(57)【要約】要約  高脂血症のＷＨＯ表現型III型（以下III型）高脂血症を、従来よりも簡便な方法で、かつ、高い診断効率で、他の表現型と判別する方法が開示されている。III型高脂血症の判定を補助する方法は、生体から分離した血液試料中のアポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定する工程と、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比、及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比を算出する工程とを含む。アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比の両方が共に各カットオフ値よりも高いことがIII型高脂血症である可能性が高いことを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した血液試料中のアポＢ−４８値、トリグリセリド値及びＬＤＬ−コレステロール値を測定する工程と、
アポＢ−４８値をトリグリセリド値で除した比、及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−コレステロール値で除した比を算出する工程とを含み、
アポＢ−４８値をトリグリセリド値で除した比及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−コレステロール値で除した比の両方が共に各カットオフ値よりも高いことが、III型高脂血症である可能性が高いことを示す、III型高脂血症の判定を補助する方法。
【請求項２】
前記血液試料が血清試料である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アポＢ−４８値を、アポＢ−４８に特異的な抗体を用いて測定する、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症のＷＨＯ分類の表現型の１つであるIII型高脂血症（familial type III hyperlipoproteinemia）の判定を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症は、脂質異常症に分類され、コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸などの血清脂質の増加した状態を指す。脂質異常症は、放置すると動脈硬化を発症し、さらに進展すると心筋梗塞、脳梗塞を発症し、最悪の場合には死に至る疾患であり、その効果的な診断法及び治療法の確立が待望されている。厚生労働省の平成２２年国民健康・栄養調査結果では、無作為に抽出した３０歳以上の日本国民において、脂質異常症が疑われる者の割合は、男性２２．３％、女性１７．７％であったことが報告されている。【０００３】
脂質異常症の基準は、日本動脈硬化学会の「動脈硬化性疾患予防ガイドライン２０１２年版」（以下、単に「ガイドライン」とも称する）では、血清低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ≧１４０ｍｇ／ｄＬ）、血清トリグリセリド（ＴＧ≧１５０ｍｇ／ｄＬ）、血清高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ＜４０ｍｇ／ｄＬ）とされている。【０００４】
脂質異常症に関与する代表的なリポ蛋白としては、カイロミクロン（ＣＭ）、ＣＭの血中での中間代謝産物であるカイロミクロンレムナント（ＣＭレムナント）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、ＶＬＤＬの血中での中間代謝産物である超低比重リポ蛋白レムナント（ＶＬＤＬレムナント）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）等が知られている。【０００５】
動脈硬化症の病因の一つとして、体内を循環する血液中に存在するリポ蛋白のうち、血管壁へのコレステロールの沈着を促進する種々のリポ蛋白が増加し、又は、コレステロールの沈着を防止する種々のリポ蛋白が減少することが挙げられている。そこで、これらのリポ蛋白の血中量を直接測定し、脂質異常症や動脈硬化症の診断及び治療に役立てることが望まれている。【０００６】
