(57)【要約】【課題】血管新生を制御するＶＥＧＦとその受容体に関連する種々の疾患、例えば、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症及び慢性関節リウマチ等の疾患の診断及び治療に有用な、血管内皮増殖因子受容体に対する新規な核酸アプタマーを提供する。【解決手段】配列番号１〜５に示されるヌクレオチド配列を含み、ヒトＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合することを特徴とする核酸アプタマー。好ましい態様では、上記核酸アプタマーは、検出を容易とするために、その５’末端又は３’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５で示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つの核酸配列を含み、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体に対して特異的に結合することを特徴とする核酸アプタマーであって、前記アプタマーがＲＮＡの場合には、前記核酸配列においてＴはＵであることを特徴とする核酸アプタマー。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のいずれか一方又は両方である請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の両方に対して特異的に結合する請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
ＤＮＡアプタマーである請求項１〜３のいずれか記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
ＶＥＧＦ受容体が、ヒトＶＥＧＦ受容体である請求項１〜４のいずれか記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換からなる群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜５のいずれか記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、請求項１〜６のいずれか記載の核酸アプタマー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸アプタマーが蛍光発光し得る金属ナノ粒子（量子ドット）表面に吸着されている核酸アプタマー。
【請求項９】
５’末端または３’末端に蛍光標識を有する請求項１〜８のいずれかに記載の核酸アプタマーがラマン散乱活性を有する金属である金、銀、銅、鉄及び珪素から選ばれる一種以上の粒子に吸着されている核酸アプタマー。
【請求項１０】
５’末端又は３’末端が、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結される、請求項１〜６のいずれか記載の核酸アプタマー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸アプタマーを含む、ヒトＶＥＧＦ受容体の検出用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸アプタマーを含む、ヒトＶＥＧＦ受容体の検出用キット。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれかに記載の核酸アプタマーを用いることを特徴とする、血管新生に関連する疾患の診断方法。
【請求項１４】
前記核酸アプタマーを内皮細胞、血管組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料と核酸アプタマーとの結合による応答を観測することによってＶＥＧＦ受容体の存在を検出する工程を含む、請求項１３に記載の診断方法。
【請求項１５】
前記応答が、蛍光応答である、請求項１４に記載の診断方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸アプタマーを含有する、血管新生に関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１７】
前記血管新生に関連する疾患が、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症又は慢性関節リウマチである請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
標的分子に対し特異的に結合する核酸アプタマーのスクリーニング方法であって、
（ａ）標的分子と複数種の一本鎖核酸フラグメントとを接触させて、標的分子と一本鎖核酸フラグメントとの複合体を形成させ、
（ｂ）前記複合体を形成していない一本鎖核酸フラグメントを除去し、
（ｃ）前記複合体を解離させて得られる一本鎖核酸フラグメントを含む候補核酸フラグメント群を取得し、
（ｄ）前記候補核酸フラグメント群を増幅し、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の工程を複数回繰り返し、
（ｆ）所定の回数繰り返した後の候補核酸フラグメント群の塩基配列を決定し、重複して検出される塩基配列からなる重複性核酸フラグメントを特定し、
（ｇ）前記工程（ｅ）における繰り返し数の増加に伴って、存在頻度が増加する前記重複性核酸フラグメントを選択する、
工程を含む核酸アプタマーのスクリーニング方法であって、
前記標的分子が、ファミリーを構成する複数種の分子の１つであり、その各分子を交互に用いて前記工程（ｅ）を繰り返すことを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体に対して特異的に結合し得る核酸及びその核酸を含む組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、生理的な条件下のみならず、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症及び慢性関節リウマチ等の疾患に関連する重要な生物学的過程である。血管新生には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Vascular Endothelial Growth Factor）とその受容体、アンジオポエチン−Ｔｉｅ受容体、エフリン−Ｅｐｈ４受容体等の多くのシグナル伝達系が関与するが、とりわけＶＥＧＦとその受容体は、血管内皮細胞の増殖や血管透過性の亢進に関与する重要な役割を果たす。【０００３】
