(57)【要約】  １種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸の検出キットを提供する。変性温度Ｔ０にて解離する、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０を含むと疑われる溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ３０と、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸由来の１本鎖に結合する第１標的用プライマー１３と、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸由来の１本鎖に結合する第２標的用プライマー２３と、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸由来の１本鎖に結合する第１標的用プローブ１５と、アニーリング温度Ｔ１及び伸長温度Ｔ２よりも低い、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸由来の１本鎖に結合する第２標的用プローブ２５とを含有させてなり、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たす。
2016194552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、
前記変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、
前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
前記伸長温度Ｔ２において、前記ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、
前記アニーリング温度Ｔ１においては、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、前記第２標的検出温度Ｔ３において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有することを特徴とする複数の標的核酸の検出キット。
【請求項２】
前記第１標識物及び前記第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の複数の標的核酸の検出キット。
【請求項３】
前記蛍光シグナルは、アニールすると消光するものである請求の範囲第１項または第２項記載の複数の標的核酸の検出キット。
【請求項４】
前記蛍光シグナルは、アニールすると発光するものである請求の範囲第１項または第２項記載の複数の標的核酸の検出キット。
【請求項５】
前記第１標的核酸はマイコプラズマＰ１遺伝子であり、前記第２標的核酸は内部コントロールである請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
【請求項６】
前記第１標的核酸はクラミジア内在性プラスミド遺伝子であり、前記第２標的核酸は淋菌ＣＭＴ遺伝子である請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
【請求項７】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の複数の標的核酸を測定する検出キットを用いる検出方法であって、
前記溶液の温度を前記変性温度Ｔ０に上げて、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸のそれぞれを、２本の１本鎖に解離させる解離ステップと、
前記溶液の温度を前記アニーリング温度Ｔ１まで下げて、前記第１標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第１標的核酸の存否を検出する第１標的核酸検出ステップと、
前記溶液の温度を前記伸長温度Ｔ２とし、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸が解離した、それぞれの２本の１本鎖を２本鎖の第１標的核酸及び第２標的核酸に増幅する増幅ステップと、
前記溶液の温度を前記第２標的検出温度Ｔ３まで下げて、前記第２標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第２標的核酸の存否を検出する第２標的核酸検出ステップとを含む検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ法を改善し、複数の標的核酸を測定する検出キット及びその関連技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査において、複数の標的遺伝子の測定が必要なことも多い。たとえばインフルエンザのＡ型とＢ型、インフルエンザとＲＳＶ、さらにはヒトメタニューモウイルス、性感染症のクラミジアと淋菌、マイコプラズマとその耐性因子などである。【０００３】
病状が似ている上に同じ時期に同時に感染が拡大する場合などは、これらを鑑別して診断し、治療方針を立てることも考えられる。また、耐性因子の存在は投薬の選定判断などにも使われる。【０００４】
一方、単独の測定項目においても、その測定が本当にうまく進んだかどうかを確認する手段として内部コントロールを設定することも有用である。これは検出目的である標的遺伝子とは関係ない核酸配列を増幅するようにあらかじめ準備しておき、標的遺伝子の有無にかかわらず反応がうまく進んだかどうかを確認できるものである。このことで測定試薬や装置が有効に作用したかどうかを測定内で確認できる。【０００５】
この様に、複数の標的核酸を検出するには、別々の測定を実施するか、或いは、それぞれの標的核酸の検出に異なる標識色素などを用いて識別する手段が考えられる。【０００６】
または、同時に増幅反応を行った後に、緩やかに温度を上昇（または下降）させて、蛍光シグナルの変化率がピークを示す温度と標的核酸の融解温度から識別判断すること（熱融解曲線分析法）も可能である。【０００７】
しかしながら、別々の測定では時間やコストがかかり、異なる標識物を識別することも、複数の標識試薬の準備のみならず分析装置の波長設定などでコストがかかってしまう。【０００８】
熱融解曲線分析法を用いる場合には、コストは低いが緩やかに温度の変化をさせる必要があるため、正確な分析を行うためには５〜１０分ほどの時間をかけて温度変化を行わなければならない。【０００９】
特許文献１（日本国特開２００２−１３６３００号公報）では、異なる反応液が入った複数の反応容器を用意し、それぞれ増幅検出する。項目ごとに試薬調製、分注作業があり手間がかかるという問題点がある。【００１０】
特許文献２（日本国特開２００４−２０３号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに標識色素を変えておくことで識別する。用いる標識色素の数だけ、検出する装置の光学系が複数必要になってくるため装置のコストが高くなってしまうという問題点がある。【００１１】
特許文献３（日本国特開２００８−１７３１２７号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。項目ごとに、ＰＣＲ産物や標識プローブの解離温度を変え、増幅後に低温側から高温側に徐々に温度を上昇させ蛍光値をモニタリングする解離曲線分析（「熱融解曲線分析」と同義。）を行い、塩基配列に依存するそれぞれの解離温度におけるピークの有無をモニタリングすることによって識別する。【００１２】
融解曲線分析時の温度変化の速度を上げると各項目の融解温度を識別するのが困難になるため、ＰＣＲ反応後５〜１０分ほど時間が余計にかかってしまうという問題点がある。【００１３】
特許文献４（日本国特表２０１２−５１３２１５号公報）では、１個の反応液容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに、ＰＣＲ産物の解離温度とプライマーの融解温度を変え、それぞれの融解温度で蛍光をモニタリングして識別する。【００１４】
通常のＰＣＲプロファイルは１サイクル中に、変性、アニーリング・伸長ステップを設けるが、特許文献４では、項目ごとにＰＣＲ産物の融解温度を変えるため、考慮すべき条件が多く、プロファイルの設計が困難であり、測定時間も長くなる。温度変化が激しいため、装置の負担も大きいという問題点がある。【００１５】
【特許文献１】日本国特開２００２−１３６３００号公報
【特許文献２】日本国特開２００４−２０３号公報
【特許文献３】日本国特開２００８−１７３１２７号公報
【特許文献４】日本国特表２０１２−５１３２１５号公報
