(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象において体重減少を刺激することに使用するための、有効量のハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）を含む、経口用組成物。
【請求項２】
必要とする対象において体重増加を減少させることに使用するための、有効量のハフニア・アルベイを含む、経口用組成物。
【請求項３】
ハフニア・アルベイが、医薬組成物の形態で前記対象に投与される、請求項１または２に記載の経口用組成物。
【請求項４】
ハフニア・アルベイが、発酵乳製品および乳製品を主体とする製品から選択される食品組成物の形態で前記対象に投与される、請求項１または２に記載の経口用組成物。
【請求項５】
前記食品組成物が、完全食品組成物、栄養補助食品、および栄養補給組成物を含む群から選択される、請求項４に記載の経口用組成物。
【請求項６】
前記食品組成物が、少なくとも１つのプレバイオティクスを含む、請求項４に記載の経口用組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのプレバイオティクスが、食物繊維である、請求項６に記載の経口用組成物。
【請求項８】
必要とする対象において飽満感を誘発することに使用するための、有効量のハフニア・アルベイを含む、経口用組成物であって、前記組成物は、医薬組成物または栄養補給組成物の形態である、経口用組成物。
【請求項９】
必要とする対象において満腹感を持続させることに使用するための、有効量のハフニア・アルベイを含む、経口用組成物であって、前記組成物は、医薬組成物、栄養補助食品または栄養補給組成物の形態である、経口用組成物。
【請求項１０】
必要とする対象において食物摂食量を減少させることに使用するための、有効量のハフニア・アルベイを含む、経口用組成物であって、前記組成物は、医薬組成物、栄養補助食品または栄養補給組成物の形態である、経口用組成物。
【請求項１１】
前記対象が、肥満ではない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の経口用組成物。
【請求項１２】
前記対象が、肥満である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の経口用組成物。
【請求項１３】
ハフニア・アルベイが、プロバイオティクスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の経口用組成物。
【請求項１４】
ハフニア・アルベイが、不活化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、必要とする対象に飽満感を誘発し満腹感を持続させる医薬組成物および食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢の組成と宿主の代謝表現型との間には相関が認められ（Ｌｅｙら，２００６）、「肥満」細菌叢の移植によって肥満（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら，２００６）および過食症（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒら，２０１０）が起こり得ることから、腸内細菌叢が宿主の摂食行動に影響を及ぼし得ることが示唆されている。宿主の食欲に対する腸内細菌の作用の根底にある機序は明らかにされていないが、腸内細菌が摂食量を制御する宿主分子経路を利用している可能性がある。
【０００３】
現時点での摂食量制御のモデルは、摂食の恒常性および快楽の局面を調節するいくつかの脳の回路にシグナルを伝達する腸由来の空腹ホルモンおよび満腹ホルモンに関係している（Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，２０１１；Ｉｎｕｉ，１９９９；ＭｕｒｐｈｙおよびＢｌｏｏｍ，２００６）。とりわけよく知られているのが、視床下部弓状核（ＡＲＣ）を起点とする食欲抑制経路および食欲促進経路であり、それぞれ、室傍核（ＰＶＮ）で中継されるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ニューロンおよび神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）／アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ニューロンを含む（Ａｔａｓｏｙら，２０１２；Ｃｏｗｌｅｙら，１９９９；Ｇａｒｆｉｅｌｄら，２０１５；Ｓｈｉら，２０１３）。ＡＲＣ経路とＰＶＮ経路は、扁桃体中心核（ＣｅＡ）に食欲抑制性の投射を行ってカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を発現する外側腕傍核で合流する（Ｃａｒｔｅｒら，２０１３；Ｇａｒｆｉｅｌｄら，２０１５）．
【０００４】
腸内細菌叢が宿主の食欲制御に及ぼす作用の機序として考えられるものに、腸内細菌叢のエネルギー摂取活動（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら，２００６）ならびに神経刺激性の伝達物質および代謝産物の産生（Ｄｉｎａｎら，２０１５；ＦｏｒｓｙｔｈｅおよびＫｕｎｚｅ，２０１３；Ｓｈａｒｏｎら，２０１４）がある。本発明者らは、腸内で局所的に、または全身で食欲制御経路に直接作用する細菌タンパク質が関係する証拠を得た。実際、食欲を調節するペプチドホルモンとの配列相同性を示す細菌タンパク質が数種類示されており（Ｆｅｔｉｓｓｏｖら，２００８）、最近、腸内共生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生するＣｌｐＢタンパク質が、αメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の抗原模倣体として同定された（Ｔｅｎｎｏｕｎｅら，２０１４）。α−ＭＳＨは、メラノコルチン受容体４（ＭＣ４Ｒ）の活性化により飽満感のシグナル伝達に重要な役割を果たすＰＯＭＣ由来神経ペプチドである（Ｃｏｎｅ，２００５）。ＭＣ４Ｒを介するα−ＭＳＨの食欲抑制作用は、主としてその中枢作用部位によるものとされてきた（Ｍｕｌら，２０１３）が、最近の研究では、腸内分泌細胞におけるＭＣ４Ｒの活性化が、満腹ホルモンであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）の放出を刺激することが示された（Ｐａｎａｒｏら，２０１４）。したがって、腸内細菌由来のα−ＭＳＨ様分子は、満腹ホルモンを合成させる腸内分泌細胞に直接作用することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、必要とする対象に飽満感を誘発し満腹感を持続させる医薬組成物および食品組成物に関する。具体的には、本発明は特許請求の範囲によって定められるものである。
【０００６】
本発明は、必要とする対象に飽満感を誘発する方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）を投与することを含む、方法に関する。
【０００７】
さらに本発明は、必要とする対象に満腹感を持続させる方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイを投与することを含む、方法に関する。
【０００８】
また本発明は、必要とする対象の食餌量を減少させる方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイを投与することを含む、方法に関する。
【０００９】
本発明の別の目的は、必要とする対象の摂食量を減少させる方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイを投与することを含む、方法である。
【００１０】
さらに本発明は、必要とする対象の体重増加を制御する方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイを投与することを含む、方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、必要とする対象の体重減少を刺激する方法であって、対象に有効量のハフニア・アルベイを投与することを含む、方法である。
【００１２】
一実施形態では、対象は肥満ではない。別の実施形態では、対象は肥満である。
【００１３】
一実施形態では、ハフニア・アルベイを、医薬組成物の形態で対象に投与する。別の実施形態では、ハフニア・アルベイを、食品組成物の形態で対象に投与する。
【００１４】
一実施形態では、食品組成物は、完全食品組成物、栄養補助食品、および栄養補給組成物を含む群から選択される
【００１５】
一実施形態では、ハフニア・アルベイは、プロバイオティクスである。別の実施形態では、ハフニア・アルベイは、不活化されている。
【００１６】
一実施形態では、食品組成物は少なくとも１つのプレバイオティクスを含む。一実施形態では、少なくとも１つのプレバイオティクスは食物繊維である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明者らは、ＣｌｐＢタンパク質またはＣｌｐＢタンパク質を発現する細菌が、必要とする対象において飽満感を誘発する、満腹感を維持する、摂食量を減少させる、体重増加を制御する、体重減少を刺激するおよび／または体脂肪量／除脂肪量比を減少させることができることを証明した。驚くべきことに、本発明者らは実際に、前記細菌が発現するＣｌｐＢタンパク質が、細菌投与によって誘発され得る免疫反応とは無関係に、おそらくＭＣＲ受容体を介して、飽満感、満腹感および摂食量に直接作用を及ぼすことを示した。
【００１８】
したがって、本発明の一態様は、必要とする対象に飽満感を誘発する方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００１９】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象に飽満感を誘発するのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象に飽満感を誘発するため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００２１】
本発明のさらなる一態様は、必要とする対象の満腹感を持続させる方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００２２】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の満腹感を持続させるのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の満腹感を持続させるため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００２４】
したがって、本発明の一態様は、必要とする対象の食餌量を減少させる方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００２５】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の食餌量を減少させるのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の食餌量を減少させるため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００２７】
本発明のさらなる一態様は、必要とする対象の摂食量を減少させる方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００２８】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の摂食量を減少させるのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の摂食量を減少させるため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００３０】
本発明のさらなる一態様はまた、必要とする対象の体重増加を制御する、特に減少させる方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００３１】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の体重増加を制御する、特に減少させるのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の体重増加を制御する、特に減少させるため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００３３】
本発明のさらなる一態様はまた、必要とする対象の体重減少を刺激する方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００３４】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の体重減少を刺激するのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の体重減少を刺激するため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００３６】
本発明のさらなる一態様は、必要とする対象の除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させる方法であって、対象に有効量のＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する有効量の細菌を投与することを含む、方法に関する。
【００３７】
本発明のまた別の態様は、必要とする対象、特に肥満対象の除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させるのに使用するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌に関する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の体脂肪量／除脂肪量比を減少させるため、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌を美容目的で非治療的に使用することに関する。
【００３９】
本明細書中使用されるように、用語「対象」は、温血動物、好ましくはヒト、ペットまたは家畜を表す。本明細書中使用されるように、用語「ペット」および「家畜」として、限定するものではないが、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよび／または家禽が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は雄性の対象または雌性の対象である。一部の実施形態では、対象は成年（たとえば１８歳超のヒトの対象）である。別の実施形態では、対象は小児（たとえば１８歳未満のヒトの対象）である。一部の実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療の受診を待機している対象、または医療を受診している対象、または本発明の方法に係る医療の対象を受けた／受けている／これから受ける対象、または疾患の発生に関してモニタリングされている対象であってもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、対象は肥満である。本明細書では、「肥満」は、対象のＢＭＩが好ましくは３０を上回っている医学的状態を指す。「ＢＭＩ」または「体格指数」は、対象の体重を対象の身長の平方で割ったものと定義される。医学で一般に用いられる公式では、尺度の単位がｋｇ／ｍ２となる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、対象は中等度の肥満である。「中等度の肥満」の対象は、ＢＭＩが３０〜３５の対象を指す。
【００４２】
いくつかの実施形態では、対象は、体格指数が１８．５〜３０である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、対象は肥満ではない。非肥満対象は通常、正常体重である。本明細書では、「正常体重」は、ＢＭＩが１８．５〜２５となる体重を指す。
【００４４】
いくつかの実施形態では、対象は体重過多である。本明細書では、「体重過多」は、ＢＭＩが２５〜３０となる体重を指す。いくつかの実施形態では、対象は健康な体重過多または合併症のない体重過多の対象である。本明細書では、「健康な体重過多」または「合併症のない体重過多」の対象は、体重を直接の原因とする疾患も病態も認められない体重過多の対象を意味する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、対象は、減量のための食餌療法を実施しており、かつ／または体重を減らすことを望んでいる。他の実施形態では、対象は、減量のための食餌療法を実施しておらず、かつ／または体重を減らすことを望んでいない。
【００４６】
本明細書で使用される「満腹感」という用語は、個体が、自身の欲求が満たされている、または最小限に抑えられていると感じる、本質的に恒常的状態を指す。個体の満腹感には多数の生理学的要因が影響を及ぼしていると考えられる。例えば、味覚または味、嗅覚または匂い、ならびに胃部膨満感はいずれも、個体が「満腹である」と感じるかどうかに寄与し得る。より具体的には、「満腹感」は、それ以上食べることが抑制された状態であり、食事の間隔および次の食餌で摂取する食物の量を決定する。「満腹感の増大」などは、対照状態よりも満腹感が強く、かつ／または持続することを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される「飽満感」という用語は、食餌中に食べることを停止する状態であり、通常、食餌摂取の開始後一定の時間（例えば、２０〜３０分）以内に起こる／観察される、状態を指す。したがって、本明細書で「飽満感を誘発する」などと言及する場合、対象が食餌中に食物の摂取を停止する傾向を生じさせることを意味する。飽満効果は、食餌終了の時点をスコア化することによって求めることができる。飽満効果は、食餌終了時点の摂取カロリー量が対照よりも有意に少ない、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％またはそれ超少ない場合などに認められるものである。さらに長期間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれ超）にわたって、体重減少または体重変化を対照食と比較してスコア化することができる。一定量の被験組成物を（例えば、１日１回、１日２回またはそれ以上）投与される対象の体重は、対照の対象よりも有意に制御される（減少する、または増加が少なくなる）のが望ましい。本明細書で使用される「対照の対象」は、本発明のプロバイオティクス菌株を投与されなかった対象を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「ＣｌｐＢ」という用語は、当該技術分野で一般的な意味を有し、六量体ＡＡＡ＋ＡＴＰアーゼのＨｓｐ１００／ＣｌｐＢファミリーに属する熱ショックタンパク質Ｆ８４．１としても知られる。ＣｌｐＢは、獲得熱耐性ならびにいくつかのグラム陰性およびグラム陽性の病原性細菌、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのビルレンスおよび感染性に不可欠な因子として記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢは熱ショックタンパク質Ｆ８４．１またはｈｔｐＭとしても知られ、８５７個のアミノ酸からなるタンパク質である。シャペロンタンパク質ＣｌｐＢは通常、配列番号１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来シャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列（２０１３年１１月６日の時点で利用可能なＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿４１７０８３．１および／または２０１３年１１月６日の時点で利用可能なＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ６３２８４）を含むか、これよりなるものである。シャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列は通常、配列番号１のアミノ酸配列と９６〜１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはこれよりなるものである。好ましくは、ＣｌｐＢのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５４０〜５５０位の配列（ＡＲＷＴＧＩＰＶＳＲ）と９６、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。本願においては、グローバルアライメント（すなわち、２つの配列をその長さ全体にわたって比較すること）を用いて同一性のパーセントを算出する。２つまたはそれ超の配列の同一性を比較する方法は当該技術分野で周知である。例えば、ニードルマン・ヴンシュのグローバルアライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて２つの配列の完全長を考慮したときの最適アライメント（ギャップを含む）を求める「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用し得る。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えばｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで入手可能である。本発明による同一性のパーセントはＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを使用して、「ギャップオープン」パラメータが１０．０に等しく、「ギャップ伸長」パラメータが０．５に等しく、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列により算出するのが好ましい。本発明では、ＣｌｐＢタンパク質は、α−ＭＳＨタンパク質を模倣して飽満感を誘発するものである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣｌｐＢタンパク質は抗α−ＭＳＨ抗体によって認識される。抗体は通常、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナルウサギ抗α−ＭＳＨ  ＩｇＧ（１：１０００、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サンカルロス、カリフォルニア州、米��）などのポリクローナル抗体である。α−ＭＳＨのアミノ酸配列は、好ましくは、アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号２）（２０１３年１２月２日の時点で利用可能なＧｅｎ  Ｐｅｐｔ配列ＩＤ，ＰＲＦ：２２３２７４）を含むか、またはこれよりなるものである。
【００４９】
配列番号１：
ＭＲＬＤＲＬＴＮＫＦ  ＱＬＡＬＡＤＡＱＳＬ  ＡＬＧＨＤＮＱＦＩＥ  ＰＬＨＬＭＳＡＬＬＮ  ＱＥＧＧＳＶＳＰＬＬ  ＴＳＡＧＩＮＡＧＱＬ  ＲＴＤＩＮＱＡＬＮＲ  ＬＰＱＶＥＧＴＧＧＤ  ＶＱＰＳＱＤＬＶＲＶ  ＬＮＬＣＤＫＬＡＱＫ  ＲＧＤＮＦＩＳＳＥＬ  ＦＶＬＡＡＬＥＳＲＧ  ＴＬＡＤＩＬＫＡＡＧ  ＡＴＴＡＮＩＴＱＡＩ  ＥＱＭＲＧＧＥＳＶＮ  ＤＱＧＡＥＤＱＲＱＡ  ＬＫＫＹＴＩＤＬＴＥ  ＲＡＥＱＧＫＬＤＰＶ  ＩＧＲＤＥＥＩＲＲＴ  ＩＱＶＬＱＲＲＴＫＮ  ＮＰＶＬＩＧＥＰＧＶ  ＧＫＴＡＩＶＥＧＬＡ  ＱＲＩＩＮＧＥＶＰＥ  ＧＬＫＧＲＲＶＬＡＬ  ＤＭＧＡＬＶＡＧＡＫ  ＹＲＧＥＦＥＥＲＬＫ  ＧＶＬＮＤＬＡＫＱＥ  ＧＮＶＩＬＦＩＤＥＬ  ＨＴＭＶＧＡＧＫＡＤ  ＧＡＭＤＡＧＮＭＬＫ  ＰＡＬＡＲＧＥＬＨＣ  ＶＧＡＴＴＬＤＥＹＲ  ＱＹＩＥＫＤＡＡＬＥ  ＲＲＦＱＫＶＦＶＡＥ  ＰＳＶＥＤＴＩＡＩＬ  ＲＧＬＫＥＲＹＥＬＨ  ＨＨＶＱＩＴＤＰＡＩ  ＶＡＡＡＴＬＳＨＲＹ  ＩＡＤＲＱＬＰＤＫＡ  ＩＤＬＩＤＥＡＡＳＳ  ＩＲＭＱＩＤＳＫＰＥ  ＥＬＤＲＬＤＲＲＩＩ  ＱＬＫＬＥＱＱＡＬＭ  ＫＥＳＤＥＡＳＫＫＲ  ＬＤＭＬＮＥＥＬＳＤ  ＫＥＲＱＹＳＥＬＥＥ  ＥＷＫＡＥＫＡＳＬＳ  ＧＴＱＴＩＫＡＥＬＥ  ＱＡＫＩＡＩＥＱＡＲ  ＲＶＧＤＬＡＲＭＳＥ  ＬＱＹＧＫＩＰＥＬＥ  ＫＱＬＥＡＡＴＱＬＥ  ＧＫＴＭＲＬＬＲＮＫ  ＶＴＤＡＥＩＡＥＶＬ  ＡＲＷＴＧＩＰＶＳＲ  ＭＭＥＳＥＲＥＫＬＬ  ＲＭＥＱＥＬＨＨＲＶ  ＩＧＱＮＥＡＶＤＡＶ  ＳＮＡＩＲＲＳＲＡＧ  ＬＡＤＰＮＲＰＩＧＳ  ＦＬＦＬＧＰＴＧＶＧ  ＫＴＥＬＣＫＡＬＡＮ  ＦＭＦＤＳＤＥＡＭＶ  ＲＩＤＭＳＥＦＭＥＫ  ＨＳＶＳＲＬＶＧＡＰ  ＰＧＹＶＧＹＥＥＧＧ  ＹＬＴＥＡＶＲＲＲＰ  ＹＳＶＩＬＬＤＥＶＥ  ＫＡＨＰＤＶＦＮＩＬ  ＬＱＶＬＤＤＧＲＬＴ  ＤＧＱＧＲＴＶＤＦＲ  ＮＴＶＶＩＭＴＳＮＬ  ＧＳＤＬＩＱＥＲＦＧ  ＥＬＤＹＡＨＭＫＥＬ  ＶＬＧＶＶＳＨＮＦＲ  ＰＥＦＩＮＲＩＤＥＶ  ＶＶＦＨＰＬＧＥＱＨ  ＩＡＳＩＡＱＩＱＬＫ  ＲＬＹＫＲＬＥＥＲＧ  ＹＥＩＨＩＳＤＥＡＬ  ＫＬＬＳＥＮＧＹＤＰ  ＶＹＧＡＲＰＬＫＲＡ  ＩＱＱＱＩＥＮＰＬＡ  ＱＱＩＬＳＧＥＬＶＰ  ＧＫＶＩＲＬＥＶＮＥ  ＤＲＩＶＡＶＱ
【００５０】
本明細書中使用されている「アミノ酸」は、当該分野でよく知られている、それらの完全名、それらの３文字表記、またはそれらの１文字表記により表されている。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように略されている：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；スレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｌｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リジンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；およびグリシンはＧｌｙまたはＧ。
【００５１】
本明細書中使用されている用語「アミノ酸」は、中性のアミノ酸および合成のアミノの両方、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含んでいる。「標準的なアミノ酸」または「天然に存在するアミノ酸」は、天然に存在するペプチドで一般的に見いだされる２０の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準的なアミノ酸残基」は、合成的に調製されたか、または天然の供給源に由来するかどうかに関わらず、標準的なアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を意味する。たとえば、ナフチルアラニン（ｎａｐｈｔｌｙｌａｌａｎｉｎｅ）は、合成を容易にするためトリプトファンと置換することができる。置換できる他の合成アミノ酸として、限定するものではないが、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、αアミノ酸、たとえばＬ−α−ヒドロキシリシルおよびＤ−α−メチルアラニル、Ｌ−α―メチルアラニル、βアミノ酸、およびイソキノリルが挙げられる。
【００５２】
本明細書中使用される「アミノ酸」はまた、限定するものではないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および置換を含む、化学的に修飾されたアミノ酸をも含む。本発明のポリペプチド内のアミノ酸、特にカルボキシ末端またはアミノ末端のアミノ酸は、それらの活性に有害に影響することなくポリペプチドの循環半減期を変えることができる、メチル化、アミド化、アセチル化、または他の化学基との置換により、修飾することができる。さらに、ジスルフィド結合が、本発明のポリペプチドに存在していてもよく、または存在していなくてもよい。
【００５３】
本発明のＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、天然の標準的なアミノ酸または非標準的なアミノ酸を含み得る。ポリペプチド模倣体は、以下の修飾：
ｉ）１つまたは複数のペプチジル−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−結合が、−ＣＨ２−カルバメート結合（−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホネート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）結合、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）結合、−ＣＨ２−二級アミン結合、またはアルキル化したペプチジル結合（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）（式中、ＲがＣ１〜Ｃ４アルキルである）などの非ペプチジル結合により置換されているポリペプチド；
ｉｉ）Ｎ末端が−ＮＲＲ１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（式中ＲおよびＲ１が水素、またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、但しＲおよびＲ１の両方が水素ではない）に誘導体化されているポリペプチド；
