(57)【要約】  NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有してなる、エクソソーム分泌阻害剤。エクソソームの分泌を抑制する事が可能となって、ひいては、癌細胞の増殖や転移を抑制する事が可能であり、当該遺伝子の発現又は当該タンパク質の活性を阻害する物質は癌治療や癌転移抑制に好適に用いられる医薬組成物の有効成分として、また、前記遺伝子の発現又は当該タンパク質の活性を特異的に抑制するという新しい作用機序の抗癌剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有してなる、エクソソーム分泌阻害剤。
【請求項２】
NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質の少なくとも１つが核酸である、請求項１記載のエクソソーム分泌阻害剤。
【請求項３】
遺伝子の発現を抑制する物質が、該遺伝子のsiRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びこれらの発現ベクターからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１又は２記載のエクソソーム分泌阻害剤。
【請求項４】
NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有してなる、医薬組成物。
【請求項５】
NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質の少なくとも１つが核酸である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
遺伝子の発現を抑制する物質が、該遺伝子のsiRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びこれらの発現ベクターからなる群より選ばれる１種以上である、請求項４又は５記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌治療用又は癌転移抑制用である請求項４〜６いずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌が大腸癌又は乳癌である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
miR-194を含有してなる、エクソソーム分泌阻害剤。
【請求項１０】
NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を指標とし、発現の抑制又は活性の抑制をする物質を候補化合物とする、エクソソーム分泌阻害用物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
下記の工程(ａ１)〜(ｃ１)を含む、請求項９記載のスクリーニング方法。
(ａ１)エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とを接触させる工程
(ｂ１)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を測定し、該測定値を、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量と比較する工程
(ｃ１)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量よりも低下している場合に、被験物質をエクソソーム分泌阻害用物質として選択する工程
【請求項１２】
下記の工程(ａ２)〜(ｃ２)を含む、請求項１０記載のスクリーニング方法。
(ａ２)エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とを接触させる工程
(ｂ２)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を測定し、該測定値を、予め測定しておいた被験物質を接触させる前の前記細胞におけるエクソソーム量と比較する工程
(ｃ２)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させる前のエクソソーム量よりも低下している場合に、被験物質をエクソソーム分泌阻害用物質として選択する工程
【請求項１３】
請求項１〜３いずれか記載のエクソソーム分泌阻害剤又は請求項４〜８いずれか記載の医薬組成物を、その治療有効量を癌の治療を必要とする個体に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項１４】
請求項１〜３いずれか記載のエクソソーム分泌阻害剤又は請求項４〜８いずれか記載の医薬組成物を、その治療有効量を癌の転移抑制を必要とする個体に投与する工程を含む、癌転移の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクソソーム分泌阻害剤に関する。さらに詳しくは、特定遺伝子の発現又は特定タンパク質の活性を抑制する物質を含有する、エクソソーム分泌阻害剤及び医薬組成物、ならびに、特定遺伝子の発現又は特定タンパク質の活性の変動に基づくエクソソーム分泌阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の最も一般的な特徴は、正常細胞に比べて急速かつ制御不能な増殖をすることである。そこで、癌治療の標的(ターゲット)となる遺伝子を見出して、当該ターゲット遺伝子の発現又は機能を抑制することで癌細胞の増殖を抑制し、癌を治療するアプローチがさかんに研究されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、肝臓癌の患者から単離したサンプルにおいて、肝臓癌の再発に関連するバイオマーカーとしてmiR-194が開示されている。また、特許文献２では、miR-194を用いて、多発性骨髄腫におけるp53/HDM2に関連する自己調節ループを抑制できることが記載されている。【０００４】
また、卵巣癌の内皮細胞においては、NAPG遺伝子の発現が増加することが知られている(特許文献３参照)。このNAPG遺伝子は、前記疾患の他に、双極性障害や小胞形成に関係しているとの報告がある(非特許文献１、２参照)。【０００５】
一方で、生体内の体液中に存在するエクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、癌などの疾患との関連性が注目されている。【０００６】
例えば、非特許文献３において、繊維芽細胞が分泌したエクソソームが肺癌細胞の隆起に関与していることを明らかにしている。また、メラノーマ由来のエクソソームは原発巣の転移を促進することや、ニュートラル  スフィンゴミエリナーゼ２(nSMase2)の刺激により転移巣から分泌されたエクソソームが癌の転移を更に促進することが報告されている(非特許文献４、５参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１５１２１２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０１９０５３号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／１０１１１８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Neuroscience Letters, 457(2009), 159-162
【非特許文献２】Genes to Cells, (2005), 10, 989-999
【非特許文献３】Cell, 151, 1542-1556, December 21, 2012
【非特許文献４】Nat Med., 2012 June; 18(6):883-891
