(57)【要約】  ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物及びそれを含む医薬組成物が提供される。
2016194869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物。
【請求項２】
グリコサミノグリカン誘導体が、疎水基導入グリコサミノグリカンである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グリコサミノグリカン誘導体が、グリコサミノグリカン架橋体である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
グリコサミノグリカン誘導体とケモカイン受容体活性調節材の共有結合物を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
グリコサミノグリカン誘導体が、ヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸の誘導体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ケモカイン受容体活性調節材が、ケモカイン受容体拮抗剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項８】
後眼部疾患処置剤である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の後眼部疾患処置剤としての使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を硝子体内へ投与することを含む後眼部疾患の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
病的な血管新生が関与する後眼部疾患である加齢黄斑変性症（Age-related Macular degeneration:以下、「ＡＭＤ」と略記する）は、滲出型と萎縮型に大別される。滲出型ＡＭＤは、黄斑部の網膜色素上皮細胞-ブルッフ膜-脈絡膜の変化により発生する脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization:以下、「ＣＮＶ」と略記する)とその増殖変化を本態とする疾患であり、進行も早く、永続する高度の視力低下を生じる。【０００３】
ＣＣケモカイン受容体（以下、「ＣＣＲ」と略記する）の１つであるＣＣＲ３が滲出型ＡＭＤ患者から採取したＣＮＶの血管内皮細胞に特異的に発現していることが知られており（例えば、Nature, 2009, 460: 225-230.参照）、ＡＭＤ病態モデルであるレーザー誘発マウスＣＮＶモデルにおいて、ＣＣＲ３阻害剤の硝子体内投与が、ＣＮＶを抑制し、滲出型ＡＭＤ治療に有用とされている（例えば、米国特許第８，５９２，４８２号明細書参照）。【０００４】
一方、硫酸化されたグリコサミノグリカン（以下、グリコサミノグリカンを「ＧＡＧ」と略記する）であるヘパラン硫酸やヘパリンのレーザー誘発マウスＣＮＶモデルへの硝子体内投与は、ＣＮＶを抑制し、滲出型ＡＭＤ治療に有用とされている（例えば、国際公開第２０１１／１２２３２１号参照）。また、Heebeom Kooらは、ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」と略記する）に５β-コラン酸を導入した化合物を硝子体内投与し、病理組織標本を用いて眼内分布を評価している（例えば、Biomaterials, 2012, 33: 3485-3493.参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，５９２，４８２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１１／１２２３２１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature, 2009, 460: 225-230.
【非特許文献２】Biomaterials, 2012, 33: 3485-3493.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、米国特許第８，５９２，４８２号明細書に記載された、薬効を有する濃度のＣＣＲ３阻害剤を調製するために所定量以上のＤＭＳＯなどの可溶化剤を含む溶液は、硝子体内投与直後に、硝子体に近接する組織（例えば水晶体など）の急激な変性等を生じる場合がある。またBiomaterials, 2012, 33: 3485-3493.及び国際公開第２０１１／１２２３２１号には、ケモカイン受容体活性調節材については開示されておらず、示唆もされていない。【０００８】
本発明は、投与に伴う急激な組織変性が抑制され、優れたケモカイン受容体活性調節作用や、後眼部疾患等に対する優れた薬効を示す組成物及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物。
＜２＞ＧＡＧ誘導体が、疎水基導入ＧＡＧである＜１＞に記載の組成物。
＜３＞ＧＡＧ誘導体が、ＧＡＧ架橋体である＜１＞又は＜２＞に記載の組成物。
＜４＞ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材の共有結合物を含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の組成物。
＜５＞ＧＡＧ誘導体が、ＨＡ又はコンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」と略記する）の誘導体である＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の組成物。
＜６＞ケモカイン受容体活性調節材が、ケモカイン受容体拮抗剤である＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の組成物。
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の組成物を含む医薬組成物。
＜８＞後眼部疾患処置剤である＜７＞に記載の医薬組成物。
＜９＞＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の組成物の後眼部疾患処置剤としての使用。
＜１０＞＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の組成物を硝子体内へ投与することを含む後眼部疾患の処置方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、投与に伴う急激な組織変性が抑制され、優れたケモカイン受容体調節作用や、後眼部疾患等に対する優れた薬効を示す組成物及び医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】動物モデルに本実施形態に係るＫｉ１９００３導入ＣＳ誘導体を硝子体内投与したときの、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図２】動物モデルに本実施形態に係るＫｉ１９００３導入ＣＳ誘導体を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図３】動物モデルに本実施形態に係るＫｉ１９００３導入ＣＳ誘導体を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図４】動物モデルに本実施形態に係るＳＢ３２８４３７とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図５】動物モデルに本実施形態に係るＳＢ２２５００２とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図６】動物モデルに本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図７】動物モデルに本実施形態に係るＫｉ１９００３とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図８】動物モデルに本実施形態に係るＡＺＤ３７７８とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図９】動物モデルに本実施形態に係るＳＢ３２８４３７とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１０】動物モデルに本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＧＡＧ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１１】動物モデルに本実施形態に係るＫｉ１９００３とＧＡＧ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１２】動物モデルに本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１３】動物モデルに本実施形態に係るＲＳ５０４３９３とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１４】動物モデルに本実施形態に係るＰＳ３７２４２４とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１５】動物モデルに本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を示すグラフである。
【図１６】動物モデルにＣＳを硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を確認したグラフである。
【図１７】動物モデルにＣＳ又はＣＳ誘導体を硝子体内投与した時の、ＣＮＶの抑制作用を確認したグラフである。
【図１８Ａ】動物にＫｉ１９００３溶液を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｂ】動物にＳＢ３２８４３７溶液を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｃ】動物にＧＷ７６６９９４溶液を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｄ】動物に本実施形態に係るＫｉ１９００３とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｅ】動物に本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｆ】動物に本実施形態に係るＫｉ１９００３とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｇ】動物に本実施形態に係るＫｉ１９００３とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１８Ｈ】動物に本実施形態に係るＳＢ３２８４３７とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ａ】動物にＲＳ５０４３９３溶液を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ｂ】動物にＰＳ３７２４２４溶液を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ｃ】動物に本実施形態に係るＲＳ５０４３９３とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ｄ】動物に本実施形態に係るＰＳ３７２４２４とＨＡ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ｅ】動物に本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【図１９Ｆ】動物に本実施形態に係るＧＷ７６６９９４とＣＳ誘導体とを含む組成物を硝子体内投与した後の、眼内状態を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「ステップ」の語は、独立したステップはもちろん、他のステップと明確に区別できなくてもそのステップの所期の目的が達成される態様も含む。また組成物中の成分の含有量は、当該成分に属する物質が組成物中に複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。
【００１３】
（１）組成物
本発明の組成物は、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とを含有する。本発明の組成物は、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とをそれぞれ独立した化合物として含有していてもよく、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とが物理的相互作用又は化学結合によって複合化した複合物として含有していてもよい。
【００１４】
この「ＧＡＧ誘導体」としては、例えば、ＧＡＧに由来する基と疎水基とが、場合によりスペーサー基を介して、共有結合した疎水基導入ＧＡＧ；ＧＡＧが分子内又は分子間で架橋されてなるＧＡＧ架橋体；ＧＡＧに由来する基とスペーサー基とを含む化合物等が挙げられる。
【００１５】
また「疎水基導入ＧＡＧ」としては、例えば、ＧＡＧが有するカルボキシ基とのアミド結合若しくはエステル結合、又はＧＡＧが有するヒドロキシ基とのエーテル結合若しくはエステル結合により、疎水基が、場合によりスペーサー基を介して、共有結合した化合物が挙げられる。また「ＧＡＧ架橋体」としては、例えば、ＧＡＧが分子内又は分子間でＧＡＧが有するカルボキシ基又はヒドロキシ基が架橋性基を介して互いに共有結合して形成される化合物、ＧＡＧが分子内又は分子間でＧＡＧが有するカルボキシ基とヒドロキシ基とが架橋性基を介さずに架橋して形成される化合物等が挙げられる。
【００１６】
