(57)【要約】  体液検体由来のmiRNAの品質を評価する新規な方法が開示されている。本発明の方法では、配列番号1〜12に示すmiRNAの少なくともいずれかを基準miRNAとし、体液検体中の当該基準miRNAの存在量と、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体中のmiRNAの存在量とを比較することにより、miRNAの品質を評価する。配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAは、体液検体中の核酸試料の分解に依存して存在量が減少するmiRNAとして本願発明者らにより選択されたmiRNAである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法であって、
体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いて、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量をそれぞれ測定する、測定工程；
体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記比較工程は、１の基準miRNAの存在量測定値の差若しくは比、複数の基準miRNAそれぞれの存在量測定値の差若しくは比、又は複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値の差若しくは比を得る工程である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記判定工程は、前記１若しくは複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記比較工程は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値から標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値を減算して差を求めること、又は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値を標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値で除算して比を求めることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含み、該差又は比が該閾値を超える場合に体液検体由来のmiRNAの品質を良と判定する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
体液検体及び標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値が、それぞれ、複数の基準miRNAの存在量測定値の平均値又は中央値である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程は、体液検体及び標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値を補正することを含み、補正済みの測定値を用いて以後の工程が実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記測定工程は、支持体上に固定化された前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体及び標準体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とをそれぞれ接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体及び標準体液検体中の当該１又は複数の基準miRNAの存在量を測定することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記測定工程は、体液検体中の前記１又は複数の基準miRNAの存在量の測定と同時に、当該体液検体中の標的miRNAの存在量を測定することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定工程は、体液検体中の標的miRNAの存在量測定値を補正することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記測定工程は、支持体上に固定化された、標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体中の標的miRNA及び当該１又は複数の基準miRNAの存在量をそれぞれ測定することを含む、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を実行させるためのプログラム。
【請求項１４】
請求項１３記載のプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１５】
配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップ。
【請求項１６】
標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
miRNA（マイクロRNA）は、ゲノムDNAからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるため、通常、miRNAを検出対象とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは15〜25塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。【０００３】
近年、miRNAは、細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その発現量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。miRNAは、2016年2月現在、ヒトで2500種以上が存在し、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAの発現を血清・血漿中で同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されており、疾患を早期に発見できるバイオマーカー検査への展開が期待されている。【０００４】
一方、RNAは熱や分解酵素、凍結融解などの物理的及び化学的な様々な要素によって分解しやすい物質であり、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う場合は、RNAの分解が発現量の測定に影響を及ぼすことが知られている。疾患のバイオマーカーとして、体液に含まれるmiRNAの発現量を測定する検査においては、不確実性を有する発現量の測定値をもとに検査・診断してしまうと、適切な治療の機会を逃したり、間違った医療を適用することで患者に不要な経済的、体力的負担を強いたりすることになる。したがって、発現量を正確に測定するために、検査標的とするmiRNAが分解していない検体を検査に使用することがきわめて重要である。【０００５】
従来、RNAの分解度を測定する手法としては、一般的に電気泳動が用いられており、例えば、28SリボソームRNA由来のバンドと18SリボソームRNA由来のバンドの濃度比（28S／18S）から測定できる。また、別の手法としては、特許文献１ではRNAセグメントの長さの違いから、RNAの分解度を定量評価する方法が提案されており、ここでは、ヌクレオチドが分解するとセグメント長が短くなるという、長鎖RNAの特徴を利用している。【０００６】
しかしながら、miRNAの発現量を測定するときには、短鎖分画のRNAを利用することが多く、この場合は長鎖RNAが含まれないため、上記のような従来方法は、RNAの分解度を測定するための有効な手法にはなりえない。遺伝子発現解析結果の全遺伝子の相関係数から、使用したRNAの分解度を測定することもできるが、全遺伝子のデータが必要であり、時間と手間がかかる。そこで、長鎖RNA由来の分解断片に着目し、短鎖分画に混入する分解断片を指標として、短鎖分画中のmiRNAの分解度を評価する手法が開発されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１５−５１９０４５号公報
【特許文献２】特開２００８−３５７７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、標的とするRNAの発現量を正確に測定するためには、検体中のRNAの分解度を測定して品質を評価することが重要である。しかし、前述した従来の方法は、リボソームRNAや長鎖RNAを利用する方法であるところ、リボソームRNAや長鎖RNAは、核内や細胞質内に存在するRNAであり、例えば血清、血漿、尿、脊髄液等の体液検体にはほとんど存在しない。そのため、この従来の方法によっては、体液検体に含まれるmiRNAの分解度を正確に測定して品質を評価することはできなかった。【０００９】
本発明の課題は、検体として、従来の方法には適さない体液検体を用いる場合に、その体液検体に含まれるmiRNAの分解度を測定して品質を評価する手法を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明者らは、体液検体に含まれる核酸試料の分解に依存して存在量が変動するmiRNA（以下、「基準miRNA」という。）を基準としてその存在量を測定することで、標的とするmiRNAの品質を評価することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、配列番号1〜12に示すmiRNAの少なくともいずれかを基準miRNAとし、体液検体中の当該基準miRNAの存在量と、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体中のmiRNAの存在量とを比較することにより、miRNAの品質を評価する方法であり、以下の態様を包含する。【００１１】
(１)  体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法であって、
体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いて、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量をそれぞれ測定する、測定工程；
