(57)【要約】  合成オリゴヌクレオチドを医薬品へ応用するために、オリゴヌクレオチド反応混合物に含まれる不完全長のオリゴヌクレオチドなどの不純物を高度に分離分析する手法を提供する。イオン対試薬を用いた逆相クロマトグラフィーにより、３１量体以上の合成オリゴヌクレオチドを分離分析する方法である。イオン対試薬がジアルキルアンモニウム塩を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン対試薬を用いた逆相クロマトグラフィーにより、３１量体以上の合成オリゴヌクレオチドを分離分析する方法であって、
イオン対試薬がジアルキルアンモニウム塩を含むことを特徴とする分離分析方法。
【請求項２】
前記ジアルキルアンモニウム塩がジブチルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の分離分析方法。
【請求項３】
前記逆相クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーであり、
前記分離分析方法は、
カラムに前記イオン対試薬と水または、前記イオン対試薬と水と水溶性有機溶媒を含む第１溶離液で平衡化する工程と、
前記第１溶離液に前記合成オリゴヌクレオチドを溶解させ、分析用サンプルを準備する工程と、
前記サンプルを前記平衡化工程で平衡化した前記カラムに前記分析サンプルを注入し、前記カラムに固定する工程と、
少なくとも、前記第１溶離液より、前記水溶性有機溶媒の含有量が多い第２溶離液を用いて、前記合成オリゴヌクレオチドを選択的に溶離する工程と
を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の分離分析方法。
【請求項４】
前記カラムに非多孔性の充填剤が含まれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成オリゴヌクレオチドの高度分離分析方法に関する。
本願は、２０１５年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１５−２５６９７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
合成オリゴヌクレオチド（合成オリゴ核酸）は、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマー、診断プローブ、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、ＤＮＡ配列決定など、多様な分子生物学的実験に利用される。合成オリゴヌクレオチドは主に固相担体上でホスホロアミダイト核酸モノマーを使用した連続的な反応により合成される。【０００３】
近年、合成オリゴヌクレオチドの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、リボザイム、アプタマー、アンチセンス、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などが挙げられ、これらは核酸医薬品と呼ばれている。【０００４】
合成オリゴヌクレオチドの体内での安定輸送のために、結合強度、標的特異性、血清安定性、ヌクレアーゼ耐性、細胞透過性などの種々の因子を考慮する必要がある。これらを改善する手法として、例えば、ホスホロチオネートやメチルホスホネートなどの修飾や、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの使用など、骨格改変が挙げられる。
これらの骨格改変はヌクレアーゼ耐性を付与する一方で、配列非特異的な効果や透過性能の軽減、さらには細胞毒性も発揮しうる。【０００５】
オリゴヌクレオチドの合成方法は、ＰＣＲプライマーなどへの使用においては、精製不要なレベルまで最適化されてはいるが、医薬品への応用のためにより高度な精製、分析が求められる。特に長鎖ＤＮＡ、また修飾・骨格改変体は、合成時にカップリング未反応・副反応を起こしやすい。したがって合成オリゴヌクレオチド反応混合物には、主に不完全長のオリゴヌクレオチド、あるいは不完全体のオリゴヌクレオチドが含有される。例えば、しばしばｎ−ｘ断片と呼ばれる目的のオリゴヌクレオチドより核酸が欠損した断片（ｎは目的のヌクレオチド（核酸）数、ｘは欠損した数、ｎ，ｘは正の整数、ｎ＞ｘであり、例えばｎ−１、ｎ−２等）、また、二重に組み入れられたｎ＋１断片が不純物として含まれる。さらには不完全、あるいは不正確に脱保護された断片、部分的キラリティーを有する異性体も含有される（特許文献１）。【０００６】
高度に合成オリゴヌクレオチドを分離する方法として、一般的にゲル電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが選択される。クロマトグラフィーは操作性に優れ、特に脱塩操作が不要な逆相クロマトグラフィーは広く利用されている。
合成オリゴヌクレオチドの逆相クロマトグラフィーにおいては、一般的に分子内に正の解離基と疎水性官能基を有するイオン対試薬を用いられる（特許文献１）。イオン対試薬は負に解離したオリゴヌクレオチドと中性のイオン対を形成し、逆相充填剤への保持を高め、鎖長の長いオリゴヌクレオチド、また修飾・骨格改変体などの疎水性度の差が小さい目的のオリゴヌクレオチドと不純物の分離分析を向上させることが多い。【０００７】
