(57)【要約】  遊離のヒドロキシ基を有する新規の短鎖ＰＨＡとその製造方法を提供することを課題とする。  本発明は、炭素数３〜６のジヒドロキシアルカン酸と、炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸のそれぞれをモノマーユニットとして含有し、前記モノヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとしての含有量が８０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸、およびそれからなる樹脂組成物等を提供する。
2017033652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数３〜６のジヒドロキシアルカン酸および炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含有するポリヒドロキシアルカン酸からなる樹脂組成物であって、
前記モノヒドロキシアルカン酸の含有量が８０モル％以上である前記樹脂組成物。
【請求項２】
前記ジヒドロキシアルカン酸が３，５−ジヒドロキシ吉草酸である、請求項１記載の樹脂組成物。
【請求項３】
前記３，５−ジヒドロキシ吉草酸の含量が０．５〜２０モル％である、請求項２記載の樹脂組成物。
【請求項４】
前記ジヒドロキシアルカン酸が３，６−ジヒドロキシヘキサン酸である、請求項１記載の樹脂組成物。
【請求項５】
前記３，６−ジヒドロキシヘキサン酸の含量が０．５〜２０モル％である、請求項４記載の樹脂組成物。
【請求項６】
前記ジヒドロキシアルカン酸が２，３−ジヒドロキシ酪酸である、請求項１記載の樹脂組成物。
【請求項７】
前記２，３−ジヒドロキシ酪酸の含量が０．０５〜１５モル％である、請求項６記載の樹脂組成物。
【請求項８】
前記ジヒドロキシアルカン酸が３，４−ジヒドロキシ酪酸である、請求項１記載の樹脂組成物。
【請求項９】
前記３，４−ジヒドロキシ酪酸の含量が０．０５〜１０モル％である、請求項８記載の樹脂組成物。
【請求項１０】
前記ジヒドロキシアルカン酸として、さらに３，４−ジヒドロキシ酪酸を含む、請求項６または７記載の樹脂組成物。
【請求項１１】
前記３，４−ジヒドロキシ酪酸の含量が０．０５〜１０モル％である、請求項１０記載の樹脂組成物。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項記載の樹脂組成物からなる成形体。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか１項記載の樹脂組成物を加工して所望の形状に成形する工程を含む、請求項１２に記載の成形体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか１項記載の樹脂組成物、または請求項１２に記載の成形体を含む細胞足場材料。
【請求項１５】
請求項１から１１のいずれか１項記載の樹脂組成物、または請求項１２に記載の成形体の、細胞足場材料としての使用。
【請求項１６】
Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子およびＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物をδ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトン存在下で培養する工程、および
前記微生物から請求項１から５のいずれか１項記載の樹脂組成物を回収する工程
を含む、樹脂組成物を製造する方法。
【請求項１７】
前記微生物はＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物である、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
前記微生物はＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が弱化された微生物である、請求項１６または１７記載の製造方法。
【請求項１９】
前記微生物がＡｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物である、請求項１６から１８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項２０】
プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、βケトチオラーゼ、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡ合成酵素のそれぞれをコードする遺伝子を有する微生物を、グリコール酸存在下で培養する工程、および
前記微生物から請求項１、および請求項６から１１のいずれか１項記載の樹脂組成物を回収する工程
を含む、樹脂組成物を製造する方法。
【請求項２１】
微生物が、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物である、請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
微生物が、βケトチオラーゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物である、請求項２０または２１記載の製造方法。
【請求項２３】
微生物が、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物である、請求項２０から２２のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項２４】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物である、請求項１６から２３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項２５】
前記Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである、請求項２４記載の製造方法。
【請求項２６】
前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項２６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離のヒドロキシ基を有するポリヒドロキシアルカン酸樹脂組成物、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；以下、「ＰＨＡ」と略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになる。したがって、ＰＨＡは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチックであると言える。近年、環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から、合成プラスチックが深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に対して悪影響を与えないグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。【０００３】
微生物中で最初に発見されたＰＨＡは、３−ヒドロキシ酪酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「３ＨＢ」と略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（Ｐｏｌｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「ＰＨＢ」と略す）である。ＰＨＢは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、しかも融点付近の温度（１８０℃）で速やかに熱分解するため、溶融加工性が低く実用範囲は極めて限られるという問題を有している。【０００４】
そこで、ＰＨＢの結晶化度を下げて脆性を改善するため、他の３−ヒドロキシアルカン酸をＰＨＢ骨格中に導入する試みがなされた。例えば、これまでに３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；以下、「３ＨＰ」と略す）、４−ヒドロキシ酪酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「４ＨＢ」と略す）、５−ヒドロキシ吉草酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ；以下、「５ＨＶ」と略す）など側鎖を持たない直鎖状モノマーや、乳酸、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ；以下、「３ＨＶ」と略す）、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｎａｔｅ；以下、「３ＨＨｘ」と略す）のようなアルキル分岐鎖を有するモノマーについて、ＰＨＢ骨格への導入が報告されている。導入するモノマーの種類やその共重合比率によって得られるＰＨＡの物性は変化するが、基本的にどのモノマーを導入してもＰＨＢの結晶化度が低下するため、ＰＨＢと比べて溶融加工性が改善することが分かっている。しかしながら、さらに優れた物性や溶融加工性を有するＰＨＡを生産するためには、これらのモノマー導入による加工性改善効果は、非常に限定的であるのが実情である。【０００５】
ＰＨＡの用途をさらに広げるには、既知のＰＨＡとは物性が大きく異なる新たなＰＨＡの開発が必要である。しかし、新たなＰＨＡを生産するためには、単純に主鎖の長さや側鎖の大きさを変化させるだけではなく、ＰＨＡに何らかの官能基を導入することが有効と考えられる。【０００６】
ＰＨＡに官能基を導入することにより、官能基同士の相互作用により、分子内または分子間の相互作用が生じ、これに伴い、ＰＨＡの融点、結晶化温度と結晶化度が高くなることが知られている。結晶化温度が高くなれば、溶融樹脂を加工する際に、樹脂の固化が速くなり、加工時間、冷却時間の短縮につながり、成形加工時の生産性が高くなる。また、融点と結晶化度が高くなると、実用上の耐熱温度が高くなり、幅広い用途展開ができる。加えて、ＰＨＡに官能基を導入することにより、官能基と親和性を有する素材との親和性が改善され、他の材料とのブレンドや積層、接着や塗装時の接着剤や塗料等との密着性を改良できる。さらに、官能基が反応性を有する場合には、この官能基と反応性がある素材や接着剤、塗料などを用いれば、反応を介することで密着性を改善できる。側鎖に反応性を有する場合は、側鎖にある官能基を介して、新たなグラフト鎖を導入したり、ＰＨＡの分子間反応、さらには架橋を導入することもできる。一般的にポリマー鎖にグラフト反応や、分子間反応により分岐鎖を導入することで、分子の絡み合いが増加し、ポリマーの溶融張力や溶融時の流動性、高温時の形状保持性等が変化することが知られている。これにより、真空成形、発泡成形、ブロー成形などの溶融時の形状保持性が求められる成形での成形性の改善や得られた成形体の熱変形温度や耐熱変形性の改善が期待できる。また、グラフト鎖として、ＰＨＡとは異なる構造の分子鎖を導入できれば、グラフト鎖と親和性が高い材料とＰＨＡをブレンドする場合の相溶化剤、界面安定剤として、あるいは接着する場合の、接着剤またはプライマーとして使用することが期待できる。【０００７】
官能基を有するＰＨＡおよびこれを介して分岐構造を導入したＰＨＡはそのものを使用することもできるが、官能基を持たないＰＨＡと共用することにより、官能基を持たないＰＨＡの改質材としても使用でき、改質材として使用する場合も、上記のような効果が期待できる。【０００８】
これまでに、ＰＨＡに官能基を導入した例として、特許文献１では炭素数６〜１２のモノヒドロキシアルカン酸を主成分とするＰＨＡ（以下、「中鎖ＰＨＡ」と略す）の側鎖にチオエステル基を導入したことが報告されている。また、非特許文献１には、中鎖ＰＨＡの側鎖に、分岐鎖アルキル基、シクロヘキシル基、ハロゲン化アルキル基、アセトキシ基、エステル基、アルコシキ基、エポキシ基、チオール基、シアノ基、ニトロ基、フェニル基やベンゾイル基などの芳香環化合物を導入した前例がまとめられている。これら官能基の導入は、ＰＨＡの物性を大きく変化させるだけでなく、化学的に修飾するための反応起点を付与する点でも重要である。ところが、中鎖ＰＨＡは、融点４０〜８０℃のエラストマーであることが知られており、耐熱性も低く、フィルム、シート、射出成形品など、固形の成形体としての実用性に乏しいという問題がある。固形の成形体用途を目的とした場合、ＰＨＡの融点は１００℃以上であることが好ましい。したがって、炭素数３〜５のモノヒドロキシアルカン酸を主成分とするＰＨＡ（以下、「短鎖ＰＨＡ」と略す）に官能基を導入した官能基含有短鎖ＰＨＡの開発が望まれている。【０００９】
しかし、短鎖ＰＨＡに官能基を導入した例としては、非特許文献２に二重結合を持つ３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸を含有するＰＨＡを生産したことが報告されているに過ぎない。官能基を有するモノマーをＰＨＡに効率的に取り込ませるためには、ＰＨＡ合成酵素の基質特異性が課題となる。上述の通り、官能基を有するモノマーを、中鎖ＰＨＡに導入した例が数多くみられるのに対して、短鎖ＰＨＡに導入した報告が少ないのは、このＰＨＡ合成酵素の基質特異性に依るところが大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公報番号ＷＯ２０１２／０３８５７２
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｒｔａ  Ｔｏｒｔａｊａｄａ，  Ｌｕｉｚｉａｎａ  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ，  Ｍａｒｉａ  Ａｕｘｉｌｉａｄｏｒａ  Ｐｒｉｅｔｏ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１−１５，２０１３
