(57)【要約】  本発明は、グラム陽性菌の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該グラム陽性菌への該複合体をコードする核酸の導入により行われる、方法を提供する。本発明はまた、当該方法に使用するための、グラム陽性菌の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該グラム陽性菌への該複合体をコードする核酸の導入により行われる、方法。
【請求項２】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記グラム陽性菌がバチルス（Bacillus）属以外の微生物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陽性菌がクロストリジウム（Clostridium）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
クロストリジウム属に属する微生物がクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ブレビバチルス属に属する微生物がブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus chosinensis）である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体をコードする核酸を、発現期間を制御可能な形態で含む発現ベクターを、前記グラム陽性菌に導入する工程、及び
二本鎖DNAの標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間、該核酸の発現を誘導する工程、
を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
グラム陽性菌の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、該グラム陽性菌で機能する核酸改変酵素複合体。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAの二重鎖切断を伴わず（無切断もしくは一本鎖切断で）、また外来DNA断片の挿入を行わずに、グラム陽性菌ゲノムの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とする、ゲノム配列の改変方法、及びそれに用いる核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌は、グラム染色により紺青色ないし紫色に染色される細菌の総称であり、乳酸菌や放線菌など、伝統的な発酵生産や新しいバイオテクノロジーで利用される有用菌を数多く含んでいる。大腸菌などのグラム陰性菌とは異なり外膜を有しないため、タンパク質等の分泌能力が高く、また、エンドトキシンを産生しないため、異種タンパク質の生産にも適している。そのため、グラム陽性菌の遺伝子を改変して、有用菌の性質をさらに改善しようとする試みが数多くなされている。【０００３】
例えば、ある種のクロストリジウム属細菌（例えば、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）等）は、工業的ブタノール発酵菌として古くから利用されており、ブタノール収率の向上を目的として、遺伝子組換えにより副生物（アセトン、エタノール、有機酸など）を低減する研究がおこなわれている。
また、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、グルタミン酸やリジンをはじめとする、食品用、飼料用、医薬用のアミノ酸の工業生産菌として50年以上にわたり使用されているが、TCAサイクルの2-オキソグルタル酸からサクシニル-CoAへの変換を触媒するODHCの活性を制御するpknG遺伝子を欠損させることにより、グルタミン酸の生産を増大させることができる。
さらに、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）は細胞外のタンパク質分解活性が低減されており、異種タンパク質の高分泌生産系として利用されているが、細胞外プロテアーゼをコードするemp遺伝子を欠損させることにより、さらに細胞外のタンパク質分解活性が低減することができる。【０００４】
しかしながら、従来法における遺伝子改変は、相同組換えを用いて外来遺伝子を挿入したり、ゲノム遺伝子を欠失したりして、目的遺伝子を破壊することにより行われているため、得られた微生物は遺伝子組換え微生物に該当する。そのため、安全性確保のために、設備費用や廃棄物の処理費用が大きくなり、製造コストが高くなるという問題がある。【０００５】
一方、近年、様々な生物種において目的の遺伝子・ゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。従来、ゲノム編集の手法としては、配列非依存的なDNA切断能を有する分子と配列認識能を有する分子とを組み合わせた人工ヌクレアーゼを利用する方法が提案されている（非特許文献１）。
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様（TAL）エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２）、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR（Clustered Regularly interspacedshort palindromic repeats）と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas（CRISPR-associated）タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法（特許文献３）などが報告されている。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法（特許文献４）も報告されている。【０００６】
これまで提案されてきたゲノム編集技術は、基本的にヌクレアーゼによるDNA二重鎖切断（double-stranded DNA breaks : DSB）を前提としている。というのも、ゲノム編集技術は、DSBが相同組換えを促進するとの知見をもとに、ゲノム中の特定の領域を切断できれば、外来遺伝子を所望の領域に挿入し易くなるのではないかとの発想に基づいているからである。
しかしながら、DSBは想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、生存細胞数が極めて少なかったり、単細胞微生物では、そもそも遺伝子改変自体が困難であるといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第4968498号公報
【特許文献２】特表2013-513389号公報
【特許文献３】特表2010-519929号公報
【特許文献４】特開2013-128413号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、DSBを伴わずに、即ち、二本鎖DNAを無切断もしくは一本鎖切断により、かつ外来DNA断片の挿入やゲノムDNA断片の欠失に依らずに、グラム陽性菌のゲノム遺伝子の特定配列の核酸塩基を改変する、新規なゲノム編集の手法、並びにそのための核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、DSB及びDNA断片の挿入及び／又は欠失を伴うことなく、DNA塩基の変換反応による塩基変換を採用することを着想した。DNA塩基の脱アミノ化反応による塩基変換反応自体は既に知られているが、これをDNAの特定の配列を認識させて任意の部位を標的化し、DNA塩基の塩基変換により標的化されたDNAを特異的に改変することは、未だ実現されていない。
そこで、このような核酸塩基の変換を行う酵素として脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼを用い、これとDNA配列認識能のある分子（核酸配列認識モジュール）とを複合体形成させることにより、3種のグラム陽性菌の特定DNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変を行った。
具体的には、CRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）を用いて行った。即ち、改変しようとする遺伝子の標的ヌクレオチド配列と相補的な配列（ターゲッティング配列）を含むゲノム特異的CRISPR-RNA（crRNA）に、Casタンパク質をリクルートするためのRNA（trans-activating crRNA : tracrRNA）を連結したキメラRNA分子（ガイドRNA）をコードするDNAを作製し、他方で二本鎖DNAの両方の鎖の切断能を失活した変異Casタンパク質をコードするDNA（dCas）とデアミナーゼ遺伝子とを連結したDNAを作製し、これらのDNAを、各宿主細胞で機能する発現ベクターを用いて、グラム陽性菌に導入した。その結果、標的ヌクレオチド配列内の目的の塩基を首尾よく他の塩基に置換することができた。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］グラム陽性菌の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該グラム陽性菌への該複合体をコードする核酸の導入により行われる、方法。
