(57)【要約】【課題】真に接合菌の測定を行うことが可能な手段を提供すること。【解決手段】試料を酸処理することにより、今まで実現されなかった接合菌の測定が可能になることを見出し、本発明では、接合菌の測定を酸処理した試料を測定対象として行う、接合菌の測定方法を提供する。本発明ではさらに、接合菌測定用試料の調製剤、接合菌測定用試料の調製方法、及び、接合菌の測定を行うための試薬キットを提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定する、接合菌の測定方法。
【請求項２】
酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、請求項１に記載の接合菌の測定方法。
【請求項３】
接合菌の測定が、接合菌成分の検出試薬を用いた接合菌の測定である、請求項１又は２に記載の接合菌の測定方法。
【請求項４】
接合菌の測定が、免疫測定法による接合菌の測定である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の接合菌の測定方法。
【請求項５】
免疫測定法が、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法である、請求項４に記載の接合菌の測定方法。
【請求項６】
試料が、動物に由来する試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の接合菌の測定方法。
【請求項７】
動物に由来する試料が、血液由来試料又は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）である、請求項６に記載の接合菌の測定方法。
【請求項８】
血液由来試料が、血清又は血漿である、請求項７に記載の接合菌の測定方法。
【請求項９】
接合菌の測定方法が、接合菌症の検知方法である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の接合菌の測定方法。
【請求項１０】
接合菌症が、ムーコル症又はエントモフトラ症である、請求項９に記載の接合菌の測定方法。
【請求項１１】
酸性成分を含有する、接合菌測定用試料の調製剤。
【請求項１２】
酸処理することにより、試料を接合菌測定用試料にする、接合菌測定用試料の調製方法。
【請求項１３】
酸性成分を含有する試薬及び／又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、接合菌の測定を行うための試薬キット。
【請求項１４】
試薬キットが、接合菌症の診断キットである、請求項１３に記載の試薬キット。
【請求項１５】
試薬キットが、ムーコル症又はエントモフトラ症の診断キットである、請求項１３に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の真菌の測定手段に関し、具体的には接合菌の測定方法、接合菌測定用試料の調製剤、接合菌測定用試料の調製方法、及び、接合菌の測定を行うための試薬キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌症（mycosis）は、真菌（fungus）が動物の皮膚や臓器等に定着することに起因する感染症である。真菌は、菌界（Fungi）に属する生物の総称として定義されている。真菌症としては、皮膚真菌症（表在性真菌症）、深部皮膚真菌症（深部表在性真菌症）、深在性真菌症（全身性真菌症、内臓真菌症）が知られている。皮膚真菌症は、表皮に限局した真菌症であり、白癬、癜風、皮膚カンジダ症等が知られている。深部皮膚真菌症は、真皮や皮下組織に限局した真菌症であり、スポロトリックス症、エントモフトラ症等が知られている。深在性真菌症は、臓器に限局した真菌症であり、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、ムーコル症等が知られている。【０００３】
真菌症において、接合菌（Zygomycota）に起因する感染症は接合菌症（zygomycosis）と呼ばれている。接合菌症としては、ケカビ亜門（Mucoromycotina）に属する接合菌に起因する真菌症であるムーコル症（mucormycosis）や、ハエカビ亜門（Entomophthoromycotina）に属する接合菌に起因する真菌症であるエントモフトラ症（entomophthoramycosis）が知られている。【０００４】
真菌の細胞壁にはキトサンやキチンが存在することが知られている。より詳しくは、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）に属する真菌の細胞壁にはキチンや（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下「β−グルカン」という。）が存在するのに対し、接合菌門（Zygomycota）に属する真菌の細胞壁にはキチンの代わりにキトサンが多く存在し、β−グルカンがほとんど存在しないことが知られている。【０００５】
非特許文献１では、がんや血液疾患等に対する免疫抑制的な治療が広く行われるようになったことを背景に、ムーコル症等の内臓真菌症（深在性真菌症）が増加していることが指摘されている。また、当該文献では、ムーコル症は感染者の死亡率が約６０％に達する劇症型の真菌症であること、及び真菌症感染者の中でムーコル症感染者の占める割合が増加傾向にあることが指摘されている。さらに、当該文献では、ムーコル症が抱える問題として早期診断に有用な血清学的補助診断法が存在しないことが指摘されている。【０００６】
前記のように本発明は接合菌の測定手段に関するものであるところ、特許文献１には、抗糖質抗体を用いたキトサンを含む糖質の微量定量法が記載され、抗糖質抗体は糖質の高感度検出に用いることができることが記載されている。しかし、生物学的試料を測定対象としたキトサンの測定に関しては、具体的な手段を伴った実質的な記載は全く認められない。【０００７】
特許文献２には、接合菌症起因菌の検出及び同定法として、検体中のＤＮＡを鋳型とし、目的の接合菌症起因菌のＤＮＡに特異的なセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットを用いたＰＣＲにより接合菌症起因菌を検出する方法が記載されている。当該文献の実施例では、検体の前処理としてプロテアーゼＫ処理が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平８−１９３１００号公報
【特許文献２】特開２０１４−２００２０１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】串間尚子、時松一成、門田淳一、「稀な菌種による深在性真菌症」、感染症学雑誌、第88巻、第4号、p.531-532
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、真菌症の治療薬として接合菌症に対しても有効な抗真菌剤が提供されつつあることを鑑みて、このような抗真菌剤の投与の可否や投与効果の確認を行うことを可能にする、接合菌の測定手段についての検討を行った。その結果、血清等の血液由来試料に対してそのまま免疫測定法を行っても、接合菌を特許文献１の非実質的な期待通りに測定することはできないことが確認された。この点に関しては後述の実施例において明らかになっている。【００１１】
本発明の課題は、真に接合菌の測定を行うことが可能な手段を提供することである。また、本発明の課題は、一態様において、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の早期診断に有用な血清学的診断を実現する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題の解決のために、本発明者らは接合菌の測定手段に関する検討、具体的には、接合菌の測定を可能にする試料の前処理方法に関する検討、を鋭意行った。試料の前処理方法としては、界面活性剤を添加する処理、有機溶媒を添加する処理、金属塩を添加する処理、酵素（ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼ等）を添加する処理、超音波やビーズ等を用いて破砕する処理、ホモジェナイザー等を用いて均質化する処理、カラムに供する処理、ろ過フィルターを用いる処理等の種々の処理方法が考えられるところ、本発明者らは、驚くべきことに、試料を酸性にする処理（酸処理）という極めて簡便かつ安価な手法により接合菌の測定が可能になることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
前記課題は、以下の態様を包含する本発明によって解決することができる。
［１］
酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定する、接合菌の測定方法。
［２］
酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、前記［１］に記載の接合菌の測定方法。
［３］
酸性成分が、オキソ酸、有機酸、無機酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［２］に記載の接合菌の測定方法。
［４］
オキソ酸が、カルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［３］に記載の接合菌の測定方法。
［５］
有機酸が、カルボン酸及び／又はスルホン酸である、前記［３］に記載の接合菌の測定方法。
［６］
カルボン酸が、酢酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［４］又は［５］に記載の接合菌の測定方法。
［７］
無機酸が、ハロゲン化水素、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［３］に記載の接合菌の測定方法。
［８］
ハロゲン化水素が、塩酸である、前記［７］に記載の接合菌の測定方法。
［９］
ハロゲンオキソ酸が、次亜ハロゲン酸及び／又は過ハロゲン酸である、前記［４］又は［７］に記載の接合菌の測定方法。
［１０］
次亜ハロゲン酸が、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［９］に記載の接合菌の測定方法。
［１１］
過ハロゲン酸が、過塩素酸、過臭素酸、過ヨウ素酸からなる群より選択される１又は２以上の酸である、前記［９］に記載の接合菌の測定方法。
［１２］
接合菌の測定が、接合菌成分の検出試薬を用いた接合菌の測定である、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
［１３］
接合菌成分の検出試薬が、キトサンに結合する抗体である、前記［１２］に記載の接合菌の測定方法。
［１４］
接合菌の測定が、免疫測定法による接合菌の測定である、前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
［１５］
免疫測定法が、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法である、前記［１４］に記載の接合菌の測定方法。
［１６］
免疫測定法が、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、イムノブロット法、凝集法、比濁法、又は比ろう法である、前記［１４］又は［１５］に記載の接合菌の測定方法。
［１７］
凝集法が、ラテックス凝集法である、前記［１６］に記載の接合菌の測定方法。
［１８］
試料が、動物に由来する試料である、前記［１］〜［１７］のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
［１９］
動物に由来する試料が、血液由来試料、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、生検検体、喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、又は腹水である、前記［１８］に記載の接合菌の測定方法。
［２０］
血液由来試料が、血清又は血漿である、前記［１９］に記載の接合菌の測定方法。
［２１］
接合菌の測定方法が、接合菌症の検知方法である、前記［１］〜［２０］のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
［２２］
接合菌症が、ムーコル症又はエントモフトラ症である、前記［２１］に記載の接合菌の測定方法。
［２３］
酸性成分を含有する、接合菌測定用試料の調製剤。
［２４］
調製剤が、前記［１］〜［２２］のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行う試料の酸処理に用いられる調製剤である、前記［２３］に記載の調製剤。
［２５］
接合菌の測定を行う試料の酸処理に使用するための酸性成分。
［２６］
酸性成分が、前記［１］〜［２２］のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行う試料の酸処理に用いられる酸性成分である、前記［２５］に記載の酸性成分。
［２７］
酸処理することにより、試料を接合菌測定用試料にする、接合菌測定用試料の調製方法。
［２８］
酸処理が、試料を前記［１］〜［２２］のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行うための試料とするための処理である、前記［２７］に記載の調製方法。
［２９］
酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、前記［２７］又は［２８］に記載の調製方法。
［３０］
酸性成分と試料を共存させる処理が、前記［２３］又は［２４］に記載の調製剤と試料を共存させる処理である、前記［２９］に記載の調製方法。
［３１］
酸性成分を含有する試薬及び／又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、接合菌の測定を行うための試薬キット。
［３２］
酸性成分を含有する試薬及び／又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、前記［１］〜［２２］のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行うための試薬キット。
［３３］
酸性成分を含有する試薬が、前記［２３］又は［２４］に記載の調製剤である、前記［３１］又は［３２］に記載の試薬キット。
［３４］
接合菌成分の検出試薬が、キトサンに結合する抗体である、前記［３１］〜［３３］のいずれかに記載の試薬キット。
［３５］
試薬キットが、接合菌症の診断キットである、前記［３１］〜［３４］のいずれかに記載の試薬キット。
［３６］
試薬キットが、ムーコル症又はエントモフトラ症の診断キットである、前記［３１］〜［３４］のいずれかに記載の試薬キット。【００１４】
＜１＞本発明の測定方法
本発明により、酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定することを特徴とする、接合菌の測定方法（以下「本発明の測定方法」という。）が提供される。本発明の測定方法は、例えば、接合菌の検知方法、接合菌の検出方法、接合菌の定量方法、接合菌症の検知方法、接合菌症の検出方法、又は接合菌症の定量化方法として用いることができる。また、本発明の測定方法は、例えば、酸処理した試料（検体）を測定対象として接合菌の測定（検体検査）を行い、動物が接合菌症に罹患しているか否かを診断するためのデータを取得することを特徴とする、接合菌症を診断するためのデータ取得方法として用いることもできる。【００１５】