ｉｉｉ）Ｃ末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２が、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシおよび−ＮＲ３Ｒ４（式中Ｒ３およびＲ４が独立して、水素およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される）に誘導体化されているポリペプチド
を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
一実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、アミノ酸配列の配列番号１またはその変異体を含むまたはからなる。一実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質は、アミノ酸配列の配列番号１を含むまたはからなる。
【００５５】
一実施形態では、本明細書中使用されている「ＣｌｐＢ変異体」は、アミノ酸配列の配列番号１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を表す配列を含む、またはからなる。
【００５６】
本明細書中使用されている、２つ以上のアミノ酸配列の配列間の関係で使用される場合の、用語「同一性」または「同一の」は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖の間の一致数により決定される、アミノ酸配列間の配列の関連性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示されるギャップアライメント（もしある場合）を用いて、２つ以上の配列のうちの小さな方の配列間での同一の一致のパーセントを測定する。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該分野でよく知られている。当該方法として、限定するものではないが、Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．  Ｌｅｓｋ，  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）；Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｗ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３）；Ｈｕｇｈ  Ｇ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ａｎｎｅｔｔｅ  Ｍ．  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４）；Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｒｅａｓｕｒｅ  Ｔｒｏｖｅ  ｏｒ  Ｔｒｉｖｉａｌ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８．  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ４８（５）：１０７３−１０８２に記載するものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最大の一致を提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムで記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １２（１  Ｐｔ  １）：３８７−３９５；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−４１０）を含むＧＣＣプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−４１０）から公開されている。ニードルマン・ヴンシュのグローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ  Ｃ．Ｄ．，１９７０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて２つの配列の完全長を考慮したときの最適アライメント（ギャップを含む）を求める「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用し得る。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、たとえば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅで入手可能である。本発明に係る同一性のパーセンテージは、ＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを使用して、「ギャップオープン」パラメータが１０．０に等しく、「ギャップ伸長」パラメータが０．５に等しく、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列により算出するのが好ましい。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。
【００５７】
本明細書中使用されている用語「変異体」は、概して、１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入が、本明細書中特に開示されているポリペプチドと異なるポリペプチドを表す。このような変異体は、天然に存在していてもよく、またはたとえば上記のポリペプチド配列のうちの１つもしくは複数を修飾し、本明細書中記載のポリペプチドの１つもしくは複数の生物学的活性を評価し、かつ／または当該分野でよく知られている多くの技術のいずれかを使用することにより、合成的に作製してもよい。修飾は、ポリペプチドの構造の中で行われてもよく、それでもなお望ましい特徴を伴う変異体または誘導体のポリペプチドをコードする機能的な分子を得ることが可能である。
【００５８】
同等の、またはさらには改善した、本発明の変異体またはリガンドの一部を作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましい場合、当業者は、概して、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変化させる。たとえば、特定のアミノ酸が、配列番号１の配列とＣｌｐＢタンパク質を比較して認容可能な機能の喪失を伴うことなく、タンパク質構造において他のアミノ酸により置換されていてもよい。
【００５９】
特定のアミノ酸配列の置換が、タンパク質配列で行われていてもよく、かつ当然、根底にあるＤＮＡコード配列で行われてもよく、にもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。よって、それらの生物学的な有用性もしくは活性の認識可能な損失を伴うことなく、様々な変化が、ペプチド配列、または上記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列でなされ得ることが考慮されている。多くの例では、ポリペプチドの変異体は、１つまたは複数の保存的置換を含むものである。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないと予測するような、類似する特性を有する別のアミノ酸によりアミノ酸が置換される置換である。よって、上記に略述されているように、アミノ酸の置換は、一般的に、アミノ酸の側鎖の置換基の相対的な類似性、たとえばそれらの疎水性、親水性、および電荷、大きさなどに基づくものである。上記の様々な特徴を考慮する例示的な置換は、当業者によく知られており、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが、挙げられる。アミノ酸の置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づき行われてもよい。たとえば、負に荷電したアミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸として、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられ；類似の親水性の値を有する無荷電の極性頭部基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の基として、（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；および（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓが挙げられる。
【００６０】
本明細書中使用される用語「保存的アミノ酸の置換」は、以下の５つの群：
（ｉ）小さな脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
（ｉｉ）極性、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
（ｉｉｉ）極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
（ｖ）大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうちの１つの中でのアミノ酸の交換としてさらに定義され得る。
【００６１】
同様にまたはあるいは、変異体は、非保存的な変化を含んでもよい。好ましい実施形態では、変異体のポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のアミノ酸の置換、欠失、または付加により天然の配列と異なる。同様に（またはあるいは）、変異体は、たとえば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、およびヒドロパシーの性質に最小限に影響するアミノ酸の欠失または付加により、修飾されてもよい。
【００６２】
一実施形態では、配列番号１の変異体は、配列番号１のうちの１つと少なくとも同等の有効性で、必要とする対象において飽満感を誘発する、満腹感を維持する、摂食量を減少させる、体重増加を制御する、体重減少を刺激する、および／または体脂肪量／除脂肪量比を減少させることができる。
【００６３】
一実施形態では、配列番号１の変異体は、配列番号１の配列と比較して、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の保存的アミノ酸の置換などの、保存的アミノ酸の置換を含む。
【００６４】
別の実施形態では、配列番号１の変異体は、配列番号１の配列由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ超のアミノ酸が、存在していない、もしくはいずれかのアミノ酸により置換されているポリペプチド、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ超のアミノ酸（連続するアミノ酸もしくは非連続のアミノ酸）が付加されているポリペプチドである。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本明細書中上述されているＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、たとえば、リン酸塩、酢酸塩、脂質、または糖質の基などの１つもしくは複数の官能基の付加、および／または１つもしくは複数の保護基の付加といった、当該分野でよく知られている方法により修飾されている。
【００６６】
たとえば、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、リン酸塩、酢酸塩、または様々な脂質および糖などの１つまたは複数の官能基の付加により、修飾することができる。また、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、ポリペプチド誘導体として存在することもできる。
【００６７】
用語「ポリペプチド誘導体」は、アミノ基（−ＮＨ−）、より具体的にはペプチド結合を有する化合物を表す。ポリペプチドは、置換アミドとしてみなすことができる。アミド基のように、ペプチド結合は、高度な共鳴安定化を示す。ペプチド結合におけるＣ−Ｎ単結合は、概して、約４０％の二重結合性を有し、Ｃ＝Ｏ二重結合は、約４０％の単結合性を有する。「保護基」は、保護されていない官能基を含む望ましくない反応（たとえばタンパク質分解）を予防する基である。アミノ保護基の具体的な例として、ホルミル；トリフルオロアセチル；ベンジルオキシカルボニル；置換ベンジルオキシカルボニル、たとえば（オルト−またはパラ−）クロロベンジルオキシカルボニルおよび（オルト−またはパラ−）ブロモベンジルオキシカルボニル；ならびに脂肪族オキシカルボニル、たとえばｔ−ブトキシカルボニルおよびｔ−アミルオキシカルボニル（ａｍｉｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）が、挙げられる。アミノ酸のカルボキシル基は、エステル基への変換を介して保護することができる。このエステル基として、ベンジルエステル、置換ベンジルエステル、たとえばメトキシベンジルエステル；アルキルエステル、たとえばシクロヘキシルエステル、シクロへプチルエステル、またはｔ−ブチルエステルが、挙げられる。グアニジノ部分は、たとえ保護基を必要としなくても、ニトロ；またはアリールスルホニル、たとえばトシル、メトキシベンゼンスルホニル、またはメシチレンスルホニルにより、保護されてもよい。イミダゾールの保護基として、トシル、ベンジル、およびジニトロフェニルが挙げられる。トリプロファンのインドール基は、ホルミルによって保護されてもよく、または保護されなくてもよい。
【００６８】
ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体の修飾は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの寿命の向上を目的としている。修飾の一種は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＣｌｐＢタンパク質またはその変異体のＮまたはＣ末端への付加である。ＰＥＧは、高い水溶性、高い溶液中の可動性、および低い免疫原性などの、ポリペプチドにとって理想的な担体となる多くの特性を有することが、当業者に知られている。またこの修飾は、エキソペプチダーゼからポリペプチドを保護することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるポリペプチドの総合的な安定性を上げる。
【００６９】
エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼによるポリペプチドの分解を予防するために使用される他の修飾として、アセチル化またはグリコシル化などのＮ末端での修飾、アミド化などのＣ末端での修飾、およびポリペプチド内の特定の部位での非天然のアミノ酸（βアミノ酸およびαトリフルオロメチルアミノ酸）の使用が、挙げられる。
【００７０】
ポリペプチドの分子の大きさを増やすための別の代替策として、ヒトのイムノグロブリン（たとえばＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含む）のＦｃドメインへのポリペプチドの遺伝子融合、またはアルブミンへのポリペプチドの融合が、ある。
【００７１】
本明細書中記載のＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、当該分野で周知である化学的合成または酵素的合成により、合成的に産生させることができる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、タンパク質発現ベクターに導入することができ、適切な宿主生物（たとえばバクテリア、昆虫細胞など）で産生させ、次に精製することができる。一実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体は、たとえば大腸菌、酵母、バキュロウイルス―昆虫細胞、またはＨＥＫもしくはＣＨＯ発現系などの哺乳類細胞などの、たとえば当該分野で公知のいずれかの産生系を使用するクローニング方法により得られる。
【００７２】
追加的なポリペプチド（「タグ」）を、本ポリペプチドを精製、または同定、または精製するために、付加することができる。タンパク質のタグによって、たとえば、ポリペプチドを、マトリックスに高親和性で吸着させることができ、次に、マトリックスを、いずれかの有意な程度に複合体を溶出させることなく適切なバッファーでストリンジェントに洗浄することができ、その後、吸着した複合体を選択的に溶出させることができる。当業者に知られているタンパク質タグの例として、（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、アフィニティキチン−結合タグを有するインテイン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグがある。これらタンパク質のタグは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部に位置し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質を医薬組成物の形態で対象に投与する。いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質を薬学的に許容される賦形剤および任意選択で生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて医薬組成物を形成する。
【００７４】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与しても有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を引き起こすことのない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料または任意の種類の製剤助剤を指す。本発明の医薬組成物では、有効成分を単独で、または別の有効成分と組み合わせて、従来の薬学的補助物との混合物として単位投与形態で動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤もしくは液剤、舌下およびバッカル投与形態などの経口経路形態、エアロゾル、インプラント、皮下投与形態、経皮投与形態、局所投与形態、腹腔内投与形態、筋肉内投与形態、静脈内投与形態、皮下投与形態、経皮投与形態、髄腔内投与形態および鼻腔内投与形態ならびに直腸内投与形態を含む。医薬組成物は、注射可能な製剤に関して薬学的に許容されるビヒクルを含有するのが好ましい。これらは、特に等張滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなどまたは上記の塩の混合物）または場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を加えると注射用液剤を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。注射用途に適した医薬形態としては、滅菌水溶液剤または分散液剤；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射用液剤または分散液剤の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。いずれの場合も、形態は無菌状態でなければならず、かつ注射針を容易に通過する程度に流動性のあるものでなければならない。形態は、製造および保管の条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩の形で含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水を用いて調製することができる。同様に、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油を用いて分散液剤を調製することができる。通常の保管および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を抑えるため保存剤を含有する。有効成分は、中性型または塩型で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸と形成される、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒子径を維持することによって、また界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって抑えることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。滅菌注射用液剤は、上記で列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に必要量の活性ポリペプチドを組み込み、必要に応じてろ過滅菌することによって調製する。分散液は一般に、基礎となる分散媒と上記で列挙した中から必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌済みの有効成分を組み込むことによって調製する。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、有効成分に任意の所望の成分を追加した溶液を予め滅菌ろ過したものからその粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。製剤化後、液剤を投与製剤と適合性のある方法で、治療効果のある量で投与する。製剤は、上記の種類の注射用液剤などの様々な投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。水溶液を非経口投与するには、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝し、最初に液体希釈剤を十分な量の生理食塩水またはグルコースで等張にするべきである。このような特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解し、皮下注入液１０００ｍＬに加えるか、または提案される注入部位に注射することが可能である。治療する対象の状態によっては、必然的に用量がいくぶん変化する。いずれにせよ、投与の責任者が個々の対象に適した用量を決定する。
【００７５】
本明細書で使用される「ＣｌｐＢを発現する細菌」という表現は、上で定義したシャペロンタンパク質ＣｌｐＢもしくはその変異体、または配列番号１のアミノ酸配列と９６〜１００％同一のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むか、またはこれよりなるポリペプチドを発現または過剰発現する細菌を指す。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を発現する細菌は食品用細菌である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を発現する細菌はプロバイオティクス菌株である。
【００７８】
本明細書で使用される「プロバイオティクス」という用語は、十分量で組み込まれると、健康、快適さおよび快調さに対して従来の栄養学的効果を上回る正の効果を発揮する生きた微生物を表すものとする。プロバイオティクス微生物は、「適切な量を投与したとき宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義されている（ＦＡＯ／ＷＨＯ  ２００１）。本明細書で使用される「プロバイオティクス菌株」という表現は、宿主の健康および幸福に対して有益な効果を示す細菌株を表す。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、生存可能な細菌株、特に生存可能なプロバイオティクス菌株である。「生存可能な細菌株」という表現は、代謝的に活性であり、対象の消化管に生着することが可能な微生物を意味する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、細菌断片の混合物からなる生存可能でない細菌株、特にプロバイオティクス菌株である。いくつかの実施形態では、本発明の細菌断片の混合物は細菌株由来のタンパク質からなる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明のプロバイオティクス菌株は、食品用細菌から選択される。「食品用細菌」は、食品に使用され、一般に食品への使用が安全であると見なされる細菌を意味する。
【００８２】
細菌株は、天然起源の細菌株であっても遺伝子操作された細菌株であってもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を構成的に発現する細菌である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細菌内でＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を過剰発現させる。一般に、タンパク質が、標準的な条件下で自然にみられる所定のベースライン産生量よりも多い量または産生量で発現または産生される場合、タンパク質発現は「アップレギュレート」される、またはタンパク質が「過剰発現」される。タンパク質の過剰発現は、例えば、以下のうちのいずれか１つまたは複数のものを変化させることによって達成することができる：（ａ）宿主細胞の増殖条件または生存条件；（ｂ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）細胞におけるポリヌクレオチドの発現およびそのコピー数を制御するのに使用するプロモーター；ならびに（ｄ）宿主細胞そのもの。
【００８５】
いくつかの実施形態では、細菌内でのＣｌｐＢタンパク質またはその変異体の発現がアップレギュレートされるよう、細菌をストレス条件に曝露した。ストレスは、熱への曝露、温度変化、機械的応力長期保管もしくは低湿度保管および／または凍結乾燥もしくは噴霧乾燥からなる群より選択され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、細菌に、栄養供給を少なくとも５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回または２０回実施した。通常、細菌の増殖に好都合な培養培地、例えば実施例に記載されるミューラー・ヒントン培地によって栄養供給する。いくつかの実施形態では、定常期の間にＣｌｐＢタンパク質またはその変異体の濃度が定常期に最大になることから、前記反復栄養供給後の定常期の段階で細菌を単離する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細菌は、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体の発現がアップレギュレートされるよう少なくとも１つの点変異を含む。本明細書で使用される「点変異」という用語は、核酸の置換および／または欠失を意味する。あるいはまたはこれと同時に、ＣｌｐＢ遺伝子の調節ＤＮＡ配列内、例えば転写および翻訳制御配列内に少なくとも１つの変異が存在し、この変異がタンパク質の発現を調節するのが好ましい。調節ＤＮＡ配列内の変異は、タンパク質の発現をアップレギュレートする役割を果たし得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を発現するよう遺伝子操作されている細菌である。細菌株は通常、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体をコードする核酸で形質転換された。「形質転換」という用語は、宿主細胞に「外来性」（すなわち、外因性または細胞外）の遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を導入することにより、宿主細胞が導入遺伝子または導入配列を発現して所望の物質、通常、導入遺伝子または導入配列がコードするタンパク質または酵素を産生することを意味する。導入ＤＮＡまたは導入ＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。核酸は、親微生物の形質転換後も染色体外に留まっている場合もあれば、微生物のゲノム内に組み込まれるよう適応する場合もある。したがって、核酸は、染色体外構築物の組込み（例えば、相同組換えおよび宿主ゲノム内への標的化組み込みを可能にする領域）または安定な発現および複製を補助するように適合させたさらなるヌクレオチド配列（例えば、複製起点、プロモーターをはじめとする制御配列）を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は核酸構築物またはベクターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物または発現ベクターであるが、他の構築物およびベクター、例えばクローン化に使用するものなども本発明に包含される。いくつかの実施形態では、発現構築物または発現ベクターはプラスミドである。発現構築物／ベクターは通常、本明細書で上に記載したプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、その制御下にある遺伝子の構成的発現を可能にする。しかし、誘導プロモーターも同様に用いてもよい。本発明の発現構築物／ベクターは必要に応じて、プロモーターに加えて任意の数の調節エレメント、ならびにＣｌｐＢタンパク質またはその変異体の発現に適した追加の遺伝子を含み得ることが理解されよう。細菌細胞を細胞外核酸で形質転換する方法は当該技術分野で周知である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、グラム陰性菌株である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、腸内細菌科のメンバーである。具体的には、細菌株は腸内細菌科の非病原性のメンバーである。
