(57)【要約】本発明の実施形態は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式（１）で表される加水分解反応（Ｘ：糖質由来の基；Ｙ：一価の置換基）を触媒する活性を有するエンドＭ変異体、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドＭ変異体を提供する。2016136984.tif 000023
2016136984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドＭ変異体。
【化１】
2016136984.tif 000021
（反応式（１）中、Ｘは糖質由来の基、Ｙは一価の置換基を示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｆｕｃはフコシル基を表し、α１−６はＦｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。ＧｌｃＮＡｃ−ＯＨは、ＧｌｃＮＡｃの還元末端の炭素に水酸基が結合していることを示す。Ｈ−ＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの４位の酸素原子に水素原子が結合していることを示す。）
【請求項２】
前記反応式（１）中、Ｙがペプチド又は蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基である請求項１に記載のエンドＭ変異体。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のエンドＭ変異体の存在下、
糖鎖供与体と、
下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、
を反応させることによりＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質を製造するＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法。
【化２】
2016136984.tif 000022
（一般式（１）中、Ｙは１価の置換基を示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、Ｆｕｃはフコシル基を表し、α１−６はＦｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。）
【請求項４】
前記反応において、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数／糖鎖受容体のモル数）が０．２〜２０．０である請求項３に記載のＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドＭ変異体、及びＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を含む製剤中のペプチドや蛋白質の多くは、糖鎖を有する（以下、糖ペプチド又は糖蛋白質という）。糖蛋白質が有する糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖やＯ結合型糖鎖が知られているが、中でもＮ−結合型糖鎖は蛋白質の機能や構造の維持に重要な影響を及ぼすことが知られている。Ｎ−結合型糖鎖は、糖鎖構造の違いから、ハイマンノース型、ハイブリット型及び複合型糖鎖に分類され、糖鎖構造の違いが、糖蛋白質自体の生理機能に影響を及ぼすことが知られている。さらに、近年では、Ｎ結合型糖鎖のコア構造と称される部位のフコース（コアフコース）の有無も、生理機能の違いに強く影響することが知られるようになった。【０００３】
糖鎖構造を制御した糖蛋白質の調製方法としては、天然から分離精製して抽出する方法、遺伝子工学的手法によって改変された細胞により調製する方法が考えられる。しかし、生産性の観点からは、後者の方法かあるいは、上記で得られる糖蛋白質をさらにインビトロで行う酵素−化学的な方法によって、糖蛋白質の糖鎖を目的の糖鎖に変換する方法を組み合わせる方法が有利であると考えられる。特に糖鎖構造を厳密に制御する観点からは、酵素−化学的な方法を組み入れることが有利である。【０００４】
酵素−化学的な方法は、目的の糖鎖を目的の蛋白質に、化学的に調製した糖鎖誘導体（糖鎖供与体）を酵素反応によって導入しようとするものであり、酵素反応においては、酵素の基質となる、糖鎖供与体と糖鎖受容体を必要とする。【０００５】
酵素−化学的な方法としては、加水分解酵素を利用した方法が良く知られているが、これは一部の加水分解酵素が基質に対し加水分解するだけでなく、他の物質に糖鎖転移する性質を利用することによるものであり、反応条件を制御することによって、糖鎖転移反応だけを優先させることが可能であることも知られている。【０００６】
糖蛋白質糖鎖のＮ結合型糖鎖を変換する酵素−化学的な方法としては、近年、毛カビ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（エンドＭ）により、糖鎖供与体であるＮ結合型糖鎖の非還元末端側の大きなオリゴ糖鎖部位を、糖鎖受容体に一度に糖鎖転移する方法が報告されている（例えば特開平７−５９５８７号公報参照）。
また、エンドＭのアミノ酸を改変した変異体（グライコシンターゼ）は、目的とするＮ結合型糖鎖由来の構造を含む糖鎖供与体の糖鎖を糖鎖受容体に効率よく糖鎖転移できることが報告されている（例えばＵｍｅｋａｗａ他、［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５（１），５１１−５２１，（２０１０）］参照）。【０００７】
さらに、エンドＭは、コアフコースを有しないＮ結合型糖鎖において、ハイマンノース型糖鎖、ハイブリット型糖鎖及び複合型糖鎖のすべてを酵素の基質として加水分解するユニークな酵素であることから、糖鎖供与体及び糖鎖受容体の調製においても重用されている。
このように、エンドＭは、酵素-化学的な糖蛋白質調製における重要なツールとしての地位を確立してきた（例えば山本憲二他、[日本応用糖質科学会誌,Ｖｏｌ．３（２），３１−３８，（２０１３）］参照）。【０００８】
一方、報告例は少ないが、コアフコースを有する糖蛋白質のＮ結合型糖鎖を加水分解するエンド酵素〔エンドＤ（例えばＭｕｒａｍａｔｓｕ他、［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２９（６），９２３−９２８，（２００１）］参照）〕も報告されており、エンドＤの変異体は糖鎖供与体を糖鎖転移して、コアフコースを含有する糖蛋白質の糖鎖を目的の糖鎖に変換できることも知られている（例えばＦａｎ他、［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８７（１５），１１２７２−１１２８１，（２０１２）］参照）。
また、コアフコースを含有するＮ結合型糖鎖を有する免疫グロブリンＧを加水分解するエンド酵素〔エンドＳ（例えばＣｏｌｌｉｎ他、［ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．２０（１２），３０４６−３０５５，（２００１）］参照）〕も報告されており、エンドＳの変異体は、糖鎖供与体を糖鎖転移して免疫グロブリンＧの糖鎖を目的の糖鎖に変換できることも報告されている（例えば国際公開第２０１３／１２００６６号参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、エンドＭ以外のエンド酵素は、加水分解時にも、糖鎖転移時にも、用いることができるＮ結合型糖鎖の種類が限定される。
Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他、［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２９（６），９２３−９２８，（２００１）］及びＦａｎ他、［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８７（１５），１１２７２−１１２８１，（２０１２）］に記載のエンド酵素（エンドＤ)は、一部のハイマンノース型糖鎖にしか作用しないという問題点を有する。【００１０】
特開平７−５９５８７号公報及びＵｍｅｋａｗａ他、［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５（１），５１１−５２１，（２０１０）］に記載のエンドＭは、幅広いＮ結合型糖鎖に作用することができるものの、コアフコースを含有するＮ結合型糖鎖を加水分解、又はコアフコースを有する糖鎖受容体に糖鎖転移することはできない。
Ｃｏｌｌｉｎ他、［ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．２０（１２），３０４６−３０５５，（２００１）］及び国際公開第２０１３／１２００６６号に記載のエンドＳは、コアフコースを含有する複合型糖鎖を基質とすることはできるものの、ハイブリッド型糖鎖、ハイマンノース型糖鎖及びそれらに由来する構造の誘導体を基質とすることはできない。さらに、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合したＮ結合型糖鎖以外にはほとんど作用しないという難点を有している。【００１１】
また、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖を含む化合物の化学的な合成法は、コアフコースのグリコシド結合が酸性条件下で切断されやすいために、合成条件が制限される。一方、コアフコースのないＮ結合型糖鎖へ、酵素的にフコースを導入することも考えられるが、インビトロでのそのような酵素的な導入方法はいまだに報告されていない。
このように、コアフコースを含有するＮ結合型糖鎖を加水分解し、さらに糖鎖転移によってコアフコースを有するＮ結合型糖鎖を有する糖蛋白質を調製することが可能なエンドＭの変異体が望まれていた。【００１２】
本開示は上記に鑑みてなされたものであり、本開示では、コアフコースが結合したＮ結合型糖鎖に対して高い加水分解活性を有するエンドＭ変異体、及びＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドＭ変異体である。【００１４】
【化１】
2016136984.tif 000003
【００１５】
（反応式（１）中、Ｘは糖質由来の基、Ｙは一価の置換基を示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｆｕｃはフコシル基を表し、α１−６はＦｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。ＧｌｃＮＡｃ−ＯＨは、ＧｌｃＮＡｃの還元末端の炭素に水酸基が結合していることを示す。Ｈ−ＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの４位の酸素原子に水素原子が結合していることを示す。）
本開示においてＹに結合するＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの１位の還元末端の炭素に結合するグリコシド結合の酸素原子又は水酸基を含まない。
＜２＞  前記反応式（１）中、Ｙがペプチド又は蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基である＜１＞に記載のエンドＭ変異体である。【００１６】
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載のエンドＭ変異体の存在下、糖鎖供与体と、下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、を反応させることによりＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質を製造するＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法である。【００１７】
【化２】
2016136984.tif 000004
【００１８】
一般式（１）中、Ｙは１価の置換基を示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、Ｆｕｃはフコシル基を表し、α１−６は、Ｆｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。
＜４＞  前記反応において、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数／糖鎖受容体のモル数）が０．２〜２０．０である＜３＞に記載のＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本開示によれば、コアフコースが結合したＮ結合型糖鎖に対して高い加水分解活性を有するエンドＭ変異体、及びＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、エンドＡとＭ３Ｎ１−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域の立体モデルを示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、エンドＤとＭ３Ｎ１−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域付近の立体モデルを示す図である。
【図２】図２は、エンドＡ、エンドＤ及びエンドＭの１次アミノ酸配列におけるアライメントの結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例に用いたエンドＭ及びエンドＭ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。矢印はエンドＭ（ＷＴ）もしくはエンドＭ変異体のバンドの位置を示す。
【図４】図４は、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎ及びＭ３−ｂｉｏｔｉｎの合成ルートの概要を示す図である。
【図５】図５は、エンドＭ（ＷＴ）によるＭ３Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎの加水分解反応後の溶液をＨＰＬＣによって測定した結果を示す図である。各矢印は、表記の化合物に相当する保持時間の位置を示す。
【図６】図６は、Ｍ３−ｂｉｏｔｉｎ及びＭ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎを含む溶液に対して、エンドＭ（ＷＴ）及びエンドＭ変異体をそれぞれ添加しインキュベートした後の試料をＴＬＣによって測定した結果を示す図である。
【図７】図７は、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎを含む溶液に対しＷ２５１Ｎ変異体を添加又は無添加後にインキュベートし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドＭ（ＷＴ）による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、Ｗ２５１Ｎ変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドＳによる加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図９】図９は、ヒトラクトフェリンに対するエンドＳ、エンドＭ（ＷＴ）及びＷ２５１Ｎ変異体のそれぞれの加水分解反応後の溶液について、ＳＤＳ―ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ヒトラクトフェリンから調製した糖ペプチドに対し、エンドＭ（ＷＴ）による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヒトラクトフェリンから調製した糖ペプチドに対し、Ｗ２５１Ｎ変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、コアフコースを含有する糖蛋白質（リツキサン）に対して、Ｗ２５１Ｎ変異体によって各時間（０時間〜７２時間）加水分解反応を行った後に得られる反応後生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、エンドＭ変異体による糖鎖転移反応についての概要を示す図である。
【図１３】図１３は、糖鎖転移反応後の溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、糖鎖転移反応後の溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって得られたｍ／ｚ２７１９．８とｍ／ｚ２５７３．９のシグナルを、さらにＭＳ／ＭＳ分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて示された用語について説明する。
数値範囲を表す「〜」はその上限及び下限の数値を含む範囲を表す。
【００２２】
