(57)【要約】  オイル中に分散した複数の液滴４が線状の流れに沿って移動するフロー列を配列平面上に複数列保持する流路部と，流路部の複数のフロー列が配列されている方向にレーザビーム３を導入し，複数のフロー列を照射するレーザビーム照射部と，レーザビームの照射によって複数のフロー列から発生される発光を，配列平面に対して垂直方向から検出する光検出部とを有する。オイルの屈折率ｎｏと液滴の屈折率ｎｄの差は，−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５である。
2017033224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿ってフロー列を配列平面上に複数列保持する流路部と，
前記流路部の前記複数のフロー列が配列されている方向にレーザビームを導入し，前記複数のフロー列を照射するレーザビーム照射部と，
前記レーザビームの照射によって前記複数のフロー列から発生される発光を，前記配列平面に対して垂直方向から検出する光検出部とを有し，
前記オイルの屈折率ｎｏと前記液滴の屈折率ｎｄの差が−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５である光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の光検出装置において，
前記オイルの屈折率ｎｏと前記液滴の屈折率ｎｄの差が−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３である光検出装置。
【請求項３】
請求項１記載の光検出装置において，
前記液滴の屈折率ｎｄがｎｄ＝１．３３であり，
前記オイルの屈折率ｎｏが１．３０≦ｎｏ≦１．３４である光検出装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，マイクロチップ内の前記配列平面上に配列した複数のチャンネルの内部に形成され，
前記複数のチャンネルは，断面形状が四角形であり，前記レーザビームが透過する側面と前記配列平面のなす角度が９０±１．５度の範囲内である光検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の光検出装置において，
前記複数のチャンネルは，前記照射される前記レーザビームの光軸方向の幅が，前記液滴が球状になった場合の球の直径よりも小である光検出装置。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは外径が２２７μｍ以下である光検出装置。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは内径が２５μｍ以上である光検出装置。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは内径に対する外径の比率が４．５以下である光検出装置。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のキャピラリは，内径が，前記液滴が球状になった場合の球の直径よりも小である光検出装置。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，前記レーザビームが照射される部分を，マイクロチップ内に設けられた単一のチャンネルの内部に有する光検出装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，前記レーザビームが照射される部分よりフローの上流の少なくとも一部の部分が，前記マイクロチップ内の同一平面上に配列した複数のチャンネルの内部に有し，
前記単一のチャンネルの前記レーザビームの中心軸方向の幅が，前記複数のチャンネルの幅の総和よりも大である光検出装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の光検出装置において，
前記複数のチャンネルのそれぞれに対して，オイルを追加供給するチャンネルが接続されている光検出装置。
【請求項１３】
請求項１２記載の光検出装置において，
前記のオイルの追加供給の方向が，前記同一平面に対して傾いている光検出装置。
【請求項１４】
請求項１２記載の光検出装置において，
前記のオイルの追加供給の方向が，前記同一平面に対して垂直である光検出装置。
【請求項１５】
請求項１０記載の光検出装置において，
前記流路部に導入されるレーザビームの中心軸が前記配列平面に対して傾いている光検出装置。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は単数又は複数のラインセンサを備える光検出装置。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は波長分散素子と複数のラインセンサを備え，異なる波長の発光をそれぞれ異なるラインセンサで検出する光検出装置。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は複数のフォトマルチプライヤー又は単数のフォトマルチプライヤーアレイを備える光検出装置。
【請求項１９】
請求項１８記載の光検出装置において，
各フロー列から発生される発光をそれぞれ異なる光ファイバを介して前記複数のフォトマルチプライヤー又は前記単数のフォトマルチプライヤーアレイで検出する光検出装置。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記各液滴は，同種かつ等濃度の蛍光体を含んでいる光検出装置。
【請求項２１】
配列平面上に配列された複数の第１のチャンネルと，
前記複数の第１のチャンネルにそれぞれ接続された複数の第２のチャンネルと，
前記複数の第１のチャンネルが融合して形成される単一の融合チャンネルと，
を有するマイクロチップ。
【請求項２２】
請求項２１記載のマイクロチップにおいて，
前記複数の第２のチャンネルの前記複数の第１のチャンネルへの接続方向が，前記配列平面に対して垂直方向であるマイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，オイル中で試料を多数の液滴に分割した後，分析する光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年，オイル中で，試料溶液を，体積がピコリットルからナノリットルのレベルの液滴１万個〜１千万個に分割し，各液滴の内部で試料の成分に基づく反応を生じさせ，各液滴について反応結果を検出することで試料の分析を高精度，高感度に行う液滴デジタル分析法が大きな注目を集めている。分析対象は，核酸，タンパク質等，様々であるが，ほとんどの液滴に分析対象が０個，又は１個含まれるように制御することにより，単一の分析対象由来の反応結果が得られたり，試料に含まれる分析対象の絶対個数を定量できたりするメリットがある。例えば，各液滴に，試料を構成する細胞が０個，又は１個含まれるように制御することにより，単一細胞由来の特定の抗原量の平均や分散を定量することができたり，単一細胞由来の遺伝子変異の比率を定量することができるようになる。中でも，ＰＣＲに応用した液滴デジタルＰＣＲ（以降，ｄｄＰＣＲ（droplet digital PCR））が目覚しく発展を遂げ，研究分野のみならず，診断分野への応用が期待されている。【０００３】
従来の定量ＰＣＲの主要な手法であるリアルタイムＰＣＲは，サーマルサイクル毎の増幅反応の進行度を逐次計測することにより，試料中に元々存在する分析対象遺伝子を定量するものである。しかしながら，この手法を実行するには，予め，分析対象遺伝子の希釈系列のそれぞれの，サーマルサイクル回数に対する増幅反応の進行度を計測し，それを検量線として用いる必要がある。したがって，試料中の分析対象遺伝子の増幅効率が，検量線を取得する際のそれと異なる場合，定量結果が事実と異なる場合が生じる。これに対して，ｄｄＰＣＲは，試料中に元々存在する分析対象遺伝子をデジタルカウントすることによって定量するため，検量線は不要であり，分析対象遺伝子の増幅効率の変化による影響を受けにくいため，簡便かつ高精度な定量ＰＣＲである。例えば，検体からゲノムを抽出した後，それをＰＣＲ試薬ごと多数の液滴に分割し，デジタル化されたＰＣＲ増幅反応を行う。変異の有無に応じて蛍光を発するＴａｑＭａｎプローブなどを利用し，個別の液滴に対する蛍光を計測し，閾値以上のものをデジタル的にカウントする。多数の液滴の採用により低頻度の遺伝子変異を，比較的低コストで見ることができる点が非常に優れている。【０００４】
現在，ｄｄＰＣＲ装置として，Bio-Rad社のＱＸ２００，RainDance Technologies社のRainDrop，等が製品化されている。いずれのｄｄＰＣＲ装置も同様の仕組みである。Bio-Rad社のｄｄＰＣＲ装置の仕組みが非特許文献１の図１に示されている。まず，ｄｄＰＣＲ装置に設置した，樹脂製の液滴形成カートリッジに，ＰＣＲ試薬を含む試料２０マイクロリットル，及びオイルを投入し，陰圧吸引及びフロー・フォーカシング・ノズル機構により，オイル中に体積１ナノリットルの液滴２万個程度を形成する。各液滴は，界面活性剤の添加によって，オイル中で安定化されている。次に，オイル中の多数の液滴を，ピペットで従来のマイクロタイタープレート上のひとつのウエルに移し，従来のサーマルサイクラーを用いてエンドポイントまでＰＣＲを実行する。続いて，再びｄｄＰＣＲ装置において，オイル中の多数の液滴を，陰圧吸引しながら，樹脂製のマイクロチップ内に形成されたチャンネル中に一列に並べてフローさせ，さらにチャンネルにオイルを追加することで液滴間隔を拡大してフローさせ，レーザビームをチャンネルに照射することで個々の液滴を順番に照射し，個々の液滴からの発光蛍光を順番に計測する。ここで，ＰＣＲ前に分析対象遺伝子が含まれた液滴はＰＣＲ後に増幅を受けて強い蛍光を発光するのに対して，ＰＣＲ前に分析対象遺伝子が含まれない液滴はＰＣＲ後に増幅を受けず弱い蛍光のみを発光する。つまり，蛍光強度について適切な閾値を設定し，閾値を超える蛍光強度を持つ液滴の数，閾値を下回る蛍光強度を持つ液滴の数をそれぞれデジタルカウントすることにより，試料に含まれていた分析対象遺伝子の絶対量を高精度に定量する。【０００５】
一方，ｄｄＰＣＲでは，ミネラルオイル，シリコン系オイル，フッ素オイル等，様々な種類のオイルが用いられているが，一般的に，オイルと液滴の屈折率は異なるため，レーザビームが液滴に照射されると，界面で散乱を生じる。特許文献１では，このような液滴     界面での散乱を回避又は低減するため，オイルと液滴の屈折率を一致又は近接させることを提案している。このことにより，液滴内部に存在する細胞由来の散乱光を高感度に検出できるようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2015/015199 A2
