(57)【要約】  本発明はより安定で、効率的なオリゴヌクレオチド、特に、３’末端に種々の官能基を連結してなるオリゴヌクレオチドを製造する方法等を提供することを課題とする。３’末端がシリル保護基によって保護されたオリゴ核酸を、シリル基以外の保護基に影響を与えない脱シリル条件にて、３’末端選択的に脱保護する。これをホスホロジアミダイト試薬を用いて、オリゴ核酸上の保護基に影響を与えないホスフィチル化条件に付し、式（Ｉａ−１）（各記号の定義は明細書中に記載の通り）で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させる工程を含む、式（Ｉａ−２）（各記号の定義は明細書中に記載の通り）で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法、等により効率的なオリゴヌクレオチドの製造が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中で５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは２以上の任意の整数を示す。）に1又は２種類以上の有機塩基の存在下、フッ化物イオン源を作用させる工程を含む、５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、該1又は２種類以上の有機塩基のうち少なくとも1種とフッ化水素との塩を該フッ化物イオン源とすることを特徴とする、方法。
【請求項２】
５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉ）を有する、請求項１記載の方法。
【化１】
2017111137.tif 000093
［式中、
ｓ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｓ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｓ個のＰ２は、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｓ個のＲ４０は、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｓ＋１個のＹは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｐ３は、シリル保護基を示し、
ｓは、１以上の任意の整数を示す。］
【請求項３】
フッ化物イオン源に対し１モル当量以上の有機塩基を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
有機塩基が強塩基と弱塩基との混合物、２種類以上の弱塩基の混合物又は単一の弱塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
強塩基がｐＫａ≧８であり、弱塩基が４≦ｐＫａ＜８である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有機塩基として強塩基を１／３モル当量以下で使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有機塩基として、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ブチルアミン、イソブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタン（ＤＡＢＣＯ）、モルホリンから選択される１種以上を使用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
有機塩基として、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ピペラジン、ピペリジン、イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、アニリン、トルイジン、ジメチルアニリン、エチルアニリン、ジエチルアニリン、エチルメチルアニリン、アニシジンから選択される１種以上を使用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
有機塩基として、トリエチルアミンとピリジンとの混合物を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
フッ化物イオン源が、トリエチルアミン五フッ化水素酸塩、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩及びピリジンフッ化水素酸塩から選択される１種以上である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
シリル保護基が、ケイ素上の３つの置換基がアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基から選択され、且つそのうちの少なくとも１つがアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基から選択されるシリル保護基である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｓ＋１個のＢａｓｅの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ
［式中、
Ｌは、式（ａ１）：
【化２】
2017111137.tif 000094
（式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｌ１は、置換されていてもよい２価のＣ１−２２炭化水素基、酸素原子、−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）を示し；かつ
Ｌ２は、単結合を示すか、または式：＊Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）−Ｏ−Ｒ１＊＊、式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３ａ）＊＊あるいは式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）＊＊（式中、＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊は、ＣＲｃＲｄとの結合位置を示し、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン基を示し、Ｒ２およびＲ３ａは、それぞれ独立して、水素原子もしくは置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基を示すか、またはＲ２およびＲ３ａが一緒になって、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン結合を形成していてもよく、Ｒ３ｂは水素原子若しくは置換されていても良いＣ１−２２アルキル基を示す）で示される基を示し；
ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素原子、置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基もしくはＲｃおよびＲｄが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい）で表される基（リンカー）を示し；
ＹＬは、単結合、酸素原子、または−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、硫黄原子を示し；ならびに
Ｚは式（ａ２）：
【化３】
2017111137.tif 000095
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｒ４は、水素原子を示すか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、Ｒ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく； 
ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｋは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；ならびに
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
【化４】
2017111137.tif 000096
（式中、＊は結合位置を示し；
ｊは、０〜４の整数を示し；
ｊ個のＲ７は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ６は、水素原子を示すか、またはＲ４と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｊ個のＯＲ７に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
ＲａおよびＲｂが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい。）で表される基）；
式（ａ２’）：
【化５】
2017111137.tif 000097
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
それ以外の各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）で示される基
または、
式（ａ２’’）：
【化６】
2017111137.tif 000098
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
環Ａ’は、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）
で表される基を示す］で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’
【化７】
2017111137.tif 000099
［式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
各記号の定義は式（ａ２’’）と同義である。］
で表される保護基で保護されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌがスクシニル基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ５及び／又はＲ７が炭素原子数１０〜４０のアルキル基である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ５がオクタデシル基である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
３’末端のヌクレオシドのＢａｓｅが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程（１）及び（２）を含有する、ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの製造方法。
（１）溶媒中で、下記式（１）：
【化８】
2017111137.tif 000100
［式中、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ２０およびＲ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。］
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて下記式（２）：
【化９】
2017111137.tif 000101
［式中、
Ｚａは活性化剤に由来する基を示し、
それ以外の各記号は、前記と同義である。］
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
（２）溶媒中で、５’位水酸基若しくは５’位リン酸基又は３’位水酸基若しくは又は３’位アミノ基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）に、塩基の存在下、工程（１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、該オリゴヌクレオチドの末端の水酸基をホスフィチル化する工程
【請求項１８】
該ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉａ）を有する、請求項１７記載の方法。
【化１０】
2017111137.tif 000102
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１aとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
【請求項１９】
該ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉａ’）を有する、請求項１７記載の方法。
【化１１】
2017111137.tif 000103
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１ａ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
【請求項２０】
ｑ＋１個のＢａｓｅＡの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（１）で用いる活性化剤が、ｐＫａ５以上の弱酸性活性化剤である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（１）で用いる活性化剤が、アゾール系化合物である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（１）で用いる活性化剤が、ジシアノイミダゾール又はジクロロイミダゾールである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（１）で用いる活性化剤が、ホスフィチル化剤前駆体に対して１．５〜２０モル当量で用いられる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（１）で用いる溶媒が、ホスフィチル化剤前駆体を溶解し、かつ活性化剤が難溶性となるものであって、酸性または塩基性官能基を有さないことを特徴とする、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（１）で用いる溶媒が、トルエン、ベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、四塩化炭素から選択される1種以上の溶媒である、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（１）で用いる溶媒が、トルエンである、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
工程（２）で用いる塩基が、ｐＫａ５〜８の塩基である、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
工程（２）で用いる塩基が、コリジン、Ｎ−メチルモルホリン及びジエチルアニリンから選択される１種以上の塩基である、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
工程（１）と工程（２）の間に、不溶物を分離する工程を含む、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１８に記載の方法により下記式（Ｉａ−１）：
【化１２】
2017111137.tif 000104
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１ａとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させる工程を含む、下記式（Ｉａ−２）：
【化１３】
2017111137.tif 000105
［式中、
Ｌｘは単結合又はリンカーを示し、
Ｇは官能基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項３２】
請求項１９に記載の方法により下記式（Ｉａ’−１）：
【化１４】
2017111137.tif 000106
［式中、Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１ａ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉａ−１）と同義である］
で表される５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの５’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させる工程を含む、下記式（Ｉａ’−２）：
【化１５】
2017111137.tif 000107
［式中、Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１ａ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉａ−２）と同義である］
で表される５’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項３３】
ｑ＋１個のＢａｓｅＡの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
官能基が、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオシド、コレステロール、ＧａｌＮａｃ３、ＰＥＧ、低分子医薬、ビオチン、ペプチド及び標識化合物からなる群より選択される少なくとも１種に由来する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
官能基が、３’位水酸基又は３’位アミノ基あるいは３’位リン酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
官能基が、５’位水酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ）を有する、請求項３５記載の方法。
【化１６】
2017111137.tif 000108
［式中、ｒ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｒ＋１個のＢａｓｅＢは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｒ個のＰ２ｂは、リン酸基の保護基を示し、
ｒ個のＲ４０ｂは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｐ３ｂは、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ３ｂとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｒ＋１個のＹｂは、水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｒは、１以上の任意の整数を示す。］
【請求項３８】
ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ’）を有する、請求項３６記載の方法。
【化１７】
2017111137.tif 000109
［式中、Ｐ３ｂ’は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ３ｂ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉｂ）と同義である］
【請求項３９】
ｒ＋１個のＢａｓｅＢの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｐ３ｂ又はＰ３ｂ’における水酸基の保護基が、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｌがスクシニル基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
下記式（Ｉａ−１’）：
【化１８】
2017111137.tif 000110
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡ’は、それぞれ独立して式：−Ｌ’−ＹＬ−Ｚ（式中、Ｌ’はスクシニル基、ＹＬ、Ｚは請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１ａとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させて下記式（Ｉａ−２’）：
【化１９】
2017111137.tif 000111
［式中、
Ｌｘは単結合又はリンカーを示し、
Ｇは官能基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドを得た後、保護基を除去する工程を含む、下記式（ＩＩ）：
【化２０】
2017111137.tif 000112
［式中、ｑ＋１個のＢａｓｅ’は無保護の核酸塩基を示し、それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項４３】
請求項１７〜４１のいずれか１項に記載の方法により３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを使用する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
官能基が、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオシド、コレステロール、ＧａｌＮａｃ３、ＰＥＧ、低分子医薬、ビオチン、ペプチド及び標識化合物からなる群より選択される少なくとも１種に由来する、請求項４２又は４３記載の方法。
【請求項４５】
官能基が、３’位水酸基又は３’位アミノ基あるいは３’位リン酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、請求項４２〜４４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ）を有する、請求項４５記載の方法。
【化２１】
2017111137.tif 000113
［式中、
ｒ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｒ＋１個のＢａｓｅＢは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｒ個のＰ２ｂは、リン酸基の保護基を示し、
ｒ個のＲ４０ｂは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｐ３ｂは、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ３ｂとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｒ＋１個のＹｂは、水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｒは、１以上の任意の整数を示す。］
【請求項４７】
ｒ＋１個のＢａｓｅＢの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｐ３ｂおける水酸基の保護基が、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される、請求項４６又は４７記載の方法。
【請求項４９】
Ｌがスクシニル基である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
下記式：
【化２２】
2017111137.tif 000114
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２は、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０は、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｐ３は、シリル保護基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される化合物。
【請求項５１】
ｑ＋１個のＢａｓｅの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は請求項１２と同義である）で表される保護基で保護されている、請求項５０記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。より詳細には、シリル保護基を利用したオリゴヌクレオチドの製造方法及びホスフィチル化剤を利用したオリゴヌクレオチドの製造方法、並びにフラグメント縮合によるオリゴヌクレオチドの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドの合成方法には、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、ホスホロアミダイト法などがあり、現在ではホスホロアミダイト法を用いた固相合成（固相法）が最も汎用されている（非特許文献１）。数個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドは、原料となるヌクレオチドを逐次連結していくことで合成可能であるが、２０ｍｅｒ程度以上のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、２〜３ヌクレオチドのビルディングブロック群を予め調製しておき、これの連結を繰り返すことで所望の鎖長の生成物を得るブロックマー合成法や１０塩基程度以上のオリゴヌクレオチド間の連結でオリゴヌクレオチドを得るユニットカップリング（フラグメント縮合）合成法等も利用されている。このフラグメント縮合の手法は、溶解性の確保や、反応部位の選択的な脱保護・活性化等に特段のケアを必要とする。
特許文献２の実施例、非特許文献２においては、オリゴ核酸フラグメントの３’−水酸基の選択的脱保護可能な保護基としてレブリニルエステルを採用して、ホスホロアミダイト法にて伸長を行い、インターヌクレオチドのリン酸エステルがシアノエチル基で保護されたオリゴマーを取得している。この脱保護には、安全性に問題があるヒドラジンを用いる必要がある。また、脱保護条件において塩基部保護基の脱落が進行しうることが非特許文献２で述べられている。
非特許文献３には、３−ｍｅｒアミダイトを用いてオリゴ核酸を合成するブロックマー合成法が記載されているが、反応過程でリン酸エステルの開裂や保護基であるシアノエチルの脱離という問題があった。特許文献１は、脱離しにくい保護基が使用されているが、該保護基は特殊なものであり、従来の反応条件等をそのまま利用することができない。
非特許文献４にはトリエステル法を用いたフラグメント縮合によるオリゴヌクレオチドの合成法が記載されているが、トリエステル法は現在殆ど実用されていない。
一方、ホスフィチル化剤を用いて調製した３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを用いたより長鎖のオリゴヌクレオチドを合成する手法が知られている。
ヌクレオシドのホスフィチル化には、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトが常用されてきた。特許文献２においてはこれと、Ｎ−メチルイミダゾールとを組み合わせることで、オリゴ核酸の脱保護された３’−末端のホスフィチル化を実施している。しかし、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトは保存安定性に劣る上、市価も高い。
上述の試剤より安価かつ安定な代替として、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトが用いられる（非特許文献５）。同剤それ自体の反応性は乏しく、ヌクレオシドのホスフィチル化に際しては活性化剤が必要となる。脆弱な保護基を持たないヌクレオシドモノマーのホスフィチル化においては、常法としてジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドが用いられる。しかしながら、オリゴ核酸フラグメントの３’−水酸基のシアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトによるホスフィチル化において上述のアンモニウム塩を用いるとインターヌクレオチドのリン酸部上の、塩基に対して脆弱なシアノエチル基が顕著に脱落することが知られている（非特許文献３）。また、トリフルオロメタンスルホン酸を始めとする強酸と塩基の塩を活性化剤とした場合、過剰活性によりホスファイトや五価のリン化合物が副生することが報告されている（非特許文献６及び７）。また、オリゴヌクレオチドの合成過程で、２’−位の水酸基の保護基としてシリル保護基が用いられるが、その脱保護、即ち脱シリル化には、フッ化水素：トリエチルアミン＝３：１の塩（３ＨＦ−ＴＥＡ）が一般に用いられている（非特許文献８）。３ＨＦ−ＴＥＡは酸性の塩であり、オリゴ核酸合成の５’末端保護基として常用される４，４’−ジメトキシトリエチルアミンは酸性で脱離が亢進される。ジメトキシトリチル基の好ましくない脱落を防止するため、非特許文献９では、３’末端のシリル保護基（乃至リンカー）の開裂に３ＨＦ−ＴＥＡにさらにトリエチルアミンを追加して酸：アミン＝１：１のモル比の塩が使用されている。また、リン酸部位がシアノエチル保護されたオリゴ核酸の３’末端の脱シリル化にトリエチルアミンを用いた場合、シアノエチル保護基が脱落する等の問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５５７１９０２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０７７２９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. L. Beaucage et al., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry; John Wiley & Sons (2000)
【非特許文献２】Chen, C.-H. et al., Aust. J. Chem. 2010, 63, 227-235
【非特許文献３】Muller, S. et al., Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 1510-1513
【非特許文献４】Chekhmakhcheva, O.G. et al., A Nucleic Acid Res. 1983, 11, 8369-8387
【非特許文献５】Gukathasan, R. et al., J. Organomet. Chem. 2005, 690, 2603-2607
【非特許文献６】Yogesh S. Sanghvi et al., Org. Proc. Res. Dev. 2000, 4, 175-181
【非特許文献７】Xie, C. et al., Org. Proc. Res. Dev. 2005, 9, 730-737
【非特許文献８】Gasparutto D. et al., Nucleic Acid Res. 1992, 20(19), 5159-5166
【非特許文献９】Ohkubo, A. et al., Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 5345-5351
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、より保存安定性に優れたホスフィチル化剤を用い、ホスフィチル化剤の過剰活性化を抑え、且つリン酸上の保護基の脱落が抑えられたホスフィチル化反応により３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌレオチドを製造する方法、シアノエチル保護基の脱落を伴わずに脱シリル化を可能にしてオリゴヌクレオチドを製造する方法、及びそれらの方法を用いて、より効率よくオリゴヌクレオチドを製造する方法、３’末端に種々の官能基を連結してなるオリゴヌクレオチドを製造する方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、ホスフィチル化剤として、ジアミダイトを利用し、特定のホスフィチル化剤の活性化剤及び活性化方法を実施すること、特定の塩基の存在下でホスフィチル化を実施することにより、上記課題が解決できることを見出した。さらに、本発明者らは、鋭意検討の結果、脱シアノエチル化を抑制し得る特定のシリル保護基とその脱保護条件を見出した。
本発明は以下を含む。
［１］溶媒中で５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは２以上の任意の整数を示す。）に1又は２種類以上の有機塩基の存在下、フッ化物イオン源を作用させる工程を含む、５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、該1又は２種類以上の有機塩基のうち少なくとも1種とフッ化水素との塩を該フッ化物イオン源とすることを特徴とする、方法。
［２］５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉ）を有する、上記［１］記載の方法。【０００７】
【化１】
2017111137.tif 000002
【０００８】
［式中、
ｓ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｓ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｓ個のＰ２は、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｓ個のＲ４０は、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｓ＋１個のＹは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｐ３は、シリル保護基を示し、
ｓは、１以上の任意の整数を示す。］
［３］フッ化物イオン源に対し１モル当量以上の有機塩基を使用する、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］有機塩基が強塩基と弱塩基との混合物、２種類以上の弱塩基の混合物又は単一の弱塩基である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］強塩基がｐＫａ≧８であり、弱塩基が４≦ｐＫａ＜８である、上記［４］に記載の方法。