「エンドＭ」は「エンド酵素」の一種を示し、「エンド酵素」は、「エンド−β−Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ」と同じ意味であり、下記一般式（２）の矢印の先を伸ばした位置、すなわちＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＮＡｃの間のグリコシド結合を加水分解する酵素を意味する。「エンド酵素変異体」とは、エンド酵素のアミノ酸の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換したものをいう。更に、本明細書中において、Ｎ結合型糖鎖含有化合物、Ｎ結合型糖鎖含有糖蛋白質、糖鎖供与体、糖鎖受容体、エンドＭ及びエンドＭ変異体の各成分の量は、特に断らない限り、反応溶液中に存在する複数の物質の合計量を意味する。「基質」とはエンド酵素又はエンド酵素変異体が加水分解又は糖鎖転移する対象となる物質をいう。糖鎖転移する対象となる物質とは、糖鎖転移反応における糖鎖供与体及び糖鎖受容体のことを指す。
【００２３】
【化３】
2016136984.tif 000005
【００２４】
一般式（２）中、Ｘ、Ｙ、ＧｌｃＮＡｃ、β１−４は後述する反応式（１）と同義である。Ｆは水素原子又はＧｌｃＮＡｃの６位とα１−６でグリコシド結合するフコシル基を表す。矢印はエンド酵素又はエンド酵素変異体が加水分解する位置を表す。
【００２５】
「加水分解反応を触媒する」とは、後述する反応式（１）に示すように、（Ａ）のＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合をエンドＭ又はエンドＭ変異体が加水分解し、（Ｂ）及び（Ｃ）を生成する反応（加水分解反応）を触媒する能力をいい、以下、加水分解活性と称することがある。また、加水分解反応を単に「反応」と称することもある。なお、加水分解活性については、一定時間において加水分解して生じる生成物の量（μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）で表される。
【００２６】
「糖鎖転移」とは、糖鎖供与体の糖鎖構造の部分、例えば前記一般式（２）であれば、矢印の先を伸ばした位置（β１−４グリコシド結合部分）から左側の部分を、糖鎖受容体に結合（転移）させることをいう。本開示における糖鎖受容体とは、一般式（１）で表されるような（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃを非還元末端に有する糖含有物質を指す。
「糖鎖転移活性」とは、エンドＭ又はエンドＭ変異体が、糖鎖供与体を糖鎖受容体に転移させ、新たな生成物を生成する（糖鎖転移する）能力をいう。
【００２７】
「糖鎖転移収量」とは、特に断らない限り、反応後に生ずる複合型糖鎖が転移された糖蛋白質の量をいい、「糖鎖転移収率」とは、糖鎖転移した生成物のモル数の、反応に用いた糖鎖受容体のモル数に対する割合をさす。
【００２８】
ここで、「エンドＭ変異体」とは、エンドＭのアミノ酸配列（配列番号１参照）のアミノ酸が欠失、付加及び置換されているエンド酵素変異体をさす。「エンドＭ」とは、毛カビであるムコールヒエマリス由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）、「エンドＡ」とはアルスロバクター  プロトホルミエ由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＤ１０８５１）、「エンドＤ」とはストレプトコッカス  ニューモニエ由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ６２０４２．１）、「エンドＳ」とは、ストレプトコッカス  パイオジェネス由来のエンド酵素（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＫ００８５０）を意味する。なお、エンドＭをエンドＭ変異体と区別する観点から、野生型（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）のエンドＭ、すなわちエンドＭ（ＷＴ）と称することがある。
【００２９】
「相同性」とは、蛋白質のアミノ酸配列の変異体において、最大の相同性（パーセント）を達成するために、必要ならば間隙を導入して、配列を整列させた後に同一である残基のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは本技術分野においてよく知られており、本明細書中ではＣｌｕｓｔｒａｌＷ２  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を使用している。
またアミノ酸残基の表記方法としては、３文字表記及び１文字表記のどちらかで表記する。
【００３０】
また、蛋白質におけるアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基を示す表記について、例えばエンドＭのアミノ酸配列においては、２５１番目のトリプトファン残基は、Ｗ２５１と示される。また、アミノ酸残基を置換、すなわち他のアミノ酸に置換されたアミノ酸残基の表記について、例えばエンドＭの２５１番目のトリプトファン残基をアスパラギン残基（もしくはアラニン）に置換した残基は、Ｗ２５１Ｎ（もしくはＷ２５１Ａ）と示され、これを含むエンドＭを、エンドＭのＷ２５１Ｎ変異体、もしくは単にＷ２５１Ｎ変異体のように称することがある。
【００３１】
また、エンドＭ変異体のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有する変異体を、「本開示のエンドＭ変異体」と称することがある。また、本開示のエンドＭ変異体のうち、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ前記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドＭ変異体を、上記のＷ２５１Ｎ変異体もしくはＷ２５１Ａ変異体等と区別する観点から、特に「本開示のエンドＭ変異体ホモログ」と称することがある。
【００３２】
エンドＭ変異体による加水分解活性は、例えば反応式（１）の（Ａ）で表される基質を溶解させた溶液に、エンドＭ変異体を添加し、所定温度、所定時間後に、反応後の溶液中に生成したオリゴ糖を、例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで測定することによって確認することができる。
【００３３】
ＴＬＣとしては、反応後の溶液を薄層クロマトグラフィーにスポット後に、例えば、展開溶媒（１−ブタノール／酢酸／水：３／２／２）によって展開し、オルシノール法で発色させ、画像取込み装置（例えばＧＴ−Ｘ９７０、エプソン社製）で生成物を定量的に確認し、反応速度、すなわちエンドＭ変異体の加水分解活性を算出できる。
【００３４】
ＨＰＬＣとしては、反応後の溶液の一定量に０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し、例えば、ＨＰＬＣ分析用のカラム［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＡＲ−ＩＩ（孔径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を装備したＨＰＬＣシステム［分離モジュール：ｅ２５６９（ウオータース社製）、フォトダイオードアレイ検出器：２９９９（ウオータース社製）］により、下記の条件で測定することにより、反応後の生成物を定量的確認し、反応速度、すなわちエンドＭ変異体の加水分解活性を算出できる。
<条件>
・溶離液：０．１体積％のＴＦＡを含有した純水（Ａ）と０．１体積％のＴＦＡを含有したアセトニトリル（Ｂ）を体積比（（Ａ）：（Ｂ））９：１で混合後、脱気した溶液
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・検出波長：２１４ｎｍ（ＵＶ−ＰＤＡ）
なおＨＰＬＣ用の分析用カラムとしては、順相系及び逆相系のどちらでもよく、順相系ではアミノカラム、逆相系ではＯＤＳ（オクタデシルシリル）カラムが挙げられる。
【００３５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとしては、例えば、次の方法が挙げられる。
すなわち、反応後の溶液に一定量のアセトンを加え、溶解した部分を乾燥後、一定量のＤＨＢＡ溶液（２０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸を５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液）に溶解させる。その後、溶解させた溶液の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析用のｐｌａｔｅにスポットし乾燥させ、ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＪＡ−１  （Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）もしくはａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）によって、下記の条件にて測定することで、反応後の生成物の質量を確認できる。
<条件>
・測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ，及びｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ
・測定電圧：２５ｋｖ及び１．５ｋｖ〜２．５ｋｖ
・測定分子量の範囲：０〜４０００（ｍ／ｚ）及び４５０００〜６００００（ｍ／ｚ）
・積算回数：２００００〜４００００及び１０００〜８０００
【００３６】
また、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性については、エンドＭ変異体が加水分解活性を有するために、正確な糖鎖転移活性の値を知ることはできない。しかし、反応後の糖鎖転移収量又は糖鎖転移収率から、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を定性的に知ることは可能である。
糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率については、糖鎖供与体と糖鎖受容体とを溶解させた溶液に、エンドＭ変異体を添加し、所定温度、所定時間インキュベート後に、得られた溶液中に生成した生成物を、例えば、上記のＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで測定することによって同定し、さらにその収量や収率を確認することができる。
【００３７】
本明細書等では、炭水化物の部分は、オリゴ糖の記述に通常用いられる命名法を参照して記載される。これらの命名法は、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄらの文献［Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，５５５（１９８１）］に見出される。この方法に従って、マンノースはＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンはＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースはＧａｌ、フコースはＦｕｃ及びグルコースはＧｌｃ、という略式表記によって表記される。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対するＮｅｕＡｃ、及び５−グリコリルノイラミン酸に対するＮｅｕＧｃという略式表記によって表記される。また、Ｎ−アセチルグルコサミニル基はＧｌｃＮＡｃ残基、マンノシル基はＭａｎ残基と称することもある。
【００３８】
単糖とは、上記の糖、例えばＧａｌやＧｌｃＮＡｃそのもののみのことをいう。
糖を形成する炭素の位置は、還元末端を１位、その隣の炭素原子を２位のように表し、それらの炭素原子それぞれに結合する水酸基又は酸素原子を１位の水酸基又は１位の酸素原子のように表し、グリコシド結合を表す場合には、単に「ＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのグリコシド結合」のように示す。なお、これらの２以上の単糖が結合したものをオリゴ糖といい、その誘導体はオリゴ糖誘導体と称する。すなわち、Ｎ結合型糖鎖はオリゴ糖である。オリゴ糖中の単糖部分のことを「糖ユニット」と称することがある。
【００３９】
「グリコシド結合」とは、糖鎖中の糖ユニットの１位の水酸基と他の糖の水酸基が脱水縮合することで、互いが酸素原子を介して結合する結合をいい、例えばα１−６グリコシド結合とは、糖の１位（の炭素）と他の糖の６位（６位の酸素原子）がα型で結合したグリコシド結合であることをいう。なお、糖の１位の水酸基はα型とβ型が存在する。
上記に従い、例えば前記反応式（１）中の（Ａ）について示すと、そのキトビオシル部位（−ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−）の非還元末端側のグルコサミニル基（ＧｌｃＮＡｃ）は、そのＧｌｃＮＡｃの１位の酸素原子を含まず、かつ４位の酸素原子を含むことを示す。還元末端側のＹに結合するＧｌｃＮＡｃは、１位の酸素原子を含まず、４位及び６位の酸素原子を含むことを示す。また、フコシル基（Ｆｕｃ）は、１位の酸素原子を含まず、２位から４位までの水酸基を含むことを表す。
なお、ＭａｎやＧｌｃＮＡｃにおいて、グリコシド結合していない２位、３位、４位及び６位の炭素は、水酸基が結合していることを示す。
また、糖鎖を説明する表現として、単糖を３つ含む糖鎖は３糖、５つ含む場合は５糖、のように称することもある。
【００４０】
「コア糖鎖」とは、Ｎ−結合型糖鎖の中で、下記Ｃ−１で表される糖鎖部分をいい、「トリマンノシル」とは、コア糖鎖の中の３つのマンノース部分をいう。また、Ｃ−１の左側の破線部分に示すように、トリマンノシル部分のうち、非還元末端側のα１−６で結合するＭａｎをＭａｎ２、非還元末端側のα１−３で結合するＭａｎをＭａｎ３及び還元末端側のＭａｎをＭａｎ１と称する。また、右側破線部分に示すように、ＧｌｃＮＡｃの６位に結合したフコシル基（Ｆｕｃ）をコアフコースと称する。
【００４１】
【化４】
2016136984.tif 000006
【００４２】
また、一般式（２）の矢印の先を伸ばした位置の左側に示すようなオリゴ糖を、トリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖と称することがある。
【００４３】
「ペプチド」と「蛋白質」は、一般的にはアミノ酸残基数が少ないものがペプチド、多いものが蛋白質と称されており、明確なアミノ酸残基数の違いはないが、本開示においては、５０残基以上のものを蛋白質と称する。また、蛋白質をポリペプチドと称することもある。なお、「化合物」はペプチドを含み、蛋白質を含まないものとする。
また「糖ペプチド」又は「糖蛋白質」は、それらのペプチドやポリペプチド部分に、Ｎ結合型糖鎖が少なくとも１つ以上存在していることを意味し、特に説明されない限り、複数のＮ結合型糖鎖の種類は１種のものも、２種以上のものも含む。
【００４４】
本開示のエンドＭ変異体は、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖に対して高い加水分解活性及び糖鎖転移活性を持つことで、従来技術では達成できなかったコアフコースを有する幅広い種類のＮ結合型糖鎖の加水分解が可能となり、さらには糖鎖転移によって、コアフコースを有する幅広い種類のＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質を製造することが可能となる。本開示におけるこのような効果を有する理由は定かではないが、発明者は以下のように考えている。
糖質加水分解酵素では、基質となる糖鎖を酵素の触媒領域で認識し、活性残基が基質に作用することによって、反応が進行する。このため、酵素が基質に作用するためには、まず酵素が基質を収容した後に認識し、さらに活性残基が基質の適切な部位に作用しなくてはならない。今回、発明者は、エンドＭがコアフコースを有するＮ結合型糖鎖に作用しないのは、エンドＭの触媒領域のいずれかのアミノ酸がコアフコース部分の収容を妨げていることによるものと考え、そのアミノ酸残基を探索した結果、２５１番目のトリプトファンであることを見出した。さらに、通常、触媒残基付近のアミノ酸残基を置換した場合、酵素活性は著しく低下することが多いが、本開示では、触媒領域の構造が類似するエンドＡ、エンドＤ及びエンドＭを詳細に比較検討し、そのアミノ酸残基を適切なもの、つまり触媒領域の物性への影響を与えないようなアミノ酸に置換することによって、コアフコースを含むＮ結合型糖鎖を触媒領域に収容させた後に強く認識できるようになり、高い加水分解活性及び糖鎖転移活性を達成することができたものと考えられる。
【００４５】
すなわち、本開示のエンドＭ変異体は、エンドＭが有していた幅広い種類のＮ結合型糖鎖を基質とする特性を維持しているため、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖の加水分解や糖鎖転移においても同様の利点を有するといえる。
また、エンドＭは、これまでの報告により、Ｎ結合型糖鎖の還元末端ＧｌｃＮＡｃについて、幅広い種類の置換基を有するものを基質とすることが知られている。加えて、該還元末端ＧｌｃＮＡｃについても、特開２００８−２２７７９号公報に示されるように、４，６シスジオール部位を有していれば、他の構造でもエンドＭの基質となることが知られている。