例えば非特許文献１、非特許文献２には、ＹＭＣ社のＨｙｄｒｏｓｈｅｒｅ  Ｃ１８を用いた逆相クロマトグラフィーによる方法が記載されている。Ｈｙｄｒｏｓｈｅｒｅ  Ｃ１８は１２ｎｍの孔径をもつ直径３μｍのシリカ基材に、オクタデシル基が結合された粒子型の充填剤である。溶離液である酢酸バッファーにイオン対試薬であるトリエチルアミンやジブチルアミンを加えることにより、２量体から３０量体の合成オリゴヌクレオチドを高度に分離することが可能である。【０００８】
また、非特許文献３には、ＷＡＴＥＲＳ社のＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８を用いた逆相クロマトグラフィーによる方法が記載されている。ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８は１３０Åの孔径をもつ直径２．５μｍのエチレン架橋型のハイブリッドシリカ基材に、オクタデシル基が結合された粒子型の充填剤である。溶離液である酢酸やＨＦＩＰにイオン対試薬であるトリエチルアミンを加えることにより、１０から６０量体の合成オリゴヌクレオチドを高度に分離することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０７７７５号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＹＭＣ社ＤＡＴＡ  ＳＨＥＥＴ  Ｆ２１０１８Ａ
【非特許文献２】ＹＭＣ社ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＤＡＴＡ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＳ（５）（Ｐ．３９）
【非特許文献３】ＷＡＴＥＲＳ社ＸＢＲＩＤＧＥ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ＭＥＴＨＯＤ  ＧＵＩＤＥＬＩＮＥＳ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、合成オリゴヌクレオチドを医薬品へ応用するために、オリゴヌクレオチド反応混合物に含まれる不完全長のオリゴヌクレオチドなどの不純物を高度に分離分析する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、オリゴヌクレオチド反応混合物の精密分離ついて鋭意検討を行った結果、ジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を用いた逆相クロマトグラフィーにより、３１量体以上の合成オリゴヌクレオチドを高度に分離分析できることを見出し、本発明に至った。本発明は以下のとおりである。【００１３】
［１］イオン対試薬を用いた逆相クロマトグラフィーにより、３１量体以上の合成オリゴヌクレオチドを分離分析する方法であって、イオン対試薬がジアルキルアンモニウム塩を含むことを特徴とする分離分析方法。
［２］前記ジアルキルアンモニウム塩がジブチルアンモニウム塩であることを特徴とする［１］に記載の分離分析方法。
［３］前記逆相クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーであり、前記分離分析方法は、カラムに前記イオン対試薬と水または、前記イオン対試薬と水と水溶性有機溶媒を含む第１溶離液で平衡化する工程と、前記第１溶離液に前記合成オリゴヌクレオチドを溶解させ、分析用サンプルを準備する工程と、前記サンプルを前記平衡化工程で平衡化した前記カラムに前記分析サンプルを注入し、前記カラムに固定する工程と、少なくとも、前記第１溶離液より、前記水溶性有機溶媒の含有量が多い第２溶離液を用いて、前記合成オリゴヌクレオチドを選択的に溶離する工程とを含むことを特徴とする［１］又は［２］に記載の分離分析方法。
［４］前記カラムに非多孔性の充填剤が含まれる［１］〜［３］のいずれかに記載の分離分析方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、３１量体以上の長鎖の合成オリゴヌクレオチドであっても、逆相クロマトグラフィーにより高度に分離分析することができる合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の逆相クロマトグラフィー用溶離液を用いて測定した紫外検出法（波長２５４ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図２】実施例２の逆相クロマトグラフィー用溶離液を用いて測定した紫外検出法（波長２５４ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図３】比較例１の逆相クロマトグラフィー用溶離液を用いて測定した紫外検出法（波長２５４ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図４】比較例２の逆相クロマトグラフィー用溶離液を用いて測定した紫外検出法（波長２５４ｎｍ）のクロマトグラムである。
【図５】比較例３の逆相クロマトグラフィー用溶離液を用いて測定した紫外検出法（波長２５４ｎｍ）のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための最適な形態を説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１７】
