(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位、１３６位及び１９１位から選択される１個以上のアミノ酸が置換されている配列を含む変異体ＢｌａＲ１タンパク質であって、配列番号1のアミノ酸配列からなる野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質と比較してβ−ラクタム系抗生物質との結合能が強化され、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、前記変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質を発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ−ラクタム系抗生物質との結合能が強化されたＢｌａＲ１（β-ｌａｃｔａｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）の変異体タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポジティブリストとは、食品衛生法に基づく、食品中に残留する農薬、動物用医薬品及び飼料添加物（以下「農薬等」という。）に関する残留基準を定めたもので、ポジティブリスト制度は、一定量以上の農薬等が残留する食品の販売等を禁止する制度である。例えば、乳中のベンジルペニシリンの基準値は４ｐｐｂとなっている。このようなポジティブリスト制度を受けて、食品中のβ−ラクタム系抗生物質を検出する方法として、β−ラクタム系抗生物質と細菌の細胞膜に存在する受容体との結合能を利用して、牛乳などの飲料や食品中の抗生物質を検出する系が知られている（特許文献１）。
【０００３】
特許文献１にはβ−ラクタム環を含む抗生物質（β−ラクタム系抗生物質）に対して感受性であるバチルス・リケニホルミス (Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ)の受容体を認識剤として用いて、生物流体中のβ−ラクタム系抗生物質を測定する方法が記載されている。特許文献１で用いられている受容体は、Ｙ． Ｚｈｕ ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．, １１３７-１１４１, (１９９０) に記載されるＢｌａＲ受容体又はＢ．  Ｊｏｒｉｓ ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ， １０７-１１４, (１９９０) に記載されるＢｌａＲのカルボキシ末端領域であるＢｌａＲ−ＣＴＤ受容体を含む。ＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤ受容体は、極めて迅速に極めて多数の抗生物質と複合体を形成することができ、既知の認識剤、例えばバチルス・ステアロサーモフィルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ)から得られる受容体が要するより短い時間で反応できるという利点を有する。
しかしながら、特許文献１の方法を簡易迅速検査法（例えば、テストストリップ）に応用した場合、その検出感度は、農薬等のポジティブリストの基準値を辛うじて上回るに過ぎず、信頼性が高いとはいえない。
【０００４】
また検出感度を向上させる方法として、抗生物質結合性タンパク質を蛍光物質や酵素などで標識することが行われている。
例えば特許文献２は、抗生物質感受性微生物（好ましくはバチルス・スアテロサーモフィルス株）から調製した抗生物質結合性タンパク質を、酵素標識して用いる抗生物質の検出方法により微量の抗生物質の検出を容易に行なうことができることを開示している。又特許文献３には、既知の系統の微生物、好ましくは、黄色ブドウ球菌から単離されるβ−ラクタム系抗生物質を特異的に認識する受容体を含有する、異なる系列の抗生物質を同時に分析するための分析用キットであって、各抗生物質結合性タンパク質を化学的に修飾して発色錯体を形成させ、検出する方法が開示されている。
しかしながらそのような方法では検出感度の向上にも限度があり、なおより検出感度の高い系を製造することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５１８０６２
【特許文献２】特開平６−２０７９３６
【特許文献３】特表２００８−５３６１３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、β−ラクタム系抗生物質結合性タンパク質を用いた検体中のβ−ラクタム系抗生物質の検出方法において、より改良された検出感度や検出速度を実現するために、β−ラクタム系抗生物質との結合能が強化された変異体ＢｌａＲ１（β-ｌａｃｔａｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）タンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、多種類のβ−ラクタム系抗生物質と迅速に結合することが知られているバチルス・リケニフォルミス菌の膜受容体タンパク質ＢｌａＲ１のアミノ酸配列のうち、β−ラクタム系抗生物質との結合部位が存在するカルボキシル末端側を分割し、その所定の位置のアミノ酸残基を１個以上置換することで、結合能が強化された変異型タンパク質を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位、１３６位及び１９１位から選択される１個以上のアミノ酸が置換されている配列を含む変異体ＢｌａＲ１タンパク質であって、配列番号1のアミノ酸配列からなる野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質と比較してβ−ラクタム系抗生物質との結合能が強化された変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［２］前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の１９１位のアミノ酸が置換されている、前記［１］に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［３］前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の４８位及び１９１位のアミノ酸が置換されている、前記［１］又は［２］に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［４］さらに前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の１３６位のアミノ酸が置換されている、前記［３］に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［５］前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の１９１位のV（バリン）がＦ（フェニルアラニン）又はＭ（メチオニン）に置換されている、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［６］前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の４８位のＡ（アラニン）がＩ（イソロイシン）又はＶ（バリン）に置換されている、前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［７］前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列の１３６位のＬ（ロイシン）がＩ（イソロイシン）またはＭ（メチオニン）に置換されている、前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［８］配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、前記［１］に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質。