脂質代謝の面からは、例えば、ＣＭレムナントやＶＬＤＬレムナント（これらはレムナント様リポ蛋白（ｒｅｍｎａｎｔ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＲＬＰ）と呼ばれている）、ＬＤＬ等は、コレステロールを血管壁に運び込むリポ蛋白であり、ＨＤＬは、動脈硬化巣からコレステロールを引き抜くリポ蛋白である。ＲＬＰは、食後脂質異常症の動脈硬化病変発現に関与していることが指摘され、動脈硬化症の危険因子の一つである。ＲＬＰを構成する部分蛋白（アポ蛋白）は、アポＢ−４８を含む外因性のＣＭ、ＣＭレムナントと、アポＢ−１００を含む内因性のＶＬＤＬ、ＶＬＤＬレムナントからなる。【０００７】
アポＢ−４８は、アポＢ−１００のアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドである。アポＢ−１００のアミノ酸配列もアポＢ−４８のアミノ酸配列は非特許文献１で報告されている。抗アポＢ−４８特異抗血清は、非特許文献２〜４で報告されている。また、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体と、これを使用した血中アポＢ−４８の測定方法は、特許文献１、２で報告され、アポＢ−４８の定量的な測定を可能とする検量線作成用の標準液は、特許文献３で報告されている。【０００８】
高脂血症のＷＨＯ分類の表現型はＩ型、IIａ型、IIｂ型、III型、IV型、Ｖ型に分類される（文献：日本臨床検査医学会「診断群別臨床検査のガイドライン2003」pp.118-121）。Ｉ型は高カイロミクロン血症、IIａ型は高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、IIｂ型は高コレステロール・高中性脂肪血症、IV型は高中性脂肪血症、Ｖ型は高カイロミクロン血症、高ＶＬＤＬ−コレステロール血症である。高脂血症患者では、特にIIａ型、IIｂ型、IV型が多くみられる。【０００９】
III型高脂血症（familial typeIII hyperlipoproteinemia）は、高トリグリセライド血症、高ＬＤＬ−コレステロール血症であり、動脈硬化に至るリスクが高い一方、早期であれば食事療法に反応をしやすい表現型であることが知られ、早期の診断、治療が非常に有用である。【００１０】
しかし、従来、高脂血症の表現型の判定方法は、電気泳動法に依るため操作上の煩雑さを伴うこと、スループットが高くないこと、定性法であるため客観的な判断が困難であることから、日常的な方法とはいえなかった。【００１１】
また、非特許文献５には、III型高脂血症の判定に、血中のアポＢ−４８定量値を用いて、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比を用いる事が有用と記載されている。しかし、アポＢ−４８値／ＴＧ比がIII型において他の表現型と比して有意に高い値を示したものの、臨床的にIII型高脂血症を判定するには、その診断効率に改良の余地が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第３４４０８５２号公報
【特許文献２】特許第３８３３１８３号公報
【特許文献３】特開２０１３−２２４８６３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Nature, Vol.323, p.738 (1986年10月)
【非特許文献２】J.Biol.Chem., Vol.265, No.15, pp.8358-8360 (1990年)
【非特許文献３】J.Biol.Chem., Vol.267, No.2, pp.1175-1182 (1992年)
【非特許文献４】Clinical Science., Vol.85, pp.521-524 (1993年)
【非特許文献５】J.Atheroscler.Thromb., Vol.19, No.9, pp.862-871 (2012年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、高脂血症のＷＨＯ表現型III型（以下III型）高脂血症を、従来よりも簡便な方法で、かつ、高い診断効率で、他の表現型と判別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは鋭意研究した結果、III型高脂血症の判定として、血中アポＢ−４８値を測定し、血中ＴＧ値だけではなく、ＬＤＬ−Ｃ値と組み合わせることで、III型高脂血症を高い判断効率で判定できることを見出した。【００１６】