従って、エンドＭ変異体も、同じような幅広い化合物を基質とすることができる。
【００４６】
≪エンドＭ変異体≫
本開示のエンドＭ変異体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドＭ変異体、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して８０％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式（１）で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドＭ変異体（エンドＭ変異体ホモログ）である。
【００４７】
【化５】
2016136984.tif 000007
【００４８】
反応式（１）中、Ｘは糖質由来の基、Ｙは一価の置換基を示す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表し、β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｆｕｃはフコシル基を表し、α１−６はＦｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。ＧｌｃＮＡｃ−ＯＨは、ＧｌｃＮＡｃの還元末端の炭素に水酸基が結合していることを示す。（Ｃ）中の、Ｈ−ＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃの４位の酸素原子に水素原子が結合していることを示す。
【００４９】
本開示のエンドＭ変異体は、エンドＭのアミノ酸に変異を導入した変異体である。配列番号１で示されるエンド酵素は、ムコールヒエマリス由来のエンドβ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＢ４３８６９）である。
エンドＭ変異体としては、Ｗ２５１Ｎ変異体又はＷ２５１Ａ変異体、あるいは上記の本開示の変異体ホモログであることで、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖の加水分解を十分に行うことができる。さらに、Ｗ２５１Ｎ変異体又はＷ２５１Ａ変異体がより好ましく、Ｗ２５１Ｎ変異体が特に好ましい。
【００５０】
本開示のエンドＭ変異体は、通常の遺伝子工学的な手法によって調製することができ、様々な宿主の種類や、対応する適切な蛋白質発現ベクターを用いて調製することができる。宿主としては、大腸菌、ブレビバシラス菌、シアノバクテリウム、乳酸菌、酵母、昆虫細胞及び動物細胞などが挙げられる。この中でも調製のしやすさ、及び発現量の観点から、大腸菌を宿主とする方法や、酵母を宿主とする方法によって調製することが好ましい。具体的な製造方法としては、大腸菌であれば梅川らの文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８５（１），５１１−５２１，（２０１０）］に詳しく記載され、酵母であれば特開平１１−３３２５６８号公報に詳しく記載されている。
【００５１】
本開示のエンドＭ変異体及びエンドＭ変異体ホモログは、加水分解反応において、他のペプチドもしくは蛋白質とそれらのＣ末端側もしくはＮ末端側で融合させた融合型エンドＭ変異体（もしくは融合型エンドＭ変異体ホモログ）としても用いることができる。融合させることができるペプチドもしくは蛋白質としては、加水分解反応を阻害するものでなければ特に限定されないが、例えば、ヘキサヒスチジンペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＨＨＨＨＨＨ）、フラッグペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＤＹＫＤＤＤＤＫ）、インフルエンザＨＡポリペプチド（アミノ酸配列はＮ末端からＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、アビジン、キチン結合蛋白質、ｃ−ｍｙｃ、チオレドキシン、ジスルフィド異性化酵素（ＤｓｂＡ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などが挙げられる。この中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの調製のしやすさという観点から、ヘキサヒスチジンペプチド及びフラッグペプチドが特に好ましい。
【００５２】
なお、上記の融合型エンドＭ変異体もしくは融合型エンドＭ変異体ホモログにおいては、融合させるペプチド又は蛋白質のポリペプチド部分と、エンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログのポリペプチド部分との間には数残基から５０残基のリンカー領域としてのペプチド部分を含む。なお、リンカー領域を構成するアミノ酸残基の種類としては特に限定されない。リンカー領域には、プロテアーゼによって加水分解されるアミノ酸配列部分（プロテアーゼサイト）を含めてもよい。プロテアーゼサイトとしては特に限定されないが、例えば、ファクターＸａサイト、トロンビンサイト、エンテロキナーゼサイト、プレシジョンプロテアーゼサイトが挙げられる。
【００５３】
天然から見いだされている糖質加水分解酵素は、公知の情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）で示されるように、アミノ酸配列の相同性等から、百数十のグリコシルヒドロラーゼファミリー（ＧＨファミリー）に分類されている。エンドＭは、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドロラーゼであり、他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質としては、ヒトから細菌類までの生物種に広く分布することが知られている。エンドＭのアミノ酸配列（配列番号１）を基に、一般に使用できるホモロジー検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を行うと、エンドＭと他のＧＨファミリー８５に属する蛋白質とは、アミノ末端側から５００番目のアミノ酸付近までの触媒領域を含む領域内で、高い相同性を有することがわかる。
従って、本開示におけるエンドＭ変異体ホモログは、エンドＭの触媒領域を含む５００残基程度のアミノ酸配列の長さを有していれば、エンドＭ変異体ホモログとしての加水分解活性を有すると予想できる。なお本開示のエンドＭ変異体ホモログが有する加水分解活性は、反応式（１）で表される加水分解反応を同じ条件下で行った場合に、エンドＭ（ＷＴ）が有する加水分解活性の１５０％以上であることを意味する。
【００５４】
さらに、エンドＭの１次構造と立体構造の予測から、高度に保存された触媒残基を含む領域は、アミノ酸配列において、６１〜４２７番目であることが知られている。従って、これらの領域を含み、蛋白質の全体構造に影響を与えないのであれば、エンドＭ変異体ホモログとしての加水分解活性を有すると予想できる。
【００５５】
本開示におけるエンドＭ変異体ホモログは、Ｗ２５１Ｎ変異体もしくはＷ２５１Ａ変異体と８０％以上の相同性を有し、かつコアフコースを有するＮ結合型糖鎖を加水分解するものであれば、２５１番目のアミノ酸残基以外のどのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換、欠失及び付加により調製されたものでもよい。
【００５６】
以上の観点から、本開示においては、エンドＭ（配列番号１）の２５１番目のアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び又は置換により生じるエンドＭ変異体ホモログのエンドＭ（配列番号１）に対する相同性が８０％以上であれば加水分解又は糖鎖転移活性を十分に維持できる。また好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、特に好ましくは９８％以上であり、最も好ましいのは９９％以上である。
【００５７】
加水分解反応において、一般式（１）の（Ａ）で表される基質のＹがアシルアミノ基以外である場合には、反応溶液中のエンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の濃度は、０．０１μｇ／μＬ〜２μｇ／μＬであることが好ましい。０．０１μｇ／μＬ以上であることで、加水分解反応をより速やかに進行させることができ、２μｇ／μＬ以下であることで、エンドＭ変異体の緩衝液への溶解性を向上させ、同じく加水分解反応をより速やかに進行させることができる。中でも０．０１μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬであることが好ましく、さらに０．０２μｇ／μＬ〜０．２μｇ／μＬであることが特に好ましい。
また、加水分解反応において、一般式（１）の（Ａ）で表される基質のＹがアシルアミノ基である場合には、反応溶液中のエンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の濃度は、０．０１μｇ／μＬ〜４０μｇ／μＬであることが好ましい。０．０１μｇ／μＬ以上であることで、加水分解反応をより速やかに進行させることができ、４０μｇ／μＬ以下であることで、エンドＭ変異体の緩衝液への溶解性を向上させ、かつより経済的である。中でも０．０１μｇ／μＬ〜３０μｇ／μＬであることが好ましく、さらに０．０２μｇ／μＬ〜２０μｇ／μＬであることが特に好ましい。
【００５８】
また、反応に用いるエンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの精製度においては、より加水分解活性を高めて反応時間を短縮化させる観点から、精製度が５０％以上であることが好ましく、さらに７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。精製度が５０％以上であることで、エンドＭ変異体もしくはエンドＭ変異体ホモログの加水分解活性をより高めることができる。なお、精製度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の染色後の画像データから算出することができる。
【００５９】
（加水分解反応における基質）
本開示におけるエンドＭ変異体は、前記反応式（１）の（Ａ）で表される基質、すなわち下記一般式（３）で表される基質を加水分解する。
【００６０】
【化６】
2016136984.tif 000008
【００６１】
一般式（３）中、Ｘ、Ｙ、ＧｌｃＮＡｃ、β１−４、Ｆｕｃ及びα１−６は前記反応式（１）とそれぞれ同義である。さらに、一般式（３）としては下記一般式（４）で表されるような構造を有することが好ましい。
【００６２】
【化７】
2016136984.tif 000009
【００６３】
一般式（４）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ6は、それぞれ独立に水素原子又は糖質由来の基を表す。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。Ｆｕｃはフコシル基を表し、Ｍａｎはマンノシル基を表す。α１−６はＭａｎの１位とＭａｎの６位とのαグリコシド結合又はＦｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表し、α１−３はＭａｎの１位とＭａｎの３位とのαグリコシド結合を表す。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合又はＭａｎの１位とＧｌｃＮＡｃの４位とのβグリコシド結合を表す。Ｚ１は、水素原子又はＧｌｃＮＡｃを表し、Ｚ１に含まれるＧｌｃＮＡｃはβ１−４でＧｌｃＮＡｃに結合したＭａｎにβ１−４で結合している。Ｙは一般式（３）と同義である。
【００６４】
Ｘ１及びＸ2における具体例としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、異種抗原：Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、マンノース６リン酸：Ｍａｎα１−（６ＰＯ４）、ポリラクトサミン：［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ケラタン硫酸［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、［Ｇａｌ（６ＳＯ３）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６ＳＯ３）β１−３］ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２（ｎは任意の数）、ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、硫酸化ＬａｃＤｉＮＡｃ：ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、末端硫酸修飾（３ＳＯ３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ルイス糖鎖：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（α１−３Ｆｕｃ）β１−２、Ｇａｌ（α１−２Ｆｕｃ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（α１−３Ｆｕｃ）β１−２、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（α１−４Ｆｕｃ）β１−２、Ｇａｌ（α１−２Ｆｕｃ）β１−３ＧｌｃＮＡｃ（α１−４Ｆｕｃ）β１−２、血液型抗原：Ｇａｌ（α１−２Ｆｕｃ）β１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌ（α１−２Ｆｕｃ、α１−３Ｇａｌ）β１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌ（α１−２Ｆｕｃ、α１−３ＧａｌＮＡｃ）β１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＨＮＫ１抗原：（３ＳＯ３）ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、が挙げられ、これらの基のいずれか一つをＸ１およびＸ2のどちらか、あるいは両方に有していてもよい。
また、Ｘ３及びＸ４としては、上記の各糖質由来の基の還元末端ＧｌｃＮＡｃがβ１−４である基、が挙げられる。
また、Ｘ５及びＸ６としては、上記の各糖質由来の基の還元末端ＧｌｃＮＡｃがβ１−６である基、が挙げられる。
Ｘ１〜Ｘ６が上記の場合には、Ｚ１は水素原子でもＧｌｃＮＡｃβ１−４であってもよい。
【００６５】
また、Ｘ１〜Ｘ６がハイマンノース型糖鎖（Ｍ４〜Ｍ９）由来の構造のいずれかを有していてもよく、これらのＭ４〜Ｍ９の各場合についてのＸ１〜Ｘ６は、Ｍ４：Ｘ１〜Ｘ４及びＸ６が水素原子であってＸ５がＭａｎα１−６、Ｍ５：Ｘ１〜Ｘ２、Ｘ４及びＸ６が水素原子、Ｘ５がＭａｎα１−６であってＸ３がＭａｎα１−３、Ｍ６：Ｘ１〜Ｘ２、Ｘ４及びＸ６が水素原子、Ｘ５がＭａｎα１−６であってＸ３がＭａｎα１−２Ｍａｎα１−３、Ｍ７：Ｘ１〜Ｘ２、Ｘ４及びＸ６が水素原子、Ｘ５がＭａｎα１−２Ｍａｎα１−６であってＸ３がＭａｎα１−２Ｍａｎα１−３、Ｍ８：Ｘ１〜Ｘ２びＸ６が水素原子、Ｘ５がＭａｎα１−２Ｍａｎα１−６であり、Ｘ３がＭａｎα１−２Ｍａｎα１−３であってＸ４がＭａｎα１−２、である。
さらに、Ｘ１〜Ｘ６がすべて水素原子である場合も挙げられる。
【００６６】
上記の中でも、エンドＭ変異体の加水分解活性の観点から、Ｘ１及びＸ２のいずれか、あるいは両方が、ＧｌｃＮＡｃβ１−２、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれかを有し、かつＸ３〜Ｘ６が水素原子である、あるいはＸ１〜Ｘ6がすべて水素原子であることが好ましい。
【００６７】
さらに、Ｘ１及びＸ２の両方が、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２、ＮｅｕＧｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２及びＮｅｕＧｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２のいずれかを有し、かつＸ３〜Ｘ６が水素原子である、あるいはＸ１〜Ｘ6がすべて水素原子であることがより好ましい。
【００６８】
前記反応式（１）、一般式（３）及び（４）において、Ｙは酸素原子、窒素原子、炭素原子及び硫黄原子がＧｌｃＮＡｃの１位の炭素に直接結合する構造を含む置換基が挙げられる。
Ｙとしては、エンドＭ変異体の加水分解活性を低下させるものでなければ、特に限定されない。例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミノ基、アシルアミノ基、イミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基又はハロゲン基が挙げられ、これらの基の中で、アルコキシ基、アシルアミノ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基及びアリールスルホニルオキシ基が挙げられる。これらの置換基は、さらに置換基を有していてもよい。
