(57)【要約】  本発明は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、特定のプロテアーゼを固定化した微粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び前記消化によって得られた、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むペプチド断片を検出するステップを含む、モノクローナル抗体の定量方法を提供する。
2016194114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化した、平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きい微粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
前記消化によって得られた、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むペプチド断片を検出するステップ
を含む、モノクローナル抗体の定量方法であって、前記プロテアーゼとして、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを使用することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼが、還元メチル化処理を行っていないトリプシンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体がモガリズマブである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチド断片が配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのキットであって、
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを固定化した微粒子と、
前記多孔質体と前記微粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記微粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
を含む、上記キット。
【請求項６】
トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼが、還元メチル化処理を行っていないトリプシンである、請求項５記載のキット。
【請求項７】
測定対象がモガリズマブであって、内部標準ペプチドが配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項５又は６記載のキット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、前記モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドについての、親イオン、フラグメントイオン、及び質量分析計の電極に印加する電圧のデータを含む、上記記録媒体。
【請求項９】
請求項８記載の記録媒体を含む、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのメソッドパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析を用いたモノクローナル抗体の定量方法に関し、より具体的には、モノクローナル抗体の特異的配列を含むペプチド断片を選択的に消化するステップと、得られたペプチド断片を質量分析によって検出するステップとを含み、選択的消化のために特定の酵素を使用する、上記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
副作用が少なく高い薬効を発揮する薬剤の開発及び投与のために、薬物動態、特に濃度モニタリング（therapeutic drug monitoring, TDM）が注目されている。濃度モニタリングによって、投与した薬剤が適正量であるかどうか、病変部位に到達しているかどうかが確認でき、薬剤の有効性を評価し、また投与量を適切に調整することが出来るようになる。また、がんや自己免疫疾患等の領域で主流となってきている分子標的薬の有効性は、薬剤が病変部位に蓄積して薬効を発揮しているかどうか、医師自身が速やかに判断できることが重要である。【０００３】
分子標的薬としては現在、抗体医薬が注目されている。抗体医薬は、がんを始めとする病巣抗原や標的分子、成長因子などに対して特異的に結合するため、副作用が少なく高い薬効が見込める医薬品として着目され、多くの抗体で臨床研究が進行している。抗体はその性質上、極めて高い分子特異性を示す一方、同じ種類のがんであっても、その病巣の場所の違いだけで薬効を発揮しないケース、転移巣には効かないケースなどもしばしば見受けられる。また、薬価の問題もあり、適正使用による最適化医療を行うことが重要であると議論されるようになっている。【０００４】
従って、抗体医薬の局在や濃度を測定し、最適な投薬量を設定することは、極めて重要である。また、医師自身が薬効を常に把握でき、積極的な治療戦略を立てることを可能とするためにも、血中濃度測定および腫瘍組織中濃度測定がより簡便に行われる必要がある。さらに、投与した医薬の薬効評価やコンパニオン診断薬の開発等のためにも抗体濃度の定量には大きな需要があり、技術革新が常に求められている。【０００５】
従来、抗体等のタンパク質の定量のための最も一般的な技術としてELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）が知られているが、時間やコストがかかることなど、多くの課題が存在する。一方、質量分析を用いたタンパク質の定量および構造解析は、質量分析技術やデータ解析サーバ・ソフトウェアの発展と共に、飛躍的にその応用範囲を広げてきている。【０００６】
本発明者等のグループは、抗体等のタンパク質の選択的プロテアーゼ消化によって、質量分析を用いたタンパク質の特異的検出のために最適なペプチド断片を得ることができる方法を見出している。この方法は、基質となるタンパク質、例えば抗体と、プロテアーゼ酵素の両方を固相に固定化することによって、モノクローナル抗体の位置選択的なプロテアーゼ消化を実現したものである（特許文献１及び非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2015/033479号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】N. Iwamoto等, Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
質量分析法によってタンパク質を簡便に検出・定量するためには、測定対象のタンパク質を位置選択的に切断し、そのタンパク質に特異的なペプチド断片を産生させ、他のペプチド断片の産生量を小さくすることが効率的である。従って、抗体の場合には、特異的配列が含まれるFabドメイン、特にFabドメインの可変領域を位置選択的に消化し、一方Fcドメインの消化を抑制することが好ましい。【００１０】
上記の特許文献１及び非特許文献１記載の方法は、固相-固相反応を用いてモノクローナル抗体の選択的なプロテアーゼ消化を行うことができる画期的な方法である。より具体的には、例えば細孔径約１００ｎｍのProtein GもしくはProtein A樹脂上に抗体のC末端側を固定化し、抗体の可変領域は必ず溶液側に配向するようにする。次に、粒子径約２００ｎｍの微粒子表面にプロテアーゼを固定化する。プロテアーゼの抗体への接触を制限することで、可変領域選択的な抗体分解反応を行う反応場を形成することが可能となる。【００１１】
しかしながら、上記の方法を実際に臨床的に使用するためには更に検討する余地が残っており、より簡便な定量方法を提供するためには、個々の抗体についての標準化などの更なる整備が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、抗体の制限的なプロテアーゼ消化を用いた検出のためには、モノクローナル抗体の可変領域の中で、特にCDR2領域に含まれるプロテアーゼ消化断片を検出することが最も有効であることを見出した。【００１３】