【非特許文献２】Ｈｅｎｒｙ  Ｅ．  Ｖａｌｅｎｔｉｎ，  Ｐｉｅｒｒｅ  Ａ．  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｊ．  Ｇｒｕｙｓ，  Ｍａｒｉａ  Ｆｉｌｏｍｅｎａ  ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，  Ｍｕｎｈｔｉｅｎ  Ｔｒａｎ，Ｊａｗｅｄ  Ａｓｒａｒ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ．３２，ｐｐ．７３８９−７３９５，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、遊離のヒドロキシ基を有する新規の短鎖ＰＨＡとその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の微生物を、δ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトンを使用して培養すること、またはグリコール酸を使用して培養することにより、遊離のヒドロキシ基を有するＰＨＡを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
即ち、本発明の第一の態様は、炭素数３〜６のジヒドロキシアルカン酸および炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含有し、前記モノヒドロキシアルカン酸の含有量が８０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸からなる樹脂組成物に関する。前記ジヒドロキシアルカン酸は、３，５−ジヒドロキシ吉草酸であることが好ましく、その含量が０．５〜２０モル％であることがより好ましい。また、前記ジヒドロキシアルカン酸は、３，６−ジヒドロキシヘキサン酸であることが好ましく、その含量が０．５〜２０モル％であることがより好ましい。また、前記ジヒドロキシアルカン酸は、２，３−ジヒドロキシ酪酸であることが好ましく、その含量が０．０５〜１５モル％であることがより好ましい。また、前記ジヒドロキシアルカン酸は、３，４−ジヒドロキシ酪酸であることが好ましく、その含量が０．０５〜１０モル％であることがより好ましい。さらに前記ジヒドロキシアルカン酸は、２，３−ジヒドロキシ酪酸と３，４−ジヒドロキシ酪酸であることが好ましい。一実施形態において、本発明は、前記樹脂組成物からなる成形体に関する。他の実施形態において本発明は、前記樹脂組成物を加工して、所望の形状に成形する工程を含むことを特徴とする、前記成形体の製造方法に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、前記樹脂組成物もしくは前記成型体を含む細胞足場材料、または前記樹脂組成物もしくは前記成型体の細胞足場材料としての使用に関する。【００１５】
本発明の第二の態様は、前記第一の態様に記載の樹脂組成物を製造する方法に関する。この方法は、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、およびＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物をδ−バレロラクトン、および／またはε−カプロラクトンを用いて培養する工程、および該微生物から前記樹脂組成物を回収する工程を含む。前記微生物は、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が強化されていることが好ましく、Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が弱化されていることが好ましい。また、前記微生物はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（カプリアビダス）属に属する微生物であることが好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス  ネカトール）であることがより好ましい。さらに、前記微生物は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属由来のＰＨＡ合成酵素を有する微生物であることが好ましい。【００１６】
本発明の第三の態様も前記第一の態様に記載の樹脂組成物を製造する方法に関する。ただし、本態様の方法では、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、βケトチオラーゼ、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＡ合成酵素のそれぞれをコードする遺伝子を有する微生物を、グリコール酸を用いて培養する工程、および該微生物から前記樹脂組成物を回収する工程を含む。前記微生物は、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物であることが好ましく、βケトチオラーゼをコードする遺伝子の発現が強化されていることが好ましい。また、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子の発現が強化された微生物であることが好ましい。さらに、前記微生物はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物であることが好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒであることがより好ましい。さらに、前記微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）属に属する微生物であることが好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア  コリ）であることがより好ましい。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-164755号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、遊離のヒドロキシ基を有する全く新規のＰＨＡを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例１および実施例２で得られたＰＨＡの構造である。
【図２】本発明の実施例３および実施例４で得られたＰＨＡの構造である。
【図３】比較例１で得られたＰＨＡの構造である。
【図４】比較例２で得られたＰＨＡの構造である。
【図５】比較例３で得られたＰＨＡの構造である。
【図６】本発明の実施例５および実施例６で得られたＰＨＡの構造である。
【図７】本発明の実施例７で得られたＰＨＡの構造である。
【図８】本発明の実施例８で得られたＰＨＡの構造である。
【図９】実施例９で得られた細胞足場のＳＥＭ像を示す。
【図１０】実施例９で得られた細胞足場にヒト間葉系幹細胞を播種し、増殖させた後の観察結果を示す。ＡはカルセインＡＭによる染色を、Ｂはエチジウムホモダイマー１による染色を、ＣはＤＩＣによる観察の結果を、Ｄはそれらのマージ（merge）画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００２１】
本発明が提供するＰＨＡは、炭素数３〜６のジヒドロキシアルカン酸と炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸のそれぞれをモノマーユニットとして含有するＰＨＡである。本発明のＰＨＡは、これらのジヒドロキシアルカン酸とモノヒドロキシアルカン酸のみからなるＰＨＡでも良いし、これら以外のモノマーユニットを有していても良い。
【００２２】
本発明のＰＨＡを構成する炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸としては、例えば、３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、３ＨＨｘ、６−ヒドロキシヘキサン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｎａｔｅ；以下、「６ＨＨｘ」と略す）などが挙げられる。本発明のＰＨＡにおけるモノヒドロキシアルカン酸は、単一種で構成されていても良いし、複数種で構成されていても良い。モノヒドロキシアルカン酸が複数種で構成される場合、少なくとも３ＨＢを含んでいることが好ましい。本発明のＰＨＡにおけるモノヒドロキシアルカン酸の共重合比率は、８０モル％以上であれば特に限定されないが、３ＨＢを含む場合、その共重合比率は、５０モル％以上であることがより好ましく、６０モル％以上であることがさらに好ましく、７０モル％以上であることが一層好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましい。
【００２３】
一方、本発明のＰＨＡを構成する炭素数３〜６のジヒドロキシアルカン酸としては、例えば、３，５−ジヒドロキシ吉草酸（３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ；以下、「３，５−ＤＨＶ」と略す）、３，６−ジヒドロキシヘキサン酸（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｎａｔｅ；以下、「３，６−ＤＨＨｘ」と略す）、２，３−ジヒドロキシ酪酸（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「２，３−ＤＨＢ」と略す）、３，４−ジヒドロキシ酪酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；以下、「３，４−ＤＨＢ」と略す）などが挙げられる。これらのジヒドロキシアルカン酸に含まれる２つのヒドロキシ基のうち、片方は重合に使用されるが、もう一方は重合後も遊離の状態として存在することになる。この重合後の状態において、遊離のヒドロキシ基は、ＰＨＡの主鎖を構成する炭素に直接結合していても良いし、アルキル分岐鎖からなる側鎖を構成する炭素に結合していても良い。本発明のＰＨＡにおけるジヒドロキシアルカン酸は、単一種で構成されていても良いし、複数種で構成されていても良い。
【００２４】
本発明のＰＨＡがジヒドロキシアルカン酸として３，５−ＤＨＶをモノマーユニットとして含有する場合、ＰＨＡにおける３，５−ＤＨＶの共重合比率（モノマーユニットとしての含量）の下限は、０．５モル％であることが好ましく、１モル％であることがより好ましく、１．５モル％であることがさらに好ましく、２モル％であることが特に好ましい。またその上限は、２０モル％であることが好ましく、１５モル％であることがより好ましく、１２モル％であることがさらに好ましく、１０モル％であることが特に好ましい。ジヒドロキシアルカン酸として３，５−ＤＨＶをモノマーユニットとして含有する本発明のＰＨＡは、モノヒドロキシアルカン酸として３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、３ＨＨｘ、および６ＨＨｘのいずれか一以上をモノマーユニットとして含有する共重合体であっても良い。また、ジヒドロキシアルカン酸として、３，５−ＤＨＶ以外に、３，６−ＤＨＨｘ、２，３−ＤＨＢ、および３，４−ＤＨＢのいずれか一以上をモノマーユニットとして含有する共重合体であっても良い。さらに、前記モノヒドロキシアルカン酸およびジヒドロキシアルカン酸のモノマーに加えて、炭素数が７以上のモノマーを含んでいても良い。より好ましくは、モノヒドロキシアルカン酸としての３ＨＢ、３ＨＰ、および５ＨＶとジヒドロキシアルカン酸としての３，５−ＤＨＶの共重合体である。なお、３，５−ＤＨＶに含まれる２つのヒドロキシ基のうち、３位のヒドロキシ基が重合に使用される方が好ましい。
【００２５】
本発明のＰＨＡがジヒドロキシアルカン酸として３，６−ＤＨＨｘをモノマーユニットとして含有する場合、ＰＨＡにおける３，６−ＤＨＨｘの共重合比率（モノマーユニットとしての含量）の下限は、０．５モル％であることが好ましく、１モル％であることがより好ましく、１．２モル％であることがさらに好ましい。またその上限は、２０モル％であることが好ましく、１５モル％であることがより好ましく、１０モル％であることがさらに好ましく、８モル％であることが特に好ましい。ジヒドロキシアルカン酸として３，６−ＤＨＨｘをモノマーユニットとして含有する本発明のＰＨＡは、モノヒドロキシアルカン酸として３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、３ＨＨｘ、６ＨＨｘのいずれか一以上をモノマーユニットとして含有する共重合体であっても良い。また、ジヒドロキシアルカン酸として、３，６−ＤＨＨｘ以外に、３，５−ＤＨＶ、２，３−ＤＨＢ、および３，４−ＤＨＢのいずれか一以上をモノマーユニットとして含有する共重合体であっても良い。さらに、前記モノヒドロキシアルカン酸およびジヒドロキシアルカン酸のモノマーに加えて、炭素数が７以上のモノマーを含んでいても良い。より好ましくは、モノヒドロキシアルカン酸としての３ＨＢおよび４ＨＢとジヒドロキシアルカン酸としての３，６−ＤＨＨｘの共重合体である。なお、３，６−ＤＨＨｘに含まれる２つのヒドロキシ基のうち、３位のヒドロキシ基が重合に使用される方が好ましい。
【００２６】
上記のような３，５−ＤＨＶおよび／または３，６−ＤＨＨｘをモノマーユニットとして含有するＰＨＡを生産する方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（以下「Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子」という）およびＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（以下、「ＰＨＡ合成酵素遺伝子」という）を有する本発明の微生物（以下、「微生物Ａ」という）を、ε−カプロラクトンまたはδ−バレロラクトンを炭素源の少なくとも一部として使用して培養する方法が挙げられる。
【００２７】
