(57)【要約】糖類を原料として、効率よくプロトカテク酸又はその塩を製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良くプロトカテク酸又はその塩を製造する方法を提供する。下記の(A)、(B)、及び(C)の操作を施したプロトカテク酸生産能を有する形質転換体。(A)  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化(B)  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化(C)  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化  この形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養してプロトカテク酸又はその塩を生産させる工程を含むプロトカテク酸又はその塩の製造方法。
2017169399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(A)、(B)、及び(C)の操作が施されたプロトカテク酸生産能を有する形質転換体。
(A)  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化
(B)  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化
(C)  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化
【請求項２】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化が、コリネバクテリウム属、ロドコッカス属、バチルス属、ロドシュードモナス属、アルテロモナス属、マリノバクター属、メチロバクテリウム属、パントエア属、ニューロスポラ属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、コリネバクテリウム  グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム  ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム  カゼイ (Corynebacterium casei)、コリネバクテリウム  エフィシェンス (Corynebacterium efficiens)、アスペルギルス  ニガー (Aspergillus niger)、又はアスペルギルス  オリゼー (Aspergillus oryzae)の遺伝子である、請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、下記の(a)または(b)のDNAによってコードされる、請求項２または３に記載の形質転換体。
(a) 配列番号7、134、135、145、147、又は149の塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号7、134、135、145、147、又は149の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項５】
コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、プロビデンシア属細菌、又は、クロノバクター属細菌由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項６】
コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、プロビデンシア ルスティジアニ (Providencia rustigianii)、プロビデンシア スチュアルティ (Providencia  stuartii)、又はクロノバクター サカザキ (Cronobacter sakazakii)由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、下記の(c)または(d)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換体。
(c) 配列番号9、128、又は129の塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号9、128、又は129の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、コリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項８】
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化が、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする、コリネバクテリウム  グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)の遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項９】
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化が、下記の(e)または(f)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１〜８のいずれかに記載の形質転換体。
(e) 配列番号8の塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号8の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項１０】
プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性が消失しているか、阻害されているか、または減少している、請求項１〜９のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項１１】
3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ、3−デヒドロキナ酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸(EPSP)シンターゼ、及びコリスミ酸シンターゼからなる酵素群より選ばれる少なくとも一つの酵素活性が強化されている請求項１〜１０のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１２】
DAHPシンターゼ活性の強化が下記の(g)または(h)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性の強化が下記の(i)または(j)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性の強化が下記の(k)または(l)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の強化が下記の(m)または(n)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、シキミ酸キナーゼ活性の強化が下記の(o)または(p)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、EPSPシンターゼ活性の強化が下記の(q)または(r)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、コリスミ酸シンターゼ活性の強化が下記の(s)または(t)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、請求項１１に記載の形質転換体。
(g)  配列番号2の塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号2と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、DAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(i)  配列番号153の塩基配列からなるDNA
(j)  配列番号153と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(k)  配列番号5の塩基配列からなるDNA
(l)  配列番号5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(m)  配列番号6の塩基配列からなるDNA
(n)  配列番号6と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(o)  配列番号154の塩基配列からなるDNA
(p)  配列番号154と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(q)  配列番号155の塩基配列からなるDNA
(r)  配列番号155と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、EPSPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(s)  配列番号156の塩基配列からなるDNA
(t)  配列番号156と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項１３】
トランスケトラーゼ活性、及びトランスアルドラーゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも一つの活性が強化されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１４】
トランスケトラーゼ活性の強化が下記の(u)又は(v)のDNAの導入によるものであり、トランスアルドラーゼ活性の強化が下記の(w)又は(x)のDNAの導入によるものである、請求項１３に記載の形質転換体。
(u)  配列番号151の塩基配列からなるDNA
(v)  配列番号151と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスケトラーゼをコードするDNA
(w)  配列番号152の塩基配列からなるDNA
(x)  配列番号152と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスアルドラーゼをコードするDNA
【請求項１５】
宿主がコリネ型細菌である、請求項１〜１４の何れかに記載の形質転換体。
【請求項１６】
グルコース、及び、キシロース、アラビノース、及びセロビオースからなる群より選ばれる少なくとも1種の糖の同時利用能を有する、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１５、又は１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又は、ATCC13869である、請求項１８に記載のコリネ型細菌形質転換体。
【請求項２０】
コリネバクテリウム グルタミカム PCA4 (受託番号：NITE BP-02217)
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養してプロトカテク酸又はその塩を生産させる工程を含むプロトカテク酸又はその塩の製造方法。
【請求項２２】
好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子操作が施されたことにより、プロトカテク酸又はその塩を、糖類を原料として効率よく生産できるようになった形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なプロトカテク酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化、および化石資源の枯渇問題を背景に、再生可能な資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料と並んで新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現に向けた重要な方策であることが認識され、注目されている。【０００３】
プロトカテク酸は、医薬、農薬、香料等の原料となる他、それ自体、抗酸化剤として用いられる有用化合物である。
従来、プロトカテク酸は主に天然物（農産品）からの抽出法によって製造されている。しかし、このような製造法では天然物原料の生産量が限られることや、天然物からの抽出効率が低いといった問題が存在するため、大量生産が難しい状況にある。【０００４】
微生物の中には、様々な芳香族化合物を代謝分解することにより炭素源として利用する能力を有し、プロトカテク酸を代謝中間体として生成するものがあることが知られている。そこで、この代謝を制御することにより、糖類を原料とする発酵法によってプロトカテク酸を経由して種々の化合物を生産する方法が提案されている。特に、再生可能な非可食バイオマス資源由来の糖類を原料としてプロトカテク酸を安価、且つ、大量に製造する方法は、環境にもやさしく、その開発が望まれている。【０００５】
特許文献１、２は、炭素源を芳香族アミノ酸生合成共通経路を介して3-デヒドロシキミ酸に変換できるエシェリヒア属細菌又はクレブシェラ属細菌に、クレブシェラ属細菌由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、及びプロトカテク酸デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からプロトカテク酸を経由してカテコールを製造する方法を教えている。特許文献２は、さらに、プロトカテク酸を経由するカテコールの生産のためには、シキミ酸デヒドロゲナーゼを失活させることにより、3-デヒドロシキミ酸からコリスミ酸への変換を阻害することが好ましいことを教えている。【０００６】
また、特許文献３、４は、エシェリヒア属細菌又はクレブシェラ属細菌に、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、プロトカテク酸デカルボキシラーゼ遺伝子、及びカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からプロトカテク酸を経由して、cis,cis-ムコン酸、又はアジピン酸を製造する方法を教えている。特許文献４、５では、3-デヒドロシキミ酸からコリスミ酸への代謝経路上の何れかの酵素を阻害することが好ましいことを教えている。【０００７】
また、特許文献５は、エシェリヒア属細菌又はクレブシェラ属細菌に、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、及び変異型の4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体を用いて、糖類からプロトカテク酸を経由して、没食子酸（Gallic acid）又はピロガロールを製造する方法を教えている。【０００８】
しかし、これら特許文献１〜５は、プロトカテク酸の製造を意図しておらず、生成したプロトカテク酸はカテコール、cis,cis-ムコン酸、アジピン酸、又は没食子酸に変換されてしまうことが問題である。また、これらの物質を実用上十分に効率よく製造することもできていない。さらに、これらの特許文献に記載の微生物は、目的化合物の生産性向上を目的として、芳香族アミノ酸の生合成経路が遮断されているため、該微生物を用いた場合、卜リプトファン、チロシン、フェニルアラニン、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸、および2，3-ジヒドロキシ安息香酸の要求性が生じるために、これら6種類の化合物を培地に添加する必要があるという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,629,181号
【特許文献２】米国特許第5,272,073号
【特許文献３】米国特許第5,487,987号
【特許文献４】米国特許第5,616,496号
【特許文献５】米国特許第6,472,190号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、糖類を原料として、効率よくプロトカテク酸又はその塩を製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良くプロトカテク酸又はその塩を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  プロトカテク酸は一般的に微生物に対して細胞毒性を示すことが知られており、生産されたプロトカテク酸の毒性により生産性が限定される可能性が考えられた。そこで、これまでに芳香族化合物の生産が報告されている幾つかの微生物について、それらの増殖に及ぼすプロトカテク酸の影響を比較したところ、コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリ、バチルス  サブチリス、シュードモナス プチダ、ロドコッカス エリスロポリスの中では、コリネバクテリウム グルタミカムが最もプロトカテク酸に対する耐性が高いことが示された。具体的には、コリネバクテリウム グルタミカムは、他の微生物の増殖が完全に、もしくは著しく抑制された、500mMという高濃度のプロトカテク酸の存在下においても高い増殖能、及び糖消費能を示した。このように、コリネバクテリウム グルタミカムはプロトカテク酸への耐性が極めて高いため、プロトカテク酸又はその塩の生産に特に好適である。