通常、プロテアーゼ消化後のペプチド断片を質量分析に供する場合は、自己消化が少なく、切断配列の選択性が高いプロテアーゼを用いることを検討する。従って、当業者であれば、市販のプロテアーゼを用いる場合、質量分析グレードや配列決定（シーケンス）グレードのプロテアーゼを用いるようにする。例えば、生体由来のネイティブのトリプシンは、自己消化によりキモトリプシン様の活性を示す疑似トリプシンを生成するため、切断部位の特異性が低いことが知られている。そのため、質量分析グレードとして、トリプシンのリジン残基を還元メチル化して自己消化に対する抵抗性を高めたものが市販されている。【００１４】
しかしながら本発明者等は、上記のいわゆる高品質のプロテアーゼを使用して測定対象となるモノクローナル抗体を消化した場合に、得られたペプチド断片を用いて定量的検出ができない場合があることを見出した。【００１５】
本発明者等は、上記の結果は、得られたペプチド断片に対して内在性抗体の存在による干渉が生じている可能性を示唆するものと考え、そのような干渉のないペプチド断片を得ることを目的として更に検討を進めた。その結果、驚くべきことに、従来使用していた構造解析用酵素よりも特異性が低い酵素を用いることで、切断サイトを増やし、異なる配列のペプチド断片を生じさせ、その結果、定量的検出に最適のペプチドを取得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
すなわち、本発明の態様は以下の発明を包含する。
（１）以下のステップ：
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化した、平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きい微粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
前記消化によって得られた、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むペプチド断片を検出するステップ
を含む、モノクローナル抗体の定量方法であって、前記プロテアーゼとして、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを使用することを特徴とする、上記方法。
（２）トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼが、還元メチル化処理を行っていないトリプシンである、（１）記載の方法。
（３）前記モノクローナル抗体がモガリズマブである、（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記ペプチド断片が配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、（３）記載の方法。
（５）液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのキットであって、
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを固定化した微粒子と、
前記多孔質体と前記微粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記微粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
を含む、上記キット。
（６）トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼが、還元メチル化処理を行っていないトリプシンである、（５）記載のキット。
（７）測定対象がモガリズマブであって、内部標準ペプチドが配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、（５）又は（６）記載のキット。
（８）（１）〜（４）のいずれか記載の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、前記モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドについての、親イオン、フラグメントイオン、及び質量分析計の電極に印加する電圧のデータを含む、上記記録媒体。
（９）（８）記載の記録媒体と、前記記録媒体の使用説明書とを含む、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのメソッドパッケージ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、制限的なプロテアーゼ反応場を用いるため、抗体の限られた領域、特にCDR2領域を選択的に分解し、回収することができる。CDR2領域は抗体において最も表面近くに露出している部位であるために優先的に分解され得る。このことを利用することで、質量分析におけるモノクローナル抗体の検出をより効率的に行うことが可能となる。抗体医薬のCDR2領域のアミノ酸を含むペプチド断片を回収して定量することで、生体試料から直接的に、抗体医薬の濃度を測定することが可能となる。【００１８】
本発明の方法を用いれば、質量分析による個々の抗体の定量を確実に行うことができる。また、個々の抗体に対して標準的な分析条件が提供されれば、臨床の場で医師自身が検体の分析に携わり、投与された抗体の有効性を速やかに評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】モガリズマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１及び２）、及び定量用に使用したTrypsin Gold切断断片の配列及び重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列中の位置を示す。
【図２】モガリズマブのTrypsin Gold切断断片（配列番号３〜９）のMRMクロマトグラムを示す。上図はモガリズマブ原末の解析結果、下図は血漿中にモガリズマブをスパイクしたサンプルの解析結果を示す。縦軸はピーク強度、横軸は保持時間を示す。尚、同一のペプチド由来の断片が同一の保持時間に検出され、各断片イオンの生成効率の差がピーク高さで示されている。
【図３】血漿中にスパイクしたモガリズマブのTrypsin Gold切断断片（配列番号３〜９）を用いて作製した検量線を示す。
【図４】モガリズマブの定量用に使用したTrypsin TPCK-treated切断断片の配列、及び重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列中の位置を示す。
【図５】モガリズマブのTrypsin TPCK-treated切断断片（配列番号１０〜１４）のMRMクロマトグラムを示す。上図はモガリズマブ原末の解析結果、下図は血漿中にモガリズマブをスパイクしたサンプルの解析結果を示す。縦軸はピーク強度、横軸は保持時間を示す。尚、同一のペプチド由来の断片が同一の保持時間に検出され、各断片イオンの生成効率の差がピーク高さで示されている。
【図６】血漿中にスパイクしたモガリズマブのTrypsin TPCK-treated切断断片（配列番号１０〜１４）を用いて作製した検量線を示す。
【図７】精密質量分析におけるモガリズマブ標的ペプチドSYYPDSVK（配列番号１０）の構造同定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下のステップ：
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化した、平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きい微粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
前記消化によって得られた、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むペプチド断片を検出するステップ
を含む、モノクローナル抗体の定量方法であって、前記プロテアーゼとして、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを使用することを特徴とする、上記方法に関する。
【００２１】