本発明に係る合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法は、ジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を用いた逆相クロマトグラフィーにより、３１量体以上の合成オリゴヌクレオチドの合成過程で含まれる不純物を高度に分離分析する手法である。
【００１８】
本発明の一態様の合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法は、逆相カラムクロマトグラフィーであることが好ましい。その場合、本発明の一態様の分離分析方法は、カラムに前記イオン対試薬と水と水溶性有機溶媒を含む第１溶離液で平衡化する工程と；前記第１溶離液に前記合成オリゴヌクレオチドを溶解させ、分析用サンプルを準備する工程と；前記サンプルを前記平衡化工程で平衡化した前記カラムに前記分析サンプルを注入し、前記カラムに固定する工程と；少なくとも、前記第１溶離液より、前記水溶性有機溶媒の含有量が多い第２溶離液を用いて、前記合成オリゴヌクレオチドを選択的に溶離する工程とを含む。
【００１９】
「合成オリゴヌクレオチド」とは、一般的には固相担体上で核酸モノマーを連続的に反応させて合成したものであり、ホスホロアミダイト法により合成された核酸オリゴマーが好ましい。合成オリゴヌクレオチドの目的の鎖長は１０から１１０量体であり、１０から７０量体が好ましく、３１から６２量体がさらに好ましい。
【００２０】
「逆相クロマトグラフィー」とは、目的対象物の疎水性の差を利用し、疎水性の固定相（充填剤）及び非疎水性の移動相（溶離液）への分配の相違による移動速度の差に基づく逆相分配クロマトグラフィーである。固定相（充填剤）及び移動相（溶離液）の形態によって、例えば、カラム逆相クロマトグラフィーなどがある。
【００２１】
「イオン対試薬」とは、イオン性の目的対象物とイオン対を形成する疎水性官能基をもつ試薬であり、形成した目的対象物を疎水性カラムへの保持を高め、分離を向上させる。
ヌクレオチド（核酸）分離には正の解離基と疎水性官能基を有するイオン対剤が使用できる。典型的なイオン対試薬には、有機又は無機酸のトリアルキルアンモニウム塩、例えば、上記非特許文献２に記載されているトリエチルアンモニウムアセテートが挙げられる。
【００２２】
「合成過程で含まれる不純物」とは、目的の合成オリゴヌクレオチドとは分子量が異なる不純物、例えば、しばしばｎ−ｘ断片と呼ばれる不完全長のオリゴヌクレオチド（オリゴ核酸）（ｎは目的のヌクレオチド（核酸）数、ｘは欠損した数、ｎ，ｘは正の整数、ｎ＞ｘであり、例えばｎ−１、ｎ−２など）、二重に組み入れられたｎ＋１断片、アセチル基、イソブチリル基、シアノエチル基、メチル基などの核酸モノマーを保護する官能基の脱保護が不十分なオリゴヌクレオチド、脱プリン体や脱ピリミジン体などの不完全オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート中のホスホジエステル不純物などの不十分な骨格改変オリゴヌクレオチド、および部分的キラリティーを有する異性体などのことである。
【００２３】
本発明の一態様の合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法は、以下のとおりである。すなわち、カラム逆相クロマトグラフィーにおいて、疎水性官能基が固定された充填剤を含むカラムにあらかじめジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を含む溶離液を通液して平衡化しておき、同溶離液に合成オリゴヌクレオチドを溶解した溶液を通液して合成オリゴヌクレオチドをカラム内に結合させる。続いて、通液する溶離液中の有機溶媒濃度を順次増大させる勾配、いわゆるグラジエントにより、合成オリゴヌクレオチドの合成過程中に含まれる不純物と目的の合成オリゴヌクレオチドを分離して溶出する。再度平衡化時に通液した溶離液を通液し、カラムを再生する。
【００２４】
本発明の一態様の充填剤としては、疎水性の官能基が固定されたシリカやポリマーで構成される充填剤が利用できる。充填剤の構成は特にシリカが好ましい。また、形状は非多孔性の粒子が好ましく、その粒径は３μｍ以下が好ましく、２μｍ以下がさらに好ましい。さらに、固定される疎水性官能基は、ブチル基、フェニル基、オクチル基、オクタデシル基が好ましく、オクタデシル基が特に好ましい。
【００２５】
本発明の一態様の溶離液は、ジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を使用すること以外は特に制限はなく、ジブチルアミンと酸からなる塩を含む水系の溶離液とＣ１から３のアルコールやニトリル系の有機溶媒と組み合わせることが好ましい。酸には炭酸、酢酸、蟻酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸が好ましい。ジブチルアミンおよび酢酸を含む水系の溶離液とアセトニトリルの組み合わせが最も好ましい。水系溶離液の塩濃度は特に制限はないが、１から１００ｍＭが好ましく、５から５０ｍＭがさらに好ましく、１０から２０ｍＭが特に好ましい。また、水系溶離液のｐＨはカラムへの結合と溶出ができる範囲であれば制限はなく、６から８が好ましく、６．５から７．５がさらに好ましい。
【００２６】
