(57)【要約】  本発明の目的は、腫瘍細胞を特異的に検出するための検出剤、腫瘍細胞特異的に提示される腫瘍抗原ペプチド、これを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等を提供することにある。  ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、ＨＬＡ結合性を有する、腫瘍抗原ペプチドまたはそのモチーフ置換体により、上記課題が解決された。
2017115798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、ＨＬＡ結合性を有する、腫瘍抗原ペプチドまたはそのモチーフ置換体。
【請求項２】
ＨＬＡが、ＨＬＡ−Ａ２４である、請求項１に記載の腫瘍抗原ペプチドまたはそのモチーフ置換体。
【請求項３】
Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチドであるか、または該ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドである、請求項１または２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項５】
複数のエピトープペプチドが連結されたポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む、遺伝子導入用組成物。
【請求項９】
（Ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドもしくは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、または、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／もしくはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）請求項６に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項７に記載の発現ベクター、
（ｄ）ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｅ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞
のいずれかを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。
【請求項１１】
（Ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドもしくは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／もしくはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、または、
（Ｃ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞
と、末梢血リンパ球とを、in vitroで接触させることを含む、細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）請求項６に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項７に記載の発現ベクター、
（ｄ）ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択されるタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（ｅ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞を特異的に傷害する細胞傷害性Ｔ細胞
のいずれかを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチド、および／または請求項５に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
がんの予防および／または治療剤である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
がんの予防および／または治療用ワクチンである、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
免疫チェックポイント阻害剤とともに用いられる、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドとＨＬＡとを含む、ＨＬＡマルチマー。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＨＬＡマルチマーを含む、診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、Ｔ細胞受容体様抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、キメラ抗原受容体。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴ細胞受容体を含む、人工ＣＴＬ。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体と、リンパ球表面抗原とを特異的に認識する、二重特異性抗体。
【請求項２５】
ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出するための検出剤を含む、腫瘍細胞検出剤。
【請求項２６】
肺、大腸、小腸、脳、心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団において腫瘍細胞を検出するための、請求項２５に記載の腫瘍細胞検出剤。
【請求項２７】
遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、請求項２５または２６に記載の腫瘍細胞検出剤。
【請求項２８】
遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーを含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の腫瘍細胞検出剤。
【請求項２９】
遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応する検出物質を含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の腫瘍細胞検出剤。
【請求項３０】
検出物質が、抗体である、請求項２９に記載の腫瘍細胞検出剤。
【請求項３１】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象患者を選択するための診断薬であって、請求項１８に記載のＨＬＡマルチマー、請求項２０に記載のＴ細胞受容体様抗体および／または請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の腫瘍細胞検出剤を含む、前記診断薬。
【請求項３２】
ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対して相補的なアンチセンス領域および該アンチセンス領域に少なくとも部分的に相補的なセンス領域を含む、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３４】
請求項３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または請求項３３に記載のｓｉＲＮＡ、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
がんの予防および／または治療剤である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞に特異的に発現する遺伝子を利用した腫瘍細胞を検出するための検出剤、がんの予防および／または治療剤として有用な、該遺伝子由来の腫瘍抗原ペプチドおよびそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、外科療法（手術）、放射線療法、および抗がん剤などを用いる化学療法ががんの三大療法といわれてきた。しかしながら、これらの治療法には、病巣の箇所やステージによっては病巣の完全な除去が困難であったり、強い副作用があったりといった問題も多い。実際、これまでに開発された抗がん剤の中には、その治療効果が十分ではないものや、強い副作用を伴うものも多い。【０００３】
かかる欠点の解消のため、近年では異常細胞において特異的にまたは過剰に発現する特定の標的を狙い撃ちにする分子標的治療が盛んに研究されている。そこからさらに進んで、自己免疫系を活性化することで腫瘍細胞を攻撃する免疫療法が注目されている。しかしながら免疫療法は、自己の免疫を活性化するため副作用が少ないものの、高い治療効果を有するものはまだ少なく、さらなる研究が求められている。【０００４】
生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が重要な働きをしている。例えば腫瘍細胞の排除の場合、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ：Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡクラスＩ抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。つまり腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。そして生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡクラスＩ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示に係る複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆるがん免疫療法剤（がんワクチン）として利用することにより、がん患者の体内のがん特異的ＣＴＬを増強させる治療法が開発されつつある。【０００５】
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍細胞において発現するタンパク質が断片化されて提示されたものである。したがって、がん免疫療法の開発においては、腫瘍細胞において発現するタンパク質、とくに正常細胞では発現が観察されないが、腫瘍細胞においては発現が観察される腫瘍抗原タンパク質の探索が重要となる。
腫瘍細胞においては、正常組織では精巣以外に発現が観察されないタンパク質がいくつも発現していることが知られており、「がん精巣抗原（ＣＴ抗原）」と呼ばれている。ＣＴ抗原は主に精巣でしか発現していないため、これを標的とした免疫療法では正常細胞が標的となることがなく、したがってがん免疫療法の好適な標的として探索が進められており、これまでにＳＯＸ２、ＯＲ７Ｃ１、ＤＮＡＪＢ８などといったタンパク質ががん精巣抗原として報告されている。また、がん精巣抗原は、いわゆるがん幹細胞／がん起始細胞（ＣＳＣ／ＣＩＣ）と呼ばれる高い増殖能を有するがん細胞において特に強く発現していることが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０２６８号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１６４９３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、腫瘍細胞を特異的に検出するための検出剤、腫瘍細胞特異的に提示される腫瘍抗原ペプチド、これを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
腫瘍細胞に特異的に抗原提示されるペプチドを探索する中で、腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質の配列中にＨＬＡと結合すると予測されるエピトープ領域が複数存在したとしても、当該タンパク質のどの部分が実際に生体内でＨＬＡと結合して細胞表面に抗原提示され得るか同定することは容易ではない。そこで、本発明者らはかかる課題を解決するため、実際に腫瘍細胞に抗原提示されているペプチド（ナチュラルペプチド）を直接同定する方法を開発し、多数のナチュラルペプチドを同定した。そしてかかるペプチドのうちのいくつかが、正常細胞においては精巣以外の組織でほとんど発現していないタンパク質由来のペプチドであることを見出し、さらに鋭意研究を続け、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、ＨＬＡ結合性を有する、腫瘍抗原ペプチドまたはそのモチーフ置換体。
［２］ＨＬＡが、ＨＬＡ−Ａ２４である、［１］の腫瘍抗原ペプチドまたはそのモチーフ置換体。
［３］Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチドであるか、または該ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドである、［１］または［２］の腫瘍抗原ペプチド。【００１０】
［４］配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５で表される、［１］〜［３］の腫瘍抗原ペプチド。
［５］複数のエピトープペプチドが連結されたポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、［１］〜［４］の腫瘍抗原ペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
［６］［１］〜［４］の腫瘍抗原ペプチドまたは［５］に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。【００１１】
［７］［６］のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［８］［７］の発現ベクターを含む、遺伝子導入用組成物。
［９］（Ａ）［１］〜［４］の腫瘍抗原ペプチドもしくは［５］のポリエピトープペプチド、または、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／もしくはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。【００１２】
［１０］  以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）［１］〜［４］の抗原ペプチドまたは［５］のポリエピトープペプチド、
（ｂ）［１］のポリヌクレオチド、
（ｃ）［１］の発現ベクター、
（ｄ）ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
（ｅ）［１］〜［４］の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞
のいずれかを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導剤。【００１３】
［１１］  （Ａ）［１］〜［４］の腫瘍抗原ペプチドもしくは［５］のポリエピトープペプチド、
（Ｂ）前記（Ａ）のペプチドおよび／もしくはポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、または、
（Ｃ）［１］〜［４］の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞
と、末梢血リンパ球とを、in vitroで接触させることを含む、細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法。【００１４】
［１２］以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）［１］〜［４］の抗原ペプチドまたは［５］のポリエピトープペプチド、
（ｂ）［６］のポリヌクレオチド、
（ｃ）［７］の発現ベクター、
（ｄ）ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択されるタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（ｅ）［１］〜［４］の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞を特異的に傷害する細胞傷害性Ｔ細胞
のいずれかを有効成分として含む、医薬組成物。【００１５】
［１３］［１］〜［４］の抗原ペプチド、および／または［５］のポリエピトープペプチドを有効成分として含む、［１２］の医薬組成物。
［１４］アジュバントをさらに含む、［１２］または［１３］の医薬組成物。
［１５］がんの予防および／または治療剤である、［１２］〜［１４］の医薬組成物。
［１６］がんの予防および／または治療用ワクチンである、［１２］〜［１５］の医薬組成物。【００１６】
［１７］免疫チェックポイント阻害剤とともに用いられる、［１２］〜［１６］の医薬組成物。
［１８］［１］〜［４］の抗原ペプチドとＨＬＡとを含む、ＨＬＡマルチマー。
［１９］［１８］のＨＬＡマルチマーを含む、診断薬。
［２０］［１］〜［４］の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、Ｔ細胞受容体様抗体。
［２１］［２０］のＴ細胞受容体様抗体を含有する腫瘍検出剤。【００１７】
［２２］［１］〜［４］の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識する、キメラ抗原受容体。