＜２＞本発明の試料調製剤
上記の通り、本発明において接合菌の測定が行われる試料は酸処理が施されている。当該酸処理は、試料に酸性成分を共存させて行うことが実用上簡便である。ここに酸性成分を含有することを特徴とする、接合菌測定用試料の調製剤（以下「本発明の試料調製剤」という。）が提供される。当該酸性成分を含む剤は、接合菌の測定を行う試料の酸処理剤として使用することができる。本発明の試料調製剤と当該酸処理剤は、どちらも酸性成分を剤に含有させる工程を含む任意の方法により製造することができる。また、本発明の試料調製剤と当該酸性成分は、どちらも本発明の測定方法を行う試料の酸処理に好適に用いることができる。【００１６】
＜３＞本発明の試料調製方法
上記の通り、酸処理を行うことにより試料を接合菌測定用試料とすることができる。ここに酸処理することにより試料を接合菌測定用試料にすることを特徴とする、接合菌測定用試料の調製方法（以下「本発明の試料調製方法」という。）が提供される。本発明の試料調製方法は、本発明の測定方法を行う試料の酸処理に好適に用いることができる。本発明の試料調製方法において、酸処理は酸性成分と試料を共存させる処理であることが好適である。酸性成分と試料を共存させる処理は、本発明の試料調製剤と試料を共存させる処理であることが好適である。【００１７】
＜４＞本発明の試薬キット
本発明において接合菌の測定は、酸性成分を含有する試薬と接合菌成分の検出試薬のうち少なくとも一方を構成品として含む試薬キット（以下「本発明の試薬キット」という。）を用いて行うことが実用上簡便である。本発明の試薬キットは、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。酸性成分を含有する試薬は、本発明の試料調製剤であることが好適である。接合菌成分の検出試薬は、キトサンに結合する抗体であることが好適である。本発明の試薬キットは、前記構成品以外に、さらに他の構成品を含んでいてもよい。当該他の構成品は、接合菌の測定の態様に応じて適宜選択できる。本発明の試薬キットは、例えば、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の診断キットとしても用いることができる。【００１８】
＜５＞酸処理
本発明において酸処理は、接合菌の測定を行う試料の前処理として行われる。当該酸処理は、試料を酸性にする処理であり、試料を酸性下に供することで行うことができる。当該酸処理は、試料に酸性成分を共存させて行われることが実用上簡便である。酸処理した試料は、酸性成分と共存させる処理が行われた試料であってよい。【００１９】
＜６＞酸性成分
本発明において酸性成分は、有機酸であってもよく、無機酸であってもよい。有機酸はカルボン酸であることが好適である。カルボン酸は酢酸、ギ酸、又はクエン酸であることが好適である。また、無機酸はハロゲン化水素、硫酸、又はリン酸であることが好適である。ハロゲン化水素は塩化水素（塩酸）であることが好適である。このような酸性成分は、１種のみを用いてもよく、２種又はそれ以上を組み合わせて用いてもよい。【００２０】
＜７＞接合菌の測定
本発明において接合菌の測定は、例えば、接合菌成分の検出試薬を用いて行うことができる。接合菌成分の検出試薬は、キトサンに結合する抗体であることが好適である。また、本発明において接合菌の測定は、例えば、免疫測定法により行うことができる。免疫測定法は、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法であることが好適である。免疫測定法としては、酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ、ＥＩＡ）法、イムノクロマト法、イムノブロット法、凝集法、比濁法、又は比ろう法が例示される。凝集法としては、ラテックス凝集法が例示される。酵素免疫測定法は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法であってよい。【００２１】
＜８＞試料
本発明において接合菌の測定を行う試料は、接合菌を含有し得る物質である限り特に制限されないが、ヒトを含む動物に由来する試料（検体）であることが好適であり、本発明は検体検査において好適に用いられる。動物に由来する試料としては、動物の体から得られる試料や動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料が例示される。動物の体と接触させる液体は、生体に適合可能な液体である限り特に制限されない。そのような液体としては、生理食塩水が挙げられる。動物の体と接触し、回収された液体は、そのまま接合菌の測定を行う試料として酸処理に供することができる。動物の体から得られる試料は、血液由来試料であることが好適である。血液由来試料は、血清又は血漿であることが特に好適である。動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）であることが好適である。また、ここにいう動物は、接合菌症に罹患した動物又は接合菌症に罹患した可能性のある動物であることが好適である。接合菌症としては、ムーコル症やエントモフトラ症が例示される。【００２２】
本発明において接合菌の測定が行われる試料は、酸処理が施されて調製される。本発明において接合菌の測定が行われる試料は、酸処理を施した後に中和がされた試料であってよい。【００２３】
以降の説明において、以下の略号を使用する場合がある。
ＧｌｃＮ：グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
ＣＴＳ：キトサン
ＣＴＳ６：キトサンヘキサマー
ＧＣＴＳ：グリコールキトサン
ＣＴＮ：キチン
ＥＧＣＴＮ：エチレングリコールキチン
ＣＴＳｐＡｂ：抗キトサンポリクローナル抗体
ＣＴＳｍＡｂ：抗キトサンモノクローナル抗体
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、試料が含有する接合菌の測定を高感度に行うことができる。本発明は、例えば、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の早期診断に有用な血清学的診断を実現する手段として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】真菌症等の各種感染症に罹患したヒトの血清を試料とし、抗キトサン抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ法によって接合菌の測定を行った場合において、酸処理を行った場合と行わなかった場合で吸光度の減少率（阻害率）を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．酸処理された試料の調製
本発明において接合菌の測定が行われる試料は、上述した通りに酸処理が施されて調製される。本発明において酸処理は、試料を酸性下に供する処理（酸性の状態にする処理）である限り、その手段は特に制限されない。そのような手段としては、陽イオン交換体、活性炭（酸性炭）、又は酸性成分と試料を共存させる方法が例示される。酸処理は、酸性成分と試料を共存させる処理であることが簡便かつ安価であり好適である。共存とは、対象物同士が接触し得る状態にあることを意味する。例えば、酸性成分と試料の共存は、試料に対して酸性成分を添加することにより行うことも可能であり、酸性成分に対して試料を添加することにより行うことも可能である。酸処理は液体中において行われることが好適である。また、酸処理が行われる液体は、水又は水溶液であることが好適である。
【００２７】
１−１：  酸性成分
酸性成分は、水と共存した時に酸性を示す物質である限り特に制限されない。酸性成分は、水と共存した時に水素イオンを遊離する化合物であってよく、イオン化した時に水素イオンを遊離する化合物であってよい。すなわち、酸性成分はアレニウス酸であってよい。酸性成分としては、オキソ酸、有機酸、無機酸等が例示される。オキソ酸としては、カルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸等が例示される。有機酸としては、カルボン酸、スルホン酸等が例示される。カルボン酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸等が例示される。無機酸としては、ハロゲン化水素、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸等が例示される。ハロゲン化水素としては、塩化水素（塩酸）等が例示される。ハロゲンオキソ酸としては、次亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸等が例示される。次亜ハロゲン酸としては、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸等が例示される。過ハロゲン酸としては、過塩素酸、過臭素酸、過ヨウ素酸等が例示される。酸性成分が有機酸である場合は、酸性成分はカルボン酸であることが好ましく、酢酸、ギ酸、又はクエン酸であることが特に好ましい。また、酸性成分が無機酸である場合は、酸性成分はハロゲン化水素、硫酸、又はリン酸であることが好ましく、ハロゲン化水素であることがより好ましい。ハロゲン化水素は塩化水素（塩酸）であることが特に好ましい。
【００２８】
また、酸性成分は、例えば、酸無水物であってもよく、ポリオキソ酸であってもよい。酸無水物としては、カルボン酸無水物やリン酸無水物等が例示され、具体的には無水酢酸やピロリン酸等が例示される。ポリオキソ酸としては、ポリリン酸等が例示される。
【００２９】
さらに、酸性成分は水と共存した時に酸性を示す物質である限り塩であってもよい。当該塩としては、アンモニウム塩やナトリウム塩等が例示され、具体的には、リン酸二水素アンモニウム、クエン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム等が例示される。
【００３０】
酸性成分の形状は特に制限されず、固体であってもよいし、液体であってもよいし、気体であってもよい。液体の酸性成分は、固体や気体の酸性成分を水等の溶媒に溶解して調製したものであってもよい。
【００３１】
酸性成分は、１種のみを酸処理に用いてもよく、２種又はそれ以上を組み合わせて酸処理に用いてもよい。
【００３２】
１−２：  試料
試料は、接合菌を含有し得る物質である限り特に制限されない。試料としては、動物に由来する試料が挙げられる。動物としては、具体的には、ヒトをはじめ、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の罹患の対象となり得るその他の動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、トリ等が挙げられる。接合菌症は、ペット由来の感染や、ペット自体の接合菌症の罹患も問題になっており、ヒト以外の動物も試料の由来として重要である。動物に由来する試料は、動物の体から得られる試料であってもよいし、動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料であってもよい。
【００３３】
動物に由来する試料としては、例えば、喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、腹水、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、生検検体、血液由来試料が挙げられる。動物の体から得られる試料としては、例えば、喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、腹水、生検検体、血液由来試料が挙げられる。動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料としては、例えば、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）が挙げられる。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、典型的には気管支内に生理食塩水等を注入して肺胞等を洗浄した後、これを回収して得られる溶液として知られている。
【００３４】
血液由来試料は、血液そのものであってもよく、抗凝固剤等の添加剤等の他の成分を含む血液であってもよく、さらに、これらの分画や精製によって得られる画分（血漿や血清等）であってもよい。これらの中で血液由来試料は、血清又は血漿であることが特に好ましい。血清は、例えば、動物から採取した血液を静置又は遠心分離し、上清を回収して得ることができる。血漿は、例えば、動物から採取した血液を抗凝固剤と混合した後に静置又は遠心分離し、上清を回収して得ることができる。
【００３５】
試料の形態は特に制限されず、液状であってもよいし、固形状であってもよい。液状の試料としては、例えば、上記した喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、腹水、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、血液由来試料等の液性成分の他、生検検体の懸濁液が挙げられる。固形状の試料としては、例えば、上記した生検検体の他、液性成分（喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、腹水、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、血液由来試料等）の凍結乾燥等による乾燥粉末が挙げられる。試料は、液状の試料そのものであっても、適宜、濃縮又は希釈したものであってもよく、固形状の試料を適宜溶解したものであってもよい。
【００３６】
１−３：  酸処理
本発明において酸処理は、試料を酸性にする処理であり、試料を酸性下に供することで行うことができる。試料の酸処理が行われる時（以下「酸処理時」という。）のｐＨは６以下の酸性である限り特に制限されず、任意のｐＨを選択することができる。酸処理時のｐＨは、例えば、試料の種類や接合菌の測定の態様に応じて適宜設定することができる。下限を含んだ当該ｐＨは、例えば、ｐＨ０以上、ｐＨ０．５以上、ｐＨ１以上、ｐＨ２以上、ｐＨ３以上、ｐＨ３．５以上等であってよい。また上限を含んだ当該ｐＨは、例えば、ｐＨ６以下、ｐＨ５．５以下、ｐＨ５以下、ｐＨ４．５以下等であってよい。さらに具体的には、ｐＨ０〜６、ｐＨ０．５〜５．５、ｐＨ０〜５、ｐＨ０．５〜５、ｐＨ１〜５、ｐＨ２〜５、ｐＨ３〜５、ｐＨ３．５〜４．５等が例示される。
【００３７】
酸処理を酸性成分と試料を共存させて行う場合において、酸処理時における酸性成分の濃度は特に制限されず、酸性成分の種類や所望するｐＨ等の諸条件に応じて適宜設定することができる。下限を含んだ当該濃度は、例えば、０．００１ｍＭ以上、０．０１ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上等であってよい。また上限を含んだ当該濃度は、例えば、１Ｍ以下、５００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下等であってよい。さらに具体的には、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、０．０１ｍＭ〜１Ｍ、０．１ｍＭ〜１Ｍ、１ｍＭ〜１Ｍ、１０ｍＭ〜１Ｍ、５０ｍＭ〜５００ｍＭ、１００ｍＭ〜５００ｍＭ、１００ｍＭ〜２５０ｍＭ等が例示される。なお、酸性成分を２種以上用いる場合の当該濃度は、それら酸性成分の濃度の総和の値である。当該濃度は、試料に添加された酸性成分の終濃度を意味してよい。
