(57)【要約】Ｂ型肝炎ウイルスを精度よく検出する手段の提供。配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを質量分析で検出又は測定することを含む、生体試料におけるＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定する方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを質量分析法で検出又は測定することを含む、生体試料におけるＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定する方法。
【請求項２】
生体試料がリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼで消化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、リンパ液、及び肝臓組織から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
質量分析法が、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、イオントラップ型質量分析計、及びオービトラップ型質量分析計から成る群より選択される質量分析計を用いる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドを生じる、前駆体ペプチド。
【請求項６】
７０アミノ酸残基以下の長さである、請求項５に記載の前駆体ペプチド。
【請求項７】
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる、請求項５又は６に記載の前駆体ペプチド。
【請求項８】
配列番号８〜３３のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項５〜７のいずれかに記載の前駆体ポリペプチド。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ポリペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための内部標準物質。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するためのキット。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号２のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号３のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号４のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号５のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号６のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、及び、配列番号７のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドから成る群より選択される少なくとも１種の同位体標識されたオリゴペプチドを同位体希釈質量分析法における内部標準物質として用いる、生体試料中のＢ型肝炎ウイルスの検出、測定、又は遺伝子型同定方法。
【請求項１２】
生体試料をリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼで消化することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
同位体希釈質量分析法でＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
質量分析法でＢ型肝炎ウイルスを検出する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）は、ヘパドナウイルス科に属するウイルスであり、外被（envelope）、コア（core）、逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼ、及び不完全環状二本鎖DNAなどを含む、直径約42 nmの球状のDNAウイルスである。HBVの外被は、large S (LHBs)、meddle S (MHBs)、small S (SHBs)３種類のアイソフォームから構成されている。これらのアイソフォームは、HBs抗原として知られている。現在、全世界で350〜400万人もの人々がHBVに感染していると考えられ、そのうちの多くの人が将来的に肝硬変や肝細胞癌を発症するリスクを有する。【０００３】
現在、HBV感染の診断は、主として、ヒト血清中に存在するHBs抗原またはその抗体を免疫法で検出することで行われている（特許文献１）。しかしながら、免疫法による検出をすりぬける抗原決定基変異体（エスケープ変異体）の出現が報告され、問題となっている。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１４２６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスをより正確に検出する手段等の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的等を解決すべく本発明者らは鋭意研究を重ね、質量分析でＢ型肝炎ウイルスを検出するというアイデアに至り、質量分析による検出に適したHBs抗原のペプチド断片を見出した。また、本発明者らは、当該ペプチド断片をプローブとして用いることにより、質量分析でＢ型肝炎ウイルスの検出が可能であるだけでなく、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の識別、及び、少量の試料中のウイルス検出も可能であることを確認した。更に、本発明者らは、当該ペプチド及びその同位体標識体を利用した同位体希釈質量分析によって、生体試料中のＢ型肝炎ウイルス抗原を定量解析することも可能であることを確認した。これらの知見及び更なる研究及び検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。【０００７】