［２３］［１］〜［４］の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴ細胞受容体を含む、人工ＣＴＬ。
［２４］［１］〜［４］の抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体と、リンパ球表面抗原とを特異的に認識する、二重特異性抗体。
［２５］ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出するための検出剤を含む、腫瘍細胞検出剤。【００１８】
［２６］肺、大腸、小腸、脳、心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団において腫瘍細胞を検出するための、［２５］の腫瘍細胞検出剤。
［２７］遺伝子の発現産物が、ｍＲＮＡおよび／または内在性ポリペプチドである、［２５］または［２６］の腫瘍細胞検出剤。
［２８］遺伝子の発現産物がｍＲＮＡであり、前記遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーを含む、［２５］〜［２７］の腫瘍細胞検出剤。
［２９］遺伝子の発現産物が内在性ポリペプチドであり、該内在性ポリペプチドと特異的に反応する検出物質を含む、［２５］〜［２８］の腫瘍細胞検出剤。【００１９】
［３０］検出物質が、抗体である、［２９］の腫瘍細胞検出剤。
［３１］［１２］〜［１７］の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象患者を選択するための診断薬であって、［１８］のＨＬＡマルチマー、［２０］のＴ細胞受容体様抗体および／または［２５］〜［３０］の腫瘍細胞検出剤を含む、前記診断薬。
［３２］ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［３３］ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対して相補的なアンチセンス領域および該アンチセンス領域に少なくとも部分的に相補的なセンス領域を含む、ｓｉＲＮＡ。【００２０】
［３４］［３２］のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または［３３］のｓｉＲＮＡ、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
［３５］がんの予防および／または治療剤である、［３４］の医薬組成物。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、腫瘍細胞を特異的に攻撃するＣＴＬの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、がん細胞株ＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５／β２ｍ、Ｃｏｌｏ３２０、ＬＨＫ２およびＳｑ−１におけるＨＬＡ−Ａ２４分子の局在を示す。ＨＣＴ−１１６以外の細胞株において、コントロールよりも多くのＨＬＡ−Ａ２４分子が細胞表面に存在していることがわかる。この結果は、これらの細胞がＨＬＡ−Ａ２４分子と複合体化したナチュラルペプチドを多く抗原提示していることを示唆する。
【図２】図２は各細胞株において細胞表面に抗原提示されたナチュラルペプチドの分布を示す。図２−１は大腸がん細胞株、図２−２は肺がん細胞株のものを示し、いずれの図においてもＡはナチュラルペプチドが有する各アミノ酸長での存在割合を、Ｂは９アミノ酸長および１０アミノ酸長のペプチドにおける各アミノ酸位置でのアミノ酸の存在比率を表す。
【００２３】
【図３】図３は、ランダムに選択した２６個のナチュラルペプチドの結合アッセイの結果から調査したNetMHCスコアとΔＭＦＩとの相関関係を表すグラフである。縦軸がΔＭＦＩを表し、横軸がNetMHCスコアを表す。NetMHCスコアが０．１２よりも小さい群は１つを除いてすべてΔＭＦＩが１０より小さくなり、NetMHCスコアが０．１８よりも大きい群は２つを除いてΔＭＦＩが約４０以上となった。この結果から、あるペプチドのNetMHCスコアが０．１５より大きい（ΔＭＦＩが１７より大きい）場合に、当該ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドであると推測した。
【図４】図４は、ＰＶＴ１およびＰＶＴ１由来のナチュラルペプチド（配列番号１）の評価結果を表す。Ａは、ナチュラルペプチドのＭＳ／ＭＳの結果を表す。Ｂは、ナチュラルペプチドの結合アッセイの結果を表す。Ｃは、ＰＶＴ１の各正常組織における発現を表す。Ｄは、ＰＶＴ１の各種がん細胞における発現を表す。
【図５】図５は、ＳＵＶ３９Ｈ２およびＳＵＶ３９Ｈ２由来のナチュラルペプチド（配列番号２）の評価結果を表す。Ａは、ナチュラルペプチドのＭＳ／ＭＳの結果を表す。Ｂは、ナチュラルペプチドの結合アッセイの結果を表す。Ｃは、ＳＵＶ３９Ｈ２の各正常組織における発現を表す。Ｄは、ＳＵＶ３９Ｈ２の各種がん細胞における発現を表す。
【００２４】
【図６】図６は、ＺＮＦ７２４ＰおよびＺＮＦ７２４Ｐ由来のナチュラルペプチド（配列番号３）の評価結果を表す。Ａは、ナチュラルペプチドのＭＳ／ＭＳの結果を表す。Ｂは、ナチュラルペプチドの結合アッセイの結果を表す。Ｃは、ＺＮＦ７２４Ｐの各正常組織における発現を表す。Ｄは、ＺＮＦ７２４Ｐの各種がん細胞における発現を表す。
【図７】図７は、ＳＮＲＮＰ４０およびＳＮＲＮＰ４０由来のナチュラルペプチド（配列番号４）の評価結果を表す。Ａは、ナチュラルペプチドのＭＳ／ＭＳの結果を表す。Ｂは、ＳＮＲＮＰ４０の各正常組織における発現を表す。Ｃは、ＳＮＲＮＰ４０の各種がん細胞における発現を表す。
【図８】図８は、ＤＹＲＫ４およびＤＹＲＫ４由来のナチュラルペプチド（配列番号５）の評価結果を表す。Ａは、ナチュラルペプチドのＭＳ／ＭＳの結果を表すＢは、ＤＹＲＫ４の各正常組織における発現を表す。Ｃは、ＤＹＲＫ４の各種がん細胞における発現を表す。
【００２５】
【図９】図９は、各ＣＴＬクローンの性質を、ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬を用いて解析した結果を表すドットプロットである。いずれも縦軸はナチュラル抗原ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬の蛍光強度であり、横軸は、ＡおよびＢの左図がＣＤ８、Ｂの右図がＨＩＶ／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬の蛍光強度を表す。Ａはナチュラル抗原ペプチドとしてＨＦ１０を用いたものであり、Ｂはナチュラル抗原ペプチドとしてＲＦ８を用いたものである。本願実施例の例５（１）に記載の方法により、いずれのナチュラル抗原ペプチドを用いた場合も複数のＣＴＬクローンが誘導されたが、ＡはそのうちＨＦ１０で誘導されたクローンＡ１０、Ｅ１０およびＨ３を、ＢはＲＦ８で誘導されたクローン１１の結果を示すものである。
【００２６】
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す図である。Ａは、ナチュラル抗原ペプチドとしてＨＦ１０を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表し、左側６段がクローンＡ１０、中央６段がＥ１０、右側６段がクローンＨ３をそれぞれＣＴＬとして用いた場合の結果を表す。Ｂは、ナチュラル抗原ペプチドとしてＲＦ８、ＣＴＬとしてクローン１１を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表し、グラフは、縦軸が１ウェルあたりのＩＦＮ−γが検出されたスポットの数、横軸がターゲット細胞を表す。またグラフの下の写真図は、各細胞に対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより得られた実際のスポットを表す写真である。
【図１１】図１１は、クローン１１を用いたＬＤＨキリングアッセイの結果を表すグラフである。Ａは各ペプチドでパルスしたＴ２−Ａ２４細胞を標的細胞として用いた場合の結果を、Ｂは各種がん細胞株を標的細胞として用いた場合の結果をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下本発明について詳細に説明する。
本発明において「エピトープペプチド」とは、ＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）と結合して、細胞表面に抗原提示され、かつ抗原性を有する（Ｔ細胞に認識され得る）ペプチドを意味する。エピトープペプチドには、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、およびＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
【００２８】
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
【００２９】
ＭＨＣと結合するペプチドの多くは、一定の特徴を有していることが知られている。本発明においては、この特徴を「結合モチーフ」という。いかなるＭＨＣがいかなる結合モチーフを有するペプチドと結合するかは、当該技術分野において知られている。例えば、ヒトＭＨＣの一種であるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、かつＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンである。
【００３０】
本明細書において「モチーフ置換体」とは、ある結合モチーフを有するペプチドにおいて、当該結合モチーフを別の結合モチーフに置換したものをいう。当業者であれば、本発明においてモチーフ置換体も置換前のペプチドと同等の効果を奏することを当然に理解するものである。
本発明において、「腫瘍(tumor)」は、良性腫瘍および悪性腫瘍（がん、悪性新生物）を含む。がん(cancer)は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍（癌、carcinoma）と非上皮性の悪性腫瘍（肉腫、sarcoma）とを含む。
【００３１】
本発明では、実際に細胞表面に抗原提示されているナチュラルペプチドを単離／同定することができる下記実施例等に記載の方法を用いることによって、本発明のナチュラルペプチドを単離／同定した。なお、本発明において、「ナチュラルペプチド」とは、実際に細胞表面に抗原提示されているペプチドのことをいう。また「ナチュラル抗原ペプチド」とは、ナチュラルペプチドのうち抗原性が確認できたものをいう。このナチュラル抗原ペプチドをがん細胞から単離し、配列およびその由来を決定することにより、ＣＴＬを用いたがんの標的治療に有用な知見を得ることが可能である。
【００３２】
本発明で用いたナチュラルペプチドの単離／同定方法には、ナチュラルペプチドを提示しているがん幹細胞を溶解し、その溶解物（ライセート）からＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を単離する工程、単離した複合体をＭＨＣ分子とナチュラルペプチドに分離してナチュラルペプチドを単離する工程、単離したナチュラルペプチドを同定する工程が含まれる。
【００３３】
下記実施例においては、ＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体の単離には、ＭＨＣに対する特異抗体を用いた免疫沈降法によるペプチド／ＭＨＣ複合体の抽出法を採用したが、ライセートと、ＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体とを単離することができる方法であればいかなる方法を用いてもよい。
下記実施例においては、適切な抗ＭＨＣ抗体として、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体などの、ＨＬＡクラスＩに対する抗体を使用したが、ＭＨＣとナチュラルペプチドとの複合体を特異的に認識できる抗体であればいかなる抗体を用いてもよい。
【００３４】
下記実施例においては、複合体をＭＨＣ分子とナチュラルペプチドとに分離する工程として弱酸を用いたペプチド単離を行ったが、ＭＨＣとナチュラルペプチドとを分離できる方法であればいかなる方法を用いてもよい。
さらに下記実施例においては、上記単離ナチュラルペプチドの配列を液体クロマトグラフィーとタンデムマススペクトロメトリーとを組み合わせたペプチド配列解析法を用いて解析し、実際に細胞表面に抗原提示されているナチュラルペプチドを同定したが、ペプチドの配列を同定可能な方法であれば、いかなる方法を用いて同定してもよい。
【００３５】
本発明者らは、ヒトがん細胞において抗原提示されているナチュラル抗原ペプチドを解析した。その結果、がん細胞において抗原提示されているナチュラルペプチドとして、３８３種のペプチドが同定された。かかる３８３種のペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４結合性の高いことが見出されたペプチドが由来する２７３種の遺伝子について正常組織における発現を調べたところ、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４の５種の遺伝子が、正常組織では精巣のみに発現が見られる、いわゆるがん精巣抗原であることがわかった。
【００３６】
ＰＶＴ１（Plasmacytoma variant translocation 1）は、癌原遺伝子として知られるＭＹＣと同じ染色体上に存在するノンコーディングＲＮＡであり、ＭＹＣアクチベーターとして機能すると考えられている。また、ＭＹＣのコピー数増加が観察される多数の癌において、同様にコピー数が増加していることが報告されており、ＰＶＴ１遺伝子の転写量の増加が細胞増殖および癌化に関与していることが示唆されている。しかしながら上述のとおりＰＶＴ１はノンコーディングＲＮＡであると考えられていたところ、本発明者らにより初めて、がん細胞においてＰＶＴ１がコードすると予測されるタンパク質の部分ペプチドが抗原提示されていることが見いだされたのであり、これは少なくともがん細胞においてＰＶＴ１がタンパク質として発現している可能性を示唆する驚くべきものである。
【００３７】
ＳＵＶ３９Ｈ２（Suppressor of variegation 3-9 homolog 2 (Drosophila)）はヒストンＨ３のＬｙｓ−９を特異的にトリメチル化する転移酵素であるヒストン−リシン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ヒストンＨ３のトリメチル化により、エピジェネティックな転写抑制が起こると考えられており、とくにＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質は、哺乳動物の細胞においてテロメア長のエピジェネティックな制御に関与していることが報告されている。またがん細胞においては、肺がん、肝細胞がん、前立腺がんなどで高発現していることが報告されている。また、初期の未分化ヒト胚性幹細胞において発現しており、分化の進行と共に発現が漸次抑制され、その後また未分化細胞と同レベルまで回復することが報告されている。さらには、がん細胞においてＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するとがん細胞のコロニー形成能が上昇し、ＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがん細胞においてＳＵＶ３９Ｈ２をノックダウンすると細胞増殖が抑えられることも報告されている（特許文献２）。
【００３８】
ＺＮＦ７２４Ｐ（zinc finger protein 724, pseudogene）は、ジンクフィンガータンパク質の一種をコードする遺伝子であると推定されるが、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質の機能についての報告はない。構造的特徴に鑑みると、ＫＲＡＢを有するＣ２Ｈ２型の古典的ジンクフィンガータンパク質であることから、ＤＮＡと相互作用することで転写制御に関与することが推測される。また、腫瘍形成や幹細胞性への関与については報告されていない。
【００３９】
ＳＮＲＮＰ４０（U5 small nuclear ribonucleoprotein 40 kDa protein）は、スプライソソームを構成する核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）のうち、Ｕ５  ｓｎＲＮＰを構成するタンパク質をコードする遺伝子である。したがってＳＮＲＮＰ４０タンパク質はｍＲＮＡのスプライシングに関与することが推測される。また、腫瘍形成や幹細胞性への関与については報告されていない。
【００４０】
ＤＹＲＫ４（Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 4）は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼの一種をコードする遺伝子である。ＤＹＲＫ４が属する二重特異性キナーゼファミリーは、細胞の分化および増殖の制御、生存ならびに発生において機能すると考えられている。ＤＹＲＫ４には複数のスプライスバリアントを含む複数のアイソフォームが存在することがわかっている。また、腫瘍形成や幹細胞性への関与については報告されていない。
【００４１】
＜１＞本発明の遺伝子発現産物
本発明において、例えば「ＰＶＴ１」など、単に遺伝子名で表記している場合、別段の記載のない限り当該遺伝子名で表される公知の核酸配列を有する遺伝子を意味し、典型的にはｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を表すが、当業者が当該遺伝子の配列として認識し得る限りこれに限定されず、たとえば。本発明における好ましい遺伝子およびその核酸配列の例としては、下記の配列で表される下記の遺伝子が挙げられる。
