．５〜２ｍＭとグルコース２〜８ｍＭと脂肪酸不含ウシ血清アルブミン５〜１５ｍｇ／１００ｍＬとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液である請求項６に記載の被験物質の評価方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）において、前記観察試料に含まれる全汗腺と被験物質と刺激薬とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察する請求項５〜７のいずれか１項に記載の被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汗腺の動態の観察方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な汗腺の動態の観察方法および被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過度の発汗は、肌のベタつきおよび不快感を招くことがある。そこで、汗腺を閉塞させることによって発汗を抑制する成分を含む制汗剤などが開発されている。しかしながら、近年の清潔志向の高まりに伴い、過度の発汗などをより効果的に抑制することが求められている。そこで、過度の発汗などをより効果的に抑制する成分を開発するために、汗腺の状態を観察するための技術が求められている。【０００３】
一方、前記汗腺に含まれる汗腺細胞には、ケラチン５が発現していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、本発明者らは、現時点では、汗腺の動態を観察する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ローランド・モール（Ｒｏｌａｎｄ  Ｍｏｌｌ）ら、「上皮の２相性中皮腫の顕著な特徴としてのケラチン５の発現；モノクローナル抗体ＡＥ１４を用いた免疫組織学的研究（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  ５  ａｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａｓ  Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＡＥ１４）」、ウィルヒョー・アーカイブ・ビー・セル・ペイソロジー・インクルーディング・モレキュラー・ペイソロジー（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１９８９年発行、第５８巻、ｐｐ．１２９−１４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生きている状態の汗腺の動態を的確に観察することができる汗腺の動態の観察方法および被験物質が有する発汗制御作用を容易に評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）（Ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺の動態を観察するステップ
を含む汗腺の動態の観察方法、
（２）前記ステップ（Ｂ）において、支持体上に保持された全汗腺上に緩衝液を添加する前記（１）に記載の汗腺の動態の観察方法、
（３）前記緩衝液が塩化ナトリウム１００〜１５０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム０．５〜２ｍＭと塩化マグネシウム０．５〜２ｍＭと炭酸水素ナトリウム２０〜３０ｍＭとリン酸二水素ナトリウム０．５〜２ｍＭとグルコース２〜８ｍＭと脂肪酸不含ウシ血清アルブミン５〜１５ｍｇ／１００ｍＬとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液である前記（２）に記載の汗腺の動態の観察方法、
（４）前記ステップ（Ｃ）において、前記観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させ、前記刺激薬に起因する全汗腺の動態を観察する前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の汗腺の動態の観察方法、
（５）被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、
（ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ、および
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で観察された全汗腺の動態に基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む被験物質の評価方法、
（６）前記ステップ（ｂ）において、支持体上に保持された全汗腺上に緩衝液を添加する前記（５）に記載の被験物質の評価方法、
（７）前記緩衝液が塩化ナトリウム１００〜１５０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム０．５〜２ｍＭと塩化マグネシウム０．５〜２ｍＭと炭酸水素ナトリウム２０〜３０ｍＭとリン酸二水素ナトリウム０．５〜２ｍＭとグルコース２〜８ｍＭと脂肪酸不含ウシ血清アルブミン５〜１５ｍｇ／１００ｍＬとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液である前記（６）に記載の被験物質の評価方法、および
（８）前記ステップ（ｃ）において、前記観察試料に含まれる全汗腺と被験物質と刺激薬とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察する前記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の被験物質の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の汗腺の動態の観察方法によれば、生きている状態の汗腺の動態を的確に観察することができるという優れた効果が奏される。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が有する発汗制御作用を容易に評価することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトの汗腺の構造を示す概略説明図である。
【図２】実施例１において、核染色試薬に由来する蛍光と細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とに基づき、タイムラプス撮影によって汗腺の動態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図３】実施例１において、図２の図面代用写真に示されるパネル（Ａ１）が拡大された図面代用写真である。
【図４】実施例１において、図２の図面代用写真に示される汗腺中の２つの細胞間の距離の経時的変化を示すグラフである。
【図５】実施例１において、図２の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図６】実施例２において、核染色試薬に由来する蛍光と細胞膜染色試薬に由来する蛍光とに基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図７】実施例３において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】実施例３において、図７の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図９】実施例４において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図１０】実施例４において、図９の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図１１】実施例５において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図１２】実施例５において、図１１の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図１３】実施例６において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図１４】実施例６において、図１３の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図１５】実施例７において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を示す図面代用写真である。
【図１６】実施例７において、図１５の図面代用写真に示される汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図１７】実施例８において、汗管の外径指標値の経時的変化の測定部位を示す図面代用写真である。
【図１８】実施例８において、汗管の内径指標値の経時的変化の測定部位を示す図面代用写真である。
【図１９】実施例８において、図１７の図面代用写真に示される測定部位における外径指標値の経時的変化を示すグラフである。
【図２０】実施例８において、図１８の図面代用写真に示される測定部位における内径指標値の経時的変化を示すグラフである。
【図２１】実施例９において、実験番号１の汗腺の動態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図２２】実施例９において、実験番号２の汗腺の動態を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図２３】実施例９において、実験番号１の汗腺における細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【図２４】実施例９において、実験番号２の汗腺における細胞の移動距離の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の汗腺の動態の観察方法は、
（Ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺の動態を観察するステップ
を含む。
【００１０】
図１のヒトの汗腺の構造を示す概略説明図に示されるように、汗腺１は、分泌腺２と分泌腺２につながった汗管３とからなる。分泌腺２は、皮膚４の真皮５内に存在し、コイル状にねじれまがったコイル構造６を有する不分枝単一管状腺である。分泌腺の表面には、筋上皮細胞（図示せず）が存在している。
【００１１】
前記全汗腺の起源は、特に限定されるものではない。本発明の汗腺の動態の観察方法をヒトにおける汗の分泌の際の汗腺の動態の観察などに用いる場合、前記汗腺のなかでは、ヒトの汗腺が好ましい。