本発明の方法は、測定対象の特異性を維持しながら、解析対象の母集団を減らすことを意図するものである。また、プロテアーゼとして、従来質量分析での使用が最適とされていたトリプシンではなく、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを使用することで、検出に適したペプチド断片を得ることを可能とするものである。
【００２２】
抗体においてアミノ酸置換頻度の特に多い領域は「相補性決定領域（complementarity determining region:CDR）」と呼ばれている。本明細書において、「CDR2（領域）」とは、抗体の一次構造における特定の連続アミノ酸残基でCDR2として規定される領域に加え、抗体の立体構造においてこの領域と近接し、全体として抗体の特異性を規定している領域を含めるものとする。一般的にフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域であっても、抗体によって配列に相違があることは知られている。FR領域の配列は抗体タンパク質の由来、作製工程等にも依存し得る。当業者であれば、目的の抗体と他の抗体とのアミノ酸配列のマルチプルアライメント、並びに目的の抗体と内在性抗体との交差反応性等を確認することにより、目的の抗体の特異性を効率的に検出するためのCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を決定し、検出対象のペプチド断片を予測し、選択することができる。
【００２３】
また、本明細書において、「CDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列」とは、目的の抗体に特有のCDR2領域由来のアミノ酸を1個以上含むアミノ酸配列であることを意味し、換言すれば、CDR2領域の一部を含むアミノ酸配列ということもできる。質量分析を用いた分析では、特異性を規定するアミノ酸残基が1個以上あれば、その特異性を確実に検出することが可能である。尚、「CDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列」とは、「CDR2領域由来のアミノ酸」を含む任意のアミノ酸配列を意図するものではなく、当該アミノ酸配列が全体として目的の抗体のアミノ酸配列の一部の連続的配列を構成していることを意図するものである。
【００２４】
以下、本発明の方法を具体的に説明する。
［質量分析］
質量分析により抗体を検出するためには、まず生体試料より抗体を抽出し、適切な溶媒に溶解することが必要である。また、抗体はそのまま分析するには分子が大きいため、プロテアーゼによりペプチドに分解し、その後液体クロマトグラフで分離した後に質量分析を行う。分析に適したペプチドの分子量は約1000〜3000 Da程度である。
【００２５】
抗体分子をプロテアーゼ分解すると、200本を遙かに超えるペプチド断片が生成する。また、生体試料に含まれる抗体を測定対象にする場合、巨大なサンプルセットとなる。上記の巨大で複雑なサンプルから、目的の特異的配列のみを分析、定量するためには、質量分析ステップの前に高分離能及び再現性のよい液体クロマトグラフが必須となる。
【００２６】
［抗体］
本発明の方法における測定対象はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域から成る。定常領域は、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有している。一方、可変領域には、相補性決定領域（CDR）が各3つずつ（CDR1、CDR2、CDR3）存在する。これらの領域が規定する立体構造が抗原との特異的結合に関わっており、それによって抗体−抗原複合体が形成される。
【００２７】
抗体の立体構造解析の結果、抗原との特異的結合に関わるCDR領域はほぼ抗体分子の外側に位置していることが確認されている。中でもCDR2領域は最も外側に位置しており（図８）、本発明の制限的プロテアーゼ消化の標的として最適である。臨床的に使用される抗体では、その全アミノ酸配列及びCDRの配列が開示されている。また、当業者であれば、抗体のアミノ酸配列情報に基づいて、そのCDR領域を特定することができる。
【００２８】
本発明の方法において測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばモガムリズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ等のヒト化抗体；セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ等のキメラ抗体等が挙げられる。尚、モノクローナル抗体の分子径は約１４．５ｎｍである。
【００２９】
本発明の方法によれば、モノクローナル抗体の特にCDR2領域を位置選択的にプロテアーゼ消化することができ、得られたCDR2領域のペプチド断片を質量分析で検出することにより、抗体の同定や定量的検出を行うことができる。抗体の種類に関わらず適用可能であるため、本発明の方法は、上記例示の抗体に限定されず、新規に開発されたモノクローナル抗体等にも適用できる。
【００３０】
［多孔質体］
本発明の方法に使用する多孔質体は、多数の細孔を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。これらの中でも、抗体を部位特異的に結合可能なものが好ましい。
【００３１】
細孔の形状は特に限定されない。また、多孔質膜のように、多孔質体を貫通する細孔が形成されたものを用いることもできる。多孔質体の細孔の大きさは特に限定されず、抗体を固定化した際に、細孔の表層付近に選択的に消化されるべき部位が位置するように、抗体の分子径等を考慮して決定することが好ましい。多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、例えば、１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の範囲で、かつ微粒子の平均粒径Ｄ１よりも小さい範囲で適宜に設定される。例えば、多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、２０ｎｍ〜２００ｎｍ程度が好ましく、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、４０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲がより好ましく、特に約１００ｎｍがさらに好ましい。
【００３２】
本発明においては、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。リンカー分子としては、抗体のFcドメインと部位特異的に結合するProtein AやProtein G等が好ましく用いられる。細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内に抗体のFcドメインが固定化され、Fabドメインが細孔の表層付近に位置する。このように、細孔内での抗体の配向が制御されることで、プロテアーゼによるFabドメイン、特にCDR2の位置選択的消化が可能となる。
【００３３】
リンカー分子の大きさは、抗体の選択的切断部位が細孔の表層付近に位置するように選択される。リンカー分子と抗体とが結合した状態の分子サイズは、多孔質体の細孔径の０．５倍〜１．５倍程度が好ましく、０．６倍〜１．２倍程度がより好ましく、０．７倍〜１．１倍程度がさらに好ましく、０．８倍〜１倍程度が特に好ましい。なお、多孔質体にリンカー分子が固定されておらず、細孔内に抗体を直接結合させる場合は、抗体の分子径と多孔質体の細孔径が上記関係を満たすことが好ましい。
【００３４】
本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）、トヨパール（TOSO社製）等が挙げられる。例えばProtein G Ultralink樹脂では、樹脂に結合したProtein Gの９５％は細孔内にあることがわかっている。
【００３５】
［多孔質体への抗体の固定化］