【００３８】
酸処理時の温度は特に制限されず、任意の温度を選択することができる。当該酸処理は、例えば、１５〜２５℃の常温で行ってもよいし、それよりも低い温度、又は、高い温度で行うことも可能である。下限を含んだ当該温度は、例えば、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、２０℃以上等であってよい。また上限を含んだ当該温度は、例えば、１２５℃以下、１００℃以下、７５℃以下、５０℃以下、３７℃以下等であってよい。さらに具体的な当該温度としては、上記の常温の他に、０℃〜１２５℃、４℃〜１００℃、１０℃〜７５℃、２０℃〜７５℃等が例示される。
【００３９】
当該酸処理は、室温（２４〜２６℃）で行うこともできるし、試料を冷却または加温して行うこともできる。試料の冷却や加温は、例えば、ヒートブロック、ウォーターバス、オイルバス、エアーバス等の機器を使用して行うことができる。
【００４０】
当該酸処理を行う時間、すなわち、酸処理を開始してから酸処理を終了するまでの時間（以下「処理時間」という。）は特に制限されない。下限を含んだ当該処理時間は、例えば、５秒間以上、３０秒間以上、１分間以上、５分間以上等であってよい。また上限を含んだ当該処理時間は、例えば、２４時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分以下であってよい。さらに具体的な当該処理時間としては、５秒間〜２４時間、３０秒間〜２時間、１分間〜１時間、５分間〜３０分間等が例示される。
【００４１】
当該酸処理を行った試料は、そのまま接合菌の測定に用いることができるが、当該測定が酸性での使用に適さない成分（例えば、抗体などのタンパク質）を用いて行われる場合には、当該酸処理を終了させた試料を接合菌の測定に用いることが好適である。
【００４２】
当該酸処理の終了は、例えば、試料を酸処理に好適なｐＨよりも高いｐＨにすることにより、好ましくは試料を中性又は塩基性にすることにより、行うことができる。当該酸処理の終了は、例えば、試料に中和成分や塩基性成分を添加することや、試料から酸性成分等の試料を酸性にするために添加した成分を除去すること等によって行うことができる。具体的に当該酸処理の終了は、例えば、試料をｐＨ６．５以上、好ましくはｐＨ７以上にすることにより、行うことができる。
【００４３】
ただし、当該酸処理の終了操作においては、アルカリ加水分解反応による成分の変性が接合菌の測定の結果に影響する可能性があるため、試料を強塩基性下に供しないこと（強塩基性の状態にしないこと）が好ましい。ここにいう強塩基性は、例えば、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．５以上、ｐＨ１３以上、ｐＨ１３．５以上、ｐＨ１４以上等である。
【００４４】
上記酸処理の終了操作は、試料をｐＨ６．５〜ｐＨ１２、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ１２、さらに好ましくはｐＨ７〜１０、よりさらに好ましくはｐＨ７〜ｐＨ８、にする操作であってよい。酸処理が行われ、中和がされた試料は、そのまま（更なる処理を必要とせずに）接合菌の測定を行う測定対象の試料として用いることができる。本発明において接合菌の測定が行われる試料は、酸処理後に上記に例示したｐＨに調整された試料であることが好ましい。
【００４５】
当該酸処理に際しては、試料の希釈や溶解が行われてもよい。試料が希釈される場合の希釈倍率は特に制限されず、下限を含んだ希釈倍率は、例えば、１倍超、１．１倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上等であってよい。また上限を含んだ希釈倍率は、例えば、５００倍以下、２００倍以下、１００倍以下等であってよい。さらに具体的には、１倍超〜５００倍、１．１倍〜５００倍、２倍〜２００倍、５倍〜２００倍、１０倍〜１００倍等が例示される。
【００４６】
当該酸処理は、１回のみ行ってもよいし、２回又はそれ以上の複数回行ってもよい。当該酸処理は、例えば、試料を酸性下に供した後、中和し、さらに再度酸性下に供して行ってもよい。当該酸処理を複数回行う場合において、酸処理の諸条件（ｐＨ、酸性成分の種類、酸性成分の濃度、温度、時間等）は、それぞれ同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４７】
１−４：  本発明の試料調製剤
本発明の試料調製剤は、上記に例示される酸性成分を含有する剤であり、試料を酸処理するために用いられる剤である。本発明の試料調製剤は、液剤であってもよいし、粉末剤、顆粒剤、錠剤等の用時溶解用の固形剤であってもよい。本発明の試料調製剤は、酸性成分そのものであってもよく、酸性成分を水等の溶媒に希釈又は溶解したものであってもよい。また、本発明の試料調製剤は、製剤上の理由等により、酸性成分や溶媒以外の他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分は、試薬・診断薬学的に許容される成分である限り特に制限されず、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、各種添加剤等が例示される。各種添加剤としては、安定化剤、保存剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、懸濁化剤、分散剤、浸透圧調整剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等が例示される。
【００４８】
本発明の試料調製剤において、酸性成分は、イオン化していない状態で存在していてもよく、イオン化した状態で存在していてもよく、これらが共存する状態で存在していてもよい。
【００４９】
本発明の試料調製剤において酸性成分が占める重量パーセント濃度（ｗ／ｗ）は特に制限されず、任意の濃度を選択することができる。下限を含んだ当該濃度（ｗ／ｗ）は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、５０％以上等であってよい。また上限を含んだ当該濃度（ｗ／ｗ）は、例えば、１００％以下、７５％以下、５０％以下、２５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下等であってよい。
【００５０】
本発明の試料調製剤の使用量は特に制限されず、本発明の試料調製剤が含む酸性成分の種類や濃度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の試料調製剤は、例えば、試料と共存させた時の酸性成分の量が上述した酸処理に適した量となるように用いることができる。
【００５１】
本発明の試料調製剤は、試薬や診断薬の調製において通常用いられる手法によって製造することができる。
【００５２】
本発明の試料調製剤を用いて接合菌の測定を行う試料に酸処理を施すことにより、試料を接合菌の測定に適した状態にすることができ、所望する接合菌の測定を高感度に行うことができる。
【００５３】
１−５：  本発明の試料調製方法
本発明の試料調製方法は、酸処理することにより試料（接合菌の測定を行う試料）を接合菌測定用試料（接合菌の測定が行われる試料）にするための方法である。本発明の試料調製方法は、酸処理する工程以外に、当該工程の前後、又は、同時において、さらに他の工程を含んでいてもよい。本発明の試料調製方法は、例えば、酸処理を終了する工程、固形状の試料を溶解する工程、液状の試料を希釈又は濃縮する工程等を含んでいてもよい。また、本発明の試料調製方法は、例えば、調製された試料が接合菌の測定に適した温度となるように、当該試料を加温又は冷却する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の試料調製方法は、例えば、調製された試料が接合菌の測定に適したｐＨとなるように、当該試料のｐＨを調整する工程を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明の試料調製方法を用いることにより、試料を接合菌の測定に適した状態にすることができ、所望する接合菌の測定を高感度に行うことができる。
【００５５】
２．接合菌の測定
２−１：  測定手法
本発明の測定方法は、上述の通りに接合菌を測定する方法である。本発明において測定の対象となる接合菌は、具体的には、酸処理された接合菌であり、一態様においては、接合菌に由来する成分である。本発明において測定の対象となる接合菌は、菌体そのものであってもよく、断片化された菌体であってもよく、菌体の一部又は一成分であってもよい。また、本発明において測定の対象となる接合菌は、生菌体であってもよく、不活化された菌体等の死菌体であってもよい。接合菌の測定は、例えば、接合菌成分の検出試薬（接合菌が有する成分を検出するための試薬）を用いて行うことができる。
【００５６】
測定の対象となる接合菌の成分は特に制限されない。当該成分としては、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物等が例示される。当該成分は、様々な接合菌の種において共通して存在する同一の構造からなる成分であることが、接合菌の有無を包括的に測定する目的において好ましい。測定の対象となる接合菌の成分は、脂質又は炭水化物であることが好適であり、炭水化物であることがより好適である。炭水化物は糖質であることが好適であり、キトサンであることがより好適である。接合菌の測定は、キトサンを測定対象の成分として行うことが特に好適である。また、本発明において測定は、検出、検知、及び、定量を含む概念である。すなわち接合菌の測定は、接合菌の検出、接合菌の検知、及び、接合菌の定量を概念として包含する。
【００５７】
上記検出試薬は、接合菌の成分と接触して当該接合菌の成分や試薬自体に物理的又は化学的な変化が生じる試薬であること意味する。当該変化には、結合、転移、転位、付加、脱離、分解、酸化、還元、標識、発色、発光等が含まれる。当該変化は、例えば、クロマトグラムのピーク、コントラスト、若しくは分析機器の測定値の変化、又は当該変化に伴い検出されるシグナル等として測定することができる。また、当該変化は、例えば、上記検出試薬や上記検出試薬と接触して生じる反応物を標識又は測定するための試薬をさらに用いて測定することもできる。そのような試薬は、上記検出試薬、上記検出試薬と接触して生じる反応物、当該試薬自体のいずれかに物理的または化学的な変化が生じる試薬であってよい。上記検出試薬や上記検出試薬と接触して生じる反応物を標識又は測定するための試薬としては、それらに結合する抗体が挙げられる。
【００５８】
上記検出試薬は、測定対象の特異的検出を可能とする試薬であることが好適である。そのような試薬としては、例えば、抗体が挙げられる。接合菌の測定は免疫測定法により行われることが好適である。上述したように、接合菌の測定はキトサンを測定対象の成分として行われることが特に好適であるから、上記検出試薬はキトサンに結合する抗体（抗キトサン抗体）であることが特に好適である。
【００５９】
免疫測定法に用いる抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、両者が混合されてなる抗体であってもよい。
【００６０】
上記抗体は、抗体そのものであってもよく、他の物質で標識された抗体（標識抗体）であってもよい。標識抗体としては、酵素標識抗体、蛍光標識抗体、ビオチン標識抗体等が例示される。
【００６１】
上記抗体の免疫グロブリンの種類は特に制限されないが、抗体が抗キトサン抗体である場合は、後述する理由により鳥類を免疫して作製することが好ましく、ＩｇＹ抗体であることが好ましい。ＩｇＹが哺乳動物に存在しない免疫グロブリンであることから、ＩｇＹ抗体は試料が哺乳動物に由来する試料である場合において特に好適に用いることができる。
【００６２】
上記抗体は、測定対象の成分におけるエピトープが同一である抗体が２種以上混合されてなる抗体であってもよいし、当該エピトープが異なる抗体が２種以上混合されてなる抗体であってもよい。
【００６３】
本発明における抗体の使用態様は、抗体のみの使用であってもよく、抗体以外の他の成分を含む抗体製剤としての使用であってもよい。ここにいう他の成分としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、界面活性剤、緩衝剤等の他、抗原によって免疫された動物に由来する抗体以外の成分等が例示される。
【００６４】
上記の抗体製剤において、抗体そのものが占める重量体積パーセント濃度（ｗ／ｖ）は特に制限されず、任意の濃度であってよい。下限を含んだ当該濃度（ｗ／ｖ）は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、５０％以上等であってよい。上限を含んだ当該濃度（ｗ／ｖ）は、例えば、１００％以下、７５％以下、５０％以下、２５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下等であってよい。
【００６５】
免疫測定法は、抗原抗体反応を利用して抗原を測定するために用いられる公知の方法により行うことができ、その態様は特に制限されない。免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法）、イムノクロマト法、イムノブロット法（ドットブロット法、スロットブロット法、スポットブロット法等）、凝集法、比濁法、比ろう法が好ましく例示される。凝集法としては、ラテックス凝集法が好ましく例示される。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ法としては、（ａ）プレートに固相化した試料に対して抗体（検出抗体）を添加して試料が含有する抗原を測定する方法（結合法）、（ｂ）プレートに固相化した抗体（固相化抗体）に対して試料と抗体（検出抗体）を添加して試料が含有する抗原を測定する方法（サンドイッチ法）、（ｃ）プレートに固相化した抗原に対して試料（競合物質）と抗体（検出抗体）を添加して試料が含有する抗原を測定する方法（競合法、阻害法）、等が例示される。これらの中で、ＥＬＩＳＡ法は、プレートを予め大量調製してストックしておくことが可能であることから、競合法（以下「競合ＥＬＩＳＡ法」という。）又はサンドイッチ法（以下「サンドイッチＥＬＩＳＡ法」という。）であることが好ましく、サンドイッチＥＬＩＳＡ法であることがより好ましい。
【００６７】
競合ＥＬＩＳＡ法又はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行う場合、酸処理を行った試料と検出抗体は任意の順序で別々にプレートに添加されてもよいし、これらを予め共存させた後にプレートに添加されてもよい。これらのＥＬＩＳＡ法において予め試料と検出抗体を共存させる時間としては、数時間から一日程度が好ましく、具体的には、１〜２４時間、１２〜２４時間、１８〜２４時間等が例示される。
【００６８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法において用いる２種類の抗体（固相化抗体と検出抗体）は、接合菌の成分に結合する抗体である限り制限されず、認識するエピトープが異なる抗体であってもよく、認識するエピトープが同一の抗体であってもよい。当該２種類の抗体は、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよい。