［６］有機塩基として強塩基を１／３モル当量以下で使用する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］有機塩基として、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ブチルアミン、イソブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ[２．２．２]オクタン（ＤＡＢＣＯ）、モルホリンから選択される１種以上を使用する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］有機塩基として、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ピペラジン、ピペリジン、イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、アニリン、トルイジン、ジメチルアニリン、エチルアニリン、ジエチルアニリン、エチルメチルアニリン、アニシジンから選択される１種以上を使用する、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］有機塩基として、トリエチルアミンとピリジンとの混合物を使用する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］フッ化物イオン源が、トリエチルアミン五フッ化水素酸塩、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩及びピリジンフッ化水素酸塩から選択される１種以上である上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。【０００９】
［１１］シリル保護基が、ケイ素上の３つの置換基がアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基から選択され、且つそのうちの少なくとも１つがアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基から選択されるシリル保護基である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ｓ＋１個のＢａｓｅの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ
［式中、
Ｌは、式（ａ１）：【００１０】
【化２】
2017111137.tif 000003
【００１１】
（式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｌ１は、置換されていてもよい２価のＣ１−２２炭化水素基、酸素原子、−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）を示し；かつ
Ｌ２は、単結合を示すか、または式：＊Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）−Ｏ−Ｒ１＊＊、式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３ａ）＊＊あるいは式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）＊＊（式中、＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊は、ＣＲｃＲｄとの結合位置を示し、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン基を示し、Ｒ２およびＲ３ａは、それぞれ独立して、水素原子もしくは置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基を示すか、またはＲ２およびＲ３ａが一緒になって、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン結合を形成していてもよく、Ｒ３ｂは水素原子若しくは置換されていても良いＣ１−２２アルキル基を示す）で示される基を示し；
ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素原子、置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基もしくはＲｃおよびＲｄが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい）で表される基（リンカー）を示し；
ＹＬは、単結合、酸素原子、または−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、硫黄原子を示し；ならびに
Ｚは式（ａ２）：【００１２】
【化３】
2017111137.tif 000004
【００１３】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｒ４は、水素原子を示すか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、Ｒ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく； 
ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｋは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；ならびに
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：【００１４】
【化４】
2017111137.tif 000005
【００１５】
（式中、＊は結合位置を示し；
ｊは、０〜４の整数を示し；
ｊ個のＲ７は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ６は、水素原子を示すか、またはＲ４と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｊ個のＯＲ７に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
ＲａおよびＲｂが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい。）で表される基）；
式（ａ２’）：【００１６】
【化５】
2017111137.tif 000006
【００１７】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
それ以外の各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）で示される基
または、
式（ａ２’’）：【００１８】
【化６】
2017111137.tif 000007
【００１９】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
環Ａ’は、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）
で表される基を示す］で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’【００２０】
【化７】
2017111137.tif 000008
【００２１】
［式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
各記号の定義は式（ａ２’’）と同義である。］
で表される保護基で保護されている、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］Ｌがスクシニル基である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］Ｒ５及び／又はＲ７が炭素原子数１０〜４０のアルキル基である、上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］Ｒ５がオクタデシル基である、上記［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１６］３’末端のヌクレオシドのＢａｓｅが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］以下の工程（１）及び（２）を含有する、ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの製造方法。
（１）溶媒中で、下記式（１）：【００２２】
【化８】
2017111137.tif 000009
【００２３】
［式中、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ２０およびＲ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。］
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて下記式（２）：【００２４】
【化９】
2017111137.tif 000010
【００２５】
［式中、
Ｚａは活性化剤に由来する基を示し、
それ以外の各記号は、前記と同義である。］
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
（２）溶媒中で、５’位水酸基若しくは５’位リン酸基又は３’位水酸基若しくは３’位アミノ基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）に、塩基の存在下、工程（１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、該オリゴヌクレオチドの末端の水酸基をホスフィチル化する工程
［１８］該ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉａ）を有する、上記［１７］記載の方法。【００２６】
【化１０】
2017111137.tif 000011
【００２７】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
［１９］該ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉａ’）を有する、上記［１７］記載の方法。【００２８】
【化１１】
2017111137.tif 000012
【００２９】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１a’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
［２０］ｑ＋１個のＢａｓｅＡの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［１７］〜［１９］のいずれかに記載の方法。【００３０】
［２１］工程（１）で用いる活性化剤が、ｐＫａ５以上の弱酸性活性化剤である、上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］工程（１）で用いる活性化剤が、アゾール系化合物である、上記［１７］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］工程（１）で用いる活性化剤が、ジシアノイミダゾール又はジクロロイミダゾールである、上記［１７］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］工程（１）で用いる活性化剤が、ホスフィチル化剤前駆体に対して１．５〜２０モル当量で用いられる、上記［１７］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］工程（１）で用いる溶媒が、ホスフィチル化剤前駆体を溶解し、かつ活性化剤が難溶性となるものであって、酸性または塩基性官能基を有さないことを特徴とする、上記［１７］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］工程（１）で用いる溶媒が、トルエン、ベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、四塩化炭素から選択される1種以上の溶媒である、上記［１７］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］工程（１）で用いる溶媒が、トルエンである、上記［１７］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］工程（２）で用いる塩基が、ｐＫａ５〜８の塩基である、上記［１７］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］工程（２）で用いる塩基が、コリジン、Ｎ−メチルモルホリン及びジエチルアニリンから選択される１種以上の塩基である、上記［１７］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］工程（１）と工程（２）の間に、不溶物を分離する工程を含む、上記［１７］〜［２９］のいずれかに記載の方法。【００３１】
［３１］上記［１８］に記載の方法により下記式（Ｉａ−１）：【００３２】
【化１２】
2017111137.tif 000013
【００３３】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１aとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させる工程を含む、下記式（Ｉａ−２）：【００３４】
【化１３】
2017111137.tif 000014
【００３５】
［式中、
Ｌｘは単結合又はリンカーを示し、
Ｇは官能基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［３２］上記［１９］に記載の方法により下記式（Ｉａ’−１）：【００３６】
【化１４】
2017111137.tif 000015
【００３７】
［式中、Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１a’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉａ−１）と同義である］
で表される５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの５’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させる工程を含む、下記式（Ｉａ’−２）：【００３８】
【化１５】
2017111137.tif 000016
【００３９】
［式中、Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１a’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉａ−２）と同義である］
で表される５’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［３３］ｑ＋１個のＢａｓｅＡの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［３１］又は［３２］に記載の方法。
［３４］官能基が、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオシド、コレステロール、ＧａｌＮａｃ３、ＰＥＧ、低分子医薬、ビオチン、ペプチド及び標識化合物からなる群より選択される少なくとも１種に由来する、上記［３１］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］官能基が、３’位水酸基又は３’位アミノ基あるいは３’位リン酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、上記［３１］記載の方法。
［３６］官能基が、５’位水酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、上記［３１］記載の方法。
［３７］ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ）を有する、上記［３５］記載の方法。【００４０】
【化１６】
2017111137.tif 000017
【００４１】
［式中、ｒ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｒ＋１個のＢａｓｅＢは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｒ個のＰ２ｂは、リン酸基の保護基を示し、
ｒ個のＲ４０ｂは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｐ３ｂは、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ３ｂとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｒ＋１個のＹｂは、水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｒは、１以上の任意の整数を示す。］
［３８］ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ’）を有する、上記［３６］記載の方法。【００４２】
【化１７】
2017111137.tif 000018
【００４３】
［式中、Ｐ３ｂ’は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ３ｂ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉｂ）と同義である］
［３９］ｒ＋１個のＢａｓｅＢの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４０］Ｐ３ｂ又はＰ３ｂ’における水酸基の保護基が、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される、上記［３７］〜［３９］のいずれかに記載の方法。【００４４】
［４１］Ｌがスクシニル基である、上記［４０］に記載の方法。
［４２］下記式（Ｉａ−１’）：【００４５】
【化１８】
2017111137.tif 000019
【００４６】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡ’は、それぞれ独立して式：−Ｌ’−ＹＬ−Ｚ（式中、Ｌ’はスクシニル基、ＹＬ、Ｚは上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１ａとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させて下記式（Ｉａ−２’）：【００４７】
【化１９】
2017111137.tif 000020
【００４８】
［式中、
Ｌｘは単結合又はリンカーを示し、
Ｇは官能基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドを得た後、保護基を除去する工程を含む、下記式（ＩＩ）：【００４９】
【化２０】
2017111137.tif 000021
【００５０】
［式中、ｑ＋１個のＢａｓｅ’は無保護の核酸塩基を示し、それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［４３］上記［１７］〜［４１］のいずれかに記載の方法により３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを得た後、該３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドを使用する、上記［４２］記載の方法。
［４４］官能基が、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオシド、コレステロール、ＧａｌＮａｃ３、ＰＥＧ、低分子医薬、ビオチン、ペプチド及び標識化合物からなる群より選択される少なくとも１種に由来する、上記［４２］又は［４３］記載の方法。
［４５］官能基が、３’位水酸基又は３’位アミノ基あるいは３’位リン酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である、上記［４２］〜［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］ｎ’個重合オリゴヌクレオチドが、下記構造（Ｉｂ）を有する、上記［４５］記載の方法。【００５１】
【化２１】
2017111137.tif 000022
【００５２】
［式中、
ｒ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｒ＋１個のＢａｓｅＢは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｒ個のＰ２ｂは、リン酸基の保護基を示し、
ｒ個のＲ４０ｂは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｐ３ｂは、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ３ｂとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｒ＋１個のＹｂは、水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｒは、１以上の任意の整数を示す。］
［４７］ｒ＋１個のＢａｓｅＢの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［４６］に記載の方法。
［４８］Ｐ３ｂ’における水酸基の保護基が、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される、上記［４６］又は［４７］記載の方法。
［４９］Ｌがスクシニル基である、上記［４８］に記載の方法。
［５０］下記式：【００５３】
【化２２】
2017111137.tif 000023
【００５４】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２は、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０は、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｐ３は、シリル保護基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
で表される化合物。
［５１］ｑ＋１個のＢａｓｅの少なくとも一つが、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（各記号の定義は上記［１２］と同義である）で表される保護基で保護されている、上記［５０］記載の化合物。
【発明の効果】
【００５５】
本発明の方法によれば、保管中安定なジアミダイトからホスフィチル化剤を調製することが可能であり、ホスフィチル化反応の際のリン酸上の保護基が脱落することを抑制することができる。従って、より安定、且つ効率よくホスホロアミダイト化オリゴヌレオチドを製造することができる。さらに本発明の方法によれば、ヌクレオチド間リン酸上のシアノエチル保護基を脱落することなく、シリル保護基を脱保護することが可能となる。従って、これらの方法を用いることで、より効率的なオリゴヌクレオチドの製造及びそれを用いたフラグメント縮合が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００５７】
本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖（例えば、２−デオキシリボース、リボース、２位炭素原子および４位炭素原子が２価の有機基により結合された２−デオキシリボースまたはリボースなど）の１位にＮ−グリコシド化により結合された化合物を意味する。
本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および２位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースも包含する。
【００５８】
本明細書中、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物を意味し、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにヌクレオチドが１個以上連結した化合物を意味する。本明細書中、なお、「オリゴヌクレオチド」には、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置き換わったホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド、リン酸基の−Ｏ−が−ＮＨ−に置き換わったオリゴヌクレオチド、リン酸基中の水酸基（−ＯＨ）が−ＯＲｐ（式中、Ｒｐは有機基を示す）に置き換わったオリゴヌクレオチドも包含される。本発明におけるオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数は特に限定されないが、好ましくは３〜５０、より好ましくは５〜３０である。
【００５９】
「３’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
「５’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
「３’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「５’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
【００６０】
本明細書中、「リン酸基」は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２だけでなく、酸素原子が硫黄原子またはＮＨに置き換わった基（例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２、−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＮＨ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２）も包含する。また、リン酸基中の水酸基（−ＯＨ）が−ＯＲｐ（式中、Ｒｐは、リン酸基の保護基などの有機基を示す）に置き換わった基（例えば、保護されたリン酸基）も、「リン酸基」に包含される。
【００６１】
本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。また、該「核酸塩基」には、上記した基の他に、核酸塩基が任意の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）により任意の位置に１〜３個置換されている修飾核酸塩基（例えば、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）も包含される。
【００６２】
本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
【００６３】
本明細書中、「アルキル（基）」としては、直鎖状または分岐鎖状の炭素数１以上のアルキル基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはＣ１−１０アルキル基であり、より好ましくはＣ１−６アルキル基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、特にメチル、エチルが好ましい。
【００６４】
本明細書中、「アラルキル（基）」としては、Ｃ７−２０アラルキル基が挙げられ、好ましくはＣ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）である。好適な具体例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられ、特にベンジルが好ましい。
【００６５】
本明細書中、「アルコキシ（基）」としては、炭素数１以上のアルキコキシ基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはＣ１−１０アルコキシ基であり、より好ましくはＣ１−６アルコキシ基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられ、特にメトキシ、エトキシが好ましい。
【００６６】
本明細書中、「アシル（基）」としては、例えば、直鎖状または分岐鎖状のＣ１−６アルカノイル基、Ｃ７−１３アロイル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等が挙げられ、これらはそれぞれ置換されていてもよい。
【００６７】
本明細書中、「アルケニル（基）」としては、直鎖状または分岐鎖状のＣ２−６アルケニル基等が好ましく、例えば、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。中でも、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基が好ましい。
【００６８】
本明細書中、「アルキニル（基）」としては、Ｃ２−６アルキニル基等が好ましく、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル等が挙げられる。中でも、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基が好ましい。
【００６９】
本明細書中、「シクロアルキル（基）」は、環状アルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。中でも、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−Ｃ６シクロアルキル基が好ましく、シクロヘキシルが特に好ましい。
【００７０】
本明細書中、「アリール（基）」又は「芳香環（基）」は、芳香族性を示す単環式あるいは多環式（縮合）の炭化水素基を意味し、具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等のＣ６−１４アリール基等が挙げられる。中でもＣ６−１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。
【００７１】
本明細書中、「アリールオキシ（基）」としては、Ｃ６−１４アリールオキシ基が好ましくは、フェノキシ、トリルオキシ、キシリルオキシ、ナフトキシ、ジメチルナフトキシ等が挙げられる。
【００７２】
本明細書中、「アラルキルオキシ（基）」は、上記「アリール基」で置換された上記「アルキルオキシ（基）」を意味し、具体的には、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、２−フェニルプロパン−２−イルオキシ、ジフェニルメチルオキシ等が挙げられる。
【００７３】
本明細書中、「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基である。
【００７４】
本明細書中、「炭化水素基を有する有機基」とは、前記「炭化水素基」を有する基を意味し、「炭化水素基を有する有機基」中の「炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば、リンカーとして−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、および−ＣＯＮＨ−等の部位を有していてもよい。
【００７５】
［３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているオリゴヌクレオチドを脱保護する方法（工程）−脱シリル化］
本方法（工程）は、溶媒中、「５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは２以上の任意の整数を示す。）」のシリル保護基を脱保護（脱シリル化ともいう）して、「５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは２以上の任意の整数を示す。）」を製造する方法（工程）である。
５’位水酸基の保護基としては、酸性条件下で脱保護可能であり、水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、トリチル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−フェニルチオキサンテニル基、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１−フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基）等のジ（Ｃ１−６アルコキシ）トリチル基、１−（４−メトキシフェニル）−１，１−ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基）等のモノ（Ｃ１−１８アルコキシ）トリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基であることが好ましく、より好ましくは、ジメトキシトリチル基である。
【００７６】
脱シリル化されるｎ個重合オリゴヌクレオチドの５’位末端は保護されていてもよいリン酸基であり得る。５’位末端における保護されたリン酸基としては、例えばリン酸基中の水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基が酸性条件下で脱保護可能な保護基で保護されている）に置き換わっているリン酸基が挙げられる。
Ｌｎ１の有機基とは、炭化水素基、または炭化水素基中の炭素原子がヘテロ原子で置き換わった基を意味する。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。また、有機基は、水酸基、アミノ基、オキソ基（＝Ｏ）等の置換基を有していてもよい。有機基が有し得る水酸基およびアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。有機基の形状は、鎖状（直鎖状または分岐鎖状）、環状またはこれらの組合せのいずれでもよい。
有機基は、細胞に対して機能性を有する基を有していてもよい。細胞に対して機能性を有する基は、有機基の主鎖または側鎖の末端に結合していることが好ましい。細胞に対して機能性を有する基としては、例えば、「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」、「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」等が挙げられる。「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」としては、例えば、コレステロール残基、トコフェロール残基等が挙げられる。「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」としては、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基等が挙げられる。
−ＯＬｎ１−ＯＨの具体例としては、以下のものが挙げられる（下記式中の＊は、リン原子との結合位置を示し、Ａｃはアセチル基を示す。）。
【００７７】
【化２３】
2017111137.tif 000024
【００７８】
３’位水酸基又は３’位アミノ基におけるシリル保護基としては、ケイ素上の置換基がアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基から選択されるシリル基であって、３つの置換基のうち少なくとも１つがアリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基から選択されるシリル基が挙げられる。具体的には、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ジイソプロピルフェニルシリル（ＤＩＰＰＳ）、ｔｅｒｔ−ブトキシジフェニルシリル（ＴＢＯＤＰＳ）、イソプロポキシジイソプロピルシリル（ＩＰＯＤＩＰＳ）等が挙げられ、好ましくはＤＩＰＰＳである。