本発明の一態様のイオン対試薬としては、例えば、ジブチルアンモニウム塩、及びジブチルアンモニウム塩以外のアルキルアンモニウム塩、例えば、トリエチルアンモニウム塩等を含むイオン対試薬を用いることができる。
その場合、イオン対試薬に対して、ジブチルアンモニウム塩の割合は３０%モル以上が好ましく、４０%がより好ましく、５０%以上が更にこのましい。また、イオン対試薬がジブチルアンモニウム塩であることがもっとも好ましい。
【００２７】
本発明の一態様の分離分析時のカラム温度は２０から１００℃が好ましく、３０から８０℃がさらに好ましく、４０から７０℃が最も好ましい。
【００２８】
本発明の一態様の合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法は、市販されている逆相クロマトグラフィ装置を用いることができ、例えば、島津製作所社ＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅやＷａｔｅｒｓ社のＡｃｕｉｔｙ等の分析用装置が挙げられる。
【００２９】
本発明の一態様の合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法に用いるカラムは、市販されている分析用又は分離用逆相カラムを用いることができ、例えば、ＥＰＲＯＧＥＮ社ＭＩＣＲＡ（登録商標）  ＮＰＳ  ＯＤＳ−１（粒子径１．５μｍ、３３×４．６ｍｍ  ＩＤ）Ｗａｔｅｒｓ社ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８（粒子径１．７μｍ、孔径１３５Å、５０×４．６ｍｍ  ＩＤ）等の分析または分取用カラムが挙げられる。
【００３０】
本発明の一態様の合成オリゴヌクレオチドの分離分析方法に用いる検出方法は、例えば、合成オリゴヌクレオチド等の紫外／可視吸収を利用する検出器、合成オリゴヌクレオチド等の質量スペクトルを利用する検出器などが挙げられる。紫外／可視吸収検出器の場合、検出波長は、例えば、２５４ｎｍが挙げられる。
このような方法で合成オリゴヌクレオチドを高度に分離分析することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
（実施例１）
ジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を用いた合成オリゴヌクレオチドの分離分析【００３２】
（１）カラムの平衡化工程
カラムにＥＰＲＯＧＥＮ社ＭＩＣＲＡ（登録商標）ＮＰＳ  ＯＤＳ−１（粒子径１．５μｍ、３３×４．６ｍｍ  ＩＤ）を用いた。クロマトグラフとしてシステムコントローラＳＣＬ−１０ＡＶＰ、送液ユニットＬＣ1０−ＡＤ、オートサンプラーＳＩＬ−１０ＡＤＶＰ、カラムオーブンＣＴＯ−ＡＣ１０ＶＰ、検出器ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ（島津製作所製）を用い、カラム温度４０℃、溶離液としてアセトニトリルを添加したジブチルアンモニウムアセテート水溶液を用いた。１０ｍＭジブチルアンモニウムアセテート水溶液（ｐＨ７．０）にアセトニトリルを添加し、最終濃度４．５ｖ／ｖ％のアセトニトリルを含む９．６ｍＭジブチルアンモニウムアセテート水溶液を第１溶離液として調整した、その第１溶離液を１０ｍＬ以上通液して、カラムを平衡化した。移動相の流速を１．０ｍＬ／分とした。なお、ＮＰＳ  ＯＤＳ−１はオクタデシル基が結合した非多孔性のシリカ粒子充填剤を含むカラムである。【００３３】
（２）分析用サンプルの準備工程
ユーロフィンジェノミクス社より購入した合成オリゴヌクレオチド６２量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品 ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号１（５’−ＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＡ−３’ ）で表される塩基配列）を１０ｍＭジブチルアンモニウムアセテート水溶液で溶解し、合成オリゴヌクレオチドの濃度が０．１ｍｇ／ｍＬになるように分析用サンプルを調製した。【００３４】
（３）合成オリゴヌクレオチドの結合工程
調整した分析用サンプル１０ｕＬを（１）で平衡化したカラムに注入し、第１溶離液を用いてカラムに合成オリゴヌクレオチドを結合させた。移動相の流速を１ｍＬ／分とした。【００３５】
（４）合成オリゴヌクレオチドと不純物の分離溶出工程
移動相は、第１溶離液から、リニアグラジエントは初めの７．５分でアセトニトリルの最終濃度を１８ｖ／ｖ％まで増大させる勾配とした第１段のグラジエント、その次の３２．５分でアセトニトリルの最終濃度を３１．５ｖ／ｖ％まで増大させる勾配とした第２段のグラジエントを含む２段グラジエントとした。アセトニトリル濃度を順次増大させるリニアグラジエント勾配により、カラムに結合させた合成オリゴヌクレオチドや不純物を分離して溶出させた。【００３６】
検出器は、紫外／可視（ｕｖ／ｖｉｓ）検出器を用い、検出波長が２５４ｎｍである。【００３７】
結果が図１に示すように、保持時間２９分で合成オリゴヌクレオチドのピークが観測され、その前には、不純物と思われるもののピークが観測された。【００３８】
（実施例２）
ジブチルアンモニウム塩を含むイオン対試薬を用いた合成オリゴヌクレオチドの分離分析
（１）カラムの平衡化工程
実施例１と同様に行った。【００３９】
（２）分析用サンプルの準備工程