【００６９】
以上の中でも、調製のしやすさから、Ｙはヒドロキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜３０のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数１〜３０のアルケニルオキシ基及び置換基を有していてもよいアシルアミノ基が好ましい。
【００７０】
さらに、加水分解活性の観点から、Ｙは炭素数１〜１２の置換基を有していてもよいアルコキシ基、炭素数６〜１２の置換基を有していてもよいアリールオキシ基及び置換基を有していてもよいアシルアミノ基が好ましい。
【００７１】
Ｙが置換基を有していてもよいアシルアミノ基以外である一般式（３）で表される化合物は、市販の試薬メーカーから購入して得ることができるし、化学的な合成方法や、化学−酵素的に調製する方法でも得ることができる。具体的には、例えば化学的な合成方法としては、Ｎａｋａｎｏら［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３４２（５），６７５−６９５（２００７）］の方法によって、調製が可能である。
【００７２】
一般式（３）中のＹが置換基を有していてもよいアシルアミノ基である場合には、Ｙはペプチド又は蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基が好ましい。
【００７３】
この場合における蛋白質の分子量としては、特に限定されないが、加水分解反応をより進行させやすいという観点から、５，０００〜５００，０００であることが好ましく、さらに好ましくは１０，０００〜１５０，０００である。
【００７４】
上記のペプチド又は蛋白質としては、例えば、動物細胞であれば、細胞外又は細胞表面に分泌しかつＮ−結合型糖鎖を有する糖蛋白質や糖ペプチドなどが挙げられ、例として、各種ホルモン、細胞接着因子、各種受容体、細胞外マトリクス、各種酵素、各種サイトカイン、抗菌性又は抗ウィルス性ペプチド、各種抗体などが挙げられる。
【００７５】
これらの糖蛋白質は、試薬や食品として購入することもできるし、購入した食品や天然物から一般的な糖蛋白質の抽出方法、例えば〔日本生化学会“基礎生化学実験法”、Ｖｏｌ．５、東京化学同人、２０００〕を用いて調製することもできる。
【００７６】
反応に用いる糖蛋白質としての精製度（純度）としては、特に制限はないが、エンドＭ変異体の加水分解反応をよりすみやかに行う観点から、純度（水分を除く全質量に対する該糖蛋白質の割合）は５０質量％以上であることが好ましい。さらに７０質量％であることが好ましく、特に８０質量％以上であることが好ましい。
この場合に、該糖蛋白質のポリペプチド部分は、１種類であっても２種類以上であってもよい。
なお、糖蛋白質の純度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる方法によって同様に確認できる。
【００７７】
またＹについて、上記のアシルアミノ基以外の置換基の中では、基質の溶解性の観点から、炭素数１〜１２の置換基を有していてもよいアルコキシ基が特に好ましい。これらの、置換基を有していてもよいアルコキシ基が結合したＮ結合型糖鎖を有する化合物は、エンドＭ変異体及びエンドＭ変異体ホモログの加水分解活性を簡易的に調査するための基質として有用である。
【００７８】
上記のＹについて、置換基を有していてもよいアシルアミノ基以外の一価の置換基において、一価の置換基がさらに有していてもよい置換基は、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数６〜１２のアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、炭素数１〜１２のアルキルアミノ基、炭素数１〜１２のアシルアミノ基、炭素数１〜１２のチオエーテル基、炭素数１〜１２のウレイド基、アジド基、炭素数１〜１２のアシルオキシ基、炭素数１〜１２のオキシカルボニル基、炭素数１〜１２のＮ−アルキルカルバモイル基、カルボキシル基及びピリジル基から選択される少なくとも１つであり、有していてもよい置換基が２以上ある場合には、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよい。
また、有していてもよい置換基の数は１〜２０であり、好ましくは１〜１０である。２０以下であることでエンドＭ変異体の加水分解活性又は糖鎖転移活性をより高めることができる。
【００７９】
Ｙにおいて、具体例としての置換基を以下に挙げることができる。しかし、本開示のエンドＭ変異体はこれらに限定されるものではない。
【００８０】
【化８】
2016136984.tif 000010
【００８１】
〜還元アミノ化したオリゴ糖誘導体〜
エンドＭ変異体の加水分解のための基質としては、上記の他に、下記一般式（５）で示すようなＮ結合型糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃを還元アミノ化したオリゴ糖誘導体も用いることができる。
【００８２】
【化９】
2016136984.tif 000011
【００８３】
一般式（５）中、Ｘ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃは前記一般式（３）とそれぞれ同義である。β１−４はＧｌｃＮＡｃの１位とＨｅｘＮＡｃｏｌの４位とのβグリコシド結合を表し、α１−６はＦｕｃの１位とＨｅｘＮＡｃｏｌの６位とのαグリコシド結合を表す。Ｒ１は一価の置換基を表す。さらに、Ｒ１に結合したＨｅｘＮＡｃｏｌは、下記一般式（６）で表される。
【００８４】
【化１０】
2016136984.tif 000012
【００８５】
一般式（６）中、Ｒ２は１価の置換基を表す。＊は一般式（６）の非還元末端側のＧｌｃＮＡｃとの結合位置を表し、＊＊は一般式（６）のＦｕｃとの結合位置を表す。
Ｒ２としては特に限定されないが、例えば、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルケニル基、炭素数７〜２０のアラルキル基、炭素数６〜１６のアリール基及びピリジル基が挙げられる。これらの置換基の中で、芳香環及び複素環上の水素原子はさらに、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、アミノ基、シアノ基、炭素数１〜６のアルキルシアノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、スルホン酸基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜１０のアルカノイル基又は炭素数１〜１０のアシルオキシ基で置換されていてもよい。
【００８６】
上記の還元アミノ化オリゴ糖誘導体は、一般的な方法によって調製することができる。例えばＲ２が２−アミノピリジル基である場合には、公知の方法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５（１），２８３−２８４（１９９１）〕に従って、糖蛋白質からＮ結合型糖鎖を遊離した試料を２−アミノピリジル化することで得られる。２−アミノピリジル化においては、例えばタカラバイオ社製の２−アミノピリジル化キットを利用することで調製できる。また、２−アミノピリジル化した多くの種類のＮ結合型糖鎖はすでに市販されている（例えばコスモバイオ社製）。
【００８７】
（加水分解反応）
加水分解反応は、エンドＭ変異体および前記一般式（１）の（Ａ）で表される基質を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドＭ変異体の加水分解活性を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、１０ｍＭ〜２５０ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１５０ｍＭがより好ましく、より好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭである。１０ｍＭ以上とすることで緩衝能力を高めてエンドＭ変異体の加水分解活性を高め、２５０ｍＭ以下とすることで、同じくエンドＭ変異体の加水分解活性を高めることができる。
【００８８】
また、反応における溶液のｐＨは、５．０〜８．５が好ましく、５．５〜７．０がより好ましく、６．０〜７．０が特に好ましい。ｐＨが５．０〜８．５で、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの加水分解活性がより向上するため有効である。また、ｐＨが５．０〜８．５であることで、一般式（１）の（Ａ）で表される基質を有する物質の安定性がより向上するので有効である。
【００８９】
反応における温度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの加水分解活性を高める観点から、４℃〜４５℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがより好ましく、２５℃〜３５℃であることが特に好ましい。４℃〜４５℃とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの加水分解活性を高めることができる。
【００９０】
一般式（１）の（Ａ）で表される基質を有する物質の濃度としては、特に限定されないが、加水分解反応をよりすみやかに完了させる観点から、１００ｍＭ以下であることが好ましい。さらに２０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００９１】
一般式（１）で表される反応における反応時間は、反応温度、（Ａ）で表される基質の濃度及びエンドＭ変異体の濃度によって適宜調整されることが好ましい。例えば、反応温度が２５℃〜４０℃、（Ａ）で表される基質が０．５ｍＭ〜２０ｍＭ、エンドＭ変異体が０．１μｇ／μＬ〜１０μｇ／μＬである場合には、反応時間は３時間〜１００時間であることが好ましい。３時間以上であることで加水分解反応をより進行させることができ、１００時間以内であることで、より純度の高い加水分解生成物を得ることができる。
【００９２】
≪Ｎ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法≫
本開示においては、上記のエンドＭ変異体の存在下、糖鎖供与体と、下記一般式（１）で表される糖鎖受容体と、を反応させることによりＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質を製造するＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法を提供することができる。
【００９３】
【化１１】
2016136984.tif 000013
【００９４】
一般式（１）中、Ｙは１価の置換基を示す。Ｆｕｃはフコシル基を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を表す。α１−６は、Ｆｕｃの１位とＧｌｃＮＡｃの６位とのαグリコシド結合を表す。
【００９５】
（糖鎖受容体）
糖鎖受容体としては、前記一般式（１）で表されるものであれば、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を阻害するものでない限り、特に限定されない。また、一般式（１）中のＹの好ましい範囲は、前記一般式（４）と同じである。
【００９６】
一般式（１）で表される糖鎖受容体のうち、Ｙが蛋白質に由来する構造を含まないものは、例えば、Ｈｕａｎｇら［Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２（６），９３２−９４１（２０１１）］に示されるように、化学的な方法で調製できる。また、Ｙが蛋白質に由来する構造を含まないアシルアミノ基であり、ペプチドに由来する構造を含むものは、特許文献（特開平１０−４５７８８号公報）に示されるようなペプチド伸長工程を含む化学的な合成法によって調製できる。さらに、試薬メーカーによって得られる糖ペプチド又はＮ結合型糖鎖の誘導体を、本開示のエンドＭ変異体もしくは市販のエンド酵素によって加水分解することで容易に調製できる。
また、Ｙが蛋白質を含むものは、上記のように、市販の試薬や食品を購入して得られる糖蛋白質、あるいは食品や天然物を一般的な抽出分離法によって得られた糖蛋白質に対し、本開示のエンドＭ変異体もしくは市販のエンド酵素で加水分解することで容易に調製できる。
【００９７】
市販のエンド酵素としては、エンドＨ（ニューイングランドバイオラボ社製)、エンドＳ(シグマ−アルドリッチ社製及びニューイングランドバイオラボ社製)，エンドＤ(コスモバイオ社製)，エンドＦ１〜Ｆ３(シグマ−アルドリッチ社製）などが挙げられる。また、市販されていない酵素としては、ＧＨファミリー８５に属するグリコシルヒドラーゼ、又はＧＨファミリー１８に属し、かつＮ−結合型糖鎖を加水分解する酵素であることが示されているものを挙げることができる。
しかし、これらの中でも、本開示のエンドＭ変異体が、基質特異性の幅広さから好適である。本開示のエンドＭ変異体で、糖鎖変換の目的となる糖蛋白質の不要なＮ結合型糖鎖の非還元末端側部位を遊離させ、所望のＮ結合型糖鎖の非還元末端側部位を新たに導入することができるので有利である。
【００９８】
（糖鎖供与体）
糖鎖供与体としては、エンドＭ変異体が糖鎖受容体に糖鎖転移できるものであれば、特に限定されない。例えば、前記一般式（３）に示すような、Ｎ結合型糖鎖を有する化合物、ペプチド及び蛋白質、あるいは下記一般式（７）のような、非還元トリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖の還元末端ＧｌｃＮＡｃがオキサゾリン化された誘導体が挙げられる。これらの糖鎖供与体は、糖鎖受容体が存在することで、エンドＭ変異体により非還元末端側糖鎖が効率的に糖鎖転移される。
しかし、高い糖鎖転移収量および糖鎖転移収率で、糖鎖受容体に糖鎖転移させるという観点からは、下記一般式（７）に示すようなトリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖の還元末端ＧｌｃＮＡｃがオキサゾリン化された誘導体が好ましい。
【００９９】
【化１２】
2016136984.tif 000014
【０１００】
一般式（７）中、Ｘ１〜Ｘ６、Ｚ１、Ｍａｎ，α１−６、α１−３及びβ１−４は一般式（４）と同義である。また、ＧｌｃＮＡｃ−ｏｘａは、下記に示すような構造を表す。＊は、Ｍａｎとβ１−４結合する位置を示す。
【０１０１】
【化１３】
2016136984.tif 000015
【０１０２】
一般式（７）において、Ｘ１〜Ｘ６、Ｚ１における糖質由来の基としては、一般式（４）とそれぞれ同義であり、好ましい範囲も同様である。
【０１０３】
このようなオキサゾリン化したＮ結合型糖鎖由来の誘導体は、例えば野口ら［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７４（５），２２１０−２２１２（２００９）］の方法によって調製が可能であり、複合型糖鎖由来の構造を有するオキサゾリン誘導体については、例えば、市販のＮ結合型糖鎖由来の構造のオリゴ糖（Ｄ４０６５、東京化成工業株式会社製）、あるいは市販の糖ペプチド〔シアログリコペプチド（ＳＧＰ、東京化成工業株式会社製）〕をエンド酵素で加水分解して得られるトリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃを、さらにオキサゾリン化して得ることができる。オキサゾリン化については、例えば市販のオキサゾリン化用の試薬（ＣＤＭＢＩ、株式会社伏見製薬所製）を利用することができる。
【０１０４】
（反応）
反応、すなわち糖鎖転移反応は、エンドＭ変異体、糖鎖供与体及び糖鎖受容体を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドＭ変異体の糖鎖転移活性を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の点から、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の点から、１０ｍＭ〜２５０ｍＭが好ましく、２０ｍＭ〜１５０ｍＭがより好ましく、より好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭである。１０ｍＭ以上とすることで緩衝能力を高め、２５０ｍＭ以下とすることで、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性を高め、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
【０１０５】
また、反応における溶液のｐＨは、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高める観点から、５．５〜８．５が好ましく、６．０〜８．０がより好ましく、６．５〜７．５が特に好ましい。
【０１０６】
反応における温度としては、エンドＭ変異体又はエンドＭ変異体ホモログの糖鎖転移活性の観点、糖鎖転移収率、糖鎖転移収量を高める観点及び糖鎖受容体やエンドＭ変異体等の安定性の観点から、４℃〜４０℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがより好ましく、２５℃〜３５℃であることが特に好ましい。４℃以上とすることで、エンドＭ変異体等の糖鎖転移活性を高めることができ、４０℃以下とすることで、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