(ii)  コリネ型細菌に、(a)3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主微生物に導入することによる該酵素活性の強化と、(b)コリスメートピルベートリアーゼをコードする遺伝子、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子とを宿主微生物に導入することによる該酵素活性の強化とを組み合わせて行うことにより、(a)のみ行う場合、又は(b)のみ行う場合に比べて、糖類からのプロトカテク酸又はその塩の生産性が相乗的に向上する。
(iii)  さらに、(a)と(b)の両者を施したコリネ型細菌形質転換体は、プロトカテク酸又はその塩の生産性が顕著に向上する一方で、芳香族アミノ酸生合成経路は遮断されていないことから、卜リプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンといった芳香族アミノ酸やパラアミノ安息香酸の要求性が生じないため、該形質転換体を増殖させるためにこれらの化合物を培地に添加する必要がないという利点を有している。
(iv)  この形質転換体は、好気的、かつ実質的に増殖しない条件下で反応を行う場合に、特にプロトカテク酸又はその塩の生産効率が高い。【００１２】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体、及び、プロトカテク酸又はその塩の製造方法を提供する。
項１．  下記の(A)、(B)、及び(C)の操作が施されたプロトカテク酸生産能を有する形質転換体。
(A)  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化
(B)  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化
(C)  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化
項２．  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化が、コリネバクテリウム属、ロドコッカス属、バチルス属、ロドシュードモナス属、アルテロモナス属、マリノバクター属、メチロバクテリウム属、パントエア属、ニューロスポラ属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、項１に記載の形質転換体。
項３．  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、コリネバクテリウム  グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム  ハロトレランス (Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム  カゼイ (Corynebacterium casei)、コリネバクテリウム  エフィシェンス (Corynebacterium efficiens)、アスペルギルス  ニガー (Aspergillus niger)、又はアスペルギルス  オリゼー (Aspergillus oryzae)の遺伝子である、項２に記載の形質転換体。
項４．  3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、下記の(a)または(b)のDNAによってコードされる、項２または３に記載の形質転換体。
(a) 配列番号7、134、135、145、147、又は149の塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号7、134、135、145、147、又は149の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項５．  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、プロビデンシア属細菌、又は、クロノバクター属細菌由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
項６．  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、プロビデンシア ルスティジアニ (Providencia rustigianii)、プロビデンシア  スチュアルティ (Providencia stuartii)、又はクロノバクター サカザキ (Cronobacter sakazakii)由来のコリスメートピルベートリアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、項５に記載の形質転換体。
項７．  コリスメートピルベートリアーゼ活性の強化が、下記の(c)または(d)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、項１〜６のいずれかに記載の形質転換体。
(c) 配列番号9、128、又は129の塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号9、128、又は129の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、コリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項８．  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化が、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする、コリネバクテリウム  グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)の遺伝子の宿主への導入によってもたらされたものである、項１〜７のいずれかに記載の形質転換体。
項９．  4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化が、下記の(e)または(f)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、項１〜８のいずれかに記載の形質転換体。
(e) 配列番号8の塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号8の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項１０．  プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性が消失しているか、阻害されているか、または減少している、項１〜９のいずれかに記載のコリネ型細菌形質転換体。
項１１．  3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ、3−デヒドロキナ酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸(EPSP)シンターゼ、及びコリスミ酸シンターゼからなる酵素群より選ばれる少なくとも一つの酵素活性が強化されている項１〜１０のいずれかに記載の形質転換体。
項１２．  DAHPシンターゼ活性の強化が下記の(g)または(h)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性の強化が下記の(i)または(j)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性の強化が下記の(k)または(l)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の強化が下記の(m)または(n)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、シキミ酸キナーゼ活性の強化が下記の(o)または(p)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、EPSPシンターゼ活性の強化が下記の(q)または(r)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものであり、コリスミ酸シンターゼ活性の強化が下記の(s)または(t)のDNAの宿主への導入によってもたらされたものである、項１１に記載の形質転換体。
(g)  配列番号2の塩基配列からなるDNA
(h)  配列番号2と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、DAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(i)  配列番号153の塩基配列からなるDNA
(j)  配列番号153と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(k)  配列番号5の塩基配列からなるDNA
(l)  配列番号5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(m)  配列番号6の塩基配列からなるDNA
(n)  配列番号6と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(o)  配列番号154の塩基配列からなるDNA
(p)  配列番号154と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、シキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(q)  配列番号155の塩基配列からなるDNA
(r)  配列番号155と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、EPSPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(s)  配列番号156の塩基配列からなるDNA
(t)  配列番号156と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、コリスミ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項１３．  トランスケトラーゼ活性、及びトランスアルドラーゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも一つの活性が強化されている、項１〜１２のいずれかに記載の形質転換体。
項１４．  トランスケトラーゼ活性の強化が下記の(u)又は(v)のDNAの導入によるものであり、トランスアルドラーゼ活性の強化が下記の(w)又は(x)のDNAの導入によるものである、項１３に記載の形質転換体。
(u)  配列番号151の塩基配列からなるDNA
(v)  配列番号151と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスケトラーゼをコードするDNA
(w)  配列番号152の塩基配列からなるDNA
(x)  配列番号152と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、トランスアルドラーゼをコードするDNA
項１５．  宿主がコリネ型細菌である、項１〜１４の何れかに記載の形質転換体。
項１６．  グルコース、及び、キシロース、アラビノース、及びセロビオースからなる群より選ばれる少なくとも1種の糖の同時利用能を有する、項１５に記載の形質転換体。
項１７．  宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、項１５、又は１６に記載の形質転換体。
項１８．  宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、項１７に記載の形質転換体。
項１９．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又は、ATCC13869である、項１８に記載のコリネ型細菌形質転換体。
項２０．  コリネバクテリウム グルタミカム PCA4 (受託番号：NITE BP-02217)
項２１．  項１〜２０のいずれかに記載の形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養してプロトカテク酸又はその塩を生産させる工程を含むプロトカテク酸又はその塩の製造方法。
項２２．  好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する、項２１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
図１に示す通り、微生物におけるプロトカテク酸の生合成経路としては、(a)3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼによって触媒される、3-デヒドロシキミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成経路と、(b)コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼによって触媒される、コリスミ酸（シキミ酸経路の最終代謝産物）のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成経路、の2種の経路が存在する。【００１４】
本発明によれば、3-デヒドロシキミ酸を基点として分岐し、ともにプロトカテク酸生成に至る、競合する上記(a)及び(b)の二つの代謝経路を同時に強化することで、意外にも、プロトカテク酸の生産が顕著に増大する。即ち、コリネ型細菌において、(a)3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性の強化と、(b)コリスメートピルベートリアーゼ活性、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の強化を同時に施すことにより、(a)のみ施す場合、又は(b)のみ施す場合に比べて、糖類からのプロトカテク酸又はその塩の生産量が相乗的に向上する。【００１５】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性による、3-デヒドロシキミ酸からのプロトカテク酸の生成を経由するカテコールの製造法においては、3-デヒドロシキミ酸からコリスミ酸への変換を阻害することがより好ましいことが知られていることを考慮すれば（特許文献１〜５）、本発明の効果は予測し難いものである。【００１６】
これらの酵素活性の強化は、例えば、該酵素をコードする遺伝子を適切なプロモーターの制御下においてコリネ型細菌に導入することにより行うことができる。
なお、コリネ型細菌は上記3種の酵素のうち、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を染色体上に有しているが、コリスメートピルベートリアーゼをコードする遺伝子は有していない。そこで、本発明の実施例においては、高活性なコリスメートピルベートリアーゼをコードすることを我々が見出していた、プロビデンシア  ルスティジアニ(Providencia rustigianii)由来の遺伝子を宿主のコリネ型細菌に導入することにより、(b)のプロトカテク酸生合成経路をコリネ型細菌において機能させた。【００１７】
本発明により、医薬品、香料、ポリマー等の原料として有用なプロトカテク酸を、環境負荷の少ない発酵法によって、安価かつ大量に生産することが可能となった。
一般に微生物はプロトカテク酸のような芳香族化合物の細胞毒性により増殖が阻害されるため、微生物を用いて効率的にプロトカテク酸を製造することは困難であった。しかし、コリネ型細菌は、プロトカテク酸を含む芳香族化合物に対する耐性が非常に高いため、本発明の形質転換体を用いれば、高濃度のプロトカテク酸又はその塩を効率よく生産することができる。また、コリネ型細菌は、大腸菌とは異なりエンドトキシンを生成しないため、生産物へのエンドトキシンの残留を懸念する必要がない。また、コリネ型細菌は、培養槽に高細胞密度に充填するとともに、増殖を制限した条件下でも溶菌せずにプロトカテク酸又はその塩の生成反応が進むため、原料の糖が増殖のために消費されずプロトカテク酸又はその塩の収率が高くなる。また増殖を制限した条件下では、微生物の増殖に一般的に求められる芳香族アミノ酸や4-ヒドロキシ安息香酸などを培養液に添加する必要がなく、その分、生産コストを抑えることができる。【００１８】
また、特許文献１〜４の方法では、3-デヒドロシキミ酸からのコリスミ酸の生成反応が阻害される結果、形質転換体は芳香族アミノ酸要求性を示し、生育のために別途、芳香族アミノ酸や芳香族ビタミンを添加する必要がある。このため、形質転換体による物質生産がコスト高になり、また菌体の増殖能力が低下している可能性が考えられる。一方、本発明の形質転換体では、コリスミ酸の生成は阻害されておらず非栄養要求性であることから、反応用菌体を調製するために行う菌体増殖（培養）においても芳香族アミノ酸や芳香族ビタミンを添加する必要がなく、また栄養要求性を示す菌株に比べ菌体増殖がより旺盛である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】コリネ型細菌におけるプロトカテク酸生成経路を示す図である。点線は、外来遺伝子産物による代謝反応を示す。
【図２】各種微生物の増殖に及ぼすプロトカテク酸の影響を示す図である。
【図３】コリネ型細菌の糖消費に及ぼすプロトカテク酸の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の理解を容易にするため、図1に、コリネ型細菌形質転換体におけるプロトカテク酸生合成経路を模式的に図示した。
（１）プロトカテク酸又はその塩の生産能を有する形質転換体
宿主
本発明において、プロトカテク酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれも宿主として用いることができる。
