(57)【要約】要約  ２種類の転写因子の結合部位を含み、それでいてサイズが小さな二本鎖オリゴヌクレオチドデコイが開示されている。２種類の転写因子に対して結合性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドデコイは、第１の転写因子に対する第１の結合部位と、第２の転写因子に対する第２の結合部位を含む。第１の結合部位のセンス鎖を含む第１の鎖と第２の結合部位のセンス鎖を含む第２の鎖とがハイブリダイズして二本鎖を形成し、第１の結合部位のセンス鎖と第２の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている。
2017043639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の転写因子に対する第１の結合部位と、第２の転写因子に対する第２の結合部位を含み、前記第１の結合部位のセンス鎖を含む第１の鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖を含む第２の鎖とがハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記第１の結合部位のセンス鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている、２種類の転写因子に対して結合性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ。
【請求項２】
サイズが13mer〜15merである請求項１記載のデコイ。
【請求項３】
前記各結合部位の少なくともいずれかは、各転写因子のコンセンサス配列に対して１個の塩基置換を有する請求項１又は２記載のデコイ。
【請求項４】
ヘアピン型の二本鎖である請求項１〜３のいずれか１項に記載のデコイ。
【請求項５】
合計２種類の異なる転写因子に対する各結合部位を含み、該２種類の異なる転写因子が以下の(1)〜(5)の組合せから選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のデコイ。
(1) NF-κBとEts1
(2) NF-κBとNF-AT
(3) NF-κBとSTAT1
(4) NF-κBとSTAT6
(5) NF-κBとNF-IL6
【請求項６】
前記２種類の異なる転写因子がNF-κBとSTAT6である請求項５記載のデコイ。
【請求項７】
配列番号１、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１５又は１６で表される塩基配列から成る請求項５記載のデコイ。
【請求項８】
配列番号１で表される塩基配列から成る請求項６記載のデコイ。
【請求項９】
サイズが15merである請求項１〜８記載のいずれか１項に記載のデコイ。
【請求項１０】
デコイを構成する二本鎖オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド間の結合の少なくとも１部にホスホロチオエート結合を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載のデコイ。
【請求項１１】
5'末端がリンカーを介して又は直接的にPLGAナノ粒子に結合されている請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種類の転写因子に結合性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ（以下、キメラデコイということがある）に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子に結合性を示す種々の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイが知られている（例えば特許文献１）。転写因子に対するデコイを投与することにより、対象となる転写因子の活性を低下させ、該転写因子に起因して起きる疾患の治療や予防を行なうことが知られている。デコイ(decoy)とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。転写因子のデコイとしては、主として転写因子のゲノム遺伝子上の結合領域と同じ塩基配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられている。このようなオリゴヌクレオチドから成るデコイの共存下では、転写因子の分子のうちの一部は、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合せずに、デコイオリゴヌクレオチドに結合する。このため、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、その結果、転写因子の活性が低下することになる。この場合、オリゴヌクレオチドは、本物のゲノム遺伝子上の結合領域の偽物（おとり)として機能して転写因子を結合するため、デコイと呼ばれる。【０００３】
複数種類の異なる転写因子に対して抑制活性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドデコイが知られている（特許文献２）。このようなデコイを投与すると、異なる複数種類の転写因子の活性を同時に抑制することが可能になり、疾患の治療又は予防上好都合である場合がある。例えば、特許文献２には、炎症に関与する転写因子であるNF-κBと、細胞増殖に関与する転写因子であるE2Fとに結合し得るデコイが開示されており、これにより人工血管吻合部の炎症反応と細胞増殖を同時に抑制して人工血管の再狭窄を予防することが記載されている。特許文献２記載の発明では、２種類の転写因子に結合する各結合部位を、数塩基の間隔を空けて同一の鎖に並列に並べており、したがって、そのサイズは、各結合部位のサイズの和よりも大きく、実施例のデコイは28mer（「mer」は二本鎖を構成する一本鎖中のヌクレオチド数を示す、以下同じ）である。同様に、特許文献３にも２種類の転写因子結合部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドデコイが記載されているが、特許文献２と同様に、２種類の転写因子結合部位を同一の鎖に並列して配置しており、各結合部位が部分的に重複してもよいことも記載されているが、デコイのサイズは20mer〜40merが好ましいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2010-090103
【特許文献２】WO2006/043722
【特許文献３】特開2010-526541
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
二本鎖オリゴヌクレオチドデコイは、所望の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成することにより製造されている。オリゴ核酸の化学合成はヌクレオシド単位の縮合合成であり、収率はホスホロチオエート型DNAの場合1単位当たり98%程度である。その為、合成収率は鎖長の乗数で変化する。例えば20merの場合理論的な合成収率は68％であるが、60merの場合その合成収率は30%に低下し、且つ不純物も増加することから分離精製収率はさらに差が大きくなる。このことから鎖長を短くすることは合成コストの削減にとって極めて重要な要素である。特にオリゴヌクレオチドのサイズが15merを超えると合成コストが大幅に増大する。デコイを医薬品として用いる場合、製造コストが高いと当然、医薬品の価格も高くなり、患者さんの負担が大きく、また、広範囲な利用の障害になる。したがって、サイズの小さなデコイが望まれる。【０００６】