ＶＥＧＦは，内皮細胞特異的増殖因子であり、分子量約２０ｋＤａのサブユニットによる二量体が形成された３４〜４５ｋＤａの糖タンパク質であって，新脈管形成の促進、血管透過性の増強およびその他の活性などの広い範囲の活性を有する。ＶＥＧＦは成長因子の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーに属しており、ＰＤＧＦのＡおよびＢ鎖とアミノ酸レベルで約１８％のホモロジーを有する。さらに，ＶＥＧＦは、ＰＤＧＦファミリーに属するすべての成長因子に共通の８個の保存システイン残基を含む。【０００４】
ＶＥＧＦは，特定の高親和性細胞表面レセプターに結合することにより、血管内皮細胞に対するその影響を発揮する。内皮細胞においては１５０及び１３０ｋＤａのレセプターが同定されている。ＶＥＧＦレセプターは，保存された細胞質触媒的キナーゼドメインおよび親水性のキナーゼ配列を特徴とするレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）のスーパーファミリーに属する。ＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインは、ＶＥＧＦ結合機能に関与していると考えられる７個のイムノグロブリン様ドメインから構成される。【０００５】
ＶＥＧＦの２つの最も多量かつ高親和性のレセプターは、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）である。ＶＥＧＦＲ１は、渋谷らにより初めて単離された遺伝子で、構造類似性からｆｍｓ様チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ−１）と称される（非特許文献１）。一方、ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦＲ１に比べてＶＥＧＦとの親和性は低いが自己リン酸化は高レベルで生じ、キナーゼ活性は他の代表的な受容体キナーゼとほぼ同程度である（非特許文献２）。ＫＤＲのネズミホモログは、ＫＤＲと８５％のアミノ酸ホモロジーを有し、ｆｌｋ−１（胎児肝臓キナーゼ−１）と称される（非特許文献３）。内皮細胞で発現し、病的血管新生に直接関わるＶＥＧＦＲ２は、炎症性疾患の進展にはあまり強く関与せず、単球、マクロファージ系に発現するＶＥＧＦＲ１が、炎症細胞の動員や機能活性化を介して炎症に深く関わることが示唆されている。【０００６】
特許文献１には、ＶＥＧＦ ＲＮＡを標的とするある種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＶＥＧＦ発現を阻害することが記載されている。非特許文献４には、特定のＶＥＧＦ特異的高親和性ＲＮＡアプタマーを用いてＶＥＧＦのそのレセプターへの結合を阻害することが記載されている。特許文献２には、ある種の抗ＶＥＧＦ受容体モノクローナル抗体を使用して内皮細胞に及ぼすＶＥＧＦの影響を中和することが記載されている。しかしながら、ＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合する核酸アプタマーの塩基配列に関する報告はない。【０００７】
タンパク質や細胞に対して特異的に吸着する新規のアプタマーの探索には試験管内進化法（in vitro selection法）が最も有効な手段として用いられている。特にＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の２ステップがある。（例えば、特許文献３）この選別と増幅を、選択圧を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法などが報告されている。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾も安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない様々な利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９５／０４１４２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９５／２１８６８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shibuya et al., 1990, Oncogene 5, 519
【非特許文献２】Sawano et al., 1996, Cell Growth Diff, 7, 213-221
【非特許文献３】Mathews et al., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci., USA ,88, 9026
【非特許文献４】Jellinek et al., 1994, Biochemistry 33, 10450
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のような背景の下に、本発明は、血管新生を制御するＶＥＧＦとその受容体の役割をさらに詳細に解明すること、例えば、ＶＥＧＦ受容体の種々の細胞での発現量やその経時的なモニタリングを通じて生細胞におけるその機能をより精密に検出し、これに関連する種々の疾患、例えば、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症及び慢性関節リウマチ等の疾患の診断及び治療に有用な、血管内皮増殖因子受容体に対する新規な核酸アプタマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、磁性微粒子を用いるＳＥＬＥＸ法により、ＶＥＧＦ受容体に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有する核酸がＶＥＧＦ受容体に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、一つの態様において、配列番号１〜５に示されるヌクレオチド配列を含み、ＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合することを特徴とする核酸アプタマーを提供する。ここで、これらのアプタマーがＲＮＡの場合は、配列番号１〜５の塩基配列においてＴ（チミン）はＵ（ウラシル）である。本発明の好ましい態様では、上記核酸アプタマーは、検出を容易とするために、その５’末端又は３’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。【００１３】
