(57)【要約】  有効な治療方法がなかったリンパ浮腫や、下肢虚血時に発生する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾病に対して、安全で簡易かつ確実に、リンパ管や血管や肉芽の再生や新生を誘導して成熟させて治療するための再生医療用皮内投与製剤、及び再生医療用皮内投与デバイスを提供する。  再生医療用皮内投与製剤は、皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有するというものである。再生医療用皮内投与デバイス(１)は、再生医療用皮内投与製剤(１５)を収容する薬室(１４)と、前記再生医療用皮内投与製剤(１５)を投与する注射針(２４)及び／又はカニューレとを有している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有することを特徴とする再生医療用皮内投与製剤。
【請求項２】
リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、及び皮膚損傷から選ばれる少なくとも何れかの疾患の治療製剤であることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項３】
リンパ管再生、リンパ管、血管、及び／又は肉芽の再生又は新生を誘導することを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項４】
前記成長因子が、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子から選ばれる少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項５】
皮膚表皮表面より１〜４ｍｍの深さである前記皮内に投与されることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項６】
前記成長因子が、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞を刺激することによって、放出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項７】
前記多血小板血漿に対し、冷却処理と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加処理との何れかにより、前記成長因子が放出されたものであり、又は
前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの前記幹細胞から、前記成長因子が放出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項８】
前記前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞が、再生医療を施す患者から採取されて由来しているものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項９】
前記多血小板血漿の血小板数、及び／又は前記幹細胞の数が、１×１０−５〜１×１０−７個／μｌであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項１０】
１〜４０ｍｌであることを特徴とする請求項９に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項１１】
前記多血小板血漿及び／又は前記幹細胞が、未培養であることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
【請求項１２】
多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかを刺激して、成長因子を放出させることにより、調製することを特徴とする再生医療用皮内投与製剤の製造方法。
【請求項１３】
前記多血小板血漿を、冷却と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加との何れかで刺激処理することにより、前記成長因子を放出させ、
又は、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞前記幹細胞から、前記成長因子を放出させることを特徴とする請求項１２に記載の再生医療用皮内投与製剤の製造方法。
【請求項１４】
皮内に投与するデバイスであり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有する再生医療用皮内投与製剤を収容する薬室と、前記再生医療用皮内投与製剤を投与する注射針及び／又はカニューレとを有していることを特徴とする再生医療用皮内投与デバイス。
【請求項１５】
前記注射針及び／又は前記カニューレが、皮膚表皮より１〜４ｍｍの深さの前記皮内に前記再生医療用皮内投与製剤を投与できる長さに調整されていることを特徴とする請求項１４に記載の再生医療用皮内投与デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮内に投与することにより、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患に対し組織を再生して治療するのに用いられる再生医療用皮内投与製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ浮腫や、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患は、リンパ管や血管の喪失に起因して発生するリンパ液の貯留、皮膚の炎症、又は感染等により、発症するものである。【０００３】