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2011, 83, 8604-8610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在，製品化されているいずれのｄｄＰＣＲ装置でも，ＰＣＲ前の液滴形成の工程は８個の試料について並列して行われているのに対して，ＰＣＲ後の液滴の蛍光検出の工程は各試料について順番に行われているため，より長い時間を要している。例えば，RainDance Technologies社のRainDropでは，そのカタログによれば，８個の試料の液滴形成は約３０分で終了するのに対して，各試料の蛍光検出にそれぞれ約３０分を要するため，８個の試料の蛍光検出に約４時間を要している。分析対象の，より高感度，高精度，広ダイナミックレンジな検出を行うためには，各試料について，より多数の液滴を形成すれば良いが，そのようにすると，液滴形成と蛍光検出の各工程に要する時間の差は一層拡大する。また，分析すべき試料の数が８個よりも増えた場合，例えば，９６個の試料を分析する場合，液滴形成の工程の並列度を１２倍向上させ，同じ３０分でその工程を終了させることは比較的容易であるが，蛍光検出の工程は並列化が困難であるため，１２倍の約４８時間という非現実的な時間を要することになる。つまり，ｄｄＰＣＲ装置における液滴の蛍光検出の工程は全体を律速する工程であるため，この工程を高スループット化するができれば，現状の分析時間を大幅に短縮できるのみならず，より高感度，高精度，広ダイナミックレンジな分析を現実的な時間内に完了させることが可能となる。【０００９】
ｄｄＰＣＲ装置の液滴の蛍光検出の工程を高スループット化するには，本工程を並列化すれば良いが，蛍光検出系は大きく，高価であるため，蛍光検出系を単純に並列化すると，ｄｄＰＣＲ装置そのものを並列化することと同等になってしまい，非現実的である。そこで，本発明では，蛍光検出系の大きさやコストを大幅に増大させずに，複数のチャンネルを配列し，各チャンネルをフローする液滴を並列に，速度や感度を落とすことなく蛍光検出することを目標とする。より具体的には，複数のチャンネルを同一のマイクロチップ内の同一平面上に平行に並べ，レーザビームを各チャンネルの長軸に垂直に，かつ上記配列平面に沿って照射する「レーザビーム横入射」により，各チャンネルを照射し，各チャンネル内をフローする各液滴からの発光蛍光を上記配列平面に対して垂直方向から検出することを目指す。【００１０】
しかし，上記のレーザビーム横入射の構成を試みたところ，レーザビームの散乱や屈折の影響により，全く上手く行かないことが判明した。後述する通り，精密な検討の結果，これには大きく二つの独立した原因があることが明らかになった。一つ目の原因は，各チャンネルをフローする液滴とオイルの間に屈折率差があるため，各液滴が凹レンズ又は凸レンズとして働き，さらにそのようなレンズがレーザビームを横切る方向に移動するため，レーザビームが入射軸から拡散したり，進行方向が変動したりして，それよりも後段のチャンネルにレーザビームを効率良く到達させることができないことであった。特許文献１において，液滴とオイルの屈折率を一致又は近接させることによって，レーザビームの液滴界面における散乱を回避又は低減する提案がなされているが，本文献では単一のチャンネルをフローする液滴に含まれる細胞由来の散乱を高感度に検出することが目的であり，本発明が対象とする複数のチャンネルをそれぞれフローする液滴をレーザビーム横入射を用いて蛍光検出することを目的とした検討はなされていない。また，本文献では，液滴とオイルの屈折率差と，液滴のレンズ効果によるレーザビームの挙動の関係を定量的に解析することは一切行われていない。すなわち，液滴とオイルの屈折率のそれぞれの値がいくつであり，それらの屈折率差がいくつであれば，複数のチャンネルに対するレーザビーム横入射が上手く行くか，あるいは上手く行かないが不明である。二つ目の原因は，マイクロチップ内に形成された各チャンネルの両側面が，各チャンネルの配列平面に対して垂直ではなく，テーパー状に傾いていており，かつ液滴又はオイルの屈折率とマイクロチップの部材の屈折率が異なるため，複数のチャンネルの側面を通過するのに伴ってレーザビームが一方向に屈折し，上記の配列平面から逸脱することであった。【００１１】
本発明では，上記の二つ原因をそれぞれ解決することにより，液滴及びオイルがフローする複数のチャンネルに対するレーザビーム横入射を実現する手法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の光検出装置は，オイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿って移動するフロー列を配列平面上に複数列保持する流路部と，流路部の複数のフロー列が配列されている方向にレーザビームを導入し，複数のフロー列を照射するレーザビーム照射部と，レーザビームの照射によって複数のフロー列から発生される発光を，配列平面に対して垂直方向から検出する光検出部とを有する。フロー列は，マイクロチップ内で配列平面上に配列された複数のチャンネルの内部に，あるいは空気中で配列平面上に配列された複数のキャピラリの内部に，あるいはマイクロチップ内で配列平面上に配列された複数のチャンネルを融合してできた単一のチャンネルの内部に形成される。【００１３】
ここで，一つ目の原因に対しては，レーザビーム光線追跡シミュレーションの結果を踏まえ，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏそれぞれの値を問わず，両者の屈折率差を−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすることによって，さらに好ましくは−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすることによって，複数のフロー列に対するレーザビーム横入射を良好に機能させる。つまり，これらの条件を満たすことにより，例えばフロー列を内部に保持するあるチャンネルでオイル中の液滴のレンズ効果によってレーザビームが多少影響を受けても，後段のチャンネルに十分な強度のレーザビームを到達させるようにする。ただし，従来法のＰＣＲ溶液の屈折率は，典型的には，水と同じ屈折率１．３３であるため，液滴の屈折率は典型的にはｎｄ＝１．３３となる。従って，この場合には，オイルの屈折率ｎｏは１．３０≦ｎｏ≦１．３４の範囲内とすることが好適であり，液滴と同じ屈折率１．３３とすることがより好適である。【００１４】
二つ目の原因に対しては，以下の三つの解決策を提案する。第一の解決策は，フロー列を形成するためにマイクロチップ内に設けられた各チャンネルの両側面が，配列平面に対して垂直に近づくようにすることであり，具体的には，両者のなす角度が９０±１．５度に収まるようにする。これにより，レーザビームの配列平面からの逸脱を抑えることが可能となる。このようなマイクロチップは，射出成形等の量産性のある方法により作製することは困難であるが，切削加工等を用いれば作製できる。【００１５】
第二の解決策は，複数のフロー列を，マイクロチップ内に配列した複数のチャンネルによって形成するのではなく，同一平面上に配列した複数のキャピラリ（ガラス製の毛細管）の内空で構成することである。ここで，各キャピラリの周囲の媒質（空気又は液体）の屈折率，キャピラリの材質（ガラス）の屈折率，キャピラリの内部の媒質の屈折率，キャピラリの外径，及びキャピラリの内径をそれぞれ適切に調整することによって各キャピラリが凸レンズとして作用するように制御し，各キャピラリの長軸に垂直かつ配列平面に沿って入射されたレーザビームをキャピラリ配列内で繰り返し集光することで各キャピラリのレーザビーム照射を可能とするマルチフォーカス方式が知られている。本方式は，Life technologies社から製品化されているキャピラリＤＮＡシーケンサであるApplied Biosystems 3500xL ジェネティックアナライザに適用されている。この製品では，２４本のキャピラリを同一平面上に配列し，マルチフォーカス方式により，レーザビーム横入射による２４本のキャピラリのレーザビーム照射及び蛍光検出を行っている。各キャピラリ内部で電気泳動によるＤＮＡシーケンスを行うため，各キャピラリの内部には８Ｍ尿素及び電気泳動分離用ポリマを含む水溶液が充填される。８Ｍ尿素を含む水溶液は屈折率１．４１程度であり，水の屈折率１．３３と比較して大きいことが知られている。【００１６】
一方，本発明においては，液滴の屈折率を１．３３とし，オイルの屈折率を１．３３に近接させることが好適な条件の一つである。ところが，上記製品の構成において，キャピラリの内部の屈折率１．４１の溶液を，屈折率１．３３の溶液で置き換えると，マルチフォーカス方式が機能せず，レーザビーム横入射による２４本のキャピラリの照射及び蛍光検出が不可能である。レーザビーム光線追跡シミュレーションの結果を踏まえ，キャピラリを外径２２７μｍ以下とすることによって，あるいは内径２５μｍ以上とすることよって，あるいは外径／内径を４．５以下とすることによって，各キャピラリの内部を屈折率１．３３の溶液で満たした場合においても，マルチフォーカス方式を機能させ，レーザビーム横入射による２４本，あるいはより多数のキャピラリの照射及び蛍光検出を可能とする。【００１７】
第三の解決策は，マイクロチップ内に形成した複数のチャンネルに液滴及びオイルをフローさせ，それらの下流部において隣り合うチャンネル間の隔壁をそれぞれ取り除き，複数のチャンネルを幅広の単一のチャンネルに融合させ，この融合チャンネル中の配列平面上に形成された複数のフロー列にレーザビームを横入射することにより，レーザビームの各チャンネルの側面における屈折，及び配列平面から逸脱を回避し，複数のフロー列に対するレーザビーム照射及び蛍光検出を可能とすることである。この方法では，個別のチャンネル内を一列に整列しながらフローする液滴が，融合チャンネルにおいて互いに混じり合わないように，各チャンネルから融合チャンネルに移動した液滴及びオイルが層流状態となるマルチシースフロー方式とすることが重要である。なお，単一のチャンネルに融合される複数のチャンネルは，複数のキャピラリで構成することもできる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると，ｄｄＰＣＲを始めとする液滴デジタル分析法の律速部分である検出部を高スループット化することが可能であり，それにより分析の高速化，高スループット化が可能となる。これらの特長は，特に，分析を診断に応用する場合に効果を発揮する。【００１９】
上記した以外の，課題，構成及び効果は，以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】１５本チャンネルを備えるマイクロチップの模式図。
【図２】レーザビームを横入射し，１本目のチャンネル内に距離Ｘが４０μｍの位置に液滴を配置した場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図３】距離Ｘを３０μｍとした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図４】距離Ｘを２０μｍとした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図５】距離Ｘを１０μｍとした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図６】距離Ｘを０μｍとした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図７】液滴の屈折率を１．４７とした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図８】液滴の屈折率を１．４８とした場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図９】１５本のチャンネルのレーザビーム照射効率を示す図。