［９］前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド。
［１０］前記［９］に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１１］前記［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の変異体ＢｌａＲ１タンパク質を発現する細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、結合能が強化された変異型タンパク質を得ることができる。またβ−ラクタム系抗生物質結合性タンパク質を用いた検体中のβ−ラクタム系抗生物質の検出方法において、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質と比較して結合能が強化された本発明のＢｌａＲ１の変異体タンパク質を利用することで、検体中のβ-ラクタム系抗生物質の検出速度が上がり、また、検出限界値を下げることが出来る。検体中のβ−ラクタム系抗生物質が、ポジティブリストに規定している濃度条件を満たしているか否かを明確に判定できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｂｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬと組換えＢｌａＲ１タンパク質（Ｎｏ.２〜４）の結合性を評価した結果を示す。
【図２】Ｂｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬと組換えＢｌａＲ１タンパク質（Ｎｏ.１、７、８及び１０）の結合性を評価した結果を示す。
【図３】Ｂｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬと組換えＢｌａＲ１タンパク質（No.５、６及び９）の結合性を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、バチルス・リケニフォルミス菌の膜貫通型受容体ＢｌａＲ１のアミノ酸配列のうち、β−ラクタム系抗生物質との結合部位が存在するカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の特定のアミノ酸残基を１個以上置換したアミノ酸配列を含む変異体タンパク質を対象とするものである。具体的には野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位、１３６位及び１９１位から選択される１個以上のアミノ酸を置換したアミノ酸配列を含む変異体ＢｌａＲ１タンパク質に関するものである。本発明の変異体ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質は、ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）からなるタンパク（以下「野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質」という）と比較してβ−ラクタム系抗生物質との結合能が強化されている。
【００１１】
本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位、１３６位及び１９１位（アミノ末端から４８、１３６及び１９１番目）からなる群から選択される１個以上のアミノ酸が置換されている配列からなる。
【００１２】
一態様では、本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質において、前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の１９１位のアミノ酸が置換されている。別態様では、本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質において、前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位及び１９１位のアミノ酸が置換されている。さらに別態様では本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質では、前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位、１３６位及び１９１位のアミノ酸が置換されている。
【００１３】
本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質において、好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の１９１位のＶ（バリン）がＦ（フェニルアラニン）、Ｍ（メチオニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｉ（イソロイシン）又はＹ（チロシン）に置換され、より好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の１９１位のＶ（バリン）がＦ（フェニルアラニン）又はＭ（メチオニン）に置換されている。１９１位のＶ（バリン）がＭ（メチオニン）に置換されている場合、４８位のＡ（アラニン）がＬ（ロイシン）に置換されていないことが好ましい。
本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質において、好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位のＡ（アラニン）がＩ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）又はＶ（バリン）に置換され、より好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位のＡ（アラニン）がＩ（イソロイシン）又はＶ（バリン）に置換されている。本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質は、好ましくは前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の１３６位のＬ（ロイシン）がＩ（イソロイシン）又はＭ（メチオニン）に置換されている。
