(57)【要約】【解決課題】  細胞内のカルパイン活性を高感度に検出する蛍光プローブを提供すること【解決手段】下記の一般式（Ｉ）：【化１】2016137004.tif 000018で表される化合物又はその塩。
2016137004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2016137004.tif 000014
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ１０が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）又は（２）で表される、請求項２に記載の化合物又はその塩。
2016137004.tif 000015
【請求項４】
以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
2016137004.tif 000016
【請求項５】
以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
2016137004.tif 000017
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項７】
カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、網膜疾患の診断薬。
【請求項９】
前記網膜疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患である、請求項８に記載の診断薬。
【請求項１０】
前記緑内障が正常眼圧緑内障である、請求項９に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルパインの活性を検出することができる緑色蛍光プローブに関する。また、本発明は、当該蛍光プローブを用いた網膜疾患の診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、日本において成人の中途失明原因第一位の疾患であり、４０歳以上の平均有病率は約５％である。緑内障の定義は、「視神経と視野に特徴的変化を有し、通常、眼圧を十分に下降させることにより視神経障害を改善もしくは抑制しうる、目の機能的構造的異常を特徴とする疾患」である（非特許文献１）。分類としては、Ｉ）原発緑内障、ＩＩ）続発緑内障、ＩＩＩ）発達緑内障、に大きく分類されており、Ｉ）原発緑内障は、更に細かく、１）緑内障原発開放隅角緑内障(広義)（Ａ：原発開放隅角緑内障、Ｂ：正常眼圧緑内障）、２）原発閉塞隅角緑内障（Ａ：原発閉塞隅角緑内障、Ｂ：プラトー虹彩緑内障）、３）混合型緑内障、に分類されている（非特許文献１）。【０００３】
緑内障に多く見られる所見の一つとして眼圧上昇があるが、日本においては、緑内障の発生進行過程において眼圧が常に正常値に留まる、正常眼圧緑内障が全緑内障患者の約７０％を占めている。これはアジアにおいて顕著にみられる傾向である。しかし、現在の緑内障に対する確実な治療法は、眼圧を下降することのみであり、眼圧以外の因子に対する治療法が模索されている。
緑内障のいずれの病型においても、進行性の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の消失とそれに対応した視野異常が特徴的である。近年、ＲＧＣの消失はカルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）活性に影響されることが示唆されており、正常眼圧緑内障の病態モデル動物にカルパイン阻害薬を投与することで、ＲＧＣの消失が減少すると報告されている（非特許文献２）。
また、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿網膜症に伴う網膜神経障害においてもカルパインの関与が示唆されている（非特許文献３〜６）。
また、虚血性疾患である網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症等の網膜血管閉塞性疾患においてもカルパインの活性化が関与すると考えられている（非特許文献７及び８）。【０００４】
カルパインは、Ｃａ２＋依存的に働くシステインプロテアーゼである。中枢神経系で普遍的に発現しており、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患に関わっている。網膜においてはＲＧＣと神経線維層で発現しており（非特許文献９〜１１）、カルパインの活性化は、軸索切断後の網膜移植片のＧＣＬ（神経節細胞層）やラットの緑内障モデルで確認されている（非特許文献１２〜１３）。カルパインは間接的にアポトーシス経路を誘導し、結果としてＲＧＣの消失につながる。
上記の観点から、カルパイン活性を病態動物でリアルタイムに観察できるようにすることにより、
（１）カルパイン活性が、いつ、どこで、どのように網膜疾患の病態に関与しているのか解明する、
（２）（１）が分かることにより、網膜疾患の進行具合や、治療介入のタイミングの判断に用いる、
ことが可能になると考えられる。【０００５】
これまでに報告されているカルパインのプローブとして、
（Ａ）カルパインの基質となるペプチドに蛍光タンパクドメインを結合させた、タンパク質ベースのプローブ（非特許文献１４）
（Ｂ）クマリンにジペプチドを結合させたプローブ（非特許文献１５）
が報告されているが、生細胞でのイメージングにおいては、遺伝子導入に頼らず、また、励起光にＵＶ光を用いなくてよいカルパイン活性検出蛍光プローブの開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本緑内障学会HP(http://www.ryokunaisho.jp/)
【非特許文献２】M. Ryu, M.Yasuda, D. Shi, A. Y. Shanab, R. Watanabe, N. Himori, K. Omodaka, Y. Yokoyama, J. Takano, T. Saido, T. Nakazawa, J Neurosci Res. 2012, 90, 802-815.
