(57)【要約】  抗PD-1抗体治療の新たな治療戦略を提供する。  下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに(iii)アミノ酸
2017099034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項２】
PD-1シグナル阻害剤が抗体である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ROS発生剤が、tert-butyl hydroperoxide、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone、2,4-dinitrophenol、2,3-dimethoxy-1、4-naphthoquinone及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
脱共役作用を示す物質が、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone、2,4-dinitrophenol、carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone、salicylic acid、4,4'-[pentane-1,5-diylbis(oxy)]dibenzenecarboximidamide)、2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid、4-hydroxy-2-methyl-N-(2-pyridinyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide、2-{1-[(4-Chlorophenyl)carbonyl]-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl}acetic acid、N-(4-nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide、4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide-1,1-dioxide、niclosamide ethanolamine salt、3-Methylbut-2-enyl 4-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyloxy)quinoline-2-carboxylate及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ROS発生剤又は脱共役作用を示す物質の下流シグナルを制御する物質が、mTOR、AMPK、SIRT1、PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）及びFoxo1のいずれか１つ又はそれ以上を制御する物質である請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
mTORを制御する物質が、4,6-di-4-morpholinyl-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine、phosphatidic acid及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
AMPKを制御する物質が、6,7-dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile、5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β,-D-ribofuranoside、N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide、6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
SIRT1を制御する物質が、trans-3,5,4'-trihydroxystilbene、N-(2-(3-(piperazin-1-ylmethyl)imidazo[2,1-b]thiazol-6-yl)phenyl)quinoxaline-2-carboxamide、N-benzyl-3,5-dicarbethoxy-4-phenyl-1,4-dihydropyridine、2-amino-N-cyclopentyl-1-(3-methoxypropyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]quinoxaline-3-carboxamide、Nicotinamide mononucleotide 及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）を制御する物質が、2-(4-{2-[(4-chlorobenzoyl)amino]ethyl}phenoxy)-2-methylpropanoic acid、9-cis,12-cis-octadecadienoic acid）、2-[4-(4-chlorobenzoyl)phenoxy]-2-methyl-propanoic acid-d6 1-methylethyl ester、(undecylthio)-acetic acid、4-methyl-5-(2-pyrazinyl)-3-dithiolethione、N,N-dimethylformamide、3-[4-(2,4-bis-trifluoromethylbenzyloxy)-3-methoxyphenyl]-2-cyano-n-(5-trifluoromethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)acrylamide及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Foxo1を制御する物質が、5-amino-7-(cyclohexylamino)-1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid、2-cyclopentyl-N-{2,4-dichloro-3-[(isoquinolin-5-yloxy)methyl]phenyl}-N-methylacetamide及びその類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アミノ酸が、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、トレオニン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、オルニチン、シトルリン及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用される請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
PD-1シグナル阻害剤と、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とが別々に投与される請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項１５】
PD-1シグナル阻害剤と、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを含む配合剤である請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項１６】
下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含む、PD-1シグナル阻害活性増強剤。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項１７】
PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を医薬的に有効な量で被験者又は被験動物に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療方法。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項１８】
がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療のための、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【請求項１９】
がん、感染症又はそれらの組み合わせを治療する方法に使用するための、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ−１シグナル阻害剤の併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の臨床試験の結果より、抗PD-1抗体治療は、様々ながんで従来の標準治療より有効であることが明らかになってきた [非特許文献1-3]。末期肺がん患者でのPD-1抗体治療の奏功率は20-30%と従来の抗がん剤に比べて劇的に向上した。しかし、不応答性を示す患者が約半数程度いるのも事実である。なぜこれらの患者はPD-1抗体治療に不応答なのか、まだほとんどわかっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bramer J, Reckamp K, et al: Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 373:1627-1639,2015.
【非特許文献２】Hamanishi J, Mandai M, Ikeda T, et al: Safety and Antitumor Activity of Anti-PD-1 Antibody, Nivolumab, in Patients With Platinum-Resistant Ovarian Cancer. J Clin Oncol, 33:4015-4022,2015.
【非特許文献３】Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, et al: Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med, 373:1803-1813,2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、抗PD-1抗体治療の新たな治療戦略を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
抗PD-1抗体治療は、従来の直接的ながん細胞殺傷作用をもつ抗がん剤とは異なり、抗腫瘍免疫を活性化させることで、がん増殖を抑制する。抗腫瘍免疫をサポートするような試薬があれば、併用することで抗腫瘍効果を向上させることができ、不応答患者にも適応できることが期待される。【０００６】
本発明者らは、PD-1シグナル阻害抗体とROS発生剤やミトコンドリア膜電位制御剤（脱共役剤）を併用すると、相乗的に抗腫瘍効果が向上することを見出した。ROS発生剤や、ミトコンドリア膜電位制御剤単独では、生体内で抗腫瘍効果を発揮しなかった。以上の結果より、ROS発生剤や、ミトコンドリア膜電位制御剤は、PD-1シグナル阻害抗体と併用することで抗腫瘍免疫をサポートし、相乗的にがん増殖を抑制する効果を持つと考えられた。【０００７】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（２）PD-1シグナル阻害剤が抗体である（１）記載の医薬組成物。
（３）抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体である（１）又は（２）記載の医薬組成物。
（４）ROS発生剤が、tert-butyl hydroperoxide、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone、2,4-dinitrophenol、2,3-dimethoxy-1、4-naphthoquinone及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）脱共役作用を示す物質が、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone、2,4-dinitrophenol、carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone、salicylic acid、4,4'-[pentane-1,5-diylbis(oxy)]dibenzenecarboximidamide)、2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid、4-hydroxy-2-methyl-N-(2-pyridinyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide、2-{1-[(4-Chlorophenyl)carbonyl]-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl}acetic acid、N-(4-nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide、4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide-1,1-dioxide、niclosamide ethanolamine salt、3-Methylbut-2-enyl 4-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyloxy)quinoline-2-carboxylate及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）ROS発生剤又は脱共役作用を示す物質の下流シグナルを制御する物質が、mTOR、AMPK、SIRT1、PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）及びFoxo1のいずれか１つ又はそれ以上を制御する物質である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）mTORを制御する物質が、4,6-di-4-morpholinyl-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine、phosphatidic acid及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（６）記載の医薬組成物。
（８）AMPKを制御する物質が、6,7-dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile、5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β,-D-ribofuranoside、N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide、6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（６）記載の医薬組成物。
（９）SIRT1を制御する物質が、trans-3,5,4'-trihydroxystilbene、N-(2-(3-(piperazin-1-ylmethyl)imidazo[2,1-b]thiazol-6-yl)phenyl)quinoxaline-2-carboxamide、N-benzyl-3,5-dicarbethoxy-4-phenyl-1,4-dihydropyridine、2-amino-N-cyclopentyl-1-(3-methoxypropyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]quinoxaline-3-carboxamide、Nicotinamide mononucleotide 及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（６）記載の医薬組成物。
（１０）PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）を制御する物質が、2-(4-{2-[(4-chlorobenzoyl)amino]ethyl}phenoxy)-2-methylpropanoic acid、9-cis,12-cis-octadecadienoic acid）、2-[4-(4-chlorobenzoyl)phenoxy]-2-methyl-propanoic acid-d6 1-methylethyl ester、(undecylthio)-acetic acid、4-methyl-5-(2-pyrazinyl)-3-dithiolethione、N,N-dimethylformamide、3-[4-(2,4-bis-trifluoromethylbenzyloxy)-3-methoxyphenyl]-2-cyano-n-(5-trifluoromethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)acrylamide及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（６）記載の医薬組成物。
（１１）Foxo1を制御する物質が、5-amino-7-(cyclohexylamino)-1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid、2-cyclopentyl-N-{2,4-dichloro-3-[(isoquinolin-5-yloxy)methyl]phenyl}-N-methylacetamide及びその類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（６）記載の医薬組成物。
（１２）アミノ酸が、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、トレオニン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、オルニチン、シトルリン及びそれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１３）抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用される（１）〜（１２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）PD-1シグナル阻害剤と、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とが別々に投与される（１）〜（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（１５）PD-1シグナル阻害剤と、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを含む配合剤である（１）〜（１３）のいずれかに記載の医薬組成物。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（１６）下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含む、PD-1シグナル阻害活性増強剤。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（１７）PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を医薬的に有効な量で被験者又は被験動物に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療方法。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（１８）がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療のための、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
（１９）がん、感染症又はそれらの組み合わせを治療する方法に使用するための、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【発明の効果】
【０００８】
ROS発生剤若しくはその下流シグナルを制御する物質及び/又は脱共役作用を示す物質若しくはその下流シグナルを制御する物質を、PD-1シグナル阻害剤と併用することで、相乗的に抗腫瘍効果が向上する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2015‐238511及び特願2016-119695の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】PD-1阻害と化学試薬によるミトコンドリア活性化の仮説図。a) PD-1阻害は、腫瘍反応性T細胞のミトコンドリアを活性化する。b）ROS誘導剤又は脱共役剤は、細胞のROSを増加させる。c）細胞のROSはAMPKとmTORを活性化し、その結果、T-betの発現に加えてPGC-1aが活性化される。d）PGC-1aと結合するNRFやPPARsの活性化は、ミトコンドリアにおけるポジティブフィードバック的活性化を引き起こす。Friederich-Persson, M., et al. Kidney hypoxia, attributable to increased oxygen consumption, induces nephropathy independently of hyperglycemia and oxidative stress. Hypertension 62, 914-919 (2013).Kenwood, B.M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Mol Metab 3, 114-123 (2014).Berrien-Elliott, M.M., et al. Checkpoint blockade immunotherapy relies on T-bet but not Eomes to induce effector function in tumor-infiltrating CD8+ T cells. Cancer immunology research 3, 116-124 (2015).
