(57)【要約】  本発明は、触媒性核酸を用いる標的核酸の検出方法において、触媒性核酸の反応効率の向上及び等温条件下での連続反応を達成可能とする核酸の検出方法に関する。触媒作用を有する活性部位を備える触媒性核酸の第一結合部位に、基質である第一核酸をハイブリダイズさせて第一核酸産物を得る反応工程と、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出する検出工程と、を含み、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行う、核酸の検出方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒作用を有する活性部位を備える触媒性核酸の第一結合部位に、基質である第一核酸をハイブリダイズさせて第一核酸産物を得る反応工程と、
前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出する検出工程と、を含み、
前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことを特徴とする、核酸の検出方法。
【請求項２】
前記反応工程が、前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程をさらに含む請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
前記触媒性核酸が、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備え、
前記反応工程において、前記第二核酸が前記第二結合部位にハイブリダイズして、前記触媒性核酸の触媒作用が生じ、
前記検出工程において、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出することで、前記第二核酸を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
カチオン性くし型共重合体が、カチオン性基を含む高分子鎖である主鎖と親水性基である側鎖とを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
前記カチオン性くし型共重合体の主鎖がポリリジンであることを特徴とする請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記カチオン性くし型共重合体の側鎖がデキストランであることを特徴とする請求項４又は５記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
前記カチオン性くし型共重合体の主鎖部分の分子量が５，０００以上であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
前記反応工程を２価の金属イオンの存在下で行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
前記２価の金属イオンがマグネシウムイオン又はマンガンイオンであることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせる工程と、
前記触媒性核酸と、前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物と、のハイブリダイズを解消させる工程と、
を温度差４０℃以内の条件下で行う請求項２〜９のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記反応工程を２０℃以上７０℃以下の温度範囲内で行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記第一核酸が標識物質により標識されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記第一核酸が互いに異なる第一標識物質及び第二標識物質により標識されており、前記第一標識物質及び前記第二標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする請求項１２に記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記第一標識物質と前記第二標識物質が、蛍光物質と消光物質の組み合わせであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
検出対象である前記第一核酸又は前記第二核酸が、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、及びそれらの複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１７】
検出対象である前記第一核酸又は前記第二核酸が、末梢血、血清、血漿、唾液、口腔スワブ、ＦＦＰＥ（パラフィン包埋）切片又は組織に由来するものであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法によって検出された前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方の量を測定することを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項１９】
触媒作用を有する活性部位を備える触媒性核酸の前記第一結合部位に、基質である第一核酸をハイブリダイズさせて第一核酸産物を得る反応工程と、
前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出する検出工程と、
前記検出工程により得られた測定結果に基づき、核酸の塩基配列を識別する識別工程と、を含み、
前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことを特徴とする、核酸の塩基配列識別方法。
【請求項２０】
前記触媒性核酸が、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備え、
前記反応工程において、前記第二核酸が前記第二結合部位にハイブリダイズして、前記触媒性核酸の触媒作用が生じ、
前記検出工程において、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出することで、前記第二核酸を検出することを特徴とする請求項１９に記載の核酸の塩基配列識別方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の核酸の塩基配列識別方法によって、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別することを特徴とする核酸の変異又は多型の識別方法。
【請求項２２】
前記第一核酸産物と未反応の前記第一核酸の量の比較により、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別することを特徴とする請求項２１に記載の核酸の変異又は多型の識別方法。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法に用いられるキットであって、前記カチオン性くし型重合体を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法に用いる反応チップであって、前記カチオン性くし型共重合体又は前記触媒性核酸の少なくとも一方を予め保持しており、前記カチオン性くし型共重合体及び前記触媒性核酸を収容するための反応ウェルを備えたことを特徴とする反応チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、触媒性核酸の触媒作用によって核酸を検出する方法、核酸を定量する方法、塩基配列を識別する方法、核酸の変異又は多型を識別する方法、核酸を検出するためのキット、及び反応チップに関する。
本願は、２０１５年５月２９日に、日本出願された特願２０１５−１１０８９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
この２０年間で、触媒活性を有する非常に様々な核酸分子が発見されてきた。一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖核酸は、触媒として機能しうる複雑な三次元構造を形成する。ＲＮＡ酵素(リボザイム、ＲＮＡｚｙｍｅ)は自然界に存在するが、標的ＲＮＡ基質を特異的に認識するように人工的に操作することもできる(非特許文献１)。さらに、ＤＮＡ酵素(デオキシリボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ)としばしば称されるデオキシリボ核酸等の多くの触媒性核酸の開発が促された(非特許文献２)。
ＤＮＡｚｙｍｅやＲＮＡｚｙｍｅの触媒反応の種類は、核酸の切断(非特許文献３〜６)、核酸のライゲーション(非特許文献７及び８)、エステル結合(非特許文献９)、ポルフィリンメタル化(非特許文献１０)、炭素−炭素結合(非特許文献１１)、アミド結合(非特許文献１２)の形成等、広範な反応を触媒する能力が報告されている。
近年、Ｅｌｉｓａ  Ｍｏｋａｎｙらは、触媒性核酸を用いる標的核酸の検出方法を開発した。彼らは、多成分核酸複合体、Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  (ＭＮＡｚｙｍｅ)の触媒活性の操作を可能にした（特許文献１)。【０００３】
一方、カチオン性高分子を用いた核酸の検出法が考案されている(特許文献２)。これは、試料核酸と基準核酸の間の配列が完全に同じ場合は、試料の１本鎖核酸と基準となる２本鎖核酸の間での鎖置換反応が速く、１塩基でも異なる場合は、完全に同じ場合に比べて著しく鎖置換反応が遅いことを利用した方法である。ここでのカチオン性高分子とは、ポリリジンやポリアルギニンなどのカチオン性高分子を主鎖としてデキストランやポリエチレングリコール等を側鎖としてグラフト重合したポリマーである。カチオン性高分子の例として、α―ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘが開示されている。本カチオン性高分子の存在下では核酸の鎖交換反応が促進することが報告されている。【０００４】
また、特許文献３の中で示されているように、カチオン性くし型共重合体は、２本鎖短鎖核酸に対して１本鎖核酸の鎖交換活性を促進するものとして使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５０５３９４号公報
【特許文献２】特許第４１７８１９４号公報
【特許文献３】特開２００８−２７８７７９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｓｅｌｏｆｆ  Ｊ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ  ＷＬ，  Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年８月、第３３４巻、第６１８３号、ｐ．５８５−５９１
【非特許文献２】Ｅｍｉｌｓｓｏｎ  ＧＭ, Ｂｒｅａｋｅｒ ＲＲ.  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００２年４月、第５９巻、第４号、ｐ．５９６−６０７
【非特許文献３】Ｃａｒｍｉ  Ｎ，  Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＡ，  Ｂｒｅａｋｅｒ  ＲＲ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６年１２月、第３巻、第１２号、ｐ．１０３９−１０４６
【非特許文献４】Ｒａｉｌｌａｒｄ  ＳＡ，  Ｊｏｙｃｅ  ＧＦ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年９月、第３５巻、第３６号、ｐ．１１６９３−１１７０１
【非特許文献５】Ｂｒｅａｋｅｒ  ＲＲ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７年６月、第１巻、第１号、ｐ．２６−３１