したがって、本発明の目的は、２種類の転写因子の結合部位を含み、それでいてサイズが小さな二本鎖オリゴヌクレオチドデコイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
２種類の転写因子の結合部位を単一のデコイに含ませようとすると、各結合部位は10mer程度はあるので、15mer以下のような小さなサイズのデコイを提供することは困難であると考えられた。本願発明者らは、鋭意研究の結果、各結合部位の各センス鎖を異なる鎖中に配置するとともに、各結合部位の各センス鎖同士が少なくとも部分的にハイブリダイズするように配置することにより、２種類の転写因子の各結合部位を含むデコイのサイズを大幅に小さくすることが可能であることに想到し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、第１の転写因子に対する第１の結合部位と、第２の転写因子に対する第２の結合部位を含み、前記第１の結合部位のセンス鎖を含む第１の鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖を含む第２の鎖とがハイブリダイズして二本鎖を形成し、前記第１の結合部位のセンス鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている、２種類の転写因子に対して結合性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドデコイを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、２種類の転写因子の結合部位を含み、それでいてサイズが小さな二本鎖オリゴヌクレオチドデコイが初めて提供された。本発明のデコイは、サイズが小さいので合成が容易であり、合成コストも安く、ひいてはデコイを医薬品として用いる場合の医薬品の価格も低くすることができるので、本発明はデコイを用いる医療に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】下記実施例において行った、マウス炎症性腸疾患(IBD)モデルを用いた動物実験における疾病活性指数(DAI)の測定結果を示す図である。
【図２】下記実施例において行った、マウス炎症性腸疾患(IBD)モデルを用いた動物実験における体重の経時変化を示す図である。
【図３】下記実施例において行った、マウス炎症性腸疾患(IBD)モデルを用いた動物実験における、大腸の長さの比較結果を示す図である。
【図４】下記実施例において行った、卵白アルブミン（OVA) 誘発マウス喘息モデルにおける、各種デコイ投与後の、メサコリン投与による気道抵抗の測定結果を示す図である。
【図５】下記実施例において解析した、肺組織中のデコイの分布を示す図である。
【図６】下記実施例において解析した、各キメラデコイによるＮＦκＢおよびＳＴＡＴ６の結合活性の阻害を示す電気泳動図である。
【図７】下記実施例において測定した、各種デコイ投与後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の各種白血球の細胞数を示す図である。図中、各デコイについて示されている４本のヒストグラムは、左側から順に総細胞、リンパ球、好酸球、好中球の数を示す。
【図８】下記実施例において行った、OVA誘発マウス喘息モデルの各群における肺組織のHE染色の結果を示す図である。
【図９】下記実施例において行った、OVA誘発マウス喘息モデルにおける、マクロファージの分布を示す、肺組織の免疫染色の結果を示す図である。
【図１０】下記実施例において測定した、各種デコイ投与後の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のインターロイキン４(IL-4)、インターロイキン５ (IL-5)及びインターロイキン１３(IL-13)の濃度を示す図である。
【図１１】下記実施例において行った、OVA誘発マウス喘息モデルの各群における肺組織のPAS染色の結果を示す図である。
【図１２】下記実施例において行った、OVA誘発マウス喘息モデルの各群における、ムチン5AC糖タンパク(MUC5AC)遺伝子の発現を比較して示す図である。
【図１３】下記実施例において測定した、各種デコイ投与後の血清IgE濃度を示す図である。図中、各デコイについて示されている３本のヒストグラムは、左側から順に感作前（第０日）、感作後（第２１日）、及び吸入暴露後（第２４日）の結果を示す。
【図１４】下記実施例において測定した、各種デコイ投与後の肺組織中のヒスタミン濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記のとおり、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイは、第１の転写因子に対する第１の結合部位と、第２の転写因子に対する第２の結合部位を含む。そして、第１の結合部位のセンス鎖を含む第１の鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖を含む第２の鎖とがハイブリダイズして二本鎖を形成している。さらに、第１の結合部位のセンス鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている。以下、この構成について、下記実施例で具体的に作製した二本鎖オリゴヌクレオチドデコイであるNF-κB/STAT6-15mer-Bを例に挙げて説明する。なお、本明細書では、特に明記しない限り、塩基配列は、5'側を左側に書く。
【００１２】
NF-κB/STAT6-15mer-Bの構造は下記式[I]で表される（配列番号１）。
【００１３】
【化１】
2017043639.tif 000003
【００１４】
式[I]に示す構造を有するNF-κB/STAT6-15mer-Bは、第１の転写因子がNF-κBであり、第２の転写因子がSTAT6である。第１鎖と第２鎖は相補的であり、したがって、第２鎖は第１鎖の相補鎖である。第１鎖中、大文字で記載されているGGGATTTCCT（配列番号２）がNF-κBの結合部位であり、第２鎖中、大文字で記載されているTTCCCAGGAAA（配列番号３）（式[I]では、相補鎖であるため、3'末端が左側に記載されているので、この配列は式[I]中の配列とは左右反対に描かれているが実体は同一である）がSTAT6の結合部位である。転写因子のコンセンサス配列は、多くの場合、一般式で表される。NF-κBのコンセンサス配列は、ＧＧＧＲＨＴＹＹＨＣ（配列番号４）（式中、ＲはＡ又はＧを、ＹはＣ又はＴを、ＨはＡ、Ｃ又はＴをそれぞれ意味する）、STAT6のコンセンサス配列は、ＴＴＣＮＮＮＮＧＡＡ（配列番号５）（式中ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣを意味する）。したがって、第１鎖中のNF-κBの結合部位GGGATTTCCTは、NF-κBのコンセンサス配列と3'末端の１塩基のみが不一致となっていること以外はNF-κBのコンセンサス配列である。また、第２鎖中のSTAT6の結合部位TTCCCAGGAAAは、STAT6のコンセンサス配列をそっくり含んでいる。なお、転写因子の結合部位やコンセンサス配列は二本鎖であるが、塩基配列を記載する場合には、センス鎖の塩基配列が記載される。したがって、上記した結合部位及びコンセンサス配列の塩基配列は、いずれもセンス鎖の塩基配列である。したがって、NF-κBの結合部位のセンス鎖が第１鎖中に含まれ、STAT6の結合部位のセンス鎖が第２鎖中に含まれている。そして、式[I]から明らかなように、NF-κBの結合部位のセンス鎖中のATTTCCTと、STAT6の結合部位のセンス鎖中のAGGAAAとがハイブリダイズしており、すなわち、第１の結合部位のセンス鎖と前記第２の結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズしている。