体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を含む、前記方法。
(２)  前記比較工程は、１の基準miRNAの存在量測定値の差若しくは比、複数の基準miRNAそれぞれの存在量測定値の差若しくは比、又は複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値の差若しくは比を得る工程である、(１)記載の方法。
(３)  前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含む、(１)又は(２)記載の方法。
(４)  前記比較工程は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値から標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値を減算して差を求めること、又は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値を標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値で除算して比を求めることを含む、(１)〜(３)のいずれか１項に記載の方法。
(５)  前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含み、該差又は比が該閾値を超える場合に体液検体由来のmiRNAの品質を良と判定する、(４)記載の方法。
(６)  体液検体及び標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値が、それぞれ、複数の基準miRNAの存在量測定値の平均値又は中央値である、(１)〜(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)  前記測定工程は、体液検体及び標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値を補正することを含み、補正済みの測定値を用いて以後の工程が実施される、(１)〜(６)のいずれか１項に記載の方法。
(８)  前記測定工程は、支持体上に固定化された前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体及び標準体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とをそれぞれ接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体及び標準体液検体中の当該１又は複数の基準miRNAの存在量を測定することを含む、(１)〜(７)のいずれか１項に記載の方法。
(９)  前記測定工程は、体液検体中の前記１又は複数の基準miRNAの存在量の測定と同時に、当該体液検体中の標的miRNAの存在量を測定することを含む、(１)〜(８)のいずれか１項に記載の方法。
(１０)  前記測定工程は、体液検体中の標的miRNAの存在量測定値を補正することを含む、(９)記載の方法。
(１１)  前記測定工程は、支持体上に固定化された、標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体中の標的miRNA及び当該１又は複数の基準miRNAの存在量をそれぞれ測定することを含む、(９)又は(１０)記載の方法。
(１２)  前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、(１)〜(１１)のいずれか１項に記載の方法。
(１３)  体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を実行させるためのプログラム。
(１４)  (１３)記載のプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
(１５)  配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップ。
(１６)  標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来の方法では困難であった、体液検体に含まれるmiRNAの品質評価が可能となる。また、本発明によれば、体液検体が、例えばmiRNAを用いた遺伝子発現解析に適する品質を有するかどうかを高精度でかつ簡便に評価することができるので、体液検体中のバイオマーカーの発現量を指標としてより正確な疾患の検査が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、体液検体由来のmiRNAの品質（分解の程度）を評価する方法であって、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数のmiRNAを基準miRNAとし、当該体液検体中の基準miRNAの存在量と、標準体液検体中の基準miRNAの存在量を測定する測定工程；当該測定工程で得られた体液検体中の基準miRNAの測定値又はその代表値と、標準体液検体に含まれる基準miRNAの測定値又はその代表値の差又は比を得る比較工程；当該比較工程で得られた各存在量測定値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質（分解の程度）を判定する判定工程、を含む方法である。
【００１４】
体液検体中の基準miRNAの存在量は、体液検体から抽出したRNAサンプル中の基準miRNA量を測定することにより調べることができる。「体液検体に含まれるmiRNAの品質」、「体液検体中のmiRNAの品質」、「体液検体由来のmiRNAの品質」という語は、体液検体から抽出したRNAサンプル中のmiRNAの品質という語と同義である。
【００１５】
本発明の方法は、遺伝子発現解析、例えばマイクロアレイ等のアレイチップを用いた解析や、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、シークエンス法による解析において、体液検体に含まれるmiRNAの品質を予め評価することにより、これらの解析を行うことの適否を判断することに用いることができる。遺伝子発現解析には、例えば、体液中のmiRNAを標識し、1又は複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブと、基準miRNAを捕捉するためのプローブとが固定された支持体を用いて各miRNAの発現量を測定すること、1又は複数の標的miRNAを増幅するためのプライマーと、基準miRNAを増幅するためのプライマーとを使用して増幅反応を行い、標的miRNAの発現量を測定することなどが含まれ、さらにこれらの結果を利用して遺伝子発現の解析や検査、例えば、病態を把握するために臨床検体を測定する検査を行うことが含まれる。
【００１６】
「miRNA」は、生体内で作られる鎖長15〜25塩基程度の短鎖RNAを意味するノンコーディングRNA（ncRNA）の一種であり、mRNAの発現を調節する機能を有すると考えられている。miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAを標的（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは様々な生物でその存在が確認されている。
【００１７】
本発明を適用できる体液検体は、生体から分離された体液検体であり、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。体液検体が由来する生体の種類は特に限定されず、各種の生物種が包含されるが、典型的には哺乳動物、特にヒトである。
【００１８】
これらの体液中のmiRNAの品質が低下する、すなわちmiRNAが分解する原因としては、温度や熱などの他、体液に対する振動や超音波などの外部力、電場や磁場など含めた各種の直接、間接的の物理的な力などが考えられるが、品質低下の原因はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明においては、これらの検体からRNAを抽出し、このRNAを用いてmiRNAの発現量を測定することができる。RNAの抽出は、公知の方法（例えば、Favaloroらの方法（Favaloro et. al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)）等）や、RNA抽出のための各種の市販のキット（例えば、キアゲン社のmiRNeasy、東レ社の“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample等）を適用することができる。
【００２０】
＜測定工程＞
本発明では、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの体液検体中の存在量、及び、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの標準体液検体中の存在量の測定を行う。また、体液検体中の基準miRNAの存在量の測定と同時に、後述する標的miRNAの存在量や補正用標準核酸の存在量の測定を行ってもよい。
【００２１】
本発明において基準miRNAとして用いる、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAは、体液検体中の核酸試料の分解に依存して存在量が減少するmiRNAとして選択されたmiRNAである。一般に、RNAが分解すると、一部が断片化するため、遺伝子RNAの存在量は減少する。この場合、遺伝子発現解析で検出された全遺伝子において、分解したRNAと分解していないRNAとの相関は低下し、例えば相関係数は0.95以下になる。本発明で用いる基準miRNAは、このようなRNAの分解と相関して存在量が変動（減少）するmiRNAである。例えば、後に示す補正処理によって得られる発現量において、RNA分解前とRNA分解後との発現量比が、好ましくは0.8以下、より好ましくは0.7以下になるようなmiRNAが好ましい。
【００２２】