【００９１】
興味深いことに、本発明者らは、腸内細菌科の全細菌のＣｌｐＢタンパク質が互いに１００％の同一性を示すことを示した。
【００９２】
いくつかの実施形態では、細菌株、特にプロバイオティクス菌株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。いくつかの実施形態では、本発明の教示に従って使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、特にプロバイオティクス大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株には、プロバイオティクス活性を示す非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が含まれる。プロバイオティクス大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例は、公知の市販のプロバイオティクス大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｍ−１７の単離体であるＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９）のプロバイオティクス大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＢＵ−２３０−９８である。非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７である。プロバイオティクスとしては知られていなかった大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例は、実験用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｋ１２である。
【００９３】
他の実施形態では、細菌株はハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）株、例えばＢｉｏｐｒｏｘ社が商品化したハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）ＡＦ０３６株である。さらに別の実施形態では、細菌株はプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）株である。
【００９４】
さらに別の実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体を発現する細菌株の組合せを使用する。
【００９５】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は通常、当該技術分野で周知の任意の適切な培養培地を用いて産生される。様々な発酵培地が本発明に適しており、例えば（特に限定されないが）第一に、菌株（１つまたは複数）を増殖させ、それをそのまままたは濃縮（例えば乾燥）後または別の食品主成分もしくは食品に添加後に使用する産業用培地が本発明に適している。あるいは、細菌細胞もしくは細菌細胞と培地（例えば、発酵ブロス）またはそのような細胞含有培地の画分（すなわち、前記細菌株の入った培地）を使用してもよい。細胞または細胞含有培地は、その菌株の生きた細菌細胞もしくは生存可能な細菌細胞および／または死滅した細菌細胞もしくは生存可能でない細菌細胞を含む。したがって、特に限定されないが、加熱または超音波処理によって培地を処理してもよい。同様に、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株の調製方法には、凍結乾燥もしくは凍結させた細菌および／または無細胞培地（濃縮されていてもよい）が包含される。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の細菌株を凍結乾燥させた後、好ましくは、投与する前に再懸濁させる。
【００９７】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は通常、経口摂取（すなわち、経口経路）によって対象に投与する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を胃から保護するためにカプセル封入する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株の生存時間が有意に改善するよう、カプセル封入形態の組成物に製剤化する。このような場合、カプセルの存在によって、特に消化管内での微生物の分解が遅延または防止され得る。本発明の実施形態の組成物は、腸溶コーティングされた持効性のカプセルまたは錠剤に封入することが可能であることが理解されよう。腸溶コーティングによって、カプセル／錠剤が消化管の中を通過し、小腸などに到達する時間までインタクトの（すなわち、溶解していない）状態を維持することが可能となる。生きた細菌細胞をカプセル封入する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｌｌｓ社に対する米国特許、例えば米国特許第６，７２３，３５８号などを参照されたい）。例えば、アルギン酸とＨｉ−Ｍａｉｚｅ（商標）デンプンでマイクロカプセル化した後、凍結乾燥させることにより、乳製品中の細菌細胞の有効期間を延ばすことに成功することが証明されている［例えば、Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ  Ｋ．  （２００２）  Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３（２），  ３９−４８を参照されたい］。あるいは、コンニャク（Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓ  ｋｏｎｊａｃ）から抽出される繊維などのグルコマンナン繊維を用いてカプセル封入を実施してもよい。あるいは、生きた細菌のゴマ油乳剤への捕捉を用いてもよい［例えば、Ｈｏｕ  Ｒ．Ｃ．，  Ｌｉｎ  Ｍ．Ｙ．，  Ｗａｎｇ  Ｍ．Ｍ．，  Ｔｚｅｎ  Ｊ．Ｔ．  （２００３）  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ８６，  ４２４−４２８を参照されたい］。いくつかの実施形態では、腸溶コーティング剤は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマーなどのメタクリル酸−アルキルアクリル酸コポリマーであるのが好ましい。ポリ（メタ）アクリル酸は、コーティング材料として特に適していることが証明されている。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）は、アクリル酸とメタクリル酸のエステルに由来するコポリマーの商標名であり、その特性は官能基によって決まる。個々のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）のグレードは、中性、アルカリ性または酸性基の割合が異なり、このため物理化学的特性が異なる。様々な薬学的応用および技術的応用において、様々なＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーを上手く用いて組み合わせることにより、薬物放出を制御するのに理想的な溶液が得られる。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）は、徐放錠およびペレットコーティングのための機能的フィルムを提供する。このポリマーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．、ＵＳＰ／ＮＦ、ＤＭＦおよびＪＰＥなどの国際薬局方に記載されている。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーは、薬物放出の制御に以下のような可能性をもたらし得る：消化管標的化（胃酸耐性、結腸での放出）、保護コーティング（味および匂いのマスキング、水分からの保護）および薬物放出の遅延（徐放性製剤）。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーは、広範囲の様々な濃度ならびに水溶液、水分散液、有機溶液および固体物質を含む広範囲の物理的形態で入手可能である。ＥＵＤＲ��ＧＩＴ（登録商標）ポリマーの薬学的特性は、その官能基の化学的特性によって決まる。以下が異なる：
−（塩形成によって）消化液に可溶性のポリ（メタ）アクリル酸：酸性またはアルカリ性の基を有するＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ（メタクリル酸コポリマー）、Ｓ（メタクリル酸コポリマー）、ＦＳおよびＥ（塩基性ブチル化メタクリル酸コポリマー）ポリマーは、有効成分のｐＨ依存性の放出を可能にする。用途：胃酸のみに対する抵抗性による単純な味のマスキングから、腸管のあらゆる区画での薬物放出の制御まで。
−消化液に不溶性のポリ（メタ）アクリル酸：アルカリ性の基を有するＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬおよびＲＳ（アンモニオメタクリル酸コポリマー）ポリマーならびに中性の基を有するＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＮＥポリマーは、ｐＨ依存性の膨潤により有効成分の持効放出の制御を可能にする。
腸溶ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）コーティングにより、胃内での薬物放出からの保護が得られ、腸内での放出制御が可能となる。主な放出の基準は、胃（ｐＨ１〜５）ではなく腸の特定の区画（ｐＨ５〜７超）で起こるコーティングのｐＨ依存性の溶解である。このような用途のために、カルボキシル基を含有するアニオン性ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）グレードを互いに混合することができる。これにより溶解ｐＨを微調整し、これにより腸内の薬物放出部位を定めることが可能となる。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＬグレードおよびＳグレードは腸溶コーティングに適している。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ（アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルおよびメタクリル酸をベースとするアニオン性コポリマーの水性分散液）は、特に結腸での放出制御に用いられる。
【００９９】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は通常、食品組成物の形態で対象に投与する。したがって、本発明のさらなる一態様は、一定量の本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物に関する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は、完全食品組成物、栄養補助食品、栄養補給組成物などから選択される。本発明の組成物は、食品成分および／または飼料成分として使用し得る。
【０１０１】
食品成分は、用途、適用様式および／または投与様式に応じて、液体形態であっても固体であってもよい。
【０１０２】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株は通常、組成物の製造工程の任意の時点で添加され、例えば、製造工程の開始時に食品主成分に添加しても、あるいは、最終的な食料製品に添加してもよい。
【０１０３】
「食品」は、液体（すなわち、飲料）、固体または半固体の食餌用組成物、特に、追加の栄養摂取または栄養補助食品組成物を必要としない完全食品組成物（代替食品）を指す。栄養補助食品組成物は、他の手段による栄養摂取に完全に代わるものとはならない。食品組成物および栄養補助食品は、例えば、好ましくは１日１回または複数回、経口的に投与または摂取する、発酵乳製品または乳製品を主体とする製品である。発酵乳製品は、製造工程に本発明による細菌を直接用いて、例えば、それ自体が公知の方法を用いて食品主成分に添加することによって、製造することができる。このような方法では、通常使用する微生物に加えて本発明の菌株（１つまたは複数）を使用してもよく、および／または通常使用する微生物の１つもしくは複数または一部と置き換えてもよい。例えば、ヨーグルトまたはヨーグルトを主体とする飲料などの発酵乳製品の調製において、本発明の細菌を開始培養物に添加するか、もしくは開始培養物の一部として使用してもよく、またはそのような発酵の過程で適切に添加してもよい。任意選択で、細菌を製造工程でのちに不活化または死滅させてもよい。発酵乳製品としては、乳を主体とする製品、例えば（特に限定されないが）デザート、ヨーグルト、ヨーグルト飲料、クワルク、ケフィア、発酵乳を主体とする飲料、バターミルク、チーズ、ドレッシング、低脂肪スプレッド、フレッシュチーズ、ダイズを主体とする飲料、アイスクリームなどが挙げられる。あるいは、食品組成物および／または栄養補助食品組成物は、非乳製品または非発酵乳製品（例えば、非発酵乳または別の食品培地中の菌株または無細胞培養培地）であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明のプロバイオティクス菌株をカプセル封入して食品培地（例えば、乳）または非食品培地に分散させる。非発酵乳製品としては、アイスクリーム、栄養補助バーおよびドレッシングなどが挙げられる。非乳製品としては、粉末飲料および栄養補助バーなどが挙げられる。製品は、公知の方法、例えば、無脂肪乳、乳または乳を主体とする組成物などの食品主成分に有効量の菌株および／または無細胞培養培地を添加すること、および公知の発酵などを用いて製造し得る。細菌細胞および／または無細胞培養培地（を含む組成物）を添加し得る他の食品主成分は、肉、代替肉または植物性主成分である。
【０１０４】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む組成物は、固体、半固体または液体であり得る。本発明の組成物は、食品または栄養補助食品の形態、例えば、錠剤、ゲル、粉末、カプセル、飲料、バーなどの形態であり得る。例えば、組成物は、小袋に詰められて、水、フルーツジュース、乳、または別の飲料に溶解することができる粉末の形態であり得る。
【０１０５】
本明細書で使用される「食品成分」または「飼料成分」という用語は、栄養補給剤として機能性食品または機能性食材に添加する、または添加することが可能な製剤を包含する。
【０１０６】
「栄養食品」、「栄養補給」食品または「機能性」食品は、健康に有益な効果をもたらす成分または生理機能を改善することが可能な成分を含有する食材を意味する。
【０１０７】
「栄養補助食品」とは、通常の食事を補完する目的を有する食材を意味する。栄養補助食品は、単独で、または少量を組み合わせて摂取したときに栄養効果または生理効果を有する、栄養素または他の物質の濃縮供給源である。
【０１０８】
本発明では、「機能性食品」とは、栄養および味の点で価値が高いのみならず、特定の成分物質により重要である、最近開発された食材および対応する製品の総称である。本発明では、健康を中期または長期にわたって維持および増進することが重要である。この点では、非治療的使用が好ましい。「栄養補給食品」、「フードシューティカル（ｆｏｏｄｓｃｅｕｔｉｃａｌ）」および「デザイナーフード」という用語も本発明の実施形態を表し、同義語として使用されるが、一部異なるように使用されることもある。しかし、健康の予防的側面および促進ならびに製品の食品特性は、機能性食品という用語によって最も明瞭になる。多くの場合、これらは、品揃え選定（本発明にも当てはまる）、精製、濃縮によって蓄積された製品に関するが、添加によって蓄積された製品にもますます関連する。特に錠剤または丸剤の形態では単独の有効物質は含まれない。機能性食品の法的定義は存在しないが、この領域に関心のある団体の多くは、機能性食品が、基本的な栄養効果を上回る特定の健康効果を有するものとして販売される食品であるという点で一致している。したがって、機能性食品は、純粋な栄養効果ではなく特定の機能的利益、例えば医学的または生理学的利益を食品にもたらす構成要素または成分（本明細書に記載されるものなど）を組み込んだ通常の食品である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、飲料は、機能性飲料または治療用飲料、喉の渇きを癒す飲料または通常の飲料である。例を挙げれば、本発明の組成物をソフトドリンク、フルーツジュースまたは乳清タンパク質を含む飲料、健康茶、ココア飲料、乳飲料および乳酸菌飲料、ヨーグルトおよび飲むヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、水氷およびデザート、糖菓、ビスケットケーキおよびケーキミックス、スナック食品、バランス食品およびバランス飲料、フルーツフィリング、ケアグレーズ（ｃａｒｅ  ｇｌａｚｅ）、チョコレートベーカリーフィリング、チーズケーキ風味フィリング、フルーツ風味ケーキフィリング、ケーキおよびドーナツのアイシング、インスタントベーカリーフィリングクリーム、クッキー用フィリング、すぐに使えるベーカリーフィリング、低カロリーフィリング、成人用栄養飲料、酸性化大豆／ジュース飲料、無菌／レトルトチョコレート飲料、バーミックス、飲料粉末、カルシウムを強化した豆乳／プレーンミルクおよびチョコレートミルク、カルシウム強化コーヒー飲料の成分として使用することができる。
【０１１０】
組成物はさらに、食品、例えばアメリカンチーズソース、粉チーズおよび細切りチーズの凝固防止剤、チップディップ、クリームチーズ、乾燥混合ホイップトッピング無脂肪サワークリーム、凍結／融解した生ホイップクリーム、凍結／融解した安定なホイップのトッピング、低脂肪／低カロリーナチュラルチェダーチーズ、低脂肪スイス式ヨーグルト、気泡の入った冷菓、ハードパックアイスクリーム、ラベルフレンドリー（ｌａｂｅｌ  ｆｒｉｅｎｄｌｙ）で経済性および嗜好性が改善されたハードパックアイスクリーム、低脂肪アイスクリーム、バーベキューソース、チーズディップソース、カッテージチーズドレッシング、ドライミックスアルフレッドソース、ミックスチーズソース、ドライミックストマトソースおよびその他などの成分として使用することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む組成物をヨーグルト、例えば発酵ヨーグルト飲料、ヨーグルト、飲むヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、乳を主体とするデザートおよびその他などの製造に使用する。組成物はさらに、チーズ用途、肉用途または防御培養物を含む用途のうちの１つまたは複数の成分として適切に使用することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は、ミールリプレイスメント製品の調製に適している。本明細書で使用される「ミールリプレイスメント製品」という用語は、特に明記されない限り、タンパク質、炭水化物、脂質、ビタミンおよびミネラルを含有し、組み合わせると食餌の唯一のまたは主要な栄養源として適切なものとなる、任意の栄養製品を含む。ミールリプレイスメント製品は通常、少なくとも１つの炭水化物源、少なくとも１つの脂質源および／または少なくとも１つのタンパク質源を含む。タンパク質源としては、任意の適切な食物タンパク質、例えば、動物タンパク質（乳タンパク質、肉タンパク質および卵タンパク質など）；植物タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質およびエンドウマメタンパク質など）；遊離アミノ酸の混合物；またはその組合せを使用し得る。カゼインおよび乳清などの乳タンパク質および大豆タンパク質が特に好ましい。タンパク質は、未加工タンパク質、加水分解タンパク質または未加工タンパク質と加水分解タンパク質の混合物であり得る。例えば牛乳アレルギーを発症するリスクがあると考えられる動物には、部分的に加水分解したタンパク質（加水分解の程度は２〜２０％）を与えるのが望ましい場合がある。加水分解タンパク質が必要な場合、所望の通りに、また当該技術分野で公知の通りに加水分解工程を実施し得る。例えば、乳清タンパク質の加水分解物は、乳清画分を１つまたは複数の段階で酵素的に加水分解することによって調製し得る。出発物質として使用する乳清画分が実質的にラクトースを含まなければ、加水分解工程でタンパク質が受けるリジン遮断はかなり少ないことが見出される。これにより、リジン遮断範囲を総リジン重量の約１５％からリジン重量の約１０％未満まで、例えばリジン重量の約７％まで低下させることが可能となり、タンパク質源の栄養品質価を大幅に改善する。組成物が脂肪源を含む場合、組成物のエネルギーの５％〜４０％、例えばエネルギーの２０％〜３０％が脂肪源によって供給されるのが好ましい。適した脂肪プロファイルは、キャノーラ油、トウモロコシ油および高オレイン酸ヒマワリ油の混和物を用いて得ることができる。炭水化物源は、組成物のエネルギーの４０％〜８０％を供給するのが好ましい。任意の適切な炭水化物、例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固体、マルトデキストリンおよびその混合物を使用することができる。通常、１日１食をミールリプレイスメントによるエネルギー制限食餌療法に置き換えることが、体重減少後の体重の維持に寄与する。
【０１１３】
本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は通常、担体またはビヒクルを含む。「担体」または「ビヒクル」は、投与に適した材料を意味し、これには、無毒性で、組成物の任意の構成要素、特に細菌株と有害に相互作用しない当該技術分野で公知の任意のそのような材料、例えば任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などがこれに含まれる。栄養学的に許容される担体の例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ロウ、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよび脂肪酸ジグリセリド、石油エーテル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は、一定量の食物繊維を含む。食物繊維は酵素による消化を受けずに小腸を通過し、天然の増量剤および緩下剤として機能する。食物繊維は可溶性であっても不溶性であってもよく、一般には両者の混合物が好ましい。適切な食物繊維源としては、大豆、エンドウマメ、エンバク、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、シアリルラクトースおよび動物の乳に由来するオリゴ糖が挙げられる。いくつかの実施形態では、食物繊維はマンナン類の中から選択される。マンナン類（グルコマンナンおよびガラクトマンナンなど）、例えばグアーガム、イナゴマメガム、コンニャクおよびキサンタンガムなどは、一部の植物細胞壁に存在する。グルコマンナンは一般に、（１−４）−β結合したグルコースとマンノースの単位からなり、ガラクトマンナンは一般に、（１−４）−β−マンナン骨格を（１−６）−α−ガラクトースの単一単位で置換したものからなる。グアーおよびイナゴマメなどの多くの内胚乳のある豆果は、種子発達時の内胚乳にガラクトマンナンを含む。グルコマンナンはまた、穀粒の微量成分として見出されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は、ＵＳＲＤＡなどの政府機関の推奨に従って、ミネラルおよび微量栄養素、例えば微量元素およびビタミンなどを含有する。例えば、組成物は、以下の微量栄養素のうちの１つまたは複数のものを所定の範囲の１日量で含有し得る：カルシウム３００〜５００ｍｇ、マグネシウム５０〜１００ｍｇ、リン１５０〜２５０ｍｇ、鉄５〜２０ｍｇ、亜鉛１〜７ｍｇ、銅０．１〜０．３ｍｇ、ヨウ素５０〜２００μｇ、セレン５〜１５μｇ、ベータカロテン１０００〜３０００μｇ、ビタミンＣ１０〜８０ｍｇ、ビタミンＢ１１〜２ｍｇ、ビタミンＢ６０．５〜１．５ｍｇ、ビタミンＢ２０．５〜２ｍｇ、ナイアシン５〜１８ｍｇ、ビタミンＢ１２０．５〜２．０μｇ、葉酸１００〜８００μｇ、ビオチン３０〜７０μｇ、ビタミンＤ１〜５μｇ、ビタミンＥ３〜１０μｇ。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む組成物は、乳化剤を含有する。食品用乳化剤の例としては通常、モノグリセリドおよびジグリセリのジアセチル酒石酸エステル、レシチンならびにモノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。同様に、適した塩および安定剤が含まれ得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明のプロバイオティクス菌株を含む食品組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスを含有する。「プロバイオティクス」は、腸内での本発明のプロバイオティクス菌株の増殖を促進することを目的とする食物物質を意味する。プレバイオティクスは、オリゴ糖類からなる群より選択することができ、任意選択で、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ダイズおよび／もしくはイヌリン；ならびに／または食物繊維を含有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の細菌株、特にプロバイオティクス菌株を含む組成物は、保護親水コロイド（ガム、タンパク質、修飾デンプンなど）、結合剤、フィルム形成剤、カプセル封入剤／材料、壁材料／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ロウ、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤および抗菌剤を含有する。組成物はまた、従来の医薬品添加剤および医薬品補助剤、賦形剤ならびに希釈剤を含有してよく、特に限定されないが、水、任意の起源のゼラチン、植物ガム、リグニンスルホン酸塩、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などがこれに含まれる。いずれの場合も、上記のさらなる成分は、意図されるレシピエントに対して適しているかどうかを考慮して選択する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、または同ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌株、特にプロバイオティクス菌株の投与を例えば、１日間またはそれ超にわたって、一般には、必要に応じて１つまたは複数の休止期間を挟み少なくとも４日間または場合によっては４〜１５週間の長期間にわたって、１日２〜３回繰り返す。いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌株を対象の１回の食餌と同時にまたは逐次的に投与する。いくつかの実施形態では、ＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌株を対象の食餌の前に投与する。
【０１２０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、有益な効果（例えば、満腹感の刺激、飽満感の持続、摂食量の減少、体重増加の制御、特に体重増加の減少、体重減少の刺激および／または体脂肪量／除脂肪量比の減少）を得るのに十分なＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌の量を指す。本発明においては、対象に投与するＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体、またはＣｌｐＢタンパク質もしくはその変異体を発現する細菌の量は、個体の特徴、例えば全般的健康状態、年齢、性別、体重などに左右される。当業者であれば、これらおよび他の要因に応じて適切な用量を決定することが可能であろう。例えば、ＣｌｐＢタンパク質またはその変異体をプロバイオティクスの形態で対象に投与すると、本発明の菌株は、対象に有益な効果をもたらすのに十分なコロニーを形成することができる。細菌株、特にプロバイオティクス菌株を食品の形態で投与する場合、それは通常、食品組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０３〜１０１２ｃｆｕの本発明の細菌株を含み得る。
【０１２１】
