(57)【要約】  高い収率で得やすい試薬を用いつつ、検出対象を適切に検出及び定量することができる検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法を提供すること。  検体中の検出対象を検出する方法は、刺激応答性物質１１を含有する第１の物質と検出対象５０に対する第１の親和性物質１３とが結合した第１の結合物１０と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質２１と検出対象５０に対する第２の親和性物質２３とが結合した第２の結合物２０と、検体とを混合し、この混合物を刺激応答性物質１１が凝集する条件下におき、刺激応答性物質１１の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む。第２の物質２１は、比重が１．４以上である粒子を含むものであり、第１の親和性物質１３と第２の親和性物質２３が、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。
2017115440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含み、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであり、
前記第１の親和性物質と前記第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる、検体中の検出対象を検出する方法。
【請求項２】
検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の前記検出対象の量を算出することを含み、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであり、
前記第１の親和性物質と前記第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる、検体中の検出対象を定量する方法。
【請求項３】
前記第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した前記磁性物質を分離することを更に含む請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記第２の物質は、前記粒子の表面に水溶性物質が結合されたものである請求項１から３いずれか記載の方法。
【請求項５】
第２の結合物を含み且つ請求項１から４いずれか記載の方法で用いられる試薬の調製方法であって、
水中で、第２の物質と、第２の親和性物質とを結合させた後、固液分離させ、固相である第２の結合物を回収する工程を有する方法。
【請求項６】
検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を備え、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであるキット。
【請求項７】
前記第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する請求項６記載のキット。
【請求項８】
前記第２の物質は、前記粒子の表面に水溶性物質が結合されたものである請求項６又は７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が利用されてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体若しくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。【０００４】
そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く利用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。【０００５】
しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体や発光試薬等の特殊な試薬が多数必須であり、作業コストが高い。また、発光試薬の退色（ブリーチング現象）を抑制する必要から、測定工程を極めて短時間に終了せざるを得ないため、測定精度が不充分になることが懸念される。一方、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程、系を洗浄する工程、発光を測定する工程等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。【０００６】
そこで、本発明者らは、刺激応答性ポリマーを含有する物質と検出対象に対する抗体とが結合した第１の結合物、並びに有電荷又は親水性の物質と検出対象に対する別の抗体とが結合した第２の結合物を用いた、検出対象の検出及び定量技術を開発した（特許文献２及び３参照）。この技術は、上記２種類の結合物と検体とを混合した混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、濁度測定等によって刺激応答性ポリマーの凝集の程度が低下したと判定された場合には、検体中に検出対象が存在すると判別するものである。【０００７】
この技術によれば、刺激応答性ポリマーを含有する物質、抗体、及び有電荷又は親水性の物質のみを用いて達成され、特殊な試薬を特に使用することなく行われるので、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公昭５８−ｌｌ５７５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００９／０８４５９５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、特許文献２で用いられる第２の結合物の製造工程では、有電荷又は親水性の物質と、抗体とを結合させる反応の後、検出・定量感度を悪化させる未結合の抗体から、第２の結合物を分離する必要がある。しかし、未結合の抗体（図７ｃ中の「Ｆｒｅｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」）と、第２の結合物（図７ｃ中の「ＰＥＧ標識Ａｎｔｉｂｏｄｙ」）とは、分子量等が互いに近似する場合が多かった。この場合、クロマトグラム等において未結合の抗体と第２の結合物の相応部分とが重なるため、当該相応部分を回収できない。このように、第２の結合物の収率と、それを用いた際の検出対象の検出・定量感度とは、トレードオフの関係にあった。【００１０】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、高い収率で得やすい試薬を用いつつ、検出対象を適切に検出及び定量することができる検出対象の検出方法及び定量方法、キット、並びに試薬の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、第２の結合物に用いられる有電荷又は親水性の物質（以下、第２の物質と呼ぶ）として比重が比較的大きい粒子を含むものを用いると、小径粒子を使用できるので、比表面積が大きい粒子を多く存在することができる結果、比活性を向上することができること、未結合の第２の親和性物質から固液分離等で容易に高い収率で第２の結合物を回収できること、並びに、当該第２の結合物を用いても、第２の物質が親水性又は有電荷の部分を有する限り、検出対象の存在に依存して刺激応答性物質の凝集阻害が生じることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のものを提供する。【００１２】
