(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞のポリクローナル刺激のためのin vitroでの方法であって、Ｔ細胞集団とヒト化抗ＣＤ３抗体断片とを接触させることを含み、前記抗ＣＤ３抗体断片が、配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメインとを含み、前記抗ＣＤ３抗体断片が粒子に結合されており、
前記抗ＣＤ３抗体断片が、Ｆａｂ（抗原結合性断片）であり、前記重鎖可変ドメインが配列番号１６の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号１７の配列を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞集団をヒト化抗ＣＤ２８抗体断片とさらに接触させ、前記抗ＣＤ２８抗体断片が、配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域および配列番号９のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメインとを含み、前記抗ＣＤ２８抗体断片が、前記抗ＣＤ３抗体断片が結合する粒子と同じまたは別々の粒子に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が、５００ｎｍから１０μｍの範囲のサイズの固相表面を備えたビーズである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含むナノマトリックスであり、
前記ナノマトリックスのサイズが１から５００ｎｍである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
閉鎖系無菌細胞培養系で実施される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化抗体またはその断片の分野、とくに抗原ＣＤ３に特異的な抗体またはその断片およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローンＯＫＴ３は、ヒト細胞表面マーカーＣＤ３（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３、サブユニットガンマ、デルタ、イプシロンおよびゼータを含むＴ細胞受容体のシグナル伝達共受容体）に特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体であり、ＣＤ３イプシロンの不規則な小領域を認識する。ＯＫＴ３は元々米国特許第４６５８０１９号およびＫｕｎｇ等（１９７９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０６、３４７〜３４９頁に記載された。抗ＣＤ３完全長抗体を使用したヒトＴ細胞の刺激において、ＯＫＴ３はＴ細胞活性化および増殖の強力な刺激剤であることがよく知られている（米国特許第６４０６６９６号、米国特許第６１４３２９７号、米国特許第６１１３９０１号、Ｙａｎｎｅｌｌｙ等（１９９０年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３０、９１〜１００頁）。抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞活性化には、複雑な分子相互作用が関与する。可溶性抗ＣＤ３抗体は、インビトロにおいて、Ｆｃ受容体を有する細胞無しではＴ細胞の活性化を誘導することができず、このような活性化は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体架橋結合に左右され、これはＴ細胞（可変領域を介する）およびＦｃ受容体を有する細胞（Ｆｃ部分を介する）の両方を結合する抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３によって媒介されることが示された（Ｃｅｕｐｐｅｎｓ等（１９８５年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５、３８８２〜３８８６頁；Ｂｏｈｕａ等（２００５年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１６、４８７〜４９８頁）。ＯＫＴ３の１価Ｆａｂ断片の効力は、親ＩｇＧの約１００分の１である（Ｖａｎ  Ｗａｕｖｅ等（１９８０年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４、２７０８〜２７１３頁）。
【０００３】
ＧｅｐｐｅｒｔおよびＬｉｐｓｋｙ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７年）１３８、１６６０〜１６６６頁）は、精製したＴ細胞集団の増殖を誘導するために、固定化抗ＣＤ３モノクローナル抗体の使用について報告した。著者等は、固定化ＯＫＴ３がＴ細胞増殖の刺激にはあまり効果的ではないことを発見した。抗ＣＤ３抗体はまた、Ｔ細胞増殖を誘導するために抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて使用する薬剤として記載されたことがある（米国特許第６３５２６９４号）。クローン１５Ｅ８、ＣＤ２８．３およびＬｅｕ−２８は、ヒトＣＤ２８抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体の例である。別個の結合特性を有する抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞活性化を誘導する能力が異なる（Ｎｕｎｅｓ等（１９９３年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５、３１１〜３１５頁）。国際公開第９４２９４３６Ａ１号パンフレットでは、Ｔ細胞集団を（ａ）Ｔ細胞に１次活性化シグナルをもたらし、それによってＴ細胞を活性化する第１の薬剤（通例は抗ＣＤ３抗体）、および（ｂ）Ｔ細胞の表面上の付属分子を刺激し、それによって活性化したＴ細胞を刺激する第２の薬剤（通例は抗ＣＤ２８抗体）が直接固定されている固相表面と接触させ、第１および第２の薬剤がそれによってＴ細胞の増殖を誘導することを含む、Ｔ細胞集団の増殖を誘導するためのインビトロ方法を開示している。Ｔ細胞のポリクローナル刺激を可能にする抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体などの薬剤はまた、国際公開第２０１４０４８９２０号パンフレットに開示されたような可動性ポリマー鎖のマトリックスに付着させることができる。
【０００４】
Ｔ細胞を刺激して形質導入効率（例えば、レンチウイルス形質導入）を増加させることができる。静止状態のＴ細胞の形質導入効率が通常非常に低いのは、この細胞が形質導入のために必要な受容体（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質シュードタイプレンチウイルスベクターの場合のＬＤＬ受容体など）を発現していないからである。抗ＣＤ３抗体単独または抗ＣＤ２８抗体との組み合わせによるＴ細胞の刺激によって、これらの受容体の発現が引き起こされるので、形質導入効率はより高くなる（Ａｍｉｒａｃｈｅ等（２０１４年）Ｂｌｏｏｄ  １２３、１４２２〜１４２４頁）。
【０００５】
残念なことに、マウスＯＫＴ３抗体の安定性は低い。国際公開第１９９８０５２９７５号パンフレットは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って位置交換Ｈ１００Ａを含有するマウス抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の変異したｓｃＦｖバリアントを開示している。変異したＯＫＴ３ｓｃＦｖは、組換え発現系を使用して生成され、国際公開第１９９８０５２９７５号パンフレットは長期保存期間中、変異した抗ＣＤ３ｓｃＦｖが親ＯＫＴ３抗体よりも安定であると述べている。
【０００６】
ヒト化抗体またはその断片は、ヒト患者に投与したとき、マウス抗体またはその断片などの非ヒト化抗体またはその断片と比較して免疫原性が少ないので、臨床および細胞療法目的にとって有用である。非ヒト抗体をヒト化する技術は当業界では公知で、ヒトまたはヒト化フレームワークにグラフト（ｇｒａｆｔ）した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、グラフトしたＣＤＲは典型的には齧歯類抗体から得られる。ＣＤＲは、抗体またはその断片の可変領域の一部で、ＣＤＲでこれらの分子は特異的抗原に結合する。ＣＤＲはＣＤＲよりも変動がずっと少ないフレームワーク領域に埋め込まれている。米国特許第６７５０３２５号、米国特許第５８８５５７３号、米国特許第７３８１８０３号、米国特許出願公開第２００４００５２７８３号および米国特許出願公開第２００４０２０２６５７号は、ＯＫＴ３からヒトフレームワークへの結合特異性の移動について開示している。国際公開第２００２０５１８７１号パンフレットは、ハイブリドーマＣＮＣＭ１−２５８２によって産生された、ＣＤ２８．３の可変領域から得られたヒト化抗体について開示している。ＣＤ２８．３は、ＩＬ−２放出／Ｔ細胞活性化をほとんど誘導することができない（Ｎｕｎｅｓ等（１９９３）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５、３１１〜３１５頁）。
【発明の概要】
【０００７】
マウス親ＯＫＴ３抗体よりも安定で、例えば、単独で、またはヒト化抗ＣＤ２８抗体またはその断片と組み合わせてＴ細胞のポリクローナル刺激のために使用することができるヒト化抗ＣＤ３抗体またはその断片が当業界では必要とされている。
【０００８】
驚くべきことに、大腸菌で発現させたとき、抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３のＣＤＲが変異したＦａｂバリアントの発現レベルは、ＣＤＲが変異していないＦａｂバリアントのレベルより４０から７０倍高く、抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８のヒト化Ｆａｂバリアントの発現レベルは、非ヒト化Ｆａｂバリアントのレベルよりも１０倍高いことを発見した。ＯＫＴ３の場合、ＣＤＲが変異したヒト化バリアントは最高の発現レベルを示しており、ここでＣＤＲ変異は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ３におけるＩＭＧＴ命名法による１１４位システインからセリンへのアミノ酸置換を含む。
【０００９】
第２に、ＣＤＲが変異したＯＫＴ３バリアント（ヒト化および非ヒト化）で得られたＦａｂ分子は、驚くべきことにＣＤＲが変異していないＦａｂバリアントおよびマウス親完全長ＯＫＴ３抗体と比較して安定性が増大していることが示された。安定性の増大は、遊離Ｆａｂ分子およびタグ付けしたＦａｂ分子において検出された。
【００１０】
第３に、予期せぬことに、可動性ポリマー鎖のマトリックスに結合したとき、Ｆａｂ型のＣＤＲが変異したＯＫＴ３バリアント（ヒト化および非ヒト化）はＴ細胞を刺激することができることが発見され、さらにより驚くべきことに、これらは完全長ＯＫＴ３抗体よりも強力であることが発見された。Ｔ細胞表面への架橋結合が可変領域だけでなく、ＯＫＴ３のＦｃ部分によっても媒介されると考えられていたので、これは完全に予測に反していた。
【００１１】
第４に、抗原ＣＤ２８に特異的なＦａｂ型のヒト化１５Ｅ８バリアントは、可動性ポリマー鎖のマトリックスに結合させたとき、マウスＯＫＴ３抗体またはＣＤＲが変異したＯＫＴ３Ｆａｂバリアント（ヒト化および非ヒト化）と組み合わせると、マウス１５Ｅ８抗体と少なくとも同じ効力でＴ細胞を刺激することができることが予期せぬことに発見された。このことは、ＦａｂにはＦｃ部分がないので、さらに予測に反していた。それぞれ可動性ポリマー鎖のマトリックスに結合したＯＫＴ３のヒト化されＣＤＲが変異した抗ＣＤ３Ｆａｂバリアントと１５Ｅ８のヒト化抗ＣＤ２８Ｆａｂバリアントの組み合わせは、活性化したＴ細胞の頻度の高さおよびＴ細胞増殖率の高さに関して最良の結果をもたらした。
【００１２】
抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３のＣＤＲ（ＩＭＧＴ命名法に従う）は、重鎖可変ドメインについては配列番号１、配列番号２および配列番号３に、軽鎖可変ドメインについては配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載される（ＩＭＧＴ命名法については図２Ａおよび図２Ｂ参照）。ＯＫＴ３のヒト化のためのフレームワークは、Ａｄａｉｒ等（１９９４年）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５、４１〜４７頁で公表された配列をベースにしている。抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８のＣＤＲ（ＩＭＧＴ命名法に従う）は、重鎖可変ドメインについては配列番号７、配列番号８および配列番号９に、軽鎖可変ドメインについては配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２に記載される。１５Ｅ８のヒト化のためのフレームワークは、ヒト生殖系列フレームワーク配列に基づく。
【００１３】