ＰＶＴ１：GenBank Accession No. NR_003367
ＳＵＶ３９Ｈ２：GenBank Accession No. NM_001193424.1およびNM_001193425
ＺＮＦ７２４Ｐ：GenBank Accession No. NR_045525.1
ＳＮＲＮＰ４０：GenBank Accession No. NM_004814.2
ＤＹＲＫ４：GenBank Accession No. NM_001282285.1、NM_001282286.1、NM_003845.2およびNR_104115.1
したがって本発明の遺伝子発現産物としてのｍＲＮＡを、単に遺伝子名の記載により表す場合がある。
【００４２】
本発明において、「ＰＶＴ１タンパク質」など、遺伝子名に「タンパク質」と付記して表す場合、当該遺伝子によりコードされるタンパク質、そのアイソフォーム、およびそのホモログのことを意味する。当該アイソフォームとしては、例えばスプライシングバリアント、個体差に基づくＳＮＰ等のバリアント等が挙げられる。具体的には、（１）当該遺伝子によりコードされるタンパク質において、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、１または複数、好ましくは１〜数個、さらに好ましくは、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００４３】
本発明の遺伝子発現産物として好ましいタンパク質は、上述の遺伝子（核酸配列）によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記タンパク質において、１〜３個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。さらに好ましくは上述の遺伝子（核酸配列）によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。
【００４４】
＜２＞本発明のペプチド
本発明のペプチドは、一態様において、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質の部分ペプチドであって、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するペプチド、好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されてＣＴＬを誘導可能なペプチドを含む。ＨＬＡにはいくつかの型が存在するが、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡクラスＩに結合可能であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２４に結合可能である。本発明のペプチドは、ＭＨＣに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のペプチドに含まれる。したがって、本発明のペプチドは、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約８〜１４アミノ酸程度が好ましく、約８〜１１アミノ酸程度がより好ましく、約９〜約１１アミノ酸程度が特に好ましい。
【００４５】
ヒトのＭＨＣクラスＩであるＨＬＡクラスＩと結合するエピトープペプチドは、約８〜１４アミノ酸長、好ましくは約９〜１１アミノ酸長であり、その配列中に結合するＨＬＡ特有の結合モチーフを有することが知られている。例えばＨＬＡ−Ａ０２と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるという結合モチーフを有し、ＨＬＡ−Ａ２４と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／またはＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるという結合モチーフを有する。
【００４６】
したがって本発明のペプチドは、好ましい一態様において、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質の部分ペプチドであって、該タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８〜１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであるペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるエピトープペプチドである。
【００４７】
また、別の好ましい一態様において、前記部分ペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているペプチドであるエピトープペプチドを含み、より好ましくは該エピトープペプチドそのものである。中でも特に好ましいのは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンに置換されており、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンに置換されているエピトープペプチドである。
【００４８】
本発明のペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端が修飾されていてもよい。当該修飾として具体的には、Ｎ−アルカノイル化（例えば、アセチル化）、Ｎ−アルキル化（例えば、メチル化）、Ｃ末端アルキルエステル（例えば、エチルエステル）、およびＣ末端アミド（例えばカルボキサミド）等が挙げられる。
本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。かかる既知の方法としては文献（Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966； The Proteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。
【００４９】
本発明のペプチドは、後述するＣＴＬ誘導方法や、ヒトモデル動物を用いたアッセイ（国際公開第０２／４７４７４号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）等に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
【００５０】
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを少なくとも１つ含む複数のエピトープペプチドを連結したペプチド（ポリエピトープペプチド）も含まれる。したがって、該ポリエピトープペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
本発明のポリエピトープペプチドは、具体的には、
（ｉ）本発明のペプチド（エピトープペプチド）および任意の本発明のペプチド以外の１または２以上のＣＴＬエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、
（ｉｉ）本発明のペプチドおよび任意の１または２以上のヘルパーエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、若しくは、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）に記載のポリエピトープペプチドに、さらに１または２以上ヘルパーエピトープペプチドを、直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド
であって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じたエピトープペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義され得る。
【００５１】
ここで、（ｉ）における本発明のペプチド以外のＣＴＬエピトープペプチドとしては特に限定はないが、具体的には、例えばヒトＡＳＢ４由来のエピトープペプチド、ヒトＯＲ７Ｃ１、ヒトＤＮＡＪＢ８由来のエピトープペプチド（例えば、国際公開第２０１０／０５０１９０号に記載されたペプチド）、ヒトＦＡＭ８３Ｂ由来のエピトープペプチド（国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７６６２５号）などが挙げられる。
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセッシングに悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、好ましくはそれぞれのエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えばいくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基およびカルボキシル基を有するリンカーなどが挙げられる。具体的にはグリシンリンカーやＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーなどが挙げられ、グリシンリンカーとしてはポリグリシン（例えばグリシン６個からなるペプチド；Cancer Sci, vol.103, p150-153）が挙げられ、ＰＥＧリンカーとしては、ＰＥＧの両端にアミノ基およびカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる（例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ；Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556）。
【００５２】
本発明のポリエピトープペプチドに含まれる本発明のエピトープペプチドは、１種または２種以上が選択されてよい。すなわち、同一のエピトープペプチドが複数個連結されていてもよいし、複数の異なるエピトープペプチドが連結されたものであってもよい。当然ながら、２種以上のエピトープペプチドが選択される場合であっても、選択されたエピトープペプチドのうちの１種または２種以上が複数個連結されてもよい。本発明のペプチド以外のエピトープペプチドについても、同様に複数種および／または複数個のエピトープペプチドが連結されてよい。本発明のポリエピトープペプチドは、２〜１２個のエピトープペプチドが連結されたものであってよく、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個のエピトープペプチドが連結されており、最も好ましくは２個のエピトープペプチドが連結されている。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープペプチドがヘルパーエピトープペプチドの場合、用いられるヘルパーエピトープペプチドとしては、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープペプチドの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
【００５３】
このような複数のエピトープペプチドを連結させたペプチド（ポリエピトープペプチド）もまた、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)）に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００５４】
以上のようにして製造された複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、国際公開第０２／４７４７４号およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりＣＴＬ誘導活性を確認することができる。
本発明のペプチド（ポリエピトープペプチドを含む）は、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のペプチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のペプチドの使用にも関する。
【００５５】
＜３＞本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のペプチドを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また１本鎖、２本鎖のいずれの形態であってもよい。具体的には、これに限定するものではないが例えば、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質の部分ペプチドであって、ＭＨＣとペプチドの結合予測プログラムであるＢＩＭＡＳ（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de/）およびＩＥＤＢ（MHC-I processing predictions；http://www.iedb.org/）などを用いて結合性を有することが予測されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。別の具体的な態様としては、配列番号１〜５に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号１〜５から選択される任意の２以上のペプチド、または配列番号１〜５から選択されるペプチドおよびヘルパーエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明のポリヌクレオチドの範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
【００５７】
本発明で用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて様々なものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。本発明で用い得る発現ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００５８】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていてもよい。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパク質ベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００５９】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。したがって、本発明には、前記発現ベクターを含む遺伝子導入用組成物が包含される。
形質転換に用いられる宿主としては、本発明のポリペプチドが有する機能を損なわない限りいかなる細胞を用いてもよく、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いればよい。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００６０】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００６１】
＜４＞本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物
本発明のペプチドはＣＴＬ誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、ＣＴＬ誘導剤となり得る。また上述のとおり、本発明者らによりＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質が腫瘍抗原であること、該タンパク質由来のペプチドが腫瘍細胞表面にＨＬＡクラスＩ抗原と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示されていることが初めて見出された。したがって、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質そのものもまたＣＴＬ誘導剤となり得る。
【００６２】
すなわち、ＨＬＡ−Ａ２４抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる（J.Immunol.,154,p2257,1995）。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定することにより、確認することができる。また５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（５１Ｃｒリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987、N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、ＣＴＬクローンを樹立することもできる。
【００６３】