微生物Ａは、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）および／または外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子およびＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する限り特に限定されないが、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが強化されていることが好ましい。ここで「Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの強化」とは、例えば、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現量を増強して宿主細胞あたりのＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの絶対量を増加すること、および／またはＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ１分子あたりの活性を高めることをいう。前記強化方法は特に限定されないが、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化する方法が好ましい。そのような遺伝子発現の強化方法としては、例えば内在性のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のプロモーターを強発現プロモーターに置換する方法、強発現プロモーターを該遺伝子の上流に挿入する方法、該遺伝子のプロモーターを一部改変する方法、が挙げられる。あるいは、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を、プラスミドで保持する形式、または染色体の任意の位置に導入する形式によって宿主細胞に導入しても良い。ただし、プラスミドで保持する形式の場合、培養中にプラスミドが脱落する可能性があるため、プラスミド保持の選択圧をかけながら培養しなければならない。したがって、染色体上に保持する形式がより好ましい。この際、導入するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、宿主由来であっても良いし、宿主以外の生物由来であっても良いし、あるいはそれらの遺伝子を人工的に改変した遺伝子であっても良い。さらに、導入するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は複数種あっても良い。
【００２８】
微生物Ａが有するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子であることが好ましい。一例として、宿主がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである場合、染色体上にはＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子としてｐｈａＪ４ａ、ｐｈａＪ４ｂ、およびｐｈａＪ４ｃの３つが存在する。これら３つの遺伝子のうち１つまたは複数についてその発現を強化すれば良い。発現強化方法の具体例として、ｐｈａＪ４ｂ直上流にｔｒｃプロモーターを挿入する方法がある。このようなプロモーターの挿入または置換の方法は、当該分野で公知の方法を用いれば良い。例えば、宿主となる微生物の染色体上に存在するＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の直上流に位置するプロモーターを別のプロモーターに置換する、または直上流に別のプロモーターを挿入するには、相同組換え法等が利用できる。ＤＮＡの挿入または置換の具体的な方法については、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の方法を参考にすれば良い。
【００２９】
さらに、微生物Ａは、内在性のＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが弱化されていることがより好ましい。ここで「Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの弱化」とは、例えば、Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（以下「Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子」という）の発現量を低減して宿主細胞あたりのＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの絶対量を減少すること、および／またはＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ１分子あたりの活性を低下することをいう。前記弱化方法は特に限定されないが、Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を全長にわたって、または部分的に、欠損する方法、またはＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子への塩基の付加、欠失、または置換によって発現するＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの機能が欠損する方法が好ましい。内在するＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の数は宿主によって異なり、また現時点で染色体上のＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が全て同定されていない場合もあるが、可能な限り弱化されていることが好ましい。
【００３０】
微生物Ａが有するＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子であることが好ましい。一例として、宿主がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである場合、少なくとも現時点では、染色体上のＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子として、ｆａｄＢ１、ｆａｄＢ２、ｆａｄＢ’の３つが存在することが報告されている。したがって、それらのうち一以上の遺伝子が欠損していることが好ましく、３つ全てが欠損していることが特に好ましい。染色体上の遺伝子機能を欠損させるための改変は、公知のＤＮＡ組換え技術を用いることで達成できる。例えば、相同組換え法によって、宿主の染色体上に存在するＳ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を全長または部分的に欠失させることができる。
【００３１】
微生物Ａは、内在性および／または外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物である。外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を保持する形式としては、プラスミドで保持する形式、または染色体の任意の位置に導入する形式のどちらであっても良い。本発明の微生物Ａが有するＰＨＡ合成酵素遺伝子が外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子である場合、当該ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、宿主と同じ種の微生物由来であっても良いし、宿主とは異なる種の微生物由来であっても良いし、またはそれらの遺伝子を人工的に改変した遺伝子であっても良い。導入する遺伝子は、複数あっても良い。
【００３２】
微生物Ａが有するＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子であることが好ましい。一例として、配列番号１に記載するアミノ酸配列からなる、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ（アエロモナス  キャビエ）由来で、かつ１４９番目のアスパラギンがセリンに、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンにそれぞれ人工的に置き換えられたＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を使用することができる。
【００３３】
微生物Ａの形質転換用宿主として用いる生物種は、微生物であれば特に限定されない。細菌、または真菌のいずれであっても良い。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（アルカリゲネス）属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ（アルロクロマチウム）属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（アゾリゾビウム）属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ（アゾトバクター）属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア）属、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ（カウロバクター）属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（クロモバクテリウム）属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ（コマモナス）属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（カプリアビダス）属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ（エクトチオドスピラ）属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（メチロバクテリウム）属、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）属、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ（パラコッカス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（リゾビウム）属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ（ロドバクター）属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（ロドスピリルム）属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（リケッチア）属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（シノリゾビウム）属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（スフィンゴモナス）属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（シネコシスティス）属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ（チオコッカス）属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ（チオキスチス）属、Ｖｉｂｒｉｏ（ビブリオ）属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ（ウォーテルシア）属、またはＺｏｏｇ／Ｌｏｅａ（ゾオグ／ロエア）属に属する微生物が挙げられる。中でもＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属等に属する微生物が好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物がより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物がさらに好ましい。微生物Ａの形質転換用宿主として特に好ましい微生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒである。
【００３４】
上記微生物Ａを、δ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトン存在下で培養することで、３，５−ＤＨＶおよび／または３，６−ＤＨＨｘをジヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有するＰＨＡを生産することができる。この場合の、δ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトンの培養液中の濃度は特に限定されないが、例えば０．１ｇ／Ｌ以上あれば良く、０．５ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。一方、培養液中のδ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトン濃度が高くなると、微生物の生育やＰＨＡの生産に悪影響が出る可能性があることから、その上限は、５ｇ／Ｌであることが好ましく、４ｇ／Ｌであることがより好ましく、３ｇ／Ｌであることがさらに好ましく、２．５ｇ／Ｌであることが特に好ましい。また、この悪影響を緩和する方法として、例えば微生物Ａをフルクトースなどの炭素源である程度増殖させた後に、δ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトンを所定量添加して培養を行うこともできる。あるいは、δ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトンを段階的、あるいは連続的に添加することで、培養液中のδ−バレロラクトンおよび／またはε−カプロラクトン濃度をより低位に抑えることもできる。
【００３５】
ＰＨＡが２，３−ＤＨＢおよび／または３，４−ＤＨＢをジヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有する場合、２，３−ＤＨＢの共重合比率は、０．０５モル％以上であることが好ましく、０．１モル％以上であることがより好ましく、０．２モル％以上であることがさらに好ましく、０．３モル％以上であることが特に好ましい。また２，３−ＤＨＢの共重合比率の上限は、１５モル％であることが好ましく、１０モル％であることがより好ましく、８モル％であることがさらに好ましく、６モル％であることが特に好ましい。
【００３６】
ＰＨＡが３，４−ＤＨＢをジヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有する場合、他にどのようなモノマーユニットを含んでも良いが、モノヒドロキシアルカン酸の共重合比率は５０モル％以上であることが好ましい。特にモノヒドロキシアルカン酸が３ＨＢの場合、その共重合比率は、５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましい。３，４−ＤＨＢの共重合比率の下限は、０．０５モル％であることが好ましく、０．０８モル％であることがより好ましく、０．１モル％であることがさらに好ましい。また３，４−ＤＨＢの共重合比率の上限は、１０モル％であることが好ましく、８モル％であることがより好ましく、６モル％であることがさらに好ましく、５モル％であることが特に好ましい。