本明細書で開示した抗体またはその断片の他に、本発明は、前記抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ポリヌクレオチドを含む発現系および前記抗体またはその断片を発現する宿主細胞、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、Ｔ細胞を刺激するための前記抗体またはその断片の使用ならびに細胞を可逆的にタグ付けするための前記抗体またはその断片の使用も含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】親マウス抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３重鎖（ＶＨ、図１Ａ）および軽鎖（ＶＬ、図１Ｂ）可変ドメインならびに抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８重鎖（ＶＨ、図１Ｃ）および軽鎖（ＶＬ、図１Ｄ）可変ドメインのインシリコ凝集予測を示した図である。各アミノ酸残基について、本明細書で位置番号として示した数値スコアは、タンパク質凝集の傾向を予測する当業界で公知の標準的ソフトウェアを使用して計算した。高いスコアほど凝集傾向が高いことを表す。最小スコアは０（凝集傾向ナシ）で、最大スコアは１００（凝集傾向が高い）である。
【図２】一例としてＣＤ２８抗原に特異的な親マウス１５Ｅ８抗体の重鎖（図２Ａ）および軽鎖（図２Ｂ）可変ドメインを使用したフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４ならびにＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の定義を示した図である。ナンバリングはＩＭＧＴに従っている。
【図３】大腸菌においてＣＤ３抗原に特異的およびＣＤ２８抗原に特異的なＦａｂ断片の発現のための原核細胞ベクターのプラスミドマップを示した図である。ＬＣ、軽鎖；ＨＣ、重鎖；ＶＬ、軽鎖可変ドメイン；ＶＨ、重鎖可変ドメイン；ＣＬ  軽鎖定常ドメイン；ＣＨ１（ｈＩｇＧ１）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン；ＲＢＳ、リボソーム結合部位；ポリ−ＨＩＳ、ポリヒスチジン配列；ｋａｎ、カナマイシン耐性遺伝子；ｌａｃＩｑ、ｌａｃ受容体遺伝子；ｏｒｉ、複製開始点；ＰｈｏＡ、シグナルペプチドＰｈｏＡ；ＰｅｌＢ、シグナルペプチドＰｅｌＢ；ｋＢｐｓ、キロ塩基対。
【図４】Ｆａｂバリアント「ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」の金属キレートアフィニティおよびイオン交換クロマトグラフィーによる様々な精製ステップの試料のクーマシー染色したＳＤＳゲルを示した図である。Ｍ、上から下へ１７０、１３０、１００、７０、５５、４０、３５、２５、１５および１０ｋＤａのサイズの分子量マーカー。列１：ペリプラズム抽出物；列２：金属キレート流出画分；列３〜４：洗浄画分；列５〜８：溶出画分；列９：イオン交換流出画分；列１０：洗浄画分；列１１〜１２：溶出画分。
【図５】抗体コンジュゲートを直接使用して、または抗ポリヒスチジン抗体と組み合わせたＦａｂを使用して間接的に染色したＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示した図である。５Ａ〜５Ｄ：抗ＣＤ３染色のドットプロット；５Ａ：陽性対照、ＯＫＴ３−ＰＥコンジュゲート；５Ｂ：陰性対照、抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲート；５Ｃ：ｃｈＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ；５Ｄ：ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ．５Ｅ〜５Ｊ：抗ＣＤ２８染色のドットプロット；５Ｅ：陽性対照、１５Ｅ８−ＰＥコンジュゲート；５Ｆ：陰性対照，抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲート；５Ｇ：ｈｕＣＤ２８＿ｖ１  Ｆａｂ；５Ｈ：ｈｕＣＤ２８＿ｖ２  Ｆａｂ；５Ｉ：ｈｕＣＤ２８＿ｖ３  Ｆａｂ；５Ｊ：ｈｕＣＤ２８＿ｖ４  Ｆａｂ．ＦＳＣ：前方散乱。ＰＥ：フィコエリトリン。ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート。抗ＨＩＳ−ＰＥ：抗ポリヒスチジン−フィコエリトリン。ｘ軸の範囲は０から１０００、ｙ軸の範囲は１Ｅ−０１から１Ｅ＋０３である。
【図６】ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片を含むナノマトリックスの様々な組み合わせによるＴ細胞の刺激を示した図である。６Ａ：刺激の４８時間後に早期活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の両方を発現するＴ細胞の出現頻度（％）。６Ｂ：刺激の１週間後のＴ細胞の増殖率（％）。各ドットは１ドナーの試料を表す。横線は対応する中央値を表す。「ｍＡｂ」は、完全長マウス親抗体（ＣＤ３についてはＯＫＴ３およびＣＤ２８については１５Ｅ８）を示す。
【図７】２５℃で２６週間保存した後の精製した親マウス抗体クローンＯＫＴ３（抗ＣＤ３）および１５Ｅ８（抗ＣＤ２８）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示した図である。７Ａ：凝集した抗体の量（％）、三角：ＯＫＴ３、ひし形：１５Ｅ８；７Ｂ：二量体抗体の量（％）、黒三角：ＯＫＴ３、白三角：１５Ｅ８。
【図８】熱ストレスを与えた抗ＣＤ３Ｆａｂを使用したＰＢＭＣの染色を示した図である。８Ａ：染色した細胞の蛍光強度中央値（％）；白い棒：インキュベートしていないＦａｂを使用、それぞれを１００％に設定（参照）；黒い棒：３７℃で１週間インキュベートしたＦａｂを使用。８Ｂ−Ｅ：フローサイトメトリー分析；８Ｂのドットプロット：インキュベートしていないｃｈＣＤ３Ｆａｂ、８Ｃ：インキュベートした（ストレスを与えた）ｃｈＣＤ３Ｆａｂ、８Ｄ：インキュベートしていないｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ、８Ｅ：インキュベートした（ストレスを与えた）ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ。ＦＳＣ：前方散乱。抗ＨＩＳ−ＰＥ：抗ポリヒスチジン−フィコエリトリン。ｘ軸の範囲は０から１０００、ｙ軸の範囲は１Ｅ−０１から１Ｅ＋０３である。
【図９】抗体またはその断片を含む熱ストレスを与えたナノマトリックスを使用するＴ細胞の刺激を示した図である。白い棒：インキュベートしていないナノマトリックスを使用（参照）；黒い棒：３７℃で１週間インキュベートしたナノマトリックスを使用。９Ａ：刺激の４８時間後に早期活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の両方を発現するＴ細胞の出現頻度（％）。９Ｂ：刺激１週間後のＴ細胞の増殖率（％）。「ｍＡｂ」は、完全長マウス親抗体ＯＫＴ３（ＣＤ３について）を示す。
【図１０】フローサイトメトリーによって分析した、抗ポリヒスチジン−蛍光色素コンジュゲートと組み合わせたＣＤ３およびＣＤ２８に特異的なＦａｂを使用したＰＢＭＣの可逆的タグ付けを示した図である。Ａ、Ｂ：ＣＤ３のドットプロット；Ｄ〜Ｆ：ＣＤ２８のドットプロット。Ａ、Ｃ、Ｅ：洗浄前にタグ付けした細胞；Ｂ、Ｄ、Ｆ：細胞洗浄後にタグを除去。抗ＨＩＳ−ＡＰＣ：抗ポリヒスチジン−アロフィコシアニン。ＦＳＣ：前方散乱。ｘ軸の範囲は０から１０００、ｙ軸の範囲は１Ｅ−０１から１Ｅ＋０３である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
第１の態様では、本発明は、抗原ＣＤ３に特異的なヒト化抗体またはその断片であって、配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメインとを含む、抗体またはその断片を提供する。前記ヒト化抗体またはその断片の様々な実施形態を本明細書で開示する。前記ＣＤＲは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域を含むフレームワーク配列に埋め込むことができる。配列の順番は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であってもよい。前記ヒト化抗体またはその断片の重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含んでいてもよく、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は配列番号１６のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。前記ヒト化抗体またはその断片の軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含んでいてもよく、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は配列番号１７のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１６】
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域は、逆突然変異を有さないヒト化バリアントと比較して抗体またはその断片の親和性を増加させるためにアミノ酸置換（逆突然変異）を含んでいてもよい。さらに、逆突然変異は、タンパク質構造の安定化または脱安定化によって製造することができる抗体の量に影響を及ぼすことができる。好ましくは、前記重鎖可変ドメインは配列番号１６のアミノ酸を含み、前記軽鎖可変ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体またはその断片は、親マウス抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３またはその断片と比較したとき、ＣＤ３抗原に少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％または１００％を上回る親和性でＣＤ３抗原に特異的に結合する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞のポリクローナル刺激のための方法であって、Ｔ細胞集団とヒト化抗ＣＤ３抗体またはその断片とを接触させることを含み、前記ヒト化抗ＣＤ３抗体およびその断片が配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変ドメインとを含み、前記抗体またはその断片が粒子に結合されている、方法を提供する。前記粒子は、５００ｎｍから１０μｍまでの範囲のサイズの固相表面を備えたビーズであってもよい。あるいは、前記粒子はナノマトリックスであってもよく、このナノマトリックスは、ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックス、およびｂ）可動性ポリマー鎖の前記マトリックスに付着させた前記抗体またはその断片を含み、ナノマトリックスのサイズは１から５００ｎｍである。
【００１８】
前記抗ＣＤ３抗体またはその断片は、抗ＣＤ２８抗体またはその断片と組み合わせて使用されてもよい。前記抗２８ＣＤ抗体またはその断片はヒト化されていてもよい。前記抗ＣＤ２８抗体またはその断片は本明細書で開示したヒト化クローン１５Ｅ８であってもよい。前記抗ＣＤ２８抗体またはその断片は、配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域および配列番号９のＣＤＲ３領域を含むヒト化重鎖可変ドメインと、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含むヒト化軽鎖可変ドメインとを含んでいてもよい。前記抗ＣＤ２８抗体またはその断片は粒子に結合されていてもよい。
【００１９】
前記抗ＣＤ２８抗体またはその断片のＣＤＲは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域を含むフレームワーク配列に埋め込むことができる。配列の順番は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であってもよい。前記ヒト化抗体またはその断片のヒト化重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含んでいてもよく、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は配列番号２６または配列番号２４のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２０】
前記ヒト化抗ＣＤ２８抗体またはその断片のヒト化軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含んでいてもよく、前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は配列番号２５のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２１】