体液検体として血清（血液）を用いる場合、本発明で用いる基準miRNAとしては、血清状態での保存時間に依存して存在量がより大きく減少するmiRNAを好ましく選択することができる。保存時間に依存して存在量が減少するmiRNAは、例えば、採血後に調製した血清検体を冷蔵庫（例えば、4℃）で保存し、保存開始0時間後、6時間後、12時間後、24時間後、さらに以降1日おきに7日後のmiRNAの存在量を測定し、その減少の程度を比較することで、選択することができる。血清検体を冷蔵庫で保存する期間がより長期に及ぶ場合には、その期間にあわせて、例えば2週後や1ヶ月後まで保存時間を延長して、miRNAの存在量を測定して比較すればよい。こうして保存時間の異なる血清から得られたmiRNAの存在量は、統計的手法を適用して、遺伝子発現解析の群間比較により、時間経過による存在量の減少が統計学的に有意であるmiRNAを選抜することができる。例えば、一般に利用されるt検定などに基づく統計解析法を利用すればよい。例えば、統計言語「R」のパッケージ「SAM」（Tusher VG et. al., Proc Natl Acad Sic USA. 2001 98（9）5116−5121）をそのまま適用することもできる。
【００２３】
本発明の測定工程では、本願発明者らが選定した特定の１２種類のmiRNA、好ましくは配列番号１〜１２で示される塩基配列からなる１２種類のmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量を測定する。標準体液検体とは、核酸試料の分解が進行していない検体であり、体液検体と比較して、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否の判定の基準とする検体である。標準体液検体としては、例えば、対象の体液検体を入手又は調製した直後のもので、それに含まれる核酸試料の分解が進行していない状態の同一検体を用いることもできる。または、調製直後の対象体液検体と同一の検体の入手ができない場合には、同一生物種の別個体の同種の体液から調製されたものを用いることもできる。または、標準品として市販されている同一生物種の体液検体を入手して用いてもよい。体液検体が血清（血液）である場合には、血清検体を調製した直後の検体（保存時間0時間経過後の検体）を標準体液検体として用いることができる。調製直後の血清検体が入手できない場合は、同じ生物種の別個体から調製された直後（保存時間0時間経過後）の血清検体を用いてもよいし、市販されている血清を用いてもよい。
【００２４】
以下、基準miRNAや、後述する標的miRNA、補正用標準核酸等の核酸を捕捉するためのプローブを、総じて「捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいう。
【００２５】
miRNAの存在量の測定は、例えば、対象のmiRNAに特異的に結合するプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ等のアレイチップを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより行なうことができる。本発明においては、1又は複数の基準miRNAを捕捉するための「基準miRNA捕捉プローブ」が固定化された支持体を含むアレイチップを用いることができる。また、後述する標的miRNAを捕捉するための「標的miRNA捕捉プローブ」、補正用標準核酸を捕捉するための「補正用標準核酸捕捉プローブ」がさらに固定化された支持体を含むアレイチップを用いてもよい。
【００２６】
「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のmiRNAと直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸は、DNAやRNAのほか、PNA（ペプチド核酸）やLNA（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２７】
核酸プローブの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性と特異性を確保する観点から、検出対象とするmiRNAの長さ以上とすることが好ましい。通常、17〜25塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするmiRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
【００２８】
核酸プローブは、対象のmiRNAと完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象のmiRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
【００２９】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体RNAの検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
【００３０】
miRNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースやmiRBaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/）から入手することができる。基準miRNA捕捉プローブ、標的miRNA捕捉プローブ及び補正用標準核酸捕捉プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
【００３１】
支持体上に固定化されるmiRNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、miRNAの存在量を測定してもよいし、検査目的等に応じて所望の数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよい。
【００３２】
捕捉プローブが整列固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えば、スライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
【００３３】
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
【００３４】
前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第5705610号明細書）、Michelらの方法（米国特許第6142266号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第7037659号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
【００３５】
後者の方法としては、廣田らの方法（特許第3922454号）やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてUV照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やSH基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
【００３６】
支持体上に固定化された各miRNA捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、検体から抽出したRNAから、標識物質で標識された核酸試料（検体由来の核酸試料）を調製し、この標識核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。「検体由来の核酸試料」には、検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。標識された検体由来の核酸試料は、検体RNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよいし、また、検体RNAから調製されたcDNAやcRNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよい。
【００３７】
検体由来の核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の3’末端に標識物質を結合させる方法、5’末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。3’末端に標識物質を結合させる方法、5’末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、3’末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。
【００３８】
このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体RNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。
【００３９】
本発明において、使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン2）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン3）、シアニン3．5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン5）、シアニン5．5、シアニン7、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
【００４１】
上記のようにして標識された検体由来の核酸試料を支持体上のmiRNA捕捉プローブと接触させ、核酸試料とプローブをハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、30℃〜70℃程度で1分間〜十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
【００４２】
検出された蛍光強度の測定値は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られた測定値と、それ以外の位置から得られた測定値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
【００４３】
検出された測定値に、バックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出した測定値から減算することもできる。その他、「藤淵航、堀本勝久編、マイクロアレイデータ統計解析プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を用いてもよい。
【００４４】