以下の図面および実施例により本発明をさらに説明する。しかし、これらの実施例および図面は、決して本発明の範囲を限定するものではないものとして解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】正常Ｃ５７Ｂｌ６成体マウスへの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型（ＷＴ）またはＣｌｐＢ遺伝子欠失大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ΔＣｌｐＢ）の連日胃内送達が体重（Ａ、Ｅ）、２４時間の摂食量（Ｂ、Ｆ）および食餌パターン（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）に及ぼす効果を３週間の強制投与の開始前および終了時に解析したものを示す図である。対照マウス（Ｃｔｒ）には強制投与を実施しなかった。食餌パターンは、１食で摂取した飼料の平均量に相当する食餌量（Ｃ、Ｇ）および少なくとも５分の間隔を空けた２４時間当たりの食餌回数に相当する食餌頻度（Ｄ、Ｈ）として測定した。食餌量の減少は、より急速な飽満感を反映し、食餌頻度の減少は、より長い満腹感を反映している。Ａ：繰り返し測定のある二元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ事後検定＊ｐ＜０．０５。Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ：ＡＮＯＶＡ、チューキーの事後検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｅ：スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５。
【図２】ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンの電気的活動に対するＣｌｐＢの効果を示す図である。活動電位頻度は基底レベルに対する変化のパーセントで表した；平均±ＳＥＭ。ボンフェローニ事後検定＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を胃内強制投与する前および胃内強制投与した期間（第０〜２１日）の体重動態を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ、処置の効果：ｐ＝０．０１、ボンフェローニ事後検定Ｃｔｒ対大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。平均±ＳＥＭ。
【図４】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｎ＝８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ｎ＝８）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ．、ｎ＝７）を３週間胃内強制投与した後の（無作為化当日（＝１００％）からの）平均体重変化の百分率を示す図である。ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０１、チューキーの事後検定、＊ｐ＜０．０５。平均±ＳＥＭ。
【図５】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｎ＝８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ｎ＝８）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ．、ｎ＝７）を３週間胃内強制投与した後、ＥｃｈｏＭＲＩにより測定した同マウスの脂肪含有量を示す図である。ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００５、チューキーの事後検定＊＊ｐ＜０．０１。平均±ＳＥＭ。
【図６】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｎ＝８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ｎ＝８）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ．、ｎ＝７）を３週間胃内強制投与した後、ＥｃｈｏＭＲＩにより測定した同マウスの除脂肪量／脂肪量比を示す図である。ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０５、スチューデントのｔ検定＊ｐ＜０．０５。平均±ＳＥＭ。
【図７】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｎ＝８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ｎ＝８）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ．、ｎ＝７）を３週間胃内強制投与した期間の同マウスの１日の平均摂食量を示す図である。ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１、チューキーの事後検定＊＊＊ｐ＜０．００１。平均±ＳＥＭ。
【図８】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｎ＝８）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔＣｌｐＢ（ｎ＝８）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ．、ｎ＝７）を３週間胃内強制投与した期間の同マウスの１日の平均食餌回数を示す図である。ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１、チューキーの事後検定＊＊＊ｐ＜０．００１。平均±ＳＥＭ。
【図９】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７、凍結乾燥した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ｌｙｏ）（いずれもミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を胃内強制投与した期間の同マウスの毎日の体重増加を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０２、ボンフェローニ事後検定ａ、Ｃｔｒ．対大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７  ｌｙｏおよびｂ、Ｃｔｒ．対大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。平均±ＳＥＭ。
【図１０】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７、凍結乾燥した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ｌｙｏ）（いずれもミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を２週間胃内強制投与した後の同マウスの（無作為化当日（＝１００％）からの）平均体重変化の割合を示す図である。クラスカル・ウォリス  ｐ＜０．０１、ダンの事後検定＊ｐ＜０．０５、マン・ホイトニーの検定＃＃ｐ＜０．０１。平均±ＳＥＭ。
【図１１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７、凍結乾燥した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ｌｙｏ）（いずれもミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を２週間胃内強制投与した後、ＥｃｈｏＭＲＩにより測定した同マウスの脂肪含有量を示す図である。スチューデントのｔ検定＊＊ｐ＜０．０１。平均±ＳＥＭ。
【図１２】ラットの脳室内に異なる用量のＣｌｐＢを直接注射したときの摂食量に対する効果を示す図である。
【図１３】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）（ｎ＝１５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２Δ−ＣｌｐＢ）（ｎ＝１５）またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈａｆｎｉａ）（ｎ＝１５）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）（ｎ＝１２）を、１７日間胃内強制投与した後の体重増加（ｇ）を示す図である。
【図１４】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）（ｎ＝１５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２Δ−ＣｌｐＢ）（ｎ＝１５）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈａｆｎｉａ）（ｎ＝１５）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）（ｎ＝１２）を、１７日間胃内強制投与した後の累積摂食量（ｇ）を示す図である。
【図１５】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）（ｎ＝１５）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２（Ｋ１２ΔＣｌｐＢ）（ｎ＝１５）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｒｉ）（ｎ＝１５）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）（ｎ＝１２）を１７日間胃内強制投与した後の、ＥｃｈｏＭＲＩにより測定した体脂肪量および除脂肪量の増加を示す図である。Ａ．体脂肪量の増加（ｇ）。Ｂ．除脂肪量の増加（ｇ）。Ｃ．除脂肪量／脂肪量比。
【図１６】肥満ｏｂ／ｏｂマウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ）（ｎ＝１５）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２）（ｎ＝１５）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）（ｎ＝１５）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）（ｎ＝１２）を１７日間胃内強制投与した後の、（標準物質としてのアクチンの発現率に対する）相対的なホルモン−感受性リパーゼタンパク質（ｐＨＳＬ）の発現率を示す図である。ＨＳＬおよびアクチンの発現率を、ウエスタンブロットにより測定した。
【図１７】高脂肪食の検証。Ａ．高脂肪／高炭水化物食（ＨＦＤ）を与えたマウス（ｎ＝４８）および対照食を与えたマウス（Ｃｔｒｌ）（ｎ＝８）の体重（ｇ）。Ｂ．体脂肪量（ｇ）。Ｃ．除脂肪量（ｇ）。
【図１８】高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満マウスに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２Δ−ＣｌｐＢ）またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｉ）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を１４日間胃内強制投与した後の、Ｄ０からの体重減少を示す図である。
【図１９】高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満マウスに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２Δ−ＣｌｐＢ）またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｉ）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を１４日間胃内強制投与した後の、Ｄ０からの体脂肪量および除脂肪量の増加を示す図である。Ａ．体脂肪量の増加（ｇ）。Ｂ．除脂肪量の増加（ｇ）。
【図２０】肥満ｆａ／ｆａマウスに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２ΔＣｌｐＢ）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｉ）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を２１日間胃内強制投与した後の体重増加（ＡＵＣ−曲線下面積）を示す図である。
【図２１】肥満ｆａ／ｆａマウスに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２ΔＣｌｐＢ）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｉ）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を２１日間胃内強制投与した後の累積摂食量（ＡＵＣ）を示す図である。
【図２２】肥満ｆａ／ｆａマウスに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（Ｎｉｓｓｌｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｋ１２ΔＣｌｐＢ）、またはＨａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ  ＡＦ０３６（Ｈ．ａｌｖｅｉ）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または対照としてのＭＨ培地のみ（Ｃｔｒ）を２１日間胃内強制投与した後の体脂肪の増加（ｇ）を示す図である。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：
材料および方法
定期的な栄養供給後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖
牛肉浸出液３０％、カゼイン加水分解物１．７５％およびデンプン０．１５％を含有するｐＨ７．３、２５℃のＭＨ培地（Ｂｅｃｔｏｎ社、ディキンソン、メリーランド州）４０ｍＬを入れた５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎバイアル中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌を３７℃にて培養した。ヒトの１日２食のスケジュールを模倣するため、細菌に５日間連続で新たなＭＨ培地を１２時間毎に供給した。細菌の増殖を、ＭＨ培地の１回目の供給後は２時間毎に、３回目の供給後は１時間毎に、５回目の供給後は１０分毎に、分光光度計によってλ＝６００ｎｍでのＯＤとして測定した。１２時間の各サイクルの終了時、細菌を室温（ＲＴ）、６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、代わりに等量（約４０ｍＬ）の新たなＭＨ培地に入れた。ＭＨ培地を最後に供給した後、対数期およびそれに続く定常期の細菌の試料を採取しタンパク質抽出に供した。
【０１２４】
タンパク質抽出
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌を４℃、４，０００ｇで３０分間遠心分離した。細菌残渣をトリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬに溶解し、ＲＴで３分間、超音波処理によりホモジナイズした。未溶解の細胞断片からタンパク質を分離するため、細菌ホモジネートを１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を回収した後、４℃、６０，０００ｇで４５分間超遠心分離し、タンパク質を細胞質画分（上清）と膜画分（残渣）とにさらに分離した。膜タンパク質をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【０１２５】
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
２Ｄ−ＰＡＧＥに関して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質抽出物３００μｇを用いて固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ（ｐＨ４〜７；１８ｃｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を再水和した。次いで、ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、計８５，０００Ｖ−ｈの等電点電気泳動により、タンパク質を第一次元に分離した。泳動後、ＩＰＧストリップを平衡化緩衝液［尿素６ｍｏｌ／Ｌ、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリス−ＨＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．８）および２％（ｗ／ｖ）ジチオスレイトールを含有する０．２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー］中で１５分間インキュベートし、次いで、４％（ｗ／ｖ）ヨードアセトアミドを含有する平衡化緩衝液中で１５分間アルキル化した。次いで、ＩＰＧストリップをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の１０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（２０ｃｍ  １８ｃｍ  １ｍｍ）上に貼り付けた。１２ｍＡ／ゲルのＥｔｔａｎ  Ｄａｌｔｓｉｘ垂直電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて２５℃で一晩、第二次元を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、２Ｄゲルを２％（ｖ／ｖ）オルトリン酸中および５０％（ｖ／ｖ）メタノール中、ＲＴで２時間固定した。次いで、ゲルを水で洗浄し、ＣＢＢ  Ｇ−２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）染色［１リットル当たり３４％（ｖ／ｖ）メタノール、１７％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、２％（ｖ／ｖ）オルトリン酸およびＣＢＢ  Ｇ−２５０  ０．６６ｇ］によりタンパク質スポットを可視化した。
【０１２６】
差次的タンパク質発現の解析
染色した２Ｄゲル画像を、グレースケールマーカー（Ｋｏｄａｋ社、ロチェスター、ニューヨーク州ロチェスター、ニューヨーク州）で較正したＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ  ＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によりスキャンし、Ｌａｂｓｃａｎ  ６．０ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でデジタル化した。スポット検出、定量化、マッチングおよび比較解析を含む差次的タンパク質発現の解析は、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ５．０ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて実施した。実施間の変動を最小限に抑えるため、各タンパク質試料を２Ｄ−ＰＡＧＥに少なくとも３回（膜タンパク質）および４回（細胞質タンパク質）供し、３個（または４個）のゲルの各組を、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒを用いて比較し、ゲルの組内に統計的に差があるスポットが出現しないことを確認した。各組の最も代表的なゲル（ゲル移動、スポットの鮮明度およびスポット数）を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を対数期と定常期とで比較した。ゲル中の各スポットの相対体積により発現レベルを求め、（スポット体積）／（ゲルで分離された全スポットの総体積）で算出される％体積で表した。このスポット体積の正規化は、ゲル中に存在する全スポットの総体積を考慮に入れることにより、タンパク質のローディングおよび染色による変動を計算に入れる。存在量の変動を２つの期の間の一群のスポットの％体積の平均値の比として算出した。体積の変動比が１．５を上回るスポットのみを重要であると見なした。ゲル内にスポットが存在しなければ、選択した実験条件下ではタンパク質の検出可能な発現は報告されないことが示された。スポット体積を対数変換した後、スチューデントのｔ検定（有意レベルはｐ＜０．０５）により対応するｐ値を決定した。
【０１２７】
液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定
目的のタンパク質スポットを、Ｅｔｔａｎ  Ｓｐｏｔ  Ｐｉｃｋｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、ＣＢＢ  Ｇ−２５０染色した２Ｄゲルから切り出し、既に記載されている（Ｇｏｉｃｈｏｎら，２０１１）通りに、Ｅｔｔａｎ  Ｄｉｇｅｓｔｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で自動タンパク質ゲル内消化を実施した。次いで、タンパク質抽出物を５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸１０μＬに再懸濁させた後、ナノスプレー源とＨＰＬＣチップキューブインターフェースとを備えた６３４０イオントラップ質量分析計と連結したナノＬＣ１２００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、クールタブフ、フランス）で分析した。簡潔に述べれば、４０ｎＬ  ＲＰ−Ｃ１８トラップカラムでペプチドを濃縮および脱塩し、Ｚｏｒｂａｘ（細孔径３０ｎｍ、粒子径５μｍ）Ｃ１８カラム（長さ４３ｍｍ×内径７５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で分離した。９分間の直線勾配（０．１％ギ酸中３％〜８０％のアセトニトリル）を流速４００ｎＬ／分で用い、溶出液をイオントラップ質量分析計で分析した。
【０１２８】
タンパク質同定のために、ＭＳ／ＭＳピークリストを抽出し、ＭＡＳＣＯＴ  Ｄａｅｍｏｎバージョン２．２．２（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）検索エンジンを用いてタンパク質データベースと比較した。検索は以下の特定のパラメータを用いて実施した：酵素特異性、トリプシン；切り残し許容数１；固定修飾無し；可変修飾、メチオニンの酸化、システインのカルバミドメチル化、セリン、チロシンおよびトレオニンのリン酸化；モノアイソトピック；ペプチド電荷、２＋および３＋；前駆体イオンの質量許容差、１．５Ｄａ；フラグメントイオンの質量許容差、０．６Ｄａ；機器としてのＥＳＩ−ＴＲＡＰ；分類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベース［ＮＣＢＩｎｒ  ２０１２０５３１（配列数１８２８０２１５、残基数６２６５２７５２３３）］（ベセスダ、メリーランド州）。タンパク質ヒットが以下の基準のうちの一方を満たせば自動的に有効なものとした：それぞれＭＡＳＣＯＴスコアが５４を上回る（ｐ＜０．０１）少なくとも上位２つのトップランクのペプチド（太字および赤文字）またはそれぞれＭＡＳＣＯＴスコアが４７を上回る（ｐ＜０．０５）少なくとも上位２つのペプチド（太字および赤文字）の同定。偽陽性率を評価するため、最初のデータベース検索はいずれも、ＭＡＳＣＯＴの選択肢「デコイ」を用いて実施した。結果については、偽陽性率が１％を超えなければ重要なものであると見なした。
【０１２９】
ＡＴＰアッセイ
ＡＴＰ比色定量／蛍光定量アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社、カリフォルニア州）を製造業者の指示通りに用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＴＰ産生を測定した。簡潔に述べれば、対数期または定常期の細菌タンパク質を各濃度（ＡＴＰアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬ）に関して２回の反復実験で一連のウェルに入れ、ＡＴＰアッセイ緩衝液で５０μＬ／ウェルとなるように調整した。次いで、異なる栄養素の溶液、１５％スクロースまたはＭＨ培地１０μＬを対応するウェルに加え、ＡＴＰアッセイ緩衝液で５０μＬ／ウェルとなるように調整し、対照ウェルには５０μＬ／ウェルのＡＴＰ緩衝液のみを加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルにＡＴＰ反応混合物（ＡＴＰアッセイ緩衝液、ＡＴＰプローブ、ＡＴＰ変換剤発色剤ミクスを含有する）５０μＬを加えた。昼光から保護しながらＲＴで３０分間インキュベートした後、５７０ｎｍでのＯＤを測定した。
【０１３０】
ＣｌｐＢイムノアッセイの開発および検証
ＣｌｐＢ検出アッセイの設計は、直線濃度範囲内での特異的かつ高感度の検出など、いくつかの基準に基づいた。１つの特定の条件は、ＣｌｐＢ分子内にα−ＭＳＨ様エピトープ（１つまたは複数）が存在することによって起こり得るα−ＭＳＨ交差反応を起こさずにＣｌｐＢが検出されることであった。技法およびシグナル検出を簡略化するため、本発明者らは、標準的な９６ウェルＥＬＩＳＡプレートと、分光光度計によるＯＤ読取りの選択肢とを用いた。ＣｌｐＢのＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット（ＷＢ）の詳細なプロトコルについては別の節に記載する。
【０１３１】
顕色抗体（Ａｂ）と捕捉Ａｂが結合するのを防ぐため、本発明者らは、ＣｌｐＢ捕捉ＡｂとＣｌｐＢ検出Ａｂをそれぞれウサギとマウスという異なる種を用いて作製した。複雑な生体試料からＣｌｐＢタンパク質を最も効率的に捕捉するため、複数の抗ＣｌｐＢエピトープを有するウサギポリクローナルＡｂでＥＬＩＳＡプレートをコートした。ＣｌｐＢとα−ＭＳＨとの間の交差反応を回避するため、複数のＡｂクローンのＥＬＩＳＡスクリーニングによって予め選択した、ＣｌｐＢを高い感度および特異性で認識するがα−ＭＳＨを認識しないことによって特徴付けられているマウスモノクローナル抗ＣｌｐＢ  Ａｂを検出Ａｂとして用いた。通常のＥＬＩＳＡツールとしてアルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス顕色Ａｂを用いて、分析物の濃度に比例するＯＤとして読み取ることが可能な発色酵素反応を得た。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢタンパク質について２ｐＭ〜１５０ｐＭの範囲の７つの連続希釈物の検出から得られるＯＤの直線変化が、プラトーに達することなく、ＯＤシグナルの飽和も起こらずに得られた。
【０１３２】
開発したＣｌｐＢアッセイの特異性を検証するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＷＴの１０種類の異なる培養物および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ΔＣｌｐＢ変異体の１種類の培養物から抽出したタンパク質試料中のＣｌｐＢ濃度を測定した。ΔＣｌｐＢ変異体および対応する野生型（ＷＴ）菌株は、Ａｘｅｌ  Ｍｏｇｋ博士（ＺＭＢＨ、ハイデルベルク大学、ドイツ）の厚意により寄贈されたものである。さらに、抗ＣｌｐＢポリクローナルウサギＡｂを用いたＷＢにより上記の細菌タンパク質試料中のＣｌｐＢの有無を分析し、ＷＢのバンドとＥＬＩＳＡのＣｌｐＢ濃度との間でシグナル強度値を比較した。全てのＷＴ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物にＣｌｐＢが検出され、そのうち７種類の培養物はＣｌｐＢ濃度が１０００ｐＭを上回ったが、ΔＣｌｐＢ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出したタンパク質試料にはＣｌｐＢは検出されなかった。ＷＢでは、予想される９６ＫＤａサイズの主要なバンドがＷＴに見られたが、ΔＣｌｐＢ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には見られなかった。これらのバンドのＯＤ強度は、個々の試料の間で差が認められ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の同じ試料でＥＬＩＳＡにより測定したＣｌｐＢ濃度との間に正の相関が認められた。このように、ΔＣｌｐＢ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のタンパク質調製物にはＣｌｐＢが検出されなかったことからアッセイの特異性が確認され、ＥＬＩＳＡとＷＢとの間に良好な一致がみられたことにより、両ＣｌｐＢ免疫検出技術の交差検証がもたらされた。
【０１３３】
ＣｌｐＢ血漿アッセイによって腸内細菌由来のＣｌｐＢが検出されることを確認するため、ＷＴまたはΔＣｌｐＢ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を３週間、胃内強制投与により連日与えたマウスの血漿中のＣｌｐＢをＣｌｐＢ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。血漿試料は、本発明者らが既に発表している研究（Ｔｅｎｎｏｕｎｅら，２０１４）から得た。対照マウスおよび細菌を含まない培養ブロスを強制投与したマウスはともに、その血漿中にＣｌｐＢが通常に存在することが見出された。ＷＴ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与したマウスでは血漿中ＣｌｐＢレベルが増加したが、ＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を与えたマウスでは血漿中ＣｌｐＢレベルは変化しなかったことから、血漿中ＣｌｐＢの起源が腸内細菌であることが確認されたのは重要なことである。