前記ヒト化抗ＣＤ２８重鎖可変ドメインおよび前記ヒト化抗ＣＤ２８軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域は、逆突然変異を有さないヒト化バリアントと比較して抗体またはその断片の親和性を増加させるためにアミノ酸置換（逆突然変異）を含んでいてもよい。さらに、逆突然変異は、タンパク質構造を安定化または脱安定化することによって、生産することができる抗体の量に影響を及ぼすことがある。好ましくは、軽鎖可変ドメインは、逆突然変異としてアミノ酸置換Ｄ７４Ａ（アスパラギン酸７４からアラニン）およびＳ９３Ｐ（セリン９３からプロリン、ＩＭＧＴ命名法に従う）を含む。好ましくは、前記ヒト化重鎖可変ドメインは配列番号２６または配列番号２４のアミノ酸を含み、前記ヒト化軽鎖可変ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体またはその断片は、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８またはその断片と比較したとき、ＣＤ２８抗原に少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％または１００％を上回る親和性でＣＤ２８抗原に特異的に結合する。
【００２２】
ナノマトリックスの１成分として、ＣＤ３およびＣＤ２８それぞれに特異的な抗体またはその断片を可動性ポリマー鎖の同じまたは異なるマトリックスに結合することができ、これらは同じマトリックス（例えば、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片を両方有するマトリックス）または別々のマトリックス（例えば、１マトリックスがＣＤ３に特異的な抗体またはその断片を有し、別のマトリックスがＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片を有する）に位置していてもよい。同じマトリックスに位置するとき、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片のモル比は変動してもよく、例えば、１００：１、１０：１、３：１、１：１、１：３、１：１０および１：１００（抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８）比が有用であり得る。
【００２３】
Ｔ細胞のポリクローナル刺激の前記方法は、閉鎖系無菌細胞培養系（閉鎖系細胞試料処理系）において実施することができる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、治療に適用するために本発明の方法によって得られた細胞組成物を提供する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、細胞の可逆的タグ付けのために抗ＣＤ３抗体またはその断片の使用であって、前記抗ＣＤ３抗体またはその断片は配列番号１のＣＤＲ１領域、配列番号２のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ３領域を含むヒト化重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ１領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ３領域を含むヒト化軽鎖可変ドメインとを含み、前記抗体またはその断片はタグに結合されている、使用を提供する。
【００２６】
本発明はまた、細胞の可逆的タグ付けのために抗原ＣＤ２８またはその断片と組み合わせた前記抗ＣＤ３抗体またはその断片の使用であって、前記抗ＣＤ２８抗体またはその断片は、配列番号７のＣＤＲ１領域、配列番号８のＣＤＲ２領域および配列番号９のＣＤＲ３領域を含むヒト化重鎖可変ドメインと、配列番号１０のＣＤＲ１領域、配列番号１１のＣＤＲ２領域および配列番号１２のＣＤＲ３領域を含むヒト化軽鎖可変ドメインとを含み、前記抗体またはその断片はタグに結合されている、使用を提供する。
【００２７】
前記タグは、粒子（例えば、ビーズ）、標識（例えば、蛍光色素、同位体標識または磁性体）、分子（例えば、核酸、タンパク質またはペプチド）または表面（例えば、培養皿またはマイクロタイタープレート）であってもよい。標識法は、前記抗体またはその断片の抗原への１価結合を可能にし、抗体またはその断片の動力学的特性によって抗体−抗原複合体の解離を引き起こすことによって解決することができる。
【００２８】
ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片はそれぞれ、融合タンパク質であってもよい。融合の例には、ポリヒスチジン配列、ビオチン化配列、ビオチン模倣ペプチド、蛍光タンパク質、ポリ−グリシン−セリンなどのリンカー配列およびキメラ抗原受容体が含まれる。
【００２９】
ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片はそれぞれ、アミノ酸置換、挿入および欠失を含有していてもよい。ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片はそれぞれ、化学的に修飾されていてもよい。例には、蛍光色素、タンパク質、磁性粒子への結合およびビオチン化などの当業界で公知の化学的修飾が含まれる。
【００３０】
一態様では、本発明は、本明細書で開示したＣＤ３抗原に特異的なヒト化抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示したＣＤ３抗原に特異的な抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現系および前記抗体またはその断片を発現する宿主細胞を提供する。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示した抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【００３３】
定義
他に規定しなければ、本明細書で使用した技術用語および科学用語は、本発明が属する業界の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、用語「抗体」は、限定はしないが、標的抗原を特異的に認識（すなわち、結合）するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（完全長抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）、抗体断片、イムノアドヘシンおよび抗体−イムノアドヘシンキメラを含む抗体構造の様々な形態を包含するために、広義に使用される。本発明による抗体は、本発明による特有の特性が保持されている限り、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子操作された抗体である。「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ（抗原結合性断片）、ｓｃＦｖ（短鎖可変断片）、シングルドメイン抗体、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ’、ダイアボディ、単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ａｈｍａｄ等（２０１２年）Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２年、９８０２５０に記載されている。用語「ヒト化抗体」とは、フレームワークおよび／またはＣＤＲが親イムノグロブリンと比較して異なる種のイムノグロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を意味する。好ましい実施形態では、齧歯類（例えば、マウス）ＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトして「ヒト化抗体」を調製する（一例は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３〜３２７頁に挙げられている）。ヒト化抗体はＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ、または類似の抗原に結合する。ヒト化イムノグロブリンのアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得たアミノ酸による置換の数が限られていてもよい。ヒト化分子は、抗原結合またはその他のイムノグロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換をさらに有することができる。保存的置換は全般的に、（ａ）置換領域のポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートまたはヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。
【００３４】
本明細書では、抗体配列に関する用語「親（ｐａｒｅｎｔ）」および「親の（ｐａｒｅｎｔａｌ）」は、ヒト化される抗体配列を意味する。したがって、親抗体は、通常、齧歯類由来のヒト化される非ヒト抗体クローンである。本発明のＣＤ３抗原に特異的なマウス抗体クローンＯＫＴ３は親抗体の一例である。
【００３５】
本明細書では、用語「抗原」は、１つまたは複数の抗体の産生を惹起する物質を含むものとする。各抗体は、鍵と鍵穴が合うのと同様の相互作用によって特異的抗原に結合する。物質は、外部環境由来であってもよく、または体内で形成されてもよい。用語「抗原」には、限定はしないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、炭水化物およびそれらの組み合わせ、例えば、グリコシル化タンパク質または糖脂質が含まれる。抗原は、細胞表面または細胞内部にあってもよい。好ましくは、抗原は細胞の細胞表面にある。好ましくは、ＣＤ３抗原はほ乳類ＣＤ３抗原である。最も好ましくは、ＣＤ３抗原はヒトＣＤ３抗原である。好ましくは、ＣＤ２８抗原はほ乳類ＣＤ２８抗原である。最も好ましくは、ＣＤ２８抗原はヒトＣＤ２８抗原である。
【００３６】
抗体またはその断片の抗原結合ドメインに関して、用語「に特異的に結合する」または「に特異的な」とは、特異的抗原、すなわち、抗ＣＤ３抗体またはその断片の場合はＣＤ３を認識して結合するが、試料中のその他の抗原は実質的に認識せず、結合もしない抗原結合ドメインを意味する。１種の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、別の種の抗原にも結合することができる。この異種間反応性は、抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反しない。抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、抗原の様々な対立遺伝子型（対立形質バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど）にも結合することができる。この交差反応性は、抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反しない。
【００３７】
用語「ドメイン」とは、タンパク質の残部とは独立した３次元構造を保持するタンパク質構造を意味する。場合によっては、ドメインは別々の機能特性を有し、機能を損失することなく別のタンパク質に添加、別のタンパク質から除去または移動することができる。
【００３８】
用語「親和性」とは、分子の１結合部位（例えば、抗体の結合腕）とその結合相手（例えば、抗原）との間の非共有的相互作用の合計の強度を意味する。他に指示しなければ、本明細書では、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗原結合タンパク質とその抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般的に、平衡解離定数（ＫＤ）によって表される。親和性は、当業界で公知の一般的な方法（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ測定法）によって測定することができる。
【００３９】
本明細書では、「可変ドメイン」または「可変領域」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））とは、抗体の抗原への結合に直接関与する軽鎖および重鎖ドメインの対のそれぞれを意味する。用語「可変ドメイン」とは、カッパ型のイムノグロブリン軽鎖の可変ドメインおよびラムダ型のイムノグロブリン軽鎖の可変ドメインの両方を意味する。
【００４０】
本明細書では、「定常ドメイン」または「定常領域」（軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の定常ドメイン（ＣＨ））とは、抗体のＣＬドメイン（軽鎖の場合）およびＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメイン（重鎖の場合）を含むドメインを意味する。重鎖の定常領域は、アイソタイプが異なる抗体では異なる。組換え抗体またはその断片では、様々なアイソタイプのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインおよびそれらの断片を一緒にすることができる。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインはまた、様々な種から選択することができる。ヒト化Ｆａｂ断片では、定常ドメインは好ましくはヒト定常ドメイン、より好ましくはヒトＣＬおよびヒトＩｇＧ１ＣＨ１である。
【００４１】