【００７９】
好ましくは、「５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基がシリル保護基で保護されているｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは２以上の任意の整数を示す。）」は、下記構造（Ｉ）を有する化合物である（以下、化合物（Ｉ））。
【００８０】
【化２４】
2017111137.tif 000025
【００８１】
［式中、
ｓ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｓ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１は、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｓ個のＰ２は、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｓ個のＲ４０は、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｓ＋１個のＹは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Ｐ３は、シリル保護基を示し、
ｓは、１以上の任意の整数を示す。］
Ｐ１における水酸基の保護基としては、上記５’位水酸基の保護基として例示したものと同様のものを用いることができる。好ましくはジメトキシトリチル基である。Ｐ１における、水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基としては、上記５’位末端における保護されたリン酸基として記載されたものと同様のものを用いることができる。
Ｐ２におけるリン酸基の保護基としては、塩基性条件下で脱保護可能であり、リン酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧ（ＷＧは、電子吸引性基を示す。）で表される基が好ましく、ＷＧとしてはシアノ基が好ましい。
Ｒ４０は、好ましくは同一で酸素原子又は硫黄原子である。
Ｙにおける保護されていてもよい水酸基の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（２００６年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシメチル、メトキシエチル、２−テトラヒドロピラニル、エトキシエチル、シアノエチル、シアノエトキシメチル、フェニルカルバモイル、１，１−ジオキソチオモルホリン−４−チオカルバモイル、アセチル、ピバロイル、ベンゾイル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）、１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。これらの中でも、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性及び入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
Ｙにおける「４位炭素原子に架橋する有機基」としては、ヌクレオシド２位と４位を架橋する限り特に限定はないが、例えば、Ｃ２−７アルキレン基が挙げられる。当該アルキレン基は、例えば、−Ｏ−、−ＮＲ３７−（Ｒ３７は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＲ３８−（Ｒ３８は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）、−ＣＯＮＲ３９−（Ｒ３９は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）等から選ばれるリンカーで１箇所以上（好ましくは、１又は２箇所）中断されていてもよい。
「４位炭素原子に架橋する有機基」として好ましくは、例えば、−ＯＲｉ（Ｒｉは４位に架橋するＣ１−６アルキレン基を示す）、−Ｏ−ＮＲ３７−Ｒｊ（Ｒｊは４位に架橋するＣ１−６アルキレン基を示し、Ｒ３７は前記と同義を示す）、−Ｏ−Ｒｋ−Ｏ−Ｒｌ（ＲｋはＣ１−６アルキレン基を示し、Ｒｌは４位に架橋するＣ１−６アルキレン基を示す）等が挙げられる。Ｒｉ、Ｒｊ、Ｒｋ及びＲｌで示されるＣ１−６アルキレン基としては、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基が好ましい。
「４位炭素原子に架橋する有機基」としては、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲ３７−ＣＨ２−（Ｒ３７は前記と同義を示す）、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−等が好ましく、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＭｅ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−（それぞれ、左側が２位に結合し、右側が４位に結合する。）等がより好ましい。
Ｐ３におけるシリル保護基としては、上記３’位水酸基におけるシリル保護基として例示したものと同様のものを用いることができる。
【００８２】
Ｂａｓｅの「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基が保護されていてもよいことを意味し、核酸塩基のアミノ基が５’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。かかる「アミノ基の保護基」としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（２００６年）等に記載されている保護基を挙げることができる。かかる「アミノ基の保護基」の具体例としては、例えば、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、４−tert−ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基等を挙げることができる。これらの中でも、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、及びジメチルホルムアミジニル基が好ましい。また、核酸塩基のカルボニル基が保護されていてもよく、例えば、フェノール、２，５−ジクロロフェノール、３−クロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２−ホルミルフェノール、２−ナフトール、４−メトキシフェノール、４−クロロフェノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、４−アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４−ピバロイロキシベンジルアルコール、４−ニトロフェネチルアルコール、２−（メチルスルフォニル）エタノール、２−（フェニルスルフォニル）エタノール、２−シアノエタノール、２−（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバミン酸クロライド、ジエチルカルバミン酸クロライド、エチルフェニルカルバミン酸クロライド、１−ピロリジンカルボン酸クロライド、４−モルホリンカルボン酸クロライド、ジフェニルカルバミン酸クロライド等を反応させて、カルボニル基を保護することが出来る。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。
核酸塩基の保護基として、ＷＯ２０１３／１２２２３６に記載の保護基（Ｃ５−３０直鎖又は分岐鎖アルキル基及び／又はＣ５−３０直鎖又は分岐鎖アルケニルを有する基）を使用することもできる。
核酸塩基の保護基として、下記式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚで表される保護基、若しくは式：−Ｚ’で表される保護基を使用することもできる。当該保護基は、該基が反応基質に結合することにより非極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、極性溶媒の添加により沈殿し、固液分離が可能となる、反応性と後処理の簡便性を兼ね備えた保護基であって、５’末端水酸基の保護基を除去し得る酸性条件で安定な基である。従って、ｓ＋１個存在するＢａｓｅの少なくとも１つは（１）式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚで表される保護基、若しくは（２）式：−Ｚ’で表される保護基で保護されていることが好ましい。
（１）
【００８３】
【化２５】
2017111137.tif 000026
【００８４】
［式中、
Ｌは、式（ａ１）：
【００８５】
【化２６】
2017111137.tif 000027
【００８６】
（式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｌ１は、置換されていてもよい２価のＣ１−２２炭化水素基、酸素原子、−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）を示し；かつ
Ｌ２は、単結合を示すか、または式：＊Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）−Ｏ−Ｒ１＊＊、式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３）＊＊あるいは式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）＊＊（式中、＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊は、ＣＲｃＲｄとの結合位置を示し、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン基を示し、Ｒ２およびＲ３ａは、それぞれ独立して、水素原子もしくは置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基を示すか、またはＲ２およびＲ３ａが一緒になって、置換されていてもよいＣ１−２２アルキレン結合を形成していてもよく、Ｒ３ｂは水素原子若しくは置換されていても良いＣ１−２２アルキル基を示す）で示される基を示し；
ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素原子、置換されていてもよいＣ１−２２アルキル基もしくはＲｃおよびＲｄが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい）で表される基（リンカー）を示し；
ＹＬは、単結合、酸素原子、または−ＮＲ−（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）、硫黄原子を示し；ならびに
Ｚは式（ａ２）：
【００８７】
【化２７】
2017111137.tif 000028
【００８８】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
Ｒ４は、水素原子を示すか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、Ｒ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく； 
ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
ｋは、１〜４の整数を示し；
環Ａは、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子、またはハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基を示し；ならびに
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
【００８９】
【化２８】
2017111137.tif 000029
【００９０】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
ｊは、０〜４の整数を示し；
ｊ個のＲ７は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し；
Ｒ６は、水素原子を示すか、またはＲ４と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａと共にフルオレニル基またはキサンテニル基を形成していてもよく；かつ
環Ｂは、ｊ個のＯＲ７に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
ＲａおよびＲｂが一緒になって、単一のカルボニル基を形成していてもよい。）で表される基）；
式（ａ２’）：
【００９１】
【化２９】
2017111137.tif 000030
【００９２】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；それ以外の各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）で示される基
または、
式（ａ２’’）：
【００９３】
【化３０】
2017111137.tif 000031
【００９４】
（式中、＊は、ＹＬとの結合位置を示し；
環Ａ’は、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
各記号の定義は式（ａ２）と同義である。）
で表される基を示す］
【００９５】
（２）
式：−Ｚ’
【００９６】
【化３１】
2017111137.tif 000032
【００９７】
［式中、＊＊は、核酸との結合位置を示し；
各記号の定義は式（ａ２’’）と同義である。］
【００９８】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、Ｃ１−６アルキレン基を示し；
Ｌ２が、単結合を示すか、または式：＊Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）−Ｏ−Ｒ１＊＊、式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３ａ）＊＊あるいは式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）＊＊（式中、＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキレン基を示し、Ｒ２、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立してそれぞれ水素原子、もしくは置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を示すか、またはＲ２およびＲ３ａが一緒になって、置換されていてもよいＣ１−６アルキレン結合を形成していてもよい。）で表される基であり；かつ
ＲｃおよびＲｄがそれぞれ独立して水素原子、またはＲｃおよびＲｄが一緒になって、単一のカルボニル基を形成している、基である。
【００９９】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、エチレン基を示し；
Ｌ２が、単結合を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している基である。
【０１００】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、エチレン基を示し；かつ
Ｌ２中のＮ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３ａ）部分が、ピペラジニレン基を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している、基である。
【０１０１】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの更に別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、エチレン基を示し；
Ｌ２が、式：＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３ａ）＊＊（式中、＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ１は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、Ｒ２およびＲ３ａは、それぞれ独立して、水素原子もしくはメチル基を示す。）で表される基であり；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している、基である。
【０１０２】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、エチレン基を示し；
Ｌ２中のＮ（Ｒ２）−Ｒ１−Ｃ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）部分が、ピペリジニレン基を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している、基である。
【０１０３】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、メチレン基またはエチレン基を示し；
Ｌ２が、単結合を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが水素原子である、基である。
【０１０４】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、ブチレン基を示し；
Ｌ２が、単結合を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している、基である。
【０１０５】
上記式（ａ１）で表されるリンカーＬの別の好ましい態様としては、式（ａ１）中、Ｌ１が、メチレン基を示し；
Ｌ２中のＣ（Ｒ３ａ）（Ｒ３ｂ）−Ｏ−Ｒ１部分が、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を示し；かつ
ＲｃおよびＲｄが一緒になって単一のカルボニル基を形成している、基である。
【０１０６】
上記リンカーＬの特に好ましい例は、入手が容易で安価なスクシニル基である。
【０１０７】
Ｚの好ましい態様としては、式（ａ２）、式（ａ２’）または式（ａ２’’）で表される基である。
【０１０８】
上記式（ａ２）または式（ａ２’’）で表されるＺの好ましい態様としては、式（ａ２）または式（ａ２’’）中、ＲａおよびＲｂは、共に水素原子を示し；
Ｒ４は、水素原子を示し、 
ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基（例えば、Ｃ１０−４０アルキル基）を示し；かつ
ｋは、１〜３の整数を示す、基である。
また、ＲａおよびＲｂが一緒になって単一のカルボニル基を形成する態様も又好ましい。
【０１０９】
上記式（ａ２）または式（ａ２’’）で表されるＺの別の好ましい態様としては、式（ａ２）または式（ａ２’’）中、
ｋは、１〜３の整数を示し；
ＲａおよびＲｂは、共に水素原子を示し；
Ｒ４は、水素原子を示し； 
ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を１〜３個有するベンジル基、または炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を１〜３個有するシクロヘキシル基を示し；かつ
環Ａが、ｋ個のＯＲ５に加えて、更にハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、基である。
【０１１０】
上記式（ａ２）または式（ａ２’’）で表されるＺの別の好ましい態様としては、式（ａ２）または式（ａ２’’）中、
Ｒａは、水素原子を示し； 
Ｒｂは、上記式（ａ３）（式中、＊は結合位置を示し；ｊは、０〜３の整数を示し；ｊ個のＲ７は、独立してそれぞれＣ１０−４０アルキル基を示し；
Ｒ４およびＲ６は、共に水素原子を示す。）で表される基である、基である。
【０１１１】
上記式（ａ２）または式（ａ２’’）で表されるＺの更に別の好ましい態様としては、式（ａ２）または式（ａ２’’）中、
Ｒａは、水素原子を示し；
Ｒｂは、上記式（ａ３）（式中、＊は結合位置を示し；ｊは、０〜３の整数を示し；ｊ個のＲ７は、独立してそれぞれＣ１０−４０アルキル基を示し；
Ｒ６は、環ＡのＲ４と一緒になって単結合または−Ｏ−を形成し、それにより環Ａと環Ｂは一緒になってフルオレニル基またはキサンテニル基を示す。）で表される基である、基である。
【０１１２】
上記式（ａ２’）で表されるＺの好ましい態様としては、式（ａ２’）中、ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基（例えば、Ｃ１０−４０アルキル基）を示し；かつ
ｋは、１〜３の整数を示す、基である。
【０１１３】
上記式：−Ｚ’中、ｋ個のＲ５は、独立してそれぞれ炭素数１０以上の脂肪族炭化水素基を有する有機基（例えば、Ｃ１０−４０アルキル基）を示し；かつ
ｋは、１〜３の整数を示す、基である。
【０１１４】
上記式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚで表される保護基、若しくは式：−Ｚ’で表される保護基としては、ヌクレオチド末端水酸基の保護基を除去し得る酸性条件下では切断されにくく、塩基性条件下で切断される基が好ましい。かかる保護基の代表的な例としては、例えば、式：−Ｌ−ＹＬ−Ｚ中のＬが、上記式（ａ１）で表される基（好ましくは、スクシニル基等）であり、かつＹＬ−Ｚが、以下の基であるもの；
式：−Ｚ’で表される基が以下の基であるものが挙げられる。
３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、
３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルオキシ基、
３，５−ビス［３'，４'，５'−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、
３，４，５−トリス［３'，４'，５'−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、
３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアミノ基、
２，４−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、
３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、
ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミノ基、
４−メトキシ−２−［３'，４'，５'−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、
４−メトキシ−２−［３'，４'，５'−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアミノ基、
２，４−ビス（ドデシルオキシ）ベンジルアミノ基、
フェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基、
ジ［４−（１２−ドコシルオキシドデシルオキシ）フェニル］メチルアミノ基、
３，５−ビス［３'，４'，５'−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、または
３，４，５−トリス［３'，４'，５'−トリ（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基。
【０１１５】
下記は化合物（Ｉ）を原料として本方法（工程）を実施した場合のスキームである。
【０１１６】
【化３２】
2017111137.tif 000033
【０１１７】
［式中、各記号の定義は上述の通りである］
本方法（工程）で用いられる溶媒としては、基質を溶解し、酸でないものであれば、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、またはペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、またはジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒、あるいはそれらの混合溶媒が好ましい。中でもテトラヒドロフランとジクロロメタンの混合溶媒が好ましく、特に２：１の混合溶媒が好ましい。
脱シリル化は、有機塩基の存在下、フッ化物イオン源を作用させることで実施される。該有機塩基は１又は２種類以上の混合物が用いられ、それらの塩基のうち少なくとも１種とフッ化水素との塩を該フッ化物イオン源とすることを特徴とする。
有機塩基は強塩基と弱塩基との混合物、２種類以上の弱塩基の混合物又は単一の弱塩基であってもよい。
強塩基としては、好ましくはｐＫａ≧８のものであり、具体的には、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ブチルアミン、イソブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、モルホリンのアミン類が挙げられ、好ましくはトリエチルアミンである。弱塩基としては、好ましくは４≦ｐＫａ＜８のものであり、具体的には、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ピペラジン、ピペリジン、イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のヘテロ環状化合物、アニリン、トルイジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、エチルアニリン、エチルメチルアニリン、アニシジン等のアニリン類が挙げられ、好ましくはピリジン、Ｎ−メチルモルホリンであり、より好ましくはピリジンである。
有機塩基は、フッ化物イオンに対し１モル当量以上で用いることが好ましい。
有機塩基が強塩基と弱塩基との混合物の場合、それぞれの使用量は所望する反応に悪影響を及ぼさない範囲で適宜設定することができるが、チオリン酸上の脱シアノエチル化が起こる可能性があるので、過剰な強塩基の使用は避けることが好ましい。通常、強塩基はフッ化物イオンに対し１／３モル当量以下で使用する。弱塩基は強塩基とあわせて少なくとも１モル当量以上となる量で使用する。強塩基を１／３モル当量以下で使用しても、弱塩基を強塩基とあわせて１モル当量以上で使用しないと５’末端保護基の脱落が起こる。弱塩基の使用量は基質が溶解する限り特に限定されない。
フッ化物イオン源は、上記塩基のうち少なくとも1種とフッ化水素との塩であって、具体的にはトリエチルアミン五フッ化水素酸塩（５ＨＦ−ＴＥＡ）、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（３ＨＦ−ＴＥＡ）、ピリジンフッ化水素酸塩（ＨＦ−ピリジン）等が挙げられ、好ましくは３ＨＦ−ＴＥＡである。
本方法（工程）は上記フッ化物イオン源に有機塩基を添加した混合物、好ましくは強塩基のフッ化水素塩に弱塩基を添加した混合物、より好ましくは、
５ＨＦ−ＴＥＡ又は３ＨＦ−ＴＥＡにピリジンを添加した混合物、特に好ましくは３ＨＦ−ＴＥＡにピリジンを添加した混合物（３ＨＦ−ＴＥＡ−ピリジン）である。弱塩基のフッ化水素塩に弱塩基を添加してもよい。例えば、ＨＦ−ピリジンにＮ−メチルモルホリンを添加してもよい。
本方法（工程）の反応温度及び反応時間は、基質・生成物が析出しない限り特に限定されないが、それぞれ、通常、−１０〜８０℃、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜２０℃、通常０．５〜９６時間、好ましくは１〜４８時間、より好ましくは１〜２４時間である。
【０１１８】
［ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの製造方法］
本方法は、三価のリン上に２つの窒素置換基を有するホスフィチル化剤前駆体をモノ選択的に活性化してホスフィチル化剤とし、該剤を用いて、塩基存在下、オリゴヌクレオチドのフリーな３’末端あるいは５’末端をホスフィチル化する反応を含む。
即ち、本方法は、以下の工程（１）及び（２）を含有する、ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの製造方法である。
（１）溶媒中で、下記式（１）：
【０１１９】
【化３３】
2017111137.tif 000034
【０１２０】
［式中、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｒ１０は、芳香環、水酸基の保護基又はチオール基の保護基を示し、
Ｒ２０およびＲ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。］
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて下記式（２）：
【０１２１】
【化３４】
2017111137.tif 000035
【０１２２】
［式中、
Ｚａは活性化剤に由来する基を示し、
それ以外の各記号は、前記と同義である。］
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
（２）溶媒中で、５’位水酸基又は３’位水酸基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）に、塩基の存在下、工程（１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、該オリゴヌクレオチドの末端の水酸基をホスフィチル化する工程
【０１２３】
工程（１）
式（１）中、Ｒ１０の芳香環としては、フェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、２−ブロモフェニル、４−ブロモフェニル、２−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル等が挙げられ、好ましくは４−ニトロフェニルである。
式（１）中、Ｒ１０における水酸基の保護基又はチオール基の保護基としては、具体的にはＣ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル）；シアノ化Ｃ１−６アルキル基（例、２−シアノエチル、２−シアノ−１，１−ジメチルエチル）；置換シリル基で置換されたエチル基（例、２−メチルジフェニルシリルエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−トリフェニルシリルエチル）；ハロゲン化Ｃ１−６アルキル基（例、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル）；Ｃ２−６アルケニル基（例、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル）；Ｃ３−６シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）；シアノ化Ｃ１−６アルケニル基（例、２−シアノブテニル）；Ｃ７−１１アラルキル基（例、ベンジル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル）；Ｃ６−１０アリール基（例、フェニル、インデニル、ナフチル）が挙げられ、より好ましくはシアノ化Ｃ１−６アルキル基であり、特に好ましくは２−シアノエチルである。
式（１）中、Ｒ２０およびＲ３０はそれぞれ独立してアルキル基を示すが、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環（例、ピロリジン）を形成してもよい。Ｒ２０およびＲ３０は好ましくはいずれもイソプロピル基である。
ホスフィチル化剤前駆体としては、下記化合物が特に好ましい。
【０１２４】
【化３５】
2017111137.tif 000036
【０１２５】
活性化剤をホスフィチル化剤前駆体に作用させることで、ホスフィチル化剤が得られる。
活性化剤は、ホスホロアミダイト上のアミンを置換して、水酸基等との反応性置換基を付与し得る酸である。具体的には、ｐＫａ５以上の弱酸性活性化剤、より好ましくはｐＫａ５以上のアゾール系化合物及びそのＣ上置換体から選ばれる少なくとも１種である。アゾール系化合物としては、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール等が挙げられ、Ｃ上置換体としては、ジシアノイミダゾール、ビス(トリフルオロメチル)イミダゾール、ジクロロイミダゾール等のハロゲン原子でジ置換された化合物が用いられる。特に好ましくはジシアノイミダゾール及びジクロロイミダゾールである。
式（２）において、Ｚａは活性化剤に由来する基であり、例えば活性化剤から水素原子を１つ除いた基であり、活性化剤としてジシアノイミダゾールを用いた場合、Ｚａはジシアノイミダゾリルであり、活性剤としてジクロロイミダゾールを用いた場合、Ｚａはジクロロイミダゾリルである。
【０１２６】
工程（１）で使用する溶媒は、ホスフィチル化前駆体を溶解し、活性化剤が難溶性となるものであれば特に限定されないが、酸性または塩基性の官能基を通常有さない。ここで「難溶性」とは、溶媒中の活性化剤の濃度が６μＭ以下であることを目安とする。具体的には、トルエン、ベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、四塩化炭素等が挙げられ、好ましくはトルエン、シクロヘキサン、特に好ましくはトルエンである。
【０１２７】
本方法（工程）の反応温度及び反応時間は、基質・生成物が析出しない限り特に限定されないが、それぞれ、通常、４０℃以下、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは５〜１５℃、特に好ましくは１０℃程度であり、通常０．５〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、より好ましくは１〜６時間である。
【０１２８】
活性化剤とホスフィチル化剤前駆体との使用量は、ホスフィチル化前駆体が活性化される限り特に限定されないが、通常、ホスフィチル化前駆体に対して、通常過剰量で、好ましくは１．５〜１０モル当量で用いられる。過剰量の活性化剤をホスフィチル化前駆体に溶媒中で作用させることで、ホスフィチル化剤前駆体を活性化すると同時に、ホスフィチル化時に副生するジイソプロピルアミンを活性化剤との塩として沈殿させる。従って、必要に応じて、工程（１）と下記工程（２）との間に、沈殿等の不溶物を分離する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。
【０１２９】
工程（２）
