(57)【要約】本発明のバイオマーカーは、食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、ＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  １１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなる。
2017131154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、
Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  Ｂ２（１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２）、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ）、２０−ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２（２０−ＯＨ  ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなることを特徴とするバイオマーカー。
【請求項２】
被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、
前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする方法。
【請求項３】
前記測定工程において、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭの含有量を測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、尿検体中の前記バイオマーカーの含有量が多い又は少ないほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する評価工程を備える、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
減感作療法に用いられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程を、イムノアッセイ又は質量分析法で行う、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
さらに、前記尿検体中に、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを内部標準として加える前処理工程を備え、前記測定工程を、質量分析法で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用キット。
【請求項１１】
さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含む、請求項１０に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
【請求項１２】
さらに、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、請求項１０又は１１に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
【請求項１３】
さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭを含む、請求項１０〜１２にいずれか一項に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
【請求項１４】
抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
【請求項１５】
さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含む、請求項１４に記載の食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食物アレルギーのバイオマーカー、食物アレルギーの検査方法、尿検体検査用キット、及び尿検体検査用スティックに関する。
本願は、２０１６年１月２９日に、日本に出願された特願２０１６−０１５６８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは食品中に含まれるアレルゲンを体内に取り込むことで起こる様々なアレルギー反応を意味する。その症状には下痢や嘔吐、皮膚炎等が挙げられる他、重篤になるとショックを起こして死に至る。国内における成人の罹患率は２．６％と高いが、新生児では５．６％とさらに高く重症例が多いため大きな問題となっている。【０００３】
よく知られている卵、牛乳、小麦以外にもアレルゲンとなり得る食品は多く、これらはごく少量の摂食でも強い症状を引き起こすため、危険である。食物アレルギーの予防にはアレルゲンの特定と摂食回避しか方法はないが、加工食品が世界的に流通する現在の食糧事情の下でそれは難しく、安心して食物を口にできない患者のＱＯＬは著しく損なわれる。また、原因物質を除去すると、特に小児の場合に、栄養に悪影響を及ぼすこともある。さらに近年の生活環境の変化は、体における免疫反応バランスを変化させ、食物アレルギー罹患率のさらなる増加や症状を悪化させる結果を招いており、その治療薬の開発、早期診断技術や食品のアレルギー原性を評価する実験系の確立が急務となっている。【０００４】
食物アレルギーの発症機構としては、ｉ）体内に侵入したアレルゲンにＴ細胞及びＢ細胞が反応してＩｇＥを産生すること、ｉｉ）アレルゲンが再度体内に入ると、ＩｇＥと結合した肥満細胞がヒスタミンなどの活性物質を放出し（脱顆粒）、強い炎症を引き起こすこと、が知られている。【０００５】
また、食物アレルギーの治療方法の一つとして、減感作療法が挙げられる。減感作療法は、医師の管理下で希釈したアレルゲンを患者に投与し、免疫寛容を誘導しようとするものである。多くのアレルギー疾患の治療法が対症療法であるのに対し、減感作療法はアレルギー疾患の作用機序に働きかけて根治を目標とする点で注目されている。減感作療法では極めて低い投与量から開始し、徐々に投与量を増やす。【０００６】
現在、食物アレルギーの診断方法として、血中ＩｇＥを測定する診断方法が用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働科学研究班による食物アレルギーの診療の手引き２０１１（http://www.allergy.go.jp/allergy/guideline/05/05_2011.pdf）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
減感作療法では、アレルゲンを徐々に投与量を増やす際に、閾値を超える量のアレルゲンを投与することで重篤な症状を引き起こすことのないよう、医師の目視による診断が行われるが、恣意的な判断であり、定量的な診断ができない。そのため、患者におけるアレルギー症状の重篤度を適切に評価する手法が必要とされる。
また、血中ＩｇＥを測定する診断方法では、アレルギー反応の有無は推測できても、発症リスクや症状の程度を知ることはできない。つまり、血中のＩｇＥ抗体の存在量と食物アレルギー症状の発症リスクや重篤度とは一致しないことが多い。また、この方法は採血が必要とされるため、医療機関にて行わなければならず、採血自体、乳幼児には負担も大きい。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、食物アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後を簡易かつ適切に評価できる検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、食物アレルギーの発症及び進行はは、肥満細胞への依存性が非常に高いことから、肥満細胞が産生する生理活性物質の代謝物が、尿に排出されて安定的に検出できることに着目し、尿検体中の脂質の網羅的濃度解析を行った。その結果、食物アレルギーの症状発現に伴って尿検体中での含有量が変化する脂質を見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、
Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  Ｂ２（１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２）、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ）、２０−ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２（２０−ＯＨ  ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなることを特徴とするバイオマーカー。
