(57)【要約】細胞培養容器は、収容容器、細胞培養領域、培養液供給部、及び排出部を備えている。細胞培養領域は、細胞を培養するための領域であり、収容容器内に設けられている。培養液供給部は、培養液を所定流量以下の流量で前記細胞培養領域内に供給する。排出部は、細胞培養領域内の液を前記収容容器外へ排出する。整流部は、培養液供給部から排出部に向かう培養液の流れ方向に垂直な方向に複数の流出口が均等に配置されたものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を収容する収容容器と、
細胞を培養するために前記収容容器内に設けられた細胞培養領域と、
前記細胞培養領域に所定流量以下の流量で培養液を供給する培養液供給部と、
前記細胞培養領域内の培養液を前記収容容器外へ排出する排出部と、
前記培養液供給部から前記排出部に向かう前記培養液の流れ方向に垂直な方向に複数の流出口が均等に配置された整流部と、
を備えた細胞培養容器。
【請求項２】
前記排出部は、前記収容容器内の液を前記収容容器外へ排出する排出口、及び前記細胞培養領域の細胞培養部上面の高さよりも高く設けられた堰を有し、前記堰を越えた液のみを前記排出口へ導くように構成されている請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記培養液供給部は、前記収容容器よりも上方に培養液を貯留する培養液リザーバを有し、前記培養液リザーバに貯留された培養液を前記培養液リザーバ内の培養液の自重によって供給するものである請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記培養液供給部は、送液ポンプを用いて前記収容容器内に培養液を供給するものである請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記堰は、上端の平面形状が前記細胞培養領域側へ向かって凸形状に湾曲した部分を有する請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記堰の平面形状は円環形状であり、その内側に前記排出口が設けられている請求項５に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記排出口は下方へ伸びた排出流路の上端であり、
前記排出流路は内径が２ｍｍ以下で内面が親水性の毛細管部を有し、当該毛細管部が前記排出部に通じている請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記収容容器の下方に前記排出流路を通じて前記収容容器外へ排出された液を受ける廃液リザーバが設けられており、
前記排出流路は前記収容容器内から鉛直下方へ延びて前記廃液リザーバに廃液を滴下するものであり、前記毛細管部の内径は下方へいくにしたがって大きくなっている請求項７に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記毛細管部は、当該毛細管部の下端に形成される液面に生じるラプラス圧が当該毛細管部内の液の重力よりも小さくなるように長さ及び下端の内径が設定されている請求項８に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記排出流路は、前記毛細管部の下方に、前記毛細管部の下端の内径よりも大きい内径を有し、下方が開口した膨大部が設けられている請求項７から９のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記堰の上端部断面は上方へ向かって収束する鋭角形状を有する請求項２から１０のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記整流部は、前記細胞培養領域の前記培養液供給部側から前記排出部側へ向かう溶媒流れ方向に平行な複数の流路が、水平面内において前記溶媒流れ方向と直交する方向に均等に配列された整流路を備えている請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記整流路を構成する各流路は、表層側の液を堰き止め、深層側の液を通過させるように構成されている請求項１２に記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するためのウェルを内部に備え、そのウェルを培養液内に浸漬させて細胞集塊を培養する細胞培養容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞集塊を培養するためのマイクロウェル（以下、単にウェルと称する。）がプレート内に形成された細胞培養プレートが提案され、実施されている。細胞培養プレートとしては、１穴のプレートのほか、６穴、２４穴など複数のウェルを有するマルチウェルプレートがある（例えば、特許文献１、特許文献２参照。）。また，円形のウェル以外にも四角形や、ウェル間が連絡しているもの、ウェルの底に貫通穴が開いたものなど、形状や大きさのことなる様々なウェルを持つ細胞培養プレートが存在する。【０００３】