（１）  検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含み、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであり、
前記第１の親和性物質と前記第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる、検体中の検出対象を検出する方法。【００１３】
（２）  検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含み、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであり、
前記第１の親和性物質と前記第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる、検体中の検出対象を定量する方法。【００１４】
（３）  前記第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む（１）又は（２）記載の方法。【００１５】
（４）  前記第２の物質は、前記粒子の表面に水溶性物質が結合されたものである（１）から（３）いずれか記載の方法。【００１６】
（５）  第２の結合物を含み且つ（１）から（４）いずれか記載の方法で用いられる試薬の調製方法であって、
水中で、第２の物質と、第２の親和性物質とを結合させた後、固液分離させ、固相である第２の結合物を回収する工程を有する方法。【００１７】
（６）  検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を備え、
前記第２の物質は、比重が１．４以上である粒子を含むものであるキット。【００１８】
（７）  前記第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する（６）記載のキット。【００１９】
（８）  前記第２の物質は、前記粒子の表面に水溶性物質が結合されたものである（６）又は（７）記載のキット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、第２の結合物を用いることで、第２の物質が親水性又は有電荷の部分を有するため、検出対象の存在に依存して刺激応答性物質の凝集阻害が生じることで、適切に検出対象の検出及び定量を行うことができる。更に、第２の物質として比重が比較的大きい粒子を含むものを用いることで、比活性を向上することができ、感度を高く、また、反応効率を高くすることができる。また、当該第２の物質を用いることで、未結合の第２の親和性物質から固液分離等で容易に高い収率で第２の結合物を回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る方法において使用される結合物の概略構成図である。
【図２】前記実施形態に係る結合物の使用状態を示す模式図である。
【図３】本発明の一形態として自己抗体を検出対象とする（実施例参照）方法において使用された結合物の概略構成図である。
【図４】本発明の一実施例に係る方法における磁力の付加の態様を示す図である。
【図５】本発明の一実施例に係る方法における濁度の測定結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例に係る方法における抗原濃度と濁度との相関式を示す図である。
【図７】従来例に係る結合物を分離する際のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２３】
＜キット＞
本発明のキットは、検出対象を検出又は定量するためのキットであって、第１の結合物と、第２の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
【００２４】
〔第１の結合物〕
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。
【００２５】
（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性物質を含有する物質であり、この刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。
【００２６】
本発明では、刺激応答性物質は、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーであることが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下、ＵＣＳＴとも称する）を有するポリマーが挙げられる。
【００２７】
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
【００２８】
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００２９】
また、本発明では、刺激応答性物質として、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。
【００３０】
このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
【００３１】
（微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒子径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒子径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
【００３２】
