(57)【要約】腫瘍等の治療に有効な抗体の提供。ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾を阻害によって露出するエピトープを認識する抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒトCD98hc抗体であって、ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する抗体。
【請求項２】
ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、ミニボディ（minobody）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はこれらの組み合わせである、請求項１〜５、７及び８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
細胞傷害活性を有する物質、酵素、タグ、又は免疫モジュレーターが結合している、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体のエピトープと同一のエピトープを有する、キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体又は請求項１２に記載のキメラ抗原受容体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
新たな抗体及びその利用等が開示される。
【背景技術】
【０００２】
形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の代表例である多発性骨髄腫は、全ての癌のおよそ１％を占め、全ての血液学的悪性腫瘍の10％強を占める。多発性骨髄腫とは、骨髄に存在する形質細胞が癌化し、単クローン性に増殖する疾患である。多発性骨髄腫では、異常な形質細胞（骨髄腫細胞）が体中の骨髄に広がり、全身の骨髄の至るところで増殖する。異常な形質細胞が増殖すると、骨の破壊を含む様々な症状が現れる。骨髄腫細胞からは、異常免疫グロブリンであるＭタンパク質が産出され、血中のＭタンパク質濃度が上昇することにより、血液が粘稠になる。Ｍタンパク質は、体内に侵入した病原体などの異物を認識するという本来の抗体としては機能しないため、免疫力の低下も引き起こす。これらが多くの臓器に影響を与え、様々な徴候が生じる。代表的な徴候は、骨の痛みと損傷、高カルシウム症、腎障害や腎不全、貧血等である。【０００３】
現在、多発性骨髄腫の治療として、プロテアソーム阻害剤、サリドマイドとその誘導体であるレナリドマイドなどのiMIDs、及びメルファランとプレドニゾンとの併用等の化学療法、並びに造血幹細胞移植が主に行われている。しかし、骨髄腫細胞は、ほとんどの場合、やがてこれらの治療薬に対して抵抗性を獲得する。このため、現在の治療手段では、発症後の平均生存期間は３〜５年程度であり、骨髄腫患者の予後は厳しいのが現実である。また、これらの治療薬は、標的とする腫瘍細胞にだけ特異的に作用するものではないため、正常な細胞に対しても毒性を示し、結果として重篤な副作用を伴うという問題がある。【０００４】
モノクローナル抗体を利用した多発性骨髄腫の治療法の開発が試みられている。例えば、抗CS1抗体（特許文献１）、及び抗CD38抗体（特許文献２）がごく最近臨床応用された。。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lonial et al., official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2012 Jun 1; 30(16): 1953-1959.
【非特許文献２】de Weers et al., Journal of immunology, 2011 Feb 1; 186(3): 1840-1848
【非特許文献３】J Immunol. 2009 Nov 1;183(9):5563-74.
【非特許文献４】N Engl J Med. 2014 Oct 16;371(16):1507-17.
【非特許文献５】Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):70-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗CS1抗体は骨髄腫細胞への特異性は比較的高いが、抗体単独での抗骨髄腫効果は高いとはいえず、単剤での有効性は臨床試験では示されていない。レナリドマイドとの併用により抗CS1抗体の抗腫瘍効果が上昇するということが見出され、この併用によりＦＤＡよって承認された。一方、CD38もFDAにより承認されたが、CD34陽性造血前駆細胞を含む多くの正常な血液細胞にも発現しているため、多発性骨髄腫の治療ターゲットとして特異性の低い抗原である。このような現状のもと、多発性骨髄腫等の形質細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患等の治療により有効な手段を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ね、骨髄腫細胞に特異的なタンパク質でなくてもそのタンパクの翻訳後修飾が骨髄腫細胞に特異的であれば、それを認識する抗体は骨髄腫特異的であろうという新たな考えに至った。そこで、まず骨髄腫細胞及び骨髄腫前駆細胞に特異的に結合する抗体を単離し、続いてそれが認識するタンパクを同定することにより、当該タンパク自体が骨髄腫細胞に特異的なのか、それとも当該タンパク自体は骨髄腫細胞に特異的ではないが、何らかの骨髄腫特異的翻訳後修飾を持つものだけを抗体が認識しているのかを明らかにすることができるだろうと考えた。そしてその結果、上述のような骨髄腫細胞及び骨髄腫前駆細胞に特異的な翻訳後修飾を持ったタンパクだけを認識する抗体を得ることができるであろうと考えた。【０００８】
上記構想に従って、本発明者らは、複数の骨髄腫細胞株を用いて、それらに結合するモノクローナル抗体を１万クローン以上作製し、その中から正常な血液細胞には結合しない抗体を選別し、その抗体が認識しているタンパクを同定した。その結果、後述する実施例に示されるように、R8H283抗体を同定し、それが結合する抗原がCD98hcであることを明らかにした。CD98hcは、正常な血液細胞にも発現しているが、R8H283抗体は、そのエピトープがCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内に存在し、N型糖鎖の付き方が骨髄腫細胞（骨髄腫形質細胞及び骨髄腫前駆細胞を含む）と正常な血液細胞で異なることにより、骨髄腫細胞を特異的に認識することが確認された。。更に、本発明者らは、R8H283抗体が細胞傷害活性を有し、骨髄腫細胞を移植した動物に当該抗体を投与することで骨髄腫細胞の増殖を抑制出来ること、及び、R8H283抗体は骨髄腫以外の種々の腫瘍細胞を認識すること等を確認した。斯かる知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。【０００９】
１．抗体
項１−１
抗ヒトCD98hc抗体であって、ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する抗体。
項１−１．５
抗ヒトCD98hc抗体であって、ヒトCD98hcを発現する細胞をTunicamycineで処理することにより、当該細胞に対する親和性が上昇する抗体。
項１−２
ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗体。
項１−３
ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗体。
項１−４
ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識する抗体。
項１−５
ヒトCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内にそのエピトープを有する抗体。
項１−６
項１−１〜１−５から成る群より選択される少なくとも２項に記載される特徴を備える、抗体。
項１−７
該領域がヒトCD98hc上の配列番号２４のアミノ酸配列から成る領域である、項１−５又は１−６に記載の抗体。
項１−８
該領域がヒトCD98hc上の配列番号２２のアミノ酸配列から成る領域である、項１−８に記載の抗体。
項１−９
該領域がヒトCD98hc上の配列番号２３のアミノ酸配列から成る領域である、項１−９に記載の抗体。
項１−１０
エピトープが配列番号２４のアミノ酸配列から成る領域内に存在する、項１−１〜１−９のいずれかに記載の抗体。
項１−１１
ヒトCD98hcの配列番号２４のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗体。
項１−１２
エピトープが配列番号２２のアミノ酸配列から成る領域内に存在する、項１−１〜項−１１のいずれかに記載の抗体。
項１−１３
ヒトCD98hcの配列番号２２のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗体。
項１−１４
エピトープが配列番号２３のアミノ酸配列から成る領域内に存在する、項１−１〜項１−１３のいずれかに記載の抗体。
項１−１５
ヒトCD98hcの配列番号２３のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗体。
項１−１６
エピトープが、R8H283抗体のエピトープと同一である、項１−１〜１−１５のいずれかに記載の抗体。
項１−１７
N型糖鎖が存在しないヒトCD98hcに対する親和性が、N型糖鎖が存在するヒトCD98hcに対する親和性よりも高い、項１−１〜１−１６のいずれかに記載の抗体。
項１−１８
配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域、
を含む、項１−１〜１−１７のいずれかに記載の抗体。
項１−１９
配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、項１−１〜１−１８のいずれかに記載の抗体。
項１−２０
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、またはこれらの組み合わせである、項１−１〜１−１９のいずれかに記載の抗体。
項１−２１
モノクローナル抗体である、項１−１〜１−２０のいずれかに記載の抗体。
項１−２２
定常領域を含む、項１−１〜１〜７及び１−２１のいずれかに記載の抗体。
項１−２３
キメラ抗体である、項１−１〜１−１９、及び１−２１のいずれかに記載の抗体。
項１−２４
ヒト化抗体である、項１−１〜１−２３のいずれかに記載の抗体。
項１−２５
ヒト抗体である、項１−１〜１〜２４のいずれかに記載の抗体。
項１−２６
イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、ミニボディ（minobody）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はこれらの組み合わせである、項１−１〜１−１９及び１−２１〜１−２５のいずれかに記載の抗体。
項１−２７
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭである、項１−１〜１−１９及び１−２１〜１−２６のいずれかに記載の抗体。
項１−２８
配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖、及び／又は
配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖
を有する項１−１〜１−１９及び１−２１〜１−２７のいずれかに記載の抗体。
項１−２９
細胞傷害活性を有する、項１−１〜１−１９及び１−２１〜１−２８のいずれかに記載の抗体。
項１−３０
サイトトキシンが結合した、項１−１〜１−２９のいずれかに記載の抗体。 
項１−３１
多重特異性抗体である、項１−１〜１−３０のいずれかに記載の抗体。
項１−３２
項１−１〜１−３１のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
項１−３３
項１−３３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
項１−３４
Ｔ細胞である、項１−３３に記載の宿主細胞。【００１０】
２．キメラ抗原受容体
項２−１
ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１．５
ヒトCD98hcを発現する細胞をTunicamycineで処理することにより、当該細胞に対する親和性が上昇する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体
項２−２
ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−３
ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗キメラ抗原受容体。
項２−４
ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−５．
項２−１〜２−４から成る群より選択される少なくとも２項に記載の特徴を備える、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−６
ヒトCD98hcの配列番号２４のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−７
ヒトCD98hcの配列番号２４のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、項２−１〜２−５のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−８
ヒトCD98hcの配列番号２２のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、項２−１〜２−５のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−９
ヒトCD98hcの配列番号２２のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１０
エピトープが配列番号２３のアミノ酸配列から成る領域内に存在する、項２−１〜２−９のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１１
ヒトCD98hcの配列番号２３のアミノ酸配列から成る領域内にエピトープを有する、抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１２
R8H283抗体のエピトープと同一のエピトープを有する、項２−１〜２−１１のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１３
N型糖鎖が存在しないヒトCD98hcに対する親和性が、N型糖鎖が存在するヒトCD98hcに対する親和性よりも高い、項２−１〜２−１２のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１４
配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域、
を含む、項２−１〜２−１３のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１５
配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、項２−１〜２−１４のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体。
項２−１６
項２−１〜２−１５のいずれかに記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
項２−１７
項２−１６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
項２−１８
Ｔ細胞である、項２−１７に記載の宿主細胞。
項２−１９
キメラ抗原受容体Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体ＮＫ細胞である、項２−１８に記載の宿主細胞。【００１１】
３．医薬組成物及び治療方法
項３−１
項１−１〜１−３４のいずれかに記載の抗体並びに項２−１９に記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体Ｔ細胞及び抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体ＮＫ細胞から成る群より選択される少なくとも１種を含む医薬組成物。
項３−２
腫瘍の治療又は予防用である、項３−１に記載の医薬組成物。