本発明の異なる態様では、上記本発明の核酸アプタマーを含む、ヒトＶＥＧＦ受容体の検出用組成物、検出用キット又は検出方法を提供する。好ましい態様では、前記核酸アプタマーをヒト内皮細胞、血管組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料と本発明の核酸アプタマーとの結合による応答を観測することによってヒトＶＥＧＦ受容体の存在を検出する工程を含む、血管新生に関連する疾患の診断方法である。【００１４】
本発明のさらに異なる態様において、上記本発明の核酸アプタマーを含む、血管新生に関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物、そのような治療用医薬組成物の製造のための上記本発明の核酸アプタマーの使用、又は本発明の核酸アプタマーを含む、血管新生に関連する疾患の治療用ドラッグデリバリーシステムを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＶＥＧＦ受容体の検出、血管新生に関連する疾患の診断を可能とするために有用な新規な材料としての核酸アプタマーを提供することができる。すなわち、ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合しうる新規核酸アプタマーを提供することにより、ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦとの結合部位の探索や、血管新生とその制御機構の解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】磁性微粒子の表面に固定化したＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）を用いてＳＥＬＥＸ法によるアプタマーの選別方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１８】
１．核酸アプタマー
本明細書において「核酸アプタマー」とは、例えば約２０〜２００塩基長のような短い配列を有する核酸分子であって、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖核酸分子を意味し、本発明に係る核酸アプタマーは、ＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合する機能を有する一本鎖核酸分子である。
本発明に係る核酸アプタマーの結合ターゲットとしては、ＶＥＧＦ受容体であり、好ましくはヒトＶＥＧＦ受容体であり、より好ましくはヒトＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）又はヒトＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）である。ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２は、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて培養細胞等で発現可能であり、あるいは研究用試薬として市販されている。典型的な態様において、本発明に係る核酸アプタマーは、以下に示す配列番号１〜５で表されるヌクレオチド配列を含む。なお、本明細書においては、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端方向に左から右に記載する。また、当該アプタマーがＲＮＡの場合には、前記核酸配列においてＴはＵである。
【００１９】
＜配列番号１＞
５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧＴＣ−３’
＜配列番号２＞
５’−ＧＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧ−３’
＜配列番号３＞
５’−ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧ−３’
＜配列番号４＞
５’−ＴＡＧＧＴＧＧＧＴＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧ−３’
＜配列番号５＞
５’−ＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧ−３’
【００２０】
本明細書において、用語「特異的」とは、ＶＥＧＦ受容体に対する本発明に係る核酸アプタマーの選択的結合を指す。アプタマーは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質又はそれを細胞膜上に発現する細胞を、所定の条件下において、無関係のタンパク質若しくは細胞に対する結合と比較することによって、結合特異性について試験され得る。本発明に係る核酸アプタマーは、ＶＥＧＦ受容体に対して、無関係のタンパク質若しくは細胞に対してよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、好ましくは少なくとも１０倍結合する場合に、そのアプタマーは特異的であると考えられる。「無関係のタンパク質」とは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質とは異なるタンパク質であり、その構造及び機能等がＶＥＧＦ受容体と異なればよい。特異的結合の結合様式は特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、静電的又は疎水的な相互作用等が含まれる。
【００２１】