【００１２】
本明細書において、「全汗腺」とは、汗腺全体を意味する。また、本明細書において、「単離された全汗腺」とは、皮膚組織から取得され、生きている状態の全汗腺を意味する。なお、全汗腺は、一部が欠損したものであってもよい。
【００１３】
前記全汗腺は、生きている状態の汗腺の動態を的確に観察する観点から、通常、ドナーから摘出した後、好ましくは７０時間以内、より好ましくは１５時間以内の皮膚組織から単離したものである。また、前記単離時から１０時間以内の全汗腺であることが好ましい。
【００１４】
なお、本明細書において、「生きている状態」とは、生体内における生物学的活性および動きと同様の生物学的活性および動きを示す状態をいう。
【００１５】
前記汗腺の動態としては、例えば、汗腺の収縮の動きなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１６】
従来の生体から得られた組織の顕微鏡観察では、前記組織を染色する前に、組織固定、前記組織の透明化処理などが行なわれる。組織固定は、前記組織における生化学的反応を停止させて前記組織中の細胞の形態が変わらないようするために行なわれる。しかし、前記組織固定および透明化処理を行なった場合、得られた組織が死んだ状態であるため、動態を観察することができない。これに対して、本発明の汗腺の動態の観察方法では、前記ステップ（Ａ）により、単離された全汗腺を生きている状態のまま染色する。さらに、本発明の汗腺の動態の観察方法では、前記ステップ（Ｂ）により、前記染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された汗腺を生きている状態のまま支持体上に保持させ、観察試料を得る。このように、本発明の汗腺の動態観察方法によれば、前記ステップ（Ａ）および前記ステップ（Ｂ）の両方が採用されているので、汗腺の動態を的確に観察することができる。
【００１７】
前記ステップ（Ａ）では、単離された全汗腺を前記染色試薬によって染色する。単離された全汗腺の染色は、単離された全汗腺と、前記染色試薬とを接触させることによって行なうことができる。これにより、前記全汗腺における細胞膜、核および細胞骨格構成物質の少なくとも１種と対応の染色試薬とを結合させ、前記染色試薬によって染色された全汗腺を得る。
【００１８】
前記細胞膜に対する染色試薬（以下、「細胞膜染色試薬」ともいう）は、細胞膜マーカーに特異的に結合する物質（以下、「細胞膜結合物質」ともいう）と検出可能な物質とを含む。なお、前記細胞膜染色試薬は、細胞膜結合物質であり、かつ、検出可能な物質である物質を含んでいてもよい。
【００１９】
前記細胞膜マーカーとしては、例えば、細胞膜キナーゼなどが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。前記細胞膜結合物質は、生きている状態の細胞膜に結合する物質であればよい。
【００２０】
前記細胞膜結合物質としては、例えば、抗細胞膜キナーゼ抗体、その抗体断片などの抗細胞膜マーカー抗体；細胞膜の糖鎖に結合するレクチンなどの細胞膜マーカーに特異的に結合する化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２１】
前記細胞膜染色試薬に含まれる検出可能な物質としては、例えば、モレキュラープローブス社製の商品名：Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８などのＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒシリーズ蛍光色素分子、Ｃｙ５などの蛍光物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２２】
なお、本発明において、抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２３】
前記核に対する染色試薬（以下、「核染色試薬」ともいう）は、核を構成する物質に特異的に結合する物質（以下、「核結合物質」ともいう）と検出可能な物質とを含む。なお、前記核染色試薬は、検出可能な核結合物質を含んでいてもよい。
【００２４】
前記核を構成する物質としては、例えば、ＤＮＡなどの核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記核結合物質は、細胞膜を透過する物質であればよい。前記核結合物質としては、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２５】
前記核染色試薬に含まれる検出可能な物質としては、例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などのＨｏｅｃｈｓｔシリーズ蛍光色素などの蛍光物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、前記核結合物質であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、蛍光物質として用いられる。
【００２６】
前記細胞骨格構成物質に対する染色試薬（以下、「細胞骨格染色試薬」ともいう）は、細胞骨格構成物質に特異的に結合する物質（以下、「細胞骨格結合物質」ともいう）と検出可能な物質とを含む。なお、前記細胞骨格染色試薬は、細胞骨格結合物質であり、かつ検出可能な物質である物質を含んでいてもよい。
【００２７】
前記細胞骨格構成物質としては、例えば、アクチン、ミオシンなどの収縮タンパク質；ケラチンなどの中間径フィラメント；チューブリンなどの微小管構成タンパク質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２８】
前記細胞骨格結合物質は、生きている状態の細胞膜に結合する物質であればよい。前記細胞骨格結合物質としては、例えば、抗アクチン抗体、抗ミオシン抗体、抗ケラチン抗体、抗チューブリン抗体、これらの抗体それぞれの抗体断片などの抗細胞骨格構成物質抗体；ファロイジンなどの細胞骨格構成物質に特異的に結合する化合物などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
【００２９】
前記細胞骨格染色試薬に含まれる検出可能な物質としては、例えば、モレキュラープローブス社製の商品名：Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、商品名：Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５などのＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒシリーズ蛍光色素分子などの蛍光物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３０】
前記核染色試薬に含まれる検出可能な物質、前記細胞膜染色試薬に含まれる検出可能な物質および前記細胞骨格染色試薬に含まれる検出可能な物質は、核、細胞膜および細胞骨格のそれぞれを区別して同時に視覚化する場合には、それぞれ異なる波長を有するシグナルを生じる物質であることが好ましい。
【００３１】
前記細胞膜染色試薬としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製の商品名：ＣｅｌｌＭａｓｋなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記細胞骨格染色試薬としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記細胞骨格染色試薬としては、例えば、サイトケラチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ）社製、商品名：Ａｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ４８８、商品名：Ａｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ５５５などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
前記単離された全汗腺と前記染色試薬との接触に際し、前記単離された全汗腺と前記染色試薬との混合比および接触時間は、前記染色試薬の種類などによって異なるため、一概には決定することができないことから、前記染色試薬の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００３３】
汗腺の動態をより的確に観察する観点から、前記単離された全汗腺と前記染色試薬との接触後、染色された全汗腺を適切な洗浄液で洗浄することが好ましい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３４】
また、前記染色試薬が抗体またはその抗体断片を含む場合、汗腺の動態をより的確に観察する観点から、前記染色された全汗腺に対し、ブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施すことが好ましい。前記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
つぎに、前記ステップ（Ｂ）において、前記ステップ（Ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された汗腺を支持体上に保持させる。前記ステップ（Ｂ）において、支持体上に保持された前記汗腺の乾燥を抑制する観点から、当該支持体上に保持された前記汗腺上に緩衝液を添加することが好ましい。これにより、生きている状態の汗腺を含む観察試料が得られる。
【００３６】
前記観察試料によれば、生きている状態の汗腺が位置ずれしないように前記支持体上に保持されているので、汗腺の動態の観察時において、前記汗腺自体の動態とは関係がない動きを抑制しながら、前記汗腺の収縮などの動きを的確に観察することができる。したがって、前記観察試料は、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡下での汗腺の動態の観察に好適である。
【００３７】
前記コラーゲンとしては、例えば、コラーゲン  タイプＩ−Ａ、コラーゲン  タイプＩ−ＢなどのＩ型コラーゲン；ＩＩＩ型コラーゲン；ＩＶ型コラーゲンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ステップ（Ｂ）において、前記コラーゲンを用いる場合、支持体上における染色された全汗腺の保持は、例えば、支持体上における染色された全汗腺に、氷上で冷却されたコラーゲン含有液を滴下し、支持体上の前記全汗腺を２２〜３８℃でインキュベーションしてコラーゲンをゲル化させることなどによって行なうことができる。
