(57)【要約】【課題】糖結合化合物による糖タンパク質を精度高く検出するために、糖タンパク質−糖結合化合物複合体の検出感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させる方法を提供する。【解決手段】本発明の糖タンパク質の測定方法は、糖タンパク質と、前記糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を反応させ、反応した糖結合化合物を検出することを含む、糖タンパク質の測定方法において、前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを８．５よりも高く、かつ１１．０未満のアルカリ性域に調整することを特徴とする。糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。【選択図】図１ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質と、前記糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を反応させ、反応した糖結合化合物を検出することを含む、糖タンパク質の測定方法において、
前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを８．５よりも高く、かつ１１．０未満のアルカリ性域に調整することを特徴とする、前記糖タンパク質の測定方法。
【請求項２】
前記糖結合化合物は、糖結合タンパク質である、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項３】
前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程のｐＨを前記アルカリ性域のｐＨに調整することを含む、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項４】
前記糖タンパク質は、担体に固定化されている、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項４に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項６】
前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブは、標識されている、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項７】
前記糖鎖が複合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、イムノグロブリンG、イムノグロブリンA、イムノグロブリンM、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フコシル化αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、チログロブリン、フェツイン、アシアロフェツイン、及びオボアルブミンからなる群から選ばれる一種である、請求項１に記載の糖タンパク質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の測定方法に関し、より詳細には糖タンパク質測定時のＳ／Ｎ比を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の半数以上が翻訳後に糖鎖修飾を受けている。糖鎖のタンパク質への結合様式は、アスパラギン残基のアミド基に結合するＮ結合型及びセリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基に結合するＯ結合型に分けられる。いずれの糖鎖修飾も、タンパク質の活性、細胞間相互作用、接着等に重要な役割を果たしている。糖鎖修飾の変化が疾患と関連することが数多く報告されている。【０００３】
例えば、αフェトプロテインは、Ｎ結合型糖鎖を持つ血清に含まれる糖タンパク質であり、健康な成人の血清にほとんど存在しない。一方、良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン−Ｌ１型糖鎖（ＡＦＰ−Ｌ１）が増加し、肝臓ガン患者にはさらにフコシル化したαフェトプロテイン−Ｌ３型糖鎖（ｆＡＦＰ又はＡＦＰ−Ｌ３）が検出される。レクチンで検出される糖鎖の違いが、肝疾患診断に利用されている。【０００４】
ハプトグロビンは、β鎖（分子量４０，０００）に４個のＮ結合型糖鎖結合部位を有する糖タンパク質である。膵臓癌になると、ハプトグロビンにフコースが付加した病変ハプトグロビンが患者血清等から検出される。病変ハプトグロビンは、膵臓癌の病期の進行とともに増え、膵臓癌の腫瘍部摘出後には消失する。フコシル化ハプトグロビンの高精度かつ迅速な検出により、膵臓癌の早期発見が期待される。【０００５】
チログロブリンは、甲状腺の上皮細胞で合成され濾胞に貯留し、一般に全身の細胞に作用して細胞の代謝率を上昇させる働きをもつホルモンである。甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症の代表例が、バセドウ病である。バセドウ病は、手足の震え、眼球突出、動悸、甲状腺腫脹、多汗、体重減少、高血糖、高血圧等の症状を引き起こす。甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症の例が慢性甲状腺炎(橋本病)である。橋本病は、全身倦怠感、発汗減少、体重増加、便秘等の症状を引き起こす。このタンパク質は、糖鎖としてフコースを有する。チログロブリンに付加した糖鎖の検出感度を高めることで、チログロブリン含量の測定精度を上げることができる。【０００６】
関節リウマチ患者では、血清中ＩgＧの末端ガラクトースの付加率が減少し、末端にＮ−アセチルグルコサミンを持つ糖鎖の割合が増加する。ガラクトース欠損は、ＩｇＧの重要な生理機能である補体の活性化やＦｃ受容体への結合能を著しく損なう。【０００７】
トランスフェリン（ＴＦ）は、６７９個のアミノ酸を有するポリペプチド鎖からなり、そして、４１３番目と６１１番目のアスパラギン酸残基が末端シアル酸を有する二個の分岐状糖鎖でＮ−グリコシル化されている糖タンパク質である。トランスフェリンには、５７０番目のアミノ酸残基がプロリンであるＴＦＣ１と、それがセリンで置換されたＴＦＣ２という多型が存在する。ＴＦＣ１Ｃ２のヘテロ接合体の遺伝子型を持つアルツハイマー疾患（ＡＤ）患者は、６個のシアル酸を有するＴＦの相対強度が、ＴＦＣ１Ｃ１ホモ接合体の遺伝子型を持つ患者よりも有意に減少している。【０００８】
ＡＤ患者から採取したＣＳＦ糖タンパク質は、シアル酸付加率が有意に低下している。シアル酸量の変化は、ＡＤ以外にも、心臓血管疾患、アルコール依存症、糖尿病等について観察されている。【０００９】
上記糖タンパク質を検出するために、糖結合化合物の一種であるレクチンの使用が公知である。レクチンは、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。特定の糖残基に親和性を有する植物、動物あるいは菌類由来のレクチンが数多く発見されている。【００１０】
レクチンを用いた糖タンパク質の検出方法として、酵素免疫測定法（レクチンＥＬＩＳＡ）が知られている。レクチンＥＬＩＳＡは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる等の長所を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｙｕｋａ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆｕｃｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７，ｐ３３９７３−３３９８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来のレクチンＥＬＩＳＡのような糖タンパク質の測定方法では、糖タンパク質を含む試料（例えば血清）に由来するノイズが発生する。糖タンパク質検出時の検出感度（Ｓ／Ｎ比）が低いと、糖タンパク質を正確に検出することは困難となる。糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断するために、レクチンＥＬＩＳＡ等の糖タンパク質の測定方法のＳ／Ｎ比を向上することが望まれる。【００１３】
そこで、本発明の目的は、レクチンをはじめとする糖結合化合物により糖タンパク質を精度高く検出するために、糖タンパク質−糖結合化合物複合体の検出感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖タンパク質と糖結合化合物との反応による糖タンパク質の測定方法における特定の工程のｐＨを、アルカリ性域のｐＨに調整することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、糖タンパク質と、前記糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物とを反応させ、反応した糖結合化合物を検出することを含む、糖タンパク質の測定方法において、前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを８．５よりも高く、かつ１１．０未満のアルカリ性域に調整することを特徴とする、前記糖タンパク質の測定方法を提供する。【００１５】