【００１４】
一態様では、本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質は前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位のＡ（アラニン）がＩ（イソロイシン）又はＶ（バリン）に置換され、かつ１９１位のＶ（バリン）がＦ（フェニルアラニン）又はＭ（メチオニン）に置換され、さらに任意に、１３６位のＬ（ロイシン）がＩ（イソロイシン）又はＭ（メチオニン）に置換されている。好ましい態様としては、前記野生型ＢｌａＲ１のカルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の４８位のＡ（アラニン）がＩ（イソロイシン）又はＶ（バリン）に置換され、かつ１９１位のＶ（バリン）がＦ（フェニルアラニン）に置換され、さらに任意に、１３６位のＬ（ロイシン）がI（イソロイシン）又はＭ（メチオニン）に置換されている。
【００１５】
好ましくは、変異体ＢｌａＲ１タンパク質は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、最も好ましくは配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくは配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１６】
本発明は、変異体ＢｌａＲ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを含むベクター、さらには変異体ＢｌａＲ１タンパク質を発現する細胞にも関する。
【００１７】
本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質は遺伝子工学的手法により製造することができる。
具体的には、まず本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド類を調製する。
【００１８】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合によって互いが結合したヌクレオチドポリマーを指し、それらにはＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸が含まれる。本発明で提供されるポリヌクレオチド類については、変異体ＢｌａＲ１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて当業者にとって公知な標準的な方法で合成することができる。
【００１９】
次に、本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド類を含む発現ベクターを使用して、細胞内で複製維持が可能であり、このタンパク質を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、細胞において本発明の変異体ＢｌａＲ１タンパク質を生産させることができる。組換え技術については、当業者に公知の標準的な方法で行うことが出来る。
【００２０】
本明細書で用いられる発現ベクターとしては、これに限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ、哺乳動物用プラスミド、ウイルスベクター、植物用ベクターなどを用いることができる。本明細書で用いられる細胞という用語は、インビトロでの細胞培養物を指し、それらには原核細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、霊長類細胞、およびヒト細胞が含まれるが、それらに限定されない。
【実施例】
【００２１】
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２２】
変異体タンパク質の設計
β−ラクタム系抗生物質との結合能の向上を目標に、バチルス・リケニフォルミス菌の膜貫通型受容体タンパク質ＢｌａＲ１のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ１７３６８）のうち、カルボキシル末端側の細胞外ドメイン配列（配列番号１）の１個以上のアミノ酸を置換した配列を有する新規な変異型タンパク質を設計した（表１）。表中、数字は配列番号１に示す野生型ＢｌａＲ１タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列のアミノ末端のアミノ酸を１としたときのアミノ酸残基の位置である。また、アミノ酸番号の左側が置換前のアミノ酸、右側が置換後のアミノ酸を意味する。例えば、Ａ４８Ｉは、アミノ末端から４８番目のＡ（アラニン）をＩ（イソロイシン）に置換したことを表している。
【００２３】
【表１】
0006987593.tif 000002
【００２４】
製造例  組換えＢｌａＲ１タンパク質の作製
変異型タンパク質の結合能を測定するために、まず、遺伝子組換え法により、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質及び変異型ＢｌａＲ１タンパク質を作製した。
（１）野生型及び変異型ＢｌａＲ１タンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に変換し、人工遺伝子（ＤＮＡ）を合成した。
（２）人工遺伝子をヒスチジンタグ付きタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２４（ノバジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入し、次にベクターを発現用大腸菌ＢＬ２１（ノバジェン社）に導入し形質転換した。
（３）１リットルのＬＢ培地（カナマイシン 終濃度２５μｇ/ｍｌ）に形質転換大腸菌を接種し、３７℃で振盪培養した。濁度（ＯＤ６００）が０．５〜１．０になったときに、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）溶液を１ｍｌ添加することで組換えタンパク質の発現を誘導し、さらに１５〜２５℃で２０〜４８時間振盪培養を続けた。培養液を遠心管に回収し、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により大腸菌のペレットを得た。
（４）大腸菌ペレットを４８ｍｌの結合緩衝液／ＰＭＳＦ（終濃度１ｍＭ）／ＮＰ−４０（終濃度１％）に懸濁し、氷中で超音波破砕後、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。上清を回収し０．４５μｍのフィルターを通して粗抽出液を得た。
（５）ヒスチジンタグ付きタンパク質の精製は、以下の方法により行った。
粗抽出液をカラムに通した後、結合緩衝液でカラムを洗浄し、結合緩衝液から溶出緩衝液にグラジエントをかけ溶出した。
使用した機器及びカラムの条件、緩衝液の組成は以下に示すとおりである。
【００２５】