【０１０７】
糖鎖転移反応においては、反応溶液中のエンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の濃度は、０．００５μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬであることが好ましい。０．００５μｇ／μＬ以上であることで、糖鎖転移収率を向上させ、０．５μｇ／μＬ以下であることで、エンドＭ変異体（もしくはエンドＭ変異体ホモログ）の糖鎖転移後生成物の再加水分解を抑制し、糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率を向上させることができる。
なお、エンドＭ変異体の加水分解活性、糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率は、上記のように、例えば、ＴＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定方法等によって確認することができる。
【０１０８】
糖鎖転移反応において、糖鎖受容体の反応溶液中の濃度としては、エンドＭ変異体の糖鎖転移反応を阻害するものでなければ特に限定されるものでなく、所望とする糖鎖転移収量や糖鎖受容体の反応溶液中への溶解度等を考慮して適宜調整される。しかし、前記一般式（１）で表される糖鎖受容体が蛋白質を含まないものでは、０．１ｍＭ〜２００ｍＭが好ましい。０．１ｍＭ以上であることで、より高い糖鎖転移収量を得ることができ、２００ｍＭ以下であることで、より高い糖鎖転移活性を有するエンドＭ変異体による糖鎖転移反応によって、糖鎖転移収率を高めることができる。中でも、１ｍＭ〜５０ｍＭであることがより好ましい。
【０１０９】
糖鎖転移反応においては、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率（糖鎖供与体のモル数／糖鎖受容体のモル数）は、用いる糖鎖供与体もしくは糖鎖受容体の種類や、反応後における、それらの回収等を考慮して、適宜設定することができる。しかし、糖鎖転移反応によってＮ結合型糖鎖含有化合物を調製する場合には、モル比率は０．２〜２０．０で行うことが好ましく、０．５〜１５．０で行うことがより好ましく、１．０〜１０．０で行うことが特に好ましく、さらに１．０〜５．０で行うことが最も好ましい。モル比率が０．２以上で、より十分な糖鎖転移収量を得ることができ、２０．０以下で行うことで、より高い糖鎖転移収率を得ることができる。
【０１１０】
糖鎖転移反応における反応時間は、反応温度及びエンドＭ変異体の質量等によって、適宜設定されるが、１０分〜６００分であることが好ましい。１０分以上であることで、糖鎖転移収率をより高いものにすることができ、６００分以下であることで、糖鎖転移後の生成物の加水分解の影響をより効果的に防ぎ、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。上記の反応時間の中でも、３０分〜１２０分であることがより好ましい。
上記の反応において、反応を開始してから所定時間後に、さらに糖鎖供与体とエンドＭ変異体を添加してもよく、この操作によって、糖鎖転移収量をさらに高めることができる。この場合には、糖鎖転移収量を高める観点からは、初めの糖鎖供与体投入時から、３時間〜４８時間まで反応を行うことが好ましい。
【０１１１】
本開示のＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法では、固体、動物組織及び細胞等を使用しないので、外部からの夾雑物又はウィルスなどは混入する可能性は極めて低い。このため、安全かつ機能を維持した医薬用組成物や薬品の構成成分として提供できる。また、医薬用組成物は、本開示の製造方法によって製造されたＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の他、製薬上許容し得る安定化剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等を適宜添加して、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤形にすることができる。
また、本開示のＮ結合型糖鎖含有化合物又はＮ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法では、多くの種類の糖鎖供与体を用いて、対応する多くの種類のＮ結合型糖鎖を高い割合で含有する化合物又はＮ結合型糖鎖を含有する蛋白質が得られるため、得られたものは糖鎖標品としても有用である。
【実施例】
【０１１２】
以下、本開示のエンドＭ変異体及び本開示の製造方法を実施例によって詳細に説明するが、本開示のエンドＭ変異体及び本開示の製造方法の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。【０１１３】
<エンドＭ変異体の調製>
（エンドＭにおけるアミノ酸の変異位置の決定）
エンドＡ及びエンドＤは、アミノ酸配列の一次構造による比較から、共にＧＨファミリー８５に属し、両者共にＮ結合型糖鎖を加水分解する酵素であることが知られている。上記のように、エンドＡはコアフコースを含有するＮ結合型糖鎖を加水分解しないが、エンドＤは加水分解する。
一方、エンドＡはＹｉｎらの文献［ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．４，４６５８（２００９）］及びＬｉｎｇらの文献［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３８９（１），１（２００９）］、エンドＤはＡｂｂｏｔらの文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８４，１１６７６（２００９）］によって、Ｎ結合型糖鎖の一部を有する化合物との共結晶の立体構造解析が報告されている。図１Ａは、エンドＡとＭ３Ｎ１−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域の立体モデルを示し、図１Ｂは、エンドＤとＭ３Ｎ１−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域付近の立体モデルを示す。【０１１４】
そこで、これらの情報を基に、エンドＡとＮ結合型糖鎖の一部を有する下記に示す化合物（Ｍ３Ｎ１−チアゾリン）との共結晶立体構造と、エンドＤとＮ結合型糖鎖の一部を有する同化合物との共結晶立体構造とを、ＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ社製）によって重ね合わせ、活性残基付近のアミノ酸残基の分布の相違について検討し、コアフコースを許容する可能性のあるアミノ酸残基もしくはコアフコースの許容を阻害する可能性のあるアミノ酸残基（エンドＡ）を推定した。なお、ＰｙＭｏｌは、タンパク質や小分子、電子密度や分子表面、軌道を３Ｄ画像化できる一般的な分子グラフィックツールである。【０１１５】
推定されたアミノ酸残基を、図２に示すように、エンドＡ、Ｍ及びＤを一次配列で比較（アライメント）した。図２中の３つのエンド酵素の配列上には、エンドＭのアミノ酸について、変異させるアミノ酸とアミノ酸番号及び変異後のアミノ酸を、例えばＷ２５１Ｎのように表記している。また、矢印の元は、対応するエンドＡのアミノ酸とアミノ酸番号を示す。さらに配列中において、エンドＭの１７５番目と１７７番目の囲み線と黒塗りの三角記号は、エンドＭ、エンドＡ及びエンドＤの加水分解反応における活性残基及び活性残基に直接関与する酸性アミノ酸残基を示す。他の囲み線は、エンドＭについて変異する候補のアミノ酸残基とそれに対応するエンドＡとエンドＤのアミノ酸残基を示している。【０１１６】
【化１４】
2016136984.tif 000016
【０１１７】
結果から、コアフコースに関与すると推定されるエンドＤの各アミノ酸残基について、エンドＭの１２５番目のグリシン（Ｇ１２５）がエンドＤのトリプトファン（Ｗ２９２）に、エンドＭの１２８番目のグルタミン（Ｑ１２８）がエンドＤのセリン（Ｓ２９５）に、エンドＭの２２８番目のトリプトファン（Ｗ２２８）がエンドＤのヒスチジン（Ｈ３８４）に、エンドＭの２５１番目のトリプトファン（Ｗ２５１）がエンドＤのアスパラギン（Ｎ４１３）に、それぞれ対応するものと推定された。これらの情報を基に、以下にエンドＭ変異体を調製した。【０１１８】
（エンドＭ変異体の発現用ベクターの構築）
エンドＭ変異体として、Ｇ１２５Ｗ変異体、Ｑ１２８Ａ変異体、Ｑ１２８Ｓ変異体，Ｗ２２８Ｈ変異体、Ｗ２５１Ａ変異体及びＷ２５１Ｎ変異体を下記のように調製した。
本実施例で用いられる、エンドＭ変異体は、梅川らの文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８５（１），５１１−５２１，（２０１０）］に記載される方法に従って調製した。配列番号１のアミノ酸配列の全長をコードするＤＮＡを、市販の蛋白質発現ベクター（ｐＥＴ２３ｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製)のマルチクローニングサイトにあるＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩサイトに導入したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２３ｂ−ＥｎｄｏＭ−Ｈｉｓ６）を鋳型とし、下記表１に示すように、変異するアミノ酸をコードしたＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ用のオリゴＤＮＡとＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ用のオリゴＤＮＡ（配列番号２〜１３）を用い、各エンドＭ変異体調製のための蛋白質発現用ベクターを構築した。この調製方法によって、各エンドＭ変異体のＣ末端領域に６つのヒスチジン（６×Ｈｉｓ、ヒスタグ）が融合した蛋白質を得ることができる。【０１１９】
具体的には、下記表１で示されるプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡社製）、鋳型となるプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２３ｂ−ＥｎｄｏＭ−Ｈｉｓ６）、核酸供与体（ｄＮＴＰ）及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４)を以下（Ｃｙ−１）の条件にて混合し、サーマルサイクラー（ＰＣＲサーマルサイクラーダイス、タカラバイオ社製）によって、下記（Ｃｙ−２）に示す各ステップにおける温度と時間の条件で、ＤＮＡを増幅させた。
〈Ｃｙ−１の条件〉
・１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ-緩衝液：５μＬ
・２ｍＭ  ｄＮＴＰ：５μＬ
・２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４：２．４μＬ
・鋳型となるプラスミド（１００ｎｇ/μＬ）：０．１μＬ（１０ｎｇ）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：１μＬ（１０ｐｍｏｌ）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：１μＬ（１０ｐｍｏｌ）
・ＫＯＤ−ｐｌｕｓ：１μＬ
・２回蒸留後滅菌した水：３５．４μＬ
〈Ｃｙ−２の条件〉
・ステップ１；温度９５℃、２分間インキュベート
・ステップ２；温度９５℃、３０秒間インキュベート
・ステップ３；温度５５℃、１分間インキュベート
・ステップ４；温度６８℃、６分３０秒間インキュベート
・ステップ５；ステップ２からステップ４までを１６サイクル
・ステップ６；ステップ５後に温度６８℃５分間インキュベート
・ステップ７；ステップ６後に４℃でインキュベート【０１２０】
【表１】
2016136984.tif 000017
【０１２１】
上記によって得られた溶液に１μＬの制限酵素ＤｐｎＩを加え、３７℃で１時間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを切断・除去した。得られた溶液の一部を用いて、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換処理を行い、アンピシリン（Ａｍｐ）１００μｇ／ｍＬ含有のアガロース含有ＬＢ培地上で形質転換体を得た後、プラスミドを抽出し、ＤＮＡシーケンスを行った。シーケンスの結果により、エンドＭをコードする遺伝子について、各アミノ酸の変異に対応する変異が導入されたことを確認した。その後、各変異導入されたエンドＭ遺伝子をコードする蛋白質発現用ベクター（ｐＥＴ２３ｂ−ΔＥｎｄｏＭ−Ｈｉｓ６）を、蛋白質発現用の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入（形質転換）し、形質転換体を得た。【０１２２】
（エンドＭ（ＷＴ）の大腸菌による発現および精製）
なお、エンドＭ（ＷＴ）においては、上記の変異導入の操作を行わずに、上記文献による方法によって、エンドＭをコードするＤＮＡが導入されたベクター（ｐＥＴ−ＥｎｄｏＭ−Ｈｉｓ６）で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を調製し、下記のようにエンドＭを発現させ、精製することで得られた。【０１２３】
（エンドＭ変異体の大腸菌による発現および精製）
ｐＥＴ２３ｂ−ΔＥｎｄｏＭ−Ｈｉｓ６を有するＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリン（Ａｍｐ）１００μｇ／ｍＬ含有のＬＢ培養液５ｍＬで前培養（３７℃、１２時間）した後、その１ｍＬ（ＯＤ値、０．５〜２．０）を１００ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）１００μｇ／ｍＬ含有のＬＢ培養液に添加し、そのまま振盪培養（１９℃、３８時間）を行った。培養後の菌体を遠心分離（３３００×ｇ，１０分間、４℃）により回収後、１ｍＭのＰＭＳＦ溶液を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）５ｍＬを加え、室温で１０分間、浸透しながらインキュベートすることにより、菌体の溶解物を得た。得られた溶解物を室温、２１５００×ｇ，１５分間遠心することで沈殿物を除去し、得られた上清に５００ｍＭのイミダゾール溶液を終濃度２０ｍＭとなるように添加し、１ｍＬ用のヒスタグ精製用カラム（Ｎｉ２＋−ｃｈａｒｇｅｄ  Ｈｉ−ｔｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ）社製）にそのまま供した。その後、２０ｍＭイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのジチオトライトール（ＤＴＴ）を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を上記カラムに１０ｍｌ加えることよってカラムに結合したヒスタグを有しない蛋白質等を除去した後、カラムに結合したタンパク質を、１００ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を４ｍＬを加え、カラムから流出する溶液を１ｍｌずつ分画（フラクション）し、その後さらに１５０ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の４ｍＬを加え、カラムから流出する溶液を１ｍｌずつ分画（フラクション）した。それぞれのフラクション（１ｍＬずつ、計８本)についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで、含有する蛋白質を確認した。その後、これらのフラクションのうち、精製された蛋白質を含むフラクションを集め、限外ろ過膜を有する遠心フィルターユニット（分画分子量３０，０００、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、ミリポア社製）を用い、０．１５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて何度も遠心濃縮を繰り返すことで、前記緩衝液への置換及び蛋白質の濃縮を行った。さらに２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｅｔｔｅ、分画分子量７ｋＤａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を行い、その一部をＭｏｎｏ−Ｑカラム（孔径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ、ＧＥ社製）を接続させた中圧クロマトグラフィー[ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ、ＧＥ社製）]によって精製した。クロマトグラフィー操作においては、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（Ａ）と１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（Ｂ）とを用い、ＮａＣｌの直線的な濃度勾配を加え、各フラクションに分画した。得られた各フラクションについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで含有する蛋白質の確認を行い、精製されたエンドＭ変異体を含むフラクションを集め、上記同様の限外ろ過膜を有する遠心フィルターユニットによって濃縮し、実施例に���用するエンドＭ変異体を含む溶液を得た。得られた各変異体についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。【０１２４】