【００３８】
前記アガロースは、汗腺を構成する細胞が生存することができる温度を融点として有するアガロースであればよい。ステップ（Ｂ）において、前記アガロースを用いる場合、支持体上における染色された全汗腺の保持は、例えば、支持体上における染色された全汗腺に、融解状態のアガロースを滴下し、支持体上の前記全汗腺をアガロースの融点以下の温度でインキュベーションしてアガロースをゲル化させることなどによって行なうことができる。
【００３９】
前記基底膜マトリックスは、構成必須成分としてラミニン、コラーゲン  タイプＩＶ、ニドゲンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンが含まれていればよい。前記基底膜マトリックスとしては、例えば、コーニング社製の商品名：マトリゲル基底膜マトリックスなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ステップ（Ｂ）において、前記基底膜マトリックスを用いる場合、支持体上における染色された全汗腺の保持は、例えば、支持体上における染色された全汗腺に、基底膜マトリックスを滴下し、支持体上の前記全汗腺を２２〜３７℃でインキュベーションして基底膜マトリックスをゲル化させることなどによって行なうことができる。
【００４０】
前記ポリ−Ｄ−リジンは、汗腺を構成する細胞を支持体に接着する程度の分子量を有していればよい。ステップ（Ｂ）において、前記ポリ−Ｄ−リジンを用いる場合、支持体上における染色された全汗腺の保持は、例えば、支持体の表面を前記ポリ−Ｄ−リジンで被覆し、前記支持体における前記ポリ−Ｄ−リジンで被覆された表面に染色された全汗腺を載置することなどによって行なうことができる。なお、前記ポリ−Ｄ−リジンと前記全汗腺との間の接着性を高め、全汗腺の位置ずれをより一層抑制する観点から、前記ポリ−Ｄ−リジンと前記全汗腺との間の接着性を高める物質、例えば、ラミニンなどをさらに用いてもよい。
【００４１】
前記メンブランは、全汗腺を通過させず、緩衝液、後述の刺激薬および後述の被験物質を通過させることができる孔径の孔を有するメンブランであればよい。前記孔径は、全汗腺の通過を抑制する観点から、好ましくは４０μｍ以下、より好ましくは０．４μｍ以下であり、後述の刺激薬などを通過させる観点から、好ましくは０．１μｍ以上である。ステップ（Ｂ）において、前記メンブランを用いる場合、支持体上における染色された全汗腺の保持は、例えば、支持体上に染色された全汗腺を載置し、載置された全汗腺の上にメンブランを載置することなどによって行なうことができる。
【００４２】
前記緩衝液としては、例えば、塩化ナトリウム１２０〜１６０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム１〜３ｍＭと塩化マグネシウム１〜３ｍＭとＨＥＰＥＳ緩衝液８〜１２ｍＭとグルコース８〜１２ｍＭとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液（以下、「緩衝液Ａ」という）、塩化ナトリウム１００〜１５０ｍＭと塩化カリウム３〜７ｍＭと塩化カルシウム０．５〜２ｍＭと塩化マグネシウム０．５〜２ｍＭと炭酸水素ナトリウム２０〜３０ｍＭとリン酸二水素ナトリウム０．５〜２ｍＭとグルコース２〜８ｍＭと脂肪酸不含ウシ血清アルブミン５〜１５ｍｇ／１００ｍＬとを含有し、ｐＨが７．１〜７．６である緩衝液（以下、「緩衝液Ｂ」という）、リン酸緩衝生理食塩水などの等張液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記緩衝液Ａとしては、例えば、細胞外溶液などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。前記緩衝液Ｂとしては、例えば、クレブス・リンガー液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの緩衝液のなかでは、刺激薬による汗腺の刺激を良好に観察することができることから、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂおよびリン酸緩衝生理食塩水が好ましく、緩衝液Ｂがより好ましく、クレブス・リンガー液がより好ましい。前記緩衝液として緩衝液Ｂ、好ましくはクレブス・リンガー液を用いた場合、刺激薬非存在下における汗腺の動きを観察することができる。
【００４３】
その後、前記ステップ（Ｃ）において、前記ステップ（Ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺の動態を観察する。
【００４４】
全汗腺の動態の観察は、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡などを用いて行なうことができる。具体的には、全汗腺の動態の観察は、例えば、染色された全汗腺をそのままライブ観察すること、染色された全汗腺における染色試薬に由来するシグナルを検出して観察することなどによって行なうことができる。全汗腺の動態は、例えば、特定の細胞の移動距離の経時的変化、特定の細胞間の距離の経時的変化、汗腺の汗管の体積の経時的変化、汗腺の汗管の外径の経時的変化、汗腺の汗管の内径の経時的変化などを指標として用いて評価することができる。
【００４５】
なお、本発明の汗腺の動態の観察方法は、前記全汗腺と刺激薬とを接触させ、前記刺激薬に起因する全汗腺の動態を観察するステップ（以下、「刺激薬接触ステップ」ともいう」）をさらに含んでもよい。この場合、前記刺激薬接触ステップは、前記ステップ（Ｂ）と（Ｃ）との間に行なってもよく、前記ステップ（Ｃ）中に行なってもよい。汗腺の動態、特に汗腺の収縮をより的確に観察する観点から、前記刺激薬接触ステップは、前記ステップ（Ｃ）中に行なうことが好ましい。
【００４６】
前記刺激薬としては、例えば、コリン作動薬、アドレナリン作動薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記コリン作動薬としては、例えば、アセチルコリン、ピロカルピン、ベタネコール、カルバコールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記アドレナリン作動薬としては、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンなどのカテコールアミンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４７】
以上説明したように、本発明の汗腺の動態の観察方法によれば、単離された全汗腺を、細胞膜染色試薬、核染色試薬および細胞骨格染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色し、染色された全汗腺を、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって支持体上に位置ずれしないように保持させて観察試料を得るという操作が行なわれている。そのため、本発明の汗腺の動態の観察方法によれば、生体組織の生化学反応を停止させる組織固定、生体組織の透明化処理などを行なわなくてもよいので、汗腺の収縮の際の動きなどを観察することができる。また、汗腺の収縮は、発汗と関連すると考えられる。このことから、本発明の汗腺の動態の観察方法は、汗腺の動態に基づき、制汗成分、発汗成分などの発汗制御成分のスクリーニングまたは評価に用いられることが期待される。したがって、本発明の汗腺の動態の観察方法は、化粧料などの外用剤の開発などに用いられることが期待される。
【００４８】
本発明の汗腺の動態の観察方法によれば、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価することができる。例えば、本発明の汗腺の動態の観察方法において、汗腺と被験物質を接触させ、汗腺の動態を観察することにより、当該被験物質が発汗制御作用を有するか否かを評価することができる。
【００４９】
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法である。本発明の被験物質の評価方法は、
（ａ）単離された全汗腺を、細胞膜に対する染色試薬、核に対する染色試薬および細胞骨格構成物質に対する染色試薬からなる群より選ばれた少なくとも１種の染色試薬によって染色するステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で染色された全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記染色された全汗腺を支持体上に保持させて観察試料を得るステップ、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ、および
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で観察された全汗腺の動態に基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価するステップ
を含む。なお、本明細書において、「発汗制御作用」には、「制汗作用」および「発汗誘導作用」が含まれる。「制汗作用」とは、発汗を抑制する作用をいう。「発汗誘導作用」とは、発汗させる作用または発汗を促進する作用をいう。
【００５０】
前記ステップ（ａ）および前記ステップ（ｂ）は、前記汗腺の動態の観察方法におけるステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）と同様の手法により行なうことができる。
【００５１】
前記ステップ（ｃ）では、前記ステップ（ｂ）で得られた観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察する。
【００５２】
前記被験物質としては、例えば、発汗制御作用を有することが期待される物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験物質としては、具体的には、無機化合物、有機化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒としては、例えば、本発明の汗腺の動態の観察方法に用いられる緩衝液、生理的食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５３】
前記観察試料に含まれる全汗腺と被験物質との接触は、例えば、前記観察試料上の全汗腺に前記被験物質を含有する溶液（以下、「被験液」ともいう）を添加して当該観察試料をインキュベーションすることなどによって行なうことができる。
【００５４】
前記観察試料に含まれる全汗腺と被験物質との接触に際し、前記全汗腺に接触させる被験物質の量および接触時間は、前記被験物質の種類などによって異なるため、一概には決定することができないことから、前記被験物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００５５】