【００１５】
以上のとおり、本発明のキメラデコイでは、２種類の転写因子の結合部位のセンス鎖が異なる鎖中に配置され、かつ、それらが少なくとも部分的にハイブリダイズすることにより、両転写因子の結合部位が少なくとも部分的にオーバーラップして存在することになる。これにより、特許文献２や特許文献３に記載されているような、２種類の転写因子の結合部位を同一の鎖中に配置する場合に比べて、デコイのサイズを大幅に小さくすることができる。本発明のキメラデコイのサイズは特に限定されないが、16mer以上になると合成コストが大幅に高くなるため、15mer以下が好ましく、一方、あまりに短いと二本鎖の安定性が低下するので、13mer以上が好ましい。結合活性や生体内での安定性を総合的に考えると、15merが最も好ましい。
【００１６】
各転写因子の各結合部位は、各転写因子のコンセンサス配列をそっくり含むことが結合活性の点からは好ましいが、それでは転写因子の組合せの選択の自由度が大幅に制限される。一方、下記実施例に具体的に記載するように、上記したNF-κB/STAT6-15mer-Bが優れた転写因子抑制活性を示すことから、各転写因子の結合部位は、各転写因子のコンセンサス配列に対して１個の塩基置換を有していてもよい（上記の通り、NF-κB/STAT6-15mer-Bは、第１鎖中のNF-κBの結合部位が、NF-κBのコンセンサス配列とは１個の塩基置換を持っている）。この１個の塩基置換により、転写因子の組合せの選択の自由度が大幅に増大し、さまざまな転写因子の組み合わせを採用することが可能になる。なお、塩基置換は最大２個まで許容可能であるが、結合活性の点から１個が好ましい。
【００１７】
２種類の転写因子は、その結合部位のセンス鎖が少なくとも部分的にハイブリダイズ可能な組合せであれば、任意の組合せを採用することができる。例えば、上記したNF-κBとSTAT6の組合せに加え、下記実施例では、NF-κBとEts1の組合せ、NF-κBとNF-ATの組合せ、NF-κBとSTAT1の組合せ、NF-κBとNF-IL6の組合せについてもデコイを作製した。また、転写因子の組合せが同じであっても、塩基配列の異なる２種以上のデコイを作製できる場合も少なくない。下記実施例では、NF-κBとSTAT6の組合せについて、下記式[II]の構造のデコイ（NF-κB/STAT6-15mer-A）（配列番号６）も作製した。
【００１８】
【化２】
2017043639.tif 000004
【００１９】
Ets1のコンセンサス配列は、ＭＧＧＡＷ（ＭはＡ又はＣ、ＷはＡ又はＴ）であるので、NF-κBとEts1の組合せとしては、下記式[III]及び[IV]の構造のデコイ（NF-κB/Ets1-15mer-A（配列番号７）及びNF-κB/Ets1-15mer-B（配列番号８）)を作製した。
【００２０】
【化３】
2017043639.tif 000005
【００２１】
【化４】
2017043639.tif 000006
【００２２】
NF-ATのコンセンサス配列は、WGGAAANHN（WはＡ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ、ＨはＡ、Ｔ又はＣ）であるので、NF-κBとNF-ATの組合せとしては、下記式[V]及び[VI]の構造のデコイ（NF-κB/NF-AT-15mer-A（配列番号９）及びNF-κB/NF-AT-15mer-B（配列番号１０）)を作製した。
【００２３】
【化５】
2017043639.tif 000007
【００２４】
【化６】
2017043639.tif 000008
【００２５】
STAT1のコンセンサス配列は、ＴＴＣＮＮＮＧＡＡ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ）であるので、NF-κBとSTAT1の組合せとしては、下記式[VII]及び[VIII]の構造のデコイ（NF-κB/STAT1-15mer-A（配列番号１１）及びNF-κB/STAT1-15mer-B（配列番号１２）)を作製した。
【００２６】
【化７】
2017043639.tif 000009
【００２７】
【化８】
2017043639.tif 000010
【００２８】
NF-IL6のコンセンサス配列は、ＴＫＮＮＧＮＡＡＫ（ＫはＧ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ）であるので、NF-κBとNF-IL6の組合せとしては、下記式[IX]及び[X]の構造のデコイ（NF-κB/NF-IL6-15mer-A（配列番号１３）及びNF-κB/NF-IL6-15mer-B（配列番号１４）)を作製した。
【００２９】
【化９】
2017043639.tif 000011
【００３０】
【化１０】
2017043639.tif 000012
【００３１】
なお、転写因子の組合せは、上記の例に限定されるものではなく、他の例として、Est-1とSTAT-1の組合せ、Est-1とSTAT-6の組合せ、Est-1とNF-ATの組合せ、Est-1とNF-IF6の組合せ、STAT-1とNF-IL6の組合せ、STAT-6とNF-IL-6の組合せ等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。各転写因子のコンセンサス配列は周知であるので、当業者であれば、選択した２種類の転写因子の組合せについて、本発明のキメラデコイを容易に設計することができる。もっとも、上記した要件を満足する必要があるので、あらゆる転写因子の組合せについて本発明のキメラデコイを設計できるわけではない。
【００３２】
本発明のキメラデコイを構成するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、転写因子に対する結合活性や安定性の観点からＤＮＡが好ましい。
【００３３】
本発明のキメラデコイは、単純な二本鎖でもよいが、各鎖の一端又は両端をスペーサーにより結合してヘアピン型又はダンベル型（ステイプル型）のデコイとしてもよい。ヘアピン型及びダンベル型の方が安定性が高く好ましい。転写因子への結合活性及び安定性を総合評価すると、ヘアピン型が最も好ましい。
【００３４】