本工程は、溶媒中で、５’位水酸基若しくは５’位リン酸基又は３’位水酸基若しくは３’位アミノ基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）に、塩基の存在下、工程（１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、該オリゴヌクレオチドの末端の水酸基をホスフィチル化する工程を含む。
【０１３０】
「５’位水酸基若しくは５’位リン酸基又は３’位水酸基若しくは３’位アミノ基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）」の好ましい一態様は、５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていない下記構造（Ｉａ）を有する化合物である（以下、化合物（Ｉａ））。
【０１３１】
【化３６】
2017111137.tif 000037
【０１３２】
［式中、
ｑ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又は−ＮＨ−を示し、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
Ｐ１ａは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ１ａとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｑ個のＰ２ａは、それぞれ独立してリン酸基の保護基を示し、
ｑ個のＲ４０ａは、それぞれ独立して酸素原子又は硫黄原子を示し、
ｑ＋１個のＹａは、それぞれ独立して水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｑは、１以上の任意の整数を示す。］
Ｐ１ａにおける水酸基の保護基としては、上記Ｐ１における水酸基の保護基として例示したものと同様のものを用いることができる。好ましくはジメトキシトリチル基である。
Ｐ２ａにおけるリン酸基の保護基としては、上記Ｐ２におけるリン酸基の保護基として例示したものと同様のものを用いることができる。好ましくは−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧ（ＷＧは、電子吸引性基を示す。）で表される基であり、ＷＧとしてはシアノ基が好ましい。
Ｒ４０ａは、好ましくは同一で酸素原子又は硫黄原子である。
Ｙａにおける保護されていてもよい水酸基の保護基としては、上記Ｙにおける保護されていてもよい水酸基の保護基として例示したものと同様のものを用いることができ、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。
Ｙａにおける「４位炭素原子に架橋する有機基」としては、上記Ｙにおける「４位炭素原子に架橋する有機基」として例示したものと同様のものを用いることができる。
ＢａｓｅＡの「保護されていてもよい核酸塩基」としては、上記Ｂａｓｅの「保護されていてもよい核酸塩基」と同様のものを用いることができ、ｑ＋１個存在するＢａｓｅＡの少なくとも１つは式−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（上述と同義）で表される保護基、若しくは式−Ｚ’（上述と同義）で表される保護基で保護されていることが好ましい。
下記は化合物（Ｉａ）を原料として本工程（２）を実施した場合のスキームである。
【０１３３】
【化３７】
2017111137.tif 000038
【０１３４】
［式中、各記号の定義は上述の通りである］
【０１３５】
本工程で用いる、化合物（Ｉａ）に例示される「５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）」は、上記化合物（Ｉ）の３’末端のシリル保護基を脱シリル化、好ましくは上記した本発明の脱シリル化によって得られたものであってもよい。
【０１３６】
「５’位水酸基若しくは５’位リン酸基又は３’位水酸基若しくは３’位アミノ基のいずれか一方が保護され、かつもう一方が保護されていないｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｎは、２以上の任意の整数を示す。）」の好ましい一態様は、３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていない下記構造（Ｉａ’）を有する化合物である（以下、化合物（Ｉａ’））。
【０１３７】
【化３８】
2017111137.tif 000039
【０１３８】
［式中、Ｐ１ａ’は、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ１a’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、それ以外の各記号の定義は式（Ｉａ）と同義である］
Ｐ１ａ’における水酸基の保護基としては、上記Ｐ１における水酸基の保護基として例示したものと同様のものを用いることができる。
Ｐ１ａ’におけるアミノ基の保護基としては、特に限定されず、例えば、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、１−（ジメチルアミノ）エチリデン基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。
下記は化合物（Ｉａ’）を原料として本工程（２）を実施した場合のスキームである。
【０１３９】
【化３９】
2017111137.tif 000040
【０１４０】
［式中、各記号の定義は上述の通りである］
【０１４１】
工程（２）で使用する溶媒としては、工程（１）で使用した溶媒と同様のものを用いることができ、具体的には、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられ、好ましくはトルエンとジクロロメタンの混合溶媒である。
工程（２）で使用する塩基は、反応により生じた酸（活性化剤）の中和に十分な塩基性を有し、且つリン酸上の脱シアノエチルを引き起こさずＰ−Ｎ結合を形成しない塩基が選択される。そのような塩基としては、具体的には、ｐＫａ５〜８の塩基、好ましくは、コリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアニリン等が用いられる。ｐＫａ８より高い塩基を用いると脱シアノ化が顕著となり、ｐＫａ５未満の塩基を用いると反応の進行に伴い再生した活性化剤の捕捉が不十分となり副生物が生じる。
工程（２）では、ホスフィチル化前駆体は添加してもしなくてもよいが、添加することが好ましい。
【０１４２】
［末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法］
本方法は、末端の水酸基がホスホロアミダイト化されたオリゴヌクレオチドの該末端に直接又はリンカーを介して官能基を連結させることを含む。より具体的には、３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に直接又はリンカーを介して官能基を連結させること、あるいは５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの５’末端に直接又はリンカーを介して官能基を連結させることを含む。「３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチド」及び「５’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチド」は任意の方法で合成されるものであってもよいが、好ましくは上記した本発明の「末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの製造方法」によって得られる下記構造を有する化合物（Ｉａ−１）及び（Ｉａ’−１）である。
【０１４３】
【化４０】
2017111137.tif 000041
【０１４４】
【化４１】
2017111137.tif 000042
【０１４５】
［式中、各記号の定義は上述の通りである］
化合物（Ｉａ−１）の３’末端に直接又はリンカーを介して官能基を連結して下記化合物（Ｉａ−２）を、化合物（Ｉａ’−１）の５’末端に直接又はリンカーを介して官能基を連結して下記化合物（Ｉａ’−２）を製造する。
【０１４６】
【化４２】
2017111137.tif 000043
【０１４７】
【化４３】
2017111137.tif 000044
【０１４８】
式中、Ｌｘは単結合又はリンカーを示す。Ｌｘが単結合の場合、官能基は化合物（Ｉａ−１）あるいは化合物（Ｉａ’−１）に直接連結している。官能基の水酸基、チオール基若しくはアミノ基で直接化合物（Ｉａ−１）の３’末端に、あるいは（Ｉａ’−１）の５’末端に連結する。Ｌｘがリンカーである場合には、水酸基、チオール基、アミノ基を反応点として有するリンカー（例、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、および−ＣＯＮＨ−）を介して化合物（Ｉａ−１）の３’末端に、あるいは（Ｉａ’−１）の５’末端に連結する。
式中、Ｇは官能基であり、例えばオリゴヌクレオチド、モノヌクレオシド、コレステロール、ＧａｌＮａｃ３、ＰＥＧ、低分子医薬、ビオチン、ペプチド及び標識化合物からなる群より選択される少なくとも１種に由来するものが挙げられる。好ましくはオリゴヌクレオチド及びモノヌクレオシドであり、より好ましくはオリゴヌクレオチドである。
【０１４９】
例えば、官能基が、３’位水酸基又は３’位アミノ基あるいは３’リン酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていない、下記構造（Ｉｂ）：
【０１５０】
【化４４】
2017111137.tif 000045
【０１５１】
［式中、
ｒ＋１個のＡ１は、それぞれ独立して酸素原子又はＮＨを示し、
ｒ＋１個のＢａｓｅＢは、それぞれ独立して保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｒ個のＰ２ｂは、リン酸基の保護基を示し、
ｒ個のＲ４０ｂは、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Ｐ３ｂは、水酸基又はアミノ基の保護基を示すか、又は−Ａ１−Ｐ３ｂとして水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、
ｒ＋１個のＹｂは、水素原子、保護されていてもよい水酸基、ハロゲン原子又は４位炭素原子に架橋する有機基を示し、
ｒは、１以上の任意の整数を示す。］
を有するｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である場合、本方法は、オリゴヌクレオチドのフラグメント縮合に相当し、具体的には以下の工程を含む。
【０１５２】
【化４５】
2017111137.tif 000046
【０１５３】
例えば、官能基が、５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていない、下記構造（Ｉｂ’）：
【０１５４】
【化４６】
2017111137.tif 000047
【０１５５】
［式中、Ｐ３ｂは、水酸基の保護基を示すか、又は−Ｏ−Ｐ３ｂ’として水酸基の１つが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示し、水酸基は保護されている）に置き換わっているリン酸基を示し、各記号の定義は式（Ｉｂ）と同義である］を有するｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である場合、本方法は、オリゴヌクレオチドのフラグメント縮合に相当し、具体的には以下の工程を含む。
【０１５６】
【化４７】
2017111137.tif 000048
【０１５７】
［式中、各記号の定義は上述の通りである。］
ＢａｓｅＢの「保護されていてもよい核酸塩基」としては、上記Ｂａｓｅの「保護されていてもよい核酸塩基」と同様のものを用いることができ、ｒ＋１個存在するＢａｓｅＢの少なくとも１つは式−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（上述と同義）で表される保護基、若しくは式−Ｚ’（上述と同義）で表される保護基で保護されていることが好ましい。
Ｐ２ｂにおけるリン酸基の保護基としては、塩基性条件下で脱保護可能であり、リン酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧ（ＷＧは、電子吸引性基を示す。）で表される基が好ましく、ＷＧとしてはシアノ基が好ましい。
Ｒ４０ｂは、好ましくは同一で酸素原子又は硫黄原子である。
Ｙｂにおける保護されていてもよい水酸基の保護基としては、特に限定されず、Ｙの定義において例示されたものが同様に用いられる。
Ｙｂにおける「４位炭素原子に架橋する有機基」としては、Ｙｂの定義において例示されたものが同様に用いられる。
Ｐ３ｂ’における水酸基の保護基としては、連結後に得られるオリゴヌクレオチドの５’位水酸基の保護基（化合物（Ｉｂ）の場合）あるいは３’位水酸基の保護基（化合物（Ｉｂ’）の場合）を除去し得る酸性条件で安定な基であり、縮合反応において反応が進行するように反応溶媒にｎ’個重合オリゴヌクレオチド（化合物（Ｉｂ）または化合物（Ｉｂ’））を溶解させうるものであれば特に限定はないが、式−Ｌ−ＹＬ−Ｚ（各記号の定義は上述の通り）で表される保護基、若しくは式−Ｚ’（上述と同義）で表される保護基を使用することができる。好ましくは、Ｌはスクシニル基である。また、Ｐ３ｂ’における水酸基の保護基としては、上記脱シリル化の項で記載したものと同様のものを用いることもでき、その場合、好ましくはジメトキシトリチル基である。
【０１５８】
Ｐ３ｂ’として−Ｌ−ＹＬ−Ｚを有するｎ’個重合オリゴヌクレオチド（１ｂ’）は５’位に−Ｌ−ＹＬ−Ｚを有し、３’位が水酸基であるモノヌクレオシドに、３’位が保護された水酸基、５’位がホスホロアミダイトであるモノマーヌクレオシドをＷＯ２０１２１５７７２３Ａ１記載と同様の液相中でのホスホロアミダイト法により連結を繰り返すことで調製可能である。ここで、該モノマーヌクレオシドは、既知文献（例、Wagner, T.; Pfleiderer, W. Nucleoside Nucleotides 1997, 16, 1657-1660.；ＵＳ８５４１５６９Ｂ２）に基づいて調製することができる。
【０１５９】
本発明の好ましい一実施態様は、下記式（Ｉａ−１’）： 
【０１６０】
【化４８】
2017111137.tif 000049
【０１６１】
［式中、
ｑ＋１個のＢａｓｅＡ’は、それぞれ独立して式−Ｌ’−ＹＬ−Ｚ（式中、Ｌ’はスクシニル基であり、ＹＬ、Ｚは上述と同義である）で表される保護基、若しくは式：−Ｚ’（上述と同義）で表される保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述と同義である］
で表される３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチドの３’末端に、直接又はリンカーを介して官能基を連結させて下記式（Ｉａ−２’）：
【０１６２】
【化４９】
2017111137.tif 000050
【０１６３】
［式中、
Ｌｘは単結合又はリンカーを示し、
Ｇは官能基を示し、
それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドを得た後、保護基を除去する工程を含む、式（ＩＩ）：
【０１６４】
【化５０】
2017111137.tif 000051
【０１６５】
［式中、ｑ＋１個のＢａｓｅ’は無保護の核酸塩基を示し、それ以外の各記号の定義は上述の通りである］
で表される３’末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドの製造方法である。
〔本発明の製造方法〕
次に、本発明の方法を用いたオリゴヌクレオチドの製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）について説明する。
本発明は、以下の工程（１）及び（２）を含有するオリゴヌクレオチドの製造方法である。
（１）３’位水酸基がホスホロアミダイト化され、かつ５’位水酸基が保護されたｎ個重合オリゴヌクレオチドを、３’位水酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチドと、その５’位水酸基を介してホスファイトトリエステル結合により縮合させる工程、ならびに
（２）工程（１）の反応液に、酸化剤、または硫化剤を添加して、工程（１）で得られたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドのホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合へと変換する工程。
以下に、各工程について詳細に説明する。
【０１６６】
工程（１）（縮合工程）
本工程は、３’位水酸基がホスホロアミダイト化され、かつ５’位水酸基が保護されたｎ個オリゴヌクレオチドを、３’位水酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチドと、その５’位水酸基を介してホスファイトトリエステル結合により縮合させる工程である。
３’位水酸基がホスホロアミダイト化され、かつ５’位水酸基が保護されたｎ個重合オリゴヌクレオチドと、３’位水酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチドとの縮合工程は、通常、縮合活性化剤の存在下で実施される。
【０１６７】
本工程に使用する縮合活性化剤としては、特に限定されないが、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ）、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）、４，５−ジシアノイミダゾール(ＤＣＩ)、テトラゾール、５−[３，５−ビス(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−テトラゾール（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ４２（登録商標））、ベンゾイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、ピリジン・トリフルオロ酢酸塩等を使用することが好ましい。ＢＴＴ、ＥＴＴ、ＤＣＩがより好ましく、ＢＴＴが特に好ましい。
【０１６８】
本工程における縮合活性化剤の使用量は、ホスホロアミダイト化オリゴヌクレオチド１モルに対し、通常０．５〜１０モル、好ましくは１．０〜２．０モル、特に好ましくは１．０モルである。
【０１６９】
本工程の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、０〜１００℃が好ましく、２０〜５０℃がより好ましく、２０〜３０℃が特に好ましい。反応時間は、使用するオリゴヌクレオチドの種類、溶媒の種類、反応温度等により異なるが、３０分〜２４時間である。
【０１７０】
本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。具体的には、ピリジン、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、アセトニトリルまたはこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。
【０１７１】
３’位水酸基がホスホロアミダイト化され、かつ５’位水酸基が保護されたｎ個オリゴヌクレオチド及び、３’位水酸基が保護され、かつ５’位水酸基が保護されていないｎ’個重合オリゴヌクレオチドとの使用量は、いずれの基質をより完全な消費に近付ける事を意図するかに依存するが、後者１モルに対して前者が０．１〜１０モルが好ましく、０．５〜３モルがより好ましく、１．０〜２.０モルが特に好ましい。
【０１７２】
工程（２）（酸化工程、または硫化工程）
工程（１）で得られたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドに酸化剤または硫化剤を反応させることにより、該ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドのホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合へと変換する工程である。
【０１７３】
本工程は、工程（１）で得られたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを単離することなく、工程（２）後の反応液に、酸化剤または硫化剤を、直接添加するだけで行うことができる。
【０１７４】
本工程に使用する「酸化剤」としては、他の部位を酸化することなく、ホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合に酸化する能力がありさえすれば、特に限定されないが、ヨウ素、（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファニルスルフォニル）オキサジリジン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）、２−ブタノンペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、ｍ−クロロ過安息香酸を使用することが好ましい。良好な酸化反応が達成できるという観点で、ヨウ素、（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファニルスルフォニル）オキサジリジン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカンがより好ましく、ヨウ素、（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファニルスルフォニル）オキサジリジン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシドが更に好ましく、ヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドが更に一層好ましく、ヨウ素が特に好ましい。かかる酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、ジクロロメタン、水、またはこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。中でも、例えば、ヨウ素／水／ピリジン―ＴＨＦあるいはヨウ素／ピリジン―酢酸や過酸化剤（ＴＢＨＰ）／ジクロロメタンを用いるのが好ましい。
【０１７５】
本工程に使用する「硫化剤」としては、ホスファイトトリエステル結合を、チオホスフェートトリエステル結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）、硫黄を使用することが好ましい。良好な反応が進行しうるという観点で、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）がより好ましく、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドが更に好ましく、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオンが特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
【０１７６】
酸化剤または硫化剤の使用量は、工程（１）で得られたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖ）１モルに対し、１〜５０モル使用することができ、好ましくは１〜５モルである。
【０１７７】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましい。反応時間は、ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖ）の種類、使用する酸化剤または硫化剤の種類、反応温度等によって異なるが、１分〜３時間である。
【０１７８】
更に、所望により下記工程（３）を含有させることにより、簡便かつ効果的に過剰原料や副生物を除去して、ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを精製することができる。
（３）工程（２）で得られた反応液に極性溶媒を添加して、ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程。
【０１７９】
本発明の製造方法には、更に、工程（４）を含有させることにより、オリゴヌクレオチドを単離・製造することができる。
（４）工程（３）で得られたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドの保護基を全て除去する工程。
【０１８０】
工程（３）（沈殿化および固液分離工程）
本工程は、工程（２）で得られたホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合を有するｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを含む反応液に極性溶媒を添加することにより該ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程である。
【０１８１】
本工程における目的物（ｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチド）を沈殿させるための極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド、水等、ならびにこれら２種以上の混合溶媒が挙げられる。中でも、アルコール系溶媒、ニトリル系溶媒が好ましく、メタノールまたはアセトニトリルがより好適に使用される。本発明における極性溶媒としては、特に実用的観点からアセトニトリルが好ましい。
【０１８２】
酸化剤としてヨウ素を使用した場合の沈殿化の際には、沈殿化溶媒であるメタノールにチオ硫酸ナトリウム（ハイポ）を飽和させた溶液を使用することにより、ヨウ素による着色を除去することができ、５’位水酸基が保護されたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを純度良く単離することが可能である。
【０１８３】
硫化剤を使用した場合の沈殿化の際には、沈殿化溶媒であるメタノールに３価のリン試薬（例えば、トリメチルホスファイト、トリエチルホスファイト、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン等）、ハイポ等の還元剤を飽和させた溶液を使用することにより、５’位水酸基が保護されたｎ＋ｎ’個重合オリゴヌクレオチドを純度良く単離することが可能である。
【０１８４】
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法は、上記工程（１）〜（３）を所望の回数繰返すことで高純度かつ高収率で目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【０１８５】
工程（４）（脱保護・オリゴヌクレオチド単離工程）
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法においては、工程（３）の後に、保護基の種類・性質に応じて、脱保護を行い、オリゴヌクレオチドを単離することができる。脱保護の方法としては、例えば、グリーンズ  プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（２００６年）等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、本発明における核酸塩基の保護基であるフェノキシアセチル基、アセチル基等、リン酸基に結合しているシアノエチル基等は、アンモニア水／エタノール溶液で処理することにより、全て除去することができる。
保護基を有しないオリゴヌクレオチドは酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下でオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
【０１８６】
上記各工程における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。すなわち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
【０１８７】
工程（３）、あるいは工程（４）より得られたオリゴヌクレオチドは、更に有機合成反応を施すことにより、所望のオリゴヌクレオチド誘導体へと導くこともできる。
工程（４）より得られたオリゴヌクレオチドにより、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴ核酸医薬を提供することができる。
【０１８８】
また、官能基が、５’位水酸基又は５’位リン酸基が保護され、かつ３’位水酸基又は３’位アミノ基が保護されていない、下記構造（Ｉｂ’）を有するｎ’個重合オリゴヌクレオチド（ｎ’は、２以上の任意の整数を示す。）である場合も同様に実施することができる。
【０１８９】
【化５１】
2017111137.tif 000052
【０１９０】
［式中、各記号の定義は上述の通りである］
【実施例】
【０１９１】
以下、実施例に沿って本発明を詳細に説明するが、これら調製例、実施例は本発明の範囲をなんら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料はとくに言及されない限り、商業的に入手可能である。また、本明細書において、略号で表示する場合、各表示はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅにより略号あるいは当該分野における慣用名に基づくものである。
以下の調製例及び、実施例中の収率はｍｏｌ／ｍｏｌ％を示す。特段の定義が無い限り、本明細書中における「％」は「質量％」を表す。また、以下の調製例および実施例中の溶媒の比率は、体積比を示す。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは内部標準としてテトラメチルシランを用い、測定溶媒としてＣＤＣｌ３を用いた。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ４００  （４００ＭＨＺ）核磁気共鳴装置を用いて測定した。
エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー／質量分析（以下ＬＣ／ＭＳと略す）はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙを用いて測定した。
下記調製例、実施例中で使用される略号は以下の通りである。ヌクレオシドの核酸塩基が保護されている場合は、保護基は各ヌクレオシドの後に上付きで表示するものとする。
ｄＴ：２’−デオキシチミジン
ｄＣ：２’−デオキシシチジン
ｄＧ：２’−デオキシグアノシン
ｄＡ：２’−デオキシアデノシン
ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル
Ａｃ：アセチル
Ｂｚ：ベンゾイル
ｄｍａ：ジメチルアミノエチリデン
ｉＢｕ：イソブチリル
ＰＡ：（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト
ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＤＩＰＰＳ：ジイソプロピルフェニルシリル
ＨＤ：ヘキシルデカノイル
ＩＰＯＤＩＰＳ：イソプロポキシジイソプロピルシリル
ＴＯＢ：３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル
ＣＯ−ＴＯＰ：３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル
ｓｕｃ：スクシネート
ＴＥＡ：トリエチルアミン【０１９２】
実施例１：Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ）の合成
（１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシシチジンの合成【０１９３】
【化５２】
2017111137.tif 000053
【０１９４】
アルゴン雰囲気下、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシシチジン（６．３２ｇ，１１．９ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２４．０ｍＬ）に溶解し、イミダゾール（２．４７ｇ，３６．４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（２．７１ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）を加えて、３５℃で１２時間撹拌した。反応の完結を薄層クロマトグラフィーにより確認後の反応液にジクロロメタン（２０ｍＬ）及び５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加えて抽出した後、水（２０ｍＬ）、続いて飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させた後、溶媒を減圧下留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製（溶出液：１％トリエチルアミン含有のｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→０：１続いて、１％トリエチルアミン含有のジクロロメタン：メタノール＝１０：１→５：１）し、表題化合物（６．８１ｇ，１０．５ｍｍｏｌ，８８．９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: -0.07 (s, 3H, SiCH3), -0.01 (s, 3H, SiCH3), 0.80 (s, 9H, tBu), 1.81 (m, 2H, 4-NH2), 2.19 (ddd, J = 4.8, 6.4, 13.2 Hz, 1H, 2'-CHH ), 2.47 (ddd, J = 6.4, 6.8, 13.2 Hz, 2'-CHH), 3.29 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5'-CHH), 3.53 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5'-CHH), 3.80 (s, 6H, OCH3 of DMTr), 3.94 (ddd, J = 2.8, 2.8, 6.4 Hz, 1H, 4'-CH), 4.60 (dd, J = 6.4, 6.4, 6.4 Hz, 1H, 3'-H), 5.38 (d, J = 7.2 Hz, 5-H), 6.26 (dd, J = 6.8, 4.8 Hz, 1H, 1'-H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H, 2, 2', 6, 6'-H of DMTr), 7.2-7.4 (m, 8H, Ar and 5-H of cytidine), 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H, 2, 6-H of Ph), 8.0-8.2 (m, 2H, -NH2).