前記被験液における被験物質の含有量は、被験物質の種類、本発明の被験物質の評価方法の用途などによって異なるため、一概には決定することができないことから、被験物質の種類、本発明の被験物質の評価方法の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００５６】
前記全汗腺の動態の観察は、前記汗腺の動態の観察方法におけるステップ（Ｃ）と同様の手法によって行なうことができる。
【００５７】
前記ステップ（ｄ）では、前記ステップ（ｃ）で観察された全汗腺の動態に基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する。なお、被験物質と接触させた全汗腺の動態のみに基づいて被験物質の発汗制御作用の有無を評価してもよく、被験物質と接触させた全汗腺の動態および被験物質と接触させていない全汗腺（被験物質と未接触の全汗腺）の動態に基づいて被験物質の発汗制御作用の有無を評価してもよい。
【００５８】
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が発汗制御作用を有するかどうかをより的確に評価する観点から、前記ステップ（ｃ）において、被験物質と未接触の全汗腺の動態も観察することが好ましい。この場合、ステップ（ｄ）において、被験物質と未接触の全汗腺の動態と、被験物質と接触後の全汗腺の動態とを比較することで被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価することが好ましい。
【００５９】
被験物質と未接触の全汗腺の動態を観察する場合、前記ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において、下記操作１または操作２を行なうことができる。
【００６０】
（操作１）
前記ステップ（ｃ）において、１つの観察試料を用い、観察試料に含まれる全汗腺の動態を観察した後、当該観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させて前記全汗腺の動態を観察し、前記ステップ（ｄ）において、被験物質の接触前後の前記全汗腺の動態の違いに基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する。
【００６１】
前記操作１を行なう場合、被験物質が制汗作用を有することの判断基準としては、例えば、被験物質接触後の全汗腺の動態の経時的変化が、被験物質と未接触の全汗腺の動態、すなわち被験物質と接触前の全汗腺の動態の経時的変化と比べて小さいことなどが挙げられる。また、被験物質が発汗誘導作用を有することの判断基準としては、例えば、被験物質接触後の全汗腺の動態の経時的変化が、被験物質と未接触の全汗腺の動態、すなわち被験物質と接触前の全汗腺の動態の経時的変化と比べて大きいことなどが挙げられる。
【００６２】
なお、前記操作１を行なうことにより、被験物質が制汗作用を有する物質であるかどうかを評価する場合、より的確に評価を行なう観点から、刺激薬を用いることもできる。この場合、前記ステップ（ｃ）において、１つの観察試料を用い、観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させて前記全汗腺の動態を観察した後、当該観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させて前記全汗腺の動態を観察し、前記ステップ（ｄ）において、被験物質の接触前後の前記全汗腺の動態の違いに基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価することができる。
【００６３】
（操作２）
前記ステップ（ｃ）において、少なくとも２種類の観察試料を用い、
（ｃ２−１）前記少なくとも２種類の観察試料から選ばれた１種の観察試料に含まれる全汗腺における被験物質と未接触の動態を観察するステップ、および
（ｃ２−２）前記ステップ（ｃ２−１）で用いられた観察試料とは異なる観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ
を行ない、前記ステップ（ｄ）において、前記ステップ（ｃ２−１）で観察された全汗腺の動態と、前記ステップ（ｃ２−２）で観察された全汗腺の動態との違いに基づき、被験物質が発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価する。
【００６４】
前記操作２を行なう場合、被験物質が制汗作用を有することの判断基準としては、例えば、前記ステップ（ｃ２−２）で観察された全汗腺の動態の経時的変化が、前記ステップ（ｃ２−１）で観察された全汗腺の動態の経時的変化と比べて小さいことなどが挙げられる。また、被験物質が発汗誘導作用を有することの判断基準としては、例えば、前記ステップ（ｃ２−２）で観察された全汗腺の動態の経時的変化が、前記ステップ（ｃ２−１）で観察された全汗腺の動態の経時的変化と比べて大きいことなどが挙げられる。
【００６５】
なお、前記操作２を行なうことにより、被験物質が制汗作用を有する物質であるかどうかを評価する場合、より的確に評価を行なう観点から、刺激薬を用いることが好ましい。この場合、前記ステップ（ｃ２−１）として、
前記少なくとも２種類の観察試料から選ばれた１種の観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させ、当該全汗腺における被験物質と接触させていないとき（被験物質と未接触のとき）の動態を観察するステップ（ｃ２−１Ａ）
を行なうことができる。前記刺激薬に加え、被験物質の対照となる対照物質をさらに用いる場合は、前記ステップ（ｃ２−１）として、下記ステップ（ｃ２−１Ａ−１）、ステップ（ｃ２−１Ａ−２）およびステップ（ｃ２−１Ａ−３）の少なくとも１つを行なうことができる。
【００６６】
ステップ（ｃ２−１Ａ−１）
前記少なくとも２種類の観察試料から選ばれた１種の観察試料に含まれる全汗腺と対照物質とを接触させた後、当該全汗腺に刺激薬を接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００６７】
ステップ（ｃ２−１Ａ−２）
前記少なくとも２種類の観察試料から選ばれた１種の観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させた後、当該全汗腺に対照物質を接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００６８】
ステップ（ｃ２−１Ａ−３）
前記少なくとも２種類の観察試料から選ばれた１種の観察試料に含まれる全汗腺と対照物質と刺激薬とを同時に接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００６９】
また、前記操作２を行なうことにより、被験物質が制汗作用を有する物質であるかどうかを評価する際に、前記刺激薬を用いる場合、前記ステップ（ｃ２−２）として、
前記ステップ（ｃ２−１）で用いられた観察試料とは異なる観察試料に含まれる全汗腺と被験物質と刺激薬とを接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ（ｃ２−２Ａ）
を行なうことができる。前記ステップ（ｃ２−２Ａ）として、例えば、下記ステップ（ｃ２−２−１）、ステップ（ｃ２−２−２）およびステップ（ｃ２−２−３）の少なくとも１つを行なうことができる。
【００７０】
ステップ（ｃ２−２−１）
前記ステップ（ｃ２−１）で用いられた観察試料とは異なる観察試料に含まれる全汗腺と被験物質とを接触させた後、当該全汗腺に刺激薬を接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００７１】
ステップ（ｃ２−２−２）
前記ステップ（ｃ２−１）で用いられた観察試料とは異なる観察試料に含まれる全汗腺と刺激薬とを接触させた後、当該全汗腺に被験物質を接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００７２】
ステップ（ｃ２−２−３）
前記ステップ（ｃ２−１）で用いられた観察試料とは異なる観察試料に含まれる全汗腺と被験物質と刺激薬とを同時に接触させ、当該全汗腺の動態を観察するステップ。
【００７３】
本発明の被験物質の評価方法で用いられる刺激薬は、前記汗腺の動態の確認方法における刺激薬と同様である。
【００７４】
前記全汗腺に接触させる刺激薬の量および接触時間は、前記刺激薬の種類などによって異なるため、一概には決定することができないことから、前記刺激薬の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００７５】
以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が発汗制御作用を有するかどうかを評価することができることから、制汗成分、発汗成分などの発汗制御成分のスクリーニングまたは評価に用いることができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、化粧料などの外用剤の開発などに用いられることが期待される。
【実施例】
【００７６】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例などにおいて、略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語の説明＞
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水
５×ＰＢＳ：５倍濃度のリン酸緩衝化生理食塩水
１０×ＰＢＳ：１０倍濃度のリン酸緩衝化生理食塩水【００７７】
製造例１
リン酸緩衝化生理食塩水５００μＬに細胞骨格染色試薬〔サイトケラチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ）社製、商品名：Ａｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ４８８、Ａｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ４８８の濃度：１４μＭ〕３．５μＬと、細胞膜染色試薬〔サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、商品名：ＣｅｌｌＭａｓｋ〕４μＬと、核染色試薬〔Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２〕１μＬとを添加し、染色試薬混合液を得た。【００７８】
製造例２
