(57)【要約】  ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ８（ＤＯＣＫ８）タンパク質、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＳＴＥ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）タンパク質及びＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＰＡＳ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＰＡＳ１）タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ８（ＤＯＣＫ８）タンパク質、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＳＴＥ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）タンパク質及びＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＰＡＳ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＰＡＳ１）タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
【請求項２】
前記遺伝子変異が、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックアウト又はノックダウンである、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
【請求項３】
再編成したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子導入されている、請求項１又は２に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
【請求項４】
ＤＯＣＫ８−／−ＴＣＲ  Ｔｇ又はＭＳＴ１−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
【請求項５】
前記ＴＣＲがＡＮＤである、請求項３又は４に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
【請求項６】
ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル細胞。
【請求項７】
前記遺伝子変異が、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックアウト又はノックダウンである、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
被験物質の投与下で、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物の掻痒行動の量を定量する工程と、
定量された前記掻痒行動の量が、前記被験物質の非投与下における前記非ヒト動物の掻痒行動の量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質の存在下で、アトピー性皮膚炎の患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン（ＩＬ）−３１の発現量を定量する工程と、
前記ＩＬ−３１の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質の存在下で、Ｔ細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、
前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、
前記発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力を測定する工程と、
前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、
前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、
前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力を測定する工程と、
前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−細胞又はＭＳＴ１−／−細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量を定量する工程と、
前記核内存在量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
被験物質の存在下で、細胞中のＥＰＡＳ１の発現量を定量する工程と、
前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞中のＥＰＡＳ１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的としてのＥＰＡＳ１。
【請求項２１】
ＥＰＡＳ１阻害剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の治療剤。
【請求項２２】
ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−又はＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する、アトピー性皮炎モデル動物作製用非ヒト動物（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
【請求項２３】
前記ＴＣＲがＡＮＤである、請求項２２に記載のアトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物。
【請求項２４】
ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−又はＤＯＣＫ８−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備え、子孫の中に出現したＤＯＣＫ８−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物がアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
【請求項２５】
ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−又はＭＳＴ１−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備え、子孫の中に出現したＭＳＴ１−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物がアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
【請求項２６】
前記ＴＣＲがＡＮＤである、請求項２４又は２５に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物及びその使用に関する。より具体的には、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物、アトピー性皮膚炎治療の創薬標的、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法、アトピー性皮膚炎の治療剤及びアトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物に関する。本願は、２０１６年２月２５日に、日本に出願された特願２０１６−０３４５１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は、慢性の皮膚の炎症性の疾患であり、その患者は世界中で増加している。アトピー性皮膚炎は、主にＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞により構成された炎症性の浸潤を伴う紅斑性で滲出性の病斑の形成を特徴とする。【０００３】
皮膚の炎症の発症と悪化に、痒み及び掻痒行動が重要な役割を担っているため、起痒物質の同定がアトピー性皮膚炎の効果的な治療戦略に有効である。そして、現在、インターロイキン（ＩＬ）−３１が主要な起痒物質であると考えられている。【０００４】
ＩＬ−３１は、活性化された２型ヘルパー（ＴＨ２）ＣＤ４＋Ｔ細胞から産生される。ＩＬ−３１を皮内注射したマウス及びＩＬ−３１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、掻痒行動を増加させ、重篤な皮膚炎を形成する。また、アトピー性皮膚炎患者では、皮膚組織にホーミングする、皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−３１を産生し、血清中のＩＬ−３１濃度が疾患の重度と相関することが知られている。更に、抗ＩＬ−３１受容体抗体をアトピー性皮膚炎患者に投与すると、痒みが抑制されるという第ＩＩ相臨床試験の結果が得られている。【０００５】
したがって、ＩＬ−３１は、Ｔ細胞由来のサイトカインであり、アトピー性皮膚炎の痒みと密接な関連性を有している。【０００６】
ところで、高ＩｇＥ症候群は、複合型原発性免疫不全症であり、高い血清中ＩｇＥ濃度を伴うアトピー性皮膚炎と、細胞外細菌による感染に感受性であることを特徴とする。最近、常染色体劣性遺伝病である高ＩｇＥ症候群は、主にＤｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ８（ＤＯＣＫ８）遺伝子の変異に起因していることが報告された（例えば、非特許文献１を参照）。【０００７】
ＤＯＣＫ８は進化的に保存されたグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）であり、Ｃｄｃ４２を活性化することが知られている。発明者らは、ＤＯＣＫ８ノックアウト（ＤＯＣＫ８−／−）マウスを作製し、ＤＯＣＫ８が間質における樹状細胞の遊走に必須であることを明らかにした（例えば、非特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zhang Q, et al., Combined Immunodeficiency Associated with DOCK8 Mutations, N. Engl. J. Med., 361 (21), 2046-2055, 2009.
【非特許文献２】Harada Y, et al., DOCK8 is a Cdc42 activator critical for interstitial dendritic cell migration during immune responses, Blood, 119 (19), 4451-4461, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、ＩＬ−３１がアトピー性皮膚炎における主要な起痒物質であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−３１産生の制御機構は未解明である。そこで、本発明は、ＩＬ−３１の産生制御機構を明らかにし、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ８（ＤＯＣＫ８）タンパク質、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＳＴＥ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）タンパク質、及びＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＰＡＳ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＰＡＳ１）タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
［２］前記遺伝子変異が、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックアウト又はノックダウンである、［１］に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
［３］再編成したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子導入されている、［１］又は［２］に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
［４］ＤＯＣＫ８−／−ＴＣＲ  Ｔｇ又はＭＳＴ１−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
［５］前記ＴＣＲがＡＮＤである、［３］又は［４］に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物。
［６］ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質、及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル細胞。
［７］前記遺伝子変異が、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックアウト又はノックダウンである、請求項６に記載の細胞。
［８］被験物質の投与下で、［１］〜［５］のいずれかに記載の非ヒト動物の掻痒行動の量を定量する工程と、定量された前記掻痒行動の量が、前記被験物質の非投与下における前記非ヒト動物の掻痒行動の量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［９］被験物質の存在下で、アトピー性皮膚炎の患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン（ＩＬ）−３１の発現量を定量する工程と、前記ＩＬ−３１の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１０］被験物質の存在下で、Ｔ細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１１］被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１２］被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１４］被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１５］被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１６］被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１７］被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１８］被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−細胞又はＭＳＴ１−／−細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量を定量する工程と、前記核内存在量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［１９］被験物質の存在下で、細胞中のＥＰＡＳ１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞中のＥＰＡＳ１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
［２０］アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的としてのＥＰＡＳ１。
［２１］ＥＰＡＳ１阻害剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の治療剤。
［２２］ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−又はＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する、アトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
［２３］前記ＴＣＲがＡＮＤである、［２２］に記載のアトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物。
［２４］ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−又はＤＯＣＫ８−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備え、子孫の中に出現したＤＯＣＫ８−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物がアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
［２５］ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−又はＭＳＴ１−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備え、子孫の中に出現したＭＳＴ１−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物がアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。
［２６］前記ＴＣＲがＡＮＤである、［２４］又は［２５］に記載のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＩＬ−３１の産生制御機構を明らかにし、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例１の結果である。（ａ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの代表的な写真である。（ｂ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの代表的な写真である。（ｃ）は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を持つオスマウス（ｎ＝２０）のアトピー性皮膚炎の発症率を示すグラフである。（ｄ）は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を持つメスマウス（ｎ＝１５）のアトピー性皮膚炎の発症率を示すグラフである。
【図２】実験例２において、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである。
【図３】実験例３の結果である。（ａ）及び（ｂ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ａ）及び同腹のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｂ）の皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３において、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ａ）及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｂ）の皮膚を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例３において、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｃ）及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｄ）の皮膚を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩｇＥ（ａ）及びＩｇＧ２ｂ（ｂ）の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図６】実験例５において、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図７】実験例６におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図８】実験例６におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図９】実験例７において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖を検討した結果を示すグラフである。
【図１０】実験例８の結果を示す。（ａ）は、ＩＬ−３１遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフであり、（ｂ）は、ＩＬ−４遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフであり、（ｃ）は、ＩＬ−２遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】実験例８において、２次刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】実験例９において、２次刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