【非特許文献３】Eye (2014) 28, 85-92
【非特許文献４】Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1783-1795
【非特許文献５】PLOS ONE August 2013, Volume 8, Issue 8, e71650
【非特許文献６】Neurobiology of Disease 48 (2012) 556-567
【非特許文献７】Retinal ischemia: Mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Osborne NN, Casson RJ, Wood JP, Chidlow G, Graham M, Melena J. Prog Retin Eye Res. 2004 Jan;23(1):91-147.
【非特許文献８】Degeneration and dysfunction of retinal neurons in acute ocular hypertensive rats: Involvement of calpains. Suzuki R, Oka T, Tamada Y, Shearer TR, Azuma M. J Ocul Pharmacol Ther. 2014 Jun;30(5):419-28.
【非特許文献９】K. Blomgren, J. O. Karlsson, Neurosci. Lett. 1990, 112, 179-183.
【非特許文献１０】H. Persson, S. Kawashima, J. O. Karlsson, Brain Res. 1993, 611, 272-278.
【非特許文献１１】M. Azuma, T. R. Shearer, Surv. Ophthalmol. 2008, 53, 150-163.
【非特許文献１２】D. P. McKernan, M. B. Guerin, O’Brien, C. J., T. G. Cotter, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007, 48, 5420-5430.
【非特許文献１３】W. Huang, J. B. Fileta, I. Rawe, J. Qu, C. L. Grosskreutz, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010, 51, 3049-3054.
【非特許文献１４】P. W. Vanderklish, L. A. Krushel, B. H. Holst, J. A. Gally, K. L. Crossin, G. M. Edelman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 2253-2258.
【非特許文献１５】M. Niapour, S. Berger, Cytometry A. 2007, 71, 475-485.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞内のカルパイン活性を高感度に検出する蛍光プローブを提供することを目的とする。
また、本発明は、当該蛍光プローブを用いて、カルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討したところ、ＨＭＲＧを基本骨格として、カルパインの基質となるペプチド鎖をアミド結合させることにより、細胞内でカルパインと酵素反応した時に蛍光が上昇する蛍光プローブを提供することができることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2016137004.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ１０が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）又は（２）で表される、［２］に記載の化合物又はその塩。
2016137004.tif 000004
［４］以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
2016137004.tif 000005
［５］以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
2016137004.tif 000006
［６］［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［７］カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
［８］［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、網膜疾患の診断薬。
［９］前記網膜疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患である、［８］に記載の診断薬。
［１０］前記緑内障が正常眼圧緑内障である、［９］に記載の診断薬。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物を用いることにより、緑色波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れ、カルパインとの反応で生成する蛍光物質の量子収率が高く、明るい蛍光プローブを提供することができる。
また、本発明の化合物を用いることにより、生細胞におけるカルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害（例えば、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿網膜症に伴う網膜神経障害及び網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患）の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することができる。特に、本発明の化合物は、フルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能である
従って、本発明は、生細胞におけるカルパイン活性のモニタリングのツールとして、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧのカルパイン添加による吸収および蛍光スペクトルの変化(カルパイン１を使用)
【図１ｂ】Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧのカルパイン添加による吸収および蛍光スペクトルの変化（カルパイン２を使用）
【図２ａ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧのカルパイン添加による吸収および蛍光スペクトルの変化（カルパイン１を使用）
【図２ｂ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧのカルパイン添加による吸収および蛍光スペクトルの変化（カルパイン２を使用）
【図３】Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
【図４ａ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング（ＡＬＬＮ未添加）
【図４ｂ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング（ＡＬＬＮを１μＭ添加）
【図４ｃ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング（ＡＬＬＮを２μＭ添加）
【図４ｄ】Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング（ＡＬＬＮを５μＭ添加）