【非特許文献６】Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＷ，  Ｊｏｙｃｅ  ＧＦ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８年９月、第３７巻、第３８号、ｐ．１３３３０−１３３４２
【非特許文献７】Ｃｕｅｎｏｕｄ  Ｂ，  Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ．  Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年６月、第３７５巻、第６５３２号ｐ．６１１−６１４
【非特許文献８】Ｐｒｉｏｒ  ＴＫ，  Ｓｅｍｌｏｗ  ＤＲ，  Ｆｌｙｎｎ−Ｃｈａｒｌｅｂｏｉｓ  Ａ，  Ｒａｓｈｉｄ  Ｉ，  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＳＫ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年２月、第３２巻、第３号、ｐ．１０７５−１０８２
【非特許文献９】Ｉｌｌａｎｇａｓｅｋａｒｅ  Ｍ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｇ，  Ｎｉｃｋｌｅｓ  Ｔ，  Ｙａｒｕｓ  Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年２月、第２６７巻、第５１９８号ｐ．６４３−６４７
【非特許文献１０】Ｌｉ  Ｙ，  Ｓｅｎ  Ｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６年９月、第３巻、第９号、ｐ．７４３−７４７
【非特許文献１１】Ｔａｒａｓｏｗ  ＴＭ，  Ｔａｒａｓｏｗ  ＳＬ，  Ｅａｔｏｎ  ＢＥ．  Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年９月、第３８９巻、６６４６号ｐ．５４−５７
【非特許文献１２】Ｌｏｈｓｅ  ＰＡ，  Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ．  Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年５月、第３８１巻、６５８１号ｐ．４４２−４４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１をはじめとする触媒性核酸を用いる標的核酸の検出方法は、優れた方法ではあるが、反応を適切に進行させるため、ハイブリダイゼーションの際と塩基対結合を解離させる際とで、温度差をつける必要がある。そのことに伴い、厳密な温度管理を行う温度制御装置も必要となる。また、通常の触媒性核酸だけの反応では、基質となる核酸が多く必要であり、微量サンプルや、サンプルに含まれる微量の核酸を検出することは困難であるという問題がある。基質となる核酸の量を増やすため核酸増幅を行ってもよいが、核酸増幅のバイアスがかかるため、擬陽性にもつながりやすい。また、核酸増幅が必要なため伸張酵素などの高価な材料も必要になり、製品コストの上昇にもつながる。【０００８】
本発明は、このような状況下、触媒性核酸と標的核酸との反応おいて、触媒性核酸の反応効率の向上を可能とする核酸の検出方法、核酸の定量方法、核酸の塩基配列識別方法、核酸の変異又は多型の識別方法、核酸検出用キット、反応チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、触媒性核酸を用いる核酸の検出方法において、反応系中にカチオン性くし型重合体を添加することにより上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の核酸の検出方法、核酸の定量方法、核酸の塩基配列識別方法、核酸の変異又は多型の識別方法、核酸検出用キット、反応チップを提供するものである。
［１］  触媒作用を有する活性部位を備える触媒性核酸の第一結合部位に、基質である第一核酸をハイブリダイズさせて第一核酸産物を得る反応工程と、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出する検出工程と、を含み、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことを特徴とする、核酸の検出方法。
［２］  前記反応工程が、前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程をさらに含む［１］に記載の核酸の検出方法。
［３］  前記触媒性核酸が、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備え、前記反応工程において、前記第二核酸が前記第二結合部位にハイブリダイズして、前記触媒性核酸の触媒作用が生じ、前記検出工程において、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出することで、前記第二核酸を検出することを特徴とする［１］又は［２］に記載の核酸の検出方法。
［４］  カチオン性くし型共重合体が、カチオン性基を含む高分子鎖である主鎖と親水性基である側鎖とを有することを特徴とする［１］〜［３］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［５］  前記カチオン性くし型共重合体の主鎖がポリリジンであることを特徴とする［４］に記載の核酸の検出方法。
［６］  前記カチオン性くし型共重合体の側鎖がデキストランであることを特徴とする［４］又は［５］に記載の核酸の検出方法。
［７］  前記カチオン性くし型共重合体の主鎖部分の分子量が５，０００以上であることを特徴とする［４］〜［６］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［８］  前記反応工程を２価の金属イオンの存在下で行うことを特徴とする［１］〜［７］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［９］  前記２価の金属イオンがマグネシウムイオン又はマンガンイオンであることを特徴とする［８］に記載の核酸の検出方法。
［１０］  前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせる工程と、前記触媒性核酸と、前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物と、のハイブリダイズを解消させる工程と、を温度差４０℃以内の条件下で行う［２］〜［９］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［１１］  前記反応工程を２０℃以上７０℃以下の温度範囲内で行うことを特徴とする［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［１２］  前記第一核酸が標識物質により標識されていることを特徴とする［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［１３］  前記第一核酸が互いに異なる第一標識物質及び第二標識物質により標識されており、前記第一標識物質及び前記第二標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする［１２］に記載の核酸の検出方法。
［１４］  前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする［１３］に記載の核酸の検出方法。
［１５］  前記第一標識物質と前記第二標識物質が、蛍光物質と消光物質の組み合わせであることを特徴とする［１３］又は［１４］に記載の核酸の検出方法。
［１６］  検出対象である前記第一核酸又は前記第二核酸が、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、及びそれらの複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸であることを特徴とする［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［１７］  検出対象である前記第一核酸又は前記第二核酸が、末梢血、血清、血漿、唾液、口腔スワブ、ＦＦＰＥ（パラフィン包埋）切片又は組織に由来するものであることを特徴とする［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
［１８］  ［１］〜［１７］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法によって検出された前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方の量を測定することを特徴とする核酸の定量方法。
［１９］  触媒作用を有する活性部位を備える触媒性核酸の前記第一結合部位に、基質である第一核酸をハイブリダイズさせて第一核酸産物を得る反応工程と、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出する検出工程と、前記検出工程により得られた測定結果に基づき、核酸の塩基配列を識別する識別工程と、を含み、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことを特徴とする、核酸の塩基配列識別方法。
［２０］  前記触媒性核酸が、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備え、前記反応工程において、前記第二核酸が前記第二結合部位にハイブリダイズして、前記触媒性核酸の触媒作用が生じ、前記検出工程において、前記第一核酸産物又は未反応の前記第一核酸の少なくとも一方を検出することで、前記第二核酸を検出することを特徴とする［１９］に記載の核酸の塩基配列識別方法。
［２１］  ［１９］又は［２０］に記載の核酸の塩基配列識別方法によって、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別することを特徴とする核酸の変異又は多型の識別方法。
［２２］  前記第一核酸産物と未反応の前記第一核酸の量の比較により、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別することを特徴とする［２１］に記載の核酸の変異又は多型の識別方法。
［２３］  ［１］〜［１７］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法に用いられるキットであって、前記カチオン性くし型重合体を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
［２４］  ［１］〜［１７］のいずれか一項に記載の核酸の検出方法に用いる反応チップであって、前記カチオン性くし型共重合体又は前記触媒性核酸の少なくとも一方を予め保持しており、前記カチオン性くし型共重合体及び前記触媒性核酸を収容するための反応ウェルを備えたことを特徴とする反応チップ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸の検出方法により、触媒性核酸を用いる標的核酸の検出方法において、触媒性核酸の反応効率の向上が可能となり、従来法では検出できなかった微量の核酸であっても、短時間で且つ簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の核酸の検出方法において用いられる触媒性核酸と、基質核酸との反応の様子の一例を模式的に示した図である。
【図２】本発明の核酸の検出方法において用いられる触媒性核酸と、基質核酸との反応の様子の一例を模式的に示した図である。
【図３Ａ】本発明の核酸の検出方法と従来法とにおける、温度制御の様子を比較した図である。
【図３Ｂ】本発明の核酸の検出方法と従来法とにおける、温度制御の様子を比較した図である。
【図４】本発明に係る反応チップの一様態を示す平面図である。
【図５】実施例１〜２で使用したＤＮＡｚｙｍｅの配列と標的核酸の配列を示す図である。
【図６】実施例３〜４で使用したＭＮＡｚｙｍｅの配列、標的核酸の配列、及び基質核酸の配列を示す図である
【図７】実施例１−１における、反応開始から所定時間経過後の、各反応液の基質核酸及び基質核酸産物を示す電気泳動像である。