【図２】PD-1阻害によるTR CTLの生体内検出とそのミトコンドリアの活性。a-d) 実験工程の概要図。CellTraceでラベルしたCD45.1+ CD8+ T 細胞をCD45.2+ CD8-/-マウスに移した。マウスにMC38を接種し、PD-L1抗体で治療した。所属リンパ節のCD8+ CD45.1+ T細胞にゲートをかけ解析した(a)。そのゲート内における細胞のCD62LとCellTraceの強度を示した (b) (左)。高分裂細胞の頻度を群間比較した。データは4から5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、一元配置分散分析(右) (b)。 (a)で示されるゲート内の細胞で、CellTrace及び、mLama4ペプチドもしくは無関係なペプチドをロードしたMHC四量体の陽性率をPD-L1抗体治療した群で解析した (c)。PD-L1抗体治療を行った所属リンパ節細胞をミトコンドリアの活性に関係する試薬で染色した。(a)のゲート中の代表的なFACSデータを示した (上図) (d)。各ミトコンドリア染色試薬の蛍光強度の中央値を高分裂(高)と低分分裂(低) ことに解析し比較した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差示している。*p<0.05、****p<0.0001、一元配置分散分析(下図) (d)。 データは三つの独立した実験の内代表的なものを示している (a-d)。 e, f) MC38担癌野生型マウスにPD-L1抗体を４日毎に３回投与した。治療もしくは未治療マウスから単離した所属リンパ節のCD8+ T細胞の酸素消費量（OCR）をXFe96解析器で計測した。二回目治療の2日後に3匹のマウスの細胞を混合し解析した (e)。(オリゴマイシン投与後の最終計測値)-(オリゴマイシン投与後の最低計測値)と定義したATP回転率を計測した (f)。データは3 wellの平均値 ± 標準誤差を示している。****p<0.0001、2標本のstudent-t検定分布。データは二つの独立した実験の内、代表的データを示している。
【図３】PD-L1抗体治療と活性酸素発生剤Luperoxの相乗効果。a) マウスにMC38を接種し3週間、7日毎にtert-Butyl hydroperoxide溶液(Luperox) を投与した。腫瘍の体積を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。b) 併用治療の工程の概要図。c) マウスにMC38を接種した7日後にPD-L1抗体とLuperox を投与した。腫瘍の体積と生存曲線を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、2標本のt検定分布(抗PD-L1 対 抗PD-L1＋Luperox)。データは二つの独立した実験の内、代表的なものを示している。
【図４】脱共役剤の相乗効果はROSが関与する。a) 図3bのように同じ工程でMC38担癌マウスにFCCPもしくはDNPとPD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積と生存曲線を示した。データは5から6匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、2標本のt検定分布(抗PD-L1 対 抗PD-L1＋FCCPもしくはDNP)。 b) (a)と同じ工程でMC38担癌マウスにFCCPもしくはDNPのみを投与した。腫瘍の体積を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。c) MC38担癌マウスにROS消去剤 (MnTBAP) とPD-L1抗体とFCCP (左)もしくはDNP (右)を投与した。データは4から5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、2標本のt検定分布(併用治療 対 併用治療＋MnTBAP)。DNP併用治療におけるコントロールIgG 群のマウス(右)は図4bと共有した。データは二つの独立した実験の内、代表的なものを示している。
【図５】DNPとLuperoxをともに併用することで抗腫瘍効果が増進される。MC38担癌マウスに図3bと同様の工程で、DNPもしくはLuperox、またはその両方と抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積を示した。データは5から6匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。データは二つの独立した実験の内代表的なデータを示している。
【図６】FCCP投与によるエフェクターCD8+ T細胞の増加。 a) 図3bで示したように同じ工程でMC38担癌マウスにPD-L1抗体とFCCP を投与した。14日目に所属リンパ節の細胞を抗CD8、CD62L、CD44抗体で染色し、CD8+ T細胞にゲートした。P1からP3の細胞群をCD62LとCD44の強度を基に定義した (上図)。各群におけるP1からP3の細胞の絶対数を計算した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、一元配置分散分析 (下図)。b) PD-L1抗体とFCCPを投与したマウスの所属リンパ節CD8+T細胞を各ミトコンドリア染料で染色した。P1-P3の代表的なFACSプロフィール（上段図）。各グループにおける各ミトコンドリア染料で染色したP3細胞群の代表的なFACSプロフィール（中段図）。各染料で染色したP1-P3のMFIを投与群間で比較した。色はP1-P3細胞群に対応する。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している（下段図）。*p<0.05、**p<0.01、一元配置分散分析。c) 腫瘍投与後11日目に酵素処理した癌組織の細胞を抗CD8、CD45、CD62L、CD44抗体で染色した。CD45+ CD8+ T細胞にゲートをかけ、そのCD62LとCD44の表現型を解析した (左図)。CD45+ T細胞中のCD8+ T細胞の頻度とCD45+ CD8+ T細胞の絶対数を群間比較した(右図)。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、一元配置分散分析。FACSデータは各群の5匹のマウスデータの内、代表的なものを示している。データは二つの独立した実験内、代表的なものを示している。
【図７】脱共役剤とPD-L1抗体の併用による相乗効果には、mTORとAMPKの経路が関与する。a) DNPもしくはFCCPの併用治療時の時に、5匹のマウスの所属リンパ節細胞を混合し、CD8+ T細胞を単離した。AMPKとACC、mTOR、S6Kのリン酸化及びSIRT1と4EBP1の発現をウェスタンブロッティング法により解析した。b) 図3bと同様の工程でMC38担癌マウスにAMPK活性剤(A76966)とmTOR活性剤 (MHY1485)、もしくはその両方をPD-L1マウス抗体と共に投与した。腫瘍の体積と生存曲線を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、2標本のt検定分布 (抗PD-L1抗体 対 併用治療)。アスタリスクの各色は同じ色で示された群と一致している。c) MC38担癌マウスにSIRT1活性剤 (レスベラトロール)とPD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積と生存曲線を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、**p<0.01、2標本のt検定分布 (抗PD-L1抗体 対 併用治療)。
【図８】mTORとAMPKの異なった活性化状態はCD8+ T細胞の分化段階に対応する。MC38担癌マウスにDNPと抗PD-L1抗体を投与した。１回目の治療の翌日に、所属リンパ節の細胞をCD8, CD62L, CD44, p-mTOR及び p-AMPKに対する抗体で染色した。図6aに示すようにP1からP3にゲートをかけ、p-AMPKとp-mTORの蛍光強度を比較した。データは二つの独立した実験の内、代表的なものを示している。
【図９】PD-L1抗体治療とAMPK阻害剤の相乗効果。MC38担癌マウスに図3bと同様の工程で、compound Cと抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積を示した。
【図１０】PD-L1抗体治療とAMPK阻害剤の相乗効果。RENCA担癌マウスに図3bと同様の工程で、compound Cと抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積を示した。
【図１１】PD-L1抗体治療とPGC-1α/転写因子複合体活性剤の相乗効果。MC38担癌マウスに図3bと同様の工程で、NRF2活性化剤(Oltipraz)又はPPARs活性化剤(Bezafibrate)と抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍の体積を示した。データは5匹のマウスの平均値 ± 標準誤差を示している。*p<0.05、two-tailed student-T検定（PD-L1抗体vs各併用療法）。
【図１２】LuperoxおよびFCCPは生体内の腫瘍細胞にほとんど影響しない。a）腫瘍組織は、２回目のFCCP又はLuperox単独投与から１日後に回収した。酵素消化後、腫瘍細胞は、腫瘍細胞以外の細胞を取除去出来る細胞分離キットにより選別された。分離された腫瘍細胞は、さらにAriaにより精製され、次の実験に使用された。b）腫瘍細胞はPD-L1、MHC class I、CD155（TIGITのリガンド）とVISTAを標的とした抗体又はミトコンドリア質量、膜電位やスーパーオキシドを染める色素で染色した。c）ミトコンドリアエネルギー代謝やアポトーシス関連遺伝子の発現レベルは、RT2 profiler PCRキットを用いて調べた。表示されている遺伝子名は、８２遺伝子中、無処理の腫瘍細胞と比較して２倍以上、有為に増加したものである。
【図１３】ミトコンドリア活性化関連試薬の抗腫瘍相乗効果。a）併用治療スケジュールの模式図。b）マウスにPD-L1抗体とParaquatの併用治療を行った。データは、5-6匹のネズミの値の平均値 ± 標準誤差を表す。データは２回の独立した実験の代表である。
【図１４】ミトコンドリア活性化関連試薬は異なる腫瘍やマウスの系統においても機能する。繊維肉腫MethAを移植したBALB/cマウスにPD-L1抗体とFCCP、Luperox、Parawuat又はOltiprazを図３のスケジュールに従い投与した。腫瘍サイズを示す。データは、5匹のネズミの値の平均値 ± 標準誤差を表す。*p<0.05、両側student-t検定（PD-L1抗体 vs それぞれの併用治療）。
【図１５】T-betとIFN-γ 産生は、FCCP又はBezafibrateとPD-L1抗体との併用治群において増加する。a）PD-L1抗体とFCCPで併用治療したマウス由来の所属リンパ節のCD8陽性細胞におけるT-betとEomes発現をフローサイトメトリーによって解析した。代表的なFACSデータを示す（上図）。PD-L1抗体とFCCP又はBezafibrateで併用治療したマウス由来の所属リンパ節におけるT-betとEomes陽性T細胞の頻度と数を算出した（下図）。b）酵素消化した腫瘍組織を３７℃で６時間培養し、PD-L1抗体とFCCP又はBezafibrateで併用治療したマウス由来のCD8陽性細胞におけるIFN-γの細胞内染色を行った。代表的なFACSデータ（左図）とCD8陽性細胞内におけるIFN-γの頻度（右図）を示している。データは、5匹のネズミの値の平均値 ± 標準誤差を表す。*p<0.05、**p<0.01は一元配置分散分析によるものである。
【図１６】PD-L1抗体治療とFoxo1阻害剤: AS1842856の相乗効果。MethAをBALB/cマウスに5x105接種し、7日後に抗PD-L1抗体（80 ug）とFoxo1阻害剤 (2mg/kg)を投与した。投与スケジュールは図3に従う。腫瘍の体積を示した。
【図１７】血中メタボライト（アミノ酸）の変化。５匹のPD-1-/-マウスと野生型マウスの血清中に含まれるアミノ酸の量をGC-MS解析にて同定した。図は野生型の値を１としたときのPD-1-/-マウスの値を示す。N=5, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, t-test.