本発明に係る核酸アプタマーは、ヒトＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号１〜５に示す配列における１もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、１〜３個であり、より好ましくは１又は２個であり、さらに好ましくは１個である。
【００２２】
また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係る核酸アプタマーの配列は、上記配列番号１〜５のそれぞれと９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の同一性を有する配列（以下、「相同体」という場合がある。）であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「配列同一性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって（例えば、Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877)または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。
【００２３】
１もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう（例えば、Loakes et al., 1997, J. Mol. Bio. 270:426-435)。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド(carbozamide)、ならびにニトロアゾール誘導体（３’−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなど）が挙げられる(Loakes, 2001, Nucleic Acids Res. 29:2437)。
【００２４】
また、本発明に係る核酸アプタマーは、ヒトＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態における核酸アプタマーの長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。
【００２５】
全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号１〜５における塩基数以上、すなわち３４塩基以上である。核酸アプタマーは１本鎖（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、その核酸アプタマーの長さは１本鎖の長さとして計算するものとする。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明に係る核酸アプタマーは、上記配列番号１〜５で示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれかの配列、及びその５’及び３’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該核酸アプタマーは、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Ｘは、配列番号１〜５で示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である。好ましくは、Ｐ１は、ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴ(配列番号６)であり、及びＰ２は、ＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ（配列番号７）である。
【００２７】
本発明に係る核酸アプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換（例えば、２’−０メチル化）、リン酸エステル部分での化学的置換（例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アセチル基等）、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、５’又は３’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明に係る核酸アプタマーは、後述のＶＥＧＦ受容体の検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば５’末端又は３’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。
【００２９】
蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
【００３０】
さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００３１】
酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを標識剤として用いてもよい。
【００３２】
ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば５’末端又は３’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、銅、鉄、珪素、量子ドットなどを用いることができる。
【００３３】
２．核酸アプタマーの選別
本発明の核酸アプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment：ＳＥＬＥＸ法）が用いられる。
【００３４】
当該ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)による指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより、ターゲット物質に親和性を有する核酸分子（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）を得るというものである。
【００３５】