ＧＡＧ誘導体を構成するＧＡＧは、アミノ糖とウロン酸（又はガラクトース）からなる二糖の繰り返し構造を有する酸性多糖である。このようなＧＡＧの例としては、ＨＡ、コンドロイチン、ＣＳ、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸が挙げられ、中でもＨＡ及びＣＳが好ましい。また、ＧＡＧが有するカルボキシ基等の酸性官能基は、塩を形成していない遊離状態であっても、薬学的に許容されうる塩を形成している状態であっても構わない。
【００１７】
薬学的に許容されうる塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩が挙げられる。なかでも生体への適合性及び親和性の観点から、薬学的に許容されるアルカリ金属イオンとの塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
ＧＡＧの重量平均分子量は特に限定されず、目的等に応じ適宜選択することができる。ＧＡＧの重量平均分子量としては、５００Ｄａ〜１０００万Ｄａ又は４万Ｄａ〜５００万Ｄａが例示できる。ＧＡＧの重量平均分子量は、光散乱法により測定することができる。
【００１８】
ＧＡＧ誘導体を構成するＧＡＧは、その種類に応じ、公知の方法で製造することができる。このような方法として、例えば、動物由来原料からの抽出精製、ＧＡＧ産生菌等からの培養精製、糖鎖修飾、糖鎖合成などを挙げることができる。
【００１９】
疎水基導入ＧＡＧにおける「ＧＡＧに由来する基」とは、ＧＡＧが有するカルボキシ基からヒドロキシ基が取り除かれて形成される基、ＧＡＧが有するヒドロキシ基等から水素原子が取り除かれて形成される基等である。
疎水基導入ＧＡＧにおける「疎水基」は特に限定されず、胆汁酸であるコール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、これらの基本骨格であるコラン酸等の脂環式化合物に由来する基、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸に由来する基が例示され、これらから選択される少なくとも１種が好ましく、脂環式化合物に由来する基がより好ましく、コラン酸、中でも５β-コラン酸に由来する基が更に好ましい。ここで「脂環式化合物に由来する基」とは、脂環式化合物から水素原子又はヒドロキシ基が取り除かれて形成される基であり、「脂肪酸に由来する基」とは脂肪酸からヒドロキシ基が取り除かれて形成される基である。
また、疎水基のＧＡＧへの導入率は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができ、例えば、０．１〜８０ｍｏｌ％が例示できる。
【００２０】
疎水基導入ＧＡＧは、ＧＡＧに由来する基がスペーサー基を介して疎水基と共有結合していてもよい。
「スペーサー基」とは２つの基を共有結合で連結し得る２価の基であり、具体的には、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−、
−ＮＨ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ−Ｏ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ−（Ｃ＝Ｏ）−、
−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−（ＯＣＨ２）ｍ−Ｏ−などが例示でき、これらから選択される少なくとも１種が好ましく、下式：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−    （Ｉ）
−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−    （II）又は
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−    （III）
で表される基がより好ましい。ここで、ｍは互いに独立して２〜１２の整数を表し、２〜５が好ましく、２が特に好ましい。
【００２１】
なお、スペーサー基は直鎖に限定されず、スペーサー基に含まれるメチレン基にアルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子などの置換基を有してもよい。またメチレン基の少なくとも一部が酸素原子、アリール基などに置き換えられたものでもよい。
【００２２】
疎水基導入ＧＡＧは、ＧＡＧと、疎水基を形成する化合物と、必要に応じて用いられるスペーサー基を形成する化合物とを、縮合剤等を用いて結合させる通常の方法で製造することができる。
【００２３】
ＧＡＧ架橋体は、例えば架橋性基を２つ有する架橋性化合物を用いて、ＧＡＧが有するカルボキシ基やヒドロキシ基の少なくとも一方を、架橋性基を介して互いに共有結合させることで形成できる。架橋性化合物としては光反応性基、重合性官能基、アミノ基又はチオール基を有する化合物が例示され、好ましくは光反応性基又は重合性官能基を有する化合物である。ＧＡＧの架橋方法としては、例えば下記の４つのカテゴリーを挙げることができるが、その方法は限定されない。
（ａ）ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド架橋剤による架橋。
（ｂ）ＧＡＧが有するカルボキシ基とＧＡＧが有するヒドロキシ基とによる、架橋性基を用いない自己架橋。
（ｃ）ジエポキシド化合物、ジビニルスルホン、ジアミン化合物、ジヒドラジド化合物などのホモ二官能性架橋剤や、エピハロヒドリンなどのヘテロ二官能性架橋剤による架橋。
（ｄ）光反応性基、重合性官能基、アミノ基、チオール基、ハロゲン原子などの官能基が導入されたＧＡＧと、上記官能基に対して相補的な反応性基が導入されたＧＡＧや該反応性基を２つ有する架橋剤とを反応させることによる架橋。
【００２４】
これらの中でも（ｄ）の架橋によるＧＡＧ架橋体が好ましく、光反応性基が導入されたＧＡＧを光架橋させたＧＡＧ誘導体、重合性官能基が導入されたＧＡＧを、チオール基を２つ有する架橋剤で架橋させたＧＡＧ架橋体等がより好ましい。
【００２５】
この光反応性基としては、桂皮酸に由来する基等が例示される。このような光反応性基はスペーサー基を介してＧＡＧに由来する基と結合していてもよく、上式（Ｉ）、（II）又は（III）で表されるスペーサー基を介して、桂皮酸に由来する基がＧＡＧに共有結合していることが好ましい。重合性官能基としては、（メタ）アクリル酸に由来する基等が例示され、これらの重合性官能基はスペーサー基を介してＧＡＧに由来する基と結合していてもよく、上式（Ｉ）、（II）又は（III）で表されるスペーサー基を介して、（メタ）アクリル酸に由来する基がＧＡＧに共有結合していることが好ましい。重合性官能基に相補的な反応性基としては例えば、チオール基等が挙げられ、チオール基を２つ有する架橋剤としてはチオール‐ＰＥＧ‐チオール等が例示される。
【００２６】
ＧＡＧ架橋体における架橋性基の含有量は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択される。
【００２７】
「ＧＡＧに由来する基とスペーサー基とを含む化合物」は、ＧＡＧに由来する基にスペーサー基の一端が共有結合してなる化合物である。組成物が該化合物を含む場合、スペーサー基の他端にはケモカイン受容体活性調節材に由来する基が共有結合していることが好ましい。ＧＡＧに由来する基及びスペーサー基については既述のとおりであり、ケモカイン受容体活性調節材に由来する基は、後述するケモカイン受容体活性調節材から水素原子又はヒドロキシ基が取り除かれて形成される基である。
ＧＡＧに由来する基とスペーサー基とを含む化合物におけるスペーサー基の含有量は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択される。
【００２８】
「ケモカイン受容体活性調節材」とは、ケモカイン受容体又はケモカイン受容体に結合する物質に作用し、ケモカイン受容体を介するシグナル伝達を調節（抑制又は亢進）する化合物（薬剤）であり、例えば、ケモカイン受容体阻害剤、抗ケモカイン抗体、ケモカイン受容体作動剤などが挙げられる。ケモカイン受容体を介するシグナル伝達を抑制する薬剤としては、例えば、ケモカイン受容体拮抗剤としてケモカイン受容体を競合阻害若しくは非競合阻害する薬剤等が挙げられ、その中でも、ＣＣＲ３拮抗剤、ＣＸＣ受容体（ＣＸＣＲ）２拮抗剤、ＣＣＲ２拮抗剤等が好ましい。ケモカイン受容体を介するシグナル伝達を亢進する薬剤としては、ケモカイン受容体作動剤としてケモカイン受容体に作用し、その作用を増強させる薬剤等が挙げられ、例えば、ＣＸＣＲ３作動剤等が好ましい。
【００２９】
具体的には、ＣＣＲ３拮抗剤として、Ｋｉ１９００３（例えば、国際公開０２／０５９０８１号参照）、ＳＢ３２８４３７（例えば、Journal of Biological Chemistry,2000,275(47),36626-31.参照）、ＧＷ７６６９９４（例えば、国際公開０３／０８２２９２号参照）、ＡＺＤ３７７８（例えば、国際公開０３／００４４８７号参照）等が例示され、ＣＸＣＲ２拮抗剤としては、ＳＢ２２５００２（例えば、Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17(23), 8102-8112．参照）が例示される。ＣＣＲ２拮抗剤として、ＲＳ５０４３９３（例えば、J. Biol. Chem., 2000, 275(33)参照）が例示される。ＣＸＣＲ３作動剤として、ＰＳ３７２４２４（例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006,349(1), 221-8参照）が例示される。なかでも、ＣＣＲ３拮抗剤を用いることが特に好ましい。以下にケモカイン受容体活性調節材の具体例を構造式で示すが、本発明に用いるケモカイン受容体活性調節材はこれらの化合物に限定されない。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
このようなケモカイン受容体活性調節材は、塩（例えば薬学的に許容される塩）を形成していてもよい。塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸水素塩、リン酸水素塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸水素塩、酢酸塩、クエン酸水素塩、フマル酸水素塩、酒石酸水素塩、シュウ酸水素塩、コハク酸水素塩、安息香酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが例示される。
【００３２】
ケモカイン受容体活性調節材は、ＧＡＧ誘導体と物理的相互作用によって複合化した複合物として組成物に含まれていてもよい。疎水基導入ＧＡＧやＧＡＧ架橋体などのＧＡＧ誘導体と、ケモカイン受容体活性調節材とを含む複合物は、投与に伴う急激な組織変性を抑制できると共に、優れたケモカイン受容体活性調節作用や、ＡＭＤなどの後眼部疾患等に対する優れた薬効を示す。
【００３３】
またケモカイン受容体活性調節材とＧＡＧ誘導体とが化学結合により複合物を形成していてもよく、中でもＧＡＧに由来する基がスペーサー基を介してケモカイン受容体活性調節材に由来する基と共有結合した共有結合物が好ましい。中でも、ＧＡＧのカルボキシ基と、ケモカイン受容体活性調節材が有するカルボキシ基とが下式（III）で表されるスペーサー基を介して共有結合した共有結合物であることが好ましく、ＧＡＧのカルボキシ基が式（III）のスペーサー基とアミド結合を形成している共有結合物であることが特に好ましい。
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−    （III）
式中、ｍは２〜１２の整数を示し、２〜５が好ましく、２がより好ましい。
【００３４】
前記共有結合物における、ケモカイン受容体活性調節材に由来する基とスペーサー基との間の共有結合形式も特に限定されず、例えばエステル結合が例示できる。
前記共有結合物の調製方法、ケモカイン受容体活性調節材の導入率等は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択することができる。
本発明の組成物では、従来、単剤では薬効を示さないような低濃度であっても硝子体内投与のために可溶化剤に溶解せざるを得なかったケモカイン受容体活性調節材についても、可溶化剤を用いずに、また用いたとしてもごく少量に留めて硝子体内投与することもできる。
ここで本願明細書にいう「可溶化剤」とは、難水溶性のケモカイン受容体活性調節材を溶解できるものであれば特に限定されず、例えば、ＤＭＳＯ等の有機溶剤、ポリソルベート８０、マクロゴール４００、シクロデキストリンなどが例示される。
本発明の組成物は、このような可溶化剤（例えば、有機溶剤）の含有量が１０重量％以下であることが好ましく、実質的に含有しないものがより好ましい。
また、本発明の組成物は、眼内へ投与した際に、眼内出血悪化を起こさないものであることが好ましい。眼内出血悪化の有無は後述する実施例の方法により確認できる。
【００３５】
（２）組成物の製造方法
本発明の組成物の実施形態として、例えば、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とが混合されたものや、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材とが共有結合してなる共有結合物を挙げることができる。この場合の混合方法や、共有結合方法も特に限定されない。例えば、混合方法としては、ＧＡＧ誘導体のＰＢＳ溶液とエタノール等の溶媒に溶解したケモカイン受容体活性調節材とを撹拌混合する方法が例示できる。また、例えば、共有結合方法としては、ＧＡＧ誘導体（好ましくは、スペーサー基を含むＧＡＧ誘導体）の官能基にケモカイン受容体活性調節材をアミド結合、エステル結合、又はエーテル結合させる方法などが挙げられる。その後、必要に応じて透析、沈殿、凍結乾燥、濃縮乾固等させてもよい。
【００３６】
（２−１）疎水基導入ＧＡＧとケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物の製造方法
（２−１−１）疎水基導入ＧＡＧの製造方法
疎水基導入ＧＡＧは、例えば、ＧＡＧ分子が有する官能基（例えば、カルボキシ基）と、疎水基が有する官能基（カルボキシ基）とをスペーサー基を介して共有結合させることで得ることができる。以下、疎水基導入ＧＡＧの製造方法の一例として、疎水基を形成する化合物が５β‐コラン酸である場合について説明するが、これに限定されるものではない。ＧＡＧに由来する基と５β-コラン酸に由来する基とをスペーサーを介して共有結合してなる疎水基導入ＧＡＧは、例えば以下のステップを含む方法で製造することができる。