＜補正処理＞
本発明において、測定工程で得られた標的miRNA及び基準miRNAの存在量の測定値をそのまま後述する比較工程、判定工程で用いてもよいが、例えば、体液検体中の標的miRNAの発現解析を行う場合には、標的miRNAの測定値及び基準miRNAの測定値の補正を行ない、補正後の測定値を発現量とし、この発現量を用いて比較工程及び判定工程を実施してよい。つまり、測定工程は、標的miRNA及び基準miRNAの測定値を補正する処理を含んでいてもよい。
【００４５】
補正方法としては、従来法を用いることができ、例えば、検出された全miRNAの測定値を用いて補正を行うグローバルノーマリゼーション法、クォンタイルノーマリゼーション法などが挙げられる。また、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAといったハウスキーピングRNA（特開2007-75095号公報; 特開2007-97429号公報など参照）や、特定の補正用内因性miRNA（Roberts, T.C.ら、2014年、PLoS ONE、第9(2)巻、e89237; Chen, X.ら、2013年、PLoS ONE、第8(11)巻、e79652; WO 2016/043170など参照）を用いて補正してもよいし、RNAの抽出時や標識時に添加した外部標準核酸を用いて補正してもよい。「内因性」とは、人工的に検体に添加されたものではなく、検体に自然に存在することを意味する。例えば「内因性miRNA」と言った場合、検体中に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAを示す。体液検体中の標的miRNAの発現解析において本発明の方法を適用しmiRNAの品質評価を行なう場合は、検体に依存されないスパイクコントロールなどの外部標準核酸を利用した補正方法を用いることが好ましい。
【００４６】
＜比較工程＞
本発明の比較工程は、前記測定工程で得られた体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、両検体中の各基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る工程である。ここで、基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比は、典型的には、次の式で求められる差又は比をいう。
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差
＝(体液検体中の存在量測定値又は代表値)−(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式I)
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の比
＝(体液検体中の存在量測定値又は代表値)／(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式II)
【００４７】
もっとも、式I、式IIに代えて、計算の順序を逆にした以下の式I'、式II'にて差又は比を計算しても差し支えない。
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差
＝(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)−(体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式I')
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の比
＝(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)／(体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式II')
【００４８】
基準miRNAの存在量測定値又は代表値の差又は比は、差又は比を算出した後に対数値に変換してもよいし、先に検体中存在量を対数変換してから差又は比を算出してもよい。本発明において、対数値とは、底が２の対数に変換された値を意味する。
【００４９】
判定工程の説明で後述するように、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち、1つのmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値の差又は比を求めて判定に用いればよい。また、複数のmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と標準体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、その両代表値の差又は比を求めて判定に使用することができる。代表値としては、後述する通り、平均値又は中央値を用いることができる。あるいは、個々の基準miRNAごとに体液検体中の存在量測定値と標準体液検体中の存在量測定値との差又は比を求め、次の判定工程において、基準miRNAごとに所定基準に従って判定を行い、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定することができる。
【００５０】
＜判定工程＞
本発明の判定工程は、比較工程で得られた体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と、前記標準体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値との差又は比に基づいて、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定する工程である。miRNAの品質の良否の判定は、体液検体と標準体液検体に含まれる1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比について、品質の良否を判定するための基準とする閾値を予め設定し、その閾値を超えるか否かによって品質の良否（良又は不良）を判定することができる。すなわち、上記式I又は式IIで得られる基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比が、予め任意に定めた閾値を超える場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質が良であると判定し、当該基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比が閾値以下である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良であると判定することができる。あるいは、上記式I'又は式II'で得られる差又は比を用いる場合には、当該差又は比が予め任意に定めた基準とする閾値を下回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質が良であると判定し、当該差又は比が該閾値以上である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良であると判定することができる。
【００５１】
判定工程においては、上述した通り、比較工程で得られた各基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を対数に変換し、その対数値を用いて判定を行ってもよい。
【００５２】
配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち、1つのmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、比較工程において、体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値の差又は比を求め、この差又は比の値が基準とする閾値を超えるか否か（式I, IIの場合）、又は下回るか否か（式I', II'の場合）によって品質の良否を判定することができる。
【００５３】
基準miRNAとして、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち複数の基準miRNAを用いる場合には、体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と標準体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、これら代表値の差又は比が基準とする閾値を超えるか否か（式I, IIの場合）、又は下回るか否か（式I', II'の場合）によって品質の良否を判定することができる。ここで、代表値としては、複数の基準miRNAの存在量の平均値又は中央値を用いることができる。
【００５４】
また、基準miRNAとして、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち複数の基準miRNAを用いる場合には、個々の基準miRNAごとに体液検体に含まれる存在量測定値と標準体液検体に含まれる存在量測定値との差又は比を求め、基準miRNAごとに基準とする閾値を超えるか否か／下回るか否かを判定してもよい。この場合には、複数の基準miRNAによる個々の判定に優先順位付けや重み付けをすること等により、さらなる判断基準を設けることが好ましい。1つの基準miRNAを用いる場合には、配列番号1〜12に示すmiRNAから1つのmiRNAを任意に選択すればよいが、保存時間に依存して存在量が顕著に減少するものを選択することが好ましく、例えば、hsa-miR-125a-3p（配列番号1）、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）のいずれかを選択することが好ましい。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、複数の基準miRNAを用いることが好ましい。例えば、2〜5個の基準miRNAを用いることがより好ましく、特に、hsa-miR-125a-3p及びhsa-miR-125b-1-3pの2つを選択することが好ましい。もっとも、下記実施例に記載する通り、hsa-miR-125a-3p及びhsa-miR-125b-1-3pのいずれか一方のみを複数の基準miRNAのうちの１つとして採用した場合でも、十分に精度よく品質の良否を判定することができる。また、例えば遺伝子発現解析を目的とする場合であって、発現解析対象である標的miRNAが配列番号1〜12に示すmiRNAのいずれかに該当する場合は、当該標的miRNAを除くmiRNAから基準miRNAを選択すればよい。