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、抗体と多孔質体あるいはリンカー分子の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、細孔内にprotein Aやprotein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。
【００３６】
多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。例えば、抗体の定量分析を行う場合、試料中の抗体のほぼ全量が多孔質体に固定化されることが望まれる。そのため、試料中の抗体の推定含有量に対して、多孔質体の量が過剰となるように量比を設定することが好ましい。
【００３７】
［微粒子］
本発明の方法において、微粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、多孔質体の細孔内に固定化された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、微粒子は、多孔質体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径Ｄ１が、多孔質体の平均細孔径Ｄ２よりも大きいものとする。
【００３８】
微粒子の形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスを均一化観点から、球状の微粒子が好ましい。また、微粒子は、平均粒径が均一であることが好ましい。
【００３９】
微粒子の平均粒径Ｄ１は、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲が好ましく、多孔質体の平均細孔径Ｄ２の１．２倍以上がより好ましく、１．５倍以上がさらに好ましく、１．８倍以上、例えば約２倍が特に好ましい。多孔質体の平均細孔径が３０〜１５０ｎｍ程度の場合、微粒子の平均粒径Ｄ１は１００ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましい。多孔質体の平均細孔径が５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の場合、微粒子の平均粒径は、１２０ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましく、１７０ｎｍ以上が特に好ましい。微粒子の平均粒径Ｄ１の上限は、プロテアーゼによる消化効率を高める観点から、５００ｎｍ以下が好ましく、３００ｎｍ以下がさらに好ましい。
【００４０】
微粒子は、上記のプロテアーゼを表面に固定化できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属や樹脂等が適宜に用いられる。また、金属表面を樹脂で被覆したものや、樹脂表面を金属で被覆したもの等を用いることもできる。
【００４１】
微粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁場の適用により容易に回収することができる磁気微粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気微粒子がより好ましい。磁気微粒子の基材としては、酸化鉄（マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γ‐Fe2O3））、フェライト（Fe/M)3O4などの強磁性合金が挙げられる。フェライト（Fe/M)3O4において、Mは、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンを意味し、典型的にはCo2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+などが用いられる。また、磁気微粒子を被覆する有機ポリマーとしては、ポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）、GMAとスチレンのコポリマー、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリアクリル酸メチル（PMA)などを挙げることができる。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomagなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性微粒子）が好適に用いられる。
【００４２】
上記微粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、微粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
【００４３】
スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。微粒子表面に固定化されたプロテアーゼのアクセス範囲を制御する観点から、スペーサは分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましく、２ｎｍ以下がさらに好ましい。また、スペーサの分子量は２０００以下が好ましく、１５００以下がより好ましく、１０００以下がさらに好ましい。
【００４４】
上記分子径で、プロテアーゼを固定化できるスペーサ分子は、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えば、トリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサ分子が好ましい。また、スペーサ分子のうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコール及びその誘導体、ポリプロピレングリコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びその誘導体、ポリ（エチレンテレフタル酸）及びその誘導体などの親水性分子が用いられる。
【００４５】
このようなスペーサ分子で表面修飾された微粒子もまた市販されており、それらを利用すればよい。例えば、N-ヒドロキシスクシイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾された微粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。FG beads NHSの粒子径は約２００ｎｍ±２０ｎｍであり、微粒子として非常に均質のものである。
【００４６】
［プロテアーゼ］
本発明の方法では、微粒子に固定化させるプロテアーゼとして、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを用いる。
【００４７】
トリプシンは基質特異性が高く、また切断後のペプチドのＣ末端にLys又はArgがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のための試料の作製のために好適である。またトリプシンは分子径が小さく（約３．８ｎｍ）、かつ活性部位が分子の内部に存在している。そのため、活性部位が抗体にアクセスできる領域が制限され、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めることができる。
【００４８】
本発明者等は、通常使用される質量分析グレードのトリプシンではなく、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼの使用により、個々の抗体の定量的検出に最適のペプチド断片を得ることができることを見出した。
【００４９】
本発明の方法に使用するプロテアーゼとして、例えば、自己消化によりキモトリプシン様の活性を示すことが知られている生体由来のネイティブのトリプシンを使用することができる。トリプシンのリジン残基を還元メチル化して自己消化に対する抵抗性を高めたものが質量分析グレードのトリプシンとして市販されているが、本発明において使用するトリプシンはこのようなリジン残基の還元メチル化処理を行っていないトリプシンであることが好ましい。
【００５０】
例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）はリコンビナントトリプシンであり、TPCK処理後に還元メチル化反応を施したものである。一方、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）はウシから精製したトリプシンをTPCK処理することでキモトリプシン活性を低減させたものであるが、還元ジメチル化反応を施していないプロテアーゼである。
