(57)【要約】【課題】一般的な茎頂培養ではウイルス除去が困難である植物種やウイルス種についても適用可能な、ウイルスフリー植物体の製造方法を提供することを目的とする【解決手段】本発明は、植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程、及び該溶液より回収した茎頂組織片から植物体を再生させる工程を含む、ウイルスフリー植物体の製造方法に関する。本発明によれば、一般的な茎頂培養によるウイルス除去が困難であった植物種からもウイルスフリー植物体を製造することができる。また、植物体の再生に要する時間を大幅に短縮することができる。【選択図】図６
2017131079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程、及び該溶液より回収した茎頂組織片から植物体を再生させる工程を含む、ウイルスフリー植物体の製造方法。
【請求項２】
茎頂組織片を浸した溶液を６０００×ｇ以下の遠心加速度で遠心処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
茎頂組織片が頂端分裂組織及び第１葉原基を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
干渉性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程を含む、茎頂組織片からの植物ウイルスの除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスフリー植物体、特に通常の茎頂培養では植物ウイルスの除去が困難な植物種からのウイルスフリー植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物に感染することで、収量や品質などに悪影響を及ぼす植物ウイルスが多数知られている。このようなウイルスの感染がない、いわゆるウイルスフリー植物体を得る技術として、茎頂を無菌的に培養する茎頂培養がある（例えば特許文献１）。【０００３】
茎頂は、半球形の頂端分裂組織（成長点（ｍｅｒｉｓｔｅｍ）とも呼ばれる）及びそれから分化した数枚の葉原基からなる。茎頂培養は、植物体がウイルスに感染した場合でも茎頂、特に頂端分裂組織にはウイルスが到達しないことがあることを利用して、頂端分裂組織のみを含むよう茎頂を無菌的に薄く切り出し、そこから植物体を再生させることでウイルスフリー植物体を製造する技術である。【０００４】
しかし、茎頂から頂端分裂組織のみを切り出すことは、０．１〜１ｍｍ程度という微小な組織片の切り出しを意味し、これは作業者の高度な熟練を必要とする。また、切り出す茎頂組織片が小さいほどウイルス除去の可能性は高まるものの、その後の植物体の再生及び栽培に長期間を要するという問題も生じる。このように、従来の茎頂培養は、技術的にも経済的にも効率的であるとは言い難い。さらに、特に頂端分裂組織までウイルスが到達し易い植物種やウイルス種については、一般的な茎頂培養によってウイルスフリー植物体を製造することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ９９／１２４１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、一般的な茎頂培養ではウイルス除去が困難である植物種やウイルス種についても適用可能な、ウイルスフリー植物体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、茎頂培養において、茎頂の組織片をウイルスの増殖等を抑制することのできる干渉性核酸を含む溶液に浸すことでウイルスフリー植物体の製造効率が向上することを見出し、以下の各発明を完成した。【０００８】
（１）植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程、及び該溶液より回収した茎頂組織片から植物体を再生させる工程を含む、ウイルスフリー植物体の製造方法。
（２）茎頂組織片を浸した溶液を６０００×ｇ以下の遠心加速度で遠心処理する工程をさらに含む、（１）に記載の製造方法。
（３）茎頂組織片が頂端分裂組織及び第１葉原基を含む、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）干渉性核酸がｓｉＲＮＡである、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程を含む、茎頂組織片からの植物ウイルスの除去方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、一般的な茎頂培養によるウイルス除去が困難であった植物種からも、ウイルスフリー植物体を製造することができる。また、茎頂培養における茎頂組織片を通常より大きく、特に頂端分裂組織だけでなく第１葉原基を含む組織片とすることができるため、植物体の再生及びその後の栽培に要する時間を大幅に短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】スペイン産ニンニクにおけるアレキシ属ウイルスの頂端分裂組織での存在を示す、免疫組織化学染色の写真である。