これら疾患の多くは、皮膚内に豊富にある毛細リンパ管や毛細血管の物理的・化学的・生物学的な損傷、消失により発生する。さらに広範な毛細リンパ管や毛細血管が、炎症等によって、消失して、これらの疾患の病態が、発生したり悪化したりする。【０００４】
中でも、リンパ浮腫の多くは、乳癌や子宮癌のような癌摘出の際、癌原発巣とリンパ節とを外科的に切除し郭清してから、癌再発防止のために抗癌剤治療やＸ線放射線治療を施すことにより、リンパ管が消失するために、事後的に発生することが知られている。特に乳癌患者の場合、腋窩リンパ節を切除してしまうと、術後に、上腕リンパ浮腫が多発する。また子宮癌患者の場合、周辺リンパ節を切除してしまうと、術後に、下肢のリンパ浮腫がしばしば発生する。【０００５】
リンパ浮腫は、初期でリンパ液が貯留し、後期で感染や蜂窩織炎を起こすという病態である。浮腫が発現すると上腕や下肢が腫れ上がる所為で、患者の日常生活は抑制され、クオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）が著しく低下する。一方、リンパ浮腫の治療としては、皮膚に貯留したリンパ液を移動させるマッサージや圧迫テープでの圧迫療法等の対症療法しかなく、今のところ根治治療法が無い。【０００６】
下肢虚血は、初期で無症状だが、病態が幾分進行すると、しびれ、冷感等の症状が認められるようになる。さらに進行すると、潰瘍等の症状が現れる。【０００７】
皮膚褥瘡は、皮膚および軟部組織への持続的圧迫の所為で、血流が途絶え、循環障害が増大し、阻血状態が続くことにより不可逆的な組織壊死が生じたものである。【０００８】
また皮膚損傷は、火傷や物理的な障害等から発生することがあるが、多くは、動脈系毛細血管の破壊を中心に、静脈系毛細血管やリンパ網等の障害との複合的な原因で発生すると考えられている。【０００９】
これらの疾患を治療するため、毛細リンパ管や毛細血管を再生させる治療薬については、ヒト成長因子（ＨＧＦ）遺伝子、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）遺伝子、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子や、バイオテクノロジー技術によりそれら遺伝子を用いて製造されたこれら成長因子（蛋白質）のようなバイオ有効成分を含有するスプレー剤、貼付剤、軟膏等が開発されつつある。これら遺伝子やそれの成長因子は、その役割について動物モデルを使用して検討されており、また血管新生やリンパ管新生に関与していることが知られている（非特許文献１）。繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）については、臨床で使用されているが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成細胞長因子（ＶＥＧＦ）等を含めたこれら成長因子、又はそれを産生する遺伝子が、患者に対して単一のバイオ有効成分で実際にどの程度の治療効果があるのか、明らかでない。まして複数のバイオ有効成分の効果については、未だ明らかになっていない。【００１０】
また、これらの遺伝子治療については、現在臨床上で応用が検討され始めたばかりで、臨床研究段階であり、長期安全性等について、明らかでない。さらにこれら遺伝子やそれに由来する蛋白質は、皮下、筋肉内投与により、リンパ浮腫、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等疾患の治療に使用されるが、これら遺伝子や蛋白質の筋肉内分布や局在性の詳細が明らかでなく、分布・局在よりむしろ、単純拡散等により標的部位から速やかに流失し、薬理効果が消失するのが早いと考えられる。【００１１】
一方、リンパ浮腫治療における形成外科分野では、リンパ節移植で治療が施されている。移植リンパ節周囲に多血小板血漿をマントー法で投与することで、輸出入リンパ管を含むリンパ管のようなリンパ組織が新生されることがラット実験で報告されている（非特許文献２）【００１２】
何れも破壊された皮膚の毛細リンパ管や毛細血管や皮膚肉芽を再生・新生させるものではなく、毛細脈管等の組織を効果的に形成できる有効な治療法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ネーチャー メディスン(Nature Medicine), 2007年, 第13巻, 第12号, p.1458-1466.
【非特許文献２】ジャーナル オブ バスキュラー リサーチ(Journal of Vascular Research), 2009年, 第46巻, 第5号, p389-396.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、特定の多血小板血漿（ＰＲＰ）や幹細胞を皮膚内に投与することにより、皮膚内に毛細リンパ管や毛細血管及び皮膚肉芽組織を再生・新生し成熟させることを見出した。特定の多血小板血漿や幹細胞を、皮膚内に投与すると、成長因子等の生理活性を保有する複数の蛋白質を放出し、皮膚内に毛細リンパ管が増生しまた皮膚線維芽細胞が遊走することから、毛細リンパ管や毛細血管及び皮膚新生肉芽組織を再生することが、実験で確かめられ、本発明を完成させた。【００１５】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、これまで、有効な治療方法がなかったリンパ浮腫や、下肢虚血時に発生する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾病に対して、安全で簡易かつ確実に、リンパ管や血管や肉芽の再生や新生を誘導して成熟させて治療するための再生医療用皮内投与製剤を提供することを目的とする。さらにその再生医療用皮内投与製剤を簡便に調製できる製造方法、及びその再生医療用皮内投与製剤を安全で簡易かつ確実に皮内へ投与するための再生医療用皮内投与デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与製剤は、皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有するというものである。【００１７】