項３−３
形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療又は予防用である、項３−１又は３−２に記載の医薬組成物。
項３−４
疾患の治療が必要な患者に請求項３−１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
項３−５
患者が癌を患う患者である、項３−４に記載の方法。
項３−６
患者が形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を患う患者である、項３−５に記載の方法。
項３−７
医薬組成物を製造するための、項１−１〜１−３４のいずれかに記載の抗体並びに項２−１９に記載の抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体Ｔ細胞及び抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体ＮＫ細胞から成る群より選択される少なくとも１種の使用。
項３−８．
該医薬組成物が腫瘍の治療又は予防用である、項３−８に記載の使用。
項３−９．
該医薬組成物が形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療又は予防用である、項３−８に記載の使用。【００１２】
４．スクリーニング方法
項４−１．
候補物質群からヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出する領域に特異的に結合する物質を選別することを含む、腫瘍の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングする方法。
項４−２．
更に、細胞傷害活性を有する物質をスクリーニングすることを含む、項４−１に記載の方法。【００１３】
５．診断方法
５−１．
被験者から採取したサンプルに項１−１〜１−３４のいずれかに記載の抗体を接触させることを含む、腫瘍の診断方法。
５−２．
該抗体に結合する細胞が検出された場合に腫瘍が存在すると診断する、項５−１に記載の方法。
５−３．
サンプルが血液又は骨髄液である、項５−１又は５−２に記載の方法。
５−４．
項１−１〜１−３４のいずれかに記載の抗体を含む、腫瘍の診断用キット。
【発明の効果】
【００１４】
上記の抗体は、骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞、及び他の腫瘍細胞を特異的に認識するため、正常細胞をターゲットとすることなく、効果的に悪性腫瘍などの疾患を治療することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（A）フローサイトメトリーを用いて、候補抗体の中からから、CD45-CD38++CD138+骨髄腫形質細胞およびCD45-CD38++CD138-骨髄腫前駆細胞には結合するが、CD45+血液細胞には結合しない抗体を選別したプロセスを示す。（B）FACSを用いてR8H283抗体がCD45-CD38++CD138+骨髄腫形質細胞およびCD45-CD38++CD138-骨髄腫前駆細胞には結合するが、CD45+血液細胞には結合しないことを確認した結果を示す。
【図２】複数の骨髄腫患者由来の骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞、CD45陽性白血球細胞に対するR8H283抗体の結合を示す。
【図３】FACS-sortingにてR8H283抗体結合BaF3細胞（当初0.1％未満）を濃縮し、結合抗原であるCD98hcを同定したプロセスを示す。
【図４】R8H283抗体がU266細胞には結合するが、CD98hc欠損U266細胞には結合しないことをFACSにて確認した結果を示す。MEM-108とは、抗ヒトCD98抗体である。
【図５】健常人末梢血細胞（A）および骨髄細胞（B）の各細胞分画に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図６】健常人末梢血Bリンパ球およびTリンパ球細胞に様々な濃度のR8H283抗体およびMEM-108抗体を結合させ、抗マウスIgG-PE抗体で染色し、FACS解析した結果を示す。横軸に抗体濃度、縦軸に蛍光強度を示している。MEM108と異なり、R8H283では抗体の濃度をあげてもリンパ球には全く結合しないことがわかる。
【図７】正常血管内皮細胞(HUVEC細胞)に対するR8H283抗体、及びMEM-108抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図８】各種がん細胞株に対するR8H283抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図９】健常人末梢血細胞の各細胞分画に対するR8H283抗体、抗CS1抗体、CD38抗体、および抗BST2抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図１０】(A)骨髄腫細胞株RPMI8226および骨髄性白血病細胞株U937に対するR8H283抗体及びMEM-108抗体の結合をFACS解析した結果を示す。(B)骨髄腫細胞株RPMI8226および骨髄性白血病細胞株U937に様々な濃度の R8H283抗体及びMEM-108抗体を結合させ、抗マウスIgG-PE抗体で染色し、FACS解析した結果を示す。横軸に抗体濃度、縦軸に蛍光強度を示している。MEM108と異なり、R8H283では抗体の濃度をあげてもU937にはほとんど結合しないことがわかる。
【図１１】（A）ツニカマイシン(2.5μg/ml)で４８時間処理したU937細胞、及び無処理のU937細胞に対するR8H283又はMEM-108の結合をFACS解析した結果を示す。数字はR8H283の結合により得られる平均蛍光強度（Mean fluorescent intesity (MFI)）をisotype controlのMFIで割った補正値）を表している。（B）タプシガルギン(1mM)で４８時間処理したU937細胞と無処理のU937細胞に対するR8H283抗体又はMEM-108の結合をFACS解析した結果を示す。
【図１２】タプシガルギン(1mM)で４８時間処理したU937細胞およびTHP1細胞と無処理細胞の細胞溶解液をSDS-PAGEゲルで電気泳動し、ポリクローナル抗CD98抗体（H300:サンタクルーズ社）を用いてウェスタンブロットした結果を示す。タプシガルギン処理による小胞体機能の阻害によりCD98の分子量は小さくなっており、糖鎖修飾が不全なまま発現されている可能性を示している。
【図１３】(A)ボルテゾミブ（10nM）で１６時間処理したMM1s骨髄腫細胞および無処理のMM1ｓ細胞に対するR8H283抗体の結合をFACSにて解析した結果を示す。（B）ボルテゾミブ（2nM）で48時間処理した骨髄腫患者由来骨髄細胞および無処理の細胞に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合をFACSにて解析した結果を示す。CD138陽性CD38強陽性の骨髄腫細胞（MM）とCD3陽性のT細胞に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図１４】（上）ヒト/マウスキメラCD98hcタンパクの構築とそれを一過性に発現させたCHO細胞に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合の有無を示す。（下）ヒト/マウスキメラCD98hcタンパクを一過性に発現させたCHO細胞に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図１５】（上）ヒト/マウスキメラCD98hcタンパクの構築とそれを一過性に発現させたCHO細胞に対するR8H283抗体の結合の有無を示す。（下）ヒト/マウスキメラCD98hcタンパクを一過性に発現させたCHO細胞に対するR8H283抗体の結合をFACS解析した結果を示す。
【図１６】（A,B）：R8H283抗体による補体依存性細胞傷害活性の有無を示す。（C,D）：R8H283抗体による抗体依存性細胞性細胞傷害活性の有無を示す。U266、OPM2、 NCI-H929、及び RPMI8226は、いずれも骨髄腫細胞株である。（B）及び（D）に結果が示される試験において、各抗体は終濃度10μg/mlで添加された。
【図１７】（A,C）SCIDマウスに皮下移植した骨髄腫細胞株OPM2が形成する腫瘤の体積変化を示す。（B）コントロール及びR8H283抗体投与マウスの２１日目の腫瘍の大きさを示す。矢印は腫瘍の幅を示す。
【図１８】（A）NOGマウスに経静脈的に移入した骨髄腫細胞株U266に対するR8H283抗体の治療効果を確認するための実験のデザイン（左）、及び１４日目の骨髄の解析結果の１例（右）を示す。（B）R8H283抗体が投与量依存的に骨髄内に生着したU266細胞を排除する能力を持つことが確認された結果を示す。（C）5mg/kgの抗体を投与後、day40にU266細胞の広がりをIVISによリ観察した結果を示す。
【図１９】（A）BRGSマウス骨髄内に移入した骨髄腫細胞株U266に対するR8H283抗体の治療効果を確認するための治療実験のデザインを示す。（B）抗体又はボルテゾミブ（Bor）投与前後の骨髄内の腫瘍量をluciferaseの発現により検出した結果を示す。（C）各治療群における腫瘍量の変化を示す。
【図２０】上段は、ヒト/マウスキメラCD98hcの構造を示す。「m328h427」とは、CD98hcの328番目〜427番目のアミノ酸残基はヒト由来CD98hcのアミノ酸残基であり、それ以外のアミノ酸残基はマウス由来であることを意味する。他のキメラCD98hcについても同様である。下段は、ヒト/マウスキメラCD98hcを一過性に発現させた293T細胞に対するR8H283抗体の結合強度を示す。縦軸のMFIとはR8H283抗体に対する結合強度を表し、数値が高いほど結合力が高いことを示す。
【図２１】ヒトCD98hc及びマウスCD98hcの365番目〜409番目のアミノ酸配列を示す。点線で囲まれた領域は、その領域のアミノ酸残基をマウス由来のアミノ酸残基にするとR8H283抗体が結合しなくなる領域である。また、矢印で示したアミノ酸残基は、ヒトCD98hcとマウスCD98hcとで異なるアミノ酸残基である。
【図２２】ヒトCD98hc、マウスCD98hc、及び７種類の変異型ヒトCD98hcを発現した293T細胞に対するR8H283抗体の結合強度を示す。上段は、フローサイトメトリーの結果であり、下段はMFIをグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．定義
「骨髄腫前駆細胞」は、骨髄腫形質細胞に分化する直前の段階の前駆細胞であり、CD38が強発現しているが、成熟形質細胞に特異的なマーカーであるCD138の発現がないことによって特徴付けられる。よって、骨髄腫前駆細胞は、「CD38＋＋CD138−細胞」又は「CD19−CD38＋＋CD138−細胞」又はと表記される場合もある。
【００１７】
「骨髄腫形質細胞」は、一般には骨髄腫細胞とも呼ばれ、異常免疫グロブリンであるMタンパクを産生する細胞である。骨髄腫形質細胞では、CD38の強発現に加え、CD138が発現している。よって、骨髄腫形質細胞は、「CD38＋＋CD138＋細胞」又は「CD19−CD38＋＋CD138＋細胞」と表記される場合もある。
【００１８】
骨髄腫前駆細胞、及び骨髄腫形質細胞は、各々多発性骨髄腫以外の形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患における腫瘍前駆細胞、腫瘍性形質細胞をも意味する。
【００１９】
「造血前駆細胞」は、様々な血球系細胞へと分化可能な細胞である。造血前駆細胞は、CD34の発現によって特徴付けられる。よって、本明細書において造血前駆細胞は、「CD34＋細胞」と表記される場合もある。
【００２０】
本書において、「含む」及び「有する」は、いわゆるオープンラングエッジであるが、これらは「のみから成る」というクローズドラングエッジを含む概念であり、一実施形態において、「のみから成る」に置き換えることができる。
【００２１】
２．抗体
一実施形態において、ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識する抗体が提供される。CD98（「4F2」とも称される）は、細胞膜上に発現し、アミノ酸トランスポーターとして機能することが知られる、約120kDaのヘテロ２量体のタンパク質である。CD98hcは、CD98を構成する約80kDaのII型膜貫通型タンパク質であり、「4F2hc」又は「SLC3A2」と称される場合もある。ヒトCD98hcには幾つかのアイソフォーム（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ等）が存在するが、細胞外ドメインのアミノ酸配列は共通している。代表的なヒトCD98hcであるアイソフォームｆのアミノ酸配列を配列番号２１として配列表に示す。ヒトCD98hcは、配列番号２１のアミノ酸配列における第264番目、第280番目、第323番目、及び第405番目にN型糖鎖が結合する構造を有する。本書では、ヒトCD98hcのアイソフォームｆのアミノ酸配列を代表例として参照するが、対応する配列／アミノ酸残基が他のアイソフォームにも存在し、同等に機能することを当業者は理解する。
【００２２】
後述する実施例に示されるように、骨髄腫細胞、骨髄腫前駆細胞、及び他の腫瘍細胞では、CD98hc上のN型糖鎖に変化（例えば、N型糖鎖修飾の不全）が生じていると考えられる。これは、骨髄腫細胞、骨髄腫前駆細胞、及び他の腫瘍細胞では小胞体ストレスが常時かかり、Ｎ型糖鎖修飾が阻害された状態であることが原因と考えられる。その結果、他の正常な細胞では抗体がアクセスできないCD98hc上のアミノ酸配列が骨髄腫細胞、骨髄腫前駆細胞、及び他の腫瘍細胞では抗体にアクセス可能な状態で細胞表面に露出すると考えられる。このような骨髄腫細胞及び骨髄腫前駆細胞に特異的なCD98hcの領域を本書では「ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出する領域」又は「N型糖鎖の存在によって影響を受ける領域」と称する。このような領域内にエピトープが存在することにより、抗体は骨髄腫細胞及び骨髄腫前駆細胞を特異的に認識することができる。前記「領域」の大きさは任意であり、特に制限されないが、例えば、４０アミノ酸残基以下、３５アミノ酸酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２５アミノ酸酸残基以下、２０アミノ酸残基以下、１５アミノ酸残基以下、又は１０アミノ酸残基以下で構成される。一実施形態において、エピトープはヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含んでいなくてもよい。
【００２３】
「ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位」とは、ヒトCD98hcを構成するアミノ酸残基のうち、N型糖鎖が付着するアミノ酸残基を意味する。一実施形態において、該N型糖鎖付着部位は、配列番号２１のアミノ酸配列における第264番目、第280番目、第323番目、又は第405番目のアスパラギン残基である。好適な一実施形態において、該N型糖鎖付着部位は、配列番号２１のアミノ酸配列における第405番目のアスパラギン残基である。
【００２４】
一実施形態において、抗ヒトCD98抗体は、細胞で発現するCD98hcに対するN型糖鎖の結合を阻害することによって、CD98hcへの親和性が高まる性質を有することが好ましい。CD98hcへのN型糖鎖の結合の阻害は、例えば、CD98hcを発現させる細胞をTunicamycin、Thapsigargin、又はBortezomibで処理することで行うことができる。よって、これらの薬剤でヒトCD98hcを発現する細胞（例えば、U937細胞）を処理することにより、未処理の場合と比較して抗体のヒトCD98hcへの結合量が上昇すれば、ヒトCD98hcに対するN型糖鎖の結合を阻害することによって、ヒトCD98hcへの親和性が高まる性質を有すること、又はN型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識することを確認できる。また、この方法によって、抗体のエピトープがN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内に存在するか否かを判断することができる。即ち、上記薬剤でヒトCD98hcを発現する細胞を処理することにより、未処理の場合と比較して抗体のヒトCD98hcへの結合能が変化すれば、当該抗体のエピトープはN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内に存在すると判断することができる。
【００２５】