結果から、８０ｋＤａ付近（矢印の位置）に、メインバンドを有するエンドＭ（ＷＴ）、Ｇ１２５Ｗ変異体、Ｑ１２８Ａ変異体、Ｑ１２８Ｓ変異体，Ｗ２２８Ｈ変異体、Ｗ２５１Ａ変異体及びＷ２５１Ｎ変異体を含む溶液を調製することができた。【０１２５】
また、Ｎ１７５Ｑ変異体については、東京化成工業株式会社製のものをそのまま用いた。Ｎ１７５Ｑ変異体は、梅川らの文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８５（１），５１１−５２１，（２０１０）］に記載されるように、上記一般式（７）で表されるような非還元トリマンノシルＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖の還元末端ＧｌｃＮＡｃがオキサゾリン化された誘導体を、コアフコースを有しない糖鎖受容体に効率的に糖鎖転移することが知られている。【０１２６】
（試薬など）
生成物の確認に用いたＭ３Ｎ１は東京化成工業株式会社製を、生成物の確認及び糖鎖転移反応に用いたＳｉａｌｏ−ｇｌｙｃｏ  ｏｘａｚｏｌｉｎｅ（ＳＧ−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎ及びＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎは、東京化成工業株式会社製のものをそのまま用いた。また、その他のエンドＭ変異体の加水分解反応に用いる試薬、エンドＭ変異体の精製に用いる試薬、下記測定に用いる試薬はすべて市販のもの（特に示さない場合、東京化成工業株式会社製のもの）を用いた。
エンドＭ変異体の加水分解反応［前記反応式（１）]の基質に用いたＭ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎとＭ３−ｂｉｏｔｉｎは、図４に示す合成ルートによって調製した。図中の括弧内は化合物番号を示す。【０１２７】
下記に具体的な調製方法を示す。また、合成した生成物については、薄層クロマトグラフィー及びＮＭＲによって確認した。薄層クロマトグラフィーはメルク社製の６０Ｆ２５４を用い１０％硫酸エタノールにて発色させて確認した。ＮＭＲは日本電子株式会社製ＥＣＡ−４００を用いた。なお、下記の「グルコサミニル基」及び「フコシル基」には、それらの水酸基が他の基に置換されているものも含むものとする。【０１２８】
【化１５】
2016136984.tif 000018
【０１２９】
〜Ｍ３-ｂｉｏｔｉｎ及びＭ３Ｆ-ｂｉｏｔｉｎの調製法〜
Ｍ３-ｂｉｏｔｉｎ及びＭ３Ｆ-ｂｉｏｔｉｎの調製においては、図４の化合物（１）に示す４糖誘導体を出発物質に用いた。
〈化合物（２）の調製〉
化合物（１）３０ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル０．６ｍｌ，トルエン０．５ｍｌ及びイオン交換水０．３ｍｌを加えて溶解させた後、０℃に冷却して硝酸セリウムアンモニウム８２ｍｇを加え、０℃で７時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーで出発物質［化合物（１）］の消失を確認した後、反応後溶液を酢酸エチルで希釈し、水相を、水、飽和重曹水、飽和食塩水の順でそれぞれ分液処理を行った。回収した有機層を、減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ（富士シリシア社製）、展開液（体積比）：トルエン／酢酸エチル＝３／２］にて精製し、化合物（２）２０ｍｇを収率７０％で得た。【０１３０】
〈化合物（３）の調製〉
化合物（２）１５０ｍｇ（０．０７９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１．５ｍｌに溶解させ、０℃に冷却した後にトリクロロアセトニトリル８０ｍμｌ及びジアザビシクロウンデセン１．１μｌを加え、０℃で１時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて、化合物（２）の消失及び生成物の生成を確認した後、シリカゲルＰＳＱ６０Ｂを用いて濾過を行った。濾液を減圧濃縮することで、化合物（３）１６０ｍｇを収率９９．３％で得た。【０１３１】
〈化合物（４）の調製〉
アルゴン雰囲気下、塩化メチレン１ｍＬ中、化合物（３）１６０ｍｇ（０．０７９ｍｍｏｌ）と、化合物（Ａ）（Ｆｕｃ１−６ＧｌｃＮＡｃ−ＰｒＮＨＺ）１４０ｍｇ（０．１３９ｍｍｏｌ）とを、モレキュラーシーブ４Ａの混合物を、−２０℃に冷却した。冷却後に、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル０．８μｌを加え、−２０℃で１時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて化合物（３）の消失及び生成物の生成を確認した後、反応溶液にさらにトリエチルアミン２μｌを加えて反応を停止させた。
これを上記同様の方法にて濾過した後、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ、展開液（体積比）：塩化メチレン／メタノール＝１００／１］にて精製を行い、化合物（４）１２０ｍｇを収率５４％で得た。
（４）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）スペクトル法にて解析し、０．９９ｐｐｍ付近に、フコシル基の６位メチル水素由来のピークが存在することから確認できた。【０１３２】
〈化合物（４’）の調製〉
アルゴン雰囲気下、塩化メチレン１ｍＬ中、化合物（３）３２０ｍｇ（０．１５７ｍｍｏｌ）、化合物（Ｂ）（ＧｌｃＮＡｃ−ＰｒＮＨＺ）３２０ｍｇ（０．４７１ｍｍｏｌ）及びモレキュラーシーブ４Ａの混合物を、上記化合物（４）と同様の操作によって化合物（４’）２３５ｍｇを収率５７％で得た。（４’）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）スペクトル法にて解析し、５．１５ｐｐｍ付近に、グルコサミニル基の還元末端炭素に結合する水素由来のピークが存在することから確認できた。【０１３３】
〈化合物（５）の調製〉
化合物（４）２０ｍｇ（０．００６９ｍｍｏｌ）を１−ブタノール２ｍｌに溶解させ、無水エチレンジアミン２８μｌを加えて還流しながら２３時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて化合物（４）の消失及び生成物の生成を確認し、さらにニンヒドリン反応によるアミノ基の生成の確認を行い陽性であることを確認した後、反応後溶液にトルエンを加えて減圧濃縮することで、シロップ状の残渣を得た。得られた残渣をメタノール２ｍｌに溶解させ、さらに無水酢酸１３０μｌを加え、室温で３０分撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて出発物質の消失及び生成物の生成の確認し、トリエチルアミン０．１９ｍｌを加えて反応を停止した。得られた溶液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［充填剤：ＰＳＱ１００Ｂ、展開液（体積比）：塩化メチレン／メタノール＝５０／１］にて精製を行い、化合物（５）１２ｍｇを収率６９％で得た。
（５）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）スペクトル法にて解析し、１．６４ｐｐｍおよび１．８４ｐｐｍ付近に、アセトアミド基のメチル水素由来のピークが存在することから確認された。【０１３４】
〈化合物（５’）の調製〉
化合物（５）の調製において、化合物（４）の代わりに化合物（４’）７５ｍｇ（０．０２９ｍｍｏｌ）を用いた他は、同様の操作を行い、化合物（５’）３８ｍｇを収率６２％で得た。
化合物（５）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）スペクトル法にて解析し、１．６１ｐｐｍおよび１．８５ｐｐｍ付近に、アセトアミド基のメチル水素由来のピークが存在することから確認された。【０１３５】
〈化合物（６）の調製〉
化合物（５）１０ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン１．４ｍｌ、エタノール１．４ｍｌ、イオン交換水０．７ｍｌ及び酢酸０．４ｍｌを混合させた溶液に溶解させ，パラジウム炭素（パラジウム約５％含有）１２ｍｇを加え、水素雰囲気下、４５℃で２４時間撹拌させた。その後、薄層クロマトグラフィー［展開液（体積比）：酢酸エチル／メタノール／イオン交換水／酢酸＝２／２／２／１］にて化合物（４）の消失及び生成物の生成を確認し、さらに反応後溶液（懸濁液）を、ゲル濾過クロマトグラフィー［充填剤：セファデックスＬＨ−２０（ＧＥ社製）、溶出液（体積比）：イオン交換水／メタノール＝１／１）］によって分離精製した。
分離後に得られた化合物（６）を含むフラクションを回収し、減圧濃縮して得られた残渣をイオン交換水に溶解させ、さらに凍結乾燥を行うことで、化合物（６）の凍結乾燥粉末５．２ｍｇを収率９８．５％で得た。
化合物（６）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。【０１３６】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：４．９２（１Ｈ，  ｂｒｓ，  ＭａｎＨ−１），４．７４（１Ｈ，  ｂｒｓ，  ＭａｎＨ−１），４．７２（１Ｈ，  ｂｒｓ，  ＦｕｃＨ−１），  ４．４９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ＧｌｃＮＡｃ  Ｈ−１），  ４．３０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ８．２  Ｈｚ，  ＧｌｃＮＡｃ  Ｈ−１），  １．９２  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３），  １．８７  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３），  １．０５  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  Ｆｕｃ  Ｈ−５）．【０１３７】
〈化合物（６’）の調製〉
化合物（６）の調製において、化合物（５）の代わりに化合物（５’）２３ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を用いた他は、同様の操作を行い、化合物（６’）の凍結乾燥粉末９．５ｍｇを収率９６．０％で得た。
化合物（６’）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。【０１３８】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：４．９７（１Ｈ，  ｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ４．７９  （１Ｈ，  ｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ４．４７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ＧｌｃＮＡｃ  Ｈ−１），  ４．３６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ＧｌｃＮＡｃ  Ｈ−１），  １．９５  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３），  １．９２  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３）．【０１３９】
〈Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎ［化合物（７）］の調製〉
化合物（６）８．０ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド１ｍｌに溶解させ、Ｄ−ビオチン Ｎ−スクシンイミジル３．６ｍｇ（０．０１０７ｍｍｏｌ）を加えて５時間撹拌した。得られた懸濁液を、ゲル濾過クロマトグラフィー［充填剤：セファデックスＬＨ−２０、溶出液（体積比）：イオン交換水／メタノール＝１／１］によって分離精製した。分離後に得られたＭ３Ｆ−ビオチンを含むフラクションを回収し、減圧濃縮して得られた残渣をイオン交換水に溶解させ、さらに凍結乾燥を行うことで、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎ［化合物（７）］の凍結乾燥粉末８．３ｍｇを収率８８％で得た。
（７）の構造は１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。【０１４０】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：  ４．９２（１Ｈ，  ｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ４．４８（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ＧｌｃＮ  Ｈ−１），  ４．４４（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ４．８  Ｈｚ，  ＣＨ２），  ４．３０（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ＧｌｃＮ  Ｈ−１），  ４．２５（２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  ４．６  Ｈｚ，  ＣＨ２），  １．９１（３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＨ３），  １．８６（３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：  １０４．５０，  １０３．１６，  １０３．０１，  １０２．３８，  １０１．５７，  １０１．２９．【０１４１】
上記より、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６つの糖ユニットの還元末端炭素に由来するピークと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて４．４ｐｐｍ付近と４．２ｐｐｍ付近にビオチン基のテトラヒドロチオフェン環上のプロトン由来のピークと、が確認されたことから、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎ［化合物（７）］の構造が確認された。【０１４２】
〈Ｍ３−ｂｉｏｔｉｎ［化合物（７’）］の調製〉
化合物（７’）の調製において、化合物（６）の代わりに化合物（６’）９ｍｇ（０．００９２ｍｍｏｌ）を用いた他は、同様の操作を行い、化合物（７’）の凍結乾燥粉末９．８ｍｇを収率８９％で得た。
化合物（７’）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。【０１４３】
１Ｈ−ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）  δ：  ５．０８  （１Ｈ，  ｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ４．９０  （１Ｈ，  ｂｒｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ４．４７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ＧｌｃＮＡｃ  Ｈ−１），  ４．４１  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  ４．６  Ｈｚ，  ＣＨ２），  ４．２４  （１Ｈ，  ｓ，  Ｍａｎ  Ｈ−１），  ２．０７  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３），  ２．０２  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＯＣＨ３）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ）  δ：  １０３．２３  ，  １０２．０９  ，  １０１．７５  ，  １０１．０８  ，  １００．３１．【０１４４】
