(57)【要約】  本発明の目的は、従来提示されてきた複雑な青色発現機構やそれを再現する技術を必要とせずに、より簡易な青色発現制御技術により、青系花色を有する植物の作出方法を提供することにある。  アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメントとなるフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体を植物の花弁など花器官の細胞内で共存させる。
2017169699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-（6′′-マロニル）グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-（6′′-マロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体とが、１：１〜１：１０の量比で共存することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
青系花色を有する植物であって、植物の細胞内でアントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体が共存していることを特徴とする植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１５】
前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１４に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１６】
前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１７】
前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、請求項１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１８】
前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、請求項１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１９】
前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、請求項１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２０】
前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-（6′′-マロニル）グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-（6′′-マロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２４】
前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存する特徴とする、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２５】
前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２６】
前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２７】
請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
【請求項２８】
請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント（フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体）を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法、ならびに、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント（フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体）が細胞内で共存していることを特徴とする青系花色を有する植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部（特に切り花）もしくはその加工品（特に切り花加工品）、組織又は細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
キク、バラ、カーネーション、ユリ等は世界的に産業上重要な花きである。しかしながら、このような主要花きでは、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなど、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色をもつ品種の作出は困難であった。これについて、本発明者らは、近年、カンパニュラF3′5′H及びチョウマメA3′5′GTを遺伝子導入することでCamF3′5′Hを単独で導入した場合（特許文献１）よりも青い、英国王立園芸協会カラーチャート（RHSCC）でViolet-Blue95、Violet-Blue97やBlue100といった真に青といえる花色をもつ「青いキク」の作出に成功した（特許文献２）。しかしながら、バラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウランなど他の主要花きでは「青いキク」と同程度の青みをもつ品種は作出されておらず、青色花作出法が模索されている。【０００３】
花の青色化を目指した遺伝子組換えによる花色改変において導入される遺伝子は、自然界に存在する青色花の青色発現機構の知見を基に選択されている。青色花の多くに蓄積するアントシアニンの基本骨格はデルフィニジン型であるため、その生合成を担うフラボノイド3′,5′-水酸化酵素の遺伝子が青色花の作出をめざして導入されて花色の改変が行われている（特許文献３）。一方で、デルフィニジン型アントシアニンであっても、桃色、赤紫色、紫色、青紫色を発現している花は自然界に多く存在する。花の青色発現機構には、デルフィニジン型アントシアニンであることに加えて、分子内会合（分子内コピグメンテーション）、分子間会合（分子間コピグメンテーション）、金属イオンとの相互作用、金属錯体形成、液胞内pHの上昇等が必要であることが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
２つ以上の芳香族有機酸と糖により修飾されたポリアシル化デルフィニジン型アントシアニンを花弁に蓄積すると、分子内会合により青色を発現する。このメカニズムで青色花色を発現するリンドウ（特許文献４、５）、デルフィニウム（特許文献６、非特許文献２）、チョウマメ（特許文献２、７）などからは、糖転移酵素遺伝子や芳香族アシル基転移酵素遺伝子などの関連酵素遺伝子が報告されている。分子間会合（コピグメンテーション）では、アントシアニンと共存させると青色発現に効果的なコピグメントとしてC-グリコシルフラボンの生合成に関与する酵素遺伝子（非特許文献３）や、バラでのフラボン類の合成を可能にする遺伝子（特許文献８）も報告されている。金属イオンとの相互作用ではチューリップで鉄イオンが、アジサイでアルミニウムイオンの関与が報告されており、アントシアニンが蓄積する液胞に金属イオンを輸送する遺伝子が報告されている（非特許文献４）。また、金属錯体形成では、金属イオンと錯体を形成するために必要と考えられるフラボンの配糖化パターンを制御するための7-配糖化酵素遺伝子がコガネバナやシロイヌナズナから（非特許文献５）、4′,7-配糖化酵素遺伝子がネモフィラ（特許文献９）などから報告されている。他にも分子内会合、分子間会合または金属錯体の形成に関与する、アントシアニンの3位水酸基に結合する糖をさらに糖で修飾する糖転移酵素遺伝子や、アントシアニンに結合した糖に有機酸のアシル基を転移するアシル基転移酵素遺伝子が報告されている。主要花きでは導入遺伝子を花弁で発現させる上で有効なプロモーターやターミネーターが明らかになっている。従って、これらの青色発現機構に関与する遺伝子を導入して機能させることは理論的には可能と考えられる。【０００５】