【図１８】Aminolebanの組成。
【図１９】PD-L1抗体治療とAminolebanの相乗効果。Fibrosarcoma MethAをBALB/cマウスに5x105接種7日後に抗PD-L1抗体（60 ug）とAminoleban (400 ul/mouse)を投与した。投与スケジュールは図３に従う。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物を提供する。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
【００１２】
ROS発生剤としては、tert-Butyl hydroperoxide （Luperox）、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)、2,4-Dinitrophenol（DNP）、2,3-dimethoxy-1, 4-naphthoquinone （DMNQ）、2-Methylnaphthalene-1,4-dione (Menadione)、1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridinium dichloride (Paraquat)及びそれらの類似体を例示することができる。
【００１３】
ROS発生剤の下流には、mTOR、ATM (ataxia telangiectasia mutated protein：血管拡張性失調症変異タンパク質)、AMPK（AMP-activated protein kinase）などのシグナル伝達があり（図１）、本発明の医薬組成物は、これらのいずれかを制御する物質を含んでもよい。制御は、賦活化と不活性化を包含する概念である。
【００１４】
ROS下流シグナルのmTORは、細胞の解糖系を活性化し、細胞分裂に必要なタンパク質・脂質・核酸の増幅を引き起こす(同化作用の促進)。それにより、PD-1シグナル阻害によって増強されたT細胞レセプターシグナルをさらに補強すると考えられる。脱共役物質の下流シグナルにより、AMPKが活性化されるとミトコンドリアの生合成が起こり、エネルギーの産生に必要な酸化的リン酸化がミトコンドリア内で活性化する。それにより、PD-1シグナル阻害によって増強されたT細胞レセプターシグナルをさらに補強すると考えられる。
【００１５】
mTORを制御する物質としては、4,6-dimorpholino-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine;4,6-Di-4-morpholinyl-N-(4-nitrophenyl)-1,3,5-triazin-2-amine （MHY1485）、Phosphatidic acid(PA)及びそれらの類似体を例示することができ、これらの物質は、mTORを賦活化する。
【００１６】
AMPKは、エネルギーセンサーとも言われ、エネルギー消費によりATP量が減り、AMPの量が増えると活性化する。AMPKの役割は、エネルギーの消費を抑制し、エネルギーを蓄積する方向へと代謝を制御することである。そのため、AMPKが活性化すると生合成が抑制され（同化作用の抑制）ミトコンドリアからのATP産生が盛んになる（異化作用の促進）1, 2, 3。AMPKシグナルの下流にはPGC-1aと転写因子の複合体があり、それによりミトコンドリアの生合成や酸化的リン酸化代謝が活性化する4。AMPKを活性化すると糖尿病の改善が見られることより、一部のAMPK活性化剤は糖尿病治療薬として使用されている。AMPKを制御する物質としては、6,7-dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile（A769662）、5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β,-D-ribofuranoside（AICAR）、N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide（Metformin）及びそれらの類似体を例示することができ、これらの物質は、AMPKを賦活化する。AMPKを不活性化する物質（AMPKの阻害剤）としては、6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine（compound C）及びそれらの類似体を例示することができる。
SIRT1は、脱アセチル化酵素であり、PGC-1αやFoxo1等の転写関連因子活性化する。SIRT1が活性化すると、ROSやストレスに対する耐性を形成する。SIRT-1はAMPKによっても活性化され、PGC-1aの活性化によりミトコンドリアの生合成や酸化的リン酸化を促進する。SIRT1の活性化により外的・内的ストレスに耐性になるため、長寿に関連するとも言われている5, 6。SIRT1を制御する物質としては、trans-3,5,4'-trihydroxystilbene（resveratrol）、N-(2-(3-(piperazin-1-ylmethyl)imidazo[2,1-b]thiazol-6-yl)phenyl)quinoxaline-2-carboxamide、N-benzyl-3,5-dicarbethoxy-4-phenyl-1,4-dihydropyridine、2-amino-N-cyclopentyl-1-(3-methoxypropyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]quinoxaline-3-carboxamide、Nicotinamide mononucleotide 及びそれらの類似体を例示することができ、これらの物質は、SIRT1を活性化する。
PGC-1αは転写因子コアクティベーターと呼ばれており、様々なミトコンドリア活性に関連する転写因子と複合体を形成する（PGC-1αを含む転写因子複合体）。例えばPGC-1αは、転写因子TRβ1、NRFs, ERRs, PPARα/β/TM等と複合体を形成し、ミトコンドリアの活性化、脂質代謝の促進、活性酸素無毒化を促進する。PGC-1αに結合する転写因をターゲットにした薬剤は、糖尿病治療薬、中性脂肪降下薬として使用されている4, 7, 8。PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）を制御する物質としては、2-(4-{2-[(4-chlorobenzoyl)amino]ethyl}phenoxy)-2-methylpropanoic acid（bezafibrate）、9-cis,12-cis-octadecadienoic acid）、2-[4-(4-chlorobenzoyl)phenoxy]-2-methyl-propanoic acid-d6 1-methylethyl ester、(undecylthio)-acetic acid、4-methyl-5-(2-pyrazinyl)-3-dithiolethione（Oltipraz）、N,N-dimethylformamide、3-[4-(2,4-bis-trifluoromethylbenzyloxy)-3-methoxyphenyl]-2-cyano-n-(5-trifluoromethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)acrylamide及びそれらの類似体を例示することができ、これらの物質は、PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）を制御する。
【００１７】
脱共役作用を示す物質としては、carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）、2,4-dinitrophenol（DNP）、carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazpne (CCCP)、salicylic acid、4,4'-[pentane-1,5-diylbis(oxy)]dibenzenecarboximidamide) (Pentamidine)、2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid (Diclofenac)、4-hydroxy-2-methyl-N-(2-pyridyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide (Piroxicam)、2-{1-[(4-Chlorophenyl)carbonyl]-5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl}acetic acid (Indomethacin)、（N-(4-nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide (Nimesulide)、4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide（Meloxicam）、niclosamide ethanolamine salt (NEN)、3-Methylbut-2-enyl 4-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyloxy)quinoline-2-carboxylate及びそれらの類似体を例示することができる。
【００１８】
脱共役剤の下流には、mTOR、AMPK（AMP-activated protein kinase）、SIRT1、PGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）などのシグナル伝達があり（図１）、本発明の医薬組成物は、これらのいずれかを制御する物質を含んでもよい。制御は、賦活化と不活性化を包含する概念である。
【００１９】
mTOR、AMPK、SIRT1及びPGC-1α/転写因子複合体（PGC-1αを含む転写因子複合体）を制御する物質については上述した。
Foxo1はmTORの下流にある転写因子である。mTORの活性化により、リン酸化されると核内より細胞質に移動し、転写開始が起こらない。これによりEOMESが抑制され、CTLの活性化に必要なT-bet の発現が増強される。(Staron MM et al. Immunity. 41: 802-14, 2014.   Rao RR et al. 36: 374-87, 2012.)
また、Foxo1はPGC-1a結合し、糖新生を促進する遺伝子発現を活性化させる。糖新生は、TCA cycleの代謝産物をもとに糖が合成されるので、酸化的リン酸化は抑制される方向に動く。また、報告によると、2型糖尿病のモデルでFoxo1を抑制するとミトコンドリア機能不全が回復する。このことからもFoxo1を抑制するとミトコンドリアは活性化すると考えられる。(Coppari R et al. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 3:160-6, 2009.   Puigserver P et al. Nature. 423:550-5, 2003.