【００３７】
（Ａ）５β-コラン酸が有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、
（Ｂ）ＧＡＧが有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、を含む製造方法。
【００３８】
（Ａ）のステップでは、５β-コラン酸が有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のＧＡＧと反応する予定のアミノ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
（Ｂ）のステップでは、ＧＡＧが有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。
ＧＡＧ誘導体の製造方法は（Ａ）のステップと（Ｂ）のステップとを含んでいればよく、ステップが実行される順番は限定されない。
【００３９】
なお、スペーサー形成分子としては、下式で表される化合物を挙げることができる。
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ２
式中、ｍは１〜１２の整数を表し、２〜５が好ましく、２がより好ましい。
【００４０】
疎水基導入ＧＡＧの製造に用いられる縮合（エステル化、アミド化）方法は、通常用いられる方法から適宜選択すればよい。例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＷＳＣ））、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド含水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を挙げることができる。縮合反応条件は適用する縮合反応に応じて適宜選択される。
縮合反応において用いる溶媒としては、例えば、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ホルムアミド、およびこれらの混合溶媒を挙げることができ、好ましくはエタノールと水の混合溶媒及びＤＭＦとホルムアミドの混合溶媒である。
【００４１】
（２−１−２）疎水基導入ＧＡＧとケモカイン受容体活性調節材の混合方法
疎水基導入ＧＡＧのＰＢＳ溶液と、例えばエタノールに溶解したケモカイン受容体活性調節材とを混合後、透析・凍結乾燥して得ることができる。混合方法、透析・凍結乾燥方法については限定されず、通常用いられる方法から適宜選択することができる。
【００４２】
（２−２）ＧＡＧ架橋体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物の製造方法１
（２−２−１）ＧＡＧ架橋体の製造方法
ＧＡＧ架橋体の一例として、例えば、特開２００２−２４９５０１号公報に記載の方法により光架橋性ＧＡＧを調製することができる。具体的には、光反応性基（例えば桂皮酸誘導体）をＧＡＧのカルボキシ基に縮合反応で導入することにより、光反応架橋性ＧＡＧを得ることができる。得られる光架橋性ＧＡＧを、光反応に付することによりＧＡＧ架橋体を製造できる。
【００４３】
（２−２−２）ＧＡＧ架橋体とケモカイン受容体活性調節材との混合方法
上記で得られるＧＡＧ架橋体の水溶液にケモカイン受容体活性調節材を撹拌混合することにより、目的とする組成物を調製することができる。
【００４４】
（２−３）ＧＡＧ架橋体とケモカイン受容体活性調節材とを含む組成物の製造方法２
（２−３−１）ＧＡＧ架橋前駆体の製造方法
例えば後述する実施例に記載される方法により、ＧＡＧのカルボキシ基にメタクリル基を、必要に応じてスペーサー基を介して導入することで、ＧＡＧ架橋前駆体を調製することができる。得られるＧＡＧ架橋前駆体は例えば、チオール‐ＰＥＧ‐チオールと反応させることで架橋体を生成することができるが、この化合物に限定されない。
【００４５】
（２−３−２）組成物の製造方法
上記で得られるＧＡＧ架橋前駆体にケモカイン受容体活性調節材を混合し、さらにチオール‐ＰＥＧ‐チオール等の架橋剤で架橋反応を行うなどの方法により、所望の組成物を得ることができる。
【００４６】
（２−４）ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材との共有結合物の製造方法３
ケモカイン受容体活性調節材が共有結合したＧＡＧ誘導体は、ＧＡＧが有する官能基（例えば、カルボキシ基）と、ケモカイン受容体活性調節材が有する官能基（例えば、カルボキシ基）とをスペーサー基を介して共有結合させることで得ることができる。
【００４７】
（２−４−１）ケモカイン受容体活性調節材が共有結合されたＧＡＧの製造方法
ＧＡＧに由来する基とケモカイン受容体活性調節材に由来する基とをスペーサーを介して共有結合してなるＧＡＧ誘導体は、例えば以下のステップを含む方法で製造することができる。
（Ａ）ケモカイン受容体活性調節材が有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のヒドロキシ基と縮合して共有結合（エステル結合）させることと、
（Ｂ）ＧＡＧが有するカルボキシ基をスペーサー形成分子のアミノ基と縮合して共有結合（アミド結合）させることと、を含む製造方法。
【００４８】
（Ａ）のステップでは、ケモカイン受容体活性調節材が有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のヒドロキシ基とを縮合して共有結合させる。このときスペーサー形成分子のＧＡＧと反応する予定のアミノ基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
（Ｂ）のステップではＧＡＧが有するカルボキシ基とスペーサー形成分子のアミノ基とを縮合して共有結合させる。
ＧＡＧ誘導体の製造方法は（Ａ）のステップと（Ｂ）のステップとを含んでいればよく、ステップが実行される順番は限定されない。
【００４９】
なお、スペーサー形成分子としては下式で表される化合物を挙げることができる。
ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ２
式中、ｍは１〜１２の整数を表し、２〜５が好ましく、２がより好ましい。
また縮合（エステル化、アミド化）方法は、通常用いられる方法から適宜選択すればよい。
【００５０】
ＧＡＧ誘導体は、種々の構造をとり得る。ＧＡＧ誘導体の構造の具体例としては、例えばＣＳ誘導体の場合、下記化学式（IＶａ）、ＨＡ誘導体の場合下記化学式（Ｖａ）で表される少なくとも１種の構造単位を、少なくとも１個を含む構造を例示することができる。
【００５１】
【化２】
2016194869.tif 000004
【００５２】
Ｒ１２又はＲ１３で表される基は、式中の＊の位置でＧＡＧに由来するカルボニル基と共有結合で結合する。
【００５３】
ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節材との共有結合物の構造の具体例としては、例えばＣＳ誘導体の場合は下記化学式（IＶｂ）、ＨＡ誘導体の場合は下記化学式（Ｖｂ）で表される少なくとも１種の構造単位を、少なくとも１個を含む構造を例示することができる。
【００５４】
【化３】
2016194869.tif 000005
【００５５】
Ｒ２２又はＲ２３で表される基は、式中の＊の位置でＧＡＧに由来するカルボニル基と共有結合で結合する。
【００５６】
（３）医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前記組成物を含み、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。
医薬組成物の用途は特に制限されないが、例えば、後眼部疾患処置に用いられることが好ましい。
【００５７】
（４）後眼部疾患処置剤
後眼部疾患処置剤は、前記組成物を含む医薬組成物であって、後眼部疾患の処置に用いられる。
本明細書において用いられる「処置」とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善及び進行の抑制（悪化の防止）が挙げられる。
【００５８】
後眼部疾患処置剤の形態は、ヒトの眼に投与可能な製剤ないし医薬の形態である限りにおいて特に限定されない。投与時における形態が液体であることが好ましく、例えば溶液や懸濁液等の形態が挙げられる。溶液や懸濁液は、前記組成物の粉体を用時溶解して調製することにより、投与することもできる。
【００５９】
後眼部疾患処置剤の投与量としては、例えば液体の場合、硝子体内投与であれば１０〜１０００μＬ程度が例示できる。
また、液体の場合の後眼部疾患処置剤の濃度は、ケモカイン受容体活性調節材として、０．００１〜５重量％、ＧＡＧ誘導体としては、０．０１〜１０重量％を例示できる。
【００６０】
後眼部疾患処置剤の投与方法としては、例えば、硝子体内投与、結膜下投与、結膜嚢投与、テノン嚢下投与、点眼投与、眼内に留置したデバイスへの投与等を挙げることができるが、硝子体内投与が好ましい。硝子体内投与の中でも、硝子体内注射であることが最も好ましい。
後眼部疾患処置剤の投与頻度は、病態や薬剤の濃度等に応じて適宜設定すればよい。あるいは、病態悪化時に必要に応じ投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
後眼部疾患処置剤は、後眼部疾患の処置に適用することを目的とする。ここで「後眼部疾患」とは、新生血管に起因または血管新生を呈する病態へ進展する後眼部で起こる疾患その他の何らかの異常を意味し、例えば、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、網膜動脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、未熟児網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症、中心性滲出性脈絡網膜症、新生血管黄斑症、ＡＭＤ（ＣＮＶ病変を有する滲出型ＡＭＤとＣＮＶ発症のリスクを有するならびに／または滲出型ＡＭＤへ移行する萎縮型ＡＭＤ）などが含まれる。これらのなかでも、本発明の後眼部疾患処置剤のより好ましい適応疾患はＡＭＤ、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫であり、特に好ましい適応疾患は滲出型ＡＭＤである。
【００６２】
後眼部疾患処置剤の態様としては、例えば、眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下である液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、ＧＡＧ架橋体及びケモカイン受容体活性調節材を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下であり、ＧＡＧ架橋体及びケモカイン受容体活性調節材を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、光架橋ＨＡ及びケモカイン受容体拮抗剤を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下であり、光架橋ＨＡ及びケモカイン受容体拮抗剤を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、疎水性基導入ＧＡＧ及びケモカイン受容体活性調節材を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下であり、疎水性基導入ＧＡＧ及びケモカイン受容体活性調節材を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、疎水性基導入ＣＳ及びケモカイン受容体拮抗剤を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下であり、疎水性基導入ＣＳ及びケモカイン受容体拮抗剤を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、コラン酸に由来する基が導入されたＣＳ及びＣＣＲ３阻害剤を含んでなる液剤；眼内出血悪化を引き起こさず、可溶化剤の含有量が１０重量％以下であり、コラン酸に由来する基が導入されたＣＳ及びＣＣＲ３阻害剤を含んでなる液剤；等が挙げられる。これらの態様の後眼部疾患処置剤は、ヒトの眼の硝子体内に注射により投与されることを特徴とする滲出型ＡＭＤ進行抑制剤として用いることができる。
【００６３】
（５）後眼部疾患の処置方法
後眼部疾患の処置方法は、後眼部疾患処置剤を眼内投与するステップを含む。後眼部疾患の処置方法は必要に応じ他のステップを更に含んでいてもよい。後眼部疾患の処置方法は、前記（４）後眼部疾患処置剤における説明に従って同様に実施でき、好ましい処置剤の条件・投与頻度等は、前記と同様である。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明の実施例及び試験例をより具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が制限されるものではない。なお、組成物内のＧＡＧ置換基及びケモカイン受容体活性調節材の含量は後述の方法により測定した。またＧＡＧの分子量は重量平均分子量である。【００６５】
（１）ＧＡＧ誘導体及び組成物の調製
（実施例１）アミノエチル５β−コラノアミドの合成
５β-コラン酸（１ｇ、アルドリッチ社製）にメタノール（５ｍｌ）、濃塩酸（０．１８ｍｌ）を加え、６０℃で６時間撹拌後、反応液を室温まで冷却して析出した固体をろ取した。得られた化合物にエチレンジアミン（５ｍｌ、和光純薬工業社製）を加え、１３０℃で５時間撹拌し、ＬＣＭＳで目的物を確認後、室温に戻し得られた固体をろ取し、蒸留水で洗浄した後乾燥して、化合物１を得た（８９５ｍｇ）。
ESI-MS; Calcd for C267H3746N2O [M+H]+, 404; found 404【００６６】
（実施例２）５β-コラン酸導入ＨＡの合成