【図１３】実験例１０において、抗ＩＬ−４抗体の存在下で１次刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１１におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図１５】実験例１２において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖を検討した結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１３において、２次刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１４において、２次刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
【図１８】実験例１５において、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図１９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１６において、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ａ）及び同腹のＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｂ）の皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例１６において、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）の皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。
【図２０】実験例１７において、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図２１】（ａ）は、実験例１８においてＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１８におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図２２】実験例１９において、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図２３】実験例２０における、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの代表的な写真である。
【図２４】実験例２０において、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである。
【図２５】（ａ）は、実験例２０において、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例２０において、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。
【図２６】実験例２０において、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図２７】（ａ）は、実験例２１で使用したＥＰＡＳ１の変異体の模式図である。（ｂ）は、実験例２１において、ＥＰＡＳ１変異体の存在下でＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２８】（ａ）は、実験例２２において、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２２において、ＡＲＮＴ遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例２２において、ＳＰ１遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。
【図２９】実験例２３において、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３０】実験例２４において、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。
【図３１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２５におけるＥＭＳＡの結果を示す写真である。
【図３２】実験例２６におけるＣｈＩＰアッセイの結果を示すグラフである。
【図３３】（ａ）は、実験例２７において、ＥＰＡＳ１−／−のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を抗ＥＰＡＳ１抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例２７において、野生型のＭＥＦを抗ＥＰＡＳ１抗体で免疫蛍光染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２７における免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例２７において、ＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図３５】（ａ）は、実験例２８における免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例２８において、ＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図３６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２９における免疫沈降の結果を示す写真である。
【図３７】実験例３０において、ＭＳＴ１遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。
【図３８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例３０における免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｄ）は、実験例３０において、ＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。
【図３９】（ａ）は、実験例３１においてＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３１におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図４０】実験例３２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図４１】実験例３３において、アトピー性皮膚炎患者及び健常人（対照）の血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図４２】（ａ）は、実験例３４において、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３４において、ＩＬ−２遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４３】実験例３５において、抗ＥＰＡＳ１抗体の有効性をウエスタンブロッティングにより検証した結果を示す写真である。
【図４４】実験例３５において、ＥＰＡＳ１阻害剤の影響をウエスタンブロッティングにより検討した結果を示す写真である。
【図４５】（ａ）は、実験例３６において、ＩＬ−３１遺伝子の発現量に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を検討した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３６において、ＩＬ−２遺伝子の発現量に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を検討した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例３６において、ＩＬ−３１遺伝子の発現量に対するＨＩＦＶＩＩの影響を検討した結果を示すグラフである。
【図４６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３７における免疫沈降の結果を示す写真である。
【図４７】実験例３８において、ＤＯＣＫ８コンディショナルノックアウトマウス及び対照マウスの皮膚炎を定量化した結果を示すグラフである。
【図４８】実験例３９において、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したＣＡＧ−ＯＶＡマウス、及び、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したＣＡＧ−ＯＶＡマウスの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物を提供する。
【００１４】
非ヒト動物としては、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル等が挙げられる。本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有している。
【００１５】
本明細書において、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物とは、アトピー性皮膚炎のモデルとなる非ヒト動物を意味する。アトピー性皮膚炎のモデルとは、アトピー性皮膚炎の発症機構又はアトピー性皮膚炎の症状の少なくとも一部を再現できる実験系を意味する。例えば、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ刺激により、ＩＬ−３１を大量に産生するため、アトピー性皮膚炎のモデルとなる。また、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した後、他の非ヒト動物に移植すること等により、非ヒト動物にアトピー性皮膚炎を発症させ、アトピー性皮膚炎のモデルとすることもできる。従来、ＴＣＲ刺激によりＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−３１を大量に産生する実験系は知られていなかった。したがって、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎の治療剤や治療方法の開発に有効に利用することができる。
【００１６】
本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、再編成したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子導入されていてもよい。再編成したＴＣＲとしては、特定の抗原を認識するＴＣＲであれば特に制限されず、例えば、ＡＮＤ、ＯＴＩＩ等が挙げられる。ＡＮＤ、ＯＴＩＩについては後述する。上記のＴＣＲは、自己反応性を有するＴＣＲであってもよい。例えば、実施例において後述するように、ＡＮＤは自己反応性を有するＴＣＲであると考えられる。
【００１７】
１実施形態において、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有し且つ自己反応性を有するＴＣＲを発現する、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を自然発症する。
【００１８】
従来アトピー性皮膚炎モデルマウスとして用いられてきたＮＣ／Ｎｇａマウスは、ダニの寄生によりアトピー性皮膚炎を発症する。しかしながら、ＮＣ／Ｎｇａマウスは、特定病原菌フリー（ＳＰＦ）環境下ではアトピー性皮膚炎を発症しない。また、ＮＣ／Ｎｇａマウスは、皮膚炎が起こっていても掻痒行動を示さない場合がある一方、過剰な皮膚炎を呈する個体が痒み反応を示さない場合がある。このように、ＮＣ／Ｎｇａマウスは、ヒトのアトピー性皮膚炎患者とは症状が異なっている点がある。
【００１９】
これに対し、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、ＳＰＦ環境下においてもアトピー性皮膚炎を自然発症する。また、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、皮膚炎及び痒み反応の症状が安定しており、皮膚炎の症状の進行に伴い痒み反応が強くなる点、血清中ＩＬ−３１の濃度が増加している点等、ヒトのアトピー性皮膚炎患者と非常に類似した症状を示す。
【００２０】
したがって、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、ヒトのアトピー性皮膚炎の発症メカニズムの解明、治療薬や治療方法の開発等を行う上で非常に有用である。
【００２１】
実施例において後述するように、発明者らはアトピー性皮膚炎の起痒物質であるＩＬ−３１の発現制御機構を明らかにした。すなわち、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成されることにより、ＥＰＡＳ１タンパク質が細胞質内に留まっている。これに対し、上記の複合体を形成することができないと、ＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行し、ＳＰ１タンパク質との相互作用によりＩＬ−３１の発現を誘導する。ＥＰＡＳ１とＳＰ１との会合はＩＬ−３１の転写誘導に必須である。
【００２２】
また、ＥＰＡＳ１は、Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（ＡＲＮＴ、ＨＩＦ−１βとも呼ばれる。）と複合体を形成し、例えば低酸素等の環境ストレスに応答して標的遺伝子の転写を活性化することが知られている。そして、ＡＲＮＴは、神経発生や気管・唾液腺の管腔形成制御に関与することが報告されており、発生に重要な因子であることが知られている。したがって、ＡＲＮＴの機能に影響を及ぼす薬剤は、重大な副作用を生じる懸念がある。
【００２３】
しかしながら、実施例において後述するように、発明者らは、ＩＬ−３１の発現誘導機構において、ＥＰＡＳ１がＡＲＮＴとは独立して機能することを明らかにした。すなわち、ＥＰＡＳ１は、ＡＲＮＴ非依存的に、ＳＰ１と協調してＩＬ−３１プロモーターを活性化することを明らかにした。
【００２４】
このことは、ＥＰＡＳ１を治療標的とした場合に、重大な副作用を生じる懸念が少ないことを意味する。すなわち、ＥＰＡＳ１は、アトピー性皮膚炎の治療標的として適している。
【００２５】
したがって、１実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的としてのＥＰＡＳ１を提供する。
【００２６】
なお、ヒトＤＯＣＫ８タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿９８２２７２であり、マウスＤＯＣＫ８タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿０８３０６１である。また、ヒトＭＳＴ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿００６２７３であり、マウスＭＳＴ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿０６７３９５である。また、ヒトＥＰＡＳ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿００１４２１であり、マウスＥＰＡＳ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿０３４２６７である。
【００２７】
本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物において、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異とは、ＥＰＡＳ１タンパク質を核に局在させる変異であれば特に制限されず、例えば、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックアウトであってもよく、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子のノックダウンであってもよく、ＤＯＣＫ８タンパク質のＮ末端側を欠失するような遺伝子変異であってもよい。
【００２８】
実施例において後述するように、発明者らは、ＤＯＣＫ８遺伝子のノックアウト、ＤＯＣＫ８タンパク質のＮ末端側の５２７アミノ酸を欠失する遺伝子変異、又はＭＳＴ１遺伝子のノックダウン等により、ＥＰＡＳ１タンパク質が細胞の核に局在し、ＴＣＲ刺激により誘導されるＩＬ−３１の発現を上昇させることを明らかにした。
【００２９】
ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子は全臓器においてノックアウトされていてもよいし、コンディショナルノックアウト等によりＣＤ４＋Ｔ細胞を含む細胞集団のみでノックアウトされていてもよい。
【００３０】
本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、上述した遺伝子変異を有するとともに、ＣＤ４＋Ｔ細胞が特定の抗原を認識する（再編成した）ＴＣＲトランスジーン（ＴＣＲ  Ｔｇ）を発現していてもよい。すなわち、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、ＤＯＣＫ８−／−ＴＣＲ  Ｔｇ又はＭＳＴ１−／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有していてもよい。ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。
【００３１】
実施例において後述するように、発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＥＰＡＳ１が核移行しやすい状態でＴＣＲ刺激を受けることにより、ＩＬ−３１を大量に発現することを明らかにした。この結果、血清中のＩＬ−３１の濃度が上昇し、アトピー性皮膚炎が発症する。
【００３２】
再編成したＴＣＲとしては、例えばＡＮＤが挙げられる。ＡＮＤは、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−Ｅκ分子と複合体を形成した、Ｍｏｔｈ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ（ＭＣＣ）の第８８番目〜１０３番目のアミノ酸からなるペプチド（配列番号１）を認識するＴＣＲであるが、胸腺においてＩ−Ａｂ分子を認識して分化・成熟することが知られている（例えば、Kaye J. et al., Selective development of CD4+ T cells in transgenic mice expressing a class II MHC-restricted antigen receptor, Nature 341, 746-749, 1989. を参照。）。
【００３３】
本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇ又はＭＳＴ１−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有するものであってもよい。
【００３４】
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、ＤＯＣＫ８を欠失しているため、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体を形成することができない。また、このＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−３１を大量に産生し、この非ヒト動物はアトピー性皮膚炎を自然発症する。
【００３５】
また、ＭＳＴ１−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、ＭＳＴ１を欠失しているため、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体を形成することができない。また、このＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−３１を大量に産生し、この非ヒト動物はアトピー性皮膚炎を自然発症する。
【００３６】
本明細書において、「ＡＮＤ  Ｔｇ」とは、ＡＮＤ  ＴＣＲが遺伝子導入されていることを意味し、ＡＮＤＴｇ／−であってもよく、ＡＮＤＴｇ／Ｔｇであってもよい。しかしながら、ＡＮＤＴｇ／Ｔｇの遺伝子型の非ヒト動物では、ゲノム上のＡＮＤ遺伝子の導入位置により、意図しない遺伝子が欠失してしまう場合があるため、ＡＮＤＴｇ／−であることが好ましい。
【００３７】
本実施形態の非ヒト動物は、個体の形態であってもよいし、受精卵又は胚の形態であってもよい。上記の個体は、飼育することによりアトピー性皮膚炎を自然発症する。また、上記の受精卵又は胚は、非ヒト動物の子宮に移植することにより個体に成長させて用いることができる。
【００３８】
［アトピー性皮膚炎モデル細胞］