［２］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、上記［１］記載の方法。
［３］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記［１］記載の方法。
［４］異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、上記［４］記載の方法。
［６］前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、上記［６］記載の方法。
［８］前記グラム陽性菌がバチルス（Bacillus）属以外の微生物である、上記［１］〜「７」のいずれかに記載の方法。
［９］前記グラム陽性菌がクロストリジウム（Clostridium）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物である、上記［８］記載の方法。
［１０］クロストリジウム属に属する微生物がクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）である、上記［９］記載の方法。
［１１］ブレビバチルス属に属する微生物がブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus chosinensis）である、上記［９］記載の方法。
［１２］コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、上記［９］記載の方法。
［１３］前記複合体をコードする核酸を、発現期間を制御可能な形態で含む発現ベクターを、前記グラム陽性菌に導入する工程、及び
二本鎖DNAの標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間、該核酸の発現を誘導する工程、
を含む、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］グラム陽性菌の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、該グラム陽性菌で機能する核酸改変酵素複合体。
［１５］上記［１４］記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のゲノム編集技術によれば、外来DNAの挿入もDNA二重鎖切断も伴わないため、安全性に優れており、従来法において遺伝子組換え微生物であるとして、生物学的あるいは法律的に議論があったケースにおいても、解決策となる可能性が少なからずある。例えば、グラム陽性菌を用いた工業的発酵生産において、設備費用や廃棄物処理費用の低減が期待できるので、経済的に有利となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】破壊ベクタープラスミドの構造を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、グラム陽性菌細胞内の改変しようとする二本鎖DNA鎖を切断することなく、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換等することにより、該二本鎖DNAの該標的化された部位を改変する方法（以下、「本発明の方法」ともいう）を提供する。当該方法は、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、宿主グラム陽性菌細胞内で該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位、即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを、他のヌクレオチドに変換等する工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の方法に用いることのできるグラム陽性菌としては、グラム染色陽性であり、かつ菌体内で複製可能なベクターが入手可能な細菌であれば、特に制限はないが、伝統的な発酵生産や新しいバイオテクノロジーで利用される有用菌であることが好ましい。例えば、クロストリジウム属（Clostridium）属、バチルス属（Bacillus属）、ストレプトマイセス属（Streptmyces属）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium属）、ブレビバチルス属（Brevibacillus属）、ビフィドバクテリウム属 (Bifidobacterium属)、ラクトコッカス属 (Lactococcus属)、エンテロコッカス属 (Enterococcus属)、ペディオコッカス属(Pediococcus属)、リューコノストック属 (Leuconostoc属)、ストレプトマイセス属（Streptomyces属）等に属する細菌などが挙げられる。好ましくは、バチルス属以外に属する細菌である。より好ましくは、クロストリジウム属、ブレビバチルス属、コリネバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。クロストリジウム属に属する細菌としては、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム等が、ブレビバチルス属に属する細菌としては、ブレビバチルス・チョウシネンシス等が、コリネバクテリウム属に属する細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム等が例示される。
【００１６】
本発明において、二本鎖DNAの「改変」とは、DNA鎖上のあるヌクレオチド（例えば、dC）が、他のヌクレオチド（例えば、dT、dA又はdG）に変換されるか、欠失すること、あるいはDNA鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変される二本鎖DNAは、宿主細胞内に存在する二本鎖DNAであれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAである。また、二本鎖DNAの「標的化された部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（5’上流及び3’下流のいずれか一方又は両方）を意味する。また、「標的ヌクレオチド配列」とは、二本鎖DNA中の核酸配列認識モジュールが結合する配列を意味する。
【００１７】
本発明において「核酸配列認識モジュール」とは、DNA鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結された核酸塩基変換酵素が二本鎖DNAの標的化された部位に特異的に作用することを可能にする。
【００１８】
本発明において「核酸塩基変換酵素」とは、DNA塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基又は原子に変換する反応を触媒することにより、DNA鎖を切断することなく、標的のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し得る酵素を意味する。
【００１９】
本発明において「核酸改変酵素複合体」とは、上記核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能が付与された核酸塩基変換酵素活性を有する分子複合体を意味する。ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とを単一の分子内に有するものも包含される。
【００２０】
本発明の方法に用いられる核酸塩基変換酵素は、上記反応を触媒し得るものであれば特に制限はなく、例えば、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属するデアミナーゼが挙げられる。好ましくは、シトシン又は5-メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼ等が挙げられる。シチジンデアミナーゼとして、より好ましくは、脊椎動物の獲得免疫においてイムノグロブリン遺伝子に変異を導入する酵素である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（以下、AIDともいう）などが挙げられる。
【００２１】
核酸塩基変換酵素の由来は特に制限されないが、例えば、シチジンデアミナーゼであれば、ヤツメウナギ由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1）、脊椎動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、チンパンジー等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、アフリカツメガエル等の両生類、ゼブラフィッシュ、アユ、ブチナマズ等の魚類など）由来のAID（Activation-induced cytidine deaminase; AICDA）を用いることができる。