ヘアピン型とは、上記した式[I]〜[X]に示すように、第１鎖の3'末端と第２鎖の5'末端がスペーサーにより結合されている構造を持つものである。ヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ自体は周知であり、例えば特許文献１等に詳しく記載されている。すなわち、スペーサーの例として、-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-、-OPO2-(OCH2CH2CH2)n3-OPO2O-及び-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-を挙げることができ、好ましくは、-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-及び-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-を挙げることができる。ここで、n3は４ないし８の整数、好ましくは５ないし７の整数、さらに好ましくは６であり、n4は３ないし１２の整数を表わす。なお、スペーサーの両端の-OPO2O-は、それぞれ、隣接するヌクレオチドの糖の3'位又は5'位と結合するリン酸ジエステル結合を表わしている。また、スペーサーの両端の-OPO2O-を除いた部分を、以下、「スペーサー部」と呼ぶことがある。なお、下記実施例で作製した式[I]〜[X]で示される構造を持つ二本鎖オリゴヌクレオチドデコイのスペーサー部は全てドデシレン基である。
【００３５】
ヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドデコイは、例えば、先ず、その5'末端にスペーサーが結合される方の一本鎖オリゴヌクレオチドを常法により合成し、その5'末端にスペーサーを結合し、さらに、スペーサーの他端に所定のヌクレオチドの3'位を結合し、さらにこのヌクレオチドに続けて常法により所定のオリゴヌクレオチドを5'側に１個ずつ結合させていくことにより合成することができる。ヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドを調製するための各種スペーサーを導入するための試薬（スペーサーの誘導体）が市販されているので、これらの市販のスペーサー試薬を用い、その指示書に従って容易にヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドを調製することができる。用いることができる市販の試薬の例として次のものを挙げることができる。
【００３６】
１．  エチレングリコール単位の繰返しから成るスペーサー部を導入するための試薬
(1)  18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト{18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite 18、米国Glen Research社)
（エチレングリコール単位６個から成るスペーサー部を結合）
(2)  9-O-ジメトキシトリチルトリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{9-O-Dimethoxytrityl-triethylene glycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite 9、米国Glen Research社)
（エチレングリコール単位３個から成るスペーサー部を結合）
(3)  DMT-ドデカン-ジオール  ホスホロアミダイト
DMT-dodecane-Diol phosphoramidite
（商品名：Spacer 12、米国ChemGenes社)
（エチレングリコール単位４個から成るスペーサー部を結合）
【００３７】
２．  アルキレン鎖から成るスペーサー部を導入するための試薬
(1)  3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite C3、米国Glen Research社)
（プロピレン鎖から成るスペーサー部を結合）
(2)  DMT-ブタン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-butane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-4 Spacer、米国ChemGenes社)
（ブチレン鎖から成るスペーサー部を結合）
(3)  DMT-ヘキサン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-hexane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-6 Spacer、米国ChemGenes社)
（ヘキシレン鎖から成るスペーサー部を結合）
(4)  DMT-ノナン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-nonane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-9 Spacer、米国ChemGenes社)
（ノニレン鎖から成るスペーサー部を結合）
(5)  12-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer C12 CE Phosphoramidite、米国Glen Research社)
（ドデシレン鎖から成るスペーサー部を結合）
【００３８】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、適切な生化学的安定性を与える目的で、ヌクレオチド間結合のすべてあるいは一部にホスホロチオエート化等の耐ヌクレアーゼ修飾を施してもよい。すなわち、本発明のキメラデコイ中のオリゴヌクレオチド部分は、基本的にDNAであることが好ましいが、隣接する少なくとも２個のヌクレオチド間の結合（及び／又はスペーサー部に隣接するヌクレオチドでは、該ヌクレオチドとスペーサー部の間）を、耐ヌクレアーゼ修飾してヌクレアーゼに対する耐性を増大させてもよい。ここで、「耐ヌクレアーゼ修飾」とは、ヌクレアーゼによる分解を天然のDNAよりも受けにくくする修飾のことを意味し、このようなDNAの修飾自体は周知である。耐ヌクレアーゼ修飾の例としては、ホスホロチオエート化（本明細書において「Ｓ化」と呼ぶことがある)、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化等を挙げることができる。これらのうち、Ｓ化が好ましい。Ｓ化は、上記の通り、隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換することを意味する。任意の隣接するヌクレオチド間の結合をＳ化する手法自体は周知であり、例えば、S化試薬（CPRII、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド）(Glen Research社)を用いて容易に行うことができるし、また、Ｓ化オリゴヌクレオチドは商業的にも合成されている。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、単なる塩基配列は、そうでないことが文脈上明らかな場合を除き、ヌクレオチド間の結合及びスペーサー部とヌクレオチド間の結合の一部又は全部がＳ化されているものも、全くＳ化されていないものをも包含する。
【００３９】
