(57)【要約】  本発明は、脂肪組織等の各種形態の細胞含有試料において間葉系幹細胞の含有量を直接的に評価するための手段を提供することを課題とする。  本発明は、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価する方法であって、前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれるＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出する核酸検出工程を有する方法に関する。
2017043637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価する方法であって、
前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出する核酸検出工程を有する方法。
【請求項２】
前記ＣｐＧ部位が、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ａ（％）と、他の細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ｂ（％）との比率（Ｂ／Ａ）が、０．７５以下となるＣｐＧ部位である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣｐＧ部位が、
配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、及び
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位
のいずれか１つ以上である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸検出工程が、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること、又は、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記核酸検出工程が、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を、制限酵素処理及び／又は核酸増幅処理を行い検出する核酸検出工程である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素処理に用いる制限酵素が、メチル化されている塩基配列のみ特異的に切断する酵素である、又は、認識配列がＣＣＧＧであり、且つメチル化されている塩基配列を切断できない酵素である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞を含む試料が、細胞培養液、脂肪組織、骨髄液、末梢血、絨毛膜、胎盤、又は羊膜、或いはこれらのうち少なくとも１つから取得された細胞含有試料である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記他の細胞が、白血球、赤血球、単核球、血管内皮細胞、周皮細胞、成熟脂肪細胞、及び上皮細胞のいずれか１つ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞を含む試料から間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法であって、
前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出し、その検出結果に基づいて前記製剤の製造に用いる前記試料を選択する試料選択工程と、
選択した前記試料から前記製剤を製造する製剤化工程と、を有する方法。
【請求項１０】
前記ＣｐＧ部位が、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ａ（％）と、他の細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ｂ（％）との比率（Ｂ／Ａ）が、０．７５以下となるＣｐＧ部位である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣｐＧ部位が、
配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、及び
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位
のいずれか１つ以上である請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料選択工程が、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること、又は、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること
を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記試料選択工程が、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を、制限酵素処理及び／又は核酸増幅処理を行い検出し、その検出結果に基づいて前記製剤の製造に用いる前記試料を選択する試料選択工程である請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記制限酵素処理に用いる制限酵素が、メチル化されている塩基配列のみ特異的に切断する酵素である、又は、認識配列がＣＣＧＧであり、且つメチル化されている塩基配列を切断しない酵素である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における、第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位、及び、第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、並びに、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列と相補的な塩基配列における、配列番号１の塩基配列における第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、及び、配列番号１の塩基配列における第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位のいずれか１つ以上を含む領域を増幅することができるプライマーセットを含む、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価するために用いるキット。
【請求項１６】
さらに、重亜硫酸塩及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
さらに、制限酵素を含む請求項１５又は１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価する方法、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価するために用いるキット及び細胞を含む試料から間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：  ＭＳＣ）は哺乳動物の脂肪組織、骨髄等に存在する体性幹細胞である。近年、間葉系幹細胞のなかには、同組織系統の細胞だけでなく、別系統の細胞にまで分化する能力を有する幹細胞が存在することが明らかになってきた（非特許文献１）。例えば、脂肪組織から採取した間葉系幹細胞は成熟脂肪細胞だけでなく、骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管内皮細胞等へと分化可能である（非特許文献２、３）。間葉系幹細胞は骨、血管、心筋の再構築等の再生医療への応用が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】田畑泰彦、ここまで進んだ再生医療の実際（２００３年）
【非特許文献２】Ｐａｔｒｉｃｉａ Ａ．Ｚｕｋ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．７（２）：２１１−２２８（２００１）
【非特許文献３】Ｙｉｎｇ Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．：Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３３２：３７０−３７９（２００５）
【非特許文献４】Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ． ２０１３， Ｏｃｔｏｂｅｒ；１３２（４）： ８４５−８５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
再生医療等に用いる、生体試料等の細胞含有試料中での間葉系幹細胞の量は、前記試料の使用方法や使用量を決定するために重要な情報である。例えば、脂肪吸引術等により取得された脂肪組織を移植する豊乳術、乳房再建等において、移植された脂肪組織の生着率は、脂肪組織での間葉系幹細胞の含有量と比例関係があるため（非特許文献４）、脂肪組織中での間葉系幹細胞の含有量を知ることができれば、それに基づいて、脂肪組織の適切な移植量や移植の回数を正確に決定することができる。また、脂肪組織から、脂肪細胞以外の脂肪組織由来細胞画分である間質血管細胞画分（ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：  ＳＶＦ）を分離し、得られたＳＶＦを豊乳術や虚血性疾患等の細胞治療に用いる場合や、ＳＶＦを培養して高純度の間葉系幹細胞を作製し、得られた間葉系幹細胞を同様に豊乳術や細胞治療に用いる場合において、出発原料となる脂肪組織中での間葉系幹細胞の含有量を予め知ることができれば、該脂肪組織から取得できるＳＶＦの量や、高純度の間葉系幹細胞の量を正確に予測することができる。また、前記脂肪組織からＳＶＦや高純度の間葉系幹細胞を得る際の条件（例えば培養条件等）を容易に決定することができる。【０００５】
このように、使用しようとする試料中での間葉系幹細胞の量を把握することができれば、間葉系幹細胞の応用技術の発展に寄与するところが大きい。間葉系幹細胞を定量する方法としては、従来、間葉系幹細胞が分散した分散液を調製し、フローサイトメーターを用いて間葉系幹細胞の細胞数を測定する方法（フローサイトメトリー法）が知られている。しかし、フローサイトメトリー法は、脂肪組織等の試料中での間葉系幹細胞の量を直接的に測定することはできず試料から細胞を単離し分散液を調製する必要があること、低感度であることなどの課題があり、改善の余地がある。【０００６】
そこで本発明は、脂肪組織等の各種形態の細胞含有試料において間葉系幹細胞の含有量を直接的に評価するための手段及びそれに関連する技術を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は上記課題解決手段として以下の発明を提供する。
（１）
細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価する方法であって、
前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出する核酸検出工程を有する方法。
（２）
前記ＣｐＧ部位が、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ａ（％）と、他の細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ｂ（％）との比率（Ｂ／Ａ）が、０．７５以下となるＣｐＧ部位である（１）に記載の方法。
（３）
前記ＣｐＧ部位が、
配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、及び
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位
のいずれか１つ以上である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）
前記核酸検出工程が、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること、又は、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること
を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
前記核酸検出工程が、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を、制限酵素処理及び／又は核酸増幅処理を行い検出する核酸検出工程である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
前記制限酵素処理に用いる制限酵素が、メチル化されている塩基配列のみ特異的に切断する酵素である、又は、認識配列がＣＣＧＧであり、且つメチル化されている塩基配列を切断できない酵素である（５）に記載の方法。
（７）
前記細胞を含む試料が、細胞培養液、脂肪組織、骨髄液、末梢血、絨毛膜、胎盤、又は羊膜、或いはこれらのうち少なくとも１つから取得された細胞含有試料である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
前記他の細胞が、白血球、赤血球、単核球、血管内皮細胞、周皮細胞、成熟脂肪細胞、及び上皮細胞のいずれか１つ以上である（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
細胞を含む試料から間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法であって、
前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出し、その検出結果に基づいて前記製剤の製造に用いる前記試料を選択する試料選択工程と、
選択した前記試料から前記製剤を製造する製剤化工程と、を有する方法。
（１０）
前記ＣｐＧ部位が、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ａ（％）と、他の細胞由来のＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中でメチル化されている割合Ｂ（％）との比率（Ｂ／Ａ）が、０．７５以下となるＣｐＧ部位である（９）に記載の方法。
（１１）
前記ＣｐＧ部位が、
配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、
配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、及び
配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列における、配列番号１の第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位
のいずれか１つ以上である（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）
前記試料選択工程が、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること、又は、
前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出すること
を含む、（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）
前記試料選択工程が、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を、制限酵素処理及び／又は核酸増幅処理を行い検出し、その検出結果に基づいて前記製剤の製造に用いる前記試料を選択する試料選択工程である（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）
前記制限酵素処理に用いる制限酵素が、メチル化されている塩基配列のみ特異的に切断する酵素である、又は、認識配列がＣＣＧＧであり、且つメチル化されている塩基配列を切断しない酵素である（１３）に記載の方法。
（１５）
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における、第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位、及び、第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、並びに、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列と相補的な塩基配列における、配列番号１の塩基配列における第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、及び、配列番号１の塩基配列における第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位のいずれか１つ以上を含む領域を増幅することができるプライマーセットを含む、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価するために用いるキット。
（１６）
さらに、重亜硫酸塩及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む（１５）に記載のキット。
（１７）
さらに、制限酵素を含む（１５）又は（１６）に記載のキット。
（１８）
疾患又は障害の治療の必要がある被験体に、間葉系幹細胞含有製剤を用いて治療する方法であって、
（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法により得られる間葉系幹細胞含有製剤を、疾患又は障害を有する被験体に投与する工程、を含む方法
（１９）
疾患又は障害の治療の必要がある被験体に、間葉系幹細胞を用いて治療する方法であって、
（１）〜（８）に記載の方法により間葉系幹細胞を含むと評価された細胞を含有する試料に由来する間葉系幹細胞を、疾患又は障害を有する被験体に投与する工程、を含む方法。【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−１７７３４５号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、脂肪組織等の各種形態の細胞含有試料において間葉系幹細胞の含有量を直接的に評価するための手段が提供される。また、本発明の間葉系幹細胞の含有量を直接的に評価する手段によると、間葉系幹細胞の含有量を予め把握することができるため、間葉系幹細胞の適正な投与量、投与回数を正確に決定することができ、投与の手間、費用、被験体への負担等を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ヒトの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）のゲノムＤＮＡに含まれるＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における、メチル化されたシトシン（Ｃ）を含むＣｐＧ配列を下線で示し、制限酵素ＨａｐＩＩ及びＭｓｐＩの認識配列であるＣＣＧＧを太字で示し、配列番号２〜９の塩基配列からなる各プライマーに対応する位置を示す。１つのプライマーセットに含まれる一対のフォワードプライマーとリバースプライマーは同じ線種で表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜材料＞
本発明において「細胞」、「細胞を含有する試料」、「間葉系幹細胞」、「ゲノムＤＮＡ」の各用語は典型的にはヒトに由来するものであるが、他の動物に由来するものであってもよく、他の動物としてはイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥が挙げられる。本発明で用いる細胞を含有する試料が前記動物に由来する試料である場合、前記動物から分離された形態の試料を本発明の方法に使用することができる。
【００１２】
「細胞を含有する試料」は、細胞を含有しており且つ間葉系幹細胞を含有する可能性のある試料であれば特に限定されないが、細胞培養液、脂肪組織、骨髄液、末梢血、絨毛膜、胎盤、羊膜又はこれらのうち少なくとも１つから取得された細胞含有試料（例えば細胞含有画分）、或いは、これらのうち２種以上を混合して調製された細胞含有試料（例えば、脂肪組織と間葉系幹細胞とを混合して調製された試料）が例示でき、特に脂肪組織又は脂肪組織から取得された細胞含有画分が好ましい。脂肪組織から取得された細胞含有画分としては、脂肪細胞以外の脂肪組織由来細胞画分である間質血管細胞画分（ＳＶＦ）が例示できる。ＳＶＦは残留する脂肪細胞を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明において「他の細胞」とは、評価対象試料に含まれる可能性のある、間葉系幹細胞以外の細胞を指す。また、評価対象試料に微少量含まれる可能性のある、間葉系幹細胞以外の細胞、例えば細胞の個数基準で、試料中の細胞総数の０．５％未満、典型的には０．１％未満の含有量の細胞は「他の細胞」として考慮しなくてもよい。「他の細胞」の種類は、試料に応じて異なるが、例えば、血液由来細胞（具体的には白血球、赤血球、単核球等）、血管内皮細胞、周皮細胞、成熟脂肪細胞、及び上皮細胞のうち１つ以上が例示できる。
【００１４】
＜間葉系幹細胞の含有量を評価する方法＞
本発明では、核酸検出工程において、細胞含有試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞におけるよりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出し、検出された前記塩基配列を指標として、間葉系幹細胞の含有量を評価する。本発明の、間葉系幹細胞の含有量を評価する方法は、前記核酸検出工程に加えて、前記核酸検出工程における、細胞含有試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出し、その検出結果を指標として、前記試料中の間葉系幹細胞の含有量を評価する評価工程を含む方法であると言える。
【００１５】
ここで間葉系幹細胞の「含有量を評価する」とは、核酸検出工程の検出結果を、試料中の間葉系幹細胞の含有量（細胞数、重量等の量の絶対量であってもよいし相対量（割合）であってもよい）を反映する指標として利用すること全般を指し、特定の形態には限定されない。例えば、前記検出結果自体を、間葉系幹細胞の含有量を反映した指標として利用する（この場合、間葉系幹細胞の含有量自体は求める必要がない）ことや、核酸検出工程の検出結果と間葉系幹細胞の含有量との相関関係に基づいて、核酸検出工程の検出結果から間葉系幹細胞の含有量を求めること等が、間葉系幹細胞の「含有量を評価する」ことに該当する。
【００１６】
ヒト由来のゲノムＤＮＡにおけるＣＤ３１プロモーターの塩基配列は配列番号１に示す塩基配列を含む。ヒト由来のゲノムＤＮＡにおけるＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列である。
【００１７】
細胞含有試料からのゲノムＤＮＡの取得方法は特に限定されない。例えば細胞含有試料からゲノムＤＮＡを抽出して取得することができ、抽出方法としては特に限定されず市販のＤＮＡ抽出キットを用い該キットの取扱説明書に従って抽出することができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては例えばＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）が例示できる。
【００１８】
核酸検出工程では、ゲノムＤＮＡにおいて、他の細胞におけるよりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中のＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出する。本発明においてある塩基配列の検出とは、当該塩基配列を含む、より好ましくは当該塩基配列からなる、核酸（通常はＤＮＡ）の検出を指す。
【００１９】
ＣｐＧ部位とは核酸分子において、シトシン（Ｃ）及びその３’側に連結したグアニン（Ｇ）とからなる二塩基の構造である。「ｐ」はシトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を意味する。
【００２０】
ＣｐＧ部位のメチル化とは、ＣｐＧ部位のうちシトシンがメチル化されることを指す。ゲノムＤＮＡでのＣｐＧ部位のメチル化は細胞の分化等に関与すると考えられている。本発明は、ゲノムＤＮＡのＣＤ３１プロモーター塩基配列に含まれる特定のＣｐＧ部位が、間葉系幹細胞において他の細胞よりもメチル化されている割合が高いことを利用して、特定のＣｐＧ部位のメチル化を間葉系幹細胞の指標とする発明である。