好適な宿主微生物として、コリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア属細菌（特に、エシェリヒア コリ）、バチルス属細菌(特にバチルス  サブチリス)、シュードモナス属細菌（特に、シュードモナス プチダ）、ブレビバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、ロドコッカス属細菌(特にロドコッカス エリスロポリス、ロドコッカス オパカス)、ストレプトマイセス属細菌、サッカロマイセス属酵母(特に、サッカロマイセス セレビシアエ)、クライベロマイセス属酵母、シゾサッカロマイセス属酵母、ヤロウィア属酵母、トリコスポロン属酵母、ロドスポリジウム酵母、ピキア属酵母、キャンディダ属酵母、ノイロスポラ属カビ、アスペルギルス属カビ、トリコデルマ属カビなどが挙げられる。
中でも、プロトカテク酸またはその塩の生産効率の点で、宿主としてコリネ型細菌を用いることが好ましい。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００２１】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
中でも、安全でかつプロトカテク酸の生産性が高い点で、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。これらのコリネバクテリウム グルタミカム株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
中でも、R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００２２】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
【００２３】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
これらのブレビバクテリウム属、アースロバクター属、マイコバクテリウム属、及びマイクロコッカス属の菌株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
【００２４】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM BP-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００２５】
図２に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、プロトカテク酸に対する耐性が極めて高いことを見出した。また、図３に示したように、コリネ型細菌は高濃度のプロトカテク酸の存在下においても、高い糖消費能力を示した。これらの点で、コリネ型細菌は本発明方法によるプロトカテク酸又はその塩の製造に好適である。
【００２６】
導入遺伝子
本発明のプロトカテク酸を効率よく生成する形質転換体は、宿主菌株において、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの各酵素活性を強化することにより得ることができる。
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼは、3-デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を生成する反応を触媒する。コリスメートピルベートリアーゼは、コリスミ酸から4-ヒドロキシ安息香酸を生成する反応を触媒する。また、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、4-ヒドロキシ安息香酸の芳香環の3位の炭素原子を水酸化することにより、プロトカテク酸を生成する反応を触媒する。
【００２７】
これらの酵素の活性強化は、これらの酵素をコードする遺伝子を宿主微生物に導入することにより行うことができる。また、これらの酵素の活性強化は、宿主微生物の染色体上に存在する該酵素遺伝子の制御配列、遺伝子コード領域、またはその両者への変異導入、又は塩基配列置換によってもたらすこともできる。このうち、これらの酵素遺伝子の宿主微生物への導入により、該酵素活性を増強することが簡便で効率が良い。
宿主としてコリネ型細菌を用いる場合、本菌は染色体上に、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を有しているが、コリスメートピルベートリアーゼ遺伝子は有していない。また、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子についても、これらの遺伝子は特定の培養条件下(プロトカテク酸、あるいは特定の芳香族化合物の存在下)でのみ発現が誘導される可能性が考えられる。従って、上記3遺伝子は、用いる培養条件で高発現をもたらす適切なプロモーターの制御下に置いた融合遺伝子として宿主のコリネ型細菌に導入することが好ましい。
【００２８】
各遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸又はその塩の生産効率が良い点で、例えば、下記の微生物の遺伝子が挙げられる。
【００２９】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウム属細菌（特に、コリネバクテリウム グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム カゼイ (Corynebacterium casei)、コリネバクテリウム エフィシエンス (Corynebacterium efficience)、コリネバクテリウム ハロトレランス (Corynebacterium halotolerans)）、ロドコッカス属細菌 (特に、ロドコッカス オパカス (Rhodococcus opacus))、マイコバクテリウム属細菌 (特に、マイコバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegmatis))、バチルス属細菌 (特に、バチルス チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis))、グルコノバクター属細菌 (特に、グルコノバクター オキシダンス (Gluconobacter oxydans）)、ロドシュードモナス属細菌 (特に、ロドシュードモナス パルストリス (Rhodopseudomonas palustris))、アルテロモナス属細菌 (特に、アルテロモナス マクレオディ (Alteromonas macleodii))、マリノバクター属細菌 (特に、マリノバクター ハイドロカーボノクラスティカス (Marinobacter hydrocarbonoclasticus))、メチロバクテリウム属細菌 (特に、メチロバクテリウム  エキソトルキエンス (Methylobacterium extorquens))、シュードモナス属細菌 (特に、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida))、アシネトバクター属細菌  (特に、アシネトバクター ベイリー (Acinetobacter baylyi))、パントエア属細菌 (特に、パントエア アナナティス (Pantoea ananatis))、ニューロスポラ属菌(特に、ニューロスポラ クラッサ (Neurospora crassa))、及び、アスペルギルス属菌(特に、アスペルギルス オリゼー (Aspergillus oryzae)、アスペルギルス ニガー (Aspergillus niger))の遺伝子などが挙げられる。
中でも、コリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム カゼイ、コリネバクテリウム エフィシエンス、コリネバクテリウム ハロトレランス、ロドコッカス オパカス、メチロバクテリウム エキソトルキエンス、ニューロスポラ クラッサ、アスペルギルス ニガー、及びアスペルギルス オリゼーの遺伝子が好ましく、中でも、コリネバクテリウム グルタミカム、及び、コリネバクテリウム ハロトレランスの遺伝子がより好ましい。
【００３０】
コリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム カゼイ、コリネバクテリウム  エフィシエンス、コリネバクテリウムハロトレランス、ロドコッカス  オパカス、マイコバクテリウムスメグマティス、バチルステューリンゲンシス、グルコノバクターオキシダンス、ロドシュードモナスパルストリス、アルテロモナス マクレオディ、マリノバクター ハイドロカーボノクラスティカス、メチロバクテリウム エキソトルキエンス、シュードモナス プチダ、アシネトバクター ベイリー、パントエア  アナナティス、ニューロスポラ クラッサ、アスペルギルス オリゼー、アスペルギルス ニガーの3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子としては、それぞれ、配列番号7、及び、配列番号134〜150に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
配列番号7のコリネバクテリウム グルタミカムの3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子はqsuBと称される。
また、配列番号7、及び、配列番号134〜150のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつ3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００３１】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
【００３２】
また、配列番号7、及び、配列番号134〜150のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００３３】
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００３４】
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性は、33℃において、50 mMトリス・塩酸バッファー(pH 7.5)、0.5 mM 3-デヒドロシキミ酸、25 mM MgCl2からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、プロトカテク酸の生成を示す290 nmの吸光 (吸光係数=3890/M・cm)の上昇をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって測定する。33℃において、1分間に1 μmolのプロトカテク酸が生成する活性を、1 unitの3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性とし、活性が検出される場合に、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ活性を測定することにより確認する。
【００３５】
コリスメートピルベートリアーゼ遺伝子
コリスメートピルベートリアーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸又はその塩の生産効率が良い点で、プロビデンシア属細菌、または、クロノバクター属細菌の遺伝子が好ましく、中でも、プロビデンシア ルスティジアニ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア ステュアルティ(Providencia stuartii)、クロノバクター サカザキ(Cronobacter sakazakii)の遺伝子がより好ましく、プロビデンシア ルスティジアニ（Providencia rustigianii）の遺伝子がさらにより好ましい。
【００３６】
プロビデンシア ルスティジアニ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア  ステュアルティ(Providencia stuartii)、及びクロノバクター サカザキ(Cronobacter sakazakii)のコリスメートピルベートリアーゼ遺伝子としては、それぞれ、配列番号9、128、及び129に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
配列番号9のプロビデンシア ルスティジアニイ（Providencia rustigianii）のコリスメートピルベートリアーゼ遺伝子はubiCと称される。
また、配列番号9、128、及び129のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００３７】
また、配列番号9、128、及び129のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつコリスメートピルベートリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００３８】
コリスメートピルベートリアーゼ活性は、「Journal of Bacteriology,  174, 5309-5316, 1992 "Materials and Methods"」に記載の方法を改変した方法を用いて測定する。即ち、33℃において、50 mMトリス・塩酸バッファー(pH 7.5)、20 mM NaCl、0.2 mM NADH、0.5mM コリスミ酸、5U/ml 乳酸デヒドロゲナーゼからなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、該酵素活性により生成するピルビン酸を基質とする乳酸デヒドロゲナーゼのカップリング反応に伴うNADHの消費に起因する340 nmの吸光度低下(吸光係数=6220/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが消費される活性を、1 unitのコリスメートピルベートリアーゼ活性とし、活性が検出される場合に、コリスメートピルベートリアーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のコリスメートピルベートリアーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のコリスメートピルベートリアーゼ活性の上昇により確認する。
【００３９】
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、フェノールモノオキシゲナーゼとも称される。4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸又はその塩の生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌の遺伝子、中でも、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum）の遺伝子が好ましい。
【００４０】
コリネバクテリウム グルタミカムの4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子としては、配列番号8に示す塩基配列からなるものが挙げられる。コリネバクテリウム グルタミカムの4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ遺伝子はpobAと称される。
また、配列番号8の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつ4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００４１】
また、配列番号8の塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００４２】
4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の測定は以下のように行う。33℃において、50 mMトリス・塩酸バッファー(pH 8.0)、0.2 mM NADPH、2 mM 4-ヒドロキシ安息香酸からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、340 nmの吸光 (吸光係数= 6220/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1μmolのNADPHが消費される活性を、1 unitの4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性とし、該活性が検出される場合に、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体の4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性の上昇により確認する。
【００４３】
3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性の強化
本発明の形質転換体は、さらに、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−7−リン酸（DAHP）シンターゼ活性が増強されていることが好ましい。DAHPシンターゼは、エリスロース-4-リン酸、及びホスホエノールピルビン酸とから、芳香族化合物生合成経路の初発代謝産物であるDAHPを生成する酵素である。
DAHPシンターゼ活性の増強は、DAHPシンターゼ遺伝子の宿主微生物への導入、又は、宿主微生物の染色体上のDAHPシンターゼ遺伝子（制御配列ないしは領域、遺伝子コード領域、またはその両者）への変異導入や配列置換によりもたらすことができる。このうち、DAHPシンターゼ遺伝子の宿主微生物への導入によりDAHPシンターゼ活性を増強することが簡便で効率が良い。
【００４４】
導入するDAHPシンターゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸又はその塩の生産効率が良い点で、コリネバクテリウム グルタミカム、又はエシェリヒア コリ(Escherichia coli)由来の遺伝子が好ましい。中でも、エシェリヒア コリ由来の遺伝子がより好ましい。
