(57)【要約】  実施形態の検出方法は、試料中の複数種類の標的核酸を検出する方法である。複数の標的核酸のそれぞれは、互いに異なる標的配列を含む短鎖核酸である。方法は、(a)標的核酸のそれぞれについて長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群、複数の長鎖核酸を共通して増幅するプライマーセットおよびプローブ固定基体を準備すること、(b)前記標的配列またはその相補配列と、それに対応する前記第１のサブ長鎖化配列と、対応する前記第２のサブ長鎖化配列とを含む長鎖核酸群を得ること、(c)前記長鎖核酸群と前記プライマーセットとを増幅条件下に維持して、増幅産物群を得ること、(d)増幅産物群と前記第１のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および／または量を検出すること、(e)結果に基づいて前記複数の標的核酸を検出することを含む。
2017158840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の複数種類の標的核酸の検出する方法であって、
前記複数の標的核酸は短鎖核酸であり、当該標的核酸間で互いに異なる標的配列をそれぞれ含み、当該標的配列は、５’端側に第１のサブ標的配列を含み、３’端側に第２のサブ標的配列を含み、
前記方法は、
（ａ）前記複数の標的配列のそれぞれについて、当該標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備すること、
ここで、
各長鎖化核酸セットは、第１のサブ長鎖化核酸と第２のサブ長鎖化核酸を含み、
目的とする当該標的配列に対応して、
前記第１のサブ長鎖化核酸は、前記第１のサブ標的配列と同じ配列またはそれに相補的な第１の相補配列を含む第１の標的結合領域を一端に含み、他端側に第１の増幅用領域を含み、
前記第２のサブ長鎖化核酸は、前記第２のサブ標的配列に相補的な第２の相補配列を含む第２の標的結合領域を３’端に含み、および５’端側に第２の増幅用領域を含む、
ここで、前記第１のサブ長鎖化核酸および前記第２のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方は、更に検出用領域を含み、前記第１のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第１の標的結合領域と前記第１の増幅用領域との間に前記第１の標的結合領域とは重なり合わないように第１の検出用領域として存在し、前記第２のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第２の標的結合領域と前記第２の増幅用領域との間に前記第２の標的結合領域とは重なり合わないように第２の検出用領域として存在し、
前記検出用領域は、目的とする当該標的配列に予め対応付けられており、前記複数の標的核酸間で互いに異なる配列を有し、前記長鎖化核酸セットは、第１のサブ長鎖化核酸および第２のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方に検出用領域を含み、
（ｂ）前記第１の増幅用領域に結合する第１のプライマーと、前記第２の増幅用領域に結合する第２のプライマーとを含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の当該長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルプライマーセットを準備することと、
（ｃ）基体と、前記基体によって提供される第１の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備すること、
ここで、前記複数種類のプローブは、
（１）前記複数種類の第１の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、
（２）前記複数の第１の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む、
（３）前記複数の第２の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、および／または
（４）前記複数の第２の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含み
（ｄ）当該試料と、前記（ｂ）で準備された前記長鎖化核酸セット群とを第２の反応場に持ち込み、
前記複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する前記第１のサブ長鎖化核酸および対応する前記第２のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および／または核酸伸長によって、前記複数の標的核酸のそれぞれについて、前記第１のサブ長鎖化配列と前記第２のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
（ｅ）第３の反応場において、前記長鎖核酸群と前記ユニバーサルプライマーセットとを増幅条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
（ｆ）前記第１の反応場において、前記（ｅ）で生じた全ての増幅産物群と前記第１のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および／または量を検出することと、
（ｇ）前記（ｆ）の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅がＰＣＲ法により行われ、
前記複数の標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であり、ここで、ｍは２以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸に対応している第１〜第ｍの標的配列であり、前記第１のサブ標的配列は、複数の前記標的配列に対応している第１１〜第１ｍのサブ標的配列であり、前記第２のサブ標的配列は、複数の前記標的配列に対応している第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、
前記第１の増幅用領域の配列は、前記第１１〜第１ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第１の増幅用領域は、第１のプライマーの配列に結合する配列を含み、
前記第２の増幅用領域の配列は、前記第２１〜第２ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第２の増幅用領域は、第２のプライマーの配列に結合する配列を含む
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、当該核酸のアニールとライゲーション反応とを含み、
前記第１のサブ長鎖化核酸において、前記第１の標的結合領域が５’端に存在し、前記第１の増幅用領域が３’端側に存在し、リン酸化されている５’端を有し、
前記第１の標的結合領域の配列が、前記第１のサブ標的配列の相補配列である
方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、ＤＮＡポリメラーゼを用いる伸張反応を含み、
前記第１のサブ長鎖化核酸において、前記第１の標的結合領域が３’端に存在し、前記第１の増幅用領域が５’端側に存在し、
前記第１の標的結合領域の配列が、前記第１のサブ標的配列と同じ配列である
方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅がＬＡＭＰにより行われ、
前記標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であり、ここで、ｍは２以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸のそれぞれに対応している第１〜第ｍの標的配列であり、前記第１のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第１１〜第１ｍのサブ標的配列であり、前記第２のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、
前記第１の増幅用領域は、Ｆ２結合領域であり、更に前記第１のサブ長鎖化核酸はＦ１結合領域を含み、前記Ｆ１結合領域は、前記Ｆ２結合領域と第１のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第１の検出用領域が第１のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第１の検出用領域は、前記第１のサブ長鎖化核酸上で前記Ｆ１結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からＦ２結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つＦ２結合領域に重複しない領域を含み、
前記第２の増幅用領域の配列は、Ｂ２結合領域であり、更に前記第２のサブ長鎖化核酸はＢ１結合領域を含み、前記Ｂ１結合領域は、前記Ｂ２結合領域と第２のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第２の検出用領域が第２のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第２の検出用領域は、前記第２のサブ長鎖化核酸上で前記Ｂ１結合領域の５’端の５’側塩基からＢ２結合領域の５’端よりも３’側の範囲に存在し、且つＢ２結合領域に重複しない領域を含み、
前記第１の検出用領域および第２の検出用領域のうちの少なくとも一方が前記長鎖化核酸セットに含まれており、
前記第１のプライマーが、５’端にＦ１ｃ配列を含み、３’端にＦ２配列を含むＦＩＰプライマーであり、
前記第２のプライマーが、５’端にＢ１ｃ配列を含み、３’端にＢ２配列を含むＢＩＰプライマーであり、
前記第１の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第１１〜第１ｍの検出用領域であり、前記第２の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第２１〜第２ｍの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第１の検出用領域および前記第２の検出用領域の存在に依存して第１１〜第１ｍのプローブおよび／または第２１〜第２ｍのプローブである
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、当該核酸のアニールとライゲーション反応とを含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第１のサブ標的結合領域は、前記第１の相補配列であり、これは対応する前記第１１〜第１ｍのサブ長鎖化核酸の５’端に存在し、これらはリン酸化されている５’端を有し、
前記第１のプライマー結合領域の配列は、Ｆ２ｃ配列であり、前記Ｆ１結合領域が、Ｆ１ｃ配列であり、前記第１のサブ長鎖化核酸において、前記第１のサブ標的結合領域が５’端に存在し、そこから３’側に向けて前記Ｆ１ｃ配列、前記Ｆ２ｃ配列がこの順番で存在する
方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、ＤＮＡポリメラーゼを用いる伸張反応を含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第１のサブ標的結合領域は、前記第１のサブ標的結合配列と同じ配列であり、これは対応する前記第１１〜第１ｍのサブ長鎖化核酸の３’端に存在し、
前記第１のプライマー結合領域の配列は、Ｆ２配列であり、前記Ｆ１結合領域が、Ｆ１配列であり、前記第１のサブ長鎖化核酸において、前記第１のサブ標的結合領域が３’端に存在し、そこから５’側に向けて前記Ｆ１配列、前記Ｆ２配列がこの順番で存在する
方法。
【請求項８】
請求項４、５または７に記載の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素である方法。
【請求項９】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記増幅がＬＡＭＰにより行われ、
前記第１のプライマーが、少なくともＬＦプライマーと組合されて第１のプライマーセットとして準備され、前記第１のサブ長鎖化核酸が、更にＬＦ結合領域含み、前記ＬＦ結合領域は、前記Ｆ１結合領域を含まずにその隣接する塩基から前記Ｆ２結合領域と重複する領域の端までの間に存在し、且つＦ２結合領域に重複しない領域を有する、および／または
前記第２のプライマーが、ＬＢプライマーと組合されて第２のプライマーセットとして準備され、前記第２のサブ長鎖化核酸が、更にＬＢ配列を含み、前記ＬＢ配列は、前記Ｂ２配列の５’端よりも３’側であり、且つ前記Ｂ１配列の５’端よりも５’側に存在し、且つＢ２配列に重複しない領域を有する
方法。
【請求項１０】
前記請求項５〜９の何れか１項に記載の方法であって、
前記第１のプライマーが、少なくともＦ３プライマーと組合されて第１のプライマーセットとして準備され、前記第１のサブ長鎖化核酸が、更にＦ３結合領域を含み、前記Ｆ３結合領域は、前記第１のサブ標的結合領域の存在していない末端に向けて前記Ｆ２結合領域よりも外側に存在し、および／または
前記第２のプライマーが、少なくともＢ３プライマーと組合されて第１のプライマーセットとして準備され、前記第２のサブ長鎖化核酸が、更にＢ３配列を含み、前記Ｂ３配列は、前記Ｂ２配列の５’側に存在する
方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法を用いて、第１〜第ｎのシリーズを分析する方法であって、前記第１〜第ｎのシリーズ内のそれぞれについて予め定められた標的核酸群を小項目セットとして含み、前記小項目セットは複数種類の小項目を含んでおり、前記複数種類の小項目が前記複数の標的核酸群のそれぞれを検出することに対応し、
前記複数種類の小項目セットは、互いに独立した数で複数の当該標的核酸を含み、それらの数は互いに同じであるか、異なっており、
前記プローブ固定基体は、前記第１〜第ｎのシリーズで共通するユニバーサルプローブ固定基体であり、ｎは２以上の整数であり
前記シリーズのそれぞれについて、当該シリーズ毎に独立して当該小項目セットに対応する当該複数種類の標的核酸を検出するために、前記（ａ）〜前記（ｇ）を行い、更に、
（ｈ）前記（ｇ）の結果に基づいて、前記第１〜第ｎのシリーズのそれぞれについての分析結果を得ること、
（ｉ）所望に応じて、第ｎ＋（１〜ｓ）の更なるシリーズについて追加して前記（ａ）〜前記（ｇ）を行い、その結果に基づいて前記第ｎ＋（１〜ｓ）の更なるシリーズについての分析結果をそれぞれ得ること、ここで、ｓは２以上の整数である
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
当該第１〜第ｎの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、ｍ１個〜ｍｎ個であり、第１〜第ｎの小項目セット群における最大値はｍｍａｘであり、ｍおよびｎは互いに独立して２以上の整数であり、
前記第１〜第ｎのシリーズのうちの任意の第ｘのシリーズは、対応する当該第ｘの小項目セットを用いて分析され、当該第ｘの小項目セットは、第１ｘ〜第ｍｘの小項目を含み、１≦ｍｘ≦ｍｍａｘである
方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法であって、
前記第１の反応場と前記第３の反応場が共通した１つの反応場であり、前記増幅反応と前記検出信号の検出および／または測定を同期間内に進行させ、そこにおいて前記検出信号を継続してモニタリングする、または経時的に複数の時点で検出若しくは測定する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、
前記第１のサブ長鎖化核酸および第２のサブ長鎖化核酸が、その一部にＬＮＡまたはＰＮＡを含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法であって、
前記第１のサブ長鎖化核酸および第２のサブ長鎖化核酸がそれぞれ第１の標的結合領域および第２の標的結合領域を除く少なくとも一部分が二本鎖である
方法。
【請求項１６】
短鎖の複数種類の標的核酸について同時期内に検出するための組み合わせ分析キットであって
当該キットは、
（１）互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬と、
（２）前記試薬と組合されて提供される、前記増幅産物を検出するための少なくとも１つのプローブ固定基体と
を備え、ここで、
前記複数の標的核酸のそれぞれは、５’端に第１のサブ標的配列を有し、３’端に第２のサブ標的配列を有する短鎖核酸であり、
（１−１）前記試薬が、
（ａ）前記複数の標的核酸のそれぞれに対応する第１のサブ長鎖化核酸および第２のサブ長鎖化核酸を含む複数の長鎖化核酸群と、
ここで、
前記第１のサブ長鎖化核酸は、前記第１のサブ標的配列またはそれに相補的な第１の相補配列を含む第１の標的結合領域を一端に含み、他端に第１の増幅用領域を含み、
前記第２のサブ長鎖化核酸は、前記第２のサブ標的配列またはそれに相補的な第２の相補配列を含む第２の標的結合領域を３’端に含み、５’端側に第２の増幅用領域を含み、
ここで、前記第１のサブ長鎖化配列および前記第２のサブ長鎖化配列の少なくとも何れか一方は更に、予め前記複数の標的配列のそれぞれに対応付けられ、互いに異なる配列を有する複数の検出用領域のうちの対応する１種類の検出用領域を含み、
第１のサブ長鎖化配列が第１の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第１の標的結合領域と第１の増幅用領域との間に前記第１の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、第２のサブ長鎖化配列が第２の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第２の標的結合領域と第２の増幅用領域との間に第２の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、
（ｂ）前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第１の増幅用領域に結合する第１のプライマーと、前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第２の増幅用領域に結合する第２のプライマーとを含むプライマーセットと、
を含み、
（２−１）前記プローブ固定基体は、
基体と、
