(57)【要約】  本発明の目的は、Dkk1による腫瘍細胞の増殖亢進に関与している標的分子を特定し、新たな抗腫瘍剤を提供することである。  CKAP4は、Dkk1によって誘導される増殖亢進効果を特異的に調節しており、腫瘍細胞においてCKAP4の発現又は機能を抑制することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CKAP4の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記物質が、CKAP4に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記物質がCKAP4特異的に結合する抗体又はその断片である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
癌の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
癌がCKAP4を発現している癌である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
癌が更にDkk1を発現している癌である、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
癌が肺癌又は膵癌である、請求項４〜６のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、
被験物質について、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を測定する第１工程、及び
CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程、
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-a工程、及び
第1-a工程後に、前記細胞におけるCKAP4発現量を測定する第1-b工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-i工程、及び
第1-i工程後に、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する第1-ii工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4の発現を測定する工程を含む、癌患者の術後の予後の検査方法。
【請求項１２】
更に、前記癌組織におけるDkk1の発現を測定する、請求項１１に記載の検査方法。
【請求項１３】
CKAP4を検出する試薬を含む、癌患者の術後の予後の検査薬。
【請求項１４】
被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4を測定する工程を含む、癌の検査方法。
【請求項１５】
CKAP4を検出する試薬を含む、癌の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関する。より具体的には、本発明は、Cytoskeleton-associated protein 4（CKAP4, 63-KDa Cytoskeleton-Linking Membrane Protein (CLIMP-63), P63, ERGIC-63)）を標的分子として、その発現又は機能を抑制することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制する抗腫瘍剤に関する。更に、本発明は、癌患者の術後の予後の検査方法、及び癌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Wntシグナル伝達経路では、細胞外分泌糖タンパク質であるWntが受容体に結合すると、LDL受容体関連タンパク質5又は6（LRP5/6）や７回膜貫通型受容体Frizzledを介して、細胞機能を担うシグナルを伝達する。Wntシグナルは、多様な細胞機能制御を担っている。Wntシグナル伝達経路の異常は、がんや骨疾患、炎症、感染等を引き起こすことが知られている。【０００３】
また、Dkk1(Dickkopf1)は、Wntシグナルによって発現し、WntリガンドとLDL受容体関連タンパク質6（LRP6）の結合を阻害することでWntシグナル伝達経路を抑制する因子であることが知られおり、抑制的フィードバック機構を形成している。Wntシグナルは、細胞増殖を正に制御することから、Dkk1は細胞増殖を負に制御すると従来考えられてきた。【０００４】
一方、近年、Dkk1は、腫瘍細胞の増殖を亢進させることが報告されている。具体的には、非特許文献１では、Dkk1は、多発性骨髄症、肝芽腫、ウィムス腫瘍、前立腺癌、腎癌、乳癌、食道癌、肺癌等において過剰発現しており、Dkk1の発現抑制や抗Dkk1抗体が、腫瘍細胞の増殖抑制に有効であることが報告されている。【０００５】
このように、Dkk1は、Wntシグナル伝達経路において細胞増殖を負に制御するにも拘わらず、細胞の増殖を亢進させる機能もあることから、Dkk1は、Wntシグナル伝達経路とは独立したシグナル経路により細胞増殖を亢進させていると類推される。しかしながら、従来、Dkk1によって細胞の増殖を亢進させるシグナル経路については解明できていない。【０００６】
一方、CKAP4は、膜貫通型の受容体であり、そのリガンドとしてはanti-proliferative factor（APF）、surfactant protein A（SPA）、tissue plasminogen activator（TPA）等が知られているが、いずれのリガンドもCKAP4を介した細胞増殖亢進作用は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者等は、後述する実施例に示すように、犬尿細管由来のMDCK細胞を用いてDkk1発現株（MDCK/Dkk1-FLAG細胞）を樹立し、Dkk1がMDCK細胞の増殖能を亢進することを確認した。このことから、Dkk1は、Wntシグナル伝達経路とは独立したシグナル経路により細胞増殖を亢進させていることが推認される。【０００８】
そこで、Dkk1による腫瘍細胞の増殖を亢進させるシグナル経路を解明し、腫瘍細胞の増殖に関与している標的分子を特定できれば、新たな抗腫瘍剤の開発が可能になる。このような背景の下、本発明の目的は、Dkk1による腫瘍細胞の増殖亢進に関与している標的分子を特定し、新たな抗腫瘍剤を提供することである。更に、本発明の他の目的は、前記標的分子を用いて、抗腫瘍剤をスクリーニングする方法を提供することである。【０００９】
更に本発明の他の目的は、癌患者の術後の予後を予測するための検査方法、及び癌の罹患の有無を予測するための検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、Dkk1による腫瘍細胞の増殖を亢進させるシグナル経路を解明すべく鋭意検討したところ、CKAP4は、Wntシグナル経路とは独立したシグナル経路においてDkk1の受容体として機能していることを見出した。また、本発明者等は、Dkk1はCKAP4とPI3Kの会合を介して癌細胞の増殖を促していることを突き止め、CKAP4は、Dkk1による細胞増殖亢進効果を特異的に調節しており、従来知られていない細胞増殖調節機構の一端を担っていることも見出した。そして、本発明者等は、腫瘍細胞においてCKAP4の発現又は機能を抑制することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制できることも見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  CKAP4の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、抗腫瘍剤。
項２．  前記物質が、CKAP4に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、項１に記載の抗腫瘍剤。
項３．  前記物質がCKAP4特異的に結合する抗体又はその断片である、項１に記載の抗腫瘍剤。
項４．  癌の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
項５．  癌がCKAP4を発現している癌である、項４に記載の抗腫瘍剤。
項６．  癌が更にDkk1を発現している癌である、項５に記載の抗腫瘍剤。
項７．  癌が肺癌又は膵癌である、項４〜６のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
項８．  CKAP4の発現又は機能を抑制する物質の、抗腫瘍剤の製造のための使用。
項９．  癌の処置に使用される、CKAP4の発現又は機能を抑制する物質。
項１０．  癌患者に、治療有効量のCKAP4の発現又は機能を抑制する物質を投与する工程を含む、癌の治療方法。
項１１．  抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、
被験物質について、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を測定する第１工程、及び
CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程、
を含むスクリーニング方法。
項１２．  前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-a工程、及び
第1-a工程後に、前記細胞におけるCKAP4発現量を測定する第1-b工程
を含む、項１１に記載のスクリーニング方法。
項１３．  前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-i工程、及び
第1-i工程後に、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する第1-ii工程
を含む、項１１に記載のスクリーニング方法。
項１４．  癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4の発現を測定する工程を含む、癌患者の術後の予後の検査方法。
項１５．  更に、前記癌組織におけるDkk1の発現を測定する、項１４に記載の検査方法。
項１６．  前記癌患者が肺癌患者又は膵癌患者である、項１４又は１５に記載の検査方法。
項１７．  CKAP4を検出する試薬を含む、癌患者の術後の予後の検査薬。
項１８．  更にDkk1を検出するための試薬を含む、項１７に記載の検査薬。
項１９．  癌患者が肺癌患者又は膵癌患者である、項１７又は１８に記載の検査薬。
項２０．  CKAP4を検出するための試薬の、癌患者の術後の予後の検査薬の製造のための使用。
項２１．  癌患者の術後の予後の検査に使用される、CKAP4を検出するための試薬。
項２２．  被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4を測定する工程を含む、癌の検査方法。
項２３．  CKAP4を検出する試薬を含む、癌の検査薬。
項２４．  CKAP4を検出する試薬の、CKAP4を検出する試薬の製造のための使用。
項２５．  癌の検査に使用される、CKAP4を検出する試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗腫瘍剤は、CKAP4がDkk1の受容体として機能しており、Dkk1がCKAP4を介して腫瘍細胞の増殖を亢進させるシグナルを伝達しているという新たな知見に基づいており、本発明によれば、CKAP4を標的分子として、その発現又は機能を抑制することによって、効果的に腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能になる。実際、種々の癌細胞に対して抗CKAP4抗体によるin vivo腫瘍抑制効果が確認されている。【００１３】
また、Dkk1及びCKAP4は、正常上皮細胞では発現が認められないため、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍特異性が高く、安全性の点でも優れている。【００１４】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、CKAP4を標的分子としてその発現又は機能を抑制する物質をスクリーニングすることにより、優れた抗悪性腫瘍薬の開発を加速させることができるので、癌患者に福音をもたらすこともできる。【００１５】
更に、本発明の癌患者の術後の予後の検査方法によれば、高い精度をもって術後の予後を予測できるので、癌患者の術後の最適な治療法策の決定に役立てることができる。また、本発明の癌の検査方法によれば、被験者の体液から採取したエクソソームを使用することによって、癌の罹患の有無を予測できるので、癌の診断を低侵襲的又は非侵襲的に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】(a)の上図に、Dkk1-FLAGを発現したMDCK細胞において、C末端側がFLAGタグ化されたDkk1が発現していることを確認した結果、及び(a)の下図に、Transwell polycarbonate filter上で培養したMDCK/Dkk1-FLAG細胞を培養し、頂端側（Ap）と基底側(Bl)に分画してDkk1の発現を分析した結果を示す。  (b)には、Transwell polycarbonate filter上で培養したMDCK/Dkk1-FLAG細胞を固定し、細胞を抗Dkk1抗体（緑色）、抗E-カドヘリン抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した結果を示す。  (c)には、胎生13日目（day E13）マウスの腎臓の組織切片をパラフィン包理し、抗Dkk1抗体（緑色）、抗aPKC抗体（赤色）で免疫染色した結果を示す。  (d)には、MDCK/Dkk1-FLAG細胞をマトリゲル上で三次元的に５日間培養し、形成された嚢胞及びその外径(細胞塊の大きさを示す)を測定した結果を示す。  (e)には、マトリゲル上で三次元的に培養したMDCK/Dkk1-FLAG細胞に対して、抗Ki67抗体（緑色）、抗aPKC抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した結果を示す。  (f)には、Transwell polycarbonate filter上で培養したMDCK細胞に対して、Dkk1を頂端側又は基底側に添加して24時間培養を行った後に、抗Ki67抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した結果を示す。NT: 無処理。(g)には、MDCK/Dkk1-FLAG細胞を3日間二次元的に培養し、細胞数を計測した結果を示す。