なお、これら以外にも当該技術分野において周知の方法を用いて本発明の核酸アプタマーを選別及び取得することもできる。
【００３６】
上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール（例えば、ＤＮＡプール）から標的分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。当該選択されたアプタマー分子のみをＰＣＲ法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができる。
【００３７】
具体的には、まず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムなヌクレオチド配列（塩基配列）領域を含む一本鎖核酸フラグメントを調製する。ランダマイズされた一本鎖核酸フラグメント群の作製は、化学的核酸合成法、自動核酸合成機を利用した合成法、ＰＣＲ法等の増幅を利用した合成法、これらの組み合わせなどによって行うことができる。ＤＮＡからＲＮＡの作製のために、二本鎖ＤＮＡライブラリーを鋳型にして例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写によって一本鎖ＲＮＡライブラリーを作成することもできる。これらの一本鎖核酸フラグメントは、ＰＣＲ増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。
【００３８】
プライマー認識配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基程度である。また、ＰＣＲ増幅後の一本鎖ＤＮＡを電気泳動などで分離可能とするために、５’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。
【００３９】
次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸フラグメント（ライブラリープール）と、磁性微粒子等の担体に固定化した標的分子とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を遠心機にかけて、核酸フラグメント−標的分子複合体と遊離核酸フラグメントとを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた複合体から回収した一本鎖核酸フラグメントを用いてＰＣＲ反応を行うことで標的分子結合性核酸配列の増幅を行う。この後、標的分子と複合体を形成しうる核酸フラグメントを当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうち細胞結合能を有するｓｓＤＮＡを分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたｓｓＤＮＡをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。
【００４０】
上述の核酸フラグメントと標的分子との混合、標的分子と結合した核酸フラグメントの分離、ＰＣＲ増幅、増幅された核酸フラグメントを再び標的分子との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸フラグメントは、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。
【００４１】
また、本発明のアプタマーの選別（スクリーニング）方法は、上記標的分子が、ファミリーを構成する複数種のタンパク質等の分子からなることが好ましい。具体的には、ＶＥＧＦ受容体のみならず、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）なども含むがこれらに限定されない。その際、そのファミリーを構成する各分子を交互に用いて前記ラウンドを繰り返すことが好ましい。このような操作を行うことにより、それぞれのファミリータンパク質に共通する立体構造部分に結合する核酸アプタマーを取得できる可能性があり、非特異的な結合を抑制して、本来の各タンパク質ファミリーの機能を担う構造部分に結合することができると考えられる。
【００４２】
したがって、本発明の１つの実施形態では、以下の工程を含む核酸アプタマーのスクリーニング方法が提供され、当該方法は、
（ａ）標的分子と複数種の一本鎖核酸フラグメントとを接触させて、標的分子と一本鎖核酸フラグメントとの複合体を形成させ、
（ｂ）前記複合体を形成していない一本鎖核酸フラグメントを除去し、
（ｃ）前記複合体を解離させて得られる一本鎖核酸フラグメントを含む候補核酸フラグメント群を取得し、
（ｄ）前記候補核酸フラグメント群を増幅し、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の工程を複数回繰り返し、
（ｆ）所定の回数繰り返した後の候補核酸フラグメント群の塩基配列を決定し、重複して検出される塩基配列からなる重複性核酸フラグメントを特定し、
（ｇ）前記工程（ｅ）における繰り返し数の増加に伴って、存在頻度が増加する前記重複性核酸フラグメントを選択する、工程を含み、前記標的分子が、ファミリーを構成する複数種の分子の１つであり、その各分子を交互に用いて前記工程（ｅ）を繰り返すことを特徴とする。
【００４３】
前記複合体が、担体に固定化された標的分子を用いて形成され、前記工程（ｅ）で得られた候補核酸フラグメント群と、標的分子が固定化されていない担体とを接触させて当該担体と複合体を形成しない候補核酸フラグメントをさらに選択する対抗選択工程を含むことが好ましい。
前記重複性核酸フラグメントの塩基配列は、前記標的分子が固定化されていない担体のみに結合する核酸フラグメントの塩基配列を含まないことがさらに好ましい。
【００４４】
３．ＶＥＧＦ受容体の検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係る核酸アプタマーは、ＶＥＧＦ受容体に対して特異的に結合する機能を有することから、当該ＶＥＧＦ受容体の検出において好適に用いることができ、本発明の核酸アプタマーを含む検出用組成物は、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞に対する検出マーカーとしても用いることができる。
【００４５】