【００２１】
前記ＣｐＧ部位としては、ゲノムＤＮＡのＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列に含まれるＣｐＧ部位のうち、間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が、試料中に含まれ得る他の細胞においてメチル化されている割合よりも高いものであれば特に限定されないが、特に好ましくは、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーター中でメチル化されている割合をＡ（％）とし、他の細胞由来のＣＤ３１プロモーター中でメチル化されている割合をＢ（％）としたときに、その比率（Ｂ／Ａ）が、０．７５以下となるＣｐＧ部位である。
【００２２】
試料として脂肪組織を用いる場合には、脂肪組織から取得したゲノムＤＮＡに含まれるＣＤ３１プロモーター中のＣｐＧ部位のうち、間葉系幹細胞由来のＣＤ３１プロモーターにおいてメチル化されている割合をＡ％、血管内皮細胞由来のＣＤ３１プロモーターにおいてメチル化されている割合をＢ１％、周皮細胞由来のＣＤ３１プロモーターにおいてメチル化されている割合をＢ２％、血液由来細胞由来のＣＤ３１プロモーターおいてメチル化されている割合をＢ３％、成熟脂肪細胞由来のＣＤ３１プロモーターおいてメチル化されている割合をＢ４％としたとき、Ｂ１／Ａは０．７５以下、好ましくは０．２０以下、Ｂ２／Ａは０．７５以下、好ましくは０．３０以下、Ｂ３／Ａは０．３４以下、好ましくは０．１０以下、Ｂ４／Ａは０．７５以下、好ましくは０．４５以下であるＣｐＧ部位を前記ＣｐＧ部位として採用する。
【００２３】
試料として間質血管細胞画分（ＳＶＦ）を用いる場合には、Ｂ１／Ａは０．７５以下、好ましくは０．２０以下、Ｂ２／Ａは０．７５以下、好ましくは０．３０以下、Ｂ３／Ａは０．３４以下、好ましくは０．１０以下であるＣｐＧ部位を前記ＣｐＧ部位として採用することが好ましい。
【００２４】
前記ＣｐＧ部位としては、ゲノムＤＮＡのＣＤ３１プロモーター塩基配列（配列番号１）中では具体的に次のＣｐＧ部位：第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位（これを「Ｃ１０９−Ｇ１１０」と表記し、以下同様に表記する）、Ｃ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１、Ｃ２１８−Ｇ２１９、Ｃ７９−Ｇ８０、Ｃ８５−Ｇ８６、Ｃ１９１−Ｇ１９２、Ｃ２１５−Ｇ２１６、Ｃ２５７−Ｇ２５８、Ｃ２６９−Ｇ２７０、Ｃ１−Ｇ２、Ｃ２４−Ｇ２５、Ｃ８３−Ｇ８４、Ｃ８９−Ｇ９０、Ｃ３００−Ｇ３０１、Ｃ３１２−Ｇ３１３、Ｃ３６０−Ｇ３６１及びＣ３８１−Ｇ３８２からなる群から選択される１種以上が挙げられ、好ましくは、Ｃ１０９−Ｇ１１０、Ｃ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１、Ｃ２１８−Ｇ２１９、Ｃ７９−Ｇ８０、Ｃ８５−Ｇ８６、Ｃ１９１−Ｇ１９２、Ｃ２１５−Ｇ２１６、Ｃ２５７−Ｇ２５８及びＣ２６９−Ｇ２７０からなる群から選択される１種以上であり、より好ましくはＣ１０９−Ｇ１１０、Ｃ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１及びＣ２１８−Ｇ２１９からなる群から選択される１種以上であり、より好ましくはＣ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１及びＣ２１８−Ｇ２１９からなる群から選択される１種以上であり、最も好ましくはＣ１５７−Ｇ１５８である。
【００２５】
同様に、ゲノムＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列におけるＣｐＧ部位としては、配列番号１に示す塩基配列の前記各ＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位が好ましい。
【００２６】
本発明の核酸検出工程では、試料から取得したゲノムＤＮＡ（以下「試料ＤＮＡ」という）に含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中の塩基配列のうち前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を含む（好ましくは、前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列からなる）ＤＮＡを検出する。より具体的には、本発明の核酸検出工程では、試料ＤＮＡに含まれる、前記ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含み且つ前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量又は前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出する。
【００２７】
ここであるＤＮＡの量を検出するとは、試料ＤＮＡに含まれる目的ＤＮＡの量を測定する又は前記量を算出することには限定されず、試料ＤＮＡ中での目的ＤＮＡの量を反映するデータを取得すること全般を包含する。このようなデータとしては、例えば、試料ＤＮＡを鋳型として目的ＤＮＡを増幅する核酸増幅反応を行う場合であれば、閾値とする増幅産物量に達するまでの増幅反応サイクル数（Ｃｔ値）や、増幅産物をゲル電気泳動して得られるバンドのパターンや濃さが挙げられる。また、核酸増幅反応を行わずに、制限酵素処理した試料ＤＮＡをゲル電気泳動して得られるバンドのパターンや濃さに基づき目的ＤＮＡの量を検出してもよい。このようなデータを取得することで試料の評価として十分な場合は、試料ＤＮＡ中での目的ＤＮＡの量を算出する必要はない。
【００２８】
試料ＤＮＡのうち、前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡ、又は、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出する手段としては例えば以下の手段が挙げられる。
【００２９】
＜選択的検出方法１＞
選択的検出方法１としては、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない場合に前記ＣｐＧ部位又はその近傍でＤＮＡ分子を切断する酵素を用いて試料ＤＮＡを処理し、次いで、該処理後の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されているＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出する方法が挙げられる。具体的には、該処理後の試料ＤＮＡを鋳型とし、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列のうち前記酵素で切断される部位を含む塩基配列を増幅可能なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、該反応で増幅された核酸分子を定量する方法が挙げられる。この方法により、試料ＤＮＡのうち、前記ＣｐＧ部位がメチル化されているＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出することができる。なお、前記酵素による処理後の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されているＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出する方法は、核酸増幅反応を用いる方法には限定されず、例えば、酵素処理した試料ＤＮＡをゲル電気泳動して得られるバンドのパターンや濃さに基づいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されているＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出してもよい。
【００３０】
更に、対照試験として、前記酵素により試料ＤＮＡを処理していない未処理の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出する。具体的には、前記酵素により試料ＤＮＡを処理していない未処理の試料ＤＮＡを鋳型とし同様の条件で核酸増幅反応を行い、該反応で増幅された核酸分子を定量して、メチル化の有無に関係なく試料ＤＮＡに含まれる前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出することができる。なお未処理の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出する方法は、核酸増幅反応を用いる方法には限定されず、例えば、未処理の試料ＤＮＡをゲル電気泳動して得られるバンドのパターンや濃さに基づいて、前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出してもよい。対照試験で求められた前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量と、前段落の試験で求められたメチル化された前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの量との差に基づいて、メチル化されていない前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの量を選択的に検出することが可能である。
【００３１】
メチル化されていない前記ＣｐＧ部位を含む塩基配列を選択的に切断する酵素としては、認識配列がＣＣＧＧであり、且つ、該ＣＣＧＧを、該ＣＣＧＧに含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない場合に切断することができるがメチル化されている場合には切断することができない酵素が挙げられ、より具体的には、ＨａｐＩＩ及びＨｐａＩＩが挙げられる。ＨａｐＩＩはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓからクローニングされたＨａｐＩＩ遺伝子を有する大腸菌株から精製され、タカラバイオ株式会社等から購入できる。ＨａｐＩＩの詳細はSugisaki H. and Takanami M., Nature New Biol. 246, 138-140, 1973.を参照されたい。ＨｐａＩＩはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからクローニングされたＨｐａＩＩ遺伝子を有する大腸菌株から精製され、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社等から購入できる。ＨｐａＩＩの詳細はCard et al., Nucleic Acids Res. 25, 1377-1383, 1990を参照されたい。
【００３２】
選択的検出方法１は、試料ＤＮＡにおける、Ｃ１０９−Ｇ１１０、Ｃ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１及びＣ２１８−Ｇ２１９から選択される１種以上のＣｐＧ部位、又は、ＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列中での、ＣＤ３１プロモーターのＣ１０９−Ｇ１１０、Ｃ１５７−Ｇ１５８、Ｃ２００−Ｇ２０１及びＣ２１８−Ｇ２１９から選択される１種以上のＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位がメチル化された又はメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出する場合に特に適する。これらのＣｐＧ部位はＣＣＧＧ配列に含まれたものである。
【００３３】
＜選択的検出方法２＞