このような細胞培養プレートを用いて細胞集塊の培養を行なう場合、細胞培養プレートは細胞を培養するための培養液を貯留する容器（収容容器）の底部に設置され、各ウェルに細胞が播種される。各ウェルに播種された細胞はマイクロウェル内に沈降し、各ウェルにおいて集塊を形成する。大きさの均一な複数のウェルが設けられている細胞培養プレートを用いることで、大きさが均一な細胞集塊を効率よく作製することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−０２２２７５号公報
【特許文献２】特開２０１４−１４７３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養プレートで細胞集塊を培養する場合、収容容器内の培養液を交換する作業を行なう必要がある。培養液の交換は、まず収容容器内の培養液について収容容器を傾けたりノズルで吸入したりして廃棄した後、新しい培養液を収容容器内に注入するという作業が手作業で行なわれることが一般的である。【０００６】
しかし、培養液の注入時に培養液の流れによって細胞集塊がくずれてしまったり、ウェルから出てしまったりするといった問題があることから、培養液を一定かつ遅い流速で収容容器に注入する必要がある。さらに、培養液の廃棄時には細胞集塊が古い培養液とともにウェルから取り除かれてしまうといった問題がある。そのため、培養液の交換作業はゆっくりと慎重に行なう必要があり、培養液の交換作業にかかる時間が長く、同時に多数の細胞培養プレートで大量の細胞集塊を培養することが困難であるという問題があった。【０００７】
そこで、本発明は、培養液の交換を容易に行なうことができるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る細胞培養容器は、収容容器、細胞培養領域、培養液供給部、排出部及び整流部を備えている。収容容器は培養液を収容する。細胞培養領域は、細胞を培養するための収容容器内に設けられた領域である。培養液供給部は、所定流量以下の流量で前記細胞培養領域に培養液を供給する。排出部は、培養領域内の培養液を収容容器外へ排出する。整流部は、前記培養液供給部から前記排出部に向かう前記培養液の流れ方向に垂直な方向に複数の流出口が均等に配置されている。【０００９】
前記培養容器は、日本薬局方に定める気密容器であってもよい。すなわち、通常の取扱い、移送、保存時に、固体・液体が浸入せず、内容物の流出を防ぐ容器であって、培養のための通気を確保した容器である。そうすれば、培養時にはより容易に安全な培養環境を維持でき、培地の交換時の初期のみ気密容器を開け、廃棄培地を除去し新鮮培地を添加することができる。【００１０】
さらに必要に応じ、日本薬局方に定める密封容器としても良い。密封容器内で培地交換を行なう場合、培養液供給部や排出部の液量変化によって圧力に不均衡が生じないよう連通路の作成や、密閉容器を開け気体を流入させるなどの処置を行なうとなおよい。【００１１】
ここで、培養液供給部の培養液供給流量である「所定流量」とは、細胞培養領域に保持されている細胞が培養液の流れによって巻き上げられたり流されたりせず、かつ細胞培養領域内に層流を発生させるような流量である。そのような流量とは、例えば２ｍＬ／ｍｉｎ以下の流量である。【００１２】
前記排出部は、前記収容容器内の液を前記収容容器外へ排出する排出口、及び前記細胞培養領域の細胞培養部上面の高さよりも高く設けられた堰を有し、前記堰を越えた液のみを前記排出口へ導くように構成されていることが好ましい。そうすれば、培養液供給部内の培養液の液面高さが細胞培養部上面の高さよりも高く維持されながら、培養液供給部によって細胞培養領域に供給された新たな培養液により押し流された古い培養液が、排出口から収容容器外へ自動的に廃棄される。これらの作用により、収容容器内の培養液の交換作業が容易になり、細胞培養領域において保持されている細胞がウェルから出てしまったり古い培養液とともに廃棄されてしまったりすることを防止することができる。【００１３】
前記培養液供給部は、前記収容容器よりも上方に培養液を貯留する培養液リザーバを有し、その培養液リザーバに貯留された培養液を培養液リザーバ内の培養液の自重によって供給するものであってもよい。そうすれば、細胞培養容器の構成を簡単にすることができる。そして、培養液リザーバに培養液を入れておくだけで、培養液リザーバ内の培養液の自重によって収容容器内に所定流量以下の流量で培養液が自動的に供給されるため、培養液の交換作業が容易になる。【００１４】