項１．
配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを質量分析で検出又は測定することを含む、生体試料におけるＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定する方法。
項２．
生体試料がリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼで消化されている、項１に記載の方法。
項３．
生体試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、リンパ液、肝臓組織、及び培養細胞から成る群から選択される、項１又は２に記載の方法。
項４．
質量分析法が、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、イオントラップ型質量分析計、及びオービトラップ型質量分析計から成る群より選択される質量分析計を用いる、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドを生じる、前駆体ペプチド。
項６．
７０アミノ酸残基以下の長さである、項５に記載の前駆体ペプチド。
項７．
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる、項５又は６に記載の前駆体ペプチド。項８．
配列番号８〜３３のいずれかのアミノ酸配列を有する、項５〜７のいずれかに記載の前駆体ポリペプチド。
項９．
項５〜８のいずれかに記載の前駆体ポリペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための内部標準物質。
項１０．
項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するためのキット。
項１１．
配列番号１のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号２のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号３のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号４のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号５のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、配列番号６のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチド、及び、配列番号７のアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドから成る群より選択される少なくとも１種の同位体標識されたオリゴペプチドを同位体希釈質量分析法における内部標準物質として用いる、生体試料中のＢ型肝炎ウイルスの検出、測定、又は遺伝子型同定方法。
項１２．
生体試料をリジン残基及びアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼで消化することを含む、項１１に記載の方法。
項１３．
同位体希釈質量分析法でＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドの使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、次の１つ以上の効果が得られる。抗体を用いることなく精度よいＢ型肝炎ウイルスの検出が可能となる。免疫法で検出できない変異型Ｂ型肝炎ウイルスの検出が可能である。定量的なＢ型肝炎ウイルスの検出が可能である。Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の識別が可能である。簡便なＢ型肝炎ウイルスの検出が可能である。侵襲性の低いＢ型肝炎ウイルスの検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】トリプル四重極型質量分析計を用いて、生体試料中の目的タンパク質を選択反応モニタリング（SRM）により検出する典型的な手順を示す。
【図２】プローブペプチドのHBs抗原（遺伝子型C）配列内における位置を示す。
【図３】HBs抗原（遺伝子型C）のプローブペプチド（LHBs領域；上段、共通領域；下段）のタンデムMSスペクトル（左）およびSRMクロマトグラフ（右）を示す。
【図４】可溶性ポリアクリルアミドゲルを用いたタンパク質試料の質量分析用前処理スキームを示す。ゲル内でプロテアーゼを用いてタンパク質を消化した後、還元処理によりゲルを可溶化し、消化ペプチドを回収、質量分析に供す。
【図５Ａ】質量分析を用いてHBV遺伝子型を判別するためのプローブペプチド配列を示す。
【図５Ｂ】同位体希釈質量分析の内部標準として用いるための安定同位体標識ペプチドを示す。
【図５Ｃ】内部標準ペプチド(SEQ ID No:9)のトリプシン消化により得られた消化ペプチド断片（FLWEWASVX：配列番号２）のタンデムMSスペクトルを示す。
【図５Ｄ】内部標準ペプチド(SEQ ID No:6)のトリプシン消化により得られた消化ペプチド断片（QPTPISPPLX：配列番号４）のタンデムMSスペクトルを示す。
【図６】HBs抗原（遺伝子型A,B,Dの3種類）およびその内部標準ペプチドのSRM解析例を示す。培養細胞抽出液に含まれるHBs抗原を、図４の手法により消化後、SRM解析に供した。
【図７Ａ】培養細胞に発現したHBs抗原（野生型および変異体）のウェスタンブロット像を示す。