遺伝子工学的手法により青系花色をもつ花きが作出され、カーネーションとバラでは市販されるに至っているが、その花色は紫色（RHSCC色相グループ：Purple）や青紫色（Purple-Violet, Violet）で、紫青色（Violet-Blue）や青色（Blue）の花色をもつ青色の花きは「青いキク」（特許文献２）以外では作出されていない。そのため様々な青色発現機構（非特許文献１）をカーネーション、ユリやバラなどの花きで再現するため、関連遺伝子の単離とそれらを組み合わせた遺伝子導入が試みられているが、青色花の作出には至っていない。これは多くの青色花の発色を担うポリアシル化アントシアニンや金属錯体の構造は複雑であり、これらの合成には多数の遺伝子が必要なためである。自然界の青い花から、その青色発現を担う一連の遺伝子が単離された例は限られている。遺伝子導入して青色化を行うために必要な遺伝子のセットが揃っているのは、リンドウのポリアシル化アントシアニン生合成遺伝子群だけである。例え青色発現に必要な全ての導入遺伝子が揃っていたとしても、多数の遺伝子の導入と制御が複雑になるため、青色花の作出は困難になっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２２８４９号
【特許文献２】国際公開第２０１７／００２９４５号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０６９００４号
【特許文献４】国際公開第１９９６／０２５５００号
【特許文献５】国際公開第２００６／０４６７８０号
【特許文献６】国際公開第２０１１／０１６２６０号
【特許文献７】国際公開第２００７／０４６１４８号
【特許文献８】国際公開第２００８／１５６２１１号
【特許文献９】国際公開第２０１２／０９６３０７号
【特許文献１０】国際公開第２００２／０８６１１０号
【特許文献１１】国際公開第２０００／０４４９０７号
【特許文献１２】国際公開第１９９４／００３６０６号
【特許文献１３】国際公開第２０１３／１５７５０２号
【特許文献１４】国際公開第２００６／１０５５９８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nat. Prod. Rep. (2009)26:884
【非特許文献２】Plant Cell Physiol. (2015) 56:28
【非特許文献３】J Biol. Chem. (2009) 284:17926
【非特許文献４】Plos one (2012)7:e43189, Genes to Cells （2013)18:341
【非特許文献５】Planta (2000) 210:1006, Biosci. Biotechnol. Biochem. （2006) 70:1471
【非特許文献６】Saito et al., (1983) A cyanidin glycoside giving scarlet coloration in plants of the Bromeliaceae., Phytochemistry 22:1735-1740
【非特許文献７】Andersen et al., The anthocyanins, in Flavonoids, Chemistry, biochemistry and applications, Edited by Andersen, O.M. & Markham, K.R., Taylor & Francis, pp. 472-537 (2006)
【非特許文献８】Shimizu-Yumoto et al., (2012) Slantingly cross loading sample system enables simultaneous performance of separation and mixture to detect molecular interactions on thin-layer chromatography. J. Chromatogr. A, 1245:183-189
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来の理論や技術とは全く異なる青色発現制御技術に基づき、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角：230°〜290°）を有する植物の作出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、芳香族有機酸による修飾が無くても、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント（フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体）を植物の細胞内で共存させることにより、青系花色を有する植物を作出することができるという驚くべき知見を得て、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］  青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント（フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体）を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
［２］  前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１に記載の方法。
［３］  前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン7-マロニルグルコシド、ルテオリン7-グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、２に記載の方法。
［４］  前記トリセチン配糖体が、トリセチン７-マロニルグルコシド又はその誘導体である、２に記載の方法。
［５］前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、２に記載の方法。
［６］前記アカセチン配糖体が、アカセチン７-ルチノシド又はその誘導体である、２に記載の方法。
［７］前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１に記載の方法。
［８］前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である，７に記載の方法。
［９］前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-（6′′-マロニル）グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である、７に記載の方法。
［１０］  前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-（6′′-マロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１〜９のいずれかに記載の方法。
［１１］  前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存することを特徴とする、１〜１０のいずれかに記載の方法。
［１２］  前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、１〜１１のいずれかに記載の方法。
［１３］  前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、１〜１２のいずれかに記載の方法。
［１４］  青系花色を有する植物であって、植物の細胞内でアントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体が共存していることを特徴とする植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１５］  前記フラボン配糖体が、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１４に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１６］  前記ルテオリン配糖体が、ルテオリン７−マロニルグルコシド、ルテオリン７−グルコシド、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド、ルテオリン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１７］  前記トリセチン配糖体が、トリセチン7-マロニルグルコシド又はその誘導体である、１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１８］前記アピゲニン配糖体が、アピゲニン7-グルコシド、アピゲニン7-ルチノシド、アピゲニン8-C-グルコシド、アピゲニン6-C-グルコシド、又はそれらの誘導体である、１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１９］前記アカセチン配糖体が、アカセチン7-ルチノシド又はその誘導体である、１５に記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２０］前記フラボノール配糖体が、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１４に記載の方法。