【００６９】
２−２：  抗体
本発明において用いられる抗体は、抗体を作製するために用いられる公知の方法により作製することができ、その方法は特に制限されない。当該抗体を作製する方法としては、動物を抗原で免疫する方法が典型例として挙げられる。抗原は、接合菌そのものであってもよく、断片化された接合菌であってもよく、接合菌の一成分であってもよく、免疫原性を高めるためにこれらを他の物質と融合させた複合体であってもよい。当該複合体の形成に用いられる他の物質としては、タンパク質が挙げられ、具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。また、抗原は、抗原性補強剤（アジュバント）と共存させた状態で動物の免疫に用いられてもよい。
【００７０】
抗原として用いられる接合菌成分は、上述の通り、キトサンであることが好ましい。抗原として用いられるキトサンの由来は特に制限されず、接合菌から抽出して得られるキトサン以外のキトサンであってもよく、例えば、市販のキトサンであってもよい。抗原として用いられるキトサンとしては、キチンのＮ−脱アセチル化によって得られるキトサンが例示される。キチンは、例えば、カニやエビ等の甲殻類に由来するものが提供されている。また当該キトサンの重合度、すなわちキトサンの分子量、は特に制限されず、ポリマーであってもよく、オリゴマー（オリゴ糖）であってもよいが、他の物質と融合させた複合体を調製する際の反応収率の観点からはオリゴマーであることが好ましい。そのようなオリゴマーとしては、ヘキサマーが例示される。当該キトサンは、分子内に抗キトサン抗体が結合するエピトープ配列（ＧｌｃＮ残基が繰り返し重合してなる配列）を有するキトサンであることが必要であり、その限りにおいてはＧｌｃＮ残基のみを含むキトサンであってもよく、ＧｌｃＮ残基とＧｌｃＮＡｃ残基を含むキトサンであってもよい。エピトープ配列において重合しているＧｌｃＮ残基の数は、好ましくは３個又はそれ以上である。当該キトサンの脱アセチル化の程度（以下「脱アセチル化度」という。）は特に制限されないが、具体的には６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、１００％等が例示される。脱アセチル化度は、高いことが好ましい。
【００７１】
キトサンの脱アセチル化度は、キトサンの骨格を構成するＧｌｃＮ残基とＧｌｃＮＡｃ残基の総数に対するＧｌｃＮ残基の総数の割合を意味するものであり、言い換えると、ＧｌｃＮ残基の総数をＧｌｃＮ残基とＧｌｃＮＡｃ残基の総数で除して百分率換算した値を意味するものである。脱アセチル化度は、公知の方法、具体的には、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）法、コロイド滴定法によって測定することができる。
【００７２】
抗キトサン抗体の作製に際して免疫される動物は、上記のキトサンによって免疫される。当該動物は、抗キトサン抗体の産生が可能な動物である限り特に制限されないが、本来的にキトサンを有さない動物であることが好ましい。そのような動物としては、哺乳類や鳥類が挙げられるが、鳥類であることが好ましく、ニワトリ（ガッルス・ガッルス・ドメスティクス（Gallus gallus domesticus））であることが特に好ましい。
【００７３】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、両者が混合されてなる抗体であってもよい。ポリクローナル抗体として得られる抗キトサン抗体は、例えば、動物に由来する成分や動物の細胞から得ることができ、具体的には、キトサンで免疫された動物の体液や卵等から得ることができる。ここにいう動物の体液としては、血液、血清、血漿、腹水等が例示される。また、モノクローナル抗体として得られる抗キトサン抗体は、例えば、キトサンで免疫された動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞のハイブリドーマや当該ハイブリドーマの培養液から得ることができる。
【００７４】
さらに、モノクローナル抗体として得られる抗キトサン抗体は、例えば、抗キトサン抗体の発現ベクターを用いて形質転換された細胞や当該細胞の培養液から得ることができる。当該細胞は、例えば、文献（ＷＯ２０１１／０４９０８２）に記載された方法やＭａｍｍａｌｉａｎ  ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡社製）等の市販のキットを用いた方法により作製することができる。当該細胞は、一過性発現細胞であってもよく、安定発現細胞であってもよい。
【００７５】
抗体は、動物に由来する成分、動物の細胞、ハイブリドーマ細胞、ハイブリドーマ細胞の培養液をそのまま抗体として用いてもよいし、動物の細胞やハイブリドーマ細胞を破砕して得られる抽出液や細胞残渣を抗体として用いてもよいし、これらを精製して得られる画分を抗体として用いてもよい。細胞の破砕は、細胞の種類に応じて適宜選択した方法により行うことができる。細胞を破砕する方法としては、例えば、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法が挙げられる。
【００７６】
抗体の精製は、タンパク質の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や各種クロマトグラフィーにより行うことができる。また、抗体の精製は、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ等の抗体に結合する成分を用いて行うこともできる。抗体の精製は所望の程度に行われてよい。
【００７７】
２−３：  接合菌の種類
本発明において測定の対象となり得る接合菌の種類は特に限定されない。接合菌は、接合菌門（Zygomycota）に属する真菌として定義される。当該真菌としては、接合菌綱（Zygomycetes）、トリコミケス綱（Trichomycetes）に属する真菌が挙げられる。接合菌綱に属する真菌としては、ディマルガリス目（Dimargaritales）、アツギケカビ目（Endogonales）、ハエカビ目（Entomophthorales）、グロムス目（Glomales）、キックセラ目（Kickxellales）、ケカビ目（Mucorales）、トリモチカビ目（Zoopagales）に属する真菌が挙げられる。トリコミケス綱に属する真菌としては、アメビディウム目（Amoebidiales）、アセラリア目（Asellariales）、エクリナ目（Eccrinales）、ハルペラ目（Harpellales）に属する真菌が挙げられる。
【００７８】
上記の他、接合菌は、グロムス門（Glomeromycota）、ハエカビ亜門（Entomophthoromycotina）、キックセラ亜門（Kickxellomycotina）、ケカビ亜門（Mucoromycotina）、トリモチカビ亜門（Zoopagomycotina）に属する真菌としても定義される。グロムス門に属する真菌としては、グロムス綱（Glomeromycetes）に属する真菌が挙げられる。さらにグロムス綱に属する真菌としては、アーケオスポラ目（Archaeosporales）、ディバーシスポラ目（Diversisporales）、グロムス目（Glomerales）、パラグロムス目（Paraglomerales）に属する真菌が挙げられる。ハエカビ亜門に属する真菌としては、ハエカビ目（Entomophthorales）に属する真菌が挙げられる。キックセラ亜門に属する真菌としては、アセラリア目（Asellariales）、ディマルガリス目（Dimargaritales）、ハルペラ目（Harpellales）、キックセラ目（Kickxellales）に属する真菌が挙げられる。ケカビ亜門に属する真菌としては、アツギケカビ目（Endogonales）、クサレケカビ目（Mortierellales）、ケカビ目（Mucorales）に属する真菌が挙げられる。トリモチカビ亜門に属する真菌としては、トリモチカビ目（Zoopagales）に属する真菌が挙げられる。
【００７９】
前記ケカビ目に属する真菌としては、ケカビ科（Mucoraceae）、クスダマカビ科（Cunninghamellaceae）、サクセネア科（Saksenaeaceae）、エダケカビ科（Thamnidiaceae）に属する真菌が挙げられる。ケカビ科に属する真菌としては、アブシディア属（Absidia）、アポフィソマイセス属（Apophysomyces）、リヒテミア属（Lichtheimia）、ムーコル属（Mucor）、リゾムーコル属（Rhizomucor）、リゾプス属（Rhizopus）に属する真菌が挙げられる。クスダマカビ科に属する真菌としては、カニングハメラ属（Cunninghamella）に属する真菌が挙げられる。サクセネア科に属する真菌としては、サクセネア属（Saksenaea）に属する真菌が挙げられる。エダケカビ科に属する真菌としては、コケロマイセス属（Cokeromyces）に属する真菌が挙げられる。
【００８０】
さらに具体的にケカビ目に属する真菌としては、アブシディア・ブトレリ（Absidia butleri）、アブシディア・コリンビフェラ（Absidia corymbifera）、アポフィソマイセス・エレガンス（Apophysomyces elegans）、アポフィソマイセス・トラペジフォルミス（Apophysomyces trapeziformis）、リヒテミア・コリンビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、ムーコル・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムーコル・プランベウス（Mucor plumbeus）、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、ムーコル・ラモシシムス（Mucor ramosissimus）、ムーコル・ルーキシィ（Mucor rouxii）、リゾムーコル・プシラス（Rhizomucor pusillus）、リゾプス・アルヒズス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス・ミクロスポラス（Rhizopus microspores）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、カニングハメラ・ベルトレティエ（Cunninghamella bertholletiae）、カニングハメラ・エキヌラタ（Cunninghamella echinulata）、サクセネア・バシフォルミス（Saksenaea vasiformis）、コケロマイセス・リカルバツス（Cokeromyces recurvatus）等が例示される。
【００８１】
前記ハエカビ目に属する真菌としては、ハエカビ科（Entomophthoraceae）、バシジオボルス科（Basidiobolaceae）に属する真菌が挙げられる。ハエカビ科に属する真菌としては、コニディオボルス（Conidiobolus）属に属する真菌が挙げられる。バシジオボルス科に属する真菌としては、バシジオボルス（Basidiobolus）属に属する真菌が挙げられる。
【００８２】
さらに具体的にハエカビ目に属する真菌としては、コニディオボルス・ブレフェルディアヌス（Conidiobolus brefeldianus）、コニディオボルス・コロナタス（Conidiobolus coronatus）、コニディオボルス・インコングルス（Conidiobolus incongruus）、コニディオボルス・ランプラゲス（Conidiobolus lamprauges）、バシジオボルス・メリストスポラス（Basidiobolus meristosporus）、バシジオボルス・ラナラム（Basidiobolus ranarum）等が例示される。
【００８３】
２−４：  他の工程と測定結果の導出
本発明の測定方法は、上述した試料の酸処理をする工程や接合菌成分の検出試薬と接合菌を接触させて接合菌を検知する工程（以下「接合菌の検知工程」という。）以外に、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。当該他の工程としては、酸処理を終了させるために酸処理をした試料を中性又は塩基性にする工程（中和工程）が挙げられる。酸処理を終了させる工程は、例えば、接合菌成分の検出試薬が酸性条件下での使用に適さない試薬である場合に好適に行われる。例えば、接合菌成分の検出試薬が抗体等のタンパク質である場合は、酸性条件下での使用がタンパク質の変性や接合菌成分との結合阻害等を引き起こす可能性があるため、接合菌の検知工程の前に中和工程が好適に行われてよい。
【００８４】
また、当該他の工程としては、接合菌の検知工程において得られる測定値を他の数値に変換する工程が挙げられる。当該他の工程は、例えば、濃度既知の標準物質と接合菌成分の検出試薬を接触させて測定した時に得られる測定値と標準物質の濃度との関係（標準曲線）に基づき、接合菌の検知工程において得られる測定値を試料が含有する接合菌の量又は数に変換する工程である。当該工程は、例えば、特に試料が動物に由来する試料である場合には、接合菌の検知工程において得られる測定値を接合菌症の進行度に変換する工程でもあってもよい。ここにいう「標準曲線」は、例えば、接合菌の測定が行われる試料を標準物質に置き換え、接合菌の検知工程を行うことにより得ることができる。当該標準物質としては、接合菌そのものを用いることも可能であるが、測定対象とする接合菌成分を用いることが実用上簡便である。測定対象とする接合菌成分としては、上述の通り、キトサンが挙げられる。接合菌そのものを標準物質として用いる場合には、高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）等によって不活化された接合菌を用いることが安全上の理由から好適である。接合菌の検知工程において得られる測定値としては、蛍光光度計の測定値（蛍光強度）や分光光度計の測定値（吸光度）が挙げられる。
【００８５】
本発明の測定方法によれば、試料が含有する接合菌の測定を高感度に行うことができる。
【００８６】
本発明の測定方法によれば、例えば、試料が接合菌を含有するか否かを判定することや、試料が含有する真菌が接合菌であることを同定することができ、さらには接合菌の数の定量や接合菌症の進行度の定量化を行うことができる。すなわち、本発明の測定方法は、一態様において、試料が接合菌を含有するか否かを判定する方法、真菌が接合菌であるか否かを判定する方法、真菌症の起因菌が接合菌であるか否かを判定する方法、真菌症が接合菌症であるか否かを判定する方法、真菌症がムーコル症であるか否かを判定する方法、真菌症がエントモフトラ症であるか否かを判定する方法、接合菌の数を定量する方法、接合菌症の進行度を定量化する方法であってもよい。
【００８７】
３．本発明の試薬キット
本発明の試薬キットは、酸性成分を含有する試薬と接合菌成分の検出試薬のうち少なくとも一方を構成品として含む、接合菌測定用の試薬キットである。本発明の試薬キットは、一態様として、接合菌症の診断キット、ムーコル症の診断キット、又はエントモフトラ症の診断キットであってもよい。
【００８８】
本発明の試薬キットは、上記構成品以外に、さらに他の構成品を含んでいてもよい。上述のように、接合菌の測定態様に応じて他の構成品は適宜選択可能であり、例えば、接合菌成分の検出試薬を標識又は測定するための試薬、緩衝剤、中和剤、標準物質、マイクロプレート、プレートに固相化する抗原、ブロッキング剤、採血管、製品情報を記載した添付文書等が例示される。接合菌成分の検出試薬としては抗キトサン抗体、プレートに固相化する抗原や標準物質としてはキトサンが例示される。