【特許文献５】日本国特許第４７２４３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで本発明は、１種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸の検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第１の発明に係る複数の標的核酸の検出キットは、変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、ＤＮＡポリメラーゼと、伸長温度Ｔ２において、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、アニーリング温度Ｔ１においては、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有する。【００１８】
好ましくは、第１、第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される。【００１９】
蛍光シグナルは、アニールすると消光するもの、アニールすると発光するもののいずれであってもよい。【００２０】
第１標的核酸及び第２標的核酸は、好ましくは、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロール、或いは、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子である。
【発明の効果】
【００２１】
以上述べたように、本発明によれば、１種類の標識物を用いて複数の標的核酸を、１種類の混合液で検出できる。熱融解曲線分析なしで複数の標的核酸の識別が可能であるため、測定時間を大幅に短縮でき、実用的効果が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明者らは、ＰＣＲ法における、プローブのアニーリング温度の条件設定と温度変化プロファイルを組み合わせた、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用いた複数核酸を検出するキットを開発した。【００２３】
本キットでは、図３５に示すように、４つの温度、即ち、変性温度Ｔ０（９５℃）、アニーリング温度Ｔ１（７０℃）、伸長温度Ｔ２（７２℃）及び第２標的検出温度Ｔ３（５５℃）を使用する。これらの温度は、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される。勿論、これらの温度数値は、例示に過ぎず、後述するように、種々変更することができる。【００２４】
複数の標的核酸とは、第１標的核酸及び第２標的核酸であるが、必要とあれば、第３標的検出温度Ｔ４（Ｔ３＞Ｔ４）等の設定温度を増やすことにより、第３標的核酸その他の標的核酸を追加することもできる。【００２５】
図３６を参照しながら、本キットの内容について説明する。まず、本キットでは、第１標的核酸１０と、第２標的核酸２０とを検出対象とする。以下説明の便宜のため、容器１内の溶液２（詳細は後述する。）には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の両方が含まれている場合（つまり、陽性と陽性である場合）のみを説明する。【００２６】
勿論、片方又は両方が陰性である場合には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の少なくとも一方又は両方が溶液２に含まれていないことになり、以下の説明において、含まれていない標的核酸に関する、蛍光シグナル及び増幅が行われないことになる。【００２７】
図３７（ａ）に示すように、溶液２の温度を上昇させ変性温度Ｔ０になると、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０は、いずれも２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖（第１標的核酸１０は、第１の１本鎖１１と第２の１本鎖１２に、第２標的核酸２０は、第１の１本鎖２１と第２の１本鎖２２に）解離する。【００２８】
図３７（ｂ）に示すように、変性温度Ｔ０から温度を下げてアニーリング温度Ｔ１になると、第１標的核酸１０について、第１標的用Ｆプライマー１３が第１の１本鎖１１の相補的な配列に特異的に結合し、第１標的用Ｒプライマー１４が第２の１本鎖１２の相補的な配列に特異的に結合する。同様に、第２標的核酸２０について、第２標的用Ｆプライマー２３が第１の１本鎖２１の相補的な配列に特異的に結合し、第２標的用Ｒプライマー２４が第２の１本鎖２２の相補的な配列に特異的に結合する。【００２９】
また、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、図３７（ｂ）に示すアニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６は蛍光サインを発生する。しかしながら、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５は、アニーリング温度Ｔ１では第２標的検出温度Ｔ３よりも温度が高いため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１には結合せず、第２標識物２６は蛍光サインを発生しない。【００３０】
図３７（ｃ）に示すように、温度をアニーリング温度Ｔ１から伸長温度Ｔ２に上げると、溶液２に、ＰＣＲサイクルを繰り返すために十分な量の、ＤＮＡポリメラーゼ３０とデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１とが含まれているため、次のように増幅反応が進行する。【００３１】
即ち、第１標的核酸１０について、第１の１本鎖１１に結合する第１標的用Ｆプライマー１３から、また、第２の１本鎖１２に結合する第１標的用Ｒプライマー１４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。【００３２】
また、第２標的核酸２０について、第１の１本鎖２１に結合する第２標的用Ｆプライマー２３から、また、第２の１本鎖２２に結合する第２標的用Ｒプライマー２４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。【００３３】
そして、増幅反応が完了すると、図３７（ｄ）を図３６と比較すると分かるように、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０の両方が、２倍に増えたことになる。【００３４】
再び、図３７（ａ）に示すステップに戻り、以上のステップ（図３７（ａ）〜図３７（ｄ））を繰り返すと、第１標的物１６による蛍光シグナルの変化と増幅反応を繰り返すことができる。【００３５】
次に、図３８を参照しながら、変性温度Ｔ０から温度を下げて第２標的温度検出温度Ｔ３となる場合について説明する。【００３６】
変性温度Ｔ０では、図３８（ａ）に示すように、図３７（ａ）と同様の状態となる。ところが、温度を第２標的温度検出温度Ｔ３に下げると、図３７（ｂ）とは異なり、図３８（ｂ）に示す状態となる。【００３７】
即ち、図３８（ｂ）に示すように、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６の蛍光シグナルが変化する点では、図３７（ｂ）と同様であるが、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５も、第２標的検出温度Ｔ３となっているため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１に結合し、第２標識物２６の蛍光シグナルが変化する。なお、第１標識物１６と第２標識物２６は同一であるのが好ましい。【００３８】
その結果、第２標識物２６による蛍光シグナルの変化による差分を捉えれば、第２標識物２０の有無（陽性／陰性）を判定できることになる。【００３９】
しかも、以上説明したところから明らかなように、１種類の反応液が入った１つの反応容器を用いて一連でとぎれないステップ中に複数の標的核酸を検出できることが理解されよう。【００４０】
以下、さらに具体的に、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）法、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法による、３種類のプローブを用いた複数核酸を検出する実施の形態を示す。実施するのに必要なプライマー配列及び各プローブの塩基配列、核酸試料の情報もあわせて示す。【００４１】
（実施の形態１）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【００４２】
ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。【００４３】
＜材料及び方法＞
（プライマー）
実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１）に示すとおりである。【００４４】
【表１】
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【００４５】
配列番号１、配列番号２は、Ｉｅｖｅｎらの報告（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９６；１７３；１４４５−５２）に記載されている（Ｐ１アドへシン遺伝子に対するプライマー対）配列を使用した。【００４６】