【００５５】
判定の基準とする閾値は、評価の目的や求める精度などに応じて任意に設定することができる。例えば、標準体液検体に含まれる基準miRNAの存在量測定値を閾値に設定することができる。
【００５６】
以下、式I又は式IIに従って基準miRNAの存在量測定値又は代表値の差又は比を計算する場合の判定工程について、より具体的に説明する。式I'又は式II'に従う場合は、下記に準じて適当な閾値を採用し、その閾値を下回る場合にmiRNAの品質を良と判定すればよい。
【００５７】
1つの基準miRNAを用いる場合には、例えば、以下の式1A〜9Aないしは式1B〜9Bに示す判断基準に従って、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値とを比較し、品質の良否を判定することができる。
【００５８】
式1Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eの比（e／E）を求め、この値が閾値t1を上回る場合に当該体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。閾値t1は、好ましくは0.7以上であり、より好ましくは0.8以上である。
e／E＞t1    （式1A）
【００５９】
また、式2Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eの差（e−E）を求め、この値が閾値t2を上回る場合に体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。miRNAの種類によってその存在量は異なることがあるので、閾値t2は判定に用いる基準miRNAに応じて任意に設定することができる。例えば、閾値t2は、-50以上0以下の範囲で設定することができ、より厳しい基準で判定する場合には、-20以上0以下の範囲で設定することができる。例えば、閾値t2を0とし、存在量測定値の差（e−E）が0より大きい（プラス）である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
e−E＞t2    （式2A）
【００６０】
また、閾値t3として標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eを採用してもよく、その場合は、式3Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eが閾値t3、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eを上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式2Aにおいて閾値t2を0とする場合に相当する。従って、式3Aは式2Aの一態様に該当する。すなわち、式3Aは存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
e＞E（＝t3）    （式3A）
【００６１】
体液検体中のmiRNAの分解のほか、実験操作上、測定結果へ影響を与える要因を考慮する場合には、RNAの分解に依存しない安定に存在するmiRNAである内因性miRNA（以下、「非分解内因性miRNA」という。）を利用して判定をしてもよい。非分解内因性miRNAは、体液検体中に、その種類に依存せず一定量が含まれているmiRNAであり、好ましくはRNA分解前（検体を入手又は調製した直後のもの等で、それに含まれる核酸試料の分解が進行していないような時点）とRNA分解後（検体の入手又は調製後、一定時間が経過しており、それに含まれる核酸試料の分解が進行していると予想される時点）との存在量測定値の比が0．90以上、より好ましくは0．95以上であるようなmiRNAを選定することができる。例えば、配列番号25で示される塩基配列からなるhsa-miR-149-3pや、配列番号26で示される塩基配列からなるhsa-miR-4463等を非分解内因性miRNAとして用いることができる。体液検体中の標的miRNAの発現解析を行う場合には、前記の補正処理で用いる「補正用内因性miRNA」を「非分解内因性miRNA」として共通に使用することができる。
【００６２】
非分解内因性miRNAを利用して体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定する場合には、例えば、式4Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を求め、これら2つの各存在量比の比が閾値t4を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
あるいは、式5Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e−c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E−C）を求め、これら2つの各存在量差の比が閾値t5を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。この場合の閾値t4及びt5は、好ましくは0.7であり、より好ましくは0.8である。
式4A、式5Aは、存在量測定値の比に基づく判定に該当する。
（e／c）／（E／C）＞t4    （式4A）
（e−c）／（E−C）＞t5    （式5A）
【００６３】
また、式6Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を求め、これら2つの各存在量比の差が閾値t6を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
あるいは、式7Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e−c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E−C）を求め、これら2つの各存在量差の差が閾値t7を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。閾値t6及びt7は、例えば-50以上0以下の範囲で設定することができ、例えば0であり得る。
式6A、式7Aは、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
（e／c）−（E／C）＞t6    （式6A）
（e−c）−（E−C）＞t7    （式7A）
【００６４】
また、閾値t8として、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を採用してもよく、その場合は、式8Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）が閾値t8、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式6Aを採用する場合において、閾値t6を0とする場合に相当する。従って、式8Aは式6Aの一態様であり、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
あるいは、閾値t9として、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E−C）を採用してもよく、その場合は、式9Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e−c）が閾値t9、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E−C）を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式7Aを採用する場合において、閾値t7を0とする場合に相当する。従って、式9Aは式7Aの一態様であり、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
e／c＞E／C（＝t8）    （式8A）
e−c＞E−C（＝t9）    （式9A）
【００６５】
複数のmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と、標準体液検体中の当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、その両代表値の差又は比を求めて判定に使用することができる。具体的には、上記式1A〜式9Aに示す判断基準において、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eに代えて体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値rを、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eに代えて標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値Rを、それぞれ用いればよい。つまり、下記の式1B〜式9Bのいずれかを用いて判定すればよい。代表値としては、各測定値の平均値又は中央値を使用することができる。
r／R＞t1    （式1B）
r−R＞t2    （式2B）
r＞R（＝t3）    （式3B）
（r／c）／（R／C）＞t4    （式4B）
（r−c）／（R−C）＞t5    （式5B）
（r／c）−（R／C）＞t6    （式6B）
（r−c）−（R−C）＞t7    （式7B）
r／c＞R／C（＝t8）    （式8B）
r−c＞R−C（＝t9）    （式9B）。
【００６６】
ここで、上記の式1A〜式9A、式1B〜式9Bにおいて、実験の誤差等を考慮して、閾値t1〜t9に一定の誤差αの幅を持たせて、それぞれ「t1±α」〜「t9±α」としてもよい。この場合の誤差αは任意に設定すればよいが、例えば、式2Aにおいては、Eの10％程度をαとして設定して閾値t2に幅を持たせることができる。
【００６７】
また、各閾値として、存在量の測定値を対数に変換したものを用いてもよい。この場合、その変換にあわせて適切な閾値を設定すればよい。例えば、式1Aを適用する場合に、基準miRNAの存在量比（e／E）を対数値に変換し、その変換にあわせて閾値t1を設定すればよい。この場合、結果的に、存在量測定値e、Eの各対数値の差を求めることになる。