ところで、培養液が堰を乗り越える際、培養液の表面張力によって培養液が堰の上端において盛り上がり、培養液の液面高さが堰の高さよりも高くなる。これは、培養液が堰の上端で盛り上がったときに、培養液の液面を挟んでラプラス圧と呼ばれる圧力差が生じるからであり、そのラプラス圧が培養液の質量を支えきれなくなったときに、堰が決壊して培養液が堰を乗り越えることとなる。【００１５】
培養液に生じるラプラス圧ΔＰの大きさは、式（１）に示されているように、表面張力とその点における液面の面曲率の積で表される。面曲率とは、曲面を直交する２方向に切ったときの切り口の曲率の和である。式（１）において、γは表面張力であり、液体に固有の変数である。１／Ｒ1は液面を垂直方向に切ったときの切り口の曲率、１／Ｒ2は液面を水平方向に切ったときの切り口の曲率である。
ΔＰ＝γ（１／Ｒ1＋１／Ｒ2）                        （１）【００１６】
上記式（１）から、堰の平面形状によってラプラス圧ΔＰの大きさが変わることがわかる。例えば、堰が板状で平面形状が直線である場合には、堰状に盛り上がった培養液を水平方向に切ったときの液面の切り口も直線形状であるから、１／Ｒ2は常に０である。したがって、ラプラス圧ΔＰは、
ΔＰ＝γ（１／Ｒ1＋０）                            （２）
となる。液面が上昇し、重力による水圧が大きくなると、それに釣り合うように液面の形状が変化し、曲率１／Ｒ1が大きくなる。液面が堰よりも下流側へせり出し、曲率１／Ｒ1が最大値をとったときにラプラス圧ΔＰが重力に負けてダムが決壊し、培養液が堰を乗り越える。【００１７】
また、堰の平面形状が培養液の流れ方向に逆らう方向に向かって凸形状に湾曲している場合には、１／Ｒ2は常にマイナスとなり、堰の平面形状が直線の場合に比べてラプラス圧ΔＰは小さくなる。ラプラス圧ΔＰが小さくなれば、堰上に盛り上がる培養液の液面高さも低くなり、培養液が堰を越えて排出流路に導かれやすくなる。培養液が堰を越えて排出流路に導かれやすくなれば、それだけ古い培養液が円滑に排出流路を通じて廃棄されることになり、収容容器内の培養液の置換が円滑に行われるようになる。【００１８】
以上のことから、本発明に係る細胞培養容器においては、排出部に設けられている堰は、上端の平面形状が前記細胞培養領域側へ向かって凸形状に湾曲した部分を有することが好ましい。堰の平面形状が細胞培養領域側へ向かって凸形状に湾曲した部分を有するとは、堰の平面形状に、「培養液の流れ方向に逆らう方向に向かって凸形状に湾曲している」部分が設けられていることを意味する。培養液は細胞培養領域を通過して排出部に達する。したがって、堰のうち平面形状が細胞培養領域側へ向かって凸形状に湾曲している部分では、堰の平面形状が直線の場合よりもラプラス圧ΔＰが小さくなり、培養液が堰を越えて排出流路に導かれやすくなる。これにより、収容容器内の培養液の置換が円滑に行われるようになる。【００１９】
上記の場合の好ましい態様として、前記堰の平面形状は円環形状であり、その内側に前記排出口が設けられているものが挙げられる。つまり、堰は少なくとも上端部が円管形状を有する。かかる堰を越えようとする培養液の任意の点における曲率１／Ｒ2は堰の曲率半径をＤ、その点の堰上端の開口の縁からの水平距離をｒとすると、
１／Ｒ2＝−（１／（Ｄ＋ｒ））＜０                （３）
と表すことができ、一定である。したがって、任意の点におけるラプラス圧ΔＰは、
ΔＰ＝γ（１／Ｒ1−１／（Ｄ＋ｒ））              （４）
である。上記（４）式から、円管形状の堰上端部の外径Ｄを小さくするほどラプラス圧ΔＰは小さくなることがわかる。【００２０】
堰の平面形状を円環形状にする場合には、排出口は下方へ伸びた排出流路の上端であり、当該排出流路は内径が２ｍｍ以下で内面が親水性の毛細管部を有し、その毛細管部が排出口に通じていることが好ましい。そうすれば、堰を乗り越えようとする培養液が毛細管力によって排出流路内に引き込まれるようになり、より円滑に古い培養液の廃棄を行なうことができる。【００２１】
さらに、収容容器の下方に前記排出流路を通じて前記収容容器外へ排出された液を受ける廃液リザーバが設けられており、排出流路は前記収容容器内から鉛直下方へ延びて廃液リザーバに廃液を滴下するものである場合には、毛細管部の内径は下方へいくにしたがって大きくなっていることが好ましい。排出流路の毛細管部の内径が小さい場合、その毛細管部内に液が留まりやすくなり、培養液の廃棄が円滑に行われなくなることが考えられる。排出流路の毛細管部の内径を下方へいくにしたがって大きくすることで、そのような不具合を緩和することができる。【００２２】
また、排出流路の下端には培養液の液滴が形成されるが、その液滴の外径が小さいと、その液滴に生じるラプラス圧が大きくなり、排出流路から廃液リザーバに培養液が滴下されにくくなる。そこで、毛細管部は、当該毛細管部の下端に形成される液面に生じるラプラス圧が当該毛細管部内の液の重力よりも小さくなるように長さ及び下端の内径が設定されていることが好ましい。そうすれば、毛細管部内に引き込まれた培養液が自重によって下降しやすくなり、毛細管部において培養液が詰まることを防止することができる。【００２３】