すなわち、本発明は、生体から分離した血液試料中のアポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定する工程と、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比、及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比を算出する工程とを含み、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比の両方が共に各カットオフ値よりも高いことがIII型高脂血症である可能性が高いことを示す、III型高脂血症の判定を補助する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、III型高脂血症を、従来よりも簡便な方法で、かつ、高い診断効率で他の表現型と判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】下記比較例１で作成した、アポＢ-48のＲＯＣ曲線（I，III，V型を陽性とした場合）を示す。
【図２】下記比較例２で作成した、アポＢ-48のＲＯＣ曲線（III型を陽性とした場合）を示す。
【図３】下記比較例３で作成した、アポＢ-48／ＴＧのＲＯＣ曲線を示す。
【図４】下記比較例４で作成した、アポＢ-48／ＬＤＬ-ＣのＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
上記のとおり、本発明の方法では、生体から分離した血液試料中のアポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定する。本明細書では、特段の説明がない限り、アポＢ−４８値、ＴＧ値、ＬＤＬ−Ｃ値は、それぞれ、μｇ／ｍＬ、ｍｇ／ｄＬ、ｍｇ／ｄＬを単位とした値とするが、これらに限定するものではない。
ここで、血液試料としては、血清又は血漿、特に血清を好ましく用いることができる。なお、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値は、通常の健康診断でも測定されており、それらの値を利用することもできるが、食事の影響等の経時変化を排除して判定の正確性を高めるためには、上記３つの値は、単一の血液試料の値を測定することが好ましい。また、検査に供する血液試料の供給源である「生体」は、通常、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。また、高脂血症の型判別を必要とする対象は、通常、脂質異常症患者である。なお、ヒト脂質異常症患者は、血清低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）≧１４０ｍｇ／ｄＬ、血清トリグリセリド（ＴＧ）≧１５０ｍｇ／ｄＬ、又は血清高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）＜４０ｍｇ／ｄＬの患者である。
【００２０】
アポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値の測定方法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、これらの値は市販のキットを用いた周知の方法により測定することができる。以下、簡単に説明する。
【００２１】
＜アポＢ−４８の測定方法＞
血中アポＢ−４８値の測定は、アポＢ−４８を定量的に測定できる方法であれば特に限定されるものではないが、アポＢ−４８に特異的な抗体を用いた免疫測定方法を好適に用いることができ、例えば、特許文献１〜３に示す方法を用いることができる。アポＢ−４８に特異的な抗体としては、特に、アポＢ−１００とは実質的に反応しない、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体を使用することが好ましい。
【００２２】
例えば、アポＢ−４８の測定は、以下の２ステップサンドイッチ法を原理とする化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）を用いて行うことが可能であるが、この方法に限定されるものではない。
【００２３】
ＣＬＥＩＡ法によるアポＢ−４８測定方法では、まず、血清または血漿試料を、界面活性剤を主成分とする処理液で処理し、カイロミクロン及びカイロミクロンレムナント中のアポＢ−４８を露出させる。次に、この処理済試料を、抗アポＢ−４８モノクローナル抗体結合粒子（固相；第１抗体）懸濁液に加えて反応させ、粒子を洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識アポＢモノクローナル抗体（第２抗体）を加えて反応させ、試料中に第１抗体−アポＢ−４８−第２抗体の３者サンドイッチ複合体を形成させる。未反応のアルカリホスファターゼ標識抗体を洗浄除去し、化学発光基質（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン−２−ナトリウム塩；ＡＭＰＰＤ）を加えて酵素反応を行う。固相に結合した試料中のアポＢ−４８量は、酵素によるＡＭＰＰＤの分解に伴う発光量に反映されるため、この発光量を測定することで、アポＢ−４８値を求めることができる。