【００３７】
ジヒドロキシアルカン酸として、２，３−ＤＨＢおよび／または３，４−ＤＨＢをモノマーユニットとして含有し、かつ３ＨＢをモノヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有するＰＨＡにおいては、例えば、３ＨＢと２，３−ＤＨＢからなる共重合体、３ＨＢと３，４−ＤＨＢからなる共重合体、および３ＨＢと２，３−ＤＨＢおよび３，４−ＤＨＢからなる共重合体が挙げられる。それ以外のモノマーとして、例えば３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、３ＨＨｘ、６ＨＨｘなどのモノマーを含んでいても良いし、さらに炭素数が６より多いモノマーを含んでいても良い。より好ましくは、３ＨＢ、３ＨＶ、および２，３−ＤＨＢの３つのモノマーからなる共重合体、または３ＨＢ、３ＨＶ、２，３−ＤＨＢ、および３，４−ＤＨＢの４つのモノマーからなる共重合体である。なお、２，３−ＤＨＢや３，４−ＤＨＢに含まれる２つのヒドロキシ基のうち、どちらが重合に使用されても良い。結果として、どちらか片方が重合に使用され、もう一方が遊離のヒドロキシ基となる。また、重合に使用されるヒドロキシ基が異なる２，３−ＤＨＢや３，４−ＤＨＢが混在していても良い。
【００３８】
このような２，３−ＤＨＢおよび／または３，４−ＤＨＢをヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有するＰＨＡを生産する方法としては特に限定されないが、例えば、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子（以下、「プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子」という）、βケトチオラーゼをコードする遺伝子（以下、「βケトチオラーゼ遺伝子」という）、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子（以下、「Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子」という）、およびＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する本発明の微生物（以下、「微生物Ｂ」という）を、炭素源の一部として少なくともグリコール酸を使用して培養することで、上記ＰＨＡを生産することができる。
【００３９】
微生物Ｂは、内在性および／または外来性のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、βケトチオラーゼ遺伝子、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する限り、特に限定されないが、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の発現が強化されていることが好ましい。プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の発現強化方法は特に限定されないが、例えば内在性のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターをより強発現プロモーターに置換する方法、該プロモーターに人為的改変を加えて発現強度を高める方法、外来性のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を適当なプロモーターに連結し、宿主である微生物Ｂに導入する方法が挙げられる。宿主細胞に導入する形式としては、プラスミドで保持する形式、または染色体上の任意の場所に挿入する形式が挙げられる。プロモーターは、例えば配列番号２に記載する塩基配列からなるｔｒｃプロモーターや、配列番号３に記載する塩基配列からなるｔａｃＩプロモーターを使用することができる。外来性のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主と同じ種の微生物由来、宿主とは異なる種の微生物由来、またはそれらの遺伝子を人工的に改変した遺伝子であっても良い。さらに、導入する遺伝子は複数あっても良い。
【００４０】
微生物Ｂが有するプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子としては、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ（メガスフェラ）属由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子であることが好ましい。一例として、配列番号４記載のアミノ酸配列からなる、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｅｄｅｎｉｉ（メガスフェラ  エルスデニイ）由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を使用することができる。このような遺伝子の導入、置換の方法は、当該分野で公知の方法を用いれば良い。例えば、宿主となる微生物Ｂの染色体上に存在するプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の直上流にあるプロモーターを置換、または直上流に別のプロモーターを挿入するには、相同組換え法等が利用できる。ＤＮＡの挿入または置換の具体的な方法については、前述のＧｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．（２０１２）を参考にすれば良い。
【００４１】
さらに、微生物Ｂは、βケトチオラーゼ遺伝子の発現が強化されていることがより好ましい。βケトチオラーゼ遺伝子についても、前述のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子と同様の方法で、発現を強化することが好ましい。導入するβケトチオラーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号５記載のアミノ酸配列からなる、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のβケトチオラーゼをコードする遺伝子（ｂｋｔＢ）を使用することができる。
【００４２】
また、微生物Ｂは、Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現が強化されていることがより好ましい。Ｒ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子についても、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子と同様の方法で、発現を強化することが好ましい。導入するＲ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子としては、例えば、配列番号６記載のアミノ酸配列からなる、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のＲ体特異的アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＢ）を使用することができる。
【００４３】
微生物Ｂは、内在性および／または外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物である。外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子を保持する形式としては、プラスミドで保持する形式、または染色体の任意の位置に導入する形式のどちらであっても良い。微生物Ｂが有するＰＨＡ合成酵素遺伝子が外来性のＰＨＡ合成酵素遺伝子である場合、当該ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、宿主と同じ種の微生物由来、宿主とは異なる種の微生物由来、またはそれらの遺伝子を人工的に改変した遺伝子であっても良い。導入する遺伝子は複数あっても良い。微生物Ｂが有するＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、炭素数３〜６のモノヒドロキシアルカン酸ＣｏＡを基質とする任意のＰＨＡ合成酵素遺伝子を使用することができる。
【００４４】
前記微生物Ｂの形質転換用宿主として用いる生物種は、微生物であれば特に限定されない。細菌、または真菌のいずれであっても良い。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属、Ｚｏｏｇ／Ｌｏｅａ属に属する微生物が挙げられる。中でもＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属等に属する微生物が好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物がより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物がさらに好ましい。微生物Ｂの形質転換用宿主として特に好ましい微生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００４５】
上記本発明の微生物Ｂを、グリコール酸存在下で培養することで、２，３−ＤＨＢおよび／または３，４−ＤＨＢをジヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットとして含有するＰＨＡを生産することができる。この場合の、グリコール酸の培養液中の濃度は特に限定されないが、例えば１ｇ／Ｌ以上あれば良く、２ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。また、その上限としては、１５ｇ／Ｌであることが好ましく、１０ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００４６】
本発明のＰＨＡを上述した微生物Ａまたは微生物Ｂを用いて生産する場合、培養時の炭素源としては、上記ε−カプロラクトンまたはδ−バレロラクトン、あるいはグリコール酸以外に、微生物Ａまたは微生物Ｂが資化可能な炭素源を併用することもできる。そのような炭素源は、特に限定されないが、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロースなどの糖類、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂、その分画油類もしくはその精製副産物、またはラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸、それらの誘導体等が好ましい。また、酵母エキスやポリペプトンなども使用することができる。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂、またはパーム油やパーム核油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、もしくはパーム核油オレインである。食糧との競合を避ける観点から、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）、ＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、または菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等は特に好ましい。
【００４７】
一方で、微生物Ａが、Ｓ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを一部欠損する場合、β酸化の全欠損または部分欠損により、微生物Ａが各種トリグリセリドや脂肪酸蒸留物に含まれる脂肪酸を資化できない場合がある。このような場合には、上記糖類を炭素源として用いることが好ましく、グルコース、フルクトースまたはスクロースを用いることがより好ましく、グルコースまたはフルクトースを用いることがさらに好ましく、フルクトースを用いることが特に好ましい。
【００４８】
微生物Ａまたは微生物Ｂによる本発明のＰＨＡの生産においては、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、およびその他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４９】
培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、微生物Ａまたは微生物Ｂにおいて通常使用される培養条件で良い。
【００５０】
本発明において、微生物菌体からＰＨＡを回収する方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００５１】
なお、本発明のＰＨＡは、上記微生物による生産に限定されず、例えば化学重合法等を利用することによっても生産できる。
【００５２】
上記本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物は、単独で、または、他のポリマーと混合して、適宜所望の形状に成形することにより成形体とすることができる。その際、当該樹脂組成物には、さらに必要に応じて、酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤、結晶核剤などを添加しても良い。また、本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物にさらに分子間反応やグラフト鎖導入、架橋などの処理を行っても良い。成形加工方法としては従来公知の方法で良く、例えば射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などが挙げられる。前記成形体は、例えば各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料等に用いることができる。
【００５３】