また、排出流路は、毛細管部の下方に、前記毛細管部の下端の内径よりも大きい内径を有し、下方が開口した膨大部を備えていることが好ましい。そうすれば、排出流路の下流端に形成される液面の外径が大きくなり、排出流路の下端において培養液の液面に生じるラプラス圧が小さくなる。これにより、排出流路の下端から廃液リザーバに培養液が滴下されやすくなり、培養液の廃棄が促進される。【００２４】
堰の上端部断面は上方へ向かって収束する鋭角形状を有すること、すなわち、堰の上端部に平面がなく、堰の上端部の外径がその内側の内径に限りなく近いことが好ましい。これにより、培養液が堰上に盛り上がりにくくなり、培養液の廃棄がより円滑化される。また、堰上端部の外径をその内径に近づけて２．５ｍｍ以下にすることで、ラプラス圧ΔＰを小さくすることができる上、液面が堰の縁よりも内側にせり出そうとしたときに、堰上で液面同士が接触して排出流路へ流れ込むため、上記（４）式における１／Ｒ1がとり得る最大値がさらに小さくなり、堰を越えた培養液の廃棄がより円滑化される。【００２５】
また、整流部の好ましい実施態様として、細胞培養領域の培養液供給部側から排出部側へ向かう溶媒の流れ方向に平行な複数の流路が、水平面内において前記溶媒流れ方向と直交する方向に均等に配列された整流路を備えているものが挙げられる。【００２６】
収容容器に供給された新たな培養液は収容容器に収容されている培養液の表層側を流れやすく、表層側の培養液は置換されるものの、収容容器の底面側に位置する培養液は置換されにくい。そこで、整流路を構成する各流路は、収容容器内の表層側の液を堰き止め、収容容器の底層側の液を通過させるように構成されていることが好ましい。そうすれば、新たな培養液は収容容器の底面近傍から細胞培養領域へ供給されるため、収容容器の底面側に位置する培養液も置換されやすくなる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る細胞培養容器では、培養液を所定流量以下の流量で細胞培養領域の一端側から収容容器内に供給する培養液供給部を備えているので、新たな培養液を所定流量以下の流量で細胞培養領域に供給することができる。さらに、培養液供給部から排出部に向かう培養液の流れ方向に垂直な方向に複数の流出口が均等に配置された整流部を有するので、培養液供給部により供給された新たな培養液が細胞培養領域の面内の流速分布が均一になり、細胞培養領域全体の培養液を新たな培養液に容易にかつ均一に置換することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】細胞培養容器の一実施例を示す平面図である。
【図２】図１のＸ−Ｘ位置における断面図である。
【図３Ａ】同実施例の培養液供給部の構造を示す正面図である。
【図３Ｂ】図３ＡのＹ−Ｙ位置における断面図である。
【図４】整流路による整流効果の検討結果を示す図であり、左側の図は整流路を設けない場合、右側の図は整流路を設けた場合の流速分布図である。
【図５】同実施例の排出部の構造を説明するための断面図である。
【図６Ａ】培養液が排出部の堰上に盛り上がった状態を示す断面図である。
【図６Ｂ】培養液が排出流路の毛細管部に引き込まれた状態を示す断面図である。
【図６Ｃ】培養液が排出流路の膨大部にまで達した状態を示す断面図である。
【図７Ａ】細胞培養容器の他の実施例を示す平面図である。
【図７Ｂ】図７ＡのＺ−Ｚ位置における断面図である。
【図７Ｃ】培養液が排出部の堰上に盛り上がった状態を示す断面図である。
【図８Ａ】排出部の堰を板状にしたときの収容容器内の液面高さの時間変化の一例を示すグラフである。
【図８Ｂ】排出部の堰を円管状にしたときの収容容器内の液面高さの時間変化の一例を示すグラフである。
【図９】収容容器内の培養液の置換状態を経過時間ごとに示す画像図である。
【図１０】細胞培養容器の他の実施例を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明に係る細胞培養装置の一実施例について図面を参照しながら説明する。
【００３０】
図１及び図２に示されているように、細胞培養容器１は、フレーム２、培養液リザーバ４、ディンプル膜８及び廃液リザーバ２４を備えている。ディンプル膜８はプレート上の部材であり、細胞を培養するための複数のマイクロウェルが一方側の面設けられている。ディンプル膜８はマイクロウェルが設けられている側の面が上になった状態でフレーム２に取り付けられている。
【００３１】