【図１０】液滴の屈折率を変化させた場合の１本目と６本目のチャンネルのレーザビーム照射効率の変化を示す図。
【図１１】オイルの屈折率を変化させた場合の１本目と６本目のチャンネルのレーザビーム照射効率の変化を示す図。
【図１２】マルチチャンネルを配列したマイクロチップの構成例を示す断面模式図。
【図１３】チャンネル側面の抜き勾配とレーザビーム照射効率の関係を示す図。
【図１４】マルチチャンネルを配列したマイクロチップの構成例を示す模式図。
【図１５】マイクロチップのレーザ照射及び蛍光検出部の構成例を示す概略図。
【図１６】蛍光検出部の変形例を示す模式図。
【図１７】蛍光検出部の変形例を示す模式図。
【図１８】蛍光検出部の変形例を示す模式図。
【図１９】蛍光検出部の変形例を示す模式図。
【図２０】蛍光検出部の変形例を示す模式図。
【図２１】空中に配列したマルチキャピラリを備える光検出装置の概略図。
【図２２】マルチキャピラリにレーザビームを横入射する系において，内径を５０μｍに固定し，外径を変化させた場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図２３】２４本のキャピラリのレーザビーム照射効率を示す図。
【図２４】キャピラリ外径とキャピラリ番号１２のキャピラリに対するレーザビーム照射効率の関係を示す図。
【図２５】マルチキャピラリにレーザビームを横入射する系において，外径を１５０μｍに固定し，内径を変化させた場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図２６】２４本のキャピラリのレーザビーム照射効率を示す図。
【図２７】キャピラリ内径とキャピラリ番号１２のキャピラリに対するレーザビーム照射効率の関係を示す図。
【図２８】マルチキャピラリにレーザビーム横入射する系において，外径を１００μｍに固定し，内径を変化させた場合のレーザビーム光線追跡結果を示す図。
【図２９】２４本のキャピラリのレーザビーム照射効率を示す図。
【図３０】キャピラリ内径とキャピラリ番号１２のキャピラリに対するレーザビーム照射効率の関係を示す図。
【図３１】チャンネルにオイルを追加するマイクロチップの構成例を示す模式図。
【図３２】複数のチャンネルにレーザビーム横入射するマイクロチップの構成例を示す模式図。
【図３３】融合チャンネルを有するマイクロチップの構成例を示す模式図。
【図３４】融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図。
【図３５】融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図。
【図３６】複数のチャンネルの配列平面に対して垂直方向からオイルが追加されるマイクロチップの構成例を示す模式図。
【図３７】融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
最初に，チャンネル配列のレーザビーム横入射に対して，液滴及びオイルがチャンネル内をフローすることがどのような影響を与えるかを，レーザビーム光線追跡シミュレーションにより定量的に調べた。図１に示すように，マイクロチップ１の内部に，複数のチャンネル２を同一平面上に配列する。以降，上記平面を配列平面と呼ぶ。図１（ａ）は各チャンネル２の長軸に垂直なマイクロチップ１の断面模式図であり，図１（ｂ）は配列平面に対して垂直方向から見たマイクロチップ１の正面模式図であり，いずれもレーザビームが照射される部分の近傍のみを描いている。マイクロチップ１の材質は，透明な樹脂又はガラスが好適であるが，ここでは屈折率が１．５３のシクロオレフィンポリマ（ＣＯＰ）とした。１５本のチャンネル２を，間隔２００μｍで平行に配列し，各チャンネル２の断面形状は一辺が５０μｍの正方形とした。各チャンネルには，左側から順番に，Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１５のチャンネル番号を名付ける。各チャンネルの内部は，屈折率が１．４８のミネラルオイルで満たした。それに加えて，図２〜図７では，Ｎｏ．１のチャンネル２に，径４０μｍ，屈折率１．３３の水溶液からなる液滴１個を所定の位置に配置した。ここで，液滴の位置を問わず，液滴の周囲は常にオイルで満たされるようにした。
【００２２】
図２〜図８は，各条件下において，図１のチャンネル配列に対して左側からレーザビーム３を，径４０μｍに絞った状態で，各チャンネル２の長軸に垂直かつ配列平面に沿って照射した場合の，レーザビーム３の光線追跡シミュレーションを行った結果を示している。各図において（ａ）及び（ｂ）は，図１の（ａ）及び（ｂ）と同様に，マイクロチップ１の断面模式図及び正面模式図を示す。図２〜図６における（ｃ）は，Ｎｏ．１のチャンネル２のレーザビーム３が照射される位置の（ｂ）の拡大図を示し，チャンネル２の内部に液滴４が所定の位置に配置されている。これらの図において，液滴４を見やすくするために，液滴４に輪郭を描いている。
【００２３】
レーザビーム３は，３００本の無限小幅のビーム要素で構成され，これらのビーム要素の位置は，径４０μｍの内部で均一かつランダムに配置した。さらに，マイクロチップ１に入射する前のレーザビーム３は，その合計強度を１．００（１００％）とし，各ビーム要素には等しくそれぞれ１／３００（０．３３％）強度を持たせた。光線追跡シミュレーションでは，ビーム要素毎に，マイクロチップ１への入射面，オイルを満たした各チャンネル２への入射面，各チャンネル２からの出射面，水溶液からなる液滴４への入射面，液滴４からの出射面，等の屈折率が変化する位置でその都度，スネルの法則及びフレネルの法則を適用し，屈折光の進行方向と強度を追跡した。ただし，ビーム要素が屈折率が変化する位置で全反射する場合は，反射光の進行方向と強度を追跡した。各図は，そのようにして計算した３００本のビーム要素の光路を示している。以上の光線追跡シミュレーションは３次元モデル上で実行されたが，各図では，見やすくするため，各チャンネル２の長軸に垂直な平面に投影した２次元イメージで示した。また，そのようにして計算した３００本のビーム要素の内，チャンネル２毎に，その内部を透過するビーム要素を抽出し，それらのその位置での強度の合計をレーザビーム照射効率として計算した。つまり，３００本のビーム要素のすべてが強度減衰ゼロでチャンネルの内部を照射するとき，そのチャンネルのレーザビーム照射効率を１．０とした。
【００２４】
図９は，図２〜図６の各条件について，チャンネル番号に対するレーザビーム照射効率を計算した結果である。レーザビーム照射効率は，３次元モデル上で計算した結果で示す。後に，図２２（ａ）及び図２３で説明するように，市販のキャピラリＤＮＡシーケンサと同等以上の蛍光検出感度を得るためには，各チャンネルのレーザビーム照射効率が０．４以上あれば良い。また，各チャンネルのレーザビーム照射効率が０．２以上あれば，実用的な蛍光検出感度が得られることが経験的に分かっている。
【００２５】
図２は，液滴４とレーザビーム３の距離がＸ＝４０μｍの場合の結果を示す図である。ここで，距離Ｘは，レーザビームの中心軸から液滴の中心までの距離を意味する。図２（ｃ）に示す通り，レーザビーム３は液滴４と接触しないため，レーザビーム３は液滴４の影響を受けず，液滴が存在しない場合と同じ挙動を示す。各チャンネル２の断面が正方形であるため，各ビーム要素の各チャンネル２の側面への入射角は常に０度となり，屈折が生じない。したがって，レーザビーム３は，径及び中心軸を変化させずに，チャンネル配列内を進行し，すべてのチャンネル２を串ざし状に効率良く照射している。図９の●プロットは，このときの各チャンネル２におけるレーザビーム照射効率を示す。各屈折率変化点でレーザビーム反射ロスが発生するため，チャンネル番号の増加に伴って僅かにレーザビーム照射効率が減少しているが，各チャンネル２でほぼ等しいレーザビーム照射効率が得られている。
【００２６】
図３は，液滴４とレーザビーム３の距離がＸ＝３０μｍの場合の結果を示す図である。図３（ｃ）に示す通り，レーザビーム３が液滴４と接触し，接触したビーム要素のみが屈折を受けている。液滴４の屈折率１．３３は，周囲のオイルの屈折率１．４８と比較して低いため，液滴４はレーザビーム３に対して凹レンズとして機能する。したがって，図３（ｂ）及び（ｃ）で，液滴４はレーザビーム３の入射中心軸よりも上側に存在するのに対して，上記のレーザビーム３の屈折はそれとは反対側，すなわちレーザビーム３の入射中心軸よりも下側に進行する。一方，液滴４と接触しないビーム要素は，図２と同様に，レーザビーム３の入射中心軸に沿って進み，各チャンネル２の照射に寄与している。図９の▲プロットは，このときの各チャンネル２におけるレーザビーム照射効率を示す。レーザビーム３と液滴４の接触の程度が小さいため，レーザビーム照射効率に対する影響も小さい。液滴４によるレーザビーム３の屈折の影響は，Ｎｏ．１からＮｏ．３のチャンネル２にかけてのレーザビーム照射効率の減少量で示されており，Ｎｏ．３以降のチャンネル２では影響は見られない。
【００２７】
同様に，図４，図５，及び図６はそれぞれ，液滴４とレーザビーム３の距離がＸ＝２０μｍ，１０μｍ，及び０μｍの場合の結果を示す図である。距離Ｘの減少に伴い，レーザビーム３と液滴４の接触の程度が増大し，液滴４の凹レンズ効果が増大し，レーザビーム３のより大きな屈折をもたらしている。図６のＸ＝０μｍでは，液滴４とレーザビームの中心（軸）が一致するため，図６（ｂ）及び（ｃ）で，レーザビーム３の屈折による進行方向が，レーザビーム３の入射中心軸に対して上下対称となっている。図９の■，○，及び△プロットはそれぞれ，図４，図５，及び図６についての各チャンネル２におけるレーザビーム照射効率を示す。距離Ｘの減少に伴い，チャンネル番号に対するレーザビーム照射効率の減衰の程度が増大し，Ｘ＝０では，レーザビーム３の屈折の程度が最大となり，Ｎｏ．６以降のチャンネル２のレーザビーム照射効率がほぼゼロになっている。つまり，液滴４及びオイルの屈折率がそれぞれ一定であっても，液滴４とレーザビーム３の相対位置によって各チャンネル２のレーザビーム照射効率は大きく変化することが明らかになった。
【００２８】
図７は，図６の条件（Ｘ＝０μｍ）で，液滴の屈折率を１．３３から１．４７に上昇させた場合の結果を示す図である。液滴４の屈折率１．４７がオイルの屈折率１．４８に近接した結果，液滴４の凹レンズ効果が減少し，レーザビーム３の屈折の程度が軽減され，レーザビーム横入射による複数のチャンネルのレーザビーム照射及び蛍光検出が可能となることが分かった。さらに，図８は，図６の条件（Ｘ＝０μｍ）で，液滴の屈折率を１．３３から１．４８に上昇させた場合の結果を示す図である。液滴４の屈折率１．４８がオイルの屈折率１．４８と一致した結果，液滴４の凹レンズ効果が消滅し，レーザビーム３の屈折が無くなり，図２のように液滴４が存在しない場合と同様に，レーザビーム３は，径及び中心軸を変化させずに，チャンネル配列内を進行し，すべてのチャンネル２を串ざし状に効率良く照射できることが分かった。
【００２９】