（核酸試料）
実施の形態１でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。【００４７】
（ｐＭＹＣ）
マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の膜タンパク質であるＰ１タンパク質をコードする遺伝子断片（配列番号１と２のプライマー対で増幅される配列）を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡは、タカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。【００４８】
（ｐＩＣＭ５）
配列番号１と２のプライマー対を共通プライマーとして増幅できるように、プライマー対と相補的な塩基配列を含む配列を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。【００４９】
（核酸試料の調製）
上記のプラスミドの長さは、ｐＭＹＣは２９４２ｂｐ、ｐＩＣＭ５は２８８６ｂｐである。【００５０】
各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用い、ｐＭＹＣは１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ｐＩＣＭ５は１×１０＾３ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。【００５１】
（プローブ）
実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表２）に示すとおりである。【００５２】
【表２】
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【００５３】
（表１）のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、配列番号３及び配列番号４は、Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。【００５４】
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＭＹＣ  ＱＰと、ｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＩＣ  ＱＰの蛍光色素にはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。【００５５】
（ＰＣＲ・蛍光測定条件）
実施の形態１では、１種類の反応液が入った１つの反応容器中で増幅する２つの標的核酸について、第１標的であるｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＭＹＣ  ＱＰ）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出した。【００５６】
次に、第２標的であるｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＩＣ  ＱＰ）のＴｍ値を増幅反応中の変化温度（７０℃―９５℃）よりも低い温度に設定し、増幅反応後に検出した。【００５７】
ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表３）と（表４）に示し、また、混合液の温度変化をグラフ化したものを図１に示す。【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
ＰＣＲ及び蛍光測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。【００６１】
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０−５２８ｎｍを選択した。各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（７２℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。【００６２】
増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図２に示す。【００６３】
（データの処理方法）
ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｎａｎｏに備え付けの解析ソフトが対応していないため、特許文献５（日本国特許第４７２４３８０号公報）に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行った。【００６４】
増幅反応と第２標的検出ステップの全てのサイクル毎に、次の数式による演算を行った。
ｆｎ＝ｆｈｙｂ．ｎ／ｆｄｅｎ．ｎ  （数１）
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．ｅ  （数１’）
ｆｎ：（数１）により算出されたｎサイクルにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｎ：ｎサイクル目の伸長ステップの蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｎ：ｎサイクル目の変性ステップの蛍光強度値
ｆｅ：（数１’）により算出された第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅ：第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値【００６５】
次に、増幅反応の全てのサイクルと第２標的検出ステップについて、次の数式で演算を行った。
Ｆｎ＝ｆｎ／ｆ１０  （数２）
Ｆｅ＝ｆｅ／ｆ１０  （数２’）
Ｆｎ：１０サイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値
Ｆｅ：１０サイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時の第２標的検出ステップの相対値【００６６】
増幅反応の最終サイクルのＦｎの値であるＦ４４を、第１標的核酸の有無の判定に用いた。【００６７】
更に、次の数式による演算を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ−Ｆ４４    （数３）
Ｆｓ：第２標的の測定値
Ｆｓの値を、第２標的核酸の有無の判定に用いた。【００６８】
ＱＰｒｏｂｅ法における判定は下記に示す方法で行った。
第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１］を陽性と判定した。【００６９】
閾値１は、陰性対照（ＤＮＡの代わりにＴＥ緩衝液を添加した試薬）のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。【００７０】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値２を比較して［Ｆｓ＜閾値２］を陽性と判定した。【００７１】
閾値２は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図３に示すとおりである。【００７２】
マイコプラズマＰ１遺伝子はｐＭＹＣ、内部コントロールはｐＩＣＭ５を、それぞれ核酸試料に用いてＰＣＲを実施した。【００７３】
ＭＹＣ  ＱＰの配列はＴｍ値を７２．５℃、ＩＣ  ＱＰの配列はＴｍ値を５７．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ  ＱＰだけがアニールすると推測された。【００７４】
第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ  ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ  ＱＰとＩＣ  ＱＰの消光を同時に検出すると推測された。【００７５】
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、実施の形態１の第１標的検出のための閾値１とし、（表５）に示す。増幅曲線を図４に示す。【００７６】
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察された。【００７７】
Ｆ４４の値０．９１３は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５６であり、第２標的検出のための閾値２とし、（表５）に示す。増幅曲線を図５に示す。【００７８】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）Ｆｓの値−０．１１８は、閾値２より低かった。【００７９】
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。【００８０】
Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図６に示す。【００８１】