フレーム２の上面側に側壁６，１０，１１が設けられており、フレーム２に取り付けられたディンプル膜８と側壁６，１０，１１によってディンプル膜８を底面とする培養液の収容容器５が形成されている。ディンプル膜８は、後述する整流路２０と整流路２２との間の平面内にマイクロウェルを有するものである。ディンプル膜８と側壁６，１０によって形成される収容容器５のうち、ディンプル膜８のマイクロウェルが設けられている破線で囲まれた領域を細胞培養領域９と称する。
【００３２】
この実施例では、細胞培養領域９は四角形状であるが、円形、楕円形状その他の形状であってもよい。また、この実施例では、細胞培養領域９内には、複数のマイクロウェルが設けられているが、必ずしもウェルが設けられている必要はなく、細胞を保持して培養可能になっていればよい。
【００３３】
また、この実施例では、収容容器５の上面が開放されているが、収容容器５の上面は必ずしも開放されている必要はなく、封止されて気密容器となっていてもよい。そうすれば、培養時にはより容易に安全な培養環境を維持でき、培地の交換時の初期のみ気密容器を開け、廃棄培地を除去し新鮮培地を添加することができる。
【００３４】
培養液リザーバ４は、フレーム２の一端側（図において左側）端部の上面に取り付けられている。培養液リザーバ４は上方が開口した容器であり、その底面に下方へ突起したピン１２が設けられている。培養液リザーバ４及びピン１２は、新しい培養液を所定流量以下の流量で細胞培養領域９に供給する培養液供給部を構成するものである。
【００３５】
ピン１２は、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、外周面に複数の溝２６を有する。培養液リザーバ４からの培養液の流出流量は溝２６の管路抵抗によって制御されるものであり、流出流量をＱとすると次式の関係が成立する。なお、ｎは溝２６の本数、Ｌは溝２６の長さ、μは培養液の粘性係数、ρは培養液の密度、ａは流路断面の一辺の長さ、ｇは重力加速度、ｈはリザーバ内の培養液の液面高さである。
2017158777.tif 000003
【００３６】
この実施例では、長さ寸法５ｍｍ、厚み寸法０．３５ｍｍ、幅寸法０．３５ｍｍの溝２６が６本設けられている。この場合、培養液が培養液リザーバ４の上端（底面からの高さが１５ｍｍ）まで溜まっているときに、流量Ｑは１．２ｍＬ／ｍｉｎで最大となる。この程度の流量であれば、細胞培養領域９における培養液の平均流速は０．１６ｍｍ／ｓ程度であり、マイクロウェルに保持されている細胞が培養液の流れによって巻き上げられることはない。この実施例の構成では、培養液リザーバ４からの培養液の供給流量が２ｍＬ／ｍｉｎ以下であれば、マイクロウェルに保持されている細胞が巻き上げられてしまうことはない。
【００３７】
なお、培養液リザーバ４から流出する培養液の流速が一定になるように、培養液リザーバ４に一定流量で培養液を供給する機構を設けてもよい。また、培養液リザーバ４に代えて、図１０に示されている送液ポンプ３２など、培養液を一定流量で供給する機構を設け、その機構から収容容器５内に培養液を一定流量で直接的に供給するようにしてもよい。
【００３８】
図１及び図２に戻って説明を続けると、フレーム２の他端側（図において右側）端部に排出部１３が設けられ、排出部１３の下方に廃液リザーバ２４が設けられている。排出部１３は鉛直下方へ伸びる排出流路１４を内部に有する。排出流路１４の上端の開口１４ａは、排出流路１４を通じて収容容器５内の培養液を排出するための排出口をなしている。以下、排出流路１４の上端の開口１４ａを「排出口１４ａ」と称する。排出口１４ａの周縁部１６はその周囲よりも隆起しており、収容容器５内の培養液の液面高さを一定の高さに維持するための堰をなしている。以下、排出口１４ａの周縁部１６を「堰１６」と称する。排出部１３は、堰１６を越えた培養液のみを排出流路１４を通じて廃液リザーバ２４へ排出するものである。
【００３９】
図５に示されているように、排出流路１４は毛細管部１４ｂと膨大部１４ｃを有する。毛細管部１４ｂの上端は排出口１４ａに通じている。排出口１４ａの周囲の堰１６は円管形状を有し、かつ上端部の外径が排出口１４ａの内径φ１と略同一となるように、上端に平面を有しないテーパ形状を有する。これにより、堰１６を乗り越えようとする培養液に生じるラプラス圧が小さくなり、図６Ａに示されているように、堰１６上に培養液が盛り上がるものの、その液面高さが図７Ａ‐図７Ｃに示されているような板状の堰２８の場合に比べて小さくなる。これにより、ディンプル膜８の表面からの堰１６の高さＬ１を越えた培養液は排出流路１４ｂを通じて排出されやすくなる。Ｌ１は例えば２ｍｍである。
【００４０】
さらに、排出流路１４の毛細管部１４ａは、毛細管力によって液を内部へ引き込むような内径で形成されている。これにより、排出口１４ａに培養液が面したときに、図６Ｂに示されているように、毛細管力によって培養液が毛細管部１４ａ内に引き込まれる。毛細管部１４ａは、内部に引き込んだ培養液が途中で詰まりにくいように、下方へいくほどその内径が大きくなっている。排出口１４ａの内径は例えば１．１ｍｍである。