【図５ａ】ＮＭＤＡ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与前の眼底撮影像
【図５ｂ】ＮＭＤＡ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与３０分後の眼底撮影像
【図５ｃ】ＮＭＤＡ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与６０分後の眼底撮影像
【図５ｄ】ＮＭＤＡ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与９０分後の眼底撮影像
【図６ａ】ＰＢＳ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与前の眼底撮影像
【図６ｂ】ＰＢＳ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与３０分後の眼底撮影像
【図６ｃ】ＰＢＳ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与６０分後の眼底撮影像
【図６ｄ】ＰＢＳ投与群のＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与９０分後の眼底撮影像
【図７ａ】ＮＭＤＡ投与群  網膜進展標本のＦＧ染色像
【図７ｂ】ＮＭＤＡ投与群  網膜進展標本のＨＭＲＧ染色像
【図７ｃ】ＮＭＤＡ投与群  網膜進展標本のＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ染色像
【図８ａ】ＰＢＳ投与群  網膜進展標本のＦＧ染色像
【図８ｂ】ＰＢＳ投与群  網膜進展標本のＨＭＲＧ染色像
【図８ｃ】ＰＢＳ投与群  網膜進展標本のＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ染色像
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１〜６個程度、好ましくは炭素数１〜４個程度である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００１３】
また、本明細書において、アリール基は単環性アリール基又は縮合多環性アルール基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含んでいてもよい。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアラルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００１４】
本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2016137004.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩である。
【００１５】
Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を示す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ１としては水素原子が好ましい。
【００１６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ２及びＲ７が水素原子であることが好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であることも好ましい。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７がいずれも水素原子であることがさらに好ましい。
【００１７】
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ８及びＲ９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合、及びＲ８がアルキル基であり、かつＲ９が水素原子である場合が好ましく、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合がさらに好ましい。
【００１８】
ＸはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）のほか、分枝鎖状アルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１０は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す。カルパインとの接触により切断される一価の置換基としては、好ましくは、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である。
【００２０】
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基としては、好ましくは、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｔｙｒの配列を有するオリゴペプチド残基（配列の右端のアミノ酸がキサンテン骨格に結合したＮＨ基と直接結合している）を含む一価の置換基である。
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基のＮ末端は保護されていてもよく、保護基としては、アセチル基、グルタリル基、スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などが挙げられるが、これら以外の置換基を用いてもよい。
【００２１】
本発明の一つの実施態様において、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基は、以下の式（１）又は（２）で表される。
2016137004.tif 000008
【００２２】
本発明の一つの好ましい実施態様は、以下の式（３）又は（４）で表される化合物又はその塩である。
2016137004.tif 000009
【００２３】
本発明における上記一般式（Ｉ）、式（３）及び式（４）で表される化合物の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
【００２４】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００２５】
本発明により提供される一般式（Ｉ）、式（３）又は式（４）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、カルパインとの接触によりＲ１０置換基又はオリゴペプチド残基を含む一価の置換基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ１０が水素原子になった化合物に相当する）を生成することができ、カルパインの測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。
【００２６】
上記した蛍光プローブを用いるカルパインの測定は、当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：（ａ）カルパインと接触することで切断される一価の置換基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。
【００２７】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれるカルパインの活性測定や、生細胞内でのカルパイン活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物及び塩を含む、網膜疾患の診断薬である。