ＨＡ（平均分子量約２１万、Lifecore Biomedical社製、５００ｍｇ）にホルムアミド（４０ｍｌ）を加えて４０℃で２時間加熱撹拌することにより溶解させ、ＷＳＣ（和光純薬工業株式会社製、２０５ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（渡辺化学工業株式会社製、１２３ｍｇ）を加え撹拌した。そこに化合物１（９６ｍｇ）のＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を加え、さらにＤＭＦ（３０ｍｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液を透析膜（スペクトラ／ポア  ＲＣ  バイオテックメンブレン  ＭＷＣＯ  ８−１０ｋＤａ、フナコシ社より購入）に入れ、メタノール：蒸留水（３：１）、メタノール：蒸留水（１：１）、蒸留水の順で三日間透析を行った。透析液を回収し陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸＴＭ  ５０Ｗｘ８  ５０−１００，２ｇ，ワコーケミカル社製）を加えて３０分間撹拌した。反応液をろ過し、凍結乾燥して化合物２（５９０ｍｇ）を得た。なお、５β−コラン酸の導入率は４．７ｍｏｌ％であった。【００６７】
（実施例３）５β-コラン酸導入ＣＳの合成
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製、５００ｍｇ）を用い実施例２の方法に準じて反応を行い、化合物３（４９０ｍｇ）を得た。なお、５β−コラン酸の導入率は１０．０ｍｏｌ％であった。動物投与用薬液については、凍結乾燥品をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製した。【００６８】
（実施例４）Ｋｉ１９００３含有ＨＡ誘導体の調製
Ｋｉ１９００３（国際公開０２／０５９０８１Ａ２に準じて合成、３５ｍｇ）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、実施例２で合成した化合物２（４０ｍｇ）のＰＢＳ（８ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を加えて溶解後、混合撹拌し、蒸留水で７時間透析（スペクトラ／ポア  ＲＣ  バイオテックメンブレン  ＭＷＣＯ  ３．５−５ｋＤａ、スペクトラム・ラボラトリーズ社製）した。透析液を回収後０．４５μｍフィルターでろ過し、凍結乾燥することにより組成物４（３５ｍｇ）を得た。Ｋｉ１９００３含有率は１４．０重量％であった。得られた組成物４をＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００６９】
（実施例５）Ｋｉ１９００３含有ＣＳ誘導体の調製
実施例３で合成した化合物３（３５ｍｇ）のＰＢＳ（８ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を用いて、実施例４の方法に準じて反応を行い、組成物５（３３ｍｇ）を得た。Ｋｉ１９００３含有率は２２．０ｗｔ％であった。得られた組成物５をＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００７０】
（実施例６）ＧＷ７６６９９４含有ＨＡ誘導体の調製
ＧＷ７６６９９４(国際公開０３／０８２２９２Ａ１に準じて合成、３０ｍｇ）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、実施例２で合成した化合物２（４０ｍｇ）のＰＢＳ（８ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を加えて分散し、得られた分散液を蒸留水で７時間透析（スペクトラ／ポア  ＲＣバイオテックメンブレン，  ＭＷＣＯ  ３．５−５ｋＤａ）した。透析液を回収後０．４５μｍフィルターでろ過し、凍結乾燥することにより組成物６（３５ｍｇ）を得た。ＧＷ７６６９９４含有率は２３．５重量％であった。得られた組成物６をＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００７１】
（実施例７）ＧＷ７６６９９４含有ＣＳ誘導体の調製（１）
実施例３で合成した化合物３（３５ｍｇ）のＰＢＳ（８ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を用いて、実施例６の方法に準じて反応を行い、組成物７（３１ｍｇ）を得た。ＧＷ７６６９９４含有率は２７．７重量％であった。得られた組成物７をＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００７２】
（実施例８）ＧＷ７６６９９４含有ＣＳ誘導体の調製（２）
ＧＷ７６６９９４（１２ｍｇ）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、実施例３で合成した化合物３（６０ｍｇ）のＰＢＳ（８ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を加えて、混合撹拌した。混合液を蒸留水で７時間透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ，  ＭＷＣＯ  ３．５ｋＤａ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を行った。透析液を回収し０．２２μｍフィルターろ過し、凍結乾燥することにより組成物８（４０ｍｇ）を得た。ＧＷ７６６９９４含有率は９．４重量％であった。得られた組成物８をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解することにより調製し、動物投与用試料とした。【００７３】
（実施例９）２−アミノエチルエステル化されたＫｉ１９００３の合成
Ｋｉ１９００３（１９０ｍｇ）を塩化メチレン（２ｍｌ）に溶解し、ジメチルアミノピリジン（和光純薬工業株式会社製、１３ｍｇ）、ＷＳＣ（和光純薬工業社製、２０６ｍｇ）、Ｎ−Ｂｏｃ−エタノールアミン（和光純薬工業社製、１７４ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下室温で３時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応終了を確認後、反応液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水、ろ過、濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製し、白色固体（８１ｍｇ）を得た。これに４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ（１０ｍｌ、国産化学工業社製）を加え、室温で１時間撹拌した。ＬＣＭＳで目的物を確認後、反応液を濃縮して化合物９（７１ｍｇ）を得た。
ESI-MS; Calcd for C27H37Cl3N4O3 [M+H]+, 573; found 573【００７４】
（実施例１０）Ｋｉ１９００３導入ＣＳの合成
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製、２７０ｍｇ）に蒸留水（４ｍｌ）を加えて３０分間撹拌し、溶解させた。化合物９（６４ｍｇ）のエタノール溶液（４ｍｌ）を加え、さらにＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬工業社製、４７ｍｇ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応液に食塩（２７０ｍｇ）を加え、エタノール（４０ｍｌ）の中に滴下した。析出した白色固体をろ取し、９０％エタノール水で３回洗浄し、真空ポンプで終夜乾燥して化合物１０（２８１ｍｇ、導入率１８．０重量％）を得た。得られた化合物１０をＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、再度０．２２μｍフィルターでろ過することにより組成物１０を得た。これを動物投与用試料とした。【００７５】
（実施例１１）Ｋｉ１９００３導入ＣＳの合成２
ＣＳ（平均分子量約１５万、生化学工業社製、１５０ｍｇ）を実施例１０に記載の方法に準じて反応を行った。反応液に食塩（１５０ｍｇ）を加え、エタノール（４０ｍｌ）の中に滴下した。析出した白色固体をろ取し、９０％エタノール水で３回洗浄し、真空ポンプで終夜乾燥して白色固体を得た。得られた固体を蒸留水に溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過し、凍結乾燥することにより化合物１１（９１ｍｇ、導入率５．３重量％）を得た。得られた化合物１１をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解することにより組成物１１を得た。これを動物投与用試料とした。【００７６】
（実施例１２）２―アミノエチルメタクリレート塩酸塩の合成
Ｎ−Ｂｏｃ−エタノールアミン（１５．５ｇ、東京化成工業社製）とジイソプロピルエチルアミン（２５．２ｍＬ、東京化成工業社製）の塩化メチレン（１８０ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下、−７８℃下でメタクリロイルクロリド（１０．５ｍＬ、東京化成工業社製）を３分間かけて滴下し１時間撹拌した。その後、室温下で１４時間撹拌した。反応液を水洗し、塩化メチレンで抽出後、硫酸ナトリウムで乾燥した。固体をろ過で除去後、濃縮して得た油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製した。得られた黄色固体をジエチルエーテルとヘキサンで洗浄してＮ−Ｂｏｃ化されたエステル体（１２．３ｇ）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ6.71 (1H, br-s), 5.75 (1H, s), 5.33-5.33 (1H, m), 4.96 )1H, br-s), 3.40-3.43 (2H, m), 3.32-3.35 (2H, m), 1.96-1.96 (3H, m), 1.44 (9H, s)
この固体に４Ｍ  ＨＣｌ／Ｄｉｏｘａｎｅ（１２０ｍＬ、国産化学工業社製）を加えて室温下、３時間撹拌した。反応液を濃縮し、析出した固体をヘキサンで洗浄した。室温下で減圧乾燥し、化合物１２（８．８３ｇ）を白色固体として得た。
1H-NMR (D2O) δ5.73 (1H, s), 5.47 (1H, s), 3.15 (2H, t, J=6.0 Hz), 2.54 (2H, t, J=6.0 Hz), 1.90 (3H, s)【００７７】
（実施例１３）メタクリル基導入ＣＳの合成
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製、４．０３ｇ）を脱イオン水（１２０ｍＬ）に溶解させ、室温下、化合物１２（０．２３ｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（０．３６ｇ）を順次加えて、１８時間撹拌した。
反応液に重曹（３．０ｇ）を加えて３０分間撹拌した後、酢酸でｐＨ７．０に中和した。３０分間撹拌した後、食塩（１２．０ｇ）を加えて３０分間撹拌した。９０％エタノール（２４０ｍＬ）を加えて３０分間撹拌した後、上澄み液を廃棄した。再度９０％エタノール（２４０ｍＬ）を加えて３０分間撹拌後、上澄み液を廃棄した。この操作をさらに２回実施後、固体を蒸留水で終夜透析（セルロースチューブ  ３６／３２，ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ、エーディア社製）した。凍結乾燥して化合物１３（４．３４ｇ）を白色固体として得た。導入率は９．５ｍｏｌ％であった。【００７８】
（実施例１４）ＳＢ３２８４３７含有ＣＳ誘導体の調製１
化合物１３（５０．０ｍｇ）とＳＢ３２８４３７（２．０ｍｇ、Journal of Biological Chemistry,2000,275(47),36626-31.に従って合成)にチオール‐ＰＥＧ‐チオール（分子量３４００、Laysan Bio社製）のｓａｌｉｎｅ溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）を６５μＬ加えた後、ｓａｌｉｎｅを１３５μＬ加えた。１分間撹拌後、４８時間静置してゲル状化合物を得た。ゲル状化合物をｓａｌｉｎｅ（３ｍＬ）の中に加えた後、２４時間静置した。先端部で２本を連結させた滅菌シリンジにゲル状化合物のみを移し、プランジャーをシリンジバレルに挿入した。シリンジ内部の空気を除いた後、プランジャーを交互に３０回押したゲル状化合物を一方のシリンジに移し、組成物１４を得た。これを動物投与用試料とした。【００７９】
（実施例１５）ＳＢ３２８４３７含有ＣＳ誘導体の調製２
実施例１４における、チオール‐ＰＥＧ‐チオールのｓａｌｉｎｅ溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）の添加量を１００μＬ、その後のｓａｌｉｎｅ添加量を１００μＬとして反応を行い、同様に合成して組成物１５を得た。これを動物投与用試料とした。【００８０】
（実施例１６）ＳＢ３２８４３７含有ＣＳ誘導体の調製３
実施例１４における、チオール‐ＰＥＧ‐チオールのｓａｌｉｎｅ溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）の添加量を２００μＬとして反応を行い、同様に合成して組成物１６を得た。これを動物投与用試料とした。【００８１】
（実施例１７）アミノエチルオレイン酸アミドの合成
オレイン酸（５００ｍｇ、東京化成工業社製）をジメチルホルムアミド（８ｍｌ、和光純薬工業社製）に溶解し、トリエチルアミン（和光純薬工業社製、０．４９ｍｌ）、ＷＳＣ（和光純薬工業社製、４０８ｍｇ）、ＨＯＢＴ（国産化学社製、４０６ｍｇ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ジエチルアミン（和光純薬工業社製、３１２ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下室温で３時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応終了を確認後、反応液に酢酸エチルを加え、有機層を飽和重層水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水、ろ過、濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、白色固体（３６０ｍｇ）を得た。これをメタノール（２ｍｌ、和光純薬工業社製）と４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥt（１０ｍｌ、国産化学工業社製）を加え、室温で一晩撹拌した。ＬＣＭＳで目的物を確認後、反応液を濃縮して化合物１７（２５０ｍｇ）を得た。