一実施形態において、抗体は、ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する抗ヒトCD98hc抗体であることが好ましい。この特性を抗体が有するか否かは、任意の手法で確認することができる。例えば、ヒトCD98hcに糖鎖が結合する条件下で発現させたヒトCD98hcに対する抗体の親和性と当該糖鎖の結合を阻害ないし抑制する条件下で発現させたヒトCD98hcに対する抗体の親和性を比較することで、当該抗体が、ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによってヒトCD98hcに対する親和性が上昇する特性を備えるか否か確認することができる。ヒトCD98hcに対する糖鎖結合の阻害ないし抑制は、例えば、上記のとおりTunicamycin、Thapsigargin、又はBortezomibでCD98hcを発現する細胞を処理することにより可能である。ヒトCD98hcを発現する細胞をTunicamycin、Thapsigargin、又はBortezomibで処理する具体的な条件は、糖鎖の結合が阻害なしい抑制される限り特に制限されず、例えば、後述する実施例で採用した条件に準拠することができる。CD98hcを発現する細胞としては、例えば、U937細胞を用いることができる。親和性の上昇は、後述する実施例で採用した条件に準拠して行ったフローサイトメトリー解析において当該抗体の結合によって得られる蛍光強度(Mean Fluorescent intensity)の上昇を指標に測定できる。蛍光強度の上昇の程度は特に制限されないが、例えば、U937細胞を用いる場合、処理前と比較して、１．５倍以上、１．７倍以上、又は２倍以上であることが好ましい。また、上昇の程度は、例えば、THP-1細胞を用いた場合、処理前と比較して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、又は６倍以上であることが好ましい。
【００２６】
一実施形態において、抗ヒトCD98抗体は、ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗体であることが好ましい。ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcとは、ヒトCD98hcの395番目のF、396番目のP、及び397番目のDが、各々I、F、及びHに置換された変異型ヒトCD98hcである。抗ヒトCD98hc抗体の変異型ヒトCD98hcに対する親和性がマウス由来ヒトCD98hcに対する親和性と同等であるとは、抗ヒトCD98hc抗体が当該変異型ヒトCD98hcに実質的に結合しないことを意味する。
【００２７】
一実施形態において、抗ヒトCD98抗体は、ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗体であることが好ましい。ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcとは、ヒトCD98hcの400番目のG及び401番目のAが、各々R及びPに置換された変異型ヒトCD98hcである。抗ヒトCD98hc抗体の変異型ヒトCD98hcに対する親和性がマウス由来ヒトCD98hcに対する親和性と同等であるとは、抗ヒトCD98hc抗体が当該変異型ヒトCD98hcに実質的に結合しないことを意味する。  
【００２８】
変異型ヒトCD98hcに対する親和性がマウス由来CD98hcに対する親和性が同等であるとは、マウス由来CD98hcに対する結合強度と変異型CD98hcに対する結合強度を同一条件でフローサイトメーターで測定し、結合強度を平均蛍光強度（MFI）で表した場合の両者の比（変異型CD98hcに対する結合強度／マウス由来CD98hcに対する結合強度）が、１．１〜０．９、好ましくは１．０５〜０．９５であることを意味する。
【００２９】
このような特性を持つ抗体は以下の手順で得ることができる。まず、ヒトCD98hcを発現させたマウス細胞を抗原として、後述する実施例に準拠した方法により抗ヒトCD98hc抗体を得る。次に得られた抗体で、実施例に準拠した方法により、ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hc(後述する実施例における構築物F395I/P396F/D397H)を発現させたCHO細胞を染色し、フローサイトメトリーにて解析する。同時にマウスCD98hcを発現させたCHO細胞も同様に染色し、フローサイトメトリーにて解析する。その結果、上述の変異型ヒトCD98hcに対する親和性がマウス由来CD98hcに対する親和性と同等であるものを選択すれば、ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である、抗ヒトCD98hc抗体を得ることができる。親和性が同等であるとは、マウス由来CD98hcに対する結合強度と変異型CD98hcに対する結合強度を同一条件でフローサイトメーターで測定し、結合強度を平均蛍光強度（MFI）で表した場合の両者の比（変異型CD98hcに対する結合強度／マウス由来CD98hcに対する結合強度）が、１．１〜０．９、好ましくは１．０５〜０．９５であることを意味する。
【００３０】
一実施形態において、ヒトCD98hcのN型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープは、ヒトCD98hc上の配列番号２１の第２０３番目〜第４２７番目に相当する領域内に存在することが好ましい。好適な一実施形態において、抗体のエピトープは、ヒトCD98hc上の配列番号２１の第３６５番目〜第４２７番目に相当する領域内に存在することが好ましい。他の好適な実施形態において、抗体のエピトープは、ヒトCD98hc上の配列番号２１の第３６５番目〜第４０９番目に相当する領域内に存在することが好ましい。ここで、「相当する」とは、アイソフォームｆ以外のヒトCD98hcでは、上記２つの領域の場所は、必ずしもＮ末端のアミノ酸残基を第１番目として、第３６５番目〜第４２７番目及び第３６５番目〜第４０９番目ではない為である。配列番号２１の第３６５番目〜第４２７番目のアミノ酸配列は次の通りである：FSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQR（配列番号２２）。配列番号２１の第３６５番目〜第４０９番目のアミノ酸配列は次の通りである：FSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVK（配列番号２３）。よって、好適な一実施形態において、ヒトCD98hcのN型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープは、ヒトCD98hcの配列番号２２で示されるアミノ酸配列から成る領域内に存在することが好ましく、配列番号２３で示されるアミノ酸配列から成る領域内に存在することがより好ましい。配列番号２１の第２０３番目〜第４２７番目のアミノ酸配列を配列番号２４として配列表に示す。
【００３１】
一実施形態において、抗ヒトCD98hc抗体のエピトープは、ヒトCD98hcの365番目〜376番目の領域および395番目〜409番目の領域に存在することが好ましい。一実施形態において、抗ヒトCD98hc抗体のエピトープは、ヒトCD98hcの374番目、375番目、395番目、396番目、397番目、400番目、401番目のアミノ酸残基を含むことが好ましい。尚、本書においてヒトCD98hcのアミノ酸残基の位置は、別段の表示をする場合を除き、配列番号２１のアミノ酸配列における位置である。
【００３２】
抗体が配列番号２３で示されるアミノ酸配列の領域にエピトープを有するか否かは、次の手順で確認することができる。即ち、配列番号２３で示されるアミノ酸配列以外の部分をマウス由来のCD98hcのアミノ酸配列に置き換えたヒト／マウスキメラCD98hcをコードするポリヌクレオチドを構築し、それを適当な細胞で強制発現させる。別途、同種の細胞にマウスCD98hcを強制発現させた細胞を準備する。そして、これらの細胞に対する抗体の結合を測定し、抗体がキメラCD98hcを発現する細胞に結合するが、マウスCD98hcには結合しない場合に、上記領域にエピトープを有すると判断することができる。尚、ここでは配列番号２３のアミノ酸配列を例に説明するが、他の領域又は部位であっても同様に測定できる。
【００３３】
ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識し、ヒトCD98hcに対するN型糖鎖の結合を阻害することによって、ヒトCD98hcへの親和性が高まる性質を有する抗体の一例は、後述する実施例において取得されたR8H283抗体である。よって、一実施形態において、抗体のエピトープは、R8H283抗のエピトープと同一であることが好ましい。他の実施形態において、抗体はR8H283抗体であることが好ましい。
【００３４】
一実施形態において、抗体は、上述の特性を有する限り、その構造は任意であるが、R8H283抗体の３つの重鎖相補性決定領域（CDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3）、並びに、３つ軽鎖相補性決定領域（CDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3）から成る群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域と同一の相補性決定領域を有することが好ましい。R8H283抗体の重鎖超可変領域及び軽鎖超可変領域のアミノ酸配列は下記表１に示す通りである。
【００３５】
【表１】
2017026497.tif 000002
【００３６】
一実施形態において、抗体は、R8H283抗体のCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3から成る群から選択される１つ以上のCDRを有し、好ましくは２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは５つ以上、好ましくは６つ全てを有する。一実施形態において、抗体は、少なくともR8H283抗体のCDR-H3、及び／又はCDR-L3を有することが好ましい。
【００３７】
一実施形態において、抗体の重鎖可変領域は、R8H283抗体の重鎖可変領域と同じアミノ酸配列（配列番号４）を有することが好ましい。一実施形態において、抗体の軽鎖可変領域は、R8H283抗体の軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列（配列番号９）を有することが好ましい。抗体は、R8H283抗体の重鎖可変領域と同じアミノ酸配列（配列番号４）、及び、R8H283抗体の軽鎖可変領域と同じアミノ酸配列（配列番号９）を有することが好ましい。ここで、「同じ」とは、アミノ酸配列が完全に一致する場合だけでなく、１個又は数個（例えば、15個以下、好ましくは10個以下、好ましくは5個以下、好ましくは3個以下、好ましくは2個）のアミノ酸残基が異なりながら、R8H283抗体と実質的に同じエピトープを有する場合を含む。
【００３８】
一実施形態において、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上の同一性を有する。一実施形態において、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上の同一性を有する。アミノ酸の同一性は後述する手法で測定される。
【００３９】
抗体は、ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識する限り、その構造は任意であり、必ずしも定常領域を有する必要はない。例えば、抗体の構造は、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、及びテトラボディ（tetrabody）、並びにこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される構造であり得る。
【００４０】
Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していても良い。
【００４１】
scFvとは、重鎖可変領域のＣ末端と軽鎖可変領域のＮ末端がリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。scFvは重鎖可変領域のＮ末端と軽鎖可変領域のＣ末端とがリンカーで繋がれた構造であってもよい。
【００４２】
ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上述のｓｃＦｖが２量体、３量体および４量体を形成し、Ｆｖなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
【００４３】
このような構造を有する抗体は、当該技術分野に知られる方法を任意に選択して作成することができる。例えば、遺伝子工学的な手段で発現ベクターを構築し、それを抗体の産生に適した宿主細胞又は無細胞発現系で発現させることにより抗体を得ることができる。宿主細胞の種類は、任意であり特に制限されないが、例えば、原核細胞（大腸菌、及び放線菌等）、並びに、真核細胞（酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞等）から適宜選択することができる。発現させた抗体を任意の精製に供して純度の高い抗体を得ることができる。
【００４４】
一実施形態において、抗体は、定常領域を有することが好ましい。重鎖には、CH1、CH2、及びCH3という３種類の定常領域が存在し、軽鎖には、CLという１種類の定常領域が存在することが知られる。CH2及びCH3を含む領域はFcドメインとも呼ばれる。抗体は、CH1、CH2、CH3、及びCLから成る群より選択される１種以上の定常領域を有し得、全ての定常領域を有していても良い。
【００４５】
定常領域のアミノ酸配列は、抗体の由来及びクラスによってある程度一定である。定常領域の由来は任意であり、例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、サル由来、又はチンパンジー由来等である。大量生産又はヒトに対する免疫原性の低減といった目的に応じて定常領域の由来を選択することができる。
【００４６】
一実施形態において、抗体はキメラ抗体であることが好ましい。キメラ抗体は、例えば、マウス抗体の定常領域をヒト由来の定常領域に置き換えることによって得ることができる。キメラ抗体は公知の方法に従って作製することができる。
【００４７】
一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であることが好ましい。ヒト化抗体は、例えば、マウス抗体の定常領域だけでなく、可変領域に存在する超可変領域以外の領域のアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列に置き換えることによって得られる。可変領域に存在する超可変領域以外の領域は、ＦＲを呼ばれる領域である。可変領域のＮ末端とＣＤＲ１との間のＦＲ１領域、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間のＦＲ２領域、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間のＦＲ３領域、ＣＤＲ３とカルボキシ末端（Ｃ末端）との間のＦＲ４領域が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域それぞれに存在する。これらの領域の１つ以上又は全てをヒト化することにより、ヒト化抗体が得られる。ヒト化抗体におけるヒト由来のアミノ酸配列は通常約９０％以上であるがこれに制限されない。ヒト化抗体は、公知の方法に従って作製することができる。
【００４８】
一実施形態において、抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。ヒト抗体は、可変領域を含む抗体全体の構造がヒトに由来する抗体である。ヒト抗体は「完全ヒト化抗体」と呼ばれることもある。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによるヒト抗体遺伝子クローニング法、ヒト型化トランスジェニックマウスに免疫して作製する方法、EBウイルスによるヒト抗体産生細胞の不死化法、又はフュージョンパートナーとヒト末梢血単核球を融合する方法等を用いて作製することができる。
【００４９】
一実施形態において、抗体は定常領域を有することが好ましい。定常領域を含む抗体の構造は任意である。例えば、抗体は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する１本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する１本の軽鎖から成る構造が２つ組み合わされたイムノグロブリンだけでなく、Fab、F（ab’）2、ミニボディ（minibody）、又はscFv‐Fcと呼ばれる構造、或いは、これらを任意に組み合わせた構造を有していても良い。また、一実施形態において、抗体は、後述するキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、又はキメラ抗原受容体ＮＫ細胞等であってもよい。