本発明では、比重が比較的大きい粒子を含む第２の物質を用いるので、比表面積が比較的大きく、親水性又は有電荷の部分による凝集阻害効果を維持できる傾向がある。
【００３３】
（第１の親和性物質）
第１の親和性物質は、検出対象に結合する物質、例えば、検出対象を認識する抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。更に、別の態様として、検出対象が抗体（イムノグロブリン）、例えばヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥの場合、第１の親和性物質は、それぞれ該ヒトイムノグロブリンＧ、該ヒトイムノグロブリンＭ、該ヒトイムノグロブリンＡ、該ヒトイムノグロブリンＥが認識する、抗原又は抗原決定基を含んだ物質であり、特に典型的には自己抗体が認識する抗原又は抗原決定基でありえる。ここでいう「抗原決定基」とは、完全に天然に存在する抗原分子中と同じ構造である必要はなく、検出対象となる抗体が認識する物質であればよい。なお、本願明細書には、自己抗体（例として抗環状シトルリン化ペプチドを認識する抗体）を検出対象とする場合に、自己抗原（例としてＣＣＰ；環状シトルリン化ペプチド）を第１の親和性物質とした例を実施例に記載し、第１の親和性物質の一態様を明示する。
【００３４】
［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性物質部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。
【００３５】
具体的には、刺激応答性物質へのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性物質及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。
【００３６】
別法として、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性物質と、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。
【００３７】
あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
【００３８】
あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性物質を結合させてもよい。
【００３９】
第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件におき、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
【００４０】
微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
【００４１】
〔第２の結合物〕
第２の結合物は、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合したものである。中でも本発明における第２の物質は、比重が比較的大きい粒子を含むものである。これにより、比活性を向上することができ、また、未結合の第２の親和性物質から固液分離等で容易に高い収率で第２の結合物を回収することができる。また、当該第２の結合物を用いても、第２の物質が親水性又は有電荷の部分を有するため、検出対象の存在に依存して刺激応答性物質の凝集阻害が生じる。これにより、適切に検出対象の検出及び定量を行うことができる。
【００４２】
第２の物質は、容易に固液分離を行える観点で、水より大きい比重を有する粒子（以下、第２の物質に含まれる高比重の粒子を「高比重粒子」ということがある。）を含むべきである。高比重粒子の比重としては、１．４以上が好ましく、１．６以上がより好ましく、１．７以上が更に好ましく、１．８以上が更により好ましく、１．９以上が特に好ましく、比重の上限値としては、２．５がより好ましく、２．３が更に好ましく、２．２が更により好ましく、２．１が特に好ましい。本明細書において、比重は、ＪＩＳ  Ｚ  ８８０７の方法により測定される値である。
【００４３】
第２の物質を構成する粒子の比重が上記範囲内であると、比較的小径の粒子を用いることができるので、１個当たりの比表面積が大きい粒子を用いることができ、しかも、個数を多く存在させることができるので、粒子全体の比表面積も高めることができる結果、比活性を向上することができ、感度を高め、また反応効率を高めることができる。第２の物質を構成する粒子は、また、上記範囲内の比重を有するので、分離性が良く、例えば従来の低比重の粒子では遠心分離をしようとしても沈降しない程度の遠心力（重力加速度）であっても、沈降することができる。
【００４４】
なお、第２の物質を構成する粒子には、後述する濁度測定で用いる波長の光に対する散乱強度が比較的小さい粒子を用いることが好ましい。第２の物質を構成する粒子に散乱強度が比較的大きい粒子を用いると、該粒子の濃度上昇に応じて濁度測定値のベースラインも上昇してしまうため好ましくない。
【００４５】
第２の物質に含まれる高比重粒子としては、特に限定されないが、上述の比重が比較的大きいという特性と、散乱強度が比較的小さいという特性とを兼ね備える粒子が多い点で、例えば、シリカ、アクリル樹脂、金属からなる粒子等が挙げられ、シリカ、アクリル樹脂からなる粒子が好ましく、シリカからなる粒子（以下、「シリカ粒子」ということがある。）がより好ましい。本発明に用いるシリカ粒子は、二酸化ケイ素を主成分とする粒子であればよく、石英又は水晶からなる粒子を含み、シリカと通称されるものからなる粒子であってよい。シリカ粒子は、粒子表面にシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を有していることから、親水性が高いので、水中で反応させやすい点で好ましい。シリカ粒子は、また、毒性がないので、取扱いが容易であり、製造も容易である点でも好ましい。
【００４６】
上述の高比重粒子と併用してもよい他の粒子としては、特に限定されないが、例えば、後述の有電荷の部分を有する化合物及び／又は親水性の部分を有する化合物等が挙げられ、例えば、ラテックス粒子等であってもよい。
【００４７】
第２の物質に含まれる高比重粒子は、平均粒子径が０．００１〜０．５０μｍであってよく、０．００５〜０．２０μｍであってもよい。特に高比重粒子は、上記範囲内のような比較的小さい平均粒子径を有することができる。本明細書において、平均粒子径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めた値である。前記平均粒子径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