（２）Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ）の合成【０１９５】
【化５３】
2017111137.tif 000054
【０１９６】
３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸（０．９２７ｇ，１．００ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５２０ｍＬ，２．０４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０．０ｍＬ）に溶解し、ここに０℃で２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．５７３ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を添加した後、室温に昇温し４０分間撹拌した。反応液に（１）で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシシチジン（０．９６９ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）を添加して４０℃にて２１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーで反応の完結を確認し、室温に冷却した後、アセトニトリル（５０ｍＬ）を添加して目的物を析出させ、桐山ロートでろ過、洗浄した。ろ紙上の白色沈殿をアセトニトリル（４０ｍＬ）中に分散させた後、再び桐山ロートでろ過・洗浄し、真空乾燥の後、目的のＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ（１．５１ｇ，０．９７３ｍｍｏｌ，９７．３％）を取得した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: -0.04 (s, 3H, Si(CH3)(CH3)), 0.02 (s, 3H, Si(CH3)(CH3)), 0.82 (s, 9H, tBu), 0.89 (t, J =6.8 Hz, 9H, O(CH2)17CH3), 1.20-1.50 (m, 90H, OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.75 (quint, J =6.8 Hz, 2H, 4-OCH2CH2(CH)2CH3), 1.83 (quint, J =6.8 Hz, 4H, 3,5-OCH2CH2(CH)15CH3), 2.22 (ddd, J = 13.6, 6.0, 4.8Hz, 1H, 2'-CHH), 2.585 (ddd, J = 13.6, 6.4, 6.4 Hz, 1H, 2'-CHH), 3.34 (dd, J =10.8, 3.6 Hz, 1H, 5'-CHH), 3.53 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5'-CHH), 3.806 (s, 3H, DMTr 4-OCH3), 3.809 (s, 3H, DMTr 4'-OCH3), 3.99-4.04(m, 7H, 3'-H and OCH2(CH2)16CH3), 4.46 (ddd, J = 6.4, 6.0, 6.0, 1H, 3'-H), 6.27 (dd, J = 6.4, 4.8 Hz, 1H, 1'-H), 6.68 (d, J =8.8 Hz, 4H,3,3',4,4'-H of p-methoxyphenyl), 7.05 (brs, 2H, 2,6-H of 3,4,5-tris(octadecyloxy)benzoyl), 7.27-7.33 (m, 8H, 2,2',6,6'-H of p-methoxyphenyl, 3,4,5-H of phenyl and 6-H of cytosine), 7.40 (d, J =7.2 Hz, 2H, 2,6-H of phenyl), 8.40 (d, J = 7.2 Hz, 1H, 5-H of cytosine), 8.53 (s, 1H, cytosine N-H).【０１９７】
実施例２：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ）の合成【０１９８】
【化５４】
2017111137.tif 000055
【０１９９】
（１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ）の合成
実施例１で得たＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ（０．７７７ｇ，０．５００ｍｍｏｌ）、５−メトキシインドール（１０．０ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２３．０ｍＬ）に溶解した。ここにトリフルオロ酢酸（５５．７μＬ，０．７５ｍＬ）を滴下して、室温で３０分撹拌し、反応の完結をＵＰＬＣにより確認した。反応混合液を２，４，６，−トリメチルピリジンで中和した後、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（１．６８ｇ，２．００ｍｍｏｌ）、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（０．３８４ｇ，２．００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．００ｍＬ）溶液を添加して、室温で２時間撹拌した。３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．４５２ｇ，２．２０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４５分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。室温でアセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加して目的化合物を析出させた。反応液を桐山ロートを用いてろ過した後、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥により目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．９７０ｇ，０．４８０ｍｍｏｌ，９６．０％）を白色固体として得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1966.23,found 1966.24[M-H]-【０２００】
（２）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ）の合成
アルゴン雰囲気下、（１）で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（９５０ｍｇ，０．４７０ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２３ｍＬ）に溶解し、５−メトキシインドール（１．３８ｇ，９．４０ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（４１．９μＬ，０．５６４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌し、反応の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した。反応混合液に２，４，６，−トリメチルピリジン（１．４９μＬ，１．１３ｍｍｏｌ）を添加して中和した後、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（１．４２ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（０．３６７ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．００ｍＬ）溶液を添加して、室温で２時間撹拌した。反応の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した後、３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．４３１ｇ，２．０１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４５分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。室温でアセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加して目的化合物を析出させた。反応液を桐山ロートを用いてろ過した後、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥により目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（１．０８ｇ，０．４５３ｍｍｏｌ，９６．４％）を白色固体として得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1142.62,found 1142.63 [M-2H]2-【０２０１】
実施例３：シアノエチル保護体の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲ分析
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳおよそ０．００３ｇをクロロホルム−ｄ（０．７ｍＬ）に溶解した。３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定した所、全てのピークは６６．４〜６７．２ｐｐｍに観測された。【０２０２】
実施例４：ＤＢＵを用いた脱シアノエチル化体標品の取得
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．００４３ｇ，０．００１７９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．１５ｍＬ）に溶解した。ここに１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ（以後ＤＢＵ）（２．０μＬ，０．０１３３ｍｍｏｌ）を添加・混合した。２３℃にて５分間、脱シアノエチル化を進行させた。反応液にアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．００１７ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）を測定すると全てのピークは５６．５〜５６．８ｐｐｍに出現し、脱シアノエチル化体はシアノエチル保護体と顕著に異なる領域に３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲのシグナルを与える事を確認した。【０２０３】
実施例５：各種フッ化物イオン源を用いた脱シリル化の検討
（１）３ＨＦ−ＴＥＡを用いた検討
実施例２と同様に得た（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２３９ｇ，０．００９９８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．０ｍｇ，０．１８０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．６０ｍＬ）溶液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０２３０ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．８〜６８．１ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認され、同時に４，４’−ジメトキシトリチル基の０．４％が脱落していた。【０２０４】
（２）３ＨＦ−ＴＥＡ−２ピリジンを用いた脱シリル化の検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２０４ｇ，０．００８３５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．４ｍｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．０６５ｍＬ，０．３６０ｍＬ）をＴＨＦ（０．６０ｍＬ）に溶解した混合溶液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０１６９ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．６〜６８．３ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２０５】
（３）３ＨＦ−ＴＥＡ−４ピリジンを用いた脱シリル化の検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．７１９ｇ，０．３００ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（９．０ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（８７０ｍｇ，５．４４ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．７５ｍＬ，２１．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１８ｍＬ）に溶解した混合溶液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液にアセトニトリル（１５０ｍＬ）を添加して目的物を析出させた。桐山ロートにより濾過し、アセトニトリルで洗浄した。全沈殿を真空乾燥させ、０．６５２ｇ（０．２５８ｍｍｏｌ，９５．２％）の白色固体を得た。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．６〜６８．３ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２０６】
（４）３ＨＦ−ＴＥＡ−２Ｎ−メチルモルホリンを用いた脱シリル化の検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２４１ｇ，０．０１０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．１ｍｇ，０．１８１ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（３９．６μＬ，０．３６０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６ｍＬ）に溶解した混合溶液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬずつに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０１９５３ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．７〜６８．２ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２０７】
（５）３ＨＦ−ＴＥＡ−２コリジンを用いた脱シリル化の検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２４０ｇ，０．０１００ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．１ｍｇ，０．１８１ｍｍｏｌ）、コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）（４７．７μＬ，０．３６０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６ｍＬ）に溶解した混合溶液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬずつに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０２１３３ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．８〜６８．１  ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２０８】
（６）３ＨＦ−ＴＥＡ−２モルホリンを用いた脱シリル化の検討
３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．４ｍｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）、モルホリン（３１．３μＬ，０．３６０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６ｍＬ）で混合し沈殿を含む溶液としこれを１５℃に冷却した。ここに、実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２３６ｇ，０．００９９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．３ｍＬ）溶液を添加した。
１５℃にて７２時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬずつに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０１８８ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定するとシアノエチル保護体に対応する６０ｐｐｍ以上のピークは見られず、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のピークのみが観測され、本条件では、チオリン酸上のシアノエチル基が完全に脱落することが明らかとなった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳでの分析により、脱シリルの完結も確認された。【０２０９】
（７）ＨＦ−ＴＥＡを用いた検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２０４ｇ，０．００８５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（２９．４ｍｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０５０１ｍＬ，０．３５９ｍＬ）をＴＨＦ（０．６０ｍＬ）中で混合した懸濁液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０１６９ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定するとシアノエチル保護体に対応する６０ｐｐｍ以上のピークと、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のピークの積分比は以下の通りとなり、本条件では顕著な脱シアノエチル化が進行することが明らかとなった。
（シアノエチル保護チオリン酸）：（脱保護チオリン酸）＝１．００：１．６６
ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２１０】
（８）ＨＦ−０．１２ピリジン−０．８８ＮＭＭを用いた検討
ＨＦ−ピリジン（０．０１６２ｍｇ；ＨＦ含量６７．２％，ＨＦ０．５４４ｍｍｏｌ，ピリジン０．０６７２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（５２．１μＬ，０．４７４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６ｍＬ）で混合し沈殿を含む溶液としこれを１５℃に冷却した。ここに、実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２４０ｇ，０．０１００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．３ｍＬ）溶液を添加した。
１５℃にて９６時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬずつに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０２０８ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定すると全てのピークはシアノエチル保護体に対応する６５．８〜６８．２ｐｐｍに観測され、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のシグナルは観測されなかった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定では、脱シリル化の完結が確認された。【０２１１】
（９）ＴＢＡＦ−ＡｃＯＨを用いた検討
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳ（０．０２０４ｇ，０．００８５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、これを１５℃まで冷却した。ここに１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフロリドのテトラヒドロフラン溶液（０．５４ｍＬ，０．５４ｍｍｏｌ）、酢酸（０．０３０９ｍＬ，０．５３６ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（０．０６ｍＬ）の混合液を添加・混合した。１５℃にて２４時間、脱シリル化を進行させた。反応液をおよそ２００μＬに４分割し、それぞれにアセトニトリル（１．０ｍＬ）を添加して、１０，０００Ｇ，４℃にて５分間遠心分離した。上澄みを除いた後、アセトニトリル（１．０ｍＬ）に分散させ、再度同様に遠心分離した。全沈殿を真空乾燥させると重量は０．０１６８ｇであった。生成物の３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲを測定するとシアノエチル保護体に対応する６０ｐｐｍ以上のピークは見られず、脱シアノエチル化体に対応する６０ｐｐｍ以下のピークのみが観測され、本条件では、チオリン酸上のシアノエチル基が完全に脱落することが明らかとなった。また、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳでの分析により、脱シリルの完結も確認された。【０２１２】
実施例６：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシシチジン−３’−イル−［Ｏ−（２−シアノエチル）］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡ）の合成
（１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈ）の合成【０２１３】
【化５５】
2017111137.tif 000056
【０２１４】
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物に実施例１８と同様の脱シリル化操作を施して、ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z: calcd 1085.58, found 1085.59 [M-2H]2-【０２１５】
（２）モノイミダゾリダイトとＮ−メチルモルホリンを用いたホスフィチル化【０２１６】
【化５６】
2017111137.tif 000057
【０２１７】
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（９６０μＬ，３．０２ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（６．６ｍＬ）に溶解し、モレキュラシーブ３Ａの粉末（０．１０ｇ）により３０分脱水した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過し５．２５ｍＬを乾燥したねじ口瓶に分取した。このトルエン溶液に、４，５−ジシアノイミダゾール（０．６１６ｇ，５．２１ｍｍｏｌ）を添加して３０分撹拌した後に、０．４５μｍのメンブレンフィルターにより濾過して、溶液１．５ｍＬを分取した。Ｎ−メチルモルホリン（０．６６ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ，ｐＫａ＝７．３８）及び（１）で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈ（０．４５５ｇ，０．２００ｍｍｏｌ）を１０℃で添加して懸濁液とした。同温度で脱水ジクロロメタン（３．０ｍＬ）を添加して均一溶液とした後、２時間撹拌した。反応の終了をＬＣ／ＭＳにより確認し、２，４，６−トリメチルピリジンで反応を停止した。反応液を０℃に冷却して、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を添加し、生成物を析出させた。桐山ロートでろ過・洗浄し、真空乾燥によりＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡ（０．４６５ｇ，０．１８７ｍｍｏｌ，９３．８％）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ分析の結果、チオリン酸上の脱シアノエチル化は確認されなかったが、反応中に副生したジシアノイミダゾールによって生成物が活性化を受けたことに起因すると考えられるＨ−ホスホネートジエステルが目的物に対して５％検出された。生成物のＴＨＦ溶液をＤＢＵにて脱シアノエチル化したサンプルのＬＣ／ＭＳ分析では、アミダイト部位の酸化体として検出された。
LC/MS m/z:calcd 1167.12,found 1167.12 [M-2H]2-【０２１８】
（３）モノイミダゾリダイトとコリジンを用いたホスフィチル化
ホスフィチル化時に添加する塩基をＮ−メチルモルホリンから同じ当量数の２，４，６−トリメチルピリジンに変更した以外は（２）と同じ混合比・手順にて０．０６７ｍｍｏｌの基質に対してホスフィチル化を行った。収率９２．８％。３１Ｐ  ＮＭＲ分析の結果、チオリン酸上の脱シアノエチル化は確認されなかったが、反応中に副生したジシアノイミダゾールによって生成物が活性化を受けたことに起因すると考えられるＨ−ホスホネートジエステルが目的物に対して６％検出された。【０２１９】
（４）モノイミダゾリダイトとピリジンを用いたホスフィチル化
ホスフィチル化時に添加する塩基をＮ−メチルモルホリンから同じ当量数のピリジン（ｐＫａ＝５．１７）に変更した以外は（２）と同じ混合比・手順にて０．０６７ｍｍｏｌの基質に対してホスフィチル化を行った。収率９２．８％。３１Ｐ  ＮＭＲ分析の結果、チオリン酸上の脱シアノエチル化は確認されなかったが、反応中に副生したジシアノイミダゾールによって生成物が活性化を受けたことに起因すると考えられるＨ−ホスホネートジエステルが顕著に生成し、生成比は
目的物：Ｈ−ホスホネートジエステル＝１：１．０５
であった。【０２２０】
（５）モノイミダゾリダイトと１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンを用いたホスフィチル化
ホスフィチル化時に添加する塩基をＮ−メチルモルホリンから同じ当量数の１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ｐＫａ＝８．８２）に変更した以外は（２）と同じ混合比・手順にて０．０６７ｍｍｏｌの基質に対してホスフィチル化を行った。収率９６．７％。３１Ｐ  ＮＭＲ分析の結果、チオリン酸上のシアノエチル保護基の８６％が脱落していることが明らかとなった。また、目的のアミダイトに対して加水分解体であるＨ−ホスホネートジエステルが９％生成していた。【０２２１】
（６）モノイミダゾリダイトとジアミダイトとＮ−メチルモルホリンを用いたホスフィチル化
２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．４３ｍＬ，４．５ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（９．８ｍＬ）に溶解し、モレキュラシーブ３Ａの粉末（０．５ｇ）により３０分脱水した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過した。このトルエン溶液に、４，５−ジシアノイミダゾール（０．８８６ｇ，７．５ｍｍｏｌ）を添加して３０分撹拌した後に、０．４５μｍのメンブレンフィルターにより濾過して固体を除いた。この反応液に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．２３８ｍＬ，０．７５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．８２６ｍＬ，７．５０ｍｍｏｌ）及び（１）で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈ（０．５３２ｇ，０．２３３ｍｍｏｌ）を１０℃で添加して懸濁液とした。同温度で脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）を添加して均一溶液とした後、２時間撹拌した。反応の終了をＬＣ／ＭＳにより確認し、２，４，６−トリメチルピリジンで反応を停止した。反応液を０℃に冷却して、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を添加し、生成物を析出させた。桐山ロートでろ過・洗浄し、真空乾燥によりＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡ（０．５２５ｇ，０．２０４ｍｍｏｌ，９４．４％）を得た。収量０．５３０ｇ（２．１４ｍｍｏｌ，９１．６％収率）。３１Ｐ  ＮＭＲ分析の結果、チオリン酸上の脱シアノエチル化は確認されなかった。生成物のＴＨＦ溶液をＤＢＵにて脱シアノエチル化したサンプルのＬＣ／ＭＳ分析では、アミダイト部位の酸化体として検出された。
LC/MS m/z:calcd 1167.12,found 1167.12 [M-2H]2-【０２２２】
実施例７：ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡとＨＯ−ｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢの縮合によるＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢの合成【０２２３】
【化５７】
2017111137.tif 000058
【０２２４】