【００５１】
本発明の方法は、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを用いることで、キモトリプシン活性を有さないトリプシン、例えば質量分析グレードのトリプシンを用いた場合に定量的検出ができなかったモノクローナル抗体を、質量分析グレードのトリプシンの消化では得られないペプチド断片を用いて定量的に検出することを可能としたものである。
【００５２】
「トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼ」としては、上記のようなキモトリプシン様の活性を示すトリプシンの使用が想定されるが、別の実施形態として、トリプシンとキモトリプシンの混合物の使用も可能である。この場合、トリプシンとして、例えばプロメガ社のトリプシンゴールドが使用でき、キモトリプシンとして、例えばシグマ社のトリプシンTPCK処理が使用できる。トリプシンとキモトリプシンの比率は、プロテアーゼ活性（Ｕ）で9：1〜1：1の比率で使用することが好適である。
【００５３】
本発明の方法において特に好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
【００５４】
［微粒子へのプロテアーゼの固定化］
プロテアーゼを微粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼと微粒子（あるいは微粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用でき、例えば、プロテアーゼをスペーサ修飾された微粒子表面に固定化する場合は、微粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、微粒子表面にプロテアーゼを固定化できる。上記のスペーサ分子の官能基を介した微粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、微粒子に表面修飾したカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC)、ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド（DIPC)等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、微粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、2官能性スクシンイミド、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3)、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。
【００５５】
スペーサ分子の官能基を介した微粒子とプロテアーゼのカップリング法は、微粒子の懸濁液にプロテアーゼ溶液を添加し、一定の条件下で混合撹拌するという簡便な操作で行うことができる。
【００５６】
微粒子表面にプロテアーゼを固定化後に、微粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化させることが好ましい。
【００５７】
［プロテアーゼ消化］
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化された微粒子とを接触させることにより、抗体がプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。接触は、液体中で行うことが好適である。ここで、「液体」とは、基質（固相）及び酵素（固相）が液相中で接触することを意味するものであり、またプロテアーゼ消化反応に適した水性媒体を意図する。
【００５８】
本発明におけるプロテアーゼ消化の条件は特に限定されず、一般的なプロテアーゼ消化と同様の条件を適宜に採用できる。例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で、通常３７℃程度の温度で、４時間〜２０時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００５９】
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化された微粒子との混合量比も特に制限されず、抗体の量に応じたプロテアーゼ量となるように設定すればよい。本発明では、多孔質体と微粒子との組み合わせにより、抗体とプロテアーゼとのアクセスが物理的に制限されるため、一般的なプロテアーゼ消化に比べて、プロテアーゼ量を多くすることが好ましい。例えば、抗体：プロテアーゼ＝３０：１〜３：１程度が好ましく、１５：１〜４：１程度がより好ましく、１０：１〜５：１程度がさらに好ましい。
【００６０】
本発明の方法では、多孔質体に抗体を固定化させたままの状態でプロテアーゼ消化が行われる。プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片は液相内に存在するため、抗体の溶出や変性操作を行うことなく、位置選択的に目的のペプチド断片が得られる。本発明の方法によれば、従来法に比して簡便な操作で、かつ位置選択的にペプチド断片の回収を行うことができる。
【００６１】
次いで、プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を検出する。検出のためには、多孔質体及び微粒子を除去することが好ましい。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の濾過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔経0.2μm、ミリポア社製）を用いて濾過することにより、多孔質体及び微粒子を簡便に除去することができる。
【００６２】
［液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）］
上記で得られたペプチド断片を含む試料を、LC-MSにより分析することで、抗体の同定や定量を行い得る。
【００６３】
ペプチド断片の分離をより確実として、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前の試料を、液体クロマトグラフ（LC）により、分離・濃縮する。LCにより試料の分離を行う場合、LCからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供しても良い。LCとタンデム質量分析を組み合わせたLC/MS/MSやLC/MSnにより分析を行うこともできる。また、LCからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。LCのカラムは特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるC30、C18、C8、C4等の疎水カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。
【００６４】
質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が抗体等の特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいて試料中のペプチド断片の濃度を決定できる。分析に際しては、必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、試料を分析に用いてもよい。
【００６５】
質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、電界脱離（FD）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を採用し得る。イオン化された試料の分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（IT）型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析を行うこともできる。