【非特許文献５】J. Biol. Chem., 2013, 288:10849-10859
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
バイオマーカーと癌、エクソソームと癌、それぞれの関連性については明らかになるものの、エクソソームの分泌を制御するバイオマーカーについては未だ知られていない。【００１０】
本発明の課題は、癌治療の新しいアプローチとして、エクソソームの分泌を阻害することで癌細胞の増殖や転移を抑制し、癌の治療を可能とする遺伝子を見出して、エクソソーム分泌阻害剤、医薬組成物、ならびに、特定遺伝子の発現又は特定タンパク質の活性の変動に基づくエクソソーム分泌阻害物質のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記〔１〕〜〔４〕に関する。
〔１〕  NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有してなる、エクソソーム分泌阻害剤。
〔１〕  NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有してなる、医薬組成物。
〔３〕  miR-194を含有してなる、エクソソーム分泌阻害剤。
〔４〕  NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を指標とし、発現の抑制又は活性の抑制をする物質を候補化合物とする、エクソソーム分泌阻害用物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制することで、エクソソームの分泌を抑制する事が可能となって、ひいては、癌細胞の増殖や転移を抑制する事が可能であり、当該遺伝子の発現又は当該タンパク質の活性を阻害する物質は癌治療や癌転移抑制に好適に用いられる医薬組成物の有効成分として用いることが出来る。本発明の医薬組成物は、特定の遺伝子の発現又は当該タンパク質の活性を特異的に抑制するという新しい作用機序の抗癌剤を提供するものである。さらに本発明により、上記遺伝子又はタンパク質をターゲットとして用いる、癌の治療用物質又は転移抑制用物質として有効なエクソソーム分泌阻害物質をスクリーニングする方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、エクソソームの分泌阻害作用を有するmiRNAを探索した結果を示す図である。(Ａ)は実施例１の一例を示す図であり、ポジティプコントロールとしてRAB27A(アプライドバイオシステムズ社)、RAB27B(アプライドバイオシステムズ社)、nSMase2(アプライドバイオシステムズ社)に対するsiRNAを用いた結果を示す。図中の点線はネガティブコントロールのsiRNAを添加した群のエクソソーム分泌量を、破線はポジティブコントロールであるRAB27Aに対するsiRNAを添加した群のエクソソーム分泌量を示す。
【図１Ｂ】図１(Ｂ)はエクソソームの分泌量を抗CD63抗体と抗CD9抗体を用いて測定した結果の一例を示し、ネガティブコントロールmiRNAの分泌量に対する相対分泌量を示す図である。左図がPC-3ML細胞を用いた結果、右図がMDA-MB-231D3H2LN細胞を用いた結果である。
【図１Ｃ】図１(Ｃ)は細胞数当たりのエクソソームの分泌粒子数を比較した結果の一例を示す図である。左図がPC-3ML細胞を用いた結果、右図がMDA-MB-231D3H2LN細胞を用いた結果である。
【図１Ｄ】図１(Ｄ)はLNAの投与によりエクソソームの分泌粒子数が変化することを示す図である。左図がPC-3ML細胞を用いてLNA処理を行ったエクソソーム分泌量の結果、右図がmiR-194自体の発現量を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、miR-194の標的遺伝子を同定した結果を示す図である。(Ａ)はmiR-194の発現変動によって変化する遺伝子を、マイクロアレイを用いて解析・抽出した結果を示す。
【図２Ｂ】図２(Ｂ)は標的遺伝子の候補であるNAPGの発現量を、リアルタイムPCR法を用いて解析し対比した結果を示す図である。左区分がPC-3ML細胞を用いた結果、右区分がMDA-MB-231D3H2LN細胞を用いた結果である。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、siRNAによるエクソソームの分泌阻害を評価した結果を示す図である。(Ａ)がMDA-MB-231D3H2LN細胞についての結果であり、上段が抗CD9抗体を、下段が抗CD63抗体をそれぞれ用いて測定した結果を示す図である。図中の点線はネガティブコントロールの値 (NC1)を、破線はポジティブコントロールの値 (RAB27A)を示す。
【図３Ｂ】図３(Ｂ)はPC-3ML細胞についての結果であり、上段が抗CD9抗体を、下段が抗CD63抗体をそれぞれ用いて測定した結果を示す図である。図中の点線はネガティブコントロールの値 (Allstar)を、破線はポジティブコントロールの値 (RAB27A)を示す。
【図４】図４は、NAPGのsiRNAによるエクソソームの分泌阻害を評価した結果を示す図である。左区分がPC-3ML細胞についての結果であり、右区分がMDA-MB-231D3H2LN細胞についての結果である。
【図５】図５は、MDA-MB-231D3H2LN細胞を用いた、siRNAによるエクソソームの分泌阻害を評価した結果を示す図である。エクソソームの分泌阻害については、CD9抗体を用いて測定した。
【図６】図６は、in vivoモデルにおけるがん転移の抑制作用を評価した結果を示す図である。（Ａ）は、siRNA投与による原発巣の腫瘍サイズ変化を計測した図であり、（Ｂ）が肺への微小転移数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のエクソソーム分泌阻害剤は、NAPG遺伝子、HINT3遺伝子、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPGタンパク質、HINT3タンパク質、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含むことを大きな特徴とする。なお、本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いる意味で用いられる。
【００１５】
種々の癌に特定のバイオマーカーが関与することが分かっている。一方で、エクソソーム分泌量の増加が癌の進行や転移に関与することが分かっている。そこで、本発明者らは、エクソソームの分泌を制御し得るバイオマーカーに着目して検討したところ、NAPG遺伝子、HINT3遺伝子、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制することで、エクソソームの分泌を抑制し、ひいては癌の進行や転移を抑制できることが分かった。
【００１６】
本明細書において、「NAPG遺伝子」とは、ヒトNAPGタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ヒトNAPG遺伝子の塩基配列及びヒトNAPGタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、NAPG遺伝子の塩基配列(配列番号１)としてGenBank Accession ID：CR536554が、ヒトNAPGタンパク質アミノ酸配列(配列番号２)としてGenBank Accession ID：CAG38791が、それぞれＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。NAPG遺伝子は、従来、卵巣癌の内皮細胞において発現量が増加することや、双極性障害や小胞形成に関与している程度の知見しかなかったが、NAPG遺伝子によるエクソソーム分泌抑制作用は本発明者らが初めて見出したことである。