Foxo1を制御する物質としては、5-amino-7-(cyclohexylamino)-1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid、2-cyclopentyl-N-{2,4-dichloro-3-[(isoquinolin-5-yloxy)methyl]phenyl}-N-methylacetamide及びそれらの類似体を例示することができる。
アミノ酸としては、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、トレオニン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、オルニチン、シトルリン及びそれらの類似体を例示することができる。アミノ酸は、１種類でも、２種類以上の組合せでもよい。アミノ酸は、L−アミノ酸、D−アミノ酸またはDL‐アミノ酸のいずれであってもよい。PD-1を阻害すると、アミノ酸等のメタボライトは同化作用（細胞増殖）が激しくなり、消費される。そこに、細胞等の骨格となるアミノ酸を入れてやると、さらに細胞増殖が進むと考えられる。アミノ酸が補給されて細胞増殖が早くなると、mTORは活性化する方向に行く。例えば、アミノ酸製剤であるアミノレバン（Aminoleban）はmTORを活性化するとの報告がある (Tamanna N, Mahmood N. Int Sch Res Notices. 2014:235619, 2014)。後述の実施例において、アミノレバンにPD-L1抗体治療との相乗効果が見られたので、アミノレバンに含まれるアミノ酸のうちの１種又は２種以上の組合せが好ましいと考えられる。
上述の(i)〜(iii)の物質は、塩の形態であってもよい。塩は、医薬的に許容されるものであるとよく、そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンルスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
また、上述の(i)〜(iii)の物質及びその塩は、水、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの溶媒と溶媒和物を生成してもよい。また、溶媒和物は、単独のものであっても、複数種の混合物であってもよい。
【００２０】
本明細書において、「類似体」とは、大きな構造変化を必要とせず、少し側鎖等を追加変更した同等の効果を示す物質をいい、医薬品におけるリード化合物の誘導体、活性代謝物に対するプロドラッグ、プロドラッグに対する活性代謝物などを含む概念である。プロドラッグとしては、活性な化合物のアミノ基がアシル化、アルキル化、リン酸化された化合物（例えば、活性な化合物のアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、ｔ−ブチル化された化合物等）、活性な化合物のヒドロキシル基がアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化された化合物（例えば、活性な化合物のヒドロキシル基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物等）、活性な化合物のカルボキシ基がエステル化、アミド化された化合物（例えば、活性な化合物のカルボキシ基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、メチルアミド化された化合物等）などを例示することができる。
【００２１】
本明細書において、「PD-1シグナル」とは、PD-1が担う情報伝達機構をいい、その一つとして、PD-1がそのリガンドであるPD-L1、PD-L2と共同して、T細胞の活性化を抑制する情報伝達機構を例示することができる。PD-1（Programmed cell death-1）は、活性化したT細胞やB細胞に発現する膜タンパク質であり、そのリガンドであるPD-L1とPD-L2は、単球や樹状細胞などの抗原提示細胞、がん等様々な細胞に発現する。PD-1、PD-L1及びPD-L2は、T細胞の活性化を抑制する抑制因子として働く。ある種の癌細胞やウイルス感染細胞は、PD-1のリガンドを発現することにより、T細胞の活性化を抑制し、宿主の免疫監視から逃避している。
【００２２】
PD-1シグナル阻害剤としては、PD-1、PD-L1又はPD-L2に特異的に結合する物質が挙げられ、そのような物質としては、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、核酸（天然型核酸、人工核酸を含む）、低分子有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、動植物や土壌などからの抽出物などがありうる。物質は、天然物であっても、合成物であってもよい。好ましいPD-1シグナル阻害剤は、抗体であり、より好ましくは、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体などの抗体である。抗体は、PD-1シグナルを阻害できるものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体のいずれであってもよい。それらの抗体の製造方法は公知である。抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、モルモットなど、いずれの生物に由来するものであってもよい。また、本明細書において、抗体とは、Fab、F(ab)’2、ScFv、Diabody、VH、VL、Sc(Fv)2、Bispecific sc(Fv)2、Minibody、scFv-Fc monomer、scFv-Fc dimerなどの低分子化されたものも含む概念である。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用することができる。
【００２４】
本発明の医薬組成物を抗がん剤として投与する場合、対象となる癌又は腫瘍としては、白血病、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫など）、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓がん、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、頭頚部癌（喉頭癌など）、口腔癌（口腔底癌など）、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌（上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌など）、甲状腺癌、腎臓がん、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍（睾丸がん）、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌（基底細胞がん、有棘細胞がん、悪性黒色腫(メラノーマ)、日光角化症、ボーエン病、パージェット病など）、肛門癌などが例示されるが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
本発明の医薬組成物を感染症治療剤として投与する場合、対象となる感染症としては、細菌感染症（レンサ球菌（A群β溶連菌、肺炎球菌など）、黄色ブドウ球菌（MSSA、MRSA）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌（0157:H7など）、クレブシエラ（肺炎桿菌）、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クロストリジウムなどによる各種感染症、結核、コレラ、ペスト、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、梅毒 、破傷風、ハンセン病、レジオネラ肺炎（在郷軍人病）、レプトスピラ症、ライム病、野兎病、Q熱など）、リケッチア感染症（発疹チフス、ツツガムシ病、日本紅斑熱など）、クラミジア感染症（トラコーマ、性器クラミジア感染症、オウム病など）、真菌感染症（アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、白癬菌症、ヒストプラズマ症、ニューモシスチス肺炎など）、寄生性原虫感染症（アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、クリプトスポリジウムなど）、寄生性蠕虫感染症（エキノコックス症、日本住血吸虫症、フィラリア症、回虫症、広節裂頭条虫症など）、ウイルス感染症（インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、後天性免疫不全症候群 (AIDS)、成人T細胞性白血病、エボラ出血熱、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群 (SARS)、進行性多巣性白質脳症、水痘、帯状疱疹、手足口病、デング熱、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹 、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、ハンタウイルス腎出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱など）などが例示されるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与される。
(i)ROS発生剤及びその下流シグナルを制御する物質、
(ii)脱共役作用を示す物質及びその下流シグナルを制御する物質、並びに
(iii)アミノ酸
本発明の医薬組成物において、PD-1シグナル阻害剤と、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを併用あるいは合剤化することができる。
【００２７】
PD-1シグナル阻害剤と、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを併用する場合、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とが別々に投与されるとよい。
【００２８】
PD-1シグナル阻害剤と、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを合剤化する場合、PD-1シグナル阻害剤と、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質とを含む配合剤とするとよい。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、全身又は局所的に、経口又は非経口で被験者又は被験動物に投与される。
【００３０】
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）は、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射又は点滴により被験者又は被験動物に投与するとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤など）などを添加してもよい。投与経路としては、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などが可能である。
【００３１】
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。製剤は、単位投与製剤に製剤化するとよい。
【００３２】
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）の投与量、投与の回数及び頻度は、被験者又は被験動物の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり、有効成分の量に換算して、0.1〜100 mg/kg体重、好ましくは、1〜10mg/kg体重を、少なくとも１回、所望の効果が確認できる頻度で投与するとよい。
【００３３】