【００２２】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールにより認識される、二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合し得る限り特に制限されず、二本鎖DNA中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールが特異的に結合するのに十分であればよく、グラム陽性菌のゲノムサイズに応じて、例えば12ヌクレオチド以上、好ましくは15ヌクレオチド以上、より好ましくは18ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。
【００２３】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを含み、DNA二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、CRISPR-変異Cas、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等が挙げられる。
【００２４】
ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3〜6個連結させたものであり、9〜18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記特許文献１を参照することができる。
【００２５】
TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12および13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、上記特許文献２を参照することができる。
【００２６】
PPRモチーフは、35アミノ酸からなり1つの核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの1、4及びii（-2）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、TALエフェクター同様、PPRモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なPPRタンパク質を作製することが可能である。PPRモチーフの作製の詳細については、上記特許文献４を参照することができる。
【００２７】
また、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のDNA結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、且つDNA二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。
【００２８】
上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記核酸塩基変換酵素との融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZドメイン、GKドメイン、GBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
【００２９】
核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが結合した複合体（融合タンパク質を含む。）を含んでなる本発明の核酸改変酵素複合体と、二本鎖DNAとの接触は、目的の二本鎖DNA（例、ゲノムDNA）を有するグラム陽性菌に、該複合体をコードする核酸を導入することにより実施される。
従って、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製される。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。RNAの場合は、好ましくは一本鎖RNAである。
核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが結合した本発明の複合体は、DNA二重鎖切断（DSB）を伴わないため、毒性の低いゲノム編集が可能であり、本発明の遺伝子改変方法は、広くグラム陽性菌全般に適用することができる。
【００３０】
ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等の核酸配列認識モジュールをコードするDNAは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするDNAは、例えば、それらのcDNA配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（DNA結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするようにオリゴDNAプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。
核酸塩基変換酵素をコードするDNAも、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、ヤツメウナギのPmCDA1をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. EF094822）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、ヤツメウナギ由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。また、ヒトAIDをコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. AB040431）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、例えばヒトリンパ節由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。他の脊椎動物由来のAIDホモログも、公知のcDNA配列情報（例えば、ブタ（accession No. CU582981）、ウシ（accession No. NM_110138682）、イヌ（accession No. NM_001003380）、チンパンジー（accession No. NM_001071809）、ニワトリ（accession No. NM_001243222）、アフリカツメガエル（accession No. NM_001095712）、ゼブラフィッシュ（accession No. AAI62573）、アユ（accession No. AB619797）、ブチナマズ（accession No. NM_001200185）等）をもとに、上記と同様にしてクローニングすることができる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカーを付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカーを連結することができる。
【００３１】
核酸配列認識モジュールをコードするDNA、核酸塩基変換酵素をコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするDNA配列を参照し、該DNA配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。
【００３２】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
例えば、クロストリジウム属で複製可能なベクターとしては、大腸菌とクロストリジウム属のシャトルベクターであれば都合がよく、例えば、pIM13由来のpKNT19（Journal of General Microbiology, 138, 1371-1378 (1992)）、pJIR756、pNAK1が挙げられる。またブレビバチルス属で複製可能なベクターとしては、Brevibacillus brevis由来のpUB110、コリネバクテリウム属で複製可能なベクターとしては、Corynebacterium glutamicum由来のpCG100-pHSG398ハイブリッドプラスミドが挙げられる。さらに、ラクトバチルス属で複製可能なベクターとしては、Lactobacillus lactis由来のpLAB1000などが挙げられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
【００３３】
発現ベクターは、所望によりターミネーター、リプレッサー、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、大腸菌等で機能し得る複製起点などを含有することができる。
【００３４】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするRNAは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
【００３５】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体を細胞内で発現させることができる。
【００３６】
発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、PEG法、CaCl2共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
【００３７】
ベクターを導入したグラム陽性菌の培養は、その種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