選択的検出方法２としては、前記ＣｐＧ部位がメチル化されている場合に前記ＣｐＧ部位又はその近傍でＤＮＡ分子を切断する酵素を用いて試料ＤＮＡを処理し、次いで、該処理後の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていないＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出する方法が挙げられる。具体的には、該処理後の試料ＤＮＡを鋳型とし、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列のうち前記酵素で切断される部位を含む塩基配列を増幅可能なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、該反応で増幅された核酸分子を定量する方法が挙げられる。この方法により、試料ＤＮＡのうち、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていないＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出することができる。なお、前記酵素による処理後の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていないＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出する方法は、核酸増幅反応を用いる方法には限定されず、例えば、酵素処理した試料ＤＮＡをゲル電気泳動して得られるバンドのパターンや濃さに基づいて、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていないＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列を含むＤＮＡの量を検出してもよい。
【００３４】
更に、対照試験として、前記酵素により試料ＤＮＡを処理していない未処理の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出する。具体的には、前記酵素により試料ＤＮＡを処理していない未処理の試料ＤＮＡを鋳型とし同様の条件で核酸増幅反応を行い、該反応で増幅された核酸分子を定量して、メチル化の有無に関係なく試料ＤＮＡに含まれる前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出することができる。なお未処理の試料ＤＮＡにおいて、前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量を検出する方法は、核酸増幅反応を用いる方法には限定されないことは上記の選択的検出方法１の対照試験と同じである。対照試験で求められた前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの全量と、前段落の試験で求められたメチル化されていない前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの量との差に基づいて、メチル化された前記ＣｐＧ部位を含むＤＮＡの量を選択的に検出することが可能である。
【００３５】
メチル化されている前記ＣｐＧ部位を含む塩基配列のみを特異的に切断する市販の酵素としてはＭｃｒＢＣが挙げられる。ＭｃｒＢＣはＭｃｒＢとＭｃｒＣの複合体であり、両者をコードする遺伝子ＭｃｒＢとＭｃｒＣを有する大腸菌株から精製され、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社等から購入できる。ＭｃｒＢＣの詳細はEllen et al., J. Mol. Biol. 225, 327-348, 1992を参照されたい。
【００３６】
＜選択的検出方法３＞
選択的検出方法３としては、重亜硫酸塩を用いて試料ＤＮＡを処理して、試料ＤＮＡ中のメチル化されていない前記ＣｐＧ部位のシトシンをウラシルに変換し、その後に、重亜硫酸塩による処理がされた試料ＤＮＡにおける、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列のうち前記ＣｐＧ部位を含む塩基配列を、シークエンス解析や制限酵素処理を用いて分析することで、試料ＤＮＡのうち、前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡ、又は、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出することができる。具体的には、重亜硫酸塩による処理がされた試料ＤＮＡを鋳型とし、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列のうち前記ＣｐＧ部位を含む塩基配列を増幅可能なプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、該反応で増幅された核酸分子を分析する方法が挙げられる。前記反応で増幅された核酸分子において、前記ＣｐＧ部位のＣに対応する塩基がセンス鎖ではシトシンでありアンチセンス鎖ではグアニンであれば、この核酸分子は、前記ＣｐＧ部位がメチル化されたＤＮＡの増幅産物である。一方、前記反応で増幅された核酸分子において、前記ＣｐＧ部位のＣに対応する塩基がセンス鎖ではチミンでありアンチセンス鎖ではアデニンであれば、この核酸分子は前記ＣｐＧ部位がメチル化されていないＤＮＡの増幅産物である。従って、選択的検出方法３の前記反応で増幅された核酸分子を、シークエンス解析や制限酵素処理を用いて分析することで、試料ＤＮＡのうち、前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡ、又は、前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出することができる。
【００３７】
以下、本発明の説明を続ける。
【００３８】
本発明の核酸検出工程において用いることができる、試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列のうち前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を増幅可能なプライマーセットとしては以下のプライマーセットが例示できる。各プライマーセットにおけるポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡであることができる。
【００３９】
例えば試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの塩基配列のうち、配列番号１の第１〜１５６番の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしては以下のプライマーセット（Ｉ）が好ましい。
【００４０】
また、試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列のうち、配列番号１の第１〜１５６番の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列の相補塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしても、以下のプライマーセット（Ｉ）が好ましい。ただしこの場合は、プライマーセット（Ｉ）での（Ｆ１１）〜（Ｆ１４）がリバースプライマーとして機能し、（Ｒ１１）〜（Ｒ１４）がフォワードプライマーとして機能する。
【００４１】
プライマーセット（Ｉ）は、
（Ｆ１１）配列番号１で示される塩基配列のうち第１番から第１０８番の領域、好ましくは第５５番から第８２番の領域に含まれる、塩基数１０以上、好ましくは塩基数１３〜２３の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ１２）（Ｆ１１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｆ１３）（Ｆ１１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｆ１４）（Ｆ１１）、（Ｆ１２）又は（Ｆ１３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１１）配列番号１で示される塩基配列のうち第１０９番から第１５６番の領域、好ましくは第１２１番から第１４９番の領域の相補塩基配列に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１３〜２３の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｒ１２）（Ｒ１１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｒ１３）（Ｒ１１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｒ１４）（Ｒ１１）、（Ｒ１２）又は（Ｒ１３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むリバースプライマーとの組合せである。
【００４２】
例えば試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの塩基配列のうち、配列番号１の第１０９〜１９９番、好ましくは第１１１〜１９９番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしては以下のプライマーセット（ＩＩ）が好ましい。
【００４３】
また、試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列のうち、配列番号１の第１０９〜１９９番、好ましくは第１１１〜１９９番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列の相補塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしても、以下のプライマーセット（ＩＩ）が好ましい。ただしこの場合は、プライマーセット（ＩＩ）での（Ｆ２１）〜（Ｆ２４）がリバースプライマーとして機能し、（Ｒ２１）〜（Ｒ２４）がフォワードプライマーとして機能する。
【００４４】
プライマーセット（ＩＩ）は、
（Ｆ２１）配列番号１で示される塩基配列のうち第１０９番から第１５６番の領域、好ましくは第１１８番から第１４５番の領域に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１３〜２３の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ２２）（Ｆ２１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｆ２３）（Ｆ２１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｆ２４）（Ｆ２１）、（Ｆ２２）又は（Ｆ２３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２１）配列番号１で示される塩基配列のうち第１５７番から第１９９番の領域、好ましくは第１７３番から第１９９番の領域の相補塩基配列に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１３〜２３の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｒ２２）（Ｒ２１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｒ２３）（Ｒ２１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｒ２４）（Ｒ２１）、（Ｒ２２）又は（Ｒ２３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むリバースプライマーと
の組合せである。
【００４５】
例えば試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの塩基配列のうち、配列番号１の第１５７〜２１７番、好ましくは第１５９〜２１７番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしては以下のプライマーセット（ＩＩＩ）が好ましい。
【００４６】
また、試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列のうち、配列番号１の第１５７〜２１７番、好ましくは第１５９〜２１７番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列の相補塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしても、以下のプライマーセット（ＩＩＩ）が好ましい。ただしこの場合は、プライマーセット（ＩＩＩ）での（Ｆ３１）〜（Ｆ３４）がリバースプライマーとして機能し、（Ｒ３１）〜（Ｒ３４）がフォワードプライマーとして機能する。