【図７Ｂ】培養細胞に発現したHBs抗原（野生型および変異体）のCLIA法による定量解析結果を示す。
【図７Ｃ】培養細胞に発現したHBs抗原（野生型および変異体）のSRMによる定量解析結果を示す。
【図８】HBs抗原（遺伝子型C）のプローブペプチド配列（LHBs領域：QPTPISPPLR（配列番号４）および共通領域：FLWEWASVR（配列番号２））内においてこれまでに知られているアミノ酸変異バリエーションを示す。
【図９Ａ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｂ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｃ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｄ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｅ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｆ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｇ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図９Ｈ】アミノ酸変異バリエーションに関するタンデムMSスペクトルおよびSRMクロマトグラフを示す。
【図１０】ヒト血清試料に含まれるHBs抗原（遺伝子型C）のSRM解析例を示す。試料A：HBV陰性血清、試料B-D：B型肝炎患者血清。[ ]：CLIA法で測定したHBs抗原値。血清試料を、図４の手法により消化後、SRM解析に供した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを質量分析法で検出又は測定することを含む、生体試料におけるＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定する方法が提供される。
【００１１】
質量分析法の1種である選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring：SRM）質量分析法を用いて生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出する原理をトリプル四重極型質量分析計を用いた場合を例に図１に示す。（１）血液等の生体試料から任意の方法でタンパク質成分を抽出する。（２）抽出したタンパク質成分をプロテアーゼ消化する。（３）消化したペプチド群を液体クロマトグラフィー等の手段を用いて分離する。（４）分離した消化ペプチドをイオン化し、質量分析に供する。（５−１）予め測定したHBs抗原の消化ペプチド（以下、「プローブペプチド」と称する場合がある）の質量電荷比と同じ質量電荷比を有するペプチドイオンのみをトリプル四重極型質量分析計のＱ１フィルタを通過させる。（５−２）Ｑ１フィルタを通過したペプチドイオンを衝突誘起解離によって断片化（フラグメンテーション）し、予め測定したプローブペプチドを断片化した際に生じる質量電荷比と同じ質量電荷比を有する断片化ペプチドのみをＱ３フィルタを通過させる。（６）目的ペプチドを断片化した際に生じる質量電荷比と同じ質量電荷比を有する断片化ペプチドが得られた場合に、生体試料中にＢ型肝炎ウイルスが存在すると判断することができる。
【００１２】
上記方法において、プローブペプチドとなるのが配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るペプチド断片である。上記の原理から明らかなように、質量分析でHBs抗原を検出するためのプローブは、HBs抗原をプロテアーゼ等で消化することによって再現性をもって生じるオリゴペプチドであること、イオン化効率が高いこと、及び翻訳後修飾による質量数変化を回避するため、アミノ酸配列内にメチオニン残基が存在しないこと等の条件を満たすことが好ましい。配列番号１〜７のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドはこれらの条件を満たす。配列番号１〜７のアミノ酸配列及びそれらが存在するHBs抗原の遺伝子型及びアイソフォームを下記の表に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
生体試料の種類及び由来等は特に制限されない。例えば、生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、リンパ液、肝臓組織、培養細胞及びＢ型肝炎ウイルス感染細胞から成る群から選択される一種以上であり得る。一実施形態において、好ましい生体試料は、血液、血漿又は血清である。また、一実施形態において、生体試料は、Ｂ型肝炎ウイルスに感染していることが疑われるヒト又はＢ型肝炎ウイルスに感染していることが確認されているヒト由来の生体試料であることが好ましい。
【００１５】
質量分析に供する生体試料は、リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼで消化されていることが好ましい。これは、このようなプロテアーゼでHBs抗原を消化することにより配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するオリゴペプチドが得られる為である。つまり、HBs抗原のアミノ酸配列において、配列番号１〜７のアミノ酸配列のＮ末端側にはアルギニン残基又はリジン残基が存在する。リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼは、特に制限されず、１種類のプロテアーゼであっても２種以上のプロテアーゼの組み合わせであってもよい。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、又はエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ製）とエンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（ロッシュ製）の組み合わせを挙げることができる。これらのプロテアーゼを用いて適切な条件下で生体試料を処理することにより、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを有する生体試料を得ることができる。