ESI-MS; Calcd for C20H40N2O [M+H]+, 325; found 325【００８２】
（実施例１８）オレイン酸導入ＣＳの合成
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製、５００ｍｇ）に蒸留水（２０ｍｌ）を加えて３０分間撹拌し、溶解させた。化合物１７（３６ｍｇ）のエタノール溶液（２０ｍｌ）を加え、さらにＤＭＴ−ＭＭ（トクヤマ社製、５５ｍｇ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応液に１規定水酸化ナトリウム水溶液（２．５ｍＬ）を加えて３０分間撹拌し、反応液の全量を透析膜（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２、ＭＷＣＯ１０Ｋ、３０ｍＬ、フナコシ社より購入）に入れ、エタノール：蒸留水（１：１）、蒸留水の順で二日間透析を行った。透析液を回収し陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸＴＭ  ５０Ｗｘ８  ５０−１００，２ｇ，ワコーケミカル社製）を加えて３０分間撹拌した。反応液をろ過し、凍結乾燥して化合物１８（２７７ｍｇ）を得た。なお、５β−オレイン酸の導入率は１０．３ｍｏｌ％であった。【００８３】
（実施例１９）ＧＷ７６６９９４含有オレイン酸導入ＣＳの合成
ＧＷ７６６９９４(１５ｍｇ）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、実施例１８で合成した化合物１８（９０ｍｇ）のＰＢＳ（９ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を加えて混合し、得られた液を蒸留水で７時間、透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２、ＭＷＣＯ３．５Ｋ、１５ｍＬ、フナコシ社より購入）した。透析液を回収後０．２２μｍフィルターでろ過し、凍結乾燥することにより組成物１９（７５ｍｇ）を得た。ＧＷ７６６９９４含有率は８．６２重量％であった。得られた組成物１９をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００８４】
（実施例２０）アミノエチルリトコール酸アミドの合成
リトコール酸（５００ｍｇ、東京化成工業社製）をジメチルホルムアミド（８ｍｌ、和光純薬工業社製）に溶解し、ＷＳＣ（和光純薬工業社製、３０５ｍｇ）、ＨＯＢＴ（国産化学社製、３０４ｍｇ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ジエチルアミン（和光純薬工業社製、２５４ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下室温で３時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応終了を確認後、反応液に酢酸エチルを加え、有機層を飽和重層水、飽和塩化アンモニウム水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水、ろ過、濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、白色固体（３１０ｍｇ）を得た。これをＴＨＦ（２ｍｌ、和光純薬工業社製）と４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥt（１０ｍｌ、国産化学工業社製）を加え、４５度で１時間撹拌した。ＬＣＭＳで目的物を確認後、反応液を濃縮して化合物２０（３０５ｍｇ）を得た。
ESI-MS; Calcd for C26H46N2O2[M+H]+, 419; found 419【００８５】
（実施例２１）リトコール酸導入ＣＳの合成
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製、４００ｍｇ）に蒸留水（１８ｍｌ）を加えて３０分間撹拌し、溶解させた。化合物２０（３６ｍｇ）のエタノール溶液（１８ｍｌ）を加え、さらにＤＭＴ−ＭＭ（トクヤマ社製、５５ｍｇ）を加えて室温で一晩撹拌した。反応液に１規定水酸化ナトリウム水溶液（２．０ｍL）を加えて３０分間撹拌し、反応液の全量を透析膜（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２、ＭＷＣＯ１０Ｋ、３０ｍＬ、フナコシ社より購入）に入れ、エタノール：蒸留水（１：１）、蒸留水の順で二日間透析を行った。透析液を回収し陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸＴＭ  ５０Ｗｘ８  ５０−１００，２ｇ，ワコーケミカル社製）を加えて３０分間撹拌した。反応液をろ過し、凍結乾燥して化合物２１（２５０ｍｇ）を得た。なお、５β−リトコール酸の導入率は１０．０ｍｏｌ％であった。【００８６】
（実施例２２）ＧＷ７６６９９４含有リトコール酸導入ＣＳの合成
ＧＷ７６６９９４(１１ｍｇ）をエタノール（２ｍｌ）に溶解し、実施例２１で合成した化合物２１（６６ｍｇ）のＰＢＳ（６ｍｌ，ｐＨ７．４）溶液を加えて混合し、得られた液を蒸留水で７時間、透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２、ＭＷＣＯ３．５Ｋ、１５ｍＬ、フナコシ社より購入）した。透析液を回収後０．２２μｍフィルターでろ過し、凍結乾燥することにより組成物２２（７５ｍｇ）を得た。ＧＷ７６６９９４含有率は１０．３重量％であった。得られた組成物２２をＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過することにより調製し、動物投与用試料とした。【００８７】
（ＧＡＧ置換基及びケモカイン受容体活性調節材の含量率の測定方法）
（Ａ）５β‐コラン酸導入率測定法
実施例１及び２における５β-コラン酸導入率は以下のとおり測定した。
重水−重メタノール（１：１）混合溶媒中で１Ｈ−ＮＭＲを測定して、下記式から算出した。
５β‐コラン酸導入率（ｍｏｌ％）＝
（５β−コラン酸の２１位メチル基由来の積分値）／（ＧＡＧのＮ−アセチル基由来の積分値）【００８８】
（Ｂ）メタクリル基導入率測定法
実施例１３におけるメタクリル基導入率は以下のとおり測定した。
重水中で１Ｈ−ＮＭＲを測定して下式から算出した。
メタクリル基導入率（ｍｏｌ％）＝
（メタクリル基由来の積分値）／（ＧＡＧのＮ−アセチル基由来の積分値）【００８９】
（Ｃ）ケモカイン受容体活性調節材の含量測定法
・実施例４及び５におけるＫｉ１９００３含有率測定法
分光光度計（島津製作所、UV SPECTROPHOTOMETER、測定波長２２０ｎｍ）を用いて検量線を作成後、測定した。薬物の含有率は下式によって算出した。
含有率（ｗｔ％）＝
（組成物内のＫｉ１９００３重量）／（組成物の重量）×１００【００９０】
・実施例６、７及び８におけるＧＷ７６６９９４含有率測定法
ＨＰＬＣを用いて以下の条件で検量線を作成後、測定した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＯＤＳ−３，４．６ｘ１５０ｍｍ，５ｕｍ（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
Ｆｌｏｗ：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔ：２２５ｎｍ
Ｅｌｕｅｎｔ：アセトニトリル：２０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液＝５：５（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）【００９１】
薬物の含有率は下式によって算出した。
含有率（ｗｔ％）＝
（組成物内のＧＷ７６６９９４重量）／（組成物の重量）×１００【００９２】
・実施例１０及び１１におけるＫｉ１９００３含有率の算出方法
秤量した化合物１０及び１１を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中３７℃で２時間加温することにより加水分解したのち、遊離したＫｉ１９００３を以下のＨＰＬＣの条件で検量線を作成後、測定した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＯＤＳ−３，４．６ｘ１５０ｍｍ，５ｕｍ（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
Ｆｌｏｗ：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔ：２２５ｎｍ
Ｅｌｕｅｎｔ：アセトニトリル：５０ｍＭギ酸水溶液＝３：７（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
含有率については下式によって算出した。
含有率（ｗｔ％）＝
（化合物から遊離したＫｉ１９００３重量）／（化合物の重量）×１００【００９３】
（２）評価方法
（試験例１）組成物１０を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物１０あるいはＫｉ１９００３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【００９４】
＜試験物質＞
Ｋｉ１９００３をＤＭＳＯに溶解して、Ｋｉ１９００３（０．６ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物１０（０．５４ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
２）Ｋｉ１９００３（０．６ｍｇ／ｍＬ）
３）ＤＭＳＯ
（組成物１０は、実施例１０で調製した動物投与用試料を用いた）【００９５】
＜方法＞
（１）レーザー誘発ＣＮＶモデル作製および試験物質投与
動物モデルにはBN/CrlCrljラット（雄性、日本チャールス・リバー株式会社）を用いた。麻酔用混合液（生理食塩液：ソムノペンチル＝９：１）の腹腔内投与（約２ｍＬ／ｂｏｄｙ）による全身麻酔下、ミドリンＰ点眼液の点眼によって両眼を散瞳させた。視神経乳頭周囲の網膜にレーザーを照射し、ＣＮＶを誘発させた。レーザー照射にはスコピゾル眼科溶液、ファンダス５．４ｍｍレーザーレンズ、レーザー光凝固装置および細隙灯照射システムを用いた。レーザー照射直後、５μＬ／ｅｙｅの試験物質を両眼の硝子体内に単回投与した。投与直後、抗菌薬（ベガモックス点眼液０．５％）を一滴点眼した。【００９６】
（２）フラットマウントの作製
モデル作製後１０日にＣＯ２により安楽死させた。眼球を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬した（室温、約６０分間）。眼杯を作製し、ＰＢＳで洗浄、メタノールで脱水を行った後、1% bovine serum albuminと0.5% Triton X-100含有ＰＢＳに眼杯を浸した（室温、約６０分間）。網膜を取り除いた後、眼杯に0.5% fluorescein griffonia simplicifolia lectin I, FITC-conjugateを６０μＬ添加して放置した（冷蔵、一晩）。これによって、ＣＮＶの血管内皮細胞をFITC-lectinで蛍光染色した。眼杯に放射状の切り込みを8箇所入れ、フラットマウントを作製した。フラットマウントを0.1% Triton X-100含有ＰＢＳで２回洗浄した後、約１２０μＬのProlong Gold Antifade Reagentを用いてスライドガラスに封入した。【００９７】
（３）ＣＮＶ画像撮影および面積測定
蛍光顕微鏡を用いて、スライドガラスに封入したフラットマウントのＣＮＶ蛍光画像を撮影した。画像解析ソフト（Image pro exp）を用いてＣＮＶ面積を測定した。【００９８】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【００９９】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１に示した。
組成物１０はＤＭＳＯおよびＫｉ１９００３に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１００】
【表１】
2016194869.tif 000006
【０１０１】
（試験例２）組成物１１を用いたＣＮＶ抑制作用の検証１
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物１１あるいはＫｉ１９００３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１０２】
＜試験物質＞
Ｋｉ１９００３をＤＭＳＯに溶解して、Ｋｉ１９００３（０．５３ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物１１（０．５３ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
２）Ｋｉ１９００３（０．５３ｍｇ／ｍＬ）
３）ＤＭＳＯ
（組成物１１は、実施例１１で調製した動物投与用試料を用いた）【０１０３】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１０４】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１０５】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図２に示した。
組成物１１はＤＭＳＯおよびＫｉ１９００３に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１０６】
【表２】
2016194869.tif 000007
【０１０７】
＜結論＞
試験例１、試験例２より、Ｋｉ１９００３導入ＣＳがＫｉ１９００３を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。ＧＡＧ誘導体を構成するＧＡＧとして、ＣＳが使用できることが示された。【０１０８】