前記基体によって提供される第１の反応場に接する面に固定されている複数のプローブとを含み、
ここで、前記複数のプローブは、
（１）前記複数の第１の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、
（２）前記複数の第１の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む、
（３）前記複数の第２の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、および／または
（４）前記複数の第２の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む
を備える
キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、前記プライマーセットがＰＣＲのためのものであり、
前記第１のプライマーと第１のプライマーとの組み合わせが、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせであり、
前記複数の標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であり、ここで、ｍは２以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸に対応して第１〜第ｍの標的配列であり、前記第１のサブ標的配列は、前記複数の標的配列に対応して第１１〜第１ｍのサブ標的配列あり、前記第２のサブ標的配列は、前記複数の標的配列に対応して第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、
前記第１の増幅用領域の配列は、前記第１１〜第１ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第１の増幅用領域は、第１のプライマーの配列に結合する配列を含み、
前記第２の増幅用領域の配列は、前記第２１〜第２ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第２の増幅用領域は、第２のプライマーの配列に結合する配列を含む
キット。
【請求項１８】
請求項１６に記載のキットであって、前記増幅条件がＬＡＭＰの反応条件であり、
前記標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であり、ここで、ｍは２以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、複数の前記標的核酸のそれぞれに対応している第１〜第ｍの標的配列であり、前記第１のサブ標的配列は、複数の前記標的配列のそれぞれに対応している第１１〜第１ｍのサブ標的配列であり、前記第２のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、
前記第１の増幅用領域は、Ｆ２結合領域であり、更に前記第１のサブ長鎖化核酸はＦ１結合領域を含み、前記Ｆ１結合領域は、前記Ｆ２結合領域と第１のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第１の検出用領域が第１のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第１の検出用領域は、前記第１のサブ長鎖化核酸上で前記Ｆ１結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からＦ２結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つＦ２結合領域に重複しない領域を含み、
前記第２の増幅用領域の配列は、Ｂ２結合領域であり、更に前記第２のサブ長鎖化核酸はＢ１結合領域を含み、前記Ｂ１結合領域は、前記Ｂ２結合領域と第２のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第２の検出用領域が第２のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第２の検出用領域は、前記第２のサブ長鎖化核酸上で前記Ｂ１結合領域の５’端の５’側塩基からＢ２結合領域の５’端よりも３’側の範囲に存在し、
前記第１のプライマーが、５’端にＦ１ｃ配列を含み、３’端にＦ２配列を含むＦＩＰプライマーであり、
前記第２のプライマーが、５’端にＢ１ｃ配列を含み、３’端にＢ２配列を含むＢＩＰプライマーであり、
前記第１の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第１１〜第１ｍの検出用領域であり、前記第２の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第２１〜第２ｍの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第１の検出用領域および／または前記第２の検出用領域に対応して第１１〜第１ｍのプローブおよび／または第２１〜第２ｍのプローブである
キット。
【請求項１９】
請求項１６〜１８の何れか１項に記載の組み合わせ分析キットであって
上記（１）の前記試薬が、第１のシリーズに対応付けられた第１の試薬であり、前記第１の試薬のための前記複数の標的配列が、前記第１のシリーズに関連する標的核酸群であり、
当該組み合わせ分析キットは、更に、
（３）上記（１）の前記第１の試薬と組み合わせて提供される、第２〜第ｎのシリーズにそれぞれ対応付けられた第２〜第ｎの試薬のうちの少なくとも１つ、
ここで、
第２〜第ｎの試薬のそれぞれは、当該第２〜第ｎのシリーズ毎に対応付けられた請求項１６〜１８の何れか１項に記載の当該試薬であり、前記シリーズ内で互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の当該標的配列をそれぞれに含む複数の当該標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の当該長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬である；および／または
（４）上記（１）および／または上記（３）の当該第２〜第ｎの試薬のうちの少なくとも１つと組合されて提供される、請求項１６に記載の前記プローブ固定基体；
を備え、
ここで、
前記第１〜第ｎのシリーズ毎に予め定められたｍ１〜ｍｎ個の小項目をそれぞれに含む第１〜第ｎの小項目セットが設定されており、当該第１〜第ｎの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、ｍ１個〜ｍｎ個であり、ｍ１〜ｍｎは互いに同じであるか、異なっており、第１〜第ｎの小項目セットにおける最大値はｍｍａｘであり、ｍおよびｎは互いに独立して２以上の整数であり、当該第１〜第ｎのシリーズのそれぞれに含まれる当該小項目の種類は、前記シリーズ間で少なくとも一部分が互いに異なっており、
前記第１〜第ｎのシリーズのうちの任意の第ｘのシリーズは、対応する当該第ｘの小項目セットを用いて分析され、当該第ｘの小項目セットは、第１ｘ〜第ｍｘの小項目を含み、１≦ｍｘ≦ｍｍａｘであり、
前記第１ｘ〜第ｍｘの小項目は、互いに異なる配列を有する第１〜第ｍｘの当該標的配列をそれぞれに有する第１ｘ〜第ｍｘの当該標的核酸の存在または存在量に関する情報をそれぞれ得ることであり、前記第ｘの小項目セットに含まれる前記第１〜第ｍｘの標的配列は、前記第ｘのシリーズ内で共通するのテーマに関連する標的核酸群であり、
前記第１ｘ〜第ｍｘの標的配列のそれぞれが、５’端に第１１ｘ〜第１ｍｘの当該サブ標的配列をそれぞれ含み、３’端には第２１ｘ〜第２ｍｘの当該サブ標的配列をそれぞれ含んでいる
キット。
【請求項２０】
請求項１６〜１９に記載の組み合わせ分析キットの供給管理方法であって、
−  それを有する場所とを紐付けられた、前記キットに含まれる当該長鎖化核酸セットおよび当該プローブ固定基体に関する在庫情報を互いに独立して記憶しているデータベースを構築することと、
−  当該キットを使用者からのオーダーを受けた管理システムが、前記オーダー内容に応じて前記データベース中の当該在庫情報を検索し、そこに含まれる当該情報の中から予め定められた条件に従って使用者に送られる当該キットまたは当該長鎖化核酸セット若しくは当該プローブ固定基体を在庫として有する場所を決定し、当該場所から前記使用者に対して、前記使用者に送る指示を出すことと、
を備える
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、試料中の複数種類の短鎖核酸の検出方法、組み合わせ分析キットおよび分析キット供給管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の様々な研究によりｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）やｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）のような小さなＲＮＡが注目されている。ｓｉＲＮＡは２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡであり、これは人工的に合成され、遺伝子発現を抑制するために用いられる。一方、ｍｉＲＮＡは１８〜３０塩基の一本鎖ＲＮＡであり、細胞内に存在し、遺伝子発現を調節していることが明らかになってきている。特に、癌をはじめとする様々な疾患とｍｉＲＮＡの種類と発現量との関係が数多く報告されている。また、ｍｉＲＮＡは、血清中にもエキソソームに内包された形で存在する。従って、ｍｉＲＮＡは、非侵襲の診断ツールとして大いに期待される。【０００３】
このような短い核酸断片を検出する場合、検出対象となる配列自身が短いために増幅用のプライマーをアニールさせる領域が確保できず、増幅が困難であり、その結果、高感度化が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４８７９９５７号公報
【特許文献２】特開２００５−２９６０１４号公報
【特許文献３】特表２００８−５１３０１１号公報
【特許文献４】特表２０１５−５０７９２８号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０７６３５６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｉａｇｙａｎ  Ｚｈｅｎｇｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕ．，  ２０１１，  ４７，  ９４６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、試料中の複数種類の短鎖核酸を簡便に検出することができる検出方法、組み合わせ分析キット並びに分析キットの供給管理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
実施形態の検出方法は、試料中の複数種類の標的核酸を検出する方法である。複数の標的核酸のそれぞれは、互いに異なる標的配列を含む短鎖核酸である。方法は、(a)標的核酸のそれぞれについて長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群、複数の長鎖核酸を共通して増幅するプライマーセットおよびプローブ固定基体を準備すること、(b)前記標的配列またはその相補配列と、それに対応する前記第１のサブ長鎖化配列と、対応する前記第２のサブ長鎖化配列とを含む長鎖核酸群を得ること、(c)前記長鎖核酸群と前記プライマーセットとを増幅条件下に維持して、増幅産物群を得ること、(d)増幅産物群と前記第１のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および／または量を検出すること、(e)結果に基づいて前記複数の標的核酸を検出することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施形態の検出方法の１例を示すフローチャートである。
【図２】実施形態の検出方法の１例を示すフローチャートである。
【図３】実施形態の長鎖化核酸セットの例を模式的に示す図である。
【図４Ａ】実施形態の長鎖化核酸セットの例を模式的に示す図である。
【図４Ｂ】実施形態の長鎖化核酸セットの例を模式的に示す図である。
【図４Ｃ】実施形態の長鎖化核酸セットの例を模式的に示す図である。
【図５】実施形態において形成される長鎖核酸の例を示す図である。
【図６Ａ】実施形態における長鎖化の例を示す図である。
【図６Ｂ】実施形態における長鎖化の例を示す図である。
【図７Ａ】実施形態における長鎖化の例を示す図である
【図７Ｂ】実施形態における長鎖化の例を示す図である
【図８】実施形態におけるプローブの例を示す図である。
【図９】実施形態の一体型デバイスおよび測定装置の例を示す図である。
【図１０】実施形態の一体型デバイスおよび測定装置による検出方法の例を示すフローチャートである。
【図１１】実施形態の供給管理方法の例を示す模式図である。
【図１２】実験結果を示す図である。
【図１３】実験結果を示す図である。
【図１４】実験結果を示す図である。
【図１５】実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【００１０】
１．短鎖核酸のマルチプレックス検出法
１つの実施形態に従う短鎖核酸マルチプレックス検出法は、試料中の複数の短鎖核酸を複数の標的核酸からなる１つのシリーズとして同時期内に検出する。この方法においては、複数の反応がマルチプレックスに行われる。即ち、１つの反応場に２種類以上の反応対象、例えば、標的核酸、例えば遺伝子などが持ち込まれる。それらが共存している状態で、それらを共通する反応条件下に持ち込み、維持する。これにより、条件に適合する複数の核酸に対して共通する反応がもたらされる。これにより、１つのシリーズとして複数の標的核酸が検出される。「同時期内」とは、例えば、同時、順次または並行と解されてもよい。
【００１１】
当該方法は、予め標的核酸として定められた複数種類の短鎖核酸を同一反応場内、例えば、１つの容器内で扱う。当該方法は、複数の短鎖核酸をマルチプレックスに長鎖化すること、得られた複数の長鎖核酸をマルチプレックスに増幅すること、生じた増幅産物をマルチプレックスに検出することを含む。
【００１２】
図１および図２を参照しながら、実施形態の検出方法について説明する。まず、当該方法により１つのシリーズとして検出されるべき複数の短鎖核酸を標的核酸として選択する。
【００１３】
実施形態において検出されるべき標的核酸は、比較的鎖長が短く、標的となる配列（即ち、標的配列）を含む短鎖核酸であり、概ね５０塩基よりも短い核酸であり得る。標的核酸の例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは長い核酸、例えば、５０塩基以上の塩基長の核酸が断片化された後に生ずる核酸断片であり得る。標的配列とは、検出されるべきヌクレオチド配列を意味する。このような標的核酸が、実施形態に従う方法により検出されるべき分析対象（analyte）である。
【００１４】
例えば、１つのシリーズとして検出されるべき複数の短鎖核酸の例は、例えば、癌、例えば、乳癌、大腸癌または肺がんなどの特定の疾患をテーマとして共通して関連している複数のｍｉＲＮＡであり得る。また例えば、１つのシリーズに含まれ得る複数種類の標的核酸は、特定の疾患の指標となる遺伝子であるということを共通するテーマとしていてもよい。１つのシリーズに含まれ得る複数種類の標的核酸は、共通するテーマ、即ち、情報、例えば、特定の疾患、疾病および障害などの健康状況に関する情報で関連付けられ得るが、これらに限定するものではない。
【００１５】
本明細書全文を通して、用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す。例えば、核酸は、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってもよい。
【００１６】
試料（sample）は、分析対象を含み得る分析されるべき対象であればよく、短鎖核酸を含む可能性のあるものであればよい。試料は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態にあることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う試料として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、試料は液体であり得る。例えば、試料は、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰、リンパ液、汗、髄液、涙液、母乳、羊水などの生体物質、または環境から採取された環境物質、或いはそれらの混合物などであってもよい。或いは、これらの何れかを試料材料として生体または環境などから採取し、何れかの手段によって核酸を抽出し、得られた核酸成分を含む液体を試料としてもよい。
【００１７】
例えば、標的核酸を含む試料の準備は次のように行われる。例えば、試料材料を採取する。その後、試料材料に対して遠心、沈殿、抽出および／または分離などの処理を行い、核酸の増幅およびハイブリダイゼーションに適切な状態にある試料を得る。また、上述の試料材料が、そのままで核酸の増幅およびハイブリダイゼーションが可能な状態にある場合には、採取された試料材料を試料として使用してもよい。
【００１８】
例えば、核酸の抽出は、これらに限定されるものではないが、市販の核酸抽出キットであるＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）  ＳＰ  Ｋｉｔ（和光純薬製）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ（タカラバイオ製）、ｍｉｒｐｒｅｍｉｅｒ（登録商標）  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｒｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）、ハイピュアｍｉＲＮＡアイソレーションキット（ロシュ・ライフサイエンス製）、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｋｉｔ（キアゲン製）などを利用して実行し得る。或いは、このようなキットを使用せずに、例えば、試料材料を緩衝液で希釈した上で、８０℃〜１００℃の加熱処理を行い、その後遠心分離し、その上清を採取することにより試料を得てもよい。
【００１９】
図１のスキーム１の（Ｓ１）に１つのシリーズに含まれる複数の標的核酸の１例を示した。この例は、標的核酸１（１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ）である。これらの標的核酸は、それぞれ標的配列１（１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ，１０Ｅ）を含む。これらの配列は、互いに異なる種類の配列を有し、その長さは互いに同じであるか、または異なり得る（Ｓ１）。