【００８９】
本発明の試薬キットにおいて、各構成品は、それぞれ別個に含まれていてもよく、任意の組合せで共存させた状態で含まれていてもよい。例えば、酸性成分やこれを含有する試薬は、採血管に封入された形態で本発明の試薬キットに含まれていてもよい。また、例えば、接合菌成分の検出試薬やプレートに固相化する抗原は、緩衝剤との混合物として本発明の試薬キットに含まれていてもよく、マイクロプレートに固相化された状態の固相化プレートとして含まれていてもよい。
【００９０】
本発明の試薬キットを用いることにより、試料が含有する接合菌の測定を高感度かつ簡便に行うことができる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例のみに限定されるものではない。【００９２】
本願の実施例において、ＥＬＩＳＡ法による測定は９６ウェルマイクロプレート（以下単に「プレート」と略記する。）を用いて行った。プレートには、Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（ヌンク社製）を用いた。【００９３】
＜参考例１＞抗キトサンポリクローナル抗体の作製
（１）免疫抗原の調製（キトサン−ウシ血清アルブミン複合体の調製）
動物を免疫する抗原には、キトサンヘキサマー（ＣＴＳ６）にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を共有結合した複合体（以下「ＣＴＳ６−ＢＳＡ」という。）を用いた。ＣＴＳ６−ＢＳＡの調製手順を以下に示す。【００９４】
ＣＴＳ６（生化学工業社製）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した溶液４ｍＬを３０分間撹拌した後、ＥＭＣＳ溶液（Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ、ピアス社製）１０．４ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．１ｍＬに添加して調製）を添加して１時間撹拌し、マレイミド基を有するＣＴＳ６（以下「ＣＴＳ６−ＭＡＬ」という。）を調製した。この溶液をゲル濾過カラム（ＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、溶出液を０．５ｍＬに分画して回収した。移動相には０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。ＣＴＳ６−ＭＡＬの溶出画分は２８０ｎｍの吸光度を指標として確認した。このようにしてＣＴＳ６−ＭＡＬ（全量：３ｍＬ）を得た。【００９５】
ＢＳＡ（Ａｒｍｏｕｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ６．０）に溶解した溶液５ｍＬにＳＰＤＰ溶液（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、ピアス社製）１０ｍｇをＤＭＦ０．１８ｍＬに添加して調製）を添加して１時間撹拌した後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）２ｍＬ、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０）０．４ｍＬ、１Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン（ｐＨ７．０）４ｍＬを順に添加して４分間撹拌し、チオール基を有するＢＳＡ（以下「ＢＳＡ−ＳＨ」という。）を調製した。この溶液をゲル濾過カラム（ＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライし、溶出液を０．５ｍＬに分画して回収した。移動相には５ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。ＢＳＡ−ＳＨの溶出画分は２８０ｎｍの吸光度を指標として確認した。このようにしてＢＳＡ−ＳＨ（全量：６ｍＬ）を得た。【００９６】
上記ＢＳＡ−ＳＨの溶液６ｍＬを限外ろ過（セントリコン３０、ミリポア社製）により３ｍＬに濃縮した後、上記ＣＴＳ６−ＭＡＬの溶液３ｍＬを添加して４℃で一晩撹拌し、ＣＴＳ６−ＢＳＡを調製した。この溶液をゲル濾過カラム（ＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライし、溶出液を０．５ｍＬに分画して回収した。移動相には０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いた。ＣＴＳ６−ＢＳＡの溶出画分は２８０ｎｍの吸光度を指標として確認した。このようにして得たＣＴＳ６−ＢＳＡの溶液を限外ろ過（セントリコン３０）により２０ｍｇ／ｍＬ（全量：１．３ｍＬ）に濃縮し、以後の試験に用いた。【００９７】
（２）抗キトサンポリクローナル抗体の調製
抗キトサンポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）は、ＣＴＳ６−ＢＳＡを用いてニワトリを免疫して調製した。ＣＴＳｐＡｂの調製手順を以下に示す。【００９８】
前記ＣＴＳ６−ＢＳＡの溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）０．０１５ｍＬに０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を０．４８５ｍＬ添加して懸濁した後、フロイント完全アジュバント（シグマ・アルドリッチ社製）を０．５ｍＬ添加してエマルジョンを形成させた。このエマルジョン全量をニワトリ（シェーバー種、２．５ヶ月齢）の腹腔へ投与して１次免疫した。初回免疫から４週間後、同様に調製したエマルジョンを再度腹腔へ投与して２次免疫した。抗体価の上昇を確認するため、初回免疫から１週間ごとに採血をし、キトサンに対する血清抗体価を後述する＜参考例２＞のＥＬＩＳＡ法で評価した。血清抗体価の上昇が観察されたニワトリに対し、前記ＣＴＳ６−ＢＳＡの溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）０．０１５ｍＬに０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を０．４８５ｍＬ添加して懸濁した溶液を静脈へ投与して３次免疫した。【００９９】
初回免疫から１２週間後（３次免疫から３週間後）のニワトリから全採血し、遠心後の上清を回収して血清を得た。このようにして得た血清を「抗キトサンポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）」として以後の実験に用いた。【０１００】
＜参考例２＞抗キトサンポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるキトサンの測定
（１）結合法による測定
結合法により、ＣＴＳｐＡｂのＣＴＳに対する結合特異性を確認した。プレートに固相化する抗原には、キトサン（ＣＴＳ、生化学工業社製、脱アセチル化度：８０％以上）、グリコールキトサン（ＧＣＴＳ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、脱アセチル化度：７６．２％）、又はエチレングリコールキチン（ＥＧＣＴＮ、生化学工業社製）を用いた。【０１０１】
上記各種抗原に１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して２μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ブロックエース（ＢＡ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置し、上記各種抗原の固相化プレートを作成した。この固相化プレートに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という。）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで１６０００倍希釈したＣＴＳｐＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（以下「ＴＭＢ試薬」という。ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６（生化学工業社製）で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。結果を表１に示す。【０１０２】
【表１】
2016153058.tif 000003
【０１０３】
表１に示した通り、キトサンで免疫したニワトリの血清（ＣＴＳｐＡｂ）はＣＴＳに最も強い反応を示した。また、ＣＴＳｐＡｂはＧＣＴＳには反応を示したが、ＥＧＣＴＮには反応を示さなかった。以上より、抗キトサンポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）は、キチンには反応を示さず、キトサンに特異性が高い抗体であることを確認した。【０１０４】
（２）競合法による測定
競合法により、ＣＴＳｐＡｂのＣＴＳに対する結合特異性を確認した。競合物質としてはＣＴＳ、ＧＣＴＳ、又はＥＧＣＴＮを用いた。【０１０５】
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して２μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置し、ＣＴＳの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、上記競合物質に１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔを添加して０．０１〜１０μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液又は１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔそのもの（競合物質を含まない）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、続いて１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで１６０００倍希釈したＣＴＳｐＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。結果を表２に示す。【０１０６】
【表２】
2016153058.tif 000004
【０１０７】
表２は競合物質を添加しなかった場合の吸光度に対する吸光度の減少率を阻害率として百分率換算した結果である。表２に示した通り、ＣＴＳｐＡｂはＣＴＳやＧＣＴＳによってプレート上のＣＴＳとの結合が阻害されたが、ＥＧＣＴＮによっては阻害されなかった。以上より、抗キトサンポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）は、キチンには反応を示さず、キトサンに特異性が高い抗体であることを競合法によっても確認した。【０１０８】
＜参考例３＞抗キトサンポリクローナル抗体が結合するキトサンオリゴ糖の分子サイズ
３〜６量体のＣＴＳオリゴ糖（生化学工業社製）を競合物質とした競合ＥＬＩＳＡ法により、ＣＴＳｐＡｂによる測定が可能なＣＴＳの分子サイズを確認した。【０１０９】
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して２μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置し、ＣＴＳの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＣＴＳオリゴ糖に１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔを添加して０．０００６４〜１０μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液又は１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔそのもの（ＣＴＳオリゴ糖を含まない）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、続いて１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで８０００倍希釈したＣＴＳｐＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。結果を表３に示す。【０１１０】
【表３】
2016153058.tif 000005
【０１１１】
表３はＣＴＳオリゴ糖を添加しなかった場合の吸光度に対する吸光度の減少率を阻害率として百分率換算した結果である。表３に示した通り、ＣＴＳｐＡｂは３〜６量体のＣＴＳオリゴ糖によってプレートに固相化したＣＴＳとの結合が阻害された。以上より、抗キトサンポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）を用いたＥＬＩＳＡ法では、３量体以上の分子サイズを有するキトサンの測定が可能であることを確認した。【０１１２】
＜参考例４＞抗キトサンモノクローナル抗体の作製
抗キトサンモノクローナル抗体（ＣＴＳｍＡｂ）の作製は、文献（ＷＯ２０１１／０４９０８２）に記載された方法を参照して行った。ＣＴＳｍＡｂの調製手順を以下に示す。【０１１３】
（１）ファージ抗体ライブラリーの作製
ファージ抗体ライブラリーの作製は、文献（nakamura et al., J Vet Med Sci. 2004 Jul; 66(7): 807-14.）に記載された方法を参照して行った。【０１１４】
前記＜参考例１＞で全採血を行ったニワトリの脾臓から単離したリンパ球からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲによって抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子配列それぞれの増幅を行った。次に、重鎖の可変領域をコードする遺伝子配列と軽鎖の同配列を連結した遺伝子配列を一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）の発現ベクター（ファージミドベクター）にクローニングした後、このベクターをファージ粒子にパッケージングした。そして、このファージ粒子を大腸菌に感染させてファージを増幅させた。このようにしてファージ抗体ライブラリーを作製した。【０１１５】
（２）ファージ抗体のスクリーニング
ＣＴＳに結合するファージ抗体のスクリーニングは、ＣＴＳを固相化したプレートを用いたパニングにより行った。【０１１６】
上記（１）で得たファージ抗体ライブラリーをＣＴＳを固相化したプレートに添加した。プレートを洗浄した後、ＣＴＳに結合した大腸菌からファージを回収した。その後、このファージを大腸菌に再度感染させてファージを増幅させた。このようにして得たパニング後のファージ抗体ライブラリーをＣＴＳを固相化試料として用いた結合ＥＬＩＳＡ法に供し、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）を用いた時の吸光度を測定した。【０１１７】