実施例６−（５）と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡ（０．１４９ｇ，０．０６０１ｍｍｏｌ）と調製例１−（３）と同様に得たｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（０．１０４ｇ，０．０４９７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍＬ）に溶解し、モレキュラシーブ３Ａ（０．２２９ｇ）で脱水した。この溶液４．５ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過した。ろ過した溶液に５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（２１．８ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ）を添加して室温で１時間３０分撹拌した。縮合の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した後、ピリジン（４８．５μＬ，０．６００ｍｍｏｌ）、次いで３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（１６．４ｍｇ，０．０７９９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液にメタノール（２０ｍＬ）を添加して目的物を析出させ、桐山ロートでろ過・洗浄し、目的物を含む固体（０．２２２ｇ）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1412.72,found 1412.71 [M-2H]2-【０２２５】
実施例８：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ジイソプロピルフェニルシリル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ）の合成
（１）ジイソプロピルフェニルシランの調製
−７８℃に冷却した脱水テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）にフェニルリチウム（１．６Ｍジブチルエーテル溶液，２０．５ｍＬ，３２．８ｍｍｏｌ）を溶解した。溶液を同温度で撹拌しながら、ここにジイソプロピルクロロシラン（５．２０ｍＬ，３０．４ｍｍｏｌ）を６分間かけて滴下すると濃褐色となった。反応液を同温度で３０分間撹拌すると、淡褐色となった。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を添加した後、室温まで昇温し、水層と有機層を分離した。水層をジクロロメタン（２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水、続いて飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧下、留去することで目的のジイソプロピルフェニルシランを含む淡褐色の油状液体１４．９ｇを得た。これを精製すること無く次のステップに用いた。【０２２６】
（２）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジンの合成【０２２７】
【化５８】
2017111137.tif 000059
【０２２８】
（１）で得たジイソプロピルフェニルシランを含む油状液体を乾燥ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、ここに加熱下で活性化したモレキュラシーブ３Ａ（０．５ｇ）を添加して脱水後、溶液をろ過した。更にジクロロメタン（２８２ｍＬ）を添加した。溶液に１，３−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントイン（９．５４ｇ，４８．４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌した。ここにイミダゾール（７．２０ｇ，１０６ｍｍｏｌ）、続いて、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン（１３．０ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）を添加して５０分間、室温で撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を添加してクエンチした後、分液した。有機層を水、続いて飽和食塩水で洗浄後、更に炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水の後、減圧下、溶媒を留去して、褐色の固体を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１〜１：１）で精製し、目的の５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（９．８０ｇ，１３．３ｍｍｏｌ，５５．９％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.95-1.02 (m, 12 H, 2CH(CH3)2 ), 1.18-1.24 (m, 2H, 2CH(CH3)2), 1.46 (d, J = 0.8 Hz, 3H, CH3(thymidine)), 2.23 (ddd, J = 13.4, 8.0, 5.6 Hz, 1H, 2’-CHH), 2.44 (ddd, J = 13.4, 6.0, 2.0 Hz, 1H, 2’-CHH), 3.24 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.44 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 2H, 5’-CHH), 3.78 (s, 6H, 2(-OCH3)), 4.09-4.15 (m, 2H), 4.64 (m, 1H, 3’-CH), 6.47 (dd, J = 8.0, 5.6 Hz, 1H , 1’-CH), 6.80 (dd, J = 8.8, 4.4 Hz, 4H, 3,3’,5,5’-CH of DMTr), 71.5-7.40 (m, 11H), 7.46 (d, J =6.8 Hz, 2H, 2,6-CH of Si-Ph), 7.63 (s, 1H, 6-CH (thymidine)), 8.40(brs, 1H, 3-NH).【０２２９】
（３）３，４，５−トリスオクタデシルオキシ安息香酸塩化物の調製【０２３０】
【化５９】
2017111137.tif 000060
【０２３１】
３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸（１４．４ｇ，１５．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５４．２ｍＬ）中に懸濁しスラリーとした。ここに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを２滴と塩化チオニル２．２５ｍＬ（３１．０ｍｍｏｌ）を添加し３５℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した。得られた淡黄色の固体を脱水トルエンに溶解、過剰の塩化チオニルと共に減圧下留去する操作を２回繰り返した後、固体を減圧下乾燥して目的の３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸塩化物を定量的に得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.879 (t, J = 6.6 Hz, 9H, CH3), 1.2-1.9 (m, 96 H, CH2), 4.01 (t, J = 6.4 ppm, 4H, 3,5-OCH2), 4.07 (t, J = 6.4 Hz, 2H, 4-OCH2), 7.32 (s, 2H, Ar).【０２３２】
（４）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ジイソプロピルフェニルシリル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−デオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ）の合成【０２３３】
【化６０】
2017111137.tif 000061
【０２３４】
（２）で得た５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（５．１４ｇ，６．９９ｍｍｏｌ）、（３）で得た３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸塩化物（９．９７ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３．６２ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（６５．０ｍＬ）に溶解して、６５℃で４時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣにより確認した後、ピリジンを留去し、固体をアセトニトリル中スラリー洗浄・ろ過した。固体をジクロロメタン中に懸濁し、濾過した。回収したジクロロメタン溶液を濃縮し、淡褐色の固体を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ（９．５２ｇ，５．７９ｍｍｏｌ，８２．７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.878 (t, J = 7.2 Hz, 9H, octadecyl-CH3), 0.94-1.00 (m, 12 H, SiCH(CH3)2), 1.19-1.85 (m, 101 H, octadecyl-CH2 , thymine-CH3 and SiCH(CH3)2), 2.22-2.29 (m, 1H, 2’-CHH), 2.46-2.53 (m, 1H, 2’-CHH), 3.27 (dd, J = 10.8, 2.4 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.47 (dd, J = 10.8, 2.4 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.79 (s, 6H, OCH3 of DMTr), 3.98 (t, J = 6.4 Hz, 4H, 3,5-OCH2(CH2)16CH3), 4.03 (t, J = 6.4 Hz, 2H, 4- OCH2(CH2)16CH3), 4.17 (m, 1H, 4’-H), 4.64 (m, 1H, 3’-H ), 6.46 (dd, J = 5.6, 8.0 Hz, 1H, 1’-H), 6.79-6.83 (m, 4H, 3,3’,5,5’-H of DMTr), 7.14 (s, 2H, 2,6-H of substituted benzoate), 7.2-7.5 (m, 14 H, Ar), 7.75 (s, 1H, 6-H of thymidine).【０２３５】
実施例９：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳ）の合成
（１）：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳ）の合成【０２３６】
【化６１】
2017111137.tif 000062
【０２３７】
実施例８と同様に得たＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ（１．４９ｇ，０．９０３ｍｍｏｌ）と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテート（１．３８ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）及びインドール（１．３７ｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、ここにトリフルオロ酢酸（０．１０３ｍＬ，１．３４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィーにより脱ジメトキシトリチル化を確認した。反応液に１−メチルイミダゾール（０．１１２ｍＬ，１．４２ｍｍｏｌ）を添加して中和した。ここに、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−［（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（２．０４ｇ，２．４３ｍｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（０．４２２ｇ，３．５７ｍｍｏｌ）の脱水アセトニトリル溶液（１２．５ｍＬ）を添加して室温で１時間３０分撹拌し、カップリング反応の完結を薄層クロマトグラフィーにより確認した。３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．５４０ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）を添加して室温で１０分間撹拌してホスファイト中間体を硫化した。続いて、無水酢酸（８０．１μＬ）、２，４，６−トリメチルピリジン（１１９μＬ）、１−メチルイミダゾール（７１．２μＬ）を添加して室温で３０分撹拌した。反応液に、室温でアセトニトリル（２００ｍＬ）を添加して目的化合物と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートを析出させた後、桐山ロートを用いてろ過・洗浄（アセトニトリル）した。得られた固体を乾燥して、ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳを定量的に得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 2057.26,found 1185.64 [M-2H]2-【０２３８】
（２）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳ）の合成【０２３９】
【化６２】
2017111137.tif 000063
【０２４０】
（１）で得た、ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳ（０．９０３ｍｍｏｌ）と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物およびインドール（１．４２ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（５０．０ｍＬ）に溶解した。ここにトリフルオロ酢酸（１０６μＬ，１．３９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。脱ジメトキシトリチル化の完了をＬＣ／ＭＳにより確認し、１−メチルイミダゾール（１１６μＬ，１．４６ｍｍｏｌ）で中和した。反応液に、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（２．００ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（０．４７９ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）の脱水アセトニトリル（１２．５ｍＬ）溶液を添加して室温で１時間３０分撹拌し、カップリング反応完結をＬＣ／ＭＳにより確認した。続いて、３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．６１２ｇ，２．９８ｍｍｏｌ）を添加して１０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液に無水酢酸（８７．６μＬ，０．９２７ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（１２３μＬ，０．９２７  ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール（７３．３μＬ，０．９２７ｍｍｏｌ）を添加して１０分間撹拌した。反応液にアセトニトリル（２００ｍＬ）を添加してオリゴ核酸トリマーと２，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を析出させた。懸濁液をろ過・洗浄した後、目的の核酸トリマーと３，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物３．５６ｇ（うち、核酸２．２１ｇ，０．８８７ｍｍｏｌ，９５．７％収率）を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1188.14,found 1188.14 [M-2H]2-【０２４１】
（３）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号１）−ＤＩＰＰＳ）の合成【０２４２】
【化６３】
2017111137.tif 000064
【０２４３】
（２）で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳから、（２）と同様に、所望の配列に対応するヌクレオシドアミダイトを順次用いて伸長を実施した。ヌクレオシドアミダイトとしては以下を用いた。【０２４４】
ｄＣＢｚ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＧｉＢｕ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＴ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
各ステップの収率を以下に示す。【０２４５】
【表１】
2017111137.tif 000065
【０２４６】
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1030.72,found 1030.72 [M-5H]5-【０２４７】
実施例１０：  ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号１）−Ｈ）の合成（脱シリル化）【０２４８】
【化６４】
2017111137.tif 000066
【０２４９】
実施例９で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物（１．６９ｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．２０ｍＬ）に溶解し１０℃に冷却した。ここに、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．１７４ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）、ピリジン（１７５μＬ，２．１６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１４．４ｍＬ）溶液を添加した。反応液を１０℃で２４時間撹拌し、脱シリル化の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した。反応液にアセトニトリル（１００ｍＬ）を添加して、目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＯＨと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を析出させた。固体を桐山ロートによるろ過で取得し、アセトニトリルによる洗浄の後、真空乾燥し白色固体１．４６ｇ（うち、オリゴ核酸は１．１４ｇ，０．２０９ｍｍｏｌ，８７．５％収率）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。ＨＰＬＣによる分析では、目的化合物の以降の保持時間に短鎖のピークが見られ、目的化合物ピークの面積比は９４．０％であった。
LC/MS m/z:calcd 1655.16,found 1655.14 [M-3H]3-【０２５０】
実施例１１：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］チミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号１）−ＰＡ）の合成【０２５１】
【化６５】
2017111137.tif 000067
【０２５２】
２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．９７１ｍＬ，３．０６ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（６．６８ｍＬ）に溶解し、モレキュラシーブ３Ａの粉末により３０分脱水し、０．４５μｍのメンブレンフィルターにより溶液３．１８ｍＬをろ別した。このトルエン溶液に、４，５−ジシアノイミダゾール（０．８８６ｇ，７．５ｍｍｏｌ）を添加して３０分撹拌した後に、０．４５μｍのメンブレンフィルターにより濾過して溶液１．２８ｍＬを取得した。この反応液に２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１６２ｍＬ，０．５１０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．５７２ｍＬ，５．１０ｍｍｏｌ）及び実施例１０で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物（１．１８ｇ）を１５℃で添加して懸濁液とした。同温度で脱水ジクロロメタン（１６．０ｍＬ）を添加して均一溶液とした後、６時間撹拌した。反応の終了をＬＣ／ＭＳにより確認し、２，４，６−トリメチルピリジンで反応を停止した。反応液を０℃に冷却して、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を添加し、生成物と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートを析出させた。桐山ロートでろ過・洗浄し、真空乾燥によりＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物１．１３ｇ（うち、オリゴ核酸は０．８８８ｇ，０．１５７１ｍｍｏｌ，  ９２．４％収率）を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1709.52,found 1709.52 [M-5H]5-【０２５３】
調製例１：Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート（Ｈ−ｄ［ＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］（配列番号２）−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成
（１）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０２５４】
【化６６】
2017111137.tif 000068
【０２５５】
５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−イル［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート（１．５１ｇ，０．９７７ｍｍｏｌ）、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテート（１．４９ｇ，１．５６ｍｍｏｌ）およびインドール（１．５０ｇ，１２．７ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（３８．９ｍＬ）に溶解した。ここにトリフルオロ酢酸（１１２μＬ，１．４６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。脱ジメトキシトリチル基の完了を薄層クロマトグラフィーにより確認し、１−メチルイミダゾール（１２２μＬ，１．５４ｍｍｏｌ）で中和した。反応液に、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（２．００ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（０．４７６ｇ，４．０３ｍｍｏｌ）の脱水アセトニトリル（９．７ｍＬ）溶液を添加して室温で２時間撹拌した。続いて、３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．５８２ｇ，２．８３ｍｍｏｌ）を添加して１０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液に無水酢酸（９２．１μＬ，０．９７４ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（１２９μＬ，０．９７４ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール（７７．１μＬ，０．９７４ｍｍｏｌ）を添加して１０分間撹拌した。反応液にアセトニトリル（２００ｍＬ）を添加してオリゴ核酸ダイマーと２，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を析出させた。懸濁液をろ過・洗浄した後、目的の核酸ダイマーと３，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物３．２４ｇ（うち、核酸１．８０ｇ，０．９４３ｍｍｏｌ，９６．９％収率）を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/ESI TOF MS:calcd 1858.13,found 1858.13 [M-H]-【０２５６】
（２）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（ＤＭＴｒ−ｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０２５７】
【化６７】
2017111137.tif 000069
【０２５８】
（１）で得た、ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（０．９７７ｍｍｏｌ）と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物およびインドール（１．４４ｇ，１２．２ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（３８．９ｍＬ）に溶解した。ここにトリフルオロ酢酸（１０８μＬ，１．４２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。脱ジメトキシトリチル基の完了をＬＣ／ＭＳにより確認し、１−メチルイミダゾール（１１８μＬ，１．４９ｍｍｏｌ）で中和した。反応液に、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（２．５３ｇ，２．９５ｍｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（０．５２６ｇ，４．０３ｍｍｏｌ）の脱水アセトニトリル（１０．０ｍＬ）溶液を添加して室温で２時間撹拌した。続いて、３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．６３８ｇ，３．１１ｍｍｏｌ）を添加して１０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液に無水酢酸（８９．２μＬ，０．９４３ｍｍｏｌ）、２，４，６−トリメチルピリジン（１２５μＬ，０．９４３ｍｍｏｌ）、１−メチルイミダゾール（７４．７μＬ，０．９４３ｍｍｏｌ）を添加して１０分間撹拌した。反応液にアセトニトリル（２００ｍＬ）を添加してオリゴ核酸トリマーと２，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を析出させた。懸濁液をろ過・洗浄した後、目的の核酸トリマーと３，４，６−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物３．５９ｇ（うち、核酸１．２０ｇ，０．９１６ｍｍｏｌ，９７．１％収率）を得た。サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1145.09,found 1145.09[M-2H]2-【０２５９】
（３）Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン−３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（ｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成（脱ＤＭＴｒ化）【０２６０】
【化６８】
2017111137.tif 000070
【０２６１】
（２）で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（２．４９ｇ，１．００ｍｏｌ）と５−メトキシインドールを脱水ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。ここに、トリフルオロ酢酸（７６．５μＬ，１．００ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて２時間撹拌した。脱ジメトキシトリチル化の完結をＬＣ／ＴＯＦ  ＭＳにより確認し、２，４，６−トリメチルピリジン（２６５μＬ，２．００ｍｍｏｌ）を添加した。アセトニトリル（２５０ｍＬ）を添加して、目的物を沈殿させた。スラリーを桐山ロートにてろ過・洗浄の後、真空乾燥により目的化合物（２．１０ｇ，０．９９９ｍｍｏｌ，９９．５％）を白色固体として得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/ MS: calcd 1989.06, found 1989.09 [M-H]-【０２６２】
（４）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン−３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］（配列番号２）−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０２６３】
【化６９】
2017111137.tif 000071
【０２６４】
（３）で取得したｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物から、（１）と同様の操作を繰り返して、所望の配列に対応するヌクレオシドアミダイトを順次用いて伸長を実施した。ヌクレオシドアミダイトとしては以下を用いた。
ｄＡＢｚ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＣＢｚ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＧｉＢｕ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＴ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