「糖タンパク質」の用語は、本明細書において、糖ペプチドを含む意味で用いられる。「糖鎖」の用語は、本明細書において、単糖を含む意味で用いられる。また、「糖結合化合物」とは、本明細書において、糖に結合する化合物を意味する。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。【００１６】
前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程のｐＨを前記アルカリ性域のｐＨに調整することを必須に含むことが好ましい。【００１７】
前記糖タンパク質は、担体に固定化されていることが好ましい。【００１８】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。【００１９】
前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブは、標識されていることが好ましい。【００２０】
前記糖鎖は、例えば複合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である。【００２１】
前記糖タンパク質は、例えばハプトグロビン（ＨＰ）、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン（ＴＦ）、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ‐ＧＴＰ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フコシル化αフェトプロテイン（ｆＡＦＰ、ＡＦＰ‐Ｌ３）、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、チログロブリン（ＴＧ）、フェツイン（ＦＥＴ）、アシアロフェツイン（ａＦＥＴ）、及びオボアルブミン（ＯＶＡ）からなる群から選ばれる一種である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の糖タンパク質の測定方法によれば、糖タンパク質検出時のＳ／Ｎ比が従来よりも向上する。特に、糖タンパク質と糖結合化合物との反応工程、及び／又は糖タンパク質−糖結合化合物複合体の糖結合化合物と２次プローブとのプローブ反応工程のｐＨを、上記特定のｐＨ域に調整することで、Ｓ／Ｎ比が顕著に向上する。糖タンパク質からの糖鎖の欠損又は付加が、疾患と関連する場合、糖タンパク質検出のＳ／Ｎ比の向上は、疾患の早期の発見、診断や治療につながる。また、疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】糖タンパク質ＴＧをＥＬＩＳＡプレートに固相化した後、ブロッキングを行い、血清を添加することでノイズ源を非特異的に吸着させた。その後、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）溶液を作用させる際の条件を変更したときのシグナル及びノイズを比較したグラフである。比較例１では、ｐＨ７．４のＰＢＳ中でレクチン反応を行なった。実施例１〜３では、ｐＨ１０．０の３種類の緩衝液中でレクチン反応を行なった。実施例１〜３では、ノイズが顕著に減少した。一方、シグナルは比較例１のレベルを維持した。
【図１ｂ】図１ａのＳ／Ｎ比を比較したグラフである。ｐＨ１０．０でレクチン反応を行なった実施例１〜３のＳ／Ｎ比は、ｐＨ７．４でレクチン反応を行なった比較例１よりも格段に高くなった。
【図２ａ】図１ａのレクチン反応（１次反応）時のｐＨ調整を、検体反応後（すなわち、１次反応前）、１次反応後又は２次反応後の洗浄時のｐＨ調整に変更した際のＳ／Ｎ比を示すグラフである。１次反応前のアルカリ洗浄時のｐＨ調整では、Ｓ／Ｎ比は向上しなかった。一方、１次反応後又は２次反応後にアルカリ性域のｐＨで洗浄を行なうことで、ノイズ低減効果によるＳ／Ｎ比の向上を確認した。
【図２ｂ】図１ａのレクチン反応（１次反応）の反応液のｐＨ調整を、２次反応時の反応液、又は、１次反応時及び２次反応時の反応液、に変更した際のＳ／Ｎ比を示すグラフである。２次反応液の溶媒をアルカリ性にすることで、１次反応時と同様に、ノイズ低減効果によりＳ／Ｎ比が向上し、１次反応時と併用することでその効果がさらに向上することを確認した。
【図２ｃ】図１ａのレクチン反応（１次反応）の反応液のｐＨ調整を、２次反応時の反応液に変更し、２次プローブをＡＰ標識ストレプトアビジンに変更した際のＳ／Ｎ比を示すグラフである。２次プローブをＡＰ標識ストレプトアビジンとしてもＨＲＰ標識ストレプトアビジンと同様に、ノイズ低減効果によるＳ／Ｎ比の向上を確認した。
【図２ｄ】図１ａのレクチン反応（１次反応）の反応液のｐＨ調整を、２次反応時の反応液に変更し、１次反応のレクチンに標識していないＰｈｏＳＬを用い、２次プローブとしてビオチン標識抗ＰｈｏＳＬ抗体を用い、３次プローブとしてＨＲＰ標識ストレプトアビジンを使用した際のＳ／Ｎ比を示すグラフである。２次プローブに抗ＰｈｏＳＬ抗体を用いてもノイズ低減効果によるＳ／Ｎ比の向上を確認した。
【図３ａ】糖タンパク質ｆＡＦＰ（ペプシン処理）とＰｈｏＳＬとの反応をグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中でｐＨを変更して行なった際の、ｐＨとシグナル及びノイズとの関係を示すグラフである。
【図３ｂ】糖タンパク質ｆＡＦＰ（ペプシン処理）とＰｈｏＳＬとの反応を炭酸−重炭酸緩衝液中でｐＨを変更して行なった際の、ｐＨとシグナル及びノイズとの関係を示すグラフである。
【図３ｃ】糖タンパク質ｆＡＦＰ（ペプシン処理）とＰｈｏＳＬとの反応をＴＡＰＳ緩衝液中でｐＨを変更して行なった際の、ｐＨとシグナル及びノイズとの関係を示すグラフである。
【図３ｄ】図３ａ〜図３ｃのＳ／Ｎ比を示すグラフである。この図から、レクチン反応時の溶媒やそれ以降に用いる溶媒のｐＨを、８．５よりも高く、かつ１１．０よりも低い範囲、好ましくは８．６〜１０．５の範囲、より好ましくは９．０〜１０．５の範囲に調整することで、糖タンパク質の検出感度が向上することがわかる。
【図４ａ】図３ａの糖タンパク質ｆＡＦＰ（ペプシン処理）とＰｈｏＳＬとの反応をマイクロビーズレクチンＥＬＩＳＡで検出した際のシグナル及びノイズを示すグラフである。固定化担体をマイクロビーズに変更しても、本発明のようにアルカリ性域のｐＨを採用することによりノイズ低減効果が発揮されることがわかる。
【図４ｂ】図４ａのＳ／Ｎ比を示すグラフである。マイクロビーズＥＬＩＳＡでも、ノイズ低減効果によるＳ／Ｎ比の向上を確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の測定方法は、糖タンパク質と、前記糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物とを反応させ、反応した糖結合化合物（糖タンパク質−糖結合化合物複合体）を検出することを含み、前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを８．５よりも高く、かつ１１．０未満のアルカリ性域に調整することを必須とする。
【００２５】
本発明の測定対象となる糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖及びＯ結合型糖鎖が含まれる。Ｎ結合型糖鎖には、下記式：
【化１】
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〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する〕
で示されるコア構造に、
フコース、シアル酸、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンで構成される側鎖（Ｎ−アセチルラクトサミン構造、ポリＮ−アセチルラクトサミン構造）が１〜６本付加した複合型糖鎖；
前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖；並びに
前記複合型と前記高マンノース型とが混成した混成型糖鎖が含まれる。
また、前記Ｎ結合型糖鎖には、コア構造の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが付加した糖鎖も含まれる。
【００２６】
本発明の測定対象となる糖鎖には、シアル酸（Ｓｉａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）等が含まれる。
【００２７】