【０１３４】
ＣｌｐＢ  ＥＬＩＳＡ
１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌの濃度のウサギポリクローナル抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢ抗体（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（ゴスリ、ベルギー）が注文により作製したもの）１００μＬを用いて、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社、ロチェスター、ニューヨーク州）を４℃で１２時間コートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄した（５分×３）。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社が注文により作製したもの）を試料緩衝液（ＰＢＳ、アジ化ナトリウム０．０２％、ｐＨ７．４）で５ｐＭ、１０ｐＭ、２５ｐＭ、５０ｐＭ、７０ｐＭ、１００ｐＭおよび１５０ｐＭに連続希釈し、２回の反復実験でウェルに加えて標準物質を作製した。分析物試料は、マウスおよびラットの結腸粘膜および血漿の試料または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２培養物のタンパク質抽出物を含んだ。分析物試料を残りのウェルに２回の反復実験で加え、ＲＴで２時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した（５分×３）。ウェルにマウスモノクローナル抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢ抗体（試料緩衝液中１：５００、Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社が注文により作製したもの）を加え、ＲＴで９０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄した（５分×３）。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ウエストグローブ、ペンシルベニア州）製のアルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（試料緩衝液中１：２０００）をウェルに加え、ＲＴで９０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄し（５分×３）、次いで、リン酸ｐ−ニトロフェニル溶液（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）１００μＬをアルカリホスファターゼ基質として加えた。ＲＴで４０分間インキュベートした後、３Ｎ  ＮａＯＨを５０μＬ加えることにより反応を停止させた。マイクロプレートリーダーＭｅｔｅｒｔｅｃｈ  ９６０（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ社、台北、台湾）を用いて４０５ｎｍでのＯＤを決定した。血漿試料もＣｌｐＢタンパク質標準物質希釈液も添加していないプレートの読みから得たブランクＯＤ値を試料ＯＤ値から減じた。
【０１３５】
ＣｌｐＢウエスタンブロット
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のタンパク質抽出物を用いてウエスタンブロットを実施した。トリス−グリシン緩衝液中２０％のアクリルアミドＳＤＳゲル上でタンパク質試料（１０μｇ）を分離してニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、オルセー、フランス）に転写し、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、ｐＨ８；１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）中５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳で少なくとも１時間、ＲＴにてブロックした。次いで、膜をウサギポリクローナル抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢ抗体（１：２０００、Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）と４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳のブロッキング溶液で３回洗浄した後、膜をペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＥＣＬ検出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてペルオキシダーゼ反応を可視化した。タンパク質バンドを分子量標準物質（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ、ＢｉｏＲａｄ社）と比較し、ＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ  ＩＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてフィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェア７．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてバンドのピクセル密度を解析した。
【０１３６】
ラット腸管内への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の投与
動物
動物の飼育および実験は、米国国立衛生研究所によって確立されフランスとヨーロッパ両方の地域法令（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｌ  ３５８，１８／１２／１９８６）に準拠したガイドラインに従った。完全に整った動物施設で、制御された環境条件下（２２±１℃、午前７：３０に点灯する１２時間の明暗サイクル）、体重２００〜２５０ｇの雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ社、ジュネスト＝サン＝ティスル、フランス）を収容ケージ（１ケージ当たりラット３匹）で１週間飼育して飼育条件に馴化させた。標準的なげっ歯類用ペレット飼料（ＲＭ１  ｄｉｅｔ、ＳＤＳ社、イギリス）および飲料水を自由摂取させた。
【０１３７】
実験１
この実験は、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖モデルと腸内でのｉｎ  ｖｉｖｏ細菌増殖状態との関連性を評価するべく設計した。ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ、Ｖｉｒｂａｃ社、カロ、フランス）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、Ｂａｙｅｒ社、レーバークーゼン、フランス）の３：１（体積）溶液の０．１ｍＬ／１００ｇ体重Ｉ．Ｐによりラットに麻酔をかけた。開腹術後、結紮を２箇所、すなわち、１箇所目は盲腸結腸接合部に、２箇所目はそこから４ｃｍ下の部分に留置することにより結腸を授動した。上行結腸に挿入し１回目の結紮で固定したポリプロピレンカテーテルを用いて、結腸内注入および管腔内容物採取を実施した。結腸内にＭＨ培地または水２ｍＬを穏やかに注入し、その直後に回収してＯＤの測定に供した。ＯＤ測定後、結腸内容物の試料全体を結腸内に戻した。このような結腸内容物の採取を、最初の２０分間は５分毎に、その後、３０分後および６０分後に、新たにＭＨ培地も水も加えずに繰り返した。細菌密度を分光光度計によりλ＝６００ｎｍでのＯＤとして測定した。１回目の注入の前、３０分後および６０分後、門脈から血液試料を採取した。実験終了時、結腸から糞便試料を採取し、ＣｌｐＢのＤＮＡ抽出およびＰＣＲに供した。
【０１３８】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＦＸ  ９６  ｑ−ＰＣＲ機器（ＢｉｏＲａｄ社、カリフォルニア州）を用いて定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施し、ＣｌｐＢ  ＤＮＡ発現細菌の細菌密度を解析した。ＱＡＭＰ  ＤＮＡ糞便ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社、フェンロー、オランダ）を用いて、ラットの糞便から全ＤＮＡを抽出した。ｑＰＣＲミックスは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（ＱＩＡｇｅｎ社、ウエストサセックス、イギリス）５μＬ、フォワードプライマーおよびリバースプライマー各０．５μＭ、試料由来ＤＮＡ、および水を含み、総体積を１０μＬとした。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（セルジー＝ポントワーズ、フランス）から購入した。３ステップＰＣＲを４０サイクル実施した。試料を９５℃で１０分間変性させ、６０℃で２分間アニールさせ、９５℃で１５秒間伸長させた。
【０１３９】
実験２
この実験は、全身循環への腸ペプチド（ＧＬＰ−１およびＰＹＹ）放出に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の効果を評価することを目的とした。上記のようにラットに麻酔をかけて結腸を授動し、対数期（ｎ＝６）または定常期（ｎ＝６）に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質（ＰＢＳ  ２ｍＬに溶解したタンパク質０．１μｇ／ｋｇ）の結腸内注入を１回、２０分間かけて実施した。結腸内注入の前および２０分後、門脈から血液試料を採取し、ＧＬＰ−１、ＰＹＹおよびＣｌｐＢのアッセイに供した。実験終了時、結腸粘膜の試料を採取し、ＣｌｐＢアッセイに供した。ＧＬＰ−１およびＰＹＹのアッセイは、蛍光酵素イムノアッセイキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、カリフォルニア州）を製造業者の指示通りに用いて実施した。マイクロプレートリーダーであるＣｈａｍｅｌｅｏｎ（ＨＩＤＥＸ社、トゥルク、フィンランド）を用いて、３２５ｎｍでの励起、４２０ｎｍでの発光により蛍光を測定した。
【０１４０】
ラットへの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質投与、摂食量および脳ｃ−ｆｏｓに関する試験
動物
体重２００〜２５０ｇの雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ社、ジュネスト＝サン＝ティスル、フランス）を上記のように飼育条件に馴化させ給餌した。実験の３日前、ラットを個別の代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ社、リヨン、フランス）に移し、粉末形態である以外は同じＲＭ１  ｄｉｅｔ（ＳＤＳ社）を自由摂取させた。飲料水は常時摂取可能な状態にした。馴化期間中、ラットを毎日数分間、穏やかに触れて操作に慣らした。馴化終了時、ラットを平均体重がほぼ同じになるように３つのグループに割り付け、実験１〜３に用いた。同じラットに対し、食餌制限を含む２つの実験を４日間隔で実施した。自由摂食のラットを用いた第三の実験は新たなシリーズを必要とした。
【０１４１】
実験１
第一の実験は、対数期および定常期に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の膜タンパク質の効果を比較することを目的とした。ラットを一晩（１８．００時〜１０．００時）絶食させ、水は自由摂取とした。絶食の翌日、１０．００時に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質をＩ．Ｐ．注射し、直ちにラットを予め重量を測定した飼料の入ったそれぞれの代謝ケージに戻した。１時間後、２時間後および４時間後に摂食量を測定した。第一群のラット（ｎ＝６）には、対数期に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出した膜タンパク質をＰＢＳ  ３００μＬに溶解して０．１ｍｇ／ｋｇ投与し、第二群のラット（ｎ＝６）には、定常期に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出した膜タンパク質０．１ｍｇ／ｋｇを投与し、対照群（ｎ＝６）にはＰＢＳ  ３００μＬを投与した。
【０１４２】
実験２
第二の実験は、対数期および定常期に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質タンパク質の効果を比較することを目的とした。実験１のものとほぼ同じ実験プロトコルを用いた。
【０１４３】
実験３
この実験は、自由摂食ラットの摂食量に対する全大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の効果を評価するべく設計した。対数期（ｎ＝６）もしくは定常期（ｎ＝６）に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質（ＰＢＳ  ３００μＬに溶解したタンパク質０．１ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．）の注射または対照（ｎ＝６）としてＰＢＳ単独の注射を、１９時３０分に実施し、ラットを予め重量を測定した飼料の入ったそれぞれの代謝ケージに戻した。２時間後、累積摂食量を測定した。その直後、ラットにペントバルビタールナトリウム（０．２ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．）で麻酔をかけて、脳内のｃ−ｆｏｓ発現の免疫組織化学的試験のために灌流した。
【０１４４】
組織の調製および免疫組織化学
脳を４％パラホルムアルデヒドの灌流／浸漬によって固定し、凍結させ、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ナンテール、フランス）で切片を作製し（１４μｍ）、次いで、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）およびフルオレセインキット（ＮＥＮ社、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて免疫組織化学用に処理した。単染色の場合、ｃ−ｆｏｓに対するウサギポリクローナル抗血清（１：４，０００、Ａｂ−５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社、ダルムシュタット、ドイツ）を用いた。二重染色の場合、ＴＳＡの後、抗ウサギシアニン３抗体の１：２００倍希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ウエストグローブ、ペンシルベニア州）によって顕色されるβ−エンドルフィン（β−ｅｎｄ）に対するウサギモノクローナル抗体の１：１，０００倍希釈液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、フレデリック、メリーランド州）、または抗マウスローダミンレッドコンジュゲート抗体の１：２００倍希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）によって顕色されるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に対するマウスモノクローナルＩｇＧの１：１，０００倍希釈液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、テキサス州）のいずれかを使用する直接免疫蛍光技術を用いた。６枚の連続切片の視床下部の弓状核および腹内側核ならびに扁桃体中心核について、２０倍の倍率で陽性細胞をカウントした。ラット１匹当たりの平均陽性細胞数を用いてグループの平均値を算出した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、サンノゼ、カリフォルニア州）でデジタル画像の明度およびコントラストを最適化した。
【０１４５】
マウスへの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の長期投与
２か月齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（ｎ＝３２）をＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ社から購入し、８時００分に点灯する１２時間の明暗サイクルで１週間、動物施設に馴化させた。次いで、自動摂食モニターをそれぞれ備えたＢｉｏＤＡＱマウスケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社、ニューブランズウィック、ニュージャージー州）にマウスを個別に入れた。ＢｉｏＤＡＱケージに３日間馴化させた後、マウスを３つのグループ（ｎ＝８）に分け、各グループには、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）対数期に抽出した細菌タンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、（ｉｉｉ）定常期に抽出した細菌タンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかを１日２回、９時００分と１８時３０分にＩ．Ｐ．注射することからなる、異なる処置を実施した。飼料（ＳＥＲＬＡＢ社、モンタテール、フランス）および飲料水を自由摂取させ、体重を毎日測定した。摂食データを１週間、常時モニターし、ＢｉｏＤＡＱデータビューア２．３．０７（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社）を用いて解析した。食餌パターンの解析には、食餌の間隔を３００秒に設定した。食餌後の間隔の時間（秒）を前の食餌で摂取した飼料の量（ｇ）で除して飽満度を算出した。実験後、マウスを断頭により屠殺し、脳を摘出し、視床下部を切出して神経ペプチドｍＲＮＡマイクロアレイに供した。
【０１４６】
視床下部の神経ペプチドｍＲＮＡマイクロアレイ
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、デューレン、ドイツ）を製造業者のプロトコル通りに用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を長期投与したマウスの視床下部から全ＲＮＡを抽出した。ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、消化したＲＮＡを４２℃で６０分間逆転写した。得られたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ反応に用いた。Ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サントーバン、フランス）で一連の９組のプライマーペアを設計し、効率および特異性を検証した。ｃＤＮＡ  ６μＬと、濃度１００ｎＭの特異的リバースプライマーおよび特異的フォワードプライマーを含むＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）６μＬとからなるＰＣＲ反応物をＢｒａｖｏ液体操作システム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で９６ウェルプレートに分注し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で増幅した。ｃＤＮＡから発生する標的遺伝子のシグナルを、投入ｍＲＮＡの量のばらつきについて参照遺伝子シグナルで内部補正した。次いで、遺伝子発現レベルを対応する対照試料群と比較し、２−ΔΔＣｑ法で制御を求めた。
【０１４７】
電気生理学的記録
既に記載されている（Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉら，２００７）通りに、成体ＰＯＭＣ−ｅＧＦＰマウス（５〜７週齢；Ｒｅｆ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ｐｏｍｃ−ＥＧＦＰ）１Ｌｏｗ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）から脳切片（２５０μｍ）を作製した。切片を少なくとも６０分の回復時間の間、ＮａＣｌ  １１８ｍＭ、ＫＣｌ  ３ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  ２５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ５ｍＭ、Ｄ−グルコース  ２．５ｍＭを含有し酸素を含ませた細胞外培地（スクロースでモル浸透圧濃度を３１０ｍＯｓＭに調整、ｐＨ７．４）中、ＲＴでインキュベートした。記録チャンバに入れた後、同じ細胞外培地を用いて切片を２〜３ｍＬ／分で灌流した。蛍光（フルオレセインフィルタ）およびＩＲ−ＤＩＣビデオ顕微鏡観察の装備を備えたＮｉｋｏｎ顕微鏡ＥＦ６００（Ｎｉｋｏｎ  Ｆｒａｎｃｅ社、シャンピニー＝シュル＝マルヌ）で切片を観察した。蛍光ビデオカメラ（Ｎｉｋｏｎ社）に４０倍の水浸対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ社）を用いて、生存ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンを可視化した。ろ過した細胞外培地をホウケイ酸ピペット（４〜６ＭΩ；ＯＤ  １．５ｍｍ、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ノバート、カリフォルニア州）に満たした。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器を用いて細胞接着型の記録を行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａインターフェースを用いてデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ  １０．３ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて３ｋＨｚで取得した。ピペットと細胞の静電容量を完全に相殺した。安定なベースラインが確立された後、１ｎＭのＣｌｐＢ（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を５〜１０分間灌流した。ＣｌｐＢ灌流の最後の３分間、つまり灌流から７分後〜１０分後にＰＯＭＣニューロンの発火率を測定し、灌流前の３分間に測定した発火率と比較した。
【０１４８】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、データを解析しグラフをプロットした。コルモゴロフ・スミルノフ検定により正規性を評価した。正規性の結果に応じて、分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス（Ｋ−Ｗ）検定にチューキーまたはダンの事後検定を用いて群間差を解析した。正規性の結果に応じて必要があれば、スチューデントのｔ検定およびピイアソンの相関関係またはマン・ホイトニー（Ｍ−Ｗ）検定を用いて個々のグループを比較した。繰り返し測定のある（ＲＭ）ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後検定を用いて、連続実験の効果を解析した。データを平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）で表し、いずれの検定でも、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
【０１４９】
結果
定期的な栄養供給後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物に１回目のＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）栄養培地供給を実施したところ、３つの細菌増殖期、すなわち、１）２時間の誘導期；２）４時間の対数増殖期および３）安定状態が６時間維持された吸光度（ＯＤ）０．３５の定常期が観察された。３回目および５回目のＭＨ培地供給後では、２つの増殖期、すなわち対数期および安定期のみがみられ、前者は栄養供給直後に始まった。新たな供給サイクルはそれぞれ、対数増殖期の時間が短くなるという特徴がみられ、３回目の後が２時間、５回目の後が２０分であった。５回目の栄養供給後、細菌タンパク質を抽出して膜画分と細胞質画分とに分離し、プロテオーム解析および絶食ラットのｉｎ  ｖｉｖｏ実験に用いた。新たな実験では、定期的な栄養供給を継続することによって細菌増殖の動態がさらに加速し得るかどうかを検証するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に栄養を９回供給した。７回目および９回目の栄養供給後、対数増殖期はそれ以上変化することはなく、ＯＤの相対的増加が同じ（Δ０．３）で２０分間継続し、それぞれの栄養供給後も細菌増殖は同じであることを反映していた。マクファーランド標準によれば、ＯＤの０．３の増加は細菌数１０８〜１０９の増分に相当する。９回目の栄養供給後、対数期および定常期に細菌タンパク質を抽出したところ、総タンパク質濃度はそれぞれ０．０８８ｍｇ／ｍＬおよび０．１５ｍｇ／ｍＬであった。抽出したタンパク質を、ＣｌｐＢレベルに関して試験し、ＡＴＰ産生アッセイ、ならびに自由摂食させたマウスおよびラットへの結腸内注入および全身注射を含むｉｎ  ｖｉｖｏ実験とそれに続く脳内のｃ−ｆｏｓ検出に用いた。
【０１５０】
プロテオーム解析
タンパク質発現プロファイルが栄養誘導性の細菌増殖期に応じて変化するかどうかを解析するため、５回目のＭＨ培地添加後、それぞれ対数期および定常期に対応する１０分後および２．３時間後に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２タンパク質の膜画分と細胞質画分について、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）を別々に実施した。検出されたタンパク質スポットの総数は２８９５（膜が１３６７、細胞質が１５２８）であった。
【０１５１】
膜タンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥを対数期と定常期とで比較したところ、差次的に（少なくとも１．５倍）発現したタンパク質が２０種類みられた。このうち１７種類のタンパク質が対数期に発現の増加を示し、１５種類を質量分析によって同定した。細胞質タンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥの比較では、差次的に（少なくとも１．５倍）発現したタンパク質が２０種類示された。膜タンパク質とは対照的に、細胞質タンパク質の大部分（１９種類）は定常期に発現の増加を示した。フラジェリンに相当するタンパク質スポット１つのみが、対数期でより高い発現を有した。同定されたタンパク質の大部分は同化または異化の過程に関与し、両増殖期において全体として混合代謝プロファイルを示した。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質によるＡＴＰ産生
増殖期での細菌プロテオームの変化がそのエネルギー抽出能に影響を及ぼし得るかどうかを検討するため、対数期および定常期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２タンパク質による栄養素からのＡＴＰ産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。両増殖期のタンパク質はともに、様々なエネルギー源からのＡＴＰ産生を増加させることが可能であることが見出された。ＡＴＰ濃度は、スクロース溶液よりもＭＨ培地などのタンパク質含有混合エネルギー源を使用したときの方が高かった。ＡＴＰ産生量は、細菌タンパク質の濃度とともに用量依存的に増加したが、タンパク質のＡＴＰ産生効果については、対数期と定常期との間に有意差は見出されなかった。
【０１５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるＣｌｐＢ産生
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢ検出するための酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発および検証し、本研究に用いてきた。細菌増殖期の間でＣｌｐＢタンパク質産生量が異なるか否かを４つの別個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２培養物で試験した。ウエスタンブロットでは、全タンパク質調製物でＣｌｐＢに対応する９６ｋＤａのバンドが検出され、定常期にそのレベルが増加した。このような変化はさらに、同じ細菌タンパク質調製物においてＣｌｐＢ  ＥＬＩＳＡを用いて確認されており、ＣｌｐＢ濃度は定常期のほぼ２倍であった。
【０１５４】
栄養素および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の腸内注入