エシェリヒア コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子としては、配列番号2の塩基配列からなるDNA（aroG S180F）がさらにより好ましい。この遺伝子は、エシェリヒア コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子の一つであるaroG遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の180番目のセリンをフェニルアラニンに変異させる変異(S180F)が導入された遺伝子であり、その遺伝子産物が芳香族アミノ酸を含む芳香族化合物によるフィードバック阻害への耐性、及び、高いDAHPシンターゼ活性を示すことを、本発明者らが比較検討により見出している（未発表）。
【００４５】
また、本発明では、配列番号2と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつDAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は配列番号2と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつDAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００４６】
DAHPシンターゼ活性の測定は以下のように行う。20 mM ビストリスプロパンバッファー(pH 6.8)、500μM ホスホエノールピルビン酸 (PEP)ナトリウム、500μM エリスロース−4−リン酸、1 mM 塩化マンガンからなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、PEPに起因する232 nmの吸光(吸光係数=2800/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1μmolのPEPが消費される活性を、1 unitのDAHPシンターゼ活性とし、活性が検出される場合に、DAHPシンターゼ活性があると判定する。また、本発明において、形質転換体のDAHPシンターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のDAHPシンターゼ活性値の上昇により確認する。
【００４７】
トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性の強化
本発明の形質転換体は、さらに、トランスケトラーゼ活性、または、トランスケトラーゼ活性とトランスアルドラーゼ活性が増強されていることが好ましい。
【００４８】
糖代謝において、トランスケトラーゼは2種の反応を触媒する。一つ目の反応は、非酸化的ペントース・リン酸経路において、D−キシルロース−5−リン酸からグリセルアルデヒド−3−リン酸への変換と、D−リボース−5−リン酸（R5P）からセドヘプツロース−7−リン酸（S7P）への変換とを触媒する反応である。これらの反応は可逆的で共役している。また、二つ目の反応は、D−フルクトース−6−リン酸（F6P）からエリスロース−4−リン酸（E4P）への変換と、グリセルアルデヒド−3−リン酸からD−キシルロース−5−リン酸への変換を触媒する反応である。これらの反応は可逆的で共役している。
【００４９】
また、糖代謝において、トランスアルドラーゼは、グリセルアルデヒド−3−リン酸からエリスロース−4−リン酸への変換と、セドヘプツロース−7−リン酸からD−フルクトース−6−リン酸への変換とを触媒する。これらの反応は共役している。
このように、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼは芳香族化合物生合成の前駆体の一つであるエリスロース−4−リン酸の生成に重要な役割を果たしている。従って、これらの酵素活性を強化することで細胞内のエリスロース−4−リン酸の供給が増大し、その結果、芳香族化合物生合成経路への代謝フラックスが高まり、プロトカテク酸の生産性向上をもたらすと考えられる。
トランスケトラーゼ活性、及びトランスアルドラーゼ活性の強化は、宿主微生物へのトランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子の導入、又は、宿主微生物の染色体上のトランスケトラーゼ遺伝子、または、トランスアルドラーゼ遺伝子の制御配列、遺伝子コード領域、またはその両者への変異導入や配列置換によりもたらすことができる。このうち、トランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子の宿主微生物への導入により該酵素活性を増強することが簡便で効率が良い。
【００５０】
導入するトランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸又はその塩の生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムのトランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子であることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカムのトランスケトラーゼ遺伝子としては、配列番号151の塩基配列からなるDNA（tkt）が挙げられ、コリネバクテリウム グルタミカムのトランスアルドラーゼ遺伝子としては、配列番号152の塩基配列からなるDNA（tal）が挙げられる。
【００５１】
また、本発明では、配列番号151又は152と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、それぞれ、トランスケトラーゼ活性、又はトランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号151又は152と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつそれぞれ、トランスケトラーゼ活性、又はトランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００５２】
本発明において、トランスケトラーゼ活性は、公知の方法(Sugimoto and Shiio, Agric. Biol. Chem. 53: 2081-2087 (1989)) を改変した方法に従って測定する。即ち、33℃において、50 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、0.5 mM MgCl2、0.01 mM チアミン二リン酸、1 mM NADH、3U グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、10U トリオースリン酸イソメラーゼ、0.5 mM D-リボース-5-リン酸、0.5 mM D-キシルロース-5-リン酸、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することにより反応を開始し、340 nmの吸光の減少(吸光係数=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometerによってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが消費される活性を1 unitのトランスケトラーゼ活性とし、活性が検出される場合にトランスケトラーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のトランスケトラーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のトランスケトラーゼ活性値の上昇により確認する。
【００５３】
本発明において、トランスアルドラーゼ活性は、公知の方法 (Sprenger, GA. et al., J. Bacteriol. 177: 5930-5936 (1995))を改変した方法に従って測定する。即ち、33℃において、100 mM トリエタノールアミン・塩酸バッファー (pH7.6)、10 mM EDTA、2.5 mM フルクトース-6-リン酸、0.5 mM エリスロース-4-リン酸、0.5 mM NADH、0.5 U/ml グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、5 U/mlトリオースリン酸イソメラーゼからなる反応用混合液に被験酵素液を添加することにより反応を開始し、340 nmの吸光の減少(吸光係数=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometerによってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが消費される活性を1 unitのトランスアルドラーゼ活性とし、活性が検出される場合にトランスアルドラーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のトランスアルドラーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のトランスアルドラーゼ活性値の上昇により確認する。
【００５４】
3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸(EPSP)シンターゼ、及びコリスメートシンターゼの各酵素活性の強化
本発明の形質転換体は、さらに、DAHPシンターゼ以降のシキミ酸経路上の一連の酵素群、すなわち、3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸(EPSP)シンターゼ、及びコリスメートシンターゼの各酵素活性のいずれか一つ以上が強化されていることが好ましく、またこれらの酵素活性のすべてが強化されていることがより好ましい。これらの１以上の酵素活性の強化により、DAHPからコリスミ酸への代謝変換が促進される。
3-デヒドロキナ酸シンターゼは、DAHPから3-デヒドロキナ酸への変換を触媒する酵素であり、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼは3-デヒドロキナ酸から3-デヒドロシキミ酸への変換を触媒する酵素であり、シキミ酸デヒドロゲナーゼは3-デヒドロシキミ酸からシキミ酸への変換を触媒する酵素であり、シキミ酸キナーゼはシキミ酸からシキミ酸-3-リン酸への変換を触媒する酵素であり、EPSPシンターゼは、シキミ酸-3-リン酸からEPSPへの変換を触媒する酵素であり、また、コリスメートシンターゼはEPSPからコリスミ酸への変換を触媒する酵素である。
【００５５】
3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、及びコリスメートシンターゼの各酵素活性の強化は、それら各酵素をコードする遺伝子の宿主微生物への導入、又は、宿主微生物の染色体上の該酵素遺伝子の制御配列、遺伝子コード領域、またはその両者への変異導入や塩基配列置換によりもたらすことができる。このうち、各酵素遺伝子の宿主微生物への導入により、それらがコードする該酵素活性を強化することが簡便で効率が良い。
【００５６】
導入する3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、及びコリスメートシンターゼをコードする各遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸やその塩の生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、特にコリネバクテリウム グルタミカムの遺伝子であることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来の上記各酵素遺伝子としては、3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子は、配列番号153からなるDNA (aroB)が挙げられ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子は、配列番号5からなるDNA (aroD)が挙げられ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号6からなるDNA (aroE)が挙げられ、シキミ酸キナーゼ遺伝子は、配列番号154からなるDNA (aroK)が挙げられ、EPSPシンターゼ遺伝子は、配列番号155からなるDNA (aroA)が挙げられ、コリスメートシンターゼ遺伝子は、配列番号156からなるDNA (aroC)が挙げられる。
【００５７】
また、本発明においては、配列番号153、5、6、154、155、又は配列番号156と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、且つ、それぞれ、3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性、シキミ酸キナーゼ活性、EPSPシンターゼ活性、又は、コリスメートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
また、本発明では、配列番号153、5、6、154、155、又は配列番号156と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつ、それぞれ、3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性、シキミ酸キナーゼ活性、EPSPシンターゼ活性、又は、コリスメートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００５８】
3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性は、公知の方法 (Meudi, S. et al., Dehydroquinate synthase from Escherichia coli, and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate. Methods. Enzymol. 142: 306-314 (1987))に従って測定する。即ち、33℃において、50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)、0.2 mM DAHP、0.2 mM NAD+、1 mM Cobalt(II) chloride・6H2O、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することにより反応を開始し、3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性と3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性のカップリング反応によって生成する3-デヒドロシキミ酸に起因する234 nmの吸光の上昇(吸光係数=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometerによってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolの3-デヒドロシキミ酸が生成する活性を1 unitのDHQシンターゼ活性とし、活性が検出される場合にDHQシンターゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体の3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性の上昇により確認する。
【００５９】
3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性は公知の方法 (Chaudhuri, S. et al., 3-Dehydroquinate dehydratase from Escherichia coli. Methods. Enzymol. 142: 320-324 (1987))に従って行う。即ち、33℃において、50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)、及び0.5 mM 3-デヒドロキナ酸からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、生成する3-デヒドロシキミ酸に起因する234 nmの吸光 (吸光係数=12000/M・cm)の上昇をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolの3-デヒドロシキミ酸を生成する活性を、1 unitの3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性とし、活性が検出される場合に3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体の3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中の3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性の上昇により確認する。
【００６０】
シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性は、公知の方法 (Chaudhuri, S. et al., Shikimate dehydrogenase from Escherichia coli. Methods. Enzymol. 142: 315-320 (1987))に従って測定する。即ち、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、0.2 mM NADPH、0.5 mM 3-デヒドロシキミ酸、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、NADPHの消費に伴う340 nmの吸光 (=6220/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolのNADPHが消費される活性を、1 unitのシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性とし、該活性が検出される場合に、シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の上昇により確認する。