【００２４】
＜ＴＧの測定方法＞
血中ＴＧ値の測定は、公知の方法をいずれも使用可能であるが、通常、医療機関で広く用いられる、血清からの酵素法による測定方法を好適に使用できる。
【００２５】
＜ＬＤＬ−Ｃの測定方法＞
ＬＤＬ−Ｃ値の測定は、公知の方法をいずれも使用可能である。ＬＤＬ−Ｃは、総コレステロール値（ＴＣ）を用いてＦｒｉｅｄｅｌｗａｌｄの式（Ｆ式；（ＬＤＬ−Ｃ）＝（ＴＣ）−（ＨＤＬ−Ｃ）−（ＴＧ／５））により算出するのが通常である。ＴＣ値の測定方法、ＨＤＬ−Ｃ値の測定方法は、公知の方法をいずれも使用可能であるが、通常、医療機関で広く用いられる、血清からのコレステロール脱水素酵素（ＵＶ）法、直接法をそれぞれ好適に使用できる。しかし、ＴＧ≧４００ｍｇ／ｄＬの場合は、正確な値が算出できないので、Ｆ式を用いず、酵素反応を原理とする直接法を用いる事もある。
【００２６】
本発明の方法では、測定した上記３つの値から、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比及びアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比を算出する。これらの比が、いずれも各カットオフ値よりも高い場合に、III型高脂血症である可能性が高いと判断することができる。
【００２７】
ここで、各カットオフ値は、好ましくはＲＯＣ(Receiver Operating Characteristic)分析により、より好ましくは各種脂質異常症患者を母集団とするＲＯＣ(Receiver Operating Characteristic)分析により決定することができる。ＲＯＣ分析は、カットオフ値を変化させ、それぞれのカットオフ値での有病正診率を縦軸に、1-無病正診率を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線に基づく分析であり、ＲＯＣ曲線上の、有病正診率、無病正診率がともに１となる点（グラフの左上端）に最も近接する点に相当するカットオフ値を、最も診断効率の高いカットオフ値として採用する方法である。ここで、「有病正診率」は、「陽性確かさ率」、「陽性率」又は「感度」とも呼ばれ、真陽性例中に占める陽性と判定された症例数の割合を示す値であり、「無病正診率」は、「陰性確かさ率」又は「特異度」とも呼ばれ、真陰性例中に占める無病と判定された症例数の割合を示す値である。
【００２８】
下記実施例では、１２３名のヒト脂質異常症患者についてＲＯＣ分析を行った結果、アポＢ−４８値（μｇ／ｍＬ）をＴＧ値（ｍｇ／ｄＬ）で除した前記比の前記カットオフ値が０．０４５、アポＢ−４８値（μｇ／ｍＬ）をＬＤＬ−Ｃ値（ｍｇ／ｄＬ）で除した前記比の前記カットオフ値が０．１０９であった。したがって、これらの値を各カットオフ値として用いることができる。もっとも、測定方法による測定値の差や母集団の差異に基づく差を考慮すれば、各カットオフ値はこれらの値に限定されるものではなく、通常、これらの値±２０％の範囲、好ましくは、これらの値±１０％の範囲から選択される。
【００２９】
本発明の方法によれば、血液試料中のアポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定するという簡便な操作により、高い診断効率でIII型高脂血症の判定を行うことができる。下記実施例では、非特許文献５に記載されたアポＢ−４８値をＴＧ値で除した比を用いた方法では、診断効率が７２％であったが、本発明の方法では８９％であった。なお、「診断効率」は、「正診率」とも呼ばれ、全被験例のうち、正しく判定された症例数の占める割合を示す。
【実施例】
【００３０】
対象患者及び測定方法
ガイドラインの基準（上述）で脂質異常症と判断された１２３例のヒト脂質異常症患者の血清について、アポＢ−４８値、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定した。高脂血症のＷＨＯの表現型分類は、Ｉ型４例、IIａ型２９例、IIｂ型３３例、III型１１例、IV型２３例、Ｖ型２３例であった。アポＢ−４８値は、「アポ蛋白Ｂ−４８測定キット」（富士レビオ株式会社製）と、全自動免疫測定装置「ルミパルスフォルテ」（富士レビオ株式会社製）とを用いて測定した。ＴＧ値は通常の酵素法、ＬＤＬ−Ｃ値は通常のＦ式法を用いて算出した。【００３１】
比較例１