本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ栄養誘導性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖モデルがｉｎ  ｖｉｖｏでの腸内細菌の増殖動態と関連するかどうかを検証するため、麻酔ラットの結腸内にＭＨ培地または水を注入した。ＭＨ培地の注入では、水の場合とは異なり、腸内に細菌増殖が誘導され、対数増殖期が２０分間継続し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータとの一致がみられた。門脈で測定した血漿ＣｌｐＢレベルは、ＭＨ注入から３０分後または６０分後で有意差は認められなかった。それでも、血漿中ＣｌｐＢ濃度は糞便中のＣｌｐＢ  ＤＮＡ含有量との正の相関が認められた。
【０１５５】
次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテオームの増殖依存性の変化が宿主の腸での食欲制御機序に局所的に影響を及ぼし得るかどうかを明らかにするため、別の実験で、麻酔ラットの結腸に対数期または定常期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質をともに０．１ｍｇ／ｋｇで２０分間注入した。注入２０分後に測定した結腸粘膜中のＣｌｐＢ濃度は、定常期のタンパク質を投与したラットでは高かったが、ＣｌｐＢの血漿中レベルは、対数期または定常期のいずれの細菌タンパク質による影響を受けることはなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質が宿主の食欲シグナル伝達に及ぼす効果は細菌増殖期に依存し得るとする本発明者らの仮説と一致して、対数期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の結腸内注入は、ＧＬＰ−１の血漿中レベルを刺激するが、定常期のタンパク質は刺激せず、これに対し、定常期のタンパク質の注入後は、ＰＹＹの血漿中レベルが増加するが、対数期のタンパク質では増加しないことが見出された。
【０１５６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を急性投与したラットの摂食量および脳ｃ−ｆｏｓ
全ての被験ラットおよび被験マウスの血漿中にＣｌｐＢが存在していたことから、血漿中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がその全身作用を介して食欲に影響を及ぼし、その効果は細菌増殖期に関連するタンパク質によって異なり得るという可能性がある。一晩絶食させたラットを用いてこの可能性を試験することにより、定常期に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の膜画分の単回腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）が、再給餌したときの１時間および２時間の摂食量を対照群と比較して減少させることが見出された。これに対し、対数期に抽出した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重、Ｉ．Ｐ．）の細胞質画分の投与は、再給餌したときの４時間の摂食量を増加させた。
【０１５７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）全タンパク質が増殖期依存性に自発的摂食量に影響を及ぼし、ＡＲＣなどの中枢部位を活性化し得るかどうかをさらに検討するため、自由摂食ラットに細菌タンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重、Ｉ．Ｐ．）を暗期開始前に注射した。注射後、摂食量を２時間測定し、次いでラットを屠殺し、脳内のｃ−ｆｏｓ発現の解析に供した。定常期の細菌タンパク質を注射したラットは、対照よりも摂食量が少なかったが、摂食量が対数期の細菌タンパク質の注射によって有意に影響を受けないことが見出された。
【０１５８】
自由摂食ラットに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質をＩ．Ｐ．注射してから２時間後、視床下部のＡＲＣおよび腹内側核（ＶＭＮ）ならびにＣｅＡでのｃ−ｆｏｓ発現を免疫組織化学的に解析した。定常期の細菌タンパク質を投与したマウスのＡＲＣおよびＶＭＮにｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の増加がみられた。ＡＲＣのｃ−ｆｏｓ発現細胞の大部分がβエンドルフィンを含有し（対照が７１．３１±１２．８１％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対数期が７３．５６±１０．４５％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）定常期が８０．５０±９．６８％、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．３６）、すなわち、食欲抑制ＰＯＭＣニューロンであると同定された。その結果、ＡＲＣの残りのｃ−ｆｏｓニューロンの割合に有意な群間差は認められなかった（対照が２８．６９±１２．８１％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対数期が２６．４４±１０．４５％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）定常期が１９．５±９．６８％、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．３６）。βエンドルフィン陽性細胞の総数に有意な群間差は認められなかった（対照が５４．８２±１０．６７個、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対数期が６６．０３±１１．４３個、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）定常期が６６．０３±５．０６個、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０９）が、活性化βエンドルフィンニューロンの相対数は、定常期のタンパク質を投与したラットで対照および対数期のタンパク質を投与したラットと比較して増加した。さらに、活性化βエンドルフィンニューロンの数には摂食量と反比例した（ピアソンのｒ＝−０．５７、ｐ＝０．０１８）。
【０１５９】
ＣｅＡのｃ−ｆｏｓ陽性細胞数は、定常期のタンパク質を注射したラットでは他の２群と比較して増加した。ＣｅＡのｃ−ｆｏｓ陽性細胞のほぼ全部の表現型がＣＧＲＰ発現ニューロンであった（対照が１００±０．０１％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対数期が１００±０．０１％、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）定常期が１００±０．０１％、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．９２）。ＣｅＡのＣＧＲＰ陽性ニューロンの総数は群間でほぼ同じであった（対照が１２３．８±１３．１５個、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対数期が１１８．３±２５．５９個、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）定常期が１２６．１±６．６４個、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．８５）が、定常期のタンパク質を投与したラットにのみｃ−ｆｏｓ活性化ＣＧＲＰニューロンの百分率が増加した。ＣＧＲＰニューロンの活性化は摂食量と反比例した（ピアソンのｒ＝−０．８９、ｐ＝０．００１）。
【０１６０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を長期注射したマウスの摂食パターンおよび視床下部神経ペプチド
細菌タンパク質が摂食パターンに影響を及ぼし得るかどうかを決定するため、自由摂食マウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）全タンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重、Ｉ．Ｐ．）を１日２回、１週間投与した。注射後第１日、定常期の細菌タンパク質を投与したマウスの体重および摂食量が対照と比較して有意に少ないが、対数期の細菌タンパク質を投与したマウスではそのようなことがないという特徴がみられた。１日の食餌量に有意な群間差は認められなかったが、定常期のタンパク質を投与したマウスでは１週間後、注射前日と比較して食餌量の減少が観察された。食餌頻度に有意な群間差は認められなかったが、定常期の細菌タンパク質を投与したマウスでは食餌頻度が増加する傾向が観察された。注射を実施した６日間の総摂食量は３つの群間で有意差がなかったが、明期と暗期について別々に総摂食量を解析したところ、対数期のタンパク質を注射したマウスでは明期の摂食量は増加するが、暗期の摂食量は減少することが示された。これに対し、定常期のタンパク質を投与したマウスでは、暗期で対照より少ない摂食量が示されたが、明期の摂食量は影響を受けなかった。注射後第１日、定常期のタンパク質を投与したマウスでは飽満度が増加し、１週間後、同じ群が飽満度の減少傾向を示した。
【０１６１】
細菌タンパク質注射の６日後に観察された摂食パターンの変化の根底にある分子の変化を理解するため、食欲制御に関与する数種類の神経ペプチドの視床下部でのｍＲＮＡ発現レベルを解析した。定常期のタンパク質を投与したマウスでは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびオレキシンの前駆体ｍＲＮＡレベルが対照と比較して上昇し、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）の前駆体ｍＲＮＡレベルが対数期のタンパク質を注射したマウスと比較して上昇し、対数期のタンパク質を注射したマウスもＢＤＮＦレベルは上昇するが、ＱＲＦＰは低下することが見出された。
【０１６２】
ＣｌｐＢによる視床下部ＰＯＭＣニューロンの電気生理学的活性化
定常増殖期にアップレギュレートされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質のマーカーであり、α−ＭＳＨの模倣体でもあるＣｌｐＢがＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンを活性化するかどうかを明らかにするため、細胞接着型パッチクランプ電気生理学を用いて、ＣｌｐＢがＰＯＭＣ−ｅＧＦＰマウス由来の脳切片に及ぼす影響を検討した。図２からわかるように、溶液槽にＣｌｐＢ（１ｎＭ）を加えると、ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンの約５０％（ｎ＝７／１３）の活動電位頻度が２２９±１０９％（基底値：２．０２±０．７８Ｈｚ対ＣｌｐＢ：３．８２±１．３６Ｈｚ）増加した。全般的に、ＰＯＭＣニューロンの発火率が完全に基底値に戻るには、ＣｌｐＢ添加後少なくとも１０分を要した。
【０１６３】
したがって、以上の結果は、ＣｌｐＢタンパク質が飽満感および満腹感に直接影響を及ぼすことを示唆している。
【０１６４】
考察
本発明者らの試験は、細菌タンパク質が、腸内細菌と、それぞれ腸内での栄養誘導性細菌増殖およびその全身作用に関連する短期的機序および長期的機序の両方を含む宿主の食欲制御とを生理的に結び付け得ることを明らかにする。以下の主要な結果がこの結論を裏付けている：１）定期的な栄養供給によって、２０分間持続する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対数増加が促進および安定化され、このことはｉｎ  ｖｉｖｏのデータと一致する；２）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の定常増殖期は、総細菌タンパク質含有量の増加、およびＣｌｐＢの増加を含む異なるプロテオームプロファイルを特徴とした；３）両増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＴＰ産生を用量依存性に刺激した；４）血漿中のＣｌｐＢレベルは、腸内での栄養誘導性の細菌増殖の後も変化しなかったが、腸内細菌叢のＣｌｐＢ  ＤＮＡと相関したこと；５）対数増殖期および定常増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を腸内に注入したところ、それぞれ血漿中のＧＬＰ−１およびＰＹＹを刺激した。６）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を全身注射すると、定常期のタンパク質にのみ、食欲抑制性のＡＲＣニューロンおよびＣｅＡニューロンのｃ−ｆｏｓ活性化を伴って摂食量が有意に減少した、最後に７）ＣｌｐＢがＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンの発火率を刺激した。
【０１６５】
定期的な栄養供給と細菌増殖
ヒトの消化管に生着する様々な細菌のなかでも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は最も存在量の多い通性嫌気性菌であり、そのため共生腸内細菌のモデル生物となっている（Ｆｏｕｃａｕｌｔら，２００９）。本発明者らは、本発明において、定期的な栄養供給の期間に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がその増殖動態を変化させ、５回目の供給サイクル直後に対数増殖が生じて２０分間継続した後、定常期に入ることを見出した。その後、次の栄養供給後も同じように増殖サイクルが再現されることから、それが細菌機序に固有のペースメーカーセットの役割を果たしている可能性が示唆される。ラットの結腸でも栄養注入に応答して同じような細菌増殖動態がみられたことから、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータがｉｎ  ｖｉｖｏの状況、例えば定期的に食餌を摂るヒトにおいて適切であり得ることが裏付けられる。毎回新たに供給した後も細菌数の増加量が１０８〜１０９個で安定に維持されたことから、これに対応する腸内タンパク質含有量の増加を含む細菌バイオマスの安定な産生が、宿主の食餌誘導性調節因子に何らかの役割を果たしている可能性が示唆される。ヒトの平均的な食事相が定期的に栄養供給した細菌の対数増殖の持続時間と類似であることを考慮すれば、摂取した栄養分と接触してから２０分後に腸内細菌が定常期に達することによって宿主の満腹感が誘発され得ると推測することは魅力的である。しかし、消化管内の細菌含有量は、胃内の１０３個〜結腸内の１０１２個の範囲内にある。さらに、摂取した栄養分が胃と小腸の中を進むのに約２時間、大腸の中を進むのに約１０時間を要する。栄養分が大部分の腸内細菌に送達されるまでこれほどの遅延があることから、食事相での細菌増殖は、栄養分の一度の供給と直接接触することのほかにも、腸管内腔に栄養分が放出されることにより食物摂取に対するパブロフの脳反射によって開始され得る可能性がある。
【０１６６】
増殖期での細菌タンパク質発現と腸内感知
定期的に栄養供給した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖動態は宿主の食事相および食後相に関連し得ることから、細菌タンパク質の発現が腸内細菌と宿主の食欲制御とを結びつける可能性があるかどうかを検討した。最初に、対数増殖期と定常増殖期との間で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプロテオームを比較した。この解析には、対数期の中間期、すなわち栄養供給から１０分後および通常満腹感を感じることを特徴とする時間である２時間後の定常期に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を抽出した。２つの増殖期の間で差次的に発現するタンパク質が少なくとも４０種類あることが発見されたことから、両増殖期は、細菌増殖後にタンパク質含有量がほぼ２倍になることにより定量的に異なるのみならず、定性的にも異なることが確認された。次いで、ｉ）細菌タンパク質がエネルギー基質を生成する能力を比較すること、およびｉｉ）細菌タンパク質が食欲調節経路に及ぼす可能性がある直接作用を決定することによって、タンパク質発現プロファイルの変化が宿主の食欲制御と関連する可能性を調べた。後者の可能性については、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢがα−ＭＳＨのコンホメーションを模倣するタンパク質であることがプロテオミクスにより最近明らかにされており（Ｔｅｎｎｏｕｎｅら，２０１４）、食欲抑制ペプチドまたは食欲促進ペプチドに相同なエピトープを示す腸内細菌タンパク質が交差反応性自己抗体の産生の原因であり得るとする本発明者らの以前の仮説の妥当性を確認したデータ（Ｆｅｔｉｓｓｏｖら，２００８）によって裏付けられている。したがって、細菌増殖期に関連するタンパク質発現プロファイルに応じて、そのような細菌模倣タンパク質が組み合わさって食欲に直接影響を及ぼし得ると考えられる。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物と腸粘膜を解析することによって、ＣｌｐＢレベルの増加が定常増殖期に関連することを見出した。したがって、ＣｌｐＢの増加が、栄養誘導性の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖および細菌タンパク質産生量の増加後に起こる食欲抑制経路の活性化に寄与し得る。重要な疑問は、ＣｌｐＢなどの細菌タンパク質が食欲調節経路のどの部分に作用するのかということである。
【０１６７】
細菌タンパク質は腸粘膜に存在する（Ｈａａｎｇｅら，２０１２）が、その腸障壁の通過については十分に研究されていない（ＬｉｍおよびＲｏｗｌｅｙ，１９８５）。理論的には、細菌が腸内で自然にまたは誘導されて溶解した（ＲｉｃｅおよびＢａｙｌｅｓ，２００８）後、腸神経系により調節される腸細胞での吸収および傍細胞拡散によって、細菌成分が粘膜上皮バリアを通過することが可能になる（Ｎｅｕｎｌｉｓｔら，２０１２）。例えば、グラム陰性菌が溶解したときに放出されるリポ多糖（ＬＰＳ）は、健常なヒトおよびマウスの血漿中に自然に存在し、高脂肪食を摂取すると基底レベルが高くなる（Ｃａｎｉら，２００７）。ＬＰＳの血漿中レベルは食後にも上昇する（Ｈａｒｔｅら，２０１２）が、細菌タンパク質に関するそのようなデータはない。本明細書では、ラットの腸内で細菌が増殖した後、またはラットの腸内に細菌タンパク質を注入した後も血漿中ＣｌｐＢレベルが安定に維持されることを示している。このことから、血漿中ＣｌｐＢのほか、最も可能性が高いものとして血漿中に存在するほかの細菌タンパク質が、栄養誘導性の細菌増殖による影響を急激に受けることはなく、したがって、脳への短時間の満腹感シグナル伝達に関与するとは考えはずがないことが示される。
【０１６８】
それでも、血漿中ＣｌｐＢ濃度には腸内細菌叢中のＣｌｐＢ  ＤＮＡとの相関が認められ、このことは、ＣｌｐＢ産生細菌の数が、長期的には栄養誘導性の細菌増殖による変動とは比較的無関係なはずであり、長期間にわたる血漿中ＣｌｐＢレベルの維持に関与する主要な要因であり得ることを示唆する。この結論は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を長期間強制投与したマウスは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｌｐＢ変異株を投与したマウスとは異なり、血漿中ＣｌｐＢ濃度の上昇を示すＣｌｐＢ  ＥＬＩＳＡの検証で得られた本発明者らのデータによってさらに裏付けられる。したがって、血漿中に存在するＣｌｐＢを含む腸内細菌タンパク質は、腸内細菌叢の組成と長期的なエネルギー代謝の制御とを系統的に結び付ける可能性がある。
【０１６９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＴＰ産生に及ぼす影響
食物連鎖を通じたエネルギー交換は、あらゆる生物体が普遍的につながっていることを表している（Ｙｕｎら，２００６）。細菌および動物の栄養素の異化作用から生じるＡＴＰはともに、同化過程の主要なエネルギー基質としての役割を果たす。動物は、アデノシン−５’−一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性を介してＡＴＰの変化を感知することができ、それにより、ＡＴＰレベルが低いときは摂食量が増加し、その逆も同様に起こる（ＤｚａｍｋｏおよびＳｔｅｉｎｂｅｒｇ，２００９）。そこで本研究では、対数期および定常期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＴＰを生成する能力を比較した。実際、同定されたタンパク質の多くが同化特性および異化特性を示した。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＴＰ産生を刺激することが可能であることを見出し、腸内で溶菌が起こった後も同タンパク質がＡＴＰ産生を触媒し続け得ることが示唆される。対数期のタンパク質と定常期のタンパク質との間にＡＴＰ産生能の差は認められなかったが、細菌タンパク質濃度依存性のＡＴＰ産生は、栄養誘導性の細菌増殖後に起こる細菌タンパク質含有量の増加によってより高いＡＴＰ合成が起こるはずであることを示している。腸内細菌叢が宿主の代謝のためにエネルギーを摂取する効率の関連性は、肥満および痩身のヒトおよびマウスを比較することによって既に確立されている（Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら，２００６）。本発明者らのデータは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質のＡＴＰ生成能を示すことにより、これらの結果をさらに裏付けている。ほかにも、食餌誘導性の細菌増殖が腸内ＡＴＰの増加を引き起こし、これが管腔でのエネルギー利用率および腸弛緩の感知に寄与するはずであることが示唆されている（Ｇｌａｓｇｏｗら，１９９８）。
【０１７０】
満腹ホルモンに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の腸内作用
次に、腸内の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がＧＬＰ−１およびＰＹＹなどの腸満腹ホルモンの全身放出を刺激し得るかどうかを検討した（Ａｄｒｉａｎら，１９８５；Ｂａｔｔｅｒｈａｍら，２００２；Ｂｅｇｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｇｅｎ，２００６；Ｆｌｉｎｔら，１９９８）。実際、両ホルモンとも、腸全体に存在し結腸に大量に存在する同じまたは異なる腸内分泌Ｌ細胞が産生し（Ｅｉｓｓｅｌｅら，１９９２）、このため、Ｌ細胞は細菌タンパク質に直接曝される。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質が及ぼす作用がＧＬＰ−１放出とＰＹＹ放出とで異なることを見出し、対数増殖期のタンパク質がＧＬＰ−１を刺激し、定常増殖期のタンパク質がＰＹＹを刺激することを示した。これらの結果は、栄養誘導性の細菌増殖と、既に知られているＧＬＰ−１およびＰＹＹの食餌誘導性の放出動態との間に何らかの類似性を指摘している。実際、ヒトで明らかにされているように、血漿ＧＬＰ−１の急激なピークは胃内に流動食を注入してから１５分後に起こるが、長時間持続する血漿中ＰＹＹの上昇は食後１５〜３０分で始まる（Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９９；Ｇｅｒｓｐａｃｈら，２０１１）。ＧＬＰ−１の放出時間が長くなることは、脂肪の摂取に関連した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌａａｕｗら，２０１３）。したがって、定期的に栄養供給した腸内細菌の増殖動態は、ＧＬＰ−１およびＰＹＹの放出動態に時間的に当てはまり、腸内細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質には、腸の満腹感の食餌誘導性シグナル伝達を誘導する役割があることが示唆される。対数期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がＧＬＰ−１を刺激する差次的効果、血糖コントロールにおけるＧＬＰ−１のインクレチンとしての役割をおそらく反映し得る（Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９９；Ｓｔｅｉｎｅｒｔら，２０１４）。最近、Ｌ細胞が機能性ＭＣ４Ｒを発現することが証明された（Ｐａｎａｒｏら，２０１４）ことは、α−ＭＳＨを模倣する細菌タンパク質によるその起こりうる活性化のバックグランドとなる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の定常期にＣｌｐＢの産生量が増加し、血漿中ＰＹＹレベルの増加に関連して腸粘膜のＣｌｐＢレベルが上昇することは、ＣｌｐＢが結腸内のＰＹＹ産生Ｌ細胞の活性化に直接的な役割を果たしていることが示唆される。他方で、対数増殖期におそらくアップレギュレートされるこれまで同定されていない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がＧＬＰ−１分泌を優先的に刺激し得る。
【０１７１】
摂食量および食欲調節脳経路に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の全身作用
本発明者らは本発明において、空腹または自由摂食のラットおよび自由摂食マウスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を末梢注射すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖期に応じてその摂食量が変化することを明らかにした。血漿中ＣｌｐＢは栄養素の腸内注入による影響は受けないが、短時間にわたって安定であったことを考えると、細菌タンパク質の全身作用は、その食欲に対する長期的調節作用と関連すると解釈できるはずである。さらに、対数期の時間が短いことから、長期間継続する定常期にアップレギュレートされる細菌タンパク質が血漿中で優勢になるはずであり、したがって、そのタンパク質を全身投与することにより、生理的状況を一層よく表すことができる。これらの実験に使用した濃度０．１ｍｇ／ｋｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質は、ヒトまたはげっ歯類に末梢投与した後に満腹感を誘発するのに有効な量のレプチンまたはＰＹＹなどのペプチドホルモンと同等のものであった（Ｂａｔｔｅｒｈａｍら，２００２；Ｈａｌａａｓら，１９９５；Ｈｅｙｍｓｆｉｅｌｄら，１９９９）。
【０１７２】
空腹ラットに対数期の細胞質タンパク質を投与したところ、明期の再給餌時の摂食量の増加、および定常期の膜タンパク質による摂食量の減少が観察された。この実験から、同じ細菌の異なるタンパク質の混合物が、その全身作用によって摂食量を増大または減少させることが可能であることが確認された。しかし、より生理的な状況下で総大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質が暗期の自由摂食ラットに及ぼす影響を試験することにより、定常期のタンパク質によって誘導される摂食量の減少のみが観察された。
【０１７３】
さらに、自由摂食マウスへの反復注射の結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質には負のエネルギーバランスを促進する役割があることを裏付けている。実際、細菌タンパク質注射の第１日、摂食量および体重の減少が起こり、満腹度の増加を特徴とする、定常期のタンパク質を投与したマウスでは有意であった。その後、これらのマウスの摂食量は平常に戻ったが、食餌量が漸減するとともに食餌頻度が増加し、これは摂食量を維持する補償機序である可能性が最も高い（Ｍｅｇｕｉｄら，１９９８）。さらに、明期と暗期で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質の作用が異なることが観察された。このため、視床下部の食欲調節神経ペプチドのｍＲＮＡ発現パターンは、食欲抑制経路と食欲促進経路の両方の活性化を伴う混合応答を示した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を投与したマウスの両方の群が、ＶＭＮのＭＣ４Ｒの下流にある食欲抑制経路であるＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの類似の増加を示したことは注目すべきことである（Ｘｕら，２００３）。この経路は、両群で観察された暗期の摂食量減少の根底にあり、このような摂食量減少は、食欲促進性のＱＲＦＰ（Ｃｈａｒｔｒｅｌら，２００３）およびＮＰＹ（Ｈｅｒｚｏｇ，２００３）のより低レベルを示す、対数期のタンパク質を注射したマウスではさらに顕著であった。これに対し、定常期の細菌タンパク質を投与したマウスは、ＣＲＨ  ｍＲＮＡレベルの上昇を伴う食欲抑制プロファイルの増強を示し、ＭＣ４Ｒ発現ＰＶＮニューロンが関与している可能性が最も高い（Ｌｕら，２００３）。注射を６日間実施したこれらのマウスでは、これらの変化が食餌頻度を刺激するオレキシンＡのｍＲＮＡ前駆体の発現増加と組み合わさって（Ｂａｉｒｄら，２００９）、それぞれ食餌量および飽満度の減少に寄与し得る。
【０１７４】