本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物は、例えば、細胞足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ、スキャフォールド）を形成するための材料（細胞足場用材料）としても好ましく使用し得る。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物もしくは上記成形体を含む細胞足場材料、または本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物もしくは上記成形体の細胞足場材料としての使用に関する。細胞足場材料と使用することができる本発明のＰＨＡの種類は特に限定しないが、例えば３ＨＢ、３ＨＶ、および２，３−ＤＨＢの３つのモノマーからなる共重合体を使用することができる。
【００５４】
本明細書において、「細胞足場材料」とは、細胞が当該材料と接することによって、細胞の接着、増殖、分化、活性化、移動、遊走、形態変化等の様々な機能が発現および／または促進される材料を意味する。
【００５５】
本発明の樹脂組成物を含む細胞足場材料は、適度な親水性と良好な機械物性を有し、かつ重大な細胞毒性を有しないことから、細胞の増殖、活性化、分化誘導、もしくは定着、または組織や臓器の形成、修復、もしくは接着等に利用することができ、特に、心臓血管や軟部組織のマトリクスとして使用できる可能性を有する。
【００５６】
本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物を含む細胞足場材料は、公知の方法により製造することが可能である。例えば、細胞足場材料は、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９９，４４，４４６−４５５．で記載された通りに製造することができる。例えば、細胞足場材料は、本発明のＰＨＡからなる樹脂組成物を、１，４−ジオキサン中に溶解させ、得られた溶液を凍結し、その後凍結乾燥によって溶媒を除去し、必要に応じて減圧乾燥によって残存する溶媒をさらに除去することで得ることができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、菌株の育種、ＰＨＡのモノマー組成分析、ＰＨＡの結晶化の評価方法、ＰＨＡフィルムの水接触角の評価方法は以下の通りである。【００５８】
（菌株の育種）
本明細書の実施例、製造例、および比較例における遺伝子操作は、前述のＧｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．（２０１２）に記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従って使用することができる。なお、実施例等に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００５９】
（ＰＨＡに含まれるモノマーの共重合比率の分析）
実施例１〜４、および比較例１〜３について、得られたＰＨＡに含まれるモノマーの共重合比率は、ＮＭＲを用いて分析した。得られたＰＨＡ２ｍｇを重クロロホルム２ｍＬに溶かし、試料管に移して測定に供した。検出された各ピークの面積から、モノマーユニットの共重合比率を算出した。【００６０】
実施例５〜８については、ガスクロマトグラフィーを用いてモノマーの共重合比率を測定した。まず、５〜１５ｍｇの乾燥菌体にメタノール１．７ｍＬ、濃硫酸０．３ｍＬ、およびクロロホルム２ｍＬを添加し、１００℃で１４０分間加熱することにより、各モノマーユニットをメチルエステル化した。反応液を室温まで冷却した後、水１ｍＬを添加して、ボルテックスミキサーにより激しく懸濁した。室温にて１０分間静置することにより二相に分離させて、下層のクロロホルム層のみを回収した。回収したクロロホルム層をフィルターろ過に供し、得られた溶液０．５ｍＬを内標準溶液０．５ｍＬ（０．１％オクタン酸メチルを含有するクロロホルム溶液）と混和した後、サンプルバイアルに移液し、ガスクロマトグラフィーに供した。前記ガスクロマトグラフとしては島津社製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムにはＮｅｕｔｒａ  Ｂｏｎｄ−１（カラム長：３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）（アジレント社製）を使用し、水素炎イオン化型検出器にて検出した。検出された各ピークの面積から、モノマーユニットの共重合比率を算出した。【００６１】
（ＰＨＡの結晶化の評価）
得られたＰＨＡの結晶化は、示差走査熱量計を用いて測定を行うことにより評価した。示差走査熱量測定において、２〜５ｍｇのＰＨＡを５℃から１７０℃まで１０℃／分で昇温して５分間保持したあと、１７０℃から５℃まで１０℃／分で冷却した。その後、５℃で５分間保持した後、再度１７０℃まで１０℃／分で昇温した。冷却時に得られた発熱曲線における結晶化ピーク温度（Ｔｃ）および結晶化発熱量（Ｈｃ）から結晶化のし易さを評価した。結晶化ピーク温度（Ｔｃ）が高く、結晶化発熱量（Ｈｃ）が大きいほど結晶化が優れている。また、２回目の昇温時に得られた吸熱曲線において、溶融ピークのピークトップの温度を融点（Ｔｍ）とした。【００６２】
また、結晶核の形成速度を偏光顕微鏡を用いて評価した。まず、約１〜２ｍｇのＰＨＡをスライドガラスに乗せ、２００℃で５分間加熱した。その後、サンプルを５５℃のステージに移し、結晶核の形成を目視で観察した。結晶核形成時間が短いほど、結晶化が優れている。【００６３】
（ＰＨＡフィルムの水接触角の評価）
ＰＨＡフィルムは、ＰＨＡをクロロホルムに溶解し、ガラスシャーレ上でクロロホルム溶液を揮発させる方法で調製した。このＰＨＡフィルムを用いて、水接触角を液滴法（Ｓｅｓｓｉｌｅ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。測定は、接触角計（協和界面科学社製Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ  ＤＭｅ−２０１）を使用して行い、１０回の測定結果の平均値を示した。【００６４】
＜製造例１：ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株の作製＞
まず、染色体上のｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流にｐｈａＪ４ｂ遺伝子の発現を強化するための発現調節配列を挿入することを目的とし、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の直上流に発現調節配列を挿入するためのプラスミドを作製した。Ｃ．  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７および配列番号８で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いた。同様に、配列番号９および配列番号１０で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を鋳型とし、配列番号１１および配列番号１２で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７および配列番号１２で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を用いて連結し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｃプロモーター、ｐｈａＣ１  ＳＤ配列、およびｐｈａＪ４ｂ遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【００６５】
次に、プロモーターおよびＳＤ配列挿入株の作製を行った。ＤＮＡ挿入用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入し、ＫＮＫ−００５  ΔｐｈａＺ１，２，６株（ＷＯ２０１４／０６５２５３号参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ−００５  ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号１３に記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する菌株である。【００６６】
上記接合伝達後の菌株から、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム ７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがＫＮＫ−００５株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株から染色体上のｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流に配列番号１４で示される、ｔｒｃプロモーターおよびｐｈａＣ１  ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株をＰＣＲにより選別し、うち１株をＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６株は、ＫＮＫ−００５  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子上流にｔｒｃプロモーターおよびｐｈａＣ１  ＳＤ配列が挿入された菌株である。【００６７】
次にｆａｄＢ１遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５および配列番号１６で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。同様に配列番号１７および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１５および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｆａｄＢ１遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ１を作製した。【００６８】
上記プロモーターおよびＳＤ配列の挿入と同様の方法で、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ１を用いてｆａｄＢ１遺伝子の破壊を行った。得られた株はＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１株と命名した。ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１株は、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｆａｄＢ１遺伝子を全長欠失した菌株である。【００６９】
さらにｆａｄＢ’遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。同様に配列番号２１および配列番号２２で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１９および配列番号２２で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｆａｄＢ’遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ’を作製した。【００７０】
上記プロモーターおよびＳＤ配列の挿入と同様の方法で、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１株を親株とし、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ’を用いてｆａｄＢ’遺伝子の破壊を行った。得られた株はＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ’株と命名した。ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ’株は、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１株を親株とし、ｆａｄＢ’遺伝子を全長欠失した菌株である。【００７１】
さらにｆａｄＢ２遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４で示したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。同様に配列番号２５および配列番号２６で示したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２３および配列番号２６で示したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｆａｄＢ２遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ２を作製した。【００７２】
上記プロモーターおよびＳＤ配列の挿入と同様の方法で、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ’株を親株とし、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ−ΔｆａｄＢ２を用いてｆａｄＢ２遺伝子の破壊を行った。得られた株はＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株と命名した。ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株は、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ’株を親株とし、ｆａｄＢ２遺伝子を全長欠失した菌株である。【００７３】
＜実施例１：δ−バレロラクトンを１ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
製造例１で得られたＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を以下の条件で培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。【００７４】
（培養）
菌株は以下のように培養した。