上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質は、PD-1シグナル阻害剤を含む製剤に含有させてもよいが、単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ、エアロゾル、坐剤、注射剤等に製剤化してもよい。賦形剤または担体は、当分野で常套的に使用され、医薬的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜変更される。例えば、液状担体としては水、植物油などが用いられる。固体担体としては、乳糖、白糖、ブドウ糖などの糖類、バレイショデンプン、トウモロコシデンプンなどのデンプン、結晶セルロースなどのセルロース誘導体などが使用される。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースなどの崩壊剤等を添加してもよい。その他、抗酸化剤、着色剤、矯味剤、保存剤等を添加してもよい。
【００３４】
上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質は、経口、経鼻、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内などの種々の経路によって投与できる。
【００３５】
上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば、液剤の場合には、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の製剤中における含量は、1〜100重量％が好ましい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の製剤中における含量は、通常約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。製剤は、単位投与製剤に製剤化するとよい。
【００３６】
上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の投与量、投与の回数及び頻度は、被験者又は被験動物の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり、有効成分の量に換算して、0.005 μg（又はml）〜25000 mg（又はml）/kg体重程度を少なくとも１回、所望の効果が確認できる頻度で投与するとよい。各薬剤（物質）の投与量について、適当な範囲、好ましい範囲及びより好ましい範囲を下記の表に示すが、これらの値に限定されるわけではない。
（表）
2017099034.tif 000003
【００３７】
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）とROS発生剤若しくはその下流シグナルを制御する物質の比率（質量）は、1:0.1〜1:100が適当であり、好ましくは 1:1〜1:50である。
【００３８】
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）と脱共役作用を示す物質若しくはその下流シグナルを制御する物質の比率（質量）は、1:0.01〜1:10が適当であり、好ましくは 1:0.1〜1:1である。
PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）とアミノ酸の比率（質量）は、1:0.001〜1:100が適当であり、好ましくは 1:0.01〜1:10である。
【００３９】
本発明は、また、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を医薬的に有効な量で被験者又は被験動物に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療方法も提供する。さらに、本発明は、がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療のための、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用を提供する。さらにまた、本発明は、がん、感染症又はそれらの組み合わせを治療する方法に使用するための、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質が投与される前記使用も提供する。
【００４０】
また、本発明は、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含む、PD-1シグナル阻害活性を増強する薬剤を提供する。
【００４１】
本発明の薬剤は、PD-1シグナル阻害剤との併用薬又は配合剤として用いることができる。PD-1シグナル阻害剤と、上記の(i)〜(iii)からなる群より選択される少なくとも１種の物質との併用及び合剤化については、上述した。本発明の薬剤は、医薬としての用途の他、実験試薬としても利用できる。
【００４２】
ある物質がROS発生剤であるか否かを調べるには、細胞（例えば、マウス脾臓細胞）にその物質を試験管内で添加し、細胞内のROSの濃度を測定するとよい。ある物質が脱共役作用若しくはその下流シグナルを制御する作用を有するか否かを調べるには、細胞（例えば、マウス脾臓細胞）にその物質を試験管内で添加し、細胞内のミトコンドリアのプロトン勾配を細胞内染色後フローサイトメターで測定するか、もしくはSeahorseを用いて直接測定するとよい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
[要旨]
PD-1阻害によるがん免疫治療により、がん患者の生存率は劇的に向上した。しかし、ある一定の患者には不応答である。PD-1阻害と他の併用剤との併用療法は免疫治療効果を改善すると考えられる。我々は、マウスがん治療モデルを用い、所属リンパ節に出現するがん反応性細胞障害性T細胞 (tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes: TR CTLs)が、大きいミトコンドリア体積と、高い膜電位、そして高い活性酸素（ROS）産生を有していることを発見した。またROS発生剤もしくは、脱共役剤によるミトコンドリア由来ROSによって、CD8+ CD44+ CD62L- T細胞が所属リンパ節と腫瘍内で増加し、PD-1阻害による抗腫瘍効果が増強されることを実証した。さらに、リスベラトロールを含み、mTOR、AMPK、SIRT等のメタボリックセンサーを直接活性化させる試薬がPD-1阻害治療効果を増強し、長期にわたり腫瘍を抑制することを明らかにした。重要なことにこれら併用治療薬単独では抗腫瘍効果を示さなかった。
[緒言]
PD-1阻害による免疫療法はがん治療に革新的なインパクトをもたらした。その特徴として、様々ながん種に高い効果がある事、長期的に抗腫瘍効果が続く事、そして副作用が少ない事があげられる9, 10, 11。活性化T細胞の表面受容体として発現するPD-1は免疫応答において、抑制因子として作用する。PD-1は2つのリガンドであるPD-L1あるいはPD-L2と結合し、ITSM中のチロシン残基をリン酸化し、チロシンホスファターゼであるSHP-2がリクルートされる。SHP-2により、T細胞受容体の活性化によってリン酸化していたZap70などの活性化シグナル伝達分子が脱リン酸化され、T細胞の活性化が抑制される12, 13。動物実験でPD-1欠損マウスが自己免疫疾患を発症したことより、PD-1による免疫抑制機能が確認された14, 15, 16。このようにPD-1は免疫チェックポイントとして作用し、自己免疫寛容をおこすことがわかった。
我々は、PD-1の基本的な役割を解明し、PD-1の特性を利用してがんや感染症に対する免疫応答を補助できる事を明らかにしてきた17, 18。実際、悪性黒色腫に対する臨床試験の結果が2010年に発表されてから19、これまで様々ながん種に対するPD-1阻害療法による臨床試験がおこなわれてきたが、そのほとんど全てにおいて驚くほどの効果を示している20。現在、PD-1阻害療法は悪性黒色腫や非小細胞肺がん、腎細胞がんで保険適応の認可が下りている。PD-1阻害療法はこれまでの免疫療法のみならず実際に使われている標準的な化学療法と比較しても、劇的にがん患者の生存率をあげている。しかし残念な事に、30-50%程の患者は未だPD-1阻害療法に不応答である。この不応例を克服するため、PD-1阻害療法と他の免疫チェックポイント因子であるLag3やTim3、がんワクチン、放射線治療、低容量の化学療法などが併用されてきた21。しかし、これまでに併用療法によって有意な相乗効果が認められたという報告はまだない。
我々は、2002年に動物モデルでPD-1阻害療法のがん治療効果を確立したが17、PD-1阻害療法による殺腫瘍効果や免疫寛容状態の解除がどのような機序でおきているのかは未だ解明されていない。例えば、チェックポイント阻害剤による免疫療法においては主にがん特異的変異抗原がターゲットとなっているが22, 23、エフェクターT細胞が活性化される部位は、腫瘍部位なのか所属リンパ節なのか不明である。またPD-1抗体治療により腫瘍が根絶される際、どのようなシグナルが腫瘍部位へエフェクターT細胞を遊走させているもか不明である。また、腫瘍反応性細胞傷害性T細胞と腫瘍非反応性T細胞を識別する方法や、PD-1シグナルの遮断がどのように腫瘍反応性細胞傷害性T細胞の活性化・分化状態に影響するかにいてもほとんどわかっていない。更には、PD-1阻害療法で治療されたがん患者において、PD-1シグナルの遮断によって活性化された免疫監視機構がなぜ数年にわたって継続するのかも謎のままである24, 25。
PD-1阻害療法をより効果的にする新しい治療戦略を確立する為には、上記のいくつかの問題に答えを出さなければならない。そこで、エフェクター機能に必要な代謝リプログラミングに注目し、腫瘍反応性細胞傷害性T細胞を解析した1, 2, 3, 26, 27。興味深いことに、PD-1阻害療法下で所属リンパ節から抽出した腫瘍特異的細胞傷害性エフェクターT細胞は、より大きなミトコンドリアの質量、より高い膜電位、および高いミトコンドリアの活性酸素種（ROS）を示した。これらの結果は、PD-1シグナルを遮断する事でミトコンドリアの活性が増加する事を示しており、これまで報告されたin vitroでの報告と一致する28, 29。
これらの結果をもとに、我々はエフェクターT細胞におけるミトコンドリアの機能刺激がPD-1遮断療法における抗腫瘍効果の増強をもたらすという仮説をたてた。実際、エネルギー代謝センサーであるAMP-activated Protein Kinase (AMPK)やSIRT1、Mechanistic Target Of Rapamycin (mTOR)にを活性化する薬剤がPD-1遮断療法との相乗的な抗腫瘍効果を示した。これらの知見は、 PD-1阻害療法に対しての効果が弱い患者に対する併用療法の開発のための道を開くかもしれない。
[結果]
PD-1遮断によるDLNにおける腫瘍反応性CD8陽性T細胞のミトコンドリア活性の増大。
T細胞の活性化に伴い、急激な細胞増殖に必要な因子が迅速に供給される必要がある。そこで我々はPD-1阻害により誘導される 腫瘍反応性CD8陽性T細胞の代謝変化を所属リンパ節において検討することにした。PD-1阻害療法のメカニズム解明における１つの問題として、PD-1遮断により様々な腫瘍抗原に反応する多様なT細胞受容体レパートリーを有したCTLが発生する為、腫瘍反応性細胞傷害性T細胞 (TR CTLs)の包括的同定が困難であるという点があげられる30, 31。この問題を解決するため、CellTraceで標識したCD45.1陽性CD8陽性T細胞をCD45.2陽性CD8KOマウスに移植した。その後、腫瘍反応性CD8陽性T細胞が選択的に活発に増殖すると推測し、所属リンパ節における標識したT細胞の増殖を検討した(図2a)。MC38担がんマウスにおいて、移植されたCD45.1陽性CD8陽性T細胞は、活発に分裂する細胞群(高分裂群)と分裂が少ない細胞群 (低分裂群)にわかれた (図2b)。担がんマウスにおけるCD45.1陽性CD8陽性T細胞の高分裂群の絶対数や割合は、コントロール抗体IgGを投与した群と比べPD-L1抗体で治療された群で増えていた (図2b)。特筆すべき事にPD-L1抗体は非担がんマウスでは上記の増殖に差が見られなかった。これにより激しく分裂をおこしたCD8陽性T細胞は実際に腫瘍抗原によって活性化可能性が高いことが示された (図2b)。更に、所属リンパ節におけるCD45.1陽性CD8陽性T細胞中で、PD-L1阻害によってもたらされた高分裂群の分画に、MC38の変異エピトープであるmLama4ペプチド/MHCテトラマー陽性細胞群が検出された (図2c)22。従って、活発に増殖している細胞群にはTR CTLsが多く含まれていると考えられた。