【００５０】
Fabとは重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
【００５１】
F(ab’)2とは、２対の上記Ｆａｂを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
【００５２】
ミニボディとは、上記scFVを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片２つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
【００５３】
scFv‐Fcとは、上記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片２つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
【００５４】
これらの定常領域を含む種々の抗体は、上述する定常領域を含まない抗体と同様に、当該技術分野において知られる任意の方法を作製することができる。Fabは、例えば、イムノグロブリンであるIgGをパパイン等のプロテアーゼを用いて分解することによって得ることもできる。F(ab’)2は、IgGをペプシンなどのプロテアーゼを用いてこれを分解することによって得ることもできる。
【００５５】
一実施形態において、抗体は、イムノグロブリンであることが好ましい。イムノグロブリンのクラスは特に限定はされず、例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、又はIgM、或いは、これらのサブクラスであり得る。一実施形態において、抗体は、IgGであることが好ましく、例えばマウス由来のIgGであれば、４つのサブクラスの中でもIgG2が好ましい。
【００５６】
定常領域を有する抗体の構造としては、例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。配列番号５のアミノ酸配列は、R8H283抗体の重鎖可変領域、及び、IgG抗体の重鎖定常領域を含むアミノ酸配列である。配列番号１０のアミノ酸配列は、R8H283抗体の軽鎖可変領域、及び、IgG抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。
【００５７】
抗体が、配列番号１〜１０から成る群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を有する場合、そのエピトープがヒトCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内に存在する限り、当該アミノ酸配列には任意の変異が存在しても良い。一実施形態において、抗体の超可変領域又は相補性決定領域に変異は施されないことが好ましい。一般的に、超可変領域及び相補性決定領域における変異は、エピトープに影響すると考えられるためである。よって、一実施形態において可変領域における変異は、重鎖ＦＲ領域及び軽鎖ＦＲに存在することが好ましい。また、定常領域に変異を挿入することによって、抗体が有するＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を調整することもできる。
【００５８】
配列番号１〜１０から成る群より選択される１つ以上のアミノ酸配列に導入され得る変異の数（アミノ酸残基換算）は、特に限定はされない。一実施形態において、変異導入前のアミノ酸配列と変異導入後のアミノ酸配列の同一性は、７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％程度以上、好ましくは９９％以上である。なお、同一性％は四捨五入によって得られるものとする。
【００５９】
アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。
【００６０】
上述のアミノ酸配列への変異とは、例えば、置換、欠失、挿入などである。具体的な変異導入は、慣用の方法を採用することにより達成できるものであれば、特に限定はされない。アミノ酸の置換は保存的な置換であることが好ましい。保存的な置換とは、あるアミノ酸残基がその側鎖と類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することである。
【００６１】
具体的な保存的アミノ酸置換としては次を挙げることができる：リジン、アルギニン、及びヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；アスパラギン酸、及びグルタミン酸等の酸性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン等の非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン等の非極性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；スレオニン、バリン、及びイソロイシン等のβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン等の芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換。
【００６２】
一実施形態において、抗体は、細胞傷害活性を有することが好ましい。細胞障害活性とは、抗体が細胞に結合することにより、当該細胞を死滅（又は増殖抑制）させる活性であり、その機構は特に制限されない。例えば、細胞傷害活性は、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ADCC）、アポトーシス誘導作用、およびリガンド結合の遮断による生存シグナルの阻害等のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせにより奏される。
【００６３】
ADCC活性とは、抗体の定常領域に特異的なレセプターを発現しているＮＫ細胞などの細胞障害活性を有する細胞を抗体近傍にリクルートさせ、斯かる細胞などの作用によって、抗体が結合した細胞に傷害を与える活性である。CDC活性とは、抗体が補体をその近傍にリクルートさせ、補体の作用によって抗体が結合している細胞に対して障害を与える活性である。ADCC活性及びCDC活性は、抗体の定常領域に変異に施すことによってその活性を調整することができる。
【００６４】
例えば、定常領域がヒトＩｇＧ１であれば、次の１種以上の変異（置換）を導入することにより、ADCC活性を高めることができる：S239D、I332E、S239D／I332E、S239D／I332E／A330L、S298A、K334A、S298A／K334A、S298A／E333A／K334Aなどの変異を施すことによって、ADCC活性を上昇させることができる。ここで、「S239D」とは、定常領域の239番目のセリン（S）がアスパラギン酸（D）に置換されていることを意味する。これは、他の置換についても同様である。
【００６５】
定常領域がヒトＩｇＧ１である場合、例えば、次の１種以上の変異（置換）を導入することにより、ADCC活性を抑制することができる：V234A／G237A、H268Q／V309L／A330S／P331S。
【００６６】
CDC活性に関しては、定常領域がヒトＩｇＧ１である場合、例えば、次の１種以上の変異（置換）を導入することにより、CDC活性を高めることができる：S267E、H268F、S324T、S267E／H268F、S267E／S324T、H268F／S324T、S267E／H268F／S324T。
【００６７】
ADCC活性の測定方法
ADCC活性は、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って測定することができる。例えば、骨髄腫細胞を10％FCS添加のRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5×10４〜1.0×10４個となるように調製する。これに適量のNa251CrO4を加え、37℃で1時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とする。エフェクター細胞としては、SCID マウスの骨髄細胞を10％のFBS、10ng/mlのマウスGM-CSF、及び40IU/mlのヒトIL2を添加したRPMI1640中で６日間培養したもの等を使用することができる。96ウェルプレートに被検抗体又はコントロールとなるそのアイソタイプ抗体を終濃度0.05〜10μg/mLとなるように添加し、さらに標的細胞（1.0×10４個）及びエフェクター細胞（5×10５個）を添加する。37℃で4時間反応させ、遠心分離後、上清に放出された５１Crをγ−カウンターにて測定する。ADCC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。
【００６８】
ADCC活性＝｛（[標的細胞からの51Cr 放出]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
【００６９】
CDC活性の測定方法
CDC性についても、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って測定することができる。例えば、標的細胞となる骨髄腫細胞を10％FCS添加のRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5×10４〜1.0×10４個となるように調製する。これに適量のNa251CrO4を加え、37℃で1時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とする。ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁した被検抗体又はコントロールとなるアイソタイプ抗体を終濃度0.5〜50μg/mLとなるように96ウェルプレートに加え、次いで前記標的細胞と補体とを加えて1.5時間反応させる。反応液を遠心分離し、上清に放出された51Crをγ−カウンターにて測定する。CDC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。
【００７０】
CDC活性＝｛（[標的細胞からの51Cr 放出]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
【００７１】
細胞傷害活性を有する抗体は、上記方法を用いて細胞傷害活性の有無を評価し、当該活性を有する抗体を選抜することによって得ることが出来る。
【００７２】
細胞傷害活性を有する抗体は、単独で疾患（例えば、悪性腫瘍）の治療に用いることができるため有用である。
【００７３】
一実施形態において、抗体は、CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内にそのエピトープが存在し、且つ、他の抗原に特異的に結合する、多重特異性抗体であってもよい。他の抗原は、目的に応じて任意に選択することができ、特に制限されない。
【００７４】
多重特異性抗体は、当該技術分野において知られる方法を適宜用いて作製することができる。例えば、次の手順で多重特性抗体を得ることができる。
（１）CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内にエピトープを有する抗体を産生するハイブリドーマを準備する。
（２）別途、上記他の抗原で免疫付与した動物から得られるＢ細胞などの抗体産生細胞を用いてハイブリドーマ作製する。
（３）これらの２種類のハイブリドーマ同士を細胞融合させてハイブリドーマ（二重特性抗体の場合は、「クワドローマ」ともいう）を作製する。
（４）（３）で作製したられたハイブリドーマの中から目的の多重特異性抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
【００７５】
二重特異性抗体は下記の手順で得ることもできる。
（ａ）CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内にエピトープを有するF(Ab’)2の構造の抗体を作製する。
（ｂ）他の抗原に特異的に結合するF（ab’）2の構造の抗体を別途作製する。
（ｃ）（ａ）および（ｂ）で得られた２種類のF(ab’)２の構造の抗体をDTTなどの還元剤を用いて処理し、更にどちらかの処理物をエルマン試薬で処理する。
（ｄ）（ｃ）で得られた処理後のF(ab’)２構造の抗体を混合して反応させる。
【００７６】
抗体は、それに任意の他の物質が結合した状態であってもよい。他の物質としては、例えば、細胞傷害活性を有する物質、酵素、タグ、及び免疫モジュレーター等を挙げることができる。
【００７７】
抗体に、細胞傷害活性を有する物質を結合させることによって、細胞傷害活性を付与することができる。サイトトキシンとは、細胞傷害活性（例えば、細胞を死滅させる活性、及び／又は細胞増殖を抑制する活性）を有する物質であり、当該活性を有する限り特にその種類は特に制限されず、例えば、抗ガン剤として知られる物質を挙げることができる。
【００７８】
サイトトキシンの具体例としては次のものを挙げることができる：シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ、90-Ittrium等の放射性同位元素等を挙げることができる。これらの中でも、好ましくは、カリケアマイシン、メルファラン、ビンクリスチン硫酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、プレドニゾロン、デキサメサゾン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブであり、より好ましくは良好な抗体への結合の実績のあるカリケアマイシンである。これらのサイトトキシンは、いずれも商業的に入手可能で上述の中から１種又は２種以上を適宜組み合わせて選択することができる。
【００７９】
サイトトキシンと抗体とは、任意の方法で結合されることができる。例えば、リンカーを介して、抗体のアミノ酸残基側鎖のアミノ基、チオール基、グアニジル基、水酸基、又はカルボキシル基など官能基にサイトトキシンを結合させることができる。
【００８０】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体集団であることを意味する。すなわち、モノクローナル抗体（集団）に含まれる個々の抗体は、僅かに存在し得る突然変異体を除けば全て同一の抗体であると解される。
【００８１】
上述の抗ヒトCD98hc抗体は、本書に開示される情報に基づき、当該技術分野において知られる任意の手法を用いて製造することができる。好適な一実施形態において、ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識する抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列（好ましくは、配列番号２３のアミノ酸配列）を有するペプチド断片、タンパク質（例えば、CD98ch）、又はそれを発現する細胞を免疫原として利用することにより得ることができる。一実施形態において、好ましい免疫原は、配列番号２２のアミノ酸配列（好ましくは配列番号２３のアミノ酸配列）及びそれ以外の領域がマウス等のヒト以外の哺乳類のCD98hcのアミノ酸配列である、ヒト／動物キメラCD98ch、その断片又はそれを発現する細胞である。前記ヒト以外の哺乳類は、任意であり、特に制限されないが、免疫動物として使用される哺乳類が好ましい。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ヤギ、サル、ブタ、及びダチョウ等を挙げることができる。一実施形態において、好ましい免疫動物はマウスである。このようなヒト／動物キメラCD98chを免疫原として当該動物を免疫することにより、配列番号２２のアミノ酸配列（好ましくは配列番号２３のアミノ酸配列）の領域のみが、免疫動物にとって外来性のタンパク質となるため、この領域をエピトープとして認識する抗体を効率的に誘導することができる。
【００８２】
ヒト／動物キメラCD98hcは、公知の各種動物のCD98hcのアミノ酸配列及び遺伝子配列に関する情報を基に、任意の手法で得ることができる。一実施形態において、免疫原として用いるCD98hcは、N型糖鎖が付加されていないことが好ましい。このようなCD98hcは、例えば、CD98hcのN型糖鎖が結合するアスパラギン残基（例えば、第405番目のアスパラギン残基）を他のアミノ酸残基（例えば、グルタミン）に置換することで得ることができる。一実施形態において、抗体を取得するための免疫原は、ヒト／動物（例えば、マウス）キメラCD98hc又はその断片を発現する細胞であることが好ましい。前記細胞の種類は任意であり、特に制限されないが、免疫動物と同種の動物に由来することが好ましい。これにより、前記細胞は免疫動物において外来性の細胞と認識されないため、配列番号２２のアミノ酸配列（好ましくは配列番号２３のアミノ酸配列）の領域をエピトープとして認識する抗体を効率的に誘導することができる。