Ｉ型、III型、Ｖ型を陽性とし、IIａ型、IIｂ型、IV型を陰性として、アポＢ−４８値についてＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）（図１）を作成し、アポＢ−４８値のカットオフ値（１０．０μｇ／ｍＬ）を割り出した。前記カットオフ値を基準として、カットオフ値以上の測定値を示す検体を陽性、カットオフ値未満の測定値を示す検体を陰性として振り分けた。振り分けられた検体の陽性確かさ率（有病正診率）、振り分けられた検体の陰性確かさ率（無病正診率）および合算した診断効率を算出した。【００３２】
比較例２
III型を陽性とし、Ｉ型、IIａ型、IIｂ型、IV型、Ｖ型を陰性とし、アポＢ−４８値についてＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）（図２）を作成し、アポＢ−４８値のカットオフ値（１５．０μｇ／ｍＬ）を割り出した。前記カットオフ値を基準として、カットオフ値以上の測定値を示す検体を陽性、カットオフ値未満の測定値を示す検体を陰性として振り分けた。振り分けられた検体の陽性確かさ率（有病正診率）、振り分けられた検体の陰性確かさ率（無病正診率）および合算した診断効率を算出した。【００３３】
比較例３
III型を陽性とし、Ｉ型、IIａ型、IIｂ型、IV型、Ｖ型を陰性とし、アポＢ−４８値をＴＧ値で除した比（アポＢ−４８／ＴＧ）についてＲＯＣ曲線（図３）を作成し、カットオフ値（０．０４５）を割り出した。前記カットオフ値を基準として、カットオフ値以上の測定値を示す検体を陽性、カットオフ値未満の測定値を示す検体を陰性として振り分けた。振り分けられた検体の陽性確かさ率（有病正診率）、振り分けられた検体の陰性確かさ率（無病正診率）および合算した診断効率を算出した。【００３４】
比較例４
III型を陽性とし、Ｉ型、IIａ型、IIｂ型、IV型、Ｖ型を陰性とし、ＲＯＣから算出したアポＢ−４８値をＬＤＬ−Ｃ値で除した比（アポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃ）についてＲＯＣ曲線（図４）を作成してカットオフ値（０．１０９）を割り出した。前記カットオフ値を基準として、カットオフ値以上の測定値を示す検体を陽性、カットオフ値未満の測定値を示す検体を陰性として振り分けた。振り分けられた検体の陽性確かさ率（有病正診率）、振り分けられた検体の陰性確かさ率（無病正診率）および合算した診断効率を算出した。【００３５】
実施例１
III型を陽性とし、Ｉ型、IIａ型、IIｂ型、IV型、Ｖ型を陰性とし、それぞれＲＯＣ曲線（図３及び図４）から割り出したアポＢ−４８／ＴＧ、及びアポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃのカットオフ（それぞれ０．０４５、０．１０９）を基準として、いずれもカットオフ値以上の測定値を示す検体を陽性、それ以外の検体を陰性として、各検体を陽性または陰性に振り分けた。振り分けられた検体の陽性確かさ率（有病正診率）、振り分けられた検体の陰性確かさ率（無病正診率）および合算した診断効率を算出した。【００３６】
比較例１〜４及び実施例１の有病正診率、無病正診率、診断効率を表１に示す。比較例１では、ＲＯＣ曲線から割り出されたアポＢ−４８値をカットオフとしたＩ型、III型、Ｖ型の診断効率は８１％であった。比較例２では、ＲＯＣ曲線から割り出されたアポＢ−４８値をカットオフとしたIII型の診断効率は７７％であった。比較例３では、ＲＯＣ曲線から割り出されたアポＢ−４８／ＴＧ値をカットオフとした、III型の診断効率は７２％であった。比較例４では、ＲＯＣ曲線から割り出されたアポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃ値をカットオフとしたIII型の診断効率は７９％であった。実施例１では、ＲＯＣ曲線から算出したアポＢ−４８／ＴＧ値及びアポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃ値をカットオフとしたIII型の診断効率は８９％を示した。アポＢ−４８／ＴＧ及びアポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃを用いる事でより高い診断効率を示した。【００３７】
通常、脂質異常症と判断された時点で、被験者のＴＧ値、ＬＤＬ−Ｃ値は測定済みである。本発明の方法は、ＴＧ値及びＬＤＬ−Ｃ値を測定したのと同一の血清検体、またはほぼ同時に採取された血清または血漿検体中のアポＢ−４８値を測定し、これと既知のＴＧ値、ＬＤＬ−Ｃ値を組み合わせることで、具体的にはアポＢ−４８／ＴＧ及びアポＢ−４８／ＬＤＬ−Ｃを用いることで、高いIII型判断効率を示すことがわかった。【００３８】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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