【００６１】
シキミ酸キナーゼ活性は、公知の方法(Cheng, WC. et al., Structures of Helicobacter pylori shikimate kinase reveal a selective inhibitor-induced-fit mechanism. PLos One. 7: e33481 (2012))に従って測定する。即ち、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、1.6 mM シキミ酸、2.5 mM ATP、1 mM ホスホエノールピルビン酸、0.1 mM NADH、2.5 U/ml ピルビン酸キナーゼ、2.7 U/ml 乳酸デヒドロゲナーゼ、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、シキミ酸キナーゼ活性によるADPの生成を、ピルビン酸キナーゼ、及び乳酸デヒドロゲナーゼによる反応と共役させ、その結果起こるNADHの酸化に伴う340 nmの吸光 (ε=6220/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが酸化される活性を、1 unitのシキミ酸キナーゼ活性とし、該活性が検出される場合に、シキミ酸キナーゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のシキミ酸キナーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のシキミ酸キナーゼ活性の上昇により確認する。
【００６２】
EPSPシンターゼ活性は、以下のようにして測定する。即ち、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、5 mM MgCl2、0.5 mM シキミ酸-3-リン酸、0.5 mM ホスホエノールピルビン酸ナトリウム、からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、PEPに起因する232 nmの吸光(吸光係数=2800/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1μmolのホスホエノールピルビン酸が消費される活性を、1 unitのEPSPシンターゼ活性とし、該酵素活性が検出される場合に、EPSPシンターゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のEPSPシンターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のEPSPシンターゼ活性の上昇により確認する。
【００６３】
コリスメートシンターゼ活性は、公知の方法(Kitzing, K. et al., Spectroscopic and Kinetic Characterization of the Bifunctional Chorismate Synthase from Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 276: 42658-42666 (2001))に従って測定する。即ち、37℃において、100 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.6)、4 mM MgSO4、10 mM グルタミン、30 mM 硫酸アンモニウム、1 mM DTT、0.01 mM FMN、0.08 mM EPSP、アントラニル酸シンターゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、アントラニル酸シンターゼとのカップリング反応によって生成するアントラニル酸の生成を示す390 nmの蛍光をF-2500 Fluorescence Spectrophotometer (日立社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。FMNの還元は5 mMのdithioniteまたは1 mMのNADPHを添加することによって行うことができる。37℃において、1分間に1μmolアントラニル酸が生成する活性を1 unitのコリスメートシンターゼ活性とし、該酵素活性が検出される場合に、コリスメートシンターゼ活性があると判定する。
また、本発明において、形質転換体のコリスメートシンターゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のコリスメートシンターゼ活性の上昇により確認する。
【００６４】
プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性の消失・阻害・減少
本発明の形質転換体は、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性が消失、阻害、又は、減少していることが好ましい。
プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼは、プロトカテク酸の異化代謝経路において、プロトカテク酸の開環によるβ-カルボキシ-cis,cisムコン酸への変換を触媒する酵素である。プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性は、染色体上のプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
コリネバクテリウム グルタミカムのプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子としては、pcaHGが挙げられる。
【００６５】
本発明において、形質転換体のプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中のプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性を測定し、該酵素活性が減少又は消失することにより確認する。
プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性は、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、及び1 mM プロトカテク酸からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、プロトカテク酸に起因する290 nmの吸光(吸光係数=2800/M・cm)の減少をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、反応初速度から酵素活性を算出する。33℃において、1分間に1μmolのプロトカテク酸が消失する活性を、1 unitのプロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性とし、該酵素活性が検出される場合に、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ活性があると判定する。
【００６６】
ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)を介した細胞内への糖の取り込みの消失・阻害・減少
ホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）は、グルコースなどの糖の細胞内への取り込みと糖のリン酸化を共役して行うことを特徴とする、原核生物のみに存在する糖輸送機構である。大腸菌やコリネ型細菌において、糖の細胞内への取り込みにはPTSが主要な役割を果たしている。PTSは、共通コンポーネントであるEnzyme I（エンザイムI）(PEP Protein kinase)、HPr (Histidine-phosphorylatable protein；ヒスチジン-ホスフォリラタブルプロテイン)、及び各種糖の特異的な輸送に関わる膜タンパク質である Enzyme II（エンザイムII）によって構成され、解糖系由来のホスホエノールピルビン酸（PEP）をリン酸供与体とし、これら構成因子間のリン酸リレーを介して糖をリン酸化体として細胞内へ輸送するシステムである。一方、PTSはグルコースの細胞内への輸送に伴って、芳香族化合物の共通前駆体の一つであるPEPをグルコース-6-リン酸生成のためのリン酸供与基として消費してしまう。PEPは芳香族化合物生産において鍵となる前駆体化合物であり、プロトカテク酸を含む芳香族化合物高生産のためにはPTSのような競合代謝経路によるPEPの消費を抑え、芳香族化合物生産経路へのPEPの利用能を高めることが重要となる。本発明の形質転換体においては、PTSを介した糖の取り込みが不活性化され、同時に、糖輸送に伴ってPEPを消費しない、PTSとは異なる糖輸送系（非PTS糖輸送系）を介した糖利用能が付与されていることが好ましい。
【００６７】
PTSを介した細胞内への糖の取り込みは、コリネ型細菌の染色体上のPTSをコードする遺伝子の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
PTSをコードする遺伝子としては、Enzyme IをコードするptsI、HprをコードするptsH、及び、Enzyme IIをコードするptsG等が挙げられる。PTS依存的なグルコース輸送を阻害するためには、これらの遺伝子の１以上が破壊、欠失、又は変異していればよく、PTSの共通コンポーネントであるHprタンパク質をコードするptsH遺伝子が破壊され、欠失し、又は変異していることが好ましい。
【００６８】
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００６９】
本発明において、コリネ型細菌形質転換体のPTSを介した糖輸送能が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体において、PTSによって輸送される糖(グルコース、スクロース、フルクトースなど)を炭素源とする生育が消失、阻害、または抑制されること、及び、そのような表現型が正常なpts遺伝子の導入によって回復することによって確認する。
【００７０】
非PTS糖輸送系を介した糖取り込み活性の強化
コリネバクテリウム グルタミカムにおいては、PTSとは異なる糖輸送体であり、糖の細胞内輸送に伴ってPEPを消費しない、非PTSグルコース輸送体が存在する。pts遺伝子の破壊等によってPTSを介した糖の取り込みが阻害されたコリネバクテリウム グルタミカムは、グルコースを単一炭素源として増殖できなくなるか、または増殖能が著しく低下するが、その株に対して非PTSグルコース輸送体、及びグルコキナーゼを共に高発現させると、グルコースを単一炭素源とした増殖が回復する(Ikeda, M., et al., Identification and application of a different glucose uptake system that functions as an alternative to the phosphotransferase system in Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1443-1451, Lindner, S. N., et al., Phosphotransferase system-independent glucose utilization in Corynebacterium glutamicum by inositol permeases and glucokinases. Appl. Environ. Microbiol. 77: 3571-3581)。
本発明においては、PTSによる糖輸送が遮断されたコリネバクテリウム グルタミカムにおいて、グルコースの細胞内への取り込み、及び、グルコースを炭素源とする菌の増殖が、非PTSグルコース輸送体活性、及びグルコキナーゼ活性の強化によって改善されていることが望ましい。このことにより、グルコースの輸送に伴うPEPの消費を回避し、より多くのPEPをシキミ酸等の芳香族化合物生合成のために供給することが可能になると考えられる。
【００７１】
非PTSグルコース輸送体によるグルコースの細胞内への取り込みは、非PTSグルコース輸送体をコードする遺伝子の導入、又はコリネ型細菌の染色体上の非PTSグルコース輸送体遺伝子(制御配列またはコード領域)における変異導入、又は塩基配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
これらのうち、非PTSグルコース輸送体遺伝子の導入によりグルコースの取り込み活性を強化することが簡便で効率がよい。
導入する非PTSグルコース輸送体遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムの遺伝子であることが好ましい。
【００７２】
非PTSグルコース輸送体は、コリネ型細菌内で機能するものであればよく、コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーター(IolT1, IolT2)、大腸菌(エシェリヒア  コリ)由来のガラクトースパーミアーゼ（GalP）、ザイモモナス  モビリス (Zymomonas mobilis)由来のグルコースファシリテーター(Glf)等が挙げられる。中でも、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーターを介した糖取り込み活性が強化されていることが好ましい。
【００７３】
コリネバクテリウム グルタミカム由来のイノシトールトランスポーター遺伝子としては、配列番号157の塩基配列からなるDNA（iolT1）が挙げられる。
また、本発明では、配列番号157と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、イノシトールトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号159と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつイノシトールトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００７４】
本発明において、DNAがコードするタンパク質が非PTSグルコース輸送体であることは、ptsH遺伝子破壊等によりPTS依存的なグルコース輸送能を失い、グルコースを炭素源とする生育が低下している宿主細胞に対して、該DNAを導入、発現させた形質転換体のグルコースを炭素源とする生育、または、グルコース消費速度が形質転換前の細胞と比べて高まっていること、また、その効果がpts遺伝子破壊等によるPTS依存的な糖輸送の阻害による影響を受けないことを指標として確認する。
また、本発明において、形質転換体の非PTSグルコース輸送体活性が強化されていることは、PTSによる糖輸送を欠損した該形質転換体におけるグルコースを炭素源とする生育、または、グルコース消費速度が、該形質転換体において、遺伝子導入前と比べて高まっていることを指標として確認する。
【００７５】
グルコキナーゼ活性の強化
非PTSグルコース輸送体によって細胞内に取り込まれたグルコースが中央代謝系で代謝されるためには、グルコキナーゼによって、グルコース−6−リン酸に変換される必要がある。グルコキナーゼは、グルコースからグルコース−6−リン酸への変換を触媒する酵素である。
本発明においては、非PTSグルコース輸送体依存的なグルコース輸送の強化と同時に、グルコキナーゼ活性が強化されていることが好ましい。このことにより、グルコースの細胞内への取り込みとそれに引き続く解糖系やペントース・リン酸経路での糖代謝が促進されることを特徴としている。
【００７６】
グルコキナーゼ活性は、グルコキナーゼ遺伝子の導入による高発現、又は、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子(制御配列および遺伝子コード領域)に対する変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
コリネバクテリウム  グルタミカム R株の染色体上には、グルコキナーゼ遺伝子として、cgR_2067 (glk1)、cgR_2552 (glk2)、及びcgR_1739 (ppgK)の少なくとも3種が存在する。このうち、cgR_2067 (glk1)、及びcgR_2552(glk2)はATPを良好な基質とするグルコキナーゼと高い相同性を有し、cgR_1739 (ppgK)はポリリン酸を良好な基質とするグルコキナーゼと高い相同性を有している。本発明においては、これらのグルコキナーゼ遺伝子のうちの1種以上が強化されていることが好ましく、3種すべてが強化されていることがより好ましい。
【００７７】
グルコキナーゼ活性の強化は、グルコキナーゼ遺伝子の導入により行うことが簡便で効率がよい。
導入するグルコキナーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、シキミ酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムの遺伝子であることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のグルコキナーゼ遺伝子としては、配列番号158、159、及び、160の塩基配列からなるDNA（それぞれ、glk1、glk2、及びppgK）が挙げられる。
【００７８】