【００８３】
一般的に、免疫動物の免疫は３〜１０日間隔で複数回行う。１回の免疫に用いられる細胞の数は任意であるが、通常、103〜108の細胞が投与される。タンパク質又はその断片を免疫原として用いる場合は、一般的に１〜１００μgが免疫される。複数回の免疫を経た免疫動物の脾臓やリンパ節から抗体酸性細胞を回収し、目的とする抗体を産生する細胞をクローニングすることにより、モノクローナル抗体を得ることができる。クローニングは、抗体産生細胞を適当な細胞株（例えば、骨髄腫細胞）と融合させてハイブリドーマを得、それが産生する抗体について、所望の結合能を測定することによって行える。結合能の測定は、FACS 、ELISA、RIA、及びEIA等の公知の方法を用いて行える。
【００８４】
このようにして得られる抗体は、ヒトCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内を特異的に認識することにより、骨髄腫細胞、骨髄腫前駆細胞、及び他の腫瘍細胞を特異的に認識するため、腫瘍等の治療又は予防に有用である。腫瘍の種類は特に制限されず、固形癌及び血液癌を含む悪性腫瘍である。固形癌としては、例えば、肺癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮癌、骨肉腫、軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫を挙げることができる。血液癌としては、白血病、形質細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患（例えば、多発性骨髄種）、及び悪性リンパ種を挙げることができる。一実施形態において、好ましい白血病は、リンパ性白血病である。
【００８５】
３．ポリヌクレオチド
上記セクション２．に記載する抗体（以下、本書において「抗体Ａ」と称する場合もある）をコードするポリヌクレオチドが提供される。「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチド）が直鎖状に重合した高分子化合物である。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００８６】
R8H283抗体の超可変領域、可変領域、重鎖、及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１１〜２０に示される。これらの対応関係を下記表２に示す。
【００８７】
【表２】
2017026497.tif 000003
【００８８】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１〜２０から成る群より選択される１種以上（２種以上である場合の組み合わせは任意）の塩基配列を有する。好適な一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１３から成る群より選択される１種以上（好ましくは２種以上、より好ましくは全て）の塩基配列、及び／又は配列番号１６〜１８から成る群より選択される１種以上（好ましくは２種以上、より好ましくは全て）の塩基配列を有する。好適な一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１３の塩基配列及び配列番号１６〜１８の塩基配列を有する。好適な一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４及び／又は配列番号１９の塩基配列を有する。別の好適な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５及び／又は配列番号２０の塩基配列を有する。
【００８９】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、抗体Ａをコードする限り、配列番号１１〜２０と完全に一致している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１１〜２０と８０％以上、好ましくは、８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有することができる。ここで、「同一性」は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。例えば、具体的には、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。ポリヌクレオチドは、それを発現させるベクター又は細胞の種類に応じてコドン使用頻度が最適化されていてもよい。
【００９０】
ポリヌクレオチドの状態は特に限定されず、例えば、単離されたものであっても、ベクター内に組み込まれたものであってもよい。ベクターの種類及び用途は特に限定されない。例えば、ベクターは、プラスミドベクター、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、又はレトロウイルス）であり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。ポリヌクレオチドは、任意の修飾が施されていてもよく、例えば、５'末端側に適宜シグナルペプチドをコードする塩基配列が付加されていてもよい。
【００９１】
４．宿主細胞
上述する抗体Ａをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞がポリヌクレオチドを含む態様は特に限定されない。例えば、宿主細胞は、ベクターの形態でポリヌクレオチドを有してもよく、宿主細胞内のゲノムＤＮＡにインテグレイトされた形態でポリヌクレオチドを有してもよい。
【００９２】
宿主細胞の種類は、任意であり特に制限されない。例えば、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞などの真核細胞、並びに大腸菌、及び放線菌等の原核細胞であり得る。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞であることが好ましく、例えば、T細胞、又はNK細胞等が好ましい。
【００９３】
上述する抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、例えば、任意の宿主細胞に該ポリヌクレオチド（例えば、ベクターの形態で）を導入して得ることができる。
【００９４】
５．キメラ抗原受容体
ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ヒトCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域内にそのエピトープが存在するキメラ抗原受容体、ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体、ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体、及びヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である抗ヒトCD98hcキメラ抗原受容体等が提供される。キメラ抗原受容体とは、一般的に、人工のT細胞受容体（TCR）様のタンパク質であり、Ｔ細胞の細胞膜上にて発現する（細胞外ドメインに相当する）抗原認識部位を所望の抗原認識部位に置換し、且つT細胞そのものが有する細胞障害活性などの機能を、より効果的に発揮できるように構築されたタンパク質として知られる。キメラ抗原受容体は、一般的に、抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを直列に結合させた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に有し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖をＣ末端側に持つ構造を有する。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞等はｓｃＦｖ領域で抗原を認識した後、その認識シグナルをζ鎖を通じてＴ細胞等の内部に伝達する。キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に共刺激分子（例えば、CD28及び／又は4-1BB）を有することが好ましい。
【００９５】
「ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープ」、「ヒトCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域」、「ヒトCD98hcに結合する糖鎖を除去することによって、ヒトCD98hcに対する親和性が上昇する」、「ヒトCD98hcの395番目〜397番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である」「ヒトCD98hcの400番目及び401番目のアミノ酸残基をマウス由来CD98hcアミノ酸残基に置換した変異型CD98hcに対する親和性が、マウス由来CD98hcに対する親和性と同等である」という特性については、抗体Ａの説明が該当する。従って、一実施形態において、キメラ抗原受容体は、CD98hcの配列番号２２で示されるアミノ酸配列の領域にエピトープを有することが好ましい。他の好適な実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列の領域内にエピトープを有することが好ましい。また、一実施形態において、キメラ抗原受容体のエピトープは、ヒトCD98hcの365番目〜376番目の領域および395番目〜409番目の領域に存在することが好ましい。一実施形態において、キメラ抗原受容体のエピトープは、ヒトCD98hcの374番目、375番目、395番目、396番目、397番目、400番目、401番目のアミノ酸残基を含むことが好ましい。
【００９６】
他の実施形態において、キメラ抗原受容体のエピトープは、R8H283抗体のエピトープと同一であることが好ましい。よって、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖは、上述の抗体の弊鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有することが好ましい。より具体的に、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖは、次の構造を有することが好ましい：
配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域。
【００９７】
好適な一実施形態において、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖは、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【００９８】
キメラ抗原受容体は、そのＮ末端から順に、上述の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が直接に連結されたｓｃＦｖ領域、スペーサー配列、膜貫通ドメイン、共刺激因子、並びにＴＣＲの細胞内ドメインが配置された構造を有することが好ましい。
【００９９】
ｓｃＦｖ領域は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に、例えば、１０個〜２５個程度のアミノ酸残基からなるスペーサー配列を有していてもよい。このようなスペーサー配列は、上記のｓｃＦｖ領域と膜貫通ドメインとの間に設けられるスペーサー配列と同一であっても異なっていてもよい。
【０１００】
上記のｓｃＦｖ領域と膜貫通ドメインとの間に設けられるスペーサー配列の長さ及びそれを構成するアミノ酸残基の種類は、キメラ抗原受容体の機能を阻害しない限り制限されない。例えば、スペーサー配列は、１０個〜２５個程度のアミノ酸残基となるように設計することができる。
【０１０１】
上記膜貫通ドメインの種類は、キメラ抗原受容体の機能を阻害しない限り制限されない。例えば、Ｔ細胞等で発現するＣＤ２８、４−１ＢＢ等を用いることができる。これらの膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
【０１０２】
上記共刺激因子は、Ｔ細胞などが有する共刺激因子であればよく特に限定はされない。例えば、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、及びＣＤ２８等から成る群から選択される１種以上を適宜選択して使用することができる。これらの共刺激因子は、キメラ抗原受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。
【０１０３】
上記ＴＣＲの細胞内ドメインは、例えば、ＴＣＲζ鎖とも呼ばれるＣＤ３などに由来する細胞内ドメインであり得る。ＣＤ３は、キメラ抗原受容体の機能を阻害しない限り、適宜変異が導入されていてもよい。ＣＤ３に変異を導入する場合は、ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が含まれるよう行うことが好ましい。
【０１０４】
キメラ抗原受容体は、非特許文献２〜４等に記載される方法を参考にして製造することができる。
【０１０５】
上記のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドの塩基配列は、上記キメラ抗原受容体をコードする限り任意であり、特に制限されない。ポリヌクレオチドの状態は特に限定されず、例えば、単離されたものであっても、ベクター内に組み込まれたものであってもよい。上記抗体をコードするポリヌクレオチドに関する説明は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドにも適用される。
【０１０６】
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。上述の抗体をコードするポリペプチドを含む宿主細胞に関する説明は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞にも適用される。宿主細胞の種類は任意であるが、細胞傷害活性を有する細胞が好ましい。細胞傷害活性を有する細胞としては、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｋ細胞等を挙げることができ、キラーT細胞（細胞障害性Ｔ細胞（CTL）ともいう）が好ましい。
【０１０７】
宿主細胞は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを発現していても良く、発現していない状態であってもよい。宿主細胞内でキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが発現している場合、キメラ抗原受容体を構成するｓｃＦｖ領域は細胞の外側に露呈し、膜貫通ドメイン、共刺激因子、及びＴＣＲの細胞内ドメインは細胞膜または細胞内に存在することが好ましい。
【０１０８】
ｓｃＦｖ領域がそのエピトープを認識すると、膜貫通ドメイン、及び共刺激因子を介して細胞内にて細胞障害活性を惹起させるシグナルを作動させ、これに連動して該細胞が同エピトープを発現する他の細胞または組織に対して攻撃または細胞障害活性を発揮する。
【０１０９】
このような機能を発揮する細胞がCTLである場合、これをキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）と呼ぶ。ＮＫ細胞などの細胞障害活性を発揮する可能性を有する細胞もキメラ抗原受容体Ｔ細胞と同様に、ｓｃＦｖ領域がそのエピトープと結合することにより、細胞障害活性を発揮する。
【０１１０】
従って、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（特に、細胞傷害活性を有する宿主細胞）は、医薬組成物の有効成分として有用である。キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、非特許文献２〜４等に記載される方法を参考にして製造することができる。
【０１１１】