【００１７】
本明細書において、「HINT3遺伝子」とは、ヒトHINT3タンパク質をコードする遺伝子を意味する。ヒトHINT3遺伝子の塩基配列及びヒトHINT3タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、HINT3遺伝子の塩基配列(配列番号３)としてGenBank Accession ID：NM_138571が、ヒトHINT3タンパク質アミノ酸配列(配列番号４)としてGenBank Accession ID：NP_612638が、それぞれＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。HINT3遺伝子はホスホアミド酸の加水分解酵素として働くことが報告されているが、ほぼ機能は不明であり、HINT3遺伝子によるエクソソーム分泌抑制作用は本発明者らが初めて見出したことである。
【００１８】
本明細書において、「GXYLT1遺伝子」とは、ヒトGXYLT1タンパク質をコードする遺伝子を意味する。ヒトGXYLT1遺伝子の塩基配列及びヒトGXYLT1タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、GXYLT1遺伝子の塩基配列(配列番号５)としてGenBank Accession ID：NM_173601が、ヒトGXYLT1タンパク質アミノ酸配列(配列番号６)としてGenBank Accession ID：NP_775872が、それぞれＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。GXYLT1遺伝子は多糖合成酵素として機能することの報告があるが、詳細な解析はなされておらず、GXYLT1遺伝子によるエクソソーム分泌抑制作用は本発明者らが初めて見出したことである。
【００１９】
本明細書において、ヒトNAPGタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、配列番号２の配列からなるタンパク質において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトNAPGタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
【００２０】
本明細書において、「NAPG遺伝子」は、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば配列番号１の塩基配列からなる遺伝子において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。さらに、「NAPG遺伝子」は、配列番号１の塩基配列に対して、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上又は９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる変異体を含む。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用して決定できる。さらに、「NAPG遺伝子」は、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする塩基配列からなる変異体を含む。なお、本明細書において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。また、ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９８９)(Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ)、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ(１９９４)(Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ)、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９９５)(Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ)などに記載されている方法に準じて行うことができる。ただし、これらの変異体遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするものである。
【００２１】
本明細書において、ヒトHINT3タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、配列番号４の配列からなるタンパク質において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトHINT3タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
【００２２】
本明細書において、「HINT3遺伝子」は、配列番号３の塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば配列番号３の塩基配列からなる遺伝子において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。さらに、「HINT3遺伝子」は、配列番号３の塩基配列に対して、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上又は９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる変異体を含む。塩基配列の同一性は、前述と同様にして決定できる。さらに、「HINT3遺伝子」は、配列番号３の塩基配列からなる遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする塩基配列からなる変異体を含む。ただし、これらの変異体遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするものである。
【００２３】
本明細書において、ヒトGXYLT1タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、配列番号６の配列からなるタンパク質において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。ただし、これらの変異体ヒトGXYLT1タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するものである。
【００２４】
本明細書において、「GXYLT1遺伝子」は、配列番号５の塩基配列からなる遺伝子のみならず、ヒト個体内で生じ得る変異体も含み、例えば配列番号５の塩基配列からなる遺伝子において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された遺伝子であって、多形性や突然変異に基づく変異により生じるもの、が含まれる。さらに、「GXYLT1遺伝子」は、配列番号５の塩基配列に対して、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上又は９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる変異体を含む。塩基配列の同一性は、前述と同様にして決定できる。さらに、「GXYLT1遺伝子」は、配列番号５の塩基配列からなる遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする塩基配列からなる変異体を含む。ただし、これらの変異体遺伝子は、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするものである。