［２］被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする方法。
［３］前記測定工程において、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭの含有量を測定する、［２］に記載の方法。
［４］さらに、尿検体中の前記バイオマーカーの含有量が多い又は少ないほど、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと評価する評価工程を備える、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］食物アレルギーの治療法又は治療薬の評価に用いられる、［２］〜［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］減感作療法に用いられる、［５］に記載の方法。
［７］前記測定工程を、イムノアッセイ又は質量分析法で行う、［２］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］さらに、前記尿検体中に、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを内部標準として加える前処理工程を備え、前記測定工程を、質量分析法で行う、［７］に記載の方法。
［９］前記評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化を評価する、［２］〜［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１１］さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含む、［１０］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１２］さらに、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、［１０］又は［１１］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１３］さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭを含む、［１０］〜［１２］にいずれか一つに記載の食物アレルギーの尿検体検査用キット。
［１４］抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体、及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
［１５］さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含む、［１４］に記載の食物アレルギーの尿検体検査用スティック。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。また、減感作療法に対する反応性を評価して、安全な範囲でなるべく多くアレルゲンを投与することにより、効率よく治療を進めることができる。
また、本発明の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、本発明の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭの含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｃ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１βの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１βの含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｄ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｅ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｆ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中での６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１αの含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１αの含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｇ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中での２０−ＯＨ  ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での２０−ＯＨ  ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｈ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのＰＧＤ３の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのＰＧＤ３の含有量の相対値を示すグラフである。
【図１Ｉ】実施例１における無処置のマウスの尿検体中でのＰＧＥ３の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中でのＰＧＥ３の含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ａ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭの含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｂ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｃ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦＭの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦＭの含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｄ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１βの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１βの含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｅ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｆ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２αの含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２αの含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｇ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１４，１５−ＬＴＥ４の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１４，１５−ＬＴＥ４の含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｈ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４の含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｉ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図２Ｊ】実施例２における食物アレルギー負荷試験前のスコア０患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２の含有量を１としたときの、食物アレルギー負荷試験後のスコア０患者、及び食物アレルギー負荷試験前後のスコア２患者（ヒト）の尿検体中での１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２の含有量の相対値を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭの含有量（絶対値）を示すグラフである。