このようなＣＡＲ−Ｔ細胞等は、ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープを認識することにより、骨髄腫細胞、骨髄腫前駆細胞、及び他の腫瘍細胞を特異的に認識するため、腫瘍等の治療又は予防に有用である。腫瘍の種類は特に制限されず、固形癌及び血液癌を含む。固形癌としては、例えば、肺癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮癌、骨肉腫、軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫を挙げることができる。血液癌としては、白血病、形質細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患（例えば、多発性骨髄種）、及び悪性リンパ種を挙げることができる。一実施形態において、好ましい白血病は、リンパ性白血病である。
【０１１２】
６．医薬組成物及び治療方法
上記抗体Ａ、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はＣＡＲ−ＮＫ細胞等を含む医薬組成物、並びに、上記抗体Ａ、ＣＲＴ−Ｔ細胞、又はＣＡＲ−ＮＫ細胞等を利用した疾患の治療又は予防方法が提供される。
【０１１３】
医薬組成物中の上記抗体または細胞の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、医薬組成物中の抗体の含量は、医薬組成物全体を１００重量部として０．００１重量部〜１０重量部程度をすることができる。医薬組成物中の細胞の含有量は、例えば、１細胞／ｍＬ〜１０４細胞／ｍＬ程度とすることができる。
【０１１４】
医薬組成物の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。有効成分は抗体又は細胞であるため、好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体又は細胞を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【０１１５】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体又は細胞を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬組成物は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
【０１１６】
医薬組成物は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。また、医薬組成物は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
【０１１７】
医薬組成物の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
【０１１８】
医薬組成物を用いて治療又は予防する疾患の種類は、その治療又は予防が達成できる限り特に限定されない。具体的な対象疾患として、例えば腫瘍が挙げられる。腫瘍の種類は特に制限されず、固形癌及び血液癌を含む。固形癌としては、例えば、肺癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、胃癌、肝癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮癌、骨肉腫、軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫を挙げることができる。血液癌としては、白血病、形質細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患（例えば、多発性骨髄種）、及び悪性リンパ種を挙げることができる。一実施形態において、好ましい白血病は、リンパ性白血病である。一実施形態において好ましい疾患は形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患である。「形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患」とは、異常な形質細胞の腫瘍性増殖とそれらより分泌される異常タンパク質の増加によって特徴づけられる疾患である。このような疾患として、例えば多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、形質細胞腫、H鎖病、全身性AL型アミロイドーシスなどを挙げることができる。一実施形態において、好適な対象疾患は、多発性骨髄腫である。
【０１１９】
医薬組成物の投与対象（被験体）は、例えば、上記疾患に罹患した動物または罹患する可能性がある動物である。「罹患する可能性がある」とは、例えば、後述する診断方法にて決定することができる。動物とは、例えば哺乳類動物であい、好ましくはヒトである。
【０１２０】
医薬組成物の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。医薬組成物の投与量は、例えば、有効成分が抗体である場合、一日当たりで、1μg/kg（体重）〜10g/kg（体重）程度とすることができる。また、有効成分が細胞(VI)の場合、104細胞／kg（体重）〜109細胞/kg（体重）程度とすることができる。医薬組成物の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の１日当たりの投与量で、１日〜１月に１回投与することできる。
【０１２１】
上述のように、上記抗体、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はＣＡＲ−ＮＫ細胞等は、上記医薬組成物を製造するために使用することができる。
【０１２２】
７．スクリーニング方法
腫瘍の治療用または予防用の医薬組成物の有効成分のスクリーニング方法が提供される。この方法は、化合物ライブラリー（候補物質群）からCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域に特異的に結合する物質を選別することを含む。尚、腫瘍の種類は、上記医薬組成物について説明した通りである。
【０１２３】
化合物ライブラリーとは特に限定はされず、既存のライブラリーを用いることができる。好ましくは抗体ライブラリーであり、所望の抗原によって免疫付与された動物から得られるＢ細胞などの抗体産生細胞を用いて作製したハイブリドーマをライブラリーとすることが好ましい。所望の抗原とは特に限定されず、例えばCD98hc又はその断片（CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域を含む断片）であることが好ましい。
【０１２４】
CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域に特異的に結合する物質を選別する方法は任意であり特に限定されない。例えば、CD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域を発現している細胞と当該領域を発現していない細胞の二種類の細胞を用意する。これら二種類の細胞は、当該領域の発現の有無を除いて同一である。次いで、各細胞に標識（例えば、蛍光標識）した被検物質を与え、細胞と被検物質との結合の有無をフローサイトメトリーを用いて測定する。当該領域を発現する細胞にのみ結合する物質は、当該領域に対して特異的な親和性を有し、そうでない抗体は当該領域に対して特異的親和性がないか低い抗体である。フローサイトメトリーで検出する蛍光シグナルの強弱により、抗体の当該領域に対する親和性の程度を測定することができる。
【０１２５】
フローサイトメトリーを用いる方法の他、免疫学的測定法を用いて、親和性を測定することもできる。この場合、精製した当該領域をマイクロタイタープレートにコートし、各ウェルに被検物質を添加し、反応させる。次いで、当該物質を認識することができ、且つ、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、又はビオチン等で標識した抗体を添加し、当該物質と反応させる。その後、当該抗体の標識を指標として、被検物質と当該領域との親和性を測定することができる。
【０１２６】
これらの方法によりCD98hc上のN型糖鎖の存在によって影響を受ける領域に対する親和性を測定することができる限り被検物質は特に制限されないが、好ましくは抗体である。
【０１２７】
スクリーニング方法は細胞障害活性を有する物質を選別する工程を含んでいてもよい。細胞傷害活性を有する物質の選別は任意であり、特に制限されない。例えば、候補物質が抗体である場合は、上述のADCC活性の測定方法及び／又はCDC活性の測定方法を用いて行うことができる。
【０１２８】
８．診断方法
腫瘍に罹患しているか否かを診断する方法が提供される。この方法は、被験者から採取したサンプルに上述の抗体を接触させることを含む。尚、腫瘍の種類は、上記医薬組成物について説明した通りである。
【０１２９】
上記抗体は、ヒトCD98hcのN型糖鎖付着部位を含み、N型糖鎖修飾の阻害によって露出するエピトープに特異的に結合することにより、骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞、及び他の腫瘍細胞を特異的に認識する。よって、当該抗体を、腫瘍性形質細胞を含むサンプルに作用させ、当該エピトープに相当する領域を発現する細胞と結合した抗体を検出することにより、試料中の腫瘍性形質細胞を同定することができる。
【０１３０】
サンプルは、癌患者から採取した腫瘍性形質細胞を含む生体試料（例えば、骨髄、血液、腫瘤）が好ましく、より好ましくは体液、更に好ましくは血液である。検出を容易にするため、抗体は、標識（例えば、蛍光色素又は放射性同位元素等）されていることが好ましい。骨髄腫形質細胞の同定は、上記抗体のみを用いて行ってもよく、他の抗体（例えば、抗ヒトCD38モノクローナル抗体又は抗CD48モノクローナル抗体）と組み合わせて行ってもよい。例えば、骨髄腫患者の骨髄から採取した試料を蛍光標識したこれらの抗体で共染色し、フローサイトメトリーにて試料中の細胞を分離することによって、容易に骨髄腫細胞集団を同定することができる。
【０１３１】
このようにしてサンプル中に骨髄腫前駆細胞及び／又は骨髄腫形質細胞が検出された場合に、被験者は癌に罹患している（又は罹患している可能性が高い）と診断することができる。
【０１３２】
９．キット
上記抗体を含む種々の目的に応じたキットが提供される。例えば、キットは、腫瘍の治療又は予防用キット、或いは癌に罹患しているか診断するためのキットであり得る。尚、腫瘍の種類は、上記医薬組成物について説明した通りである。
【０１３３】
キットは、上記抗体のみを含んでもよいが、その用途に応じて他の成分（例えば、他の抗体、緩衝液、蛍光色素等）、器具、及びマニュアル等を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１３４】
以下、実施例を参照して説明するが本書に開示される発明はこれらに限定されない。【０１３５】
１．フローサイトメトリー及びソーティング
以下の試験において、細胞の選別のために用いたフローサイトメトリーは次の要領で行った。インフォームドコンセントを得た骨髄腫患者の腸骨から採取した骨髄単核球をACK液(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3)に浮遊し、３分間、４℃で静置することにより、赤血球を除去した。2%胎児ウシ血清を添加したPBS(Phosphate-buffered saline)で洗浄したのち、非特異的な抗体の結合を防ぐため、10%ヒトAB型血清を含んだPBS中で、20分間、４℃でブロッキングを行った。その後、蛍光色素でラベルされた各抗体（下記参照）を加え、３０分間、４℃で染色を行い、PBSで洗浄したのち、1μg/ml propidium iodide (PI)を含んだPBS中に浮遊し、フローサイトメトリー解析に供した。解析およびセルソーティングはFACS Aria セルソーター(Becton Dickinson Immunocytometry System社製)を用いて行った。細胞の染色には、次のモノクローナル抗体を適宜選択して使用した。
・APC-conjugated anti-CD34 antibody (BD Pharmingen社製) ・Cy7-PE-conjugated anti-CD34 antibody (BD Pharmingen社製)・Cy7-APC-conjugated anti-CD19 antibody (Biolegend社製)・FITC-conjugated anti-CD38 antibody (eBioscoiences社製)・APC-conjugated anti-CD138 antibody (Biolegend社製)・Cy7-PE-conjugated anti-CD3 antibody (Biolegend社製)・FITC-conjugated anti-CD14 antibody (BD Pharmingen社製)・Cy7-PE conjugated human CD45 antibody (Biolegend社製)【０１３６】
２．骨髄腫細胞株に結合し健常人末梢血に結合しないモノクローナル抗体ライブラリーの作製
多発性骨髄腫に対する抗体治療においては、骨髄腫細胞には結合するが正常血液細胞には結合しない抗体を用いることが望ましい。そこで、以下の方法により多発性骨髄腫の治療の有用な抗体を同定した。【０１３７】
まず、以下の手法を用いて、様々な骨髄腫細胞株に結合するモノクローナル抗体を１万クローン以上作製した。６種類のヒト骨髄腫細胞株（MM1s, RPMI8226, INA6, U266, OPM2, KMS121BM）を抗原として、Balb/cマウスのfootpadに週２回、２−３週間免疫した。その後、膝下リンパ節を取り出して、細胞浮遊液を作製し、SP2/0マウスミエローマ細胞株と細胞融合させた。細胞融合はポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）を用いて行った。その後ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）で細胞を培養することにより、ハイブリドーマを選択した。最後に、ハイブリドーマの培養上清を用いて、免疫に用いた骨髄腫細胞株に結合し、健常人末梢血由来単核球には結合しない抗体を含む上清をフローサイトメトリーを用いて選択した。その結果得られた骨髄腫細胞特異的抗体の候補は約200クローンであり、それらを増殖させ、凍結保存した。【０１３８】
３．ヒト多発性骨髄腫患者骨髄において骨髄腫細胞特異的に結合する抗体R8H283の同定  上記２．で得られた約２００クローンの候補抗体を用いて、骨髄腫患者由来骨髄細胞を染色し、FACSを用いて解析した。多発性骨髄腫患者由来の骨髄細胞に各候補抗体を加えて４℃で３０分間インキュベートしたのち洗浄し、二次抗体としてPE-conjugated 抗mouse IgG-PE を加えてさらに３０分４℃でインキュベートした。洗浄の後、最後に、APC-conjugated anti-CD138 antibody (Biolegend社製)、FITC-conjugated anti-CD38 antibody (Biolegend社製)、Cy7-PE-conjugated anti-CD45 antibody (Biolegend社製)を用いて染色した。Isotype controlとして、候補抗体の代わりに、mouse IgGを加えたサンプルを同時に用意した。それらをフローサイトメトリーを用いて解析することにより、CD45-CD38++CD138+骨髄腫形質細胞およびCD45-CD38++CD138-骨髄腫前駆細胞には結合するが、CD45+血液細胞には結合しない抗体を選択した。その結果、これらの条件を満たす抗体としてR8H283抗体が同定された（図１及び２）。各ヒストグラムについて、Y軸は、細胞数を示し、X軸はR8H283抗体の結合強度を示す。さらに多数の症例で検討を行い、多くの症例において、R8H283抗体のCD45-CD38++CD138+骨髄腫形質細胞およびCD45-CD38++CD138-骨髄腫前駆細胞への結合が確認された。一方、CD45+血液細胞にはほとんど結合しないことが明らかとなった。【０１３９】
４．R8H283抗体が結合する抗原タンパクの同定
R8H283抗体が結合する抗原タンパクの同定は発現クローニング法によって行った。まず、R8H283抗体が結合することがわかっているRPMI8226細胞から、superscript choice system for cDNA synthesis (Invitrogen社)を用いてcDNAライブラリーを作製し、BstXIアダプター（Invitrogen社）を用いて、pMXsレトロウィルスベクター（東京大学医科学研究所  北村  俊雄先生より分与）に挿入した。このようにして作製されたcDNA libraryをplat-E細胞（北村  俊雄先生より分与）に導入することにより得たレトロウィルスをBaF３細胞に感染させることによりRPMI8226由来のcDNAライブラリーを発現するBaF3細胞を得た。次に、これらの細胞をR8H283抗体で染色し、陽性細胞をFACS-sortingで濃縮する操作を繰り返した。（図３）３回目のsorting後にはほとんどの細胞がR8H283に結合する細胞となった。そこで、それらの細胞が持つレトロウィルスのインサートを、PCRにて増幅した後、シークエンシングすることにより同定した結果、CD98hcが抗原タンパクであることが明らかになった。【０１４０】