【００２０】
標的核酸１は、標的配列１０を含む。標的配列１０は、５’端に第１のサブ標的配列１１を含み、３’端に第２のサブ標的配列１２を含む。例えば、標的配列１０は、５’側の第１のサブ標的配列１１と３’側の第２のサブ標的配列１２とからなってもよく、それ以外の更なる配列を含んでもよい。更なる配列を含む場合、それは、第１のサブ標的配列１１と第２のサブ標的配列１２との間に存在していてもよく、第１のサブ標的配列１１よりも５’側および／または第２のサブ標的配列１２の３’側に存在してもよい。また、第１のサブ標的配列１１の一部分と第２のサブ標的配列１２の一部分とが、標的配列１０上で互いに重なり合っていてもよい。このような重なり合っている部分の長さは、例えば１〜４塩基であり得る。第１のサブ標的配列１１および第２のサブ標的配列１２の長さは、互いに同じ長さであってもよく、異なる長さであってもよい。例えば、標的配列１０を概ね半分ずつ分け合うような塩基数であってもよく、例えば、互いのＴｍ差が小さい長さであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
例えば、標的配列１０は、標的核酸１の全長であってもよく、その一部分の配列であってもよいが、概ね５０塩基よりも短い長さであり得る。例えば、第１のサブ標的配列１１および第２のサブ標的配列１２の長さは、例えば、それぞれ２塩基以上５５塩基以下、例えば、５塩基以上５０塩基以下、１０塩基以上３５塩基以下、１２塩基以上２８塩基以上などであり得るが、これらの数値に限定されるものではない。
【００２２】
標的核酸１０の長鎖化は、長鎖化核酸セット４０を用いて行われる。長鎖化核酸セット４０は、第１のサブ長鎖化核酸４１と第２のサブ長鎖化核酸４２とを含む。１つのシリーズに含まれる全ての標的配列について、各標的配列に特異的な１つの長鎖化核酸セット４０を準備する。
【００２３】
第１のサブ長鎖化核酸４１は、一端に第１の標的結合領域５１を含む。これは、第１のサブ標的配列１１と同じ配列か、またはそれに相補的な第１の相補配列であり得る。第１のサブ長鎖化核酸４１は、他端側に第１の増幅用領域６１を含み、第１の標的結合領域５１と第１の増幅用領域６１との間に第１の検出用領域７１を含み得る（Ｓ１）。或いは、第１の検出用領域７１が配置され得る領域は、第１の標的結合領域５１を含まずに、それに隣接する塩基から第１の増幅用領域６１と重複する領域内の何れかの範囲であってもよい。また、第１の検出用領域７１は、第１の増幅用領域６１と重複する場合であっても、第１の増幅用６１には含まれない領域にまで及んでいる。第１の増幅用領域６１の外側に更なる配列が含まれていてもいなくともよい。
【００２４】
第２のサブ長鎖化核酸４２は、３’端に第２の標的結合領域５２を含む。これは、第２のサブ標的配列１２に相補的な第２の相補配列であり得る。第２のサブ長鎖化核酸４２は、５’端側に第２の増幅用領域６２を含む（Ｓ１）。これよりも５’端側に更なる配列が存在していてもいなくともよい。
【００２５】
検出用領域７１は、１つのシリーズに含まれる全ての標的核酸１に対して１つずつ割り当てられている。１つのシリーズのために準備される全ての検出用領域７１は、互いに異なる配列を有する。図１（Ｓ１）には、１例として標的核酸１（１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ）を示した。標的核酸１（１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ）のそれぞれは、検出用領域７１（７１Ａ，７１Ｂ，７１Ｃ，７１Ｄ，７１Ｅ）のそれぞれに対応付けられている。標的核酸１が長鎖化される際に、割り当てられた特定の標的核酸に特異的な検出用領域が組み込まれることによって、得られた長鎖核酸は識別可能となる。
【００２６】
長鎖化の詳細は後述するが、マルチプレックス長鎖化によって各標的核酸１の存在に依存して、次のような長鎖核酸が得られる。長鎖核酸９５は、対応する標的配列１０上の第１のサブ標的配列１１と第２のサブ標的配列１２とに沿って、第１の標的結合領域５１と第２の標的結合領域５２とを向い合せる方向で、第１のサブ長鎖化核酸４１および第２のサブ長鎖化核酸４２に由来する配列を含む。即ち、第１のサブ長鎖化核酸４１の配列またはその相補配列と第２のサブ長鎖核酸４２の配列またはその相補配列とを含む（Ｓ２）。
【００２７】
第１の増幅用領域６１および第２の増幅用領域６２は、このような長鎖核酸９５を鋳型として共働して核酸鎖を増幅する１つのプライマーセットのための配列である（Ｓ２）。第１の増幅用領域６１の配列は１つのシリーズ内で共通しており、同様に第２の増幅用領域６２の配列も１つのシリーズ内で共通している。即ち、１つのシリーズ内でマルチプレックス長鎖化によって形成された複数の長鎖核酸９５は、１種類のプライマーセットによって共増幅される。言い換えれば、１つのシリーズ分に対応して得られる複数の長鎖核酸は、標的核酸毎に互いに異なるが、何れも同じ配列で構成されている増幅用領域を有しているために、複数種類の長鎖核酸は共増幅、即ち、マルチプレックス増幅できる（Ｓ３）。
【００２８】
増幅反応に使用されるプライマーセットは、１つのシリーズに含まれる全ての種類の長鎖核酸９５を増幅するように構成されたユニバーサルプライマーセットである。これは、少なくとも第１の増幅用領域６１に対応する第１のプライマーと、第２の増幅用領域６２に対応する第２のプライマーとを含む。
【００２９】
ここにおいて「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製することを指す。実施形態において、使用され得る増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するそれ自身公知の何れの増幅方法であり得る。増幅法は、変温増幅法であってもよく、等温増幅方法であってもよく、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰ、ＲＣＡおよびＩＣＡＮなどであり得る。また、所望に応じて逆転写反応を前段階で行ってもよく、増幅反応と同期間内に行ってもよい。
【００３０】
プライマーセットの種類は、行われ得るべき増幅反応の種類により選択され得る。例えば、ＰＣＲのためのプライマーセットは、例えば、第１のプライマーとしてのフォワードプライマーと第２のプライマーとしてのリバースプライマーを含み得る。例えば、ＬＡＭＰのためのプライマーセットは、例えば、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとを含み得る。更にＬＡＭＰのためのプライマーセットは、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーおよび／またはループプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含み得る。その場合、サブ長鎖化核酸はそれらに対応する更なる増幅用領域を更に含み得る。
【００３１】
増幅用領域の長さは１０塩基〜３５塩基であってよく、好ましくは１５塩基から３０塩基であり得る。検出用領域の長さは、５塩基〜５０塩基であってよく、好ましくは１０塩基〜４０塩基、より好ましくは１５塩基から３５塩基であり得る。
【００３２】
検出用領域および増幅用領域は、試料中に含まれ得る核酸とは異なる配列から選択され得る。好ましくはこれらの配列は、人工的に設計した核酸配列であり得る。これらの配列として、例えば自然界に存在する配列が用いられた場合には、意図せずして試料に混入した核酸についても増幅や検出が行われ得る。それにより結果が偽陽性となり得る。そのような意図せずして試料に混入し得る核酸は、例えば、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物および／または対象以外の動物などの核酸などであり得る。人工的設計した核酸配列を検出用領域および増幅用領域として使用することにより、これらの偽陽性の発生が抑制される。
【００３３】
人工的な配列は、例えば、次にように作製することが可能である。例えば、乱数を発生させて、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔに割り付けるという方法によって、人工的な配列を容易に作製できる。例えば製造された人工配列は、ＢＬＡＳＴ検索により、自然界に存在するものかどうかを確認し、それにより類似配列が検索されないものを選択すればよい。人工的配列は、増幅用のプライマーおよび検出用のプローブとして、より効率のよい配列を自由に作製および選択できるために有用である。それにより検出系の感度および精度を高めることが可能である。
【００３４】
上記の増幅により増幅産物１００（１００Ａ，１００Ｂ，１００Ｃ，１００Ｄ，１００Ｅ）が得られる（図１（Ｓ３））。増幅産物１００は、検出用領域７１とプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより検出される。ハイブリダイゼーションの検出は、プローブ固定基体２００により行われ得る。プローブ固定基体２００は、基体２２０と、基体２２０上に固定されている複数種類のプローブとを備える（図１（Ｓ４））。プローブは、各検出用領域の配列と同じ配列またはその相補配列を含み得る。それによってプローブは、対応する配列を含む増幅産物１００とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションを検出することにより増幅産物の存在または存在量を検知する。それによって、当該検出方法は、試料中の標的核酸の存在または存在量を検出する。
【００３５】
プローブ固定基体は、例えば狭義には、一般的に使用される「ＤＮＡチップ」、「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義と解されてもよく、互いに交換可能に使用され得る。また広義には、詳しくは後述するが、更なる支持体に固定されている、例えばＤＮＡチップなどの小型のプローブ固定基体と、例えば増幅反応部、流路などを構成するために必要な他の構成部材とが一体化されてなる検出用カセット、カートリッジなどのデバイスもプローブ固定基体と解され得る。これらの全ての態様が実施形態として提供され得る。
【００３６】
図２のスキーム２に示すように１つの実施形態において、当該検出方法は次の手続きを含む；予め標的核酸（または標的配列）に対応付けられた長鎖化核酸群、プライマーセットおよびプローブ核酸を準備すること（Ｓ２１）；これらを用いて目的とする複数の標的核酸を配列特異的に長鎖化すること（Ｓ２２）；得られた長鎖核酸群を、標的配列に非特異的に、ユニバーサルプライマーセットを用いて増幅すること（Ｓ２３）；生じた増幅産物中の検出用領域とプローブとのハイブリダイゼーションを検出すること（Ｓ２４）；試料中の複数の標的核酸を同時期内に検出すること（Ｓ２５）。
【００３７】
上述では、第１のサブ長鎖化核酸４１が１つの増幅用領域６１と１つの検出用領域７１とを含み、第２のサブ長鎖化核酸４２が１つの増幅用領域６２を含む例を示した。しかしながら更に、第１のサブ長鎖化核酸４１および第２のサブ長鎖化核酸４２は、更なる増幅用領域を含み得る。
【００３８】
また、第２のサブ長鎖化核酸４２が更なる検出用領域を含んでもよい。その場合、第１のサブ長鎖化核酸４１の検出配列７１が第１の検出用領域７１として存在し、第２のサブ長鎖化配列４２が第２の検出用領域を含み得る。或いは、第１のサブ長鎖化核酸４１が検出用領域７１を含まずに、第２のサブ長鎖化配列４２が第２の検出用領域を含んでもよい。
【００３９】
第２のサブ長鎖化配列４２において検出用領域は、第２の標的結合領域５２と第２の増幅用領域６２との間に含まれ得る。或いは、第２の検出用領域７２が配置され得る領域は、第２の標的結合領域５２を含まずに、それに隣接する塩基から第２の増幅用領域６２と重複する領域内の何れかの範囲であってもよい。また、第２の検出用領域７２は、第２の増幅用領域６２と重複する場合であっても、第２の増幅用６２には含まれない領域にまで及んでいる。
【００４０】
例えば、第１および第２のサブ長鎖化核酸が、５０塩基以上の長さを有する場合には、これらの鎖上の標的結合領域以外の部分の少なくとも一部分または全部分について、対応する相補鎖を用いて二本鎖にしておくことも好ましい。これによってこれらの核酸はより安定化される。これにより、特異性の低下、アニール効率の低下、ミスマッチにより生じる非特異的な反応、例えば、望まれないアニールの発生などを抑制することが可能となる。
【００４１】
また、第１および第２のサブ長鎖化核酸に含まれる第１の標的結合領域および第２の標的結合領域が、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）および／またはＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含んでいてもよい。このようにすることによりサブ標的配列との結合性を高めることが可能である。それによって安定した長鎖化を行うことが可能であり、その結果、高精度に標的核酸を検出することが可能となる。
【００４２】
このような検出法により、試料中の複数の標的核酸を同時に簡便に検出することが可能となる。
【００４３】
以下更に、具体的に当該方法について説明する。特定の配列に関する名称、符号または数字の直後に「ｃ」を付けた場合には、その特定の配列の相補配列または相補鎖であることを表す。
【００４４】
２．長鎖化核酸セットの例
（１）第１および第２の例
図１（Ｓ１）に示した長鎖化核酸セットのうちの第１のサブ長鎖化核酸４１について図３を用いて更に説明する。図１（Ｓ１）および図３（ａ）に示す第１のサブ長鎖化核酸４１は、例えば、図３（ｂ）に示すような第１のサブ長鎖化核酸４１Ａまたは４１Ａｃの何れかであり得る。第１のサブ長鎖化核酸４１Ａと第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃとは互いに相補鎖である。標的配列１０を含む標的核酸１を長鎖化するために、長鎖化核酸セット４０は、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａまたは４１Ａｃの何れかと、第２のサブ長鎖化核酸４２とを含み得る。
【００４５】
（１−１）第１の例
第１のサブ長鎖化核酸４１Ａは、５’端に第１の標的結合領域５１Ａを含む。これは、第１のサブ標的配列１１の相補配列である。第１のサブ長鎖化核酸４１Ａは、５’端から第１の標的結合領域５１Ａ、第１の検出用領域７１Ａ、第１の増幅用領域６１Ａをこの順番で含み、５’端がリン酸化されている。
【００４６】
（１−２）第２の例
第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃは、３’端に第１の標的結合領域５１Ａｃを含む。これは、第１のサブ標的配列１１と同じ配列である。第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃは、３’端側から第１の標的結合領域５１Ａｃ、第１の検出用領域７１Ａｃ、第１の増幅用領域６１Ａｃをこの順番で含む。
【００４７】
（２）第３および第４の例
第３および第４の例を図３（ｃ）および（ｄ）にそれぞれ示す。第３の例は、第２のサブ長鎖化核酸４２が検出用領域７２を含み、第１のサブ長鎖化核酸４２が検出用領域７１を含まない例である。第３の例において、第２のサブ長鎖化核酸４２ｓは、３’端から第２の標的結合領域５２、第２の検出用領域７２、第２の増幅用領域６２を含む（Ｓ１）。第４の例は、第１および第２のサブ長鎖化核酸がどもに検出用領域を含む例である。
【００４８】
（３）第５、第６および第７の例
ＬＡＭＰなどの等温増幅法に好ましい長鎖化核酸セットの例を第５の例として図４Ａおよび図４Ｃを参照しながら以下に説明する。図４Ａは、第１のサブ長鎖化核酸１４１および第２のサブ長鎖化核酸１４２が含み得る増幅用領域と検出用領域とを含む態様の例を示している。しかしながら、これらのサブ長鎖化核酸１４１，１４２は、これらの増幅用領域および検出用領域を必ずしも全て含む必要はなく、所望に応じて選択され得る。以下に組み合わせの例について説明する。
【００４９】
図４Ａの第５の例は基本的な例の１つである。そこにおいて、長鎖化核酸１４０は、第１のサブ長鎖化核酸１４１と、第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂとを含む。第１のサブ長鎖化核酸１４１は、一端に第１の標的結合領域１５１を含む。これは、第１のサブ標的配列１１と同じ配列か、またはそれに相補的な第１の相補配列であり得る。第１のサブ長鎖化核酸１４１は、他端側に第１の増幅用領域１６１を含む。更に第１のサブ長鎖化核酸１４１は、第１の標的結合領域１５１のある一端側から他端に向けて、第１の標的結合領域１５１、プライマー結合領域１６３、第１の検出用領域１７１、第１の増幅用領域１６１をこの順番で含み得る。他方、第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは、３’端に第２の標的結合領域１５２Ｂを含む。これは、第２のサブ標的配列１２に相補的な第２の相補配列であり得る。第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは、５’端側に第２の増幅用領域１６２Ｂを含む。第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは、３’端から第２の標的結合領域１５２Ｂ、プライマー結合領域１６４Ｂ、第２の増幅用領域１６２Ｂをこの順番で含み得る。ここでプライマー結合領域は、ＬＡＭＰなどの方法においてＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーの一部分に対応する配列を有する配列であり、増幅用領域または配列とも称され得る。
【００５０】