図１０は，図７及び図８の結果を含めて，図６の条件（Ｘ＝０μｍ）で，液滴の屈折率ｎｄを１．３３から１．６３まで変化させた際のレーザビーム照射効率の変化を詳細に調べた結果を示す図である。この際，オイルの屈折率ｎｏは１．４８に固定している。●プロットはＮｏ．１のチャンネル，○プロットはＮｏ．６のチャンネルのレーザビーム照射効率を示す。Ｎｏ．６のチャンネルは，Ｎｏ．１のチャンネルから１ｍｍ離れた位置にあり，レーザビーム横入射の機能の可否を判断する指標として選択した。Ｎｏ．６のチャンネルのレーザビーム照射効率は，液滴の屈折率ｎｄが１．３３からオイルの屈折率ｎｏ＝１．４８に近づくに従って上昇し，液滴の屈折率ｎｄがオイルの屈折率ｎｏ＝１．４８と一致するときに最大となり，液滴の屈折率ｎｄがオイルの屈折率ｎｏ＝１．４８を超えて離れるに従って低下することが分かった。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，液滴の屈折率ｎｄを１．４６≦ｎｄ≦１．５３とすれば良いことが分かった。つまり，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすれば良いことが分かった。また，より高感度な蛍光検出を可能とするレーザビーム照射効率０．４以上を得るためには，液滴の屈折率ｎｄを１．４７≦ｎｄ≦１．５１とすれば良いことが分かった。つまり，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすれば良いことが分かった。
【００３０】
図１１は，図１０とは逆に，図６の条件（Ｘ＝０μｍ）で，オイルの屈折率ｎｏを１．４８から１．１８まで変化させた際のレーザビーム照射効率の変化を詳細に調べた結果を示す図である。この際，液滴の屈折率はｎｄ＝１．３３に固定している。●プロットはＮｏ．１のチャンネル，○プロットはＮｏ．６のチャンネルのレーザビーム照射効率を示す。Ｎｏ．６のチャンネルのレーザビーム照射効率は，オイルの屈折率ｎｏが１．４８から液滴の屈折率ｎｄ＝１．３３に近づくに従って上昇し，オイルの屈折率ｎｏが液滴の屈折率ｎｄ＝１．３３と一致するときに最大となり，オイルの屈折率ｎｏが液滴の屈折率ｎｄ＝１．３３を下回って離れるに従って低下することが分かった。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，オイルの屈折率ｎｏを１．２８≦ｎｏ≦１．３５とすれば良いことが分かった。つまり，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすれば良いことが分かった。また，より高感度な蛍光検出を可能とするレーザビーム照射効率０．４以上を得るためには，オイルの屈折率ｎｏを１．３０≦ｎｏ≦１．３４とすれば良いことが分かった。つまり，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすれば良いことが分かった。
【００３１】
図１０及び図１１の結果から，液滴及びオイルのそれぞれの屈折率を問わず，両者の屈折率差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすることがレーザビーム横入射を機能させる上で効果的であり，より望ましくは屈折率差ｎｄ−ｎｏを−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とするのが良いことが分かった。言うまでもなく，さらに望ましくは屈折率差をなくして，液滴とオイルの屈折率を一致させることが良い。
【００３２】
次に，図１２に，各チャンネル２の長軸に垂直な断面図によるマイクロチップ１の構成例を示す。マイクロチップ１の材質は透明な樹脂又はガラス等である。図１２（ａ）に示すように，一般に，マイクロチップ１は，表面がフラットな上側基板１７と，表面に複数の溝を持つ下側基板１８を，張り合わせ面１９で結合し，上記溝をチャンネル２に変換することにより作製される。しかしながら，下側基板１８を，樹脂の射出成形のように，金型を用いて作製する場合，つまり量産が可能であり，製造単価を下げることが容易な方法で作製する場合は，金型から成形品（下側基板１８）を取り外す際の抜き勾配が必要なため，図１２（ａ）のようにチャンネル２の断面形状が正方形又は長方形ではなく，図１２（ｂ）のようにチャンネル２の断面形状が台形となる。このとき，マイクロチップ１の側面から配列平面に沿って入射されたレーザビーム３は，各チャンネル２の左右の両側面で同一方向に屈折を受けるため，複数のチャンネル２を透過するのに伴って配列平面から逸脱してしまう課題が新たに見出された。より具体的には，マイクロチップ１の屈折率よりも各チャンネル２の内部（液滴又はオイル）の屈折率が小さい場合は，図１２（ｂ）のように，レーザビームは配列平面よりも下側に逸脱する。逆に，マイクロチップ１の屈折率よりも各チャンネル２の内部（液滴又はオイル）の屈折率が大きい場合は，レーザビームは配列平面よりも上側に逸脱する。いずれの場合も，仮に液滴とオイルの屈折率が一致していたとしても，複数のチャンネル２の同時照射が困難となる。
【００３３】
図１３は，図１２（ａ）の条件（抜き勾配０度）から，抜き勾配を増大させた場合のレーザビーム照射効率を調べた結果を示す図である。ただし，マイクロチップの部材の屈折率は１．５３のままであるが，チャンネル内部の液滴及びオイルの屈折率はいずれも１．４８ではなく，１．３３とした。抜き勾配は，複数のチャンネルの配列平面と各チャンネルの側面のなす角度から９０度を差し引いた角度，又は，チャンネル断面の四角形の底辺と側辺のなす角度（台形の底角）から９０度を差し引いた角度と定義した。●プロットはＮｏ．１のチャンネル，○プロットはＮｏ．６のチャンネルのレーザビーム照射効率を示す。抜き勾配が０度のときのレーザビーム照射効率は，図１１でオイルの屈折率が１．３３のときのレーザビーム照射効率と同じである。図１３のレーザビーム照射効率は，抜き勾配０度について左右対称であり，抜き勾配の増大，又は減少に伴って減少した。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，抜き勾配は±１．５度以内とすれば良いことが分かった。また，より高感度な蛍光検出を可能とするレーザビーム照射効率０．４以上を得るためには，抜き勾配を±１．０度以内とすれば良いことが分かった。
【００３４】
図１２（ａ）のようなマイクロチップ１を作製する手段として，例えば，下側基板の溝を切削により加工することが考えられる。しかしながら，そのような加工方法は，量産には向かず，製造単価も高くなるという欠点がある。そこで，図１２（ｃ）のように，マイクロチップ１を，上側基板１７，下側基板１８に加えて，複数の中間基板２０で構成し，張り合わせ面１９，２１で結合する方法を考案した。ここで，複数の中間基板２０は，隣り合う２つのチャンネル２の間の壁，及び，両端のチャンネル２とマイクロチップ１の両側面の間の壁を構成するそれぞれ別個の基板である。したがって，上記の張り合わせによる結合の前に，それぞれの中間基板２０の側面をチャンネルの配列平面に対して９０度に近づけること，さらには，それぞれの中間基板２０の側面を鏡面状に研磨することが比較的容易である。
【００３５】
［実施例１］
図１２（ｃ）の構成に従い，材質をガラスとするマイクロチップ１を作製した。１５本のチャンネル２を，レーザビーム照射位置において２００μｍ間隔で同一平面上に配列した。各チャンネル２の断面は一辺が５０μｍの正方形とし，両側面の配列平面に対する角度を９０±０．５度に収めた。１５種類の試料のそれぞれについて，総体積２０マイクロリットルをオイル中で体積３４ピコリットルの液滴，約６０万個に分割してからＰＣＲを行い，各試料の液滴及びオイルを陰圧吸引によって液滴を一列に並べた状態で上記１５本のチャンネル２に導入し，フローさせた。このとき，液滴のサイズは，球状の場合，直径４０μｍとなる。
【００３６】
ここで，先の検討から，レーザビーム横入射による検出を効果的に行うには，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすること，好ましくは−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすることが必要である。本実施例では，オイルに，屈折率１．３７５の信越化学工業のシリコンオイルＫＦ−９６Ｌ−０．６５ｃｓを用いた。一方，液滴には，２５％のショ糖をＰＣＲ試薬とともに含ませることによって，その屈折率を１．３７５に調整し，オイルの屈折率と一致させた。一般に，ＰＣＲ溶液に，ショ糖を混入することは良く行われることであり，ＰＣＲを阻害しないと考えられる。
【００３７】
本実施例では，各試料に含まれるゲノムの中の，１箇所，又は３箇所の遺伝子変異量を絶対定量する。１箇所の遺伝子変異定量の場合，各液滴の内部に対象となる遺伝子変異が存在する場合にＰＣＲによる増幅を生じさせ，レーザビーム照射により主要波長帯が５６０〜５８０ｎｍの蛍光が発光されるようにした。一方，３箇所の遺伝子変異定量の場合，３箇所それぞれについて，並列にＰＣＲを行い，それぞれの遺伝子変異が存在する場合に独立に増幅を生じさせ，異なる蛍光が発光されるようにした。つまり，３箇所の増幅を３色の蛍光で識別するようにした。３色の蛍光の主要波長帯は，５２０〜５４０ｎｍ，５６０〜５８０ｎｍ，及び６００〜６２０ｎｍとした。
【００３８】
いずれの遺伝子変異も含まない液滴は，比較的弱い蛍光，又は散乱光を発生するため，上記の増幅によって比較的強い蛍光を発光する液滴と識別しながら検知し，個数をカウントすることが可能である。そのような液滴をより感度良く検知するためには，３色の波長帯におけるオイルと液滴のレーザビーム照射によるラマン散乱光の差を利用することができる。３色の波長帯におけるラマン散乱光の強度比率は，各蛍光のそれと異なるため，ラマン散乱光と蛍光を精度良く識別することができる。
【００３９】
図１４（ａ）は，マルチチャンネルを配列したマイクロチップ１の例を示す正面模式図である。簡単のため，チャンネル２は４本のみを描いた。各チャンネル２の両端には，それぞれ入口１３及び出口１４が設けられ，液滴及びオイルのフローは入口１３から出口１４に向かう方向で行った。本実施例で，マイクロチップ１は光検出装置の流路部を構成し，各チャンネル２の内部にはフロー列が形成される。レーザ光源５から出射されたレーザビーム３を，マイクロチップ１の側面より，チャンネル２の配列平面に沿って，各チャンネルの長手方向に対して垂直に導入した。チャンネル２の配列間隔は，中央のレーザビーム照射位置では密，両端の入口１３及び出口１４では疎となるように構成した。レーザ光源５及びマイクロチップ１のレーザビーム３が照射される領域は，レーザビーム照射部を構成する。
【００４０】
図１４（ｂ）は，レーザビーム照射位置における，各チャンネル２の内部をフローする液滴の間隔を広げることで検出精度を向上するため，各チャンネル２に対して，入口１３とレーザビーム照射位置の間でオイルを追加する機構を加えた構成例を示す模式図である。チャンネル２毎に，２箇所のオイル入口１５からオイルが導入され，２方向から各チャンネル２にオイルが導入される。追加されたオイルは，入口１３から導入された液滴及びオイルとともに，出口１４から排出される。
【００４１】
図１５は，光検出装置の全体構成を示す概略図であり，マイクロチップ１のレーザビーム照射部及び光検出部の構成例を示している。光検出部では，レーザビーム３の照射によって各フロー列の液滴から個別に発生される発光を，配列平面に対して垂直方向から検出する。図１５（ａ）は，各チャンネル２の長軸と平行な方向から見た図であり，図１５（ｂ）は各チャンネル２の長軸に垂直な方向から見た図である。
【００４２】