【００４８】
第２の物質に含まれる高比重粒子は、比表面積が１０〜９００ｍ２／ｇであってよく、５０〜５００ｍ２／ｇが好ましく、１００〜３００ｍ２／ｇがより好ましい。特に高比重粒子は、上記範囲内のような比較的大きい比表面積を有することができる。本明細書において、比表面積は、ＪＩＳ  Ｚ  ８８３０により測定される値である。
【００４９】
第２の物質は、高比重粒子の表面又は高分子鎖の中若しくは末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよく、第２の親和性物質が物理吸着するための疎水性基を有してもよい。中でも、短時間で容易に第２の結合物を製造できる点で、第２の親和性物質が物理吸着するための疎水性基を有する第２の物質が好ましい。疎水性基は、吸着した第２の親和性物質によってマスクされるため、親水性又は有電荷の部分による凝集阻害を有意には損なわれない。第２の親和性物質を結合させるための官能基等としては、高比重粒子として例えばシリカ粒子を用いる場合、シリカ粒子の表面のシラノール基であってよい。
【００５０】
親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質としては、高比重粒子自体が親水性又は有電荷の部分を有するものである場合、該高比重粒子のみであってもよいし、該高比重粒子に親水性又は有電荷の部分を有する化合物を結合したものであってもよい。親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質としては、例えば、高比重粒子としてシリカ粒子を用いる場合、シリカ粒子の表面のシラノール基を親水性の部分としてもよいし、例えば該シラノール基に、親水性又は有電荷の部分を有する化合物を結合したものであってもよい。
また、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質としては、高比重粒子自体が親水性又は有電荷の部分を有しないものである場合、該高比重粒子に親水性又は有電荷の部分を有する化合物を結合したものを用いることができる。
【００５１】
第２の物質のうち高比重粒子以外の有電荷の部分を有する化合物としては、例えば、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子（ポリスチレン等で構成されてよい）等も挙げられる。
【００５２】
また、第２の物質のうち高比重粒子以外の親水性の部分を有する化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の多糖類、中性アミノ酸を含むポリペプチド等が挙げられる。
【００５３】
第２の物質のうち高比重粒子以外の親水性の部分を有する化合物としては、前述のポリマー粒子の他、赤血球由来細胞膜等も使用することができる。赤血球由来細胞膜は、親和性物質（抗体）が結合した状態の赤血球が安価に販売されており、そのような市販品の赤血球を常法で破壊し、膜化したものを使用してもよい。
【００５４】
第２の物質の粒径は、大きすぎると、検出・定量の効率を下げる傾向を有する一方、小さすぎると、固液分離の効率を下げる傾向を有する。この観点で第２の物質の平均粒子径は適宜選択されてよく、例えば、０．００１〜０．５０μｍであってよく、０．００５〜０．２０μｍであってよい。
【００５５】
本発明では、高比重粒子の表面に水溶性物質が結合された第２の物質を用いることが好ましい。高比重粒子の表面に結合した水溶性物質により、凝集阻害効果を向上し得る。ここで用い得る水溶性物質は、前述の有電荷の部分を有する物質（ポリアニオン、ポリカチオン）、水溶性の高分子化合物等である。この結合は、化学吸着、物理吸着のいずれであってもよい。
【００５６】
第２の物質は、一種単独で利用しても、複数を組み合わせて利用してもよい。
【００５７】
（第２の親和性物質）
第２の親和性物質は、第１の親和性物質とは異なる部位において、第１の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識する抗体、例えばモノクローナル抗体であってよい。
【００５８】
［作製方法］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
【００５９】
第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、  １、  ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。
【００６０】
第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（（株）同仁化学研究所製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００６１】
第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
【００６２】
この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。
【００６３】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
【００６４】
Ｎｕｌｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ  第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
【００６５】
核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。
【００６６】
第２の結合物は、上記の化学結合によるものに限られず、第２の物質に第２の親和性物質を物理吸着することでも製造することができる。この方法は、迅速且つ簡便に終了できる点で有利である。なお、前述のように、物理吸着を促進する観点で、第２の物質は疎水性部分を有することが好ましい。
【００６７】
前述の反応工程の条件は、反応効率及び失活抑制等の観点で適宜選択される。温度は、特に限定されないが、１０〜５０℃であってよく、２０〜４０℃であってよい。
【００６８】
いずれの方法を採用しても、反応後に、未結合の第２の親和性物質を第２の結合物から分離し除去する必要がある。残存する未結合の第２の親和性物質は、第２の結合物と競合して検出対象に結合する結果、第２の結合物による凝集阻害効果を低下させるからである。
【００６９】