前培養培地の組成は、１０ｇ／Ｌ  Ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、９ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８とした。【００７５】
ＰＨＡ生産培地の組成は、１１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＬ／Ｌ  マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ  微量金属塩溶液とした。マグネシウム溶液は、水に２００ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１６．２ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１０．３ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１１８ｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶かして調製した。【００７６】
菌株のグリセロールストック溶液５０μＬを前培養培地１０ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。【００７７】
ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地５０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を２５０μＬ、微量金属溶液を５０μＬ、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース溶液を３．１２５ｍＬ添加し、さらにδ−バレロラクトンを１ｇ／Ｌとなるように添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μL接種し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。【００７８】
（精製）
培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、水で懸濁した後、終濃度３％（ｗ／ｖ）となるようにラウリル硫酸ナトリウムを添加した。調製した菌体溶液を、氷冷しながら超音波で処理し、菌体を破砕した。破砕菌体溶液から遠心分離によってＰＨＡを沈殿として回収し、水およびエタノールで１回ずつ洗浄した後、沈殿を６０℃で２時間真空乾燥して、精製ＰＨＡとして取得した。【００７９】
得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、結果を以下の表１に示した。
【表１】
2017033652.tif 000003
【００８０】
また、得られたＰＨＡの構造を以下の式（Ｉ）および図１に示した。
【化１】
2017033652.tif 000004
【００８１】
＜実施例２：δ−バレロラクトンを２．５ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
実施例１と同様に、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。ただし、添加するδ−バレロラクトンの終濃度は２．５ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析、および結晶化の評価を行った。得られた結果を前記表１および以下の表２に示した。
【表２】
2017033652.tif 000005
【００８２】
なお、得られたＰＨＡの構造は前記式（I）および図１に示した通りである。【００８３】
＜実施例３：ε−カプロラクトンを１ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
実施例１と同様に、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。ただし、δ−バレロラクトンの代わりにε−カプロラクトンを終濃度１ｇ／Ｌとなるように添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、結果を前記表１に示した。      【００８４】
また、得られたＰＨＡの構造を以下の式（ＩＩ）および図２に示した。
【化２】
2017033652.tif 000006
【００８５】
＜実施例４：ε−カプロラクトンを２．５ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
実施例３と同様に、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。ただし、添加するε−カプロラクトンの終濃度は２．５ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析、および結晶化の評価を行った。得られた結果を前記表１および表２に示した。【００８６】
なお、得られたＰＨＡの構造は前記式（ＩＩ）および図２に示した通りである。【００８７】
＜比較例１：ラクトン類を含有しない培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
実施例１と同様に、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。ただし、δ−バレロラクトンを添加しない培地を使用した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、結果を前記表１に示した。【００８８】
なお、得られたＰＨＡの構造を以下の式（ＩＩＩ）および図３に示した。
【化３】
2017033652.tif 000007
【００８９】
＜比較例２：γ-ブチロラクトンを２．５ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株によるＰＨＡの生産＞
実施例１と同様に、ＫＮＫ−００５  Ｐｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ  ΔｐｈａＺ１，２，６  ΔｆａｄＢ１，Ｂ２，Ｂ’株を培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。ただし、δ−バレロラクトンの代わりにγ−ブチロラクトンを終濃度２．５ｇ／Ｌとなるように添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、その結果を前記表１に示した。【００９０】
なお、得られたＰＨＡの構造を以下の式（IＶ）および図４に示した。
【化４】
2017033652.tif 000008
【００９１】
＜比較例３：ＫＮＫ−６３１株による、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）の生産＞
培養生産にはＫＮＫ−６３１株（ＷＯ２００９／１４５１６４参照）を用いた。
培養は以下のように行った。種母培地の組成は１０ｇ／Ｌ  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ、２ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、９ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）、５０μｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩とした。【００９２】
前培養培地の組成は１１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１２．９ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２５ｇ／Ｌ  パーム核油オレイン、５ｍＬ／Ｌ  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、とした。【００９３】
ＰＨＡ生産培地の組成は３．８５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．６７ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＬ／Ｌ  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１６ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．５ｇ／Ｌ  ＢＩＯＳＰＵＭＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源としてはパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを用いた。流加用のリン酸塩水溶液としては、４０ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、６．９ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、となるよう調製したものを用いた。【００９４】
ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００９５】
次に、ＰＨＡの生産培養は４．３Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は培養全般を通じ、パーム核油オレインを、比基質供給速度が０．１〜０．１２（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）−１×（ｈ）−１となるように流加した。ここで、比基質供給速度とは、単位時間に正味の菌体重量あたり供給される油脂の量、つまり、正味の乾燥菌体重量あたりの油脂流加速度として定義される培養変数である。また、正味の乾燥菌体重量とは、全乾燥菌体重量から含有するポリエステル重量を差し引いた乾燥菌体重量である。すなわち、比基質供給速度は上記の式より求められる値である。【００９６】
また、リン酸塩水溶液を培養２０時間目以降、Ｃ／Ｐ比が６００〜８００となるような流速にて連続的に添加した。培養は約６４時間行った。【００９７】
菌体からのＰＨＡの精製、モノマーユニットの共重合比率の分析、および結晶化の評価は、実施例１と同様の方法で行い、その結果を前記表１、表２に示した。また、接触角の測定結果を表４に示した。【００９８】
また、得られたＰＨＡの構造を以下の式（Ｖ）および図５に示した。
【化５】
2017033652.tif 000009
【００９９】
（結果と考察）
表１の結果から、δ−バレロラクトンを添加して培養した場合には、式Ｉおよび図１に示す３ＨＢ、３ＨＰ、５ＨＶ、３，５−ＤＨＶの４つのモノマーユニットからなる共重合ＰＨＡが生産されることが分かった。また、３ＨＢ以外の３つの共重合比率については、添加するδ−バレロラクトンの量に応じて変化した。また、ε−カプロラクトンを添加して培養した場合には、式ＩＩおよび図２に示す３ＨＢ、４ＨＢ、３，６−ＤＨＨｘの３つのモノマーユニットからなる共重合ＰＨＡが生産されることが分かった。δ−バレロラクトンを用いた場合と同様に、添加するε−カプロラクトンの量に応じて、４ＨＢや３，６−ＤＨＨｘの共重合比率が変化した。【０１００】
一方、比較例１のように、ラクトンを添加しない場合には、式ＩＩＩおよび図３に示す３ＨＢのみからなるＰＨＡが生産された。また、比較例２のように、γ−ブチロラクトンを添加した場合には、式ＩＶおよび図４に示すように４ＨＢは導入されたものの、側鎖にヒドロキシ基を有するモノマーはＰＨＡに導入されなかった。【０１０１】
また、得られたＰＨＡの結晶性評価結果を前記表２に示した。一般に、３ＨＢを主成分とするＰＨＡの場合、３ＨＢ以外のモノマーユニットが増えると結晶性は低下するため、３ＨＢの共重合比率がほぼ同程度である、実施例２、実施例４、比較例３の３サンプルで比較した。まず示差走査熱量測定において、実施例２および実施例４は比較例３と比べてＴｃ、Ｈｃが高いことが分かった。また結晶核形成についても、実施例２および実施例４は比較例３と比べて短時間で結晶核の形成が認められた。また、実施例２は比較例３より高いＴｍを示した。これらの結果から、ＰＨＡにヒドロキシ基含有モノマーを構成成分として導入すれば、溶融樹脂加工時の樹脂の固化が速くなり、実用上の耐熱温度が高くなることが明らかとなった。【０１０２】
＜製造例２：Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製＞
まずｐｈａＺ６遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７および配列番号２８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いた。同様に配列番号２９および配列番号３０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２７および配列番号３０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を用いて連結し、ｐｈａＺ６構造遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）を作製した。【０１０３】
次に遺伝子破壊株の作製を行った。遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）を大腸菌Ｓ１７−１株に導入し、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【０１０４】
上記接合伝達後の菌株から、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株からｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを全長欠失したものをＰＣＲにより選別し、うち１株をＨ１６  ΔｐｈａＺ６株と命名した。Ｈ１６  ΔｐｈａＺ６株は、染色体上のｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失した菌株である。【０１０５】
次にｐｈａＺ１遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１および配列番号３２で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。同様に配列番号３３および配列番号３４で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号３１および配列番号３４で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ１構造遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を作製した。【０１０６】