【図８】実施例１−２における、反応開始から所定時間経過後の、各反応液の基質核酸及び基質核酸産物を示す電気泳動像である。
【図９】実施例２における、反応溶液中のカチオン性くし型重合体の有無による適応温度範囲を比較したグラフである。
【図１０】実施例３における、カチオン性くし型重合体を添加の前後による、反応液の蛍光強度の変化の様子を示すグラフである。
【図１１】実施例４−１における、各標的核酸濃度におけるカチオン性くし型共重合体有無によるＭＮＡｚｙｍｅの基質の切断効率の差を示すグラフである。
【図１２】実施例４−２における、各標的核酸濃度におけるカチオン性くし型共重合体有無によるＭＮＡｚｙｍｅの基質の切断効率の差を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪核酸の検出方法≫
本発明の核酸の検出方法は、基質である第一核酸とハイブリダイズ可能な第一結合部位と、触媒作用を有する活性部位と、を備える触媒性核酸の、前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせ、前記活性部位の触媒作用により前記第一核酸を反応させ、第一核酸産物を得る反応工程と、前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸を検出する検出工程と、を含み、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことを特徴とする。
なお、「前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行う」ことの態様の一例として、「前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体を添加した溶液中で行う」こととしてもよい。
以下に説明する実施形態における核酸の検出方法は、触媒性核酸の基質となりうる第一核酸が、触媒性核酸の触媒作用により反応したか否かを検出することで、試料中に検出対象の核酸が含まれるか否かを検出することをいう。検出対象の核酸は、基質である第一核酸そのものであってもよいし、第一核酸が検出されたことを介して、別の検出対象である他の核酸を検出してもよい。他の核酸としては、後述する第二核酸が挙げられる。
【００１４】
（第一実施形態）
＜反応工程＞
本実施形態の核酸の検出方法は、基質である第一核酸とハイブリダイズ可能な第一結合部位と、触媒作用を有する活性部位と、を備えるＤＮＡザイムの、前記第一結合部位に、第一核酸をハイブリダイズさせ、活性部位の触媒作用により第一核酸を反応させ、第一核酸産物を得る反応工程含む。
図１は、第一実施形態における触媒性核酸と基質核酸との反応の一例を模式的に示した図である。ＤＮＡザイム（触媒性核酸）は、基質である第一核酸と相補的な配列からなる第一結合部位を備えている。第一結合部位は第一核酸とハイブリダイズ可能である。ＤＮＡザイムは触媒作用を有する活性部位を備え、活性部位は、第一核酸を切断可能な活性を有している。第一結合部位は、活性部位を挟んで、結合部位ａと結合部位ｂの２つの領域に分断されている。
【００１５】
基質や標的核酸の配列に合せて、ＤＮＡザイムは、固相合成法など公知の手法を用いて人工的に合成することができる。
基質結合部位は、反応速度を高くする為に、３’末端及び／又は５’末端から３塩基以上１５塩基以内に配置されることが好ましい。
また、標的結合部位は、様々な標的核酸に対応する為、３’末端及び／又は５’末端から４塩基以上２０塩基以内に配置されることが好ましい。
ＤＮＡザイムの長さは特に限定されず、所望する塩基長に調整できる。
【００１６】
反応工程では、触媒性核酸の前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせる工程（以下、結合工程ということがある。）、及び触媒性核酸と、前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物と、のハイブリダイズを解消させる工程（以下、解離工程ということがある）の両工程を含むことが好ましい。反応工程において、結合工程と解離工程は繰り返し行われてもよい。
本実施形態において、反応工程では、ＤＮＡザイムと第一核酸とをハイブリダイズさせる工程、及びＤＮＡザイムと第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程の両工程を含むことが好ましい。
第一結合部位、即ち、結合部位ａ及び結合部位ｂに第一核酸がハイブリダイズすることで、活性部位の触媒作用により、第一核酸が切断され、産物（第一核酸産物）が生じる。第一核酸産物が第一結合部位から解離すると、ＤＮＡザイムの第一結合部位は、新たな基質である未反応の第一核酸とハイブリダイズし得る。このようにして、ＤＮＡザイムは連続して反応を行うマルチターンオーバー酵素として機能する。
【００１７】
本実施形態の核酸の検出方法は、ＤＮＡザイムと第一核酸とをハイブリダイズさせる工程、及びＤＮＡザイムと第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程を、カチオン性くし型重合体の存在下で行う。
なお、「ＤＮＡザイムと第一核酸とをハイブリダイズさせる工程、及びＤＮＡザイムと第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程を、カチオン性くし型重合体の存在下で行う」ことの態様の一例として、「ＤＮＡザイムと第一核酸とをハイブリダイズさせる工程、及びＤＮＡザイムと第一核酸産物とのハイブリダイズを解消させる工程を、カチオン性くし型重合体を添加した溶液中で行う」こととしてもよい。
図３Ａ及び図３Ｂは、第一実施形態の核酸の検出方法と従来法とにおける、触媒性核酸と基質核酸の反応の一例を模式的に示した図である。図３Ａは従来法を示し、図３Ｂは第一実施形態の核酸の検出方法を示す。
図３Ａに示すように、従来の触媒性核酸と基質核酸の反応では、触媒性核酸と基質核酸とのハイブリダイゼーションは低温で行い、触媒性核酸と基質核酸との間の塩基対結合の解離は、それよりも高温で行い、このことにより、基質のターンオーバーを促進させる。
これに対して、図３Ｂに示される第一実施形態の核酸の検出方法では、反応系にカチオン性くし型重合体が添加されており、前記ハイブリダイズ及びハイブリダイズの解消をカチオン性くし型重合体の存在下で行うことにより、触媒性核酸と基質核酸とのハイブリダイゼーション及び触媒性核酸と基質核酸との間の塩基対結合の解離が促進される。したがって、基質のターンオーバーが促進されるので、反応速度が格段に高まり、短時間で効率よく反応を行うことができる。
【００１８】
＜検出工程＞
本実施形態の核酸の検出方法は、前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸を検出する検出工程を含む。
上記反応工程で説明したように、第一結合部位とハイブリダイズ可能な標的塩基配列を有する第一核酸が反応系に含まれていれば、触媒性核酸の触媒作用により第一核酸が切断され、第一核酸産物が生成される。一方、第一核酸が反応系に含まれていなければ、第一核酸産物は生成されない。このようにして、第一核酸産物の存在を示す値を検出することにより、反応系中に検出対象である第一核酸が存在するか否かを検出可能である。また、第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸の存在を示す値を検出することにより、反応系中に検出対象である第一核酸が存在するか否かを検出可能である。第一核酸産物の存在からは、第一核酸が触媒性核酸と反応可能な核酸であることも検出可能である。
【００１９】
検出工程は、反応工程の終了時において行ってもよく、反応工程の開始時及び終了時に行ってもよい。例えば、第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸について、反応工程前と後の測定値を比較することにより行ってもよい。また反応工程において経時的に（リアルタイムに）検出工程を行ってもよい。反応工程と検出工程をリアルタイムに行う場合には、公知のリアルタイム−ＰＣＲ装置などを使って、蛍光変化などを逐次測定してもよい。
【００２０】
触媒性核酸の触媒作用により第一核酸を反応させるとは、例えば、触媒性核酸の触媒作用により第一核酸を切断する、第一核酸と他の核酸とをライゲーションさせる、第一核酸と他の分子とをエステル結合させる、第一核酸と他の分子とを炭素−炭素結合させる、第一核酸と他の分子とをアミド結合させる等の反応が挙げられる。
【００２１】
検出工程では、第一核酸産物と未反応の第一核酸とは区別して検出されるか、第一核酸産物と未反応の第一核酸とのどちらか一方のみが検出又は優先的に検出されることが必要であり、その方法は特に制限されない。
例えば、触媒性核酸によって触媒される上記反応において、第一核酸産物と未反応の第一核酸とは、一例として、核酸の長さにより区別が可能である。核酸の長さの識別は電気泳動法等の公知の手法により行うことができる。
【００２２】
従来の核酸の検出方法の場合、一定温度での反応では、ターンオーバーの速度が遅い。
また、通常７０ｎＭ程度の標的核酸が必要であり、通常の試料量での７０ｎＭコピー数としては、例えば４×１０１０コピー程度となり、これに相当するコピー数を実用的に行うためには、標的核酸に対するＰＣＲや等温増幅法などによる核酸増幅が必須になる。この点が、触媒性核酸を実用的に使う上で、測定時間、あるいは、核酸増幅工程を経ることによるコストの増加などの原因となり、ボトルネックとなっている。また、核酸増幅工程や触媒性核酸と基質のターンオーバー工程では、厳密な温度制御を行うための装置も必要になる。
一方、第一実施形態の核酸の検出方法によれば、反応系（例えば反応液）の高温と低温の温度変化を繰り返さずとも、触媒性核酸と基質核酸とのハイブリダイゼーション及び触媒性核酸と基質核酸との間の塩基対結合の解離が繰り返し生じるため、等温条件で反応を行うことができる。更には、カチオン性くし型共重合体を添加することで触媒性核酸の触媒活性適応温度範囲を拡張することもできる。
触媒性核酸を利用した標的核酸の検出反応では、従来、温度制御が必要とされおり、このことが、触媒性核酸を利用した標的核酸の検出反応の実用化の障壁となっている。しかし、本法によれば、触媒性核酸を利用した標的核酸の検出反応から厳密な温度制御を不要とすることができ、これまでの実用化の障壁を取り払う革新的な方法を提供できる。
【００２３】
加えて、従来、核酸増幅工程を経なければ実用上検出が不可能であるような低濃度の標的核酸を含む試料に対しても、核酸増幅工程を経ることなく、試料の検出が可能である。
【００２４】
標的核酸増幅方法は、研究／臨床分野において広く用いられてきた。しかし、その能力にかかわらず、それぞれに固有の短所がある。それは、ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などのタンパク質酵素を必要とする点である。タンパク質酵素を含めることにより、プロトコールの複雑さ、阻害物質の影響、ｐＨの影響を考慮する必要がある。さらに、高価なタンパク質酵素による費用の増加や試薬物、キットの保存安定性、製品寿命も短縮せざるを得なくなる問題がある。
第一実施形態の核酸の検出方法によれば、触媒性核酸を使用する方法であるので、タンパク質酵素に関連するこれらの問題を回避できる。
【００２５】
関連するそのほかの技術的課題としては、他の増幅物の反応系への汚染による擬陽性検出や酵素の典型的エラーによる間違った塩基の挿入の増幅などから擬陽性へつながる可能性が高い。上記の標的核酸増幅反応は、指数関数的に劇的にテンプレートを増幅させるため、そのような問題が起こりやすい。さらに、アッセイの検出系によってはプライマーの二量体化を擬陽性としてしまう可能性もある。したがって、酵素を用いる標的核酸増幅反応は、様々なバイアス要因があり、目的の核酸の検出を困難にする場合がある。
一方、第一実施形態の核酸の検出方法では、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことにより、後述の実施例で述べるように、核酸の検出感度を従来法に比べ、約３５，０００倍向上させることができた。この検出感度の向上は驚異的であり、従来法では直接検出が不可能であった低濃度の核酸であっても、核酸増幅工程なしで直接、且つ精度よく検出できる。
【００２６】