可変軽鎖および重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインには、配列が広く保存され、３つの「高頻度可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）が連結した４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が含まれる。抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって３次元構造を保持し、その他の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。本明細書では、抗体配列へのＣＤＲおよびＦＲ領域の割り当ては、ＦＲ−ＩＭＧＴおよびＣＤＲ−ＩＭＧＴとも呼ばれるＩＭＧＴ定義（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によって決定される。例えば、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＦＲおよびＣＤＲ領域のその他の定義があり、ＦＲおよびＣＤＲ領域の連結部位のアミノ酸の位置の割り当てに少し差が生じることがあり、したがって、ＣＤＲの長さが少し異なる。本発明による抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスから選択されるヒト由来のＦｃ部分を含んでいてもよい。好ましくは、ヒト由来のＦｃ部分はＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスである。Ｆｃ部分はアミノ酸置換、挿入および欠失を含有していてもよい。例えば、Ｆｃガンマ受容体結合に関与するアミノ酸残基は、この相互作用を増加、最小化または消失させるためにその他のアミノ酸残基で置換されていてもよい。
【００４２】
本発明による抗体は、その断片であってもよい。抗体断片は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含有していてもよい。例えば、ポリヒスチジン配列が任意のＦａｂ断片鎖に挿入、または付加されていてもよく、これによって抗ヒスチジン抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーおよび／または免疫学的検出を使用した精製が可能になる。本発明による抗体の特徴は、定常ドメインがヒト由来であることが好ましい。このような定常ドメインは当業界では周知で、例えば、Ｋａｂａｔによって記載されている。
【００４３】
本明細書では、用語「ＣＤ３抗原」は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３としても知られているＣＤ３タンパク質を意味し、用語「ＣＤ２８抗原」は、Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８としても知られているＣＤ２８タンパク質を意味する。
【００４４】
本明細書では、用語「ＩＭＧＴ命名法」は、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ等（２００５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３、Ｄ２５６〜Ｄ２６１）による抗体配列のナンバリング方式を示す。図２Ａおよび２Ｂは、抗ＣＤ２８抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインのＩＭＧＴ命名法を示した例である。
【００４５】
本明細書では、用語「ＩＧＫＶ」は、イムノグロブリンカッパ可変領域遺伝子の略語として使用される。用語「ＩＧＨＶ」は、イムノグロブリン重鎖可変領域遺伝子の略語として使用される。
【００４６】
本明細書では、用語「ＣＤＲグラフト」とは、第１の抗体またはその断片のＣＤＲ領域を取り出して、第２の抗体またはその断片またはその断片のフレームワークにこれらを移す方法を意味し、受け入れるフレームワーク（アクセプターフレームワーク）は、第１の抗体のフレームワーク（ドナーフレームワーク）と同一ではない。
【００４７】
本明細書では、用語「フレームワーク」および「フレームワーク領域」は、重鎖および軽鎖可変領域の両方のドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む抗体またはその断片のアミノ酸配列、すなわち、ＣＤＲ領域を含まない可変ドメインを意味する。したがって、用語「生殖系列フレームワーク」および「生殖系列フレームワーク領域」とは、ヒト生殖系列抗体遺伝子によってコードされるＣＤＲ領域を含まない可変抗体ドメインを意味する。
【００４８】
本明細書では、アミノ酸配列に関する（タンパク質およびポリペプチドの）用語「同一性」とは、タンパク質鎖の比較のために使用される。２つの配列間の「配列同一性」の計算は、以下の通りに実施する。配列は、最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸１つまたは両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる）。最適なアラインメントは、ＦＡＳＴＡ３６ソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｕｌｔｙ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｗｒｐｅａｒｓｏｎ／ｆａｓｔａ／）において「ｓｓｅａｒｃｈ３６」プログラムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ５０  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘでギャップ開始ペナルティ−１０、ギャップ伸長ペナルティ−２で最良のスコアとして決定する。対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を次に比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置の同じアミノ酸残基によって占有されているとき、これらの分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００４９】
本明細書では、用語「逆突然変異」とは、ヒト化抗体配列のフレームワーク領域におけるアミノ酸置換を意味する。これは通常、ヒト化後に抗原に対する抗体の親和性を増加させるために実施する。逆突然変異の候補となる残基には、例えば、ＣＤＲグラフト後のヒト化抗体および親非ヒト化抗体における様々なアミノ酸の位置、ならびにＣＤＲグラフト後のヒト化抗体および抗体コンセンサス配列における様々なアミノ酸の位置が含まれる。通常、候補残基は、抗体の結合特性に重要で、および／または抗原結合ループの主鎖立体構造を決定するフレームワーク領域の部位にある。
【００５０】
ＣＤＲとは異なり、構造フレームワーク領域（ＦＲ）におけるより実質的な変化は、抗体の結合特性に有害な影響を及ぼすことなく実施することができる。ＦＲの変化には、限定はしないが、非ヒト由来フレームワークのヒト化または抗原接触もしくは結合部位の安定化に重要なある種のフレームワーク残基の操作、例えば、定常領域のクラスもしくはサブクラスの変化、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変化させることができる特定のアミノ酸残基の変化（Ｌｕｎｄ等（１９９１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７、２６５７〜２６６２頁；Ｍｏｒｇａｎ等（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６、３１９〜３２４頁）または定常領域を得る種の変化が含まれる。
【００５１】
本発明の抗体は典型的に、組換えによって発現するポリペプチドである。抗体はキメラポリペプチドであってもよく、用語「キメラポリペプチド」とは、普通ならば近接して生じない２つまたは３つ以上のペプチド断片の並立によって生じる人工的な（非天然の）ポリペプチドを意味する。Ｆａｂ分子の場合、用語「キメラＦａｂ」とは、様々な由来の可変および定常領域の組み合わせ、例えば、マウス由来の可変領域およびヒト由来の定常領域の組み合わせを意味する。Ｆａｂバリアント「ｃｈＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ」は、キメラＦａｂの一例である。
【００５２】
本明細書では、用語「細胞の陽性選択」および「細胞の濃縮」は同義の意味を有し、組織を含む細胞集団からの細胞の亜集団の単離を意味する。細胞の陽性選択に適した方法には、遠心分離、濾過、磁気細胞分離、および蛍光細胞分離が含まれる。
【００５３】
本明細書では、用語「細胞の除去」とは、所望しない細胞から所望する細胞を分離する陰性選択の方法を意味する。本明細書で使用した細胞試料には、ＰＢＭＣなどの血液由来の細胞、細胞培養由来の細胞、または使用前に分離することができる脳もしくは骨などの組織由来の細胞を含めることができる。細胞の除去に適した方法には、遠心分離、濾過、磁気細胞分離、および蛍光細胞分離が含まれる。本明細書では、用語「ＣＤ３発現」および「ＣＤ３陽性」（ＣＤ３＋）細胞は同義の意味を有し、ＣＤ３抗原を発現する細胞を示す。したがって、本明細書では、用語「ＣＤ３非発現」および「ＣＤ３陰性」（ＣＤ３−）細胞は同義の意味を有し、ＣＤ３抗原を検出可能な状態では発現しない細胞を示す。
【００５４】
ヒト化重鎖可変ドメインのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列ならびにヒト化軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１３および配列番号１４に示される。
【００５５】
本発明による抗体またはその断片は、組換え手段によって産生することが好ましい。このような方法は従来技術で広く知られており、原核細胞および真核細胞における、好ましくは非ほ乳類細胞におけるタンパク質発現およびその後の抗体ポリペプチド（完全な抗体またはその断片）の単離を含む。抗体ポリペプチドの精製は、薬学的に許容される純度まで実施することができる。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖またはそれらの断片をコードする核酸は、標準的方法によって発現ベクターまたはウイルス形質導入ベクターに挿入することができる。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、バチルスまたは大腸菌などの適切な原核または真核宿主細胞で実施し、抗体は細胞から（上清から、または完全なもしくは部分的な細胞溶解後に）回収する。抗体の組換え体産生は、当業界では周知である。
【００５６】
用語「治療上有効な量」とは、治療上の利益をもたらす量を意味する。
【００５７】
用語「単離された」は、天然の状態から変化させるか、または取り出すことを意味する。例えば、細胞の単離された集団とは、このような細胞を濃縮し、天然に生じる状態において前記単離された細胞に通常随伴するその他の細胞から分離することを意味する。細胞の単離された集団とは、細胞の同種集団である実質的に精製された細胞の集団を意味する。
【００５８】
本明細書では、用語「Ｔ細胞刺激」および「Ｔ細胞活性化」は同義の意味を有し、Ｔ細胞増殖および早期Ｔ細胞活性化マーカー、特にＣＤ２５およびＣＤ６９の発現が特徴の細胞応答を意味する。
【００５９】
本明細書では、用語「ＣＤＲが変異したバリアント」とは、６個のＣＤＲ領域の１つの中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含む抗体またはその断片のバリアントを意味する。抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３の重鎖可変ドメインのＣＤＲ３における位置１１４（ＩＭＧＴ命名法）のシステインからセリンへのアミノ酸置換は、ＣＤＲが変異したバリアントの一例である。したがって、本明細書では、用語「ＣＤＲが変異していないバリアント」とは、６個のＣＤＲ領域の１つの中にアミノ酸置換、挿入または欠失を含まない抗体またはその断片のバリアントを意味する（すなわち、元のＣＤＲ領域を使用する）。
【００６０】
本明細書では、用語「タグ」とは、抗原結合分子、例えば、抗体またはその断片のその他の分子、例えば、粒子、蛍光色素、ビオチンのようなハプテンまたは培養皿およびマイクロタイタープレートなどの大きな表面へのカップリングを意味する。場合によっては、例えば、抗原結合分子が培養皿などの大きな表面にカップリングされる場合、カップリングによって抗原結合分子は直接固定される。その他の場合、このカップリングによって、間接的に固定され、例えば、磁気ビーズに直接または間接的に（例えば、ビオチンを介して）カップリングされた抗原結合分子は、前記ビーズが磁場に保持されると固定される。他の場合では、抗原結合分子のその他の分子へのカップリングは、直接または間接的な固定を引き起こさないが、本発明による細胞の濃縮、分離、単離および検出を可能にし、例えば、抗原結合分子が蛍光色素にカップリングされる場合、例えば、ＦＡＣソーティングのようなフローサイトメトリー法または蛍光顕微鏡によって、強く標識された細胞、弱く標識された細胞および標識されていない細胞を区別することが可能である。
【００６１】
本明細書では、用語「粒子」とは、コロイド粒子、小球体、ナノ粒子またはビーズなどの固相を意味する。このような粒子の作製方法は当業界ではよく知られている。粒子は磁気粒子であってもよい。粒子は、溶液もしくは懸濁液中にあってもよく、または本発明で使用する前に、凍結乾燥状態であってもよい。その後、本発明では、処理する試料と接触させる前に凍結乾燥した粒子を便利な緩衝液で再構成する。
【００６２】