次に、我々は所属リンパ節において強く増殖しているTR CTLの代謝機能を調べた。ミトコンドリアの代謝はT細胞の活性化だけでなく継続的なT細胞の増殖やメモリーT細胞の形成にも重要であると考えられているため、我々はTR CTLsにおけるミトコンドリアの機能について着目した26, 32。CD8陽性T細胞のうち高分裂群は低分裂群に比べて、ミトコンドリアの質量が大きく、膜電位が高く、ミトコンドリアの活性酸素種（ROS）の産生が多かったことより33、PD-1遮断によりTR CTLsでミトコンドリアが活性化していることが明らかになった (図2d)。上記の結果と一致し、ミトコンドリアの呼吸の指標であるOCR (酸素消費速度)とATPの基本的使用量は、PD-L1抗体で治療されたマウスの所属リンパ節におけるCD8陽性T細胞で顕著に高かった (図2e-f)34。これらの結果より、PD-1遮断治療ではTR CTLsの増殖に伴ってミトコンドリアの代謝速度が上がる事が証明された。
ROSはPD-1遮断による抗腫瘍活性を増強するために必要である。
上記に示した通り、ROSはPD-L1抗体治療により顕著に増える。ROSはミトコンドリアの電気伝達系 (ETC)の複合体I, 複合体II, 複合体IIIにおいて発生する35。そしてミトコンドリアのROSはT細胞の抗原性の拡張のためのシグナル伝達因子としても機能する26, 32。一方で、外因性のROSやその発生源は、腫瘍細胞を直接損傷することが知られており、がん治療薬候補として考えられてきた36。これらの2つのことを考慮し、我々はまずROS発生剤が単独で殺腫瘍効果をもつか試すことにした。ROSの前駆体であるtert-Butyl hydroperoxide溶液 (Luperox)をMC38担がんマウスに投与したが、抗腫瘍効果は認めなかった (図3a)。さらに、Luperox単独でin vivo処理した腫瘍細胞の免疫制御表面マーカー及び転写プロフィールの有意な変化がないことを確認した（図１２）。しかし、PD-L1抗体と併用すると抗腫瘍効果を顕著に強化し、担がんマウスの生存率が延長した (図3b, c)。これらのデータより、Luperoxは腫瘍細胞への直接的な作用ではなくT細胞の活性化を介して、PD-L1抗体の抗腫瘍効果を高めていることが示唆された。直接的なミトコンドリアROS発生剤であるParaquatもPD-1阻害の効果を増強した（図１３a, b）。コントロールとしてミトコンドリアを不安定化させATP合成を阻害する薬剤であるオリゴマイシンとカルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン (FCCP), 2,4-ジニトロフェノール (DNP)を投与した37。すると予想外な事に、ミトコンドリアの脱共役剤であるFCCPとDNPはPD-L1抗体治療の効果を増強させ、PD-L1単独投与群と比べてマウスモデルの生存率を顕著にあげた (図4a)。重要なことに、Leuperoxと同様、FCCPとDNPも単剤投与では抗腫瘍効果を示さず、腫瘍細胞への直接的な作用をもたずにPD-L1抗体の抗腫瘍効果を高めていることがわかった (図4b)。さらに、FCCPを単独投与したマウスから採取した腫瘍細胞の表面型分析、転写プロファイル解析では有意差が示されず、このことは、脱共役剤は腫瘍を直接殺傷するのではなく、腫瘍を殺傷するキラーT細胞の機能を増強していることを示す（図１２）。ミトコンドリアの脱共役(アンカップリング)は、ミトコンドリア膜電位を低下させる際にROSを減少させることにより、酸化的損傷から保護する役割があると考えられていた為、FCCPとDNPの抗腫瘍効果における相乗効果は想定外であった37。そもそも、脱共役剤はミトコンドリアのROS産生を減少もしくは、増加させるとの、相反する報告がある38, 39。我々はPD-L1抗体と脱共役剤の併用療法の効果がMnTBAP (ROS消去効果をもつ合成メタロポルフィリン) の投与により抑制されることを確認した (図4c)。これにより脱共役剤の相乗効果はROSシグナルを介するものであることが明らかになった。不思議なことにPD-L1抗体とDNP、Luperoxの3剤併用では強い抗腫瘍効果を認めた (図5)。これは脱共役剤がROS以外の何かの経路でもPD-1阻害の効果を高めている可能性を示唆している。
脱共役剤は、DLNにおけるCD62L陰性CD44陽性エフェクターT細胞の生成を促進し、腫瘍部位でのそれらの集積を増強する。
では、どうやってアンカップラーはROSを介してPD-L1抗体の抗腫瘍免疫を高めているのだろうか？この疑問に答えるべく、我々はまず所属リンパ節と腫瘍部位の両方でのCD8陽性T細胞の区画を調べた。図6aに示すように所属リンパ節においては、エフェクターCD8陽性T細胞 (CD62L陰性CD44陽性: P3ゲート) の絶対数や割合は、PD-L1抗体とFCCPの併用療法群の方がPD-L1抗体単独群より顕著に増加していた。対照的に、ナイーブT細胞 (CD62L陽性CD44陰性：P1ゲート)とセントラルメモリーT細胞 (CD62L陽性CD44陽性：P2ゲート)は、PD-L1抗体単独では増加したものの、FCCPを加えてもそれ以上の増加はなかった (図6a)。重要なポイントは、どの治療群でのP3細胞群でもP1やP2細胞群と比べて、細胞当たりのミトコンドリアの質量、膜電位が高く、ROSが多かった事と、膜電位とROS産生に関してはFCCPとの併用療法で有意に増加していた事である (図6b)。これらの現象より、a)使用したFCCPの容量ではミトコンドリアの質量の低下や膜電位の下落はなく、毒性はなかった (より高い容量では毒性が予想される)こと、b)増加していたP3細胞群で高いミトコンドリアROS産生をみとめることより、脱共役剤による相乗効果はROSを介していること、c)マイルドなミトコンドリア損傷のフィードバックがかえってミトコンドリア活性を増強する可能性があることが示唆された (図6b)。
特筆すべき事に、所属リンパ節でのこのような変化に伴って、腫瘍内に浸潤しているCD8陽性T細胞でもP3細胞群は顕著に増加していた (図6c)。これらの結果よりPD-L1抗体と脱共役剤の併用療法は、所属リンパ節とそのターゲットである腫瘍部位の両方において、エフェクターCD8陽性T細胞のサイズや機能性を増強させる効果が明らかになった。
エネルギー代謝センサーのAMPKとmTORは脱共役剤の免疫増強効果に関与している。
AMPKとmTORは相反するエネルギー代謝センサーであるが、リン酸化AMPKとmTORのバランスがCD8陽性T細胞の分化を制御していると考えられている1, 40, 41, 42, 43, 44。脱共役剤によるAMP/ATP比の増加が、AMPKを活性化する事がわかっていることから45、我々はPD-L1抗体と脱共役剤の併用療法で治療した担がんマウスの所属リンパ節におけるCD8陽性T細胞のAMPKとmTORのリン酸化状態を調べた。PD-L1抗体とDNPもしくはFCCPの併用療法で治療されたマウスから採取したCD8陽性T細胞では、AMPKとそれに関連した蛋白であるACCとSIRT1が併用療法の後の複数の時点で活性化されていた (図7a)。しかし、想定外なことに、mTORとその関連蛋白であるS6Kと4EBP1もまた併用療法後に活性化されていたのである (図7a)。
だが、この不可解な結果は、所属リンパ節におけるCD8陽性T細胞の中にAMPK/mTORバランスが異なる細胞が不均一に混在していることにより説明される。実際、P2細胞群ではp-AMPKがp-mTORより上昇していたが、P3細胞群ではp-mTORの方がp-AMPKより高かった (図8)。これらの結果に基づき、次にmTORとAMPKどちらを直接的に活性化させるとPD-1阻害療法の効果を増強できるか検討した。図7bに示すように、mTOR活性剤もAMPK活性剤も早期 (day20以前)ではPD-1阻害療法の効果をやや増強したのに対し、mTOR活性剤とAMPK活性剤の3剤併用ではPD-L1抗体の効果を増強し生存率を改善させた。これらの結果は、mTORとAMPKの両方の活性化が、PD-L1抗体と脱共役剤の相乗的な殺腫瘍活性に関与することを示している。
PD-L1抗体と脱共役剤の併用療法はSIRT1を増加させた事より (図7a)、NAD依存性蛋白脱アセチル化酵素であるSIRT1の活性化がPD-L1抗体治療の効果に影響があるか調べた。腫瘍抑制効果をもつ可能性があることが報告されているポリフェノールの1種、レスベラトロールでSIRT1は活性化することが報告されている6, 46。さらに低容量のレスベラトロールは、SIRT1依存性的にAMPK活性化とミトコンドリアの生合成を引き起こすことが報告されており6、更に特定の条件下ではmTOR経路を補助することも報告されている47, 48, 49。実際、PD-L1抗体とレスベラトロールの併用療法ではPD-L1単独治療に比べ、顕著に腫瘍サイズの減少と生存率の延長を認めた (図7c)。この結果よりPD-L1抗体とエネルギー代謝センサーであるAMPKやmTOR, SIRT１の活性化の併用は、生体内でのTR CTLの増殖や機能性を増強させることが明らかになった。
PGC-1α活性剤はPD-1抗体の治療効果を増強する
PGC-1αは、AMPKやmTORによって調節される転写補因子であり、ミトコンドリアの生合成や酸化的リン酸化を増強させる因子である45, 46。FCCPや、mTOR活性剤、AMPK活性剤とPD-L1抗体の併用治療では、タンパク質とmRNAにおけるPGC-1αの発現が増加していており、これまでの報告と矛盾しない結果であった (図11a) 37, 45, 46。PD-L1抗体のみ投与した場合、タンパク質でのPGC-1αの発現は増加したが、mRNAでのPGC-1αの発現が減少していた。これはPGC-1αの調節には転写、翻訳およびタンパク質安定性などの多くの段階が関わっているためと考えられる 46, 47。PGC-1αは、NRFsやPPARsなどの転写因子と相関することで機能する46。我々はPGC-1α/NRF2の活性剤であるOltiprazとPGC-1α/PPARs活性剤であるBezafibrateが、PD-L1抗体の抗腫瘍効果を増強するか実験した 48, 29。結果、OltiprazとBezafibrateはどちらもPD-L1抗体の腫瘍成長抑制効果を増強し、担がんマウスの生存率を改善した （図11b）。
MC38以外の腫瘍におけるPD-1抗体の併用治療効果を調べるため、マウスの皮膚肉腫細胞株であるMethAをBALB/cマウスの皮内に移植し、FCCPやParaquat、Oltiprazを用いた併用療法を試した。結果、すべての薬剤がPD-L1抗体の抗腫瘍効果の増強を示した (図14)。これは、ミトコンドリア活性剤とPD-1阻害抗体の併用治療が異なる遺伝子背景をもつ様々な腫瘍に対して効果があることを示している。
FCCPもしくはBezafibrateとの併用治療はCTLのT-bet発現を増強する。
PD-1阻害によるサイトカイン分泌や腫瘍反応性CTLの活性化に重要な転写因子T-betは、mTORによりFOXO1阻害を介して活性化されることが知られている。そこで我々は、PD-L1抗体とFCCPの併用治療が、T-betとEomesの発現に影響するかどうかを検討した。PD-L1抗体とFCCPの併用療法がmTORを活性化させるという上記の発見と一致して、FCCPは、CD8陽性細胞においてT-betの発現を増加させたが、Eomesの発現は増加させなかった(図15a)。興味深い事に、FOXO1がT-betとEomesを逆方向に制御するという報告と一致して、mTORの下流の転写因子を活性化させるBezafibrateもまた、T-betを増加させ、Eomesをむしろ減少させた(図15a)。さらに併用治療ではキラーT細胞機能の一つであるIFN-γ産生が腫瘍内で増強していた(図15b)。これはTh1型免疫に重要であるT-betの発現増強にと一致する。これらの結果は、Bezafibrateが、おそらくミトコンドリアを活性化し、さらにポジティブフィードバックが起こり、mTORを活性化させることを示唆している。以上の結果をまとめると、脱共役剤とPD-1阻害との相乗効果の分子機構は、AMPKやmTORとその下流のNRF2やPPARsを含む転写因子やPGC-1aなどの共役因子の活性化を介している(図１)。
[考察]