グラム陽性菌の培養は、通常約30〜約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
【００３８】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするRNAのグラム陽性菌への導入は、自体公知の方法により行うことができる。RNA導入は1回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、2〜5回）繰り返して行うことができる。
【００３９】
細胞内に導入された発現ベクター又はRNA分子から、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖DNA（例、ゲノムDNA）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結された核酸塩基変換酵素の作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で塩基変換が起こり、二本鎖DNA内にミスマッチが生じる（例えば、PmCDA1やAIDなどのシチジンデアミナーゼを核酸塩基変換酵素として用いた場合、標的化された部位のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖上のシトシンがウラシルに変換され、U:GもしくはG:Uミスマッチを生じる）。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり（上記の例では、T-AもしくはA-T）、修復の際にさらに他のヌクレオチドに置換（例えば、U→A、G）、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。
【００４０】
ジンクフィンガーモチーフは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するジンクフィンガーの作製効率が高くなく、また、結合特異性の高いジンクフィンガーの選別が煩雑なため、実際に機能するジンクフィンガーモチーフを多数作製するのは容易ではない。TALエフェクターやPPRモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに比べて標的核酸配列認識の自由度が高いが、標的ヌクレオチド配列に応じて巨大なタンパク質をその都度設計し、構築する必要があるので、効率面で問題が残る。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）が用いられる。
【００４１】
CRISPR-変異Casを用いた本発明の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を含むCRISPR-RNA（crRNA）と、変異Casタンパク質のリクルートに必要なtrans-activating RNA（tracrRNA）とからなるキメラRNA（ガイドRNA）と、変異Casタンパク質との複合体として提供される。
【００４２】
本発明で使用されるCasタンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り、特に制限はないが、好ましくはCas9である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9; PAM配列NGG(NはA、G、T又はC。以下同じ)）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（MmCas9; PAM配列NNNNGATT）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはPAMによる制約が少ないSpCas9である（実質2塩基であり、理論上ゲノム上のほぼどこでも標的化することができる）。本発明で用いられる変異Casとしては、Casタンパク質の二本鎖DNAの両方の鎖の切断能が失活したものと、一方の鎖の切断能のみを失活したニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠くD10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、ガイドRNAと相補鎖の切断能を欠くH840A変異体、さらにはその二重変異体を用いることができるが、他の変異Casも同様に用いることができる。
【００４３】
核酸塩基変換酵素は、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Casとの複合体として提供される。あるいは、核酸塩基変換酵素と変異Casとを、RNA aptamerであるMS2F6、PP7等とそれらとの結合タンパク質によるRNA scaffoldを利用して結合させることも出来る。ガイドRNA中のターゲッティング配列が標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、これに続くtracrRNAに変異CasがリクルートされてPAMを認識するが、一方あるいは両方のDNAを切断することができず、変異Casに連結された核酸塩基変換酵素の作用により、標的された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）で塩基変換が起こり、二本鎖DNA内にミスマッチが生じる。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり、修復の際にさらに他のヌクレオチドに変換、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。
【００４４】
CRISPR-変異Casを核酸配列認識モジュールとして用いる場合でも、ジンクフィンガー等を核酸配列認識モジュールとして用いる場合と同様に、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とは、それらをコードする核酸の形態で、目的の二本鎖DNAを有するグラム陽性菌に導入される。
CasをコードするDNAは、核酸塩基変換酵素をコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Casは、クローン化されたCasをコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、Cas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいは変異CasをコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAや核酸塩基変換酵素をコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。
【００４５】
変異CasをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAとは、融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。
得られた変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAは、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。
【００４６】
一方、ガイドRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列の「標的鎖（targeted strand）」に対して相補的なヌクレオチド配列（「ターゲッティング配列（targeting sequence）」ともいう）を含むcrRNA配列と、既知のtracrRNA配列（例えば、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt; 配列番号１）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
ここで「標的鎖」とは、標的ヌクレオチド配列のcrRNAとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、その反対鎖で標的鎖とcrRNAとのハイブリッド形成により一本鎖状になる鎖を「非標的鎖（non-targeted strand）」と呼ぶこととする。また、核酸塩基変換反応は通常、一本鎖状になった非標的鎖上で起こる場合が多いと推定されるので、標的ヌクレオチド配列を片方の鎖で表現する場合（例えばPAM配列を表記する場合や、標的ヌクレオチド配列とPAMとの位置関係を表す場合等）、非標的鎖の配列で代表させるものとする。
【００４７】
ターゲッティング配列の長さは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的に結合し得る限り特に制限はないが、例えば15〜30ヌクレオチド、好ましくは18〜25ヌクレオチドである。標的ヌクレオチド配列の選択は、該配列の3’側に隣接するPAMの存在により制限されるが、CRISPR-変異Casとシチジンデアミナーゼとを組み合わせた本発明のシステムによれば、標的ヌクレオチド配列の長さに拘わらず、その5’端から7ヌクレオチド以内の位置にあるCに変異が導入され易いという規則性があるので、標的ヌクレオチド配列（その相補鎖であるターゲッティング配列）の長さを適宜選択することにより、変異を導入できる塩基の部位をシフトさせることができる。これにより、PAM（SpCas9においてはNGG）による制約を少なくとも部分的に解除することができ、変異導入の自由度がさらに高くなる。