上記より、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて５つの糖ユニットの還元末端炭素に由来するピークと、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて４．４ｐｐｍ付近と４．２ｐｐｍ付近にビオチン基のテトラヒドロチオフェン環上のプロトン由来のピークと、が確認されたことから、Ｍ３−ｂｉｏｔｉｎ［化合物（７）］の構造が確認された。【０１４５】
<コアフコースを含有する糖蛋白質（リツキサン）の調製>
コアフコースを含有する糖蛋白質として、以下の性質を有する市販のリツキシマブ製剤（リツキサン、全薬工業株式会社製）を実施例３として用いた。
・分子量：１４４５１０
・構造：可変領域の一部がマウス型に置換されたヒト型ＩｇＧ１
・機能：分化抗原ＣＤ２０を抗原とする
・調製：リツキシマブをコードする遺伝子発現構成体をチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に導入し、その後に発現誘導を行って調製
上記のように、ＣＨＯから生産されるリツキサンが有するＮ結合型糖鎖は、ほとんどがコアフコースを有していることが知られており、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓらの文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７７，２６７３３（２００２）］及びＲａｊｕらの文献［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．，Ｖｏｌ．４，４４（２００３）］、Ｌｉらの文献［ｍＡｂｓ，Ｖｏｌ．５，５６５（２０１３）］に詳しく記載されている。【０１４６】
<コアフコースを含有する糖ペプチド（リツキサンペプチド）の調製>
リツキサン８００μｇを４００μＬの４０ｍＭの炭酸アンモニウムに溶解させ、１０ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して５５度にて４５分間インキュベートした。その後、室温まで冷却した後、終濃度３０ｍＭとなるようにヨードアセタミドを添加し、さらにチューブを遮光して、１時間室温にてさらに静置した。次いで、５μｇのトリプシン（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｇｒａｄｅ  Ｔｒｙｐｓｉｎ、プロメガ社製）を加え、３７度で１６時間インキュベートすることによって、リツキサンをペプチドにまで消化した。得られたリツキサンペプチドは、乾燥後、５%酢酸に溶解し、得られた溶液を、Ｃ１８カートリッジカラムにアプライした。その後、Ｃ１８カラムを５％酢酸で洗浄した後、該カラムに結合したペプチド・糖ペプチドを２０％の２-プロパノールを含む５％酢酸および４０％の２−プロパノールを含む５％酢酸によって、順次溶出し、溶出後に回収した溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、リツキサンペプチドを得た。なお、得られたリツキサンペプチドは、Ｎ結合型糖鎖を有する糖ペプチドを、全リツキサンペプチドの質量に対して１０質量％程度有する混合物である。【０１４７】
<ヒトラクトフェリンの調製>
コアフコースを含有する糖蛋白質であるヒトトランスフェリン（ｈＬＦ）は、市販品（Ｌ３７７０、シグマ−アルドリッチ社製）をそのまま用いた。なお、Ｙｕらの文献［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，２０６（２０１１）］に記載されるように、ｈＬＦ中のほとんどがコアフコースを含有する複合型糖鎖を２つ有することが知られている。【０１４８】
<各種測定方法>                    
（ＴＬＣ）
下記反応後の溶液２μＬを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０、Ｍｅｒｃｋ社製）にスポットし、展開溶媒（１−ブタノール／酢酸／水：３／２／２）によって展開し、オルシノール法、すなわち２Ｍの硫酸に溶解させた０．２体積％のオルシノール溶液に浸漬した後、１１０℃で１０分程度加熱することで呈色させた。呈色したプレートは市販のスキャナー装置で画像化した。【０１４９】
（ＨＰＬＣ）
反応後の溶液１０μＬに、１０μＬの０．１体積％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し、ＨＰＬＣ測定の試料として用いた。ＨＰＬＣ測定は、分析用のカラム［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＡＲ−ＩＩ（孔径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）］を装備したＨＰＬＣシステム［分離モジュール：ｅ２５６９（ウオータース社製）、フォトダイオードアレイ検出器：２９９９（ウオータース社製）］により下記の条件で行った。
〔条件〕
・溶離液：０．１体積％のＴＦＡを含有した純水（Ａ）と０．１％のＴＦＡを含有したアセトニトリル（Ｂ）を体積比（（Ａ）：（Ｂ））９：１で混合後、脱気した溶液
・流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・検出波長：２１４ｎｍ（ＵＶ−ＰＤＡ）【０１５０】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）
反応後の溶液に８０μＬの冷アセトンを加え、−８０℃で３０分静置した。その後、１７４００×ｇで１０分間遠心し、上清を別チューブに移し濃縮遠心によって乾燥後、１０μＬの純水に溶解させた。得られた溶液２μＬをＴＬＣによって確認し、１μＬを３μＬのＤＨＢＡ溶液（２０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸を５０％メタノール水溶液に溶解させた溶液）に溶解させた。得られた溶液の２μＬずつを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析用のｐｌａｔｅにスポットし乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を、Ｕｌｔｒａｆｌｅ  Ｘｔｒｅｍｅ  ＪＡ（ブルーカー・ダルトニクス社製）もしくはａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ−ｔｋｏ１リフレクタシステム（ブルーカー・ダルトニクス社製）を用い、下記の測定条件で行った。
・測定モード：ポジティブイオンモード，及びリフレクターモード
・測定電圧：２５ｋｖ及び１．５ｋｖ〜２．５ｋｖ
・測定分子量の範囲：ｍ／ｚ０〜４０００及び４５０００〜６００００
・積算回数：２００００〜４００００及び１０００〜８０００
また、ＭＳ／ＭＳ測定は、上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定によって得られた、所定のｍ／ｚ値を有するシグナルをプリカーサーイオンとして用い、アルゴンガスを使用して行った。【０１５１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定は、市販のスラブゲル用の装置（日本エイドー株式会社製の恒温式２連ミニスラブゲル電気泳動装置）を用い、１０％のポリアクリルアミドゲルを、４０ｍＡで６０分間電気泳動後に、ゲルをクマシブリリアントブルーで染色し、得られたゲルを評価した。マーカーは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（２−２１２ｋＤａ）（ＮＥＢ社製）を用いた。なお、検出においては、ゲル撮影装置(スキャナーＧＴ−Ｘ９７０、エプソン社製）を用いた。【０１５２】
<エンドＭ変異体による加水分解>
〔実施例１〕
１．５ｍＬのマイクロチューブ中に、エンドＭ変異体としてＷ２５１Ａ変異体の１μｇと、基質（反応式（１）の（Ａ））としてＭ３−ｂｉｏｔｉｎ又はＭ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎの１０μｇと、を３０ｍＭのリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）１０μＬに溶解させた後、恒温槽中、３０℃でインキュベートした。所定時間のインキュベート後に、９５℃で５分間の熱処理によって反応を停止し、反応後の溶液を得た。得られた溶液について、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定を行い、加水分解活性を算出した。【０１５３】
［実施例２、比較例１〜５］
表２に示すように、実施例１のＷ２５１Ａ変異体をＷ２５１Ｎ変異体、エンドＭ，Ｇ１２５Ｗ変異体、Ｇ１２８Ａ変異体、Ｑ１２８Ｓ変異体又はＷ２２８Ｈ変異体に変更した以外は同様にして、実施例２又は比較例１〜５での反応後の溶液を得た。得られた各溶液は、実施例１と同様の方法で測定し、加水分解活性を算出した。【０１５４】
〜測定結果〜
反応時間２０分後でのＴＬＣ測定の結果を図５に示す。図５中、矢印は基質及び加水分解後の生成物のＴＬＣ上での位置を示す。結果から、Ｍ３−ｂｉｏｔｉｎに対しては、エンドＭ及びエンドＭ変異体のすべてが、反応時間２０分以内で加水分解を完了することが示された。一方、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎに対しては、Ｗ２５１Ａ変異体及びＷ２５１Ｎ変異体を添加した場合にのみ、加水分解物〔Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｍ３Ｎ１，反応式（１）の（Ｂ）に相当）及びＦｕｃα１−６ＧｌｃＮＡｃ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｆ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎ、反応式（１）の（Ｃ）に相当）〕を生じることが示された。しかし、Ｗ２５１Ａ変異体及びＷ２５１Ｎ変異体以外のエンドＭ変異体を添加した場合にはほとんど加水分解物を生じていないことが示された。【０１５５】
Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎを含む溶液に対しＷ２５１Ｎ変異体を添加し、上記条件にて２０分インキュベートした後に得られた溶液のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定結果を図７に示す。結果から、Ｗ２５１Ｎ変異体を添加した場合には、Ｗ２５１Ｎ変異体を添加していない場合に検出されたＭ３Ｆ（Ｎａ＋付加）のシグナル（ｍ／ｚ１３６３．６）が消滅し、代わりにＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎ（Ｎａの＋付加）のシグナル（ｍ／ｚ６７３．６）とＭ３Ｎ１（Ｎａの＋付加）のシグナル（ｍ／ｚ７３０．６）が出現した。このことから、Ｍ３ＦがＷ２５１Ｎ変異体によって加水分解して、Ｆ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎとＭ３Ｎ１を生成したことが判明した。
また、ＨＰＬＣによる解析から、Ｍ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎに対する加水分解後の生成物の量を算出し、反応時間（インキュベートした時間）と、加えたエンドＭ変異体又はエンドＭの質量から、特異的加水分解活性（μｍｏｌ／（ｍｉｎ・ｍｇ））及び相対活性を算出した。なお、相対活性については、エンドＭのＭ３Ｆ−ｂｉｏｔｉｎに対する前記活性を１とした場合のエンドＭ変異体の各基質に対する相対活性として示した。結果を表２に示す。【０１５６】
また、ＨＰＬＣ測定の一例として、エンドＭをＭ３−ｂｉｏｔｉｎに加えた場合のＨＰＬＣ測定の結果を図５に示す。図６中、３つのチャートは、それぞれ上部から、エンドＭを反応液に加えない場合、１０ｎｇ加えた場合、１００ｎｇ加えた場合の結果を示す。横軸はカラム保持時間を、縦軸はＵＶ吸収による検出感度を示す。矢印は生じた生成物の保持時間を示す。【０１５７】
【表２】
2016136984.tif 000019
【０１５８】
表２の結果から、本開示のエンドＭ変異体（実施例１及び２）は、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖であるＭ３Ｆ−ビオチンに対する加水分解活性が、エンドＭ又は他のエンドＭ変異体に比べて著しく高いことが示された。
このように、エンドＭの２５１番目のトリプトファン残基を適切なアミノ酸に置換することが、コアフコースを有するＮ結合型糖鎖の加水分解に極めて重要であることが示された。【０１５９】
〔実施例３〕
実施例３として、Ｗ２５１Ｎ変異体の糖ペプチドを含むリツキサンペプチドに対する加水分解反応を行った。
上記で調製したリツキサンペプチド２００μｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）４００μｌに溶解しＷ２５１Ｎ変異体４μｇを添加し、３０℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応後溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、５%酢酸に再溶解した後、得られた溶液をＣ１８カラムにアプライした。アプライ後に、該カラムへの非結合画分を回収し、凍結乾燥することで、エンドＭ変異体による加水分解によって遊離したＮ結合型糖鎖画分の乾燥物を得た。当該乾燥物を次のマススペクトロメトリーによる糖鎖分析に供した。【０１６０】
〜<マススペクトロメトリーによる糖鎖分析>〜
上記の乾燥物は、Ａｎｕｍｕｌａらの文献〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２０３，１０１−１０８〕による定法に従って完全メチル化を行ってから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ分析によって糖鎖の分子量とフラグメントパターンによる糖鎖の構造推定を行った。なお、当該分析には、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄをマトリックスとして用いた。以下、上記の各加水分解後に得られた乾燥物を、上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ分析によって行った結果を、「各加水分解後のＭＳ分析の結果」と称することがある。【０１６１】
〔比較例６〕
実施例３において、Ｗ２５１Ｎ変異体４μｇの代わりにエンドＭ（ＷＴ）４μｇを用いた他は実施例３と同じにして、リツキサンペプチドに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。【０１６２】
〔参考例１〕
実施例３において、Ｗ２５１Ｎ変異体４μｇ及び１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の代わりにエンドＳ（ニューイングランドバイオラボ社製)１００Ｕ及びＮＥＢ社製のＧ６  ｂｕｆｆｅｒを用いた他は実施例３と同じにして、リツキサンペプチドに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。【０１６３】
〜測定結果〜
結果を図８Ａ〜図８Ｃに示す。図８Ａは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドＭ（ＷＴ）による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示し、図８Ｂは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、Ｗ２５１Ｎ変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示し、図８Ｃは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドＳによる加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す。なお、図８Ａ〜図８Ｃ中の黒の四角はＮ―アセチルグルコサミン、灰色の丸はマンノース、白い丸はガラクトース、黒のひし形はＮ―アセチルノイラミン酸を示す。
結果から、遊離したＮ結合型糖鎖は、比較例６では、図８Ａに示すように、ｍ／ｚ １４１６．８ （ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ３）のピークが弱く検出されるのみであった。一方、実施例３では、図８Ｂに示すようにｍ／ｚ  １１７１．７，１４１６．８，１６２０．９，１８２５．０，２１８７．１，２５４８．３とそれぞれＨｅｘＮＡｃ２Ｎｅｘ２，ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ３，ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ４，ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ５，  ＮｅｕＡｃ１ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ５，ＮｅｕＡｃ２ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ５に相当するピークが検出された。また、図８Ａ〜図８Ｃに、各ピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析の結果から得られたフラグメントパターンから推定される糖鎖構造を示す。推定された糖鎖構造においては、実施例３と、図８Ｃに示す参考例１とが一致することが示された。