［２１］前記ケンフェロール配糖体が、ケンフェロール3-グルコシド又はその誘導体である，２０に記載の方法。
［２２］前記ケルセチン配糖体が、ケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-（6′′-マロニル）グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド、又はそれらの誘導体である，２０に記載の方法。
［２３］  前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンが、デルフィニジン3-（6′′-マロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１４〜２２のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２４］  前記アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと前記フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体とが、1:1〜1:10の量比で共存する特徴とする、１４〜２３のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２５］  前記植物の液胞内のpHが5.2〜6.4であることを特徴とする、１４〜２４のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２６］  前記植物がバラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクである、１４〜２５のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２７］  １４〜２６のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
［２８］  １４〜２７のいずれかに記載の植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、キクのみならず、バラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウランなど他の主要花きにおいても、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角：230°〜290°）を有する品種を作出できる。特に、適当なコピグメントであるフラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体を含む花においては、アントシアニンのB環の3′及び5′位を配糖化するだけという、単純な方法で「青い花」を作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】宿主のキクおよび青系花色の遺伝子組換えキクの花弁に含まれるアントシアニン：a）シアニジン型アントシアニン（A1-A4）；b）デルフィニジン型アントシアニン（A5-A10）。
【図２】a）クロスTLC法により青いキク花弁抽出液を展開した結果（蛍光灯下）を示す。b）クロスTLCにより青いキク花弁抽出液を展開した結果（UV光(365nm)下）を示す。バンドAはB環が配糖化されたアントシアニン（テルナチンC5とプレテルナチンC5）を含む。バンドAの中でも青を発色している部分を灰色の矢印で示す。灰色の矢印の部分にはUV光下で黄色い蛍光を示すバンドC1が交差している。バンドAの中でも紫色を発色している部分には、UV光下で暗いバンドC2（破線）が交差している。C1及びC2にはそれぞれAを青、紫にするコピグメント物質が含まれている。c）及びd）同定したC1及びC2の構造を示す。矢印はHMBCを示す。
【図３】a）青色の可視光域の吸光スペクトルを示す。テルナチンC5(TC5;A8）にLt7MG（C1）を混合した結果、TC5との量比を1:1から1:5、1:10へと増加するに従って、青色花弁に特徴的な600-620nmにかけての吸光度が上昇するとともに、吸収極大波長も長波長側へとシフトし、青色花弁と同等の吸光スペクトルへと変化している。b）紫／青紫色の可視光域の吸光スペクトルを示す。A5にC1を加えることによって570nm付近の吸光度が上昇し、紫色花弁の吸光スペクトルと同等のスペクトルパターンを示している。c）C1及びC2に加え、Mg2+イオンをA8等量またはFe3+イオンをA8の1/10等量加えた場合の可視光域の吸光スペクトルを示す。
【図４】様々なpH条件（pH4.0, 4.6, 5.0, 5.6, 5.8, 6.0, 6.6, 7.0）におけるB環配糖化アントシアニン（TC5）とフラボン配糖体（Lt7MG）の混合液の色と吸光スペクトルを示す。
【図５】B環配糖化アントシアニン（TC5）と様々なフラボン配糖体（Lt7MG, Lt7G, Lt3′7G, Tr7MG, Ap7G, Ap7RG, Aca7RG）の混合液の吸光スペクトルを示す。
【図６】様々なB環修飾パターンを有するアントシアニン（Pg3MG, Cy3MG, Dp3MG3′G, TC5）とフラボン配糖体（Lt7MG）の混合液の吸光スペクトルを示す（左図）。多様な条件におけるアントシアニンとフラボン配糖体の混合液（Lt7MG+TC5 (pH5.6), Lt7MG+pTC5 (pH5.6), Tr7MG+pTC5 (pH5.6), Lt7MG+pTC5 (pH5.8））の吸光スペクトルを示す（右図）。
【図７】B環配糖化アントシアニン（TC5）と様々なフラボン配糖体（Lt7OMG=Lt7MG(C1), Lt8CG, Lt6CG, Ap8CG, Ap6CG）の混合液の吸光スペクトルを示す。
【図８】B環配糖化アントシアニン（TC5）とフラボン配糖体（Lt7MG）又は様々なフラボノール配糖体（Km3G, Qu3G, Qu3MG, Qu3RG）の混合液の吸光スペクトルを示す。
【００１３】
本発明は、青系花色を有する植物の作出方法であって、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとコピグメント（フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体）を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法に関する。【００１４】
アントシアニンは、植物において広く存在する色素群であり、赤色、紫色、青色の花色を呈することが知られている。アグリコンであるアントシアニジン部位のB環の水酸基の数により、ペラルゴジニン、シアニジン及びデルフィニジンの3系統に分類される。発色団はアグリコン部分であり、ペラルゴニジンは橙赤色、シアニジンは赤色、デルフィニジンは紫赤色を呈する。青いキク花弁の主要色素であるB環3′位や5′位が配糖化されたアントシアニンは、配糖化されていないアントシアニンと比べて、酸性条件下での吸光スペクトルの吸収極大波長が、短波長側へとシフトしていることが知られており（非特許文献６）、さらに、B環が配糖化されたアントシアニンが花弁に蓄積すると赤みを帯びた花色を発現することが報告されている（非特許文献７）。【００１５】