用語「可動性ポリマー鎖のマトリックス」および「可動性マトリックス」は、本明細書では同義の意味を有する。これらのポリマーは、可動性（運動性）の、好ましくは可動性（運動性）の高い鎖から構成されるので、マトリックスは抗体またはその断片などの刺激剤のための付着点として固い表面を有さないことが特徴で、通例は柔軟性がなく、固定された硬い表面を有する現在使用されているビーズまたは小球体とは非常に対照的である。結果として、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含むナノマトリックスは柔軟で、細胞の表面の形状に調節することができる。さらに、結果として、このナノマトリックスは、水性溶液中におけるナノマトリックスの全体積の大部分（すなわち、５０％超）、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９９％超が可動性ポリマー鎖から構成されるナノマトリックスである。
【００６３】
マトリックスは、細胞に非毒性のポリマー性、好ましくは生分解性または生体適合性の不活性材料から構成される。マトリックスは、鎖の水和作用によって水性溶液中で最大移動度が得られる親水性ポリマー鎖から構成されることが好ましい。可動性マトリックスは、それに付着させる薬剤に関わりなく、ナノマトリックスの唯一の、または少なくとも主要な成分である。
【００６４】
可動性マトリックスは、コラーゲン、精製したタンパク質、精製したペプチド、多糖類、グリコサミノグリカンまたは細胞外マトリックス組成物であってもよい。多糖類には、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアゴム、アガロース、セファロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアガム、デンプンまたはアルギン酸を含めることができる。その他のポリマーには、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクアテルニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマーまたはポリウレタンを含めることができる。好ましくは、可動性マトリックスはデキストランのポリマーである。
【００６５】
薬剤は、当業界において公知で利用可能な様々な方法によって可動性マトリックスに付着させるかまたはカップリングすることができる。付着は、共有結合または非共有結合、静電的または疎水的であってもよく、例えば、化学的、機械的、酵素的または薬剤が細胞を刺激することができるその他の手段を含む様々な付着手段によって実現してもよい。例えば、細胞表面構造に対する抗体はまず、マトリックスに付着させてもよく、またはアビジンもしくはストレプトアビジンは、ビオチン化した薬剤に結合させるためにマトリックスに付着させてもよい。細胞表面構造に対する抗体は、直接、または、例えば抗アイソタイプ抗体を介して間接的にマトリックスに付着させてもよい。別の例には、抗体を結合させるためにマトリックスに付着させたタンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ、またはその他の非特異的抗体結合分子に使用が含まれる。間接的結合の別の例には、抗ヒスチジン抗体もしくはその断片またはポリヒスチジンタグを結合することができる金属キレート基のいずれかを有する粒子と組み合わせた、ポリヒスチジンタグを含む抗体または断片の融合タンパク質が含まれる。あるいは、薬剤は、マトリックスへの架橋結合などの化学的手段によって、マトリックスに付着させることができる。
【００６６】
本明細書では、「磁気粒子」における用語「磁気」とは、当業者に周知の方法で調製することができる磁気粒子の全サブタイプ、特に、強磁性粒子、超常磁性粒子および常磁性粒子を意味する。「強磁性」材料は、磁場に強く影響を受けやすく、磁場を取り除いても磁気特性を保持することができる。「常磁性」材料は、弱い磁化率のみを有し、磁場を取り除くと迅速にその弱い磁気を失う。「超常磁性」材料は、高い磁化率を有し、すなわち、磁場に置くと強く磁気を帯びやすいが、常磁性材料のように迅速に磁気を失う。
【００６７】
本明細書では、用語「標識」とは、例えば、標識を検出、追跡、分離、単離、除去または定量するために使用することができる、標的に直接または間接的に付着した検出可能な分子を意味する。標的は、単一の細胞または細胞集団、細胞表面構造、炭水化物、タンパク質およびペプチドであってもよい。標識の例には、蛍光、磁気および同位体標識が含まれる。場合によっては、標識は標的自体の一部であってもよい。
【００６８】
本明細書では、用語「細胞の可逆的タグ付け」とは、細胞を標識または粒子などのタグを使用して最初にタグ付けする方法を意味する。場合によっては、タグを組み合わせて使用してもよい。次に、細胞を、例えば、培養、活性化、増殖、選別、単離または分析して処理することができる。その後、タグを細胞から除去する。抗体およびその断片の場合、タグは、前記抗体またはその断片の抗原への１価結合をその段階で可能にすることによって除去または解除し、多価結合を引き起こさず、抗体またはその断片の動力学的特性によって抗原およびタグ付けした抗体の解離を引き起こす。
【００６９】
用語「閉鎖系試料処理系」および「閉鎖系の無菌（細胞培養）系」は同義に使用することができる。本明細書では、用語「閉鎖系細胞試料処理系」とは、新たな材料の導入、例えば、形質転換および形質導入などの培養方法の実施、ならびに細胞の増殖、分化、活性化および／または分離などの細胞培養ステップの実施の間の細胞培養汚染の危険性を低下させるいかなる閉鎖系も意味する。このような系は、ＧＭＰまたはＧＭＰ様条件（「無菌」）下での操作を可能にし、臨床的に適用可能な細胞組成物を生じる。本明細書では、例としてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を閉鎖系細胞試料処理系として使用する。この系は、国際公開第２００９／０７２００３号パンフレットに開示されている。本発明の方法をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙへの使用に制限するものではない。
【００７０】
実施形態
本発明の抗体またはその断片は、本明細書で開示した様々な実施形態で提示し、前記項目で詳細に記載することができる。抗原ＣＤ３に特異的なヒト化抗体またはその断片のこれらの実施形態全てに共通するのは、ヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインそれぞれにおいて配列番号１から配列番号６で示したＣＤＲ１からＣＤＲ６の存在である。
【００７１】
本発明の一実施形態では、抗体またはその断片は、親抗体クローンＯＫＴ３とは異なるＣＤＲ配列（例えば、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＫａｂａｔＣＤＲ）を有する。マウス親抗体クローンとは異なるＣＤＲ配列には、ＣＤＲの長さが３〜４個のアミノ酸の場合、１個もしくは２個のアミノ酸の置換、またはＣＤＲの長さが５〜７個のアミノ酸の場合、１、２、３もしくは４個のアミノ酸の置換、またはＣＤＲの長さが１０個もしくはそれ以上のアミノ酸の場合、ＣＤＲの配列中の１、２、３、４、５、６もしくは７個のアミノ酸の置換などのアミノ酸変化が含まれる。置換されるアミノ酸は、類似の電荷、疎水性または立体化学的特性を有し得る。本発明の一部の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的置換である。本発明のその他の実施形態では、アミノ酸置換は、非保存的置換である。このような置換は、当業者の技能の範囲内である。置換したＣＤＲを含有する抗体またはその抗体断片は、ＣＤ３抗原に結合する抗体を同定するためにスクリーニングすることができる。本発明の一実施形態では、本明細書で開示したヒト化抗体またはその断片は、ＣＤ３発現（ＣＤ３＋）細胞を含む試料からＣＤ３発現細胞を濃縮（陽性選択）するために使用することができる。好ましい実施形態では、試料は、ＣＤ３発現細胞およびＣＤ３非発現細胞（その他の細胞）を含む。濃縮に適した方法は当業界では周知で、限定はしないが、ＦＡＣＳ（登録商標）などのフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）などの磁気細胞分離が含まれる。濃縮したＣＤ３発現細胞は、サイトカイン発現もしくは受容体シグナル伝達などのさらに様々な分析で使用することができるか、またはこれらのＣＤ３発現細胞を含む医薬組成物で使用することができる。濃縮したＣＤ３発現細胞は、それらを必要とする患者に適用する前に治療有効量までインビトロで増殖させることができる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示したヒト化抗体またはその断片は、ＣＤ３発現細胞を含む試料からＣＤ３発現細胞を除去するために使用することができる。好ましい実施形態では、試料は、ＣＤ３発現細胞およびＣＤ３非発現細胞（その他の細胞）を含む。除去に適した方法は当業界では周知で、限定はしないが、ＦＡＣＳ（登録商標）などのフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）などの磁気細胞分離が含まれる。
【００７３】
例として、ＭＡＣＳＲ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の原理を本明細書に記載する：ＣＤ３抗原に特異的な抗体またはその断片は、リンパ球サブセットの直接または間接的磁気標識のために使用することができる。ＣＤ３抗原はＴ細胞および胸腺細胞上で発現する。まず、ＣＤ３発現細胞をＣＤ３マイクロビーズで磁気的に標識し、すなわち、ＣＤ３抗体またはその断片を磁気粒子にコンジュゲートする。次に、細胞懸濁液をＭＡＣＳ（登録商標）カラムに添加し、ＭＡＣＳ（登録商標）分離器の磁場に置く。磁気標識したＣＤ３発現細胞はカラム上に保持される。標識されていない細胞は通過し、この細胞画分はＣＤ３＋細胞が除去されている。磁場からカラムを取り除いた後、磁気を保持しているＣＤ３＋細胞は陽性選択細胞画分として溶出することができる。
【００７４】
本明細書で開示した抗体またはその断片を使用する細胞の濃縮（陽性選択）および除去の場合のいくつかの適用例は、（ａ）同種幹細胞移植のため、またはＴ細胞除去移植片の調製のため、またはその後のＣＤ３非発現細胞（例えば、ＮＫＴ細胞を含まないＮＫ細胞）の濃縮ための末梢血またはリンパ組織からのヒトＣＤ３＋細胞の除去、（ｂ）分析のため、その後の濃縮のため、または養子細胞移植療法（例えば、ドナーリンパ球注入または遺伝子改変Ｔ細胞、それぞれ同種移植または自家移植である）のため、末梢血、リンパ組織または組織ホモジェネート（腫瘍組織など）からのヒトＣＤ３＋細胞の陽性選択であってもよい。
【００７５】
ＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットの陽性選択のために、ＣＤ３に特異的な抗体またはその断片を、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７９、Ｔｉｍ−３および／またはＬＡＧ−３などの抗原に特異的な抗体またはその断片と一緒にすることができる。一実施形態では、ＣＤ３に特異的な抗体またはその断片は、生きたＣＤ３＋Ｔ細胞のみが単離されたことを確かめるために、例えば、アネキシンＶタンパク質ならびに／または表面抗原ＣＤ１９および／もしくはＣＤ１４および／もしくはＣＤ５６に特異的な抗体またはその断片と一緒にすることができる。
【００７６】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示したＣＤ３に特異的なヒト化抗体またはその断片は、臨床適用のためにナイーブな制御性Ｔ細胞を陽性選択するために使用することができる。ナイーブな制御性Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５ｈｉ、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ１２７ｄｉｍを特徴とする）を単離するために、末梢血またはリンパ組織を使用して、ヒト化ＣＤ３抗体またはその断片をＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１２７に特異的な抗体またはその断片と一緒にする。
【００７７】
ＣＤ３＋Ｔ細胞およびその他の細胞を一緒に除去するために、ＣＤ３に特異的な抗体またはその断片を、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３および／またはＣＤ２７１などの抗原に特異的な抗体またはその断片と一緒にすることができる。
【００７８】
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞以外の細胞も、Ｔ細胞受容体または抗原受容体を有するならば、ＣＤ３に特異的な抗体もしくはその断片単独で、またはＣＤ２８に特異的な抗体もしくはその断片との組み合わせにより、刺激されうる。好ましい実施形態では、これらの細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現する細胞の例には、Ｔ細胞、樹状細胞、間葉幹細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。ＣＡＲおよび／またはＴＣＲの標的分子の例には、細胞表面マーカーＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２が含まれる。
【００７９】
本発明の一実施形態では、例えば、形質導入効率（例えば、レンチウイルス形質導入）を高めるために、Ｔ細胞は、本明細書で開示した抗ＣＤ３抗体もしくはその断片単独で、または本明細書で開示した抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片との組み合わせより刺激される。ＣＤ３に特異的な、およびＣＤ２８に特異的な抗体またはその断片はそれぞれ、いずれも粒子に結合されていてもよい。
【００８０】