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物及び塩を含む、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患（網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症）の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障の診断薬である。
また、本発明の一つの側面は、本発明の化合物及び塩を含む、正常眼圧緑内障の診断薬である。
【００２９】
本発明の化合物及び塩は、緑色波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れていることから、眼科領域で使用することにより、カルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害、例えば、緑内障（特に、正常眼圧緑内障）、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害及び網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患の病態解明、臨床診断、治療効果の判定を可能とするものである。
また、本発明の化合物はフルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能であるという利点を有する。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。【００３１】
［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明の化合物１（Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ）を合成した。【００３２】
スキーム１：本発明の化合物１（Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ）の合成方法
2016137004.tif 000010
【００３３】
（１）ｌｅｕｃｏＨＭＲＧの合成
Ｒｈｏｄａｍｉｎ１１０  ３６２ｍｇ（０．９８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）と硫酸４００μＬ（７．５０４ｍｍｏｌ、７．６ｅｑ．）をメタノール４０ｍＬに溶かし８０°Ｃで終夜撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。得られた固体を水及びメタノールで抽出した。有機層の溶媒を除去し、固体を得た。続いて、ＴＨＦ６０ｍＬに溶かし、氷冷下でＬＡＨ  ２４７．８ｍｇ（６．５３ｍｍｏｌ、６．６ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて０°Ｃで終夜撹拌した。メタノールでクエンチ後、ジクロロメタンを５０ｍＬ、ロッシェル塩水溶液を１００ｍＬ加え、終夜撹拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層に硫酸ナトリウム加えてろ過した後に、溶媒を除去し固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロロメタン／メタノール＝９７／３）目的化合物（６４ｍｇ、２１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.36-7.34 (m, 1H), 7.12-7.10 (m, 2H), 6.96-6.94 (m, 1H), 6.59 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 6.24 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.16 (dd, 2H, J = 8.2 Hz, 2.2 Hz), 5.29 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 5.07 (s, 4H), 4.54 (d, 2H, J = 4.9 Hz). HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 341.12605, Found, 341.12576 (-0.29 mmu).【００３４】
（２）Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ（本発明の化合物１）の合成
Ｌｅｕｃｏ−ＨＭＲＧ６．３ｍｇ（０．０１９８ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．２ｍＬに溶かし、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ５ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）５．７ｍｇ（０．０１５０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）５μＬ（０．０２８７ｍｍｏｌ、２．９ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで２時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残査８．０ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル６．６ｍｇ（０．０２６８ｍｍｏｌ、２．７ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。続いてチオアニソール５８μＬ（０．４９５ｍｍｏｌ、５０ｅｑ．）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２ｍｌを加え７時間撹拌し、ショートカラムで粗精製した。次に、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ）  ａｎｄ  ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０  ｔｏ  １０／９０  ２０ｍｉｎ））目的化合物（１．４ｍｇ、１９％（ｉｎ  ２  ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 748.37048, Found, 748.36998 (-0.5 mmu). 【００３５】
［合成実施例２］
以下のスキーム２により、本発明の化合物２（Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ）を合成した。【００３６】
スキーム２：本発明の化合物２（Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ）の合成方法
2016137004.tif 000011
【００３７】
（１）Ａｃ−ＬＭ−ｌｅｕｃｏＨＭＲＧの合成
Ｌｅｕｃｏ−ＨＭＲＧ１０．６ｍｇ（０．０３３ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３ｍＬに溶かし、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＯＨ５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）９．５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）８．６μＬ（０．０４９ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで９０分間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロルメタン／メタノール＝９１／９）目的化合物（８．１ｍｇ、８２％）を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 627.26116, Found, 627.25978 (-1.4 mmu).【００３８】