【００４８】
ターゲッティング配列の設計は、例えば、公開のガイドRNA設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPRdirect等）を用いて、目的遺伝子のCDS配列の中からPAM（例えば、NGG）を3’側に隣接する20mer配列をリストアップし、その5’端から7ヌクレオチド以内のCをTに変換した場合に、目的遺伝子がコードするタンパク質にアミノ酸変化を生じるような配列を選択することにより行うことができる。さらに、ターゲッティング配列の長さを、例えば18〜25ヌクレオチドの範囲で変化させた場合に、同様に、その5’端から7ヌクレオチド以内にTへの塩基変換によりアミノ酸変化を生じるCが存在する配列を選択する。これらの候補の中から、目的のグラム陽性菌ゲノム中のオフターゲットサイト数が少ない候補配列をターゲッティング配列として用いることができる。CRISPR Design ToolやCRISPRdirectには、現在のところグラム陽性菌ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能はないが、例えば、候補配列の3’側の8〜12ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いseed配列）について、宿主となるグラム陽性菌ゲノムに対してBlast検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
【００４９】
ガイドRNAをコードするDNAも、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、T6配列）を用いることが好ましい。pol III系プロモーターを用いる場合、4つ以上Tが連続するヌクレオチド配列をターゲッティング配列に選ばないようにすべきである。
【００５０】
変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするRNAは、例えば、上記した変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
ガイドRNA（crRNA-tracrRNA）は、標的ヌクレオチド配列の標的鎖に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列とを連結したオリゴRNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
【００５１】
変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAあるいはRNA、ガイドRNA（crRNA-tracrRNA）又はそれをコードするDNAは、宿主に応じて、上記と同様の方法によりグラム陽性菌に導入することができる。
【００５２】
従来型の人工ヌクレアーゼでは、DNA二重鎖切断（DSB）を伴うため、ゲノム内の配列を標的とすると染色体の無秩序な切断（オフターゲット切断）によると思われる増殖阻害と細胞死とが引き起こされる。この影響は多くの微生物・原核生物において特に致命的であり、応用性を阻んでいる。本発明では、変異導入をDNA切断ではなくDNA塩基上の置換基の変換反応（特に脱アミノ化反応）によって行うため、毒性の大幅な軽減が実現できる。
尚、本発明の二本鎖DNAの改変では、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）以外で、該二本鎖DNAの切断が生じることを妨げない。しかしながら、本発明の最大の利点の1つが、オフターゲット切断による毒性を回避することであることを考慮すれば、好ましい一実施態様においては、本発明の二本鎖DNAの改変は、選択された二本鎖DNAの標的化された部位のみならず、それ以外の部位でのDNA鎖切断も伴わない。
【００５３】
また、後述の実施例では二重変異型Cas9を用いているが、本発明者らは、出芽酵母や大腸菌などの他の微生物を宿主として用い、変異Casとして、二本鎖DNAのうちの一方の鎖のみを切断し得るニッカーゼ（nickase）活性を有するCasを用いた場合、両方の鎖を切断できない変異Casを用いた場合に比べて、変異導入効率が上昇すること、従って、例えば、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素に加えて、さらにニッカーゼ活性を有するタンパク質を連結して標的ヌクレオチド配列の近傍でDNA一本鎖のみを切断することにより、DSBによる強い毒性を回避しつつ、変異導入効率を向上させることが可能であることを見出している。さらに、異なる鎖を切断する2種のニッカーゼ活性を有する変異Casの効果を比較した結果、一方では、変異部位が標的ヌクレオチド配列の中央付近に集中したのに対し、他方では、標的ヌクレオチド配列から数百塩基にわたる領域に多様な変異がランダムに導入されることも確認している。従って、本発明においても、ニッカーゼが切断する鎖を選択することにより、グラム陽性菌の有する二本鎖DNAの特定のヌクレオチド又はヌクレオチド領域にピンポイントに変異を導入したり、あるいは比較的広い範囲に多様な変異をランダムに導入したりすることが可能となり、目的に応じて使い分けることもできる。
【００５４】
本発明者らはまた、近接する複数の標的ヌクレオチド配列に対して配列認識モジュールを作製し、同時に用いることにより、単独のヌクレオチド配列を標的とするよりも、変異導入効率が大幅に上昇することを、出芽酵母を用いて確認している。その効果は、両標的ヌクレオチド配列の一部が重複するような場合から、両者が600bp程度離れている場合でも同様に変異誘導が実現する。また、標的ヌクレオチド配列が同じ方向（標的鎖が同一鎖）である場合と、対向する（二本鎖DNAの両方の鎖が標的鎖となる）場合のどちらでも起こり得る。
【００５５】
本発明者らはまた、本発明のゲノム配列の改変方法によれば、適当な標的ヌクレオチド配列を選択すれば、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させたほぼすべての細胞で変異を導入することができることを、出芽酵母を用いて確認している。そのため、従来のゲノム編集では必須であった選択マーカー遺伝子の挿入と選抜が不要である。これは遺伝子操作を劇的に簡便にすると同時に、外来DNAの組換え微生物ではなくなるので、有用微生物の分子育種などの応用性が大きく広がる。
また、変異導入効率が極めて高く、かつマーカーによる選抜を必要としないことから、本発明のゲノム配列の改変方法においては、全く異なる位置の複数のDNA領域を標的として改変することが可能である。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列（１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよい。）とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、核酸塩基変換酵素とが、核酸改変酵素複合体を形成する。ここで核酸塩基変換酵素は共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合、Casタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ガイドRNA（crRNA-tracrRNA）として、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する2以上のcrRNAの各々と、tracrRNAとのキメラRNAを２種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやTALエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、核酸塩基変換酵素を融合させることができる。
【００５６】
本発明の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように該核酸改変酵素複合体をコードするDNAを含む発現ベクターや、該核酸改変酵素複合体をコードするRNAをグラム陽性菌に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上の核酸改変酵素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、宿主細胞内で自律複製可能な発現ベクター（プラスミド等）を導入することが確実であるが、該プラスミド等は外来DNAであるため、首尾よく変異導入が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。あるいは、複数の標的遺伝子を順次改変する場合であって、使用可能なプラスミドが1種もしくは2種以上あっても不和合性である場合には、後のプラスミド導入前に先に導入したプラスミドを除去する必要がある。従って、宿主細胞の種類等によって変動するが、例えば、発現ベクター導入から６時間〜２日間経過後に、当該技術分野で周知の種々のプラスミド除去法を用いて、宿主細胞から導入したプラスミドを除去することが望ましい。
あるいは、変異導入に十分な核酸改変酵素複合体の発現が得られる限り、宿主細胞内での自律複製能を有しない発現ベクター（例えば、宿主細胞で機能する複製起点及び/又は複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を欠くベクター等）や、RNAを用いて、一過的発現により目的の二本鎖DNAに変異を導入することもまた好ましい。