【図２】図１の写真の一部を拡大したものである。
【図３】β−グルクロニダーゼ遺伝子及びアレキシ属ウイルスのコートタンパク質遺伝子に対する干渉性核酸として作製したｄｓＲＮＡと、これらをＤｉｃｅｒで処理して作製したｓｉＲＮＡの、非変性ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】水（ネガティブコントロール）又はＧＵＳ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡコントロール）で処理したスペイン産ニンニク茎頂の、培養２０日後におけるアレキシ属ウイルスの存在をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。
【図５】水（ネガティブコントロール）又は本発明のＡｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡで処理した常呂町産ニンニク茎頂の、培養２０日後におけるアレキシ属ウイルスの存在をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。
【図６】水（ネガティブコントロール）又は本発明のＡｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡで処理した常呂町産ニンニク茎頂を培養して鉢上げした後の、アレキシ属ウイルスの存在をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。
【図７】リバビリンで処理したスペイン産ニンニク茎頂の、培養２週間後におけるアレキシ属ウイルスの存在をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程、及び該溶液より回収した茎頂組織片から植物体を再生させる工程を含む、ウイルスフリー植物体の製造方法に関する。本発明は、植物ウイルスの増殖を抑制することができる干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程を含む、茎頂組織片からの植物ウイルスの除去方法として表すこともできる。
【００１２】
本発明は、茎頂培養によるウイルスフリー植物体の製造が望まれる植物種であればいずれにも適用可能であるが、好ましくは一般的な茎頂培養ではウイルスフリー植物体の製造が困難であった植物種に対して適用される。また、除去対象とされるウイルスについても特に制限はないが、好ましくは、本発明は茎頂、特に頂端分裂組織にまで到達し易いウイルスに対して適用される。
【００１３】
本発明が好適に適用される植物種とウイルス種の組合せとしては、ニンニクに対するアレキシ属ウイルス、アスパラガスに対するアスパラガスウイルス２（ＡＶ２）、ジャガイモに対するジャガイモウイルスＳ（ＰＶＳ）などを挙げることができる。また、茎頂分裂組織に容易に侵入するウイロイドも含まれる。これらは、一般的な茎頂培養ではウイルスフリー植物体を得ることが困難であった植物種とウイルス種の組合せの例である。
【００１４】
本発明で利用可能な干渉性核酸は、除去対象とされるウイルスの増殖に関与する遺伝子の宿主細胞内における発現を抑制することができる核酸であり、好ましくはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる核酸、典型的にはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はこれらをコードするＤＮＡである。特に好ましい干渉性核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００１５】
干渉性核酸は、標的遺伝子、すなわちウイルスの増殖に関与する遺伝子の核酸配列に基づいて作成することができる。本発明における標的遺伝子は、特定の遺伝子に限定されるものではなく、宿主におけるウイルスの増殖に関与するタンパク質をコードする遺伝子、すなわち宿主細胞表面への吸着、宿主細胞内への侵入、脱殻、ウイルスゲノム複製及びタンパク質合成、会合、成熟、細胞外への放出の各工程に関与するタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましく、例えば、ウイルスのゲノム複製に関与する酵素をコードする遺伝子、ウイルスのコートタンパク質をコードする遺伝子、移行タンパク質遺伝子、ＲＮＡサイレンシングサプレッサー遺伝子等を挙げることができる。好ましい標的遺伝子は、複製に関与する酵素又はウイルスの複製において発現量の高い遺伝子である。また、より多くの種類のウイルスに対応するため、異なるウイルス属又は種の間で塩基配列が保存されている遺伝子を標的として選択することが好ましい。
【００１６】
干渉性核酸の代表例であるｓｉＲＮＡは、通常、相互に相補的な二本のＲＮＡ鎖（ｄｓＲＮＡ）の形態で合成され、使用される。また干渉性核酸の一種であるｓｈＲＮＡは、ヘアピンループ構造を取ることができる一本鎖ＲＮＡの形態で合成され、使用される。ｓｈＲＮＡは、二本鎖構造のＲＮＡ鎖すなわちｄｓＲＮＡを形成した後、宿主細胞内のＤｉｃｅｒにより認識、切断されて、対応するｓｉＲＮＡとなる。