このように本実施形態の核酸の検出方法は、核酸のハイブリダイズ特性による標的核酸の塩基配列の相違を検出可能な程度の精度を保持しつつ、従来法よりも反応性を劇的に向上させ、且つ、非常に短時間で、試料に含まれる核酸が標的塩基配列を有する核酸であるか否かを、核酸増幅過程を必要とせず検出可能である。これらの反応性の向上レベルは、従来の触媒性核酸を用いた核酸の検出方法の常識を覆す画期的なものである。
【００２７】
（第二実施形態）
＜反応工程＞
第二実施形態の核酸の検出方法は、基質である第一核酸とハイブリダイズ可能な第一結合部位と、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位触媒作用を有する活性部位と、を備えるＤＮＡザイムの、第二結合部位に、第二核酸をハイブリダイズさせて、ＤＮＡザイムの触媒作用が可能な状態とさせ、前記第一結合部位に、第一核酸をハイブリダイズさせ、活性部位の触媒作用により第一核酸を反応させ、第一核酸産物を得る反応工程を含む。なお後述の検出工程においては、第一核酸産物及び／又は未反応の第一核酸を検出することで、第二核酸を検出する。
第二実施形態の核酸の検出方法では、上記第一実施形態で説明した点について説明を省略する。
【００２８】
図２は、第二実施形態における触媒性核酸と基質核酸の反応の一例を模式的に示した図である。本実施形態の触媒性核酸であるＭＮＡｚｙｍｅ（多成分核酸酵素）は、２つのパートザイムＡ，パートザイムＢで構成されている。それぞれのパートザイムＡ，Ｂは、第一核酸とハイブリダイズしうる部位である第一結合部位の一部を備えており、第一結合部位は結合部位ａと結合部位ｂから構成される。また、それぞれのパートザイムＡ，パートザイムＢは、第二核酸とハイブリダイズし得る部位である第二結合部位の一部を備えており、第二結合部位は結合部位ｃと結合部位ｄから構成される。
第二実施形態では、変異等の有無を検出する対象の核酸は第二核酸（標的核酸）である。検出対象の第二核酸がハイブリダイズ可能なように、パートザイムＡ、Ｂの第二結合部位ｃ、ｄの核酸配列を決定することができる。
【００２９】
基質や標的核酸の配列に合せて、パートザイムは、固相合成法など公知の手法を用いて人工的に合成することができる。
基質結合部位は、反応速度を高くする為に、３’末端及び／又は５’末端から３塩基以上１５塩基以内に配置されることが好ましい。
また、標的結合部位は、様々な標的核酸に対応する為、３’末端及び／又は５’末端から４塩基以上２０塩基以内に配置されることが好ましい。
パートザイムの長さは特に限定されず、所望する塩基長に調整できる。
【００３０】
パートザイムＡの結合部位ｃ及びパートザイムＢの結合部位ｄに第二核酸がハイブリダイズし、パートザイムＡの結合部位ａ及びパートザイムＢの結合部位ｂに第一核酸がハイブリダイズすると、パートザイムＡ，Ｂが集合して、ＭＮＡ複合体が形成され、基質を切断する活性ＭＮＡｚｙｍｅの組織化を導く。なお、第二結合部位に第二核酸がハイブリダイズすることと第一結合部位に第一核酸がハイブリダイズすることは同時に行われてもよいし、第二結合部位に第二核酸がハイブリダイズした後に第一結合部位に第一核酸がハイブリダイズしてもよいし、又は第一結合部位に第一核酸がハイブリダイズした後に、第二結合部位に第二核酸がハイブリダイズしてもよい。
第一結合部位に第一核酸がハイブリダイズし、第二結合部位に第二核酸がハイブリダイズすると、活性部位の触媒作用により第一核酸が切断され、産物（第一核酸産物）が生じる。このように、第一核酸の切断は、第二結合部位に第二核酸がハイブリダイズすることにより可能となる。そのため、第一核酸（第一核酸産物）が検出されたことを介して、第二核酸の存在を検出できる。
【００３１】
反応工程では、触媒性核酸の前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせ、触媒性核酸の前記第二結合部位に、前記第二核酸をハイブリダイズさせる工程（以下、結合工程ということがある。）、及び前記触媒性核酸の前記第一結合部位にハイブリダイズした前記第一核酸産物と、触媒性核酸と、のハイブリダイズを解消させ、前記触媒性核酸の前記第二結合部位にハイブリダイズした前記第二核酸と、触媒性核酸と、のハイブリダイズを解消させる工程（以下、解離工程ということがある）の両工程を含むことが好ましい。反応工程において、結合工程と解離工程は繰り返し行われてもよい。
本実施形態において、反応工程では、ＭＮＡｚｙｍｅと、第一核酸と、第二核酸とをハイブリダイズさせる工程（以下、結合工程ということがある。）、及びＭＮＡｚｙｍｅと、第一核酸産物と、第二核酸とのハイブリダイズを解消させる工程（以下、解離工程ということがある。）の両工程を含むことが好ましい。
第一核酸産物が第一結合部位から解離すると、ＭＮＡｚｙｍｅの第一結合部位は、核酸と再びハイブリダイズ可能な状態となり、新たな基質である未反応の第一核酸とハイブリダイズし得る。また、第二核酸産物が第二結合部位から解離すると、ＭＮＡｚｙｍｅの第一結合部位は、核酸と再びハイブリダイズ可能な状態となり、新たな第二核酸とハイブリダイズし得る。このようにして、別の基質がＭＮＡｚｙｍｅと反応することを繰り返す(ターンオーバー)。
【００３２】
＜検出工程＞
第二実施形態の核酸の検出方法では、第一核酸は標識物質により標識されている。例えば、第一核酸がもとのままか、または切断されているかを調べるためには、二つの標識がごく近傍にあるかあるいは離れた位置にあるかを検出できる標識を使用すればよい。そのような場合の検出にもっともよく利用されるのが蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)であり、前記第一核酸が互いに異なる第一標識物質及び第二標識物質により標識されており、前記第一標識物質及び前記第二標識物質との間で、エネルギー移動が可能であるものである。標識物質間のエネルギー移動とは、エネルギーを発生するドナー標識物質とこのドナー標識物質から発生したエネルギーを吸収するアクセプター標識物質との少なくとも２種の標識物質が、互いに近接した状態にある場合に、ドナー標識物質からアクセプター標識物質へのエネルギーの移動をいう。例えば、２種の標識物質が蛍光物質である場合、ドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収し、このアクセプター標識物質が発する蛍光を測定するか、又はドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収することにより起こるドナー標識物質の消光を測定することができる（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４，３５７−３６２（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，４９−５３（１９９８））。
なお、ドナー標識物質の蛍光波長とアクセプター標識物質の吸収波長に重なりがなくてもエネルギー移動が起こる場合があるが、このようなエネルギー移動も本発明に含まれるものである。例えば、第一核酸のうち、第一核酸の切断対象部位から見て３’端部を蛍光物質で標識し、５’端部を別の蛍光物質で標識しておく。第一核酸が未切断の場合、二つの蛍光物質は蛍光共鳴エネルギー移動可能であるが、第一核酸が切断された場合は二つの蛍光物質は蛍光共鳴エネルギー移動不可能となる。従って、蛍光共鳴エネルギー移動の測定を行うことによって切断によるシグナル、すなわち切断されたか否かを知ることができる。具体的には、本発明において、５’端部及び３’端部とは、核酸鎖の５’末端及び３’末端からそれぞれ３０塩基以内の範囲を示すが、両方の標識物質が近ければ近いほどエネルギー移動を起こし易いため、好ましくは第一核酸の切断対象部位から１０塩基以内である。
【００３３】
この場合の蛍光物質としては各種蛍光物質の組み合わせが可能であり、例としてフルオロセインとテトラメチルローダミンなどがあげられる。また、一方を蛍光物質、他方を消光物質で標識することによっても鎖の切断を検出することができる。この場合は、蛍光物質が近傍にあるときは発光せず、蛍光物質と消光物質が離れると（鎖が切断された場合）発光する。蛍光物質と消光物質の組み合わせは種々可能であり、たとえば蛍光物質としてフルオロセインやテトラメチルローダミン、消光物質としてはダブシルやブラックホールクエンチャーなどの組み合わせが可能である。
【００３４】
互いにエネルギー移動可能な２種類の標識物質としては、互いに近接した状態でエネルギー移動可能なものであれば特に制限されないが、中でも蛍光物質、遅延蛍光物質が好ましく、場合によっては化学発光物質、生物発光物質等を用いることもできる。このような標識物質の組み合せとしては、フルオレセイン及びその誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアネート等）とローダミン及びその誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネート、テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６−）ヘキサノイックアシッド等）との組み合わせ、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬとの組み合わせ等が挙げられ、これらの中から任意の組み合わせを選択することができる（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。
その他、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であってもよい。このような標識物質の組み合わせとしては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ  ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１とＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２との組み合わせ等が挙げられる。
なお、グアニンは、ＦＡＭが近接した場合にクエンチする能力があるため(Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２、ｖｏｌ．３０．ｎｏ．９  ２０８９−２１９５)、これを利用してもよい。例えば、標準２本鎖核酸の一方の鎖の３’端部をＦＡＭで標識した場合であって、他方の鎖の５’末端の塩基がグアニンである場合には、前記他方の鎖を標識物質で標識せずともよい。
【００３５】
第二実施形態の核酸の検出方法によれば、上記第一実施形態の核酸の検出方法による作用効果に加え、触媒性核酸と基質の複合体を安定化させる作用効果を奏する。
第二実施形態の核酸の検出方法のように、ＭＮＡＺｙｍｅ等の複合体を形成して活性型となる触媒性核酸の場合には、複合体が安定化しないことで反応性が低下してしまう傾向があり、実用化に向けた課題となっていた。しかし、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うことによれば、触媒性核酸と基質の複合体を安定して形成させ、その後の基質切断のターンオーバーを劇的に向上させることができる。
【００３６】
（触媒性核酸）
上記第一実施形態の核酸の検出方法に用いられる触媒性核酸としては、第一結合部位及び活性部位を有するものであれば特に制限されない。上記第二実施形態の核酸の検出方法に用いられる触媒性核酸としては、第一結合部位、第二結合部位及び活性部位を有するものであれば特に制限されない。例えば、上記の図１及び図２に示す触媒性核酸の他にも、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、「１０：２３」ＤＮＡｚｙｍｅ、「８：１７」ＤＮＡｚｙｍｅ、「７Ｚ８１」リガーゼ及び「７Ｚ４８」リガーゼを挙げることができる。
「１０：２３」及び「８：１７」ＤＮＡｚｙｍｅは、特定のＲＮＡホスホジエステル結合の箇所で核酸基質を切断して、２’,３’−環状リン酸基及び５’−ヒドロキシル基を有する反応産物を作り出す(非特許文献５、非特許文献１参照)。２’,３’−環状リン酸産物及び５’−ヒドロキシル産物を連結しうるデオキシリボザイムの例には、「７Ｚ８１」、「７Ｚ４８」リガーゼが含まれる (非特許文献７参照)。
【００３７】