再生医療用皮内投与製剤は、例えばリンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、及び皮膚損傷から選ばれる少なくとも何れかの疾患の治療製剤である。【００１８】
再生医療用皮内投与製剤は、例えばリンパ管、血管、及び／又は肉芽の再生又は新生を誘導することができるものである。【００１９】
再生医療用皮内投与製剤は、前記成長因子が、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子から選ばれる少なくとも何れかであることが好ましい。【００２０】
再生医療用皮内投与製剤は、皮膚表皮表面より１〜４ｍｍの深さである前記皮内に投与されるものであることが好ましい。【００２１】
再生医療用皮内投与製剤は、前記成長因子が、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞を刺激することによって、放出されたものであることが好ましい。【００２２】
再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿に対し、冷却処理と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加処理との何れかにより、前記成長因子が放出されたものであり、又は、前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの前記幹細胞から、前記成長因子が放出されたものであることが好ましい。この幹細胞は活性化処理をしなくとも、前記成長因子を放出する。例えば、前記脂肪系幹細胞は、採取時にコラゲナーゼで分離され、前記成長因子を、放出する。【００２３】
再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞が、再生医療を施す患者から採取されて由来しているものであると、一層好ましい。【００２４】
再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿の血小板数、及び／又は前記幹細胞の数が、１×１０−５〜１×１０−７個／μｌであることが好ましい。【００２５】
そのとき、再生医療用皮内投与製剤は、１〜４０ｍｌであることが好ましい。【００２６】
再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿及び／又は前記幹細胞が、未培養であってもよい。【００２７】
前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかを刺激して、成長因子を放出させることにより、調製するというものである。【００２８】
再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、前記多血小板血漿を、冷却と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加との何れかで刺激処理することにより、前記成長因子を放出させ、又は、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞前記幹細胞から、前記成長因子を放出させることが好ましい。前記脂肪系幹細胞は、採取時にコラゲナーゼで分離され、前記成長因子を、放出する。【００２９】
前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、皮内に投与するデバイスであり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有する再生医療用皮内投与製剤を収容する薬室と、前記再生医療用皮内投与製剤を投与する注射針及び／又はカニューレとを有しているというものである。【００３０】
再生医療用皮内投与デバイスは、前記注射針及び／又は前記カニューレが、皮膚表皮より１〜４ｍｍの深さの前記皮内に前記再生医療用皮内投与製剤を投与できる長さに調整されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の再生医療用皮内投与製剤は、多血小板血漿や、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、人工多能性幹細胞等の幹細胞のように成長因子を放出させたもので、皮膚皮内区画に限局的に到達させ、皮膚皮内で限局的に分布させることにより、毛細リンパ管網及び毛細血管網を効率的に再生させることができる。【００３２】
この再生医療用皮内投与製剤によれば、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷に対して、皮内投与によって、皮下、筋肉、局所噴霧等の皮内外への投与に比較して、毛細リンパ管網及び毛細血管網を再生させるべき皮内の病態部位へ限局分布させることができるので、高い治療効果が期待できる。【００３３】
この再生医療用皮内投与製剤を用いた治療方法によれば、皮膚毛細リンパ管や毛細血管等の毛細脈管の確実で迅速な再生が可能となり、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷のような疾患の患者の皮膚再生、早期回復、治癒が、可能となる。【００３４】