上記の操作は、吸光度の上昇が認められるようになるまで繰り返し行った。【０１１８】
上記により得たファージをクローン化した後にＧＣＴＳ又はＥＧＣＴＮを固相化試料として用いた結合ＥＬＩＳＡ法に供し、ＣＴＳに特異的に結合する（ＣＴＳ及びＧＣＴＳに結合し、ＥＧＣＴＮに結合しない）ファージのクローンを得た。【０１１９】
（３）抗キトサンモノクローナルＩｇＹ抗体の調製
抗キトサンモノクローナルＩｇＹ抗体の調製は、文献（Shimamoto et al., Biologicals. 2005 Sep; 33(3): 169-74.）に記載された手法を参照して行った。【０１２０】
上記（２）で得たＣＴＳに特異的に結合する抗体をコードするファージのクローンを鋳型としたＰＣＲにより、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子配列それぞれの増幅を行った。その後、これらの遺伝子をＩｇＹ発現ベクターへクローニングした。そして、この発現ベクターを用いて形質転換したＨＥＫ２９３細胞を培養し、培養液を精製して、＜参考例１＞で得たポリクローナル抗体（ＣＴＳｐＡｂ）と同じエピトープを認識するモノクローナル抗体（ＣＴＳｍＡｂ）を得た。【０１２１】
＜参考例５＞ＨＲＰ標識抗キトサンモノクローナル抗体の作製
ＥＬＩＳＡ法に用いる検出抗体には西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）で標識したＣＴＳｍＡｂ（ＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂ）を用いた。ＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学社製）を用いて調製した。ＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂの調製手順を以下に示す。【０１２２】
Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに１００μＬのＷａｓｈｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒとＣＴＳｍＡｂ（３．７ｍｇ／ｍＬ）５４μＬを順に添加して混合した後、８０００×ｇで１０分間遠心した。その後、Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに１００μＬのＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、再度８０００×ｇで１０分間遠心した。【０１２３】
次に、ＨＲＰ標識溶液（ＮＨ２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを１０μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解して調製）をＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに添加して混合した後、３７℃に２時間静置した。その後、Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに１００μＬのＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、８０００×ｇで１５分間遠心した。続いて、Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに２００μＬの保存溶液（５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）／０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０）を添加して混合し、全量を回収した。このようにしてＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂを得た。【０１２４】
＜参考例６＞菌体の調製
本願実施例の一部においては、培養により調製した菌体（以下「培養菌体」という。）を含有する試料を測定対象として接合菌の測定を行った。本願の実施例において、「菌体」の語は、真菌（Fungi）と真正細菌（Bacteria）を含む微生物の総称として使用される。培養菌体の調製に使用した菌体を表４に示す。【０１２５】
【表４】
2016153058.tif 000006
【０１２６】
表４に示した菌体のうち、Escherichia coli DH5αはタカラバイオ社から、その他菌体はアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection, ATCC）、理化学研究所微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms, JCM）、帝京大学医真菌研究センター（Teikyo University Institute of Medical Mycology, TIMM）、又は製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center, NBRC）から入手した。【０１２７】
表４に示した各種菌体を１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にそれぞれ植菌し、２０〜４４時間振盪培養した。培養する時の温度は、真正細菌は３７℃、真菌は室温とした。培養は増殖曲線が静止期（定常期）に達したことを確認した後に終了した。このようにして得られた培養液から培地を除去し、菌体を回収した。【０１２８】
菌体を洗浄するため、上記で回収した菌体を洗浄液（生理食塩水（大塚製薬社製））に懸濁した後、洗浄液を除去し、菌体を再度回収した。当該洗浄の操作は２回繰り返して行った。【０１２９】
上記洗浄後の菌体のうち、真正細菌（グラム陰性菌、グラム陽性菌）を１ｍＬの蒸留水（大塚製薬社製）に懸濁し、培養菌体の懸濁液を調製した。このようにして得た菌体の懸濁液を「培養菌体懸濁液」として以後の試験に用いた。【０１３０】
次に、培養菌体懸濁液と蒸留水を混合して１０倍希釈する操作を吸光度の測定値がブランク値（蒸留水に対する吸光度）と同じになるまで繰り返し、培養菌体懸濁液の希釈液を調製した。このようにして得た希釈液を「培養菌体試料」として以後の試験に用いた。【０１３１】
また、上記洗浄後の菌体のうち、真菌（接合菌を含む）は培養により得られる菌体の凝集塊そのものを「培養菌体試料」として以後の試験に用いた。【０１３２】
＜参考例７＞不活化菌体の調製
本願の実施例の一部においては、作業上の安全確保の理由により、高圧蒸気滅菌により不活化した培養菌体（以下「不活化菌体」という。）を使用した。不活化菌体の調製手順を以下に示す。【０１３３】
上記＜参考例６＞で得た試料のうち、真正細菌は培養菌体懸濁液を、真菌は培養菌体試料を、それぞれ高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分間）に供し、菌体を不活化した。次に、高圧蒸気滅菌により菌体の一部が形成する凝集塊を除去するため、低速度の遠心分離により凝集塊を沈殿させた後、上清から菌体の懸濁液を回収した。凝集塊はＥＬＩＳＡにおいて抗原抗体反応を物理的に阻害する可能性があるため、これを除去した溶液（上清の菌体懸濁液）を以後の試験に用いた。このようにして得た不活化後の菌体懸濁液を「不活化菌体懸濁液」として以後の試験に用いた。【０１３４】
次に、不活化菌体懸濁液と蒸留水を混合して１０倍希釈する操作を吸光度の測定値がブランク値（蒸留水に対する吸光度）と同じになるまで繰り返し、不活化菌体懸濁液の希釈液を調製した。このようにして得た希釈液を「不活化菌体試料」として以後の試験に用いた。【０１３５】
＜参考例８＞標準曲線
以下の手順に従い、ＣＴＳ含有ヒト血清、及びＣＴＳ含有ウサギ血清を調製した。【０１３６】
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して６２．５ｎｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対して等量の１％（ｖ／ｖ）酢酸を混合する操作を繰り返し、６２．５〜３．９ｎｇ／ｍＬのＣＴＳ希釈液を調製した。これらのＣＴＳ希釈液５μＬにヒト血清又はウサギ血清を４５μＬ混合して６．２５〜０．３９ｎｇ／ｍＬのＣＴＳを含有する標準試料を調製した。この試料を０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４５０μＬと混合し、以後の試験に用いた。【０１３７】
ＣＴＳの測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。測定の手順を以下に示す。【０１３８】
ＣＴＳｍＡｂを９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈して２００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して２時間静置し、ＣＴＳｍＡｂの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、試料（ＣＴＳ含有ヒト血清又はＣＴＳ含有ウサギ血清）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。続いて、プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで８００００倍希釈したＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。測定はプレートを３７℃に加温した状態で行った。【０１３９】
上記測定の結果を表５に示す。【０１４０】
【表５】
2016153058.tif 000007
【０１４１】
表５に示した通り、同じキトサン濃度の試料を測定した場合の測定値は、ウサギ血清を用いた場合とヒト血清を用いた場合とで同等であった。ウサギ血清はヒト血清と比べて入手が容易であり、かつウイルス等への感染リスクが低減されることから、標準曲線の作成において好適に使用することができる。そこで以後の試験で使用する標準曲線は、ウサギ血清を用いて作成する場合がある。【０１４２】
＜実施例１＞真菌症等の感染症に罹患したヒトの血清を試料とした接合菌の測定
本願実施例の一部においては、真菌症等の感染症に罹患したヒトの血清を試料として接合菌の測定を行った。当該試料は帝京大学医真菌研究センター（Teikyo University Institute of Medical Mycology, TIMM）から入手した。【０１４３】
真菌症等の感染症に罹患したヒトの血清を試料とし、接合菌の測定を行った。接合菌の測定はＣＴＳｐＡｂを用いた競合ＥＬＩＳＡ法により行い、酸処理の有無による測定の結果の違いを比較した。【０１４４】
競合物質（測定対象試料）は以下の通りに調製した。【０１４５】
（ａ）ヒト血清（酸処理なし）：
ヒト血清０．０２５ｍＬに１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔを０．２２５ｍＬ添加して調製した。【０１４６】
（ｂ）ヒト血清（酸処理あり）：
ヒト血清０．０２２ｍＬに終濃度で１％（１７５ｍＭ）となるように２％（ｖ／ｖ）酢酸を０．０２２ｍＬ添加して３０秒間撹拌した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔを０．１７６ｍＬ添加して調製した。この時、ヒト血清に酢酸を添加した時のｐＨは４．１であり、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔを添加した後のｐＨは４．９であった。【０１４７】
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して２μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置し、ＣＴＳの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＣＴＳｐＡｂと競合物質（ａ）又は（ｂ）の混合液（１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで１６０００倍希釈したＣＴＳｐＡｂと競合物質を等量ずつ混合し、４℃で２１時間静置して調製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ニワトリＩｇＹ（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。測定はプレートを３７℃に加温した状態で行った。【０１４８】
上記測定の結果を図１と表６に示す。【０１４９】
【表６】
2016153058.tif 000008
【０１５０】
表６は酸処理なしのヒト血清（コージンバイオ社製）を競合物質として添加した場合の吸光度に対する吸光度の減少率を阻害率として百分率換算した結果である。図１と表６に示した通り、酸処理をしなかった場合はいずれのヒト血清もＣＴＳｐＡｂとプレートに固相化したＣＴＳとの結合を阻害しなかったが、酸処理をした場合は接合菌症ではないヒトに由来する血清（検体番号：５〜９、健常人由来ヒト血清を含む）が１０％以下の阻害率であったのに対し、接合菌症のヒトに由来する血清（検体番号：１〜４、検体はそれぞれ異なるヒトに由来する）は３０％以上の阻害率を示し、顕著にＣＴＳｐＡｂとＣＴＳとの結合を阻害した。以上より、血清に対して酸処理を行うことにより、試料が含有する接合菌の測定が可能になること、及び菌体として接合菌のみを特異的に検出できることを臨床検体において確認した。【０１５１】
＜実施例２＞ヒト血清を試料とした接合菌の測定（１）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料（酸処理なし、酸処理あり）、菌体を含有しない試料（ブランク試料）、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０１５２】
（ａ）菌体含有試料（酸処理なし）：
不活化菌体試料２５μＬとヒト血清２２５μＬを混合して調製した試料に対して２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２５０μＬ混合した。【０１５３】
（ｂ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料２５μＬとヒト血清２２５μＬを混合して調製した試料に対して５％（ｖ／ｖ）酢酸を６２．５μＬ混合し、室温に１分間静置して酸処理を行った。その後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１８７．５μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１５４】
（ｃ）菌体不含試料（ブランク試料）：
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記（ｂ）と同じ操作を行った。【０１５５】
（ｄ）ＣＴＳ標準液：