糖タンパク質の具体例には、ハプトグロビン（ＨＰ）、フコシル化ハプトグロビン（ｆＨＰ）、トランスフェリン（ＴＦ）、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フコシル化αフェトプロテイン（ｆＡＦＰ、ＡＦＰ−Ｌ３）、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、チログロブリン（ＴＧ）、フェツイン（ＦＥＴ）、アシアロフェツイン（ａＦＥＴ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）等が挙げられる。糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。
【００２８】
糖タンパク質の出所は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。好ましくは血液、血漿又は血清であり、特に好ましくは血清である。血液、血漿又は血清の試料を本発明の方法に適用すると、血液、血漿又は血清由来のノイズを低減することができる。
【００２９】
本発明の測定方法に供する試料は、糖タンパク質以外に、糖鎖を有する限りその断片（糖ペプチド）であってもよい。糖ペプチドは、糖タンパク質をプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で処理することにより得られる。上記プロテアーゼは、糖タンパク質に作用して糖ペプチドを生成させるものであれば特に制限はない。該プロテアーゼを機能的に分類すると、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３０】
上記プロテアーゼは、その由来を問わない。例えば、動物由来のプロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンD、カルパイン等が挙げられる。植物由来のプロテアーゼとしては、パパイン、キモパパイン、アクチニジン、カリクレイン、フィシン、ブロメライン等が挙げられる。微生物由来のプロテアーゼとしては、バチルス属、アスペルギルス属、リゾプス属、アオカビ属（ペニシリウム属）、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属及びリソバクター属由来のものが挙げられる。
【００３１】
本発明に使用するプロテアーゼは、市販のものを特に制限なく使用可能である。例えば、本発明の実施例に使用したペプシンとして、ブタ胃粘膜由来（シグマ・アルドリッチ社製）、及びストレプトマイセス由来のプロテアーゼとしてアクチナーゼＥ（科研製薬株式会社製）等が挙げられる。
【００３２】
プロテアーゼ処理は、通常、水、緩衝液等の水性媒体中で行われる。プロテアーゼ処理を一定のｐＨの下で行うために、緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液の例としては、グリシン塩酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。プロテアーゼ処理を促進するために、水性媒体中に界面活性剤等の変性剤を添加してもよい。
【００３３】
プロテアーゼの使用量は、糖タンパク質とプロテアーゼとの反応が進行する量であればよい。プロテアーゼ処理の条件（ｐＨ、温度、及び時間）は、使用するプロテアーゼに依存する。
【００３４】
プロテアーゼ処理後、ｐＨの変更、加熱処理、酵素反応停止液の添加等、適宜の手段で酵素反応を停止させる。その後、反応液を濾過、透析、遠心分離等の分離手段によって、上清と固体残渣とに分離してもよい。上清をさらに、塩析、エタノール沈殿等の除タンパク質処理にかけてもよい。
【００３５】
本発明の測定方法において、前記糖タンパク質は、必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材でできたマイクロタイタープレート、ビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。これらの担体への糖タンパク質の固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。
【００３６】
前記糖タンパク質は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。
【００３７】
抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。さらに、抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。
【００３８】
上記の抗体等が糖結合化合物と反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖結合化合物と反応する糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のＦｃ部をペプシン、パパイン等のプロテアーゼにより限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。
【００３９】
上記抗体の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体（例えば抗トランスフェリン抗体）の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。
【００４０】
本発明の方法は、まず、抗体を適宜、結合させた担体に、糖タンパク質を含む検体（例えば血清）の溶液を添加することにより、糖タンパク質を担体に結合させる。
【００４１】
次に、前記糖タンパク質含有溶液に、該糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物溶液を作用させ、糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させる。使用する糖結合化合物は、糖タンパク質に結合する糖鎖に依存して、適宜、選択される。
【００４２】
前記糖結合化合物は、例えば糖に結合するタンパク質（ペプチドを含む）、並びに糖に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸である。
【００４３】
前記糖結合タンパク質には、レクチン、抗糖鎖抗体、マルトース結合タンパク質、グルコース結合タンパク質、ガラクトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、炭水化物結合モジュールが含まれる。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質であり、より好ましくはレクチン及び抗糖鎖抗体であり、さらに好ましくはレクチンである。
【００４４】
前記糖結合化合物は、一種単独でもよく、または二種の併用でもよい。
【００４５】
前記レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示す。赤血球凝集反応阻害試験法は、特許４５１４１６３（フコースα１→６特異的レクチン）に記載されている方法で行うことができる。
【００４６】
前記レクチンは、天然由来レクチン、若しくは化学合成又は遺伝子工学的合成により得られるレクチンのいずれでもよい。レクチンの由来は、植物、動物及び菌類のいずれでもよい。以下に、本発明に使用可能な天然レクチンの例を示す。
【００４７】
ガラクトース（Ｇａｌ）／Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に親和性を有するレクチンの例には、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、ドリコスマメレクチン（ＤＢＡ）、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｐ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ダイズレクチン（ＳＢＡ）、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）が挙げられる。マンノース（Ｍａｎ）に親和性を有するレクチンの例には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）が挙げられる。フコース（Ｆｕｃ）に親和性を有するレクチンの例には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ロータスレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、ミヤコグサレクチン（ＬＴＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）、ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）、サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）、クリタケレクチン（ＮＳＬ）、コムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）、ベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）が挙げられる。