【００１７】
このような干渉性核酸、特にｄｓＲＮＡの形態の干渉性核酸は、当業者に公知の方法によって作製することができ、特別な方法は特に必要とされない。干渉性核酸の塩基数は、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り特に制限はないが、例えば、１５〜４５塩基の長さ、好ましくは１９〜４０塩基の長さ、より好ましくは２１〜３０塩基の長さであることができる。また、干渉性核酸は、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または双方の５’末端および／または３’末端において、１または数個（例として１、２または３個）の塩基の付加により形成されるオーバーハング配列を有していてもよい。
【００１８】
さらに、本発明における干渉性核酸は、以下のＤＮＡ、及び該ＤＮＡによりコードされるＲＮＡを包含する。
（１）標的遺伝子の塩基配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、最も好ましくは少なくとも約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉能を持つＤＮＡ。
（２）標的遺伝子の塩基配列において１または複数の塩基を付加し、欠失させまたは置換した塩基配列を含むＤＮＡであって、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉能を持つＤＮＡ。
（３）標的遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉能を持つＤＮＡ。
【００１９】
本発明において用いられる干渉性核酸であるＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などの修飾を受けたヌクレオチド誘導体を含むものでもよい。ヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジンまたはシチジン、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン、５‐ブロモウリジンなど；８位修飾アデノシンまたはグアノシン、例えば８‐ブロモグアノシンなど；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンなど；Ｏ−またはＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどを挙げることができる。また、ＲＮＡ鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラＲＮＡもまた、本発明の干渉性核酸の範囲内にある。
【００２０】
干渉性核酸がＤＮＡである場合、かかるＤＮＡは、一般的な遺伝子工学的方法に従って作成される発現ベクターの形態であってもよい。かかる発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモーター配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記干渉性核酸と機能的に連結され得る。
【００２１】
本発明は、干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程を含む。溶液は、干渉性核酸のみを含む水溶液であってもよく、干渉性核酸の機能を妨げない限り他の成分を含む適当な混合液（例えば緩衝液）であってもよい。溶液における干渉性核酸の濃度は適宜設定することができ、例えば１〜１０μｇ／５０μＬ、好ましくは１０μｇ／５０μＬである。
【００２２】
茎頂組織片を溶液に浸すとは、茎頂組織片の少なくとも一部、好ましくは全部が溶液で覆われるようにすることをいい、典型的な態様は、適当な容器中の溶液に茎頂組織片を沈めるものである。浸す時間は短時間で足り、例えば１０秒〜数分程度でよい。
【００２３】
本発明の好ましい態様は、茎頂組織片を浸した溶液を６０００×ｇ以下の遠心加速度で遠心処理する工程を含む。遠心加速度は、好ましくは１００〜６０００×ｇ、より好ましくは５００〜６０００×ｇ、さらに好ましくは２０００〜６０００×ｇである。遠心処理の時間は、いわゆるスピンダウン操作に用いる程度の短時間で足り、例えば３〜１０秒間程度でよい。かかる遠心処理は、卓上型の微量用遠心機（例えば、メルクミリポア社のＣｈｉｂｉｔａｎ、アズワン社の小型微量遠心機）などによって行うことができる。全く意外なことに、かかる穏やかな遠心処理工程を加えることによって、干渉性核酸によるウイルスの除去効率及び植物体の再生率を大きく高めることができる。
【００２４】
溶液に浸す茎頂組織片は、少なくとも頂端分裂組織の一部を含む組織であればよいが、さらに第１葉原基（頂端分裂組織に最も近い葉原基）を含む組織片であることが好ましい。一般に、多くのウイルスは葉原基にまで到達しやすく、したがってウイルスフリー植物体を得るための茎頂培養では葉原基を含めた組織片を利用することは困難であったが、干渉性核酸を含む溶液を利用する本発明はかかる問題を解消し、頂端分裂組織及び第１葉原基を含む茎頂組織片を利用することを可能にする。