（試験例３）組成物１１を用いたＣＮＶ抑制作用の検証２
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物１１あるいはＣＳとＫｉ１９００３の配合剤の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１０９】
＜試験物質＞
ＣＳ（１９ｍｇ、実施例１１におけるＣＳと同じもの、生化学工業社製）、Ｋｉ１９００３（１ｍｇ）をＰＢＳ（２ｍＬ）と混合し、振とうすることによりＣＳとＫｉ１９００３の配合剤１を調製した。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物１１（０．５３ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
２）配合剤１（（０．５ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
３）ＤＭＳＯ  
（組成物１１は、実施例１１で調製した動物投与用試料を用いた）【０１１０】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１１１】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１１２】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図３に示した。
組成物１１はＤＭＳＯに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１１３】
【表３】
2016194869.tif 000008
【０１１４】
＜結論＞
Ｋｉ１９００３導入ＣＳが、ＣＳとＫｉ１９００３の配合剤を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。ＧＡＧとケモカイン受容体拮抗剤を単に配合するだけでは、後眼部疾患処置剤として十分でないことが示され、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤との共有結合物を用いる有用性が確認された。【０１１５】
（試験例４）組成物１４、組成物１５及び組成物１６を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＶＮモデルを作製し、組成物１４、組成物１５、組成物１６及びＳＢ３２８４３７の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１１６】
＜試験物質＞
ＳＢ３２８４３７をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ３２８４３７（２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物１４（１．３３ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７を含む）
２）組成物１５（１．６７ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７を含む）
３）組成物１６（３．３３ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７を含む）
４）ＳＢ３２８４３７（２ｍｇ／ｍＬ）
（組成物１４、１５、１６は、それぞれ実施例１４、１５、１６で調製した動物投与用試料を用いた）【０１１７】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１１８】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１１９】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図４に示した。
組成物１４、組成物１５及び組成物１６は、ＳＢ３２８４３７に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１２０】
【表４】
2016194869.tif 000009
【０１２１】
＜結論＞
ＳＢ３２８４３７とＣＳ架橋体を含む組成物が、ＳＢ３２８４３７を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤して使用できることが示された。ＧＡＧ誘導体としてＧＡＧ架橋体を使用できることが示され、ＧＡＧとしてＣＳが使用できることが示された。また、ケモカイン受容体拮抗剤として、ＳＢ３２８４３７が使用できることが示された。【０１２２】
（試験例５）
ＳＢ２２５００２とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＳＢ２２５００２とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＳＢ２２５００２の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１２３】
＜試験物質＞
ＳＢ２２５００２（Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17(23), 8102-8112に従って合成）をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ２２５００２（０．０２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＳＢ２２５００２をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ２２５００２（０．２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た後、ＳＢ２２５００２（０．２ｍｇ／ｍＬ）溶液０．１５ｍＬとＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．５ｍＬ）とを混合し、撹拌することにより組成物３１を得た。ＳＢ２２５００２をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ２２５００２（２ｍｇ／ｍＬ）を得た後、２ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２５００２（０．０１５ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．５ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３２を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３１（０．０１８ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２５００２を含む）
２）組成物３２（０．０２ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２５００２を含む）
３）ＳＢ２２５００２（０．０２ｍｇ／ｍｌ）
４）ＤＭＳＯ【０１２４】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１２５】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１２６】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図５に示した。
組成物３１および組成物３２がＤＭＳＯおよびＳＢ２２５００２に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１２７】
【表５】
2016194869.tif 000010
【０１２８】
＜結論＞
ＳＢ２２５００２とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＳＢ２２５００２を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。ＧＡＧ誘導体としてＧＡＧ架橋体が使用できることが示され、ＧＡＧとしてＨＡが使用できることが示された。また、ケモカイン受容体拮抗剤として、ＳＢ２２５００２が使用できることが示された。【０１２９】
（試験例６）ＧＷ７６６９９４とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＧＷ７６６９９４とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＧＷ７６６９９４の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１３０】
＜試験物質＞
ＧＷ７６６９９４をＤＭＳＯに溶解して、ＧＷ７６６９９４（２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＧＷ７６６９９４をＤＭＳＯに溶解して、ＧＷ７６６９９４（５０ｍｇ／ｍＬ）を得た後、５０ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４（０．０４１７ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３３を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３３（２ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
２）ＧＷ７６６９９４（２ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ【０１３１】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１３２】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１３３】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図６に示した。
組成物３３はＤＭＳＯおよびＧＷ７６６９９４に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１３４】
【表６】
2016194869.tif 000011
【０１３５】
＜結論＞
ＧＷ７６６９９４とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＧＷ７６６９９４を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。ケモカイン受容体拮抗剤としてＧＷ７６６９９４が使用できることが示された。【０１３６】
（試験例７）Ｋｉ１９００３とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、Ｋｉ１９００３とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＫｉ１９００３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１３７】
＜試験物質＞
Ｋｉ１９００３をＤＭＳＯに溶解して、Ｋｉ１９００３（０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。Ｋｉ１９００３をＤＭＳＯに溶解して、Ｋｉ１９００３（２５ｍｇ／ｍＬ）を得た後、２５  ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３（０．０２０４ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０  ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３４を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３４（０．５ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
２）Ｋｉ１９００３（０．５ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ  【０１３８】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１３９】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１４０】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図７に示した。
組成物３４はＤＭＳＯに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１４１】
【表７】
2016194869.tif 000012
【０１４２】
＜結論＞
Ｋｉ１９００３とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、Ｋｉ１９００３を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。また、試験例１、試験例２、試験例３、試験例７より、Ｋｉ１９００３は複数のＧＡＧ誘導体（疎水基導入ＧＡＧあるいはＧＡＧ架橋体）と組合せ可能であった。このことから、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤の組合せは１対１対応とは限らないことが示された。【０１４３】
（試験例８）ＡＺＤ３７７８とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＡＺＤ３７７８（国際公開０３／００４４８７Ａ１に準じて合成）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＡＺＤ３７７８の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１４４】
＜試験物質＞