【表５】
2016194552.tif 000007
【００８２】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【００８３】
Ｆｓの値−０．１１６は、閾値２より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図７に示す。【００８４】
これらのＰＣＲ産物はＰＣＲ終了後にアガロース電気泳動し、ｐＭＹＣを添加した試料では２０６ｂｐ付近、ｐＩＣＭ５を添加した試料では１５０ｂｐ付近に目的のＰＣＲ産物が確認された。【００８５】
以上の結果より、ＱＰｒｏｂｅ法において、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。【００８６】
（実施の形態２）
＜第２検出ステップのプロファイルを変更したＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【００８７】
実施の形態１の第２標的検出ステップのプロファイルを変更した方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。【００８８】
ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。本形態の反応条件は、（表６）に示すとおりである。【００８９】
【表６】
2016194552.tif 000008
【００９０】
実施の形態２では、第２標的検出ステップで５５℃において蛍光測定を行った。増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図８に示す。【００９１】
実施の形態２においてｆｅは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．４４
ｆｅ：第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．４４：増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値【００９２】
以下に、実施の形態２の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値３を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値３］を陽性と判定した。【００９３】
閾値３は、陰性対照のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。【００９４】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値４を比較して［Ｆｓ＜閾値４］を陽性と判定した。【００９５】
閾値４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【００９６】
陰性対照の増幅曲線は、増幅反応が終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値３とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図９に示すとおりである。【００９７】
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【００９８】
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５２であり、第２標的検出のための閾値４とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図１０に示すとおりである。【００９９】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．１７０は、閾値４より低かった。【０１００】
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１１に示す。【０１０１】
【表７】
2016194552.tif 000009
【０１０２】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１１は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１０３】
Ｆｓの値−０．１１４は、閾値４より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１２に示す。【０１０４】
以上の結果より、ｆｅの算出に、増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値（ｆｄｅｎ．４４）を用いても、第２標的を検出できることが示された。【０１０５】
（実施の形態３）
＜Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【０１０６】
Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。【０１０７】
ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。実施の形態３におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表８）に示すとおりである。【０１０８】
【表８】
2016194552.tif 000010
【０１０９】
Ｅｐｒｏｂｅは、株式会社ダナフォームが作製したソフトウェアである「Ｅｄｅｓｉｇｎ」を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。【０１１０】
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＭＹＣ  ＥＰとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＩＣ  ＥＰの蛍光色素にはＤ５１４を使用し、ＭＹＣ  ＥＰは５’末端から１９番目のＴを標識し、ＩＣ  ＥＰは５’末端から９番目のＴを標識した。【０１１１】
Ｅｐｒｏｂｅはユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表９）と（表１０）に示す。【０１１２】
【表９】
2016194552.tif 000011
【０１１３】
【表１０】
2016194552.tif 000012
【０１１４】
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０−５４８ｎｍを選択した。【０１１５】
実施の形態３におけるＦｓは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ−Ｆ４０【０１１６】
実施の形態３における判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４０の値と閾値５を比較して［測定試料のＦ４０＞閾値５］を陽性と判定した。【０１１７】
閾値５は、陰性対照のＦ４０の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。【０１１８】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値６を比較して［Ｆｓ＞閾値６］を陽性と判定した。【０１１９】
閾値６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図１３に示すとおりである。【０１２０】
ＭＹＣ  ＥＰの配列はＴｍ値を７６．４℃に、ＩＣ  ＥＰの配列はＴｍ値を５９．８℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ  ＥＰだけがアニールすると推測された。【０１２１】
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ  ＥＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ  ＥＰとＩＣ  ＥＰの発光を同時に検出すると推測された。【０１２２】
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４０サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４０の値１．００７が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０１３となり、第１標的核酸検出のための閾値５とし、（表１１）に示す。増幅曲線を図１４に示す。【０１２３】
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２９サイクル付近からＭＹＣ  ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３１４が閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１２４】