【００２５】
本明細書において、「遺伝子の発現を抑制する物質」とは、標的遺伝子のmRNAの転写を抑制する物質、転写されたmRNAを分解する物質、又はmRNAからのタンパク質の翻訳を抑制する物質であれば特に限定されるものでない。かかる物質としては核酸が挙げられ、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及びこれらの発現ベクターなどが例示される。其の中でも、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそれらの発現ベクターが好ましく、siRNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチドがより好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、本発明において標的遺伝子は、NAPG遺伝子、HINT3遺伝子、若しくはGXYLT1遺伝子である。
【００２６】
本明細書において、「siRNA」とは、約１５〜４０塩基からなる二本鎖RNA部分を有するRNA分子であり、前記siRNAのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のmRNAを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるsiRNAは、NAPG遺伝子、HINT3遺伝子、若しくはGXYLT1遺伝子のmRNA中の連続したRNA配列と相同な配列からなるセンスRNA鎖と、該センスRNA配列に相補的な配列からなるアンチセンスRNA鎖とからなる二本鎖RNA部分を含んでなるRNAである。かかるsiRNA及び後述の変異体siRNAの設計及び製造は当業者の技量の範囲内である。
【００２７】
本明細書において、「miRNA」とは、約２１〜２５塩基からなる二本鎖RNA部分を有するRNA分子であり、標的遺伝子のmRNAに結合することで、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるmiRNAは、NAPG遺伝子、HINT3遺伝子、若しくはGXYLT1遺伝子のmRNA中の連続したRNA配列と相同な配列からなるセンスRNA鎖と、該センスRNA配列に相補的な配列からなるアンチセンスRNA鎖とからなる二本鎖RNA部分を含んでなるRNAである。かかるmiRNA及び後述の変異体siRNAの設計及び製造は当業者の技量の範囲内である。
【００２８】
siRNAの二本鎖RNA部分の長さは、塩基として、好ましくは約１５〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基、更に好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、より更に好ましくは１９〜２１塩基である。また、miRNAの二本鎖RNA部分の長さは、塩基として、好ましくは約２１〜２５塩基、より好ましくは２２〜２４塩基である。siRNA及びmiRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端(オーバーハング)を有するものであってもよく、３’末端が突き出したタイプが好ましい。センスRNA鎖及びアンチセンスRNA鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、より好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するsiRNA及びmiRNAは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、RNAを構成する塩基あるいはDNAを構成する塩基のいずれであってもよい。
【００２９】
さらに、上記siRNA及びmiRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖の一方又は両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加されているsiRNA及びmiRNAもまた、本発明のエクソソーム分泌阻害剤に用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、より好ましくは１〜３塩基、更に好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’末端のオーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’末端のオーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加又は欠失により上記センスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体siRNA及びmiRNAにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体siRNA及びmiRNAが変異を有しないsiRNA及びmiRNAと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００３０】
さらに、該siRNA及びmiRNAは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA及びmiRNA(Short hairpin RNA；shRNA)であってもよい。shRNAは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖RNA、該センス鎖RNAに相補的な配列からなるアンチセンス鎖RNA及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むRNAであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖RNA部分を形成する。
【００３１】
siRNA及びmiRNAは、臨床使用の際には、いわゆるoff−target効果を示さないことが望ましい。off−target効果とは、標的遺伝子以外に、使用したsiRNA及びmiRNAに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。off−target効果を避けるために、候補siRNA及びmiRNAについて、予めDNAマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、NCBI(National Center for Biotechnology Information)などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補siRNA及びmiRNAの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、off−target効果を避けることが可能である。
【００３２】
本発明のsiRNA及びmiRNAを作製するには、化学合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖RNAを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列を組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖RNAやアンチセンス鎖RNAをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖RNA、該センス鎖RNAに相補的な配列からなるアンチセンス鎖RNA及びその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するshRNAを発現させることにより、所望の二本鎖RNAを作製することもできる。