【００１６】
質量分析法は、生体試料中のHBs抗原を検出又は測定できる限り特に制限されず、公知の質量分析法及び今後開発される質量分析法を用いることができる。一実施形態において、質量分析法は、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、イオントラップ型質量分析計、及びオービトラップ型質量分析計から成る群より選択される質量分析計を用いることが好ましい。一実施形態において、好ましい質量分析計はトリプル四重極型質量分析計である。
【００１７】
表１に示す通り、配列番号１〜７のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドをプローブとしてHBs抗原を検出することにより、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を識別することができる。具体的には、質量分析によって、生体試料から配列番号１のアミノ酸配列から成るオリゴペプチド及び配列番号４のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合に、当該生体試料に含まれるＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型をＡ型又はＧ型と識別することができる。同様に、配列番号１のアミノ酸配列から成るオリゴペプチド及び配列番号５のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型はＢ型と識別することができる。配列番号２のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型はＣ型であると識別できる。配列番号３のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型はＤ型と識別できる。配列番号６のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型はＥ型と識別できる。配列番号１のアミノ酸配列から成るオリゴペプチド及び配列番号７のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドが検出された場合は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型はＦ型又はＨ型と識別することができる。
【００１８】
配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを内部標準物質として用いることにより、生体試料中のHBs抗原の量を測定すること（即ち、定量分析）ができる。配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを内部標準物として用いる場合、当該オリゴペプチドは標識されていることが好ましい。標識の種類は、質量分析法によって、内部標準物質の測定が可能である限り特に制限されない。一実施形態において、好ましい標識は同位体標識である。同位体標識された標準物質を用いた定量解析は、同位体希釈質量分析とも呼ばれる。標識されるアミノ酸残基及び数等は任意であり、特に制限されない。例えば、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを構成するアルギニン残基の全ての炭素原子を１３Ｃで標識し、全ての窒素原子を１５Ｎで標識することができる。このように同位体標識されたオリゴペプチドは、質量数のみが生体試料に由来する配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドと相違するため、予め量（濃度）を測定した内部標準物質のピークエリアの面積と対応する生体試料に由来するオリゴペプチドのピークエリアの面積を比較することによって、生体試料中のHBs抗原を測定ことができる。
【００１９】
内部標準物質として用いるオリゴペプチドは、内部標準物質として機能する限り、任意の構造を有し得る。一実施形態において、内部標準物質として用いるオリゴペプチドは、アルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼでの消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドを生じる構造を有することが好ましい。本書において、このような構造を有するペプチドを「前駆体ペプチド」とも称する。即ち、前駆体ペプチドは、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端側にアルギニン残基又はリジン残基を有し、Ｃ末端側に任意のアミノ酸残基を有し得る。このような前駆体ペプチドは、リジン残基又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼでの消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドを生じる限り、そのＮ末端側及び／又はＣ末端側に１以上の更なる他のアミノ酸残基が付加されていても良い。前駆体ペプチドには、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチド（即ち、上記１以上の他のアミノ酸が付加されていないオリゴペプチド）も含まれる。
【００２０】