ここで、上記の第１のサブ長鎖化核酸１４１は更に、第１の増幅用領域１６１よりも更に他端側に第３の増幅用領域１６５を含み得る（図４Ｃ（Ａ１）または（Ａ２））。同様に、第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは更に、第２の増幅用領域１６２Ｂよりも更に５’側に第４の増幅用領域１６６Ｂを含み得る（図４Ｃ（Ｂ２）または（Ｂ３））。また、第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは、検出用領域１７２Ｂを第２の増幅用領域１６２Ｂと第２のプライマー結合領域１６４Ｂとの間に含んでもよい（図４Ｃ（Ｂ１）または（Ｂ３））。この場合、第１のサブ長鎖化核酸１４１は、第１の検出用領域１７１を含んでいても、含んでいなくともよい（例えば図４Ｃ（Ａ２）または（Ａ３））。また、第１のサブ長鎖化核酸１４１は、第１のプライマー結合領域１６３と第１の第１の増幅用領域１６１との間に第５の増幅用領域を含んでもよい（例えば、１７１の位置に１７１に代わりに、または１７１に加えて）。同様に第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂは、第２のプライマー結合領域１６４Ｂと第２の増幅用領域１６２Ｂとの間に第６の増幅用領域（例えば、１７２Ｂ（図４（Ｂ１）））を含んでいてもよい。この場合、この第５（または第６）の増幅用領域は、第１（または第２）の増幅用領域１６１（または１６２Ｂ）と第１（または第２）のプライマー結合領域１６３（または１６４Ｂ）との間にあり、第１（または第２）の増幅用領域１６１（または１６２Ｂ）の存在する領域を含み、且つ第１（または第２）のプライマー結合領域１６３（または１６４Ｂ）の領域を含まない領域に存在し得る。この領域は、後に形成され得る増幅産物においては、分子内結合により形成される一本鎖ループ領域となる。このような一本鎖ループ領域に、第１の検出用領域１７１、第２の検出用領域１７２Ｂ、第５の増幅用領域（例えば、１７１）および第６の増幅用領域（例えば、１７２Ｂ）などが含まれ得る。第５および第６の増幅用領域は一般的にはループプライマーに対応する領域であり得る。また、第１のサブ長鎖化核酸１４１および第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂの少なくとも一方に検出用領域を含ませるように、第１の検出用領域１７１または第２の検出用領域１７２Ｂが、第５の増幅用領域１７１または第６の増幅用領域１７２に置き換わって配置されてもよく、この領域に検出用領域と増幅用領域とが共に含まれてもよい。それらを共存させる場合には、検出用領域が標的配列に特異的であり、増幅用領域が標的配列に非特異的であるという構成から、それらは完全には重なり合わない。
【００５１】
サブ長鎖化核酸において、標的核酸結合領域、増幅用領域、検出用領域およびプライマー結合領域は、互いに直接に連結されていてもよく、望まれない非特異的なハイブリダイズが生じない配列がこれらの領域の間に存在していてもよい。例えば、上述の人工的な配列が含まれていてもよい。またプライマー結合領域は、上述した増幅用領域および検出用領域と同様に設計され得る。これらの配列は、例えば、２０塩基以下であることが好ましいが、この限りではない。
【００５２】
図５（ａ）および（ｂ）に上記第５の例の長鎖化核酸セット１４０を用いて得られた長鎖核酸を増幅して得られる増幅産物の例を示した。第１のプライマー１８１は、第１のサブ長鎖化核酸１４１の増幅用領域に対応し、例えば、５’側にＦ１ｃ配列を有し、３’側にＦ２配列を有するＦＩＰプライマーである。第２のプライマーは、第２のサブ長鎖化核酸１４２の増幅用領域に対応し、例えば、５’側にＢ１ｃ配列を有し、３’側にＢ２配列を有するＢＩＰプライマーである。増幅産物１００Ｓは、一端から他端に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、検出用領域１７１Ａｃ、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み得る（ａ）。増幅産物１００Ｔは、一端から他端に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、検出用領域１７１Ａ、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み得る。このような増幅産物は、分子内結合によって例えば図５（ｃ）および（ｄ）に示す立体構造を形成する。この例において分子内結合は、Ｆ１ｃ配列とＦ１配列との間で形成され、他端のＢ１配列とＢ１ｃ配列との間で形成され得る。
【００５３】
第６の例を図４Ｂ（ａ）に示す。ここにおいて、長鎖化核酸１４０は、第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａと上記第５の例に示した第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂと同じ構成のものを含む。
【００５４】
第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａは、５’端から第１の標的結合領域１５１Ａ、第１のプライマー結合領域１６３Ａ、第１の検出用領域１７１Ａおよび第１の増幅用領域１６１Ａをこの順番で含み、５’端がリン酸化されている。ここで、第１の標的結合領域１５１Ａは、第１のサブ標的配列１１の相補配列である。
【００５５】
第７の例を図４Ｂ（ｂ）に示す。ここにおいて、長鎖化核酸１４０は、第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａｃと上記第５の例に示した第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂと同じ構成のものを含む。
【００５６】
第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａｃは、３’端から第１の標的結合領域１５１Ａｃ、第１のプライマー結合領域１６３Ａｃ、第１の検出用領域１７１Ａｃおよび第１の増幅用領域１６１Ａｃをこの順番で含む。ここで、第１の標的結合領域１５１Ａｃは、第１のサブ標的配列１１と同じ配列である。
【００５７】
上記の第５〜第７の例において、或いは、第１の検出用領域１７１（１７１Ａ，１７１Ａｃ）が配置され得る領域は、第１の標的結合領域１５１（１５１Ａ，１５１Ａｃ）を含まずに、それに隣接する塩基から第１の増幅用領域１６１（１６１Ａ，１６１Ａｃ）と重複する領域内の何れかの範囲であってもよい。また、第１の検出用領域１７１（１７１Ａ，１７１Ａｃ）は、第１の増幅用領域１６１（１６１Ａ，１６１Ａｃ）と重複する場合であっても、第１の増幅用領域１６１（１６１Ａ，１６１Ａｃ）には含まれない領域にまで及んでいる。
【００５８】
例えば、ＬＡＭＰによる増幅のために、第１のサブ長鎖化核酸１４１（１４１Ａ，１４１Ａｃ）において、前記第１の増幅用領域１６１（１６１Ａ、１６１Ａｃ）は、Ｆ２結合領域であり、プライマー結合領域１６３（１６３Ａ，１６３Ａｃ）は、Ｆ１結合領域である。また、増幅用領域１６５（１６５Ａ，１６５Ａｃ）は、Ｆ３結合領域であり、ループプライマー結合領域は、ＬＦ結合領域であり得る。
【００５９】
第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａにおいて、第１の検出用領域１７１Ａは、Ｆ１結合領域１６３Ａの３’端よりも３’側に存在し、Ｆ２結合領域１６１Ａの３’端よりも５’側に存在し得る。第１の検出用領域１７１Ａは、その一部分がＦ２結合領域１６１Ａの配列に重なっていてもよいが、その場合であってもＦ２結合領域１６１Ａとは独立した配列も含む。
【００６０】
第１のサブ長鎖化核酸１４１Ａｃにおいて、第１の検出用領域１７１Ａｃは、Ｆ１結合領域１６３Ａｃの５’端よりも５’側に存在し、Ｆ２結合領域１６１Ａｃの５’端よりも３’側に存在する。第１の検出用領域１７１Ａｃは、第１のサブ長鎖化核酸Ａｃ上でＦ１結合領域を含まずにそれに隣接する塩基からＦ２結合領域と重複する領域までの間に存在し得る。第１の検出用領域１７１Ａｃは、その一部分がＦ２結合領域１６１Ａｃの配列に重なっていてもよいが、その場合であってもＦ２結合領域１６１Ａｃとは独立した配列も有する。
【００６１】
第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂにおいて、第２の検出用領域１７２Ｂは、第２の標的核酸領域１５２Ｂと第２のプライマー結合領域１６２Ｂとの間に存在し得る。また、第２の検出用領域１７２Ｂは、第２の標的結合領域１５２Ｂの５’端よりも５’側であり、且つ第２のプライマー結合領域１６２Ｂの５’端よりも３’側に存在し得る。第２の検出用領域１７２Ｂは、第２のプライマー結合領域１６２Ｂと重複する場合であっても、第２のプライマー結合領域１６２Ｂには含まれない領域に及んでいる。
【００６２】
上述においては、第２のサブ長鎖化核酸として図４Ａに示す第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂを用いる例を示した。しかしながら、第２のサブ長鎖化核酸として図４Ａに示すサブ長鎖化核酸１４２Ｂｃを用いることも可能である。その場合においても、対応する構成要素間の関係および第１のサブ長鎖化核酸との関係は、上述の関係に対応している。それに伴う第１のサブ長鎖化核酸の構成の変更などは上記に基づいて当業者により容易且つ明確に理解され得る。その１例を図４Ｃ（Ｂ４）に示す。この第２のサブ長鎖化核酸１４２Ｂｃは、５’端に第２の標的結合領域５２Ｂｃ、３’端側に第２のプライマー結合領域１６２Ｂｃ、これらの間に第３の増幅用領域１７２Ｂｃとを含み、５’端がリン酸化されている。第３の増幅用領域１７２Ｂｃは、ＬＢプライマーの結合する領域に置換され得る。最も３’端側に更なる増幅用領域１６６Ｂｃが含まれ得る。
【００６３】
３．長鎖化核酸セットによる長鎖化
上述のような長鎖化核酸セットを用いる標的核酸の長鎖化は、後述する２種類の方法の何れかを利用して行われ得る。
【００６４】
（３−１）ライゲーションによる長鎖化
第１の方法を図６Ａのスキーム３および図６Ｂスキーム４に示す。ここで使用される第１のサブ長鎖化核酸は、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａ，１４１Ａであり、これらはそれぞれ、５’端に第１の標的結合領域５１Ａ，１５１Ａを含み、且つ５’端がリン酸化されている。長鎖化の反応は、例えば、（Ｓ３１）〜（Ｓ３３）を含むスキーム３または（Ｓ４１）〜（Ｓ４３）を含むスキーム４のように進行する。
【００６５】
この方法では、まず標的核酸１に対して、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａ，１４１Ａと第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２Ｂとをアニールさせる（Ｓ３１，Ｓ４１）。次に第１のサブ長鎖化核酸４１Ａ，１４１Ａと第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２Ｂとをそれぞれライゲーションによって繋いで長鎖核酸４０Ｅ，１４０Ｅを形成する（Ｓ３２，Ｓ４２）。次に標的核酸１を遊離させ、長鎖核酸４０Ｅ，１４０Ｅを得る（Ｓ３３，Ｓ４３）。長鎖核酸４０Ｅ，１４０Ｅは、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａ，１４１Ａの配列と第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２Ｂの配列とをそれぞれ含み、これらの配列の一部分に重複して標的配列１０の相補配列１０ｃを含む。このようにして標的核酸１の情報を含む長鎖核酸４０Ｅ，１４０Ｅを得ることにより、標的核酸の長鎖化が達成される。
【００６６】
（３−２）ライゲーションによる長鎖化反応の例
上述のようなライゲーションによる長鎖化反応は、例えば、次にように行われ得る。標的核酸を含み得る試料と長鎖化核酸セットとを混合して長鎖化反応液を調製する。これを第１のサブ標的配列および第２のサブ標的配列のＴｍ以下の温度で維持する。これにより長鎖化核酸セットを標的核酸に対してアニールさせる。次にリガーゼを添加し、その活性温度付近の温度に反応液を維持する。それによって２つのサブ標的配列を介して標的核酸に結合している第１のサブ長鎖化核酸と第２のサブ長鎖化核酸との間に存在するニック部分を連結する。これにより長鎖核酸が得られる。
【００６７】
或いは上記アニーリングとライゲーションとが同時に進行されてもよい。その場合、アニーリング用の反応液にリガーゼを持ち込まれ得る。
【００６８】
リガーゼの例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、ＳｐｌｉｎｔＲ  ｌｉｇａｓｅなどが含まれる。例えば、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２は、連結する３’端の２塩基以上をＲＮＡとしたキメラ合成オリゴＤＮＡを用いることによりライゲーション効率を高めることが可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２００４，１６，２１１を参照されたい。反応温度は、概ね１０〜６０℃で実施され得るが、酵素の種類、長鎖化核酸がＬＮＡやＰＮＡを含んでいるか否かに応じて任意に調製され得る。例えば、ＬＮＡやＰＮＡを導入したサブ長鎖化核酸を用いる場合には、それらはサブ標的配列への結合力が強くため、通常よりも高い温度で反応を進めることが可能である。それにより標的配列に対するサブ長鎖化核酸のアニールの特異性が増大し、その結果、非特異反応を抑制することが可能となる。その場合には耐熱性リガーゼが好ましく用いられ得る。ライゲーションによる長鎖化に用いられる長鎖化試薬は、リガーゼを含み得る。
【００６９】
このようにして、予め標的核酸と定められた複数種類の短鎖核酸を１シリーズとして同一反応場内で扱い、複数種類の標的配列を１つの反応場、例えば、同一反応容器内で同時期内に長鎖化することが可能となる。
【００７０】
（３−３）ポリメラーゼによる長鎖化
第２の方法を図７Ａおよび図７Ｂに示す。ここで使用される第１のサブ長鎖化核酸は、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃ，１４１Ａｃであり、３’端に第１の標的結合領域５１Ａｃ，１５１Ａｃを含む。この長鎖化の反応は、（Ｓ５１）〜（Ｓ５５）を含むスキーム５または（Ｓ６１）〜（Ｓ６５）を含むスキーム６のように進行する。
【００７１】
この方法では、まず標的核酸１に対して第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２Ｂをアニールさせる（Ｓ５１，Ｓ６１）。標的核酸１を鋳型にして、第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２ＢをＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって３’端方向に伸張させる（Ｓ５２，Ｓ６２）。これにより第１の伸長鎖４２ＢＥ，１４２ＢＥを形成する。形成された第１の伸長鎖４２ＢＥ，１４２ＢＥに対して、第１の長鎖化核酸４１Ａｃ，４１Ａｃをアニールさせる（Ｓ５３，Ｓ６３）。第１の伸張鎖４２ＢＥ，１４２ＢＥを鋳型にして第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃ，１４１Ａｃを３’端方向に伸張させる（Ｓ５４，Ｓ６４）。これにより第２の伸長鎖４０Ｅｃ，１４０Ｅｃを形成する。第２の伸長鎖４０Ｅ，１４０Ｅを第１の伸長鎖４２ＢＥ，１４２ＢＥから遊離させる。これにより長鎖核酸４０Ｅｃ，１４０Ｅｃを得る。
【００７２】
長鎖核酸４０Ｅｃ，１４０Ｅｃは、第１のサブ長鎖化核酸４１Ａｃ，１４１Ａｃの配列と第２のサブ長鎖化核酸４２Ｂ，１４２Ｂの相補配列４２Ｂｃ，４１２Ｂｃとを含み、これらの配列の一部分に重複して標的配列１０と同じ配列を含む。このようにして標的核酸１の情報を含む長鎖核酸４０Ｅｃおよび１４０Ｅｃを得ることにより、標的核酸の長鎖化が達成される。
【００７３】
（３−４）ポリメラーゼによる長鎖化反応の例
上述のようなポリメラーゼによる長鎖化反応は、例えば、次のように行われ得る。標的核酸を含み得る試料と第２のサブ長鎖化核酸とＤＮＡポリメラーゼとを混合して第１の長鎖化反応液を調製する。標的核酸がＲＮＡである場合には、ＤＮＡポリメラーゼの代わりに逆転写酵素を長鎖化反応液に持ち込む。このような第１の長鎖化反応液を第２のサブ標的配列のＴｍ以下の温度に維持する。それにより、第２のサブ標的配列と第２のサブ長鎖化核酸とがアニールする。次にＤＮＡポリメラーゼ（または逆転写酵素）によって第１の伸長鎖を形成する。そこに第１の長鎖化核酸とＤＮＡポリメラーゼ（または逆転写酵素）とを添加して第２の長鎖化反応液を調製する。これを第１のサブ標的配列のＴｍ以下の温度に維持する。それによって第１の伸長鎖に対して第１のサブ長鎖化核酸をアニールさせ、第１の伸長鎖を鋳型として第１のサブ長鎖化核酸を伸長する。これにより第２の伸長鎖を形成する。
【００７４】
或いは第１の長鎖化反応液に、第２のサブ長鎖化核酸と共に第１のサブ長鎖化核酸を存在させてもよい。この場合、第１のサブ長鎖化核酸の伸長と第２のサブ長鎖化核酸の伸長とが同時に進行される。即ち、２つの方向に向かう伸長が同時に行われる。
【００７５】
第１の長鎖化反応液および第２の長鎖化反応液に含ませるＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素は、互いに同じ酵素であっても異なる酵素であってもよい。第１の長鎖化反応液と第２の長鎖化反応液とに含ませる酵素が互いに異なる場合、その違いは、例えば温度特性などであり得る。上述の例では、第１の長鎖化反応液に酵素を含ませて反応を行った後に、第２の長鎖化反応液に再度酵素を添加する例を示した。しかしながらこれに限定するものではない。例えば、第１の長鎖化と第２の長鎖化とを同時に行ってもよく、その場合、必要な酵素および長鎖化核酸が１つの反応場に共存し得る。また上述のように２段階の反応により第１の長鎖化反応と第２の長鎖化反応とを行う場合に、第１の長鎖化反応液中に予め第１の長鎖化反応のための第１の酵素と第２の長鎖化反応のための第２の酵素とを持ち込んでおいてもよい。ポリメラーゼによる長鎖化に用いられる長鎖化試薬は、ポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素を含み得る。
【００７６】
ＤＮＡポリメラーゼの例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｌａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ）、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  ９６−７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＤＤＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどであり得る。或いはそれは、ＤＮＡを鋳型にすることもできる逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどであってもよい。
【００７７】
逆転写酵素の例は、これらに限定するものではないが、Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ，  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどであり得る。
【００７８】