本発明の一実施形態では、ＣＤ３＋Ｔ細胞を除去するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）などの閉鎖系細胞試料処理系を使用する。例えば、８Ｅ＋０９全細胞の白血球除去は、滅菌溶接によってＣｌｉｎｉｃＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に装着した管類に連結する。細胞を洗浄し、磁気粒子にカップリングしたＣＤ３に特異的な抗体またはその断片で標識する。標識したＴ細胞は、制御可能な磁場に設置したカラム（チューブ類の一部）を使用して、磁気濃縮によって細胞の残部から特異的かつ自動的に単離する。単離したＴ細胞は、濃縮するか（陽性画分）、または廃棄して（陰性画分）、さらに臨床適用のために使用することができる。
【００８１】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示したＣＤ３抗原に特異的なヒト化抗体またはその断片はタグにカップリングすることができる。前記タグは、磁気粒子または蛍光色素であってもよい。本発明の一実施形態では、本明細書で開示したＣＤ３に特異的なヒト化抗体またはその断片は、ＣＤ３発現細胞の蛍光標識のために使用することができる。これはインビトロ（例えば、細胞培養）またはインビボ（例えば、体内）で達成することができる。蛍光標識は、抗体もしくはその断片に直接（例えば、化学結合によって）または間接的に（例えば、ヒト化抗体もしくはその断片のビオチン化およびビオチン化抗体のストレプトアビジン蛍光色素コンジュゲートへの結合によって）付着させることができる。いくつかのバリアントでは、ＣＤ３に特異的な前記ヒト化抗体またはその断片は、本明細書で開示したＣＤ２８に特異的なヒト化抗体またはその断片と組み合わせて使用されてもよい。
【００８２】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示したヒト化抗体またはその断片は、インビトロまたはインビボにおいてＣＤ＋３Ｔ細胞を同定しモニターするために使用することができる。
【００８３】
いくつかのバリアントでは、ＣＤ３に特異的な前記ヒト化抗体またはその断片は、本明細書で開示したＣＤ２８に特異的なヒト化抗体またはその断片と組み合わせて使用されてもよい。
【００８４】
本発明の一実施形態では、本明細書で開示したヒト化抗体またはその断片は、細胞の可逆的タグ付けのために使用することができる。前記抗体またはその断片は、標識、例えば、蛍光色素または粒子にコンジュゲートすることができる。細胞は、タグにカップリングされる前記抗体またはその断片の多価結合によってタグ付けされる。タグは、前記抗体またはその断片の多価結合から１価結合への転換によって細胞から除去される。抗原に結合した前記抗体またはその断片の解離は、ＫＤ（平衡解離定数）および／またはＫｏｆｆ（「オフレート定数」）値などの適切な動力学的特性に左右され、細胞から１価で結合した抗体または断片を遊離させる。前記抗体またはその断片の多価結合から１価結合への転換方法には、例えば、特異的切断部位もしくは構造を使用した酵素切断によって、あるいはタグまたは抗体もしくはその断片のいずれかと置換することができる物質を過剰に添加することによる、抗体もしくはその断片からのタグの競合的置換によって（例えば、ＣＤ３などの標的抗原を対象とするビオチン化抗体またはその断片に結合した、抗ビオチン抗体蛍光色素コンジュゲートと置換するビオチンで、ビオチン化抗体または断片は抗ビオチン抗体蛍光色素コンジュゲートによって架橋結合している）、抗体もしくはその断片を粒子または標識などのタグから除去することが含まれる。
【００８５】
本明細書で開示した抗体またはその断片を使用することによって濃縮および／または分離した細胞組成物は、単独で、または希釈剤および／またはサイトカインなどのその他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与してもよい。簡単に説明すると、本発明の医薬組成物は、本明細書で開示した抗体またはその断片を使用することによって濃縮および／または分離した細胞組成物を、薬学的または生理学的に許容される１つまたは複数の担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでいてもよい。このような組成物は、中性で緩衝された生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースもしくはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでいてもよい。
【００８６】
好ましくは、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化する。細胞組成物の対象への投与は、当業界で公知のいかなる便利な方法で実施してもよい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、治療する疾患に適切な方法で投与することができる。適切な投薬は、臨床試験によって決定することができる。しかし、投与の量および頻度はまた、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要素によって決定され、影響を受ける。
【実施例１】
【００８８】
親マウス抗体ＯＫＴ３および１５Ｅ８のインシリコ凝集分析
抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３および抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８の重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、凝集しやすい配列領域を予測するために当業界で公知のアルゴリズムを使用して分析した。このような領域は、タンパク質の組換え発現を妨害し、タンパク質発現レベルを低下させることが知られている。有用なアルゴリズムには、例えば、ＰＡＳＴＡ（Ｗａｌｓｈ等（２０１４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２、Ｗ３０１〜３０７）、ＷＡＬＴＺ（Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｔｒｏｈ等（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７、２３７〜２４２頁）およびＡＧＧＲＥＳＡＣＮ（Ｃｏｎｃｈｉｌｌｏ−Ｓｏｌｅ等（２００７年）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８、６５〜８１頁）が含まれる。アルゴリズムは典型的に、各アミノ酸に数値スコアを割り当て、このスコアは凝集する可能性の指標である。図１は、マウス親ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３の重鎖（配列番号１３、図１Ａ）および軽鎖（配列番号１４、図１Ｂ）可変ドメインならびにマウス親抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８の重鎖（配列番号１８、図１Ｃ）および軽鎖（配列番号１９、図１Ｄ）可変ドメインへのこのようなスコアの割り当てを示す。スコア０はナシを示し、スコア約＞２０は中程度を示し、スコア約＞５０は高度の凝集形成傾向を示す。抗ＣＤ３ＯＫＴ３の場合、凝集しやすい領域は検出されなかった。したがって、抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３の組換え発現は、タンパク質凝集によっては妨害されないことが予測され、したがって、正常な発現レベルおよび生成物力価が予測された。抗ＣＤ２８１５Ｅ８の場合、軽鎖は凝集の危険性が高いことが予測され、より低い発現レベルおよび生成物力価が生じる可能性がある。表２に示したように、抗ＣＤ２８のヒト化バリアントはまた、少なくとも親抗ＣＤ２８配列と同じ強さで凝集の危険性が高いことが予測される。
【実施例２】
【００８９】
ヒト生殖系列フレームワーク配列へのＣＤＲグラフトによる抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８のヒト化
ＣＤＲおよびＩＭＧＴ命名法によるアミノ酸残基のナンバリングは、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８の重鎖および軽鎖配列をＩＭＧＴ「ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ」ツールで処理することによって決定した。得られたナンバリング方式およびＣＤＲ定義を図２Ａおよび図２Ｂに示し、ＣＤＲはまた、配列番号７から配列番号１２で記載する。次のステップで、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列をヒト生殖系列Ｖ領域（ポリペプチド配列）の参照データベースと比較した。ＩＭＧＴヒトＩＧ参照ディレクトリセットの現行バージョン（２０１４年８月）を参照データベースとして使用した。これらの配列には、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２およびＦＲ３が含まれるが、ＣＤＲ３およびＦＲ４は含まれない。重鎖のＣＤＲ３はＶ領域の小部分、Ｄ領域全体およびＪ領域の小部分から主に組み立てられる。軽鎖のＣＤＲ３はＶ領域の小部分およびＪ領域の小部分から主に組み立てられる。ＦＲ４はＪ領域から得られる。さらに処理する前に、疑似遺伝子および重複配列をＩＭＧＴ参照セットから除去した。元の非ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域と高い同一性を有するヒト生殖系列配列の同定のために、ＦＡＳＴＡ３６パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｕｌｔｙ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｗｒｐｅａｒｓｏｎ／ｆａｓｔａ／）の一部であるｓｓｅａｒｃｈ３６プログラムに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することによって、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３ならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２の同一性を処理したＩＭＧＴ参照のアミノ酸レベルと比較した。重鎖には、Ｖ領域の対立遺伝子ＩＧＨＶ４−４＊０８（配列番号２７）をＣＤＲグラフトの適切な鋳型として選択した。軽鎖可変ドメインには、Ｖ領域の対立遺伝子ＩＧＫＶ４−１＊０１（配列番号２８）をＣＤＲグラフトの適切な鋳型として選択した。ＦＲ−４では、重鎖には対立遺伝子ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号３３）、軽鎖可変ドメインにはＩＧＫＪ４＊０１（配列番号３４）を鋳型として使用した。さらに、抗ＣＤ２８抗体配列は、ＩＭＧＴ参照配列、ＮＣＢＩ生殖系列配列およびａｂＹｓｉｓウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いたＶ−ＢＡＳＥを含む総合配列データベースと比較した。前述の鋳型配列の選択は、このように確認した。最後に、選択したヒト生殖系列鋳型配列ＩＧＨＶ４−４＊０８およびＩＧＫＶ４−１＊０１のＣＤＲ（ＩＭＧＴ定義に従う）を親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８（配列番号７〜１２）のＣＤＲと置換し、「抗ＣＤ２８グラフトＶＨ＿ｆｉｎａｌ＿ｌＭＧＴ」（配列番号２９）および「抗ＣＤ２８グラフトＶＬ＿ｆｉｎａｌ＿ｌＭＧＴ」（配列番号３０）を生成した。
【実施例３】
【００９０】
ＣＤ２８に特異的なヒト化抗体バリアントの構造モデリングおよび逆突然変異のためのアミノ酸残基の同定
親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８（配列番号１８および配列番号１９）とは異なるＣＤＲをグラフトしたヒト生殖系列配列（配列番号２９および配列番号３０）のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３のアミノ酸残基を同定するために、これらの配列間のペアワイズアラインメントをＬＡＬＩＧＮプログラムを使用して行った。ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基（「Ｖｅｒｎｉｅｒ残基」）と物理的に相互作用し（水素結合、静電的、疎水性またはその他の相互作用によって）、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８とヒト鋳型生殖系列配列との間で異なるフレームワーク領域内のアミノ酸残基は、ヒト化抗体の抗原結合および構造強度に重要であり得る。これらの残基は逆突然変異されなければならない、すなわち、ＣＤＲをグラフトした配列内のそれぞれのアミノ酸残基は、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８内の同じ位置の対応するアミノ酸によって置換されなければならない。逆突然変異に適切なアミノ酸残基の同定には、改変する抗体の３次元構造についての知識が必要である。親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８の構造データは利用することができなかったので、親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８と高い配列同一性を有する代わりの抗体を使用した。この目的のために、１５Ｅ８の軽鎖および重鎖配列のＰＤＢタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）に対するＢＬＡＳＴ検索を実行し、最高のビットスコアおよび最低のＥ値を示す対応するペプチド配列を有する構造を軽鎖および重鎖用に別々に選択した。重鎖には構造１ＧＩＧ（鎖Ａ）、軽鎖には構造４ＢＫＬ（鎖Ｃ）をそれぞれ選択した。構造をベースにした分析には、公開されているソフトウェア「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．０」（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用した。最初に、ＩＭＧＴ命名法によるＣＤＲを構造内に定義し、ＣＤＲの半径５Å内の全フレームワーク原子を同定した。その後、この手法によって同定した各フレームワークアミノ酸について、ヒト鋳型と親マウス抗ＣＤ２８抗体クローン１５Ｅ８との間の保存を調べた。この手法を使用して、ＣＤＲと特異的に相互作用し、おそらくＣＤＲの構造を安定化するアミノ酸を同定し、対応するヒトＣＤをグラフトした生殖系列配列に逆突然変異した。４つの異なるヒト化バリアント、配列番号２０および２１を含む「ｈｕＣＤ２８＿ｖ１」、配列番号２２および２３を含む「ｈｕＣＤ２８＿ｖ２」、配列番号２４および２５を含む「ｈｕＣＤ２８＿ｖ３」ならびに配列番号２６および２５を含む「ｈｕＣＤ２８＿ｖ４」を設計した。ｈｕＣＤ２８＿ｖ３とｈｕＣＤ２８＿ｖ４との間に対するｈｕＣＤ２８＿ｖ１とｈｕＣＤ２８＿ｖ２との間の主な差は、軽鎖可変ドメインにおける２つの逆突然変異、すなわち、アミノ酸置換Ｄ７４ＡおよびＳ９３Ｐ（ＩＭＧＴ命名法）である。