また、本発明では、配列番号158、159、又は、160と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号158、159、又は、160と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００７９】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がグルコキナーゼであることは、該DNAがコードするタンパク質のグルコキナーゼ活性を測定することにより確認する。グルコキナーゼ活性は、33℃において、100 mMトリス塩酸バッファー(pH 7.5)、4 mM 塩化マグネシウム、1 mM ATP、0.2 mM NADP+、20 mM グルコース、1U グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼからなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、NADPHの生成を示す340 nmの吸収 (=6220/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって測定する。33℃において、1分間に1μmolのNADPHが生成される活性を、1 unitのグルコキナーゼ活性とする。
また、本発明において、形質転換体のグルコキナーゼ活性が強化されていることは、該形質転換体の細胞抽出液中のグルコキナーゼ活性を測定することにより確認する。
【００８０】
GAPDH活性の強化
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、グリセルアルデヒド3−リン酸を1，3−ビスホスホグリセリン酸に変換する酵素である。
本発明の形質転換体においては、GAPDH活性が強化されていることが好ましい。
【００８１】
本発明において、pts遺伝子が破壊され、非PTSグルコース輸送体を介した糖取り込み活性、及びグルコキナーゼ活性を強化したコリネ型細菌形質転換体は、培養、及び反応時に解糖系代謝中間体であるジヒドロキシアセトンリン酸が脱リン酸化された代謝産物であるジヒドロキシアセトン（DHA）や、DHAがさらに代謝されて生成するグリセロールを顕著に蓄積する。また、グリセルアルデヒド−3−リン酸、及びその上流の解糖系代謝中間体の細胞内濃度が、該形質転換体において顕著に増大する。これらの現象は、該形質転換体において、GAPDHによって触媒される反応段階が解糖系での糖代謝の律速となっていることを示しており、該形質転換体におけるGAPDHの高発現により糖消費が促進され、それに伴い目的生成物の生産も促進されることを、本発明者は見出している。
そこで、本発明においては、形質転換体のGAPDH活性を強化することによって、糖代謝の律速を解除して糖消費を促進させるとともに、プロトカテク酸生産能力を向上させていることが望ましい。
【００８２】
GAPDH活性は、GAPDH遺伝子の導入による高発現、又は、染色体上のGAPDH遺伝子(制御配列および遺伝子コード領域)における変異導入、又は配列置換による、該遺伝子発現量の増大、または、該遺伝子産物の活性の増大により強化することができる。
中でも、GAPDH活性の強化は、GAPDH遺伝子の導入により行うことが簡便で効率がよい。
導入するGAPDH遺伝子の由来は特に限定されないが、プロトカテク酸生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、中でもコリネバクテリウム グルタミカムの遺伝子であることが好ましい。
コリネバクテリウム グルタミカム由来のGAPDH遺伝子としては、配列番号161の塩基配列からなるDNA（gapA）が挙げられる。
【００８３】
また、本発明では、配列番号161と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであって、GAPDH活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
また、本発明では、配列番号161と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGAPDH活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
【００８４】
本発明において、DNAがコードするタンパク質がGAPDHであることは、該DNAがコードするポリペプチドのGAPDH活性を測定することにより確認する。GAPDH活性の測定は、33℃において、25 mMリン酸バッファー(pH 7.5)、25 mM トリスエタノールアミン(pH 7.5)、0.2 mM EDTA、5 mM NAD+、5 mM グリセルアルデヒド−3−リン酸、からなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、NADHの生成を示す340 nmの吸収 (=6220/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターすることによって行う。33℃において、1分間に1 μmolのNADHが生成される活性を、1 unitのGAPDH活性とする。
また、本発明において、コリネ型細菌形質転換体のGAPDH活性が強化されていることは、該コリネ型細菌形質転換体の細胞抽出液中のGAPDH活性を測定することにより確認する。
【００８５】
ジヒドロキシアセトンリン酸 (DHAP)脱リン酸化活性の消失・阻害・減少
DHAP脱リン酸化酵素は、DHAPの脱リン酸化によるジヒドロキシアセトン (DHA)への変換を触媒する酵素である。
本発明の形質転換体は、DHAP脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、又は、減少していることが好ましい。上述のように、高発現させた非PTSグルコース輸送体及びグルコキナーゼに依存的に糖を細胞内に取り込み利用するコリネ型細菌は、副生物としてDHAを高生成する。このため、DHA生成経路の遮断により、プロトカテク酸等の芳香族化合物生成により多くの炭素を供給することが可能になる。
コリネバクテリウム  グルタミカムはDHAPの脱リン酸化を触媒する酵素として、HAD(haloacid dehalogenase)スーパーファミリーホスファターゼ(HdpA)を有している(Jojima, T. et. al., Identification of a HAD superfamily phosphatase, HdpA, involved in 1,3-dihydroxyacetone production during sugar catabolism in Corynebacterium glutamicum. FEBS. Lett. 586: 4228-4232 (2012))。コリネバクテリウム  グルタミカムのDHAP脱リン酸化酵素活性は、染色体上のDHAP脱リン酸化酵素遺伝子 (hdpA)の破壊、欠失、又は変異により、消失、阻害、または減少させることができる。
【００８６】
また、本発明において、形質転換体のDHAP脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、または減少していることは、該形質転換体の細胞抽出液中のDHAP脱リン酸化酵素活性を測定することによって確認する。DHAP脱リン酸化酵素活性は、33℃において、100 mMトリス・リンゴ酸バッファー(pH 7.5)、5 mM 硫酸マグネシウム、5 mM DHAP、からなる反応用混合液に酵素液を添加することで反応を開始し、DHAPから遊離する無機リン酸イオンを公知の方法(Gawronski, J.D., et. al., Microtiter assay for glutamine synthetase biosynthetic activity using inorganic phosphate detection. Anal. Biochem. 327: 114-118 (2004))に従い比色定量することにより測定する。この定量値が減少又は消失する場合に、ジヒドロキシアセトンリン酸脱リン酸化酵素活性が消失、阻害、または減少していると判定する。
【００８７】
形質転換体のためのベクターの構築
宿主微生物への遺伝子導入により、それがコードするタンパク質ないしは酵素の活性を強化させる場合、各タンパク質ないしは酵素をコードするDNAは、各々宿主の染色体に組み込むか、または、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングして宿主に導入すればよい。
プラスミドベクターは、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58−67699号公報〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及び〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム  グルタミカム  ATCC3058由来のpHM1519  〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム  T250由来のpCG4〔特開昭57−183799号公報〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕等が挙げられる。
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼＡ遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhA等が挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーター等が挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００８８】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などがあげられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる（Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)）。
【００８９】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、1種を単独で使用でき、または2種以上を混合してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。
【００９０】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。
【００９１】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、または炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v %）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられるが、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００９２】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日とすればよい。
【００９３】
（２）プロトカテク酸又はその塩の製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、糖類を含有する反応液中で培養又は反応させることによりプロトカテク酸又はその塩を生産させる工程を含む方法によりプロトカテク酸又はその塩を製造することができる。
糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどの単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙などを糖化酵素などで糖化した、グルコースなどの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
【００９４】
微生物の増殖
糖類を含む培地での培養、即ち反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜38℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
【００９５】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
【００９６】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【００９７】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００９８】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００９９】
培養液又は反応液
培養液又は反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としては、上記説明した糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液などを用いればよい。また、炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
反応液中の原料化合物である糖類の濃度は、約1〜20（w/v ％）が好ましく、約2〜10（w/v ％）がより好ましく、約2〜5（w/v ％）がさらにより好ましい。
また、原料の糖類を含む全炭素源の濃度は、約2〜5（w/v ％）とすればよい。
【０１００】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【０１０１】
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のｐＨは約6〜8が好ましい。
【０１０２】
具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【０１０３】
培養条件又は反応条件
培養温度又は反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約20〜50℃が好ましく、約25〜47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くプロトカテク酸を製造できる。
また、培養又は反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。本発明の形質転換体自体のプロトカテク酸又はその塩の生産能力は、好気的条件下の方が高い。しかし、好気的条件下では形質転換体が増殖するため、原料化合物が増殖のために消費され、その分、プロトカテク酸又はその塩の製造効率が低下する。
従って、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で反応を行うのが好ましい。本発明で増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源、または栄養要求性の形質転換体の増殖に必須のアミノ酸などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避または抑制できる。
【０１０４】
また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため、原料化合物が増殖のために消費されない分、プロトカテク酸又はその塩の製造効率が高くなる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200 mV〜−500 mVが好ましく、約−150 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP  Electrodes）を用いて測定できる。
【０１０５】
還元条件にある培養液又は反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate−reducing  bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and  Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【０１０６】
還元条件下で反応させる場合は、反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
上記のようにして培養することにより、培養液又は反応液中にプロトカテク酸又はその塩が生産される。
プロトカテク酸の塩は、培地又は反応液の成分によっても異なるが、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）が挙げられる。
【実施例】
【０１０７】
[実施例1]
PCA生産株の構築
(１)  染色体DNAの調整
PCA生産関連酵素遺伝子を取得するため、下記菌株から染色体DNAを調整した。