【図２】(a)には、頂端側表面にあるDkk1結合タンパク質をスクリーニングした実験手順の概略図を示す。  (b)には、Dkk1結合タンパク質を精製し、銀染色を行った結果（左図）及び同定した結合タンパク質群（右図）を示す。  (c)には、コントロール（MDCK細胞）、MDCK/Dkk1-FLAG細胞、又はMDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞（Dkk1-FLAG-GPI）の溶解液（Input）及びその抗FLAG抗体による免疫沈降物（IP）に対して、CKAP4、LRP6、及びDkk1の検出を行った結果を示す。  (d)の上図には、試験に使用したDkk1のドメイン構造の概略図を示し、(d)の下図には、コントロール（MDCK細胞）、及び野生型(wild type)Dkk1-FLAG（WT）又は欠失変異体Dkk1-FLAG（ΔCRD-1、ΔCRD-2）を発現するMDCK細胞の溶解液（Input）及びその抗FLAG抗体による免疫沈降物（IP）に対して、CKAP4、LRP6、及びDkk1の検出を行った結果を示す。  (e)の上図には、試験に使用したCKAP4のドメイン構造の概略図を示し、(e)の左下図には、野生型CKAP4（WT）-HA又は欠失変異体CKAP4-HA（ECD、ΔC1、ΔC2、ΔC3）を一過的に発現させたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）及びその抗FLAG抗体による免疫沈降物（IP）に対して、HA及びDkk1を検出した結果を示す。(e)の右下図には、野生型CKAP4-HA（WT）又は欠失変異体CKAP4-HA（ΔLZ）を一過的に発現させたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）及びその抗FLAG抗体による免疫沈降物（IP）に対して、HA及びDkk1を検出した結果を示す。
【図３】(a)及び(b)には、CKAP4の細胞外ドメイン(CKAP4-ECD)のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を連結させたポリペプチド（GST-CKAP4-ECD）又はGSTをDkk1と共にインキュベートし、GST-CKAP4-ECD又はGSTに結合したDkk1を検出し、測定した結果を示す。
【図４】(a)にはMDCK細胞（Control）、MDCK/Dkk1-FLAG細胞（Dkk1-FLAG）、又はMDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞（Dkk1-FLAG-GPI）の溶解液に対して、各種タンパク質のリン酸化状態を検出した結果を示す。  (b)には、Dkk1を含む調整液でインキュベートしたMDCK細胞の溶解液に対して、pAKT、AKT、及びクラスリンを検出した結果を示す。  (c)には、コントロールsiRNA又はCKAP4 siRNAを形質導入したMDCK細胞（Control）又はMDCK/Dkk1-FLAG細胞の溶解液に対して、各種タンパク質を検出した結果を示す。  (d)には、コントロールsiRNA又はCKAP4 siRNAを形質導入したMDCK細胞（Control）又はMDCK/Dkk1-FLAG細胞（Dkk1-FLAG）について、細胞増殖アッセイを行った結果を示す。
【図５】(a)には、コントロール（MDCK細胞）及び野生型Dkk1-FLAG（WT）を過剰発現するMDCK細胞（MDCK/Dkk1-FLAG）の溶解液（Input）を抗CKAP4抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p85α、CKAP4及びDkk1の検出を行った結果を示す。  (b)には、コントロール（MDCK細胞）及び野生型Dkk1-FLAG（WT）を過剰発現するMDCK細胞（MDCK/Dkk1-FLAG）の溶解液（Input）を抗CKAP4抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p110α、CKAP4及びDkk1の検出を行った結果を示す。  (c)には、p85αと共に、CKAP4-HA又はCKAP4-ECD-HAを発現したX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）及びその抗HA抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p85α及びHA(CKAP4)を検出した結果を示す。  (d)には、FLAG-p110βと共に、CKAP4-HA又はCKAP4-ECD-HAを発現したX293T/Dkk1細胞の溶解液（Input）及びその抗HA抗体による免疫沈降物（IP）に対して、FLAG(p110β)及びHA(CKAP4)を検出した結果を示す。  (e)には、コントロールshRNA（Control）又はDkk1 shRNA (Dkk1)を発現するS2-CP8細胞の溶解液（Input）及びその抗CKAP4抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p85α、CKAP4及びDkk1の検出を行った結果を示す。  (f)には、コントロールshRNA（Control）又はDkk1 shRNA (Dkk1)を発現するS2-CP8細胞の溶解液（Input）及びその抗CKAP4抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p110β、CKAP4及びDkk1の検出を行った結果を示す。(g)の上図には、CKAP4のプロリンリッチ領域のアミノ酸配列を示す。  (g)の下図には、野生型CKAP4-HA又はプロリンをアラニンに置換したCKAP4-HA(PA mutant CKAP4-HA)をコードする遺伝子をトランスフェクトしたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）及びその抗HA抗体による免疫沈降物（IP）に対して、p85α及びHA(CKAP4)の検出を行った結果を示す。  (h)の上図には、p85αのドメイン構造の模式図を示す。  (h)の下図には、野生型のp85α（WT）（GFP-WT）、SH3ドメインが欠失しているΔSH3（GFP-ΔSH3）、SH2及びiSH2ドメインが欠失しているΔSH2（GFP-ΔSH2）をコードする遺伝子トランスフェクトしたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）及びその抗CKAP4抗体による免疫沈降物（IP）に対して、GFP（p85α）及びCKAP4の検出を行った結果を示す。
【図６】肺癌細胞、膵癌細胞、子宮頸管癌細胞、胃癌細胞、食道扁平上皮癌細胞、肝癌細胞、及び胎児由来腎臓細胞の溶解液に対して、Dkk1、CKAP4、及びHSP90の検出を行った結果を示す。
【図７】(a)の左図には、膵癌患者から摘出した膵癌組織を抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。  (a)の右図には、膵癌患者から摘出した膵癌組織(n=59)についてDkk1とCKAP4の発現量で分類した結果を示す。  (ｂ)には、膵癌患者から摘出した膵癌組織(n=59)をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と全生存率の関係を分析した結果を示す。  (ｃ)には、膵癌患者から摘出した膵癌組織(n=59)をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と無再発生存率の関係を分析した結果を示す。
【図８】(a)の左図には、肺腺癌患者から摘出した肺腺癌組織を抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。  (a)の右図には、肺腺癌患者から摘出した肺腺癌組織(n=67)についてDkk1とCKAP4の発現量で分類した結果を示す。  (b)には、肺腺癌患者から摘出した肺腺癌組織(n=67)をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と無再発生存率の関係を分析した結果を示す。  (c)の左図には、肺扁平上皮癌患者から摘出した肺扁平上皮癌組織を抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。  (c)の右図には、肺扁平上皮癌患者から摘出した肺扁平上皮癌組織(n=61)についてDkk1とCKAP4の発現量で分類した結果を示す。  (d)には、肺扁平上皮癌患者から摘出した肺扁平上皮癌組織(n=61)をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と無再発生存率の関係を分析した結果を示す。  (e)の左図には、肺異型腺腫様過形成を示す肺組織に対して、抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。(e)の右図には、肺異型腺腫様過形成患者から摘出した肺異型腺腫様過形成組織(n=11)についてDkk1とCKAP4の発現量で分類した結果を示す。
【図９】ヒト膵癌(a,b)、ヒト肺腺癌(c)、及びヒト肺扁平上皮癌(d)の各癌組織に対して抗Dkk1抗体、抗CKAP4抗体、又は抗pAKT抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。
【図１０】(a)の左上図には、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、又はDkk1 shRNA およびDkk1-FLAGを形質導入したS2-CP8細胞の溶解液に対して、各種タンパク質を検出した結果を示し、(a)の右上図には、コントロールshRNA、CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNA 及びCKAP4-HAを形質導入したS2-CP8細胞の溶解液に対して、各種タンパク質を検出した結果を示す。  (a)の下図には、前記各細胞について細胞増殖アッセイを行った結果を示す。  (b)の左上図には、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、又はDkk1 shRNA およびDkk1-FLAGを形質導入したA549細胞の溶解液に対して、各種タンパク質を検出した結果を示し、(b)の 右上図には、コントロールshRNA、CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNA およびCKAP4-HAを形質導入したA549細胞の溶解液に対して、各種タンパク質を検出した結果を示す。  (b)の下図には、前記各細胞について細胞増殖アッセイを行った結果を示す。  (c)には、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、CKAP4 shRNA、Dkk1 shRNAおよびDkk1-FLAG、又はCKAP4 shRNAおよびCKAP4-HA、を発現するS2-CP8細胞をマトリゲル上で三次元的に培養し、1視野当たりの凝集塊数を測定した結果を示す。  (d)には、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、CKAP4 shRNA、Dkk1 shRNAおよびDkk1-FLAG、又はCKAP4 shRNAおよびCKAP4-HA、を発現するA549細胞をマトリゲル上で三次元的に培養し、1視野当たりの凝集塊数を測定した結果を示す。
【図１１】(a)には、コントロールshRNA、 CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNAおよびCKAP4-HAを発現するS2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスにおいて、注入後21間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を分析した結果を示す。  (b)には、コントロールshRNA、 CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNAおよびCKAP4-HAを発現するA549細胞を皮下注入したヌードマウスにおいて、注入後28日間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を分析した結果を示す。  (c)には、コントロールshRNA、 又はDkk1 shRNAを発現するS2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスにおいて、注入後21日間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を分析した結果を示す。  (d)には、コントロールshRNA、 又はDkk1 shRNAを発現するA549細胞を皮下注入したヌードマウスにおいて、注入後28日間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を分析した結果を示す。
【図１２】(a)の左図には、ポリクローナル抗CKAP4抗体のエピトープの概略図を示し、(a)の右図には、S2-CP8細胞（Control）、又はCKAP4 cDNA又はCKAP4 shRNAを発現するS2-CP8細胞の溶解液に対して、CKAP4の検出を行った結果を示す。  (b)には、コラーゲンをコートしたスライドガラス上で増殖させたS2-CP8細胞を未固定の状態で抗CKAP4抗体（緑色）、ファロイジン（赤色）及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した結果を示す。  (c)には、GST-CKAP4-ECDと抗CKAP4抗体又は抗GST抗体を混合した後にDkk1を添加してインキュベートし、GST-CKAP4-ECDに結合したDkk1を測定した結果を示す。  (d)には、ノコダゾールで処理した後に、抗CKAP4抗体又は抗GST抗体の存在下でDkk1又はインスリンを添加してインキュベートしたMDCK細胞の溶解液に対して、各種タンパク質の検出を行った結果を示す。  (e)には、抗CKAP4抗体又は抗GST抗体を添加してインキュベートしたS2-CP8細胞およびA549細胞の溶解液に対して、各種タンパク質の検出を行った結果を示す。  (f)には、抗GST抗体又は抗CKAP4抗体の存在下で、S2-CP8細胞およびA549細胞をマトリゲル中で三次元的に培養し、1視野における細胞凝集塊の数を計測した結果を示す。  (g)には、抗GST抗体又は抗CKAP4抗体の存在下で、S2-CP8細胞をマトリゲル中で三次元的に培養し、1視野におけるS2-CP8細胞の凝集塊の数を計測した結果を示す。  (h)には、検体LC189及びLB95のcancer tissue-originated spheroid（CTOS）を抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す。  (i)には、検体LC189及びLB95のCTOSを抗CKAP4抗体又は抗GST抗体の存在下で増殖アッセイを行った結果を示す。
【図１３】(a)の左図には、S2-CP8細胞を皮下注入したヌードマウスを上部から観察した結果及び当該ヌードマウスから摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。(a)の右図には、抗体注入後14日間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を測定した結果を示す。  (b)の左図には、A549細胞を皮下注入したヌードマウスを上部から観察した結果及び当該ヌードマウスから摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。(b)の右図には、抗体注入後25日間の異種腫瘍組織片の腫瘍体積変化と最終重量を測定した結果を示す。