【００４１】
毛細管部１４ｂの長さＬ２は、毛細管部１４ｂ内の培養液の重力が毛細管部１４ｂの下端に形成される液面に生じるラプラス圧よりも大きくなるように設計されている。毛細管部１４ｂ内に引き込まれた培養液は、下端の液面に生じるラプラス圧によって毛細管部１４ｂ内に留まろうとするものの、そのラプラス圧が毛細管部１４ｂ内の培養液の重力に耐え切れず下降するようになり、毛細管部１４ｂで培養液が詰まりにくくなる。Ｌ２は例えば８ｍｍである。
【００４２】
毛細管部１４ａの下方に膨大部１４ｃが設けられている。膨大部１４ｃは下方が開口し、その開口に形成される培養液の液面に生じるラプラス圧が膨大部１４ｃ内の培養液の水圧よりも小さくなるように、開口部の内径φ２が設定されている。すなわち、排出流路１４の下端部の開口面積を大きくすれば、図６Ｃに示されているように、そこに形成される培養液の液面の面曲率も小さくなり、液面に生じるラプラス圧も小さくなる。φ２は例えば４．８ｍｍである。
【００４３】
これにより、収容容器５内の培養液の液面が堰１６を越えたときに、培養液が円滑に排出流路１４を通じて廃液リザーバ２４へ排出され、培養液の交換を安定的に行なうことができる。
【００４４】
ここで、図７Ａ‐図７Ｃに示されているように、収容容器５内の培養液の液面高さを一定に維持するための堰２８を設け、その堰２８の下流側に堰２８を乗り越えてきた培養液を廃液リザーバ２４へ導くための排出口３０を設けたような場合、図８Ａに示されているように、培養液が堰２８を乗り越える際に液面に生じるラプラス圧によって、培養液の流出は断続的に起こることとなる。すなわち、培養液の液面高さが堰２８の高さ（Ｌ１）に達しても、その表面量力によるラプラス圧によって堰２８の縁で培養液が盛り上がって液面が上昇し、ラプラス圧が培養液の水圧に耐えきれなくなったときに決壊し、培養液が流出して液面高さは下降し、液面が堰２８の高さとなったときにその流出は止まる。そして、一旦培養液の流出が止まると、再び堰２８の縁において培養液がラプラス圧によって堰き止められ、液面高さが上昇し、ある一定の高さ（Ｌ１＋α）となったときに決壊する。
【００４５】
本発明に係る細胞培養容器としては、図７Ａ−図７Ｃに示されているような細胞培養容器１ａも含むものであるが、細胞培養容器１ａの堰２８の平面形状が直線であるため、堰２８の縁において培養液の液面に比較的大きなラプラス圧が生じ、堰２８よりも高くなる液面の高さαが大きくなる。
【００４６】
これに対し、図１から図６Ｃを用いて説明した細胞培養容器１における堰１６は、円管形状であるとともにその上端に平面が存在しないため、直線状の堰２８よりもラプラス圧が小さくなる。これにより、図８Ｂに示されているように、堰１６が決壊して培養液が排出流路１４に引き込まれるまでに必要な液面上昇高さαが小さくなり、廃液リザーバ２４へ排出される培養液の流出周期が短くなり、細胞培養領域９における培養液の流れも連続的になる。したがって、細胞培養領域９における培養液の置換を安定して行なうことができる。
【００４７】
なお、既述のように、堰を乗り越える際の液面に生じるラプラス圧ΔＰは、
ΔＰ＝γ（１／Ｒ1＋１／Ｒ2）
によって表され、このラプラス圧ΔＰを小さくするためには、液面を水平方向に切ったときの切り口の曲率１／Ｒ2がマイナスになるようにすればよいのであるから、例えば、図７Ａ−図７Ｃの細胞培養容器１ａの堰１ａの平面形状を、細胞培養領域９側へ出っ張った湾曲部分を有する形状としてもよい。
【００４８】
図１及び図２に戻って説明を続けると、フレーム２は、廃液リザーバ２４の上方であって排出部１３とは異なる位置に、吸入ノズルによって廃液リザーバ２４内の古い培養液を吸入するための開口部１８を備えている。これにより、当該細胞培養容器１を傾けたり、廃液リザーバ２４を取り外したりすることなく古い培養液を回収することができる。
【００４９】
収容容器５の細胞培養領域９よりも一端側（図において左側）にピン１２から流出した培養液の流速を細胞培養領域９の面内において均一化させるための整流路２０が設けられている。整流路２０は、ピン１２から排出部１３に向かって流れる培養液の流れ方向（図における左右方向）に平行な複数の流路を、水平面内において培養液の流れ方向に垂直な方向（図１において上下方向、図２において紙面に垂直な方向）に均等に配列したものである。この実施例では、整流路２０を２２本の流路によって構成し、各流路を幅２ｍｍ、高さ０．５ｍｍ、長さ１０ｍｍとした。
【００５０】