レーザ光源５から出射された波長５０５ｎｍ，出力１０ｍＷのレーザビーム３を，径４０μｍに絞った状態で，マイクロチップ１の側面より，複数のチャンネル２の配列平面に沿って入射し，各チャンネル２を照射した。各チャンネル２の中をフローする液滴は，レーザビーム３が照射される位置を横切る際，レーザビーム３による励起を受け，ＰＣＲに応じた蛍光を発光する。つまり，液滴に分析対象の遺伝子変異が含まれていれば強い蛍光を発光し，含まれていなければ弱い蛍光のみ発光する。各チャンネル２から発光する蛍光は蛍光検出光学系によって検出される。すなわち，共通の集光レンズ６で平行光束にされ，フィルタ及び回折格子７を透過し，結像レンズ８によってセンサ９のセンサ面上に結像される。フィルタは蛍光検出の際の背景光となるレーザビーム３の波長を遮断するために設けられ，波長分散素子としての回折格子は蛍光を波長分散して多色検出するために設けられる。ここで，１箇所の遺伝子変異定量の場合のように，蛍光の多色検出が必ずしも必要ない場合は，フィルタ及び回折格子７の内の回折格子を省くことができる。以降では，多色検出を行う場合について説明する。図１５（ａ）に示すように，異なるチャンネル２からの発光蛍光は，センサ９のセンサ面上の異なる位置に結像するため，それらを識別して検出することができる。一方，図１５（ｂ）に示すように，各チャンネル２の発光点１１からの発光蛍光は，各チャンネル２の長手方向すなわちレーザビーム３の光軸に垂直な方向に波長分散されて結像されるため，各波長の蛍光を識別して検出することができる。
【００４３】
集光レンズ６，及び結像レンズ８は，それぞれ収差の影響を低減して結像性を高くするため，組み合わせレンズであることが望ましい。市販の，一眼レフカメラのカメラレンズ，又は顕微鏡用の対物レンズを用いることが有効である。集光レンズ６と結像レンズ８は同じ仕様のレンズでも良いし，異なっていても良い。
【００４４】
従来のキャピラリＤＮＡシーケンサ等では，複数のキャピラリからの発光蛍光を同様の蛍光検出光学系によって検出しているが，そこではセンサ９として２次元のＣＣＤセンサやＣＭＯＳセンサが用いられている。本実施例においても，同様の２次元センサを用いても構わないが，液滴のフロー速度が速くなると，撮像速度が追い付かず，検出し損ねる液滴が発生する問題が生じた。そこで，本実施例では，２次元センサの代わりに，複数の１次元のラインセンサ１２を配置した。一般に，２次元センサでは，行方向及び列方向に２次元に配列するセンサ素子の内，行方向に１次元に配列するセンサ素子について一括してＡＤ変換を含むデータ取得を行い，この工程を列方向に順次シフトすることで全センサ素子のデータ取得を行っている。したがって，２次元センサのデータ取得時間は，露光時間とは独立に，１次元センサのデータ取得時間と比較して，列の数分だけ，すなわち数千倍を要する場合がある。本実施例では，図１５（ｂ）のように，３箇所の波長帯：５２０〜５４０ｎｍ，５６０〜５８０ｎｍ，６００〜６２０ｎｍをそれぞれ検出する３個のラインセンサ１２を配置した。各ラインセンサの各センサ素子について一括してＡＤ変換を含めてデータ取得できるだけでなく，上記を各ラインセンサについて並列に行うことができるようにした。以上のような構成にすることにより，各ラインセンサ１２を構成する全センサ素子について，１００ｋＨｚの高速データ取得を可能とした。これにより，各チャンネル２を１ｋＨｚでフローする液滴，つまりレーザビーム３を１秒間に千個も通過する液滴を漏れなく多色検出することが可能となる。
【００４５】
データ処理部１０は，センサ９の検出データを分析することにより，１５種類の試料について，分析対象である３箇所の遺伝子変異の絶対数量，及び全ゲノム数に対する比率を導出する。以上では，３箇所の遺伝子変異を独立に絶対定量するために３色検出を行う例を示したが，一般にＮ箇所（Ｎ＝1，２，３，・・・）の遺伝子変異を独立に絶対定量するためにはＮ色検出すれば良い。あるいは，Ｍ＜ＮなるＭ色検出（Ｍ＝２，３，４，・・・）であっても，Ｍ色の強度比を分析対象毎に変化させることによってＮ箇所（Ｎ＝３，４，５・・・）の遺伝子変異を独立に絶対定量することも可能である。
【００４６】
図１５のセンサ９として，図１７に示すフォトマルチプライヤーアレイ３２を用いることも有効である。これにより，複数のチャンネル２からの発光蛍光を，より高速かつ高感度に同時に多色検出することが可能である。
【００４７】
図１６（ａ）は，図１５に示すマイクロチップ１のレーザ照射及び蛍光検出部の構成の変形例を示す模式図である。本例は，マイクロチップに配列したマルチチャンネルにレーザビームを横入射し，マルチチャンネルからの発光をそれぞれ異なる光ファイバ及び異なるフォトマルチプライヤーで検出するものである。光検出器として，ラインセンサ１２の代わりに，フォトマルチプライヤー３０を用いることによって，図１５に示した光検出装置よりもさらに高速かつ高感度な蛍光検出を実現した。フォトマルチプライヤー３０のサイズは，一般にラインセンサ１２と比較して大きいため，図１５（ｂ）と同様の光学系を採用することが困難である。そこで，発光点と光検出器を光ファイバ２８でつなぐ構成とした。レーザビーム３の照射による各チャンネル２からの発光はそれぞれ，個別集光レンズ２７により集光され，光ファイバ２８の一端に入射される。光ファイバ２８の他端から出射される発光はそれぞれ，再び個別集光レンズ２９により集光され，フィルタを介してフォトマルチプライヤー３０に入射され，高速かつ高感度に検出される。本構成は分光手段を持たないため，１箇所の遺伝子変異定量の場合のように単色検出を行う場合に有効である。ここで，各個別集光レンズ２７とそれらと接続する各光ファイバの一端の相対位置は予め調整することが可能であるが，各個別集光レンズ２７と各チャンネル２の相対位置を，異なるマイクロチップ１に対して毎回調整することは煩雑である。そこで，各マイクロチップ１にガイドを設け，各個別集光レンズ２７と各チャンネル２の相対位置を容易に調製できるようにした。
【００４８】
図１６（ｂ）は，図１６（ａ）のさらなる変形例を示し，各光ファイバからの出射光を多色検出できるようにした光検出装置の模式図である。まず，個別集光レンズ２７を，光ファイバ２８とではなく，マイクロチップ１と一体化し，各チャンネル２と各個別集光レンズ２７の相対位置を予め調整した。このような構造は，マイクロチップ１の作製工程において，射出成形等により容易に実現可能である。一般に，各チャンネル２と各個別集光レンズ２７の間の相対位置は，各個別集光レンズ２７と各光ファイバ２８の一端の相対位置と比較して高い精度が求められる。したがって，図１６（ｂ）の構成により，位置調整が全体として容易化される。また，図１６（ｂ）では，多色検出を行うため，各光ファイバ２８の他端から出射した発光をそれぞれ，個別集光レンズ２９で集光した後，ダイクロイックミラー３１で分割し，それぞれを異なるフォトマルチプライヤー３０で検出した。図１６（ｂ）では，各発光について２色検出を行う例を示したが，もちろん，３色以上の多色検出にも同様の構成により対応できることは言うまでもない。
【００４９】
図１７は，複数の光ファイバ２８からの出射光を，図１６のようにそれぞれ異なるフォトマルチプライヤー３０で検出するのではなく，複数のフォトマルチプライヤーが一体化された単一のフォトマルチプライヤーアレイ３２で検出する光検出装置の例を示す模式図である。ここでは，浜松ホトニクス（株）より販売されている８チャンネルリニアアレイＰＭＴ（Ｈ９５３０）を用いた。本センサは，２．０×２．５ｍｍの検出エリアが８個，２．８ｍｍ間隔で配列したものである。各検出エリアに入射する光をそれぞれ独立に，１チャンネルのフォトマルチプライヤー３０と同等の感度と速度で検出することが可能である。各光ファイバ２８の光出射端を２．８ｍｍ間隔で配列し，各光ファイバ２８からの出射光をそれぞれ，個別集光レンズ２９で集光し，異なる検出エリアに入射させ，１ＭＨｚで高感度に検出した。１ＭＨｚの検出データを，データ処理部１０で積算処理することによって，さらに感度を向上した。本構成は分光手段を持たないため，１箇所の遺伝子変異定量の場合のように単色検出を行う場合に有効である。
【００５０】
図１８は，図１７の構成を多色検出に発展させた例を示す模式図である。レーザ光源５から個別集光レンズ２９までの構成は図１７と同じである。図１８は，図１７の右側から見た図であり，図１７の一番右に配列された光ファイバ２８の光出射端のみが描かれている。各光ファイバ２８の出射光はそれぞれ，個別集光レンズ２９で平行光束化された後，４種類のダイクロイックミラー３１により，同一方向に進行する４色の平行光束に４分割した。ここで，各ダイクロイックミラー３１は，各光ファイバ２８について１個の共通の部材としても構わない。フォトマルチプライヤーアレイ３２は，浜松ホトニクス（株）より販売されている６４チャンネル２次元アレイＰＭＴ（Ｈ７５４６）を用いた。本センサは，２．０×２．０ｍｍの検出エリアが８×８＝６４個，２．３ｍｍ間隔で配列したものである。２次元アレイの内，１次元を複数の光ファイバ２８の配列方向，他の１次元をダイクロイックミラー３１による平行光束の分割方向に設定することにより，複数のチャンネル２からの発光蛍光を独立に，１ＭＨｚで高感度に４色検出した。ここで，複数のチャンネル２からの発光由来の各分割平行光束が入射する検出エリアは，必ずしも１個である必要はなく，複数個の検出エリアに跨っても構わない。そのような場合は，データ処理部１０で各平行光束が入射する複数の検出エリアの検出信号を積算処理することが有効である。
【００５１】
図１９は，図１８の変形例であり，図１８における光ファイバ２８とダイクロイックミラー３１の順番を逆にした光検出装置の構成例を示す模式図である。図１９は，図１８と同様にレーザビームの照射軸方向から見た図であり，マイクロチップ１を含めて描いている。各チャンネル２のレーザビーム照射位置である発光点１１からの発光蛍光はそれぞれ，個別集光レンズ２７により集光され，４種類のダイクロイックミラー３１により，同一方向に進行する４色の平行光束に４分割され，それぞれ異なる光ファイバ２８の一端に入射される。各光ファイバ２８の他端から出射される発光はそれぞれ，再び個別集光レンズ２９により集光され，フォトマルチプライヤーアレイ３２の各検出エリアに入射され，高速かつ高感度に検出される。図１９の構成は，図１８と比較して必要な光ファイバ２８の数が４倍になるものの，光ファイバ２８の光出射端と，フォトマルチプライヤーアレイ３２の検出エリアの位置合わせが容易になるメリットがある。
【００５２】
図２０は，図１６の場合よりも装置コストを低減するため，複数のチャンネル２からの発光を１個のフォトマルチプライヤー３０で独立に検出する光検出装置の構成例を示す模式図である。複数の光ファイバ２８を，光ファイバスイッチ３３を介して単数の統合光ファイバ３４に統合し，統合光ファイバ３４からの出射光を個別集光レンズ２９によって集光した後，フォトマルチプライヤー３０で検出した。光ファイバスイッチ３３は，複数の光ファイバ２８の内，いずれかひとつのみと統合光ファイバ３４を光学的に接続し，その光ファイバ２８の伝送光を統合光ファイバ３４に伝送させる機能を有する。ここでは，０．１ミリ秒ごとに（１０ｋＨｚで），複数の光ファイバ２８について，順番に，繰り返し接続させることによって，複数のチャンネル２からの発光を単一のフォトマルチプライヤー３０で時分割によって検出した。
【００５３】