ハンマーヘッド型リボザイム、１０：２３、８：１７ＤＮＡｚｙｍｅ、「７Ｚ８１」及び「７Ｚ４８」リガーゼを含むいくつかの触媒性核酸は、複数のドメインを有する類似の基本構造を有する。これらの核酸酵素は、基質を特異的に認識してそれとハイブリダイズする二つの非保存的な基質結合ドメイン(アーム)に挟まれた触媒ドメイン(触媒コア)を有する。これらの酵素はマルチターンオーバー酵素として機能しうる。
【００３８】
（カチオン性くし型重合体）
本発明において用いられるカチオン性くし型重合体は、主鎖に対してくし型状に側鎖が導入されており、かつカチオン性基を含む重合体であれば、特に限定されるものではない。本発明において用いられるカチオン性くし型重合体は、カチオン性基を含む高分子鎖（ポリカチオン）を主鎖とする重合体に、側鎖としてくし型状に親水性基を導入した重合体であることが好ましく、主鎖であるポリカチオンに、親水性基を含む高分子をくし型状に導入した共重合体（以下、カチオン性くし型共重合体」）であることがより好ましい。
【００３９】
カチオン性くし型共重合体の主鎖であるポリカチオンとしては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等のアミノ酸、グルコサミン等の糖、アリルアミン、エチレンイミン等のカチオン性単量体のうち、１種類又は複数種類を重合して得られた重合体や、これらの誘導体が挙げられる。本発明においては、ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体、又はこれらの誘導体を主鎖とするカチオン性くし型共重合体を用いることが好ましい。
【００４０】
カチオン性単量体の重合体の誘導体としては、例えば、重合体を構成する単量体の一部又は全部に官能基を付加したもの等が挙げられる。このような官能基としては、重合体が有するカチオン性を損なわない限り特に限定されるものではないが、例えば、グアニジル基等が挙げられる。
【００４１】
カチオン性くし型共重合体の側鎖である親水性基を含む高分子としては、デキストラン、アミロース、セルロース等の多糖類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル、及びこれらの誘導体等が挙げられる。本発明においては、デキストラン、ポリエチレングリコール、又はこれらの誘導体を側鎖とするカチオン性くし型共重合体を用いることが好ましい。
【００４２】
側鎖として用いる親水性基を含む高分子の誘導体としては、親水性を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、カルボキシメチル誘導体、アミノ酸誘導体、アルデヒド誘導体等が挙げられる。
【００４３】
本発明において用いられるカチオン性くし型重合体としては、主鎖がポリリジン若しくはポリアルギニン又はこれらの誘導体であり、側鎖がデキストランであるカチオン性くし型共重合体であることが好ましく、主鎖がポリリジン若しくはポリアルギニン又はこれらのグアニジン誘導体（グアニジル基を含む誘導体）であり、側鎖がデキストランであるカチオン性くし型共重合体であることがより好ましく、ポリリジン又はグアニジド化ポリリジンにデキストランをグラフト重合して得られるカチオン性くし型共重合体であることがさらに好ましい。
【００４４】
本発明において用いられるカチオン性くし型重合体の大きさは、ハイブリダイゼーションに用いる試料２本鎖核酸や標準２本鎖核酸の鎖長に応じて適切なものを選択すればよい。本発明においては、例えば、ポリリジン又はグアニジド化ポリリジンにデキストランをグラフト重合して得られるカチオン性くし型共重合体を用いる場合には、主鎖部分の分子量が２，０００以上２０，０００以下、好ましくは５，０００以上１５，０００以下であることが好ましい。なお、主鎖のポリカチオンの重合度を調整することにより、所望の大きさの主鎖部分を有するカチオン性くし型重合体を得ることができる。
【００４５】
（反応工程の反応条件）
カチオン性くし型重合体は、反応工程開始後に反応系（例えば反応液）に添加してもよいが、反応工程開始前に反応系に添加しておくことが好ましい。反応系に添加するカチオン性くし型重合体の量は、反応系中において、カチオン性くし型重合体と核酸の荷電比（［カチオン性くし型重合体の電荷］／［核酸の電荷］）に基づいて決定することができ、荷電比が０．０１以上１０，０００以下の範囲内で適切な値を選択し、０．１以上１００以下の範囲内であることが好ましく、０．１以上１０以下の範囲内であることがより好ましく、１以上１０以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、「核酸の電荷」は、反応系中に存在する全核酸の電荷の総和である。
反応系に添加するカチオン性くし型重合体の量は、核酸の電荷の算出に代えて、反応系中における核酸のリン酸基の数に基づいて決定することもできる。同様に、反応系に添加するカチオン性くし型重合体の量は、カチオン性くし型重合体の電荷の算出に代えて、カチオン性重合体のカチオン性基の数に基づいて決定することもできる。例えば、カチオン性くし型重合体がアミノ基を有する場合、反応系に添加するカチオン性くし型重合体の量は、［カチオン性くし型重合体のアミノ基］／［核酸のリン酸基］）に基づいて決定することができ、前記基のモル比で［カチオン性くし型重合体のアミノ基］／［核酸のリン酸基］＝０．１以上１００以下の範囲内であることが好ましく、０．１以上１０以下の範囲内であることがより好ましく、１以上１０以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、「核酸のリン酸基」は、反応系中に存在する全核酸のリン酸基の総和である。
【００４６】
また、反応系には、その他、反応系のｐＨを調整する緩衝剤や、２本鎖形成に必要な１価あるいは２価の陽イオン、２本鎖核酸の安定性に影響を与える有機溶媒等を添加することができる。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸等が挙げられる。陽イオンとしては、例えば、ナトリウムイオンやマグネシウムイオン等が挙げられる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）等が挙げられる。
多くの核酸酵素の触媒的切断の速度は、例えば、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋等の二価金属イオンの存在及び濃度に依存することが分っている。一般的に、触媒性核酸の活性を得るためには、二価の金属イオンが必要であるが、カチオン性くし型共重合体とＤＮＡの相互作用は、触媒活性には何ら影響を与えないこと、すなわち、ＤＮＡと二価の金属イオンの相互作用を阻害しないことが、本発明において明らかとなった。
【００４７】
反応工程では、触媒性核酸と、触媒性核酸にハイブリダイズする核酸とをハイブリダイズさせる工程（結合工程）、及び前記触媒性核酸と前記核酸とのハイブリダイズを解消させる工程（解離工程）の両工程を含むことが好ましい。この、結合工程及び解離工程の両工程は等温で行うことが好ましい。
触媒性核酸にハイブリダイズする核酸とは、上記実施形態で説明した第１核酸、第２核酸に代表される。
【００４８】
等温を意味する温度範囲は、結合工程の実施温度と解離工程の実施温度との差により規定される。結合工程の実施温度とは、触媒性核酸とハイブリダイズする核酸とをハイブリダイズさせる温度である。解離工程の実施温度とは、前記触媒性核酸と前記核酸とのハイブリダイズを解消させる温度である。
触媒性核酸に結合し得る核酸とは、上記で説明した第１核酸、第２核酸に代表される。
前記結合工程と前記解離工程とを、４０℃以内の温度差の条件下で行うことが好ましく、３０℃以内の温度差の条件下で行うことがより好ましく、２０℃以内で行うことがより好ましく、１０℃以内で行うことがさらに好ましく、５℃以内で行うことが特に好ましい。後述する各実施例において示すように、温度差およそ２℃以内のほぼ一定の温度条件で、触媒性核酸と核酸とのハイブリダイズ及びそれら塩基対の解消を行った場合でも、高効率に核酸を検出可能であることが示された。
なお、ここでいう結合工程の実施温度及び解離工程の実施温度には、結合工程又は解離工程の開始にあたって目的とする反応温度へと加熱冷却する途中の段階に係る温度、結合工程又は解離工程の終了にあたって目的とする反応温度以外の温度へと加熱冷却に係る温度、反応工程の中断等に係るその他加熱冷却温度は含まれない。例えば、後述の実施例３では、結合工程及び解離工程の実施温度は、ともに５０℃である。
【００４９】
等温反応を行う温度範囲は、反応工程の開始から終了にかけての温度変化を、触媒性核酸に結合し得る核酸のＴｍ値を基準として前後２０℃以内の範囲とすることが好ましく、Ｔｍ値の前後１５℃以内の範囲とすることが好ましく、Ｔｍ値の前後１０℃以内の範囲とすることがより好ましく、Ｔｍ値の前後５℃以内の範囲とすることがさらに好ましく、Ｔｍ値の前後２℃以内の範囲とすることがさらに好ましい。
触媒性核酸に結合し得る核酸とは、上記で説明した第１核酸、第２核酸に代表される。
反応工程に係る、触媒性核酸に結合する核酸が複数ある場合には、それらの核酸のＴｍ値の平均値を基準とする。反応工程に係る触媒性核酸に結合する核酸とは、先に説明したＭＮＡｚｙｍｅの例の第１核酸及び第２核酸が挙げられる。
Ｔｍ値の算出法にはいくつかの手法があるが、本発明及び本明細書においては、最近接塩基対法(Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ)法を採用することとする。
なお、ここでいう反応工程には、反応工程の開始にあたって目的とする反応温度へと加熱冷却すること、及び反応工程の終了にあたって目的とする反応温度以外の温度へと加熱冷却すること、反応工程の中断等に係るその他加熱冷却は含まれない。例えば、後述の実施例３では、反応工程の開始から終了にかけての実施温度は５０℃である。
【００５０】
等温反応を行う温度範囲は、反応工程の開始から終了にかけての温度変化を、反応工程の反応をカチオン性くし型重合体の非存在下で行った場合の、反応速度が最も高くなる最適温度を基準として定めてもよい。この場合、等温を意味する温度範囲は、最適温度を基準として前後２０℃以内の範囲とすることが好ましく、最適温度の前後１５℃以内の範囲とすることが好ましく、最適温度の前後１０℃以内の範囲とすることがより好ましく、最適温度の前後５℃以内の範囲とすることがさらに好ましい。
触媒性核酸に結合し得る核酸とは、上記で説明した第１核酸、第２核酸に代表される。
最適温度の求め方は、カチオン性くし型重合体の非存在下で、反応工程を行い、第一核酸産物の生産速度が最も高まる温度を求めることとすればよい。例えば、後述の実施例２で得られた結果からは、最適温度は、４５℃より高く５５℃より低い値に推定されることが分かる。最適温度を求めるにあたっては、最適温度の推定値は５℃以内に特定された値を採用することが好ましい。
【００５１】
また、等温反応を行う温度範囲は、反応工程の開始から終了にかけての温度変化を、触媒性核酸とハイブリダイズする塩基の配列や長さ、使用する触媒性核酸が実質的に機能しうる温度範囲を考慮して、適宜定めてもよい。通常、１５から３５塩基程度の基質核酸又は標的核酸であれば、反応工程の開始から終了にかけての温度変化を、２０℃以上７０℃以下の温度範囲内で行うことが挙げられる。温度範囲を２０℃以上とすると、触媒性核酸と核酸とのハイブリダイズが解消されやすくなることから、ターンオーバーが促進される点で好ましい。温度範囲を７０℃以下とすると、触媒性核酸と核酸とがハイブリダイズしやすくなることから、ターンオーバーが促進される点で好ましい。２０℃以上７０℃以下の温度範囲内であれば、実用レベルとして良好な反応速度が達成される。また、後述する実施例２に示されるように、５０℃付近において、触媒性核酸と核酸とのハイブリダイズと解離のバランスが最も良好となることから、反応工程は３０℃以上６０℃以下の温度範囲内で行うことが好ましく、４０℃以上６０℃以下の温度範囲内で行うことがより好ましく、４０℃以上５５℃以下の範囲で行うことがさらに好ましい。
【００５２】
反応工程において、触媒性核酸とハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ、及びそれら塩基対の解消のために、温度制御は行われないことが好ましい。温度制御を行う例としては、市販のＰＣＲ装置等による温度制御が挙げられる。温度制御を行わない例としては、室温に放置すること、前記等温に保たれたインキュベーター内に反応液を静置すること、等が挙げられる。