コラーゲン  タイプＩ−Ａ液（コラーゲン  タイプＩ−Ａの含有率：３質量％）〔新田ゼラチン（株）製〕７００μＬと、５×ＰＢＳ〔組成：６８５ｍＭ塩化ナトリウム、１３．５ｍＭ塩化カリウム、５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム十二水和物および９ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４〕２００μＬと、コラーゲン再構成緩衝液〔組成：５０ｍＭ水酸化ナトリウム、２６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ１０．０〕１００μＬとを混合することにより、コラーゲン含有液Ａを得た。また、コラーゲン  タイプＩ−Ａ液（コラーゲン  タイプＩ−Ａの含有率：３質量％）〔新田ゼラチン（株）製〕８００μＬと、１０×ＰＢＳ〔組成：１３７０ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム十二水和物および１８ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４〕１００μＬと、前記コラーゲン再構成緩衝液１００μＬとを混合することにより、コラーゲン含有液Ｂを得た。【００７９】
実施例１
（１）全汗腺の単離
皮膚組織として、生体から摘出後すぐに冷蔵され、４℃で１５時間保存された皮膚組織を用いた。皮膚組織を１０μＭニュートラルレッド（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ）含有リン酸緩衝化生理食塩水に浸すことにより、前記皮膚組織中の汗腺にＮｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄを取り込ませた。つぎに、前記皮膚組織の真皮部分を細かく裁断し、真皮細片を得た。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から全汗腺を採取した。【００８０】
（２）染色
実施例１（１）で得られた全汗腺を製造例１で得られた染色試薬混合液中に室温（２４℃）で３０分間浸漬させることにより、全汗腺を染色した。染色された全汗腺をＰＢＳで洗浄した。【００８１】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例１（２）で得られた洗浄後の全汗腺をガラスボトムディッシュに静置した。ガラスボトムディッシュに静置された全汗腺に、製造例２で得られたコラーゲン含有液Ａを滴下した。つぎに、前記ガラスボトムディッシュを３７℃で５分間インキュベーションすることにより、前記全汗腺にコラーゲン含有液Ａに含まれるコラーゲン  タイプＩ−Ａをゲル化させた。
その後、全汗腺が乾燥しないように、前記全汗腺上に等張液（ＰＢＳ）を添加した。これにより、全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン  タイプＩ−Ａによって前記全汗腺を支持体であるガラスボトムディッシュに保持させて観察試料を得た。【００８２】
（４）観察
ゲル化したコラーゲン  タイプＩ−Ａによって全汗腺がガラスボトムディッシュに接着していることを実体顕微鏡下で確認しながら、ゲル化したコラーゲン  タイプＩ−Ａに、ダルベッコリン酸緩衝液〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製、カタログ番号：１４１９０−１４４〕４００μＬを添加した。【００８３】
前記緩衝液の添加時から５分間経過後に、生物用共焦点レーザー走査型顕微鏡〔オリンパス（株）製の商品名：ＦＶ１２００を搭載した倒立顕微鏡（オリンパス（株）製、商品名：ＩＸ−８３）〕を用いて、ガラスボトムディッシュ上の全汗腺のタイムラプス撮影による観察を開始した。このとき、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出することにより、全汗腺を視覚化した。観察開始時から６０秒間経過後に、汗腺収縮誘導試薬（刺激薬）であるピロカルピンをその濃度が１０ｍＭとなるように前記全汗腺に添加した。タイムラプス撮影の条件は、以下のとおりである。【００８４】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：１２６．７２８μｍ
Ｙ：７６．１３６μｍ
Ｚ：１６μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：９枚
タイムインターバル：４０秒間
全フレーム数：５１フレーム
全観察時間：３０分間以上【００８５】
実施例１において、核染色試薬に由来する蛍光と細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とに基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図２に示す。図２に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は核染色試薬と細胞骨格染色試薬とによる二重染色像である。また、図２に記載のパネル（Ａ２）〜（Ｇ２）は、それぞれ、パネル（Ａ１）〜（Ｇ１）に対応する核染色試薬による染色像である。図２に記載のパネル（Ａ３）〜（Ｇ３）は、それぞれ、パネル（Ａ１）〜（Ｇ１）に対応する細胞骨格染色試薬による染色像である。図２に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ３）と、観察開始時からの経過時間との対応関係を表１に示す。また、図２に記載のスケールバーは、５０μｍを示す。【００８６】
【表１】
2018016501.tif 000002
【００８７】
また、図２において、細胞Ａ、細胞Ｂ、細胞Ｃおよび細胞Ｄ（図３参照）を選択し、各細胞の移動距離の経時的変化及び細胞間の距離の経時的変化を調べた。細胞の移動距離を求めるために、まず、各細胞のｘ座標およびｙ座標を用い、連続するフレーム間での座標の変化（差）を、式（Ｉ）および（ＩＩ）：
Ｘｎ+1-Ｘｎ                                                  （Ｉ）
（式中、ｎは１〜３０の整数を示す）
Ｙｎ+1-Ｙｎ                                                  （ＩＩ）
（式中、ｎは前記と同じ）
にしたがって求めた。つぎに、三平方の定理（ａ２＋ｂ２＝ｃ２）により、式（ＩＩＩ）：
（Ｘｎ＋1−Ｘｎ）2＋（Ｙｎ＋1−Ｙｎ）2                          （ＩＩＩ）
（式中、ｎは前記と同じ）
の平方根を算出することにより、連続するフレーム間毎の細胞間の移動値を求めた。さらに、実際の移動距離を求めるため、取得画像の大きさ〔１２６．７２８×７６．１３６（単位：μｍ２）〕とピクセル（５１２×３０６）から、座標１あたりの単位（μｍ／ピクセル）を求めた。移動値と座標１あたりの大きさを乗じて実際の細胞の移動距離（μｍ）を算出した。【００８８】
実施例１において、図２における汗腺中の２つの細胞間の距離の経時的変化を図４に示す。図４において、（Ａ）は細胞Ａと細胞Ｂとの間の距離、（Ｂ）は細胞Ａと細胞Ｃとの間の距離、（Ｃ）は細胞Ａと細胞Ｄとの間の距離、（Ｄ）は細胞Ｂと細胞Ｃとの間の距離、（Ｅ）は細胞Ｂと細胞Ｄとの間の距離、（Ｆ）は細胞Ｃと細胞Ｄとの間の距離を示す。【００８９】
また、実施例１において、図２における汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図５に示す。図５において、（Ａ）は細胞Ａの移動距離、（Ｂ）は細胞Ｂの移動距離、（Ｃ）は細胞Ｃの移動距離、（Ｄ）は細胞Ｄの移動距離を示す。【００９０】
図４に示された結果から、細胞Ａと細胞Ｂとの間の距離、細胞Ａと細胞Ｃとの間の距離、細胞Ａと細胞Ｄとの間の距離、細胞Ｂと細胞Ｃとの間の距離、細胞Ｂと細胞Ｄとの間の距離および細胞Ｃと細胞Ｄとの間の距離は、経時的に変化することがわかる。【００９１】
また、図５に示された結果から、細胞Ａ、細胞Ｂ、細胞Ｃおよび細胞Ｄそれぞれの移動距離は、観察開始時から１５０〜３００秒間経過時点に移動距離が大きくなることがわかる。【００９２】
したがって、これらの結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン  タイプＩによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【００９３】
実施例２
実施例１において、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の変更点を除き、実施例１と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。
（ｉ）コラーゲン含有液Ａを用いる代わりに、製造例２で得られたコラーゲン含有液Ｂを用いた。
（ｉｉ）核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞膜に結合した細胞膜染色試薬に由来する蛍光とを検出した。
（ｉｉｉ）汗腺収縮誘導試薬ピロカルピンの代わりに、汗腺収縮誘導試薬アセチルコリンを用いた。
（ｉｖ）観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに、観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加した。【００９４】
タイムラプス撮影の条件は、以下の通りである。【００９５】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：１１６．１２７μｍ
Ｙ：１８５．６７９μｍ
Ｚ：３４．６μｍ
Ｚインターバル：５μｍ
Ｚ枚数：８枚
タイムインターバル：３０秒間
全フレーム数：６６フレーム
全観察時間：３０分間以上【００９６】
実施例２において、核染色試薬に由来する蛍光と細胞膜染色試薬に由来する蛍光とに基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図６に示す。図６に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬と細胞膜染色試薬とによる二重染色像である。
また、図６に記載のパネル（Ａ２）〜（Ｇ２）は、それぞれ、パネル（Ａ１）〜（Ｇ１）に対応する核染色試薬による染色像である。図６に記載のパネル（Ａ３）〜（Ｇ３）は、それぞれ、パネル（Ａ１）〜（Ｇ１）に対応する細胞膜染色試薬による染色像である。図６に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ３）と、観察開始時からの経過時間との対応関係は、表２に示されるとおりである。また、図６に記載のスケールバーは、５０μｍを示す。
【表２】
2018016501.tif 000003
【００９７】