このうち、ＰｈｏＳＬ、ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ及びＡＭＬは、α１→６フコースにのみ特異的に結合するので、α１→６フコースの有無が疾患と関連する糖タンパク質の検出に有利である。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮAｃ）に親和性を有するレクチンの例には、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、バンデリアマメレクチン−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）が挙げられる。シアル酸（Ｓｉａ）に親和性を有するレクチンの例には、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ−Ｉ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）、及び西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ−Ｉ）が挙げられる。
【００４８】
糖結合化合物及び／又は糖結合化合物を検出するプローブは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。標識手段の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、ＣｙＤｙｅ等の蛍光化合物、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラテックス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。糖結合化合物を検出するプローブは、一種単独、又は二種以上の併用でもよい。
【００４９】
標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の基質としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］２アンモニウム塩、５−アミノサリチル酸、又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、アルカリフォスターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）又は４−メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてはｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを挙げることができる。
【００５０】
標識手段は、常法により前記糖結合化合物又は前記糖結合化合物を検出するプローブへ結合することができる。特に、ストレプトアビジン（又はアビジン）−ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。
【００５１】
固定化された上記糖タンパク質に上記糖結合化合物を含む溶液に曝すことにより、糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させる。本発明の方法は、前記糖タンパク質と前記糖結合化合物との反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを、上記特定のアルカリ性域に調整することを特徴とする。すなわち、本発明は、糖タンパク質及び糖結合化合物が共存する環境のｐＨを上記特定の範囲に調整することが重要である。具体的には、糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させて糖タンパク質−糖結合化合物複合体を得る糖結合化合物反応工程の溶媒、糖タンパク質−糖結合化合物複合体を洗浄する洗浄工程の洗浄液、糖タンパク質−糖結合化合物複合体に２次プローブ以降のプローブを反応させるプローブ反応工程の溶媒、プローブ反応後の糖タンパク質−糖結合化合物複合体を洗浄する洗浄液等のｐＨを調整する。
【００５２】
上記溶媒のｐＨの下限は、８．５よりも高い。ｐＨが８．５以下であると、糖タンパク質−糖結合化合物複合体のＳ／Ｎ比の改善が図れない場合がある。ｐＨの下限は、好ましくは８．６以上、より好ましくは８．８以上、さらに好ましくは９．０以上である。逆に、上記溶媒のｐＨの上限は、１１．０未満である。ｐＨが１１．０以上であると、複合体のＳ／Ｎ比の改善が図れない場合がある。ｐＨの上限は、好ましくは１０．５以下である。
【００５３】
上記ｐＨは、アルカリ性溶液、好ましくはアルカリ性緩衝液によって調整される。緩衝液の例には、グリシン−水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）緩衝液；炭酸−重炭酸緩衝液；ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等のグッド緩衝液；ホウ酸ナトリウム緩衝液；塩化アンモニウム緩衝液；Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ 緩衝液等の広域緩衝液等が挙げられる。好ましくはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液及びＴＡＰＳ緩衝液から選ばれる一種以上であり、より好ましくはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液及びＴＡＰＳ緩衝液から選ばれる一種以上である。これらの緩衝液の調製は、従来公知の方法に基づく。
【００５４】
上記反応の後、反応した糖結合化合物を検出することにより、糖タンパク質を検出する。糖結合化合物の測定方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。測定方法の例としては、レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法、サンドイッチ法、競合法）、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。表面プラズモン共鳴法は、担体に固定化した糖タンパク質量、及び、糖タンパク質に結合した検出レクチン量を多段階法で同時に測定できるので便利である。
【００５５】
いくつかの代表的な測定方法を、以下に概説する。レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法）では、糖タンパク質を含む溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加して固定化する（固相化）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応、１次反応）。２次標識化合物としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プローブ反応、２次反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。上記レクチン反応以降の工程の少なくとも一工程を本発明で規定するアルカリ性域に調整する。予め、既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
【００５６】
レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）では、糖タンパク質（抗原）に結合する抗体をプレートやマイクロプレートに添加し抗体をプレート等に固定化する。次いで、糖タンパク質を含む検体（血清等）を添加して、前記抗体と糖タンパク質とを反応させる（検体反応）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応）。２次標識化合物としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プロ―ブ反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。上記レクチン反応以降の工程の少なくとも一工程を本発明で規定するアルカリ性域に調整する。予め、既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
【００５７】