【図３Ｂ】実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量（絶対値）を示すグラフである。
【図３Ｃ】実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中での１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２の含有量（絶対値）を示すグラフである。
【図３Ｄ】実施例３における食物アレルギー負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者（ヒト）の尿検体中でのＬＴＥ４の含有量（絶対値）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜食物アレルギーのバイオマーカー＞
一実施形態として、本発明は、食物アレルギーを検査するためのバイオマーカーであって、Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅ４（ＬＴＥ４）、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  Ｂ２（１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２）、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ）、２０−ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２（２０−ＯＨ  ＰＧＥ２）、ＰＧＥ３、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ３（ＰＧＤ３）、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つからなる、バイオマーカーを提供する。
【００１５】
本実施形態のバイオマーカーによれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。
【００１６】
本明細書において、「食物アレルギー」とは、食品中に含まれるアレルゲンが体内に取り込まれることで起こる様々なアレルギー反応を意味する。食物アレルギーとしては、例えば、鶏卵、牛乳、甲殻類、小麦、果物、ナッツ類、魚介類、蕎麦等であってよく、これら以外のアレルゲンによるアレルギーも含まれる。アレルギー症状としては、皮膚、粘膜、消化器、呼吸器などに生じ、下痢、嘔吐、皮膚炎などが代表的である。
【００１７】
本明細書において、「食物アレルギーのバイオマーカー」とは、その量が、アレルギーの発症リスクやその症状の重篤度、予後の指標となる物質を意味する。
【００１８】
本実施形態のバイオマーカーについて、具体的な脂質の名称、構造式、該脂質についての簡単な説明及び食物アレルギー症状発現に伴う尿検体中の含有量の増減を以下に示す。
【００１９】
【表１】
2017131154.tif 000003
【００２０】
【化１】
2017131154.tif 000004
【００２１】
実施例に示す通り、食物アレルギー患者において、上述の１３種の脂質の尿検体中の含有量は一定期間増加又は減少が維持されるため、食物であると判断することができる。さらに、尿検体中の含有量の増加した値又は減少した値から、症状の重篤性を評価することができる。
【００２２】
本明細書において、一定期間とは、例えば、食物アレルギーの原因となる物質を摂取してから３日以上、５日以上、７日以上、１０日以上、又は２０日以上を意味する。
【００２３】
また、上述の１３種の脂質のうち、中でも、ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、又は１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２が好ましく、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、又はｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭがより好ましい。
これらの脂質の量は、肥満細胞依存的に上昇又は減少すると考えられており、肥満細胞は、食物アレルギーが起こる消化管の粘膜に非常に多く存在することが知られている。よって、食物を摂取し、消化される際に、上述の脂質の量が変化を、被検者から血液、尿、又は便を採取することによって、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。中でも、非侵襲的に採取することができ、含有量が多いことから、上述のバイオマーカーを測定する場合には、尿を試料として用いることが好ましい。
【００２４】
＜食物アレルギーの検査方法＞
一実施形態において、本発明は、被検者の尿検体中のバイオマーカーの含有量を測定する工程を備えた食物アレルギーの検査方法であって、前記バイオマーカーがＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、ＰＧＥ３、ＰＧＤ３、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つである、方法を提供する。
【００２５】
本実施形態の検査方法によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。
本実施形態の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、後述の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
【００２６】
本明細書において、「被検者」とは、食物アレルギーの可能性がある者、食物アレルギーを現に発症した者、食物アレルギーの治療を受けている者、食物アレルギーの治療薬を服用している者、食物アレルギーを有するかどうか不明な者等を意味する。また、「被検者」としては、例えば、ヒトに限らず、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ等の哺乳動物であってもよい。
【００２７】
［測定工程］
測定工程において、被検者より採取した尿を試料として用いる。本実施形態の検査方法に用いられる尿は、常法に従って採取したものを用いることができる。一回の尿であってもよく、二回以上の蓄尿であってもよい。採取した尿は、測定まで室温で保存してもよく、−４０℃以下、例えば−８０℃で保存してもよい。凍結した尿は、急速に融解させて測定に用いることができる。
なお、上述の＜食物アレルギーのバイオマーカー＞に記載したとおり、前記バイオマーカーは、被検者の血液、尿、又は便に含まれるが、非侵襲的に採取することができ、含有量が多いことから、尿を試料として用いることが好ましい。
【００２８】
上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法は、溶液中の特定の物質を検出、測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができる。本明細書において、「バイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法」という場合、その量を正確に測定するだけでなく、有無を検出すること、又は一定量より多いか少ないかだけを判定することも含む。上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量は、クレアチニン等の基準物質の量により補正してもよい。
【００２９】
また、さらに、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を測定することが好ましく、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ及びｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を測定することがより好ましい。
ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭは、国際公開第２０１６／０２１７０４号に記載の食物アレルギーのバイオマーカーであって、本発明者らによって見出されたものである。
脂質の産生及び代謝機構については、脂質の種類が多く、詳細は明らかにされていないが、ＰＧＤ２及びＴＸＢ２、並びにこれらの代謝産物（例えば、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２）は、肥満細胞由来のものであると考えられ、また、上述の１３種の脂質のうち、ＰＧＤ２及びＴＸＢ２の代謝産物以外の脂質は、肥満細胞由来のもの又はその活性によって起こる二次的な炎症反応産物であると考えられる。