ＡＺＤ３７７８をＤＭＳＯに溶解して、ＡＺＤ３７７８（０．１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＡＺＤ３７７８をＤＭＳＯに溶解して、ＡＺＤ３７７８（５ｍｇ／ｍＬ）を得た後、５ｍｇ／ｍＬのＡＺＤ３７７８（０．０２０４ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３５を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３５（０．１ｍｇ／ｍＬのＡＺＤ３７７８を含む）
２）ＡＺＤ３７７８（０．１ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ【０１４５】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１４６】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１４７】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図８に示した。
組成物３５はＡＺＤ３７７８に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１４８】
【表８】
2016194869.tif 000013
【０１４９】
＜結論＞
ＡＺＤ３７７８とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＡＺＤ３７７８を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。また、ケモカイン受容体拮抗剤として、ＡＺＤ３７７８が使用できることが示された。【０１５０】
（試験例９）ＳＢ３２８４３７とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＳＢ３２８４３７とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＳＢ３２８４３７の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１５１】
＜試験物質＞
ＳＢ３２８４３７をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ３２８４３７（１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＳＢ３２８４３７をＤＭＳＯに溶解して、ＳＢ３２８４３７（５０ｍｇ／ｍＬ）を得た後、５０ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７（０．０２ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３６を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３６（１ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７を含む）
２）ＳＢ３２８４３７（１ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ  【０１５２】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１５３】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１５４】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図９に示した。
組成物３６はＳＢ３２８４３７に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１５５】
【表９】
2016194869.tif 000014
【０１５６】
＜結論＞
ＳＢ３２８４３７とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＳＢ３２８４３７を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。また、ケモカイン受容体拮抗剤として、ＳＢ３２８４３７が使用できることが示された。試験例５、試験例６、試験例７、試験例８、試験例９より、ＧＡＧ架橋体は複数のケモカイン受容体拮抗剤（ＧＷ７６６９９４、Ｋｉ１９００３、ＡＺＤ３７７８、ＳＢ３２８４３７、ＳＢ２２５００２）と組合せ可能であった。このことから、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤の組合せは１対１対応とは限らないことが示された。【０１５７】
（試験例１０）組成物６及び組成物７を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物６、組成物７及びＧＷ７６６９９４の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１５８】
＜試験物質＞
ＧＷ７６６９９４をＤＭＳＯに溶解して、ＧＷ７６６９９４（１．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物６（０．７１ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
２）組成物７（０．８３ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
３）ＧＷ７６６９９４（１．５ｍｇ／ｍＬ）
４）ＤＭＳＯ
（組成物６、７はそれぞれ実施例６、７で調製した動物投与用試料を用いた）【０１５９】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１６０】
＜統計解析＞
ＤＭＳＯ群と他群のＣＮＶ面積に関して、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により解析した。有意水準は両側５％とした。また、ＧＷ７６６９９４群と組成物群のＣＮＶ面積に関して、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１６１】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１０に示した。
組成物６、組成物７はＧＷ７６６９９４に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１６２】
【表１０】
2016194869.tif 000015
【０１６３】
＜結論＞
ＧＷ７６６９９４と疎水基導入ＨＡとを含む組成物、ＧＷ７６６９９４と疎水基導入ＣＳとを含む組成物が、ＧＷ７６６９９４を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。疎水基導入ＧＡＧに用いるＧＡＧとして、ＨＡおよびＣＳが使用できることが示された。【０１６４】
（試験例１１）組成物４及び組成物５を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物４、組成物５及びＫｉ１９００３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１６５】
＜試験物質＞
Ｋｉ１９００３をＤＭＳＯに溶解して、Ｋｉ１９００３（０．６ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物４（０．４２ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
２）組成物５（０．６６ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
３）Ｋｉ１９００３（０．６ｍｇ／ｍＬ）
４）ＤＭＳＯ
（組成物４、５は、それぞれ実施例４、５で調製した動物投与用試料を用いた）【０１６６】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１６７】
＜統計解析＞
ＤＭＳＯ群と他群のＣＮＶ面積に関して、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１６８】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１１に示した。組成物４、組成物５はＤＭＳＯに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１６９】
【表１１】
2016194869.tif 000016
【０１７０】
＜結論＞
Ｋｉ１９００３と疎水基導入ＨＡとを含む組成物及びＫｉ１９００３と疎水基導入ＣＳとを含む組成物が、Ｋｉ１９００３を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。疎水基導入ＧＡＧに用いるＧＡＧとして、ＨＡおよびＣＳが使用できることが示された。【０１７１】
（試験例１２）組成物８を用いたＣＮＶ抑制作用および眼内出血への影響の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物８あるいはヘパリンとＧＷ７６６９９４の配合剤の硝子体内投与による血管新生抑制作用および眼内出血への影響を検討した。【０１７２】
＜試験物質＞
ＧＷ７６６９９４をＤＭＳＯに溶解して、ＧＷ７６６９９４（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ヘパリン（１０ｍｇ、アルドリッチ社製）をＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解し、ヘパリン（１０ｍｇ／ｍL）を得たのち、１０ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４（０．１ｍＬ）と混合し、ヘパリンとＧＷ７６６９９４の配合剤２を調製した。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物８（０．９６ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
２）配合剤２（０．９１ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
３）ＰＢＳ
（組成物８は、実施例８で調製した動物投与用試料を用いた）【０１７３】
＜方法＞
（血管新生抑制作用）
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１７４】
（眼内出血への影響）
試験物質投与直後および投与後１０日に、眼内出血のスコア評価を行い、眼内出血悪化の有無より眼内出血への影響を検討した。【０１７５】
（１）試験物質投与直後の眼内出血スコア評価
スリットランプ等を用いて眼内観察を行い、下記の眼内出血スコア基準を用いて、眼内出血スコアとした。
スコア０：出血が観察範囲内に観察されない。
スコア１：出血が観察範囲内の１／４以下観察された。
スコア２：出血が観察範囲内の１／４以上１／２以下観察された。
スコア３：出血が観察範囲内の１／２以上観察された。【０１７６】
（２）投与後１０日目の眼内出血スコア評価
眼杯作製直後に、硝子体液・網膜を観察し、下記の硝子体液・網膜の出血スコア基準を用いてスコア化した。硝子体液・網膜の出血スコアの平均値を眼内出血スコアとした。
スコア０：出血が観察範囲内に観察されない。
スコア１：出血が観察範囲内の１／４以下観察された。
スコア２：出血が観察範囲内の１／４以上１／２以下観察された。
スコア３：出血が観察範囲内の１／２以上観察された。【０１７７】
（３）眼内出血悪化の有無の算出
試験物質投与直後および投与後１０日における眼内出血スコアの差より、悪化あり（差が＋の眼）の眼数、および悪化なし（差が−もしくは０）の眼数を算出した。【０１７８】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。
各群の眼内出血悪化の有無に関して、２×２Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定により解析した。有意水準は片側５％とした。【０１７９】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を表１２及び図１２に示した。組成物８はＰＢＳに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。
眼内出血への影響の結果を表１３に示した。ヘパリンとＧＷ７６６９９４との配合剤２は、ＰＢＳおよび組成物８に比べて、眼内出血の悪化数が有意に多いことが示された。【０１８０】
【表１２】
2016194869.tif 000017
【０１８１】
【表１３】
2016194869.tif 000018
【０１８２】
＜結論＞
ＧＷ７６６９９４と疎水基導入ＣＳとを含む組成物が、ヘパリンとＧＷ７６６９９４との配合剤２を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。ＧＡＧとケモカイン受容体拮抗剤を単に配合するだけでは、後眼部疾患処置剤として十分でないことが示され、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤とを含む組成物を用いる有用性が確認された。
ヘパリンとＧＷ７６６９９４の配合剤２では眼内出血が悪化したことから、硝子体内投与には適さないことが確認された。【０１８３】
（試験例１３）特許文献１に用いられている可溶化剤（ＤＭＳＯ）を用いたケモカイン受容体拮抗剤溶液と、本発明に係る組成物の硝子体内投与時の組織変性の検証
ラットの硝子体内に試験物質を単回投与し、眼内の状態を観察した。【０１８４】
＜試験物質＞
試験物質として、以下を使用した。
１）Ｋｉ１９００３（０．６ｍｇ／ｍＬ）
２）ＳＢ３２８４３７（１ｍｇ／ｍＬ）
３）ＧＷ７６６９９４（１．５ｍｇ／ｍＬ）
４）組成物５（０．６６ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
５）組成物７（０．８３ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
６）組成物１０（０．５４ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
７）組成物１１（０．５３ｍｇ／ｍＬのＫｉ１９００３を含む）
８）組成物３６（１ｍｇ／ｍＬのＳＢ３２８４３７を含む）