また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは３．６９５であり、第２標的検出のための閾値６とし（表１１）に示す。増幅曲線を図１５に示す。【０１２５】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４０の値１．０１２が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、Ｆｓの値４．０１２は、閾値６より高かった。【０１２６】
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１６に示す。【０１２７】
【表１１】
2016194552.tif 000013
【０１２８】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ  ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３５５は閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１２９】
Ｆｓの値４．２５４は、閾値６より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１７に示す。【０１３０】
以上の結果より、Ｅｐｒｏｂｅ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。【０１３１】
（実施の形態４）
＜ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【０１３２】
ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。【０１３３】
実施の形態４におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１２）に示すとおりである。【０１３４】
【表１２】
2016194552.tif 000014
【０１３５】
ＴａｑＭａｎプローブは、ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。【０１３６】
ｐＭＹＣに特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＭＹＣ  ＴａｑとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＩＣ  Ｔａｑの蛍光色素には、それぞれ５’末端にＦＡＭ（登録商標）、３’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）を標識した。【０１３７】
ＴａｑＭａｎプローブはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１３）と（表１４）に示す。【０１３８】
【表１３】
2016194552.tif 000015
【０１３９】
【表１４】
2016194552.tif 000016
【０１４０】
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０−５４８ｎｍを選択した。【０１４１】
増幅反応後の第２標的を検出するためのステップでは９５℃と５０℃において蛍光測定を行った。【０１４２】
実施の形態４ではｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５０℃の蛍光強度値とし、その他は実施の形態１と同様な演算ステップを行った。【０１４３】
実施の形態４における判定方法は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値７を比較して［測定試料のＦ４４＞閾値７］を陽性と判定した。【０１４４】
閾値７は、陰性対照のＦ４４の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。【０１４５】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値８を比較して［Ｆｓ＞閾値８］を陽性と判定した。【０１４６】
閾値８は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。【０１４７】
ＭＹＣ  Ｔａｑの配列はＴｍ値を７５．８℃に、ＩＣ  Ｔａｑの配列はＴｍ値を５３．７℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ  Ｔａｑだけがアニールすると推測された。【０１４８】
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ  ＴａｑのＴｍ値よりも低い５０℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ  ＴａｑとＩＣ  Ｔａｑの発光を同時に検出すると推測された。【０１４９】
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０２８となり、第１標的核酸検出のための閾値７とし、（表１５）に示す。増幅曲線を図１８に示す。【０１５０】
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ  Ｔａｑのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４４の値１．４２７が閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１５１】
また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは０．１１０であり、第２標的検出のための閾値８とし（表１５）に示す。増幅曲線を図１９に示す。【０１５２】
【表１５】
2016194552.tif 000017
【０１５３】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、Ｆｓの値０．１３０は、閾値８より高かった。【０１５４】
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。【０１５５】
Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２０に示す。【０１５６】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ  ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値１．３４８は閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１５７】
Ｆｓの値０．１７７は、閾値８より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２１に示す。【０１５８】
以上の結果より、ＴａｑＭａｎプローブ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。【０１５９】
（実施の形態５）
＜実検体を用いたＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【０１６０】
実検体を用いた、ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。【０１６１】
マイコプラズマＰ１遺伝子は、ＬＡＭＰ法（日本国特許第３３１３３５８号）によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陽性と判定された（検査は株式会社ビー・エム・エルに委託）咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。【０１６２】
また、陰性試料としてＬＡＭＰ法によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陰性と判定された咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。その他条件は、実施の形態１と同様にＰＣＲを実施した。【０１６３】
得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。【０１６４】
以下に、実施の形態５の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値９を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値９］を陽性と判定した。【０１６５】
閾値９は、陰性試料のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。【０１６６】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１０を比較して［Ｆｓ＜閾値１０］を陽性と判定した。閾値１０は、陽性試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０１６７】