各ステップの収率を以下に示す。【０２６５】
【表２】
2017111137.tif 000072
【０２６６】
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1280.64,found 1280.66[M-4H]4-【０２６７】
（５）Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−デオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（Ｈ−ｄ［ＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］（配列番号２）−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成（脱ＤＭＴｒ化）【０２６８】
【化７０】
2017111137.tif 000073
【０２６９】
（４）で得た、ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］（配列番号２）−ｓｕｃ−ＴＯＢと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物４．５１ｇ（うちオリゴ核酸３．５３ｇ，０．６３１ｍｍｏｌ）、インドール（０．９７１ｇ，８．２９ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（３１．２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２１７μＬ，２．８４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、ＬＣ／ＴＯＦ  ＭＳにより脱ジメトキシトリチル化の完結を確認した。１−メチルイミダゾール（２３６μＬ，２．９８ｍｍｏｌ）により中和の後、アセトニトリル（２００ｍＬ）を添加して、目的化合物と３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートを析出させた。桐山ロートによりろ過、洗浄した後、真空乾燥で白色固体４．１９ｇ（うちオリゴ核酸３．２５ｇ，０．６１４ｍｍｏｌ，９７．５％  ｙｉｅｌｄ）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、１，８−ｄｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ  （以下ＤＢＵ）でリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1205.11,found 1205.13 [M-4H]4-【０２７０】
実施例１２：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］チミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン−３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート  （ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］（配列番号３）−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０２７１】
【化７１】
2017111137.tif 000074
【０２７２】
実施例１１で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物（０．０８６２ｇ，０．１２１ｍｍｏｌ）と調製例１で取得したＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡＢｚＣＢｚＡＢｚＴＧｉＢｕＣＢｚＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６１の混合物（０．０６７８ｇ，０．０１００ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、モレキュラシーブ３Ａ（０．０５８８ｇ）で脱水した。この溶液、０．６ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過し、乾燥した５φ  ＮＭＲチューブに取得した。溶液に５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（２．８８ｍｇ，０．０１４９ｍｍｏｌ）を添加して室温で３時間撹拌した。縮合の完結を３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲにより確認した後、ピリジン（９．７μＬ，０．１２ｍｍｏｌ）、次いで３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（２．８２ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液にメタノール（４ｍＬ）を添加して目的物を析出させ、桐山ロートでろ過・洗浄し、真空乾燥させ、カップリング生成物の白色固体（０．０９３１ｇ）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 1095.76,found 1095.66 [M-5H]5-【０２７３】
実施例１３：  ５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ）の合成
（１）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄＴ−ＴＢＤＭＳ）の合成【０２７４】
【化７２】
2017111137.tif 000075
【０２７５】
５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン（３．２４ｇ，５．９５ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１．０３ｇ，１５．１ｍｍｏｌ）を脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２ｍＬ）に溶解した。ここにｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．３５ｇ，８．９５ｍｍｏｌ）を添加して、アルゴン下、４５℃にて１．５時間撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を添加して撹拌した。分液の後、水層を１０ｍＬのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機層を水１０ｍＬ×２回、続いて飽和食塩水１０ｍＬで洗浄した。ジクロロメタン溶液を無水硫酸ナトリウムにより脱水の後、ろ過し、減圧下で濃縮下。得られた微黄色透明のオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１〜３：２）にて精製し、目的のＤＭＴｒ−ｄＴ−ＴＢＤＭＳを白色固体３．２９ｇ（４．９ｍｍｏｌ，８４．０％）として得た。【０２７６】
（２）５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］チミジン（ＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ）の合成【０２７７】
【化７３】
2017111137.tif 000076
【０２７８】
（１）にて取得したＤＭＴｒ−ｄＴ−ＴＢＭＤＳ（３．２８ｇ，４．９８ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（４５ｍＬ）に溶解した。ここに３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸塩化物（６．９１ｇ，７．３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３．９ｍＬ，２２．４ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃にて６時間撹拌した。反応液を室温まで冷却後、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を添加し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水した。ジクロロメタン−ピリジン溶液を減圧下濃縮した。得られた褐色の固体にジクロロメタン（３０ｍＬ）を添加し、ろ過した。溶分を再度濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：テトラヒドロフラン＝１４：１〜７：１）にて精製し目的のＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳ（２．２１ｇ，１．４１ｍｍｏｌ，２８．３％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: -0.03 (s, 3H, SitBu(CH3)(CH3)), 0.02 (s, 3H, SitBu(CH3)(CH3)), 0.82 (s, 9H, SitBu(CH3)(CH3)), 0.85-0.91(t, J = 6.8 Hz, 9H, octadecyl-CH3), 1.18-1.47 (m, 90H, OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.52 (d, J = 0.6 Hz, 3H, thymine 5-CH3), 1.72 (quint, J =6.8 Hz, 2H, 4-OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.78 (quint, J =6.8 Hz, 4H, 3,5-OCH2CH2(CH2)15CH3), 2,24 (ddd, J = 13.6, 6.8, 6.8 Hz, 1H, 2’-CHH), 2.36 (ddd, J = 13.6, 5.8, 3.2 Hz, 1H, 2’-CHH), 3.30 (dd, J = 10.7, 3.6 Hz, 1H, 5’-CHH); 3.49 (dd, J = 10.7, 2.6 Hz, 1H), 3.80 (two singlets, 6H, 4,4’-OMe), 3.98 (t, J
= 6.5 Hz, 4H, 3,5-OCH2CH2(CH2)15CH3), 4.04 (t, J = 6.5 Hz, 2H, 3,5-OCH2CH2(CH2)15CH3), 3.95-4.05 (probably m, 1H), 4.51 (m, 1H), 6.33 (m, 1H), 6.84 (d, 1.2 Hz, 2H), 6.84-6.87 (m,4H), 7.13 (s, 2H); 7.24-7.271 (m, 1H), 7.28-7.33(m, 6H), 7.41 (d, J = 7.2 Hz, 2H); 7.76 (s, 1H).【０２７９】
実施例１４：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ３−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシチミジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号１）−ＴＢＤＭＳ）の合成
実施例１３で得たＤＭＴｒ−ｄＴＣＯ−ＴＯＰ−ＴＢＤＭＳを実施例９と同様の伸長に付すことで目的の１０ｍｅｒを得た。
各ステップの収率を以下に示す。【０２８０】
【表３】
2017111137.tif 000077
【０２８１】
実施例１５：ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳの脱シリル化
（１）実施例１０と同一フッ化物イオン濃度、昇温条件での脱シリル化【０２８２】
【化７４】
2017111137.tif 000078
【０２８３】
実施例１４で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物（０．１４１ｇ，０．０１９９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．６ｍＬ）に溶解し２０℃に冷却した。ここに、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１６．７μＬ，０．１００ｍｍｏｌ）、ピリジン（３２．３μＬ，０．４０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．２ｍＬ）溶液を添加・混合した。反応液を２０℃で２４時間進行させた所、脱シリル化は未完であった。【０２８４】
（２）フッ化物イオン濃度を向上させた条件
実施例１４で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートのモル比１．００：１．６０の混合物（０．３５０ｇ，０．０４９３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し２０℃に冷却した。ここに、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．１６７ｍＬ，１．００ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．３２４ｍＬ，４．０１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３．０ｍＬ）溶液を添加した。反応液を２０℃で２４時間撹拌した、脱シリル化の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した。反応液にアセトニトリル（１８ｍＬ）を添加して、目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＴＣＯ−ＴＯＰ］−ＯＨと３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアセテートの混合物を析出させた。固体を桐山ロートによるろ過で取得し、アセトニトリルによる洗浄の後、真空乾燥し白色固体０．２１６ｇ（うち、オリゴ核酸は０．１６８ｇ，０．３１０ｍｍｏｌ，６２．８％収率）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。ＨＰＬＣによる分析では、目的化合物の以降の保持時間に短鎖のピークが見られ、目的化合物ピークの面積比は６２．０％であった。【０２８５】
実施例１６：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニル−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄＣｓｕｃ−ＴＯＢ−ＴＢＤＭＳ）の合成【０２８６】
【化７５】
2017111137.tif 000079
【０２８７】
３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート・トリエチルアンモニウム塩（１．１１ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を脱水クロロホルム３．３ｍＬに溶解した。ここに、ジイソプロピルエチルアミン（０．５１２ｍＬ,３．００ｍｍｏｌ）を添加した後、０℃で２−（１Ｈベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．７５９ｇ，２．００ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温にて３０分撹拌した後、３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン（０．９６６ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）を転化して、４０℃にて１７時間撹拌した。反応の終了を薄層クロマトグラフィーで確認した後、室温に冷却した。反応液にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加して目的物を析出させて濾過した。得られたケーキを５ｍＬのアセトニトリルで洗浄したのち真空乾燥して１．６４ｇ（１．００ｍｍｏｌ，１００％）の目的物を取得した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: -0.06 (s, 3H, Si-CH3), 0.00 (s, 3H, Si-CH3), 0.81 (s, 9H, tBu), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H , OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.2-1.5 (m, 90H, OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.73 (quint, J = 8.0 Hz, 2H, 4- OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.78 (quint, J = 8.0 Hz, 4H, 2,5- OCH2CH2(CH2)15CH3), 2.19 (ddd, J = 13.6, 6.0, 4.4 Hz, 2’-CHH), 2.55 (ddd, J = 13.6, 6.4, 6.4, 2’-CHH), 2.68-2.75 (m, 4H, -COCH2CH2CO-), 3.32 (dd, J = 10.8, 3.2 Hz, 1 H, 5’-CHH), 3.52 (dd, J =10.8, 2.8 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.79 (s, 6H, OCH3 of DMTr), 3.91-3.97 (m, 4H,-OCH2(CH2)16CH3), 4.00 (ddd, J =5.6, 3.2, 2.8 Hz, 1H, 4’-H) ,4.42 (ddd, J = 6.4, 6.0, 5.6 Hz, 1H, 3’-H), 5.02 (s, 2H, suc-OCH2Ar), 6.22 (dd, J =6.4, 4.4 Hz, 1H, 1’-H), 6.54 (s, 2H, 2,6-H of tri(octadecyloxy)phenyl), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H, 3,5-H of methoxyphenyl), 7.06 (d, 7.2 Hz, 1H, 6H of cytosine), 7.20-7.30 (m, 7H, Ar), 7.38 (d, J =7.2 Hz, 2H, 2,6-of phenyl), 8.19 (brs, 1H, N-H), 8.37 (d, J = 7.2 Hz, 5-H of cytosine).【０２８８】
実施例１７：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニル−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＤＭＳ）の合成
（１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニル−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＭＤＳ）の合成【０２８９】
【化７６】
2017111137.tif 000080
【０２９０】
アルゴン雰囲気下、実施例１６で取得したＤＭＴｒ−ｄＣｓｕｃ−ＴＯＢ−ＴＢＤＭＳ（８２０ｍｇ，０．５００ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２３ｍＬ）に溶解し、５−メトキシインドール（１．４７ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（５５．７μＬ，０．７５０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌し、反応の完結をＵＰＬＣにより確認した。反応混合液を２，４，６，−トリメチルピリジンで中和した後、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（１．８８ｇ，２．２４ｍｍｏｌ）、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（０．４３２ｇ，２．２５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．００ｍＬ）溶液を添加して、室温で２時間撹拌した。３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．６２０ｇ，３．０２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４５分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。室温でアセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加して目的化合物を析出させた。反応液を桐山ロートを用いてろ過した後、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥により目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＭＤＳ（１．００ｇ，０．４７１ｍｍｏｌ，９４％）を白色固体として得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z: calcd 2052.26, found 2052.26 [M-H]-【０２９１】
（２）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニル−３’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＤＭＳ）の合成【０２９２】
【化７７】
2017111137.tif 000081
【０２９３】
アルゴン雰囲気下、（１）で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＭＤＳ（９７４ｍｇ，０．４５８ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン２３ｍＬに溶解し、５−メトキシインドール（１．４７ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（４７．６μＬ，０．７５０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌し、反応の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した。反応混合液に２，４，６，−トリメチルピリジン（３２５μＬ，２．４５ｍｍｏｌ）を添加して中和した後、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−チミジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイト（１．０２ｇ，１．３７ｍｍｏｌ）、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール０．２６４ｇ（１．３７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．００ｍＬ）溶液を添加して、室温で２時間撹拌した。反応の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した後、３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン０．３１１ｇ（１．５１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４５分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。室温でアセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加して目的化合物を析出させた。反応液を桐山ロートを用いてろ過した後、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥により目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＤＭＳ（１．０５ｇ，０．４１９ｍｍｏｌ，９２％）を白色固体として得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z: calcd 1185.64, found 1185.64 [M-2H]2-【０２９４】
実施例１８−１：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−Ｈ）の合成（脱シリル化）【０２９５】
【化７８】
2017111137.tif 000082
【０２９６】
実施例１７で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＴＢＤＭＳ（０．７４８ｇ，０．３０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン９．０ｍＬに溶解し１５℃に冷却した。ここに、トリエチルアミン三フッ化水素塩（８７５ｍｇ，５．４２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．７５ｍＬ，２２．１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１８．０ｍＬ）溶液を添加し、１５℃で３０時間撹拌した。反応液にアセトニトリル（１０８ｍＬ）を添加して析出させた後、桐山ロートにてろ過・洗浄し、真空乾燥により目的のＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−Ｈ（０．６８６ｇ，２．２９ｍｍｏｌ，９６．６％）を取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z: calcd 2258.20, found 2258.21 [M-H]-【０２９７】
実施例１８−２：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニルデオキシシチジン−３’−イル−［Ｏ−（２−シアノエチル）］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＰＡ）の合成
実施例１８−１で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］を実施例６−（５）と同様にしてホスフィチル化して、ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＰＡを得た。【０２９８】
実施例１９：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニルデオキシシチジン−３’−イル−［Ｏ−（２−シアノエチル）］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＰＡ）とＮ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン−３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネートの縮合による５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシニルデオキシシチジン−３’−イル−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン−３’−イル−３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルスクシネート（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０２９９】
【化７９】
2017111137.tif 000083
【０３００】
実施例１８−２で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢ］−ＰＡ（０．１５６ｇ，０．０６０６ｍｍｏｌ）と調製例１−（３）で得たｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（０．１０３ｇ，０．４９２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５．０ｍＬに溶解し、モレキュラシーブ３Ａ，０．２２９ｇで脱水した。この溶液、４．５ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過した。ろ過した溶液に５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（２０．５ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）を添加して室温で１時間３０分撹拌した。縮合の完結をＬＣ／ＭＳにより確認した後、ピリジン（４８．５μＬ，０．６００ｍｍｏｌ）、次いで３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（０．３１１ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分撹拌してホスファイト中間体を硫化した。反応液にメタノール（２０ｍＬ）を添加して目的物を析出させ、桐山ロートでろ過・洗浄し、目的物を含む固体０．２２１ｇを取得した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z: calcd 1441.40, found 1441.40 [M-3H]3-【０３０１】
実施例２０：フラグメント縮合により生成した６−ｍｅｒオリゴ核酸ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ及びＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢのアンモニア水中での脱保護の比較【０３０２】
【化８０】
2017111137.tif 000084
【０３０３】
（１）ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣｓｕｃ−ＴＯＢＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢの脱保護
実施例１９の生成物６．０５ｍｇを１．５ｍＬのアンモニア水中に分散させた。分散液を２３℃でマグネチックスターラーで撹拌し、１２時間までは２時間おきに、それ以降は１２時間ごとに反応液をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