よって、上述の１３種の脂質に加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
【００３０】
上述のバイオマーカーの尿検体中の含有量の測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティグ法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法、各種クロマトグラフィー技術を用いた方法（例えば、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等）、質量分析法等が挙げられ、これらに限定されない。この中でも、上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体と、尿検体中の上述のバイオマーカーとの抗原抗体反応を利用して、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定するイムノアッセイ又は質量分析法が好ましい。
【００３１】
（イムノアッセイ）
イムノアッセイは、検出可能に標識された上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、又は、検出可能に標識された上述のバイオマーカーのうちいずれか一つに特異的に結合する抗体に対する抗体（二次抗体）を用いればよい。抗体の標識方法としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ））、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＣＬＩＡ）等が挙げられる。
【００３２】
ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識された抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子で標識された抗体を用いてもよい。
【００３３】
また、イムノアッセイでは、ビオチンで標識された上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いて、酵素等で標識されたアビジン又はストレプトアビジンを結合させることで検出することもできる。
【００３４】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができる。ＥＬＩＳＡ法には競合法とサンドイッチ法とがある。
競合法では、マイクロプレート等の固相担体に、上述のバイオマーカーのうち、例えば、ＬＴＥ４に特異的に結合する抗体（以下、「抗ＬＴＥ４抗体」と呼ぶ。）を固定し、尿検体と、酵素標識された抗原として、前記抗体と反応する酵素標識されたＬＴＥ４とを添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。尿検体中のＬＴＥ４の含有量が多ければ発色は弱くなり、尿検体中のＬＴＥ４の含有量が少なければ発色は強くなるので、検量線を用いて、ＬＴＥ４の尿検体中の含有量を求めることができる。ＬＴＥ４以外のバイオマーカーを用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
【００３５】
サンドイッチ法では、固相担体に、例えば抗ＬＴＥ４抗体を固定し、尿検体を添加し、反応させた後、さらに酵素で標識された同じ抗原（ＬＴＥ４）の別のエピトープを認識する抗ＬＴＥ４抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ＬＴＥ４の尿検体中の含有量を求めることができる。ＬＴＥ４以外のバイオマーカーを用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
また、サンドイッチ法では、前記固相担体に固定した抗ＬＴＥ４抗体と、尿検体中の抗原（ＬＴＥ４）を反応させた後、まず非標識の同じ抗原（ＬＴＥ４）の別のエピトープを認識する抗ＬＴＥ４抗体を添加し、この非標識の抗ＬＴＥ４抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
【００３６】
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｓｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
【００３７】
本明細書において、「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特別な限定はなく、固相担体の形状としては、例えば、マイクロタイタープレート、基板、ビーズ、メンブレン等が挙げられる。固相担体の材質としては、シリカ、アルミナ、ガラス、金属等の無機物質、熱可塑性樹脂（例えば、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）等）、ニトロセルロース等の有機高分子物質が挙げられる。標識物質又は抗体は、上述の固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
【００３８】
上述のバイオマーカーのうちいずれか一つに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、いずれの抗体も公知の方法に従って、作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、上述のバイオマーカーのうちいずれか一つで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄種細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、上述のバイオマーカーのうちいずれか一つで免疫した非ヒト哺乳動物の血清から得ることができる。
【００３９】
（質量分析法）
測定工程において、質量分析法を用いる場合、測定工程の前に尿検体中に含まれる代謝物質を分離するための分離工程を備えていてもよい。分離工程では、尿検体中に含まれる代謝物質の時間分解分離が得られる。分離方法としては、すべてのクロマトグラフィー分離技術を用いることができ、より具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
また、分離工程において、上述のバイオマーカーのうち、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ、及びｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭは尿検体中からの分離条件が近しいため、質量分析法を用いた測定においては、好ましくは１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ、又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭ、より好ましくは１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ、及びｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭを標的のバイオマーカーとすればよい。
【００４０】
測定工程において用いられる質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法としては、例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法、直接注入質量分析法若しくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｏｎ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）法、キャピラリー電気泳動質量分析（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＣＥ−ＭＳ）法、高速液体クロマトグラフィー結合質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）法、四重極質量分析法、上述の分離方法と結合したタンデム質量分析法（例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法等）、誘導結合プラズマ質量分析（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＩＣＰ−ＭＳ）法、熱分解質量分析（Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；Ｐｙ−ＭＳ）法、イオン移動度質量分析法、飛行時間質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ；ＴＯＦ  ＭＳ）法等が挙げられる。中でも、質量分析法としては、ＬＣ−ＭＳ法又は上述の分離方法と結合したタンデム質量分析法が好ましい。