本発明者らは、この度、カンパニュラF3′5′H遺伝子とともにチョウマメA3′5′GT遺伝子をキク花弁で発現させることにより作出された青いキク（特許文献２）が、主要色素としてデルフィニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5，TC5）を含み、微量色素としてテルナチンC5の脱マロニル体であるデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5，pTC5）、デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド（Dp3MG3′G）、そしてシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド（Cy3MG3′G）を含むことを見出した。青いキクの主要アントシアニンであるテルナチンC5は、酸性条件下であるHPLC分析での可視吸収極大波長が511nmであり、もとの赤やピンク色の主要アントシアニンであるシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド（Cy3MG）の吸収極大波長518nmよりも短波長側にシフトしていた。これは、テルナチンC5はもとのシアニジン型アントシアニン色素よりも赤いにもかかわらず、キクの花弁においては青色を発色させていることを意味する。テルナチンC5のようなアントシアニンB環の3′位及び5′位水酸基がともに配糖化された赤色アントシアニンが花の花弁器官などで青色発現をする例はこれまで報告されていない。【００１６】
アントシアニン色素は、フラボン、フラボノール、有機酸エステル類、タンニン類などの物質と共存することで、それらと分子間相互作用をして青みを帯びた色を発現する場合がある。この現象はコピグメンテーション（コピグメント作用、分子間コピグメンテーション、分子間会合）と呼ばれ、現象を引き起こす物質はコピグメント（補助色素）と呼ばれる。コピグメンテーションには青色の発現を引き起こす深色効果だけで無く、濃色効果や色の安定性向上の効果もある。したがって、本発明者らは、青いキクにおいては、テルナチンC5、プレテルナチンC5、デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシドなどのアントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンと、植物に内在性のコピグメント物質が相互作用することなどにより、花弁が青色発現しているものと推測した。【００１７】
本願明細書中、「アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニン」は、フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体と共存して青色を呈することができる限り、特に制限されないが、例えば、テルナチンC5、プレテルナチンC5などが挙げられる。また青い遺伝子組換えキク花弁で蓄積が認められるデルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシド-3′,5′-ジグルコシドも、フラボン配糖体もしくはフラボノール配糖体との共存で青色を呈すると考えられる。【００１８】
フラボンは、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、植物内では、主に配糖体として存在する。フラボンは、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量222.24の化合物、2,3-ジデヒドロフラバン-4-オンを指すが、広義のフラボン（フラボン類）は、フラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに3位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。本願明細書中、「フラボン配糖体」は、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体の配糖体を意味する。フラボン配糖体としては、ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体，アカセチン配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。ルテオリン配糖体、トリセチン配糖体、アピゲニン配糖体、アカセチン配糖体もまた、ルテオリン、トリセチン、アピゲニン，アカセチンの誘導体の配糖体を含む。ルテオリン配糖体としては、例えばルテオリン7-(6′′-マロニル)グルコシド（Lt7MG）、ルテオリン7-グルコシド（シナロシド）、ルテオリン7,3′-ジグルコシド、ルテオリン8-C-グルコシド（オリエンチン）、ルテオリン6-C-グルコシド（イソオリエンチン）、又はそれらの誘導体が挙げられ、トリセチン配糖体としては、例えばトリセチン7-(6′′-マロニル)グルコシド（Tr7MG）又はその誘導体が挙げられ、アピゲニン配糖体としては、例えばアピゲニン7-グルコシド（コスモシイン）、アピゲニン7-ルチノシド（イソロイホリン）、アピゲニン8-C-グルコシド（ビテキシン）、アピゲニン6-C-グルコシド（イソビテキシン）、又はそれらの誘導体があげられ、また、アカセチン配糖体としては、例えばアカセチン7-ルチノシド（リナリン）又はその誘導体があげられる。
フラボノール類はフラボノイドのカテゴリーの１つであり、3-ヒドロキシフラボン（3-ヒドロキシ-2-フェニルクロメン-4-オン）骨格をもつ。植物内では、主に配糖体として存在する。本願明細書中、「フラボノール配糖体」は、フラボノール類に属する誘導体の配糖体を意味する。フラボノール配糖体としては、ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。ケンフェロール配糖体、ケルセチン配糖体、ミリセチン配糖体もまた、ケンフェロール、ケルセチン、ミリセチンの誘導体の配糖体を含む。ケンフェロール配糖体としては、例えばケンフェロール3-グルコシド、ケンフェロール3-ルチノシド又はそれらの誘導体があげられ、また、ケルセチン配糖体としては、例えばケルセチン3-グルコシド、ケルセチン3-（6′′-マロニル）グルコシド、ケルセチン3-ルチノシド又はそれらの誘導体があげられる。【００１９】
フラボンは、キク、カーネーション、ガーベラ、など多くの植物の花弁で合成されて、配糖体として蓄積されているが、バラ、ユリやトルコギキョウなど、フラボンが花弁から検出されないか、ごく微量しか蓄積しない植物も存在する。この様な植物の花弁でフラボンを合成させ、その配糖体を蓄積させるために、フラボン合成酵素遺伝子を用いることができる。例えば、オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであるフラボン合成酵素I（FNSI）をコードする遺伝子（特許文献１０）とNADPH依存型シトクロムP450であるフラボン合成酵素II（FNSII）をコードする遺伝子（特許文献１１）が様々な植物種からクローニングされている。従ってこれらの遺伝子を遺伝子導入することで、バラなどのフラボン配糖体が花弁から検出されない植物でもフラボンを合成させ、その配糖体を花弁に蓄積させることが出来る（特許文献８）。また、フラボノールは、バラ、ユリやトルコギキョウなど多くの植物の花弁で合成されて、配糖体として蓄積されているが、キク、カーネーション、ガーベラなど、フラボノールが花弁から検出されないか、ごく微量しか蓄積しない植物も存在する。この様な植物の花弁でフラボノールを合成させ、その配糖体を蓄積させるために、フラボノール合成酵素遺伝子（FLS）を用いることができる。オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであるフラボノール合成酵素をコードする遺伝子が様々な植物種からクローニングされている（特許文献１２）。従ってこの遺伝子を遺伝子導入することで、キクなどフラボノール配糖体が花弁から検出されない植物でもフラボノールを合成させ、その配糖体を花弁に蓄積させることが出来る。本発明において用いられる植物については特に制限されず、例えば、バラ、ユリ、カーネーション、ダリア、コチョウラン又はキクなどが挙げられるが、遺伝子を導入する方法が報告されているトルコギキョウ、シクラメン、スターチス、シンビジウム，ガーベラ、デンドロビウム、チューリップ、ペラルゴニウム、ペチュニア、カトレアなどの様々な植物を用いることが出来る。【００２０】
このようなフラボン配糖体が蓄積した植物において、その細胞内におけるアントシアニンB環の3′及び5′位を配糖化することにより、アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体を共存させることが可能となる。アントシアニンB環の3′及び5′位の配糖化は、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）を植物に導入することにより達成できる（特許文献２）。また3′,5′位が配糖化されたアントシアニンを含む植物器官や組織より、アントシアニン3′,5′位糖転移酵素遺伝子をクローン化することによっても達成できる。また、CtA3′5′GTと共に、カンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）（特許文献１３）を共発現させてもよい（特許文献２）。【００２１】