【実施例４】
【００９１】
ＤＮＡベクターのクローニングおよび大腸菌の形質転換
大腸菌におけるＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な非ヒト化およびヒト化Ｆａｂ断片それぞれの発現のために、抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３（配列番号１４と組み合わせた配列番号１３；配列番号１４と組み合わせた配列番号１５；配列番号１７と組み合わせた配列番号１６）または抗ＣＤ２８クローン１５Ｅ８（配列番号１９と組み合わせた配列番号１８；配列番号２１と組み合わせた配列番号２０；配列番号２３と組み合わせた配列番号２２；配列番号２５と組み合わせた配列番号２４；配列番号２５と組み合わせた配列番号２６）のいずれかの非ヒト化およびヒト化重鎖および軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬと称する）をコードする合成遺伝子をそれぞれ、ヒトカッパ軽鎖定常領域（ＣＬと称する、配列番号３２）のため、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ＣＨ１（配列番号３１）のために標準的ソフトウェアツールを使用して設計した。大腸菌発現ベクターへの直接クローニングを容易にするために、適合性のある隣接した制限部位を合成遺伝子配列に付加した。遺伝子合成は、サービス提供会社によって外部で実施した。Ｆａｂ断片の軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン（ＶＬおよびＣＬ）をコードする遺伝子配列は、軽鎖のペリプラズム移動のためにｐｈｏＡシグナル配列を含む。Ｆａｂ断片の重鎖（ＨＣ）可変ドメイン（ＶＨおよびＣＨ１、場合によってポリヒスチジンタグが続く）をコードする遺伝子配列は、重鎖のペリプラズム移動のためにｐｅｌＢシグナル配列を含む。クローニングは、当業界で公知の標準的技術を使用して実施した。得られた大腸菌発現ベクターを図３に示す。クローニング手法によって影響を受けたベクター領域は全て、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【実施例５】
【００９２】
大腸菌におけるＦａｂ断片の発現
ＣＤ３に特異的な、およびＣＤ２８に特異的なＦａｂを産生するために、大腸菌Ｗ３１１０細胞を、例えば、配列番号１６および配列番号１７で記載した重鎖（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを有するヒト化Ｆａｂバリアント「ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」をコードする「ｐＯＰＥ３１３  ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」などの適切な発現ベクターで形質転換した。形質転換した大腸菌の前培養物を複合培地（ダイズペプトン、酵母抽出物およびＮａＣｌを含有し、グルコースを補給）中で、一晩３７℃で震盪フラスコにおいて増殖させた。翌朝、複合培地（ダイズペプトン、酵母抽出物およびＮａＣｌを含有し、炭素源としてグルコースを補給）を含有する撹拌可能な研究室規模のバイオリアクター（３Ｌ）に、該前培養を使用して６００ｎｍでの最終光学濃度が０．０５になるよう接種した。細胞は、２８℃、ｐＨ７．０、ｐＯ２が少なくとも３０％で増殖させた。誘導前に、バイオリアクターを２５℃まで冷却し、その後ＩＰＴＧ０．２ｍＭを添加することによって標的タンパク質発現を誘導した。培養は、２５℃で少なくとも２０時間継続した。グルコースは、炭素源として常時添加し、ｐＨは７．０に維持した。細胞収集は、６０００×ｇで１時間遠心分離することによって実施した。収集した細胞ペレットは、さらに処理するために−２０℃で保存した。
【実施例６】
【００９３】
Ｆａｂ断片の精製
ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な組換えＦａｂは、実施例５の発酵した大腸菌細胞から、ペリプラズム抽出ステップおよびその後のクロマトグラフィー精製ステップによって精製した。細胞抽出のため、凍結した大腸菌ペレットを、細胞ペレット１ｇ（湿重量）当たりペリプラズム抽出緩衝液（Ｔｒｉｓ１００ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭ）１０ｍＬに再懸濁して、常時撹拌しながら少なくとも１６時間３７℃でインキュベートした。その後、懸濁液を６０００×ｇで１時間遠心分離した。上清は、Ｆａｂを含む大腸菌のペリプラズム画分を含有した。細胞ペレットは廃棄した。上清を濾過し、最初の親和性捕捉精製ステップとして、ＦＰＬＣ系の金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（ＡＫＴＡ）用のＩＭＡＣ樹脂（例えば、ＰｒｏＣａｔｃｈＨｉｓ樹脂、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を充填した適切なクロマトグラフィーカラムに添加した。不純物は、イミダゾール含有緩衝液（５ｍＭ）を使用して洗浄した。標的タンパク質は、少なくとも５０ｍＭの高濃度のイミダゾールを含有する緩衝液を使用して溶出した。溶出画分を収集し、カチオン交換マトリックス（例えば、ＳＰセファロース）に添加した。溶出は、０．３〜０．５Ｍの範囲のＮａＣｌを含有し、ｐＨ範囲６．０〜７．４のリン酸（２５ｍＭ）をベースにした緩衝液を使用して実施した。Ｆａｂを含有する溶出液を収集し、タンパク質含量はＢＣＡアッセイおよびＵＶ吸収（Ａ２８０ｎｍ）によって定量した。ＣＤ３に特異的な精製ＦａｂおよびＣＤ２８に特異的な精製Ｆａｂの一定量を使用するまで−７０℃で保存した。場合によっては、Ｆａｂは、例えば、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで再緩衝化した。図４は、一例として、Ｆａｂバリアント「ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」の精製工程の様々なステップの試料のクーマシー染色ＳＤＳゲルを示す。表１および２には、大腸菌細胞ペレット１００ｇから精製したＦａｂの量を示す。発現および精製工程はどのバリアントについてもほぼ同じだったので、精製したＦａｂの量はＦａｂバリアントの個々の発現レベルの良好な指標である。ＣＤ３については、精製後最高量のタンパク質がヒト化Ｆａｂバリアント「ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」で見いだされ、このことはバリアント「ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ」の発現レベルはまた、試験したバリアント全ての中で最高であったことを示している。ＣＤ２８については、精製後最高量のタンパク質がヒト化Ｆａｂバリアント「ｈｕＣＤ２８＿ｖ３」で見いだされ、このことはバリアント「ｈｕＣＤ２８＿ｖ３」の発現レベルはまた、試験したバリアント全ての中で最高であったことを示している。
【００９４】
【表１】
0006987640.tif 000002
【００９５】
表１は、（大腸菌細胞ペレット１００ｇからの）ＣＤ３抗原に特異的な精製Ｆａｂバリアントの収量を示す。Ｆａｂバリアント「ｃｈＣＤ３」の収率を１００％に設定した。配列番号はそれぞれ、重鎖および軽鎖可変ドメインの配列を意味する。
【００９６】
【表２】
0006987640.tif 000003
【００９７】
表２は、（大腸菌細胞ペレット１００ｇからの）ＣＤ２８抗原に特異的な精製Ｆａｂバリアントの収量を示す。Ｆａｂバリアント「ｃｈＣＤ２８」の収率を１００％に設定した。配列番号はそれぞれ、重鎖および軽鎖可変ドメインの配列を意味する。
【実施例７】
【００９８】
組換え体ＣＤ２８抗原を使用したＦａｂバリアントの動力学的定数の決定
ＣＤ２８抗原に特異的な実施例６のＦａｂバリアントは、表面プラズモン共鳴分光法（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって分析した。したがって、組換えＣＤ２８抗原（細胞外ドメイン、ほ乳類細胞で発現）を標準アミンカップリングによってＣＭ５チップに固定した。Ｆａｂバリアントは、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ０．０１Ｍ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＥＤＴＡ  ３ｍＭ、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０  ０．００５％ｖ／ｖ）において分析物として５０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。評価は、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェアで、１：１結合物質移動モデルを使用して実施した。表３は、５つのＦａｂバリアントについて測定した動力学的定数：速度定数「ｋ（ｏｎ）」および「ｋ（Ｏｆｆ）」および平衡解離定数「ＫＤ」を示す。
【００９９】
【表３】
0006987640.tif 000004
【０１００】
表３は、精製したＦａｂバリアントの動力学的定数を示す。［Ｍ］で示したＫＤ値によって決定した、Ｆａｂバリアント「ｃｈＣＤ２８」のＣＤ２８抗原に対する親和性を１００％に設定した。Ｍ、モル濃度；ｓ、秒。
【実施例８】
【０１０１】
ＣＤ３またはＣＤ２８抗原を発現する細胞の染色
実施例６の抗ＣＤ３ＦａｂバリアントのＣＤ３＋細胞に対する結合および染色について分析した。ＰＢＭＣ（末梢血単核球）をＦａｂバリアントｃｈＣＤ３＿ｍｕｔまたはｈｕｍＣＤ３＿ｍｕｔのいずれか２．５μｇ／ｍＬでインキュベートした。ＯＫＴ３−ＰＥコンジュゲート（１．５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。細胞に結合したＦａｂは、抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲートでインキュベートした後に検出した。Ｆａｂによってさらにインキュベートせずに抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲートによってのみ染色した細胞は、陰性対照として使用した。図５Ａ〜Ｄは、ＣＤ３バリアントのフローサイトメトリー分析のドットプロットを示す。類似の分析を、実施例６の抗ＣＤ２８ＦａｂバリアントのＣＤ２８＋細胞に対する結合／染色について実施した。ＰＢＭＣ（末梢血単核球）をＦａｂバリアントｈｕＣＤ２８＿ｖ１、ｈｕＣＤ２８＿ｖ２、ｈｕＣＤ２８＿ｖ３またはｈｕＣＤ２８＿ｖ４のいずれか５μｇ／ｍＬでインキュベートした。１５Ｅ８−ＰＥコンジュゲート（３．０μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。さらに、細胞を抗ＣＤ３−ＦＩＴＣコンジュゲートでインキュベートした。細胞に結合したＦａｂは、抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲートでインキュベートした後に検出した。Ｆａｂによってさらにインキュベートせずに抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲートによってのみ染色した細胞は、陰性対照として使用した。図５Ｅ〜Ｊは、ＣＤ２８バリアントのフローサイトメトリー分析のドットプロットを示す。Ｆａｂバリアントは全て機能的で、それらのマウス親抗体と類似の染色パターンを示す。
【実施例９】
【０１０２】
抗ＣＤ３Ｆａｂ、親ＯＫＴ３抗体、抗ＣＤ２８Ｆａｂおよび親１５Ｅ８抗体を含むナノマトリックスの作製