図６に示された結果から、経時とともに汗腺が動いていることがわかる。したがって、前記結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲンによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【００９８】
実施例３
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【００９９】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１００】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例３（２）で得られた洗浄後の全汗腺をガラスボトムディッシュに静置した。つぎに、前記全汗腺に、４０℃に保たれた３質量％低融点アガロース含有ＰＢＳを滴下した。低融点アガロース滴下後の全汗腺を室温（２４℃）で１０分間放置することにより、低融点アガロースをゲル化させた。その後、全汗腺が乾燥しないように、ゲル化された低融点アガロース上に等張液〔細胞外溶液（組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭエンカカルシウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）〕を添加した。これにより、全汗腺が位置ずれしないように、低融点アガロースによって前記全汗腺を支持体であるガラスボトムディッシュに保持させて観察試料を得た。【０１０１】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、実施例３（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。タイムラプス撮影の条件は、以下の通りである。【０１０２】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：３１９．１９４μｍ
Ｙ：２２７．２８６μｍ
Ｚ：３０．０μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：１６枚
タイムインターバル：１０秒間
全フレーム数：２０１フレーム
全観察時間：３０分間以上【０１０３】
実施例３において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図７に示す。図７に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬による染色像である。図７に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係を、表３に示す。また、図７に記載のスケールバーは、１００μｍを示す。
【表３】
2018016501.tif 000004
【０１０４】
また、図７に記載の矢印で示された細胞を選択し、細胞の移動距離の経時的変化を調べた。【０１０５】
実施例３において、図７の隣り合うパネル間での汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図８に示す。【０１０６】
図８に示された結果から、時間の経過に伴い、細胞の移動が見られることがわかる。したがって、前記結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、アガロースによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１０７】
実施例４
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【０１０８】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１０９】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
実施例１（３）において、コラーゲン  タイプＩ−Ａを用いる代わりに、基底膜マトリックス〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、商品名：マトリゲル基底膜マトリックス〕を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、観察試料を得た。【０１１０】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、実施例４（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。タイムラプス撮影の条件は以下の通りである。【０１１１】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：２７４．４８２μｍ
Ｙ：４０１．１６６μｍ
Ｚ：４４．０μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：２３枚
タイムインターバル：２０秒間
全フレーム数：１０１フレーム
全観察時間：３０分間以上【０１１２】
実施例４において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図９に示す。図９に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬による染色像である。図９に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係は、表３に示されるパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係と同様である。また、図９に記載のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１１３】
また、図９に記載の矢印で示された細胞を選択し、細胞の移動距離の経時的変化を調べた。【０１１４】
実施例４において、図９の隣り合うパネル間での汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図１０に示す。【０１１５】
図１０に示された結果から、時間の経過に伴い、細胞の移動が見られることがわかる。
したがって、前記結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、基底膜マトリックスによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１１６】
実施例５
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【０１１７】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１１８】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
２００μg/ｍＬポリ−Ｄ−リジン含有水溶液をガラスボトムディッシュの表面に塗布した。塗布後のガラスボトムディッシュを３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後のガラスボトムディッシュを滅菌水で２回洗浄した。これにより、ポリリジン被覆ガラスボトムディッシュを得た。【０１１９】
つぎに、実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例１（２）で得られた洗浄後の全汗腺をポリリジン被覆ガラスボトムディッシュに静置した。その後、全汗腺が乾燥しないように、全汗腺上に等張液（細胞外溶液）を添加した。これにより、全汗腺が位置ずれしないように、ポリ−Ｄ−リジンによって前記全汗腺を支持体であるガラスボトムディッシュに保持させて観察試料を得た。【０１２０】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、実施例５（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。タイムラプス撮影の条件は以下の通りである。【０１２１】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：４０３．６５μｍ
Ｙ：２７１．９８８μｍ
Ｚ：７０μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：３６枚
タイムインターバル：２０秒間
全フレーム数：１０１フレーム
全観察時間：３０分間以上【０１２２】
実施例５において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図１１に示す。図１１に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬による染色像である。図１１に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係は、表３に示されるパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係と同様である。また、図１１に記載のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１２３】
また、図１１に記載の矢印で示された細胞を選択し、細胞の移動距離の経時的変化を調べた。【０１２４】
実施例５において、図１１に記載の隣り合うパネル間での汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図１２に示す。【０１２５】
図１２に示された結果から、時間の経過に伴い、細胞の移動が見られることがわかる。
したがって、これらの結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、ポリ−Ｄ−リジンによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１２６】
実施例６
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【０１２７】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１２８】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
２００μg/ｍＬポリ−Ｄ−リジン含有水溶液をガラスボトムディッシュの表面に塗布した。塗布後のガラスボトムディッシュを３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後のガラスボトムディッシュを滅菌水で２回洗浄した。これにより、ポリリジン被覆ガラスボトムディッシュを得た。【０１２９】