【図１４】各種癌細胞及び正常細胞株の細胞培養液から回収したエクソソーム中のCKAP4、TSG101及び細胞溶解液（Input）中のCKAP4、クラスリンの検出を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、CKAP4の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の抗腫瘍剤について詳述する。
【００１８】
（有効成分）
本発明の抗腫瘍剤では、有効成分として、CKAP4の発現又は機能を抑制する物質を使用する。CKAP4は、Dkk1の受容体として腫瘍細胞の増殖調節機構に関与しており、腫瘍細胞の増殖を亢進させる作用がある。本発明の抗腫瘍剤では、CKAP4の発現又は機能を抑制することによって、腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制させることが可能になる。
【００１９】
CKAP4は、膜貫通型タンパク質として公知であり、そのアミノ酸配列及び塩基配列についても公知である。例えば、ヒトCKAP4のアミノ酸配列は配列番号１、ヒトCKAP4をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２として知られている。
【００２０】
本発明において、「CKAP4の発現を抑制する物質」としては、薬学的に許容され、且つCKAP4をコードするDNA（CKAP4遺伝子）からCKAP4の発現を抑制できることを限度として特に制限されない。CKAP4の発現を抑制する物質は、CKAP4遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいずれの段階でCKAP4の発現に対する抑制作用を発揮するものであってもよい。CKAP4の発現を抑制する物質として、具体的には、デコイ核酸等のCKAP4遺伝子の転写を抑制する核酸分子；siRNA、shRNA、dsRNA等のCKAP4のmRNAに対してRNA干渉作用を有するRNA分子又はその前駆体；miRNA、アンチセンス核酸（アンチセンスDNA、アンチセンスRNA）、リボザイム等のCKAP4のmRNAの翻訳を抑制する核酸分子等の核酸医薬が挙げられる。これらの核酸医薬は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの核酸医薬の塩基配列は、CKAP4遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。これらの核酸医薬の中でも、臨床応用への容易性等の観点から、好ましくは、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、アンチセンス核酸、更に好ましくはsiRNA、shRNAが挙げられる。
【００２１】
また、前記核酸分子がRNA分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該RNA分子をコードしているDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
【００２２】
また、「CKAP4の機能を抑制する物質」としては、薬学的に許容され、且つ腫瘍細胞の細胞膜に存在するCKAP4の機能を抑制できるものであることを限度として特に制限されない。CKAP4の機能を抑制する物質として、例えば、CKAP4特異的に結合する抗体又はその断片、CKAP4特異的に結合するアプタマー、CKAP4の機能を抑制する低分子化合物等が挙げられる。これらの物質は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの物質の中でも、好ましくはCKAP4特異的に結合する抗体又はその断片が挙げられる。
【００２３】
CKAP4特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。また、これらの抗体のアイソタイプについては、特に制限されず、IgG、IgM、IgA等のいずれであってもよいが、好ましくはIgGが挙げられる。
【００２４】
また、本発明の抗腫瘍剤をヒトに投与する場合には、前記抗体は、ヒト体内での抗原性が低減されている抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ニワトリ−ヒトキメラ抗体等が好ましい。これらの中でも、完全ヒト抗体、ヒト化抗体が更に好ましい。
【００２５】
また、CKAP4は膜貫通タンパク質であるので、前記抗体のCKAP4に対する結合部位は、CKAP4の細胞外に露出している部位（例えば、ヒトCKAP4の場合であれば、配列番号１の第128〜602位の領域内の部位、好ましくは配列番号１の第128〜503位の領域内の部位）であることが望ましい。特に、CKAP4とDkk1との結合には、CKAP4のロイシンジッパー領域（配列番号１の第468〜503位）が必要になっているので、当該ロイシンジッパー領域におけるDkk1との結合を抑制できるように、前記抗体のCKAP4に対する結合部位が設定されていればよい。
【００２６】
また、前記抗体の断片としては、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであればよく、具体的には、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、scFv-Fc等が挙げられる。
【００２７】
前記抗体及びその断片は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。
【００２８】
（対象疾患）
CKAP4は、腫瘍細胞において発現し、腫瘍細胞の増殖を亢進させているので、本発明の抗腫瘍剤では、CKAP4の発現又は機能を抑制することにより、腫瘍細胞の増殖抑制が可能になっている。従って、本発明の抗腫瘍剤は、癌の治療の用途に使用できる。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌としては、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗腫瘍剤は、CKAP4を発現している腫瘍細胞、特にCKAP4とDkk1の双方を発現している腫瘍細胞に対して、効果的に腫瘍細胞の増殖抑制効果を奏するので、CKAP4を発現している癌、とりわけCKAP4とDkk1の双方を発現している癌が、好適な適用対象といえる。癌の中でも、肺癌及び膵癌は、高い頻度でCKAP4及びDkk1が高発現しており、本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌として特に好適である。
【００３０】
癌におけるCKAP4の発現については、採取した癌組織に対して組織免疫することによって確認することができる。具体的には、採取した癌組織に対して、抗CKAP4抗体を用いて免疫染色し、腫瘍領域においてCKAP4の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、CKAP4が発現されていると判断される。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌の好適な例として、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域が5％以上存在する癌、更に好ましくは、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域が20％以上存在する癌、特に好ましくは、腫瘍領域においてCKAP4の発現領域50％以上存在する癌が挙げられる。
【００３１】
また、癌におけるCKAP4の発現については、採取した癌組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定することもできる。この場合、CKAP4の発現の有無の判定は、同一症例の非癌組織を指標として行えばよい。具体的には、癌組織の細胞溶解液におけるCKAP4量が、同一症例の非癌組織の細胞溶解液におけるCKAP4量よりも多い場合には、当該癌ではCKAP4が発現されていると判断される。
【００３２】
また、癌におけるDkk1の発現の確認についても、CKAP4の場合と同様に、採取した癌組織に対して組織免疫する方法、採取した癌組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定する方法等によって確認することができる。
【００３３】
具体的には、採取した癌組織に対して抗Dkk1抗体を用いて免疫染色する場合には、腫瘍領域においてDkk1の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、Dkk1が発現されていると判断される。本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる癌の好適な例として、腫瘍領域においてDkk1の発現領域が5％以上存在する癌、更に好ましくは、腫瘍領域においてDkk1の発現領域が20％以上存在する癌、特に好ましくは、腫瘍領域においてDkk1の発現領域50％以上存在する癌が挙げられる。
【００３４】
また、採取した癌組織からRNAを回収してDkk1を測定する場合には、癌組織の細胞溶解液におけるDkk1量が、同一症例の非癌組織の細胞溶解液におけるDkk1量よりも多い場合には、当該癌ではDkk1が発現されていると判断される。
【００３５】
また、本発明の抗腫瘍剤は、ヒトのみならず、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物に対して使用できるが、ヒト用の医薬品として好適に使用される。
【００３６】
（投与態様）
本発明の抗腫瘍剤の投与形態については、抗腫瘍効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよく、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。本発明の抗腫瘍剤の投与形態として、具体的には、経口投与；注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等）、座薬投与等の非経口投与が挙げられる。
【００３７】
本発明の抗腫瘍剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与形態、適用対象となる癌の種類、患者の症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、核酸分子の１回量として、通常0.01 μg〜1000 mg／kg体重程度、好ましくは0.1〜100 μg／kg体重程度を投与すればよい。また、例えば、有効成分として抗体、その断片、又は低分子化合物を使用する場合であれば、これらの物質の１回量として、通常0.1 mg〜20 mg／kg体重程度を、1〜3週毎に１回程度の頻度で投与すればよい。
【００３８】
本発明の抗腫瘍剤は、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗腫瘍作用を有する他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。
【００３９】
（製剤形態）
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分の種類や投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の抗腫瘍剤の製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤；液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の抗腫瘍剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
【００４１】
また、本発明の抗腫瘍剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子が腫瘍細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。
【００４２】
２．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、被験物質について、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を検出する第１工程、及びCKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のスクリーニング方法について詳述する。
【００４３】
（被験物質）
本発明のスクリーニング方法において、被験物質は、抗腫瘍剤の有効成分の候補物質となり得るものであればよく、その種類については、特に制限されず、例えば、生体由来物質等の天然物質であってもよく、また化学的に合成された合成物質であってもよい。具体的には、被験物質として、低分子化合物；抗体等のタンパク質；siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、アプタマー等の核酸分子等が挙げられる。
【００４４】
（第１工程）
本発明のスクリーニング方法では、先ず、第１工程として、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を検出する。
【００４５】
被験物質のCKAP4の発現抑制能を検出する具体的手法については、特に制限されないが、例えば、下記第1-a工程及び第1-ｂ工程を行う方法が挙げられる。
第1-a工程：被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる工程。
第1-b工程：第1-a工程後に、前記細胞におけるCKAP4発現量を測定する工程。
【００４６】
前記第1-a工程において使用するCKAP4を発現する細胞については、CKAP4を発現することを限度として、特に制限されないが、例えば、腫瘍細胞等のCKAP4を内在的に発現している細胞、正常細胞にCKAP4遺伝子をトランスフェクトすることにより、CKAP4発現能を獲得させた細胞等を使用することができる。正常細胞へのCKAP4遺伝子のトランスフェクションは、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００４７】
また、前記第1-a工程において、被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させるには、当該細胞が生育可能な培地中に、当該細胞と被験物質を添加して、当該細胞が生育可能な温度で培養すればよい。また、被験物質として、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA等の核酸分子を使用する場合であれば、これらの核酸分子が前記細胞内に導入され易いように、核酸導入補助剤も共存させることが好ましい。このような核酸導入補助剤の種類については、前記「１．抗腫瘍剤」の欄で例示した通りである。