反応温度は、例えば概ね１０℃〜６０℃であり得る。また、反応温度は、使用される酵素の種類、サブ長鎖化核酸の配列、例えば、ＬＮＡやＰＮＡを含むか否かなどに依存して変更または調製され得る。例えば、サブ長鎖化核酸がＬＮＡやＰＮＡを含んでいる場合には、サブ長鎖化核酸と標的核酸との結合力が強くなり、通常よりも高い温度で反応を進めることが可能である。これによりサブ長鎖化核酸の標的核酸へのアニールの特異性を増大することが可能となり、その結果、非特異的反応の発生を抑制することが可能となる。このような場合には、使用される酵素は耐熱性酵素、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性逆転写酵素を用いることが好ましい。
【００７９】
このようにして、予め標的核酸と定められた複数種類の短鎖核酸を１シリーズとして同一反応場内で扱い、複数種類の標的配列を１つの反応場、例えば、同一反応容器内で同時期内に長鎖化することが可能となる。
【００８０】
４．長鎖核酸のマルチプレックス増幅
上述の通り、当該方法では、１つのシリーズに含まれる全ての長鎖核酸をユニバーサルプライマーセットを用いて１つの反応場において同時期内に増幅する。増幅反応条件は、選択される増幅反応に応じて決定され、一般的に用いられるそれ自身公知の酵素および反応条件から選択され得る。
【００８１】
例えば、ＬＡＭＰを用いる場合には、一般的に用いられるＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｅｒａｓｅ、９６−７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＳＳＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを用いて、５０℃〜７０℃の等温で１５〜９０分間に亘り増幅を行い得る。増幅に必要な試薬（増幅試薬）は、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素などの酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含み得る。また増幅試薬として増粘剤が更に含まれ得る。このような増幅試薬は後述するアッセイキットに含まれて提供され得る。
【００８２】
５．増幅産物の検出
増幅産物に含まれる検出用領域とプローブとのハイブリダイゼーションを検出することによって、増幅産物が検出される。増幅産物を検出することによって、試料中の標的核酸が検出される。
【００８３】
ここで「検出」とは、標的核酸の有無および／または標的核酸の定量であり得る。ここで「プローブ」とは、プライマーセットにより形成された増幅産物を検出するための核酸鎖であり、検出用領域と特異的に結合する配列を有する。例えば、プローブは、検出用領域に相補的な配列を含んでいてもよく、検出用領域と同じ配列を含んでいてもよい。
【００８４】
プローブの塩基長は、これに限定するものではないが、例えば５塩基〜５０塩基の範囲でよく、例えば１０塩基〜４０塩基の範囲が好ましく、例えば１５塩基〜３５塩基の範囲がより好ましい。
【００８５】
ハイブリダイゼーションの検出は、それ自身公知の何れかのハイブリダイズの有無または程度を検出するための原理を利用して行われ得る。例えば、適切な条件下に増幅産物とプローブとを共存させ、生じたハイブリダイゼーション信号を検知または定量すればよい。ハイブリダイゼーション信号は、光学的信号、化学的信号、電気化学的信号、放射能信号およびこれらの組み合わせなどであり得る。
【００８６】
増幅反応とハイブリダイズ反応とが同一反応場において同一反応溶液中で同時期に進行されてもよく、その場合、それらが同時に行われてもよく、増幅反応とハイブリダイズ反応とが連続して並行して行われてもよく、増幅反応に続いてハイブリダイズ反応が行われてもよい。或いは、増幅反応とハイブリダイズ反応とが同一反応場において異なる反応溶液中で連続して実施されてもよい。
【００８７】
（５−１）プローブ固定基体
プローブは、基体表面に固定された状態で提供され得る。例えば、プローブは、基体と、前記基体によって提供される第１の反応場に接する面に固定されている複数のプローブとを含むプローブ固定基体として提供されてもよい。プローブ固定基体の例を図８に示す。
【００８８】
図８（ａ）〜（ｃ）は、プローブ固定基体の例の平面図である。図８（ａ）に示すプローブ固定基体３００は、基体３０１と、基体３０１上面にアレイ状に配置された複数のプローブ固定領域３０２と、プローブ固定領域に種類毎に固定された複数のプローブ３０３とを備える。このようなプローブ固定基体３００は、例えば蛍光、化学発光などの光学信号を利用する測定原理により増幅産物を検出する場合に使用され得る。増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを検出するために、二本鎖を認識してそこに結合する標識物質、抗体や二次プローブ核酸を利用する増幅産物への標識物質の結合、増幅反応時の増幅産物へのｄＮＴＰに付与された標識物質の取り込みなどの手段を利用し得る。
【００８９】
図８（ｂ）に示すプローブ固定基体４００は、基体４０１と、基体４０１上面にアレイ上に配置されているプローブ固定領域としての複数の電極４０２と、電極４０２上に種類毎に固定された複数のプローブ４０３と、電極４０２に電気的に接続されたパット４０４とを備える。このようなプローブ固定基体４００は、ハイブリダイゼーションの電気化学的検出のために使用され得る。このような検出は、例えば、プローブ４０３と増幅産物とにより形成される二本鎖を識別して結合するインタカレータなどの二本鎖認識物質などを利用してハイブリダイゼーションを検出し得る。ハイブリダイゼーション信号は電気信号として検出され、電気信号として伝えられる情報はパット４０４から取り出し得る。このプローブ固定基体４００は、参照電極および対極を更に具備し得る。
【００９０】
二本鎖認識物質の例は、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどのそれ自身工程の二本鎖認識物質、更に、これらの二本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで更に修飾してもよい。二本鎖認識物質の濃度は、種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が０．００１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いることができる。例えば、このような二本鎖認識物質は、ハイブリダイズ信号発生に関与する挿入剤であり得る。このような挿入剤は、ハイブリダイズ試薬として後述するアッセイキットに含まれ得る。
【００９１】
測定は、例えば二本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いはパルスで印加するか、或いは定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流および電圧を制御してもよい。
【００９２】
プローブ固定基体３００，４００を用いる実施形態に従う方法において、これらのプローブ固定基体上で増幅反応および検出が同時期に行われ得る。或いは、他の反応場で行われた増幅反応により形成された増幅反応物をこれらのプローブ固定基体上に持ち込むことにより検出が行われてもよい。
【００９３】
図８（ｃ）に、例えば、このプローブ固定基体３００，４００上を１つの反応場として、そこにおいて増幅反応とハイブリダイズ反応とを行う態様の１例を模式的に示す略図である。プローブ固定基体５００は、基体５０１、基体上にアレイ状に配置されたプローブ固定領域５０２、プローブ固定領域５０２に種類毎に固定された複数のプローブ５０３、基体上に遊離可能に固定されたプライマーセット５０５および基体上に遊離可能に固定された増幅試薬５０７を備える。プライマーセット５０５および増幅試薬５０７は、液体による反応場の形成時に、または液体との接触によりプローブ基体５００上から液体中に遊離し得る。例えば、このようなプローブ基体５００による実施形態の方法では、プローブ固定基体５００に対して試料または試料を含む液体を持ち込むこと、この液体により反応場を形成すること、増幅反応条件および検出反応条件下に反応場を持ち込むこと、ハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。例えば、反応場は、流路、容器などの収容空間内に形成され得る。プライマーセット５０５および増幅試薬５０７の固定位置は、基体上に限らず反応場に接する何れかの収容空間内面であり得る。増幅試薬５０７は、プライマーセット以外の試薬であり、増幅反応に必要な何れかの物質または複数種類の物質の組み合わせであり得る。或いは増幅反応の際に共存し得る何れかの物質または複数の物質の組み合わせであり得る。増幅試薬は、例えば塩、ｄＮＴＰなどの基質、増幅酵素などであり得る。
【００９４】
図８（ｄ）には、例えば、上記のプローブ固定基体が流路を備える態様の１例を示す。これは、流路により連絡している２つの反応場において増幅反応とハイブリダイズ反応とをそれぞれ行うためのプローブ固定基体の１例であり、これは上記何れの検出様式に組み合わされてもよい。プローブ固定基体６００は、基体６０１内部に反応場を維持するために例えば２つのチャンバを備える。例えばこれらは、増幅反応をその内部で行う第１のチャンバ６１０と、ハイブリダイズ反応をその内部で行う第２のチャンバ６２０であり、これらのチャンバは流路６３０で連絡されている。第１のチャンバ６１０底面６１５には、プライマーセット６０５と反応試薬６０７とが遊離可能に固定されている。第２のチャンバ６２０の底面６２５には、複数のプローブ固定化領域６０２がアレイ状に配置されており、そこに種類毎に複数のプローブ６０３が固定されている。第１のチャンバ６１０の上部には、液体を流入するための貫通孔６１８が形成されている。プローブ固定基体６００での反応は、第１のチャンバ６１０に貫通孔６１８を通して試料または試料を含む液体を持ち込むこと、第１のチャンバ６１０を増幅反応条件下に維持すること、増幅産物を含み得る第１のチャンバ内の液体を流路６３０を通して第２のチャンバ６２０内に送ること、第２のチャンバ６２０内をハイブリダイズ反応条件下に維持すること、第２のチャンバ６２０内で生じたハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。
【００９５】
上述のプローブ固定基体の例では、プライマーセットと増幅試薬とを遊離可能に固定した例を示したが、必ずしもこれらを共に固定せずともよく、例えば、プライマーセットまたは増幅試薬が試料または試料を含む液体に含まれて反応場に持ち込まれてもよく、それらとは別に反応場に持ち込まれてもよい。また何れの例においても、ハイブリダイズ反応を行う反応場を規定する何れかの壁面に検出可能なハイブリダイズ信号の発生を補助する、または当該発生に必要な試薬が固定されていてもよい。上記の例では、５カ所のプローブ固定領域を配置した例を示したが、この領域の数は、任意に変更可能であり、アレイ状に配置するとは、例えば縦横に所望の数で当該領域を配置することを指す。
【００９６】
基体は固相であればよく、一般的にＤＮＡチップのための固相として使用される何れかの基体であればよい。基体は、例えば、ガラス、シリコン、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂または光ファイバーなどによって構成されていてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
プローブ固定基体は、標的核酸に対応付けられた検出用領域とハイブリダイズするための検出用プローブの他に、ネガティブコントロールプローブまたはポジティブコントロールプローブを更に含んでもよい。その場合、それらを固定する固定領域が基体に配置され得る。
【００９８】
プローブの基体への固定は、これらに限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基およびビオチンなど末端修飾基を介して行ってよい。これらの官能基の選択およびプローブの固定は、それ自身公知の手段により達成することが可能である。
【００９９】
プライマーセットおよび増幅試薬の固定は、例えばこれらを水または有機溶媒などに溶解または懸濁して得られた液体を滴下、乾燥することにより行われ得る。
【０１００】
例えば、増幅反応の後にハイブリダイズ反応を行う場合には、次のように行い得る。増幅反応により得られた増幅産物を上記のようなプローブ固定基体の反応場に持ち込む。これをプローブ存在下でハイブリダイズ条件に維持することにより、プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーション温度は、適宜設定すればよい。反応効率を高めるために塩を添加し得る。そのために、予めプローブ固定基体のプローブ固定領域の近傍に塩を固定していてもよい。或いは増幅反応後の増幅産物を含む液体に塩を添加、混合することによって反応場に塩を持ち込んでもよい。例えば、ハイブリダイズ条件を満たすために必要な塩は、ハイブリダイズ試薬として後述するアッセイキットに含まれ得る。ハイブリダイズ反応中または反応前若しくは後に攪拌または振盪などを行ってもよい。それにより反応効率が高まり得る。
【０１０１】
ハイブリダイゼーション後にプローブを洗浄するための洗浄液として、イオン強度が０．０１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜９の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩および界面活性剤などを含み得る。例えば、ＳＳＣ溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、Ｔｗｅｅｎ２０溶液またはＳＤＳ溶液などが用いられ得る。洗浄温度は、例えば１０℃〜７０℃の範囲であり得る。例えば、洗浄液は、プローブ固定基体の表面またはプローブ固定領域に通過または滞留させればよい。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、所望の単一時点または経時的若しくは複数時点で行われてよく、蛍光検出方式または電気化学的検出方式が利用され得る。
【０１０３】
図８（ｅ）は、プローブ固定領域とそこに固定されたプローブとを示す一部抜粋した拡大図である。プローブ固定基体において、図８（ｅ）に示す二本鎖核酸プローブ（以下、二本鎖プローブ）が使用されてもよい。プローブ固定基体７００は、プローブ固定領域７０２に固定された二本鎖プローブ７０３を備える。二本鎖プローブ７０３は、アンカー核酸鎖（以下、アンカー鎖）７１０と、これに対してハイブリダイズしている被覆核酸鎖（以下、被覆鎖）７２０とを含む。被覆鎖７２０は、アンカー鎖７１０にハイブリダイズによる結合により捕捉されており、それによって基体７０１に固定されている。被覆鎖７２０は、アンカー鎖７１０に結合するためのアンカー相補配列７１１に加えて、検出されるべき検出用領域７５１とハイブリダイズするための検出相補配列７２１とを含む。このような被覆鎖７２０の構成によって、被覆鎖７２０とのハイブリダイズすることを巡って増幅産物７５０とアンカー鎖７１０とが競合する。その結果、二本鎖プローブに対して、対応する検出用領域７５１を含む増幅産物７５０が近づくと、被覆鎖７２０はアンカー鎖７１０から乖離し、増幅産物７５０とハイブリダイズして二本鎖を形成し得る。発明者らは、この現象が、反応場に存在する増幅産物の濃度依存性に生じることを実験によって証明している。例えば、このような二本鎖プローブ７０３を用いることにより、１つの反応場において増幅反応と並行してハイブリダイズ反応を行い、生じたハイブリダイゼーションを経時的に且つ定量的に検出ことが可能となる。このような二本鎖プローブ７０３を使用することによって増幅産物を従来に比べてより精度よく定量することが可能となる。二本鎖プローブ７０３の一本鎖への変化の測定は、例えば、電気化学的または光学的に検出することが可能である。例えば、電気化学的検出のためには電極上に二本鎖プローブ７０３が固定され得る。
【０１０４】
二本鎖プローブ７０３において、被覆鎖がアンカー鎖に結合していることにより、プローブ中の標識物質の信号の検出が阻害されている。実施形態において、標識物質の信号の検出の阻害とは、標識物質が本来的に生ずる信号を検出できない状態、または被覆鎖がアンカー鎖に結合していないときに検出されるべき信号が検出できない状態に修飾するなど、検出が阻害される、または検出可能性が阻害されることをいう。例えば、標識物質を有するアンカー鎖が独立して一本鎖で存在するときには検出される信号が、アンカー鎖への被覆鎖の結合によって、減弱若しくは消失または検出不可能な信号に変更若しくは変調するなどをいう。このような標識物質の信号の検出の阻害は可逆的である。核酸プローブへの被覆鎖の結合の解消、即ち、被覆鎖が核酸プローブから脱離すると、本来的に標識物質の生じる信号が検出できる状態になる。
【０１０５】
二本鎖プローブ７０３の一本鎖への変化の検出は、検出可能な信号を生ずる標識物質の使用により観察されるが、そのような標識物質は、アンカー鎖に結合している核酸の存在または存在量の増加により標識物質からの信号の検出が阻害されるという特徴を有する。言い換えればそのような標識物質は、例えばアンカー鎖に核酸が結合している場合には、標識物質からは信号が発生しない、生じる信号の大きさが小さくなる、標識物質からの信号が伝わりにくくなる、および／または検出が阻害されることなどを特徴としている。
【０１０６】
このような標識物質の例は、電極活性物質であってもよく、これらに限定されるものではないが、例えば、電気的化学的に活性な金属錯体、鉄錯体、ルテニウム錯体、ルビジウム錯体、コバルト錯イオン、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、アントラキノン（Anthraquinone）、メチレンブルー（Methylene Blue）などであり得る。例えばフェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、コバルト錯イオンなどは、その酸化還元電位が検出可能な電気的化学的信号となり得る酸化剤とも解され、そのような特性を有する他の酸化剤も同様に用い得る。例えば、フェロセンを含む化合物を用いることは好ましい。これらの標識物質は、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、鉄錯体、ルテニウム錯体、コバルト錯体を反応液に溶解することにより得られる。
【０１０７】
それらの反応液中の濃度は、例えば、１０μＭ〜１００ｍＭであってもよく、また例えば約１ｍＭであってもよい。電気化学的に活性な物質を標識物質として使用する場合、標識物質はセンサのより近くに配置される方が、センサから遠くにあるよりもより好ましい。標識物質のセンサからの距離は、例えば、５０塩基程度のときであっても、電気化学的な信号を好ましく検出可能である。標識物質のセンサからの距離は、これらに限定するものではないが、例えば、６０塩基以下、５５塩基以下、５０塩基以下、４０塩基以下、３０塩基以下、２０塩基以下、１０塩基以下であってもよい。或いは、標識物質は、アンカー鎖に含まれる核酸鎖中に配置されてもよく、核酸鎖の基板から近い末端若しくは遠い末端に付与されてもよく、アンカー鎖の核酸鎖と基体とを結合するための末端修飾基と当該核酸鎖との間に配置されてもよい。更に、標識物質は１つのアンカー鎖中に複数で含まれてもよく、単数で含まれてもよい。複数で含まれる場合、それらは同じ種類であっても、異なる種類であってもよい。或いは、標識物質は反応液中に存在させてもよい。