つぎに、２０μg/ｍＬラミニン含有水溶液を前記ポリリジン被覆ガラスボトムディッシュの表面に塗布した。塗布後のガラスボトムディッシュを３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後のガラスボトムディッシュを滅菌水で２回洗浄した。これにより、ポリリジン−ラミニン被覆ガラスボトムディッシュを得た。【０１３０】
その後、実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例１（２）で得られた洗浄後の全汗腺を前記ポリリジン−ラミニン被覆ガラスボトムディッシュに静置した。その後、全汗腺が乾燥しないように、全汗腺上に等張液（細胞外溶液）を添加した。これにより、全汗腺が位置ずれしないように、ポリ−Ｄ−リジンとラミニンとを併用することによって前記全汗腺を支持体であるガラスボトムディッシュに保持させて観察試料を得た。【０１３１】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、実施例６（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。タイムラプス撮影の条件は以下の通りである。【０１３２】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：３５１．４８６μｍ
Ｙ：６１４．７９μｍ
Ｚ：３４．０μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：１８枚
タイムインターバル：２０秒間
全フレーム数：１０１フレーム
全観察時間：３０分間以上【０１３３】
実施例６において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図１３に示す。図１３に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬による染色像である。図１３に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係は、表３に示されるパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係と同様である。また、図１３に記載のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１３４】
また、図１３に記載の矢印で示された細胞を選択し、細胞の移動距離の経時的変化を調べた。【０１３５】
実施例６において、図１３の隣り合うパネル間での汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図１４に示す。【０１３６】
図１４に示された結果から、時間の経過に伴い、細胞の移動が見られることがわかる。
したがって、これらの結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、ポリ−Ｄ−リジンとラミニンとを併用することによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１３７】
実施例７
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【０１３８】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１３９】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
メルクミリポア社製の商品名：ミリセルセルカルチャーインサートのメンブラン部分を切り取り、メンブランを得た。【０１４０】
つぎに、実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例１（２）で得られた洗浄後の全汗腺をガラスボトムディッシュに静置した。ガラスボトムディッシュに静置された全汗腺上に前記メンブランを載置した。その後、全汗腺が乾燥しないように、全汗腺上に等張液（細胞外溶液）を添加した。これにより、前記全汗腺が位置ずれしないように、メンブランによって全汗腺を支持体であるガラスボトムディッシュに保持させて観察試料を得た。【０１４１】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、実施例７（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。タイムラプス撮影の条件は以下の通りである。【０１４２】
＜タイムラプス撮影条件＞
Ｘ：４７３．２０２μｍ
Ｙ：５１５．４３μｍ
Ｚ：３０μｍ
Ｚインターバル：２μｍ
Ｚ枚数：１６枚
タイムインターバル：２０秒間
全フレーム数：１０１フレーム
全観察時間：３０分間以上【０１４３】
実施例７において、核染色試薬に由来する蛍光に基づき、汗腺の動態をタイムラプス撮影によって観察した結果を図１５に示す。図１５に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）は、核染色試薬による染色像である。図１５に記載のパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係は、表３に示されるパネル（Ａ１）〜（Ｇ１）と、観察開始時からの経過時間との対応関係と同様である。また、図１５に記載のスケールバーは、２００μｍを示す。【０１４４】
また、図１５に記載の矢印で示された細胞を選択し、細胞の移動距離の経時的変化を調べた。【０１４５】
実施例７において、図１５に記載の隣り合うパネル間での汗腺中の細胞の移動距離の経時的変化を図１６に示す。【０１４６】
図１６に示された結果から、時間の経過に伴い、細胞の移動が見られることがわかる。
したがって、これらの結果から、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、メンブランによって前記全汗腺を支持体に保持させることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１４７】
比較例１
（１）全汗腺の単離
実施例１（１）と同様の操作を行ない、全汗腺を単離した。【０１４８】
（２）染色
実施例１（２）と同様の操作を行ない、染色を行なった。【０１４９】
（３）支持体上への染色された全汗腺の位置固定
２０μg/ｍＬラミニン含有水溶液をガラスボトムディッシュの表面に塗布した。塗布後のガラスボトムディッシュを３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後のガラスボトムディッシュを滅菌水で２回洗浄した。これにより、ラミニン被覆ガラスボトムディッシュを得た。【０１５０】
その後、実体顕微鏡〔ライカ（Ｌｅｉｃａ）社製、商品名：Ｍ１２５〕下において、実施例１（２）で得られた洗浄後の全汗腺を前記ラミニン被覆ガラスボトムディッシュに静置した。その後、全汗腺が乾燥しないように、全汗腺上に等張液（細胞外溶液）を添加し、観察試料を得た。【０１５１】
（４）観察
実施例１（４）において、実施例１（３）で得られた観察試料を用いる代わりに、比較例１（３）で得られた観察試料を用いたこと；実施例１（４）において、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光と、細胞骨格に結合した細胞骨格染色試薬に由来する蛍光とを検出する代わりに、核に結合した核染色試薬に由来する蛍光を検出したこと；実施例１（４）において、観察開始時から６０秒間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加する代わりに観察開始から１０分間経過後に汗腺収縮誘導試薬を全汗腺に添加したことを除き、実施例１（４）と同様の操作を行ない、汗腺の動態を観察した。【０１５２】
その結果、汗腺が位置ずれしてしまい、汗腺の動態を観察することができなかった。【０１５３】
以上説明したように、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬の少なくとも１種の染色試薬によって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記全汗腺を支持体に保持させた観察試料を用いることにより、生きている状態の汗腺の動きが観察できることがわかる。【０１５４】
実施例８
実施例１において、ＰＢＳを用いる代わりにクレブス・リンガー液（組成：１２５ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１．２ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５ｍＭグルコースおよび１０ｍｇ／１００ｍＬ脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４８）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、全汗腺のタイムラプス撮影による観察を行なった。観察開始時から１０分間経過後に、汗腺収縮誘導試薬（刺激薬）であるピロカルピンをその濃度が１０ｍＭとなるように前記全汗腺に添加し、全汗腺のタイムラプス撮影による観察を続けた。【０１５５】
つぎに、画像解析ソフトウェア〔ビットプレーン（ＢＩＴＰＬＡＮＥ）製、商品名：Ｉｍａｒｉｓ〕を用い、図１７に示される測定部位（Ａ）〜（Ｃ）それぞれにおける外径指標値の経時的変化を求めた。外径指標値は、データをＺ方向に積み重ね、サーフェス（Ｓｕｒｆａｃｅ）モードで下記の設定条件で画像解析ソフトウェアを用いることによって算出された値である。【０１５６】
＜測定部位（Ａ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  ６５０．９６３、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  １５３９．６８、および
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｏｘｅｌｓ  ａｂｏｖｅ  ２．３７ｅ４。【０１５７】
＜測定部位（Ｂ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  ５８８．３８９、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  １６２９．６９、および
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｏｘｅｌｓ  ａｂｏｖｅ  ２．８４ｅ４。【０１５８】
＜測定部位（Ｃ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  ３５３．４９４、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  １７２０．１２、および
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｏｘｅｌｓ  ａｂｏｖｅ  ２．６９ｅ４。【０１５９】