光ファイバスイッチ３３の仕組みとしては，複数の光ファイバ２８と単数の統合光ファイバ３４の相対位置を機械的にスライドさせて相互の光学的な接続を切り替える方式，複数の光ファイバ２８からの出射光をそれぞれ反射させるマイクロミラーの角度を機械的に制御して統合光ファイバ３４に入射させる光ファイバ２８を切り替える方式などがある。ここでは，光ファイバスイッチ３３として，より高速で安定な切り替えが可能な液晶シャッターアレイを用いた。各光ファイバ２８からの出射光を個別集光レンズで平行光束化し，それぞれを個別の液晶シャッタを介して異なる光ファイバに入射させる。これらの光ファイバは後段で統合光ファイバ３４に統合されている。液晶シャッタは電気的な制御により開閉を高速に制御できるため，各光ファイバ２８と統合光ファイバ３４の光学的な接続を高速かつ容易に切り替えることができる。このような光ファイバスイッチは機械的な動作が不要なため，高い安定性も得ることができる。光ファイバスイッチ３３による光ファイバ２８の切り替えと，フォトマルチプライヤー３０による検出信号は，データ処理部１０で対応付けられ，各チャンネル２からの発光を独立，高速，かつ高感度に検出することが可能である。
【００５４】
以上の図１５から図２０に示す光検出装置の構成例は，マイクロチップ１の内部に構成された複数のチャンネル２のレーザ照射による発光を対象にした場合について説明したが，そのような対象に限定されるものではなく，複数の発光点が配列した任意の対象について同様の効果を発揮することができる。本実施例では，特に，各チャンネルの内部に液滴及びオイルをフローさせ，レーザ照射によって液滴から蛍光が発光される場合を対象にしているが，これらの光検出装置の用途はそのような場合に限定されるものではない。複数の発光点からの発光を，高速かつ高感度に検出する場合，特に多色検出する場合に，同様の効果が発揮される。
【００５５】
［実施例２］
本実施例の光検出装置は，複数のフロー列をマイクロチップ内部に構成するのではなく，複数のキャピラリの内空で構成する。すなわち，本実施例では，配列平面上に整列して配列された複数のキャピラリによって光検出装置の流路部が構成される。
【００５６】
図２１は，本実施例の光検出装置の概略図である。図２１は，複数のキャピラリ１６へのレーザビーム照射部及び蛍光検出部の構成例を示し，実施例１における図１５（ａ）に対応している。特に説明がない場合は，実施例１と同様の構成，方法とする。屈折率１．４６の石英ガラス製のキャピラリ１６を２４本，空気中で配列平面上に配列した。キャピラリ１６内には，オイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿って移動するフロー列が形成される。各キャピラリ１６に，左側から順番に，Ｎｏ．１〜Ｎｏ．２４のキャピラリ番号を付ける。キャピラリの外径は１００〜３２３μｍ，内径は１０〜５０μｍ，レーザビーム照射位置における配列間隔は１５０μｍ又は３７０μｍの範囲でレーザビーム横入射が有効な条件を検討した。本実施例では，レーザビーム照射部は，レーザ光源５及び複数のキャピラリ１６をレーザビーム３が照射する領域によって構成される。また，光検出部は，キャピラリの配列平面に対して垂直方向に設けられている。
【００５７】
２４種類の試料のそれぞれについて，総体積２０マイクロリットルをオイル中で体積３４ピコリットルの液滴，約６０万個に分割してからＰＣＲを行い，各試料の液滴及びオイルを陰圧吸引によって液滴を一列に並べた状態で上記２４本のキャピラリ１６に導入し，フローさせた。このとき，液滴のサイズは，球状の場合，直径４０μｍとなる。２４本のキャピラリの一端を，ＰＣＲ後の２４種類の試料溶液に直接挿入し，他端より吸引する構成によって，装置を簡便化した。
【００５８】
ここで，先の検討から，レーザビーム横入射による検出を効果的に行うには，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすること，好ましくは−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすることが必要である。本実施例では，オイルには，屈折率１．２９の３Ｍ社のフロリナートＦＣ−４３に高屈折率物質を微量混合することにより屈折率１．３３に調製したものを用いた。一方，液滴には，屈折率１．３３の標準的なＰＣＲ溶液を用い，オイルの屈折率と一致させた。また，液滴をオイル中で安定化させるため，界面活性剤であるRainDance Technologies社のEA-surfactantをオイル中に１％混合した。
【００５９】
空中における２４本のキャピラリ配列に対するレーザビーム横入射について，図２〜図８と同様のレーザビーム光線追跡シミュレーションを行った。図２２，図２５，及び図２８に示すレーザビーム光線追跡シミュレーションの結果には，各キャピラリを見やすくするために，各キャピラリの外径に輪郭を描いて示した。
【００６０】
図２２（ａ）は，外径３２３μｍ，内径５０μｍ，配列間隔３７０μｍ，かつキャピラリ内部を屈折率１．４１の溶液で満たした場合の結果を示す図である。横入射させるレーザビームは径５０μｍとした。本条件は，市販のキャピラリＤＮＡシーケンサのそれと同等であり，マルチフォーカス方式が機能し，横入射されたレーザビームがすべてのキャピラリを串ざし状に貫通する照射を可能としている。これはキャピラリ配列の左側からレーザビーム横入射した場合の結果であるが，これを，レーザビームを強度が５０％ずつになるように２分割し，それらをキャピラリ配列の左右両側から横入射した場合に拡張した場合の各キャピラリのレーザビーム照射効率を求めた結果を図２３に△プロットで示す。
【００６１】
図２２（ａ）に示されるように，マルチフォーカス方式が機能している場合においても，レーザビームは各キャピラリの外表面での反射ロスによって，キャピラリ番号の増加に伴ってレーザビーム照射効率が低下するが，上記のようにレーザビームをキャピラリ配列の両側から横入射することによって，それぞれ減衰が相殺され，各キャピラリについて比較的均一なレーザビーム照射効率が得られる。図２３の△プロットの結果によれば，２４本のキャピラリのレーザビーム照射効率の平均値は４７％，ＣＶ値は１１％となり，効率と均一性の両方が極めて優れていることが分かった。中央に配列されたキャピラリ番号１２又は１３のキャピラリでレーザビーム照射効率が最小の４２％となる。つまり，各キャピラリのレーザビーム照射効率が０．４以上あれば，市販のキャピラリＤＮＡシーケンサと同等以上の高感度な蛍光検出が可能である。また，各キャピラリのレーザビーム照射効率が０．２以上あれば，実用レベルの蛍光検出感度が得られることが経験的に分かっている。
【００６２】
図２２（ｂ）は，図２２（ａ）の条件から，キャピラリ内部の溶液の屈折率を１．４１から，本実施例の条件である１．３３に低減した場合の結果を示す図である。各キャピラリのガラス部分の凸レンズ作用よりも，内部の凹レンズ作用が勝り，マルチフォーカス方式が機能しなくなり，レーザビームのキャピラリ配列平面からの発散が顕著になった。図２３の▲プロットは，△プロットと同様の方法で求めたレーザビーム照射効率を示す。レーザビーム照射効率が急激に低下し，平均値１７％，ＣＶ値７８％となり，効率と均一性のいずれもが大きく劣化し，２４本のキャピラリの同時照射に不適当な条件と考えられた。
【００６３】
上記で明らかになった新たな課題を解決するため，図２２（ｃ）〜（ｆ）に示すように，キャピラリの外径を３００μｍ，２５０μｍ，２００μｍ，及び１５０μｍに減少させることによって，ガラス部分の凸レンズ作用を増大させることを図った。その他の条件は図２２（ｂ）と同一とした。その結果，期待通りに，外径の減少に伴ってマルチフォーカス方式が機能するようになっていった。図２３の□プロット，■プロット，○プロット，及び●プロットは，それぞれ外径３００μｍ，２５０μｍ，２００μｍ，及び１５０μｍについて同様にレーザビーム照射効率を求めた結果である。図２３より，各キャピラリの外径を２５０μｍ未満にすることによって，急激にマルチフォーカス方式が機能することが明らかになった。すなわち，２４本のキャピラリをフローする多数の液滴からの発光蛍光を同時，高速，かつ高感度に多色検出できることが分かった。
【００６４】
図２４は，以上をより詳細に検討した結果を示す図であり，キャピラリ番号１２のキャピラリに対して，キャピラリの外径とレーザビーム照射効率の関係を示している。キャピラリの外径が２５０μｍから２００μｍに減少する過程でマルチフォーカスが機能するようになり，レーザビーム照射効率が急激に向上することが明らかになった。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，キャピラリの外径を２２７μｍ以下とすれば良いことが分かった。
【００６５】
図２５は，外径１５０μｍ，内径１０μｍ〜５０μｍ，配列間隔１５０μｍ，かつ内部を屈折率１．３３の溶液で満たした２４本のキャピラリの空中配列に対するレーザビーム横入射について同様のレーザビーム光線追跡シミュレーションを行った結果を示す図である。図２５（ａ）は，内径５０μｍの場合の結果であり，図２２（ｆ）との違いは配列間隔を３７０μｍから１５０μｍに縮小した点だけである。図２６の●プロットは，このときのレーザビーム照射効率を同様に計算した結果であり，平均値は４６％，ＣＶ値は１２％と図２３の●プロットと同等となり，効率と均一性の両方が極めて優れていることが分かった。
【００６６】
図２５（ｂ），（ｃ），（ｄ），及び（ｅ）はそれぞれ，図２５（ａ）の条件から，内径を４０μｍ，３０μｍ，２０μｍ，及び１０μｍに縮小した場合の結果を示す図である。内径の縮小に伴い，今度はキャピラリの内部の凹レンズ作用が強まり，再びマルチフォーカス方式が機能しなくなり，レーザビームのキャピラリ配列平面からの発散が顕著になっていった。図２６の○プロット，■プロット，□プロット，及び▲プロットはそれぞれ，内径４０μｍ，３０μｍ，２０μｍ，及び１０μｍについて同様にレーザビーム照射効率を求めた結果である。図２６より，各キャピラリの内径を３０μｍよりも大きくすることによって，マルチフォーカス方式を機能させることができることが明らかになった。すなわち，２４本のキャピラリをフローする多数の液滴からの発光蛍光を同時，高速，かつ高感度に多色検出できることが分かった。
【００６７】
図２７は，以上をより詳細に検討した結果を示す図であり，キャピラリ番号１２のキャピラリに対して，キャピラリの内径とレーザビーム照射効率の関係を示している。キャピラリの内径が３０μｍから４０μｍに増大する過程でマルチフォーカスが機能するようになり，レーザビーム照射効率が急激に向上することが明らかになった。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，キャピラリの内径を３４μｍ以上とすれば良いことが分かった。
【００６８】
図２８は，外径１００μｍ，内径１０μｍ〜５０μｍ，配列間隔１５０μｍ，かつ内部を屈折率１．３３の溶液で満たした２４本のキャピラリの空中配列に対するレーザビーム横入射について同様のレーザビーム光線追跡シミュレーションを行った結果を示す図である。図２５の場合よりも，キャピラリの外径をさらに縮小することによって，ガラス部分の凸レンズ作用を再び強めることを図った。図２８（ａ）は，内径５０μｍの場合の結果を示す図であり，図２５（ａ）との違いは外径を１５０μｍから１００μｍに縮小した点だけである。図２９の●プロットは，このときのレーザビーム照射効率を同様に計算した結果であり，平均値は４６％，ＣＶ値は１２％と図２６の●プロットと同等となり，効率と均一性の両方が極めて優れていることが分かった。
【００６９】