【０１０８】
例えば、増幅反応とハイブリダイズ反応とを１つの反応場において同時に進行させる場合にはそれらは次のように行い得る。
【０１０９】
例えば、プローブ固定領域７０２としての電極上に二本鎖プローブ７０３を備えるプローブ固定基体７００を用いる場合、基体上で等温増幅を実施しながらリアルタイムでハイブリダイゼーションの進行をモニターすることができる。即ち、そのようなプローブ固定基体上で等温増幅を行った場合、反応液中の増幅産物７５０の存在量に依存して、被覆鎖７２０中の検出相補配列７２１と増幅産物７５０とがハイブリダイズし、被覆鎖７２０が電極７０２から解離する。このとき電極に固定されたプローブは二本鎖から一本鎖に変化する。この変化は、電極を用いて連続的に電気応答を調べることでリアルタイムに信号変化として捉えることができる。電極で信号を得るために、例えば、二本鎖認識物質にフェロセンなどの電極活性物質が結合している標識物質を用いることができる。この場合、プローブが一本鎖に変化すると、フェロセン標識された二本鎖認識物質が解離する。その結果、フェロセン応答が減少する。フェロセンは、電位掃引をサイクルで行うと酸化還元を繰り返す。それによりその応答を連続測定することが可能であるため、増幅の進行がモニターできる。
【０１１０】
また、電極活性物質の応答は電極の極近傍の状態をよく反映する。従って、二本鎖認識物質を用いることなく、直接に応答変化を計測することも可能である。この場合、電極活性物質として、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、鉄錯体、ルテニウム錯体、コバルト錯体、フェロセンなどが使用され得る。これらは何れも電位掃引をサイクルで行った場合に、酸化還元を繰返す。そのため、これらは増幅の進行に合わせて繰返し測定できる。これらの電極活性物質の応答は、電極上の二本鎖が一本鎖に変化する際に、電流値が増加すると共に、また或いはピーク電位が低電位側にシフトする。増幅反応の速さは増幅前の鋳型量に依存するため、あらかじめ定めた閾値を超えるまでの時間を計測すれば、増幅前の鋳型量に割り戻すことができ、増幅産物を定量可能となる。
【０１１１】
電気化学的に活性な物質からの信号は、例えば、電流値、電位値、電気容量値、インピーダンス値などの何れかの電気的な指標であればよい。核酸プローブからの被覆核酸鎖５の脱離に伴う当該信号の量的変化および／または予め定めた電気的特性の変化を測定することによって、標的核酸の有無または存在量を決定することが可能となる。信号の量的変化または電気的特性の変化は、例えば、信号の大きさの変化、例えば、信号の減少または消失であってもよく、これらの大きさの変化が生じるまでの時間の長さ、大きさの変化の開始時点のシフトなどであってよく、特定時間内での積算値の変化などであってもよい。
【０１１２】
核酸プローブからの電気信号は、核酸プローブが固定される基板から獲得され得る。その場合、例えば、少なくとも一部の基板表面に電極が配置されればよい。その場合、核酸プローブは、電極上に固定され得る。
【０１１３】
或いは電気活性物質に代えて光学的活性物質が使用され得る。そのような物質からの信号は、何れかの光学的な指標であればよく、例えば、特定の波長を有する光、例えば、蛍光、発光などであってよい。アンカー鎖からの被覆鎖の脱離に伴う信号の量的および／または予め定めた光学的特性の変化を測定することによって、標的核酸の有無または存在量を決定することが可能となる。信号の量的または光学的特性の変化は、例えば、光強度の変化、光強度の増加、減弱若しくは消失、波長の変化などであってもよく、光強度の大きさまたは波長の変化が生じるまでの時間の長さ、当該変化の開始時点のシフトなどであってよく、また特定時間内での積算値の変化であってもよい。
【０１１４】
標識物質として使用される蛍光物質の例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ、ＴＥＭＲＡ、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）などを含む。
【０１１５】
このような光学的活性物質は、例えば、被覆鎖にクエンチャーを含ませることによりその検出可能性を阻害することが可能である。クエンチャーの例は、例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＤａｂｃｙｌなどを含む。また、例えば、標識物質としてＣｙ３またはＣｙ５が選択される場合には、クエンチャーとして例えば、ＥｕキレートまたはＵｌｉｇｈｔを用い得る。
【０１１６】
このような二本鎖プローブを使用することにより、複数の短鎖核酸をより簡便に検出することが可能となる。
【０１１７】
（５−２）一体型デバイスおよび測定装置
図９に更なるプローブ固定基体の例を示す。図９（ａ）はプローブ固定基体の平面図であり、図９（ｂ）は線Ｂ−Ｂに沿った断面図である。このプローブ固定基体は、反応セルでの増幅反応とＤＮＡチップ上でのハイブリダイズ反応とを連続して行うために、複数の構成要素を組み合わせて一体化してなるデバイス（以下、一体型デバイスと記す）の１例である。なお、一体型デバイス９０１は、検出用カセットまたは検出用カートリッジとも称され得る。
【０１１８】
一体型デバイス９０１は、検体シリンジ９０２、洗浄液シリンジ９０３、挿入剤シリンジ９０４、反応セル９０５およびＤＮＡチップ９０６を備える。ＤＮＡチップ９０６は、検出セル９１６内底面に固定されている。検体シリンジ９０２は、流路９０７で反応セル９０５に連結されている。洗浄シリンジ９０３、挿入剤シリンジ９０４は、流路９０９で検出セル９１６に連結されている。反応セル９０５は流路９０８で検出セル９１６と連結されている。一体型デバイス９０１は、本体９２０と、その一方の面に取り付けられている蓋体９３０とを備える。本体９２０の蓋体９３０側には凹部９２１ａ，９２１ｂ，９２１ｃが形成されており、この凹部９２１ａ，９２１ｂ，９２１ｃと蓋体９３０とにより検体シリンジ９０２、洗浄液シリンジ９０３、挿入剤シリンジ９０４、反応セル９０５および検出セル９１６が規定されている。蓋体９３０の検体シリンジ９０２、洗浄液シリンジ９０３、挿入剤シリンジ９０４に対応する位置には、それぞれ貫通孔９３１ａ，９３１ｂ，９３１ｃが形成されている。使用時には、検体シリンジ９０２には検査の行われるべき試料が、洗浄液シリンジ９０３には洗浄液が、挿入剤シリンジ９０４にはハイブリダイズ信号発生に関与する挿入剤が収容されている。それらは貫通孔９３１ａ，９３１ｂ，９３１ｃを通じて予め流入されている。ＤＮＡチップ９０６には、複数のプローブ固定領域としての電極９０６ａがアレイ状に配置されており、そこにプローブ９０６ｂが種類毎に複数本ずつ固定されている。
【０１１９】
一体型デバイス９０１による試料中の複数の標的核酸の検出方法を行うときには、測定装置により行われ得る。測定装置の例を図９（ｃ）に示す。測定装置９５０は、測定ユニット９６０と、測定ユニット９６０を制御する制御機構９７０と、制御機構９７０を制御するコンピュータ９８０とを備える。測定ユニット９６０は、一体型デバイス９０１がカートリッジとして着脱可能にセットされるカートリッジ収容部９６１と、そこに収容されている一体型デバイス９０１からの信号を得る測定系９６２と、一体型デバイス９０１への液体の送りおよび／または出しをする送液系９６３と、一体型デバイス９０１の温度を制御する温度制御機構９６４とを備える。温度制御機構９６４による一体型デバイス９０１の温度制御は、カートリッジ収容部９６１内部に配置され、一体型デバイス９０１底面に接触する温度制御ブロック９４１ａ，９４１ｂ，９４１ｃによって行われる（図９（ｂ））。温度制御ブロック９４１ａ，９４１ｂ，９４１ｃは、検体シリンジ９０２、洗浄液シリンジ９０３および挿入剤シリンジ９０４に亘る領域、反応セル９０５の領域、検出セル９１６の領域をそれぞれカバーしている。温度制御ブロック９４１ａ，９４１ｂ，９４１ｃは、例えばヒータ、ペルティエ素子、冷却機構などであり得る。また温度制御ブロック９４１ａ，９４１ｂ，９４１ｃは、更に小型の複数のユニットからなってもよく、それらは独立して制御されてもよい。
【０１２０】
このような一体型デバイス９０１と測定装置９５０とを用いる検出方法の１例を図１０のスキーム７に示した。検出方法は、試薬チューブ９９０内で標的核酸を含み得る試料、長鎖化核酸セットおよび長鎖化試薬を混合すること（Ｓ７１）、検体シリンジ９０２内で標的核酸を長鎖化すること（Ｓ７２）、反応セル９０５内で長鎖核酸、プライマーセットおよび増幅試薬を混合すること（Ｓ７３）、反応セル９０５内で長鎖核酸を増幅すること（Ｓ７４）、ＤＮＡチップ９０６内で増幅産物を検出すること（Ｓ７５）を含む。このような手続きが実施される場所を図１０（ａ）にパターン１として示す。
【０１２１】
試薬チューブ９９０内での混合は、一体型デバイス９０１外にて行う。なお、一体型デバイス９０１および試薬チューブ９９０は、一体型デバイス９０１と共に後述するアッセイキットに含まれて提供され得る。試薬チューブ９９０には、長鎖化核酸および長鎖化試薬が予め含まれ得る。検出方法を行う場合には、必要に応じて試料材料から抽出された核酸を試料として試薬チューブ９９０に添加する。これを混合した後に、混合液を貫通孔９３１ａを通して検体シリンジ９０２内に収容する。検体シリンジ９０２に収容されている反応液を温度制御ブロック９４１ａによって、長鎖化に必要な温度条件下に一定時間維持し、長鎖化を進行させる。長鎖化後、送液系９６３により提供される送液機構によって反応液は検体シリンジ９０２から流路９０７を通って反応セル９０５に送られる。送液機構９６３は、それ自身公知の何れかの手段が利用され得る。反応セル９０５には、予めプライマーセットと増幅試薬とが遊離可能に固定されている。反応液との接触により、これらが液中に遊離し、増幅反応条件下で増幅反応が開始される。増幅温度条件は、温度制御ブロック９４１ｂによって満たされ得る。増幅後、送液系９６３によって反応液は、反応セル９０５から流路９０８を通り検出セル９１６に送られる。検出セル９１６の内壁には、予め複数種類のプローブがアレイ状に固定されている。更にＤＮＡチップ９０６のプローブ固定領域を覆うように複数回に亘り蛇行している流路が形成されており、検出セル９１６の反応場が流路内に存在していてもよい。この場合、複数のプローブ固定領域は、流路内に流れ方向に沿って間隔を有して配置され得る。プローブと共にハイブリダイズ試薬が固定されていてもよい。ハイブリダイズの温度条件は、温度制御ブロック９４１ｃにより満たされる。ハイブリダイズ条件下で一定時間に亘り反応液を維持した後に、送液系９６３によって洗浄液シリンジ９０３に収容されている洗浄液を流路９０９を通り検出セル９１６に送る。温度制御ブロック９４１ｃにより検出セル９１６内の温度を洗浄温度に維持しながら洗浄液を一定時間に亘ってそこに維持する。これによりハイブリダイズ反応を停止する。その後、挿入剤シリンジ９０４に収容されている挿入剤を送液系９６３によって流路９０９を通り検出セル９１６に送る。プローブが固定されている各電極は、電気的に測定系９６２に接続されている。測定系９６２は、電極に電圧を印加しながらそこから生ずる電気信号をハイブリダイゼーション信号として受け取り、これを検出位置と対応付けて制御機構９７０に送る。制御機構９７０は、検出位置、ハイブリダイゼーション信号、ハイブリダイゼーション信号に関して予め決定された閾値、予め設定された計算式および検出位置と標的配列とを対応付けるテーブルなどに基づいて、試料中に所望の標的核酸が存在するか否か、存在する場合には必要に応じて存在量を決定する。
【０１２２】
制御機構９７０は、測定系９６２２、送液系９６３、温度制御機構９６４、およびコンピュータ９８０に電気的に接続されている。制御機構９７０は、例えば、コンピュータ９８０に格納されたプログラム、テーブル、計算式などに従って、これらを制御し得る。更に、コンピュータ９８０は、得られた信号を測定データとして格納する機構を有し得る。コンピュータ９８０は、制御機構９７０に制御条件パラメータを与えて制御機構９７０を制御するとともに、制御機構９７０から送られた測定データに基づいて解析処理を実行し、標的核酸を検出および／または定量し得る。
【０１２３】
上述の実施形態の例では、電気信号を検出する装置の例を示したが、光信号を生ずる標識物質を使用する場合であっても、同様に測定装置を利用し得る。その場合、例えば、ハイブリダイゼーション信号として光信号を検出するように測定系９６２が構成されていること、プローブ固定領域に電極が存在しなくてもよいこと、挿入剤シリンジに光学信号の検出に関与する試薬が収納されること以外は、上述と同様の構成を有し得る。例えば、標識物質として蛍光物質を使用する場合の測定系９６２は、ＤＮＡチップ９０６に励起光を照射する光照射ユニット、標識物質からの蛍光を光信号として得るセンシングユニット、光信号を電気信号に変換する光電変換ユニットなどを備え得る（図示せず）。
【０１２４】
上記の実施形態においては、図１０（ａ）のパターン１に従う例を示した。更なる態様においては、上述と同様の装置構成を有する一体型デバイス９０１と測定装置９５０とを用いて、そこにおいて行う手続きを変更する例を図９および図１０を参照しながら２つの例について説明する。第１の更なる例は、図１０（ｂ）に示すパターン２であり、長鎖化（Ｓ７２）を検体シリンジ９０２ではなく、一体型デバイス９０１外で行うこと以外は、パターン１と同様に手続きを行う。パターン２では、長鎖化反応を例えば試薬チューブ９９０内で行う。その場合、試薬チューブ９９０をヒートブロックなどで加熱して長鎖化を達成し得る。このような検出システムの場合には、測定装置９５０は、温度制御ブロック９４１ａを必ずしも備える必要はない。試薬チューブ９９０内で形成された長鎖核酸を含む反応液が、貫通孔９３１ａを通り検体シリンジ９０２に収納される。例えば、測定装置９５０が更に試薬チューブフォルダを備えてもよく、送液系９６３が試薬チューブフォルダに収容された試薬チューブ内からシリンジ機構などによって反応液を採取し、カートリッジ収容部９６１にある一体型デバイス９０１の貫通孔９３１ａから検体シリンジ９０２内に送るように構成されていてもよい。また、測定装置９５０は、試薬チューブフォルダ内の試薬チューブ９９０に接して反応液の温度を調整する更なる温度制御ブロックを備え得る。
【０１２５】
第２の更なる例は、図１０（ｃ）に示すパターン３であり、長鎖化（Ｓ７２）を反応セル９０５内で行い、プライマーセットおよび増幅試薬との混合（Ｓ７３）と増幅（Ｓ７４）とを検出セル９１６のＤＮＡチップ９０６上で行うこと以外は、パターン１と同様に手続きを行う。パターン３では、長鎖化反応を反応セル９０５内で行う。その場合、貫通孔９３１ａから流入された試薬チューブ９９０からの混合液は、直ちに反応セル９０５に送られ得る。試薬チューブ９９０内で行う代わりに反応セル９０５内で行うこと以外は上述と同様にして長鎖化が達成され得る。このような検出システムの場合には、測定装置９５０は、温度制御ブロック９４１ａを必ずしも備える必要はない。長鎖化後の反応液は、上述と同様にして検出セル９１６に送られ、検出セル９１６内で増幅反応および検出反応を行うことを除いてパターン１および２と同様に増幅、ハイブリダイズ反応および検出を行い得る。或いは上述した態様により検出セル９１６内で増幅反応を進行させながらハイブリダイズ反応を進行し、更に１つの反応場において検出を行い得る。この場合、検体シリンジ９０２に対応する温度調節ユニットはなくともよい。検出セル９１６内での増幅反応のために、予めＤＮＡチップ上または検出セル９１６内部の何れか１箇所以上の壁面に増幅プライマーと増幅試薬とが固定されていてもよい。これらが溶け出すことで増幅が開始する。このようなパターン３は、増幅反応とハイブリダイズ反応とを同時に進行させながら、ハイブリダイゼーション信号をリアルタイムに測定するのに好ましい。その場合、二本鎖プローブと組み合わせることがより好ましい。その場合、電気化学検出に必要な電極活性物質は、選択された手続きに応じて試薬チューブ９９０内、検体シリンジ９０２内、挿入剤シリンジ９０４内、反応セル９０５内または検出セル９１６内に予め収容または固定しておいてもよく、もし存在するのであれば、そこに含まれる液体に混合しておいてもよい。
【０１２６】
実施形態に従う核酸検出装置は、従来よりも高い精度で簡便に標的核酸を検出または定量することが可能である。また、当該核酸検出装置によれば、従来よりも短時間で標的核酸に関する検査を行うことが可能である。
【０１２７】
６．マルチシリーズについての短鎖核酸のマルチプレックス検出法
１つの実施形態に従うと、マルチシリーズについての短鎖核酸のマルチプレックス検出法が提供される。この方法によれば、上述した１つのシリーズのためのマルチプレックス検出法を利用して複数の種類のシリーズについて、試料中の複数種類の短鎖核酸を簡便に検出し得る。
【０１２８】
実施形態において、全てのシリーズについて、１種類のプローブ固定基体を共通して使用し得る。即ち、全てのシリーズに共通して、１種類のプローブセットを使用し得る。また全てのシリーズに共通して１種類のプライマーセットを使用し得る。１つのシリーズ内で使用される検出用領域の配列群を全てのシリーズに共通して使用し得る。１つのシリーズ内で使用される検出用領域の配列群は、そのシリーズ内で検出されるべき複数の標的核酸に対して割り当てられている。例えば、複数種類の検出用領域の配列群を予め用意し、それらに対して第１のシリーズに含まれる標的核酸群のそれぞれを対応付ける。シリーズの数を増やした場合には、それぞれのシリーズに含まれる標的核酸群に対して当該検出用領域の配列群を割り当てる。このような対応付けは、第１のシリーズについての検査を行う前に全てのシリーズについて行っておいてもよく、或いは順次行ってもよく、或いは非常に応じて定期的にシリーズを増やしてもよい。
【０１２９】
このような方法により検出されるべきマルチシリーズに含まれ得る各シリーズは、例えば、複数の短鎖核酸により特徴付けられる共通するテーマ、例えば、ヘルスケア関連情報などであり得る。マルチシリーズは例えば、互いに異なる複数の健康状態の指標の組み合わせ、異なる疾患、例えば、癌、糖尿病、バセドウ病、膠原病などの組み合わせ、異なる遺伝子関連疾患の組み合わせ、異なる癌種の組み合わせ、例えば、乳癌、大腸癌または肺癌などの組み合わせ、特定の個人の身体状態を示す複数の検査項目の組み合わせなどであり得る。それらの組み合わせは、実施形態に従う検出方法の実施者が自由に選択することが可能である。例えば、１つのシリーズの検査またはマルチシリーズの検査に先駆けて全体的に決定されていてもよく、所望に応じて順次選択されてもよく、所望に応じて異なる時期に更なる検査が追加されてもよい。
【０１３０】