ｐｈａＺ６遺伝子破壊と同様に、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を用いてｐｈａＺ１遺伝子の破壊を行った。得られた株はＨ１６  ΔｐｈａＺ１，６株と命名した。Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，６株株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失した菌株である。【０１０７】
次にｐｈａＺ２遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３５および配列番号３６で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。同様に配列番号３７および配列番号３８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種ＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号３５および配列番号３８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉIで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＺ２構造遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を作製した。【０１０８】
ｐｈａＺ６遺伝子破壊と同様に、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を用いてｐｈａＺ２遺伝子の破壊を行った。得られた株はＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。【０１０９】
＜製造例３：プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＢＢＲ−ｐｃｔの作製＞
プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＢＢＲ−ｐｃｔは以下のように構築した。まず、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｅｄｅｎｉｉ由来のｐｃｔ遺伝子について、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒでの発現のために塩基配列を最適化した。この配列に、配列番号４６で示す塩基配列からなる、リボソーム結合部位およびリンカー配列（ＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣ）を連結した配列を設計し、配列番号３９に記載したＤＮＡ断片を化学的に合成した。合成したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＢＲ−ＭＣＳ２（非特許文献、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９４，  ｖｏｌ．１６，  ｐ．８００−８０２参照）の該当部位に挿入して、プラスミドｐＢＢＲ−ｐｃｔを得た。【０１１０】
＜製造例４：βケトチオラーゼおよびプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔの作製＞
βケトチオラーゼおよびプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔは以下のように構築した。まずＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４０および配列番号４１で示したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢＢＲ−ｐｃｔの該当部位に挿入して、プラスミドｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔを得た。【０１１１】
＜製造例５：Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とする、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはβケトチオラーゼの導入株の作製＞
プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはβケトチオラーゼの発現が強化された菌株の取得を目的とし、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、製造例３および製造例４記載のプラスミドのいずれかを導入した菌株を作製した。【０１１２】
まず、ｐＢＢＲ−ｐｃｔおよびｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔを大腸菌Ｓ１７−１に導入し、Ｓ１７−１／ｐＢＢＲ−ｐｃｔおよびＳ１７−１／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔを作製した。Ｓ１７−１／ｐＢＢＲ−ｐｃｔおよびＳ１７−１／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔを、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム）３ｍＬに接種し、３７℃で一晩振盪培養を行った。得られた培養液のうち０．４ｍＬをチューブに移し、遠心分離後に上清を廃棄し、菌体をＬＢ培地０．１ｍＬに懸濁して大腸菌溶液を得た。【０１１３】
次に、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地３ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養液０．１ｍＬを上記大腸菌溶液０．１ｍＬと混合し、メンブレンフィルター（アドバンテック社製、Φ＝０．２μｍ）を乗せたＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地に塗布した。３０℃で６〜８時間インキュベートした後、メンブレンフィルターを回収し、０．８％塩化ナトリウム溶液（シグマ社製）１ｍＬで洗浄して、フィルター上の菌体を回収した。得られた菌体液０．２ｍＬを２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地に塗布した。３０℃で３日間培養し、得られたコロニーから各プラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ、およびＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔと命名した。【０１１４】
＜実施例５：グリコール酸を１０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ株によるＰＨＡの生産＞
製造例５で得られたＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ株を、以下の条件で培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。【０１１５】
（培養）
菌株は以下のように培養した。
前培養培地の組成は、１０ｇ／Ｌ  Ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、２ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔとした。ＰＨＡ生産培地の組成は、９ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＬ／Ｌ  マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ  微量金属溶液とした。マグネシウム溶液は、水に０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、９．７ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、７．８ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．１１８ｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１５６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを溶かして調製した。【０１１６】
なお各培地は、直前にカナマイシンを２５０ｍｇ／Ｌの濃度になるように添加してから使用した。【０１１７】
菌株のグリセロールストック溶液５０μＬを前培養培地１０ｍＬに接種し、３０で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地９０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を０．１ｍＬ、微量金属溶液を０．１ｍＬ、１００ｇ／Ｌ  グリコール酸溶液を１０ｍＬ添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μL接種し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。【０１１８】
（精製）
培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、水で３回洗浄した後、ＥＹＥＬＡ社製凍結乾燥機ＦＤＵ−２１００を用いて菌体を凍結乾燥した。得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍＬになるまで濃縮後、約９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、精製ＰＨＡとして取得した。【０１１９】
得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、その結果を表３に示した。
【表３】
2017033652.tif 000010
【０１２０】
また、得られたＰＨＡの構造を以下の式（ＶＩ）および図６に示した。
【化６】
2017033652.tif 000011
【０１２１】
＜実施例６：グリコール酸を１０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔ株によるＰＨＡの生産＞
製造例５で得られたＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔ株を、実施例５と同様の条件で培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、その結果を前記表３に示した。【０１２２】
なお、得られたＰＨＡの構造は前記式（ＶＩ）および図６に示した通りである。【０１２３】
＜製造例６：Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製＞
まず、ｐｈａＡ遺伝子の破壊を目的とし、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７および配列番号４８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いた。次に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ社製）を用いて得られたＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（非特許文献、Ｇｅｎｅ，  １９９４，  ｖｏｌ．１４５，  ｐ．６９−７３参照）をＳｍａＩで消化したＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を用いて連結した。得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号４９および配列番号５０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて得られたＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化し、その後ＤＮＡリガーゼによってセルフライゲーションさせることにより、ｐｈａＡ構造遺伝子より上流および下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドｐＫ１８ΔｐｈａＡを作製した。【０１２４】
製造例１のｐｈａＺ６遺伝子破壊と同様に、製造例１で作製したＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｐＫ１８ΔｐｈａＡを用いてｐｈａＡ遺伝子の破壊を行った。得られた株はＨ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＡ遺伝子、ｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。【０１２５】
＜製造例７：Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とする、プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼの導入株の作製＞
プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が強化された菌株の取得を目的とし、Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、製造例３記載のプラスミドを導入した菌株を作製した。プラスミドの導入は、製造例５と同様の方法で行った。得られた菌株を、Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ株と命名した。【０１２６】
＜実施例７：グリコール酸を１０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ株によるＰＨＡの生産＞