本発明の核酸の検出方法では、反応系にカチオン性くし型共重合体を加えることで、より活性な温度範囲が広くなるので、むしろ厳密に反応温度を制御する必要はなくなるという利点がある。
【００５３】
（核酸）
検出対象となる第一核酸又は第二核酸は、天然のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。第一核酸は、反応工程において用いられる触媒性核酸の基質となり得るものであれば特に制限されない。第一核酸又は第二核酸としては、例えば、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、若しくはそれらの誘導体、アンプリコン又は複合体を例示できる。
【００５４】
検出対象となる第一核酸又は第二核酸の由来は特に制限されるものではないが、末梢血、血清、血漿、唾液、口腔スワブ、ＦＦＰＥ（パラフィン包埋）切片又は組織に由来するものであることが好ましい。
【００５５】
本発明の核酸の検出方法において、標的となる核酸として、がん関連遺伝子、遺伝子病に関連する遺伝子、薬剤の代謝や効き目に関する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子に由来する核酸を挙げることができる。
がん関連遺伝子としては、例えばｋ−ｒａｓ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、又はＡＰＣ遺伝子、ＡＢＬ、ＡＬＫ等が挙げられる。遺伝病に関連する遺伝子としては、各種先天性代謝異常症等との関連が報告されている遺伝子等が挙げられる。
【００５６】
近年、上記のがん遺伝子などが、末梢血中に循環していることが分り、それらを検出することにより、薬剤の耐性やがんの再燃、再発などを予測することができ、治療の切替などを行うための指標となることが分っている。そこで、循環しているＤＮＡはセルフリーであり、おおよそ、１００ｂｐ以下に断片化されていることが報告されており、それらのＤＮＡを検出することにも本法は、適応可能である。
さらに、がん患者の末梢血中には、腫瘍由来の循環ＤＮＡ以外にも、腫瘍細胞やエキソソームが含まれる。エキソソーム中にはマイクロＲＮＡが豊富に含まれており、それらを検出することで、がんの早期発見にも繋がることが報告されている。発明の核酸検出方法によれば、そのようなマイクロＲＮＡに対し、核酸増幅工程を含まない直接検出を行うことも可能である。
【００５７】
薬剤の代謝に関しては薬剤の代謝に関わる酵素であるシトクロムＰ４５０やトランスポーターなどの遺伝子があげられる。ウィルス遺伝子、細菌遺伝子としては、例えばＣ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス等の遺伝子が挙げられる。さらに、病気の原因とは直接は関係のないヒト白血球抗原遺伝子であるＨＬＡなども移植の適合性や薬の副作用などと関連して重要である。さらに、ミトコンドリアにコードされている遺伝子変異も病気との関連が示唆されており、これらの遺伝子の変異も標的となりうる。
【００５８】
本発明における試料は、必要により、核酸増幅反応を利用して調整されたものであっても構わない。目安として、試料中に含まれる検出対象の核酸が１０６コピー未満だった場合は、核酸増幅工程を行うことが挙げられる。核酸増幅法としてはＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、３ＳＲ法（Ｓｅｌｆ-ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの公知の核酸増幅反応の中から適宜選択して用いることができる。これら増幅法のなかでも、ＰＣＲ法は目的の核酸断片を２本鎖増幅物としてえることができ、本発明に利用可能である。また、基質核酸も遺伝子増幅反応を利用して調製することができるが、標識物質の導入位置などの自由度を考慮すると化学合成が最適である。また、標的核酸が１０６コピー以上あれば、核酸増幅工程なしでも検出可能である。さらに、標的核酸がＤＮＡだけでなくＲＮＡなどの検出にも展開が可能である。例えば、ｍｉＲＮＡなどの直接検出も可能である。
さらに、「一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバ」特許第３７２７０２６号(平成１７年１０月７日)／特願２００３-１０６０９８（平成１５年４月１０日）や、「ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置」特願２０１１-５０６２９（２０１１年３月８日）などの技術と本発明を組み合わせれば、触媒性核酸を利用した標的核酸一分子からの検出なども可能であると考えられ、微細空間で反応を行うために、核酸増幅工程なしで、標的核酸を検出する時間なども大幅に短縮することができると推測される。
【００５９】
≪核酸の定量方法≫
本発明の核酸の定量方法は、検出された前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸の量を測定することにより、検出対象の核酸の量を定量するものである。
検出対象の核酸は、基質である第一核酸そのものであってもよいし、第一核酸が検出されたことを介して、別の検出対象である他の核酸であってもよい。他の核酸としては、上記で説明した第二核酸が挙げられる。核酸の量の測定は、核酸の量が判明している既知のサンプルに対して本発明にかかる反応工程で得られた結果と比較して求めればよく、予め作成された検量線に基づいて算出する等、従来公知の方法を用いることができる。
【００６０】
≪核酸の塩基配列識別方法≫
本発明の核酸の塩基配列識別方法は、基質である第一核酸とハイブリダイズ可能な第一結合部位と、触媒作用を有する活性部位と、を備える触媒性核酸の前記第一結合部位に、前記第一核酸をハイブリダイズさせ、前記活性部位の触媒作用により前記第一核酸を反応させ、第一核酸産物を得る反応工程と、前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸を検出する検出工程と、前記検出工程により得られた測定結果に基づき、核酸の塩基配列を識別する識別工程と、を含み、前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行うものである。
なお、「前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体の存在下で行う」ことの態様の一例として、「前記ハイブリダイズを、カチオン性くし型重合体を添加した溶液中で行う」こととしてもよい。
【００６１】
本発明の核酸の塩基配列識別方法は、前記触媒性核酸が、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備え、前記第二結合部位に、前記第二核酸をハイブリダイズさせて、前記反応工程における前記触媒性核酸の触媒作用が可能な状態とさせ、前記検出工程において、前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸を検出することで、前記第二核酸を検出するものであってもよい。
【００６２】
本発明及び本願明細書における核酸の塩基配列識別方法は、触媒性核酸の基質となりうる第一核酸が、触媒性核酸と反応したか否かを検出することで、試料中に含まれている核酸が、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む核酸であるか否かを識別することをいう。
反応系中に似かよった塩基配列を有する核酸鎖が存在する場合、触媒性核酸の第一結合部位と完全に相補的な塩基配列を有する核酸鎖が優先的に第一結合部位へと結合する。同様に、触媒性核酸が第二結合部位を有する場合、第二結合部位と完全に相補的な塩基配列を有する核酸鎖が優先的に第二結合部位へ結合する。この結合の差により、前記第一核酸産物及び／又は未反応の前記第一核酸の生成量に差が生じ、検出工程により得られた測定結果に基づき核酸の塩基配列を識別することができる。
このように、核酸の塩基配列識別方法は、触媒性核酸の第一結合部位の配列を既知とすることで、試料中に含まれている核酸が、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む核酸であるか否かを識別可能である。
反応工程及び検出工程については、先に記載の前記核酸の検出方法において説明したものと共通するため、説明を省略する。
【００６３】
本発明の識別方法は、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別することに好適に用いることができる。具体的には、遺伝子変異の変異部位を含む領域の塩基配列を標的塩基配列とする。なお、本発明において遺伝子変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味し、変異部位とは、塩基配列中の相違する部位を意味する。具体的には、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されていることにより、塩基配列の相違は生じる。このような遺伝子変異として、例えば、ＳＮＰやＣＮＶ多型等が挙げられる。また、本発明において遺伝子変異とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のような先天的な変異に加えて、同一個体中の細胞間において存在する遺伝子の塩基配列の相違である体細胞変異等のように後天的な変異も含む。
【００６４】
本発明の識別方法において、標的となる遺伝子変異又は多型としては特に制限されず、上記≪核酸の検出方法≫において例示した遺伝子が有する、変異又は多型を同様に挙げることができる。
【００６５】
本発明の核酸の塩基配列識別方法は、前記第一核酸産物と未反応の前記第一核酸の量の比較により、検出対象の核酸の塩基配列の変異又は多型を識別してもよい。比較対象となる第一核酸産物と未反応の第一核酸とは、例えば、反応工程を経た同一反応系内に存在する第一核酸産物及び未反応の第一核酸であってもよく、同一の反応工程を経た異なる反応系内に存在する第一核酸産物及び未反応の第一核酸であってもよい。同一の反応系内に存在する第一核酸産物及び未反応の第一核酸の量の比較をする場合としては、遺伝子多型のヘテロ型とホモ型を識別する場合を例示できる。
【００６６】
≪核酸検出用キット≫
本発明の核酸検出用キットは、本発明の核酸の検出方法に用いられるキットであって、カチオン性くし型重合体を含むことを特徴とする。その他、核酸検出用キットには、触媒性核酸の基質となりうる第一核酸の配列とハイブリダイズ可能な第一結合部位を備えた触媒性核酸、前記第一結合部位に加えて、第二核酸とハイブリダイズ可能な第二結合部位をさらに備えた触媒性核酸、緩衝剤、陽イオン、有機溶媒等の触媒性核酸の反応系に添加する試薬や、標識物質の標識を検出するための試薬等を組み合わせても良い。このように、本発明の識別方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便かつ短時間で標的塩基配列の識別を行うことができる。
【００６７】
本発明の核酸検出用キットは、特に、識別したい標的塩基配列と相同的な塩基配列を備える触媒性核酸を含むことで、標的塩基配列識別用キットとして用いられる。
【００６８】
本発明の核酸検出用キットは、特に、遺伝子変異の特定の遺伝子型の変異部位を含む領域と相同的な塩基配列を備える触媒性核酸を含むことで、遺伝子変異又は多型を検出する標的塩基配列識別用キットとして用いられる。
【００６９】
≪反応チップ≫
本発明の反応チップは、本発明の核酸の検出方法に用いる反応チップであって、カチオン性くし型共重合体及び／又は触媒性核酸を予め保持しており、カチオン性くし型共重合体及び触媒性核酸を収容するための反応ウェルを備える。前記反応ウェルは、カチオン性くし型共重合体、触媒性核酸、基質核酸を含む反応溶液を反応させ、本発明の核酸の検出方法における前記反応工程を行うための反応室として用いることができる。反応チップにおいて、本発明の核酸の検出方法における前記検出工程を行ってもよい。