本発明のキメラデコイは、そのまま投与することも可能であるが、適切な薬剤送達系(drug delivery system, DDS)を構成する物質と結合してから投与することもできる。オリゴヌクレオチドのDDSとしては、カチオン性物質を含むリポソーム、細胞膜透過性ペプチドやそれらを含む高分子、アテロコラーゲン等を挙げることができ、これらは本発明のキメラデコイの投与においても利用可能である。これらの他に、PLGA（ポリ乳酸／グリコール酸共重合体）ナノ粒子に本発明のキメラデコイを抱合させて投与することもできる。PLGAナノ粒子は、PLGAから成る直径数十nm〜数百nmの粒子であり、DDS用の粒子として製造されている（ホソカワミクロン社等）ので、市販品の技術を好ましく利用することができる。本発明のキメラデコイをPLGAナノ粒子に結合して抱合させる場合、第１鎖の5'末端にジスルフィドリンカーとアミノリンカーを介してPLGAと結合することが好ましい。これは、例えば、PLGA-NHSエステル体とキメラデコイを反応させることでPLGA結合型キメラデコイが得られ、さらにマランゴニ効果を利用してナノサイズに粒子化することにより行うことができ、下記実施例にも詳細な調製方法が記載されている。なお、二本鎖オリゴヌクレオチドデコイのDDSのために、PLGAナノ粒子にデコイを結合することはこれまでに知られていない。
【００４０】
本発明のキメラデコイは、２種類の転写因子の結合部位を有するので、それらの２種類の転写因子の活性を低減することができる（ただし、一分子のデコイに２種類の転写因子が同時に結合するものではない）。したがって、本発明のキメラデコイは、それら２種類の転写因子の高活性により引き起こされる各種疾患の治療及び予防に用いることができる。すなわち、NF-κBの結合部位を持つデコイは、NF-κBデコイが有効成分として用いられる医薬の有効成分として用いることができる。このような医薬は、下記の各種疾患の治療及び予防に有効であることが認められている。
【００４１】
血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、大動脈瘤、脳動脈瘤。さらには、
１．免疫系疾患
大動脈炎症候群（高安動脈炎）
バージャー病（ビュルガー病）
結節性動脈周囲炎
ウェゲナー肉芽腫症
アレルギー性肉芽腫性血管炎（チャーグ・ストラウス症候群）
全身性エリテマトーデス
多発性筋炎・皮膚筋炎
シェーグレン症候群
成人スティル病
２．神経・筋疾患
パーキンソン病
筋萎縮性側索硬化症(ALS)
多発性硬化症(MS)
３．呼吸器系疾患
特発性間質性肺炎
サルコイドーシス
原発性肺高血圧症
４．消化器系疾患
自己免疫性肝炎
劇症肝炎
重症急性膵炎
５．皮膚・結合組織疾患
強皮症
６．骨・関節系疾患
広範脊柱管狭窄症
７．腎・泌尿器系疾患
IgA腎症
急速進行性糸球体腎炎
【００４２】
同様に、STAT6の結合部位を持つデコイは、喘息等の呼吸器疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアレルギー性疾患、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎，潰瘍性大腸炎、クローン病、関節症、慢性疼痛、がん等の治療及び予防に用いることができ、Ets1の結合部位を持つデコイは、虚血性心不全、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、器官移植または器官手術の予後の悪化、再灌流障害、ＰＴＣＡ後の再狭窄、腎炎、肝炎、関節炎、急性腎不全、慢性腎不全、動脈硬化症、リウマチ、多発性硬化症、がん等の治療及び予防に用いることができ、NF-ATの結合部位を持つデコイは、骨粗鬆症・関節症、自己免疫疾患、感染症、がん等の治療及び予防に用いることができ、STAT1の結合部位を持つデコイは、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患等の治療及び予防に用いることができ、NF-IL6の結合部位を持つデコイは、免疫関連細胞増殖疾患、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸窮迫症候群、虚血性心疾患、透析後症候群、白血病、リウマチ様関節炎、後天性免疫不全症候群、脈管炎、脂質組織球症、敗血症性等の治療及び予防に用いることができる。
【００４３】
なお、本発明のキメラデコイを投与することにより、同時に２種類の転写因子の活性を低減させることができるので、同時に活性を低減させることが望まれる２種類の転写因子の活性低減に用いることができる。例えば、同じ疾患の治療又は予防に有効な２種類の転写因子を組み合わせて治療又は予防効果をさらに高めることもできるし、機能的に関連している２種類の転写因子を組み合わせることもできる。もっとも、広範囲な疾患の治療又は予防のために、全く無関係な転写因子を組み合わせることもできる。
【００４４】
本発明のキメラデコイを医薬用途に用いる場合、デコイの投与経路は、特に限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、対象臓器ないしは組織への直接投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、対象疾患、患者の症状、投与経路等により適宜設定されるが、通常、成人１日当たり0.1〜10000nmol、好ましくは1 〜1000 nmol、より好ましくは10〜100 nmolを投与することができる。製剤は、常法により行なうことができ、例えば、注射剤の場合には、生理食塩水中に本発明のキメラデコイを溶解した溶液の形態とすることができる。製剤中には、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの、製剤分野で常用される添加剤が適宜混合されていてもよい。また、他の薬効成分を含んでいてもよい。
【００４５】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ヘアピン型のものは全て、スペーサー部がドデシレン基である。また、全ての実施例において、各ヌクレオチド間は全てＳ化されている。
【００４６】
実施例１〜１０
１．二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの作製
上記したNF-κB/Ets1-15mer-A（配列番号７、式[III])（実施例１）、NF-κB/Ets1-15mer-B（配列番号８、式[IV]）（実施例２）、NF-κB/NF-AT-15mer-A（配列番号９、式[V]）（実施例３）、NF-κB/NF-AT-15mer-B（配列番号１０、式[VI]）（実施例４）、NF-κB/STAT1-15mer-A（配列番号１１、式[VII]）（実施例５）、NF-κB/STAT1-15mer-B（配列番号１２、式[VIII]）（実施例６）、NF-κB/STAT6-15mer-A（配列番号６、式[II]）（実施例７）、NF-κB/STAT6-15mer-B（配列番号１、式[I]）（実施例８）、NF-κB/NF-IL6-15mer-A（配列番号１３、式[IX]）（実施例９）及びNF-κB/NF-IL6-15mer-B（配列番号１４、式[X]）を作製した。ヘアピン型の各デコイは、第２鎖を化学合成し、次いで、その5'末端にスペーサー（ドデシレン鎖）を結合し、さらに、スペーサーの他端に所定のヌクレオチドの3'位を結合し、さらにこのヌクレオチドに続けて常法により所定のオリゴヌクレオチドを5'側に１個ずつ結合させていくことにより合成した。ドデシレン鎖の結合は、市販の試薬（商品名：Spacer C12 CE Phosphoramidite、米国Glen Research社)を用い、その指示書にしたがって行った。