５． R8H283抗体の結合抗原がCD98hcタンパクであることの確認
次の手順でCrispa-Cas9システムを用いてCD98hc欠損U266骨髄腫細胞株を作製し、R8H283抗体の抗原タンパク質がCD98hcであることを確認した。まず、PX330(adgene社)ベクターにCD98hc特異的な標的配列の二本鎖DNA配列を挿入してベクターを作製した。それを薬剤選択のためのベクターであるlinear hygromycin-resistance genen expression vector (Clontech社)とともに、NucleofectorII (Lonza社)を用いてU266細胞に導入した。その後、Hygromycin添加培地中で増えてきたクローンについてCD98hcの発現をMEM-108抗体（抗CD98抗体、Biolegend社）を用いて染色してFACSにて解析することにより、CD98hc欠損細胞（U266CD98hcKO）を同定した。次にそのCD98hc欠損細胞をR8H283抗体を用いて染色し、FACSにて解析したところ、野生型のU266細胞にはR8H283抗体が結合するのに対して、CD98hc欠損株ではR8H283抗体の結合が完全に消失していた（図４）。これはR8H283はCD98hcタンパクのみに結合することを示すため、CD98hcタンパクがR8H283抗体の抗原であることが確認された。【０１４１】
６．健常人の末梢血及び骨髄の各細胞分画におけるR8H283抗体の結合パターンの測定
市販されている抗CD98抗体（MEM-108, Biolegend社）及びR8H283抗体を用いて、健常人の末梢血および骨髄細胞における様々な細胞分画への結合を測定した。健常人由来の末梢血細胞からHES40をもちいて赤血球を除いた後、Fc receptor blocking reagent (Miltenyi社)を加えて非特異的な抗体の結合をblockingし、その後、R8H283抗体、MEM-108抗体、又はマウスIgG2aアイソタイプコントロールを加えて４℃で３０分間インキュベートした。洗浄した後、二次抗体としてPE-conjugated 抗mouse IgG-PE を加えてさらに３０分４℃でインキュベートした。洗浄の後、最後に、Cy7-APC-conjugated anti-CD19 antibody (Biolegend社製)、FITC-conjugated anti-CD14 antibody (Biolegend社製)、及びCy7-PE-conjugated anti-CD3 antibody (Biolegend社製)を用いて染色した。それらをフローサイトメトリーを用いて解析することにより各分画におけるR8H283抗体及びMEM-108抗体の結合を測定した（図５A）。また、末梢血1μlをEDTA-PBS100μlに加えたものを、同様にR8H283抗体あるいはMEM-108抗体を用いて染色し、最後にPacific blue-conjugated anti-CD235 antibody (BD paharmingen社)を用いて染色することにより、CD235陽性の赤血球への各抗体の有無も検討した（図５A）。【０１４２】
健常人由来の骨髄細胞を末梢血細胞と同様にR8H283抗体あるいはMEM-108抗体を用いて染色し、最後にAPC-conjugated anti-CD34 antibody (BD Pharmingen社製)、Cy7-APC-conjugated anti-CD19 antibody (BD pahrmingen社製)、Cy7-PE-conjugated anti-CD38 antibody (eBioscoiences社製)、Alexa647-conjugatged anti-CD3 antibody (BD pharmingen社製)、及びFITC-conjugated anti-CD14 antibody (ebiosciences社製)を用いて染色した。それらをフローサイトメトリーを用いて解析することにより、各分画におけるR8H283抗体、及びMEM-108抗体の結合を測定した（図５B）。これらの結果はMEM-108抗体が赤血球を除く全ての血液細胞に結合するのに対して、R8H283は形質細胞及びB細胞のごく一部を除けば正常血球細胞には結合しないことを示している。【０１４３】
さらに、様々な濃度のR8H283あるいはMEM-108抗体を用いて、健常人末梢血B細胞あるいはT細胞を染色しFACSにて各抗体の結合を測定したところ、MEM-108抗体では濃度依存的に抗体の結合量を表す蛍光強度が上昇するのに対して、R8H283抗体は抗体濃度を50μg/mlまであげても、健常者由来のリンパ球への結合は見られなかった（図６）。このことより、リンパ球にはCD98hcタンパクは存在するが、R8H283抗体は正常なリンパ球に結合しないことがわかる。【０１４４】
CD98タンパクは血液系以外の他の臓器においても発現していることが知られている。血液系以外の正常細胞でFACS解析が可能な細胞として、正常血管内皮細胞であるHUVEC細胞に対するR8H283抗体、MEM-108抗体の結合を解析した。その結果、MEM-108はHUVECに結合するが、R8H283はほとんど結合しないことが明らかとなった（図７）【０１４５】
上記と同様にして、R8H283抗体の骨髄腫以外のがん細胞株への結合を解析した。その結果、図８に示される通り、R8H283抗体は、Ｔ細胞性白血病/リンパ腫細胞株であるJurkat細胞及びMolt4細胞、Ｂ細胞性白血病/リンパ腫細胞株であるRaji細胞及びDaudi細胞、肺がん細胞株であるA549細胞、大腸がん細胞株であるDLD-1細胞、卵巣がん細胞株であるTYK-nu-CPr細胞、乳がん細胞株であるMCF-7細胞、及び脳腫瘍細胞株であるT98G細胞のいずれの細胞にもR8H283抗体が結合することが明らかになった。以上の結果から、R8H283抗体は、正常な細胞には結合しないが、がん細胞全般に特異的に結合することが示唆された。がん細胞では、CD98hc上に特異的な構造変化が生じており、R8H283抗体は、その変化した構造を特異的に認識していると考えられる。【０１４６】
７．健常人末梢血細胞に対する結合能の他の抗体との比較
R8H283抗体の健常人末梢血に対する結合を、他の多発性骨髄腫の治療に有効であることが報告されている抗体それらの細胞に対する結合と比較した。一次抗体に抗CS1抗体（Biolegend社）、抗CD38抗体（Biolegend社）、及び抗BST2抗体（Biolgend社）を用いた以外は上記と同様の方法で染色し、FACS解析を行った（図９）。その結果、R8H283抗体は正常なT細胞には全く結合しないのに対して、抗CS1抗体は一部の正常なT細胞への結合が確認された。抗CD38抗体は、R8H283抗体と比較して全ての正常末梢血細胞に有意に結合することが確認された。抗BST2抗体は、R8H283抗体と比較して、正常なT細胞及び単球に有意に結合することが確認された。これらの結果はR8H283がより骨髄腫細胞を含むがん細胞に対する高い特異性を有する抗体であることを示している。【０１４７】
８．R8H283の結合とCD98hcタンパクの糖鎖修飾の関連の解析
骨髄腫細胞株RPMI8226および骨髄性白血病細胞株U937に対するR8H283抗体およびMEM-108抗体の結合をFACSを用いて解析した。染色の方法は上記試験６の末梢血等の場合と同じである。その結果、MEM-108抗体はほぼ全ての細胞株に結合する一方、R8H283抗体は同じCD98hcタンパクを抗原とするにもかかわらず、結合する細胞株としない細胞株が存在することが確認された。たとえば、骨髄腫細胞株であるRPMI8226にはどちらの抗体もよく結合するが、骨髄性白血病細胞株であるU937にはMEM-108抗体はよく結合するが、R8H283抗体はほとんど結合しない（図１０A）。様々な濃度のR8H283あるいはMEM-108抗体を用いて、RPMI8226細胞あるいはU937細胞を染色しFACSにて各抗体の結合を測定したところ、RPMI8226ではMEM-108抗体、及びR8H283抗体共に濃度依存的に抗体の結合量を表す蛍光強度が上昇するのに対して、U937細胞ではR8H283抗体の抗体濃度を50μg/mlまであげても、R8H283の結合はほとんど見られなかった。（図１０B）。【０１４８】
骨髄腫細胞株と白血病細胞株に発現するCD98hcの翻訳後修飾の違いがこのような違いの原因となっていると予想された。CD98hcは非常に高度にN型糖鎖修飾を受けるタンパクであり、糖鎖修飾に差がある可能性がある。そこで、R8H283抗体が結合しないU937細胞あるいはTHP1細胞の培養液中にN型糖鎖合成阻害剤であるツニカマイシン（2.5mg/ml）を２４時間加えたのち、R8H283抗体あるいはMEM-108抗体の結合をFACSにて解析した。各抗体による染色は以下のような方法で行った。1X105個の細胞をPBS＋２％ウシ胎児血清  50μlに浮遊させ、FC blocking reagent (ミルテニ―社  ＃130-059-901)を1μl添加した。次に、R8H283もしくはMEM-108を最終濃度が50μg/ml, 2.5μg/mlとなるように添加し、氷上で30分静置した。また、同じようにして用意した別の細胞浮遊液に、それぞれに対するisotype control抗体も同様の濃度になるように添加した。PBS＋２％ウシ胎児血清で細胞を2回洗浄した後、PBS＋２％ウシ胎児血清中に1μg/mlに希釈したPhycoerythin(PE)-conjugated Goat anti-mouse IgG抗体50μl中に細胞を再浮遊し、さらに30分静置した。その後、PBS＋２％ウシ胎児血清で細胞を2回洗浄した後、1μg/mlのPropidium Iodide（ＰＩ）を添加したPBS＋２％ウシ胎児血清に再浮遊し、FACS Canto II(Beckton Dickinson社)を用いて解析した。その際に、PI陽性の死細胞は解析から除き、生細胞に結合する抗体の量をPEの蛍光量強度の平均値（Mean fluorescent intensity (MFI)）  として定量化した。その結果、R8H283抗体の結合量を示すMFIの値（isotype control（mouse IgG2a isotype control (Biolegend社  #401502)）の値で割った補正値）が、ツニカマイシン処理前：U937細胞 1.5、  THP-1細胞 2.6、処理後：U937細胞 3.0、  THP-1細胞 17.1と、ツニカマイシン処理後に R8H283抗体の結合の増加（MFIでU937:2.0倍、THP-1 6.6倍） が見られた。一方、MEM-108抗体の結合量を示すMFIの値（isotype control（mouse IgG1 isotype control (Biolegend社  #400102)）の値で割った補正値）がはそれぞれ処理前：U937細胞 11.8、THP-1細胞 29.4、処理後： U937細胞 8.3、THP-1細胞 29.1であり、結合するR8H283の量の増加は見られなかった（図１１Ａ）。これは明らかに、N型糖鎖修飾の違いがR8H283抗体の結合量を決定していることを示している。【０１４９】
ツニカマイシンはN型糖鎖合成阻害剤であるが、それにより強い小胞体ストレスを惹き起こすため、小胞体ストレスを惹起するための薬剤として用いられている。また、骨髄腫細胞においては、非常に大量のタンパク合成が常に行われているため、小胞体ストレスが常時かかった状態にある。そこで、小胞体ストレス下では、CD98hcの糖鎖修飾に変化が起こり、R8H283抗体がCD98hcに結合できるようになるのではないかと考え、ツニカマイシンとは異なり直接的には糖鎖修飾を阻害しない小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギン(1nM)でU937細胞あるいはTHP1細胞を処理したのち、R8H283抗体あるいはMEM-108抗体の結合をFACSにて解析した。その結果、タプシガルギン処理によって、R8H283抗体の結合が見られるようになることがわかった（図１１B）。また、タプシガルギンで処理した細胞と無処理の細胞におけるCD98hcの分子量をウェスタンブロッティングにより検討したところ、タプシガルギンによる小胞体ストレス下においても、分子量の小さい、すなわち糖鎖修飾の不全なCD98ｈｃが発現していることが明らかとなった（図１２）。【０１５０】
プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブも骨髄腫細胞に強い小胞体ストレスを惹き起こす。そこで次に、R8H283の結合が比較的弱い骨髄腫細胞株であるMM1sをボルテゾミブ（10nM）で処理したのち、無処理の細胞とR8H283の結合を比較したところ、ボルテゾミブ処理により、R8H283の結合が明らかに上昇した（図１３A）。同様の検討を骨髄腫患者由来骨髄細胞で行ったところ、骨髄腫細胞ではMEM-108の結合量の変化はないにもかかわらず、R8H283の結合が増加したが、ボルテゾミブによる小胞体ストレスの増加が起こらないTリンパ球ではそのような変化は見られなかった(図１３B)。これらの結果は、骨髄腫細胞で一般に見られる高い小胞体ストレスによる糖鎖修飾の変化がR8H283抗体の結合エピトープの出現に関連していることを示唆する。【０１５１】
９．エピトープの同定
R8H283が認識しているエピトープを同定するために、オーバーラッピングPCR法を用いて、各種のヒト/マウスキメラCD98hcタンパク発現ベクターを以下のように作製した。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
EcoRIhCD98F, CCGGAATTCCCACCATGAGCCAGGACACCGAGGTGGATATGA（配列番号25）BamHIhCD98R, AAAGGATCCTCATCAGGCCGCGTAGGGGAAGCGGAGCAGCAGCC（配列番号26）EcoRImCD98F, CCGGAATTCCCACCATGAGCCAGGACACCGAAGTGGACATGAAA（配列番号27）BamHImCD98R, CGCGGATCCTCATCAGGCCACAAAGGGGAACTGTA（配列番号28）cCD98-203F, TCATTCTGGACCTTACTCCCAACTACC（配列番号29）cCD98-203R, GGTAGTTGGGAGTAAGGTCCAGAATGA（配列番号30）cCD98-365F, TTCCGGCGGCTGAGTGAC（配列番号31）
cCD98-365R, GTCACTCAGCCGCCGGAA（配列番号32）
cCD98-427F, AGCTACGGGGATGAGATTGGCCT（配列番号33）cCD98-427R, AGGCCAATCTCATCCCCGTAGCT（配列番号34）cCD98-370F, TTGGCCTGGATGCAGCTGCCCTTCCTGGACAGC（配列番号35）cCD98-370R, GCTGTCCAGGAAGGGCAGCTGCATCCAGGCCAA（配列番号36）cCD98-376F, TGCCCTTCCTGGACAGCC（配列番号37）
cCD98-376R, GGCTGTCCAGGAAGGGCA（配列番号38）
cCD98-402F, CCAGCTTCCCTGACATCCCAGGGGCTGTAA（配列番号39）cCD98-402R, TTACAGCCCCTGGGATGTCAGGGAAGCTGG（配列番号40）cCD98-409F, CTGTAAGTGCCAACATGACTGTGAAG（配列番号41）cCD98-409R, CTTCACAGTCATGTTGGCACTTACAG（配列番号42）【０１５２】
ヒトあるいはマウスCD98hc cDNAを挿入したMSCV-ires-GFPベクターを鋳型として用いて、PCRを行った。PCRはprime star (タカラバイオ社)、KODfx(東洋紡社)、Accuprime taq (インビトロジェン社)をもちいて行った。キメラcDNA（図１４）は次のように作製した。まず、cDNA1を鋳型として、F primer1, R primer1を用いて、それとは別にcDNA２を鋳型として、F primer２, R primer２を用いて、上記のいずれかのPCR酵素を用いて２５サイクルのPCRを行った。PCR産物を１％アガロースゲルで電気泳動したのち、qia-quick gel extraction kitにて精製した。各PCR productを2.5μlを水5μl加え、94℃15秒、55℃30秒、68℃２分を３サイクル行った後、99℃５分間インキュベートしたもの１μlを鋳型として、F primer1とR primer2を用いて、overlapping PCRを行った。PCR産物をアガロースゲルでの電気泳動にて確認の後、TA cloning kit(インビトロジェン社)を用いてクローニングし、その配列をシークエンシングにより確認した。その後、インサートをEcoRIとBaｍHIを用いて切り出して、MSCV-ires-GFPベクターに挿入したものを発現ベクターとして用いた。プライマーと鋳型の組み合わせとそれによりできた発現ベクターの名前は下記表３の通りである。【０１５３】