【００４１】
測定工程において、質量分析法を用いる場合、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を定量するために、内部標準を尿検体に加える前処理工程を備えていてもよい。内部標準としては、例えば、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、重水素化ＰＧＥ２等が挙げられ、これらを単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【００４２】
［評価工程］
本実施形態の検査方法において、上述の［測定工程］の後に、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量に基づき、食物アレルギーの発症リスクや重篤度を評価する評価工程を備えていてもよい。
【００４３】
評価工程において、上述のバイオマーカーのうち、ＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つの尿検体中の含有量がより多いときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。
また、上述のバイオマーカーのうち、ＰＧＥ３又はＰＧＤ３の尿検体中の含有量がより少ないときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。
【００４４】
尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量は、同一個体から複数回採取した尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定して結果を比較して判断してもよい。この場合、同一個体における重篤度や発症リスクの変化を評価することができる。また、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量がより多いか否かは、複数人から採取した尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定して結果を比較してもよい。この場合、他の人と比較して、重篤度や発症リスクが高いかどうかを評価することができる。
【００４５】
また、評価工程において、上述のバイオマーカーのうち、ＬＴＥ４、１４，１５−ＬＴＥ４、１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２０−ＯＨ  ＰＧＥ２、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つの尿検体中の含有量が所定の値より多いときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。一方、所定の値より低いときに、食物アレルギーの症状が軽い若しくは軽くなった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが低い若しくは低くなったと判断することができる。
また、上述のバイオマーカーのうち、ＰＧＥ３又はＰＧＤ３の尿検体中の含有量が所定の値より少ないときに、食物アレルギーの症状が重篤である若しくは重篤になった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが高い若しくは高くなったと判断することができる。一方、所定の値より高いときに、食物アレルギーの症状が軽い若しくは軽くなった、又は、食物アレルギーを発症するリスクが低い若しくは低くなったと判断することができる。
【００４６】
所定値（カットオフ値）は、複数の健常者又は非食物アレルギー患者の尿検体における上述のバイオマーカーの含有量と、複数の食物アレルギー患者の尿検体における上述のバイオマーカーの含有量とを比較して、常法により決定することができる。
【００４７】
また、上述の１３種のバイオマーカーに加えて、さらに、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭの尿検体中の含有量による判断を行うことで、より高い精度で食物アレルギーの症状及び発症リスクを判定することができる。より具体的には、尿中のｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ量が所定の値より高い場合に、症状が重篤である、又は発症リスクが高いと判断され、所定の値より低い場合に、症状が軽い、又は発症リスクが低いと判断される。また、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ量は一定期間上昇が維持され、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ量は一過性に上昇してすぐに低下する場合、食物アレルギーであると判断することができる。一方で、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ量に変化がなく、尿中ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ量が持続的に高値である場合、食物アレルギー以外の炎症関連性疾患の罹患を示唆することができる。
【００４８】
評価工程において、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化も評価することができる。
【００４９】
本明細書において、「肥満細胞の活性化」とは、肥満細胞の数の増大、脱顆粒の増加及び活性物質産生量の増加を意味する。尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量は、肥満細胞の増加に伴い増加又は減少し、脱顆粒抑制下では、減少または増加する。よって、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を指標として、肥満細胞の活性化を評価することができる。
【００５０】
［用途］
本実施形態の検査方法は、食物アレルギー患者に投与する治療薬、又は患者に対して行う治療方法の評価に用いることができる。例えば、治療開始前から治療開始後の任意の時点で採取した尿検体における上述のバイオマーカーの含有量を測定し、上述のバイオマーカーの含有量が減少又は増加する場合には、その治療薬又は治療方法は有効であると判断することができる。一方、上述のバイオマーカーの含有量が減少しない若しくは増加する又は増加しない又は減少する場合には、その治療薬又は治療方法は有効ではないと判断することができる。このとき、上述のバイオマーカーの含有量の減少または増加は、有意な減少又は増加でなくてもよく、減少または増加の傾向があると当業者が判断できる程度であってもよい。
【００５１】
患者に対して行う治療方法としては、例えば減感作療法等が挙げられる。減感作療法の投与経路、投与量及び投与頻度については、特別な限定はなく、患者の年齢、体重、症状などの様々な条件に応じて、適宜選択することができる。投与経路としては、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入等により個体に投与する経路が挙げられる。
【００５２】
本実施形態の検査方法は、食物アレルギーの治療薬の開発のための動物実験において、その薬の効果を評価するために用いてもよい。
【００５３】
本実施形態の検査方法は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べる際に用いてもよい。かかる検査方法は、例えば検査会社等で実施することができる。
【００５４】
＜尿検体検査用キット＞
一実施形態において、本発明は、抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群（前記１３種の抗体をまとめて、以下、「上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体」と呼ぶ。）から選ばれる少なくとも一つを含む、食物アレルギーの尿検体検査用キットを提供する。
【００５５】
本実施形態の尿検体検査用キットは、上述の検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うために使用するものであり、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
【００５６】
本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用キットを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