この再生医療用皮内投与製剤を用いた治療方法は、特定の多血小板血漿や肝細胞に由来する成長因子を、皮内、例えば毛細リンパ管や毛細血管を再生すべき真皮に選択的に投与し、真皮で毛細リンパ管や毛細血管が再生・新生してより太いリンパ管や血管を誘導するという新しい治療方法となる。特にリンパ浮腫は、癌治療後の放射線治療や抗癌剤治療により、毛細リンパ管が壊れて発症する。よってこの微小循環を速やかに再生する必要がある。また、微小循環が再生されれば、リンパ液が一定の方向に流れることから、より太いリンパ管が誘導される。【００３５】
本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法によれば、簡便かつ確実に、高い安全性を保ちつつ、毛細リンパ管や毛細血管を再生する有効成分となる成長因子を含有した製剤を、再現性良く速やかに調製することができる。【００３６】
本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、高度で専門的な熟練した投与技能を備えなくても、皮膚表皮より１〜４ｍｍの深さという極めて限定的な皮内へ、再生医療用皮内投与製剤を選択的に、漏れることなく且つ確実に投与し、毛細リンパ管や毛細血管を確実に再生・新生させて成熟させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤が収容された再生医療用皮内投与デバイスを示す分解正面図である。
【図２】本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤が収容された再生医療用皮内投与デバイスの使用途中を示す部分拡大断面図である。
【図３】ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を投与した投与群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部直径計測結果を示すグラフである。
【図４】ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を投与した投与群と、投与しない陽性対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部の状態を示す写真である。
【図５】ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した投与群と、皮下投与した比較群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部直径計測結果を示すグラフである。
【図６】ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した投与群と、皮下投与した比較群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部の状態を示す写真である。
【図７】ラット背の皮膚損傷モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した後、ＨＥ染色し病理組織学的検討をした結果を示す写真である。
【図８】ラット背の皮膚損傷モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤をＰＲＰ皮下・皮内投与し、又はｂＦＧＦ皮内投与した後、病理組織学的検討をし、表皮再生をスコア化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００３９】
本発明の再生医療用皮内投与製剤の好ましい形態は、多血小板血漿から放出された成長因子を、含有するというものである。
【００４０】
多血小板血漿が、刺激によって、毛細リンパ管や毛細血管を再生させ得る、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ−β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ−１ａ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような成長因子を放出している。再生医療用皮内投与製剤には、これら成長因子などの生理活性物質が、有効成分として複数含有されている。これら成長因子などの生理活性物質が細胞と異なり安定であるから、再生医療用皮内投与製剤は、水や生理食塩水等に溶解又は懸濁し低温保存しても使用でき、凍結乾燥しておき用時に水や生理食塩水等に溶解又は懸濁しても使用できる。
【００４１】
遺伝子組換え技術で製造した単独の成長因子に比べ、刺激した多血小板血漿からは、簡便に各種成長因子などの生理活性物質を同時に複数種放出されている。再生医療用皮内投与製剤は、成長因子等の複数種の有効成分が、高濃度で局所へ分布し、相乗的に作用するから、皮膚再生、早期回復、治癒の期間を短くさせる。ヒトには免疫原性があるので、多血小板血漿は治療すべき患者本人から採取したものであることが好ましい。非ヒト動物では、治療すべき動物と同種の動物の多血小板血漿を用いることが好ましい。
【００４２】
この再生医療用皮内投与製剤は、以下のようにして製造される。
【００４３】
患者や対象動物から血液を採取し、１０００〜５０００ｒｐｍ．で１〜６０分間、室温、例えば２０〜３０℃で遠心分離し、多血小板血漿を得る。例えば、ヒト血液１０〜２０ｍｌから多血小板血漿が約４ｍｌ得られる。これに、２０〜３０℃で、トロンビンを５０〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように添加し、さらに塩化カルシウムを１〜１００ｍＭの濃度となるように添加すると、両者の影響で相乗的に血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出する結果、再生医療用皮内投与製剤が得られる。なお、トロンビンだけで活性化させてもよく、塩化カルシウムだけで活性化させてもよい。
【００４４】