１実施形態において、本発明は、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異を有する、アトピー性皮膚炎モデル細胞を提供する。
【００３９】
本実施形態の細胞は、上述したアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、培養細胞において、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたものであってもよい。培養細胞としては、特に制限されず、例えばヒト細胞を用いることができる。細胞は、例えば血球系の細胞であってもよく、例えば繊維芽細胞等の非血球系の細胞であってもよい。
【００４０】
本実施形態の細胞は、例えば、後述するアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法に用いることができる。
【００４１】
［アトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物及びアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法］
１実施形態において、本発明は、ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−又はＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する、アトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物を提供する（ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。）。再編成したＴＣＲとしては、特定の抗原を認識するＴＣＲであれば特に制限されず、例えば、ＡＮＤ、ＯＴＩＩ等が挙げられる。
【００４２】
上記のＴＣＲがＡＮＤである場合、本実施形態のアトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−、ＭＳＴ１＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−又はＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有することになる。
【００４３】
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−、ＭＳＴ１＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−又はＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を自然発症しない。しかしながら、これらの非ヒト動物を交配させることにより、その子孫の中にアトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物が出現する。したがって、これらの非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎モデル動物作製用非ヒト動物であるということができる。
【００４４】
例えば、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を発症しない。しかしながら、この非ヒト動物を、例えば、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−、ＤＯＣＫ８−／−等の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させると、その子孫の中にＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物が出現する。この非ヒト動物はアトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である。
【００４５】
同様に、ＭＳＴ１＋／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を発症しない。しかしながら、この非ヒト動物を、例えば、ＭＳＴ１＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−、ＭＳＴ１−／−等の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させると、その子孫の中にＭＳＴ１−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物が出現する。この非ヒト動物はアトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である。
【００４６】
すなわち、１実施形態において、本発明は、ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＤＯＣＫ８＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＤＯＣＫ８＋／−又はＤＯＣＫ８−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備える、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。再編成したＴＣＲとしては、特定の抗原を認識するＴＣＲであれば特に制限されず、例えば、ＡＮＤ、ＯＴＩＩ等が挙げられる。
【００４７】
本実施形態の製造方法により得られた非ヒト動物の子孫のうち、例えばＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である。
【００４８】
また、本実施形態の製造方法により得られた非ヒト動物の子孫のうち、例えば、ＤＯＣＫ８−／−、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を自然発症することはない。しかしながら、これらの非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ刺激によりＩＬ−３１を大量に産生するため、アトピー性皮膚炎のモデルとなる。また、ＤＯＣＫ８−／−、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇ等の遺伝子型を有する非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した後、他の非ヒト動物に移植すること等により、非ヒト動物にアトピー性皮膚炎を発症させ、アトピー性皮膚炎のモデルとすることもできる。
【００４９】
また、１実施形態において、本発明は、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物を、ＭＳＴ１＋／−ＴＣＲ  Ｔｇ、ＭＳＴ１＋／−又はＭＳＴ１−／−の遺伝子型を有する非ヒト動物と交配させる工程を備える、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の製造方法を提供する。ここで、ＴＣＲ  Ｔｇは再編成したＴＣＲが遺伝子導入されていることを表す。再編成したＴＣＲとしては、特定の抗原を認識するＴＣＲであれば特に制限されず、例えば、ＡＮＤ、ＯＴＩＩ等が挙げられる。
【００５０】
本実施形態の製造方法により得られた非ヒト動物の子孫のうち、例えばＭＳＴ１−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎を自然発症するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物である。
【００５１】
また、本実施形態の製造方法により得られた非ヒト動物の子孫のうち、例えば、ＭＳＴ１−／−、ＭＳＴ１−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇの遺伝子型を有する非ヒト動物はアトピー性皮膚炎を自然発症することはない。しかしながら、これらの非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ刺激によりＩＬ−３１を大量に産生するため、アトピー性皮膚炎のモデルとなる。また、ＭＳＴ１−／−、ＭＳＴ１−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇ等の遺伝子型を有する非ヒト動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した後、他の非ヒト動物に移植すること等により、非ヒト動物にアトピー性皮膚炎を発症させ、アトピー性皮膚炎のモデルとすることもできる。
【００５２】
［アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の投与下で、上記のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物の掻痒行動の量を定量する工程と、定量された前記掻痒行動の量が、前記被験物質の非投与下における前記非ヒト動物の掻痒行動の量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５３】
掻痒行動は細胞レベルでは評価することができないため、個体レベルで評価する必要がある。上述したように、上記のアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物はヒトのアトピー性皮膚炎と非常に類似した症状を示す。このため、本実施形態のスクリーニング方法は、ヒトのアトピー性皮膚炎に有効な治療剤を効率よくスクリーニングすることができる。
【００５４】
被験物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができ、後述するスクリーニング方法においても同様である。また、後述するいずれかのスクリーニング方法により得られたアトピー性皮膚炎の治療剤又はその候補物質を被験物質として用いてもよい。
【００５５】
被験物質の投与方法は特に制限されず、例えば、経口投与してもよいし、注射等により血中に投与してもよいし、皮膚に塗布してもよい。
【００５６】
掻痒行動の量の定量方法は特に制限されない。例えば、掻痒行動の頻度を測定することが挙げられる。掻痒行動の頻度は、例えば、非ヒト動物を所定の時間ビデオ撮影した動画を再生し、掻痒行動の回数を計上すること等により測定することができる。
【００５７】
被験物質を投与することにより掻痒行動の量が低下した場合、当該被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断することができる。このような被験物質の作用としては、ＩＬ−３１の産生を抑制する、ＩＬ−３１の受容体の下流のシグナル経路を遮断する等が考えられる。
【００５８】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、アトピー性皮膚炎の患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、前記ＩＬ−３１の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５９】
ＩＬ−３１の発現量は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ等により遺伝子レベルで定量してもよいし、例えばＥＬＩＳＡ法等によりタンパク質レベルで定量してもよい。
【００６０】
実施例において後述するように、アトピー性皮膚炎の患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激すると、ＩＬ−３１の発現量が上昇した。したがって、このＩＬ−３１の発現量の上昇を抑制する物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。また、アトピー性皮膚炎の治療剤は、ＩＬ−３１発現阻害剤といいかえることもできる。
【００６１】
ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、上述した、ＩＬ−３１を過剰産生するアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、樹立されたＴ細胞株等において、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたものであってもよい。また、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞には、再構成したＴＣＲが遺伝子導入されていてもよい。
【００６２】
また、ＴＣＲの刺激は、ＴＣＲに特異的な抗原を接触させることによって行ってもよいし、抗ＴＣＲ抗体を接触させることによって行ってもよい。また、実施例において後述するように、ＴＣＲの刺激を２回行うことにより、ＩＬ−３１の発現量を顕著に上昇させることができる。
【００６３】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、Ｔ細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６４】
実施例において後述するように、ＣＤ４＋Ｔ細胞でＥＰＡＳ１遺伝子を過剰発現させると、ＩＬ−３１の発現量が上昇した。したがって、このＩＬ−３１の発現量の上昇を抑制する物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。また、アトピー性皮膚炎の治療剤は、ＩＬ−３１発現阻害剤といいかえることもできる。
【００６５】
Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞であってもよいし、樹立されたＴ細胞株であってもよいし、胸線細胞株であってもよい。
【００６６】
（第４実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６７】
実施例において後述するように、発明者らは、レポーターアッセイにより、ＥＰＡＳ１の存在下でＩＬ−３１プロモーターの活性を測定できることを明らかにした。したがって、ＩＬ−３１プロモーターの活性化を抑制する物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。また、アトピー性皮膚炎の治療剤は、ＩＬ−３１発現阻害剤といいかえることもできる。
【００６８】
ＩＬ−３１プロモーターとしては、例えば、配列番号２に示すヒトＩＬ−３１のプロモーター、配列番号３に示すマウスＩＬ−３１のプロモーター等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えばルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。ＥＰＡＳ１遺伝子は、例えばヒトＥＰＡＳ１遺伝子であってもよい。ＥＰＡＳ１遺伝子の発現制御方法は特に制限されず、例えば、ＥＰＡＳ１遺伝子の発現ベクターを細胞に導入して一過性に過剰発現させること等により行ってもよい。あるいは、例えば、テトラサイクリンやドキシサイクリンの添加により、標的遺伝子の発現のＯＮ又はＯＦＦを調節できるテトラサイクリン発現誘導システム等を利用してＥＰＡＳ１遺伝子の発現を調節してもよい。あるいは、内在性に発現するＥＰＡＳ１遺伝子を利用してもよい。
【００６９】
細胞としては、特に制限されず、例えばヒト細胞を用いることができる。細胞は、例えば血球系の細胞であってもよく、例えば繊維芽細胞等の非血球系の細胞であってもよい。
【００７０】
（第５実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、ＩＬ−３１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合のＩＬ−３１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００７１】
実施例において後述するように、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激すると、ＩＬ−３１の発現量が上昇した。したがって、このＩＬ−３１の発現量の上昇を抑制する物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。また、アトピー性皮膚炎の治療剤は、ＩＬ−３１発現阻害剤といいかえることもできる。
【００７２】
ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞は、上述したアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、初代Ｔ細胞、樹立されたＴ細胞株、胸線細胞株等において、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたものであってもよい。
【００７３】
また、ＴＣＲの刺激は、ＴＣＲに特異的な抗原を接触させることによって行ってもよいし、抗ＴＣＲ抗体を接触させることによって行ってもよい。
【００７４】
（第６実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＩＬ−３１プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを導入した、ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞のＴＣＲを刺激し、前記レポーター遺伝子の発現量を定量する工程と、前記レポーター遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下で前記細胞のＴＣＲを刺激した場合の前記レポーター遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００７５】
実施例において後述するように、ＤＯＣＫ８−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲを刺激すると、ＩＬ−３１の発現量が上昇した。したがって、このＩＬ−３１の発現量の上昇を抑制する物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。また、アトピー性皮膚炎の治療剤は、ＩＬ−３１発現阻害剤といいかえることもできる。
【００７６】
ＩＬ−３１プロモーターとしては、例えば、配列番号２に示すヒトＩＬ−３１のプロモーター、配列番号３に示すマウスＩＬ−３１のプロモーター等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えばルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００７７】
ＤＯＣＫ８−／−Ｔ細胞又はＭＳＴ１−／−Ｔ細胞は、上述したアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、初代Ｔ細胞、樹立されたＴ細胞株、胸線細胞株等において、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたものであってもよい。
【００７８】
また、ＴＣＲの刺激は、ＴＣＲに特異的な抗原を接触させることによって行ってもよいし、抗ＴＣＲ抗体を接触させることによって行ってもよい。
【００７９】
（第７実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８０】
実施例において後述するように、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成されることにより、ＥＰＡＳ１タンパク質が細胞質内に留まっている。これに対し、上記の複合体を形成することができないと、ＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行し、ＳＰ１との相互作用によりＩＬ−３１の発現を誘導する。
【００８１】
したがって、ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力を上昇させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補であるということができる。ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降、ビアコア（登録商標）等で測定することができる。ここで、ＥＬＩＳＡ法や免疫沈降においては、ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合量が多いほど両者の結合力が高いということができる。また、ビアコア（登録商標）による測定では、例えば、ＫＤ値が小さいほど結合力が高いということができる。
【００８２】
ＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力は、被験物質を培地に添加した細胞サンプルを用いて測定してもよい。あるいは、試験管内において、被験物質の存在下で、精製されたＥＰＡＳ１タンパク質及び精製されたＤＯＣＫ８タンパク質を用いて測定してもよい。
【００８３】
（第８実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８４】
実施例において後述するように、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成されることにより、ＥＰＡＳ１タンパク質が細胞質内に留まっている。これに対し、上記の複合体を形成することができないと、ＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行し、ＳＰ１との相互作用によりＩＬ−３１の発現を誘導する。