【００４７】
プライマーセット（ＩＩＩ）は、
（Ｆ３１）配列番号１で示される塩基配列のうち第１５７番から第１９９番の領域、好ましくは第１６０番から第１８６番の領域に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１２〜２２の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ３２）（Ｆ３１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｆ３３）（Ｆ３１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｆ３４）（Ｆ３１）、（Ｆ３２）又は（Ｆ３３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３１）配列番号１で示される塩基配列のうち第２００番から第２１７番の領域、好ましくは第２０３番から第２１７番の領域の相補塩基配列に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１６以下の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｒ３２）（Ｒ３１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｒ３３）（Ｒ３１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｒ３４）（Ｒ３１）、（Ｒ３２）又は（Ｒ３３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むリバースプライマーと
の組み合わせである。
【００４８】
例えば試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの塩基配列のうち、配列番号１の第２００〜３８６番、好ましくは第２０２〜３８６番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしては以下のプライマーセット（ＩＶ）が好ましい。
【００４９】
また、試料ＤＮＡのＣＤ３１プロモーターの相補鎖の塩基配列のうち、配列番号１の第２００〜３８６番、好ましくは第２０２〜３８６番、の範囲内に存在するＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列の相補塩基配列を増幅するためのプライマーセットとしても、以下のプライマーセット（ＩＶ）が好ましい。ただしこの場合は、プライマーセット（ＩＶ）での（Ｆ４１）〜（Ｆ４４）がリバースプライマーとして機能し、（Ｒ４１）〜（Ｒ４４）がフォワードプライマーとして機能する。
【００５０】
プライマーセット（ＩＶ）は、
（Ｆ４１）配列番号１で示される塩基配列のうち第２００番から第２１７番の領域、好ましくは第２０３番から第２１７番の領域に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１６以下の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｆ４２）（Ｆ４１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｆ４３）（Ｆ４１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｆ４４）（Ｆ４１）、（Ｆ４２）又は（Ｆ４３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４１）配列番号１で示される塩基配列のうち第２１８番から第３８６番の領域、好ましくは第２６０番から第２８７番の領域の相補塩基配列に含まれる塩基数１０以上、好ましくは塩基数１３〜２３の連続した部分塩基配列からなるポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（Ｒ４２）（Ｒ４１）のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（Ｒ４３）（Ｒ４１）のポリヌクレオチドの塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び
（Ｒ４４）（Ｒ４１）、（Ｒ４２）又は（Ｒ４３）のポリヌクレオチドの塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加した塩基配列からなるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むリバースプライマーと
の組み合わせである。
【００５１】
前記（Ｆ１２）、（Ｒ１２）、（Ｆ２２）、（Ｒ２２）、（Ｆ３２）、（Ｒ３２）、（Ｆ４２）及び（Ｒ４２）のポリヌクレオチドに関して、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４０〜６８℃、好ましくは４０〜６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１〜７×ＳＳＣ、０．０２〜３％  ＳＤＳ、温度４０℃〜６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜０．３％  ＳＤＳ、温度５０〜６５℃で行うことができる。
【００５２】
前記（Ｆ１３）、（Ｒ１３）、（Ｆ２３）、（Ｒ２３）、（Ｆ３３）、（Ｒ３３）、（Ｆ４３）及び（Ｒ４３）のポリヌクレオチドに関して、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。前記（Ｆ１３）、（Ｒ１３）、（Ｆ２３）、（Ｒ２３）、（Ｆ３３）、（Ｒ３３）、（Ｆ４３）及び（Ｒ４３）のポリヌクレオチドにおいて配列同一性の値は、それぞれ独立に、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。
【００５３】
前記（Ｆ１４）、（Ｒ１４）、（Ｆ２４）、（Ｒ２４）、（Ｆ３４）、（Ｒ３４）、（Ｆ４４）及び（Ｒ４４）のポリヌクレオチドにおいて「１もしくは複数個」とは好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。更に好ましくは、１もしくは複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、所定のポリヌクレオチドの塩基配列の５’末端のみで生じている。
【００５４】
＜間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法＞
本発明はまた、他の実施形態として、
細胞を含む試料から間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法であって、
前記試料から取得したゲノムＤＮＡに含まれる、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖の塩基配列中の、他の細胞よりも間葉系幹細胞においてメチル化されている割合が高いＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出し、その検出結果に基づいて前記製剤の製造に用いる前記試料を選択する試料選択工程と、
選択した前記試料から前記製剤を製造する製剤化工程と、を有する方法を提供する。
【００５５】
各材料及び試料選択工程にてゲノムＤＮＡ中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列を検出する方法は、核酸検出工程において述べた通りである。
【００５６】
試料選択工程では更に、前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列の検出結果に基づいて、前記製剤の製造に用いる試料を選択する。前記検出結果は、試料中の間葉系幹細胞の含有量を反映しているため、間葉系幹細胞含有製剤の製造に適した試料を選択する指標として有用である。特に、該工程では、ＣＤ３１プロモーター又はその相補鎖中の前記ＣｐＧ部位を少なくとも１つ含む塩基配列において、前記ＣｐＧ部位がメチル化されている塩基配列を含むＤＮＡの量又は前記ＣｐＧ部位がメチル化されていない塩基配列を含むＤＮＡの量を選択的に検出することが好ましい。試料選択工程では、これらの検出結果を指標として、間葉系幹細胞を多く含む試料を選択し、製剤の製造に用いることができる。この場合もまた上記の「間葉系幹細胞の含有量を評価する方法」の欄で詳述したのと同様に、間葉系幹細胞の含有量を求めることなく前記検出結果自体を指標として試料を選択してもよいし、前記検出結果と間葉系幹細胞の含有量との相関関係に基づいて、前記検出結果から間葉系幹細胞の含有量を求め、求められた間葉系幹細胞の含有量を指標として試料を選択してもよい。
【００５７】
製剤化工程は、試料選択工程において選択した試料から前記製剤を製造する工程である。製剤化工程は特に限定されないが、例えば選択された前記試料から間葉系幹細胞を更に分離、培養、濃縮、及び／又は回収する工程や、前記試料から分離、培養、濃縮、及び／又は回収された間葉系幹細胞と、後述の＜間葉系幹細胞含有製剤における他の成分＞に記載したような製剤の他の成分とを組み合わせる工程等を含むことができる。前記の各製剤化工程は、目的に応じて好ましい手段を選択し、さらに各工程は必要に応じて適宜組み合わせることができる。各製剤化工程の詳細を以下で述べる。
【００５８】
分離工程としては、間葉系幹細胞を含む試料を分離できる工程であれば特に限定されず、例えば遠心分離、メッシュやフィルター等による濾過、中空糸分離膜等の公知の方法によって間葉系幹細胞を含有する試料を分離することができる。
【００５９】
培養工程としては、上記分離工程によって得られた試料及び／又は分離工程前の試料を培養することができる工程であれば特に限定されない。特に分離工程で得られた試料を培養する態様においては、高純度の間葉系幹細胞を作製することができる。培養方法としては特に限定されず、目的に応じて適切な公知の培養方法を選択することができる。
【００６０】
濃縮工程としては、例えば上記の分離及び／又は培養工程で得られた試料を濃縮し、間葉系幹細胞を治療に適した濃度まで高めることができる工程であれば特に限定されない。そのような濃縮方法としては、例えば遠心分離、メッシュやフィルターによる濾過、中空糸分離膜等の公知の方法によって前記試料を濃縮することができる。
【００６１】
回収工程としては、例えば上記の分離、培養及び／又は濃縮工程で得られた試料から夾雑物や老廃物、培地成分等を除去して高純度の間葉系幹細胞を作製することができる工程であれば特に限定されない。そのような回収方法としては、例えば遠心分離、メッシュやフィルターによる濾過、中空糸分離膜等の公知の方法によって前記試料から間葉系幹細胞を回収することができる。
【００６２】
上記の各製剤化工程の組み合わせについては、特に限定されず、その順序についても特に限定されない。各工程の組み合わせとしては例えば、上記分離、培養、濃縮、回収の全ての工程を実施してもよいし、上記の各製剤化工程から、例えば分離と培養と濃縮、分離と培養と回収、分離と濃縮と回収、分離と培養、分離と濃縮、分離と回収、培養と濃縮、培養と回収、の工程を適宜選択して実施することもできる。また、製剤化工程として分離工程のみを行うこともできる。
【００６３】
上記分離、培養、濃縮及び／又は回収によって得られた間葉系幹細胞は、後述の＜間葉系幹細胞含有製剤における他の成分＞に記載したような製剤の他の成分と組み合わせることによって間葉系幹細胞含有製剤を製造してもよい。
【００６４】
製剤化工程の具体例としては例えば、脂肪組織から、間葉系幹細胞を含有するＳＶＦを分離し、分離されたＳＶＦから間葉系幹細胞含有製剤を製造する工程や、脂肪組織から、間葉系幹細胞を含有するＳＶＦを分離したのち、ＳＶＦを培養して高純度の間葉系幹細胞を作製し、得られた間葉系幹細胞から間葉系幹細胞含有製剤を製造する工程が例示できる。
【００６５】
また、本発明の製剤化工程は、間葉系幹細胞を含む試料を凍結保存する工程を含むことができる。製剤化工程に前記試料を凍結保存する工程を含む態様においては、前記試料を解凍後、必要に応じて前記試料を分離、培養、濃縮及び／又は回収し、それによって得られた間葉系幹細胞から間葉系幹細胞含有製剤を製造してもよい。また、前記試料を解凍後、必要に応じて輸液製剤等で希釈して間葉系幹細胞含有製剤を製造してもよいし、後述の＜間葉系幹細胞含有製剤における他の成分＞に記載したような製剤の他の成分と組み合わせることによって間葉系幹細胞含有製剤を製造してもよい。