また、このようにして採取された多血小板血漿は、室温、例えば２０〜３０℃、好ましくは２０℃で、血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出するので、それを用いて、再生医療用皮内投与製剤としてもよい。トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加と組み合わせて活性化させて、再生医療用皮内投与製剤としてもよい。また、多血小板血漿を低温、例えば０〜１０℃、好ましくは３〜５℃、より好ましくは４℃で、一定時間以上、好ましくは３０分間以上静置して刺激した低温処理ＰＲＰも、血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出する。
【００４５】
なお、活性化した血小板よりも放出された成長因子などの生理活性物質の方が、有効成分として重要なので、例えば、血小板を残存させたまま又は血小板を濾別して再生医療用皮内投与製剤として、患者に投与してもよい。再生医療用皮内投与製剤は、刺激されて成長因子等を含んだ多血小板血漿を、凍結乾燥製剤にしておき、患者に投与する用時に飽和食塩水等で溶解又は懸濁させたものであってもよい。
【００４６】
この再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿の血小板数が、１×１０−５〜１×１０−７個／μｌに調製されていることが好ましい。この濃度範囲よりも薄いと、希薄過ぎて、十分に成長因子等が算出されず、この濃度範囲を超えると、効果が頭打ちとなり、貴重な製剤が無駄となる。０．５×１０−６〜５×１０−６個／μｌであると好ましく、１×１０−６個／μｌであると一層好ましい。
【００４７】
この再生医療用皮内投与製剤を使用するには、例えば再生医療用皮内投与デバイスが用いられる。
【００４８】
その再生医療用皮内投与デバイス１は、その分解正面図である図１を参照して説明すると、シリンジ本体１０と注射針組立体２０とからなる。
【００４９】
シリンジ本体１０は、再生医療用皮内投与デバイスのシリンジ外筒１２と、先端にガスケット１３が捻じ込まれガスケット１３ごとシリンジ外筒１２に挿入されて基端側が露出している押し子１１と、シリンジ外筒１２から延びておりシリンジ外筒１２内部から外界へ通じる内空を有する筒先１７と、筒先１７及びガスケット１３に挟まれシリンジ外筒１２内で薬液となる再生医療用皮内投与製剤１５を収容する薬室１４と、筒先１７の外周でシリンジ外筒１２に取り付けられた雌螺子であるロック機構１６とを有する。再生医療用皮内投与製剤１５を排出できる筒孔を有する筒先１７は、キャップ１８で封止され、及び／又はシリンジ本体１０ごと密閉包装されている。
【００５０】
注射針組立体２０は、ロック機構１６と螺合する雄螺子が外周に設けられた嵌入筒２２の内部に、針先から針基端に連通する針穴が設けられ針先に刃面を有する針管からなる注射針２７と、先端部で注射針２７を保持する針ハブ２４と、ロック機構１６の螺合により筒先１７及び針ハブ２４の隙間を埋める弾性体２３とが、嵌め込まれている（図２参照）。注射針２７は、針ハブ２４の中央の調整部２５から突出しており、皮内３２に投与できるように、針ハブ２４の調整部２５の針先側端面から針先に到るまでの突出針長Ｌ１を最長でも２ｍｍとし、針胴長Ｌ２を最短でも１ｍｍとし、２６〜３５ゲージ（直径０．４５〜０．１５ｍｍに相当）のものである。針ハブ２４は、調整部２５を取り巻いて筒状の安定部２６が突き出している。注射針組立体２０は、使用直前まで、包装蓋２１ａで覆われる包装容器２１ｂに封入され、使用時に包装蓋２１ａを剥がして、取り出されるようになっている。
【００５１】
再生医療用皮内投与製剤１５は、再生医療用皮内投与デバイス１を用いて、以下のようにして投与される。
【００５２】
先ず、用時に、トロンビンと塩化カルシウムとを添加し刺激して活性因子等を放出させた多血小板血漿である再生医療用皮内投与製剤１５を、シリンジ本体１０へ針付き針基（不図示）を介して吸入する。再生医療用皮内投与製剤１５を皮内３２の一箇所へ投与できるワンショット量は、患者に対してせいぜい５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌであるので、吸入量を５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌ以下にする。単回投与で投与量は患者に対して最大で５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌ、同一部位での２〜３回の複数回連続投与で患者に対して連続投与量合計が最大で５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌとする。次いで、包装蓋２１ａを剥がして、包装容器２１ｂを挟みながら針付き針基を注射針組立体２０に付け替える。
【００５３】
再生医療用皮内投与デバイス１の使用途中を示す部分拡大断面図である図２に示すように、シリンジ本体１０の筒先１７を、注射針組立体２０の嵌入筒２２へ軽く押し込んだ後、筒先１７を取り囲む雌螺子のロック機構１６を、注射針組立体２０の嵌入筒２２の外周の雄螺子に螺合させ、締め付ける。すると、筒先１７が、更に嵌入筒２２の奥へ、挿入され、弾性体２３が圧縮されて筒先１７との隙間が無くなって液密となる。ロック機構１６を十分に締め付けたら、包装容器２１ｂを取り去る。
【００５４】