【００４８】
前記第1-b工程において、前記細胞におけるCKAP4発現量の測定は、細胞内のCKAP4のmRNA量及び／又はCKAP4量（タンパク質量）を公知の手法に従って測定することによって行うことができる。
【００４９】
また、被験物質の細胞膜上のCKAP4との結合能を検出する具体的手法については、特に制限されないが、例えば、下記第1-i工程及び第1-ii工程を行う方法が挙げられる。
第1-i工程：被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる工程。
第1-ii工程：第1-i工程後に、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する工程。
【００５０】
前記第1-i工程は、前記第1-a工程と同様の方法で行うことができる。
【００５１】
また、前記第1-b工程において、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する具体的手法については、特に制限されないが、公知の免疫染色法を用いて被験物質量を測定することによって求めることができる。また、前記第1-i工程後の細胞からCKAP4を回収し、当該CKAP4に結合している被験物質量を測定することによって求めることができる。
【００５２】
（第２工程）
第２工程では、前記第１工程において、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する。
【００５３】
具体的には、CKAP4の発現抑制能を判定基準にする場合であれば、被験物質を添加せずに前記第１工程を行った際のCKAP4の発現量に比べて、CKAP4の発現量が少ない被験物質が、CKAP4の発現抑制能があると判定される。
【００５４】
また、細胞膜上のCKAP4との結合能を判定基準にする場合であれば、細胞膜上のCKAP4に対して結合が認められた被験物質が、細胞膜上のCKAP4との結合能があると判定される。
【００５５】
第２工程において、CKAP4の発現抑制能、又はCKAP4とDkk1との結合の抑制能が認められた被験物質については、腫瘍細胞の増殖抑制作用があり、抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択される。斯して選択された被験物質は、実際に、腫瘍細胞の増殖抑制作用を試験し、抗腫瘍剤としての臨床応用の是非を評価すればよい。
【００５６】
癌患者の術後の予後の検査方法
本発明の癌患者の術後の予後の検査方法は、癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4およびDkk1の発現を測定する工程を含むことを特徴とする。本発明の検査方法によれば、癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4およびDkk1双方の発現を指標とすることにより、癌患者の術後の予後を推定することが可能になる。
【００５７】
本発明の検査方法において、予後の検査方法の対象となる患者の癌の種類については、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの中でも、本発明の検査方法の検査対象の好適な例として肺癌及び膵癌が挙げられる。
【００５８】
本発明の検査方法において、癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4の発現の測定は、CKAP4を検出できる試薬を使用して行うことができる。
【００５９】
CKAP4の発現の測定方法として、例えば、採取した癌組織に対して抗CKAP4抗体を用いて免疫染色する方法が挙げられる。具体的には、採取した癌組織に対して、抗CKAP4抗体を用いて免疫染色し、腫瘍領域においてCKAP4の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、CKAP4が発現されていると判断される。
【００６０】
更に、CKAP4の発現の測定は、例えば、採取した癌組織からRNAを回収し、定量的PCRによって行うこともできる。この場合、CKAP4の発現の有無の判定は、同一症例の非癌組織を指標として行えばよい。具体的には、癌組織の細胞溶解液におけるCKAP4量が、同一症例の非癌組織の細胞溶解液におけるCKAP4量よりも多い場合には、当該癌ではCKAP4が発現されていると判断される。
【００６１】
また、本発明の検査方法において、患者の術後の予後の予測精度をより高めるという観点から、癌患者から採取した癌組織におけるDkk1の発現の測定も行っておくことが望ましい。癌患者から採取した癌組織におけるDkk1の発現の測定は、Dkk1を検出できる試薬を使用して行うことができる。
【００６２】
Dkk1の発現の測定方法については、CKAP4の場合と同様に、採取した癌組織に対して組織免疫する方法、採取した癌組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定する方法等によって確認することができる。
【００６３】
具体的には、採取した癌組織に対して抗Dkk1抗体を用いて免疫染色する場合には、腫瘍領域においてDkk1の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、当該癌ではDkk1が発現されていると判断される。また、採取した癌組織からRNAを回収してDkk1を測定する場合には、癌組織の細胞溶解液におけるDkk1量が、同一症例の非癌組織の細胞溶解液におけるDkk1量よりも多い場合には、当該癌ではDkk1が発現されていると判断される。
【００６４】
本発明の検査方法において、CKAP4およびDkk1の双方の発現が認められた癌の患者は、全生存期間が短い、無再発生存期間が短い等、術後の予後が悪いと推定される。
【００６５】
更に、本発明は、前記検査方法を行うための検査キットとして、癌組織におけるCKAP4を検出するための試薬を提供する。CKAP4を検出するための試薬としては、特に制限されないが、例えば、抗CKAP4抗体、及びその断片等が挙げられる。また、本発明の検査キットには、癌組織におけるDkk1を検出するための試薬が含まれていてもよい。これらの抗体は、必要に応じて、ビオチン、蛍光標識、磁気ビーズ等によって標識化されていてもよい。
【００６６】
癌の検査方法
本発明の癌の検査方法は、被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4を測定する工程を含むことを特徴とする。本発明によれば、被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4の有無を指標とすることにより、被験者が癌に罹患しているか否かを診断することが可能になる。
【００６７】
本発明の検査方法において、検査対象となる癌の種類については、特に制限されないが、具体的には、肺癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経膠腫（グリオーマ）、膠芽腫、多型性神経膠芽腫等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの中でも、本発明の検査方法の検査対象の好適な例として肺癌及び膵癌が挙げられる。
【００６８】
本発明の検査方法において、エクソソームの由来については、特に制限されないが、例えば、血清、尿等の体液が挙げられる。これらの中でも、好ましくは血清が挙げられる。
【００６９】
被験者からエクソソームを採取する方法は、CKAP4検出用の試料として使用可能なものが得られる限り特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。エクソソームの分離は超遠心処理により行うことができるが、より簡便には、商業的に入手可能なキットを用いてエクソソームの分離を行うことができる。商業的に入手可能なエクソソーム分離キットとしては、具体的にはＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ溶液、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ−ＴＣ等（いずれもＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が挙げられる。
【００７０】
エクソソーム中のCKAP4は、エクソソームからタンパク質を溶出させて、抗CKAP4抗体等のDkk1を検出するための試薬を使用することによって検出することができる。
【００７１】
本発明の検査方法において、エクソソーム中にCKAP4が認められた場合、その被験者は癌に罹患している可能性が高いと推測される。
【００７２】
更に、本発明は、前記検査方法を行うための検査キットとして、エクソソーム中のCKAP4を検出するための試薬を提供する。CKAP4を検出するための試薬としては、特に制限されないが、例えば、抗CKAP4抗体、及びその断片等が挙げられる。抗CKAP4抗体には、必要に応じて、ビオチン、蛍光標識、磁気ビーズ等によって標識化されていてもよい。また、本発明の検査キットには、体液からエクソソームを分離するための試薬等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、実験データに基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００７４】
なお、以下、トランスフェクションした細胞について「X/Y細胞」（例えば、MDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞等）という形式で表記することがあるが、当該細胞は、X細胞にタンパク質YをコードしているDNAが形質導入された細胞を意味する。また、タンパク質について「A-B」(例えば、Dkk1-FLAG等)という形式で表記することがあるが、当該タンパク質はペプチドＡにペプチドＢ（タグ等）が融合しているタンパク質を意味する。また、トランスフェクションした細胞については、以下に作製方法を説明するもの以外についても、以下の作製方法に準じて、又は公知の遺伝子工学的手法に従って作製した。【００７５】
１．試験方法
１−１．Dkk1と結合するタンパク質の分離
FLAGエピトープ及びグリコシルフォスファチジルイノシトール（GPI）アンカーシグナル配列をC末端側に直列に挿入したDkk1遺伝子（Dkk1-FLAG-GPI）を有するレンチウイルスベクターを構築した。【００７６】
犬尿細管由来正常細胞であるMDCK細胞に前記ベクターを形質導入し、10μg/mlのブラストサイジンSを含むDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培地で、ヒトDkk1遺伝子（Dkk1-FLAG-GPI；ヒトDkk1の塩基配列を配列番号３に示し、Dkk1-FLAG-GPIの塩基配列を配列番号４に示す）が形質導入されたMDCK細胞（MDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞）のセレクションを行った。コンフルエントの状態のMDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞を含む10 cm培養ディッシュ3枚に、0.5 mg/mlのSulfo-NHS-LC-biotinを添加して、4℃で30分間インキュベートした後に、50 mMのNH4Clを含む1×PBS（5 ml）で3回洗浄した。次いで、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（10 μg/mlのLeupeptin及びAprotinin、1 mMのPMSF）を含むNP40バッファー（20 mMのTris-HCl pH 8.0、10%のグリセロール, 137 mMのNaCl、及び1%のNP40)1 mlを用いて細胞の溶解を行った。【００７７】
その後、10分間の遠心分離を行い、回収した上清1 mlにプロテインGセファロースビーズの50％スラリー20 μl添加して4℃で30分間振盪した。次いで、抗FLAG抗体（NOVUS）を添加して4℃で30分間振盪し、その後、更にプロテインGセファロースビーズの50％スラリー40μl添加して4℃で1時間振盪した。その後、ビーズを1 mlのNP40バッファーで3回洗浄し、更にTBS（25 mMのTris-HCl pH 7.4、150 mMのNaCl）で３回洗浄した。回収したビーズを、0.2 mg/mlのFLAGペプチドを含むTBS（50 μl）中で4℃で30分間のインキュベートを3回行うことにより溶出させた。溶出サンプル（〜150μl）にニュートラアビジンビーズの50％スラリー40μlを添加し、4℃で2時間振盪しながらインキュベートした。次いで、ビーズを、1 mlのNP40バッファーで2回、及び1 mlの10 mM Tris-HCl（pH 7.5）で１回洗浄した後に、Dkk1が結合している複合体を20 μlのLaemmli サンプルバッファーで溶出させた。その後、Dkk1と結合しているタンパク質をタンパク質銀染色によって検出した。17個のバンド（図２の(b)中の矢印）をゲルから切り出し、質量分析法によって分析した。【００７８】
１−２．Dkk1の極性分泌
Dkk1を発現するMDCK細胞（2×105 cells）をTranswell polycarbonate filter（Corning Costar Quality Biological, Gaithersburg, MD, USA）に播種した。48時間後に培地を交換し、更に24時間培養を行った。培養液中に分泌されたDkk1を検出するために、頂端側と基底側から得られた培養液にBlue Sepharoseを加えて、4℃で2時間インキュベートした後に、遠心分離を行った。次いで、沈殿物を回収し、抗Dkk1抗体を用いてDkk1の検出を行った。【００７９】
１−３．細胞株及び細胞培養
腎尿細管細胞MDCK type I（MDCK I）はDr. S. Tsukita（大阪大学）から供与されたもの、ヒト肺腺癌細胞A549及びNCI-H1579はDr. Y. Shintani（大阪大学）から供与されたもの、ヒト子宮頸癌細胞HeLaS3はDr. K. Matsumoto (名古屋大学) から供与されたもの、ヒト胃癌細胞AGS はDr. M. Hatakeyama (東京大学) から供与されたもの、 KKLSは Dr. W. Yasui (広島大学) から供与されたもの、ヒト肝芽腫細胞HepG2 は Dr. Y. Matsuura (大阪大学) から供与されたもの、ヒト肺腺癌細胞A549、Calu-6とヒト食道扁平上皮癌KYSE-70およびTE-11 は塩野義製薬株式会社から供与されたものを使用した。膵癌細胞S2-CP8及びSUIT-2は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから購入した。X293T細胞はタカラバイオ株式会社から購入した。【００８０】
これらの全ての細胞株は、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）、又はRPMI-1640で培養した。本試験に使用したcDNA又はshRNAを発現する細胞は、10％FBS及び10μg/mlブラストサイジン、又は800μg/ml G418（ジュネティシン）を含むDMEMで維持した。【００８１】