本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質によって誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドならびに／または他のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質由来のエピトープペプチドを抗原として提示する細胞に対する傷害作用やリンフォカインの産生能を有する。本発明のペプチドは上述のとおり腫瘍抗原ペプチドであり、またＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質は細胞内で分解されて腫瘍抗原ペプチドを生じるため、それら機能を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質、ならびにそれにより誘導されたＣＴＬは、がんの予防および／または治療のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４抗原に本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質由来のエピトープペプチドが提示され、ＨＬＡ抗原と提示されたペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および／または治療することができる。したがって、本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防および／または治療のために使用することができる。
【００６４】
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「治療」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
【００６５】
本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、例えばＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患している、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん患者に対して特に有効である。具体的には、例えば、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のがん（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。したがって、本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分として含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。かかる医薬組成物は、好ましくはがんの予防および／または治療用の組成物、すなわちがんの予防および／または治療剤である。また、本発明の医薬組成物は、がん細胞に特異的なＣＴＬを誘導、すなわちがん細胞特異的な細胞性免疫を活性化することによりがんを予防および／または治療するものであるため、好ましくはがんの予防および／または治療用ワクチンである。
【００６６】
本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物は、単一のＣＴＬエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであってもよい。近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、がん抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ１１、−Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、ポリエピトープペプチドが抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。このようにしてがんの治療または予防が促進される。
【００６７】
本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分とする医薬組成物は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、または併用して投与することができる。
【００６８】
アジュバントとしては、文献（例えば、Clin Infect Dis.:S266-70, 2000)に記載のものなど、当該技術分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、例えば、ゲルタイプとして水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなど、菌体タイプとしてＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A；ＭＰＬ）、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチド（Muramyl dipeptide；ＭＤＰ）など、油乳濁液タイプ（エマルション製剤）としてフロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９およびＳＡＦなど、高分子ナノ粒子タイプとして免疫刺激複合体（Immunostimulatory complex；ISCOMs）、リポソーム、生分解性マイクロスフェア（Biodegradable microsphere）およびサポニン由来のＱＳ−２１など、合成タイプとして非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ（Muramyl peptide analogue）、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなど、サイトカインタイプとしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などを挙げることができる。
また、本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質を有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
【００６９】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
本発明のペプチドを実際に医薬として作用させる手法としては、当該ペプチドを直接体内に導入するin vivo法の他に、ヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のペプチドを作用させ、その細胞を体内に戻すex vivo法があり（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）、当業者であれば、かかる手法に適切な細胞、投与方法、投与形態および投与量を選択することができる。
【００７０】
＜５＞本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物
本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質由来の他のエピトープペプチドを抗原として提示し得る細胞となるため、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまたＣＴＬの誘導剤となり得る。誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドならびに／またはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質によって誘導されたＣＴＬと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および／または予防し得るものである。
【００７１】
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の方法によりがん患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原などのＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、がん特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。以上のようにして、がんの治療または予防が達成される。したがって、本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。かかる医薬組成物は、好ましくはがんの予防および／または治療用の組成物、すなわちがんの予防および／または治療剤である。また、本発明の医薬組成物は、がん細胞（好ましくはがん幹細胞）に特異的なＣＴＬを誘導、すなわちがん細胞特異的な細胞性免疫を活性化することによりがんを予防および／または治療するものであるため、好ましくはがんの予防および／または治療用ワクチンである。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤／医薬組成物は、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患した対象に対して使用することができる。ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防または治療のために使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁，月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）のいずれの方法も適用することができる。したがって、本発明の医薬組成物の一態様において、本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが有効成分として含有される。
【００７３】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のポリヌクレオチドを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁，月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。in vivo法がより好ましい。
本発明のポリヌクレオチドならびに／またはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質およびＤＹＲＫ４タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをin vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとり得るが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００７５】
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、ポリヌクレオチドの含量として、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
【００７６】
また近年、複数のＣＴＬエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
したがって、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなＣＴＬの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
【００７７】
また近年、がん細胞が免疫細胞による攻撃を遮蔽することにより、免疫系による排除を回避していること、かかる遮蔽は、もともと自己に対する過剰な免疫反応や正常組織に対する障害を抑えるために備わっている「免疫チェックポイント」と呼ばれるメカニズムを利用していることなどがわかってきた。したがって、がん細胞において免疫チェックポイントの機能を抑制することにより、免疫細胞による攻撃を効果的なものとすることができる。本発明の医薬組成物は、腫瘍特異的な免疫細胞を誘導することにより抗腫瘍効果を発揮するものであるため、免疫チェックポイントの機能を併せて抑制することにより、より高い治療効果を発揮することができる。したがって好ましい一態様において、本発明の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤とともに用いられる。
【００７８】
本発明において、ある剤Ａと別の剤Ｂとを「ともに用いる」または「併用する」という場合、剤Ａが効果を発揮している間に剤Ｂが効果を発揮する状態にすることをいう。したがって、剤Ａの投与と同時に剤Ｂを投与してもよいし、剤Ａの投与後一定の間隔を空けて剤Ｂを投与してもよい。また、剤Ａと剤Ｂとは同一の投与形態であってもよいし、異なる投与形態であってもよい。さらに、剤Ａまたは剤Ｂがその効果を喪失してしまわない限り、剤Ａと剤Ｂとを混合して一つの組成物としてもよい。
【００７９】
本態様における免疫チェックポイント阻害剤としては、本発明の組成物のＣＴＬを誘導する能力を阻害しない限り、免疫チェックポイント阻害剤として公知である任意の剤を用いることができる。免疫チェックポイント阻害剤として知られたものとしては、これに限定するものではないが、例えば抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ５抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体などが挙げられる。
【００８０】
＜６＞本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とをin vitroで接触させることにより、本発明の抗原ペプチドを抗原として提示する抗原提示細胞を作製することができる。したがって本発明の一態様において、細胞表面にＨＬＡ抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。上述のとおり、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドはがんを予防および／または治療するために利用することが可能である。したがって本態様の抗原提示細胞またはその製造方法は、好ましくはがん患者由来の単離された細胞を利用するものである。具体的には、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にＨＬＡ抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞を製造する。
【００８１】
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれであってもよい。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをin vitroでパルスして、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998、J. Immunol., 158, p1796, 1997、Cancer Res., 59, p1184, 1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００８２】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であってもよい。具体的には、ＤＮＡの場合はCancer Res.,56:p5672,1996やJ.Immunol.,161: p5607,1998（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合はJ.Exp.Med., 184: p465,1996（本文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができる。
【００８３】
前記抗原提示細胞はＣＴＬの誘導剤および／または医薬組成物の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤および／または医薬組成物は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤および／または医薬組成物を患者の体内に戻すことにより、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患している患者の体内で、本発明のペプチドを抗原提示するがん細胞に特異的なＣＴＬが効率良く誘導され、結果として本発明のペプチドを抗原提示するＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを予防および／または治療することができる。
【００８４】
＜７＞本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、ＣＴＬを誘導することができる。したがって本発明の一態様において、本発明のペプチドを抗原提示する細胞を特異的に傷害するＣＴＬおよびその誘導方法を提供するものである。上述のとおり、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドはがんを予防および／または治療するために利用することが可能である。したがって本態様のＣＴＬおよびその誘導方法には、好ましくは癌患者由来の末梢血リンパ球を利用するものである。具体的には、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、本発明のペプチドを抗原提示する細胞を特異的に傷害するＣＴＬを誘導する。
【００８５】
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をin vitroで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２により刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997）。これは、抗原提示細胞のＭＨＣと腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。したがって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００８６】