実施例６のＦａｂバリアントおよびＣＤ３に特異的、およびＣＤ２８に特異的な精製した親マウス抗体それぞれをナノマトリックスの作製のために使用した。デキストランは、可動性ポリマー鎖として使用した。この実施例では、磁気ナノマトリックスを生成し、したがって、ＭｏｌｄａｙおよびＭａｃＫｅｎｚｉｅの改変法を使用した。デキストランＴ４０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１０ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １．５ｇおよびＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．６４ｇをＨ２Ｏ  ２０ｍｌに溶解し、４０℃まで加熱する。撹拌中、４Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍｌをゆっくり添加し、溶液を７０℃まで５分間加熱する。粒子懸濁液を酢酸で中和する。凝集物を除去するため、懸濁液を２０００×ｇで１０分間遠心分離し、孔径０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過する。結合していないデキストランを、高勾配磁場（ＨＧＭＦ）において洗浄することによって除去する。磁気ナノマトリックスのＨＧＭＦ洗浄は、以下に記載したように組み立て、約０．６テスラ（ＭＡＣＳ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置いたスチールウールカラムで実施する。ナノマトリックス懸濁液１０ミリリットルをスチールウール２ｇの１５×４０ｍｍカラムに添加する。添加したカラムを酢酸ナトリウム０．０５Ｍ、３０ｍｌで洗浄する。外部磁場からカラムを取り除いた後、磁気ナノマトリックスを酢酸ナトリウム０．０５Ｍで溶出する。ナノマトリックスは茶色い懸濁液を形成する。相対的粒子濃度は、４５０ｎｍでの吸光度として表す。ナノマトリックスのサイズは、電子顕微鏡および動的光散乱法によって３０±２０ｎｍ（ｅ．ｍ．）および６５±２０ｎｍ（ＤＬＳ）であることが測定された。ナノマトリックスは、磁化率測定によって測定すると、超常磁性の振る舞いを示す。捕捉したフェライト微結晶のサイズは、磁気測定から約１０ｎｍであることが測定された。抗体およびＦａｂは、標準的生体共役反応化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２編、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．出版、２００８年）によって別々のナノマトリックスにコンジュゲートさせた。滅菌濾過後、得られたナノマトリックスをＰＢＳ緩衝液／０．３％ポロクサマー１８８中で−７０℃で保存した。結果として、以下のナノマトリックスを作製した：親抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ８を含むナノマトリックス、親抗ＣＤ２８抗体１５Ｅ８を含むナノマトリックス、抗ＣＤ３ＦａｂバリアントｃｈＣＤ３＿ｍｕｔを含むナノマトリックス、抗ＣＤ３ＦａｂバリアントｈｕＣＤ３＿ｍｕｔを含むナノマトリックス、抗ＣＤ２８ＦａｂバリアントｈｕＣＤ＿ｖ３を含むナノマトリックスおよび抗ＣＤ２８ＦａｂバリアントｈｕＣＤ３＿ｖ４を含むナノマトリックス。
【実施例１０】
【０１０３】
抗ＣＤ３タンパク質を含むナノマトリックス単独または抗ＣＤ２８タンパク質を含むナノマトリックスとの組み合わせによるＴ細胞の刺激
実施例９の抗体およびＦａｂバリアントを含むナノマトリックスをＴ細胞の刺激のために使用した。したがって、汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、汎Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。その後、細胞をカルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）２００ＩＵ／ｍＬを補給したＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）中でｃｍ２当たり１Ｅ＋０６細胞の密度で培養した。抗ＣＤ３Ｆａｂバリアントもしくは完全長抗体（ＯＫＴ３）のいずれかを含むナノマトリックスを単独で、または抗ＣＤ２８Ｆａｂバリアントもしくは完全長抗体（１５Ｅ８）それぞれを含むナノマトリックスと様々に組み合わせて使用した。Ｔ細胞刺激中の最終濃度は、各抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８完全長抗体については５００ｎｇタンパク質／ｍＬで、各抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ｆａｂバリアントそれぞれについては３３３ｎｇタンパク質／ｍＬであった。ナノマトリックスの刺激能力は、４８時間細胞培養した後、早期活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９（生きたＴ細胞中）を検出するためにフローサイトメトリーを使用して測定した。その後細胞をさらに５日間培養し、増殖率（生細胞中）をフローサイトメトリー収集によって測定した。図６Ａは、刺激後にＣＤ２５およびＣＤ６９の両方を発現するＴ細胞の頻度を示し、図６Ｂは刺激したＴ細胞の増殖率を示す。各ドットは、１ドナーの試料を表し、横線は中央値を表す。抗ＣＤ３単独の場合、ヒト化Ｆａｂ  ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔを含むナノマトリックスは、親ＯＫＴ３抗体を含むナノマトリックスよりも、早期活性化マーカーを発現し増殖率も高い細胞を多数誘導した。予測通り、抗ＣＤ３タンパク質を含むナノマトリックスを用いずに使用した抗ＣＤ２８タンパク質を含むナノマトリックスは、ＣＤ２５およびＣＤ６９の検出可能な発現を引き起こさず、細胞増殖の増加も引き起こさなかった。抗ＣＤ２８抗体１５Ｅ８を含むナノマトリックスと組み合わせると、ｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂを含むナノマトリックスは、ＯＫＴ３抗体を含むナノマトリックスと比較してより高い活性化および類似の増殖率をもたらした。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を含むナノマトリックスと組み合わせて、ｈｕＣＤ２８＿ｖ３またはｈｕＣＤ２８＿ｖ４  Ｆａｂのいずれかを含むナノマトリックスはいずれも、１５Ｅ８抗体を含むナノマトリックスよりも高い活性化および高い増殖率を示し、これらの結果は非常に確実で、再現性があった。ＦａｂバリアントｈｕＣＤ２８＿ｖ３またはｈｕＣＤ２８＿ｖ４のいずれかを含むナノマトリックスとＦａｂバリアントｈｕＣＤ３＿ｍｕｔを含むナノマトリックスとを組み合わせると、活性化した細胞の高い頻度および高い増殖率の着実な誘導について最高の結果をもたらした。
【実施例１１】
【０１０４】
マウス親ＯＴ３および１５Ｅ８抗体の凝集および二量体形成
精製ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）および１５Ｅ８（抗ＣＤ２８）抗体はそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で、気候室において密封したガラスバイアルに入れて２５℃、相対湿度４０％で２６週間保存した。いくつかの時点で、保存した抗体の試料は、単量体、二量体および凝集した抗体を区別するために分析用ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。図７Ａに示したように、１５Ｅ８の場合、保存開始時にほんのわずかの凝集形成が存在する。ＯＫＴ３の場合、直線状から指数関数的な凝集形成が検出され、２６週間後には凝集含量が１％に達した。同様の傾向が抗体二量体の形成（すなわち、２つの抗体の二量体）において認めることができ、一方、１５Ｅ８（図７Ｂ）では、二量体含量は保存中３〜５％の範囲で安定して維持され、二量体含量ＯＫＴ３は２６週間後９％まで連続的に増加した。この時点で、ＯＫＴ３単量体の含量は９０％未満まで減少した。
【実施例１２】
【０１０５】
精製した抗ＣＤ３Ｆａｂの安定性
実施例６のＦａｂバリアントはＰＢＳ／ＥＴＤＡ緩衝液中０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で３７℃で１週間インキュベートした。ＰＢＭＣをこれらのＦａｂおよびインキュベートしていないＦａｂ（参照）力価１μｇ／ｍＬを使用して染色した。細胞に結合したＦａｂは、抗ポリヒスチジン−ＰＥコンジュゲートでインキュベートした後に検出した。例示したドットプロットは、ｃｈＣＤ３Ｆａｂ（図８Ｂ＋Ｃ）およびｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ  Ｆａｂ（図８Ｄ＋Ｅ）について示している。図８Ｂ＋Ｄはインキュベートしていない（ストレスを与えていない）Ｆａｂを示し、図８Ｃ＋Ｅはインキュベートした（ストレスを与えた）Ｆａｂを示す。染色した細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ、％）を図８Ａに示す。インキュベートしていないＦａｂでは、各ＭＦＩを１００％に設定した。ＣＤＲが変異していないバリアントのＭＦＩはＦａｂの熱負荷後に３５％減少し、一方、両ＣＤＲ変異バリアント（ヒト化および非ヒト化）のＭＦＩ値の減少はずっと少ない（１１〜１２％）ことが認められる。インキュベートした、およびインキュベートしていないＦａｂ分子はまた、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。違いは検出することはできず、試料全ては熱負荷後に同じタンパク質バンドを示し、目に見える変化はなかった。目に見えるタンパク質凝集または分解生成物はなかった。
【実施例１３】
【０１０６】
抗ＣＤ３タンパク質を含むナノマトリックスの安定性
抗ＣＤ３タンパク質を含むナノマトリックスの安定性を試験するために、実施例９のナノマトリックスを３７℃で１週間インキュベートした。その後、これらのインキュベートした試料およびインキュベートしていない参照試料を実施例１０で記載したＴ細胞の刺激のために使用した。再度、刺激して４８時間後の早期活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９両方の発現ならびに刺激して１週間後のＴ細胞の増殖率を分析した。図９は、マウス親ＯＫＴ３抗体を含むナノマトリックスと比較したＦａｂバリアントｃｈＣＤ３＿ｍｕｔまたはｈｕＣＤ３＿ｍｕｔのいずれかを含むナノマトリックスの安定性の増加を例示しており、早期活性化マーカーの発現およびＴ細胞の増殖率はいずれも熱負荷後にＯＫＴ３を含むナノマトリックスの場合は減少するが、一方、Ｆａｂバリアントの１つを含むナノマトリックスはいずれも熱負荷後に受ける影響はずっと少ない。ＦａｂバリアントｈｕＣＤ＿ｍｕｔ３を含むナノマトリックスは最良の結果を示し、Ｔ細胞を効率よく刺激する能力は損失してないか、または損失は最小限である。
【実施例１４】
【０１０７】
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ｆａｂによる細胞の可逆的タグ付け
実施例６のＦａｂバリアントを細胞の可逆的タグ付けのために使用した。したがって、ＦａｂバリアントｈｕＣＤ３＿ｍｕｔ、ｈｕＣＤ２８＿ｖ３またはｈｕＣＤ２８＿ｖ４それぞれ１μｇ／ｍｌをリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液中においてＰＢＭＣと４℃で１０分間インキュベートした。その後、試料を分割した。一部をＦａｂバリアントに結合することができる抗ポリヒスチジン−ＡＰＣコンジュゲート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、製造者の指示による力価）で４℃で１０分間インキュベートした。リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液を添加し、タグ付けした細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、その後フローサイトメトリーによって分析した。その他の部分を最初にリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄し、次いで抗ポリヒスチジン−ＡＰＣコンジュゲートでインキュベートし、前述のようにフローサイトメトリーによって分析した。図１０Ａおよび１０Ｂは、抗ＣＤ３バリアントのフローサイトメトリー分析のドットプロットを示し、図１０Ｃ〜１０Ｆは抗ＣＤ２８バリアントのドットプロットを示す。全Ｆａｂバリアントは細胞をタグ付けすることができ（図１０Ａ、１０Ｃおよび１０Ｅ）、タグは抗ポリヒスチジン蛍光色素コンジュゲートを含む。タグ付けは可逆的で、細胞を洗浄することによって除去することができる（図１０Ｂ、１０Ｄおよび１０Ｆ）。結果はまた、Ｆａｂの動力学的特性が特異的および可逆的な細胞のタグ付けに有用な範囲内であることを示している。
【図１−１】
0006987640.tif 000005
【図１−２】
0006987640.tif 000006
【図２】
0006987640.tif 000007
【図３】
0006987640.tif 000008
【図４】
0006987640.tif 000009
【図５−１】
0006987640.tif 000010
【図５−２】
0006987640.tif 000011
【図６】
0006987640.tif 000012
【図７】
0006987640.tif 000013
【図８】
0006987640.tif 000014
【図９】
0006987640.tif 000015
【図１０】
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【配列表】
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