【００５７】
本発明の核酸改変酵素複合体をグラム陽性菌で発現させて、核酸塩基変換反応を行っている間、標的遺伝子の発現は抑制されているため、宿主細胞の生存に必須の遺伝子を標的遺伝子として、直接編集するのはこれまで難しかった（宿主の生育障害・変異導入効率の不安定化・ターゲットとは異なる部位への変異等の副作用を生じる）。本発明では、所望の時期に、核酸塩基変換反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間だけ、一過的に本発明の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させることにより、必須遺伝子の直接編集を効率よく実現することができる。核酸塩基変換反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間は、宿主細胞の種類や培養条件等によっても異なるが、通常2〜20世代は必要であると考えられる。当業者は、使用する培養条件下での宿主細胞の倍加時間に基づいて、好適な発現誘導期間を適宜決定することができる。本発明の核酸改変酵素複合体をコードする核酸の発現誘導期間は、宿主細胞に副作用を生じさせない範囲で、上記「標的された部位の改変が固定されるのに必要な期間」を超えて延長されてもよい。
【００５８】
本発明の核酸改変酵素複合体を、所望の時期に所望の期間、一過的に発現させる手段としては、該核酸改変酵素複合体をコードする核酸（CRISPR-Casシステムにおいては、ガイドRNAをコードするDNAと、変異Cas及び核酸塩基変換酵素をコードするDNA）を、発現期間を制御可能な形態で含むコンストラクト（発現ベクター）を作製し、グラム陽性菌に導入する方法が挙げられる。「発現期間を制御可能な形態」としては、具体的には、本発明の核酸改変酵素複合体をコードする核酸を、誘導性の調節領域の制御下においたものが挙げられる。「誘導性の調節領域」は特に制限されないが、例えば、温度感受性（ts）変異リプレッサーとこれに制御されるオペレーターとのオペロンが挙げられる。ts変異リプレッサーとしては、例えばλファージ由来のcIリプレッサーのts変異体が挙げられるが、これに限定されない。λファージcIリプレッサー(ts)の場合、30℃以下（例、28℃）ではオペレーターに結合して下流の遺伝子発現を抑制しているが、37℃以上（例、42℃）の高温ではオペレーターから解離するために、遺伝子発現が誘導される。従って、核酸改変酵素複合体をコードする核酸を導入した宿主細胞を、通常は30℃以下で培養し、適切な時期に温度を37℃以上に上げて一定期間培養して、核酸塩基変換反応を行わせ、目的遺伝子に変異が導入された後は、速やかに30℃以下に戻すことにより、目的遺伝子の発現が抑制される期間を最短にすることができ、宿主細胞にとって必須遺伝子を標的化する場合でも、副作用を押さえつつ効率よく編集することができる。
【００５９】
温度感受性変異を利用する場合、例えば、ベクターの自律複製に必要なタンパク質の温度感受性変異体を、本発明の核酸改変酵素複合体をコードするDNAを含むベクターに搭載することにより、該核酸改変酵素複合体の発現後、速やかに自律複製が出来なくなり、細胞分裂に伴って該ベクターは自然に脱落する。従って、上記λファージのcIリプレッサー(ts)と併用することで、本発明の核酸改変酵素複合体の一過的発現と、プラスミド除去とを、同時に行うことができる。
【００６０】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１  クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムにおける遺伝子改変
（１）破壊ベクタープラスミドの構築−pKNT19への改変CRISPRの導入
大腸菌とクロストリジウム属微生物で複製可能なプラスミドpKNT19の制限酵素BamHIとKpnIで切断される間に下記の必要な遺伝子配列を挿入して破壊ベクタープラスミドを構築した。
双方向プロモーター領域を含むStreptococcus pyogens Cas9遺伝子にD10A及びH840Aのアミノ酸変異を導入し（dCas9）、リンカー配列を介してPmCDA1との融合タンパク質として発現するコンストラクトを構築し、さらにC. サッカロパーブチルアセトニカムのpta遺伝子（配列番号２および３）内の各標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（ターゲッティング配列）をコードしたキメラgRNAを同時に載せたプラスミド（全長ヌクレオチド配列を配列番号４に示す。配列中n20の部分（ヌクレオチド番号5560-5579）に各ターゲッティング配列が挿入される）を作成した（図１）。【００６２】
（２）破壊ベクタープラスミドのC．サッカロパーブチルアセトニカムへの導入
上記（１）で作成した破壊ベクタープラスミドのうち、11757または1269+AatIIをC. サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株及びATCC27021Δptb1株（特開2014-207885の実施例１を参照）に形質転換した。破壊ベクタープラスミド11757、1269+AatIIのターゲッティング配列等を表１に示した。【００６３】
【表１】
2017043656.tif 000002
【００６４】
・方法
前培養として、C. サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株及びATCC27021Δptb1株のグリセロールストック0.5 mLをTYA培地5 mLに接種し、30℃、24時間培養した。TYA培地の組成を表２に示す。【００６５】
【表２】
2017043656.tif 000003
【００６６】
この前培養液をTYA培地10 mLにOD=0.1となるよう接種、15 mL容ファルコンチューブで37℃にてインキュベートした。OD=0.6となった段階で発酵液を遠心分離して上清を除去し、氷冷しておいた65 mM MOPSバッファー（pH 6.5）10 mLを加えピペッティングにより再懸濁し、遠心分離を行った。MOPSバッファーによる洗浄は2回繰り返した。遠心分離によりMOPSバッファーを除去した後、氷冷しておいた0.3 Mスクロース100 μLで菌体ペレットを再懸濁し、コンピテントセルとした。コンピテントセル50 μLをエッペンドルフチューブに取り、プラスミド1 μgと混合した。氷冷したエレクトロポレーション用セルに入れ、Exponential dcayモード、2.5 kV/cm、25 μF、350 Ωで印加した。用いたエレクトロポレーション装置はGene pulser xcell（Bio-rad）である。その後5 mL TYA培地に全量を接種し、30℃で2時間程度回復培養した。その後、回復培養液を、エリスロマイシン10 ppmを含有するMASS固体培地に塗布し、30℃で数日間培養を行って出現したコロニーからの選抜を行い、プラスミドが導入されエリスロマイシン耐性となった株を取得した。次に得られた株にプラスミドが保持されていることを確認することとした。各4コロニーずつ、エリスロマイシン10 ppmを含有するTYA培地に植菌し、生育した形質転換体コロニー由来の培養液を鋳型に、プラスミド特有の領域をPCRで増幅し、電気泳動による増幅物の解析からプラスミド保持の有無を確認した。【００６７】
・結果
全てプラスミド特有の領域の増幅物が得られた。従ってブタノール発酵菌内で破壊ベクタープラスミドが保持されていることが明らかとなった。【００６８】
（３）破壊ベクタープラスミドを用いたC. サッカロパーブチルアセトニカムpta遺伝子配列変換
破壊ベクタープラスミドを用い、ブタノール発酵菌のpta遺伝子のDNA配列変換を行った。破壊ベクタープラスミドは破壊ツールに制御機構を有しないため、単純に世代を重ねるのみで機能する。【００６９】
・方法
上記（２）で作成した11757保持株である11757/ATCC27021Δptb1株、1269+AatII保持株である1269+AatII/ATCC27021Δptb1及び1269+AatII/ATCC27021株を、エリスロマイシン10 ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10 ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを11757/ATCC27021Δptb1株及び1269+AatII/ATCC27021株では8コロニー、1269+AatII/ATCC2702１Δptb1では16コロニー取り、これを鋳型にゲノム上のpta遺伝子全長の増幅を行った。【００７０】
PCR 組成（1サンプル分）
2×KODFX buffer 25 μL
2 mM dNTPS 10μＬ
20μM F primer 0.75 μL （NS-150414-i02）
20 μM R primer 0.75 μL （NS-150304-i04）
D.W. 11.5 μL
KODFX 1μL【００７１】
NS-150414-i02の配列
5’-GCCCTTTATGAAAGGGATTATATTCAG-3’（配列番号７）
NS-150304-i04の配列
5’-GCTTGTACAGCAGTTAATGCAAC-3’（配列番号８）【００７２】
49 μLずつ分注後、鋳型としてシングルコロニーの懸濁液を1 μL加え、下記条件にてPCRした。
94℃ 2 min