実施例１９の生成物は２時間以内に、シアノエチル基、アセチル基、ベンゾイル基、スクシニル基の脱離が完結しており、イソブチリル基の一部が残存していた。イソブチリル基の脱保護は３６時間で完結した。【０３０４】
（２）ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢの脱保護
実施例７の生成物６．０１ｍｇを１．５ｍＬのアンモニア水中に分散させた。分散液を２３℃でマグネチックスターラーで撹拌し、１２時間までは２時間おきに、それ以降は１２時間ごとに反応液をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
実施例７の生成物は２時間の時点でシアノエチル基、アセチル基、ベンゾイル基、スクシニル基の脱離が完結しており、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基、イソブチリル基の一部が残存していた。３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基の一部は１２時間の時点でも残存しており、２４時間において完全な脱離が確認された。イソブチリル基の脱保護は３６時間で完結した。【０３０５】
実施例２１：４，５−ジクロロイミダゾールを用いたジアミダイト活性化とホスフィチル化
（１）４，５−ジクロロイミダゾールの滴定によるｐＫａ決定
４，５−ジクロロイミダゾール（０．２３９６ｇ，１．７４９ｍｍｏｌ）を、煮沸により脱気したイオン交換水に溶解し、５０．０ｍＬ（０．０３５０Ｍ）とした。この溶液２０ｍＬを２５℃で、０．１０Ｍ  ＮａＯＨにより滴定した。
滴定結果の非対数直線化プロット(Benet, L. Z.; Goyan, J. E. J. Pharm. Sci. 1967, 56, 665-680.)によりジクロロイミダゾールの２５℃の水中におけるｐＫａは９．０９と求められた。【０３０６】
（２）４，５−ジクロロイミダゾールを用いたジアミダイト活性化とホスフィチル化
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１２０ｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を乾燥したトルエン：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）溶媒（１．５ｍＬ）に溶解した。ここに４，５−ジクロロイミダゾール（０．１３８ｇ，１．００ｍｍｏｌ）を加えて乾燥アルゴン下、１７時間撹拌し、ホスフィチル化剤を含む溶液を調製した。この溶液全量を０．４５μｍメンブレンフィルターによりろ過した。ろ液にＮ−メチルモルホリン（０．８８１ｍＬ，８．０ｍｍｏｌ）を添加したのち、実施例６−（１）と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈ（０．２２９ｇ，０．１００ｍｍｏｌ）とＭｅＯＣＯＣ６Ｈ２（ＯＣ１８Ｈ３７）３（０．１６２ｇ）からなる混合物およびＮ−メチルイミダゾール（０．０４０ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を１５℃で加えて懸濁液とした。同温度でジクロロメタン（１０．０ｍＬ）を添加して均一溶液とした後４３時間撹拌した。０℃に冷却の上、２，４，６−トリメチルピリジン（０．５３ｍＬ，４．９ｍｍｏｌ）を添加し、アセトニトリル（６０ｍＬ）を添加して生成物を析出させた。桐山ロートによりろ過・洗浄し、真空乾燥によりＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）を含む白色固体（０．３８６ｇ）を得た。３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲによる分析の結果、３’−末端へのアミダイト導入率は５０％であった。インターヌクレオチドのリン酸上の脱シアノエチル化体は観測されなかった。【０３０７】
実施例２２：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−イソプロポキシジイソプロピルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＩＰＯＤＩＰＳ）の合成
（１）イソプロポキシジイソプロピルシランの合成
乾燥アルゴン雰囲気下、イミダゾール（３．２７ｇ，４８．１ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解した。ここに２−プロパノール（３．７０ｍＬ，５２．２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルクロロシラン（４．００ｍＬ，２３．４ｍＬ）を滴下した。この混合液を４０℃で１１時間撹拌した。反応液を室温まで冷却した後に、ヘキサン（４０ｍＬ）を添加し、続いて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）、イオン交換水（２０ｍＬ）を順次添加後、気泡の発生が収まるまで撹拌した。ヘキサン相を分取し、水（４０ｍＬ）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥したのち、ロータリーエバポレーター（１００ｍｍＨｇ，水浴３５℃）にて溶媒を留去しイソプロポキシジイソプロピルシラン（２．６９ｇ）を無色透明の液体として得た。生成物の精製は行わずに次の工程に用いた。【０３０８】
（２）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（イソプロポキシジイソプロピルシリル）デオキシシチジンの合成
（１）で得たイソプロポキシジイソプロピルシラン（１．４０ｇ，８．０１ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（８．０ｍＬ）に溶解し、ここに加熱下で活性化したモレキュラシーブ３Ａ（０．１ｇ）を添加して脱水後、溶液をろ過した。更にジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加した。溶液に１，３−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントイン（１．５８ｇ，８．００ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。ピリジン（０．６５ｍＬ，８．０３ｍｍｏｌ）、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（２．１８ｇ，４．００ｍｍｏｌ）、イミダゾール（２．７４ｇ，４０．２ｍｍｏｌ）を添加して５時間、室温で撹拌した。反応液にチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液（４０ｍＬ）を添加してクエンチした後、分液した。有機層を水、続いて飽和食塩水で洗浄後、更に炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水の後、減圧下、溶媒を留去して表題化合物を含む黄色の固体３．４５ｇを得た。精製は行わずに次工程に用いた。【０３０９】
（３）Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（イソプロポキシジイソプロピルシリル）デオキシシチジンの合成
（２）で得た５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（イソプロポキシジイソプロピルシリル）デオキシシチジンを３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸（１．８５ｇ，２．００ｍｍｏｌ）と共に実施例１−（２）同様の縮合条件に付して表題化合物を含む淡黄色固体２．５７ｇを取得した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１〜３：１）により精製して表題の化合物１．２０ｇ（０．７４４ｍｍｏｌ，３７％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.88 (t, J =6.8 Hz, 9H, O(CH2)17CH3), 0.94-1.00 (m, 12H, SiCH(CH3)2), 1.11 (d, J = 6.4 Hz, 2H, -OCH(CH3)(CH3)), 1.13 (d, J = 6.4 Hz, 2H, -OCH(CH3)(CH3)), 1.20-1.50 (m, 92H, OCH2CH2(CH2)15CH3 and SiCH(CH3)2), 1.74 (quint, J =6.8 Hz, 2H, 4-OCH2CH2(CH)2CH3), 1.85 (quint, J =6.8 Hz, 4H, 3,5-OCH2CH2(CH)15CH3), 2.22 (ddd, J = 13.6, 6.0, 4.8Hz, 1H, 2’-CHH), 2.70 (ddd, J = 13.6, 6.4, 6.4 Hz, 1H, 2’-CHH), 3.35 (dd, J =10.8, 3.6 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.51 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.798 (s, 3H, DMTr 4-OCH3), 3.803 (s, 3H, DMTr 4’-OCH3), 3.99-4.04(m, 6H, 3’-H and OCH2(CH2)16CH3), 4.09 (sep, J = 6.0 Hz, 1H, OCHMe2), 4.65 (ddd, J = 6.4, 6.0, 6.0, 1H, 4’-H), 6.32 (dd, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H, 1’-H), 6.68 (d, J =9.2 Hz, 4H, 3, 3’, 5, 5’-H of p-methoxyphenyl), 7.04 (brs, 2H, 2,6-H of 3,4,5-tris(octadecyloxy)benzoyl), 7.26-7.31(m, 8H, 2,2’,6,6’-H of p-methoxyphenyl, 3,4,5-H of phenyl and 6-H of cytosine), 7.40(d, J =7.2 Hz, 2H, 2,6-H of phenyl), 8.31 (d, J = 7.2 Hz, 1H, 5-H of cytosine), 8.50 (s, 1H, cytosine N-H).【０３１０】
（４）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−イソプロポキシジイソプロピルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＩＰＯＤＩＰＳ）の合成【０３１１】
【化８１】
2017111137.tif 000085
【０３１２】
（３）で得たＮ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（イソプロポキシジイソプロピルシリル）デオキシシチジンを原料として実施例２と同様に伸長した。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ２３４６．３１，  ｆｏｕｎｄ  ２３４６．３０［Ｍ−Ｈ］−【０３１３】
実施例２３：３’−シリル基の脱保護効率の比較
（１）ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＩＰＯＤＩＰＳの脱シリル化
実施例２２で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＩＰＯＤＩＰＳ（０．４９１５ｇ，０．２００ｍｍｏｌ)をジクロロメタン６．０ ｍｌに溶解した。ここに３ＨＦ−ＴＥＡ（１４６ｍｇ，０．９０６ｍｍｏｌ）及びピリジン（１４６μＬ，１．８０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ(１２ｍＬ)溶液を添加し１５℃に保冷した。反応液をサンプリング、ＨＰＬＣにより分析し３’−脱シリル化の進捗を追跡した所、３’−シリル体の半減期は３０分であり、８時間にて３’−シリル体は検出限界以下となった。【０３１４】
（２）ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳの脱シリル化
実施例２と同様に得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＴＢＤＭＳを（１）と同一の脱シリル化条件に付した所、８時間における脱シリル化の進行度は５３％であった。【０３１５】
実施例２４：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−３’−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号４）−ＤＩＰＰＳ）の合成【０３１６】
【化８２】
2017111137.tif 000086
【０３１７】
（１）４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシシチジン（ＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ）の合成【０３１８】
【化８３】
2017111137.tif 000087
【０３１９】
実施例８−（１）、（２）同様にジイソプロピルクロロシランと５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシシチジンから５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ジイソプロピルフェニルシリルデオキシシチジンを調製した。生成物を精製すること無く３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸と実施例１−（２）同様の縮合条件に付すことで表題の化合物を白色固体として得た（３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸使用量に基づく収率４３％）。
１H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.88 (t, J =6.8 Hz, 9H, O(CH2)17CH3), 0.95-1.01 (m, 12H, SiCH(CH3)2), 1.20-1.50 (m, 92H, OCH2CH2(CH2)15CH3 and SiCH(CH3)2), 1.82 (quint, J =6.8 Hz, 2H, 4-OCH2CH2(CH)2CH3), 1.85 (quint, J =6.8 Hz, 4H, 3,5-OCH2CH2(CH)15CH3), 2.18 (ddd, J = 13.6, 6.0, 4.8Hz, 1H, 2’-CHH), 2.76 (m, 1H, 2’-CHH), 3.31 (dd, J =10.8, 3.6 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.50 (dd, J = 10.8, 2.8 Hz, 1H, 5’-CHH), 3.790 (s, 3H, DMTr 4-OCH3), 3.794 (s, 3H, DMTr 4’-OCH3), 3.99-4.07(m, 7H, 3’-H and OCH2(CH2)16CH3), 4.59 (ddd, J = 6.4, 6.0, 6.0, 1H, 4’-H), 6.32 (dd, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H, 1’-H), 6.80-6.83 (d, J =9.2 Hz, 4H, 3, 3’, 5, 5’-H of DMTr), 7.04 (brs, 2H, 2,6-H of 3,4,5-tris(octadecyloxy)benzoyl), 7.22-7.40 (m, 8H, 2,2’,6,6’-H of p-methoxyphenyl, 3,4,5-H of phenyl and 6-H of cytosine), 7.46 (dd, J = 6.4, 2.0 Hz, 2H, 2,6-H of C-phenyl), 8.29 (d, J = 7.2 Hz, 1H, 5-H of cytosine), 8.48 (s, 1H, cytosine N-H).【０３２０】
（２）（１）で得たＤＭＴｒ−ｄＣＣＯ−ＴＯＰ−ＤＩＰＰＳ（１．６３ｇ，１．００ ｍｍｏｌ）に３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチル（１．６５ｇ，１．７５ｍｍｏｌ）を添加した上で、実施例９同様の伸長を施すことで表題の１０残基オリゴ核酸を取得した。【０３２１】
【表４】
2017111137.tif 000088
【０３２２】
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 965.70,found 965.79 [M-5H]5-【０３２３】
実施例２５：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］デオキシチジン（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］（配列番号４）−Ｈ）の合成（脱シリル化）【０３２４】
【化８４】
2017111137.tif 000089
【０３２５】
実施例２４で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＤＩＰＰＳを７６ｗｔ％の含量で含有する３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルとの混合物４．８８ｇ（０．７０ｍｍｏｌ）を実施例１０と同一の脱シリル化条件に２６時間付し、表題の化合物を７５ｗｔ％の含量で含有する３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルとの混合物４．４０ｇ（０．６５０ｍｍｏｌ，９３％収率）を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 927.68,found 927.68 [M-5H]5-【０３２６】
実施例２６：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］シチジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡ）の合成
実施例２５で取得したＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−Ｈ（４．０９ｇ）（含量７５．７１ｗｔ％，０．６０６ｍｍｏｌ）を実施例１１と同様のホスフィチル化条件に付し、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルと共に表題化合物を含量５６ｗｔ％で含有する白色固体（４．１０ｇ）（０．４３０ｍｍｏｌ，７１％収率）を得た。
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。目的物のオリゴヌクレオチド間リン酸上のみで脱シアノエチル化が進行し、３’−末端のホスホロアミダイト上のシアノエチル基は保持され同リンがイオン化条件にて酸化された化学種が主ピークとして観測された。
LC/MS m/z:calcd 970.90,found 970.85 [M-5H]5-【０３２７】
調製例２  Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ジメチルアミノエチリデンデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−（２−ヘキシルデカノイル）デオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ジメチルアミノエチリデンデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−（２−ヘキシルデカノイル）デオキシシチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−Ｎ４−ジメチルアミノエチリデンデオキシアデノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル−デオキシチミジン  ３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート（Ｈ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］（配列番号５）−ｓｕｃ−ＴＯＢ）の合成【０３２８】
【化８５】
2017111137.tif 000090
【０３２９】
５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−イル［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート（１．２４ｇ，０．８０ｍｍｏｌ）、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチル（１．２３ｇ，１．３１ｍｍｏｌ）の混合物から調製例１と同様の伸長・脱ＤＭＴｒ化を行い、表題の化合物を得た。
ヌクレオシドアミダイトとしては以下を用いた。
ｄＡｄｍａ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ジメチルアミノエチリデン−２’−デオキシアデノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＣＨＤ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−（２−ヘキシルデカノイル）−２’−デオキシシチジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＧｉＢｕ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
ｄＴ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
サンプルをテトラヒドロフランに溶解の後、ＤＢＵでリン酸上のシアノエチル保護基を脱落させ、ＬＣ／ＭＳにより目的物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 996.58,found 996.54 [M-5H]5-【０３３０】
実施例２７：１０＋１０フラグメント縮合と脱保護によるによる５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシチミジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシグアノシン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシグアノシン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシグアノシン  ３’−［ホスホロチオニルデオキシアデノシン  ３’−［ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシアデノシン  ３’−ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシグアノシン  ３’−ホスホロチオニルデオキシシチジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシアデノシン  ３’−ホスホロチオニルデオキシチミジン  ３’−ホスホロチオニルデオキシチミジン  （ＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＴＴ］（配列番号６）−Ｈ）の合成【０３３１】
【化８６】
2017111137.tif 000091
【０３３２】
実施例２６で得たＤＭＴｒ−ｄ［ＴＣＢｚＣＢｚＣＢｚＧｉＢｕＣＢｚＣＢｚＴＧｉＢｕＣＣＯ−ＴＯＰ］−ＰＡを含量５６ｗｔ％で３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルと共に含有する固体（１．００ｇ，０．１００ｍｍｏｌ）、調製例２で得たＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢを含量８２ｗｔ％で３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルと共に含有する固体（０．５５６ｇ，０．０８３ｍｍｏｌ）を、予め強熱脱水したモレキュラシーブ３Ａの粉末（０．５４４ｇ）と共に脱水ジクロロメタン（７．５ｍＬ）中、１時間撹拌することで脱水溶液とした。この懸濁液に脱水アセトニトリル（０．７５ｍＬ）を添加し０．４５μｍのメンブレンフィルターにより全量を濾過して２０ｍＬシュレンクチューブに取得した。ここに５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（４７．２ｍｇ，０．２４５ｍｍｏｌ）を添加して乾燥アルゴン下で３時間撹拌した。反応液にピリジン（８０μＬ，１．０ｍｍｏｌ）及びエタノール（５．８４μＬ）を添加して系をクエンチした。ここに３−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（３３．７ｍｇ，０．１６４ｍｍｏｌ）を添加し３０分撹拌することで、ホスファイト中間体を硫化した。アセトニトリル（４２ｍＬ）を添加してアンカーを有する化合物群を沈殿させた。沈殿をろ過により取得し、アセトニトリル（４２ｍＬ）で洗浄した。これを真空乾燥することで、１．３４ｇの固体を取得した。サンプルの内、１０．６ｍｇをスターラーチップを入れた２ｍＬのガラスバイアル中で、メタノール（２５０μＬ）および２８％アンモニア水（１．０ｍＬ）と共に密封して４５℃のオイルバス中１８時間撹拌し、脱保護を行った。この水溶液を室温まで冷却の後、遠心エバポレータ中３５℃で１０分間アンモニアの除去を行った。２Ｍトリエチルアミン−酢酸バッファーで５．０ｍＬまでメスアップし、０．４５μｍのメンブレンフィルターにより濾過し不溶分を除去し、液体クロマトグラフィーにより分析した。別途、１０．６ｍｇ精秤したＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢを含量８２ｗｔ％で３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸メチルと共に含有する固体を同様に脱保護・希釈したサンプルを標品としてカップリング混合物中の未反応のＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢを定量した所、実際に用いた、晶析補助剤との混合物（８２  ｗ／ｗ％）として１３７ｍｇ相当のＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢを含有しており、縮合反応によるＨ−ｄ［ＧｉＢｕＡｄｍａＣＨＤＡｄｍａＴＧｉＢｕＣＨＤＡｄｍａＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢの転化率は７６％と求まった。
前述の脱保護・希釈を行ったサンプルをＬＣ／ＭＳにより分析し、表題の化合物を同定した。
LC/MS m/z:calcd 2209.57,found 2209.55 [M-3H]3-【０３３３】
実施例２８：５’−末端のホスフィチル化【０３３４】
【化８７】
2017111137.tif 000092
【０３３５】
実施例６同様に、脱水トルエン中，２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトと４，５−ジシアノイミダゾールから調製したホスフィチル化剤溶液（濾液として１．５ｍＬ，０．６０ｍｍｏｌ）にＮ−メチルモルホリン（０．６６ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）を添加した。ここにＨ−ｄ［ＣＡｃＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（０．４９６ｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を１０℃で加えて懸濁液とした。同温度でジクロロメタン（１０．０ｍＬ）を添加して均一溶液とした後、２時間、撹拌した。原料の完全転化をＬＣ／ＭＳにより確認した後２，４，６−トリメチルピリジン（０．７９ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）で反応を停止した。反応液を０℃に冷却してアセトニトリルを添加して生成物を析出させた。桐山ロートによりろ過・洗浄し、真空乾燥により（ｉＰｒ２Ｎ）（ＮＣＣＨ２ＣＨ２Ｏ）Ｐ−ｄ［ＣＡｃＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢ（０．４２２７ｇ，０．１６ｍｍｏｌ，７９％収率）を白色固体として得た。Ｈ−ｄ［ＣＡｃＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢは、調製例１−（３）と同様にして得たｄ［ＡＢｚＴＴ］−ｓｕｃ−ＴＯＢをヌクレオシドホスホロアミダイトと縮合し、さらに脱ＤＭＴｒ化することで調製した。用いたヌクレオシドホスホロアミダイトは以下の通り。
ｄＣＡｃ：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−アセチル−２’−デオキシシチジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト
生成物を３１Ｐ｛１Ｈ｝ＮＭＲにより分析した所、Ｈ−ホスホネートジエステルが目的物に対して９％検出されたが、インターヌクレオチドリン酸上の脱シアノエチル化体は検出されず、本反応で導入したリンを介して２つのオリゴ核酸５’−末端同士が連結したホスファイトは検出限界以下であった。
５’末端がホスフィチル化されたホスホロアミダイトを用いることで５’末端側に直接又はリンカーを介して官能基が連結されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０３３６】
本発明の方法によれば、保管中安定なジアミダイトからホスフィチル化剤を調製することが可能であり、ホスフィチル化反応の際のリン酸上の保護基が脱落することを抑制することができる。従って、より安定、且つ効率よく３’末端ホスホロアミダイト化オリゴヌレオチドを製造することができる。さらに本発明の方法によれば、ヌクレオチド間リン酸上のシアノエチル保護基を脱落することなく、３’末端のシリル保護基を脱保護することが可能となる。従って、これらの方法を用いることで、より効率的なオリゴヌクレオチドの製造及びそれを用いたフラグメント縮合が可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２０１５−２５０６６５（出願日：２０１５年１２月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【配列表】
2017111137000001.app
【国際調査報告】
2017111137.tif 000115
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