定常期に産生される細菌タンパク質がいくつかの重要な中枢食欲抑制経路を活性化し得るとする本発明者らの仮説に一致して、本発明者らは、自由摂食ラットでは、食欲抑制ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロン、ならびに長い間満腹中枢として知られ、ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンと相互に連結しているＶＭＮ（Ｓｔｅｒｎｓｏｎら，２００５）においてｃ−ｆｏｓ発現が増加することを見出した。得られたｃ−ｆｏｓパターンは、食物摂取時の（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら，２００６）、またはＰＹＹもしくは膵ポリペプチドなどの満腹ホルモンによって誘導される（Ｂａｔｔｅｒｈａｍら，２００２；Ｃｈａｌｌｉｓら，２００４；Ｌｉｎら，２００９）満腹感誘発応答のパターンと類似している。ｃ−ｆｏｓ活性化ＰＯＭＣニューロンの数が比較的少数（約１０％）であることから、循環血中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質がこれら視床下部経路を介して作用し、食欲および体重に対して調節効果を示し得ることが示唆される。ＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンによるｃ−ｆｏｓ活性化を決定することは実現不能であったが、これらのニューロンもＭＣ３ＲおよびＭＣ４Ｒを発現する（Ｍｏｕｎｉｅｎら，２００５）ことから、細菌タンパク質によるシグナル伝達へのその関与を除外することはできない。さらに、ＣｅＡ  ＣＧＲＰニューロンにおけるｃ−ｆｏｓの活性化がＡＲＣ  ＰＯＭＣよりも強い（約４０％）ことは、ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンおよびＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロン、および可能性として、本発明では解析しなかった孤束核などの他の食欲調節脳領域から収束する下流の作用があることを示し得る。
【０１７５】
最後に、ＡＲＣ  ＰＯＭＣニューロンなどの食欲を調節する脳部位の細菌タンパク質による活性化が細菌タンパク質の局所作用によって引き起こされ得るかどうかを決定するため、これらのニューロンへのＣｌｐＢ添加がその電気的活動を活性化し得るかどうかを調べた。本発明者らの結果から、被験ニューロンの約半数はその活動電位頻度が増加し、活性化状態が少なくとも１０分間持続することが示された。ＣｌｐＢの持続的作用は、機能性のＭＣ３ＲおよびＭＣ４Ｒを発現するＰＯＭＣニューロンに対するα−ＭＳＨの作用（Ｓｍｉｔｈら，２００７）と一致し、ＣｌｐＢが、満腹感を誘発するＰＹＹおよびレプチン（Ｂａｔｔｅｒｈａｍら，２００２；Ｃｏｗｌｅｙら，２００１）といくぶん類似する、視床下部ＰＯＭＣニューロンの生理活性化因子でありうることを示唆している。しかし、ＣｌｐＢがＰＯＭＣニューロンを直接活性化することができたのか、または局所ネットワークを介して活性化することができたのかは明らかではない。
【０１７６】
以上のデータを考え合わせると、これらのデータは、全身に存在し定常増殖期に発現が増加するＣｌｐＢなどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質が、脳の食欲抑制経路の活性化を介して負のエネルギーバランスの促進に何らかの役割を果たしていることを裏付ける。同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および可能性として腸内細菌科に属するほかの細菌の少ないまたは多い存在量をもたらす微生物叢の組成の変化が、宿主のエネルギーバランスにそれぞれ正の影響または負の影響を及ぼし得ることが示唆される。
【０１７７】
実施例２
この実施例は、ＣｌｐＢ発現細菌の摂食量に対する効果を証明する。
【０１７８】
１か月齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を上記の通りに動物施設に１週間馴化させ維持した。マウスを以下の３つの群に割り付けた：（ｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌（ＣｌｐＢを発現する）を強制投与する群；（ｉｉ）１０８個のＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌を強制投与する群；（ｉｉｉ）いかなる処置も実施しない対照群。ＣｌｐＢ変異株は、Ｂｅｒｎｄ  Ｂｕｋａｕ研究室（ＺＭＢＨ、ハイデルベルク大学、ハイデルベルク、ドイツ）で作製され、Ａｘｅｌ  Ｍｏｇｋ博士の厚意により、対応する野生型（ＷＴ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とともに寄贈された。マウスを個別にＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社）に入れ、２１日間、細菌を含むＬＢ培地０．５ｍＬを連日、暗期開始前に胃内強制投与した。強制投与の最初の数日は、ＣｌｐＢタンパク質を発現しない細菌とは対照的に、ＷＴ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与したマウスに体重および摂食量の減少がみられた（図１）。
【０１７９】
実施例３
この実施例は、ＣｌｐＢ発現細菌の肥満ｏｂ／ｏｂマウスに対する効果を証明する。
【０１８０】
遺伝的に肥満のｏｂ／ｏｂマウスを上記の通りに動物施設に１週間馴化させ維持した。マウスに（ｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌（ＣｌｐＢ発現する）；（ｉｉ）１０８個のＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌；両菌ともミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れたもの、または（ｉｉｉ）対照のＭＨ培地のみを胃内強制投与した。ＣｌｐＢ変異株は、Ｂｅｒｎｄ  Ｂｕｋａｕ研究室（ＺＭＢＨ、ハイデルベルク大学、ハイデルベルク、ドイツ）で作製され、Ａｘｅｌ  Ｍｏｇｋ博士の厚意により、対応する野生型（ＷＴ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とともに寄贈された。マウスを個別にＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社）に入れ、図のように、２１日間、胃内強制投与を連日実施した。
【０１８１】
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＷＴ菌の強制投与により、体重増加が５６％減少し（図３および４）、脂肪量／除脂肪量比が減少し（図５および６）、総摂食量が２０％減少する（図７および８）が、ＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌では以上のことは観察されないことを示した。
【０１８２】
実施例４
この実施例では、ＣｌｐＢを発現するほかの菌株の肥満ｏｂ／ｏｂマウスに対する効果を証明する。
【０１８３】
遺伝的に肥満のｏｂ／ｏｂマウスを上記の通りに動物施設に１週間馴化させ維持した。マウスに（ｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌（ＣｌｐＢを発現する）；（ｉｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ＣｌｐＢを発現する）；（ｉｉｉ）凍結乾燥形態の１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７菌（ＣｌｐＢを発現する）；いずれの菌ミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れたもの、または（ｉｖ）対照のＭＨ培地のみを胃内強制投与した。図のように、マウスに１４日間、胃内強制投与を連日実施した。
【０１８４】
本発明者らは、ＣｌｐＢを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれの株を強制投与しても、体重増加の減少（図９および１０）および脂肪含有量の減少（図１１）が引き起こされることを示した。
【０１８５】
実施例５
この実施例では、ＣｌｐＢの直接的な満腹感誘発作用を裏付ける。
【０１８６】
脳室内（ＩＣＶ）にＣｌｐＢを注射したラットに関する動物実験では、ＣｌｐＢが視床下部ＭＣＲ受容体ファミリーを介して摂食行動に作用する可能性が示された。
【０１８７】
空調管理された特殊な動物施設で２００〜２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ社、ラルブレル、フランス）を１２時間：１２時間の明暗サイクル（明期７〜１９時）下、２４℃にて維持した。ラットに標準的なペレット固形飼料（ＲＭ１  ｄｉｅｔ、ＳＤＳ社、エセックス、イギリス）を与えた。飲料水は常時自由摂取とした。
【０１８８】
ステンレス鋼カニューレ（Ｃ３１１  ＧＡ、外径０．９ｍｍ、内径０．５８ｍｍ、Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ社、ロアノーク、バージニア州）を埋め込むため、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）混合物（３：１ｖｏｌ−０．１ｍＬ／１００ｇ体重）の腹腔内注射によりラットに麻酔をかけ、Ｎｅｗ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｒａｔｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｅ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｅｕｒｏｐｅ社、ダブリン、アイルランド）に入れた。手術用顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、イェーナ、ドイツ）下、切歯バーを−３．３ｍｍに設定してカニューレを視床下部室傍核内（ブレグマ：＋２．８ｍｍ、側方：正中より−０．４ｍｍおよび腹側：硬膜より８．２ｍｍ）に埋め込んだ。歯科用セメントを用いてカニューレを頭蓋に固定し、アンカースクリューにより補強した。覚醒後、ラットを個別に代謝ケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ社、リヨン、フランス）内で１週間飼育し、同じ標準げっ歯類用固形飼料（ＲＭ１、ＳＤＳ社）を自由に摂食させ、水を常時摂取可能にした。術後期間中、健康状態および体重増加を毎日モニターし、回復が良好であることを確認した。
【０１８９】
次いで、自動摂食モニターをそれぞれ備えたＢｉｏＤＡＱラットケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社、ニューブランズウィック、ニュージャージー州）にラットを個別に入れた。ＢｉｏＤＡＱケージに３日間馴化させた後、ラットを注射前の１２時間絶食させ、３つの群（ｎ＝３）に分け、それぞれ無菌人工脳脊髄液２ｍＬで希釈した異なる用量、すなわち１０ｎｇ、１００ｎｇおよび１ｍｇのＣｌｐＢを単回注射で投与した。注射は暗期および給餌の開始の１５分前に実施した。暗期に摂食量を測定した。
【０１９０】
ラットは摂食量の用量依存的減少を示した（図１２を参照されたい）。
【０１９１】
実施例６
この実施例は、肥満ｏｂ／ｏｂマウスに及ぼすＣｌｐＢを発現するハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）の効果を実証するものである。
【０１９２】
遺伝的に肥満のｏｂ／ｏｂマウスを上記の通りに動物施設に１週間馴化させ維持した。マウスに、（ｉ）１０８個のハフニア・アルベイＡＦ０３６菌（ＣｌＢｐを発現）；（ｉｉ）１０８個のＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌；（ｉｉｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ＣｌｐＢを発現する）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または（ｉｖ）対照としてのＭＨ培地のみを、胃内強制投与した。
【０１９３】
本発明者らは、ハフニア・アルベイでの処置が、肥満の対照と比較して体重増加の有意な減少を誘導したことを示している（図１３）。さらに、この体重増加の減少は、累積摂食量の減少と関連しており（図１４）、かつ、体脂肪／除脂肪比を変えることなく、体脂肪量および除脂肪量の両方の減少に関連していた（図１５）。
【０１９４】
ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）は、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびコレステリルエステル、ならびに他の脂質および水溶性の物質を加水分解できる細胞内の中性リパーゼである。特に、ＨＳＬの活性化は、脂肪分解を誘導する。ＨＳＬのホルモンによる活性化は、ＨＳＬをリン酸化する、環状ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）を介して起こる。よって、リン酸化した形態のＨＳＬタンパク質（ｐＨＳＬ）の発現の増大は、脂肪分解の活性化を意味する。ｐＨＳＬの発現は、ウエスタンブロットにより測定した。
【０１９５】
本発明者らは、対照および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌の強制投与と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７およびハフニア・アルベイ菌での強制投与が、ｐＨＳＬ発現を増大させたことを示した（図１６）。よって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７およびハフニア・アルベイ菌は、脂肪分解の機構を活性化する。
【０１９６】
実施例７
この実施例は、高脂肪食誘導性肥満マウスにおけるＣｌｐＢを発現するハフニア・アルベイの効果を示すものである。
【０１９７】
月齢１ヶ月の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、高脂肪／高炭水化物食を２週間導入（ｉｎｄｕｃｅ）した。次に、マウスに、（ｉ）１０８個のハフニア・アルベイＡＦ０３６菌（ＣｌＢｐを発現）；（ｉｉ）１０８個のＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または（ｉｉｉ）対照としてのＭＨ培地のみを胃内強制投与した。マウスを個別にＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社）に入れ、２１日間、指定通りに毎日胃内強制投与を行った。
【０１９８】
高脂肪食による肥満の誘導を、肥満を誘導した群および誘導していない群において体重の平均値（図１７Ａ）、脂肪量（図１７Ｂ）、および除脂肪量（図１７Ｃ）を測定することにより、検証した。
【０１９９】
本発明者らは、ＣｌＢｐを発現するハフニア・アルベイ菌のいずれかの菌株を用いる強制投与が、体重増加の減少を誘導し（図１８）、脂肪含有量の減少を誘導する（図１９）ことを示した。
【０２００】
実施例８
この実施例は、肥満ｆａ／ｆａ  ＺｕｃｋｅｒラットにおけるＣｌＢｐを発現するハフニア・アルベイの効果を示すものである。
【０２０１】
遺伝的に肥満のｆａ／ｆａ  Ｚｕｃｋｅｒラット（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、上記の通りに動物施設に１週間馴化させ維持した。ラットに、（ｉ）１０８個のハフニア・アルベイＡＦ０３６菌（ＣｌＢｐを発現）；（ｉｉ）１０８個のＣｌｐＢ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２菌、（ｉｉｉ）１０８個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７（ＣｌｐＢを発現する）（ともにミューラー・ヒントン（ＭＨ）培地に入れて）、または（ｉｖ）対照としてのＭＨ培地のみを、胃内強制投与した。ラットを個別にＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社）に入れ、２１日間、指定通り２１日間毎日胃内強制投与を行った。
【０２０２】
この結果は、体重増加が、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２Δ−ＣｌｐＢまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｅｓｓｌｅ  １９１７菌を投与したラット、または対照と比較して、Ｈ．ａｌｖｅｉの群で最も減少することを示している（図２０）。さらに、他の３つの群と比較して、Ｈ．ａｌｖｅｉの群で最少の累積摂食量が観察された（図２１）。
【０２０３】
また本発明者らは、脂肪量の増加が、Ｈ．ａｌｖｅｉの群でのみ減少することを示している（図２２）。
【０２０４】
（参考文献）
本願全体を通じて、様々な参考文献により本発明に関連する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示は参照により本開示に組み込まれる。
【０２０５】
Ａｄｒｉａｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｆｅｒｒｉ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｃａｒｅｓｅ−Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｆｕｅｓｓｌ，Ｈ．Ｓ．，Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｍ，Ｓ．Ｒ．（１９８５）．Ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｎｅｗ  ｇｕｔ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８９，１０７０−１０７７．
Ａｔａｓｏｙ，Ｄ．，Ｂｅｔｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．，Ｓｕ，Ｈ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．（２０１２）．Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  ｈｕｎｇｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，１７２−１７７．
Ｂａｉｒｄ，Ｊ．−Ｐ．，Ｃｈｏｅ，Ａ．，Ｌｏｖｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｅｃｋ，Ｊ．，Ｍａｈｏｎｅｙ，Ｃ．Ｅ．，Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｇｇ，Ｌ．Ａ．（２００９）．Ｏｒｅｘｉｎ−Ａ  ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ：ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｓｕｍｍａｔｏｒｙ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０，１２０２−１２１６．
Ｂａｔｔｅｒｈａｍ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｏｗｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍａｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｅｒｚｏｇ，Ｈ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｄａｋｉｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｗｒｅｎ，Ａ．Ｍ．，Ｂｒｙｎｅｓ，Ａ．Ｅ．，Ｌｏｗ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｈａｔｅｉ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｇｕｔ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＰＹＹ（３−３６）ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，６５０−６５４．
Ｂｅｇｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｄｅｇｅｎ，Ｌ．（２００６）．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓａｔｉｅｔｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ−Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＧＬＰ−１  ａｎｄ  ＰＹＹ  ？  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ８９，４６０−４６４．
Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｈ．−Ｒ．（２０１１）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｄｏｎｉｃ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｐｐｅｔｉｔｅ：ｗｈｏ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｂｏｓｓ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，８８８−８９６．
Ｃａｎｉ，Ｐ．Ｄ．，Ａｍａｒ，Ｊ．，Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｐｏｇｇｉ，Ｍ．，Ｋｎａｕｆ，Ｃ．，Ｂａｓｔｅｌｉｃａ，Ｄ．，Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ａ．Ｍ．，Ｆａｖａ，Ｆ．，Ｔｕｏｈｙ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｈａｂｏ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６，１７６１−１７７２．
Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｏｄｅｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｚｗｅｉｆｅｌ，Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．（２０１３）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｐｐｅｔｉｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，１１１−１１４．
Ｃｈａｌｌｉｓ，Ｂ．Ｇ．，Ｃｏｌｌ，Ａ．Ｐ．，Ｙｅｏ，Ｇ．Ｓ．Ｈ．，Ｐｉｎｎｏｃｋ，Ｓ．Ｂ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｈｒｅｓｈｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．，Ｚａｈｎ，Ｄ．，Ｒｏｃｈｆｏｒｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｗｈｉｔｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｐｒｏ−ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ａｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ａｎｏｒｅｃｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＹＹ３−３６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，４６９５−４７００．
Ｃｈａｒｔｒｅｌ，Ｎ．，Ｄｕｊａｒｄｉｎ，Ｃ．，Ａｎｏｕａｒ，Ｙ．，Ｌｅｐｒｉｎｃｅ，Ｊ．，Ｄｅｃｋｅｒ，Ａ．，Ｃｌｅｒｅｎｓ，Ｓ．，Ｄｏ−Ｒｅｇｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｖａｎｄｅｓａｎｄｅ，Ｆ．，Ｌｌｏｒｅｎｓ−Ｃｏｒｔｅｓ，Ｃ．，Ｃｏｓｔｅｎｔｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２６ＲＦａ，ａ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＦａｍｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，１５２４７−１５２５２．
Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．（２００５）．Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，５７１−５７８．
Ｃｏｗｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｎｃｈｕｋ，Ｎ．，Ｆａｎ，Ｗ．，Ｄｉｎｕｌｅｓｃｕ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｏｌｍｅｒｓ，Ｗ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．（１９９９）．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＰＹ，ＡＧＲＰ，ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｔａｔ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２４，１５５−１６３．
Ｃｏｗｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍａｒｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｃｅｒｄａｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｄｉａｎｏ，Ｓ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｔ．Ｌ．，Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｌｏｗ，Ｍ．Ｊ．（２００１）．Ｌｅｐｔｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ａｎｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ＰＯＭＣ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４８０−４８４．
Ｄｉｎａｎ，Ｔ．Ｇ．，Ｓｔｉｌｌｉｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．（２０１５）．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｕｎｃｏｎｓｃｉｏｕｓ：Ｈｏｗ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｓｈａｐｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，１−９．
Ｄｚａｍｋｏ，Ｎ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｒ．（２００９）．ＡＭＰＫ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  １９６，１１５−１２７．
Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｍａｈｍｏｕｄｉ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｇｈａｔｅｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｍ，Ｓ．Ｒ．（１９９９）．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｈａｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｅｘｅｎｄｉｎ  ９−３９．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８，８６−９３．
Ｅｉｓｓｅｌｅ，Ｒ．，Ｇｏｋｅ，Ｒ．，Ｗｉｌｌｅｍｅｒ，Ｓ．，Ｈａｒｔｈｕｓ，Ｈ．Ｐ．，Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｈ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｏｋｅ，Ｂ．（１９９２）．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｏｆ  ｒａｔ，ｐｉｇ  ａｎｄ  ｍａｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２２，２８３−２９１．