従来、分子量分画等のクロマトグラフィーにより、第２の結合物を単離し回収してきた。この方法は、煩雑であるとともに、クロマトグラムにおいて第２の結合物と第２の親和性物質とが互いに重複することが多く、収率が悪い。これに対し、本発明では、第２の物質を含む第２の結合物が固相を構成する一方、未結合の第２の親和性物質は液相を構成するため、固液分離により容易且つ高収率で、第２の結合物を回収することができる。なお、第２の結合物には、未結合の第２の物質が混入し得るが、未結合の第２の物質は第２の結合物と競合しないため、問題にならない。
【００７０】
固液分離は、常法に従って行えばよく、遠心分離等を利用することができる。また、遠心分離後に、上清除去、沈殿の再分散、及び遠心分離という洗浄工程を行ってもよい。なお、遠心分離における遠心力は、過小であると分離効率を下げる一方、過大であると沈殿の再分散に時間を要する傾向を有する。このため、遠心力は、特に限定されないが、５０００〜１０００００ｇであってよく、１００００〜３００００ｇであってよい。
【００７１】
＜検出方法＞
本発明の検出方法は、まず第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性物質が凝集する条件下において、刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。
【００７２】
（混合・凝集）
まず、第１の結合物と第２の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合物を得る。続いて、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第２の結合物中の親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
【００７３】
この現象を、図１〜図３を参照しながら説明する。
【００７４】
図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。（なお、図３の形態では、検出対象５０Ａに対して自己抗原１３Ａが結合されている）また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０は親水性の部分を有する第２の物質２１を含み、この第２の物質２１は検出対象５０に対する第２の抗体２３に結合されている。そして、第１の抗体１３（図３の場合、検出対象５０Ａに対して結合する自己抗原１３Ａ）及び第２の抗体２３は、検出対象５０(図３の場合、自己抗体５０Ａ)の異なる部位において、同時に検出対象５０(図３の場合、自己抗体５０Ａ)に結合できる。
【００７５】
図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０（図３の場合、自己抗体５０Ａ）が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（図２（Ｂ））。
【００７６】
刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。例えば、ＬＣＳＴが３２℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３２℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。
【００７７】
また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。
【００７８】
また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。
【００７９】
なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物の検出対象への結合の後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。ただし、温度応答性ポリマーが凝集する条件が、第１の結合物及び第２の結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好ましい。
【００８０】
ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
【００８１】
また、上限臨界溶液温度の場合は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。
【００８２】
（判定）
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、５５０ｎｍ）であることが好ましい。
【００８３】
目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値との差に基づいて判定を行ってもよい。
【００８４】
刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象は、特に限定されず、展開担体に展開したときの信号（薄層クロマトグラフィー）、磁性物質を含む第１の物質を用いた場合には磁界の増加の程度等であってよい。
【００８５】
展開担体に展開したときの信号に基づく検出方法は、ＷＯ２０１０／１３７５３２号パンフレットに開示されている。具体的には、刺激応答性物質の凝集条件においた混合物を展開担体に展開させる、又は展開中の混合物を刺激応答性物質の凝集条件におき、展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む。この方法は、適宜選択された展開担体において、刺激応答性物質が凝集すると、展開しにくくなるという相関性を利用するものである。
【００８６】
磁界の強さに基づく検出方法は、ＷＯ２００９／０８４５９６号パンフレットに開示されている。具体的には、刺激応答性物質が凝集する条件下に混合物をおいた後、磁力を付加し、発生する磁界を測定し、磁力の付加後における磁界の増加の程度に基づいて、検出対象を検出する工程を含む。この方法は、凝集体による磁界が大きいという現象を利用するものである。
【００８７】
＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、検出対象の量と濁度又は上記パラメータとの所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
【００８８】
（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度又はそれと相関するパラメータとの相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度又はパラメータとの測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２点以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