【００４７】
２．結合活性試験
１で作製した各二本鎖オリゴヌクレオチドデコイについて、結合活性を測定した。結合活性の測定は次のようにして行った。
【００４８】
(1)結合活性試験
試験方法
市販の転写因子アッセイキット(TransAM（商品名）NF-κB p65：Cat.No.40096，：TransAM（商品名）STAT Family：Cat.No. 42296，TransAM（商品名）NFATc1：Cat.No. 40296，TransAM（商品名）C/EBP α/β：Cat.No. 44196，Active Motif, Inc社)を用い、各転写因子のコンセンサス配列が固相化されているプレートへデコイ溶液と、Jurkat 細胞（ヒトTリンパ腫由来）核抽出液あるいはHeLa細胞（ヒト子宮頸がん由来）核抽出液を添加し、反応（室温、１時間）させた。洗浄後、一次抗体（抗NF-κB p65抗体）と二次抗体（HRP-抗IgG抗体）をキット説明書に従って添加、洗浄し、比色法を用いて測定した。
【００４９】
評価方法
各デコイ溶液の濃度値を対数に変換し、横軸を対数に変換した濃度値（0.005〜400nmol/Lの濃度内で5〜10点）、縦軸に各群のパーセンテージ値をプロットし、近似曲線を作成し、各反応時間におけるIC50（inhibition concentration 50%）を算出した。
【００５０】
(2)ゲルシフトアッセイによる結合確認
試験方法
STAT6及びEst-1へのゲルシフトアッセイ法による結合確認は、市販のアッセイキット（Light Shift（商品名）Chemiluminescent EMSA kit：Cat.No. p74026，タカラバイオ）を用い，試験管内にSTAT6及びEst-1の結合配列をBiotin化プローブ配列として添加し，デコイ溶液とHeLa細胞（ヒト子宮頸がん由来）核抽出液を添加し、キット付属の試薬と共に室温、30分反応させた。得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンに転写、UVでクロスリンクし、ブロッキング後、Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugateをキット説明書に従って添加、洗浄し、化学発光法を用いて測定した。
【００５１】
評価方法
添加した各デコイ溶液の濃度値（1，10，100 pmol）の内，STAT6あるいはEst-1のバンドが完全に消失する濃度を有効濃度とした。
【００５２】
結果を下記表１に示す。
【００５３】
【表１】
2017043639.tif 000013
【００５４】
表１に示されるように、本発明のキメラデコイは、それぞれに含まれる２種類の結合部位に結合する２種類の転写因子に結合することが確認された。
【００５５】
３．サイトカイン産生に対する作用
試験方法
マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞を播種（24ウェルプレート： 4.0×104細胞/ウェル/250μL）し、37℃、5％CO2で24時間培養（10％FBS含有RPMI1640）した。各デコイ溶液 20nmol/Lを遺伝子導入用試薬（FuGENE HD Transfection Reagent : Cat.No. E2311, Promega社）により細胞に導入した。その後、LPS刺激（100ng/mL、24時間）を加えた。培養上清を回収し、市販のサイトカインELISAキット(Mouse IL-1 beta/IL-1F2 Quantikine ELISA Kit：Cat.No. MLB00C, Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit：Cat.No. M6000B, Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit：Cat.No. MTA00B, R&D systems社)を用い、各サイトカイン濃度を測定した。
【００５６】
評価方法
下記の式により各デコイ配列のサイトカイン抑制率（%）を算出した。
サイトカイン抑制率（%）＝100‐（デコイ添加群のサイトカイン濃度÷対照群（LPS刺激単独）のサイトカイン濃度）×100
【００５７】
結果を下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
2017043639.tif 000014
【００５９】
表２に示されるように、本発明のキメラデコイは、調査した３種類のサイトカインの産生を抑制することが確認された。なお、表２に示す結果から、総合的に見て、実施例８（NF-κB/STAT6-15mer-B）が最も優れた効果を発揮すると考えられる。このため、以下の実施例では、NF-κB/STAT6-15mer-Bを用いた。
【００６０】
実施例１１
PLGAナノ粒子への結合
上記実施例８で作製したNF-κB/STAT6-15mer-BをPLGAナノ粒子に結合した。この操作は具体的に次のようにして行った。ヘアピン型オリゴヌクレオチド合成の際に、５’末端側にアミノリンカーを付加した。一方PLGA（和光純薬工業社製）の末端のカルボキシル基は反応性の高いN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルにし、これとオリゴヌクレオチドの末端のアミノ基とをアミド結合で結合させPLGA結合型オリゴヌクレオチドを作製した。さらに還元状態である細胞内で速やかにオリゴヌクレオチドを放出させるために、オリゴヌクレオチドとアミノ基の間にジスルフィド結合を挿入しており、これも合成機上で付加している。アミノリンカーやジスルフィド結合含有リンカーはオリゴヌクレオチド合成用の市販品を利用可能である。得られたPLGA結合型NF-κB/STAT6-15mer-Bは、PLGAおよびアセトン、エタノール、水と混合し、ポリビニルアルコールおよびキトサン、水の混合溶媒中に滴下し粒子化した。その後、溶媒留去、加圧ろ過を行い、粒子を含む溶液を得た。さらに必要な場合は凍結乾燥を行った。
【００６１】
実施例１２
動物試験１
１．マウスIBD（炎症性腸疾患）モデル
実施方法
(1) 動物モデル
C57BL/6Jマウス（雄、6週齢）に1.5 %DSS（デキストラン硫酸ナトリウム）溶液を21日間にわたって自由飲水させ、病態が完成した第７日（Day7）から治療を開始する慢性期モデルを用いた。
【００６２】
(2) 群構成
投与群と投与量を下記表３に示す。投与方法は、各投与物質を200 μL/匹で強制経口投与（マウスの体重が20 gの場合10 mL/kgに相当）した。投与は、飲水開始日をDay 0として、Day 7から週3回（Day 7, 9, 11, 14, 16及び18）の合計6回行った。
【００６３】
【表３】
2017043639.tif 000015
投与物質： NF-κB/STAT6-HSD-PLGA-NS = NF-κB/STAT6-15mer-BのHSD-PLGA-ナノ粒子（HSDはヘアピン型）、NF-κB-HSD-PLGA-NS = HSD 13 mer PS (C12)のHSD-PLGA-ナノ粒子、NFκB/STAT6-HSD = NF-κB/STAT6-15mer-B