（２）Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ（本発明の化合物２）の合成
Ａｃ−ＬＭ−ｌｅｕｃｏＨＭＲＧ８．１ｍｇ（０．０１３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル９．２ｍｇ（０．０３７４ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。ショートカラムで粗精製した後、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ）  ａｎｄ  ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝７５／２５  ｔｏ  ２５／７５  ３０ｍｉｎ））目的化合物（１．３ｍｇ、１３％（ｉｎ  ２  ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 603.26357, Found, 603.26343 (-0.13 mmu).【００３９】
カルパインプローブ（Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ）の機能機序
カルパインの基質であるアミノ酸を、ＨＭＲＧのキサンテン環の一方のアミノ基にアミド結合でつなげたプローブ（Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ）から、カルパインによってアミノ酸が切り出されると、ＨＭＲＧに変化する。このように反応前後で閉環構造から開環構造へと変化することで、無吸収・無蛍光から強蛍光性へと大きく変化する（スキーム３）。【００４０】
スキーム３  カルパインプローブの作用機序
2016137004.tif 000012
【００４１】
［実施例１］
Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ及びＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの光学特性の測定
ｐＨ２の０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＡｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ及びＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの光化学特性を測定した。下記の表１に酵素反応生成物であるＨＭＲＧの光化学特性と共に示す。
【表１】
2016137004.tif 000013
【００４２】
［実施例２］
Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いて、以下の条件でＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、酵素反応によりＡｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が２倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図１ａ(カルパイン１を使用)及び図１ｂ(カルパイン２を使用)に示す。【００４３】
（実験条件）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２．４  ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３．８  ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ−１  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ−２  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．２０８７１５）【００４４】
［実施例３］
Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いてＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、カルパイン２では酵素反応によりＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が４倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図２ａ(カルパイン１を使用)及び図２ｂ(カルパイン２を使用)に示す。【００４５】
（実験条件）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２４  ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３８  ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ−１  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ−２  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  （Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０８７１５）【００４６】
［実施例４］
Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｓｔａｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。
その結果を図３に示す（図３の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図３で示すように、Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。【００４７】
［実施例５］
Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｓｔａｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、（ｂ）１μＭ  ＡＬＬＮ（カルパイン選択的阻害剤）を含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（−））、（ｃ）２μＭ  ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（−））、（ｄ）５μＭ  ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（−））、を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。その結果を図４ａ〜図４ｄに示す（各図の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図４ａで示すように、Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。また、図４ｂ〜４ｄで示すように、カルパイン選択的阻害剤であるＡＬＬＮの添加により細胞内の蛍光強度は低下し、ＡＬＬＮの添加濃度が増大に伴い蛍光強度が低下した。【００４８】