ユーロフィンジェノミクス社より購入した合成オリゴヌクレオチド６２量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号１（５’−ＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＡ−３’）で表される塩基配列）、４０量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号２（５’−ＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＡ−３’）で表される塩基配列）、８０量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号３（５’−ＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＣ−３’）で表される塩基配列）、１００量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号４（５’−ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＣ−３’）で表される塩基配列）、１１０量体（商品名：スタンダードオリゴ５０ｎｍｏｌスケール品ｓａｌｔ−ｆｒｅｅグレード；配列番号５（５’−ＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＧＧＣ−３’）で表される塩基配列）を１０ｍＭジブチルアンモニウムアセテート水溶液で溶解し、各鎖長の合成オリゴヌクレオチドの最終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬになるように分析用サンプルを調製した。【００４０】
（３）合成オリゴヌクレオチドの結合工程
調整した分析用サンプルのカラムへの注入量を２０ｕＬとしたこと以外は実施例１と同様に実施した。【００４１】
（４）合成オリゴヌクレオチドと不純物の分離溶出工程
勾配を変化させないように第２段のグラジエント５８．５分でアセトニトリルの最終濃度を４２．３ｖ／ｖ％まで増大させるようにしたこと以外は実施例１と同様に実施した。【００４２】
検出器は、実施例１と同様に実施した。【００４３】
結果が図２に示すように、保持時間２４分で合成オリゴヌクレオチド４０量体のピークが、保持時間２９分で合成オリゴヌクレオチド６２量体のピークが、保持時間３２分で合成オリゴヌクレオチド８０量体のピークが、保持時間３５分で合成オリゴヌクレオチド１００量体のピークが保持時間３７分で合成オリゴヌクレオチド１１０量体のピークが観測された。【００４４】
（比較例１）
イオン対試薬としてトリエチルアンモニウム塩を用いた合成オリゴヌクレオチドの分離分析
実施例１のカラムの平衡化工程（１）に用いた溶離液を１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ  ７．０）としたこと以外は実施例１と同様に実施した。
保持時間８．５分で合成オリゴヌクレオチドのピークが観測された。しかしながら、カラムへの保持が弱く、実施例1で見られたようなメインピークの手前に検出された不純物のピークは分離できず、合成オリゴヌクレオチドの分離は不十分であり、高度な分離分析は不可能であった。
結果を図３に示す。【００４５】
（比較例２）
イオン対試薬としてトリエチルアンモニウム塩を用いた合成オリゴヌクレオチドの分離分析
実施例１のカラムの平衡化工程（１）に用いた溶離液を１００ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ  ７．０）とし、合成オリゴヌクレオチドの結合工程（３）のリニアグラジエントを３０分でアセトニトリルの最終濃度を３１．５ｖ／ｖ％まで増大させる１段のグラジエントとしたこと以外は、実施例１と同様に実施した。
保持時間１５分で合成オリゴヌクレオチドのピークが観測された。しかしながら、実施例１で見られたようなメインピークの手前に検出された不純物のピークと分離できず、合成オリゴヌクレオチドの分離は不十分であり、高度な分離分析は不可能であった。
結果が図４に示す。【００４６】
（比較例３）
イオン対試薬としてトリエチルアンモニウム塩を用いた合成オリゴヌクレオチドの分離分析
実施例２のカラムの平衡化工程（１）に用いた溶離液を１０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ  ７．０）としたこと以外は実施例２と同様に実施した。
保持時間８．５分で合成オリゴヌクレオチドのピークが観測された。しかしながら、カラムへの保持が弱く、実施例２で見られたような５つのメインピークは分離できず、まとまって溶出した。したがって、合成オリゴヌクレオチドの分離は不十分であり、高度な分離分析は不可能であった。
結果を図５に示す。
【図１】
2017115652.tif 000002
【図２】
2017115652.tif 000003
【図３】
2017115652.tif 000004
【図４】
2017115652.tif 000005
【図５】
2017115652.tif 000006
【配列表】
2017115652000001.app
【国際調査報告】
2017115652.tif 000007
2017115652.tif 000008
2017115652.tif 000009
2017115652.tif 000010