配列番号４のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを生じる前駆体ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端側にリジン残基又はアルギニン残基が付加されていることが好ましい。同様に、配列番号５及び６のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを生じる前駆体ペプチドは、配列番号５及び６のアミノ酸配列のＮ末端側にリジン残基又はアルギニン残基が付加されていることが好ましい。これは、配列番号４〜６のアミノ酸配列は、Ｎ末端がグルタミン酸残基であり、これがＮ末端残基として存在すると自発的にPyro-Glu化し、定量バイアスが生じかねないためである。配列番号４〜６のアミノ酸配列のいずれかから成るオリゴペプチドのＮ末端側にリジン残基又はアルギニン残基を有する前駆体ペプチドは、更にＮ末端側に１以上の他のアミノ酸残基を有していてもよく、Ｃ末端側に１以上の他のアミノ酸残基を有していても良い。
【００２１】
前駆体ペプチドの構造は、アルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドを生じる限り、特に制限されない。一実施形態において、前駆体ポリペプチドの長さは、７０アミノ酸残基以下、６５アミノ酸残基以下、６０アミノ酸残基以下、５５アミノ酸残基以下、５０アミノ酸残基以下、４５アミノ酸残基以下、４０アミノ酸残基以下、３５アミノ酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２５アミノ酸残基以下、２０アミノ酸残基以下、又は１５アミノ酸残基以下である。
【００２２】
一実施形態において、前駆体ペプチドは、アルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる構造を有することが好ましい。このような前駆体ペプチドを用いることにより、生体試料中のHBs抗原に由来する任意のオリゴペプチドの組み合わせについて、それらの量を想定することができる。それにより、生体試料中のHBs抗原のアイソフォーム比を求めることもできる。このような前駆体ペプチドの例を下記の表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
表２に例示する前駆体ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜７のアミノ酸配列を直接（リンカー配列を介さずに）結合しているが、アルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる限り、任意のリンカー配列を介していてもよい。また、表２に例示される前駆体ペプチドは、便宜上配列番号の小さい順にＮ末端側から連結されているが、アルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる限り、それらの並びは任意である。
【００２５】
上述のように、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列から成るオリゴペプチドをプローブとすることにより、質量分析法にていわゆるエスケープ変異体を逃すことなく、HBs抗原を検出することができる。しかし、HBs抗原が配列番号１〜７に相当する領域において変異を有する場合もある。具体的には、図８に示されるような変異の存在が報告されている。図８には、上段に配列番号４のアミノ酸配列が示され、下段に配列番号２のアミノ酸配列が示される。各アミノ酸配列のアミノ酸残基を示すアルファベットの下に示されるアルファベットは、当該アミノ酸残基の置換として報告されるアミノ酸残基である。例えば、配列番号４のＮ末端のグルタミン（Ｑ）は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）に置換する場合があることが報告されている。よって、このような変異型HBs抗原は、配列番号１〜７のアミノ酸配列を変異体の配列に合わせて変更することで検出可能である。従って、本発明には、そのような変異体に応じて変更されたアミノ酸配列から成るオリゴペプチド、及び、前駆体ペプチドも含まれる。
【００２６】
前駆体ペプチドは、同位体希釈質量分析法にて生体試料中のＢ型肝炎ウイルスのタンパク質量を測定することを可能にする。よって、前駆体ペプチドを含む、同位体希釈質量分析法にて生体試料中のＢ型肝炎ウイルスのタンパク質量を測定するためのキットが提供される。当該キットには、同位体希釈質量分析法にて生体試料中のＢ型肝炎ウイルスのタンパク質量を測定するために有用な他の試薬及び使用説明書等を含めることができる。
【００２７】
上述の内部標準物質として用いるオリゴペプチド、及び、前駆体ペプチドは、当該技術分野で知られる任意の手法で製造することができる。例えば、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等の化学合成法を利用することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。【００２９】
１．HBs抗原用プローブペプチドの決定
HBs抗原用SRMアッセイの構築には、イオン化効率の高いプローブペプチド（「Proteotypic peptides」とも呼ぶ）を得るために、培養細胞由来のリコンビナントHBs抗原（遺伝子型C）を解析材料とするペプチドマッピング解析を行った。可溶化したHBs抗原をSDS-PAGEにより分離後、ゲル内でトリプシン消化を行い、HBs抗原の各アイソフォーム（LHBs, MHBs, and SHBs）に由来するトリプシン消化産物を回収した。得られた消化試料を用いてトリプル四重極型質量分析計（QTRAP5500, AB-SCIEX社製）によるタンデムMS解析を行った結果、下記の表３及び図２に示す通り、LHBs特異的配列に由来する１種類の消化ペプチド、及び全アイソフォームに共通する1種類の消化ペプチドを検出した（Confidence Score 95以上）。【００３０】