陰性試料の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値９とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２２に示す。【０１６８】
第１標的核酸である陽性試料の増幅曲線は、３５サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５１は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１６９】
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．１３２であり、第２標的検出のための閾値１０とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２３に示す。【０１７０】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．２２７は、閾値１０より低かった。【０１７１】
この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２４に示す。【０１７２】
第１標的核酸である陽性試料に第２標的核酸であるｐＩＣＭ５を添加した際の増幅曲線は、陽性試料の増幅曲線と同様に、３５サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５３は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０１７３】
Ｆｓの値−０．２３５は、閾値１０より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２５に示す。【０１７４】
【表１６】
2016194552.tif 000018
【０１７５】
以上の結果より、実際の臨床検体でも、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。【０１７６】
本発明は、感染症の病原体の亜型識別や一塩基多型の識別にも応用可能である。【０１７７】
（実施の形態６）
＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出＞【０１７８】
ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出を行った。【０１７９】
（ｐＣＴ）
性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミド（ｐＬＧＶ４４０）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。【０１８０】
（ｐＮＧ）
淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。【０１８１】
上記のプラスミドの長さは、ｐＣＴは３０６４ｂｐ、ｐＮＧは３０５９ｂｐである。【０１８２】
各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）を用いて、ｐＣＴ、ｐＮＧ共に１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。【０１８３】
実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１７）に示すとおりである。【０１８４】
【表１７】
2016194552.tif 000019
【０１８５】
実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１８）に示すとおりである。【０１８６】
【表１８】
2016194552.tif 000020
【０１８７】
ＣＴ  ＱＰは配列番号６と配列番号７のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から日鉄住金環境株式会社Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。【０１８８】
ＮＧ  ＱＰは配列番号８と配列番号９のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、Ｊ−Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。【０１８９】
ｐＣＴに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＣＴ  ＱＰとｐＮＧに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＮＧ  ＱＰの蛍光色素にはそれぞれＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。【０１９０】
ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１９）と（表２０）に示す。【０１９１】
【表１９】
2016194552.tif 000021
【０１９２】
【表２０】
2016194552.tif 000022
【０１９３】
蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０−５２８ｎｍを選択した。【０１９４】
各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（６８℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。【０１９５】
得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。【０１９６】
以下に、本実施の形態の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１１］を陽性と判定した。【０１９７】
閾値１１は、陰性対照のＦ４４の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。【０１９８】
第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１２を比較して［Ｆｓ＜閾値１２］を陽性と判定した。【０１９９】
閾値１２は、ｐＮＧだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０２００】
ＣＴ  ＱＰの配列はＴｍ値を７３．４℃に、ＮＧ  ＱＰの配列はＴｍ値を６２．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（６８℃から９５℃）では、プローブはＣＴ  ＱＰだけがアニールすると推測された。【０２０１】
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＮＧ  ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＣＴ  ＱＰとＮＧ  ＱＰの発光を同時に検出すると推測された。【０２０２】
陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９６となり、本例の第１標的検出のための閾値１１とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２６に示す。【０２０３】
第１標的核酸であるｐＣＴの増幅曲線は、２８サイクル付近からＣＴ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２０は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。【０２０４】
また、この時のＦｓのｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０３９であり、第２標的検出のための閾値１２とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２７に示す。【０２０５】
第２標的核酸であるｐＮＧの増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、Ｆｓの値−０．０６５は、閾値１２より低かった。【０２０６】
この結果より、ｐＣＴの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２８に示す。【０２０７】
【表２１】
2016194552.tif 000023
【０２０８】
第１標的核酸であるｐＣＴと第２標的核酸であるｐＮＧの両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＣＴの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＣＴ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２９は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。【０２０９】