【００３３】
siRNA及びmiRNAは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、siRNA及びmiRNAを構成する核酸の一部がDNAであっても良い。また、siRNA及びmiRNAは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、siRNA及びmiRNAを構成する核酸の全体又はその一部が修飾された核酸であってもよい。
【００３４】
修飾された核酸とは、ヌクレオシド(塩基部位、糖部位)及び／又はヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基(abasic)ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ホスフェート基が結合したペプチド核酸(ＰＨＯＮＡ)、ロックド核酸(ＬＮＡ)、モルホリノ核酸等が挙げられる。前記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；及び他の複素環塩基等が挙げられる。
【００３５】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ(エチレングリコール)結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００３６】
標的遺伝子のmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドを「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼び、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする遺伝子(mRNA)と二本鎖を形成することによりmRNAの働きを抑制する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となる遺伝子(mRNA)と完全に相補的であるもののみならず、mRNAと安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定して標的遺伝子の発現を阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型(ホスホロチオエート型)、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型(ホスホジエステル型)、Ｍ−オリゴ型(メチルフォスフォネイト型)、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、RNAへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(又はその誘導体)は常法によって合成することができ、例えば、市販のDNA合成装置(例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など)によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などがある。
【００３９】
「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、標的遺伝子をコードするmRNA又は初期転写産物を、コード領域の内部(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得る。リボザイムで最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約１０塩基程度)をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる(Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001))。
【００４０】
標的遺伝子の発現を抑制する物質は、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイムなどの核酸分子、ならびに、該核酸分子をコードする発現ベクターでもよい。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター(例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター)、哺乳動物用プロモーター(例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター)などが挙げられる。
【００４１】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ(ポリ)ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。
【００４２】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００４３】
本発明の発現ベクターとしては、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイムの発現ベクターが例示されるが、其の中でも、siRNAの発現ベクターが好ましい。
【００４４】
これらの「遺伝子の発現を抑制する物質」は、エクソソームの分泌を阻害することで、肺癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌などを含む広範囲の癌細胞の増殖や転移を抑制するか又は癌細胞を減少させる効果を有するので、医薬組成物として使用することができる。
【００４５】
本明細書において、「タンパク質の活性を抑制する物質」とは、標的タンパク質の活性を抑制する物質であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、タンパク質やペプチド、抗体あるいは他の低分子化合物などが例示される。其の中でも、ペプチド、抗体、及び低分子化合物が好ましく、抗体、低分子化合物がより好ましい。なお、本発明において標的タンパク質は、NAPGタンパク質、HINT3タンパク質、又はGXYLT1タンパク質である。
【００４６】
本発明において、NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、生体内に投与することにより、例えば、癌治療用医薬組成物又は癌転移抑制用医薬組成物として使用することができる。
【００４７】
よって、本発明はまた、有効成分として、NAPG、HINT3、若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3、若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を含有する医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、例えば、治療対象を癌とする場合、癌の種類は特に限定されることはない。また、固形癌であっても浸潤癌であってもよい。具体的には、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍を挙げることができる。なかでも、乳癌、大腸癌には本発明の医薬組成物の適用が期待される。
【００４９】
また、本発明の医薬組成物は、癌の治療だけでなく、癌治療後の再発予防、転移の防止にも使用できる。よって、本発明の医薬組成物の好適態様として、癌治療用医薬組成物、癌再発予防用医薬組成物、癌転移抑制用医薬組成物が挙げられる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。非経口投与の場合は、腫瘍部位に直接投与することも可能である。