【００８９】
ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であってもよい。
【００９０】
（算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
【００９１】
濁度と相関するパラメータとしては、特に限定されず、展開担体に展開したときの信号強度（薄層クロマトグラフィー）、磁性物質を含む第１の物質を用いた場合には磁界の強さ等であってよい。
【００９２】
展開担体に展開したときの信号に基づく定量方法は、ＷＯ２０１０／１３７５３２号パンフレットに開示されている。具体的には、展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、検出対象の量と信号強度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する工程が含まれる。この方法は、適宜選択された展開担体において、刺激応答性物質が凝集すると、展開しにくくなるという相関性を利用するものである。
【００９３】
磁界の強さに基づく定量方法は、ＷＯ２００９／０８４５９６号パンフレットに開示されている。具体的には、混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下においた後、磁力を付加し、発生する磁界を測定し、検出対象の量と磁界との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する工程が含まれる。この方法は、凝集体による磁界が大きいという現象を利用するものである。
【００９４】
（分離）
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。
【００９５】
磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができる。この磁石の磁力は、用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマグナ社製ネオジム磁石が挙げられる。
【００９６】
また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費やされる時間を短縮化できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁度は、夾雑物が存在していた場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。
【００９７】
なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定することのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラメータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの１点は、例えば、検出対象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出対象の量をより正確に定量できることになる。
【００９８】
（検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。
【００９９】
＜キット＞
本発明は、検出対象を検出及び／又は定量するためのキットも包含する。このキットは、刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を備え、第２の物質は、比重が１．４以上である粒子が０．０１以上である粒子を含むものである。第１の物質は微粒子状の磁性物質を含有することが好ましい。第２の物質は、高比重粒子の表面に水溶性物質が結合されたものであることが好ましい。各構成要素の詳細は前述の通りであるので、省略する。
【実施例】
【０１００】
＜参考例１〜２＞  未修飾シリカ粒子の回収率の測定
表１の未修飾シリカ粒子を水に分散させてなる各コロイド溶液から、１ｍｇを分取できるピペットマンを用いて、下記１）の遠心分離前の乾燥重量が得られる量をそれぞれ分取し、下記１）〜３）の方法により乾燥重量を測定した。
１）遠心分離前
分取したコロイド溶液を６０℃の恒温槽にて２４時間乾燥させ、シリカ粒子の乾燥重量を測定した。
２）遠心分離８０分後
遠心分離機にて重力加速度２００００ｇにおいて８０分間に亘り遠心分離し、上清を除去した後、残った沈降物を６０℃の恒温槽にて２４時間乾燥させ、シリカ粒子の乾燥重量を測定した。
３）遠心分離１６０分後
遠心分離機にて重力加速度２００００ｇにおいて１６０分間に亘り遠心分離し、上清除去をした後、上記２）と同様に乾燥させ、シリカ粒子の乾燥重量を測定した。
結果を表１に示す。【０１０１】
＜比較調製例１＞  抗体修飾ラテックス粒子の調製
ポリスチレン製ラテックス粒子（平均粒子径５０ｎｍ）の水分散液０．４ｍＬ、及び抗ヒトＩｇＧ抗体（医学生物学研究所社製）を混合し、室温で６０分間スターラーで撹拌することで、ラテックス粒子に抗ヒトＩｇＧ抗体を物理吸着させた。この反応液を２００００ｇで８０分間に亘り遠心分離し、上清を除去した。残った沈殿を、加えたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に分散させ、再び２００００ｇで８０分間に亘り遠心分離し、上清を除去した。これを、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に分散させ、０．０２５％の抗ヒトＩｇＧ抗体結合ラテックス粒子を含む第２の結合物の分散溶液を調製した。【０１０２】
＜比較参考例１〜２＞  ラテックス粒子の回収率の測定
比較調製例１により得た抗体修飾ラテックス粒子の分散溶液（比較参考例１）又は表１に記載した未修飾ラテックス粒子を水に分散させてなる各コロイド溶液（比較参考例２）から、参考例１〜２と同様にして、１）〜３）の方法による乾燥重量を測定した。
【表１】
2017115440.tif 000003
【０１０３】
表１から明らかなように、未修飾ラテックス粒子は平均粒子径が５０ｎｍであっても、遠心分離を１６０分行うことによっては回収率が１０％程度であった。抗体修飾ラテックス粒子は未修飾ラテックス粒子よりも回収率が高くなった。
これに対し、シリカ粒子は、平均粒子径が５０ｎｍであるもののみならず３０ｎｍであっても、抗体修飾ラテックス粒子よりもはるかに回収率が高かった。【０１０４】
＜実施例＞
［第１の結合物の調製］