投与量： HSDとしての投与量（カッコ内は粒子としての投与量）
HSD 13 mer PS (C12)は、配列番号１５の塩基配列を持つ二本鎖オリゴヌクレオチドをスペーサー部がドデシレン基のスペーサーによりヘアピン型にしたもの。
【００６４】
(3) 評価
薬効の評価は、飲水開始時（Day 0）、Day 7、Day 14及び解剖時（Day 21）に体重測定及びDAI（疾病活性指数）を評価した。解剖時に大腸の長さを測定した。
【００６５】
3) 試験結果
結果を図１〜図３に示す。DAIの評価では、NS-キメラ群は2週目から症状の進行の抑制を示し、HSD-キメラ群は3週目に有意なDAIの低値を示した。体重減少の程度もDAIと同様の結果であったが、NS-キメラ、NS-NF-ΚB及びHSD-キメラ群の3週目の体重は2週目より増加を示した。大腸の長さに関しては、NS-キメラ及びHSD-キメラ群では有意な短縮抑制が認められた。
【００６６】
HSD-キメラ群はNS-NF-κB群と比較し，いずれの評価項目においても効果が高かった。
【００６７】
２．OVA誘発マウス喘息モデル
実施方法
(1) 動物モデル
メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０〜１２週齢）にOVA （卵白アルブミン）20μｇ + Alum 2mgを初日（Day 0）及びDay 14に腹腔内感作した。Day 21, 22及び23に1%OVA を20min吸入することで気道に炎症を惹起し，病態モデルを作製した。
(2) 群構成
投与群と投与量を下記表４に示す。各投与物質は20 nmolでDay 18に一回のみ気管内に投与した。
【００６８】
【表４】
2017043639.tif 000016
【００６９】
(3) 評価
薬効の評価は、Day24に気管支収縮薬であるメサコリン（3.1，6.25，12.5及び25 mg/mL）を吸入させ，気道抵抗を次のように測定した。最後のＯＶＡ曝露（Day24）から２４時間後に麻酔下でＭＣｈ（メサコリン）誘発ＡＨＲ（気道過敏性）を測定した。全身麻酔後のマウスに気管切開術を行い、カニューレをして、機械的人工換気（１５０回呼吸／分、２００μｌの一回換気量）を行った。神経筋反応の阻止には、臭化パンクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。その後、侵襲的気道抵抗およびコンプライアンスをレジスタンス＆コンプライアンスシステム（Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社）によって測定した。ベースラインの計測後、１０μｌのＰＢＳまたはＭＣｈ（３．１２５ｍｇ／ｍｌ、６．２５ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｇ／ｍｌ、および２５ｍｇ／ｍｌ）を気管チューブ中に３０秒間にわたって噴霧し、２７０秒間にわたって反応させた。
【００７０】
3) 試験結果
結果を図４に示す。ＡＨＲは喘息の主要な特徴であり、且つ、重要な治療標的であるので、本願発明者らはＯＶＡ処理マウスにおけるＭＣｈの用量依存性ＡＨＲ増強に対するＮＦκＢデコイＯＤＮおよびキメラデコイＯＤＮの効果を調査した。生理食塩水（対照群）およびスクランブルデコイＯＤＮで処理されたマウスでは、気道抵抗がＭＣｈの用量依存的に著しく増加し、２つの群の間ではＭＣｈに対する応答に差はなかった。一方、ＮＦκＢデコイＯＤＮおよびキメラデコイＯＤＮでは気道抵抗の増加を著しく抑制した。ＭＣｈに対する応答はキメラデコイＯＤＮによって完全に改善され、キメラデコイＯＤＮの効果はＮＦκＢデコイＯＤＮの単独導入の効果よりも有意に高かった（図４）。
【００７１】
３．OVA誘発マウス喘息モデルを用いたさらなる実験
方法
(1) 肺のアレルギー反応に対するＮＦκＢおよび／またはＳＴＡＴ６の阻害の効果
肺のアレルギー反応に対するＮＦκＢおよび／またはＳＴＡＴ６の阻害の効果を評価するため、薬品含有溶液をエアロゾル化することができるＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標）エアロゾライザー（モデル１Ａ−１Ｃ、Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ社、ペンシルバニア州）を使用してDay18（ＯＶＡ吸入の３日前）にＯＶＡ感作マウスにキメラデコイＯＤＮ、ＮＦκＢデコイＯＤＮ、またはスクランブルデコイＯＤＮ（マウス当たり２５μｌの生理食塩水中の２０ｎｍｏｌ）を気管内投与した。対照マウスおよびシャムマウスは生理食塩水（マウス当たり２５μｌ）を気管内投与した。デコイＯＤＮの投与では、キシラジン（１０ｍｇ／Ｋｇ）とケタミン（１００ｍｇ／Ｋｇ）の腹膜内注射によりマウスを麻酔した。
【００７２】
ＦＩＴＣ標識キメラデコイＯＤＮの気管内投与もＯＶＡ吸入の３日前にＯＶＡ感作マウスにおいて実施し、ＯＶＡ曝露から１日後に肺組織を得た。蛍光顕微鏡観察法を用いてそれらの肺組織の凍結切片（５μｍ）を作製し、検査した。
【００７３】
本実験プロトコルは地区動物実験委員会によって承認され、本研究は大阪大学医学部の動物実験ガイドラインおよび日本国政府動物愛護管理法（法律第１０５号）に準拠して動物研究委員会の監督の下に実施された。
【００７４】
(3)  気管支肺胞洗浄分析
ＡＨＲ測定のすぐ後に各マウスの気道内腔を０．４ｍＬの氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。血球計算盤を使用してＢＡＬＦ中の総細胞数を計数した。ディフ・クイック溶液で細胞を染色し、血球細胞の判別を行った。また、ＢＡＬＦ中のＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ＩＬ−５（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）およびＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄシステムズ社）の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７５】
(4)  電気泳動移動度シフトアッセイ
常法により、肺組織から核抽出物を調製した。ＯＶＡ曝露後の核抽出物中のＮＦκＢおよびＳＴＡＴ６の発現はゲルシフトアッセイシステム（プロメガ社、ウィスコンシン州）で分析した。プライマーとしてＮＦκＢ結合部位を含むＯＤＮ（５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’；センス鎖のみが示されている）またはＳＴＡＴ６結合部位を含むＯＤＮ（５’−ＧＴＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣ−３’；センス鎖のみが示されている）を３’末端で［γ−３２Ｐ］ＡＴＰにより標識した。３２Ｐ標識プライマー（１０，０００ｃｐｍ）および１μｇのポリデオキシイノシン−デオキシシチジン酸を含む結合混合物（１０μｌ）を１０μｇの核抽出物と室温で３０分間にわたってインキュベートし、その後で６％ポリアクリルアミドゲルにアプライした。また、対照として試料を過剰な（１００倍の）非標識ＯＤＮと共にインキュベートしたものを用いた。ゲルを電気泳動にかけ、乾燥後、オートラジオグラフィーによって分析した。
【００７６】
(5)  血清中ＩｇＥレベルおよび組織中ヒスタミンレベルを決定するためのＥＬＩＳＡ