１−４．抗体
本試験で使用した抗体は、以下の表１に示す通りである。
【表１】
2016136372.tif 000002
【００８２】
１−５．細胞増殖アッセイ
MDCK I細胞、S2-CP8細胞、及びA549細胞を、1×105cell/mlとなるように35mmディッシュに播種した。MDCK I細胞については、10％FBSを含むDMEMで培養を行った。S2-CP8細胞及びA549細胞については、1％FBSを含むDMEMで培養を行った。所定日数経過後に細胞数を計測した。【００８３】
１−６．MDCK I細胞、S2-CP8細胞及びA549細胞の三次元培養
３次元培養による試験は、従来報告されている内容（(Matsumoto et al., EMBO J, 2014)に従って実施した。マトリゲル上（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）でのMDCK I細胞の嚢胞形成、S2-CP8細胞及びA549細胞の増殖を分析するために、先ず、40μlのマトリゲルを円形のスライドグラスに載せ、37℃で30分間インキュベートしてゲルを固化させた。次いで、10％FBS及び2％マトリゲルを含むDMEMに懸濁したMDCK I細胞（3×104 cells）、及び0.1％ウシ血清アルブミン及び2％マトリゲルを含むDMEMに懸濁したS2-CP8細胞又はA549細胞（2×104 cells）を、固化させたマトリゲルの上に添加し、培養を行った。【００８４】
１−７．腫瘍移植片分析
腫瘍移植片分析は、従来報告されている内容（Fujii et al., Oncogene, 2014）を改変した手法を用いて行った。6週齢の雄BALB/cAnNCrj-nuヌードマウス（Charles River Laboratory Japan Inc, Osaka, Japan）をメデトミジン（0.3 mg/kg体重）及びミダゾラム（4 mg/kg体重）で麻酔を行った後に、100 μlのリン酸緩衝液（PBS）に懸濁したS2-CP8細胞（5×106 cells）又はA549細胞（5×106 cells）を皮下注入した。次いで、移植21日後（S2-CP8細胞）及び移植28日後（A549細胞）のヌードマウスを分析に供した。【００８５】
抗体の効果を評価するために、平均腫瘍サイズが50 mm3に達した時点で、ヌードマウスを２つのグループに分けた。抗pCKAP4抗体（150 μg/body）、又は抗グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）抗体（150 μg/body）を、1週間に2回の頻度で2週間（at days 0, 4, 8, 12）（S2-CP8細胞）及び3.5週間（at days 0, 4, 9, 12, 16, 18, 22）（A549細胞）腹腔内に注入した。抗体投与から14日目（S2-CP8細胞）及び25日目（A549細胞）にヌードマウスを分析に供した。【００８６】
移植部位に形成された異種腫瘍組織片について、大きさと重量を測定し、更に免疫組織化学的分析に供した。腫瘍の大きさは、式：長径×短径×短径×0.5によって算出した。なお、本試験における全ての動物実験は、大阪大学動物実験委員会の承認（No.21-048-1）の下で行った。【００８７】
１−８．siRNAによるタンパク質発現のノックダウン
本試験において、ノックダウンの標的としたタンパク質の種類とその標的配列を表２に示す。RNAiMAX（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて、標的タンパク質に対するsiRNA（各々20 nM）の混合物を細胞に形質導入した。形質導入から36〜48時間後の細胞を用いて試験を行った。
【表２】
2016136372.tif 000003
【００８８】
１−９．プラスミドの構築
pcDNA3mycTEVflagにおけるFLAG-p110α、FLAG-p110β及びpCAGGSにおけるp85αは、Dr. T. Asano（広島大学）から供与されたものを使用した。A549 cDNAライブラリーからCKAP4 cDNAを増幅し、全ての変異体は一般的な手法で作成した。Dr. H. Miyoshi（理化学研究所）から供与されたCSII-CMV-MCS-IRES2-BsdにcDNAを挿入することにより、レンチウイルスベクターを構築した。Gateway technology （Invitrogen）を用いて、H1プロモーターとshRNAを含むオリゴDNAフラグメントをCS-RfA-EVBsd中にクローン化し、shRNAを含むレンチウイルスベクターを構築した。本試験で使用したshRNAの標的タンパク質とその標的配列を表３に示す。
【表３】
2016136372.tif 000004
【００８９】
１−１０．レンチウイルスの増幅及び安定な形質転換体の調製
FuGENE HD トランスフェクション試薬（Roche Applied Science, Basel, Switzerland）を用いて、パッケージングベクター（pCAG-HIV-gp及びpCMV-VSV-G-RSV-Rev）及びレンチウイルスベクターをX293T細胞にトランスフェクトし、レンチウイルスを増幅させた。また、条件培地及び10 μg/mLのポリブレンの存在下で各レンチウイルスを親細胞（5×104 cells/well in a 12-well plate）に導入した。細胞を1200×gで1時間遠心分離して回収し、更に24時間インキュベートすることにより、Dkk1-Flag、CKAP4-HA、Dkk1 shRNA、又はCKAP4 shRNAを安定に発現するMDCK I細胞、S2-CP8細胞、及びA549細胞を作製した。【００９０】
１−１１．免疫細胞化学的分析
細胞をスライドガラス上に播種し、4％パラホルムアルデヒドを用いて室温で20分間固定した。次いで、細胞をPBSで3回洗浄した後、1% BSA及び0.05% Tween-20を含むPBSで20分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体を添加して、終夜インキュベートした。PBSで細胞を3回洗浄した後に、蛍光標識二次抗体を添加して室温で1時間インキュベートした。その後、PBSでスライドガラスを十分に洗浄し、50%グリセロールを含むPBSをにより封入した。本試験の操作及び測定は、LSM510 system (Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd, Jena, Germany)を用いて行った。【００９１】
１−１２．患者及び癌組織
大阪大学附属病院にて2001年4月〜2015年4月に外科的処置を受けた膵癌患者（59名）、肺腺癌患者（67名）、肺扁平上皮癌患者（61名）、及び肺異型腺腫様過形成患者（11名）から切除された腫瘍組織片（標本）を用いて行った。何れも腫瘍病変に対して術前に化学療法及び放射線療法を施行されていない患者のみを対象とした。膵癌患者の年齢は47〜83歳であり、平均年齢は70歳であった。肺腺癌患者の年齢は39〜85歳であり、平均年齢は68歳であった。肺扁平上皮癌患者の年齢は38〜82歳であり、平均年齢は71歳であった。肺異型腺腫様過形成患者の年齢は58〜78歳であり、平均年齢は67歳であった。【００９２】
切除した各標本を顕微鏡観察し、腫瘍の局在部位とサイズを測定し、標本を10容量％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋ブロックを作製し組織学的分析を行った。試験に使用した標本は、4μmの厚みに切片化して、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）、又は免疫ペルオキシダーゼで染色し、各分析に供した。本試験は、大阪大学医学部倫理審査委員会の承認（No. 13455）の下で行った。【００９３】
１−１３．膵癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺異型腺腫様過形成組織におけるDkk1、CKAP4、及びpAKTの免疫組織化学的分析
免疫組織化学的分析は、従来報告されている内容（Fujii et al., Oncogene, 2014）を改変した手法を用いて行った。具体的手法の概要は以下の通りである。先ず、DakoRealTMEnVisionTM Detection System (Dako, Carpentaria, CA, USA)を用いて、その製造元の推奨する方法に従って、全ての組織切片を染色した。具体的には、先ず、Pascalプレッシャーチャンバー（Dako社製）を用いて抗原賦活化を行い、Dako REAL Peroxidase-Blocking Solutionを５分間反応させて非特異的結合サイトをブロックした。次いで、組織切片に対して、抗Dkk1抗体（1:100）、抗CKAP4抗体（1:100）、又はpAKT抗体(1:50)を用いて、4℃で16時間処理した。その後、組織切片に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識のヤギ抗マウスIgGを添加して1時間インキュベートした後に、ジアミノベンジジン（DAB）（Dako）を添加した。次いで、組織切片に0.1% (w/v)のヘマトキシリンで対比染色した。5％を超える領域が染色されていた腫瘍を、Dkk1陽性又はCKAP4陽性と分類した。【００９４】
１−１４．統計分析
統計分析は、JMP software（SAS Institute. Inc., Cary NC, USA）を用いて行った。結果の差は、術後無再発生存期間および全生存期間の検討は、Kaplan-Meier 法にてlog-rank testを用いた。Dkk1、CKAP4、及びDkk1とCKAP4の発現との相関については、各検定間の相関をモンテカルロシミュレーションによって計算し、多重補正係数を検定間の相関を考慮に入れながら計算し、元のP値を多重補正係数でかけるという方法で多重性に対応した。その他の検定は、スチューデントのt検定、もしくはマン・ホイットニーのU検定を用いて、統計学的優位性を検定した。P値が0.05未満の場合には、統計学的に有意差があるとみなした。【００９５】
２．試験結果
２−１．Dkk1が細胞の増殖能に与える影響
Dkk1遺伝子（Dkk1-FLAG）を発現したMDCK細胞において、C末端側がFLAGタグ化されたDkk1が発現していることを確認した結果を図１の(a)の上図に示す。図１の(a)に示すコントロールは、親細胞であるMDCK細胞を使用した結果である。また、HSP90は、ローディングコントロールとして使用した。図１の(a)の下図には、Transwell polycarbonate filter上で培養したMDCK/Dkk1-FLAG細胞を培養し、頂底極性を確立した後に、頂端側と側底側に分けてDkk1の発現を分析した結果である。図１の(a)の下図において、Apは頂端側、Blは基底側を指している。この結果から、Dkk1遺伝子（Dkk1-FLAG）が形質導入されたMDCK細胞（MDCK/Dkk1-FLAG細胞）において、C末端側がFLAGタグ化されたDkk1が安定的に発現し、極性化したMDCK細胞において頂上側有意にDkk1-FLAGが分泌されることが確認された。【００９６】
また、MDCK/Dkk1-FLAG細胞をTranswell polycarbonate filter上で固定化し、細胞を抗Dkk1抗体（緑色）、抗E-カドヘリン抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した結果を図１の(b)に示す。E-カドヘリンは、側底膜のマーカーとして使用した。図１の(b)中、Apは頂端側、Blは側底側を指し、スケールバーは20μmである。この結果から、MDCK/Dkk1-FLAG細胞においてDkk1-FLAGは頂端膜に局在していることが確認された。【００９７】
胎生13日目（day E13）マウスの腎臓の組織切片をパラフィン包理し、抗Dkk1抗体で免疫染色した結果を図１の(c)に示す。図１の(c)の右上図は、左上図の枠内の拡大図である。図１の(c)の右上図に示すスケールバーは100μmである。図１の(c)の下図には、当該組織片を抗Dkk1抗体（緑色）、及び抗aPKC抗体（赤色）で免疫染色した結果を示す。aPKCは、頂端側膜のマーカーである。図１の(c)の白矢印は頂端側膜に局在するDkk1を示す。図１の(c)の下図に示すスケールバーは20 μmである。この結果から、Dkk1は胎児腎の尿管において頂上側に発現していることが明らかとなった。【００９８】
MDCK/Dkk1-FLAG細胞をマトリゲル上で三次元的に５日間培養した。また、コントロールとして野生型MDCK細胞を使用した。形成された嚢胞の外径を測定した（n=50）。その結果を図１の(d)に示す。また、マトリゲル上で三次元的に培養した嚢胞を固定化した後に、抗Ki67抗体（緑色）、抗aPKC抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した。その結果を図１の(e)に示す。Ki67陽性率は、各嚢胞においてDRAQ5で染色された細胞数に対するKi67で染色された細胞数の割合として算出した（n=50）。図１の(d)及び(e)において、中央値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、*はP < 0.05、**はP < 0.01、(d)のスケールバーは100μm、(e)のスケールバーは20μmである。これらの結果から、MDCK/Dkk1-FLAG細胞は、MDCK細胞に比して増殖能が亢進しており、Dkk1が細胞の増殖能を亢進させていることが確認された。【００９９】
MDCK細胞をTranswell polycarbonate filter上で二次元的に5日間培養した後に、250 ng/mlのDkk1を頂端側又は基底側に添加して24時間培養を行った。次いで、細胞を固定化した後に、抗Ki67抗体（赤色）、及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した。得られた結果を図１の(f)に示す。Ki67陽性率は、核染色された細胞数に対して抗Ki67抗体で染色された細胞数の割合として算出した（5視野）。また、結果は、3回の独立した試験の平均値±s.d.として示した。図１の(f)中、NTはDkk1を添加しなかった場合、APは頂端側にDkk1を添加した場合、及びBlは基底側にDkk1を添加した場合を示し、**はP < 0.01であり、スケールバーは20μmである。この結果から、Dkk1を添加することにより、細胞増殖マーカーであるKi67の発現量が増加し、特に頂端側にDkk1をした場合にKi67の発現量が著しく高くなることが明らかとなった。すなわち、Dkk1が作用する受容体が頂端側に存在する可能性が示唆された。【０１００】
MDCK/Dkk1-FLAG細胞を3日間二次元的に培養し、細胞数を計測した。得られた結果を図１の(g)に示す。なお、コントロールとしてMDCK細胞を使用した。この結果からも、MDCK/Dkk1-FLAG細胞では、コントロールに比して増殖能が高く、Dkk1が細胞増殖を亢進していることが確認された。【０１０１】
２−２．Dkk1と結合するタンパク質の同定