【００５１】
本発明の医薬組成物は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００５２】
添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は２種以上適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、又は適当な剤形により投与が可能である。非経口投与の場合は、経肺剤形(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤形、経皮投与剤形(例えば軟膏、クリーム剤)、注射剤形等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【００５３】
標的遺伝子の発現を抑制する物質がsiRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、若しくはリボザイムなどの核酸分子、又は該核酸分子をコードする発現ベクターである場合は、リポソームなどのリン脂質小胞体に当該発現抑制物質を導入し、その小胞体を本発明の医薬組成物とすることも可能である。
【００５４】
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり好ましくは０．０１μｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１μｇ〜１００μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００５５】
本発明は、さらなる態様において、
(ｉ) NAPG、HINT3若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質を投与する工程を有する、癌を治療する方法、
(ｉｉ)癌の治療に用いられる、NAPG、HINT3若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質、ならびに
(ｉｉｉ)癌の治療剤の調製における、NAPG、HINT3若しくはGXYLT1遺伝子の発現を抑制する物質又はNAPG、HINT3若しくはGXYLT1タンパク質の活性を抑制する物質の使用
を提供する。
上記「遺伝子の発現を抑制する物質」又は「タンパク質の活性を抑制する物質」については、上で説明したとおりである。また、「遺伝子の発現を抑制する物質」として、siRNAが用いられる場合、好ましいsiRNAについては上述したとおりである。
【００５６】
本発明は、もう１つの態様において、エクソソーム量を指標とし、エクソソームの分泌を抑制する物質を候補化合物とする、エクソソーム分泌阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００５７】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法としては、好適には以下の態様１及び態様２の方法を挙げることができる。態様１のスクリーニング方法としては、下記の工程(ａ１)〜(ｃ１)を含む。
(ａ１)エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とを接触させる工程
(ｂ１)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を測定し、該測定値を、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量と比較する工程
(ｃ１)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量よりも低下している場合に、被験物質をエクソソーム分泌阻害用物質として選択する工程
【００５９】
態様２の方法としては、下記の工程(ａ２)〜(ｃ２)を含む。
(ａ２)エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とを接触させる工程
(ｂ２)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を測定し、該測定値を、予め測定しておいた被験物質を接触させる前の前記細胞におけるエクソソーム量と比較する工程
(ｃ２)被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させる前のエクソソーム量よりも低下している場合に、被験物質をエクソソーム分泌阻害用物質として選択する工程
【００６０】
工程(ａ１)及び(ａ２)では、エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とが接触条件下におかれる。かかる細胞に対する被験物質の接触は、培養培地中で行われる。
【００６１】
エクソソーム量の測定可能な細胞としては、ほぼ全ての動物細胞が挙げられるが、その例として、がん細胞をはじめとする疾患細胞や正常細胞である血管内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、免疫細胞などが挙げられる。なお、これらの細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サルあるいはヒトの哺乳動物細胞を用いることができ、なかでも、ヒト由来の細胞が望ましい。
【００６２】
エクソソーム量の測定可能な細胞と被験物質とが接触される培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地(ＭＥＭ)、ダルベッコ改変最少必須培地(ＤＭＥＭ)、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約１４４時間である。
【００６３】
工程(ｂ１)では、被験物質を接触させた細胞及び被験物質を接触させていない対照細胞におけるエクソソーム量を測定し、工程(ｂ２)では、被験物質を接触させる細胞について、接触前後のエクソソーム量を測定する。エクソソーム量の測定は、公知の方法に従って行うことができ、細胞数当たりのエクソソーム量に換算することができる。具体的には、例えば、質量分析方法や測定対象のマーカーを特異的に認識できる抗体を用いる方法が好適例として挙げられる。なお、接触させていない対照細胞におけるエクソソーム量は、被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を測定する都度、新たに測定することもできるが、予め測定しておいたエクソソーム量を利用することもできる。細胞数の測定は、公知の方法に従って行うことができる。
【００６４】
質量分析法としては、MALDI(マトリックス支援レーザ脱離イオン化法)型質量分析装置、ESI(エレクトロスプレイイオン化法)型質量分析装置等を用いる質量分析方法が挙げられ、タンパク質の一部のペプチドから定量する方法であってもよい。なかでも、MALDI型質量分析装置を用いるMALDI-TOF MS法が好ましい。
【００６５】