収容容器５の細胞培養領域９よりも他端側（図において右側）にも整流路２０と同一構成の整流路２２が設けられている。これらの整流路２０，２２の整流効果のシミュレーション結果を図４に示す。このシミュレーションは、物理シミュレーションソフトＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓを使用して行なったものである。図４に示されているように、整流路２０，２２がない場合、培養液の流速はピン１２の近傍と排出部１３の近傍で速く、その分布は面内で大きくばらついている。一方、整流路２０，２２を設けた場合、細胞培養領域９の上流端と下流端の近傍を除き、面内の流速分布は均一になった。面内の流速分布が均一になると、古い培養液が取り残されにくくなるので、等量の新しい培養液でより多くの古い培養液を置換することができる。
【００５１】
また、収容容器５内において培養液は、液面付近で最も速く、底面付近で最も遅いという流速分布をとる。この相対的な流速分布そのものは平均流速に依らない。平均流速が速い場合（例えば１０ｍＬ／ｍｉｎ以上）、液面付近では古い培養液が新しい培養液にすぐに置換されるが、底面付近ではほとんど流れが生じないため、古い培養液が取り残される。そのため、細胞培養領域９に流入する新たな培養液の量に対して、取り除かれる古い培養液の量が少ない。したがって、培養液を一方向へ流しているだけでは、深層側で古い培養液が淀んでしまい、ウェルに保持された細胞付近の古い培養液を新たな培養液に効率よく置換することが困難である。
【００５２】
これに対し、整流路２０をなす各流路は、培養液を表層側で堰き止め、深層側でのみ流すようになっている。整流路２０によって新たな培養液を深層側から細胞培養領域９に供給することで、深層側の古い培養液の置換も促進されることとなる。
【００５３】
また、ピン１２を通じて収容容器５に供給される新たな培養液の流量は最大でも１．２ｍＬ／ｍｉｎと非常に小さい。この平均流速の遅さによって、表層側を流れる新たな移動相と底面付近に存在する古い培養液とが分子拡散によって混合され、より多くの古い培養液が置換される。
【００５４】
なお、整流路２０を設けなくとも、培養液リザーバ４の培養液を流出させる複数の流出口を培養液の流れ方向に対して垂直な方向（図１において上下方向）に均等に設けることで、整流路２０を設けた場合と同様の効果を得ることができる。
【００５５】
次に、上記の細胞培養容器１を用いて培養液の交換について行った実験結果について、図９を用いて説明する。この実験では、色素水溶液を古い培養液の代わりとして用い、水を新しい培養液の代わりとして用い、色素としてローダミンＢ（Sigma-Aldrich Corporation）を使用した。培養液リザーバ４から流出した水によって細胞培養領域９のローダミンＢ水溶液が置換される様子を観察した。
【００５６】
時刻０秒でリザーバに注ぎ込まれた水は、約８００秒かけて細胞培養領域９に流入し、ローダミン水溶液が廃液リザーバ２４に溜まった。図９は、実験中の細胞培養領域を、プレートの下方からＬＥＤ面光源で光を照射しながら、上方から一眼レフカメラで撮影し、撮像した画像から、ＲＧＢのうちＧ（緑）チャネルのみを取り出した画像である。シャッタースピードは１／２０秒、絞りはＦ２２とした。Ｇチャネル画像上では、赤いローダミンＢは黒く見えている。
【００５７】
これらの画像から、細胞培養領域のローダミンＢ水溶液が、培養液リザーバ４からの水によって置換されることで、黒色が次第に薄まっていくことを確認することができる。
【００５８】
このように、上記の細胞培養容器１では、培養液リザーバ４に必要量の新しい培養液を入れるだけで、培養液リザーバ４内の培養液が自重によって培養液リザーバ４から流出し、細胞培養領域９の各ウェルに収容されている細胞を巻き上げないような緩やかな流量で細胞培養領域９に流入する。そして、細胞培養領域９に流入した新しい培養液は古い培養栄を排出部１３側へ押し流し、古い培養液が排出流路１４を通じて廃液リザーバ２４へ排出される。これにより、培養液の交換作業が非常に簡便になり、同時に複数の細胞培養容器の培養液を交換することも可能となる。
【符号の説明】
【００５９】
１，１ａ      細胞培養容器
２      フレーム
４      培養液リザーバ
６，１０，１１      側壁
８      ディンプル膜
９      細胞培養領域
１２      ピン
１３      排出部
１４      排出流路
１４ａ，３０      排出口
１４ｂ      毛細管部
１４ｃ      膨大部
１６，２８      堰
１８      開口部
２０，２２      整流路
２４      廃液リザーバ
２６      溝
【図１】
2017158777.tif 000004
【図２】
2017158777.tif 000005
【図３Ａ】
2017158777.tif 000006
【図３Ｂ】
2017158777.tif 000007
【図４】
2017158777.tif 000008
【図５】
2017158777.tif 000009
【図６Ａ】
2017158777.tif 000010
【図６Ｂ】
2017158777.tif 000011