【００６８】
また、個々の基準miRNAごとに体液検体中の存在量測定値と標準体液検体中の存在量測定値との差又は比を求め、基準miRNAごとに判定基準に従って判定を行い、その結果を総合して体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定することができる。
【００６９】
具体的には、例えば、基準miRNAごとの判定において、良と判定された基準miRNAの数が、不良と判定された基準miRNAの数又は任意の所定数を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。逆に、不良と判定された基準miRNAの数が、良と判定された基準miRNAの数又は所定数を上回る場合に、検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定することができる。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、良判定を与えた基準miRNAの数よりも特定の1種の基準miRNAによる不良判定を優先してもよい。すなわち、その特定の1種の基準miRNAの判定結果が不良の場合には、良判定の基準miRNAの数にかかわらず、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定してもよい。そのような特定の1種の基準miRNAとしては、hsa-miR-125a-3p（配列番号1）及びhsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）のいずれかを好ましく採用できる。
【００７０】
また、本発明は、上記本発明のmiRNA品質評価方法に従い、体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を実行させるための（すなわち、1又は複数のコンピュータに上記各工程を実行させる命令を含む）プログラム、及び該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
【００７１】
例えば、miRNAの発現量を解析する装置に該プログラムが組み込まれ、測定値取得工程において、該装置の発現測定部又は該装置とは別個の発現測定装置が測定した基準miRNA発現量（すなわち検体中の基準miRNA存在量）の測定値を取得し、該測定値を用いて各工程が実施されてよい。取得する測定値は、補正済みの測定値であってもよい。また、該プログラムが、取得した測定値を補正する処理をコンピュータに実行させる命令を含んでいてもよい。各工程の詳細は、本発明のmiRNA品質評価方法に関して上記に説明した通りである。
【００７２】
「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、OS（Operating System）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【００７３】
「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO、DVD等の任意の「可搬用の物理媒体」（非一過性の記録媒体）であり得る。あるいは、LAN、WAN、インターネットに代表される、ネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」であり得る。
【００７４】
本発明はまた、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップを提供する。また、本発明は、標的miRNAを捕捉するためのプローブと、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップを提供する。ここで、標的miRNA、配列番号1〜12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNA、これらを捕捉するためのプローブ、また、これらの捕捉プローブが固定化される支持体は、前記のとおりである。
【００７５】
本発明のmiRNA発現解析用チップは、前記の補正処理で用いるハウスキーピングRNA、特定の補正用内因性miRNA、添加する外部標準核酸等の補正用核酸、特に補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが、さらに支持体に固定化されていてもよい。
【００７６】
本発明においては、miR-125a-3p、miR-125b-1-3p、miR-3184-5p、miR-4443、miR-4638-5p、miR-4746-3p、miR-5572、miR-575、miR-6798-5p、miR-7110-5p、miR-887-3p、及びmiR-939-5pから選択される1又は複数のmiRNA、好ましくは配列番号１〜１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数のmiRNAを、体液検体由来RNAの分解度を測定するための基準miRNAとして使用する。体液検体がヒトの体液検体である場合、配列番号１〜１２に示す塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数のmiRNAを基準miRNAとして使用すればよい。
【００７７】
「miR-125a-3p遺伝子」又は「miR-125a-3p」という用語は、ヒトのmiR-125a-3p（すなわちhsa-miR-125a-3p、miRBase Accession No. MIMAT0004602）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１に示すRNA配列はhsa-miR-125a-3pの配列である。hsa-miR-125a-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Curr Biol、12巻、p735-739に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-125a-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-125a」も包含され、例えば「hsa-miR-125a-3p」という語にはhsa-mir-125a（miRBase Accession No. MI0000469、配列番号13）も包含される。
【００７８】
「miR-125b-1-3p遺伝子」又は「miR-125b-1-3p」という用語は、ヒトのmiR-125b-1-3p（すなわちhsa-miR-125b-1-3p、miRBase Accession No. MIMAT0004592）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号２に示すRNA配列はhsa-miR-125b-1-3pの配列である。hsa-miR-125b-1-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Curr Biol、12巻、p735-739に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-125b-1-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-125b-1」も包含され、例えば「hsa-miR-125b-1-3p」という語にはhsa-mir-125b-1（miRBase Accession No. MI0000446、配列番号14）も包含される。
【００７９】
「miR-3184-5p遺伝子」又は「miR-3184-5p」という用語は、ヒトのmiR-3184-5p（すなわちhsa-miR-3184-5p、miRBase Accession No. MIMAT0015064）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号３に示すRNA配列はhsa-miR-3184-5pの配列である。hsa-miR-3184-5p遺伝子は、Stark MSら、2010年、PLoS One、5巻、e9685に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-3184-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-3184」も包含され、例えば「hsa-miR-3184-5p」という語にはhsa-mir-3184（miRBase Accession No. MI0014226、配列番号15）も包含される。
【００８０】
「miR-4443遺伝子」又は「miR-4443」という用語は、ヒトのmiR-4443（すなわちhsa-miR-4443、miRBase Accession No. MIMAT0018961）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号４に示すRNA配列はhsa-miR-4443の配列である。hsa-miR-4443遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p118-127に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4443」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4443」も包含され、例えば「hsa-miR-4443」という語にはhsa-mir-4443（miRBase Accession No. MI0016786、配列番号16）も包含される。
【００８１】
「miR-4638-5p遺伝子」又は「miR-4638-5p」という用語は、ヒトのmiR-4638-5p（すなわちhsa-miR-4638-5p、miRBase Accession No. MIMAT0019695）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号５に示すRNA配列はhsa-miR-4638-5pの配列である。hsa-miR-4638-5p遺伝子は、Persson Hら、2011年、Cancer Res、71巻、p78-86に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4638-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4638」も包含され、例えば「hsa-miR-4638-5p」という語にはhsa-miR-4638（miRBase Accession No. MI0017265、配列番号17）も包含される。