抗体を用いる方法(免疫学的測定法)としては、例えば、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、発光免疫測定法、蛍光免疫測定法(エクソスクリーン法等)が挙げられる。かかる方法において用いる抗体としては、エクソソームの膜表面に特異的に発現している抗原(例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１４７、ＥＰＣＡＭなど)が知られているので、これらに特異的に結合できる抗体を用いることができる(例えば、国際公報２０１３／０９９９２５号)。このような抗体は、当業者に周知の方法により作製することができ、例えば、モノクローナル抗体又はその断片を好適に用いることができる。また、前記モノクローナル抗体又はその断片は、通常公知の方法に従って、標識化や固相化して用いることができる。なお、本明細書において、「モノクローナル抗体の断片」としては、前記のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様に目的のタンパク質に対して特異的な結合性を有する断片を意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｓＦｖ)、２量化体Ｖ領域断片(Ｄｉａｂｏｄｙ)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる。
【００６６】
工程(ｃ１)では、被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量を、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量と比較し、工程(ｃ２)では、被験物質の接触前後のエクソソーム量を比較する。エクソソーム量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。例えば、被験物質を接触させた細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるエクソソーム量よりも、あるいは、被験物質を接触させた後の細胞におけるエクソソーム量が、被験物質を接触させる前の細胞におけるエクソソーム量よりも、それぞれ統計学的に有意に、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは４倍以上、更に好ましくは５倍以上の量で低下している場合に、被験物質をエクソソーム分泌阻害用物質として選択することが好ましい。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【００６７】
また、本発明は、もう１つの態様において、エクソソーム量を指標とし、エクソソーム量の分泌を抑制する物質を候補化合物とする、癌の治療剤をスクリーニングする方法を提供する。具体的に用いる試料や方法は、前記本発明のエクソソーム分泌阻害剤をスクリーニングする方法と同様である。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。なお、本実施例において「常温」とは15〜30℃を意味する。【００６９】
実施例１(エクソソーム分泌阻害作用を有するmiRNAの探索)
96well plateに血清入りの培地で各ウェルに1×104個のPC-3ML細胞(Xenogen社)又はMDA-MB-231D3H2LN細胞(Xenogen社)を播種した。翌日、培養上清をadvanced RPMI(aRPMI; 血清無添加、抗生剤無添加)に交換した(90μL/well)。【００７０】
別に用意した96well plate(PCR plate)の各ウェルに、micro RNA library (Accu Target Human Library mimic)中の各miRNAについて、5μLの2μM miRNAと10μLのaRPMIを混ぜた。
次いで、DharmaFECT1 Transfection Reagent(Thermo Scientific)をaRPMIで10μL/wellになるように希釈し、5分間常温でインキュベートし、90μL/wellになるようにaRPMIを加えた。当該溶液を、前記miRNAを注入したPCR plate 1wellあたり90μLを加え、30分間常温でインキュベートした。30分間常温でインキュベーション後、90μLをPC-3ML細胞又はMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した96well plateの各wellにそれぞれ添加した。翌日培養上清を除去し、新しいaRPMIを60μL加えた。さらに24時間後、培養上清10μLをエクソソーム分泌量の定量に用い、残りの培養上清を細胞数の定量に用いた。なお各定量は以下の方法に従って行った。【００７１】
＜エクソソーム量の定量＞
回収した培養上清を96 well white plateの各ウェルに10μLずつ加える。
ビオチン化抗CD9抗体(シオノギ製薬, Clone 12A12)、ビオチン化抗CD63抗体(シオノギ製薬, Clone 8A12)を、AlphaLISA Universal Buffer (PerkinElmer社)を用いて5nMに希釈し、一方、AlphaLISA Acceptor Beadsと結合している抗CD9抗体(シオノギ製薬, Clone 12A12)、抗CD63抗体(シオノギ製薬, Clone 8A12)を、AlphaLISA Universal Buffer (PerkinElmer社)を用いて50μg/mLに希釈する。
培養上清に、5nMビオチン化抗体と、50μg/mL AlphaLISA Acceptor Beadsと結合している抗体を10μLずつ加えて、37℃遮光条件下で1時間インキュベートする。
5mg/mL AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(PerkinElmer社)をAlphaLISA Universal Bufferで62.5倍に希釈し、25μLずつ各ウェルに加え、TopSeal-Aをプレートに貼り、37℃遮光条件下で30分間インキュベートし、Enspireで蛍光強度を測定する。【００７２】
＜細胞数の定量＞
回収した培養上清に、MTS溶液(Dojindo, Cell Counting Kit-8)を50μL/wellになるように加え、37℃で1時間インキュベーションし、細胞数の増殖を測定する。【００７３】
得られたエクソソーム量を細胞数で割り、細胞数あたりのエクソソーム分泌量として、micro RNA library中の2042種類のmiRNAの効果を比較した。【００７４】
比較の結果、miR-194にエクソソーム分泌抑制作用があることが判明した(図１Ａ〜Ｄ)。【００７５】
実施例２(miR-194の標的遺伝子の同定)
6 well plateに血清入りの培地で各ウェルに1×104個のPC-3ML細胞又はMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した。翌日、培養上清をadvanced RPMI(aRPMI; 血清無添加、抗生剤無添加)に交換した(2mL/well)。【００７６】
1.5mL容チューブに2μMのmiR-194mimic(Ambion社)又はmiR-194のLNAを100μLと、100μLのaRPMIを加えた。DharmaFECT1 Transfection Reagentを6μL/wellになるように用意し、aRPMIで10μL/wellになるように希釈し、5分間常温でインキュベートした。インキュベーション終了後、当該溶液400μLを各wellの細胞に添加した。【００７７】
翌日培養上清を除去し、新しいaRPMIを4mL加えた。さらに24時間後、培養上清を回収して実施例１と同様にして細胞数あたりのエクソソーム分泌量を算出した。また、トランスフェクションした細胞を回収し、miRNeasy mini kit(キアゲン社)でRNA抽出を行い、Agilent社製のチップを用いたマイクロアレイで各遺伝子の発現を比較した。【００７８】
miR-194mimicを投与することで発現量が減少し、miR-194のLNAを投与することで発現量が増加する遺伝子がmiR-194のターゲット遺伝子候補であるところ、NAPG等の遺伝子がmir-194のターゲット遺伝子候補として見出すことができた(図２Ａ、Ｂ)。【００７９】
実施例３(NAPG、TMED5のsiRNAのエクソソーム分泌抑制)