例えばＤＮＡ反応、タンパク質反応等の生化学反応の分野において、微量の試料溶液を処理する反応装置として、μ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が知られている。これは、１個のチップやカートリッジに複数のウェルや流路を供えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数の反応を行うことができる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来、様々なメリットがあるとされてきた。
本発明の反応チップでは、前記反応ウェルに、カチオン性くし型共重合体及び触媒性核酸が予め保持されていてもよいし、カチオン性くし型共重合体及び触媒性核酸のどちらか一方または両方が、前記ウェルとは別の部分であり、本発明の反応チップの内部にある部分に保持されていてもよい。この場合、反応工程を行うにあたって、保持部からカチオン性くし型共重合体及び触媒性核酸のどちらか一方または両方を、前記反応ウェルへと配液する。したがって、本発明の反応チップは、前記反応ウェルに送液する流路をそなえたものであることが好ましく、カチオン性くし型共重合体又は触媒性核酸を保持するための保持部をさらに備えたものであってもよい。保持部は複数設けられていても良く、カチオン性くし型共重合体、触媒性核酸のほか、その他の反応工程に必須な試薬類を保持していてもよい。試薬類は、それぞれが一種類ずつ別々の保持部に保持されていてもよく、複数種類が同一の保持部に保持されていてもよい。本発明の核酸の検出方法は、例えば、室温の等温条件で前記反応工程を行うことができるので、反応工程に必須な試薬類及びサンプル類を前記反応ウェルへと配液する工程を行うことのみで、反応工程を開始及び継続をさせることも可能である。
【００７０】
図４に本発明の第一の形態に係る反応チップの一様態の平面図を示す。
反応チップ１００は、基材１０１上に複数の反応ウェル１０２と、反応ウェル１０２に溶液、例えば液体試料（溶液）を送液するための流路を有している。流路は、各反応ウェルに送液するために、少なくとも各反応ウェルと連絡する一つの主流路１０３を有し、さらに主流路と反応ウェルをつなぐ側路１０５を有する。反応チップ１００は、溶液を注入するための注入口を有する。図４の様態では、主流路１０３の端部に注入口（ＩＮＬＥＴ）１０７ａ、及びもう一方の端部に空気の脱出口を兼ねた余剰溶液の出口（ＯＵＴＬＥＴ）１０７ｂを有している。さらに、本実施形態の試料分析チップでは、各反応ウェル１０２と主流路１０３を連絡する側路１０５において、側路ごとに保持部１０４が設けられている。保持部１０４は、側路から分岐した分岐流路１０４ａと、液分岐流路に連結したチャンバ１０４ｂにより構成することができる。
本実施形態の反応チップでは、反応ウェル１０２にカチオン性くし型共重合体、基質核酸（第一核酸）、及び反応バッファーが予め保持されており、保持部１０４に触媒性核酸を含む溶液が保持されている。注入口（ＩＮＬＥＴ）に、検出対象の核酸を含む試料液を注入した後、前記反応チップを回転させると、回転で生じる遠心力により、各ウェル１０２に触媒性核酸を含む溶液及び試料液を配液することができ、反応ウェル１０２において、反応が開始される。
【実施例】
【００７１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７２】
[実施例１−１]シングルターンオーバー【００７３】
カチオン性くし型共重合体が、基質／触媒性核酸とのターンオーバーを加速、促進していることを確認するため以下の手順で実験を行った。
本実施例で用いたＤＮＡｚｙｍｅの配列（配列番号１）、及び基質核酸且つ検出対象の標的核酸である核酸（第一核酸）の配列（配列番号２）を図５に示す。配列中の小文字で示す塩基配列は、前記配列部分がＲＮＡであることを示す。なお基質核酸として、蛍光標識のされていないＳｕｂｓｔｒａｔｅ１を用いた。【００７４】
ＤＮＡｚｙｍｅ、基質核酸（本実施例では標的核酸でもある。）、及びカチオン性くし型共重合体を含む反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。前記溶液の組成（終濃度）を以下に示す。【００７５】
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ０．５ｍＭ
基質核酸  ５００ｎＭ
ＤＮＡｚｙｍｅ  ７５０ｎＭ
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ  （カチオン性くし型重合体）【００７６】
カチオン性くし型重合体は、ポリリジンを主鎖として、デキストランを側鎖に重合させたものであり、ポリリジンの分子量が約７５００、デキストランの分子量が約９０００、デキストラン含量が９０ｗｔ％である。濃度は反応液中の全ＤＮＡに対してアミノ基（カチオン性くし型重合体）／リン酸基（ＤＮＡ）＝２となるように添加した。反応液液中において、カチオン性くし型重合体の電荷／核酸の荷電＝２である。なお、上記のリン酸基及び核酸の電荷比についての値は、反応液中の全てのＤＮＡのリン酸基をもとにしており、ＤＮＡとしては、ＤＮＡｚｙｍｅ及び基質核酸の両方を含めて算出した。
反応液中、ＤＮＡｚｙｍｅ：基質＝１：１．５（モル）となるように添加した。反応液中、マグネシウム濃度は、終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。【００７７】
対照として、上記溶液の組成においてカチオン性くし型共重合体を含まない反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））。【００７８】
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）及びＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）を２５℃でインキュベートした。なお、反応の停止は、ＥＤＴＡを添加して行った。反応後のサンプルを１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。【００７９】
結果を図７に示す。カチオン性くし型重合体を添加したＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）では、カチオン性くし型重合体を添加していないＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）と比較して、基質核酸が切断されて産物核酸が生産される速度が速いことが分かる。【００８０】
[実施例１−２]マルチプルターンオーバー
カチオン性くし型共重合体が、基質／触媒性核酸とのターンオーバーを加速、促進していることを確認するため以下の手順で実験を行った。
本実施例で用いたＤＮＡｚｙｍｅ、及び基質核酸（第一核酸）の配列は、前記［実施例１−１］で用いたものと同様である。【００８１】
ＤＮＡｚｙｍｅ、基質核酸（本実施例では標的核酸でもある。）、及びカチオン性くし型重合体を含む反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。前記溶液の組成（終濃度）を以下に示す。【００８２】
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ０．５ｍＭ
基質核酸  ５００ｎＭ
ＤＮＡｚｙｍｅ  １６．７ｎＭ
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（カチオン性くし型重合体）【００８３】
反応液中、カチオン性くし型重合体およびその濃度は、前記［実施例１−１］と同様である。反応液中、ＤＮＡｚｙｍｅ：基質＝１：３０（モル）となるように添加し、マグネシウム濃度は、終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。【００８４】
対照として、上記溶液の組成においてカチオン性くし型共重合体を含まない反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））。【００８５】
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）及びＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）を２５℃でインキュベートした。なお、反応の停止は、ＥＤＴＡを添加して行った。反応後のサンプルを１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。【００８６】
結果を図８に示す。カチオン性くし型重合体を添加したＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）では、反応後約１５分から切断物のバンドが確認された。一方で、カチオン性くし型重合体を添加していないＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）では、基質核酸産物のバンドが確認されるまでに６０分以上の時間を要した。また、得られるバンドが薄いため、切断反応効率が悪いことが分る。【００８７】
上記［実施例１−１］及び［実施例１−２］の結果により、カチオン性くし型共重合体とＤＮＡ間の相互作用は、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を維持させつつ、ＤＮＡｚｙｍｅのターンオーバーを従来よりも促進、加速させていることが示唆された。【００８８】
［実施例２］
カチオン性くし型共重合体は、ＤＮＡｚｙｍｅを活性化し、ターンオーバーを促進、適応温度範囲を広げているかを確認するために、下記の手順で実験を行った。【００８９】
本実施例で用いたＤＮＡｚｙｍｅ、及び基質核酸（第一核酸）の配列は、前記［実施例１−１］で用いたものと同様である。
なお基質核酸としては、フルオロセイン（Ｆ）とブラックホールクエンチャー  I（Ｑ）により標識されたＳｕｂｓｔｒａｔｅ２を用いた（図５）。【００９０】
ＤＮＡｚｙｍｅ、基質核酸（本実施例では標的核酸でもある。）、及びカチオン性くし型重合体を含む反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。前記溶液の組成（終濃度）を以下に示す。
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ
基質核酸  ２００ｎＭ
ＤＮＡｚｙｍｅ  ６．７ｎＭ
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（カチオン性くし型重合体）【００９１】
カチオン性くし型重合体は、ポリリジンを主鎖として、デキストランを側鎖に重合させたものであり、ポリリジンの分子量が約７５００、デキストランの分子量が約９０００、デキストラン含量が９０ｗｔ％である。濃度は反応液中の全ＤＮＡに対してアミノ基（カチオン性くし型重合体）／リン酸基（ＤＮＡ）＝２となるように添加した。反応液液中において、カチオン性くし型重合体の電荷／核酸の荷電＝２である。なお、上記のリン酸基及び核酸の電荷比についての値は、反応液中の全てのＤＮＡのリン酸基をもとにしており、ＤＮＡとしては、ＤＮＡｚｙｍｅ及び基質核酸の両方を含めて算出した。【００９２】
対照として、上記溶液の組成においてカチオン性くし型共重合体を含まない反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））。【００９３】
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）をそれぞれ１８℃から７５℃（１８℃、２５℃、３７℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃）でインキュベートした。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）をそれぞれ２５℃から６５℃（２５℃、３７℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃）でインキュベートした。各温度における基質核酸の切断に伴う蛍光を、蛍光分光光度計（日本分光株式会社製)を用いて測定を行った。【００９４】
結果を図９に示す。縦軸は速度定数、横軸は反応温度を示す。図９の結果から、カチオン性くし型共重合体を添加していない系では、反応速度の極大値を示す温度の幅が小さいが（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））、カチオン性くし型共重合体を添加することにより、各温度での反応速度が増加し、適応温度範囲も広がっていることがわかる（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。