【００８５】
したがって、ＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を上昇させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補であるということができる。ＥＰＡＳ１タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力は、上述したＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と同様にして測定することができる。
【００８６】
（第９実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力と比較して上昇していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００８７】
実施例において後述するように、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成されることにより、ＥＰＡＳ１タンパク質が細胞質内に留まっている。これに対し、上記の複合体を形成することができないと、ＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行し、ＳＰ１との相互作用によりＩＬ−３１の発現を誘導する。
【００８８】
したがって、ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を上昇させる物質にもＥＰＡＳ１を細胞質内に留める作用があるということができる。したがって、ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力を上昇させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補であるということができる。ＤＯＣＫ８タンパク質とＭＳＴ１タンパク質との結合力は、上述したＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と同様にして測定することができる。
【００８９】
（第１０実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力を測定する工程と、前記結合力が、前記被験物質の非存在下におけるＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００９０】
実施例において後述するようにＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行すると、ＳＰ１との相互作用によりＩＬ−３１の発現を誘導する。
【００９１】
したがって、ＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力を低下させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補であるということができる。ＥＰＡＳ１タンパク質とＳＰ１タンパク質との結合力は、上述したＥＰＡＳ１タンパク質とＤＯＣＫ８タンパク質との結合力と同様にして測定することができる。
【００９２】
（第１１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＤＯＣＫ８−／−細胞又はＭＳＴ１−／−細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させ、ＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量を定量する工程と、前記核内存在量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞にＥＰＡＳ１遺伝子を発現させた場合のＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００９３】
実施例において後述するように、発明者らは、正常な細胞では、通常条件下においてＥＰＡＳ１タンパク質が細胞質内に局在しており、低酸素条下ではＥＰＡＳ１タンパク質が核内に移行することを明らかにした。また、ＤＯＣＫ８−／−細胞又はＭＳＴ１−／−細胞では、通常条件下においてもＥＰＡＳ１遺伝子が核に局在しやすいことを明らかにした。
【００９４】
したがって、通常条件下のＤＯＣＫ８−／−細胞又はＭＳＴ１−／−細胞において、ＥＰＡＳ１タンパク質の核内存在量を低下させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。ここで、通常条件下とは、酸素濃度が通常（約２０％（ｖ／ｖ））である条件を意味する。
【００９５】
ＤＯＣＫ８−／−細胞、ＭＳＴ１−／−細胞は、上述したアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、培養細胞において、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたものであってもよい。培養細胞としては、特に制限されず、例えばヒト細胞を用いることができる。細胞は、例えば血球系の細胞であってもよく、例えば繊維芽細胞等の非血球系の細胞であってもよい。
【００９６】
（第１２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、細胞中のＥＰＡＳ１の発現量を定量する工程と、前記発現量が、前記被験物質の非存在下の前記細胞中のＥＰＡＳ１の発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質はアトピー性皮膚炎の治療剤であると判断する工程と、を備える、アトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００９７】
実施例において後述するように、ＥＰＡＳ１タンパク質は、ＳＰ１タンパク質と相互作用してＩＬ−３１の発現を誘導する。したがって、ＥＰＡＳ１の発現量を低下させる物質はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。
【００９８】
ＥＰＡＳ１の発現量は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ等により遺伝子レベルで定量してもよいし、例えばウエスタンブロッティング法等によりタンパク質レベルで定量してもよい。
【００９９】
また、細胞は、上述したアトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物から抽出したものであってもよいし、ＤＯＣＫ８遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子をノックアウト又はノックダウンした細胞であってもよいし、野生型の遺伝子型を有する細胞であってもよい。細胞は、例えばヒト細胞であってもよい。また、細胞は、例えば血球系の細胞であってもよく、例えば繊維芽細胞等の非血球系の細胞であってもよい。
【０１００】
［アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的］
１実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的としてのＥＰＡＳ１を提供する。ＥＰＡＳ１は、ＥＰＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子であってもよいし、ＥＰＡＳ１タンパク質であってもよい。
【０１０１】
実施例において後述するように、発明者らは、ＥＰＡＳ１が、（１）ＩＬ−３１の発現を制御する、（２）神経発生や気管・唾液腺の管腔形成制御に関与するＡＲＮＴとは独立して機能する、という新たな属性を有することを見出した。したがって、ＥＰＡＳ１は、アトピー性皮膚炎の治療剤の創薬標的としての用途に適している。
【０１０２】
［アトピー性皮膚炎の治療剤］
１実施形態において、本発明は、ＥＰＡＳ１阻害剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の治療剤を提供する。
【０１０３】
ＥＰＡＳ１阻害剤とは、ＥＰＡＳ１の機能を阻害する物質を意味する。実施例において後述するように、ＥＰＡＳ１タンパク質は、ＳＰ１タンパク質と相互作用してＩＬ−３１の発現を誘導する。したがって、ＥＰＡＳ１阻害剤はアトピー性皮膚炎の治療剤の候補である。
【０１０４】
ＥＰＡＳ１阻害剤としては、例えば、ＥＰＡＳ１の発現阻害物質、ＥＰＡＳ１タンパク質によるＩＬ−３１遺伝子の発現を低下させる物質等が挙げられる。ＥＰＡＳ１タンパク質によるＩＬ−３１遺伝子の発現を低下させる物質としては、例えばＥＰＡＳ１タンパク質に対する特異的結合物質であってＥＰＡＳ１−ＳＰ１相互作用を阻害するもの、ＳＰ１タンパク質に対する特異的結合物質であってＥＰＡＳ１−ＳＰ１相互作用を阻害するもの等が挙げられる。
【０１０５】
（発現阻害物質）
発現阻害物質としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。これらの発現阻害物質を生体に投与することにより、ＥＰＡＳ１タンパク質の発現を阻害することができる。その結果、ＩＬ−３１の発現を抑制し、アトピー性皮膚炎を治療することができる。上記の低分子化合物としては、例えば実施例において後述するＦＭ１９Ｇ１１（３−［（２，４−ジニトロベンゾイル）アミノ］−安息香酸２−（４−メチルフェニル）−２−オキソエチルエステル，［２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル］３−［（２，４−ジニトロベンゾイル）アミノ］安息香酸、例えば、Moreno-Manzano V., et al., FM19G11, a new hypoxia-inducible factor (HIF) modulator, affects stem cell differentiation status., J. Biol. Chem., 285 (2), 1333-1342, 2010. を参照。）等が挙げられる。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【０１０７】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【０１０８】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【０１０９】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【０１１０】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【０１１２】
（特異的結合物質）
ＥＰＡＳ１タンパク質に対する特異的結合物質は、ＥＰＡＳ１タンパク質に結合し、例えばＳＰ１タンパク質との結合を抑制することができる。その結果、ＩＬ−３１の発現を抑制し、アトピー性皮膚炎を治療することができる。同様に、ＳＰ１タンパク質に対する特異的結合物質は、ＳＰ１タンパク質に結合し、ＥＰＡＳ１タンパク質との結合を抑制することができる。その結果、ＩＬ−３１の発現を抑制し、アトピー性皮膚炎を治療することができる。
【０１１３】
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に抗原を免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。
【０１１４】
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、上記の抗体又は抗体断片は、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したものであってもよい。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。
【０１１５】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。ＥＰＡＳ１タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ＥＰＡＳ１タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【０１１６】
特異的結合物質は、上記の他にも、例えば、対象物質に対する結合性を指標として、化合物ライブラリー等からスクリーニングしたものであってもよい。
【０１１７】
（ＥＰＡＳ１タンパク質によるＩＬ−３１遺伝子の発現を低下させる物質）
ＥＰＡＳ１タンパク質によるＩＬ−３１遺伝子の発現を低下させる物質は、アトピー性皮膚炎の治療剤であるといえる。このような物質は、例えば、上述したいずれかのスクリーニング方法により、化合物ライブラリー等からスクリーニングすることができる。
【０１１８】
（剤型及び投与量）
上述したアトピー性皮膚炎の治療剤は、それ自体を生体に投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを生体に投与してもよい。
【０１１９】
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
【０１２０】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【０１２１】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【０１２２】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【０１２３】
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【０１２４】
アトピー性皮膚炎の治療剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
【０１２５】
アトピー性皮膚炎の治療剤の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．１〜１００ｍｇ、例えば１〜５０ｍｇ、例えば１〜２０ｍｇ等が挙げられる。
【０１２６】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．０１〜３０ｍｇ、例えば０．１〜２０ｍｇ、例えば０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射又は局所注射により投与することが挙げられる。
【０１２７】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＥＰＡＳ１阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、アトピー性皮膚炎の治療方法を提供する。
【０１２８】
１実施形態において、本発明は、ＥＰＡＳ１阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、ＩＬ−３１の発現抑制方法を提供する。
【０１２９】
１実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療のためのＥＰＡＳ１阻害剤を提供する。
【０１３０】
１実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療剤を製造するためのＥＰＡＳ１阻害剤の使用を提供する。
【実施例】
【０１３１】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【０１３２】
［材料及び方法］
（マウス）
ＤＯＣＫ８−／−マウスは以前に作製した（非特許文献２を参照。）。ヘテロマウス（ＤＯＣＫ８＋／−）はＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに９世代以上戻し交配した。ＤＯＣＫ８＋／−マウスはＡＮＤ  ＴＣＲ  Ｔｇマウスと交配し、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス又はＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスを得た。ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘマウスはジャクソンラボラトリー社から購入し、ＣＤ４−Ｃｒｅ  Ｔｇマウスと交配してＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスを得た。マウスは特定病原菌フリー（ＳＰＦ）環境下において九州大学動物施設で飼育した。週齢及び性別が一致した同腹仔を対照に用いた。すべての実験は九州大学動物実験倫理委員会のガイドラインにしたがって行った。マウスはランダムに選択し、遺伝子型にしたがって各実験群に割り当てた。実験者はマウスの遺伝子型を知らされずに実験を行った。【０１３３】
（掻痒行動の測定）
マウスは１１×１４×２０ｃｍのアクリル製のかごに入れて少なくとも１時間順化させた後、その行動をビデオ撮影した。ビデオを再生し、２時間の期間における掻痒行動の合計を決定した。【０１３４】
（組織学的解析及び免疫蛍光染色）
皮膚組織は４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。厚さ３μｍの切片をヘマトキシリン及びエオジンで染色し、明視野顕微鏡観察した。免疫蛍光解析においては、組織はＯＣＴコンパウンド（サクラファインテック社）に包埋し、液体窒素で凍結した。厚さ１０μｍの凍結切片を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングした。続いて、切片を、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＣＤ３抗体（型式「１７Ａ２」、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（型式「ＲＡ３−６Ｂ２」、ＢＤバイオサイエンス社）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８ａ抗体（型式「５３−６．７」、ＢＤバイオサイエンス社）又はビオチン標識抗マウスＣＤ４抗体（型式「Ｈ１２９．１９」、ＢＤバイオサイエンス社）及び後に続くアレクサフルオロ４８８標識ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で染色した。ＥＰＡＳ１染色は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）３×１０５個／ｍＬをポリ−Ｌ−リジンコートされたガラスボトムディッシュ（マツナミ社）上で１％Ｏ２環境下で３０時間培養し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間処理することにより透過処理した。続いて、１０％ヤギ血清で１時間室温で処理してブロッキングし、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、同仁化学研究所社）及びウサギ抗ＥＰＡＳ１抗体（ＮＯＶＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）で染色し、続いてアレクサフルオロ４８８標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｆａｂフラグメント、ジャクソンイムノリサーチ社）で染色した。全ての画像は共焦点レーザー走査型顕微鏡（カールツァイス社）で撮影した。【０１３５】
（ＥＬＩＳＡ）
血清サンプル中及び細胞培養上清中のＩＬ−３１の濃度は、ＥＬＩＳＡキット（ヒトサンプルはＲ＆Ｄシステムズ社、マウスサンプルはＵＳＣＮ社）を用いて説明書にしたがって測定した。血清中のＩｇＥ及びＩｇＧ２ｂの濃度の測定は次のようにして測定した。まず、血清サンプルを段階希釈し、ヤギ抗マウスＩｇＥ抗体又はヤギ抗マウスＩｇ（ＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ，Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でコートした９６ウェルプレートに入れた。２時間インキュベート後、ウェルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識ラット抗マウスＩｇＥ抗体又はヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）と共にインキュベートした。【０１３６】
（フローサイトメトリー）