頂端側表面にあるDkk1結合タンパク質をスクリーニングした実験手順の概略図を図２の(a)に示す。Dkk1結合タンパク質を精製し、銀染色を行った結果を図２の(b)に示す。Dkk1-FLAG-GPIに結合するタンパク質として溶出された17個のバンドについて、質量分析を行ったところ、図２の(b)の右側の表に示すタンパク質が検出され、その内、CKAP4はバンド１０として検出された。【０１０２】
コントロール（野生型MDCK細胞）、MDCK/Dkk1-FLAG細胞、又はMDCK/Dkk1-FLAG-GPI細胞の溶解液（Input）を抗FLAG抗体で免疫沈降させた。次いで、溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗CKAP4抗体、抗LRP6抗体、又は抗Dkk1抗体を用いてCKAP4、LRP6又はDKK1の検出を行った。その結果を図２の(c)に示す。なお、LRP6は、既知のDkk1結合タンパク質であり、陽性コントロールである。この結果から、CKAP4がLRP6と同様にDkk1と複合体を形成することが明らかとなり、CKAP4がDkk1結合タンパク質であるという従来にない新たな知見が得られた。【０１０３】
図２の(d)の上図に、本試験で使用したDkk1のドメイン構造の概略図を示す。図２の(d)の上図において、Sはシグナルペプチド領域を示す。【０１０４】
また、コントロール（MDCK細胞）、及び野生型Dkk1-FLAG（WT）又は欠失変異体Dkk1-FLAG（ΔCRD-1、ΔCRD-2）を発現するMDCK細胞の溶解液（Input）を抗FLAG抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗CKAP4抗体、抗LRP6抗体、又は抗Dkk1抗体を用いて、CKAP4、LRP6又はDkk1の検出を行った。その結果を図２の(d)の下図に示す。図２の(d)の下図から明らかなように、WT -FLAGとΔCRD-2-FLAGはCKAP4と複合体を形成したが、ΔCRD-1 -FLAGとは複合体を形成しなかった。これまでの報告に一致して、WT-FLAGとΔCRD-2-FLAGはLRP6と複合体を形成したが、ΔCRD-2-FLAGとLRP6は複合体を形成しなかった。従って、Dkk1は異なる領域を介してCKAP4、LRP6と複合体を形成していることが明らかとなった。【０１０５】
図２の(e)の上図に、本試験で使用したCKAP4のドメイン構造の概略図を示す。図２の(e)の上図において、ICDは細胞内ドメイン、ECDは細胞外ドメイン、Eは小胞体アンカードメイン、MBは微小管結合ドメイン、Mは膜貫通ドメイン、Tはチロシン硫酸化領域、LZはロイシンジッパー領域、αはアルファへリックス領域を示す。【０１０６】
野生型CKAP4-HA（WT）又は欠失変異体CKAP4-HA（ECD、ΔC1、ΔC2、ΔC3）を一時的に発現させたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）を抗FLAG抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗HA抗体又は抗Dkk1抗体でプローブした。その結果を図２の(e)の左下図に示す。この結果から、CKAP4の細胞外領域において、Dkk1はΔC1と複合体を形成するが、ΔC2、ΔC3と複合体を形成しないことが明らかになった。すなわち、Dkk1のN端側とCKAP4のロイシンジッパー領域が結合する可能性が示唆された。【０１０７】
更に、前記と同様に、野生型CKAP4-HA（WT）又は欠失変異体CKAP4-HA（ΔLZ）を一時的に発現させたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液（Input）を抗FLAG抗体で免疫沈降させ後に、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗HA抗体又は抗Dkk1抗体を用いて、HA及びDkk1の検出を行った。その結果を図２の(e)の右下図に示す。この結果から、Dkk1はΔLZと複合体を形成しないことが明らかになった。すなわち、Dkk1のN端側のCRD-1領域とCKAP4のロイシンジッパー領域が、Dkk1とCKAP4との結合に必要であることが確認された。【０１０８】
CKAP4の細胞外ドメイン（ECD）（配列番号１に示すアミノ酸配列の128〜602位）のN末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を連結させたポリペプチド（GST-CKAP4-ECD）（細胞内ドメインが欠失している改変体）を準備した。NP40バッファー500μl中で、0.5 nMのGST-CKAP4-ECD又は0.5 nMのGSTを0〜16 nMのDkk1（R&D Systems）と4℃で2時間反応させた。次いで、遠心分離によりGST-CKAP4-ECD及びGSTを回収し、NP40バッファーで3回洗浄した。得られた沈殿物に対して、抗Dkk1抗体を用いてDkk1の検出を行った。その結果を図３の(a)及び(b)に示す。この結果から、Dkk1は、CKAP4の細胞外ドメインに直接結合することが確認された。【０１０９】
２−３．Dkk1がMDCK細胞におけるAKTリン酸化及び増殖促進に及ぼす影響の確認
MDCK細胞（WT）、MDCK/Dkk1-FLAG細胞（Dkk1-FLAG）、又はMDCK/Dkk1-GPI1-FLAG細胞（Dkk1-FLAG-GPI）の溶解液に対して、図４の(a)に示す各種タンパク質に対する抗体を反応させた。その結果、図４の(a)に示すように、MDCK細胞において、Dkk1を過剰発現することによりAKTのリン酸化が促進したが、ErK1/2、JNK、Srcのリン酸化の亢進は認められなかった。すなわち、Dkk1がAKTを活性化することが示唆された。【０１１０】
MDCK細胞を1 nMのノコダゾールで24時間処理した後に、250 ng/mlのDkk1を含む調整液、又はDkk1を含まない調整液でMDCK細胞を60分間刺激した。刺激開始から0、10、30及び60分後に細胞を回収して細胞の溶解液を作製した。次いで、細胞の溶解液に対して、抗pAKT抗体、抗AKT抗体、及び抗クラスリン抗体を用いて、pAKT、AKT及びクラスリンの検出を行った。クラスリンは、ローディングコントロールとして使用した。得られた結果を図４の(b)に示す。この結果から、Dkk1の存在下で、MDCK細胞のAKTのリン酸化を促進していることが示され、Dkk1がAKTを時間依存的に活性化することが示唆された。【０１１１】
MDCK細胞（コントロール）又はMDCK/Dkk1-FLAG細胞（Dkk1-FLAG）に、コントロールsiRNA又はCKAP4 siRNAを形質導入した。得られた細胞に対して細胞増殖アッセイを行った。得られた結果を図４の(c)に示す。この結果から、Dkk1を発現する細胞においてCKAP4の発現を抑制した場合に細胞増殖能の低下が認められ、Dkk1がCKAP4を介して細胞増殖を亢進していることが確認された。【０１１２】
MDCK細胞（コントロール）又はMDCK/Dkk1-FLAG細胞に、コントロールsiRNA又はCKAP4 siRNAを形質導入した。得られた細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、図４の(d)に示す各種タンパク質に対する抗体を反応させて、当該各種タンパク質の検出を行った。得られた結果を図４の(d)に示す。この結果、Dkk1が発現している場合にCKAP4の発現を抑制することにより、有意にAKTのリン酸化が減少した。従って、MDCK細胞におけるAKTの活性化にDkk1およびCKAP4が必要であることが示唆された。【０１１３】
CKAP4によるAKTの活性化機構を明らかにするために、コントロール（MDCK細胞）及び野生型(wild type)Dkk1-FLAG（WT）を過剰発現するMDCK細胞（MDCK/Dkk1-FLAG）の溶解液（Input）を抗CKAP4抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p85α抗体、抗ｐ110α抗体、抗CKAP4抗体、及び抗Dkk1抗体を用いて、p85α、ｐ110α、CKAP4及びDkk1の検出を行った。その結果を図５の(a)及び(b)に示す。この結果から、Dkk1を過剰発現している細胞では、CKAP4はPI3Kを構成するp85α及びｐ110αと結合することが明らかとなった。即ち、本結果から、CKAP4はDkk1を過剰発現している細胞においてPI3Kと結合し、AKTを活性化させていることが示唆された。【０１１４】
X293T/Dkk1-FLAG細胞に、p85αと共に、CKAP4-HA又はCKAP4-ECD-HA を発現した。得られた細胞の溶解液（Input）を作製した。また、得られた溶解液を抗HA抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p85α抗体又は抗HA抗体を用いてp85α及びCKAP4の検出を行った。得られた結果を図５の(c)に示す。この結果から、Dkk1依存性のCKAP4とp85αの結合にはCKAP4の細胞内領域が必要であることが明らかとなった。【０１１５】
X293T/Dkk1-FLAG細胞に、FLAG-p110βと共に、CKAP4-HA又はCKAP4-HA ECDを発現した。得られた細胞の溶解液（Input）を作製した。また、得られた溶解液を抗HA抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p110β抗体又は抗HA抗体を用いてp110β及びCKAP4の検出を行った。得られた結果を図５の(d)に示す。この結果から、Dkk1依存性のCKAP4とp110βの結合にはCKAP4の細胞内領域が必要であることが明らかとなった。【０１１６】
コントロールshRNA又はDkk1 shRNA (Dkk1)を安定に発現するS2-CP8細胞の溶解液（Input）を作製した。また、得られた溶解液を抗CKAP4抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p85α抗体、抗ｐ110β抗体、抗CKAP4抗体、及び抗Dkk1抗体を用いて、p85α、ｐ110β、CKAP4及びDkk1の検出を行った。その結果を図５の(e)及び(f)に示す。この結果から、S2-CP8細胞においてもDkk1依存的にCKAP4とp85α及びp110βが複合体を形成することが明らかとなった。【０１１７】
図５の(g)の上図に、CKAP4のプロリンリッチ領域のアミノ酸配列を示す。図５の(g)の上図に示すように、CKAP4のプロリンリッチ領域のプロリンの一部をアラニンに置換したCKAP4の変異体（PA mutant-CKAP4-HA）をコードする遺伝子を作製した。CKAP4-HA又はPA mutant-CKAP4-HAをコードする遺伝子をトランスフェクトしたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液に対して抗HA抗体又は非免疫抗体で免疫沈降させた。細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p85α抗体及び抗HA抗を用いて、p85α及びHAの検出を行った。その結果を図５の(g)の下図に示す。この結果から、CKAP4のプロリンリッチ領域におけるプロリンをアラニンに置換すると、CKAP4とPI3Kの結合が阻害されることが確認された。【０１１８】
図５の(h)の上図に、p85αのドメイン構造の模式図を示す。図５の(h)の上図に示すように、野生型のp85α（WT）（GFP-WT）、SH3ドメインが欠失しているΔSH3（GFP-ΔSH3）、SH2及びiSH2ドメインが欠失しているΔSH2（GFP-ΔSH）をコードする遺伝子を作製した。GFP-WT、GFP-ΔSH3又はGFP-ΔSHをコードする遺伝子をトランスフェクトしたX293T/Dkk1-FLAG細胞の溶解液に対して抗CKAP4抗体又は非免疫抗体で免疫沈降させた。細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗GFP（p85α）抗体及び抗CKAP4抗体を用いて、GFP（p85α）及びCKAP4の検出を行った。その結果を図５の(h)の下図に示す。この結果から、p85α（PI3K）のSH3ドメインがCKAP4との結合に関与していることが明らかとなった。【０１１９】
２−４．培養細胞株におけるDkk1とCKAP4の発現の確認
肺癌細胞（A549、Calu-6、及びNCl-H1579）、膵癌細胞（SUIT-2及びS2-CP8）、子宮頸管癌細胞（HeLaS3）、胃癌細胞（AGS及びKKLS）、食道扁平上皮癌細胞（KYSE-70及びTE-11）、肝芽腫細胞（HepG2）、及び胎児由来腎臓細胞（X239T）の溶解液に、抗Dkk1抗体、抗CKAP4抗体及び抗HSP90抗体を反応させ、Dkk1、CKAP4、及びHSP90（コントロール）量を測定した。得られた結果を図６に示す。この結果から、Dkk1は正常細胞では発現しておらず、癌細胞の一部で発現している一方、CKAP4はいずれの細胞においても発現していることが確認された。【０１２０】
２−５．膵癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌における腫瘍組織特異的なDkk1及びCKAP4の発現と予後の相関の確認
膵癌患者から摘出した膵癌組織(n=59)に対して抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を図７の(a)の左図に示す。図７の(a)の左上図において枠で囲んだ領域は腫瘍領域の拡大像、右上図において枠で囲んだ領域は非腫瘍領域の拡大像である。図７の(a)の左図中のスケールバーは、50 μmである。また、図７の(a)の右図において、腫瘍領域においてDkk1又はCKAP4が発現している領域が5％以上20％未満の症例をlow、20％以上50％未満の症例をmedium、50％以上の症例をhighとした。5%以下の発現はnegativeとした。この結果から、膵癌症例においてDkk1が76.3％、CKAP4が66.1％という高頻度で発現していることが確認された。更に、図７の(b)および(c)に、各検体をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と全生存率および無再発生存率の関係を分析した結果を示す。これらの結果から、Dkk1とCKAP4の双方を発現している膵癌患者では、術後全生存期間および無再発生存期間の短縮が認められることが明らかとなった。【０１２１】
肺腺癌組織（n=67）に対して抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を図８の(a)の左図に示す。図８の(a)の左図において枠で囲んだ領域は、腫瘍領域および非腫瘍領域の拡大像である。図８の(a)の左図中のスケールバーは、100 μmである。また、図８の(a)の右図において、腫瘍領域においてDkk1又はCKAP4が発現している領域が5％以上20％未満の症例をlow、20％以上50％未満の症例をmedium、50％以上の症例をhighとした。5%以下の発現はnegativeとした。この結果から、肺腺癌症例においても、Dkk1が79.1％、CKAP4が74.6％という高頻度で発現していることが確認された。更に、図８の(b)に、各検体をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と無再発生存率の関係を分析した結果を示す。これらの結果から、Dkk1とCKAP4の双方を発現している肺腺癌患者では、無再発生存期間の短縮が認められることが明らかとなった。【０１２２】