我々はPD-L1抗体によって活性化したTR CTLなどがミトコンドリアを活性化させROSの産生を増強し、さらにROSを発生させる薬剤がPD-1阻害の抗腫瘍効果を増強させることを示した。想定外なことに、2つの有名なミトコンドリアの脱共役剤であるFCCPとDNPもまたPD-L1抗体の抗腫瘍効果を増強させる事が判明した。ROSスカベンジャーがその相乗効果を打ち消す事より、脱共役剤の相乗効果はROSの発生に依存している事は明らかである。ミトコンドリアの脱共役剤はROSの産生をおさえる働きがあるため、虚血性損傷や心不全、インスリン抵抗性、肥満、老化などの酸化ストレスに関する疾患への治療に有用ではないかと考えられていた為、今回の結果は想定外であった50。脱共役剤の単独投与はT細胞の増殖にも腫瘍増成にも影響を及ぼさなかったことより、本研究で用いた最低用量での脱共役剤はむしろPD-1遮断により誘発される免疫学的事象や免疫反応を補う働きをもつことがわかった。
天然のポリフェノールであるレスベラトロールは心血管改善作用やアンチエイジング効果、抗腫瘍効果で知られているが、それはレスベラトロールがミトコンドリア生合成を誘導し、病気から保護する代謝機能を誘導する可能性を示している。我々は低容量のレスベラトロールがPD-1阻害治療の効果を増強する事を明らかにした。脱共役剤と同様に、レスベラトロールはそれ自身では腫瘍増殖に関与しないか、むしろ腫瘍を増大させた。だが、PD-L1抗体と併用する事で顕著に腫瘍の抑制効果を示し、動物モデルでの生存率を向上させた。
ところで、どのようにしてこれらの薬剤は同じようにPD-1阻害療法との相乗効果をおこすのだろうか？ミトコンドリアのエネルギー代謝はmTORやAMPKを介した細胞内代謝と密接に関与している5, 6, 49, 51。我々はAMPKおよびその関連蛋白が、PD-L1抗体と脱共役剤の併用療法で活性化されることを確認した。重要なことにAMPKまたはSIRT1の直接的活性剤の全てがPD- L1抗体の抗腫瘍効果を増強した。
我々は、脱共役剤とPD-1阻害の併用療法がAMPK経路だけでなくmTOR経路も活性化し、mTORの直接的活性剤もPD-L1抗体の効果を増強することを証明した。これまでmTOR経路の活性化はAMPKのリン酸化と競合するとされていたため、これらの結果は意外であった1, 41, 42, 43, 52。しかし、単離したCD8陽性T細胞が、異なった活性化機能状態だけでなく、生化学的反応や動的な変動により異なった不均一な細胞で構成されていると考える場合、我々の結果はこれまでの報告とは矛盾することなく、説明することができる。我々はmTOR経路の活性化がPD-L1阻害とともにFCCP又はBezafibrateにより刺激されたDLN CTLにおけるT-betの発現をおこすと考えている。T-betは、腫瘍退縮のために必要な終末分化エフェクターCTLの供給源になるメモリープリカーサーの分化において重要であり、CTLの抗腫瘍効果に関しても重要とされている55, 56。一方でEOMESを強発現する終末分化CTLは慢性的な抗原認識により免疫寛容の状態であるとされている56, 57。我々の実験結果では、FCCPやベザフィブラートとPD-1抗体治療の併用により、T-betとIFN-γの発現が上がり、EOMESの発現はむしろ低下した。これは併用療法によりミトコンドリアの活性化を伴うエフェクター・メモリー細胞群（P3細胞群）が増えるという我々の結論と矛盾しない結果である。
PGC-1αは、ミトコンドリアの生合成やミトコンドリアの酸化的リン酸化に関する一連の転写因子を調節する分子である。AMPKやmTORの活性化は、PGC-1αの発現を増加させ、リン酸化を介して活性化させる。我々は脱共役剤とPD-1抗体の併用療法でPGC-1αの発現が増加することや、腫瘍の治療モデルでPGC-1α活性剤 (Bezafibrate、Oltipraz)もまたPD-L1抗体と相乗的増強効果を持つことを示した。この結果により、PGC-1αはミトコンドリアの活性化や拡大をおこす重要な分子であり、かつAMPKやmTOR活性化のポジティブフィードバックシグナル伝達を誘導する重要な分子であることを明らかにした。更に脱共役剤やBezafibrateはPD-L1抗体と併用することで、mTOR下流に位置する重要なサイトカイン調節因子であるT-betを活性化した。
これまでの機序に関する仮説の全体像を図１にまとめた。
a) PD-1遮断により、活性化CD8陽性T細胞におけるミトコンドリアの拡大や増殖が引き起こされる。
b) 脱共役剤やROS発生剤はミトコンドリアの体積を増加させ、ROSの増加をもたらす。おそらくROSは何かしらの経路によりAMPKとmTORを活性化するとされている36。
c) AMPKとmTORの活性化はPGC-1αの発現を増加させ、活性化させる。
d) 最終的に、PGC-1αとその結合転写因子であるNRFsとPPARsは、脂肪酸の酸化と酸化的リン酸化を活性化させる一連の転写因子の発現を増加させ、またCTLの活性化や分化をもたらすミトコンドリアの拡大を引き起こす。
ごく最近、PD-1経路がミトコンドリアの活性化とPGC-1αの発現を阻害することが報告されたが、これらの報告も我々の仮説と矛盾しない63, 64。 ROSや脱共役剤、AMPK活性剤、mTOR活性剤、PGC-1α活性剤などの我々が本研究で使用した全ての薬剤はPD-1抗体との併用した場合はミトコンドリアの活性化や拡大を介してCD8＋T細胞の活性化や分化をもたらしたが、単剤で投与した場合は同様の効果はなかった。
我々は、PD-1抗体治療に不応性の癌患者に応用でき得る革新的な併用療法の有効性をこれまでの結果により示した。PD-1治療に不応性の腫瘍を移植したマウスから抽出したCTLではミトコンドリアの活性化が起きていなかったことより、我々の研究はPD-1抗体治療の有効性を判定するバイオマーカーの研究にも繋りうると考える。今後は、ミトコンドリアの代謝変化に応じて変化する血清中メタボライト量や、PD-1抗体治療前後で収集したサンプルにおけるCD8+ T細胞のOCR活性、ミトコンドリアの活性化シグナルに関するRNAの発現が、PD-1抗体治療の応答性に関するバイオマーカーになりうるのか調べることが重要であろう。また併用薬によるPD-1抗体治療の相乗的増強効果は、社会保障制度を脅かすと議論されている高価なPD-1抗体の投与量を減らすことにつながるだろう。
現在、PD-1/PD-L1遮断によるがん治療には大きく2つの問題がある。1つ目の問題は上述したように、PD-1阻害治療が全ての患者に対して効果がある訳ではないと言う事である。したがって、PD-1阻害療法の抗腫瘍効果を増強する可能性が高く臨床応用可能な薬の開発が行われている。我々の結果は、PD-1阻害療法に効果がない患者に対し、新たな併用療法の選択肢を提供する。もう一方の問題はPD-1阻害療法単独もしくは併用療法による副作用に関するもので、特に薬剤特有の毒性や過度の免疫応答により誘発される自己免疫性疾患があげられる57。このような免疫治療を増強する治療介入に伴って副作用も増強される可能性は十分にあり得る。PD-L1抗体と今回の検討で使用した薬剤でとの併用治療では、特に目立った自己免疫反応が見られなかったが、臨床応用を考えると、我々が以前に確立した自己免疫疾患モデルマウスを使ってこのリスクを評価することが必要である14, 15, 16。DNPは1930年代にダイエットサプリや代謝速度をあげる薬剤として使用されていた58。しかし、プロトン動機力の崩壊による効果のため、DNPは重篤な健康傷害をおこし、使用が禁じられてきた59。FCCPはミトコンドリアの生体エネルギー学の研究に広く用いられてきたが、FCCPも細胞毒性と、ある程度のプラズマ膜減極作用があるため臨床応用に至っていない50。本研究では、5種の薬剤がPD-1阻害による抗腫瘍効果を増強する事を示してきたが、代謝性疾患の治療に多く試されている事や日常でのサプリメントとして服用されている事を加味すると、SIRT1活性剤である天然のポリフェノールのレスベラトロールが理想的である5, 51。レスベラトロール単独の抗腫瘍効果が報告されているが、その用量依存性もあり、抗腫瘍効果には異論がある60。本試験で使用した用量は最低用量であり、我々が試した限りでは腫瘍増成抑制効果はなかった(むしろその逆を呈した)。我々が同定したその他の併用療法は脱共役剤やROSの下流のシグナルの活性剤である。オフターゲットの減少を考えると、mTORとAMPK、SIRT1の下流を標的とした治療法は、抗腫瘍効果を増強しながら望ましくない副作用を弱める可能性がある。
以上をまとめると、我々はミトコンドリアのエネルギー代謝チェックポイント制御し、PD-1阻害治療の効果を増強する薬剤を同定した。PD-1を介したT細胞の制御や、PD-1阻害療法抵抗性のがん患者、もしくは感染疾患に対する併用療法に対して、本研究の結果は新たなる道を開いたといえよう。注目すべきことに、Oltipraz及びBezafibrateはすでに臨床医薬として使用されてきているので、PD-1抗体との併用療法の臨床研究に適用できる。
[手順と材料]
マウスと細胞
全てのマウスは京都大学大学院医学部動物実験施設において、病原体のない特別なSPF環境下で飼育され、適切な実験計画のもと使用された。C57BL/6及びBALB/c（５-６週齢）はCharles River Laboratories Japan（横浜）より入手した。マウス結腸腺癌MC38細胞は、Dr. Jim Allison (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY)のご厚意により提供していただいた。線維肉腫MethAは、Cell Resource Center for Biomedical Research（仙台、日本）から得た。これらの細胞は10% 熱不活化 FBSおよび1%抗真菌性抗生物質(インビトロジェン)を含むDMEM (インビトロジェン)中で培養を行った。この細胞系はマイコバクテリアでは感染されない。
マウス治療モデル
MC38 (5×105)及びMethA（5×105）は右側面皮内に注入した。MC38はC57BL/6マウスに接種し、MethAはBALB/cマウスに接種した。単独治療のために、腫瘍接種５日後、 PD-L1マウス抗体（1-111A) (当研究室作製)150 ugをマウス腹腔内に接種した。PD-L1抗体単独治療は４日おきに３回繰り返した。PD-L1抗体と化学薬品の併用治療は、腫瘍接種７日後に開始した。化学薬品は２日おき、PD-L1抗体は５日おきに投与した (図3b)。腫瘍は1日おきに測定し、腫瘍の体積は楕円体の公式 π×（縦× 横× 高さ/ 6）に従って計算した。
CD8欠損マウスモデル
CD8欠損マウスモデルでは、CD45.1+ マウスよりCD8+ T細胞をautoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec)を用いて単離した。単離したCD45.1+ CD8+細胞は、PBSで希釈したCellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific) で20分インキュベーションし染色した。洗浄後、細胞をCD45.2+ CD8-/-マウスへ尾静脈投与した。５日後、MC38 (5×105) を皮内に接種、腫瘍接種８日後にPD-L1抗体を腹腔内接種した。
化学試薬
以下の試薬を下記の濃度で併用し治療に用いた。AMPK活性剤：A769662 6 mg/kg (Abcam); mTOR 活性剤: MHY1485, 3μg/kg (SIGMA-ALDRICH); Uncoupler: carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), 1.2 mg/kg (Abcam); Uncoupler: 2,4-Dinitrophenol: DNP, 1.7 mg/kg (ALDRICH); SIRT1 活性剤: Resveratrol, 0.5 mg/kg (Abcam); ROS 補足剤: Mn (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP)、1.25 mg/kg (Calbiochem); ROS 発生剤: tert-Butyl hydroperoxide solution (Luperox TBH70X)、200μl/kg (SIGMA-ALDRICH)。ATP合成阻害剤：olygomicin 250μg/kg (SIGMA-ALDRICH)；Paraquat 2 mg/kg (Nakalai Tesque)；Oltipraz 1.9 mg/kg (Sigma)；Bezafibrate 1 mg/kg (ChemCruz)。
全ての試薬は使用前に新たに調製した。それぞれの試薬は説明書に示された溶媒に溶かした。AMPK activator、mTOR activator、uncouplers、SIRT1 activatorは毎回一連の実験において、新しい未使用のバイアルから調製した。溶かした試薬はPBSで希釈し、マウス一匹あたり200μlずつ接種した。
サイトカインビーズアレイアッセイ（CBA）