以下の抗体及び試薬を使用した。ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体（型式「ＲＡ３−６Ｂ２」）、ＦＩＴＣ標識講マウスＣＤ４抗体（型式「ＲＭ４−５」）、ビオチン標識抗マウスＣＤ４抗体（型式「ＲＭ４−５」）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ８ａ抗体（型式「５３−６．７」）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４４抗体（型式「ＩＭ７」）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（型式「ＭＥＬ−１４」）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＶα１１抗体（型式「ＲＲ８−１」）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＶα２抗体（型式「Ｂ２０．１」）、ビオチン標識抗マウスＶβ３（型式「ＫＪ２５」）、ビオチン標識抗マウスＶβ５（型式「ＭＲ９−４」）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＰｅｒＣＰ−５．５シアニン標識ストレプトアビジン（以上いずれもＢＤバイオサイエンス社）、ビオチン標識抗マウスＣＤ９０．２／Ｔｈｙ１．２（型式「３０−Ｈ１２」、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。抗体で染色する前に、細胞を抗ＦｃγＩＩＩ／ＩＩレセプター抗体（型式「２．４Ｇ２」、ＢＤバイオサイエンス社）と共に氷上で１０分間インキュベートし、Ｆｃ受容体をブロックした。フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（商品名、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて行った。【０１３７】
（細胞の調製及び培養）
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、脾臓及び抹消リンパ節からダイナビーズマウスＣＤ４を用いた磁気ソーティングにより分離し、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤマウスＣＤ４（ライフテクノロジーズ社）で処理し、１０％加熱不活性化処理した仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ社）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ライフテクノロジーズ社）及びＭＥＭ非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬）に懸濁した。抗原刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（３×１０５個／ウェル）を、２４ウェルプレート中で、Ｔ細胞を除去し放射線照射した脾臓細胞（５×１０６個／ウェル）と共に、ＭＣＣ８８−１０３ペプチド（配列番号１、３μｇ／ｍＬ）又はＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（配列番号４、１μｇ／ｍＬ）の存在下で培養することにより行った。【０１３８】
２次刺激は、上記の培養物から回収したＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３ε抗体（型式「１４５−２Ｃ１１」、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／ｍＬ）で、場合により抗ＣＤ２８抗体（型式「３７．５１」、ＢＤバイオサイエンス社、１μｇ／ｍＬ）と共に刺激することにより行った。【０１３９】
Ｔ細胞増殖アッセイは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０４個／ウェル）を、Ｔ細胞を除去し放射線照射した脾臓細胞（１×１０６個／ウェル）と共に、様々な濃度の所定のペプチドの存在下又は非存在下で６６時間培養することにより行った。培養の最後の１８時間に［３Ｈ］チミジン（０．０３７ＭＢｑ）を添加し、取り込まれた放射線活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。【０１４０】
ヒト末梢血サンプルは、アトピー性皮膚炎患者及び健常人ボランティアから、施設の審査委員会の手順書を順守して採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、パーコール（ＧＥヘルスケア社）を用いた密度勾配遠心により分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから、ダイナビーズヒトＣＤ４及び後に続くＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤヒトＣＤ４（ライフテクノロジーズ社）を用いた磁気ソーティングにより分離した。【０１４１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞（３×１０５個／ウェル）を完全ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した後、抗ヒトＣＤ３ε抗体（型式「Ｈｉｔ３ａ」、Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をコートした２４ウェルプレート中で６時間刺激した。いくつかの実験においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＥＰＡＳ１阻害剤であるＦＭ１９Ｇ１１又はＨＩＦＶＩＩ（いずれもカルビオケム社）３０μＭで処理した。【０１４２】
これらの実験は、九州大学病院倫理委員会により承認され、全ての患者及び健常人ボランティアからインフォームドコンセントへの署名された同意を得た。【０１４３】
（ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＰＣＲ）
ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン社）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（ライフテクノロジーズ社）で処理した後、ＲＮＡサンプルをオリゴ（ｄＴ）プライマー（ライフテクノロジーズ社）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社）を用いて逆転写し、ＰＣＲ増幅した。【０１４４】
各遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列の配列番号を下記表１に示す。なお、本明細書において、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの略である。【０１４５】
【表１】
2017146227.tif 000002
【０１４６】
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（商品名、アプライドバイオシステムズ社）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。【０１４７】
リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列の配列番号を下記表２に示す。なお、本明細書において、ＨＰＲＴはヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの略である。【０１４８】
【表２】
2017146227.tif 000003
【０１４９】
ヒト及びマウスの標的遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴの発現量に基づいて標準化した。リアルタイムＰＣＲ装置に付属の配列検出ソフトウエアを解析に用いた。【０１５０】
（マイクロアレイ解析）
ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン社）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ｃＲＮＡの増幅及び標識を、市販のキット（型式「Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」、アジレントテクノロジー社）を用いて行った。【０１５１】
ｃＲＮＡをマイクロアレイ（型式「４４Ｋ  ６０−ｍｅｒ  ｏｌｉｇｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ２．０）」、アジレントテクノロジー社）にハイブリダイズした。ハイブリダイズ後のマイクロアレイスライドはアジレントテクノロジー社製のスキャナーを用いてスキャンした。相対的ハイブリダイゼーション強度及びバックグラウンドハイブリダイゼーションの値はソフトウエア（型式「Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．５．１．１」、アジレントテクノロジー社）を用いて計算した。Ｒａｗシグナル強度及び各プローブのフラグは、ハイブリダイゼーション強度及びスポット情報に基づいてアジレントテクノロジー社により推奨された手法にしたがって計算した。実験サンプルにおいて発現上昇又は発現低下した遺伝子を同定するために、発明者らは、各プローブの標準化されたシグナル強度に基づいてＺ−スコア及び比を計算した（発現上昇した遺伝子はＺ−スコア＞２．０及び比＞１．５倍、発現低下した遺伝子はＺ−スコア＜−２．０及び比＜０．６６倍）。【０１５２】
（ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のノックダウン）
ＤＯＣＫ８−／−又はＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ  ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１遺伝子又はＭＳＴ１遺伝子の発現をノックダウンするために、市販のキット（商品名「Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ」、型式「Ｅ−０４０６３５−００−０００５」（ＥＰＡＳ１用）又は「Ｅ−０５９３８５−００−０００５」（ＭＳＴ１用）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を使用した。【０１５３】
遺伝子導入は、オリゴヌクレオチド（商品名「Ａｃｃｅｌｌ  Ｒｅｄ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ」、型式「Ｄ−００１９６０−０１−０５」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を対照に用いて、製造業者の説明書にしたがって行った。【０１５４】
簡単には、ＤＯＣＫ８−／−又はＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇ  ＣＤ４＋Ｔ細胞（３×１０５個／ウェル）を、２．５％ＦＣＳを添加した培地（型式「Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉａ」、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）中で、Ｔ細胞を除去し放射線照射した脾臓細胞（５×１０６個／ウェル）及びＭＣＣ８８−１０３ペプチド（配列番号１、３μｇ／ｍＬ）と共に培養した。続いて、ｓｉＲＮＡ又は対照のオリゴヌクレオチドを終濃度１μＭで添加した。４日間培養した後、生存したＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、プレートに結合した抗ＣＤ３ε抗体（型式「１４５−２Ｃ１１」、１μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８抗体（型式「３７．５１」、１μｇ／ｍＬ）で３時間刺激した。ノックダウンの有効性をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。【０１５５】
ＭＥＦにおけるＳＰ１遺伝子及びＡＲＮＴ遺伝子の発現をノックダウンする場合には、ｓｉＲＮＡ（商品名「Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ」、型式「Ｌ−０４０６３３−０２−０００５」（ＳＰ１用）又は「Ｌ−０４０６３９−０１−０００５」（ＡＲＮＴ用）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）及び対照オリゴヌクレオチド（商品名「ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ」、ライフテクノロジー社）を用いた。【０１５６】
遺伝子導入には、まず、血清フリーＤＭＥＭ培地（和光純薬）中のｓｉＲＮＡ溶液（１５０ｎＭ）４００μＬを５μＬのＤｈａｒｍａＦｅｃｔトランスフェクション試薬と混合し、２０分間室温で静置した。この溶液を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地１．６ｍＬに懸濁したＭＥＦ（３×１０５個／ウェル）に滴下し、３７℃で２４時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイのための一過性遺伝子導入に用いた。ノックダウンの有効性をウエスタンブロット法により確認した。【０１５７】
（プラスミド及び遺伝子導入）
マウスＩＬ−３１レポータープラスミド（ｐＧＬ４．１０−ＩＬ−３１）を作成するために、マウスＩＬ−３１遺伝子のプロモーターの−１３６７〜−１の位置をＰＣＲにより増幅し、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクター（プロメガ社）にサブクローニングした。ＩＬ−３１プロモーターの欠失及び変異はＰＣＲにより行った。これらのプラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（ライフテクノロジー社）を用いてＭＥＦに導入し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。【０１５８】
ＦＬＡＧタグを有するヒト及びマウスＥＰＡＳ１（ｐｃＤＮＡ−ＥＰＡＳ１）及びその欠失変異体、ＨＡタグを有するマウスＤＯＣＫ８（ｐｃＤＮＡ−ＤＯＣＫ８）、ＦＬＡＧタグ又はＶ５タグを有するマウスＭＳＴ１（ｐｃＤＮＡ−ＭＳＴ１）、並びにＨＡタグを有するヒトＡＲＮＴ（ｐｃＤＮＡ−ＡＲＮＴ）の発現ベクターは、ｐｃＤＮＡベクター（インビトロジェン社）を用いて作製した。【０１５９】
これらの発現コンストラクトは、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、免疫沈降に用いた。【０１６０】
ＷＴ（野生型）ＤＯＣＫ８及びその変異体、ＤＯＣＫ８のＮ末端の５２７アミノ酸を欠失した変異体（ΔＮ）、ＤＯＣＫ８の１５３５〜２１００番目のアミノ酸を欠失した変異体（ΔＤＨＲ２）の発現ベクターは、ネオマイシンをコードするｐＢＪベクター（ｐＢＪ−ｎｅｏ）を用いて作製した。【０１６１】
レトロウイルスベクターｐＭＸを、ｐＭＸ−ＥＰＡＳ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）プラスミドの作製に使用した。【０１６２】
このプラスミドＤＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ６遺伝子導入試薬（プロメガ社）を用いてＰｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（コスモバイオ社）に遺伝子導入した。遺伝子導入から４８時間後に細胞培養上清を回収し、ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（５μｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ）を添加してＣＤ４＋Ｔ細胞に感染させた。【０１６３】
２０００ｒｐｍで１時間遠心した後、プレートを３２℃で８時間及び３７℃で１６時間インキュベートした。１日間隔で２回の追加のレトロウイルス感染を行い、３回目の遺伝子導入の３０時間後にＧＦＰ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス社）でソートし、ＲＮＡを抽出した。【０１６４】
レトロウイルスベクターであるｐＳＵＰＥＲ  ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏ  ｓｈ  ＭＳＴ１を作製するために、ＭＳＴ１の特定の領域に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号２７及び２８）からなる２本鎖ＤＮＡ断片をｐＳＵＰＥＲ  ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏベクター（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社）のＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションした。【０１６５】
ＭＥＦに、レトロウイルスベクターｐＳＵＰＥＲ  ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏ  ｓｈ  ＭＳＴ１を上述したようにして導入した。【０１６６】
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＭＥＦに、ｐＲＬ−ＳＶ４０−Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅプラスミド（０．１μｇ、プロメガ社）、ｐＧＬ４．１０−ＩＬ−３１（２μｇ）、及びｐｃＤＮＡ−ＥＰＡＳ１又はその変異体（２μｇ）を共導入した。【０１６７】
これらのプラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００遺伝子導入試薬（５μＬ）と共にＯｐｔｉ−ＤＭＥＭ培地（ライフテクノロジー社）５００μＬ中で混合して２０分間室温で静置し、１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地１．５ｍＬ中で培養したＭＥＦ（３×１０５個／ウェル）に滴下し、遺伝子導入した。遺伝子導入から６時間後に、細胞を１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地に懸濁し、更に２４時間インキュベートした。いくつかの実験においては、ｐＧＬ４．１０−ＩＬ−３１由来の変異体を使用した。【０１６８】
プラスミドＤＮＡの合計量は、対照ベクターにより同等化した。ルシフェラーゼ活性は市販のキット（型式「Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」、プロメガ社）を用いて説明書にしたがって測定した。【０１６９】
（イムノブロッティング及び免疫沈降）
細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４及びｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ロシュ社）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で溶解した。【０１７０】
遠心後、上清を等容量の２×サンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ブロモフェナシルブロミド、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール及び２００μＭジチオトレイトール）と混合し、５分間煮沸し、イムノブロッティングにより解析した。【０１７１】
以下の抗体を使用した。ウサギ抗ＥＰＡＳ１抗体（ＮＯＶＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、ウサギ抗ＳＰ１抗体（ミリポア社）、ウサギ抗ＡＲＮＴ抗体（セルシグナリング社）、ウサギ抗ＭＳＴ１抗体（セルシグナリング社）、ヤギ抗アクチン抗体（型式「Ｉ−１９」、サンタクルーズ社）ラット抗ＨＡ抗体（型式「３Ｆ１０」、ロシュ社）、抗ＦＬＡＧ抗体（ＭＢＬ社）及び抗Ｖ５抗体（ライフテクノロジー社）。【０１７２】
ＤＯＣＫ８に対するポリクローナル抗体は、ウサギをＫＬＨに結合した、ヒト及びマウスのＤＯＣＫ８のＣ末端配列に対応する合成ペプチド（第２０８１−２１００番目、配列番号２９）で免疫して作製した。いくつかの実験では、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞溶解物を適切な抗体で免疫沈降してイムノブロッティングを行った。シグナルはソフトウエア（ソフト名「ＩｍａｇｅＪ」、http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて測定し、β−アクチンに対して標準化した。【０１７３】
（ＥＭＳＡ）
定法により、ＭＥＦから核抽出物を調製した。簡単には、細胞をＰＢＳで洗浄し、バッファーＡ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ＋、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。続いて、ＮＰ−４０を終濃度０．６７％添加することにより細胞を溶解させ、直ちに１０秒間ボルテックスした。【０１７４】
溶解物を２００００ｇで３０秒間４℃で遠心し、核を沈殿させた。核をバッファーＢ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ＋、ｐＨ７．９、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、時々懸濁しながら氷上で１５分間インキュベートし、２００００ｇで５分間、４℃で遠心し、核抽出物を調製した。【０１７５】