図２８（ｂ），（ｃ），（ｄ），及び（ｅ）はそれぞれ，図２８（ａ）の条件から，内径を４０μｍ，３０μｍ，２０μｍ，及び１０μｍに縮小した場合の結果を示す図である。内径の縮小に伴い，キャピラリの内部の凹レンズ作用が強まり，再びマルチフォーカス方式が機能しなくなり，レーザビームのキャピラリ配列平面からの発散が顕著になっていった。図２９の○プロット，■プロット，□プロット，及び▲プロットはそれぞれ，内径４０μｍ，３０μｍ，２０μｍ，及び１０μｍについて同様にレーザビーム照射効率を求めた結果を示している。図２９より，各キャピラリの内径を２０μｍよりも大きくすることによって，マルチフォーカス方式を機能させることができることが明らかになった。すなわち，２４本のキャピラリをフローする多数の液滴からの発光蛍光を同時，高速，かつ高感度に多色検出できることが分かった。
【００７０】
図３０は，以上をより詳細に検討した結果であり，キャピラリの内径とキャピラリ番号１２のレーザビーム照射効率の関係を示す。キャピラリの内径が２０μｍから３０μｍに増大する過程でマルチフォーカスが機能するようになり，レーザビーム照射効率が急激に向上することが明らかになった。実用レベルの蛍光検出感度を得るのに必要なレーザビーム照射効率０．２以上を得るためには，キャピラリの内径を２５μｍ以上とすれば良いことが分かった。このように，マルチフォーカス方式を機能させるための内径の閾値が図２７の場合よりも縮小したのは，外径の縮小によって凸レンズ作用が強められたためである。
【００７１】
図２２〜図３０の結果は，各キャピラリのガラス部分の凸レンズ作用と，内部の凹レンズ作用のバランスが，凸レンズ側に傾いた場合にマルチフォーカス方式が機能することを示している。凸レンズ作用は外径が小さいほど強くなり，凹レンズ作用は内径が小さいほど強くなるため，外径／内径の比を一定値より小さくすることによってマルチフォーカス方式を機能させることができる。図２４の結果によれば，外径／内径の比を２２７／５０＝４．５以下にすれば良いことが分かった。図２７の結果によれば，外径／内径の比を１５０／３４＝４．４以下にすれば良いことが分かった。図３０の結果によれば，外径／内径の比を１００／２５＝４．０以下にすれば良いことが分かった。つまり，外径／内径の比は少なくとも４．５以下，より望ましくは４．０以下にするのが良いことが明らかになった。
【００７２】
本実施例で取り扱う液滴１個は，球状の場合のサイズが直径４０μｍである。従来のｄｄＰＣＲの蛍光検出部では，チャンネル短軸幅（キャピラリ内径）＞液滴直径としている。例えば，内径が５０μｍのキャピラリを用いれば上記条件が満たされ，良好に液滴の蛍光検出が可能となる。しかし一方で，チャンネル短軸幅（キャピラリ内径）＜液滴直径とすることによって新たな効果を発揮する場合がある。例えば，内径３０μｍのキャピラリを用いることにより，液滴がキャピラリ内部でつぶされた状態となり，液滴の界面の曲率が，液滴が球である場合の曲率よりも小さくなる。このとき，レーザビームに対する液滴のレンズ作用が小さくなるため，複数のチャンネル又はキャピラリをフローする液滴を検出する上で有利となる。
【００７３】
［実施例３］
本実施例の光検出装置では，複数のチャンネルを同一のマイクロチップ内部に構成する。特に説明がない場合は，実施例１と同様の構成，方法とする。マイクロチップは屈折率１．５３のシクロオレフィンポリマ（ＣＯＰ）とした。複数種類の試料のそれぞれについて，総体積２０マイクロリットルをオイル中で体積４ピコリットルの液滴，約５００万個に分割してからＰＣＲを行い，各試料の液滴及びオイルを陰圧吸引によって液滴を一列に並べた状態で２４本のチャンネルに導入し，フローさせた。このとき，液滴のサイズは，球状の場合，直径２０μｍとなる。
【００７４】
ここで，先の検討から，レーザビーム横入射による検出を効果的に行うには，液滴の屈折率ｎｄとオイルの屈折率ｎｏの差ｎｄ−ｎｏを−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５とすること，好ましくは−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３とすることが必要である。本実施例では，オイルには，屈折率１．３３のBausch & Lomb社のPerfluoro-phenanthrene Aqsiaを用いた。一方，液滴には，屈折率１．３３の標準的なＰＣＲ溶液を用い，オイルの屈折率と一致させた。また，液滴をオイル中で安定化させるため，界面活性剤であるDolomite Microfluidics社のPico-Surf 1をオイル中に１％混合した。
【００７５】
図３１に示す通り，従来のｄｄＰＣＲ装置の蛍光検出部では，多数の液滴４をチャンネル２２中に一列に並べてフローさせ，さらにチャンネルにオイルを追加することで液滴間隔を拡大して幅広のチャンネル２内にフローさせ，レーザビーム３をチャンネル２に照射することで個々の液滴４を順番に照射し，個々の液滴からの発光蛍光を順番に計測している。レーザビーム３の照射位置よりもフローの上流に位置するチャンネル２２においては，多数の液滴が一列に並んでいるが，その間隔は密である。チャンネル２２に対して２方向から接続するチャンネル２３よりオイルを追加供給すると，チャンネル２においては多数の液滴が一列に並んだまま，配列間隔が疎となる。チャンネル２２及び２３と，チャンネル２の中間にはチャンネル２４が存在している。チャンネル２の短軸幅は，チャンネル２２の短軸幅よりも大きい。チャンネル２４の短軸幅は，チャンネル２２の短軸幅と同等か，あるいはそれより小さい。これらの構造は，同一のマイクロチップの内部に形成されている。
【００７６】
以降では，複数のチャンネル２２を配列してレーザビーム横入射で照射する構成を検討する。図３２，図３３には簡単のためチャンネル２２を３本のみ描いたが，もちろん本数は３本に限定されない。
【００７７】
図３２（ａ）に示すように，図３１の構成を同一のマイクロチップの内部に並列化し，かつ複数のチャンネル２に対してレーザビーム横入射を適用した。図３２（ｂ）は，図３２（ａ）のレーザビーム３の照射位置における各チャンネル２の長軸に垂直な断面図を示す。図３２（ｂ）に示されている通り，図１２（ｂ）と同様に，各チャンネル２の断面が台形形状であるため，レーザビーム３は，各チャンネル２の側面を通過する際に一方向に屈折を受け，チャンネル２の配列平面から逸脱してしまった。つまり，図３２の構成では，複数のチャンネル２をフローする液滴を一括検出することは困難であることが判明した。
【００７８】
そこで，図３３に示すように，レーザビーム３の照射位置における各チャンネル２の間の隔壁を取り除き，複数のチャンネル２を単一の融合チャンネル２５に融合した。融合チャンネル２５のレーザビーム３の中心軸方向の幅は，複数のチャンネル２２の幅の総和よりも大きい。このような構成を同一のマイクロチップの内部に作製することは射出成形等の量産性のある手段によって可能である。この例の場合，単一の融合チャンネル２５が設けられたマイクロチップによって光検出装置の流路部が構成され，融合チャンネル２５内にオイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿って移動するフロー列が複数列保持されている。複数のチャンネル２２を同一平面上に形成することにより，各チャンネル２２から流出して融合チャンネル２５内に形成される複数のフロー列を配列平面上に配列させることが可能である。また，複数のフロー列は，レーザビーム３が照射される部分を，融合チャンネル２５の内部に有する。
【００７９】
このような構成によれば，図３２で問題となった各チャンネル２の側面におけるレーザビーム３の屈折を回避できるため，レーザビーム３は融合チャンネル２５の内部を複数のフロー列が配列されている方向に進み，各チャンネル２２及び２４から流出するフロー列の液滴を照射及び蛍光検出することが可能となる。ただし，レーザビーム３が融合チャンネル２５の入射側面で屈折する場合があるため，レーザビーム３をチャンネル２２の配列平面に対して平行から傾けて流路部の融合チャンネル２５に入射することによって，融合チャンネル２５の内部でレーザビーム３がフロー列の配列平面に対して平行になるように調節することが有効である。
【００８０】
ここで，図３３に示されているように，各チャンネル２２及び２４から流出するフロー列の液滴４が融合チャンネル２５において互いに混じり合わないようにすること，つまり，融合チャンネル２５においても，各チャンネル２２及び２４からフローされた液滴がそれぞれ一列に並んだまま融合チャンネル２５内に設定される配列平面上をフローすることが重要である。そのためには，融合チャンネル２５の内部において，液滴及びオイルが層流となっている必要がある。
【００８１】
図３４は，流路部すなわち融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図である。図３３に示した構成の場合，融合チャンネル２５のレーザビーム３の中心軸方向の幅は，図３２の各チャンネル２のレーザビーム３の中心軸方向の幅の合計よりも大きくなっている。この条件下で層流を維持するためには，図３３でチャンネル２３から供給するオイル量は，図３２の場合よりも多くしなければならず，層流の制御も困難である。そこで，図３４に示すように，各チャンネル２２の配列平面に対して垂直な２方向よりチャンネル２３を接続し，同２方向よりオイルを追加供給した。図３４（ａ）はチャンネル２２の配列平面に対して垂直方向から見た図であり，図３４（ｂ）は配列平面に対して平行方向から見た図である。このような構成により，各チャンネル２２の間隔を図３２又は図３３の場合よりも縮小することが可能となり，結果，融合チャンネル２５のレーザビーム３の中心軸方向の幅を図３３の場合より縮小することができる。ここで，各チャンネル２３は，各チャンネル２２の配列平面に対して必ずしも垂直である必要はなく，配列平面に対して傾いていて構わない。要は，各チャンネル２２の配列間隔を縮小できるような構成であれば良い。図３４では，融合チャンネル２５のレーザビーム３の中心軸方向の幅が，図３２の各チャンネル２のレーザビーム３の中心軸方向の幅の合計と等しくなるようにした。すなわち，図３４でチャンネル２３から供給するオイル量は，図３２の場合と等しくて良く，層流の制御は図３１又は図３２と同様に可能である。
【００８２】
図３５は，融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図であり，図３４の変形例を示している。オイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿って移動するフロー列は，融合チャンネル２５内の配列平面上に複数列保持されている。オイルを追加供給するチャンネル２３を，各チャンネル２２の配列平面に対して垂直な一方向より接近させ，配列平面で直角に曲げることにより，各チャンネル２２に接続した。図３５（ａ）は各チャンネル２２の配列平面に対して垂直方向から見た図である。図３５（ｂ）は，図３５（ａ）のチャンネル２３とチャンネル２２の接続部における断面図である。つまり，図３５の構成により，図３３と同様に，オイルを各チャンネル２２内における液滴４及びオイルのフローの方向に対して垂直方向から追加することができ，なおかつ図３４と同様に，各チャンネル２２の配列間隔を縮小することができる。
【００８３】