当該ＣＴＬは、がんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなＣＴＬを有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患した患者の体内でＣＴＬによるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
【００８７】
本発明のＣＴＬは、腫瘍細胞に抗原提示されている本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を標的として細胞傷害活性を発揮することができる。すなわち本発明のＣＴＬのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するものである。近年、ＣＴＬに発現する特定のペプチド−ＨＬＡ複合体を認識するＴＣＲ遺伝子をクローニングし、当該ＴＣＲ遺伝子をがん患者より採取したＣＤ８＋Ｔ細胞に遺伝子導入して人工的にＣＴＬを作製し、大量に培養した後、患者体内に戻す養子免疫療法が考案されている（例えばOchi et al., Blood. 2011 Aug 11;118(6):1495-503など）。本発明において、「人工ＣＴＬ」という場合、前述のようにペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を、Ｔ細胞に遺伝子導入して作製されたＣＴＬを意味し、これもまた上述の天然のＣＴＬと同様にがんの治療に用いることができるものである。したがってかかる人工ＣＴＬもまた、本発明のＣＴＬに包含される。かかる態様において、人工ＣＴＬに遺伝子導入される、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲは、該複合体に対する結合親和性や細胞傷害活性を上げるために、適宜改変されてもよい。したがって、「人工ＣＴＬ」には、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を、適宜遺伝子改変したのち患者由来のＴ細胞に遺伝子導入して作製されたＣＴＬも包含される。人工ＣＴＬの作製には、当該技術分野において知られた方法を用いることができる。
【００８８】
＜８＞本発明のペプチドを用いた腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤
本発明のペプチドは、腫瘍特異的ＣＴＬに認識され得るため、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤の成分として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを含む、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤に関する。一態様において、本発明の腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマー（モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーおよびデキストラマー）を含む。
【００８９】
例えば、ＨＬＡテトラマーとは、ＨＬＡのα鎖とβ２ミクログロブリンをペプチド（エピトープペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡテトラマーが市販されており（例えば（株）医学生物学研究所より）、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる。また、ＨＬＡダイマーおよびＨＬＡペンタマーも同様な原理に基づいており、これらにおいては、それぞれ、前記ＨＬＡモノマーが２量体化および５量体化されている。したがって、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマーもまた、本発明の一態様である。
【００９０】
具体的には、例えば配列番号１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーが挙げられる。当該ＨＬＡテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の既知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することができるように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）などにより標識されたＨＬＡテトラマーが挙げられる。
【００９１】
ＨＬＡテトラマーの製法例としては、例えば、Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)などの文献に記載のものが挙げられ、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４のα鎖発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４と本発明のペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ２４のα鎖のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
【００９２】
＜９＞腫瘍細胞検出剤
上述のとおり、本発明者らはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子が腫瘍細胞において特異的に高発現しているがん精巣抗原であることを見出した。すなわち本発明者らにより、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子は、精巣を除く通常の体細胞においては発現が見られないが、腫瘍細胞においては高発現している遺伝子であることが明らかとなった。かかる知見からＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子は、腫瘍細胞、特にがん細胞を識別するためのマーカーとして利用可能であることが見出された。したがって本発明は一側面において、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出するための検出剤を含む、腫瘍細胞検出剤に関する。
【００９３】
本発明において、単にＰＶＴ１などという場合、別段の記載のない限りＰＶＴ１遺伝子などを意味する。好ましくはヒトの遺伝子であるが、そのホモログであってもよい。
本発明において「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とする一連の生体反応をいい、「発現産物」とは、例えばｍＲＮＡや内在性ポリペプチドなど、この一連の生体反応によって生成される分子をいう。遺伝子の発現産物である内在性ポリペプチドは、好ましくは当該遺伝子の発現により最終的に産生されるタンパク質である。
本発明において「遺伝子の発現産物の検出剤」とは、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物を、定性的および／または定量的に検出するための剤を意味する。
【００９４】
本発明の腫瘍細胞検出剤は、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物を検出するための検出剤を含む。検出対象においてＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物が検出された場合、検出対象が腫瘍細胞を有する、すなわち腫瘍細胞が検出されたと決定できる。本発明の腫瘍細胞検出剤は、in vivoでもin vitroでも用いることが可能であるが、好ましくは生物個体（検査対象）から採取された生体試料由来の細胞集団（検出対象）に対してin vitroで用いる。この場合、検出対象である生体試料由来の細胞集団において腫瘍細胞が検出されたことは、すなわち検査対象である生体試料が採取された生物個体においても腫瘍細胞が検出された、すなわち該生物個体が腫瘍細胞を有することを意味する。したがって、後述するように、本発明の腫瘍細胞検出剤を使用して、検査対象において腫瘍細胞を検出する方法、すなわち検査対象が腫瘍を有しているかを検査する方法も本発明に包含される。
検査対象である生物個体は、腫瘍を有し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。
検出対象の細胞集団は、上記検査対象から得られた任意の生体試料由来の細胞集団に対して用いることが可能であるが、好ましくはヒトから得られた生体試料に由来する細胞集団であり、より好ましくは組織の細胞においてＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子がほとんど発現していないことが確認されている精巣以外の組織、例えば心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸および血液からなる群から選択される１または２以上の生体試料に由来する細胞を含む細胞集団である。
【００９５】
本発明の腫瘍細胞検出剤に含まれる、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物の検出剤は、検出する発現産物に依拠して変化し得、当業者であれば適宜最適なものを選択し得る。具体的には、例えば発現産物がｍＲＮＡである場合、当該技術分野において公知である任意のｍＲＮＡ検出法を用いることができ、これに限定するものではないが、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、ノーザンブロッティング法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられ、中でも検出感度の高さ、実験手技の簡便さなどから、ＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。例えば発現産物が内在性ポリペプチド（好ましくはＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質および／またはＤＹＲＫ４タンパク質）である場合は、これに限定するものではないが、例えばウェスタンブロッティング法、免役組織染色法などが挙げられる。用いるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現産物の検出剤は、検出する発現産物や採用する検出法に依存して変化し得、当業者は適宜最適なものを選択し得る。
【００９６】
具体的には、例えば内在性ポリペプチドを検出する場合はＰＶＴ１タンパク質、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質、ＺＮＦ７２４Ｐタンパク質、ＳＮＲＮＰ４０タンパク質および／またはＤＹＲＫ４タンパク質に対する特異抗体（好ましくはモノクローナル抗体）など、ｍＲＮＡを検出する場合はＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーなどが挙げられるが、これに限定するものではない。また検出する発現産物は、単一の発現産物であっても複数の発現産物を組み合わせて用いてもよい。
【００９７】
＜１０＞本発明のペプチドを認識する抗体
上述のとおり本発明のペプチドは、腫瘍細胞によりＣＴＬエピトープペプチドとして抗原提示される。この際、ＭＨＣと複合体を形成して細胞表面に提示されるため、本発明のペプチドや該ペプチドとＭＨＣとの複合体を認識する抗体を用いることで、本発明のペプチドを腫瘍マーカーとして利用できる。このような抗体としては、例えば、本発明のペプチドを特異的に認識する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）や、本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４との複合体を認識するＴＣＲ（Ｔ細胞抗原受容体）様抗体などが挙げられる。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドや該ペプチドとＭＨＣとの複合体を認識する抗体、とくにモノクローナル抗体やＴ細胞抗原受容体様抗体にも関する。
本発明において「ＴＣＲ様抗体」は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）分子との複合体（ｐＭＨＣ）に対してＴＣＲ様の結合力（抗原認識能）を有する分子である。例えば、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で報告されているように、腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＴＣＲ様抗体は、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができる。
【００９８】
前記ＴＣＲ様抗体は、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で記載されている方法で作製することができる。例えば、ＭＨＣとペプチド複合体をマウス等の動物に免疫することにより複合体特異的な抗体を取得できる。また、ファージディスプレイ法を利用して複合体特異的抗体を取得することも可能である。
【００９９】
上述のとおり、本発明のペプチドおよび／または該ペプチドを提示するＭＨＣ複合体を認識することにより、本発明のペプチドを含む該ＭＨＣ複合体を細胞表面に提示する腫瘍細胞を検出することが可能である。したがって本発明は、上記ＴＣＲ様抗体を含む腫瘍検出剤にも関する。また本発明のペプチドは、腫瘍細胞の他、抗原提示細胞、特に樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にも同様に提示されるため、上記ＴＣＲ様抗体は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞等の検出にも有用である。
なお、本発明において「抗体」といった場合、免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙおよびｓｃ（Ｆｖ）２などの、抗体の機能的断片も含まれる。また、これら機能的断片の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の抗体に含まれる。
【０１００】
また上述のとおり本発明のペプチドは、腫瘍細胞によりＣＴＬエピトープペプチドとして提示されるため、本発明のペプチドおよび／または該ペプチドとＨＬＡとの複合体、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４との複合体を認識するＴＣＲ様抗体は、対象において細胞表面に存在する前記複合体と結合することができる。ＴＣＲ様抗体が腫瘍細胞表面に結合すると、該抗体のＦｃ部位にマクロファージやＮＫ細胞などのエフェクター細胞のＦｃ受容体が結合し、該エフェクター細胞が腫瘍細胞を攻撃する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が生じることで腫瘍を処置することができる。したがって上記ＴＣＲ様抗体は、がんの予防および／または治療にも有用である。したがって、本発明はまた、本発明のＴＣＲ様抗体を含む、がんの予防および／または治療剤にも関する。
【０１０１】
また近年では、２つの抗原結合部位がそれぞれ異なる抗原と結合するように改変した二重特異性抗体が開発されている。一方の抗原結合部位でＭＨＣ−抗原ペプチド複合体などのがん細胞表面抗原を認識し、もう一方の抗原結合部位でＣＤ３などのリンパ球表面抗原を認識する二重特異性抗体は、がん細胞の近傍にＣＴＬやエフェクター細胞などのリンパ球表面抗原を有する細胞を拘束、集積化することが可能となる。がん細胞近傍に拘束されたリンパ球は、自身がＡＤＣＣ活性などの抗腫瘍活性を示すだけでなく、サイトカインなどの分泌によりがん細胞周辺のナイーブな免疫細胞を抗腫瘍性に活性化するバイスタンダーな効果を発揮することでがん細胞を攻撃することができる。
【０１０２】
したがって本発明は、本発明のペプチドおよび／または該ペプチドとＨＬＡとの複合体と、リンパ球表面抗原とを特異的に認識する二重特異性抗体も包含する。特異的に認識されるリンパ球表面抗原は、リンパ球の表面に特異的に発現している抗原であれば特に限定されないが、好ましくはＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４などが挙げられる。特にＣＤ３はＣＴＬの細胞傷害活性の誘導に関与している細胞表面抗原であり、ＣＤ３に抗体が結合するとＨＬＡ−がん抗原複合体を認識せずにＨＬＡ非拘束的にＣＴＬが活性化でき、強力な細胞傷害活性を発揮することが期待できるため好ましい。
【０１０３】
さらに、近年、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の一部に遺伝子操作を加えて改変したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を患者由来のＴ細胞に遺伝子導入し、この遺伝子改変Ｔ細胞を体外で増幅培養した後に患者に輸注するという新たな免疫細胞治療法が考案されている（Nat Rev Immunol. 2012;12:269-81）。具体的には、患者から採取された末梢血単核球を抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２等の存在下で培養することによりＴ細胞を活性化したのち、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの形質転換用ベクターを用いてＣＡＲをコードする遺伝子をＴ細胞に導入することにより、遺伝子改変Ｔ細胞を作製する。