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第１の親和性物質としての抗体（クローン：１９５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）を、従来周知のｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ法（旭テクノグラス社）によりビオチン化し、ビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を調製した。【０１０５】
一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマグナビート株式会社製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここにＴＢＳバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、ＰＢＳバッファー（０．０１Ｍ  リン酸バッファー、０．００２７Ｍ  塩化カリウム、０．１３７Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に溶解したビオチン識抗ＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、室温で１５分間転倒混和した。マイクロチューブを４２℃に加熱してＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ  ＬＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なビオチン標識抗ＴＳＨベータ抗体を分離した（Ｂ／Ｆ分離）。ここにＴＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のビオチンを添加して、ストレプトアビジンのビオチン結合部位を被覆した後、余分なビオチンを分離した（Ｂ／Ｆ分離）。更に０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）溶液に分散させることで、第１の結合物を調製した。【０１０６】
［第２の結合物の調製］
シリカ粒子（比重：１．８、平均粒子径１００ｎｍ）の水分散液０．４ｍＬ、及びヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗体（クローン：１９５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）を混合し、室温で６０分間スターラーで撹拌することで、シリカ粒子に抗ヒトＩｇＧ抗体を物理吸着させた。この反応液を２００００ｇで８０分間に亘り遠心分離し、上清を除去した。残った沈殿を、加えたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に分散させ、再び２００００ｇで８０分間に亘り遠心分離し、上清を除去した。これを、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に分散させ、０．０２５％の抗ヒトＩｇＧ抗体結合シリカ粒子を含む第２の結合物の分散溶液を調製した。【０１０７】
［試料の調製］
検出対象である抗原として、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製、活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に３０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液をビトロスＴＳＨキャリブレータ１（ＴＳＨ：０ｍＩＵ／Ｌ、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製）で１０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、となるよう希釈したものを試料とした。【０１０８】
［混合］
第１の結合物１５０μＬ及び第２の結合物１２０μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサで１秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に上記各試料７５０μＬを添加し、再びボルテックスミキサで６０秒間撹拌し、混合液を得た。同様に、陰性対照として、ヒト甲状腺刺激ホルモンが存在しない混合液も用意した。【０１０９】
［相関式の作成］
図４に示されるように、汎用されている分光光度計用セミミクロセル７１の光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石（西興産業社製）７３を取り付けた。このセル７１を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計「ＵＶ−３１０１ＰＣ」（島津製作所製）内に設置し、３２℃のもと１０分間以上保持した。【０１１０】
上記混合液をセル内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直にスリット幅１０ｍｍで２０分間にわたって連続して濁度（吸光度Ａｂｓ）を測定した。同様に、陰性対照となる混合液についても濁度（吸光度Ａｂｓ）の測定を行った。その結果を図５に示す。【０１１１】
図５に示されるように、約９分ぐらいまでは、検出対象である抗原濃度が高いほど、刺激応答性物質が凝集阻害されて分散し濁度が低いことがわかった。一方、約９分付近から、抗原濃度と濁度の関係が反転し始め、時間の経過とともに濁度が初期値よりも低下する。これは、凝集した磁性物質が磁石に吸着されて分離されるからであると推測される。【０１１２】
次に、各試料の抗原濃度と、抗原濃度ゼロの９分での濁度の測定値から１５分での濁度の測定値を差し引いた値から、各抗原濃度の９分での測定値から１５分での濁度の測定値を差し引いた値を差し引いた値との相関式を図６に示す。図６に示されるように、相関係数Ｒ２が０．９４８３と極めて高い相関式を得ることができた。この相関式を用いることで、抗原濃度を高精度に定量できることが分かった。
【符号の説明】
【０１１３】
１０、１０Ａ  第１の結合物
１１  刺激応答性物質
１３  第１の抗体（第１の親和性物質）
１３Ａ  自己抗原(例としてＣＣＰ；第１の親和性物質）
１５  アビジン
１７  ビオチン
１９  磁性物質
２０  第２の結合物
２１  第２の物質
２３  第２の抗体（第２の親和性物質）
５０、５０Ａ  検出対象
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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