Ｆｓの値−０．１１１は、閾値１２より低く、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２９に示す。【０２１０】
以上の結果より、２項目の遺伝子においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。【０２１１】
（実施の形態７）
＜増幅反応中に複数回第２標的を検出するＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞【０２１２】
第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。【０２１３】
ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。反応条件は、（表２２）に示すとおりである。【０２１４】
【表２２】
2016194552.tif 000024
【０２１５】
また増幅反応の温度変化をグラフ化したものを図３０に示す。【０２１６】
実施の形態７の解析においては次の演算を行い、その他は実施の形態１同様のステップを行った。
ｆｅｎ＝ｆｈｙｂ．ｅｎ／ｆｄｅｎ．ｅｎ  （数４）
ｆｅｎ：（数４）により算出されたｎ回目の第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値
Ｆｅｎ＝ｆｅｎ／ｆ１０  （数５）
Ｆｅｎ：１０サイクル目の（数４）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎ回目の第２標的検出ステップの相対値
Ｆｓ１＝Ｆｅ１−Ｆ２０  （数６）
Ｆｓ２＝Ｆｅ２−Ｆ２７  （数６’）
Ｆｓ３＝Ｆｅ３−Ｆ３４  （数６’’）
Ｆｓ４＝Ｆｅ４−Ｆ４１  （数６’’’）
Ｆｓ１：１回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ２：２回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ３：３回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ４：４回目の第２標的検出ステップの測定値【０２１７】
判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４１の値と閾値１３を比較して［測定試料のＦ４１＜閾値１３］を陽性と判定した。
閾値１３は、陰性対照のＦ４１の平均値−標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ−３ＳＤ）の値を用いた。【０２１８】
第２標的核酸の有無は、１回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ１＜閾値１４］を陽性と判定した。【０２１９】
閾値１４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ１のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０２２０】
２回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ２＜閾値１５］を陽性と判定した。【０２２１】
閾値１５は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ２のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０２２２】
３回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ３＜閾値１６］を陽性と判定した。【０２２３】
閾値１６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ３のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０２２４】
４回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ４＜閾値１７］を陽性と判定した。【０２２５】
閾値１７は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ４のｍｅａｎ−３ＳＤの値を用いた。【０２２６】
陰性対照の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外ではＰＣＲが終了する４１サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ−３ＳＤは０．９９８となり、本例の第１標的検出のための閾値１３とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３１に示す。【０２２７】
第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、３０サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９２は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０２２８】
また、この時のＦｓ１のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０５８、Ｆｓ２のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０７０、Ｆｓ３のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０８０、Ｆｓ４のｍｅａｎ−３ＳＤは−０．０８７でそれぞれ第２標的検出のための閾値１４、１５，１６，１７とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３２に示す。【０２２９】
【表２３】
2016194552.tif 000025
【０２３０】
第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外では増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、Ｆｓ１の値−０．０５８は、閾値１４より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。【０２３１】
Ｆｓ２の値−０．０５７も閾値１５より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。【０２３２】
Ｆｓ３の値−０．０８４は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。【０２３３】
Ｆｓ４の値−０．１９２も閾値１７より低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値を（表２３）に示す。増幅曲線を図３３に示す。【０２３４】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、３０サイクル付近からＭＹＣ  ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９７は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。【０２３５】
Ｆｓ１の値−０．０５８は、閾値１４よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。【０２３６】
Ｆｓ２の値−０．０６８も閾値１５よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。【０２３７】
Ｆｓ３の値−０．１０９は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。【０２３８】
Ｆｓ４の値―０．１５４も閾値１７よりも低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値は、（表２３）に示すとおりである。増幅曲線を図３４に示す。【０２３９】
以上の結果より、第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でもマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】本発明の実施の形態１における混合液の温度変化を示すグラフ
【図２】本発明の実施の形態１における蛍光測定のタイミング説明図
【図３】本発明の実施の形態１における判定方法を示すフローチャート
【図４】本発明の実施の形態１における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図５】本発明の実施の形態１における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図６】本発明の実施の形態１における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図７】本発明の実施の形態１における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図８】本発明の実施の形態２における蛍光測定のタイミング説明図