【００６６】
本発明の方法の実施のために好適な質量分析装置としては、限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、及びLCMS-8050（いずれも島津製作所社製）等の液体クロマトグラフ-三連四重極型質量分析装置、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF（いずれも島津製作所社製）等の精密質量を分析する構造解析用質量分析装置が挙げられる。
【００６７】
抗体に特異的なCDR2領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片が検出できれば、目的の抗体を同定・定量することができる。質量分析結果に基づいて抗体を同定するために、既存のデータベースを用いることもできる。また、多段階の質量分析等により、ペプチド断片のアミノ酸配列を特定することにより、抗体を同定することもできる。
【００６８】
なお、検出結果に基づいて、抗体の同定や定量を行う場合、検出対象のペプチドは、アミノ酸残基数が５〜３０程度のものが好ましく、７〜２５程度がより好ましい。
【００６９】
抗体の濃度を定量する場合、検出されたペプチド断片イオン（多段階MSの場合は、親イオンの開裂により得られたフラグメントイオン）のピーク面積やピーク強度に基づいて、抗体の量を算出できる。例えば、予め求められた検量線（較正曲線）とピーク面積との関連付けや、試料中に添加された内部標準に由来するピーク面積と試料由来のピーク面積との関連付け等によって、試料中のペプチド断片の濃度が算出され、ペプチド断片濃度に基づいて、抗体の量や濃度が算出される。
【００７０】
質量分析では、プロテアーゼ消化に続き、例えばカチオン交換樹脂（WCXおよびMCX）による精製を行うことで、抗体医薬の特異的ペプチドの高感度分析を可能とすることができる。
【００７１】
［CDR2領域のアミノ酸を含むペプチド］
本発明の方法における検出対象のペプチド断片は、抗体医薬等のモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものである。
【００７２】
抗体医薬として使用することが意図されるモノクローナル抗体は、そのアミノ酸配列情報等が公開されており、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、Fab及びFcドメイン、CDR領域、ジスルフィド結合等の情報を入手することが可能である。また、本発明の方法により、抗体とプロテアーゼとの接触が限られるため、選択的プロテアーゼ消化によって得られるペプチドの種類も限られることになる。従って、当業者であれば、特定のプロテアーゼによって消化されるペプチド断片のアミノ酸配列を予測することが可能である。
【００７３】
従って、本発明の方法によって、予測される複数のペプチド断片の検出を並行して同時に行い、抗体の検出・定量を行うことも可能である。しかしながら、より簡便な測定のために、また測定に必要となる時間の短縮及びコストの削減のために、個々の抗体において最適なペプチド断片を選択しておくことが好適である。最適なペプチド断片がわかっていれば、そのペプチド断片の検出にのみ適した質量分析条件を決定することができ、そうした情報を提供することが可能となる。
【００７４】
従って、本発明の方法は、一実施形態として、個々のモノクローナル抗体の定量のために適したCDR2領域のアミノ酸を含むペプチド断片を選択することを含む。また、本発明の別の実施形態は、個々のモノクローナル抗体の定量のために適するとして選択されたCDR2領域のアミノ酸を含むペプチド断片を検出することを含む方法を提供する。
【００７５】
例えば、本発明の方法を用いてモガムリズマブを質量分析グレードのトリプシン、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）で消化した場合に得られるペプチドの中で質量分析に適すると予測されたペプチドは、配列番号３〜９で示されるペプチドである。しかしながら、本発明者等の行った試験において、これらのペプチドは、血清試料中で、おそらくは内在性抗体の干渉により、濃度に依存した定量的検出をすることができなかった。
【００７６】
FSGVPDR（配列番号３）
FTISR（配列番号４）
FSGSGSGTDFTLK（配列番号５）
NSLYLQMNSLR（配列番号６）
HSDGNFAFGYWGQGTLVTVSSASTK（配列番号７）
GLEWVATISSASTYSYYPDSVK（配列番号８）
NIVHINGDTYLEWYLQPKGQSPQLLIYK（配列番号９）
【００７７】
これに対してプロテアーゼとしてTrypsin TPCK-treated（シグマ社製）を用いた場合に得られるペプチドの中で質量分析に適すると予測されたペプチドは、配列番号１０〜１４で示されるペプチドである。これらのペプチドについて実際に検出を行った結果、ペプチドSYYPDSVK（配列番号１０）で良好な結果を得ることができた。
【００７８】
SYYPDSVK（配列番号１０）
GMSWVR（配列番号１１）
ISRVEAEDVGVY（配列番号１２）
YLQKPGQSPQLLIYK（配列番号１３）
NIVHINGDTYLEW（配列番号１４）
【００７９】
従って、測定対象となるモノクローナル抗体がモガムリズマブである場合には、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するペプチドを検出対象として選択することが好ましい。この場合、例えば表１に記載の条件を指標にして、三連四重極型質量分析装置（例えばLCMS-8050、島津製作所）による多重反応モニタリングによって検出することができる。
【００８０】
【表１】
2016194114.tif 000003
【００８１】
［キット］
本発明は、上記した高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのキットであって、
測定対象のモノクローナル抗体を固定化するための多孔質体と、
トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを固定化した微粒子と、
前記多孔質体と前記微粒子とを接触させてモノクローナル抗体を選択的に消化するための反応容器と、
前記微粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるための緩衝液と、
を含む、上記キットに関する。
【００８２】
質量分析による測定は、非常に高精度な分析ができる一方、適切なサンプル調製と適正な分析条件の設定が非常に重要である。例えば臨床の場においてより簡便に正確な検査結果が得られるようにするために、本発明は、上記の方法を実施するために利用できるキットを提供する。
【００８３】
本発明のキットに含まれる多孔質体及び微粒子は、上記した通りである。反応容器としては、多孔質体に固定化されたモノクローナル抗体と、微粒子に固定化されたプロテアーゼとを液相中で接触させることが可能な容器であればいずれでも良く、特に限定するものではないが、質量分析で検出するサンプル調製用であることを考慮すれば、マイクロチューブやプレートとすることが好ましい。反応のために行うボルテックス又はローテーターによる混合、反応後のペプチドと多孔質体及び微粒子との分離のためのろ過等の反応工程を考慮して、当業者であれば適切な反応容器を想定することができる。
【００８４】
本発明のキットに含まれる緩衝液は、前記微粒子及び多孔質体と共に前記反応容器内に導入され、前記プロテアーゼによる消化反応をさせるためのものであって、プロテアーゼ消化のために適した反応条件を提供するものである。反応条件は、選択されるプロテアーゼ等によって、適宜決定することができ、緩衝液の組成も適宜決定することができる。
【００８５】
本発明のキットはまた、プロテアーゼ消化反応後に前記多孔質体および前記微粒子を除去して、消化反応の生成物を前記緩衝液と共に抽出するためのろ過膜を含めることができる。プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及び微粒子を除去することが必要であるためである。
【００８６】