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して２００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対して等量の１％（ｖ／ｖ）酢酸を混合する操作を繰り返し、２００〜２５ｎｇ／ｍＬのＣＴＳ希釈液を調製した。これらのＣＴＳ希釈液２５μＬにウサギ血清２２５μＬを混合して２０〜２．５ｎｇ／ｍＬのＣＴＳを含有する標準試料を調製した。この試料を２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５０μＬと混合し、以後の試験に用いた。【０１５６】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。測定の手順を以下に示す。【０１５７】
ＣＴＳｍＡｂに９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を混合して０．２μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して２時間静置し、ＣＴＳｍＡｂの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、試料を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。その後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで４００００倍希釈したＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。測定はプレートを３７℃に加温した状態で行った。【０１５８】
上記測定の結果を表７に示す。【０１５９】
【表７】
2016153058.tif 000009
【０１６０】
表７において、「＋」は酸処理を行ったことを、「−」は酸処理を行わなかったことを意味する。またＣＴＳ濃度は、吸光度の測定値（平均値）から標準曲線を用いて算出されるＣＴＳ濃度への換算値である。【０１６１】
表７に示したとおり、真正細菌（グラム陰性菌）であるEscherichia coliを含有する試料の測定値は、酸処理の有無によらずブランク値以下であった。その一方、接合菌を含有する試料の測定値は、酸処理を行わない場合にはブランク値以下であったが、酸処理を行った場合にはブランク値以上の有意な値を示し、試料中にキトサンが存在すること、すなわち接合菌が存在することを確認できた。以上より、血清に対して酸処理を行うことにより、試料が含有する接合菌の測定が可能になること、及び菌体として接合菌のみを特異的に検出できることを臨床検体以外の試料においても確認した。【０１６２】
＜実施例３＞ヒト血清を試料とした接合菌の測定（２）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、菌体を含有しない試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０１６３】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料１２．５μＬとヒト血清１１２．５μＬを混合して調製した試料に対して５％（ｖ／ｖ）酢酸を３１．３μＬ混合し、室温に１分間静置して酸処理を行った。その後、０．８Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を９３．７μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１６４】
（ｂ）菌体不含試料（ブランク試料）：
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０１６５】
（ｃ）ＣＴＳ標準液：
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して１００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対して等量の１％（ｖ／ｖ）酢酸を混合する操作を繰り返し、２５〜１．５６ｎｇ／ｍＬのＣＴＳ希釈液を調製した。これらのＣＴＳ希釈液１２．５μＬにウサギ血清１１２．５μＬを混合して２．５〜０．１５６ｎｇ／ｍＬのＣＴＳを含有する標準試料を調製した。この試料を０．８Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５０μＬと混合し、以後の試験に用いた。【０１６６】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法はＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂの希釈倍率を８００００倍に変更したことを除き、実施例２に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表８に示す。【０１６７】
【表８】
2016153058.tif 000010
【０１６８】
表８に示したとおり、真正細菌（グラム陽性菌）であるStaphylococcus aureus、又は接合菌以外の真菌であるCandida albicansもしくはAspergillus fumigatusを含有する試料の測定値は、いずれもブランク値以下であった。その一方、接合菌を含有する試料の測定値は、ブランク値以上の有意な値を示し、試料中にキトサンが存在すること、すなわち接合菌が存在することを確認できた。以上より、血清に対して酸処理を行うことにより、試料が含有する接合菌の測定が可能になること、及び菌体として接合菌のみを特異的に検出できることを実施例２とは異なる接合菌（ムーコル属以外の接合菌）を含有する試料においても確認した。【０１６９】
以上、実施例２及び実施例３に示した通り、酸処理を行うことにより種々の菌体の中から接合菌のみを特異的に検出できることが分かった。また、ムーコル属の接合菌を含有する試料の測定値は、いずれも他の接合菌を含有する試料の測定値に比して高い値（ＣＴＳ濃度への換算値において１ｎｇ／ｍＬ以上の値）を示した。よって、本発明において測定対象とする接合菌としては、ムーコル属の真菌が特に好適であることが示された。【０１７０】
また、実施例２及び実施例３に示した通り、測定法としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた場合は、接合菌以外の菌体を含有する試料の測定値はいずれもブランク（菌体を含有しない試料）の測定値に対して有意差がない値を示し、キトサン濃度に換算した時にその値がゼロになることが分かった。一方、実施例１に示した通り、測定法として競合ＥＬＩＳＡ法を用いた場合は、接合菌以外の菌体を含有する試料の測定値もブランク（菌体を含有しない試料）の測定値よりも低い値を示したため、キトサン濃度に換算した時にその値がゼロとはならないことが分かり、健常人由来試料を陰性コントロールとして同時に測定することが必須であることが分かった。すなわち、本発明においてＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いることが測定の利便性の観点から好適であることが分かった。【０１７１】
＜実施例４＞酸の種類の検討
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。【０１７２】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料２．５μＬとヒト血清２２．５μＬを混合して調製した試料に対して２％（ｖ／ｖ）の酸（硫酸、塩酸、ギ酸、又はリン酸）又は２％（ｗ／ｖ）の酸（クエン酸）を２５μＬ混合し、室温に１分間静置して酸処理を行った。その後、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２００μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１７３】
（ｂ）菌体不含試料（ブランク試料）：
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０１７４】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例３に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表９に示す。【０１７５】
【表９】
2016153058.tif 000011
【０１７６】
表９において、酸処理を行っている時（酸処理時）の酸の濃度、すなわち、試料に対して酸を混合した時（中和処理を行う前）における当該酸のモル濃度は、硫酸においては１８０ｍＭ、塩酸においては１２０ｍＭ、ギ酸においては２６０ｍＭ、クエン酸においては５２ｍＭ、リン酸においては１４６ｍＭである。【０１７７】
表９に示したとおり、酢酸以外を用いて酸処理を行った場合においても、接合菌以外の菌体を含有する試料の測定値はいずれもブランク値以下であった。その一方、接合菌を含有する試料の測定値は、酢酸を用いて酸処理を行った場合と同様に、ブランク値以上の有意な値を示し、試料中にキトサンが存在すること、すなわち接合菌が存在することを確認できた。以上より、血清に対して酸処理を行うことにより、試料が含有する接合菌の測定が可能になること、及び菌体として接合菌のみを特異的に検出できることを、酢酸以外の酸を用いた酸処理を行った場合においても確認した。【０１７８】
＜実施例５＞酸処理する時間の検討
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。【０１７９】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料５μＬとヒト血清４５μＬを混合して調製した試料に対して２％（ｖ／ｖ）酢酸を５０μＬ混合し、室温に所定時間（１０分間、１時間、又は２時間）静置して酸処理を行った。その後、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２００μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１８０】
（ｂ）菌体不含試料（ブランク試料）：
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０１８１】
（ｃ）ＣＴＳ標準液：
実施例３に記載した手順に従い調製した。【０１８２】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例３に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１０に示す。【０１８３】
【表１０】
2016153058.tif 000012
【０１８４】
表１０に示したとおり、酸処理する時間には依存せず、試料が含有する接合菌の測定が可能であった。【０１８５】
＜実施例６＞酸処理する温度の検討
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。【０１８６】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料５μＬとヒト血清４５μＬを混合して調製した試料に対して２％（ｖ／ｖ）酢酸を５０μＬ混合し、所定の温度（室温（２５℃）、３７℃、５０℃、又は７０℃）に１０分間静置して、試料自体を各設定温度にして酸処理を行った。その後、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４００μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１８７】
（ｂ）菌体不含試料（ブランク試料）：
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０１８８】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例３に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１１に示す。【０１８９】
【表１１】
2016153058.tif 000013
【０１９０】
表１１に示したとおり、酸処理する時の温度には依存せず、試料が含有する接合菌の測定が可能であった。【０１９１】
＜実施例７＞酸処理時のｐＨの検討（１）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０１９２】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
１ｍｍ四方の培養菌体試料（Cunninghamella bertholletiae）にヒト血清０．５ｍＬと蒸留水０．５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去した。次に、ヒト血清０．４５ｍＬと蒸留水０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去する操作を２回繰り返した。続いて、ヒト血清０．４５ｍＬと酢酸（２％、１％、０．４％、又は０．１％）０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、室温に５分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清０．１ｍＬに０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．４ｍＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０１９３】
（ｂ）菌体含有試料（酸処理なし）：
酢酸に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０１９４】
（ｃ）ＣＴＳ標準液：
ＣＴＳに１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加して１０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対して等量の１％（ｖ／ｖ）酢酸を混合する操作を繰り返し、１０００〜１５．６２５ｎｇ／ｍＬのＣＴＳ希釈液を調製した。これらのＣＴＳ希釈液０．１ｍＬにヒト血清０．９ｍＬを混合して１００〜１．５６２５ｎｇ／ｍＬのＣＴＳを含有する標準試料を調製した。この試料を０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．４ｍＬと混合し、以後の試験に用いた。【０１９５】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。測定の手順を以下に示す。【０１９６】
ＣＴＳｍＡｂに９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を混合して１μｇ／ｍＬとなるように調製した溶液をプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩静置した。９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を２回繰り返した後、２５％ＢＡ／９．５７ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して２時間静置し、ＣＴＳｍＡｂの固相化プレートを作成した。この固相化プレートにＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、試料を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置した。その後、１０％ＢＡ／ＰＢＳ−Ｔで８００００倍希釈したＨＲＰ標識ＣＴＳｍＡｂを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔを３００μＬ／ｗｅｌｌで添加して洗浄する操作を４回繰り返した後、ＴＭＢ試薬を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して１５分間静置し、続いて１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。吸光度の測定はウェルリーダーＭＰ−９６で行い、測定波長を４５０ｎｍ、対照波長を６３０ｎｍに設定した。測定はプレートを３７℃に加温した状態で行った。【０１９７】