再生医療用皮内投与デバイス１の注射針２７の針先側を、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷の疾患の治療対象部位の皮膚３０に向ける。例えば、これらの疾患のうちリンパ浮腫に対して皮膚３０は、患部皮膚であり、その他の疾患に対して皮膚３０は、病態部周辺皮膚である。注射針２７が皮膚３０に対し垂直となるように、再生医療用皮内投与デバイス１を押し付ける。すると、注射針２７の針先が先ず皮膚３０に穿刺される。それと共に、安定部２６が皮膚３０の皮膚表皮３３を押し当て、調整部２５が皮膚表皮３３に接触する結果、調整部２５と安定部２６とで皮膚表皮３３表面を引っ張り、針ハブ２４で、再生医療用皮内投与デバイス１がずれないように安定化する。注射針２７がその針先の鋭角な刃面により皮膚表皮３３を貫通し、刃面の針穴の開口が丁度皮膚上層部の皮内（真皮層）３２のうち、皮膚表皮３３表面から１〜４ｍｍの比較的浅い注入すべき皮内標的部位３２ａに達するが、皮下組織３１に達しない。この状態で、押し子１１を押し切って、再生医療用皮内投与製剤１５を注入する。すると、皮膚表皮３３の表面より１〜４ｍｍの深さである皮内３２へ再生医療用皮内投与製剤１５が到達する。
【００５５】
再生医療用皮内投与製剤１５の投与は、広範に行なうことが好ましいので、例えば治療すべき上腕や下肢の範囲に１〜１０ｍｍ間隔で、１ショット当たり１００〜５００μｌ（０．１〜０．５ｍｌ）の容量で、１〜４０ショット、好ましくは複数回繰り返して行なう。投与は、７〜２８日間隔で行なうことが好ましい。再生医療用皮内投与デバイス１を、包装蓋２１ａ（図１参照）で再度封鎖してから、医療廃棄物として、廃棄する。
【００５６】
再生医療用皮内投与製剤１５の効能は、以下のように説明される。
【００５７】
リンパ浮腫に対しては、再生医療用皮内投与製剤１５に含まれていた血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）により、リンパ内皮細胞が遊走し、さらに血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）により、平滑筋やタイトジャンクションが遊走し、毛細リンパ管が再生する結果、成熟したリンパ管を形成するようになったと推察される。現に、ラットを使用した尾リンパ浮腫モデルにおいて、新生リンパ管の再生や、浮腫の改善効果が確認されている。従って、再生医療用皮内投与製剤１５は、臨床におけるリンパ浮腫の改善に有効である。例えばリンパ管については、とりわけ血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の相互作用によって、再生・新生を複合的に促していると考えられる。さらに別な因子も何らかの相互作用によって、再生・新生を複合的に促していると考えられる。
【００５８】
一方、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷疾患に対しては、毛細リンパ管や毛細血管の欠如が要因で発生し、特に肉芽組織の再生が重要と考えられているから、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）や血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）による脈管の新生のみならず、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ−β）により肉芽細胞が遊走し、リンパ管新生及び肉芽新生が起こる結果、成熟したリンパ管や肉芽を形成するようになったと推察される。現に、ラット皮膚欠損モデルにおいて、リンパ管新生及び肉芽新生が確認されている。従って、再生医療用皮内投与製剤１５は、臨床における皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷疾患の改善に有効である。
【００５９】
再生医療用皮内投与製剤１５は、皮膚表皮３３表面より１〜４ｍｍの深さの部位に投与されると、毛細リンパ管や毛細血管や肉芽の再生や新生、さらにそれらの成熟の効果が高い。この深さであれば、再生医療用皮内投与製剤１５内の成長因子等が、限局的に投与され、不必要に拡散せずに、確実に皮膚内に長期間分布したまま滞在するので、毛細リンパ管・毛細血管等の脈管や肉芽等の細胞を再生・新生させて成熟させることができる。皮膚表皮から１ｍｍよりも浅い部位に投与されても、折角の成長因子が、新生すべきリンパ管や肉芽を形成させないばかりか、皮膚表皮から液漏れしてしまう。一方、皮膚表皮から４ｍｍよりも深い部位である皮下に投与されると、折角の成長因子が、拡散してしまい、再生・新生すべきリンパ管や血管や肉芽を形成させることができない。
【００６０】
これらの成長因子の遺伝子をバイオテクノロジーで作製し投与する場合には、皮下、筋肉内に投与しなければ、必要な成長因子蛋白質は、発現しないことが公知であるから、皮膚表皮より１〜４ｍｍの深さの真皮にリンパ管や血管や肉芽を再生・新生させることができない。
【００６１】
再生医療用皮内投与製剤１５として、多血小板血漿を刺激することによって成長因子を放出させている例を示したが、多血小板血漿に代えて、前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの幹細胞を用いても、成長因子などの生理活性物質を放出することができる。この場合、多血小板血漿と同様に、これら幹細胞やその懸濁液を用いることができる。例えば、これら幹細胞のうち脂肪系幹細胞に対し、回収にコラゲナーゼを使用する。また、血液幹細胞は、血液循環後、幹細胞を同定し、その後培養し、必要数まで増やす。これにより、成長因子を放出した再生医療用皮内投与製剤１５を得ることができる。骨髄系幹細胞は、分解せずにそのまま用いてもよい。
【００６２】
これらの血小板、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、人工多能性幹細胞のような細胞は、何れも、多分化能及び増殖能を保有し、組織再生等の治療に有用である。これらの細胞は、多くの成長因子などの生理活性物質（例えば成長誘導因子である蛋白質等）を放出し、さらに皮下投与でリンパ管や血管を再生する。例えば、多血小板血漿に含有される血小板は、α顆粒及びβ顆粒を含有している。これら顆粒には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ−β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ−１ａ）、上皮細胞因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増埴因子（ＨＧＦ）のような成長因子などの生理活性物質を含有している。血小板への刺激によってα顆粒やβ顆粒から、これらの成長因子等を複数種放出する。血小板の他、幹細胞でも同様である。