更に、肺扁平上皮癌患者から摘出した肺扁平上皮癌組織(n=61)を抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を図８の(c)の左図に示す。図８の(c)の左図において枠で囲んだ領域は、腫瘍領域および非腫瘍領域の拡大像である。図８の(c)の左図中のスケールバーは、100 μmである。また、図８の(c)の右図において、腫瘍領域においてDkk1又はCKAP4が発現している領域が5％以上20％未満の症例をlow、20％以上50％未満の症例をmedium、50％以上の症例をhighとした。5%以下の発現はnegativeとした。これらの結果から、肺扁平上皮癌でも、Dkk1が73.8％、CKAP4が768.9％という高頻度で発現していることが確認された。更に、図８の(d)に、各検体をDkk1とCKAP4の発現の有無に基づいて分類し、術後日数と無再発生存率の関係を分析した結果を示す。これらの結果から、Dkk1とCKAP4の双方を発現している肺扁平上皮癌患者でも、無再発生存期間の短縮が認められることが明らかとなった。【０１２３】
また、肺異型腺腫様過形成（AAH）を示す肺組織（n=11）に対して抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した結果を図８の(e)の左図に示す。図８の(e)の左図において枠で囲んだ領域は、腫瘍領域および非腫瘍領域の拡大像である。図８の(e)の左図中のスケールバーは、100 μmである。また、図８の(e)の右図において、AAHにおいてDkk1又はCKAP4が発現している領域が5％以上20％未満の症例をlow、20％以上50％未満の症例をmiddle、50％以上の症例をhighとした。5%以下の発現はnegativeとした。この結果から、AAHにおいてはDkk1陽性でもCKAP4は陰性であり、AAHが前癌病変であることを考えあわせると、CKAP4の発現が肺癌の前癌病変から癌への移行に伴う可能性が示唆された。【０１２４】
２−６．ヒト膵癌、ヒト肺腺癌、及びヒト肺扁平上皮癌におけるDkk1及びCKAP4の発現とAKT活性化の確認
ヒト膵癌、ヒト肺腺癌、及びヒト肺扁平上皮癌の各癌組織に対して抗Dkk1抗体、抗CKAP4抗体、又は抗pAKT抗体とヘマトキシリンで免疫染色した。得られた結果を図９に示す。図９中、黒色のボックスは拡大像を示し、バーのスケールは200μmである。この結果から、試験に供したヒト膵癌、ヒト肺腺癌、及びヒト肺扁平上皮癌において、Dkk1及びCKAP4を発現している腫瘍領域では、AKTが活性化していることが確認された。【０１２５】
２−７．Dkk1-CKAP4シグナルが癌細胞の増殖に与える影響の確認
S2-CP8細胞に、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、Dkk1shRNA及びDkk1-FLAG、CKAP4 shRNA、又はCKAP4shRNA及びCKAP4-HAを形質導入した。得られた細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、図１０の(a)の上図に示す各種タンパク質に対する抗体を用いて、当該各タンパク質の検出を行った。また、得られた細胞について、細胞増殖アッセイを行った。得られた結果を図１０の(a)の下図に示す。この結果から、S2-CP8細胞においてDkk1又はCKAP4の発現を抑制することにより、AKTの活性が阻害され細胞増殖能を低減させ、各々に対してDkk1又はCKAP4の過剰発現することによって、AKTの活性と細胞増殖が回復し得ることが確認された。【０１２６】
A549細胞に、コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、Dkk1 shRNA及びDkk1-FLAG、CKAP4  shRNA、又はCKAP4 shRNA及びCKAP4-HAを形質導入した。得られた細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、図１０の(b)の上図に示す各種タンパク質に対する抗体を用いて、当該各タンパク質の検出を行った。また、得られた細胞について、細胞増殖アッセイを行った。得られた結果を図１０の(b)の下図に示す。この結果から、A549細胞においてDkk1又はCKAP4の発現を抑制することにより、AKTの活性が阻害され細胞増殖能を低減させ、各々に対してDkk1又はCKAP4の過剰発現することによってAKTの活性と細胞増殖が回復し得ることが確認された。【０１２７】
コントロールshRNA、Dkk1 shRNA、Dkk1 shRNA及びDkk1-FLAG、CKAP4 shRNA、又はCKAP4 sｈRNA及びCKAP4-HAを発現するS2-CP8細胞（2×104 cells）又はA549細胞（2×104 cells）をマトリゲル上で三次元的に５日間培養した。1 mm2当たりの細胞凝集塊数（5視野）を測定した。得られた結果を図１０の(c)及び(d)に示す。この結果から、Dkk1又はCKAP4の発現を抑制しているS2-CP8細胞およびA549細胞では、コントロールに比べて細胞凝集塊数が低下しており、Dkk1又はCKAP4の発現を抑制することによって、腫瘍形成を抑制し、各々に対してDkk1又はCKAP4の過剰発現することによって腫瘍形成が回復し得ることが確認された。【０１２８】
コントロールshRNA、CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNA及びCKAP4-HAを発現するS2-CP8細胞（5×106 cells）をヌードマウスの背部に皮下注入した。21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。得られた結果を図１１の(a)に示す。図１１の(a)の左図に21日後のヌードマウスを上部から観察した結果および摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。図１１の(a)において、点線は異種腫瘍組織片の輪郭を示しており、スケールバーは10 mmである。また、図１１の(a)の中図に腫瘍組織片の大きさを測定した結果、右図に異種腫瘍組織片の重量を測定した結果を示す。図１１の(a)の右図において、中央値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、*はP<0.05、**はP<0.01である。この結果から、CKAP4の発現を抑制することによって、S2-CP8細胞による腫瘍形成能を低減でき、CKAP4の過剰発現によって回復することが確認された。【０１２９】
コントロールshRNA、CKAP4 shRNA、又はCKAP4 shRNA及びCKAP4-HAを発現するA549細胞（5×106 cells）をヌードマウスの背部に皮下注入した。28日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。得られた結果を図１１の(ｂ)に示す。図１１の(b)の左図に28日後のヌードマウスを上部から観察した結果および摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。図１１の(b)において、点線は異種腫瘍組織片の輪郭を示しており、スケールバーは10 mmである。また、図１１の(b)の中図に腫瘍組織片の大きさを測定した結果、右図に異種腫瘍組織片の重量を測定した結果を示す。図１１の(b)の右図において、中央値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、*はP<0.05、**はP<0.01である。この結果から、CKAP4の発現を抑制することによって、A549細胞による腫瘍形成能を低減でき、CKAP4の過剰発現によって回復することが確認された。【０１３０】
コントロールshRNA、又はDkk1 shRNAを発現するS2-CP8細胞（5×106 cells）をヌードマウスの背部に皮下注入した。21日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。得られた結果を図１１の(c)に示す。図１１の(c)の左図に21日後のヌードマウスを上部から観察した結果および摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。図１１の(c)において、点線は異種腫瘍組織片の輪郭を示しており、スケールバーは10 mmである。また、図１１の(a)の中図に腫瘍組織片の大きさを測定した結果、右図に異種腫瘍組織片の重量を測定した結果を示す。図１１の(a)の右図において、中央値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、*はP<0.05、**はP<0.01である。この結果から、Dkk1の発現を抑制することによって、S2-CP8細胞による腫瘍形成能を低減できることが確認された。【０１３１】
コントロールshRNA、又はDkk1 shRNAを発現するA549細胞（5×106 cells）をヌードマウスの背部に皮下注入した。28日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。得られた結果を図１１の(d)に示す。図１１の(d)の左図に28日後のヌードマウスを上部から観察した結果および摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。図１１の(d)において、点線は異種腫瘍組織片の輪郭を示しており、スケールバーは10 mmである。また、図１１の(d)の中図に腫瘍組織片の大きさを測定した結果、右図に異種腫瘍組織片の重量を測定した結果を示す。図１１の(d)の右図において、中央値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、*はP<0.05、**はP<0.01である。この結果から、Dkk1の発現を抑制することによって、A549細胞による腫瘍形成能を低減できることが確認された。【０１３２】
２−８．抗CKAP4抗体によるDkk1とCKAP4の結合阻害効果の確認とDkk1及びCKAP4を発現する癌細胞における増殖抑制効果の確認
図１２の(a)の左図に、ポリクローナル抗CKAP4抗体（CKAP4 pAb）の抗原部位を示す。【０１３３】
S2-CP8細胞（コントロール）、又はCKAP4 cDNA又はCKAP4 shRNAを発現するS2-CP8細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して抗CKAP4抗体を用いてCKAP4の検出を行った。得られた結果を図１２の(a)の右図に示す。この結果から、CKAP4 cDNAを発現するS2-CP8細胞では、CKAP4の発現量がコントロールに比較して増加し、CKAP4 shRNAを発現するS2-CP8細胞では、コントロールに比べてCKAP4の発現量を抑制できていることが確認された。したがって、作製したCKAP4抗体が正しく作用していることが示された。【０１３４】
コラーゲンをコートしたスライドガラス上で増殖させたS2-CP8細胞を未固定で抗CKAP4抗体（緑色）で染色した。また、アクチン細胞骨格及び核をファロイジン（赤色）及びDRAQ5 DNA Dye（青色）で染色した。得られた結果を図１２の(b)に示す。この結果から、S2-CP8細胞の細胞膜には、CKAP4が強く発現していることが確認された。【０１３５】
また、NP40バッファー500μl中で、2 nMのGST-CKAP4-ECDと20 nMの抗CKAP4抗体（図１２の(a)に示すCKAP4の細胞外ドメインを抗原部位とするラビット抗CKAP4ポリクローナル抗体）又は抗GST抗体を混合した後に、2.5 nMのDkk1を添加して2時間インキュベートした。得られた沈殿物に対して、抗Dkk1抗体を用いてDkk1の検出を行った。得られた結果を図１２の(c)に示す。この結果から、抗CKAP4抗体によってDkk1とCKAP4の結合が阻害されることが確認された。【０１３６】
MDCK細胞を1 nMのノコダゾールで24時間処理した後に、25 μg/mlの抗CKAP4抗体又は抗GST抗体と共に4時間インキュベートした。次いで、細胞を、抗CKAP4抗体又は抗GST抗体の存在下で、250 ng/ml Dkk1又は1 nMインスリンで30分間刺激した。その後、細胞を回収して細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、抗pAKT抗体、抗AKT抗体、及び抗クラスリン抗体を用いてpAKT、AKT及びクラスリンの検出を行った。抗GST抗体はコントロールとして使用し、クラスリンはローディングコントロールとして使用した。得られた結果を図１２の(d)に示す。この結果から、抗CKAP4抗体はDkk1依存性のAKTの活性化は抑制するが、インスリン依存性のAKTの活性には影響しないことが確認された。【０１３７】
S2-CP8細胞、又はA549細胞を5 μg/mlの抗CKAP4抗体又は抗GST抗体と共に4時間インキュベートした。その後、細胞を回収して細胞の溶解液を作製し、当該溶解液に対して、抗pAKT抗体、抗AKT抗体、及び抗クラスリン抗体を用いてpAKT、AKT及びクラスリンの検出を行った。抗GST抗体はコントロールとして使用し、クラスリンはローディングコントロールとして使用した。得られた結果を図１２の(e)に示す。この結果から、抗CKAP4抗体は癌細胞のAKTの活性化は抑制することが確認された。【０１３８】
抗GST抗体5 μg/ml、又は抗CKAP4抗体5 μg/mlの存在下で、S2-CP8細胞（2×104 cells）、又はA549細胞（2×104 cells）をマトリゲル上で三次元的に５日間培養し、1 視野当たりの細胞凝集塊数を計測した（5視野）。抗GST抗体はコントロールとして使用した。得られた結果を図１２の(f)に示す。**はP<0.01である。この結果から、抗CKAP4抗体によりS2-CP8細胞及びA549細胞では、細胞凝集塊数が低下しており、抗CKAP4抗体はS2-CP8細胞およびA549細胞のin vitroにおける腫瘍形成能を抑制し得ることが確認された。【０１３９】
更に、抗GST抗体25 μg/ml、抗CKAP4抗体12.5 μg/ml、又は抗CKAP4抗体25 μg/mlの存在下で、S2-CP8細胞（2×104 cells）をマトリゲル上で三次元的に7日間培養し、1 mm2当たりの細胞凝集塊数を計測した。得られた結果を図１２の(g)に示す。図１２の(g)の上図のスケールバーは200 μmである。また、図１２の(g)の下図において、平均値は太線、ボックスは25th〜75thパーセンタイルの範囲、エラーバーは5th〜95thパーセンタイルの範囲、**はP<0.01である。この結果からも、抗CKAP4抗体はS2-CP8細胞のin vitroにおける腫瘍形成能を抑制し得ることが確認された。【０１４０】