本発明において、「キメラ抗原受容体」は、がん細胞の細胞表面に存在する分子を認識する抗体の抗体可変領域の軽鎖と重鎖を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を構成する分子のうちＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つように設計されたキメラタンパク分子である。このキメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ領域で特定の抗原を認識すると、ＣＤ３ζ鎖を介してＴ細胞の活性化が生じる。Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に１または２以上の共刺激分子（例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）を組み込んでもよい。本発明においては、ｓｃＦｖとして、本態様のＴＣＲ様抗体（ＴＣＲ様抗体から設計され得る抗体分子またはその断片を含む）を用いてＣＡＲを作製することができる。腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲは、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができるため、前記ＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞は、人工ＣＴＬと同様に、前記腫瘍抗原に特異的ながんの予防および／または治療剤として有用である。したがって、本発明はまた、本発明の腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞または人工ＣＴＬを含む、がんの予防および／または治療剤にも関する。
【０１０４】
＜１１＞腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）
本発明は、前述した本発明のＣＴＬ検出剤または腫瘍細胞検出剤（腫瘍検出剤）を利用した腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）を提供するものである。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、本発明のＣＴＬ検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【０１０５】
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、もしくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４発現産物の量を、本発明の腫瘍検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、もしくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、本発明の腫瘍検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、乳癌、骨髄腫、口腔癌、膵癌、皮膚癌、前立腺癌等のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【０１０６】
本発明の検出（検査、診断）方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出（検査、診断）することもできる。さらに本発明の検出（検査、診断）方法は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できる治療対象患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。また、本発明の腫瘍検出剤を用いる態様においては、本発明のペプチドを有効成分とするがんワクチンを投与することにより患者生体内で誘導されるＣＴＬが実際に標的とし得る、腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞を検出することが可能である。
【０１０７】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ａ）および（ｂ）、および任意に（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者から得られた生体試料と本発明のＣＴＬ検出剤とを接触させる工程、
（ｂ）該生体試料中のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、上記ＣＴＬ検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む。
【０１０８】
本発明の腫瘍細胞検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ｄ）および（ｅ）、および任意に（ｆ）の工程を含むものである：
（ｄ）被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍細胞検出剤とを接触させる工程、
（ｅ）該生体試料中のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４発現産物の量を測定する工程、
（ｆ）（ｅ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍細胞検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を含む。
本発明の腫瘍細胞検出剤を用いる腫瘍細胞を検出する方法の態様は、上記（ｄ）、（ｅ）の工程および（ｆ）に代えて下記（ｆ’）の工程を含む：
（ｆ’）（ｅ）の結果をもとに、生体試料中の腫瘍細胞の存在または不存在を決定する工程。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から採取された組織細胞を含む試料などを挙げることができる。
【０１０９】
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出（検査）方法の特定の態様は、次の（ｇ）および（ｈ）、および任意に（ｉ）の工程を含むものである：
（ｇ）被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
（ｈ）該生体試料中のＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｉ）（ｈ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から採取された組織細胞を含む試料などを挙げることができる。
【０１１０】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）の一態様は、生体試料中の本発明のペプチド特異的ＣＴＬを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献（Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体の４量体（ＨＬＡテトラマー）を作製し、これを用いてがんが疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
【０１１１】
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４遺伝子発現レベル、本発明のペプチドレベルまたはＣＴＬレベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量または本発明のペプチドを提示する細胞の量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
【０１１２】
被験者が、がんに罹患しているかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。
また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量を測定することにより、実際にＣＴＬが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。
【０１１３】
＜１２＞がんの予防および／または治療方法
本発明はまた、対象におけるがんを予防および／または治療する方法であって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞、ＴＣＲ様抗体、人工ＣＴＬ、遺伝子改変Ｔ細胞からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、がんに罹患し得る生物個体であればいかなる生物個体であってもよいが、好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の個体であり、より好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ２４陽性である。本発明の一態様において、対象はＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
【０１１４】
本発明の予防／治療方法に用いる本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞、ＴＣＲ様抗体、人工ＣＴＬ、および遺伝子改変Ｔ細胞としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本発明における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【０１１５】
具体的な用量としては、例えば、本発明のペプチドの場合、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの場合、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のＴＣＲ様抗体の場合、通常、０．０００１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１週間〜４週間に１回投与するのが好ましい。本発明の遺伝子改変Ｔ細胞または人工ＣＴＬの場合、通常、１×１０４〜１×１０８、好ましくは１×１０５〜１×１０７であり、これを１日〜４週間に１回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。また、本発明のペプチドやヌクレオチドを直接体内に投与するin vivo法の他、ヒトからある種の細胞を採集し、体外で本発明のペプチドやポリヌクレオチドを用いてＣＴＬや抗原提示細胞を誘導した後、これらの細胞を体内に戻すex vivo法を用いることもできる。
【０１１６】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のＨＬＡ型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんの検出は、上記＜１１＞に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程および対象におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。
【０１１７】
＜１３＞がん細胞を標的とするがん治療薬のスクリーニング方法
本発明の腫瘍細胞検出剤を用いる態様において、検出対象におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４発現産物の発現量は、検出対象中の腫瘍細胞の量と正に相関していると考えられる。したがって、検出対象に対してがん治療薬の候補化合物を投与する前後におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４発現産物の発現量を比較することで、投与した候補化合物が腫瘍細胞を標的とするがん治療薬として有用であるか否かを判定することができる。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（Ｉ）、（ＩＩ）および任意に（ＩＩＩ）を含むものである：
（Ｉ）がん治療薬の候補化合物を、対象に投与する前に、該対象におけるＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４遺伝子の発現産物の検出量Ａを測定する工程、
（ＩＩ）前記候補化合物を前記対象細胞集団に投与した後に、該対象における前記遺伝子の発現産物の検出量Ｂを測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記検出量ＡとＢとを比較し、該検出量ＡがＢより有意に大きい場合に、前記候補化合物を、がん幹細胞を標的とすることを特徴とするがん治療薬候補であると判定する工程。
本発明のスクリーニング方法の特定の態様は、上記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を含む。ここで工程（Ｉ）および（ＩＩ）の検出量を測定する工程は、それぞれ上記検出（検査、診断）方法における工程（ｄ）および（ｅ）を含む。
【０１１９】
＜１４＞遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチド
上述のとおり、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子は、精巣以外の正常細胞においては発現していないが腫瘍細胞において発現しているがん精巣抗原であることが初めて見いだされた。このことは、これらの遺伝子の発現が細胞のがん化に関与していることを示唆し、したがってこれらの遺伝子の発現を抑制することでがんを処置することができると考えられる。
【０１２０】
すなわち本発明は一態様において、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤に関する。
細胞において特定の遺伝子を選択的に発現抑制する方法は特に限定されず、例えばアンチセンスＲＮＡ法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ法、ＺＦＮ法、ＴＡＬＥＮ法などが挙げられる。中でもバイオアベイラビリティやオフターゲット効果の低さ、などの観点から、アンチセンスＲＮＡ法およびＲＮＡｉ法が好ましく、ＲＮＡｉ法がより好ましい。
【０１２１】
したがって本発明の好ましい一態様において、遺伝子発現抑制剤は、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明において、ある遺伝子に対する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、当該遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡに対してハイブリダイズすることにより、当該遺伝子の発現を抑制することができるオリゴヌクレオチドを意味し、これはＤＮＡやＲＮＡなどの任意の核酸であってよい。かかるオリゴヌクレオチドとしては、典型的には、当該遺伝子のｍＲＮＡの配列の一部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「相補的」という語は、ある核酸が他の核酸配列と水素結合を形成できることを意味し、特定の「配列（の一部分）と相補的な配列」とは、当該配列を有するヌクレオチドと細胞内環境でハイブリダイズすることができる程度に相補性を有する配列を意味する。したがって配列の全てが相補的（すなわち完全に相補的）である必要はない。
【０１２２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には約１５〜３０ヌクレオチドの長さを有する。また、生体内での安定性や発現抑制活性の向上、オフターゲット効果の低減などの目的のため、当該技術分野において知られた修飾を施されていてよい。
【０１２３】
また本発明の好ましい一態様において、遺伝子発現抑制剤は、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子に対するｓｉＲＮＡである。本発明においてある遺伝子に対する「ｓｉＲＮＡ」とは、当該遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖構造ＲＮＡを意味し、当該二本鎖構造ＲＮＡは、センス領域およびアンチセンス領域を有し、アンチセンス領域は特定遺伝子のｍＲＮＡの配列に相補的であり、センス領域はアンチセンス領域の配列に相補的である。本発明のｓｉＲＮＡの各センス領域およびアンチセンス領域は、約１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有し、好ましくは１９〜２７ヌクレオチド程度の長さを有する。また、センス領域およびアンチセンス領域は、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖の二本の鎖により二本鎖構造を形成していてもよい。また、センス領域およびアンチセンス領域は、連結されて１つのヌクレオチド鎖を構成していてもよく、この場合一本鎖のＲＮＡがヘアピン状に折りたたまれて、センス領域およびアンチセンス領域が二本鎖構造を形成することになる。
【０１２４】
当該技術分野において、ｓｉＲＮＡの発現抑制効果を向上させたり、バイオアベイラビリティを向上させたり、オフターゲット効果を低減させたりする方法は知られている。本発明のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとしての機能を向上させるためのこれらの知られた修飾や改変を適宜適用することができる。
上記ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の方法、例えば市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
【０１２５】