98℃ 10 sec → 50℃ 30 sec → 68℃ 2 min ×30 cycles
10℃ hold【００７３】
次にPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製し、該精製物を鋳型にシーケンス反応を行った。【００７４】
シーケンス反応組成（１サンプル分）
Terminator Ready Reaction Mix 1 μL
5×Sequencing buffer 3.5 μL
3.2pmol primer 1 μL
Template DNA 0.35 μL
D.W. 14.15 μL
Template DNAとprimerは下記の組み合わせとした。
1269+AatII保持株
F側NS-150414-i02 / R側NS-150304-i04
11753保持株
F側NS-150525-i01 / R側NS-150304-i04【００７５】
NS-150525-i01の配列
5’-GGTGTTACAGGAAATGTTGCAG-3’（配列番号９）【００７６】
上記組成物を下記条件にてPCRした。
96℃ 1 min
96℃ 10 sec → 50℃ 5 sec → 60℃ 4 min ×25 cycles
10℃ hold
反応終了後に反応物の配列をDNAシーケンサーABI PRISM3101にて解析した。【００７７】
・結果
11757/ATCC27021Δptb1由来コロニーの配列解析結果のうち、pta遺伝子のDNA配列の916〜935番目を表３に示した。【００７８】
【表３】
2017043656.tif 000004
【００７９】
この結果、配列が解析できた８株全てに何らかの変異が導入されていた。この結果からベクタープラスミド11757がクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムに対して破壊ツールプラスミドとして機能することが確認された。変異導入の位置としては、c.932G>A（pta遺伝子の932番目の塩基GがAに改変）変異株が6株、c.934G>Aが1株、c.932G>A、c.934G>A及びc.935G>Aの変異株が1株であった。c.932G>Aの変異によりPTAタンパク質としては311番目のアミノ酸アルギニン（AGAでコードされる）がリジン（AAAでコードされる）となり、同様にc.934G>A及びc.935G>Aの変異によりG312Kとなる。特にR311はPTAの活性中心と推定されており、c.932G>Aの変異により大幅な酵素活性の低下が期待された。【００８０】
次に1269+AatII/ATCC27021及び1269+AatII/ATCC27021Δptb1由来コロニーの配列解析結果のうち、pta遺伝子のDNA配列の6〜30番目の結果を、それぞれ表４および５に示した。【００８１】
【表４】
2017043656.tif 000005
【００８２】
【表５】
2017043656.tif 000006
【００８３】
配列が解析できた22株中21株に何らかの変異が導入されていた。この結果から1269+AatIIがクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムに対して破壊ツールプラスミドとして機能することが確認された。変異導入の位置としては、変異導入された株全てでpta遺伝子25番目のGがAに変わっており、これに加えてc.24G>Aまたはc.28G>Aの変異を有している株も複数存在した。c.24G>Aの変異導入によりPTAタンパク質としては8番目のアミノ酸トリプトファン（UGGでコードされる）が終止コドン（UGAでコードされる）に変わり、ここでタンパク質合成が停止するため機能を喪失すると期待された。【００８４】
実施例２  コリネバクテリウム・グルタミカムにおける遺伝子改変
（１）シャトルベクターの作製
WO 2007/013695の実施例１に記載された方法で、C. グルタミカム ATCC13058株由来のpCG100プラスミドを取得した。
pHSG398とのライゲーションを行うため、pCG100を制限酵素BglIIで切断処理し、pHSG398はBamHIで切断し、脱リン酸化処理してセルフライゲーションが起こらないようにした。pCG100（BglIIで切断）とpHSG398（BamHIで切断）をライゲーションし、大腸菌に導入した。【００８５】
（２）pknG遺伝子改変プラスミドの作製
改変CRISPRのDNA断片（配列番号１８のHindIII-XhoI約6 kbp断片）の両末端にPstI部位を付加し、これをpCG100-pHSG398プラスミドをPstIで切断した場所に挿入して、C. グルタミカムで機能する改変CRISPRプラスミドを作製した。C. グルタミカムのpknG遺伝子（配列番号１９及び２０）を改変するためのターゲッティング配列（表６）をデザインし、そのうちNo. 6、7、8及び10を、この改変CRISPRプラスミドのターゲッティング配列挿入部位（n20）（配列番号１８のヌクレオチド番号8773-8492）に挿入し、pknG遺伝子改変プラスミドを作製した。【００８６】
【表６】
2017043656.tif 000007
【００８７】
（３）C. グルタミカムへのpknG遺伝子改変プラスミドの導入と遺伝子改変の確認
WO 2007/013695の実施例２に記載された方法で、C.グルタミカム ATCC13032株に（２）で作製したpknG遺伝子改変プラスミドを導入した。形質転換後にLBCm60ppm寒天培地でコロニーを形成させた。このコロニーをLBCm60ppm液体培地に接種して2回植え継ぎ培養した後、希釈してLB寒天培地でコロニーを形成させた。
生育したコロニーをLB培地で培養し、下記プライマーを用いてpknG遺伝子断片をPCRで増幅し、その配列を解析したところ、推測された位置に終止コドンが導入されていることを確認することができた。
PCRプライマーF  atgaaggataatgaagatttcgatccagattcac（配列番号４１）
PCRプライマーR  gaaccaactcagtggccgc（配列番号４２）【００８８】
（４）C. グルタミカムへの他のpknG遺伝子改変プラスミドの導入と遺伝子改変の確認
また、表６に記載の他のターゲッティング配列を、上記（２）の改変CRISPRプラスミドのターゲッティング配列挿入部位に挿入したpknG遺伝子改変プラスミドを作製し、上記（３）と同様の方法で、C.グルタミカム ATCC13032株を形質転換し、コロニーを形成させた。
生育したコロニーをLB培地で培養し、下記プライマーを用いてpknG遺伝子断片をPCRで増幅し、その配列を解析したところ、No. 2のターゲッティング配列を用いた場合に、203番目のCがTに変わり、終始コドン形成ではなかったが、コードするアミノ酸がスレオニンからイソロイシンに変わった株を得ることができた。
PCRプライマーF   cagcaaccgaagctgttgcc（配列番号７２）
PCRプライマーR   gccatcagcaactgggcg（配列番号７３）【００８９】
実施例３  ブレビバチルス・チョウシネンシスにおける遺伝子改変
（１）emp遺伝子改変プラスミドの作製
B. チョウシネンシスで使用可能なpBIC1プラスミドを制限酵素XhoIとHindIIIで切断し、その間に必要な改変CRISPRのDNA断片（上述の配列番号１８のHindIII-XhoI約6 kbp断片）を挿入し、B. チョウシネンシスを形質転換して機能する改変CRISPRプラスミドを作製した。B. チョウシネンシスのemp遺伝子（配列番号４３及び４４）を改変するためのターゲッティング配列（表７）をデザインし、そのうちNo. 5、6および7を、この改変CRISPRプラスミドのターゲッティング配列挿入部位（n20）（配列番号１８のヌクレオチド番号8773-8792）に挿入し、emp遺伝子改変プラスミドを作製した。【００９０】
【表７】
2017043656.tif 000008
【００９１】
（２）B. チョウシネンシスへのemp遺伝子改変プラスミドの導入と遺伝子改変の確認
B. チョウシネンシスの形質転換はTAKARA Brevibacillus Expression system HB300に基づいて行った。形質転換後にMTNm 50 ppmプレートでコロニーを形成させた。コロニーをMTNm 50 ppm液体培地に接種して2回植え継ぎ培養した後、希釈してMTプレートでコロニーを形成させた。
・培地
MTNmプレート
MT培地にネオマイシン50 ppmになるように添加
MT培地
グルコース  10 ｇ/L
ファイトンペプトン  10 g/L
エルリッヒ  カツオエキス  5 ｇ/L
粉末酵母エキスS   2 g/L
FeSO4・7H2O  10 mg/L
MnSO4・4H2O  10 mg/L
ZnSO4・7H2O  1 mg/L
pH 7.0に調節【００９２】
生育したコロニーをMT液体培地で培養し、下記プライマーを用いてemp遺伝子断片をPCRで増幅し、その配列を解析したところ終止コドンの導入になる改変を確認することができた。
PCRプライマーF   gggacatgattcgccggttg（配列番号５９）
PCRプライマーR   gcgtccatcgtagtaccagatc（配列番号６０）【００９３】
（３）B. チョウシネンシスへの他のrmp遺伝子改変プラスミドの導入と遺伝子改変の確認
また、表７に記載の他のターゲッティング配列を、上記（１）の改変CRISPRプラスミドのターゲッティング配列挿入部位に挿入したemp遺伝子改変プラスミドを作製し、上記（２）と同様の方法で、B. チョウシネンシスを形質転換し、コロニーを形成させた。