本発明の方法によれば、糖タンパク質の検出感度が向上するので、糖鎖変化と関連する疾患の診断精度の向上に寄与する。ガラクトース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌、骨髄腫等がある。マンノース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、直腸癌等がある。フコース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、大腸癌、膵臓癌、肝癌等がある。Ｎ−アセチルグルコサミン残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、特発性正常圧水頭症、肝癌等がある。シアル酸残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、心筋梗塞、繊維症、膵炎、糖尿病、糖タンパク質糖鎖転移不全症等がある。
【実施例】
【００５８】
以下に本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５９】
使用した試薬は、以下に示すように入手又は調製をした。
＜リン酸緩衝化生理食塩水（ｐH７．４）（ＰＢＳ）＞
リン酸水素二ナトリウム５．７５ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、塩化カリウム１．０ｇ、及び塩化ナトリウム４０．０ｇを水５Ｌに溶解して、ＰＢＳを得た。【００６０】
＜０．６Ｍ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）＞
トリスヒドロキシメチルアミノメタン７．３ｇを、水８０ｍL程度に溶解し、６Ｎ  塩酸を添加してｐＨ９．０に合わせ、さらに水で１００ｍLにメスアップした。【００６１】
＜５０ｍＭ  グリシン‐水酸化ナトリウム（グリシン−ＮａＯＨ）緩衝液（ｐH８．５〜１１．０）＞
グリシン３７５．４ｍｇを、水８０ｍＬ程度に溶解し、５Ｎ  水酸化ナトリウムを添加してｐＨ８．５に合わせ、さらに水で１００ｍＬにメスアップした。同様にｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、ｐＨ１１．０の緩衝液を調製した。【００６２】
＜５０ｍＭ  炭酸−重炭酸緩衝液（ｐH８．６〜１１．０）＞
炭酸ナトリウム１．０６ｇを、水２００ｍＬに溶解し、炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを水２００ｍＬに溶解した。炭酸ナトリウム溶液と炭酸水素ナトリウム溶液を混合し、ｐＨ８．６、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、ｐＨ１１．０の緩衝液を調製した。【００６３】
＜５０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５〜１１．０）＞
ＴＡＰＳ  １．２２ｇを、水８０ｍＬ程度に溶解し、５Ｎ  水酸化ナトリウムを添加してｐＨ８．５に合わせ、さらに水で１００ｍＬにメスアップした。同様にｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、ｐＨ１１．０の緩衝液を調製した。【００６４】
＜１．２Ｍ  グリシン‐塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）＞
グリシン９．００ｇを、水８０ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ  塩酸を添加してｐＨ３．３に合わせ、さらに水で１００ｍＬにメスアップした。【００６５】
＜ＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．４）＞
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名  Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク（株）製）２．５ｍＬを５ＬのＰＢＳに溶解して、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔという）を得た。【００６６】
＜アルカリフォスファターゼ用洗浄液＞
Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２０X）（ＫＰＬ社製）１０ｍＬを、水９０ｍＬと混合した。【００６７】
＜１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ＞
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ社製）１ｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、濃度１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液（以下、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳという）を得た。【００６８】
＜０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ＞
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ社製）１００mｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、濃度０．１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液（以下、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳという）を得た。【００６９】
＜ペプシン溶液＞
ペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ・アルドリッチ社製）を、１．２Ｍ  グリシン‐塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）で、１５００Ｕ／ｍＬになるように溶解した。【００７０】
＜ヒト血清＞
ヒト血清はＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社製（製品名：Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｕｅ  Ａ  ｓｅｒｕｍ，  Ｐｏｏｌ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒｓ、型番：ＳＥＲ０１９Ａ０５０Ｂ６３４）のものを使用した。【００７１】
＜糖タンパク質溶液＞
以下の糖タンパク質を、それぞれ、濃度１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶解して糖タンパク質溶液を得た。
オボアルブミン（ＯＶＡ、シグマ・アルドリッチ社製）、
フェツイン（ＦＥＴ、シグマ・アルドリッチ社製）、
アシアロフェツイン（ａＦＥＴ、シグマ・アルドリッチ社製）、
チログロブリン（ＴＧ、Ｓｃｉｐａｃ社製）、
フコシル化αフェトプロテイン（ｆＡＦＰ）又はフコシル化ハプトグロビン（ｆＨＰ）は以下の方法で調製した。【００７２】
＜ｆＡＦＰ溶液の調製＞
肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２、理化学研究所より入手）を常法に従い培養し、培養上清液を得た。培養上清液１０００  ｍＬを、限外ろ過フィルター（製品名：ＶＩＶＡ  ＳＰＩＮ  ２０‐１０Ｋ、ザルトリウス社製）で１ｍＬに濃縮した。ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）に抗ＡＦＰ抗体を固定化したゲル０．５ｍｌに上記濃縮液を添加した。室温で１０分毎に混和して１時間後、前記ゲルを含む溶液を０．４５μｍフィルターチューブ（ミリポア社製）に加え、４００×ｇ、４℃で５分間遠心し、ろ液を廃棄した。次に、ＰＢＳ  ２００μＬを加えて４００×ｇ、４℃で５分間遠心して、ろ液を廃棄した。これを２回繰り返した。次いで、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  グリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）２００μＬを加えて、４００×ｇ、４℃で５分間遠心して、ろ液を回収した。これを２回繰り返した。この液を合わせて得た溶液を３ＮのＮａＯＨで中和した後、ＰＢＳ  ６００μＬを加え、ｆＡＦＰ溶液を得た。【００７３】
＜ｆＨＰ溶液の調製＞
抗ＡＦＰ抗体の代わりに抗ハプトグロビン抗体を固定化したゲルを用いたこと以外、上記ｆＡＦＰ溶液の調製と同様に行い、ｆＨＰ溶液を得た。【００７４】
＜抗ＡＦＰ抗体＞
以下の商品名に示す抗体を入手した。
抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（ミクリ免疫研究所製）【００７５】
＜脱グリコシル化抗ＡＦＰ抗体＞
上記抗ＡＦＰ抗体を、非特許文献１に記載の方法に準じて脱グリコシル化を行った。【００７６】