ろ過膜は、圧力又は遠心力を加えない条件下では緩衝液及びプロテアーゼ消化によって生成するペプチドをほとんど透過せずに「反応容器の底」として機能し、かつ遠心分離等の操作の際には緩衝液及びペプチドを透過することができる「ザル」として機能するものであることが好ましい。
【００８７】
ろ過膜が緩衝液及びペプチドを透過することができるために加える遠心分離条件としては、限定するものではないが、例えば3,000〜10,000gの範囲が好ましい。本発明のキットにおいて好適に使用可能なろ過膜としては、例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社製）を挙げることができる。
【００８８】
キットが多検体を同時に処理するためのキットである場合、例えばろ過膜がPVDF製であり、ハウジング素材がポリアクリロニトリル樹脂、例えばBarex(登録商標)（三井化学ファイン株式会社製）であるものを使用することができる。
【００８９】
本発明のキットにはまた、キットの使用方法、及び／又はモノクローナル抗体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含めることができる。
【００９０】
本発明のキットはまた、１以上の内部標準ペプチドを含めることができる。内部標準ペプチドは、検体と同時に、又は別個に、同じ条件で分析することで、より確実な分析結果を提供する。内部標準ペプチドは、測定対象のモノクローナル抗体の特異的アミノ酸配列を含み、本発明のキットに含まれるプロテアーゼによる消化によって生じるペプチドとする。内部標準ペプチドには、安定同位体アミノ酸でラベルしたものを含めても良く、その場合、同位体を含まないペプチドと比較すると質量分析定量条件が異なるため、内部標準用定量条件を同封することが好ましい。
【００９１】
例えば測定対象がモガリズマブである場合、内部標準ペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチドを含めることができる。
【００９２】
本発明のキットを使用することにより、モノクローナル抗体の同定・定量のためのペプチド断片調製の操作をより簡便にすることができ、装置による自動化も容易になし得る。特に、プロテアーゼが微粒子表面に固定化された状態でキットの構成要素として提供されれば、ペプチド断片調製の操作をさらに簡略化できる。
【００９３】
［記録媒体及びメソッドパッケージ］
本発明はまた、本発明の方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、前記モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化によって得られるペプチドについての、親イオン、フラグメントイオン、及び質量分析計の電極に印加する電圧のデータを含む、上記記録媒体、並びに、上記記録媒体を含む、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の定量的検出のためのメソッドパッケージを提供する。
【００９４】
本明細書において、「メソッドパッケージ」とは、特定の測定対象に対する液体クロマトグラフ質量分析の分析条件を読取り可能な形態で含み、単独で流通可能なものをいう。メソッドパッケージに含まれるデータをLC-MSにインポートすることで、詳細な検討の末に得られた最適測定条件で分析することが可能となる。メソッドパッケージには、上記記録媒体の使用説明書を含めることもできる。
【００９５】
上記した通り、質量分析による測定は、非常に高精度な分析ができる一方、目的のイオンによって分析条件が全く異なってくるため、適正な分析条件の設定が非常に重要でありながら、非常に困難であり、条件設定のために膨大な時間を要する。こうした条件を予め準備しておくことで、実際に質量分析を行うユーザーの利便性を向上させることができる。本出願人はこれまでに、ユーザーが例えば農薬や動物医薬品の質量分析をより簡便に行うことを可能とするために、これらのLC-MSによる分析のためのメソッドパッケージを提供してきた。従って本発明は、試料中のモノクローナル抗体のLC-MSによる同定・定量のためのメソッドパッケージも提供する。
【００９６】
すなわち、本発明は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを固定化した微粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって分析することによって前記モノクローナル抗体の検出を行う方法に使用するための、前記質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記データが、限定するものではないが、例えば前記モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化によって得られるCDR2領域のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドに対して、少なくとも親イオン、フラグメントイオン、質量分析計の電極、例えば三連四重極のそれぞれ（第１四重極、第２四重極、第３四重極）に印加する電圧のデータを含む、上記記録媒体を提供する。上記記録媒体には、予想保持時間等の更なるデータを含めることもできる。尚、上記の予想保持時間、電圧データ等は、使用する機器及び測定条件等によって変動する数値であり、機器に合わせて提供することが好ましい。また、当業者には理解されるように、条件によって変動する数値についてはその変動幅も併せて提供することが好ましい。
【００９７】
記録媒体はどのような形態のものでも良く、特に限定するものではない。例えば情報を磁気的、光学的に記録することが可能なディスクやメモリを挙げることができる。
【００９８】
より具体的には、上記のメソッドパッケージ中には、例えば以下の情報及びソフト機能を含むことができる。
【００９９】
・最適化※されたペアレントイオンm/z値
・最適化されたフラグメントイオンm/z値
・最適化されたQ1 pre bias電圧値
・最適化されたQ2 collision energy電圧値
・最適化されたQ3 pre bias電圧値
・目的イオンの予想保持時間および質量分析時間
・定量値換算式
・解析結果レポート出力機能
※：各条件項目を実測し、最もイオン強度の高いもの、および最も再現性のあるm/z値を採択し、これを最適値とする。
【０１００】
本発明はまた、上記の記録媒体を含む、液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によるモノクローナル抗体の検出のためのメソッドパッケージを提供する。メソッドパッケージには、上記記録媒体の使用説明書を含めることもできる。
【０１０１】
上記の記録媒体又はメソッドパッケージの例として、特定のモノクローナル抗体に限定した情報のみを含むものが挙げられる。従って、モノクローナル抗体が、例えばモガムリズマブである場合、その分析に適した条件を記載した記録媒体またはメソッドパッケージを提供することができる。この場合、記録媒体に含まれるデータは、例えば配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチドに対する分析条件に関するものとすることができる。
【０１０２】
メソッドパッケージは、複数の質量分析装置で共通のデータを記載するものであっても良く、あるいは特定の質量分析装置による分析に適した種々のデータを記載するものであっても良い。
【０１０３】
記録媒体又はメソッドパッケージは、上記の本発明のキットと併せて、あるいはキットと別個に提供することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【０１０５】
［プロテアーゼの固定化］
以下のステップによって微粒子にプロテアーゼを固定化した。
1. FGビーズ洗浄
FGビーズNHS 200 mg（多摩川精機社製）を遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）し、保存用上清イソプロパノールを除去する。上清は、沈殿しない浮遊物も含め、慎重に除去する。
2. 酵素準備
Trypsin Gold 1 mg（プロメガ社製）又はTrypsin TPCK 5 mg（シグマアルドリッチ社製）を開封し、4 ℃に冷却した25 mM HEPES-NaOH, pH7.0に溶解する。溶解後、50 ml遠沈管に取り、氷上に静置する。酵素は25 mM HEPES-NaOH, pH7.0を用いて1回共洗いし、できる限り回収する。最終緩衝液量は25 ml程度となる。