（組成物５、７、１０、１１、３６については、それぞれ、実施例５、７、１０、１１、試験例９で調製した動物投与用試料を用いた）
Ｋｉ１９００３は試験例１と、ＳＢ３２８４３７は試験例９と、ＧＷ７６６９９４は試験例１０と同様に得た。【０１８５】
＜方法＞
（１）試験物質投与
動物はBN/CrlCrljラット（雄性、日本チャールス・リバー株式会社）を用いた。麻酔用混合液（生理食塩液：ソムノペンチル＝９：１）の腹腔内投与（約２ｍＬ／ｂｏｄｙ）による全身麻酔下、ミドリンＰ点眼液の点眼によって両眼を散瞳させた。その後、５μＬ／ｅｙｅの試験物質を両眼の硝子体内に単回投与した。投与直後、抗菌薬（ベガモックス点眼液０．５％）を一滴点眼した。【０１８６】
（２）眼内撮影
デジタルマイクロスコープを用いて、ラットの眼内の状態を撮影した。【０１８７】
＜試験結果＞
眼内撮影の結果を図１８Ａ〜１８Ｈに示した。
可溶化剤を用いたケモカイン受容体拮抗剤溶液（Ｋｉ１９００３（図１８Ａ）、ＳＢ３２８４３７（図１８Ｂ）、ＧＷ７６６９９４（図１８Ｃ））では、図中の矢印で示したように、水晶体の組織変性が生じた。一方で、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤とを含む組成物である組成物５（図１８Ｄ）、組成物７（図１８Ｅ）、組成物１０（図１８Ｆ）、組成物１１（図１８Ｇ）及び組成物３６（図１８Ｈ）では、水晶体の組織変性は観察されなかった。【０１８８】
＜結論＞
可溶化剤を用いたケモカイン受容体拮抗剤溶液に比べて、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体拮抗剤とを含む組成物は、急激な組織変性の発生が抑制され、優れたケモカイン受容体拮抗作用を有することが示された。【０１８９】
（試験例１４）ＲＳ５０４３９３とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＲＳ５０４３９３とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＲＳ５０４３９３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１９０】
＜試験物質＞
ＲＳ５０４３９３（１０ｍｇ、ａｂｃａｍ社製）をＤＭＳＯに溶解して、ＲＳ５０４３９３（０．０１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＲＳ５０４３９３をＤＭＳＯに溶解して、ＲＳ５０４３９３（１ｍｇ／ｍＬ）を得た後、１ｍｇ／ｍＬのＲＳ５０４３９３（０．０１ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３７を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３７（０．０１ｍｇ／ｍＬのＲＳ５０４３９３を含む）
２）ＲＳ５０４３９３（０．０１ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ【０１９１】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１９２】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０１９３】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１３に示した。
組成物３７はＤＭＳＯおよびＲＳ５０４３９３に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０１９４】
【表１４】
2016194869.tif 000019
【０１９５】
＜結論＞
ＲＳ５０４３９３とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＲＳ５０４３９３を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。また、ケモカイン受容体拮抗剤として、ＲＳ５０４３９３が使用できることが示された。【０１９６】
（試験例１５）ＰＳ３７２４２４とＨＡ架橋体（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）とを含む組成物を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＰＳ３７２４２４とＧｅｌ−Ｏｎｅ（光架橋ＨＡ：生化学工業社製）とを含む組成物及びＰＳ３７２４２４の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０１９７】
＜試験物質＞
ＰＳ３７２４２４（１０ｍｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）をＤＭＳＯに溶解して、ＰＳ３７２４２４（０．１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を得た。ＰＳ３７２４２４をＤＭＳＯに溶解して、ＰＳ３７２４２４（１ｍｇ／ｍＬ）を得た後、１ｍｇ／ｍＬのＰＳ３７２４２４（０．１ｍＬ）とＧｅｌ−Ｏｎｅ（１．０ｍＬ）を混合し、撹拌することにより組成物３８を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）組成物３８（０．０９１ｍｇ／ｍＬのＰＳ３７２４２４を含む）
２）ＰＳ３７２４２４（０．１ｍｇ／ｍｌ）
３）ＤＭＳＯ【０１９８】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０１９９】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０２００】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１４に示した。
組成物３８はＤＭＳＯおよびＰＳ３７２４２４に比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０２０１】
【表１５】
2016194869.tif 000020
【０２０２】
＜結論＞
ＰＳ３７２４２４とＧｅｌ−Ｏｎｅとを含む組成物が、ＰＳ３７２４２４を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。また、ケモカイン受容体作動剤 として、ＰＳ３７２４２４が使用できることが示された。【０２０３】
（試験例１６）組成物２２（リトコール酸導入ＣＳ：実施例２２）及び組成物１９（オレイン酸導入ＣＳ：実施例１９）を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、組成物２２、組成物１９の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０２０４】
＜試験物質＞
試験物質として、以下を使用した。
１）ＰＢＳ
２）組成物２２（０．８６ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
３）組成物１９（１．０３ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
（組成物２２、１９は、それぞれ実施例２２、１９で調製した動物投与用試料を用いた）【０２０５】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０２０６】
＜統計解析＞
ＰＢＳ群と他群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０２０７】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１５に示した。組成物２２、組成物１９はＰＢＳに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示した。【０２０８】
【表１６】
2016194869.tif 000021
【０２０９】
なお、試験例６及び１０に記載のとおり、ＤＭＳＯに溶解したＧＷ７６６９９４
（２ｍｇ／ｍＬ及び１．５ｍｇ／ｍＬ）は、ＤＭＳＯに比べて、どちらの濃度でもＣＮＶ抑制作用を有していなかった。【０２１０】
＜結論＞ 
ＧＷ７６６９９４と疎水基導入ＣＳとを含む組成物が、ＧＷ７６６９９４を上回る薬効を示す後眼部疾患処置剤、特にＡＭＤ治療剤として使用できることが示された。疎水基導入ＧＡＧにおける「疎水基 」について、胆汁酸であるリトコール酸等の基本骨格であるコラン酸等の脂環式化合物に由来する基オレイン酸等の脂肪酸に由来する基が使用できることが示された。【０２１１】
（試験例１７）米国特許第８，５９２，４８２号明細書に用いられている可溶化剤（ＤＭＳＯ）を用いたケモカイン受容体活性調節剤溶液と、本発明に係る組成物の硝子体内投与時の組織変性の検証
ラットの硝子体内に試験物質を単回投与し、眼内の状態を観察した。【０２１２】
＜試験物質＞
試験物質として、以下を使用した。
１）ＲＳ５０４３９３（０．０１ｍｇ／ｍＬ）
２）ＰＳ３７２４２４（０．１ｍｇ／ｍＬ）
３）組成物３７（０．０１ｍｇ／ｍＬのＲＳ５０４３９３を含む）
４）組成物３８（０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ３７２４２４を含む）
５）組成物２２（０．８６ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
６）組成物１９（１．０３ｍｇ／ｍＬのＧＷ７６６９９４を含む）
（組成物３７、ＲＳ５０４３９３については試験例１４で、組成物３８、ＰＳ３７２４２４については試験例１５で、組成物２２については実施例２２で、組成物１９については実施例１９で、それぞれ調製した動物投与用試料を用いた）【０２１３】
＜方法＞
試験例１３の＜方法＞と同様に実施した。【０２１４】
＜試験結果＞
眼内撮影の結果を図１９Ａ〜１９Ｆに示した。
可溶化剤を用いたケモカイン受容体活性調節剤溶液（ＲＳ５０４３９３（図１９Ａ）、ＰＳ３７２４２４（図１９Ｂ））では、図中の矢印で示したように、水晶体の組織変性が生じた。一方で、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節剤とを含む組成物である組成物３７（図１９Ｃ）、組成物３８（図１９Ｄ）、組成物２２（図１９Ｅ）及び組成物１９（図１９Ｆ）では、水晶体の組織変性は観察されなかった。【０２１５】
＜結論＞
可溶化剤を用いたケモカイン受容体活性調節剤溶液に比べて、ＧＡＧ誘導体とケモカイン受容体活性調節剤とを含む組成物は、急激な組織変性の発生が抑制され、優れたケモカイン受容体活性調節作用を有することが示された。【０２１６】
（試験例１８）ＣＳを用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、ＣＳの硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０２１７】
＜試験物質＞
ＣＳ（平均分子量約１４万、生化学工業社製）をＰＢＳに溶解して、ＣＳ（２０ｍｇ／ｍＬ）を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）ＣＳ（２０ｍｇ／ｍＬ）
２）ＰＢＳ【０２１８】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞と同様に実施した。【０２１９】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０２２０】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１６に示した。
ＣＳはＰＢＳに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示さなかった。【０２２１】
【表１７】
2016194869.tif 000022
【０２２２】
ＣＳ単独では加齢黄斑変性治療薬として有意に薬効を示さなかった。【０２２３】
（試験例１９）化合物３を用いたＣＮＶ抑制作用の検証
ラットのレーザー誘発ＣＮＶモデルを作製し、化合物３の硝子体内投与による血管新生抑制作用を検討した。【０２２４】
＜試験物質＞
ＣＳ（平均分子量約４万、生化学工業社製）をＰＢＳに溶解して、ＣＳ（１０ｍｇ／ｍＬ）を得た。試験物質として、以下を使用した。
１）化合物３
２）ＣＳ（１０ｍｇ／ｍＬ）【０２２５】
＜方法＞
試験例１の＜方法＞におけるフラットマウントの作製を、モデル作製後１０日の代わりにモデル作製後４日としたこと以外は、試験例１と同様に実施した。【０２２６】
＜統計解析＞
各群のＣＮＶ面積に関して、対応のない２群の検定（ｔ検定）により解析した。有意水準は両側５％とした。【０２２７】
＜試験結果＞
ＣＮＶ面積測定の結果を下表及び図１７に示した。
化合物３はＣＳに比べて有意なＣＮＶ抑制作用を示さなかった。【０２２８】
【表１８】
2016194869.tif 000023
【０２２９】
＜結論＞
コラン酸導入ＣＳのみでは、ＣＳのみと同様に加齢黄斑変性治療薬として有意に薬効を示さなかった。【０２３０】
日本国特許出願２０１５−１１０７８４号（出願日：２０１５年５月２９日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
2016194869.tif 000024
【図２】
2016194869.tif 000025
【図３】
2016194869.tif 000026
【図４】
2016194869.tif 000027
【図５】
2016194869.tif 000028
【図６】
2016194869.tif 000029
【図７】
2016194869.tif 000030
【図８】
2016194869.tif 000031
【図９】
2016194869.tif 000032
【図１０】
2016194869.tif 000033
【図１１】
2016194869.tif 000034
【図１２】
2016194869.tif 000035
【図１３】
2016194869.tif 000036
【図１４】
2016194869.tif 000037
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【国際調査報告】
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