具体的には、本発明の核酸アプタマーを含む検出用組成物を内皮細胞、血管組織、血液、血清及び血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料と核酸アプタマーとの結合による応答（シグナルの有無）を観測することによってＶＥＧＦ受容体の存在を検出する。
【００４６】
当該生体から採取された試料は、動物から採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、インビトロ細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。
【００４７】
また、ＶＥＧＦ受容体の存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においては核酸アプタマーの５’末端又は３’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においては核酸アプタマーの５’末端又は３’末端にＣｙ３．５（登録商標）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。
【００４８】
また、本発明のＶＥＧＦ受容体の検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるため核酸アプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいて核酸アプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸アプタマーが固相担体上に固定されたＤＮＡアレイの態様で提供されることができる。
【００４９】
例えば、核酸アプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によって核酸アプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【００５０】
４．医薬組成物及びＤＤＳ
別の態様において、本発明は、上記核酸アプタマーを含有する、ＶＥＧＦ受容体の検出、診断又は治療用医薬組成物を提供するものである。好ましくは、当該医薬組成物は、核酸アプタマーに加えて、有効量のＶＥＧＦ受容体の検出、診断又は治療のための医薬化合物（有効成分）、及び医薬上許容される担体を含むことができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物中に含まれるその他の有効成分は、血管新生に関連する疾患、例えば、腫瘍血管新生、糖尿病性網膜症又は関節リウマチ等の予防又は治療に有効なものであれば、特に限定されるものではないが、好ましくはその他の血管新生阻害剤である。かかる血管新生阻害剤の例としては、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ−β阻害剤、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、塩基性ＦＧＦ結合分子、パクリタキセル、ラパマイシン、フマギリン、ドキソルビシンおよび多数の他の薬剤等が挙げられる。
【００５２】
アテローム性動脈硬化症を回避するために一般的に使用される薬剤のクラスは、コレステロール値をコントロールする能力を有することからスタチン類と総称される。これらは、付加的特性として血管新生阻害能を有することから、本発明の医薬組成物におけるその他の医薬化合物としても有用である。
【００５３】
したがって、本発明の医薬組成物は、アトルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン等のスタチン類を含み得る。典型的には、本発明の医薬組成物は経口投与されるが、非経口投与を採用することもできる。本発明の医薬組成物に含まれるその他の薬剤は、コエンザイムＱ等の抗酸化剤、ホモシステイン濃度を下げる葉酸、ビタミンＢ６、およびＢ１２等の特定のビタミンＢ、ニコチン酸治療、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、およびフェノフィブラート等のフィブリン酸誘導体、プロブコール等のコレステロール輸送阻害剤、コレスチラミンおよびコレスチポール等の非吸収性樹脂等を含む。
【００５４】
本発明の医薬組成物中に含まれる医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明に係る医薬組成物の標的部位への送達を促進するために、当該組成物には、さらに核酸導入用試薬を含むこともできる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。  
【００５６】
本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、多様な製剤形態、例えば、カプセル剤、錠剤、液剤等の剤形をとることができ、限定はしないが、より一般的には、液剤化され、注射剤とされるか、または、経口剤とされるか、又は徐放剤とされる。
【００５８】
当該注射剤は、当該技術分野における周知の方法より調製することができる。例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等の適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。
【００５９】
経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化される。
【００６０】
徐放剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、マイクロカプセル等の剤形に製剤化される。製剤化する場合には、好ましくは、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等の安定化剤が添加され得る。
【００６１】
さらに、本発明の医薬組成物の製剤化においては、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等の必要な補助添加物を含んでもよい。
【００６２】
液状製剤とした場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００６３】