【００８２】
「miR-4746-3p遺伝子」又は「miR-4746-3p」という用語は、ヒトのmiR-4746-3p（すなわちhsa-miR-4746-3p、miRBase Accession No. MIMAT0019881）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号６に示すRNA配列はhsa-miR-4746-3pの配列である。hsa-miR-4746-3p遺伝子は、Persson Hら、2011年、Cancer Res、71巻、p78-86に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4746-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4746」も包含され、例えば「hsa-miR-4746-3p」という語にはhsa-mir-4746（miRBase Accession No. MI0017385、配列番号18）も包含される。
【００８３】
「miR-5572遺伝子」又は「miR-5572」という用語は、ヒトのmiR-5572（すなわちhsa-miR-5572、miRBase Accession No. MIMAT0022260）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号７に示すRNA配列はhsa-miR-5572の配列である。hsa-miR-5572遺伝子は、Tandon Mら、2012年、Oral Dis、18巻、p127-131に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-5572」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-5572」も包含され、例えば「hsa-miR-5572」という語にはhsa-mir-5572（miRBase Accession No. MI0019117、配列番号19）も包含される。
【００８４】
「miR-575遺伝子」又は「miR-575」という用語は、ヒトのmiR-575（すなわちhsa-miR-575、miRBase Accession No. MIMAT0003240）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号８に示すRNA配列はhsa-miR-575の配列である。hsa-miR-575遺伝子は、Cummins JMら、2006年、Proc Natl Acad Sci USA、103巻、p3687-3692に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-575」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-575」も包含され、例えば「hsa-miR-575」という語にはhsa-mir-575（miRBase Accession No. MI0003582、配列番号20）も包含される。
【００８５】
「miR-6798-5p遺伝子」又は「miR-6798-5p」という用語は、ヒトのmiR-6798-5p（すなわちhsa-miR-6798-5p、miRBase Accession No. MIMAT0027496）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号９に示すRNA配列はhsa-miR-6798-5pの配列である。hsa-miR-6798-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Res、22巻、p1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-6798-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-6798」も包含され、例えば「hsa-miR-6798-5p」という語にはhsa-mir-6798（miRBase Accession No. MI0022643、配列番号21）も包含される。
【００８６】
「miR-7110-5p遺伝子」又は「miR-7110-5p」という用語は、ヒトのmiR-7110-5p（すなわちhsa-miR-7110-5p、miRBase Accession No. MIMAT0028117）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１０に示すRNA配列はhsa-miR-7110-5pの配列である。hsa-miR-7110-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Res、22巻、p1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-7110-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-7110」も包含され、例えば「hsa-miR-7110-5p」という語にはhsa-mir-7110（miRBase Accession No. MI0022961、配列番号22）も包含される。
【００８７】
「miR-887-3p遺伝子」又は「miR-887-3p」という用語は、ヒトのmiR-887-3（すなわちhsa-miR-887-3p、miRBase Accession No .MIMAT0004951）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１１に示すRNA配列はhsa-miR-887-3pの配列である。hsa-miR-887-3p遺伝子は、Berezikov Eら、2006年、Genome Res、16巻、p1289-1298に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-887-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-887」も包含され、例えば「hsa-miR-887-3p」という語にはhsa-mir-887（miRBase Accession No. MI0005562、配列番号23）も包含される。
【００８８】
「miR-939-5p遺伝子」又は「miR-939-5p」という用語は、ヒトのmiR-939-5p（すなわちhsa-miR-939-5p、miRBase Accession No. MIMAT0004982）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１２に示すRNA配列はhsa-miR-939-5pの配列である。hsa-miR-939-5p遺伝子は、Lui WOら、2007年、Cancer Res、67巻、p6031-6043に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-939-5p」という語には、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「mir-939」も包含され、例えば「hsa-miR-939-5p」という語にはhsa-mir-939（miRBase Accession No. MI0005761、配列番号24）も包含される。
【実施例】
【００８９】
以下、RNAの分解に依存する基準miRNAを選択した過程を含め、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００９０】
＜実施例1＞  基準miRNAの選択
（DNAマイクロアレイ）
東レ株式会社製の“3D-Gene” human miRNA oligo chip（miRBase release 21対応）を用いて以下の実験を行なった。【００９１】
（血清検体の調製）
健常ヒト3名よりそれぞれ採血し、血清を調製した。得られた血清を300μLずつ1名につき6本に分注し、うち5本を4℃に設定した冷蔵庫に静置した。1名につき1本はただちに−80℃に設定した冷凍庫に収容した（0時間）。冷蔵庫に静置した血清検体について、6時間、24時間、48時間、72時間および168時間後にそれぞれ回収して、−80℃に設定した冷凍庫に収容した。−80℃の冷凍庫に収容した検体は、下記に述べるRNA抽出作業まで、そのまま静置した。【００９２】
（検体RNAの調製とmiRNA発現量の測定）
上記のように調製され、冷凍庫に静置された血清を同時に溶解し、血清検体に含まれるRNA（以下、検体RNAという。）を抽出した。抽出には、“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ社）を用いた。【００９３】
得られた検体RNAを、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識時には、miRNAの測定値を発現量に補正するために、外部標準核酸を添加した。標識した検体RNAについて、“3D-Gene” miRNA chip（東レ社）を用い、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイをマイクロアレイスキャナー（東レ社）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。【００９４】
DNAマイクロアレイで検出された各miRNAの測定値を、底が2の対数に変換し、標識時に添加した外部標準核酸による補正を行い、各miRNAの発現量を取得した。【００９５】
以上のようにして、DNAマイクロアレイでの検出後0、6、24、48、72、168時間、4℃で静置された血清について、各静置時間経過時における各miRNAの発現量を3回測定し、その平均値を得た。【００９６】
（基準miRNAの選択）
上記のようにして得られた各血清検体のmiRNA発現量を比較し、静置時間に依存して発現量（検体中存在量）が変動する程度の大きいmiRNAを抽出することで、基準miRNAの選択を行った。【００９７】
まず、静置0時間経過時の各miRNAの発現量を基準とし、静置6、24、48、72、168時間経過時の各miRNAの発現量との比（（6、24、48、72又は168時間経過時の発現量）／0時間の発現量）を得た。【００９８】