なお、図１７において、測定部位（Ａ）は筋細胞に包まれている部分、測定部位（Ｂ）と測定部位（Ｃ）は筋細胞に包まれておらず、汗の通り道となる部分である。また、図１７中、スケールバーは５０μｍを示す。【０１６０】
また、前記データのＺ方向への積み重ねを解除し、Ｚ方向において、１種類のデータを用い、図１８に示される測定部位（Ａ）〜（Ｃ）それぞれにおける内径指標値の経時的変化を求めた。内径指標値は、サーフェス（Ｓｕｒｆａｃｅ）モデルを作成した後、画像解析ソフトウェアに含まれるＭａｓｋツールを用いてサーフェス（Ｓｕｒｆａｃｅ）モデル中の成分を抽出し、下記の設定条件で画像解析ソフトウェアを用いることによって算出された値である。【０１６１】
＜測定部位（Ａ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  １５９．８３９、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  ２８９．４３４、および
Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｏｒｄｅｒ  ＸＹ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ４０．６μｍ  ａｎｄ  ２４５０μｍ。【０１６２】
＜測定部位（Ｂ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  ３０５．０１１、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  ５８５．９８９、および
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｏｘｅｌｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １．００  ａｎｄ  １０９１
Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｏｒｄｅｒ  ＸＹ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ４３．０μｍ  ａｎｄ  ５５．１μｍ。【０１６３】
＜測定部位（Ｃ）の設定条件＞
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  ＝  ３６５．９７７、
Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｖａｌｕｅ  Ｂ  ＝  ５１８．２３５、
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｏｘｅｌｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １．００  ａｎｄ  １０２１、
Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｏｒｄｅｒ  ＸＹ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ５３．６μｍ  ａｎｄ  ７２．８μｍ、および
Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １６６μｍ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ。【０１６４】
なお、図１８に示される測定部位（Ａ）〜（Ｃ）は、図１７に示される測定部位（Ａ）〜（Ｃ）に対応する。図１８中、スケールバーは５０μｍを示す。【０１６５】
実施例８において、図１７の図面代用写真に示される測定部位における外径指標値の経時的変化を図１９に示す。図１９中、（Ａ）は図１７中の（Ａ）の測定部位における外径指標値の経時的変化、（Ｂ）は図１７中の（Ｂ）の測定部位における外径指標値の経時的変化、（Ｃ）は図１７中の（Ｃ）の測定部位における外径指標値の経時的変化を示す。また、実施例８において、図１８の図面代用写真に示される測定部位における内径指標値の経時的変化を図２０に示す。図２０中、（Ａ）は図１８中の（Ａ）の測定部位における内径指標値の経時的変化、（Ｂ）は図１８中の（Ｂ）の測定部位における内径指標値の経時的変化、（Ｃ）は図１８中の（Ｃ）の測定部位における内径指標値の経時的変化を示す。【０１６６】
図１９に示された結果から、測定部位（Ａ）における外径指標値は、刺激薬による刺激後に低下した後、上昇するので、測定部位（Ａ）は、刺激薬による刺激後に収縮した後、膨張することがわかる。また、測定部位（Ｂ）における外径指標値は、刺激薬による刺激後に上昇するので、測定部位（Ｂ）は、刺激薬による刺激後に膨張することがわかる。さらに、測定部位（Ｃ）における外径指標値は、刺激薬による刺激後にほとんど変化しないことがわかる。【０１６７】
図２０に示された結果から、測定部位（Ａ）における内径指標値は、刺激薬による刺激後に大きく低下した後、上昇するので、測定部位（Ａ）は、刺激薬による刺激後に収縮した後、膨張することがわかる。また、測定部位（Ｂ）における外径指標値は、刺激薬による刺激直後にはほとんど変化しないが、しばらく時間が経過した時点で上昇するので、測定部位（Ｂ）は、刺激薬による刺激後から時間が経過した後に膨張することがわかる。さらに、測定部位（Ｃ）における外径指標値は、刺激薬による刺激直後にはほとんど変化しないが、しばらく時間が経過した時点で上昇するので、測定部位（Ｃ）は、刺激薬による刺激後から時間が経過した後に膨張することがわかる。【０１６８】
これらの結果から、汗管は、筋肉に包まれた部分がいったん収縮した後、膨張することにより、汗の通り道に汗を輸送することが示唆される。【０１６９】
なお、クレブス・リンガー液の代わりにＰＢＳまたは細胞外溶液を用いたときの汗腺の収縮および膨張を調べたところ、ＰＢＳまたは細胞外溶液を用いたときの汗腺の収縮および膨張の度合いは、クレブス・リンガー液を用いたときの汗腺の収縮および膨張の度合いと比べて小さいことが示された。【０１７０】
以上説明したように、生きている状態で単離された全汗腺を細胞骨格染色試薬、細胞膜染色試薬および核染色試薬のいずれかによって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって支持体に保持された全汗腺上に緩衝液としてクレブス・リンガー液を添加することにより、汗腺の収縮および膨張の動きを良好に観察できることがわかる。【０１７１】
実施例９
実施例１において、ＰＢＳを用いる代わりにクレブス・リンガー液を用いたこと、全汗腺のタイムラプス撮影による観察前に被験物質としてアトロピンをその濃度が４０μＭになるように全汗腺に添加して当該全汗腺を３０分間インキュベーションしたこと、および観察開始から１０分間経過後にピロカルピンをその濃度が１０ｍＭとなるように全汗腺に添加したことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、全汗腺のタイムラプス撮影による観察を行なった（実験番号１）。つぎに、図２１において、細胞Ｅ、細胞Ｆ、細胞Ｇ、細胞Ｈおよび細胞Ｉを選択し、実施例１と同様の操作を行なうことにより、各細胞の移動距離を調べた。つぎに、各細胞の移動距離を用いて細胞の移動距離の平均値を求めた。なお、図２１中、スケールバーは、５０μｍを示す。【０１７２】
また、実施例１において、ＰＢＳを用いる代わりにクレブス・リンガー液を用いたこと、および観察開始から１０分間経過後にピロカルピンをその濃度が１０ｍＭとなるように全汗腺に添加したことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、全汗腺のタイムラプス撮影による観察を行なった（実験番号２）。つぎに、図２２において、細胞Ｊ、細胞Ｋ、細胞Ｌ、細胞Ｍおよび細胞Ｎを選択し、実施例１と同様の操作を行なうことにより、各細胞の移動距離を調べた。つぎに、各細胞の移動距離を用いて細胞の移動距離の平均値を求めた。なお、図２２中、スケールバーは、５０μｍを示す。【０１７３】
実施例９において、実験番号１の汗腺における細胞の移動距離の経時的変化を図２３、実験番号２の汗腺における細胞の移動距離の経時的変化を図２４に示す。【０１７４】
図２３および２４に示された結果から、アトロピンを接触させた実験番号１の汗腺における細胞の移動距離の経時的変化（図２３）は、アトロピンを接触させていない実験番号２の全汗腺における細胞の移動距離の経時的変化（図２４）と比べて小さいことがわかる。これらの結果から、アトロピンは、制汗作用を有する物質であると判断することができる。したがって、生きている状態で単離された全汗腺を染色試薬によって染色し、前記全汗腺が位置ずれしないように、コラーゲン、アガロース、基底膜マトリックス、ポリ−Ｄ−リジンおよびメンブランからなる群より選ばれた少なくとも１種によって前記全汗腺を支持体に保持させた観察試料を用いることにより、被験物質が制汗作用などの発汗制御作用を有する物質であるかどうかを評価することができることがわかる。
【符号の説明】
【０１７５】
１  汗腺
２  分泌腺
３  汗管
４  皮膚
５  真皮
６  コイル構造
【図１】
2018016501.tif 000005
【図２】
2018016501.tif 000006
【図３】
2018016501.tif 000007
【図４】
2018016501.tif 000008
【図５】
2018016501.tif 000009
【図６】
2018016501.tif 000010
【図７】
2018016501.tif 000011
【図８】
2018016501.tif 000012
【図９】
2018016501.tif 000013
【図１０】
2018016501.tif 000014
【図１１】
2018016501.tif 000015
【図１２】
2018016501.tif 000016
【図１３】
2018016501.tif 000017
【図１４】
2018016501.tif 000018
【図１５】
2018016501.tif 000019
【図１６】
2018016501.tif 000020
【図１７】
2018016501.tif 000021
【図１８】
2018016501.tif 000022
【図１９】
2018016501.tif 000023
【図２０】
2018016501.tif 000024
【図２１】
2018016501.tif 000025
【図２２】
2018016501.tif 000026
【図２３】
2018016501.tif 000027
【図２４】
2018016501.tif 000028
【国際調査報告】
2018016501.tif 000029
2018016501.tif 000030
2018016501.tif 000031
2018016501.tif 000032