上記の実施例で例証したように、本発明により、カルパインをターゲットとした新たな蛍光プローブを提供することができる。具体的には、実施例２〜３で示した通り、Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧはカルパインと反応することで、蛍光強度が上昇することが分かった。また、両者を細胞に適用した結果、Ａｃ−ＬＬＹ−ＨＭＲＧ、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧともに蛍光強度上昇を示した。また、実施例５の阻害剤添加実験から、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの蛍光上昇が低下したことから、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧは細胞内カルパイン活性を特異的に蛍光検出できることが示された。【００４９】
［実施例６］
ラットＮＭＤＡ障害モデルを用いたＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
ＳＤラットにネンブタールを用いて全身麻酔を行った。眼内にＮ‐メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）（１０ｍＭ、２μＬ）、またはＰＢＳを眼内に投与した。４時間後にケタミン・キサラジン混合液で再度麻酔を行い、眼内にＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ（２ｍＭ、２μＬ）を投与した。その後、Ｆ１０（ニデック社共焦点生体顕微鏡）で眼底を撮影した。
その結果を図５ａ〜図５ｄ及び図６ａ〜図６ｄに示す。図５及び図６中、矢印で示す箇所は、ＨＭＲＧで染色された神経細胞を示す。
図５ａで示すように、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与前には明らかなシグナルを認めていない。しかし、図５ｂ〜図５ｄで示すように、ＮＭＤＡを投与したラット（ＮＭＤＡ投与群）では、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧを投与して３０分後、６０分後、９０分後には明らかに神経細胞が染色された。一方、ＰＢＳを投与したラット（ＰＢＳ投与群）では、Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与前にシグナルを認められず（図６ａ）、３０分後（図６ｂ）、６０分後（図６ｃ）、９０分後（図６ｄ）にはごくわずかに神経細胞が染色された。
ラットＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。【００５０】
［実施例７］
マウスＮＭＤＡ障害モデル網膜進展標本を用いたＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
マウスＮＭＤＡ障害モデルは網膜伸展標本で検討を行った。まず、マウス  オス  ＢＬ６／Ｊに上丘から逆行性蛍光染色トレーサーであるフルオロゴールド（ＦＧ）を注入して、網膜神経節細胞をラベルした（図７ａ及び図８ａ）。１週間後、ネンブタールで麻酔を行い、眼内にＮＭＤＡ３０ｍＭ  １μＬ（ＰＢＳ溶解）またはＰＢＳ  １μＬを硝子体に投与した。その２時間後に再度ケタミン・キサラジン混合液で麻酔を行い、眼内にＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ（０．５ｍＭ、１μＬ、ＰＢＳ溶解）を投与した。Ａｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ投与の更に１時間後にＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（細胞死を起こした細胞を染色する目的、２５μＬ、１μＬ，ＰＢＳ溶解）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を硝子体投与した。その１０分後に眼球摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定を2時間行い、網膜進展標本を作製した。
その結果を図７ａ〜図７ｃ及び図８ａ〜図８ｃに示す。
図７ａ〜図７ｃはＮＭＤＡ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図７ａはＮＭＤＡ投与群のＦＧによる染色像、図７ｂはＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧによる染色像、図７ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図７ｂ、図７ｃで示すように、ＮＭＤＡ投与群ではカルパインの活性化がＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧで検出され、細胞死も検出された。図８ａ〜図８ｃはＰＢＳ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図８ａはＰＢＳ投与群のＦＧによる染色像、図８ｂはＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧによる染色像、図８ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図８ｂ及び図８ｃで示すように、ＰＢＳ投与群では細胞死が起こっていないためＡｃ−ＬＭ−ＨＭＲＧ及びＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで染色像が認められなかった。
マウスＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。【００５１】
本発明の蛍光プローブを緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患の患者に適用することで、まず患者個人の眼底・網膜神経節細胞におけるカルパイン活性を迅速に知ることが出来るため、臨床診断・治療選択に大きな効果を発揮すると期待される。具体的には、カルパイン活性上昇が確認された患者には、カルパイン阻害薬の処方を実施するなど、本発明の蛍光プローブの医療上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きい。
【図１ａ】
2016137004.tif 000019
【図１ｂ】
2016137004.tif 000020
【図２ａ】
2016137004.tif 000021
【図２ｂ】
2016137004.tif 000022
【図３】
2016137004.tif 000023
【図４ａ】
2016137004.tif 000024
【図４ｂ】
2016137004.tif 000025
【図４ｃ】
2016137004.tif 000026
【図４ｄ】
2016137004.tif 000027
【図５ａ】
2016137004.tif 000028
【図５ｂ】
2016137004.tif 000029
【図５ｃ】
2016137004.tif 000030
【図５ｄ】
2016137004.tif 000031
【図６ａ】
2016137004.tif 000032
【図６ｂ】
2016137004.tif 000033
【図６ｃ】
2016137004.tif 000034
【図６ｄ】
2016137004.tif 000035
【図７ａ】
2016137004.tif 000036
【図７ｂ】
2016137004.tif 000037
【図７ｃ】
2016137004.tif 000038
【図８ａ】
2016137004.tif 000039
【図８ｂ】
2016137004.tif 000040
【図８ｃ】
2016137004.tif 000041
【国際調査報告】
2016137004.tif 000042
2016137004.tif 000043
2016137004.tif 000044
2016137004.tif 000045
2016137004.tif 000046