96 well plateに血清入りの培地で各ウェルに1×104個のPC-3ML細胞又はMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した。翌日、培養上清をadvanced RPMIに交換した(90μL/well)。【００８０】
別に用意した96well plateに、ターゲット遺伝子の候補に挙げられたNAPG及びTMED(図２Ａ参照)に対する各siRNA(2μM)を10μLと10μLのaRPMIを混ぜた。
次いで、DharmaFECT1 Transfection ReagentをaRPMIで10μL/wellになるように希釈し、5分間常温でインキュベートし、90μL/wellになるようにaRPMIを加えた。当該溶液を、PCR plate 1wellあたり90μLを加え、30分間常温でインキュベートした。30分間常温でインキュベーション後、90μLをPC-3ML細胞又はMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した96well plateの各wellにそれぞれ添加した。翌日培養上清を除去し、新しいaRPMIを60μL加えた。さらに24時間後、培養上清10μLをエクソソーム分泌量の定量に用い、残りの培養上清を細胞数の定量に用いた。各定量は実施例１と同様に行った。【００８１】
得られたエクソソーム量を細胞数で割り、細胞数あたりのエクソソーム分泌量として、候補に挙げられた各標的遺伝子に対するsiRNAの効果を比較した。【００８２】
比較の結果、NAPGのsiRNAに顕著なエクソソーム分泌量抑制作用があることが判明した(図３Ａ、Ｂ)。【００８３】
実施例４(NAPGの siRNAのエクソソーム分泌への関与の測定)
6well plateに血清入りの培地で各ウェルに5×105個のPC-3ML細胞又はMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した。翌日、培養上清をadvanced RPMIに交換した(2mL/well)。【００８４】
1.5mL容チューブに2μMのNAPGのsiRNAを100μLと100μLのaRPMIを加えた。
次いで、DharmaFECT1 Transfection ReagentをaRPMIで200μL/wellになるように希釈し、５分常温でインキュベートし、各siRNAが入っているチューブに加えた。30分間常温でインキュベートした後、400μLを各細胞のwellに添加した。【００８５】
翌日培養上清を除去し、新しいaRPMIを4mL加えた。さらに24時間後、培養上清全量を回収した。残った細胞を回収し細胞数を血球計算盤で計測して数えた。また、回収した培養上清を2,000×gで10分間遠心し、上清を回収し、回収した培養上清を0.22μmのフィルターでフィルトレイトした。フィルトレイトされた培養上清を、100,000×g、70min、4℃で超遠心を行った。上清を捨て、PBSで100,000×g、70minの洗浄を行った。上清を捨て、超遠心チューブに200μLのPBSを加えて、エクソソームを回収し、エクソソーム量をNanosightもしくはmicroBCA assay(Pierce社)を用いて定量した。【００８６】
結果、NAPGのsiRNAがエクソソームの分泌を抑制することが判明した(図４)。【００８７】
実施例５(HINT3、GXYLT1の siRNAのエクソソーム分泌への関与の測定)
実施例２でmir-194のターゲット遺伝子候補として見出した、HINT3、GXYLT1の遺伝子についても、実施例３と同様の解析を行った。
具体的には、96 well plateに血清入りの培地で各ウェルに1×104個のMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した。翌日、培養上清をadvanced RPMIに交換した(90μL/well)。【００８８】
別に用意した96well plateに、2μMのHINT3又はGXYLT1に対するsiRNAをそれぞれ10μLと10μLのaRPMIを混ぜた。
次いで、DharmaFECT1 Transfection ReagentをaRPMIで10μL/wellになるように希釈し、5分間常温でインキュベートし、90μL/wellになるようにaRPMIを加えた。当該溶液を、PCR plate 1wellあたり90μLを加え、30分間常温でインキュベートした。30分間常温でインキュベーション後、90μLをMDA-MB-231D3H2LN細胞を播種した96well plateの各wellにそれぞれ添加した。翌日培養上清を除去し、新しいaRPMIを60μL加えた。さらに24時間後、培養上清10μLをエクソソーム分泌量の定量に用い、残りの培養上清を細胞数の定量に用いた。各定量は実施例１と同様に行った。【００８９】
得られたエクソソーム量を細胞数で割り、細胞数あたりのエクソソーム分泌量として、候補に挙げられた各標的遺伝子に対するsiRNAの効果を比較した。【００９０】
比較の結果、HINT3及びGXYLT1のsiRNAに顕著なエクソソーム分泌抑制作用があることが判明した(図５)。【００９１】
実施例６（NAPGのsiRNAによるin vivoモデルにおけるがん転移の抑制）
スキッドマウスの乳腺にMDA-MB-231D3H2LN細胞を1x106 cells/mouseで移植(各群10匹)した。移植1週間後から週2回、NAPGに対するsiRNAおよび陰性対照となるsiRNA（AllStars、キアゲン社）を20μg/mouse、in vivo-jetPEI(Polyplus-transfection社)を用いて腫瘍内投与を行った(３週間、計6回投与)。原発巣の腫瘍サイズは１週間に一度ずつノギスにより計測した（図６Ａ）。移植44日後にマウスを解剖し、肺への転移の程度に関する評価を行った。肺組織の切片を作製し、抗ヒト・ビメンチン抗体による免疫組織染色を行った。各マウスにおいて同抗体で陽性となる微小転移数を計測し、１mm2あたりの微小転移数を計算した（図６Ｂ）。その結果、NAPGに対するsiRNAを投与したマウスでは陰性対照となるsiRNAを投与したマウスに比べて、原発巣の腫瘍サイズに差は見られなかったが、肺への微小転移数が有意に減少していた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、医薬品の分野、特に抗癌剤の開発および製造の分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列表の配列番号１は、ヒトNAPGのmRNAの塩基配列である。
配列表の配列番号２は、ヒトNAPGのポリペプチドである。
配列表の配列番号３は、ヒトHINT3のmRNAの塩基配列である。
配列表の配列番号４は、ヒトHINT3のポリペプチドである。
配列表の配列番号５は、ヒトGXLT1のmRNAの塩基配列である。
配列表の配列番号６は、ヒトGXLT1のポリペプチドである。
【図１Ａ】
2017043370.tif 000002
【図１Ｂ】
2017043370.tif 000003
【図１Ｃ】
2017043370.tif 000004
【図１Ｄ】
2017043370.tif 000005
【図２Ａ】
2017043370.tif 000006
【図２Ｂ】
2017043370.tif 000007
【図３Ａ】
2017043370.tif 000008
【図３Ｂ】
2017043370.tif 000009
【図４】
2017043370.tif 000010
【図５】
2017043370.tif 000011
【図６】
2017043370.tif 000012
【配列表】
2017043370000001.app
【国際調査報告】
2017043370.tif 000013
2017043370.tif 000014
2017043370.tif 000015
2017043370.tif 000016