例えば、複数のシリーズについての実施形態は、第１〜第ｎのシリーズを分析する方法であり得る。その場合、第１〜第ｎのシリーズ内のそれぞれについて予め定められた標的核酸群を小項目セットとして含み、前記小項目セットは複数種類の小項目を含んでおり、前記複数種類の小項目が前記複数の標的核酸群のそれぞれを検出することに対応し得る。複数種類の小項目セットは、互いに独立した数で複数の当該標的核酸を含み、それらの数は互いに同じであるか、異なり得る。
【０１３１】
プローブ固定基体は、第１〜第ｎのシリーズ（ｎは２以上の整数である）で共通するユニバーサルプローブ固定基体であり、シリーズのそれぞれについて、シリーズ毎に独立して小項目セットに対応する複数種類の標的核酸を検出するために、
（ａ）複数の標的配列のそれぞれについて、標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備することと、
（ｂ）第１の増幅用領域に結合する第１のプライマーと、第２の増幅用領域に結合する第２のプライマーとを含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルプライマーセットを準備することと、
（ｃ）基体と、基体によって提供される第１の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備することと、
（ｄ）試料と、（ｂ）で準備された長鎖化核酸セット群とを第２の反応場に持ち込み、
複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する第１のサブ長鎖化核酸および対応する第２のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および／または核酸伸長によって、複数の標的核酸のそれぞれについて、第１のサブ長鎖化配列と第２のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
（ｅ）第３の反応場において、長鎖核酸群と前記ユニバーサルプライマーセットとを増幅条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
（ｆ）第１の反応場において、（ｅ）で生じた全ての増幅産物群と第１のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および／または量を検出することと、
（ｇ）（ｆ）の結果に基づいて、試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと、
更に、
（ｈ）前記（ｇ）の結果に基づいて、前記第１〜第ｎのシリーズのそれぞれについての分析結果を得ること、
（ｉ）所望に応じて、第ｎ＋（１〜ｓ）の更なるシリーズについて追加して前記（ａ）〜前記（ｇ）を行い、その結果に基づいて前記第ｎ＋（１〜ｓ）の更なるシリーズについての分析結果をそれぞれ得ること、ここで、ｓは２以上の整数である
を含み得る。
【０１３２】
更に、実施形態に従えば、第１〜第ｎの小項目セットがそれぞれに含む小項目数は、ｍ１個〜ｍｎ個であり、第１〜第ｎの小項目セット群における最大値はｍｍａｘであり、ｍおよびｎは互いに独立して２以上の整数であり、第１〜第ｎのシリーズのうちの任意の第ｘのシリーズは、対応する当該第ｘの小項目セットを用いて分析され、当該第ｘの小項目セットは、第１ｘ〜第ｍｘの小項目を含み、１≦ｍｘ≦ｍｍａｘであり得る。
【０１３３】
ここにおいて、第１の反応場と第３の反応場が共通した１つの反応場であり、増幅反応と検出信号の検出および／または測定を同期間内に進行させ、検出信号を継続してモニタリングする、または経時的に複数の時点で検出若しくは測定し得る。
【０１３４】
このような実施形態により、１つのシリーズに関しては、そこに含まれる複数種類の短鎖核酸を簡便に、同時期内に検出することが可能となり、そのような効果を複数種類のシリーズについて得ることが可能となる。
【０１３５】
７．組み合わせ分析キット
実施形態によれば組み合わせ分析キットが提供される。これは、実施形態に従う検出方法を行うためのアッセイキットであり、以下キットとも称する。キットは、上述の何れかの２種類以上の長鎖化核酸セットを含む１シリーズ分の長鎖化核酸セット群、ユニバーサルプライマーセット、２種類以上のプローブを備えるプローブ固定基体を含み得る。アッセイキットは更に、任意に長鎖化試薬、増幅試薬、例えば酵素、基質、緩衝剤または緩衝液など、ハイブリダイズ試薬、例えば、塩など、洗浄剤、例えば洗浄液、標識物質、例えば電極活性物質、二本鎖認識物質など、取扱説明書並びにそれらの何れかの組み合わせなどを含み得る。
【０１３６】
プローブ固定基体は、２種類以上のプローブ群を固定して備える。プローブ固定基体は、更に例えば長鎖化核酸セット、長鎖化試薬、ユニバーサルプライマーセット、増幅試薬、ハイブリダイズ試薬、洗浄剤、標識物質およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つを遊離可能に固定された状態で備えるか、或いは溶液中に含まれた長鎖化試薬および洗浄剤を、例えば長鎖化試液および洗浄液として備える一体型デバイスとして提供され得る。或いはこれらの要素は、プローブ固定基体とは別体としてキットに含まれてもよい。その場合、長鎖化核酸セット、長鎖化試薬、ユニバーサルプライマーセット、増幅試薬、ハイブリダイズ試薬、洗浄剤、標識物質などおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つが少なくとも１つの試薬チューブに含まれた状態で提供され得る。
【０１３７】
例えばキットは、プローブ固定基体の外部で行われる反応のための試薬チューブを含み得る。試薬チューブは、例えば長鎖化試薬を固体または液体として含み得る。このような試薬チューブを第１のチューブとして備えるキットは、更に第２試薬チューブを備え得る。第２の試薬チューブは、長鎖化核酸セット、長鎖化試薬、ユニバーサルプライマーセット、増幅試薬、ハイブリダイズ試薬、洗浄剤、標識物質などおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つを含み得る。例えば、第２の試薬チューブは、第１の試薬チューブ内に含まれず、一体型デバイス内にも備えられていない要素を含み得る。
【０１３８】
例えばキットは、１シリーズ毎に作製され得る。上述のマルチシリーズについて短鎖核酸のマルチプレックス検出法を行うためのキットの組み方の例を表１を参照しながら説明する。
【表１】
2017158840.tif 000003
【０１３９】
シリーズＩ，II，III，IVについて検査を行うためのキットＩ、キットII、キットIII、キットIVは、それぞれ標的核酸１１〜１６、標的核酸２１〜２８、標的核酸３１〜３４、標的核酸４１〜４７を検出するためのキットである。ここで、標的核酸は何れも短鎖核酸である。それぞれの標的核酸について特異的な配列をそれぞれの標的配列とする。これらの標的配列のそれぞれに対して検出用領域の配列をそれぞれ割り当てる。その際、標的核酸群１１、２１、３１、４１（即ち、１０Ｎ＋１、１≧Ｎ≧４）については検出用配列Ａ、標的核酸群１２、２２、３２、４２（即ち、１０Ｎ＋２）には検出用配列Ｂ、標的核酸群１３、２３、３３、４３（即ち、１０Ｎ＋３）には検出用配列Ｃ、標的核酸群１４、２４、３４、４４（即ち、１０Ｎ＋４）には検出用配列Ｄ、標的核酸群１５、２５、４５（即ち、１０Ｎ＋５）には検出用配列Ｅ、標的核酸群１６、２６、４６（即ち、１０Ｎ＋６）には検出用配列Ｆ、標的核酸群２７、４７（即ち、１０Ｎ＋７）には検出用配列Ｇ、標的核酸２８（即ち、１０Ｎ＋８）には検出用配列Ｈをそれぞれ割り当てる。これに従って、標的核酸毎に長鎖化核酸セットを作製する。増幅用領域は、全ての群間で共通させる。増幅用領域に従いプライマーセットを準備する。プライマーセットは、全ての群間で共通しているユニバーサルプライマーセットである。プローブ群は、検出用配列Ａ、検出用配列Ｂ、検出用配列Ｃ、検出用配列Ｄ、検出用配列Ｅ、検出用配列Ｆ、検出用配列Ｇ、検出用配列Ｈに相補的な配列またはそれらと同じ配列をそれぞれ有するプローブＡ、プローブＢ、プローブＣ、プローブＤ、プローブＥ、プローブＦ、プローブＧ、プローブＨを含み得る。プローブ群の配列は、増幅産物の配列を考慮して検出用領域の配列に相補的な配列であるのか、同じ配列であるのかを選択し得る。或いは両方の配列をそれぞれ含む２種類のプローブを用意し得る。これらのプローブ群をプローブ固定基体の反応場が形成される面に種類毎に固定する。プローブ固定基体の態様は、所望に応じて選択する。例えば、プローブ群は、プローブ固定基体をＤＮＡチップとして作製し、それを上述の一体型デバイスの検出セル内に固定されて提供され得る。シリーズ間で共通するプローブ群を搭載している共通する一体型デバイス、即ち、ユニバーサル一体型デバイスを用いることによって共通する測定装置が使用が可能となる。このような一体型デバイスをカートリッジとして提供することにより検査の汎用性が向上する。
【０１４０】
組み合わせ分析キットは、そこに含まれる要素が例えば異なる時点で提供元、例えば製造者または販売者などの提供者から提供先、例えば使用者、例えば病院、検査機関、研究施設および対象、例えば被検者および患者などに提供されてもよい。例えば、対応する測定装置を所有する提供先が、組み合わせ分析キットを使用する場合、第１のシリーズとして検査すべき複数の短鎖核酸のための組み合わせ分析キットを入手し得る。
【０１４１】
組み合わせ分析キットは、例えば第１のシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するための長鎖化核酸セットを収容している第１の試薬チューブおよび一体型デバイスを含む。例えば一体型デバイスは、上記の一体型デバイス９０１であり、検体シリンジ９０２内壁に遊離可能に固定されている長鎖化試薬、洗浄液シリンジ９０３に収容された洗浄液、挿入剤シリンジ９０４に収容された標識物質液、反応セル９０５内に遊離可能に固定されているユニバーサルプライマーセットおよび増幅試薬、検出セル９１６内部に固定されているＤＮＡチップ９０６にアレイ状に配置された電極上に固定されている複数種類のプローブセットおよび／または検出セル９１６内壁に遊離可能に固定された塩を備え得る。
【０１４２】
更なる態様において、組み合わせ分析キットは、例えば第１のシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するための長鎖化核酸セットを収容している第１の試薬チューブおよび一体型デバイスを含む。例えば一体型デバイスは、増幅反応とハイブリダイズ反応とを１つの反応場において行うように構成されている一体型デバイス９０１であり、反応セル９０５内壁に遊離可能に固定されている長鎖化試薬、洗浄液シリンジ９０３に収容された洗浄液、挿入剤シリンジ９０４に収容された標識物質液、検出セル９１６内部に固定されているＤＮＡチップ９０６にアレイ状に配置された電極上に固定されている複数種類のプローブセット、遊離可能に固定されているユニバーサルプライマーセットおよび増幅試薬を備え得る。何れの態様においてもプローブセットは、上述の何れかのプローブであるが、例えば二本鎖プローブであり得る。
【０１４３】
ここにおいて、複数の一体型デバイスが先に提供先に納品されており、所望の検査項目についての検査が必要になった時に、順次に検査されるべきシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するための複数の長鎖化核酸セットを収容している試薬チューブが提供先に納品されてもよい。或いは複数の種類のシリーズのための第１の試薬チューブと、対応する複数個の一体型デバイスとが一緒に納品されてもよく、第１の試薬チューブの種類数と一体型デバイスの個数とが異なっていてもよく、同じであってもよい。或いは特定のシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するために必要とされる構成要素の一揃いが、シリーズ毎に提供されてもよい。或いは単一のシリーズについてのマルチプレックス検出を行うために必要とされる構成要素の一揃いを含む組み合わせ分析キットが一つの纏まりを形成している状態で組み合わせ分析キットとして提供されてもよい。
【０１４４】
或いは例えば、対応する測定装置を所有する第１の提供先と、病院などの検査機関など、試料材料を対象から採取する第２の提供先に対して、それぞれ第１の提供先には一体型デバイスが納品され、第２の提供先には、検査されるべきシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するための複数の長鎖化核酸セットを収容している試薬チューブが提供されてもよい。
【０１４５】
即ち、実施形態の組み合わせ分析キットは、そこに含まれる複数の要素が、互いに時間的および／または空間的に離れていてもよい。或いはそこに含まれる互いに異なる複数の要素の数が、必ずしも互いに対応しておらずともよい。
【０１４６】
当該キットは、
（１）互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬と、
（２）試薬と組合されて提供される、増幅産物を検出するための少なくとも１つのプローブ固定基体とを備え得る。
【０１４７】
このとき、複数の標的核酸のそれぞれは、５’端に第１のサブ標的配列を有し、３’端に第２のサブ標的配列を有する短鎖核酸であり、試薬が、
（ａ）複数の標的核酸のそれぞれに対応する第１のサブ長鎖化核酸および第２のサブ長鎖化核酸を含む複数の長鎖化核酸群と、
（ｂ）前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第１の増幅用領域に結合する第１のプライマーと、前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第２の増幅用領域に結合する第２のプライマーとを含むプライマーセットと、
を含み得る。
【０１４８】
例えばプライマーセットがＰＣＲ法のためのものであるとき、第１のプライマーと第１のプライマーとの組み合わせが、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせであってよく；更に
複数の標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であり、ここで、ｍは２以上の整数であり、
複数の標的配列は、標的核酸に対応して第１〜第ｍの標的配列であり、第１のサブ標的配列は、複数の標的配列に対応して第１１〜第１ｍのサブ標的配列あり、第２のサブ標的配列は、複数の標的配列に対応して第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、
第１の増幅用領域の配列は、第１１〜第１ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、第１の増幅用領域は、第１のプライマーの配列に結合する配列を含み、
第２の増幅用領域の配列は、第２１〜第２ｍのサブ長鎖化核酸間で共通しており、第２の増幅用領域は、第２のプライマーの配列に結合する配列を含み得る。
【０１４９】
増幅条件がＬＡＭＰ法の反応条件であるとき、標的核酸は第１〜第ｍの標的核酸であってよく、ここで、ｍは２以上の整数であり、
複数の標的配列は、複数の標的核酸のそれぞれに対応している第１〜第ｍの標的配列であり、第１のサブ標的配列は、複数の標的配列のそれぞれに対応している第１１〜第１ｍのサブ標的配列であり、第２のサブ標的配列は、標的配列のそれぞれに対応している第２１〜第２ｍのサブ標的配列であり、第１の増幅用領域は、Ｆ２結合領域であり、更に前記第１のサブ長鎖化核酸はＦ１結合領域を含み、前記Ｆ１結合領域は、前記Ｆ２結合領域と第１のサブ標的結合領域との間に存在してよい。例えば、第１の検出用領域が第１のサブ長鎖化配列に含まれる場合には、第１の検出用領域は、第１のサブ長鎖化核酸上でＦ１結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からＦ２結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つＦ２結合領域に重複しない領域を含み得る。第２の増幅用領域の配列は、Ｂ２結合領域であり、更に第２のサブ長鎖化核酸はＢ１結合領域を含み、Ｂ１結合領域は、Ｂ２結合領域と第２のサブ標的結合領域との間に存在し得る。第２の検出用領域が第２のサブ長鎖化配列に含まれる場合には、第２の検出用領域は、第２のサブ長鎖化核酸上でＢ１結合領域の５’端の５’側塩基からＢ２結合領域の５’端よりも３’側の範囲に存在し得る。第１のプライマーが、５’端にＦ１ｃ配列を含み、３’端にＦ２配列を含むＦＩＰプライマーであり、第２のプライマーが、５’端にＢ１ｃ配列を含み、３’端にＢ２配列を含むＢＩＰプライマーであり得る。第１の検出用領域が、標的配列のそれぞれに対応して第１１〜第１ｍの検出用領域であり、第２の検出用領域が、標的配列のそれぞれに対応して第２１〜第２ｍの検出用領域であり得る。プローブは、第１の検出用領域および／または第２の検出用領域に対応して第１１〜第１ｍのプローブおよび／または第２１〜第２ｍのプローブであり得る。
【０１５０】
更なる実施形態によれば、当該試薬が、第１のシリーズに対応付けられた第１の試薬であり、第１の試薬のための複数の標的配列が、第１のシリーズに関連する標的核酸群であってもよい。組み合わせ分析キットは、プローブ固定基体と、上記の第１の試薬と組み合わせて提供される、第２〜第ｎのシリーズにそれぞれ対応付けられた第２〜第ｎの試薬のうちの少なくとも１つ、および第２〜第ｎの試薬のうちの少なくとも１つと組合されて提供され得る。
【０１５１】
第２〜第ｎの試薬のそれぞれは、第２〜第ｎのシリーズ毎に対応付けられた当該試薬であり、シリーズ内で互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬であり、および／または
第１〜第ｎのシリーズ毎に予め定められたｍ１〜ｍｎ個の小項目をそれぞれに含む第１〜第ｎの小項目セットが設定されていてよい。第１〜第ｎの小項目セットがそれぞれに含む小項目数は、ｍ１個〜ｍｎ個であり、ｍ１〜ｍｎは互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。第１〜第ｎの小項目セットにおける最大値はｍｍａｘであり、ｍおよびｎは互いに独立して２以上の整数であり、第１〜第ｎのシリーズのそれぞれに含まれる小項目の種類は、前記シリーズ間で少なくとも一部分が互いに異なっていてもよい。第１〜第ｎのシリーズのうちの任意の第ｘのシリーズは、対応する第ｘの小項目セットを用いて分析され、第ｘの小項目セットは、第１ｘ〜第ｍｘの小項目を含み、１≦ｍｘ≦ｍｍａｘであり得る。
【０１５２】
第１ｘ〜第ｍｘの小項目は、互いに異なる配列を有する第１〜第ｍｘの標的配列をそれぞれに有する第１ｘ〜第ｍｘの標的核酸の存在または存在量に関する情報をそれぞれ得ることであり、第ｘの小項目セットに含まれる第１〜第ｍｘの標的配列は、第ｘのシリーズ内で共通するのテーマに関連する標的核酸群であり得る。第１ｘ〜第ｍｘの標的配列のそれぞれが、５’端に第１１ｘ〜第１ｍｘのサブ標的配列をそれぞれ含み、３’端には第２１ｘ〜第２ｍｘのサブ標的配列をそれぞれ含んでいてもよい。