ペプチドFLWEWASVR（配列番号２）を、HBs抗原の全発現量推定用プローブペプチドとして選択した。LHBs特異的配列に由来するペプチドQPTPISPPLR（配列番号４）は、N末にGln残基を有しており、消化後に生じるPyro-Glu化を原因とする定量バイアスが生じる可能性がある。そこで、FLWEWASVR（配列番号２）とQPTPISPPLR（配列番号４）を結合した人工配列（FLWEWASVRQPTPISPPLR（配列番号８））をデザインし、その13C/15N標識体を内部標準として用いた同位体希釈質量分析をおこなうことで定量バイアスの補正を行った。尚、FLWEWASVR（配列番号２）及びQPTPISPPLR（配列番号４）は、いずれも遺伝子型ＣのHBs抗原におけるアミノ酸配列である。これらに対応する他の遺伝子型におけるアミノ酸配列は上記表１に示す通りである。【００３１】
【表３】
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【００３２】
２．ＨＢｓ抗原用SRMアッセイの構築
選択した２種類のプローブペプチドを標的とするSRMアッセイの構築には、ナノ流量の液体クロマトグラフ（ＬＣ）（NanoLC400, Ekisigent社製）に接続したトリプル四重極型質量分析計（QTRAP5500, AB-SCIEX社製）を用いた。ペプチドの分離は、C18逆相カラム（７５μｍ  ＩＤ×１５ｃｍ）により行った。ＬＣの移動相Ａには０．１％蟻酸を、移動相Ｂには０．１％蟻酸／８０％アセトニトリルを用いた。タンデムＭＳ解析時の流量は３００ｎＬ／分とし、２−２０％移動相Ｂ／３分間、２０−３０％移動相Ｂ／３２分間、３０−９０％移動相Ｂ／５分間、９０−９０％移動相Ｂ／１０分間、２−２％移動相Ｂ／１０分間のグラジエント条件で分析を行った。タンデムＭＳ解析から得られた断片化イオン情報に基づいて、HBs抗原（遺伝子型Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＤ）のＳＲＭ用パラメータを決定した。遺伝子型Ｃについて得られた断片化情報を図３に示す。得られた情報に基づいて、SRMトランジションやコリジョンエネルギー等のアッセイパラメータを設定した。トランジションの設定には、観測された二価のプレカーサーイオン（例えば、遺伝子型Ｃの場合、m/z 597.3 for FLWEWASVR（配列番号２）; m/z 553.3 for QPTPISPPLR（配列番号４））から生じる断片化イオンのうち、イオン強度が高いyイオン群を用いた。選択したトランジションを用いて培養細胞由来のリコンビナントHBs抗原（遺伝子型C）のトリプシン消化試料のSRM測定をおこない、プローブペプチドのSRMクロマトグラフを取得した（図３の右側）。取得したデータの解析には、Skyline software (MacLean B, et al., Bioinformatics. 2010 Apr 1;26(7):966-8.)を用いた。【００３３】
内部標準用ペプチドは、ペプチド内のアルギニン残基を安定同位体（13C6/15N4）で標識して合成した。精製（９５％）後の合成ペプチドの絶対量をアミノ酸分析により決定後、定量解析時の内部標準用ストック溶液（０．５ｐｍｏｌ／μＬ）を調整した。【００３４】
３．可溶性ポリアクリルアミドゲルを用いた試料前処理
難溶性の膜タンパク質であるHBs抗原の質量分析では、試料前処理工程における効率的な可溶化及びプロテアーゼ消化が再現性のある定量解析を実現する上で好ましい。これまでに本発明者らは、可溶性ポリアクリルアミドゲルを用いた難溶性タンパク質のゲル内タンパク質消化法を開発しており（Takemori N. et al., Analyt Technol Biomed Life Sci. 2014 Sep 15;967:36-40.）、この手法を用いてHBs抗原の質量分析前処理を行った。前処理スキームを図４に示す。前処理スキームを含め、次の手順で分析を行った：（１）各種生体試料からSDS溶解液によりHBs抗原を抽出、（２）N,N’-ビス（アクリロイル）シスタミン（BAC）-アクリルアミド溶液と混合することでポリアクリルアミドゲルを作成、（３）作成したゲルを洗浄することでイオン化を阻害する夾雑物を除去、（４）ゲルを乾燥後に、内部標準ペプチドとトリプシンを添加し、37℃でトリプシン消化処理を実施、（５）還元処理によりゲルを溶解、（６）消化ペプチドを回収後、逆相カラムで精製、（７）SRM分析。【００３５】
ゲル内トリプシン消化は、具体的には、次の手順で行った。ヒト培養細胞もしくはヒト血清から得られた質量分析用タンパク質試料（５μＬ）は、２００ｍＭジチオトレイトール（１μＬ）で還元処理をおこなった後、１．２Ｍアクリルアミド（１μＬ）でアルキル化処理をおこなった。還元アルキル化処理後の分析試料（７μＬ）は、３０％／０．８％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ＢＡＣ溶液（５μＬ）と混合した後、１．５％ペルオキソ二硫酸アンモニウム（１μＬ）とテトラメチルエチレンジアミン（０．５μＬ）を加えて重合反応をおこない、ポリアクリルアミドゲルを作成した。作成したアクリルアミドゲルは、洗浄液Ａ（５０ｖ／ｖ％メタノール＋５ｖ／ｖ％酢酸）および洗浄液Ｂ（５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム＋５０ｖ／ｖ％アセトニトリル）で洗浄した後、アセトニトリルを用いて水分を除き、室温で風乾した。プラスチックチューブへゲルを回収し、内部標準用ペプチド溶液（２μＬ）を添加し、４℃で３０分静置した。さらにトリプシン（０．１μｇ）を添加した後、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液（４０μＬ）中で、ゲル内消化（３７℃、２４時間）を行った。反応終了後に、５０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン溶液（２０μＬ）を加えてゲルを完全に溶解した。得られたゲル溶解液は、アセトニトリル（６０μＬ）と混合し、３０秒間撹拌した。当該溶液を１５，０００×ｇで３分間遠心分離し、別チューブへ上清を回収した。回収した上清は、２０ｍＭギ酸アンモニウム（４８０μＬ）と混合し、３ＭエムポアディスクＳＤＢ−ＸＣを用いて自作した固相抽出用ミニカラムへ添加した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸／１０％アセトニトリル（４０μＬ）で洗浄した後、０．１％トリフルオロ酢酸／３０％アセトニトリル（３０μＬ）を用いてペプチドを回収した。回収したペプチド溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸（７０μＬ）と混合し、質量分析用試料とした。【００３６】