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)、エシェリヒア コリ（Escherichia coli K-12 MG1655）、プロビデンシア ルスティジアニイ（Providencia rustigianii JCM 3953）、コリネバクテリウム カゼイ（Corynebacterium casei JCM 12072）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens NBRC 100395）、パントエア アナナティス（Pantoea ananatis LMG 20103）、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans ATCC 621H）、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida NBRC 14164）、ロドシュードモナス パルストリス（Rhodopseudomonas palustris ATCC BAA-98）、アシネトバクター バイリイ（Acinetobacter baylyi ATCC33305）、アルテロモナス マクレオディイ（Alteromonas macleodii NBRC 102226）、マリノバクター ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus JCM 20777）、メチロバクテリウム エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens JCM 2802）、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa ATCC 36373）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger JCM 22282）、マイコバクテリウム スメグマチス（Mycobacterium smegmatis ATCC 700084）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans JCM 12676）、ロドコッカス オパクス（Rhodococcus opacus ATCC 51881）、アスペルギルス オリゼ（Aspergillus oryzae   JCM 13832）、バチルス チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis NBRC 3951）を菌株入手機関の情報に従って培養した後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調整した。【０１０８】
(２)   PCA生産関連遺伝子発現プラスミドの構築
目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表1に示す。PCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
得られたDNA断片を、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクター（pCRB207 [Hasegawa S et  al., Improvement of the redox balance increases L-valine production by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation conditions. Appl Environ Microbiol. 78(3):865-875 (2012)]、pCRB209 [国際公開 WO2012/033112]、pCRB210 [国際公開 WO2012/033112]に導入した。【０１０９】
【表１】
2017169399.tif 000003
【０１１０】
導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表2に示す。尚、tktとtal(tkt-tal遺伝子；配列番号1）、aroCとaroKとaroB(aroCKB；配列番号3）は染色体上で連続して同じ向きに配置されているため、まとめてクローニングを行った。【０１１１】
【表２】
2017169399.tif 000004
【０１１２】
(３)  PCA生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドの構築
PCA生産関連遺伝子をCorynebacterium glutamicum R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の生育に必須でないと報告されている配列 [Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372 (2005)]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域PCR法により増幅した。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] に導入した。なお、pCRB260、pCRB263、pCRB266、pCRB267、pCRB274及びpCRB279は、インバース PCR法によりSSI領域に遺伝子を組み込むための制限酵素部位（ユニークサイト）を導入した。SSI領域の単離及びインバースPCRに用いたプライマー配列および得られた染色体導入用ベクターを表3に示す。【０１１３】
【表３】
2017169399.tif 000005
【０１１４】
上述の染色体導入用プラスミドに、上記表2で構築したPCA生産関連遺伝子発現プラスミドからPgapAプロモーター融合酵素遺伝子断片を取得し導入した。得られたPCA生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドを表4に示す。【０１１５】
【表４】
2017169399.tif 000006
【０１１６】
(４) Corynebacterium glutamicum R株染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
Corynebacterium glutamicum R株の染色体遺伝子をマーカーレスで破壊するために必要なDNA領域をPCR法により増幅した。各PCR断片はオーバーラップ領域により連結可能である。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] に導入した。得られた染色体遺伝子破壊用プラスミドを表5に示す。【０１１７】
【表５】
2017169399.tif 000007
【０１１８】
（５）  染色体遺伝子組換えによるPCA生産株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入した染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
上記方法により、上述したPCA生産関連遺伝子染色体導入用プラスミド及び染色体遺伝子破壊用プラスミドを用いてPCA生産関連遺伝子染色体導入株を構築した。宿主菌株としてキシロース・セロビオース資化性コリネ型細菌Corynebacterium glutamicum X5C1株 [Appl Microbiol Biotechnol. 81(4):691-699 (2008)]を使用した。また、ldhA遺伝子破壊用プラスミドpCRA728 [J Mol Microbiol Biotechnol. 8(4):243-254 (2004)]、アラビノース資化遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD109 [Appl Microbiol Biotechnol. 85(1):105-115 (2009) ]及びアラビノーストランスポーター遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD108 [Appl Microbiol Biotechnol. 85(1):105-115 (2009) ]も使用した。尚、本染色体遺伝子組換えの概要は、表6にまとめて示した。【０１１９】
【表６】
2017169399.tif 000008
【０１２０】
(６)  PCA生産遺伝子発現プラスミド導入株の構築
上述の各種微生物由来3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子発現プラスミドを導入したコリネバクテリウム グルタミカム形質転換体を構築した。尚、本プラスミド導入株の概要は、表7にまとめて示した。【０１２１】
【表７】
2017169399.tif 000009
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PCA4は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに国際寄託した（ブダペスト条約に基づく国際寄託の受託日：2016年3月9日、受託番号：NITE BP-02217）。この株は、公に利用可能である。【０１２２】
[参考例1]
他の微生物に比べコリネ型細菌がプロトカテク酸に対して高い耐性を有することの検証
プロトカテク酸のような細胞毒性を有する生産物を微生物を用いて発酵法によって生産させる場合、宿主微生物が、その生産物に対する耐性を持つこと、すなわち、生産物による増殖阻害を受けにくいことが重要である。そこで、本発明における宿主微生物として好ましいCorynebacterium glutamicumのプロトカテク酸に対する耐性度を、他の微生物との比較において検証するため、Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis, 及びSaccharomyces cerevisiaeについて、好気培養におけるプロトカテク酸による増殖阻害効果について調べた。【０１２３】
Corynebacterium glutamicum R株を4%のグルコースを含んだA寒天培地[(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、agar 20 gを蒸留水1 Lに溶解]に塗布し、33℃で16時間培養した。上記プレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum R株を4%のグルコースを含んだA液体培地[(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] 10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて16時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したCorynebacterium glutamicum R株を、4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.1となるように植菌し、同時にプロトカテク酸が終濃度0, 25, 50, 100, 250, 500 mMとなるように添加し、33°Cにて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。【０１２４】
また、Escherichia coli K12株, Bacillus subtilis NBRC14144株, Pseudomonas putida ATCC700801株, 及びRhodococcus erythropolis ATCC27854株を各々、LB寒天培地 [1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、及び1.5%寒天] に塗布し、Escherichia coli K12株、及びBacillus subtilis NBRC14144株は37℃、また、Pseudomonas putida ATCC700801株、及びRhodococcus erythropolis ATCC27854株は30℃において、16時間培養を行った。上記プレート上で増殖した各菌株をLB液体培地 [1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5% 塩化ナトリウム] 10 ml に植菌し、Escherichia coli K12株, 及びBacillus subtilis NBRC14144株は37℃、また、Pseudomonas putida ATCC700801株, 及びRhodococcus erythropolis ATCC27854株は30℃において16時間好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖した各菌株を前記LB液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.1となるように植菌し、同時にプロトカテク酸濃度が終濃度0, 25, 50, 100, 250, 500 mMとなるように添加し、Escherichia coli K12株, 及びBacillus subtilis NBRC14144株は37℃、また、Pseudomonas putida ATCC700801株, 及びRhodococcus erythropolis ATCC27854株は30℃において好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。【０１２５】
また、Saccharomyces cerevisiae NBRC2376株をYPD寒天培地 [2%ポリペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース、及び1.5%寒天] に塗布し、30℃、16時間培養を行った。上記プレート上で増殖したSaccharomyces cerevisiae NBRC2376株をYPD液体培地 [2%ポリペプトン、1%酵母エキス、及び2% グルコース] に植菌し、30℃、16時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したSaccharomyces cerevisiae NBRC2376株を前記YPD液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.1となるように植菌し、同時にプロトカテク酸濃度が終濃度0, 25, 50, 100, 250, 500 mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。【０１２６】
培地中へのプロトカテク酸添加による各菌株の好気増殖への影響を調べた結果を図2に示す。
Escherichia coli K12株は、100 mM プロトカテク酸存在下で著しい増殖阻害を受け、250 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
Bacillus subtilis NBRC14144株は250 mM プロトカテク酸存在下で著しい増殖阻害を受け、500 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
Pseudomonas putida ATCC700801株は100 mM プロトカテク酸存在下で強い増殖阻害を受け、250 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
Rhodococcus erythropolis ATCC27854株は250 mM プロトカテク酸存在下で強い増殖阻害を受け、500 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
Saccharomyces cerevisiae NBRC2376株は250 mM プロトカテク酸存在下で増殖阻害を受け、500 mMでは、著しい増殖阻害を受けた。
これに対し、Corynebacterium glutamicum R株は、他の菌株の増殖が著しく、または、ほぼ完全に阻害される250〜500 mMのプロトカテク酸存在下においても旺盛な増殖が可能であった。
このように、Corynebacterium glutamicumは、プロトカテク酸生産宿主として報告のある他の微生物や代表的な溶媒耐性菌と比較してプロトカテク酸に対する高い耐性を有することから、プロトカテク酸生産宿主として高い適性を有することが示された。【０１２７】
[参考例2]
コリネ型細菌が高濃度のプロトカテク酸存在下において高い糖消費能力を有することの検証
参考例1で示したように、Corynebacterium glutamicumは高濃度のプロトカテク酸存在下でも増殖可能であった。そこでさらに、高濃度のプロトカテク酸存在下におけるCorynebacterium glutamicumのグルコース消費能を以下のように調べた。
Corynebacterium glutamicum R株を4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃で16時間培養した。上記プレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum R株を4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて16時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したCorynebacterium glutamicum R株を、4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.2となるように植菌し、同時にプロトカテク酸が終濃度0, 50, 250, 500 mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振とう培養を行った。培養24時間後に培養液を回収し、遠心分離(4℃, 15,000×g、5分)して得られた上清液中のグルコース濃度を、後述する実施例2と同様にしてグルコースセンサーにより測定した。各濃度のプロトカテク酸存在下における培養24時間後のCorynebacterium glutamicum R株のグルコース消費量を図3に示す。
図3に示したように、Corynebacterium glutamicumは高濃度のプロトカテク酸存在下においても糖消費の低下が僅かであることが分かる。【０１２８】
参考例1と2の結果より、Corynebacterium glutamicumはプロトカテク酸生産宿主として極めて優れていることが示された。【０１２９】
[実施例2]
コリネバクテリウム  グルタミカム形質転換体によるジャーファーメンター制御下の好気静止菌体反応によるプロトカテク酸生産試験
コリネバクテリウム  グルタミカムR株由来の混合糖利用株をベースとして構築したプロトカテク酸生産株である、PCA1、PCA2、PCA3、PCA4、PCA5の各菌株(実施例1(表6))について、ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)制御下の好気的静止菌体反応におけるプロトカテク酸生産能を以下に述べる方法に従って確認した。