また、徐放剤とした場合、徐放用担体として例えば、可溶性コラーゲン又は可溶性コラーゲン誘導体、ゼラチン等のタンパク質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、その形態に応じた適切な投与経路により投与され得る。経口的に又は非経口的投与することが可能であるが、非経口的に投与する場合は、例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。また、徐放剤の形態にして生体内、例えば患部、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。
【００６５】
投与量及び投与回数等は、投与の目的、投与方法、癌の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、基本的には上記有効成分における望ましい投与形態に従う。
【００６６】
また、本発明の核酸アプタマーをリポソームやナノ粒子等の輸送材料の表面に付着もしくは内包させることによって、当該輸送材料中に含まれる医薬成分をＶＥＧＦ受容体に選択的に輸送することができる。従って、更なる態様において、本発明は上記核酸アプタマーを含有する、血管新生に関連する疾患の予防又は治療用ドラッグデリバリーシステムを提供するものである。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００６８】
［実施例１］  アプタマーの選別
ＳＥＬＥＸ法を用いて、３４塩基のランダムな配列を有するＤＮＡプールからＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対し特異的に結合するアプタマーの選別を行った。図１は、磁性粒子を用いるＳＥＬＥＸ法の工程を示す。詳細は以下のとおりである。用いるランダムＤＮＡは１本鎖であるが、これを以後センス鎖とする。標的分子であるＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、Ｒ＆Ｄシステムズ社から購入し、Ｐｉｅｒｃｅ社製の磁性粒子表面に固定化し、これを用いた。【００６９】
ＤＮＡプール（図１における一本鎖ＤＮＡライブラリー）は、以下の配列を有する全長が７０塩基でランダム配列部分（Ｎ）が３４塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
ＤＮＡプール  ランダム３４（日本遺伝子研究所社製）
配列：５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴ（Ｎ３４）ＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号８）
長さ：７０塩基（ランダム配列は中央の３４塩基）
分子量：２１３９１．３ｇ／ｍｏｌ
モル吸光係数：６３０４７５Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ
ランダム配列の両末端の塩基配列はＰＣＲの時に用いるプライマー配列である。
磁性粒子表面へのＶＥＧＦＲ１およびＲ２の固定化は、磁性粒子に添付してある説明書に従い行った。【００７０】
磁性粒子を用いるＳＥＬＥＸの実施例
タンパク質固定化磁性粒子を１７μＬとり、磁石を用いながらバッファーＩ（リン酸バッファー、ｐＨ７．４、Ｃａ、Ｍｇフリー、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＨＳＡ）で良く洗浄したのち、１０μＭ濃度に調整したＤＮＡプール２０μＬを添加し、３０分間室温で混ぜ合わせる。その後、磁石を用いながらバッファーＩで洗浄を３回行うことでターゲット結合性ＤＮＡと非結合性ＤＮＡを分離した。最終的に溶液を５０μＬのＴＥバッファーに置換したのち、９５℃で１０分加熱し、タンパク質固定化磁性粒子に吸着したＤＮＡをはがした。回収した上澄み液にはタンパク質結合能を有するセンス鎖ＤＮＡが含まれているので、これを、ＰＣＲ法を用いて増幅した。増幅したＤＮＡは２重鎖構造をしており、アンチセンス鎖を形成するプライマー配列にはビオチンが修飾されているため、この２重鎖から目的とするセンス鎖のみをストレプトアビジン固定化磁性粒子を用いて精製・回収した。この回収した一本鎖ＤＮＡを再びタンパク質固定化磁性粒子と混合し、上記手順を繰り返した。図１に示すように、まずＶＥＧＦＲ１固定化磁性粒子に対して上記手順を行い、その後ＶＥＧＦＲ２固定化磁性粒子に対して上記操作を行った。これを１サイクルとし、計４サイクルおよび５サイクル行ったところで得られたＤＮＡを、次世代シーケンサー（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ）を用いて解析した。この解析により得られたシーケンスデータをＲ１−４Ｒ、Ｒ１−５Ｒ、Ｒ２−４Ｒ、Ｒ２−５Ｒとする。【００７１】
さらに、上記５サイクル行ったところで得られた一本鎖ＤＮＡをＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２を修飾していない磁性粒子と混合し、まず上澄みを回収した。その後、バッファーＩで洗浄を３回行い、最終的に溶液を５０μＬのＴＥバッファーに置換したのち、９５℃で１０分加熱し、未修飾磁性粒子に対して高い親和性を有するＤＮＡを回収した。ここで得られたＤＮＡを次世代シーケンサー(Ion Torrent PGM)を用いて解析した。この解析により得られたシーケンスデータをｎｅｇａｔｉｖｅとする。また、上記操作で回収した上澄み（磁性粒子に対する親和性が低い一本鎖ＤＮＡを含む溶液）をＶＥＧＦＲ１固定化磁性粒子と混合し、上記と同様の洗浄・加熱回収・増幅・一本鎖化の操作を行った。ここで得られたＤＮＡを次世代シーケンサーを用いて解析した。この解析により得られたシーケンスデータをＲ１−６Ｒとする。さらに、ここで得られた一本鎖ＤＮＡを未修飾磁性粒子と混合し、まず上澄みを回収した。その後バッファーＩで洗浄を３回行い、最終的に溶液を５０μＬのＴＥバッファーに置換したのち、９５℃で１０分加熱し、未修飾磁性粒子に対して高い親和性を有するＤＮＡを回収した。ここで得られたＤＮＡを次世代シーケンサー(Ion Torrent PGM)を用いて解析した。この解析により得られたシーケンスデータをｎｅｇａｔｉｖｅとする。また、上記操作で回収した上澄み（磁性粒子に対する親和性が低い一本鎖ＤＮＡを含む溶液）をＶＥＧＦＲ２固定化磁性粒子と混合し、上記と同様の洗浄・加熱回収・増幅・一本鎖化の操作を行った。ここで得られたＤＮＡを次世代シーケンサーを用いて解析した。この解析により得られたシーケンスデータをＲ２−６Ｒとした。【００７２】