Ｆｅｔｉｓｓｏｖ，Ｓ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ，Ｐ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｕｔ−ｂｒａｉｎ  ａｘｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｅ  １４，４７７−４８２．
Ｆｅｔｉｓｓｏｖ，Ｓ．Ｏ．，Ｈａｍｚｅ  Ｓｉｎｎｏ，Ｍ．，Ｃｏｅｆｆｉｅｒ，Ｍ．，Ｂｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ，Ｃ．，Ｄｕｃｒｏｔｔｅ，Ｐ．，Ｈｏｋｆｅｌｔ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ，Ｐ．（２００８）．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｐｐｅｔｉｔｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２４，３４８−３５９．
Ｆｉｏｒａｍｏｎｔｉ，Ｘ．，Ｃｏｎｔｉｅ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｒｏｕｔｈ，Ｖ．Ｈ．，Ｌｏｒｓｉｇｎｏｌ，Ａ．，ａｎｄ  Ｐｅｎｉｃａｕｄ，Ｌ．（２００７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅｎｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ  ａｎｄ  ｐｒｏ−ｏｐｉｏ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ？  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６，１２１９−１２２７．
Ｆｌｉｎｔ，Ａ．，Ｒａｂｅｎ，Ａ．，Ａｓｔｒｕｐ，Ａ．，ａｎｄ  Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．（１９９８）．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓａｔｉｅｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０１，５１５−５２０．
Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｕｎｚｅ，Ｗ．（２０１３）．Ｖｏｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ：ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＣＮＳ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７０，５５−６９．
Ｆｏｕｃａｕｌｔ，Ｍ．−Ｌ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．，Ｇｏｕｓｓａｒｄ，Ｓ．，Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ，Ｂ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，Ｃ．（２００９）．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７６，２６４−２７４．
Ｇａｒｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｃ．，Ｍａｄａｒａ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｈａｈ，Ｂ．Ｐ．，Ｗｅｂｂｅｒ，Ｅ．，Ｓｔｅｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｎ．，Ｇａｖｒｉｌｏｖａ，Ｏ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｐｐｅｔｉｔｅ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４０１１．
Ｇｅｒｓｐａｃｈ，Ａ．Ｃ．，Ｓｔｅｉｎｅｒｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｃｈｏｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．，Ｇｒａｂｅｒ−Ｍａｉｅｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｇｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＧＬＰ−１，ＰＹＹ，ａｎｄ  ＣＣＫ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３０１，Ｅ３１７−Ｅ３２５．
Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｉ．，Ｍａｔｔａｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｒａｎｔｉｓ，Ａ．（１９９８）．Ｒａｔ  ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＯ  ａｎｄ  ＡＴＰ  ｉｎ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７５，Ｇ８８９−Ｇ８９６．
Ｇｏｉｃｈｏｎ，Ａ．，Ｃｏｅｆｆｉｅｒ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ，Ｓ．，Ｌｅｃｌｅｉｒｅ，Ｓ．，Ｃａｉｌｌｅｕｘ，Ａ．−Ｆ．，Ｂｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ，Ｃ．，Ｃｈａｎ，Ｐ．，Ｄｏｎｎａｄｉｅｕ，Ｎ．，Ｌｅｒｅｂｏｕｒｓ，Ｅ．，Ｌａｖｏｉｎｎｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｔｅｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ９４，７８４−７９４．
Ｈａａｎｇｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｏｂｅｒｂａｃｈ，Ａ．，Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ，Ｎ．，Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ，Ｆ．，Ｓｍｉｄｔ，Ｈ．，ｖｏｎ  Ｂｅｒｇｅｎ，Ｍ．，Ｔｉｌｌ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｊ．（２０１２）．Ｍｅｔａｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １１，５４０６−５４１７．
Ｈａｌａａｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｇａｊｉｗａｌａ，Ｋ．Ｓ．，Ｍａｆｆｅｉ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｌａｌｌｏｎｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）．Ｗｅｉｇｈｔ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｂｅｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，５４３−５４６．
Ｈａｒｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｖａｒｍａ，Ｍ．Ｃ．，Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｇ．，ＭｃＧｅｅ，Ｋ．Ｃ．，Ａｌ−Ｄａｇｈｒｉ，Ｎ．Ｍ．，Ａｌ−Ａｔｔａｓ，Ｏ．Ｓ．，Ｓａｂｉｃｏ，Ｓ．，Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｅｒｉｅｌｌｏ，Ａ．，Ｓａｒａｖａｎａｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｉｎｔａｋｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ３５，３７５−３８２．
Ｈｅｒｚｏｇ，Ｈ．（２００３）．Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８０，２１−２９．
Ｈｅｙｍｓｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｓ．，Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｋ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｒ．，Ｈｕｎｔ，Ｔ．，Ｌｕｂｉｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｐａｔａｎｅ，Ｊ．，Ｓｅｌｆ，Ｂ．，Ｈｕｎｔ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｅｐｔｉｎ  ｆｏｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ａｎｄ  ｌｅａｎ  ａｄｕｌｔｓ：Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  ２８２，１５６８−１５７５．
Ｉｎｕｉ，Ａ．（１９９９）．Ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ−ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ−−ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，６２−６７．
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｅｎｇ，Ｇ．（２００６）．Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４，３１３−３２１．
Ｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｐ．Ｊ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｉ．（２００６）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，１０２２−１０２３．
Ｌｉｍ，Ｐ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｗｌｅｙ，Ｄ．（１９８５）．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．ＩＩ．Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７６，３０−３６．
Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｙ．−Ｃ．，Ｙｕｌｙａｎｉｎｇｓｉｈ，Ｅ．，Ａｌｊａｎｏｖａ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｍａｃｉａ，Ｌ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｅ．−Ｊ．Ｄ．，Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｅｒｚｏｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｒｃｕａｔｅ  Ｙ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ８４８８．
Ｌｕ，Ｘ．Ｙ．，Ｂａｒｓｈ，Ｇ．Ｓ．，Ａｋｉｌ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．（２００３）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｌｐｈａ−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｏ−ｐｉｔｕｉｔａｒｙ−ａｄｒｅｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，７８６３−７８７２．
Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｂａｔｔｅｒｈａｍ，Ｒａｃｈｅｌ  Ｌ．（２０１４）．Ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ＭＣ４Ｒ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ：ｌｉｎｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ｏｆ  ｉｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０，９２９−９３１．
Ｍｅｇｕｉｄ，Ｍ．Ｍ．，Ｌａｖｉａｎｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ−Ｆａｎｅｌｌｉ，Ｆ．（１９９８）．Ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｅｑｕａｌｓ  ｍｅａｌ  ｓｉｚｅ  ｔｉｍｅｓ  ｍｅａｎ  ｎｕｍｂｅｒ．Ａｐｐｅｔｉｔｅ  ３１，４０４．
Ｍｏｕｎｉｅｎ，Ｌ．，Ｂｉｚｅｔ，Ｐ．，Ｂｏｕｔｅｌｅｔ，Ｉ．，Ｖａｕｄｒｙ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｊｅｇｏｕ，Ｓ．（２００５）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ＭＣ３  ａｎｄ  ＭＣ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ｂｙ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ８２，１６４−１７０．
Ｍｕｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｐｒｕｉｊｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｂｒａｋｋｅｅ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ａｄａｎ，Ｒ．Ａ．Ｈ．（２０１３）．Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ＭＣ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｒｏｏｍｉｎｇ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７１９，１９２−２０１．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｍ，Ｓ．Ｒ．（２００６）．Ｇｕｔ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，８５４−８５９．
Ｎｅｕｎｌｉｓｔ，Ｍ．，Ｖａｎ  Ｌａｎｄｅｇｈｅｍ，Ｌ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｄｅｒｋｉｎｄｅｒｅｎ，Ｐ．，Ｂｒｕｌｅｙ  ｄｅｓ  Ｖａｒａｎｎｅｓ，Ｓ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｒｏｌｌｉ−Ｄｅｒｋｉｎｄｅｒｅｎ，Ｍ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ−ｇｌｉａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｕｎｉｔ：ａ  ｎｅｗ  ａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｇｕｔ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １０，９０−１００．
Ｐａｎａｒｏ，Ｂ．Ｌ．，Ｔｏｕｇｈ，Ｉ．Ｒ．，Ｅｎｇｅｌｓｔｏｆｔ，Ｍ．Ｓ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｄｉｇｂｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｍｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｂ．，Ｇｒｉｂｂｌｅ，Ｆ．，Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｆ．，Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０，１０１８−１０２９．
Ｐａｒｋｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｎａｍ，Ｅ．，Ｏｒｇ，Ｅ．，Ｋｏｓｔｅｍ，Ｅ．，Ｎｏｒｈｅｉｍ，Ｆ．，Ｈｕｉ，Ｓ．Ｔ．，Ｐａｎ，Ｃ．，Ｃｉｖｅｌｅｋ，Ｍ．，Ｒａｕ，Ｃ．Ｄ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ，ｈｉｇｈ−ｓｕｃｒｏｓｅ  ｄｉｅｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １７，１４１−１５２．
Ｐｏｗｅｒ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｋｉｎ，Ｊ．（２００８）．Ａｎｔｉｃｉｐａｔｏｒｙ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｐｈａｌｉｃ  ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ａｐｐｅｔｉｔｅ  ５０，１９４−２０６．
Ｒｉｃｅ，Ｋ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂａｙｌｅｓ，Ｋ．Ｗ．（２００８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７２，８５−１０９．
Ｓｈａｒｏｎ，Ｇ．，Ｇａｒｇ，Ｎ．，Ｄｅｂｅｌｉｕｓ，Ｊ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｒ．，Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ，Ｐｉｅｔｅｒ  Ｃ．，ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓａｒｋｉｓ  Ｋ．（２０１４）．Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０，７１９−７３０．
Ｓｈｉ，Ｙ．−Ｃ．，Ｌａｕ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｚｈａｉ，Ｌ．，Ｓｐｅｒｋ，Ｇ．，Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ，Ｒ．，Ｍｉｅｔｚｓｃｈ，Ｍ．，Ｗｅｇｅｒ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．−Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｒｃｕａｔｅ  ＮＰＹ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｏｕｔｐｕｔ  ａｎｄ  ＢＡＴ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  ｒｅｌａｙ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＶＮ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １７，２３６−２４８．
Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｓａｄｏｍｅ，Ｋ．，Ａｌ−Ｑａｓｓａｂ，Ｈ．，Ｈｅｆｆｒｏｎ，Ｈ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｓｈｆｏｒｄ，Ｍ．Ｌ．（２００７）．Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｓ  ａｎｄ  ａｇｏｕｔｉ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｎｅｕｒｏｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５７８，４２５−４３８．
Ｓｔｅｉｎｅｒｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｃｈｉｒｒａ，Ｊ．，Ｍｅｙｅｒ−Ｇｅｒｓｐａｃｈ，Ａ．Ｃ．，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｐ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｆ．，Ｇｏｅｋｅ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｇｌｉｎｇｅｒ，Ｃ．（２０１４）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｎ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １００，５１４−５２３．
Ｓｔｅｒｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｇ．Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．（２００５）．Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＶＭＨ−ａｒｃｕａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｉｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆａｓｔｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，１３５６−１３６３．
Ｔａｋａｇｉ，Ｋ．，Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｒ．，Ａｓａｋａｗａ，Ａ．，Ａｍｉｔａｎｉ，Ｈ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｍ．，Ｔｅｎｎｏｕｎｅ，Ｎ．，Ｃｏｅｆｆｉｅｒ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ，Ｓ．，ｄｏ  Ｒｅｇｏ，Ｊ．−Ｃ．，Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｎｔｉ−ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４：２６８５．
Ｔｅｎｎｏｕｎｅ，Ｎ．，Ｃｈａｎ，Ｐ．，Ｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．，Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｒ．，Ｃｈａｂａｎｅ，Ｙ．Ｎ．，Ａｋｋｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｊａｒｖ，Ａ．，Ｏｕｅｌａａ，Ｗ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｋ．，Ｇｈｏｕｚａｌｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＣｌｐＢ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ［ａｌｐｈａ］−ＭＳＨ，ａｔ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４，ｅ４５８．
Ｔｅｎｎｏｕｎｅ，Ｎ．，Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｒ．，Ｏｕｅｌａａ，Ｗ．，Ｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．，Ｌｕｃａｓ，Ｎ．，Ｂｏｌｅ−Ｆｅｙｓｏｔ，Ｃ．，Ｒｅｇｏ，Ｊ．−Ｃ．ｄ．，Ｄｅｃｈｅｌｏｔｔｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｆｅｔｉｓｓｏｖ，Ｓ．Ｏ．（２０１５）．Ｓｅｘ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ３１，４９８−５０７．
Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｍａｈｏｗａｌｄ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｇｒｉｎｉ，Ｖ．，Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｉ．（２００６）．Ａｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈａｒｖｅｓｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，１０２７−１１３１．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌａａｕｗ，Ａ．Ａ．，Ｋｅｏｇｈ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｎｎｉｎｇ，Ｅ．，Ｔｒｏｗｓｅ，Ｖ．Ｍ．，Ｄｈｉｌｌｏ，Ｗ．Ｓ．，Ｇｈａｔｅｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｆａｒｏｏｑｉ，Ｉ．Ｓ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔａｋｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ＧＬＰ１  ａｎｄ  ＰＹＹ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ２１，１６０２−１６０７．
Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ，Ｍ．，Ａｉｔｋｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｆ．Ａ．，Ｃｕｌｌｅｎｄｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｍｗａｎｇｉ，Ｓ．，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｓ．，Ｓｉｔａｒａｍａｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｒ．，Ｌｅｙ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｅｗｉｒｔｚ，Ａ．Ｔ．（２０１０）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８，２２８−２３１．
Ｗｉｃｋ，Ｌ．Ｍ．，Ｑｕａｄｒｏｎｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｅｇｌｉ，Ｔ．（２００１）．Ｓｈｏｒｔ−ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｅｘｃｅｓｓ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｖｉｃｅ  ｖｅｒｓａ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３，５８８−５９９．
Ｘｕ，Ｂ．，Ｇｏｕｌｄｉｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｚａｎｇ，Ｋ．，Ｃｅｐｏｉ，Ｄ．，Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｔｅｃｏｔｔ，Ｌ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｆ．（２００３）．Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６，７３６−７４２．
Ｙｕｎ，Ａ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｐ．Ｙ．，Ｄｏｕｘ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．（２００６）．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ６６，６６４−６７０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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