【図９】本発明の実施の形態２における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１０】本発明の実施の形態２における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１１】本発明の実施の形態２における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１２】本発明の実施の形態２における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１３】本発明の実施の形態３における判定方法を示すフローチャート
【図１４】本発明の実施の形態３における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１５】本発明の実施の形態３における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１６】本発明の実施の形態３における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１７】本発明の実施の形態３における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１８】本発明の実施の形態４における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図１９】本発明の実施の形態４における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２０】本発明の実施の形態４における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２１】本発明の実施の形態４における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２２】本発明の実施の形態５における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２３】本発明の実施の形態５における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２４】本発明の実施の形態５における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２５】本発明の実施の形態５における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２６】本発明の実施の形態６における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２７】本発明の実施の形態６における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２８】本発明の実施の形態６における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図２９】本発明の実施の形態６における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図３０】本発明の実施の形態７における混合液の温度変化を示すグラフ
【図３１】本発明の実施の形態７における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ
【図３２】本発明の実施の形態７における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図３３】本発明の実施の形態７における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図３４】本発明の実施の形態７における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ
【図３５】本発明の実施の形態１における温度変化の拡大図
【図３６】本発明の実施の形態１における混合液成分を示す説明図
【図３７】（ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図  （ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図  （ｃ）本発明の実施の形態１における伸長ステップの説明図  （ｄ）本発明の実施の形態１における伸長完了ステップの説明図
【図３８】（ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図  （ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図
【符号の説明】
【０２４１】
１  容器
２  溶液
１０  第１標的核酸
１３  第１標的用Ｆプライマー
１４  第１標的用Ｒプライマー
１５  第１標的用プローブ
１６  第１標識物
２０  第２標的核酸
２３  第２標的用Ｆプライマー
２４  第２標的用Ｒプライマー
２５  第２標的用プローブ
２６  第２標識物
３０  ＤＮＡポリメラーゼ
３１  デオキシリボヌクレオチド３リン酸
Ｔ０  変性温度
Ｔ１  アニーリング温度
Ｔ２  伸長温度
Ｔ３  第２標的検出温度
【図１】
2016194552.tif 000026
【図２】
2016194552.tif 000027
【図３】
2016194552.tif 000028
【図４】
2016194552.tif 000029
【図５】
2016194552.tif 000030
【図６】
2016194552.tif 000031
【図７】
2016194552.tif 000032
【図８】
2016194552.tif 000033
【図９】
2016194552.tif 000034
【図１０】
2016194552.tif 000035
【図１１】
2016194552.tif 000036
【図１２】
2016194552.tif 000037
【図１３】
2016194552.tif 000038
【図１４】
2016194552.tif 000039
【図１５】
2016194552.tif 000040
【図１６】
2016194552.tif 000041
【図１７】
2016194552.tif 000042
【図１８】
2016194552.tif 000043
【図１９】
2016194552.tif 000044
【図２０】
2016194552.tif 000045
【図２１】
2016194552.tif 000046
【図２２】
2016194552.tif 000047
【図２３】
2016194552.tif 000048
【図２４】
2016194552.tif 000049
【図２５】
2016194552.tif 000050
【図２６】
2016194552.tif 000051
【図２７】
2016194552.tif 000052
【図２８】
2016194552.tif 000053
【図２９】
2016194552.tif 000054
【図３０】
2016194552.tif 000055
【図３１】
2016194552.tif 000056
【図３２】
2016194552.tif 000057
【図３３】
2016194552.tif 000058
【図３４】
2016194552.tif 000059
【図３５】
2016194552.tif 000060
【図３６】
2016194552.tif 000061
【図３７】
2016194552.tif 000062
【図３８】
2016194552.tif 000063
【配列表】
2016194552000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月15日(2017.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ  Ｔａｑのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値１．３４８は閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＮＧ  ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＣＴ  ＱＰとＮＧ  ＱＰの消光を同時に検出すると推測された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
以上の結果より、２項目の遺伝子においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子を検出できることが示された。
【国際調査報告】
2016194552.tif 000064
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