【００５７】
本実施形態の尿検体検査用キットは、上述のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を利用するイムノアッセイに用いることができ、上述のバイオマーカーの含有量を測定するために必要な試薬及び装置を含んでいてもよい。
【００５８】
［サンドイッチ法による測定（１）］
本実施形態の尿検体検査用キットは、サンドイッチ法によって、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、マイクロタイタープレート；抗原（ＬＴＥ４）捕捉用の抗ＬＴＥ４抗体（以下、「捕捉用抗体１」と呼ぶ。）；ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された抗ＬＴＥ４抗体（以下、「標識抗体１」と呼ぶ。）；及び、ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）又はアルカリホスファターゼ基質（例えば、ＮＰＰ等）を含んでいてもよい。
捕捉用抗体１と標識抗体１は、抗原（ＬＴＥ４）の異なるエピトープを認識するものであることが好ましい。
【００５９】
このような尿検体検査用キットの使用例を以下に説明する。まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体１を固定する。続いて、ここに尿検体を適宜希釈して添加し、インキュベートする。続いて、尿検体を除去して洗浄する。続いて、標識抗体１を添加し、インキュベートする。続いて、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて、発色を測定することにより、ＬＴＥ４の含有量を求めることができる。
ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
【００６０】
［サンドイッチ法による測定（２）］
本実施形態の尿検体検査用キットは、二次抗体を使用したサンドイッチ法によって、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、マイクロタイタープレート；抗原（ＬＴＥ４）捕捉用の抗ＬＴＥ４抗体（以下、「捕捉用抗体２」と呼ぶ。）；一次抗体としての抗ＬＴＥ４抗体（以下、「一次抗体１」と呼ぶ。）；二次抗体としての、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識された抗ＬＴＥ４抗体に対する抗体（以下、「二次抗体１」と呼ぶ。）；及び、ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）又はアルカリホスファターゼ基質（例えば、ＮＰＰ等）を含んでいてもよい。
捕捉用抗体２と一次抗体１は、抗原（ＬＴＥ４）の異なるエピトープを認識するものであることが好ましい。
【００６１】
このような尿検体検査用キットの使用例を以下に説明する。まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体２を固定する。続いて、ここに尿検体を適宜希釈して添加し、インキュベートする。続いて、尿検体を除去して洗浄する。続いて、一次抗体１を添加してインキュベートし、洗浄する。続いて、二次抗体を添加してインキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて、発色を測定することにより、ＬＴＥ４の含有量を求めることができる。また、二次抗体１を用いることにより、反応が増幅されて、検出感度を高めることができる。
ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、含有量を求めることができる。
【００６２】
上述の標識抗体１及び上述の二次抗体１は、酵素標識された抗体に限定されず、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等で標識された抗体であってもよい。
また、上述の標識抗体１及び上述の二次抗体１は、ビオチン化抗体であってもよく、この場合、本実施形態の尿検体検査用キットは、標識されたアビジン又はストレプトアビジンを含んでいてもよい。
【００６３】
［質量分析法による測定］
本実施形態の尿検体検査用キットは、質量分析法により上述のバイオマーカーを測定する場合には、さらに、内部標準として、重水素化ＬＴＣ４、重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、及び重水素化ＰＧＥ２からなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでいてもよい。これらを内部標準とすることにより、尿検体中の上述のバイオマーカーの含有量を測定する際に、分析毎の抽出効率及びイオン化効率を補正することができる。
【００６４】
重水素化ＬＴＣ４としては、例えばＬＴＣ４−ｄ５等が挙げられる。重水素化６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１αとしては、例えば、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α−ｄ４等が挙げられる。重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭとしては、例えばｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ−ｄ６等が挙げられる。重水素化ＰＧＥ２としては、例えばＰＧＥ２−ｄ４等が挙げられる。
【００６５】
本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭを含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用キットを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭの含有量を測定することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
重水素化ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭとしては、例えば、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ−ｄ６等が挙げられる。
【００６６】
本実施形態の尿検体検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マクロプレートリーダー等を含んでいてもよい。
【００６７】
本実施形態の尿検体検査用キットは、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の評価に用いることができる。
【００６８】
＜尿検体検査用スティック＞
一実施形態として、本発明は、抗ＬＴＥ４抗体、抗１４，１５−ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４抗体、抗１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２抗体、抗２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β抗体、抗６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α抗体、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ抗体、抗２０−ＯＨ  ＰＧＥ２抗体、抗ＰＧＥ３抗体、抗ＰＧＤ３抗体、抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２抗体及び抗１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２抗体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む、食物アレルギーの尿検体検査用スティックを提供する。
【００６９】
本実施形態の尿検体検査用スティックは、上述の検査方法を使用して食物アレルギーの検査を行うために使用するものであり、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
【００７０】
本実施形態の尿検体検査用スティックは、スティック状の検査薬であって、例えば、尿検体の上述のバイオマーカーの含有量が色のついたライン等で可視化されるものであればよい。
【００７１】