現在の技術水準の下では、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的又は組織特異的に発現させるために、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。【００２２】
アントシアニンB環の3′及び5′位が配糖化されたデルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体は、典型的には1:1〜1:10、好適には1:5〜1:10、最適には約1:10の量比で共存することにより、青色を呈することが可能となる。【００２３】
アントシアニン色素及びアントシアニン色素とコピグメントとの分子間コピグメンテーションはpHによってその発色が左右される。発色を担う色素が蓄積する液胞などの細胞内小器官内のpHは、直接電極をさして測定することも出来るし、花弁などの組織の搾汁液のpHを測定することでも大まかな値を測定することが出来る。花弁などの組織の青色を発現させたい植物の花においてアントシアニンとコピグメントが蓄積して共存する液胞のpHがコピグメンテーションによる青色発現には適当でない場合でも、pHを調節する遺伝子を働かせることで液胞pHを最適化することが出来る。液胞のpHは、液胞膜に存在する液胞型H+-ATPアーゼ （V-ATPase)と液胞型H+-pyrophosphatases（V-PPase)の液胞型プロトンポンプの働きによって酸性になっており、これらの遺伝子の働きを促進または抑制することでpHを調節することが可能である（特許文献１４）。また、開花時にpH6.6から7.7に上昇して、花色が紫から青色へと変化する空色アサガオでは、カリウムイオンの液胞内への輸送に伴ってプロトンイオンを排出することでpHを上昇させるナトリウムイオン−水素イオン対向輸送体（ＮＨＸ）をコードする遺伝子（非特許文献１）が報告されており、より青を発色しやすい液胞内pHに調節することが可能である。青色を呈する液胞内のpHは、典型的には5.2〜6.4程度、好適には5.4〜6.2程度、最適には5.6〜6.0程度であるが、青色を呈することが出来ればこれらの範囲に限定されない。【００２４】
さらに、本発明は、上述の方法で得られた青系花色を有する植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１：青いキクの花弁に蓄積しているB環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体の同定］
カンパニュラ由来のF3′5′H（CamF3′5′H；特許文献１３；GenBank accession number: FW570877）とチョウマメ由来のアントシアニン3′,5′-配糖化酵素をコードするCtA3′5′GT （特許文献２；GenBank accession number: AB115560)を共発現させるバイナリーベクターpB423を導入したアグロバクテリウムを用いて形質転換して得られた青色を示す‘大平’形質転換体の主要アントシアニンをLC-MSで分析した。用いたキク舌状花弁の花色は英国王立園芸協会カラーチャート（RHSCC）第５版を用いて、蛍光灯下で比較して測色したところViolet-Blue 97やBlue 100に相当する青色花色を有していた。CIEL*a*b*表色系における L*値（明度）、a*値（赤／緑）、b*値（黄／青）を、CD100測色計 （横河メータ＆インスツルメンツ) を用いて３回以上測定した値の平均値を算出し、その値を基に色相角（Hue angle）を算出したところ、230-290°の青色を表す色相角の値を示した。LC-MS分析は、ACQUITY UPLC BEH C18カラム （1.7μm, 2.1 i.d. x 100 mm; ウォーターズ) を用いて35℃でACQUITY UPLCで分画し、ACQUITY UPLCフォトダイオードアレイ（PDA）検出器とACQITY タンデム四重極質量分析計（TQD）（ウォーターズ)で検出した。UPLCの移動相には、1％ギ酸水溶液（溶媒A）と1％ギ酸含有アセトニトリル（溶媒B）を用いた。移動相の流速は、0.1ml／分で、0-5％B （0-5分), 5-35％B （5-20分), 35％B （20-25分)のグラジエント溶出をおこなった。PDAで200-800nmを検出し、フラボノイドとアシルキナ酸類のクロマトグラムを360nmで、アントシアニンのクロマトグラムを530nmで得た。質量分析計の分析条件は以下の通りとした：ESIポジティブイオンモード、キャピラリ電圧, 3.5 kV; コーン電圧, 45 V; ソース温度 150 °C; 脱溶媒温度, 350 °C; 脱溶媒ガス流速 flow rate, 500 L/h; コーンガス流速, 50 L/h; コリジョンエナジー, 6 V, 20 V; 測定質量範囲, 180-1080 m/z。検出波長530nmのクロマトグラムを解析した結果、主要アントシアニン色素はA7とA8だった。また、微量色素としてA3をはじめ8つのアントシアニン成分（A1-6, A9-10, 図1)を検出した。【００２６】
A8をLC-MS/MS分析した結果、プレカーサーイオンとしてm/z=875[M]+、プロダクトイオンとしてm/z=713 （-グルコース)、 627 （-グルコース-マロニル)、 465 （-2×Glc-マロニル)、 303（-3×Glc-マロニル; デルフィニジン)が得られた。また、花弁より単離精製し、1H-NMR, NOESYスペクトル（表1)及び高分解能ESI-TOF-MSスペクトルを測定（表2)し、テルナチンC5と同定した（図1）。A7をLC-MS/MS分析した結果、プレカーサ-イオンとしてm/z=789[M]+、プロダクトイオンとして627 （-Glc)、465（-2×グルコース)、 303（-3×グルコース))が得られ、A8の酸加水分解産物とHPLCの保持時間とスペクトルの一致が認められたことから、プレテルナチンC5と考えられた（図1)。青色花弁中では微量アントシアニンとして検出されたA3をLC-MS分析した結果、プレカーサ-イオンとしてm/z=773[M]+が得られた。花弁より単離精製しNMR解析（1H-NMR、NOESY)及び精密質量分析を行い、Cy3MG3′Gと同定した（図1, 表1, 表2)。
【表１】
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【表２】
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【００２７】
［実施例２：花弁に含まれるB環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体の割合と青色の発色との関係］
デコラ咲きのピンク色品種である‘セイアラベラ’にCamF3′5′H及びCtA3′5′GTを導入することで得られた形質転換体系統の花色とアントシアニンの組成、導入遺伝子の発現を解析した。シアニジン型アントシアニンが主要アントシアニンである花は、3′位の配糖化に関わらず、紫がかってはいるが宿主の花色に近いピンク色を示した。デルフィニジン型アントシアニンが主要アントシアニンである花は、宿主に比べて青色の色調が強くなり紫色あるいは青色を呈し、3′位及び5′位が配糖化されたアントシアニンの割合が高いほど青の色調が強くなった。デルフィニジン型アントシアニンの割合とCamF3′5′Hの発現量、及び3′位及び5′位が配糖化されたアントシアニンの割合とCtA3′5′GTの発現量には相関が認められた。以上の結果からも、3′,5′位のグルコシル化されたデルフィニジン型アントシアニンであるA7とA8が青色の発色を担っていることが明らかになった。【００２８】
［実施例３： B環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体の溶液中及びキクの花弁での吸光スペクトルの違い］