図３６は，図３２におけるチャンネル２３の構成を図３４と同様にすることによって，チャンネル２の配列間隔を縮小した構成例を示す模式図である。すなわち，各チャンネル２２において，オイルがチャンネル２２の配列平面に対して垂直方向から供給されている。図３２と同様に，各チャンネル２は融合されずに分離されたままである。このような構成の場合，図３２（ｂ）に示されるレーザビーム３の各チャンネル２の側面による屈折の影響を避けることはできないが，チャンネル２の配列間隔が縮小されているため，レーザビーム３が配列平面から逸脱するまでに照射できるチャンネル２の数が増大する効果がある。
【００８４】
図３７は，融合チャンネルを有するマイクロチップの他の構成例を示す模式図であり，図３４の変形例を示している。各チャンネル２２をそれぞれキャピラリで構成し，融合チャンネル２５の内部に各キャピラリから流出する液滴４の複数のフロー列が配列平面上を移動するようにした。図３７（ａ）はチャンネル２２の配列平面に対して垂直方向から見た図であり，図３７（ｂ）は配列平面に対して平行な方向から見た図である。各チャンネル２２の内部をフローする液滴４及びオイルは各チャンネル２２の終端より融合チャンネル２５に排出されてフロー列を形成すると同時に，チャンネル２６から供給されたオイルが各チャンネル２２の周囲を包囲してフロー列と同一方向に流動する。その結果，図３４の場合と同様に，各チャンネル２２から排出された液滴４は互いに混じり合うことなく，それぞれフロー列を形成して一列に並んだまま配列平面上を移動した。つまり，融合チャンネル２５の内部において，液滴及びオイルが層流となるように調節した。
【００８５】
［実施例４］
本実施例では，本発明をｄｄＰＣＲ以外の分析方法に応用した一例を示す。試料として体積１ミリリットルの大容量の検体に含まれる大腸菌の数をデジタルカウントした。１ミリリットルの検体をオイル中で３４ピコリットルの液滴，約３千万個に分割し，一方で１ミリリットルの試薬をオイル中で３４ピコリットルの液滴，約３千万個に分割し，それぞれを１対１で混合して，６８ピコリットルの液滴，約３千万個を作製した。これは，従来技術であるマイクロチップデバイスを用いて実行することが可能である。マイクロチップデバイス内において，チャンネルαをフローする検体の液滴１個と，チャンネルβをフローする試薬の液滴１個が，チャンネルαとチャンネルβが統合されたチャンネルγで混合される工程が，多数の液滴について連続的に繰り返されるのである。このとき，混合された各液滴のサイズは，球状の場合，直径５０μｍとなる。試薬には，大腸菌を溶解する酵素，大腸菌の分解産物が結合すると蛍光を発光するDNAzime sensorが含まれている。また，大腸菌を含まない液滴の存在を確認するため，上記試薬に，上記と異なる発光波長を持つ蛍光体を一定濃度混合した。これにより，すべての液滴に同種かつ等濃度の蛍光体が含まれることになり、すべての液滴をデジタルカウントすることが可能になる。
【００８６】
作製された液滴群は試料容器に移され，室温で２時間放置することで大腸菌の溶解及びその分解産物とDNAzime sensorの結合の反応を行った。その後，図３４に示す流路部及びレーザビーム照射部の構造で，チャンネル２２が１００本並列化されたマイクロチップに，上記液滴群を１００分割してチャンネル２２に導入し，フローさせた。続いて，融合チャンネル２５において，レーザビーム３を横入射することにより，各チャンネル２２から排出されて各々フロー列を形成する複数の液滴を並列に照射し，発光蛍光をフロー列の配列平面に垂直な方向から同時に検出した。
【００８７】
液滴の検出速度は各チャンネル２２について１ｋＨｚ，すなわち１秒間に１０００個を検出した。仮に１チャンネルのみで検出を行うと，３千万個の液滴をすべて検出するには８時間以上を要してしまう。本実施例では，１００チャンネルを用いて，同等の検出速度で並列検出できるため，３千万個の液滴をわずか５分間で検出することができた。
【００８８】
なお，本発明は上記した実施例に限定されるものではなく，様々な変形例が含まれる。例えば，上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり，必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また，ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり，また，ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また，各実施例の構成の一部について，他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８９】
１  マイクロチップ
２  チャンネル
３  レーザビーム
４  液滴
５  レーザ光源
６  集光レンズ
７  フィルタ及び回折格子
８  結像レンズ
９  センサ
１０  データ処理部
１１  発光点
１２  ラインセンサ
１３  入口
１４  出口
１５  オイル入口
１６  キャピラリ
１７  上側基板
１８  下側基板
２０  中間基板
２２  チャンネル
２５  融合チャンネル
２７  個別集光レンズ
２８  光ファイバ
２９  個別集光レンズ
３０  フォトマルチプライヤー
３１  ダイクロイックミラー
３２  フォトマルチプライヤーアレイ
３３  光ファイバスイッチ
３４  統合光ファイバ
【図１】
2017033224.tif 000003
【図２】
2017033224.tif 000004
【図３】
2017033224.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月19日(2017.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オイル中に分散した複数の液滴が線状の流れに沿ってフロー列を配列平面上に複数列保持する流路部と，
前記流路部の前記複数のフロー列が配列されている方向にレーザビームを導入し，前記複数のフロー列を照射するレーザビーム照射部と，
前記レーザビームの照射によって前記複数のフロー列から発生される発光を，前記配列平面に対して垂直方向から検出する光検出部とを有し，
前記オイルの屈折率ｎｏと前記液滴の屈折率ｎｄの差が−０．０２≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０５である光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の光検出装置において，
前記オイルの屈折率ｎｏと前記液滴の屈折率ｎｄの差が−０．０１≦ｎｄ−ｎｏ≦０．０３である光検出装置。
【請求項３】
請求項１記載の光検出装置において，
前記液滴の屈折率ｎｄがｎｄ＝１．３３であり，
前記オイルの屈折率ｎｏが１．３０≦ｎｏ≦１．３４である光検出装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，マイクロチップ内の前記配列平面上に配列した複数のチャンネルの内部に形成され，
前記複数のチャンネルは，断面形状が四角形であり，前記レーザビームが透過する側面と前記配列平面のなす角度が９０±１．５度の範囲内である光検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の光検出装置において，
前記複数のチャンネルは，前記照射される前記レーザビームの光軸方向の幅が，前記液滴が球状になった場合の球の直径よりも小である光検出装置。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは外径が２２７μｍ以下である光検出装置。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは内径が２５μｍ以上である光検出装置。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，空気中で前記配列平面上に配列した複数のキャピラリの内部に形成され，
前記複数のキャピラリは内径に対する外径の比率が４．５以下である光検出装置。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のキャピラリは，内径が，前記液滴が球状になった場合の球の直径よりも小である光検出装置。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，前記レーザビームが照射される部分を，マイクロチップ内に設けられた単一のチャンネルの内部に有する光検出装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の光検出装置において，
前記複数のフロー列は，前記レーザビームが照射される部分よりフローの上流の少なくとも一部の部分が，前記マイクロチップ内の同一平面上に配列した複数のチャンネルの内部に有し，
前記単一のチャンネルの前記レーザビームの中心軸方向の幅が，前記複数のチャンネルの幅の総和よりも大である光検出装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の光検出装置において，
前記複数のチャンネルのそれぞれに対して，オイルを追加供給するチャンネルが接続されている光検出装置。
【請求項１３】
請求項１２記載の光検出装置において，
前記のオイルの追加供給の方向が，前記同一平面に対して傾いている光検出装置。
【請求項１４】
請求項１２記載の光検出装置において，
前記のオイルの追加供給の方向が，前記同一平面に対して垂直である光検出装置。
【請求項１５】
請求項１０記載の光検出装置において，
前記流路部に導入されるレーザビームの中心軸が前記配列平面に対して傾いている光検出装置。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は単数又は複数のラインセンサを備える光検出装置。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は波長分散素子と複数のラインセンサを備え，異なる波長の発光をそれぞれ異なるラインセンサで検出する光検出装置。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記光検出部は複数のフォトマルチプライヤー又は単数のフォトマルチプライヤーアレイを備える光検出装置。
【請求項１９】
請求項１８記載の光検出装置において，
各フロー列から発生される発光をそれぞれ異なる光ファイバを介して前記複数のフォトマルチプライヤー又は前記単数のフォトマルチプライヤーアレイで検出する光検出装置。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項記載の光検出装置において，
前記各液滴は，同種かつ等濃度の蛍光体を含んでいる光検出装置。
【請求項２１】
配列平面上に配列された複数の第１のチャンネルと，
前記複数の第１のチャンネルにそれぞれ接続された複数の第２のチャンネルと，
前記複数の第１のチャンネルが融合して形成される単一の融合チャンネルと，
を有し，
前記複数の第１のチャンネルの短軸方向の幅の合計が，前記融合チャンネルの前記短軸方向の幅よりも小であるマイクロチップ。
【請求項２２】
請求項２１記載のマイクロチップにおいて，
前記複数の第２のチャンネルの前記複数の第１のチャンネルへの接続方向が，前記配列平面に対して垂直方向であるマイクロチップ。
【国際調査報告】
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