【００２５】
茎頂培養において、頂端分裂組織のみを含む組織片を用いるよりも頂端分裂組織及び葉原基を含む組織片を用いる方が、より短時間で植物体を再生させることができる。本発明の方法は、頂端分裂組織及び第１葉原基を含む茎頂組織片を利用することで、植物体の再生に要する時間を大幅に短縮することができる。例えばニンニクを対象とした場合、一般的な方法による茎頂培養でウイルスフリー植物を製造し、圃場で栽培して鱗茎を出荷するまでに要する時間はおおよそ３年であるのに対して、本発明の方法を適用することでおおよそ１年へと大幅に短縮することが可能となる。
【００２６】
本発明では、干渉性核酸を含む溶液に茎頂組織片を浸す工程及び遠心処理工程を行うこと以外の茎頂培養に関する条件は、植物種毎にこれまで蓄積された一般的な条件であればよい。例えば、茎頂組織を採取する植物の消毒は、次亜塩素酸ナトリウム溶液（アンチホルミン溶液）などの一般的な試薬を用いて行えばよく、消毒を助けるために、洗剤での洗浄やエタノール溶液への浸漬を行ってもよい。
【００２７】
また、茎頂組織片の再生に用いる培地も、例えばムラシゲ・スクーグ培地などの一般的な培地であればよく、また固体でも液体でもよい。さらに、温度、照度、日長などの諸条件も、植物種ごとに適した条件に設定すればよい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を説明する。なお、実施例中、「％」は、特記しない限り、溶媒濃度は容量％、その他は重量％を示す。また、溶媒の混合比は、特記しない限り、容量比を示す。【００２９】
＜試験法＞
１）植物組織の免疫組織化学法
免疫組織化学法を、文献（Ｔ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、Ｊ  Ｇｅｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．、２００４年、第７０巻、第３６３ページ）を参考に、以下の通り実施した。【００３０】
ａ）パラフィン切片の調製
植物体から２ｍｍ角程度の組織を切り出し、パラフィン切片を作成するため、ＦＡＡ固定液（エタノール：５０ｍＬ、酢酸：５ｍＬ、ホルムアルデヒド溶液：５ｍＬ、水：４０ｍＬの混合液）に移した。【００３１】
真空ポンプで１０分間減圧して脱気処理を行い、４℃で一晩静置した。ＦＡＡ固定液を取り除き、５０％エタノールを加えて氷上で１５分間静置した。同様に液を入れ替える作業を７０％エタノールと９０％エタノールでも行った（９０％エタノールを処理するときは室温で行った）。次に、液を取り除き、１００％エタノールを加えて氷上で３０分静置する作業を室温で２回行った。液を取り除き、１００％エタノールと１００％キシレンを１：１で加え、室温で３０分間静置した。さらに、液を取り除き、１００％キシレンを加え室温で３０分静置する作業を室温で２回行った。次に、オーブン内で１００％キシレンと等量の溶解パラフィンを加えてよく混合し、キシレンが完全に蒸発するまで６０℃で静置した。キシレンが完全に蒸発したら、試料を冷蔵庫に入れて、パラフィンを固まらせた。固まったパラフィンを四角形に切り出し、ロータリーミクロトームで準薄切片（厚さ２０μｍ）を切り出した。ＭＡＳコートスライドグラスに蒸留水を適量滴下し、パラフィンリボンを乗せ、３７℃のオーブンで一晩静置した。【００３２】
静置後のスライドグラスを１００％キシレンに室温で１５分間浸し、同様にキシレンを入れ替えて、もう一度１５分間浸して脱パラフィン処理した。次に１００％エタノール：１００％キシレン＝１：１の液に５分間浸し、その後、１００％エタノールに５分間浸し、１００％エタノールを入れ替えてもう一度１００％エタノールに５分間浸した。液からスライドグラスを取り出し、室温で静置し、風乾させた。次に、９０％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、３０％エタノール、蒸留水の順番に２分間ずつ室温で浸すことで、試料を調製した。【００３３】
ｂ）抗体反応
ａ）の試料に、４％スキムミルク−ＰＢＳＴ（１０×ＰＢＳ：２５ｍＬ、スキムミルク：１０ｇ、Ｔｗｅｅｎ−２０：１２５μＬを滅菌水で総量２５０ｍＬに調製したもの）を加え、３０分間室温でブロッキングを行った。ＰＢＳ−Ｔ（１０×ＰＢＳ：６０ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ−２０：３００μＬを滅菌水で総量６００ｍＬに調製したもの）で、１０００〜３０００倍に希釈したアレキシ属ウイルス特異的な一次抗体ＧＭｂ−９２０−８０２（青森県産業技術センター野菜研究所から分譲）をスライドグラスに滴下し、室温で２時間、あるいは４℃で一晩反応させた。その後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。次に、二次抗体（Ｇｏａｔ  ＡＰ−ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＩｇＧ）をＰＢＳ−Ｔで２０００倍に希釈し、室温で２時間、あるいは４℃で一晩反応させた。その後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。【００３４】