また、コンセンサスＳＰ１結合配列を含む、マウスＩＬ−３１プロモーター領域に対応するＤＮＡプローブ（ＷＴ、配列番号３０）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（プロメガ社）を用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（パーキンエルマー社）で標識し、ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社）で精製した。【０１７６】
タンパク質−ＤＮＡ結合は次のようにして行った。４μｇの核抽出物を、非標識の競合ＤＮＡ（ＷＴ（配列番号３０）又は変異体（配列番号３１））の存在下又は非存在下で、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）（シグマアルドリッチ社）を添加した９μＬの結合バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｋ＋、ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で２．５時間氷上でインキュベートした後、１μＬの［３２Ｐ］標識したプローブ（０．０３５ｐｍｏｌ）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。【０１７７】
タンパク質−ＤＮＡ複合体は、６％ネイティブポリアクリルアミド／０．５×ＴＢＥゲル上で４℃で分離し、８０℃で２時間吸引してろ紙上に乾燥させ、ＢＡＳ２０００  ＢＩＯ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（富士フイルム社）を用いて解析した。【０１７８】
スーパーシフトアッセイは、３μｇの抗ＳＰ１抗体（ミリポア社）又は対照としての６μｇの抗ＧＦＰ抗体（インビトロジェン社）を核抽出物に添加し、氷上で２．５時間インキュベートした後に、放射性標識したプローブを添加して行った。【０１７９】
（クロマチン免疫沈降）
野生型（ＷＴ）及びＥＰＡＳ１−／−のＭＥＦを、２枚の１００ｍｍ培養ディッシュ中で、１０％ＦＣＳを含有する１０ｍＬのＤＭＥＭ培地で１２時間培養し、続いて１％Ｏ２環境下で２４時間培養した。続いて、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間、室温でクロスリンクした。続いてグリシンを添加して５分間、室温で反応させ中和した。続いて、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で掻き取って洗浄し、続いて市販のキット（型式「Ｍａｇｎａ  ＣｈＩＰ（商標）ＨｉＳｅｎｓ  Ｋｉｔ」、ミリポア社）を用いて説明書にしたがって核を抽出した。【０１８０】
抽出した核をソニケーションバッファーに懸濁し、超音波ホモジナイザー（型式「Ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  ２００」、ブランソン社）を用いて１０パルスを１６回、出力を「６」に設定して氷上で超音波破砕し、クロマチンＤＮＡを切断した。続いて、１００００ｇで１０分間、４℃で遠心した後、切断したクロマチンＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡ含有量を測定した。【０１８１】
免疫沈降は次のようにして行った。まず、３〜７μｇのクロマチンＤＮＡを、予め２μｇの抗ＳＰ１抗体（型式「０７−６４５」、ミリポア社）又は１μｇのウサギノーマルＩｇＧ（セルシグナリング社）とインキュベートした、プロテインＡ／Ｇ磁性ビーズと混合し、４℃で一晩インキュベートした。【０１８２】
磁性ビーズは、生理的濃度の塩を含有するバッファーで３回洗浄したのち、低塩濃度バッファーで１回洗浄した。続いて、磁性ビーズをプロテイナーゼＫで６５℃、２時間処理し、９５℃で１５分間加熱してプロテイナーゼＫを失活させ、結合したクロマチンＤＮＡを溶出した。【０１８３】
溶出したＤＮＡを、マウスＩＬ−３１プロモーター（−２４９／−９７）を増幅するプライマー（配列番号３２及び３３）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより解析した。【０１８４】
（統計解析）
群間の差は、対応のない片側スチューデントｔ検定（２群の場合）又は一元配置分散分析（多重群の場合）により比較し、続いて事後ボンフェローニテストを行った。また、０．０５未満のＰ値を有意であると見なした。【０１８５】
＜Ｉ．ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおけるアトピー性皮膚炎＞
［実験例１］
ＡＮＤは、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−Ｅκ分子と複合体を形成した、ｍｏｔｈ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ（ＭＣＣ）の第８８番目〜１０３番目のアミノ酸からなるペプチド（配列番号１）を認識するＴＣＲである。【０１８６】
ＤＯＣＫ８の欠損がＣＤ４＋Ｔ細胞の分化及び機能に与える影響を検討するために、発明者らは、ＡＮＤ  ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＤＯＣＫ８−／−マウスと交配した。その結果、発明者らは、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスが１４〜１５週齢までに、自発的に重篤なアトピー性皮膚炎を発症することを明らかにした。【０１８７】
図１（ａ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの代表的な写真である。また、図１（ｂ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの代表的な写真である。【０１８８】
また、図１（ｃ）は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を持つオスマウス（ｎ＝２０）のアトピー性皮膚炎の発症率を示すグラフである。図１（ｄ）は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇの遺伝子型を持つメスマウス（ｎ＝１５）のアトピー性皮膚炎の発症率を示すグラフである。図１（ｃ）及び（ｄ）において、対照として、同数のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇの同腹仔を解析した。【０１８９】
図１（ｃ）及び（ｄ）に示すように、オスとメスの間で発症率に有意な差は認められなかった。アトピー性皮膚炎は、７〜８週齢で発症し、週齢が上昇するごとに悪化した。一方、ＤＯＣＫ８−／−マウスと同様に、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスではアトピー性皮膚炎は発症しなかった。【０１９０】
［実験例２］
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの掻痒行動を解析した。図２は、６週齢（ｎ＝８）、１２週齢（ｎ＝６）及び１８週齢（ｎ＝８）のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの２時間あたりの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである。グラフの値は平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。図２に示すように、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスは、１２及び１８週齢において、激しい掻痒行動を起こした。この結果は、この皮膚炎が非常に痒いことを示す。【０１９１】
［実験例３］
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚の組織学的及び免疫組織学的解析を行った。図３（ａ）及び（ｂ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図３（ａ））及び同腹のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図３（ｂ））の皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。スケールバーは５０μｍを示す。【０１９２】
図３（ｃ）は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（各週齢においてｎ＝４）及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（各週齢においてｎ＝４）の皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０１９３】
図４（ａ）及び（ｂ）は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図４（ａ））及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図４（ｂ））の皮膚を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚にはＣＤ４＋Ｔ細胞が浸潤していることが明らかとなった。【０１９４】
続いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞の浸潤について検討した。図４（ｃ）及び（ｄ）は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図４（ｃ））及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（図４（ｄ））の皮膚を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚にはＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞の浸潤は認められなかった。【０１９５】
以上の結果から、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚では、アトピー性皮膚炎患者の皮膚で認められるのと同様に、大量のＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を伴う表皮肥厚症及び過角化症が認められることが明らかとなった。【０１９６】
［実験例４］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩｇＥ及びＩｇＧ２ｂの濃度を測定した。図５（ａ）及び（ｂ）は、６週齢（ｎ＝１３）、１２週齢（ｎ＝８〜９）及び１８週齢（ｎ＝４）のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩｇＥ（図５（ａ））及びＩｇＧ２ｂ（図５（ｂ））の濃度を示すグラフである。グラフ中の線は平均値を示し、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０１９７】
その結果、１２週齢及び１８週齢のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいて、ＩｇＥの血清中濃度が上昇したが、ＩｇＧ２ｂの血清中濃度は上昇しなかった。【０１９８】
［実験例５］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した。図６は、６週齢（ｎ＝６）及び１８週齢（ｎ＝６）のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を示すグラフである。グラフ中の線は平均値を示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０１９９】
その結果、１８週齢のＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいて、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスと比較して、ＩＬ−３１の血清中濃度が有意に上昇した（１４７．２±２９．３ｐｇ／ｍＬ対４１．５±２８．６ｐｇ／ｍＬ）。【０２００】
＜ＩＩ．ＤＯＣＫ８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１の産生を負に制御している＞
［実験例６］
ＩＬ−３１は、主に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞から産生される。そこで、発明者らは、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫学的な機能を比較した。【０２０１】
図７は、６〜８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの胸腺細胞及び末梢リンパ節細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示すグラフである。また、図８は、６〜８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスの脾臓細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示すグラフである。【０２０２】
その結果、ＤＯＣＫ８が欠損していても、胸腺におけるＴ細胞の発達は正常であることが明らかとなった。しかしながら、ＤＯＣＫ８−／−マウスにおいて報告されているのと同様に、末梢リンパ節及び脾臓におけるＴ細胞の割合は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいて減少していた。また、ＤＯＣＫ８の発現とは関係なく、末梢Ｔ細胞は、Ｖα１１＋Ｖβ３＋ＡＮＤ  ＴＣＲを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞であった。【０２０３】
更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞における、活性化／メモリーマーカーであるＣＤ４４の発現は、６〜８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいて同様であった。【０２０４】
［実験例７］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖を検討した。図９は、Ｉ−Ｅκを発現するＢ１０．ＢＲマウスの脾臓細胞の存在下において、ＭＣＣペプチド（配列番号１）で刺激した、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を測定した結果を示すグラフである。【０２０５】
その結果、図９に示すように、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖は同程度であることが明らかとなった。【０２０６】
［実験例８］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＣＣペプチドで１次刺激し、サイトカイン遺伝子の発現を検討した。【０２０７】
図１０（ａ）は、ＩＬ−３１遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフであり、図１０（ｂ）は、ＩＬ−４遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフであり、図１０（ｃ）は、ＩＬ−２遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフである。図１０（ａ）〜（ｃ）において、各遺伝子の発現量は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の結果を１とした相対値で示した。また、グラフは、４つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０２０８】
その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、抗原刺激の２４時間後において、ＩＬ−３１の転写物が増加した。一方、ＩＬ−２遺伝子の発現は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞で同等であった。【０２０９】
図１１は、抗ＣＤ３ε抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２次刺激した、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフである。図中の値は、２次刺激を行わなかったＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。グラフは、３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２１０】
図１１に示すように、ＤＯＣＫ８欠損による上記の効果は、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原刺激の９６時間後に回収し、抗ＣＤ３ε抗体で再度刺激することにより、更に顕著となった。【０２１１】
抗原刺激しなかった対照サンプルと比較して、ＩＬ−３１の転写物は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の２次刺激の３時間後に２８６０倍に達した。この値は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１の転写物の量の２７．３倍であった。【０２１２】
［実験例９］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を２次刺激した後のＩＬ−３１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０２１３】
図１２は、測定結果を示すグラフである。グラフは、３ウェルずつ測定した３つの独立した実験の代表的な結果における、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２１４】
その結果、実験例８の結果と一致して、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原刺激により、より多くのＩＬ−３１を産生することが明らかとなった。【０２１５】
［実験例１０］
図１０（ｂ）に示したように、活性化したＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−４遺伝子の発現を上昇させた。【０２１６】
そこで、発明者らは、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の１次刺激において、抗ＩＬ−４抗体を反応させ、ＩＬ−３１遺伝子の発現に対するＩＬ−４の影響を検討した。具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＣＣペプチドで１次刺激する間、抗ＩＬ−４抗体を培地に添加して共にインキュベートした。【０２１７】
図１３はＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、２次刺激を行わなかったＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。グラフは、３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２１８】
その結果、抗ＩＬ−４抗体処理は、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の双方におけるＩＬ−３１遺伝子の発現量を減少させた。しかしながら、対照であるＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現量は有意に高かった。【０２１９】
以上のことから、ＤＯＣＫ８は、ＩＬ−４に媒介されるシグナル伝達と独立して、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−３１の産生を負に制御することが明らかとなった。【０２２０】
［実験例１１］
上述した知見が、異なる抗原に対するＴＣＲにまで拡張することが可能か否かを検討するために、発明者らはＩ−Ａｂ分子によって提示されるオブアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド（配列番号４）を認識する、ＯＴＩＩ  ＴＣＲを発現するＤＯＣＫ８−／−マウスを作製して解析した。【０２２１】
図１４は、６〜８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスの末梢リンパ節細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示すグラフである。【０２２２】
その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスと同様にＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  ＴｇマウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞は正常に発達することが明らかとなった。【０２２３】
［実験例１２］