血液をDay0（感作前）、Day21（ＯＶＡ曝露前）およびDay24（最後のＯＶＡ曝露から２４時間後）に採取し、ＥＬＩＳＡ（ＡＫＲＩＥ−０１０、株式会社シバヤギ、日本）により血清ＩｇＥレベルを測定した。さらに、ＢＡＬＦの採取後に動物を殺処理し、ホモジナイズした全肺組織から全タンパク質を抽出した。その後、ＥＬＩＳＡ（ＥＡ３１、オックスフォード・バイオメディカルリサーチ社、ミシガン州）によりタンパク質抽出物（５０μｇ）中のヒスタミンレベルを測定した。
【００７７】
(6)  組織学的研究および免疫組織学的研究
動物をDay24（ＢＡＬＦの採取後）に安楽死させ、肺下葉部を注意深く回収し、固定後、パラフィン包埋した。肺組織の横断切片（６μｍ）を作製し、ヘマトキシリン/エオシン（ＨＥ）染色とＰＡＳ染色を行った。
【００７８】
ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキットを用い、免疫ペルオキシダーゼ・アビジンビオチン複合方法による免疫組織学的染色を行った。免疫複合体は０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジンで特定し、ヘマトキシリンで核染色を行った。肺の凍結切片（５μｍ）は、Ｆ４／８０に対するラットモノクローナル抗体（１：５００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で染色し、マクロファージの集積を分析した。ＩｇＧを一次抗体の代わりに使用し、陰性対照とした。陽性染色された細胞と全部の細胞を計測し、統計解析を行った。
【００７９】
(7)  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
Day24にＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、メリーランド州）を用いて全ＲＮＡを肺から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩファーストストランド合成システム（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）を使用して相補的ＤＮＡを作製した。Ｍｕｃ５ａｃ（ムチン5AC糖タンパク）用ＴａｑＭａｎプローブセット（Ｍｍ０１２７６７１８−ｍ１、アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州）およびリアルタイムＰＣＲマスターミックス（東洋紡株式会社、日本）を用い、Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州）を使用して定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨの発現量を内部標準として用い、Ｍｕｃ５ａｃの発現を算出した。
【００８０】
(8)  統計分析
シャピロ・ウィルク検定を用いて正規性を検定した。２つの群の間の比較にはｔ検定、多群の比較には、テューキー・クラマー多重範囲検定を用いた。ノンパラメトリックの場合には、ノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス検定を用いた。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００８１】
結果
(1)  ＦＩＴＣ標識デコイＯＤＮの分布
気管内投与によるデコイＯＤＮの導入を確認するため、ＯＶＡ感作マウスにおける蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デコイＯＤＮの分布を評価した。ＦＩＴＣ標識ＯＤＮをＯＶＡ吸入の３日前に投与し、蛍光がＯＶＡ曝露後に主に肺胞腔および気管支周辺領域内のリンパ球において検出され得ることが組織学的検査により示された。また、遊走マクロファージにおいてもＦＩＴＣ標識ＯＤＮが検出されることが免疫蛍光染色によって明らかにされた（図５）。
【００８２】
(2)  キメラデコイＯＤＮによるＮＦκＢおよびＳＴＡＴ６の結合活性の阻害
標的転写因子の活性化に対するキメラデコイＯＤＮの阻害効果をＥＭＳＡにより評価した。ＮＦκＢとＳＴＡＴ６の両方の活性化が生理食塩水（対照）またはスクランブルデコイＯＤＮで処理したＯＶＡ感作マウスの肺の核抽出物において著しく上昇した。一方、キメラデコイＯＤＮの導入によってＮＦκＢとＳＴＡＴ６の両方の活性化が著しく阻害され、ＮＦκＢデコイＯＤＮの単独導入によってもＮＦκＢの活性化が阻害された（図６）。
【００８３】
(4)  キメラデコイＯＤＮによる炎症、粘液産生およびヒスタミン分泌の阻害
キメラデコイＯＤＮの治療効果を明らかにするため、我々は喘息の悪化の防止の分子機序を調査した。まず、我々はキメラデコイＯＤＮの抗炎症効果を評価した。ＯＶＡ感作およびＯＶＡ曝露の後に全ての処理群でＢＡＬＦ中の総細胞数が増加した。しかしながら、ＮＦκＢデコイＯＤＮおよびキメラデコイＯＤＮで処理されたマウスでは好酸球数の著しい減少が観察された。さらに、キメラデコイＯＤＮのこの減少効果はＮＦκＢデコイＯＤＮのものよりも有意に大きかった（図７）。
【００８４】
組織学的分析ではヘマトキシリン・エオシン染色により、対照およびスクランブルデコイＯＤＮでは炎症性浸潤が気管支周辺領域および血管周辺領域において明らかに増加するが、キメラデコイＯＤＮによって炎症性細胞の動員が著しく抑制されることが示された（図８）。さらに、キメラデコイＯＤＮによってマクロファージの浸潤が抑制され、一方でスクランブルデコイＯＤＮまたは生食投与群の気管支周辺領域では多数のマクロファージが浸潤した（図９）。さらに、ＴＨ２サイトカインはアレルギー性喘息の発病にとって重要な因子であるので、我々はＢＡＬＦ中のこれらのサイトカインを調査した。キメラデコイによる処理により、ＢＡＬＦにおけるＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生亢進を著しく抑制した。一方でＮＦκＢデコイＯＤＮはＩＬ−４分泌を抑制しただけであった（図１０）。
【００８５】
次に、粘液分泌の増加も喘息の主要な症状であるので、我々はＯＶＡ誘導性喘息マウスにおける粘液産生を調査した。対照マウスおよびスクランブルデコイＯＤＮ群では、粘液細胞の顕著な増加がＰＡＳ染色によって示された（図１１）。しかしながら、キメラデコイＯＤＮによる処理は粘液細胞の増加を著しく抑制した。粘液産生はＭＵＣ５ＡＣによって制御されるが、キメラデコイＯＤＮおよびＮＦκＢデコイＯＤＮによる処理によってＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現が対照およびスクランブルデコイＯＤＮ転移と比較して著しく抑制された(図１２）。
【００８６】
最後にＩｇＥ関連免疫応答をこのモデルにおいて調査した。血清中ＩｇＥレベルは感作後の全ての処理群において上昇し、ＯＶＡ曝露後も有意差は存在しなかった（図１３）。一方、肺組織中のヒスタミン量については、ＮＦκＢデコイＯＤＮでは対照群と同程度で無作用であったが、キメラデコイＯＤＮでは顕著な低下作用を示した（図１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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