キク舌状花弁の吸光スペクトルを、積分球付属装置ISR-2200を装着した分光光度計UV-2450 （島津製作所)を用いて測定した。宿主品種‘セイアラベラ’のピンク色の花弁の可視光領域の吸収極大（λvismax）は556 nmであり、紫色の組換え体のλvismaxはより長波長域の561nmであった。青色の組換え体のλvismaxはさらに長波長域の573 nmであり、615 nm付近に特徴的なショルダー領域を有していた。HPLCの酸性条件における測定では、ピンク花色の宿主の主要色素A1, A2のλvismaxは518 nmであるのに対し、紫色の組換え体の主要色素A5のλvismaxは527 nmであった。一方、青色の組換え体の主要アントシアニンであるA8のλvismaxはA1やA2よりも短波長域の511 nmであった。それぞれの主要アントシアニンを花弁の搾汁液のpHであるpH5.6の酢酸バッファーに溶解した場合、A1のλvismaxは533 nmにあった。A5のλvismaxは535 nmにあり570 nm付近にショルダー領域が認められた。A8のλvismaxは561 nmにあり590 nm付近にショルダー領域が観察された。A8は、酸性条件では他のアントシアニンよりも短波長にλmaxを持つにも関わらず、弱酸性条件では、λvismaxが長波長側に大きくシフトして青紫色を発色する特徴があった。いずれの花弁のλvismaxも、それぞれの主要アントシアニンのλvismaxより長波長域にあったことから、キクの花色、特に青色の発色には深色効果を示すコピグメント物質の関与を推定した。【００２９】
［実施例４： B環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体と共存することで青色を発色するコピグメント物質の探索］
クロスTLC法 （非特許文献８)を用いて青色の花弁をもつキク‘大平’の形質転換体の主要アントシアニンと相互作用するコピグメント物質の探索を行なった。遺伝子組換えキクの青色花弁約200mgを凍結したまま破砕し、10％酢酸水溶液500μlを添加して花弁に含まれる成分を抽出した。セルロースTLCガラスプレート （100 x 100 mm, メルク社)を用い、抽出液を既報（非特許文献８)に従って、斜めに交差して展着した。展着したTLCプレートを展開溶媒BAW （n-ブチルアルコール:酢酸:水=4:1:2 （v/v/v)) を用い室温で展開した。展開したプレートは風乾し、蛍光灯下（ライトボックスNEW5000 インバーター, フジカラー)とUV光下 （254/360nm, CSN-15AC, コスモバイオ)で観察するとともに，デジタルカメラで撮影した。アントシアニン類のRf値 は、テルナチンC5 （A8): 0.15; プレテルナチンC5（A7）: 0.11; Cy3MG3′G（A3): 0.30であった。【００３０】
アントシアニンの展開線はコピグメントと分離したと考えられる赤色を呈した部分とともに、コピグメントと共存していると考えられる紫色及び青色を呈した部分が存在した （図2a)。UV光下で観察すると、青色の部分には黄色い蛍光を発するバンド、紫色の部分には暗いバンドが交差していた（図2b)。それぞれのバンドに含まれるコピグメントであるC1及びC2がアントシアニンと共存することで、青色の発現に寄与していると考えられた。C1とC2をTLCプレートから抽出しUPLC-MS/MSで分析した結果、それぞれ[M+H]+=535と[M+H]+=551が得られた。【００３１】
分子量535及び551をもつC1及びC2のピークを青色キク花弁抽出物より精製した。また、アントシアニンA7, A8及びA3も精製して単離した。【００３２】
［実施例５：コピグメントとB環3′位／3′位と5′位の水酸基に糖が結合したアントシアニン配糖体の精製と構造決定］
青色キク舌状花弁を採集して-80℃で保存した。約2.5kgの凍結花弁を液体窒素中で粉砕し、約5.9Lの10％ギ酸水溶液に浸漬して、成分の抽出を行った。抽出後の花弁に対して6Lの10％ギ酸水溶液を用いた抽出を再度行った。抽出液をメッシュフィルター（100メッシュ）を用いて濾過した後、3,000 rpmで10 分間、遠心して上清を得た。上清をDiaion HP-20樹脂（三菱化成）3Lを充填したカラムに注入した。カラムを9Lの0.1％ギ酸水溶液で洗浄した後、0.1％ギ酸含有メタノールを用いて、樹脂に吸着していたコピグメントとアントシアニンを再溶出した。溶出液を濃縮後、凍結乾燥して得られた14.2gの残渣を0.1％ギ酸含有20％アセトニトリル水溶液に溶解した。溶解した試料をYMC-Pack ODS A（S-15μm, 50mm i.d. × 250mm)カラムで、流速30 ml/分で0.1％ギ酸含有20％アセトニトリル水溶液を溶媒に用い、360nmで検出してさらに分画を行った。アントシアニンA7（プレテルナチンC5)、 A8（テルナチンC5)、及びA3（Cy3MG3′G)を含む画分１、コピグメント２（C2； Tr7MG) を含む画分２、コピグメント１（C1； Lt7MG) を含む画分３、それぞれを濃縮、凍結乾燥後、0.1％ギ酸含有10％アセトニトリル水溶液に再溶解した。画分1は、A3とA7およびA8それぞれを含む画分に0.1 ％ギ酸含有35 ％メタノールを溶媒に用いた分取HPLC（流速30 ml/分、検出波長530nm）で分画した。A3, A7とA8は0.5 ％ ギ酸含有20 ％メタノールを溶媒に用いた分取HPLC（流速28 ml/分、検出波長530nm）でさらに分画して単離した。【００３３】
C1とC2は0.1 ％ギ酸含有35 ％メタノールを溶媒に用いた分取HPLC（流速30 ml/分、検出波長280nm）で分画して単離した。単離したコピグメントとアントシアニンは濃縮、凍結乾燥して、黄色い粉末（C1，Lt7MG：201.5 mg；C2，Tr7MG：52 mg)と濃い赤色（A8，テルナチンC5：52mg；A7, プレテルナチンC5：7mg; A3，Cy3MG3′G：9.8 mg）として得た。【００３４】
コピグメントC1とC2はDMSO-d6に溶解した。アントシアニンA8とA3はそれぞれ10％（v/v)トリフルオロ酢酸（TFA）-重メタノール混合液とTFA-ジメチルスルホキシド-d6（DMSO-d6）混合液に溶解した。コピグメントの1H- NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC, COSY，各スペクトル、アントシアニンの1H-NMR及びNOESYスペクトルは核磁気共鳴装置JNM-ECZ600R/S1（JEOL Ltd., Japan)で測定した。1H と 13Cの共鳴周波数はそれぞれ600.17 MHzと150.91 MHzであった。【００３５】
精製したコピグメントとアントシアニンの高分解能質量分析（HR-MS)は、Agilent 1200 LC にESI-TOF-MS （JMS-T100LP, Jeol)を連結して行った。サンプルを0.01mg/mlの濃度でメタノールに溶解し、10-20μlを注入した。分析条件は以下の通り： 溶媒, メタノール; ニードル電圧, 2.2 kV; オリフィス 1電圧, 85V; オリフィス2電圧, 10V; リングレンズ電圧, 25 V; ピーク管電圧, 2kV; ドライガス流量, 1 L/分, ネブライザーガス流量, 0.5 L/分; 脱溶媒温度, 250°C; オリフィス1温度, 80°C。【００３６】
コピグメント1 （C1)の高分解能マススペクトルは、m/z値535.10457 （M+H)+, 557.10887 （M+Na)+ が検出され、Lt7MGの分子式 C24H23O14 （535.10878), C24H22O14Na （557.09725) から算出される質量と一致していた。コピグメント2（C2)の高分解能マススペクトルは、m/z値551.10341 （M+H)+, 573.09189 （M+Na)+ が検出され、Tr7MGの分子式（C24H23O15 （551.10369), C24H22O15Na （573.08564) )から算出される質量と一致していた。
HR-MSスペクトル、1H-NMRと13C-NMRの一次元NMRスペクトル、及びHMBC,HMQCの二次元NMRスペクトルの解析によりC1の構造をLt7MG、C2の構造をTr7MGと決定した（図2c及びd, 表2及び3)。
【表３】
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【００３７】
［実施例６： B環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体とコピグメントを試験管内にて混合することによる青色花弁の吸光スペクトルの再構築］