続いて、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖を検討した。図１５は、Ｉ−Ａｂを発現するＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞の存在下において、ＯＶＡペプチド（配列番号４）で刺激した、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を測定した結果を示すグラフである。【０２２４】
その結果、図１５に示すように、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的な増殖は同程度であることが明らかとなった。【０２２５】
［実験例１３］
続いて、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を２次刺激し、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した。図１６は、ＩＬ−３１遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフである。ＩＬ−３１遺伝子の発現量は、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の結果を１とした相対値で示した。グラフは、３つの独立した実験の代表的な結果における、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０２２６】
［実験例１４］
ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を２次刺激した後のＩＬ−３１タンパク質の発現量をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０２２７】
図１７は、測定結果を示すグラフである。グラフは、３ウェルずつ測定した２つの独立した実験の代表的な結果における、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２２８】
図１６及び図１７に示すように、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、２次刺激により、より多くのＩＬ−３１を産生することが明らかとなった。これらの結果は、ＤＯＣＫ８が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異性には関係なく、一般的に、ＩＬ−３１誘導の負の制御因子として作用することを示す。【０２２９】
［実験例１５］
続いて、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝７）及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝７）の血清中のＩＬ−３１の濃度を比較した。【０２３０】
図１８は、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。グラフ中の線は平均値を示す。【０２３１】
その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスと異なり、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスは血清中のＩＬ−３１濃度の上昇を示さないことが明らかとなった。【０２３２】
［実験例１６］
続いて、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）及び同腹のＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）の皮膚の組織学的解析を行った。【０２３３】
図１９（ａ）及び（ｂ）は、１８週齢のＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（図１９（ａ））及び同腹のＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（図１９（ｂ））の皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。スケールバーは５０μｍを示す。【０２３４】
図１９（ｃ）は、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）及びＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）の皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、平均値±標準偏差を示す。【０２３５】
その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスと異なり、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスはアトピー性皮膚炎を発症しないことが明らかとなった。【０２３６】
以上の結果は、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞が自己反応性のＴ細胞であり、Ｉ−Ａｂ分子に提示された、特定されていない自己抗原により、継続的に刺激を受けていることを示す。すなわち、ＡＮＤ  ＴＣＲは、自己反応性を有するＴＣＲである。【０２３７】
＜ＩＩＩ．ＩＬ−３１のマスター制御因子としてのＥＰＡＳ１の同定＞
［実験例１７］
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−３１の過剰発現の機構を明らかにするために、発明者らはマイクロアレイ解析を行った。その結果、抗原刺激後において、対照であるＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、８５６個の遺伝子が、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞で高発現していることが明らかとなった。【０２３８】
これらの遺伝子は、４０個の推定上の転写因子を含んでおり、そのうちの１つがＥＰＡＳ１であった。そこで、野生型のＣＤ４＋Ｔ細胞にＥＰＡＳ１を過剰発現させて、ＩＬ−３１遺伝子の発現を検討した。【０２３９】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３ε抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激した。続いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＧＦＰのみを導入したレトロウイルスベクターであるｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（対照）、及び、ＥＰＡＳ１及びＧＦＰを導入したレトロウイルスベクターであるｐＭＸ−ＥＰＡＳ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入し、ＩＬ−３１遺伝子の発現を測定した。【０２４０】
図２０は、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。図中の値は、対照（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ導入群）におけるＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。グラフは、３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差（ｎ＝６）を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０２４１】
その結果、対照と比較して、ＥＰＡＳ１を過剰発現させたＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＴＣＲ刺激により誘導されるＩＬ−３１遺伝子の発現が顕著に増大した。【０２４２】
［実験例１８］
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１遺伝子をノックダウンし、ＩＬ−３１遺伝子の発現に及ぼす影響を検討した。【０２４３】
ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ又はＥＰＡＳ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、抗原刺激を行った後、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した。また、ノックダウンの有効性をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。【０２４４】
図２１（ａ）は、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、抗原刺激を行わなかった細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。グラフは、３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。図２１（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。【０２４５】
その結果、ＥＰＡＳ１遺伝子をノックダウンすることにより、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現が顕著に抑制されることが明らかとなった。【０２４６】
［実験例１９］
続いて、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１遺伝子の欠失が、ＩＬ−３１遺伝子の発現に及ぼす影響を検討した。【０２４７】
具体的には、Ｔ細胞特異的にＥＰＡＳ１遺伝子を欠失する、ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスを作製し、このマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した。【０２４８】
図２２はＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、抗原刺激を行わなかった細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。３ウェルずつ測定した３つの独立した実験の代表的な結果における、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２４９】
その結果、ＥＰＡＳ１遺伝子を欠失させた場合においても、ＥＰＡＳ１遺伝子をノックダウンした場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＥＰＡＳ１遺伝子を欠失させることにより、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現が顕著に抑制されることが明らかとなった。【０２５０】
［実験例２０］
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおける、アトピー性皮膚炎の発症、掻痒行動及び血清中のＩＬ−３１の濃度を検討した。【０２５１】
図２３は、１４週齢のＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの代表的な写真である。【０２５２】
図２４は、１４週齢のＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの２時間あたりの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである（ｎ＝４）。グラフの値は、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２５３】
図２５（ａ）は、１４週齢のＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス及び同腹の対照マウスの皮膚をヘマトキシリン及びエオジン染色した結果を示す写真である。スケールバーは５０μｍを示す。【０２５４】
図２５（ｂ）は、１４週齢のＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）及び同腹の対照マウス（ｎ＝４）の皮膚における０．２５ｍｍ２あたりの炎症性細胞の総数を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２５５】
図２６は、１４週齢のＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス（ｎ＝４）及び同腹の対照マウス（ｎ＝４）の血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである。グラフ中の線は平均値を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２５６】
図２３〜図２６において、対照マウスとしては、ＣＤ４−Ｃｒｅ−ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウス又はＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｗＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスを用いた。【０２５７】
以上の結果から、解析した全てのＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＥＰＡＳ１ｌｏｘ／ｌｏｘＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいて、血清中のＩＬ−３１の濃度の上昇が認められず、掻痒行動及びアトピー性皮膚炎の発症も認められなかった。【０２５８】
したがって、ＥＰＡＳ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１誘導のマスター制御因子として機能し、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおけるアトピー性皮膚炎の発症に必須であることが明らかとなった。【０２５９】
［実験例２１］
続いて、ＥＰＡＳ１がどのようにしてＩＬ−３１のプロモーターを活性化するのかについて検討した。【０２６０】
発明者らは、ＩＬ−３１のプロモーター配列（−１３６７〜−１）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターコンストラクトを作製した。また、ＥＰＡＳ１の変異体の発現ベクターを作製した。【０２６１】
図２７（ａ）は、本実験例で使用したＥＰＡＳ１の変異体の模式図である。続いて、レポーターコンストラクト及びＥＰＡＳ１の変異体をマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に遺伝子導入し、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した。【０２６２】
図２７（ｂ）は、各ＥＰＡＳ１変異体の存在下でＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は４つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２６３】
その結果、野生型のＥＰＡＳ１の存在下ではＩＬ−３１プロモーターの活性化が誘導されたが、Ｎ末端側の活性化ドメイン（Ｎ−ＴＡＤ）又はＣ末端側の活性化ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）を欠失したＥＰＡＳ１の変異体の存在下では、ＩＬ−３１プロモーターの活性化が誘導されないことが明らかとなった。【０２６４】
［実験例２２］
続いて、ＭＥＦに、実験例２１のレポーターコンストラクト、野生型のＥＰＡＳ１の発現ベクター、及びＡｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（ＡＲＮＴ）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ又はＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＳＰ１）遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した。【０２６５】
図２８（ａ）は、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。図２８（ｂ）は、ＡＲＮＴ遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。図２８（ｃ）は、ＳＰ１遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。【０２６６】
その結果、ＡＲＮＴ遺伝子をノックダウンしてもＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性化には影響しないことが明らかとなった。一方、ＳＰ１遺伝子をノックダウンすると、ＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性が低下することが明らかとなった。【０２６７】
以上の結果は、ＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性化には、ＡＲＮＴではなくＳＰ１が必須であることを示す。【０２６８】
［実験例２３］
続いて、発明者らは、実験例２１のレポーターコンストラクトにおけるＩＬ−３１プロモーターを少しずつ短くしたレポーターコンストラクトを作製し、野生型のＥＰＡＳ１の発現ベクターと共にＭＥＦに導入し、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した。【０２６９】
図２９は、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２７０】
その結果、発明者らは、ＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性化に重要な領域を特定した。その領域は、−１１８〜−１１５のＳＰ１結合配列である「ＧＣＧＣ」を含んでいた。【０２７１】
［実験例２４］
続いて、発明者らは、ＩＬ−３１プロモーターに部位特異的変異を導入したレポーターコンストラクトを作製し、野生型のＥＰＡＳ１の発現ベクターと共にＭＥＦに導入し、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した。【０２７２】
図３０は、ＩＬ−３１プロモーターの活性を測定した結果を示すグラフである。図中の「＃１；ＣＡＡ」は、図３０下に示すＩＬ−３１プロモーターの＃１領域（−１３５〜−１３３）に位置する「ＴＧＧ」を「ＣＡＡ」に変異させたことを意味し、以下同様である。グラフの値は３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２７３】
その結果、ＩＬ−３１プロモーターの−１１８〜−１１５に位置するＳＰ１結合配列である「ＧＣＧＣ」を「ＡＡＧＴ」に変異させると、ＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性がほぼ完全に失われることが明らかとなった。この結果は、ＥＰＡＳ１に媒介されたＩＬ−３１プロモーターの活性化には、−１１８〜−１１５に位置するＳＰ１結合配列が重要であることを示す。【０２７４】
［実験例２５］
続いて、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）によりＩＬ−３１プロモーターにＳＰ１が結合するか否かについて検討した。【０２７５】
図３１（ａ）及び（ｂ）は、ＥＭＳＡの結果を示す写真である。図中、「Ｃ」はＳＰ１−ＤＮＡ複合体を示し、「ＳＳ」はスーパーシフトを示す。「ＮＥ」は各抽出物を意味し、「ＷＴ」は野生型配列を意味し、「Ｍｕｔ」は変異型配列を意味する。【０２７６】
その結果、ＳＰ１が確かにＩＬ−３１プロモーターに結合することが明らかとなった。また、ＳＰ１は、ＩＬ−３１プロモーターの−１１８〜−１１５に位置するＳＰ１結合配列である「ＧＣＧＣ」を「ＡＡＧＴ」に変異させたＤＮＡ断片には結合しないことが明らかとなった。【０２７７】
［実験例２６］
続いて、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により、ＩＬ−３１プロモーターへのＳＰ１の結合に与えるＥＰＡＳ１の影響を検討した。【０２７８】
図３２は、ＣｈＩＰアッセイの結果を示すグラフである。グラフの値は７つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０２７９】
その結果、ＥＰＡＳ１の非存在下では、ＳＰ１のＩＬ−３１プロモーターへの結合が顕著に低下することが明らかとなった。【０２８０】
以上の結果から、ＥＰＡＳ１は、ＡＲＮＴ非依存的に、ＳＰ１と協調してＩＬ−３１プロモーターを活性化することが明らかとなった。【０２８１】
発明者らはまた、ＭＥＦの代わりにＣＤ４＋Ｔ細胞を用いたＣｈＩＰを行い、ＩＬ−３１プロモーターへのＳＰ１の結合に与えるＥＰＡＳ１の影響を検討した。その結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合においても、ＭＥＦを用いた場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＥＰＡＳ１の非存在下では、ＳＰ１のＩＬ−３１プロモーターへの結合が顕著に低下することが明らかとなった。【０２８２】