＜抗ＰｈｏＳＬ抗体＞
ＰｈｏＳＬを免疫原として公知の方法に従いポリクローナル抗体を作製した。プロテインＧ固相担体を用いて抗血清からＩｇＧ画分を精製した。【００７７】
＜ビオチン標識抗ＰｈｏＳＬ抗体＞
ビオチン化試薬（シグマ・アルドリッチ社製；型番：Ｂ２６４３）をジメチルスルホキシドに溶解し、上記抗ＰｈｏＳＬ抗体に加え反応させた。反応液は限外ろ過（５０Ｋの膜、ミリポア社製）でＰＢＳに対して溶媒置換を行い、ビオチン標識抗ＰｈｏＳＬ抗体溶液を得た。【００７８】
＜レクチン＞
スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）は、非特許文献１に記載の方法に従って、スギタケから精製した。ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）は、上記スギタケレクチン精製と同様の手順で、ツチスギタケから精製した。サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）及びクリタケレクチン（ＮＳＬ）は、特許４５１４１６３に記載の方法に従って精製した。【００７９】
＜ビオチン標識レクチン＞
小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、日本ニワトコレクチン（ＳＳＡ）、及びマッシュルームレクチン（ＡＢＡ）は、株式会社Ｊ−オイルミルズ社製のビオチン標識レクチンを使用した。ＰｈｏＳＬ、ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬは非特許文献１に記載の方法に準じてビオチン標識化した。ビオチン標識レクチンを、１ｍｇ／ｍL  ＰＢＳに調製して保存しておき、使用時に適切な濃度に希釈した。【００８０】
発色試薬として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ社製）、ＨＲＰ用発色基質（商品名：ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、ＫＰＬ社製）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ社製）、及びＡＰ用発色基質（商品名：ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＫＰＬ社製）を用意した。【００８１】
発色反応の停止液として、ＨＲＰ用反応停止液（１Ｍ  リン酸／水）、及びＡＰ用反応停止液（ＡＰＳｔｏｐTM  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （１０Ｘ）（ＫＰＬ社製）１０ｍＬを水９０ｍＬと混合して調製したもの）を用意した。【００８２】
〔実施例１〜３〕レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法）によるＴＧの測定（Ｉ）
糖タンパク質ＴＧの測定を、レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法）により行なった。具体的な工程を以下に示す。
（１）ＴＧ固定化
ＴＧ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈液２５μＬを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加して、４℃で一晩放置し、その後、添加液を廃棄した。
（２）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。
（３）ブロッキング
上記ウェルに１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを５０μＬ添加して、３７℃で６０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（４）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計２回繰り返した。
（５）検体反応（ヒト血清添加）
ＴＧ等の糖タンパク質は、通常、血清、血液等の生体試料中に含まれている。これらの試料は、目的の糖タンパク質以外に、さまざまな物質を含む。これらの物質が、糖タンパク質測定時のノイズ源となる。そこで、糖タンパク質測定時のノイズ源をシミュレートするため、上記ウェルにヒト血清を追加的に添加した。具体的には、ヒト血清２５μＬを上記ウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（６）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）１次反応（糖タンパク質とレクチンとの反応）
表１に示す緩衝液で、ビオチン標識ＰｈｏＳＬを０．２５μｇ／ｍＬに希釈した。このレクチン溶液２５μＬを上記ウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（８）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）２次反応（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応）
上記ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをＰＢＳで、０．０４μｇ／ｍＬに希釈した。これを上記ウェルに２５μＬ添加して、室温で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（１０）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計４回繰り返した。
（１１）発色反応
上記ウェルに、ＨＲＰ用発色基質２５μＬを添加し、室温で１０分間放置した。
（１２）反応停止
反応停止液（１Ｍ  リン酸／水）を２５μＬ添加し、発色反応を停止させた。プレートリーダー（製品名：ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ（登録商標）ＨＴ、バイオテック（株）製）を用いて、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定した。糖タンパク質添加の４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を引いた値をシグナル値：吸光度ＴＧ（＋）とした。同様に、糖タンパク質未添加での４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を引いた値をノイズ値：吸光度ＴＧ（−）とした。式（１）に示すように、糖タンパク質添加でのシグナル値を糖タンパク質未添加でのノイズ値で除することにより、Ｓ／Ｎ比を求めた。結果を表１、並びに図１ａ及び図１ｂに示す。
【数１】
2017131021.tif 000004
【００８３】
【表１】
2017131021.tif 000005
【００８４】
比較例１のように、糖タンパク質−レクチン複合体を含有する血清を、中性域のｐＨを有する緩衝液中で検出すると、シグナル値が２．８２８と高いものの、ノイズ値も１．７０２と高い。比較例１のＳ／Ｎ比は、１．７倍である。一方、実施例１〜３のように、糖タンパク質ＴＧとレクチンとの反応時の溶媒をアルカリ性域に調整することにより、糖タンパク質に由来するシグナル値を高く維持したまま、血清に由来するノイズ値が顕著に低下する（表１及び図１ａ）。その結果、Ｓ／Ｎ比で表される糖タンパク質−レクチン複合体の検出感度が４．６〜８．９倍へと格段に向上する（表１及び図１ｂ）。【００８５】
〔実施例４〜７〕TGのレクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法）による測定（II）
実施例１では、（７）糖タンパク質とレクチンとの反応時にアルカリ性域の溶媒を使用したが、実施例４〜７では、以下のように変更した。【００８６】
実施例４では、比較例１において（８）１次反応後の洗浄をＰＢＳ−Ｔ×３回から、ＰＢＳ−Ｔ×１回、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）×２回、及びＰＢＳ−Ｔ×１回（合計４回の洗浄）へ変えた以外は、比較例１と同じ手順でＴＧを測定した。結果を表２及び図２ａに示す。【００８７】
実施例５では、比較例１において（９）２次反応の溶媒をＰＢＳ（ｐＨ７．４）からグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に変えた以外は、比較例１と同じ手順でＴＧを測定した。結果を表２及び図２ｂに示す。【００８８】
実施例６では、比較例１において（１０）２次反応後の洗浄をＰＢＳ−Ｔ×３回から、ＰＢＳ−Ｔ×１回、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）×２回、及びＰＢＳ−Ｔ×１回（合計４回の洗浄）へ変えた以外は比較例１と同じ手順でＴＧを測定した。結果を表２及び図２ａに示す。【００８９】