４．遺伝子型の識別に向けたSRMアッセイの構築
上述のアッセイ構築に用いたプローブペプチド配列は遺伝子Ｃ型より得られたものであり、他の主要な遺伝子型（Ａ型、Ｂ型、及びＤ型）において対応するアミノ酸配列には１アミノ酸残基の違いが見られる（図５Ａ）。そこで、各遺伝子型を識別するために、各遺伝子型に特異的なプローブペプチドの連結体を合成し（図５Ｂ）、それを用いてアッセイ構築を行った。取得したMS/MSスペクトルを図５Ｃ及び５Ｄに示す。取得したＳＲＭクロマトグラフを図６に示す。【００３７】
５．HBV変異体の検出
HBs抗原のエピトープ領域内（D144A/G145R）における変異は、現行のイムノアッセイにおける偽陰性の主要な原因となっている。リコンビナント抗原（野生型および変異体D144A/G145R）を用いて各種抗体法（CLIA法およびWB法）による定量解析を行ったところ、推定される野生型と抗原決定基変異体の発現比は、従来の報告と同様、CLIA法とWB法では大きく異なる結果を示した（図７）。一方、SRMによるHBｓ抗原の定量解析では、エピトープ領域以外の配列をプローブとするため、CLIA法における偽陽性の問題は回避することが可能である。今回構築したSRMアッセイを用いてリコンビナント抗原の絶対量を計測した結果、WBの結果と近似した値を得ることに成功した。【００３８】
一方、プローブペプチド配列内における変異株の出現は、特異性の高いSRMを用いたHBV診断において偽陰性の主原因となることが予想される。これまでに報告された遺伝子Ｃ型のプローブ配列内におけるアミノ酸変異を図８に示す。問題の解決には、各変異配列のSRMアッセイをあらかじめ構築し、変異バリエーションの一斉モニタリングを実施することが有効と考えられる。従来、アッセイ構築に必要となる標準品の調製には時間とコストかかったが、粗精製ペプチド合成サービスを活用すれば、あらゆる変異配列をカバーしたペプチドライブラリを迅速かつ安価に合成することが可能である。試験的に遺伝子Ｃ型の主要な変異体をカバーする粗精製ペプチドセットを合成し、アッセイ構築へ利用することで、各変異体に対応したSRMトランジションを迅速に決定することに成功した（図９）。今回確立した手法は、新たな変異体の出現にも迅速に対応可能であることから、HBVより変異の頻度が高いRNAウイルス（たとえばHCVなど）のエンベロープタンパク質に対するアッセイ構築においても、極めて有効な手法となることが期待される。【００３９】
６．血中HBs抗原のターゲット分析
質量分析によるHBV感染診断には、絶対定量SRMによる血清診断法が好ましい。また近年では、侵襲性の低い血清診断の実現に向けてアッセイの小スケール化が進んでいることから、微量血清試料（サブマイクロリットルレベル）からの分析が可能な高感度SRMアッセイの開発が望まれている。そこで、これまでにリコンビナント抗原で確立した分析手法を活用して、HBV陽性血清試料に含まれるHBs抗原の定量分析を行った。使用する血清試料は、あらかじめSDS溶液と混合（終濃度１％）することでウイルス活性を不活化した。SRM分析用の試料調製には、血清0.1μｌ相当の溶液を用いておこなった。HBV陽性3検体を用いてSRM分析をおこなった結果、すべての検体で共通配列FLWEWASVR（配列番号２）を検出することに成功した（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年11月14日(2016.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜７から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列から成る同位体標識されたオリゴペプチドを生じる、前駆体ペプチド。
【請求項６】
７０アミノ酸残基以下の長さである、請求項５に記載の前駆体ペプチド。
【請求項７】
リジン残基及び／又はアルギニン残基のカルボキシル側のペプチド結合を特異的に切断するプロテアーゼによる消化によって、配列番号１〜３のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチド、並びに、配列番号４〜７のアミノ酸配列から成る群より選択される１種以上のオリゴペプチドを生じる、請求項５又は６に記載の前駆体ペプチド。
【請求項８】
配列番号８〜３３のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項５〜７のいずれかに記載の前駆体ポリペプチド。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ポリペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための内部標準物質。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドを含む、同位体希釈質量分析法で生体試料中のＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するためのキット。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
同位体希釈質量分析法でＢ型肝炎ウイルスを検出又は測定するための請求項５〜８のいずれかに記載の前駆体ペプチドの使用。
【国際調査報告】
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