洗浄後、１００ｍＭのＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．２）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．２：１２．１１４ｇ、ＮａＣｌ：５．８４４ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１．０１６５ｇを滅菌水で１００ｍＬに調製したもの）で５分間、平衡化した。ＶＥＣＴＯＲ  ＢＬＵＥ（フナコシ株式会社）で反応液を作成し、３００〜４００μＬを滴下して３０分静置した。発色停止液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：４０ｍＬ及び０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：３６０ｍＬの混合液）に浸し、蒸留水で３回洗浄した。コントラストを強くするため、１００％エタノールに１分程度浸漬した。風乾させ、７０％グリセロールで封入した。【００３５】
２）ＲＴ−ＰＣＲを用いたアレキシ属ウイルスの検出方法
乳鉢に植物組織０．０５〜０．１ｇを入れ、ＴＥ飽和フェノールと核酸抽出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１％ＳＤＳ）を５００μＬずつ加えて、乳棒で磨砕した。チューブに回収し、ボルテックスで１５秒混合し、室温で１２０００ｒｐｍ、３分間遠心した。上層３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、フェノールとクロロホルムを１５０μＬずつ入れた。これをボルテックスで混合し、室温で１４０００ｒｐｍ、５分間遠心した。さらに、上清２４０μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、フェノールとクロロホルムを１２０μＬずつ入れた。これをボルテックスで混合し、室温で１４０００ｒｐｍ、５分間遠心した。最後に上清を２００μＬ回収し、ここに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を１／１０量（２０μＬ）、−３０℃で冷やしておいた９９％エタノールを３倍量（６００μＬ）加え、ボルテックスで混合した。４℃で１４０００ｒｐｍ、２０分間冷却遠心し、上清を捨てた。５００μＬの８０％エタノールを加え、４℃で１４０００ｒｐｍ、５分間冷却遠心した。上清を捨て、室温で静置して乾燥させた後、３０〜５０μＬの滅菌水で懸濁した。【００３６】
ＴａＫａＲａ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）を使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。アレキシ属ウイルスの検出用に、Ｃｈｅｎら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、第１４９巻、第４３５ページ）を参考に、配列番号１、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーセットを合成した。ＰＣＲは、５０℃−１５分、９４℃−２分での熱変性後、「９４℃−３０秒、５７℃−３０秒、７２℃−１分」のサイクルを３５回実施し、最後に７２℃−１分反応させ、アガロースゲル電気泳動で増幅断片のサイズを確認した。アレキシ属ウイルスが存在する時の増幅断片のサイズは、約７５０ｂｐとなる。【００３７】
＜実施例＞アレキシ属ウイルスに感染したニンニク茎頂組織へのｓｉＲＮＡ処理
ａ）材料の選択
スペイン産及び北海道常呂町産のニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）を用意し、茎頂組織についてブロッキング時間を３０分、染色時間を３５分とした前記免疫組織化学法を行った結果、いずれのニンニクについても茎頂組織及び第１葉原基に染色、すなわちアレキシ属ウイルスが観察された。スペイン産ニンニクにおける染色結果を図１及び図２に示す。
ｂ）茎頂組織片の調製
スペイン産及び常呂町産のニンニクの鱗茎を鱗片に分け、それぞれの鱗片の皮を取り除いた。水道水に１０分間浸けた後、薄皮を取り除いた。水道水を交換し、その中に中性洗剤を適量入れ、泡立つまでこの溶液を撹拌し、２０分静置した。その後、水洗いした鱗片を不織布に入れ、ヒートシーラーで封をした。８０％エタノール溶液を５００ｍＬ計量カップに用意し、ニンニクを浸して１分静置した。８０％エタノール溶液を捨て、１０％アンチホルミン溶液５００ｍＬにニンニクを浸し、２０分静置した。適時カップを水平に回転させ、溶液が計量カップ内に行き渡るようにした。その後、クリーンベンチ内に計量カップを移し、滅菌水で３回以上洗浄した。エタノール消毒したゴム板上でカミソリ（青函両刃、フェザー安全剃刀（株））を用いて、頂端分裂組織及び第１葉原基を含む１ｍｍの組織片を取り出した後、下記の組成からなるＭＳ培地にすばやく移植した。【００３８】