3. FGビーズ洗浄
それぞれ10 mlの氷冷したメタノールを加え、氷冷した超音波洗浄機の中で、FGビーズの懸濁を確認してから遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）し、上清メタノールを除去する。
4. 酵素固定化反応
FGビーズの沈殿200 mgに、Trypsin Gold又はTrypsin TPCK溶液を加える。氷冷した超音波洗浄機を用いてFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで30 分間連続してボルテックスを行う。
30分間反応させた後、遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）を行い、上清を除去する。上清を回収し、BCAアッセイによりカップリング効率確認試験を行う。
5. 活性基ブロック
FGビーズの沈殿200 mgに、それぞれ25 mlの1M 2-アミノエタノール塩酸塩、pH8.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで連続ボルテックスを行う。30分間反応させてブロッキングした後、遠心分離を行い、上清を除去する。
6. 酵素ビーズ洗浄
FGビーズの沈殿200 mgに、それぞれ25 mlの25 mM HEPES-NaOH、50 mM NaCl、pH7.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで連続ボルテックスを行う。洗浄5分後、遠心分離を行い、上清を除去する。
7. 保存
プロテアーゼ終濃度0.5 μg/μlとなるように25 mM Tris-HCl、pH8.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いてFGビーズの懸濁を確認してから、それぞれ500 μlに分注する。その後-80 ℃で保存する。【０１０６】
［プロテアーゼ消化］
血漿試料中のモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化は以下のステップによって実施した。
1. 血漿からのモノクローナル抗体の回収
血漿20μlをとり、180 μlのPBS ＋ 0.1 % n-オクチル-β-D-チオグリコシド（同仁化学）で希釈する。
ここにProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）の50%懸濁液を40μl加える。室温で1〜2時間緩やかにボルテックス、もしくはロータリーミキサーで回転させることで、血漿中の抗体分子を樹脂に結合させる。遠心分離により樹脂を沈殿させ、上清を捨てる。
200μlのPBS ＋ 0.1 % n-オクチル-β-D-チオグリコシドを添加して3回洗浄することで、樹脂に非特異的に結合した血漿中タンパク質を洗浄する。次いで、200μlのPBSで1回洗浄し、界面活性剤を除去する。
2. プロテアーゼ反応
Protein G Ultralink樹脂が残っているチューブに、200μlの25 mM Tris-HCl、pH8.0を加える。次いで、これに上記で調製したトリプシン（Trypsin Gold又はTrypsin TPCK）を固定化したビーズを80μl加え、ローテータ−にセットし、37℃で6時間ゆっくり回転する。
反応後、0.2 μmの低結合性親水性PVDF膜（ミリポア社製）でろ過することで、Protein G樹脂とトリプシンを固定化したビーズを共に除去し、反応溶液を回収する。【０１０７】
［質量分析］
市販の血漿（シグマ社製）に抗体医薬をスパイクし、プロテアーゼ消化によって得られるペプチドを検出した。モノクローナル抗体として、モガムリズマブ（医薬品名ポテリジオ、協和発酵キリン）を用いた。質量分析の条件は以下の通りである。
＜HPLC条件（Nexera LC30A液体クロマトグラフシステム）＞
溶媒A：0.1% ギ酸、溶媒B：0.1% ギ酸＋アセトニトリル
流速：0.5 ml/分
グラジェント時間：1%B（1.5分）、1-40%Bグラジェント（5分）、95%B（5分）、1%B（5分）
カラム：L-column2 ODS, 2 x 50 mm（化学物質評価研究機構）
カラム温度：50℃
＜MSインターフェイス条件（LCMS-8050(島津製作所)）＞
ネブライザーガス：3 L/分
ヒーティングガス：10 L/分
ドライイングガス：10 L/分
インターフェイス温度：300℃
DL温度：250℃
ヒートブロック温度：400℃【０１０８】
［Trypsin Goldによる消化断片の検出］
図１に、モガリズマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１及び２）、及び定量用に使用したTrypsin Goldによる切断断片の配列（配列番号３〜９）及び重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列中の位置を示す。【０１０９】
上記の分析条件によってモガリズマブのTrypsin Gold切断断片（配列番号３〜９）をMRMクロマトグラムにかけた結果を図２に示す。図２に示す通り、モガリズマブ原末をそのまま分析した場合（上図）には、添加量に応じたピークが観察されたが、血漿中にモガリズマブをスパイクしたサンプル（下図）では、検出できるピークが減少した。【０１１０】
血漿中にスパイクしたTrypsin Gold切断断片（配列番号３〜９）で検出されたピークに基づいて検量線を作成した結果を図３に示す。図３の結果からわかる通り、プロテアーゼとしてTrypsin Goldを使用した場合、血漿中にスパイクしたペプチド断片の量に応じた検量線を作成することはできず、これらのペプチド断片がいずれも濃度に依存した定量的検出には適さないことが判明した。【０１１１】
［Trypsin TPCKによる消化断片の検出］
図４は、モガリズマブの定量用に使用したTrypsin TPCK切断断片の配列（配列番号１０〜１４）、及び重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列中の位置を示す。モガリズマブのTrypsin TPCK切断断片（配列番号１０〜１４）を上記と同様の条件で分析した結果を図５に示す。図５の結果から、モガリズマブ原末をそのまま分析した場合（上図）、血漿中にモガリズマブをスパイクした場合（下図）のいずれにおいても、５種のペプチド断片に由来するピークが確認された。【０１１２】
血漿中にスパイクしたTrypsin TPCK切断断片（配列番号１０〜１４）を用いて検量線を作成したところ、図６に示すように、ペプチドSYYPDSVK（配列番号１０）で定量的検出のために好適な検量線が得られ、モガリズマブの定量のために最適であることが判明した。【０１１３】
次に、ペプチドSYYPDSVK（配列番号１０）を精密質量分析におけるモガリズマブ標的ペプチドとして選択し、精密質量分析による構造同定を行った結果を図７に示す。図７の結果から、ペプチド配列から予測される通りの構造の同定が可能であることが確認された。【０１１４】
検出されたペプチドSYYPDSVK（配列番号１０）は、構造科学的解析の結果、Fv領域由来であり、Protein Data Bankで得られたヒトイムノグロブリン分子の立体構造において最も外側に位置することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の方法により、特定のプロテアーゼを用いて抗体を選択的に消化し、得られたペプチド断片を質量分析することで、試料中の抗体を定量することができる。本発明の方法は、操作が簡便で、かつ再現性や定量性を確保することができる。【０１１６】
現在、抗体医薬は40品目が上市されており、さらに前臨床試験は300程度、動物試験を含む全臨床試験では2,000種以上、研究段階やシーズも含めると5,000種を超えると言われている。本発明は、このような多種多様な抗体医薬に対し、極めて汎用性の高い分析手法を提供できるものであり、今後の抗体医薬開発の加速に寄与できる。【０１１７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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