次に、検出されたmiRNAのうち、高発現領域で安定して検出されるmiRNAに絞り込みをした。【００９９】
絞り込んだmiRNAのなかから、静置時間の経過に依存して発現量が変動する程度が大きいmiRNAを選択するため、統計言語「R」のパッケージ「SAM」（Tusher VG et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2001，98（9），5116−5121）を用いて、SAMの統計量が−1以下であるmiRNAを抽出した。抽出された上位12種のmiRNAとその発現量比を表１に示す。【０１００】
表１に示すmiRNA（配列番号1〜12）は、4℃という、血清中のmiRNAが比較的不安定な状態で保存される条件において、継時的に発現量が低下し、その程度が大きかった。また、冷蔵庫での静置時間が0時間時の血清検体と168時間経過時の血清検体で検出された全miRNAの発現量において、その両血清検体間の相関係数は0.95以下であったことから、168時間経過時点で血清検体中のRNAの分解が進行していることが確認された。このことから、表１に示すmiRNAは、血清検体に含まれるRNAの分解に依存して、経時的にその発現量（検体中存在量）が変動するmiRNA指標として利用できることが確認された。すなわち、表１に示すmiRNAは、その発現量を測定することによって、血清検体のmiRNAの品質（分解の程度）を知ることが可能であることが分かった。特にhsa-miR-125a-3p（配列番号1）およびhsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）は、早期（48時間経過時）から鋭敏な変動を示しており、より高精度な品質の評価に適していることが分かった。【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
実施例1の結果より、以下の実施例2〜6では、基準miRNAの発現量比の閾値を0.8と設定し、これを上回る場合に、その検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。【０１０３】
＜実施例2＞
健常ヒト1名より採血し、血清検体を調製した。得られた血清を300μL分注し、ただちに-80℃に設定した冷凍庫に収容した。RNAの抽出には、“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ社）を用いた。【０１０４】
得られた検体RNAを、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識し、標識時には、miRNAの測定値を発現量に補正するために、外部標準核酸を添加した。標識した検体由来RNAは、“3D-Gene” miRNA chip（東レ社）を用い、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイをマイクロアレイスキャナー（東レ社）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。検出されたmiRNAのシグナル値を、外部標準核酸のシグナル値により補正して、発現量を得た。【０１０５】
品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）を選択した。また、市販されている血清検体を、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体として使用し、上記と同様にして、その標準体液検体に含まれるhsa-miR-125b-1-3pの発現量を得た。【０１０６】
血清検体由来のhsa-miR-125b-1-3pの発現量を、標準体液検体由来のhsa-miR-125b-1-3pの発現量で割り返して、両者の発現量比を求めた。発現量比は0.99であり、閾値0.8を上回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。【０１０７】
一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。【０１０８】
＜実施例3＞
品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）の代わりに、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9）の2種を用いることに変更し、これ以外は実施例2と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。【０１０９】
両検体の発現量の比較は、2種のmiRNAの発現量の平均値を代表値として行った。血清検体の代表値を標準体液検体の代表値で割り、発現量比を求めた。その結果、発現量比は0.98であり、閾値0.8を上回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。【０１１０】
一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。【０１１１】
＜実施例4＞
血清検体を、血清を調製後、4℃で静置168時間経過後のものに変更し、これ以外は実施例3と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来の2種のmiRNA（hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9））の発現量を測定した。2種のmiRNAの発現量の平均値を代表値とし、代表値から発現量比を求めた。【０１１２】
その結果、発現量比は0.34であり、閾値0.8を下回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定した。【０１１３】
一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.93と低い値であり、miRNAの分解が生じ、品質が悪化していたことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。【０１１４】
＜実施例5＞
血清検体を、血清を調製後、4℃で静置72時間経過後のものに変更し、これ以外は実施例3と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来の2種のmiRNA（hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9））の発現量を測定した。hsa-miR-125b-1-3pの発現量比とhsa-miR-6798-5pの発現量比をそれぞれ求め、発現量の比較を行なった。【０１１５】
その結果、hsa-miR-6798-5pの発現量比は0.95であり、閾値0.8を上回ったが、hsa-miR-125b-1-3pの発現量比は0.73であり、閾値0.8を下回った。2種の基準miRNAのうち1種が閾値を下回ったため、検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定した。【０１１６】
一方、検出された全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.94とやや低い値であり、miRNAの分解が生じ、品質がやや悪化していたことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。【０１１７】
＜比較例1＞
本発明のmiRNAの品質の評価方法を、従来の品質評価方法である電気泳動による方法と比較するため、上記実施例4、5で使用した血清検体を用いて電気泳動による品質の評価を実施した。【０１１８】
その結果、上記静置72時間経過時、静置168時間経過時の血清検体から抽出されたRNAは、核酸試料の分解が進行していない標準体液検体である市販の血清検体から抽出されたRNAと比べて、電気泳動の結果では品質（分解の程度）の差が確認できなかった。【０１１９】
＜比較例2＞
品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）の代わりに、hsa-miR-149-3p（配列番号25）を用いることに変更し、また、血清検体を、血清調製後に4℃で静置168時間経過後のものに変更し、これら以外は実施例2と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。ここで、基準miRNAとして用いたhsa-miR-149-3pは、上記実施例1において、静置時間の経過によっても発現量が変動（低下）せず最も安定していたmiRNAの1つである。【０１２０】
その結果、発現量比は0.98であり、閾値0.8を上回った。本発明の方法と同様の基準で評価した場合には、検体に含まれるmiRNAの品質は良と判定された。しかしながら、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.94であったことから、実際にはmiRNAの分解が生じ、品質は悪化していたことが示された。すなわち、本発明で用いることのできる基準miRNAには該当しないhsa-miR-149-3pを用いた場合には、正しく品質の判定ができなかった。【０１２１】
＜実施例6＞
実施例2と同様にして、品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）を用いることに加えて、RNAの分解に依存しない非分解内因性miRNAであるhsa-miR-4463（配列番号26）も利用して、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。血清検体と標準体液検体のそれぞれについて、hsa-miR-125b-1-3pの発現量をhsa-miR-4463の発現量で割り返した発現量比を求めた後、血清検体由来の発現量比を標準体液検体由来の発現量比で割り返して発現量比の比を求め、閾値と比較した。【０１２２】
その結果、hsa-miR-125b-1-3pの発現量をhsa-miR-4463の発現量で割り返した発現量比は、血清検体由来では0.97であり、標準体液検体由来では0.98であった。これら発現量比の比は0.99であり、閾値0.8を上回ったため、検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。【０１２３】
一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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