本発明は別の側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または上記ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。本態様の医薬組成物に含まれ得る他の成分としては、例えば薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤などが挙げられ、とくに薬学的に許容可能な担体を含むことが好ましい。薬学的に許容可能な担体としては、これに限定するものではないが、例えばリポソーム、親水性ポリマーなどが挙げられる。
【０１２６】
上述のとおり、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現を抑制することでがんを処置することができるものと考えられる。したがって本態様のポリヌクレオチドを含む上記医薬組成物は、がんの予防および／または治療剤として用いることができる。
【０１２７】
本発明は別の側面において、上記ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現を抑制することを含む、がんを予防および／または処置する方法にも関する。本方法においては、投与される有効成分がＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤、好ましくはＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡであること以外は、上記＜１２＞に記載の方法に準じて実施することができる。
【０１２８】
すなわち上記方法は、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０およびＤＹＲＫ４からなる群から選択される遺伝子の発現抑制剤の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、がんを予防および／または処置する方法ということができる。対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。したがって、対象はＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
【０１２９】
また、本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含んでよい。対象の選択に際しては、上記＜１１＞の対象においてＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０またはＤＹＲＫ４陽性のがんを検出する方法を用い得る。
【０１３０】
本態様における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【０１３１】
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０１３２】
例１．ＨＬＡ−Ａ２４に提示されるナチュラルペプチドの同定【０１３３】
（１）細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４分子の確認
ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５／β２ｍおよびＣｏｌｏ３２０、肺腺癌細胞株であるＬＨＫ２および肺扁平上皮癌であるＳｑ−１をそれぞれ用いて、細胞表面に存在するＨＬＡ−Ａ２４分子の局在を調べた。【０１３４】
培養した上記がん細胞を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco）で処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、約２×１０５個／ウェルとなるようにＵ底９６ウェルプレート（Corning）に分注した。細胞を３８０ｇで５分間遠心し、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマＣ７７０９Ａ２（P. G. Coulie博士（de Duve Institute, Brussel）より供与されたもの）または抗汎ＨＬＡクラスＩ抗体を産生するマウスハイブリドーマＷ６／３２の培養上清と共に、氷上で１時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに氷上で３０分インキュベートした。再度細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで細胞を再懸濁し、BD FACS Caliburシステム（BD Biosciences, Mountain View, CA）で分析し、ＨＬＡ−Ａ２４分子の量と比例する蛍光強度を計測した。【０１３５】
結果を図１に示す。用いた６種の細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５／β２ｍ、Ｃｏｌｏ３２０、ＬＨＫ２、およびＳｑ−１）のうち、遺伝子的にＨＬＡ−Ａ＊２４０２であるＳＷ４８０、ＨＣＴ−１５／β２ｍ、Ｃｏｌｏ３２０、ＬＨＫ２、およびＳｑ−１の５種において、Ｗ６／３２抗体と同程度の蛍光強度がＣ７７０９Ａ２抗体においても観察された。このことは、Ｃ７７０９Ａ２によって、細胞表面におけるＨＬＡ−Ａ２４とナチュラルペプチドとの複合体が選択的に検出されたことを意味する。
（２）ペプチドの単離
がん細胞表面に局在する、ナチュラルペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体の単離は、Purcell et al., Methods Mol Biol. 2004, 251, 291-306およびEscobar et al., J. Immunol, 2008, 181: 4874-4882に記載の方法に準じて行った。簡潔には、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマＣ７７０９Ａ２（P. G. Coulie博士（de Duve Institute, Brussel）より供与されたもの）の培養上清を収集し、ＰＥＧ−２０，０００（WAKO chemicals）に対する逆浸透により約１／４０の体積まで濃縮した濃縮液約４０ｍｌ（ｐＨ約７．２〜７．４に調製）を、約３ｍｌの洗浄済みプロテインＡ−セファロースビーズ（GE Healthcare）に添加し、４℃で一晩揺動してインキュベートした。【０１３６】
その後ビーズを０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）および０．２Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）で洗浄した。プロテインＡに結合した抗体を、０．２Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ８．３）に２０体積の２０ｍＭピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）二塩酸塩（Sigma）を加えた液体中にビーズを再懸濁することにより、共有結合で連結した。カップリング反応は、室温のRotamix中で１〜１．５時間進行させた。ＤＭＰ中の残った遊離イミド酸基を、セファロースビーズを１０体積の２０〜５０ｍＭモノエタノールアミン溶液とともに、室温で２時間、Rotamix中でインキュベートすることによりクエンチした。その後ビーズを０．１Ｍのホウ酸緩衝液で洗浄し、０．０２％のアジ化ナトリウムを加えて４℃で保存した。【０１３７】
細胞は、上記（１）で用いた細胞株をそれぞれ用いた。細胞を、０．５％のNonidet P-40、５０ｍＭのトリス塩酸、１５０ｍＭのＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤（Roche）を含む氷冷緩衝液中でライセートした。４℃で２，０００ｇ−１０分、３８，０００ｇ−３０分、１００，０００ｇ−９０分という一連の遠心によって細胞ライセートを清澄化した。最後の遠心後、上清を収集し、Poly-Prep Chromatography Columns（Bio-Rad）中の、０．５ｍｌのプロテインＡ−セファロースビーズスラリーを通過させて、タンパク質Ａと非特異的に結合するあらゆる分子を除去した。【０１３８】
得られた精製前のライセートを、１ｍｌの上記で作製した抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体（Ｃ７７０９Ａ２）を共有結合させたプロテインＡ−セファロースビーズと混合し、一晩４℃で穏やかにロータミックス処理した。ビーズを４つの氷冷緩衝液（緩衝液１：０．００５％Nonidet P-40、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびプロテアーゼ阻害剤、緩衝液２：５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、緩衝液３：５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０および４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、緩衝液４：５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）で順次洗浄した。最終的に、ＨＬＡ分子とペプチドとの複合体を６ｍｌの１０％酢酸で溶出した。続けて、ＨＬＡ分子とペプチドとを、３ｋＤａカットオフフィルターAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units（Millipore）を用いた限外ろ過により分離した。得られた５．５ｍｌまでの通過画分をSpeedVacで数マイクロリットルまで濃縮し、０．１％ギ酸を溶媒として再溶解し、ＭＡＬＤＩスポッティングデバイスと連結されたナノフローＨＬＰＣシステムに供した。【０１３９】
（２）ペプチドの同定
ペプチドを、ＭＡＬＤＩスポッティングデバイスと連結されたDiNaシステム（KYA Technologies）中のHiQsilC18W-3カラム（１００μｍ  ＩＤ×１００ｍｍ；KYA Technologies, Tokyo, Japan）上で分離した。溶出溶媒Ａとして０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、溶出溶媒Ｂとして７０％アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を用いた。濃度勾配を、８０分間で溶媒Ｂが５％〜５０％となるようにし、３００ｎＬ／分の流速とした。分離したペプチドを、DiNa MaP ＭＡＬＤＩスポッティングシステム中のOpti-TOFTM 384 Well Insert（１２３×８１ｍｍ）ステンレスＭＡＬＤＩプレート（AB Sciex, Foster City, CA）にスポットした。３０秒ごとに１５０ｎＬのペプチド分画を収集し、were overlaid with７０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中の４ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（CHCA; Sigma, Tokyo, Japan）７００ｎＬおよび８０μｇ／ｍｌのクエン酸水素ジアンモニウムで重層した。質量分析は、4800 Plus MALDI-TOF/TOF Analyzer（AB Sciex）と4000 Series Explorer software (ver. 3.5.3)（AB Sciex）上で実施した。質量の正確さを較正するため、トリプシン処理ＢＳＡ標準（KYA Technology）および６−ペプチドミクスチャ（AB Sciex）を用いた。【０１４０】
プリカーサイオンスキャンは６００〜３５００ｍ／ｚの範囲で実施し、１０以上のＳ／Ｎ閾値を有する１００個までのプリカーサイオンを、結果として起こる分裂のために選択した（TOP100 algorithm）。ＭＳ／ＭＳの取得は、空気を衝突ガスとし、衝突エネルギーを１ｋＶとして実施した。取得データからのペプチド同定は、ProteinPilot 3.0 software（AB Sciex）に採用されているParagon search algorithmを用いて、human International Protein Index（IPI）データベース（ipi.HUMAN.v3.71.fasta、８６７３９種のタンパク質配列を含む；ipi.HUMAN.v3.87.fasta、９１４４４種のタンパク質配列を含む）およびhuman UniProt Knowledge Base（UniProtKB_HUMAN.fasta、２０１４年６月時点で８８９９３種のタンパク質配列を含む）に対して行った。【０１４１】
調査のため、以下の設定を選択した:sample type-identification;Cys. alkylation-none;digestion-none; instrument-4800;species-Homo sapiens;ID Focus-no focus / focus on amino acid substitutions;search effort-thorough。ペプチド同定の生データ（ProteinPilot's .group files）はエクセルファイルフォーマット（Microsoft）に移行し、各スペクトルを同定したアミノ酸配列とそのＭＳ／ＭＳイオンシグナルの間の対応について手動で調査したのち、偽陽性の判定をリストから除去した。【０１４２】
結果を図２に示す。得られた複合体からナチュラルペプチドを単離してその配列を決定した結果、５種の細胞株いずれの場合においても、９アミノ酸長のナチュラルペプチドが大部分を占めていた。また、各アミノ酸位置におけるアミノ酸残基の分布を調べたところ、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシンおよび／またはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニンであるペプチドが大部分であった（図２）。これはＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフと符合する。【０１４３】
さらにＭＳ／ＭＳにより配列決定した３８４種のナチュラルペプチドが由来する親タンパク質を調査したところ、そのほとんど（３０４種）がそれぞれの親タンパク質に由来する唯一のものであった。同定された親タンパク質のうち、３０種は２つのナチュラルペプチドを供与し、５種のタンパク質は３つのナチュラルペプチドを供与し、１種のタンパク質は５つのナチュラルペプチドを供与していた。【０１４４】
例２．ＨＬＡ−Ａ２４に対する結合アッセイ
（１）ペプチドの合成
上記１．で同定されたナチュラルペプチドを合成により製造した（PH Japan Co. Ltd., Hiroshima）。７０％以上の純度のペプチドを結合アッセイに用いた。ＨＬＡ−Ａ２４結合性についてのネガティブコントロールとして、合成ペプチドＧＫ１２（配列番号６）を用いた。【０１４５】
（２）結合アッセイ
ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＴ２細胞であるＴ２−Ａ２４細胞を、２７℃で一晩、ＣＯ２インキュベーター内でプレインキュベートした。収集した細胞をOpti-MEMで再懸濁し、Ｕ底９６ウェルプレート（Corning社製）に１ウェルあたり約１×１０５細胞／２００μＬで播種した。対象ペプチドを０．３３μＭ、１μＭおよび１０μＭの濃度でそれぞれ添加し、２７℃で３時間、続いて３７℃で２．５時間、ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。その後、細胞をプレートに入れたまま遠心（３８０ｇ、５分）し、１００μＬのＣ７７０９Ａ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清で再懸濁し、氷上で４５〜６０分インキュベートした。氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（KPL, Gaithersburg, MD）とともに氷上で３０分インキュベートした。プレートに入れたまま氷冷ＰＢＳで洗浄した後、１％ホルムアルデヒドおよびＰＢＳで再懸濁し、FACScan（BD Biosciences, Mountain View, CA）で分析し、安定ＨＬＡ−Ａ２４分子の量の増加に起因する平均蛍光強度（ＭＦＩ）シフト（結合ペプチドにより安定化するため、結果として蛍光が増大する）を計測した。非結合ペプチドＧＫ１２（濃度０〜１０μＭ）で処理した細胞のＭＦＩは一定であり、それをネガティブコントロールとして用いた。【０１４６】
上記例１で得られたナチュラルペプチドのうち、ランダムに選択した２６種のペプチドについて、ペプチド濃度１μＭにおけるＭＦＩシフト（ΔＭＦＩ）を計測した。またそれらのペプチドについて、NetMHC3.4を用いてそれぞれスコアを算出し、ΔＭＦＩとの相関関係について検討した。結果を図３に示す。ΔＭＦＩとNetMHCスコアとは、決定係数Ｒ２＝０．６で線形に相関することがわかった。そしてNetMHCスコアの閾値を０．１５（ΔＭＦＩが１７に相当）として、それより大きいNetMHCスコアを示す場合に結合ペプチドであると推測されることがわかった。その結果、同定されたナチュラルペプチド３８４種のうち、２７３種のペプチドが結合ペプチド（すなわちNetMHC＞０．１５）であると推測されることがわかった（データ示さず）。【０１４７】
例３．腫瘍特異的遺伝子の同定
（１）親遺伝子の正常組織における発現確認