このように、Ｗ２５１Ｎ変異体は、コアフコースを含有する様々な種類の複合型糖鎖等が結合した糖ペプチドに対して、エンドＳと同様に加水分解活性を有することが示された。【０１６４】
〔実施例４〕
実施例４として、Ｗ２５１Ｎ変異体のヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）に対する加水分解を行った。
１０μｇのｈＬＦ（Ｌ３７７０、シグマ−アルドリッチ社製）を溶解した１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）２０μｌに、２μｇのＷ２５１Ｎ変異体を添加し３０℃で１６時間反応させた、
反応後の溶液にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを等量加え、５分間沸騰水中で加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を得た。次に、各レーン中にｈＬＦが０．５μｇ含まれるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の７．５％のポリアクリルアミドゲルのウェルにアプライし、ＳＤＡ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＡ−ＰＡＧＥ後のゲルの染色は、クマシー染色により行った。【０１６５】
〔比較例７〕
実施例４において、Ｗ２５１Ｎ変異体の代わりにエンドＭ（ＷＴ）２μｇを用いた他は実施例４と同じにして、ｈＬＦに対する加水分解反応を行い、反応後の溶液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【０１６６】
〔比較例８〕
実施例４において、Ｗ２５１Ｎ変異体及び１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）２０μｌの代わりにエンドＳ（ニューイングランドバイオラボ社製)１００Ｕ及びＮＥＢ社製Ｇ６  ｂｕｆｆｅｒを用いた他は実施例４と同じにして、ｈＬＦに対する加水分解反応を行い、反応後の溶液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【０１６７】
〜測定結果〜
各反応後の溶液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９に示す。各レーンの上部には、加水分解反応に用いたエンド酵素の種類を示す。図９中、矢印の始点は、終点が示す各バンドにおいて推定される蛋白質名を表す。ＤＧ―ｈＬＦは、１つのあるいは２つのＮ結合型糖鎖が、エンド酵素によって加水分解されたｈＬＦを意味する。ｎａｔｉｖｅ  ｈＬＦは、Ｎ結合型糖鎖が加水分解されていないｈＬＦを意味する。
結果から、加水分解を行っていないｈＬＦ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、８０ｋＤａより少し上に２つの糖鎖を持つｎａｔｉｖｅ  ｈＬＦに相当するバンドが認められる。またごく一部は３本の糖鎖を持つと推定されることから更に上に分離される。
比較例８、すなわち、エンドＳによる加水分解反応の場合には、Ｃｏｎｔｒｏｌよりも低分子量側にバンドが出現することから、エンドＳによる加水分解反応によって、ｈＬＦ（ｎａｔｉｖｅ  ｈＬＦ）から少なくとも１つの糖鎖が遊離したと考えられる。比較例７、すなわちエンドＭ（ＷＴ）による加水分解反応の場合も、同様にＣｏｎｔｒｏｌよりも低分子量側にバンドが出現することから、少なくとも１つの糖鎖が該ｈＬＦから脱離したと考えられる。なお、エンドＭ（ＷＴ）はコアフコースを有しないＮ結合型糖鎖を加水分解しないが、該ｈＬＦにはコアフコースを有しないＮ結合型糖鎖も含まれていると考えられるので、比較例７においては、エンドＭ（ＷＴ）が、ｈＬＦ中のそれらのＮ結合型糖鎖を加水分解したものと考えられる。
一方、実施例４、すなわちＷ２５１Ｎ変異体による加水分解反応の場合には、比較例７及び８で見られた低分子量側のバンド以外にも、さらに低分子量側のバンドが現れることから、少なくとも２つの糖鎖がｈＬＦから遊離したことが示された。従って、Ｗ２５１Ｎ変異体は、エンドＳには加水分解できないｈＬＦが有するＮ結合型糖鎖に対しても加水分解活性を有することが示された。
このように、Ｗ２５１Ｎ変異体は、コアフコースを含有する糖タンパク質糖鎖に対しても、加水分解活性を有することが示された。【０１６８】
〔実施例５〕
実施例５として、Ｗ２５１Ｎ変異体のｈＬＦに対する加水分解反応を行った。
上記で調製したｈＬＦ１００μｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌに溶解しＷ２５１Ｎ変異体２０μｇを添加し、３０℃で１６時間反応させた。反応終了後、反応後溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、５%酢酸に再溶解した後、得られた溶液をＣ１８カラムにアプライした。アプライ後に、該カラムへの非結合画分を回収し、凍結乾燥することで、エンドＭ変異体による加水分解によって遊離したＮ結合型糖鎖画分の乾燥物を得た。当該乾燥物を次のマススペクトロメトリーによる糖鎖分析に供した。【０１６９】
〜<マススペクトロメトリーによる糖鎖分析>〜
上記の乾燥物は、Ａｎｕｍｕｌａらの文献〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２０３，１０１−１０８〕による定法に従って完全メチル化を行ってから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ分析によって糖鎖の分子量とフラグメントパターンによる糖鎖の構造推定を行った。なお、当該分析には、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄをマトリックスとして用いた。以下、上記の各加水分解後に得られた乾燥物を、上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ分析によって行った結果を、「各加水分解後のＭＳ分析の結果」と称することがある。【０１７０】
〔比較例９〕
実施例５において、Ｗ２５１Ｎ変異体２０μｇの代わりにエンドＭ（ＷＴ）２０μｇを用いた他は実施例５と同じにして、ｈＬＦに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。【０１７１】
〜測定結果〜
結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ａは、ｈＬＦに対し、エンドＭ（ＷＴ）による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示し、図１０Ｂは、ｈＬＦに対し、Ｗ２５１Ｎ変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定した結果を示す。なお、図１０Ａ及び図１０Ｂ中の黒の四角はＮ―アセチルグルコサミン、灰色の丸はマンノース、白い丸はガラクトース、黒のひし形はＮ―アセチルノイラミン酸を示す。
結果から、エンドＭ（ＷＴ）を用いた場合も、Ｗ２５１Ｎ変異体を用いた場合もともにＮ結合型糖鎖が加水分解したものと推定されるシグナルが得られた。一方、主なシグナルとして、ｍ／ｚ  １３３５（Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ１）、ｍ／ｚ  １６２１（Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ３）、ｍ／ｚ  １８２５（Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３）、ｍ／ｚ  ２０００（ｄＨｅｘ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３）、ｍ／ｚ  ２１８７（ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ３）を検出した。また、図１０Ａ及び図１０Ｂに、各ピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析の結果から得られたフラグメントパターンから推定される糖鎖構造を示す。
このように、Ｗ２５１Ｎ変異体処理において、エンドＭ（ＷＴ）処理のものよりもシグナルが強く、多くの糖鎖が遊離したことが示唆された。本結果は、実施例５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に矛盾しないことが示された。【０１７２】
〔実施例６〕
実施例６として、Ｗ２５１Ｎ変異体のリツキサン（抗体、ＩｇＧ１）に対する加水分解反応を行った。
上記の市販のリツキサン２００μｇを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）１００μｌに溶解させ、膜濃縮装置［分画分子量１００００、アミコンウルトラ１５（メルクミリポア社製）］にて４℃で、緩衝液の交換を行った。緩衝液の交換によって得られたリツキサン（ＩｇＧ１）２００μｇが溶解した５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）１００μＬに、Ｗ２５１Ｎ変異体の１ｍｇを０時間後、２４時間後、４８時間後にそれぞれ加え、恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製、ＴＨＥＲＭＩＳＴＯＲ  ＴＥＭＰＰＥＴ  Ｔ−８０）中、３７℃で振盪しながらインキュベートした。インキュベートした時間（以下、反応時間と称する）が０時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）、４８時間後（Ｃ）、７２時間後（Ｄ）に、反応後溶液から一部をサンプルとして採取し、各サンプルをさらに還元処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでＭＳ分析を行った。結果を、図１１で示す。図１１に示すように、反応時間の経過につれて、Ｎ結合型糖鎖が結合した重鎖の分子量に相当する位置のピークが減少し、代わりにＮ結合型糖鎖を有しない重鎖の質量の位置に相当するピークが増大することから、反応時間の経過によって、リツキサンのＮ結合型糖鎖が遊離したことが示された。また、４８時間後から７２時間後の間に、原料のＩｇＧ（リツキサン）のＮ結合型糖鎖が加水分解されて生じた加水分解物（（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧ、ｍ／ｚ  ４９５０２））のピーク（ｍ／ｚ  ４９５０２）が、原料のピークよりも高くなることが示された。【０１７３】
このように、Ｗ２５１Ｎ変異体は、ＩｇＧが有するフコース含有Ｎ結合型糖鎖に対しても加水分解活性を有することが示された。【０１７４】
<エンドＭ変異体による糖鎖転移>
〔実施例７〕
糖鎖転移反応は、下記の組成条件の溶液２０μＬを、１．５ｍＬのマイクロチューブ中に作成した後、恒温槽中、３０℃で６０分インキュベートすることで行った。
〔条件〕
・糖鎖供与体：５ｍＭのＳＧ−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ
・糖鎖受容体：５ｍＭのＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎ
・エンドＭ変異体：０．６６μｇのＷ２５１Ｎ変異体
・緩衝液濃度とｐＨ及び溶液全体の体積：２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）２０μＬ
インキュベート後に、９５℃で５分間の熱処理によって反応を停止し、反応後の溶液を得た。得られた溶液を乾燥し２０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ溶液に溶解してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に処した。【０１７５】
〔比較例１０〜１２〕
下記表３に示すように、比較例１０では、実施例７における糖鎖受容体を同濃度のＮ１−ｂｉｏｔｉｎに、比較例１１では、実施例７におけるエンドＭ変異体を同質量のＮ１７５Ｑ変異体に、比較例１２では、比較例１１における糖鎖受容体を同濃度のＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎにそれぞれ変えた他は同じ条件で反応を行い、反応後溶液を同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に処した。【０１７６】
【表３】
2016136984.tif 000020
【０１７７】
〜測定結果〜
図１２に、実施例及び比較例で行った糖鎖転移反応についての概要を示す。図１２が示すように、Ｗ２５１Ｎ変異体又はＮ１７５Ｑ変異体の糖鎖転移反応によって、Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎ又はＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎと、ＳＧ−ｏｘａｚｏｌｉｎｅと、がそれぞれ縮合した
生成物、ＳＧ−ｂｉｏｔｉｎ又はＳＧＦ−ｂｉｏｔｉｎが検出された。
以下に詳細を示す。【０１７８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおける分析結果を図１３に示す。Ｂに示すように、実施例７では、Ｆ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎと、ＳＧ−ｏｘａｚｏｌｉｎｅと、が縮合した生成物、すなわちＳＧＦ−ｂｉｏｔｉｎのナトリウムイオン付加体（ＮｅｕＡｃ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ−ｂｉｏｔｉｎ［Ｍ＋３Ｎａ−２Ｈ］＋）に相当すると考えられるシグナル（ｍ／ｚ２７１９．８）が検出された。
一方、Ａに示すように、糖鎖受容体としてＮ１−ｂｉｏｔｉｎを用いた比較例１０では、縮合生成物に相当するピークは検出できなかった。
また、エンドＭ変異体としてＮ１７５Ｑを用いた比較例１１（図１３のＣ）では、糖鎖受容体であるＮ１−ｂｉｏｔｉｎとＳＧ−ｏｘａｚｏｌｉｎｅが縮合した生成物、すなわちＳＧ−ｂｉｏｔｉｎのナトリウムイオン付加体（ＮｅｕＡｃ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ｂｉｏｔｉｎ［Ｍ＋３Ｎａ−２Ｈ］＋）に相当すると考えられるシグナル（ｍ／ｚ２５７３．９）が検出された。
一方、Ｄに示すように、糖鎖受容体としてＦ１Ｎ１−ｂｉｏｔｉｎを用いた比較例１２では、縮合生成物に相当するシグナルは検出できなかった。【０１７９】
実施例７と比較例１１で得られたシグナル（図１３のＢ及びＣ）について、さらに、それぞれのシグナルについてのＭＳ／ＭＳ解析を行った。結果を、実施例７については図１４の上、比較例１１については図１４の下に示す。なお、図中において表記される◇（白菱形）はＮｅｕＡｃ、○（白丸）はＧａｌ、●（黒丸）はＭａｎ、□（白四角）はＧｌｃＮＡｃ、△（白三角）はＦｕｃを示す。【０１８０】
結果から、図１３で得られたｍ／ｚ２７１９．８及びｍ／ｚ２５７３．９のシグナルについては、いずれも２つのシアル酸ナトリウム及びＬａｃＮＡｃ残基（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃが結合した基、図中の○−□の部分）の欠損に由来するフラグメントが検出された。このことにより、図１３で得られたそれぞれのシグナルは図１４中に示すような構造であることが確認された。【０１８１】
このように、本開示のエンドＭ変異体は、糖鎖供与体を、コアフコースが結合した糖鎖受容体に、効率的に糖鎖転移することが示された。【０１８２】
日本出願２０１５−０３７１８７の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
2016136984.tif 000024
【図１Ｂ】
2016136984.tif 000025
【図２】
2016136984.tif 000026
【図３】
2016136984.tif 000027
【図４】
2016136984.tif 000028
【図５】
2016136984.tif 000029
【図６】
2016136984.tif 000030
【図７】
2016136984.tif 000031
【図８Ａ】
2016136984.tif 000032
【図８Ｂ】
2016136984.tif 000033
【図８Ｃ】
2016136984.tif 000034
【図９】
2016136984.tif 000035
【図１０Ａ】
2016136984.tif 000036
【図１０Ｂ】
2016136984.tif 000037
【図１１】
2016136984.tif 000038
【図１２】
2016136984.tif 000039
【図１３】
2016136984.tif 000040
【図１４】
2016136984.tif 000041
【配列表】
2016136984000001.app
【国際調査報告】
2016136984.tif 000042
2016136984.tif 000043
2016136984.tif 000044
2016136984.tif 000045