【００６６】
本明細書における輸液製剤としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。
【００６７】
＜間葉系幹細胞含有製剤における他の成分＞
間葉系幹細胞含有製剤とは、再生医療等の所望の目的に使用することができる形態に調製された間葉系幹細胞を含有する製剤であれば特に限定されず、間葉系幹細胞以外に他の成分、例えば液体又は固体の細胞培養培地、アルブミン又は血清、液体又は固体の担体、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、増粘剤、生理食塩水、凍結保存溶液、水、更なる細胞等を含んでいてもよい。更なる細胞としては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞、内皮細胞、壁細胞、筋芽細胞、心筋細胞、肝細胞、内分泌前駆細胞、神経細胞、膵臓β細胞、成熟脂肪細胞等の臓器細胞が例示できる。間葉系幹細胞と更なる細胞とを含む間葉系幹細胞含有製剤は、被験体への投与、又は、生体外における組織又は臓器の再構築に用いることができる。
【００６８】
＜間葉系幹細胞含有製剤の形態＞
間葉系幹細胞含有製剤の形態は、特に限定されないが、例えば注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤のような液剤であってもよいし、シート状製剤やゲル状製剤であってもよい。前記形態の間葉系幹細胞含有製剤は、被験体への投与が容易である。
【００６９】
間葉系幹細胞含有製剤は、その用い方は限定されず、例えば、被験体へ直接投与するために利用することや、間葉系幹細胞と更なる細胞とを混合して細胞含有組成物を製造するための間葉系幹細胞の供給源として利用することや、生体外において行われる、組織や器官の再構築のための細胞の供給源として利用することができる。
【００７０】
間葉系幹細胞含有製剤をヒト等の被験体に投与して用いる場合の具体的な用途は、後述の＜間葉系幹細胞を用いて治療する方法＞において詳述する。
【００７１】
＜キット＞
本発明はまた、他の実施形態として、
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における、第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位、第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位、第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位、及び、第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位、並びに、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列と相補的な塩基配列における、配列番号１の塩基配列における第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、配列番号１の塩基配列における第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位、及び、配列番号１の塩基配列における第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位に相補的なＣｐＧ部位のいずれか１つ以上を含む領域を増幅することができるプライマーセットを含む、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価するために用いるキットを提供する。
【００７２】
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における第１０９番のＣ及び第１１０番のＧからなるＣｐＧ部位を含む領域、又は、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターに対する相補鎖の塩基配列における、該ＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位を含む領域を増幅することができるプライマーセットとしては前記のプライマーセット（Ｉ）が好ましい。
【００７３】
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における第１５７番のＣ及び第１５８番のＧからなるＣｐＧ部位を含む領域、又は、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターに対する相補鎖の塩基配列における、該ＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位を含む領域を増幅することができるプライマーセットとしては前記のプライマーセット（ＩＩ）が好ましい。
【００７４】
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における第２００番のＣ及び第２０１番のＧからなるＣｐＧ部位を含む領域、又は、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターに対する相補鎖の塩基配列における、該ＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位を含む領域を増幅することができるプライマーセットとしては前記のプライマーセット（ＩＩＩ）が好ましい。
【００７５】
配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターの塩基配列における第２１８番のＣ及び第２１９番のＧからなるＣｐＧ部位を含む領域、又は、配列番号１で示されるＣＤ３１プロモーターに対する相補鎖の塩基配列における、該ＣｐＧ部位に対応する相補的なＣｐＧ部位を含む領域を増幅することができるプライマーセットとしては前記のプライマーセット（ＩＶ）が好ましい。
【００７６】
本発明のキットは、選択的検出方法１又は２に用いる場合には更に制限酵素を含むことが好ましい。制限酵素としては選択的検出方法１又は２に関して詳述したものが好ましいがこれには限定されない。
【００７７】
本発明のキットは、選択的検出方法３に用いる場合には更に重亜硫酸塩とデオキシリボヌクレオチド三リン酸とを含むことが好ましい。重亜硫酸塩としては重亜硫酸ナトリウム塩が例示できる。
【００７８】
本発明のキットは、核酸増幅反応に用いられる各種試薬、例えばポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液等、を更に含むことが好ましい。
【００７９】
＜間葉系幹細胞を用いて治療する方法＞
本発明はまた、他の実施形態として
疾患又は障害の治療の必要がある被験体に、間葉系幹細胞を用いて治療する方法であって、
上記の＜間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法＞において詳述した方法により得られる間葉系幹細胞含有製剤、又は上記の＜間葉系幹細胞の含有量を評価する方法＞において詳述した方法により、間葉系幹細胞を含むと評価された前記試料に由来する間葉系幹細胞を、疾患又は障害を有する被験体に投与する、投与工程を含む方法を提供する。
【００８０】
本発明において、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系幹細胞を用いて治療する方法が対象とし得る疾患又は障害は、免疫性疾患、虚血性疾患（下肢虚血、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、冠動脈性心疾患、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血等）、神経性疾患、クローン病、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデスを含む膠原病、肝硬変、脳梗塞、脳内血腫、脳血管痙攣、放射線腸炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、紅斑性狼瘡、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ−Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、眼疾患、血管新生関連疾患、うっ血性心不全、心筋症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、癌等の疾患や障害が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系幹細胞を用いて治療する方法には、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制を必要とする被験体に、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記試料に由来する間葉系幹細胞を投与して、前記被験体において心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制を行うことも含む。また、本発明における、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系幹細胞を用いて治療する方法には、美容目的の治療、処置又は改善も含む。美容目的とは、純粋に健常状態への美容を目的とするのみならず、手術後または外傷後の変形および先天性の変形に対する美容治療も含まれる。例えば、乳房の組織増大術（豊乳術、乳房再建）、頬もしくは上下眼瞼の陥凹に対する組織増大術、ならびに顔面半側萎縮症、顔面または漏斗胸への組織増大術に利用できるが、本発明が対象とし得る疾患又は障害はそれらに限定されない。
【００８１】
被験体において、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系幹細胞を用いて治療することができる疾患又は障害の他の例、前記疾患又は障害の更なる具体例、及び、治療の具体的な手順は、Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ２００９  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ８；  ５４（２４）：  ２２７７−２２８６、Ｈｏｎｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  ２０１１：  １３４；  １７９０−１８０７、Ｍａｋｈｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２０１３；  ９５：  １８２７−１８３３、特許第５９０５７７号公報、特開２０１０−５１８０９６号公報、特表２０１２−５０９０８７号公報、特表２０１４−５０１２４９号公報、特開２０１３−２５６５１５号公報、特開２０１４−１８５１７３号公報、特表２０１０−５３５７１５号公報、特開２０１５−０３８０５９号公報、特開２０１５−１１０６５９号公報、特表２００６−５２１１２１号公報、特表２００９−５４２７２７号公報、特開２０１４−２２４１１７号公報、特開２０１５−０６１８６２号公報、特表２００２−５１１０９４号公報、特表２００４−５０７４５４号公報、特表２０１０−５０５７６４号公報、特表２０１１−５１４９０１号公報、特開２０１３−０６４００３号公報、特開２０１５−１３１７９５号公報等に記載された事項を参照することができる。
【００８２】
また、本発明において、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系幹細胞を用いて治療する方法が対象とし得る疾患又は障害は、間葉系幹細胞のみにより治療、処置又は改善され得る疾患又は障害だけではなく、間葉系幹細胞と更なる他の細胞との組み合わせにより治療、処置又は改善され得る疾患又は障害を含む。例えば、間葉系幹細胞は血管新生作用や組織の定着を促進する作用を有することから、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞及び／又は成熟脂肪細胞等の臓器細胞と間葉系幹細胞と必要に応じて血管内皮細胞とを含む細胞含有組成物の投与により被験体における組織又は臓器の再生が促進され、それによって該被験体において疾患又は障害を治療、処置又は改善することができる。また、上記細胞含有組成物は、公立大学法人横浜市立大学の公開公報（ＷＯ２０１３／０４７６３９）に記載の混合比を参考に作製することができる。