上記測定の結果を表１２に示す。【０１９８】
【表１２】
2016153058.tif 000014
【０１９９】
表１２において、「酢酸濃度」は試料と酢酸を混合した時（酸処理時）における酢酸の終濃度を、「酸処理時ｐＨ」は酸処理時における試料溶液のｐＨを、それぞれ示している。【０２００】
表１２に示したとおり、ｐＨが６．５又はそれ以上の場合には酸処理による接合菌の測定の高感度化は認められなかったが、ｐＨが６．５未満の場合には酸処理による接合菌の測定の高感度化が可能であることが示唆された。具体的には、５以下のｐＨにおいて酸処理による接合菌の測定の高感度化が可能であることが確認された。【０２０１】
＜実施例８＞酸処理時のｐＨの検討（２）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０２０２】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
１ｍｍ四方の培養菌体試料（Rhizopus oryzae）にヒト血清０．５ｍＬと蒸留水０．５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去した。次に、ヒト血清０．４５ｍＬと蒸留水０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去する操作を２回繰り返した。続いて、ヒト血清０．４５ｍＬと塩酸（０．５Ｎ、０．１Ｎ、又は０．０５Ｎ）０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、室温に５分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清０．１ｍＬに０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．４ｍＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０２０３】
（ｂ）菌体含有試料（酸処理なし）：
塩酸に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０２０４】
（ｃ）ＣＴＳ標準液：
実施例７に記載した手順に従い調製した。【０２０５】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例７に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１３に示す。【０２０６】
【表１３】
2016153058.tif 000015
【０２０７】
表１３において、「塩酸濃度」は試料と塩酸を混合した時（酸処理時）における塩酸の終濃度を、「酸処理時ｐＨ」は酸処理時における試料溶液のｐＨを、それぞれ示している。【０２０８】
表１３に示したとおり、酸処理時ｐＨの下限は特に制限されず、０以上の任意のｐＨにおいて酸処理による接合菌の測定の高感度化が可能であることが示唆された。具体的には、０．７以上のｐＨにおいて酸処理による接合菌の測定の高感度化が可能であることが確認された。また、５．２以下のｐＨにおいて酸処理による接合菌の測定の高感度化が可能であることが確認された。【０２０９】
以上の実施例７及び実施例８の結果より、接合菌の測定が高感度化される酸処理時ｐＨの範囲は、０〜６、より好ましくは０．５〜６又は０〜５．５、さらに好ましくは０．５〜５．５であることが示された。【０２１０】
＜実施例９＞ヒト血清を試料とした接合菌の測定（３）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０２１１】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
１ｍｍ四方の培養菌体試料（Cunninghamella bertholletiae、及びBasidiobolus ranarum）にヒト血清０．５ｍＬと蒸留水０．５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去した。次に、ヒト血清０．４５ｍＬと蒸留水０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去する操作を２回繰り返した。続いて、ヒト血清０．４５ｍＬと２％（ｖ／ｖ）酢酸０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、室温に５分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清０．１ｍＬに０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．４ｍＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０２１２】
（ｂ）ＣＴＳ標準液：
実施例７に記載した手順に従い調製した。【０２１３】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例７に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１４に示す。【０２１４】
【表１４】
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【０２１５】
表１４に示したとおり、酸処理はムーコル目の接合菌（Cunninghamella bertholletiae）のみならず、エントモフトラ目の接合菌（Basidiobolus ranarum）に対しても有効であった。【０２１６】
＜実施例１０＞ヒト血清を試料とした接合菌の測定（４）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０２１７】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
１ｍｍ四方の培養菌体試料（Cunninghamella bertholletiae）にヒト血清０．５ｍＬと蒸留水０．５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去した。次に、ヒト血清０．４５ｍＬと蒸留水０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去する操作を２回繰り返した。続いて、ヒト血清０．４５ｍＬと酢酸（１００％（ｖ／ｖ）酢酸０．０１ｍＬ、２５％（ｖ／ｖ）酢酸０．０４ｍＬ、１０％（ｖ／ｖ）酢酸０．１ｍＬ、又は２％（ｖ／ｖ）酢酸０．４５ｍＬ）を添加して３０秒間撹拌した後、室温に５分間静置して酸処理を行った。全量１ｍＬとなるように蒸留水を混合した後、遠心後の上清０．１ｍＬに０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．４ｍＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０２１８】
（ｂ）ＣＴＳ標準液：
実施例７に記載した手順に従い調製した。【０２１９】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例７に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１５に示す。【０２２０】
【表１５】
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【０２２１】
表１５において、「酢酸濃度」は酸処理のために試料に添加した酢酸の濃度を、「添加量」は酸処理のために試料に添加した酢酸の量を、「血清濃度」は酸処理時におけるヒト血清の濃度を、「酸処理時ｐＨ」は酸処理時における溶液のｐＨを、それぞれ示している。【０２２２】
表１５に示したとおり、酸処理時におけるヒト血清の濃度に依らず、試料中にキトサンが存在すること、すなわち接合菌が存在することを確認できた。よって、本発明においては、試料を水等の溶媒によって希釈する前処理は必要とせず、試料（例えば、ヒト血清）をそのまま酸処理に供することが可能であることを確認できた。【０２２３】
＜実施例１１＞ヒト血清を試料とした接合菌の測定（５）
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。【０２２４】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
不活化菌体試料（Mucor racemosus）８μＬとヒト血清７２μＬを混合して調製した試料に対して５％（ｖ／ｖ）酢酸を２０μＬ混合し、室温に５分間静置して酸処理を行った。その後、０．８Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を６０μＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０２２５】
（ｂ）菌体含有試料（酸処理なし）：
酢酸に代えて蒸留水を用い、上記（ａ）と同じ操作を行った。【０２２６】
ＣＴＳｍＡｂが結合したラテックス粒子の溶液（ＣＴＳｍＡｂ感作ラテックス液）は、市販のキット（ＩＭＭＵＴＥＸ  Ｐ０３０７（ＪＳＲ社製））を用い、添付文書に記載された方法に従って調製した。調製の手順を以下に示す。【０２２７】
免疫診断用ポリマー粒子溶液１２５μＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０、４２０μＬ）、ＣＴＳｍＡｂ（３．７ｍｇ／ｍＬ、２５μＬ）を混合した溶液を室温に１時間静置した。この混合液に１％ＥＤＣ・ＨＣｌ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride）溶液１２．５μＬ混合し、室温に１時間静置した。この混合液を１５，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除去してポリマー粒子を回収した。この粒子と０．５ｍＬの２５％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅを混合した後、超音波処理をした。この混合液を１５，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除去してポリマー粒子を再度回収した。この粒子と０．５ｍＬのＲ２  Ｂｕｆｆｅｒを混合した後、超音波処理をした。この混合液を室温に１時間静置した後、再度超音波処理をして粒子を分散させた。その後、この混合液を３７℃に２０時間静置した。このようにして得た混合液を「ＣＴＳｍＡｂ感作ラテックス液」として以後の試験に用いた。【０２２８】
接合菌の測定はラテックス凝集法により行った。測定の手順を以下に示す。【０２２９】
試料７５μＬを反応板（セロダイレクト‘栄研’クリプトコックス、栄研化学社製）の１区画に滴下して区画内に広げた後、ＣＴＳｍＡｂ感作ラテックス液２５μＬを滴下した。この反応板を水平回転振盪器で１０分間振盪して試料とラテックス液を混合した後、凝集塊の有無を目視で確認した。【０２３０】
上記試験の結果、酸処理した試料は凝集塊を生成するが、酸処理をしていない試料は凝集塊を生成しないことを確認した。すなわち、接合菌の測定は凝集法によっても可能であることが確認された。よって、抗体が結合したラテックス等の粒子を使用する他の測定法（比濁法、比ろう法等）によっても接合菌の測定が可能であることは、当業者に容易に理解される。さらに、抗体を使用する測定法であって、酵素免疫測定法や凝集法以外の測定法（イムノクロマト法、イムノブロット法等）によっても接合菌の測定が可能であることも、当業者に容易に理解される。【０２３１】
＜実施例１２＞ヒト血清以外を試料とした接合菌の測定
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるＣＴＳ標準液を調製した。【０２３２】
（ａ）菌体含有試料（酸処理あり）：
１ｍｍ四方の培養菌体試料（Rhizopus oryzae、又はCunninghamella bertholletiae）に血漿等（ヒト血漿（コスモバイオ社製）、ウマ血清（コスモバイオ社製）、ウシ血清（日本バイオテスト研究所社製）、ウサギ血清（コージンバイオ社製）、又は生理食塩水（大塚製薬社製））０．５ｍＬと蒸留水０．５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去した。次に、血漿等０．４５ｍＬと蒸留水０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、遠心後の上清から０．９ｍＬを除去する操作を２回繰り返した。続いて、血漿等０．４５ｍＬと２％（ｖ／ｖ）酢酸０．４５ｍＬを添加して３０秒間撹拌した後、室温に５分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清０．１ｍＬに０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．４ｍＬ混合して中和し、酸処理を終了した。【０２３３】
（ｂ）ＣＴＳ標準液：
実施例７に記載した手順に従い調製した。【０２３４】
接合菌の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は実施例７に記載した方法と同一の条件で行った。結果を表１６に示す。【０２３５】
【表１６】
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【０２３６】
表１６に示したとおり、ヒト血清以外の試料を対象とした場合においても接合菌の測定が可能であることを確認した。特に、生理食塩水を試料とした場合において接合菌の測定が可能であったことから、本発明において接合菌の測定を行う試料は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）であってもよいことが示された。よって、本発明において測定の対象となる試料は、接合菌を含有し得る物質である限り特に制限されないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２３７】
本発明によれば、試料が含有する接合菌の測定を高感度に行うことができる。よって、本発明は、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の早期診断に有用な血清学的診断を実現する手段として活用することができる。 【０２３８】
日本国特許出願第２０１５−０６３８８７号（出願日：２０１５年３月２６日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが、具体的かつ個々に記された場合と同程度に参照により本明細書に取り込まれる。
【図１】
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【国際調査報告】
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