生育したコロニーをMT液体培地で培養し、下記プライマーを用いてemp遺伝子断片をPCRで増幅し、その配列を解析したところ、No. 3のターゲッティング配列を用いた場合に、454番目のCがTに変わり、それに伴いグルタミンから終止コドンに変わった株を得ることができた。
PCRプライマーF   ccggaagccatacaggtaagatc（配列番号７４）
PCRプライマーR   cctgagtcgacatcaatcacgttc（配列番号７５）【００９４】
以上の結果から、本発明の方法により、遺伝子の挿入・欠失及びDSBを伴うことなく、広くグラム陽性菌の遺伝子改変が可能であることが示された。【００９５】
実施例４  クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムにおける遺伝子改変(2)
（１）複数遺伝子破壊用宿主の作成
実施例１（２）で作成した11757保持株である11757/ATCC27021を用いて、ATCC27021株のpta遺伝子のDNA配列変換を行った。次に、複数の遺伝子が破壊された株の作成のため、得られた変異株R311K（pta遺伝子の932番目の塩基GがAに改変）及びG312R（pta遺伝子の934番目の塩基GがAに改変）からプラスミド11757を除去した。【００９６】
・方法
実施例１（２）で作成した11757保持株である11757/ATCC27021を用いて、実施例１（３）と同様の方法でpta遺伝子のDNA配列変換及び配列解析を行った。配列解析の結果得られた変異株R311K（pta遺伝子の932番目の塩基GがAに改変）及びG312R（pta遺伝子の934番目の塩基GがAに改変）株を、抗生物質を含まないTYA培地で培養した後、固形培地に希釈塗布し、生育したシングルコロニーを鋳型に、実施例１（２）に示した方法でプラスミド保持の有無を確認し、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを選抜した。【００９７】
PCR 組成（1サンプル分）
2×KODFX buffer 25 μL
2 mM dNTPS 10μＬ
20 μM F primer 0.75 μL （NS-150410-i01）
20 μM R primer 0.75 μL （NS-150410-i02）
D.W. 11.5 μL
KODFX 1μL【００９８】
NS-150410-i01の配列
5’-CCGATAGCTAAGCCTATTGAG-3’（配列番号６１）
NS-150410-i02の配列
5’-TCATCCTGTGGAGCTTAGTAG-3’（配列番号６２）【００９９】
49 μLずつ分注後、鋳型としてシングルコロニーの懸濁液を1 μL加え、下記条件にてPCRした。
94℃ 2 min
98℃ 10 sec → 50℃ 30 sec → 68℃ 2 min ×30 cycles
10℃ hold【０１００】
・結果
得られたPCR産物を電気泳動し、各変異株（R311K及びG312R）由来の、プラスミド特有の領域の増幅物が無いコロニーを、それぞれ11757脱落株ATCC27021R311K及びATCC27021G312Rとした。【０１０１】
（２）破壊ベクタープラスミドのC．サッカロパーブチルアセトニカムへの導入
実施例１（１）で作成した破壊ベクタープラスミドのターゲッティング配列部分［配列番号４で表されるヌクレオチド配列中n20の部分（ヌクレオチド番号5560-5579）；図１の「Target」に相当］を、C. サッカロパーブチルアセトニカムのptb1遺伝子（配列番号６３および６４）内の各標的ヌクレオチド配列に相補的な配列に置換した、4種のptb1破壊ベクタープラスミド64G>A、655G>A、442C>Tおよび745G>Aを構築した。これらの破壊ベクタープラスミドのターゲッティング配列等を表８に示した。【０１０２】
【表８】
2017043656.tif 000009
【０１０３】
64G>Aは、標的遺伝子ptb1に64G>Aおよび／または66G>Aおよび／または67G>Aの変異を導入、アミノ酸レベルでV22IまたはV22および／またはA23Tの変異を導入する。442C>TはP148をLまたはSに変異させる破壊ベクターである。プロリンはイミノ酸で、タンパク質の自由度を局所的に低下させることが知られており、これがロイシンに変わることで構造の保持が困難となり、活性の低下あるいは消失が期待される。655G>AはA219をTに、745G>AはA249をTに、それぞれ変異させる破壊ベクターである。非極性で側鎖の小さいアラニンが極性で嵩高い側鎖を有するトレオニンに変異することによりPTB1タンパク質の構造が変化し、活性の低下あるいは消失が期待される。745G>Aはまた、751G>Aの変異（V251をＩに変異）を導入することもできる。【０１０４】
・方法
上記のptb1破壊ベクタープラスミド64G>A、442C>T、655G>Aまたは745G>Aで、C. サッカロパーブチルアセトニカムATCC27021株、並びに上記（１）で作成したATCC27021R311K及びATCC27021G312株を形質転換した。破壊ベクタープラスミドの導入とプラスミド保持の確認は、実施例１（２）に示した方法で行った。【０１０５】
・結果
得られた株を鋳型にしたプラスミド保持確認PCRの結果、全ての宿主においてプラスミド特有の領域の増幅物が得られ、形質転換体と確認された。【０１０６】
（３）破壊ベクタープラスミドを用いたC. サッカロパーブチルアセトニカムptb1遺伝子配列変換
破壊ベクタープラスミドを用い、ブタノール発酵菌のptb1遺伝子のDNA配列変換を行った。【０１０７】
・方法
上記（２）で作成した64G>A保持株である64G>A/ATCC27021株、64G>A/ATCC27021R312K株及び64G>A/ATCC27021G312株、442C>T保持株である442C>T/ATCC27021株、442C>T/ATCC27021R311K株及び442C>T/ATCC27021G312株、655G>A保持株である655G>A/ATCC27021株、655G>A/ATCC27021R311K株及び655G>A/ATCC27021G312R株、745G>A保持株である745G>A/ATCC27021株、745G>A/ATCC27021R311K株及び745G>A/ATCC27021G312R株を、エリスロマイシン10 ppmを含有するTYA培地に植菌し培養した後、エリスロマイシン10 ppmを含有するTYA固体培地に希釈塗布し、シングルコロニーとした。このシングルコロニーを取り、これを鋳型にゲノム上のptb1遺伝子全長の増幅を行った。
PCR組成、条件は実施例１（３）に従い、プライマーのみptb1用のNS-150819-i01及びNS-150819-i02を用いた。【０１０８】
NS-150819-i01の配列
5’-GCAAGAAATGAGCAAAAACTTTGACG-3’（配列番号６９）
NS-150819-i02の配列
5’-GCTGCAACTAATGCTGCTAAAGC-3’ （配列番号７０）【０１０９】
次にPCR産物をWizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製し、精製物を鋳型にシーケンス反応を行った。
シーケンス反応組成、条件は実施例１（３）に従い、プライマーのみ64G>A保持株についてはNS-150819-i01（配列番号６９）、その他はNS-150324-i01を用いた。【０１１０】
NS-150324-i01の配列
5’-CTCTGACTGTGCAGTTAACC-3’ （配列番号７１）【０１１１】
・結果
64G>A保持株由来コロニーの配列解析の結果、ptb１遺伝子内に64G>Aおよび／または67G>Aの変異導入のある株が得られた。64G>Aおよび／または67G>Aの変異により、PTB1タンパク質としてV22Iおよび／またはA23Tとなった株が得られた。V22M変異が導入された株は今回の解析では無かった。442C>T保持株由来コロニーの配列解析の結果、442C>Tおよび／または443C>Tの変異導入のある株が得られた。442C>Tおよび／または443C>Tの変異により、PTB1タンパク質としてP148LまたはP148Sとなった株が得られた。655G>A保持株由来コロニーの配列解析の結果、655G>Aの変異導入のある株が得られた。655G>Aの変異により、PTB1タンパク質としてA219Tとなった株が得られた。745G>A保持株由来コロニーの配列解析の結果、745G>Aおよび／または751G>Aの変異導入のある株が得られた。745G>Aおよび／または751G>Aの変異により、PTB1タンパク質としてA249Tおよび／またはV251Iとなった株が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により、外来DNAの挿入もDNA二重鎖切断も伴わずに、安全に任意のグラム陽性菌に部位特異的変異を導入することが可能となる。こうして得られる遺伝子改変株は遺伝子組換え微生物に該当しないと考えられるので、グラム陽性菌を用いた工業的発酵生産において、設備費用や廃棄物処理費用の低減が期待でき、製造コストの削減が可能となる点で極めて有用である。【０１１３】
本出願は、2015年9月9日付で日本国に出願された特願2015-178022を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
2017043656.tif 000010
【配列表】
2017043656000001.app
【国際調査報告】
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