大阪府立成人病センターにて同意の得られた癌患者2名より、外科検体もしくは胸水の提供を受けた。2つの検体（LC189及びLB95）を機械的、酵素的に分散させ、40〜250μmの組織片を回収してStemPro hESC (Invitrogen, Carlsbad, CA)で浮遊培養し、cancer tissue-originated spheroid（CTOS）を得た。得られたCTOSをNOD/scidマウスに移植して飼育を行い、マウスの移植部位の移植腫瘍を形成させた。その後、移植腫瘍より作製した切片に対して抗Dkk1抗体又は抗CKAP4抗体とヘマトキシリンで免疫染色した。得られた結果を図１２の(h)に示す。その結果、検体LC189の移植腫瘍はDkk1及びCKAP4の発現量が共に高く、検体LB95の移植腫瘍ではDkk1及びCKAP4の発現が認められないことが確認された。【０１４１】
次いで、前記で得られた移植腫瘍から再度CTOSを単離・凍結保存したものを融解後、以下の増殖アッセイに供した。増殖アッセイは、具体的には、CTOSをmatrigel Growth Factor Reduced (GFR) (BD Biosciences, Bedford, MA)に埋め、各濃度の抗CKAP4抗体又は抗GST抗体を含むStemPro hESC培地中で37℃で7日間培養した。培養期間中に、CTOSの面積をImage J. (National Institutes of Health, Bethesda, MD)で計測し、培養開始時のCTOSの面積に対する培養7日後のCTOSの面積を求めた（抗体を添加していない条件はn=6、抗体を添加した条件はn=12）。得られた結果を図１２の(i)に示す。図１２の(i)中、**はP<0.01、***はP<0.001である。この結果から、Dkk1及びCKAP4の発現量が低い検体LB95のCTOSでは抗CKAP4抗体の存在下でも増殖抑制効果が認められなかったが、Dkk1及びCKAP4の発現量が高い検体LC189のCTOSでは抗CKAP4抗体の存在下で増殖抑制効果が有意に求められた。【０１４２】
ヒト膵癌細胞（S2-CP8）（5×106 cells）又はヒト肺癌細胞（A549）（5×106 cells）をヌードマウスの背部に皮下注入した。平均腫瘍サイズが50 mm3に達した時点で、ヌードマウスを無作為に２つのグループに分けた。抗pCKAP4抗体（150 μg/body）（n=6）、又は抗グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）抗体（150 μg/body）（n=6）を、1週間に2回の頻度で、S2-CP8細胞では2週間（at days 0, 4, 8, 12）、A549細胞では3.5週間（at days 0, 4, 9, 12, 16, 18, 22）腹腔内に注入した。S2-CP8細胞では14日後に、A549細胞では25日後に、ヌードマウスの移植部位の異種腫瘍組織片を分析した。ヒト膵癌細胞（S2-CP8）の場合の結果を図１３の(a)に示し、ヒト肺癌細胞（A549）（5×106 cells）の場合の結果を図１３の(b)に示す。図１３の(a)及び(b)の左図に14日後のヌードマウスを上部から観察した結果、(a)及び(b)の左下図に摘出した異種腫瘍組織片を観察した結果を示す。図１３の(a)及び(b)の左上図において、点線は異種腫瘍組織片の輪郭を示しており、図１３の(a)及び(b)の左上図と左下図のスケールバーは10 mmである。また、図１３の(a)及び(b)の中図に異種腫瘍組織片の体積を、図１３(a)および(b)の右図に重量を、測定した結果を示す。図１３の(a)及び(b)の左図において結果は平均値±s.d.で示す。*はP<0.05、**はP<0.01である。この結果から、抗CKAP4抗体の投与によって、膵癌細胞（S2-CP8）及び肺癌細胞（A549）による腫瘍形成能を低減できることが確認された。【０１４３】
２−９．エクソソームにおけるCKAP4発現と癌との関連性の確認
膵癌細胞(SUIT-2及びS2-CP8)、肺癌細胞(A549及びCalu-6)、胎児由来正常腎臓細胞 (X293T)、及び犬尿細管由来正常細胞(MDCK)を10cmディッシュで80〜90％コンフルエントな状態になるまで培養した後に、培養上清を回収した。培養上清を2,000×gで10分間の条件にて遠心分離した後に、更に10,000×gで10分間の条件で遠心分離を行い、細胞破砕物を分離した。回収した上清を4℃、100,000×g、3時間の条件で超遠心分離し、エクソソームペレットを得た。エクソソームペレットを1.2 mlのPBSで洗浄した後に、再度、4℃、100,000×g、2時間の条件で超遠心分離に供した。その後、上清を廃棄してエクソソームを回収し、エクソソームをLaemmliサンプルバッファーに溶解させた。エクソソームと各細胞の溶解液に対して、抗CKAP4抗体、抗TSG101抗体、及び抗クラスリン抗体を用いて、CKAP4、TSG101及びクラスリンの検出を行った。【０１４４】
得られた結果を図１４に示す。この結果から、膵癌細胞及び肺癌細胞の培養上清に含まれるエクソソームではCKAP4が検出されたのに対し、正常細胞の培養上清に含まれるエクソソームではCKAP4は検出されなかった。すなわち、エクソソーム中のCKAP4を指標とすることにより、癌の罹患の有無の診断が可能になることが確認された。
【図１】
2016136372.tif 000005
【図２】
2016136372.tif 000006
【図３】
2016136372.tif 000007
【図４】
2016136372.tif 000008
【図５】
2016136372.tif 000009
【図６】
2016136372.tif 000010
【図７】
2016136372.tif 000011
【図８】
2016136372.tif 000012
【図９】
2016136372.tif 000013
【図１０】
2016136372.tif 000014
【図１１】
2016136372.tif 000015
【図１２】
2016136372.tif 000016
【図１３】
2016136372.tif 000017
【図１４】
2016136372.tif 000018
【配列表】
2016136372000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月21日(2016.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＫＡＰ４の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記物質が、ＣＫＡＰ４に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記物質がＣＫＡＰ４特異的に結合する抗体又はその断片である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
癌の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
癌がＣＫＡＰ４を発現している癌である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
癌が更にＤｋｋ１を発現している癌である、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
癌が肺癌又は膵癌である、請求項４〜６のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、
被験物質について、ＣＫＡＰ４の発現抑制能、又は細胞膜上のＣＫＡＰ４との結合能を測定する第１工程、及び
ＣＫＡＰ４の発現抑制能、又は細胞膜上のＣＫＡＰ４との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程、
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
前記第１工程として、
被験物質を、ＣＫＡＰ４を発現する細胞に接触させる第１−ａ工程、及び
第１−ａ工程後に、前記細胞におけるＣＫＡＰ４発現量を測定する第１−ｂ工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記第１工程として、
被験物質を、ＣＫＡＰ４を発現する細胞に接触させる第１−ｉ工程、及び
第１−ｉ工程後に、被験物質が細胞膜上のＣＫＡＰ４に結合しているか否かを確認する第１−ｉｉ工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した癌組織におけるＣＫＡＰ４及びＤｋｋ１の発現を測定する工程を含む、癌患者の術後の予後の検査方法。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
ＣＫＡＰ４を検出する試薬、及びＤｋｋ１を検出する試薬を含む、癌患者の術後の予後の検査薬。
【請求項１４】
被験者から採取されたエクソソーム中のＣＫＡＰ４を測定する工程を含む、癌の検査方法。
【請求項１５】
体液からエクソソームを分離するための試薬、及びＣＫＡＰ４を検出する試薬を含む、癌の検査薬。
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月24日(2017.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CKAP4の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記物質が、CKAP4に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記物質がCKAP4特異的に結合する抗体又はその断片である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
癌の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
癌がCKAP4を発現している癌である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
癌が更にDkk1を発現している癌である、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
癌が肺癌又は膵癌である、請求項４〜６のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、
被験物質について、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を測定する第１工程、及び
CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程、
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-a工程、及び
第1-a工程後に、前記細胞におけるCKAP4発現量を測定する第1-b工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-i工程、及び
第1-i工程後に、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する第1-ii工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4及びDkk1の発現を測定する工程を含む、癌患者の術後の予後の検査方法。
【請求項１２】
CKAP4を検出する試薬、及びDkk1を検出する試薬を含む、癌患者の術後の予後の検査薬。
【請求項１３】
被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4を測定する工程を含む、癌の検査方法。
【請求項１４】
体液からエクソソームを分離するための試薬、及びCKAP4を検出する試薬を含む、癌の検査薬。
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月4日(2017.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CKAP4の発現を抑制、又はCKAP4とDkk1の結合を阻害する物質を有効成分とすることを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記物質が、CKAP4に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、及びアンチセンス核酸よりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記物質がCKAP4特異的に結合する抗体又はその断片である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
癌の治療、予防又は進行防止の用途に使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
癌がCKAP4を発現している癌である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
癌が更にDkk1を発現している癌である、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
癌が肺癌又は膵癌である、請求項４〜６のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤の有効成分をスクリーニングする方法であって、
被験物質について、CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能を測定する第１工程、及び
CKAP4の発現抑制能、又は細胞膜上のCKAP4との結合能が認められた被験物質を抗腫瘍剤の有効成分の候補として選択する第２工程、
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-a工程、及び
第1-a工程後に、前記細胞におけるCKAP4発現量を測定する第1-b工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記第１工程として、
被験物質を、CKAP4を発現する細胞に接触させる第1-i工程、及び
第1-i工程後に、被験物質が細胞膜上のCKAP4に結合しているか否かを確認する第1-ii工程
を含む、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した癌組織におけるCKAP4及びDkk1の発現を測定する工程を含む、癌患者の術後の予後の検査方法。
【請求項１２】
CKAP4を検出する試薬、及びDkk1を検出する試薬を含む、癌患者の術後の予後の検査薬。
【請求項１３】
被験者から採取されたエクソソーム中のCKAP4を測定する工程を含む、癌の検査方法。
【請求項１４】
体液からエクソソームを分離するための試薬、及びCKAP4を検出する試薬を含む、癌の検査薬。
【国際調査報告】
2016136372.tif 000019
2016136372.tif 000020
2016136372.tif 000021
2016136372.tif 000022
2016136372.tif 000023
2016136372.tif 000024