PCA1株は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン各20 μg/ml、p-アミノ安息香酸 10 μg/ml、シキミ酸3.2 mM、及びグルコース4% (各終濃度)を添加した10 mlの前記A液体培地（試験管内）に植菌後、また、PCA2、PCA3、PCA4、及びPCA5株はグルコース4%を添加した10 mlの 前記A液体培地（試験管内）に植菌後、33℃で12-16時間、好気的に振盪培養を行った。【０１３０】
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカム  PCA1株は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 各20μg/ml、p-アミノ安息香酸10μg/ml、シキミ酸3.2 mM、及びグルコース4%(各終濃度)を添加した100 mlの前記A液体培地(500 ml容量フラスコ内)に初期OD=0.05となるよう植菌し、また、上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカムPCA2、PCA3、PCA4、及びPCA5株は4%グルコースを含む100 mlの前記A液体培地(500 ml容量フラスコ内)に初期OD=0.05となるよう植菌し、33℃で16時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカム  PCA1株については、グルコース  80 g/l、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン各100 μg/ml、p-アミノ安息香酸 50 μg/ml、シキミ酸 16 mM、及び消泡剤(ディスホームCB-442) 3 g/l(各終濃度)を添加した、600 mlの前記A(-UB)液体培地にOD610が0.3となるように植菌し、また、上記条件で増殖したコリネバクテリウム グルタミカム  PCA2、PCA3、PCA4、及びPCA5株については、グルコース  100 g/l、及び消泡剤(ディスホームCB-442) 3 g/l(各終濃度)を添加した、600 mlの前記A(-UB)液体培地にOD610が0.3となるように植菌し、各々、1000 ml容量ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)により33℃、pH 7.0 (5 N アンモニア水の添加により一定に制御)、通気量0.6 L/min (air、1 vvm)、溶存酸素濃度(DO) 10%（33℃における大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件において19-20時間通気撹拌培養を行った。【０１３１】
上記条件で増殖したコリネバクテリウム  グルタミカム菌株を遠心分離(4℃, 5000×g, 10分)により集菌し、菌体をBT(-UB)液体培地[(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) (Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O)  1 ml、100 μg/ml thiamine solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解]で1回洗浄した後、10% グルコースを含む前記BT(-UB)液体培地に対して25 g 湿菌体/ 250 ml(湿菌体重量として10%の菌体が培地中に存在)となるように懸濁し、前記1000 ml容量ジャーファーメンターを用いて33℃、pH 7.0(5 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.25 L/min (air、1 vvm)、溶存酸素濃度(DO) 5%（33℃における大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として）の条件においてプロトカテク酸生成反応を行った。なお、反応液中のグルコース濃度はグルコースセンサー(王子計測機器、BF-5i)を用いて経時的に測定し、必要に応じてグルコースの追添加を行った。菌体反応上清液中の芳香族代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィー(Prominence HPLC装置 (島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に[20%メタノール、0.07%過塩素酸]を用いて分離)により分析した。【０１３２】
各菌株を用いた好気静止菌体反応によるプロトカテク酸生産実験の結果を表8に示す。【０１３３】
【表８】
2017169399.tif 000010
【０１３４】
反応24時間後の各菌株のPCA生成量は、PCA1株は273 mM (42.1 g/l)、PCA2株は153 mM (23.6 g/l)、PCA3株は515 mM (79.4 g/l)、PCA4株は536 mM (82.5 g/l) 、PCA5株は408 mM (62.8 g/l)であった。また、各菌株におけるPCA生産の対糖モル収率は、PCA1株は33.8%、PCA2株は10.0% 、PCA3株は34.6%、PCA4株は39.3%、PCA5株は30.2%であった。【０１３５】
以上の結果より、(a) 3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼによって触媒される、3-デヒドロシキミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成と、(b)コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼによって触媒される、コリスミ酸（シキミ酸経路の最終代謝産物）のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成、の両者を強化したPCA3、PCA4、及びPCA5株は、無機塩最少培地を用いる静止菌体反応プロセスにおいて、高いプロトカテク酸生産能を有することが示された。中でも、コリネバクテリウム  グルタミカムの3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子を導入したPCA3株、及び、コリネバクテリウム  ハロトレランスの3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子を導入したPCA4株が特に高いPCA生産性を示した。また、これらPCA3、PCA4、及びPCA5株は、栄養培地での菌体培養時においても芳香族アミノ酸を含む補助栄養源を添加しなくても旺盛に増殖することが示された。
また、(a)3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼによって触媒される、3-デヒドロシキミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成のみに依存するPCA1株も比較的高いプロトカテク酸生産能を示したが、その生産性は、(a)と(b)の両経路からPCAを生成する、PCA3、PCA4、またはPCA5株と比べ劣っていた。また、PCA1株は芳香族アミノ酸生合成経路がシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(aroE)の破壊により遮断されているため、芳香族アミノ酸及び4-アミノ安息香酸の要求性を示し、本菌株を栄養培地で増殖させる場合には培地にそれら栄養源を添加する必要があった。
一方、(b) コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼによって触媒される、コリスミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成のみに依存してプロトカテク酸を生成するPCA2株のPCA生産性は、上記の他菌株と比べて大幅に低いことが示された。【０１３６】
以上の結果から、(a) 3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼによって触媒される、3-デヒドロシキミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成、及び、(b) コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼによって触媒される、コリスミ酸のプロトカテク酸への変換によるプロトカテク酸生成、の双方をともに強化することが、それらのどちらか一方の経路のみを強化した場合に比べ、プロトカテク酸生産能が相乗的に増大することが示された。【０１３７】
[実施例3]
プロトカテク酸生産株における、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリスメートピルベートリアーゼ、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの各酵素活性の測定
PCA1株、PCA2株、PCA3株、及び、これらの菌株の親株であるCRZ22株(表6)について、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、コリスメートピルベートリアーゼ、及び、4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼの各種酵素活性を下記の方法に従って測定した。
実施例1と同様の手順で、CRZ22株、PCA1株、PCA2株、及びPCA3株のジャーファーメンターを用いた好気的静止菌体反応を行い、反応6時間後の各菌株培養液を採取し、菌体を遠心分離により回収した。菌体を20 mM Tris-HCl(pH7.5)で1回洗浄した後、1 mlの菌体破砕用バッファー（100 mM Tris-HCl(pH7.5),20 mM KCl, 20 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, and 2 mM DTT））に懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械)及びグラスビーズを用いて破砕した。菌体破砕液を15000 rpm, 10 min, 4℃の条件で遠心分離を行い、上清画分を粗酵素抽出液として得た。各粗酵素抽出液のタンパク質濃度は、Protein assay kit (Bio-Rad, USA)を用い、BSA(Bovine serum albumin)をスタンダードとして定量した。各菌株の粗酵素抽出液中の各酵素活性の測定は、先述の活性測定方法に従って行った。【０１３８】
結果を表9に示す。
【表９】
2017169399.tif 000011
【０１３９】
親株のCRZ22株は、試験した3種の酵素活性のいずれも有意な活性が検出されなかった。このことから、これらの酵素は該株では発現が弱いか、ほとんど発現していないことが示唆された。
一方、PCA1株では、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子(qsuB)の導入に伴って3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ(QsuB)活性が検出された。PCA1株は、シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするaroE遺伝子が破壊されていることから、該酵素反応段階でシキミ酸経路が遮断される。従って、PCA1株におけるPCA生成が(a) 3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼのみに依存的に起こっていることを支持している。
PCA2株においては、コリスメートピルベートリアーゼ(UbiC)、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ(PobA)遺伝子の導入に対応してそれらの酵素活性が検出されたのに対し、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ(QsuB)活性は検出されなかった。このことからPCA2株においては、(a) 3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ依存的なプロトカテク酸生成は起こっておらず、(b)コリスメートピルベートリアーゼ(UbiC)、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ(PobA)を介した経路によってプロトカテク酸が生成することを支持している。
また、PCA3株においては、上記3種のすべての酵素活性が検出されたことから、本菌株においては、(a)と(b)の双方の経路を介してPCA生成が起こることを支持している。【０１４０】
以上の結果から、構築した各PCA生産菌株において、導入した酵素遺伝子が機能的に発現していることが示された。この結果に加え、実施例2の結果(表8)も各菌株において特定のPCA生成経路が機能していることを示唆している。即ち、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)遺伝子を破壊したPCA1株の反応上清中にはコリスミ酸や4-HBAが全く検出されないことは、本菌株において、(b)のPCA生成経路（コリスメートピルベートリアーゼ(UbiC)活性、及び4-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ(PobA)活性によって触媒される、コリスミ酸からのプロトカテク酸生成経路）が機能していないことを示唆している。一方、コリスミ酸生成に至るシキミ酸経路上のすべての酵素遺伝子が導入されたPCA2株、及びPCA3株の反応上清中にコリスミ酸や4-HBAの蓄積が検出されたことは、これらのPCA生産菌株において コリスミ酸からの(b)のPCA生成経路が機能していることを示唆している。【０１４１】
[実施例4]
有能なシキミ酸デヒドラターゼをコードする異種遺伝子の探索
実施例2及び実施例3の結果より、コリネ型細菌形質転換体によるプロトカテク酸の生産性は、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子導入による該酵素活性の強化により顕著に高まることが示された。一方、コリネ型細菌形質転換体PCA1株、及びPCA3株においては、コリネバクテリウム  グルタミカム由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子を導入しているが、より有能な3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼが他の微生物に存在する可能性も考えられた。そこで、有能な異種3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子の探索を行った。
3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子探索用の宿主として、染色体上の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子(qsuB)、及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(aroE)が破壊され、また、シキミ酸経路遺伝子aroGS180F、aroB、及びaroDが導入された、3-デヒドロシキミ酸生産菌株である、DHS1株(表6)を用いた。本菌株に対し、種々の微生物由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子をマルチコピー型発現ベクター(pCRB209、pCRB207、またはpCRB210)を用いて導入した各形質転換株を構築し(表7)、それらについて試験管培養を行い、プロトカテク酸生産能を調べた。
各形質転換体のプロトカテク酸生産能は、以下のようにして測定した。まず、グルコース 4%、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン  各20 μg/ml、p-アミノ安息香酸  10μg/ml、シキミ酸  3.2 mM、及び、カナマイシン 50 μg/ml  （各終濃度）を含む10 mlの前記 A液体培地(試験管内)に植菌後、33℃で16-18時間、好気的に振盪培養を行った。【０１４２】
上記条件で増殖した菌体を、グルコース 4%、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン  各20 μg/ml、p-アミノ安息香酸  10μg/ml、シキミ酸  3.2 mM、及び、カナマイシン 50 μg/ml  （各終濃度）を含む10 mlの前記 A液体培地(試験管内)にOD610が0.2となるよう植菌し、33℃で24時間、好気的に振盪培養を行った。培養24時間後の培養液を遠心分離(4℃, 15,000×g、5分)して得られた上清液についてHPLC分析を行い、芳香族関連化合物の定量分析を行った。その結果を表10に示す。その結果、コリネバクテリウム  ハロトレランス由来の3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子を導入したPRO34株は、コリネバクテリウム  グルタミカムの同遺伝子を導入した株PRO17株よりも高濃度のプロトカテク酸を生産することが示された。【０１４３】
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でグルコース等からプロトカテク酸又はその塩を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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