シーケンスデータ解析の実施例
得られたシーケンスデータ、Ｒ１−４Ｒ、Ｒ１−５Ｒ、Ｒ２−４Ｒ、Ｒ２−５Ｒ、ｎｅｇａｔｉｖｅ（×２）、Ｒ１−６Ｒ、Ｒ２−６Ｒで得られた各配列の数をソフトウエア（ＣＬＣ）を用いて解析した。さらに、これらシーケンスデータをエクスポート後、ひとつに混ぜ合わせたファイルを作成し、ソフトウエア（ＣｌｕｓｔａｌＸなど）を用いてアラインメントを行った。得られた解析結果から、ｎｅｇａｔｉｖｅの配列を含まず、且つ４Ｒから６Ｒになるにつれて存在割合が増大している配列を選び出した。このようにして選択されたＤＮＡアプタマーの塩基配列は以下のとおりである。【００７３】
＜Ｎｏ．１１（配列番号１）＞
５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧＴＣ−３’
＜Ｎｏ．１７（配列番号２）＞
５’−ＧＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧ−３’
＜Ｎｏ．１８（配列番号３）＞
５’−ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧ−３’
＜Ｎｏ．２２（配列番号４）＞
５’−ＴＡＧＧＴＧＧＧＴＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧ−３’
＜Ｎｏ．２３（配列番号５）＞
５’−ＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧ−３’
＜Ｎｏ．２４（配列番号９）＞
５’−ＧＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧ−３’【００７４】
表面プラズモン共鳴センサーを用いる結合定数の算出
表面プラズモン共鳴センサー（ｂｉａｃｏｒｅＸ）を用いて、得られた核酸アプタマーとＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対する結合能を評価した。まず、説明書に書かれている操作を参照し、核酸アプタマーをセンサーチップ表面に固定化した。その後、濃度の異なるＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２タンパク質をインジェクトしセンサーグラムを得た。このセンサーグラムを、ソフトウエア(bia-evaluation)を用いて single cycle analysisにより解析を行うことで、表１に示すような解離定数が算出できた。【００７５】
【表１】
2016158851.tif 000002
【００７６】
さらに１〜３サイクル目のシーケンスデータを用いて００７２と同様の解析を行った。選抜した塩基配列は以下のとおりである。【００７７】
＜Ｎｏ．０１（配列番号１０）＞
５’−ＧＴＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＣ−３’
＜Ｎｏ．０２（配列番号１１）＞
５’−ＧＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＣＴＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣ−３’【００７８】
表面プラズモン共鳴センサー（ｂｉａｃｏｒｅＸ）を用いて、得られた核酸アプタマーとＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対する結合能を評価した。まず、説明書に書かれている操作を参照し、ＶＥＧＦＲ１と核酸アプタマー間の結合を評価する場合はＶＥＧＦＲ１をセンサーチップ表面に固定化した。一方、ＶＥＧＦＲ１と核酸アプタマー間の結合を評価する場合は核酸アプタマーをセンサーチップ表面に固定化した。その後、表２に示した濃度の異なる核酸アプタマー又はＶＥＧＦＲ２タンパク質をインジェクトしセンサーグラムを得た。このセンサーグラムを、ソフトウエア(bia-evaluation)を用いて single cycle analysisにより解析を行うことで、表２に示すような解離定数が算出できた。  【００７９】
【表２】
2016158851.tif 000003
【００８０】
これらの結果より明らかなように、上記いずれのＤＮＡアプタマーもＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の両方に結合するという興味深い結合挙動を示すが、すべてのＤＮＡアプタマーは、ＶＥＧＦＲ２よりもＶＥＧＦＲ１により強く結合することが分かる。この理由は明らかではないが、天然のＶＥＧＦ(VEGF-A)についても、ＶＥＧＦＲ２よりもＶＥＧＦＲ１により強く結合することが知られている。つまり、本発明のＤＮＡアプタマーは、天然のリガンドと同様の結合挙動を示すことから、ＶＥＧＦの阻害剤として機能することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の核酸アプタマーは、蛍光標識等、検出手段に合わせた化学修飾が容易であるため、ＶＥＧＦ受容体の検出キットを作製するうえで抗体を利用するよりも有利であり、さらに、血管新生阻害剤等の薬物をコンジュゲートさせることで、当該薬剤をターゲット部位に確実に作用させることが可能である。また、化学合成が容易であることから、抗体のような大がかりな培養装置を必要とせず、製造のための手間やコストを抑制できるという利点もあり、その産業上の利用価値は極めて大きい。
【図１】
2016158851.tif 000004
【配列表】
2016158851000001.app
【国際調査報告】
2016158851.tif 000005
2016158851.tif 000006
2016158851.tif 000007
2016158851.tif 000008
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2016158851.tif 000013
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