【００８３】
また、間葉系幹細胞を含む脂肪組織や、間葉系幹細胞及び成熟脂肪組織を含む細胞含有組成物の被験体への投与は、該被験体における豊乳術又は乳房再建に有効である。具体的な豊乳術又は乳房再建の方法については、株式会社バイオマスターの公開公報（特開２００８−２７１９７１号公報）に記載の方法に準じて行えばよい。
【００８４】
投与工程では、前記疾患又は障害を有する被験体に、前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記試料に由来する間葉系幹細胞を投与することを含む。本発明において、「投与」は「移植」も包含する。このとき、投与される「前記間葉系幹細胞含有製剤」は、前記試料から、上記の＜間葉系幹細胞含有製剤を製造する方法＞において説明した方法により製造することができる。また、投与される「前記試料に由来する間葉系幹細胞」としては、間葉系幹細胞を含有する前記試料自体の形態であってもよいし、前記試料から分離された間葉系幹細胞であってもよいし、前記試料から分離されたのち培養された間葉系幹細胞であってもよい。前記間葉系幹細胞含有製剤又は前記間葉系細胞は、それが投与される被験体と同一種の動物又は同一個体に由来するものであることができるが、これらに限定されない。
【００８５】
投与工程では、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価することによって、被験体へ投与する間葉系幹細胞の適正な投与量や投与回数を予め決定することができる。間葉系幹細胞の含有量を評価しない場合、前記試料における間葉系幹細胞の含有量が明らかでないため、被験体へ前記試料に由来する間葉系幹細胞を投与する際の適正な投与量や投与回数を予め把握することができず、投与後に効果を確認してから再度投与するなどの手順が必要であり、間葉系幹細胞の投与量や投与回数が必要以上に多くなり、被験体への負担も増大する可能性がある。本発明では、細胞を含む試料における間葉系幹細胞の含有量を評価する工程において評価された前記試料中の間葉系幹細胞の含有量に基づいて、投与工程における間葉系幹細胞の適正な投与量や投与回数を決定することができるため、投与の手間、費用、被験体への負担等を軽減することができる。
【００８６】
間葉系幹細胞含有製剤又は前記試料に由来する間葉系幹細胞の被験体への投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は患部に直接移植することなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）とは典型的にはヒトであるが他の動物であってもよい。他の動物としてはイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類が例示できる。
【実施例】
【００８８】
図１には、ヒトの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ＡＳＣ）のゲノムＤＮＡに含まれるＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）における、メチル化されたシトシン（Ｃ）を含むＣｐＧ配列を下線で示す（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２００７，  ２５（４）：  ８５２−６１）。図１では更に、メチル化感受性制限酵素ＨａｐＩＩ及びＨａｐＩＩのイソシゾマーであってメチル化非感受性の制限酵素ＭｓｐＩの認識配列であるＣＣＧＧを太字で示す。図１ではまた、配列番号２〜９の塩基配列からなる各プライマーに対応する位置を示す。【００８９】
メチル化依存性制限酵素ＭｃｒＢＣは、（Ａ／Ｇ）ｍＣからなるジヌクレオチドを含むＤＮＡを認識し切断する。ここで、ｍＣはメチル化されたシトシンを指す。ＭｃｒＢＣによるＤＮＡの切断には、ＤＮＡ上で４０〜３，０００塩基離れた前記ジヌクレオチドが少なくとも２か所必要である。【００９０】
ここで、配列番号２で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号３で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを第１プライマーセットという。ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）のうち、第１プライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅される配列番号１中の領域を第１領域という。【００９１】
さらに、配列番号４で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号５で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを第２プライマーセットという。ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）のうち、第２プライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅される配列番号１中の領域を第２領域という。【００９２】
さらに、配列番号６で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号７で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを第３プライマーセットという。ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）のうち、第３プライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅される配列番号１中の領域を第３領域という。【００９３】
さらに、配列番号８で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号９で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとするプライマーセットを第４プライマーセットという。ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＤ３１プロモーターのＤＮＡ塩基配列（配列番号１）のうち、第４プライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅される配列番号１中の領域を第４領域という。【００９４】
＜実験１＞
培養ヒト由来ＡＳＣを以下の手順により取得した。同意を得たボランティアから提供されたヒト脂肪組織を０．１％コラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社、０３８−２２３６１）処理（３７℃、３０分）した後、遠心分離（８００ｇ、５分）によって細胞を回収し、α−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、１２５６１−０４９）＋１０％  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社、ＳＨ３００７０．０３）＋１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、１５２４０−０６２）を使用して培養を行った。３度目の経代培養（コンフレンシー８０−９０％に達した時点で経代）後の細胞を培養ヒト由来ＡＳＣとして取得した。上記の培養ヒト由来ＡＳＣからゲノムＤＮＡを次の手順により抽出した。ＤＮＡ抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ株式会社、Ｕ０９５２Ｓ）を使用して行い、添付文書のプロトコル通り操作を行った。【００９５】
上記で抽出されたＤＮＡ試料を制限酵素処理せずに鋳型とし第１プライマーセットを用いて以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。先ず、５μＬの鋳型ＤＮＡ（６．２５ｕｇ）、２μＬの第１プライマーセット（フォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ、４ｐｍｏｌ）に純水を添加し１０μＬのプレミックスを調製した。この溶液に２×ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ ＧＣ (タカラバイオ株式会社、ＲＲ０７１Ａ)を１０μＬ添加して反応溶液を調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は （１）９５℃、３０秒  （２）９５℃、１５秒  （３）６０℃、３０秒  （４）（２）−（３）を４０回繰返す、で行った。Ｃｔ値は７３００  ＳＤＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて自動で算出した。【００９６】
この条件で求められたｎ＝５での平均のＣｔ値（Ｃｔｔｏｔａｌ）は２３．４４であった。ＣｔｔｏｔａｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる全てのＣＤ３１プロモーターの量（Ｉｔｏｔａｌ）を反映している。【００９７】
上記で抽出されたＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素ＨａｐＩＩ（タカラバイオ株式会社、１０５３ＡＨ）により処理し、Ｃがメチル化されていないＣＣＧＧ配列を選択的に切断した。ＨａｐＩＩ処理後のＤＮＡを鋳型とし、第１プライマーセットを用い、上記と同様の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。この条件で求められたｎ＝５での平均のＣｔ値（Ｃｔｍｅｔｈｙｌ）は２３．４６であった。ＣｔｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第１０９番のＣがメチル化されたＣＤ３１プロモーターの量（Ｉｍｅｔｈｙｌ）を反映している。【００９８】
上記で抽出されたＤＮＡ試料をメチル化依存性制限酵素ＭｃｒＢＣ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社、Ｍ０２７２Ｓ）により処理し、（Ａ／Ｇ）ｍＣ配列（ｍＣはメチル化されたシトシンを指す）を選択的に切断した。ＭｃｒＢＣ処理後のＤＮＡを鋳型とし、第１プライマーセットを用い、上記と同様の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。この条件で求められたｎ＝５での平均のＣｔ値（Ｃｔｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ）は３２．７５であった。Ｃｔｎｏ−ｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第７９番のＣ及び第８５番のＣが共にメチル化されていないＣＤ３１プロモーターの量（Ｉｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ）を反映している。【００９９】
上記で抽出されたＤＮＡ試料をメチル化非感受性の制限酵素ＭｓｐＩ（タカラバイオ株式会社、１１５０ＡＨ）により処理し、Ｃのメチル化の有無に関係なく全てのＣＣＧＧ配列を切断した。ＭｓｐＩ処理後のＤＮＡを鋳型とし、第１プライマーセットを用い、上記と同様の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。ヒトゲノムＤＮＡに含まれるＣＤ３１プロモーターは配列番号１の第１０８〜１１１番にＣＣＧＧ配列を含むため、この条件では増幅産物は生じないはずであり、ネガティブコントロールとした。実際にｎ＝５の試験で増幅産物は検出できずＣｔ値は求められなかった。【０１００】
ＰＣＲでの１サイクルでの増幅率をＥとすると下記式（１）及び（２）が成り立つ：
式（１）  Ｉｔｏｔａｌ×ＥＣｔ ｔｏｔａｌ＝Ｉｍｅｔｈｙｌ×ＥＣｔ ｍｅｔｈｙｌ
式（２）  Ｉｔｏｔａｌ×ＥＣｔ ｔｏｔａｌ＝Ｉｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ×ＥＣｔ ｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ【０１０１】
ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡ中でのＣＤ３１プロモーターの配列番号１の第１０９番のＣがメチル化された割合（％）（Ｃ１０９メチル化率という）は１００×Ｉｍｅｔｈｙｌ／Ｉｔｏｔａｌであり、上記式（１）から次式（３）により算出できる。
式（３）  １００×Ｉｍｅｔｈｙｌ／Ｉｔｏｔａｌ＝１００×ＥＣｔ ｔｏｔａｌ−Ｃｔ ｍｅｔｈｙｌ【０１０２】
同様に、ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡ中でのＣＤ３１プロモーターの第７９番のＣ及び第８５番のＣが共にメチル化されていない割合（％）（Ｃ７９Ｃ８５非メチル化率という）は１００×Ｉｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ／Ｉｔｏｔａｌであり、上記式（２）から次式（４）により算出できる。
式（４）  １００×Ｉｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ／Ｉｔｏｔａｌ＝１００×ＥＣｔ ｔｏｔａｌ−Ｃｔ ｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ【０１０３】
増幅率Ｅを２とすると、式（３）から、Ｃ１０９メチル化率（％）＝１００×２−０．０２＝９８．６２であり、ほぼ１００％であった。【０１０４】
また式（４）から、Ｃ７９Ｃ８５非メチル化率（％）＝１００×２−９．３１＝０．１６であり、ほぼ０％であった。この結果から、第１領域の第７９番のＣ及び第８５番のＣの少なくとも一つがメチル化されている割合（Ｃ７９Ｃ８５メチル化率（％））は、１００−０．１６＝９９．８４％であり、ほぼ１００％であることもわかる。【０１０５】
＜実験２＞
プライマーセットとして第２プライマーセットを用いた以外は実験１と同様に、培養ＡＳＣから抽出されたＤＮＡの、制限酵素処理なし、ＨａｐＩＩ処理、ＭｃｒＢＣ処理、ＭｓｐＩ処理の４つの試料を鋳型としてリアルタイムＰＣＲをｎ＝５で行い、平均値としてＣｔｔｏｔａｌ、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ、Ｃｔｎｏ−ｍｅｔｈｙｌを求めた。Ｃｔｔｏｔａｌ、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ、Ｃｔｎｏ−ｍｅｔｈｙｌはそれぞれ２３．５１、２３．５２、３３．９１であった。ＭｓｐＩ処理の場合、増幅産物は検出できずＣｔ値は求められなかった。【０１０６】
実験２でのＣｔｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第１５７番のＣがメチル化されたＣＤ３１プロモーターの量を反映している。実験２でのＣｔｎｏ−ｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第１９１番のＣがメチル化されていないＣＤ３１プロモーターの量を反映している。【０１０７】
そして実験１と同様に求められる、ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡ中でのＣＤ３１プロモーターの配列番号１の第１５７番のＣがメチル化された割合（％）（Ｃ１５７メチル化率という）は１００％であり、第１９１番のＣがメチル化されていない割合（％）（Ｃ１９１非メチル化率という）は０．０７％でほぼ０％あった。【０１０８】
＜実験３＞
プライマーセットとして第３プライマーセットを用いた以外は実験１と同様に、培養ＡＳＣから抽出されたＤＮＡの、制限酵素処理なし、ＨａｐＩＩ処理の２つの試料を鋳型としてリアルタイムＰＣＲをｎ＝５で行い、平均値としてＣｔｔｏｔａｌ、Ｃｔｍｅｔｈｙｌを求めた。Ｃｔｔｏｔａｌ、Ｃｔｍｅｔｈｙｌはそれぞれ２４．２１、２４．８７であった。【０１０９】
実験３でのＣｔｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第２００番のＣがメチル化されたＣＤ３１プロモーターの量を反映している。【０１１０】
そして実験１と同様に求められる、ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡ中でのＣＤ３１プロモーターの配列番号１の第２００番のＣがメチル化された割合（％）（Ｃ２００メチル化率という）は６３％であった。【０１１１】
＜実験４＞
プライマーセットとして第４プライマーセットを用いた以外は実験１と同様に、培養ＡＳＣから抽出されたＤＮＡの、制限酵素処理なし、ＨａｐＩＩ処理の２つの試料を鋳型としてリアルタイムＰＣＲをｎ＝５で行い、平均値としてＣｔｔｏｔａｌを求めた。Ｃｔｔｏｔａｌ、Ｃｔｍｅｔｈｙｌはそれぞれ２１．３０、２２．３５であった。【０１１２】
実験４でのＣｔｍｅｔｈｙｌはヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡに含まれる、配列番号１の塩基配列中の第２１８番のＣがメチル化されたＣＤ３１プロモーターの量を反映している。【０１１３】
そして実験１と同様に求められる、ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡ中でのＣＤ３１プロモーターの配列番号１の第２１８番のＣがメチル化された割合（％）（Ｃ２１８メチル化率という）は４８％であった。【０１１４】
＜実験５＞
脂肪組織は、コラゲナーゼ処理して、成熟脂肪細胞と、間質血管細胞群（ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：  ＳＶＦ）とに分離することができる。ＳＶＦはＡＳＣに加えて血管内皮細胞、周皮細胞、血液由来細胞（白血球、赤血球、単核球）を含む。一般的には脂肪組織は、細胞数基準で、成熟脂肪細胞を約１０％、ＡＳＣを約３５％、血管内皮細胞を約１０％、周皮細胞を約１０％、血管由来細胞を約３５％含有する。【０１１５】
実験１〜実験４と同様の方法で各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、各細胞における、Ｃ１０９メチル化率、Ｃ１５７メチル化率、Ｃ２００メチル化率及び、Ｃ２１８メチル化率を求めた。ＡＳＣでの各メチル化率は実験１〜４において求められた値を示す。【０１１６】
成熟脂肪細胞は実験１〜実験４で使用した培養ＡＳＣからＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）  Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、Ａ１００７０−０１）を使用して誘導し、調製した。添付資料通りに誘導処理（３週間）を行った後、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、１２５６３０２９）処理（３７℃、１０分）により細胞を剥離させた。細胞懸濁液を遠心分離（８００ｇ、５分）し、浮いた細胞だけを回収することで、高純度（ほぼ１００％）の成熟脂肪細胞を取得した。【０１１７】
血管内皮細胞として、市販のヒト臍帯静脈内皮細胞：ＨＵＶＥＣの細胞ペレット（Ｄ１１０１８）をタカラバイオ株式会社から購入した。【０１１８】
周皮細胞として、市販のヒト胎盤由来周皮細胞：ｈＰＣ−ＰＬの細胞ペレット（Ｄ１１０７５）をタカラバイオ株式会社から購入した。【０１１９】
血液由来細胞は同意を得たボランティアから提供された血液を遠心し、調製した。【０１２０】
【表１】
2017043637.tif 000003
【０１２１】
上記表に示される通り、ヒトＡＳＣのゲノムＤＮＡではＣＤ３１プロモーター配列（配列番号１）の第１０９番、第１５７番、第２００番及び、第２１８番のＣのメチル化率が、脂肪組織又はＳＶＦに含まれる他の細胞のゲノムＤＮＡよりも顕著に高いことが明らかになった。この結果、脂肪組織又はＳＶＦからなる試料中のＡＳＣの含有量を評価する指標として、試料から抽出されたゲノムＤＮＡに含まれる、メチル化された第１０９番、第１５７番、第２００番、及び、第２１８番のＣの量が有効であること、メチル化された第１５７番、第２００番、及び、第２１８番のＣの量がより有効であること、メチル化された第１５７番のＣの量が特に有効であることが明らかになった。【０１２２】
＜実験６＞
ヒト脂肪組織から得られたＳＶＦを試料とし、ゲノムＤＮＡのＣＤ３１プロモーター配列（配列番号１）において第１５７番のＣがメチル化されているものの量を指標に、該試料中のＡＳＣの含有量を評価した。比較のためにフローサイトメトリー法により前記試料中のＡＳＣ量を求めた。【０１２３】
ＳＶＦは３人のボランティアから提供されたヒト脂肪組織をコラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社、０３８−２２３６１）処理（３７℃、３０分）した後、遠心分離（８００ｇ、５分）を行い、調製した。３名の脂肪組織から調製されたＳＶＦをそれぞれ＃１、＃２、＃３とした。【０１２４】
検量線作成に用いた培養ＡＳＣは実験１と同様の方法で調製した。【０１２５】
ＳＶＦからのゲノムＤＮＡの抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ株式会社、Ｕ０９５２Ｓ）を使用して行い、添付文書のプロトコル通り操作を行った。【０１２６】
上記実験２と同様に、ＳＶＦから抽出されたゲノムＤＮＡを制限酵素ＨａｐＩＩで処理した試料を鋳型とし、第２プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ値を求めた。下記手順により作成した、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ値とＡＳＣ細胞数との相関関係を示す検量線を用いて、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ値からＡＳＣ細胞数を推定した。【０１２７】
検量線は下記手順により作成した。上記で調製した検量線用細胞の細胞数をヌクレオカウンター ＮＣ−２００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）で測定した後、３．３×１０６、１．７×１０６、８．３×１０５、４．１×１０５、２．０×１０５、１．０×１０５、５．０×１０４、２．５×１０４、１．３×１０４、６．５×１０３（ｃｅｌｌｓ）になるように調製した。各試料からゲノムＤＮＡの抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ株式会社、Ｕ０９５２Ｓ）を使用して行い、添付文書のプロトコル通り操作を行った。上記実験２と同様に、抽出されたゲノムＤＮＡを制限酵素ＨａｐＩＩで処理した試料を鋳型とし、第２プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔｍｅｔｈｙｌ値を求め、ＡＳＣ細胞数との相関関係を示す検量線を作成した。【０１２８】
フローサイトメトリー法によるＳＶＦ試料中のＡＳＣ量は以下の手順で求めた。先ず、ＳＶＦ試料中の全細胞数（ＣＡｌｌ）をヌクレオカウンター ＮＣ−２００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）で測定した。次にＳＶＦ試料をＣＤ３４−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、３４８０５７）抗体とＣＤ３１−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５３３７２）抗体で２重染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤバイオサイエンス）によってＡＳＣの特徴であるＣＤ３１陰性／ＣＤ３４陽性の細胞割合（ＰＡＳＣ、％）を測定した。ＳＶＦ試料中のＡＳＣ量は次式（５）により算出できる。【０１２９】
式（５）  ＣＡｌｌ×ＰＡＳＣ ／１００＝ＳＶＦ試料中のＡＳＣ量
結果を下記表２に示す。【０１３０】
【表２】
2017043637.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明は、間葉系幹細胞を用いる再生医療等の技術分野において利用価値が高い。【０１３２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2017043637.tif 000005
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017043637.tif 000008
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