機器：ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社）
カラム：Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社）
グラジエント：結合緩衝液１００％（０分）→溶出緩衝液１００％（２５分）
流速：５．０ｍｌ／分
分画：２．５ｍｌずつ
（結合緩衝液）
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）
３００ｍＭ  塩化ナトリウム
１０ｍＭ  イミダゾール
（溶出緩衝液）
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）
３００ｍＭ  塩化ナトリウム
５００ｍＭ  イミダゾール
【００２６】
試験例１  Ｂｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ（蛍光標識したペニシリンＶの誘導体）を用いた結合強度測定
Ｂｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と遺伝子組換え法で作製した変異型ＢｌａＲ１との結合力を測定し、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質の測定値と比較した。
（１）２０μＭ〜２．５μＭ（２０，１０，５及び２．５μＭ）の組換えＢｌａＲ１タンパク質溶液と２０μＭのＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬ溶液をそれぞれ４０μｌずつ混合し、３７℃で１５分間反応させた。
（２）反応後の溶液を２０μｌ分取し、リン酸緩衝液（１５０ ｍＭ  ＮａＣｌ / １００ ｍＭリン酸カルシウム (ｐＨ ７.４)）８０μｌと混合し、脱塩カラムを通して未反応のＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬを除き、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質を精製した。
（３）精製タンパク質溶液全量を９６穴マイクロタイタープレートのウェルに分注し、マイクロプレートリーダー（コロナ電気社，ＳＨ−９０００）で蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ，蛍光波長５１５ｎｍ）。
【００２７】
図１〜３に組換えＢｌａＲ１タンパク質濃度に対する蛍光強度をプロットしたグラフを示した。野生型及び変異型タンパク質について、近似曲線を作成し一次近似式を算出した（表２〜４）。一次近似式の傾きは結合強度を表すので、値が大きいほど結合能が強いことを示す。表５に野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質の傾きを１としたときの各試料（変異型タンパク質）の傾きの相対値をまとめた。特に試料番号２、４及び７の結合能は、野生型に比べて約１．５倍強化された。
【００２８】
【表２】
0006987593.tif 000003
【００２９】
【表３】
0006987593.tif 000004
【００３０】
【表４】
0006987593.tif 000005
【００３１】
【表５】
0006987593.tif 000006
0006987593.tif 000007
【００３２】
β−ラクタム系抗生物質（実験にはペニシリンＶの蛍光標識誘導体であるＢｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬを使用）と、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質又は変異型ＢｌａＲ１タンパク質との結合能をそれぞれ測定し、両者を比較することで、結合能が強化された変異型タンパク質が存在することを確認した。
【００３３】
試験例２  クロキサシリン(Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ)との結合性の評価
β−ラクタム系抗生物質の結合量を検出する為の一般的な方法が存在しないところ、組換えＢｌａＲ１タンパク質との結合において、Ｂｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬとＣｌｏｘａｃｉｌｌｉｎが競合関係にあることが知られていることから、試験例１で用いた蛍光標識化されたペニシリンＶであるＢｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬを利用して、変異型タンパク質のＣｌｏｘａｃｉｌｌｉｎへの結合性を評価した。
【００３４】
野生型タンパク質並びに試料番号２及び４の変異型タンパク質をそれぞれ用いて、Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎとの結合性を試験した。
（１）下記の反応液を調製し、３７℃で３０分間反応させた。
４０μＭ  ＢｌａＲ１                     ６０μｌ
１６０μＭ   Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ      ３０μｌ（対照はリン酸緩衝液 ３０μｌ）
０.４％  カザミノ酸                      １５μｌ
リン酸緩衝液                             １５μｌ
計                                 １２０μｌ
（２）反応液に１００μＭ  Ｂｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬを６０μｌ加え、さらに３７℃で３０分間反応させた。
（３）蛍光強度とタンパク質量の測定
最終反応液を等量ずつとり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、画像解析装置（バイオラッド社、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ）を用いてゲルのＵＶ強度を測定した。次いでゲルをＣＢＢ染色し、同じく画像解析装置でＣＢＢ濃度を測定した。
（４）結果
Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎを添加した場合と無添加の場合について単位タンパク質量当たりのＢｏｃｉｌｌｉｎ  ＦＬの結合量を算出した（表６）。野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質と変異型タンパクのいずれの場合もＣｌｏｘａｃｉｌｌｉｎを添加した場合にＢｏｃｉｌｌｉｎ ＦＬの結合量が減少していることから、野生型ＢｌａＲ１細胞外ドメインタンパク質と同様、変異型タンパク質はＣｌｏｘａｃｉｌｌｉｎに対しても結合することが示された。
【００３５】
【表６】
0006987593.tif 000008
【図１】
0006987593.tif 000009
【図２】
0006987593.tif 000010
【図３】
0006987593.tif 000011
【配列表】
0006987593000001.app