【０１５３】
検出用領域およびプローブについてはシリーズ間で必要とされる種類数は異なるものの、プライマーセット、プローブ群、例えば、一体型デバイスなどのプローブ固定基体は、複数のシリーズに亘って共通して使用できる。このような共通している構成要素の構成を固定することによって、容易に低コストのアッセイキットを組むことが可能となる。またこのようなアッセイキットであれば、提供者側も消費者側もアッセイキットの在庫管理が簡便になり、ランニングコストを下げることも可能となる。
【０１５４】
８．組み合わせ分析キット供給管理方法
実施形態は、上述のマルチシリーズについて短鎖核酸のマルチプレックス検出法を行うために組み合わせ分析キットの提供を管理する方法である。
【０１５５】
図１１を参照しながら当該提供方法の例について説明する。この方法は、上述した何れかの組み合わせ分析キットを提供する方法であり得る。例えば、当該キットは、１つのシリーズに含まれる複数の標的核酸を検出するための長鎖化核酸セットを収容している試薬チューブと、ユニバーサル一体型デバイスとを含む。ユニバーサル一体型デバイスは、検体シリンジ９０２内壁に遊離可能に固定されている長鎖化試薬、洗浄液シリンジ９０３に収容された洗浄液、挿入剤シリンジ９０４に収容された標識物質液、反応セル９０５内に遊離可能に固定されているユニバーサルプライマーセットおよび増幅試薬、検出セル９１６内部に固定されているＤＮＡチップ９０６にアレイ状に配置された電極上に固定されている複数種類のプローブセット、検出セル９１６内壁に遊離可能に固定された塩を備え得る。このような組み合わせ分析キットの場合、ユニバーサル一体型デバイスは、例えば常に同じ構成を有し得る。一方、長鎖化核酸は、シリーズ間で異なっており、検査されるべき対象により特定のシリーズが選択され得る。このような構成であるため、ユニバーサル一体型デバイスの管理については一括して制御することが可能である。
【０１５６】
例えば、図１１に示すように当該キットの在庫状況をクラウド１０００にデータベース１０１０として保存することが可能である。このデータベース１０１０には、当該キットの提供元１０２０が自社の有する在庫情報を保存し得る。提供元１０２０が有する工場１０３０は、製造が進行中のキットの在庫情報を保存し得る。提供元からのキットを保持している問屋１０４０は、その在庫情報をそこ保存し得る。キットを使用する第１の使用施設１０５０および第２の使用施設１０６０も在庫情報をそこに保存し得る。これらの在庫情報によりデータベース１０１０を作製する。これらの情報に基づいて、例えば提供元が備える管理システム１０２１、例えば、コンピュータが当該キットの供給管理を行う。在庫情報は、例えばキット数および各キットの構成要素の数、並びにシリーズの種類など、シリーズが含む標的配列の情報、製造中のキットの数および種類、キットまたは各要素の製造年月日、使用可能期限に関する情報などであり得る。
【０１５７】
図１１に実施形態の１例における手続きの概要を示す。例えば、第１の使用施設１０５０が病院などの医療機関である場合、診察室において医師が検査の第１のシリーズの検査を行うというオーダーを出し得る（Ｓ１０１）。オーダーは、管理システム１０２１に送られる。オーダーを受けて管理システム１０２１は、クラウド１０１０のデーターを検索（Ｓ１０２）し、例えば施設１０５０に地理的に最も近くにあり且つ使用期限に時間的に最も近いキットを特定し、そのキットを施設１０５０に送るように指示を出す（Ｓ１０３）。この指示に従って、オーダーされたキットが施設１０５０に送られる。送られるキットは、例えば製造元１０２０、工場１０３０、問屋１０４０、第２の施設１０６０などが所有する在庫に含まれているものであり得る。施設１０５０に送られるキットを選定する条件は、所望に応じて予め定められた条件であればよく、またそれは任意に変更することが可能である。そのような条件は、例えば地理的に提供先に近いまたは最も近いこと、使用期限に時間的に近いまたは最も近いこと、ルーチン化された物流があり、他品との同時輸送が可能なことなどが設定され得る。また、在庫情報は、その在庫を有する場所と紐付けられ得る。クラウド１０１０に含まれるデータは、テーブルとして存在してもよく、それ自身公知のデータの集合体として存在してもよい。
【０１５８】
或いは管理システム１０２０が、クラウド１０００をモニターしていてもよい。施設１０５０からのオーダー（Ｓ１０１）は、クラウド１０００に送られ、オーダー記憶部に記録され得る。管理システム１０２１は、クラウド１０００に新たに追加された当該オーダーを検知し、クラウド１０００の在庫データーを検索し（Ｓ１０３）、例えば試薬チューブについては、それを製造した後に施設１０５０に送るように工場１０３０に指示し、一体型デバイスについては、施設１０５０に地理的に近くの何れかの場所にあるものを施設１０５０に送るように指示を出す。この指示に従って、オーダーされたキットは、構成要素ごとに施設１０５０に送られる（Ｓ１０４）。
【０１５９】
例えば施設１０５０内に試薬チューブのみが存在している場合、当該医師のオーダー（Ｓ１０１）を受けた信号を管理システムがクラウド１０１０内で検知し、施設１０５０に試薬チューブがあることを施設１０５０の検査実施部（図示せず）に知らせ（Ｓ１０４）、一体型デバイスについては上述の方法に従って、施設１０５０に送るように指示を出す（Ｓ１０４）。
【０１６０】
上述ではクラウド１０００を用いる例を示したが、クラウド１０００の代わりに管理システム１０２０がデータベースを有し、そこに情報が保存されてもよい。その場合、オーダーに関する信号などのクラウド１０００に送られる情報やクラウド１０００から送られる情報は、管理システム１０２０に送られ、それに基づいて移行の手続きが上述のように行われ得る。
【０１６１】
クラウド１０００が含む在庫情報は、長鎖化核酸セットに関する情報とプローブ固定基体、例えば、ユニバーサル一体型デバイスに関する情報が独立して存在し得る。また使用者からのオーダーは、特定のシリーズを検査するためのキット一式であってもよく、その一部分、例えば、長鎖化核酸セットまたはプローブ固定基体のどちらか一方であってもよい。
【０１６２】
このような提供方法により、検査実施者においては、より簡便にキットを入手可能となり、簡便に複数の短鎖核酸を同時期に検出することが可能となる。このようなキットにより、提供者側も消費者側もキットの在庫管理が簡便になり、ランニングコストを下げることが可能となる。また、例えば使用期限の最も近いキットを優先的に使用するように管理することにより、無駄な在庫を生有することなく、また工場における過剰な製造が防止で得る。
【０１６３】
［例］
以下の例においては、サブ長鎖化核酸を長鎖化核酸と略す。また、例において参照される図面の符号については、上述にて引用された図面と符号とは別系統のものとして番号を割り振った。
【０１６４】
１．ＬＡＭＰによる短鎖核酸のマルチプレックス検出
（１）長鎖化核酸の準備
表２に示すｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７−ａ（配列番号１）を検出するために実施形態に従って、図１２（ａ）に示す長鎖化核酸２（それぞれ配列番号４および５）および長鎖化核酸３（配列番号１０）を用意した。配列番号４は合成ＤＮＡオリゴ、配列番号５は３’端の２塩基がＲＮＡであるキメラ合成オリゴである。
【表２】
2017158840.tif 000004
【０１６５】
配列番号１０は５’端がリン酸化された合成ＤＮＡオリゴである。サブ長鎖化核酸２に含まれる増幅用配列４、検出用配列５、プライマー結合配列６は、それぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８である。ｍｉＲＮＡとアニールする標的結合領域７の配列（標的短鎖核酸部分相補鎖７）は配列番号９である。長鎖化核酸３に含まれるｍｉＲＮＡとアニールする標的結合領域８の配列（標的短鎖核酸部分相補鎖８）は配列番号１１である。プライマー結合配列９、増幅用配列１０、増幅用配列１１は、それぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４である。また、ライゲーション反応のポジティブコントロールとして、長鎖化核酸２および長鎖化核酸３を連結した合成オリゴＤＮＡ配列番号１５を用意した。各配列についての詳細を表３および表４に記す。また表中では、プライマー結合配列を増幅用配列と記載する。
【表３】
2017158840.tif 000005
【表４】
2017158840.tif 000006
【０１６６】
（２）標的短鎖核酸の長鎖化
長鎖化核酸２と長鎖化核酸３のライゲーションを以下のように電気泳動で確認した。２０μＬの反応溶液にて、何れも終濃度で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２０μＭのＡＴＰ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを２０ＵおよびｍｉＲＮＡ（配列番号１）、長鎖化核酸２（配列番号４，５）および長鎖化核酸３（配列番号１０）をいずれについても３３ｐｍｏｌずつ添加し、６５℃５分、３０℃１０分でアニールした。その後、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２を２Ｕで添加して３９℃３５分インキュベートしてライゲーションした。反応液の１０μＬをＥ−Ｇｅｌ  Ｅｘ  ２％（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にて電気泳動した。その結果を図１２（ｂ）に示す。そこに示される通り、標的短鎖核酸が存在し、長鎖化核酸２としてＲＮＡキメラを用いた場合にライゲーション産物の生成を確認できた。
【０１６７】
（３）増幅鋳型の増幅
次に、低濃度のｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７−ａ（配列番号１）をライゲーションし、得られた増幅用鋳型を用いてＬＡＭＰ増幅を行った。ｍｉＲＮＡを０．２ｆｍｏｌと、長鎖化核酸２（配列番号５）および長鎖化核酸３（配列番号１０）をそれぞれ０．２ｆｍｏｌずつとを混合し、１０μＬ反応液で、上記（２）記載の反応条件にてライゲーションを行った。続いて、１５μＬの反応液を以下の組成となるよう添加して６３℃９０分のＬＡＭＰ増幅を行った。ＬＡＭＰ反応液組成は次の通りである：何れも終濃度で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、３０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８ＭのＢｅｔａｉｎｅ、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．６μＭのＦＩＰ（配列番号２０）、１．６μＭのＢＩＰ（配列番号２１）、０．８μＭのＬＦ（配列番号２２）および８ＵのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。反応はいずれも２連で行った。結果、ｍｉＲＮＡを添加してライゲーションしたものでは、平均３３分で濁度が立ち上がったが、ｍｉＲＮＡを添加せずにライゲーションしたものでは９０分増幅後も濁度が立ち上らなかった。ｍｉＲＮＡ存在下でライゲーションしたもののみ、ＬＡＭＰ増幅されることが確認された。さらに、増幅産物の特異性を確認するため、ライゲーションＰＣ（配列番号１５）を同様にＬＡＭＰ増幅した産物と共に、制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉで断片化して電気泳動した。その結果は図１３に示す通りである。ｍｉＲＮＡを介してライゲーションしたサンプルはポジティブコントロールと同じバンドパターンとなり、特異性が確認された。
【０１６８】
（４）増幅産物の検出
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６の核酸プローブを搭載したＤＮＡチップを以下のように作成した。各配列の詳細を表５に示す。
【表５】
2017158840.tif 000007
【０１６９】
３’末端がチオールで修飾されているプローブＤＮＡを３μＭとなるよう１００μＭメルカプトヘキサノール溶液で調製し、ガラス上にφ２００μｍで形成した金電極に１００ｎＬスポット（各Ｎ＝４）して固定した。乾燥後、超純水で洗浄、風乾しＤＮＡチップを得た。上記（３）で増幅したＬＡＭＰ産物を９５℃５分で熱処理し、終濃度が２×ＳＳＣ緩衝液となるよう２０×ＳＳＣ緩衝液を添加したのちに、ＤＮＡチップ上に載せて６５℃１０分ハイブリダイゼーションを行った。その後、０．２×ＳＳＣ緩衝液で置換して３５℃で３分間放置して洗浄し、次に７５μＭヘキスト３３２５８を含むＰＩＰＥＳ緩衝液に置換し２５℃で１分放置して、二本鎖ＤＮＡにヘキスト３３２５８を結合させた。電極に１００ｍＶ／ｓｅｃで電位掃引してヘキスト３３２５８の酸化電流を測定した。
【０１７０】
その結果、図１４に示す通りである。ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７−ａのプローブ（配列番号２３）を固定した電極からは平均９７．９ｎＡの高い電流値が得られ、無関係な配列すなわちネガティブコントロール（配列番号２６）を固定した電極からは平均２５ｎＡと低い電流値となった。このようにＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーションにより電気化学的信号を得ることができた。
【０１７１】
以上のことから、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７−ａに二つの長鎖化核酸をアニールさせてライゲーションし、それを増幅鋳型にすることにより特異的にＬＡＭＰ増幅することができ、さらにその産物は電気化学的ＤＮＡチップで検出できることが示された。
【０１７２】
（５）マルチプレックス検出
次に、ｍｉＲＮＡ  ３種ｌｅｔ−７−ａ（配列番号１）、ｍｉＲ  ２１−５ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ  ２１−３ｐ（配列番号３）のマルチプレックス検出を行った。３者に対し、サブ長鎖化核酸２としてそれぞれ配列番号５、配列番号１６、配列番号１８を、サブ長鎖化核酸３としてそれぞれ、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１９を用意した。ｍｉＲＮＡ、サブ長鎖化核酸２、サブ長鎖化核酸３をそれぞれ０．２ｆｍｏｌずつ混合した。これらを上記（３）に記載の条件にて、ライゲーションおよびＬＡＭＰ増幅を行った。ＬＡＭＰ増幅用のプライマーは上記（３）と同じくＦＩＰ（配列番号２０）、ＢＩＰ（配列番号２１）、ＬＰ（配列番号２２）である。なお、増幅時間は６０分に短縮した。増幅後のマルチ増幅産物をｌｅｔ−７−ａプローブ（配列番号２３）、２１−５ｐプローブ（破裂番号２４）、２１−３ｐ（配列番号２５）およびネガティブコントロール（配列番号２６）を搭載した４枚のＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ１、ＤＮＡチップ２、ＤＮＡチップ３、ＤＮＡチップ４）それぞれについて上記（４）に記載の方法で同様に測定した。ＤＮＡチップ１、ＤＮＡチップ２、ＤＮＡチップ３、ＤＮＡチップ４に持ち込んだ試料は、サンプルＡ、サンプルＢ、サンプルＣ、サンプルＤであり、これらの試料にはそれぞれ表６−１中で「＋」で示されている標的核酸を含ませた。その結果を表６−２に示す。
【表６−１】
2017158840.tif 000008
【表６−２】
2017158840.tif 000009
【０１７３】
表７−２中に太枠で示されているカラムが陽性結果を示しているが、この結果は、各サンプルが含む標的核酸の種類と一致している。この結果から、いずれのプローブからもシグナルが得られ、サンプルの状態を正確に示すことが明らかになった。したがって、同一容器内での標的３種のライゲーション、ＬＡＭＰによる増幅反応を行い、それぞれに対応したＤＮＡチップ検出が可能であることが示された。なお、同表に示す通り、単独での検出で各プローブの特異性についても確認された。
【０１７４】
以上のことから、本実施形態によれば、複数の標的短鎖核酸を簡便にマルチプレックス長鎖化、増幅および検出できる方法およびキットを提供することができることが示された。
【０１７５】
２．長鎖化核酸の二本鎖化による反応効率向上 
長鎖化核酸を安定化するために、サブ長鎖化核酸を部分的に二本鎖化することにより、反応を効率化することができる。サブ長鎖化核酸２（配列番号５）に配列番号２７を、長鎖化核酸３（配列番号１０）に配列番号２８の合成ＤＮＡをそれぞれアニールさせて一部を二本鎖化した。
【表７】
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【０１７６】
その後、０．２ｆｍｏｌずつをｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７−ａ（配列番号１）の１Ｅ＋４〜８コピーと混合し、１０μＬ反応液で、上記（２）記載の反応条件にて、ライゲーションを行った。続いて、１５μＬの反応液を以下の組成となるよう添加して６３℃９０分ＬＡＭＰ増幅を行った。ＬＡＭＰ反応液組成は次の通りである：何れも終濃度で２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、３０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．８ＭのＢｅｔａｉｎｅ、１．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．６μＭのＦＩＰ（配列番号２０）、１．６μＭのＢＩＰ（配列番号２１）、０．８μＭのＬＦ（配列番号２２）、および８ＵのＢｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。反応はいずれも２連で行った。比較として、二本鎖化していない長鎖化核酸を用いたものも同様に増幅した。９０分の増幅後、制限酵素  Ｈｉｎｆ  Ｉで断片化して電気泳動したところ、図１５に示す結果となった。ライゲーションＰＣと同じバンドパターンが得られ特異増幅されたと判断できたものは、長鎖化核酸を二本鎖化せずに用いた場合には、ｍｉＲＮＡ １Ｅ＋８コピーまでであったが、長鎖化核酸を二本鎖化して用いた場合には、ｍｉＲＮＡ １Ｅ＋７〜６コピーまでで、より低濃度のｍｉＲＮＡを検出することができた。
【０１７７】
以上の結果から、実施形態により複数種類の短鎖核酸を簡便に検出することができることが明らかとなった。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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