治療マウスから採取した血清中の種々のサイトカイン濃度は、種々のマウスサイトカイン（IL-17A, IL-21, MIG, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12）に対する抗体でコーティングされたビーズで定量的に測定した。染色したサンプルを説明書に沿ってフローサイトメトリーFACS Canto II (BD Biosciences) で測定した。得られたデータはFCAS Array software v3.0 (BD Biosciences)を用いて解析した。
酵素結合免疫吸着法 (ELISA)
PD-L1抗体単独治療で述べたようにMC38をマウスに接種し、PD-L1抗体で治療した。血清中のMIGはMIG ELISA kit (abcam)を用いて説明書に従い定量的に測定した。
細胞調製
所属リンパ節の解析のため、腫瘍を接種したマウスの右側腋窩、上腕および鼠径部のリンパ節から細胞を採取し、混合した。一つのリンパ節あたりの平均細胞数を絶対細胞数として用いた。腫瘍解析では、腫瘍組織をハサミで2-3 mm片に刻み、gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec)を用いて、コラゲナーゼタイプIV (Thermo Fisher Scientific) で酵素処理した。ミリグラムあたりの腫瘍細胞数を絶対数として用いた。消化した腫瘍組織から、Tumor Cell Isolation kit, mouse (MiltenyiBiotec)を用いて腫瘍細胞を単離した。このキットは、リンパ球、赤血球、線維芽細胞、内皮細胞及び腫瘍関連ストローマ細胞を排除することにより、腫瘍細胞を精製する。FACSAria (BD BioScience)により、腫瘍細胞集団をさらに単離・精製して用いた。
フローサイトメトリー解析
示された抗原を認識する以下の抗体を使用した。: CD44 (1M7)、CD45.2 (104)、CD45.1 (A20)、CD8 (53-6.7), CD62L (MEL-14)、T-bet (4B/O)及びIFN-γ(XMG1.2)、MHC class I (AF6-88.5)、CD155 (Tx56)及びVISTA (MIH63) from BioLegend; p-AMPK (EPR5683) from Ancam; p-mTOR (MRRBY)、Eomes (Danllmag)及びPD-L1 (M1H5) from eBioscience。全てのフローサイトメトリーはFACS canto II (BD Biosciences)で行い、FlowJo software (FLOWJO, LLC)で解析した。細胞内リン酸化タンパクの評価には、細胞を0.5% TritonXで透過処理し、染色前に1.5% PFAで固定した。ミトコンドリアの質量、膜電位、ミトコンドリアのスーパーオキシドおよび細胞のROSの測定は、それぞれMitoTracker Green、MitoTracker Deep Red、MitoSOX Red および CellROX Green reagentsを用いて行った (全て Life technologies)。これらの色素のそれぞれの最終濃度は0.125μM, 0.125μM, 5.0μM and 0.625μMとし、37℃ 5% CO2加湿インキュベーターにて30分インキュベートした。
酸素消費率の測定
酸素消費率はXF96 Extracellular Flux analyzer (Seahorse Biosciences)で測定した。 4 x 105 のCD8+ T細胞を決められたXF96プレートに撒いた。XF Cell Mito Stress Test Kit (Seahorse Bioscience) 付属のミトコンドリアの酸化的リン酸化の４つの薬剤をモジュールへ順次加えた。具体的には、基本的なOCR測定はオリゴマイシン、FCCP、ロテノン/アンチマイシンAの逐次添加後なされた。ATP回転率は（オリゴマイシン添加前の最終値 - オリゴマイシン添加後の最小値）として定義した34。
Real-time PCR
CD8陽性T細胞または腫瘍細胞からRNeasy mini kit (QIAGEN)を用いてRNAを単離し、逆転写によりcDNAを合成した。PGC-1aのReal-time PCRは、以下のプライマーを用いて行った：Forward ACTCGGATTGCTCCGGCCCT （配列番号１）と Reverse ACTGACGGCCTAACTCCACCCA （配列番号２）。アポトーシスとミトコンドリアのエネルギー代謝関連遺伝子の発現レベルを解析するために、RT2 Profiler PCR Array Gene Expression kit PAMM-012Z 又は PAMM-008Z(QIAGEN)を使用した。本アッセイに含まれる遺伝子リストは、
http://www.sabiosciences.com/Apoptosis.php
から見る事ができる。
ウェスタンブロッティング
CD8+ T細胞をマウスCD8マイクロビーズ(Milteni Biotec)で単離した。PBS 2回洗浄後、2x106の細胞を30 mM Tris-Hcl (pH.7.4)、150 mM Nacl、10 % Glycerol、0.1 % SDS、1% Triton-x-100、0.05 % Na-Doc、5 mM EDTA (pH.8.0)、protease inhibitor mixture (Roche Molecular Biochemicals) そしてphosphatase inhibitors (Nacalai tesque)から成る溶解バッファーで可溶化した。DC protein assay (Bio-Rad)によるタンパク質濃度測定後、タンパク質4 ugを4-20 % gradient Mini-PROTEAN TGX Gels (Bio-Rad)にのせ、ニトロセルロース膜へ電気的にブロットし、その後、TBS中に1 % BSA を含むブロッキングバッファーでインキュベートした。一次抗体インキュベーションはブロッキングバッファーにて4°Cで一晩行った。洗浄後、二次抗体インキュベーションをブロッキングバッファーで室温、40間行った。ブロットはenhanced chemiluminescence (Amersham Pharmacia)で展開した。 以下のタンパク質を認識する一次抗体を使った: Phospho-mTOR (P-mTOR) (Cat#5536)、Phospho-AMPKα (P-AMPK) (#2535)、Phospho-p70 S6 Kinase (P-S6K) (#9205)、4E-BP1 (#9644)、Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (P-ACC) (#3661)、SIRT1 (#9475)。全ての一次抗体はCell Signaling Technologyより入手した。PGC-1α (SC-13067)を認識する抗体は、Sant Cruzから得た。
統計分析
統計分析はPrism 6で行った。３つ以上の変数を分析するために、一方向ANOVA分析（一元配置分散分析）の後にシダックの多重比較検定を行った。二つの群を比較するためにstudent-T検定を行った。全ての統計解析はパラメトリックデータと仮定し、２標本検定をおこなった。p値が0.05未満のものを有意とした。データのばらつきは平均値 ± 標準誤差 (SEM)として評価した。5つ以上の試料が本研究における試料サイズの推定のために適切であると考えられる。試料と動物は集団から無作為に選び、処理を行った。 試料や動物の処理は盲検でない。
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【００４４】
〔実施例２〕
C57BL/6マウスにマウス大腸がんMC38を5x105接種した。7日後に抗PD-L1抗体（1-111A, 150 ug）とAMPK阻害剤（Compound C: 200ug in BBS, 200 ul）腹腔内投与した。抗PD-L1抗体は6日おきに3回投与し、Compound C (C. C)は2日おきに7回投与した。MC38接種から25日目までの腫瘍の体積（mm3）とを示す。
結果を図９に示す。AMPK阻害剤は抗PD-L1抗体治療の効果を増強する。【００４５】
〔実施例３〕
BALB/cマウスにマウス腎がんRENCAを2x106接種した。7日後に抗PD-L1抗体（1-111A, 150 ug）とAMPK阻害剤（Compound C: 200ug in PBS, 200 ul）腹腔内投与した。抗PD-L1抗体は6日おきに3回投与し、Compound C (C. C)は2日おきに7回投与した。 RENCA接種から25日目までの腫瘍の体積（mm3）とを示す。
結果を図１０に示す。AMPK阻害剤は抗PD-L1抗体治療の効果を増強する。【００４６】
〔実施例４〕
C57BL/6マウスにMC38を5x105接種した。7日後に抗PD-L1抗体（1-111A, 150 ug）と PGC-1α/転写因子複合体活性化剤（2-(4-{2-[(4-chlorobenzoyl)amino]ethyl}phenoxy)-2-methylpropanoic acid (Bezafibrate) :10 ug in PBS, 200 ul）腹腔内投与した。抗PD-L1抗体は6日おきに3回投与し、Bezafibrate は2日おきに7回投与した。MC38接種から25日目までの腫瘍の体積（mm3）を示す。
結果を図１１に示す。PGC-1α/転写因子複合体活性化剤は抗PD-L1抗体治療の効果を増強する。
〔実施例５〕
MethAをBALB/cマウスに5x105接種し、7日後に抗PD-L1抗体（1-111A, 80 ug）とFoxo1阻害剤（5-amino-7-(cyclohexylamino)-1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid, Calbiochem） (2mg/kg)を腹腔内投与した。投与スケジュールは図3に従う。MethA接種から28日目までの腫瘍の体積（mm3）を図16に示す。Foxo1阻害剤は抗PD-L1抗体治療の効果を増強する。
〔実施例６〕
５匹のPD-1-/-マウス（Immunity 11, 141-151 (1999).; Science 291, 319-322 (2001).; Nat. Med. 9, 1477-1483 (2003).）と野生型C57BL/6Nマウス（PD-1-/-マウスと同腹のマウス）の血清中に含まれるアミノ酸の量をGC-MS解析にて同定した。結果を図１７に示す。図１７は野生型の値を１としたときのPD-1-/-マウスの値を示す。PD1を欠損したマウスではT細胞の分裂が進み血中アミノ酸が代謝され、その値が減少する。
Fibrosarcoma MethA（Cell Resource Center for Biomedical Research）をBALB/cマウスに5x105接種し、7日後に抗PD-L1抗体（1-111A, 60 ug）とAminoleban (大塚製薬、400 ul/mouse)を投与した。投与スケジュールは図３に従う。Aminolebanの組成を図１８に示す。
結果を図１９に示す。アミノ酸は抗PD-L1抗体治療の効果を増強する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の医薬組成物は、抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
＜配列番号１＞
フォワードプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
リバースプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2017099034.tif 000004
【図２】
2017099034.tif 000005
【図３】
2017099034.tif 000006
【図４】
2017099034.tif 000007
【図５】
2017099034.tif 000008
【図６】
2017099034.tif 000009
【図７】
2017099034.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2017099034.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2017099034000001.app
【国際調査報告】
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