【表３】
2017026497.tif 000004
【０１５４】
それぞれの発現ベクターはlipofectamine2000(インビトロジェン社)を用いてCHO細胞に導入し、２４時間にR8H283抗体およびMEM-108抗体をもちいて染色することによりGFP陽性細胞（ベクターが導入されている）における、各抗体の結合をFACSにて解析した。その染色方法は、上記３．と同じである。【０１５５】
その結果、まず、R8H283が認識する抗原が形成されるために必要なエピトープのアミノ酸配列は、ヒトCD98hcの203番目〜427番目の領域に存在することが明らかになった。更に絞り込みを進めるにより、エピトープは、ヒトCD98hcの365番目のアミノ酸から427番目のアミノ酸の間に存在することが明らかとなった。一方、MEM-108抗体が認識するエピトープは428番目からC末端までの間に存在すると考えられた（図１４）。更なる絞り込みを進めたところ、エピトープはヒトCD98hcの３６５番目〜407番目の領域（YGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVK（配列番号23））に存在することが確認された（図１５）。この中で、C末端側から5番目のNははN型糖鎖付着部位である。【０１５６】
１０．R8H283抗体の抗体分子可変部領域の塩基配列の決定
R8H283モノクローナル抗体サブクラスの確認をIsotyping kit (Roche社)を用いて行い、IgG2aサブクラスであることを確認した。さらに、ハイブリドーマR8H283が産生する抗体分子の可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。配列決定の方法は、Smarter RACE cDNA amplification kit (Clontech)社を用いて行った。すなわち、R8H283抗体を産生するハイブリドーマ由来mRNAから作製したcDNAを鋳型にして、PCR反応によりH鎖、κ鎖可変部領域のcDNA断片を増幅し、その塩基配列を解読した。解読したＨ鎖及びＬ鎖（κ鎖）の可変領域及び相補性決定領域（CDR１〜３）のアミノ酸配列及び塩基配列を下記の表４及び５に示す。【０１５７】
【表４】
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【０１５８】
【表５】
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【０１５９】
１１．R8H283モノクローナル抗体の細胞傷害活性の測定
R8H283抗体産生ハイブリドーマ培養上清からprotein G(GE healthcare社)を用いて精製したR8H283モノクローナル抗体についてin vitroでの細胞傷害活性の有無を調べた。試験は、クロミウム遊離法を用いて補体依存性細胞傷害（CDC）活性の有無を調べることにより行った。Baby rabbit complement (Cedarene)を補体として用いた。骨髄腫細胞としては、R8H283抗体が結合することがわかっているU266、OPM2、NCI-H929、及びRPMI8226を用いた。各骨髄腫細胞株を51Cr で2時間ラベルし、３回洗浄した。標識された細胞（1 x 104cells）を、96-well U-bottomed plates (1 x 104 cells) において、R8H283モノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール及び25%のbaby rabbit complementを添加したRPMI1640培地+ウシ胎児血清160μL中で培養した。U266を用いた試験では、終濃度0.1mg/ml又は1mg/mlで各抗体を用いた。OPM2、NCI-H929、及びRPMI8226を用いた試験では終濃度10μｇ／mlで各抗体を用いた。37℃、5% CO2の条件にて９０分間培養した後、上清に放出された51Crをカウントした。特異的細胞傷害活性を以下のように計算した。【０１６０】
CDC活性＝（実験に用いた細胞からの51Cr 放出− 抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出）／（１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量 -抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出）× 100【０１６１】
測定した結果を図１６Ｃ，Ｄに示す。R8H283モノクローナル抗体は、検討した全ての骨髄腫細胞株に対して明らかな補体依存性細胞傷害活性を有することが確認された。【０１６２】
さらに、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性の検討も行った。標的細胞を上記補体依存性細胞傷害活性の測定の場合と同様に51Crで標識し、エフェクター細胞としては、SCID マウスの骨髄細胞を10%のFBS、10ng/mlのマウスGM-CSF、及び40IU/mlのヒトIL2を添加したRPMI1640培地中で６日間培養したものを使用した。９６ウェルプレートにR8H283抗体又はコントロールとなるそのアイソタイプ抗体を添加し、さらに標的細胞（１．０×１０４個）及びエフェクター細胞（５×１０５個）を添加した。U266を用いた試験では、終濃度0.1mg/ml又は1mg/mlで各抗体を用いた。OPM2、NCI-H929、及びRPMI8226を用いた試験では終濃度10μｇ／mlで各抗体を用いた。３７℃で４時間反応させ、遠心分離後、上清に放出された５１Crをγ−カウンターにて測定した。ADCC活性は、以下の式に基づいて求めた。【０１６３】
ADCC活性＝（実験に用いた細胞からの51Cr 放出− 抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出）／（１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量 -  抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出）× 100  【０１６４】
測定した結果を図１６Ａ、Ｂに示す。R8H283モノクローナル抗体は、検討した全ての骨髄腫細胞株に対して明らかなADCC活性を有することが確認された。【０１６５】
これらの結果は、R8H283モノクローナル抗体及びこれと同一のエピトープを認識する抗体が多発性骨髄腫の治療の有効成分となり得ることを示す。【０１６６】
１２．抗ヒトCD98hc細胞傷害活性モノクローナル抗体によるin vivo骨髄腫細胞増殖抑制効果(皮下腫瘍モデル)
上記１１．において細胞傷害活性を有することが確認されたR8H283モノクローナル抗体を用いて、in vivoでの多発性骨髄腫に対する治療効果を調べた。SCIDマウスの皮下に骨髄腫細胞株OPM2細胞（1×107 個）を移植した。腫瘍体積が３０mm3を超えた時点で、マウスを抗CD98hc抗体投与群とコントロールIgG投与群に分け、10 mg/kg のR8H283モノクローナル抗体又はコントロールIgGを週2回投与した。腫瘍体積の計測は週2回行い、体積は以下の近似値で表現した：長径×短径×高さ／２。移植した骨髄腫細胞株OPM2が形成する腫瘤の体積が30mm3を超えた時点をday0とし、その日からの腫瘍体積の変化を図１７Ａに示す。また、day21におけるコントロール（IgG投与）マウスおよびR8H283抗体投与マウスでの腫瘍の大きさを図１７Ｂに示す。矢印は腫瘍の幅を示す。図１７A, Bに示されるように、コントロールIgGを投与した場合は、骨髄腫細胞が指数関数的に増殖しているのに対し、細胞傷害活性を有するR8H283モノクローナル抗体（R8H283）を投与した場合は、骨髄腫細胞の増殖がほぼ完全に抑制された。次に、投与量を1mg/kgあるいは0.1mg/kgに減量して、全く同じ実験を行ったところ、1mg/kgの投与でも効果は十分であることが示された。（図１７C）【０１６７】
１３．抗ヒトCD98hc細胞傷害活性モノクローナル抗体によるin vivo骨髄腫細胞増殖抑制効果(経静脈投与モデル)
より生理的環境下での骨髄腫細胞に対する効果を見るため、経静脈的に移入して骨髄内に生着した骨髄腫細胞に対する抗体投与の効果を検討した。2.4Gyの放射線照射を行ったNOD/SCIDγc-/-(NOG)マウスの静脈中に、luciferase発現ベクターを導入した骨髄腫細胞株U266細胞 5X106個を移植したのち、７日および１０日後にR8H283抗体又はコントロールIgGを腹腔内投与した。その後、抗体の効果を検討するため、Day14にマウス骨髄におけるヒト骨髄腫細胞のキメリズムを解析した。コントロールIgG抗体投与群ではいずれも、骨髄中に明らかなCD138+U266細胞の生着が見られたのに対して、R8H283抗体投与群では、10mg/kgおよび1mg/kg投与群では骨髄腫細胞は消失していた。また、驚いたことに0.01mg/kgという非常な低投与量でも骨髄中のU266細胞数が有意に減少していた（図１８A、B）。さらに、5mg/kgを投与した実験ではマウスをday14では解析せずにday40にIVISを用いて腫瘍をイメージングしたところ、コントロールIgG投与群では全身に腫瘍の広がりが観察されたが、R8H283投与群では腫瘍は検出されず治癒していると考えられた(図１８C)。これらの実験結果から、R8H283モノクローナル抗体（R8H283）及びこれと同一のエピトープを認識する抗体はCD98hcを発現する骨髄腫細胞に対し、強力な細胞傷害活性を有することが明らかとなった。【０１６８】
１４．抗ヒトCD98HC細胞傷害活性モノクローナル抗体によるin vivo骨髄腫細胞増殖抑制効果(骨髄内移植モデル)
骨髄腫細胞は多くの場合、骨髄内でのみ増殖する腫瘍であり、また骨髄微小環境から強い生存支持を受けていると考えられる。さらに生理的環境下での骨髄腫細胞に対する効果を見るため、骨髄内に直接投与することにより骨髄内に大量に生着させた骨髄腫細胞に対する抗体投与の効果を検討した。2.4Gyの放射線照射を行ったB6-Rag2-/-γc-/-sirpa(BRGS)マウスの脛骨骨髄中に、luciferase発現ベクターを導入した骨髄腫細胞株U266細胞 ４X10５個を移植したのち、７日後にIVISによりluciferaseを発現するU266細胞が生着していることを確認した。その後、day7,10, 14, 17にR8H283抗体、コントロールIgGを0.5mg/kg、又はBortezomibを1mg/kg腹腔内に投与した。抗体又はBortezomibの効果を見るためday21にIVISにてluciferaseの発現をイメージングしたところ、コントロールIgG群およびbortezomib投与群ではluciferaseを発現するU266細胞が検出されたが、R8H283抗体投与群では腫瘍は検出されなかった（図１９）。これらの実験結果から、R8H283モノクローナル抗体（R8H283）及びこれと同一のエピトープを認識する抗体はCD98hcを発現する骨髄腫細胞に対し、それが骨髄内に存在する場合でも強力な細胞傷害活性を有することが明らかとなった。【０１６９】
１５．エピトープの検討
R8H283抗体のエピトープについて、上記９．にて検討した結果を更に詳細に検討した。図２０に示す6種類のヒト/マウスキメラCD98hcタンパク質の発現用ベクターを作製し、それぞれをリポフェクション法によりCHO細胞に導入し、48時間後にR8H283抗体の結合の有無をFACSにて解析した。【０１７０】
その結果、CD98hcタンパク質の365〜376番目又は395〜409番目のアミノ酸残基からなる領域をマウス由来のアミノ酸残基に置換することによって、R8H283抗体はCD98hcタンパク質に結合しなくなることが確認された（図２０）。図２１に示すとおり、CD98hcタンパク質の365番目〜409番目のアミノ酸配残基から成る断片において、ヒト由来CD98hcとマウス由来CD98hcとで異なるアミノ酸残基は、371番目、374番目、375番目、376番目、383番目、384番目、387番目、389番目、391番目、395番目、396番目、397番目、400番目、401番目、及び404番目の１５アミノ酸残基である。よって、図２０に示す結果は、371番目、374番目、375番目、376番目、395番目、396番目、397番目、400番目、401番目、及び／又は404番目のアミノ酸残基をR8H283抗体が認識していることを示唆する。【０１７１】
そこで、ヒトCD98hcの1〜4アミノ酸残基をマウス由来のアミノ酸配列に変異させた7種類の変異体（I371L, D374/A375Q, A376G, D391N/F395I/P396F/D397H, F395I/P396F/D397H , G400R/A401P, A404L)を発現するベクターを作成し、リポフェクション法によりCHO細胞に導入した。7種類の変異型CD98hcタンパク質の発現用ベクターの作製は、Primestar mutagenesis basal kit (タカラバイオ社)を用いて行った。使用したプライマーの配列、templateに用いたDNAは以下の通りである。【０１７２】
【表６】
2017026497.tif 000007
【０１７３】
また、コントロールとしてヒトCD98hc及びマウスCD98hcも同様にCHO細胞に発現させた。そして、これらの細胞に対するR8H283抗体の結合の有無をFACSにて解析した。その結果、図２２に示すように、R8H283抗体は、D391N/F395I/P396F/D397H, F395I/P396F/D397H , G400R/A401P には結合しないこと（即ち、フローサイトメトリーでの蛍光強度の測定においてアイソタイプコントロール（マウス由来CD98hc）で得られる蛍光強度（Mean fluorescent intensity(MFI)）との比が1.05未満）が示された。これらの結果は、R8H283抗体のCD98への結合には、395-7番目のアミノ酸および401,402番目のアミノ酸が必須であることを示す。また、D374/A375Qの変異体でも著明なR8H283の減弱が見られたことより、374,375番目のアミノ酸もR8H283の結合に寄与していることが示された。
【図１】
2017026497.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
2017026497000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月19日(2016.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
ヒトＣＤ９８ｈｃの３９５番目〜３９７番目のアミノ酸残基をマウス由来ＣＤ９８ｈｃアミノ酸残基に置換した変異型ＣＤ９８ｈｃに対する親和性が、マウス由来ＣＤ９８ｈｃに対する親和性と同等である、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体。
【請求項３】
ヒトＣＤ９８ｈｃの４００番目及び４０１番目のアミノ酸残基をマウス由来ＣＤ９８ｈｃアミノ酸残基に置換した変異型ＣＤ９８ｈｃに対する親和性が、マウス由来ＣＤ９８ｈｃに対する親和性と同等である、抗ＣＤ９８ｈｃ抗体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項２又は３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を含む、請求項２〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、またはこれらの組み合わせである、請求項２〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項２〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項２〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
イムノグロブリン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又はこれらの組み合わせである、請求項２〜５、７及び８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
細胞傷害活性を有する物質、酵素、タグ、又は免疫モジュレーターが結合している、請求項２〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項２〜１０のいずれかに記載の抗体のエピトープと同一のエピトープを有する、キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
請求項２〜１０のいずれかに記載の抗体又は請求項１２に記載のキメラ抗原受容体を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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