【００６３】
既に多血小板血漿については、アンチエイジングや美容のため皮下に注射し皮膚組織を再生する治療法に用いられており、安全性が高いことが分かっている。
【００６４】
再生医療用皮内投与製剤１５を皮内、とりわけ真皮層に投与するという治療方法は、複数の成長因子などの生理活性物質との相乗効果により、壊れた皮膚の毛細リンパ管や毛細血管や肉芽を効率的に新生・再生させ、成熟させて太いリンパ管や血管の再生を誘導し、貯留した皮膚のリンパ液を排出させるというリンパ浮腫の治療となり得る。
【００６５】
また、この再生医療用皮内投与製剤１５を用いた治療方法によれば、複数の成長因などの生理活性物質が、治療すべき対象部位の皮膚皮内に分布し滞留することで、リンパ浮腫や、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患を、短期で安全に治療することができる。
【００６６】
この再生医療用皮内投与製剤１５を投与には、再生医療用皮内投与製剤１５が、皮膚の乳頭真皮ならびに網状真皮へ到達するような形態で投与するのが望ましい。乳頭真皮は、毛細リンパ網や毛細血管網が密である組織であり、網状真皮は、毛細リンパ管や毛細血管の通り道となる組織である。毛細リンパ管や毛細血管が再生・新生し、また肉芽が再生・新生すると、リンパ浮腫の改善や損傷組織の再生に繋がり、皮膚等の再生医療に役立つ。
【００６７】
リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患の病態は、これら脈管網の破壊が原因でリンパ液が皮膚に貯留し、さらに貯留できないリンパ液が皮下組織に貯留して、発症する。再生医療用皮内投与製剤１５を皮内に投与すると、皮内の毛細リンパ管や毛細血管の再生に必要な成長因子や細胞が限局的に分布し、分散して滞留するため、望ましい。投与には、図１のような再生医療用皮内投与デバイスを用いてもよいが、汎用のマントー法用の針付き針基を装着したシリンジを用いてもよい。但し、マントー法で皮内に注射するには非常に熟練した技能を要するうえ、対象部位へ０．５〜数ｍｌ投与するのに適したマントー法用シリンジよりも、図１で示した再生医療用皮内投与デバイス１の方が、臨床的な使用に、一層適している。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を使用した実施例と、対照のため本発明の再生医療用皮内投与製剤を使用しなかった対照例及び比較例とについて、具体的に説明する。【００６９】
（実施例１：再生医療用皮内投与製剤の調製）
哺乳動物の全血から、複数回遠心分離することにより多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。なお、ＰＲＰ作製用のキット及び遠心分離器を使用してもよい。この多血小板血漿に対し、血球カウンターを使用することにより、血小板数を１×１０６個／μｌの濃度に調整後、その多血小板血漿を４℃で３０分間以上静置して刺激した４℃冷却処理ＰＲＰと、その多血小板血漿に３００Ｕｎｉｔ／ｍｌ  ０．３ｍｌ  トロンビン液モチダ  ソフトボトル５千  ５ｍｌ（持田製薬株式会社製）＋塩化カルシウム（ナカライテスク株式会社製  １ｍＭ／１ｍｌ  最終濃度）を加えて２０℃で３０分間静置して刺激したトロンビン／ＣａＣｌ２添加処理ＰＲＰとを、再生医療用皮内投与製剤として調製した。【００７０】
これらのようにして刺激したＰＲＰの２種類の再生医療用皮内投与製剤を用いて、ラット浮腫モデルにより、ＰＲＰ皮内投与有効性について、検討した。【００７１】
（作製例１：ラット尾浮腫リンパモデルの作製）
ＰＲＰ皮内投与有効性を比較検討するため、既知のラット尾浮腫リンパモデルを使用して、検討した。ラット尾浮腫リンパモデルは、８週令ＳＤラットに対し、吸入麻酔下で、尾つけ根より５ｍｍから尾先へ１ｃｍだけ尾皮膚を切除手術して、尾浮腫モデルを作製した。【００７２】
（試験例１：ＰＲＰ皮内投与有効性検討）
ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、再生医療用皮内投与製剤として、実施例１で調製した４℃冷却処理ＰＲＰと、トロンビン／ＣａＣｌ２添加処理ＰＲＰとを、別々なラット尾浮腫リンパモデルのラット尻部皮膚に、通常のシリンジである２７Ｇ針を使用したシリンジでマントー法にて、それぞれ１００μｌ×１０箇所（総量１０００μｌ）ずつ、皮内投与した。このモデルの試験方法は、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測し、さらに尾皮膚切除末梢部の治癒を経時的に観察するという、経過観察である。なお、対照群として、ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、切除手術したまま再生医療用皮内投与製剤を投与することなく自然治癒を経過観察する手術群（陽性対照）と、健常な未処置で再生医療用皮内投与製剤を投与せずに経過観察する未処置群（陰性対照）とを、用いた。【００７３】
ラット尾浮腫リンパモデル作製後、４週目まで、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測した結果を、図３に示す。また、ラット尾浮腫リンパモデル作製後１週間経過時での手術群とＰＲＰ投与群（４℃冷却処理ＰＲＰ群）との尾皮膚切除末梢部の治癒経過状態を、図４に示す。図３及び図４から明らかな通り、ＰＲＰ投与群は、何れも、浮腫リンパを生じ尾が腫れた手術群に比べ、浮腫リンパが抑制され尾の腫れが小さく、尾皮膚切除末梢部の新生肉芽が明瞭に観察され、肉芽組織再生及び創傷治癒が、速やかであり且つ顕著に確認された。【００７４】