製造例７で得られたＨ１６  ΔｐｈａＡ  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｐｃｔ株を、実施例５と同様の条件で培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、その結果を前記表３に示した。また、接触角の測定結果を表４に示した。
【表４】
2017033652.tif 000012
【０１２７】
なお、得られたＰＨＡの構造は以下の式（ＶＩＩ）および図７に示した。
【化７】
2017033652.tif 000013
【０１２８】
＜製造例８：βケトチオラーゼおよびプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢの作製＞
βケトチオラーゼおよびプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入用プラスミドｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢは以下のように構築した。まず製造例３で作製したｐＢＢＲ−ｐｃｔを鋳型とし、配列番号４２および配列番号４３で示したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（ライフテクノロジーズ社製）のクローニングサイトに挿入して、プラスミドｐＴｒｃ−ｐｃｔを得た。【０１２９】
さらにＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４４および配列番号４５で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いた。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＸｂａＩで消化し、ｐＴｒｃ−ｐｃｔのクローニングサイトに挿入して、プラスミドｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢを得た。【０１３０】
＜製造例９：大腸菌ＪＭ１０９株を親株とする、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣＡＢオペロン、βケトチオラーゼおよびプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ導入株の作製＞
まず、大腸菌を用いてＰＨＡを生産するため、大腸菌ＪＭ１０９株（ライフテクノロジーズ社製）を親株として、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣＡＢオペロン（非特許文献、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００１，  ｖｏｌ．１９８，  ｐ．６５−７１参照）を導入した菌株を作製した。形質転換はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ記載の塩化カルシウム法で行った。得られた菌株はＪＭ１０９／ｐＢＢＲ−ＣＡＢと命名した。【０１３１】
さらにプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびβケトチオラーゼの発現が強化された菌株の取得を目的とし、ＪＭ１０９／ｐＢＢＲ−ＣＡＢ株を親株として、製造例８で作製したプラスミドｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢを導入した菌株を作製した。形質転換はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ記載の塩化カルシウム法で行った。得られた菌株はＪＭ１０９／ｐＢＢＲ−ＣＡＢ＋ｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢと命名した。【０１３２】
＜実施例８：グリコール酸を５ｇ／Ｌ含有する培地における、ＪＭ１０９／ｐＢＢＲ−ＣＡＢ＋ｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢ株によるＰＨＡの生産＞
製造例９で得られたＪＭ１０９／ｐＢＢＲ−ＣＡＢ＋ｐＴｒｃ−ｐｃｔ−ｂｋｔＢ株を、以下の条件で培養、精製し、精製ＰＨＡを取得した。【０１３３】
（培養）
菌株は以下のように培養した。培地はＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム）を用い、直前にカナマイシン、およびアンピシリンを１００ｍｇ／Ｌの濃度になるように添加してから使用した。【０１３４】
まず菌株のグリセロールストック溶液５０μＬをＬＢ培地１０ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＬＢ培地９５ｍＬを入れ、前培養液を５００μＬ接種して、３７℃で振盪培養を行った。ＯＤが０．６に到達した時点でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、さらに１００ｇ／Ｌ  グリコール酸溶液を５ｍＬ添加して、培養温度を３０℃に変更して培養を継続した。培養は７２時間実施した。【０１３５】
（精製）
精製は、実施例５と同様の方法により行った。【０１３６】
得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行い、その結果を前記表３に示した。【０１３７】
なお、得られたＰＨＡの構造を以下の式（ＶＩＩＩ）および図８に示した。
【化８】
2017033652.tif 000014
【０１３８】
＜比較例４：フルクトースを１０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔ株によるＰＨＡの生産＞
実施例６と同様に、製造例５で作製したＨ１６  ΔｐｈａＺ１，２，６／ｐＢＢＲ−ｂｋｔＢ−ｐｃｔ株を培養し、菌体から精製ＰＨＡを取得した。ただし、グリコール酸の代わりに、フルクトースを１０ｇ／Ｌとなるように添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーの共重合比率の分析を行った。その結果を前記表３に示した。【０１３９】
(結果と考察）
表３の結果から、グリコール酸を添加して培養した場合には、３ＨＢ、３ＨＶ、２，３−ＤＨＢ、３，４−ＤＨＢからなる共重合ＰＨＡが生産されることが明らかとなった。２，３−ＤＨＢ、および３，４−ＤＨＢは、重合反応に利用できるヒドロキシ基が２個あるため、異なる２種類の重合様式でＰＨＡ中に取り込まれていた。【０１４０】
また実施例５と実施例７の比較から、ｐｈａＡ遺伝子破壊によりジヒドロキシアルカン酸の共重合比率が向上したことが分かる。これは、ＰｈａＡと比べてＢｋｔＢの方が炭素数の多い基質に対する特異性が高く、アセチルＣｏＡとグリコリルＣｏＡの縮合を触媒しやすいためと考えられる。【０１４１】
一方、同じ菌株を使用しても、比較例４のグリコール酸を使用しないフルクトース含有培地で培養をした場合には、ＰＨＡは、表３で示すように３ＨＢのみからなるＰＨＢが生産され、側鎖にヒドロキシ基を有するモノマーはＰＨＡに導入されなかった。【０１４２】
また本発明によれば、宿主がＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａかＥ．ｃｏｌｉかによらず、２，３−ＤＨＢや３，４−ＤＨＢをモノマーユニットとして有するＰＨＡが生産された。【０１４３】
さらに表４の結果から、側鎖にヒドロキシ基を有するＰＨＡは、フィルム成形時の水接触角が低下することが明らかとなった。これは、ヒドロキシ基の効果でフィルム表面の親水性が向上したためと考えられる。【０１４４】
過去の研究報告により、親水性が高められた変性ＰＨＡは、細胞の成長と増殖を促進することが示されている。一方、表面の親水性が高すぎると（例えば、水の接触角が４０°未満の場合）、細胞の接着性が低下する。上記のように、本発明のＰＨＡの表面は中程度の親水性を有しているため、細胞の成長および増殖を促し、かつ細胞の接着性にも優れる細胞足場用材料として適するものであることが示唆された。【０１４５】
＜実施例９：ＰＨＡを用いた細胞足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）の製造＞
実施例７で得られたＰＨＡを用い、以下の方法（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９９，４４，４４６−４５５．）で細胞足場を製造した。【０１４６】
実施例７で得られたＰＨＡ４００ｍｇを、１，４−ジオキサン１０ｍＬ中で６５℃、６０分間の条件で激しく攪拌することによって、溶解させた。得られた溶液を−８０℃、２時間の条件で凍結し、その後４８時間の凍結乾燥によって溶媒を除去した。残存する溶媒をさらに除去するために減圧乾燥を実施し、細胞足場を得た。【０１４７】
（ＳＥＭ観察）
実施例９で得られた細胞足場の二次電子像を、ＳＥＭ（ＪＣＭ−６０００  ＮｅｏＳｃｏｐｅ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＪＥＯＬ製）で分析した。分析条件は、加速電圧５ｋＶ、減圧、標準プローブ電流量、とした。なお、細胞足場の分析サンプルとしては、カーボンテープ上に載置し、１分間のスパッタにより金をコーティングしたものを使用した。撮影されたＳＥＭ像を図９に示す。図９に示すように、実施例９で得られた細胞足場は、孔径２０〜１５０μｍの多孔質構造を有していた。【０１４８】
（機械物性測定）
実施例９で得られた細胞足場の圧縮試験を、５００Ｎのロードセルを有する引張試験機（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＥＺ−ＬＸ  ＨＳ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｔｅｓｔｅｒ、島津製作所製）を用いて実施した。具体的には、直径１２ｍｍ、厚み２ｍｍのカラム形状に加工した細胞足場を、一定の速度（２ｍｍ／分）で圧縮した際の圧縮強度（２０％変形時の圧縮強度）と弾性率を測定し、３サンプルの測定値の平均とを算出した。その結果、圧縮強度は３８．９±１１．１ｋＰａであり、弾性率は１７０．８±５０．６ｋＰａであった。【０１４９】
（細胞の培養と生存性）
生存した細胞に対する適合性を評価するため、実施例９で得られた細胞足場にヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を播種した。細胞足場は、ポリスチレン製の９６ウェルプレートに配置した。また、殺菌のため、細胞足場は７０％エタノールに２時間浸した後、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、最後に無菌フードにおいてＵＶを照射しながら２４時間ＰＢＳバッファーの中でインキュベートした。【０１５０】
ｈＭＳＣｓは、ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．２０１５，１，５６７−５７６．に記載の以下の方法で培養した。【０１５１】
幹細胞培地（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）１００μＬ中の１００００セルを細胞足場に播種し、３７℃、５％ＣＯ２下、２４時間の条件で培養した。次いで、さらに上記幹細胞培地１００μＬを加え、２４時間培養した。【０１５２】
生存性（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて評価した。つまり、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬２０μＬを１００μＬの培地中の細胞足場を含む９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２下、１〜２時間の条件で培養した。上清を新たな９６ウェルプレートに移し、４９０ｎｍでの吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。同測定は、６回実施した。さらに生存性は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ａｓｓａｙ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いても観察した。４８時間の培養のあと、培地を細胞足場から取り除き、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマー１を５μＭ含む溶液１００μＬを加えた。３７℃、５％ＣＯ２下、１５分間の条件で培養した後、細胞足場をプラスチック製のペトリ皿に置き、５０μＬの培地を加えた。この細胞足場を、すぐにＺｅｉｓｓＳＭ  ７００  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＣＬＳＭ，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した。細胞の生存（緑）／死亡（赤）を示す蛍光を観察するため、それぞれ４８８／５５５ｎｍの励起波長を用いた。細胞足場の構造は、微分干渉（ＤＩＣ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）モードで観察した。結果を図１０に示す。【０１５３】
観察の結果、ｈＭＳＣｓは細長い形状を示し、良好に拡がった通常の形態を有しており、実施例９で得られた細胞足場は重大な細胞毒性を示さなかった。なお、ｈＭＳＣｓの生存率は５９．７±８．７％であり、他のＰＨＡ（例えば、ＰＨＢＨ、ＰＨＢＶ）を使用した細胞足場を用いた場合（データ示さず）の生存率と同等であった。【０１５４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2017033652.tif 000015
【図２】
2017033652.tif 000016
【図３】
2017033652.tif 000017
【図４】
2017033652.tif 000018
【図５】
2017033652.tif 000019
【図６】
2017033652.tif 000020
【図７】
2017033652.tif 000021
【図８】
2017033652.tif 000022
【図９】
2017033652.tif 000023
【図１０】
2017033652.tif 000024
【配列表】
2017033652000001.app
【国際調査報告】
2017033652.tif 000025
2017033652.tif 000026
2017033652.tif 000027
2017033652.tif 000028