本実施形態の尿検体検査用スティックは、さらに、抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ抗体又は抗ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ抗体を含んでいてもよい。本実施形態の尿検体検査用スティックを用いて、上述の１３種の脂質のうち少なくともいずれか一つに加えて、ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤＭ又はｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥＭを検出することにより、複数の脂質を指標とすることができ、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定することができる。
【００７２】
尿検体検査用スティックとしては、公知のものを用いることができ、例えば、イムノクロマト法等を利用した構成とすることができる。
本実施形態の尿検体検査用スティックは、イムノクロマト法により、例えば、上述のバイオマーカーのうちＬＴＥ４の含有量を測定する場合には、金コロイドなどで標識された第１の抗ＬＴＥ４抗体が格納された抗体格納部と、ＬＴＥ４の別のエピトープを認識する第２の抗ＬＴＥ４抗体とが、セルロース膜などにライン状に固定化された判定部が細い溝でつながれた構成とすることができる。
【００７３】
このような尿検体検査用スティックの使用例を以下に説明する。尿検体検査用スティックに尿検体を添加し、抗体格納部で第１の抗ＬＴＥ４抗体と、ＬＴＥ４とを抗原抗体反応させ、ＬＴＥ４−第１の抗ＬＴＥ４抗体複合体を形成させる。続いて、前記複合体が毛細管現象により溝を通って、判定部に移動する。続いて、前記複合体が、判定部に固定された第２の抗ＬＴＥ４抗体に捕捉される。続いて、金コロイドのプラズモン効果により、赤色のラインが判定部に出現することで、ＬＴＥ４を検出することができる。
ＬＴＥ４以外のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を用いた場合においても、同様の方法により、検出することができる。
【００７４】
本実施形態の尿検体検査用スティックは、食物アレルギーにおける肥満細胞の活性化の評価に用いることができる。
【００７５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
［実施例１］食物アレルギーモデルマウスにおける尿検体中脂質メディエーターの動態
（１）オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）誘導性食物アレルギーモデルマウスの作製
（１−１）感作条件
野生型のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１２週齢、雌）にオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）５０μｇ及びミョウバン１ｍｇを腹腔内投与し、２週間後にＯＶＡ５０μｇを腹腔内投与することにより、感作した。【００７７】
（１−２）刺激条件
続いて、２回目の投与から２週間後に、マウスにＯＶＡ１０ｍｇを２日おきに計１０回経口投与した。【００７８】
（１−３）尿採取
続いて、１０回目の刺激後、観察中に、マウス（ｎ＝５）の尿を採取した。コントロールとして、無処置のマウス（ｎ＝３）について観察中に、尿を採取した。【００７９】
（２）尿検体の前処理
尿上清に内部標準として、ＬＴＣ４−ｄ５、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１α−ｄ４、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ−ｄ６、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ−ｄ６、ＰＧＥ２−ｄ４を加えた。続いて、塩酸及びエタノールを用いて、尿検体をｐＨ３〜４の５０％エタノール含有溶液となるように調製した。続いて、エタノール及び精製水で平衡化したＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に、調製した尿検体を注入した。続いて、３ｍＬの水と３ｍＬ×２のヘキサンとで夾雑物を洗浄した。続いて、０．０５％ギ酸メタノールで目的の成分を溶出させた。続いて、５時間の減圧乾燥後、１００％メタノールに再溶解し、濾過した。【００８０】
（３）脂質メディエーターの測定
（２）の前処理済の尿検体について、エレクトロスプレーイオン化をイオン源とする３連四重極型質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ８０３０、島津製作所製）に注入し、ソフトウエア「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ」（島津製作所製）を用いて脂質網羅解析を行った。結果として、無処置のマウスの尿検体中での各脂質の含有量を１としたときの、食物アレルギーモデルマウスの尿検体中での各脂質の含有量の相対値を示すグラフを図１Ａ〜図１Ｉに示す。図１Ａ〜図１Ｉにおいて、「ｎａｉｖｅ」とは無処置のマウスを意味し、「ＯＶＡ×１０」とは食物アレルギーモデルマウスを意味する。【００８１】
（４）結果
図１Ａ〜図１Ｉから、ＯＶＡ誘導性食物アレルギーモデルマウスの尿検体中において、コントロール群と比較して、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α、及び２０−ＯＨ  ＰＧＥ２の５成分が有意に増加することが明らかとなった。また、ＰＧＤ３及びＰＧＥ３の２成分が有意に減少することが明らかとなった。【００８２】
［実施例２］食物アレルギー負荷試験患者（ヒト）における尿検体中脂質メディエーターの動態
（１）尿検体の入手
３〜２２歳の食物アレルギー患者（男女）に医師の監督のもと適切な負荷量及び摂取間隔で食物負荷試験を行い、症状の程度により０〜２のスコアを付けた。なお、数値が高いほど、症状が重篤な患者である。スコア０及びスコア２の患者それぞれについて、負荷試験前の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｒｅ」、「ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｒｅ」と表す。）及び負荷試験後の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔ」、「ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｏｓｔ」と表す。）を採取した。なお、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｒｅ」はｎ＝９、「ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｒｅ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｏｓｔ」」はｎ＝１０である。【００８３】
（２）尿検体の前処理
内部標準として、さらにＴＸＭ−ｄ４を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、尿検体を前処理した。【００８４】
（３）脂質メディエーターの測定
実施例１の（３）と同様の方法を用いて、（２）の前処理済み尿検体について、脂質網羅解析を行った。結果として、負荷試験前のスコア０患者の尿検体中での各脂質の含有量を１としたときの、負荷試験後のスコア０患者、及び負荷試験前後のスコア２患者の尿検体中での各脂質の含有量の相対値を示すグラフを図２Ａ〜図２Ｊに示す。【００８５】
（４）結果
図２Ａ〜図２Ｊから、ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α、１４，１５−ＬＴＥ４及び１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４の６成分が有意に増加することが明らかとなった。また、ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｒｅと比較して、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２の５成分が有意に増加することが明らかとなった。【００８６】
また、図２Ｃから、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭは、ｓｃｏｒｅ  ２  ｐｒｅにおいて、ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｒｅ及びｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔと比較して、増加していることから、食物アレルギーの体質を反映するマーカーとして使用できる可能性が示唆された。【００８７】