（試験例２：ＰＲＰ皮内／皮下投与有効性比較）
ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、再生医療用皮内投与製剤として、実施例１で調製した４℃冷却処理ＰＲＰとを、別々なラット尾浮腫リンパモデルのラット尻部皮膚に、通常のシリンジである２７Ｇ針を使用したシリンジでマントー法にて、それぞれ５００μｌずつ皮内投与、それぞれ１００μｌ×５箇所（総量５００μｌ）ずつ皮下投与した。このモデルの試験方法は、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測し、さらに尾皮膚切除末梢部の治癒を経時的に観察するという、経過観察である。なお、対照群として、ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、切除手術したまま再生医療用皮内投与製剤を投与することなく自然治癒を経過観察する手術群（陽性対照）と、健常な未処置で再生医療用皮内投与製剤を投与せずに経過観察する未処置群（陰性対照）とを、用いた。【００７５】
ラット尾浮腫リンパモデル作製後、４週目まで、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測した結果を、図５に示す。また、ラット尾浮腫リンパモデル作製後３週間経過時でのＰＲＰ皮内投与群とＰＲＰ皮下投与群との尾皮膚切除末梢部の治癒経過状態を、図６に示す。図５及び図６から明らかな通り、ＰＲＰ皮内投与群は、浮腫リンパを生じ尾が腫れた手術群や浮腫リンパの改善が認められないＰＲＰ皮下投与群に比べ、浮腫リンパが抑制され尾の腫れが小さく、尾皮膚切除末梢部の新生肉芽が明瞭に観察され、肉芽組織再生及び創傷治癒が、速やかであり且つ顕著に確認された。【００７６】
（試験例３：ＰＲＰ皮下／皮内投与・ｂＦＧＦ皮内投与の表皮再生比較）
別な皮膚障害モデルによって、表皮再生を比較した。ラット（ＳＤ、雄、８週齢）を使用し、背部を剃毛し、正中部中央左右の皮膚を直径２０ｍｍ正円でメスを使用し、２ヵ所／１匹皮膚を切除し、モデル作製を行なった。ＰＲＰ（１０６個／μｌ  に調整）を４℃、３０分以上冷却し、さらに皮内、皮下に１００μｌ×５カ所それぞれ投与した（投与は、５日間隔で、計２回）。陽性対照としてｂＦＧＦ（フィブラストスプレー２５０μｇ：トラフェルミン／科研製薬）を１０μｇ／ｈｅａｄ皮膚採取部位周辺に投与した（投与は、１日間隔で、計５回）。上記被検物質を投与開始後１１日間観察した後、剖検を行ない、皮膚を採取し、ＨＥ染色後病理組織学的検討を実施した。病理評価は、表皮再生をスコア化して行った。スコア化は、±：僅かにある、＋：再生が見られる、＋＋：十分な再生、＋＋＋：完全（切除部全面）に再生の４段階で評価したものである。【００７７】
ＰＲＰ皮内投与のＨＥ染色後の病理組織の写真を、図７に示す。また、ＰＲＰ皮下・皮内投与し、又はｂＦＧＦ皮内投与した後、スコア化した結果を、図８に示す。【００７８】
図７及び８から明らかな通り、ＰＲＰ皮内投与では、ＰＲＰ皮下投与やｂＦＧＦ皮内投与に比べ、有意に表皮組織が再生していた。【００７９】
以上の結果から明らかな通り、再生医療用皮内投与製剤によれば、多血小板血漿に由来するような血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ−β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ−１ａ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の成長因子が、毛細リンパ管や毛細血管の脈管や損傷細胞等のような欠損組織を修復すべき生体部位である皮内とりわけ真皮に投与されると、これら毛細リンパ管・毛細血管や肉芽の再生・新生を複合的に促し、それらが輸出入リンパ管の形成を促進したり動脈・静脈へ繋がる太い血管の形成を促したりして、新たな細胞が熟成する結果、リンパ浮腫ならびに皮膚損傷を効率的に治療できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の再生医療用皮内投与製剤は、癌原発巣とリンパ節との郭清後や抗癌剤治療やＸ線放射線治療により発生したリンパ浮腫、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍・皮膚褥瘡・皮膚損傷等の疾患の治療に、用いることができる。本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、治療の用時に又は事前に、再生医療用皮内投与製剤を調製して、効率よく皮内に投与する際に、使用される。本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、再生医療用皮内投与製剤を専ら皮内に投与するのに、使用される。
【符号の説明】
【００８１】
１：再生医療用皮内投与デバイス、１０：シリンジ本体、１１：押し子、１２：シリンジ外筒、１３：ガスケット、１４：薬室、１５：再生医療用皮内投与製剤、１６：ロック機構、１７：筒先、１８：キャップ、２０：注射針組立体、２１ａ：包装蓋、２１ｂ：包装容器、２２：嵌入筒、２３：弾性体、２４：針ハブ、２５：調整部、２６：安定部、２７：注射針、３０：皮膚、３１：皮下組織、３２：皮内、３２ａ：皮内標的部位、３３：皮膚表皮
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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