まず、青いキク花弁に含まれるアントシアニンとフラボンをHPLCで分析して定量した。アントシアニンでは検出波長530nm、フラボンでは検出波長360nmで得られるクロマトグラムのHPLCピークエリアの値から、デルフィニジン 3-グルコシド（アントシアニン）及びルテオリン（フラボン）の検量線を用いて花弁当たりの化合物量（nmol/mg）を算出した。その結果、青色花弁の3′-及び5′-位がともにグルコシル化されたアントシアニンA7-A9の合計とコピグメントC1（Lt7MG）及びC2（Tr7MG）のモル比率は平均で1.0:1.7:0.4であった。また、アントシアニン総量とフラボン総量のモル比率は平均で1:5であった。これらの比率を基にアントシアニンに対するフラボンの比率を1:1から1:10になるように混合液を作製した。【００３８】
次に、約5gの舌状花弁を液体窒素中で破砕したのち、蒸留水15ml中にて抽出して搾汁液を得た。搾汁液を15mlチューブに入れ、8,000rpm，10℃で10分間遠心し、上清のpHを9611-10D pH電極を装着したpHメーターD-71 （堀場製作所)で測定した。花色の再構築実験は、この‘大平’形質転換体の花弁搾汁液の平均pHであったpH5.6の酢酸バッファーを用いて行った。精製したコピグメント（フラボン）のLt7MG及びTr7MGはジメチルスルホオキシド（DMSO）に溶解した。アントシアニンであるテルナチンC5（A8）、Cy3MG3′G（A3）、デルフィニジン 3-（6′′-マロニル)グルコシド（Dp3MG)（A5）、Cy3MG（A1）は蒸留水に溶解した。Dp3MGはチョウマメの藤色花弁より精製した。Cy3MGは、シアニジン3-グルコシド（フナコシ）とマロニル-CoA（シグマ・アルドリッチ）をチョウマメ花弁から抽出した粗酵素を用いて合成して、精製した。【００３９】
1.5mlマイクロチューブに100 mM 酢酸バッファー（pH5.6）（96-78μl）を入れ、10mMのフラボンDMSO溶液（2-20μl）を添加して均一に溶解した。次に10mMのアントシアニン水溶液（2μl）を添加して均一に溶解させた反応液100μlを超ミクロブラックセル（光路長10 mm, 島津製作所)に注入し、UV-2450分光光度計（島津製作所）を用いて吸光スペクトルを測定した。A8に対するC1の比率を1:1から1:10になるように加えると、C1の比率が上昇するに従って、吸収極大波長及びショルダーが長波長側へとシフトし、吸収極大波長の吸光度が上昇した（図3a)。C1をA8に対して5当量以上加えた場合では、吸収極大波長は570 nm付近、ショルダー領域は600-620 nmとなって青色花弁と同等のスペクトルを示すとともに、青色の色調が強まった（図3a）。またC2にもC1と同等の青色発現効果が認められた。C1かC2がA8の5当量分存在すればキク花弁の青色発現は達成されることが明らかとなった。また、A5にC1を加えることによって570nm付近の吸光度が上昇し，紫色花弁の吸光スペクトルと同等のスペクトルパターンを示した（図3b）。この結果は、紫／青紫色の発色にも同じコピグメントが関与していることを示した。【００４０】
青色の発現への金属イオンの影響を調査するため、マグネシウムイオンと鉄イオンの添加実験を行った。二価マグネシウム塩である酢酸マグネシウム（Mg（OAc)2）を10mMの濃度で蒸留水に溶解した。また三価鉄塩である硫酸アンモニウム鉄（III )（NH4Fe（SO4)2）を 1mMの濃度で蒸留水に溶解した。それぞれの金属イオン水溶液2μlをフラボンを含む酢酸バッファー溶液に添加した後にアントシアニンを添加し、最終量100μlの反応液の吸光スペクトルを測定した。その結果、C1及びC2に加え、Mg2+イオンをA8等量またはFe3+イオンをA8の1/10等量加えた結果では、吸光スペクトルパターンに変化は無かった（図3c）。従って、金属イオンは関与せず、B環配糖化アントシアニンとフラボン配糖体とのコピグメンテーションがキクの青色発現の主な要因であることが明らかになった。【００４１】
［実施例７：B環3′位と5′位の水酸基に糖が結合したデルフィニジン配糖体とフラボン配糖体のコピグメンテーションにおいて様々なpH条件が発色に及ぼす影響］
様々なキクの育成系統や品種、および形質転換体の花弁搾汁液のpHを測定した結果、その値は5.6〜6.1程度と幅があった。そこでまず、0.2Mリン酸水素二ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液をpH5.6、5.8、6.0になるように混合したマッキルベイン（McIlvaine）緩衝液を用い、B環配糖化アントシアニンとフラボン配糖体とのコピグメンテーション反応による青色発現へのpHの影響を調査した。B環配糖化アントシアニンにはA8（テルナチンC5）、フラボン配糖体にはC1(Lt7MG)を用いた。1.5mlマイクロチューブに各pHに調整したマッキルベイン緩衝液（88μl）を入れ、10mM C1のDMSO溶液（10μl）を添加して均一に溶解した。次に10mMのA8水溶液（2μl）を添加して均一に溶解させた反応液100μlを超ミクロブラックセル（光路長10 mm, 島津製作所)に注入し、UV-2450分光光度計（島津）を用いて吸光スペクトルを測定した。その結果、pH5.6よりもpH5.8の方が吸収極大波長が長波長側（約600nm）にシフトし、さらにpH6.0では600nm付近の吸光度が上昇した（図4）。この事は花弁の液胞内pHが5.6や、より高い5.8や6.0などになる品種・系統・植物種において、また液胞内pHが5.8や6.0になる栽培・保管・輸送条件において、B環配糖化アントシアニンとフラボン配糖体を共存させることで、より鮮やかな青色発現を可能にすることを示している。
植物の花でアントシアニンが蓄積している液胞内pHは、アジサイなどの4程度からアサガオなどの7程度など様々である。そこで次に、様々なpH条件がコピグメンテーションによる発色に及ぼす影響を調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントのフラボン配糖体にC1(Lt7MG)を用い、1:5の量比で混合した。バッファーには、pH4.0、pH4.6、pH5.0、pH5.6、pH5.8、pH6.0、pH6.6、pH7.0のマッキルベイン緩衝液（リン酸・クエン酸緩衝液）を用いた。緩衝液88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル（島津製作所）に入れ、UV2450（島津製作所）で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、pH5.6で吸収極大波長が577nm付近、ショルダーが590-596nmとなり、また600-620nmのショルダー領域の吸収が認められる青いキクの生花弁と同等の吸収スペクトルパターンを示し、わずかに紫がかった青色となった。pH5.8〜6.0では吸収極大波長は593nm〜596nmとなり、青色を発色した。pH6.6〜7.0でさらに吸収極大波長は長波長側へシフト（597-598nm）したが、400-500nmの吸光度が高くなり、緑青〜青緑色を発色した。pH5.6からpH4.0へ酸性度が高くなるに従って、吸収極大波長は577nmから568nmの短波長側へとシフトするとともに、吸光度が著しく低下した。また反応液の色は、青色から赤紫色へと変化した。以上の結果より、B環配糖化デルフィニジン型アントシアニンとフラボン配糖体のコピグメンテーションによる青色の発色に適したpH条件は5.6〜6.0程度で、青いキクの花弁搾汁液で測定されうるpHの範囲と同程度であることが明らかになった。【００４２】
［実施例８：B環配糖化デルフィニジン型アントシアニンとコピグメンテーションを起こすフラボン配糖体の構造の違いが発色に及ぼす影響］