実施例７では、比較例１において（７）１次反応の溶媒及び（９）２次反応の溶媒をグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）へ変えた以外は、比較例１と同じ手順でＴＧを測定した。結果を表２及び図２ｂに示す。【００９０】
比較例２では、比較例１において（６）検体反応後の洗浄をＰＢＳ−Ｔ×３回から、ＰＢＳ−Ｔ×１回、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）×２回、及びＰＢＳ−Ｔ×１回（合計４回の洗浄）へ変えた以外は比較例１と同じ手順で、ＴＧを測定した。結果を表２に示す。【００９１】
比較例３では、比較例１において（９）２次反応のプローブをＡＰ標識ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍｌ）に変え、酵素に合わせて洗浄液及び発色基質及び発色反応停止液をアルカリフォスファターゼ用に変えた以外は、比較例１と同じ手順でＴＧを測定した。実施例８では、比較例３において２次反応の溶媒をグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に変えた以外は、比較例３と同じ手順でＴＧを測定した。これらの結果を表２及び図２ｃに示す。【００９２】
比較例４では、１次プローブにＰｈｏＳＬ（標識していないもの）を、２次プローブにビオチン標識抗ＰｈｏＳＬ抗体を、３次プローブにＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いた以外は、比較例1に準じてＴＧを測定した。全てのプローブ反応はＰＢＳで行った。実施例９では、２次プローブを使った２次反応の溶媒をグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に変えた以外は、比較例４と同じ手順でＴＧを測定した。これらの結果を表２及び図２ｄに示す。【００９３】
【表２】
2017131021.tif 000006
【００９４】
比較例１でレクチン反応及びその後の洗浄をｐＨ７．４で行ったところ、Ｓ／Ｎ比は１．７であった。比較例２のように、（６）検体反応後の洗浄をｐＨ１０．０のアルカリ性域に変更しても、Ｓ／Ｎ比は改善しなかった。このことから、糖タンパク質単独の環境をアルカリ性のｐＨ域に変更するだけでは、Ｓ／Ｎ比が改善しないことがわかる。【００９５】
一方、実施例１、４、５、６、７、８及び９のように、１次反応時の溶媒、１次反応後の洗浄液、２次反応時の溶媒、又は２次反応後の洗浄液のいずれかを、本発明で規定するｐＨ範囲に変更すると、Ｓ／Ｎ比が改善した。すなわち、糖タンパク質及びレクチンが共存する環境をアルカリ性のｐＨ域に変更することにより、Ｓ／Ｎ比が向上する（図２ａ〜ｂ）。特に、１次反応時及び／又は２次反応時の溶媒をアルカリ性域に調整することが、Ｓ／Ｎ比を顕著に高める点で好ましい（図２ｂ）。【００９６】
［実施例１０〜２２］レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）によるｆＡＦＰの測定（Ｉ）
ｆＡＦＰ糖タンパク質の測定を、レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により行なった。本実施例では、糖タンパク質を糖ペプチドに加工してから、測定を行なった。具体的な工程を以下に示す【００９７】
１．プロテアーゼ処理
糖タンパク質ｆＡＦＰのプロテアーゼ処理を、ペプシンを用いて行った。具体的には、上記ｆＡＦＰ溶液を４００ｎｇ／ｍＬになるよう、ヒト血清に加えた。次に、上記ｆＡＦＰ添加血清溶液２．５ｍＬと上記ペプシン溶液１．２５ｍＬとを混合して撹拌後、３７℃の温度で３０分間、静置した。この混合物に０．６Ｍ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１．２５ｍＬを添加してタンパク質分解反応を停止させ、２００ｎｇ／ｍＬのペプシン処理ｆＡＦＰの血清溶液（ｆＡＦＰ（＋））を得た。ブランクとして、上記ｆＡＦＰを添加することなくヒト血清をペプシン処理することにより、ｆＡＦＰ未含有のペプシン処理血清溶液（ｆＡＦＰ（−））を調製した。【００９８】
２．糖タンパク質の検出
上記で得られたｆＡＦＰ（＋）又はｆＡＦＰ（−）を、表３に示す緩衝液で希釈したビオチン標識ＰｈｏＳＬを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で検出した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、非特許文献１に記載の方法に準じた。具体的には、試験を以下の手順で行った。【００９９】
（１）抗体固定化
脱グリコシル化した抗ＡＦＰ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに２５μＬ添加して、４℃で一晩放置し、その後、添加液を廃棄した。
（２）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。
（３）ブロッキング
上記ウェルに１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを５０μＬ添加して、３７℃で６０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（４）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計２回繰り返した。
（５）検体反応
前記ｆＡＦＰ（＋）又は前記ｆＡＦＰ（−）２５μＬを上記ウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（６）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）１次反応（糖タンパク質とレクチンとの反応）
表３に示す緩衝液で、ビオチン標識ＰｈｏＳＬを０．２５μｇ／ｍＬに希釈した。このレクチン溶液２５μＬをウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（８）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）２次反応（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応）
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをＰＢＳで、０．０４μｇ／ｍＬに希釈した。これを各ウェルに２５μＬ添加して、室温で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（１０）洗浄
上記ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（１１）発色反応
上記ウェルに、ＨＲＰ用発色基質２５μＬを添加し、室温で１０分間放置した。
（１２）反応停止
上記ウェルに反応停止液（１Ｍ  リン酸／水）を２５μＬ添加し、発色反応を停止させた。前記プレートリーダーを用いて、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定した。ｆＡＦＰ（＋）の４５０ｎｍの吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を引いた値をシグナル値（吸光度ｆＡＦＰ（＋））とした。同様に、ｆＡＦＰ（−）の値をノイズ値（吸光度ｆＡＦＰ（−））として求めた。次に、ｆＡＦＰのＳ／Ｎ比を式（２）から求めた。
【数２】
2017131021.tif 000007
【０１００】
１次反応時の溶媒に、各種緩衝液を用いた場合の結果を表３、及び図３a〜dに示す。
【表３】
2017131021.tif 000008
【０１０１】
表３及び図３ａ〜ｄの結果から、糖タンパク質をＴＧからｆＡＦＰに変更しても、糖タンパク質のＳ／Ｎ比で表される検出感度が向上すること、そして糖タンパク質を糖ペプチドに断片化してもＳ／Ｎ比が向上することが判明した。【０１０２】
１次反応用溶媒に従来のｐＨ７．４であるＰＢＳを用いた比較例５のＳ／Ｎ比は１．２であったところ、緩衝液をアルカリ性域のグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液に変更すると、ｐＨが８．５を超え、１１以下の範囲でＳ／Ｎ比が向上する（実施例１０〜１３、及び参考例１）、緩衝液を炭酸−重炭酸緩衝液に変更すると、ｐＨが８．６以上１１．０未満の範囲でＳ／Ｎ比が向上する（実施例１４〜１８）、そして、緩衝液をＴＡＰＳ緩衝液に変更すると、ｐＨが８．５以上１１．０以下の範囲でＳ／Ｎ比が向上する（実施例１９〜２２、及び参考例２〜３）ことが確認された。【０１０３】
以上の結果から、レクチン反応時の溶媒やそれ以降に用いる溶媒のｐＨを、８．５よりも高く、かつ１１．０よりも低い範囲、好ましくは８．６〜１０．５の範囲、より好ましくは９．０〜１０．５の範囲に調整することで、糖タンパク質の検出感度が向上するといえる。【０１０４】