ＭＳ培地
ＫＮＯ３：                          １９００ｍｇ
ＮＨ４ＮＯ３：                    １６５０ｍｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：        ４４０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：        ３７０ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４：                      １７０ｍｇ
Ｎａ２−ＥＤＴＡ：                ３７．３ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：          ２７．８ｍｇ
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ：          ２２．３ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：            ８．６ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３：                             ６．２ｍｇ
ＫＩ：                                      ０．８３ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ：       ０．２５ｍｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：            ０．０２５ｍｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：            ０．０２５ｍｇ
合計                             ４６００ｍｇ
さらに以下の試薬を作成時に加えた。
２ｍｇ／ｍＬ塩酸チアミン溶液：  ２００μＬ
ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ：      １００ｍｇ
Ｓｕｃｒｏｓｅ  ：                ３０ｇ
Ａｇａｒ（植物培地用）：             ７ｇ
１Ｍ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した後、１０００ｍＬに合わせたもの。【００３９】
ｃ）ｓｉＲＮＡの作製
アレキシ属ウイルスのコートプロテイン（ＣＰ）遺伝子中の約７００ｂｐの塩基配列に対応するｄｓＲＮＡを作製するため、ｐＧＥＭベクター（プロメガ製）上にクローニングされた前記ＣＰ遺伝子を鋳型とし、配列番号７と配列番号８、及び配列番号９と配列番号１０の２組のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行った。ポリメレースとしては、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）を使用した。ＰＣＲ条件としては、９４℃−１分での熱変性後、「９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−１分」のサイクルを３５回実施した。各々のＰＣＲ産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン製）で精製し、Ｔ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）に供し、Ａｌｌｅｘｉ−ｄｓＲＮＡ（配列番号１１）を作製した。【００４０】
更に、Ａｌｌｅｘｉ−ｄｓＲＮＡにＰｏｗｅｒＣｕｔＤｉｃｅｒ（サーモサイエンティフィック製）を作用させて、Ａｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡを作製した。得られたサンプルを、Ｎｏｖｅｘ  Ｈｉ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＴＢＥ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ライフテクノロジーズ製）と混ぜ、Ｎｏｖｅｘ  ＴＢＥ  Ｇｅｌｓ  ６％（ライフテクノロジーズ製）にて非変性ＰＡＧＥ電気泳動（１００Ｖ，３５分）した結果を図３に示す。この様にして作製されたＡｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡは、アレキシ属ウイルスのＣＰの発現に対して抑制的に作用する。【００４１】