クロスTLC法により、青いキクの花弁において3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンと共存することによって青色を発現するコピグメントであることを明らかにした、Lt7MGおよびTr7MGと異なる構造を持つフラボン配糖体を用い、それらがB環配糖化デルフィニジン型アントシアニンの発色に及ぼす影響を調査した。アントシアニンに蒸留水に溶解したテルナチンC5を用いた。フラボン配糖体にB環4′位のみ水酸化されているアピゲニンの７-グルコシドと７-ルチノシド、B環4′位が水酸化、3′位がメトキシル化されているアカセチン７-ルチノシド、B環3′位および4′位が水酸化されているルテオリンの７-グルコシド、７-（6′′-マロニル）グルコシド（Lt7MG）、および3′,7-ジグルコシド、B環3′位，4′位，5′位が水酸化されているTr7MGをDMSOに溶解して用いた。pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して、アントシアニンとフラボンを1:5の量比で混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル（島津製作所）に入れ、UV2450（島津製作所）で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、テルナチンC5だけを溶解した時の吸収極大波長は559nmであったが、テルナチンC5とのコピグメンテーションを試験したフラボン配糖体の全てで、吸収極大波長が572-574nm、ショルダーが595-597nmのスペクトルパターンを示し、青色を発現した（図5）。この結果から、フラボンB環3′位および5′位の水酸基とメトキシル基による修飾パターンの違い、7位水酸基における糖残基の違い、7位グルコシル基のマロニル基による修飾の有無は、コピグメンテーションによる青色発現に大きな差を与えていないことが明らかになった。従って、青いキクの花弁では3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニン類全てとフラボン配糖体全てがコピグメンテーションして、青色を発現していると考えられる。 また、キクのフラボン配糖体とは異なる構造のフラボン配糖体を花で合成する他の植物種においても、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンを蓄積させることで青色を発現させられることを示している。【００４３】
［実施例９：アントシアニンのB環の修飾パターンの違いがコピグメンテーションによる発色に及ぼす影響］
Lt7MGが共存するとコピグメンテーションによって青色を発現するアントシアニンの構造的特徴を調査した。アントシアニンにはペラルゴニジン3-（6′′-マロニル）グルコシド（Pg3MG）、Cy3MG、Dp3MG3′G、テルナチンC5(TC5)を用いた。図6左に示されるとおり、アントシアニンのB環3′位および5′位が修飾されていないPg3MGや、3′位が水酸化されているCy3MGでは青色を発色するスペクトルが得られなかった。青色を発現するTC5の5′位グルコシル基がないDp3MG3′Gでは吸収極大値はほぼ同じであったが、600nmのショルダーから620nmくらいまでの吸光度が低く、逆に短波長側の530nm付近にショルダー領域が観察されるスペクトルを示し、青色の発色は起きなかった。この事からフラボン配糖体をコピグメントとするアントシアニンの構造として、3′位及び5′位の水酸基がともに配糖化されていることが重要であることが示された。【００４４】
［実施例１０：3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンの３位グルコースのマロニル基の有無がコピグメンテーションによる発色に及ぼす影響］
フラボン配糖体とコピグメンテ−ションする際、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンの３位グルコースのマロニル基の有無が、青色の発色に影響するかを調査した。アントシアニンに、テルナチンC5（TC5）およびプレテルナチンC5（pTC5）、コピグメントのフラボン配糖体に、Lt7MG、Tr7MGを用いた。プレテルナチンC5は、キクの青色花弁から精製し、LC-MS/MSで構造を確認してから用いた。アントシアニンとフラボンは1:5の量比で混合した。pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル（島津製作所）に入れ、UV2450（島津製作所）で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図6右に示されるとおり、アントシアニンの３位グルコースにマロニル基がない場合（Lt7MG + pTC5）でも、ある場合（Lt7MG + TC5）と同様に吸収極大波長572nm，ショルダー595nm付近のスペクトルパターンを示し、青色を発色した。また、pHを5.6から5.8にすると、吸収極大波長が572nmから594nmへとシフトし、青色を発色した。一方で、マロニル基のあるTC5と比べ、pTC5の混合溶液では退色が著しく早く、より安定した青色の発色のためにはアントシアニン３位グルコースにおけるマロニル基による修飾が必要であると考えられた。【００４５】
［実施例１１：3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンとC-グルコシル化フラボンとのコピグメンテーションによる発色］
コピグメントのフラボン配糖体における糖の結合様式が青色発現に及ぼす影響を、C-グリコシル化フラボン（フナコシ）を用いて調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントには、O-結合で糖がフラボンのアグリコンに結合しているLt7MG、C-結合で糖がフラボンのアグリコンに結合しているルテオリン8-C-グルコシド（オリエンチン，Lt8CG）、ルテオリン6-C-グルコシド（ホモオリエンチン，イソオリエンチン，Lt6CG）、アピゲニン8-C-グルコシド（ビテキシン，Ap8CG）、アピゲニン6-C-グルコシド（イソビテキシン，Ap6CG）の５種類を用いた。アントシアニンとフラボンは1:5の量比で混合した。 pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル（島津製作所）に入れ、UV2450（島津製作所）で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図7に示されるとおり、8位に糖がC-結合しているLt8CGおよびAp8CGでは、Lt7OMGと比べて、吸収極大とショルダーがともに数nm短波長側にシフトし、紫青色になった。一方、６位に糖がC-結合しているLt6CGおよびAp6CGでは、Lt7OMGと比べ、吸収極大が3nm程度長波長側へシフトし、さらに595nm付近のショルダーの吸光度も上昇した。とくにAp6CG（イソビテキシン）では595nmにピークが現れており、Lt7OMGや他のC-グリコシルフラボンと比べて安定的できれいな青色を発現した。この結果は、6位にグルコースがC結合しているフラボン配糖体を共存させることが、 3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンの青色の発現に有効であることを示している。【００４６】
［実施例１２：3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンとフラボノール配糖体とのコピグメンテーションによる発色］
フラボン配糖体と同様に花弁でアントシアニンともに蓄積することが数多く報告されているフラボノール配糖体をコピグメントに用い、コピグメンテーションによる青色の発現に及ぼす影響を調査した。3′,5′-配糖化アントシアニンにテルナチンC5、コピグメントにはフラボノ−ル配糖体であるケンフェロール3-グルコシド（Km3G）、ケルセチン3-グルコシド（Qu3G）、ケルセチン3-マロニルグルコシド（Qu3MG）、およびケルセチン3-ルチノシド（ルチン，Qu3RG）およびフラボンのLt7MGを用いた。アントシアニンとフラボノールまたはフラボンを1:5の量比で混合した。 pH5.6の酢酸バッファー88μLに、10mMフラボノールDMSO溶液またはフラボンDMSO溶液を10μL添加して混合した後に、10mMアントシアニン水溶液を2μL添加して混合した。反応液をスーパーミクロブラックセル（島津製作所）に入れ、UV2450（島津製作所）で400-700nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、図8に示されるとおり、フラボンのLt7MGでは吸収極大波長は572nm，ショルダーを−595nm付近に持つ吸収スペクトルパターンを示し、青色を発現した。一方、フラボノ−ルのKm3G、Qu3MG、Qu3RGでは吸収極大が568-569nmの短波長側へシフトし、ショルダーも592mm付近となりLt7MGと比べて紫がかった青色となった。Qu3Gは、調査したフラボノ−ル４種の中で最もフラボンのLt7MGをコピグメントとした吸収スペクトルに近く、吸収極大波長とショルダーの位置はほぼ同じであった。以上の結果より、フラボン類だけでなくフラボノール類も、3′,5′-配糖化デルフィニジン型アントシアニンとコピグメンテーションすることで青色や紫青色を発色することが可能であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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