各正常組織における遺伝子発現の確認のため、ハウスキーピング遺伝子により標準化されたヒトｃＤＮＡパネル（Human MTC Panels IおよびII、Clontech社製）を用いた。また、各がん細胞株のトータルＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いて調製し、oligo(dT)プライマーおよびSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを調製した。【０１４８】
上記で調製したｃＤＮＡライブラリを用いて、例２で結合ペプチドであると推測された２７３種のペプチドが由来する親タンパク質をコードする遺伝子（親遺伝子）の発現をＰＣＲで確認した。プライマーセットは、上記ナチュラルペプチドをコードする領域を含み、ＰＣＲ産物が約２００〜４００塩基対の長さになるように設計した。ＰＣＲは、DreamTaqＤＮＡポリメラーゼ、１０×DreamTaqバッファ（Thermo Scientific社製）、２ｍＭのｄＮＴＰミクスチャ、０．２５μＭの順行および逆行プライマー、ならびに対応するｃＤＮＡテンプレートを含む、２０μＬの体積で行った。ＰＣＲサイクルは以下の条件で行った：
【表１】
2017115798.tif 000003
得られたＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで可視化して、ＵＶ光下で観察した。【０１４９】
（２）がん精巣抗原の同定
がん抗原として知られている遺伝子の中には、正常な組織細胞においてはほとんど発現が確認されない遺伝子が存在する。かかる遺伝子は多くの場合精巣にのみ発現が確認されることから、「がん精巣抗原」と称されている。上記（１）の結果から、がん精巣抗原であると推測される遺伝子を選択した。その結果、ＰＶＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＺＮＦ７２４Ｐ、ＳＮＲＮＰ４０、ＤＹＲＫ４およびＴＯＰＫ／ＣＴ８４の６種の遺伝子ががん精巣抗原であると推測された。このうちＴＯＰＫ／ＣＴ８４については、がん精巣抗原であり、当該遺伝子に由来するペプチドががん細胞において抗原提示されていることがすでに報告されている（国際公開第２０１３／０６１５９４号）。【０１５０】
例４．ナチュラル抗原ペプチドの評価
例３で推測されたがん精巣抗原遺伝子を親遺伝子とする、以下の各ナチュラルペプチドについて、ナチュラル抗原ペプチドとしての評価試験を行った。
ＰＶＴ１：ＨＷＮＤＴＲＰＡＨＦ（配列番号１）
ＳＵＶ３９Ｈ２：ＲＹＧＮＶＳＨＦ（配列番号２）
ＺＮＦ７２４Ｐ：ＫＹＶＫＤＦＨＫＦ（配列番号３）
ＳＮＲＮＰ４０：ＩＦＱＧＮＶＨＮＦ（配列番号４）
ＤＹＲＫ４：ＶＹＴＹＩＱＳＲＦ（配列番号５）【０１５１】
上記各遺伝子の発現解析には下表のプライマーセットを用いた。
【表２】
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【０１５２】
（１）ＰＶＴ１およびそれに由来するナチュラルペプチドについて
ＰＶＴ１および配列番号１のペプチドについての試験結果を図４に示す。ＰＶＴ１は従前ｎｃＲＮＡとして知られていたものであるが、本発明者らにより、少なくともがん細胞においてはタンパク質レベルで発現している可能性が示唆された。ＰＶＴ１は精巣以外の正常組織細胞においてはｍＲＮＡレベルでの発現が確認されておらず、ＰＶＴ１に由来する配列番号１のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４との高い結合性を示したことから、免疫治療の標的として有用であると考えられる。また、当該遺伝子はがん細胞において特異的に発現していることから、がん細胞化やがん細胞の生存性に関与している可能性があるため、発現抑制などによる核酸治療などの標的としても効果が期待される。【０１５３】
（２）ＳＵＶ３９Ｈ２およびそれに由来するナチュラルペプチドについて
ＳＵＶ３９Ｈ２および配列番号２のペプチドについての試験結果を図５に示す。ＳＵＶ３９Ｈ２は精巣以外の正常組織細胞においてはｍＲＮＡレベルでの発現が確認されておらず、ＳＵＶ３９Ｈ２に由来する配列番号２のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４との高い結合性を示したことから、免疫治療の標的として有用であると考えられる。また、当該遺伝子はがん細胞において特異的に発現していることから、がん細胞化やがん細胞の生存性に関与している可能性があるため、発現抑制などによる核酸治療などの標的としても効果が期待される。【０１５４】
（３）ＺＮＦ７２４Ｐおよびそれに由来するナチュラルペプチドについて
ＺＮＦ７２４Ｐおよび配列番号３のペプチドについての試験結果を図６に示す。ＺＮＦ７２４Ｐは精巣以外の正常組織細胞においてはｍＲＮＡレベルでの発現が確認されておらず、ＺＮＦ７２４Ｐに由来する配列番号３のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４との高い結合性を示したことから、免疫治療の標的として有用であると考えられる。また、当該遺伝子はがん細胞において特異的に発現していることから、がん細胞化やがん細胞の生存性に関与している可能性があるため、発現抑制などによる核酸治療などの標的としても効果が期待される。【０１５５】
（４）ＳＮＲＮＰ４０およびそれに由来するナチュラルペプチドについて
ＳＮＲＮＰ４０および配列番号４のペプチドについての試験結果を図７に示す。ＳＮＲＮＰ４０は精巣以外の正常組織細胞においてはｍＲＮＡレベルでの発現が確認されておらず、ＳＮＲＮＰ４０に由来する配列番号４のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４との高い結合性を示したことから、免疫治療の標的として有用であると考えられる。また、当該遺伝子はがん細胞において特異的に発現していることから、がん細胞化やがん細胞の生存性に関与している可能性があるため、発現抑制などによる核酸治療などの標的としても効果が期待される。【０１５６】
（５）ＤＹＲＫ４およびそれに由来するナチュラルペプチドについて
ＤＹＲＫ４および配列番号５のペプチドについての試験結果を図８に示す。ＤＹＲＫ４は精巣以外の正常組織細胞においてはｍＲＮＡレベルでの発現が確認されておらず、ＤＹＲＫ４に由来する配列番号５のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４との高い結合性を示したことから、免疫治療の標的として有用であると考えられる。また、当該遺伝子はがん細胞において特異的に発現していることから、がん細胞化やがん細胞の生存性に関与している可能性があるため、発現抑制などによる核酸治療などの標的としても効果が期待される。【０１５７】
例５．ＣＴＬ誘導および評価
（１）ＣＴＬの誘導
インフォームドコンセントを得たＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者の末梢血をヘパリン添加５０ｍＬシリンジにて採血した。全血を、リンフォプレップ（Nycomed社）を１３ｍＬ添加した５０ｍＬチューブ（ファルコン社）に重層し、２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。リンフォプレップ層上に沈殿したＰＢＭＣ層をピペットにて回収し、ＰＢＳにて３回洗浄し、ヒトＰＢＭＣとした。【０１５８】
９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレート（BECTON DIKINSON社）の各ウェルに、Ｈｅｐｅｓ改変ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma社）に２−メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、抗生物質としてストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）とペニシリンＧ（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ）および５％の血清成分を加えた培地を１０ｍＬおよび上記で分離したヒトＰＢＭＣを約３×１０７個／プレート入れ、浮遊させて培養した。これに１０μｇ／ｍＬの濃度で配列番号１のＰＶＴ１由来ナチュラル抗原ペプチド（以下「ＨＦ１０」と記載）または配列番号２のＳＵＶ３９Ｈ２由来ナチュラル抗原ペプチド（以下「ＲＦ８」と記載）を加えた。２日間培養後、５０Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２を添加し、さらに２週間培養した。【０１５９】
上記培養細胞の適量に対して、２０μＬのＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体と、ＨＦ１０パルス細胞に対しては１０μＬのＰＥ標識ＨＦ１０／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬を、ＲＦ８パルス細胞に対してはＰＥ標識ＲＦ８／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬をそれぞれ加え、穏やかに混合し、４℃にて３０分静置した。１．５ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターにて分析し、ＣＤ８（＋）およびＨＬＡ−Ａ２４テトラマー（＋）となる細胞分画をソーティングして増殖し、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを調製し、ＣＴＬとした。【０１６０】
図９は、各ＣＴＬの性質を、ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー試薬を用いて解析したフローサイトメトリー（テトラマーアッセイ）の結果を表す。いずれの株もＣＤ８（＋）およびナチュラル抗原ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー（＋）を示した。また、ＲＦ８パルスＣＴＬは、ＨＩＶ／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマーに対して結合性が低く、ＲＦ８／ＨＬＡ−Ａ２４テトラマーに対して高い特異性を有することが示唆された。【０１６１】
（２）インターフェロン（ＩＦＮ）−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
実験は、Human IFNγ ELISPOT set（BD社）を使用して行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレートに、２００倍希釈した抗ＩＦＮγ抗体を４℃で一晩静置してコートした。１０％ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ（Sigma-Aldrich社）にてプレートを室温にて２時間培養し、ブロッキングし、ＥＬＩＳＰＯＴプレートとした。
２０μｇ／ｍＬの濃度にて各ペプチドを、ヒトリンパ芽球様細胞Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株であるＴ２−Ａ２４細胞（葛島先生、愛知県がんセンターより供与）に室温にて１時間パルスした。ペプチドパルス群は［１］ペプチドパルス無し、［２］ＨＩＶペプチドパルス、［３］ＨＦ１０またはＲＦ８ペプチドパルスの３群とした。ペプチドパルス後ＰＢＳ添加、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを５×１０５個／ｍＬになるように懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに各ウェル５×１０４個ずつ播種した。上記で調製したＣＴＬを各ウェル５×１０４個播種し、３７℃にて一晩培養した。【０１６２】
一晩培養したＥＬＩＳＰＯＴプレートから培養液および細胞を除去後、Milli Q水にて２回、wash bufferにて３回洗浄した。各ウェルに２５０倍希釈したビオチン化検出抗体を添加、室温にて２時間培養した。Wash bufferにて３回洗浄後、１００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを各ウェルに添加、室温にて１時間培養した。Wash bufferにて３回洗浄およびＰＢＳにて２回洗浄後、発色試薬を各ウェルに添加、室温にて１５〜３０分間発色反応を行った。十分な可視スポット形成を確認後、Milli Q水にて洗浄し、反応を終了した。ニトロセルロース膜を乾燥後、KS ELISPOT（ZEISS社）にて検出、撮影した。【０１６３】
また標的細胞として、ペプチドパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に代えて、がん細胞を用いて同様にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。がん細胞は、ＣＴＬクローンＡ１０、Ｅ１０およびＨ３に対しては大腸がん細胞ＳＷ４８０およびｃｏｌｏ３２０ならびに肺がん細胞Ｓｑ−１を用い、ＣＴＬクローン１１に対しては、大腸がん細胞ＳＷ４８０を用いた。【０１６４】
結果を図１０に示す。Ａは、ＨＦ１０ペプチドを用いて誘導したＣＴＬクローンＡ１０、Ｅ１０およびＨ３を用いたアッセイの結果を表す。いずれのクローンも、ＨＦ１０でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に対して特異的な反応性を示した。また、がん細胞を用いたアッセイにおいては、例４においてＰＶＴ１のｍＲＮＡが検出されたＳＷ４８０およびｃｏｌｏ３２０に対して反応性が示されたが、ＰＶＴ１のｍＲＮＡが検出されなかったＳｑ−１に対しては反応が見られなかった。このことは、ＳＷ４８０およびｃｏｌｏ３２０がＰＶＴ１タンパク質を発現し、ＨＦ１０を細胞表面に抗原提示していることを表す。
ＢはＲＦ８ペプチドを用いて誘導したＣＴＬクローン１１を用いたアッセイの結果を示す。こちらもＨＦ１０と同様、ＲＦ８でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に対して特異的な反応性を示した。またペプチドパルス細胞に代えて、ＲＦ８が単離された細胞であるＳＷ４８０細胞に対しても、やはり特異的な反応性を示した。このことは、ＳＷ４８０がＲＦ８を細胞表面に抗原提示していることを表す。【０１６５】
（３）ＬＤＨキリングアッセイ
上記で調製したＲＦ８ペプチド特異的ＣＴＬが、実際にＳＵＶ３９Ｈ２を発現する細胞を攻撃するかを、LDH killingアッセイ（TaKaRa Bio社）で解析した。まず、ＲＦ８ペプチド特異的ＣＴＬの攻撃の対象となる標的細胞（Target）として、上記（２）と同様に、ペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞を調製した。標的細胞は、９６ウェルＶ底プレート（コーニング社）に、１×１０４個／ウェルずつ播種した。ＲＦ８特異的ＣＴＬ（Effector）は、図１１に記載したE/T ratio（すなわち標的細胞の３倍、１０倍および３０倍）となるようウェルごとに細胞数を調整し、９６ウェルプレートに撒いた標的細胞と混合した。その後、９６ウェルプレートを、１８００ｒｐｍ、１０分遠心後、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で４時間から１２時間静置した。９６ウェルプレートを遠心し、細胞を沈殿させた後、上清１００μＬを平底９６ウェルプレートに移した。それぞれのウェルに、ジアホラーゼを含む反応液を１００μＬ加えて室温で３０分静置し、そののち４９０ｎｍの吸光度を測定した。この操作により、通常は細胞膜内に存在するＬＤＨが、細胞が傷害を受けている場合、細胞膜の損傷により細胞外に放出されるため、培養液中のＬＤＨ量を、吸光度として測定することにより細胞傷害性を査定することが可能である。この方法を用いて、ＲＦ８ペプチド特異的ＣＴＬが、ＲＦ８ペプチドを提示する標的細胞を認識し攻撃するかを検討した。【０１６６】
次に標的細胞として、各種がん細胞株を用いて同様の試験を行った。標的細胞としては、ＲＦ８が単離された細胞株である大腸がん細胞株ＳＷ４８０の他、肺がん細胞株であるＬＨＫ２およびＳｑ−１を用いた。両細胞株はいずれもＳＵＶ３９Ｈ２を発現しており、さらにＨＬＡ−Ａ２４も発現していることを確認している。また、ネガティブコントロールとして、ＨＬＡを発現していないことが知られている慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞株を用いた。【０１６７】
結果を図１１に示す。ＡはペプチドパルスＴ２−Ａ２４細胞に対する傷害活性アッセイの結果を示すものであり、ペプチドパルスなしおよびＨＩＶペプチドパルスＴ２−Ａ２４に対しては細胞傷害活性を示さなかったのに対し、ＲＦ８ペプチドでパルスしたＴ２−Ａ２４に対しては強い細胞傷害活性を示した。またＢは各種がん細胞株に対する傷害活性アッセイの結果を示すものであり、ＳＷ４８０、ＬＨＫ２およびＳｑ−１のいずれの細胞株に対しても、強い細胞傷害活性を示した。一方ネガティブコントロールであるＫ５６２に対しては、細胞傷害活性を示さなかった。この結果は、ＲＦ８ペプチドがＳＵＶ３９Ｈ２発現細胞のＨＬＡ−Ａ２４にナチュラルに提示されることを示しており、同時に誘導したＣＴＬががん細胞に対して抗腫瘍効果をもたらすことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明のペプチドは、いずれも腫瘍特異的に抗原提示されているペプチドであり、分子標的治療、免疫療法、核酸治療などの腫瘍特異的な治療の標的として非常に有用であることが示されたものである。とくにこれらのペプチドは、実際にがん細胞表面に、ＨＬＡ−Ａ２４との複合体として抗原提示されているペプチドとして同定されたものであり、したがって免疫療法において特に好適に用いることができるものである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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