また、ウイルス抑制効果のないｓｉＲＮＡとして、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＧＵＳ）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＧＵＳ−ｓｉＲＮＡ）を、ｐＢＩ１２１（クロンテック製）上にクローニングされたＧＵＳ遺伝子を鋳型とし、配列番号３と配列番号４、及び配列番号５と配列番号６の２組のプライマーセットを用いた点以外は上記と同様にして作成した。【００４２】
ｄ）ｓｉＲＮＡ処理
ｂ）で調製した組織片（常呂町産ニンニクはｎ＝５、スペイン産ニンニクはｎ＝８）を、ｃ）で作製したＡｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡ又はＧＵＳ−ｓｉＲＮＡを１０μｇ／５０μＬの濃度で含む水溶液に浸漬した後、速やかに卓上遠心機（２０００×ｇ）で３〜５秒間、遠心処理を行った。その後すぐにＭＳ固形培地に組織片を移植し、無菌で培養した。培養条件は、温度２５℃、１２時間照明下とした。【００４３】
培養開始から２０日後に組織片を磨砕し、ＲＴ−ＰＣＲ法でアレキシ属ウイルスが組織片に残っているか確認した。なお、コントロールとしてｓｉＲＮＡに代えて組織片を水で処理したもの（常呂町産ニンニクはｎ＝４、スペイン産ニンニクはｎ＝８）を用意した。【００４４】
その結果、いずれの産地のニンニクでもコントロールは全ての個体でアレキシ属ウイルスが検出される一方、Ａｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡ処理区は常呂町産ニンニクで約６割（処理後ウイルス検出数／処理数  ２／５）、スペイン産ニンニクで約４割（処理後ウイルス検出数／処理数  ５／８）のウイルス感染率の低下が見られ（培養２０日後）、ウイルスフリー化が明瞭に促進された。また、ウイルス抑制能のないｓｉＲＮＡであるＧＵＳ−ｓｉＲＮＡ処理区では、全ての個体でアレキシ属ウイルスが検出された。代表的な検出結果として、培養２０日後の検出結果を図４（スペイン産ニンニクをＧＵＳ−ｓｉＲＮＡで処理したもの）及び図５（常呂町産ニンニクをＡｌｌｅｘｉ−ｓｉＲＮＡで処理したもの）に示す。【００４５】
培養２０日目でサンプリングした後も、常呂町産のニンニクは引き続き栽培を続けて、鉢上げまで行った。その後に葉の一部を採取し、アレキシ属ウイルスの検出を行った。その結果、培養２０日目の結果と同様の感染状況が確認され、茎頂培養時に除去されたウイルスはその後再生した植物体においても復活しないことが確認された（図６）。【００４６】
＜比較例＞
強力な抗ウイルス剤として知られ、茎頂培養にも使用されるリバビリンのウイルス除去効果を、アレキシ属ウイルスに感染したニンニクにおいて評価した。上記実施例のｂ）で調製したスペイン産ニンニク由来の組織片５つをＭＳ培地で、５つを１２ｍｇ／Ｌのリバビリンを含むＭＳ培地でそれぞれ２週間、無菌で培養した。培養条件は、温度２５℃、１２時間照明下とした。培養後、各組織片を磨砕し、ＲＴ−ＰＣＲ法でアレキシ属ウイルスが組織片に残っているか確認した。その結果を図７に示す。アレキシ属ウイルスは１２ｍｇ／Ｌという高濃度のリバビリン処理によっても除去されないことが確認された。【００４７】
＜配列表の説明＞
配列番号１：アレキシ属ウイルス検出用プライマーの塩基配列
配列番号２：アレキシ属ウイルス検出用プライマーの塩基配列
配列番号３：ＧＵＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号４：ＧＵＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号５：ＧＵＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号６：ＧＵＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号７：アレキシ属ウイルスのＣＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号８：アレキシ属ウイルスのＣＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号９：アレキシ属ウイルスのＣＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号１０：アレキシ属ウイルスのＣＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ作製用プライマーの塩基配列
配列番号１１：アレキシ属ウイルスのＣＰ遺伝子に対するｄｓＲＮＡの塩基配列
【図１】
2017131079.tif 000003
【図２】
2017131079.tif 000004
【図３】
2017131079.tif 000005
【図４】
2017131079.tif 000006
【図５】
2017131079.tif 000007
【図６】
2017131079.tif 000008
【図７】
2017131079.tif 000009
【配列表】
2017131079000001.app
【国際調査報告】
2017131079.tif 000010
2017131079.tif 000011
2017131079.tif 000012
2017131079.tif 000013