【図６Ｃ】
2017158777.tif 000012
【図７Ａ】
2017158777.tif 000013
【図７Ｂ】
2017158777.tif 000014
【図７Ｃ】
2017158777.tif 000015
【図８Ａ】
2017158777.tif 000016
【図８Ｂ】
2017158777.tif 000017
【図９】
2017158777.tif 000018
【図１０】
2017158777.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月5日(2018.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を収容する収容容器と、
細胞を培養するために前記収容容器内に設けられた細胞培養領域と、
前記細胞培養領域に所定流量以下の流量で培養液を供給する培養液供給部と、
前記細胞培養領域内の培養液を前記収容容器外へ排出する排出部と、を備え、
前記排出部は、前記収容容器内の液を前記収容容器外へ排出する排出口、及び前記細胞培養領域の細胞培養部上面の高さよりも高く設けられた堰を有し、前記堰を越えた液のみを前記排出口へ導くように構成されており、
前記堰は、上端の平面形状が前記細胞培養領域側へ向かって凸形状に湾曲した部分を有する、細胞培養容器。
【請求項２】
前記堰の平面形状は円環形状であり、その内側に前記排出口が設けられている請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記排出口は下方へ伸びた排出流路の上端であり、
前記排出流路は内径が２ｍｍ以下で内面が親水性の毛細管部を有し、当該毛細管部が前記排出部に通じている請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記収容容器の下方に前記排出流路を通じて前記収容容器外へ排出された液を受ける廃液リザーバが設けられており、
前記排出流路は前記収容容器内から鉛直下方へ延びて前記廃液リザーバに廃液を滴下するものであり、前記毛細管部の内径は下方へいくにしたがって大きくなっている請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記毛細管部は、当該毛細管部の下端に形成される液面に生じるラプラス圧が当該毛細管部内の液の重力よりも小さくなるように長さ及び下端の内径が設定されている請求項４に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記排出流路は、前記毛細管部の下方に、前記毛細管部の下端の内径よりも大きい内径を有し、下方が開口した膨大部が設けられている請求項３から５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
培養液を収容する収容容器と、
細胞を培養するために前記収容容器内に設けられた細胞培養領域と、
前記細胞培養領域に所定流量以下の流量で培養液を供給する培養液供給部と、
前記細胞培養領域内の培養液を前記収容容器外へ排出する排出部と、を備え、
前記排出部は、前記収容容器内の液を前記収容容器外へ排出する排出口、及び前記細胞培養領域の細胞培養部上面の高さよりも高く設けられた堰を有し、前記堰を越えた液のみを前記排出口へ導くように構成されており、
前記堰の上端部断面は上方へ向かって収束する鋭角形状を有する細胞培養容器。
【請求項８】
前記培養液供給部は、前記収容容器よりも上方に培養液を貯留する培養液リザーバを有し、前記培養液リザーバに貯留された培養液を前記培養液リザーバ内の培養液の自重によって供給するものである請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記培養液供給部は、送液ポンプを用いて前記収容容器内に培養液を供給するものである請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記培養液供給部から前記排出部に向かう前記培養液の流れ方向に垂直な方向に複数の流出口が均等に配置された整流部を備えている、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記整流部は、前記細胞培養領域の前記培養液供給部側から前記排出部側へ向かう溶媒流れ方向に平行な複数の流路が、水平面内において前記溶媒流れ方向と直交する方向に均等に配列された整流路を備えている請求項１０に記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記整流路を構成する各流路は、表層側の液を堰き止め、深層側の液を通過させるように構成されている請求項１１に記載の細胞培養容器。
【国際調査報告】
2017158777.tif 000020
2017158777.tif 000021