＜ＩＶ．ＤＯＣＫ８は、ＥＰＡＳ１の核移行を制御するアダプターとして機能する＞
［実験例２７］
ＥＰＡＳ１は、細胞質から核に移動し、核内でＩＬ−３１プロモーターの活性化を媒介する。そこで、発明者らは、ＤＯＣＫ８がＩＬ−３１の誘導を負に制御する機構を解明するために、野生型のＭＥＦ及びＤＯＣＫ８−／−のＭＥＦの間でＥＰＡＳ１の細胞内局在を検討した。【０２８３】
まず、免疫蛍光染色により、抗ＥＰＡＳ１抗体の検証を行った。図３３（ａ）は、ＥＰＡＳ１−／−のＭＥＦを抗ＥＰＡＳ１抗体で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。核を染色するためにＤＡＰＩを使用した。スケールバーは２０μｍである。図３３（ｂ）は、野生型のＭＥＦを抗ＥＰＡＳ１抗体で免疫蛍光染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。この結果、抗ＥＰＡＳ１抗体の有効性が確認された。【０２８４】
続いて、野生型（ＷＴ）及びＤＯＣＫ８−／−のＭＥＦの、通常条件下及び低酸素条件下におけるＥＰＡＳ１の細胞内局在を、免疫蛍光染色により検討した。図３４（ａ）及び（ｂ）は、免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。核を染色するためにＤＡＰＩを使用した。スケールバーは２０μｍである。図３４（ｃ）は、ＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は４つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２８５】
その結果、野生型及びＤＯＣＫ８−／−のいずれのＭＥＦにおいても、低酸素条件下ではＥＰＡＳ１が核に移行した。また、ＤＯＣＫ８−／−のＭＥＦにおけるＥＰＡＳ１の核への局在は、野生型のＭＥＦと比較して、通常条件下においても顕著に増加していた。【０２８６】
［実験例２８］
野生型のＤＯＣＫ８（ＷＴ）又はＤＯＣＫ８の変異体（ΔＮ及びΔＤＨＲ２）をＤＯＣＫ８−／−ＭＥＦで発現させ、ＥＰＡＳ１の細胞内局在を検討した。【０２８７】
図３５（ａ）は、通常条件下及び低酸素条件下におけるＥＰＡＳ１の細胞内局在を、免疫蛍光染色により検討した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。核を染色するためにＤＡＰＩを使用した。スケールバーは２０μｍである。図３５（ｂ）はＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は４つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２８８】
その結果、ＤＯＣＫ８の欠失によるＥＰＡＳ１の核への集積は、野生型のＤＯＣＫ８をＤＯＣＫ８−／−ＭＥＦで発現させることにより消失することが明らかとなった。同様の結果は、Ｃｄｃ４２の活性化に必須であるＤＯＣＫ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎ（ＤＨＲ）−２ドメインを欠失したＤＯＣＫ８の変異体（ΔＤＨＲ２）をＤＯＣＫ８−／−ＭＥＦで発現させた場合においても認められた。【０２８９】
しかしながら、ＤＯＣＫ８のＮ末端の５２７アミノ酸を欠失したＤＯＣＫ８の変異体（ΔＮ）をＤＯＣＫ８−／−ＭＥＦで発現させた場合においては、ＥＰＡＳ１の核への集積を抑制することができなかった。この結果は、ＥＰＡＳ１の細胞内局在の制御に、ＤＯＣＫ８のＮ末端領域が重要であることを示す。【０２９０】
［実験例２９］
ところで、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＳＴＥ２０−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＭＳＴ１）は、Ｔ細胞の接着、遊走、増殖及びアポトーシスに関与するセリン／スレオニンキナーゼである。ＤＯＣＫ８に結合するタンパク質を探索した結果、発明者らは、ＤＯＣＫ８がそのＮ末端領域を介してＭＳＴ１に結合することを明らかにした。【０２９１】
図３６（ａ）はＤＯＣＫ８とＭＳＴ１がＤＯＣＫ８のＮ末端領域を介して結合することを示す免疫沈降の写真である。【０２９２】
続いて、ＤＯＣＫ８、ＭＳＴ１及びＥＰＡＳ１をヒト胚性腎臓細胞である２９３Ｔ（ＨＥＫ−２９３Ｔ）細胞で共発現させ、免疫沈降を行った。図３６（ｂ）は、免疫沈降の結果を示す写真である。その結果、ＥＰＡＳ１とＭＳＴ１は、ＤＯＣＫ８の存在とは関係なく共免疫沈降することが明らかとなった。【０２９３】
この結果は、ＤＯＣＫ８がＭＳＴ１と結合することにより、ＥＰＡＳ１の細胞内局在を制御している可能性を示した。【０２９４】
［実験例３０］
続いて、野生型のＭＥＦにおいて、ＭＳＴ１のノックダウンがＥＰＡＳ１の核への局在に及ぼす影響を検討した。【０２９５】
野生型のＭＥＦにレトロウイルスベクターであるｐＳＵＰＥＲ  ｒｅｔｒｏ−ｐｕｒｏ  ｓｈ  ＭＳＴ１を用いてＭＳＴ１のｓｈＲＮＡを導入し、ＭＳＴ１をノックダウンした。図３７は、ＭＳＴ１遺伝子のノックダウンの有効性をウエスタンブロッティング法により検討した結果を示す写真である。【０２９６】
続いて、野生型（ＷＴ）、ＤＯＣＫ８−／−及びＭＳＴ１遺伝子をノックダウンした野生型のＭＥＦにおいて、通常条件下及び低酸素条件下でのＥＰＡＳ１の細胞内局在を、免疫蛍光染色により検討した。【０２９７】
図３８（ａ）〜（ｃ）は、免疫蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図３８（ａ）は野生型のＭＥＦの結果を示し、図３８（ｂ）はＤＯＣＫ８−／−のＭＥＦの結果を示し、図３８（ｃ）はＭＳＴ１遺伝子をノックダウンした野生型のＭＥＦの結果を示す。核を染色するためにＤＡＰＩを使用した。スケールバーは２０μｍである。図３８（ｄ）は、ＥＰＡＳ１が核に局在した細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は３つの独立した実験結果の平均値±標準偏差を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０２９８】
その結果、ＭＳＴ１遺伝子をノックダウンすることにより、ＥＰＡＳ１の核への局在が顕著に増加することが明らかとなった。【０２９９】
［実験例３１］
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞のＭＳＴ１遺伝子をノックダウンした場合のＩＬ−３１遺伝子の発現を検討した。【０３００】
ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ又はＭＳＴ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、抗原刺激を行った後、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した。また、ノックダウンの有効性をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。【０３０１】
図３９（ａ）は、ＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は、抗原刺激を行わなかった細胞のＩＬ−３１遺伝子の発現量を１とした相対値である。グラフは、２つの独立した実験結果の平均値±標準偏差（ｎ＝４）を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。図３９（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。【０３０２】
その結果、ＭＳＴ１遺伝子をノックダウンすることにより、ＤＯＣＫ８＋／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１遺伝子の発現が顕著に増加することが明らかとなった。【０３０３】
以上の結果は、ＤＯＣＫ８−ＭＳＴ１系がＥＰＡＳ１の核移行を阻害することによって、ＩＬ−３１の誘導を負に制御していることを示す。【０３０４】
＜Ｖ．アトピー性皮膚炎患者のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１の役割＞
［実験例３２］
ＥＰＡＳ１がマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−３１の誘導に必須であることが明らかになったため、発明者らは、ヒトのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１の役割を検討した。【０３０５】
抗ＣＤ３ε抗体がコートされた又はコートされていない２４ウェルプレート中で、アトピー性皮膚炎患者及び健常人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を６時間培養し、ウエスタンブロッティングによりＤＯＣＫ８の発現を検討した。【０３０６】
図４０はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、アトピー性皮膚炎患者と健常人（対照）との間でＤＯＣＫ８の発現に顕著な差は認められなかった。【０３０７】
［実験例３３］
続いて、アトピー性皮膚炎患者及び健常人（対照）の血清中のＩＬ−３１の濃度を測定して比較した。図４１は血清中のＩＬ−３１の濃度を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝６）。グラフ中の線は平均値を示す。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０３０８】
その結果、アトピー性皮膚炎患者の血清中のＩＬ−３１の濃度は健常人（対照）と比較して顕著に上昇していることが明らかとなった。【０３０９】
［実験例３４］
続いて、ＴＣＲ刺激により誘導される、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン遺伝子の発現を検討した。【０３１０】
アトピー性皮膚炎患者及び健常人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３ε抗体で刺激し、ＩＬ−３１遺伝子及びＩＬ−２遺伝子の発現量を測定した。図４２（ａ）はＩＬ−３１遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。図４２（ｂ）はＩＬ−２遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。【０３１１】
グラフの値は、ＴＣＲ刺激を行わなかった健常人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞による各サイトカイン遺伝子の発現量を１とした相対値であり、平均値±標準偏差（ｎ＝６）を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０３１２】
その結果、ＤＯＣＫ８−／−ＡＮＤ  ＴｇマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞において見られるのと同様に、ＴＣＲ刺激により誘導されるＩＬ−３１遺伝子の発現量は、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、健常人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（対照）と比較して顕著に高かったが、ＩＬ−２遺伝子の発現量は同等であった。【０３１３】
［実験例３５］
続いて、発明者らは、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＥＰＡＳ１阻害剤の影響を検討した。ＥＰＡＳ１阻害剤としては、ＦＭ１９Ｇ１１及びＨＩＦＶＩＩを使用した。正確な機構は解明されていないが、ＦＭ１９Ｇ１１はＥＰＡＳ１の発現を阻害することが知られている。【０３１４】
まず、ウエスタンブロッティング法により、抗ＥＰＡＳ１抗体の検証を行った。図４３は、ＦＬＡＧタグを連結したヒトＥＰＡＳ１の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ−ＥＰＡＳ１−ＦＬＡＧをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に導入した後、細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＥＰＡＳ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法により解析した。図４３は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。この結果、抗ＥＰＡＳ１抗体の有効性が確認された。【０３１５】
続いて、ＥＰＡＳ１阻害剤がアトピー性皮膚炎患者及び健常人（対照）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１の発現に及ぼす影響を検討した。【０３１６】
図４４は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。３つの独立した実験の代表的な結果を示す。その結果、ＦＭ１９Ｇ１１がヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥＰＡＳ１タンパク質の発現量を顕著に減少させることが確認された。【０３１７】
［実験例３６］
続いて、ＥＰＡＳ１阻害剤であるＦＭ１９Ｇ１１（ｎ＝６）及びＨＩＦＶＩＩ（ｎ＝３）が、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ刺激により誘導されるサイトカイン遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。【０３１８】
図４５（ａ）はＩＬ−３１遺伝子の発現量に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を検討した結果を示すグラフである。図４５（ｂ）はＩＬ−２遺伝子の発現量に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を検討した結果を示すグラフである。図４５（ｃ）はＩＬ−３１遺伝子の発現量に対するＨＩＦＶＩＩの影響を検討した結果を示すグラフである。図４５（ａ）〜（ｃ）において、グラフの値は、ＴＣＲ刺激を行わなかったアトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における各サイトカインの発現量を１とした相対値の平均値±標準偏差である。図中の「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。【０３１９】
その結果、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＭ１９Ｇ１１で処理すると、ＴＣＲ刺激により誘導されるＩＬ−３１遺伝子の発現が顕著に抑制されたが、ＩＬ−２遺伝子の発現量は同等であった。一方、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＦＶＩＩで処理した場合においては、ＦＭ１９Ｇ１１のようなＩＬ−３１遺伝子の発現抑制効果は認められなかった。【０３２０】
［実験例３７］
ところで、ＨＩＦＶＩＩはＥＰＡＳ１のＰＡＳ−Ｂドメインに結合し、ＥＰＡＳ１とＡＲＮＴとの結合を阻害することが知られている。このことを確認するために、ＡＲＮＴ及びＥＰＡＳ１をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で共発現させ、ＨＩＦＶＩＩの存在下又は非存在下で免疫沈降を行った。図４６（ａ）及び（ｂ）は、免疫沈降の結果を示す写真である。その結果、ＨＩＦＶＩＩ処理はＡＲＮＴ及びＥＰＡＳ１の結合を阻害することが確認された。【０３２１】
以上の結果は、アトピー性皮膚炎患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＥＰＡＳ１が、ＡＲＮＴとの結合とは無関係にＩＬ−３１の誘導を制御していることを示す。【０３２２】
＜ＶＩ．ＤＯＣＫ８コンディショナルノックアウトマウスにおけるアトピー性皮膚炎＞
［実験例３８］
ＡＮＤ  ＴＣＲを有しＣＤ４＋Ｔ細胞特異的にＤＯＣＫ８を欠失したコンディショナルノックアウトマウスが、アトピー性皮膚炎を発症するか否かを検討した。【０３２３】
まず、ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘマウスを定法により作製した。続いて、ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘマウスをＡＮＤ  ＴＣＲ  Ｔｇマウスと交配し、ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘＡＮＤ  Ｔｇマウスを得た。更に、ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘＡＮＤ  ＴｇマウスをＣＤ４−Ｃｒｅ  Ｔｇマウスと交配してＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘＡＮＤ  Ｔｇマウスを得た。【０３２４】
ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘＡＮＤ  ＴｇマウスはＣＤ４＋Ｔ細胞特異的にＤＯＣＫ８を欠失する。ＣＤ４−Ｃｒｅ＋ＤＯＣＫ８ｌｏｘ／ｌｏｘＡＮＤ  Ｔｇマウスを特定病原菌フリー（ＳＰＦ）環境下で飼育し、皮膚炎の発症を検討した。週齢及び性別が一致した同腹仔を対照に用いた。【０３２５】
皮膚炎の状態をＳｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＳＣＯＲＡＤ）インデックスにしたがって評価した。具体的には、（１）紅斑／出血、（２）落屑／乾燥、（３）浮腫、（４）表皮剥脱／ただれ、の４項目を、０：なし、１：軽度、２：中程度、３：重度、の１２点満点で評価した。【０３２６】
図４７は、ＤＯＣＫ８コンディショナルノックアウトマウス（ＫＯ、ｎ＝４）及び対照マウス（ヘテロ、ｎ＝４）のＳＣＯＲＡＤインデックスの推移を測定した結果を示すグラフである。グラフの値は平均値±標準偏差で示した。【０３２７】
その結果、対照マウスが皮膚炎を発症しなかったのに対し、ＤＯＣＫ８コンディショナルノックアウトマウスは、７週齢以降でアトピー性皮膚炎を発症することが明らかとなった。【０３２８】
この結果は、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＤＯＣＫ８タンパク質、ＭＳＴ１タンパク質及びＥＰＡＳ１タンパク質を含む複合体が形成不能となる遺伝子変異が、アトピー性皮膚炎を発症させることを更に支持するものである。【０３２９】
＜ＶＩＩ．ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の検討＞
［実験例３９］
実験例１６において、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウスはアトピー性皮膚炎を発症しないことが示された。そこで、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡ抗原を全身に発現するＣＡＧ−ＯＶＡマウスに移入し、痒みを惹起するか否かを検討した。【０３３０】
具体的には、まず、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス、又は同腹のＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（配列番号４、１μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｔ細胞を除去し放射線照射した脾臓細胞（５×１０６個／ウェル）と共に培養することにより活性化した。続いて、活性化した各ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５．７×１０６個／マウスの投与量でＣＡＧ−ＯＶＡマウスに静脈投与した。続いて、細胞の投与から５時間後に掻痒行動の観察を開始した。【０３３１】
図４８は、ＤＯＣＫ８＋／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したＣＡＧ−ＯＶＡマウスの２時間あたりの掻痒行動を定量した結果を示すグラフである（各群についてそれぞれｎ＝４）。グラフの値は平均値±標準偏差を示す。図中の「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。【０３３２】
その結果、図４８に示すように、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したＣＡＧ−ＯＶＡマウスは、激しい掻痒行動を起こすことが明らかとなった。この結果は、ＤＯＣＫ８−／−ＯＴＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＡＧ−ＯＶＡマウスに移入することにより、痒みを惹起することができることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０３３３】
本発明によれば、ＩＬ−３１の産生制御機構を明らかにし、アトピー性皮膚炎モデル非ヒト動物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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