したがって、カチオン性くし型共重合体は、核酸塩基対の解離・再形成を促すことで、準安定なミスハイブリッドから熱力学的にもっとも安定な状態に落とし込む為、ＤＮＡｚｙｍｅを活性化し、ターンオーバーを促進、適応温度範囲を広げることが示された。【００９５】
［実施例３］
カチオン性くし型共重合体はＭＮＡｚｙｍｅの反応性を従来よりも顕著に増大することを確認するために以下の実験を行った。【００９６】
本実施例で用いた基質核酸の配列（配列番号２）、ＭＮＡパートザイムＡの配列（配列番号３）、ＭＮＡパートザイムＢの配列（配列番号４）、標的核酸の配列（配列番号５）を図６に示す。図６に示すように、基質核酸はフルオロセイン（Ｆ）とブラックホールクエンチャーＩ（Ｑ）により標識されたものを用いた。【００９７】
まず、ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイム、標的核酸、基質核酸を含む反応溶液Ａ、Ａ’及びＢを、以下に示す組成で用意した。
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ
基質核酸  ２００ｎＭ
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムＡ  以下の所定濃度
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムＢ  以下の所定濃度
標的核酸  ２ｎＭ（終濃度）【００９８】
溶液Ａ、Ａ’
Ｓ／Ａ／Ｂ／Ｔａｒｇｅｔ  ＝  ２００／２／２／２（単位は全てｎＭ）
溶液Ｂ
Ｓ／Ａ／Ｂ／Ｔａｒｇｅｔ  ＝  ２００／２００／２００／２（単位は全てｎＭ）
（Ｓは基質、ＡはパートザイムＡ、ＢはパートザイムＢ、Ｔａｒｇｅｔは標的核酸を表す。）【００９９】
溶液Ａ、溶液Ａ’及び溶液Ｂを５０℃でインキュベートし、溶液Ａに対して、インキュベート開始から１８分経過後に、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（カチオン性くし型重合体）をＤＮＡに対してアミノ基（カチオン性くし型重合体）／リン酸基（ＤＮＡ）＝２となるように添加した。反応液液中において、カチオン性くし型重合体の電荷／核酸の荷電＝２である。なお、上記のリン酸基及び核酸の電荷比についての値は、反応液中の全てのＤＮＡのリン酸基をもとにしており、ＤＮＡとしては、ＭＮＡｚｙｍｅ及び基質核酸の両方を含めて算出した。
カチオン性くし型重合体は、ポリリジンを主鎖として、デキストランを側鎖に重合させたものであり、ポリリジンの分子量が約７５００、デキストランの分子量が約９０００、デキストラン含量が９０ｗｔ％である。各反応溶液中の基質核酸の切断に伴う蛍光は、蛍光分光光度Ｖ−７７０(日本分光株式会社製))を用いて測定を行った。【０１００】
結果を図１０に示す。カチオン性くし型共重合体が加えられていない溶液Ａ’と比較して、反応の途中からカチオン性くし型共重合体が加えられた溶液Ａでは、カチオン性くし型共重合体が加えられたときを境に、切断反応に伴う蛍光シグナルが増大していくことが分かる。特に、溶液Ａでは、カチオン性くし型共重合体が加えられたときを境に、切断反応に伴う蛍光シグナルが劇的に増大していくことが分かる。
所定濃度のカチオンポリマーを添加することにより、溶液ＡではＭＮＡｚｙｍｅの終濃度２ｎＭであっても、切断によるシグナルの蓄積が見られる。対して、ポリマー未添加の反応系である溶液Ｂでは、ＭＮＡｚｙｍｅを２００ｎＭに増加しても基質の切断反応による蛍光シグナルがほとんど観察されていない。このことは、カチオン性くし型共重合体が、ＭＮＡｚｙｍｅによる反応を、５０℃の等温反応にて、顕著に促進していることを示している。【０１０１】
［実施例４−１］
カチオン性くし型共重合体は、ＭＮＡｚｙｍｅの反応性を従来よりも顕著に増大することを確認するため、以下の実験を行った。
本実施例で用いた基質核酸、ＭＮＡパートザイムＡ、ＭＮＡパートザイムＢ、標的核酸は、前記［実施例３］で用いたものと同じである。【０１０２】
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイム、標的核酸、基質核酸、及びカチオン性くし型重合体を含む反応溶液を、以下に示す組成で用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。標的核酸の濃度は、図１１のグラフ中に示す濃度で添加した。
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ
基質核酸  ２００ｎＭ
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムＡ  ６．７ｎＭ
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムＢ  ６．７ｎＭ
標的核酸  図１１中に示す所定濃度
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（カチオン性くし型重合体）【０１０３】
カチオン性くし型重合体は、ポリリジンを主鎖として、デキストランを側鎖に重合させたものであり、ポリリジンの分子量が約７５００、デキストランの分子量が約９０００、デキストラン含量が９０ｗｔ％である。濃度はＤＮＡに対してアミノ基（カチオン性くし型重合体）／リン酸基（ＤＮＡ)＝２となるように添加した。【０１０４】
対照として、上記溶液の組成においてカチオン性くし型重合体を含まない反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））。【０１０５】
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）及びＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）を３７℃でインキュベートした。各反応溶液における基質核酸の切断に伴う蛍光を、蛍光分光光度計ＦＰ−８３００(日本分光株式会社製)を用いて測定を行った。【０１０６】
結果を図１１に示す。図１１は、各標的核酸濃度におけるカチオン性くし型共重合体有無による、ＭＮＡｚｙｍｅの基質の切断効率を示すグラフである。
カチオン性くし型重合体を含まない反応で、標的核酸濃度６７００ｐＭを用いたときの蛍光と、カチオン性くし型重合体を含む反応で、標的核酸濃度２ｐＭを用いたときの蛍光がほぼ同等の結果を得た。このことから、カチオン性くし型共重合体は、ＭＮＡｚｙｍｅの反応を促進することが分り、カチオン性くし型共重合体がない場合よりも標的核酸濃度を約３０００倍程度薄くすることが可能であった。【０１０７】
［実施例４−２］
カチオン性くし型共重合体はＭＮＡｚｙｍｅの反応性を従来よりも顕著に増大することを確認するために以下の実験を行った。
本実施例で用いた基質核酸、ＭＮＡパートザイムＡ、ＭＮＡパートザイムＢ、標的核酸は、前記［実施例４−１］で用いたものと同じである。【０１０８】
ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイム、標的核酸、基質核酸、及びカチオン性くし型重合体を含む反応溶液を、以下に示す組成で用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋））。標的核酸の濃度は、図１２中のグラフに示す濃度で添加した。
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）緩衝液  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
ＭｎＣｌ２  ０．５ｍＭ
基質核酸  ２００ｎＭ
パートザイムＡ  ２ｎＭ
パートザイムＢ  ２ｎＭ
標的核酸  図１２中に示す所定濃度
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（カチオン性くし型重合体）【０１０９】
カチオン性くし型重合体は、ポリリジンを主鎖として、デキストランを側鎖に重合させたものであり、ポリリジンの分子量が約７５００、デキストランの分子量が約９０００、デキストラン含量が９０ｗｔ％である。濃度はＤＮＡに対してアミノ基（カチオン性くし型重合体）／リン酸基（ＤＮＡ）＝２となるように添加した。反応液中において、カチオン性くし型重合体の電荷／核酸の荷電＝２である。なお、上記のリン酸基及び核酸の電荷についての値は、反応液中の全てのＤＮＡのリン酸基をもとにしており、ＤＮＡとしては、ＭＮＡｚｙｍｅ及び基質核酸の両方を含めて算出した。【０１１０】
対照実験として、上記溶液の組成においてカチオン性くし型共重合体を含まない反応溶液を用意した（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−））。【０１１１】
ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（＋）及びＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ（−）を５０℃でインキュベートした。各反応溶液における基質核酸の切断に伴う蛍光を、蛍光分光光度計          (日本分光株式会社製)を用いて測定を行った。【０１１２】
結果を図１２に示す。図１２は、各標的核酸濃度におけるカチオン性くし型共重合体有無によるＭＮＡｚｙｍｅの基質の切断効率を示すグラフである。カチオン性くし型重合体を含まない反応で、標的核酸濃度５０ｎＭを用いたときの蛍光と、カチオン性くし型重合体を含む反応で、標的核酸濃度０．０２ｎＭを用いたときの蛍光がより大きい結果を得た。このことから、カチオン性くし型共重合体は、ＭＮＡｚｙｍｅの反応を促進することが分り、カチオン性くし型共重合体がない場合よりも標的核酸濃度を約１０００倍程度薄くすることが可能であった。【０１１３】
上記実施例［４−１］及び実施例［４−２］の結果から、カチオン性くし型共重合体を反応系に添加することで、ＭＮＡ複合体の触媒活性適応温度範囲を拡張、ＭＮＡ複合体形成のターンオーバーの促進、ＭＮＡ複合体と基質複合体を従来法よりも安定化することができ、３７℃、５０℃の一定温度で、１０６コピー程度の鋳型核酸の存在を検出することができることが可能であることが示された。【０１１４】
従来のカチオン性くし型共重合体が存在しない系を用いた場合、３７℃の一定温度に対して、７０分間の反応でＳ／Ｎ比が２以下のシグナルを得る場合、標的核酸が７０ｎＭが検出限界であるが、カチオン性くし型共重合体を添加した場合では、およそ２０分間でＳ／Ｎ比が７程度のシグナルを得ることが可能になり、２ｐＭの標的核酸をおよそ７０分で検出することが可能であることがわかった。したがって、標的核酸の検出感度を約３５，０００倍向上させたことになり、必要な標的核酸のコピー数も１．２×１０６程度あれば、核酸増幅工程なしで直接検出できる可能性が示唆された。
ちなみに、２ｐＭの標的核酸は、おおよそ１０６コピーであり、１Ｌの血清あるいは血漿中に含まれる検出対象のｍｉＲＮＡの濃度は、１０８から１０１０（０．２から２．０ｆＭ）である場合がある。したがって、これを標的核酸とする場合であっても、本発明に係る核酸の検出方法によれば、ＰＣＲなどの核酸増幅工程を経ずに、これを検出できる可能性がある。【０１１５】
以上、本発明の実施形態について、図面を参照し、実施例を交えて詳述したが、具体的な構成はこれらの実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の標的塩基配列の検出方法は、試料中の標的核酸から核酸増幅工程を経ずとも、高精度かつ迅速に識別することができるため、コストを大きく下げることができ、臨床検査等の分野、特に体細胞変異の検査等の分野において利用が可能である。
【符号の説明】
【０１１７】
１００・・・反応チップ
１０１・・・基材
１０２・・・反応ウェル
１０３・・・主流路
１０４・・・保持部
１０４ａ・・・分岐流路
１０４ｂ・・・チャンバ
１０５・・・側路
１０７ａ・・・ＩＮＬＥＴ
１０７ｂ・・・ＯＵＴＬＥＴ
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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