［実施例２３］レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）によるｆＡＦＰの測定（ＩＩ）
実施例１２のレクチンＥＬＩＳＡの固定化担体をマイクロビーズに変更した実験を行なった。その具体的手順を以下に示す。
１．プロテアーゼ処理
実施例１２と同様に、糖タンパク質ｆＡＦＰのプロテアーゼ処理を行なった。【０１０５】
２．糖タンパク質の検出
上記で得られたｆＡＦＰ（＋）又はｆＡＦＰ（−）を、表４に示すビオチン標識レクチンを用いてマイクロビーズＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）で検出した。具体的には、試験を以下の手順で行った。なお、マイクロビーズの保持のため適宜プレート状の磁石を用いた。
（１）抗体固定化
マイクロビーズ（商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ‐２８０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ、ＶＥＲＩＴＡＳ社製）と脱グリコシル化した抗ＡＦＰ抗体を２０μｇ／ｍｇ beadｓとなるように調製し、３７℃で一晩固定化後０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで２％のビーズ浮遊液とした。９６穴マイクロタイタープレートのウェルに前記ビーズ浮遊液を１μＬずつ添加した。
（２）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。
（３）検体反応
前記ｆＡＦＰ（＋）又は前記ｆＡＦＰ（−）２５μＬをウェルに添加して、撹拌後、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（４）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、撹拌後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（５）１次反応（糖タンパク質とレクチンとの反応）
表４に示す緩衝液で、ビオチン標識ＰｈｏＳＬを０．２５μｇ／ｍＬに希釈した。このレクチン溶液２５μＬをウェルに添加して、撹拌後、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（６）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、撹拌後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）２次反応（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応）
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをＰＢＳで、０．０４μｇ／ｍＬに希釈した。これを各ウェルに２５μＬ添加して、撹拌後、室温で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（８）洗浄
各ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、撹拌後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）発色反応
各ウェルに、ＨＲＰ用発色基質２５μＬを添加し、撹拌後、室温で１０分間放置した。
（１０）反応停止
ウェルに反応停止液（１Ｍ  リン酸／水）を２５μＬ添加し、発色反応を停止させた。実施例１２と同様にシグナル値及びノイズ値を測定し、そしてＳ／Ｎ比を求めた。その結果を、表４、図４a及び図４ｂに示す。【０１０６】
【表４】
2017131021.tif 000009
【０１０７】
表４において、従来使用されているｐＨ７．４のＰＢＳを用いた比較例８のＳ／Ｎ比は４．１であった。一方、ｐＨ９．５のグリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液を用いると、Ｓ／Ｎ比は６．１に向上した。本発明の方法は、固相担体の種類に依存しないことがわかる。【０１０８】
〔実施例２４〜３７〕レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法）による各種糖タンパク質の測定
（１）糖タンパク質の固定化
表５に示す糖タンパク質を、それぞれ、ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈液２５μＬを９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに添加して、４℃で一晩放置し、その後、添加液を廃棄した。
（２）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。
（３）ブロッキング
ウェルに１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを５０μＬ添加して、３７℃で６０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（４）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計２回繰り返した。
（５）検体反応（ヒト血清添加）
ヒト血清２５μＬをウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（６）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）１次反応（糖タンパク質とレクチンとの反応）
表５に示すビオチン標識レクチンを、それぞれ、表５に記載の緩衝液で０．２５μｇ／ｍＬに希釈した。このレクチン溶液２５μＬをウェルに添加して、室温で３０分間放置し、その後、添加液を廃棄した。
（８）洗浄
ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）２次反応（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応）
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをＰＢＳで、０．０４μｇ／ｍＬに希釈した。これを各ウェルに２５μＬ添加して、室温で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（１０）洗浄
各ウェルにＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ添加し、添加液を廃棄した。この操作を合計４回繰り返した。
（１１）発色反応
各ウェルに、ＨＲＰ用発色基質２５μＬを添加し、室温で１０分間放置した。
（１２）反応停止
反応停止液（１Ｍ  リン酸／水）を２５μＬ添加し、発色反応を停止した。前記プレートリーダーを用いて、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定した。糖タンパク質添加の４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を引いた値をシグナル値：吸光度糖タンパク質（＋）とした。同様に、糖タンパク質未添加での４５０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を引いた値をノイズ値：吸光度糖タンパク質（−）とした。式（３）に示すように、シグナル値をノイズ値で除することにより、Ｓ／Ｎ比を求めた。結果を表５に示す。
【数３】
2017131021.tif 000010
【０１０９】
【表５】
2017131021.tif 000011
【０１１０】
表５の結果から、本発明の方法は、糖タンパク質及びその糖鎖、並びにそれに親和性を有する糖結合化合物の種類を問わず、Ｓ／Ｎ比を向上させ得ることが判明した。
【図１ａ】
2017131021.tif 000012
【図１ｂ】
2017131021.tif 000013
【図２ａ】
2017131021.tif 000014
【図２ｂ】
2017131021.tif 000015
【図２ｃ】
2017131021.tif 000016
【図２ｄ】
2017131021.tif 000017
【図３ａ】
2017131021.tif 000018
【図３ｂ】
2017131021.tif 000019
【図３ｃ】
2017131021.tif 000020
【図３ｄ】
2017131021.tif 000021
【図４ａ】
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【図４ｂ】
2017131021.tif 000023
【国際調査報告】
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