実施例１及び２から、マウス及びヒトにおいて、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＦ１β、１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＤ２及び１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１５−ｋｅｔｏ−ｔｅｔｒａｎｏｒ  ＰＧＥ２は、共通して有意に増加することが明らかとなった。【００８８】
一方、６，１５−ｄｉｋｅｔｏ−１３，１４−ｄｉｈｙｄｒｏ  ＰＧＦ１α及び２０−ＯＨ  ＰＧＥ２は、マウスにおいてのみ有意に増加しており、ＰＧＤ３及びＰＧＥ３は、マウスにおいてのみ有意に減少していた。
よって、上記４成分については、マウスを用いた食品のアレルギー原性を評価する実験系におけるバイオマーカーとして有用であることが示唆された。【００８９】
また、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＦＭ、２，３−ｄｉｎｏｒ−８−ｉｓｏ  ＰＧＦ２α、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、１４，１５−ＬＴＥ４、及び１１−ｔｒａｎｓ  ＬＴＥ４は、ヒトにおいてのみ有意に増加していた。
よって、上記５成分については、ヒトにおける食物アレルギーの発症リスクや重篤度を適切に評価、又は、減感作療法に対する反応性を評価するためのバイオマーカーとして有用であることが示唆された。【００９０】
［実施例３］食物アレルギー負荷試験患者（ヒト）における尿検体中脂質メディエーターの動態２
（１）尿検体の入手
３〜２２歳の食物アレルギー患者（男女）に医師の監督のもと適切な負荷量及び摂取間隔で食物負荷試験を行い、症状の程度により０〜４のスコアを付けた。なお、数値が高いほど、症状が重篤な患者である。スコア０及びスコア４の患者それぞれについて、負荷試験前の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｒｅ」、「ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｒｅ」と表す。）及び負荷試験後の尿（以下、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔ」、「ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｏｓｔ」と表す。）を採取した。なお、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｒｅ」はｎ＝８、「ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｒｅ」はｎ＝１０、「ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔ」はｎ＝８、「ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｏｓｔ」」はｎ＝１０である。【００９１】
（２）尿検体の前処理
尿上清に内部標準として、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ−ｄ６、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ−ｄ６、ＴＭＸ−ｄ４、ＬＴＣ４−ｄ５を加えた。続いて、塩酸を用いて、尿検体をｐＨ３〜４となるように調製した。続いて、メタノール及び精製水で平衡化したＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に、調製した尿検体を注入した。続いて、３ｍＬの水と３ｍＬ×２のヘキサンとで夾雑物を洗浄した。続いて、メタノールで目的の成分を溶出させた。続いて、４時間の減圧乾燥後、８０％メタノールに再溶解し、濾過した。【００９２】
（３）脂質メディエーターの測定
（２）の前処理済の尿検体について、エレクトロスプレーイオン化をイオン源とする３連四重極型質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ８０３０、島津製作所製）に注入し、ソフトウエア「ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ」（島津製作所製）を用いて脂質網羅解析を行った。結果として、負荷試験前後のスコア０及びスコア４患者の尿検体中での各脂質の含有量（絶対値）を示すグラフを図３Ａ〜図３Ｄに示す。なお、図３Ａ〜図３Ｄにおいて、縦軸の単位「ｎｇ／ｍｇ  Ｃｒｅ」は、尿検体中のクレアチン１ｍｇに対する各脂質の含有量（ｎｇ）を示している。【００９３】
（４）結果
図３Ａ〜図３Ｄから、ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ  ０  ｐｏｓｔと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ＬＴＥ４は有意に増加することが明らかとなった。また、ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｏｓｔにおいて、ｓｃｏｒｅ  ４  ｐｒｅと比較して、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ、ｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭ、１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２、ＬＴＥ４は有意に増加することが明らかとなった。
以上のことから、本発明で初めて明らかとなった１１−ｄｅｈｙｄｒｏ  ＴＸＢ２及びＬＴＥ４の２成分、並びに公知のｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＤＭ及びｔｅｔｒａｎｏｒ−ＰＧＥＭの２成分、合計４成分については、ヒトにおける食物アレルギーの発症リスクや重篤度を適切に評価、又は、減感作療法に対する反応性を評価するためのバイオマーカーとして有用であり、これら４成分を指標とすることで、食物アレルギーの有無、及び発症リスクや重篤度をより高い精度で判定できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、食物アレルギーの有無のみならず、発症リスクや重篤度を適切に評価することができる。さらに、アレルギー症状が出る前にリスクを評価して予防的治療を行うことができる。また、減感作療法に対する反応性を評価して、安全な範囲でなるべく多くアレルゲンを投与することにより、効率よく治療を進めることができる。
また、本発明の検査方法は、採血等の医療技術を必要とせず、本発明の尿検体検査用キット又は尿検体検査用スティックを用いて、小児から高齢者まで簡便に家庭で検査を行うことができる。
【図１Ａ】
2017131154.tif 000005
【図１Ｂ】
2017131154.tif 000006
【図１Ｃ】
2017131154.tif 000007
【図１Ｄ】
2017131154.tif 000008
【図１Ｅ】
2017131154.tif 000009
【図１Ｆ】
2017131154.tif 000010
【図１Ｇ】
2017131154.tif 000011
【図１Ｈ】
2017131154.tif 000012
【図１Ｉ】
2017131154.tif 000013
【図２Ａ】
2017131154.tif 000014
【図２Ｂ】
2017131154.tif 000015
【図２Ｃ】
2017131154.tif 000016
【図２Ｄ】
2017131154.tif 000017
【図２Ｅ】
2017131154.tif 000018
【図２Ｆ】
2017131154.tif 000019
【図２Ｇ】
2017131154.tif 000020
【図２Ｈ】
2017131154.tif 000021
【図２Ｉ】
2017131154.tif 000022
【図２Ｊ】
2017131154.tif 000023
【図３Ａ】
2017131154.tif 000024
【図３Ｂ】
2017131154.tif 000025
【図３Ｃ】
2017131154.tif 000026
【図３Ｄ】
2017131154.tif 000027
【国際調査報告】
2017131154.tif 000028
2017131154.tif 000029
2017131154.tif 000030
2017131154.tif 000031
2017131154.tif 000032
2017131154.tif 000033
2017131154.tif 000034
2017131154.tif 000035